(57)【要約】      （修正有）【課題】リンパ球等の細胞の集団を拡大するインビトロ方法の提供。【解決手段】細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含む方法。前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤、そして、任意で、共刺激シグナルを提供する第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されている。また、本発明は、細胞を拡大するための多量体化試薬、キット、配置、及び装置を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、そして
前記第１の剤が、前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する方法。
【請求項２】
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、前記多量体化剤上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記第２の剤が、前記細胞の表面上のアクセサリ分子に結合し、それによって、活性化された前記細胞を刺激する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の集団が、リンパ球集団である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ球集団が、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、ナチュラルキラー細胞集団、又はこれらの混合物である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞集団が、抗原特異的Ｔ細胞集団、ヘルパーＴ細胞集団、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞集団である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第１の剤が、ＭＨＣ  Ｉ：ペプチド複合体を含むか、又は前記第１の剤が、前記Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第１の剤が、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ２８又はＣＤ１３７である、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記アクセサリ分子に結合する前記第２の剤が、ＣＤ２８若しくはＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬であるか、又は前記第２の剤が、いずれもＣＤ２８若しくはＣＤ１３７に特異的に結合する２つの異なる種類の結合試薬の混合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第１の剤が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され、並びに／又は
Ｃ２８に特異的に結合する前記第２の剤が、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、４−１ＢＢリガンド、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項７〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＣＤ１３７結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ（glubody）、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞集団が、Ｂ細胞集団であり、そして、前記第１の剤が、ＣＤ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬である、請求項４記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する前記第１の結合試薬が、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子、又は抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子又はタンパク質性ＣＤ１３７結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ４０である、請求項３及び１４〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の剤が、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）又はＣＤ１３７である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及びＺ２が同一である、請求項２〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
単一の多量体化試薬を用いる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記多量体化試薬が、固体表面上に固定化される、請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
前記固体表面が、磁気ビーズ、ポリマービーズ、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、メンブレン、中空繊維、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログ、ビオチンに可逆的に結合するアビジンのアナログ、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬からなる群から選択され、前記少なくとも２つのキレート基が、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、部分Ａが、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記多量体化試薬が、可溶性形態である、請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２７】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジンのオリゴマー又はポリマー、アビジンのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するアビジンのアナログのオリゴマー又はポリマー、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬を含み、前記少なくとも２つのキレート基が、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、前記試薬が、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ストレプトアビジン、アビジン、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログが、多糖によって架橋されるか、あるいはストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、二官能性リンカーを介して架橋することによって得られる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記ストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、３つ以上のストレプトアビジン単量体を含む、請求項２７又は２８記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ビオチンを含み、そして、前記多量体化試薬が、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログを含むか、
（ｂ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ビオチンアナログに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含むか、又は
（ｃ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含む、請求項１〜２９のいずれか記載の方法。
【請求項３１】
前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン結合ペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lysを含み、そして、前記多量体化試薬が、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログ、又は野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記結合パートナーＣ１と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１との間の結合及び前記結合パートナーＣ２と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ２との間の結合が、二価カチオンの存在下で生じる、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記結合パートナーＣ１及び前記結合パートナーＣ２が、互いに独立して、カルモジュリン結合ペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、カルモジュリンを含むか、又は
前記結合パートナーＣが、ＦＬＡＧペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、前記ＦＬＡＧペプチドに結合する抗体を含むか、又は
前記第１の結合Ｃが、オリゴヒスチジンタグを含み、そして、前記多量体化試薬が、前記オリゴヒスチジンタグに結合する抗体を含む、請求項３２記載の方法。
前記結合パートナーＣと前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚとの間の結合が、金属イオンのキレート化によって分離する、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項３４】
前記金属のキレート化が、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡの添加によって達成される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記結合パートナーＣ１及びＣ２が異なる、請求項２〜３０のいずれか記載の方法。
【請求項３６】
前記結合パートナーＣ１及びＣ２が同一である、請求項２〜３０のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の剤の前記結合パートナーＣ１及び／又は前記第２の剤の前記結合パートナーＣ２と、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及び／又はＺ２との間の結合を分離させることを更に含む、請求項１〜３６のいずれか記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の剤の前記結合パートナーＣ１及び／又は前記第２の剤の前記結合パートナーＣ２と、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及び／又はＺ２との間の結合を分離させることによって、前記細胞の刺激を終了させる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記結合部位Ｚ１と前記結合パートナーＣ１との間の可逆的結合、及び／又は前記結合部位Ｚ２と前記結合パートナーＣ２との間の可逆的結合についての解離定数（Ｋｄ）が、１０−２M〜１０−１３Mの範囲である、請求項１〜３８のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の剤の前記結合パートナーＣ１及び／又は前記第２の剤の前記結合パートナーＣ２と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及び／又は結合部位Ｚ２との間の前記可逆的結合が、前記第１の結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１若しくは前記第１の結合パートナーＣ１のアナログ、及び／又は前記第２の結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間の結合を分離させることができる前記第２の結合パートナーＣ２の遊離型パートナー若しくは前記第２の結合パートナーＣ２のアナログを前記細胞の集団と接触させることによって分離する、請求項１〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の遊離型パートナー及び／又は前記第２の遊離型パートナーが、前記細胞にとって有害ではない化合物である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ビオチンを含み、そして、前記多量体化試薬が、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログを含む場合、
（ｂ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ビオチンアナログに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含む場合、又は
（ｃ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくはストレプトアビジンアナログ、若しくは前記ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するアビジンアナログを含む場合、
前記細胞をビオチン又はビオチンアナログと接触させることによって前記可逆的結合を分離させる、請求項２５〜４１記載の方法。
【請求項４３】
前記結合パートナーＣ１と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１との間の結合及び前記結合パートナーＣ２と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ２との間の結合が、二価カチオンの存在下で生じる場合、前記細胞を金属キレート剤と接触させることによって前記可逆的結合を分離させる、請求項２５〜３９記載の方法。
【請求項４４】
細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記多量体化試薬が、可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が、前記多量体化試薬上に固定化されており（結合しており）、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合し、そして
前記第１の剤が、前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する方法。
【請求項４５】
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、前記多量体化剤上に固定化されており（結合しており）、
前記第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ２に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記第２の剤が、前記細胞の表面上のアクセサリ分子に結合し、それによって、活性化された前記細胞を刺激する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される前記結合が不可逆的であり、かつ／又は前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される前記結合が不可逆的である、請求項４４又は４５記載の方法。
【請求項４７】
前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される前記結合が可逆的であり、かつ／又は前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される前記結合が可逆的である、請求項４４又は４５記載の方法。
【請求項４８】
前記結合部位Ｚ１と前記結合パートナーＣ１との間の可逆的結合、及び／又は前記結合部位Ｚ２と前記結合パートナーＣ２との間の可逆的結合についての解離定数（Ｋｄ）が、１０−２M〜１０−１３Mの範囲である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞の集団が、リンパ球集団である、請求項４４〜４８のいずれか記載の方法。
【請求項５０】
前記リンパ球集団が、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、又はナチュラルキラー細胞集団である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｔ細胞集団が、抗原特異的Ｔ細胞集団、ヘルパーＴ細胞集団、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の剤が、ＭＨＣ  Ｉ：ペプチド複合体を含むか、又は前記第１の剤が、前記Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記第１の剤が、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔ細胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ２８である、請求項５２又は５３記載の方法。
【請求項５５】
前記アクセサリ分子に結合する前記第２の剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する結合試薬である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第１の結合試薬が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され、並びに／又は
Ｃ２８に特異的に結合する前記第２の剤が、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子からなる群から選択される、請求項５３〜５５のいずれか記載の方法。
【請求項５７】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３又はＣＤ２８結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の剤が、ＣＤ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬である、請求項５０記載の方法。
【請求項６１】
Ｃ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する前記第１の結合試薬が、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子、又は抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子からなる群から選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子又はタンパク質性ＣＤ１３７結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｂ細胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ４０である、請求項５０及び６０〜６４のいずれか記載の方法。
【請求項６６】
前記第２の剤が、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）又はＣＤ１３７である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する第１の剤であって、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する第１の剤と、
（iii）前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤であって、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合し、前記第２の剤が、前記細胞の表面上のアクセサリ分子に結合し、それによって、活性化された前記細胞を刺激する第２の剤と
を含む試薬キット。
【請求項６８】
細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する第１の剤であって、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ１に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する第１の剤と
を含む試薬キット。
【請求項６９】
（iii）前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤であって、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ２に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合する第２の剤を更に含む、請求項６８記載の試薬キット。
【請求項７０】
前記細胞の集団が、リンパ球集団である、請求項６７〜６９のいずれか記載のキット。
【請求項７１】
前記リンパ球集団が、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、又はナチュラルキラー細胞集団である、請求項７０記載のキット。
【請求項７２】
前記Ｔ細胞集団が、抗原特異的Ｔ細胞集団、ヘルパーＴ細胞集団、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞である、請求項７１記載のキット。
【請求項７３】
前記第１の剤が、ＭＨＣ  Ｉ：ペプチド複合体を含むか、又は前記第１の剤が、前記Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する、請求項６７〜７２記載のキット。
【請求項７４】
前記第１の剤が、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬である、請求項７３記載のキット。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ２８である、請求項７２〜７４のいずれか記載のキット。
【請求項７６】
前記アクセサリ分子に結合する前記第２の剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する結合試薬である、請求項７５記載のキット。
【請求項７７】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第１の結合試薬が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され、並びに／又は
Ｃ２８に特異的に結合する前記第２の剤が、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子からなる群から選択される、請求項７４〜７６のいずれか記載のキット。
【請求項７８】
前記多量体化剤が、固体表面上に固定化される、請求項６７記載のキット。
【請求項７９】
前記固体表面が、磁気ビーズ、ポリマービーズ、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、メンブレン、中空繊維、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７８記載のキット。
【請求項８０】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログ、ビオチンに可逆的に結合するアビジンのアナログ、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬からなる群から選択される多量体化試薬であり、前記少なくとも２つのキレート基が、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、部分Ａが、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる、請求項７９記載のキット。
【請求項８１】
前記多量体化試薬が、可溶性形態である、請求項６７記載のキット。
【請求項８２】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログ、ビオチンに可逆的に結合するアビジンのアナログ、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬からなる群から選択され、前記少なくとも２つのキレート基が、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、前記試薬が、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる、請求項６８〜７８又は８１のいずれか記載のキット。
【請求項８３】
前記ストレプトアビジン、アビジン、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログが、多糖によって架橋されるか、あるいはストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、二官能性リンカーを介して架橋することによって得られる、請求項８２記載のキット。
【請求項８４】
リンパ球の集団を連続拡大するインビトロ方法であって、前記リンパ球の集団が、Ｔ細胞を含み、前記方法が、
リンパ球の集団を含む前記Ｔ細胞を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記多量体化試薬が、可溶性形態であり、そして、（ｉ）前記Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤及び（ii）前記Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記多量体化試薬が、前記第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含み、
前記第２の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記第１の剤が、前記Ｔ細胞の表面上の受容体分子と結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記Ｔ細胞を活性化し、
前記第２の剤が、前記Ｔ細胞の表面上の前記アクセサリ分子に結合して、活性化された前記細胞を刺激し、それによって、前記第１の剤及び前記第２の剤が共に、前記Ｔ細胞を誘導して拡大させる方法。
【請求項８５】
リンパ球の集団を含む前記Ｔ細胞を含むサンプルを、前記第１及び第２の剤が固定化されている前記多量体化試薬と接触させることによって、Ｔ細胞が前記多量体化試薬に特異的に結合する、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記多量体化剤に結合している前記Ｔ細胞を前記リンパ球集団の非結合細胞から分離することを更に含む、請求項８４又は８５記載の方法。
【請求項８７】
リンパ球の集団を含む前記Ｔ細胞を含むサンプルを、前記第１及び第２の剤が固定化されている前記多量体化試薬との接触が、培養プレート、中空繊維バイオリアクタ、又はプラスチックバッグバイオリアクタ等のバイオリアクタにおいて実施される、請求項８４〜８６のいずれか記載の方法。
【請求項８８】
請求項８４〜８８のいずれか記載の方法であって、前記リンパ球の集団（前記第１の剤及び前記第２の剤を介して前記多量体化試薬に結合している前記Ｔ細胞を含有する反応混合物）を、（ｉ）前記第１の結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１又はそのアナログ、及び（ii）前記第２の結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間の結合を分離させることができる遊離型の第２の結合パートナーＣ２又はそのアナログと接触させることを更に含み、
前記第１の剤の前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間の前記可逆的結合に加えて、前記第２の剤の前記結合パートナーＣ２と前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ２との間の前記可逆的結合が分離し、それによって、前記可溶性多量体化試薬から、並びに前記第１の剤及び前記第２の剤から前記Ｔ細胞が放出され、そして、前記Ｔ細胞の拡大を停止させる方法。
【請求項８９】
放出された前記Ｔ細胞、前記可溶性多量体化試薬、前記第１の剤及び／又は前記第２の剤、前記遊離型の結合パートナーＣ１又はそのアナログ、並びに前記遊離型の結合パートナーＣ２又はそのアナログを含有する溶出液を回収することを含む、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及びＺ２が同一である、請求項８４〜８９のいずれか記載の方法。
【請求項９１】
単一の多量体化試薬を用いる、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記溶出液を好適な固定相のクロマトグラフィーに供することを更に含み、前記固定相が、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、前記ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが、アフィニティー試薬を含み、前記アフィニティー試薬が、前記第１の剤又は前記第２の剤に含まれる前記結合パートナーＣ１及び／又はＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ１及び／又はＺ２を含み、それによって、前記第１の剤、前記第２の剤、前記第１の結合パートナーＣ１若しくはそのアナログ、及び／又は前記遊離型の第２の結合パートナーＣ２若しくはそのアナログを前記固定相に固定化する、請求項８９〜９１のいずれか記載の方法。
【請求項９３】
前記固定相が、前記バイオリアクタに流体接続される、請求項８８〜９２のいずれか記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｔ細胞が、前記可溶性多量体化試薬から分離される、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔ細胞及び前記多量体化試薬を含む混合物を好適な固定相のクロマトグラフィーに供し、前記固定相が、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、前記ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが、アフィニティー試薬を含み、前記アフィニティー試薬が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に（特異的に）結合する結合パートナーＤを含み、それによって、前記固定相上に前記多量体化試薬を固定化する、請求項９３記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の剤が、前記Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する、請求項８４〜９５のいずれか記載の方法。
【請求項９７】
前記第１の剤が、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬である、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔ胞上の前記アクセサリ分子が、ＣＤ２８である、請求項８４〜９７のいずれか記載の方法。
【請求項９９】
前記アクセサリ分子に結合する前記第２の剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する結合試薬である、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第１の剤が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択される、並びに／又は
Ｃ２８に特異的に結合する前記第２の剤が、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子からなる群から選択される、請求項９７〜９９のいずれか記載の方法。
【請求項１０１】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジンのオリゴマー又はポリマー、アビジンのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するアナログアビジンのオリゴマー又はポリマーを含む、請求項８４〜１０２のいずれか記載の方法。
【請求項１０４】
前記ストレプトアビジン、アビジン、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログが、多糖によって架橋されるか、あるいはストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、二官能性リンカーを介して架橋することによって得られる、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
前記ストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、３つ以上のストレプトアビジン単量体を含む、請求項１０３又は１０４記載の方法。
【請求項１０６】
（ａ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ビオチンを含み、そして、前記多量体化試薬が、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログを含むか、
（ｂ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ビオチンアナログに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含むか、又は
（ｃ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含む、請求項８４〜１０５のいずれか記載の方法。
【請求項１０７】
前記結合パートナーＣが、ストレプトアビジン結合ペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lysを含み、そして、前記多量体化試薬が、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログ、又は野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログを含む、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
前記結合部位Ｚ１と前記結合パートナーＣ１との間の可逆的結合、及び／又は前記結合部位Ｚ２と前記結合パートナーＣ２との間の可逆的結合についての解離定数（Ｋｄ）が、１０−２M〜１０−１３Mの範囲である、請求項８４〜１０７のいずれか記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１の遊離型パートナー及び／又は前記第２の遊離型パートナーが、前記細胞にとって有害ではない化合物である、請求項８９〜１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記可逆的結合が、前記細胞をビオチン又はビオチンアナログと接触させることによって分離する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
拡大後又は拡大中に、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を前記Ｔ細胞に導入する、請求項９２〜１１０のいずれか記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ細胞が、導入された前記Ｔ細胞受容体又は前記キメラ抗原受容体に結合する第３の剤で刺激される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
前記Ｔ細胞を含むリンパ球の集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団又は濃縮若しくは精製されたＴ細胞の集団である、請求項８４〜１１２のいずれか記載の方法。
【請求項１１４】
バイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の（第１の）固定相の配置であって、
前記バイオリアクタが、細胞の拡大に好適であり、
前記（第１の）固定相が、細胞の分離及び試薬の除去に好適であり、
前記固定相が、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、前記ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが、アフィニティー試薬を含み、前記アフィニティー試薬が、第１の剤に含まれる結合パートナーＣ１に特異的に結合する結合部位Ｚ１を含み、及び／又は前記アフィニティー試薬が、第２の剤に含まれる結合パートナーＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ２を含み、それによって、前記第１の剤及び／又は前記第２の剤、前記第１の結合パートナーＣ１及び／又は前記遊離型の第２の結合パートナーＣ２を前記固定相に固定化するのに好適になる、
前記バイオリアクタ及び前記固定相が、流体接続している配置。
【請求項１１５】
前記第１の固定相が、クロマトグラフィーカラムに含まれるか、又は平面固定相である、請求項１１４記載の配置。
【請求項１１６】
第２の固定相を更に含み、前記第２の固定相が、前記第１の固定相に流体接続している、請求項１１５記載の配置。
【請求項１１７】
前記第２の固定相が、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、前記ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが、アフィニティー試薬を含み、前記アフィニティー試薬が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に（特異的に）結合する結合パートナーＤを含み、それによって、前記固定相上に前記多量体化試薬を固定化するのに好適になる、請求項１１６記載の配置。
【請求項１１８】
前記第２の固定相及び前記バイオリアクタが、互いに流体接続している、請求項１１７記載の配置。
【請求項１１９】
標的細胞を精製及び拡大するための装置であって、請求項１１４〜１１８に定義のバイオリアクタ及び少なくとも１つのクロマトグラフィー用の固定相の少なくとも１つの配置を含む装置。
【請求項１２０】
バイオリアクタ及び少なくとも１つのクロマトグラフィー用の固定相の前記配置の前記バイオリアクタに流体接続しているサンプル入口を含む、請求項１１９記載の装置。
【請求項１２１】
精製及び拡大された標的細胞用のサンプル出口を含み、前記サンプル出口が、バイオリアクタ及び少なくとも１つのクロマトグラフィー用の固定相の前記配置の前記固定相に流体接続している、請求項１１９又は１２０記載の装置。
【請求項１２２】
前記装置が、機能的閉鎖系である、請求項１１９〜１２１のいずれか記載の方法。
【請求項１２３】
細胞の集団を拡大することができる多量体化試薬であって、
可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する前記第１の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する多量体化試薬。
【請求項１２４】
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を更に含み、
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する前記第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ２に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合する、請求項１２３記載の多量体化試薬。
【請求項１２５】
リンパ球集団を拡大することができる、請求項１２３又は１２４記載の多量体化試薬。
【請求項１２６】
拡大される前記リンパ球集団が、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、又はナチュラルキラー細胞集団である、請求項１２５記載の多量体化試薬。
【請求項１２７】
前記Ｔ細胞集団が、抗原特異的Ｔ細胞集団、ヘルパーＴ細胞集団、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルレキラーＴ細胞集団である、請求項１２６記載の多量体化試薬。
【請求項１２８】
前記第１の剤が、ＭＨＣ  Ｉ：ペプチド複合体を含むか、又は前記Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する、請求項１２７記載の多量体化試薬。
【請求項１２９】
前記第１の剤が、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬である、請求項１２８記載の多量体化試薬。
【請求項１３０】
前記アクセサリ分子に結合する前記第２の剤が、ＣＤ２８又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬である、請求項１２４〜１２９のいずれか記載の多量体化試薬。
【請求項１３１】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第１の剤が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され、そして、
Ｃ２８又はＣＤ１３７に特異的に結合する前記第２の剤が、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、４−１ＢＢリガンド、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１２８〜１３０のいずれか記載の多量体化試薬。
【請求項１３２】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項１３１記載の多量体化試薬。
【請求項１３３】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１３１記載の多量体化試薬。
【請求項１３４】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＣＤ１３７結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項１３３記載の多量体化試薬。
【請求項１３５】
前記第１の剤が、ＣＤ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬であり、そして、前記細胞集団が、Ｂ細胞集団である、請求項１２６記載の多量体化試薬。
【請求項１３６】
Ｃ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する前記第１の結合試薬が、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子、又は抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）からなる群から選択される、請求項１３５記載の多量体化試薬。
【請求項１３７】
前記二価抗体断片が、（Ｆａｂ）２’断片又は二価単鎖Ｆｖ断片である、請求項１３６記載の多量体化試薬。
【請求項１３８】
前記一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１３６記載の多量体化試薬。
【請求項１３９】
前記抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子又はタンパク質性ＣＤ１３７結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーからなる群から選択される、請求項１３６記載の多量体化試薬。
【請求項１４０】
前記Ｂ細胞上のアクセサリ分子が、ＣＤ４０若しくはＣＤ１３７又はこれらの混合物である、請求項１２６記載の多量体化試薬。
【請求項１４１】
前記第２の剤が、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＣＤ１３７、又はこれらの混合物であり、そして、前記細胞集団が、Ｂ細胞集団である、請求項１４０記載の多量体化試薬。
【請求項１４２】
前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１及びＺ２が同一である、請求項１２４〜１４１のいずれか記載の多量体化試薬。
【請求項１４３】
前記多量体化試薬が、ストレプトアビジンのオリゴマー又はポリマー、アビジンのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するアナログアビジンのオリゴマー又はポリマー、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬を含み、前記少なくとも２つのキレート基が、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、前記試薬が、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる、請求項１２４〜１４２のいずれか記載の多量体化試薬。
【請求項１４４】
前記ストレプトアビジン、アビジン、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログが、多糖によって架橋されるか、あるいはストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、二官能性リンカーを介して架橋することによって得られる、請求項１４３記載の多量体化試薬。
【請求項１４５】
前記ストレプトアビジン、アビジンの、又はビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンのアナログの架橋オリゴマー又はポリマーが、３つ以上のストレプトアビジン単量体を含む、請求項１４３又は１４４記載の多量体化試薬。
【請求項１４６】
（ａ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ビオチンを含み、そして、前記多量体化試薬が、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ若しくはアビジンアナログを含むか、
（ｂ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ビオチンアナログに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含むか、又は
（ｃ）前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドを含み、そして、前記多量体化試薬が、ストレプトアビジン、若しくはアビジン、若しくは前記ストレプトアビジン若しくはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ、若しくはアビジンアナログを含む、請求項１２３〜１４５のいずれか記載の多量体化試薬。
【請求項１４７】
前記結合パートナーＣ１及びＣ２が、互いに独立して、ストレプトアビジン結合ペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lysを含み、そして、前記多量体化試薬が、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログ、又は野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンアナログを含む、請求項１４６記載の多量体化試薬。
【請求項１４８】
細胞の集団を拡大することができる組成物であって、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含む第１の多量体化試薬であって、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する前記第１の剤が、前記第１の多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する第１の多量体化試薬と、
（ii）可溶性形態であり、そして、前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含む第２の多量体化試薬であって、
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する前記第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ２に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合する第２の多量体化試薬とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１４年４月１６日に米国特許商標局に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，５０６号「Methods, Kits And Apparatus For Expanding A Population Of Cells」に対する優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のために全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、リンパ球の集団等の細胞の集団の拡大（増殖）に関する。本発明は、一般に、細胞の表面上の受容体分子に受容体結合分子（例えば、本明細書に記載する第１の剤等）を結合させて、該細胞に一次活性化シグナルを提供することを必要とする、細胞集団を拡大（増殖）させるための新規方法及び試薬を提供する。本発明は、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が固定化されている（結合している）多量体化試薬を使用する。この一次活性化シグナルは、それ自体、前記細胞を活性化して拡大／増殖させるのに十分であり得る。この第１の剤は、前記多量体化試薬に可逆的に結合することができ、又は不可逆的に結合することもできる。また、前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤も、前記多量体化試薬上に固定化されていてよい（結合していてよい）。前記第２の剤は、前記細胞の表面上のアクセサリ分子に結合したとき、活性化された細胞を刺激して拡大させることができる。また、この第２の剤も、前記多量体化試薬に可逆的に結合することができ、又は不可逆的に結合することもできる。多量体化剤は、固体支持体上に固定化されていてもよく、又は可溶性であってもよい。１つの態様では、本明細書に開示する方法は、リンパ球の完全集団を刺激／拡大し、次いで、拡大に必要な試薬を好適な固定相のクロマトグラフィーによって除去し、そして、拡大／刺激された細胞に、任意で、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をトランスフェクトし、そして、導入されたＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体に結合する異なる刺激分子による第２の刺激拡大に供する、細胞の集団の連続拡大である。また、本発明は、選択された細胞集団を拡大するための装置に関する。
【０００３】
発明の背景
インビトロにおいてＴ細胞集団を増殖させるための技術の開発は、抗原のＴ細胞認識及びＴ細胞活性化の理解の進展の多くにとって不可欠である。ヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを作製するための培養方法の開発は、様々なヒト疾患を処置するための免疫療法の方法を確立するために、Ｔ細胞によって認識される病原体及び腫瘍が発現する抗原を明らかにするのに有用である。抗原特異的Ｔ細胞は、このようなＴ細胞の注入が担癌宿主において抗腫瘍反応性を有することが示されている養子細胞免疫療法又は癌療法において使用するために、インビトロで拡大することができる。更に、養子免疫療法は、免疫無防備状態の個体においてウイルス感染症を処置するためにも用いられている。
【０００４】
近年確立された、外因性成長因子及びアクセサリ分子の非存在下、インビトロでヒトＴ細胞を拡大する方法が、米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ１号及び欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号に記載されている。これら特許には、Ｔ細胞の集団を誘導して増殖させるインビトロ方法が開示されている。前記方法は、（ａ）Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供して、前記Ｔ細胞を活性化する第１の剤及び（ｂ）前記Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激して、活性化された前記Ｔ細胞を刺激する第２の剤が直接固定化されている固相表面をＴ細胞の集団と接触させることを含む。第１の剤及び第２の剤のＴ細胞への結合によってＴ細胞が誘導されて増殖／拡大する。米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ１及び欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号に記載されている好ましい第１の剤は、ＴＣＲ／ＣＤ３（ＴＣＲ＝Ｔ細胞受容体）複合体に結合して、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激するモノクローナル抗ＣＤ３抗体である。これら２つの特許による、好ましい第２の剤は、Ｔ細胞上に存在するアクセサリ分子ＣＤ２８に結合するモノクローナル抗ＣＤ２８抗体である。この第２の剤のＣＤ２８アクセサリ分子への結合は、活性化されたＴ細胞の拡大／増殖に必要な必須共刺激を提供する。一方、Dynabeads（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Invitrogen）は、Ｔ細胞の拡大のために市販されている。Dynabeads（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ（商標）は、ヒトＴ細胞上のＣＤ３及びＣＤ２８細胞表面分子に対するアフィニティー精製されたモノクローナル抗体の混合物でコーティングされた、均一な４．５μmの超常磁性、無菌、非発熱性のポリスチレンビーズである。
【０００５】
しかし、このような磁気ビーズは、拡大されたＴ細胞を患者に投与する前にこれら磁気ビーズが完全に除去されたことを確認しなければならないので、例えば、臨床試験又は処置目的のために必要な条件下で細胞を拡大する方法に組み込むことが難しい。したがって、本発明は、研究目的、診断目的、そして、特に処置目的のために、制御性Ｔ細胞又はセントラルメモリーＴ細胞等の細胞集団を拡大するための別の方法を提供することを目的とする。理想的には、この新規方法は、処置用途のために所望の細胞集団を迅速かつ容易に拡大するために用いることができる自動化プロセスへの組み込みにも適合しなければならない。
【０００６】
この目的は、独立項の主題、特に、独立項に記載の方法、キット、配置、及び装置によって解決される。
【０００７】
発明の概要
本発明は、好適な剤が結合した際に、細胞の集団に一次活性化シグナルを提供し、それによって、拡大（増殖）のために前記細胞の集団を活性化することができる受容体分子をその表面上に有する、所望の細胞の集団をインビトロで拡大するための方法、キット、配置、及び装置を提供する。したがって、本発明の方法は、細胞の集団を誘導して増殖させるためにも用いられる。
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、前記細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、そして
前記第１の剤が、前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する方法を提供する。
【０００９】
第２の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、前記細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記多量体化試薬が、可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が、前記多量体化試薬上に固定化されており（結合しており）、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合し、そして
前記第１の剤が、前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する方法を提供する。
【００１０】
第３の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する第１の剤と、
ここで、前記第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み（前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ）、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
（iii）前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤と、
ここで、前記第２の剤は、結合パートナーＣ２を含み（前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ）、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合し、前記第２の剤が、前記細胞の表面上のアクセサリ分子に結合し、それによって、活性化された前記細胞を刺激する
を含む試薬キットを提供する。
【００１１】
第４の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）前記細胞の表面上の受容体分子に結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記細胞を活性化する第１の剤と、
ここで、前記第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の結合部位Ｚ１に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する
を含む試薬キットを提供する。
【００１２】
第５の態様によれば、本発明は、リンパ球の集団を連続拡大するインビトロ方法であって、前記リンパ球の集団が、Ｔ細胞を含み、前記方法が、
前記リンパ球の集団を含むＴ細胞を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
前記多量体化試薬が、可溶性形態であり、そして、（ｉ）前記Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤及び（ii）前記Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており、
前記多量体化試薬が、前記第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記多量体化試薬が、前記第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含み、
前記第２の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の前記結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合し、
前記第１の剤が、前記Ｔ細胞の表面上の受容体分子と結合して、前記細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、前記Ｔ細胞を活性化し、
前記第２の剤が、前記Ｔ細胞の表面上の前記アクセサリ分子に結合して、活性化された前記細胞を刺激し、それによって、前記第１の剤及び前記第２の剤が共に、前記Ｔ細胞を誘導して拡大させる方法を提供する。
【００１３】
第６の態様によれば、本発明は、バイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の固定相の配置であって、
前記バイオリアクタが、細胞の拡大に好適であり、
前記固定相が、細胞の分離及び試薬の除去に好適であり、前記固定相が、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、前記ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが、アフィニティー試薬を含み、前記アフィニティー試薬が、第１の剤に含まれる結合パートナーＣ１に特異的に結合する結合部位Ｚ１を含み、及び／又は前記アフィニティー試薬が、第２の剤に含まれる結合パートナーＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ２を含み、それによって、前記第１の剤及び／又は前記第２の剤、前記第１の結合パートナーＣ１及び／又は前記遊離型の第２の結合パートナーＣ２を前記固定相に固定化するのに好適であり、
前記バイオリアクタ及び前記固定相が、流体接続している配置を提供する。
【００１４】
第７の態様によれば、本発明は、細胞の集団を精製及び拡大するための装置であって、第６の態様に係るバイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の固定相の少なくとも１つの配置を含む装置を提供する。
【００１５】
第８の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大することができる多量体化試薬であって、
可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する前記第１の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、
前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成されうる可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する、
多量体化試薬を提供する。
【００１６】
第９の態様によれば、本発明は、細胞の集団を拡大することができる組成物であって、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、前記細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含む第１の多量体化試薬であって、
前記細胞に一次活性化シグナルを提供する前記第１の剤が、前記第１の多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、前記結合パートナーＣ１が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、前記第１の剤が、前記結合パートナーＣ１と前記結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して前記多量体化試薬に結合する第１の多量体化試薬と、
（ii）可溶性形態であり、そして、前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含む第２の多量体化試薬であって、
前記細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する前記第２の剤が、前記多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、
前記第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、前記結合パートナーＣ２が、前記多量体化試薬の前記少なくとも１つの結合部位Ｚ２に結合することができ、前記第２の剤が、前記結合パートナーＣ２と前記結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して前記多量体化試薬に結合する第２の多量体化試薬とを含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明は、非限定的な例及び添付図面と併せて検討するとき、詳細な説明を参照してよりよく理解される。図面は、本発明の方法の実施態様を説明するものである。理論に縛られるものではないが、図面は、根底にある拡大機序に関する結論を含む。結論は、説明目的のためだけに与えられるものであって、単に、拡大方法が分子レベルで達成可能であることを可視化する上で役立つものである。
【図１Ａ】図１は、第１の剤が結合することによって細胞が拡大するための活性化シグナルを提供することができる細胞表面受容体を有する細胞の集団を拡大する、インビトロにおける拡大方法の実施態様を示す。図１ａに示す通り、表面受容体分子（３０）を有する細胞の集団（２）を含むサンプルを、多量体化試薬（４）と接触させる。細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。図１に示す例では、多量体化試薬（４）は、この例では用いられない第２の結合部位Ｚ２（４４）を有する。多量体化試薬（４）は、それ自体、細胞培養プレート又は反応器の表面の磁気ビーズ、ポリマービーズ等の固体支持体（１０）上に固定化されている。細胞の集団（２）は、例えば、ＣＤ４０受容体を介して活性化され得るＢ細胞の集団等のリンパ球細胞集団であってよい（例えば、Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 “Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulationを参照）。この場合、細胞表面受容体（３０）は、ＣＤ４０であり、そして、第１の剤（６）は、所望の活性シグナルを提供する任意のＣＤ４０結合分子、例えば、モノクローナル抗体ＣＰ−８７０，８９３、又は一価Ｆａｂ断片等のその抗体結合断片であってよい。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１は、例えば、抗体分子の２本のポリペプチド鎖（重鎖又は軽鎖）のうちの１本のＣ末端に融合又はコンジュゲート化している例えば任意のアフィニティーペプチドであってよい。結合パートナーＣ１（６ａ）は、例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載のペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（配列番号０１）（「Strep-tag（登録商標）」としても知られている）等、又は国際公開公報第０２／０７７０１８号若しくは米国特許第７，９８１，６３２号に記載の通り２つ以上の個々の結合分子の連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチド等のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。ストレプトアビジン結合ペプチドを結合パートナーＣ１として用いたとき、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンペプチド（＝第１の結合パートナーＣ１（６ａ））が、図１に概略的に示されているその（ビオチン）結合部位Ｚ１（４２）を介して可逆的に結合する任意のストレプトアビジンムテインであってよい。このような多量体化試薬は、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）、又は野性型ストレプト���ビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）であってよく、これらはいずれも、例えば米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、商標名Strep-Tactin（登録商標）として市販されている。図１の実施例では、多量体化試薬（４）は、多量体カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを更に含んでよく、これらはいずれもカルモジュリン結合ペプチド又はグルタチオンと可逆的結合を形成する。したがって、結合部位Ｚ２（４４）は、カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって形成することができる。例えば、カルモジュリンとストレプトアビジンムテインとのこのようなタンパク質コンジュゲートは、例えば、二官能性リンカーを用いることによって、標準的なタンパク質化学によって作製することができる。図１ｂに示す通り、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該細胞の集団（２）は、第１の剤（６）を介して該多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤は、この実施例ではＣ４０等の細胞表面受容体分子に特異的に結合し、そして、例えばＢ細胞の細胞拡大のための活性化シグナルを提供する。特異的細胞表面分子（３０）を有しない初期サンプル中に含有されている他の細胞集団（２２）は、多量体化試薬には結合しない。これに関して、細胞集団（２）は、通常、その表面上に複数コピーの細胞表面分子（３０）を有し、そして、典型的には、これら複数コピーの結合が活性化にとって必要であることに留意する。したがって、複数の第１の剤（６）が可逆的に結合して、第１の剤の「多量体化」を達成するように、すなわち、十分な密度の第１の剤を細胞の集団（２）に提示するように、多量体化剤（４）は、典型的には、１を超える結合部位Ｚ１を提供する（図１のスキームには図示しない）。これに関して、本明細書で使用するとき、多量体化剤は、それ自体、複数の結合部位Ｚ１を有し得、例えば、そのネイティブな状態のストレプトアビジンムテイン（ホモ四量体である）は、４つのこのような結合部位Ｚ１を有することに留意する。しかし、多量体化試薬は、それ自体、結合パートナーＣ１が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１を１つしか有しない化合物に基づくことも可能である。このような例は、多量体カルモジュリンである。カルモジュリン自体は、カルモジュリン結合ペプチドのための結合部位を１つしか有しない。しかし、カルモジュリンをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジン−オリゴマー（以下も参照）と反応させて、複数のカルモジュリン分子が「骨格」上に高密度で提示されている多量体化試薬を提供し、それによって、多量体カルモジュリンを提供することができる。図１ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。該分離は、多量体化試薬に結合している細胞の集団（２）を含有するイン��ュベーション／反応混合物に競合体を添加することによって達成し得る。第１の剤の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬の結合部位Ｚ１（２２）との間の可逆的結合の競合的分離（競合的溶出として理解することができる）については、インキュベーション混合物／細胞の集団を、第１の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部Ｚ１（２２）との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１（２０）又は該第１の結合パートナーＣのアナログと接触させてよい。ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１の例では、第１の遊離型パートナーＣ１（２０）は、対応する遊離型ストレプトアビジン結合ペプチド又は競合的に結合するアナログであってよい。このようなアナログは、例えば、ビオチン又はデスチオビオチン等のビオチン誘導体であってよい。図１ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー（２０）又はそのアナログの添加によって、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）が置き換えられ、ひいては、結合パートナーＣ１は第１の剤（６）に含まれているので、第１の剤（６）が多量体化試薬（４）から置き換えられる。次に、特に、第１の剤と細胞表面受容体（３０）との間の結合の結合親和性が１０−２M〜１０−１３Mの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有し、したがって可逆的でもある場合、この第１の剤（６）の置換によって細胞表面受容体（３０）から第１の剤（６）が解離する。この解離に起因して、細胞集団（２）の刺激も終了する。したがって、本発明は、細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。この状況では、抗体分子のその抗原（例えば、この実施例では、ＣＤ４０等の細胞表面受容体分子を含む）に対する結合親和性は、通常、１０−７M〜１０−１３MのＫｄの親和性の範囲内であることに留意する。したがって、従来のモノクローナル抗体を、本発明において第１の剤として（そして、無論、以下に説明する第２の剤としても）用いることができる。より強固な結合を導く何らかの望ましくないアビディティー効果を避けるために、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片等の一価抗体断片の形態で用いることもできる。更に、細胞表面分子（３０）からの第１の剤の解離に起因して、本発明は、刺激された細胞集団が、刺激期間の最後に刺激剤を含まず、そして、バイオリアクタ表面又は磁気ビーズ等の固体支持体に固定化されている多量体化試薬（４）は留めながら、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の「除去カートリッジ」を介して、前記方法で用いられる全ての他の試薬、すなわち、第１の剤（６）及び結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）又はそのアナログを、刺激された細胞集団（２）から容易に除去できるという追加の利点を有する。したがって、遊離剤（６）及び遊離型の第１のパートナー（２０）の除去に戻ると、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号における「除去カートリッジ」の記載に従って（例えば、その図４を参照して）、本願の図１ｄにおいて得られる溶出液サンプルを国際公開公報第２０１３／１���４４７４号の第２のクロマトグラフィーカラムにロードしてよい。このクロマトグラフィーカラムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスであると同時に、ゲル浸透マトリクスとして作用し得る好適な固定相を有する。このアフィニティークロマトグラフィーマトリクス上には、アフィニティー試薬が固定化されている。アフィニティー試薬は、本実施例の場合、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、又はこれらの混合物であってよい。第１の剤（６）、結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）（本明細書では「競合試薬」とも呼ばれる）は、アフィニティー試薬に結合して、クロマトグラフィーマトリクス上に固定化される。その結果、単離及び拡大された細胞集団（２）を含有する溶出液サンプルは、第１の剤（６）及び競合試薬（２０）を含まない。任意の反応物質を含まない、拡大された細胞集団（２）は、例えば、診断用途（例えば、更なるＦＡＣＳ（商標）選別）又は任意の細胞に基づく処置用途のために更に使用できる状態である。
【図１Ｂ】図１は、第１の剤が結合することによって細胞が拡大するための活性化シグナルを提供することができる細胞表面受容体を有する細胞の集団を拡大する、インビトロにおける拡大方法の実施態様を示す。図１ａに示す通り、表面受容体分子（３０）を有する細胞の集団（２）を含むサンプルを、多量体化試薬（４）と接触させる。細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。図１に示す例では、多量体化試薬（４）は、この例では用いられない第２の結合部位Ｚ２（４４）を有する。多量体化試薬（４）は、それ自体、細胞培養プレート又は反応器の表面の磁気ビーズ、ポリマービーズ等の固体支持体（１０）上に固定化されている。細胞の集団（２）は、例えば、ＣＤ４０受容体を介して活性化され得るＢ細胞の集団等のリンパ球細胞集団であってよい（例えば、Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 “Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulationを参照）。この場合、細胞表面受容体（３０）は、ＣＤ４０であり、そして、第１の剤（６）は、所望の活性シグナルを提供する任意のＣＤ４０結合分子、例えば、モノクローナル抗体ＣＰ−８７０，８９３、又は一価Ｆａｂ断片等のその抗体結合断片であってよい。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１は、例えば、抗体分子の２本のポリペプチド鎖（重鎖又は軽鎖）のうちの１本のＣ末端に融合又はコンジュゲート化している例えば任意のアフィニティーペプチドであってよい。結合パートナーＣ１（６ａ）は、例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載のペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（配列番号０１）（「Strep-tag（登録商標）」としても知られている）等、又は国際公開公報第０２／０７７０１８号若しくは米国特許第７，９８１，６３２号に記載の通り２つ以上の個々の結合分子の連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチド等のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。ストレプトアビジン結合ペプチドを結合パートナーＣ１として用いたとき、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンペプチド（＝第１の結合パートナーＣ１（６ａ））が、図１に概略的に示されているその（ビオチン）結合部位Ｚ１（４２）を介して可逆的に結合する任意のストレプトアビジンムテインであってよい。このような多量体化試薬は、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）、又は野性型ストレプト���ビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）であってよく、これらはいずれも、例えば米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、商標名Strep-Tactin（登録商標）として市販されている。図１の実施例では、多量体化試薬（４）は、多量体カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを更に含んでよく、これらはいずれもカルモジュリン結合ペプチド又はグルタチオンと可逆的結合を形成する。したがって、結合部位Ｚ２（４４）は、カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって形成することができる。例えば、カルモジュリンとストレプトアビジンムテインとのこのようなタンパク質コンジュゲートは、例えば、二官能性リンカーを用いることによって、標準的なタンパク質化学によって作製することができる。図１ｂに示す通り、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該細胞の集団（２）は、第１の剤（６）を介して該多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤は、この実施例ではＣ４０等の細胞表面受容体分子に特異的に結合し、そして、例えばＢ細胞の細胞拡大のための活性化シグナルを提供する。特異的細胞表面分子（３０）を有しない初期サンプル中に含有されている他の細胞集団（２２）は、多量体化試薬には結合しない。これに関して、細胞集団（２）は、通常、その表面上に複数コピーの細胞表面分子（３０）を有し、そして、典型的には、これら複数コピーの結合が活性化にとって必要であることに留意する。したがって、複数の第１の剤（６）が可逆的に結合して、第１の剤の「多量体化」を達成するように、すなわち、十分な密度の第１の剤を細胞の集団（２）に提示するように、多量体化剤（４）は、典型的には、１を超える結合部位Ｚ１を提供する（図１のスキームには図示しない）。これに関して、本明細書で使用するとき、多量体化剤は、それ自体、複数の結合部位Ｚ１を有し得、例えば、そのネイティブな状態のストレプトアビジンムテイン（ホモ四量体である）は、４つのこのような結合部位Ｚ１を有することに留意する。しかし、多量体化試薬は、それ自体、結合パートナーＣ１が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１を１つしか有しない化合物に基づくことも可能である。このような例は、多量体カルモジュリンである。カルモジュリン自体は、カルモジュリン結合ペプチドのための結合部位を１つしか有しない。しかし、カルモジュリンをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジン−オリゴマー（以下も参照）と反応させて、複数のカルモジュリン分子が「骨格」上に高密度で提示されている多量体化試薬を提供し、それによって、多量体カルモジュリンを提供することができる。図１ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。該分離は、多量体化試薬に結合している細胞の集団（２）を含有するイン��ュベーション／反応混合物に競合体を添加することによって達成し得る。第１の剤の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬の結合部位Ｚ１（２２）との間の可逆的結合の競合的分離（競合的溶出として理解することができる）については、インキュベーション混合物／細胞の集団を、第１の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部Ｚ１（２２）との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１（２０）又は該第１の結合パートナーＣのアナログと接触させてよい。ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１の例では、第１の遊離型パートナーＣ１（２０）は、対応する遊離型ストレプトアビジン結合ペプチド又は競合的に結合するアナログであってよい。このようなアナログは、例えば、ビオチン又はデスチオビオチン等のビオチン誘導体であってよい。図１ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー（２０）又はそのアナログの添加によって、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）が置き換えられ、ひいては、結合パートナーＣ１は第１の剤（６）に含まれているので、第１の剤（６）が多量体化試薬（４）から置き換えられる。次に、特に、第１の剤と細胞表面受容体（３０）との間の結合の結合親和性が１０−２M〜１０−１３Mの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有し、したがって可逆的でもある場合、この第１の剤（６）の置換によって細胞表面受容体（３０）から第１の剤（６）が解離する。この解離に起因して、細胞集団（２）の刺激も終了する。したがって、本発明は、細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。この状況では、抗体分子のその抗原（例えば、この実施例では、ＣＤ４０等の細胞表面受容体分子を含む）に対する結合親和性は、通常、１０−７M〜１０−１３MのＫｄの親和性の範囲内であることに留意する。したがって、従来のモノクローナル抗体を、本発明において第１の剤として（そして、無論、以下に説明する第２の剤としても）用いることができる。より強固な結合を導く何らかの望ましくないアビディティー効果を避けるために、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片等の一価抗体断片の形態で用いることもできる。更に、細胞表面分子（３０）からの第１の剤の解離に起因して、本発明は、刺激された細胞集団が、刺激期間の最後に刺激剤を含まず、そして、バイオリアクタ表面又は磁気ビーズ等の固体支持体に固定化されている多量体化試薬（４）は留めながら、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の「除去カートリッジ」を介して、前記方法で用いられる全ての他の試薬、すなわち、第１の剤（６）及び結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）又はそのアナログを、刺激された細胞集団（２）から容易に除去できるという追加の利点を有する。したがって、遊離剤（６）及び遊離型の第１のパートナー（２０）の除去に戻ると、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号における「除去カートリッジ」の記載に従って（例えば、その図４を参照して）、本願の図１ｄにおいて得られる溶出液サンプルを国際公開公報第２０１３／１���４４７４号の第２のクロマトグラフィーカラムにロードしてよい。このクロマトグラフィーカラムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスであると同時に、ゲル浸透マトリクスとして作用し得る好適な固定相を有する。このアフィニティークロマトグラフィーマトリクス上には、アフィニティー試薬が固定化されている。アフィニティー試薬は、本実施例の場合、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、又はこれらの混合物であってよい。第１の剤（６）、結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）（本明細書では「競合試薬」とも呼ばれる）は、アフィニティー試薬に結合して、クロマトグラフィーマトリクス上に固定化される。その結果、単離及び拡大された細胞集団（２）を含有する溶出液サンプルは、第１の剤（６）及び競合試薬（２０）を含まない。任意の反応物質を含まない、拡大された細胞集団（２）は、例えば、診断用途（例えば、更なるＦＡＣＳ（商標）選別）又は任意の細胞に基づく処置用途のために更に使用できる状態である。
【図１Ｃ】図１は、第１の剤が結合することによって細胞が拡大するための活性化シグナルを提供することができる細胞表面受容体を有する細胞の集団を拡大する、インビトロにおける拡大方法の実施態様を示す。図１ａに示す通り、表面受容体分子（３０）を有する細胞の集団（２）を含むサンプルを、多量体化試薬（４）と接触させる。細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。図１に示す例では、多量体化試薬（４）は、この例では用いられない第２の結合部位Ｚ２（４４）を有する。多量体化試薬（４）は、それ自体、細胞培養プレート又は反応器の表面の磁気ビーズ、ポリマービーズ等の固体支持体（１０）上に固定化されている。細胞の集団（２）は、例えば、ＣＤ４０受容体を介して活性化され得るＢ細胞の集団等のリンパ球細胞集団であってよい（例えば、Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 “Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulationを参照）。この場合、細胞表面受容体（３０）は、ＣＤ４０であり、そして、第１の剤（６）は、所望の活性シグナルを提供する任意のＣＤ４０結合分子、例えば、モノクローナル抗体ＣＰ−８７０，８９３、又は一価Ｆａｂ断片等のその抗体結合断片であってよい。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１は、例えば、抗体分子の２本のポリペプチド鎖（重鎖又は軽鎖）のうちの１本のＣ末端に融合又はコンジュゲート化している例えば任意のアフィニティーペプチドであってよい。結合パートナーＣ１（６ａ）は、例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載のペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（配列番号０１）（「Strep-tag（登録商標）」としても知られている）等、又は国際公開公報第０２／０７７０１８号若しくは米国特許第７，９８１，６３２号に記載の通り２つ以上の個々の結合分子の連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチド等のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。ストレプトアビジン結合ペプチドを結合パートナーＣ１として用いたとき、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンペプチド（＝第１の結合パートナーＣ１（６ａ））が、図１に概略的に示されているその（ビオチン）結合部位Ｚ１（４２）を介して可逆的に結合する任意のストレプトアビジンムテインであってよい。このような多量体化試薬は、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）、又は野性型ストレプト���ビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）であってよく、これらはいずれも、例えば米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、商標名Strep-Tactin（登録商標）として市販されている。図１の実施例では、多量体化試薬（４）は、多量体カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを更に含んでよく、これらはいずれもカルモジュリン結合ペプチド又はグルタチオンと可逆的結合を形成する。したがって、結合部位Ｚ２（４４）は、カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって形成することができる。例えば、カルモジュリンとストレプトアビジンムテインとのこのようなタンパク質コンジュゲートは、例えば、二官能性リンカーを用いることによって、標準的なタンパク質化学によって作製することができる。図１ｂに示す通り、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該細胞の集団（２）は、第１の剤（６）を介して該多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤は、この実施例ではＣ４０等の細胞表面受容体分子に特異的に結合し、そして、例えばＢ細胞の細胞拡大のための活性化シグナルを提供する。特異的細胞表面分子（３０）を有しない初期サンプル中に含有されている他の細胞集団（２２）は、多量体化試薬には結合しない。これに関して、細胞集団（２）は、通常、その表面上に複数コピーの細胞表面分子（３０）を有し、そして、典型的には、これら複数コピーの結合が活性化にとって必要であることに留意する。したがって、複数の第１の剤（６）が可逆的に結合して、第１の剤の「多量体化」を達成するように、すなわち、十分な密度の第１の剤を細胞の集団（２）に提示するように、多量体化剤（４）は、典型的には、１を超える結合部位Ｚ１を提供する（図１のスキームには図示しない）。これに関して、本明細書で使用するとき、多量体化剤は、それ自体、複数の結合部位Ｚ１を有し得、例えば、そのネイティブな状態のストレプトアビジンムテイン（ホモ四量体である）は、４つのこのような結合部位Ｚ１を有することに留意する。しかし、多量体化試薬は、それ自体、結合パートナーＣ１が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１を１つしか有しない化合物に基づくことも可能である。このような例は、多量体カルモジュリンである。カルモジュリン自体は、カルモジュリン結合ペプチドのための結合部位を１つしか有しない。しかし、カルモジュリンをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジン−オリゴマー（以下も参照）と反応させて、複数のカルモジュリン分子が「骨格」上に高密度で提示されている多量体化試薬を提供し、それによって、多量体カルモジュリンを提供することができる。図１ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。該分離は、多量体化試薬に結合している細胞の集団（２）を含有するイン��ュベーション／反応混合物に競合体を添加することによって達成し得る。第１の剤の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬の結合部位Ｚ１（２２）との間の可逆的結合の競合的分離（競合的溶出として理解することができる）については、インキュベーション混合物／細胞の集団を、第１の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部Ｚ１（２２）との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１（２０）又は該第１の結合パートナーＣのアナログと接触させてよい。ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１の例では、第１の遊離型パートナーＣ１（２０）は、対応する遊離型ストレプトアビジン結合ペプチド又は競合的に結合するアナログであってよい。このようなアナログは、例えば、ビオチン又はデスチオビオチン等のビオチン誘導体であってよい。図１ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー（２０）又はそのアナログの添加によって、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）が置き換えられ、ひいては、結合パートナーＣ１は第１の剤（６）に含まれているので、第１の剤（６）が多量体化試薬（４）から置き換えられる。次に、特に、第１の剤と細胞表面受容体（３０）との間の結合の結合親和性が１０−２M〜１０−１３Mの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有し、したがって可逆的でもある場合、この第１の剤（６）の置換によって細胞表面受容体（３０）から第１の剤（６）が解離する。この解離に起因して、細胞集団（２）の刺激も終了する。したがって、本発明は、細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。この状況では、抗体分子のその抗原（例えば、この実施例では、ＣＤ４０等の細胞表面受容体分子を含む）に対する結合親和性は、通常、１０−７M〜１０−１３MのＫｄの親和性の範囲内であることに留意する。したがって、従来のモノクローナル抗体を、本発明において第１の剤として（そして、無論、以下に説明する第２の剤としても）用いることができる。より強固な結合を導く何らかの望ましくないアビディティー効果を避けるために、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片等の一価抗体断片の形態で用いることもできる。更に、細胞表面分子（３０）からの第１の剤の解離に起因して、本発明は、刺激された細胞集団が、刺激期間の最後に刺激剤を含まず、そして、バイオリアクタ表面又は磁気ビーズ等の固体支持体に固定化されている多量体化試薬（４）は留めながら、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の「除去カートリッジ」を介して、前記方法で用いられる全ての他の試薬、すなわち、第１の剤（６）及び結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）又はそのアナログを、刺激された細胞集団（２）から容易に除去できるという追加の利点を有する。したがって、遊離剤（６）及び遊離型の第１のパートナー（２０）の除去に戻ると、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号における「除去カートリッジ」の記載に従って（例えば、その図４を参照して）、本願の図１ｄにおいて得られる溶出液サンプルを国際公開公報第２０１３／１���４４７４号の第２のクロマトグラフィーカラムにロードしてよい。このクロマトグラフィーカラムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスであると同時に、ゲル浸透マトリクスとして作用し得る好適な固定相を有する。このアフィニティークロマトグラフィーマトリクス上には、アフィニティー試薬が固定化されている。アフィニティー試薬は、本実施例の場合、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、又はこれらの混合物であってよい。第１の剤（６）、結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）（本明細書では「競合試薬」とも呼ばれる）は、アフィニティー試薬に結合して、クロマトグラフィーマトリクス上に固定化される。その結果、単離及び拡大された細胞集団（２）を含有する溶出液サンプルは、第１の剤（６）及び競合試薬（２０）を含まない。任意の反応物質を含まない、拡大された細胞集団（２）は、例えば、診断用途（例えば、更なるＦＡＣＳ（商標）選別）又は任意の細胞に基づく処置用途のために更に使用できる状態である。
【図１Ｄ】図１は、第１の剤が結合することによって細胞が拡大するための活性化シグナルを提供することができる細胞表面受容体を有する細胞の集団を拡大する、インビトロにおける拡大方法の実施態様を示す。図１ａに示す通り、表面受容体分子（３０）を有する細胞の集団（２）を含むサンプルを、多量体化試薬（４）と接触させる。細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。図１に示す例では、多量体化試薬（４）は、この例では用いられない第２の結合部位Ｚ２（４４）を有する。多量体化試薬（４）は、それ自体、細胞培養プレート又は反応器の表面の磁気ビーズ、ポリマービーズ等の固体支持体（１０）上に固定化されている。細胞の集団（２）は、例えば、ＣＤ４０受容体を介して活性化され得るＢ細胞の集団等のリンパ球細胞集団であってよい（例えば、Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 “Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulationを参照）。この場合、細胞表面受容体（３０）は、ＣＤ４０であり、そして、第１の剤（６）は、所望の活性シグナルを提供する任意のＣＤ４０結合分子、例えば、モノクローナル抗体ＣＰ−８７０，８９３、又は一価Ｆａｂ断片等のその抗体結合断片であってよい。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１は、例えば、抗体分子の２本のポリペプチド鎖（重鎖又は軽鎖）のうちの１本のＣ末端に融合又はコンジュゲート化している例えば任意のアフィニティーペプチドであってよい。結合パートナーＣ１（６ａ）は、例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載のペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（配列番号０１）（「Strep-tag（登録商標）」としても知られている）等、又は国際公開公報第０２／０７７０１８号若しくは米国特許第７，９８１，６３２号に記載の通り２つ以上の個々の結合分子の連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチド等のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。ストレプトアビジン結合ペプチドを結合パートナーＣ１として用いたとき、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンペプチド（＝第１の結合パートナーＣ１（６ａ））が、図１に概略的に示されているその（ビオチン）結合部位Ｚ１（４２）を介して可逆的に結合する任意のストレプトアビジンムテインであってよい。このような多量体化試薬は、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）、又は野性型ストレプト���ビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）であってよく、これらはいずれも、例えば米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、商標名Strep-Tactin（登録商標）として市販されている。図１の実施例では、多量体化試薬（４）は、多量体カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを更に含んでよく、これらはいずれもカルモジュリン結合ペプチド又はグルタチオンと可逆的結合を形成する。したがって、結合部位Ｚ２（４４）は、カルモジュリン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって形成することができる。例えば、カルモジュリンとストレプトアビジンムテインとのこのようなタンパク質コンジュゲートは、例えば、二官能性リンカーを用いることによって、標準的なタンパク質化学によって作製することができる。図１ｂに示す通り、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該細胞の集団（２）は、第１の剤（６）を介して該多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤は、この実施例ではＣ４０等の細胞表面受容体分子に特異的に結合し、そして、例えばＢ細胞の細胞拡大のための活性化シグナルを提供する。特異的細胞表面分子（３０）を有しない初期サンプル中に含有されている他の細胞集団（２２）は、多量体化試薬には結合しない。これに関して、細胞集団（２）は、通常、その表面上に複数コピーの細胞表面分子（３０）を有し、そして、典型的には、これら複数コピーの結合が活性化にとって必要であることに留意する。したがって、複数の第１の剤（６）が可逆的に結合して、第１の剤の「多量体化」を達成するように、すなわち、十分な密度の第１の剤を細胞の集団（２）に提示するように、多量体化剤（４）は、典型的には、１を超える結合部位Ｚ１を提供する（図１のスキームには図示しない）。これに関して、本明細書で使用するとき、多量体化剤は、それ自体、複数の結合部位Ｚ１を有し得、例えば、そのネイティブな状態のストレプトアビジンムテイン（ホモ四量体である）は、４つのこのような結合部位Ｚ１を有することに留意する。しかし、多量体化試薬は、それ自体、結合パートナーＣ１が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１を１つしか有しない化合物に基づくことも可能である。このような例は、多量体カルモジュリンである。カルモジュリン自体は、カルモジュリン結合ペプチドのための結合部位を１つしか有しない。しかし、カルモジュリンをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジン−オリゴマー（以下も参照）と反応させて、複数のカルモジュリン分子が「骨格」上に高密度で提示されている多量体化試薬を提供し、それによって、多量体カルモジュリンを提供することができる。図１ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。該分離は、多量体化試薬に結合している細胞の集団（２）を含有するイン��ュベーション／反応混合物に競合体を添加することによって達成し得る。第１の剤の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬の結合部位Ｚ１（２２）との間の可逆的結合の競合的分離（競合的溶出として理解することができる）については、インキュベーション混合物／細胞の集団を、第１の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部Ｚ１（２２）との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１（２０）又は該第１の結合パートナーＣのアナログと接触させてよい。ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１の例では、第１の遊離型パートナーＣ１（２０）は、対応する遊離型ストレプトアビジン結合ペプチド又は競合的に結合するアナログであってよい。このようなアナログは、例えば、ビオチン又はデスチオビオチン等のビオチン誘導体であってよい。図１ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー（２０）又はそのアナログの添加によって、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）が置き換えられ、ひいては、結合パートナーＣ１は第１の剤（６）に含まれているので、第１の剤（６）が多量体化試薬（４）から置き換えられる。次に、特に、第１の剤と細胞表面受容体（３０）との間の結合の結合親和性が１０−２M〜１０−１３Mの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有し、したがって可逆的でもある場合、この第１の剤（６）の置換によって細胞表面受容体（３０）から第１の剤（６）が解離する。この解離に起因して、細胞集団（２）の刺激も終了する。したがって、本発明は、細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。この状況では、抗体分子のその抗原（例えば、この実施例では、ＣＤ４０等の細胞表面受容体分子を含む）に対する結合親和性は、通常、１０−７M〜１０−１３MのＫｄの親和性の範囲内であることに留意する。したがって、従来のモノクローナル抗体を、本発明において第１の剤として（そして、無論、以下に説明する第２の剤としても）用いることができる。より強固な結合を導く何らかの望ましくないアビディティー効果を避けるために、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片等の一価抗体断片の形態で用いることもできる。更に、細胞表面分子（３０）からの第１の剤の解離に起因して、本発明は、刺激された細胞集団が、刺激期間の最後に刺激剤を含まず、そして、バイオリアクタ表面又は磁気ビーズ等の固体支持体に固定化されている多量体化試薬（４）は留めながら、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の「除去カートリッジ」を介して、前記方法で用いられる全ての他の試薬、すなわち、第１の剤（６）及び結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）又はそのアナログを、刺激された細胞集団（２）から容易に除去できるという追加の利点を有する。したがって、遊離剤（６）及び遊離型の第１のパートナー（２０）の除去に戻ると、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号における「除去カートリッジ」の記載に従って（例えば、その図４を参照して）、本願の図１ｄにおいて得られる溶出液サンプルを国際公開公報第２０１３／１���４４７４号の第２のクロマトグラフィーカラムにロードしてよい。このクロマトグラフィーカラムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスであると同時に、ゲル浸透マトリクスとして作用し得る好適な固定相を有する。このアフィニティークロマトグラフィーマトリクス上には、アフィニティー試薬が固定化されている。アフィニティー試薬は、本実施例の場合、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、又はこれらの混合物であってよい。第１の剤（６）、結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー（２０）（本明細書では「競合試薬」とも呼ばれる）は、アフィニティー試薬に結合して、クロマトグラフィーマトリクス上に固定化される。その結果、単離及び拡大された細胞集団（２）を含有する溶出液サンプルは、第１の剤（６）及び競合試薬（２０）を含まない。任意の反応物質を含まない、拡大された細胞集団（２）は、例えば、診断用途（例えば、更なるＦＡＣＳ（商標）選別）又は任意の細胞に基づく処置用途のために更に使用できる状態である。
【図２Ａ】図２は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。図２ａに示す通り、サンプルは、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有する細胞の集団（２）を含む。細胞表面分子（３０）は、細胞集団に対する一次活性化シグナルに関与しているが、一方細胞表面分子（３２）は、細胞への刺激の提供に関与している細胞表面上のアクセサリ分子である。細胞の集団は、例えば、細胞表面分子（３０）がＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）がアクセサリ分子ＣＤ２８であるＴ細胞集団であってよい。Ｔ細胞の拡大／増殖には、一次活性化シグナルとしてのＴＣＲ／ＣＤ３複合体及び共刺激剤としてのＣＤ２８の両方が結合することが必要である。Ｔ細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）及び（３２）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。また、この実施態様では、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させる。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。更に、細胞の表面上のアクセサリ分子としてのＣＤ２８を刺激する第２の剤（８）が、多量体化試薬上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。更に、図２に示す実施例では、第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）に可逆的に結合することができる。第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２（４４）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。この実施例では、第１の剤（６）は、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第２の剤（８）は、モノクローナル抗ＣＤ２８抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第１の結合パートナー（６ａ）は、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ３抗体断片と融合又はコンジュゲート化しているストレプトアビジン結合ペプチド（６ａ）であってよい。第２の結合パートナー（８ａ）は、ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８結合抗体断片とコンジュゲート化又は融合しているカルモジュリン結合ペプチドであってよい。この状況では、例えば、ＣＤ３又はＣＤ２８に対するモノクローナル抗体は周知であり（例えば、上で論じた米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ号又は欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号を参照）、そして、ほんの数例を挙げると、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)、Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)、BD Biosciences (San Jose, CA, USA)、Biolegend (San Diego, CA, USA)、又はMiltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)等の多数の供給元から市販されていることに留意する。したがって、このようなモノク��ーナル抗体は、第１及び第２の剤として用いることができ、そして、例えば、結合パートナーＣ１又はＣ２と化学的に結合（コンジュゲート化）することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株由来の可変ドメインの遺伝子をクローニングするか又はアミノ酸配列が公知である抗体を用い、そして、Ｆａｂ断片又はＦｖ等のそれぞれの抗体断片を組み換えで産生することも可能である。モノクローナル抗ＣＤ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ATCC（登録商標）CRL-8001（商標）、米国特許第４，３６１，５４９号に記載）並びにVanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570及びGenBankアクセッション番号AF451974.1に記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の両方について実施例の部分に記載するアプローチ等を用いる場合、抗体断片が軽鎖又は重鎖のいずれかのＣ末端に融合ペプチドとして結合パートナーＣ１又はＣ２を有するように、結合パートナーＣ１及びＣ２は、組み換え産生のために用いられるそれぞれの発現ベクターによって簡便に提供される（この状況では、Arakawa et al  J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載されている抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７及び１８として、そして、添付の配列表に説明目的のために示されており、一方、Vanhoveら（上記）によって記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の可変ドメインのアミノ酸配列は、添付の配列表に配列番号１９（ＶＨ）及び２０（ＶＬ）として示されている）。また、抗体分子の可変ドメインをクローニングし、そして、それぞれの抗体断片を組み換えで産生するこの方法論は、当業者に周知である（例えば、Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141, 79-84、又はSkerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr Opin Immunol. 5, 256-562を参照）。最後に、ファージディスプレイ（例えば、Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、又はRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93に概説）、リボソームディスプレイ（Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405に概説）、又はｍＲＮＡディスプレイ（Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755に報告）等の周知の進化的方法によって、図２の実施例のように、ＣＤ３又はＣＤ２８等の所与の標的に対して抗体様特性を有する人工結合分子の抗体分子を作製することも可能である。図２に示す実施例の場合、多量体化試薬（４）は、２つの異なる結合部位Ｚ１（４２）及びＺ２（４４）を有する。ストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１（６ａ）を用いると、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１（４２）は、ストレプトアビジンペプチド（６ａ）が可逆的に結合する好適なストレプトアビジンムテインによって提供される。結合Ｃ２はカルモジュリン結合ペプチドであるので、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）は、多量体カルモジュリンによって提供される。多量体化試薬（４）は、単一の分子、例えば、多量体カルモジュリンとストレプトアビジンとのコンジュゲートであってもよく（この代替例は、通常、可溶性多量体化の場合��用いられる）、又は２つの独立分子からなっていてもよい。後者の選択肢は、図２に示す通り多量体化試薬（４４）が固体支持体上に固定化されているときに好ましい。この場合、ストレプトアビジンムテイン及びカルモジュリンの混合物を、例えば、結合部位Ｚ１及びＺ２に対して１：１のモル比で、固体支持体上にコーティング（固定化）してよい。この状況では、固体支持体の表面上にカルモジュリンが固定化されたことにより、上に説明したように多量体カルモジュリンを調製する必要はないが、カルモジュリンの表面への固定化は、カルモジュリン（上述の通り、細胞集団（２）の結合を確実にするのに十分に高い密度で、カルモジュリン結合ペプチドのための単一の結合部位のみを有する）を提示するのに十分であることに留意する。例えば、この場合、ＣＤ２８に対する２つの結合部位を有する二価抗体断片、又はそれ自体２つの同一の結合部位を有するインタクトな抗体を、第２の試薬（８）として用いることができる。図２ｂに示す通り、Ｔ細胞集団（２）と多量体化試薬（４）とを接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該Ｔ細胞の集団（２）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）を介して多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８に特異的に結合して、Ｔ細胞の増殖／拡大を誘導する。図２ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。同様に、第２の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１との間の可逆的結合は、ビオチン（遊離型の第１のパートナーのアナログ（２０）として作用する）によって分離させることができ、一方、第１の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２との間の可逆的結合は、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ（遊離型の第２のパートナーのアナログ（２０）として作用する）等の金属キレート剤（カルシウムキレート剤）を添加することによって分離させることができるが、その理由は、カルモジュリン結合ペプチドに対するカルモジュリンの結合が、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性であるためである）。これは、無論、細胞集団（２）の接触がＣａ２＋含有バッファ中で実施されることを意味する。図２ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー及び第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）の添加によって、それぞれ、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）及びＣ２（８ａ）が置き換えられ、ひいては、多量体化試薬（４）から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が置き換えられる。次に、この第１の剤（６）及び第２の剤（８）の置き換えによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が解離し、それによって、細胞集団（２）の刺��／拡大が終了する。したがって、上記の通り、本発明は、Ｔ細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、Ｔ細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、そして、重要なことに、初期サンプルが、例えば、フィコール勾配から得られたＰＭＢＣの形態のリンパ球の集団であった場合、Ｔ細胞集団（２）は、本明細書に定義する通り、連続拡大のために利用可能である。（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８を介する初期刺激によって）拡大された細胞集団は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、人工Ｔ細胞受容体として知られている）を拡大中にトランスフェクトすることができるので、次いで、遺伝的に改変された細胞を、初期刺激から解放することができ、そして、次いで、例えば、デノボ導入された受容体を介して、第２の種類の刺激で刺激することができる。これら第２の刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然リガンド）、又は（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体等）の形態の抗原刺激を含んでよい。したがって、この連続拡大から得られたＴ細胞集団は、養子細胞移入のために用いることができる。
【図２Ｂ】図２は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。図２ａに示す通り、サンプルは、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有する細胞の集団（２）を含む。細胞表面分子（３０）は、細胞集団に対する一次活性化シグナルに関与しているが、一方細胞表面分子（３２）は、細胞への刺激の提供に関与している細胞表面上のアクセサリ分子である。細胞の集団は、例えば、細胞表面分子（３０）がＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）がアクセサリ分子ＣＤ２８であるＴ細胞集団であってよい。Ｔ細胞の拡大／増殖には、一次活性化シグナルとしてのＴＣＲ／ＣＤ３複合体及び共刺激剤としてのＣＤ２８の両方が結合することが必要である。Ｔ細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）及び（３２）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。また、この実施態様では、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させる。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。更に、細胞の表面上のアクセサリ分子としてのＣＤ２８を刺激する第２の剤（８）が、多量体化試薬上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。更に、図２に示す実施例では、第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）に可逆的に結合することができる。第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２（４４）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。この実施例では、第１の剤（６）は、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第２の剤（８）は、モノクローナル抗ＣＤ２８抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第１の結合パートナー（６ａ）は、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ３抗体断片と融合又はコンジュゲート化しているストレプトアビジン結合ペプチド（６ａ）であってよい。第２の結合パートナー（８ａ）は、ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８結合抗体断片とコンジュゲート化又は融合しているカルモジュリン結合ペプチドであってよい。この状況では、例えば、ＣＤ３又はＣＤ２８に対するモノクローナル抗体は周知であり（例えば、上で論じた米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ号又は欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号を参照）、そして、ほんの数例を挙げると、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)、Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)、BD Biosciences (San Jose, CA, USA)、Biolegend (San Diego, CA, USA)、又はMiltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)等の多数の供給元から市販されていることに留意する。したがって、このようなモノク��ーナル抗体は、第１及び第２の剤として用いることができ、そして、例えば、結合パートナーＣ１又はＣ２と化学的に結合（コンジュゲート化）することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株由来の可変ドメインの遺伝子をクローニングするか又はアミノ酸配列が公知である抗体を用い、そして、Ｆａｂ断片又はＦｖ等のそれぞれの抗体断片を組み換えで産生することも可能である。モノクローナル抗ＣＤ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ATCC（登録商標）CRL-8001（商標）、米国特許第４，３６１，５４９号に記載）並びにVanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570及びGenBankアクセッション番号AF451974.1に記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の両方について実施例の部分に記載するアプローチ等を用いる場合、抗体断片が軽鎖又は重鎖のいずれかのＣ末端に融合ペプチドとして結合パートナーＣ１又はＣ２を有するように、結合パートナーＣ１及びＣ２は、組み換え産生のために用いられるそれぞれの発現ベクターによって簡便に提供される（この状況では、Arakawa et al  J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載されている抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７及び１８として、そして、添付の配列表に説明目的のために示されており、一方、Vanhoveら（上記）によって記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の可変ドメインのアミノ酸配列は、添付の配列表に配列番号１９（ＶＨ）及び２０（ＶＬ）として示されている）。また、抗体分子の可変ドメインをクローニングし、そして、それぞれの抗体断片を組み換えで産生するこの方法論は、当業者に周知である（例えば、Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141, 79-84、又はSkerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr Opin Immunol. 5, 256-562を参照）。最後に、ファージディスプレイ（例えば、Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、又はRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93に概説）、リボソームディスプレイ（Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405に概説）、又はｍＲＮＡディスプレイ（Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755に報告）等の周知の進化的方法によって、図２の実施例のように、ＣＤ３又はＣＤ２８等の所与の標的に対して抗体様特性を有する人工結合分子の抗体分子を作製することも可能である。図２に示す実施例の場合、多量体化試薬（４）は、２つの異なる結合部位Ｚ１（４２）及びＺ２（４４）を有する。ストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１（６ａ）を用いると、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１（４２）は、ストレプトアビジンペプチド（６ａ）が可逆的に結合する好適なストレプトアビジンムテインによって提供される。結合Ｃ２はカルモジュリン結合ペプチドであるので、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）は、多量体カルモジュリンによって提供される。多量体化試薬（４）は、単一の分子、例えば、多量体カルモジュリンとストレプトアビジンとのコンジュゲートであってもよく（この代替例は、通常、可溶性多量体化の場合��用いられる）、又は２つの独立分子からなっていてもよい。後者の選択肢は、図２に示す通り多量体化試薬（４４）が固体支持体上に固定化されているときに好ましい。この場合、ストレプトアビジンムテイン及びカルモジュリンの混合物を、例えば、結合部位Ｚ１及びＺ２に対して１：１のモル比で、固体支持体上にコーティング（固定化）してよい。この状況では、固体支持体の表面上にカルモジュリンが固定化されたことにより、上に説明したように多量体カルモジュリンを調製する必要はないが、カルモジュリンの表面への固定化は、カルモジュリン（上述の通り、細胞集団（２）の結合を確実にするのに十分に高い密度で、カルモジュリン結合ペプチドのための単一の結合部位のみを有する）を提示するのに十分であることに留意する。例えば、この場合、ＣＤ２８に対する２つの結合部位を有する二価抗体断片、又はそれ自体２つの同一の結合部位を有するインタクトな抗体を、第２の試薬（８）として用いることができる。図２ｂに示す通り、Ｔ細胞集団（２）と多量体化試薬（４）とを接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該Ｔ細胞の集団（２）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）を介して多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８に特異的に結合して、Ｔ細胞の増殖／拡大を誘導する。図２ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。同様に、第２の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１との間の可逆的結合は、ビオチン（遊離型の第１のパートナーのアナログ（２０）として作用する）によって分離させることができ、一方、第１の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２との間の可逆的結合は、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ（遊離型の第２のパートナーのアナログ（２０）として作用する）等の金属キレート剤（カルシウムキレート剤）を添加することによって分離させることができるが、その理由は、カルモジュリン結合ペプチドに対するカルモジュリンの結合が、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性であるためである）。これは、無論、細胞集団（２）の接触がＣａ２＋含有バッファ中で実施されることを意味する。図２ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー及び第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）の添加によって、それぞれ、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）及びＣ２（８ａ）が置き換えられ、ひいては、多量体化試薬（４）から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が置き換えられる。次に、この第１の剤（６）及び第２の剤（８）の置き換えによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が解離し、それによって、細胞集団（２）の刺��／拡大が終了する。したがって、上記の通り、本発明は、Ｔ細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、Ｔ細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、そして、重要なことに、初期サンプルが、例えば、フィコール勾配から得られたＰＭＢＣの形態のリンパ球の集団であった場合、Ｔ細胞集団（２）は、本明細書に定義する通り、連続拡大のために利用可能である。（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８を介する初期刺激によって）拡大された細胞集団は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、人工Ｔ細胞受容体として知られている）を拡大中にトランスフェクトすることができるので、次いで、遺伝的に改変された細胞を、初期刺激から解放することができ、そして、次いで、例えば、デノボ導入された受容体を介して、第２の種類の刺激で刺激することができる。これら第２の刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然リガンド）、又は（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体等）の形態の抗原刺激を含んでよい。したがって、この連続拡大から得られたＴ細胞集団は、養子細胞移入のために用いることができる。
【図２Ｃ】図２は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。図２ａに示す通り、サンプルは、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有する細胞の集団（２）を含む。細胞表面分子（３０）は、細胞集団に対する一次活性化シグナルに関与しているが、一方細胞表面分子（３２）は、細胞への刺激の提供に関与している細胞表面上のアクセサリ分子である。細胞の集団は、例えば、細胞表面分子（３０）がＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）がアクセサリ分子ＣＤ２８であるＴ細胞集団であってよい。Ｔ細胞の拡大／増殖には、一次活性化シグナルとしてのＴＣＲ／ＣＤ３複合体及び共刺激剤としてのＣＤ２８の両方が結合することが必要である。Ｔ細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）及び（３２）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。また、この実施態様では、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させる。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。更に、細胞の表面上のアクセサリ分子としてのＣＤ２８を刺激する第２の剤（８）が、多量体化試薬上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。更に、図２に示す実施例では、第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）に可逆的に結合することができる。第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２（４４）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。この実施例では、第１の剤（６）は、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第２の剤（８）は、モノクローナル抗ＣＤ２８抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第１の結合パートナー（６ａ）は、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ３抗体断片と融合又はコンジュゲート化しているストレプトアビジン結合ペプチド（６ａ）であってよい。第２の結合パートナー（８ａ）は、ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８結合抗体断片とコンジュゲート化又は融合しているカルモジュリン結合ペプチドであってよい。この状況では、例えば、ＣＤ３又はＣＤ２８に対するモノクローナル抗体は周知であり（例えば、上で論じた米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ号又は欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号を参照）、そして、ほんの数例を挙げると、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)、Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)、BD Biosciences (San Jose, CA, USA)、Biolegend (San Diego, CA, USA)、又はMiltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)等の多数の供給元から市販されていることに留意する。したがって、このようなモノク��ーナル抗体は、第１及び第２の剤として用いることができ、そして、例えば、結合パートナーＣ１又はＣ２と化学的に結合（コンジュゲート化）することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株由来の可変ドメインの遺伝子をクローニングするか又はアミノ酸配列が公知である抗体を用い、そして、Ｆａｂ断片又はＦｖ等のそれぞれの抗体断片を組み換えで産生することも可能である。モノクローナル抗ＣＤ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ATCC（登録商標）CRL-8001（商標）、米国特許第４，３６１，５４９号に記載）並びにVanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570及びGenBankアクセッション番号AF451974.1に記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の両方について実施例の部分に記載するアプローチ等を用いる場合、抗体断片が軽鎖又は重鎖のいずれかのＣ末端に融合ペプチドとして結合パートナーＣ１又はＣ２を有するように、結合パートナーＣ１及びＣ２は、組み換え産生のために用いられるそれぞれの発現ベクターによって簡便に提供される（この状況では、Arakawa et al  J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載されている抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７及び１８として、そして、添付の配列表に説明目的のために示されており、一方、Vanhoveら（上記）によって記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の可変ドメインのアミノ酸配列は、添付の配列表に配列番号１９（ＶＨ）及び２０（ＶＬ）として示されている）。また、抗体分子の可変ドメインをクローニングし、そして、それぞれの抗体断片を組み換えで産生するこの方法論は、当業者に周知である（例えば、Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141, 79-84、又はSkerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr Opin Immunol. 5, 256-562を参照）。最後に、ファージディスプレイ（例えば、Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、又はRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93に概説）、リボソームディスプレイ（Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405に概説）、又はｍＲＮＡディスプレイ（Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755に報告）等の周知の進化的方法によって、図２の実施例のように、ＣＤ３又はＣＤ２８等の所与の標的に対して抗体様特性を有する人工結合分子の抗体分子を作製することも可能である。図２に示す実施例の場合、多量体化試薬（４）は、２つの異なる結合部位Ｚ１（４２）及びＺ２（４４）を有する。ストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１（６ａ）を用いると、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１（４２）は、ストレプトアビジンペプチド（６ａ）が可逆的に結合する好適なストレプトアビジンムテインによって提供される。結合Ｃ２はカルモジュリン結合ペプチドであるので、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）は、多量体カルモジュリンによって提供される。多量体化試薬（４）は、単一の分子、例えば、多量体カルモジュリンとストレプトアビジンとのコンジュゲートであってもよく（この代替例は、通常、可溶性多量体化の場合��用いられる）、又は２つの独立分子からなっていてもよい。後者の選択肢は、図２に示す通り多量体化試薬（４４）が固体支持体上に固定化されているときに好ましい。この場合、ストレプトアビジンムテイン及びカルモジュリンの混合物を、例えば、結合部位Ｚ１及びＺ２に対して１：１のモル比で、固体支持体上にコーティング（固定化）してよい。この状況では、固体支持体の表面上にカルモジュリンが固定化されたことにより、上に説明したように多量体カルモジュリンを調製する必要はないが、カルモジュリンの表面への固定化は、カルモジュリン（上述の通り、細胞集団（２）の結合を確実にするのに十分に高い密度で、カルモジュリン結合ペプチドのための単一の結合部位のみを有する）を提示するのに十分であることに留意する。例えば、この場合、ＣＤ２８に対する２つの結合部位を有する二価抗体断片、又はそれ自体２つの同一の結合部位を有するインタクトな抗体を、第２の試薬（８）として用いることができる。図２ｂに示す通り、Ｔ細胞集団（２）と多量体化試薬（４）とを接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該Ｔ細胞の集団（２）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）を介して多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８に特異的に結合して、Ｔ細胞の増殖／拡大を誘導する。図２ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。同様に、第２の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１との間の可逆的結合は、ビオチン（遊離型の第１のパートナーのアナログ（２０）として作用する）によって分離させることができ、一方、第１の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２との間の可逆的結合は、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ（遊離型の第２のパートナーのアナログ（２０）として作用する）等の金属キレート剤（カルシウムキレート剤）を添加することによって分離させることができるが、その理由は、カルモジュリン結合ペプチドに対するカルモジュリンの結合が、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性であるためである）。これは、無論、細胞集団（２）の接触がＣａ２＋含有バッファ中で実施されることを意味する。図２ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー及び第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）の添加によって、それぞれ、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）及びＣ２（８ａ）が置き換えられ、ひいては、多量体化試薬（４）から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が置き換えられる。次に、この第１の剤（６）及び第２の剤（８）の置き換えによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が解離し、それによって、細胞集団（２）の刺��／拡大が終了する。したがって、上記の通り、本発明は、Ｔ細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、Ｔ細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、そして、重要なことに、初期サンプルが、例えば、フィコール勾配から得られたＰＭＢＣの形態のリンパ球の集団であった場合、Ｔ細胞集団（２）は、本明細書に定義する通り、連続拡大のために利用可能である。（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８を介する初期刺激によって）拡大された細胞集団は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、人工Ｔ細胞受容体として知られている）を拡大中にトランスフェクトすることができるので、次いで、遺伝的に改変された細胞を、初期刺激から解放することができ、そして、次いで、例えば、デノボ導入された受容体を介して、第２の種類の刺激で刺激することができる。これら第２の刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然リガンド）、又は（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体等）の形態の抗原刺激を含んでよい。したがって、この連続拡大から得られたＴ細胞集団は、養子細胞移入のために用いることができる。
【図２Ｄ】図２は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。図２ａに示す通り、サンプルは、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有する細胞の集団（２）を含む。細胞表面分子（３０）は、細胞集団に対する一次活性化シグナルに関与しているが、一方細胞表面分子（３２）は、細胞への刺激の提供に関与している細胞表面上のアクセサリ分子である。細胞の集団は、例えば、細胞表面分子（３０）がＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）がアクセサリ分子ＣＤ２８であるＴ細胞集団であってよい。Ｔ細胞の拡大／増殖には、一次活性化シグナルとしてのＴＣＲ／ＣＤ３複合体及び共刺激剤としてのＣＤ２８の両方が結合することが必要である。Ｔ細胞の集団（２）は、表面受容体分子（３０）及び（３２）を有しない他の細胞集団（２２）との混合物中に存在する。また、この実施態様では、細胞集団（２）を多量体化試薬（４）と接触させる。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤（６）が、多量体化試薬（４）上に可逆的に固定化されている（結合している）。更に、細胞の表面上のアクセサリ分子としてのＣＤ２８を刺激する第２の剤（８）が、多量体化試薬上に可逆的に固定化されている（結合している）。多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１（４２）を含み、そして、該第１の剤（６）は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ）を含み、該結合パートナーＣ１（６ａ）は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。更に、図２に示す実施例では、第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）に可逆的に結合することができる。第２の剤（８）は、結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２（４４）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。この実施例では、第１の剤（６）は、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第２の剤（８）は、モノクローナル抗ＣＤ２８抗体、又はＦａｂ断片等のその抗原結合断片であってよい。第１の結合パートナー（６ａ）は、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ３抗体断片と融合又はコンジュゲート化しているストレプトアビジン結合ペプチド（６ａ）であってよい。第２の結合パートナー（８ａ）は、ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８結合抗体断片とコンジュゲート化又は融合しているカルモジュリン結合ペプチドであってよい。この状況では、例えば、ＣＤ３又はＣＤ２８に対するモノクローナル抗体は周知であり（例えば、上で論じた米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ号又は欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号を参照）、そして、ほんの数例を挙げると、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)、Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)、BD Biosciences (San Jose, CA, USA)、Biolegend (San Diego, CA, USA)、又はMiltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)等の多数の供給元から市販されていることに留意する。したがって、このようなモノク��ーナル抗体は、第１及び第２の剤として用いることができ、そして、例えば、結合パートナーＣ１又はＣ２と化学的に結合（コンジュゲート化）することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株由来の可変ドメインの遺伝子をクローニングするか又はアミノ酸配列が公知である抗体を用い、そして、Ｆａｂ断片又はＦｖ等のそれぞれの抗体断片を組み換えで産生することも可能である。モノクローナル抗ＣＤ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ATCC（登録商標）CRL-8001（商標）、米国特許第４，３６１，５４９号に記載）並びにVanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570及びGenBankアクセッション番号AF451974.1に記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の両方について実施例の部分に記載するアプローチ等を用いる場合、抗体断片が軽鎖又は重鎖のいずれかのＣ末端に融合ペプチドとして結合パートナーＣ１又はＣ２を有するように、結合パートナーＣ１及びＣ２は、組み換え産生のために用いられるそれぞれの発現ベクターによって簡便に提供される（この状況では、Arakawa et al  J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載されている抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７及び１８として、そして、添付の配列表に説明目的のために示されており、一方、Vanhoveら（上記）によって記載されている抗ＣＤ２８抗体２８．３の可変ドメインのアミノ酸配列は、添付の配列表に配列番号１９（ＶＨ）及び２０（ＶＬ）として示されている）。また、抗体分子の可変ドメインをクローニングし、そして、それぞれの抗体断片を組み換えで産生するこの方法論は、当業者に周知である（例えば、Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141, 79-84、又はSkerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr Opin Immunol. 5, 256-562を参照）。最後に、ファージディスプレイ（例えば、Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、又はRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93に概説）、リボソームディスプレイ（Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405に概説）、又はｍＲＮＡディスプレイ（Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755に報告）等の周知の進化的方法によって、図２の実施例のように、ＣＤ３又はＣＤ２８等の所与の標的に対して抗体様特性を有する人工結合分子の抗体分子を作製することも可能である。図２に示す実施例の場合、多量体化試薬（４）は、２つの異なる結合部位Ｚ１（４２）及びＺ２（４４）を有する。ストレプトアビジン結合ペプチドである結合パートナーＣ１（６ａ）を用いると、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１（４２）は、ストレプトアビジンペプチド（６ａ）が可逆的に結合する好適なストレプトアビジンムテインによって提供される。結合Ｃ２はカルモジュリン結合ペプチドであるので、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２（４４）は、多量体カルモジュリンによって提供される。多量体化試薬（４）は、単一の分子、例えば、多量体カルモジュリンとストレプトアビジンとのコンジュゲートであってもよく（この代替例は、通常、可溶性多量体化の場合��用いられる）、又は２つの独立分子からなっていてもよい。後者の選択肢は、図２に示す通り多量体化試薬（４４）が固体支持体上に固定化されているときに好ましい。この場合、ストレプトアビジンムテイン及びカルモジュリンの混合物を、例えば、結合部位Ｚ１及びＺ２に対して１：１のモル比で、固体支持体上にコーティング（固定化）してよい。この状況では、固体支持体の表面上にカルモジュリンが固定化されたことにより、上に説明したように多量体カルモジュリンを調製する必要はないが、カルモジュリンの表面への固定化は、カルモジュリン（上述の通り、細胞集団（２）の結合を確実にするのに十分に高い密度で、カルモジュリン結合ペプチドのための単一の結合部位のみを有する）を提示するのに十分であることに留意する。例えば、この場合、ＣＤ２８に対する２つの結合部位を有する二価抗体断片、又はそれ自体２つの同一の結合部位を有するインタクトな抗体を、第２の試薬（８）として用いることができる。図２ｂに示す通り、Ｔ細胞集団（２）と多量体化試薬（４）とを接触させ、そして、通常、該細胞集団を該多量体化試薬（４）と共にインキュベートした後、該Ｔ細胞の集団（２）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）を介して多量体化試薬と複合体を形成する／結合する。第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８に特異的に結合して、Ｔ細胞の増殖／拡大を誘導する。図２ｃに示す通り、（通常、所望の細胞集団を拡大させるのに好適な期間にわたって実施される）インキュベート後、第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。同様に、第２の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ２との間の結合を、それぞれの可逆的結合を分離させることによって分離する。第１の剤（６）の結合パートナーＣ１（６ａ）と結合部位Ｚ１との間の可逆的結合は、ビオチン（遊離型の第１のパートナーのアナログ（２０）として作用する）によって分離させることができ、一方、第１の剤（８）の結合パートナーＣ２（８ａ）と結合部位Ｚ２との間の可逆的結合は、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ（遊離型の第２のパートナーのアナログ（２０）として作用する）等の金属キレート剤（カルシウムキレート剤）を添加することによって分離させることができるが、その理由は、カルモジュリン結合ペプチドに対するカルモジュリンの結合が、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性であるためである）。これは、無論、細胞集団（２）の接触がＣａ２＋含有バッファ中で実施されることを意味する。図２ｄに示す通り、第１の遊離型パートナー及び第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）の添加によって、それぞれ、多量体化試薬（４）から結合パートナーＣ１（６ａ）及びＣ２（８ａ）が置き換えられ、ひいては、多量体化試薬（４）から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が置き換えられる。次に、この第１の剤（６）及び第２の剤（８）の置き換えによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びアクセサリ分子ＣＤ２８から第１の剤（６）及び第２の剤（８）が解離し、それによって、細胞集団（２）の刺��／拡大が終了する。したがって、上記の通り、本発明は、Ｔ細胞集団の刺激又は拡大の期間を正確に制御することができるので、Ｔ細胞集団の機能状態も厳密に制御することができるという利点を提供する。図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、そして、重要なことに、初期サンプルが、例えば、フィコール勾配から得られたＰＭＢＣの形態のリンパ球の集団であった場合、Ｔ細胞集団（２）は、本明細書に定義する通り、連続拡大のために利用可能である。（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８を介する初期刺激によって）拡大された細胞集団は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、人工Ｔ細胞受容体として知られている）を拡大中にトランスフェクトすることができるので、次いで、遺伝的に改変された細胞を、初期刺激から解放することができ、そして、次いで、例えば、デノボ導入された受容体を介して、第２の種類の刺激で刺激することができる。これら第２の刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然リガンド）、又は（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体等）の形態の抗原刺激を含んでよい。したがって、この連続拡大から得られたＴ細胞集団は、養子細胞移入のために用いることができる。
【図３Ａ】図３は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。この実施例で用いられるサンプルも、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有するＴ細胞の集団（２）を含み、該細胞表面分子（３０）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）は、アクセサリ分子ＣＤ２８である。図３ａには、多量体化試薬（４）と接触した後のＴ細胞の集団（２）が示されている。また、この実施例では、第１の剤（６）としての、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、第２の剤（８）としての、アクセサリ分子としてＣＤ２８を刺激する抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片とが多量体化試薬（４）上に可逆的に固定されている（結合している）。図３の実施例に示す多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）の両方が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１（４２）を１種しか含まない。第１の剤（６）及び第２の剤（８）はいずれも、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ、８ａ）を含み、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナー（８ａ）はいずれも、多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、それぞれ、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。結合パートナーＣ１及びＣ２は、異なっていても同一であってもよい。例えば、結合パートナーＣ１は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０１）、「Strep-tag（登録商標）」）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよく、一方、結合パートナーＣ２は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０４）、「di-tag3」としても知られている）又は配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０５）、「di-tag2」としても知られている）、Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203又は米国特許第７，９８１，６３２号に記載）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。これらストレプトアビジン結合ペプチドは、全て、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。このようなストレプトアビジン結合ペプチドのうちの１つ以上を結合パートナーＣ１及びＣ２として用いる場合、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンムテインである。図３に示す通り、可溶性多量体化試薬（４）が用いられる。ストレプトアビジンムテインの場合、この可溶性多量体化試薬は、例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテイン（アナログ）のオリゴマー又はポリマーであってよい。オリゴマーは、ストレプトアビジン、アビジン、又はこれらのムテインの３つ以上の単量体を含んでよい。オリゴマー又はポリマーは、多糖によって架橋され得る。ストレプトアビジン若しくはアビジン又はストレプトアビジン若しくはアビジンのムテインのこのようなオリゴマー又はポリマーは、第１の工程において、本質的に「Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132-137」に記載の通り、カルボキシル残基を多糖、例えば、デキストランに導入することによって調製され得る。第２の工程では、ストレプトアビジン若しくはアビジン又はこれらのムテインを、従来のカルボジイミド化学を用いて、内部リジン残基及び／又は遊離Ｎ末端の一級アミノ基を介して、デキストラン骨格におけるカルボキシル基に連結させる。あるいは、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテインの架橋オリゴマー又はポリマーは、グルタルジアルデヒド等の二官能性リンカーを介して架橋させることによって、又は文献に記載されている他の方法によって得ることもできる。結合パートナーＣ１及びＣ２として、多量体化剤の同じ結合部位（４２）に結合する部分を用いることは、図３ｂに示す通り、（第１の結合パートナーＣ１の、また、第２の結合パートナーＣ２の）同じ遊離型パートナー又はそのアナログを用いて、Ｔ細胞の集団（２）の拡大を終了させ、そして、多量体化剤からこのＴ細胞の集団（２）を放出させることができるという利点を有する。図３の実施例では、ビオチン又はビオチン誘導体（イミノビオチン又はデスチオビオチン）等の第１及び第２のパートナーＣ１及びＣ２のアナログは、Ｔ細胞の集団（２）の拡大の終了及び溶出のために便利に用いることができる。図３ｃに示す通り、図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）としてのビオチンは、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、可溶性多量体化試薬（４）を用いる実施態様は、磁気ビーズ等の任意の固体支持体を避けることができるという更なる利点を有する。これは、このような磁気ビーズによる活性化Ｔ細胞の汚染のリスクがないことを意味する。また、これは、最終的な拡大されたＴ細胞集団が磁気ビーズを含まないことを保証するために更なる測定を行わなくてはならないDynabeads（登録商標）の使用等の公知の方法と比べて、ＧＭＰ標準に準拠するプロセスをはるかに容易に確立できることを意味する。更に、可溶性多量体化剤を使用することによって、活性化細胞集団（Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞も）からそれを除去するのがはるかに容易になるが、その理由は、該細胞を遠心分離によって簡単に沈降させることができ、そして、可溶性多量体化剤を含む上清を廃棄することができるためである。あるいは、可溶性多量体化剤は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号の除去カートリッジのゲル浸透マトリクス中の拡大された細胞集団から除去してもよい。固相（例えば、磁気ビーズ）が存在しないので、本発明は、また、Xuri Cell Expansion System W25及びWAVE Bioreactor 2/10 System（GE Healthcare（Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom）から入手可能）又はQuantum（登録商標）Cell Expansion System（TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA）)から入手可能）等の公知の細胞拡大システムに組み込���ことができる、細胞を拡大するための自動化閉鎖系を提供する。
【図３Ｂ】図３は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。この実施例で用いられるサンプルも、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有するＴ細胞の集団（２）を含み、該細胞表面分子（３０）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）は、アクセサリ分子ＣＤ２８である。図３ａには、多量体化試薬（４）と接触した後のＴ細胞の集団（２）が示されている。また、この実施例では、第１の剤（６）としての、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、第２の剤（８）としての、アクセサリ分子としてＣＤ２８を刺激する抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片とが多量体化試薬（４）上に可逆的に固定されている（結合している）。図３の実施例に示す多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）の両方が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１（４２）を１種しか含まない。第１の剤（６）及び第２の剤（８）はいずれも、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ、８ａ）を含み、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナー（８ａ）はいずれも、多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、それぞれ、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。結合パートナーＣ１及びＣ２は、異なっていても同一であってもよい。例えば、結合パートナーＣ１は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０１）、「Strep-tag（登録商標）」）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよく、一方、結合パートナーＣ２は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０４）、「di-tag3」としても知られている）又は配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０５）、「di-tag2」としても知られている）、Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203又は米国特許第７，９８１，６３２号に記載）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。これらストレプトアビジン結合ペプチドは、全て、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。このようなストレプトアビジン結合ペプチドのうちの１つ以上を結合パートナーＣ１及びＣ２として用いる場合、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンムテインである。図３に示す通り、可溶性多量体化試薬（４）が用いられる。ストレプトアビジンムテインの場合、この可溶性多量体化試薬は、例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテイン（アナログ）のオリゴマー又はポリマーであってよい。オリゴマーは、ストレプトアビジン、アビジン、又はこれらのムテインの３つ以上の単量体を含んでよい。オリゴマー又はポリマーは、多糖によって架橋され得る。ストレプトアビジン若しくはアビジン又はストレプトアビジン若しくはアビジンのムテインのこのようなオリゴマー又はポリマーは、第１の工程において、本質的に「Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132-137」に記載の通り、カルボキシル残基を多糖、例えば、デキストランに導入することによって調製され得る。第２の工程では、ストレプトアビジン若しくはアビジン又はこれらのムテインを、従来のカルボジイミド化学を用いて、内部リジン残基及び／又は遊離Ｎ末端の一級アミノ基を介して、デキストラン骨格におけるカルボキシル基に連結させる。あるいは、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテインの架橋オリゴマー又はポリマーは、グルタルジアルデヒド等の二官能性リンカーを介して架橋させることによって、又は文献に記載されている他の方法によって得ることもできる。結合パートナーＣ１及びＣ２として、多量体化剤の同じ結合部位（４２）に結合する部分を用いることは、図３ｂに示す通り、（第１の結合パートナーＣ１の、また、第２の結合パートナーＣ２の）同じ遊離型パートナー又はそのアナログを用いて、Ｔ細胞の集団（２）の拡大を終了させ、そして、多量体化剤からこのＴ細胞の集団（２）を放出させることができるという利点を有する。図３の実施例では、ビオチン又はビオチン誘導体（イミノビオチン又はデスチオビオチン）等の第１及び第２のパートナーＣ１及びＣ２のアナログは、Ｔ細胞の集団（２）の拡大の終了及び溶出のために便利に用いることができる。図３ｃに示す通り、図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）としてのビオチンは、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、可溶性多量体化試薬（４）を用いる実施態様は、磁気ビーズ等の任意の固体支持体を避けることができるという更なる利点を有する。これは、このような磁気ビーズによる活性化Ｔ細胞の汚染のリスクがないことを意味する。また、これは、最終的な拡大されたＴ細胞集団が磁気ビーズを含まないことを保証するために更なる測定を行わなくてはならないDynabeads（登録商標）の使用等の公知の方法と比べて、ＧＭＰ標準に準拠するプロセスをはるかに容易に確立できることを意味する。更に、可溶性多量体化剤を使用することによって、活性化細胞集団（Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞も）からそれを除去するのがはるかに容易になるが、その理由は、該細胞を遠心分離によって簡単に沈降させることができ、そして、可溶性多量体化剤を含む上清を廃棄することができるためである。あるいは、可溶性多量体化剤は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号の除去カートリッジのゲル浸透マトリクス中の拡大された細胞集団から除去してもよい。固相（例えば、磁気ビーズ）が存在しないので、本発明は、また、Xuri Cell Expansion System W25及びWAVE Bioreactor 2/10 System（GE Healthcare（Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom）から入手可能）又はQuantum（登録商標）Cell Expansion System（TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA）)から入手可能）等の公知の細胞拡大システムに組み込���ことができる、細胞を拡大するための自動化閉鎖系を提供する。
【図３Ｃ】図３は、本発明の拡大方法の更なる実施態様を示す。この実施例で用いられるサンプルも、２つの特異的細胞表面分子（３０）及び（３２）を有するＴ細胞の集団（２）を含み、該細胞表面分子（３０）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体であり、そして、細胞表面分子（３２）は、アクセサリ分子ＣＤ２８である。図３ａには、多量体化試薬（４）と接触した後のＴ細胞の集団（２）が示されている。また、この実施例では、第１の剤（６）としての、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、第２の剤（８）としての、アクセサリ分子としてＣＤ２８を刺激する抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片とが多量体化試薬（４）上に可逆的に固定されている（結合している）。図３の実施例に示す多量体化試薬（４）は、第１の剤（６）及び第２の剤（８）の両方が可逆的に結合するための結合部位Ｚ１（４２）を１種しか含まない。第１の剤（６）及び第２の剤（８）はいずれも、少なくとも１つの結合パートナーＣ１（６ａ、８ａ）を含み、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナー（８ａ）はいずれも、多量体化試薬の結合部位Ｚ１（４４）に可逆的に結合することができる。したがって、固定化のために、第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、それぞれ、結合パートナーＣ１（６ａ）及び結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ１（４２）との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬（４）に結合する。結合パートナーＣ１及びＣ２は、異なっていても同一であってもよい。例えば、結合パートナーＣ１は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０１）、「Strep-tag（登録商標）」）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよく、一方、結合パートナーＣ２は、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０４）、「di-tag3」としても知られている）又は配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（（配列番号０５）、「di-tag2」としても知られている）、Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203又は米国特許第７，９８１，６３２号に記載）のストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。これらストレプトアビジン結合ペプチドは、全て、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。このようなストレプトアビジン結合ペプチドのうちの１つ以上を結合パートナーＣ１及びＣ２として用いる場合、多量体化試薬（４）は、ストレプトアビジンムテインである。図３に示す通り、可溶性多量体化試薬（４）が用いられる。ストレプトアビジンムテインの場合、この可溶性多量体化試薬は、例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテイン（アナログ）のオリゴマー又はポリマーであってよい。オリゴマーは、ストレプトアビジン、アビジン、又はこれらのムテインの３つ以上の単量体を含んでよい。オリゴマー又はポリマーは、多糖によって架橋され得る。ストレプトアビジン若しくはアビジン又はストレプトアビジン若しくはアビジンのムテインのこのようなオリゴマー又はポリマーは、第１の工程において、本質的に「Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132-137」に記載の通り、カルボキシル残基を多糖、例えば、デキストランに導入することによって調製され得る。第２の工程では、ストレプトアビジン若しくはアビジン又はこれらのムテインを、従来のカルボジイミド化学を用いて、内部リジン残基及び／又は遊離Ｎ末端の一級アミノ基を介して、デキストラン骨格におけるカルボキシル基に連結させる。あるいは、ストレプトアビジン若しくはアビジン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテインの架橋オリゴマー又はポリマーは、グルタルジアルデヒド等の二官能性リンカーを介して架橋させることによって、又は文献に記載されている他の方法によって得ることもできる。結合パートナーＣ１及びＣ２として、多量体化剤の同じ結合部位（４２）に結合する部分を用いることは、図３ｂに示す通り、（第１の結合パートナーＣ１の、また、第２の結合パートナーＣ２の）同じ遊離型パートナー又はそのアナログを用いて、Ｔ細胞の集団（２）の拡大を終了させ、そして、多量体化剤からこのＴ細胞の集団（２）を放出させることができるという利点を有する。図３の実施例では、ビオチン又はビオチン誘導体（イミノビオチン又はデスチオビオチン）等の第１及び第２のパートナーＣ１及びＣ２のアナログは、Ｔ細胞の集団（２）の拡大の終了及び溶出のために便利に用いることができる。図３ｃに示す通り、図１ｄに示す通り細胞を溶出した後、第１の剤（６）、第２の試薬（８）、並びに結合パートナーＣ１の遊離型の第１のパートナー及び結合パートナーＣ２の第２の遊離型パートナーのアナログ（２０）としてのビオチンは、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載されている「除去カートリッジ」を介して、刺激された細胞集団（２）から容易に除去することができる。更に、可溶性多量体化試薬（４）を用いる実施態様は、磁気ビーズ等の任意の固体支持体を避けることができるという更なる利点を有する。これは、このような磁気ビーズによる活性化Ｔ細胞の汚染のリスクがないことを意味する。また、これは、最終的な拡大されたＴ細胞集団が磁気ビーズを含まないことを保証するために更なる測定を行わなくてはならないDynabeads（登録商標）の使用等の公知の方法と比べて、ＧＭＰ標準に準拠するプロセスをはるかに容易に確立できることを意味する。更に、可溶性多量体化剤を使用することによって、活性化細胞集団（Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞も）からそれを除去するのがはるかに容易になるが、その理由は、該細胞を遠心分離によって簡単に沈降させることができ、そして、可溶性多量体化剤を含む上清を廃棄することができるためである。あるいは、可溶性多量体化剤は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号の除去カートリッジのゲル浸透マトリクス中の拡大された細胞集団から除去してもよい。固相（例えば、磁気ビーズ）が存在しないので、本発明は、また、Xuri Cell Expansion System W25及びWAVE Bioreactor 2/10 System（GE Healthcare（Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom）から入手可能）又はQuantum（登録商標）Cell Expansion System（TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA）)から入手可能）等の公知の細胞拡大システムに組み込���ことができる、細胞を拡大するための自動化閉鎖系を提供する。
【図４Ａ】図４は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin（登録商標）でコーティングされたビーズ上に可逆的に固定化されたαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図４Ａは、刺激された細胞のサイズ分布（前方散乱）を示すヒストグラムであり、図４Ｂは、図４Ｂ上に示されている細胞分裂当たりの細胞数に従って増殖の程度を示すヒストグラムであり（０は、分裂していない細胞を表し；５は、少なくとも５回分裂した細胞を表す）、そして、図４Ｃは、４日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図４Ｂ】図４は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin（登録商標）でコーティングされたビーズ上に可逆的に固定化されたαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図４Ａは、刺激された細胞のサイズ分布（前方散乱）を示すヒストグラムであり、図４Ｂは、図４Ｂ上に示されている細胞分裂当たりの細胞数に従って増殖の程度を示すヒストグラムであり（０は、分裂していない細胞を表し；５は、少なくとも５回分裂した細胞を表す）、そして、図４Ｃは、４日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図４Ｃ】図４は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin（登録商標）でコーティングされたビーズ上に可逆的に固定化されたαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図４Ａは、刺激された細胞のサイズ分布（前方散乱）を示すヒストグラムであり、図４Ｂは、図４Ｂ上に示されている細胞分裂当たりの細胞数に従って増殖の程度を示すヒストグラムであり（０は、分裂していない細胞を表し；５は、少なくとも５回分裂した細胞を表す）、そして、図４Ｃは、４日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図５Ａ】図５は、αＣＤ３抗体ＯＫＴ３、又はStrep-tactin（登録商標）で多量体化されたＯＫＴ３のＦａｂ断片（本明細書ではＦａｂ多量体とも称する）のいずれかで標識されたJurkat細胞における細胞内カルシウム動員差異の結果を示す。図５Ａ：Jurkat細胞にカルシウム感受性色素Indo-1-AMをロードし、そして、予めＤ−ビオチンで分離させた又はさせていない（それぞれ、濃い灰色の三角形及び薄い灰色の円）αＣＤ３ｍＡｂ（黒四角）又はαＣＤ３  ＯＫＴ３Ｆａｂ多量体（親細胞株ＯＫＴ３に由来）を注入することによってカルシウム放出をトリガーし、ＰＢＳの注入と比較した（白色の倒立三角形）。イオノマイシンの適用は、ポジティブコントロールとして機能した。細胞内Ｃａ２＋濃度の時間分解変化を、ＦＬ６／ＦＬ７比の変化に基づいてフローサイトメトリーによってモニタリングした。図５Ｂ：Indo-1-AMで標識されたJurkat細胞を、図４ａに記載の通り様々なαＣＤ３刺激によって活性化し（ＯＫＴ３：上のグラフ及びαＣＤ３Ｆａｂ多量体：中央のグラフ）、次いで、αＣＤ３Ｆａｂ多量体のシグナル伝達をＤ−ビオチンが媒介して崩壊させた（ｔ＝１４０ｓ）。ＰＢＳの注入（下のグラフ）及びイオノマイシンは、ネガティブコントロール又はポジティブコントロールとして機能した。データは、３つの異なる実験の代表的なものである。
【図５Ｂ】図５は、αＣＤ３抗体ＯＫＴ３、又はStrep-tactin（登録商標）で多量体化されたＯＫＴ３のＦａｂ断片（本明細書ではＦａｂ多量体とも称する）のいずれかで標識されたJurkat細胞における細胞内カルシウム動員差異の結果を示す。図５Ａ：Jurkat細胞にカルシウム感受性色素Indo-1-AMをロードし、そして、予めＤ−ビオチンで分離させた又はさせていない（それぞれ、濃い灰色の三角形及び薄い灰色の円）αＣＤ３ｍＡｂ（黒四角）又はαＣＤ３  ＯＫＴ３Ｆａｂ多量体（親細胞株ＯＫＴ３に由来）を注入することによってカルシウム放出をトリガーし、ＰＢＳの注入と比較した（白色の倒立三角形）。イオノマイシンの適用は、ポジティブコントロールとして機能した。細胞内Ｃａ２＋濃度の時間分解変化を、ＦＬ６／ＦＬ７比の変化に基づいてフローサイトメトリーによってモニタリングした。図５Ｂ：Indo-1-AMで標識されたJurkat細胞を、図４ａに記載の通り様々なαＣＤ３刺激によって活性化し（ＯＫＴ３：上のグラフ及びαＣＤ３Ｆａｂ多量体：中央のグラフ）、次いで、αＣＤ３Ｆａｂ多量体のシグナル伝達をＤ−ビオチンが媒介して崩壊させた（ｔ＝１４０ｓ）。ＰＢＳの注入（下のグラフ）及びイオノマイシンは、ネガティブコントロール又はポジティブコントロールとして機能した。データは、３つの異なる実験の代表的なものである。
【図６】図６は、抗ＣＤ３  ＯＫＴ３Ｆａｂ多量体による細胞の可逆的染色の結果を示す。新たに単離したＰＢＭＣを、モノクローナル抗体（左のドットプロット、Ｆａｂ多量体の親クローン）又は同族のＰＥで標識されたＦａｂ多量体のいずれかで染色し、そして、Ｄ−ビオチンで処理する前（左から２番目の列）又は後（中央の列）に分析した。次いで、新たなＰＥで標識されたStrep-Tactin（登録商標）を用いた後続の洗浄工程後、残りのＦａｂ単量体を検出した（右から２番目の列）。可逆的に染色された細胞の二次Ｆａｂ多量体染色は、コントロールとして機能した（右の列）。生存（ＰＩ陰性）細胞のみを示す。ドットプロットにおける数字は、ゲート内の細胞の百分率を示す。
【図７】図７は、蛍光標識としてフィコエリトリンで標識されたStrep-Tactin（登録商標）で多量体化された抗ＣＤ２８Ｆａｂ断片の可逆的結合による細胞の単離を示す。国際公開公報第２０１３／０１１０１１号に記載の通り、新たに単離したＰＭＢＣからＦａｂ多量体磁気細胞選択によってＣＤ２８＋細胞を選択／単離した。選択前に、同族蛍光ａＣＤ２８多量体（左のドットプロット）又は免疫グロブリンカッパ軽鎖に対する抗体（左から２番目のドットプロット、α−ＩｇカッパｍＡｂ）のいずれかで細胞をコントロール染色した。選択後、細胞をＤ−ビオチンで処理し、次いで、洗浄して、磁気ビーズ及びＦａｂ単量体を除去した。次いで、遊離したＣＤ２８＋細胞を、ＣＤ２８Ｆａｂ多量体（右から２番目のドットプロット）又はα−ＩｇカッパｍＡｂ（右のドットプロット）のいずれかで（再）染色して、残存している可能性のあるＦａｂ単量体を検出した。生存（ＰＩ陰性）ＣＤ３＋細胞のみを示す。ドットプロットにおける数字は、ゲート内の細胞の百分率を示す。
【図８−１】図８は、可溶性多量体化試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化された可逆的αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図８に結果を示す実験では、３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を２μM カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、そして、様々な量の、いずれも重鎖にストレプトアビジン結合ペプチドとしてStrep-tagを有するαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂの組み合わせが固定化された可溶性Streptactinオリゴマーの調製品で刺激した。（「１×」は、αＣＤ３Ｆａｂ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで官能化した多量体化Strep-tactin ３μgに対応し；数字は、「１×」の倍数を示す）。Ｔｒｅｓｐ細胞は、刺激されないままであったか、又はネガティブコントロールとして機能するブランクStrep-tactin多量体（Ｆａｂ無し）で刺激した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の２０U/mL インターロイキン２（ＩＬ−２）を添加した細胞培養培地 １mLに、３００．０００個のＣＤ３陰性自己フィーダー細胞（３０Gyで照射）と共にデュープリケートで播種した。培地を交換することなく細胞を３７℃でインキュベートし、そして、ＦＡＣＳ分析によって５日間後のＣＦＳＥ希釈度に従って増殖を分析した（図８Ｂ）。図８Ａは、５日間培養した後の細胞のサイズ分布を示す。ヒストグラムは、生存ＣＤ３＋細胞を示し、一方、図８Ｃは、１mM Ｄ−ビオチンで処理し、そして、洗浄した後、刺激試薬によって遊離させた培養後の細胞を示す。蛍光標識としてのフィコエリトリン標識Strep-Tactin（登録商標）（ＳＴ−ＰＥ）で再染色することによって単量体Ｆａｂ断片の解離及び除去を分析し、そして、代表的なヒストグラムを示す。図８Ｄは、ノイバウアー計数チャンバを用いて計数し、そして、それぞれの刺激条件に対してプロットした５日間後の生存（トリパンブルー陰性）細胞の絶対数を示す。中央細胞数を図８Ｄに示し；エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を示す。図８Ｅは、５日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図８−２】図８は、可溶性多量体化試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化された可逆的αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図８に結果を示す実験では、３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を２μM カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、そして、様々な量の、いずれも重鎖にストレプトアビジン結合ペプチドとしてStrep-tagを有するαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂの組み合わせが固定化された可溶性Streptactinオリゴマーの調製品で刺激した。（「１×」は、αＣＤ３Ｆａｂ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで官能化した多量体化Strep-tactin ３μgに対応し；数字は、「１×」の倍数を示す）。Ｔｒｅｓｐ細胞は、刺激されないままであったか、又はネガティブコントロールとして機能するブランクStrep-tactin多量体（Ｆａｂ無し）で刺激した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の２０U/mL インターロイキン２（ＩＬ−２）を添加した細胞培養培地 １mLに、３００．０００個のＣＤ３陰性自己フィーダー細胞（３０Gyで照射）と共にデュープリケートで播種した。培地を交換することなく細胞を３７℃でインキュベートし、そして、ＦＡＣＳ分析によって５日間後のＣＦＳＥ希釈度に従って増殖を分析した（図８Ｂ）。図８Ａは、５日間培養した後の細胞のサイズ分布を示す。ヒストグラムは、生存ＣＤ３＋細胞を示し、一方、図８Ｃは、１mM Ｄ−ビオチンで処理し、そして、洗浄した後、刺激試薬によって遊離させた培養後の細胞を示す。蛍光標識としてのフィコエリトリン標識Strep-Tactin（登録商標）（ＳＴ−ＰＥ）で再染色することによって単量体Ｆａｂ断片の解離及び除去を分析し、そして、代表的なヒストグラムを示す。図８Ｄは、ノイバウアー計数チャンバを用いて計数し、そして、それぞれの刺激条件に対してプロットした５日間後の生存（トリパンブルー陰性）細胞の絶対数を示す。中央細胞数を図８Ｄに示し；エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を示す。図８Ｅは、５日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図８−３】図８は、可溶性多量体化試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化された可逆的αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後に、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を増殖させた実験の結果を示す。図８に結果を示す実験では、３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を２μM カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、そして、様々な量の、いずれも重鎖にストレプトアビジン結合ペプチドとしてStrep-tagを有するαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂの組み合わせが固定化された可溶性Streptactinオリゴマーの調製品で刺激した。（「１×」は、αＣＤ３Ｆａｂ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで官能化した多量体化Strep-tactin ３μgに対応し；数字は、「１×」の倍数を示す）。Ｔｒｅｓｐ細胞は、刺激されないままであったか、又はネガティブコントロールとして機能するブランクStrep-tactin多量体（Ｆａｂ無し）で刺激した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の２０U/mL インターロイキン２（ＩＬ−２）を添加した細胞培養培地 １mLに、３００．０００個のＣＤ３陰性自己フィーダー細胞（３０Gyで照射）と共にデュープリケートで播種した。培地を交換することなく細胞を３７℃でインキュベートし、そして、ＦＡＣＳ分析によって５日間後のＣＦＳＥ希釈度に従って増殖を分析した（図８Ｂ）。図８Ａは、５日間培養した後の細胞のサイズ分布を示す。ヒストグラムは、生存ＣＤ３＋細胞を示し、一方、図８Ｃは、１mM Ｄ−ビオチンで処理し、そして、洗浄した後、刺激試薬によって遊離させた培養後の細胞を示す。蛍光標識としてのフィコエリトリン標識Strep-Tactin（登録商標）（ＳＴ−ＰＥ）で再染色することによって単量体Ｆａｂ断片の解離及び除去を分析し、そして、代表的なヒストグラムを示す。図８Ｄは、ノイバウアー計数チャンバを用いて計数し、そして、それぞれの刺激条件に対してプロットした５日間後の生存（トリパンブルー陰性）細胞の絶対数を示す。中央細胞数を図８Ｄに示し；エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を示す。図８Ｅは、５日間刺激した後の培養皿の写真を示す。
【図９】図９は、本発明の連続拡大方法の説明を示し（図９ａ）、一方、図９ｂは、連続拡大の幾つかの特徴及び利点を簡潔に記載する。
【図１０】図１０は、本発明の拡大方法と共に用いることができる本発明の配置を示す。この配置（１００）は、バイオリアクタ（５０）、第１の「除去カートリッジ」（７０）、及び第２の「除去カートリッジ」（９０）を含む。バイオリアクタ（５０）は、第１の除去カートリッジに流体接続しており、そして、第１の除去カートリッジは、第２の除去カートリッジ（９０）に流体接続している。この配置（１００）は、本明細書に記載の通りの細胞を自動的に拡大及び精製するための装置の一部であってよい。  バイオリアクタ（５０）では、本明細書に記載する拡大方法、例えば、可溶性多量体化試薬を利用する図３に示した拡大方法が実施される。この場合、競合体（２０）（結合パートナーＣ１の遊離型パートナー又はそのアナログ）を添加することによって細胞集団（２）の活性化／拡大を終了させた後、バイオリアクタから放出される反応混合物は、拡大された細胞の集団（２）、第１の剤（６）、第２の剤（８）、及び可溶性多量体化試薬（４）を含有する。この実施例では、第１の剤（６）は、結合パートナーＣ１としてストレプトアビジン結合ペプチドを含むＣＤ３結合抗体断片であり、第２の剤（８）は、結合パートナーＣ１としてストレプトアビジン結合ペプチドを含むＣＤ２８結合抗体断片であり、そして、競合体（２０）（結合パートナーＣ１の遊離アナログ）は、ビオチンである。この反応混合物が、第１の除去カートリッジ（７０）に適用される。この第１の除去カートリッジ（７０）は、好適な固定相を有するクロマトグラフィーカラムを含む、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の除去カートリッジである。該固定相は、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスとして機能し得ると同時に、ゲル浸透マトリクスとしても作用し得る。このアフィニティークロマトグラフィーマトリクス上には、アフィニティー試薬が固定化されている。該アフィニティー試薬は、本実施例の場合、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、又はこれらの混合物であってよい。したがって、第１の剤（６）及び第２の剤（８）は、これらのストレプトアビジン結合ペプチドを介してアフィニティー試薬に結合する。また、競合体（２０）としてのビオチンも、アフィニティー試薬に結合する。したがって、これら３つの試薬は全て、第１の除去カートリッジのクロマトグラフィーマトリクス上に固定化されているが、拡大された細胞集団（２）及び可溶性多量体化試薬（４）は、固定相を通過する。次いで、この「フロースルー」を第２の除去カートリッジ（９０）に適用する。また、この第２の除去カートリッジ（９０）も固定相を含む。この固定相上には、多量体化試薬（４）の結合部位Ｚ１（４２）に結合することができる第２のアフィニティー試薬が含まれる。このアフィニティー試薬は、例えば、該固定相に共有結合しているビオチンであってよい。このような固定相は、例えば、Affiland S.A.（Ans-Liege, Belgium）から入手可能なd-biotin Sepharose（商標）であってよい。したがって、可溶性多量体化試薬（４）は、第２の除去カートリッジ（９０）の固定相に結合する（保持される）が、拡大された細胞の集団（２）は、該固定相を通過し、そして、反応物質を全く含まない。細胞の集団（２）は、ここで、任意の更なる使用、例えば、診断用途（例えば、更なるＦＡＣＳ（商標）選別）又は任意の細胞に基づく治療用途のための状態にある。無論、配置（１００）における第１の「除去カートリッジ」（７０）及び第２の「除去カートリッジ」（９０）の順序を変更することも可能であり、その結果、バイオリアクタ（５０）は、第２の除去カートリッジ（９０）に（直接）流体接続され、そして、第１の除去カートリッジ（７０）は、その後に配置され、そして、第２の除去カートリッジ（９０）に流体接続されることに留意する。この配置では、まず多量体化試薬（４）が細胞の集団（２）から除去され、次いで、第１の剤（６）、第２（８）、及び例えば、競合体（２０）が除去される。このような配置も本発明に包含され、そして、本明細書に記載の通りの自動的に細胞を拡大及び精製するための装置の一部であってもよい。
【図１１】図１１は、本発明の拡大方法と共に用いることができる本発明の配置の更なる実施態様を示す。この配置（１１０）は、バイオリアクタ（５０）、第１の「除去カートリッジ」（７０）、及び第２の「除去カートリッジ」（９０）を含む。バイオリアクタ（５０）は、第１の除去カートリッジ（７０）に流体接続しており、そして、第１の除去カートリッジは、第２の除去カートリッジ（９０）に流体接続している。更に、第２の除去カートリッジ（１１０）は、バイオリアクタ（５０）に流体接続している。また、この配置（１１０）は、本明細書に記載の通りの自動的に細胞を拡大及び精製するための装置の一部であってよい。例えば、可溶性多量体化試薬（４）を使用する拡大方法と共に用いられる場合、精製され、拡大された細胞の集団（２）は、第２の除去カートリッジ（９０）の溶出液として得られる。除去カートリッジ（９０）はバイオリアクタ（５０）に流体接続しているので、細胞の集団（２）は、例えば、Ｔ細胞受容体の遺伝子を該細胞の集団にトランスフェクトし、次いで、本発明の拡大方法を用いて更に（第２の）拡大させることによって、例えば、上記の通り連続クローン拡大のためにバイオリアクタ（５０）に戻してもよい。
【図１２】図１２は、本発明の拡大方法と共に用いることができる本発明の配置の更なる実施態様を示す。この配置（１２０）は、バイオリアクタ（５０）、第１の「除去カートリッジ」（７０）、及び第２の「除去カートリッジ」（９０）を含む。バイオリアクタ（５０）は、第１の除去カートリッジ（７０）に流体接続しており、そして、第１の除去カートリッジは、第２の除去カートリッジ（９０）に流体接続している。図１１に示す実施態様と同様に、第２の除去カートリッジ（１１０）は、バイオリアクタ（５０）に流体接続している。しかし、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の「選択カートリッジ」（９２）が、第２の除去カートリッジ（９０）とバイオリアクタ（５０）との間に配置される。したがって、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の通り、この「選択カートリッジ」（９２）を介して、細胞の集団（２）に含まれる細胞の亜集団（２ａ）を選択／濃縮することができる。この細胞の亜集団（２ａ）は、例えば、本明細書に記載の通り連続拡大させるために、バイオリアクタ（５０）に移してもよい。あるいは（図示しないが）、この細胞の亜集団（２ａ）を細胞に基づく療法のために用いてもよい。本明細書に記載する可溶性多量体化試薬の使用によって、機能的に閉鎖されているので汚染されにくい、自動的に細胞を精製及び拡大する装置を設計することが可能になることにも同様に留意する。更に、可溶性多量体化試薬は、磁気ビーズ等の固相物質の必要性をなくすので、このような細胞精製装置を連続流動装置として設計することもできる。
【図１３】図１３は、可溶性多量体化試薬として作用する２種類の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）ムテイン上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片又はαＣＤ３／αＣＤ２８／αＣＤ８のいずれかでインビトロにおいて刺激された精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖の拡大動態を示す。第１の種類のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）は、実施例５で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分（本明細書では「従来のStreptactin（登録商標）骨格」とも称する、図１３では先端が下を向いている三角形記号によって示される）であり、可溶性多量体化試薬として用いた第２の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインとビオチン化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とを反応させることによって得られたオリゴマーであった。このＨＳＡに基づく可溶性多量体化試薬は、本明細書では「大きなStreptactin（登録商標）骨格」とも称する。図１３の実験では、培地を交換することなく拡大を実施した。ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１３Ａに示し、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１３Ｂに示す。この状況では、第１の剤、並びに任意で第２及び第３の剤に可逆的に結合することによって機能化された、実験で用いた可溶性多量体化試薬を、図面では「Streptamer（登録商標）多量体」と称することに留意する。
【図１４】図１４は、可溶性多量体化試薬として作用する２種類の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）で可逆的に固定化された、可逆的に固定化された断片であるαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激された精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖の拡大動態を示す。第１の種類のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）は、実施例５で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分（本明細書では「従来のStreptactin（登録商標）骨格」とも称される、図１４では先端が上を向いている三角形記号によって示される）であり、可溶性多量体化試薬として用いた第２の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、上述のＨＳＡに基づく可溶性多量体化剤（「大きなStreptactin（登録商標）骨格」）であった。図１４の実験では、培地を交換して拡大を実施した。ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１４に示し、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１４Ｂに示す。
【図１５】図１５は、精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の増殖の拡大動態について、図１３及び１４で得られた結果の統合データを示し、図１５Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞についての結果を示し、そして、図１５Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を示す。３日目に培地を交換した培養については直線を用い、一方、破線は、３日目に培地を交換しなかった場合の拡大の程度について得られた値を示す。図１５に示すデータを入力細胞数に対して正規化する。オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）で刺激したＴｒｅｓｐ、市販されているDynabeadsで刺激したＴｒｅｓｐ（ポジティブコントロール）、及び刺激されていないＴ細胞（ネガティブコントロール）についてのデータのみを示し、「大きなStreptactin（登録商標）骨格」を有する多量体化試薬についてのデータは示さない。
【図１６】図１６は、実施例５に記載の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の活性化後のＴ細胞の早期クラスタ形成を示す。図１６Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞についての結果を示し、そして、図１６Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を示す。可溶性多量体化試薬（オリゴマーストレプトアビジンムテイン）で刺激したＴｒｅｓｐ、市販されているDynabeadsで刺激したＴｒｅｓｐ（ポジティブコントロール）、及び刺激されていないＴ細胞（ネガティブコントロール）についてのデータを示す。
【図１７−１】図１７は、実施例５に記載の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいてポリクローナルに刺激したＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）（ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｃｍ）の拡大動態及び表現型を示す。図１７に示すグラフは、時点毎に採取した細胞数に従って増殖の程度を示し、図１７Ａは、ＩＬ−２のみを添加した培地における増殖を示し、そして、図１７Ｂは、ＩＬ−２及びＩＬ−１５を添加した培地における増殖を示す。図１７Ｃは、これら可変サイトカイン環境において１４日間培養した後のＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１７−２】図１７は、実施例５に記載の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいてポリクローナルに刺激したＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）（ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｃｍ）の拡大動態及び表現型を示す。図１７に示すグラフは、時点毎に採取した細胞数に従って増殖の程度を示し、図１７Ａは、ＩＬ−２のみを添加した培地における増殖を示し、そして、図１７Ｂは、ＩＬ−２及びＩＬ−１５を添加した培地における増殖を示す。図１７Ｃは、これら可変サイトカイン環境において１４日間培養した後のＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１８−１】図１８は、ペプチド：ＭＨＣ分子複合体（細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤として作用）及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片（細胞の表面上のアクセサリ分子に結合する第２の剤として作用）の両方でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞のバルク集団からの選択的抗原特異的（Ａｇ特異的）拡大の動態を示し、そして、刺激されていないＴ細胞（ネガティブコントロール）が示される。抗原特異的ペプチドとＭＨＣ分子との複合体及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片はいずれも、実施例５に記載のものと同じ可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されていた。図１８Ａにおいて抗原特異的拡大のために用いたペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なHLA-C7/IE-1エピトープを表すHLA-C702  ＭＨＣ分子（Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, e1003383に記載）によって制限される前初期１タンパク質のアミノ酸３０９〜３１７である、ペプチドCRVLCCYVL（配列番号０６）であった。このペプチドを提示するＭＨＣ  Ｉ分子は、重鎖のＣ末端に、ストレプトアビジン結合ペプチド（IBA GmbH, Gottingen, Germanyから「Twin-Strep-tag（登録商標）」として市販されているSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７））を有する。図１８Ａは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、このHLA-C7/IE-1エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の画分についての例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図１８Ｂ〜図１８Ｅにおけるグラフは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、抗原特異的ペプチドとＭＨＣ  Ｉ分子との異なる複合体を用いて、図１８Ａと同様に、時点毎に採取した特異的ペプチド：ＭＨＣＩ多量体陽性細胞の数に従って更なるＡｇ特異性の拡大動態を示す。より詳細には、図１８Ｂは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-A2402によって制限されるアミノ酸３４１〜３５０（QYDPVAALF（配列番号０８））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｃは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸２６５〜２７４（RPHERNGFTV（配列番号０９））に特異的な別のペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｄは、アデノウイルスのhexon5エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸１１４〜１２４（CPYSGTAYNSL（配列番号１０））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｅは、ＣＭＶのHLA-B7/IE-1309-317エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示す（例示的なＦＡＣＳデータについては、上記図１８Ａを参照）。Twin Strep（登録商標）-Tagを有するペプチド：ＭＨＣ分子は全て、IbaGmbHから市販されている。この状況では、Ｃ末端として「Twin-Strep-tag（登録商標）」を有するHLA-A*2402分子、HLA-B*0702分子、及びHLA-C*0702分子のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２１、２２、及び２���として示し、一方、β２マイクログロブリン（α鎖、すなわち、ＨＬＡをコードする分子と共に、それぞれのＭＨＣ  Ｉ分子を形成する）のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２４として示す。更に、図１８Ｆは、図１８ＤからHLA-B7/Hexon5114-124で刺激／拡大された細胞について、１４日間培養した後のＣ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。
【図１８−２】図１８は、ペプチド：ＭＨＣ分子複合体（細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤として作用）及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片（細胞の表面上のアクセサリ分子に結合する第２の剤として作用）の両方でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞のバルク集団からの選択的抗原特異的（Ａｇ特異的）拡大の動態を示し、そして、刺激されていないＴ細胞（ネガティブコントロール）が示される。抗原特異的ペプチドとＭＨＣ分子との複合体及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片はいずれも、実施例５に記載のものと同じ可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されていた。図１８Ａにおいて抗原特異的拡大のために用いたペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なHLA-C7/IE-1エピトープを表すHLA-C702  ＭＨＣ分子（Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, e1003383に記載）によって制限される前初期１タンパク質のアミノ酸３０９〜３１７である、ペプチドCRVLCCYVL（配列番号０６）であった。このペプチドを提示するＭＨＣ  Ｉ分子は、重鎖のＣ末端に、ストレプトアビジン結合ペプチド（IBA GmbH, Gottingen, Germanyから「Twin-Strep-tag（登録商標）」として市販されているSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７））を有する。図１８Ａは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、このHLA-C7/IE-1エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の画分についての例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図１８Ｂ〜図１８Ｅにおけるグラフは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、抗原特異的ペプチドとＭＨＣ  Ｉ分子との異なる複合体を用いて、図１８Ａと同様に、時点毎に採取した特異的ペプチド：ＭＨＣＩ多量体陽性細胞の数に従って更なるＡｇ特異性の拡大動態を示す。より詳細には、図１８Ｂは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-A2402によって制限されるアミノ酸３４１〜３５０（QYDPVAALF（配列番号０８））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｃは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸２６５〜２７４（RPHERNGFTV（配列番号０９））に特異的な別のペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｄは、アデノウイルスのhexon5エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸１１４〜１２４（CPYSGTAYNSL（配列番号１０））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｅは、ＣＭＶのHLA-B7/IE-1309-317エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示す（例示的なＦＡＣＳデータについては、上記図１８Ａを参照）。Twin Strep（登録商標）-Tagを有するペプチド：ＭＨＣ分子は全て、IbaGmbHから市販されている。この状況では、Ｃ末端として「Twin-Strep-tag（登録商標）」を有するHLA-A*2402分子、HLA-B*0702分子、及びHLA-C*0702分子のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２１、２２、及び２���として示し、一方、β２マイクログロブリン（α鎖、すなわち、ＨＬＡをコードする分子と共に、それぞれのＭＨＣ  Ｉ分子を形成する）のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２４として示す。更に、図１８Ｆは、図１８ＤからHLA-B7/Hexon5114-124で刺激／拡大された細胞について、１４日間培養した後のＣ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。
【図１８−３】図１８は、ペプチド：ＭＨＣ分子複合体（細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤として作用）及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片（細胞の表面上のアクセサリ分子に結合する第２の剤として作用）の両方でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞のバルク集団からの選択的抗原特異的（Ａｇ特異的）拡大の動態を示し、そして、刺激されていないＴ細胞（ネガティブコントロール）が示される。抗原特異的ペプチドとＭＨＣ分子との複合体及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片はいずれも、実施例５に記載のものと同じ可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されていた。図１８Ａにおいて抗原特異的拡大のために用いたペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なHLA-C7/IE-1エピトープを表すHLA-C702  ＭＨＣ分子（Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, e1003383に記載）によって制限される前初期１タンパク質のアミノ酸３０９〜３１７である、ペプチドCRVLCCYVL（配列番号０６）であった。このペプチドを提示するＭＨＣ  Ｉ分子は、重鎖のＣ末端に、ストレプトアビジン結合ペプチド（IBA GmbH, Gottingen, Germanyから「Twin-Strep-tag（登録商標）」として市販されているSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７））を有する。図１８Ａは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、このHLA-C7/IE-1エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の画分についての例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図１８Ｂ〜図１８Ｅにおけるグラフは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されている細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としての、抗原特異的ペプチドとＭＨＣ  Ｉ分子との異なる複合体を用いて、図１８Ａと同様に、時点毎に採取した特異的ペプチド：ＭＨＣＩ多量体陽性細胞の数に従って更なるＡｇ特異性の拡大動態を示す。より詳細には、図１８Ｂは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-A2402によって制限されるアミノ酸３４１〜３５０（QYDPVAALF（配列番号０８））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｃは、ＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸２６５〜２７４（RPHERNGFTV（配列番号０９））に特異的な別のペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて拡大したＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｄは、アデノウイルスのhexon5エピトープ（HLA-B702によって制限されるアミノ酸１１４〜１２４（CPYSGTAYNSL（配列番号１０））に特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示し、図１８Ｅは、ＣＭＶのHLA-B7/IE-1309-317エピトープに特異的なペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体を用いて増殖させたＡｇ特異的細胞の拡大を示す（例示的なＦＡＣＳデータについては、上記図１８Ａを参照）。Twin Strep（登録商標）-Tagを有するペプチド：ＭＨＣ分子は全て、IbaGmbHから市販されている。この状況では、Ｃ末端として「Twin-Strep-tag（登録商標）」を有するHLA-A*2402分子、HLA-B*0702分子、及びHLA-C*0702分子のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２１、２２、及び２���として示し、一方、β２マイクログロブリン（α鎖、すなわち、ＨＬＡをコードする分子と共に、それぞれのＭＨＣ  Ｉ分子を形成する）のアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２４として示す。更に、図１８Ｆは、図１８ＤからHLA-B7/Hexon5114-124で刺激／拡大された細胞について、１４日間培養した後のＣ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。
【図１９】図１９は、ａ）抗原特異的ペプチドＭＨＣ  Ｉ複合体及びｂ）可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に第１及び第２の剤として可逆的に固定化されたαＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞からの選択的Ａｇ特異的拡大の動態を示す。この目的のために、５００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、ストレプトアビジン結合ペプチド（特異的ペプチドは、HLA-B0702によって制限されるアデノウイルスのHexon5タンパク質のアミノ酸１１４〜１２４（CPYSGTAYNSL、配列番号１０）を表す、上記を参照）を備えるペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化されたStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μLを用いてＡｇ特異的に刺激した。代替例として、Streptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μLに、このペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードした。比較のために、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL） ３μLを用いて、ポリクローナル刺激を実施した。更に、上記刺激条件の代替例として、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactin多量体の調製品 ４．５μLを用いた。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsでポリクローナル刺激されたＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２及び５ng/mL ＩＬ−１５を添加した細胞培養培地 １mLに播種した。３日間毎に培地を交換しながら細胞を３７℃でインキュベートし、そして、７及び１４日間後に細胞数を解析した。図１９に示す写真は、アデノウイルスのHLA-B7/Hexon5エピトープについて例示するＡｇ特異的刺激について、５日目におけるクラスタ形成の程度を表す。
【図２０】図２０は、可溶性多量体化試薬として作用する２種類の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の拡大の収量及び表現型を示す。第１の種類のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）は、実施例５で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分（従来の骨格）であり、可溶性多量体化試薬として用いた第２の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、上記可溶性オリゴマーであり、そして、本明細書では「大きな」Streptactin（登録商標）骨格と称する。これら実験では、従来のオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分も、単一のＦａｂ断片（図２０Ａ及び図２０Ｂにおける３番目の棒）又はαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片の組み合わせで機能化された多量体化試薬として用いた。更に、αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片による複合刺激に対して、特定のＴ細胞亜集団を優先的に刺激することが可能であるかどうかを試験するために、更なるαＣＤ８Ｆａｂ断片（IBA GmbH, Gottingen, Germanyから市販）も固定した。図２０Ａは、ネガティブコントロール（刺激されていない精製ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞）と比較し、そして、ポジティブコントロール（市販されているDynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）で刺激した精製ＣＤ８＋Ｔレスポンダー）に対して正規化した、６日目に採取した細胞の数に従って増殖の程度を表す棒グラフを示す。図２０Ｂは、細胞培養後のＣＤ８及び（Ｔ細胞の増殖及び活性化の指標である）Ｔ細胞表面分子ＣＤ４５ＲＯの表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。一方向分散分析を用いて様々な刺激条件を比較したところ、有意差（n.s.）は検出されなかった。
【図２１】図２１は、（既に上記した通り）単一のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の組み合わせで機能化された可溶性多量体化試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の拡大の収量及び表現型を示す。これら実験では、任意で上記αＣＤ８Ｆａｂ断片と共に、様々な量のαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片で機能化された可溶性多量体化試薬（実施例５の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）（１mg/mL））でＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞を刺激した。用語「１×」は、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μgのみで機能化された多量体化Streptactin １．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgのみで機能化された多量体化Streptactin １．５μg、又はαＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたオリゴマーStreptactinの調製品 ３μL、又はstrepタグ付αＣＤ３ ０．５μg、strepタグ付αＣＤ８ ０．５μg、及びstrepタグ付αＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactin多量体の調製品 ４．５μLに相当する。したがって、用語「２×」は、αＣＤ３Ｆａｂ断片 １μgのみで機能化された多量体化Streptactin ３．０μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ １μgのみで機能化された多量体化Streptactin ３．０μgに相当する、すなわち、固定化されたαＣＤ３Ｆａｂ断片の量の２倍を用いたことを意味する。未処理Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、市販されているDynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）で刺激された精製ＣＤ８＋Ｔレスポンダーは、ポジティブコントロールとして機能した。図２１Ａは、ネガティブコントロールと比較し、そして、ポジティブコントロールに対して正規化した、５日目に採取した細胞数に従って増殖の程度を表す棒グラフを示す。図２１Ｂは、細胞培養後のＣＤ８及びＣＤ４５ＲＯの表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図２２】図２２は、αＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変され、そして、可溶性多量体化試薬として実施例５のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）を用いて刺激した、形質導入されたJurkat細胞の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を示す。ＣＡＲの特異性は、典型的には、ＣＤ１９等の標的／腫瘍関連抗原に特異的に結合し、そして、それをＴ細胞特異的シグナル伝達に関連付けるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の抗原結合領域から組み立てられたｓｃＦｖ領域に由来する（Hudecek et al, Clin Cancer Res. 2013 June 15; 19(12): 3153-3164に記載）。この実験では、αＣＤ１９ＣＡＲの天然リガンドを含有するＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に加えて、αＣＤ１９−ＣＡＲ内のＩｇＧ４スペーサーを認識するポリクローナルαＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片（ロバ抗ヒトＦ（ａｂ）２は、Jackson Immuno Researchから市販されている）を、jurkat細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤としてこの実験でも用いた。可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインへの可逆的固定化は、ＣＤ１９のＥＣＤのＣ末端に融合したストレプトアビジンペプチドSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７）によって、又はαＩｇＧのビオチン化（Ｆａｂ）２断片によって提供された（ストレプトアビジンムテイン「ｍ２」は、低い親和性でビオチンに結合するので、この結合は可逆的であり、そして、例えば、過剰の遊離型ビオチンの添加によって置き換えられ得る）。図２２Ａの対照実験では、３００．０００個のＣＤ３＋Jurkatレスポンダー細胞（Ｊｒｅｓｐ）を、様々な量の、αＣＤ３Ｆａｂ及びαＣＤ２８Ｆａｂで機能化されたオリゴマーStreptactinの調製品（１mg/mL）の混合物で刺激した（「×１」は、ａＣＤ３ＦａｂポリクローナルStreptamer多量体 ０．５μg及びａＣＤ２８ＦａｂポリクローナルStreptamer多量体 ０．５μgで機能化された多量体化Streptactin ３μgに相当する）。図２２Ｂの実験では、オリゴマーStreptactinの調製品 ３μLを、ＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ） ０．５μg（×１）若しくは１μg（×２）、又はＩｇＧ４スペーサーを認識するαＩｇＧ ０．５μg（×１）若しくは１μg（×２）をロードしたオリゴマーStreptactinの調製品 ３μL（これらはいずれも、ＣＡＲ特異的なStreptamer（登録商標）多量体である）で機能化した。Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）、又はポジティブコントロールとして機能するＰＭＡ及びイオノマイシンでＪｒｅｓｐを刺激した。Ｊｒｅｓｐ細胞を、１．５mL Eppendorfチューブ中の、３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 ２００μLに播種した。細胞を３７℃でインキュベートし、そして、０分間又は２０分間刺激した後、氷上に置き、そして、溶解させた。
【図２３】図２３は、可溶性多量体化試薬として機能する実施例５の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞の拡大を示す。１つの実験では、αＣＤ８Ｆａｂ断片も可逆的に固定化されている本発明の多量体化試薬を用いてバルクＣＤ３＋培養物内のＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団をインビトロにおいて優先的に刺激することが可能であるかどうかを試験するために、αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片に加えて、IBA GmbH, Gottingen, Germanyから市販されているαＣＤ８Ｆａｂ断片（カタログ番号6-8000-203）をストレプトアビジンムテインの可溶性オリゴマー上に固定化した。より詳細には、５００．０００個の精製ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、αＣＤ３ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたオリゴマーストレプトアビジンの調製品（１mg/mL） ３μLで刺激した。代替アプローチとして、Streptactinオリゴマー ４．５μLに上記αＣＤ３ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードした。未刺激Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）で刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能した。
【図２４】図２４は、本発明の可溶性多量体化試薬として用いることができるオリゴマーストレプトアビジンムテインを生成するための例示的なストラテジを示す。図２４Ａは、第１の工程において、「従来の骨格」を有するオリゴマーストレプトアビジンムテインを生成するために野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン「ｍ２」（ＳＡｍ２）を用いることを示す。第２の工程では、ストレプトアビジンムテインをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のビオチン化担体タンパク質とカップリングすることによって、又はストレプトアビジンムテインをＰＥＧ等の合成担体とカップリングすることによって、「大きな骨格」を有するオリゴマー可溶性ストレプトアビジンムテインを生成することができる。図２４Ｂ：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のビオチン化。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞の集団を拡大するか又はＴ細胞の集団を誘導して増殖させるための方法、キット、及び装置を提供する。
【００１９】
用語「細胞の集団」とは、本明細書で使用するとき、細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤を細胞表面受容体に結合させることによって拡大することができる全ての細胞を包含する。また、細胞の集団の拡大については、細胞の拡大に必要な共刺激シグナルを生成するために第２の剤が第２の細胞表面受容体（アクセサリ分子）に結合することが必要になり得ることも可能である。幾つかの実施態様では、細胞集団は、Ｂ細胞の集団、Ｔ細胞の集団、又はナチュラルキラー細胞の集団を含むが、これらに限定されないリンパ球の集団であってよい。細胞集団の例示的な例は、ＣＤ４０又はＣＤ１３７を有するＢ細胞である（両細胞集団は、活性化シグナルを提供する第１の剤、例えば、４−１ＢＢリガンド；又はαＣＤ４０抗体分子若しくはαＣＤ１３７抗体分子のみに結合した際に増殖することができる（例えば、Zhang et al., 2010, J Immunol, 184:787-795を参照））。Ｂ細胞を拡大するために用いることができる剤（第１又は第２のいずれか）についての他の例示的な例は、ＩｇＧ、ＣＤ１９、ＣＤ２８、又はＣＤ１４に結合する剤、例えば、αＣＤ１９、αＩｇＧ、αＣＤ２８、又はαＣＤ１４の抗体分子である。また、Ｂ細胞を拡大するための第１又は第２の剤は、toll様受容体又はインターロイキン、例えば、ＩＬ−２１のリガンドを含んでよいことも想定される（例えば、Dienz O, et al. 2009. J. Exp. Med. 206:69を参照）。Ｂ細胞のリポ多糖依存性活性化も本発明に包含されることに留意するが、その理由は、本明細書で使用するとき、リポ多糖も第１の剤として用いることができ、そして、結合パートナーＣ１を備えることができるためである。好適な細胞集団の他の例示的な例は、第１の剤がＴＣＲ／ＣＤ３に結合し、そして、第２の剤がＴ細胞上のアクセサリ分子、例えば、ＣＤ２８に結合することによって活性化した後に拡大するＴ細胞集団を含む。この場合、第１の剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激し、そして、第２の剤は、アクセサリ分子としてのＣＤ２８に結合することによって第２の刺激を提供する。Ｔ細胞を拡大するために用いることができる剤は、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はＩＬ−２１等を含んでもよい（例えば、Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8、Bazdar and Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674、Battalia et al, 2013, Immunology, 139(1):109-120を参照）。Ｔ細胞を拡大するために用いることができる剤についての他の例示的な例は、ＣＤ８、ＣＤ４５、又はＣＤ９０に結合する剤、例えば、αＣＤ８、αＣＤ４５、又はαＣＤ９０の抗体である。Ｔ細胞集団の例示的な例は、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（メモリーＴ細胞の例示的な例は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋特異的セントラルメモリーＴ細胞である）、又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇの例示的な例は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋  Ｔｒｅｇ細胞である）を含む。用語「Ｔ細胞（集団）」とは、本明細書で使用するとき、人工Ｔ細胞受容体又はキメラＴ細胞受容体としても知られているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞も含む。したがって、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞集団も、本発明の方法、試薬、及び装置を用いて拡大することができる���これに関しては、キメラＣＤ１９特異的抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するJurkat細胞を本発明の可溶性多量体化試薬を用いて刺激した実施例１５も参照されたい。好適な細胞集団の別の例示的な例は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含み、これは、例えば、ＣＤ１６又はＣＤ５６に結合する剤、例えば、αＣＤ１６又はαＣＤ５６の抗体を用いて拡大することができる。例示的な例では、このようなαＣＤ１６抗体は、配列番号２５に記載のＶＨ配列及び配列番号２６に記載のＶＬ配列を有する抗体３Ｇ８である（例えば、Hoshino et al, Blood. 1991 Dec 15;78(12):3232-40.を参照）。ＮＫ細胞を拡大するために用いることができる別の剤は、ＩＬ−１５であり得る（例えば、Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92を参照）。好適な細胞集団の更に別の例示的な例は、単球を含み、これは、例えば、ＣＤ１４に結合する剤、例えば、αＣＤ１４抗体分子を用いて拡大することができる。細胞集団は、ヒト、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ネコ、イヌ、キツネザル、ヤギ、ブタ、ウマ、アカゲザル、マカク、又はチンパンジーを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類起源であってよい。
【００２０】
したがって、上記を踏まえて、本発明は、リンホカイン等の外因性成長因子及びアクセサリ分子の非存在下、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はナチュラルキラー細胞等の細胞の集団のエクスビボにおける拡大を選択的に誘導する方法に関する。更に、Ｂ細胞又はＴ細胞等のこれら細胞の増殖を抗原の必要なく誘導することができ、したがって、抗原反応性に関してポリクローナルであるＴ細胞集団等の拡大された細胞集団を提供することができる。本明細書に開示する方法は、長期間にわたってＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞等の選択されたＴ細胞の集団の持続的な増殖を提供し、元のＴ細胞集団に対してこれら細胞の数を何倍にも増加させることができる。一般に、本明細書に記載する通り、リンパ球集団の（クローン性）拡大の場合、全ての後代が、拡大のために選択された細胞集団と同じ抗原特異性を共有することができる。
【００２１】
また、上記を踏まえて、抗原特異的Ｔ細胞の集団を拡大する方法が本発明によって提供される。抗原特異的Ｔ細胞の集団を産生するためには、Ｔ細胞において一次活性化シグナルをトリガーするのに好適な形態の抗原とＴ細胞を接触させる、すなわち、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じてＴ細胞においてシグナルがトリガーされるように、Ｔ細胞に抗原を提示する。例えば、抗原は、ＭＨＣ分子と併せて抗原提示細胞によってＴ細胞に提示され得る。Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、又はＴ細胞に抗原を提示することができる他の細胞等の抗原提示細胞は、該抗原提示細胞がＴ細胞に抗原を提示するように、抗原（例えば、可溶性抗原）の存在下でＴ細胞と共にインキュベートしてよい。あるいは、対象となる抗原を発現する細胞をＴ細胞と共にインキュベートしてもよい。例えば、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞をＴ細胞と共にインキュベートして、腫瘍特異的応答を誘導することができる。同様に、病原体の抗原を提示する、病原体（例えば、ウイルス）に感染した細胞をＴ細胞と共にインキュベートしてもよい。Ｔ細胞の集団の抗原特異的活性化に続いて、本発明の方法に従って細胞を拡大することができる。例えば、抗原特異性が確立された後、本明細書に記載する方法に従って抗ＣＤ３抗体（第１の剤として使用）及び抗ＣＤ２８抗体（第２の剤として使用）と共に培養することによってＴ細胞を拡大することができる。別の実施態様では、第１の剤は、抗原特異的Ｔ細胞集団に結合するＭＨＣ  Ｉ：ペプチド複合体であってよい。このような実施態様では、公知であり、そして、それぞれのＭＨＣ  Ｉ分子と複合体化され得る任意の抗原特異的ペプチドを用いてよい。これに関しては、４つの異なる抗原特異的細胞について、バルクＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞からのＴｃｍレスポンダー細胞の選択的抗原特異的拡大を例示した実施例１１及び１２を参照。あるいは、細胞の拡大をトリガーする受容体の天然リガンドを第１の剤として使用することも可能である。これに関しては、ＣＤ１９の細胞外ドメインが、キメラＣＤ１９結合抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された形質導入Jurkat細胞の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を引き起こした実施例１５を参照。
【００２２】
細胞集団のサンプルは、任意の好適な起源、典型的には、体組織又は血液等の体液の全てのサンプル由来であってよい。後者の場合、該サンプルは、例えば、血液細胞のフィコール勾配等の標準的な単離方法によって得ることができる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団であってよい。しかし、拡大される細胞集団は、精製された形態であってもよく、そして、米国特許第７，７７６，５６２号、米国特許第８，２９８，７８２号、国際公開公報第０２／０５４０６５号、又は国際公開公報第２０１３／０１１０１１号に記載の可逆的細胞染色／単離技術を用いて単離されていてもよい。あるいは、細胞の集団は、米国特許第６，３５２，６９４  Ｂ１号又は欧州特許第０  ７００  ４３０  Ｂ１号に記載の負磁気免疫付着を介する細胞選別によって得ることもできる。本明細書に記載する単離方法を基礎研究で用いる場合、サンプルは、インビトロ細胞培養実験の細胞であってよい。サンプルは、典型的には、溶液又は分散液等の流体の形態で調製される。
【００２３】
上記を踏まえて、１つの実施態様では、本発明は、細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含む方法を提供する。細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、該多量体化試薬は、該第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含む。第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１は、多量体化試薬の結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、該第１の剤は、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合する。第１の剤は、細胞の表面上の受容体分子と結合して、該細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、該細胞を活性化する。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、多量体化剤上に可逆的に固定化される（結合している）方法を提供する。第２の剤は、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬の結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、該第２の剤は、該結合パートナーＣ２と該結合部位Ｚ２との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合する。第２の剤は、細胞の表面上のアクセサリ分子に結合して、活性化された細胞を刺激する。この実施態様では、第１の剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激することができ、そして、ＣＤ３に特異的に結合する結合剤であってよい。この実施態様では、Ｔ細胞上のアクセサリ分子は、ＣＤ２８であってよく、そして、該アクセサリ分子に結合する第２の剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する結合試薬である。この場合、ＣＤ３に特異的に結合する第１の剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択してよい。また、ＣＤ２８に特異的に結合する第２の剤は、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子からなる群から選択してよい。二価抗体断片は、（Ｆａｂ）２’断片、又は二価単鎖Ｆｖ断片であってよく、一方、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択してよい。抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３又はＣＤ２８結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ（glubody）、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、及びアビマーであってよい。
【００２５】
一般に、本発明において用いられる第１及び第２の剤は、例えば、抗体、その断片、及び抗体様機能を有するタンパク質性結合分子であってよい。（組み換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二価抗体断片、例えば、（Ｆａｂ）２’断片、二重特異性抗体、三重特異性抗体（Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441）、十重特異性抗体（Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94）、及び他のドメイン抗体（Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490）である。幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤の１つ以上の結合部位は、二価タンパク質性人工結合分子、例えば、「デュオカリン（duocalin）」としても知られている二量体リポカリンムテイン等であってよい。幾つかの実施態様では、受容体結合試薬は、単一の第２の結合部位を有してよい、すなわち、一価であってよい。一価の第１又は第２の剤の例は、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、又はＭＨＣ分子を含むが、これらに限定されない。一価抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び二価単鎖Ｆｖ断片を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
上述の通り、抗体様機能を有するタンパク質性結合分子の例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（例えば、国際公開公報第０３／０２９４６２号、Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903を参照）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ、又はヒト涙液リポカリン等のリポカリンは、所与の標的に結合するように改変され得る天然のリガンド結合部位を有する。受容体分子に特異的に結合する受容体結合試薬として用いることができる抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子の更なる例は、いわゆるグルボディ（例えば、国際公開公報第９６／２３８７９号を参照）、アンキリン骨格に基づくタンパク質（Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448）、又は結晶質骨格に基づくタンパク質（例えば、国際公開公報第０１／０４１４４号）、Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187に記載のタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、及びアビマーを含むが、これらに限定されない。ヒト受容体ドメインのファミリーのエキソンシャフリングによって進化した多価アビマータンパク質を含むアビマーは、幾つかの細胞表面受容体における複数のドメインのストリングスとして生じる、いわゆるＡドメインを含有する（Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的に対して免疫グロブリン様に結合するように操作され得る３つのループを含有する（Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、同様に、所望の結合のために操作され得るＣ型レクチンドメインにおけるループ領域を含有する（同書）。タンパク質のリガンドとして作用し得るペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素に結合する点でペプチドとは異なるオリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは、典型的には、プロテアーゼ及び他の修飾酵素に対して耐性であり、そして、ペプチドよりもはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509を参照）。好適なタンパク質性結合分子の更なる例は、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、Ｉ型フィブロネクチンドメイン、II型フィブロネクチンドメイン、III型フィブロネクチンドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇ１ａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニッツ／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ドメイン、テンダミスタット、カザール型セリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンビルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、サイログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリンドメイン、又は免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ドメイン抗体又はラクダ重鎖抗体）、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンビルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイ���、Ｃ２ドメイン、「カッパボディ」（Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57を参照、いわゆる「ミニボディ」（Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309）、二重特異性抗体（Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448を参照）、いわゆる「Janusis」（Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659又はTraunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52を参照）、ナノボディ、マイクロボディ、アフィリン、アフィボディ、ノッティン、ユビキチン、ジンクフィンガータンパク質、自己蛍光タンパク質、又はロイシンリッチリピートタンパク質である。抗体様機能を有する核酸分子の例は、アプタマーである。アプタマーは、規定の三次元モチーフに折り畳まれ、そして、所与の標的構造に対して高い親和性を示す。
【００２７】
ここで多量体化試薬に転じると、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１及びＺ２は、同一であってよい（図３の実施例も参照）。この場合、単一の多量体化剤を用いてよい。
【００２８】
可逆的に結合する第１の、そして、任意で第２の剤を用いる実施態様では、多量体化試薬は、固体表面上に固定化されていてよい。任意の固体表面（支持体）を、多量体化試薬を固定化するために用いることができる。多量体化試薬を固定化することができる固体表面の例示的な例は、磁気ビーズ、ポリマービーズ、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、メンブレン、又は中空繊維を含む。中空繊維は、例えば、TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA)から入手可能なQuantum（登録商標）Cell Expansion Systemにおいてバイオリアクタとして用いられる。多量体化試薬は、通常、固体支持体に共有結合するが、必要に応じて、例えば、プラスチック基材上に固定化するために非共有結合性相互作用を用いることもできる。以下でもより詳細に説明する通り、多量体化試薬は、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジン又はアビジンのムテインであってよい。このようなストレプトアビジンムテインは、任意の表面、例えば、クロマトグラフィー精製用に用いられるレジン（ビーズ）に共有結合することができ、そして、IBA GmbH, Gottingenから、例えば、Strep-Tactin（登録商標）Sepharose、Strep-Tactin（登録商標）Superflow（登録商標）、Strep-Tactin（登録商標）Superflow（登録商標）high capacity、又はStrep-Tactin（登録商標）MacroPrep（登録商標）等の形態で市販されている。容易に商業的に入手可能な多量体化試薬の他の例示的な例は、一般にオリゴヒスチジンタグ付き（ヒスタグ付き）タンパク質の可逆的固定化のため、すなわち、本明細書では、第１の結合パートナーＣ１又は第２の結合パートナーＣ２としてペンタ−又はヘキサ−ヒスチジンタグ等のオリゴヒスチジンタグを有する第１又は第２の剤の可逆的結合のために用いることができる、TALON（登録商標）レジン（Westburg, Leusden, The Netherlands）等の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）レジンである。多量体化試薬の他の例は、結合パートナーＣ１若しくはＣ２としてカルモジュリン結合ペプチドを含む第１若しくは第２の剤と共に使用することができる、GE Life Sciencesから入手可能なカルモジュリンセファロース、又はグルタチオンが結合するセファロースである。この場合、結合パートナーＣ１又はＣ２は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。
【００２９】
本発明の方法の他の実施態様では、多量体化試薬は、可溶性形態であってよい。原則として、固体支持体上に固定化される多量体化試薬の場合と同じ多量体化剤を用いてよい。多量体化試薬は、可溶性形態であり、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、カルモジュリンオリゴマー、少なくとも２つのキレート基Ｋを提供する化合物（オリゴマー）であってよく、該少なくとも２つのキレート基は、遷移金属イオンに結合して、部分Ａをオリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、又はビオチン化担体タンパク質に結合できるようにする。
【００３０】
上記で説明した通り、第１及び第２の剤は、それぞれの細胞表面受容体分子に結合することができる結合部位に加えて、結合パートナーＣ１又はＣ２（これらは、参照を容易にするために以後「結合パートナーＣ」と称する）を有する。この結合パートナーＣは、多量体化試薬の結合部位Ｚに結合することができる（Ｚは、多量体化試薬の結合部位Ｚ１又は結合部位Ｚ２のいずれかを意味する）Ｃ。第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣと多量体化試薬の結合部位Ｚとの間に形成される非共有結合は、本発明の方法が実施される条件下で分離可能又は可逆性である限り、任意の所望の強度及び親和性であってよい。受容体結合試薬に含まれる結合パートナーＣと多量体化試薬の結合部位Ｚとの間の結合の解離定数（ＫＤ）は、約１０−２M〜約１０−１３Mの範囲の値を有してよい。したがって、この可逆的結合は、例えば、約１０−２M〜約１０−１３M、又は約１０−３M〜約１０−１２M、又は約１０−４M〜約１０−１１M、又は約１０−５M〜約１０−１０MのＫＤを有し得る。この結合のＫＤ、並びに受容体結合試薬の結合部位Ｂと受容体分子との間に形成される結合のＫＤ、ｋｏｆｆ、及びｋｏｎ速度は、例えば、蛍光滴定、平衡透析、又は表面プラズモン共鳴等の任意の好適な手段によって求めることができる。受容体分子結合試薬は、少なくとも１つ（２つ、３つ、又はそれ以上を含む）の第２の結合パートナーＣを含んでよく、そして、アフィニティー試薬は、少なくとも２つ（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はそれ以上）の、該受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーのための結合部位を含んでよい。米国特許第７，７７６，５６２号、米国特許第８，２９８，７８２号、又は国際公開公報第２００２／０５４０６５号に記載の通り、結合パートナーＣ及びアフィニティー剤の結合部位Ｚが（多価）複合体に可逆的に結合するか又は該（多価）複合体において多量体化することができる限り、結合パートナーＣと１つ以上の対応する結合部位Ｚを有するアフィニティー剤との任意の組み合わせを選択してよく、これは、典型的には、アビディティー効果と同調する。
【００３１】
第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖、オリゴ糖、又は多糖であってよい。このような結合パートナーは、他の物質よりも多量体化試薬の結合部位に対する親和性が高い。それぞれの結合パートナーの例は、免疫グロブリン分子、その断片、及び抗体様機能を有するタンパク質性結合分子を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、ビオチンを含み、そして、アフィニティー試薬は、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ又はアビジンアナログを含む。
【００３３】
幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、ストレプトアビジン又はアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、そして、アフィニティー試薬は、ストレプトアビジン、アビジン、それぞれのビオチンアナログに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ又はアビジンアナログを含む。
【００３４】
幾つかの更なる実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、ストレプトアビジン又はアビジン結合ペプチドを含み、そして、アフィニティー試薬は、ストレプトアビジン、アビジン、それぞれのストレプトアビジン又はアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログ又はアビジンアナログを含む。
【００３５】
幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーは、ストレプトアビジン結合ペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（配列番号０１）を含んでよく、そして、アフィニティー試薬は、野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）又は野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）を含んでよく、これらはいずれも、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、Strep-Tactin（登録商標）という商標で市販されている。ストレプトアビジン結合ペプチドは、例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載の「Strep-tag（登録商標）」等の単一のペプチド、又は国際公開公報第０２／０７７０１８号若しくは米国特許第７，９８１，６３２号に記載の通り２つ以上の個々の結合分子の連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチドであってよい。
【００３６】
幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤の結合パートナーＣは、アフィニティータグとして当業者に公知の部分を含む。このような実施態様では、アフィニティー試薬は、対応する結合パートナー、例えば、アフィニティータグに結合することが知られている抗体又は抗体断片を含む。公知のアフィニティータグの幾つかの例示的な例として、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーは、オリゴヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、又はチオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ’ペプチド、ＨＡタグ（配列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala（配列番号１１))、ＶＳＶ−Ｇタグ（配列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys（配列番号１２））、ＨＳＶタグ（配列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp（配列番号１３））、Ｔ７エピトープ（Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly（配列番号１４））、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄの配列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp（配列番号１３）のＨＳＶエピトープ、配列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu（配列番号１５）の転写因子ｃ−ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープ、Ｖ５タグ（配列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr、配列番号１６）、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んでよい。このような実施態様では、多量体化試薬の１つ以上の結合部位間、この場合、抗体又は抗体断片と抗原との間に形成される複合体は、遊離抗原、すなわち、遊離ペプチド（エピトープタグ）又は遊離タンパク質（例えば、ＭＢＰ又はＣＢＰ）を添加することによって、競合的に分離することができる。また、アフィニティータグは、オリゴヌクレオチドタグであってもよい。このようなオリゴヌクレオチドタグは、例えば、オリゴヌクレオチドをアフィニティー試薬に連結されているか又は含まれている相補配列とハイブリダイズさせるために用いることができる。
【００３７】
幾つかの実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣと多量体化試薬の１つ以上の結合部位との間の結合は、二価、三価、又は四価のカチオンの存在下で生じる。これに関して、幾つかの実施態様では、多量体化試薬は、典型的には、好適なキレート剤を用いて保持、例えば、複合体化されている、二価、三価、又は四価のカチオンを含む。受容体結合試薬に含まれる結合パートナーは、このような実施態様では、二価、三価、又は四価のカチオンを含む、例えば、錯体形成する部分を含んでよい。それぞれの金属キレート剤の例は、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ニトリロ三酢酸、ＮＴＡとも呼ばれる）、又は１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）を含むが、これらに限定されない。例として、ＥＤＴＡは、大部分の一価、二価、三価、及び四価の金属イオン、例えば、カルシウム（Ｃａ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋）、コバルト（Ｃｏ３＋）、及びジルコニウム（Ｚｒ４＋）と錯体を形成し、一方、ＢＡＰＴＡは、Ｃａ２＋に特異的である。例示的な例として、当技術分野において用いられる標準的な方法は、オリゴヒスチジンタグと銅（Ｃｕ２＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、コバルト（Ｃｏ３＋）、又は亜鉛（Ｚｎ２＋）イオンとの間の錯体の形成であり、これは、キレート剤ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いて提示される。
【００３８】
幾つかの実施態様では、例えば、米国特許第５，９８５，６５８号に記載されている通り又は図２を参照して本明細書に記載する通り、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、カルモジュリン結合ペプチドを含み、そして、アフィニティー試薬は、多量体カルモジュリンを含む。幾つかの実施態様では、米国特許第４，８５１，３４１号に記載の通り、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、ＦＬＡＧペプチドを含み、そして、アフィニティー試薬は、ＦＬＡＧペプチド、例えば、モノクローナル抗体４Ｅ１１に結合するＦＬＡＧペプチドに結合する抗体を含む。１つの実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣは、オリゴヒスチジンタグを含み、そして、アフィニティー試薬は、オリゴヒスチジンタグに結合する抗体又は遷移金属イオンを含む。全てのこれら結合錯体の分離は、例えば、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを添加することによる金属イオンのキレート化、例えば、カルシウムのキレート化によって達成され得る（上記）。カルモジュリン、４Ｅ１１等の抗体、又はキレート化金属イオン、又は遊離キレート剤は、従来の方法、例えば、ビオチン化、及びストレプトアビジン若しくはアビジン又はこれらの多量体との錯体形成によって、あるいは、第１の工程において本質的にNoguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137に記載の通りカルボキシル残基を多糖、例えば、デキストランに導入し、そして、第２の工程において、従来のカルボジイミド化学を用いて、一級アミノ基を介してカルモジュリン又は抗体又はキレート化金属イオン又は遊離キレート剤を多糖、例えば、デキストラン骨格のカルボキシル基に連結させることによって、多量体化することができる。このような実施態様では、第１又は第２の剤に含まれる結合パートナーＣと多量体化試薬の１つ以上の結合部位Ｚとの間の結合は、金属イオンのキレート化によって分離し得る。金属のキレート化は、例えば、ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡの添加によって達成され得る。
【００３９】
幾つかの実施態様では、具体的には、多量体化試薬が可溶性形態であり、そして、ストレプトアビジン又はアビジンに基づく場合、それは、ストレプトアビジン若しくはアビジンの、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテイン（アナログ）のオリゴマー又はポリマーである。結合部位Ｚは、アビジン又はストレプトアビジンの天然のビオチン結合である。それぞれのオリゴマー又はポリマーは、多糖によって架橋され得る。１つの実施態様では、ストレプトアビジン若しくはアビジンの、又はストレプトアビジン若しくはアビジンのムテイン（アナログ）のオリゴマー又はポリマーは、第１の工程において、本質的にNoguchi, A, et al., Bioconjugate Chemistry (1992) 3,132-137に記載の通り、カルボキシル残基を多糖、例えば、デキストランに導入することによって調製される。次いで、第２の工程において、従来のカルボジイミド化学を用いて、内部リジン残基及び／又は遊離Ｎ末端の一級アミノ基を介して、ストレプトアビジン若しくはアビジン又はこれらのアナログをデキストラン骨格におけるカルボキシル基に連結させてよい。更に、ストレプトアビジン若しくはアビジンの、又はストレプトアビジン若しくはアビジンの任意のムテイン（アナログ）の架橋オリゴマー又はポリマーは、リンカーとして機能する二官能性分子、例えば、グルタルジアルデヒドを介して、個々のストレプトアビジン又はアビジン分子（ストレプトアビジン又はアビジンの四量体ホモ二量体は、本明細書では、「個々の分子」と称され、すなわち、それぞれのオリゴマー又はポリマーの最小構成要素である）を架橋させることによって得ることもでき、当技術分野において記載されている他の方法によって得ることもできる。例えば、第１の工程において、チオール基をストレプトアビジンムテインに導入することによってストレプトアビジンムテインのオリゴマーを作製することが可能である（これは、例えば、ストレプトアビジンムテイン２−イミノチオラン（Trauts試薬）の反応によって、そして、ストレプトアビジンムテインにおいて利用可能なアミノ基を別個の反応において活性化することによって行うことができる）。このアミノ基の活性化は、ストレプトアビジンムテインと、市販されているヘテロ二官能性架橋剤、例えば、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）又はスクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）等とを反応させることによって達成され得る。第２の工程では、このように得られた２つの反応生成物を混合して、修飾ストレプトアビジンムテインの１つのバッチに含有されているチオール基と修飾ストレプトアビジンムテインの他のバッチの（マレイミド官能基により）活性化されたアミノ酸と反応させる。この反応によって、ストレプトアビジンムテインの多量体／オリゴマーが形成される。これらオリゴマーは、３超の任意の好適な数の「個々の分子」又はストレプトアビジン構成要素」を有し得、そして、オリゴマー化度は、反応条件に応じて変動し得る（図２４を参照）。これら２つのバッチの修飾ストレプトアビジンムテインを反応させた後、オリゴマー可溶性多量体化試薬を、��型的には、サイズ排除クロマトグラフィーを介して単離し、そして、任意の所望の画分を多量体化試薬として用いることができる。典型的には、オリゴマーは、単一の分子量を有さず（そして、有する必要もなく）、通常、ガウス分布等の統計的重量分布がみられる。３超のストレプトアビジンホモ四量体（構成要素；（ｎ≧３））を含む任意のオリゴマーを可溶性多量体化試薬として用いてよい。オリゴマーは、例えば、３〜２５個のストレプトアビジンムテインホモ四量体を有し得る。以下により詳細に記載するムテイン「ｍ１」又は「ｍ２」等のストレプトアビジンムテインが約５０kDaの分子量を有する場合、これら可溶性オリゴマーは、約１５０kDa〜約１２５０kDaの分子量を有する。各ストレプトアビジン分子／ムテインは、４つのビオチン結合部位を有するので、このような多量体化試薬は、本明細書に記載する通り、１２〜１００個の結合部位Ｚ１（及びＺ２）を提供する。
【００４０】
上記開示に従って、架橋ストレプトアビジンホモ四量体のみを含有するこのようなオリゴマー多量体化試薬に加えて、四量体ストレプトアビジンムテインを担体と反応させて、本発明で用いられる多量体化試薬を得ることが可能である。上記の多糖との反応に加えて、担体タンパク質として血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））等の生理学的に又は薬学的に許容し得るタンパク質を使用することも可能である。このような場合、ストレプトアビジンムテイン（個々のホモ四量体として、又はｎ≧３のオリゴマーの形態でも）は、非共有結合性相互作用を介して担体タンパク質と連結し得る。この目的のために、ビオチン化ＢＳＡ（ほんの数例を挙げると、ThermoFisher Scientific、Sigma Aldrich、又はVectorlabs等の様々な供給元から市販されている）をストレプトアビジンムテインと反応させてよい。このようにした場合、ストレプトアビジンオリゴマーの一部が、１つ以上のビオチン結合部位（Ｚ１、Ｚ２）を介してビオチン化担体タンパク質に非共有結合的に結合し、例えば、第１の剤及び任意で第２の剤、並びに本明細書に記載する任意の更なる剤等の剤に対する結合に利用可能なオリゴマーの結合部位（Ｚ１、Ｚ２）の大部分は残る。したがって、このようなアプローチによって、多数の結合部位Ｚ１を有する可溶性多量体化試薬を簡便に調製することができる（図２４を参照）。あるいは、ストレプトアビジンムテイン（個々のホモ四量体として、又はｎ≧３のオリゴマーの形態でも）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子等の合成担体に共有結合することもできる。ＰＥＧ分子及びそれぞれの多量体化試薬が可溶性である限り、任意の好適なＰＥＧ分子をこの目的のために用いることができる。典型的には、分子量１０００Da以下のＰＥＧ分子は、全て、水又は本発明において用いることができる培養培地に対して可溶性である。このようなＰＥＧ系多量体化試薬は、ストレプトアビジンムテインのアミノ基を有する市販されている活性化ＰＥＧ分子（例えば、NOF North America Corporation, Irvine, California, USAから入手可能なＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体、又はCreative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USAから入手可能な活性化ＰＥＧ誘導体）を用いて容易に調製することができる。
【００４１】
ストレプトアビジン又は野性型ストレプトアビジン（ｗｔ−ストレプトアビジン）については、Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882によって開示されているアミノ酸配列を参照する。ストレプトアビジンムテインは、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加によって野性型ストレプトアビジンの配列と区別され、そして、ｗｔ−ストレプトアビジンの結合特性を保持しているポリペプチドである。ストレプトアビジン様ポリペプチド及びストレプトアビジンムテインは、本質的に野性型ストレプトアビジンと免疫学的に等価であるポリペプチドであり、そして、具体的には、ｗｔ−ストレプトアビジンと同じ又は異なる親和性でビオチン、ビオチン誘導体、又はビオチンアナログに結合することができる。ストレプトアビジン様ポリペプチド又はストレプトアビジンムテインは、野性型ストレプトアビジンの一部ではないアミノ酸を含有していてもよく、又は野性型ストレプトアビジンの一部のみを含んでいてもよい。また、ストレプトアビジン様ポリペプチドは、野性型ストレプトアビジンと同一ではないポリペプチドであるが、その理由は、宿主が産生するポリペプチドを野性型ストレプトアビジンの構造に転換するために必要な酵素を宿主が有していないためである。また、用語「ストレプトアビジン」は、ストレプトアビジン四量体及びストレプトアビジン二量体、具体的には、ストレプトアビジンホモ四量体、ストレプトアビジンホモ二量体、ストレプトアビジンヘテロ四量体、及びストレプトアビジンヘテロ二量体を含む。各サブユニットは、通常、ビオチン若しくはビオチンアナログ、又はストレプトアビジン結合ペプチドのための結合部位を有する。ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインの例は、例えば、国際公開公報第８６／０２０７７号、独国特許第１９６４１８７６  Ａｌ号、米国特許第６，０２２，９５１号、国際公開公報第９８／４０３９６号、又は国際公開公報第９６／２４６０６号において言及されている。
【００４２】
好ましい実施態様では、多量体化試薬として用いられるストレプトアビジンムテインは、米国特許第６，１０３，４９３号及び独国特許第１９６  ４１  ８７６．３号にも記載されているストレプトアビジンムテインである。これらストレプトアビジンムテインは、野性型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸位置４４〜５３の領域内に少なくとも１つの変異を有する。Ｎ末端が野性型ストレプトアビジンのアミノ酸１０〜１６の領域で始まり、そして、Ｃ末端が野性型ストレプトアビジンのアミノ酸１３３〜１４２の領域で終わる最小ストレプトアビジンのムテインが好ましい。このような好ましいストレプトアビジンムテインの例は、４４位にＧｌｕの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、４５位に任意のアミノ酸、４６位に疎水性脂肪族アミノ酸、又は／及び４７位にＶａｌの代わりに塩基性アミノ酸を有する。ストレプトアビジンムテインは、配列位置４４〜４７においてアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47（配列番号０２）を含むムテイン、又は野性型ストレプトアビジンの配列位置４４〜４７においてアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47（配列番号０３）を含むストレプトアビジンムテイン（アナログ）であってよい。このようなムテインは、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、そして、商標名Strep-Tactin（登録商標）としてムテイン「ｍ１」及びムテイン「ｍ２」の形態でIBA GmbHから市販されている。
【００４３】
本発明に係る方法は、幾つかの実施態様では、細胞拡大において既に用いられた試薬のサンプルを枯渇させるために用いてよい。例えば、上記拡大方法の溶出液に含まれる、第１又は第２の剤及びそれぞれの遊離型パートナー（競合剤）が存在してよい。本発明に係る方法を用いると、このような試薬は、サンプルから、例えば、細胞集団から、少なくとも本質的に（完全にを含む）除去され得る。例示的な例として、上に定義した第１又は第２の剤は、例えば、ＦＡＣＳ又はウエスタンブロットの検出限界を下回るレベルまでサンプルから枯渇させることができる。競合試薬（遊離型の第１若しくは第２の結合パートナー、又はこれらのアナログ）は、拡大を終了及び制御し、そして、多量体化剤から細胞集団を放出させるために用いられていてよい。この競合試薬は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号の「除去カートリッジ」におけるアフィニティー試薬の結合部位Ｚに特異的に結合することができる結合部位を有し得る。このような実施態様では、本発明のそれぞれの方法は、第１及び第２の剤、並びに競合試薬の枯渇（これらの除去を含む）においても機能し得る。
【００４４】
本発明に係る方法は、細胞集団の生存率が少なくとも本質的に損なわれない任意の温度で実施してよい。本明細書において少なくとも本質的に有害ではなく、不利益でもなく、少なくとも本質的に生存率を損なうこともない条件について言及するとき、十分な生存率で拡大される細胞の集団の百分率が少なくとも７０％（少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％を含む）になる条件に言及する。幾つかの実施態様では、本発明に係る方法は、約２０℃以上の温度で実施される。拡大される細胞集団に依存して、好適な温度範囲は、例えば、約２０℃〜約４５℃（約２５℃〜約４０℃又は約３２℃〜３７℃を含む）であってよい。幾つかの実施態様では、本発明に係る方法は、一定温度値、又は選択した温度値±約５℃、±約４℃、±約３℃、±約２℃、±約１℃、又は±約０．５℃で実施される。当業者は、細胞の性質及び拡大条件を考慮して、好適な温度を実験的に決定することができる。典型的には、ヒト細胞は、３７℃等の温度で拡大する。
【００４５】
更なる実施態様では、本発明は、細胞の集団を拡大するインビトロ方法であって、細胞の集団を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、該多量体化試薬が、可溶性形態であり、そして、該細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が該多量体化試薬上に固定化されている（結合している）方法を提供する。多量体化試薬は、第１の剤が結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、該第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１は、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１に結合することができる。第１の剤は、結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間に形成される結合を介して多量体化試薬に結合し、そして、該第１の剤は、細胞の表面上の受容体分子に結合して、該細胞に一次活性化シグナルを提供し、そして、該細胞を活性化する。可溶性多量体化剤を用いるとき、結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間の結合が可逆的である必要はないことを、本明細書において明確に留意する。
【００４６】
この第２の実施態様では、細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が多量体化剤上に固定化されており（結合しており）、該第２の剤は、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２は、多量体化試薬の結合部位Ｚ２に結合することができる。第２の剤は、結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して多量体化試薬に結合し、該第２の剤は、細胞の表面上のアクセサリ分子に結合して、活性化された該細胞を刺激する。
【００４７】
この第２の方法の１つの実施態様では、結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間に形成される結合が不可逆的であってよく、かつ／又は結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ２との間に形成される結合も不可逆的であってよい。
【００４８】
この第２の方法の異なる実施態様では、結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間に形成される結合は、不可逆的であってよい。また、結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ２との間に形成される結合も、不可逆的であってよい。この場合、前記結合部位Ｚ１と前記結合パートナーＣ１との間の可逆的結合、及び／又は前記結合部位Ｚ２と前記結合パートナーＣ２との間の可逆的結合についての解離定数（Ｋｄ）は、１０−２M〜１０−１３Mの範囲であってよい。
【００４９】
可溶性多量体化試薬に基づくこの第２の方法では、第１及び第２の剤に加えて、多量体化試薬及び全ての他の試薬、並びに細胞集団は、その他の点では、第１又は第２の剤と多量体化試薬との間の可逆性を使用する方法について上に開示したのと同様に用いてよい。
【００５０】
本発明は、更に、細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）該細胞の表面上の受容体分子に結合して、該細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、該細胞を活性化する第１の剤であって、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１が、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、該第１の剤が、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合する第１の剤と、
（iii）該細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤であって、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２が、該多量体化試薬の結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、該第２の剤が、該結合パートナーＣ２と該結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して該多量体化試薬に結合し、該第２の剤が、該細胞の表面上のアクセサリ分子に結合し、それによって、活性化された該細胞を刺激する第２の剤と
を含む試薬キットを提供する。
【００５１】
本発明は、また、細胞の集団を拡大するための試薬キットであって、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚを含む多量体化試薬と、
（ii）該細胞の表面上の受容体分子に結合して、該細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、該細胞を活性化する第１の剤であって、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１が、該多量体化試薬の結合部位Ｚ１に結合することができ、該第１の剤が、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合する第１の剤と
を含む試薬キットを提供する。
【００５２】
この第２の試薬キットは、（iii）該細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤であって、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２が、該多量体化試薬の結合部位Ｚ２に結合することができ、該第２の剤が、該結合パートナーＣ２と該結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して該多量体化試薬に結合する第２の剤を更に含んでよい。
【００５３】
本明細書に開示するキットは、特に、細胞の集団がリンパ球集団であるときに用いられる。
【００５４】
上記開示に従って、本発明は、また、新規多量体化試薬、及び細胞の集団を拡大することができる多量体化試薬を含む新規組成物を提供する。細胞の集団を拡大することができるこのような多量体化試薬は、可溶性形態であり、そして、該細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含む多量体化試薬であり、該細胞に一次活性化シグナルを提供する該第１の剤が該多量体化試薬上に可逆的に固定化されている（結合している）；該第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１は、該多量体化試薬の少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、該第１の剤は、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して多量体化試薬に結合する。本明細書に記載する第１の剤のいずれかが、このような多量体化剤上に固定化されていてよいことに本明細書では留意すべきである。
【００５５】
本発明の多量体化試薬は、細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を更に含んでよく、該細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、該多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、該第２の剤は、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２は、該多量体化試薬の少なくとも１つの結合部位Ｚ２に結合することができる。この実施態様では、第２の剤は、結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して多量体化試薬に結合する。
【００５６】
また、上記開示を踏まえて、このような多量体化試薬は、リンパ球集団、又は該リンパ球集団に含有される亜集団を拡大することができる。拡大されるリンパ球集団は、任意の好適な集団、例えば、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、又はナチュラルキラー細胞集団であってよい。Ｔ細胞集団は、抗原特異的Ｔ細胞集団、ヘルパーＴ細胞集団、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞集団であってよい。したがって、多量体化試薬のこのような実施態様では、第１の剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激することができる。したがって、多量体化試薬中に存在する第１の剤は、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬であってよく、一方、アクセサリ分子に結合する第２の剤は、ＣＤ２８又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合剤であってよい。
【００５７】
多量体化試薬の実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合する第１の剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片、及び／又は抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子であってよい。これら実施態様では、ＣＤ２８又はＣＤ１３７に特異的に結合する第２の剤は、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、４−１ＢＢリガンド、及びこれらの任意の混合物であってよい。したがって、本発明の多量体化試薬には、一般的に、１種の第１の剤と第２の剤の混合物、例えば、第１の剤としての抗ＣＤ３抗体と、例えば、（結合部）第２の剤としての抗ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢリガンドとが固定化されていてよい。
【００５８】
多量体化試薬がＢ細胞を拡大するために用いられる場合、多量体化試薬上に固定化されている第１の剤は、ＣＤ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する結合試薬であってよい。本明細書において与えられる開示に従って、このような実施態様では、Ｃ４０又はＣＤ１３７に特異的に結合する第１の結合試薬は、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０抗体の一価抗体断片、及び抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子、又は抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子、及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）から選択してよい。
【００５９】
また、本発明の一般的な開示に従って、本明細書に記載する多量体化試薬では、多量体化試薬の結合部位Ｚ１及びＺ２は、同一であってよい。上記の通り、このような多量体化試薬は、ストレプトアビジンのオリゴマー又はポリマー、アビジンのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのアナログのオリゴマー又はポリマー、ビオチンに可逆的に結合するアナログアビジンのオリゴマー又はポリマー、少なくとも２つのキレート基Ｋを含む試薬を含んでよく、該少なくとも２つのキレート基は、遷移金属イオンに結合することができ、それによって、該試薬は、オリゴヒスチジンアフィニティータグ、多量体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、多量体カルモジュリン、及びビオチン化担体タンパク質に結合することができるようになる。
【００６０】
細胞の集団を拡大することができる、本明細書に提供する新規組成物は、
（ｉ）可溶性形態であり、そして、該細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含む第１の多量体化試薬であって、該細胞に一次活性化シグナルを提供する該第１の剤が、該第１の多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、該第１の剤が、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１が、該多量体化試薬の該少なくとも１つの結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、該第１の剤が、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合する第１の多量体化試薬と、
（ii）可溶性形態であり、そして、該細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含む第２の多量体化試薬であって、該細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する該第２の剤が、該多量体化試薬上に可逆的に固定化されており（結合しており）、該第２の剤が、結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２が、該多量体化試薬の該少なくとも１つの結合部位Ｚ２に結合することができ、該第２の剤が、該結合パートナーＣ２と該結合部位Ｚ２との間に形成される結合を介して該多量体化試薬に結合する第２の多量体化試薬と
を含んでよい。
【００６１】
このような新規組成物は、例えば、２つの別個の多量体化試薬をαＣＤ３Ｆａｂ断片のみ又はαＣＤ２８Ｆａｂ断片のみで機能化した実施例１３で用いられる反応混合物である。この状況では、このような組成物が、実施例１３において、第１の剤及び第２の剤の両方が一緒に固定化されている単一の多量体化試薬と同じ拡大効率を有することが示されたことに留意する。したがって、１種のみの試薬（例えば、１種の第１の剤又は１種の第２の剤）で個々に機能化された２種以上の多量体化試薬の併用は、第１の剤及び第２の剤の両方が固定化されている１つの結合部の多量体化試薬を拡大のために使用するのと機能的に等価である。この状況では、本発明の多量体化試薬が、選択した細胞集団を拡大するために用いることを意図する多くの剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は更により多くの剤）で機能化されることにも留意する。第３又は第４の剤は、例えば、細胞の所望の亜集団を拡大するための刺激を提供し得る。この状況では、例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞（リンパ球）の集団のサンプル中のＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団を濃縮するために、３つの試薬、すなわち、第１の試薬としてのαＣＤ３Ｆａｂ断片、第２の試薬としてのαＣＤ２８Ｆａｂ断片、及び第３の試薬としてのαＣＤ８Ｆａｂ断片で可溶性多量体化試薬を可逆的に機能化した実施例１３を参照。全てを同じ多量体化試薬上に可逆的に固定化することができるこのような剤の組み合わせを使用することによって、本発明は、例えば、様々な異なる亜集団を含むサンプルから任意の所望の細胞（亜）集団を優先的に拡大又は選択的に濃縮することが可能になる。しかし、この状況では、３つの異なる多量体化試薬、例えば、αＣＤ３Ｆａｂ断片のみで機能化された第１の多量体化試薬、αＣＤ２８Ｆａｂ断片で機能化された第２の多量体化試薬、及びαＣＤ８Ｆａｂ断片で機能化された第３の多量体化試薬をこの目的のために用いることも可能であることに留意する。同様に、αＣＤ３Ｆａｂ断片のみで機能化された第１の多量体化試薬とαＣＤ２８Ｆａｂ断片及びαＣＤ８Ｆａｂ断片の両方で機能化された第２の多量体化試薬との２つの異なる多量体化試薬のみを用いることも可能である。したがって、本発明によって、モジュール方式で任意の種類の望ましい拡大試薬を設計することができる。
【００６２】
また、本発明は、リンパ球の集団を連続拡大するインビトロ方法であって、該リンパ球の集団が、Ｔ細胞を含む方法を提供する。この方法は、
リンパ球の集団を含む該Ｔ細胞を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることを含み、
該多量体化試薬は、可溶性形態であり、そして、（ｉ）該Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤及び（ii）該Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の剤が、該多量体化試薬上に可逆的に固定化されており、
該多量体化試薬は、該第１の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ１を含み、
該第１の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ１を含み、該結合パートナーＣ１は、該多量体化試薬の該結合部位Ｚ１に可逆的に結合することができ、該第１の剤は、該結合パートナーＣ１と該結合部位Ｚ１との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合し、
該多量体化試薬は、該第２の剤が可逆的に結合するための少なくとも１つの結合部位Ｚ２を含み、
該第２の剤は、少なくとも１つの結合パートナーＣ２を含み、該結合パートナーＣ２は、該多量体化試薬の該結合部位Ｚ２に可逆的に結合することができ、該第１の剤は、該結合パートナーＣ２と該結合部位Ｚ２との間に形成される可逆的結合を介して該多量体化試薬に結合し、
該第１の剤は、該Ｔ細胞の表面上の受容体分子と結合して、該細胞に一次活性化シグナルを提供し、それによって、該Ｔ細胞を活性化し、
該第２の剤は、該Ｔ細胞の表面上の該アクセサリ分子に結合して、活性化された該細胞を刺激し、それによって、該第１の剤及び該第２の剤が共に、該Ｔ細胞を誘導して拡大させる。
【００６３】
この方法では、次にＴ細胞集団を含有するリンパ球の集団を含有するサンプルを、第１及び第２の剤が固定化されている可溶性多量体化試薬と接触させると、Ｔ細胞が該多量体化試薬に特異的に結合する。
【００６４】
リンパ球の集団を含むＴ細胞を含むサンプルを多量体化試薬と接触させることは、中空繊維バイオリアクタ（例えば、Quantum（登録商標）cell expansion systemの中空繊維バイオリアクタ）又はプラスチックバッグバイオリアクタ（例えば、GE Healthcare製のXuri Cell Expansion System W25で用いられるCellbag（登録商標））等のバイオリアクタ内で実施してよい。
【００６５】
この方法は、リンパ球の集団（第１の剤及び第２の剤を介して多量体化試薬に結合しているＴ細胞を含有する反応混合物）を、（ｉ）第１の結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間の結合を分離させることができる遊離型の第１の結合パートナーＣ１又はそのアナログ、及び（ii）第２の結合パートナーＣ２と結合部位Ｚ２との間の結合を分離させることができる遊離型の第２の結合パートナーＣ２又はそのアナログと接触させることを更に含む。このようにすることによって、第１の剤の結合パートナーＣ１と結合部位Ｚ１との間の可逆的結合に加えて、第２の剤の結合パートナーＣ２と多量体化試薬の結合部位Ｚ２との間の可逆的結合が分離し、それによって、第１の剤及び第２の剤を介して多量体化試薬に結合しているＴ細胞が溶出液中に放出され、そして、Ｔ細胞の拡大が停止する。
【００６６】
この方法では、拡大されたＴ細胞集団を含有する溶出液（遊離型の第１のパートナー又はそのアナログの添加によって拡大反応が既に終了している反応混合物）を好適な（第１の）固定相のクロマトグラフィーに供してよい。（第１）の固定相は、国際公開公報第２０１３／１２４４７４号に記載の通り、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであってよい。このゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスは、アフィニティー試薬を含み、該アフィニティー試薬は、第１の剤又は第２の剤に含まれている結合パートナーＣ１及び／又はＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ１及び／又はＺ２を含む。このようにすることによって、第１の剤、第２の剤、第１の結合パートナーＣ１、及び／又は遊離型の第２の結合パートナーＣ２は、固定相に固定化される。この方法では、第１の固定相は、バイオリアクタに流体接続している。
【００６７】
この連続拡大の実施態様のうちの１つでは、多量体化剤の結合部位Ｚ１及びＺ２は同一である。更に、単一の多量体化剤を用いてよい。可溶性多量体化剤を用いるとき、Ｔ細胞集団（又は一般に、拡大された細胞集団）を可溶性多量体化試薬から分離する。分離／除去は、第２の固定相を用いて実施してよい。この目的のために、Ｔ細胞及び可溶性多量体化試薬を含む混合物を、上記第１の固定相に適用する前又は後に、好適な第２の固定相のクロマトグラフィーに供する。この第２の固定相は、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであってよく、該ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスは、アフィニティー試薬を含む。クロマトグラフィーレジンに含まれるアフィニティー試薬は、存在する場合、多量体化試薬の結合部位Ｚ１及び／又は結合部位Ｚ２に（特異的に）結合する結合パートナーＤを含み、それによって、固定相上に多量体化試薬を固定化する。ストレプトアビジン系多量体化剤が用いられ、そして、第１及び第２の剤がいずれも結合パートナーＣ１又はＣ２としてストレプトアビジン結合ペプチドを有する場合、この第２の固定相のアフィニティー試薬に含まれる結合パートナーＤは、ビオチンであってよい。次いで、多量体化試薬として用いられるストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインの可溶性オリゴマーは、通常、市販されているビオチン−セファロース（商標）等のクロマトグラフィーマトリクスに共有結合しているビオチンに結合する。
【００６８】
この連続拡大の方法では、第１の剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激することができるので、該第１の剤は、ＣＤ３に特異的に結合する結合試薬であってよい。更に、Ｔ細胞上のアクセサリ分子は、ＣＤ２８であってよい。この場合、アクセサリ分子に結合する第２の剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する結合試薬である。
【００６９】
この連続拡大の方法では、拡大中又は拡大後、例えば、Ｔ細胞にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、人工Ｔ細胞受容体としても知られている）をトランスフェクトしてもよい。所望の受容体の遺伝子を導入するためのこのトランスフェクションは、例えば、任意の好適なレトロウイルスベクターを用いて実施してよい。次いで、遺伝的に改変された細胞集団は、初期刺激（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激）から解放され得、次いで、例えば、デノボ導入された受容体を介して、第２の種類の刺激で刺激され得る。この第２の種類の刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然リガンド）、又は（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（例えば、抗体）の形態の抗原刺激を含んでよい。これに関しては、Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66又はBarrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)を参照。
【００７０】
この方法では、Ｔ細胞を含むリンパ球の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団、又は濃縮若しくは精製されたＴ細胞の集団であってよい。リンパ球の集団は、例えば、全血、又は非動員アフェレーシス生成物、又は凍結組織標本に由来していてよい。
【００７１】
可溶性多量体化試薬に基づくこの連続拡大の方法では、第１及び第２の剤に加えて、多量体化試薬及び全ての他の試薬、並びに細胞集団は、その他の点では、第１又は第２の剤と多量体化試薬との間の可逆性を使用する方法について上に開示したのと同様に用いてよい。
【００７２】
本発明は、更に、バイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の第１の固定相の配置を目的とする。バイオリアクタは、細胞の拡大に好適であり、そして、固定相は、細胞の分離及び試薬の除去に好適である。第１の固定相は、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであり、該ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスは、アフィニティー試薬を含み、該アフィニティー試薬は、第１の剤に含まれる結合パートナーＣ１に特異的に結合する結合部位Ｚ１を含み、かつ／又は該アフィニティー試薬は、第２の剤に含まれる結合パートナーＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ２を含む。それによって、第１の固定相は、第１の剤及び／又は第２の剤、第１の結合パートナーＣ１及び／又は遊離型の第２の結合パートナーＣ２をその上に固定化するのに好適である。更に、バイオリアクタ及び固定相は、流体接続される。この配置は、上で説明した連続拡大において用いることができ、そして、Quantum（登録商標）cell expansion system又はXuri Cell Expansion System W25等の公知の細胞拡大システムに組み込むことができる。
【００７３】
この配置では、第１の固定相は、クロマトグラフィーカラムに含まれるか、又は平面固定相である。該配置は、第１の固定相に流体接続している第２の固定相を更に含んでよい。第２の固定相は、ゲル濾過マトリクス及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスであってよく、該ゲル濾過及び／又はアフィニティークロマトグラフィーマトリクスは、アフィニティー試薬を含む。このアフィニティー試薬は、多量体化試薬の結合部位Ｚ１に（特異的に）結合する結合パートナーＤを含んでよく、それによって、固定相上に多量体化試薬を固定化するのに好適になる。
【００７４】
本発明は、更に、細胞の集団を精製及び拡大するための装置であって、上に定義したバイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の第１の固定相又は第２の固定相の少なくとも１つの配置を含む装置を目的とする。
【００７５】
該装置は、更に、直列に流体接続しているバイオリアクタ及び固定相の複数の配置を含んでよい。
【００７６】
該装置は、該バイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の固定相の配置の該バイオリアクタに流体接続しているサンプル入口を含んでよい。また、該装置は、精製及び拡大された標的細胞用のサンプル出口を含んでよく、該サンプル出口は、バイオリアクタ及びクロマトグラフィー用の固定相の少なくとも１つの配置の最後の固定相に流体接続している。
【００７７】
最後に、該装置は、機能的閉鎖系として設計してよい。
【００７８】
当業者であれば本発明の開示から容易に理解する通り、本明細書に記載する対応する例示的な実施態様と実質的に同じ機能を果たすか又は実質的に同じ結果が得られる、現在存在しているか又は将来的に開発される物質の他の組成、手段、用途、方法、又は工程は、本発明に従って同様に利用することができる。
【００７９】
実験例
実施例１：ストレプトアビジンムテインStrep-tactin（登録商標）でコーティングされたビーズ上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片によるＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞の刺激／拡大
３００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２ＬレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ、非動員ドナーアフェレーシス生成物から連続磁気濃縮によって単離）を３μM ＣＦＳＥで標識し、そして、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μgのみ、αＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgのみ、又はαＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの混合物をロードしたStreptactin（登録商標）ビーズの調製品 １５μL(１mL当たり磁気粒子 １０mg、ビーズ１mg当たりStreptactin（登録商標） ３５μgをロード）のうちの５μLで刺激した。
【００８０】
用いたαＣＤ３Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３によって産生されたＣＤ３結合モノクローナル抗体に由来していた。ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３及びＯＫＴ３抗体は、米国特許第４，３６１，５４９号に記載されており、該細胞株は、アクセッション番号ATCC（登録商標）CRL-8001（商標）として寄託されている。用いたＣＤ２８Ｆａｂは、モノクローナル抗ヒトＣＤ２８抗体ＣＤ２８．３に由来していた（Vanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570）。この抗体ＣＤ２８．３の可変ドメインのヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号ＡＦ４５１９７４．１として合成単鎖Ｆｖコンストラクト抗ヒトＣＤ２８抗体ｓｃＦｖ２８．３の形態でGenBankに寄託されている。
【００８１】
両Ｆａｂ断片は、定常領域として（ＣＨ１及びＣカッパ）ＩｇＧ１コンセンサス配列を有する、国際公開公報第２０１３／０１１０１１号及び同第２０１３／１２４４７４号に記載の通り、大腸菌（E. coli）において組み換えで産生させた。両Ｆａｂ断片の重鎖を、IBA GmbH, Gottingen, Germanyから「Twin-Strep-tag（登録商標）」として市販されている、２つのストレプトアビジン結合モジュール（SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７）の連続配置とカルボキシ末端で融合させた。αＣＤ３Ｆａｂ断片を、結合パートナーＣ１として機能するストレプトアビジン結合ペプチドを有する第１の剤として用い、そして、αＣＤ２８Ｆａｂ断片を、結合パートナーＣ２として機能するストレプトアビジン結合ペプチドを有する第２の剤として用いた。（四量体）ストレプトアビジンムテイン「Strep-tactin（登録商標）は、両Ｆａｂ断片が可逆的に固定化されている多量体化試薬として機能する。
【００８２】
拡大実験では、ブランクビーズ（Ｆａｂ無し）で刺激したＴｒｅｓｐ細胞がネガティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の１０U/mL インターロイキン２（ＩＬ−２）を添加した完全細胞培養培地（１０％（v/v） ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ｂ−メルカプトエタノール、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ（Gibco）） ３mLに、３００．０００個のＣＤ３細胞自己フィーダー細胞（３０Gyで照射）と共にトリプレットで播種した。該細胞を、培地を交換することなく３７℃でインキュベートし、そして、４日間後にＦＡＣＳ分析によって分析した。１００μM Ｄ−ビオチンと共に１０分間インキュベートした後に、ＦＡＣＳ染色及び分析を行った。各条件につき１つの代表的なプロットを図４に示す。プロットは、生／死を判別するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した生存ＣＤ３＋細胞を示す。図４ａは、刺激された細胞のサイズ分布（前方散乱）を示すヒストグラムである。図４ａは、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin（登録商標）でコーティングされたビーズ上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの混合物が固定化されたビーズの存在下でインキュベートしたとき、Ｔｒｅｓｐ細胞の特定の細胞集団が刺激され、そして、拡大した（刺激されていない「ビーズのみ」のコントロールと比べてサイズ／数が増加）ことを示す。図４Ｂは、細胞分裂当たりの細胞数に従って増殖の程度を表す増殖色素ＣＦＳＥの希釈度のヒストグラムを示す（図４Ｂの上部に示されている０は、分裂していない細胞を表し；５は、少なくとも５回分裂した細胞を表す）。図４Ｂから、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの混合物が固定化されたビーズで刺激されたＴ細胞の集団のほとんどが、３回細胞分裂しており、そして、単一の刺激のみよりも均一な増殖パターンを表す（分裂していないピーク「０」の細胞数が少ない）ことが分かる。また、増殖の絶対量の増加（αＣＤ３及びαＣＤ２８機能化ビーズで４日間刺激した後、より多くの細胞が均一に増殖した）は、図４Ｃにおいて指示薬の色が黄色に変化したことによって示される通り、より著しい培地の消費によって表される。
【００８３】
実施例２：Jurkat細胞における細胞内カルシウム動員差異の分析
ここでは、αＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３又はStrep-tactin（登録商標）で多量体化されたＯＫＴ３のＦａｂ断片のいずれかで標識されたJurkat細胞において誘導された細胞内カルシウム動員差異のリアルタイムフローサイトメトリ（low-cytometric）解析について調べた。
【００８４】
この目的のために、Jurkat細胞にカルシウム感受性色素Indo-1-AMをロードし、そして、αＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３によって産生、上記を参照、黒四角）又はそのストレプトアビジン結合ペプチドをフィコエリトリンと蛍光的にコンジュゲート化された可溶性Strep-Tactinに可逆的に結合させることによって多量体化されたαＣＤ３Ｆａｂ断片（親細胞株ＯＫＴ３に由来）のいずれかを注入することによってカルシウム放出をトリガーした。インタクトな多量体ＯＫＴ３Ｆａｂ−Strep-Tactin複合体の場合、親抗体クローンと同一期間にわたってカルシウム放出をトリガーした（濃い灰色の三角形）。細胞の活性化は、ＰＢＳネガティブコントロールの注入（白色の倒立三角形）と同じく、Ｄ−ビオチンで処理され、予め解離していたＦａｂ−Strep-Tactin複合体の注入（薄い灰色の円）によって完全に避けることができた。イオノマイシンの適用は、カルシウム流入についてのポジティブコントロールとして機能した。細胞内Ｃａ２＋濃度の時間分解変化を、ＦＬ６／ＦＬ７比の変化に基づいてフローサイトメトリーによってモニタリングした。図５Ａから、親抗体ＯＫＴ３及びＯＫＴ３の多量体化一価Ｆａｂ断片の両方がカルシウム放出に影響を与えることが分かる、すなわち、ＯＫＴ３の多量体化一価Ｆａｂ断片は、本質的に親抗体と同等に機能的である。なお、Streptactin−ＯＫＴ３Ｆａｂ断片を添加する前に、ＯＫＴ３Ｆａｂ断片が固定化されたStrep-tactinにビオチンを添加した場合、多量体ＯＫＴ３Ｆａｂ断片はカルシウム放出をトリガーすることができなかった。この場合、ビオチンは、多量体化剤としてのStrep-tactinとＯＫＴ３Ｆａｂ断片との間に形成される可逆的結合を分離させた。したがって、一価Ｆａｂ断片は、多量体化剤から置き換えられ、そして、解離後、Jurkat細胞のＣＤ３に結合することによってカルシウム放出をトリガーすることができなかった。
【００８５】
図５Ｂに示す実験では、Indo-1-AMで標識されたJurkat細胞は、図５ａに記載の通り、ＯＫＴ３由来のαＣＤ３Ｆａｂ−Strep-Tactin複合体によって活性化された。インタクトな（上のグラフ）又は予め解離していた複合体（下のグラフ）の注入は、それぞれ、ポジティブコントロール又はネガティブコントロールとして機能した。更に、インタクトなＦａｂ−Strep-Tactin複合体で細胞を刺激し、続いて（活性化ピーク付近のｔ＝１４０ｓにおいて）Ｄ−ビオチンを注入したところ、αＣＤ３Ｆａｂ多量体シグナル伝達が急激に崩壊した（中央のグラフ）。予め解離していたＦａｂ複合体群へのイオノマイシンの注入は、ポジティブコントロールとして機能した。データは、３つの異なる実験の代表である。重要なことに、図５Ｂは、Ｄ−ビオチンをサンプルに添加することによって、Strep-Tactin多量体化剤からＦａｂ断片が速やかに置き換えられ、それによって、カルシウム刺激の継続中であってもカルシウム放出を有効に終了させることを示し、そして、解離したＯＫＴ３Ｆａｂ断片は、もはや生物学的に活性ではないことを立証する。同様に、多量体ＯＫＴ３Ｆａｂ断片は、Streptactin−ＯＫＴ３ＦａｂサンプルをJurkat細胞に添加する前にStrep-tactin−ＯＫＴ３Ｆａｂ断片多量体にビオチンを添加したときも、カルシウム放出をトリガーすることができなかった。
【００８６】
実施例３：ＣＤ３Ｆａｂ多量体による細胞の可逆的染色
この実施例では、ＣＤ３Ｆａｂ多量体による細胞の可逆的染色について調べる。新たに単離したＰＢＭＣを、αＣＤ３モノクローナル抗体クローンＯＫＴ３（左のドットプロット、Ｆａｂ多量体の親クローン）又は同族のフィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたＯＫＴ３Ｆａｂ多量体のいずれかで染色し、そして、Ｄ−ビオチンで処理する前（左から２番目の列）又は後（中央の列）に分析した。次いで、新たなＰＥで標識されたStrep-Tactin（登録商標）を用いた後続の洗浄工程後、残りのＦａｂ単量体を検出した（右から２番目の列）。可逆的に染色された細胞の二次Ｆａｂ多量体染色は、コントロールとして機能した（右の列）。生／死を判別するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色において陰性である生存ＣＤ３細胞のみを図６に示す。ドットプロットにおける数字は、ゲート内の細胞の百分率を示す。この実験は、多量体化試薬としてのStreptactinで多量体化された抗ＣＤ３Ｆａｂ断片によるＣＤ３＋ＰＢＭＣの染色が、Ｄ−ビオチンの添加によって完全に可逆的であること、そして、一価Ｆａｂ断片のみでは、ＰＢＭＣ上に存在するＣＤ３分子に結合しないことを示す。
【００８７】
実施例４：ＣＤ２８Ｆａｂ多量体による細胞の可逆的単離
この実施例は、Strep-Tactin（登録商標）磁気粒子（この磁気粒子は、IBA GmbH Gottingen, Germanyから入手可能である）で多量体化された抗ＣＤ２８Ｆａｂ断片の可逆的結合による細胞の単離を示す。上記実施例１に記載した抗体ＣＤ２８．３に由来するＦａｂ断片をこの目的のために用いた。本質的に国際公開公報第２０１３／０１１０１１号に記載の通り、新たに単離したＰＭＢＣからＦａｂ多量体磁気細胞選択によってＣＤ２８＋細胞を選択／単離した。選択前に、コントロール染色としての同族蛍光αＣＤ２８多量体（左のドットプロット）又は免疫グロブリンカッパ軽鎖に対する抗体（左から２番目のドットプロット、α−ＩｇカッパｍＡｂ）のいずれかで細胞をコントロール染色した。選択後、ＣＤ２８＋細胞をＤ−ビオチンで処理し、次いで、洗浄して、磁気ビーズ及びＦａｂ単量体を除去した。次いで、遊離したＣＤ２８＋細胞を、ＣＤ２８Ｆａｂ多量体（右から２番目のドットプロット）又はα−ＩｇカッパｍＡｂ（右のドットプロット）のいずれかで（再）染色して、残存している可能性のあるＦａｂ単量体を検出した。生存（ＰＩ陰性）ＣＤ３＋細胞のみを示す。ドットプロットにおける数字は、ゲート内の細胞の百分率を示す。図７は、このように多量体化された抗ＣＤ２８Ｆａｂ断片を用いてＰＭＢＣからＣ２８＋細胞を単離できること、そして、選択後に、抗ＣＤ２８Ｆａｂ単量体を含む全ての単離試薬を除去できることを示す。
【００８８】
実施例５：可溶性Strep-tactin上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片によるＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞の刺激／拡大
この実施例では、ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（フィコール勾配から得られた新たなＰＢＭＣのサンプルから磁気選択によって単離）を、可溶性多量体化試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した後、拡大した。製造業者（Thermo Scientific）のプロトコールに従って、Strep-tactin（登録商標）をスルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、製品番号22122 Thermo Scientific）及びイミノチオラン（製品番号26101 Thermo Scientific）と重合させることによって、オリゴマーStrep-tactin（登録商標）を得た。サイズ排除クロマトグラフィーによって単量体（未反応）及び二量体のストレプトアビジンムテインからオリゴマーストレプトアビジンを分離し、そして、このようにして得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分を可溶性多量体化試薬として用いた。
【００８９】
インビトロ拡大については、３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を２μM カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、そして、様々な量の、（いずれも重鎖にストレプトアビジン結合ペプチドとして上述のTwin-Strep-tag（登録商標）を有する）上記αＣＤ３  ＯＫＴ３Ｆａｂ断片と抗体２８．３のαＣＤ２８Ｆａｂ断片との組み合わせが固定化された可溶性Strep-tactin（登録商標）オリゴマーの調製品で刺激した。（「１×」は、αＣＤ３単量体Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８単量体Ｆａｂ断片 ０．５μgで機能化された多量体化Streptactin ３μgに対応し、「０．５×」、「２×」及び「５×」という数字は、それぞれ「１×」のｎ倍量を示す）。Ｔｒｅｓｐ細胞は、刺激されないままであったか、又はネガティブコントロールとして機能するブランクStrep-tactin多量体（Ｆａｂ無し）で刺激した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の２０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mL中に、３００．０００個のＣＤ３陰性自己フィーダー細胞（３０Gyで照射）と共にデュープリケートで播種した。培地を交換することなく細胞を３７℃でインキュベートし、そして、ＦＡＣＳ分析によって５日間後ＣＦＳＥ希釈度に従って増殖を分析した。図８Ａは、ネガティブコントロールと比較した、５日間培養した後の増殖細胞のサイズ分布の増加を示す。図８Ｂは、αＣＤ３Ｆａｂ及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片の混合物が固定化された（図４における固体Streptactin磁気粒子と比較して）可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）と共にインキュベートしたとき、ＣＤ３＋Ｔｒｅｓｐ細胞が適切に刺激され、そして、激しく増殖したことを示す。図８ａ及び８ｂにおける結果は、これらインビトロ条件下において、表面ＣＤ２８及びＴＣＲ／ＣＤ３複合体と可溶性Strep-tactin（登録商標）オリゴマー上に可逆的に固定化されたαＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片との会合後にＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞の大部分が分裂した（２〜５回の細胞分裂）ことを示す。インビトロ拡大後、可溶性Fab-Strep-Tactin刺激試薬を解離させ、そして、Ｄ−ビオチン処理後に除去した。フィコエリトリン標識Strep-Tactin（登録商標）（ＳＴ−ＰＥ）で細胞を再染色することによって、単量体Ｆａｂ断片の解離及び除去をフローサイトメトリーで分析した。適切なＳＴ−ＰＥのみのネガティブコントロール（薄い灰色のヒストグラム）と比較した、代表的なヒストグラム（濃い灰色のヒストグラム）を示す。図８Ｃから、両Ｆａｂ断片が完全に解離しており、そして、拡大した細胞から完全に除去されたことが分かる。図８Ｄは、５日間後の生存（トリパンブルー陰性）細胞の絶対数を示す。ノイバウアー計数チャンバを用いて数を計数し、そして、それぞれの刺激条件に対してプロットした。中央細胞数を図８Ｄに示し、エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を示す。図８Ｄは、可溶性Strep-tactin多量体化試薬上に固定化されたαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片の混合物が全て、ＣＤ３＋細胞の拡大において等しく有効であり、そして、絶対細胞数が約４倍増加したことを示す。
【００９０】
実施例６：培地を交換せずに、可逆的ａＣＤ３／ａＣＤ２８Ｆａｂ−Streptamer多量体でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の増殖の動態
この実施例では、可逆的に固定化された可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインであったαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激された精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖の拡大動態を調べた。この目的のために、２つの異なるサイズの可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）ムテインが、可溶性多量体化試薬として機能した。第１の種類のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）は、実施例５で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分であった（本明細書では「従来のStreptactin（登録商標）骨格」とも称する、図１３では先端が上を向いている三角形記号によって示される）。可溶性多量体化試薬として用いた第２の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、ビオチン化ヒト血清アルブミンと反応させたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）であった（本明細書では「大きなStreptactin（登録商標）骨格」とも称する）。
【００９１】
この実施例では、５００．０００個の精製ＣＤ４＋又はＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、上に説明した通りのこれら２つの異なるStreptamer多量体、すなわち、実施例５のStreptactin骨格（１mL当たりオリゴマーストレプトアビジンムテイン １mgの濃度の溶液を用いる）又は大きなStreptactin骨格（０．１mg/mL）のいずれかで別個に刺激した。両方の異なる骨格 ３μLに、上記実施例で用いたαＣＤ３ ０．５μg及びＦａｂ断片の重鎖のＣ末端にストレプトアビジン結合ペプチドSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７）を有するαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードした。更に、従来のStreptactin骨格 ４．５μLに、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ断片（IBA GmbH Gottingen、これもＦａｂ断片のＣ末端にストレプトアビジン結合ペプチドSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７）を有する） ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgをロードした。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、市販のDynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）で刺激したＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地（１０％(v/v)ウシ胎仔血清、０．０２５％(w/v) Ｌ−グルタミン、０．０２５％(w/v) Ｌ−アルギニン、０．１％(w/v) ＨＥＰＥＳ、０．００１％(w/v) ゲンタマイシン、０．００２％(w/v) ストレプトマイシン、０．００２％(w/v) ペニシリンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Gibco）） １mLにデュープリケートで播種した。培地を交換せずに細胞を３７℃でインキュベートし、そして、１、３、及び６日間後に細胞数を解析した。図１３の実験では、培地を交換することなく拡大を実施した。ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１３Ａに示し、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１３Ｂに示し、グラフは、ＣＤ４＋Ｔｒｅｓｐ（図１３Ａ）及び図１３ＢにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐについて時点毎に採取した細胞の数に従って増殖の程度を表す。
【００９２】
図１３Ａから分かる通り、αＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片が可逆的に固定化された「小さな」可溶性多量体化試薬は、Dynabeads（Ｔ細胞の拡大について今までのところ標準的な試薬である）と同じ量のＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大をもたらしたが、一方、「大きな」オリゴマー可溶性streptactinは、Dynabeadと比べて更により優れた拡大をもたらした。この改善は、「小さな」可溶性オリゴマーよりも多くのＴ細胞に同時に結合することができ、その結果、「小さな」オリゴマーよりも多くのＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することができる、可溶性の「大きなオリゴマー多量体化試薬」によって引き起こされた可能性がある。
【００９３】
図１３Ｂから明らかであるように、本発明の可溶性多量体化試薬を用いると、最初の３日間以内は、少なくともDynabeadsと同程度効率的にＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大することができた。なお、この期間において、（第１及び第２の剤として）αＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片に加えてαＣＤ８Ｆａｂ断片が可逆的に固定化された可溶性多量体化試薬を用いた拡大実験は、これら培養条件下で最高の拡大度を示した。これは、細胞の特定の亜集団に特異的な刺激（本明細書ではαＣＤ８Ｆａｂ断片）を用いることによって、拡大の選択性を増大又は調節することが可能であり、その結果、より多くの量の所望の細胞（亜）集団を得ることができることを示す。
【００９４】
したがって、上記を要約すると、実施例６は、Ｔ細胞の拡大をトリガーするという観点で、本発明において用いられる可溶性多量体化試薬の機能が、この目的のためにDynabeadsを用いる現行の標準的な方法論と同等であることを示す。しかし、第１及び第２の剤と多量体化試薬との間のストレプトアビジンに基づく可逆的相互作用の場合、ビオチン等の競合体を添加することによって刺激を制御する（及び必要に応じて終了させる）ことができるので、本発明は、Dynabeads技術よりも大きな利点を提供するが、その理由は、拡大条件を最適化できるためである（例えば、３日間後、図１３Ｂの実験において刺激を停止することができるだろう）。更に、可溶性多量体化試薬は、（例えば、拡大反応後、ビオチン化カラムに該試薬を固定化することによって）反応物から容易に除去することができるので、本発明の拡大方法は、例えば、Dynabeads等のビーズの除去に対処する必要なく、処置目的のために細胞のＧＭＰ生成に必要な閉鎖系において実施及び自動化することができる。
【００９５】
実施例７：培地を交換して、可逆的ａＣＤ３／ａＣＤ２８Ｆａｂ−Streptamer多量体でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の増殖の動態
この実施例でも、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激された精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖の拡大動態を調べた。この目的のために、２つの異なるサイズの可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）ムテインが、可溶性多量体化試薬として機能した。第１の種類のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）は、実施例５で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）の画分であった（本明細書では「従来のStreptactin（登録商標）骨格」とも称する、図１３では先端が下を向いている三角形記号によって示される）。可溶性多量体化試薬として用いた第２の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、実施例５で得られたオリゴマーStrep-tactin（ｎ≧３）とビオチン化ヒト血清アルブミンとを反応させることによって得られた。この可溶性オリゴマー多量体化試薬は、本明細書では「大きなStreptactin（登録商標）骨格とも称する。
【００９６】
この実施例では、４００．０００個の精製ＣＤ４＋又はＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、上に説明した通りのこれら２つの異なるStreptamer多量体、すなわち、実施例５のStreptactin骨格（１．０mg/mL）又は大きなStreptactin骨格（０．１mg/mL）のいずれかで別個に刺激した。両方の異なる骨格 ３μLに、上記αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgの組み合わせをロードした。更に、実施例５のStreptactin骨格 ４．５μLに、上記αＣＤ３ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgをロードした。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されている）で刺激したＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種した。細胞を３７℃でインキュベートし３日目に培地を交換して、そして、１、３、及び６日間後に細胞数を解析した。ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１４Ａに示し、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞についての結果を図１４Ｂに示し、グラフは、ＣＤ４＋Ｔｒｅｓｐ（図１４Ａ）及び図１４ＢにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐについて時点毎に採取した細胞の数に従って増殖の程度を表す。
【００９７】
図１４Ａから分かる通り、αＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片が可逆的に固定化されている本発明の可溶性多量体化試薬は、Dynabeadsよりも優れたＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大をもたらした。
【００９８】
図１４Ｂから明らかであるように、本発明の可溶性多量体化試薬を用いると、最初の６日間以内は、少なくともDynabeadsと同程度効率的にＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大することができた。なお、この期間において、（第１及び第２の剤として）αＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片を有する大きな可溶性多量体化試薬を用いた拡大実験は、これら培養条件下で最高の拡大度を示した。これも、「小さな」可溶性オリゴマーよりも多くのＴ細胞に同時に結合することができ、その結果、「小さな」オリゴマーよりも多くのＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することができる、可溶性の「大きなオリゴマー多量体化試薬」によって引き起こされた可能性がある。
【００９９】
実施例８：培地を交換した又は交換しない精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞培養物の拡大動態
この実施例では、「小さな」可溶性多量体化試薬並びにポジティブ及びネガティブコントロールについて、実施例６及び７の統合データを入力細胞数に対して正規化した。「大きな」多量体化試薬の正規化データは得られなかった。実施例６及び７に説明した通り、４００．０００〜５００．０００個のＣＤ４＋又はＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、Streptactin多量体の調製品（１mg/mL；αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgが固定化されている） ３μLで刺激した。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsで刺激したＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種した。細胞を３７℃でインキュベートし３日目に培地を交換して（図１５における直線）又は培地を交換せずに（図１５における破線）、そして、１、３、及び６日間後に細胞数を解析した。図１５Ａの正規化データから明らかであるように、αＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片が可逆的に固定化された「小さな」可溶性多量体化試薬からは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が約２．５倍拡大されたが、一方、Dynabeadsを用いた拡大では、約１．８倍の拡大率が得られた。したがって、本発明の可溶性多量体化試薬の使用は、更に、DynabeadsよりもＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大を改善する。同様に、図１５Ｂは、本発明の可溶性多量体化試薬を用いると、最初の３日間以内は、少なくともDynabeadsと同程度効率的にＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大することができたことを確認する。
【０１００】
実施例９：可逆的ａＣＤ３／ａＣＤ２８Ｆａｂ−Streptamer多量体でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の活性化後の早期クラスタ形成
この実施例では、４００．０００個のＣＤ４＋又はＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたオリゴマーStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL）３μLで刺激した。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsで刺激したＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種した。細胞を３７℃でインキュベートし、そして、１及び２日間後に顕微鏡で解析した。それぞれ、Dynabeads（中央の列）及びStreptamer多量体（下の列）について、ＣＤ４＋Ｔｒｅｓｐ（図１６Ａ）及びＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐ（図１６Ｂ）の刺激を示す。写真は、クラスタ形成の程度を表す：見やすくするために、図１６Ａ及び図１６Ｂでは、可溶性ストレプトアビジンムテインオリゴマーによる刺激についての例示的なクラスタを円で示す。Dynabead刺激におけるクラスタは、濃い色の刺激粒子の蓄積によって容易に視認される。明らかであるように、可溶性オリゴマー多量体化試薬を使用する本発明の拡大方法を用いたとき、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において早期にクラスタが形成された。
【０１０１】
実施例１０：ポリクローナル活性化／拡大されたバルクＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）の拡大動態及び表現型
この実施例では、５００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、αＣＤ３ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードした実施例５の可溶性オリゴマーStreptactinの調製品（１mg/mL）３μLで刺激した。更に、αＣＤ３ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactin多量体の調製品 ４．５μLを更なる刺激条件として用いた。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されている）で刺激したＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２のみ又は３０U/mL ＩＬ−２及び５ng/mL ＩＬ−１５を添加した細胞培養培地 １mLに播種した。３日間毎に培地を交換しながら細胞を３７℃でインキュベートし、そして、７及び１４日間後に細胞数を解析した。グラフは、図１７ＡではＩＬ−２のみを添加した培地、そして、図１７ＢではＩＬ−２及びＩＬ−１５を添加した培地における、時点毎に採取した細胞数に従って増殖の程度を示す。図１７Ａ及び図１７Ｂの両方から分かる通り、ＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片が可逆的に固定化されている可溶性多量体化試薬からは、Dynabeadsよりも優れた細胞拡大が得られた。図１７Ｃの可変サイトカイン環境中で１４日間培養した後のＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現のフローサイトメトリー分析によって更に示される通り、本発明の可溶性多量体化試薬を用いる実験アプローチでは、本明細書で選択した両条件下において、ＣＤ１２７を発現する長寿命メモリーＴ細胞の含量がDynabeadsを用いた拡大よりも高く保持される。これは、本発明の方法の更なる利点を示す。
【０１０２】
実施例１１：バルクＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞からのレスポンダーＴｃｍ細胞の選択的抗原特異的拡大（動態及び表現型）
この実施例では、精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞からの選択的抗原特異的（Ａｇ特異的）拡大の動態及び表現型について調べた。
【０１０３】
より詳細には、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞を、ペプチド：ＭＨＣ分子複合体（細胞に一次活性化シグナルを提供する第１の剤として作用）及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片（細胞の表面上のアクセサリ分子を刺激する第２の試薬として作用）の両方でインビトロにおいて刺激した。抗原特異的ペプチドとＭＨＣ分子との複合体及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片はいずれも、実施例５に記載の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン（ｎ≧３）上に可逆的に固定化されていた。抗原特異的拡大のために用いたペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なＨＬＡ−Ｃ７／ＩＥ−１エピトープを表す前初期１タンパク質（Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, e1003383に記載）のアミノ酸３０９〜３１７であるペプチドCRVLCCYVL（配列番号０６）であった。このペプチドを提示するＭＨＣ  Ｉ分子は、α鎖（重鎖）のＣ末端に、ストレプトアビジン結合ペプチド（IBA GmbH, Gottingen, Germanyから「Twin-Strep-tag（登録商標）」として市販されているSAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK（配列番号０７））を有する。
【０１０４】
この目的のために、５００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、ストレプトアビジン結合ペプチドを備えるペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg及び上記αＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化した可溶性オリゴマーStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μLを用いてＡｇ特異的に刺激した。代替例として、Streptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μLに、これらペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg、ＣＤ８αＦａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードした。比較のために、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL）３μLを用いて、ポリクローナル刺激を実施した。更に、上記刺激条件の代替例として、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgを可逆的にロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μLを用いた。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）でポリクローナル刺激されたＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２及び５ng/mL ＩＬ−１５を添加した細胞培養培地 １mLに播種した。３日間毎に培地を交換しながら細胞を３７℃でインキュベートし、そして、７及び１４日間後に細胞数を解析した。（ＣＭＶの）HLA-C7/IE-1エピトープのためのペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体が固定化された可溶性strept-tactinオリゴマーを介して刺激／拡大したＡｇ特異的細胞の画分についての例示的なフローサイトメトリー分析（図１８Ａ）は、これら抗原特異的Ｔ細胞が特異的に拡大されたことを示す。（図１８Ａに示した拡大実験と同様に、時点毎に採取したペプチド：ＭＨＣＩ多量体陽性細胞の数に従って、異なるＡｇ特異性の拡大の程度を表す）図１８Ｂ〜図１８Ｅのグラフは、Ａｇ特異的ペプチド及びＭＨＣ１分子のそれぞれの複合体を用いた多量体化試薬が最大数の拡大細胞を提供することを示し（HLA-A2402によって制限されるＣＭＶのｐｐ６５エピトープ（アミノ酸３４１〜３５０（QYDPVAALF（配列番号０８））を認識するＡｇ特異的細胞の細胞数の２０倍増加（図１８Ｂを参照）から、ＣＭＶのHLA-B7/IE-1309-317エピトープ（CRVLCCYVL（配列番号０６））を認識するＡｇ特異的細胞の数の９８倍増加（図１８Ｅを参照）に及ぶ）、それによって、本発明の拡大方法がＡｇ特異的細胞の拡大に十分に適用可能であることを示す。最後に、図１８Ｆに示す（アデノウイルスの）ＨＬＡ−Ｂ７/Hexon5エピトープを１４日間培養した後のＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の表面発現の例示的なフローサイトメトリー分析は、更に、本発明の可溶性多量体化試薬を用いる実験アプローチが、ポリクローナルかつＡｇ特異的な刺激条件において、ＣＤ１２７を発現する長寿命メモリーＴ細胞の含量をより高く保持することを確認する。
【０１０５】
実施例１２：バルクセントラルメモリーＴ細胞の選択的Ａｇ特異的拡大動態及び表現型
この実施例は、ａ）抗原特異的ペプチドＭＨＣ  Ｉ複合体及びｂ）可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に第１及び第２の剤として可逆的に固定化されたαＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞からの選択的Ａｇ特異的拡大の動態について調べる。
【０１０６】
この目的のために、５００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、ストレプトアビジン結合ペプチド（特異的ペプチドは、HLA-B07によって制限されるアデノウイルスのHexon5タンパク質のアミノ酸１１４〜１２４（CPYSGTAYNSL、配列番号１０）を表す）を備えるペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化されたStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μLを用いてＡｇ特異的に刺激した。代替例として、Streptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μLに、このペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードした。比較のために、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL） ３μLを用いて、ポリクローナル刺激を実施した。更に、上記刺激条件の代替例として、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactin多量体の調製品 ４．５μLを用いた。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsでポリクローナル刺激されたＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２及び５ng/mL ＩＬ−１５を添加した細胞培養培地 １mLに播種した。３日間毎に培地を交換しながら細胞を３７℃でインキュベートし、そして、７及び１４日間後に細胞数を解析した。図１９に示す写真は、５日目におけるクラスタ形成の程度を表し、アデノウイルスのHLA-B7/Hexon5エピトープについての例示的なＡｇ特異的刺激が示される。図１９から分かる通り、元のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ集団からこのようなアデノウイルス抗原特異的細胞を特異的に拡大することができた。
【０１０７】
実施例１３：拡大されたＣＤ８＋Ｔ細胞の収量及び表現型−可溶性多量体化試薬のサイズ変動及び刺激のためのαＣＤ８−Ｆａｂ添加物の添加
この実施例では、可逆的に固定化されている可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインであったαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の拡大について調べた。更に、ＣＤ８＋Ｔ細胞についての拡大の特異性を増大させるために多量体化試薬にαＣＤ８Ｆａｂを添加した効果について調べた。
【０１０８】
この目的のために、３００．０００個の精製ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、２つの異なるStreptactinに基づく可溶性多量体化試薬、すなわち、実施例５の小さなオリゴマーStreptactin多量体化試薬（１mg/mL）又は上記大きなStreptactinオリゴマー（０．１mg/mL）で別個に刺激した。両方の異なる多量体化試薬（骨格） ３μLに、上記αＣＤ３ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgの組み合わせをロードした。更に、小さなStreptactin多量体化試薬（骨格） ４．５μLに、上記αＣＤ３ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgをロードした。更に、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μgのみ又はαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgのみで機能化された「小さな」Streptactin多量体化試薬（骨格） ３μLのみを用いた。非刺激Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsで刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種した。細胞を３７℃でインキュベートし３日間後に培地を交換して、そして、６日間後に解析した。図２０Ａは、ネガティブコントロールと比較し、そして、ポジティブコントロールに対して正規化した、６日目に採取した細胞数に従って増殖の程度を表す。図２０Ａは、本発明の可溶性多量体化試薬を用いるＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大によって、dynabeadsを用いる拡大よりも高収量のＣＤ８＋Ｔ細胞が得られることを示す。細胞培養後のＣＤ８の表面発現（図２０Ｂ）及びＣＤ４５ＲＯの表面発現（図２０Ｃ）のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の同じ表現型が、本発明の多量体化試薬又はDynabeadsのいずれによっても拡大されたことを示す（一方向分散分析を用いて様々な刺激条件を比較したところ、有意差（n.s.）は検出されなかった）。Dynabeadsに比べて本発明の拡大方法を用いたＣＤ８＋細胞の収量の改善は、可溶性多量体化試薬がDynabeads上に固定化されている抗体よりも、細胞表面上の標的受容体によりアクセスしやすくなり得るという事実によるものである可能性がある。この改善された収量は、初期サンプルから稀な細胞の集団を拡大するとき、非常に有利になり得る。
【０１０９】
更に、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgの両方が一緒に固定化されている多量体化剤を用いて得られた拡大の収量（図２０Ｂ中左から２番目の列）をαＣＤ３Ｆａｂ断片のみ又はαＣＤ２８Ｆａｂ断片のみを用いて機能化した２つの多量体化試薬を用いた収量（図２０Ｂ中左から３番目の列）と比較したところ、両実験が同じ拡大効率を有していたことが分かる。したがって、これら実験は、第１の剤及び第２の剤の両方が一緒に固定化されている１つの多量体化試薬の使用は、それぞれ、第１の剤及び第２の剤のみをロードした２つの別個の多量体化試薬の拡大のための使用と機能的に等価であることを示す。
【０１１０】
実施例１４：拡大されたＣＤ８＋Ｔ細胞の収量及び表現型−様々な比のαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片が固定化されている別個の可溶性多量体化試薬の滴定
この実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に様々な量で可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した、拡大されたＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の収量及び表現型について調べた。
【０１１１】
この目的のために、３００．０００個のＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、様々な量の、αＣＤ３Ｆａｂのみ及びαＣＤ２８Ｆａｂのみで機能化した「小さな」オリゴマーStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL）の混合物（「１×」は、αＣＤ３ ０．５μgのみで機能化されたStreptactin多量体化試薬 １．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgのみで機能化された多量体化Streptactin １．５μgに相当する）、又はαＣＤ３ ０．５μg及びＣＤ２８Ｆａｂ α０．５μgをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μL、又はαＣＤ３ ０．５μg、strepタグ付αＣＤ８ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μLで刺激した。未処理Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeadsで刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLに播種した。培地を交換することなく細胞を３７℃でインキュベートし、そして、５日間後に解析した。図２１Ａは、ネガティブコントロールと比較し、そして、ポジティブコントロールに対して正規化した、５日目に採取した細胞数に従って増殖の程度を表す。図２１Ａは、本発明の様々な可溶性多量体化試薬を用いるＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大によって、dynabeadsを用いる拡大よりも高収量のＣＤ８＋Ｔ細胞が得られることを示す（特に、５×条件の累積合計試薬量によって、特に経時的に細胞の最適な拡大が生じ／細胞分裂を開始させることによって合計細胞が増加した）。細胞培養後のＣＤ８の表面発現（図２１Ｂ）及びＣＤ４５ＲＯの表面発現（図２１Ｃ）のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の同じ表現型が、本発明の様々な多量体化試薬又は市販されているDynabeadsのいずれかによって拡大されたことを示す。
【０１１２】
実施例１５：ａＣＤ１９−ＣＡＲが形質導入されたJurkat細胞のStreptamer多量体による刺激後の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化
この実施例では、腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、すなわちここではＣＤ１９を発現するように改変され、そして、可溶性多量体化試薬として実施例５のオリゴマーStrep-tactin（登録商標）を用いて刺激した、形質導入されたJurkat細胞の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化について調べた。
【０１１３】
この目的のために、３００．０００個のJurkatレスポンダー細胞（Ｊｒｅｓｐ）を、（Ａ）様々な量の、本明細書に記載のαＣＤ３Ｆａｂ及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片で機能化されたStreptactin多量体化試薬の調製品（１mg/mL）の混合物（「×１」は、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化されたStreptactin多量体化試薬 ３μgに相当する、これは、「ポリクローナルなStreptactinに基づく多量体化試薬」を提供する）、あるいは（Ｂ）ＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ） ０．５μg（×１）若しくは１μg（×２）で機能化されたStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μL（αＣＤ１９−ＣＡＲの天然リガンド、これは、「ＣＡＲ特異的なStreptactinに基づく可溶性多量体化試薬」を提供する）、又はαＣＤ１９−ＣＡＲ内のＩｇＧ４スペーサーを認識するαＩｇＧ ０．５μg（×１）若しくは１μg（×２）をロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品 ３μL（これも「ＣＡＲ特異的なストレプトアビジンムテインに基づく多量体化試薬」を提供する）で刺激した。ヘキサヒスチジンタグを備えるＣＤ１９のＥＣＤは、Sino Biological/Life technologiesから入手し（配列番号２７）、そして、１：１の分子比でＣＤ１９のＥＣＤをアダプタ分子His-STREPPER（IBA GmbH, Germany、注文番号2-0920-005）と混合し、そして、室温で１５分間インキュベートすることによって、ストレプトアビジンに基づく多量体化試薬に結合させるために機能化した。His-STREPPERアダプタ分子は、ヘキサヒスチジンタグ及びストレプトアビジン結合ペプチドに結合するキレート部分を含有し、それによって、一時的に標的分子、本明細書では、ストレプトアビジンムテインに基づく多量体化試薬に可逆的に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドを有するＣＤ１９のＥＣＤを提供する。Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）、又はポジティブコントロールとして機能するＰＭＡ及びイオノマイシンでＪｒｅｓｐを刺激した。Ｊｒｅｓｐ細胞を、１．５mL Eppendorfチューブ中の、３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 ２００μLに播種した。細胞を３７℃でインキュベートし、そして、０分間〜２０分間刺激した後、氷上に置き、そして、溶解させた。リン酸化ＥＲＫの検出は、活性ＭＡＰＫのシグナル伝達を示し、ハウスキーパーβ−アクチンの染色は、条件及び時間当たり等量の合計タンパク質がロードされたことを示す。「ポリクローナルStreptactin多量体化試薬」を介したJurkat細胞の活性化を示す図２２Ａと２つの「ＣＡＲ特異的なStreptactinに基づく多量体化試薬」を介したJurkat細胞の活性化を示す図２２Ｂとの比較から分かる通り、Jurkat細胞は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体に対するＣＤ１９細胞外ドメインの結合を介して活性化／拡大され得る。Ｔ細胞の遺伝的下流プロセシングは、ほとんど予め選択された細胞集団に対してのみ実施されるので、ＩｇＧ４スペーサードメイン（これは、異なる特異性を有する様々なＣＡＲ内で保存されている）を介して導入されたＣＡＲの架橋を介した包括的な活性化は、これらインビトロにおける細胞プロセシング状況における可逆的な細胞刺激／拡大のための適用範囲を広げる。
【０１１４】
したがって、この実験は、原則として、細胞集団に一次活性化シグナルを提供する剤（リガンド）の結合によって活性化される任意の細胞集団を、上記の通り多量体化試薬上に可逆的に固定化されている第１の剤を用いて拡大できることを示す。
【０１１５】
実施例１６：刺激のためにαＣＤ８−Ｆａｂを添加した、拡大されたＣＤ３＋Ｔ細胞の収量及びサブセット組成
この実験は、可溶性多量体化試薬として機能する実施例５の可溶性オリゴマーStrep-tactin（登録商標）上に可逆的に固定化されたαＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片でインビトロにおいて刺激した精製ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞の拡大を示す。１つの実験では、可逆的ａＣＤ３／ａＣＤ２８Ｆａｂ−Streptamer多量体でインビトロにおいて特異的Ｔ細胞亜集団を優先的に刺激することが可能であるかどうかを試験するために、αＣＤ３／αＣＤ２８Ｆａｂ断片に加えて、IBA GmbH, Gottingen, Germanyから市販されているαＣＤ８Ｆａｂ断片（カタログ番号6-8000-203）をストレプトアビジンムテインの可溶性オリゴマー上に固定化した。より詳細には、５００．０００個の精製ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、αＣＤ３ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードしたオリゴマーストレプトアビジンの調製品（１mg/mL） ３μLで刺激した。代替アプローチとして、Streptactinオリゴマー ４．５μLにαＣＤ３ ０．５μg、strepタグ付αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びstrepタグ付αＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードした。未刺激Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３及びαＣＤ２８モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ）で刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能した。図２３Ａから分かる通り、αＣＤ３Ｆａｂ断片、αＣＤ２８Ｆａｂ断片、そして、αＣＤ８Ｆａｂ断片も可逆的にロードした多量体化試薬は、最大数の拡大されたＣＤ３＋Ｔ細胞を提供した。拡大された細胞数は１×１×１０６であり、収量は、市販されているDynabeadsを用いたＴ細胞の拡大よりも約３０％高かった。更に、そして、より重要なことに、図２３Ｂに示す通り、αＣＤ３Ｆａｂ断片、αＣＤ２８Ｆａｂ断片、及びαＣＤ８Ｆａｂ断片を有するこの多量体化試薬を用いた場合、Dynabeads、又は本明細書に記載する第１の剤及び第２の剤としてαＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片のみを有する本発明の可溶性多量体化試薬を用いた両拡大と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の量が最も多かった。したがって、この実験も、所望の細胞集団に一次活性化シグナルを提供する第１の剤、任意で、共刺激シグナルを提供する第２の剤に加えて、所望の細胞集団の活性化に特異的な更なる剤を多量体化試薬上に固定化することができるという本発明の利点を示す。したがって、このようにすることによって、本発明は、例えば、様々な異なる亜集団を含むサンプルから任意の所望の細胞（亜）集団を優先的に拡大又は選択的に濃縮する可能性を提供する。
【０１１６】
実施例１７：単一のプールからのレスポンダーＴｃｍ細胞の平行抗原特異的拡大 
この実施例では、複数の可逆的ペプチド：ＭＨＣ／αＣＨ２８Ｆａｂ−Streptamer多量体でインビトロにおいて刺激したレスポンダーＴ細胞の単一のプールからの平行抗原特異的（Ａｇ特異的）拡大の動態について調べる。
【０１１７】
５００．０００個のＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−レスポンダーＴｃｍ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、各特異性について、ストレプトアビジン結合ペプチドを有するそれぞれのペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg及び同様にストレプトアビジン結合ペプチドを有するαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化したStreptactin多量体 ３μLを用いて複数のＡｇ特異性について同時に刺激する。代替アプローチとして、各特異性について、本明細書に記載するストレプトアビジン結合ペプチドを有するペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体 ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgで機能化したStreptactinに基づく多量体化試薬 ４．５μLを用いる。比較のために、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせを可逆的にロードした、Streptactinに基づく多量体化試薬の調製品（１mg/mL） ３μLを用いて、ポリクローナル刺激を実施する。同様に、上記刺激条件の代替として、αＣＤ３Ｆａｂ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μg（それぞれストレプトアビジン結合ペプチドを有する）を可逆的にロードしたStreptactinに基づく多量体化試薬の調製品 ４．５μLを用いてもよい。未処理（非刺激）Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３ｍＡｂ及びαＣＤ２８ｍＡｂでコーティングされたビーズ）でポリクローナル刺激されたＴｒｅｓｐ細胞は、ポジティブコントロールとして機能する。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２及び５ng/mL ＩＬ−１５を添加した細胞培養培地 １mLに播種する。３日間毎に培地を交換しながら細胞を３７℃でインキュベートし、そして、７及び１４日間後に細胞数を解析する。
【０１１８】
実施例１８：αＣＤ３／αＣＤ８／αＣＤ２８Ｆａｂ断片で可逆的に機能化されたストレプトアビジンに基づく多量体化試薬でインビトロにおいて刺激されたＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的増殖
３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、αＣＤ３ ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgの組み合わせをロードした大きなStreptactin骨格（０．１mg/mL）を用いるStreptactin多量体化の調製品（１mg/mL）又は多量体化試薬の調製品 ３μL、あるいはαＣＤ３ ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgをロードしたStreptactinに基づく多量体化試薬の調製品 ４．５μL、あるいはαＣＤ３Ｆａｂ ０．５μgのみ及びαＣＤ２８Ｆａｂ ０．５μgのみ（各Ｆａｂ断片は、同様に、ストレプトアビジン結合ペプチドを有する）を有するStreptactinに基づく多量体化試薬の調製品の混合物 ３μLで刺激する。未処理Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３ｍＡｂ及びαＣＤ２８ｍＡｂでコーティングされたビーズ）で刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能する。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLにデュープリケートで播種する。細胞を３７℃でインキュベートし３日間後に培地を交換して、そして、６日間後に解析する。
【０１１９】
実施例１９：αＣＤ３及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片で可逆的に機能化されたストレプトアビジンに基づく多量体化試薬でインビトロにおいて刺激されたＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的増殖
３００．０００個のＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、様々な量の、αＣＤ３Ｆａｂ断片のみ及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片のみで機能化されたStreptactinに基づく多量体化試薬の調製品（１mg/mL）の混合物（αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μgのみで機能化されたStreptactinに基づく多量体化試薬 １．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgのみで機能化されたStreptactinに基づく多量体化試薬 １．５μg）、又は様々な量の、αＣＤ８Ｆａｂ断片を用いて又は用いずに、αＣＤ３Ｆａｂ断片及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片で機能化されたStreptactinに基づく多量体化試薬の調製品の混合物（各Ｆａｂ断片は、同様にストレプトアビジン結合ペプチドを有する）（αＣＤ８Ｆａｂ断片を用いずに、αＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgで機能化されたStreptactinに基づく多量体化試薬 ３μg、又はαＣＤ３Ｆａｂ断片 ０．５μg、αＣＤ８Ｆａｂ断片 ０．５μg、及びαＣＤ２８Ｆａｂ断片 ０．５μgをロードしたStreptactin多量体化試薬の調製品 ４．５μL（該Ｆａｂ断片は、同様に、ストレプトアビジン、結合ペプチドを有する）で刺激する。未処理Ｔｒｅｓｐ細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、そして、Dynabeads（αＣＤ３ｍＡｂ及びαＣＤ２８ｍＡｂでコーティングされたビーズ）で刺激されたＴｒｅｓｐは、ポジティブコントロールとして機能する。Ｔｒｅｓｐ細胞を、４８ウェルプレート中の３０U/mL ＩＬ−２を添加した細胞培養培地 １mLに播種する。細胞を３７℃でインキュベートし３日間後に培地を交換して、そして、６日間後に解析する。
【０１２０】
この明細書における既に公開されている文書の一覧又は考察は、必ずしも、該文書が当技術分野の現状の一部であるか、又は周知の一般的な知識であることを認めると解釈すべきではない。
【０１２１】
本明細書に例証として記載される発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、限定の非存在下で好適に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」等は、拡大的に、そして、限定することなく読むものとする。更に、本明細書で使用する用語及び表現は、説明のための用語として用いられ、限定するものではなく、そして、このような用語及び表現の使用は、図示及び記載されている特徴又はその一部の任意の等価物を除外することを意図するものではなく、請求する本発明の範囲内で様々な改変例が可能であると認識される。したがって、本発明は例示的な実施態様及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示する、本明細書で具現化される本発明の改変例及び変形例は、当業者によって再分類することができ、また、このような改変例及び変形例は、本発明の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。
【０１２２】
本発明は、本明細書において広く、一般的に記載されている。一般的な開示内のより狭い種及び亜属の分類も、それぞれ、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、属から任意の発明主題を除去する条件又は負の限定と共に本発明の一般的な記載を含む。
【０１２３】
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。更に、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群として記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーの部分群としても記載されることを認識する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
2020124210000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月23日(2020.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020124210000001.pdf