(57)【要約】【課題】  ヒトを含む様々な動物種において、プライム型多能性幹細胞または体細胞からナイーブ型多能性幹幹細胞を簡便に得る方法を提供する。【解決手段】  プライム型多能性幹細からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、（Ａ）プライム型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または（Ｂ）プライム型多能性幹細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させることを特徴とする方法。  さらに、組織の体細胞あるいは血球細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、（Ｃ）前記細胞初期化時に、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または（Ｄ）前記細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
（Ａ）プライム型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または
（Ｂ）プライム型多能性幹細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させる
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記（Ａ）におけるβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤が、２−（４−アセチルフェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチルー３−、４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライム型多能性幹細胞をβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、前記プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変化させることを特徴とするプライム型多能性幹細胞のナイーブ化方法。
【請求項４】
ナイーブ型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、ナイーブ型多能性幹細胞を安定に維持することを特徴とするナイーブ型多能性幹細胞の保存方法。
【請求項５】
前記（Ｂ）における高次構造の変化を、プライム型多能性幹細胞にリジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造を形成する変異型βカテニン蛋白質の遺伝子を導入することにより行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記において、カテニン変異型蛋白質の遺伝子が、βカテニンのリジン４９残基をグルタミンまたはグルタミン酸に置換した変異型βカテニンをコードする遺伝子であることを特徴とすることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織の体細胞あるいは血球細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
（Ｃ）前記細胞初期化時に、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または
（Ｄ）前記細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させる
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法、プライム型多能性幹細胞のナイーブ化方法およびナイーブ型多能性幹細胞の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）といった多能性幹細胞は、体を構成する全ての細胞になることができる。そのため、再生医療の材料として大変な注目を集めている。
【０００３】
また、神経細胞や心筋細胞のような、個人からの採取が困難な細胞を分化誘導できるため、オーダーメードの調剤や創薬、あるいは薬効・安全性試験のセンサーとしても有用である。
【０００４】
上記のような多能性幹細胞の有効性を発揮するためには、目的に合致した細胞種を分化誘導する必要があり、体外培養下での分化誘導方法が研究、検討されてきた。
【０００５】
一方、現在までの研究で、ヒト多能性幹細胞の分化能力はマウスやラットなどの多能性幹細胞に比べてかなり限定的であることがわかってきた。
【０００６】
その最大の原因として、ヒト多能性幹細胞とマウスやラットの多能性幹細胞では発生学的な段階が異なっていると考えられている。現在では、ヒトやサル、ウサギなどの多能性幹細胞とマウスやラットの多能性幹細胞では異なるカテゴリの細胞として分類されており、前者はプライム型幹細胞、後者はナイーブ型幹細胞とされている。
【０００７】
詳細な解析によると、プライム型幹細胞はナイーブ型幹細胞に比べて分化した状態にあり、また、個々の細胞の性質が少しずつ異なっている不均質性を示すこと、細胞株により特定の細胞への分化偏向性を示すこと、染色体が不安定であること、増殖が遅いことが明らかとなっている。
【０００８】
非特許文献１には、ナイーブ型幹細胞は初期胚に移植すると、胎児形成に寄与し、生殖細胞を含む様々な組織に取り込まれるという性質を有するが、プライム型幹細胞は初期胚に取り込まれないことが記載されている。
【０００９】
現存するヒト多能性幹細胞はプライム型であるがゆえに、分化能力が限定的で、かつキメラ動物作成を介した臓器の製造に適しない。幅広い医療応用を考える上では、既存のヒト多能性幹細胞をナイーブ型に変化させる、あるいは体細胞などからナイーブ型ヒト多能性幹細胞細胞を作成する技術が必要である。
【００１０】
これまでに、ヒト多能性幹細胞をナイーブ型幹細胞に変化させる方法がいくつか開発されており、非特許文献２にはこれまでに報告されているヒト多能性幹細胞のナイーブ化法がまとめられている。
【００１１】
たとえば、分化に関わる複数の酵素を同時に阻害する方法、ナイーブ型幹細胞で特異的に発現している遺伝子を強制的に発現させる方法によりナイーブ型幹細胞を製造できることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｅｈｅｅ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｍｕｎｅｅｆ  Ａｙｙａｓｈ，  Ｎｏａ  Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂ  Ｈ．  Ｈａｎｎａ、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｔｅｓ：  ｎａｉｖｅ  ｔｏ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．ＮＡＴＵＲＥ  ＲＥＶＩＥＷＳ：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１７巻３号、１５５−１６９頁
【非特許文献２】ＡＪ，  Ｒｕｇｇ−Ｇｕｎｎ  ＰＪ著、Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｉｖｅ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、４０巻５号、電子版ｅ１７００２３９、Ｃｏｌｌｉｅｒ
【非特許文献３】Ｔｒｕｓｌｅｒ，  Ｏ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．，  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｊ．，  ＆  Ｌａｓｌｅｔｔ，  Ａ．  Ｌ  著、Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｉｖｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６巻  ３６-４３頁、１７巻３号  １５５−１６９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、前記非特許文献の方法で製造されるナイーブ型幹細胞にはゲノムのメチル化修飾の不完全性、低い分化多能性、製造法として再現性が低いといった欠点があり（非特許文献２）、遺伝子組換えを介さず、単純で再現性の高い方法の開発が望まれている。
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究の結果、多能性幹細胞のβカテニン補因子ヒストンアセチルトランスフェラーゼＥＰ３００（以下、通称のＰ３００として記載する）の機能を薬剤で阻害することにより分化に偏りが生じたプライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導し得ることを見出すとともに、βカテニンの翻訳後修飾が多能性幹細胞のナイーブ性に関わり特にβカテニンのリジン４９残基（Ｋ４９）のアセチル化がナイーブ化に影響することを見出し本発明を完成した。
【００１５】
また、この方法は、組織の体細胞あるいは血球細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法にも適用できることを見出し本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明の目的は、ヒトを含む様々な動物種において、プライム型多能性幹細胞から、あるいは組織の体細胞や血球細胞から、ナイーブ型多能性幹幹細胞を簡便に得る方法を提供しようというものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、プライム型多能性幹細からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
（Ａ）プライム型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または
（Ｂ）プライム型多能性幹細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させる
ことを特徴とする方法である。
【００１８】
また本発明は、前記（Ａ）におけるβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤が、２−（４−アセチルフェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチルー３−、４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドであることを特徴とする。
【００１９】
また本発明は、プライム型多能性幹細胞をβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、前記プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変化させることを特徴とするプライム型多能性幹細胞のナイーブ化方法である。
【００２０】
さらに本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、ナイーブ型多能性幹細胞を安定に維持することを特徴とするナイーブ型多能性幹細胞の保存方法である。
【００２１】
さらに本発明は、前記（Ｂ）におけるβカテニンの高次構造の変化を、プライム型多能性幹細胞にリジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造を形成する変異型βカテニン蛋白質の遺伝子を導入することにより行うことを特徴とする。
【００２２】
さらに本発明は、前記変異型βカテニン蛋白質の遺伝子が、βカテニンのリジン４９残基をグルタミンまたはグルタミン酸に置換した変異型βをコードする遺伝子であることを特徴とする。
【００２３】
さらに本発明は、組織の体細胞あるいは血球細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
（Ｃ）前記細胞初期化時に、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または
（Ｄ）前記細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させる
ことを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、プライム型多能性幹細胞、体細胞、血球細胞などをβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することにより、ナイーブ型幹細胞を製造するので、複数の阻害剤処理や遺伝子組み換えといった特別な操作は一切必要なく、簡便で再現性が高いという明白な利点がある。
【００２５】
さらに、本発明は従来の方法とは異なり、蛋白質間相互作用によって、プライム型多能性幹細胞、体細胞、血球細胞などのβカテニンの高次構造を変化させることによって、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造できるので、単一遺伝子の操作によってナイーブ型幹細胞を製造することができる。
【００２６】
さらに、ナイーブ型多能性幹細胞を長期間、ナイーブ状態を維持して安定に保存できるので、いつでもナイーブ型多能性幹細胞を利用できるという利点がある。
【００２７】
さらに、βカテニンはアミノ酸配列、構造とも異なる動物種間での保存性が極めて高いため、あらゆる動物種に対して適応できるという既存の方法にはない明白な利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１で使用した細胞の形態を示す位相差顕微鏡写真であり、（Ａ）はプライム型マウスｉＰＳ細胞、（Ｂ）はナイーブ型マウス胚性幹細胞、（Ｃ）はβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養したマウスエピブラスト幹細胞、（Ｄ）は本発明のナイーブ型マウス多能性幹細胞をそれぞれ示す。
【図２】実施例２で使用した細胞の形態を示す位相差顕微鏡写真であり、（Ａ）はプライム型ヒトｉＰＳ細胞、（Ｂ）は本発明のナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞、（Ｃ）はβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養したヒトｉＰＳ細胞、をそれぞれ示す。
【図３】実施例３で使用した細胞の形態を示す位相差顕微鏡写真であり、（Ａ）はプライム型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞、（Ｂ）は本発明によるナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞、（Ｃ）はβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養したアマミノクロウサギｉＰＳ細胞をそれぞれ示す。
【図４】実施例１で得たナイーブ型マウス多能性幹細胞のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の結果を示す図である。
【図５】実施例１で得たナイーブ型マウス多能性幹細胞から作成したキメラマウスの写真である。
【図６】実施例２で得られたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の評価結果を示す図であり、（Ａ）は、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞細胞の全ＲＮＡシーケンス解析のうち、ナイーブ型の遺伝子発現状態が顕著に現れている遺伝子群について示した結果である。、（Ｂ）は同細胞より抽出したゲノムＤＮＡのメチル化シトシンの割合を計測した結果を示す。
【図７】実施例３で用いたナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞について、ナイーブ型細胞で特異的に発色強度が増強することを利用したアルカリフォスファターゼ活性試験の結果であり、（Ａ）はβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養したアマミノクロウサギｉＰＳ細胞に対するアルカリフォスファターゼ活性試験の結果であり、（Ｂ）はβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤の添加によりナイーブ型に変化させたアマミノクロウサギｉＰＳ細胞に対するアルカリフォスファターゼ活性試験の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図８】実施例２で使用したヒトｉＰＳ細胞についての定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析結果である。
【図９】実施例２で得られたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞を分離する際のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析の結果である。
【図１０】実施例５で使用した細胞の位相差顕微鏡写真であり、（Ａ）材料として用いたヒト繊維芽細胞と、（Ｂ）同細胞より作成したヒトナイーブ型ｉＰＳ細胞、（Ｃ）対照実験区で作成されたヒトｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、（Ａ）プライム型多能性幹細胞をβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理すること（以下、Ａ法という）により、または（Ｂ）プライム型多能性幹細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させること（以下、Ｂ法という）により、プライム型多能性幹細からナイーブ型多能性幹細胞を製造することを特徴とするナイーブ型多能性幹細胞の製造方法である。
【００３０】
また本発明は、（Ｃ）組織の体細胞あるいは血球細胞の初期化時に、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理する、または（Ｄ）前記細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させることにより、組織の体細胞あるいは血球細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造することを特徴とするナイーブ型多能性幹細胞の製造方法である。
【００３１】
まず、Ａ法について説明する。Ａ法において、プライム型多能性幹細胞とは、いわゆる基底状態の細胞から前記着床後胚に相当するまでの種々の分化段階にある多能性幹細胞、または基底状態の細胞が有する分化マーカーの少なくとも１つが消失した多能性幹細胞をいう。
【００３２】
かかるプライム型多能性幹細胞の代表的なものをあげるとすれば、従来の培養方法では着床後胚細胞に類似した性質を有する多能性幹細胞であって、キメラ形成能を欠く、コロニー形態は平坦である、ＴＦＣＰ２Ｌ１等のナイーブ関連遺伝子が発現していない、などの特徴を少なくとも１つ有するものをいう。
【００３３】
かかる細胞の具体例をあげれば、たとえばヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスエピブラスト幹細胞など、いわゆる分化万能性を持つプライム型幹細胞があげられる。これらの多能性幹細胞は、ヒト細胞であってもよく、マウス、カニクイザル、ウサギ、その他の哺乳動物由来の細胞であってもよく、さらには公知のもののほか、市販の細胞であっても好適に使用することができる。
【００３４】
たとえば、ｉＰＳ細胞としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８などの転写因子を導入した細胞があげられる。
【００３５】
ｉＰＳ細胞は、既知の方法によって製造することができ、製造に用いる体細胞としては、例えば線維芽細胞であれば好適に使用することができ、単球などの血液細胞や上皮細胞も好適に使用することができる。
【００３６】
またこの場合、ｉＰＳ細胞の作成方法としては、例えばセンダイウイルスを用いる方法が最も好適であるが、レトロウイルス、ＲＮＡの導入によっても行うことができる。
【００３７】
ＥＳ細胞としては、ヒト細胞があげられ、ＫｈＥＳ−１細胞、ＫｈＥＳ−２細胞、ＫｈＥＳ−３細胞があげられ、またサルＥＳ細胞としてはカニクイザルＥＳ細胞があげられる。
【００３８】
本発明において、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤とはβカテニン補因子Ｐ３００とβカテニンの相互作用を阻害する薬剤といい、たとえばβカテニン補因子Ｐ３００の脱リン酸化を促進するものであれば好適に使用することができる。
【００３９】
かかるβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤としては、２−（４−アセチルフェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチルー３−、４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（ＩＱ―１：セレックケミカルズ社）、１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール（ＩＤ―８：セレックケミカルズ社）などがあげられる。
【００４０】
これらのうち、入手の容易さ、安価さ、簡便さ、毒性の低さなどからＩＱ―１が好ましい。
【００４１】
本発明において、プライム型多能性幹細胞をβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤（以下、単に阻害剤ということがある）で処理する方法としては、前記阻害剤の存在下で、プライム型多能性幹細胞を培養する方法があげられる。
【００４２】
また阻害剤は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの製造過程において添加することもできる。
【００４３】
本発明において、阻害剤は概ね、処理液中の濃度として、０．５〜１０μｇ／ｍｌとなるように用いればよく、とりわけ２〜４μｇ／ｍｌが好ましい。
【００４４】
このとき、阻害剤は、そのまま添加してもよいが、溶媒中に溶解して、培地中に所望の濃度なるように添加してもよく、溶媒としては、多能性幹細胞の生育を阻害せず、阻害剤を溶解し、培地と混合するものであれば特に限定されない。
【００４５】
かかる溶媒としては、たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノールなどがあげられる。阻害剤を培養液に添加する場合には、概ね１２〜４８時間ごとに阻害剤を交換することにより、さらに好ましい結果を得ることができる。
【００４６】
阻害剤の存在下に、培養によってプライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する場合には、培養を培養開始から２週間程度行ってもよく、細胞の培養期間中、継続して行ってもよい。
【００４７】
また、阻害剤は、培養期間中、毎日または数日おきなど、適当な間隔で培地に追加してもよく、培地毎交換してもよい。
【００４８】
阻害剤による処理温度は、多能性幹細胞が生育する温度であればよく、特に制限されないが、具体的にはたとえば３０〜４０℃であればよく、培養液に阻害剤を添加する場合には、培養の適否を考慮して３５〜３８℃の温度であるのが好ましい。培養液に阻害剤を添加する場合の培養方法としては、細胞培養に用いられる種々の培養方法を好適に使用できる。
【００４９】
具体的な培養方法の一例をあげると、たとえば、プライム型多能性幹細胞の培養中、培養液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶媒とするＩＱ―１溶液を希釈倍率１／２０００程度となるように添加し、２日毎に同様の組成の培養液と交換し、二週間程度培養を継続することによりナイーブ型幹細胞を得ることができる。
【００５０】
かくしてプライム型多能性幹細胞からのナイーブ型多能性幹細胞の生成は、既知の方法（たとえば非特許文献３に記載の方法）などを用いて、ナイーブ型細胞が特異的に有する表面抗原を認識する抗体等を用いて標識化するなどの方法により、容易に判別することができる。
【００５１】
具体的には、たとえば、ＣＤ７５やＣＤ７７やＣＤ１３０などの発現を確認すればよく、あるいは細胞内抗原であるＫＬＦ２やＴＢＸ３などに対する抗体を使用し、免疫染色、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリーによって目的細胞がナイーブ型幹細胞であることを確認することもできる。
【００５２】
また、細胞のゲノム修飾状態の変化によって確認してもよく、例えばゲノム全体に含まれるメチル化シトシンの割合が低下することによっても、ナイーブ型多能性幹細胞であることを確認することができる。
【００５３】
かくして得られたナイーブ型多能性幹細胞は、いわゆる基底状態に極めて近いナイーブ型多能性幹細胞であり、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＺＦＰ４２、ＳＴＥＬＬＡ、ＦＧＦ４、ＴＢＸ３など、種々の分化マーカを有する多能性に優れた幹細胞である。
【００５４】
次にＢ法について説明する。Ｂ法は、プライム型多能性幹細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させることを特徴とする方法である。
【００５５】
Ｂ法において、プライム型多能性幹細胞としては、前記Ａ法に関して例示したプライム型多能性幹細胞を好適に使用することができる。
【００５６】
βカテニンの高次構造が、リジン４９残基をグルタミン酸に置換した変異型βカテニンによって、βカテニンのリジン４９残基がアセチル化することで形成される高次構造変化と同様の高次構造に変化することについては、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２００６  ｓｅｐ  ８；２８１（３６）：２６１８１−７）に記載されている。
【００５７】
前記βカテニンの高次構造を変化させるには、プライム型多能性幹細胞にリジン４９残基がアセチル化することで形成される高次構造変化と同様の高次構造変化を生じたβカテニン蛋白質を発現する遺伝子を導入すればよい。
【００５８】
かかる蛋白質を発現する遺伝子としては、βカテニンのリジン４９残基をグルタミンまたはグルタミン酸に置換したβカテニンをコードするアミノ酸配列を含む遺伝子（ＢＣ−Ｋ４９常時アセチル化変異体遺伝子）があげられる。該遺伝子は、イントロンを含むものであってもよいが、とりわけ前記アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが好ましい。
【００５９】
前記遺伝子は、適宜この分野で常用されるプラスミド、ベクター等に組込んで、プライム型多能性幹細胞に導入し、培養することにより、リジン４９残基がアセチル化したβカテニンと同様の効果を有する蛋白質を発現することができる。
【００６０】
かかるベクター、プラスミドとしては、哺乳動物での遺伝子発現用のベクター、プラスミドであればよく、たとえばｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧ、ｐｉｇ  ｇ  ｙ  ｂａｃトランスポゾンベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどがあげられる。
【００６１】
これらのうち、操作の簡便さ、安定性、毒性の低さ、安全性などからセンダイウイルスベクターが好ましい
【００６２】
また、組み換え遺伝子をプライム型多能性幹細胞に導入する方法は、既知の方法であればよく、エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法などを用いることができる。
【００６３】
ついで、遺伝子を導入した多能性幹細胞を、培養液中で培養し、目的とする細胞を薬剤耐性などを利用して選別、採取し、さらに培養することによって、目的のナイーブ型多能性幹細胞を得ることができる。
【００６４】
かくして得られたナイーブ型多能性幹細胞は、前記Ａ法で得られるナイーブ型多能性幹細胞と同様に、基底状態の細胞に限りなく近いものであって、種々の分化マーカーを有する多能性に富んだナイーブ細胞である。
【００６５】
本発明のプライム型多能性幹細胞のナイーブ化方法は、プライム型多能性幹細胞をβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、前記プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変化させる方法である。
【００６６】
本発明において、プライム型多能性幹細胞、阻害剤は、前記ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法において用いるものを好適に使用することができ、阻害剤の濃度、処理温度、処理時間においても、前記製造方法と同様に実施することにより、基底状態に限りなく近いナイーブ型多能性幹細胞にまで、ナイーブ化することができる。
【００６７】
さらに、本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞を、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤の存在下に維持するナイーブ型多能性幹細胞の保存方法である。
【００６８】
本発明において、プライム型多能性幹細胞、阻害剤は、前記ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法において用いるものを好適に使用することができ、本発明において、阻害剤の存在下に維持するとは、ナイーブ型多能性幹細胞を阻害剤を含む媒体中に保持することであり、媒体は前記ナイーブ型多能性幹細胞の多能性を損なうことなく、生存させることができるものであれば、特に制限されない。
【００６９】
かかる媒体は、生理食塩水、生育培地、幹細胞用生育培地などがあげられ、とりわけ好ましくは幹細胞用生育培地である。媒体中の阻害剤の濃度は、媒体中、０．５〜１０μｇ／ｍｌとなるように用いればよく、とりわけ２〜４μｇ／ｍｌが好ましい。阻害剤は、適宜追加してもよく、また媒体毎、交換してもよい。
【００７０】
温度は、３５〜３８℃で保持することによって、長期間、ナイーブ型多能性幹細胞の分化を抑制して、ナイーブ型多能性幹細胞のままで、細胞を維持することができる。
【００７１】
次に、Ｃ法について説明する。Ｃ法は、組織の体細胞あるいは血球細胞の初期化時において、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤で処理することによって、前記細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法である。
【００７２】
Ｃ法において、組織の体細胞あるいは血球細胞としては、転写因子の導入によって、多能性が付与できるものであればよく、特に制限されない。かかる転写因子としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８などの初期化転因子があげられる。
【００７３】
体細胞としては、線維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などの細胞があげられ、血球細胞としては、リンパ球、単球などの白血球があげられる。
【００７４】
Ｃ法において、細胞初期化時とは、体細胞あるいは血球細胞に前記転写因子を導入したときをいう。
【００７５】
また、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤および該阻害剤を用いる処理条件は、前記Ａ法で採用されるものを好適に使用できる。
【００７６】
さらに、Ｄ法について説明する。Ｄ法は組織の体細胞あるいは血球細胞におけるβカテニンの高次構造を、リジン４９残基がアセチル化されたβカテニンと同様の高次構造に変化させて、前記細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法である。
【００７７】
Ｄ法において、体細胞としては、前記Ｃ法においてあげたものを好適に使用することができる。また、βカテニンの高次構造を、βカテニンのリジン４９残基がアセチル化することで形成される高次構造変化と同様に変化させるには、前記Ｂ法において採用される方法や遺伝子を好適に使用することができる。
【００７８】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、これらに限られるものではない。
【００７９】
実施例１
（１）＜マウスエピブラスト幹細胞からのナイーブ型マウス多能性幹細胞の製造＞
近畿大学において、Ｃ５７ＢＬ／６系マウス同士を交配させて、交配確認後５．７５日後に雌マウス子宮より採取した胎仔エピブラストをマウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）より作成したフィーダー細胞上で塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  ｂＦＧＦ）を添加した多能性幹細胞培養培地中にて１週間培養することによりエピブラスト幹細胞ＫＥｐ１株を樹立した。
【００８０】
前記マウスエピブラスト幹細胞をマウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）より作成したフィーダー細胞上で培養し、培養皿の約２５％程度（２５％コンフルエント）まで増殖した前記ＫＥｐ１株に、前記幹細胞培養培地１ｍＬ毎に対して４μｇのＩＱ―１を添加し、２４時間ごとに新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地と交換しながら２週間培養した。
【００８１】
前記エピプラスト幹細胞の詳細な樹立方法は文献（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１５  Ｓｅｐ  ３０；５：１４７２２．  Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４７２２．）に記載されている。
【００８２】
この間、コンフルエントに達した細胞は０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁し、１／４から１／８量を新しいフィーダー細胞上で培養した。
【００８３】
ドーム状のコロニーを形成した細胞をガラス管あるいはマイクロピペットで分取し、０．２５％トリプシン―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で個々の細胞が単一化されるまで処理したのち、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁したものを新しいフィーダー細胞上で培養した。
【００８４】
以上の操作により、ナイーブ型マウス多能性幹細胞を得た。
【００８５】
得られたナイーブ型マウス多能性幹細胞を、位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製、ＣＫ３０型）を用いて、形態面での特徴を確認した。
【００８６】
得られたナイーブ型マウス多能性幹細胞は、ナイーブ型マウス胚性細胞と同様に、ドーム状で小さなコロニーという典型的なナイーブ型の形態（図１、ＢおよびＤ）を示し、優れた増殖能力を示した。
【００８７】
これに対して、マウスエピブラスト幹細胞ＫＥｐ１およびβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養した上記ＫＥｐ１は、いずれも平坦で大きなコロニーというプライム型多能性幹細胞の形態（図１、ＡおよびＣ）を示した。
【００８８】
また、得られたナイーブ型マウス多能性幹細胞を検体として、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ナイーブ型マウス多能性幹細胞マーカーであるＫＬＦ４、ＺＦＰ４２の発現の著しい増加を認めた。
【００８９】
なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲに際しては、予め作成したマウスＧａｐｄｈ、遺伝子の配列に特異的なプライマーを用いて行った。遺伝子の配列は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されている。
【００９０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲについて、細胞をＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）で処理し、クロロホルムと混合して１５，０００回転で１０分間遠心することによりＲＮＡを含む水層を分離した。ＲＮＡを含む水層を同量のイソプロパノールと混合し、再度１５，０００回転で１０分間遠心することでＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物は氷冷した８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水に溶解した後に逆転写反応に使用した。
【００９１】
逆転写反応はプライムスクリプトＲＴ（タカラバイオ社製）を使用して実施した。ＰＣＲ反応液は、ＴＢ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて作成し、ＲＴ−ＰＣＲ定量用チューブ（ミクロアンプ  オプチカル８−チューブストリップ、商品名、アプライド、バイオシステムズ社製）に分注した。
【００９２】
ＰＣＲ反応はＴＡＫＡＲＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を使用し、９４℃で２０秒間の変性反応の後、９４℃で５秒間、６０℃で３０秒間のアニーリング、増幅反応を４０回繰り返し、結果を解析した。
【００９３】
図４は、実施例１で得たナイーブ型マウス多能性幹細胞を用いて、ナイーブ型多能性幹細胞に特異的な遺伝子の発現が上昇することを確認することによって、製造された細胞がナイーブ型多能性幹細胞であることを示す図である。
【００９４】
（２）マウスキメラ動物（キメラマウス）の製造
（１）で得られたナイーブ型マウス多能性幹細胞をマウス胚盤胞期胚へ移植することによりキメラ動物の形成を誘導した。４週齢雌マウスにＰＭＳＧ、ｈＣＧを注射し、１０週齢の雄マウスと交配することにより、多量の受精卵の産生を誘発した。２４時間後、雌マウスを安楽死させ、卵管より２細胞期胚をとりだした。
【００９５】
続いて取り出した２細胞期胚をＫＳＯＭ培養液で３日間培養し、胚盤胞期胚を作製した。マイクロマニピュレーター（ライカ社製）を用い、本発明により製造されたナイーブ型細胞８個から１２個程度を上記胚盤胞期胚の胚盤胞腔に注入した。注入完了後、胚盤胞期胚を偽妊娠状態のＩＣＲ系雌マウス（白色マウス）子宮に移植した。移植から１７日後、帝王切開を行い、キメラマウスを取り出した。
【００９６】
得られたマウスは、白色マウスの体毛に、通常では現れない黒色の毛が出現しており（図５）、本発明により製造されたナイーブ型マウス多能性幹細胞（Ｃ５７ＢＬ／６系：黒色マウス由来）をＩＣＲ系マウス（白色マウス）胚盤胞期胚に注入することにより得られたキメラマウスであって、製造された細胞がナイーブ型多能性幹細胞に固有の、組織を形成する能力を有していることが明らかである。
【００９７】
実施例２
＜ヒトｉＰＳ細胞からのナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の製造＞
京都大学で作製され、理化学研究所から譲受けたヒトｉＰＳ細胞株４０９Ｂ２株（ＨＳＰ００７６）をマウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）より作成したフィーダー細胞上で培養し、培養皿の約２５％程度（２５％コンフルエント）まで増殖した段階で、幹細胞培養培地１ｍＬに対して４μｇのＩＱ―１を添加し、２４時間ごとに新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地と交換しながら２週間培養した。
【００９８】
ヒトｉＰＳ細胞の場合、マウスに比べてナイーブ型細胞の出現率が低い。そのため、ヒトｉＰＳ細胞株４０９Ｂ２株（ＨＳＰ００７６）にあらかじめナイーブ型に変化すると緑色蛍光を発する遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１ΔＰＥ−ＧＦＰ：Ａｄｄｇｅｎｅ社、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃５２３８０）を導入しておき、これをマウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）より作成したフィーダー細胞上で培養し、培養皿の約２５％程度（２５％コンフルエント）まで増殖した４０９Ｂ２に、幹細胞培養培地１ｍＬに対して４μｇのＩＱ―１を添加し、２４時間ごとに新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地と交換しながら２週間培養した。
【００９９】
この間、コンフルエントに達した細胞は０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁し、１／４から１／８量を新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１００】
ドーム状コロニーの形成が確認された段階で０．２５％トリプシン―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で個々の細胞が単一化されるまで処理したのち、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、ＨＥＰＥＳを添加した幹細胞培養培地に懸濁した。これをＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析し、緑色蛍光陽性の画分を分離することによって本発明方法によるナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞を得た。
【０１０１】
得られたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は、ドーム状で小さなコロニーという典型的なナイーブ型の形態（図３、Ｂ）を示し、優れた増殖能力を示した。
これに対して、ヒトｉＰＳ細胞４０９Ｂ２株およびβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養した上記４０９Ｂ２株は、いずれも平坦で大きなコロニーというプライム型多能性幹細胞の形態（図３、ＡおよびＣ）を示した。
【０１０２】
得られたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞からＲＮＡを取り出し、全ＲＮＡシーケンス解析を行った（株式会社ダナフォームで実施）ところ、ナイーブ型幹細胞に特徴的な遺伝子発現状態への変化を示した（図６、Ａ）。また、全ゲノムのＤＮＡメチル化解析をおこなったところ、本発明により製造されたナイーブ型幹細胞において、メチル化シトシンの含有率が低下していることを示す結果（図６、Ｂ）が得られた。
【０１０３】
実施例３
＜アマミノクロウサギｉＰＳ細胞からのナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞の製造＞
環境省担当局より事故死した成体アマミノクロウサギ組織の一部を譲り受け、定法によって、アマミノクロウサギ線維芽細胞を分離した。同アマミノクロウサギ線維芽細胞にエピソーマルプラスミドを用いてＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｓｏｘ２、マウスｐ５３ドミナントネガティブ変異体を導入し、ｉＰＳ細胞を作製した。
【０１０４】
上記記載の方法により作製したアマミノクロウサギｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で培養し、培養皿の約２５％程度（２５％コンフルエント）まで増殖した段階で、幹細胞培養培地１ｍＬ毎に対して４μｇのＩＱ―１を添加し、２４時間ごとに新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地と交換しながら２週間培養した。
【０１０５】
この間、コンフルエントに達した細胞は０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁し、１／４から１／８量を新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１０６】
ドーム状のコロニーを形成した細胞をガラス管あるいはマイクロピペットで分取し、０．２５％トリプシン―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で個々の細胞が単一化されるまで処理したのち、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁したものを新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１０７】
以上の操作により、ナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞を得た。
【０１０８】
得られた細胞は、典型的なナイーブ型の形体を示し、優れた増殖能力を示した。
処理後の細胞をアルカリフォスファターゼ活性評価試験により、本発明で製造したナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞がアルカリフォスファターゼ活性強陽性となることを確認した。アルカリフォスファターゼ活性はプライム型幹細胞で弱陽性であり、ナイーブ型幹細胞で強陽性となることから、同結果は本発明がアマミノクロウサギ細胞においても有効であることを示している。
【０１０９】
得られたナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞は、ドーム状で小さなコロニーという典型的なナイーブ型の形態（図３、Ｂ）を示し、優れた増殖能力を示した。
これに対して、アマミノクロウサギｉＰＳ細胞およびβカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養した上記アマミノクロウサギｉＰＳ細胞は、いずれも平坦で大きなコロニーというプライム型多能性幹細胞の形態（図３、ＡおよびＣ）を示した。
【０１１０】
また、図７に示すとおり、本発明のナイーブ型アマミノクロウサギｉＰＳ細胞（Ｂ）は、アマミノクロウサギｉＰＳ細胞（Ａ）に比べて、ナイーブ型で特異的に認識するアルカリフォスファターゼ活性を示す染色が強くなっており、本発明のアマミノクロウサギｉＰＳ細胞がナイーブ型であることが明らかである。
【０１１１】
実施例４
＜ＢＣ−Ｋ４９常時アセチル化変異体遺伝子の導入によるマウスエピブラスト幹細胞からのナイーブ型多能性幹細胞の製造＞
近畿大学で作製されたマウスエピブラスト幹細胞ＫＥｐ１株に、βカテニンのリジン４９残基をグルタミンに置換したβカテニン（配列１）をコードするｃＤＮＡを組込んだｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンおよびトランスポゼース（ＰＢａｓｅ）をエレクトロポーレーション法により導入した。
【０１１２】
エレクトロポーレーション処理２４時間後より、ハイグロマイシンを含む幹細胞培養液で培養し、この間、コンフルエントに達した細胞は０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいハイグロマイシン添加幹細胞培養培地に懸濁し、１／４から１／８量を新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１１３】
ＢＣ−Ｋ４９常時アセチル化変異体ｃＤＮＡとハイグロマイシン耐性遺伝子は同じベクター状に組み込んであり、薬剤耐性を示す細胞は全てＢＣ−Ｋ４９常時アセチル化変異体ｃＤＮＡを発現する。
【０１１４】
２週間の薬剤選抜後にコロニーを形成した細胞をガラス管あるいはマイクロピペットで分取し、０．２５％トリプシン―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で個々の細胞が単一化されるまで処理したのち、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しい幹細胞培養培地に懸濁したものを新しいフィーダー細胞上で培養した。以上の操作により、ナイーブ型マウス多能性幹細胞を得た。
【０１１５】
得られたナイーブ型マウス多能性幹細胞を、実施例１に示す方法で定量ＲＴ−ＰＣＲ解析することにより、ナイーブ型マーカー遺伝子であるＫｌｆ４やＺｆｐ４２などが陽性となることを確認した。
【０１１６】
また、図８に示すとおり、ナイーブ型マウス多能性幹細胞は、プライム型幹細胞に特異的な遺伝子の発現が低下していることから、ナイーブ型幹細胞に特徴的な性質を獲得したことが明らかである。
【０１１７】
実施例５
＜ヒト体細胞からのナイーブ型ｉＰＳ細胞の直接的な製造＞
理化学研究所バイオリソースセンターよりヒト表皮由来繊維芽細胞を入手し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて培養をおこなった。同細胞に対し、センダイウイルスベクターを用いてＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｓｏｘ２を導入した。その際、培地１ｍＬ毎に対して４μｇのＩＱ―１を添加し、２４時間ごとに新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地と交換しながら２週間培養した。
【０１１８】
この間、コンフルエントに達した細胞は０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁し、１／４から１／８量を新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１１９】
ドーム状のコロニーを形成した細胞をガラス管あるいはマイクロピペットで分取し、０．２５％トリプシン―０．０２％ＥＤＴＡ混合液で個々の細胞が単一化されるまで処理したのち、遠心処理により生存細胞のペレットを得、上清を全て除去したのち、新しいＩＱ―１添加幹細胞培養培地に懸濁したものを新しいフィーダー細胞上で培養した。
【０１２０】
以上の操作により、ヒトナイーブ型ｉＰＳ細胞を得た。
【０１２１】
得られたヒトナイーブ型ｉＰＳ細胞は、ドーム状で小さなコロニーという典型的なナイーブ型の形態（図１０、Ｂ）を示し、優れた増殖能力を示した。
これに対して、βカテニン−Ｐ３００相互作用阻害剤なしで培養した場合には平坦で大きなコロニーという通常のプライム型ヒトｉＰＳ細胞が形成された（図１０、Ｃ）。
【図１】
2020130099.tif 000002
【図２】
2020130099.tif 000003
【図３】
2020130099.tif 000004
【図４】
2020130099.tif 000005
【図５】
2020130099.tif 000006
【図６】
2020130099.tif 000007
【図７】
2020130099.tif 000008
【図８】
2020130099.tif 000009
【図９】
2020130099.tif 000010
【図１０】
2020130099.tif 000011
【配列表】
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