(57)【要約】【課題】試料中の複数の生体分子を迅速かつ簡便に検出する。【解決手段】生体分子の検出方法は、試料中の複数の生体分子をＴＬＣで分離する分離ステップＳ１０と、ＴＬＣプレートに光を照射する照射ステップＳ２０と、ＴＬＣプレートから発せられる光を第１及び第２の分光により２以上の波長域の光に分光する分光ステップＳ３０と、分光された光を受光素子で検出する検出ステップＳ４０とを有する。複数の生体分子は光源からの光により蛍光を発する分子と光源からの光を吸収する分子とを含む。第１の分光は蛍光を発する生体分子の蛍光輝度がＴＬＣプレートのバックグランド輝度よりも高くなる波長域の光を通過させ、第２の分光は光源から照射される光の波長域の光を通過させる。検出ステップＳ４０では、さらに、第１の分光で分光された光を結像させた画像と、第２の分光で分光された光を結像させた画像とを含む２以上の画像に基づき複数の生体分子を検出する。【選択図】図２
2020106412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる複数の生体分子の検出方法であって、
前記試料中の前記複数の生体分子を薄層クロマトグラフィーで分離する分離ステップと、
前記分離ステップで分離された前記複数の生体分子を保持する薄層クロマトグラフィープレートに光源から光を照射する照射ステップと、
前記光の照射により前記薄層クロマトグラフィープレートから発せられる光を、第１の分光及び第２の分光により、２以上の波長域の光に分光する分光ステップと、
前記２以上の波長域の光に分光された光を受光素子で検出する検出ステップと、を有し、
前記複数の生体分子は、前記光源から照射される光により励起されて蛍光を発する生体分子と、前記光源から照射される光を吸収する生体分子と、を含み、
前記第１の分光は、前記複数の生体分子のうち前記蛍光を発する生体分子の蛍光輝度が、前記薄層クロマトグラフィープレートのバックグランドの輝度よりも高くなる波長域の光を通過させ、
前記第２の分光は、前記光源から照射される光の波長域の光を通過させ、
前記検出ステップでは、さらに、前記第１の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、前記第２の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、を含む２以上の画像に基づいて、前記試料中の前記複数の生体分子を検出する、
生体分子の検出方法。
【請求項２】
前記光源から照射される光は、紫外光であり、
前記蛍光を発する生体分子は、芳香環を有し、
前記光を吸収する生体分子は、前記紫外光を吸収する、
請求項１に記載の生体分子の検出方法。
【請求項３】
前記分離ステップでは、
前記薄層クロマトグラフィーによる分離に先立ち、前記試料中の前記複数の生体分子を等電点電気泳動で第１の方向に分離し、
前記薄層クロマトグラフィーによる分離では、前記第１の方向に分離された前記複数の生体分子を前記第１の方向に直交する第２の方向に分離する、
請求項１又は２に記載の生体分子の検出方法。
【請求項４】
前記試料は、角層由来成分である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項５】
前記第１の分光により分光されて検出される生体分子は、タンパク質、ペプチド、及び、アミノ酸のうち少なくとも１つを含み、
前記第２の分光により分光されて検出される生体分子は、アミノ酸の代謝中間体である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の代謝中間体は、ウロカニン酸である、
請求項５に記載の生体分子の検出方法。
【請求項７】
前記第１の分光により分光される波長域の光は、波長２９０ｎｍ以上４００ｎｍ以下の光であり、前記第２の分光により分光される波長域の光は、波長２５０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の光である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項８】
被験者の肌状態を評価する評価方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体分子の検出方法に含まれる各ステップと、
前記検出ステップで得られた前記２以上の画像のそれぞれの明暗パターンに基づき、前記複数の生体分子のうち、前記第１の分光により分光されて検出された生体分子と前記第２の分光により分光されて検出された生体分子との量の比率を導出する導出ステップと、
導出された前記比率に基づき前記被験者の肌状態を評価する評価ステップと、
を有する、
肌状態の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体分子の検出方法及び肌状態の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料には、複数種の生体分子が含まれており、生体試料からそれらの生体分子を分離した後、染色して検出する。例えば、特許文献１は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた分離後の、アミノ酸、ペプチド及び類似の化合物の染色、可視化のための方法及び試薬混合物を開示している。
【０００３】
また、例えば、特許文献２は、ＴＬＣプレート上で分離された複数種類の物質を該ＴＬＣプレートから質量分析（以下、ＭＳ：Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）プレートに転写させて質量分析に供するためのＭＳプレートを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５４５７２８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１４９０４１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の従来技術では、生体分子をＴＬＣで分離し、染色することにより可視化できるが、試薬混合物による処理の後、ＴＬＣプレートを熱処理する必要があり、手間がかかる。
【０００６】
また、特許文献２に記載の従来技術では、ＴＬＣプレートで複数種類の物質を一次分離した後、これらの物質を該ＴＬＣプレートからＭＳプレートに転写する前に、該ＴＬＣプレートを乾燥させる必要がある。その分、分離に要する時間が長くなるため、試料に含まれる複数種類の物質を迅速に分離することができない。
【０００７】
そこで、本開示は、試料に含まれる複数種類（以下、複数）の生体分子を、迅速に、かつ、簡便に検出できる生体分子の検出方法及び肌状態の評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の一態様に係る生体分子の検出方法は、試料中に含まれる複数の生体分子の検出方法であって、前記試料中の前記複数の生体分子を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣ）で分離する分離ステップと、前記分離ステップで分離された前記複数の生体分子を保持するＴＬＣプレートに光源から光を照射する照射ステップと、前記光の照射により前記ＴＬＣプレートから発せられる光を、第１の分光及び第２の分光により、２以上の波長域の光に分光する分光ステップと、前記２以上の波長域の光に分光された光を受光素子で検出する検出ステップと、を有し、前記複数の生体分子は、前記光源から照射される光により励起されて蛍光を発する生体分子と、前記光源から照射される光を吸収する生体分子と、を含み、前記第１の分光は、前記複数の生体分子のうち前記蛍光を発する生体分子の蛍光輝度が、前記ＴＬＣプレートのバックグランドの輝度よりも高くなる波長域の光を通過させ、前記第２の分光は、前記光源から照射される光の波長域の光を通過させ、前記検出ステップでは、さらに、前記第１の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、前記第２の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、を含む２以上の画像に基づいて、前記試料中の前記複数の生体分子を検出する。
【０００９】
また、本開示の一態様に係る評価方法は、被験者の肌状態を評価する評価方法であって、上記のいずれかの生体分子の検出方法に含まれる各ステップと、前記検出ステップで得られた前記２以上の画像のそれぞれの明暗パターンに基づき、前記複数の生体分子のうち、前記第１の分光により分光されて検出された生体分子と前記第２の分光により分光されて検出された生体分子との量の比率を導出する導出ステップと、導出された前記比率に基づき前記被験者の肌状態を評価する評価ステップと、を有する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、試料に含まれる複数種類の生体分子を、迅速に、かつ、簡便に検出できる生体分子の検出方法を提供することができる。また、本開示によれば、試料を採取した被験者の肌状態を、迅速に、かつ、簡便に評価できる肌状態の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施の形態に係る生体分子を検出するために用いる検出装置の概略構成図である。
【図２】図２は、実施の形態に係る生体分子の検出方法を説明するフローチャートである。
【図３】図３は、電気泳動法の一例を示す図である。
【図４】図４は、電気泳動法により１次元分離した複数の生体分子をＴＬＣにより２次元分離する例を示す図である。
【図５】図５は、ＴＬＣで分離された複数の生体成分の吸収波長及び蛍光波長と、分光に使用する複数の蛍光フィルタ３２の透過帯の一例を示す図である。
【図６】図６は、第１の分光及び第２の分光により分光された光をそれぞれ結像した画像の一例を示す図である。
【図７】図７は、第１の分光及び第２の分光を行わない場合に得られる画像の一例である。
【図８】図８は、本実施の形態に係る肌状態の評価方法を説明するフローチャートである。
【図９】図９は、実施例１の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、比較例１の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例２の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、比較例２の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例３の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、画像解析方法の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、ウロカニン酸（シス型：トランス型＝１：１）の検量線及び実施例３の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、シス型及びトランス型の含有比率の異なるウロカニン酸標準液のＴＬＣの結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例５の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
【００１３】
本開示の一態様に係る生体分子の検出方法は、試料中に含まれる複数の生体分子の検出方法であって、前記試料中の前記複数の生体分子を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離する分離ステップと、前記分離ステップで分離された前記複数の生体分子を保持するＴＬＣプレートに光源から光を照射する照射ステップと、前記光の照射により前記ＴＬＣプレートから発せられる光を、第１の分光及び第２の分光により、２以上の波長域の光に分光する分光ステップと、前記２以上の波長域の光に分光された光を受光素子で検出する検出ステップと、を有し、前記複数の生体分子は、前記光源から照射される光により励起されて蛍光を発する生体分子と、前記光源から照射される光を吸収する生体分子と、を含み、前記第１の分光は、前記複数の生体分子のうち前記蛍光を発する生体分子の蛍光輝度が、前記ＴＬＣプレートのバックグランドの輝度よりも高くなる波長域の光を通過させ、前記第２の分光は、前記光源から照射される光の波長域の光を通過させ、前記検出ステップでは、さらに、前記第１の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、前記第２の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、を含む２以上の画像に基づいて、前記試料中の前記複数の生体分子を検出する。
【００１４】
これにより、複数の生体分子それぞれの蛍光特性及び吸光特性などの分光特性の差異から、複数の生体分子を、いくつかの分子群、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などに分類して検出することができる。また、第１の分光及び第２の分光によりＴＬＣプレートから発せられる光を分光することにより、分光しない場合に比べて、受光素子における光の受光感度が向上する。そのため、受光素子で受光される光の信号強度が相対的に高まり、より多くの情報が得られるようになる。また、第１の分光及び第２の分光により分光された波長域の光を結像させた２以上の画像に基づいて、例えば、各画像における分離スポットの形状、位置、信号強度、及び、個数、画像中の任意エリアの信号強度の平均値、分散度などの情報に基づいて、簡便に、試料中の複数の生体分子を検出することができる。したがって、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法によれば、試料に含まれる複数種類（以下、複数）の生体分子を、迅速に、かつ、簡便に検出できる。
【００１５】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法では、前記光源から照射される光は、紫外光であり、前記蛍光を発する生体分子は、芳香環を有し、前記光を吸収する生体分子は、前記紫外光を吸収してもよい。
【００１６】
これにより、光物質などの標識物質を使用することなく、ＴＬＣにより分離された生体分子に励起光を照射するだけで、生体分子が発光する蛍光と、生体分子が励起光を吸収する吸光と、を検出することができる。したがって、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法によれば、試料中の複数の生体分子を迅速に、かつ、簡便に検出することができる。
【００１７】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法は、前記分離ステップでは、前記ＴＬＣによる分離に先立ち、前記試料中の前記複数の生体分子を等電点電気泳動で第１の方向に分離し、前記ＴＬＣによる分離では、前記第１の方向に分離された前記複数の生体分子を前記第一の方向に直交する第２の方向に分離してもよい。
【００１８】
これにより、電気泳動法により分離された複数の生体分子を、ＴＬＣにより２次元分離することより、試料中の複数の生体分子を物理量の異なるパラメータで分離することができる。例えば、ＴＬＣによる分離に先立ち、試料中の複数の生体分子を等電点電気泳動で１次元分離することによって、タンパク質又はペプチドなどの分子量が比較的大きな生体分子に対しても高い分解解像度が得られる。そのため、取得できる情報量が多くなり、より高精度に複数の生体分子を分離することができる。
【００１９】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法では、前記試料は、角層由来成分であってもよい。
【００２０】
これにより、角層に含まれる種々の成分から被験者の健康状態及び肌状態を把握することができる。角層由来成分を試料として採取する方法は、例えば、血液又は粘膜などの他の生体試料の採取方法に比べて、被験者の負担になりにくい。例えば、角層由来成分は、テープストリッピング法により採取されてもよく、水又は生理食塩水などの肌に刺激などのダメージを与えにくい溶媒を肌に所定の時間接触させて採取されてもよい。そのため、より手軽に試料を採取することができる。
【００２１】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法では、前記第１の分光により分光されて検出される生体分子は、タンパク質、ペプチド、及び、アミノ酸のうち少なくとも１つを含み、前記第２の分光により分光されて検出される生体分子は、アミノ酸の代謝中間体であってもよい。
【００２２】
これにより、例えば、第２の分光により分光されて検出される生体分子と第１の分光により分光されて検出される生体分子との比率を求めることにより、より正確に生体状態を把握することができる。
【００２３】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法では、前記アミノ酸の代謝中間体は、ウロカニン酸であってもよい。
【００２４】
これにより、例えば、試料が角層由来成分である場合、角層由来成分中のウロカニン酸の含有比率、又は、ウロカニン酸総量に対する幾何異性体の比率を簡便に検出することができる、ウロカニン酸は、紫外線によりトランス型からシス型に変換される。また、紫外線により角層中のウロカニン酸の総量が減少することが知られている。そのため、ウロカニン酸を検出することにより、被験者の肌状態の評価につなげることができる。
【００２５】
例えば、本開示の一態様に係る生体分子の検出方法では、前記第１の分光により分光される波長域の光は、主として波長２９０ｎｍ以上４００ｎｍ以下の光であり、前記第２の分光により分光される波長域の光は、主として波長２５０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の光であってもよい。
【００２６】
これにより、例えば、ＴＬＣプレートが発する光を、光源から照射される紫外光の波長域と、それ以外の領域とに分けて検出することができる。そのため、分光して検出しない、つまり、フィルタリングしない場合に比べて、得られる情報量が多くなり、試料中の複数の生体分子をより精度よく検出することができる。
【００２７】
また、本開示の一態様に係る肌状態の評価方法は、被験者の肌状態を評価する評価方法であって、上記のいずれかの生体分子の検出方法に含まれる各ステップと、前記検出ステップで得られた前記２以上の画像のそれぞれの明暗パターンに基づき、前記複数の生体分子のうち、前記第１の分光により分光されて検出された生体分子と前記第２の分光により分光されて検出された生体分子との量の比率を導出する導出ステップと、導出された前記比率に基づき前記被験者の肌状態を評価する評価ステップと、を有する。
【００２８】
これにより、上記の生体分子の検出方法により得られる情報から、所望の成分、例えば、角層成分由来のウロカニン酸の含有比率を導出することにより、肌が受けた紫外線の影響を画像に基づき評価することができる。そのため、例えば、研究室で使用するような特殊な分析装置などを使用する必要がなく、試料を採取した被験者の肌状態を、迅速に、かつ、簡便に評価できる。
【００２９】
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム、又は、コンピュータで読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
【００３０】
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
【００３１】
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化することがある。
【００３２】
（実施の形態）
［検出装置の概要］
まず、本実施の形態に係る生体分子の検出方法に用いる検出装置の構成について説明する。図１は、本実施の形態に係る生体分子を検出するために用いる検出装置１００の概略構成図である。
【００３３】
図１に示すように、検出装置１００は、生体分子の分離に供したＴＬＣプレート４０を載せるサンプルステージ１０と、生体分子に励起光を照射する光源２０と、生体分子からの蛍光を検出する受光素子３４と、を備える。
【００３４】
生体分子は、生体を構成する物質であり、例えば、タンパク質、核酸、多糖類などの高分子、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂質、アミノ酸、及び、これらの代謝中間体などが挙げられる。タンパク質は、例えば、ケラチン及びコラーゲンのように生体の構造を作り強度を保つ機能、酵素のように生体反応の触媒になる機能、抗体のように生体を防御する機能など、様々な機能を有する。そのため、例えば、毛髪、皮膚、粘膜、唾液、及び、血液などの生体試料（以下、試料）に含まれる複数の生体分子を分離し、検出することにより、生体状態を把握することができる。
【００３５】
本実施の形態では、試料は、角層由来成分である例について説明する。角層由来成分に含まれる複数の生体分子を検出することにより、被験者の皮膚の状態、つまり、肌状態を把握することができる。
【００３６】
肌状態は、例えば、太陽の紫外線による影響、乾燥による影響、老化による影響又はアトピーなどの疾病による影響などにより変化する。太陽の紫外線による影響は、例えば、紫外線により肌内部の組織（例えば、コラーゲン、及び、エラスチン）が破壊されることにより、肌弾力及び保湿力が低下すること、紫外線により肌表面及び内部で炎症が起こること、及び、紫外線によりメラノサイトが活性化されること、などが挙げられる。また、乾燥による影響は、例えば、空気の乾燥、又は、過度の皮膚洗浄などによる皮膚の乾燥により、角質細胞における細胞間脂質（例えば、セラミドなど）が減少し、肌のバリア機能及び保水機能が低下することが挙げられる。老化による影響は、例えば、加齢により細胞活動が低下してターンオーバーの乱れることにより、角質表面に重層剥離が起こること、又は、タンパク質の糖化反応（メイラード反応）が生じることが挙げられる。なお、ターンオーバーの乱れは、加齢だけでなく、乾燥、及び、紫外線によるダメージによっても引き起こされる。
【００３７】
例えば、肌における紫外線の影響を評価する場合、肌が紫外線を浴びることにより含有量が変化する成分を分析してもよい。このとき、試料は、肌へのダメージが少ない方法で、かつ、容易に採取できる方法で採取されるとよい。このような方法で採取される成分で、かつ、紫外線により含有量が変化する成分としては、例えば、ウロカニン酸が挙げられる。ウロカニン酸は、水溶性成分であるため、例えば、水を含ませたコットン又は水を入れた小さな容器を肌に所定の時間接触させることで採取できる。角質層中のウロカニン酸は、紫外線から皮膚を保護する働きをする成分である。ウロカニン酸は、肌が紫外線に暴露されると減少することが知られている。なお、角質層に含まれる水溶性成分には、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質も含まれている。これらの成分も検出することにより、ウロカニン酸の相対的な含有量を算出することができる。
【００３８】
試料中の複数の生体分子は、光源２０から光を照射されると蛍光を発する生体分子と、光源２０から照射される光を吸収する生体分子とを含む。本実施の形態では、光源２０から照射される光は、例えば、紫外光である。このとき、当該蛍光を発する生体分子は、紫外光により励起されて蛍光を発する芳香環を有し、当該光を吸収する生体分子は、紫外光を吸収する。芳香環は、炭素原子が二重結合と単結合を繰り返すπ電子系の結合を有しているため、励起光として紫外光を照射されるとπ電子系の結合が紫外光を吸収して励起状態になり、蛍光を発する。芳香環を有する生体分子として、例えば、タンパク質及びペプチドの構成要素であるアミノ酸、つまり、芳香族アミノ酸が挙げられる。芳香族アミノ酸は、例えば、フェニルアラニン、チロシン、及び、トリプトファンである。芳香族アミノ酸は、２８０ｎｍ付近の紫外光を吸収し、３５０ｎｍの蛍光を発する。中でも、トリプトファンは量子効率が高く、蛍光強度が強い。トリプトファンに次いで、チロシンの蛍光強度が強い。そのため、これらの芳香族アミノ酸を分子構造中に有するペプチド及びタンパク質も、芳香族アミノ酸の種類及び含有量に応じて蛍光を発する。
【００３９】
なお、上記の蛍光を発する生体分子は、複素環を有してもよい。複素環も芳香環と同様に、π電子系の結合を有するため、紫外光を照射されると蛍光を発する。このように、検出対象分子、すなわち、生体分子が蛍光物質で修飾されることなく、蛍光を発することを自家蛍光と言う。本実施の形態では、生体分子の自家蛍光を検出することにより、蛍光を発する生体分子の種類及び濃度などを分析することができる。
【００４０】
また、紫外光を吸収する生体分子としては、例えば、ウロカニン酸である。ウロカニン酸は、ヒスチジンの代謝中間体である。
【００４１】
光源２０は、ＴＬＣにより分離された複数の生体分子を保持するＴＬＣプレート４０に光を照射する。本実施の形態では、光源２０は紫外光を照射する。検出装置１００を小型化する観点から、光源２０は、例えば、ＬＥＤであってもよい。生体分子は、例えば、レーザのように高出力の光が照射されると、分解する可能性がある。そのため、比較的出力の低いＬＥＤを光源２０に用いることで、光の照射により生体分子が受けるダメージを低減することができる。
【００４２】
光源２０は、ヒートシンク２１と、ヒートシンク２１に固定されたＬＥＤ２２と、ＬＥＤ２２の光の出射側に配置された励起光フィルタ２３と、を有する。ＬＥＤ２２をヒートシンク２１に固定することにより、ＬＥＤ２２点灯時にＬＥＤ２２の発熱による温度上昇を抑えることができる。なお、光源２０は、サンプルステージ１０の左右（図１のＸ軸方向のプラス側とマイナス側）に、Ｚ軸方向に沿って４灯ずつ所定の間隔で配置されている。
【００４３】
本実施の形態では、受光素子３４は、例えば、イメージセンサであり、有機樹脂から構成される光電変換膜を有してもよい。受光素子３４がイメージセンサであることにより、本実施の形態における検出装置１００は、ＴＬＣで分離された生体分子の蛍光を撮像することができる。また、受光素子３４が有機イメージセンサであることにより、生体分子が発する蛍光の強度に合わせて、受光素子３４の光感度を調整することができる。これにより、生体分子を高精度に検出することができる。
【００４４】
図１に示すように、受光素子３４は、撮像装置３０に含まれる。撮像装置３０は、レンズ３１と、電動フィルタホイール３３に設置された複数の蛍光フィルタ３２と、受光素子３４と、ペルチェ素子３５と、ヒートシンク３６とを備える。レンズ３１は、紫外光の透過性に優れているとよく、例えば、石英レンズである。ペルチェ素子３５は、暗電流抑制の観点から、受光素子３４の裏面に接触するように配置され、受光素子３４を冷却する。ヒートシンク３６は、ペルチェ素子３５に蓄積した熱を放熱する。
【００４５】
複数の蛍光フィルタ３２は、例えば、光の透過帯及び禁止帯がそれぞれ異なるバンドパスフィルタである。検出装置１００は、これらの複数の蛍光フィルタ３２を電動フィルタホイール３３で切り替えることにより、上記のＴＬＣプレート４０から発せられる光を、第１の分光及び第２の分光により、２以上の波長域の光に分光し、２以上の波長域に分光された光を受光素子３４で検出する。第１の分光は、複数の生体分子のうち蛍光を発する生体分子の蛍光輝度がＴＬＣプレート４０のバックグランドの輝度よりも高くなる波長域の光を通過させ、第２の分光は、光源２０から照射される光の波長域の光を通過させる。第１の分光により分光される波長域の光は、主として波長２９０ｎｍ以上４００ｎｍ以下の光であり、第２の分光により分光される波長域の光は、主として波長２５０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の光である。第１の分光により分光されて検出される生体分子は、タンパク質、ペプチド、及び、アミノ酸のうち少なくとも１つを含み、第２の分光により分光されて検出される生体分子は、アミノ酸の代謝中間体（ここでは、ウロカニン酸）である。
【００４６】
以上の構成を有することにより、検出装置１００は、試料中の複数の生体分子を迅速に、かつ、簡便に検出することができる。
【００４７】
［生体分子の検出方法］
以下、本実施の形態に係る生体分子の検出方法について説明する。図２は、本実施の形態に係る生体分子の検出方法を説明するフローチャートである。
【００４８】
本実施の形態に係る生体分子の検出方法は、試料中に含まれる複数の生体分子の検出方法であって、試料中の複数の生体分子をＴＬＣで分離する分離ステップ（ステップＳ１０）と、分離ステップＳ１０で分離された複数の生体分子を保持するＴＬＣプレート４０に光源から光を照射する照射ステップ（ステップＳ２０）と、光の照射によりＴＬＣプレート４０から発せられる光を、第１の分光（ステップＳ３１）及び第２の分光（ステップＳ３２）により、２以上の波長域の光に分光する分光ステップ（ステップＳ３０）と、２以上の波長域の光に分光された光を受光素子３４で検出する（ステップＳ４１）検出ステップ（ステップＳ４０）と、を有する。
【００４９】
検出ステップ（ステップＳ４０）では、さらに、第１の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、第２の分光により分光された波長域の光を結像させた画像と、を含む２以上の画像に基づいて、試料中の前記複数の生体分子を検出する（ステップＳ４２）。
【００５０】
以下、各ステップについてより具体的に説明する。
【００５１】
図２〜図４に示すように、分離ステップ（ステップＳ１０）では、ＴＬＣによる分離（ステップＳ１２）に先立ち、試料中の複数の生体分子を等電点電気泳動で分離してもよい（ステップＳ１１）。
【００５２】
図３は、電気泳動法の一例を示す図である。図４は、電気泳動法により１次元分離した複数の生体分子をＴＬＣにより２次元分離する例を示す図である。
【００５３】
図２に示すように、分離ステップ（ステップＳ１０）では、試料中の複数の生体分子を等電点電気泳動で第１の方向（Ｚ軸方向）に分離する（ステップＳ１１）。より具体的には、図３に示すように、電気泳動装置２００は、電気泳動用の緩衝液を入れた容器５０に試料を含ませた分離担体６０を配置し、電極５１で分離担体を挟持し、電圧を印加することにより、複数の生体分子７０を分離する。次いで、ＴＬＣによる分離（ステップＳ１２）では、第１の方向に分離された複数の生体分子７０を第一の方向に直交する第２の方向（Ｘ軸方向）に分離する。より具体的には、図４に示すように、ステップＳ１１で分離された複数の生体分子７０を保持する分離担体６０をＴＬＣプレート４０の固定相表面に配置し、分離担体６０をＴＬＣプレート４０に対して速やかに押圧し、分離担体６０をＴＬＣプレート４０から取り除く。ＴＬＣ装置３００は、展開容器８０内の載置部８１が地面に対して水平である水平展開層であり、凹部８２に展開溶媒９０が保持され、供給ストリップ８３を押出部８４にてＸ軸プラス方向に押し、展開溶媒９０を供給ストリップ８３を介してＴＬＣプレート４０に供給する。展開方向は、図４の矢印方向（第２の方向）である。
【００５４】
これにより、複数の生体分子を等電点の違いにより分離した後、ＴＬＣにより生体分子の極性の違いにより分離することができる。そのため、物理量の異なるパラメータで２次元に分離することにより、得られる情報量がより多くなり、より高精度に複数の生体分子を検出することができる。
【００５５】
次いで、照射ステップ（ステップＳ２０）では、光源２０からＴＬＣプレート４０に紫外光を照射する。なお、照射ステップ（ステップＳ２０）及び検出ステップ（ステップＳ３０）は、分離ステップ（ステップＳ１０）において、複数の生体分子をＴＬＣ（ステップＳ１２）で分離させながら行われてもよい。これにより、生体分子がＴＬＣにより分離される状況を確認しながら分離ステップ（ステップＳ１０）を行うことができる。そのため、複数の生体分子を適切に分離することができる。
【００５６】
次いで、分光ステップ（ステップＳ３０）では、ＴＬＣプレート４０から発せられる光を、第１の分光（ステップＳ３１）及び第２の分光（ステップＳ３２）により、２以上の波長域の光に分光し、２以上の波長域に分光された光を受光素子３４で検出する。
【００５７】
図５は、ＴＬＣで分離された複数の生体成分の吸収波長及び蛍光波長と、分光に使用する複数の蛍光フィルタ３２の透過帯の一例を示す図である。
【００５８】
第１の分光（ステップＳ３１）は、複数の生体分子のうち蛍光を発する生体分子の蛍光輝度がＴＬＣプレート４０のバックグランドの輝度よりも高くなる波長域の光を通過させる。このとき使用される蛍光フィルタ３２は、例えば、図５に示すバンドパスフィルタ（２）及びバンドパスフィルタ（３）である。バンドパスフィルタ（２）は、波長２９０ｎｍ以上３２５ｎｍ以下の範囲の光を透過させ、バンドパスフィルタ（３）は、波長３２５ｎｍ以上３５５ｎｍ以下の範囲の光を通過させる。これにより、第１の分光では、ＴＬＣプレート４０においてＴＬＣプレートのバックグランド輝度よりも高く、蛍光を発する複数の生体分子の蛍光を分光する。
【００５９】
第２の分光（ステップ３２）は、光源２０から照射される光の波長域の光を通過させる。このとき使用される蛍光フィルタ３２は、例えば、図５に示すバンドパスフィルタ（１）である。バンドパスフィルタ（１）は、波長２５０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の範囲の光を透過させる。これにより、第１の分光では、光源２０から照射された紫外光がＴＬＣプレートの表面で反射された光を抽出する。
【００６０】
以上のように、分光ステップ（ステップＳ３０）では、ＴＬＣプレートから発せられる光を第１の分光（ステップＳ３１）により、２つの波長域の光に分光し、第２の分光（ステップＳ３２）により光源から照射された光の波長域と同じ波長域の光を抽出する。
【００６１】
次いで、検出ステップ（ステップＳ４０）では、分光ステップ（ステップＳ３０）により分光された、ＴＬＣプレートが発する光を検出する（ステップＳ４１）。第１の分光（ステップＳ３１）において、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（２）を使用した場合、検出ステップ（ステップＳ４１）では、受光素子３４は、主たる成分としてチロシンとチロシンを分子構造中に含むペプチド及びタンパク質とを含む生体分子が発する蛍光を検出する。また、第１の分光（ステップＳ３１）において、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（３）を使用した場合、検出ステップ（ステップＳ４１）では、受光素子３４は、主たる成分としてトリプトファンとトリプトファンを分子構造中に含むペプチド及びタンパク質とを含む生体分子が発する蛍光を検出する。
【００６２】
また、第２の分光（ステップＳ３２）において、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（１）を使用した場合、検出ステップ（ステップＳ４１）では、受光素子３４は、ＴＬＣプレート４０において、主たる成分としてウロカニン酸を含む生体分子のスポット以外の領域が反射する光を検出する。
【００６３】
次いで、撮像装置３０（図１参照）は、ステップＳ４１で検出された第１の分光及び第２の分光により分光された光を結像した２以上の画像データをメモリ（不図示）に格納する。検出装置１００は、メモリ（不図示）に格納された２以上の画像データを読み出す。
【００６４】
図６は、第１の分光及び第２の分光により分光された光をそれぞれ結像した画像の一例を示す図である。図６の（ａ）は、第２の分光においてバンドパスフィルタ（１）を使用して分光された光を結像した画像である。図６の（ｂ）は、第１の分光においてバンドパスフィルタ（２）を使用して分光された光を結像した画像である。図６の（ｃ）は、第１の分光においてバンドパスフィルタ（３）を使用して分光された光を結像した画像である。
【００６５】
図６の（ａ）に示すように、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（１）を使用した場合、得られる画像では、主たる成分としてウロカニン酸を含む複数の生体分子のスポットが黒く表示され、ＴＬＣプレートにおいて当該スポット以外の領域は光っている。
【００６６】
また、図６の（ｂ）に示すように、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（２）を使用した場合、得られる画像では、主たる成分としてチロシンとチロシンを分子構造中に含むペプチド及びタンパク質とを含む複数の生体分子のスポットが明るく表示される。
【００６７】
また、図６の（ｃ）に示すように、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（３）を使用した場合、得られる画像では、主たる成分としてトリプトファンとトリプトファンを分子構造中に含むペプチド及びタンパク質とを含む複数の生体分子のスポットが明るく表示される。
【００６８】
このようにして得られた画像を比較し、評価することにより、複数の生体分子について多くの情報を簡便に得ることができるため、迅速に、かつ、適切に複数の生体分子を検出することができる。
【００６９】
なお、蛍光フィルタ３２として、例えば、図５に示すバンドパスフィルタ（４）のみを使用して、試料中の複数の生体分子を検出した場合は、上記のように多くの情報を得ることができず、複数の生体分子を適切に検出することができない。バンドパスフィルタ（４）は、波長３００ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の範囲の光を透過させる。
【００７０】
図７は、第１の分光及び第２の分光を行わない場合に得られる画像の一例である。図７に示すように、蛍光フィルタ３２としてバンドパスフィルタ（４）を使用した場合、蛍光を発する生体分子及び紫外光を吸収する生体分子を含む複数のスポットが重なり、検出感度も悪いことが分かる。このように、同じ試料を同じ条件で分離しても、分光ステップ（ステップＳ３０）により適切に分光しなければ、多くの情報を得ることができない。
【００７１】
したがって、本実施の形態に係る生体分子の検出方法によれば、検出対象分子の分光特性に応じて、適切に分光することにより、試料中の複数の生体分子を完全に分離しなくても、複数の生体分子を精度良く検出することができる。
【００７２】
以上により、本実施の形態に係る生体分子の検出方法によれば、簡便に、かつ、迅速に生体分子を検出することができる。
【００７３】
（肌状態の評価方法）
続いて、上述の生体分子の検出方法で得られた結果から、被験者の肌状態を評価する評価方法について説明する。なお、生体分子の検出方法で上述した内容と重複する内容については説明を省略する。図８は、本実施の形態に係る肌状態の評価方法を説明するフローチャートである。
【００７４】
図８に示すように、本実施の形態に係る肌状態の評価方法は、上述の生体分子の検出方法を含まれる各ステップ（ステップＳ１０〜Ｓ４０）と、検出ステップ（ステップＳ４０）で得られた２以上の画像のそれぞれの明暗パターンに基づき、複数の生体分子のうち、第１の分光により分光されて検出された生体分子と第２の分光により分光されて検出された生体分子との量の比率を導出する導出ステップ（ステップＳ５０）と、導出された比率に基づき被験者の肌状態を評価する評価ステップ（ステップＳ６０）と、を有する。
【００７５】
図６を再び参照すると、導出ステップ（ステップＳ５０）では、第１の分光により分光された光を結像させた画像（図６の（ｂ）及び（ｃ）参照）それぞれについて、蛍光輝度が高いスポット（明パターン）の全ての信号強度の合計を算出する。次いで、第２の分光により分光された光を結像させた画像（図６の（ａ）参照）について、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度よりも信号強度が低いスポット（暗パターン）の信号強度の合計を算出する。なお、これらの明パターン及び暗パターンの算出順序はこの順に限られない。次いで、算出された明暗パターンに基づいて、例えば、試料中のウロカニン酸の含有比率を求める場合は、明暗パターン全てに対応する生体分子の量に対する暗パターンに対応するウロカニン酸の量の比率を求める。具体的な導出方法の一例については、実施例３及び実施例５にて後述する。
【００７６】
次いで、評価ステップ（ステップＳ６０）では、ステップＳ５０で導出された比率に基づいて、被験者の肌状態を評価する。本実施の形態では、例えば、ウロカニン酸の含有比率を肌状態の指標に用い、角層中のウロカニン酸量が少ないほど、被験者の肌が紫外線の影響を受けていると評価する。ウロカニン酸は、紫外線（ＵＶ−Ｂ）を吸収する特性があり、紫外線を吸収することで、トランス型ウロカニン酸がシス型ウロカニン酸に変換される。所定量の紫外線の影響を受けた場合、角層中のウロカニン酸の総量（つまり、シス型及びトランス型の合計）が減少し、ウロカニン酸が検出されないほど低下する場合がある。そして、ある程度の期間の後、肌状態が回復してくると、角層中のウロカニン酸量が増え始める。本実施の形態では、このような角層中のウロカニン酸の挙動を踏まえ、被験者の肌状態を評価してもよい。具体的な評価方法の一例については、実施例３〜５にて後述する。なお、後述する指標Ｘの算出方法はあくまでも一例であり、分母の第１項を例えばバンドパスフィルタ（２）又は（３）の画像から導出した信号強度を用いてもよく、分光により得られる２以上の画像をグリッド化して特徴的な箇所の信号強度のみを使用してもよく、信号強度の合計ではなく、平均値を用いてもよい。また、以下の実施例３〜５では、信号強度（スポット体積）により評価したが、画素毎の信号値の分散値などの統計値を用いてもよい。
【００７７】
また、ウロカニン酸に限らず、例えば、肌の保湿に寄与する保湿成分、肌表面の荒れによる肌表面のタンパク質量の増加、又は、抗炎症成分などの含有比率を導出することにより、肌状態を評価してもよい。
【００７８】
なお、本実施の形態では、試料は、角層由来成分である例について説明するが、試料は角層由来成分に限られない。例えば、肌に対する紫外線による影響を評価するために、例えば、血液中又は粘液中の炎症成分を検出してもよい。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例にて本開示の生体分子の検出方法を具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
【００８０】
［１］ＴＬＣによる角層サンプルの１次元分離
（実施例１）
［角層サンプル］
シリコーンゴムのリング（高さ：１．５ｃｍ、底面積：５．９ｃｍ２）を腕部に密着させ、脱イオン水１ｍＬを注ぎ、約２分間静置した。その後、その液を回収することで、角層の水溶性成分を採取した。さらに、脱塩処理を行った後に、凍結乾燥して、サンプル濃縮を行った。濃縮倍率のコントロールは、サンプル中の生体分子の総量を波長２６０ｎｍの紫外吸光法によって吸光度をモニタすることで行い、１０倍に濃縮されたサンプルを得た。
【００８１】
［ＴＬＣ］
得られたサンプル（１μＬ）をＴＬＣに供した。ＴＬＣプレートは、シリカ粒子非蛍光ＨＰＴＬＣプレート（ｇｅｌ６０ＲＰ−１８、メルク社製）で、２０ｍｍ×３０ｍｍのサイズのプレートを用いた。展開溶媒は、イソプロピルアルコール／クエン酸／水（体積比）＝４０／０．１／５９．９の比で混合したものを用いた。使用した溶媒の体積は２ｍＬであった。展開層は、水平展開槽を用いた。展開後、ＴＬＣプレートを７０℃に保持されたホットプレート上に置き、ＴＬＣプレートに含まれる展開溶媒を蒸発させた。その後、以下の条件で当該ＴＬＣプレートを撮像した。
【００８２】
［撮影条件］
以下の光源及び撮像装置を使用し、以下の撮像条件にてＴＬＣプレートの画像を得た。
【００８３】
［光源］
サンプルステージ１０（図１参照）の左右に、中心波長２８０ｎｍ、光出力５０ｍＷのＵＶ−ＬＥＤを４灯ずつ２０ｍｍ間隔に配置した。サンプルステージ１０から光源２０までの高さは、６５ｍｍであった。上述したように、各ＬＥＤ２２は、ヒートシンク２１に固定され、駆動時に発生する熱を排熱しながら使用した。
【００８４】
また、励起光フィルタ２３には、透過帯が２５０ｎｍ〜２９０ｎｍであり、禁止帯が概ねＯＤ５以下であるバンドパスフィルタを使用した。当該バンドパスフィルタは、ＬＥＤの前に設置された。
【００８５】
［撮像装置］
受光素子３４には、２００万画素（有効画素）のモノクロＣＣＤ冷却カメラ（ビットラン社製  ＢＵ−５４ＤＵＶ）を用いた。受光素子３４の裏面には、ペルチェ素子３５を接触させ、約−２０℃に冷却した。
【００８６】
撮像レンズ３１には、焦点距離２５ｍｍ、Ｆ値２．８のＵＶ光撮影用石英レンズを用いた。
【００８７】
蛍光フィルタ３２には、以下の３つのバンドパスフィルタを用いた。
（１）透過帯が２５０ｎｍ〜２９０ｎｍであり、禁止帯が概ねＯＤ５以下であるバンドパスフィルタ
（２）透過帯が２９０ｎｍ〜３２５ｎｍであり、禁止帯が概ねＯＤ７以下であるバンドパスフィルタ
（３）透過帯が３２５ｎｍ〜３５５ｎｍであり、禁止帯が概ねＯＤ７以下のバンドパスフィルタ
【００８８】
これらの３つのバンドパスフィルタを電動フィルタホイール３３にセットし、撮像レンズ３１の前に設置した。
【００８９】
［撮像条件］
上記撮像装置を用いて、２００万画素で撮像した。上記の３つのバンドパスフィルタを（１）〜（３）の順に電動で切り替えながら、各フィルタにおいて励起光を照射し、一定時間シャッターを電子的に開放し、ＴＬＣプレートを撮像した。具体的には、バンドパスフィルタ（１）を使用した場合は、露光時間は、１秒であり、バンドパスフィルタ（２）を使用した場合は、露光時間は、１８０秒であり、バンドパスフィルタ（３）を使用した場合は、露光時間は、１８０秒であった。撮像中のみ、ＬＥＤ２２を上記の条件で点灯した。フィルタ毎に異なる色収差によるピントずれは、被写体であるＴＬＣプレートとカメラとの相対位置を調整することで補正した。画像の明暗諧調は、１６ｂｉｔであった。
【００９０】
図９は、実施例１の結果を示す図である。図９の（ａ）は、バンドパスフィルタ（１）を使用して、露光時間０．０５秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。図９の（ｂ）は、バンドパスフィルタ（２）を使用して、露光時間１８０秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。図９の（ｃ）は、バンドパスフィルタ（３）を使用して、露光時間１８０秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。
【００９１】
図９の（ａ）では、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が低いスポットが確認された。当該スポットに含まれる成分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などで分析したところ、当該スポットは、ウロカニン酸を多く含むことが確認できた。また、当該スポットには、ウロカニン酸以外に、アミノ酸、ペプチド、及び、タンパク質の存在を示唆する成分が含まれていることが確認できた。
【００９２】
図９の（ｂ）及び（ｃ）では、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が高い複数のスポットが確認された。図９の（ｂ）と（ｃ）とでは、複数のスポットそれぞれの位置及び大きさなどが異なっていたが、大きな差異はなかった。これらのスポットのそれぞれに含まれる成分をＨＰＬＣなどで確認したところ、各スポットは、アミノ酸、ペプチド、及び、タンパク質を多く含むことが確認できた。また、これらのスポットのそれぞれには、ウロカニン酸の存在を示唆する成分も含まれていることが確認できた。
【００９３】
（比較例１）
蛍光フィルタ３２として、透過率が３００ｎｍ〜３７０ｎｍであり、禁止帯が概ねＯＤ７以下であるバンドパスフィルタ（以下、バンドパスフィルタ（４））を使用し、露光時間が４秒であったこと以外は、実施例１と同様に行った。バンドパスフィルタ（４）は、主にアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の自家蛍光を包括的に検出できるように構成されたフィルタである。図１０は、比較例１の結果を示す図である。
【００９４】
図１０では、ＴＬＣのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が高い複数のスポットが確認された。これらのスポットのそれぞれに含まれる成分をＨＰＬＣなどで確認したところ、各スポットは、ウロカニン酸、アミノ酸、ペプチド、及び、タンパク質を含むことが確認できた。
【００９５】
［２］等電点電気泳動及びＴＬＣの併用による角層サンプルの２次元分離
（実施例２）
実施例１と同様にして得られた角層サンプルを、等電点電気泳動にて１次元分離した後、ＴＬＣにて２次元分離した。図４は、２次元分離の方法を模式的に示す図である。
【００９６】
［等電点電気泳動］
１％アンフォライト（ｐＨレンジ：３〜１０）溶液１μＬに、上記角層サンプルを添加し、合計７μＬとした。それを長さ２４ｍｍ×幅２ｍｍのセルロースアセテート膜全体に含侵させた。次に、セルロースアセテート膜をペルチェ素子で１０℃に冷却しながら、白金電極をセルロースアセテート膜の長手方向の両端に接触させた。白金電極に電圧を２００から４００Ｖまで１０分間昇圧しながら印加した。その後、定電圧４００Ｖを１０分間印加し、トータル時間で２０分間の等電点電気泳動を実施した。
【００９７】
［ＴＬＣ］
等電点電気泳動が終了した後、電気泳動装置からセルロースアセテート膜を取り外し、図４に示すように、セルロースアセテート膜（図４の分離担体６０に相当）に保持された１次元分離サンプルを、ＴＬＣプレートに供給した。より具体的には、当該セルロースアセテート膜をＴＬＣプレートの展開方向に対して直交するように配置し、ＴＬＣプレートに対して圧力２ＭＰａで垂直にセルロースアセテート膜を４５秒押圧することにより、等電点電気泳動で分離された角層サンプルをＴＬＣプレートに供給した。ＴＬＣの条件は、実施例１と同様である。
【００９８】
［撮像条件］
実施例２の撮像条件は、実施例１と同様である。図１１は、実施例２の結果を示す図である。図１１の（ａ）は、バンドパスフィルタ（１）を使用して、露光時間０．０５秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。図１１の（ｂ）は、バンドパスフィルタ（２）を使用して、露光時間１８０秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。図１１の（ｃ）は、バンドパスフィルタ（３）を使用して、露光時間１８０秒で撮像したＴＬＣプレートの画像である。
【００９９】
図１１の（ａ）では、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が低いスポットが確認された。当該スポットに含まれる成分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などで分析したところ、当該スポットは、ウロカニン酸を主成分とすることが確認できた。
【０１００】
図１１の（ｂ）及び（ｃ）では、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が高い複数のスポットが確認された。これらのスポットに含まれる成分をＨＰＬＣなどで分析したところ、図１１の（ｂ）では、主たる成分としてアミノ酸であるチロシンと、それを含むペプチド、タンパク質の存在を示唆する成分が含まれていた。特にアミノ酸、ペプチドが多く含まれていた。図１１の（ｃ）では、主たる成分としてアミノ酸であるトリプトファンと、それを含むペプチド、タンパク質の存在を示唆する成分が含まれていた。特にタンパク質が多く含まれていた。
【０１０１】
以上のように、２次元分離を行い、３つのバンドパスフィルタを使用して撮像することにより、角質サンプルに含まれる成分を以下の３種類のスポットとして検出することができた。
（１）ウロカニン酸を主成分とするスポット
（２）チロシンを多く含むアミノ酸、ペプチド及びタンパク質を含むスポットで、特に、アミノ酸とペプチドとを多く含むスポット
（３）トリプトファンを多く含むアミノ酸、ペプチド及びタンパク質を含むスポットで、特に、タンパク質を多く含むスポット
【０１０２】
（比較例２）
比較例２では、実施例２と同様に、角層サンプルを２次元分離した。撮像条件は、比較例１と同様である。図１２は、比較例２の結果を示す図である。
【０１０３】
図１２では、ＴＬＣのバックグランド輝度に比べて、蛍光輝度が低い１つのスポット、及び、蛍光輝度が高い複数のスポットが確認された。これらのスポットのそれぞれに含まれる成分をＨＰＬＣなどで確認したところ、各スポットは、ウロカニン酸、アミノ酸、ペプチド、及び、タンパク質を含むことが確認できた。
【０１０４】
［３］画像パターンからのウロカニン酸の分析
被験者Ａ及びＢの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例１と同様にして得た。
【０１０５】
（実施例３）
得られた被験者Ａ及びＢの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例２と同様に、２次元分離に供した。各被験者の角層サンプルについて、３サンプルずつ準備した。撮像条件は、実施例１に記載のバンドパスフィルタ（１）を使用した条件と同様である。得られた画像について、以下の画像解析方法により、画像における各スポットの信号強度（以下、スポット体積ともいう）を導出した。図１３は、実施例３の結果を示す図である。図１３の（ａ）は、被験者Ａの角層サンプルを２次元分離した結果の一例を示し、図１３の（ｂ）は、被験者Ｂの角層サンプルを２次元分離した結果の一例を示す。
【０１０６】
［画像解析方法］
図１４は、画像解析方法の一例を示す図である。図１４の（ａ）は、被傾斜Ａの角層サンプルを２次元分離して得られた画像において、画素毎にグレー値（輝度値）を導出する例を示す図である。図１４の（ｂ）は、図１４の（ａ）における矢印方向に画素毎のグレー値を導出した結果からスポット体積を導出する一例を示す図である。
【０１０７】
得られた画像において、各画像におけるスポットの蛍光輝度分布の平均値と、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度の輝度分布の平均値との差分値を算出した後、絶対値を取り、スポットの分散の±σの領域の間で積分することで、スポット体積を導出した。これにより、被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの角層サンプルについて、３つのスポット体積が導出された。
【０１０８】
導出されたスポット体積の平均値を算出したところ、被験者Ａの角層サンプルでは、ウロカニン酸を多く含むスポットのスポット体積は、１．０×１０７であった。被験者Ｂの角層サンプルでは、ウロカニン酸を多く含むスポットのスポット体積は、２．９×１０７であった。
【０１０９】
［角層サンプル中のウロカニン酸の定量］
続いて、ＴＬＣで得られたスポットのスポット体積と、ウロカニン酸の濃度との相関を取るために、被験者Ａ及び被験者Ｂの角層サンプルのそれぞれをＨＰＬＣに供し、ウロカニン酸を定量した。その結果、被験者Ａの角層サンプル中のウロカニン酸量は、２．０９ｎｇ／μＬであり、被験者Ｂの角層サンプル中のウロカニン酸量は、３．４１ｎｇ／μＬであった。
【０１１０】
［ウロカニン酸の検量線］
続いて、ウロカニン酸（シス型：トランス型＝１：１）の標準試料を用い、ウロカニン酸の検量線を作成した。１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、及び、１００ｎｇ／μＬのウロカニン酸標準液を調製した。これらのウロカニン酸標準液を実施例１と同様にＴＬＣに供した。撮像条件は、実施例１に記載のバンドパスフィルタ（１）を用いた場合の条件である。得られた画像におけるスポット体積は、上記の画像解析方法により導出された。１ｎｇ／μＬのウロカニン酸のスポット体積は、１．２×１０７であり、１０ｎｇ／μＬのウロカニン酸のスポット体積は、１．４×１０８であり、１００ｎｇ／μＬのウロカニン酸のスポット体積は、６．０×１０８であった。結果を図１３に示す。図１５は、ウロカニン酸（シス型：トランス型＝１：１）の検量線及び実施例３の結果を示す図である。図１３では、縦軸がスポット体積（信号強度）を表し、横軸はウロカニン酸の濃度を表している。図１５では、見やすさの観点から、ウロカニン酸の濃度が０ｎｇ／μＬ〜１０ｎｇ／μＬまでの範囲を示している。
【０１１１】
図１５では、ウロカニン酸の検量線と、被験者Ａ及び被験者Ｂの角層サンプル中のウロカニン酸の線形性を比較している。図１５に示すように、被験者Ａ及び被験者Ｂの角層サンプル中のウロカニン酸は、ウロカニン酸（シス型：トランス型＝１：１）の検量線に対して、検量線の傾きに近い線形性が得られた。これにより、角層サンプルをＴＬＣで分離して得られたスポットのスポット体積からウロカニン酸を概ね定量できることが示唆された。言い換えると、角層サンプルを分離したＴＬＣプレートを上記の撮像条件で撮像した画像におけるスポットの信号強度を上記の画像解析方法で導出することにより、角層サンプル中のウロカニン酸量を概ね定量できることが示唆された。
【０１１２】
被験者Ａ及び被験者Ｂの角層サンプルから分離されたウロカニン酸の線形性と、検量線とが一致しなかった理由は、被験者Ａ及び被験者Ｂの角層サンプルに含まれるウロカニン酸のシス型及びトランス型の含有比率と、ウロカニン酸の標準試料におけるシス型及びトランス型の含有比率とが異なったためであると考えられる。シス型及びトランス型の幾何異性体では、紫外線のモル吸光係数が異なる。また、シス型及びトランス型の幾何異性体では、等電点が異なる。例えば、Ｈ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｚ／Ｅ  ＰＨＯＴＯＩＳＯＭＥＲＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＲＯＣＡＮＩＣ  ＡＣＩＤ”，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９８０年，  ｖｏｌ．４５，  ｐｐ．７９８−８０３（非特許文献１）によれば、シス型ウロカニン酸の等電点は、４．８であり、トランス型ウロカニン酸の等電点は、５．１であることが知られている。幾何異性体における等電点の違いを鑑みると、図１３の（ａ）に示す被験者Ａの角層サンプル中のウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、紙面の左側に偏った形状のスポットである。これは、シス型ウロカニン酸の含有比率が高いことを示唆している。
【０１１３】
図４を参照して説明したように、ＴＬＣによる２次元分離では、ウロカニン酸の標準試料を等電点電気泳動により１次元分離した後、分離された当該標準試料（以下、１次元分離試料）が保持された担体を、ＴＬＣの展開方向と直交するようにＴＬＣプレート上に配置し、当該担体をＴＬＣプレートの表面に向かって素早く押圧し、当該担体に保持された１次元分離試料をＴＬＣプレートに供給した。電気泳動の方向とＴＬＣの展開方向に対する右方向とが一致するように、当該担体をＴＬＣプレート上に配置した。そのため、シス型及びトランス型ウロカニン酸のうち等電点の高いトランス型ウロカニン酸がＴＬＣプレートの展開方向に対して右側に位置する。図１３の（ｂ）に示す被験者Ｂの角層サンプル中のウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、紙面の右側に偏った形状のスポットである。そのため、トランス型ウロカニン酸の含有比率が高いと示唆される。
【０１１４】
［４］シス型及びトランス型のウロカニン酸の半定量分析
実施例３の結果から、角層サンプル中のウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、当該成分中のシス型及びトランス型のウロカニン酸の含有比率の違いにより、その形状及び検出位置に差異が生じることが分かった。そこで、角層サンプル中にシス型及びトランス型のウロカニン酸のどちらが多く含まれているかを簡便に検出する方法を検討した。上述のとおり、角層中のウロカニン酸は、紫外線によりトランス型からシス型に変換される。そのため、肌状態の評価への有用性を鑑み、ウロカニン酸総量に対する幾何異性体の含有比率を半定量する方法を検討した。
【０１１５】
（実施例４）
試料として、シス型及びトランス型の含有比率の異なるウロカニン酸標準液を準備した。準備したウロカニン酸標準液は、以下の３種類である。
（ａ）シス型：トランス型＝３０：７０
（ｂ）シス型：トランス型＝７０：３０
（ｃ）シス型：トランス型＝１００：０
【０１１６】
次いで、これらのウロカニン酸標準液をＴＬＣに供した後、上述のバンドパスフィルタ（１）を使用した撮像条件で、ＴＬＣプレートを撮像した。図１６は、シス型及びトランス型の含有比率の異なるウロカニン酸標準液のＴＬＣの結果を示す図である。図１６の（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ上記のウロカニン酸標準液のスポットである。図１６に示すように、シス型及びトランス型のウロカニン酸の含有比率により、スポットの形状及び位置に差異が見られた。
【０１１７】
各スポットの位置、つまり、各スポットの中心の位置を比較すると、図１６の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の順に、各スポットの位置が高くなっている。これは、試料中のシス型ウロカニン酸の含有比率が高いほど、試料とＴＬＣプレートの固定相との親和性が低くなることを示唆している。したがって、試料中のシス型ウロカニン酸の含有比率が高いほど、ＴＬＣにより分離されたスポットのＲｆ値が高くなることが分かった。
【０１１８】
また、各スポットの形状及び下端の位置を比較すると、図１６の（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）の順に、各スポットの形状は、縦方向に伸び、各スポットの下端の位置が低くなっている。これは、試料中のトランス型ウロカニン酸の含有比率が高いほど、試料とＴＬＣプレートの固定相との親和性が高くなることを示唆している。これにより、試料中のトランス型ウロカニン酸の含有比率が高いほど、ＴＬＣにより分離されたスポットのＲｆ値が低くなることが分かった。
【０１１９】
以上により、ＴＬＣにより２次元分離されたウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、シス型ウロカニン酸の含有比率が高い場合、例えば、図１３の（ｂ）に示すように、スポットの形状は、展開方向に対して右上に伸びた雫型になることが予測された。
【０１２０】
［５］スポットの形状と角層サンプル中のシス型及びトランス型ウロカニン酸の含有比率との関係性
被験者Ｃ及びＤの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例１と同様にして得た。
【０１２１】
（実施例５）
得られた被験者Ｃ及びＤの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例２と同様に、２次元分離に供した。撮像条件は、実施例１に記載のバンドパスフィルタ（１）を使用した条件と同様である。図１７は、実施例５の結果を示す図である。図１７の（ａ）は、被験者Ｃの角層サンプルを２次元分離した結果を示す。図１７の（ｂ）は、被験者Ｄの角層サンプルを２次元分離した結果を示す。
【０１２２】
図１７の（ａ）に示すように、被験者Ｃの角層サンプル中のウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、楕円形状であった。一方、図１７の（ｂ）に示すように、被験者Ｄの角層サンプル中のウロカニン酸を多く含む成分のスポットは、ＴＬＣの展開方向に対して右上に伸びた雫型の形状であった。
【０１２３】
［角層サンプル中のシス型ウロカニン酸の定量］
続いて、被験者Ｃ及び被験者Ｄの角層サンプルのそれぞれをＨＰＬＣに供し、シス型ウロカニン酸を定量した。その結果、被験者Ｃの角層サンプル中のシス型ウロカニン酸量は、１．４２ｎｇ／μＬであり、被験者Ｄの角層サンプル中のシス型ウロカニン酸量は、２．３１ｎｇ／μＬであった。
【０１２４】
以上により、ウロカニン酸を多く含む成分のシス型ウロカニン酸の含有比率が高い場合、例えば図１６の（ｂ）に示すように、ＴＬＣにより分離されたスポットは、展開方向に対して右上に伸びる雫型の形状になることが確認できた。
【０１２５】
［６］肌状態の分析
被験者Ａ及びＢの２名の肌状態を以下の方法で分析した。
【０１２６】
（実施例６）
被験者Ａ及びＢの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例１と同様にして得た。得られた被験者Ａ及びＢの２名の角層サンプルを、それぞれ、実施例２と同様に、２次元分離に供した。撮像条件は、実施例１に記載のバンドパスフィルタ（１）〜（３）を使用した条件と同様である。
【０１２７】
被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの角層サンプルを２次元分離に供したＴＬＣプレート（以下、単に、ＴＬＣプレート）を、バンドパスフィルタ（１）を使用した条件で撮像し、ウロカニン酸を多く含む成分のスポットの画像を得た。次いで、バンドパスフィルタ（２）を使用した条件でＴＬＣプレートを撮像し、チロシンを多く含むアミノ酸、ペプチド及びタンパク質を含む成分で、特に、アミノ酸とペプチドとを含む成分のスポット（以下、アミノ酸＋ペプチドのスポット）の画像を得た。次いで、バンドパスフィルタ（３）を使用した条件でＴＬＣプレートを撮像し、トリプトファンと多く含むアミノ酸、ペプチド及びタンパク質を含む成分で、特に、ペプチドとタンパク質とを多く含む成分のスポット（以下、ペプチド＋タンパク質のスポット）の画像を得た。
【０１２８】
これらのスポット体積を、以下の画像解析方法にて導出した。なお、ウロカニン酸を多く含む成分のスポット（以下、ウロカニン酸のスポット）のスポット体積については、実施例１に記載の画像解析方法にて導出した。
【０１２９】
［画像解析方法］
バンドパスフィルタ（２）及びバンドパスフィルタ（３）を使用した条件で撮像された画像は、ＴＬＣプレートのバックグランド輝度に対して、角層サンプル由来のスポットの蛍光輝度が高いため、該当スポットの蛍光輝度値からＴＬＣプレートのバックグランド輝度の平均輝度値の差分値を、スポットの分散の±σの領域の間で積分することで、スポットの信号強度（いわゆる、スポット体積）を導出した。
【０１３０】
［肌状態の指標］
肌状態の指標Ｘは、下記式を用いて算出された。
【０１３１】
Ｘ＝ウロカニン酸のスポット体積／α＋ウロカニン酸のスポット体積
【０１３２】
αは、定数であり、ここでは、α＝０．０１である。なお、αは、アミノ酸＋ペプチドのスポット体積とペプチド＋タンパク質のスポット体積との和であるが、これらのスポットの信号強度がウロカニン酸のスポットの信号強度に対して非常に大きかったため、ここでは、定数０．０１を用いた。αは、信号強度を補正するために用いた定数であり、ＨＰＬＣ及びニンヒドリン染色法などにより定量された、複数の被験者の角層サンプルにおける「ウロカニン酸」と「アミノ酸＋ペプチド＋タンパク質」との量比の平均値から算出した。
【０１３３】
上記式により算出された被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの肌状態の指標Ｘは、２．４５及び４．５３であった。これにより、被験者Ａは、被験者Ｂに比べて角層成分中にはウロカニン酸の濃度が低いことが分かった。
【０１３４】
［被験者のしみの大きさの測定］
続いて、被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの腕部のカラー画像を撮像し、当該画像から「しみ」と考えられ得る黒ずみ部位の面積を算出した。黒ずみ部位の面積を、腕部の１０ｍｍ２の領域に対して見積もったところ、被験者Ａは０．８ｍｍ２であり、被験者Ｂは０．２２ｍｍ２であった。
【０１３５】
以上により、被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの肌状態の指標Ｘの値は、被験者Ａ及び被験者Ｂそれぞれの腕部の黒ずみ部分の面積に対して線形的な相関を有することが示唆される。
【０１３６】
本実施例では、肌状態の分析の一例として、角層由来成分中のウロカニン酸の割合を肌状態の指標Ｘとして算出し、当該指標Ｘと、被験者の腕部における黒ずみ部位の面積とが相関を有することを見出したが、あくまでも一例であり、これに限られない。例えば、肌表面に「しみ」が顕在化する前であっても、日焼けによる肌の炎症、ターンオーバーの乱れ、乾燥によるダメージなどによるバリア機能の低下を示すパラメータに対しても、上記の肌状態の指標Ｘとの相関が得られると期待される。
【０１３７】
［まとめ］
以上の実施例及び比較例の結果から、本開示に係る生体分子の検出方法は、試料中に含まれる複数の生体分子の自家蛍光及び紫外光の吸光を検出するために、適切な分光を行うことにより、分光を行わずに得られる情報量よりも多くの情報量を得ることができる。そのため、例えば、分離ステップにおいて分離が十分な分離が難しい状況であっても、検出対象とする生体分子の分光特性に合わせた分光を行うことにより、適切に生体分子の検出を行うことができる。
【０１３８】
以上、本開示に係る生体分子の検出方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本開示に係る生体分子の検出方法は、試料中の複数の生体分子を、簡便に、かつ、迅速に検出することができるため、例えば、血液などの生体試料からそれらの生体分子を分離し、検出することにより、生体状態を簡便に把握することができる。また、本開示に係る肌状態の評価方法は、上記の生体分子の検出方法により、被験者の角層由来成分から簡便に肌状態を検出することができる。そのため、これらの方法を用いれば、簡便に、特別な専門知識を必要なく、生体分子を検出し、検出した結果から生体状態を把握するための装置に利用可能である。
【符号の説明】
【０１４０】
１０  サンプルステージ
２０  光源
２１  ヒートシンク
２２  ＬＥＤ
２３  励起光フィルタ
３０  撮像装置
３１  レンズ
３２  蛍光フィルタ
３３  電動フィルタホイール
３４  受光素子
３５  ペルチェ素子
３６  ヒートシンク
４０  ＴＬＣプレート
５０  容器
５１  電極
６０  分離担体
７０  生体分子
８０  展開容器
８１  載置部
８２  凹部
８３  供給ストリップ
８４  押出部
９０  展開溶媒
１００  検出装置
２００  電気泳動装置
３００  ＴＬＣ装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020106412.tif 000009
【図８】
2020106412.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2020106412.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020106412.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
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