(57)【要約】【課題】臨床におけるがんと類似の性質を有する細胞を、大量に短時間で得る。【解決手段】アミノ基転移物質高含量培地においてがん含有材料中のがん細胞を選択的に増殖および／または生存させることを特徴とする、がん細胞の製造方法、そのためのアミノ基転移物質高含量培地および培地添加剤、ならびに該方法で得られたがん細胞およびその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基転移物質高含量培地においてがん含有材料中のがん細胞を選択的に増殖および／または生存させることを特徴とする、がん細胞の製造方法。
【請求項２】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が０．１〜１００ｍＭである請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が０．５〜５ｍＭである請求項２記載の方法。
【請求項４】
がん含有材料が、喀痰、口腔洗浄液、胸水、腹水、血液、骨髄液、擦過細胞診試料、便または尿である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られたがん細胞。
【請求項６】
がん細胞を選択的に増殖および／または生存させるためのアミノ基転移物質高含量培地。
【請求項７】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が０．１〜１００ｍＭである請求項６記載の培地。
【請求項８】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が０．５〜５ｍＭである請求項７記載の培地。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の培地の濃縮物。
【請求項１０】
アミノ基転移物質を含む、培地中のがん細胞を選択的に増殖および／または生存させるための培地添加剤。
【請求項１１】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、培地に添加した場合にその濃度が０．１〜１００ｍＭとなるように処方されている請求項１０記載の培地添加剤。
【請求項１２】
アミノ基転移物質がアンモニアであり、培地に添加した場合にその濃度が０．５〜５ｍＭとなるように処方されている請求項１０記載の培地添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞の選択的増殖・生存方法、そのための培地および培地添加物、ならびに該方法で得られたがん細胞およびその使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは根治の難しい疾患である。特に消化器癌は悪性度が高く、根治は非常に難しい。主ながん治療としては、外科手術、化学療法、放射線療法および免疫療法が挙げられる。抗がん剤などの化学療法の基礎的研究には、一般的には、確立されたがん細胞株が用いられているが、臨床におけるがんとはその形態、機能、遺伝子発現など多くの点で性質が異なる。近年、生態環境に近いがん研究モデルとして、患者由来がん細胞（patient derived cancer cell (PDC)）や患者由来異種移植モデル（patient derived xenograft model (PDX model）)を用いて、薬剤スクリーニングや至適薬剤反応試験等に利用する試みもなされているが、がん組織から回収されるがん細胞が少ない、細胞の回収に時間がかかる、長期の培養中に細胞の性質が変化する、動物への移植に手間がかかる等の問題がある。このような理由から、薬剤スクリーニングや至適薬剤反応試験、ならびにがんの化学療法の基礎研究等には、生態環境に近い性質を有するがん細胞をできるだけ多く、しかも時間をかけずに得ることが必要である。
【０００３】
がん組織由来細胞を初代培養する方法が報告されているが（特許文献１参照）、臨床におけるがんと類似の性質を有する細胞を、大量に短時間で得ることは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床におけるがんと類似の性質を有する細胞を、大量に短時間で得ることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、驚くべきことに、生体内では通常あり得ない高濃度のアミノ基転移物質の存在で、がん細胞が選択的に増殖および／または生存しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のものを提供する：
（１）アミノ基転移物質高含量培地においてがん含有材料中のがん細胞を選択的に増殖および／または生存させることを特徴とする、がん細胞の製造方法。
（２）アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が約０．１〜約１００ｍＭである（１）記載の方法。
（３）アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が約０．５〜約５ｍＭである（２）記載の方法。
（４）がん含有材料が、喀痰、口腔洗浄液、胸水、腹水、血液、骨髄液、擦過細胞診試料、便または尿である（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか記載の方法により得られたがん細胞。
（６）（５）記載のがん細胞に候補薬剤を接触させることを特徴とする、薬剤スクリーニング方法。
（７）（５）記載のがん細胞を非ヒト動物に移植することを特徴とする、患者由来異種移植モデル動物の製造方法。
（８）（５）記載のがん細胞を移植した非ヒト動物に候補薬剤を投与することを特徴とする、薬剤スクリーニング方法。
（９）（５）記載のがん細胞をＴ細胞に作用させることを特徴とする、がん治療のためのＴ細胞の製造方法。
（１０）がん細胞を選択的に増殖および／または生存させるためのアミノ基転移物質高含量培地。
（１１）アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が約０．１〜約１００ｍＭである（１０）記載の培地。
（１２）アミノ基転移物質がアンモニアであり、その濃度が約０．５〜約５ｍＭである（１１）記載の培地。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか記載の培地の濃縮物。
（１４）アミノ基転移物質を含む、培地中のがん細胞を選択的に増殖および／または生存させるための培地添加剤。
（１５）アミノ基転移物質がアンモニアであり、培地に添加した場合にその濃度が約０．１〜約１００ｍＭとなるように処方されている（１４）記載の培地添加剤。
（１６）アミノ基転移物質がアンモニアであり、培地に添加した場合にその濃度が約０．５〜約５ｍＭとなるように処方されている（１５）記載の培地添加剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、がん細胞を選択的に増殖および／または生存させ、回収することができる。本発明によれば、臨床におけるがん細胞と同様の性質を有するがん細胞を、大量に、しかも短時間で得ることができるので、多くの薬剤スクリーニングや至適薬剤反応試験を行うことができ、がんの化学療法の質、量の大幅な向上をはかることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、１の態様において、アミノ基転移物質高含量培地においてがん含有材料中のがん細胞を選択的に増殖あるいは生存させることを特徴とする、がん細胞の製造方法を提供する。
【０００９】
正常血中アンモニア濃度は約０．０５ｍＭ以下であること、アンモニアにより正常細胞のアポトーシスやオートファジーが惹起されることが知られている（Soria LR, Brunetti-Pierri N. J Inherit Metab Dis. 2019 Jan 22.およびFreyer N, Greuel S, Knoespel F, Gerstmann F, Storch L, Damm G, Seehofer D, Foster Harris J, Iyer R, Schubert F, Zeilinger K. Bioengineering (Basel). 2018 Mar 15;5(1).）。しかし、本発明者らは、０．１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、あるいは４０ｍＭ以上といった生体内（正常組織およびがん組織を含め）では通常あり得ない高濃度のアミノ基転移物質の存在下においてがん細胞が生存し、むしろ増殖することを初めて見出した。本発明者らは、これらの濃度のアミノ基転移物質の存在下において正常細胞が観察視野から消失しうることも確認した。ここで、アミノ基転移物質は、アミノ基を転移することができる物質であればよく、特に限定されない。アミノ基転移物質の例としては、アンモニアのほか、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、メチルアミン、エチルアミンなどのアミン類、プトレッシン、スペルミジン、スペルミンなどのポリアミン類などが挙げられる。
【００１０】
本発明の方法に使用されうる培地は、動物細胞培養用であればよく、特に限定されない。該培地は無血清培地であっても、血清含有培地であってもよい。様々な動物細胞培養用培地が当業者に公知であり、Ｄ−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｄ−ＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１などが例示されるが、これらに限定されない。当業者は公知の培地を適宜選択して用いることができ、あるいは公知の培地の成分を適宜改変して用いることもできる。このような培地にアミノ基転移物質を添加して使用することができる。
【００１１】
アミノ基転移物質が培地中で高含量とは、アミノ基転移物質がアンモニアである場合、その濃度が約０．１ｍＭ以上、例えば約０．５ｍＭ以上、約２ｍＭ以上、約５ｍＭ以上、約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上であることをいう。高含量のアンモニアの濃度の例としては、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約２ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭなどが挙げられるが、これらに限定されない。がん細胞を選択的に増殖させるのに好ましいアンモニア濃度は約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約２ｍＭ〜約５ｍＭなどであってもよい。がん細胞を選択的に生存させるのに好ましいアンモニア濃度は、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭなどであってもよい。なお、本明細書においてアンモニアという場合、アンモニウムイオンを包含する。また、アンモニア以外のアミノ基転移物質の培地中の濃度は、１つのアミノ基を１つのアンモニアあるいは１つのアンモニウムイオンと同数として換算した値とすることができる。本明細書において、「約」が数値の前にある場合、その数値±２０％、好ましくはその数値±１０％の範囲を包含する。
【００１２】
上記濃度のアミノ基転移物質を、培地調製時に添加してもよく、培養開始前または開始時あるいは培養途中で添加してもよい。培地へのアミノ基転移物質の添加は１回でもよく、２回以上であってもよい。
【００１３】
がん含有材料は、がん細胞を含むかあるいはがん細胞を含む可能性のある材料をいう。該材料はいずれの動物に由来するものであってもよいが、典型的にはヒト由来である。該組織を身体のいずれの部分から採取してもよい。該材料はがん患部組織であってもよい。該組織は生検で得られた組織や外科手術で採取または摘出された組織であってもよく、あるいは喀痰、口腔洗浄液、胸水、腹水、血液、骨髄液、擦過細胞診試料、便または尿などであってもよい。また該材料は、すでにがん組織から回収されあるいは単離されたがん細胞を含む培養物、公知のがん細胞株を含む培養物などであってもよい。
【００１４】
がん含有材料をそのまま、あるいは必要に応じてほぐす、あるいは細切または酵素処理して、アミノ基転移物質高含量培地に添加し、適当な条件下で培養する。必要であれば、培地に添加する前にがん含有材料から挟雑物を除去してもよい。細切はナイフ、メス、カッター、はさみなどの公知の器具を用いて行ってもよい。適切なサイズの注射針を備えたシリンジにがん組織の懸濁液を繰り返し出し入れすることにより細切してもよい。かかる処理の前に、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などのバッファーまたは生理食塩水でがん含有材料を洗浄してもよい。コラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼなどを単独使用または併用して酵素処理を行ってもよい。
【００１５】
がん含有材料が喀痰、口腔洗浄液、胸水、腹水、血液、骨髄液、擦過細胞診試料、便または尿など、そのままあるいは適宜ほぐすだけでアミノ基転移物質高含量培地に添加して培養できるものである場合、がん細胞の製造に時間がかからない。これらのがん含有材料は手術や生検によらずに得ることができる。したがって、本発明を用いてかかる材料から迅速に十分な量のがん細胞を術前に得ることができ、その特徴を調べることができるので、適切な治療方法を選択することができる。
【００１６】
本発明の方法により製造されるがん細胞は、いずれの種類のがん細胞であってもよい。例えば、大腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、肛門癌、膵癌、肝癌、胆管癌、消化器内分泌腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、乳癌、肺癌、中皮腫、胸腺癌、腎癌、尿路上皮癌、精巣腫瘍、前立腺癌、子宮体癌、子宮頚癌、子宮肉腫、卵巣悪性腫瘍、舌癌、歯肉癌、口腔底癌、咽頭癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲状腺癌、骨肉種、Ｅｗｉｎｇ肉腫、軟部肉腫、骨髄異形成症候群、皮膚癌、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫（グリオブラストーマ）、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などの細胞が例示されるが、これらに限定されない。
【００１７】
培養は、いずれの動物細胞培養用培地で行ってもよく、浮遊培養、接着培養などいずれの方法で培養を行ってもよい。培養方法および条件は当業者に公知であり、がん含有材料の種類や形態、がん細胞の種類、必要ながん細胞数などに応じて適宜選択することができる。浮遊培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し難い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いてもよい。浮遊培養の培地の組成、培養温度、静置か撹拌または振盪を行うかなどの浮遊培養に関するその他の条件も、がん細胞の種類その他の条件に応じて当業者が適宜定めうるものである。接着培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し易い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。がんの種類や組織型によってはラミニン５１１、可溶性Ｅカドヘリン等を固層化したプレートに播種してもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。接着培養の培地も、がん細胞の種類その他の条件に応じて選択することができる。培地の種類、培養温度などの接着培養に関するその他の条件も、当業者が適宜定めうるものである。
【００１８】
本発明の方法の１の具体例において、がん組織を細切および／または酵素処理して得られた細胞集団を、アミノ基転移物質高含量無血清培地、次いでアミノ基転移物質高含量血清含有培地またはアミノ基転移物質高含量足場材含有培地もしくはアミノ基転移物質高含量足場材塗布培養基材にて培養することによりがん細胞を製造することができる。
【００１９】
がん細胞の選択的増殖とは、がん細胞と正常細胞が共存している場合に、がん細胞の比増殖速度が正の値であり、正常細胞の比増殖速度が負であること；および／またはがん細胞の比増殖速度および正常細胞の比増殖速度がともに正である場合は、がん細胞の比増殖速度が正常細胞の比増殖速度を上回っていることを意味する。比増殖速度の計算方法は当業者に公知である。培養終了時点でがん細胞数が正常細胞数よりも多いことが好ましい。培養終了時点でがん細胞数が正常細胞数の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましく、１０００倍以上であることがさらに好ましい。培養終了時点で正常細胞が観察視野から消失していることが最も好ましい。無血清培地を用いた場合は、正常細胞が観察視野から消失しやすい。
【００２０】
がん細胞の選択的生存とは、がん細胞と正常細胞が共存している場合に、正常細胞の数を減少させ（死滅させることを含む）、その一方で、がん細胞の数を維持あるいは増加させることをいう。
【００２１】
本発明の方法により得られたがん細胞をさらに継代培養してもよい。継代培養を行うことにより、さらに多くの初代培養細胞を得ることができる。継代培養の方法は当業者に公知である。継代は、初代培養物の性質（形態学的性質、遺伝学的性質、生理学的性質など）が変化しない回数行うことが好ましい。また、本発明の方法により得られたがん細胞を株化させてもよい。
【００２２】
本発明は、もう１つの態様において、本発明の方法で得られたがん細胞に候補薬剤を接触させることを特徴とする、薬剤スクリーニング方法を提供する。薬剤スクリーニングは、例えば抗がん剤などの創薬のためのスクリーニング、精密医療のための各患者に対する至適薬剤反応試験などを包含する。薬剤スクリーニングにおいて、本発明の方法で得られたがん細胞を二次元培養したものを用いてもよく、三次元培養したものを用いてもよい。
【００２３】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法で得られたがん細胞を非ヒト動物に移植することを特徴とする、患者由来異種移植モデル動物の製造方法を提供する。かかるモデル動物は、ヒト以外であればいずれの動物であってもよいが、成長が早く、多産であることからマウスが好ましい。典型的には、かかるモデル動物は、本発明の方法で得られたがん細胞を免疫不全非ヒト動物に移植することによって得ることができる。かくして得られたモデル動物に候補薬剤を投与することによって薬剤スクリーニングを行うことができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、本発明の方法で得られたがん細胞を移植して得られた非ヒト動物に候補薬剤を投与することを特徴とする、薬剤スクリーニング方法を提供する。
【００２４】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法で得られたがん細胞をＴ細胞に作用させることを特徴とする、がん治療のためのＴ細胞の製造方法を提供する。例えば、本発明の方法で得たがん細胞とＴ細胞を共培養することによりＴ細胞を「教育」して、当該がん細胞を標的とするＴ細胞を得てもよい。かくして得られたＴ細胞を例えば注射により患者に戻し、患者のがんを治療してもよい。がん細胞とＴ細胞の由来は同一個体であってもよく、別個体であってもよい。好ましくは、これらの細胞は同一個体に由来する。
【００２５】
本発明は、もう１つの態様において、がん細胞を選択的に増殖させるためのアミノ基転移物質高含量培地を提供する。培地は、動物細胞培養用であればよく、特に限定されない。該培地は無血清培地であっても、血清含有培地であってもよい。様々な動物細胞培養用培地が当業者に公知であり、Ｄ−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１などが例示されるが、これらに限定されない。動物細胞培養用培地の成分についても当業者に公知ある。当業者は公知の培地を適宜選択して用いることができ、あるいは公知の培地の成分を適宜改変して用いることができる。
【００２６】
上記培地は、アミノ基転移物質がアンモニアである場合は、高含量のアンモニアに関して説明した濃度のアンモニアを含む。
【００２７】
上記培地を用いることにより、がん細胞を選択的に増殖させることができる。上記培地を用いてがん細胞を所望の数にまで増やしてもよい。また、上記培地を用いてがん細胞と正常細胞との混合物からがん細胞を濃縮してもよい。
【００２８】
上記培地は濃縮物の形態であってもよい。本発明の培地濃縮物は、例えば糖類、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、および例えばアンモニア、塩化アンモニウムやポリアミンのようなアミノ基転移物質を含むものであってもよい。本発明の培地濃縮物の形態は特に限定されず、例えば液体、ペーストのような半固体、粉末や凍結乾燥物のような固体であってもよい。本発明の培地濃縮物は、水などの媒体で希釈することにより、あるいは水などの媒体を添加することにより所望の成分濃度として用いることができる。
【００２９】
本発明は、さらなる態様において、アミノ基転移物質を含む、培地中のがん細胞を選択的に増殖させるための培地添加剤を提供する。本発明の培地添加剤は、アンモニア、塩化アンモニウムやポリアミンのようなアミノ基転移物質を含み、所望により他の培地成分を含んでいてもよい。本発明の培地添加剤中のアミノ基転移物質の含量は、培地に添加したときに所望の濃度となるように選択される。
【００３０】
該所望のアミノ基転移物質の培地中の濃度の例は、アミノ基転移物質がアンモニアである場合は、高含量のアンモニアに関して説明した濃度である。
【００３１】
本発明の培地添加剤の形態は特に限定されず、例えば液体、ペーストのような半固体、粉末や凍結乾燥物のような固体であってもよい。本発明の培地添加剤を、培地調製時に添加してもよく、培養開始前または開始時あるいは培養途中で添加してもよい。本発明の培地添加剤を１回添加してもよく、２回以上添加してもよい。
【００３２】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
肺がん患者由来の肺がん細胞（PDC: Patient-derived Cancer cells）の増殖に及ぼす培地中のアンモニア濃度について検討した。
肺腺がん患者から同意を得て入手した手術時余剰試料である肺腺がん組織を、ハサミにて細切し、Ｌｉｂｅｒａｓｅにて３７℃、６０分処理した。ＰＢＳにて３回洗浄後、フィルターにてｄｅｂｒｉｓを除去し、２０％  ＫＳＲ（Knockout Serum Replacement, Life Technologies）および５ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ含有ＲＰＭＩ１６４０にて７日間培養した。７日目以降は５％  ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、１ｘＩＴＳ（insulin-transferrin-selenite, Life Technologies）含有ＳｔｒｅＭｅｄｉａ（細胞科学（CSTI））に培地を変更し、２日ないし３日おきに培地交換し、増殖する細胞をがん細胞として得た。得られたがん細胞を、０、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、４０、１００ｍＭのアンモニアを含有する培地（SteMedia bFGF 10mL）に５．０ｘ１０５個／ｄｉｓｈ（直径１０ｃｍ）にて播種し、４日間培養、回収して生細胞を計測、倍化率を算出した。結果を表１に示す。
【表１】
2020124148.tif 000002
【００３４】
アンモニア濃度が０．５ｍＭ以上２ｍＭ以下の条件では肺がん細胞は、アンモニア非含有条件以上の増殖をしていた。アンモニア濃度が５ｍＭの条件下でも肺がん細胞は、アンモニア非含有条件と同等に増殖していた。また、アンモニア濃度が２ｍＭを越えても４０ｍＭまでは肺がん細胞は増殖することが示された。正常細胞では２０ｍＭ以上の濃度では細胞はほとんど生存しておらず、アンモニアを高濃度とすることで、がん細胞を増殖させ、正常細胞を死滅させる、がん細胞の製造方法が可能となる。なお、２０ｍＭ以上のアンモニア濃度であってもがん細胞は増殖を示すため、継代培養によりがん細胞と正常細胞が混合した細胞集団からがん細胞を増殖させ、がん細胞を主要な細胞集団として製造することも可能である。
【実施例２】
【００３５】
がん組織からがん細胞を単離する過程での培地中のアンモニア濃度について検討した。
がん細胞の代表例として肺がん患者由来の肺がん細胞（PDC: Patient-derived Cancer cells）を用い、該細胞をＳＣＩＤマウス皮下に移植してＰＤＸ（Patient derived xenograft）を形成させ、形成した腫瘤をヌードマウスに植え継ぎ３回植え継を行った。ヌードマウス皮下から、腫瘍の代替であるＰＤＸとして腫瘤を摘出し、Ｌｉｂｅｒａｓｅにて３７℃、６０分処理し、洗浄後に細胞を単離・回収した。得られたがん細胞を、０、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、４０、１００ｍＭのアンモニアを含有する培地（RPMI1640 with 20% KSR 5ng/mL bFGF 10mL）に５．０ｘ１０５個／ｄｉｓｈ（直径１０ｃｍ）にて播種し、３日間培養、回収して生細胞を計測、倍化率を算出した。結果を表２に示す。
【表２】
2020124148.tif 000003
【００３６】
アンモニアを０．１ｍＭ以上〜５ｍＭ含有する培地では、ＰＤＸから回収した細胞の増殖を認めた。正常細胞では細胞生存率が低下する濃度である１０ｍＭであってもＰＤＸから回収した細胞は生存していることから、アンモニア高濃度含有培地では正常細胞を排除することでがん細胞を回収することが可能である。
【００３７】
以上の結果から、がん細胞は、１００ｍＭのアンモニアを含む培地中でもある程度生存可能であり、０．１ｍＭ〜４０ｍＭのアンモニアを含む培地中で増殖可能であり、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、例えば０．５ｍＭ〜５ｍＭのアンモニア濃度でよく増殖するといえる。
【比較例１】
【００３８】
正常細胞の例として脂肪組織由来間質細胞（ＡＤＳＣ）を用い、アンモニア含有培地での細胞の増殖傾向について検討した。
培地（ＳｔｅＭｅｄｉａ  ＥＧＦ）にて１ｘ１０５個／ｍＬとして懸濁し、２４穴ディッシュに５００μＬずつ播種した。播種３日後、ＣＣＫ−８溶液を添加し、吸光度にて細胞量を測定した。各濃度での吸光度とアンモニアを添加していない培地の吸光度との差分を細胞数とし、アンモニアを添加していない条件で培養した細胞との比率として提示した（表３）。アンモニアを含有した培地で細胞を培養すると、含有しない培地で培養した場合と比して増殖は抑制された。
【表３】
2020124148.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、がんの研究、抗がん剤の開発等に有用である。