(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類細胞を培養する及び組換えタンパク質を回収するための方法及び材料を提供する。【解決手段】長期周期的回収のための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、新鮮な細胞培養培地を前記バイオリアクター内に灌流し、細胞培養物をフィルタに通し、及び透過物を収集することによって前記細胞培養を維持することを含み、ヌル透過物が、第一の所定のパラメータに到達するまで最初に収集され、そのとき回収透過物は所定の時間にわたって収集され、この後、第二の所定のパラメータに到達するまでヌル透過物を交互に収集し、次いで回収透過物を所定の時間にわたって収集し、ヌル透過物及び回収透過物の前記交互収集が、前記細胞培養が終了するまで継続される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期周期的回収のための方法であって
バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、
新鮮な細胞培養培地を前記バイオリアクター内に灌流し、細胞培養物をフィルタに通し、及び透過物を収集することによって前記細胞培養を維持すること
を含み、
ヌル透過物が、第一の所定のパラメータに到達するまで最初に収集され、そのとき回収透過物は所定の時間にわたって収集され、
この後、第二の所定のパラメータに到達するまでヌル透過物を交互に収集し、次いで回収透過物を所定の時間にわたって収集し、
ヌル透過物及び回収透過物の前記交互収集が、前記細胞培養が終了するまで継続される、方法。
【請求項２】
前記所定のパラメータが、時間、生存細胞密度、血中血球容積または力価から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の所定のパラメータが、前記細胞培養の前記確立の少なくとも１２時間〜２５日後である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の所定のパラメータが、前記回収透過物の前記収集の少なくとも１２〜７２時間後である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記所定の時間が、少なくとも１２〜７２時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌル透過物が収集されるとき、前記フィルタが、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記回収透過物が収集されるとき、前記フィルタが、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルタが、単一ユニットフィルタシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記透過物が、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタであるフィルタから収集されるとき、前記新鮮な細胞培養培地が、少なくとも５ｇ／Ｌの非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養プロセス中に試料を採取すること、前記組換えタンパク質及び／または前記細胞培養プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために前記試料を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記灌流が、連続灌流である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記灌流が、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記灌流が、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断力ポンプまたは交互接線流により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記細胞培養物を温度変化に供することをさらに含み、前記細胞は、ａ）第一の期間にわたって第一の温度で、及びｂ）第二の期間にわたって第二の温度で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記温度変化が、所定のパラメータに反応し、前記所定のパラメータを達成することが静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養が、前記バイオリアクターに少なくとも０．１×１０６生存細胞／ｍＬを接種することにより確立される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換えタンパク質が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質が、凝結、沈殿、遠心分離、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１つまたは複数によって前記回収透過物から精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記精製プロセス中に試料を採取すること、前記組換えタンパク質及び前記精製プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために前記試料を評価することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が、プロセス分析技術を使用して定量的に及び／または定性的にモニターされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えタンパク質が、医薬的に許容され得る製剤に製剤化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法により産生される、組換えタンパク質。
【請求項２４】
組換えタンパク質を回収するための方法であって、
バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、
少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を細胞培養物に灌流することにより前記細胞培養を維持すること、
前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、及び
前記組換えタンパク質を含有する透過物を収集すること
を含む、方法。
【請求項２５】
組換えタンパク質を回収するための方法であって、
バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、
少なくとも１ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を細胞培養物に灌流し、前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通し、及び透過物を収集することによって前記細胞培養を維持すること、
一度所定のパラメータに到達したら、少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を前記細胞培養物に灌流すること、及び前記細胞培養を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、ならびに、
前記組換えタンパク質を含有する透過物を収集すること
を含む、方法。
【請求項２６】
前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ及び前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する前記中空糸フィルタが、単一ユニットフィルタシステムの構成要素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
異なる孔径または分子量カットオフの２つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含む単一ユニットフィルタシステムであって、滅菌流路が前記個別の中空糸間で維持されるように前記中空糸フィルタ構成要素が互いに一連に固定され、それぞれの中空糸フィルタ構成要素から透過物を独立して除去することができるように、異なる孔径または分子量カットオフの前記中空糸フィルタ構成要素が、そこから前記透過物が取り出されるそれらの中空シェル側に関して互いに単離される、前記単一ユニットフィルタシステム。
【請求項２８】
少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素が、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有し、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素が、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタである孔径フィルタを有する、請求項２７に記載の単一ユニットフィルタシステム。
【請求項２９】
前記単一ユニットフィルタシステムが、筐体内に含有される、請求項２７に記載の単一ユニットフィルタシステム。
【請求項３０】
前記中空糸フィルタ構成要素の少なくとも２つの間にスペーサーをさらに含む、請求項２７に記載の単一ユニットフィルタシステム。
【請求項３１】
組換えタンパク質を発現する細胞を培養するための方法であって、
バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、
新鮮な細胞培養培地を前記バイオリアクター内に灌流し、細胞培養物を請求項２７に記載の単一ユニットフィルタシステムに通し、及び透過物を収集することによって前記細胞培養を維持すること
を含み、
前記単一ユニットフィルタシステムが前記バイオリアクターに取り付けられ、前記細胞培養物が、単一のポンプシステムにより前記バイオリアクターから取り出されて前記単一ユニットフィルタシステム内へと入り、前記細胞培養物が、前記単一ユニットフィルタシステムの前記中空糸の内腔側を通過し、前記バイオリアクター内に戻り、透過物が、前記中空糸フィルタ構成要素の１つまたは複数から取り出される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年６月４日に出願された米国仮出願第６２／００７，５８８号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、哺乳類細胞を培養する及び組換えタンパク質を回収するための方法及び材料を提供する。
【背景技術】
【０００３】
より多くの量の治療用組換えタンパク質に対する需要が高まり続けており、プロセス最適化、特に、細胞生存率及びタンパク質回収率に正の影響を有する産生細胞培養物を増殖させる、成長させる、及び維持するための方法及び戦略に対して多大な努力がなされている。組換えタンパク質の産生のための製造プロセスの開発は、多くの変数がバランスを取らなければならない複雑な試みである。これは、特に、細胞培養プロセスの全ての要素が産生の後期段階、特に回収及び下流処理に大きな影響を有することができる上流のプロセスにあてはまる。
【０００４】
典型的な細胞培養は、増殖期を経験し、これは細胞密度が増加する指数関数的増殖の期間である。増殖期の後に、指数関数的細胞増殖が遅くなりタンパク質産生が増加し始める遷移期が続く。これは、細胞密度が典型的に横ばいになり産生力価が増加する産生期である、固定相の開始をマークする。バッチ回収システムでは、細胞培養が設定数の日数にわたって維持されてから一度で全部の培養物全体を回収し、生成物の大半は、細胞培養が典型的にその最大産出量に到達する回収前の最後の数日間において産生され得る。これが単回の高力価回収をもたらし得る一方で、次の実行を開始するための非生産的所要時間及び再びピーク産生を達成するためのラグタイムを対価としている。連続回収システムでは、透過物を含有する生成物が、産生期を通して連続的に細胞培養物から収集され、細胞培養期間は延長されるが、低い産生力価及び回収及び精製段階の間に扱われる高容積の廃棄細胞培養液を対価としている。
【０００５】
細胞培養及び回収プロセス開発は、究極的には、プロセス最適化、産生力価及び生成物品質に対する処理速度などの変数の取引における運動である。課題には、例えば、細胞生存率を維持すること、実行可能な産生力価を達成すること、及び上流プロセスからの産出量と回収及び下流プロセスが対処できることのバランスをとることが含まれる。
【０００６】
組換えタンパク質産生及び回収率におけるなおもさらなる改善を提供する新しいプロセス方法は、大規模な細胞培養プロセス及びより量が多くて低費用なバイオ製品への需要の増加を考えると、価値がある。より多くの生成物回収率をもたらし、それによりタンパク質治療薬の製造に関する費用を減少させることができる細胞培養プロセスに対する改善が必要とされている。本発明は、タンパク質回収率を増加させつつ細胞培養期間を長期化するためのかかる方法及び材料を提供することによりこれらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、長期周期的回収のための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、新鮮な細胞培養培地をバイオリアクター内に灌流し、細胞培養物をフィルタに通し、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持することを含み、ヌル透過物は、第一の所定のパラメータに到達するまで最初に収集され、そのとき回収透過物は所定の時間にわたって収集され、この後、交互に、第二の所定のパラメータに到達するまでヌル透過物を収集し、次いで回収透過物を所定の時間にわたって収集し、ヌル透過物及び回収透過物の交互収集は、細胞培養が終了するまで継続される、前記方法を提供する。
【０００８】
一実施形態では、所定のパラメータは、時間、生存細胞密度、圧縮細胞容量または力価から選択される。
【０００９】
一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも１２時間〜２５日後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも２４〜７２時間後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも４日後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも５日以上後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも２５日後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも５〜２５日後である。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくとも１０〜１２日後である。
【００１０】
一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集の少なくとも１２〜７２時間後である。一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集の少なくとも２４〜７２時間後である。一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集の少なくとも２４〜４８時間後である。
【００１１】
一実施形態では、所定の時間は、少なくとも１２〜７２時間である。一実施形態では、所定の時間は、少なくとも２４〜７２時間である。一実施形態では、所定の時間は、少なくとも２４〜４８時間である。
【００１２】
一実施形態では、ヌル透過物は、最初に少なくとも２４時間〜２５日間にわたって収集され、そのとき回収透過物は、１２〜７２時間にわたって収集され、その後交互に、ヌル透過物を少なくとも２４時間〜２５時間にわたって収集し、次いで回収透過物を１２〜７２時間にわたって回収する。
【００１３】
一実施形態では、ヌル透過物が収集されるとき、フィルタは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタである。関連する実施形態では、分子量カットオフは、３００ｋＤａ以下である。関連する実施形態では、中空糸フィルタは、限外ろ過膜である。
【００１４】
一実施形態では、回収透過物が収集されるとき、フィルタは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタである。関連する実施形態では、分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。関連する実施形態では、中空糸フィルタは、精密ろ過膜である。
【００１５】
一実施形態では、フィルタは、単一ユニットフィルタシステムである。関連する実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素及び組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素を含む。関連する実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素の分子量カットオフは、３００ｋＤａ以下である。関連する実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素の分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。関連する実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、限外ろ過膜であり、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、精密ろ過膜である。関連する実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、筐体内に含有される。関連する実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、中空糸フィルタ構成要素の少なくとも２つの間にスペーサーをさらに含む。
【００１６】
一実施形態では、ヌル透過物が収集されるとき、それは組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素から取り出される。
【００１７】
一実施形態では、回収透過物が収集されるとき、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素から取り出される。
【００１８】
一実施形態では、透過物が、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタであるフィルタから収集されるとき、新鮮な細胞培養培地は、少なくとも５ｇ／Ｌの非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されか、または補充される。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体である。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である。
【００１９】
一実施形態では、上記方法は、細胞培養プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び／または細胞培養プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。関連する実施形態では、試料は、プロセス分析技術を使用して定量的に及び／または定性的にモニターされる。
【００２０】
一実施形態では、灌流は連続灌流である。一実施形態では、灌流の速度は一定である。一実施形態では、灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる。一実施形態では、灌流は、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断力ポンプまたは交互接線流により達成される。関連する実施形態では、灌流は、交互接線流により達成される。
【００２１】
一実施形態では、上記方法は、細胞培養物を温度変化に供することをさらに含み、細胞は、ａ）第一の期間にわたって第一の温度で、及びｂ）第二の期間にわたって第二の温度で培養される。関連する実施形態では、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。関連する実施形態では、温度変化は、産生期中に生じる。関連する実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応する。関連する実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応し、所定のパラメータを達成することは、静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される。
【００２２】
一実施形態では、細胞培養は、バイオリアクターに少なくとも０．１×１０６生存細胞／ｍＬを接種することにより確立される。関連する実施形態では、種菌は、交互接線流ろ過を使用する灌流プロセスの手段で増殖される。
【００２３】
一実施形態では、バイオリアクターに入れる前に、細胞培養培地は、ナノろ過、高温短時間法（ＨＴＳＴ）、またはろ過と組み合わせたＵＶを使用して処理される。
【００２４】
一実施形態では、バイオリアクターは、産生バイオリアクターである。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。
【００２５】
一実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、無血清の既知組成細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、灌流細胞培養培地である。
【００２６】
一実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群より選択される。
【００２７】
一実施形態では、組換えタンパク質は、凝結、沈殿、遠心分離、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１つまたは複数によって回収透過物から精製される。一実施形態では、上記方法は、精製プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び精製プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。
【００２８】
一実施形態では、組換えタンパク質は、医薬的に許容され得る製剤に製剤化される。一実施形態では、上記方法により産生された組換えタンパク質を提供する。
【００２９】
本発明では、組換えタンパク質を回収するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、細胞培養物に少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流することによって細胞培養を維持すること、及び細胞培養物を組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタに通すこと、及び組換えタンパク質を含有する透過物を収集することを含む、前記方法も提供する。
【００３０】
一実施形態では、分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。一実施形態では、中空糸フィルタは、精密ろ過膜である。
【００３１】
本発明は、組換えタンパク質を回収するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、細胞培養物に少なくとも１ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流すること、細胞培養物を、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタに通すこと、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持すること；一度所定のパラメータに到達したら、細胞培養物に少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流すること、及び細胞培養物を組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタに通すこと、及び組換えタンパク質を含有する透過物を収集することを含む、前記方法も提供する。
【００３２】
一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフは、３００ｋＤａ以下である。一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタは、限外ろ過膜である。
【００３３】
一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタの分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸フィルタは、精密ろ過膜である。
【００３４】
一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ及び組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタは、単一ユニットフィルタシステムの構成要素である。
【００３５】
一実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体である。一実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である。
【００３６】
一実施形態では、上記方法は、細胞培養プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び／または細胞培養プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。一実施形態では、定量的に及び／または定性的にモニターするための試料はプロセス分析技術を使用する。
【００３７】
一実施形態では、灌流は連続灌流である。一実施形態では、灌流の速度は一定である。一実施形態では、灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる。一実施形態では、灌流は、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断力ポンプまたは交互接線流により達成される。一実施形態では、灌流は、交互接線流により達成される。
【００３８】
一実施形態では、上記方法が、細胞培養物を温度変化に供することをさらに含み、細胞は、ａ）第一の期間にわたって第一の温度で、及びｂ）第二の期間にわたって第二の温度で培養される。関連する実施形態では、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。関連する実施形態では、温度変化は、産生期中に生じる。関連する実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応する。関連する実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応し、所定のパラメータに到達することは、静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される。
【００３９】
一実施形態では、細胞培養物は、バイオリアクターに少なくとも０．１×１０６生存細胞／ｍＬを接種することにより確立される。一実施形態では、種菌は、交互接線流ろ過を使用する灌流プロセスの手段で増殖される。
【００４０】
一実施形態では、バイオリアクターに入れる前に、細胞培養培地は、ナノろ過、高温短時間法（ＨＴＳＴ）、またはろ過と組み合わせたＵＶを使用して処理される。
【００４１】
一実施形態では、バイオリアクターは、産生バイオリアクターである。一実施形態では、ｎバイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。
【００４２】
一実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、無血清の既知組成細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、灌流細胞培養培地である。
【００４３】
一実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００４４】
一実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群より選択される。
【００４５】
一実施形態では、組換えタンパク質は、凝結、沈殿、遠心分離、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１つまたは複数によって回収透過物から精製される。
【００４６】
一実施形態では、上記方法は、精製プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び産生プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。
【００４７】
一実施形態では、組換えタンパク質は、医薬的に許容され得る製剤に製剤化される。
【００４８】
一実施形態では、上記方法により産生された組換えタンパク質を提供する。
【００４９】
本発明は、単一ユニットフィルタシステムであって異なる孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の２つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含み、滅菌流路が個別の中空糸間で維持されるように中空糸フィルタ構成要素が互いに一連に固定され、それぞれの中空糸フィルタ構成要素から透過物を独立して除去することができるように、異なる孔径または分子量カットオフの中空糸フィルタ構成要素が、そこから透過物が取り除かれるそれらの中空シェル側に関して互いに単離される、前記単一ユニットフィルタシステムも提供する。
【００５０】
一実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有し、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタである孔径フィルタを有する。関連する実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、３００ｋＤａ以下の分子量カットオフを有し、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、少なくとも５００ｋＤａの分子量カットオフを有する。関連する実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、限外ろ過膜であり、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、精密ろ過膜である。関連する実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、筐体内に含有される。一実施形態では、単一フィルタユニットは、中空糸フィルタ構成要素の少なくとも２つの間にスペーサーをさらに含む。
【００５１】
本方法は、組換えタンパク質を発現する細胞を培養するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、新鮮な細胞培養培地をバイオリアクター内に灌流し、細胞培養物を単一ユニットフィルタシステムに通し、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持することを含み、単一ユニットフィルタシステムはバイオリアクターに取り付けられ、細胞培養物は、単一のポンプシステムによりバイオリアクターから取り出されて単一ユニットフィルタシステム内へと入り、細胞培養物は、単一ユニットフィルタシステムの中空糸の内腔側を通過し、バイオリアクター内に戻り、透過物は、中空糸フィルタ構成要素の１つまたは複数から取り出される、前記方法も提供する。
【００５２】
一実施形態では、上記方法は、細胞培養プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び／または細胞培養プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。関連するプロセスでは、試料は、プロセス分析技術により定量的に及び／または定性的にモニターされる。
【００５３】
一実施形態では、灌流は連続灌流である。一実施形態では、灌流の速度は一定である。一実施形態では、灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる。
【００５４】
一実施形態では、灌流は、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断力ポンプまたは交互接線流により達成される。一実施形態では、灌流は、交互接線流により達成される。
【００５５】
一実施形態では、透過物が、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ構成要素から収集されるとき、新鮮な細胞培養培地は、少なくとも５ｇ／Ｌの非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されるまたは補充される。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体である。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である。
【００５６】
一実施形態では、上記方法が、細胞培養物を温度変化に供することをさらに含み、細胞は、ａ）第一の期間にわたって第一の温度で、及びｂ）第二の期間にわたって第二の温度で培養される。一実施形態では、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。関連する実施形態では、温度変化は、産生期中に生じる。関連する実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応し、所定のパラメータに到達することは、静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される。
【００５７】
一実施形態では、細胞培養は、バイオリアクターに少なくとも０．１×１０６生存細胞／ｍＬを接種することにより確立される。関連する実施形態では、種菌は、交互接線流ろ過を使用する灌流プロセスの手段で増殖される。
【００５８】
一実施形態では、バイオリアクターに入れる前に、細胞培養培地は、ナノろ過、高温短時間法（ＨＴＳＴ）、またはろ過と組み合わせたＵＶを使用して処理される。
【００５９】
一実施形態では、バイオリアクターは、産生バイオリアクターである。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。関連する実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。
【００６０】
一実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、無血清の既知組成細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、灌流細胞培養培地である。
【００６１】
一実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６２】
一実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群より選択される。
【００６３】
一実施形態では、組換えタンパク質は、凝結、沈殿、遠心分離、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１つまたは複数によって回収透過物から精製される。
【００６４】
一実施形態では、上記方法は、精製プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び産生プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。
【００６５】
一実施形態では、組換えタンパク質は、医薬的に許容され得る製剤に製剤化される。一実施形態では、上記方法により産生された組換えタンパク質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】単一開口部を有し、単一開口部を通して細胞培養液が出入りする、単一ユニットフィルタシステムの概略図。フィルタは、任意の配向であることができ、精密ろ過膜中空糸の後に限外ろ過膜中空糸を示す。
【図２】限外ろ過プロセス、ｎ＝４（黒丸）と比較した、長期周期的回収プロセス、ｎ＝２（白四角）からの力価。
【図３】限外ろ過プロセス、ｎ＝４（黒丸）と比較した、長期周期的回収プロセス、ｎ＝２（白四角）からの生存細胞密度。
【図４】限外ろ過プロセス、ｎ＝４（黒丸）と比較した、長期周期的回収プロセス、ｎ＝２（白四角）からの生存率（％）。
【図５】７５０ｋＤａフィルタ（白丸）を備えたリアクター及び３０ｋＤａフィルタ（黒丸）を備えたリアクターからの生存率（％）。生存率（％）は、７５０ｋＤａフィルタを備えたリアクターで６日までに８０％まで低減した。３０ｋＤａフィルタを備えたリアクターでの生存率（％）は８０％を超えて１４日間にわたって維持された。
【図６】３０ｋＤａまたは７５０ｋＤａ中空糸フィルタユニットを有するリアクターの上清（黒丸）及び透過物（白四角）において測定されたＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度。３０ｋＤａ上清は、９〜１３日目にわたるＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の蓄積を示す。
【図７Ａ】細胞密度比を与える、１ｇ／Ｌと比較した各Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度（２ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ）での細胞系Ａ及びＢに関する正規化生存細胞密度。比較は、１ｇ／Ｌのそれと比較した全継代でのデータ間でスチューデントのｔ検定を使用してなされた。統計学的有意性：＊≦０．０００１；＊＊≦０．００１；＊＊＊≦０．０１；＊＊＊＊≦０．０５。
【図７Ｂ】１ｇ／Ｌと比較した各Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度（２ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ）での細胞系Ａ及びＢに関する生存率（％）。比較は、１ｇ／Ｌのそれと比較した全継代でのデータ間でスチューデントのｔ検定を使用してなされた。統計学的有意性：＊≦０．０００１；＊＊≦０．００１；＊＊＊≦０．０１；＊＊＊＊≦０．０５。
【図７Ｃ】１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８での細胞直径と比較した、各Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度での細胞系Ａ及びＢに関する細胞直径。比較は、１ｇ／Ｌのそれと比較した全継代でのデータ間でスチューデントのｔ検定を使用してなされた。統計学的有意性：＊≦０．０００１；＊＊≦０．００１；＊＊＊≦０．０１；＊＊＊＊≦０．０５。
【図８】１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（白四角）及び５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（黒丸）での細胞系Ａ及びＢに関する細胞生存率（％）。生存率は、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の濃度を５ｇ／Ｌに増加したとき、９０％を超えて３０日間より長くにわたって維持された。
【図９】１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（黒四角）または５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（白丸）を含有する灌流培地を伴う７５０ｋＤａ  ＡＴＦフィルタを有する２Ｌリアクターで増殖された細胞の生存率に及ぼすプルロニック濃度の効果。
【図１０】１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８で７５０ｋＤａ  ＡＴＦフィルタを有する２Ｌリアクターにおいて増殖する細胞の生存率の回復に与えるＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（最大５ｇ／Ｌまで）の濃度の増加の効果。培地Ａ：黒丸。培地Ｂ：白丸。矢印は、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度が増加したときを示す。
【図１１Ａ】グルコース及びマンノースのＧＣＭＳ定量化。ヘキソースのＧＣ分離に関するＴＩＣ。
【図１１Ｂ】グルコース及びマンノースのＧＣＭＳ定量化。１２Ｃ−ヘキソース及び１３Ｃ−内部標準ヘキソースの両方を含有するヘキソースピークにおいて見いだされる典型的なマススペクトル断片化パターン。
【図１１Ｃ】グルコース及びマンノースのＧＣＭＳ定量化。グルコース及びマンノース定量化に関するアッセイ線形性。
【図１２Ａ】ＩｇＧの高マンノースグリコシル化に及ぼすマンノースの効果。増加する量のマンノースで培養されたＣＨＯ細胞。高マンノースグリコシル化における線形増加はグルコース濃度から独立する。
【図１２Ｂ】ＩｇＧの高マンノースグリコシル化に及ぼすマンノースの効果。増加する量のマンノース及び異なる濃度のグルコースで培養されたＣＨＯ細胞。高マンノースグリコシル化における線形増加はグルコース濃度から独立する。
【図１３】ＰＡＣフィードバックループの概略図。前もって規定した生成物品質特性を送達するために必要とされるＰＡＣプロセスの重要な要素は、ＱＴＰＰ、自動化サンプリング及び特性特異的分析を含むＰＡＴシステム、プロセスを修正するための制御モデル及び特性レベルを調整するための既知のコントロールレバーを有するプロセスである。
【図１４Ａ】単一のリアクター実行を使用して、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを算出した。記号は、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを見出すために使用される測定値である。破線は、結果得られたモデルアウトプットである。点線は、ＭＰＣのために使用された増殖パラメータを使用するモデル当てはめである。図における赤色の実ラインは、この訓練データを生成するために使用されたマンノース供給を示す。高マンノース率（％）。
【図１４Ｂ】単一のリアクター実行を使用して、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを算出した。記号は、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを見出すために使用される測定値である。破線は、結果得られたモデルアウトプットである。点線は、ＭＰＣのために使用された増殖パラメータを使用するモデル当てはめである。図における赤色の実ラインは、この訓練データを生成するために使用されたマンノース供給を示す。リアクターマンノース濃度。
【図１４Ｃ】単一のリアクター実行を使用して、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを算出した。記号は、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを見出すために使用される測定値である。破線は、結果得られたモデルアウトプットである。点線は、ＭＰＣのために使用された増殖パラメータを使用するモデル当てはめである。細胞密度（任意の規模とした算出容積）。
【図１４Ｄ】単一のリアクター実行を使用して、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを算出した。記号は、最小二乗回帰を介してモデルパラメータを見出すために使用される測定値である。破線は、結果得られたモデルアウトプットである。点線は、ＭＰＣのために使用された増殖パラメータを使用するモデル当てはめである。生成物濃度。
【図１５Ａ】モデル予測制御を介する高マンノース率（％）の制御の実証。全ての図において、記号は、測定された値であるが、白抜き記号のみがモデル予測制御に使用された。点線は、測定値及び取られた制御操作を与えられたモデルアウトプットである。図における赤色の実ラインは、ＭＰＣにより決定されるマンノース供給を示す。高マンノース率（％）。
【図１５Ｂ】モデル予測制御を介する高マンノース率（％）の制御の実証。全ての図において、記号は、測定された値であるが、白抜き記号のみがモデル予測制御に使用された。点線は、測定値及び取られた制御操作を与えられたモデルアウトプットである。図における赤色の実ラインは、ＭＰＣにより決定されるマンノース供給を示す。リアクターマンノース濃度。
【図１５Ｃ】モデル予測制御を介する高マンノース率（％）の制御の実証。全ての図において、記号は、測定された値であるが、白抜き記号のみがモデル予測制御に使用された。点線は、測定値及び取られた制御操作を与えられたモデルアウトプットである。任意の規模とした（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｓｃａｌｅｄ）算出容積（ＳＣＶ）としての細胞密度。
【図１５Ｄ】モデル予測制御を介する高マンノース率（％）の制御の実証。全ての図において、記号は、測定された値であるが、白抜き記号のみがモデル予測制御に使用された。点線は、測定値及び取られた制御操作を与えられたモデルアウトプットである。生成物濃度。
【図１６】ＰＡＣ及び非ＰＡＣデータの比較。高マンノース率（％）データを、ＨＩＬＩＣアッセイを介して獲得した。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、高力価の透過物を獲得しつつ連続細胞培養をそのピーク産生に維持することの利点を与える長期周期的回収法を提供する。本発明は、長期周期的回収のための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質生成物を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、新鮮な細胞培養培地をバイオリアクター内に灌流し、細胞培養物をフィルタに通し、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持することを含み、ヌル透過物は、第一の所定のパラメータに到達するまで最初に収集され、そのとき回収透過物は所定の時間にわたって収集され、この後、交互に、第二の所定のパラメータに到達するまでヌル透過物を収集し、次いで回収透過物を所定の時間にわたって収集し、ヌル（ｍｕｌｌ）透過物及び回収透過物の交互収集は、細胞培養が終了するまで継続される、前記方法を提供する。
【００６８】
所定のパラメータは、細胞培養物のいくつかの望ましい特徴、特性、または性能のマイルストーン；例えば、生存細胞密度、圧縮細胞容量または力価または時点を達成することにより到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、生存細胞密度が、１×１０６生存細胞／ｍｌ以上であるときに到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、生存細胞密度が、少なくとも２０×１０６生存細胞／ｍｌ〜３０×１０６生存細胞／ｍｌであるときに到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、圧縮細胞容量が、３５％以下であるときに到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、圧縮細胞容量が、３０％以下であるときに到達されてよい。
【００６９】
所定のパラメータは、時点に基づいてよい。時点は、引き金となる事象または作用後の時間、日数、週数、または月数において測定されてよい。引き金となる事象または作用は、培養における時間または日数、生存細胞密度、圧縮細胞容量、力価の到達、バイオリアクターの接種または回収透過物の収集などの事象後の時間または日数であってよい。一実施形態では、所定のパラメータは、引き金となる事象または作用後、１２時間〜２５時間以内に到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、引き金となる事象または作用後、２４〜７２時間以内に到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、引き金となる事象または作用の４日以内に到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、引き金となる事象または作用の、５日以上後で到達されてよい。一実施形態では、所定のパラメータは、引き金となる事象または作用の、少なくとも２５日後に到達されてよい。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、バイオリアクターの接種後、５〜２５日以内に到達されてよい。一実施形態では、第一の所定のパラメータは、バイオリアクターの接種後、１０〜１２日以内に到達されてよい。一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集後、１２〜７２時間以内に到達されてよい。一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集後、２４〜７２時間以内に到達されてよい。一実施形態では、第二の所定のパラメータは、回収透過物の収集後、２４〜４８時間以内に到達されてよい。
【００７０】
一度所定のパラメータに到達すると、回収透過物は、所定の時間にわたって収集されてよい。一実施形態では、所定の時間は、少なくとも１２〜７２時間である。一実施形態では、所定の時間は、２４〜７２時間である。一実施形態では、所定の時間は、２４〜４８時間である。
【００７１】
一実施形態では、フィルタは、単一ユニットフィルタシステムである。関連する実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素及び組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素を含む。別の実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素の分子量カットオフは、３００ｋＤａ以下である。別の実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素の分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。別の実施形態では組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、限外ろ過膜であり、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、精密ろ過膜である。別の実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、筐体内に含有される。別の実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、中空糸フィルタ構成要素の少なくとも２つの間にスペーサーをさらに含む。
【００７２】
一実施形態では、単一ユニットフィルタシステムを使用してヌル透過物が収集されるとき、それは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素から取り出される。一実施形態では、単一ユニットフィルタシステムを使用して回収透過物が収集されるとき、それは、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する少なくとも１つの中空糸フィルタから取り出される。一実施形態では、透過物は、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタであるフィルタから収集され、新鮮な細胞培養培地は、少なくとも５ｇ／Ｌの非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されるまたは補充される。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体である。別の関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である。
【００７３】
本発明は、組換えタンパク質を回収するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、細胞培養物に少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流することによって細胞培養を維持すること、及び細胞培養物を、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、及び組換えタンパク質を含有する透過物を収集することを含む、前記方法も提供する。一実施形態では、分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。一実施形態では、中空糸フィルタは、精密ろ過膜である。
【００７４】
本発明は、組換えタンパク質を回収するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、細胞培養物に少なくとも１ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流し、及び細胞培養物を組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通し、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持すること；一度所定のパラメータに到達したら、細胞培養物に少なくとも５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合されたまたは補充された新鮮な細胞培養培地を灌流すること、及び細胞培養物を、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、及び組換えタンパク質を含有する透過物を収集することを含む、前記方法も提供する。一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフは、３００ｋＤａ以下である。関連する実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタは、限外ろ過膜である。一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフは、少なくとも５００ｋＤａである。関連する実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタは、精密ろ過膜である。一実施形態では、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ及び組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタは、単一ユニットフィルタシステムの構成要素である。関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体である。別の関連する実施形態では、非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である。
【００７５】
本発明は、単一ユニットフィルタシステムであって、異なる孔径または分子量カットオフの２つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含み、滅菌流路が個別の中空糸間で維持されるように中空糸フィルタ構成要素が互いに一連に固定され、それぞれの中空糸フィルタ構成要素から透過物を独立して除去することができるように、異なる孔径または分子量カットオフの中空糸フィルタ構成要素が、そこから透過物が取り除かれるそれらの中空シェル側に関して互いに単離される、前記単一ユニットフィルタシステムも提供する。一実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有し、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、組換えタンパク質をバイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタである孔径フィルタを有する。一実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、３００ｋＤａ以下の分子量カットオフを有し、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、少なくとも５００ｋＤａの分子量カットオフを有する。一実施形態では、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、限外ろ過膜であり、少なくとも１つの中空糸フィルタ構成要素は、精密ろ過膜である。一実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、筐体内に含有される。一実施形態では、単一ユニットフィルタシステムは、中空糸フィルタ構成要素の少なくとも２つの間にスペーサーをさらに含む。
【００７６】
関連する実施形態では、本発明は、細胞を培養する及び／または組換えタンパク質を発現することを含む組換えタンパク質を回収するための方法であって、バイオリアクターに組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を接種することによって細胞培養を確立すること、新鮮な細胞培養培地をバイオリアクター内に灌流し、細胞培養物を単一ユニットフィルタシステムに通すこと、及び透過物を収集することによって細胞培養を維持することを含み、単一ユニットフィルタシステムはバイオリアクターに取り付けられ、細胞培養物は、単一のポンプシステムによりバイオリアクターから取り出されて単一ユニットフィルタシステム内へと入り、細胞培養物は、単一ユニットフィルタシステムの中空糸の内腔側を通過し、バイオリアクター内に戻り、透過物は、中空糸フィルタ構成要素の１つまたは複数から取り出される、前記方法を提供する。
【００７７】
関連する実施形態では、本発明の方法は、細胞培養プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び／または細胞培養プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。関連する実施形態では、試料は、プロセス分析技術を使用して定量的に及び／または定性的にモニターされる。
【００７８】
本発明の方法の関連する実施形態では、灌流は連続灌流である。一実施形態では、灌流の速度は一定である。一実施形態では、灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる。一実施形態では、灌流は、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断力ポンプまたは交互接線流により達成される。一実施形態では、灌流は、交互接線流により達成される。
【００７９】
関連する実施形態では、本発明の方法は、細胞培養物を温度変化に供することをさらに含み、細胞は、ａ）第一の期間にわたって第一の温度で、及びｂ）第二の期間にわたって第二の温度で培養される。一実施形態では、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。一実施形態では、温度変化は、産生期中に生じる。一実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応し、所定のパラメータを達成することは、静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される。一実施形態では、温度変化は所定のパラメータに反応し、所定のパラメータを達成することは、静電容量に基づくバイオマスプローブを使用して決定される。
【００８０】
本発明の方法の関連する実施形態では、細胞培養は、バイオリアクターに少なくとも０．１×１０６生存細胞／ｍＬを接種することにより確立される。一実施形態では、種菌は、交互接線流ろ過を使用する灌流プロセスの手段で増殖される。一実施形態では、バイオリアクターに入れる前に、細胞培養培地は、ナノろ過、高温短時間法（ＨＴＳＴ）、またはろ過と組み合わせたＵＶを使用して処理される。
【００８１】
本発明の方法の関連する実施形態では、バイオリアクターは、産生バイオリアクターである。一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。
【００８２】
本発明の方法の関連する実施形態では、細胞培養培地は、無血清の既知組成細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、灌流細胞培養培地である。一実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群より選択される。
【００８３】
本発明の方法の関連する実施形態では、組換えタンパク質は、凝結、沈殿、遠心分離、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１つまたは複数によって回収透過物から精製される。一実施形態では、本発明の方法は、精製プロセス中に試料を採取すること、組換えタンパク質及び精製プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために試料を評価することをさらに含む。一実施形態では、試料は、プロセス分析技術を使用して定量的に及び／または定性的にモニターされる。一実施形態では、組換えタンパク質は、医薬的に許容され得る製剤に製剤化される。
【００８４】
本発明は、本発明の任意の方法により産生される組換えタンパク質も提供する。
【００８５】
細胞培養
「細胞培養」または「培養」は、多細胞生物または組織外での細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳類細胞に好適な培養条件は、当該分野において既知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳類細胞は、懸濁液中で培養されてよいかまたは固体基質に付着される間に培養されてよい。
【００８６】
本明細書で用いるとき、「細胞を培養する培地」（「培養培地」、「細胞培養培地」、「組織培養培地」とも呼ばれる）という用語は、細胞、例えば、動物または哺乳類細胞を増殖させるために使用される任意の栄養液を指し、通常、以下：エネルギー源（通常は、グルコースなどの炭水化物の形態）；全必須アミノ酸の１つまたは複数、及び一般に２０種の塩基性アミノ酸、とシステイン；ビタミン及び／または典型的に低濃度で必要とされる他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；ならびに微量元素、例えば、通常はマイクロモル範囲の非常に低い濃度で典型的に必要とされる無機化合物または天然に存在する元素からの少なくとも１つまたは複数の成分を提供する。
【００８７】
栄養液は、細胞の増殖を最適化するために、ホルモン及び他の増殖因子、例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、血清、等；塩、例えば、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩、及び緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ；ヌクレオシド及び塩基、例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン；及びタンパク質及び組織加水分解物、例えば、加水分解植物または動物タンパク質（ペプトンまたはペプトン混合物、これは、動物副産物、精製ゼラチンまたは植物材料から得ることができる）；抗生物質、例えば、ゲンタマイシン；ポリアミン、例えば、プトレスシン、スペルミジン及びスペルミン（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ２００８／１５４０１４を参照されたい）及びピルベート（米国特許第８０５３２３８号を参照されたい）、抗アポトシス性（ａｎｔｉ−ａｐｏｔｏｔｉｃ）化合物、例えば、ＭＤＬ２８１７０、シペルメトリン、シクロスポリンＡ、ＢＢＭＰ、ボンクレキン酸、Ｓ−１５１７６ジフメレート、環状ピフィスリン−α、ピフィスリンミュー、ＢＩ−６Ｃ９、ＮＳＣＩ、ＮＳ３６９４またはネクロスタチン−１（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ２０１４／０２２１０２を参照されたい）などの追加の成分を、培養される細胞の要件及び／または所望の細胞培養パラメータに応じて任意選択で補充されてよい。
【００８８】
非イオン性界面活性剤も細胞培養培地に加えてよい。非イオン性界面活性剤の例には、これらに限定されないが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコスル（ｇｌｙｃｏｓｌ）、及び非イオン性ブロック共重合体界面活性剤が挙げられる。また、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）の共重合体（ＥＯ−ＰＯブロック共重合体）、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド（例えば、ショ糖モノステアリン酸、ラウリルジグルコシド、またはソルビタンモノラウレート、オクチルグルコシド及びデシルマルトシド）、脂肪族アルコール（セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、またはコカミド（コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ及びコカミドＴＥＡ）も含まれる。
【００８９】
また、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドをベースとするブロック共重合体、別称ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体も含む。これらの分子は、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖を有する非イオン性トリブロック共重合体である。特に対象となるのは、７０ポリオキシプロピレン単位及び３０単位のそれぞれのポリオキシエチレン鎖を有するものである。好ましい実施形態では、ブロック共重合体は、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ−１８８、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、及びＬｕｔｒｏｌ（登録商標）１８８などの様々な商標名で販売されている、ポロクサマー１８８（ＣＡＳ番号９０００３−１１−６、有する平均分子量は８．４ｋｄ、ＢＡＳＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ニュージャージー州、ワシントン）である。
【００９０】
これらのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体は、リアクター内の散布及び泡に起因する気泡により誘発される死から細胞を保護するために使用される。本明細書に記載のように、細胞培養培地（１ｇ／Ｌ）において典型的に使用されるポロクサマー１８８のレベルは、細胞培養物が精密ろ過に曝露されたときに交互接線流（ＡＴＦ）灌流システム内で高い剪断力から細胞を保護するのに十分でない可能性がある。本明細書に記載のように、ポロクサマー１８８などのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体を、５ｇ／Ｌなどの高濃度で加えることは、細胞生存率に正の影響を与え、これは、ＡＴＦ灌流条件下でのより長い培養期間を可能にした。
【００９１】
細胞培養培地は、これらに限定されないが、細胞の、バッチ、長期バッチ、流加及び／または灌流または連続培養などの、任意の細胞培養プロセスにおいて典型的に採用される及び／またはそこでの使用が既知であるものを含む。
【００９２】
「ベース」（またはバッチ）細胞培養培地または供給培地は、細胞培養を開始するために典型的に使用され、細胞培養を支持するのに十分に完全である、細胞培養培地を指す。
【００９３】
「増殖」細胞培養培地または供給培地は、指数関数的増殖の期間である「増殖期」中の細胞培養において典型的に使用され、この期間中に細胞培養を支持するのに十分に完全である細胞培養培地を指す。増殖細胞培養培地は、宿主細胞系に組み込まれた選択可能マーカーに耐性または生存を与える選択薬剤も含有してよい。そのような選択薬剤には、ジェネテシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシイミン、メトトレキサート、グルタミン不含細胞培養培地、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン、またはチミジンのみを欠く細胞培養培地が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
「産生」細胞培養培地または供給培地は、指数関数的増殖が終了する遷移時中及びその後の遷移時及び／またはタンパク質産生が取って代わる産生期中の細胞培養において典型的に使用される、細胞培養培地を指す。そのような細胞培養培地は、この期間中に所望の細胞密度、生存率及び／または産生力価を維持するのに十分に完全である。
【００９５】
「灌流」細胞培養培地または供給培地は、灌流または連続培養法によって維持される細胞培養において典型的に使用され、このプロセス中に細胞培養を支持するのに十分に完全である細胞培養培地を指す。灌流細胞培養培地製剤は、使用済み培地を除去するために使用する方法を適応させるためにベース細胞培養培地製剤よりも濃厚であるまたはより濃度が高くてよい。灌流細胞培養培地は、増殖及び産生期の両方の間で使用することができる。
【００９６】
細胞培養培地成分は、粉末培地製剤へと完全に粉砕；必要に応じて細胞培養培地に液体補充の添加を伴って部分的に粉砕；または細胞培養物に完全に液体形態で加えられてよい。
【００９７】
細胞培養物は、細胞培養の産生期の経過中に消費される、栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮供給培地を補充されることができる。濃縮細胞培養培地は、細胞培養を維持するために必要ないくつかまたは全ての栄養素を含有することができ；具体的には、濃縮培地は、細胞培養の産生期の経過中に消費されると同定されたかまたは知られている栄養素を含有することができる。濃縮培地は、任意の細胞培養培地製剤に大体基づいてよい。濃縮供給培地は、細胞培養培地のいくつかまたは全ての成分を、その通常量の、例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、またはさらには約１０００倍で含有することができる。
【００９８】
細胞培養物は、製剤することが難しくあり得るまたは細胞培養物において素早く枯渇する特定の栄養素の独立した濃度の供給を補充されることもできる。そのような栄養素は、チロシン、システイン及び／またはシスチンなどのアミノ酸であってよい（例えば、ＷＩＰＯ公開第２０１２／１４５６８２を参照されたい）。一実施形態では、細胞培養物中のチロシンの濃度が８ｍＭを超えないように、チロシンの濃縮液は、チロシンを含有する細胞培養培地中で増殖する細胞培養物に独立して供給される。別の実施形態では、チロシン及びシスチンの濃縮液は、チロシン、シスチンまたはシステインを欠く細胞培養培地中で増殖している細胞培養物に独立して供給される。この独立供給は、産生期の開始前または開始時に始めることができる。この独立供給は、濃縮供給培地と同じまたは異なる日に細胞培養培地に流加することによって達成することができる。この独立供給は、灌流された培地と同じまたは異なる日に灌流されることもできる。そのような独立供給は、１日または複数日後に細胞培養培地に加えられることができ、細胞培養培地中のチロシン、システイン及びシスチン枯渇が回避される限り、産生期の経過中に反復して加えられることもできる。
【００９９】
方法を、フィードバック制御を採用しないものなどの、哺乳類細胞培養への連続供給に採用することができる（ＷＩＰＯ公開第ＷＯ２０１３／０４０４４４を参照されたい）。
【０１００】
細胞培養培地は、ある特定の実施形態では、無血清であるか及び／または動物起源の生成物もしくは構成要素を含まない。細胞培養培地は、ある特定の実施形態では、その全ての化学成分が既知である場合に、既知組成である。
【０１０１】
動物または哺乳動物細胞は、培養される特定の細胞に好適である培地中で培養され、これは過度な実験を行うことなく当業者によって決定することができる。市販の培地を活用することができ、イスコブ変法ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０、最小必須培地−アルファ．（ＭＥＭ−アルファ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、アルファＭＥＭ、基礎培地イーグル（アールＢＳＳ含む）、ＤＭＥＭ高グルコース（グルタミン含有）、ＤＭＥＭ高グルコース（グルタミン不含）、ＤＭＥＭ低グルコース（グルタミン不含）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２１：１（グルタミン含有）、ＧＭＥＭ（グラスゴーＭＥＭ）、ＧＭＥＭ（グルタミン含有）、グレース完全昆虫培地、グレース昆虫培地（ＦＢＳ不含）、ハムＦ−１０（グルタミン含有）、ハムＦ−１２（グルタミン含有）、ＩＭＤＭ（ＨＥＰＥＳ及びグルタミン含有）、ＩＭＤＭ（ＨＥＰＥＳ含有及びグルタミン不含）、ＩＰ４１昆虫培地、１５（リーボビッツ）（２Ｘ）（グルタミンまたはフェノールレッド不含）、１５（リーボビッツ）（グルタミン不含）、マッコイ５Ａ改変培地、培地１９９、ＭＥＭイーグル（グルタミンまたはフェノールレッド（２Ｘ）不含）、ＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ（グルタミン含有）、ＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ（グルタミン不含）、ＭＥＭイーグル−ハンクＢＳＳ（グルタミン不含）、ＮＣＴＣ−１０９（グルタミン含有）、リヒターＣＭ培地（グルタミン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（ＨＥＰＥＳ、グルタミン及び／またはペニシリン−ストレプトマイシン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（グルタミン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（グルタミン不含）、シュナイダー昆虫培地または当業者に既知の任意の他の培地が挙げられるがこれらに限定されず、これらは特定の細胞腫について製剤化される。前述の例示的な培地に、必要または所望に応じて、及び当業者に既知で日常的な技術を用いて実施されるように、補足成分または構成要素を加えることでき、それには適切な濃度または量の任意選択的な成分が含まれる。
【０１０２】
培地処理
細胞培養培地は、バイオリアクター及び／または細胞培養物への添加の前に培地を滅菌するまたは消毒するための方法またはデバイスを使用して処理することができる。一実施形態では、細胞培養培地は、高温短時間法（ＨＴＳＴ）を使用して処理される（例えば、米国特許第７，４２０，１８３号を参照されたい）一実施形態では、細胞培養培地は、ろ過と組み合わせたＵＶを使用して処理される（例えば、ＷＩＰＯ公開ＷＯ２００８／１５７２４７；ＷＯ２０１２／１１５８７４；ＷＯ２０１３／０６３２９８及びＷＯ２０１３／１３８１５９を参照されたい）。別の実施形態では、細胞培養培地は、ナノろ過に供される（例えば、Ｌｉｕら、（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：４２５−４３４を参照されたい）。別の実施形態では、細胞培養培地は、溶媒、洗剤、ソラレンまたはベータ−プロピオラクトンなどのウイルスを不活性化する化学物質で処理される。
【０１０３】
細胞
本発明において使用される細胞系（「細胞」または「宿主細胞」とも呼ばれる）は、商業的または科学的対象となるポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている。細胞系は、典型的には、無期限にわたって培養物内に維持されることができる初代培養物から生じる細胞系譜に由来する。細胞は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、または注入を介して導入された発現ベクター（構築物）、例えば、プラスミド等を含有することができ、これらは、培養プロセスにおいて発現及び産生するためのタンパク質をコードするコード配列またはその一部を抱える。そのような発現ベクターは、挿入されるコード配列の転写及び翻訳に必須のエレメントを含有する。当業者に周知でありかつ実践されている方法を使用して、産生されるタンパク質及びポリペプチドをコードする配列、ならびに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、これらの全てが任意の目的のために本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．または前版のいずれか；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、２０１３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，または前版のいずれか；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  １９９０に記載されている。
【０１０４】
動物細胞、哺乳類細胞、培養細胞、動物または哺乳類宿主細胞、宿主細胞、組換え細胞、組換え宿主細胞等は、全て本発明のプロセスに従って培養することができる細胞に対する用語である。そのような細胞は、典型的には、哺乳類から得られたまたは由来する細胞系であり、適切な栄養及び／または他の因子、例えば、本明細書に記載のものを含有する培地内で単層培養または懸濁培養のいずれかに配置されたときに増殖する及び生存することができる。細胞は、典型的には、培養培地内に、タンパク質を発現及び分泌することができるか、または大量の特定のタンパク質を、より具体的には、対象となる糖タンパク質を発現及び分泌するように分子操作することができるものが選択される。宿主細胞により産生されたタンパク質が、宿主細胞に内在性であるまたは相同であることができることが理解されるだろう。あるいは、タンパク質は、宿主細胞に対して非相同、すなわち、異質である、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞により産生及び分泌されたヒトタンパク質。加えて、哺乳類タンパク質、すなわち、哺乳類生物から元々得られるまたは由来するものは、本発明の方法により得られ、細胞により培養培地へと分泌されることができる。
【０１０５】
本発明の組成物を使用して様々な細胞を培養することができる。一実施形態では、培養された細胞は、植物及び／または動物細胞などの真核細胞である。細胞は、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞または鳥類細胞であることができる。培養での増殖に好適な広範な哺乳類細胞系が、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（バージニア州、マナサス）及び他の保存機関ならびに商業的ベンダーから入手可能である。本発明のプロセスにおいて使用することができる細胞は、ＭＫ２．７細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら、１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５−５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒら、１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１−１０９０９；及びＷＯ０１／９２３３７Ａ２）、ジヒドロ葉酸レダクターゼネガティブＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）；ＳＶ４０により形質転換したサル腎ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）；ＨＥＫ２９３細胞、及びＳｐ２／０細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ、Ｄａｕｄｉ細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｓｐ２／０細胞、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）及び樹立細胞系及びそれらの株（例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、２９３細胞、または懸濁培養における増殖のためにサブクローンされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞腫細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝臓由来細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、デトロイト５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはそれらの誘導体）、任意の組織または臓器からの繊維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、大腸、小腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、及び繊維芽細胞及び繊維芽細胞様細胞系（例えば、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）；ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、マッコイ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、またはそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）または当業者に既知の任意の他の細胞型を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
細胞は、タンパク質、例えば抗体の接着、単層及び／または懸濁培養、トランスフェクション、及び発現に好適であってよい。細胞は、例えば、バッチ、流加及び灌流または連続培養法で使用することができる。
【０１０７】
細胞培養物の種類
理解の目的のために、しかし限定するものではなく、タンパク質産生のための細胞培養及び培養実行は、バッチ培養、流加培養、灌流培養またはそれらの組み合わせを含むことができることが当業者により理解されるだろう。バッチ培養では、細胞は、最初に培地内で培養され、この培地は除去、置換または補充されない、すなわち、細胞は、培養実行の間または終了の前に新鮮な培地を「供給」されない。細胞培養物全体が、培養実行の終了時に回収される。
【０１０８】
流加培養については、培養実行時間は、実行中に周期的にまたは連続的に新鮮な培地を培養培地に補充することにより増加する、すなわち、細胞は培養実行中に新しい培地（「供給培地」）を「供給」される。流加培養は、上述のように様々な供給レジメン及び時間、例えば、毎日、１日毎、２日毎等、１日１回以上、または１日１回未満等を含むことができる。さらに、流加培養は、供給培地を連続的に供給されることができる。所望の生成物は、次いで、培養実行の終了時に回収される。
【０１０９】
灌流培養は、連続培養としても知られることがあり、細胞培養物が新鮮な培地（「灌流培地」）の添加を受け、使用済みの培地がバイオリアクターから除去されるものである。灌流は、連続的、段階的、断続的またはこれらのいずれかまたはいずれかの全ての組み合わせであることができる。灌流速度は、１日あたり１作業量未満から多くの作業量であることができる。「灌流流速」という用語は、バイオリアクターを通過する（加えられる及び除去される）培地の量であり、典型的に、所与の時間でのいくつかのまたは複数の作業量として表される。「作業量」は、細胞培養に使用されるバイオリアクター容積の量を指す。一実施形態では、灌流流速は、１日あたり１作業量以下である。灌流供給培地は、灌流栄養濃度を最大化して灌流速を最小化するように製剤化することができる。
【０１１０】
好ましくは、細胞は培養物中に保持され、除去される使用済み培地は、細胞を実質的に含まないかまたは細胞培養物よりも有意に少ない細胞を有する。細胞培養物により発現される組換えタンパク質は、使用される保持システムに応じて保持されてよいかまたは細胞培養物から除去されてよい。宿主細胞及び発現された組み換えタンパク質にとってバイオリアクター内の被保持物中に残ること、及び透過物にとって実質的にそれらのいずれかを含まないことまたは有意に少なく有すること（「ヌル透過物」）が好ましいときがある。細胞を保持するが、発現されたタンパク質を透過物中に通すこと（「回収透過物」）が好ましくあり得るときもある。
【０１１１】
灌流は、遠心分離、沈降、またはろ過を含む多くの手段によって達成することができ、例えば、Ｖｏｉｓａｒｄら、（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８２：７５１−６５を参照されたい。一実施形態では、ろ過法が使用される。フィルタには、膜フィルタ、セラミックフィルタ及び金属フィルタが含まれ、任意の形であってよく、それには、渦巻きまたは管状またはシートの形態が含まれる。１つまたは複数のフィルタは、バイオリアクターと、１つにまたは独立して、一連でまたは並行で、流体連通で、接続されることができる。
【０１１２】
中空糸フィルタは、細胞及び／または組換えタンパク質生成物保持のために哺乳類細胞の灌流培養において使用される。細胞培養培地、細胞（全及び溶解）、可溶性の発現した組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質、廃棄物等を含む培養物が、フィルタに導入されたとき、孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）に応じて、中空糸材料は、ある特定の細胞培養物成分を内腔側（内部）に保持し得、中空糸材料の孔径または分子量カットオフに基づいて、ある特定の成分をフィルタに通過させる（透過物）。保持される物質（被保持物）は、バイオリアクターに戻される。新鮮な灌流細胞培養培地をバイオリアクターに加え、透過物を所定の間隔でまたは連続的にフィルタから取り出して、所望または一定のバイオリアクター容積を維持する。透過物は、廃棄される、保留タンク、バッグもしくは袋に保管されるまたはろ過、遠心分離及び／もしくは他の下流精製方法などの別のユニット操作に直接移されることができる。精密ろ過のための中空糸は、典型的に、０．１μｍから５〜１０μｍの範囲の孔径または５００ｋＤａ以上の分子量カットオフを有し、タンパク質を透過物中に通過させるために使用することができる。限外ろ過中空糸は、典型的に、０．０１μｍ〜０．１μｍの範囲の孔径または３００ｋＤａ以下の分子量カットオフを有し、所望のタンパク質を被保持物中に保持し、それをバイオリアクター内に戻すために使用することができる。これは、例えば、回収するための組換えタンパク質生成物を濃縮するために使用することができる。そのようなフィルタは、市販されており、例えば、Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−３０−Ｅ−４ＭＡ、（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）及びＭｉｄｉｋｒｏｓ  ＴＣモジュールＴ０２−Ｅ０３０−１０、Ｔ０２−０５０−１０、Ｔ０２−Ｅ７５０−０５、Ｔ０２−Ｍ１０Ｕ−０６（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州、ランチョ・ドミンゲス）である。
【０１１３】
本発明は、ヌル透過物が収集されるとき、組換えタンパク質生成物を透過物中に通さず、代わりにバイオリアクター内に保持することを可能にする孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタであるフィルタを提供する。本発明は、回収透過物が収集されるとき、組換えタンパク質が中空糸を通過することを可能にする孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタであるフィルタも提供する。
【０１１４】
細胞培養物は、細胞培養物を中空糸の内腔側に通過させるポンプシステムによってバイオリアクターからフィルタ内へと取り出される。細胞ポンプシステムの例には、蠕動ポンプ、ダブルダイヤフラムポンプ、低剪断ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ（登録商標）ポンプ、スイス、チューリッヒ）及び交互接線流システム（ＡＴＦ（商標）、Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州、パイン・ブルック、例えば、米国特許第６，５４４，４２４号；Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７），６２−６３を参照されたい）が挙げられる。透過物は、蠕動ポンプを使用することによってフィルタから取り出されてよい。
【０１１５】
単一ユニットフィルタシステム
本発明は、単一ユニットフィルタシステムであって、任意選択で筐体内に含有された単一ユニットフィルタシステム内で一連に組み合わされた異なる孔径または分子量カットオフの２つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含み、単一の細胞ポンプデバイスによって操作することができる、前記単一ユニットフィルタシステムを提供する。これにより、１つのフィルタシステム（図１）を介して（ヌル透過物を除去する）生成物保持様式または（回収透過物を除去する）生成物収集様式で収集することが可能になる。単一ユニットフィルタシステムは、回収サイクル中に宿主細胞タンパク質及び他の廃棄物を細胞培養物から除去して、細胞培養の期間を延長する利点を提供する。単一ユニットフィルタシステムは、潜在的に、より高い回収効率に対してフィルタの汚染可能性はより少ない。単一ユニットフィルタシステムは、下流の精製カラムのより容易な及び効率的なローディングのための複数のより小さなバッチにおいて透過物を提供することができる。単一ユニットフィルタシステムは、連続製造プロセスの一部として使用してよい。
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【０１１６】
単一ユニットフィルタシステムの機器構成には、全てのフィルタが互いに及びバイオリアクターに流体連通し、単一のポンプデバイスによって操作し得るように、一連で構成された、異なる孔径または分子量カットオフを有する２つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含む。そのような中空糸フィルタ構成要素は、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ及びＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。細胞培養物が全てのフィルタを流通する一方で、透過物は、一度に１つまたは複数のフィルタから選択的に除去されてよい。透過物（ヌルまたは回収）は、適切な中空糸構成要素からその孔径または分子量カットオフに基づき透過物を取り出すことによって除去される。ヌル透過物及び回収透過物は、個別の蠕動ポンプの使用により別々に及び独立して除去される。透過物収集の時期及び比率は、それらの別々の蠕動ポンプを通して制御することができる。
【０１１７】
個別の中空糸フィルタ構成要素は、本出願に好適な任意の機器構成に配置してよい。一実施形態では、細胞培養物の組換えタンパク質生成物が細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持されるように孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ構成要素（複数可）は、バイオリアクターからの細胞培養物流を最初に受けるように配置される。
【０１１８】
単一ユニットフィルタシステムの機器構成により、回収透過物及びヌル透過物を、隔離様式で及び除去の相対的な容積比及び時期を望ましく制御することができるような様式でバイオリアクターから除去することが可能になる。透過物は、単一ユニットフィルタシステムから灌流速度と同じ速度で収集される。
【０１１９】
市販の中空糸フィルタ構成要素を使用することに加えて、中空糸材料は、ポッティング領域によって互いに単離されている２つの別々の領域を単一のフィルタ内に有するように構築されてよい。さらに、異なる孔径または分子量カットオフを有する別々の中空糸は、２つの透過物側を単離するために真ん中のポッティング区域内のコネクタ領域によって接合されてよい。各孔径ドメインは、中空糸の長さにわたって、他の孔径シェル側ドメインから単離された対応するシェル側を有し得、ゆえに透過物は、他と独立して各孔径シェル側ドメインから取り出され得る。
【０１２０】
フィルタは、中空糸フィルタ構成要素間での流体連通を可能にする任意の方法によって互いに固定されてよい。フィルタ構成要素は、１つに接着または溶接されてよい。フィルタは、トライクランプ（ｔｒｉ  ｃｌａｉｍ）などのクランプ、またはフィルタユニットを１つ固定しフィルタ間の流体連通を可能にする他の機械的デバイスにより１つに接合されてよい。フィルタ筐体は、直接またはねじ付き連結部を通してのいずれかでフィルタユニットを接合するために使用される雌ねじ及び雄ねじ区域を伴って提供されてよい。フィルタは、任意のタイプのロッキング機構により接続されてもよい。
【０１２１】
２つのフィルタを直接端と端をつけて配置することは、細胞の流れを妨げて細胞に剪断による傷害を引き起こし得る中空糸間での密着結合またはわずかなずれを創出する可能性がある。結果として、フィルタの配置に帰する生存率の落下が起こり得る。１フィルタの内腔から隣の中空糸の内腔への間で細胞の流れがより容易に移行することを可能にする、隣接するフィルタユニットの間にいくらかの距離を提供するスペーサーまたは連結器を、フィルタユニットの間で使用してよい。スペーサーは、個別のフィルタユニットを互いに分離し、そこから透過物が取り出されるそれぞれの中空シェル側の単離も維持する一方で個別の中空糸間での滅菌流路を可能にする。
【０１２２】
そのようなスペーサーは、フィルタ間で固定した及び滅菌した接続を作り、フィルタ間での流体連通を可能にすることができるだろう任意の材料から作成されてよい。そのようなスペーサーは、フィルタに自己封着してよい。スペーサーは、接合されているフィルタに接着または溶接されてよい。スペーサーは、クランプなどのスペーサーをフィルタに固定する機械的デバイスによりフィルタに固定されてよい。スペーサーは、直接またはねじ付き連結部を通してフィルタにスペーサーを固定するために使用される雌ねじ及び雄ねじ区域を伴って提供されてよい。スペーサーは、任意のタイプのロッキング機構により接続されてもよい。
【０１２３】
単一ユニットフィルタシステムは、特に、２つを超えるフィルタが一連に構成されているとき、使い勝手のために任意選択で外側筐体により囲まれてよい。外側筐体は、プラスチック製またはフィルタユニットの内側の材料に滅菌障壁を維持するだろう他の好適な材料で作成されてよい。筐体は、市販の中空糸フィルタ上にあてはめるように作成された二次的な囲いであってよいか、または筐体は、接続された中空糸フィルタのための主要な筐体として製造されてよい。筐体は、供給物及び被保持物の導入及び収集を可能にするのに十分な開口部ならびに異なる孔径または分子量カットオフを有する各中空糸フィルタのための少なくとも１つの透過物ポートを有するべきである。
【０１２４】
単一ユニットフィルタシステムは、細胞培養物を中空糸の内腔側に一定の流速で通過させる単一の細胞ポンプシステムと併せて使用されてよく、それを上述している。
【０１２５】
細胞培養プロセス
細胞培養は、動物または哺乳類細胞培養に従来採用されている培養容器及び／または培養装置を使用して組換えタンパク質の小規模産生から大規模産生に適応する条件下で行うことができる。大規模で培養するために、ローラーボトルシステム、充填層型培養デバイス、発酵型槽バイオリアクター、エアリフト型バイオリアクター、流動床バイオリアクター、固定化菌体バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、撹拌槽バイオリアクター、多段バイオリアクター、遠心分離バイオリアクターまたは当業者に既知の任意の他の好適なデバイスなどの機器を使用することができる。単回使用バイオリアクターなどの単回使用バイオ処理機器も使用してよい。マイクロキャリアもバイオリアクターシステムと使用してよい。このシステムは、バッチ、流加または灌流／連続様式で操作することができる。加えて、培養容器は、フィルタ、重力、遠心力等を使用する細胞分離器などの追加の装置を備えていてよい。
【０１２６】
細胞培養物の「増殖期」という用語は、細胞が通常急速に分裂する指数関数的細胞増殖の期間（すなわち、対数期）を指す。細胞は、約１日、または約２日、または約３日、または約４日、または４日以上の期間にわたって増殖期に維持される。細胞が増殖期に維持される時間の持続期間は、例えば、細胞の種類、細胞の増殖の速度及び／または培養条件に基づいて変動するだろう。
【０１２７】
「遷移期」という用語は、増殖期と産生期の間の期間を指す。一般に、遷移期は、その間に増殖期から産生期への変化を支持するように培養条件が制御されてよい時間である。様々な細胞培養パラメータをモニターまたは操作して変化を制御してよく、それには、温度、重量オスモル濃度、ビタミン、アミノ酸、糖、アンモニウム、乳酸、及び塩等の濃度の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
「産生期」という用語は、細胞増殖が定常に達する／達している期間を指す。対数的な細胞増殖は、典型的に、この期間前または間に低減し、タンパク質産生が優勢になる。流加及び灌流細胞培養プロセスは、この期間中に細胞培養培地を補充するまたは新鮮な培地を提供して、所望の細胞密度、生存率及び／まは組換えタンパク質産生力価を達成する及び／または維持する。産生期は、大規模で実施することができる。大規模細胞培養は、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットル以上の容積で維持されることができる。好ましい実施形態では、産生期は、５００Ｌ、１０００Ｌ及び／または２０００Ｌバイオリアクターで実行される。
【０１２９】
組換えタンパク質の産生は複数の段階においてなされることができる。複数の段階のプロセスでは、細胞は２つ以上の異なる段階において培養される。典型的には、細胞は、細胞増殖及び生存率を最大化する環境的条件下で、最初に１つまたは複数の増殖期において培養され、次いで、タンパク質産生を最大化する環境条件下の産生期に移行する。哺乳類細胞による組換えタンパク質の産生のための商業的プロセスでは、通常、複数、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の増殖期があり、それは最終の産生培養に先行して、異なる培養容器（Ｎ−ｘからＮ−１）において生じる。増殖及び産生期は、１つまたは複数の遷移期に先行されてよいか、またはそれにより分離されてよい。産生期は、大規模で実行することができる。本発明に係る方法は、細胞培養の産生期を長期化するために使用してよい。
【０１３０】
組換えタンパク質の商業的産生のために調製するとき、最終産生培養に先行する細胞培養は、典型的に、２つのプロセス、シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）及び接種トレイン（ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｔｒａｉｎ）を経る。シードトレイン期（Ｎ−Ｘ）は、小規模で起こり、そこでは細胞が素早く数を増やす。接種トレイン期（Ｎ−１）では、細胞は、さらに拡張して、産生バイオリアクターのための接種を生成する。シード及びＮ−１トレインは、任意の培養方法、典型的にはバッチ細胞培養により産生することができる。１５×１０６細胞／ｍＬを超えるＮ−１細胞密度は、産生バイオリアクターに播種するのに典型的である。より高いＮ−１細胞密度及び／または細胞培養培地を調整することは、産生バイオリアクターにおいて所望の細胞密度に到達するために必要とされる時間を低減またはさらには排除することもできる。一実施形態では、より高いＮ−１細胞密度は、交互接線流ろ過を使用する灌流培養を介して達成される。交互接線流ろ過を使用する灌流プロセスの手段によるＮ−１細胞培養物増殖は、任意の所望の密度を提供することができ、９０×１０６細胞／ｍＬ以上の密度などの高い細胞密度を容易に達成することができる。Ｎ−１細胞培養物は、単回ボーラス接種培養物を生成するために使用することができるか、または複数の産生バイオリアクターに接種するように維持される回転シードストック培養物としても使用することができる。接種密度は、産生される組換えタンパク質のレベルに正の影響を有することができる。組換えタンパク質生成物レベルは、接種密度の増加とともに増加する傾向がある。力価の改善は、より高い接種密度のみに縛られず、産生内に配置される細胞の代謝及び細胞周期状態により影響される可能性が高い。Ｎ−１プロセスの間、細胞培養物は、産生バイオリアクターへの接種の前に産生期に入ることが可能であってよい。そのような接種は、産生を、産生バイオリアクターにおいてすぐに開始することを可能にする。
【０１３１】
「細胞密度」という用語は、培養培地の所与の容積中の細胞の数を指す。「生存細胞密度」は、標準の生存率アッセイ（トリパンブルー色素排除法など）によって決定される、培養培地の所与の容積中の生細胞の数を指す。「圧縮細胞容量率（％）」（ＰＣＶ率（％））とも称される「圧縮細胞容量」（ＰＣＶ）という用語は、細胞培養物の全容積に対する細胞が占める容積の比率であり、百分率で表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒら、（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｄｅｃ  ２０：９５（６）：１２２８−３３を参照されたい）。圧縮細胞容量は、細胞密度及び細胞直径の関数であり、圧縮細胞容量の増加は、細胞密度もしくは細胞直径またはその両方の増加に起因し得る。圧縮細胞容量は、細胞培養物中の固形分の尺度である。宿主細胞の大きさが変動し、細胞培養物が死細胞及び死にかけている細胞ならびに他の細胞残屑も含有するため、圧縮細胞容量は、細胞培養物中の固形分をより正確に説明することができる。例えば、５０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有する２０００Ｌの培養物は、細胞の大きさに応じて非常に異なる圧縮細胞容量を有する。加えて、いくつかの細胞は、増殖停止状態にあるときに、大きさを増加させ、増殖停止前及び増殖停止後の圧縮細胞容量は、細胞の大きさの増加の結果としてのバイオマスの増加のために、異なる可能性が高いだろう。産生期中のより少ない圧縮細胞容量は、より高い細胞密度の灌流培養物を妨害し得る溶存酸素散布問題を軽減するのに役立つ。より少ない圧縮細胞容量は、より小さい培地保存容器の使用を可能にするより小さい培地容積も可能にし、より遅い流速と組み合わせることができる。より少ない圧縮細胞容量は、より高い細胞バイオマス培養物と比較して、回収及び下流処理への影響も低い。これらは全て、組換えタンパク質治療薬の製造に関連する費用を削減する。
【０１３２】
一実施形態では、本方法は、産生期中の圧縮細胞容量は３５％以下であることを含む。関連する実施形態では、圧縮細胞容量は３０％以下である。
【０１３３】
一実施形態では、３５％以下の圧縮細胞容量での哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、１０×１０６生存細胞／ｍｌ〜８０×１０６生存細胞／ｍｌである。関連する実施形態では、哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、２０×１０６生存細胞／ｍｌ〜３０×１０６生存細胞／ｍｌである。
【０１３４】
細胞培養制御
本発明の方法に好適な細胞培養条件は、細胞のバッチ、流加、もしくは灌流（連続）培養に関して典型的に採用される及び知られているものまたはこれらの方法の任意の組み合わせであり、ｐＨ、溶存酸素（Ｏ２）、及び二酸化炭素（ＣＯ２）、撹拌及び湿度、ならびに温度に注意を払う。組換えタンパク質産生の間、細胞が所望の時間にわたってまたは所望の密度まで増殖し、その後細胞の生理学的状態が、増殖が制限または停止した、細胞がエネルギー及び基質を使用して細胞密度を増加させるために組換えタンパク質を産生する高生産特性態に切り替えられる、制御されたシステムを有することが望ましい。商業的規模の細胞培養及び生物学的治療薬の製造については、産生期中に細胞増殖を制限するまたは停止し、細胞を増殖制限または停止状態に維持することができる能力が非常に望ましい。そのような方法には、例えば、温度変化、タンパク質産生の化学誘導物質、栄養制限または飢餓及び細胞周期阻害剤、の単独または併用のいずれかでの使用が含まれる。
【０１３５】
増殖を制限するまたは停止するための１つのそのようなメカニズムは、細胞培養中に温度を変化することである。例えば、増殖期は、より高い温度で発生し得、より低い温度への変化は産生期を開始及び／または維持し得る。例えば、増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第一の温度設定点で発生し得、産生期は、約２９℃〜約３７℃、任意選択で約３０℃〜約３６℃または約３０℃〜約３４℃の第二の温度設定点で発生し得る。
【０１３６】
温度設定点を切り替えることは、手動でなされることができるかまたはバイオリアクター制御システムを使用することにより自動的になされることができる。温度設定点は、所定の時間でまたは細胞密度、力価、もしくは１つもしくは複数の培地成分の濃度などの１つもしくは複数の細胞培養パラメータに応答して切り替えられてよい。１つのそのような方法は、バイオリアクター制御システム内に統合されたオンラインバイオマスモニタリングツールを使用して、所望の細胞密度に到達したときに温度設定点変更を引き起こす。例えば、静電容量に基づくバイオマスプローブは、オンラインでの細胞密度推定のために使用されてよく、オンライン測定からのデータを使用してバイオリアクター温度における変化を引き起こすことができる。そのような静電容量に基づくプローブは、Ｆｏｇａｌｅの静電容量センサ（ＤＮ１２−２００）（フランス、ニーム）を含む。
【０１３７】
加えて、カフェイン、酪酸塩、及び／またはヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学誘導物質は、温度変化と同時に、温度変化の前に、または温度変化の後に加えてよい。誘導物質が温度変化後に加えられる場合、それらは、温度変化の１時間〜５日間後、任意選択で、温度変化の１〜２日後に加えられることができる。細胞培養物は、細胞が所望のタンパク質（複数可）を産生する間、数日間またはさらには数週間にわたって維持されることができる。
【０１３８】
細胞を所望の生理学的状態に維持するための別の方法は、細胞培養物を低Ｌ−アスパラギン条件及び／またはアスパラギン飢餓に暴露することにより細胞増殖停止を誘導することである（例えば、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ２０１３／００６４７９を参照されたい）。細胞増殖停止は、制限濃度のＬ−アスパラギンを含有する培養培地及び細胞培養物中の低濃度のＬ−アスパラギンを維持することを通して達成及び維持されてよい。Ｌ−アスパラギンの濃度を５ｍＭ以下に維持することは、細胞を増殖停止された状態に誘導する及び維持するために使用することができ、それにより生産性が増加する。
【０１３９】
細胞周期進行及びこれに関連する転写、ＤＮＡ修復、分化、老化及びアポトーシスの関連するプロセスを制御すると知られているまたは疑われている化合物である細胞周期阻害剤も、細胞増殖停止を誘導するのに有用である。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などの周期機構と相互作用する細胞周期阻害剤は、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ及び細胞周期に直接または間接的に影響する他の経路などの他の経路からのタンパク質と相互作用する分子のように有用である。
【０１４０】
回収及び精製
発現した組換えタンパク質は、そこからそれらを回復及び／または収集することができる培養培地中に分泌されてよい。次いで、組換えタンパク質は、好適な医薬製剤及び／または保管へと、回収、精製、エンドトキシン及び／またはウイルス不活性化／ろ過、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを含む１つまたは複数の処理ステップに供されてよい。
【０１４１】
発現した組換えタンパク質は、回収透過物中に捕獲されてよい。タンパク質は、当該分野で既知である及び／または商業的ベンダーから入手可能なプロセス及び市販製品を使用して回収透過物から精製される、または部分的に精製されてよい。そのような方法には、他の利用可能な方法のなかでも、凝結；遠心分離；沈殿；深層ろ過などのろ過方法；アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーが含まれる。
【０１４２】
精製されたタンパク質は、次いで「製剤化される」ことができ、これは、緩衝液が交換され、滅菌され、バルク包装され、及び／または最終使用者用に包装されることを意味する。医薬組成物に好適な製剤には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載のものが含まれる。
【０１４３】
プロセス分析技術
プロセス分析技術及び方法は、組換えタンパク質及び産生プロセスの特徴を定量的に及び／または定性的にモニターするために細胞培養及び精製プロセス中に採取された試料をモニターする及び評価するために利用可能である。このリアルタイムまたはインライン情報を使用して、力価、細胞密度；翻訳後修飾などの生成物品質特性；不純物などの生成物またはプロセス変動性などの生成物及び産生パラメータをモニター及び／または制御してタイムリーな決断及び修正プロセスを必要に応じて行うことができる。例えば、グリカン種の分布、酸化レベルまたは脱アミド化などの生成物品質特性をモニター及び／または制御することができる。
【０１４４】
上流の細胞培養プロセスまたは下流の精製プロセスの各ステップをモニターして、特定の生成物品質特性（ＰＱＡ）の量に関する情報を提供してよい、及びこのＰＱＡを前もって設定した標的及び範囲で制御してよい。
【０１４５】
試料は、断続的に、所望の頻度で、または連続的に採取されてよい。試料は、リアルタイムまたは準リアルタイムで分析されてよいか、または後の分析のために保管されてよい。この情報を使用して、上流及び下流プロセス中に変更をなすことができる。
【０１４６】
生成物品質特性の検出は、質量分析、ＵＶ及び／または質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動等を使用して行ってよい。
【０１４７】
これらのプロセスは、特定の生成物品質特性のレベルによって決定される、供給、温度、プロセス持続期間などの手動または自動プロセス調節を伴う連続モニタリングに適応可能である。
【０１４８】
アミノ酸プロセシング及びグリコシル化などの翻訳後修飾の存在を検出するためのインタクト質量分析は、サイズ排除様式で操作され、ＥＳＩ−ＭＳと結合された、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドカラムを使用してなされてよい（Ｂｒａｄｙら、（２００８）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏ，１９：５０２−５０９）。
【０１４９】
リアルタイムモニタリングは、レーザー光散乱検出器及びＵＶ吸光度を使用して各割合について正規化ＬＳ／ＵＶ比率をモニターすることによりイオン交換クロマトグラフィーから溶出される、米国特許公開第ＵＳ２０１３−０３０３７３２を参照されたい。
【０１５０】
多特性方法は、単一の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、タンデムＭＳデータを検索及び特徴づけし、これは様々なデータベース及び検索プラットホーム、例えば、Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州、ラホヤ）、Ｘ！タンデム（Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）またはＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州、ボストン）を使用する。試料は、高いｐＨで変性されてよいかまたはジスルフィドイソ型を維持しスクシンイミド変異体を保護するために、低いｐＨで変性されてよい。次いで、試料は、還元及びアルキル化され、その後トリプシンで消化される。次いで、試料をＭＳ（例えば、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ウォルサム）内に注入し、分析をＰｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行する。同定される、定量化される及びモニターされることができる特性には、異性化、脱アミノ、ジスルフィド還元、宿主細胞タンパク質汚染、変異、誤取り込み、ヒドロキシリジン、チオエーテル、非グリコリス化（ｇｌｙｃｏｌｙｓａｔｅｄ）重鎖、Ｃ末端アミド化、残余プロテインＡを含み、グリカンを特徴づけ、分子同一性を提供する。モニターされる各特性についての質量精度は、予測される質量の５ｐｐｍ未満に設定することができる。ペプチド／特性の同定は、ＭＳ２断片化及びオルトゴナルな特徴評価方法（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、グリコシル化に対するＨＩＬＩＣ−ＭＳ）により確かめられる。実験的な同位体分布は、理論的な同位体分布と比較したとき０．９５より良好なドット積スコアを有さなければならない。保持時間ウィンドウは、各特性について設定され、各特性に関する全ての検出可能な荷電状態は、定量化のために考慮される。特性における変化を検出するだろう判定基準が定義される。例えば、脱アミノは、脱アミノ値（脱アミノ化ペプチドを脱アミノ化ペプチド及び未修飾親ペプチドの合計で割って１００を乗じたものを決定することによってモニターすることができる。グリコシル化は、各特定のグリカンを全ての検出可能なグリカンの合計に対して比較することによってモニターすることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、プロセス分析技術は、「生成物特性制御」（ＰＡＣ）も含んでよい。ＰＡＣは、複数のＰＡＴ要素をバイオプロセスのモデルと組み合わせて１つまたは複数のＣＱＡのリアルタイムフィードバック制御をおこなう。この新しいＰＡＣプロセスは、バイオ医薬品のＱｂＤ産生の実装の例である。ＰＡＣプロセスは、ＣＱＡに影響することができるコントロールレバーの使用を利用する。コントロールレバーは、ＱＴＰＰで指定された所望の標的にＣＱＡを維持するためにモデルベースの制御ループ内に組み込まれる。具体的には、コントロールレバーは、数学的にモデル化することができる方法でＣＱＡに影響するプロセスパラメータに対する調整である。例えば、阻害剤またはアクチベーターのレベルは、これらの影響が数学的にモデル化することができるという条件で、生成物のグリコシル化プロファイルを調整ためのグリコシル化酵素活性を制御するために、動的に調整され得る。同様に、温度またはｐＨは、ＣＱＡへのそれらの影響も確かにモデル化できるいう条件で、実行中に調整され得る。
【０１５２】
タンパク質
本明細書で用いるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書を通して互換可能に使用され、ペプチド結合によって相互に結合される２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボース化を含むが、これらに限定されない修飾も含む。
【０１５３】
タンパク質は、タンパク質をベースとする薬物を含む、科学的または商業的目的のタンパク質であることができる。タンパク質は、なかでも、抗体、融合タンパク質、及びサイトカインを含む。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、細胞培養方法を用いて原核生物及び真核生物細胞系によって産生されてよく、「組換えペプチド」、「組換えポリペプチド」、及び「組換えタンパク質」と称してよい。発現されるタンパク質（複数可）は、細胞内で産生されてよいか、またはそれが回復及び／もしくは収集されることができる培養培地内に分泌されてよい。
【０１５４】
本発明の方法により有利に産生されることができる哺乳類タンパク質の非限定的な例には、以下のタンパク質：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質性リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪国特許第５８８８１９号）、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、巨核球成長及び発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６８２；Ｒｕｅｇｇ  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ（１９９５），Ｇｅｎｅ  １６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号及び同第４，８９７４７１号）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病抑制因子、ならびにオンコスタチン−Ｍのうちの１つの全てもしくは一部と同一であるかまたは実質的に類似するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。本発明の方法に従って産生され得るタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１〜３巻（Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）全版；及びＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１巻及び２巻（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００３）において見い出され得る。
【０１５５】
さらに、本発明の方法は、上述のタンパク質のうちのいずれかに対する受容体のアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むタンパク質、そのような受容体もしくは上述のタンパク質のうちのいずれかに対するアンタゴニスト、及び／またはそのような受容体またはアンタゴニストに実質的に類似するタンパク質の産生に有用であるだろう。これらの受容体及びアンタゴニストには、両方の形態の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ、ｐ５５及びｐ７５と称される、米国特許第５，３９５，７６０号及び米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型、欧州特許第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、及び米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３号、同第６，０９６，７２８号、及び同第５，０７５，２２２号）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０３６７５６６号及び米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４を含む）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの死ドメインを含む受容体が含まれる。
【０１５６】
本発明を使用して産生することができる他のタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそれらのリガンドのアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むタンパク質、またはそれらのいずれかに実質的に類似するタンパク質が含まれる。そのような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉら、編、Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）に開示されている。同様のＣＤタンパク質がそれに続くワークショップにて開示されている。そのような抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、及びそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。ＣＤ抗原のうちのいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、それには４１ＢＢ及びＯＸ４０も含まれる。リガンドは、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドであるように、多くの場合、ＴＮＦファミリーのメンバーである。
【０１５７】
酵素的に活性なタンパク質またはそれらのリガンドも、本発明を使用して産生することができる。例には、以下のタンパク質もしくはそれらのリガンドのうちの１つの全てもしくは一部を含むタンパク質、または以下のうちの１つに実質的に類似するタンパク質が挙げられる：ＴＮＦ−アルファ変換酵素を含むディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインファミリーメンバー、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポ蛋白Ｅ、アポリポ蛋白Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１抗トリプシン、上述の酵素のうちのいずれかのリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそれらのリガンド。
【０１５８】
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプもしくはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリン及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及、または特異的結合についてインタクト抗体と競合するその抗原結合性領域への言及を含み、別途明記されない限り、ヒト、ヒト化、キメラ、多特異的、モノクローナル、ポリクローナル、及びオリゴマー、またはそれらの抗原結合性断片を含む。抗原結合性断片または領域、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、一本鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び標的ポリペプチドに対する特異的抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを有するタンパク質も含まれる。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離される抗体などの組換え手段によって調製、発現、創出、または単離される抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
抗体の例には、上述のタンパク質及び／または以下の抗原：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号及び同第５，１４９，７９２号を参照されたい）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、及びｚＴＮＦ４としても知られる；Ｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌と関連して発現される遺伝子生成物）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵臓癌を有する患者の血清において上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳癌細胞、結腸癌細胞、扁平上皮癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、及び／もしくは腎癌細胞ならびに／またはメラノーマ、グリオーマ、もしくは神経芽腫細胞上で発現される癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン付着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子組織因子の阻害剤）、ＭＨＣＩ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ミュータンス連鎖球菌、ならびに黄色ブドウ球菌を含むが、これらに限定されないタンパク質のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを認識する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法を用いて産生することができる既知の抗体の具体例には、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウ���セタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
本発明を使用して、例えば、上述のタンパク質のうちのいずれかを含む組換え融合タンパク質を産生することもできる。例えば、上述のタンパク質のうちの１つに加えて、多量体化ドメイン、例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分、または実質的に同様のタンパク質を含む組換え融合タンパク質を、本発明の方法を用いて産生することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙら、（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙら、（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙら、（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：２５５−６４を参照されたい。そのような組換え融合タンパク質の中でも特に含まれるものが、受容体の一部がエタネルセプト（ｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃ）及びベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）などの抗体のＦｃ部分に融合されるタンパク質である。キメラタンパク質及びポリペプチド、ならびに前述のいずれかのタンパク質及びポリペプチドの、断片もしくは部分、または突然変異体、変異体、または類似体も、本発明の方法により産生することができる好適なタンパク質、ポリペプチド及びペプチドに含まれる。
【０１６１】
本出願で使用される専門用語は、当該分野において標準的なものであるが、特許請求の範囲の意味に対する明確性及び確定性を確かなものにするために、ある特定の用語の定義が本明細書に提供されている。単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳＩに認められた形態で示され得る。本明細書に列挙される数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数を含み、かつそれを支援する。本明細書に記載の方法及び技法は、概して、別途示されない限り、当該分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書を通じて引用され、論じられる様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９５）、及びＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１３）、または任意の前版を参照されたい。特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含むが、これらに限定されない本出願で引用される全ての文書または文書の一部は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。本発明の実施形態において説明されることは、本発明の他の実施形態と組み合わせることができる。
【０１６２】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明となるよう意図される本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されず、機能的に同等の方法及び成分は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示されかつ記載される修正に加えて、本発明の様々な修正は、前の記述及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入るよう意図される。
【実施例】
【０１６３】
実施例１
長期周期的な細胞培養プロセス
この実験は、限外ろ過培養プロセス（ＵＦ）と比較して長期周期的回収（Ｘ−ＰＨ）を伴う細胞培養プロセスを説明する。長期周期的プロセスでは、灌流は、対象となる組換えタンパク質が透過物中に運ばれて生成物回収として収集されるように孔径または分子量カットオフを有する精密ろ過膜に接続された、細胞培養物の組換えタンパク質生成物が、細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持されるように孔径またはＭＷＣＯを有する限外ろ過膜を含む単一フィルタユニットシステムを使用して実行された。灌流は、組換えタンパク質不含透過物、またはヌル透過物、を限外ろ過膜構成要素から所定のパラメータに到達するまで取り出すことによって行われ、この場合は、培養において数日間、そのときに、灌流は、精密ろ過膜構成要素から組み換えタンパク質含有透過物、または回収透過物、を所定の時間にわたって取り出すことによって実行された。所定の時間が経過した後、プロセスを反復した。タンパク質生成物を保持する及び回収するというこのサイクルは、培養が終了するまで反復された。
【０１６４】
限外ろ過培養プロセスについては、細胞は、組換えタンパク質生成物が細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持され、組換えタンパク質不含透過物が回収されるように孔径または分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用した灌流システムにおいて培養された。保持された組換えタンパク質生成物は、培養が終了したときにバイオリアクターからの回収物として回復された。
【０１６５】
長期周期的回収培養プロセス（Ｘ−ＰＨ）
０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２つの２Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、カリフォルニア州、フォスターシティ）内に、１５００ｍｌの作業量の無血清既知組成バッチ培地中１×１０６生存細胞／ｍＬで接種した。培養物を３６℃、４８．０ｍｍＨｇのＤＯ、３５０ＲＰＭでの撹拌に維持した。
【０１６６】
細胞培養をバッチ様式で開始し、灌流を、３０ｃｍの７５０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と一連に接続された３０ｃｍの３０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−３０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を使用するＡＴＦ−２（商標）交互接線流ろ過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージャージー州、ハノーバー）を使用して２日に開始した。サニタリークランプを使用しておおよそ１インチ長のサニタリーコネクタスプール片とフィルタを１つに接合した。培地は、１．５ｇ／Ｌのプルロニック（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ  １８８  ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミズーリ州、セントルイス）を含有する無血清既知組成灌流培地とした。
【０１６７】
灌流速度は、０．５から１．０バイオリアクター作業量／日まで細胞培養実行にわたって徐々に増加され、フィルタユニットを通して均一とした。ヌル及び回収透過物を、独立した灌流ポンプを介して、灌流速度と同じ速度で収集した。試料を毎日バイオリアクターから採取して培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率をＶｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州、ブレア）を使用して決定した。力価は、ＨＰＬＣ分析により測定した。
【０１６８】
グリカン分析については、タンパク質を含有する試料を収集し、プロテインＡにより精製した。精製された試料は、ＰＮＧａｓｅ−Ｆで処理し、３７℃で２時間にわたってインキュベートしてＮ結合グリカンを放出した。酵素的に放出されたグリカンを、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）を用いて８０℃で７５分間標識した。次いで、過剰２−ＡＡ標識をＧｌｙｃｏｃｌｅａｎ  Ｓカートリッジで除去した。試料を一晩蒸発させて、結果得られた乾燥ペレットを、その後のＨＩＬＩＣ（親水性相互作用液体クロマトグラフィー）分析のために水で再構成した。グリカンを注入し、高有機条件下でカラムに結合し、増加するグラジエントのギ酸アンモニウム緩衝水溶液で溶出した。蛍光検出を使用してグリカン溶出をモニターし、主要及び少数グリカン種の相対割合（％）を算出した。
【０１６９】
１１日目の前に、ヌル透過物、または非生成物含有透過物を、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １２０Ｕ／ＤＶ  イギリス、コーンウォール、ファルマス）を使用して３０ｋＤａ精密ろ過膜から透過物を取り出すことにより連続的に収集し、廃棄した。フィルタサイズのために、細胞培養物のタンパク質生成物は、細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持された。
【０１７０】
回収透過物、または生成物含有透過物は、表１に提供するスケジュールに従って細胞培養実行中に５つの分離された所定の時間で収集された。回収透過物は、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １２０Ｕ／ＤＶ  イギリス、コーンウォール、ファルマス）を使用して７５０ｋＤａ限外ろ過膜から透過物を取り出すことにより収集した。細胞培養物のタンパク質生成物は、透過物中に運ばれ、回収透過物の一部として収集された。回収透過物は、上述のように力価及び生成物品質について評価された。回収透過物は、透過物バッグ（ＲＣＢＢ−３００、ＲＩＭ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、ワシントン州、シアトル）中に保管した。
【表１】
2020124207.tif 000002
【０１７１】
それぞれの回収透過物の収集の完了の直後、ヌル透過物を３０ｋＤａ精密ろ過膜フィルタから再度連続して収集し、廃棄した。培養は２４日目の回収透過物の収集の後に終了した。
【０１７２】
限外ろ過膜培養プロセス（ＵＦ）
０日目に、上と同じ組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、４つの２Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、カリフォルニア州、フォスターシティ）内に、１５００ｍｌの作業量の無血清既知組成バッチ培地中１×１０６生存細胞／ｍＬで接種した。培養物を３６℃、４８．０ｍｍＨｇのＤＯ、３５０ＲＰＭでの撹拌に維持した。
【０１７３】
細胞培養をバッチ様式で開始し、灌流を、６０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−３０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を備えたＡＴＦ−２（商標）交互接線流ろ過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージャージー州、ハノーバー）を使用して２日目に開始した。培地は、１ｇ／Ｌプルロニック（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ  １８８  ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミズーリ州、セントルイス）を含有する無血清既知組成灌流培地とした。
【０１７４】
灌流速度は、０．５から１．０作業量／日まで細胞培養実行にわたって徐々に増加された。試料を毎日採取して培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率をＶｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州、ブレア）を使用して決定した。力価をＨＰＬＣ分析により測定した。
【０１７５】
透過物を灌流速度と同じ速度で収集した。フィルタサイズのために、細胞培養物のタンパク質生成物は、培養が１５日目に終了したときに回収されるまで細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持された。
【０１７６】
Ｘ−ＰＨプロセスからの力価プロファイルは、１１日目までＵＦ培養プロセスからの力価と一致した（図２）。力価プロファイルは、最初の７５０ｋＤａ回収サイクルがＸ−ＰＨプロセスに導入されるときに分離する。同様の対応関係が生存細胞密度（図３）及び生存率（％）（図４）において観察された。
【０１７７】
５１日間のバイオリアクター産生期間を使用して、実行の間に産生バイオリアクターの３日間の転換を割り当てて、ＵＦプロセスに対するＸ−ＰＨプロセスの比較を可能にした。この判定基準で、２つの２４日間Ｘ−ＰＨプロセス実行及び３つのＵＦプロセス実行が比較可能な５１日間の期間でなされ得る。
【０１７８】
Ｘ−ＰＨプロセスは、５１日間の産生期間にわたってＵＦプロセスと比較して９８％多く回復される生成物を提供し得る（表２）。これは主に、積算生存細胞密度（ＩＶＣＤ）において２６％増加、及び比生産性において４６％増加を含んだ。Ｘ−ＰＨプロセスは、ＵＦプロセスの３つの実行に対し、２７％多い培地を２つの実行において使用し得るが、これは、ＵＦプロセスと比較してＸ−ＰＨプロセスにより産生される生成物の1グラムあたりの培地必要量（培地コスト）の約３６％低下を意味する。
【表２】
2020124207.tif 000003
【０１７９】
Ｘ−ＰＨプロセス生成物品質を、ＨＩＬＩＣグリカンマッピングによって評価し、１５日間のＵＦプロセスを使用して生成した標準と比較した（表３）。Ｘ−ＰＨプロセスのグリカンマップ特性は、ＵＦプロセスを使用する標準と一致する。
【表３】
2020124207.tif 000004
【０１８０】
実施例２
この実験は、低濃度及び高濃度のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、及び灌流培養システムにおける３０ｋＤａ対７５０ｋＤａフィルタの影響を比較する。
【０１８１】
０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞系を４つの２Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、フォスターシティ）内に、１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州、マウントオリーブ）を含有する１５００ｍｌの作業量の無血清既知組成バッチ灌流培地中２×１０６生存細胞／ｍＬで接種した。培養物を３６℃、４８％の溶存酸素濃度、ｐＨ６．９、３５０ＲＰＭでの撹拌で維持した。
【０１８２】
細胞培養実行を、バッチ様式で開始し；細胞密度が４〜５×１０６細胞／ｍｌに到達した２日目に灌流を開始した。灌流は、ＡＴＦ−２（商標）Ｍ交互接線流灌流及びろ過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージャージー州、ハノーバー）を使用して達成した。細胞培養物を、上端で入れて、外側の垂直に方向付けられたフィルタの内腔側を通して連続して循環させた。透過物を蠕動ポンプにより連続的に取り出した。２つのリアクターは、３０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−３０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を備えた。２つのリアクターは、７５０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を備えた。
【０１８３】
灌流速度は、細胞培養実行にわたって０．５から３ｍＬ／分へと徐々に増加した。透過物試料を、灌流速度と同じ速度で収集した。試料をバイオリアクター及び透過物ラインから１日１回採取した。細胞密度、生存率及び細胞直径を、１０７細胞／ｍｌ未満の細胞密度を得るためにリン酸緩衝生理食塩水で希釈した後、ＣＥＤＥＸ（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州、ナットリー）により測定した。ＣＯ２（ｐＣＯ２）及びＯ２（ｐＯ２）のｐＨ及び部分圧を、血液ガス分析装置を使用して測定し、グルコースの濃度、乳酸塩、グルタミン、アンモニア及びＫ＋及びＮａ＋のイオン濃度をＮｏｖａＦＬＥＸ機器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、マサチューセッツ州、ウォルサム）により維持した。
【０１８４】
７５０ｋＤａフィルタを備えたリアクターでは、細胞の生存率は、６日目までに８０％まで低減した。この低減は、３０ｋＤａフィルタを備えたリアクターでは明らかにならず、ここでは生存率は１４日間にわたって８０％超に維持された（図５）。
【０１８５】
３０ｋＤａ中空糸フィルタを備えたリアクターの上清において最大で７ｇ／ＬまでのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の蓄積が見られた。これらの条件下で、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８は、透過物試料において検出可能レベルより低かった。７５０ｋＤａフィルタを備えたリアクターでは、バイオリアクター上清及び透過物中のＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８のレベルは、比較的一定のままであり、灌流培地でのレベルと同様に１〜１．５ｇ／Ｌの範囲であり、これは、蓄積がなかったことを示す（図６）。Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の平均モル質量は、８，４００Ｄａであり、理論的には、３０ｋＤａフィルタを流通するはずである。Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８ミセルの形成は、１ｇ／Ｌよりはるかに低い濃度で生じることができる（製造業者によると、２０〜２５℃で０．０４ｍＭ）。Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の濃度は、リアクター及びフィルタ内でのミセルの形成のために向上された可能性が高い。
【０１８６】
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８毒性試験
細胞に及ぼす高いＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度の毒性の効果について検査するために、異なるモノクローナル抗体を発現する２つのＣＨＯ細胞系（細胞系Ａ及び細胞系Ｂ）を（３日／継代で）１０継代にわたって繰り越し、初期接種密度は、２５０ｍｌ振とうフラスコ中８×１０５細胞／ｍｌとし、細胞培養培地は、１、２、３、４または５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を含有した。
【０１８７】
細胞密度における全体的な増加は、３日後に観察された（３．４〜６．５×１０６細胞／ｍｌ）。生存細胞密度を、１ｇ／Ｌ条件に正規化して、異なるＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度間の比較を可能にした。
【０１８８】
３、４または５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を含有する培地にて増殖した細胞は、継代にわたって一貫して高く、１ｇ／Ｌ条件と比較して細胞密度において１０％増加が測定された（ｐ＜０．０１）（図７Ａ）。生存率も、より高いＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８培養についてより大きかった（平均＞９５％）（図７Ｂ）。細胞直径も、１ｇ／Ｌ条件（１５．４２μＭ）と比較して全ての条件下で微かに増加すると見いだされた（ｐ＜０．０５）（図７Ｃ）。より高いＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８条件における生存細胞密度、生存率（％）及び直径の変動は、連続継代にわたって変わる特徴に起因する。
【０１８９】
細胞に及ぼす高いＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度の毒性の効果は、モノクローナル抗体を発現する２つのＣＨＯ細胞系を使用して２Ｌの流加培養においても実行された。再度、生存細胞密度、生存率、細胞直径または力価に与える、高いＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の影響はなかった（図８）。
【０１９０】
ＡＴＦ灌流培養物への５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の補充
１ｇ／Ｌと５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を比較する実験を行った。０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞系を、６つの２Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、フォスターシティ）内に、１５００ｍｌの作業量中２×１０６生存細胞／ｍＬで接種した。２つのリアクターは、１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を含有する無血清既定灌流培地を受け、２つのリアクターは、５ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を含有する無血清既定灌流培地を受けた。培養物を３６℃、４８％の溶存酸素濃度、ｐＨ６．９、３５０ＲＰＭでの撹拌で維持した。
【０１９１】
細胞培養実行を、バッチ様式で開始し；灌流を２日目に開始した。灌流は、７５０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を備えたＡＴＦ−２（商標）交互接線流ろ過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージャージー州、ハノーバー）を使用して達成した。灌流速度は３作業量／日とした。
【０１９２】
試料を１日１回バイオリアクター及び透過物ラインから採取し、上述のように検査した。
【０１９３】
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度を５ｇ／Ｌまで増加することで、１４日間にわたって９５％を超える及び最大２５日までにわたって９０％を超える長期生存率の結果がもたらされた（図９）。
【０１９４】
高Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を用いた低Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８濃度培養物の回復
０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞系を４つの２Ｌ産生バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、フォスターシティ）内に、１５００ｍｌの作業量中２×１０６細胞／ｍＬで接種した。細胞培養実行を、バッチ様式で開始し；灌流を２日目に開始した。灌流は、７５０ｋＤａ中空糸フィルタ（Ｘａｍｐｌｅｒ  ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を備えたＡＴＦ−２（商標）交互接線流ろ過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージャージー州、ハノーバー）を使用して達成した。リアクターを２つの２群に分割し、各群は異なる灌流細胞培養培地製剤（培地Ａ及び培地Ｂ）を受けた。両方の培地製剤は、１ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を含有した。培養物を３６℃、４８％の溶存酸素濃度、ｐＨ６．９、３５０ＲＰＭでの撹拌で維持した。培養物を、細胞生存率（％）が８０％に落ちるまでこれらの条件下で維持した。その時、両群用の培地に、追加の４ｇ／ＬのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８を補充した（合計で５ｇ／Ｌ）。培養物を、これらの高プルロニック条件下で３０日目まで維持した。より高い濃度のＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の添加による細胞の生存率の回復を図１０に示す。補充後、生存率（％）は、最大で１５％増加した。細胞生存率の低下を伴う培養物中のより高い濃度のプルロニックの保護効果は、細胞培養培地製剤にかかわらず明らかであった。
【０１９５】
実施例３
この実験は、前もって定義された目標製品品質プロファイル（ＱＴＰＰ）の送達ためのＰＡＣプロセスへの複数のクオリティバイデザイン（ＱｂＤ）要素の試験的な規模適用の成功を実証する。この実験における制御されたＣＱＡは、モノクローナル抗体のＦｃドメイン上の高マンノースＮ結合型グリコシル化（「高マンノース」）とした。
【０１９６】
生成物中の高マンノースのレベルは、細胞培養培地へのマンノースの添加または除去（コントロールレバー）により制御された。しかしながら、代謝生成物前駆体、代謝阻害剤、小分子、酵素補助因子及び誘導性プロモーターも使用され得る。最近の研究は、異なる糖が抗体生成物上の高マンノースのレベルに影響することができることを示している。具体的には、マンノースの供給は、培養物生産性に影響することなく高マンノースのレベルを増加させると示されている。実証研究を通して、細胞培養培地中のマンノース濃度がＩｇＧ高マンノースレベルに与える影響の理解が発展し、細胞培養プロセスへの関係が研究された。小規模試験及び試験的規模での訓練産生実行から得られた知識を組み込んで、モデル予測制御（ＭＰＣ）の原理に基づいたＰＡＣアルゴリズムを開発した。ＭＰＣは、プロセスの数理モデルを使用してその将来の軌道を予測する制御スキームである。典型的なＣＨＯバイオリアクタープロセスの一時的な性質、複数のＣＱＡとそれらのコントロールレバー間の相互作用の可能性、複雑な分析に関連したラグは全て、ＭＰＣへの強力な動機を提供する。標準的なバイオリアクターモニタリングと組み合わせた準リアルタイム質量分析を含むＰＡＴ技術は、ＭＰＣに使用されたモデルを通知するためのタイムリーなデータを提供するために使用された。複数のアッセイからのデータを、高マンノースＣＱＡを標的範囲内に維持するためにバイオリアクターに加えるマンノースの量を決定するＭＰＣシステムへと組み込んだ。
【０１９７】
グルコース対マンノースの細胞培養プレートアッセイ比率：
細胞系は、モノクローナル抗体を発現する組換えＣＨＯ細胞系とした。細胞を、ディープウェルプレートに、２ｍＬの作業量で１２ｇ／Ｌグルコースを含有する既知組成（ＣＤ）培地中７．５ｅ５細胞／ｍＬで播種した。細胞を、オービタルシェーカー内、３６．０℃及び５％ＣＯ２、２２０ｒｐｍでインキュベートした（オービタル直径は５０ｍｍ）。３〜４日目に、グルコース濃度を、Ｐｏｌｙｃｈｅｍグルコース試薬プレートアッセイ（ＭｅｄＴｅｓｔ  ＤＸ、ミシガン州、カントン）を介して測定し、培養物を遠心分離して使用済み培地の２６％を新鮮なＣＤ培地と置き換えた。同様に、５日目に、使用済み培地の１００％を、グルコースを含有しない新鮮なＣＤ培地と置き換えた。総ヘキソース濃度を、その後、濃縮ヘキソース原液からの添加により異なる比率のグルコース対マンノースを使用して１０ｇ／Ｌに調整した。細胞を２４時間自然に増殖させた。上清を除去し、ＩｇＧを精製し、高マンノース率（％）を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）アッセイによって測定した。
【０１９８】
ＧＣ−ＭＳヘキソースアッセイ
グルコース及びマンノース濃度は、ＧＣ−ＭＳにより細胞培養培地において定量化された。細胞培養物の１ｍＬ試料をペレット細胞に遠心分離して、上清をろ過した（０．２μＭ）。ろ過された上清を１０分の１に脱イオン水中に希釈し、１０μＬのこの希釈液を１．５μＬの遠心分離管に加えた。１０ｍＭ  Ｄ−［ＵＬ−１３Ｃ６］マンノース９９．９％（Ｏｍｉｃｒｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及び１０ｍＭ  Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース９９．９％（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ）を含有する、５μＬの一定分量のヘキソース内部標準溶液を加えた。試料を３０分間乾燥させた（ＳｐｅｅｄＶａｃ）。ヘキソースを、２０μＬ無水ピリジンの添加により誘導体化し、１％トリメチクロロシラン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ）（ＴＭＣＳ）を含む３０μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を４０℃で３０分間インキュベートした。誘導体化の直後、試料をＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣ  ６８９０Ｎ  ＭＳＤ  ５９７３システムにて分析した。１μＬ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−３５ＧＣカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｕｍ）に１／５０分割で注入した。ヘリウムを１ｍＬ／分の一定流に保った。オーブン温度を１９０℃に２分間保ち、２０２℃まで４℃／分の速度で強めた。
【０１９９】
温度を、２８０℃まで６０℃／分の速度でさらに強めた。総実行時間は６．３分であった。各ヘキソースは、オープン及びクローズ型異性体形態の両方を表す２つのピークを示した。マンノースは、２．７分及び３．３４分で溶出した；グルコースは、３．５分及び４．１８分で溶出した（図１１（Ａ））。３．３４分ピーク面積は、マンノース定量化のために使用され、４．１８分ピークは、グルコース定量化のために使用された。ヘキソースは、１２Ｃ糖のｍ／ｚ＝２０４ピーク面積を１３Ｃ糖のｍ／ｚ＝２０６ピーク面積と比較した場合、特徴的なＴＭＳ炭水化物断片ｍ／ｚ＝２０４１６及び標準同位体希釈を使用して定量化された。（図１１（Ｂ））。
【０２００】
ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））タンパク質限定加水分解ＭＳ−ＰＡＴアッセイ
ろ過された細胞培養培地試料を、さらなる精製は行わずに分析した。おおよそ６０μｇの各試料を６０単位のＩｄｅＳ酵素（ｆａｂＲＩＣＡＴＯＲ、Ｇｅｎｏｖｉｓ、スウェーデン、ルンド）を用いて３７℃で３０分間消化した。消化された試料を、次いで、４Ｍ塩化グアニジニウム中で５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて５５℃で１０分間還元した。次いで、消化された及び還元された試料をＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０２０１】
ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＳＴ飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（カリフォルニア州、サンタクララ）に連結されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）（マサチューセッツ州、ミルフォード）を使用して実施した。調製した試料を、８０℃に維持した逆相Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨフェニルカラム（１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ；マサチューセッツ州、ミルフォード）で分離した。ピークは、２２０ｎｍのＵＶ及びＴＯＦ−ＭＳによってモニターした。質量データは、ピークの全イオン電流（ＴＩＣ）から抽出し、その後Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して逆重畳及び定量化を行った。
【０２０２】
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）グリカンマップアッセイ
１００μｇの精製された抗体を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、その後、０．０４Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウムを伴う１２ｍｇ／ｍＬの２−アミノ安息香酸（２ＡＡ）を含有する５０μＬの蛍光標識溶液を添加した。この混合物を８０℃で７５分間インキュベートした。標識されたグリカンを、蛍光検出器（マサチューセッツ州、ミルフォード）を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣによって分析した。おおよそ３μＬの標識されたグリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨグリカンカラム（１８６００４７４１番、マサチューセッツ州、ミルフォード）に注入し、その後、３６０ｎｍでの発光及び４２５ｎｍでの検出を使用して蛍光検出した。２ＡＡで標識したグリカン種は、ＭＳ／ＭＳ技術により同定した。
【０２０３】
モデルパラメータを当てはめるためのデータの生成、及びその後の高マンノース率（％）の制御のためのＭＰＣの実証をバイオリアクター内で行った。マンノース（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６０２０）を、２５％原液を使用して１ｇ／Ｌの培養濃度まで培養の初日に加えた。灌流を、培養の２日目に開始した。灌流培地は、１日あたり０．５から１．０バイオリアクター容積に増加する容積で送達された。バイオリアクターは、Ｄｅｌｔａ  Ｖオートメーション（Ｅｍｅｒｓｏｎ）を使用して制御した。バイオリアクターサンプリングは、力価、ヘキソース及び生成物グリカン測定のために、ＭＡＳＴ  ＳＰ２００オートサンプルバルブ（Ｂｅｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して４時間毎に行われた。自動化試料収集の後、試料を、手動で遠心分離し、０．２ｕｍろ過して、細胞及び残屑を除去した。増殖、生存率、重量オスモル濃度、及び乳酸塩の測定のための毎日の試料は、手動でまたはＭＡＳＴ  ＳＰ２００を使用してのいずれかで収集された。生存細胞密度（ＶＣＤ）及び培養物生存率（％）は、Ｎｏｖａ  ＣＤＶ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して測定された。乳酸塩濃度は、Ｎｏｖａのバイオプロファイルベーシックアナライザ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して決定した。
【０２０４】
モデル予測制御
モデル予測制御（ＭＰＣ）及びモデルパラメータを当てはめるためのプログラミングは、ＭＡＴＬＡＢ（バージョンＲ２０１４ａ、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）においてなされ、コードは補足資料にて入手可能である。モデルパラメータは、単回の訓練リアクター実行からのデータに対するモデル方程式の最小二乗回帰により決定した。（ＭＰＣを介する）マンノース供給による高マンノースの制御のために、それぞれの毎日の割合変化を以下のステップを介して算出した：
１．現行モデルオフセットの算出。毎日の測定値（入手可能である場合）と組み合わせたリアクター操作履歴を入力として使用してモデル微分方程式の数値解を生成する。そして、モデルと最も直近の測定との間の差異が算出され得る。この差異は、将来のオフセットの推定として使用された。
Ｈｋ−時点ｋでのモデル値＝ｆ（ｔｋ）
Ｈ’ｋ＝時点ｋでの測定値
Ｈｋ＋１＝時点ｋ＋１での調整された予測値＝Ｆ（ｔｋ＋１）＋（Ｈｋ−Ｈ’ｋ）
２．ＭＰＣを介した最適な将来割合の決定。標準ＭＰＣ後退ホライズン法１７を一度制御が開始されたら各日に使用した。５つの割合変更の最適なセットを、モデルにより予測される生成物品質プロファイルと標的設定点との間の二乗誤差の合計を最小化することによって決定した。５つの割合変更が算出されたが、最初のもののみを使用した。次の割合変更が実施されることになったころには、新しいデータが利用可能であり、これは、次いで将来の割合の最適なセットを再算出するために使用された。
【０２０５】
マンノース供給速度は、目的関数（この場合では、分子上の所望の高マンノースレベルと支配微分方程式の組み込みを介して見いだされたものとの間の差異の二乗の合計である）の最小化における独立変数としてそれを処理することにより見いだされた。上記の方程式は、十分に良好に機能するため、ＭＡＴＬＡＢソルバーにより得られた解は、抗体上の＋／−１％高マンノースを制御するのに十分であった。高マンノースを制御するための方法は、リアクターへのマンノースの添加が抗体上の高マンノース率（％）を増加させるという点で一側である。高マンノース産生率（％）の低下は、（マンノース供給速後を低くした後の灌流を介する希釈によって）マンノース濃度を低下させることにより達成される。
【０２０６】
ＧＣ−ＭＳヘキソース定量化
マンノースのリアルタイム定量化は、ＭＰＣのために必要な入力であった。ＧＣＭＳを使用して、細胞培養培地中のヘキソース（マンノース及びグルコース）を区別した。ヘキソースは、上述のように同位体希釈により定量化した。図１１（Ａ）は、マンノースのＧＣによる及び典型的な実行中の細胞培養培地からのベースライン分離を示す。図１１（Ｂ）は、ヘキソース断片化パターン（マンノース及びグルコース間で同一）を示し、ここでｍ／ｚ２０４ピークは、１３Ｃ標識内部標準からのｍ／ｚ２０６ピークを使用して定量化された。グルコース及びマンノースの両方に関する検出限界は、０．０２ｇ／Ｌであり、線形性は最大で６ｇ／Ｌヘキソースまでの定量化について実証された（図１１（Ｃ））。
【０２０７】
グルコース対マンノースの細胞培養プレートアッセイ比率
細胞を、一定の１０ｇ／Ｌ総ヘキソースで、しかし１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８及び０：１０のグルコース：マンノース比率へとマンノースの濃度を増加させて培養した。細胞を、異なるヘキソース比率で２４時間培養した。上清を除去し、ＩｇＧを精製し、高マンノース率（％）をＨＩＬＩＣアッセイにより測定した。図１２（Ａ）は、細胞培養培地中のマンノースの濃度と総高マンノースレベルとの間で線形関係を実証し、ここで、高マンノースは、グルコースのみを含有する培地中では１０％で最小であり、マンノースのみを含有する培地中では３７％で最高であった。
【０２０８】
高マンノースにおける増加が、マンノース糖濃度の増加またはグルコース糖濃度の低減のいずれによるものかどうかを確立するために、細胞を第一のプレート実験と同じように、ただし、培地が１、３、５、７または１０ｇ／Ｌマンノースを含有する新鮮な培地に交換された５日目を除いて培養した。５つの異なる濃度のグルコース（１、３、５、７または９ｇ／Ｌ）をそれぞれのマンノース含有培地に加えた。これにより、合計で２５の異なる培養物ができ、総ヘキソースの最小量は２ｇ／Ｌ（１ｇｍ／Ｌグルコース及び１ｇｍ／Ｌマンノース  図１２（Ｂ））であり、最高量は１９ｇ／Ｌ（９ｇｍ／Ｌグルコース及び１０ｇｍ／Ｌマンノース；図１２（Ｂ））であった。細胞を２４時間自然に増殖させた。次いで、上清を除去し、ＩｇＧを精製し、高マンノース率（％）をＨＩＬＩＣアッセイにより測定した。図１２（Ｂ）は、高マンノースにおける線形増加がグルコース濃度に独立し、培地中のマンノース濃度にのみ依存することを示す。この関係を使用して、ＭＰＣ制御ループを開発した。
【０２０９】
制御ループ開発：モデル予測制御
制御ループ開発のために、バイオリアクターを、通常のバイオリアクター制御及びオフライン分析に加えて、ＭＡＳＴ  ＳＰ２００自動化サンプリング装置及びマンノース溶液供給ポンプに接続した。（図１３）。１５日間の灌流バイオリアクター実行を行って、マンノース供給を使用する高マンノースの一側制御のためのＭＰＣフィードバックループを開発するための訓練データを生成した。高マンノース率（％）（図１４（Ａ））、リアクター内のマンノース濃度（図１４（Ｂ））、細胞増殖（図１４（Ｃ））及び力価蓄積（図１４（Ｄ））についてのデータを、９〜１１日目の間収集しなかったグリカンデータを除いて、４時間間隔で収集した。ＭＰＣモデルは、エラーのために、同様の実行から算出された増殖パラメータを除いて、このデータセットから開発された。増殖パラメータの両方のセットを使用するモデル予測を図１４に示し、これはほとんど同一である。
【０２１０】
制御ループ開発：モデル方程式
通常の微分方程式を、細胞数、生成物、マンノース濃度、及び高マンノース種の変化の割合を説明するように、構築した。
【数１】
2020124207.tif 000005
ここで、Ｎは、細胞密度であり、μは、最大増殖速度であり、Ｎｍは、最大細胞密度である。細胞密度は、細胞／容積または細胞容積／容積であることができる。この作業では、算出された及び任意の規模とした容積は、Ｎｏｖａ  ＣＤＶで測定された細胞計数及び直径から算出された。力価については、比生産性は、定数であると想定され、生成物の変数保持（使用される灌流フィルタに依存する）は、
【数２】
2020124207.tif 000006
で説明される。
生成物濃度は、Ｐであり、ｑｐは、比生産性である。Ｓは、灌流フィルタを通過する生成物の割合であるふるい係数であり、Ｄは、リアクター容積／日での灌流速度である。マンノースの変化の割合
【数３】
2020124207.tif 000007
リアクター内のマンノース濃度は、Ｍであり、Ｍｆは、灌流培地中の有効濃度のマンノースであり、ｑＭは、比マンノース消費速度である。ミカエリス・メントン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）動力学に従うと想定されるマンノース消費速度：
【数４】
2020124207.tif 000008
最大反応速度は、ＶＭであり、ＫＭは、ミカエリス・メントン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）定数である。細胞培養プレートからのデータは、高マンノース種の産生の相対速度がマンノース濃度に比例したことを示した（図１２（Ｂ））：
【数５】
2020124207.tif 000009
ここで、Ｈは、高マンノース種の濃度であり、ＦＨは高マンノース比例定数である。以前のデータ（示されず）の検査は、ＦＨが細胞密度とともに変化したことを示し、ゆえに以下の純粋な経験式をＦＨについて使用した：
【数６】
2020124207.tif 000010
Ｋ１及びＫ２は、経験定数である。最終的に、高マンノースの変化の割合は、連鎖律を介して見いだされる：
【数７】
2020124207.tif 000011
【０２１１】
全てのモデルパラメータを、図１４に示す訓練データの最小二乗回帰を介して決定した。パラメータは、図１４（Ｃ）に示す細胞増殖プロファイルを当てはめることにより見いだされた。ｑｐに対する値は、図１４（Ｄ）に示す力価曲線を当てはめることにより見いだされた。１２日目以降の力価の低下は、限外濾過膜（これに対するふるい係数、Ｓ、はゼロである）から精密ろ過膜（０．７６〜０．７８の範囲のふるい係数を与えた）への切り替えによる。残りのパラメータは、これらの方程式を図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）のデータに同時に当てはめることにより見いだされた。
【０２１２】
モデルにおいて使用されたパラメータ値及びそれらの９５％信頼限界を表４に示す。モデルパラメータ及び信頼限界の数値は訓練データから獲得され、ＭＰＣのために使用された。訓練データに当てはめた結果得られたモデルのグラフを図１４（破線Ａ〜Ｄ）に示し、一方でＭＰＣのために使用された増殖パラメータと当てはまるものは点線である。マンノースミカエリス・メントン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）定数、ＫＭ、に対して当てはまるパラメータは、使用された濃度よりはるかに大きく、ゆえにマンノース消費動力学は、有効に一次であった。ＭＰＣの訓練データ及びその後の実証は、高マンノースに対するコントロールレバーとして機能するマンノース濃度を除いて同じ条件下で行われた。
【表４】
2020124207.tif 000012
【０２１３】
高マンノースレベルを制御するためのＭＰＣの実証
パラメータ値の誘導の後、フィードバックループをバイオリアクター実行において使用して、抗体Ａについて高マンノースレベル率（％）を６％＋／−１％に能動的に制御した。灌流及びマンノース供給を、産生培養の２日目に開始した。初期マンノース供給は、リアクター内のその濃度を大体一定に保つ速度に設定した。この初期マンノース供給は、本プロセスを用いた以前の実験に基づいて推算され、制御ループの一部ではなかった。制御ループは、産生の５日目に開始された。試料を毎日採取し、分析して、ＭＰＣモデルへの入力を決定した。リアクター試料及び速度変化間のラグは、５〜１４時間の範囲であり、平均は８．５時間であった。一度、全ての必要なデータが利用可能になると、それらを、ＭＡＴＬＡＢモデルに手動で入力して、次のマンノース供給速度を算出した。結果得られた高マンノース率（％）、他のモデル化量、及び結果得られたＭＰＣに基づく供給濃度（供給速度から算出）の軌道を図１５に示す。一度、制御が開始されたら、測定された及びモデル化された高マンノース率（％）は、急速に増加し、６％標的の１％以内に維持された（図１５（Ａ））。測定された及びモデル化されたマンノース濃度プロファイルは、予測通りマンノース供給に応答して増減した（図１５（Ｂ））。細胞増殖は、６日目及び１２日目のかなり著しい偏差を除いて、想定されたロジスティック曲線に大部分が従った（図１５（Ｃ））。測定された力価は、モデルと適合したが、培養の最後の数日での中断は、モデルがタンパク質産生を推定中であった証拠であった（図１５（Ｄ））。測定を適合させるためのＭＰＣモデル状態の調整は、観察された偏差にもかかわらず、高マンノースの良好な制御を可能にした。図１６では、ＰＡＣプロセス及び過去の試験的プラント実行間の比較を示す。過去の実行は、能動的な制御ループは伴わないが、ＰＡＣプロセスに設計及び性能において類似する従来のプロセスを使用して行われた。代わりに、従来のプロセスは、析出のための品質管理を通る必要があるだろう、所望の生成物を送達するために全バッチについて誤差内で実行するための静的なプロセスパラメータに依存する。ＰＡＣプロセスでは、ＰＱは、準リアルタイムで測定され、産生実行中の能動的制御のために、その後の析出前の分析的特徴づけを必要としないだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月30日(2020.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を回収するための方法であって、
組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞をバイオリアクターに播種することによって細胞培養を確立すること、
少なくとも２、３、４又は５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を細胞培養物に灌流することにより、前記細胞培養を維持すること、
前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、及び
前記組換えタンパク質を含有する透過物を収集すること
を含む、方法。
【請求項２】
組換えタンパク質を回収するための方法であって、
組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞をバイオリアクターに播種することによって細胞培養を確立すること、
少なくとも１ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を細胞培養物に灌流し、前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すことによって、前記細胞培養を維持すること、
所定のパラメータに到達したら、少なくとも２、３、４又は５ｇ／Ｌの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合または補充された新鮮な細胞培養培地を前記細胞培養物に灌流すること、及び前記細胞培養を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すこと、ならびに、
前記組換えタンパク質を含有する透過物を収集すること
を含む、方法。
【請求項３】
前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径または分子量カットオフを有する中空糸フィルタ及び前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径または分子量カットオフを有する前記中空糸フィルタが、単一ユニットフィルタシステムの構成要素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養培地は、非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培養培地は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコスル（ｇｌｙｃｏｓｌ）、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）の共重合体、及びポリ（プロピレンオキシド）の共重合体、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド、脂肪族アルコール、又はコカミドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非イオン性ブロック共重合体は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー１８８である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養培地は、非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養培地は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコスル（ｇｌｙｃｏｓｌ）、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）の共重合体、及びポリ（プロピレンオキシド）の共重合体、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド、脂肪族アルコール、又はコカミドをさらに含む、請求項２に記載の方法。