(57)【要約】【課題】ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンをリードスルーして全長タンパク質を生合成させる方法を提供する。【解決手段】ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせることを特徴とする。ウリジンやアデニンをメチル化、ハロゲン化、アミノ化等すると未成熟終止コドン以下の下流のｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡの全長が翻訳されたタンパク質が生合成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法。
【請求項２】
前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記修飾される核酸塩基が、ウラシルおよび／またはアデニンであることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡは、ナンセンス突然変異型疾患で発現されたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法であって、
ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法。
【請求項６】
前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、請求項５記載の未成熟終止コドンの修飾方法。
【請求項７】
ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に塩基修飾する方法であって、
化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の未成熟終止コドンの修飾方法で前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質を生合成させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせタンパク質を生合成させる方法、および未成熟終止コドンの修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナンセンス突然変異は、アミノ酸のコドンを終止コドンに変える変異である。変異によって生じた終止コドンは未成熟終止コドンと称され、未成熟終止コドン以降のタンパク質が翻訳されない。このような変異を起因とする疾患は、ナンセンス変異型遺伝子疾患と称され、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などで、ナンセンス突然変異が知られている。
【０００３】
未成熟終止コドンによって本来のタンパク質の生成が困難となった患者に特定の化合物を投与すると、未成熟終止コドンを読み飛ばして翻訳を継続する現象が観察され、この現象をリードスルーと称し、リードスルー可能な化合物をリードスルー化合物と称する。リードスルー化合物は、野生型正常タンパク質と同様なタンパク質を合成してナンセンス変異型遺伝子疾患を改善し、または疾患を治療することができると期待されている。このようなリードスルー活性を有する化合物として、アミノグリコシド系化合物が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５３４５９２８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｈｎ  Ｋａｒｉｊｏｌｉｃｈ  ＆  Ｙｉ−Ｔａｏ  Ｙｕ、”Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ｓｅｎｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ  （２０１１）、Ｖｏｌ．４７４，ｐ３９５−３９８
【非特許文献２】Ｍｄ  ＴＡ  Ａｚａｄ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２０１７），ｐ１−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、アミノグリコシド系化合物は、難聴を併発させ、または腎障害のある患者で症状が悪化するなどの副作用が生じる恐れがある。また、標的となる未成熟終止コドンのみならず本来の終止コドンをもリードスルーして正常なタンパク質に余分なＣ末端ペプチドを付加する場合もある。
【０００７】
一方、未成熟終止コドンを構成するウリジンをシュードウリジン（Ψ）に置換するとリードスルーし得るという報告もある（非特許文献１）。しかしながら、哺乳動物細胞内で未成熟終止コドンを構成するウリジンをΨ化する方法は知られていない。
【０００８】
一方、ＲＮＡレベルでグアノシンからアデノシンへの突然変異を修正するために、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）のデアミナーゼドメインを使用する方法がある（非特許文献２）。修正目的の標的アデノシンを含むＲＮＡをＴａｒｇｅｔＲＮＡとした場合、図２に示すように、ＴａｒｇｅｔＲＮＡの相補鎖でＧｕｉｄｅＲＮＡを構成し、このＧｕｉｄｅＲＮＡにＭＳ２ＲＮＡ、ＭＳ２タンパク質およびＡＤＡＲ１を順次結合させた人工酵素複合体を調製して使用するものである。ＧｕｉｄｅＲＮＡによってＴａｒｇｅｔＲＮＡの近傍にＡＤＡＲ１が誘導される。ＧｕｉｄｅＲＮＡとして、標的アデノシンに対応する核酸塩基がシチジンであるものを使用すると、標的アデノシンはＧｕｉｄｅＲＮＡのシチジンとミスマッチであるためＴａｒｇｅｔＲＮＡから弾き出され、ＡＤＡＲ１による脱アミノ化が容易となる。脱アミノ化によりアデノシンがイノシンに変換されると、翻訳中にグアノシンとして読み取られるという。しかしながら、非特許文献２には、アデノシンデアミナーゼ以外の記載は存在しない。
【０００９】
上記現状に鑑みて、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡの未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡの未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾したところ、メチル化やハロゲン化によって未成熟終止コドンを構成する核酸塩基に官能基を導入すると未成熟終止コドンがリードスルーされることを見出し、本発明を完成させた。未成熟終止コドンのウラシルがメチルウラシルやフルオロウラシルに修飾されることで未成熟終止コドンがリードスルーされ、ポリペプチド鎖の生合成が継続されることは、従来全く知られていない。
【００１２】
すなわち、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、前記方法を提供するものである。
【００１４】
また本発明は、前記修飾される核酸塩基が、ウラシルおよび／またはアデニンであることを特徴とする、前記方法を提供するものである。
【００１５】
また本発明は、前記ｍＲＮＡは、ナンセンス突然変異型疾患で発現されたものである、前記方法を提供するものである。
【００１６】
更に本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法であって、ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、前記未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。
【００１８】
加えて、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に塩基修飾する方法であって、化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記未成熟終止コドンの修飾方法で、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾することを特徴とする、前記タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせることで、ｍＲＮＡの全長が翻訳されたタンパク質を生合成することができる。
【００２１】
本発明によれば、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡに、当該ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いてＲＮＡ修飾酵素の活性部位や化学的な塩基修飾用の活性基を塩基配列特異的に誘導し、前記酵素を作用させ、または化学的な塩基修飾用の活性基を作用させることで、未成熟終止コドンの核酸塩基を修飾することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】非特許文献２に記載される人工酵素複合体を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の第一は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法である。本発明において、「ナンセンス突然変異」とは、アミノ酸のコドンを終止コドンに変える変異をいい、「未成熟終止コドン」とは、ナンセンス突然変異によって、正常な終止コドンより５’末端側に出現した終止コドンを意味する。終止コドンには、ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡの３種がある。また、「リードスルー」とは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の際に未成熟終止コドンにいずれかのアミノ酸を対応させてポリペプチド鎖の生合成を継続させることを意味する。また、「核酸塩基の修飾」とは、未成熟終止コドンを構成するウラシル（Ｕ）のピリミジン骨格、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）のプリン骨格に官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することを意味する。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
タンパク質は、細胞内のリボソームがｍＲＮＡ上を５’→３’方向に動きつつｍＲＮＡのコドンを読み取り、アミノアシルｔＲＮＡがコドンの指定するアミノ酸をリボソーム上に運び、各アミノ酸がペプチド結合してポリペプチド鎖を伸長して生合成される。終止コドンには対応するアミノ酸がなく、この位置でタンパク質合成が終了される。従来から、未成熟終止コドンのリードスルー化合物として、アミノグリコシド系抗生物質等が知られているが、翻訳を司るリボソームへ作用すると考えられている。これに対し、本発明の特徴は、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾することで、未成熟終止コドンにアミノアシルｔＲＮＡを結合させ、またはサプレッサーｔＲＮＡに未成熟終止コドンに適当なアミノ酸を割り当て、いずれかのアミノ酸を対応させてポリペプチド鎖の生合成を継続させる点に特徴がある。アミノグリコシド系抗生物質等は、翻訳を司るリボソームへ作用してリードスルーすると考えられているが、本願発明は未成熟終止コドンを修飾するものでありリボソーム自体への直接作用でないため、副作用が少ないと期待される。
【００２５】
本発明において、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基としては、ウラシル、アデニン、グアニンのいずれでもよい。核酸塩基を構成するピリミジン骨格やプリン骨格に導入する官能基としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基、エーテル結合がある。また、脱アミノ化、酸化、還元するものであってもよい。例えば、アデニンを構成するアミノ基を脱アミノ化したり、ウラシル、グアニン、アデニンの−ＮＨを酸化してピリミジン骨格やプリン骨格に更に二重結合を導入したり、ウラシルの＝Ｏ（ケトン）を還元して水酸基を導入してもよい。本発明においては、核酸塩基をアルキル化、ハロゲン化に修飾することが好ましい。後記する実施例に示すように、ウラシルにメチル基を導入し、またはフッ素化すると、リードスルーすることが判明した。好ましい官能基は、メチル基、フッ素、アミノ基、水酸基であり、核酸塩基の還元物であってもよい。修飾された核酸塩基としては、ジヒドロウラシル、ヒドログアニン、ヒドロアデニン、メチルウラシル、メチルグアニン、メチルアデニン、フッ化ウラシル、フッ化グアニン、フッ化アデニン、アミノウラシル、アミノアデニン、水酸化ウラシル、水酸化アデニンなどが好ましい。本発明では特に、５−メチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−塩化ウラシル等を好適に使用することができる。
【００２６】
リードスルーによって、ｍＲＮＡの全長を翻訳することができる。生成するタンパク質は、ナンセンス突然変異が無い場合に生合成される野生型タンパク質や、野生型タンパク質において、未成熟終止コドンに割り当てられたアミノ酸が相違するタンパク質となる。野生型タンパク質は、特定の機能を有する機能性タンパク質であることが多く、ナンセンス突然変異型疾患においては機能性タンパク質が生合成されない結果、各種症状が発現する。本発明によれば、野生型タンパク質の発揮する機能を有するタンパク質を生合成することができるため、ナンセンス突然変異型疾患の治療に役立てることができる。このようなナンセンス突然変異型疾患としては、サラセミア、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー疾患、血友病、テイ−サックス病などを例示することができる。
【００２７】
本発明によれば、未成熟終止コドンのみがリードスルーされるため、本来の終止コドンがリードスルーされることがない。
【００２８】
本発明の第二は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法であって、ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法である。この方法により未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾すると、未成熟終止コドンがリードスルーされ、ｍＲＮＡの全長が翻訳されタンパク質が生合成される。
【００２９】
ＲＮＡ修飾酵素としては、広く、ＲＮＡを構成する核酸塩基のピリミジン骨格やプリン骨格に官能基を導入し、または脱アミノ化、酸化、還元することができる酵素が挙げられる。ＲＮＡを構成する核酸塩基に、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基、エーテル結合などの官能基を導入できる各種酵素を賜与することができる。また、ＲＮＡを構成する核酸塩基を脱アミノ化、酸化、還元することができる酵素であってもよい。このような酵素は、天然酵素であってもよく、また、特定の官能基を導入するために新たに調製された人工酵素であってもよい。本発明ではこのようなＲＮＡ修飾酵素をそのまま使用してもよく、このような酵素の活性部位のみを使用してもよい。更には、ＲＮＡ修飾酵素やその活性部位に変異を導入し、より酵素活性を高めた活性部位を使用してもよい。ＲＮＡ修飾酵素の多くは既に遺伝子情報が公開されているため、クローニングにより入手することができる。
【００３０】
ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を未成熟終止コドンに誘導するには、未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いる。未成熟終止コドンの修正対象の核酸塩基を「標的核酸塩基」と称すると、「相補的な塩基鎖」とは、ｍＲＮＡの標的核酸塩基にＲＮＡ修飾酵素を誘導するために使用され、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基と相補な核酸塩基で構成される塩基鎖である。説明の便宜のため、この相補的な塩基鎖を「ガイドＲＮＡ」と称する。例えば、未成熟終止コドンとしてＵＡＡを含むｍＲＮＡとして５’−ＣＵＧＣＵＡＡＧＡＣＡ−３’の相補鎖は、３プライム末端から５プライム末端に向かって記載すると、３’−ＧＡＣＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’となる。ガイドＲＮＡは、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基の全てが相補的な塩基で構成されてもよく、上記例では、３’−ＧＡＣＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’をガイドＲＮＡとして使用することができる。一方、標的核酸塩基に酵素を誘導できればよく、ガイドＲＮＡは、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基の一部に相補的でない核酸塩基が含まれていてもよい。上記例で説明すると、ＧＡＣを除いた３’−ＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’であってもよい。更に、ガイドＲＮＡは、標的核酸塩基に対応する核酸塩基が、ミスマッチ塩基対であることが好ましい。例えば未成熟終止コドンを構成するウラシルを修飾する場合には、３プライム末端から５プライム末端に向かって記載する３’−ＧＡＣＧＣＵＵＣＵＧＵ−５’を使用する。標的核酸塩基であるウラシルはガイドＲＮＡのシトシンとミスマッチであるため弾き出され、ＲＮＡ修飾酵素を効率的に標的核酸塩基に作用させることができる。本発明では、ガイドＲＮＡとして、標的核酸塩基がウラシルやアデニンである場合はミスマッチ塩基対としてシトシンが、グアニンの場合はアデニンまたはウラシルであることが好ましい。
【００３１】
ガイドＲＮＡにＲＮＡ修飾酵素やその活性部位を結合させる方法として、非特許文献２記載のＭＳ２システムを使用することができる。ＭＳ２システムは、ＭＳ２ファージ由来のＲＮＡ結合コートタンパク質とそれに特異的に結合するＲＮＡを含む。ＭＳ２ファージはＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは＋鎖のｍＲＮＡとして機能する１本鎖ＲＮＡである。大腸菌に感染すると、ファージの増殖に必要な遺伝子の翻訳に引き続き−鎖のＲＮＡが合成され、この−鎖ＲＮＡを鋳型とし＋鎖のＲＮＡが合成される。ＭＳ２ファージは、ＲＮＡに基づいてＭＳ２ファージのコートタンパク質を合成するが、コートタンパク質の蓄積に伴いコートタンパク質が複製遺伝子の上流に結合する。すなわち、ＭＳ２ファージでは、ウイルスタンパク質が翻訳の鋳型となったウイルスｍＲＮＡと結合することを特徴を有する。ＭＳ２システムはこれらを利用してタンパク質とＲＮＡをさせるものである。
【００３２】
まず、ＲＮＡ修飾酵素やその活性部位の遺伝子配列をクローニングすれば、ＭＳ２コートタンパク質とＲＮＡ修飾酵素とのキメラタンパク質（ＭＳ２コートタンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位）を生成することができる。また、ＭＳ２ＲＮＡにガイドＲＮＡを結合させてＲＮＡ鎖（ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ）を調製することができる。ＭＳ２ＲＮＡとＭＳ２タンパク質とは強い結合性を有するため、キメラタンパク質（ＭＳ２コートタンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位）とＲＮＡ鎖（ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ）とを混合し、またはこれらを共に細胞内で発現させると、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位とを含む複合体を得ることができる。この複合体は、細胞内でガイドＲＮＡによってｍＲＮＡと相補的に結合する。未成熟終止コドンの近傍にＲＮＡ修飾酵素の活性部位が誘導されると標的核酸塩基の修飾を効率的に行うことができる。
【００３３】
本発明の第三は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に塩基修飾する方法であって、化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法である。この方法により未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に修飾すると、未成熟終止コドンがリードスルーされ、ｍＲＮＡの全長が翻訳されタンパク質が生合成される。
【００３４】
「化学的な塩基修飾用の活性基」としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基およびエーテル結合がある。第二の発明に準じて、ｍＲＮＡの標的核酸塩基に化学的な塩基修飾用の活性基を誘導するために使用され、かつｍＲＮＡを構成する核酸塩基と相補な核酸塩基で構成される塩基鎖をガイドＲＮＡとする。ガイドＲＮＡを使用すれば、第二の発明に準じて、ＭＳ２システムを利用して、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−化学的な塩基修飾用の活性基とを含む複合体を得ることもできる。この複合体を使用すると、細胞内でガイドＲＮＡによってｍＲＮＡと相補的に結合し、これにより標的核酸塩基の化学的な修飾を効率的に行うことができる。例えば、化学的な塩基修飾用の活性基がフッ素である場合には、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−フッ素となり、標的核酸塩基にフッ素を導入することができる。一方、ＭＳ２システムを使用せず、例えば上記したガイドＲＮＡ等の相補的な人工核酸鎖に、直接官能基を結合した化合物複合体を用いることもできる。化学的な塩基修飾用の活性基がフッ素である場合には、相補的な人工核酸鎖（例えばガイドＲＮＡ）−フッ素となり、標的核酸塩基にフッ素を導入することができる。なお、何れの場合でも、必要に応じて紫外線照射、加熱などのエネルギー付加を行い反応を促進させることもできる。
【００３５】
本発明によれば、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を特定し、この標的核酸塩基のみを修飾することができるため、本来の終止コドンをリードスルーすることがない。このため、正常タンパク質のＣ末端に更にポリペプチド鎖が結合する異常タンパク質の生合成を回避することができる。
【００３６】
本発明によって生合成されるタンパク質は、未成熟終止コドンにアミノ酸が割り当てられたポリペプチド鎖であり、未成熟終止コドンに野生型タンパク質と異なるアミノ酸が割り当てられた場合でも野生型タンパク質と同様の機能を期待することができる。したがって、本発明のタンパク質を生合成させる方法は、ナンセンス変異型遺伝子疾患の治療に有効に使用することができる。例えば、上記したガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を含む複合体や、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−化学的な塩基修飾用の活性基、ガイドＲＮＡ−化学的な塩基修飾用の活性基を含む複合体を患者に投与すると、細胞内のタンパク質合成機能を利用して、ｍＲＮＡが発現した組織内でタンパク質を生合成させることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
ＲＢＳ（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）配列（ＡＡＧＧＡＧ）、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、開始コドン（ＡＵＧ）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、終止コドン（ＵＡＡ）、ＦＬＡＧ配列、終止コドン（ＵＡＧ）を含む配列番号１と、配列番号１において、前記終止コドンＵＡＡのＵが、それぞれＡ、Ψ、５ｍｅｔｈｙｌＵ、および５ｆｌｕｏｒｏＵである配列番号２〜５のリボ核酸鎖を製造委託して使用した。なお、配列番号１は対照、配列番号２は陽性対照である。
【００３９】
配列番号１：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG UAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
【００４０】
配列番号２：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG AAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
【００４１】
配列番号３：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG Ψ-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
【００４２】
配列番号４：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5methylU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
【００４３】
配列番号５：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5fluoroU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
【００４４】
無細胞翻訳キット（ジーンフロンティア社製、ＰＵＲＥｆｌｅｘ（登録商標）２．０）を使用し、添付のマニュアルに従って反応液を調製し、前記配列番号１〜５のいずれかのリボ核酸鎖を添加してインビトロ翻訳を行い、ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒを１μＬ添加して反応を終了させた。得られた反応液にＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して希釈し、一部をニトロセルロースメンブレンに滴下し、３０分放置（乾燥）後、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０：最終濃度０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）内で１５分震盪し、次いでブロッキング溶液（プライムワン）に浸して４℃で一晩放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔで軽く洗浄した後、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆｌａｇ  ｔａｇ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１次抗体として滴下し、メンブレンフィルムで挟み室温で２時間放置した。これをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後にＦＬＡＧ抗体用二次抗体（プロテインＧ  ＨＲＰ）を滴下、１次抗体と同様にメンブレンフィルムで挟み９０分、室温で放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。その後ラップ上でメンブレンに検出溶液としてＥＣＬ溶液を添加してＬＡＳ３０００（富士フィルム）を利用して化学発光を検出した。
【００４５】
結果を図１に示す。なお、図１において×１は原液を、×１０、×１００、×１０００はそれぞれ１０倍、１００倍、１０００倍希釈を示す。５ｆｌｕｏｒｏＵおよび５ｍｅｔｈｙｌＵを使用したサンプルでは抗ＦＬＡＧ抗体にポジティブなシグナルが出現した。
【図１】
2020124155.tif 000002
【図２】
2020124155.tif 000003
【配列表】
2020124155000001.app