(57)【要約】【課題】エクスビボおよびインビボでの改善されたＴ細胞モジュレーションのための、あるいは癌および他の病理の処置のための、組成物および方法の提供。【解決手段】単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体を用いて、癌を処置するか、あるいは血球減少症を処置または予防する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において癌を処置するための医薬の調製における、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体の使用であって、前記対象が、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍に冒されている、使用。
【請求項２】
前記ＮＴＢ−Ａエクトドメインが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインであるか、または
前記ＮＴＢ−Ａエクトドメインが、エピトープタグおよび／または血清半減期延長物質をさらに含む、
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記対象が、血球減少症の対象であるか、または血球減少症を発症するリスクのある対象である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＩＬ−２が前記対象に体外から投与されないか、または
ＣＤ１３７リガンドを前記対象に投与することをさらに含む、
請求項４に記載の使用。
【請求項５】
有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体を含む、血球減少症に罹患している対象またはそれを発症するリスクのある対象においてＴ細胞死を低減または阻害するための医薬組成物。
【請求項６】
前記ＮＴＢ−Ａエクトドメインが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌または感染性疾患の症状の発症を軽減または改善するように設計された養子移入免疫療法の後にＴ細胞死をインビボで低減または阻害するための医薬組成物であって、有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体を含む、医薬組成物。
【請求項８】
それを必要とする対象において血球減少症を処置または予防するための医薬の調製における、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体の使用。
【請求項９】
血球減少症が、放射線照射または化学療法に関連しているか、または
リンパ球減少症の処置または予防のための、
請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記対象が、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていないか、または
前記対象が、癌に冒されていない、
請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＮＴＢ−Ａエクトドメインが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインである、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
（１）単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト抗体と、（２）ＣＤ１３７リガンドを含むポリペプチドまたはそのアゴニスト抗体と、任意選択で（３）医薬的に許容し得る担体と、の治療的組み合わせを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメイン、ヒトＣＤ１３７リガンド、および／またはヒトＮＴＢ−ＡエクトドメインもしくはヒトＣＤ１３７に対するアゴニスト抗体を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫療法の分野を対象とする。具体的には本発明は、癌および他の病理の処置において有用な、エクスビボおよびインビボでの改善されたＴ細胞モジュレーションを提供する組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー６（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ６）（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５２、Ｌｙ−１０８、ＳＦ２０００およびＫＡＬＩとしても公知のＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢ−Ａ）は、免疫細胞受容体のＳＬＡＭファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質である。ＳＬＡＭファミリータンパク質は、ＩｇスーパーファミリーのＣＤ２サブグループの一種である。ＮＴＢ−Ａはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞上で発現され、受容体複合体にＳＬＡＭ結合タンパク質（ＳＡＰ）およびさらなるアダプタータンパク質を動員することにより媒介されるホモタイプ相互作用を示す。
【０００３】
ＮＴＢ−Ａは２つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインおよび３つの細胞質チロシン依存性シグナル伝達モチーフを含み、このモチーフのうちの１つは従来の免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフに含まれる。ヒトＴ細胞上のＮＴＢ−Ａのエンゲージメントは、ＣＤ２８共刺激経路を代替でき、Ｔｈ１表現型への偏倚を誘導する。しかし、ＮＴＢ−Ａ（Ｌｙ−１０８）ノックアウトマウスからのＣＤ４陽性Ｔ細胞はＩＬ−４産生における障害を示し、Ｔｈ２偏倚におけるＮＴＢ−Ａの役割が示唆される。この矛盾の理由は、完全には解明されていない。ヒトＮＫ細胞上でのＮＴＢ−Ａの活性化は、細胞傷害性および増殖に加えて、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生も刺激する。
【０００４】
Ｖａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，２００４年は、ＮＴＢ−Ａがホモタイプ相互作用によりＴ細胞を活性化し、Ｔｈ１の特性を特異的に増強することを教示している。ＮＴＢ−Ａの最初の２２６アミノ酸をネズミＩｇＧ１のＦｃ部分に融合することにより生成されるＮＴＢ−Ａ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔｈ１型サイトカインにより一般に誘導されるＢ細胞アイソタイプスイッチングを阻害することが見出され、Ｔｈ１依存性自己免疫疾患（ＥＡＥモデル）を阻害した。したがって報告されたＮＴＢ−Ａ融合タンパク質は、Ｖａｌｄｅｚらにより報告された実験系においてＮＴＢ−Ａアンタゴニストとして作用することが見出された。
【０００５】
Ｖａｌｄｅｚらへの米国特許出願公開第２００９／０１７０１４号は、ＰＲＯ２００８０ポリペプチド（ＮＴＢ−Ａのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する）、その細胞外部分、そのホモログ、アゴニスト、およびアンタゴニストを対象としており、それらは免疫疾患の推定上のモジュレータであると示唆されている。’０１４号特許公開は、癌処置のための免疫アジュバント療法においてそこに開示される特定の免疫刺激性化合物の使用を示唆している。
【０００６】
Ｕｚａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年は、特異的抗体による抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＮＴＢ−Ａ遮断がＣＤ８＋リンパ球からのサイトカイン分泌を阻害したことを開示している。この特許公開は、抗癌免疫療法を改善するための潜在的ターゲットとしてこの分子を示唆するが、ＣＤ２８などの他の共刺激受容体をアゴニスト抗体で標的化する類似のアプローチが臨床試験において致死的転帰で終了したため、このアプローチに関連する実験的探求が是認されるべきであると言われている。
【０００７】
ＮＴＢ−Ａは特定の造血組織系腫瘍上で発現されるため、この抗原を異常に発現する腫瘍に対して抗腫瘍免疫応答を誘導するように、この分子に由来するペプチドエピトープを用いるワクチン接種が提案された。例えば、ＰＣＴ公開第２００６／０３７４２１号には、抗腫瘍免疫応答を誘発するためのワクチン組成物中で用いられ得る、ヒト腫瘍細胞株のＨＬＡクラスＩＩ分子由来の３３８のペプチド配列が開示されている。これらの配列の中の一つは、ＳＬＡＭＦ６の１０３〜１１８位に対応する１６アミノ酸のペプチドである。加えて、これらのエピトープを抗体またはその免疫毒素コンジュゲートでターゲッティングすることが示唆された。例えば、米国特許出願公開第２０１１１７１２０４号には、抗ＮＴＢ−Ａ抗体およびその抗原結合フラグメントと、それらを使用してＮＴＢ−Ａを結合し、ＮＴＢ−Ａの発現を特徴とする血液癌などの疾患を処置する方法が開示されている。ＮＴＢ−Ａに対するさらなる抗体が、例えばＫｒｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されている。これらの抗体は、ＮＴＢ−Ａ発現リンパ球への細胞傷害性効果を発揮し、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌への影響を有さなかった。
【０００８】
ＥＰ２０８３０８８号には、とりわけＳＬＡＭＦ６からなる群から選択される遺伝子の発現生成物のレベルをモジュレートすることを含む、患者における癌を処置する方法が開示されており、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、胃癌または皮膚癌からなる群から選択される。この特許公開には、この方法が上記遺伝子の過剰発現を特徴とする患者を処置するのに有用であることが開示されている。
【０００９】
ＷＯ０３／００８４４９号は、ＮＴＢ−Ａポリペプチド、それをコードする核酸分子およびその使用に関する。この公報はまた、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エクスビボまたはインビボで調節することによりＮＫ細胞活性を調節する方法、およびＮＴＢ−Ａもしくはその断片、またはそれをコードする核酸、または上記ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を用いて活性化合物をスクリーニングする方法にも関する。さらに開示されるのは、対象における免疫機能を調節するための医薬の調製におけるＮＴＢ−Ａポリペプチドの活性を調節する化合物の使用である。
【００１０】
Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染の際にリンパ球数を極端に、通常は致死的に増加させる希少な先天性免疫不全である。ＸＬＰは通常、染色体Ｘｑ２４−２５上のＳＨ２Ｄ１Ａ遺伝子における突然変異により起こる、ＸＬＰ１とも称されるＳＬＡＭ結合タンパク質（ＳＡＰ）の欠損により生じる。したがって、ＮＴＢ−Ａは、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を殺傷するＮＫ細胞の不能に寄与するとして、この病理において関連づけられている。
【００１１】
Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００９年、２０１０年）は、健常なドナーおよびＸＬＰ患者から得られたＴ細胞の再刺激誘導細胞死（ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）（ＲＩＣＤ）の調節における、ＮＴＢ−Ａおよびその下流のエフェクターＳＡＰの役割を検討した。この特許公開は、正常ドナーのＴ細胞において、ＮＴＢ−ＡがＴＣＲによるアポトーシスに積極的に関与し、それに必要であることを報告している。これに反してＸＬＰ患者では、ＮＴＢ−ＡがＸＬＰ  Ｔ細胞におけるＲＩＣＤ抵抗性に寄与することが見出されており、この現象が逆行する。
【００１２】
インターロイキン−２は、培養におけるリンパ球の重要な増殖因子である。これが存在しない場合、活性化Ｔ細胞は維持されず、活性化誘導細胞死に供される。したがって、ＩＬ−２は、癌、自己免疫疾患、および他の免疫を介した病理のための様々な細胞組成物、ワクチンおよび免疫療法の調製において、実験目的および臨床適用の両方のために、細胞培養で広範に利用されている。
【００１３】
ＩＬ−２は、インビボでの治療薬としても用いられる。例えば、ＩＬ−２は、腎臓癌の処置に関して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されており、患者に及ぼすその顕著な治療効果は、多くの臨床試験で報告されている。黒色腫患者での臨床試験では、ＩＬ−２は多くの個体の生存率を増加させ、それは化学療法薬で通常得られる平均生存率よりも高かった。
【００１４】
しかし、ＩＬ−２の使用が制御性Ｔ細胞の出現を増加させて、最終的に阻害作用を発揮し得ることが、繰り返し示されている。この問題は、インビボでの患者の全身処置、およびエクスビボでの養子細胞療法でのリンパ球生成の両方の臨床関連でＴ細胞を用いる場合に、特に関連する。ＩＬ−２の十分な代用物質は、まだ見出されていない。
【００１５】
加えて、インビボで外因性ＩＬ−２および他の外因性サイトカインを使用する際の主要な難題は、それらの高い毒性である。副作用、特に心臓の症状および機能不全、敗血症性ショックおよび発熱が、少なからぬ規模である。これは、有害作用の治療または制御のために集中治療を必要とし、処置の中止に至る場合もある。
【００１６】
癌の管理のための治療モダリティーの改善には、依然としてアンメットメデイカルニーズがある。加えて、培養におけるＴ細胞の増大（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）および活性化を促進するため、そして改善された細胞ワクチン組成物を提供するためのさらなる手段が、求められている。したがって、現在利用されている処置の欠点を回避する、より安全でより効果的な治療が、望まれている。
【発明の概要】
【００１７】
発明の概要
本発明は、免疫療法の分野を対象とする。具体的には本発明は、エクスビボおよびインビボでの改善されたＴ細胞モジュレーションのため、そして癌および他の病理の処置のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明の実施形態は、癌患者の処置のため、そして罹患し易い患者において血球減少症を予防および処置するための、可溶性ＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの使用を対象とする。高い抗腫瘍効果を有する有利な併用療法が、本明細書でさらに提供される。本発明の追加的実施形態によれば、ＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはアゴニストがエクスビボ細胞培養で用いられ、改善されたＴ細胞組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、一部には、ヒトＮＴＢ−Ａの細胞外ドメイン（ＮＴＢ−Ａエクトドメイン）に対応する、体外から添加されたポリペプチドがＴ細胞のアポトーシス細胞死を防御し得るという驚くべき発見に基づいている。予想外に、ＮＴＢ−ＡエクトドメインはＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞死から救出し、電離放射線照射およびＩＬ−２枯渇後にそれらの活力を回復させた。本発明は、一部には、先天性黒色腫細胞と共培養した場合に、ＮＴＢ−Ａエクトドメインにより活性化されたＴ細胞クローンが改善された細胞傷害性、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の増加、および表面ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）発現の増加を示す、という予測に反した発見にさらに基づいている。したがって、強い共刺激受容体であるＣＤ１３７とＮＴＢ−Ａが相乗作用して、黒色腫細胞によるＴ細胞活性化を３倍に増加させた。加えて、驚くべきことに、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、Ｔ細胞培養に補充されると、従来のＴ細胞増殖因子であるＩＬ−２を用いて達成される場合によりも優れた活性および生存性を与えて抗腫瘍リンパ球の成長および増殖に好都合に働くことも、実証された。本発明は、ヒト黒色腫移植のマウスモデルにおいて、腫瘍発生のインビボ阻害に予想外に効果的であることをさらに実証する。
【００１９】
したがって、本発明の第一の態様によれば、Ｔ細胞含有細胞集団をエクスビボで有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にインキュベートするステップを含む、細胞組成物を調製するための改善された方法が提供される。特定の実施形態によれば、この方法は、細胞集団にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激を提供することをさらに含む。
【００２０】
特定の有利な実施形態によれば、本明細書に記載されるように調製された細胞組成物は、免疫療法に用いられ得る。したがって別の態様において、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、
ｉ）対象から、または対象と実質的に組織適合性があるドナーからＴ細胞含有集団を得ること、
ｉｉ）このＴ細胞含有細胞集団をエクスビボで有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にインキュベートすること、および
ｉｉｉ）得られたＴ細胞含有細胞集団を上記対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置すること、
を含む、方法が提供される。
【００２１】
一実施形態において、本発明の方法で用いられるポリペプチドは、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、本質的にヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインからなる。別の実施形態において、このポリペプチドは、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインからなる。別の実施形態において、上記ポリペプチドは、エピトープタグ（例えば、ポリヒスチジンタグ）および／または血清半減期延長物質（例えば、ＰＥＧまたは免疫グロブリン（Ｉｇ）融合パートナー）をさらに含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００２２】
別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａアゴニストの使用が、本発明の方法において企図される。本明細書で称されるアゴニストは、標的細胞上の標的受容体（例えば、ＮＴＢ−Ａ）に特異的に結合する物質（例えば、抗体、ポリペプチドまたは小分子）であり、その結合が、受容体とその先天的リガンドとの結合を介して発揮される生物学的効果を実質的に模倣する生物学的効果（例えば、ホモタイプＮＴＢ−Ａ相互作用）を発揮する。したがって別の実施形態において、このアゴニストは、ＮＴＢ−Ａエクトドメイン、例えばヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインに特異的な抗体であり得る。
【００２３】
それらの機能上の能力を損なうことなく抗原（例えば腫瘍）特異的Ｔ細胞を増殖させる能力は、日和見感染または癌の患者の養子移入免疫療法の成功にとって不可欠である。移入に適した抗原特異的Ｔ細胞は、比較的少数で血液または組織部位から採取できるのみである。結果としてそれらは通常、移入の前に特異的または非特異的に増殖される。しかしそのようなエクスビボ操作は、潜在的に、注入後のＴ細胞ホーミング、増殖および生存を損なう可能性がある。
【００２４】
ＣＤ４＋細胞は抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に非常に良好に応答するが、ＣＤ８＋細胞は、あまり大規模に増殖せず、アポトーシスの割合が高い。増殖を刺激するための一般に用いられる別の一アプローチは、Ｆｃ受容体を担うアクセサリー細胞（フィーダー細胞）の存在下でＴ細胞を可溶性抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートする、「急速増殖法（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」（ＲＥＰ）と称されるアプローチである。この手法でＴ細胞に「提示された」抗体は、可溶性抗ＣＤ３単独、または可塑性表面に固定された抗ＣＤ３よりも効果的な増殖シグナルを発生する。癌の処置において、養子細胞療法は、患者の腫瘍内に見出されるＴ細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＴＩＬと呼ばれる）を回収することを典型的に含み、これは高濃度のＩＬ−２、抗ＣＤ３およびアロ反応性フィーダー細胞を用いてエクスビボで増殖するように促進される。これらのＴ細胞は、その後、ＩＬ−２の体外からの投与とともに患者に戻され、抗癌活性をさらに強化する。しかし、患者への再注入のための自己ＴＩＬ養子細胞療法生成物の作製は技術的に困難で、ＩＬ−２およびフィーダー細胞の使用により、望ましくない可変性を生じる。本発明は、別の実施形態において、養子細胞療法のためのそのようなＴＩＬ組成物を生成するための改善された方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、この集団は、ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、この細胞は、遺伝子操作または組換えされている（例えば、悪性細胞の根絶において所望の抗原特異性または任意の他の望ましい形質を発揮するため）。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドまたはアゴニストとのインキュベーションは、活性化マーカーおよび／またはＴ細胞活性化と関連するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなどのＴｃ１活性化マーカー）を誘導またはアップレギュレートするのに十分な量および条件で実施される。有利には、ＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドまたはアゴニストとのこのインキュベーションは、Ｔ細胞上のＣＤ１３７発現をアップレギュレートするように実施される。別の実施形態において、このインキュベーションは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激の存在下で実施される。別の実施形態において、ＴＣＲ刺激は、抗原非特異的（例えば、結合により受容体を活性化させるＣＤ３に特異的な抗体、例えばＯＫＴ３を用いて実施される）または抗原特異的（適切な抗原提示細胞および抗原を用いる）であり得る。別の実施形態において、インキュベーションは、フィーダー細胞（例えば、同種の正常ドナーの末梢血単核細胞である、ＰＢＭＣ）の存在下で実施される。特定の有利な実施形態によれば、養子細胞療法のためのＴＩＬ組成物は、放射線照射されたＰＢＭＣ（増殖不能）を用いて調製される。別の実施形態において、このインキュベーションは、外因性ＩＬ−２を添加せずに実施される。別の実施形態において、このインキュベーションは、３００〜６０００ＩＵ／ｍｌの範囲の外因性ＩＬ−２を添加して実施される。別の実施形態において、インキュベーションは、外因性ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストの存在下で実施される。別の実施形態において、このインキュベーションは、ＴＣＲ刺激およびフィーダー細胞の存在下で、かつ外因性ＩＬ−２を添加せずに実施される。
【００２６】
別の態様において、本発明の方法により調製された細胞組成物が提供される。別の実施形態において、この細胞組成物は、それを必要とするレシピエント対象への養子移入に適している。したがってこの組成物は、養子移入免疫療法に有効な量、例えば１０６〜１０１２個の細胞のＴ細胞含有集団を含み得る。
【００２７】
別の態様において、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、本発明の細胞組成物をこの対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置することを含む、方法が提供される。本発明の方法の特定の好ましい実施形態によれば、この細胞組成物は、この対象と組織適合性がある（例えば、自家細胞またはＭＨＣＩＩ適合の同種細胞）。
【００２８】
別の態様において、この方法は、治療有効量のＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与することをさらに含む。特定の理論または作用機序に結びつけられることを望むものではないが、レシピエント対象への養子移入後の細胞のインビボ生存は、幾つかの実施形態において、補足的ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共同的な（同時または連続での）投与により増強され得る。
【００２９】
別の態様において、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置することを含む、方法が提供される。
【００３０】
別の実施形態において、本発明の方法により処置される対象は、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍に冒されている。別の実施形態において、腫瘍は、固体腫瘍である。別の実施形態において、対象は、ＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍に冒されている。別の実施形態において、上記対象は、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍、またはＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍に冒されている。別の実施形態において、上記対象は、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍、固形腫瘍およびＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍からなる群から選択される腫瘍に冒されている。別の実施形態において、癌は、黒色腫、尿管癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸癌および他の腸管癌、骨悪性腫瘍、結合および軟組織腫瘍、ならびに皮膚癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、癌は、黒色腫である。
【００３１】
別の実施形態において、対象は、血球減少症対象、または血球減少症を発症する（例えば、放射線照射または化学療法により）リスクのある対象である。別の実施形態において、対象は、リンパ球減少症に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある。別の実施形態において、対象は、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていない。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、より安全でより効果的なＴ細胞活性化をもたらすことに関して、ＩＬ−２よりも予想外に優れていることが実証された。したがってＩＬ−２の使用を実質的に減少させることができ、本発明のポリペプチドで完全に置き換えることさえ可能である。したがって別の実施形態において、本発明の方法は、外因性ＩＬ−２を添加せずに実行される（インビボおよび／またはエクスビボで）。したがって別の実施形態において、ＩＬ−２は、上記対象に体外から投与されない。別の実施形態において、ＩＬ−２の使用は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および好ましくは少なくとも９０％減少され得る。
【００３３】
別の実施形態において、本発明のＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの投与または添加は、ＣＤ１３７リガンドポリペプチドまたはそのアゴニスト（抗ＣＤ１３７抗体など）の投与と併せて（同時にまたは連続して）有利に実施され得る。市販の、または臨床試験下にあるそのような抗ＣＤ１３７抗体の非限定的例としては、例えばＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ；ニュージャージー州プリンストン所在）カタログ番号６６３５１３の、 例えば１０〜２０ｎｇ／ｍｌで使用され得る、完全ヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＡＦ８３８の、例えば２０〜４０ｎｇ／ｍｌで使用され得る、ポリクローナルヤギ抗４−１ＢＢ抗体が挙げられる。
【００３４】
別の実施形態において、本発明のＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの投与または添加は、免疫細胞機能への修飾効果を示す他のシグナル伝達受容体標的化試薬の投与と併せて（同時にまたは連続して）実施され得る。そのような試薬の例としては、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対するアンタゴニストまたは阻害剤（抗体など）が挙げられる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞をストレス性細胞死から救済して、放射線照射またはＩＬ−２枯渇後の生存を促進することが予想外に実証された。これは、再刺激誘導アポトーシスのインビトロモデルにおいてＮＴＢ−Ａのアポトーシス促進的役割を示唆するＳｎｏｗらの教示を考慮すれば、特に驚くべきことである。
【００３６】
したがって別の態様において、本発明は、Ｔ細胞を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと接触させることを含む、Ｔ細胞死を低減または阻害する方法を対象とする。
【００３７】
別の実施形態において、接触は、インビトロ（例えば、エクスビボ）で実施される。別の実施形態において、接触は、インビボで実施される。別の実施形態において、この方法は、血球減少症に罹患している対象またはそれを発症するリスクのある対象において、Ｔ細胞死を低減または阻害するために用いられ得る。
【００３８】
別の態様において、それを必要とする対象における血球減少症を処置または予防する方法であって、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象における血球減少症を処置または予防することを含む、方法が提供される。
【００３９】
幾つかの実施形態において、血球減少症は、放射線照射または化学療法に関連する。例えば血球減少症は、高用量化学療法に関連する血球減少症、従来の腫瘍療法に関連する血球減少症、薬物による血球減少症、毒素による血球減少症および放射線による血球減少症であり得る。他の実施形態によれば、血球減少症は、ＮＴＢ−Ａ経路での損傷に関連しない後天性または先天性免疫不全に関連し得る。したがってＸＬＰ患者は、これらの実施形態から明白に除外される。例えば血球減少症は、ステロイド性であり得、感染性疾患（肝炎、ウイルス性疾患）により誘発もしくは増悪され得、または自己免疫誘発性（例えば、全身エリテマトーデスによる）であり得る。特定の実施形態において、この方法は、リンパ球減少症の処置または予防に用いられる。
【００４０】
別の態様において、１）単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、２）ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、場合により３）医薬的に許容し得る担体と、の治療的組み合わせを含む医薬組成物が提供される。
【００４１】
別の実施形態において、組み合わせは、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む。別の実施形態において、組み合わせは、ヒトＣＤ１３７リガンドを含む。別の実施形態において、アゴニストは、抗体（例えば、ＮＴＢ−Ａ特異的またはＣＤ１３７特異的）である。
【００４２】
他の態様によれば、本発明は、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、本発明の方法においてこのポリペプチドを使用するための使用説明書と、を含むキットを対象とする。
【００４３】
本発明の他の目的、特色および利点は、以下の説明および図面から明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＬＡＭＦ６の可溶性エクトドメイン）が、腫瘍浸潤リンパ球上のＳＬＡＭＦ６に結合する。ｓｅＳＬＡＭＦ６は、腫瘍浸潤リンパ球への抗ＳＬＡＭＦ６抗体の結合を完全に阻害し（Ａ）、これらの表面受容体への抗ＣＤ８および抗２Ｂ４抗体の結合を阻害しない（Ｂ）。
【図２Ａ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒト（図２Ａ）およびマウス（図２Ｂ）抗黒色腫Ｔ細胞の生存を改善する。（図２Ｃ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ＲＥＰ手順のエンドポイント後７日目のヒトＴＩＬ７でのＲＥＰ後生存率を増進した。
【図２Ｂ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒト（図２Ａ）およびマウス（図２Ｂ）抗黒色腫Ｔ細胞の生存を改善する。（図２Ｃ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ＲＥＰ手順のエンドポイント後７日目のヒトＴＩＬ７でのＲＥＰ後生存率を増進した。
【図２Ｃ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒト（図２Ａ）およびマウス（図２Ｂ）抗黒色腫Ｔ細胞の生存を改善する。（図２Ｃ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ＲＥＰ手順のエンドポイント後７日目のヒトＴＩＬ７でのＲＥＰ後生存率を増進した。
【図３Ａ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒトおよびマウス抗黒色腫Ｔ細胞の機能を改善する。（図３Ａ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、マウス脾臓細胞によるＩＦＮγ産生を改善し；（図３Ｂ，Ｃ）急速な増殖の間のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメント（Ｂ）およびヒトＴＩＬの３日間活性化（Ｃ）が、ＣＤ１０７ａ表出により評価される細胞傷害性を改善し；（図３Ｄ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞による黒色腫細胞殺傷を増進する。
【図３Ｂ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒトおよびマウス抗黒色腫Ｔ細胞の機能を改善する。（図３Ａ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、マウス脾臓細胞によるＩＦＮγ産生を改善し；（図３Ｂ，Ｃ）急速な増殖の間のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメント（Ｂ）およびヒトＴＩＬの３日間活性化（Ｃ）が、ＣＤ１０７ａ表出により評価される細胞傷害性を改善し；（図３Ｄ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞による黒色腫細胞殺傷を増進する。
【図３Ｃ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒトおよびマウス抗黒色腫Ｔ細胞の機能を改善する。（図３Ａ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、マウス脾臓細胞によるＩＦＮγ産生を改善し；（図３Ｂ，Ｃ）急速な増殖の間のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメント（Ｂ）およびヒトＴＩＬの３日間活性化（Ｃ）が、ＣＤ１０７ａ表出により評価される細胞傷害性を改善し；（図３Ｄ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞による黒色腫細胞殺傷を増進する。
【図３Ｄ】可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、活性化されたヒトおよびマウス抗黒色腫Ｔ細胞の機能を改善する。（図３Ａ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、マウス脾臓細胞によるＩＦＮγ産生を改善し；（図３Ｂ，Ｃ）急速な増殖の間のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメント（Ｂ）およびヒトＴＩＬの３日間活性化（Ｃ）が、ＣＤ１０７ａ表出により評価される細胞傷害性を改善し；（図３Ｄ）ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞による黒色腫細胞殺傷を増進する。
【図４】ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ｓｅＳＬＡＭＦ６を補充した急速増殖手順（ＲＥＰ）を受けたヒトＴＩＬ上での活性化マーカーＧＩＴＲ、ＰＤ−１、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４）の発現をアップレギュレートする。
【図５】ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、ＴＩＬをＩＬ−２と同じ効率で増殖する。
【図６】ＲＥＰの際のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントが、より高い割合の黒色腫特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を生成する。
【図７】ｓｅＳＬＡＭＦ６により増殖された抗黒色腫ＴＩＬが、標準のＩＬ−２プロトコルにより増殖されるＴＩＬと同じ効率でインビボでの黒色腫成長を阻害する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫療法の分野を対象とする。詳細には本発明は、エクスビボおよびインビボでの改善されたＴ細胞モジュレーションのための、そして癌および他の病理の処置のための、組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明の実施形態は、癌患者の処置のための、そして罹患し易い患者において血球減少症を予防および処置するための、可溶性ＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの使用を対象とする。高い抗腫瘍効果を有する有利な併用療法が、本明細書でさらに提供される。本発明のさらなる実施形態によれば、ＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはアゴニストがエクスビボ細胞培養で用いられ、改善されたリンパ球調製物を提供する。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、Ｔ細胞含有細胞集団を治療有効量の単離された（例えば、組換え生成された）ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートするステップを利用する。別の実施形態において、本発明の方法は、治療有効量の単離された（例えば、組換え生成された）ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを、それを必要とする対象に投与することを含むステップを利用する。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、
ｉ）対象から、または上記対象と実質的に組織適合性があるドナーから、Ｔ細胞含有集団を得ること、
ｉｉ）このＴ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートすること、および
ｉｉｉ）得られたＴ細胞含有細胞集団を上記対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置すること、
を含む、方法に関する。
【００４８】
別の実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与することを含み、上記対象が、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍、固形腫瘍およびＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍からなる群から選択される腫瘍に冒されている、方法に関する。
【００４９】
さらなる実施形態によれば、本発明は、有効量の単離されたＮＴＢ−ＡエクトドメインまたはそのアゴニストとＴ細胞を接触させることを含む、Ｔ細胞を低減または阻害する方法に関する。
【００５０】
さらなる実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象における血球減少症を処置または予防する方法であって、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象における血球減少症を処置または予防することを含む、方法に関する。
【００５１】
さらなる実施形態によれば、本発明は、Ｔ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートすることを含み、この細胞集団にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激を提供することをさらに含む、細胞組成物を調製するための改善された方法に関する。
【００５２】
さらなる実施形態において、本発明は、１）単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、２）ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、場合により３）医薬的に許容し得る担体と、の治療的組み合わせを含む医薬組成物に関する。
【００５３】
これらの方法および組成物の特定の特別な実施形態は、本明細書の以下に詳述される。
【００５４】
ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト
用語「ＮＴＢ−Ａ」（または「ＳＬＡＭＦ６」）は、以下の構造的および機能的特性を有するポリペプチドを指す：１）当該技術分野で認識される（例えば、天然由来の）哺乳動物ＮＴＢ−Ａポリペプチド（全長または成熟形態）に対応するアミノ酸配列；２）内因性ＮＴＢ−Ａ分子を発現する細胞表面と特異的に結合する能力（ホモタイプ結合）；および３）本明細書に記載されるアゴニストＮＴＢ−Ａ活性を発揮する能力。
【００５５】
一般にＮＴＢ−Ａは、Ｎ’からＣ’の順に以下のドメインで構成される：
Ｉ．Ｎ末端シグナルペプチド；
ＩＩ．２つの保存された免疫グロブリン（Ｉｇ）様モチーフ：Ｎ’Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（ＩｇＶ；主に中性であるが極性の前表面を含む二層のβシート構造を有する）およびＣ’Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（ＩｇＣ２；全体的なβ鎖トポロジーおよび複数のジスルフィド結合を特徴とする）、を含む細胞外部分（エクトドメイン）；
ＩＩＩ．らせん形膜貫通ドメイン；ならびに
ＩＶ．ＳＬＡＭ結合タンパク質（ＳＡＰ）のＳＨ２ドメインと、それに関係するユーイング肉腫関連転写産物とのドッキング部位である免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＭＳ）を含む、トポロジカル（細胞質）ドメイン。ＩＴＳＭモチーフは、活性化および阻害性結合パートナーに対する重複した特異性を有するコンセンサス配列ＴｘＹｘｘＶ／Ｉ／Ｌを担う。
【００５６】
例えば、ヒトＮＴＢ−Ａ（例えば、アクセション番号Ｑ９６ＤＵ３、アイソフォーム１）において、シグナルペプチドは１〜２１位に位置することが同定され、エクトドメインは２２〜２２６位に位置することが同定され（ここでＩｇＶは３５〜１２０位に位置し、ＩｇＣ２は１３２〜２０９位に位置した）、膜貫通ドメインは２２７〜２４７位に位置し、細胞質（細胞内）ドメインは２４８〜３３１位に位置した。
【００５７】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＮＴＢ−Ａエクトドメイン」、「ｓＮＴＢ−Ａ」および「ｓｅＳＬＡＭＦ６」は、少なくともＩｇＶおよびＩｇＣ２ドメインを含むＮＴＢ−Ａの細胞外表面露出部分を指す。典型的には、そして有利には、本発明の方法および組成物で用いられるＮＴＢ−Ａエクトドメインは、本明細書に記載された他のＮＴＢ−Ａドメイン、例えばシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびトポロジカルドメインを実質的に排除する。そのような有利なＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドは、本明細書では「単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメイン」と称される。単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインは、典型的におよび都合よく合成で、例えば本明細書に記載されるように組換え法で生成される。言い換えれば、単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドは、残留するＮＴＢ−Ａ配列（例えば、１〜１０、好ましくは５以下のアミノ酸）を含み得るが、それらは、インタクトＮＴＢ−Ａポリペプチド内にある場合に機能する任意のさらなるＮＴＢ−Ａ構造を欠く。
【００５８】
特にシグナルペプチドが、有利に排除される。先行するシグナルペプチドを含むＮＴＢ−Ａの細胞外ドメインを含むポリペプチドがＮＴＢ−Ａアンタゴニスト活性により特徴づけられると報告する、Ｖａｌｄｅｚらによる以前の開示（Ｖａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に反して、本開示は、シグナルペプチドまたはさらなる配列を欠く単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインが強力なＮＴＢ−Ａアゴニスト活性と、本明細書に記載されるように予想外の治療上有利な特性と、を示すことを実証する。
【００５９】
本明細書に詳述される通り、ＮＴＢ−Ａホモタイプ型エンゲージメントがシグナル伝達カスケードを開始し、そこでＳＡＰ結合が誘導または増加され、ＦｙｎおよびＬｃｋが動員される。これらの事象が、緊密な免疫シナプスの生成および特異的Ｔ細胞活性化に寄与し、精密な溶解性分解のためのｍＴＯＣ形成を方向づける。ＮＴＢ−ＡエクトドメインによるＮＴＢ−Ａのエンゲージメントは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）および電離放射線照射から抗腫瘍Ｔ細胞を救済し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生を改善し、表面ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）発現を増強し、Ｔ細胞アポトーシスを逆行させ、そしてＴ細胞による腫瘍細胞死滅を増進することが、本明細書に記載される。これらの活性を測定するための方法の非限定的例が、本明細書の以下の実施例に提示されている。したがって本明細書で用いられる「ＮＴＢ−Ａアゴニスト活性」は、本明細書に記載される、ネイティブＮＴＢ−Ａの生物学的活性を発揮する能力を指す。
【００６０】
したがって本明細書で用いられる語句「ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト」は、細胞表面で発現される内因性ＮＴＢ−Ａ分子と特異的に結合して（ホモタイプ型結合）、本明細書に記載されるようにＮＴＢ−Ａホモタイプ型エンゲージメントに特徴的なシグナル伝達経路を誘導し、それによりＮＴＢ−Ａアゴニスト活性を発揮する、本明細書に記載される分子を指す。幾つかの実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストは、内因性ＮＴＢ−Ａの活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％を保持する。別の実施形態において、上記ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストは、増強されたアゴニスト活性、例えばネイティブＮＴＢ−Ａの１１０％、１２０％、１３０％、１４０％または１５０％を発揮する。特定の他の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインアゴニストは、ネイティブＮＴＢ−Ａの増強された生物活性、例えばネイティブＮＴＢ−Ａエクトドメインにより発揮される活性の最大２００％を発揮し得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインアゴニストは、エピトープタグ（例えばポリヒスチジンタグ）および／または血漿半減期延長部分をさらに含む。例えばｓＮＴＢ−Ａポリペプチドは、免疫グロブリンまたはその一部に融合またはコンジュゲートされ得る。他の半減期延長物質としては、生物学的に適したポリマーまたはコポリマー、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が挙げられる。別の適切なポリアルキレングロコール化合物としては、以下のタイプの荷電または中性ポリマー：デキストラン、ポリリシン、コロミン酸または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明による半減期延長部分の他の例としては、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、デキストラン、ｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖状もしくは分枝状グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリン軽鎖および重鎖、免疫グロブリンＦｃドメインもしくはその一部（例えば米国特許第６，６６０，８４３号参照）、ＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））；（米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号；米国特許第６，８８７，４７０号参照）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４  Ａ１号;同第 ２００３／０１９１０５６  Ａ１号参照）、またはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。
【００６２】
本明細書に記載される通り、ＮＴＢ−Ａアゴニスト活性が実質的に維持されるように、得られるポリペプチドまたはコンジュゲートが選択されることが、理解されなければならない。
【００６３】
別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインアゴニストは、抗体である。本明細書で用いられる用語「抗体」または「複数の抗体」は、好ましくはモノクローナル抗体またはその断片である抗体を指し、非限定的にヒト免疫グロブリン定常領域を有する全長抗体、モノクローナルＩｇＧ、一本鎖抗体、ヒト化モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ断片、標識抗体、固定抗体および異種化合物とコンジュゲートした抗体を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。
【００６４】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。抗体は、複数の公知の方法のいずれか１つにより作製でき、抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング、または培養された連続細胞株によるモノクローナル抗体分子の産生を利用できる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限定されない。インビボで抗体を生成させる従来の方法の他に、当該技術分野で周知の方法により、ファージディスプレイ技術を利用して、抗体をインビトロで作製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ｅｄｓ．），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９２−２０００），  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．１）。
【００６５】
抗原（例えば、ＮＴＢ−Ａエクトドメイン）または免疫原性複合体（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質キャリアにコンジュゲートされたＮＴＢ−Ａエクトドメインエピトープ）を、マウス、ウサギなどの適切な哺乳動物対象に注射できる。適切なプロトコルは、血清中での抗体産生を増幅するように設計されたスケジュールに従って、アジュバントの存在下で免疫原を反復注射することを含む。免疫血清の力価は、当該技術分野で周知の免疫アッセイ手順を利用して即座に測定できる。本明細書に記載されるように、得られた抗血清は直接使用でき（例えば希釈された血清または精製されたポリクローナル抗体として）、またはモノクローナル抗体が得られる。
【００６６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、特異的抗原に対する抗体の実質的に均質な集団である。ｍＡｂは、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  １９９４）を参照されたい。
【００６７】
抗体断片は、当該技術分野で周知の方法を利用して得ることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  （１９８８）．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。例えば本発明による抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解により、またはその断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物または他のタンパク質発現系）内での発現により、調製できる。
【００６８】
Ｆｖは、対合される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成される。この会合は、非共有結合性であり得る。あるいは本明細書の先に記載された通り、可変ドメインは、分子間ジスルフィド結合により一本鎖Ｆｖを生成するようにつながれていてもよく、またはそのような鎖が、グルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋されていてもよい。
【００６９】
好ましくはＦｖは、一本鎖Ｆｖである。一本鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドにより連結される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。この構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、続いて大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つの可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを含む一本のポリペプチド鎖を合成する。一本鎖Ｆｖを生成するための十分なガイダンスは、当該技術分野の文献に示されている。
【００７０】
用語「ヒト抗体」は、当該技術分野で公知のヒト生殖系免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変および定常領域を有する抗体を包含する。本発明の実施形態で用いられるヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたは他の周知方法（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号）など、当該技術分野で公知の様々なさらなる技術を利用して生成することもできる。
【００７１】
キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子である。実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基と、実質的にマウス抗体（ドナー抗体と呼ばれる）からの相補性決定領域と、を有する抗体は、ヒト化抗体とも呼ばれる。キメラ抗体は、適用の際に免疫原性を低減するため、そして生成収率を上昇させるために主として用いられ、例えばネズミｍＡｂがハイブリドーマからのより高い収率を有するがヒトにおける免疫原性がより高い場合には、ヒト／ネズミキメラｍＡｂが用いられる。キメラ抗体およびその生成方法は、当該技術分野で公知である（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８６／０１５３３号、ＷＯ９７／０２６７１号およびＷＯ９０／０７８６１号、ならびに米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，２２５，５３９号）。加えて、ＣＤＲグラフティングを実施して、親和性または特異性などの抗体分子の特定の性質を変化させてもよい。ＣＤＲグラフティングの非限定的例は、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されている。
【００７２】
ヒトの治療のために、好ましくはヒト化抗体が用いられることは、理解されよう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する部分（好ましくは最小の部分）を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）のＣＤＲが所望の機能性を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換された抗体を包含する。幾つかの例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも、または導入されるＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のそれに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが関連のヒトコンセンサス配列のそれに対応する。ヒト化抗体は、場合により、典型的にはヒト抗体に由来する、Ｆｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部も含む。
【００７３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。一般にヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、導入残基（ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）と称され、典型的には導入される可変ドメインから得られる。ヒト化は、ヒトＣＤＲを対応するげっ歯類ＣＤＲと置換することにより、当該技術分野で公知の通り実施され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。したがってヒト化抗体はキメラ抗体であり、インタクトヒト可変ドメインよりも実質的に少ない配列が非ヒト種からの対応する配列により置換されている。
【００７４】
抗体が得られた後、抗体は、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、活性についてテストされ得る。
【００７５】
様々な実施形態において、本発明の抗体は、抗ｓＮＴＢ−Ａ抗体、即ちＮＴＢ−Ａエクトドメインに特異的に結合するＡｂである。用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、生理学的条件下で相対的に安定な複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、高い親和性と低〜中度の能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を特徴としており、低い親和性と中〜高度の能力を通常は有する非特異的結合と区別される。典型的には結合は、結合定数ＫＡが１０６Ｍ−１よりも高い場合に特異的と見なされる。必要に応じて、結合条件を変化させることにより、特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく、非特異的結合を低減できる。抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合が可能な時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの適切な結合条件を、日常的技術を利用して当業者により最適化できる。本明細書で用いられる用語「特異的に結合する」は、抗原への抗体の結合が無関係の分子の存在により拮抗阻害されないことをさらに示すことができる。簡便には、抗原、例えばＮＴＢ−Ａエクトドメインを特異的に結合する抗体の能力の検出は、特異的な抗原−抗体複合体形成を定量することにより（例えば、ＥＬＩＳＡにより）実施され得る。
【００７６】
別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインアゴニストは、小分子である。「小分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有すると、本明細書で定義される。そのような化合物は、合成有機または無機化合物、ペプチドなどを包含し得る。所望の活性について化合物をスクリーニングする方法、および所望の構造と相互作用する分子を合理的に設計する方法は、当該技術分野で公知である。
【００７７】
合成および組換え法
本発明のポリペプチドおよびペプチド（例えば、ＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドおよび誘導体）を、当該技術分野で公知の任意の組換えまたは合成方法を用いて単離または合成できる。例えばペプチドまたはポリペプチド断片を、非限定的に固相（Ｂｏｃまたはｆ−Ｍｏｃの化学作用）および溶液相合成法などの方法により合成できる。例えばペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５，  ２１４９）の固相ペプチド合成法により合成できる。あるいはペプチドを、当該技術分野で周知の標準的溶液法（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  １９８４参照）を利用して、またはペプチド合成に関して当該技術分野で公知の任意の他の方法により、合成できる。
【００７８】
ポリペプチドおよびペプチドは、組換え技術により簡便に生成され得る。タンパク質およびペプチドを設計、発現および精製するための組換え法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  １９９２，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を包含し得る。ポリペプチドまたはペプチドをコードする単離された核酸配列は、天然供給源から、遺伝子全体（即ち、完全な遺伝子）またはその一部のいずれかとして得ることができる。核酸分子は、組換えＤＡＮ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を利用して生成することもできる。核酸配列は、非限定的に、そのような修飾が機能的ペプチドをコードする核酸分子の能力を実質的に妨害しないような手法で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または反転されている、天然の対立遺伝子変異型および修飾核酸配列をはじめとする天然核酸配列およびその相同体を包含する。ポリペプチドまたはオリゴペプチド配列は、タンパク質の遺伝子コードから推定できるが、いわゆる「ウォブル則」により与えられるようなコドンの第三の位置における従来の塩基対合への例外を許容することに加えて、コードの縮退が考慮されなければならない。幾分かのヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、同様の、または同一のタンパク質をもたらし得る。組換え生成法を利用して、例えば大腸菌または酵母などの微生物の、選択された宿主細胞が、ポリペプチドまたはポリペプチド類似体をコードする特異的ＤＮＡ配列を含むハイブリッドウイルスまたはプラスミドＤＮＡベクターで形質転換され、このポリペプチドは、ＤＮＡ配列の転写および翻訳により宿主内で合成される。
【００７９】
様々な実施形態において、配列は、受容体の対応する配列から直接得ることができ（配列が受容体の配列の一部と同一になり得るように）、または特定の誘導体化および置換を含んでよい。したがって幾つかの実施形態において、これらの配列の塩および機能的誘導体の使用が、本明細書に詳述される通り、各生物学的機能を保持する限り企図される。したがって本発明は、非天然アミノ酸誘導体または非タンパク質側鎖を含むペプチド相同体を包含する。カルボキシアミドとして、還元された末端アルコールとして、または任意の医薬的に許容し得る塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩もしくはカルシウム塩などを含む金属塩として、または有機塩基の塩として、または硫酸、塩酸もしくはリン酸を含む鉱酸の塩として、または有機酸、例えば酢酸もしくはマレイン酸の塩として、末端カルボキシ酸を有する本発明のペプチド相同体を、用いることができる。一般にペプチドの任意の医薬的に許容し得る塩を、その生物活性が維持される限り用いることができる。
【００８０】
本明細書に記載されたアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかしペプチドが所望の機能的性質を実質的に保持する限り、「Ｄ」異性体形態の残基を任意のＬ−アミノ酸残基と置換できる。
【００８１】
化学的誘導体は、側鎖または官能基の反応により化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有し得る。そのような誘導体化された分子としては、例えば遊離アミノ酸基を誘導体化して、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するそれらの分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルもしくはヒドラジドを形成できる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成できる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成できる。化学的誘導体としてまた、２０の標準的アミノ酸残基の１つまたは複数の天然由来アミノ酸誘導体を含むそれらのペプチドが包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換でき；５−ヒドロキシリシンでリシンを置換でき；３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換でき；ホモセリンでセリンを置換でき；オルニチンでリシンを置換できる。
【００８２】
加えて、誘導体は、非限定的に末端ＮＨ２アシル化、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化をはじめとする化学修飾により、そして例えばアンモニア、メチルアミンなどでの末端カルボキシルアミド化により、本発明のポリペプチドまたはペプチドの天然配列と異なっていてよい。
【００８３】
別の態様において、本発明の方法は、対象から得られた細胞集団において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む単離されたポリペプチドを発現させることにより実行できる（例えば、対象からＴ細胞を単離すること、単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインを発現可能なベクターを導入すること、およびポリペプチドを対象内で分泌させて対象のＴ細胞と接触させ得るように、細胞を対象に再導入することによる）。したがって例えば、Ｔ細胞死を低減または阻害する方法は、Ｔ細胞をＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストの治療有効量と接触させることにより実行でき、上記ＮＴＢ−Ａエクトドメインは遺伝子療法によりインビボで生成される。
【００８４】
所望の遺伝子産物を送達および発現するために用いられる発現構築物またはベクターの調製は、当該技術分野で公知である。そのような構築物は、当該技術分野で公知の通り、調節配列または選択マーカーを典型的に含む。核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを原核生物、真核生物、または場合によりその両方（例えば、シャトルベクター）の中での複製および取込みに適するようにするさらなる配列を含み得る。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳ターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルも含んでよい。
【００８５】
哺乳動物発現ベクターの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅから入手されるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、およびｐＮＭＴ８１；Ｐｒｏｍｅｇａから入手されるｐＣＩ；Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手されるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手されるｐＴＲＥＳ、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、本明細書で記載される実施形態において有用な構築物のためのベクターバックボーンとして働き得る。
【００８６】
組換えウイルスベクターは、水平感染および標的特異性などの利点を提供するため、本発明の遺伝子のインビボ発現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有であり、１つの感染細胞が多くの子孫ビリオンを産生してそれが出芽し隣接する細胞に感染する過程である。その結果、そのほとんどが元のウイルス粒子に初めは感染していなかった細胞の大きな領域が、急速に感染する。これは、感染因子が娘子孫を通してのみ拡散する垂直感染とは対照的である。水平に拡散できないウイルスベクターを作製することもできる。この特徴は、特異的遺伝子を局在化した若干数の標的細胞にのみに導入することが所望の目的である場合に、有用であり得る。
【００８７】
エクスビボ増殖および細胞調製
したがって、本発明の第一の態様によれば、Ｔ細胞含有細胞集団を、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む単離された（例えば、組換え生成された）ポリペプチドの治療有効量と共にインキュベートするステップを含む、細胞組成物を調製するための改善された方法が提供される。典型的には方法は、本明細書に詳述される通り、Ｔ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートするステップを含む。
【００８８】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答に関与する様々な異なる細胞型の１つである。Ｔ細胞の活性は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関連してＴ細胞に提示される抗原により調節される。その後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ−抗原複合体に結合する。抗原がＭＨＣに複合体化すると、ＭＨＣ−抗原複合体が、Ｔ細胞上の特異的ＴＣＲにより結合され、それによりそのＴ細胞の活性を改変する。抗原提示細胞によるＴリンパ球の適正な活性化は、ＴＣＲの刺激だけでなく、その共受容体の合同的かつ調和的なエンゲージメントも必要とする。
【００８９】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的過程において他の白血球細胞を支援する。これらの細胞は、表面でＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋  Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示されると、活性化されるようになる。それらは、活性化されると、急速に分裂して、活性免疫応答を調節または支援する、サイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。
【００９０】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）はウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。これらの細胞は、それらの表面でＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。
【００９１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、正式にはサプレッサーＴ細胞として公知であり、免疫寛容の維持に不可欠である。それらの主要な役割は、免疫反応の終了に向かってＴ細胞を介した免疫を停止させること、および胸腺において負の選択の過程を回避する自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００９２】
ＴＣＲは内在性膜タンパク質の複合体であり、特異的ＭＨＣ提示抗原認識による刺激およびクロノタイプ特異的α／βヘテロダイマーによる結合が転写の活性化ならびにそれに続く増幅およびエフェクター機能（ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害活性およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌など）をもたらす。この活性化は、タンパク質リン酸化、イノシトールリン酸の放出および細胞内カルシウムレベルの上昇などの下流シグナル伝達経路に細胞外リガンド事象を結びつける、以下に詳述される受容体複合体の他のサブユニットを含む。
【００９３】
ＣＤ３γ、δ、ε、およびζサブユニットの細胞内部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ）と称される配列モチーフのコピーを含有する。ＩＴＡＭは、タンパク質チロシンキナーゼの基質として、そしてリン酸化後に、さらに他のキナーゼのＳＨ２ドメインの結合部位として働き得る。活性化Ｔ細胞受容体へのプロテインキナーゼの動員の調節および機序は、キナーゼのＳｙｋファミリー（ＺＡＰ−７０）およびＳｒｃファミリー（Ｌｃｋ）の両方の要素を含む。
【００９４】
先の詳述されたＴＣＲ刺激は、抗原特異的または抗原非特異的（ポリクローナル）であり得る。適切な抗原特異的ＴＣＲ活性化物質としては、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）の文脈にある、ＭＨＣ分子に結合した抗原が挙げられる。ポリクローナルＴＣＲ活性化物質は、特異的抗原の非存在下で、特異的ＴＣＲエンゲージメントに関連したシグナル伝達および転写活性化経路を開始できる。適切なポリクローナルＴ細胞活性化物質としては、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体、例えば本明細書に記載されるサブユニットを結合および架橋する抗体が挙げられる。Ｔ細胞受容体を架橋する例示的抗体としては、ＨＩＴ３ａ、ＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３モノクローナル抗体が挙げられる。刺激は、先に述べられた機能的効果を誘導するよう当該技術分野で公知の量および条件で提供される。ＴＣＲ刺激のための様々な非限定的例（抗原特異的およびポリクローナルの両方）が、本明細書の以下の実施例に示されている。
【００９５】
別の実施形態において、集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、細胞は、遺伝子操作または組換えされている（例えば、所望の抗原特異性を発揮するために）。例えば別の実施形態において、細胞は、癌細胞または病原（例えば、ウイルス）に対抗してそれらを誘導しなおすために予め設計されたＴＣＲを発現するように遺伝子操作されたリンパ球（例えば、ＣＴＬなどの精製Ｔ細胞）である。非限定的例によれば、Ｔ細胞は、多くの固形腫瘍、例えば滑膜肉腫で発現される抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対抗して誘導されるＴＣＲを発現するように操作されている。別の実施形態において、細胞は、癌細胞または病原に対抗してそれらを誘導しなおすためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された末梢血単核細胞である。例えば限定ではないが、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞を、急性リンパ芽急性白血病などのＢ細胞悪性腫瘍の処置に用いることができる。別の実施形態において、細胞は、生物学的機能を増強する遺伝子を発現するように遺伝子操作された末梢血単核細胞である。例えば非限定的に、そのような遺伝子は、膜結合サイトカインおよびサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒ）を包含し得る。主要関連抗原ｇｐ１００２５−３３または４−１ＢＢＬなどの共刺激分子に対して誘導されるＴＣＲを発現する、遺伝子修飾された細胞の使用に関する特定の追加的な非限定的例が、以下の実施例に記載される。
【００９６】
別の実施形態において、集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、集団は、骨髄細胞を含む。別の実施形態において、集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞と骨髄細胞との組み合わせを含む。
【００９７】
別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドまたはアゴニストとのインキュベーションは、Ｔ細胞活性化に関連する活性化マーカーおよび／またはサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなどのＴｃ１活性化マーカー）を誘導またはアップレギュレートするのに十分な量および条件で実施される。有利には、ＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドまたはアゴニストとのインキュベーションは、Ｔ細胞上でのＣＤ１３７発現をアップレギュレートするように実施される。そのような例示的な有利な条件を、以下に明記する。
【００９８】
したがって特定の有利な実施形態によれば、インキュベーションは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激の存在下で実施される。別の実施形態において、ＴＣＲ刺激は、抗原非特異的（例えば、結合により受容体を活性化するＣＤ３に特異的な抗体、例えばＯＫＴ３を用いて実施される）または抗原特異的（適切な抗原提示細胞および抗原を用いる）であり得る。
【００９９】
癌の処置の状況では、抗原特異的刺激は、典型的には腫瘍関連抗原への刺激を利用する。用語「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、腫瘍または腫瘍細胞（複数可）に関連する（によって運搬される、発現される、生成される、分泌されるなど）任意のタンパク質、ペプチド、または抗原を指す。腫瘍関連抗原は、（ほぼ）排他的に腫瘍または腫瘍細胞（複数可）に関連し得るが、健常な正常細胞には関連し得ず、または健常で正常な組織もしくは細胞に比較して腫瘍組織もしくは腫瘍細胞（複数可）中で過剰発現され得る（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはそれを超える）。より詳細にはＴＡＡは、腫瘍細胞のＭＨＣ決定基により提示される（処理された形態で）ことが可能な抗原である。つまり腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子を発現する腫瘍または腫瘍細胞のみと会合する可能性がある。周知のＴＡＡの非限定的例は、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００１５４−１６３、ＣＳＰＧ４、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＡＧＥ−Ａ１、チロシナーゼである。
【０１００】
特定のさらなる有利な実施形態によれば、インキュベーションは、フィーダー細胞（例えば）の存在下で実施される。
【０１０１】
用語「フィーダー細胞」は、第二のタイプの細胞が保持および増殖され得る環境を提供するために、第二のタイプの細胞と共培養される第一のタイプの細胞を一般に指す。フィーダー細胞は、それらが支持している細胞と異なる種のものであり得る。本発明の目的では、この用語は、Ｆｃ受容体を担うアクセサリー細胞を具体的に指し、それらは典型的には増大されるＴ細胞含有集団とアロ反応性である。言い換えれば、フィーダー細胞は、増大されるＴ細胞含有集団と組織適合性がある必要はなく、特定の有利な実施形態において、２つの集団は典型的にはＨＬＡ不適合である。本発明の実施形態で用いられるフィーダー細胞の典型的な例は、同種の正常ドナーの末梢血単核細胞、ＰＢＭＣである。典型的そして有利には、そのようなフィーダー細胞の使用は、抗原非特異的ＴＣＲ刺激と共同的に、例えば本明細書に詳述されるように、抗原非特異的刺激抗体と共にインキュベートすることにより、実施される。
【０１０２】
さらなる有利な実施形態によれば、養子細胞療法のＴＩＬ組成物が、放射線照射されたＰＢＭＣ（増殖が不可能な）を用いて調製される。例えばＰＢＭＣは、簡便には細胞を６０００ＲＡＤに暴露することで放射線により減弱され得る。別の実施形態において、養子細胞療法のＴＩＬ組成物は、抗原特異的刺激を提供するために、抗原提示細胞および抗原を担う不活性粒子を含む人工抗原提示物質を用いて調製される。
【０１０３】
本発明のポリペプチドは、より安全でより効果的なＴ細胞活性化を生成する上で、ＩＬ−２よりも予想外に優れていることが実証された。したがってＩＬ−２の使用を、実質的に減少させることができ、さらに本発明のポリペプチドに完全に置き換えることさえできる。したがって別の実施形態において、インキュベーションは、外因性ＩＬ−２を添加せずに有利に実施される。特定の理論または作用機序に結びつけられることを望むものではないが、本発明の実施形態は、エフェクターＴ細胞活性（例えば、ＣＴＬ活性）が増大され、一方で制御性Ｔ細胞活性が最小限である、そのような改善された細胞組成物を対象とする。
【０１０４】
別の実施形態において、インキュベーションは、３００〜６０００ＩＵ／ｍｌの範囲内の外因性ＩＬ−２を添加して実施される。別の実施形態において、インキュベーションは、外因性ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストの存在下で実施される。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「内因性」は、その分子が生物体または組織または細胞内で産生または合成されたことを意味する。用語「外因性」は、この抗原または増強分子が細胞または組織の外部から導入されたことを意味する。
【０１０６】
例えば非限定的に、ＴＩＬ組成物は、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（例えば、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体）、および１〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドの存在下で、２００：１〜１：３００、例えば１：２００〜１：１００のＴＩＬ（または本明細書に記載されるようなＴ細胞）対ＰＢＭＣ比でＴＩＬをＰＢＭＣとインキュベートすることにより得られる。インキュベーションは、３〜１５日間、好ましくは８〜１２日間、実施され得る。細胞組成物を生成するための追加の方法およびプロトコルは、本明細書の実施例の節に例示される。
【０１０７】
特定のプロトコルによれば、患者の腫瘍から得られたＴＩＬは、先に記載されたＲＥＰ増殖のステップの前にエクスビボで培養できる。例えばＴＩＬは、抗ＣＤ３抗体およびフィーダー細胞の添加の前に、ＩＬ−２（例えば、３００〜６，０００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で最大２８日まで予備培養できる。様々な実施形態によれば、本発明のＮＴＢ−Ａエクトドメインポリペプチドが、この予備培養ステップで、例えば１０〜５０μｇ／ｍｌでさらに補充され（ＩＬ−２を含む、または含まず）、Ｔ細胞応答がモニタリングされる。  
【０１０８】
幾つかの実施形態において、得られたＴＩＬ組成物は、１０８〜１０１２で、または別の実施形態では１０６〜１０１２細胞／患者で、例えば１０１０〜１０６細胞／患者で、それを必要とする対象に投与できる。
【０１０９】
様々な実施形態において、本発明の方法は、Ｔ細胞増大および増殖を提供する。特別な実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはアゴニストとのインキュベーションは、Ｔ細胞数を少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍、増加させるように実施される。特定の実施形態によれば、例えば改善されたＲＥＰプルトコルが用いられる場合、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはアゴニストとのインキュベーションは、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも７０００倍または少なくとも１０，０００倍増加したＴ細胞数を典型的にもたらす。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１１０】
別の態様において、本発明の方法により調製された細胞組成物が提供される。別の実施形態において、細胞組成物は、それを必要とするレシピエント対象への養子移入に適している。他に断りがなければ、本明細書で用いられる用語「養子移入」は、予め感作された免疫学的物質（例えば、細胞または血清）がレシピエントに移入される受動免疫療法の一形態を指す。
【０１１１】
語句「養子移入免疫療法」、「養子細胞療法」および「養子細胞免疫療法」は本明細書において互換的に用いられ、本発明の細胞組成物などのエフェクター免疫拮抗細胞を、それを必要とする対象に投与（養子移入）して、癌または感染性疾患の発症または症状を軽減または改善する、治療または防御レジメンまたはモダリティーを表す。
【０１１２】
細胞組成物は、Ｔ細胞含有集団を有効量で含み得る。例えば養子移入免疫療法に効果的な量は、抗腫瘍応答などの有益な免疫応答を誘導または増強するのに十分な量、例えば１０６〜１０１２個の細胞である。特にヒト対象用の、インビボ投与に適した細胞調製物は、医薬的に許容し得る賦形剤または希釈剤を含み得るが、そのような調製物は、病原物質、毒素、化膿素ならびに医薬的に許容し得ると認識されていない任意の他の生物学的および非生物学的物質による混入が十分に回避されていることが理解されなければならない。例えば非限定的に、養子移入免疫療法用のＴ細胞は、滅菌生理食塩水を２％ヒトアルブミン、および場合によりＩＬ−２（例えば、３００ＩＵ／ｍｌ）と共に含有する、注射に適した緩衝液中に簡便に懸濁され得る。
【０１１３】
特定の好ましい実施形態によれば、細胞組成物は、処置される対象と組織適合性がある（例えば、自家細胞またはＭＨＣクラスＩＩ適合の同種細胞）。
【０１１４】
用語「組織適合性」は、異なる個体間の組織の類似性を指す。組織適合性のレベルは、患者およびドナーがどれほど良好に適合するかを表す。主要組織適合性決定因子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。ＨＬＡの型付けが、潜在的ドナーと潜在的レシピエントとの間で実施され、２つのＨＬＡがどれ程密接に適合するかを決定する。本明細書で用いられる用語「組織適合性」は、ＨＬＡ抗原の６つ全て（２つのＡ抗原、２つのＢ抗原および２つのＤＲ抗原）がドナーとレシピエント間で同一である実施形態を指す。
【０１１５】
しかし他の実施形態において、ドナーとレシピエントが完全に適合を有さなくとも、２つ以上の抗原で、例えば６つのうちの５つの抗原で「不適合」である、または他の実施形態で、６つのうちの４つもしくは６つのうちの３つで不適合である、ドナーおよびレシピエントが、本発明の特定の実施形態により包含され得る。本明細書で用いられる用語「実質的に組織適合性がある」は、ＨＬＡ抗原の６つのうち５つがドナーとレシピエント間で同一である実施形態を指す。
【０１１６】
したがって幾つかの実施形態によれば、本発明は、
ｉ）それを必要とする対象から（または対象と組織適合性がある、もしくは実質的に組織適合性があるドナーから）Ｔ細胞含有集団を得ること、
ｉｉ）Ｔ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートすること、および
ｉｉｉ）得られたＴ細胞含有細胞集団を上記対象に投与すること、
を含む方法に関する。
【０１１７】
他の実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、
ｉ）対象から（または対象と組織適合性があるドナーから）Ｔ細胞含有集団を得ること、
ｉｉ）Ｔ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートすること（例えば、それによりＴ細胞上のＣＤ１３７発現をアップレギュレートするように）、および
ｉｉｉ）得られたＴ細胞含有細胞集団を上記対象に投与し（例えば、それにより抗腫瘍免疫応答を誘導または増強するように）、それにより上記対象における癌を処置すること、
を含む、方法に関する。
【０１１８】
他の実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象におけるＴ細胞を介した病理を処置する方法であって、
ｉ）対象から（または対象と組織適合性があるドナーから）Ｔ細胞含有集団を得ること、
ｉｉ）Ｔ細胞含有細胞集団を有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートすること（例えば、それによりＴ細胞上でのＣＤ１３７発現をアップレギュレートするように）、および
ｉｉｉ）得られたＴ細胞含有細胞集団を上記対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置すること、
を含む、方法に関する。
【０１１９】
様々な有益な実施形態によれば、ステップｉｉ）は、抗原刺激の存在下で、そして／または本明細書に記載される方法およびプロトコルに従って実施される。
【０１２０】
医薬組成物、キットおよび治療的組み合わせ
他の実施形態において、本発明の方法で用いられるＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストは、場合により医薬的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、医薬組成物の形態で提供される。
【０１２１】
上記組成物は、非限定的に溶液、懸濁液、使用前に適切なビヒクルまたは希釈剤で再構成される凍結乾燥粉末、カプセル、錠剤、徐放性配合剤などをはじめとする、患者への投与に適した任意の医薬形態であり得る。組成物は、好ましくは精製された形態の、治療有効量の本発明の薬剤、および医薬賦形剤を含み得る。本明細書で用いられる「医薬賦形剤」は、医薬投与に適合性がある、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤など、ならびにそれらの組み合わせを包含する。本明細書では以後、互換的に用いられ得る語句「治療上許容し得る担体」および「医薬的に供し得る担体」は、生物体への著しい刺激を誘発せず、投与された化合物の生物活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を指す。化合物は、補助的、追加的、または増強された治療的機能を提供する他の活性化合物も含有し得る。別の実施形態において、組成物は、本質的にＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、１種または複数の医薬的賦形剤からなる。別の実施形態において、組成物は、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、１種または複数の医薬賦形剤からなる。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の工程により、例えば従来の混合、溶解、造粒、研磨、粉砕、糖剤作製（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程により、製造され得る。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性があるように配合される。投与を果たすための方法は、当業者に公知である。組成物を配合するための適切な賦形剤および様式の例は、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版に記載される。
【０１２３】
本発明による医薬組成物（例えば、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含有する）は、典型的には注射または輸液に適した液体配合剤である。医薬組成物の投与の例としては、経口摂取、吸入、静脈内および連続輸液、腹腔内、筋肉内、体腔内、皮下、皮膚、または経皮投与が挙げられる。特定の特別な実施形態によれば、組成物は、病巣内（例えば、腫瘍内）投与に適している。別の実施形態において、組成物は、静脈内投与に適している。
【０１２４】
例えば、生理食塩液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射溶液用の、液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【０１２５】
静脈内投与に用いられる溶液または懸濁液としては、典型的には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー所在）、エタノール、またはポリオールが挙げられる。全ての例において、組成物は、無菌でありかつ容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が得られるような流動体でなければならない。適切な流動性は、レシチンまたは界面活性剤を使用して得ることができる。組成物はまた、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。微生物の予防は、抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合において、等張剤（糖）、ポリアルコール（マンニトールおよびソルビトール）または塩化ナトリウムが、組成物中に含有されてよい。組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを添加することにより達成され得る。必要に応じて、組成物は、注射部位の痛みを緩和するリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に成分は、別々に、または単位投与剤型で一緒に混合して、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が輸液により投与される場合は、それを滅菌医薬等級水または生理食塩水を含む輸液ボトルを用いて分配できる。組成物が注射により投与される場合は、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供できる。
【０１２６】
経口組成物は、不活性希釈剤または摂食可能な担体を含む。組成物は、ゼラチンに封入するか錠剤に打錠できる。経口的治療の目的では、活性剤は、賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチまたはカプセル剤に入れられ得る。薬学的に適合性がある結合剤またはアジュバント物質が、組成物に含まれ得る。錠剤、トローチ、およびカプセル剤は、場合により、微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；スターチもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；コロイド性二酸化ケイ素などの滑剤；または甘味剤；または香味剤を含有してよい。
【０１２７】
組成物はまた、経粘膜または経皮経路により投与され得る。例えばＦｃ部分を含む抗体は、腸、口、または肺の粘膜を通過する（Ｆｃ受容体を介して）ことが可能であってもよい。経粘膜投与は、ロゼンジ、鼻腔スプレー、吸入器、または坐剤の使用を通して実現され得る。経皮投与もまた、当該技術分野で公知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームを含む組成物の使用により実現され得る。経粘膜または経皮投与の場合、透過されるバリアに適した浸透剤が用いられる。吸入による投与の場合、抗体が、噴射剤（例えば、液体または気体）またはネブライザーを含む加圧式容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレー中で送達される。組成物は、坐剤として、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に配合され得る。
【０１２８】
皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、典型的には以下の成分の少なくとも１種が挙げられる：水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化剤。ｐＨは、酸または塩基を用いて調整され得る。そのような調製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、または反復投与バイアルに封入され得る。
【０１２９】
特定の実施形態において、ポリペプチド活性剤（例えば、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニスト）は、身体からの急速な排出に対しポリペプチドを防御するように担体と共に調製される。生分解性ポリマー（例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が多くの場合に用いられる。そのような配合剤の調製方法は、当業者に公知である。リポソーム懸濁液もまた、医薬的に許容し得る担体として用いることができる。リポソームは、当該技術分野で公知の確立された方法に従って調製され得る（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号）。別の特別な実施形態において、ＰＥＧ部分または糖脂質を含むリポソームを有利に用いて血漿滞留を増進し、かつ／または肝臓取込みを減少させることができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、より大きなリポソーム（例えば、３００ｎｍ以上）が用いられ、それは優先的に脾臓による取込みおよびクリアランスを媒介し、低減した肝臓クリアランスを有する。別の実施形態において、より小さなリポソーム（例えば、４０ｎｍ以下）が用いられ、それは肝臓の取込みおよびクリアランスを優先的に媒介する。さらに別の実施形態において、４０〜３００ｎｍのリポソームが用いられ、それは血漿滞留を増進し得る。他の実施形態において、リポソームは、ＰＥＧなどのポリマーをさらに含み得る（例えば、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９４  Ｆｅｂ  ２３；１１９０（１）：９９−１０７参照）。米国特許出願公開第２０１１１６０６４２号には、肝臓および脾臓での蓄積が減少したペグ化リポソーム配合剤が開示されている。細網内皮系による取込みを回避し、より長時間循環するように配合された様々なリポソームが、米国特許第６，２８４，２６７号に記載されている。
【０１３１】
加えて、本発明のＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはアゴニストを、異種ポリペプチド、薬物、放射線核種、または毒素などの様々なエフェクター分子と共に投与できる。したがって幾つかの実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはアゴニストは、癌の処置、例えば放射線照射または化学療法と併せて（同時または連続で）投与され得る。
【０１３２】
連続および間欠静脈内投与を、埋込み型または体外ポンプ（例えば、ＩＮＦＵＳＡＩＤポンプ）を用いて実現することもできる。そのようなポンプの使用および必要なパラメータに対する投与プロトコルの調整は、十分に当業者の能力内である。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明のＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはアゴニストの投与または添加は、ＣＤ１３７リガンド（例えば、ヒトＣＤ１３７リガンドまたはその細胞外部分）またはそのアゴニスト（ＣＤ１３７のその同族リガンドでの活性化に関連する生物学的機能を誘導する、抗ＣＤ１３７抗体など）の投与と併せて（同時にまたは連続で）実施され得る。市販の、または臨床試験下にあるそのような抗ＣＤ１３７抗体の非限定的例としては、例えばＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ；ニュージャージー州プリンストン所在）カタログ番号６６３５１３の、 例えば１０〜２０ｎｇ／ｍｌで使用され得る完全ヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＡＦ８３８の、例えば２０〜４０ｎｇ／ｍｌで使用され得るポリクローナルヤギ抗４−１ＢＢ抗体が挙げられる。ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列は、アクセション番号Ｑ０７０１１に見出され得る。例えば全長ヒトＣＤ１３７は、以下のアミノ酸配列を有し得る：MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。ヒトＣＤ１３７リガンドのアミノ酸配列は、アクセション番号ＮＰ＿００３８０２．１に見出され得る。例えばヒトＣＤ１３７リガンド（細胞外部分）は、以下のアミノ酸配列を有し得る：MREGPELSPD DPAGLLDLRQ GMFAQLVAQN VLLIDGPLSW YSDPGLAGVS LTGGLSYKED TKELVVAKAG VYYVFFQLEL RRVVAGEGSG SVSLALHLQP LRSAAGAAAL ALTVDLPPAS SEARNSAFGF QGRLLHLSAG QRLGVHLHTE ARARHAWQLT QGATVLGLFR VTPEIPAGLP SPRSE （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
【０１３４】
別の態様において、１）ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、２）ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストを含む単離されたポリペプチドと、場合により３）医薬的に許容し得る担体と、の治療的組み合わせが提供される。別の実施形態において、組み合わせは、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む。別の実施形態において、組み合わせは、ヒトＣＤ１３７リガンドを含む。別の実施形態において、アゴニストは、抗体（例えば、ＮＴＢ−Ａ特異的またはＣＤ１３７特異的）である。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明のＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはアゴニストの投与または添加は、他の免疫モジュレータ、例えば免疫細胞機能への修飾作用を示すシグナル伝達受容体ターゲティング試薬の投与と併せて（同時にまたは連続で）実施され得る。そのような試薬の例としては、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤（抗体など）が挙げられる。市販の、または臨床試験下にある抗体の非限定的例としては、ＣＴＬＡブロッキング抗体（１〜３ｍｇ／ｋｇで臨床における使用が認可されたＹＥＲＶＯＹ（商標）（ＢＭＳ））、ＰＤ−１ブロッキング抗体（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）、０．５〜２ｍｇ／ｋｇ；ＯＰＤＩＶＯ（商標）（ＢＭＳ）、１〜３ｍｇ／ｋｇ）、およびＰＤ−Ｌ１ターゲティング抗体（ＲＯＣＨＥ、臨床試験中）が挙げられる。
【０１３６】
別の態様において、１）ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと、２）免疫モジュレータと、場合により３）医薬的に許容し得る担体と、を含む治療的組み合わせが提供される。
【０１３７】
別の実施形態において、組み合わせは、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む。別の実施形態において、組み合わせは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤を含む。別の実施形態において、アゴニストは、抗体（例えば、ＮＴＢ−Ａ特異的、ＣＴＬＡ−４特異的、ＰＤ−１特異的またはＰＤ−Ｌ１特異的）である。
【０１３８】
他の態様によれば、本発明は、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、本発明の方法においてこのポリペプチドを使用するための使用説明書と、を含むキットを対象とする。
【０１３９】
別の実施形態において、組成物は、追加の抗原をさらに含むワクチンの形態で投与されない。別の実施形態において、組成物は、ワクチン処置に適合させた治療レジメンにより投与されない。ワクチンおよびワクチン処置プロトコルは、当該技術分野で周知である。ワクチンは、所望の免疫応答が誘発される１つまたは複数の抗原（例えば、弱毒化癌細胞または腫瘍関連抗原）を典型的に含有し、多くの場合、免疫応答を増幅または増強するのに用いられる追加のアジュバント（例えば、ミョウバンまたは鉱物油）を含む。
【０１４０】
例えば非限定的に、本発明のＮＴＢ−Ａ含有ポリペプチドまたはアゴニストの適切な用量範囲は、７〜９０日の投与間隔で投与される０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり得る。処置は、処置する医師により維持または調整されて、臨床利益を維持し全体的処置計画の規定毒性を回避できる。
【０１４１】
対象および治療的使用
本発明の特定の実施形態によれば、それを必要とする対象における癌を処置する際に使用するための、Ｔ細胞含有細胞集団を治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストと共にエクスビボでインキュベートするステップを含む方法により調製された細胞組成物が提供される。
【０１４２】
本発明の特定の別の実施形態によれば、それを必要とする対象における癌を処置する際に使用するための、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む医薬組成物が提供される。
【０１４３】
本発明の特定の追加の実施形態によれば、Ｔ細胞死を低減または阻害する際に使用するための、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む医薬組成物が提供される。
【０１４４】
本発明の特定のさらなる実施形態によれば、それを必要とする対象における血球減少症を処置または予防する際に使用するための、治療有効量の単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む医薬組成物が提供される。
【０１４５】
様々な実施形態において、組成物およびその使用は、本明細書に詳述されている。
【０１４６】
別の態様において、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、本発明の細胞組成物を対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置することを含む、方法が提供される。別の実施形態によれば、本発明の細胞組成物は、様々な他のＴ細胞依存性病理および状態、即ち有益なＴ細胞応答により軽減され得る状態の処置に用いられ得る。例えば非限定的に、様々な腫瘍および感染（例えば、ウイルス）は、ＣＴＬエピトープなどの特徴的なＴ細胞エピトープにより明示される。本発明の方法によるこれらのエピトープを対象とするＴ細胞の特異的活性化および増大は、そのような状態を処置するのに有益であり得る。
【０１４７】
本発明の組成物は、増殖性障害、詳細には悪性障害の処置のための様々な実施形態において意図される。本発明を説明するために本明細書で用いられる「増殖性障害」、「癌」、「腫瘍」および「悪性腫瘍」は全て、組織または臓器の過形成に等しく関連する。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性腫瘍細胞は循環細胞の非固形腫瘍を包含し得る。他の組織または臓器の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生成し得る。一般に本発明の組成物および方法は、非固形および固形腫瘍の処置に用いられ得る。用語「癌」または「癌細胞」は、正常な組織または組織細胞と識別される特徴を有する、新生物内に見出される組織または細胞を示すために本明細書で用いられる。
【０１４８】
本発明の方法の特定の好ましい実施形態によれば、細胞組成物は、対象と組織適合性がある（例えば、自家細胞またはＭＨＣＩＩ適合の同種細胞）。
【０１４９】
別の態様において、それを必要とする対象における癌を処置する方法であって、治療有効量のＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象における癌を処置することを含む、方法が提供される。
【０１５０】
別の態様において、それを必要とする対象におけるＴ細胞依存性病理を処置する方法であって、治療有効量のＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象におけるＴ細胞依存性病理を処置することを含む、方法が提供される。
【０１５１】
「有効量」または「治療有効量」は、本発明の方法において有益な結果を発揮するのに十分な量を指す。より具体的には、治療有効量は、処置される対象の障害（例えば、癌）の症状を予防、軽減、もしくは改善するのに、または処置される対象の生存を延長するのに効果的な有効成分（例えば、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはエフェクター細胞）の量を意味する。インビトロ細胞培養法に関連して、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストの有効量は、非限定的に、Ｔ細胞増殖、活性化マーカー（例えば、ＣＤ１３７）のアップレギュレーションおよび活性化により誘導されたＴ細胞死の減少を含む、アゴニストＮＴＢ−Ａ活性を発揮するのに十分な量である。
【０１５２】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供された詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力内である。本発明の方法で用いられる任意の調製物について、投与量または治療有効量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定され得る。例えば用量は、所望の濃度または力価を実現するために動物モデルで配合され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。
【０１５３】
本明細書に記載される有効成分の毒性および治療有効性は、インビトロ、細胞培養または実験動物において標準医薬手順により決定できる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトの使用のための投与量範囲を配合するのに用いることができる。投与量は、用いられる投与剤型、および利用される投与経路に応じて変動し得る。厳密な配合、投与経路、および投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択できる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５），  ”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｃｈ．  １，  ｐ．１．参照）。
【０１５４】
別の実施形態において、本発明の方法により処置される対象は、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍に冒されている。別の実施形態において、腫瘍は、ＮＴＢ−Ａ過剰発現を特徴としない。別の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。別の実施形態において、対象は、ＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍に冒されている。別の実施形態において、癌は、黒色腫、尿管癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸癌および他の腸管癌、骨悪性腫瘍、結合および軟組織腫瘍、ならびに皮膚癌からなる群から選択される。別の実施形態において、癌は、黒色腫、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌および結腸癌からなる群から選択される。別の実施形態において、癌は、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌および結腸癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、癌は、黒色腫である。別の特別な実施形態において、癌は、黒色腫以外である。別の特別な実施形態において、癌は、造血系腫瘍以外である。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１５５】
受容体およびポリペプチドマーカーの表面発現に関して用いられる用語「実質的な」および「実質的に」は、免疫アッセイなどの従来の方法により検出可能な量での発現を表す。特定の実施形態において、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍は、腫瘍細胞の表面で検出されるＮＴＢ−Ａの量が、リンパ球などの、内因性に発現するＮＴＢ−Ａに特徴的な量の１０％を超えない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満である腫瘍を意味する。
【０１５６】
別の実施形態において、対象は、養子免疫療法、例えば本発明のＴ細胞含有組成物をさらに受けた、または現在受けている。
【０１５７】
別の実施形態において、対象は、血球減少症（例えば、放射線照射または化学療法による）の対象、または血球減少症を発症するリスクがある対象である。別の実施形態において、対象は、リンパ球減少症に冒されているか、またはリンパ球減少症を発症するリスクがある。別の実施形態において、対象は、活動性の感染性疾患、または急性もしくは病的炎症に冒されていない。別の実施形態において、対象は、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていない。別の実施形態において、対象は、自己免疫疾患に冒されていない。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１５８】
本発明のポリペプチドは、より安全で効果的なＴ細胞活性化をもたらすことに関して、ＩＬ−２よりも予想外に優れていることが実証された。したがってＩＬ−２の使用を、実質的に減少させることができ、本発明のポリペプチドに完全に交換することさえ可能である。したがって別の実施形態において、本発明の方法は、外因性ＩＬ−２を添加せずに実行される（インビボおよび／またはエクスビボで）。別の実施形態において、ＩＬ−２の使用は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および好ましくは少なくとも９０％減少され得る。
【０１５９】
例えば、ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））は現在、癌の免疫療法に適応され、例えば６００，０００国際単位／ｋｇ（０．０３７ｍｇ／ｋｇ）用量で１５分間の静脈内輸液を８時間ごとに最大１４回投与され；インビトロでのＴ細胞増殖用の標準用量は、例えば６０００Ｕ／ｍｌである。本発明の実施形態によれば、減少されたＩＬ−２レベルを、本明細書に詳述されるように用いることができる。例えば非限定的には、以下の実施例は、６０００Ｕ／ｍｌから３００Ｕ／ｍｌへの、即ち標準用量の２０％への、細胞培養で用いられるＩＬ−２の良好な減少を実証している。特定の特別な実施形態において、本発明の方法を、１０００Ｕ／ｍｌ以下のＩＬ−２を用いて、または他の実施形態において８００、６００、４００、３００もしくは２００Ｕ／ｍｌ以下の外から添加されるＩＬ−２をインビトロで用いて、利用できる。
【０１６０】
別の態様において、本発明は、Ｔ細胞を、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む単離されたポリペプチドの治療有効量と接触させることを含む、Ｔ細胞死を低減または阻害する方法を提供する。
【０１６１】
別の実施形態において、接触は、インビトロ（例えば、エクスビボ）で実施される。別の実施形態において、接触は、インビボで実施される。別の実施形態において、方法は、血球減少症に罹患した対象またはそれを発症するリスクのある対象において、Ｔ細胞死を低減または阻害するために用いられ得る。別の実施形態において、方法は、それを必要とするレシピエント対象へのＴ細胞の投与後に、Ｔ細胞死を低減または阻害するために用いられる。
【０１６２】
別の実施形態において、対象は、血球減少症（例えば、放射線照射または化学療法による）の対象、または血球減少症を発症するリスクのある対象である。別の実施形態において、対象は、リンパ球減少症に冒されているか、またはリンパ球減少症を発症するリスクがある。別の実施形態において、対象は、活動性の感染性疾患、または急性もしくは病的炎症に冒されていない。別の実施形態において、対象は、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていない。
【０１６３】
別の態様において、それを必要とする対象における血球減少症を処置または予防する方法であって、治療有効量のＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを対象に投与し、それにより上記対象における血球減少症を処置または予防することを含む、方法が提供される。
【０１６４】
本明細書で用いられる用語「血球減少症」は、循環血中の細胞要素の減少を指す。血球減少症は様々な原因で生じる可能性があり、血中の細胞数の全般的減少、および白血球減少症における白血球の減少などの、特定の細胞型の特異的減少の両方を包含する。白血球減少症は、循環する白血球細胞（ＷＢＣ）数の４０００個／μＬ未満への減少である。それは通常、循環する好中球数の減少を特徴とするが、リンパ球数、単球数、好酸球数、または好塩基球数の減少も寄与し得る。したがって免疫機能は、一般に大きく低下する。好中球減少症は、血中好中球数の減少である。重度の好中球減少症は通常、５００個／μＬ未満の絶対好中球数により定義される。それは、単球減少症およびリンパ球減少症を伴う場合には、より重篤である。リンパ球の総数が成人で１０００個／μＬ未満であるリンパ球減少症は、リンパ球数が全ＷＢＣ数の２０〜４０％を占めるに過ぎないため、全ＷＢＣ数に必ずしも反映されない。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、血球減少症は、放射線照射または化学療法に関連する。例えば血球減少症は、高用量化学療法に関連する血球減少症、従来の腫瘍療法に関連する血球減少症、薬物による血球減少症、毒素による血球減少症および放射線による血球減少症であり得る。他の実施形態によれば、血球減少症は、ＮＴＢ−Ａ経路の損傷に関連しない後天性または先天性免疫不全に関連し得る。したがってＸＬＰ患者は、これらの実施形態から明白に除外される。例えば血球減少症はステロイド誘導性であり得、感染性疾患（肝炎、ウイルス性疾患）により誘発もしくは増悪され得、または自己免疫誘導性（例えば、全身エリテマトーデスによる）であり得る。特定の実施形態において、方法は、リンパ球減少症の処置または予防に用いられる。
【０１６６】
特定の別の実施形態において、血球減少症の期間が、減少され得る。例えば血球減少症の期間は、処置開始から１２日未満、好ましくは１０日未満、より好ましくは８日未満および最も好ましくは７日未満に減少され得る。別の実施形態において、血球減少症の期間は、処置開始から５日未満、４日未満、３日未満、２日未満または１日未満に減少され得る。別の実施形態において、方法は、感染の発生を減少させるのに、そして癌患者における化学療法または放射線療法後の生存率を上昇させるのに有用である。
【０１６７】
追加の実施形態
本発明の特定の例示的実施形態を、以下に記載する。
１．Ｔ細胞含有細胞集団をＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む単離されたポリペプチドの治療有効量と共にエクスビボでインキュベートするステップを含む、細胞組成物を調製する方法。
２．ポリペプチドまたはアゴニストとのインキュベーションが、Ｔ細胞上のＣＤ１３７発現をアップレギュレートするように実施される、条項１に記載の方法。
３．集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、条項１〜２に記載の方法。
４．インキュベーションが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激の存在下で実施される、条項１〜３に記載の方法。
５．インキュベーションが、フィーダー細胞の存在下で実施される、条項１〜４に記載の方法。
６．インキュベーションが、外因性ＩＬ−２を添加せずに実施される、条項１〜５に記載の方法
７．インキュベーションが、外因性ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストの存在下で実施される、条項１〜６に記載の方法。
８．組成物が、細胞ワクチンである、条項１〜７に記載の方法。
９．組成物が、Ｔ細胞ワクチンである、条項８に記載の方法。
１０．条項１〜９のいずれか１つに記載の方法により調製される細胞組成物。
１１．それを必要とする対象における癌を処置する薬剤の調製のための、条項１０に記載の細胞組成物の使用。
１２．細胞組成物が、上記対象と組織適合性がある、条項１１に記載の使用。
１３．それを必要とする対象における癌を処置するための薬剤の調製のための、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む単離されたポリペプチドの治療有効量の使用。
１４．上記ポリペプチドが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む、上記条項のいずれか１つに記載の使用。
１５．アゴニストが、ＮＴＢ−Ａエクトドメインに特異的な抗体である、上記条項のいずれか１つに記載の使用。
１６．アゴニストが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインに特異的な抗体である、条項１５に記載の使用。
１７．上記対象が、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍に冒されている、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
１８．上記腫瘍が、固形腫瘍である、条項１７に記載の使用。
１９．上記対象が、ＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍に冒されている、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２０．上記対象が、血球減少症の対象、または血球減少症を発症するリスクのある対象である、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２１．上記対象が、リンパ球減少症に冒されている、またはリンパ球減少症を発症するリスクがある、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２２．上記対象が、活動性の感染性疾患、または急性炎症もしくは病的炎症に冒されていない、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２３．上記対象が、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていない、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２４．外因性ＩＬ−２が、上記対象に投与されない、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。  
２５．上記対象にＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストを投与することをさらに含む、条項１１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
２６．Ｔ細胞死を低減または阻害するための薬剤の調製のための、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含む単離されたポリペプチドの治療有効量の使用。
２７．接触が、インビトロで実施される、条項２６に記載の使用。
２８．接触が、インビボで実施される、条項２６に記載の使用。
２９．血球減少症に罹患した対象または血球減少症を発症するリスクのある対象において、Ｔ細胞死を低減または阻害するための、条項２６に記載の使用。
３０．それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血球減少症を処置または予防するための薬剤の調製のための、ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含むポリペプチドの治療有効量の使用。
３１．血球減少症が、放射線照射または化学療法に関連する、条項３０に記載の使用。
３２．リンパ球減少症の処置または予防のための、条項３０に記載の使用。
３３．上記対象が、活動性の感染性疾患、または急性もしくは病的炎症に冒されていない、条項３０に記載の使用。
３４．上記対象が、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）に冒されていない、条項３０に記載の使用。
３５．上記対象が、癌に冒されていない、条項３０に記載の使用。
３６．上記ポリペプチドが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む、条項２６〜３５のいずれか１つに記載の使用。
３７．アゴニストが、ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインに特異的な抗体である、条項２６〜３５のいずれか１つに記載の使用。
３８．１）ＮＴＢ−Ａエクトドメインまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、２）ＣＤ１３７リガンドまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、場合により３）医薬的に許容し得る担体と、を含む治療的組み合わせ。
３９．ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメインを含む、条項３８に記載の組み合わせ。
４０．ヒト１３７リガンドを含む、条項３８に記載の組み合わせ。
４１．アゴニストが、抗体である、条項３８に記載の組み合わせ。
【０１６８】
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより完全に例示するために提示されている。しかしそれらは、広範囲の本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【０１６９】
実施例
実施例１．ヒトＮＴＢ−Ａエクトドメイン
以下に示されるアミノ酸配列を有するヒトＮＴＢ−Ａは、以下の通りアクセション番号Ｑ９６ＤＵ３に対応する：
MLWLFQSLLF VFCFGPGNVV SQSSLTPLMV NGILGESVTL PLEFPAGEKV NFITWLFNET SLAFIVPHET KSPEIHVTNP KQGKRLNFTQ SYSLQLSNLK MEDTGSYRAQ ISTKTSAKLS SYTLRILRQL RNIQVTNHSQ LFQNMTCELH LTCSVEDADD NVSFRWEALG NTLSSQPNLT VSWDPRISSE QDYTCIAENA VSNLSFSVSA QKLCEDVKIQ YTDTKMILFM VSGICIVFGF IILLLLVLRK RRDSLSLSTQ RTQGPAESAR NLEYVSVSPT NNTVYASVTH SNRETEIWTP RENDTITIYS TINHSKESKP TFSRATALDN VV （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【０１７０】
このタンパク質のエクトドメインは、２２〜２２６位に位置すると同定されている。したがってＮＴＢ−Ａエクトドメインは、先のヒト配列の２２〜２２６位に、または当該技術分野で公知のＮＴＢ−Ａ配列内の対応する位置に対応するアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態において、当業者によりその構造的および機能的均等物として認識されるその変異体、相同体および誘導体の使用が、企図される（例えば、保存的アミノ酸置換）。加えて、いずれかの末端でのアミノ酸（例えば、１〜５アミノ酸または５％までのアミノ酸）の伸長および／または切り詰めが、許容され得る。特定の有利な実施形態によれば、アミノ酸１〜２１が排除される。特定の別の有利な実施形態によれば、アミノ酸１〜２７が排除される。
【０１７１】
例えば非限定的に、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２６位を含み得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２６位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２６位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２５位を含み得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２５位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２〜２２５位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２５位を含み得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２５位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２５位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２６位を含み得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２６位からなり得る。別の実施形態において、ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２８〜２２６位からなり得る。特定の特別な実施形態によれば、上記ＮＴＢ−Ａエクトドメインは、ポリヒスチジンタグなどのエピトープタグをさらに含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１７２】
以下の実施例に記載される実験では、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎから購入した組換えヒトＮＴＢ−Ａ（カタログ番号Ｃ３８７）を用いた。このタンパク質の配列は、幾つかの実施形態において、Ｃ末端でポリヒスチジンタグと融合された、ヒトＮＴＢ−Ａの細胞外ドメインに対応する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアクセション番号Ｑ９６ＤＵ３のＧｌｕ２２〜Ｍｅｔ２２６の位置）。他に断りがなければ、実施例および図の全体において、「ｓｅＳＬＡＭＦ６」および「ｓＮＴＢ−Ａ」は、この組換え融合タンパク質を指す。
【０１７３】
以下に示される特定の他の実施例で用いられる配列は、Ｃ末端でポリヒスチジンタグと融合されたアクセション番号Ｑ９６ＤＵ３のＬｅｕ２８〜Ｌｙｓ２２５の位置に対応する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、以下の通り：LMVNGILGES VTLPLEFPAG EKVNFITWLF NETSLAFIVP HETKSPEIHV TNPKQGKRLN FTQSYSLQLS NLKMEDTGSY RAQISTKTSA KLSSYTLRIL RQLRNIQVTN HSQLFQNMTC ELHLTCSVED ADDNVSFRWE ALGNTLSSQP NLTVSWDPRI SSEQDYTCIA ENAVSNLSFS VSAQKLCEDV KIQYTDTKVD HHHHHH）。
【０１７４】
実施例２．ｓｅＳＬＡＭＦ６の特異的結合
ｓｅＳＬＡＭＦ６の、そのホモタイプ受容体への結合を実証するために、ヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、増加濃度のｓｅＳＬＡＭＦ６またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、無関係のタンパク質対照）と共にインキュベートした。これらの実験では、ＦＡＣＳ緩衝液１００μｌ中の２００，０００ＴＩＬ（２０９）を、各ＦＡＣＳ試験管に添加した。０〜３０μｇ／ｍｌの範囲で様々なｓＮＴＢ−Ａ（ｓｅＳＬＡＭＦ６）またはＢＳＡ濃度を各試験管に添加して、４℃で４５分間インキュベートした。試料を１回洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ｓｅＳＬＡＭＦ６抗体（クローンＮＴ−７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはアイソタイプ対照１０μｌを、各試験管に添加した（図１Ａ）。追加の陰性対照として、試料をＣＤ８および２Ｂ４受容体に関しても染色した（図１Ｂ）。４℃で４５分間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。図１Ａ〜Ｂで見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦは、腫瘍浸潤リンパ球への抗ＳＬＡＭＦ−６抗体の結合を完全に阻害し（Ａ）、これらの表面受容体への抗ＣＤ８および抗２Ｂ４抗体の結合を阻害しなかった。これらの実験の結果は、ｓｅＳＬＡＭＦ６の活性がＳＬＡＭＦ６へのその結合により媒介されることを明確に実証している。
【０１７５】
実施例３．ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントは活性化抗黒色腫Ｔ細胞の生存率を改善する
ヒトＴＩＬ（２０９）を、同族黒色腫細胞（６２４ｍｅｌ）と３日間共培養し（１：４の比で；ＩＬ−２  ６，０００ＩＵ／ｍｌを含む完全培地中；３７℃、５％ＣＯ２）、その後、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）を含有する完全培地（ＣＭ）中で７日間増殖させた。増殖後に、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）をさらに補充するか、または除去し、細胞をｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１０μｇ／ｍｌ）もしくはＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ；「対照」）のいずれかで処置するか、または未処置のままにした。細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（細胞死のマーカー）およびアネキシン−Ｖ（アポトーシスのマーカー）で標識して、フローサイトメトリーにより分析した。図２Ａは、ｓｅＳＬＡＭＦ６の添加により細胞死およびアポトーシスの比率が２３％から４％に減少したことを示している。ｓｅＳＬＡＭＦ６の効果は、ＩＬ−２と同一であり、ＳＬＡＭＦ６エンゲージメントがＩＬ−２と置き換わり、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を予防し得ることを示している。
【０１７６】
異なる実験において、６２４ｍｅｌに対して反応性があるヒトＴＩＬ（２０９）を、腫瘍と７２時間共培養した。次の７日培養の間に、ＩＬ−２  ６，０００ＩＵ／ｍｌ（ＩＬ−２＋）を補充した。その後、ＩＬ−２を培地から除去し、細胞を３回洗浄して、すべての残留ＩＬ−２を除去し、ｓｅＳＬＡＭＦ６（ポリヒスチジンタグを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含み、または含まずに成長させて、無関係のタンパク質対照と比較した。言い換えれば、細胞から４日間ＩＬ−２を枯渇させた場合は、ストレスの間だけｓｅＳＬＡＭＦ６が細胞培養物中に存在した。アポトーシスおよび細胞死を、フローサイトメトリーにより評価した。結果を以下の表１に要約する（値は、全集団からのアネキシン＋ＰＩ＋細胞の割合％を表す）。結果は、ｓｅＳＬＡＭＦ６エクトドメインの添加がＩＬ−２の非存在を完全に補填したことを示した。この実験をＴＩＬ２０９では３回、そしてＴＩＬ４３１では１回（２名のヒトドナーからのＴＩＬ）繰り返し実施したが、非常に類似した結果を得た。
【表１】
2020105219.tif 000002
【０１７７】
別の実験において、Ｐｍｅｌ−１マウス脾臓細胞（黒色腫抗原ｇｐ１００２５−３３に対するトランスジェニックＴＣＲを発現する）を、ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）を補充したＣＭ中の１μｇ／ｍｌ同族ペプチド（ｇｐ１００２５−３３）で刺激した。５日後に、細胞を洗浄し、ＩＬ−２  ０、３００、３０００ＩＵ／ｍｌまたはｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（５０μｇ／ｍｌ）と共にＣＭ中で最大９６時間インキュベートした。細胞を異なる時点で回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシン−Ｖで標識した。細胞死をフローサイトメトリーにより決定し、生存細胞の比率を測定した（全集団からのＰＩ／アネキシン−Ｖ陰性細胞の割合）。結果を図２Ｂに示す。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６は、ＡＩＣＤを予防する上でＩＬ−２の最大濃度（３０００ＩＵ／ｍｌ）と同程度に効率的であった。
【０１７８】
ＲＥＰは、養子細胞移入による免疫療法のための腫瘍同族リンパ球の必要数を達成するための日常的手順である。実施例全体において「ＲＥＰ」または「急速な増殖」が言及される場合、これは、特に３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体およびフィーダー細胞としての放射線照射されたＰＢＭＣの存在下で、ＴＩＬ：ＰＢＭＣ比１：２００〜１：１００での１２〜１４日間インキュベートステップの存在を表している。
【０１７９】
さらなる実験において、ヒトバルクＴＩＬ集団（２０９）を、ＩＬ−２（３，０００ＩＵ／ｍｌ）またはｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（５０μｇ／ｍｌ）のいずれかを補充したＣＭを利用してＲＥＰにより増殖させた。ＲＥＰの終了時に、細胞を洗浄し、以下の条件下でインキュベートした：ＩＬ−２不含（未処置）、ＩＬ−２含有（３００ＩＵ／ｍｌ）、またはｓｅＳＬＡＭＦ６含有（５０μｇ／ｍｌ）。細胞を２、３および７日目に回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシン−Ｖで標識して、細胞死をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図２Ｃに示す。図で見られるように、ＲＥＰ−ＩＬ−２により増殖された細胞へのｓｅＳＬＡＭＦ６の添加（左図）は、７日目の細胞死の比率を、ＣＭ中での７１％およびＩＬ−２中での４５％に比較して、１１％に低減した。同様に、ＲＥＰ−ｓｅＳＬＡＭＦ６により増殖された細胞へのｓｅＳＬＡＭＦ６の添加（右図）は、７日目の細胞死の比率を、ＣＭ中での７８％およびＩＬ−２中での５２％に比較して、１１％に低減した。
【０１８０】
実施例４．ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントは活性化抗黒色腫Ｔ細胞の機能を改善する
ＩＦＮγ生成：
Ｐｍｅｌ−１マウス脾臓細胞を、ＩＬ−２（３０ＩＵ／ｍｌ）を補充したＣＭ中の１μｇ／ｍｌ同族ペプチド（ｇｐ１００２５−３３）で活性化した。５日後に、細胞を３群に分割し、それぞれを以下の細胞ターゲットの１つと６時間共培養した：１．オボアルブミンで安定にトランスフェクトされた抗原提示細胞であるＥＬ４−ＯＶＡ（陰性対照）；２．Ｂ１６−Ｈ２Ｄｂ黒色腫（ＭＨＣクラスＩ発現が増強されたｇｐ１００２５−３３含有黒色腫細胞）；または３．ｇｐ１００２５−３３ペプチドをパルスされた抗原提示細胞である、ｇｐ１００を負荷されたＥＬ４（陽性対照）。各群を３つのサブグループ：ｓｅＳＬＡＭＦ６（ｓＮＴＢＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５０μｇ／ｍｌ）での処置、ＢＳＡ（５０μｇ／ｍｌ）での処置、および未処置細胞、にさらに分割した。
【０１８１】
６時間共培養した後、各群の細胞を回収し、抗ＣＤ８／抗ＩＦＮγ細胞内染色で標識して、フローサイトメトリーの取得および分析に供した。結果を図３Ａに示す（示されたデータは、３つの独立した実験の要約である）。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は、Ｔ細胞クローンによるＩＦＮγの特異的産生を増強し、活性化Ｐｍｅｌ−１マウス脾臓細胞と標的細胞（同族黒色腫またはペプチドパルスＡＰＣ）との共培養物へのｓｅＳＬＡＭＦ６の添加は、ＩＦＮγを産生する細胞の割合を有意に増加させた（それぞれｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０００２）。
【０１８２】
異なる実験において、ｓｅＳＬＡＭＦ６（Ｃ’Ｈｉｓタグを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の存在下でのＴＩＬとそれらの同族腫瘍細胞株とのインキュベーションは、ＩＦＮγの産生を増加させた。Ａ２陰性の非同族８８８ｍｅｌを、陰性対照とした。共溶媒物へのｓｅＳＬＡＭＦ６の添加は、ＩＦＮγの分泌を、ベースラインよりも２７％〜１３３％増加させた。黒色腫認識の非存在下では、バックグランド活性は検出されなかった。
【０１８３】
ＲＥＰ後のＩＦＮγ産生
さらなる実験において、ｓｅＳＬＡＭＦ６（ポリヒスチジンタグが添加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）での１２日間急速増殖（ＲＥＰ）手順後のバルクＴＩＬによるＩＦＮγ産生を評価した。ＩＬ−２補充（６０００ＩＵ／ｍｌ）の標準的手順を、ＳＬＡＭＦ６（５０μｇ／ｍｌ）の可溶性エクトドメインの排他的供給と比較した。
【０１８４】
ＲＥＰ後に、Ｔ細胞を同族黒色腫株（６２４ｍｅｌおよび５２６ｍｅｌ）と一晩（ｏ／ｎ）共培養して、ＩＦＮγ分泌を測定した。結果を以下の表２に要約する。結果は、ｓｅＳＬＡＭＦ６により増殖されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、２つの同族黒色腫（５２６ｍｅｌおよび６２４ｍｅｌ）とのｏ／ｎインキュベーション後に著しく高レベルのＩＦＮγを産生したことを示した。
【表２】
2020105219.tif 000003
【０１８５】
ＣＤ１０７ａ発現（溶解性脱顆粒（ｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｏｎ））：
ヒトＴＩＬ（２０９）を３群に分割し、それぞれを以下の条件の１つの下で急速増殖させた：ＩＬ−２を含まない完全培地、ＩＬ−２（３，０００ＩＵ／ｍｌ）含有またはｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）５０μｇ／ｍｌ含有の完全培地。増殖後に、細胞を回収して洗浄した。その後、各群を３つのサブグループにさらに分割し、２つは以下の同族黒色腫細胞ターゲット：５２６ｍｅｌまたは６２４ｍｅｌ、のうちの一方と１．５時間共培養し、１つはＨＬＡ不適合の８８８ｍｅｌと共培養して、バックグランド活性を評価した。
【０１８６】
共培養後に、細胞を抗ＣＤ８および抗ＣＤ１０７ａで染色した。ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）は、リソゾーム膜タンパク質である。その表面発現を、ここでは溶解性脱顆粒のマーカーとして評価した。結果を、５２６ｍｅｌ細胞に関して図３Ｂに示している。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６を用いたＲＥＰは、脱顆粒能が約２倍高いヒトＴＩＬを生成した。同様の結果が、６２４ｍｅｌ細胞で得られた。
【０１８７】
さらなる実験において、ｇｐ１００２０９−２１７エピトープに対して反応性があるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２、５０μｇ／ｍｌ  ｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、またはその両方を補充された完全培地中で、プレートに結合された抗ＣＤ３により３日間活性化させた。活性化期間の終了時に、細胞をＨＬＡ−Ａ２適合（６２４ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ）または無関係の（８８８ｍｅｌ）黒色腫ターゲットと１．５時間共培養した。細胞傷害性顆粒の放出のマーカーであるＣＤ１０７ａのレベルを、フローサイトメトリーにより測定した。結果を図３Ｃに示す。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６単独またはＩＬ−２と組み合わせたｓｅＳＬＡＭＦ６は、Ｔ細胞の脱顆粒能上昇に関して、ＩＬ−２単独よりも優れていた。
【０１８８】
細胞の殺傷：
ｇｐ１００２０９−２１７エピトープに対して反応性があるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、１μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３単独（未処置）を含むＣＭ、または３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２、５０μｇ／ｍｌ  ｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、もしくはその両方を補充したＣＭ中で、プレートに結合された抗ＣＤ３により５日間活性化させた。活性化期間の終了時に、細胞を、ＤＤＡＯ−ＳＥを標識されたＨＬＡ−Ａ２適合（６２４ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ）または無関係の（８８８ｍｅｌ）黒色腫ターゲットと１．５時間共培養した。アポトーシスの早期マーカーである細胞内切断カスパーゼ−３のレベルを、フローサイトメトリーにより黒色腫細胞内で測定した。結果を図３Ｄに示す。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６単独またはＩＬ−２と組み合わせたｓｅＳＬＡＭＦ６は、黒色腫細胞殺傷の改善に関して、ＩＬ−２単独よりも優れていた。
【０１８９】
実施例５．ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントは活性化マーカーの発現をアップレギュレートする
ヒトＴＩＬを、以下の条件下で急速に増殖させた：ＩＬ−２を含まない完全培地、ＩＬ−２（３，０００ＩＵ／ｍｌ）含有またはｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）５０μｇ／ｍｌ含有完全培地。増殖後に、細胞を回収して洗浄し、黒色腫ターゲット５２６ｍｅｌおよび６２４ｍｅｌ（同族黒色腫）ならびに８８８ｍｅｌ（バックグランド活性を評価するためのＨＬＡ不適合）と一晩共培養した。一晩のインキュベートの後、細胞を回収して、以下の抗体パネル：抗ＣＤ８／ 抗ＧＩＴＲ／ 抗ＰＤ−１／ 抗４１ＢＢ／ 抗２Ｂ４で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果を図４に示す（示されるデータは、５２６ｍｅｌターゲットと共培養された細胞のものである）。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６  ＲＥＰが、テストされた活性化誘導マーカーを発現するリンパ球を最大の割合で生成した。
【０１９０】
先と同じ設定の異なる実験において、活性化マーカー４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の発現に及ぼす、ｓｅＳＬＡＭＦ６（ポリヒスチジンタグを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いる急速増殖の影響を測定した。結果を以下の表３に要約する（値は、全集団からのＣＤ８＋４−１ＢＢ＋細胞の％を表す）。結果は、２つの同族黒色腫（５２６ｍｅｌおよび６２４ｍｅｌ）とのｏ／ｎインキュベーションが、ＩＬ−２の標準的使用に比較して、ＲＥＰのためにｓｅＳＬＡＭＦ６を用いる腫瘍への応答において、４−１ＢＢ発現細胞数を倍増させたことを示した。
【表３】
2020105219.tif 000004
【０１９１】
実施例６．ｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントを利用してＩＬ−２と同じ効率でＴＩＬを増殖させることができる
７つの異なるＴＩＬ集団(ＴＩＬ  ４３１  ｆ（３）、ＴＩＬ  ２０９  ｎｅｗ、ＴＩＬ  ４１２（１１．０９．１２）、Ｃｌｏｎｅ＃４（２０９）１３．４．１４、Ｂｕｌｋ  ４１２、Ｃｌｏｎｅ＃１（２０９）、Ｃｌｏｎｅ＃４（２０９）１０．６．１４)を、ＩＬ−２（３，０００ＩＵ／ｍｌ）またはｓｅＳＬＡＭＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１０μｇ／ｍｌ）を用いて完全培地中でＲＥＰにより増殖させた。増殖後に細胞をカウントして、最終的な細胞数を最初の細胞数と比較した。結果を図５に示す（細胞数の増加の倍率として表す）。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６は、ＩＬ−２と実質的に同じ効率で細胞を増殖させた。
【０１９２】
実施例７．ＲＥＰの間のｓｅＳＬＡＭＦ６によるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントは黒色腫特異的ＣＤ８  Ｔ細胞をより高い割合で生成する
実施例６に記載されたバルクＴＩＬ集団を、全ＣＤ８＋リンパ球の中のｇｐ１００１５４−１６２反応性サブセットの割合についてさらに分析した。ＲＥＰの後、細胞を回収し、抗ＣＤ８およびｇｐ１００１５４四量体（Ｉｍｍｕｄｅｘ）で標識して、フローサイトメトリーにより分析した。結果を図６に示す。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６は、ＩＬ−２に比較して、ｇｐ１００１５４−１６２反応性リンパ球をより高い割合で生成した。
【０１９３】
実施例８．ｓｅＳＬＡＭＦ６により増殖された抗黒色腫ＴＩＬによる黒色腫成長の阻害
ヒト抗ｇｐ１００２０９−２１７ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２または５０μｇ／ｍｌ  ｓｅＳＬＡＭＦ６を補充したＣＭ中で、プレートに結合された抗ＣＤ３により５日間活性化させた。活性化された細胞集団をウィンアッセイで使用し：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｆｏｘｎ１−／−（ヌード）マウスに１×１０６個５２６ｍｅｌヒト黒色腫細胞を皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。注射の前に、黒色腫細胞をＣＭ（対照）、ＩＬ−２で生育された抗ｇｐ１００ヒトＴＩＬ、またはｓｅＳＬＡＭＦ６で生育された抗ｇｐ１００ヒトＴＩＬと混合した。腫瘍の成長を週に３回、２０日間モニタリングした（群あたりｎ＝５）。結果を図７に示す。図で見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６により増殖されたＴＩＬは、追跡調査期間に黒色腫成長を完全に阻害した。類似の結果が、ＩＬ−２増殖ＴＩＬで観察された。
【０１９４】
実施例９．ｓｅＳＬＡＭＦ６はＴ細胞クローンによるＩＦＮγ産生において４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）ライゲーションと相乗作用する
以下に記載される実験において、４−１ＢＢＬを発現するようにトランスフェクトされた、またはｍｏｃトランスフェクトされた黒色腫６２４ｍｅｌを、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性Ｔ細胞クローンと共培養した。対照として、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性Ｔ細胞クローンを、無関係の黒色腫（ｍｅｌ８８８）と共培養した。Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌を測定し、結果を以下の表４に要約している。表４は、黒色腫が４−１ＢＢＬを発現する場合に、この効果（ＩＦＮγ分泌）が著しく増強されることを実証するデータを表している。
【表４】
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【０１９５】
実施例１０．可溶性エクトドメインによるＳＬＡＭＦ６エンゲージメントは黒色腫細胞のＴＣＲ特異的認識に応じてＣＤ８  Ｔ細胞上の活性化マーカーを増加させる
以下の表５は、ＳＬＡＭＦ６エクトドメインが、ＴＣＲ依存的様式で２つの黒色腫細胞株と６、１６および２４時間共培養し続いて一晩共溶媒した後の、ドナー３名からの活性化ＣＤ８＋リンパ球上の４−１ＢＢ発現を増加させることを実証している。
【表５】
2020105219.tif 000006
【０１９６】
２つのＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞株（５２６および６２４）および１つの対照ＨＬＡ−Ａ２−（８８８）株を、ＣＭ（完全培地）、ＢＳＡ（対照として用いられるウシ血清アルブミン）およびＳＬＡＭＦ６の可溶性エクトドメイン中で、３つのＡ２＋ＭＡＲＴ−１反応性ＴＩＬ（２０９、４１２、４３１）、または対照ＴＩＬ（４７０）と共にインキュベートした。ほとんどの例で、ｓｅＳＬＡＭＦ６は、ＴＩＬ上の４−１ＢＢの発現を有意に増加させた（下線が引かれた値）。
【０１９７】
実施例１１．ＳＬＡＭＦ６の可溶性エクトドメインは放射線照射後のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化誘導細胞死を防御する
活性化誘導細胞死に対する防御（Ｔ細胞の生存）を測定するために用いられるアッセイを、以下の通り実施した。１００万個のＴＩＬを、２ｍｌ培地（ＣＭ）を含む２４ウェルプレート中で２５０，０００個の６２４ｍｅｌ  ＨＬＡ適合黒色腫細胞と３日間共培養することにより活性化した。この時点で全ての黒色腫細胞が死滅し、それゆえＴＩＬのみが培養中に残った。活性化相の間には、ＩＬ−２を添加しなかった。ＴＩＬを６０００単位／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で７〜９日間増殖させた。１〜２日ごとに、１ｍｌの培地を新しいＣＭで交換した。細胞を、集団の増殖に従って１２ウェルおよび６ウェルプレートに移した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して残留するすべてのＩＬ−２を除去し、ショック（様々な線量の放射線および２４時間後の分析）に暴露した。細胞をその後ＰＩおよびアネキシンＶで染色して、フローサイトメトリーにより分析した。ｓｅＳＬＡＭＦ６を、３つの実験段階（活性化、増殖、ショック）に応じて異なる時点で添加して、Ｔ細胞生存へのその全体的影響を評価し、関連する段階を決定した。±ＩＬ−２は、ショック相でのＩＬ−２の存在を指す。アポトーシスを測定するために、アネキシンＶアポトーシス検出キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ♯８８−８００７）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。手短に述べると、細胞をＰＢＳおよび結合緩衝液で洗浄した。５μｌアネキシンＶ染色剤＋１００μｌ結合緩衝液を各試験管に添加し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。追加の洗浄後に、５μｌ  ＰＩ染色剤＋２００μｌ結合緩衝液を各試験管に添加し、４時間以内に細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１９８】
ＳＬＡＭＦ６の可溶性エクトドメインはＰＢＭＣ細胞の放射線誘導性細胞死を防御する
これらの実験において、ウェルあたり１ｍｌ  ＰＢＳ中の１μｇ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および１μｇ抗ＣＤ２８で、６ウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳを除去して、ウェルを２ｍｌ  ＣＭで室温で１時間ブロックした。ウェルごとに、３００単位ＩＬ−２／ｍｌを含む５ｍｌ  ＣＭ中の１０７個のＰＢＭＣを添加した。細胞を３日間活性化させ、その後、ＩＬ−２を２日ごとにさらに７日間添加した。ＣＭを交換して、必要に応じて細胞を分割した。細胞を３回洗浄して残留するＩＬ−２を除去し、低温ＣＭ中に懸濁させた。試験管を氷上に静置して、増加線量で放射線照射し、照射後直ちに新しいＣＭで洗浄した。新しい培地に、１０μｇ／ｍｌ  ｓｅＳＬＡＭＦ６またはＢＳＡ（対照）を添加した。２４時間後に、細胞をアネキシンＶ＆ＰＩで染色した。２名のヒトドナーからのＰＢＭＣを評価した。アポトーシスおよび細胞死を、フローサイトメトリーにより評価した。結果を以下の表６に要約する（値は、全集団からのアネキシン＋ＰＩ＋細胞の％を表す）。結果は、ＳＬＡＭＦ６エクトドメインの添加がＩＬ−２と同じ強度で放射線の損傷効果を補填したことを示した。ｓｅＳＬＡＭＦ６は、ヒトＰＢＭＣを、増加線量の放射線により誘発された損傷から防御する。ｓｅＳＬＡＭＦ６により発揮された生存作用は、ＩＬ−２により発揮された作用と類似している。この実験を２名のヒトドナーからのＰＢＭＣで再度実施し、非常に類似した結果を得た。
【表６】
2020105219.tif 000007
【０１９９】
参照文献
Ｋｒｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００７,  １３７，  ｐｐ．  ３０７−３１８．
Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２０１０，  ２３６，  ｐｐ．  ６８−８２．
Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００９，  １１９，  ｐｐ．  ２９７６−２９８９.
Ｕｚａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２，  １８８，  ｐｐ．  ６３２−６４０．
Ｖａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，  ２７９（１８），  ｐｐ．  １８６６２−１８６６９．
【０２００】
具体的実施形態の前述の記載は、他者が現在の知見を適用することにより、過度の実験を行わずに一般的概念から逸脱することなくそのような具体的実施形態を様々な適用例に向けて即座に改良および／または適合させ得るという、本発明の一般的性質を完全に明らかにしており、それゆえ、そのような適合および改良は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内であると解釈されるものとする。本明細書で用いられる表現法または用語法は、説明を目的としており限定ではない。様々な開示された機能を実施するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく様々な別の形態をとることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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