(57)【要約】【課題】de novo 活性が生じにくい維持メチルトランスファーゼの提供及びそれを用いたヒドロキシメチル化部位をメチル化部位であるという誤認識が生じにくいメチル化解析方法の提供。【解決手段】本発明のメチル化酵素は、Ｄｎｍｔ１からＰＣＮＡ結合領域及びＲＦＴＳの両ドメインを欠落させたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有する。本発明では、このメチル化酵素の活性をいわゆるバイサルファイト法に応用して、ＤＮＡのメチル化を解析する方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
維持メチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）から増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）結合領域及び複製フォーク標的化領域（ＲＦＴＳ）の両ドメインを欠落させたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有する、メチル化酵素。
【請求項２】
前記Ｄｎｍｔ１がヒト由来である請求項１記載のメチル化酵素。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかのタンパク質からなるメチル化酵素：
（ａ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質のアミノ酸配列において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
バイサルファイト法による測定対象ＤＮＡのメチル化解析方法であって、
測定対象ＤＮＡを鋳型としての一本鎖へと解離させる工程、
鎖置換性の無いＤＮＡポリメラーゼを用いた複製により前記鋳型としての一本鎖に伴う新生鎖を得る工程、
新生鎖が合成されずに未反応の前記鋳型としての一本鎖をエキソヌクレアーゼにより分解・除去する工程、
前記新生鎖を伴った前記鋳型としての一本鎖に請求項１〜３のいずれか１項記載のメチル化酵素を作用させることにより前記新生鎖をメチル化する工程、
前記メチル化する工程の後に、前記新生鎖を伴った前記鋳型としての一本鎖に亜硫酸水素塩を作用させることにより前記新生鎖中のメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する工程、
前記変換する工程の後に、前記新生鎖をＰＣＲ反応に供して増幅する工程、
を有する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化酵素及びそれを用いた測定対象ＤＮＡのメチル化解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティックとは遺伝子の配列は変わらずに、ヒストンやＤＮＡの修飾が変わることで遺伝子の発現が変化することを意味する。ＤＮＡにおけるエピジェネティックな変化が多くの疾患に関連してきていることがわかってきており、例えば、多くのがんにおける報告や、精神疾患における報告も出始めている。エピジェネティックな変化を把握するにはＤＮＡの配列を解析する必要があり、ＤＮＡの配列自体を直接評価できるのは、例えば特許文献１に記載されるようなバイサルファイトシークエンス法（以下、バイサルファイト法とも表記する。）のみである。
【０００３】
バイサルファイト法においては、亜硫酸水素塩処理（バイサルファイト処理）によって、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化シトシンは他の塩基に変換されないことを利用する。より詳細には、バイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行うことによって、ＤＮＡのメチル化の状態を知ることができる。
【０００４】
上記バイサルファイト法におけるＤＮＡの増幅過程において、維持メチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）を用いる。何故なら、Ｄｎｍｔ１を用いないと、増幅過程においてメチル化の複製が行われず、鋳型鎖のみメチル化され、新生鎖はメチル化されないヘミメチル化のＤＮＡが不所望に生じてしまうからである。Ｄｎｍｔ１を用いると、細胞分裂後にヘミメチル化から両鎖メチル化への変換が触媒される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１７／１０４６７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らの知見によれば、上述のバイサルファイト法には以下の問題がある。
ＤＮＡ中のシトシンの変位としては上述した「メチル化」の他に、「ヒドロキシメチル化」という態様もある。エピジェネティックの観点では、メチル化シトシンは生体への異常の原因となるが、ヒドロキシメチル化シトシンは異常の原因にならないことがある。よって、メチル化シトシンとヒドロキシメチル化シトシンとを区別して判別できることが好ましい。しかし、バイサルファイト処理においては、ヒドロキシメチル化シトシンはメチル化シトシンと同挙動を示すため、結果的にヒドロキシメチル化シトシンをメチル化シトシンであると誤認識する懸念がある。
【０００７】
また、維持メチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）固有の問題として、生体内ではメチル化修飾部位のみを正確に維持するが、in vitro では、非メチル化部位やヒドロキシメチル化部位をも新たにメチル化することがあり、この不所望な挙動をde novo活性と呼ぶ。このde novo 活性に起因して、本来は非メチル化部位あるいはヒドロキシメチル化部位であると判別すべき塩基をメチル化部位であると誤認識してしまうことが懸念される。
【０００８】
上記事情を考慮し、本発明は、上述のde novo 活性が生じにくい維持メチルトランスファーゼの提供及びそれを用いたヒドロキシメチル化部位をメチル化部位であるという誤認識が生じにくいメチル化解析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、本発明を完成した。
本発明のメチル化酵素は、維持メチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）から増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）結合領域及び複製フォーク標的化領域（ＲＦＴＳ）の両ドメインを欠落させたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有する。そして、Ｄｎｍｔ１は好ましくはヒト由来である。
【００１０】
本発明のメチル化酵素のアミノ酸配列の具体例として、以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかのタンパク質からなるメチル化酵素が挙げられる。（ａ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質；（ｂ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号１又は２のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドがコードする組換えタンパク質のアミノ酸配列において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有するタンパク質。
【００１１】
本発明ではバイサルファイト法による測定対象ＤＮＡのメチル化解析方法も提供される。
本発明のメチル化解析方法では、測定対象ＤＮＡを鋳型としての一本鎖へと解離させる工程、鎖置換性の無いＤＮＡポリメラーゼを用いた複製により前記鋳型としての一本鎖に伴う新生鎖を得る工程、新生鎖が合成されずに未反応の前記鋳型としての一本鎖をエキソヌクレアーゼにより分解・除去する工程、前記新生鎖を伴った前記鋳型としての一本鎖に請求項１〜３のいずれか１項記載のメチル化酵素を作用させることにより前記新生鎖をメチル化する工程、前記メチル化する工程の後に、前記新生鎖を伴った前記鋳型としての一本鎖に亜硫酸水素塩を作用させることにより前記新生鎖中のメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する工程、前記変換する工程の後に、前記新生鎖をＰＣＲ反応に供して増幅する工程、を有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｄｎｍｔ１からＰＣＮＡ結合領域及びＲＦＴＳの両ドメインを欠落させた構造のメチル化酵素は、de novo活性が生じにくい維持メチルトランスフェラーゼとして機能する。
【００１３】
さらに、本発明によれば、ＤＮＡ増幅の新生鎖のみを対象として上記メチル化酵素を作用させることにより、ヒドロキシメチル化部位をメチル化部位であると誤認識することが十分に抑制される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による解析法の説明図である。
【図２】メチル化酵素の製造に用いたベクターの説明図である。
【図３】メチル化酵素の活性評価例を示す。
【図４】メチル化酵素のドメイン構造の説明図である。
【図５】チロシナーゼ遺伝子上流のＣＧ配列のメチル化解析の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のメチル化酵素は、Ｄｎｍｔ１からＰＣＮＡ結合領域及びＲＦＴＳの両ドメインを欠落させた構造を有する。プライマリーをアニールした後にＤｎｍｔ１を作用させると、メチル化されたシトシンのメチル化状態を維持して複製が行われる。Ｄｎｍｔ１の由来となる生物は特に限定は無く、好ましくはヒト由来である。
【００１６】
本発明のメチル化酵素のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の一例を配列番号１として挙げる。配列番号１のＤＮＡ配列のポリヌクレオチドからコードされるタンパク質はヒト由来のＤｎｍｔ１からＰＣＮＡ結合領域及びＲＦＴＳの両ドメインを欠落させた構造である。前記タンパク質におけるアミノ酸配列については、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよく、例えば、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されていてもよい。前記同一性については、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。
【００１７】
本発明のメチル化酵素のアミノ酸をコードする別のＤＮＡ配列の例として配列番号２を挙げる。配列番号２のＤＮＡ配列のポリヌクレオチドからコードされるタンパク質は維持型ＤＮＡメチル化酵素であるＤｎｍｔＩ（DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1）のことであり、その開始コドンから終始コドンの前までのアミノ酸配列からなる酵素である。前記タンパク質におけるアミノ酸配列についても、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよく、例えば、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されていてもよい。前記同一性については、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。
【００１８】
タンパク質のアミノ酸配列を求める方法は特に限定は無く、従来公知の方法を適宜採用することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質は、ＤＮＡ等の塩基配列に対するメチル化活性をもつ。具体的には、本発明のタンパク質は、ＤＮＡの複製過程で前記ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンのメチル化状態を維持する活性を有する。
【００２０】
本発明者らの新知見によれば、本発明のメチル化酵素のメチル化活性は、天然のＤｎｍｔ１とは異なり、いわゆるde novo 活性が生じにくい。具体的には、in vitro の環境においても、非メチル化部位やヒドロキシメチル化部位が不所望にメチル化することが基本的には無い。そのような不所望なメチル化を妨げる結果として、メチル化解析における解析結果の正確性が向上する。
【００２１】
本発明のメチル化酵素の製造方法は特に限定は無く、例えば、対応する遺伝子をもつベクターから大腸菌などの増殖、タンパク質の発現誘導を介して得ることができる。あるいは、公知のＤｎｍｔ１からＰＣＮＡ結合領域及びＲＦＴＳの両ドメインを化学合成的に欠落させて得ることもできる。
【００２２】
本発明のメチル化酵素の応用的な使用例として、本発明者らは以下に詳述するＤＮＡのメチル化解析法（以下、本発明の解析法とも呼ぶ。）を、本発明の実施形態の一つとして提案する。
【００２３】
図１は、本発明による解析法の説明図である。
解析対象とするＤＮＡは、各鎖に無変性のシトシン１３、メチル化されたシトシン１２、ヒドロキシメチル化されたシトシン１１が含まれていると仮定する。その中で、エピジェネティックに影響が大きいとされるメチル化されたシトシン１２の位置などを特定することを解析の目的とする。
【００２４】
まず、図１の符号１の過程に示すように、解析対象のＤＮＡを熱変性等により一本鎖１０Ａ及び１０Ｂへと解離し、プライマー２０をアニーリングさせる。次いで、符号２の過程に示すように、鎖置換活性の無いＤＮＡポリメラーゼにより新生鎖２０を合成する。このとき、新生鎖の合成ができなかった一本鎖１０Ｂは、符号３で示すように、エキソヌクレアーゼＩで分解する。分解された一本鎖１０Ｃを除去して、合成された新生鎖２０を伴った一本鎖（鋳型鎖）１０Ａを精製する。
【００２５】
次いで、符号４に示すように、上記精製後に、本発明のメチル化酵素を作用させると、新生鎖２０Ａに塩基配列が合成される。その際に、鋳型１０Ａに含まれていた、無変性のシトシン１３、メチル化されたシトシン１２、ヒドロキシメチル化されたシトシン１１はそれぞれ、新生鎖２０Ａにおいては、無変性のシトシン２３、メチル化されたシトシン２２、無変性のシトシン２１へと複製される。ここで留意すべきは、鋳型鎖１０Ａにおいてメチル化されたシトシン１２は、新生鎖２０Ａにおいてもメチル化されたシトシン２２へと複製されるのに対して、鋳型鎖１０Ａにおいてヒドロキシメチル化されたシトシン１１は、新生鎖２０Ａにおいては無変性のシトシン２１へと複製される点である。
【００２６】
次いで、符号５の操作において、亜硫酸水素塩を作用させた後、ＰＣＲを行う。ここで、亜硫酸水素塩を作用させたことにより、無変性のシトシンはウラシル（ＤＮＡではチミン）へと変化するが、メチル化されたシトシンは塩基としてはシトシンから変化していない。また、亜硫酸水素塩を作用させた場合、シトシン−グアニンの配列におけるシトシンはメチル化されることがあるが、それ以外の配列におけるシトシン（グアニン−シトシンやシトシン−シトシンなど）はメチル化されないため、確実にウラシルになることがわかっている。この性質を利用して適切なプライマーを設計してＰＣＲを行うことにより、新生鎖２０Ａのみを鋳型として増幅することが可能である。その結果を解析することにより、符号６に示すようにヒドロキシメチル化されたシトシンの影響を受けずに鋳型鎖のどこにメチル化されたシトシンが存在していたかを知ることができる。また、従来の亜硫酸水素塩を作用させて解析する方法と比較することにより、ヒドロキシメチル化されたシトシンがどこに存在していたかを知ることもできる。
【００２７】
亜硫酸水素塩の作用により、メチル化されたシトシンだけではなく、ヒドロキシメチル化されたシトシンも、塩基の種類としてはシトシンから変更しない。よって、Ｄｎｍｔ１の作用が無い鋳型鎖をそのまま用いたり、de novo 活性が生じる従来法のメチル化酵素を用いた場合には、鋳型鎖におけるヒドロキシメチル化されたシトシンの部位が、亜硫酸水素塩の作用後にシトシンのまま残ることから、本来の意図に反して、ヒドロキシメチル化されたシトシンをメチル化されたシトシンであると誤認識することになっていた。本発明では、そのような誤認識が基本的には無くなる。
【００２８】
なお、メチル化酵素として、上述した本発明のメチル化酵素を用いることの他は従来のバイサルファイト法における手法や資剤などをそのまま用いることができる。
【００２９】
図１に示したスキームで得られる新生鎖２０Ａをさらに複製することで、大量の新生鎖を得ることができる。よって、解析対象のＤＮＡが少量であっても、本発明の方法により高確度、高精度のメチル化解析が可能となる。また、図１に示したスキームを自動化するようにすれば、フロー式のＤＮＡメチル化解析装置の製造も可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００３１】
１．メチル化酵素の製造例
配列番号１のアミノ酸配列をもつメチル化酵素を以下のようにして製造した。
ヒト肝がん株化細胞であるＨｅｐＧ２細胞からＲＮＡを抽出し、市販の逆転写キットを用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを対象に、ＤｎｍｔＩの配列をプライマー（Ｆｗ：５’−ＡＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号３）、Ｒｖ：５’−ＧＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧ−３’（配列番号４））を用いてＰＣＲにより増幅させたのち、ベクターに導入するための制限酵素配列（ＦｗにＫｐｎＩ、ＲｖにＥｃｏＲＩと終始コドン）を含むプライマー（Ｆｗ：５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＣＧＣ−３’（配列番号５）、Ｒｖ：ＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣ−３’ （配列番号６））を用いてＰＣＲにより増幅させた。増幅させた産物は、市販の酵母用発現ベクターであるｐＹＥＳ２に精製用のＨｉｓタグとＧＳＴタグおよびその切断を行うための配列等を付加したオリジナルベクター（図２）のＭＣＳ領域に導入した（増幅産物およびベクターはいずれもＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで処理した）。
【００３２】
構築したＤｎｍｔＩを導入したベクター（ｐＹＥＳ２−ｔａｇｓ−ＤｎｍｔＩ）は酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃＩ株にエレクトロポレーション法により形質転換を行った。形質転換した酵母を培養し、ザイモラーゼ処理後ビーズ粉砕法によりタンパク質を抽出、ＨｉｓタグおよびＧＳＴタグを用いて精製を行った。なお、配列番号２で示す部分欠損体では凝集しやすく、精製効率が下がるため、溶解度が上がるＧＳＴタグを付与して今回の実験に用いた。
【００３３】
２．得られたメチル化酵素を用いたメチル化解析例
得られたメチル化酵素を用いて、その活性を評価したものを図３に示す。図３のＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈはＤｎｍｔＩの全長を用いたものであり、また、１６３−１６１６というものは、図４に示すドメイン構造をもとに構成されているアミノ酸配列の位置を示している。図３で示したように、アミノ酸６４６番目から１６１６番目までの配列（配列番号２）で構成された部分欠損したＤｎｍｔＩはｄｅ  ｎｏｖｏ活性とヒドロキシメチル化ＤＮＡともに認識しないことが示された。
【００３４】
この配列番号２由来のＤｎｍｔＩを用いて、図１で示す方法でチロシナーゼ遺伝子上流のＣＧ配列のメチル化解析を行った例を図５に示す。悪性黒色腫細胞であるＢ１６メラノーマ細胞を培養し、ＤＮＡを抽出し、従来法として、亜硫酸水素塩を作用させた後ＤＮＡ配列を解析することでシトシンのメチル化状態を調べる方法（バイサルファイトシークエンス）により解析すると、６検体から取得したＤＮＡ由来のチロシナーゼのプロモーター領域のＣＧ配列がすべてメチル化されている結果が得られた。一方、本発明の方法（図１で示す方法）で上記と同様に６検体から取得したＤＮＡ由来のチロシナーゼのプロモーター領域を解析すると、メチル化なされていないＣＧ配列があることが示された。このメチル化されていないと判断されたシトシンはヒドロキシメチル化されていたシトシンであり、これまで簡易には評価できなかったヒドロキシメチル化状態を評価できたとともに、本発明の方法によれば従来法より詳細にメチル化状態の評価を行えることが判明した。
【符号の説明】
【００３５】
１０  鋳型鎖
２０  新生鎖
１１  ヒドロキシメチル化されたシトシン
１２、２２  メチル化されたシトシン
１３、２１、２３  無変性のシトシン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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