(57)【要約】      （修正有）【課題】結晶性キチン分解能を有する新規な微生物製剤の提供。【解決手段】以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、結晶性キチン分解能を有する微生物を含んでなる、結晶性キチン分解剤：（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、特定の塩基配列を有する、イソプテリコラ・ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、（ａ）の配列と異なる特定の塩基配列を有する、イソプテリコラ・ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、結晶性キチン分解能を有する微生物を含んでなる、結晶性キチン分解剤：
（ａ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｂ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。
【請求項２】
結晶性キチン分解能を有する微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、請求項１に記載の結晶性キチン分解剤：
（ｃ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）、
（ｄ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１９株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載の微生物を含んでなる、結晶性キチン分解剤。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、結晶性キチン分解能を有する微生物：
（ａ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｂ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。
【請求項５】
結晶性キチン分解能を有する微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、請求項４に記載の微生物：
（ｃ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）、
（ｄ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１９株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）。
【請求項６】
請求項１〜２のいずれかに記載の結晶性キチン分解剤を、結晶性キチンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、結晶性キチンの分解方法。
【請求項７】
結晶性キチンが、甲殻類の外骨格の破砕物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
甲殻類の消化管内から微生物を分離する工程、
分離された微生物を結晶性キチン分解能検出系で培養する工程、
を含む、甲殻類の消化管から結晶性キチン分解能を有する微生物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陸ガニ消化管由来キチン分解細菌群に関し、該細菌を含んでなる結晶性キチン分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス資源が、持続的に利用可能な製造原料、あるいは高機能製品の製造原料として、注目されている。また、バイオマス資源の利用に伴って生じる膨大な廃棄物の処理を、容易に行うことができる手段が求められるようになってきている。
【０００３】
カニやエビなどの甲殻類の外骨格は水産業において大量に廃棄されるが、これらは非常に安定しており、再利用の処理も廃棄の処理も容易ではない。そこで、カニやエビなどの甲殻類の外骨格に由来するバイオマス資源の利用、あるいはその利用に伴う廃棄物の処理のために、キチン及びキトサンの分解手段が従来から探索されてきた。
【０００４】
非特許文献１は、キチン・キトサンを分解する酵素源として、様々な細菌、古細菌が主に研究、応用されてきていることを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｏｏｄａｙ  ＧＷ．１９９０．Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．，１１：３８７−４３０．，Ｋｉｅｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９：２６３−２７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
キトサンは、キチンの熱濃アルカリ処理による分解生成物である。そのため、キトサンよりも、キチンを直接分解する処理のほうが、より難易度は高い。このキチンの分解のために、キチナーゼ分解活性を有する酵素（キチナーゼ）の探索研究がなされてきた。しかし、本発明者の検討によれば、従来の研究開発において、キチナーゼ分解活性は、キチンを濃酸で分解処理して可溶化した後に、再沈殿して得られたコロイダルキチンを用いた系において活性を示すものにすぎず、天然のキチンそのもの、すなわち結晶性キチンにおいて活性を示すものとは言えない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、結晶性キチン分解能を有する新規な微生物製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意探索研究を進めた結果、北陸地方の海辺林における生態学的な観察から、森林に生息するアカテガニ等の甲殻類が、森林と海を往復する習性から海辺林−水域の物質循環や沿岸の水産資源維持を担うほどの大量のバイオマス処理を行っているという洞察を得た。そして、カニ類は頻繁に共食いをするという習性なども考慮すると、これらの甲殻類自身の外骨格も含めて、このようなバイオマス処理を行うだけの強いバイオマス分解能力を持っていると予想して、この甲殻類の消化管に対してスクリーニングを行ったところ、強い結晶性キチン分解能を有する微生物を単離して、本発明に到達した。
【０００９】
したがって、本発明は、次の（１）以下を含む。
（１）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、結晶性キチン分解能を有する微生物を含んでなる、結晶性キチン分解剤：
（ａ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｂ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。
（２）
結晶性キチン分解能を有する微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（１）に記載の結晶性キチン分解剤：
（ｃ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）、
（ｄ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１９株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）。
（３）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物を含んでなる、結晶性キチン分解剤。
（４）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、結晶性キチン分解能を有する微生物：
（ａ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｂ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。
（５）
結晶性キチン分解能を有する微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（４）に記載の微生物：
（ｃ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）、
（ｄ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１９株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）。
（６）
（１）〜（２）のいずれかに記載の結晶性キチン分解剤を、結晶性キチンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、結晶性キチンの分解方法。
（７）
結晶性キチンが、甲殻類の外骨格の破砕物である、（６）に記載の方法。
（８）
甲殻類の消化管内から微生物を分離する工程、
分離された微生物を結晶性キチン分解能検出系で培養する工程、
を含む、甲殻類の消化管から結晶性キチン分解能を有する微生物を製造する方法。
【００１０】
さらに、本発明は、次の（１１）以下を含む。
（１１）
（１）〜（８）のいずれかに記載の微生物の、結晶性キチン分解のための使用（ｕｓｅ）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、カニやエビなどの甲殻類の外骨格に由来する結晶性キチンを容易に分解することができる。これによって、カニやエビなどの甲殻類の外骨格に由来するバイオマス資源の利用、あるいはその利用に伴う廃棄物の処理を、効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１ＡはＬＢ３−１０株とＬＢ３−１９株によるエビキチンパウダーの分解能を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１ＢはＬＢ３−１９株によるカニキチンチップの分解能を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは培養３日目のハロの様子を示すためにプレートの外観の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは培養３日目のハロの濃さを数値化したグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは培養３日目のハロの大きさを数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［本発明の好気性微生物］
本発明の微生物は、次の（ａ）及び（ｂ）の微生物にある。
（ａ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｂ）  １６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属する微生物。
【００１４】
上記微生物は、好ましくは、次の（ｃ）及び（ｄ）の微生物にある。
（ｃ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）
（ｄ）  イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）  ＬＢ３−１９株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）
【００１５】
［ＬＢ３−１０株］
ＬＢ３−１０株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列（１３８０塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、９９．９％の相同性があったことから、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属すると同定された。このイソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）ＬＢ３−１０株（３−１０  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６）は、〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６６（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８６６）として、２０１９年１月２２日に寄託されている。
【００１６】
［ＬＢ３−１９株］
ＬＢ３−１９株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列（１３７９塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、９９．７％の相同性があったことから、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属すると同定された。このイソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）ＬＢ３−１９株（３−１９  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７）は、〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６７（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８６７）として、２０１９年１月２２日に寄託されている。
【００１７】
［結晶性キチン分解剤］
上記微生物は、結晶性キチン分解能を有し、結晶性キチン分解剤として好適に使用できる。この結晶性キチン分解剤は、好気的かつ室温条件下で容易に使用できる生物製剤であり、取り扱いが容易である。
【００１８】
結晶性キチンとは、例えば、カニやエビなどの甲殻類や昆虫類の外骨格、あるいは、カビやキノコの細胞壁等の中に存在する形態のキチンであり、濃酸や濃アルカリによる部分分解を受けていない状態のキチンである。
【００１９】
本発明によれば、結晶性キチンを分解することができるから、例えば、カニやエビなどの甲殻類の外骨格の破砕物を、濃酸や濃アルカリによって部分分解することなく、そのままに分解することができる。濃酸や濃アルカリによって部分分解する工程を要しないから、工程は簡易となり、費用が低減され、さらに濃酸や濃アルカリに由来する廃液の処理も必要がないものとなる。
【００２０】
好適な実施の態様において、結晶性キチン分解能の試験に使用するための結晶性キチンは、例えば甲殻類や昆虫類の外骨格の破砕物として得ることができる。具体的には、実施例において後述する市販の甲殻類の破砕物を使用することができる。このような甲殻類の破砕物は、水洗処理されていてもよく、結晶性キチンが分解除去されない範囲において、希酸や希アルカリの水溶液で、洗浄処理されたものであってもよい。
【００２１】
［コロイダルキチン分解剤］
上記微生物は、コロイダルキチン分解能を有し、すなわち、従来タイプのキチン分解剤としても、好適に使用できる。このキチン分解剤は、好気的かつ室温条件下で容易に使用できる生物製剤であり、取り扱いが容易である。
【００２２】
コロイダルキチンは、例えば、キチンを濃酸などで部分分解して可溶化した後、再沈殿させて調製される。コロイダルキチンは、溶液への溶解性及び分散性に優れているために、従来から、キチナーゼ活性の測定やスクリーニングに使用されている。しかし、これによって測定される活性は、キチン分解能と称されてはいるが、実際にはコロイダルキチン分解能であるから、このようにして同定されるキチナーゼ活性を活用するためには、その基質は結晶性キチンではなくコロイダルキチンとなる。このようなコロイダルキチン分解剤を活用するためには、カニやエビなどの甲殻類の外骨格の破砕物を、濃酸や濃アルカリによって部分分解する工程を要することになるが、そのために工程は複雑となり、費用負担は増大し、さらに濃酸や濃アルカリに由来する廃液の処理の必要が生じる。
【００２３】
［結晶性キチン分解能を有する微生物のスクリーニング］
本発明の微生物は、甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、分離された微生物を結晶性キチン分解能検出系で培養する工程、を含む方法によって、甲殻類の消化管からスクリーニングして取得することができる。
【００２４】
［甲殻類の消化管］
甲殻類の消化管がスクリーニング源として好適であることは、本発明者による北陸地方の海辺林における生態学的な観察と物質循環の洞察から、導かれたものである。好ましい甲殻類としては、例えば、アカテガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓ  ｈａｅｍａｔｏｃｈｅｉｒ）、クロベンケイガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓ  ｄｅｈａａｎｉ）、ベンケイガニ（Ｓｅｓａｒｍｏｐｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）等をあげることができる。
【００２５】
［結晶性キチン分解能のスクリーニング］
結晶性キチン分解能検出系は、例えば、実施例において後述する甲殻類の外骨格の破砕物、具体的にはエビ、カニ殻破砕物との培養による検出系を、好適に使用することができる。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［アカテガニ由来消化管細菌の単離］
石川県加賀市で採取したアカテガニを解剖し、口腔近傍の消化管から細菌を回収した。アカテガニはオスバン消毒液で表面を殺菌し、解剖した。消化管は１×ＰＢＳ（表１）で懸濁し、ＬＢ培地（表２）にプレーティングした。アカテガニから３４株の細菌群を得た。
【００２７】
2020130059.tif 000002
【００２８】
【表２】
2020130059.tif 000003
【００２９】
［菌の同定］
アカテガニから得られた細菌を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子によって同定した。
ユニバーサルプライマーである１６ＳｒＲＮＡの２７ｆと１４９２ｒ（表３）を用いてＰＣＲ増幅し、電気泳動を行って１．５ｋｂｐに出たバンドを切り出した後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）でリボソームＲＮＡ遺伝子を回収した。そのＲＮＡ遺伝子をシーケンスし、得られた塩基配列をインターネットのＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）のデータベースで検索して相同性を検討した。
【００３０】
【表３】
2020130059.tif 000004
【００３１】
一般に、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の相同性が９７％以上であれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種である可能性が高いとされる。９８．７％以上の種がいない場合、新種であろうとされる。相同性と属や種の帰属とは異なるが、本明細書では、一般的な基準に従って、相同性が９８％以上であれば当該の菌（種）に属し、それ未満では異なる菌（種）に属するとした。
【００３２】
この結果、得られたアカテガニ由来消化管細菌のうち、ＬＢ３−１０株は、Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＣＬＧと９９．９％相同性を有することから、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属すること、ＬＢ３−１９株は、Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＣＬＧと９９．７％相同性を有することから、イソプテリコラ  ジアングスエンシス（Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ  ｊｉａｎｇｓｕｅｎｓｉｓ）に属することがわかった。配列番号１（１３８０塩基）は、ＬＢ３−１０株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。配列番号２（１３７９塩基）は、ＬＢ３−１９株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。
【００３３】
［結晶性キチン分解菌のスクリーニング］
アカテガニ由来消化管細菌に対して、結晶性キチン分解活性を有しているか否かのスクリーニングを行った。具体的には、以下の手順で行った。
Ｍ９最小培地に最終濃度０．５％のキチンパウダー（Ｓｉｇｍａ社、製品名：Ｃ７１７０キチン、エビ殻由来）、０．５％のカニキチンチップ（三谷産業）を添加した培地を用意し、ＬＢ培地で種培養した細菌を３％接種し、３７度で３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離（１００００ｘｇ，１０分）にて培養上清を取得し、培養上清中のキチン分解産物であるＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ及びそのオリゴマーを測定した。測定においてはキチン分解により、出現する還元末端をＳｈａｌｅｓ’変法（Ｉｍｏｔｏ＆Ｙａｇｉｓｈｉｔａ  １９７１）で測定した。発色試薬としてはヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（Ｋ3Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）6）を用いて、この化合物の黄色の発色が還元末端の還元力による鉄イオンの還元によって無色化することを利用している。発色試薬（０．０５ｇ  Ｋ3Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）6／１００ｍＬ、０．５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3）４００μｌと培養上清３００μｌを混合した後、１００℃、１５分間処理し、４２０ｎｍにて吸光度を測定した。本測定では検量線としてＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ溶液（０−２００μｇ／ｍＬ）を作製して、分解の定量化を行った。ＬＢ３−１０株はキチンパウダーに、ＬＢ３−１９株は両者に対して従来のキチナーゼ細菌株よりも強い活性を示した。
【００３４】
得られた結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１ＡはＬＢ３−１０株とＬＢ３−１９株によるエビキチンパウダーの分解能を示すグラフである。図１ＢはＬＢ３−１９株によるカニキチンチップの分解能を示すグラフである。図１Ａ及び図１Ｂのグラフにおいて、結晶性キチン分解能を有さないＬＢ２株の吸光度の値をバックグラウンドとして減じて縦軸の各吸光度の値を対比した。
【００３５】
［結晶性キチン分解菌のコロイダルキチンに対する分解活性の確認］
上記得られた結晶性キチン分解菌が、コロイダルキチンに対する分解活性を有しているか否かの検討を、以下の手順で行った。結晶性キチン分解菌であるＬＢ３−１０株とＬＢ３−１９株に追加して、比較対照実験のために、結晶性キチン分解能を有さないＬＢ２株を用いた。
【００３６】
［コロイダルキチンの調製］
Ｈｉｒａｎｏ＆Ｎａｇａｏ（１９８８）の方法に一部変更を加えて、キチン粉末（ｃｈｉｔｉｎ，ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ，ｐｏｗｄｅｒ；Ｃ７１７０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からコロイダルキチンを作製した。具体的な方法は以下の通りである。まず、氷上にて８０％（ｗ／ｗ）メタンスルホン酸１００ｇを撹拌しながらキチン粉末１．０ｇを少量ずつ加えた。約１．５時間撹拌した後、混合液をガラス繊維ろ紙（ＧＦ／Ｄ；Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過した。氷上でミリＱ水約６００ｍＬを撹拌しながら、ろ液をゆっくりと加えた。懸濁液を４℃にて一晩静置した後、遠心分離（４℃、１００００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりコロイダルキチンを回収した。回収したコロイダルキチンはｐＨが中性になるまでミリＱ水で繰り返し洗浄した。洗浄したコロイダルキチンをミリＱ水に懸濁させ、４℃にて保存した。また、懸濁液を一部抜き取り、乾燥重量を測定することにより懸濁液のコロイダルキチン濃度を算出した。
【００３７】
コロイダルキチンＭ９プレートの調製は以下のようにして行った。
Ｍ９最小培地（３３．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，２２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，８．５５ｍＭ  ＮａＣｌ，９．３５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ）に０．２％酵母エキスを添加した基本培地に０．３％のコロイダルキチンに２％寒天を入れて、オートクレーブ後（１２１℃１５分）固化させて作成した。このプレート上に各細菌株を塗布して３７℃で４日間培養し、ハロの形成を観察した。ハロの大きさはコロニー端からハロの端までの距離を測定して記録した。またハロの濃さは、写真を撮影後、これをＩｍａｇｅＪソフトウエアでハロ部分とハロのない部分の色の濃さを数値化し、その差で示した。
【００３８】
培養３日目のハロの様子を示すためにプレートの外観の写真を図２Ａに示す。培養３日目のハロの濃さを上述の手順で数値化したグラフを図２Ｂに示す。培養３日目のハロの大きさを上述の手順で数値化したグラフを図２Ｃに示す。
【００３９】
［結果のまとめ］
単離したＬＢ３−１０株とＬＢ３−１９株は、結晶性キチンの分解能を有する株であることがわかった。このＬＢ３−１０株とＬＢ３−１９株は、コロイダルキチンの分解能をあわせて有し、かつ従来のキチナーゼ生産細菌株であるＬＢ２株よりも強い活性を有する株であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は結晶性キチン分解能を有する新規微生物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。
【図１Ａ】
2020130059.tif 000005
【図１Ｂ】
2020130059.tif 000006
【図２Ａ】
2020130059.tif 000007
【図２Ｂ】
2020130059.tif 000008
【図２Ｃ】
2020130059.tif 000009
【配列表】
2020130059000001.app