(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞療法のためのＮＫ細胞の集団を製造するための、ＮＫ細胞の体外での増幅効率を改善し、ＮＫ細胞のライセンシングに必要なシグナルを柔軟に増やす、有効な方法の提供。【解決手段】複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理増殖上有効な条件、例えばＮＫ細胞の増殖に適した培地を用いてインキュベート培養し、ＮＫ細胞を増殖させることを含む、ＮＫ細胞を含む細胞集団の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、
準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートする
ことを含む、ＮＫ細胞を含む細胞集団の製造方法。
【請求項２】
単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３４陽性細胞を除去する工程を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取された末梢血から単核細胞の集団を得る工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取されたアフェレーシス血液から単核細胞の集団を得る工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーに由来する、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び成体幹細胞からなる群より選択されるいずれかに由来する単核細胞の集団を準備するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
複数のドナーが、一のドナーと、それとはＨＬＡ及びＫＩＲの少なくとも一方において遺伝子型が異なる他のドナーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
以下の特徴を備える、ＮＫ細胞を含む細胞集団：
（１）複数のドナーに由来する。
（２）ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
【請求項１１】
感染症及び／又はがんを治療するための、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む細胞集団の製造方法とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は国民の死亡原因の１位であり、その対策が急務とされている。特に、外科手術、放射線治療及び化学療法からなる既存の治療方法に抵抗性である進行期難治性悪性腫瘍に対する新しい治療方法の開発は、極めて重要で意義がある。近年、第４の治療方法として、免疫チェックポイント阻害剤やキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor, CAR）遺伝子改変Ｔ細胞を用いた療法（ＣＡＲ−Ｔ療法）といった免疫療法が注目を集めている。しかし、その多くが抗原を認識することにより活性化されるＴ細胞をエフェクターとしているために特異抗原への拘束性という根源的な壁がある。
【０００３】
自然免疫の主要因子として働くＮＫ細胞を用いる免疫療法として、ＮＫ細胞を体外で増殖させた後、患者に投与するＮＫ細胞療法が、副作用の比較的少ない治療方法として注目されている。しかし、ＮＫ細胞は末梢血等から得られる数が比較的少ない上に体外での増殖性が低い。そのためＮＫ細胞を培養し、増殖させるための技術が検討されてきた。例えば特許文献１は、ＮＫ細胞を含む細胞集団を調製するステップと、前記ＮＫ細胞を含む細胞集団からＴ細胞を除去するステップと、除去された残りの細胞をＩＬ−２だけをサイトカインとして含む培地でフィーダー細胞を用いることなく培養するステップとを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の増幅方法、及び増幅により得られたＮＫ細胞を含む細胞集団を含有する、細胞療法のための医薬組成物を提案する。また特許文献２は、造血前駆細胞を、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌを含む単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞を、ＩＬ−２を含む培養条件下５、６、7、８又は９日間でＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む、ＮＫ細胞の調製方法、並びに調製されたＮＫ細胞を含む細胞集団を含有する、細胞療法のための医薬組成物を提案する。
【０００４】
また本発明者らは、腫瘍細胞傷害活性を高めた培養細胞として、ＣＤ１６陽性、ＣＤ５６高発現性、かつＣＤ５７陰性であり、かつＮＫＧ２Ｃ陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、及びＣＤ９４陽性であるＮＫ細胞、及びそのＮＫ細胞を含む細胞集団（特許文献３）を報告し、またケモカインレセプターと細胞接着分子を発現するＣＤ３陰性細胞について報告してきた（特許文献４）。
【０００５】
一方、ＮＫ細胞の細胞表面上には、ＨＬＡクラスＩを認識する受容体群が発現している。これら受容体のうち、ＫＩＲ（Killer cell Immunoglobulin-like Receptor）ファミリーはＨＬＡと同様に多様性を有する。造血幹細胞移植においては、ＨＬＡをできる限りマッチさせるのではなく、最近ではドナーＮＫ細胞のＫＩＲに対するリガンドをレシピエントがもたないようにドナーを選ぶこと等、ドナー・レシピエント間の意図的なＫＩＲ／ＨＬＡミスマッチが、再発、ＧＶＨＤ（graft versus host disease、移植片対宿主病）及び予後の観点からより望ましい結果をもたらしうるとして有効に利用されつつある。しかし、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性に関しては、ＮＫ細胞を、抑制性ＫＩＲリガンドに関して一致又はミスマッチ（ＮＫ細胞ドナーに存在する１つ以上のリガンドが欠如している）のいずれかのフィーダー細胞と共に培養し、ＨＬＡクラスＩ−ＫＩＲ相互作用が同種異系環境におけるヒトＮＫ細胞増殖にどの程度影響するかを調べた報告（非特許文献１）からは、抗腫瘍効果を指標にＮＫ細胞の高活性化を望む場合、ＫＩＲからのシグナルは少ないほうがよいことが示唆される。また、近年の、ＨＬＡハプロタイプホモ接合型（ＨＬＡホモ）ｉＰＳ細胞由来の組織に対するＨＬＡヘテロＮＫ細胞（一方向適合の場合）の同種応答性に関する報告（非特許文献２）は、ＮＫ細胞の培養に関し、ＨＬＡ／ＫＩＲミスマッチを含む混合培養が成立しないことを強く示唆するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2013-27385号公報（特許第5572863号、特許第5989016号）
【特許文献２】特開2014-226079号公報（特許第5511039号、特許第6164650号）
【特許文献３】特開2018-193303号公報
【特許文献４】特願2018-059624号出願明細書（本願出願時には未公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mingus J. J. Rose et al., Killer Ig-Like Receptor Ligand Mismatch Directs NK Cell Expansion In Vitro, The Journal of Immunology, 2009, 183: 4502-4508.
【非特許文献２】Hiroshi Ichise et al., NK Cell Alloreactivity against KIR-Ligand-Mismatched HLA-Haploidentical Tissue Derived from HLA Haplotype-Homozygous iPSCs, Stem Cell Reports, 2017, 9: 853-867,
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、活性の高いＮＫ細胞を含む細胞集団の開発を進めている。しかし、原料である末梢血やアフェレーシス法で得られる血液の量には限界があるため、治療用のＮＫ細胞集団を将来の治療に備えてoff-the-shelf化しておくことができない。
【０００９】
一方、本発明者らの検討によると、ドナーによってはＮＫ細胞の体外での増幅効率が極めて悪い場合がある。
【００１０】
さらに、体内であれば骨髄中の造血幹細胞から分化する過程において、リガンド（ＨＬＡクラスＩ）との結合を経験した未熟ＮＫ細胞が「ライセンス」され、成熟後に自己ＨＬＡクラスＩの発現が低下した細胞を検知する「missing-self応答」の能力を備えると考えられているが、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から分化成熟させたＮＫ細胞はライセンスに必要なシグナルが抗腫瘍効果を得るには十分でない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下を提供する。
［１］複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、
準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートする
ことを含む、ＮＫ細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程を含む、１に記載の製造方法。
［３］単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３４陽性細胞を除去する工程を含む、１又は２に記載の製造方法。
［４］単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取された末梢血から単核細胞の集団を得る工程を含む、１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取されたアフェレーシス血液から単核細胞の集団を得る工程を含む、１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーに由来する、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び成体幹細胞からなる群より選択されるいずれかに由来する単核細胞の集団を準備するものである、１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］複数のドナーが、一のドナーと、それとはＨＬＡ及びＫＩＲの少なくとも一方において遺伝子型が異なる他のドナーを含む、１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］以下の特徴を備える、ＮＫ細胞を含む細胞集団：
（１）複数のドナーに由来する。
（２）ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
［９］１〜７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
［１０］８に記載の細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
［１１］感染症及び／又はがんを治療するための、９又は１０に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
原料となる血液又はＰＢＭＣを複数人分混合することができるため、原材料量を増やすことができ、off-the shelf化が期待できる。
【００１３】
ドナーに拠らず安定してＮＫ細胞を増殖でき、また増殖率を向上できる。
【００１４】
ＨＬＡ−ＫＩＲマッチングの多様化に対応可能となり、安定した活性化が期待できる。
【００１５】
ＮＫ細胞のライセンシングに必要なシグナルを柔軟に増やすことが可能となり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞由来のＮＫ細胞集団の抗腫瘍効果の改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】培養試験：複数人分のＰＢＭＣから、それぞれＣＤ３陽性細胞を除去し、ＫＢＭ−５０１培地を用いて１４日間培養した。
【図２】実験結果のまとめ（左）と統計解析（右）：混合培養を行うと、単独ドナー由来の培養と比較して優位に増殖率が向上した。
【図３】腫瘍細胞傷害活性試験：混合培養と単独ドナー由来培養とで作成したＮＫ細胞の傷害活性を、ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞株）に対する傷害を指標に評価した。
【図４−１】５００ｃｍ2培養バッグによる培養。培養開始から３０分後、及び培養9日目に、バッグを裏返す作業を行った。
【図４−２】培養試験。凍結アフェレーシス血液（２ドナー分）を材料とし、自動閉鎖系細胞処理装置を用いてＣＤ３陽性細胞及びＣＤ３４陽性細胞を除去後、Ｔ７５フラスコ又は５００ｃｍ2培養バッグを用い、ＫＢＭ−５０１培地を用いて１４日間培養した。
【図５】単球／ＮＫ細胞swapping実験：ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１からのシグナルが一方又は両方入る条件の場合にＣＤ１６highの集団が増えた。ＣＤ１６highの集団は、より高いＡＤＣＣ活性が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＮＫ細胞を含む細胞集団に関する。
【００１８】
［細胞集団の製造］
本発明のＮＫ細胞を含む細胞集団は、次の工程を含む方法で製造することができる：
複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、
準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートする。
【００１９】
（複数ドナーに由来する、単核細胞の集団の準備）
本発明の細胞集団は、複数のドナーに由来する単核細胞の集団から得られる。ここでいう単核細胞の集団は、ＮＫ細胞を含み、ＮＫ細胞以外の単核細胞、例えば単球を含んでいてもよい。ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞（生体から採取され、継代されていないＮＫ細胞）であってもよい。
【００２０】
複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団は、一のドナーから得た単核細胞（ＮＫ細胞を含み、単球を含んでいてもよい。）の集団と、他のドナーから得た単核細胞（ＮＫ細胞を含み、単球を含んでいてもよい。）の集団が混合されたものである場合があり、また一のドナーから得たＮＫ細胞と、他のドナーから得た単球とが混合されたものである場合がある。
【００２１】
ドナーに関し、複数とは２以上であることをいい、上記の条件を満たせば特に限定されず、例えば、３以上、４以上、７以上、９以上のドナーに由来する単核細胞が混合されたものを用いることができる。複数のドナーには、ＮＫ細胞を含む細胞集団が投与される患者自身、該患者の近縁者が含まれる場合がある。
【００２２】
複数のドナーは、一のドナーと、それとはＨＬＡ及びＫＩＲの少なくとも一方において遺伝子型が異なる他のドナーを含むように選択することができる。ＫＩＲには、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂが含まれる。
【００２３】
ＮＫ細胞に関し、ライセンス（ライセンシング）とは、ＮＫ細胞に特有の「missing-self応答（自己ＨＬＡの欠如の検出）」の能力を，細胞の分化成熟の過程で獲得するプロセスをいう。ヒトやマウスに関しては、骨髄中の造血幹細胞からＮＫ細胞が分化する過程において、ＫＩＲやＮＫＧ２ＡとＨＬＡクラスＩ分子の結合を経験した未熟ＮＫ細胞のみがライセンスされて成熟後に自己ＨＬＡクラスＩの発現が低下した細胞を検知する能力を獲得すると考えられている。ライセンスに関わることが知られているＫＩＲの例は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３，ＫＩＲ３ＤＬ１及びＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４である。ＮＫ細胞が認識し得るＨＬＡタイプは、古典的ＨＬＡのうち、ＨＬＡ−Ｃ全アロタイプ、ＨＬＡ−Ｂアロタイプの約１／３、ＨＬＡ−Ａアロタイプの一部（Ｂｗ４モティーフを有するもの）、非古典的ＨＬＡのＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇである。本発明において、複数のドナーを、一のドナーと、それとはＨＬＡ及びＫＩＲの少なくとも一方において遺伝子型が異なる他のドナーを含むように選択するに際しては、上記のようなライセンスに関わるＫＩＲ及びＨＬＡを特に考慮することができる。
【００２４】
本発明の好ましい態様の一つにおいては、ＮＫ細胞のライセンシングに供される分子のレパートリーを増やすように、遺伝子型の異なるドナーを選択することができる。また、ＮＫ細胞の抑制性ＫＩＲに刺激が入らないように、又は抑制性ＫＩＲに刺激が入るように選択してもよい。
【００２５】
ドナーの選択は、ＮＫ細胞による抗体依存性細胞傷害（Antibody dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）活性を期待する場合は、混合した単核細胞の集団を培養した際に、ＣＤ１６highであるＮＫ細胞が増えるように行ってもよい。ＮＫ細胞による細胞傷害の機構の一つとして、ＡＤＣＣが知られているが、ＮＫ細胞はその細胞表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を介して、標的細胞に結合した抗体に結合し、標的細胞の傷害を行う。そのため、ＣＤ１６highであるＮＫ細胞が増えることにより、ＡＤＣＣ活性がより高くなることが期待できる。このようなドナーの組み合わせの条件の例は、ＮＫ細胞にＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＳ１の一方又は両方からのシグナルによるライセンシングが行われるようにドナーを選択して混合することである。
【００２６】
混合は、ＮＫ細胞を対象へ投与する前に行われる。混合は、目的とする混合による効果が得られる限り、種々の段階で行うことができる。例えば、複数のドナーから採取された血液を混合し、次に混合したものから単核細胞の集団を得てもよく、また各ドナーから採取された血液から単核細胞の集団を各々得た後に、各集団を混合してもよい。また、複数のドナーから採取された単核細胞の集団を各々培養した後に、各集団を混合してもよい。増殖が良好になるとの観点からは、混合は培養前に行うことが好ましい。
【００２７】
複数ドナーに由来する、単核細胞の集団の混合割合は、適宜とすることができる。例えば、複数のドナー由来の細胞が、ほぼ等しい割合で含まれるようにすることができ、また特定のドナーに由来する細胞を、多く、又は少なく含まれるようにすることができる。一のドナー由来のＮＫ細胞と他のドナー由来の単球を混合する場合も、混合割合は適宜とすることができる。例えば、ＮＫ細胞１に対し、その１〜９倍の単球を混合することができ（ＮＫ細胞：単球＝１：１〜９）、またＮＫ細胞１に対し、その２〜４倍の単球を混合することができる（ＮＫ細胞：単球＝１：２〜４）。本発明に関し、細胞の混合割合を表すときは、特に記載した場合を除き、細胞の数に基づいている。
【００２８】
単核細胞の集団を得る原料としては、末梢血、臍帯血、骨髄及び／又はリンパ節から採取される血液細胞を用いることができる。好ましい原料の一つが末梢血であり、末梢血はアフェレーシス法により採取してもよい。すなわち、本発明の好ましい態様においては、単核細胞の集団を準備する工程は、複数のドナーから採取された末梢血から単核細胞の集団を得る工程を含む。また、別の好ましい態様においては、単核細胞の集団を準備する工程は、複数のドナーから採取されたアフェレーシス血液から単核細胞の集団を得る工程を含む。
【００２９】
ＮＫ細胞と単球を含む、単核細胞の集団は、当業者に知られたさまざまな手順を用いて調製することができる。例えば、末梢血及び臍帯血のような血液からは、室温条件で密度遠心分離を行うことで赤血球の除去及び単核球細胞画分の回収が行える。末梢血から分離される単核細胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球及び樹状細胞などの多様なリンパ球を含む。本発明に関し、ＣＤ３陰性であり、かつＣＤ５６陽性である単核細胞をＮＫ細胞ということができる。ＮＫ細胞は、当業者に知られたさまざまな手順を用いて調製することができる。例えば、全血又はPBMCから、不要な細胞を除いてＮＫ細胞を分離するための方法が知られている。単球は、当業者に知られたさまざまな手順を用いて調製することができる。例えば全血又はPBMCから不要な細胞を除いて単球を分離するための方法が知られている。
【００３０】
（ＣＤ３陽性細胞の除去、ＣＤ３４陽性細胞の除去）
単核細胞の集団は、単球、ＮＫ細胞以外に、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞等を含む場合がある。所望のＮＫ細胞が、増幅後、例えば、比重遠心法、免疫磁気ビーズ、ＦＡＣＳ、フロー・サイトメトリー等を用いて選択される場合がある。例えば、ＮＫ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５抗体、抗ＮＫｐ４６抗体、抗ＮＫｐ３０抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体等を用いて、細胞集団から選択的に分離される場合がある。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の場合がある。ＮＫ細胞の選択は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞その他の細胞を選択的に除去して行われる場合がある。
【００３１】
単核細胞の集団を準備する工程は、Ｔ細胞を除去する工程を含んでいてもよく、この工程はＣＤ３陽性細胞を除去することにより達成される場合がある。また単核細胞の集団を準備する工程は、造血前駆細胞を除去するステップを含んでいてもよく、この工程は、ＣＤ３４陽性細胞を除去することにより達成される場合がある。すなわち、単核細胞の集団を準備する工程は、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程を含んでいてもよく、ＣＤ３４陽性細胞を除去する工程を含んでいてもよい。
【００３２】
ＣＤ３陽性細胞の除去、ＣＤ３４陽性細胞の除去は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されるＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓや、ミルテニーバイオテク社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ等の免疫磁気ビーズを用いて、細胞表面抗原ＣＤ３及び／又はＣＤ３４を発現する細胞を分離除去することにより実施できる。このような工程は、ＮＫ細胞を疲弊させないように、また単球が余計な貪食機能を発揮しないように行うことが好ましい。具体的には、比較的小型の磁気ビーズを用いる（細胞と結合していない未反応のビーズを遠心操作により上清とともに除去することができる。）こと、ビーズと細胞集団との低温でのインキュベート時間を比較的短く設定すること、未反応のビーズを除いた上でカラムを用いてビーズと結合していない細胞を目的の細胞集団として得ること、等を好ましい操作として挙げることができる。細胞の除去は、自動閉鎖系細胞処理装置を用いて行ってもよい。
【００３３】
（ｉＰＳ細胞等の利用）
単核細胞の集団は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び成体幹細胞からなるグループから選択されるいずれかに由来する造血幹細胞から調製されたものであってもよい。これらの幹細胞からＮＫ細胞を含む単核細胞の細胞を誘導する方法が知られており、当業者であれば、本発明に適用することができる（Domogala A. et al., Natural killer cell immunotherapy: from bench to bedside, Frontiers in Immunology, 2015;6, doi: 10.3389/fimmu.2015.00264、及びZeng J. et al., Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Reports, 2017;9:1796-1812）。幹細胞は、また高活性のＮＫ細胞が得られるように改変してもよく、例えば、高親和性ＣＤ１６（１５８Ｖ：１５８番アミノ酸がバリン）が知られており、このような知見を適用することができる。
【００３４】
（単核細胞の集団の培養）
準備した単核細胞の集団は、複数のドナーに由来する細胞が混合された状態で、ＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートされる。インキュベート（すること）は、細胞の増殖を伴わない場合と伴う場合がある。本発明の好ましい態様の一つにおいては、インキュベート（すること）は増殖を伴う。増殖を伴うインキュベート（すること）は、培養（すること）と、又は増殖（させること）と読み替えることができる。
【００３５】
ＮＫ細胞処理上有効な条件とは、複数のドナーに由来する混合された細胞が、目的とする混合による効果を奏するのに適した条件をいう。目的の効果が奏される限り、細胞懸濁のために使用する培地又は等張液、時間、温度、環境等に、特に限定はない。
【００３６】
ＮＫ細胞処理上有効な条件は、ＮＫ細胞の活性化上有効な条件を含む。このような条件は例えば、適切な濃度の活性化に必要な因子、例えばＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で、３７℃、５％ＣＯ2及び飽和水蒸気雰囲気下で、４〜１８時間インキュベートすることが含まれる。
【００３７】
ＮＫ細胞処理上有効な条件は、ＮＫ細胞の増殖上有効な条件を含む。ＮＫ細胞増殖上有効な条件は、ＮＫ細胞の増殖に適した培地を用いることを含む。そのような培地の例は、ＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社）、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地（セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
培地には、インターロイキン２（ＩＬ−２）が、本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある。ＩＬ−２の濃度は、２０００ＩＵ／ｍＬを超える場合があり、２５００〜２８１３ＩＵ／ｍＬの場合がある。ＩＬ−２は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ−２の濃度は、国内標準単位（ＪＲＵ）及び国際単位（ＩＵ）で示される場合がある。１ＩＵが約０．６２２ＪＲＵであるから、１７５０ＪＲＵ／ｍＬは約２８１３ＩＵ／ｍＬである。
【００３９】
培地には、被験者の自家血清、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。自家血清及びヒトＡＢ型血清は１〜１０％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは１〜１０％の濃度で添加されることが好ましい。被験者は、健常者と、疾患に罹患した患者との場合がある。また、培地には血清に替えて又は血清とともに、免疫細胞の増殖のために配合された組成物が添加される場合がある。このような組成物は市販されている。例えばUltraGroシリーズ（AventaCell社）、CTS Immune Cell SR（Thermo Fisher Scientific社）を本発明のためにも用いることができる。
【００４０】
培地には、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。サイトカインは、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び／又は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の場合がある。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＳＣＦ及びＦｌｔ３Ｌは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。
【００４１】
培地の交換は、所望のＮＫ細胞の細胞数が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、３〜５日毎が好ましい。
【００４２】
培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。治療用のＮＫ細胞を含む細胞集団を得るためには、多くの細胞が培養でき、取り扱いが容易である培養容器を用いることが好ましい。このような培養容器の例として、高いガス透過性を有した素材からなる細胞培養用バッグが挙げられる。
【００４３】
バッグを用いる場合、培養期間中に上下を反転しながら用いることが好ましい。 培養の際、ＮＫ細胞、単球とも培養面への接着がみられる。接着系の細胞の場合、単位容積当たり細胞密度とともに単位面積当たりの細胞密度が、細胞の生存率及び増殖速度を含む培養効率に大きく影響する。培養期間中にバッグを反転させることにより、それまで上側であったために細胞の接着が比較的少ない面へ一部のＮＫ細胞と単球を移動させることができるため、培養をより効率的に行うことができる。
【００４４】
培養条件は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、３７℃、５％ＣＯ2及び飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。本発明の目的の一つはＮＫ細胞を大量に調製することであるため、培地で培養する期間が長いほどより多くのＮＫ細胞が得られるので有利である。培養期間は、ＮＫ細胞を所望の細胞数まで増幅することを条件として、特に限定されない。例えば、７〜２８日間行うことができ、１０〜１８日間としてもよく、１２〜１６日間、例えば１４日としてもよい（Saito S. et al., Ex vivo generation of highly purified and activated natural killer cells from human peripheral blood. Hum Gene Ther Methods. 2013;24(4):241-252、及び前掲特許文献１）。
【００４５】
培養は、単核細胞の集団が準備された後に直ちに実施しなくてもよい。準備した単核細胞を含む細胞集団は凍結保存され、患者への投与時期に応じて解凍され、ＮＫ細胞の培養に供される場合がある。なお、単核細胞の集団は、本発明のＮＫ細胞の増幅方法によって増幅される途中か、増幅が終わった後かに凍結され、患者への移植時期に応じて解凍され、患者への移植に供されてもよい。凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。
【００４６】
培養により得られた所定のＮＫ細胞の集団は、目的のＮＫ細胞に加えて、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞等を含む場合がある。培養後、目的のＮＫ細胞、又はその集団が、例えば比重遠心法、免疫磁気ビーズ、ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー等を用いて選択される場合がある。例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５抗体、抗ＮＫｐ４６抗体、抗ＮＫｐ３０抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体等を用いて、目的のＮＫ細胞、又はその集団が選択的に分離される場合がある。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の場合がある。目的のＮＫ細胞、又はその集団の選択は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞その他の細胞を選択的に除去して行われる場合がある。
【００４７】
（混合培養の効果）
本発明者らの検討によると、複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を培養することにより、ＮＫ細胞の増殖が良好となる。これは、ＨＬＡ／ＫＩＲの組み合わせのバリエーションが増えることで、より多くのライセンシングシグナルが互いに入るようになったことに起因すると考えられる。増殖に関し良好とは、混合培養の複数のドナーのうちのいずれか一の単独ドナー由来の細胞を培養した場合に比較して、細胞の増殖率（培養後の細胞数／培養前の細胞数）が向上していることをいう。
【００４８】
また、混合培養により得られた細胞集団においては、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上が、ＮＫ細胞でありうる。
【００４９】
また本発明者らの検討によると、複数ドナー由来のＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団の混合培養により、得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性は、単独ドナー由来のＮＫ細胞と比較して、同等以上でありうる。さらにＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞が含まれる割合も、単独ドナー由来のＮＫ細胞と比較して、同等以上でありうる。細胞傷害活性とは、特に記載した場合を除き、対象細胞（エフェクター細胞、Ｅ）の標的細胞（Ｔ）に対する溶解能を指す。細胞傷害活性は、エフェクター細胞により死に至った標的細胞の百分率（％）で表すことができ、例えば次式により求められる。
【００５０】
（エフェクター細胞と共培養した場合の細胞死−自然細胞死(陰性コントロール)）／（最大細胞死(陽性コントロール)−自然細胞死(陰性コントロール)）×１００
【００５１】
細胞傷害活性の測定に際しては、一般的には、エフェクター細胞の細胞傷害活性の程度等に応じ、エフェクター細胞と標的細胞の混合比（Ｅ：Ｔ）、エフェクター細胞と標的細胞の共培養の時間は、用いる細胞の種類や活性の強さに応じて適宜とすることができる。ＮＫ細胞をエフェクター細胞とするとき、標的細胞は、Ｋ５６２細胞、ＳＫＯＶ３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。エフェクター細胞と標的細胞、生細胞と死細胞は、放射性物質、蛍光色素等で標識した抗体等の試薬により、区別し、また定量することができる。
【００５２】
また本発明による複数のドナーに由来する本発明のＮＫ細胞の集団は、ＭＤＳＣ（Myeloid-derived suppressor cells）による抑制を受けないか、又はその抑制が著しく低い。本発明者らは、これまでの研究から、上述のような培養方法で得られた単独のドナーに由来するＮＫ細胞の集団は、ＭＤＳＣによる抑制を受けないことを確認してきた。この理由の一つとして、液性因子（ＴＧＦ−β，ＩＬ−１０）に対する受容体の発現が無いか、又は著しく低いことが挙げられる。本発明者らの今般の検討によると、また複数のドナーからの細胞を混合する場合であっても、上記の利点は損なわれないことが分かっている。
【００５３】
［ＮＫ細胞を含む細胞集団］
本発明により得られる、ＮＫ細胞を含む細胞集団は、以下の特徴を備える：
（１）複数のドナーに由来する。
（２）ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
上記の（２）の特徴の代わりに、または（２）の特徴ともに、下記の特徴を備えていてもよい：
（２’）ＳＫＯＶ３細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）３：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
【００５４】
このような細胞集団はさらに、下記の特徴を備えていてもよい。
（３）ＮＫ細胞の割合が７０％以上、より特定すると８０％以上、さらに特定すると９０％以上である。
（４）ＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞の集団、及びＣＤ１６低発現性であるＮＫ細胞の集団の双方を含んでいてもよい。ＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞の割合が、５０％以上である。
【００５５】
ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、当業者に周知の方法によって測定し、算出できる。細胞傷害活性（％）は、通常、エフェクター細胞（Ｅ）作用後の標的細胞（Ｔ）の生細胞数に基づき、例えば、式：（１−生細胞数／陰性コントロール生細胞数）×１００により算出できる。
ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性は、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、ＳＫＯＶ３細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）３：１で共培養した場合の細胞傷害活性は、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００５６】
ＣＤ１６等のマーカーに関し、陽性であることは、＋で表され、陰性であることは−で表されることがある。例えば、ＣＤ１６陽性は、ＣＤ１６+と表され、ＣＤ１６陰性は、ＣＤ１６-と表されることがある。陽性は、高発現性である場合と低発現性である場合を含む。高発現性であることは、ｈｉｇｈ、ｂｒｉｇｈｔと表されることがある。例えば、ＣＤ１６高発現性は、ＣＤ１６high、ＣＤ１６brightと表されることがある。低発現性であることは、ｌｏｗ、ｄｉｍと表されることがある。例えば、ＣＤ１６低発現性は、ＣＤ１６low、ＣＤ１６dimと表されることがある。
【００５７】
陽性、陰性、高発現性、低発現性は、フローサイトメトリー法により得られるチャートに基づき、判断することができる。チャートに現れる位置は、機器の電圧設定、感度設定、使用抗体クローン、染色条件、使用色素等により変動することがあるが、当業者であれば、得られたチャートにおいて一群と認められる細胞集団を切り分けないように適宜線引きすることができる。
【００５８】
目的のマーカーの発現が、陽性であるか陰性であるかの判断には、アイソタイプ・コントロール（Isotype control）抗体を用いた場合をネガティブ・コントロールとして用いて判断することができる。Isotype control抗体は特定の抗原とは反応しない抗体である。一般に、抗体を用いた実験においては、ターゲット以外のタンパク質との非特異的な結合や、細胞表面上の Fc レセプターとの結合によって、バックグラウンドが発生する可能性がある。ネガティブ・コントロールとなる抗体を使用した系と比較することにより、目的の抗原に対する一次抗体の反応が特異的であることが明確になる。またバックグラウンドの影響が排除され、シグナルの強さを正確に解釈することができる。
【００５９】
目的のマーカーの発現の程度（低発現性であるか、高発現性であるか）は、同一条件で測定した対照細胞の結果との比較により、判断することができる。対照細胞の例は、本願明細書の実施例の項に記載したプライマリーＮＫ細胞のような、末梢血から得た、実質的な培養を行なっていないＮＫ細胞である。
【００６０】
例えば、あるＮＫ細胞の集団におけるＣＤ１６の発現の程度は、フローサイトメトリーを用い、その細胞集団におけるＣＤ１６発現量を、末梢血から得た実質的な培養を行なっていないＮＫ細胞の集団（対照）におけるＣＤ１６発現量と比較し、対照と同等の発現が見られる場合は高発現性であると判断し、対照細胞より発現が低い場合は低発現性であると判断することができる。なお、対照のＮＫ細胞はＣＤ１６高発現性であることが知られている。
【００６１】
［医薬用途］
本発明はまた、上述のＮＫ細胞を含む細胞集団を有効成分とする、細胞療法のための医薬品組成物を提供する。細胞療法とは、体外で処理した細胞を対象に投与することにより、対象における疾患又は状態を処置する方法をいい、これには免疫細胞療法が含まれる。
【００６２】
医薬組成物は、有効成分である細胞集団のほか、ＮＫ細胞を懸濁することができる溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。医薬組成物又は溶液はまた、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与することができる。医薬組成物による細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法等と組み合わせて実施することができる。
【００６３】
ＮＫ細胞を含む、細胞集団はがん治療や感染症治療への適用が期待されているが（Dahlberg C. M. et al., Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity, Front. Immunol., 2015;30 :https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00605、及びSchmidt S. et al, Natural killer cells as a therapeutic tool for infectious diseases-current status and future perspectives, Oncotarget, 2018;9(29): 20891-20907）、本発明の医薬組成物は、このようながん、又は感染症を治療するために用いることができる。より具体的には、口腔癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、白血病；ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を用いた細胞療法において、ＮＫ細胞は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される場合がある。細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法、抗体医薬品等と組み合わせて実施される場合がある。
【００６４】
抗体医薬品の多くは静脈内投与後、ＡＤＣＣ活性による抗腫瘍効果を示すとされる。その一方で、ＡＤＣＣ活性を発揮する際にはＮＫ細胞の他に単球／マクロファージや好中球も動員される。そしてＮＫ細胞以外のエフェクターは、正常細胞とがん細胞とを区別せずにＡＤＣＣ活性を示し、それは副作用の発現にもつながっていると考えられる。本発明においては、ＮＫ細胞と抗体とを、投与前に混合し、ＮＫ細胞に予め抗体を装備させてもよい。これによりエフェクターがＮＫ細胞に限定され、投与する抗体の量を減じることができ、また副作用の低減にも極めて有効であると考えられる。すなわち、本発明の医薬組成物は、ＮＫ細胞集団と抗体とを混合した後、ＮＫ細胞と結合していない抗体を除去する工程を経て、調製されていてもよい。すなわち、本発明の医薬組成物の好ましい態様の一つは、ＮＫ細胞と抗体を含むが、抗体はＮＫ細胞に結合しており、ＮＫ細胞に結合していない抗体が実質的に含まれないものである。（前掲特許文献３参照）。
【００６５】
本発明の医薬組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件（good manufacturing practice、ＧＭＰ）及び再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準（Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice、ＧＣＴＰ）で実施されることが好ましい。
【００６６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００６７】
［実施例1：新鮮末梢血から得たNK細胞の混合培養１］
健常人ボランティアから採血を実施し、フィコール（GEヘルスケア、17144002）を用いた密度勾配遠心により末梢血単核球を単離した。単離した複数人分の末梢血単核球をほぼ同率で混合し、CD3 beads※1を添加・懸濁し、4℃, 15分間インキュベート後、分離バッファー 1 mL※2を加えてよく懸濁し、300 x g、10分間、遠心分離を行った。上清を除去し、0.5 mLの分離バッファーに懸濁し、分離バッファー 2 mLをあらかじめ添加して湿らせたLDカラム（ミルテニーバイオテク, 130-042-901）に添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー 1 mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収した。その後、分離バッファー1 mLでカラムをwashし、回収された液中の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。500 x g、５分間、遠心分離を行い、上清を除去後、5x105 細胞/mLとなるようにKBM501培地※3に懸濁した。
【００６８】
一部の細胞をフローサイトメーター測定用に回収し、残りの細胞を培養した。培養は、6ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 140675）、T-75フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 156499）、又は500cm2培養バッグ（ニプロ）を使用し、CO2インキュベーターで行った（37℃, 5% CO2）。培養5日目及び9日目に培養液の一部を取り、細胞数をカウントし、9日目には最終液量が、6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり6 mL、T-75フラスコの場合は1フラスコあたり50 mLになるようにKBM501培地を添加した。14日目に細胞を回収し、細胞数をカウント、一部の細胞を用いてフローサイトメーターで細胞表面抗原の測定を行った。
【００６９】
※1:  CliniMACS CD3, ミルテニーバイオテク, 130-017-601 (1x107細胞あたり5μL)
※2:  0.5%ヒトAB型血清 (コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)、2mM EDTA（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 15575-020）を含むPBS（（和光純薬工業, 045-29795）
※3:  5％ヒトAB型血清（コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)を添加したKBM 501（コージンバイオ,16025015）
【００７０】
結果を図１に示した。9人混合（図１のA）、8人混合（図１のB）、7人混合（図１のC）のいずれにおいても、細胞の増殖は良好であった。純度を確認したところ、いずれの混合培養においても、90％以上がCD3-CD56+のNK細胞であった。8人混合培養では、T-75フラスコと500cm2培養バッグとで培養を行ったが、双方とも細胞の増殖は良好であった。なお9人混合培養、7人培養、及び単独ドナー（7人のうちの1人）由来の培養は、6ウェルプレートを用いて培養を行った。500cm2培養バッグを用いた培養においては、後述の実施例4に記載されているように、バッグを裏返す作業を行った。
【００７１】
また7人混合培養と単独ドナー由来の培養との細胞増殖を比較すると、単独ドナー由来の培養では6.8×106 cellsから1.9×107cellsに増殖した（約2.8倍）のに対し、混合培養では7.8×106 cellsから3.7×107 cellsに増殖し（約4.7倍）、混合培養のほうが細胞の増殖が良好であった（図１のC)）。
【００７２】
［実施例2：新鮮末梢血から得たNK細胞の混合培養２］
実施例1に記載の方法で、単独ドナー由来の培養（n=17）、及び4人以上の混合培養（n=10）をT-75フラスコで行ったデータを合算し、得られたNK細胞数の細胞増殖率について統計解析を行った。解析ソフトにはJMP Pro13を用い、Wilcoxonの順位和検定を行った。
【００７３】
結果を図２に示した。単独ドナー由来の細胞の培養の場合の増殖率（増殖後の全細胞数／増殖前の全細胞数）が3.10±0.56であるのに対し、混合培養の場合の増殖率は6.56±1.24であり、混合培養のほうが統計学的に有意に増殖率が高かった（P<0.01）。
【００７４】
［実施例3：腫瘍細胞傷害活性試験］
《NK細胞の調製》
健常人ボランティアから実施例1に記載の方法で得られた4人の混合培養NK細胞と単独ドナー（4人のうちの1人）からの培養NK細胞を回収洗浄後、それぞれ10%FBS（ニチレイバイオサイエンス, 171012-500ML）及び100ユニットのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン（ナカライテスク, 26253-84）を含むRPMI1640培地（和光純薬工業, 189-02025）（以下、10%FBS/RPMI1640とする）にて懸濁し、同培地で1x106 cells/mLの濃度に調製した。
【００７５】
《SKOV3の調製》
SKOV3細胞（ヒト卵巣がん細胞株）を血清成分を含まないRPMI1640培地（和光純薬工業, 189-02025）にて1x106 cells/mLの濃度に調製した。調製したSKOV3細胞をPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mL及び2x105 cells/mLとなるように調製した。
【００７６】
《MDSC（Myeloid-derived suppressor cells）の調製》
健常人ボランティア（NK細胞のドナーとは別）からフィコールを用いて末梢血単核球を単離し、10 ng/mL IL-6 （PEPROTECH, 200-06-5UG）及び10 ng/mL GM-CSF（CellGenix, 1012-050) を含む10%FBS/RPMI1640で７〜10日間培養することによりMDSCを誘導した。MDSCを血清成分を含まないRPMI1640培地（和光純薬工業, 189-02025）にて懸濁し、PKH Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, MINI67-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて8x105cells/mLとなるように調製した。
【００７７】
《細胞傷害活性試験》
複数ドナー由来の混合培養NK細胞とSKOV3細胞の群、単独ドナー由来の培養NK細胞とSKOV3細胞の群、これら2群にそれぞれMDSCを加えた群の計4群と、陰性コントロールとしてSKOV3細胞のみの群を用意した。
【００７８】
NK細胞とSKOV3細胞は、細胞比で3:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に播種、混合し、37℃、5% CO2下で4時間反応させた。MDSCを添加した群は、NK細胞とSKOV3とMDSCの細胞比が5:1:4となるように、まずNK細胞とMDSCを96ウェルプレートで混合し、37℃、5% CO2下で12〜18時間反応させた。その後、遠心分離（500 x g, 5分間）し、上清を除去後、SKOV3細胞を添加、混合し、37℃、5% CO2下で4時間反応させた。反応後、遠心分離（500 x g, 5分間）し、上清を除去後、PBSで希釈したZombie溶液（Biolegend, 423105）を添加、混合し、室温、暗所で30分間インキュベートした。遠心、上清除去後、PBSで懸濁し、AccuCheck Counting Beads（サーモフィッシャーサイエンティフィック, PCB100）を添加した。フローサイトメーター（BD LSR Fortessa、BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア（FLOWJO, LLC）で解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した※4。
【００７９】
※4:  細胞傷害活性率=（1-SKOV3生細胞数/陰性コントロールSKOV3生細胞数）×100
生細胞数: SKOV3細胞実測数×添加ビーズ液中のビーズ数/ビーズ実測数
SKOV3細胞実測数： FSC/SSC gated （debris exclusion）、doublet exclusionの後、PKH26+ gated
【００８０】
結果を図３に示した。複数ドナー由来の混合培養NK細胞は、単独ドナー由来のNK細胞と比較して、同等以上の細胞傷害活性を示した。
【００８１】
［実施例4：凍結アフェレーシス血液から調製したNK細胞の混合培養］
2ドナーの凍結アフェレーシス血液（HemaCare, PB001CLP）を解凍後、混合し、HBSS(-)溶液（ナカライテスク, 17461-05）にて希釈し、自動閉鎖系細胞処理装置Lovo Cell Processing System（FRESENIUS KABI）を使用してPBS/EDTA溶液(Miltenyi Biotec, 130-021-201) で洗浄、濃縮を行った。次に、濃縮した細胞液をCliniMACS Prodigy TS 310（Miltenyi Biotec, 130-097-183）、CliniMACS CD3 MicroBeads（Miltenyi Biotec, 130-017-601）、CliniMACS CD34 Reagent（Miltenyi Biotec, 130-017-501）を使用してCD3陽性細胞、CD34陽性細胞を除去し、洗浄、溶出を行った。溶出液中の細胞数をカウントして総細胞数を算出した。500 x g、5分間、遠心分離を行い、上清を除去後、1x106cells/mLとなるようにKBM501培地に懸濁した。培養は、T-75フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 156499）又は500cm2培養バッグ（ニプロ）を使用しCO2インキュベーターで行った（37℃, 5% CO2）。バッグの培養は、培養開始から30分後にバッグを裏返し、培養9日目に再度裏返す作業を行った（図４−１参照）。また、培養９日目に培養液の一部を取り細胞数をカウントし、最終液量がT-75フラスコでは1フラスコあたり50 mL、培養バッグでは１バッグあたり500 mLになるようにKBM 501培地を添加した。14日目に細胞を回収し、総細胞数をカウント、一部の細胞を用いてフローサイトメーターで細胞表面抗原の測定を行った。
【００８２】
回収した細胞を以下のように抗体で染色した：
Alexa Fluor(R)700標識抗ヒトCD56抗体（Biolegend, 318316）、PerCP/Cy5.5標識抗ヒトCD3抗体（Biolegend, 300430）、PE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体（Biolegend, 302016）を1μg/mLの濃度で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 x g, 5分間, 4℃）し、上清を除去し、PBS（-）（和光純薬工業）に懸濁後、フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア(FLOWJO, LLC)で解析した。
【００８３】
結果を図４−２に示した。凍結アフェレーシス血液から得たNK細胞を用いた場合も混合培養により、細胞は14日間で十分に増殖した。詳細には、T-75フラスコ培養の場合は1.50 x108cellsから5.72 x108cellsに増殖し（約3.81倍）、500cm2培養バッグ培養の場合は1.50 x108cellsから5.60 x108cellsに増殖した（約3.73倍）（図４−２、左）。
【００８４】
得られた培養NK細胞の集団におけるNK細胞の純度は、T-75フラスコ培養の場合は90.5%、500cm2培養バッグ培養の場合は91.7%であった。またCD16の発現に関しては、混合培養NK細胞の集団は、単独ドナー由来の培養NK細胞の集団（特開2018-193303参照）と同様、二峰性であった。詳細には、CD16低発現性、及びCD16高発現性の割合は、T-75フラスコ培養の場合は順に50.9%、及び49.1%であり、500cm2培養バッグ培養の場合は順に46.7%、及び53.3％であった（図４−２、右）。
【００８５】
［実施例5：単球/NK細胞  swapping実験］
《プライマリーNK細胞と単球の調製》
健常人ボランティア2名 （ドナー1、2とする） から採血を実施、フィコールを用いた密度勾配遠心により末梢血単核球を単離した。単離した末梢血単核球からEasySepTM Human NK Cell Enrichment Kit (STEMCELL, 19055) を使用しプライマリーNK細胞を、EasySepTM Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion (STEMCELL, 19058)を使用し、単球を分離し、それぞれ細胞数をカウントした。プライマリーNK細胞は1x105 cells/mL、単球は3x105 cells/mLとなるようにKBM 501培地で懸濁した。
【００８６】
《swapping培養》
ドナー1のプライマリーNK細胞とドナー1の単球、ドナー1のプライマリーNK細胞とドナー2の単球、ドナー2のプライマリーNK細胞とドナー2の単球、ドナー2のプライマリーNK細胞とドナー1の単球をそれぞれ組み合わせた、計4群を、プライマリーNK細胞と単球の細胞比が1:3となるように混合して6ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 140675）で培養を開始した（37℃, 5% CO2）。実施例1に記載の方法と同様に培養9日目にKBM501培地を追加し、14日目に細胞を回収した。得られた細胞を用いて細胞表面抗原とK562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株)に対する細胞傷害活性率の測定を行った。
【００８７】
細胞表面抗原の測定は回収した細胞を以下のように抗体で染色し解析した：
Alexa Fluor(R)700標識抗ヒトCD56抗体（Biolegend, 318316）、APC/Cy7標識抗ヒトCD3抗体（Biolegend, 300426）、FITC標識抗ヒトKIR2DL1抗体（Miltenyi Biotec, 130-103-966）、PerCP/Cy5.5標識抗ヒトKIR3DL1抗体（Biolegend, 312718）を1μg/mLの濃度で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 x g, 5分間, 4℃）し、上清を除去し、PBS（-）（和光純薬工業）に懸濁後、フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア(FLOWJO, LLC)で解析を行った。
【００８８】
細胞傷害活性の測定には、2ドナーのプライマリーNK細胞と単球を組み合わせてできたそれぞれの培養NK細胞とK562細胞を反応させた4群、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群を用意した。
【００８９】
《K562の調製》
K562細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）を血清成分を含まないRPMI1640培地（和光純薬工業, 189-02025）にて1x106 cells/mLの濃度に調製した。調製したK562細胞をPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調製した。
【００９０】
《培養NK細胞の調製》
上記の方法で得られた2ドナーのプライマリーNK細胞と単球を組み合わせて培養して得た4群の培養NK細胞を回収洗浄後、それぞれ10%FBS/RPMI1640にて懸濁し、同培地で1x106 cells/mLの濃度に調製した。
【００９１】
《細胞傷害活性試験》
NK細胞とK562細胞は、細胞比で1:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合し、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応後、遠心分離（500 x g, 5分間）し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液（Beckman Coulter, A07704）を添加、懸濁し、室温で20分間インキュベートした。フローサイトメーター（BD LSR Fortessa、BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア(FLOWJO, LLC)で解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した※5。
【００９２】
※5:  細胞傷害活性率=（K562細胞死細胞率-陰性コントロール死細胞率）/（陽性コントロール死細胞率-陰性コントロール死細胞率）×100
【００９３】
ドナータイピング情報を下表に、結果を図５に示した。
【００９４】
【表１】
2020124114.tif 000002
【００９５】
KIR3DL1、KIR3DS1からのシグナルが一方あるいは両方入る条件の場合に、CD16highの集団が増えることから、より高いADCC活性が期待できる。
【図１】
2020124114.tif 000003
【図２】
2020124114.tif 000004
【図３】
2020124114.tif 000005
【図４−１】
2020124114.tif 000006
【図４−２】
2020124114.tif 000007
【図５】
2020124114.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、
準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートする
ことを含み、
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取された末梢血から単核細胞の集団を得る工程を含む、ＮＫ細胞を含む細胞集団の製造方法。
【請求項２】
単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
単核細胞の集団を準備する工程が、ＣＤ３４陽性細胞を除去する工程を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーから採取されたアフェレーシス血液から単核細胞の集団を得る工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
複数のドナーに由来し、ＮＫ細胞を含む、単核細胞の集団を準備し、
準備した単核細胞の集団をＮＫ細胞処理上有効な条件でインキュベートする
ことを含み、
単核細胞の集団を準備する工程が、複数のドナーに由来する、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び成体幹細胞からなる群より選択されるいずれかに由来する単核細胞の集団を準備するものである、ＮＫ細胞を含む細胞集団の製造方法。
【請求項６】
複数のドナーが、一のドナーと、それとはＨＬＡ及びＫＩＲの少なくとも一方において遺伝子型が異なる他のドナーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
以下の特徴を備える、ＮＫ細胞を含む細胞集団：
（１）複数のドナーから採取された末梢血に由来する、または複数から採取された胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び成体幹細胞からなる群より選択されるいずれかに由来する。
（２）ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞集団を含む、細胞療法のための医薬組成物。
【請求項１０】
感染症及び／又はがんを治療するための、請求項８又は９に記載の医薬組成物。