(57)【要約】      （修正有）【課題】有機溶媒を使用する一般的な核酸抽出方法を必要とすることなく試料を調製する工程を含み、該調製によって得られた調製液を直接、微生物の検出方法に供することができる微生物の検出方法を提供する。【解決手段】試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ〜Ｆ：（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、を包含するとともに、少なくとも前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ〜Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
【請求項２】
前記反応容器の容量が、５０ｍＬ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応容器中にビーズが含まれている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビーズがジルコニアビーズである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程Ｂにおいて微生物を濃縮する工程が、遠心分離処理を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理からなる群より選択される少なくとも一つの処理を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、ビーズ破砕処理を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理及びビーズ破砕処理を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記工程Ｅを含み、前記工程Ｅにおいて溶菌液又は破砕液を精製する工程が、遠心分離処理を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
微生物の検出が、微生物由来の核酸の検出である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
微生物由来の核酸の検出が、微生物由来の核酸の増幅をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸の増幅が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、及びＴＲＣ法からなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出対象微生物が、Mycobacterium属に分類される微生物の少なくとも一つである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
検出対象微生物が、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M. gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、及びM. yongonenseからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料の前処理方法、又は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ〜Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは請求項１〜１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のための試薬であって、
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、
前記工程Ｄに使用するためのビーズ、或いは
前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、
を含む、試薬。
【請求項２０】
請求項１９に記載の試薬の少なくとも一つを含む、請求項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは請求項１〜１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のためのキット。
【請求項２１】
前記工程Ａ〜Ｄ、工程Ａ〜Ｅ、又は工程Ａ〜Ｆで使用するための反応容器をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれ得る微生物の検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる微生物を検出することは臨床診断、食品衛生などにおいて重要である。しかしながら、試料を直接検出に供すると核酸の増幅又は検出中に反応阻害などが起こり、正しい測定結果が得られないことがある。この点はとりわけ、夾雑物を多く含む生体試料を対象として微生物を検出する方法において大きな問題である。そこで、試料中に含まれる微生物を検出する際に、試料を直接検出に供するのではなく、何らかの前処理を行うことが一般的である。これは、試料中に含まれる夾雑物の除去や測定に供するための標識作業などを目的としており、試料中の微生物をより正確に検出するために必要な操作と考えられている。
【０００３】
特に、微生物を検出する方法が微生物由来の核酸を検出する方法である場合、前処理として、試料中の核酸を精製することが一般的に行われる（例えば、特許文献１、非特許文献１）。これは、核酸を検出するために、例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応に供する場合、試料中の夾雑物により反応が阻害されることを抑制するためである。精製法の一つとして核酸抽出法があり、核酸抽出法としてはＢＯＯＭ法を原理とした方法等がある。
【０００４】
しかしながら、核酸抽出は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高いといった課題があった。特に、核酸抽出は操作が煩雑であるとともに、タンパク質変性作用がある毒性の高い試薬を必要とすることがある。また、核酸抽出は、操作によって反応容器を移して行うことがあるため、操作性が悪いとともにコンタミリスクがあった。
【０００５】
ところで、抗酸菌等の一部の細菌は、ミコール酸を含む脂質層を有した強固な細胞壁を持つことが知られており、通常、他の微生物よりも検出精度が低い。これまでにも、このような強固な細胞壁を有する抗酸菌の検査を行う手法の検討がなされているが（例えば、特許文献２）、より高感度に検査を行うための更なる前処理法の検討が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−０６７２９１
【特許文献２】特開２０１０−２３３５０３
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】R. Boom et al, Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids, Journal of Clinical Microbiology, 1990, vol.28, no.3, p.495-503.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、フェノール等の有機溶媒を使用する一般的な核酸抽出方法を必要とすることなく、試料を前処理する工程を含み、該前処理によって調製された検出対象試料液を微生物の検出方法に供することができる微生物の検出方法の提供を一つの目的とする。また、その前処理、検出対象試料液の調製、又は微生物の検出を実施するための試薬又はキットの提供を一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、試料（生体試料、食品試料等）を水又はアルカリ性溶液で懸濁した後、懸濁液に含まれる微生物を濃縮し、さらにアルカリ性溶液を添加後、懸濁液中の微生物を溶菌又は破砕する、簡便な、有機溶媒を必須としない、試料の前処理方法によって、試料中の微生物の検出が可能であることを見出し本発明を完成させた。代表的な本発明は以下のとおりである。
【００１０】
［項１］
試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ〜Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
［項２］
前記反応容器の容量が、５０ｍＬ以下である、項１に記載の方法。
［項３］
前記反応容器中にビーズが含まれている、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記ビーズがジルコニアビーズである項３に記載の方法。
［項５］
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記工程Ｂにおいて微生物を濃縮する工程が、遠心分離処理を含む、項１〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理からなる群より選択される少なくとも一つの処理を含む、項１〜７のいずれかに記載の方法。
［項９］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理を含む、項１〜８のいずれかに記載の方法。
［項１０］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、ビーズ破砕処理を含む、項１〜８のいずれかに記載の方法。
［項１１］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理及びビーズ破砕処理を含む、項１〜８のいずれかに記載の方法。
［項１２］
前記工程Ｅにおいて溶菌液又は破砕液を精製する工程が、遠心分離処理を含む、項１〜１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］
微生物の検出が、微生物由来の核酸の検出である、項１〜１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］
微生物由来の核酸の検出が、微生物由来の核酸の増幅をさらに含む項１３に記載の方法。
［項１５］
前記核酸の増幅が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、及びＴＲＣ法からなる群より選択される少なくとも一つを含む、項１４に記載の方法。
［項１６］
検出対象微生物が、Mycobacterium属に分類される微生物の少なくとも一つである、項１〜１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］
検出対象微生物が、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M. gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、及びM. yongonenseからなる群より選択される少なくとも一つである、項１６に記載の方法。
［項１８］
試料の前処理方法、又は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ〜Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
［項１９］
項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは項１〜１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のための試薬であって、
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、
前記工程Ｄに使用するためのビーズ、或いは
前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、
を含む、試薬。
［項２０］
項１９に記載の試薬の少なくとも一つを含む、項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは項１〜１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のためのキット。
［項２１］
前記工程Ａ〜Ｄ、工程Ａ〜Ｅ、又は工程Ａ〜Ｆで使用するための反応容器をさらに含む、項２０に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡便な試料の前処理によって、微生物の検出、特に核酸検出に基づく微生物の検出、に適した液（検出対象試料液）を、有機溶媒を必須とせずに調製でき、この検出対象試料液を直接、微生物の検出に供することができる。また、試料の前処理の過程及び検出対象試料液を調製する過程において実効的なタンパク質変性剤が必須ではないため、薬傷の危険性もない。また、試料の前処理及び検出対象試料液の調製は、同一の反応容器内で行われるので、操作性の向上、資材コストの削減、コンタミリスクの回避も期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上述の代表的な発明を中心に説明する。
【００１３】
［微生物の検出方法］
生体試料、食品、環境試料等の一部を採取し、採取試料に微生物の検出が可能になる程度にまで各種の前処理を施し、得られた前処理物に含まれる微生物を検出することが一般的に行われている。本発明の一実施形態は、試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ〜Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。  
【００１４】
［試料］
本発明において使用できる試料は、検出目的の微生物を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。試料は工程Ａにおいて懸濁される。試料としては、例えば、生体試料や食品、環境試料等が挙げられる。なお、本発明でいう微生物とは、広義の意味で小さな生物を示し、バクテリア、真菌、ウイルス、寄生虫、線虫等を含むがこれらに限定されない。また、微生物の検出とは、微生物そのものの有無だけでなく、微生物構成成分（タンパク質、核酸、脂質等）及びそれらをコードする遺伝子等を検出することも含む。検出の対象となる微生物は生きた微生物、死んだ微生物のいずれであってもよいが、生きた微生物が好ましい。
【００１５】
生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血漿、血清、血液培養液、尿、唾液、羊水、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、直腸拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、鼓膜切開液、肺胞洗浄液、胃洗浄液、腸洗浄液、子宮頸管拭い液、尿道擦過物、臓器抽出液、組織抽出液分離培養コロニー、気管支洗浄液、カテーテル洗浄液等が挙げられる。本発明は、夾雑物を多く含む生体試料を対象とする場合であっても、感度のよい微生物検出が可能である。このような観点から、本発明が対象とする生体試料としては、例えば、排泄物、吐瀉物、糞便、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、喀痰が好適であり、糞便、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰がより好適であり、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰が更に好適であり、喀痰がとりわけ好適であり、これらの中でも哺乳動物由来、殊にヒト由来のものがより一層好適である。
【００１６】
食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具等の食品接触部又は人接触部やドアノブ等の人接触部を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。液体成分が多い試料については、必要に応じて、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。
【００１７】
環境試料の例として、水、氷、土壌等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川、滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。また、施設の壁面、床面、設備や備品、便器等を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。液体成分が多い試料については、必要に応じて、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。
【００１８】
試料の採取方法は、特に制限されず、試料の種類、大きさ、目的に応じて公知の方法を用いることができる。例えば、綿棒、スワブ、白金耳、スポイト、へら、さじなどの採取具を用いた採取方法である。
【００１９】
試料は、本発明の工程Ａに供する前に、必要に応じて前処理を実施してもよい。例えば、液体成分が多い試料については、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。例えば、粘性の高い試料（喀痰など）については、セミアルカリプロテアーゼ（ＳＡＰ）処理やＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理を施してもよい。これらの処理を行った検体も試料として、本発明に使用することができる。  
【００２０】
［工程Ａ］
工程Ａでは、試料をそのまま、又は試料の一部を採取して、水又はアルカリ性溶液に懸濁する。水、アルカリ性溶液のどちらを使用するかは、試料によって適宜選択することができる。例えば、ｐＨ調整や夾雑物除去を目的として、アルカリ性溶液を選択できる。アルカリ性溶液を使用することで、目的の微生物以外の夾雑物を分解又は溶解しやすくなる。なお、採取された試料や前処理された試料において試料中の微生物がが水又はアルカリ性溶液に含有され、次の工程Ｂに供することができる場合、本工程を省略しても差し支えない。
【００２１】
水としては、例えば精製水、滅菌水、水道水等が挙げられるが、不純物が少ない点で精製水又は滅菌水が好ましい。また、試料が水の場合は、必要に応じて精製水又は滅菌水で希釈することもできるし、工程Ａを省略することもできるが、アルカリ性溶液を使用することが好ましい。
【００２２】
アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つが挙げられ、水酸化カリウム水溶液及び／又は水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。これらのアルカリ性溶液は、微生物の検出に不適切な大きな影響を与えない。
【００２３】
また、アルカリ性溶液として緩衝作用を持つ緩衝液を使用してもよい。緩衝液として、例えば、当該分野で周知のＴｒｉｓ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＰＢＳ、アミノ酸緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
アルカリ性溶液のｐＨは、７．０以上、８．０以上、９．０以上、１０．０以上、１１．０以上等とすることができ、また、１４．０以下、１３．０以下、１２．５以下、１２．０以下、１１．０以下等とすることができ、８．０〜１４．０が好ましく、９．０〜１３．０がより好ましい。なお、ここでいうアルカリ性溶液のｐＨとは、試料を懸濁する前のアルカリ性溶液のｐＨをいうが、工程Ａで得られるアルカリ性溶液添加後の懸濁液のｐＨも上記範囲にあることが好ましい。
【００２５】
水又はアルカリ性溶液に対する試料の量は、以降の工程を行うことができる量であれば制限されず、例えば、水又はアルカリ性溶液に対して、８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、５０％（ｖ／ｖ）以下がより好ましく、４０％（ｖ／ｖ）以下がさらに好ましく、下限としては０．１％（ｖ／ｖ）以上、０．５％（ｖ／ｖ）以上、１％（ｖ／ｖ）以上とすればよい。
【００２６】
工程Ａにおいて、必要に応じてさらに添加剤等を加えてもよい。添加剤として、ＥＤＴＡ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドン、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、これらに限定されない。添加剤の添加量は、各添加剤が有効にはたらく範囲内であれば、特に制限されない。
【００２７】
工程Ａにおける懸濁は、公知の方法で実施できる。例えば、試料、及び水又はアルカリ性溶液を含んだチューブを手動で振動させて懸濁する方法（タッピング）、ピペットマン等によるピペッティング、転倒混和、ボルテックスミキサー等による懸濁などである。
【００２８】
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する。濃縮とは、懸濁液中に含まれる微生物を集菌するあるいはその微生物の濃度を上げることである。濃縮後、濃縮物を得るために不要な成分、例えば遠心分離による濃縮により微生物が沈降する場合における上清、の一部若しくは全部の除去を行ってもよい。濃縮方法は、目的の微生物を濃縮できれば特に制限はなく、例えば、遠心分離や磁性ビーズ分離、加熱乾燥、凍結乾燥等による処理で実施できるがこれらに限定されない。
【００２９】
遠心分離は、懸濁液に遠心力をかけることで、比重の異なる物質を分離あるいは分画する方法である。目的の微生物が沈降物にならないほどの遠心力をかければ、目的の微生物は上清に残り、夾雑物等は沈降物として分離される。一方で、目的の微生物が沈降物になるほどの遠心力をかければ、目的の微生物は沈降物として分離され、沈降物にならない夾雑物等は上清に残る。好ましくは目的の微生物が沈降物となる遠心分離である。遠心分離での遠心力は、目的の微生物や懸濁液中の物質に応じて適宜選択できる。遠心力は、例えば２，０００ｇ以上、５，０００ｇ以上、７，０００ｇ以上、８，０００ｇ以上、９，０００ｇ以上、１０，０００ｇ以上、１３，０００ｇ以上等とでき、目的の微生物を沈降物とする場合には５，０００ｇ以上が好ましく、８，０００ｇ以上がより好ましく、１０，０００ｇ以上がさらに好ましく、１３，０００ｇ以上がより一層好ましいが、これらに限定されない。遠心力の上限値は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されないが、一例として、５０，０００ｇ以下とすることができ、好ましくは２０，０００ｇ以下とすることができる。また、遠心分離を行う時間も目的の微生物や懸濁液中の物質に応じて適宜選択できる。一般的に遠心分離を行う時間を長くすれば、沈降物はできやすくなるが、時間を要する。したがって、遠心分離を行う時間は短いほうが好ましく、例えば１０分以内、５分以内、３分以内等とすることができるが、これらに限定されない。
例えば、目的の微生物が沈降物となる遠心力で遠心分離を行い、その上清の一部若しくは全部を除くことで、目的の微生物が濃縮される。
【００３０】
［工程Ｃ］
工程Ｃでは、工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する。濃縮物は、工程Ｂによって微生物が濃縮されたものであり、固形物及び／又は液体物であり得る。固形物であれば、アルカリ性溶液を添加した後、懸濁することで懸濁液を調製する。液体物であれば、アルカリ性溶液を添加した後、懸濁することで溶液を均一化してもよい。
【００３１】
工程Ｃにおいてアルカリ性溶液としては、前記工程Ａで説明したと同様のアルカリ性溶液を使用できる。また、工程Ｃでは、工程Ａで説明したと同様に、添加剤等を懸濁液に更に加えてもよい。
【００３２】
また、工程Ｃにおいて、濃縮物に対して添加するアルカリ性溶液の量は特に制限されないが、後述する工程Ｄにおける懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程で、アルカリ処理としてはたらく量が好ましい。例えば、工程Ｂにおいて得られる濃縮物が液体物の場合、その濃縮物１５０μＬに対して、工程Ｃで添加するアルカリ性溶液の量は、一例として１５０μＬ以下、好ましくは１００μＬ以下、より好ましくは７５μＬ以下とすることができる。下限値としては、例えば、１μＬ以上、好ましくは５μＬ以上、より好ましくは１０μＬ以上とすることができる。更に、工程Ｃで用いるアルカリ性液のｐＨとしては、例えば、アルカリ性溶液を添加した後の懸濁液のｐＨが、８．０〜１４．０が好ましく、９．０〜１３．０がより好ましい。
【００３３】
工程Ｃでは、工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加した後、懸濁（混合）させることが好ましい。工程Ｃにおける懸濁は、公知の方法で実施できる。例えば、濃縮物とアルカリ性溶液を含んだチューブを手動で振動させて懸濁する方法（タッピング）、ピペットマン等によるピペッティング、転倒混和、ボルテックスミキサー等による懸濁などである。
【００３４】
［工程Ｄ］
工程Ｄでは、工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する。この工程では、微生物に含まれる核酸、タンパク質、脂質等が液中に放出されうる。放出された核酸、タンパク質、脂質等をターゲットにすることで、後の、微生物の検出が感度よく効率的に実施できる。
【００３５】
工程Ｄは、撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理の少なくとも一つの処理を含む方法により好ましく実施できる。
【００３６】
撹拌処理は懸濁液を撹拌して微生物を破砕する方法である。撹拌処理は、転倒混和、ボルテックスミキサー、撹拌機などにより行うことができる。
【００３７】
ビーズ破砕処理は、懸濁液にビーズを加えて撹拌することで微生物を破砕する方法である。用いるビーズの種類は特に制限はなく微生物破砕用のものであれば使用でき、例えば、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等が挙げられるが、ジルコニアビーズがより好ましい。また、ビーズのサイズは例えば５ｍｍ以下が好ましく、複数のサイズのビーズを組み合わせて使用してもよい。複数のサイズのビーズを用いることで、破砕効率の向上が期待できる。処理時間は例えば１０秒間〜１０分間、好ましくは２０秒間〜５分間、より好ましくは３０秒〜３分間である。
なお、ビーズ破砕処理に用いるビーズは、工程Ａ〜Ｄのいずれの段階で反応容器に加えてもよいが、工程Ａを行う段階、特に試料、水、又はアルカリ性溶液を反応容器に加える前、から反応容器に含めておくと、以降の工程でビーズを導入する操作を要しないため好ましい。工程Ａ〜Ｅにおいて反応容器にビーズが含まれていても前処理が可能である。
【００３８】
超音波処理は、懸濁液に超音波を当てることで、微生物を破砕する方法である。例えば、超音波ホモジナイザーは簡便に細胞壁を壊すことができ、微生物が破砕されやすい。処理時間は例えば１０秒間〜２分間、好ましくは１０秒間〜１分間であり、１回のみでも複数回（例えば２〜６回、２〜４回等）繰り返してもよい。
【００３９】
加熱処理は、懸濁液に熱を加えることで微生物を溶菌させる方法である。加熱温度は特に制限されないが、一例として７５℃以上とすることができ、８０℃以上が好ましい。加熱時間は例えば１０秒間〜３０分間、好ましくは２０秒間〜２０分間、より好ましくは３０秒間〜１０分間である。
【００４０】
アルカリ処理は、懸濁液にアルカリ性物質を加えて微生物を溶菌する方法である。アルカリ性物質は、懸濁液中の微生物を溶菌できる程度のアルカリ性であり、微生物の検出を阻害しないもの、あるいは阻害しうるとしても検出に供される前に簡便に除去できるものであれば、特に制限されない。アルカリ性物質は、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム又は炭酸カルシウムであってもよく、これらを単独で又は複数種を組み合わせて使用でき、好適にはこれらの水溶液（アルカリ性溶液）である。懸濁液にアルカリ性溶液が添加される場合アルカリ性溶液のｐＨは、７．０以上、８．０以上、９．０以上、１０．０以上、１１．０以上等とすることができ、また、１４．０以下、１３．０以下、１２．５以下、１２．０以下、１１．０以下等とすることができ、ｐＨ８．０〜１４．０であることが好ましく、ｐＨ９．０〜１３．０であることがより好ましい。
【００４１】
また、工程Ｃで得られた懸濁液中のアルカリ性溶液が溶菌作用を有するときは、当該懸濁液をそのまま、静置等する、或いは撹拌処理等の他の処理を併用することによって溶菌することができ、このような態様は本工程のアルカリ処理を省略又は簡便にできるため好ましい。例えば、工程Ｃにおいて得られる懸濁液が溶菌に適したアルカリ性（例えばｐＨ８．０〜１４．０、ｐＨ９．０〜１３．０等）であるときは、工程Ｄとしての操作を省略することもできる。
【００４２】
工程Ｄでは、一つ又は複数の処理を連続して行ってもよいし、可能であれば複数の処理を組み合わせて同時に行ってもよい。複数の処理を組み合わせることは、より溶菌又は破砕されやすくなるので好ましい。一実施形態において、工程Ｃで溶菌に適したアルカリ性溶液に懸濁し、工程Ｄにおいて他の処理、例えば撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理等を行う。また、他の実施形態では、工程Ｃで得られた懸濁液に撹拌処理及びビーズ破砕処理を行う。さらに別の実施形態では、工程Ｃで得られた懸濁液にビーズ破砕処理を行う。なかでも、強固な細胞壁を有するMycobacterium属の微生物を検出する場合には、工程Ｄにおいて、加熱処理（例えば、約８０℃以上で１０分間程度）とビーズ破砕処理を組み合わせて行うことが好ましく、上記のような加熱処理を先に行い、次いでビーズ破砕処理を行うことがより好ましい。
【００４３】
［工程Ｅ］
本発明では工程Ｅとして、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を精製する工程を設けてもよい。工程Ｅで該液が精製されることによって、微生物の検出をより高感度に行うことができる。ここでいう精製とは、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液中の核酸、タンパク質、脂質等の純度を上げることをいう。すなわち、該液中に放出された核酸、タンパク質、脂質等以外の夾雑物の量を低減し、工程Ｅで得られる精製液における核酸、タンパク質、脂質等の純度を工程Ｄで得られた液より上げることをいう。精製する方法は特に制限されないが、限外ろ過処理、分離処理等が挙げられ、これらの処理は単独でも複数組み合わせてもよい。工程数を小さく、前処理を簡便にする観点からは工程Ｅを設けないこともできる。
【００４４】
限外ろ過とは、目的に応じた孔径を有するフィルター等を用いて目的物とそれ以外の夾雑物を分離する方法である。例えば、溶液中に放出された微生物由来の核酸、タンパク質、脂質等を選択的に分離するため、それらが通過する大きさの孔を有するフィルターを用いることが好ましい。該フィルターを用いることで、核酸、タンパク質、脂質等の小分子はろ液として通過し、孔よりも大きい夾雑物を除去することができる。
【００４５】
分離とは、物理的あるいは化学的な方法で核酸、タンパク質、脂質等を選択的に収集することをいう。例えば、遠心分離、ＨＰＬＣ等をはじめとするクロマトグラフィー、磁気分離、電気分離等が挙げられるが、これらに限定されない。一例として遠心分離にて選択的に分離する場合、核酸、タンパク質、脂質等が沈降物にならない程度の遠心力を加えることが好ましい。該遠心力を加えて処理することで、核酸、タンパク質、脂質等の目的物は上清に残るため、上清をのちの検出に使用することができる。遠心力は、５，０００ｇ以上が好ましく、８，０００ｇ以上がより好ましく、１０，０００ｇ以上がさらに好ましく、１３，０００ｇ以上がより一層好ましいが、これらに限定されない。遠心力の上限値は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されないが、一例として、５０，０００ｇ以下とすることができ、好ましくは２０，０００以下とすることができる。また、遠心分離を行う時間は１０分以内が好ましく、５分以内がより好ましく、３分以内がさらに好ましいが、これらに限定されない。
【００４６】
［反応容器］
本発明では、少なくとも工程Ａ〜Ｅを同一の反応容器内で行い、工程Ａ〜Ｆを同一の反応容器内で行ってもよい。反応容器は、工程Ａ〜Ｅ又は工程Ａ〜Ｆを実施できる形態であれば、特に制限されず、材質、形、色、容量等は目的に合わせて選択することができる。例えば、工程Ｂあるいは工程Ｅにおいて遠心分離を行う場合、該反応容器は遠心分離機に適応可能であることが好ましい。したがって、該反応容器の容量は、例えば、５０ｍＬ以下、好ましくは２５ｍＬ以下、より好ましくは１５ｍＬ以下、更に好ましくは５ｍＬ以下、更により好ましくは２ｍＬ以下又は１．５ｍＬ以下である。本発明の方法では、少なくとも工程Ａ〜Ｅを同一容器で行うことで、懸濁操作の不足や溶液の分注ロス等の発生を抑制することができる。また、複数の反応容器を用いて溶液等を移す操作をすると、操作回数が１回以上増えるとともに、資材コストの増加、コンタミリスクの増加、試料からの感染リスクの増加等のデメリットがあり、本発明ではこれらのデメリットが小さい。したがって、同一の反応容器内で各工程を行う本発明は、操作性、安全性等の観点からも非常に優れている。
【００４７】
また、反応容器中にビーズが含まれていてもよい。特定の好ましい実施形態では、最初の工程Ａの段階から反応容器中にビーズが充填された状態で本発明の方法を実施することができる。本発明では、反応容器がビーズを含む状態で工程Ａを行い、次いで、その同じ反応容器内で工程Ｂの濃縮工程（例えば、遠心分離処理）以降の工程を行っても、良好な検出結果が得られている（試験例１〜３）。このため、ビーズを反応容器に供給すると汚染が懸念される等の理由により工程Ｂ以降におけるビーズ供給操作を回避したい場合等があり、そのような場合でも、本発明において工程Ａの段階からビーズを含んだ反応容器を使用しておけば、ビーズ供給による汚染の心配がなく、そのため、工程Ｄにおいてビーズ破砕処理を容易に実施することができる。用いるビーズの種類は特に制限はなく微生物破砕用のものであれば使用でき、例えば、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等が挙げられるが、ジルコニアビーズがより好ましい。また、ビーズのサイズは例えば粒子径５ｍｍ以下が好ましく、複数のサイズのビーズを組み合わせて使用してもよい。複数のサイズのビーズを用いることで、破砕効率の向上が期待できる。
【００４８】
［工程Ｆ］
工程Ｆでは、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供し、微生物を検出する。該液を検出対象試料液として直接、微生物の検出に供してもよい。該液に必要に応じて各種標識、核酸増幅、核酸検出等のための、微生物検出用試薬等を添加することで微生物を検出できる。また、該液を含む工程Ａ〜Ｅと同一の反応容器にこのような試薬等を添加してもよい、つまり工程Ｆも工程Ａ〜Ｅと同一の反応容器で行ってもよい。あるいは、該液をこのような試薬等を予め含んだ検出用容器に添加してもよい。なお、微生物の検出を阻害しない限りにおいて、適宜の、他の成分を加えたり、他の処理を加えたりできる。
【００４９】
微生物の検出は、例えば核酸検出法、抗原検査法、抗体検査法、培養同定法、質量分析法、生化学的性状試験等により行えるが、検出の精度及び検出に要する時間の点で核酸検出法が好ましい。
【００５０】
核酸を検出する方法は、さらに、微生物由来の核酸の増幅を含むことが好ましい。核酸増幅を行うことで、より高感度に目的の微生物由来の核酸を検出することができる。核酸増幅の方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法等が挙げられ、これらは単独で又は組み合わせて利用される。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて適宜選択できる。好ましい核酸増幅はＰＣＲ法である。
【００５１】
ＰＣＲ法は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。
【００５２】
［検出対象の微生物（検出対象微生物）］
本発明において、検出の対象となる微生物は、特に制限されないが、例えば、Mycobacterium属に分類される微生物（結核菌群（Mycobacterium tuberculosis complex）、非結核性抗酸菌等）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile、Clostridioides difficile）、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、ウレアプラズマ、ＨＩＶ、ＨＰＶ等であり、検出対象微生物は１種単独でも複数種組み合わせてもよい。なお、目的の微生物の形態、性状、性質等に合わせて、各工程を本発明の範囲内で適宜変更してもよい。
【００５３】
例えば、Mycobacterium属に分類される微生物の一つである、結核菌群は、ミコール酸を細胞壁に多く含み、外的因子に対して高い抵抗性を示すため、工程Ｄの溶菌又は破砕する工程において複数種の処理を行うこと（なかでも、加熱処理とビーズ破砕処理を相前後又は並行して行うこと）が好ましいが、特に限定されない。
【００５４】
Mycobacterium属に分類される微生物としては、特に限定されないが、例えば、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M. gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、M. yongonense等を挙げることができる。本発明の検出方法では、これらのMycobacterium属の任意の微生物を検出することができるが、なかでもM. avium、M. intracellulare、M. africanum、M. bovis、M. microti、及びM. tuberculosisからなる群より選択される少なくとも一つが高感度に検出できるので好ましい。
【００５５】
［試料の前処理方法］
本発明の一実施形態は、微生物の検出ための試料の前処理方法であって、以下の工程Ａ〜Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。
この方法によって、微生物の検出に適した検出対象試料液を簡便に得ることができる。この方法の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。
【００５６】
［検出対象試料液の調製方法］
本発明の一実施形態は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ〜Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ〜Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。
この方法によって調製される検出対象試料液は、上記工程Ｆに記載された溶菌液、破砕液、又は精製液として利用できる。この方法の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。
【００５７】
［試薬］
本発明の一実施形態は、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のための試薬である。試薬の種類、個数について、これらの方法が実施できれば特に制限されない。
例えば、工程Ａ〜Ｅ又は工程Ａ〜Ｆに使用するための反応容器；工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液；工程Ｄに使用するためのビーズ；工程Ｆに使用するための核酸増幅酵素、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩等の１種又は２種以上；等が挙げられる。核酸増幅酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡリガーゼ、ヘリカーゼ；が試薬のひとつとして挙げられる。これらの試薬は本発明の効果が得られる限りにおいて公知のものを適宜使用できる。また、本発明の試薬の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。
【００５８】
［キット］
本発明の一実施形態は、前記試薬を含む、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のためのキットである。キットの構成について、前記試薬の少なくとも一つを含み、本発明の方法が実施できれば特に制限されない。
例えば、前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、前記工程Ｄに使用するためのビーズ、のいずれか一つを少なくとも含む、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のためのキットが挙げられる。また、例えば、前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、のいずれか一つを少なくとも含む、本発明の微生物の検出方法のためのキットが挙げられる。  これらのキットはさらに、前記工程Ａ〜Ｄ、工程Ａ〜Ｅ、又は工程Ａ〜Ｆで使用するための反応容器を含んでもよい。本発明のキットの構成要素の詳細は本発明の検出方法における詳細と同様である。
【実施例】
【００５９】
以下に試験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は試験例に限定されるものではない。
【００６０】
〔試験例１：反応容器の検討〕
（１−１）概要
工程Ａ〜Ｅを同一の反応容器で行う場合と、複数の反応容器で行う場合における微生物検出結果を比較した。
【００６１】
（１−２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. avium菌体を１５００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。
【００６２】
（１−３）同一の反応容器を用いた方法
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ〜Ｆを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器はジルコニアビーズを含む（以下の試験例においても同様）。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器に滅菌水２４０μＬ、試料約１６０μＬを分注、懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１００μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２〜１３の水酸化カリウム水溶液を約１００μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を１分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. aviumの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。
【００６３】
（１−４）複数の反応容器を用いた方法
複数の反応容器を用いて以下に示す工程Ａ〜Ｆを行った。
工程Ａ：一つ目の反応容器として１．５ｍＬマイクロチューブ（ザルスタット社）を使用した。該容器を工程Ａから工程Ｃまで使用した。該容器に滅菌水２４０μＬ、試料約１６０μＬを分注、懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１００μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２〜１３の水酸化カリウム水溶液を約１００μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液の全量を二つ目の反応容器であるジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズに移し、８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を１分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. aviumの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。
【００６４】
（１−５）結果
同一の反応容器で各工程を行った場合（１−３）と、複数の反応容器で各工程を行った場合（１−４）でのM. avium検出結果(陽性率)を比較した。
【００６５】
表１が同一の反応容器で各工程を行った場合と、複数の反応容器で各工程を行った場合での陽性率である。複数の反応容器を使用した場合、陽性率は４３．８％程度と低かった一方、同一の反応容器で各工程を行った場合、陽性率は１００％であった。これは容器から懸濁液を移す際のロスを抑制できたことが一因であると考えられるが、そのようなロスの抑制から予想される以上に高い陽性率を達成することができた。本発明の検出方法により予想以上に高い陽性率を達成できることが確認できた。
【００６６】
【表１】
2020130131.tif 000002
【００６７】
〔試験例２：従来方法との比較１〕
（２−１）概要
本発明の検出方法における試料の前処理方法（工程Ａ〜Ｅ）と従来技術における試料の前処理方法（核酸抽出法）を比較した。従来方法として、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セット（東洋紡社）及びＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）（東洋紡社）による核酸抽出を用いた。
【００６８】
（２−２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. bovis菌体を７５００ＣＦＵ／ｍＬあるいはM. intracellulare菌体を１５００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。
【００６９】
（２−３）本発明の検出方法における検出対象試料液の調製（試料の前処理）
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ〜Ｅを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器にｐＨが約１１の水酸化カリウム約１０００μＬを分注した。該溶液に試料約４００μＬを懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１５０μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２〜１３の水酸化カリウム水溶液を約５０μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を３分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
【００７０】
（２−４）従来技術の検出対象試料液の調製（核酸抽出法）
ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットを用いて試料から核酸抽出を行った。各試薬の操作、取扱いは、それぞれの取扱説明書にしたがって行った。なお、構成試薬である洗浄液は、エタノール溶液（６０〜１００％（ｖ／ｖ））であった。さらに、構成試薬である溶解吸着液はグアニジン塩を含んでいた。
【００７１】
（２−５）微生物の検出
工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注し、該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢ（東洋紡社）あるいはジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用して、M. bovis又はM. intracellulareの検出を行った（工程Ｆ）。従来技術の方法でも同様にして、得られた核酸抽出液を検出対象試料液とし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢ（東洋紡社）あるいはジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用して、M. bovis又はM. intracellulareの検出を行った。装置及び各試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。
【００７２】
（２−６）結果
表２がM. bovis菌体を含む試料を前処理（工程Ａ〜Ｅ又は核酸抽出）して得られた検出対象試料液をジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢで検出した結果である。表３がM. intracellulare菌体を含む試料を前処理（工程Ａ〜Ｅ又は核酸抽出）して得られた検出対象試料液をジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩで検出した結果である。本発明における前処理（工程Ａ〜Ｅ）で調製された検出対象試料液と、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットによる前処理で調製された検出対象試料液（核酸抽出液）を測定した際の各試薬の検出結果（陽性率）は同等であることを確認した。なお、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットは、エタノールやグアニジン塩を含む一方で、本発明における前処理（工程Ａ〜Ｅ）はそれらの有機溶媒や毒性が懸念される試薬は必要としない。したがって、本発明は、従来技術と同等の性能を得ながら、操作性の向上、安全性の向上が期待できることを確認した。
【００７３】
【表２】
2020130131.tif 000003
【００７４】
【表３】
2020130131.tif 000004
【００７５】
〔試験例３：従来方法との比較２〕
（３−１）概要
本発明の微生物検出方法（工程Ａ〜Ｆ）と従来技術における微生物検出方法を比較した。従来方法として、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）及びコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）ＭＡＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。
【００７６】
（３−２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. intracellulare菌体を１５０〜３００００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。
【００７７】
（３−３）本発明の方法
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ〜Ｆを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器にｐＨが約１１の水酸化カリウム約１０００μＬを分注した。該溶液に試料約４００μＬを懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１５０μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２〜１３の水酸化カリウム水溶液を約５０μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を３分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. intracellulareの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。
【００７８】
（３−４）従来技術の方法
アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩを用いて試料を処理し、得られた検出対象試料液をコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）４８及びコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）ＭＡＩを使用してM. intracellulareの検出を行った。装置及び各試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。なお、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩは毒性の高い試薬を含むことをＳＤＳで確認した。また、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩによる検体処理は、１時間以上を要した。
【００７９】
（３−５）結果
M. intracellulare菌体濃度が異なる試料を前処理して得られた各検出対象試料液について、本発明の方法及び従来技術の方法における結果（陽性率）を比較した。
表４が本発明あるいは従来技術での各菌体濃度の試料を前処理して得られた検出対象試料液における結果（陽性率）である。本発明の方法では、菌体濃度７５０ＣＦＵ／ｍＬ以上で陽性率１００％であった。一方で、従来技術の方法では３０００ＣＦＵ／ｍＬ以上で陽性率１００％であった。したがって、本発明は、従来技術よりも感度よく微生物の検出が可能であることを確認できた。また、検出対象試料液調製（前処理）の時間について、本発明の検出方法における調製法（工程Ａ〜Ｅ）が約３０分であるのに対して従来技術の方法が１時間以上であった。したがって、操作時間の観点からも本発明のほうが有意であることを確認した。
【００８０】
【表４】
2020130131.tif 000005
【００８１】
本発明の検出方法における工程Ａ〜Ｅで調製した液（検出対象試料液）を核酸増幅反応に直接供したところ（工程Ｆ）、驚くべきことに、優れた結果が得られた（試験例１〜３）。この結果は、本発明の検出方法における検体の前処理方法（工程Ａ〜Ｅ）で後の検出反応に悪影響を及ぼす夾雑物等を高度に除去でき、その結果、核酸増幅及び検出反応において夾雑物による反応阻害が抑制されたことを示唆する。
【００８２】
また、試験例１〜３では、ミコール酸を細胞壁に多く含み、外的因子に対して高い抵抗性を示すMycobacterium属に分類される微生物の検出を行った。該微生物は、上記の特徴的な細胞壁を有するため、他の微生物と比較して核酸抽出等が煩雑とされているが、本発明によれば、簡便な方法で該微生物を核酸抽出法と同程度に検出できた。したがって、本発明は他の様々な種類の微生物でも検出を行うことが可能であり、臨床診断等の場面で非常に有益である。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の方法を用いることで、核酸精製することなく、試料中に含まれる微生物由来の核酸を検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。