(57)【要約】【課題】従来の栽培トマトと比べてより早咲きとなるトマト育苗を可能とする、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物及びその生産方法を提供する。【解決手段】配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異がゲノムに導入されてなるトマト植物である。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異がゲノムに導入されてなることを特徴とする、トマト植物。
【請求項２】
配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有する請求項１に記載のトマト植物。
【請求項３】
配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の機能が破壊されるように変異がゲノムに導入され、かつ、
配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有することにより、早咲きとなる機能を有する請求項１に記載のトマト植物。
【請求項４】
トマト植物の生産方法であって、
配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異をゲノムに導入する工程を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のトマト植物の生産方法。
【請求項５】
前記変異をゲノムに導入する工程をゲノム編集により行う、請求項４に記載のトマト植物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花成が促進されたトマト植物及びその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物には栄養生長期と生殖生長期とがあり、特に、種子植物においては、生長相が栄養生長期から生殖生長期へ転換して花芽が形成される時期がある。この栄養生長期から生殖生長期への転換は花成と称される。花成を制御することができれば、育種を効率化することが可能になるとされている。花成の制御機構に関しては、アブラナ科の野草であるシロイヌナズナ（アラビドプシス）を用いた研究によって、ＦＴ遺伝子（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ遺伝子）とＴＦＬ１遺伝子（ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ  １遺伝子）が花成制御遺伝子として知られており、ＦＴ遺伝子の働きにより花成が促進され、ＴＦＬ１遺伝子の働きにより花成が抑制されることが報告されている。
【０００３】
日長を感受して花成が起きる（光周的応答花成）植物には、明期が暗期より長いと花成誘導が起きる長日植物と、明期が暗期より短いと花成が起きる短日植物とが存在する。また、日長に応答せずに花成が起きる植物は、中性植物と呼ばれている。長日植物や短日植物では光周的花成応答により、日長条件だけを調整すれば、希望するタイミングで花成を起こすことができるが、中性植物は、季節に依らずに花成が起きるというメリットがある一方で、花成のタイミングを人為的に調節するためには、温度、養分など多くの栽培条件を適切に管理しなければならず、条件が一つでも整わなければ花成制御に失敗することがある。
【０００４】
現在の生産用栽培トマトは、日長に応答せずに花成が起きる中性植物である。栽培トマトは、早咲きになるように品種改良され、温度や養分を調節する栽培管理によって、平均８枚程度の普通葉を生じた後に花芽が形成される。現在の品種より早咲きにすることは難しいとされており、また、夏期の高温の影響により、夏を超えて栽培する夏秋トマトは花芽形成時の葉枚数が増加（花成が遅延する）傾向にあり、生産効率の低下を招くとして、栽培現場で問題になっている。
【０００５】
特許文献１には、植物から単離され、花成に関与するＦＴ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を抑制することで花成を抑制する花成制御遺伝子、及びその花成制御遺伝子を用いた花成制御方法が記載されている。これによれば、花成制御遺伝子の植物内での発現を制御（過剰発現または抑制）することで、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能になるとされている。
【０００６】
また、特許文献２には、特定のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されているタバコ植物体が記載されている。これによれば、タバコ植物の栽培時における不要なわき芽の発達を抑制できるので、栽培の手間とコストを減らすとともに、収穫される葉の品質の向上につながるとされている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１及び２のいずれにも、トマト植物における特定の遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異をゲノムに導入することについての記載はなく、より早咲きとなるトマト育苗が可能なトマト植物が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−９８７２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１７／１７０７９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、従来の栽培トマトと比べてより早咲きとなるトマト育苗を可能とする、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物及びその生産方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異がゲノムに導入されてなることを特徴とする、トマト植物を提供することによって解決される。
【００１１】
このとき、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有するトマト植物であることが好適である。また、このとき、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の機能が破壊されるように変異がゲノムに導入され、かつ、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有することにより、早咲きとなる機能を有するトマト植物であることが好適である。
【００１２】
また、上記課題は、トマト植物の生産方法であって、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異をゲノムに導入する工程を有するトマト植物の生産方法を提供することによっても解決される。
【００１３】
このとき、前記変異をゲノムに導入する工程をゲノム編集により行うことが好適な実施態様である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のように、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物を提供することにより、従来の栽培トマトと比べてより早咲きとなるトマト育苗が可能になる。さらに、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされ、かつ、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するトマト植物を提供することにより、短日条件下で早咲きとなるトマト育苗が可能になる。したがって、本発明によりトマトの生産性向上に寄与することができる。特に、トマト栽培では夏期の高温時に花芽形成が遅れる傾向にあるため、夏秋トマトの生産性向上に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】トマトＳＰ遺伝子ファミリーがコードするタンパク質の分子系統樹を示した図である。
【図２】ＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子モデル、並びにｃＤＮＡ配列で得られたＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子に基づくアミノ酸配列アライメントを示した図である。
【図３】ＳＰ１１ａ遺伝子のｃＤＮＡ配列アライメントを示した図である。
【図４】ＳＰ１１ｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列アライメントを示した図である。
【図５】ｃＤＮＡ配列で得られたＳＰ１１ａ遺伝子に基づくアミノ酸配列に、更にデータベースから得られるアミノ酸配列のバリエーションをアライメントした結果を示した図である。
【図６】ｃＤＮＡ配列で得られたＳＰ１１ｂ遺伝子に基づくアミノ酸配列に、更にデータベースから得られるアミノ酸配列のバリエーションをアライメントした結果を示した図である。
【図７】栽培品種であるＭ８２におけるＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンを示した図である。
【図８】近縁野生種S. pennellii（LA0716）におけるＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンを示した図である。
【図９】栽培品種であるＭ８２、近縁野生種S. pennellii (LA0716)の染色体部分置換系統（CSSL）であるＩＬ１１−１、及びゲノム編集系統ｇＲ１７＃１における花成表現型の比較結果を示した図である。
【図１０】近縁野生種S. pennellii (LA0716)の染色体部分置換系統（CSSL）であるＩＬ１１−１、ゲノム編集系統ｇＲ１６＃１０Ｔ１、及びゲノム編集系統ｇＲ１６＃１０Ｔ２における花成表現型の比較結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のトマト植物は、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異がゲノムに導入されてなることを特徴とするものである。本発明者らは、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子をＳＰ１１ａ遺伝子と命名した。本発明のように、ＳＰ１１ａ遺伝子をノックアウトしたトマト植物とすることにより、従来の栽培品種トマトに比べて、より早咲きとなるトマト育苗が可能になった。なお、本発明におけるトマト植物には、種子、苗、栄養繁殖体が含まれる。ここで、図１には、１２個のトマトＳＰ遺伝子ファミリーをコードするタンパク質の分子系統樹が示されており、シロイヌナズナ（アラビドプシス）ではＦＴ ｃｌａｄｅとＴＦＬ１ ｃｌａｄｅに分類される。ＦＴ ｃｌａｄｅに分類される遺伝子は、花成を促進するフロリゲンをコードする遺伝子に相同性が高く、ＴＦＬ１ ｃｌａｄｅに分類される遺伝子は、花成を抑制するアンチフロリゲンをコードする遺伝子に相同性が高いものである。しかしながら、本発明者らが、ＦＴ ｃｌａｄｅに分類されるＳＰ１１ａ遺伝子をノックアウトしたところ、驚くべきことに花成が抑制されるのではなく、花成が促進される結果となった。したがって、本発明のトマト植物において、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異がゲノムに導入される構成を採用する意義は大きい。
【００１７】
本発明において、欠失又は置換させるアミノ酸配列の数としては、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列において、タンパク質の機能を破壊できる数であれば特に限定されない。好ましくは１以上であり、より好ましくは５以上であり、更に好ましくは１５以上であり、特に好ましくは３０以上であり、最も好ましくは４５以上である。一方、欠失又は置換させるアミノ酸配列の数としては、好ましくは１７０以下である。また、付加させるアミノ酸配列の数としては、好ましくは１〜２である。
【００１８】
本発明のトマト植物は、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有することが好ましい。本発明者らは、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子をＳＰ１１ｂ遺伝子と命名した。ここで、図２における第１１番染色体の上の遺伝子モデルは、ＩＴＡＧ３．２に基づくものであり、ＳＰ１１ｂ遺伝子は１つではなく２つの遺伝子として計算されているが、このＳＰ１１ｂの遺伝子モデルは誤ったものであった。本発明ではｃＤＮＡの塩基配列に基づいてＳＰ１１ｂとしている。また、図２に示されるように、栽培品種であるＭ８２では、ＳＰ１１ｂ遺伝子は、フレームシフト突然変異を持っていることが本発明者らにより明らかとなった。そして本発明者らが、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するように、栽培品種トマトの染色体の一部を交配によりトマト近縁野生種の染色体の相同部分に置き換えた染色体部分置換系統（ＣＳＳＬ）について花成の検定を行ったところ、図９に示されるように、ＳＰ１１ｂ遺伝子の機能を有さない栽培品種であるＭ８２よりも、かえって染色体部分置換系統（ＣＳＳＬ）の方が遅咲きとなった。ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するだけでは不十分であることが本発明者らの検討により明らかとなった。したがって、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物であることが重要であり、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するともに、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物であることが本発明の好適な実施態様である。
【００１９】
また、本発明者らが、栽培品種トマト（Ｍ８２）と近縁野生種トマト（S. pennellii（LA0716））を用いて、ＳＰ１１ａ遺伝子とＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンを検討したところ、図７及び８に示されるように、ＳＰ１１ａ遺伝子は、短日条件（ＳＤ）でやや発現が高いが、特徴的な日周変動が確認されず、一方、ＳＰ１１ｂ遺伝子は、短日条件（ＳＤ）で特異的に発現し、日周的変動パターンが確認された。このことから、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するトマト植物であれば、短日条件（ＳＤ）で早咲きとなることが予想されたが、図９について上記説明したように、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するだけでは不十分であることが本発明者らの検討により明らかとなった。したがって、本発明のように、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物であることが重要である。そして、ＳＰ１１ｂ遺伝子が機能するともに、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされたトマト植物であることが本発明の好適な実施態様であり、短日条件下でより早咲きとなるトマト育苗が可能になる。すなわち、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の機能が破壊されるように変異がゲノムに導入され、かつ、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を有することにより、早咲きとなる機能を有するトマト植物であることが本発明の好適な実施態様である。
【００２０】
本発明のトマト植物の生産方法としては、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質が発現するように変異をゲノムに導入する工程を有することが好適な実施態様である。前記変異をゲノムに導入する方法としては特に限定されず、例えば、ゲノム編集により前記変異をゲノムに導入してもよいし、突然変異体により前記変異をゲノムに導入してもよい。中でも、効率良く目的とする位置に変異を導入できる観点から、ゲノム編集により前記変異をゲノムに導入することがより好適な実施態様である。
【００２１】
ゲノム編集により前記変異をゲノムに導入する場合、標的ＤＮＡとの結合に関わる部分がＲＮＡであり、ＤＮＡ切断に関わる部分がタンパク質である複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等や、標的ＤＮＡとの結合に関わる部分とＤＮＡ切断に関わる部分の両方がタンパク質であるＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ等を用いる方法が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いる方法では、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９等を標的細胞内に導入し、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮを用いる方法では、ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼが融合した融合タンパク質等を標的細胞に導入することにより、前記変異をゲノムに導入することができる。標的細胞に導入する方法としては、アグロバクテリア法、ＲＮＡウィルスベクター法、プラズマ処理法、パーティクルガン（ボンバートメント）法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２２】
ゲノム編集により前記変異をゲノムに導入する好適な方法としては、標的塩基配列を切断後、切断部位が自然修復される際に変異を発生させる方法であってもよいし、標的塩基配列と相同的な配列に１又は数塩基の変異を有するＤＮＡ断片を細胞内に導入し、標的塩基配列を切断後、導入した前記ＤＮＡ断片を鋳型として切断部位が修復される際に１又は数塩基の変異が挿入される方法であってもよい。なお、数塩基としては、通常２〜６の塩基である。
【００２３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いる方法において、ガイドＲＮＡの設計は、ＳＰ１１ａ遺伝子がノックアウトされるように設計する。すなわち、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子に対して、アミノ酸配列が一部欠失、置換又は付加されたタンパク質を発現させるように設計することになる。
【００２４】
突然変異体により前記変異をゲノムに導入する方法としては、例えば、自然突然変異体、ＵＶ照射、ガンマ線などの放射線照射、エチルメタンスルフォン酸（EMS）などの化学物質により誘導された変異体の中から、当該遺伝子に変異を持つものをPCR法、TILLING（Targeting Induced Local Lesions in Genomes）法、HRM（High Resolution Melting）法などにより選抜することによって、当該遺伝子に変異が生じたものを取得することによって行う方法が挙げられる。
【００２５】
本発明のトマト植物により、従来の栽培トマトと比べてより早咲きとなるトマト育苗が可能であることから、トマトの生産性向上に寄与することができる。特に、短日条件下でより早咲きとなるトマト育苗が可能であることから、高温により花成が遅延しやすい夏秋トマトの花成を日長処理により促進させることで、生産性向上に寄与することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【００２７】
１．トマトＳＰ遺伝子ファミリーの検出
トマトゲノム情報（2012）に基づいて、主にパラログ遺伝子の検索を目的としてＢＬＡＳＴによるデータベース検索を行い、表１に示されるように、既知のものを含めて複数のトマト遺伝子を検出した。これらをトマトＳＰ遺伝子ファミリーと呼ぶ。なお、用いたデータベースは、以下のとおりである。
Sol Genomics Network (https://solgenomics.net) gene model=ITAG ver. 2.4および3.2
EnsemblPlants (http://plants.ensembl.org/Solanum_lycopersicum/Info/Index) gene model=SL2.5
後述するｃＤＮＡクローニングの結果、ＳＰ１１ａはITAG2.4の遺伝子モデルのとおりであった。一方、ＳＰ１１ｂについては、遺伝子モデルは誤っており、ｃＤＮＡの塩基配列（生体内で発現しているＲＮＡ）に基づき、ＳＰ１１ｂとした。ＳＰ１１ｂ遺伝子モデルは２つの遺伝子として計算されており、Solyc11g008660とSolyc11g008650とを合わせ、exon-intron境界を修正する必要があった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
２．トマトＳＰ遺伝子ファミリーがコードするタンパク質の分子系統解析
表１に示されるトマトＳＰ遺伝子ファミリーについて、ｃＤＮＡクローニングを行った。ｃＤＮＡクローニングは下記方法により行った。
【００３０】
（１）ＲＮＡの抽出
トマトの成熟した本葉を15mLのconical tube（eppendorf）サンプリング後、直ちに液体窒素で凍結した。ステンレス製ビーズ（SUS304 直径5mm）を加え、シェイクマスターオート Ver.2.0（株式会社バイオメディカルサイエンス）を用いて粉砕（1000 rpm，2min）した。この植物粉末を材料として、RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いてtotal RNAを抽出した。
【００３１】
（２）ｃＤＮＡ合成
抽出したtotal RNA 1.0μｇを用い、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time、Takara Bio）により、プロトコールどおりにｃＤＮＡを合成した。
【００３２】
（３）ｃＤＮＡクローニング
各遺伝子特異的なプライマーを用いて、PCR法により遺伝子を増幅した（PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa Bio), 98℃ 10s, 55℃ 15s, 68℃ 1minを30サイクル）。
ＳＰ１１ａとＳＰ１１ｂを増幅させるために用いたプライマーは表２に示されるとおりである。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
（４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、GenElute Agarose Spin Columns（SIGMA）で抽出して精製した。ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitsと3130xl Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific K.K.）を使用して塩基配列を解読した。
【００３５】
（５）分子系統解析
トマトＳＰ遺伝子ファミリーのｃＤＮＡ配列に基づいて、各遺伝子のコード領域から予測されるアミノ酸配列を計算した。突然変異が生じているものは修正して、完全長のタンパク質ができるようにした。近隣結合法（Neighbor-Joining法、NJ法）により、分子系統樹を作製した。結果を図１に示す。図１において、ＳＰはトマトの遺伝子であり、ＭＦＴ、ＦＴ、ＴＳＦ、ＢＦＴ、ＡＴＣ及びＴＦＬ１はシロイヌナズナの遺伝子である。Ｈｕｍａｎ_ＰＥＢＰはｒｏｏｔを計算するためのヒトの遺伝子である。
【００３６】
３．ＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列アライメント
Ｍ８２（栽培品種）、S. pennellii（LA0716）及びS. habrochaites（LA1777）のトマト近縁野生種の葉からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲを用いてクローニングし、塩基配列を求めた。ｃＤＮＡクローニングは、上記「２．トマトＳＰ遺伝子ファミリーがコードするタンパク質の分子系統解析」により行った。配列アライメントの結果を図３及び４に示す。
【００３７】
４．ＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子モデルとアミノ酸配列アライメント
図２は、上記「１．トマトＳＰ遺伝子ファミリーの検出」で得られたＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子モデルを示したものと、上記「３．ＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列アライメント」で得られたＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子に基づくアミノ酸配列（Ｍ８２、ＬＡ０７１６、ＬＡ１７７７）をアライメントした結果を示したものである。図２における第１１番染色体の上の遺伝子モデルは、ITAG 3.2に基づくものであり、ＳＰ１１ｂ遺伝子モデルは２つの遺伝子として計算されている。Ｍ８２（栽培品種）のＳＰ１１ｂは、フレームシフト突然変異を持っている。
図５及び６は、図２のＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子に基づくアミノ酸配列（Ｍ８２、ＬＡ０７１６、ＬＡ１７７７）に、更にデータベースから得られるアミノ酸配列のバリエーションをアライメントした結果である。なお、用いたデータベースは、以下のとおりであり、accession番号と学名は表３のとおりである。accession番号は、Tomato genetics resource center (TGRC, U.C. Davis; https://tgrc.ucdavis.edu)の分類、命名による。
150 Tomato Genome ReSequencing project (Tomato Genome Sequencing et al., 2014) (http://www.tomatogenome.net/index.html)
AGIS Tomato 360 Resequencing Project (Lin et al., 2014) (https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/tomato_360)
【００３８】
【表３】
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【００３９】
５．ＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターン
栽培品種であるS. lycopercicum var.M82と、近縁野生種であるS. pennellii (LA0716)の栽培を下記のとおり長日条件（ＬＤ）と短日条件（ＳＤ）で６０日間行い、各遺伝子の発現の日周変動を調べた。
（１）栽培条件
白色蛍光灯（FLR40S・D-SDL-TAB/M東芝ライテック）照明下の人工気象室で栽培した。
長日条件（ＬＤ）：１６時間明期／８時間暗期（光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）：５０〜７０μｍｏｌ／ｓ・ｍ２）
短日条件（ＳＤ）：８時間明期／１６時間暗期（光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）：９０〜１２０μｍｏｌ／ｓ・ｍ２）
栽培温度：２２℃（±１℃）
【００４０】
（２）培土の組成
３号黒ポット（直径9cm plastic pot）に培土を入れて使用した。培土の組成は、バーミキュライトとメトロミックス３５０が１：１のものを使用した（Metro-Mix 350, HYPONeX JAPAN CORP.,LTD.）。
【００４１】
（３）灌水溶液
タンクミックスＡ（ＯＡＴアグリオ株式会社）５００ｇとタンクミックスＢ（ＯＡＴアグリオ株式会社）１ｋｇに水を加えて１０Ｌにし、これを灌水溶液の原液とした。灌水原液の電気伝導度（ＥＣ）は７．０〜８．０Ｓ／ｍであった。なお、灌水する際には、灌水原液を１／１００に希釈して灌水溶液を調製し、ほぼ１日おきに与えた。
【００４２】
（４）発現解析
発現解析については、「２．トマトＳＰ遺伝子ファミリーがコードするタンパク質の分子系統解析」の「（１）ＲＮＡの抽出」と「（２）ｃＤＮＡ合成」に記載の方法にしたがって、各時間において葉からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡ合成溶液を滅菌水で５倍希釈し、THUNDERBIRD(R) Probe qPCR Mix（TOYOBO）を使用して、TaqMan probe法によりCFX96 TouchＴＭ Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）を用いて、蓄積しているＲＮＡ量を測定して計算した。用いたprimer等は表４に示されるとおりである。また、PCR条件は、95℃ 1min→[95℃15s, 60℃ 30s]×50サイクルであった。Ｍ８２（栽培品種）におけるＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンを図７に、近縁野生種S. pennellii（LA0716）におけるＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンを図８に示す。図７及び８において、横軸は、夜明け（照明点灯開始時）を０時とするZeitgeber time (ZT)であり、単位は時間（ｈ）である。縦軸は、内部標準とするハウスキーピング遺伝子であるＥＦ１αの発現量を１としたときの相対値を表す。生物学的繰り返しを少なくとも３回行い、標準誤差（SEM）をエラーバーとして表示した。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
図７及び８の結果から、Ｍ８２（栽培品種）と近縁野生種S. pennellii (LA0716)におけるＳＰ１１ａ及びＳＰ１１ｂ遺伝子の日周発現パターンは、ほぼ同じであった。ＳＰ１１ａ遺伝子は、短日条件（ＳＤ）でやや発現が高いが、特徴的な日周変動はみられなかった。一方、ＳＰ１１ｂ遺伝子は、短日条件（ＳＤ）で特異的に発現し、日周的変動パターンを示した。
【００４５】
６．ゲノム編集
（１）ガイドＲＮＡの設計
ＷｅｂツールであるＣＲＩＳＰＲ−Ｐ２．０（Liu et al., 2017）を用いて、標的配列であるガイドＲＮＡを設計し、表５に示されるようにＧ１６とＧ１７のオリゴＤＮＡを合成した。このとき、トマトＳＰ遺伝子ファミリーのオフターゲットにならないように標的配列を選定した。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
（２）ベクターの構築
本実施例におけるベクターとしては、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構から分譲されたものを使用した。
（ａ）Ｇ１６
pUC19_AtU6_ccdB_oligo（Mikami et al., 2015）に、表５に示されるアニールさせたＧ１６オリゴＤＮＡを挿入し、Thermo Fisher Scientific K.K.社製Gatewayテクノロジーにより、バイナリベクターpMR285に組み換えした（Fauser et al., 2014, A.Britt and M. Ron（UC Davis personal communication））。生成したプラスミドをＧ16／pMR285と名付けた。
（ｂ）Ｇ１７
pMR218（Ritter et al., 2017）に、表５に示されるアニールさせたＧ１７オリゴＤＮＡを挿入し、Thermo Fisher Scientific K.K.社製Gatewayテクノロジーにより、pMR285に組み換えした（Fauser et al., 2014, A.Britt and M. Ron（UC Davis personal communication））。生成したプラスミドをＧ17／pMR285と名付けた。
【００４８】
（３）形質転換（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）
上記で得られたＧ16／pMR285及びＧ17／pMR285をエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムに導入し、Sun et al., 2006に記載の方法に従って行った。具体的には、IL11-1（Eshed and Zamir, 1995）に対して下記の手順で形質転換を行った。
（ｉ）種子を無菌的に播種し、１０日後発芽した子葉を切り、子葉切片を共存培地（COM-Z）に４日間置床した（２２℃，１６時間明期／８時間暗期）。
（ii）約１６時間培養したアグロバクテリア培養液を遠心（5000rpm，5min）し上清を捨て、アグロバクテリア懸濁用溶液（１／２ＭＳ塩溶液にSilwet L-77 ０．３％、１００μＭアセトシリンゴン、１０μＭメルカプトルエタノールを加えたもの）に懸濁した（ＯＤ＝０．８の濃度に調製）。
（iii）５０ｍＬのチューブに懸濁液と子葉片を入れて１０分間２８℃で振とう後、滅菌したろ紙に余分な液を吸わせて共存培地に置床した。
（iv）シャーレは暗所に置き、２５℃で２日間培養した。
（ｖ）２日後、カルス誘導培地（CIM-0）に植替えし、７日置きに培地を交換した。２週間後ハイグロマイシン（終濃度１０ｍｇ／Ｌ）を含むカルス誘導培地（CIM-H10）に植替えた。その２週間後シュート誘導培地（SIM-H10）に植え替えた。
（vi）感染から４ヶ月（１７週）以降、カルスからシュートが出てきたところでシュートを切り、発根培地（RIM-H10）に挿し発根させた。
（vii）以降プラントボックスに植え替え、順次土へ移植した。
使用した培地は以下のとおりである。
・基本培地：１／２ＭＳ塩溶液、０．８％寒天、２％スクロース
・共存培地（COM-Z）：基本培地＋アセトシリンゴン（終濃度０．１ｍＭ）＋ｔ−Ｚｅａｔｉｎ（終濃度１．５ｍｇ／Ｌ）
・カルス誘導培地（CIM-0）：基本培地＋ＩＡＡ（終濃度１ｍｇ／Ｌ）＋ｔ−Ｚｅａｔｉｎ（終濃度１．５ｍｇ／Ｌ）＋メロペン（終濃度１２．５ｍｇ／Ｌ）
・カルス誘導培地（CIM-H10)：基本培地＋ＩＡＡ（終濃度１ｍｇ／Ｌ）＋ｔ−Ｚｅａｔｉｎ（終濃度１．５ｍｇ／Ｌ）＋メロペン（終濃度１２．５ｍｇ／Ｌ）＋Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（終濃度１０ｍｇ／Ｌ）
・シュート誘導培地（SIM-H10）：基本培地＋ｔ−Ｚｅａｔｉｎ（終濃度１．５ｍｇ／Ｌ）＋メロペン（終濃度１２．５ｍｇ／Ｌ）＋Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（終濃度１０ｍｇ／Ｌ）
・発根培地（RIM-H10）：基本培地＋ＩＢＡ（終濃度２ｍｇ／Ｌ）＋メロペン（終濃度１２．５ｍｇ／Ｌ）＋Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（終濃度１０ｍｇ／Ｌ）
【００４９】
（４）ゲノム編集個体の検出
（ａ）Ｇ１６
（ｉ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ
MightyAmp Genotyping Kit（TaKaRa Bio）でゲノムＤＮＡを抽出し、表５に示されるプライマーであるSP11a-GE-tstF3とSP11a-GE-tstR1を用いて、１回目のＰＣＲを行った（98℃ 2min→［98℃ 10s, 55℃ 15s, 68℃ 1min］を35サイクル）。次いで、上記ＰＣＲ液の1/25と、表５に示されるプライマーであるSP11a-G16-check-F2とSP11a-G16-check-R2を用いて、２回目のＰＣＲを行った（98℃ 2min→［98℃ 10s, 68℃ 30s］を30サイクル）。
【００５０】
（ii）Heteroduplex Mobility Assay（HMA）による検出
親株（IL11-1）と形質転換植物由来のゲノムＤＮＡを用いた２回目のＰＣＲ溶液を用いて、Heteroduplex Mobility Assay（HMA）を行い、ゲノム編集された植物を検出した。
上記２回目のＰＣＲ溶液、各２．５μＬに、１．１μＬの10X Heteroduplex Annealing Bufferと５．０μＬの滅菌水を加え、９５℃で２分加熱し、４℃まで冷却した。
この溶液をMultiNA（株式会社島津製作所）で電気泳動し、ＤＮＡの易動度の変化を検出した。複数のバンドが検出されるサンプルはheteroduplexを形成しているので、ゲノム編集された植物と判断した。
10X Heteroduplex Annealing Buffer：1000 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, pH 7.8, 20 mM EDTA
【００５１】
（ｂ）Ｇ１７
（ｉ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ
Ｇ１６の場合と同様にして、表５に示されるプライマーであるSP11a-GE-tstF6とSP11a-GE-tstR6を用いて、１回目のＰＣＲを行った（98℃ 2min→［98℃ 10s, 55℃ 15s, 68℃ 1min］を35サイクル）。
【００５２】
（ii）制限酵素による検出
上記１回目のＰＣＲ溶液を用いて、制限酵素Bsl I（New England Biolabs）で処理した(55℃で2h)。親株由来のＤＮＡは切断されるので、切断されないＤＮＡ断片を含むものをゲノム編集された植物と判断した。
【００５３】
（ｃ）ゲノム編集による変異の確定
形質転換当代（T0）において変異がホモになった個体（bi-allelic mutation）を含め、形質転換次世代（T1）において、変異がホモ接合体になった個体からゲノムＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequecing Kitsと3130xl Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific K.K.）を使用して標準プロトコールとおりに行った。次いで、決定された塩基配列に基づいて、ゲノム編集系統gR16#10とgR17#1のノックアウト変異体（SP11a）のアミノ酸配列を得た。なお、親株であるIL11-1（SP11a）のアミノ酸配列は以下のとおりである。
gR16#10：ＭＱＲＥＲＤＴＬＲＬＡＲ＊（配列番号９）
gR17#1：ＭＱＲＥＲＤＴＬＲＬＡＲＶＩＧＤＶＬＤＰＦＴＫＳＩＮＬＲＶＶＹＮＮＫＥＩＲＮＧＣＤＬＲＰＳＭＶＶＮＱＰＲＶＥＶＧＧＤＤＦＱＴＦＹＴＬＶＭＶＤＰＤＡＰＴＰＳＮＰＣＨＫＤＹＬＨＷＬＶＴＮＩＰＡＳＴＧＶＴＦＧＮＥＶＶＳＹＥＣＰＲＱＷＶＹＩＤＬＦ＊（配列番号１０）
IL11-1：ＭＱＲＥＲＤＴＬＲＬＡＲＶＩＧＤＶＬＤＰＦＴＫＳＩＮＬＲＶＶＹＮＮＫＥＩＲＮＧＣＤＬＲＰＳＭＶＶＮＱＰＲＶＥＶＧＧＤＤＦＱＴＦＹＴＬＶＭＶＤＰＤＡＰＴＰＳＮＰＣＨＫＤＹＬＨＷＬＶＴＮＩＰＡＳＴＧＶＴＦＧＮＥＶＶＳＹＥＣＰＲＰＴＭＧＩＨＲＬＶＬＶＬＦＲＱＬＲＲＥＩＩＹＡＰＥＮＲＱＮＦＤＴＲＥＦＡＲＬＹＮＦＧＬＰＶＡＡＶＹＦＮＣＱＲＥＮＧＴＧＧＲＲＩ＊（配列番号６）
【００５４】
（ｄ）花成の検定
上記T1およびT2世代の植物を用いて、第１花房の蕾が顕著に肉眼で観察できるようになったときに、本葉の枚数を測定することにより花成の検定を行った。枚数の値は、第一花の開花時においても変化しないので、開花時葉枚数とした。なお、T2世代の植物の種子は、元の導入プラスミドを持たないT1（null segregant）に実った果実から得た。結果を図９及び１０に示す。ゲノム編集系統gR16#10及びgR17#1は、親株IL11-1より早咲きとなった。特に、SP11bが発現する短日条件（ＳＤ）で、より早く花が咲いた。SP11a（抑制因子）の機能の損失とSP11b（促進因子）の野生型を持つことで花成が促進され、短日条件（ＳＤ）でそれがより顕著に現れたことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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