(57)【要約】【課題】  新たな多発性硬化症の治療剤又はその病態を緩和する医薬を提供すること。【解決手段】  ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現抑制物質、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、多発性硬化症抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現抑制物質、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、多発性硬化症抑制剤。
【請求項２】
発現抑制物質が、当該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１に記載の多発性硬化症抑制剤。
【請求項３】
機能阻害物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対する抗体、抗原結合性断片及び化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の多発性硬化症抑制剤。
【請求項４】
発現抑制物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対するモノクローナル抗体である、請求項３に記載の多発性硬化症抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（MultipleSclerosis：ＭＳ）とは、自己免疫疾患のひとつで、髄鞘及び神経軸索を標的とする多発性炎症が惹起され、広汎な脱髄に起因する神経伝導障害を引き起こす疾患である。多発性硬化症の病態が進行すると、運動障害や視覚障害などの重篤な神経症状が現れる。
【０００３】
多発性硬化症は、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）と、進行型ＭＳがある。進行型ＭＳには、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）と、ＲＲＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）が知られている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
多発性硬化症の患者は、世界中で約２５０万人存在すると推測されており、特に欧米地域において、その患者数が多い。日本においても、多発性硬化症の患者数は、年々増加傾向にあり、治療が困難な疾患（難病）の１つに指定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／００２８２７号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１１４３８６号
【特許文献３】国際公開第２０１８／１０１２６１号
【特許文献４】特開２０１８−１７２３２７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】NatureReviews Neurology 2012, 8, 647-656.
【非特許文献２】NatureReviews Neurology 2013, 9, 496-503.
【非特許文献３】MultipleSclerosis Journal 2013, 19: 1428-1436.
【非特許文献４】NatureCommunications 2015, 6: 8437, 1-11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多発性硬化症の病態メカニズムは十分に解明されておらず、有効な多発性硬化症の治療剤もいまだ少ない。そこで、本発明の目的は、新たな多発性硬化症の治療剤又はその病態を緩和する医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまでに、単相型の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、誘導初期に通常の四肢麻痺を伴うＥＡＥ病態が観察されない一方で、誘導後期（誘導後約２８日以降）にＥＡＥ病態（以下、「後期ＥＡＥ病態」ともいう。）が観察されること等の知見を得ていた（特許文献１〜４参照）。
【０００９】
本発明者らは、ＥＡＥマウスのＣＮＳ浸潤Ｔ細胞において、特定の遺伝子群がＮＲ４Ａ２依存的に発現することを見出し、さらにこれらの遺伝子の発現を抑制することにより、多発性硬化症の臨床病態を軽減できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供する。
［１］  ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現抑制物質、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、多発性硬化症抑制剤。
［２］  発現抑制物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を含む、［１］に記載の多発性硬化症抑制剤。
［３］  発現抑制物質が、当該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、［１］又は［２］に記載の多発性硬化症抑制剤。
［４］  機能阻害物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対する抗体、抗原結合性断片及び化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の多発性硬化症抑制剤。
［５］  発現抑制物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対するモノクローナル抗体である、［３］又は［４］に記載の多発性硬化症抑制剤。
［６］  ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現抑制物質、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能阻害物質を、それを必要とするヒト対象に投与するステップを含む、多発性硬化症の治療方法、又は病態の進行抑制方法。
［７］  発現抑制物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質を含む、［５］に記載の方法。
［８］  発現抑制物質が、当該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、［５］又は［６］に記載の方法。
［９］  機能阻害物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対する抗体、抗原結合性断片及び化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］  発現抑制物質が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡに対するモノクローナル抗体である、［８］又は［９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、新たな多発性硬化症の治療剤又はその病態を緩和する薬剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス及び対照マウスのＥＡＥ臨床スコアを示すグラフ、及びこれらマウスにおけるＣＮＳへ浸潤したＴ細胞によるＩＬ−１７産生量を示すグラフである。
【図２】ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を移入した後のＬｙ５マウスのＥＡＥ病態の経時変化を示すグラフである。
【図３】ＥＡＥ発症マウスから採取したＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の表面におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６の発現を示すサイトグラムである。
【図４】ＥＡＥ発症マウスから採取したＣＮＳ浸潤Ｔ細胞におけるＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５発現を示すサイトグラムである。
【図５】抗ＣＤ１１ｃ抗体又は抗ＣＤ１１６抗体を投与したＥＡＥ発症マウスのＥＡＥスコアの経時変化を示すグラフである。
【図６】抗ＣＤ１１６抗体を投与したＥＡＥ発症マウスのＣＮＳ浸潤Ｔ細胞における、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ発現を示すサイトグラムである。
【図７】抗ＣＤ１１６抗体を投与したＥＡＥ発症マウスのＣＮＳ浸潤Ｔ細胞におけるＣＣＬ２及びＣＤ１１ｃの発現を示すグラフである。
【図８】ヒトの末梢血におけるＣＤ４＋ＣＤ１１６＋Ｔ細胞の割合及びＣＤ１１６＋Ｔ細胞の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図９】ヒト（ＲＲＭＳ患者）のＣＮＳ浸潤Ｔ細胞におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６の発現を示すサイトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について、以下に詳細に説明する。
【００１４】
本発明の一実施形態は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（発現抑制物質）、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質（機能阻害物質）を有効成分として含有する、多発性硬化症抑制剤である。本実施形態に係る治療剤は、１種又は複数の発現抑制物質を含有していてもよく、１種又は複数の機能阻害物質を含有してもよく、発現抑制物質及び機能阻害物質をそれぞれ組み合わせて含有していてもよい。
【００１５】
本明細書において、「多発性硬化症抑制剤」とは、例えば、多発性硬化症の発症を抑制する薬剤、多発性硬化症の病態の進行を抑制する薬剤、多発性硬化症の症状を低減又は緩和する薬剤のいずれであってもよい。多発性硬化症の病態進行では、ＣＩＳ（Clinically isolated syndrome）と称される単一の脱髄性症状を発症した後、脱髄性症状を再発して多発性硬化症の発症と診断される場合が多い。具体的には、ＣＩＳを発症した患者は、脱髄性症状が時間的又は空間的多発性を呈することで多発性硬化症と診断され得る。本発明の多発性硬化症抑制剤は、ＣＩＳから多発性硬化症への進展の予防又は抑制に使用するための薬剤としても有効であり得る。また、多発性硬化症は、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、及び進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）のいずれであってもよい。
【００１６】
ＣＤ１１ｃは、インテグリンαＸ鎖を構成するタンパク（Ｉｔｇａｘとも呼ばれる。）であり、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、ＮＫ細胞を含む種々の細胞上に存在する分子量１４５〜１５０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパクである。
【００１７】
ＣＤ１１６は、分子量７５〜８５ｋＤａのヒト顆粒球・単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体のα鎖を構成するタンパク（Ｃｓｆ２ｒａとも呼ばれる。）であり、リンパ球には発現せず、単球、顆粒球及びそれらの前駆細胞に強く発現するタンパクである。ＣＤ１１６分子は、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体の共通β鎖（ＣＤｗ１３１）と会合して、ＧＭ−ＣＳＦに対する高親和性の受容体を形成する。
【００１８】
ＣＣＬ２は、単球走化性タンパク−１（ＭＣＰ−１）とも呼ばれ、主に単球、血管内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞等から産生されるサイトカインである。ＣＣＬ２は、単球、メモリーＴ細胞及び樹状細胞を組織障害部位又は感染部位に誘引する作用、マクロファージ又は単球の表面抗原（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ）又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６）の発現を調節する作用、及び好塩基球の活性化に寄与し、ヒスタミンの遊離を促進する作用を有する。
【００１９】
ＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）は、ＩＬ−１ｒｎによってコードされるタンパクであり、ＩＬ−１受容体に結合してＩＬ−１α及びＩＬ−１βと競合的に拮抗し、ＩＬ−１の生理活性の発現に対して抑制的に作用する。
【００２０】
発現抑制物質は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２又はＩＬ−１ＲＡのいずれかのタンパクをコードする遺伝子の発現を抑制する物質である。発現抑制物質は、当該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はリボザイムの形態であってもよい。本実施形態に係る治療剤は、これら発現抑制物質の１種を単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。発現抑制物質は少なくとも、ＣＤ１１ｃをコードする遺伝子の発現を抑制する物質、ＣＣＬ２をコードする遺伝子の発現を抑制する物質、又は、ＩＬ−１ＲＡをコードする遺伝子の発現を抑制する物質のいずれかを含むことが好ましい。
【００２１】
本実施形態に係る多発性硬化症抑制剤における発現抑制物質の含有量は、当該抑制剤全量を基準として０．０００１〜１００質量％であってよい。
【００２２】
機能阻害物質は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１６、ＣＣＬ２若しくはＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質である。機能阻害物質は、前述の分子（タンパク）に対する抗体、抗原結合性断片の形態であってもよく、低分子化合物の形態であってもよい。本実施形態に係る治療剤は、これら機能阻害物質の１種を単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。機能阻害物質は少なくとも、ＣＤ１１ｃの機能を阻害する物質、ＣＣＬ２の機能を阻害する物質、又は、ＩＬ−１ＲＡの機能を阻害する物質のいずれかを含むことが好ましい。
【００２３】
各抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。各抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。また、各抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。さらに、各抗体は、多発性硬化症又は当該疾患に不随して発症する疾患に対する抑制効果、症状の緩和効果又は治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。抗ＣＣＬ２抗体の具体例としては、ＡＢＮ９１２（抗ヒトＣＣＬ２モノクローナル抗体）が挙げられる。各抗原結合性断片については、上述の抗体に関する説明と同様である。
【００２４】
抗原結合性断片としては、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片であればよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等が挙げられる。
【００２５】
抗体又は抗原結合性断片は、常法に従い製造することができる。また、抗体又は抗原結合性断片は、市販品を使用してもよい。
【００２６】
また、機能抑制物質は、ＣＣＬ２の受容体であるＣＣＲ２の活性化を阻害する物質であってもよい。このような物質としては、例えば、抗ＣＣＲ２抗体、ＣＣＲ２結合性断片、ＣＣＬ２阻害剤が挙げられる。抗ＣＣＲ２抗体又はＣＣＲ２結合性断片については、上述の抗体に関する説明と同様である。抗ＣＣＲ２抗体の具体例としては、ＭＬＮ１２０２が挙げられる。ＣＣＬ２阻害剤としては、例えば、ドキシサイクリン、クエルセチン、カルシウムチャネル阻害剤（例えば、アムロジピン、マニジピン）、ヘムオキシゲナーゼＩ、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、ＦＲ１６７６５３、ＳＢ２０３５８０、ＰＤ９８０５９、ＡＧ４９０）、プロペントフィリン、プロパゲルマニウム、ＭＣＰ−１のドミナントネガティブ変異体が挙げられる。
【００２７】
本実施形態に係る多発性硬化症抑制剤における機能阻害物質の含有量は、当該抑制剤全量を基準として０．０００１〜１００質量％であってよい。
【００２８】
本実施形態の多発性硬化症抑制剤における上記有効成分（発現抑制物質又は機能阻害物質）の総含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、多発性硬化症抑制剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００２９】
本実施形態に係る多発性硬化症抑制剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００３０】
本実施形態に係る多発性硬化症抑制剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００３１】
本実施形態に係る多発性硬化症抑制剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの多発性硬化症抑制剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００３２】
上記実施形態は、それを必要とするヒト対象に発現抑制物質又は機能阻害物質を投与するステップを含む、多発性硬化症の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
１．動物
（１）ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス
本試験で使用したマウスはすべて６〜８週齢で、特定病原体不在条件下で飼育した。当該マウスは、特許文献１及び非特許文献４を参考にして、ｌｏｘｐ配列でＮＲ４Ａ２遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスを樹立した。すなわち、ＮＲ４Ａ２遺伝子上流と下流にｌｏｘｐ配列を挿入して得たマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６  ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）Ｃ５７ＢＬ／６  ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎｒ４ａ２ｆｌ／ｆｌ）を作製した。得られたマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４−Ｃｒｅマウス（タコニック社）と交配させることにより、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス、以下、「ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス」という。）を樹立した。一群あたり５〜１０匹のマウスとなるようにマウスを分類し、ＥＡＥ臨床スコアの評価に使用した。
【００３５】
ＮＲ４Ａ２遺伝子は、Ｎｕｒｒ１遺伝子、ＮＯＴ遺伝子、又はＲＮＲ１遺伝子とも呼ばれ、オーファン核内受容体の１種である。ＮＲ４Ａ２遺伝子の主な発現部位は、中枢神経系であり、特に中脳腹側、脳幹、脊髄に強く発現している。また、ＮＲ４Ａ２は，プロスタグランジン、増殖因子、炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体架橋に応答して発現が誘導され、リガンド依存性又はリガンド非依存性にＤＮＡと直接結合して転写を制御する。ヒトＮＲ４Ａ２遺伝子の転写産物のNCBI Reference Sequenceのアクセッション番号は、ＮＭ＿００６１８６．３である。
【００３６】
（２）ＥＡＥ誘導（単相型ＥＡＥ）
１００μｇのＭＯＧ３５−５５残基に相当するペプチド（東レリサーチセンターにて合成、以下、「ＭＯＧペプチド」ともいう。）と１ｍｇの結核菌Mycobacterium Tuberculosis H37Ra死菌（Difco社製）を完全フロイントアジュバントで乳化したものを等量混和し、ホモジナイザーを用いて乳化させ、ＭＯＧエマルジョンを調製した。得られたＭＯＧエマルジョンを、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及びＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（対照マウス、Ｃｏｎｔｒｏｌ）の背部皮下に１〜２か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与後０日目と２日目に、１匹あたり、２００ｎｇの百日咳毒素（List Biological Laboratories製）のＰＢＳ溶液２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。注射した後、表１に示すＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
【表１】
2020100582.tif 000002
【００３７】
結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示すように、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスでは、対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）で観察されたＥＡＥ発症期、ピーク期及び慢性期（ＥＡＥ誘導後約９〜２８日後）におけるＥＡＥ病態が抑制されていた。一方、ＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、ＥＡＥ誘導後２８日以降に新たな病態（後期ＥＡＥ病態）が出現した。
【００３８】
（３）初期ＥＡＥ病態とＩＬ−１７産生
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Roche社製）を含有したRPMI 1640培地（Invitrogen社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳヘ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞をセルソーター（装置名：FACS ARIA II、BD Cytometry Systems社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Biolegend社製）、及び抗ＣＤ４抗体（Biolegend社製）である。得られたＴ細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ存在下に５ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）及び５００ｎｇ／ｍＬ  イオノマイシンで５時間刺激し、培養上清中におけるＩＬ−１７含有量を、FlowCytomixサイトメトリックビーズアレイ（eBioscience社製）及びBio-Plexサスペンジョンアレイシステム（バイオラッド社）を用いて測定した。得られたＩＬ−１７量をＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の数で除し、ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞あたりのＩＬ−１７産生量を算出した。
【００３９】
結果を図１（ｂ）に示す。ＮＲ４Ａ２が関わるＥＡＥ病態にＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞の関与が示唆されている。対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＤａｙ１８（初期ＥＡＥ病態）における高いＩＬ−１７産生量はこれを反映していると考えられる。一方、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスでは、Ｄａｙ１８における高いＩＬ−１７産生量は観察されなかった。
【００４０】
２．ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の病原性
（１）ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の単離
上記１．（２）と同様にして、マウスの脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳ浸潤リンパ球を単離した。すなわち、組織を切断して得られた小切片を、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを添加したRPMI 1640培地（Invitrogen社製）溶液中で３７℃、４０分間消化した。得られた組織ホモジネートを７０μｇセルストレイナー（ＢＤ社製）に通して、白血球を得た。得られた白血球を、３７％／８０％パーコール密度勾配遠心法（ＧＥヘルスライフサイエンス社製）を利用して、さらに濃縮した。
濃縮された白血球細胞を蛍光標識抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって精製した。フローサイトメーター（装置名：FACS Canto II、BD Cytometry Systems社製）及びソフトウェア（製品名：FACS DIVA）を用いてデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStarSoftwear社製）を用いて解析した。セルソーティングには、染色したシングルセル浮遊液をセルソーター（装置名：FACS ARIA II、BD Cytometry Systems社製）を用いた。
【００４１】
（２）単離したＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の移入
上記２．（１）と同様にして、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及び対照マウスの脳及び脊髄から採取したＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を染色して、フローサイトメーター（装置名：FACS ARIA II、BD Cytometry Systems社製）を用いたＦＡＣＳソートにより、ＣＤ４５＋ＴｃＲｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ１１ｂ−細胞を分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４５抗体（Biolegend製）、抗ＴｃＲｂ抗体（Biolegend製）、抗ＣＤ４抗体（Biolegend社製）及び抗ＣＤ１１ｂ抗体（Biolegend製）である。得られたＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を用いた再刺激を２４時間行った。再刺激の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Biolegend社製）及び抗ＣＤ２８抗体（Biolegend製）である。再刺激されたＴ細胞を、免疫受容ＣＤ４５．１（Ｌｙ５）コンジェニックマウスに静脈注射によって移入した。移入した日（Ｄａｙ０）及び移入後２日目（Ｄａｙ２）の日に、１００ｎｇの百日咳毒素を各マウスの腹腔内に投与し、Ｄａｙ１１まで、上記ＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
【００４２】
結果を図２に示す。対照マウス由来のＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を移入したＬｙ５マウスでは、ＥＡＥ病態は特に観察されなかった。一方、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス由来のＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を移入したＬｙ５マウスでは、Ｄａｙ４からＥＡＥ病態が発現し始めた。これにより、ＥＡＥに関するＣＮＳ浸潤Ｔ細胞の病原性は、ＮＲ４Ａ２依存的であることが示唆された。
【００４３】
３．ＮＲ４Ａ２依存的に発現する遺伝子
（１）シングルセル逆転写ＰＣＲ
ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞は、ＥＡＥが最も進行した状態のマウスの脳及び脊髄から採取したＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を染色し、フローサイトメーター（装置名：FACS ARIA II、BD Cytometry Systems社製）を用いたＦＡＣＳソートにより、ＣＤ４５＋ＴｃＲｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ１１ｂ−細胞を分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４５抗体（Biolegend製）、抗ＴｃＲｂ抗体（Biolegend製）、抗ＣＤ４抗体（Biolegend社製）及び抗ＣＤ１１ｂ抗体（Biolegend製）である。
次に、シングルセル遺伝子解析装置（装置名：C1 single-cell Preamp 5-10μm IFC、Fluidigm社製）を用いて、シングルセルをキャプチャーした。キャプチャーサイト内でシングルセルを溶解した。前増幅用シングルセル試薬キット（Fluidigm社製）を用いて、製造者の取扱説明にしたがい、ＲＮＡの逆転写及び前増幅を行った。前増幅されたＲＮＡを回収し、集積流体回路（ＩＦＣ）用アレイ（商品名：96.96 Dynamic Array IFC for gene expression、Fluidigm社製）に供した。９６個の標的遺伝子について、Biomark HD装置（Fluidigm社製）を用いて、製造者の取扱説明にしたがい、Ｄｅｌｔａ遺伝子アッセイを実施した。解析ツール（商品名：Singular Toolset for the R environment、Fluidigm社製）を用いて、更に遺伝子解析を行った。
【００４４】
ＥＡＥ発症マウスにおけるＣＮＳ浸潤Ｔ細胞をシングルセル解析した結果、ＣＤ１１ｃ、ＣＣＬ２、ＣＤ１１６及びＩＬ−１ｒｎが、ＮＲ４Ａ２依存的に発現することがわかった。
【００４５】
（２）細胞表面におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６遺伝子の発現
ＥＡＥが発症したＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及び対照マウスの脳及び脊髄からＣＮＳ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、その脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。得られた各細胞の表面におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６タンパクの発現量をフローサイトメーターにより解析した。解析の際に使用した抗体は、抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend社製）及び抗マウスＣＤ１１６抗体（Biolegend社製）である。
【００４６】
結果を図３に示す。図３（ａ）は、対照マウスのＣＮＳ及び脾臓由来の各ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６の発現を示すサイトグラムである。ＣＮＳ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ１１６が発現したＴ細胞が多く存在しており、脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞では、これらの遺伝子はほとんど発現していないことがわかった。一方、図３（ｂ）は、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＣＮＳ及び脾臓由来の各ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面におけるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６発現を示すサイトグラムである。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスでは、ＣＮＳ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞においても、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１６発現が顕著に少ないことがわかった。
【００４７】
（３）
上記３．（２）と同様にして、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス及び対照マウスの脳及び脊髄からＣＮＳ浸潤細胞を分離した。得られた各細胞の表面におけるＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５遺伝子の発現量をフローサイトメーターにより解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Biolegend製）及び抗ＣＤ４５抗体（Biolegend製）である。
【００４８】
結果を図４に示す。図４（ａ）は、対照マウスのＣＮＳ由来細胞の表面におけるＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５遺伝子の発現を示すサイトグラムである。図４（ｂ）は、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＣＮＳ由来の各細胞の表面におけるＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５遺伝子の発現を示すサイトグラムである。ＣＤ４５の発現量が約１．５×１０３であることを示す線を境界としてＣＤ４５ｈｉ（単球）及びＣＤ４５ｉｎｔ（ミクログリア）に分類すると、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス由来のＣＮＳでは、対照マウス由来のＣＮＳと比べて単球の数が顕著に少ないことがわかった。すなわち、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスでは、ＣＣＬ２依存性単球のＣＮＳへの集積が低下していた。
【００４９】
４．Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
（１）マウス
本試験では、Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス）及びＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（対照マウス）を使用した。
【００５０】
（２）抗体
精製された抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend社製）及びそのアイソタイプ抗体（Biolegend製）、並びに精製された抗マウスＣＤ１１６抗体（Biolegend社製）を準備した。
【００５１】
（３）抗体の投与
対照マウスを２群に分けた後、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス群と併せて３群を準備した。上記１．（２）と同様にして、各群のマウスにＥＡＥを誘導した。誘導８日後（Ｄａｙ８）に、ＥＡＥ状態の対照マウスに精製された抗マウスＣＤ１１ｃ抗体又はそのアイソタイプ抗体を、マウス１匹あたり２００μｇの量で腹腔内投与した。その後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
別途、対照マウスを２群に分けた後、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウス群と併せて３群を準備した。上記１．（２）と同様にして、各群のマウスにＥＡＥを誘導した。誘導８日後（Ｄａｙ８）及び１１日後（Ｄａｙ１１）に、ＥＡＥ状態の対照マウスに、精製された抗マウスＣＤ１１６抗体又はアイソタイプ抗体を、マウス１匹あたり２００μｇの量で腹腔内投与した。その後、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
【００５２】
結果を図５に示す。図５（ａ）は、抗マウスＣＤ１１ｃ抗体又はそのアイソタイプ抗体を投与した対照マウスと、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。図５（ｂ）は、抗マウスＣＤ１１６抗体又はアイソタイプ抗体を投与した対照マウスと、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＥＡＥスコアを示すグラフである。図５（ａ）及び（ｂ）中の点線は、抗体を投与した時を示す。抗ＣＤ１１ｃ抗体又は抗ＣＤ１１６抗体を投与することにより、ＥＡＥスコアの上昇が抑制された。
【００５３】
（４）抗ＣＤ１１６抗体の投与後のＴ細胞
上記４．（３）において誘導１７日後（Ｄａｙ１７）に、抗マウスＣＤ１１６抗体又はアイソタイプ抗体を投与されたマウスのＣＮＳを採取し、ＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を単離した。得られたＴ細胞をGolgi Stop（BD Bioscience社製）の存在下、５ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）及び５００ｎｇ／ｍＬ  イオノマイシン（Sigma-Aldrich社製）を用いて５時間、再刺激した。その後、eBioscience Foxp3染色キットを使用し、製造者の取扱説明にしたがい、抗ＩＦＮ−γ抗体蛍光標識抗体及び抗ＩＬ−１７抗体蛍光標識抗体（ともにBiolegend社製）を利用して、表面染色及び固定／細胞内染色した。
【００５４】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、アイソタイプ抗体を投与した対照マウス由来のＣＮＳ浸潤Ｔ細胞における、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ遺伝子の発現を示すサイトグラムである。また、図６（ｂ）は、抗ＣＤ１１６抗体を投与したマウス由来のＣＮＳ浸潤Ｔ細胞における、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ遺伝子の発現を示すサイトグラムである。図７（ａ）及び（ｂ）を比較すると、抗ＣＤ１１６抗体を投与することにより、ＩＦＮ−γ−ＩＬ−１７＋Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）の数が減少したことがわかった。
【００５５】
（５）抗ＣＤ１１６抗体の投与後のＴ細胞
上記４．（４）と同様にして得たＣＮＳ浸潤Ｔ細胞から、フローサイトメーター（装置名：FACS Canto II、BD Cytometry Systems社製）を用いたゲーティングにより、ＣＤ４５＋ＴｃＲｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ１１ｂ−細胞を取得した。得られたＣＤ４５＋ＴｃＲｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ１１ｂ−細胞を、ＲＬＴバッファー中で溶解させ、ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、製造者の取扱説明にしたがい、細胞集団から総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡから、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを生成させた。市販のプライマーを用いて、LightCycler96リアルタイムＰＣＲ装置で定量的リアルタイムＰＣＲを行い、ｍＲＮＡの転写物の定量を行った。各遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、β−アクチンまたはＲＰＬ１３）に基づいて補正した。
【００５６】
結果を図７に示す。図７（ａ）に示すように、対照マウスのＣＮＳ浸潤Ｔ細胞と比較して、抗マウスＣＤ１１６抗体を投与したマウスでは、ＣＣＬ２遺伝子及びＣＤ１１ｃ遺伝子の発現量が顕著に低下したことがわかった。
【００５７】
５．ヒトへの投与
本試験は、国立精神・神経医療研究センター（ＮＣＮＰ）の倫理委員会の承認、及び、全ての患者からの明示の同意を得て、実施された。標準McDonald基準を用いて診断された２４名のＲＲＭＳ患者と１６名の健康成人（ＨＣ：HealthyControl）を採用し、ヘパリン処理済チューブを用いて末梢血及び脳脊髄液を採取した。得られた末梢血をフィコール勾配（ＧＥヘルスケア）に沈殿させ、４００ｇで３０分間、遠心分離することによってＰＢＭＣサンプルを分離した。蛍光標識化抗体とともに室温で９０分間震盪することにより、ＰＢＭＣサンプルを染色した。フローサイトメーター（装置名：FACS Canto、BD Cytometry Systems社製）及びFlowJoソフトウェア（TreeStar Softwear社製）を用いて、ＣＤ１１６＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を計算し、ＣＤ１１６＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。
また、蛍光標識化抗体とともに室温で９０分間震盪することにより、脳脊髄液サンプルを染色した。使用した蛍光標識化抗体は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識化抗ＣＤ１１６抗体（Biolegend製）、PacificBlue標識化抗ＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend製）及びＰＥ（フィコエリスリン）標識化抗ＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend製）である。
【００５８】
結果を図８及び図９に示す。図８（ａ）及び（ｂ）は、健康成人及びＲＲＭＳ患者の末梢血における、ＣＤ１１６＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合とその平均蛍光強度を示したグラフである。図９（ａ）は、健康成人のＣＮＳにおけるＣＤ１１６及びＣＤ１１ｃ発現を示すサイトグラムである。図９（ｂ）及び（ｃ）は、ＲＲＭＳ患者のＣＮＳにおけるＣＤ１１６及びＣＤ１１ｃ発現を示すサイトグラムであり、使用した抗ＣＤ１１ｃ抗体の蛍光標識が異なっている。これらの結果によれば、ＲＲＭＳ患者の末梢血及びＣＮＳでは、健康成人のものと比較して、Ｔ細胞のＣＤ１１６及びＣＤ１１ｃの発現が亢進していることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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