(57)【要約】【課題】急性肺傷害の予防及び治療のうち少なくともいずれか一方のためのコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造する方法を提供する。【解決手段】該方法は、下記ステップすなわち：（ａ）コルジセプス・シケイダエ菌糸体をプレート培地にて１５〜３０℃で１〜２週間培養するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の菌糸体をフラスコに接種し、これを１５〜３０℃、ｐＨ２〜６で３〜１４日間培養するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の菌糸体を発酵槽タンクに接種し、これを１５〜３０℃、ｐＨ２〜６で３〜２１日間培養して、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含有するコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を得るステップ、を含む。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性肺傷害を予防すること及び改善することのうち少なくともいずれか一方のためにコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造する方法であって、前記方法は、下記ステップ：
（ａ）コルジセプス・シケイダエ菌糸体をプレート培地にて１５〜３０℃で１〜２週間培養するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）のコルジセプス・シケイダエ菌糸体をフラスコへ接種し、該菌糸体を１５〜３０℃及びｐＨ２〜６で３〜１４日間培養するステップ；および
（ｃ）コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含有しているコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を得るために、ステップ（ｂ）のコルジセプス・シケイダエ菌糸体を発酵槽タンクへ接種し、該菌糸体を１５〜３０℃及びｐＨ２〜６で３〜２１日間撹拌することにより培養するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法は、（ｄ）：コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含有しているコルジセプス・シケイダエ菌糸体粉末を得るために、コルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を凍結乾燥して凍結乾燥生成物を粉砕するステップ、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）の発酵槽タンクにガスがさらに供給され、前記ガスは、空気、酸素、二酸化炭素、ヘリウム又はこれらの組み合わせを含み、前記発酵槽タンクの圧力は０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２であり、かつガス流速は０．０１〜１．５ＶＶＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法を使用して製造されたコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質。
【請求項５】
急性肺傷害を予防すること及び改善することのうち少なくともいずれか一方のための組成物であって、前記組成物は、請求項４に記載のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントと、を含む、組成物。
【請求項６】
請求項４に記載のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の使用であって、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質は、急性肺傷害を予防すること及び改善することのうち少なくともいずれか一方のための組成物を製造するために使用される、前記使用。
【請求項７】
急性肺傷害を改善することは、肺炎症の病理学的症状を軽減することを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
肺炎症の病理学的症状を軽減することは、損傷又は融合した肺胞の完全性を回復することを含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
急性肺傷害を改善することは、タンパク質漏出応答を低減することを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
急性肺傷害を改善することは、炎症性の細胞の浸潤のレベルを低減することを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記炎症性の細胞は、白血球、貪食細胞及び好中球のうち少なくともいずれかを含む、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造するための方法、及びその使用に関する。特に、本発明は、急性肺傷害の予防及び改善のうち少なくともいずれかのためのコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造するための方法、並びにその食品又は医薬における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
台湾の衛生福利部による２０１７年の死因の上位１０位の中で、そのうちの４つは肺の炎症に緊密に関係している。すなわち、気管、気管支及び肺のがんを含む悪性新生物（１位にランキング）、肺炎（３位にランキング）、並びに慢性下気道疾患（７位にランキング）である。
【０００３】
米国における死因の上位１０位の中で、そのうちの３つは肺疾患に関係している。すなわち肺がん及び気管支原生癌、慢性呼吸疾患、インフルエンザ及び肺炎、である。統計分析からさらに、米国では１００，０００例中７９例が急性肺傷害（ＡＬＩ）を負い、１００，０００例中５９例が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を伴うこと、及び総死亡のうち４３％、すなわち１年当たり７５，０００例の死亡がＡＬＩ／ＡＲＤＳによって引き起こされることが示された。大気汚染のレベルは高まり続け、かつ期待寿命は毎年伸び続けるので、米国におけるＡＬＩ／ＡＲＤＳの発病率は２５年で少なくとも２倍になるであろうと見積もられる。
【０００４】
ＡＬＩ及びＡＲＤＳ（ＡＬＩよりも重症）は臨床的に頻繁に見られる急性の炎症性肺疾患であり、いずれも呼吸不全を引き起こす可能性がありかつ命取りになる場合がある。これらはまた、数多くの呼吸器疾患に関係している。
【０００５】
ＡＬＩを引き起こす危険因子は、２つの主な群、すなわち：直接的危険因子及び間接的危険因子に分かれる。直接的危険因子は、肺で発生するもの、例えば細菌若しくはウイルスによって引き起こされる感染性肺炎、胃酸若しくは異物の誤嚥、又は肺挫傷などである。他方、間接的危険因子は、肺から始まるのではないもの、例えば敗血症、アルコール及び薬物の慢性使用、又は人工血漿の輸注などである。細菌感染は上述の主な危険因子のうちの１つであり、一例は、そのエンベロープがリポ多糖類（ＬＰＳ）としても知られるエンドトキシンで主として構成されているグラム陰性細菌による感染である。
【０００６】
ＡＬＩの複雑なメカニズム及び高い致死率が原因で、ＡＬＩの致死率に対処するために使用可能な臨床的に有効な医薬品は今なお不足しており、一方でＡＬＩの一般的治療には、機械的換気、β２アドレナリン作動性受容体アゴニスト、血液凝固阻止、血栓溶解、サーファクタント療法、及び手術が含まれる。したがって、ＡＬＩの有効な治療についての探求は発展にとって依然不可欠なままである。
【０００７】
虫花、土蝉花、胡蝉及び蝉蛹草としても知られるコルジセプス・シケイダエは、セミ幼虫の前端に菌体を伴って形成される花芽形状のストロマであり、該セミ幼虫はバッカクキン科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）コルジセプス属真菌の胞子に寄生されて細菌を保有する死骸へと変貌している。「本草綱目」、「證類本草」及び「中華薬海」には、コルジセプス・シケイダエが主として、赤ん坊の病的な夜泣き、動悸、及びマラリアを治療するため、並びに身体から風邪（ふうじゃ）及び熱（ねつ）を一掃して痙病（けいびょう）を緩和するために使用されることが記載されている。天然のコルジセプス・シケイダエ子実体及びオフィオコルジセプス・シネンシス（Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は同じようにして構成されていることが、構成比率分析によって見出されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年の薬学研究から、コルジセプス・シケイダエは、免疫応答調節、抗酸化、抗炎症、神経保護、及び抗がんの効果を備えた生物活性を有していることが見出されている。しかしながら、コルジセプス・シケイダエ菌糸体を使用してＡＬＩを改善することについて行われた研究は存在していない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここに提供されるのは、急性肺傷害の予防及び改善のうち少なくともいずれか一方に有効な組成物の製造のために使用可能な、コルジセプス・シケイダエ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｉｃａｄａｅ）菌糸体活性物質及び前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造する方法である。従来の医薬品及び治療と比較して、本明細書中に開示されるコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の発酵液を製造するための方法はより安全かつより簡単であり、また製造されるコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質はより自然かつより安全であって、加えてＡＬＩを改善させるのに有効である。
【００１０】
本発明の１つの実施形態によれば、ＡＬＩを改善させるためのコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造するための方法が提供される。該方法は、下記ステップ、すなわち：
（ａ）コルジセプス・シケイダエ菌糸体をプレート培地にて１５〜３０℃で１〜２週間培養するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）のコルジセプス・シケイダエ菌糸体をフラスコへ接種し、該菌糸体を１５〜３０℃及びｐＨ２〜６で３〜１４日間培養するステップ；並びに
（ｃ）コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含有しているコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を得るために、ステップ（ｂ）のコルジセプス・シケイダエ菌糸体を発酵槽タンクへ接種し、該菌糸体を１５〜３０℃及びｐＨ２〜６で３〜２１日間撹拌することにより培養するステップ、を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を製造するための方法は、次のステップすなわち（ｄ）：コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含有しているコルジセプス・シケイダエ菌糸体粉末を得るために、コルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を凍結乾燥して凍結乾燥生成物を粉砕するステップ、をさらに含む。
【００１２】
１つの実施形態では、ステップ（ｃ）の発酵槽タンクにガスがさらに供給され、前記ガスは、空気、酸素、二酸化炭素、ヘリウム又はこれらの組み合わせを含み；発酵槽タンクの圧力は０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２であり、かつガス流速は０．０１〜１．５ＶＶＭである。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、前記方法を使用して製造されたコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントと、を含む、急性肺傷害の予防及び改善のうち少なくともいずれか一方のための組成物が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、前記コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の使用が提供され、同コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質は、急性肺傷害の予防及び改善のうち少なくともいずれか一方のための組成物の製造のために使用される。
【００１５】
１つの実施形態では、上述のような急性肺傷害の改善は、肺炎症の病理学的症状を軽減することを含む。
１つの実施形態では、上述のような肺炎症の病理学的症状の軽減は、損傷又は融合した肺胞の完全性を回復することを含む。
【００１６】
１つの実施形態では、上述のような急性肺傷害の改善は、タンパク質漏出応答を低減することを含む。
１つの実施形態では、上述のような急性肺傷害の改善は、炎症性の細胞の浸潤のレベルを低減することを含む。
【００１７】
１つの実施形態では、前記の炎症性の細胞は、白血球、貪食細胞及び好中球のうち少なくともいずれかを含む。
本発明の上記及びその他の態様をさらに例証する目的で、いくつかの例示の実施形態について添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】腹腔内注射によりコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩの病理学的状態を改善することが可能であることを示す。
【図２】腹腔内注射によりコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩで引き起こされる肺胞−毛細血管関門の損傷を改善することが可能であることを示す。
【図３】腹腔内注射によりコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩで引き起こされる（Ａ）白血球、（Ｂ）貪食細胞及び（Ｃ）好中球の浸潤を改善することが可能であることを示す。
【図４】経口的にコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩの病理学的状態を改善することが可能であることを示す。
【図５】経口的にコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩで引き起こされる肺胞−毛細血管関門の損傷を改善することが可能であることを示す。
【図６】経口的にコルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を投与し、次に急性の肺炎症を誘発するために鼻吸入によってエンドトキシンを投与することにより、ＡＬＩで引き起こされる（Ａ）白血球、（Ｂ）貪食細胞及び（Ｃ）好中球の浸潤を改善することが可能であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
実施例１：コルジセプス・シケイダエ菌糸体の培養
本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体は、下記ステップすなわち：天然の台湾のコルジセプス・シケイダエ菌株を採集するステップ、その菌糸体を子実体から分離するステップ、及び菌糸体を継代培養によってプレート培地に保管するステップ、によって得られる。菌株の遺伝子配列は、台湾の財団法人食品工業発展研究所によってコルジセプス・シケイダエと確認される。コルジセプス・シケイダエ菌株のうちこの菌株は現在、台湾の財団法人食品工業発展研究所の生物資源保存及研究中心（ＢＣＲＣ）に、ＢＣＲＣ番号：ＭＵ３０１０６を伴って公的に寄託されているが、しかし本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質はそのような菌株から調製された物質に限定はされない。
【００２０】
（１）プレート培養：コルジセプス・シケイダエ菌糸体をプレート培地上に接種し、１５〜３０℃で１〜２週間（本実施例では２５℃で７日間）培養した。培地の処方には、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、炭素源及び窒素源が含まれうるが、特に制限はない。
【００２１】
（２）フラスコにおける培養：コルジセプス・シケイダエ菌糸体をステップ（１）のプレートから掻き集めてフラスコに接種した。培養物を、１５〜３０℃の振盪恒温器内で１１０〜１３０ｒｐｍ及びｐＨ２〜６で３〜１４日間（本実施例では１２０ｒｐｍ、２５℃及びｐＨ５で７日間）増殖させた。振盪培養物の処方は表１に示した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
上記の成分のうち、炭素源及び窒素源の混合物は、穀物（例えば小麦粉など）又は豆果（例えば大豆粉、緑豆粉、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の粉末若しくはシナモンの粉末など）であってよく；炭水化物は、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロースなどであってよく；無機塩類は、硫酸マグネシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸第二鉄などであってよい。留意すべきなのは、表１に示すような処方は単なる例示であること、及び該処方の成分は特に限定されておらず、実際の必要に応じて調整されてもよいし、市販の培地と組み合わせて使用されてもよいということである。
【００２４】
（３）発酵槽タンクにおける培養：ステップ（２）のフラスコの培養物を発酵槽タンクにさらに接種し、１５〜３０℃の温度、０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２のタンク圧力及びｐＨ２〜６にて５０〜１５０ｒｐｍで撹拌した。その間、ガスを０．１〜１．０ＶＶＭのガス流速でタンクに供給した。得られた培養物を３〜２１日間インキュベートしてコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を得た（本実施例では培養条件は、２５℃、０．５ｋｇ／ｃｍ２、ｐＨ５、８０ｒｐｍ及び１．０ＶＶＭ（空気）で１４日間であった）。発酵槽タンク内で使用される培地は、ステップ（２）のフラスコ中の培養液と同じ処方、又はその他の適切な培地のいずれかを含みうる（本実施例ではステップ（２）と同じ処方を使用した）。このコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液は、本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含んでいる。コルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液をさらに凍結乾燥して、コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を得ることも可能である。本実施例では、１００Ｌのコルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液を凍結乾燥して３ｋｇの凍結乾燥粉末とした。
【００２５】
コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質は、コルジセプス・シケイダエ菌糸体発酵液（菌体及び清澄な液体）、発酵液から作製された凍結乾燥粉末、溶媒中に溶解された凍結乾燥粉末、又はその他の調合物など様々な形態をとることが可能である。好ましい実施形態では、凍結乾燥粉末を溶解するための溶媒は、水、エタノール又はこれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、凍結乾燥粉末を溶解するための溶媒として使用される水とエタノールとの比率は１：１である。次の実施例２では、発酵液から作製された凍結乾燥粉末の形態のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を用いて次の実験及び分析を行った。
【００２６】
実施例２：ＡＬＩを改善するためのコルジセプス・シケイダエ菌糸体凍結乾燥粉末の使用についての分析
ＡＬＩに結びつく主な危険因子のうちの１つは、そのエンベロープがリポ多糖類（ＬＰＳ）としても知られるエンドトキシンから主として構成されているグラム陰性細菌の感染である。ＡＬＩを引き起こす様々な病原体の中でも、ＬＰＳは急性肺炎症の最も効果的な誘発因子として広く見なされており、この誘発のモデルは臨床的に生じる急性炎症に最も近い。したがって、ＬＰＳで引き起こされる肺炎症並びに免疫調節の機能及びメカニズムを抑制すれば、ＡＬＩを改善する効果を達成することになる。エンドトキシン誘発型ＡＬＩの動物モデルを使用する実験が存在している。ユンへ・フ（Ｙｕｎｈｅ  Ｆｕ）ら、「マウスにおけるＬＰＳ誘発型急性肺傷害に対するＴＭ６の保護効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＴＭ６  ｏｎ  ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」、サイエンティフィック・リポーツ（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ）、２０１７年、第７巻、ｐ．５７２を参照のこと。急性肺炎症のマウスモデルを上記出版物の説明に従ってＬＰＳにより確立した。急性肺傷害を誘発するために５０μｇ／２０μＬのＬＰＳを鼻腔内投与した。その後、肺の病理学的状態の変化、気管支肺胞洗浄液の総細胞数、タンパク質濃度及び様々なサイトカインの分析を行って、細胞浸透性のＴＩＲドメイン由来デコイペプチドのような合成ペプチドがＡＬＩに対して施した改善を評価した。この実験では、急性肺炎症のマウスモデルもＬＰＳを使用して確立した。その後、肺の病理学的状態の変化、気管支肺胞洗浄液の総細胞数、タンパク質濃度及び様々なサイトカインの分析を行って、コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質がＡＬＩに対して施した改善を評価した。
【００２７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスをこの動物実験に使用し、投与経路すなわち腹腔内投与及び経口投与により２つの主要群に分けた。２つの主要群をさらに４つの群すなわち：物質を投与されない対照群（対照群）、ＬＰＳのみが投与される群（ＬＰＳ群）、ＬＰＳ及びコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の両方が投与される群（ＣＣ菌糸体群）、並びにＬＰＳ及びデキサメサゾンの両方が投与される陽性対照群（ＤＥＸ群）に分け、以下の表２に示すような合計８群を作製した。各群に６匹のマウス、合計４８匹のマウスを用いた。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
腹腔内投与の群では、２０μＬのＬＰＳを鼻腔内投与したが、ＬＰＳの濃度はマウス１匹当たり５０μｇである。マウスを投与の２４時間後に屠殺し、後述のように分析するための試料を収集した。ＣＣ菌糸体群では、コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を１：１の比率の水／エタノール溶媒に溶解した。得られた混合物を、超音波処理を用いて均質化し、沈殿が形成されないことを確認したら投与すべき試料として使用した。５０μＬのコルジセプス・シケイダエ試料をマウスに腹腔内投与し、上記した方法と同じ投与及び屠殺の方法を使用して、コルジセプス・シケイダエ試料の投与の３０分後にエンドトキシン（ＬＰＳ）を鼻腔内投与した。ＤＥＸ群では、ＤＥＸを生理食塩水に溶解し、得られた混合物５０μＬをマウスに腹腔内投与した。上記した方法と同じ投与及び屠殺の方法を使用して、エンドトキシン（ＬＰＳ）をＤＥＸ試料の投与の３０分後に鼻腔内投与した。
【００３０】
経口投与群では、２０μＬのエンドトキシン（ＬＰＳ）を鼻腔内投与したが、ＬＰＳの濃度はマウス１匹当たり５０μｇである。マウスを投与の２４時間後に屠殺し、後述のように分析するための試料を収集した。ＣＣ菌糸体群では、コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末を１：１の比率の水／エタノール溶媒に溶解した。得られた混合物を、超音波処理を用いて均質化し、沈殿が形成されないことを確認したら投与すべき試料として使用した。２００μＬのコルジセプス・シケイダエ試料を、胃ゾンデを介してマウスに１日１回、３日間投与した。上記した方法と同じ投与及び屠殺の方法を使用して、エンドトキシン（ＬＰＳ）を３日後に鼻腔内投与した。ＤＥＸ群では、ＤＥＸを生理食塩水に溶解し、得られた混合物を、胃ゾンデを介してマウスに１日１回投与した。上記した方法と同じ投与及び屠殺の方法を使用して、エンドトキシン（ＬＰＳ）を３日後に鼻腔内投与した。
【００３１】
肺組織の組織病理学的観察：肺胞洗浄法で処理しなかったマウスの右肺を取り出して直ちにホルマリン固定した。固定生成物をパラフィン切片とし、従来のヘマトキシリン−エオシン染色法（Ｈ＆Ｅ染色）で染色した。光学顕微鏡検査法を使用して組織病理学的変化を観察した。
【００３２】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）：肺洗浄をマウスの左肺について、肺胞腔中の内容物を洗い出してＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を得るために、気管内挿管を使用して１ｍＬのＰＢＳで３回実施した。ＢＡＬＦを遠心分離処理し、沈殿した細胞を、血球分類計数を使用して計測した。上清中のタンパク質濃度はブラッドフォードのタンパク質アッセイを使用して測定した。
【００３３】
フローサイトメトリーを使用する白血球の数及び種類の計測：フローサイトメトリーは、白血球の表面に存在する特異的抗原に基づいて血液試料及びＢＡＬＦ試料中の白血球の差異を測定するための、小さな個人誤差しか引き起こさない高感度な定量化方法である。計測の対象には：（１）ＢＡＬＦ中の細胞数；（２）白血球（ＣＤ４５）の数；（３）貪食細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ）の数；（４）好中球（ＣＤ４５＋／Ｌｙ６Ｇ＋）の数；及び（５）マクロファージ［（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋）−（ＣＤ４５＋／Ｌｙ６Ｇ＋）］の数、が挙げられる。
【００３４】
統計的方法：データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表現し、一元配置分散分析を使用して分析する。群の差はＬＳＤ事後検定を使用して分析する。０．０５未満のｐ値を伴う結果は統計的に有意であるとみなす。
【００３５】
図１に示すように、コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末の腹腔内注射は炎症性肺疾患を改善するのに有効であると判明した。ほとんどの肺胞構造が完全なままである対照群では有意な変化は観察されなかった。ＬＰＳ群では、損傷を受けて融合した肺胞構造を伴って、肺の病理学的変化が明らかに観察された。他方、ＣＣ菌糸体群及びＤＥＸ群のマウスの肺疾患は明らかに改善した。
【００３６】
腹腔内注射の後、エンドトキシン誘発性の肺炎症によって引き起こされたタンパク質漏出応答を分析した。コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末は、図２及び以下の表３に示すように、タンパク質漏出応答の低減に有効であることが見出された。＃は対照群との比較でｐ＜０．０５；＊はＬＰＳ群との比較でｐ＜０．０５である。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
腹腔内注射の後、エンドトキシン誘発性の肺炎症によって引き起こされた、（Ａ）白血球（ＣＤ４５）（Ｂ）貪食細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋）及び（Ｃ）好中球（ＣＤ４５＋／Ｌｙ６Ｇ＋）の浸潤応答を分析した。コルジセプス・シケイダエ菌糸体の凍結乾燥粉末は、図３（Ａ〜Ｃ）及び以下の表４〜６に示すように、白血球、貪食細胞、及び好中球の浸潤応答の低減に有効であることが見出された。＃は対照群との比較でｐ＜０．０５；＊はＬＰＳ群との比較でｐ＜０．０５である。
【００３９】
【表４】
2020105159.tif 000006
【００４０】
【表５】
2020105159.tif 000007
【００４１】
【表６】
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【００４２】
図４に示されるように、コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の凍結乾燥粉末の経口投与は、炎症性肺疾患の改善に有効であることが判明した。ほとんどの肺胞構造が完全なままである対照群では有意な変化は観察されなかった。ＬＰＳ群では、損傷を受けて融合した肺胞構造を伴って、肺の病理学的変化が明らかに観察された。他方、ＣＣ菌糸体群及びＤＥＸ群のマウスの肺疾患は明らかに改善した。
【００４３】
経口投与の後、エンドトキシン誘発性の肺炎症によって引き起こされたタンパク質漏出応答を分析した。コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の凍結乾燥粉末は、図５及び以下の表７に示すように、タンパク質漏出応答の低減に有効であることが見出された。＃は対照群との比較でｐ＜０．０５；＊はＬＰＳ群との比較でｐ＜０．０５である。
【００４４】
【表７】
2020105159.tif 000009
【００４５】
経口投与の後、エンドトキシン誘発性の肺炎症によって引き起こされた、（Ａ）白血球（ＣＤ４５）（Ｂ）貪食細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋）及び（Ｃ）好中球（ＣＤ４５＋／Ｌｙ６Ｇ＋）の浸潤応答を分析した。コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の凍結乾燥粉末は、図６（Ａ〜Ｃ）及び以下の表８〜１０に示すように、白血球、貪食細胞、及び好中球の浸潤応答の低減に有効であることが見出された。＃は対照群との比較でｐ＜０．０５；＊はＬＰＳ群との比較でｐ＜０．０５である。
【００４６】
【表８】
2020105159.tif 000010
【００４７】
【表９】
2020105159.tif 000011
【００４８】
【表１０】
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【００４９】
本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質は、上記の実験によってＡＬＩの改善に有効であることが証明された。
実施例３：組成物の調製
本発明は、医薬組成物及び健康食品へと調製するためのコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質を含む組成物を提供する。
【００５０】
該組成物はさらに添加剤を含む。好ましい実施形態では、添加剤は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、増量剤、吸収促進剤、甘味料、潤滑剤、増粘剤又はこれらの組み合わせであってよい。賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、スクロース又はこれらの組み合わせから選択可能である。防腐剤、例えばベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル類、シリコン又はこれらの組み合わせは、医薬組成物の貯蔵寿命を延長することができる。希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセロール又はこれらの組み合わせから選択可能である。増量剤は、ラクトース、高分子量ポリエチレングリコール又はこれらの組み合わせから選択可能である。吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール又はこれらの組み合わせから選択可能である。甘味料は、アセスルファムＫ、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、ネオテーム又はこれらの組み合わせから選択可能である。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム又はアラビアゴムから選択可能である。増粘剤はコーンスターチであってよい。上記に挙げた添加剤に加えて、組成物の医薬としての効果に影響しない条件で、実際の必要性に応じて他の添加剤が選択されてもよい。
【００５１】
組成物は、製薬産業における様々な製品へと開発することが可能である。好ましい実施形態では、組成物は、医薬品、飼料、飲料、栄養補給剤、乳製品又は健康食品である。
組成物は、対象者のニーズを満たすために様々な形態をとることが可能である。好ましい実施形態では、組成物は、粉末、錠剤、顆粒、坐薬、マイクロカプセル、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ／ａｍｐｕｌｅ）、液体のスプレー又は坐薬の形態であることが可能である。
【００５２】
本発明の組成物は動物又はヒトに投与することが可能である。組成物の効果に対して影響がないという条件で、該組成物を任意の剤形とし、かつ剤形に応じて動物又はヒトに適切な経路で投与することが可能である。
【００５３】
本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質が食餌に用いられる場合、後述のような組成物１の形態がコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の例示の実施例となる。
組成物１：コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の凍結乾燥粉末（２０重量％）を、潤滑剤として使用されるステアリン酸マグネシウム（８重量％）及び防腐剤として使用されるシリコン（７重量％）とともに十分に混合した。得られた混合物を純水（６５重量％）に溶解し、今後の使用のために４℃で保管した。記法「重量％」は、組成物の全重量に対する各成分の重量の比率を指している。
【００５４】
本発明のコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質が液体形態で医療に用いられる場合、後述のような組成物２の形態がコルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の例示の実施例となる。
【００５５】
組成物２：コルジセプス・シケイダエ菌糸体活性物質の凍結乾燥粉末（２０重量％）を、甘味料として使用されるスクラロース（８重量％）、潤滑剤として使用されるアラビアゴム（７重量％）及び賦形剤として使用されるスクロース（１０重量％）とともに十分に混合した。得られた混合物を純水（５５重量％）に溶解し、今後の使用のために４℃で保管した。記法「重量％」は、組成物の全重量に対する各成分の重量の比率を指している。
【００５６】
これらの実施例は、上記の説明において開示されてはいるが、本発明を限定するように意図するものではない。当業者であれば、上記の教示を参照して該実施例に記載された特徴に適切な変更を加え、かつなおも本出願が主張するような効果を達成することができるはずである。したがって、本発明を保護している特許請求の範囲の範囲は、添付の特許請求の範囲によって決まるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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