(57)【要約】      （修正有）【課題】ジスルフィド含有ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合の還元を防止するための方法の提供。【解決手段】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組換型ホスト細胞培養物中で抗体を発現することと、細胞培養物の生産段階に続いて、処理中の抗体中のジスルフィド結合の還元を防止するために、組換型ホスト細胞の収集前の細胞培養液を空気でスパージングすることとを含み、空気スパージングが、収集前の細胞培養液中の溶存酸素（ｄＯ２）の量が少なくとも１０％空気で飽和されるまで継続される、抗体を生産するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞中で発現されるポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、組換え宿主細胞の収集前又は収集培養液にチオレドキシン阻害剤を補充することを含む方法。
【請求項２】
上記チオレドキシン阻害剤を収集前培養液に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記チオレドキシン阻害剤を収集培養液に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンの直接阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記チオレドキシン阻害剤がアルキル−２−イミダゾリルジスルフィド又はナフトキノンスピロケタール誘導体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンレダクターゼの特異的阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記チオレドキシン阻害剤が金錯体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記金錯体がオーロチオグルコース（ＡＴＧ）又は金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記ＡＴＧ又は上記ＡＴＭを、約０．１ｍＭと約１ｍＭの間の濃度で添加する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記ＡＴＧ又は上記ＡＴＭを、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシンレダクターゼ濃度の少なくとも約４倍の濃度で添加する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記金属イオンが、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、及びＭｎ２＋からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記金属イオンが、硫酸銅の形態で存在するＣｕ２＋である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記硫酸銅が、五水和物形態又は無水物形態である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記硫酸銅を、約５ｍＭと約１００ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記硫酸銅を、約１０ｍＭと約８０ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記硫酸銅を、約１５ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
上記硫酸銅を、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約２倍の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
上記チオレドキシン阻害剤がＧ６ＰＤの阻害剤としてである請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記チオレドキシン阻害剤が、ピリドキサール５’−リン酸，１フルオロ−２，４ジニトロベンゼン，デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及びエピアンドロステロン（ＥＡ）からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＤＨＥＡを、約０．０５ｍＭと約５ｍＭの間の濃度で添加する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記ＤＨＥＡを、約０．１ｍＭと約２．５ｍＭの間の濃度で添加する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記チオレドキシン阻害剤が、ヘキソキナーゼ活性の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンのキレート剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
金属イオンの上記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記ＥＤＴＡを、約５ｍＭと約６０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記ＥＤＴＡを、約１０ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
上記ＥＤＴＡを、約２０ｍＭと約４０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
上記チオレドキシン阻害剤が、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、及びリキソースからなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記チオレドキシン阻害剤が、シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンである請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
上記シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンを、上記収集前又は収集培養液中の上記ポリペプチドの濃度の少なくとも約４０倍の濃度で添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシンレダクターゼに特異的に結合するｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、又は抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシン活性の阻害を間接的に生じさせる手段である請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液への空気散布である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液のｐＨを低下させることである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
上記組換え宿主細胞の収集培養液へ空気散布する工程を更に含む請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
上記組換え宿主細胞の収集培養液のｐＨを低下させる工程を更に含む請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
上記ポリペプチドが、抗体又は抗体の生物学的に機能的な断片である請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
上記抗体断片が、抗体断片から形成されたＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び多重特異的抗体から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記抗体又は抗体断片が、治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片である請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
上記治療用抗体が、抗ＨＥＲ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体，抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃレセプター抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；乳房上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７−１Ａ抗体；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体，及び抗ＨＬＡＤＲ抗体からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記治療用抗体が、ＨＥＲレセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、又はＤＲ５に結合する抗体である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
上記ＨＥＲレセプターがＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＨＥＲレセプターがＨＥＲ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
上記治療用抗体が、配列番号１６、１７、１８、及び１９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記治療用抗体が、ＣＤ２０に結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
上記治療用抗体が、配列番号１から１５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記治療用抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
上記治療用抗体が、配列番号２０から２５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記治療用抗体が、ＣＤ１１ａに結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
上記治療用抗体が、配列番号２６から２９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記治療用抗体がＤＲ５レセプターに結合する請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
上記治療用抗体が、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３，８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３，及び２５．３からなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ８．３又はＡｐｏｍａｂ７．３である請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
上記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ７．３である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
治療用ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン及び牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上記ポリペプチドの断片からなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
上記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
上記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
組換え宿主細胞が原核生物宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
原核生物宿主細胞が細菌細胞である請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
細菌細胞が大腸菌細胞である請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジスルフィド含有ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合の還元を防止するための方法及び手段に関する。特に、本発明は、組換え宿主細胞培養物から、抗体を含むジスルフィド含有ポリペプチドの収集の間におけるジスルフィド結合の還元の防止に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー産業では、薬学的利用には様々なタンパク質を組換えＤＮＡ技術を使用して生産することを必要とする。一般に、組換えタンパク質は、所望のタンパク質をコードする核酸を含む組換えプラスミドの挿入によって対象のタンパク質を生産するために操作された、哺乳動物細胞のような真核生物細胞、又は細菌細胞のような原核生物細胞の何れかを使用して、細胞培養によって生産される。タンパク質が生物学的に活性であるためには、その三次構造を含むタンパク質のコンフォメーションがその精製と単離の間、維持されなければならず、タンパク質の複数の官能基が分解から保護されなければならない。
哺乳動物細胞は、主に正しく折り畳まれ組み立てられた異種タンパク質を生産するその能力と、翻訳後修飾のその能力のため、臨床用途のための哺乳動物タンパク質の生産のための優位な系になった。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び例えばマウスミエローマ（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胚腎臓(HEK-293)及びヒト網膜細胞、例えばヒト網膜細胞から単離されたPER.C6(登録商標)細胞株のような様々な他の哺乳動物源から得られた細胞株は、ヒト糖鎖修飾特性をもたらすが、ヒトの生理に適合する抗体を自然に生産することができ、生物製剤製品の製造のための規制機関によって承認されている。
【０００３】
通常、生産サイクルを開始するために、少数の形質転換組換え宿主細胞を数日の間、培養して増殖させる（例えば図２３を参照）。細胞がひとたび数回の複製を受ければ、それらを、発酵を受ける準備がされた大きな容器に移す。細胞が増殖される培地及び生産サイクル中に存在する酸素、窒素及び二酸化炭素のレベルは、生産プロセスに対して顕著な影響を持ちうる。増殖パラメーターが特に各細胞株に対して決定され、これらのパラメーターは最適な増殖と生産条件を保証するために頻繁に測定される。
細胞が十分な数まで増殖したとき、それらを大規模製造タンクに移し、長期間にわたって増殖させる。プロセスのこの点で、組換えタンパク質を収集することができる。典型的には、細胞を操作してポリペプチドを細胞培養培地中に分泌させるので、精製工程における最初の工程は培地から細胞を分離することである。典型的には、収集は、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を生産するために遠心分離と濾過を含む。ついで、培地について、細胞片、望まれないタンパク質、塩、無機質又は他の望ましくない元素を除去する数種の更なる精製工程を実施する。精製プロセスの終わりには、組換えタンパク質は高度に純粋であり、ヒトの治療用途に適している。
【０００４】
このプロセスはこれまでの数十年にわたって多くの研究と改良の主題となっているが、組換えタンパク質の生産は尚も困難なしにはできない。よって、例えば、ジスルフィド結合を有するポリペプチド、特に抗体のような鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドの組換え生産中に、必要な生物学的活性を持つ正しく折り畳まれたポリペプチドを生産するためには、製造、回収及び精製プロセスを通してジスルフィド結合を保護し保持することが必須である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一般に、組換え宿主細胞中で発現されるポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、組換え宿主細胞の収集前又は収集培養液にチオレドキシン又はチオレドキシン様タンパク質の阻害剤を補充することを含む方法に関する。
一実施態様では、チオレドキシン阻害剤が収集前培養液に添加される。
他の実施態様では、チオレドキシン阻害剤が収集培養液添加される。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤はチオレドキシンの直接阻害剤である。
全ての実施態様において、チオレドキシン阻害剤は、例えば、アルキル−２−イミダゾリルジスルフィド又はナフトキノンスピロケタール誘導体でありうる。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、チオレドキシンレダクターゼの特異的阻害剤である。
また更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は金錯体であり、ここで、金錯体は、例えばオーロチオグルコース（ＡＴＧ）又は金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）でありうる。効果的な阻害濃度は変動し得、典型的には約０．１ｍＭ及び１ｍＭの間である。同様に、最小の有効阻害濃度はポリペプチドの性質及び全体の状況に依存して変動し、典型的にはＡＴＧ又はＡＴＧ濃度が収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約４倍である場合に達する。
【０００６】
本発明のこの態様の他の実施態様では、チオレドキシン阻害剤は金属イオンであり、ここで、金属イオンは、限定するものではないが、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、及びＭｎ２＋からなる群から選択されうる。金属イオンが硫酸銅の形態で添加される場合、有効阻害濃度は一般に、約５μＭと約１００μＭの間、又は約１０μＭと約８０μＭの間、又は約１５μＭと約５０μＭの間である。硫酸銅の最小阻害濃度もまた変動するが、典型的には、硫酸銅が、収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約２倍の濃度で添加される場合に達する。
【０００７】
異なった実施態様では、チオレドキシン阻害剤は酸化剤、例えばＧ６ＰＤの阻害剤、例えば、ピリドキサール５’−リン酸、１フルオロ−２，４ジニトロベンゼン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）又はエピアンドロステロン（ＥＡ）；シスチン又はシステインである。ＤＨＥＡの典型的な有効阻害剤濃度は約０．０５ｍＭと約５ｍＭの間、又は約０．１ｍＭと約２．５ｍＭの間である。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、限定するものではないが、金属イオンのキレーター、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むヘキソキナーゼ活性の阻害剤である。ＥＤＴＡが典型的には添加され、約５ｍＭと約６０ｍＭの間、又は約１０ｍＭと約５０ｍＭの間、又は約２０ｍＭと約４０ｍＭの間の濃度で効果的である。
【０００８】
他の好ましい実施態様では、ヘキソキナーゼ活性の阻害剤は、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、及びリキソースからなる群から選択される。他の阻害剤には、シスチン、システイン、及び酸化グルタチオンが含まれ、これらは典型的には、収集前又は収集培養液中の当該ポリペプチド濃度の少なくとも約４０倍の濃度で添加される。
【０００９】
また更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、チオレドキシンレダクターゼに特異的に結合するｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、又は抗体である。
他の実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、チオレドキシン活性の阻害を間接的に生じせしめる手段である。この実施態様は、例えば、組換え宿主細胞の収集培養液の空気スパージング、及び／又は組換え宿主細胞の収集培養液のｐＨを低下させることを含む。
様々な実施態様では、チオレドキシン活性を阻害するための間接的な手段、例えば空気スパージング及び／又はｐＨの低減は、上に列挙したもののような直接的なチオレドキシン阻害剤の使用と組み合わせることができる。
全ての実施態様において、ポリペプチドは、例えば、抗体、又は抗体の生物学的に機能的な断片でありうる。代表的な抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
治療用抗体は、限定するものではないが、抗ＨＥＲ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃレセプター抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；乳房上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７−１Ａ抗体；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体を含む。
他の実施態様では、治療用抗体は、ＨＥＲレセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、又はＤＲ５に結合する抗体である。
更なる実施態様では、ＨＥＲレセプターは、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２、好ましくはＨＥＲ２である。ＨＥＲ２抗体は、例えば、配列番号１６、１７、１８、及び１９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
他の実施態様では、治療用抗体はＣＤ２０に結合する抗体である。抗ＣＤ２０抗体は、例えば、配列番号１から１５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
また別の実施態様では、治療用抗体はＶＥＧＦに結合する抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、配列番号２０から２５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
更なる実施態様では、治療用抗体はＣＤ１１ａに結合する抗体である。抗ＣＤ１１ａ抗体は、例えば、配列番号２６から２９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
更なる実施態様では、治療用抗体は、ＤＲ５レセプターに結合する。抗ＤＲ５抗体は、例えば、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３，８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３からなる群から選択され得、好ましくはＡｐｏｍａｂ８．３又はＡｐｏｍａｂ７．３、最も好ましくはＡｐｏｍａｂ７．３である。
【００１０】
本発明の方法の他の実施態様では、組換え宿主細胞中で発現されるポリペプチドは治療用ポリペプチドである。例えば、治療用ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン及び牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６)、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ(ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ)；デス(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上記ポリペプチドの断片からなる群から選択されうる。
【００１１】
全ての実施態様において、組換え宿主細胞は、真核生物宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でありうる。
全ての実施態様において、組換え宿主細胞はまた原核生物宿主細胞、例えば限定するものではないが大腸菌細胞を含む細菌細胞でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】透析実験：透析バッグ内のオクレリズマブ（ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７−変異体Ａ）がインキュベーション期間中にインタクトなまま残ったことを証明するバイオアナライザー分析から得られたゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図２】透析実験：透析バッグ外のオクレリズマブがインキュベーション期間中に還元されたことを示すバイオアナライザー分析から得られたゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。これは、図に示されたインタクトな抗体（〜１５０ｋＤａ）の消失と抗体断片の形成によって証明される。４８時間の時点（レーン７）で、還元された抗体は、おそらくは収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）中での還元活性の喪失の結果として再酸化されたようである。２８ｋＤａマーカーの直ぐ上に見えるバンドは抗体軽鎖から生じている。インキュベーション開始前にＨＣＣＦ中に有意な量の遊離軽鎖が既に存在していた。ＨＣＣＦ中における過剰な遊離の軽鎖及び軽鎖二量体の存在は、オクレリズマブ生産細胞株に典型的である。
【図３】透析実験からの遊離チオールレベル：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ)中の精製オクレリズマブは透析バッグ内にあり、オクレリズマブを含むＨＣＣＦはバッグ外にあった。透析バッグ内（ボックス印）及び透析バッグ外（菱形印）の遊離チオールは数時間以内に比較できる量に達したが、これは、透析バッグ内と透析バッグ外との間でのＨＣＣＦ中の小分子成分の良好な交換を示している。
【図４】チオレドキシン系及び抗体還元に関与する他の反応：チオレドキシン（Ｔｒｘ）、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）及びＮＡＤＰＨを含むチオレドキシン系は、タンパク質中のジスルフィド結合の還元のための水素供与体系として機能する。Ｔｒｘはチオール−ジスルフィド交換を通して多くの酸化還元反応を触媒するＣＸＸＣ活性部位モチーフを有する小単量体タンパク質である。酸化ＴｒｘはＴｒｘＲを介してＮＡＤＰＨによって還元されうる。ついで、還元Ｔｒｘはタンパク質中のジスルフィドの還元を触媒することができる。チオレドキシン系に必要とされるＮＡＤＰＨはペントースリン酸経路及び解糖における反応を介して提供される。
【図５】チオレドキシン系のインビトロ活性：ＰＢＳ中の０．１ｍＭのＴｒｘＲ（ラット肝臓）、５ｍＭのＴｒｘ（ヒト）、及び１ｍＭのＮＡＤＰＨと共にインタクトなオクレリズマブ（１ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすると、オクレリズマブの還元が生じ、オクレリズマブは２１時間以内に完全に還元したことを証明するバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図６】オーロチオグルコースにより阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性：上記の図５の注釈に記載されたものと同じ反応混合物にオーロチオグルコース（ＡＴＧ）を添加すると、オクレリズマブの還元が効果的に阻害される。これは、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像によって見られる（各レーンが時点を表す）。
【図７】金チオリンゴ酸により阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性：上記の図５の注釈に記載されたものと同じ反応混合物に１ｍＭの濃度で金チオリンゴ酸（ＡＴＭ）を添加すると、オクレリズマブの還元が効果的に阻害される。これは、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に見られる（各レーンが時点を表す）。
【図８】チオレドキシン系のインビトロ活性：１０ｍＭのヒスチジン硫酸バッファー中の０．１ｍＭのＴｒｘＲ（ラット肝臓）、５ｍＭのＴｒｘ（ヒト）、及び１ｍＭのＮＡＤＰＨと共にインタクトなオクレリズマブ（１ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすると、１時間以内にオクレリズマブの還元が生じることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図９】ＣｕＳＯ４により阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性：図８の注釈に記載されたものと同じ反応混合物に５０μＭの濃度でＣｕＳＯ４を添加すると、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に見られるようにオクレリズマブの還元が効果的に阻害される（各レーンが時点を表す）。
【図１０】オクレリズマブの還元：３Ｌの発酵槽から生成されたホモジナイズされたＨＣＣＦを使用するインキュベーション実験でオクレリズマブが還元されることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図１１】オーロチオグルコースによるＨＣＣＦ中のオクレリズマブ還元の阻害：図１０に示すインキュベーション実験で使用されたものと同じＨＣＣＦに１ｍＭのオーロチオグルコースを添加すると、オクレリズマブの還元が効果的に阻害されることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図１２】金チオリンゴ酸によるＨＣＣＦ中のオクレリズマブ還元の阻害：図１０に示すインキュベーション実験で使用されたものと同じＨＣＣＦに１ｍＭの金チオリンゴ酸を添加すると、オクレリズマブの還元が効果的に阻害されることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図１３】ＨＣＣＦ中での還元活性の消失：数回の凍結融解サイクルを受けたオクレリズマブの大規模製造実験の一つ（「ベータ」実験）からのＨＣＣＦはインキュベーション実験で使用したときオクレリズマブの還元を示さなかった。これは、バイオアナライザー分析（各レーンが時点を表す）によって示され、同じ発酵バッチからの新鮮に融解されたＨＣＣＦに先に見られた抗体還元と対比することができる。
【図１４】ＮＡＤＰＨの添加により回復されるＨＣＣＦ中の消失還元活性：図１３において上述した条件下で還元活性が失われたＨＣＣＦ中に５ｍＭの濃度でＮＡＤＰＨを添加した後、オクレリズマブの還元がバイオアナライザーアッセイにおいて再び観察された（各レーンが時点を表す）。
【図１５】グルコース−６−リン酸の添加により回復されるＨＣＣＦ中の消失還元活性：図１３において上述した処理のために還元活性が失われたＨＣＣＦ中に１０ｍＭの濃度でＧ６Ｐを添加した後、オクレリズマブの還元がバイオアナライザーアッセイにおいて再び観察された（各レーンが時点を表す）。
【図１６】オクレリズマブ還元：大規模製造実験（「アルファ」実験）からのＨＣＣＦを使用するインキュベーション実験でオクレリズマブが還元されることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図１７】ＥＤＴＡはオクレリズマブの還元を阻害する：図１６において還元活性が証明されたＨＣＣＦにＥＤＴＡが２０ｍＭの濃度で添加されたアルファ実験からのＨＣＣＦを使用するインキュベーション実験でオクレリズマブの還元が阻害されることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンが時点を表す）。
【図１８】グルコース−６−リン酸の添加により回復されるがＥＤＴＡによる還元阻害のない「ベータ実験」ＨＣＣＦ中の消失還元活性：還元活性が失われているＨＣＣＦ（図１３参照）中に５ｍＭ及び２０ｍＭのＥＤＴＡ濃度でＧ６Ｐを添加した後、オクレリズマブの還元がバイオアナライザーアッセイにおいて観察された（各レーンが時点を表す）。図１７に示された結果と異なり、ＥＤＴＡの存在はオクレリズマブの還元を阻止しなかった。
【図１９】オクレリズマブの還元の阻害：（ｉ）ＥＤＴＡの添加、（ｉｉ）ＣｕＳＯ４の添加、又は（ｉｉｉ）５．５へのｐＨの調節による。独立に使用した（１）ＥＤＴＡの添加、（２）ＣｕＳＯ４の添加、及び（３）５．５へのｐＨの調節の３通りの異なった方法の全てがオクレリズマブの還元の阻害に効果的であった。これは、プロテインＡ溶離プール中にほぼ１００％のインタクトな（１５０ｋＤａ）抗体が残ったことを示す定量バイオアナライザーの結果によって証明された。これに対して、オクレリズマブは、２０時間のＨＣＣＦ保持時間後にコントロールＨＣＣＦ中で完全に還元された。
【図２０】空気スパージングによるオクレリズマブの還元の阻害：ＨＣＣＦへの空気スパージングはオクレリズマブジスルフィド結合還元の阻害に効果的であった。これは、プロテインＡ溶離プール中にほぼ１００％のインタクトな（１５０ｋＤａ）抗体が残ったことを示す定量バイオアナライザー結果によって証明された。これに対して、オクレリズマブは、５時間の窒素スパージング後にコントロールＨＣＣＦ中で完全に還元された。
【図２１】抗Ｈｅｒ２抗体（トラスツズマブ）のＶＬ（配列番号２４）アミノ酸配列を示す。
【図２２】抗Ｈｅｒ２抗体（トラスツズマブ）のＶＨ（配列番号２５）アミノ酸配列を示す。
【図２３】典型的な大規模製造プロセスの幾つかの工程を示す概略図である。
【図２４】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）。
【図２５】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋１ｍＭのＡＴＧ。
【図２６】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋０．６μＭのＡＴＧ（６：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）。
【図２７】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋０．４μＭのＡＴＧ（４：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）。
【図２８】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋０．２μＭのＡＴＧ（２：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）。
【図２９】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋０．１ｍＭの金チオリンゴ酸（ＡＴＭ）。
【図３０】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋０．０１ｍＭの金チオリンゴ酸（ＡＴＭ）。
【図３１】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋２０μＭのＣｕＳＯ４（４：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）。
【図３２】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋１０μＭのＣｕＳＯ４（２：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）。
【図３３】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋５μＭのＣｕＳＯ４（１：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）。
【図３４】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋５３２μＭのシスタミン（２０：１  シスタミン：２Ｈ７ジスルフィド）。
【図３５】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋２６６μＭのシスタミン（１０：１  シスタミン：２Ｈ７ジスルフィド）。
【図３６】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋１３３μＭのシスタミン（５：１  シスタミン：２Ｈ７ジスルフィド）。
【図３７】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋２６．６μＭのシスタミン（１：１  シスタミン：２Ｈ７ジスルフィド）。
【図３８】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）（ｐＨ＝７．６）＋２．６ｍＭシスチン。
【図３９】バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像：２Ｈ７（変異体Ａ）＋１ｍＭのＮＡＤＰＨ＋５μＭのチオレドキシン＋１０ｍＭのヒスチジン硫酸中の０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ（組換え体）＋２．６ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）。
【図４０】再構築された酵素還元系。１ｍｇ／ｍｌの２Ｈ７（変異体Ａ）＋１０μｇ／ｍＬのヘキソキナーゼ、５０μｇ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、５μＭのチオレドキシン、０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ、２ｍＭのグルコース、０．６ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＭｇ２＋、及びｐＨ＝７．３８の５０ｍＭのヒスチジン硫酸バッファー中の２ｍＭのＮＡＤＰ。
【図４１】チオレドキシン系はＮＡＤＰＨを必要とする。１ｍｇ／ｍｌの２Ｈ７（変異体Ａ）＋５μＭのチオレドキシン、０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ、及びｐＨ＝７．３８の５０ｍＭのヒスチジン硫酸バッファー中の２ｍＭのＮＡＤＰ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．定義
本発明において、一般に、又は任意の特定のタンパク質又は抗体に関して、抗体を含むタンパク質について、「還元」なる用語は、そのタンパク質又は抗体の一又は複数のジスルフィド結合の還元を指すために使用される。よって、例えば、「オクレリズマブ還元」なる用語は、「オクレリズマブジスルフィド結合還元」なる用語と交換可能に使用され、「抗体（Ａｂ）還元」なる用語は「抗体（Ａｂ）ジスルフィド結合還元」なる用語と交換可能に使用される。
「還元」又は「ジスルフィド結合還元」なる用語は、最も広義に使用され、完全な及び部分的な還元、及び抗体のようなタンパク質中に存在する鎖内又は鎖間のジスルフィド結合の幾らか又は全ての還元を含む。
【００１４】
「タンパク質」とは、鎖長が三次及び／又は四次構造のより高いレベルを生産するのに十分であるアミノ酸の配列を意味する。これは、「ペプチド」又はそのような構造を持たない他の小分子量薬とは区別される。典型的には、ここでのタンパク質は少なくとも約１５−２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有するであろう。ここでの定義範囲に含まれるタンパク質の例には、あらゆる哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用タンパク質、例えば治療用及び診断用抗体、一般に、一又は複数の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、一又は複数のジスルフィド結合を含むタンパク質が含まれる。
【００１５】
「治療用タンパク質」又は「治療用ポリペプチド」なる用語は、その適応症又は作用機序にかかわらず、疾患の治療に使用されるタンパク質を意味する。治療用タンパク質がクリニックにおいて有用であるためには、それが多量に製造されなければならない。治療用タンパク質又は他のタンパク質の「製造スケール」の生産は、製造されるタンパク質及び需要に応じて、約４００Ｌから約８００００Ｌの範囲の細胞培養を利用する。典型的には、そのような製造スケールの生産は、約４００Ｌから約２５０００Ｌの細胞培養サイズを利用する。この範囲内において、特手の細胞培養サイズ、例えば４０００Ｌ、約６０００Ｌ、約８０００、約１００００、約１２０００Ｌ、約１４０００Ｌ、又は約１６０００Ｌが利用される。
【００１６】
「治療用抗体」なる用語は疾患の治療に使用される抗体を意味する。治療用抗体は様々な作用機序を有しうる。治療用抗体は抗原に結合し、抗原に関連した標的の正常な機能を中和しうる。例えば、癌の生存に必要とされるタンパク質の活性を阻止するモノクローナル抗体は細胞死を引き起こす。他の治療用抗体は抗原に結合し、抗原に関連した標的の正常な機能を活性化させうる。例えば、モノクローナル抗体は細胞上のタンパク質に結合しアポトーシスシグナルを惹起させうる。また他のモノクローナル抗体は疾患組織にのみ発現される標的抗原に結合しうる；モノクローナル抗体への毒性ペイロード(有効な薬剤)、例えば化学療法剤又は放射性剤のコンジュゲーションは、疾患組織への毒性ペイロードの特異的送達のための薬剤をつくり、健康な組織への害を減少させることができる。治療用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の幾らか又は全てとはいかないまでも少なくとも一つを示し、該機能は標的抗原への特異的結合を少なくとも含む。
【００１７】
「診断タンパク質」という用語は、疾患の診断に使用されるタンパク質を意味する。
「診断用抗体」なる用語は、疾患のための診断用試薬として使用される抗体を意味する。診断用抗体は、特定の疾患に特に関連し、又はそこでの発現増加を示す標的抗原に結合しうる。診断用抗体は、例えば、患者からの生体試料、又は患者における腫瘍のような疾患部位の診断画像における標的を検出するために使用することができる。診断用抗体の「生物学的に活性な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の幾らか又は全てとはいかないまでも少なくとも一つを示し、該機能は標的抗原への特異的結合を少なくとも含む。
「精製された」は、分子が、それが含まれている試料の少なくとも８０−９０重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００１８】
精製される抗体を含むタンパク質は好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質（つまり汚染タンパク質等が含まれていない）である。
「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
「本質的に均質な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９９重量％のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
上で述べたように、ある実施態様では、タンパク質は抗体である。「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を有している糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を一般に欠く他の抗体様分子の双方を含む。 後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、ミエローマによって増加したレベルで生産される。
【００１９】
「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体(免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び短鎖分子、例えばｓｃＦｖ分子、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を包含する。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる可能な変異、例えば自然に生じる変異を除いて、同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別々の抗体の混合物ではないものとしての抗体の特性を示している。ある実施態様では、かかるモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を典型的に含み、ここで標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって得られたものである。例えば、選択プロセスは、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの独特のクローンの選択でありうる。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその生産を改善するため、インビボでのその免疫原性を低減するため、多重特異性抗体を作製する等のために更に改変され得、改変された標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点が有利である。
【００２０】
「モノクローナル」との形容詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の特性を示しており、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解してはならない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ法(例えばKohler 等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow 等., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988)；Hammerling 等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson 等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks 等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu 等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee 等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee 等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004))、及びヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又はすべてを含む動物のヒト様抗体又はヒト抗体を産生するための技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits 等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann 等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号；Marks 等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg 等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild 等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995))によって作製されうる。
【００２１】
ここでのモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性がある「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を有する限りかかる抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))
【００２２】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するためになされうる。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また次の概説記事及びそこに引用された文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、対象の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるPrimatized（商標）抗体が含まれる。
【００２３】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のものに相当する、及び／又はここに開示されたヒト抗体を製造する何れかの技術を使用して製造されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「親和性成熟」抗体とは、改変を持たない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめるその一又は複数のＣＤＲｓ／ＨＶＲｓに一又は複数の変化を有するものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルでさえの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られている方法によって生産される。Marks等 Bio/Technology 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲ／ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994)；Schier等, Gene 169:147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol. 155:1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)に記載されている。
【００２４】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることもある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることもある。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して保たれ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与を示す。
【００２５】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つに割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、ｄ、ｅ、ｇ及びｍと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られており、例えばAbbas等, Cellular and Mol. Immunology, 4版(2000)に一般に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合によって形成された大きな融合分子の一部であってもよい。
【００２６】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、ここでは交換可能に使用され、以下に定義する抗体断片ではなく、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。該用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部のみを含み、その一部は、インタクトな抗体に存在する場合にその一部に通常関連する機能の少なくとも一で、多くは殆どないしは全てを保持する。一実施態様では、抗体断片はインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原結合能を保持している。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含み、インタクトな抗体に存在する場合にＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能の一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでいてもよい。
【００２７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を持つ２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが、抗原に尚も架橋可能なＦ(ａｂ')２断片が生成される。
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されている点でＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００２８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有的に結合した一つの重鎖と一つの軽鎖の二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造で結合できるように可撓性ペプチドリンカーによって共有的に結合されうる。各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識しそれに結合する能力を持つが、結合部位全体よりは低い親和性でである。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦＶが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００２９】
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位をつくり出す。ダイアボディは二価又は二重特異的でありうる。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。トリアボディ（triabodies）及びテトラボディ（tetrabodies）もまたHudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００３０】
抗体は、限定するものではないが、ＨＥＲレセプターファミリーメンバー、例えばＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、及びＣＤ３４；細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びａｖ／ｐ３インテグリン、例えばそのα又はβサブユニット（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；及びプロテインＣを含む任意のタンパク質に結合しうる。他の例示的なタンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及び牛成長ホルモン（ｂＧＨ）を含む成長ホルモン（ＧＨ）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(ｔ−ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−α)；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６)、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ(ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ)；デス(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)；インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子（ＤＡＦ）；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；及び上記リストのポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片又は変異体を含む。
【００３１】
抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に存在する場合、その部分に通常は付随する機能の少なくとも一つ、また多くは幾らか又は全てをその部分が保持しているインタクトな抗体の一部のみを含む。一実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片はインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持する。他の実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片は、例えば、Ｆｃ領域を含むものは、インタクトな抗体に存在する場合、Ｆｃ領域に通常は付随する生物学的機能の少なくとも一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片は、インタクトな抗体と実質的に同様なインビボ半減期を有している一価抗体である。例えば、抗体のそのような生物学的に機能的な断片は、断片にインビボ安定性を付与し得るＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含みうる。
【００３２】
「チオレドキシン阻害剤」及び「Ｔｒｘ阻害剤」という用語は交換可能に使用され、チオレドキシン活性の阻害に効果的であるあらゆる薬剤及び手段を含む。よって、チオレドキシン（Ｔｒｘ）阻害剤は、Ｔｒｘ、Ｇ６ＰＤ及び／又はヘキソキナーゼ酵素系の任意の成分をブロックするあるあらゆる薬剤及び手段を含む。この文脈で、「阻害」は、チオレドキシン活性の完全な除去（ブロッキング）及び低減と、結果的に抗体のようなタンパク質におけるジスルフィド結合の還元の完全な又は部分的な排除を含む。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体は、（１）例えばローリー法で測定したときに９５重量％より多くの抗体まで、ある実施態様では９９重量％より多くの抗体まで、（２）例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度に、あるいは、（３）例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３３】
「プロテインＡ」と「ＰｒｏＡ」という用語はここでは交換可能に使用され、その天然源から回収されるプロテインＡ、合成的に（例えば、ペプチド合成あるいは組換え技術により）産生されるプロテインＡ、及びＦｃ領域のようなＣＨ２／ＣＨ３領域を持つタンパク質と結合する能力を保持しているその変異体を包含する。プロテインＡはＲｅｐｌｉｇｅｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ及びＦｅｒｍａｔｅｃｈから商業的に購入することができる。プロテインＡは一般に固相担体材料上に固定化される。「ＰｒｏＡ」なる用語もまたプロテインＡが共有結合したクロマトグラフィー固体担体マトリックスを含むアフィニティクロマトグラフィー樹脂又はカラムを意味する。
「クロマトグラフィー」なる用語は、混合物中の興味ある溶質が、混合物の個々の溶質が移動相の影響下で固定媒質を通って移動する速度の差の結果として、又は結合及び溶離プロセスで、他の溶質から分離されるプロセスを意味する。
【００３４】
「アフィニティクロマトグラフィー」及び「プロテインアフィニティクロマトグラフィー」なる用語はここでは交換可能に使用され、興味あるタンパク質又は興味ある抗体が可逆的かつ特異的に生体分子特異的リガンドに結合されるタンパク質分離技術を意味する。好ましくは、生体分子特異的リガンドはクロマトグラフィー固相材料に共有的に結合させられ、溶液がクロマトグラフィー固相材料に接触すると溶液中の興味あるタンパク質に到達できる。興味あるタンパク質（例えば抗体、酵素、又はレセプタータンパク質）はクロマトグラフィー工程中、生体分子特異的リガンド（例えば抗原、基質、コファクター、又はホルモン）に対するその特異的な結合親和性を保持する一方、混合物中の他の溶質及び／又はタンパク質はリガンドには顕著には又は特異的には結合しない。固定化リガンドへの興味あるタンパク質の結合により、汚染タンパク質又はタンパク質不純物がクロマトグラフィー媒質を通過することが可能になる一方、興味あるタンパク質は固相材料上の固定リガンドに特異的に結合したままである。ついで、興味ある特異的に結合したタンパク質を、低ｐＨ、高ｐＨの固定リガンド、高濃度塩、競合リガンド等から活性形態で除去し、先にカラムを通過させられた汚染タンパク質又はタンパク質不純物を含まない溶離バッファーと共にクロマトグラフィーカラムを通過させる。そのそれぞれの特異的結合タンパク質、例えば抗体を精製するためのリガンドとして任意の成分を使用することができる。
「非アフィニティクロマトグラフィー」及び「非アフィニティ精製」なる用語は、アフィニティクロマトグラフィーが利用されない精製プロセスを意味する。非アフィニティクロマトグラフィーは、興味ある分子（例えばタンパク質、例えば抗体）と固相マトリックスの間の非特異的相互作用に依存するクロマトグラフィー技術を含む。
【００３５】
「カチオン交換樹脂」は負に荷電し、よって固相の上又は中を通過する水溶液中のカチオンと交換される遊離のカチオンを有する固相を意味する。固相に結合してカチオン交換樹脂を形成する負に荷電したリガンドは、例えば、カルボキシレート又はスルホネートでありうる。市販のカチオン交換樹脂は、カルボキシ-メチル-セルロース、アガロース上に固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、SP-SEPHAROSE FAST FLOW(商品名)又はSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE(商品名)、GE Healthcare製）及びアガロース上に固定化されたスルホニル（例えば、S-SEPHAROSE FAST FLOW(商品名)、GE Healthcare製）を含む。「混合モードイオン交換樹脂」は、カチオン性、アニオン性、及び疎水性部分で共有的に修飾された固相を意味する。市販の混合モードイオン交換樹脂は、シリカゲル固相担体マトリックスに結合した弱いカチオン交換基、低濃度のアニオン交換基、及び疎水性リガンドを含むBAKERBOND ABX(商品名) (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)である。
ここで用いられる「アニオン交換樹脂」は、正に荷電し、例えばそれに結合した第４級アミノ基等の一又は複数の正荷電リガンドを有する固相を意味する。市販のアニオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商品名）及びＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）（GE Healthcare)を含む。
【００３６】
「バッファー」は、その酸−塩基結合成分の作用によりｐＨ変化に抗する緩衝溶液である。例えばバッファーの所望のｐＨに応じて使用できる様々なバッファーが、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.,編, Calbiochem Corporation (1975)に記載されている。一実施態様では、バッファーは、約２から約９の範囲のｐＨ、あるいは約３から約８、あるいは約４から約７、あるいは約５から約７のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを調節するバッファーの例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリス、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、及びアンモニウムバッファー、並びにこれらの組み合わせを含む。
「負荷バッファー」は、対象とするポリペプチド分子及び一又は複数の汚染物質を含む組成物をイオン交換樹脂に充填するのに使用するものである。負荷バッファーは、対象とするポリペプチド分子（及び一般に一又は複数の汚染物質）がイオン交換樹脂に結合するような、又は対象とするタンパク質がカラムを流れる一方、不純物が樹脂に結合するような、伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００３７】
「中間バッファー」は、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、一又は複数の汚染物質をイオン交換樹脂から溶離するのに使用される。中間バッファーの伝導率及び／又はｐＨは、一又は複数の不純物はイオン交換樹脂から溶離されるが、対象とするポリペプチドの有意な量は溶離されないものである。
「洗浄バッファー」なる用語は、ここで用いられる場合、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、イオン交換樹脂を洗浄又は再平衡化するのに使用されるバッファーを意味する。簡便には、洗浄バッファー及び負荷バッファーは同じであってもよいが、そうである必要はない。
【００３８】
「溶離バッファー」は、対象とするポリペプチドを固相から溶離するのに使用される。溶離バッファーの伝導率及び／又はｐＨは、対象とするポリペプチドがイオン交換樹脂から溶離されるものである。
「再生バッファー」は、イオン交換樹脂を再生して再利用できるようにするのに使用される。再生バッファーは、実質的に全ての汚染物質と対象とするポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するのに必要な伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００３９】
ここで使用される「実質的に同様の」又は「実質的に同じ」なる用語は、当業者が、２つの値の差異が、該値（例えばＫｄ値）により測定される生物学的特徴の範囲内において生物学的及び／又は統計的有意性がほとんどないか又はないとみなすように、２つの数値間（例えば一方は本発明の抗体で、他方は参照／比較抗体に関連）に十分に高度な類似性があることを示す。前記２つの値の差異は、参照／比較値の関数として、例えば約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
ここで使用される「実質的に減少」、又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の関数として、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
【００４０】
ここで使用される「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送可能な核酸分子を指すことを意図している。ベクターの一タイプは、そこに付加的なＤＮＡセグメントが結合されてもよい環状の二重鎖ＤＮＡを意味する「プラスミド」である。他のタイプのベクターはファージベクターである。他のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合されうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されると、宿主細胞のゲノムに結合可能で、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現に対するものであり得る。そのようなベクターをここで「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と言う。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用することができる。
【００４１】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社の著作であり、ソースコードは米国著作権庁，ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテック社、サウスサンフランシスコ，カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００４２】
アミノ酸配列比較のために用いるＡＬＩＧＮ−２の状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのプログラムのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用する全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２比較コンピュータプログラムを用いた直ぐ上の段落に記載されたようにして得られる。
【００４３】
「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、参照Ｄ因子コード配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ついで、配列同一性は、より長い配列に対して計算され、つまり、たとえ短い配列が長い配列の一部と１００％の配列同一性を示しても、全体の配列同一性は１００％未満である。
【００４４】
「治療」とは、治癒的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療が必要な者とは、既に疾患に罹っている者、並びに疾患が防止されるべき者を含む。ここでの「治療」は、疾患及び特定の疾患の徴候及び症状の軽減を包含する。
「疾患」はタンパク質で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、当該疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療されるべき疾患の非限定的な例は癌腫及びアレルギーを含む。
治療の目的での「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト高等霊長類、他の脊椎動物、家畜及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「干渉ＲＮＡ」又は「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、標的遺伝子の発現を低減させる約３０ヌクレオチド長未満の二本鎖ＲＮＡ分子である。干渉ＲＮＡは既知の方法を使用して同定され、合成され（Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003),国際公開第２００３０５６０１２号及び国際公開第２００３０６４６２１号)、ｓｉＲＮＡライブラリーは例えばDharmacon, Lafayette, Coloradoから商業的に入手できる。しばしば、ｓｉＲＮＡは遺伝子の５’端を標的とするために成功裏に設計され得る。
【００４５】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
本発明の実施には、別段記載しない限り、一般的な分子生物学の技術等を使用するが、これは当業者の技量の範囲内である。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)；Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編, 1987最新版)；Essential Molecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991)；Gene Expression Technology (Goeddel編, Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990)；Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology II (R. Wu等編, Academic Press 1995)；PCR: A Practical Approach (M. McPherson等., IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis (M. Gait編, 1984)；Cell Culture for Biochemists (R. Adams編, Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller及びM. Calos編, 1987)；Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler編, 1991)；Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells, 2版 (R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987)；Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990)；シリーズMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Wirth M.及びHauser H. (1993)；Immunochemistry in Practice, 3版, A. Johnstone及びR. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996；Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock及びP. Petrusz編, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989)；Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir 及びC. Blackwell編)；Current Protocols in Immunology (J. Coligan等編 1991)；Immunoassay (E. P. Diamandis及びT.K. Christopoulos編, Academic Press, Inc., 1996)；Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2版) Academic Press, New York；Ed Harlow及びDavid Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988；Antibody Engineering, 2版(C. Borrebaeck編, Oxford University Press, 1995)；及びシリーズAnnual Review of Immunology；シリーズ Advances in Immunologyを参照のこと。
【００４６】
１．ジスルフィド結合の還元の防止
本発明は、組換え生産中におけるタンパク質のジスルフィド結合の還元を防止するための方法に関する。特に、本発明は、発酵に続くプロセシング中における組換えタンパク質のジスルフィド結合の還元を防止するための方法に関する。本発明の方法は、例えば製造規模におけるように、ジスルフィド結合含有タンパク質の大規模生産に対して特に貴重である。一実施態様では、本発明の方法は、５０００Ｌを超える規模の大規模のタンパク質生産に有用である。
【００４７】
ジスルフィド結合を含む組換えタンパク質の製造中に生産される収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）のプロセシング中にジスルフィド結合の還元が生じることが実験的に見出されている。典型的には、この還元は、細胞溶解後、特に収集操作中の機械的細胞溶解後、それが例えば、全細胞溶解の約３０％から約７０％、又は約４０％から約６０％、又は約５０％  から約６０％のようなある閾値に達するときに観察される。この閾値は、製造されるタンパク質の性質（例えば抗体）、組換え宿主、生産系、使用される生産パラメータ等に応じて変動し、実験的に即座に決定することができる。
理論的には、かかる還元は、製造プロセス中の様々な因子及び条件から生じるかも知れず、様々な還元剤によって引き起こされるかも知れない。本発明は、この還元の根本的な原因がＨＣＣＦ中の活性なチオレドキシン（Ｔｒｘ）又はチオレドキシン様系であるという認識に少なくとも部分的に基づいている。
【００４８】
Ｔｒｘ、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）及びＮＡＤＰＨからなるＴｒｘ酵素系は、タンパク質中のジスルフィド結合の還元に対する水素供与系である。Ｔｒｘは、チオール−ジスルフィド交換を通して多くの酸化還元反応を触媒するＣＸＸＣ活性部位モチーフを有する小単量体タンパク質である。酸化されたＴｒｘはＴｒｘＲを介してＮＡＤＰＨによって還元されうる。還元されたＴｒｘはついでタンパク質中のジスルフィドの還元を触媒することができる。チオレドキシン系に必要とされるＮＡＤＰＨは、ペントースリン酸経路及び解糖の反応を介して提供される。ここに提示された結果は、Ｔｒｘ系の活性に必要とされるＮＡＤＰＨがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性によってもたらされ、これが、ヘキソキナーゼによってグルコース及びＡＴＰからＮＡＤＰＨを生産することを証明している（図４参照）。これらの細胞性酵素（Ｔｒｘ系、Ｇ６ＰＤ、及びヘキソキナーゼ）はその基質と共に、細胞溶解時にＣＣＦ中に放出され、還元を生じさせる。従って、ジスルフィドの還元は、Ｔｒｘ酵素系又はＧ６ＰＤ及びヘキソキナーゼ活性のような活性なＴｒｘ系のための成分を提供する上流の酵素系の阻害剤によって防止されうる。
【００４９】
これらの酵素系の更なる詳細、又はタンパク質生産の他の詳細に関しては、例えば、Babson, A.L.及びBabson, S.R. (1973) Kinetic Colorimetric Measurement of Serum Lactate Dehydrogenase Activity. Clin. Chem. 19: 766-769；Michael W. Laird等, “Optimization of BLyS Production and Purification from Eschericia coli,” Protein Expression and Purification 39:237-246 (2005)；John C. Joly等, “Overexpression of Eschericia coli Oxidoreductases Increases Recombinant Insulin-like Growth Factor-I Accumulation,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777 (March 1998)；Dana C. Andersen等, “Production Technologies for Monoclonal Antibodies and Their Fragments,” Current Opinion in Biotechnology 15:456-462 (2004)；Yariv Mazor等, “Isolation of Engineered, Full-length Antibodies from Libraries Expressed in Escherichia coli,” Nature Biotech. 25, 563 - 565 (01 Jun 2007)；Laura C. Simmons等, “Expression of Full-length Immunoglobulins in Escherichia coli: Rapid and Efficient Production of Aglycosylated Antibodies,” Journal of Immunological Methods 263:133-147 (2002)；Paul H. Bessette等, “Efficient Folding of Proteins with Multiple Disulfide Bonds in the Escherichia coli cytoplasm,” Proc. Natl. Acad. Sci. 96(24):13703-08 (1999)；Chaderjian, W.B., Chin, E.T., Harris, R.J.,及びEtcheverry, T.M., (2005) “Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed,” Biotechnol. Prog. 21: 550-553；Gordon G., Mackow M.C., 及びLevy H.R., (1995) “On the mechanism of interaction of steroids with human glucose 6-phosphate dehydrogenase,” Arch. Biochem. Biophys. 318: 25-29；Gromer S., Urig S.,及びBecker K., (2004) “TheTrx System - From Science to Clinic,” Medicinal Research Reviews, 24: 40-89；Hammes G.G.及びKochavi D., (1962a) “Studies of the Enzyme Hexokinase. I. Steady State Kinetics at pH 8,” J. Am. Chem. Soc. 84:2069-2073；Hammes G.G.及びKochavi D., (1962b) “Studies of the Enzyme Hexokinase. III. The Role of the Metal Ion,” J. Am. Chem. Soc. 84:2076-2079；Johansson C., Lillig C.H.,及びHolmgren A., (2004) “Human Mitochondrial Glutaredoxin Reduces S-Glutathionylated Proteins with High Affinity Accepting Electrons from Either Glutathione or Thioredoxin Reductase,” J. Biol. Chem. 279:7537-7543；Legrand, C., Bour, J.M., Jacob, C. , Capiaumont J., Martial, A., Marc, A., Wudtke, M., Kretzmer, G., Demangel, C., Duval, D.,及びHache J., (1992) “Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity of the Number of Dead Cells in the Medium of Cultured Eukaryotic Cells as Marker,” J. Biotechnol., 25: 231-243；McDonald, M.R., (1955) “Yeast Hexokinase : ATP + Hexose --> Hexose-6-phosphate + ADP,” Methods in Enzymology, 1: 269-276, Academic Press, NY；Sols, A., DelaFuente, G., Villar-Palasi, C.,及びAsensio, C., (1958) “Substrate Specificity and Some Other Properties of Bakers' Yeast Hexokinase,” Biochim Biophys Acta 30: 92-101；Kirkpatrick D.L., Kuperus M., Dowdeswell M., Potier N., Donald L.J., Kunkel M., Berggren M., Angulo M.,及びPowis G., (1998) “Mechanisms of inhibition of the Trx growth factor system by antitumor 2-imidazolyl disulfides,” Biochem. Pharmacol. 55: 987-994; Kirkpatrick D.L.,Watson S.,Kunkel M., Fletcher S., Ulhaq S.,及びPowis G., (1999) “Parallel syntheses of disulfide inhibitors of the Trx redox system as potential antitumor agents,” Anticancer Drug Des. 14: 421-432；Milhausen, M.,及びLevy, H.R., (1975) “Evidence for an Essential Lysine in G6PD from Leuconostoc mesenteroides,” Eur. J. Biochem. 50: 453-461；Pleasants, J.C., Guo, W.,及びRabenstein, D.L., (1989) “A comparative study of the kinetics of selenol/diselenide and thiol/disulfide exchange reactions,” J. Am. Chem. Soc. 111: 6553-6558；Whitesides, G.M., Lilburn, J.E.,及びSzajewski, R.P., (1977) “Rates of thiol disulfide interchange reactions between mono- and dithiols and Ellman’s reagent,” J. Org. Chem. 42: 332-338；及びWipf P., Hopkins T.D., Jung J.K., Rodriguez S., Birmingham A., Southwick E.C., Lazo J.S.,及びPowis G, (2001) “New inhibitors of the Trx-TrxR system based on naphthoquinone spiroketal natural product lead,” Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2637-2641を参照のこと。
【００５０】
本発明の一態様によれば、ジスルフィド結合還元は、Ｔｒｘ、Ｇ６ＰＤ及びヘキソキナーゼ酵素系の任意の成分をブロックすることによって、防止することができる。これらの酵素系の阻害剤をここでは集合的に「チオレドキシン阻害剤」又は「Ｔｒｘ阻害剤」と呼ぶ。Ｔｒｘ阻害剤は典型的には、組換え宿主細胞と培養培地を含む細胞培養液（ＣＣＦ）に、及び／又は収集後に遠心分離、濾過、又は類似の分離方法によって得られる収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）に加えられる。ＨＣＣＦはインタクトな宿主細胞を欠くが、典型的には、続く精製工程で除去される宿主細胞タンパク質及び他の汚染物質を含んでいる。よって、Ｔｒｘ阻害剤は、収集前及び／又は収集中、好ましくは収集前に加えることができる。
あるいは、又は加えて、空気スパージング又はｐＨ調節のような、他の非特異的方法をまた使用して、組換えタンパク質の組換え生産中に発酵後に、ジスルフィド結合還元を防止することができる。ここで考えられるある種の還元阻害方法は次の表１に列挙する。
【００５１】
2020105180.tif 000002
【００５２】
本発明の方法において使用される「Ｔｒｘ阻害剤」には、限定するものではないが、（１）Ｔｒｘの直接阻害剤、例えばアルキル−２−イミダゾリルジスルフィド及び関連化合物(例えば、１メチルプロピル−２−イミダゾリルジスルフィド) (Kirkpatrick等., 1998及び1999,上掲)及びナフトキノンスピロケタール誘導体(例えば パルマルマイシンCP1) (上掲のWipf 等, 2001)；（２）金錯体を含むＴｒｘＲの特異的阻害剤、例えばオーロチオグルコース（ＡＴＧ）及び金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）(例えばGromer等, 2004の概説を参照)で、これはＴｒｘＲの不可逆的阻害剤の例である；（３）金属イオン、例えばＨｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、及びＭｎ２＋で、これはチオール及びセレノールと容易に錯体を形成し、よってＴｒｘＲ又はＴｒｘの阻害剤として本発明の実施態様において使用することができる；（４）Ｇ６ＰＤの阻害剤、例えば、ピリドキサール５’−リン酸及び１フルオロ−２，４ジニトロベンゼン (上掲のMilhausen及びLevy 1975)、ある種のステロイド、例えばデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及びエピアンドロステロン（ＥＡ）(上掲のGordon等, 1995)；及び（４）ヘキソキナーゼ活性（よってＧ６ＰＤに対するＧ６Ｐの生産）の阻害剤、例えば、金属イオン、例えばＭｇ２＋のキレート剤、例えばＥＤＴＡ、及びＳＨ基、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース及びリキソースと反応する化合物(Sols等, 1958, 上掲; McDonald, 1955, 上掲)が含まれる；更なるヘキソキナーゼ阻害剤は「ヘキソキナーゼ阻害剤との発明の名称の米国特許第５８５４０６７号に開示されている。これらの阻害剤は例示のためだけのものであることが理解される。他のＴｒｘ阻害剤は存在し、本発明の方法において、単独で又は様々な組合せで使用することができる。
【００５３】
本発明の方法で使用される「Ｔｒｘ阻害剤」はまた組換え生産された抗体又はタンパク質の還元が、生産キャンペーン中の様々な点でのＴｒｘ系、ペントースリン酸経路又はヘキソキナーゼの酵素の量を減少させることによって低減又は防止されうる試薬を含む。ある実施態様では、この酵素量の減少は、標的ｓｉＲＮＡｓ、アンチセンスヌクレオチド、又は抗体の使用によって達成することができる。ＣＨＯ細胞に見出される遺伝子に対する標的ｓｉＲＮＡｓ又はアンチセンスヌクレオチドを設計するため、これらの遺伝子配列は、異なった生物における酵素を標的とする配列を選択するために公的データベースから入手できる。大腸菌及びマウスＴｒｘ系の遺伝子の例については以下の実施例９を参照のこと。
【００５４】
上で検討した阻害剤を使用することに加えて、本発明のある実施態様では、ＨＣＣＦ中の酸化還元電位を維持するためにＨＣＣＦに空気をスパージングすることによって精製される組換えタンパク質の還元を防止することがまたできる。これは、Ｔｒｘ及びＴｒｘＲの還元形態を連続的に酸化することによって、グルコース、Ｇ６Ｐ及びＮＡＤＰＨを枯渇させることができる非直接型手段である。ＨＣＣＦタンクの空気スパージングは、例えば、約１００リットルから約２００リットル、例えば、１５０リットル／分の空気流で実施することができる。空気スパージングは、飽和のエンドポイントパーセントに達するまで実施することができる；例えば、空気スパージングは、ＨＣＣＦが空気で約１００％飽和されるまで継続することができ、あるいはＨＣＣＲが空気で約３０％飽和されるまで、あるいは空気での約１００％飽和から約３０％飽和までの間になるまで継続することができる。所望の阻害効果に必要とされる溶存酸素（ｄＯ２）の最小量はまた製造される抗体又は他の組換えタンパク質に依存する。よって、例えば、約１０％のｄＯ２（又は連続流に対して約１０ｓｃｃｍ）は抗体２Ｈ７（変異体Ａ）の生産中に所望の効果を有する一方、Ａｐｏｍａｂはより高い（約３０％）ｄＯ２を必要とするかも知れない。
【００５５】
更なる実施態様では、組換えタンパク質の還元を阻止するために使用可能な他の非直接型方法はＨＣＣＦのｐＨの低下である。この実施態様は、低ｐＨ値での特に遅いチオール-ジスルフィド交換を利用する(上掲のWhitesides等, 1977；上掲のPleasants等, 1989)。違って、Ｔｒｘ系の活性は６以下のｐＨ値で有意に低く、よってオクレルズマブのような組換えタンパク質の還元を阻害することができる。
非直接型アプローチはまた互いに及び／又は一又は複数のＴｒｘ阻害剤の使用と組み合わせることもできる。
【００５６】
ジスルフィド結合の還元は、好ましくは収集前のＣＣＦに又は収集直後のＨＣＣＦ中に、一又は複数のＴｒｘ阻害剤を使用し、及び／又は細胞培養プロセスの完了後に非直接型アプローチを適用することによって、阻害（つまり、部分的に又は完全にブロック）することができる。最適な時間及び適用様式及び有効量は、精製されるタンパク質の性質、組換え宿主細胞、及び使用される特定の生産方法に依存する。最適なパラメータの決定は当業者の技量の範囲である。
例えば、哺乳動物細胞培養プロセス、例えばここの実施例に記載されたＣＨＯ抗体生産プロセスでは、硫酸銅（五水和物又は無水物形態のＣｕＳＯ４）をＴｒｘ阻害剤として使用する場合、それは、約５μＭから約１００μＭ、例えば約１０μＭから約８０μＭ、好ましくは約１５μＭから約５０μＭの濃度範囲でＣＣＦ又はＨＣＣＦに補充するために添加できる。幾つかの細胞培養物は銅（例えば、ここでの実施例で使用されたＣＨＯ細胞培養物では約０．０４μＭのＣｕＳＯ４）を既に含んでいるので、この量は、銅に加えて、あるならば、細胞培養中に既に存在している。任意の銅（ＩＩ）塩を、溶解度が問題でない限り、ＣｕＳＯ４の代わりに使用することができる。例えば、酢酸銅及び塩化銅は、共に水に可溶性であり、ＣｕＳＯ４の代わりに使用することができる。最小有効濃度はまた製造される抗体及び阻害剤が使用される段階に依存しうる。よって、例えば、硫酸銅が溶解前に添加される場合、抗体２Ｈ７（変異体Ａ）では、最小有効濃度は約３０μＭであり、Ａｐｏｍａｂでは約７５μＭであり、抗体変異体Ｃ（表２を参照）では約５０μＭである。硫酸銅がＣＣ培地に添加される場合、抗体２Ｈ７（変異体Ａ）では、最小有効濃度は約１５μＭであり、Ａｐｏｍａｂでは約２５μＭであり、抗体変異体Ｃでは約２０μＭである。一つの典型的な最小ＣｕＳＯ４阻害剤濃度は２×Ｔｒｘ濃度（又はＴｒｘ均等物）である。
【００５７】
ＥＤＴＡは、細胞溶解度合い、使用される組換え宿主細胞、及び生産プロセスの他のパラメータに応じて、広い濃度範囲で使用することができる。例えば、ＣＨＯ又は他の哺乳動物宿主細胞を使用する場合、ＥＤＴＡは、典型的には、細胞溶解度合いに応じて、約５ｍＭから約６０ｍＭ、例えば約１０ｍＭから約５０ｍＭ、又は約２０ｍＭから約４０ｍＭの濃度で添加することができる。低い細胞溶解度合いでは、低濃度のＥＤＴＡが十分であるが、約７５％−１００％の細胞溶解では、必要とされるＥＤＴＡ濃度は高く、例えば、約２０ｍＭから約４０ｍＭである。最小有効濃度はまた生産される抗体にまた依存しうる。よって、例えば、抗体２Ｈ７（変異体Ａ）では、最小有効ＥＤＴＡ濃度は約１０ｍＭである。
Ｔｒｘ阻害剤としてのＤＨＥＡは典型的には低い濃度で、例えば約０．０５ｍＭから約５ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭから約２．５ｍＭの濃度範囲で有効である。
他のＴｒｘ阻害剤、例えばオーロチオグルコース（ＡＴＧ）及び金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）はジスルフィド結合の還元をμＭ濃度範囲で阻害する。よって、例えば、ＡＴＧ又はＡＴＭは、約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で添加されうる。最小阻害濃度は実際の条件に応じて変動するが、ＡＴＧ及びＡＴＭでは、典型的には約４×ＴｒｘＲ濃度である。
全ての阻害剤は過剰量で使用することができ、従って系中のＴｒｘ又はＴｒｘＲの量は必ずしも分かる必要はない。
【００５８】
好ましい実施態様では、製造方法において使用される哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))である。他の哺乳動物宿主細胞には、限定するものではないが、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather 等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）；及びミエローマ又はリンパ腫細胞（例えばＹ０，Ｊ５５８Ｌ，Ｐ３及びＮＳ０細胞）（米国特許第５８０７７１５号を参照)が含まれる。
【００５９】
ここでのポリペプチドの生産のために好ましい宿主細胞はＣＨＯ細胞株ＤＰ１２(CHO K1 dhfr-)である。これは実験室での実施で広く使用されている最もよく知られているＣＨＯ細胞株の一つである（例えば、１９８９年３月１５日公開の欧州特許出願公開第０３０７２４７号を参照）。また、他のＣＨＯ−Ｋ１(dhfr-)細胞株が知られ、本発明の方法で使用することができる。
ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を製造するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ),Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)、及びダルベッコの改良イーグル培地(DMEM,Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、その全ての開示が出典明示によりここに援用されるHam及びWallace (1979), Meth. in Enz. 58:44、Barnes及びSato (1980), Anal. Biochem. 102:255、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；又は同第４５６０６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；米国特許再発行第３０９８５号；又は米国特許第５１２２４６９号に記載された培地の何れかも宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地は何れも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適切な濃度で含めることができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６０】
ＣＨＯのような哺乳動物細胞における組換え抗体の生産、回収及び精製のためのプロトコルは次の工程を含みうる：
細胞を撹拌タンクバイオリアクターシステムで培養することができ、流加培養法を用いる。好ましい流加培養では、哺乳動物宿主細胞と培養培地を最初に培養容器に供給し、培養中に培養物へ更なる培養栄養素を連続的に又は離散した増分で供給し、培養の終了前に周期的な細胞及び／又は産物の収集を行うか行わない。流加培養法は、例えば、周期的に（細胞及び培地を含む）全培養物が除去され新鮮な培地に置き換えられる半連続流加培養を含みうる。流加培養法は、（細胞及び全ての培養栄養分を含む）細胞培養のための全ての成分が培養プロセスの開始時点で培養容器に供給される単純なバッチ培養法とは区別される。流加培養法は、上清がプロセス中培養容器から除去されない限りにおいて潅流培養とも更に区別できる（潅流培養では、細胞は例えばマイクロキャリアへの固着化、被包、濾過等によって培地に拘束され、培養培地は連続的又は断続的に培養容器に導入され、除去される）。
【００６１】
更に、培養の細胞は、特定の宿主細胞及び考慮される特定の生産計画に適している任意のスキーム又はルーチンに従って増殖させることができる。従って、単一工程又は複数工程培養手順を用いることができる。単一工程培養では、宿主細胞は培養環境中に播種され、細胞培養の単一生産段階中でプロセスが用いられる。あるいは、多段階培養法を使用することができる。多段階培養法では、細胞は多くの工程又は段階で培養されうる。例えば、細胞は、おそらくは貯蔵から除去された細胞が増殖及び高生存率を促進するのに適した培地中に播種される第一工程又は増殖段階で増殖されうる。細胞は宿主細胞培養物への新鮮培地の添加によって適切な期間、増殖段階に維持されうる。
【００６２】
ある実施態様では、細胞培養の増殖段階において哺乳動物細胞の増殖を亢進させるための流加培養又は連続細胞培養条件が案出されうる。増殖段階において、細胞は増殖を最大にする条件下及び期間、増殖させる。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）等は特定の宿主で使用されるものであり、当業者には明らかであろう。一般に、ｐＨは、酸（例えばＣＯ２）又は塩基（例えばＮａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ）の何れかを使用して約６．５と７．５の間のレベルに調節される。ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞を培養するために適した温度範囲は、約３０℃から３８℃であり、適切なｄＯ２は空気飽和の５−９０％である。
特定の段階で、細胞を使用して、細胞培養の生産段階又は工程で播種することができる。あるいは、上に記載したように、生産段階又は工程は播種又は増殖段階又は工程と連続的であってもよい。
【００６３】
細胞培養の生産段階における細胞培養環境は典型的には制御される。よって、糖タンパク質が生産される場合、哺乳動物宿主細胞の細胞特異的生産性に影響する因子を、所望のシアル酸含量が得られた糖タンパク質で達成されるように操作することができる。好ましい態様では、細胞培養プロセスの生産段階に、細胞培養の生産段階のパラメーターをかみ合わせる細胞培養の遷移段階が先行する。このプロセスの更なる詳細は、その全体の開示が出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５７２１１２１号及びChaderjian等, Biotechnol. Prog. 21(2):550-3 (2005)に見出される。
【００６４】
発酵に続いてタンパク質は精製される。細胞片からのタンパク質の精製の手順は最初はタンパク質の発現部位に依存する。幾つかのタンパク質は細胞から回りの増殖培地中に直接分泌させることができる；他のものは細胞内に生産される。後者のタンパク質では、精製プロセスの最初の工程は、細胞の溶解を含み、これは、機械的剪断、浸透圧ショック、又は酵素処理を含む様々な方法によってなすことができる。そのような破壊は細胞の全内容物をホモジネート中に放出し、またその小さいサイズのために除去するのが難しい細胞内断片をつくり出す。これらは分画遠心法又は濾過によって一般に除去される。同じ問題が、小規模でではあるが、細胞の自然死及び細胞内宿主細胞タンパク質及びタンパク質製造実験の過程で成分の放出のために、直接分泌されたタンパク質の場合でも生じる。
【００６５】
興味あるタンパク質を含む清澄な溶液がひとたび得られれば、細胞によって製造される他のタンパク質からのその分離は、通常は異なったクロマトグラフィー技術の組合せを使用して試みられる。これらの技術はその電荷、疎水性度、又はサイズに基づいてタンパク質の混合物を分離する。数種の異なったクロマトグラフィー樹脂がこれらの技術のそれぞれに対して利用でき、関連する特定のタンパク質に対して精製スキームを正確に仕立てることが可能である。これら分離法の各々の本質は、タンパク質を、長いカラムを異なった速度で移動させることができ、それらがカラムを更に通過するにつれて増加する物理的分離を達成し、又は選択的に分離媒質に固着し、ついで異なった溶媒で差次的に溶離されることである。ある場合には、所望のタンパク質は、不純物がカラムに特異的に付着し、対象のタンパク質が付着しない場合に不純物から分離させられ、つまり、対象のタンパク質は「通過画分」中に存在する。よって、哺乳動物宿主細胞の細胞培養からの組換えタンパク質の精製は一又は複数のアフィニティ（例えばプロテインＡ）及び／又はイオン交換クロマトグラフィー工程を含みうる。
【００６６】
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の精製に一般的に使用されるクロマトグラフィー技術である。イオン交換クロマトグラフィーでは、溶質の表面上の荷電パッチが、回りのバッファーのイオン強度が低い場合、クロマトグラフィーマトリックスに付着した反対の電荷によって吸引される。溶離は、イオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合させるためにバッファーのイオン強度（つまり、伝導度）を増加させることによって一般に達成される。ｐＨを変化させて溶質の電荷を変えることは溶質の溶離を達成する他の方法である。伝導度又はｐＨの変化は、徐々（勾配溶離）か段階的（段階溶離）でありうる。過去では、これらの変化は、漸進的であった；つまりｐＨ又は伝導度は単一の方向に増加又は減少させられる。
治療用抗体の工業的精製の更なる詳細については、その全体の開示が出典明示によりここに明示的に援用されるFahrner 等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-27 (2001)を例えば参照のこと。
【００６７】
哺乳動物宿主細胞に加えて、他の真核生物を組換えタンパク質の発現のための宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミセス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に対しては、好適なベクターには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。異種タンパク質の組換え生産に適した他の酵母には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Beach及びNurse (1981), Nature 290: 140; １９８５年５月２日公開のEP139383）；例えばＫ．ラクチス (ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Louvencourt等, J. Bacteriol., 737 (1983))、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６；Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、Ｋ．サーモトレランス及びＫ．マルキシアナスのようなクルイベロミセス宿主（米国特許第４９４３５２９号；Fleer等, Bio/Technology, 2: 968 975 (1991)）；ヤローウィア(欧州特許出願公開第４０２２２６号)；ピチア・パストリス(欧州特許出願公開第１８３０７０号；Sreekrishna等, J. Basic Microbiol., 28: 265 278 (1988))；カンジダ、トリコデルマ・リーシア(欧州特許出願公開第２４４２３４号)；ニューロスポラ・クラッサ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259 5263 (1979)）； シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許出願公開第３９４５３８号)；及び例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（１９９１年１月１０日公開の国際公開第９１／００３５７号）のような糸状菌、及びＡ．ニジュランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284 289 (1983)；Tilburn等, Gene, 26: 205 221 (1983)；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470 1474 (1984)）及びＡ．ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475 479 (1985)）のようなアスペルギルス宿主である。メチロトローフ酵母はここでは適しており、限定するものではないが、ハンゼヌラ、カンジダ、 クロエケラ、ピキア、サッカロミセス、トルロプシス及び ロドトルラからなる属から選択されるメタノールで増殖可能な酵母が含まれる。このクラスの酵母の例である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見出すことができる。列挙された及び他の酵母のための発現系は当該分野でよく知られており、及び／又は商業的に入手可能である。
【００６８】
ＳＦ９細胞のような昆虫宿主細胞での発現に対しては、好適なベクターにはバキュロウイルスベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主における発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００６９】
本発明の方法はまた原核生物宿主細胞の培養にも拡張される。本発明によって保護される抗体及び他のタンパク質を発現するために適した原核生物宿主細胞は、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体を含む。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。大腸菌株の例には、大腸菌Ｗ３１１０(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ＡＴＣＣ寄託番号２７３２５)及びその派生体、例えば遺伝子型W3110 ΔfhuA(ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanRを有する株３３Ｄ３ (米国特許第５６３９６３５号)が含まれる。他の株及びその派生体、例えば大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）もまた適切である。これらの例は限定ではなく例示的なものである。定まった遺伝子型を有する上述の細菌の何れかの派生体を構築する方法は当該分野で知られており、例えばBass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが一般に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼ阻害剤を細胞培養中に導入することができる。
【００７０】
非哺乳動物宿主細胞培養物から組換えタンパク質を生産、回収及び精製する方法は当該分野でよく知られている。ポリペプチドが非哺乳動物細胞、例えば菌類又は大腸菌等の微生物において生産される場合、ポリペプチドは細胞内又は細胞膜周辺腔で回収される（Kipriyanov及びLittle, Molecular Biotechnology, 12: 173-201 (1999); Skerra及びPluckthun, Science, 240: 1038-1040 (1988)）。よって、細胞溶解等の抽出法によりタンパク質を細胞から細胞外培地中に放出することが必要である。そのような破壊により、細胞の内容物全体がホモジネート中へと放出され、加えて小さすぎることにより除去が困難な細胞内断片が生成される。これらは一般に分画遠心法又は濾過により除去される。
【００７１】
細胞溶解は、典型的にはホモジナイゼーション又はヘッドミル等の機械的破壊技術を用いて達成される。対象のタンパク質は一般に効率的に遊離されるが、そのような技術には幾つかの欠点がある（Engler, Protein Purification Process Engineering, Harrison編, 37-55 (1994)）。処理の間にしばしば温度が上昇し、タンパク質の不活性化が起こる場合がある。更に、得られた懸濁液が幅広いスペクトルの汚染タンパク質、核酸及び多糖類を含む。核酸及び多糖類により溶液の粘度が増大し、引き続いて行われる遠心分離、クロスフロー濾過、又はクロマトグラフィーによる処理が困難となる可能性がある。これら汚染物質が対象のタンパク質と複雑に関連することにより、精製プロセスが複雑化し、その結果十分な産生量が得られない場合がある。微生物発酵ブロス又はホモジネートからの異種性ポリペプチドの改良された精製法は、例えば、その全開示が出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第７１６９９０８号に記載されている。
【００７２】
ここに記載される発酵、回収及び精製法は例示的な目的のみのものであることを強調する。本発明の方法は、組換えタンパク質の生産、回収及び精製のために開発された任意の製造方法と組み合わせることができる。
【００７３】
２．抗体
好ましい実施態様では、本発明の方法は、治療用及び診断用抗体を含む抗体の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合の還元を防止するために使用される。本発明の範囲内の抗体には、限定されるものではないが、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))を含む抗ＨＥＲ２抗体(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)、米国特許第５７２５８５６号)；ＣＤ２０抗体、例えば米国特許第５７３６１３７号におけるようなキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」（リツキサン（登録商標））、米国特許第５７２１１０８号におけるような２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はトシツモマブ（BEXXAR(登録商標)）；抗ＩＬ-８(St John等, Chest, 103:932 (1993)、及び国際公開第９５／２３８６５号)；抗ＶＥＧＦ抗体、例として、ヒト化及び／又は親和性成熟した抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４.６.１ アバスチン(登録商標)(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992)、１９９８年１０月１５日公開の国際公開第９６／３００４６号及び同第９８／４５３３１号)；抗ＰＳＣＡ抗体(国際公開第０１／４０３０９号)；抗ＣＤ４０抗体、例えばＳ２Ｃ６及びそのヒト化変異体（国際公開第００／７５３４８号）；抗ＣＤ１１ａ抗体(米国特許第５６２２７００号、国際公開第９８／２３７６１号、Steppe等, Transplant Intl. 4:3-7 (1991)及びHourmant等, Transplantation 58:377-380 (1994))；抗ＩｇＥ(Presta等, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)、及び国際公開第９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８(１９９７年４月２２日発行の米国特許第５６２２７００号、又は１９９７年７月３１日公開の国際公開第９７／２６９１２号)；抗ＩｇＥ（Ｅ２５，Ｅ２６及びＥ２７を含む；１９９８年２月３日発行の米国特許第５７１４３３８号、又は１９９２年２月２５日発行の米国特許第５０９１３１３号、１９９３年３月４日公開の国際公開第９３／０４１７３号、又は１９９８年６月３０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５７１４３３８号）；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体(１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号)；抗ＴＮＦ−α抗体、例えばｃＡ２(REMICADE(登録商標))、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５(１９９７年９月３０日発行の米国特許第５６７２３４７号、Lorenz等, J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)、及びDhainaut等, Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)を参照)；抗組織因子(ＴＦ)(１９９４年１１月９日に権利付与された欧州特許第０４２０９３７号Ｂ1)；抗ヒトα４β７インテグリン(１９９８年２月１９日公開の国際公開第９８／０６２４８号)；抗ＥＧＦＲ(１９９６年１２月１９日公開の国際公開第９６／４０２１０号の、キメラ化又はヒト化の２２５抗体)；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３(１９８５年５月７日発行の米国特許第４５１５８９３号)；抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体、例としてＣＨＩ-６２１(SIMULECT(登録商標))及びZENAPAX(登録商標)(１９９７年１２月２日発行の米国特許第５６９３７６２号を参照)；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ-７４１２抗体(Choy等 Arthritis Rheum 39(1): 52-56 (1996))；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(Riechmann等 Nature 332:323-337 (1988))；抗Ｆｃレセプター抗体、例えばGraziano等 J. Immunol. 155(10): 4996-5002 (1995)に記載のＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体；抗癌胎児性抗原(ＣＥＡ)抗体、例えばｈＭＮ-１４ (Sharkey等 Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995))；胸部上皮細胞に対する抗体、例としてｈｕＢｒＥ-３、ｈｕ-Ｍｃ３及びＣＨＬ６(Ceriani等 Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995)；及びRichman等 Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995))；結腸癌細胞と結合する抗体、例えばＣ２４２(Litton等 Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996))；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５(Ellis等 J. Immunol. 155(2): 925-937 (1995))；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕＭ１９５(Jurcic等 Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995))及びＣＭＡ-６７６又はＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ(Juweid等, Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995))；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７-１Ａ(PANOREX(登録商標))；抗ＧｐIIｂ／IIIａ抗体、例えばアブシキマブ(abciximab)又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ(REOPRO(登録商標))；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ-４９３(SYNAGIS(登録商標))；抗ＣＭＶ抗体、例えばPROTOVIR(登録商標)；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗ＨｅｐＢ抗体OSTAVIR(登録商標)；抗ＣＡ１２５抗体 OvaRex；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体 ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体VITAXIN(登録商標)；抗ヒト腎臓細胞上皮癌抗体、例えばｃｈ-Ｇ２５０；ＩＮＧ-１；抗ヒト１７-１Ａ抗体(３６２２Ｗ９４)；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(Ａ３３)；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌(ＳＦ-２５)；及び抗ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体オンコリン(Oncolym)(Ｌｙｍ-１)が含まれる。ここでの抗体に対する好ましい標的抗原は、ＨＥＲ２レセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ４０である。
これらの抗体の多くが、癌を含む様々な疾患を治療するために臨床実務において広く使用されている。
ある特定の実施態様では、本発明の方法は、次の抗体及び組換えタンパク質の生産のために使用される。
【００７４】
抗ＣＤ２０抗体
リツキシマブ(リツキサン(登録商標))は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号(Anderson等)において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキシマブは、再発性又は難治性の軽度又はろ胞性の、ＣＤ２０が陽性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫を患ってる患者に対して効能がある。インビトロの作用機序の研究では、リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)によりリンパ系Ｂ細胞系を溶解することが証明されている(Reff等, Blood 83(2)：435-445(1994))。また、抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)のアッセイでは、有意な活性を有する。より最近では、リツキシマブはトリチウム化チミジン導入アッセイにおいて抗増殖効果を有し、直接アポトーシスを誘導するが、他の抗ＣＤ２０抗体ではこのようなことはないことが示されている(Maloney等, Blood 88(10)：637a(1996))。また、リツキシマブと化学療法剤と毒素との相乗作用が実験的に観察されている。特にリツキシマブは、ドキソルビシン、ＣＤＤＰ、ＶＰ-１６、ジフテリア毒素及びリシンの細胞毒性効果に対して薬剤耐性を有するヒトＢ細胞リンパ腫細胞系を感作させる(Demidem等, Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)：177-186(1997))。インビボでの前臨床的研究では、リツキシマブは、カニクイザルの末梢血、リンパ節及び骨髄からのＢ細胞を、おそらくは補体及び細胞媒介性プロセスにより涸渇させることが示されている(Reff等, Blood 83(2)：435-445(1994))。
【００７５】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第６３９９０６１号、及び同第５８４３４３９号、並びに米国特許出願第２００２／０１９７２５５Ａｌ号、米国特許出願第２００３／００２１７８１Ａ１号、米国特許出願第２００３／００８２１７２Ａ１号、米国特許出願第２００３／００９５９６３Ａ１号、米国特許出願第２００３／０１４７８８５Ａ１号（Anderson等）；米国特許第６４５５０４３Ｂ１号及び国際公開第００／０９１６０号（Grillo-Lopez,A.）；国際公開第００／２７４２８号（Grillo-Lopez及びWhite）；国際公開第００／２７４３３号（Grillo-Lopez及びLeonard）；国際公開第００／４４７８８号（Braslawsky等）；国際公開第０１／１０４６２号（Rastetter,W.）；国際公開第０１／１０４６１号（Rastetter及びWhite）；国際公開第０１／１０４６０号（White及びGrillo-Lopez）；米国特許出願第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号（Hanna及びHariharan）；米国出願第２００２／００１２６６５Ａｌ号及び国際公開第０１／７４３８８号（Hanna,N.）；米国出願第２００２／０００９４４４Ａ１号及び国際公開第０１／８０８８４号（Grillo-Lopez,A.）；国際公開第０１／９７８５８号（White,C.）；米国出願第２００２／０１２８４８８Ａ１号及び国際公開第０２／３４７９０号（Reff,M.）；国際公開第０２／０６０９５５号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０９６９４８号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０７９２５５号（Reff及びDavies）；米国特許第６１７１５８６Ｂ１号及び国際公開第９８／５６４１８号（Lam等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju,S.）；国際公開第９９／２２７６４号（Raju,S.）；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、米国特許第６２４２１９５Ｂ１号、米国特許第６５２８６２４Ｂ１号及び米国特許第６５３８１２４号（Idusogie等）；国際公開第００／４２０７２号（Presta,L.）；国際公開第００／６７７９６号（Curd等）；国際公開第０１／０３７３４号（Grillo-Lopez等）；米国出願第２００２／０００４５８７Ａ１号及び国際公開第０１／７７３４２号（Miller及びPresta）；米国出願第２００２／０１９７２５６号（Grewal,I.）；米国出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号（Presta,L.）；米国特許第６０９０３６５Ｂ１号、第６２８７５３７Ｂ１号、第６０１５５４２号、第５８４３３９８号及び第５５９５７２１号（Kaminski等）；米国特許第５５００３６２号、第５６７７１８０号、第５７２１１０８号、及び第６１２０７６７号（Robinson等）；米国特許第６４１０３９１Ｂ１号（Raubitschek等）；米国特許第６２２４８６６Ｂ１号及び国際公開第００／２０８６４号（Barbera-Guillem,E.）；国際公開第０１／１３９４５号（Barbera-Guillem,E.）；国際公開第００／６７７９５号（Goldenberg）；米国出願第２００３／０１３３９３０１Ａ１号及び国際公開第００／７４７１８号（Goldenberg及びHansen）；国際公開第００／７６５４２号（Golay等）；国際公開第０１／７２３３３号（Wolin及びRosenblatt）；米国特許第６３６８５９６Ｂ１号（Ghetie等）；米国出願第２００２／００４１８４７Ａｌ号（Goldenberg,D.）；米国出願第２００３／００２６８０１Ａ１号（Weiner及びHartmann）；国際公開第０２／１０２３１２号（Engleman,E.）；米国出��第２００３／００６８６６４Ａ１号（Albitar等）；国際公開第０３／００２６０７号（Leung,S）；国際公開第０３／０４９６９４号及び米国出願第２００３／０１８５７９６Ａ１号(Wolin等)；国際公開第０３／０６１６９４号(Sing及びSiegall)；米国出願第２００３／０２１９８１８Ａ１号(Bohen等)；米国出願第２００３／０２１９４３３Ａ１号及び国際公開第０３／０６８８２１号(Hansen等)が含まれ、その各々が出典明示によりここに取り込まれる。また、米国特許第５８４９８９８号及び欧州特許出願第３３０１９１号（Seed等）；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許出願第３３２８６５Ａ２号（Meyer及びWeiss）；米国特許第４８６１５７９号(Meyer等)及び国際公開第９５／０３７７０号（Bhat等）を参照のこと。
【００７６】
リツキシマブを用いた治療法に関する文献には、Perotta及びAbuel 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab」 Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Stashi等 「Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura」 Blood 98(4):952-957 (2001)；Matthews, R. 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro等 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002)；Leandro等 「Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro等 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)；Edwards and Cambridge 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rhematology 40:205-211 (2001)；Edwards等 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002)；Edwards等 「Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Levine and Pestronk 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita等 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheumatism 46:2029-2033 (2002)；Hidashida等 「Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」 Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; Ne Orleans, LA 2002；Tuscano, J. 「Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」 Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002が含まれる。Sarwal 等 N. Eng. J. Med. 349(2):125-138 (July 10, 2003)では、ＤＮＡマイクロアレイプロファイリングによって同定される急性の腎臓同種異系移植片拒絶反応における分子不均一性が報告されている。
【００７７】
様々な実施態様において、本発明はヒト化２Ｈ７抗ＣＤ２０抗体を含有する薬学的組成物を提供する。特定の実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は表２に挙げられた抗体である。
2020105180.tif 000003
【００７８】
表２の抗体変異体Ａ、Ｂ及びＩの各々は、軽鎖可変配列（ＶＬ）：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR（配列番号１）；及び
重鎖可変配列（ＶＨ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号２）
を含む。
【００７９】
表２の抗体変異体Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧの各々は、軽鎖可変配列（ＶＬ）：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR（配列番号３）、及び
重鎖可変配列（ＶＨ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号４）
を含む。
【００８０】
表２の抗体変異体Ｈは、配列番号３（上記）の軽鎖可変配列（ＶＬ）及び重鎖可変配列（ＶＨ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号５）
を含む。
【００８１】
表２の抗体変異体Ａ、Ｂ及びＩの各々は、完全長軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号6)
を含む。
【００８２】
表２の変異体Ａは、完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号７）
を含む。
【００８３】
表２の変異体Ｂは完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号８）
を含む。
【００８４】
表２の変異体Ｉは完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１５）
を含む。
【００８５】
表２の抗体変異体Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ及びＨは、完全長軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号９）
を含む。
【００８６】
表２の変異体Ｃは完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１０）
を含む。
【００８７】
表２の変異体Ｄは、完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１１）
を含む。
【００８８】
表２の変異体Ｆは、完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１２）
を含む。
【００８９】
表２の変異体Ｇは、完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK（配列番号１３）
を含む。
【００９０】
表２の変異体Ｈは、完全長重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１４）
を含む。
【００９１】
ある実施態様では、本発明のヒト化２Ｈ７抗体はＩｇＧ Ｆｃにおいてアミノ酸改変を更に含み、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりもヒトＦｃＲｎに対して少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、更により好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍、増加した結合親和性を示す。
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。本発明のヒト化２Ｈ７抗体組成物はＦｃ領域を有する先のヒト化２Ｈ７抗体の何れかの組成物を含み、組成物中の抗体の約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）はフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような組成物はヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合を驚くほど改善することがここで証明された。Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）は正常で健康なアメリカ黒人及び白人において、Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)参照。歴史的には、最も一般的に使用される工業的宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において生産された抗体は、約２から６％をフコシル化されていない集団に含む。YB2/0及びLec13は、しかしながら、78から98%の非フコシル化種を持つ抗体を生産できる。Shinkawa等 J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、ＹＢ２／０及びＬｅｃ１３細胞で生産された抗体は、少ないＦＵＴ８活性を有し、インビトロで有意に増加したＡＤＣＣ活性を示すことを報告している。減少したフコース量の抗体の生産はまた例えばLi等, (GlycoFi) 「Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris」Nature Biologyオンライン刊行物 22 Jan. 2006；Niwa R.等, Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004)；米国出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta)；米国特許第６６０２６８４号及び米国出願公開第２００３／０１７５８８４号 (Glycart Biotechnology)；米国出願公開第２００４／００９３６２１号、米国出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国出願公開第２００４／０１３２１４０号(全て協和発酵工業)に記載されている。
【００９２】
二重特異性ヒト化２Ｈ７抗体は、抗体の１本のアームが本発明のヒト化２Ｈ７抗体のＨ及び／又はＬ鎖の抗原結合領域を少なくとも有し、他のアームは第二抗原に対してＶ領域結合特異性を有する抗体を包含する。具体的な実施態様では、第二抗原は、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ活性化リガンドからなる群から選択される。
【００９３】
抗ＨＥＲ２抗体
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第５８２１３３７号)は、広範な抗癌治療を前に受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、１９９８年９月２５日、食品医薬品局から販売許可を受けた。２００６年１１月には、ＦＤＡは、ＨＥＲ２陽性リンパ節陽性乳癌患者のアジュバント療法のための、ドキソルビシン、シクロホスファミド及びパクリタキセルを含む治療法の一部としてハーセプチンを承認した。
【００９４】
一実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体は次のＶＬ及びＶＨドメイン配列を含む：
ヒト化２Ｃ４型５７４抗体ＶＬ（配列番号１６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK
及びヒト化２Ｃ４型５７４抗体ＶＨ（配列番号１７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS。
【００９５】
他の実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体は、それぞれ図２１及び図２２に示されるようなトラスツズマブのＶＬ（配列番号１８）及びＶＨ（配列番号１９）ドメイン配列を含む。
様々な性質を持つ他のHER2 抗体は、Tagliabue等, Int. J. Cancer 47:933-937 (1991)；McKenzie等, Oncogene 4:543-548 (1989)；Maier等, Cancer Res. 51:5361-5369 (1991)；Bacus等, Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990)；Stancovski等, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)；Bacus等, Cancer Research 52:2580-2589 (1992)；Xu等, Int. J. Cancer 53:401-408 (1993)；国際公開第９４／００１３６号；Kasprzyk等, Cancer Research 52:2771-2776 (1992)；Hancock等, Cancer Res. 51:4575-4580 (1991)；Shawver等, Cancer Res. 54:1367-1373 (1994)；Arteaga等, Cancer Res. 54:3758-3765 (1994)；Harwerth等, J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992)；米国特許第５７８３１８６号；及びKlapper等, Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記載されている。
【００９６】
抗ＶＥＧＦ抗体
抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば次の配列を含みうる：
一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は次のＶＬ配列（配列番号２０）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVI ISCSASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIATYYCQQ YSTVPWTFGG GTKLEIKR；及び
次のＶＨ配列（配列番号２１）：
EIQLVQSGPE LKQPGETVRI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLETSASTAY LQISNLKNDD TATYFCAKYP HYYGSSHWYF DVWGAGTTVT VSS
を含む。
【００９７】
他の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は次のＶＬ配列（配列番号２２）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR；及び
次のＶＨ配列（配列番号２３）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
を含む。
【００９８】
第三の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は次のＶＬ配列（配列番号２４）：
DIQLTQSPSS  LSASVGDRVT  ITCSASQDIS  NYLNWYQQKP  GKAPKVLIYF  TSSLHSGVPS  RFSGSGSGTD  FTLTISSLQP  EDFATYYCQQ  YSTVPWTFGQ  GTKVEIKR；  及び    
次のＶＨ配列（配列番号２５）：
EVQLVESGGG  LVQPGGSLRL  SCAASGYDFT  HYGMNWVRQA  PGKGLEWVGW  INTYTGEPTY  AADFKRRFTF  SLDTSKSTAY  LQMNSLRAED  TAVYYCAKYP  YYYGTSHWYF  DVWGQGTLVT  VSS
を含む。
【００９９】
抗ＣＤ１１ａ抗体
ヒト化抗ＣＤ１１ａ抗体であるエファリズマブ又はラプティバ(登録商標)(米国特許第６０３７４５４号)は、乾癬の治療について２００３年１０月２７日に食品医薬品局から承認を受けた。一実施態様は、以下のＨｕＭＨＭ２４のＶＬ及びＶＨ配列を含んでなる抗ヒトＣＤ１１ａ抗体を提供する：
ＶＬ（配列番号２６）：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKR；及び
ＶＨ（配列番号２７）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSS。
【０１００】
抗ヒトＣＤ１１ａ抗体は、配列番号２７のＶＨと、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２８）
の配列を有するＨｕＭＨＭ２４の完全長Ｌ鎖、又は、
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２９）
の配列を有するＨ鎖と共に上記のＬ鎖を含みうる。
【０１０１】
ＤＲ５レセプターに対する抗体（抗ＤＲ５抗体）もまた本発明に従って製造することができる。かかる抗ＤＲ５抗体は特にＰＣＴ公開公報第２００６／０８３９７１号に開示された全ての抗体変異体、例えばＡｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３、８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３と命名された抗ＤＲ５抗体、特にＡｐｏｍａｂ８．３及びＡｐｏｍａｂ７．３、好ましくはＡｐｏｍａｂ７．３を含む。国際公開第２００６／０８３９７１号の全内容は出典明示により明示的にここに援用される。
【０１０２】
３．他のジスルフィド含有タンパク質
抗体に加えて、本発明の方法は、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチドの製造において有用性を見出す。かかるポリペプチドの代表的な例には、限定するものではないが、次の治療用タンパク質が含まれる：心筋梗塞の治療のための血栓溶解剤である組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡｓ）、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｔＰＡ，アルテプラーゼ，ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標））、単回ボーラス投与のための延長半減期及びフィブリン特異性を有するｈｔ−ＰＡ変異体であるＴＮＫアーゼ（商標）；小児及び成人における成長ホルモン欠乏症の治療のための組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ，ソマトロピン，NUTROPIN(登録商標），PROTROPIN(登録商標))；及び嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療のための組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ Ｉ）。
【０１０３】
ジスルフィドを含有する生物学的に重要なタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン及び牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６)、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ(ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ)；デス(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上記ポリペプチドの断片が含まれる。
【０１０４】
４．抗体の組換え生産のための一般的方法
ここでの抗体及び他の組換えタンパク質は組換えＤＮＡ法のよく知られた技術によって生産することができる。よって、上で特に特定された抗体の他に、当業者は、例えば以下に起債される技術を使用して、興味ある抗原に対して抗体を産生させることができるであろう。
【０１０５】
抗原選択と調製
ここでの抗体は対象の抗原に対して産生される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原（例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照）に対して産生された抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子（例えばレセプター）又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。例示的な抗原は、以下のセクション（３）に記述されるタンパク質を含む。本発明に包含される抗体に対する典型的な分子標的は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０のようなＣＤタンパク質；ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３あるいはＨＥＲ４レセプターのようなＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８あるいは抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＶＥＧＦのような増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、あるいはここで言及された他の抗原の任意のものを含む。上に列挙された抗体が結合する抗原は特にここでの範囲に含まれる。
【０１０６】
他の分子に場合によっては結合した可溶型抗原あるいはその断片は、抗体産生のための免疫原として用いることができる。レセプターのような膜貫通型分子については、これらの断片（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）は免疫原として用いることができる。あるいは、膜貫通型分子を発現する細胞を免疫原として用いることができる。そのような細胞は、天然源（例えば癌細胞株）に由来しうるか、あるいは膜貫通型分子を発現させるために組換え技術によって形質転換された細胞でありうる。
抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当業者には明らかであろう。
【０１０７】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による結合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより結合させることが有用でありうる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合体として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１０８】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 590-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１０９】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中でも、好ましいミエローマ株化細胞は、マウスミエローマ系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１１０】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。好ましくは、ここに記載されたプロテインＡクロマトグラフィー手順が使用される。
【０１１１】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで、修飾できる。
【０１１２】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用する、マウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。次の刊行物は、鎖シャッフリング(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産を記載している。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ法に対する実行可能な代替手段である。
【０１１３】
ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体には非ヒトである供給源由来の一又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかのＣＤＲ残基と場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623 (1993))。
【０１１４】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これらディスプレイを見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１１５】
別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等, Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーから取り出すこともまたできる（Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等, Nature Biotech 14:309 (1996)）。
【０１１６】
抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である（国際公開第９３／１６１８５号を参照）。
【０１１７】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような分子は通常は二つの抗原を結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。
二重特異性抗体を製造する方法は当該分野で知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づき、ここで該二つの鎖は異なる特異性を有している(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられるため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によりなされる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。類似の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１１８】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じか又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方はアビジンに結合され得、他方はビオチンに結合され得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を不要の細胞に向けるため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号、及び欧州特許出願公開第０３０８９号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１１９】
抗体断片から二重特異性抗体を生産するための技術もまた文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製することができる。Brennan等, Science, 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体をタンパク分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生産する手順を記載している。これらの断片は、隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止するためにジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元させる。ついで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転化させる。ついで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つを、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再転化させ、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。製造された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ’−ＳＨ断片を直接回収できるようになり、これを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子を記載している。各Ｆａｂ’断片は別個に大腸菌から分泌され、インビトロでの定方向化学カップリングによって二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合することができ、またヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を惹起させた。
【０１２０】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。あるいは、抗体は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されているように、「直鎖状抗体」でありうる。簡単に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異性又は単一特異性でありうる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１２１】
イムノアドヘシン
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合体において、コードされるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合体はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端に、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端が直ぐに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【０１２２】
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかしながら、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【０１２３】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＧグロブリンと、時折ＩｇＧグロブリンは、血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【０１２４】
ここに記載した範囲内の様々な例示的構築イムノアドヘシンは以下に概略的に模式化される：
ＡＣＬ-ＡＣＬ；
ＡＣＨ-(ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)
ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,ＶＬＣＬ-ＡＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ,又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２、
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１２５】
簡潔にするため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様の作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要とはされないが、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されて存在するかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが典型的にはアドヘシン免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時に、ハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造の調製に適した方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
【０１２６】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの公開配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部分が、選ばれた宿主細胞中での効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムで挿入される。
【０１２７】
次の実施例は例示目的のみで提供するもので、決して本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書で引用される全ての特許及び文献についてその全体を出典明示によりここに援用する。
【実施例】
【０１２８】
実施例において言及される市販試薬は、別に記載しない限り、製造者の指示に従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号によって次の実施例においてまた明細書を通して特定される細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア州である。
【０１２９】
実施例１
材料と方法の記載
次の材料と方法を以下の実施例２−８において使用した。
材料
実験実施例に記載された実験において使用された材料及び装置は、ステンレス鋼製バイアル(ミニタンク, Flow Components, Dublin, CA；低(50 cc)及び高(55 cc))；透析チューブ(Spectra/Por, 6-8000 MWCO, カタログ番号132645)、０．２２μｍフィルター(Millipore Millipak Gamma Gold カタログ番号MPGL04GH2)；リン酸緩衝生理食塩水(PBS, EMD, カタログ番号6506)；エチレンジアミン四酢酸(EDTA, Sigma, カタログ番号E4884)；α-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH, Calbiochem, カタログ番号481973)；デヒドロエピアンドロステロン (DHEA, TCI, カタログ番号D0044)；硫酸銅 (Sigma, カタログ番号C8027)、グルコース-６-リン酸(G6P, Calbiochem, カタログ番号346764)；オーロチオグルコース (ATG, USP, カタログ番号1045508)；金チオリンゴ酸塩 (ATM, Alfa Aesar, カタログ番号39740)；還元型グルタチオン(GSH, J.T. Baker, カタログ番号M770-01)；モノブロモビマン(mBB, Fluka, カタログ番号69898)；ヒスチジン(J.T. Baker, カタログ番号2080-05)；硫酸ナトリウム(J.T. Baker, カタログ番号3897-05)；Ｔｒｘ(Sigma, カタログ番号T8690)；ＴｒｘＲ(Sigma, カタログ番号T9698)を含む。全ての化学薬品及び試薬は更なる精製なしに受け取ったまま使用した。ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＣｕＳＯ４（１０ｍＭ）、ＡＴＧ（３０ｍＭ）、ＡＴＭ（３０ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（７５ｍＭ）、Ｇ６Ｐ（３００ｍＭ）の原液を、ミニタンク経時変化研究での使用のために調製した。
【０１３０】
細胞培養液（ＣＣＦ）の生成
様々な還元研究のためのオクレリズマブＣＣＦを生成するために、代表的な小規模発酵プロセスを、過去に記載された方法と同様に利用した(Chaderjian等, 2005)。簡潔に述べると、傾斜ブレードインペラを装備した３リットルガラス攪拌タンクApplikon（登録商標）バオリアクターを、オクレリズマブ培地成分を含む接種材料列及び生産培養に使用した。バイオリアクターには、較正溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ及び温度プローブを装備した。ＤＯ、ｐＨ、温度、及び攪拌速度は、デジタル制御装置を使用してオクレリズマブ製造プロセスの定まったパラメータに制御した。接種材料列及び生産培養双方に対する作業体積は１．５Ｌであった。毎日の試料をＮＯＶＡバイオプロファイル血液ガスアナライザーで分析して、ｐＨ及び溶存酸素のオンライン値の精度を確実にし培養物中のグルコース、乳酸、アンモニウム、グルタミン、グルタミン酸、及びナトリウム濃度をモニターした。毎日の試料をまた採取して細胞増殖、生存率、及び力価をモニターした。細胞増殖は、ＶｉＣｅｌｌを使用する生存細胞数と血中血球容積（ＰＣＶ）ベースの双方で測定した。培養生存率はＶｉＣｅｌｌ機器でのトリパンブルー排除によって決定した。上清試料をＨＰＬＣベース法によってアッセイして、オクレリズマブ力価値を測定した。. 
【０１３１】
収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）調製物
ＣＣＦの完全な溶解は、Microfluidics HC-8000 ホモジナイザーを使用して高圧ホモジナイゼーションによって達成した。機器の圧力調整器を４０００−８０００ｐｓｉに設定し、ＣＣＦを、ホモジナイザーを通して引き込み、単一パス後に完全な細胞溶解（膜破壊）を達成した。系に水をパージしたところで、ＣＣＦホモジネートを集めた。ホモジネートを遠心ボトルに移し、２０℃にてSorval RC-3Bローター遠心機で４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心物をデカントした後、デプスフィルターで濾過し、ついでシリコンチュービングを備えた蠕動ポンプを使用して０．２２μｍの滅菌濾過を施し、ホモジナイズされたＣＣＦ（１００％細胞溶解物）から最終ＨＣＣＦを生成した。別法では、ＣＣＦをホモジナイゼーションなしに発酵槽からそのまま遠心分離した後、遠心物を０．２２μｍの滅菌フィルターで濾過してＨＣＣＦを生成した。
【０１３２】
ミニタンクのハンドリング
層流フードを全てのミニタンクのハンドリングにおいて使用し、ＨＣＣＦインキュベーション実験において使用した全ての材料をオートクレーブするか７０％のイソプロパノールを使用してすすいで細菌汚染を最小にした。
【０１３３】
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイについては、出典明示によりここに援用されるBabson及びBabson (1973)及びLegrand等, (1992)を参照のこと。
【０１３４】
透析実験
透析実験を、オクレリズマブの還元を引き起こす成分が小分子か巨大分子（つまり、酵素）かを決定するために実施した。３ｍＬの精製し製剤化したオクレリズマブの試料（３０．２ｍｇ／ｍＬ）を１Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，１０ｍＭ ｐＨ７．２）で２４時間透析し、ＰＢＳを８時間後に変えた。ついで、オクレリズマブ試料の濃度を、２８０ＮＭでの吸光度を使用して１ｍｇ／ｍＬに調節した。アリコートを使用前に−７０℃で保存した。透析チュービングを０．０５％のアジド溶液で一晩水和させ、使用前に滅菌水ですすいだ。３Ｌの発酵槽からＣＣＦのホモジナイゼーションから得られたＨＣＣＦを解凍し、蠕動ポンプを使用して０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋフィルターで濾過した。６つの短いミニタンクに３０ｍＬのＨＣＣＦをそれぞれ満たした。各ミニタンクに、密封した透析チュービング内の５００μＬのオクレリズマブ試料を加えた。ミニタンクを密封し、３５ｒｐｍと雰囲気温度で操作するベンチトップミキサー(Barnstead Lab-Line MAX Q 4000)中に入れた。各時点で、一つのミニタンクをミキサーから取り除き、ＨＣＣＦ（ミニタンク中）及びオクレリズマブ試料（透析バッグ中）のアリコートを取り上げて、遊離チオールアッセイ及びバイオアナライザーアッセイ(以下に記載)で分析するまで、−７０℃で保存した。
【０１３５】
インビトロ系における小規模での還元のための試験阻害剤
高いミニタンクに２７ｍＬのＨＣＣＦを満たした。実験設計に応じて、様々な試薬（ＮＡＤＰＨ，Ｇ６Ｐ，Ｇ６ＰＤ又はＴｒｘＲの阻害剤）を所望の濃度まで加え、ミニタンク内の最終容積を、ＰＢＳ（１０ｍＭ ｐＨ７．２）を用いて３０ｍＬにした。ミニタンクを密封し、３５ｒｐｍ及び雰囲気温度で操作するベンチトップミキサー中に入れた。サンプリングの各時点で、ミニタンクの外部を７０％のＩＰＡで滅菌し、アリコートの除去のために層流フード中で開放した。ついで、ミニタンクを再密封し、ベンチトップミキサー中に戻した。全てのアリコートを、遊離チオールアッセイ及びバイオアナライザーアッセイ(以下に記載)で分析するまで、−７０℃で保存した。
【０１３６】
インビトロＴｒｘ／Ｔｒｘレダクターゼ研究
市販のＴｒｘＲ（ラット肝臓）溶液（４μＭ）を水で希釈して２．８６μＭの溶液を得た。凍結乾燥したＴｒｘ（ヒト）をＰＢＳ（１０ｍＭ，ｐＨ７．２）で再構成して５００μＭの溶液を得た。２０ｍＭのＮＡＤＰＨと１０ｍＭのＡＴＧの溶液及びＡＴＭ溶液を水で調製した。
黒色ポリプロピレンの１．５ｍＬのマイクロ遠心管、４３７μＬのＰＢＳ、２５μＬのＮＡＤＰＨ、１６μＬの製剤化オクレリズマブ溶液（３０．２ｍｇ／ｍＬ）及び５μＬのＴｒｘを穏やかに混合した。１７．５μＬのＴｒｘＲを添加して反応を開始させた。反応物を室温で２４時間インキュベートした。２０μＬのアリコートを各サンプリング時点で採取して、バイオアナライザーアッセイによる分析（以下参照）まで−７０℃で保存した。コントロールは、反応混合物中のＴｒｘ及び／又はＴｒｘＲの何れかを等容量のＰＢＳに置き換えることにより酵素を省略した場合に酵素経路が活性かどうかを決定するために実施した。
Ｔｒｘ系の阻害を、５μＬのＡＴＧ又はＡＴＭを添加して上述と同じ反応条件を使用して証明した。Ｃｕ２＋によるＴｒｘ系の阻害を証明するため、同じ酵素であるが異なったバッファー（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．０）を使用する反応混合物に２．５μＬのＣｕＳＯ４（１０ｍＭ）を加えて不溶性Ｃｕ３（ＰＯ４）２の形成を防いだ。
【０１３７】
遊離チオールアッセイ
ＧＳＨを使用する標準曲線をＰＢＳ（１０ｍＭ，ｐＨ６．０±０．０５）で生成した。１１０ｍＭのＧＳＨ溶液から、連続希釈によって０、５．５、１１、２２、４４、５５、１１０及び５５０μＭの濃度で標準体を調製した。ｍＢＢのアセトニトリル原液（−２０℃で保存した１０ｍＭ）から、ｍＢＢの1００μＭ溶液をＰＢＳ（１０ｍＭ，ｐＨ１０．０±０．０５）中で調製し、光を遮蔽して保存した。
黒色の平底の９６ウェルプレートにおいて、１００μＬのｍＢＢを各ウェルに分配した。標準曲線に対して、１０μＬの標準ＧＳＨ溶液を加え、８．０±０．２の作用ｐＨを得た。試料は、１０μＬの試料をウェルに加えた。全てのウェルを三組調製した。プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートし、ついで３９０ｎｍの励起波長と４９０ｎｍの発光波長で蛍光プレートリーダー(Molecular Devices SpectraMaxR Gemini XS)を使用して読み取った。線形標準曲線を、ＧＳＨ濃度に対してプロットした３つの標準ウェルの平均結果を使用して作成した。試料中の遊離チオール量は、３つの試料ウェルの平均値を使用して標準曲線の線形式から計算した。
【０１３８】
バイオアナライザーアッセイ
Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用してキャピラリー電気泳動測定値を獲得した。試料調製は、若干の変化を加えて、Ａｇｉｌｅｎｔプロテイン２３０アッセイプロトコル（マニュアルパート番号Ｇ２９３８−９００５２）に記載されたようにして実施した。ＨＣＣＦ試料を１：４に希釈し、プロテインＡ試料を、調製前に１．０ｇ／Ｌに水で希釈した。変性工程でのＨＣＣＦ試料では、提供された２μＬの変性溶液に加えて、２４μＬの５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、０．５％のＳＤＳ溶液を加えた。プロテインＡの試料では、ＩＡＭのない０．５％のＳＤＳと２ｍＬの変性溶液を使用した。ゲル様デジタル画像を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを使用して作成した。
【０１３９】
ＨＣＣＦ保持時間研究のための原液
３種の別個の原液を研究室規模のＨＣＣＦ保持時間研究において使用した：（１）ＥＤＴＡ、二ナトリウム二水和物（Mallinckrodt，カタログ番号７７２７−０６又はSigma，カタログ番号Ｅ−５１３４）及びＥＤＴＡ、四ナトリウム二水和物（Sigma，カタログ番号Ｅ−６５１１）を使用して調製した２５０ｍＭのＥＤＴＡ原液、（２）硫酸銅五水和物の５０ｍＭの原液（ＣｕＳＯ４，Sigma，カタログ番号Ｃ−８０２７）、及び（３）１Ｍの酢酸溶液（Mallinckrodt，カタログ番号Ｖ１９３）。
【０１４０】
阻害剤添加及び細胞培養液（ＣＣＦ）混合
２５０ｍＭのＥＤＴＡ又は５０ｍＭのＣｕＳＯ４の原液をホモジナイゼーション前のＣＣＦに添加して最終濃度の範囲を評価して、抗体のジスルフィド還元を防止した。最終ＨＣＣＦをホモジナイズされたＣＣＦから生成したところで、希釈し１００％最大以下まで細胞溶解物の全レベルを減少させるためにホモジナイズされていないＣＣＦ（またＥＤＴＡ又はＣｕＳＯ４を含む）から生成したＨＣＣＦとこれら溶液をついで混合した。あるいは、１Ｍの酢酸の原液を週の配合ＨＣＣＦ溶液（ホモジナイズされたＣＣＦ及びホモジナイズされていないＣＣＦ）に加え、抗体のジスルフィド還元を防止するために溶液のｐＨを減少させた。
およそ３０−５０ｍＬの各ＨＣＣＦ溶液（ＥＤＴＡ、ＣｕＳＯ４、酢酸を含むか、又はコントロールでは無添加）を５０ｍＬの３１６Ｌステンレス鋼製バイアルに入れた。バイアルをクランプで密封し、溶液は曝気又は攪拌はしなかった。バイアルを室温（１８−２２℃）で保存した。予め定めた時点で、溶液を取り除き、実験室規模のプロテインＡアフィニティ樹脂で精製した。
同様の結果を、他の酸化剤、例えばシスチン及び酸化型グルタチオンを用いて得ることができる。
【０１４１】
空気スパージング
抗体のジスルフィド還元を防止するためのホモジナイズされたＣＣＦから生産したＨＣＣＦの空気スパージングを評価するために、３Ｌのガラス製又は１５Ｌのステンレス鋼製容器を利用した。およそ１−５ＬのＨＣＣＦを０．２２μｍで滅菌濾過し、各滅菌容器に入れた。実験条件は、二酸化炭素の添加によってｐＨ制御を伴うか伴わないで１８−２２℃及び５０（１５Ｌ発酵槽）又は２７５ｒｐｍ（３Ｌ発酵槽）に維持した。溶液に空気をスパージングして空気飽和状態まで溶存酸素レベルを増加させるか窒素（コントロール）をスパージングして溶液中の溶存酸素を除去した。各容器へのガス流は、一定の曝気速度が使用されたか又は最小レベルの溶存酸素が維持されたかに応じて変動した。予め定めた時点で、２５−５０ｍＬの試料を両方の容器から取り除き、分析の前に実験室規模のプロテインＡアフィニティ樹脂で精製した。
【０１４２】
プロテインＡプロセシング
収集細胞培養液試料中の抗体は、特異的アフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用して捕捉し精製することができる。プロテインＡ樹脂(Millipore, Prosep-vA High Capacity)を抗体精製のためのアフィニティ樹脂として選択した。樹脂を、１４ｃｍの床高の０．６６ｃｍ内径のガラスカラム(Omnifit(登録商標))に充填し、４．８ｍＬの最終カラム体積にした。カラムクロマトグラフィーを、AKTA Explorer 100 クロマトグラフィー系(GE Healthcare)を使用して実施した。
樹脂を３５０−５６０ｃｍ／時の線形流速でバッファー及びＨＣＣＦにさらした。樹脂を２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．１で平衡にした。各精製に対して、樹脂を樹脂１ｍＬ当たり５−１５ｍｇ抗体で充填した。ＨＣＣＦ中の抗体濃度を、固定化プロテインＡのＨＰＬＣカラム(Applied Biosystems, POROS A)を使用して決定した。充填後、樹脂を２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＴＭＡＣ，ｐＨ７．１で洗浄し、ついで、抗体を０．１Ｍの酢酸，ｐＨ２．９を使用して溶離させた。溶離プール化はカラム後でインラインで測定した２８０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいた。精製した溶離プールは、１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳを使用してｐＨ５．０−５．５にｐＨ調節した。０．１Ｍのリン酸での樹脂の再生後に、同じか又は類似の充填樹脂を、他のＨＣＣＦ溶液の続く精製に使用した。
精製したプロテインＡプール中の抗体濃度は２８０ｎｍでのＵＶ分光測定法を使用して測定した。精製したプロテインＡ溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、１５０ｋＤａの分子量のインタクトな抗体の割合を定量した。
【０１４３】
実施例２
透析実験
透析実験を設計し、実施して、オクレリズマブの還元が小還元分子又は巨大分子（例えば酵素）によって引き起こされたかどうかを決定した。この透析実験では、精製されたインタクトなオクレリズマブを、７０００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の透析バッグ中に配し、ステンレス鋼製ミニタンク内でオクレリズマブを含むＨＣＣＦ中の透析バッグでインキュベートした。図１及び２に示されているように、バッグ内のオクレリズマブは、インキュベーション期間後に還元されなかったが（図１）、ＨＣＣＦ中のバッグ外のオクレリズマブはインキュベーションの開始の直ぐ後に有意に還元された。これは、インタクトなオクレリズマブ（〜１５０ｋＤａ）の消失とオクレリズマブ断片（重鎖及び軽鎖の様々な組合せ）の形成によって裏付けられた（図２）。還元製造実験からのプロテインＡ溶離プール中のオクレリズマブの質量分析は、その観察された断片が鎖間ジスルフィド結合のみの還元によって形成されたことを示していた。
遊離チオールの測定は、インキュベーションの最初に透析バッグ内に遊離チオールが存在していなかったことを示している；しかしながら、透析バッグ内外の遊離チオールレベルが、インキュベーション開始後５時間以内に比較できるようになり、ＨＣＣＦ中の小分子成分が透析バッグ内外で完全に平衡になったことを示している（図３）。還元は７０００ＤａのＭＷＣＯの透析バッグの外側のみで観察され内部では観察されなかったので、還元分子の分子量は７０００Ｄａよりも大きくなければならない。よって、酵素反応がオクレリズマブの還元の原因である。
【０１４４】
実施例３
インビトロでのＴｒｘ／ＴｒｘＲによるオクレリズマブ（ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７，変異体Ａ）の還元
Ｔｒｘ系を、インタクトなオクレリズマブをＴｒｘ、ＴｒｘＲ、及びＮＡＤＰＨと共にインキュベートすることによってインビトロでオクレリズマブを還元するその能力について試験した。バイオアナライザーは、オクレリズマブがＴｒｘ系によってインビトロで還元されていることを示している（図５）。このインビトロ系における還元速度は、（例えば図２に示される還元と比較して）ＨＣＣＦ中のものよりも遅いと思われる。これは、Ｔｒｘ系の反応速度が酵素濃度とバッファー系の双方に依存するので、インビトロ反応において使用される低濃度の酵素（Ｔｒｘ及びＴｒｘ−Ｒ）及び／又はバッファー系のためであるようである。
【０１４５】
実施例４
Ｔｒｘ系の阻害剤
（ｉ）硫酸銅による組換え抗体の還元の阻害
硫酸銅は酸化還元電位を提供するその能力で知られており、組換え抗体分子における遊離チオールレベル（つまり、不対システインを最小化）を最小化するために細胞培養過程で使用されている(上掲のChaderjian等, 2005)。硫酸銅を、Ｔｒｘ系をインビトロで阻害する効果と続くオクレリズマブの還元について試験した。このインビトロ還元実験では、バッファー系をＰＢＳからヒスチジン硫酸に変えて不溶性Ｃｕ３（ＰＯ４）２の形成を避けた。図８は、オクレリズマブがヒスチジン硫酸バッファー（ＰＢＳバッファー中では更に速く）中でＴｒｘ系によって直ぐに還元されたことを示している。この反応へのＣｕＳＯ４の添加がオクレリズマブの還元を明らかに阻害する（図９）。
【０１４６】
（ｉｉ）ＡＴＧ及びＡＴＭによるＨＣＣＦ中の組換え抗体の還元の阻害
ＴｒｘＲの２種の市販の特異的阻害剤オーロチオグルコース（ＡＴＧ）及び金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）について、インビトロでＴｒｘ系を阻害しオクレリズマブの還元を阻害するその能力を試験した。ＡＴＧ及びＡＴＭ共、上述のアッセイにおいてオクレリズマブの還元を効果的に阻害することができる（図６及び７を参照）。図５の脚注に記載したものと同じ反応混合物に１ｍＭの濃度でオーロチオグルコース又は金チオリンゴ酸塩を添加すると、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に示されているようにオクレリズマブの還元を効果的に阻害した。
Ｔｒｘ系がＨＣＣＦ中で活性であり、還元オクレリズマブが還元抗体分子を生じる製造実験又は実験室規模の実験で観察されるならば、双方の金化合物（ＡＴＧ及びＡＴＭ）がＨＣＣＦ中のオクレリズマブの還元を阻害することができなければならない。図１０は、インキュベーションの期間後３Ｌの発酵槽から生成したホモジナイズされたＣＣＴからのＨＣＣＦ中においてオクレリズマブが直ぐに還元されたことを示している。しかしながら、オクレリズマブ還元事象は、１ｍＭのＡＴＧかＡＴＭがＨＣＣＦに添加されたときには完全に阻害された（図１１及び１２）。これらの結果は、Ｔｒｘ系がＨＣＣＦにおいて活性であり、オクレリズマブの還元の直接的な原因であることを証明している。
【０１４７】
実施例５
Ｔｒｘ系活性のためのＮＡＤＰＨの供給源と還元機構におけるＧ６Ｐとグルコースの役割
Ｔｒｘ系によるジスルフィドの還元は、ＮＡＤＰＨからの還元均等物を必要とする（図４）。全ての還元的生合成反応に対してＮＡＤＰＨを提供する主要な細胞代謝経路はペントースリン酸経路である。抗体還元事象が生じるためには、この経路における酵素はＴｒｘ系を活性に維持するためにはＨＣＣＦ中で尚活性でなければならない。最小では、（Ｇ６ＰＤによって触媒される）ペントースリン酸経路における最初の工程は、Ｇ６Ｐを６−ホスホグルコノラクトンに転化させながらＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元させるために活性でなければならない。また、Ｇ６Ｐは、ＨＣＣＦ中のヘキソキナーゼ活性によってグルコース及びアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）から生産される可能性が高い。オクレリズマブの還元の全機構は図４にまとめられている。
ＨＣＣＦ中の還元活性は、ある場合には一過性であると思われ、ある保存条件下又は複数の凍結／解凍サイクル後に経時的に阻害されうる。還元活性を完全に失ったＨＣＣＦは、Ｔｒｘ系によるオクレリズマブの還元におけるＮＡＤＰＨ及びＧ６Ｐの役割を探求する機会を提供した。
【０１４８】
大規模製造実験（「ベータ」実験）からのＨＣＣＦに幾つかの凍結／解凍サイクルを施し、還元を測定するために設計された実験で使用した；この同じ発酵からの新鮮に解凍したＨＣＣＦに過去に見られた抗体還元をもたらすその能力にかかわらず、オクレリズマブ還元は観察されなかった（図１３）。ＮＡＤＰＨを５ｍＭの濃度でこの非還元ＨＣＣＦに添加し、還元事象が戻った（図１４）。従って、Ｔｒｘ系は尚もインタクトであり、還元がもはや生じないＨＣＣＦ中で活性であり、コファクターが供給されたならばタンパク質及び／又は抗体を還元することができる。加えて、還元活性は、ＮＡＤＰＨ源が枯渇するにつれて（おそらくはＮＡＤＰＨと競合する還元的反応の全てによるＮＡＤＰＨの酸化による）経時的に失われるが、Ｔｒｘ系が分解又は不活性化されたので失われなかった。
これは、他の実験によって証明された。１０ｍＭのＧ６Ｐを、ベータ実験から繰り返しで凍結解凍させたＨＣＣＦに添加した。このＧ６Ｐ添加は、続いてＨＣＣＦインキュベーション実験においてオクレリズマブを還元したＴｒｘ系を再活性化した（図１５）。これは、ＨＣＣＦ中でのオクレリズマブの還元がＴｒｘ系とＧ６ＰＤの双方の活性によって引き起こされることを証明した。更に、Ｇ６ＰＤはベータ実験の繰り返し凍結／解凍したＨＣＣＦにおいて尚も活性である；この繰り返し凍結／解凍したＨＣＣＦベータ実験における還元活性の消失はＧ６Ｐの枯渇のためのようであり、これがＮＡＤＰＨへのＮＡＤＰ＋の転化を排除した。
【０１４９】
我々の研究で、我々は、ＥＤＴＡがＨＣＣＦインキュベーション実験においてオクレリズマブの還元を効果的に阻害できることを観察した。図１６に示されるように、オクレリズマブは、１９時間を越えて雰囲気温度で１２０００Ｌのスケールのオクレリズマブ製造実験(繰り返し凍結／解凍されず、還元活性の消失のない）からのＨＣＣＦをインキュベートした後に、還元された。しかしながら、還元は、２０ｍＭのＥＤＴＡが１２ｋＬのＨＣＣＦに添加され別個のステンレス鋼製ミニタンクに保持された場合、完全に阻害された（図１７）。解糖の最初の工程では、ヘキソキナーゼが、ＡＴＰでのＭｇ２＋の錯体化を必要とする反応であるＭｇ２＋−ＡＴＰからグルコースへのリン酸基の移動を触媒する(上掲のHammes及びKochavi, 1962a及び1962b)。ＥＤＴＡは、特にＭｇ２＋に対して、金属イオンキレート剤であるので、それは効果的なヘキソキナーゼ阻害剤でありうる。過剰量のＥＤＴＡが還元を効果的に阻止できるという知見は、オクレリズマブ還元機構におけるヘキソキナーゼ（つまりＧ６Ｐを提供）の関与を示している。この又は他の理論に拘束されるものではないが、ＥＤＴＡは、ヘキソキナーゼ活性を除去し、それによってＧ６ＰＤに対して利用できるＧ６Ｐレベルを、ついでＴｒｘ系に対して利用できるＮＡＤＰＨレベルを減少させることによって、オクレリズマブの還元を阻止する。
【０１５０】
ＥＤＴＡは新鮮なＨＣＣＦ中におけるオクレリズマブの還元を阻止するのに全て効果的であるが、Ｔｒｘ系の活性が失われ、Ｇ６Ｐの添加によってついで再活性化されたベータ実験ＨＣＣＦにおけるオクレリズマブの還元を防止することができなかった。例えば、オクレリズマブの還元は、還元活性を完全に失ったベータ実験ＨＣＣＦに５ｍＭのＧ６Ｐ及び２０ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）が添加されたＨＣＣＦインキュベーション実験で観察された（図１８）。しかしながら、還元は、Ｇ６Ｐ及びＥＤＴＡが添加されなかったコントロールインキュベーション実験では見られなかった。この又は他の理論に拘束されるものではないが、このようにして使用されるＥＤＴＡはよってＴｒｘ系もＧ６ＰＤも阻害し得ず、Ｇ６ＰＤに対してＧ６Ｐを生産するヘキソキナーゼの阻害剤として機能しうる。Ｇ６Ｐなしでは、Ｔｒｘ系には活性に必要なＮＡＤＰＨが供給されないであろう。
【０１５１】
実施例６
ＤＨＥＡによる組換え抗体の還元の阻害
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、並びに他の同様のＧ６ＰＤ阻害剤は、Ｇ６ＰＤ活性 (上掲のGordon等, 1995)を効果的に阻害する。Ｇ６ＰＤ阻害剤はまたＮＡＤＰＨの生成を阻止することによって、ＨＣＣＦ中の抗体、例えば、オクレリズマブの還元を防止する。オクレリズマブの還元を阻害するＤＨＥＡの能力は、ＨＣＣＦインキュベーション実験において証明されている。ＨＣＣＦへのＤＨＥＡの添加は抗体還元を防止する。
ＤＨＥＡは典型的には約０．０５ｍＭから約５ｍＭの濃度範囲で使用される。ＤＨＥＡはまた典型的には約０．１ｍＭから約２．５ｍＭの濃度範囲で使用される。
【０１５２】
実施例７
（ｉ）ＥＤＴＡ、（ｉｉ）硫酸銅、及び（ｉｉｉ）酢酸の添加による組換え抗体の還元の阻害
４種の異なったＨＣＣＦを保存し、ステンレス鋼製バイアルに入れた。溶液は、ホモジナイズされたＣＣＦからのＨＣＣＦをホモジナイズされていないＣＣＦからのＨＣＣＦで希釈することによって生成された細胞溶解物の量では同様であった。例えば、１５０ｍＬの第一溶解溶液を、５０ｍＬの第二溶液とそれぞれ混合した。この研究で評価された４種のＨＣＣＦ混合物は、（１）２０ｍＭのＥＤＴＡ、（２）３０μＭのＣｕＳＯ４、（３）１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）の何れかを含んでおり、（４）コントロール溶液には化学的阻害剤は添加しなかった。４種全ての混合物からのオクレリズマブ抗体はプロテインＡクロマトグラフィーを使用して直ぐに（ｔ＝０時間）精製し、ついでステンレス鋼製バイアル中に２０時間及び４０時間保存した後に再び生成した。精製したプロテインＡ溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、インタクトな抗体（１５０ｋＤａ）の割合を定量した。結果は、９０％のインタクトな抗体が初期時点で４種全ての混合物中に存在していることを示している（図１９）。しかしながら、２０時間の時点では、インタクトな抗体はコントロール混合物（添加なし）では検出されず、抗体ジスルフィド結合の還元を示している。他の３種の混合物では、９０％を越えるインタクトな抗体が２０時間及び４０時間の双方の時点でも尚検出されており、試験した３種全ての阻害剤によるジスルフィド結合の還元の防止を証明している。
【０１５３】
実施例８
ＨＣＣＦの空気スパージングによる組換え抗体の還元の阻害
ホモジナイズされたＣＣＦから生成した一つのＨＣＣＦ混合物を保存し、二つの別個の１０Ｌのステンレス鋼製発酵槽に入れた。一方の容器に空気をスパージすると共に、他方の容器に窒素ガスをスパージした。オクレリズマブ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、初期混合物から直ぐに（ｔ＝０時間）精製した。選択された時点で、５０ｍＬの試料を各容器から除去し、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。ついで、精製したプロテインＡ溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、１５０ｋＤａのインタクトな抗体の割合を定量した。結果は、およそ８５％のインタクトな抗体が初期溶液中に存在していることを示しており（図２０）、酸素への暴露（つまり発酵槽への空気スパージ）の前の抗体ジスルフィド結合のある程度の初期の還元を示している。混合物に２時間の間、空気をスパージすると、３６時間の研究の残りに対して９０％より多いインタクトな抗体が測定された。これに対して、混合物に窒素ガスをスパージした場合は、２時間（２８％の１５０ｋＤａピーク）及び６時間（５％の１５０ｋＤａピーク）に測定したところ抗体還元事象が継続した。これらの結果は、ホモジナイズされたＣＣＦから生成したＨＣＣＦ混合物が酸素に暴露されると、抗体中のジスルフィド結合の還元を防止できることを証明している。
【０１５４】
実施例９
標的ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスヌクレオチドＴｒｘ阻害剤の設計
ＣＨＯ細胞に見出される遺伝子に対する標的ｓｉＲＮＡｓ又はアンチセンスヌクレオチドの設計は、公的に利用可能な配列、例えば大腸菌チオレドキシンＴｒｘＡ（配列番号３０）、大腸菌チオレドキシンレダクターゼＴｒｘＢ（配列番号３１）；マウスチオレドキシン１（配列番号３２）、マウスチオレドキシン２（配列番号３３）、マウスチオレドキシンレダクターゼ１（配列番号３４）、及びマウスチオレドキシンレダクターゼ２（配列番号３５）のものを使用して行うことができる。当業者はこれらの配列を用いて配列を選択し、異なった生物及び／又は細胞、例えばＣＨＯ細胞における酵素を標的にするためのＴｒｘ阻害剤を設計することができる。
【０１５５】
大腸菌チオレドキシンＴｒｘＡの配列は、
ATG TTA CAC CAA CAA CGA AAC CAA CAC GCC AGG CTT ATT CCT GTG GAG TTA TAT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GAC GAC AGT TTT GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GAA TAT CAG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT GGC ACT GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTG CTG TTC AAA AAC GGT GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCG TAA（配列番号３０）である。
【０１５６】
大腸菌チオレドキシンＴｒｘＢの配列は、
ATG GGC ACG ACC AAA CAC AGT AAA CTG CTT ATC CTG GGT TCA GGC CCG GCG GGA TAC ACC GCT GCT GTC TAC GCG GCG CGC GCC AAC CTG CAA CCT GTG CTG ATT ACC GGC ATG GAA AAA GGC GGC CAA CTG ACC ACC ACC ACG GAA GTG GAA AAC TGG CCT GGC GAT CCA AAC GAT CTG ACC GGT CCG TTA TTA ATG GAG CGC ATG CAC GAA CAT GCC ACC AAG TTT GAA ACT GAG ATC ATT TTT GAT CAT ATC AAC AAG GTG GAT CTG CAA AAC CGT CCG TTC CGT CTG AAT GGC GAT AAC GGC GAA TAC ACT TGC GAC GCG CTG ATT ATT GCC ACC GGA GCT TCT GCA CGC TAT CTC GGC CTG CCC TCT GAA GAA GCC TTT AAA GGC CGT GGG GTT TCT GCT TGT GCA ACC TGC GAC GGT TTC TTC TAT CGC AAC CAG AAA GTT GCG GTC ATC GGC GGC GGC AAT ACC GCG GTT GAA GAG GCG TTG TAT CTG TCT AAC ATC GCT TCG GAA GTG CAT CTG ATT CAC CGC CGT GAC GGT TTC CGC GCG GAA AAA ATC CTC ATT AAG CGC CTG ATG GAT AAA GTG GAG AAC GGC AAC ATC ATT CTG CAC ACC AAC CGT ACG CTG GAA GAA GTG ACC GGC GAT CAA ATG GGT GTC ACT GGC GTT CGT CTG CGC GAT ACG CAA AAC AGC GAT AAC ATC GAG TCA CTC GAC GTT GCC GGT CTG TTT GTT GCT ATC GGT CAC AGC CCG AAT ACT GCG ATT TTC GAA GGG CAG CTG GAA CTG GAA AAC GGC TAC ATC AAA GTA CAG TCG GGT ATT CAT GGT AAT GCC ACC CAG ACC AGC ATT CCT GGC GTC TTT GCC GCA GGC GAC GTG ATG GAT CAC ATT TAT CGC CAG GCC ATT ACT TCG GCC GGT ACA GGC TGC ATG GCA GCA CTT GAT GCG GAA CGC TAC CTC GAT GGT TTA GCT GAC GCA AAA TAA（配列番号３１）である。
【０１５７】
マウスチオレドキシン１の配列は、
ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCCGCGGGAGACAAGCTTGTCGTGGTGGACTTCTCTGCTACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTCCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTGGATGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTTTATAAAAAGGGTCAAAAGGTGGGGGAGTTCTCCGGTGCTAACAAGGAAAAGCTTGAAGCCTCTATTACTGAATATGCCTAA（配列番号３２）である。
【０１５８】
マウスチオレドキシン２の配列は、
ATGGCTCAGCGGCTCCTCCTGGGGAGGTTCCTGACCTCAGTCATCTCCAGGAAGCCTCCTCAGGGTGTGTGGGCTTCCCTCACCTCTAAGACCCTGCAGACCCCTCAGTACAATGCTGGTGGTCTAACAGTAATGCCCAGCCCAGCCCGGACAGTACACACCACCAGAGTCTGTTTGACGACCTTTAACGTCCAGGATGGACCTGACTTTCAAGACAGAGTTGTCAACAGTGAGACACCAGTTGTTGTGGACTTTCATGCACAGTGGTGTGGCCCCTGCAAGATCCTAGGACCGCGGCTAGAGAAGATGGTCGCCAAGCAGCACGGGAAGGTGGTCATGGCCAAAGTGGACATTGACGATCACACAGACCTTGCCATTGAATATGAGGTGTCAGCTGTGCCTACCGTGCTAGCCATCAAGAACGGGGACGTGGTGGACAAGTTTGTGGGGATCAAGGACGAGGACCAGCTAGAAGCCTTCCTGAAGAAGCTGATTGGCTGA（配列番号３３）である。
【０１５９】
マウスチオレドキシンレダクターゼ１の配列は、
ATGAATGGCTCCAAAGATCCCCCTGGGTCCTATGACTTCGACCTGATCATCATTGGAGGAGGCTCAGGAGGACTGGCAGCAGCTAAGGAGGCAGCCAAATTTGACAAGAAAGTGCTGGTCTTGGATTTTGTCACACCGACTCCTCTTGGGACCAGATGGGGTCTCGGAGGAACGTGTGTGAATGTGGGTTGCATACCTAAGAAGCTGATGCACCAGGCAGCTTTGCTCGGACAAGCTCTGAAAGACTCGCGCAACTATGGCTGGAAAGTCGAAGACACAGTGAAGCATGACTGGGAGAAAATGACGGAATCTGTGCAGAGTCACATCGGCTCGCTGAACTGGGGCTACCGCGTAGCTCTCCGGGAGAAAAAGGTCGTCTATGAGAATGCTTACGGGAGGTTCATTGGTCCTCACAGGATTGTGGCGACAAATAACAAAGGTAAAGAAAAAATCTATTCAGCAGAGCGGTTCCTCATCGCCACAGGTGAGAGGCCCCGCTACCTGGGCATCCCTGGAGACAAAGAGTACTGCATCAGCAGTGATGATCTTTTCTCCTTGCCTTACTGCCCGGGGAAGACCCTAGTAGTTGGTGCATCCTATGTCGCCTTGGAATGTGCAGGATTTCTGGCTGGTATCGGCTTAGACGTCACTGTAATGGTGCGGTCCATTCTCCTTAGAGGATTTGACCAAGACATGGCCAACAAAATCGGTGAACACATGGAAGAACATGGTATCAAGTTTATAAGGCAGTTCGTCCCAACGAAAATTGAACAGATCGAAGCAGGAACACCAGGCCGACTCAGGGTGACTGCTCAATCCACAAACAGCGAGGAGACCATAGAGGGCGAATTTAACACAGTGTTGCTGGCGGTAGGAAGAGATTCTTGTACGAGAACTATTGGCTTAGAGACCGTGGGCGTGAAGATAAACGAAAAAACCGGAAAGATACCCGTCACGGATGAAGAGCAGACCAATGTGCCTTACATCTACGCCATCGGTGACATCCTGGAGGGGAAGCTAGAGCTGACTCCCGTAGCCATCCAGGCGGGGAGATTGCTGGCTCAGAGGCTGTATGGAGGCTCCAATGTCAAATGTGACTATGACAATGTCCCAACGACTGTATTTACTCCTTTGGAATATGGCTGTTGTGGCCTCTCTGAAGAAAAAGCCGTAGAGAAATTTGGGGAAGAAAATATTGAAGTTTACCATAGTTTCTTTTGGCCATTGGAATGGACAGTCCCATCCCGGGATAACAACAAATGTTATGCAAAAATAATCTGCAACCTTAAAGACGATGAACGTGTCGTGGGCTTCCACGTGCTGGGTCCAAACGCTGGAGAGGTGACGCAGGGCTTTGCGGCTGCGCTCAAGTGTGGGCTGACTAAGCAGCAGCTGGACAGCACCATCGGCATCCACCCGGTCTGTGCAGAGATATTCACAACGTTGTCAGTGACGAAGCGCTCTGGGGGAGACATCCTCCAGTCTGGCTGCTGA（配列番号３４）である。
【０１６０】
マウスチオレドキシンレダクターゼ２の配列は、
ATGGCGGCGATGGTGGCGGCGATGGTGGCGGCGCTGCGTGGACCCAGCAGGCGCTTCCGGCCGCGGACACGGGCTCTGACACGCGGGACAAGGGGCGCGGCGAGTGCAGCGGGAGGGCAGCAGAGCTTTGATCTCTTGGTGATCGGTGGGGGATCCGGTGGCCTAGCTTGTGCCAAGGAAGCTGCTCAGCTGGGAAAGAAGGTGGCTGTGGCTGACTATGTGGAACCTTCTCCCCGAGGCACCAAGTGGGGCCTTGGTGGCACCTGTGTCAACGTGGGTTGCATACCCAAGAAGCTGATGCATCAGGCTGCACTGCTGGGGGGCATGATCAGAGATGCTCACCACTATGGCTGGGAGGTGGCCCAGCCTGTCCAACACAACTGGAAGACAATGGCAGAAGCCGTGCAAAACCATGTGAAATCCTTGAACTGGGGTCATCGCGTCCAACTGCAGGACAGGAAAGTCAAGTACTTTAACATCAAAGCCAGCTTTGTGGATGAGCACACAGTTCGCGGTGTGGACAAAGGCGGGAAGGCGACTCTGCTTTCAGCTGAGCACATTGTCATTGCTACAGGAGGACGGCCAAGGTACCCCACACAAGTCAAAGGAGCCCTGGAATATGGAATCACAAGTGACGACATCTTCTGGCTGAAGGAGTCCCCTGGGAAAACGTTGGTGGTTGGAGCCAGCTATGTGGCCCTAGAGTGTGCTGGCTTCCTCACTGGAATTGGACTGGATACCACTGTCATGATGCGCAGCATCCCTCTCCGAGGCTTTGACCAGCAAATGTCATCTTTGGTCACAGAGCACATGGAGTCTCATGGCACCCAGTTCCTGAAAGGCTGTGTCCCCTCCCACATCAAAAAACTCCCAACTAACCAGCTGCAGGTCACTTGGGAGGATCATGCTTCTGGCAAGGAAGACACAGGCACCTTTGACACTGTCCTGTGGGCCATAGGGCGAGTTCCAGAAACCAGGACTTTGAATCTGGAGAAGGCTGGCATCAGTACCAACCCTAAGAATCAGAAGATTATTGTGGATGCCCAGGAGGCTACCTCTGTTCCCCACATCTATGCCATTGGAGATGTTGCTGAGGGGCGGCCTGAGCTGACGCCCACAGCTATCAAGGCAGGAAAGCTTCTGGCTCAGCGGCTCTTTGGGAAATCCTCAACCTTAATGGATTACAGCAATGTTCCCACAACTGTCTTTACACCACTGGAGTATGGCTGTGTGGGGCTGTCTGAGGAGGAGGCTGTGGCTCTCCATGGCCAGGAGCATGTAGAGGTTTACCATGCATATTATAAGCCCCTAGAGTTCACGGTGGCGGATAGGGATGCATCACAGTGCTACATAAAGATGGTATGCATGAGGGAGCCCCCACAACTGGTGCTGGGCCTGCACTTCCTTGGCCCCAACGCTGGAGAAGTCACCCAAGGATTTGCTCTTGGGATCAAGTGTGGGGCTTCATATGCACAGGTGATGCAGACAGTAGGGATCCATCCCACCTGCTCTGAGGAGGTGGTCAAGCTGCACATCTCCAAGCGCTCCGGCCTGGAGCCTACTGTGACTGGTTGCTGA（配列番号３５）である。
【０１６１】
実施例１０
インビトロＴｒｘ／Ｔｒｘレダクターゼ研究
材料と方法
市販のＴｒｘＲ（ラット肝臓）溶液（４μＭ）を水で希釈して２．８６μＭの溶液を得た。凍結乾燥したＴｒｘ（ヒト）をＰＢＳ（１０ｍＭ，ｐＨ７．２）で再構成して、５００μＭの溶液を得た。２０ｍＭのＮＡＤＰＨと１０ｍＭのＡＴＧの溶液とＡＴＭ溶液を水で調製した。
黒色ポリプロピレンの１．５ｍＬのマイクロ遠心管、４３７μＬの反応バッファー（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．０）、２５μＬのＮＡＤＰＨ、１６μＬの製剤化オクレリズマブ溶液（３０．２ｍｇ／ｍＬ）及び５μＬのＴｒｘを穏やかに混合した。１７．５μＬのＴｒｘＲを添加して反応を開始させた。反応物を室温で２４時間インキュベートした。２０μＬのアリコートを各サンプリング時点で採取して、バイオアナライザーアッセイによる分析まで−７０℃で保存した。
Ｔｒｘ系の阻害を、様々な阻害剤を添加して上述と同じ反応条件を使用して証明した。
【０１６２】
１．チオレドキシン系のインビトロ活性
図２４は、インタクトなオクレリズマブ（「２Ｈ７」ヒト化抗ＣＤ２０抗体、上では「変異体Ａ」と呼ばれる）（１ｍｇ／ｍＬ）を０．１μＭのＴｒｘＲ（ラット肝臓）、５μＭのＴｒｘ（ヒト）及び１０ｍＭのヒスチジン硫酸バッファー中の１ｍＭのＮＡＤＰＨと共にインキュベートすると、１時間以内にオクレリズマブの還元が生じることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンは時点を表す）を示す。
【０１６３】
２．オーロチオグルコースによって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
オーロチオグルコース（ＡＴＧ）を次の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に添加した：１ｍＭ；０．６μＭ（６：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）；０．４μＭ（４：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）；及び０．２μＭ（２：１  ＡＴＧ：ＴｒｘＲ）。
図２５−２７に示されたバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像によって証明されているように、１ｍＭ、０．６μＭ、及び０．４μＭの濃度で添加されたオーロチオグルコースは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。しかしながら、図２８に示されているように、これらの実験条件では、０．２μＭの濃度で添加されたオーロチオグルコースは２４時間後でもオクレリズマブの還元を阻害できない。
【０１６４】
３．金チオリンゴ酸塩によって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）を、０．１ｍＭ及び０．０１ｍＭの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図２９及び３０に示されたバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像によって証明されているように、ＡＴＭは、試験した両方の濃度でチオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。
【０１６５】
４．ＣｕＳＯ４によって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
ＣｕＳＯ４を、２０μＭ（４：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）；１０μＭ（２：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）；及び５μＭ（１：１  Ｃｕ２＋：Ｔｒｘ）の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図３１−３３に示されるように、ＣｕＳＯ４は、２０μＭ及び１０μＭの濃度でオクレリズマブのチオレドキシンに誘発された還元を効果的に阻害する（図３１及び３２）が、５μＭの濃度は還元の完全な阻害には不十分である（図３３）。
【０１６６】
５．シスタミンによって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
シスタミンを次の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた：５３２μＭ（２０：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）；２６６μＭ（１０：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）；１３３μＭ（５：１  シスタミン：２Ｈ７ジスルフィド）；及び２６．６μＭ（１：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）。図３４−３７に示されるように、シスタミンは、５３２μＭ（２０：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）及び２６６μＭ（１０：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ））（図３４及び３５）の濃度でオクレリズマブのチオレドキシンに誘発された還元を効果的に阻害するが、１３３μＭ（５：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）及び２６．６μＭ（１：１  シスタミン：２Ｈ７（変異体Ａ）ジスルフィド）濃度は２４時間後でもオクレリズマブの還元を阻害するには不十分である（図３６及び３７）。
【０１６７】
６．シスチンによって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
シスチンを２．６ｍＭの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図３８に示されるように、この濃度では、シスチンは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。シスチンの最小の有効濃度は（他の阻害剤の有効最小濃度のように）実際の環境に依存し、抗体のような異なったタンパク質に対して異なるかもしれないし、添加のタイミングに依存して変わるかも知れないことに留意される。よって、例えば、シスチンが溶解前に添加される場合、抗体２Ｈ７（変異体Ａ）に対する最小有効濃度は、約１．３ｍＭであり、Ａｐｏｍａｂでは約１ｍＭ、抗体変異体Ｃでは約４．５ｍＭである。シスチンが細胞培養培地に添加される場合、最小の有効濃度は典型的には些か高く、２Ｈ７（変異体Ａ）には約５．２ｍＭ、Ａｐｏｍａｂには６ｍＭ、抗体変異体Ｃには９ｍＭである。通常は、シスチン、シスタミン及び酸化型グルタチオン（以下参照）では、最小の有効な阻害濃度は抗体濃度（μＭ）の約４０×である。
【０１６８】
７．酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）よって阻害されるチオレドキシン系のインビトロ活性
ＧＳＳＧを、２．６ｍＭの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図３９に示されるように、この濃度では、ＧＳＳＧは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。しかしながら、酸化型グルタチオンの最小の有効濃度は（他の阻害剤のもののように）実際の環境、例えば製造されるタンパク質の性質（例えば抗体）及び添加のタイミングに依存することに留意される。例えば、抗体２Ｈ７（変異体Ａ）では、最小有効濃度は、溶解前の添加に対して約１．３ｍＭである。
【０１６９】
８．酵素的還元系のインビトロ活性
図４０は、インタクトなオクレリズマブ（「２Ｈ７」ヒト化抗ＣＤ２０抗体、変異体Ａ）（１ｍｇ／ｍＬ）を１０μｇ／ｍＬのヘキソキナーゼ、５０μｇ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、５μＭのチオレドキシン、０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ、２ｍＭのグルコース、０．６ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＭｇ２＋、及びｐＨ７．３８で緩衝させた５０ｍＭのヒスチジン硫酸中の２ｍＭのＮＡＤＰと共にインキュベートすると、約１時間以内にオクレリズマブの還元が生じることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像（各レーンは時点を表す）を示す。既知のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤である０．１ｍＭのＨＤＥＡの添加は還元を阻害しない。
【０１７０】
９．酵素還元系のインビトロ活性はＮＡＤＰＨを必要とする
図４１のバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に示されるように、インタクトなオクレリズマブ（１ｍｇ／ｍＬ）を５μＭのチオレドキシン、０．１μＭのチオレドキシンレダクターゼ、及び５０ｍＭのｐＨ７．３８のヒスチジン硫酸バッファー中の２ｍＭのＮＡＤＰと共にインキュベートした場合、オクレリズマブ抗体の還元を生じない。オクレリズマブの還元は、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰＨを生成するためのその基質なしには生じ得ない。
【０１７１】
ここに例証され記載される本発明は、ここに特に開示されていない要素又は要素群、限定又は限定群が存在しない状態で適切に実施することができる。よって、例えば、「含有する」、「含んでいる」、「含む」等の用語は、広く限定無しに読まれなければならない。加えて、ここで用いられる用語及び表現は、説明のための用語として使用されているのであって、限定としてではなく、示された発明又はその一部の均等物を排除するためにかかる用語及び表現を使用する意図はないが、様々な変形が請求項記載の発明の範囲内で可能であることが認識される。よって、本発明は好ましい実施態様及び任意的な特徴によって特に開示されているが、ここに開示され実施態様が記載された発明の変更及び変形は当業者によって即座になされ得、かかる変更及び変形はここに開示された発明の範囲内にあると考えられる。本発明はここでは広く、上位概念的に記載される。上位概念的開示内に入る狭い種及び下位グループのそれぞれがこれら発明の一部をまた形成する。これは、各々の発明の上位概念的な記載には、取り除かれる材料が特に記載されているかどうかにかかわらず、上位概念から任意の主題事項を除去することを許容する仮定又は負の限定を含む。また、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループによって記載されている場合、当該分野で訓練された者は、発明がまたマーカッシュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループによって記載されているものと認識するであろう。更に、本発明の一態様への言及において例えば「配列番号１から配列番号１００」のように個々の部材の範囲が列挙されている場合、列挙の各メンバーを個々に挙げるのと均等であることが意図されており、また各個々のメンバーが個別に排除され請求項中に含められうることが理解されなければならない。
【０１７２】
ここでの方法において示され及び／又は使用される工程は、示され及び／又は述べられたものとは異なる順序で実施されてもよい。工程はこれらの工程が生じうる順序の単なる例示である。工程は、請求項記載の発明の目的を尚も遂行すべく望まれる任意の順序で生じうる。
【０１７３】
ここでの発明の記載から、本発明の概念をその範囲から逸脱しないで実施するのに様々な均等物を使用することができることは明らかである。更に、本発明をある実施態様を特に参照して記載したが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱しないで形態及び詳細を変化させることができることが分かるであろう。記載された実施態様は、あらゆる点で例示的なものであり限定するものではないと考えられる。本発明はここに記載された特定の実施態様に限定されないで、発明の範囲から逸脱しないで多くの均等物、再構成、変更、及び置換が可能になることがまた理解されなければならない。よって、更なる実施態様は本発明の範囲であり次の特許請求の範囲に入る。
ここに述べた全ての米国特許及び出願；外国特許及び出願；化学的文献；本；及び刊行物は、図面、図及び表を含む各個々の特許又は刊行物が、全体が記載された状態で特にかつ個々に出典明示により援用された旨が示されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される。
【図１】
2020105180.tif 000004
【図２】
2020105180.tif 000005
【図３】
2020105180.tif 000006
【図４】
2020105180.tif 000007
【図５】
2020105180.tif 000008
【図６】
2020105180.tif 000009
【図７】
2020105180.tif 000010
【図８】
2020105180.tif 000011
【図９】
2020105180.tif 000012
【図１０】
2020105180.tif 000013
【図１１】
2020105180.tif 000014
【図１２】
2020105180.tif 000015
【図１３】
2020105180.tif 000016
【図１４】
2020105180.tif 000017
【図１５】
2020105180.tif 000018
【図１６】
2020105180.tif 000019
【図１７】
2020105180.tif 000020
【図１８】
2020105180.tif 000021
【図１９】
2020105180.tif 000022
【図２０】
2020105180.tif 000023
【図２１】
2020105180.tif 000024
【図２２】
2020105180.tif 000025
【図２３】
2020105180.tif 000026
【図２４】
2020105180.tif 000027
【図２５】
2020105180.tif 000028
【図２６】
2020105180.tif 000029
【図２７】
2020105180.tif 000030
【図２８】
2020105180.tif 000031
【図２９】
2020105180.tif 000032
【図３０】
2020105180.tif 000033
【図３１】
2020105180.tif 000034
【図３２】
2020105180.tif 000035
【図３３】
2020105180.tif 000036
【図３４】
2020105180.tif 000037
【図３５】
2020105180.tif 000038
【図３６】
2020105180.tif 000039
【図３７】
2020105180.tif 000040
【図３８】
2020105180.tif 000041
【図３９】
2020105180.tif 000042
【図４０】
2020105180.tif 000043
【図４１】
2020105180.tif 000044
【配列表】
2020105180000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を生産するための方法であって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組換型ホスト細胞培養物中で抗体を発現することと、細胞培養物の生産段階に続いて、処理中の抗体中のジスルフィド結合の還元を防止するために、組換型ホスト細胞の収集前の細胞培養液を空気でスパージングすることとを含み、空気スパージングが、収集前の細胞培養液中の溶存酸素（ｄＯ２）の量が少なくとも１０％空気で飽和されるまで継続される方法。
【請求項２】
抗体がＣＤ２０に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培養物中で増殖する組換型ホスト細胞により発現される抗体におけるジスルフィド結合の還元を防止するための方法であって、細胞培養物の生産段階に続いて、組換型ホスト細胞の収集前の細胞培養液を空気でスパージングすることを含み、組換型ホスト細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組換型ホスト細胞であり、
組換型ホスト細胞中で発現される抗体が、ＣＤ２０に結合する治療的なモノクローナル抗体であり、
空気スパージングが、収集前の細胞培養液中の溶存酸素（ｄＯ２）の量が少なくとも１０％空気で飽和されるまで継続される、
方法。
【請求項４】
ＣＤ２０に結合する抗体がリツキシマブである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ２０に結合する抗体がオクレリズマブである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
空気スパージングが、収集前の細胞培養液が空気で少なくとも３０％飽和になるまで継続される、請求項１−５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
空気スパージングが、収集前の細胞培養液が空気で１００％飽和から３０％飽和の間になるまで継続される、請求項１−６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
収集前の細胞培養液中の溶存酸素（ｄＯ２）の量が少なくとも３０％である、請求項１−７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換型ホスト細胞中で発現される抗体が５０００Ｌより大きいスケールで生産される、請求項１−８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組換型ホスト細胞の収集された細胞培養液を調製することと、収集された細胞培養液から抗体を回収することと、をさらに含む、請求項１−９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組換型ホスト細胞の収集された細胞培養液を調製することと、収集された細胞培養液から抗体を精製することと、をさらに含む、請求項１−９の何れか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020105180000001.pdf