(57)【要約】      （修正有）【課題】ミステリンの阻害剤を含む、もやもや病を処置することに用いるための、または脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物の提供。【解決手段】ミステリンの阻害剤が、ミステリンの発現抑制剤であり、その発現抑制剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される医薬組成物。また、ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下させた非ヒト哺乳動物の脂肪代謝異常モデル、もしくは、ミステリンの異常凝集形成による個体障害モデルとしての使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミステリンの阻害剤を含む、もやもや病を処置することに用いるための、または脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物。
【請求項２】
ミステリンの阻害剤が、ミステリンの活性阻害剤および／または発現抑制剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ミステリンの阻害剤が、ミステリンの活性阻害剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ミステリンの阻害剤が、ＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ阻害剤である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ミステリンの阻害剤が、ユビキチンリガーゼ阻害剤である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ミステリンの阻害剤が、ミステリンの発現抑制剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
発現抑制剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下させた非ヒト哺乳動物の脂肪代謝異常モデル、もしくは、ミステリンの異常凝集形成による個体障害モデルとしての使用。
【請求項９】
脂肪代謝を調整する化合物、もしくは、ミステリンの異常凝集形成を解消する化合物のスクリーニング方法であって、
被検化合物とミステリンまたはその変異体とを接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、もやもや病を処置することに用いるための、または脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
もやもや病（ＭＭＤ）は、東アジア人に多く認められる希少な脳血管障害である（Scott and Smith, 2009）。ＭＭＤは、頭蓋内の内頸動脈の左右両方の狭窄または閉塞により特徴付けられる疾患であり、脳梗塞、側副血管から生命を脅かす出血をしばしば引き起こす。遺伝学的研究から、東アジア人の0．5〜2％がミステリン遺伝子（moyamoya steno-occlusive disease-associated AAA+ and RING finger protein; RNF213としても知られている）におけるミスセンス変異（R4810KもしくはR4859K）を有することが明らかになり（(Liu et al., 2011; Kamada et al., 2011; Morito et al., 2014; Koizumi et al., 2016）、この変異が、東アジア人のＭＭＤに対する感受性（白人に対して約10倍高い感受性）の原因であると考えられている。
【０００３】
ミステリン遺伝子は、591kDaの分子量（主要なアイソフォーム）を有し、2つのＡＡＡ＋モジュールと1つのＲＩＮＧフィンガーユビキチンリガーゼドメインとを有する（図１Ａ参照；Liu et al., 2011; Morito et al., 2014）。ＡＡＡ＋タンパク質は、共通してドーナツ型複合体（多くの場合６量体）を形成し、ＡＴＰ結合／加水分解サイクルに伴う構造変化を介して機械的力を発生し、生物物理学的な工程を媒介する（例えば、ダイニンがモーター活性を発揮するように）（Ogura and Wilkinson, 2001）。ミステリンは、ドーナツ型のオリゴマーを形成し、ＡＴＰを分解する能力を有する（Liu et al., 2011; Morito et al., 2014）が、ミステリンが細胞内においてどのような機械的工程を媒介するのかは不明である。また、ユビキチンリガーゼは、低分子量タンパク質ユビキチンで基質タンパク質を共有結合修飾し、そのタンパク質分解または機能制御を行う（Metzger et al., 2014）。これまでの研究から、ミステリンは、自己を含む様々な基質タンパク質に対してユビキチン化活性を発揮すると提案されてきた（Kotani et al., 2017; Liu et al., 2011; Banh et al., 2016; Scholz et al., 2016）。また、ミステリンタンパク質は、細胞質に拡散した分布を示し、一部は未決定の細胞内構造に会合する（Liu et al., 2011; Morito et al., 2014）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Liu, W. et al., 2011, PLoS One. Vol. 6, Issue 7, e22542
【非特許文献２】Kamada, F. et al., 2011, J. Hum. Genet. 56:34-40
【非特許文献３】Morito, D. et al., 2014, Sci. Rep. Vol. 4, Article Number: 4442
【非特許文献４】Koizumi, A. et al., 2016, Environ. Health Prev. Med. 21:55-70
【非特許文献５】Ogura, T., and A.J. Wilkinson, 2001, Genes to Cells, 6:575-597
【非特許文献６】Metzger, M.B. et al., 2014, Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1843:47-60
【非特許文献７】Kotani, Y. et al., 2015, Sci. Rep. Vol. 5, Article Number: 16161
【非特許文献８】Banh, R.S. et al., 2016, Nat. Cell Biol. 18(7): 803-813
【非特許文献９】Scholz, B. et al., 201, Dev. Cell. 36:79-93
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、もやもや病を処置することに用いるための、または脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物を提供する。
【０００６】
本発明者らは、ミステリンが脂肪滴を包み込み、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）を脂肪滴から除去することによって脂肪滴を安定化することを明らかにした。本発明者らは、ミステリンを阻害または発現抑制することにより、脂肪滴の分解（または代謝）を促進し、脂肪滴を減少させることができることを明らかにした。本発明者らは、ミステリンの脂肪滴への局在とＭＭＤとの関係を見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ミステリンの阻害剤を含む、もやもや病を処置することに用いるための、または脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物。
（２）ミステリンの阻害剤が、ミステリンの活性阻害剤および／または発現抑制剤である、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）ミステリンの阻害剤が、ミステリンの活性阻害剤である、上記（２）に記載の医薬組成物。
（４）ミステリンの阻害剤が、ＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ阻害剤である、上記（３）に記載の医薬組成物。
（５）ミステリンの阻害剤が、ユビキチンリガーゼ阻害剤である、上記（３）に記載の医薬組成物。
（６）ミステリンの阻害剤が、ミステリンの発現抑制剤である、上記（２）に記載の医薬組成物。
（７）発現抑制剤が、ミステリンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、上記（６）に記載の医薬組成物。
（８）ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下させた非ヒト哺乳動物の脂肪代謝異常モデル、もしくは、ミステリンの異常凝集形成による個体障害モデルとしての使用。
（９）脂肪代謝を調整する化合物、もしくは、ミステリンの異常凝集形成を解消する化合物のスクリーニング方法であって、
被検化合物とミステリンまたはその変異体とを接触させることを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ミステリンの構造及び細胞内局在を示す。図１Ａは、ミステリンの主要なアイソフォームである、５，２０７アミノ酸からなるヒトミステリンの基本構造を示す。ミステリンは、隣り合う２つのＡＡＡ＋モジュールと１つのＲＩＮＧフィンガーユビキチンリガーゼドメインを有する。Ｒ４８１０Ｋ（マイナーアイソフォームのＲ４８５９Ｋと同等）は、東アジア人のもやもや病（ＭＭＤ）と関係する代表的なミスセンス変異である。図１Ｂは、Ｎ末端にmCherryを有するミステリン（mCherry-mst）を一過的発現した場合、HeLa細胞内で直径約１μｍの球形構造体を形成することを示す。ミステリンの残りは、細胞質ゾルに分散する分布を示す。核のクロモソームは、Hoechst33342によって染色された。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図１Ｃは、ER膜上で合成されたトリグリセリド（TG）が、ER膜の二重層の疎水面に貯蔵され、細胞質側に球形の脂肪滴（LD）を形成する様子を示す。LDは、これを包む単層の膜と様々な表面タンパク質を伴う。右のパネルは、脂肪酸であるオレイン酸（OA）を添加したHeLa細胞における、中性脂肪（最上段）、内在性PLIN3（上から２段目）、及び内在性のATGLを示す。オレイン酸（OA）は以下、LD形成を促進させるために実施例において用いられた。スケールバーは、１μｍを示す。図１Ｄは、HeLa細胞においてBODPY 493/503で染色した中性脂肪をmCherry-mstが囲い込むことを示す。いくつかのLDは、ミステリンによって包み込まれていなかった（白い矢印）。mCherry-mstは、LDに一過的に会合するか、またはLDの特定のサブセットに会合し得ると考えられる。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図１Ｅは、抗ヒトミステリン抗体（１Ｃ９）で染色された内在性ミステリンがＬＤに局在することを示す。HeLa細胞は、OAで処理することでLD形成が促進されおり、また、インターフェロンνで処理されて内在性ミステリンの発現が増強されている。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図１Ｆでは、上記と同様に染色されたHepG2細胞における内在性のミステリンを示す。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図１Ｇでは、mCherry-mstが、脂質合成阻害剤であるトリアクシンCで6時間処理してLDを破壊させたHeLa細胞において、分散する分布を示したことを示す（左パネル）。トリアクシンCを除去し、OAを添加するとLDとミステリンのLDへの分布が回復した（中央パネル）。ミステリンのLD局在の回復は、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の添加によっては影響を受けなかった（右パネル）。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図１Ｈは、光退色後の蛍光の回復を示す。mCherry-mst、ｍCherry-AUP1、PLIN3-GFP、およびGFP-ATGLを、それぞれOAを添加したHeLa細胞に過剰発現させた（それぞれｎ＝５、５、７、および８）。ドーナツ型パターンを示す蛍光シグナルをレーザー照射によって消光させ、蛍光の回復（FRAP）を測定した。データは平均±SEMで示された。以上より、ミステリンが細胞質ゾルに分散した局在を示すとともに、細胞内の脂肪貯蔵オルガ��ラである脂肪滴（LD）に特異的に局在すること、また、ミステリンは他の脂肪滴タンパク質（AUP1、PLIN3、ATGL）より早いスピードで脂肪滴に局在し、また、その局在はCOPI非依存的（BFAの影響を受けない）であることが明らかとなった。
【図２】図２は、ミステリンが脂質分解を抑制することによってLDを増加させることを示す図である。図２Ａでは、培地交換４８時間後にHeLa細胞はLDを形成するが、mCherry-mstを過剰発現させるとLD形成が増強された。図中の星印は、ミステリンを過剰発現していない細胞を示し、o/eは過剰発現する細胞を示す。スケールバーは、１０μｍを示す。図２Ｂでは、図２Ａの実験においてＬＤを定量した結果を示す。ＬＤの数およびＬＤにより占められる面積は、mCherry-mstの過剰発現細胞（ｎ＝３２）において対照の細胞（ｎ＝３７）よりも大きかった。データは平均±ＳＥＭとして表示された。＊＊＊は、対照との比較におけるｐ値が＜０．００１であり、統計的に有意な差がついていることを示す。図２Ｃは、HeLa細胞におけるCRISPR-Cas9システムを用いたミステリンノックアウト（KO株：＃1および＃2）によって、LD形成が対照細胞（WT）よりも低下することを示す。これらの細胞においては、あらかじめLD形成がOA添加によって増強されている。スケールバーは、２０μｍを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験においてＫＯ細胞におけるＬＤを定量した結果を示す。ＬＤの数とＬＤによって占められる面積は、ミステリンＫＯ細胞（＃１株で細胞数４１、＃２株で細胞数３５）において対照細胞（ＷＴ、細胞数３９）と比較して顕著に低下した。図２Ｅは、トリアクシンＣによる６時間の処理がOA添加環境下でHeLa細胞からLDを消失させるが、同一条件下でmCherry-mstの過剰発現はLDを維持させることができた（上のパネルを参照）。図２Ｅでは、星印は、ミステリンを過剰発現していない細胞を示し、o/eは過剰発現する細胞を示す。上のパネルは、ＯＡおよびトリアクシンＣ存在条件下における結果を示し、下のパネルはＯＡ存在条件下における結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅの実験においてＬＤを定量した結果を示す。ＬＤの数とＬＤによって示される面積は、mCherry-mst過剰発現細胞（n=29）において、対照細胞（n=17）よりも増加した。データは、平均±SEMで表される。＊＊＊は、対照との比較におけるｐ値が＜０．００１であることを示す。図２Ｇは、リパーゼ阻害剤であるオルリスタットがミステリンＫＯの効果を打ち消すことを示す。図２Ｇの上のパネルは、ＯＡを添加したミステリンＫＯ細胞の像であり、下のパネルはオルリスタットおよびＯＡを添加したミステリンＫＯ細胞の像である。スケールバーは、２０μｍを示す。図２Ｈは、図２Ｇの実験においてＬＤを定量した結果を示す。オルリスタットで処理されなかった細胞から得られたデータは、図２Ｄと同一である。解析したオルリスタット処理細胞の数は、対照細胞（ＷＴ）で４５、＃１株で４４、＃２株で４０であった。データは、平均±SEMで表される。＊＊および＊＊＊は、オルリスタットで処理された対象細胞との比較におけるｐ値がそれぞれ＜０．０１および＜０．００１であり、いずれも統計的に有意な差がついていることを示す。以上より、ミステリンが脂肪滴の数と量を増やすはたらきを持ち、しかも、そのはたらきは脂肪合成経路の増強ではなく、脂肪分解経路の抑制によることが示された。
【図３】図３は、ミステリンがＬＤからＡＴＧＬを特異的に除去し、それにより脂肪滴を安定化することを示す。図３Ａは、mCherry-mst過剰発現細胞ではATGLのLDへの集積が顕著に減少することを示す。HeLa細胞におけるLD形成はOAの添加によって安定化されたが、mCherry-mstの過剰発現細胞（o/eにより示される）では、ミステリンを過剰発現しない対照細胞（星印により示される）に対して、ATGLのLDへの集積が顕著に減少した。挿入図は拡大画像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図３Ｂは、HeLa細胞におけるミステリンKOがLDを減少させること（上のパネル参照）、および、LDにおける内在性のATGLの集積が増加することを示す（下のパネル参照）。本実験におけるLD形成は、OA添加により増強させられている。スケールバーは、２０μｍを示す。図３Ｃは、図３Ｂの実験における結果を定量したデータである。ATGLの斑点によって示される面積が測定され、全細胞に対する比が平均±SEMで示されている。＊＊＊は、対照（WT）との比較におけるｐ値が＜０．００１であることを示す。分析した細胞数はWTが２０であり、＃１株が２０であり、＃２株が１５であった。図３ＤおよびＥは、mCherry-mstを過剰発現するHeLa細胞におけるPLIN3とATGLの免疫染色像（それぞれ抗PLIN3抗体および抗ATGL抗体による）を示す。LD形成は、OAの添加により増強されている。挿入図は拡大像である。スケールバーは、原図では１０μｍであり、挿入図では１μｍである。図３Ｆは、ATGLのsiRNAによるノックダウン（ＫＤ）は、ミステリンKOにおいて減少したLDを顕著に増加させることを示す。図３Ｆでは、ＯＡ存在下であってもミステリンＫＯはＬＤ形成を減少させること（上のパネル）、およびＡＴＧＬのノックダウンは、ＬＤ形成を対象細胞（ＷＴ）のレベルにまで増加させることを示す。以上より、ミステリンによるLD増強効果はATGLの排除を介したものであることが示された。
【図４】図４は、ミステリンの各種変異体におけるＬＤの形成と当該ミステリンのＬＤへの集積の観察結果を示す。図４Ａは、図４で用いられた酵素学的な変異体の主要な構造を示す。それぞれの変異体はそのN末端にmCherryを有する。ミステリンＡ１Ａ２変異体（以下、「Ａ１Ａ２」という）は、２つのＡＡＡ＋モジュールのＡＴＰ結合ドメインそれぞれに１アミノ酸置換が導入され、それぞれのＡＴＰアーゼ活性を消失した変異体である。ミステリンＢ１Ｂ２変異体（以下、「Ｂ１Ｂ２」という）は、２つのＡＡＡ＋モジュールのＡＴＰの加水分解に必須のマグネシウムイオン結合モチーフにそれぞれ１アミノ酸置換が導入され、それぞれのＡＴＰアーゼ活性を消失した変異体である。ミステリンのＲＩＮＧフィンガードメイン欠損変異体（以下、「ΔＲＩＮＧ」という）は、ＲＩＮＧフィンガードメインを完全に欠損した変異体である。図４Ｂは、ミステリンＫＯのHeLa細胞（＃１）において、ＯＡの添加条件下では明確なＬＤ形成が認められるのに対して、ＡＴＰ結合ドメインに２つの変異を有するミステリンの変異体（Ａ１Ａ２）と、ＡＴＰの加水分解に必須のマグネシウムイオン結合モチーフの変異体（Ｂ１Ｂ２）が、これらのLDに局在せず、分散した分布を有することを示す。挿入図は、拡大像である。スケールバーは、原図および拡大像においてそれぞれ10μｍおよび1μｍである。図４Ｃは、ＲＩＮＧフィンガードメインを欠失した変異体（ΔＲＩＮＧ）が、ほとんどの細胞（〜８０％）において、異常な凝集体様パターンを示し（左パネル参照）、少数の細胞（〜２０％）においてのみＬＤ局在が認められることを示す（右パネル参照）。細胞（ＫＯ ＃１ HeLa細胞）は、内在性のミステリンを発現せず、また、ＯＡ処理されている。挿入図は拡大像である。スケールバーは、原図および拡大像においてそれぞれ10μｍおよび1μｍである。図４Ｄは、ＯＡ処理および続くトリアクシンＣ処理後の、各種ミステリン変異体を発現させた細胞におけるＬＤの数とＬＤの細胞に占める面積（相対面積）を示す。ミステリンＫＯ ＃１ HeLa細胞をＯＡで１６時間処理してＬＤ形成を飽和させた。その後、ＯＡを除去し、得られた細胞をトリアクシンＣで６時間処理して脂質合成を停止させた。ＬＤの数および相対面積を測定した。ｍCherry-ΔRINGのLDへの局在化を示した少数の細胞（ΔR (LD)）ではLDが維持されたが、凝集体様パターンを示した細胞（ΔR (agg)）ではLD形成増強作用が失われていた。測定された細胞の数は、対照細胞で３０、野生型ミステリン発現細胞（ＷＴ）で３０、Ａ１Ａ２発現細胞で３０、Ｂ１Ｂ２発現細胞で３０、ΔＲ  （ＬＤ）細胞で１６、ΔＲ  （ａｇｇ）細胞で３０であった。測定データは全て平均±SEMで表した。N.S.はWTと比較して有意でないことを示し、***は、P < 0.001であることを示す。図４Ｅは、ミステリンが、保存された８つのシステイン（Ｃ）／ヒスチジン（Ｈ）残基で２つの亜鉛イオンをキレートするＲＩＮＧフィンガードメインのＨＣサブタイプを有することを示す模式図である。白人に稀に認められる変異事例においてこれらのうちの４つが変異している（C3997Y、H4014N、C4017S、およびC4032R）。図４Ｆは、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有するC3997Y (CY)変異体、H4014N (HN)変異体、C4017S (CS)変異体、およびC4032R (CR)変���体が多くの細胞（〜８０％）において凝集体様パターンを示すが（上のパネル）、少数派の細胞（〜２０％）ではある程度のLD局在が維持された（下のパネル）。実験には、内在性ミステリンを発現していない細胞（ＫＯ ＃１ HeLa細胞）を用い、OA処理を行った。挿入図は拡大像である。スケールバーは、原図および拡大像においてそれぞれ10μｍおよび1μｍである。図４Ｇは、上記４つのリングフィンガードメインにおける変異体のＬＤ形成に対する影響を示す。ミステリンＫＯ ＃１ HeLa細胞をＯＡで１６時間処理してＬＤ形成を飽和させた。その後、ＯＡを除去し、得られた細胞をトリアクシンＣで６時間処理して脂質合成を停止させた。ＬＤの数および相対面積を測定した。それぞれの変異体（ＬＤ）のＬＤへの標的化を示す細胞はＬＤを保持したが、凝集体様パターンを示す細胞（ａｇｇ）はＬＤ保持能を喪失した。測定した細胞数は、各変異体につき、ａｇｇで３０、ＬＤで１０であった。測定データは全て平均±SEMで表した。***は、P < 0.001であることを示す。図４Ｈは、カタニンおよびＶｐｓ４がそれぞれ、その基質である微小管上、あるいはESCRT-III複合体上で複合体形成することを示す。ATP加水分解により基質タンパク質複合体を分解した後に、これらは解離する。図４Ｉは、以上のデータより、カタニン／Ｖｐｓ４との類似性から、ミステリンがＡＴＰ結合時にＬＤ上で複合体化し、ＡＴＰ加水分解時に機械的プロセスを介してＡＴＧＬをＬＤから除去した後、拡散する単量体形態に戻るとの仮説を示す。
【図５】図５は、ミステリンがＬＤ局在することを示す（図１の関連データ）。図５Ａ〜５Ｃはそれぞれ、ＯＡ添加されたHeLa細胞、HEK293T細胞およびHepG2細胞においてmCherry-mstがLDの周囲を囲むことを示す。HepG2細胞はHeLa細胞よりも大きなLD（〜2μｍ）を形成した。挿入図は、拡大像を示す。スケールバーは、原図および拡大像においてそれぞれ10μｍおよび1μｍである。図５Ｄは、HeLa細胞、HEK293T細胞、HepG2細胞および脂肪前駆細胞および成熟脂肪細胞における内在性ミステリンの発現を示すウェスタンブロットである。それぞれの細胞をＯＡ存在下及び非存在下で培養して細胞溶解液を電気泳動し、ウェスタンブロットした。ミステリンの検出は、抗ミステリン抗体（１Ｄ６）を用いて行った。矢印は、ミステリン（５９１ｋＤａ）に対応する位置を示す。ミステリンの電気泳動において成熟した脂肪細胞においてのみ泳動の遅延が観察された（＊印参照）。脂肪細胞への分化過程でミステリンは何らかの修飾を受けた可能性がある。下のウェスタンブロットは、ＧＡＰＤＨによるインターナルコントロールである。図５Ｅおよび５Ｆは、ミステリンがインターフェロンν処理によって誘導されることを示す図である。図５Ｅでは、HeLa細胞、図５Ｆでは、HepG2細胞が試験された。ミステリンKO細胞では、ミステリンの誘導は観察されなかった。矢印は、ミステリン（５９１ｋＤａ）に対応する位置を示す。下のパネルは、ＧＡＰＤＨによるインターナルコントロールである。図５Ｇは、細胞分画によって得られたＬＤ画分の蛍光顕微鏡画像である。中性脂質はLipiDyeによる染色で検証した。EGFP-mstを過剰発現する細胞から得られたLDは、LDを取り囲むミステリンを保持していた。ミステリンの迅速なLD結合・解離（図１Ｈおよび図４I参照）は、４度におけるサンプリング過程の間に停止したと思われる。図５Ｈ〜５Ｊはそれぞれ、OA添加された３×ＦＬＡＧタグをＣ末端に有するミステリン（mst-３×FLAG）を発現するHEK293T細胞、未処理のHEK293T細胞、およびHepG2細胞を、密度勾配に基づく細胞分画に供した結果を示す。Tは全量、LDは低分子分画、Cは細胞質画分、およびpptは膜／細胞骨格分画のウェスタンブロットの結果を示す。PLIN3は、LD分画マーカーであり、カルネキシンは、PPT分画マーカーであり、GAPDHは、C分画マーカーである。図５Ｋは、トリアクシンＣ処理によってＬＤが破壊されたHeLa細胞における内在性のATGLの分散した分布を示す。トリアクシンＣの除去とＯＡの添加によってＬＤとＡＴＧＬのＬＤへの分布が回復した。これに対してＡＴＧＬのＬＤへの標的化は、ミステリンとは対照的に、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の同時添加によって阻害された。スケールバーは、１０μｍを示す。図５Ｌは、図１Ｈに開示したデータに基づく蛍光消光後の蛍光の最大回復率を示す。回復率は、ＬＤ上のmCherry-mstの稼働する割合を反映する。データは、平均±SEMで表される。図５Ｍは、図１Ｈに開示したデータに基づく半回復時間を示す。時間が短くなるほどmCherry-mstの稼働する分画のシャトリングが高速化していることを示唆する。データは、平均±SEMで表される。以上より、ミステリンが脂肪細胞、肝細胞をふくむ種々の細胞に発現し、LDに局在することを確認した。
【図６】図６は、内在性ミステリンのノックアウトおよびノックダウンの効率を確認した結果を示す。ヒトミステリンを標的とするpSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0（CRISPR-Cas9システム）でHeLa細胞を形質転換し、細胞をクローニングした（＃1および＃2）。図６Ａは、ミステリンの発現を抗ミステリン抗体（１Ｄ６）を用いて検出したウェスタンブロットの結果を示す。図６Ｂは、ミステリンノックダウンの結果を示す。２つの独立したsiRNA（＃１および＃２）でHeLa細胞中のミステリンをノックダウンした。図６Ｃは、得られたノックダウン細胞におけるＬＤ形成を示す。ＬＤの形成はＯＡ添加によって増幅させた。ノックダウン細胞では、ＬＤ形成が減少していた。スケールバーは、２０μｍを示す。図６Ｄは、ミステリンＫＯ株における細胞抽出液中のトリグリセリド密度を示す。野生型株及びミステリンＫＯ株（株＃１および＃２）のHeLa細胞を1% Triton X-100を含むPBSで溶解し、TGの比色定量アッセイに供した。TGの標品を参照として並行してアッセイした。データは、平均±SEM（各試料につきｎ＝３）で表される。***は、野生型と比較してP < 0.001であることを示す。ミステリンをノックダウンした場合、細胞レベルで脂肪蓄積が減弱することを確認した。
【図７−１】図７−１は、ミステリンによってＡＴＧＬの分布が特異的に変動することを示す。図７−１Ａでは、HeLa細胞においてミステリンのノックダウンが、OA添加によらず、ATGL（矢尻により示される）のタンパク質発現レベルを変化させないことを示す。下部のパネルは、インターナルコントロール（GAPDH）を示す。図７−１Ｂは、mCherry-mstを過剰発現するHeLa細胞におけるmCherry-mstおよびAUP1の局在を示す。AUP1は、抗AUP1抗体を用いて染色した。挿入図は拡大像である。原図および拡大像におけるスケールバーはそれぞれ、１０μｍおよび１μｍを示す。図７−１Ｃおよび７−１Ｄは、mCherry-mstを過剰発現する細胞（o/eで示す）が、周囲の過剰発現していない細胞と同様に観察されるように、PLIN3（図７−１Ｃ）およびAUP1（図７−１Ｄ）に関して通常の斑点状のLD分布を示す。すなわちミステリンはAUP1およびPLIN3に影響を与えない。この際、ＬＤ形成はＯＡ添加により増強された。スケールバーは、２０μｍを示す。過剰発現細胞の拡大像は、図３Ｃおよび７−１Ｂに示される通りである。図７−１Ｅでは、mCherry-mstとPLIN3-GFPを過剰発現するHeLa細胞をOAで処理し、LDを形成させた。PLIN3は、ミステリンで覆われたLDにおいて常に検出された（100％）。但し、いくらかのLDはミステリンを含まなかったがPLIN3を含んでいた。この挙動は、ミステリンとは決して共局在を示すことがない（0％）ATGLと全く異なっていた。スケールバーは、10μｍを示す。図７−１Ｆでは、mst-3×FLAGおよびmCherry-AUP1を過剰発現するHeLa細胞をOAで処理し、LDを形成させた。AUP1はミステリンで覆われたLDにおいて常に検出された（100％）。この挙動は、ミステリンとは決して共局在を示すことがない（0％）ATGLと全く異なっていた。スケールバーは、10μｍを示す。図７−１Ｇでは、野生型HeLa細胞およびミステリンKD（＃１）HeLa細胞をBFA（５μｇ／ｍL）で０、４、および８時間処理し、ATGLのLDへの流入を阻害した。内在性のATGLのLDへの結合を、各時点でそれぞれ観察し、LDからのATGLの流出（消失）をモニターした。この際、終濃度２００μＭのＯＡをＢＦＡと共に細胞に添加してＬＤの量を保った。挿入図は、拡大像である。原図および拡大像のスケールバーはそれぞれ、２０μｍおよび２μｍを示す。図７−１Ｈでは、野生型HeLa細胞およびミステリンKD（＃１）HeLa細胞をBFA（５μｇ／ｍL）で１２時間前処理して、ＬＤに局在するＡＴＧＬを完全に枯渇させた。ＬＤにおける内在性ＡＴＧＬの回復（流入）を培地交換によってＢＦＡを除去した０、８、および１６時間後にモニターした。上記において、細胞は常時２００μＭのＯＡを添加した状態で維持された。挿入図は、拡大像を示す。原図および拡大像のスケールバーはそれぞれ、２０μｍおよび２μｍである。図７−１Ｉは、GFP-ATGLを、OA添加した野生型HeLa細胞（ｎ＝８）およびミステリンＫＯ（＃１）細胞（ｎ＝５）において過剰発現させた結果を示す。ドーナツ型パターンを示す蛍光シグナルを強力で短いレーザー照射により退色させ、蛍光回復を測定した。データは、平均±SDを表す。回復の曲線は、野生型およびKO細胞において測定され、有意差を示した。＊＊はＰ＜０．０１を示す。図７−１Ｊは、光退色直後の回復を図７−１Ｉに示されるデータから抽出した。半回復時間と最大蛍光回復率を、回付曲線に対す���非線形カーブフィット解析を用いて算出した。秒から分のタイムスケールのＬＤの運動の影響を除外するために、初期回復を光退色直後の約1.6秒間にわたって計測したが、この値はＫＯ細胞において有意に大きかった。このことは、ＬＤにおけるＡＴＧＬの分子交換がＫＯ細胞において有意に速いことを示唆する。半回復時間はＫＯ細胞においてより短く、最大蛍光回復はＫＯ細胞においてより大きい傾向があり、ＫＯ細胞においてはＬＤにおけるＡＴＧＬの回復がより効果的であったことを支持する。データは、平均±ＳＤで表された。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図７−２】図７−２Ｋでは、ＯＡを添加した野生型HeLa細胞（ｎ＝６）およびミステリンＫＯ（＃１）細胞（ｎ＝９）においてPLIN3-GFPを過剰発現させた結果を示す。ドーナツ型パターンを示す蛍光シグナルを強力なレーザー照射で退色させ、蛍光回復を測定した。データは、平均±SEMで表された。ATGLとは異なって、PLIN3-GFPの回復曲線は、野生型とKO細胞とで同様であった。図７−２Ｌは、光退色直後の回復を図７−２Ｋにおいて示されるデータから抽出した。半回復時間と最大蛍光回復率は、非線形カーブフィット解析により算出した。データは、平均±ＳＤで示される。＊は、ｐ＜０．０５を示す。図７−２Ｍは、GFP-ATGLとmCherry-mstとの共発現が、LDからのmCherry-mstの除去を引き起こすことを示す。多くの細胞（〜９０％；上のパネル群）において、GFP-ATGLは、LDとの共局在を示したが、mCherry-mstは分散的な分布を示した。少数の細胞（〜１０％；下のパネル群）において、mCherry-mstはLDにおいてドーナツ型分布を示したが、GFP-ATGLと共局在することはなく、このことは、ミステリンとATGLがLDへの局在化に関して互いに競合することを示唆する。核染色体は、Hoechst33342で染色された。挿入図は拡大像である。元像および挿入像におけるスケールバーはそれぞれ、２０μｍおよび２μｍであった。図７−２Ｎは、ミステリンとＡＴＧＬ間のＬＤにおける競合のモデルを示す。（ａ）ＡＴＧＬはＥＲ−ＬＤ結合部位を通じてＬＤに分布する。ミステリンはおそらくこの段階でＡＴＧＬのＬＤへの流入を防ぎ、ミステリンによって除去されたＡＴＧＬは前ＬＤ部位であるＥＲに保持されることが推測された。（ｂ）ＡＴＧＬの過剰発現はＬＤにおけるミステリン量を減少させるが、このことはＡＴＧＬがＬＤへのミステリンの流入を防ぐこと（または、ＬＤからのミステリンの流出を促進させること）を示唆する。ミステリンとＡＴＧＬとの直接的相互作用がないとすると（図７−２Ｏ参照）、ミステリンとＡＴＧＬとは未同定のアンカータンパク質に関して競合する可能性がある。図７−２Ｏは、ミステリンとＡＴＧＬとが直接相互作用しないことを示す。Mst-3×FLAGを一過的に発現するHEK293細胞を溶解し、抗FLAG  M2アガロースでの免疫沈降に供した。細胞溶解物および共免疫沈降したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、抗ATGL抗体を用いた免疫ブロットで分析した。ミステリンとATGLとの共免疫沈降は観察されなかった。なお、ミステリンがスメア状のバンドパターンとして検出される点は、電気泳動における処理に起因し得るが、このことは（Kotani et al., 2017）において議論された通りである。図７−２Ｐは、ミステリンKOのHeLa細胞（＃１）および３つの独立したsiRNA（＃１〜＃３）で処理したHepG2細胞においてsiRNAによりATGLをノックダウンした結果を示す。ATGLの発現は、抗ATGL抗体を用いた免疫ブロットにより試験され、図３Ｆで行ったATGLノックダウンの効果を確認できた。下のパネル群はインターナルコントロール（PLIN3）を示す。以上より、ミステリンはATGLに特異的に作用することが確認できた。
【図８】図８は、酵素学的変異体および病原性変異体の分子の振る舞いを示す。図８Ａは、ｍCherry-ΔRINGを過剰発現した細胞（o/eで示される）が２つのパターンを示すことを示す。多数派の細胞（〜８０％；上のパネル群）は、ΔRING変異体の凝集様構造形成と、内在性ATGLのLDへの正常な局在を示した。少数の細胞（〜２０％；下のパネル群）は、ΔRINGミステリンがLDを覆っていたが、ΔRINGミステリンによって取り囲まれたLDに対してATGLは局在できなかった。このことは、ミステリンのユビキチンリガーゼ活性がATGLの除去に直接的に必要ではないことを示唆する。ミステリンを過剰発現しない細胞（＊で示される）は、ATGLで高度に覆われたLDを示す（上および下のパネル群）。スケールバーは、２０μｍを示す。図８Ｂは、D4013N変異体とR4810変異体（いずれもｍCherry標識）がOAを添加したミステリンＫＯ＃1 HeLa細胞において正常にLD局在することを示す。挿入図は拡大像である。原図および拡大像におけるスケールバーはそれぞれ、10μｍおよび1μｍである。ミステリン全長における変異の位置は、上のパネルにおいて示されている。4013番目のアスパラギン酸残基は保存された4014番目のヒスチジン残基に隣接して存在する（図４Ｅ参照）が、酵素活性には必須ではないと考えられる。R4810Kは、推定される機能構造を有しないＣ末端領域に分布する。これらの変異の遺伝学的浸透度は不完全である。図８Ｃは、R4810K変異体（RKとして示される）とD4013N変異体（DNとして示される）におけるLD形成を示す。ミステリンＫＯ＃１ HeLa細胞をＯＡで１６時間処理してＬＤ形成を飽和させた。OAを除去し、細胞をトリアクシンＣで6時間処理して脂質合成を停止させた。ＬＤの数と相対面積を定量した。模擬処理細胞とＷＴ細胞のデータは図4Ｄおよび4Ｅと同一である。R4810K（RK）変異体とD4013N（DN）変異体とは野生型（WT）と同様、LDに局在していた。定量した細胞の数は、RKについて26、DNについて29であった。データは平均±SEMで示される。N.S.は有意でないことを示し、＊＊＊は、野生型と比較してp<0.001であることを示す。図８Ｄは、ミステリンの第１のＡＡＡ＋モジュールにＡＴＰが結合するとオリゴマー形成を誘発し、第２のＡＡＡ＋モジュールにおける別のＡＴＰの加水分解によって解離するモデルを示す。以上より、ミステリンのAAA+ ATPアーゼ活性とユビキチンリガーゼ活性の両方がミステリンのLD局在および機能に重要であり、もやもや病患者で認められる病原性変異により、この機能が障害されることを確認した。
【発明の具体的な説明】
【０００９】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、特にヒトを含む意味で用いられる。
【００１０】
本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置を含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減を意味する。本明細書では、「予防」とは、疾患もしくは病態の発症の可能性を低下させる、または疾患もしくは病態の発症を遅らせることを意味する。
【００１１】
本明細書では、「脂肪代謝」とは、脂肪の異化作用を含む意味で用いられる。脂肪代謝としては、細胞の脂肪代謝および臓器の脂肪代謝が挙げられる。
【００１２】
本明細書では、「阻害剤」とは、標的タンパク質の機能を阻害することができる薬剤を意味する。阻害剤としては、化学物質（低分子化合物）、ペプチド、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびその発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。阻害剤は、好ましくは、その標的タンパク質に対して特異性または選択性を有し得る。特異性または選択性を有するとは、IC50値において、他の如何なるタンパク質に対するよりもその標的タンパク質に対して、低いこと、好ましくは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、１／１００未満、１／１０００未満または１／１００００未満であることを意味する。
【００１３】
本明細書では、「発現抑制剤」とは、標的タンパク質の発現を阻害することができる薬剤を意味する。発現抑制剤としては、例えば、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とした核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびその発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。標的タンパク質のプロモーター領域または転写開始領域に対して、エンドヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質をｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を用いてリクルートすることによっても標的タンパク質の発現を抑制することができる。このような発現抑制の仕組みをＣＲＩＳＰＲｉという。ｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの設計方法は、周知であり、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの５’末端の約２０ｍｅｒを標的配列に生理的条件下でハイブリダイズ可能なように設計することができる。
【００１４】
本明細書では、「ミステリン」は、リングフィンガードメインとＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼドメインとを含むタンパク質であり、リングフィンガープロテイン２１３（ＲＦＰ２１３）、染色体１７上のＡＬＫリンパ腫オリゴマー形成パートナー（ALK lymphoma oligomerization partner on chromosome 17；ＡＬＯ１７）、もやもや病２（ＭＹＭＹ２）、ミステリン（ＭＹＳＴＲ）、ＮＥＴ５７、染色体１７オープンリーディングフレーム２７（Ｃ１７ｏｒｆ２７）、またはＫＩＡＡ１６１８とも呼ばれるタンパク質である。
ミステリンは、リングフィンガードメインを有し、２つまでの亜鉛イオンを結合する能力と、ユビキチンリガーゼ活性（ユビキチンをタンパク質に連結させる活性）を有すると共に、２つのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼドメインを有し、ＡＴＰアーゼ活性を有する。ミステリンは、リングフィンガードメインの活性によって自己および他のタンパク質をユビキチン化し得る。
「ミステリン」は、ヒトミステリンであり得、ヒトミステリンは、UniProtKBにおいて登録番号：Q63HN8として登録されるアミノ酸配列を有し得る。また、ヒトミステリンをコードする塩基配列は、GenBankの登録番号：NM_020914.4に登録された塩基配列を有し得る。ヒトミステリンには、UniProtKBにおいて登録番号：Q63HN8-4として登録されるアミノ酸配列を有するアイソフォーム２が知られている。ミステリンにはまた、天然にいくつかの変種が存在する。ミステリンは、もやもや病の原因遺伝子であることが知られている。
【００１５】
本明細書では、ミステリンは、細胞内の脂肪滴表面に結合し、脂肪滴を安定化する。この脂肪の安定化効果の一部は、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）を脂肪滴から除去することによって発揮される。ミステリンのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、および発現のいずれかを抑制すると、脂肪滴が減少する。このことから、ミステリンを細胞内で阻害することによって、細胞における脂肪代謝が亢進することが見出された。
【００１６】
従って、本発明では、ミステリンの阻害剤を含む、脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００１７】
また、ミステリンの阻害剤は、脂肪滴の蓄積を伴う疾患を処置することに用いることができる。脂肪滴は、過体重、肥満、脂肪肝などの疾患の患者において観察される。従って、ミステリンの阻害剤は、肥満、脂肪肝などの疾患の患者を処置することに用いることができる。また、ミステリンの阻害剤は、脂肪滴の蓄積に起因する生活習慣疾患を処置することに用いることができる。脂肪滴の蓄積に起因する生活習慣疾患としては、糖尿病、非アルコール性肝炎、肝硬変、動脈硬化などの疾患が挙げられる。
【００１８】
脂肪滴の蓄積は、例えば、脂肪滴の過剰な蓄積である。脂肪滴の過剰な蓄積は、例えば、健常者の脂肪滴の蓄積と比較して、その平均値から最大値の間の特定の値、またはその平均値から第３四分位値の間の特定の値よりも高い場合に脂肪滴の蓄積を伴うと評価することができる。脂肪滴の蓄積はまた、健常者の脂肪滴の蓄積と比較して、平均値からその平均値＋σ、＋２σ、または＋３σの値の間の特定の値よりも高い場合に脂肪滴の蓄積を伴うと評価することができる。ここでσは、健常者の母集団の標準偏差である。
【００１９】
脂肪滴の蓄積は、細胞中の脂肪滴を定量的に観察することによって定量評価することができる。組織や細胞から脂肪滴を分離し、分離された脂肪滴中のトリグリセリドを定量することによっても調べることができる。脂肪滴の定量的観察およびトリグリセリドの定量は、当業者に周知の方法で行うことができる。脂肪滴の定量的観察は、例えば、脂肪滴内トリグリセリドを蛍光標識し、蛍光顕微鏡を用いて、脂肪滴数、および／または、脂肪滴面積を評価することによって定量することができる。トリグリセリドの定量は、例えば、トリグリセリドをリパーゼで加水分解し、得られた遊離グリセロールをＨＰＬＣや光散乱検出技術等によって測定することにより定量することができる。また、トリグリセリドは、sulfo-phospho-vanillin法によって定量することもできる。sulfo-phospho-vanillin法では、組織や細胞から分離された脂肪滴に濃硫酸を添加し、試料を可溶化するために加熱し、バニリンを加えると生じる比色生成物を測定することにより脂肪滴の量を定量することができる。脂肪滴の抽出は、例えば、脂溶性の有機溶媒（例えば、クロロホルム）を用いて（例えば、Ｆｏｌｃｈ法によって）行うことができる。脂肪滴の定量はまた、非イオン性界面活性剤を含む生理食塩水に細胞や組織を懸濁し、市販の比色定量キット（例えば、Serum Triglyceride Quantification Kit, CELL BIOLABS, INC.）を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明によれば、ミステリンをノックアウトまたはノックダウンすることにより、ミステリンの発現を消失させる、または減少させると、ＡＴＧＬの脂肪滴へのリクルートが回復し、ＡＴＧＬによる脂肪滴の分解が促進されることよって、脂肪滴が小さくなる。従って、本発明によれば、ミステリンの発現抑制剤を含む、脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００２１】
ミステリンの発現抑制剤としては、ミステリンを標的とする核酸が挙げられる。ミステリンを標的とする核酸としては、ミステリンを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこれらの細胞内発現ベクターが挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴの設計方法は、当業者に周知である。従って、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴは、当業者に周知の方法によって設計して用いることができる。また、これらの核酸は、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびモルホリノオリゴ等の修飾オリゴヌクレオチドを含み得る。核酸は、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、および２’−フルオロ修飾ＲＮＡからなる群から選択される１以上を含んでいてもよい。核酸はまた、ホスホロチオエート連結基によって塩基間が連結されていてもよい。ある態様では、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、配列番号２の配列を有する核酸と配列番号３の配列を有する核酸とを含み得る。
【００２２】
ミステリンの発現抑制剤としてはまた、マイクロＲＮＡが挙げられる。本発明では、ミステリンの発現を抑制できるマイクロＲＮＡであれば特に限定されないが、例えば、ｌｅｔ−７ｃを用いることができる。
【００２３】
ミステリンの発現抑制剤としてはまた、ミステリンを標的としたＣＲＩＳＰＲ−オフシステムが挙げられる。ミステリンを標的としたＣＲＩＳＰＲｉは、ミステリンのプロモーター領域または転写開始領域にｄＣＡＳ９をリクルートするためのｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組合せと、ｄＣａｓ９タンパク質とを含み得る。ｄＣＡＳ９タンパク質とは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが有する２つのエンドヌクレアーゼドメインのエンドヌクレアーゼ活性が不活化されたＣａｓ９タンパク質である。ミステリンのプロモーター領域または転写開始領域にリクルートされたｄＣａｓ９タンパク質は、転写されるＤＮＡ上で物理的障害を形成し、これにより、ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター上へのリクルートやＲＮＡポリメラーゼIIによるｍＲＮＡの転写伸長を阻害することによってｍＲＮＡの転写を阻害し得る。Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼを不活化させるためには、例えば、化膿レンサ球菌のＣａｓ９タンパク質においては、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａのアミノ酸変異が導入され得る。他の種のＣａｓ９タンパク質においても、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａに対応する２つのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸変異を導入することができる。ｄＣａｓ９タンパク質は、核移行シグナルをさらに有し得る。また、ｄＣａｓ９タンパク質は、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ；Kruppel-associated Box）との融合タンパク質としてもよい。
【００２４】
ミステリンの発現抑制剤としては、プロモーターにｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴから選択される１以上をコードする遺伝子（核酸）を作動可能に連結した核酸を含む、遺伝子発現ベクターが挙げられる。プロモーターとしては、Ｕ６プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーターを用いることができる。ミステリンの発現抑制剤としてはまた、プロモーターに作動可能に連結したｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸またはｄＣａｓ９タンパク質と転写抑制ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸と、プロモーターに作動可能に連結したｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組合せをと含む遺伝子発現ベクターであり得る。プロモーターに作動可能に連結したｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸またはｄＣａｓ９タンパク質と転写抑制ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸と、プロモーターに作動可能に連結したｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組合せは、２以上の遺伝子発現ベクターに別々に含まれていることができ、好ましくは１つの遺伝子発現ベクターに含まれていることができる。
【００２５】
ミステリンはまた、そのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性を阻害することによっても、その脂肪滴の安定化作用を阻害することができる。従って、本発明によれば、ミステリンのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤を含む、脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物が提供される。ミステリンのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤は、ミステリンに結合し得るものであり、例えば、ミステリンのＡＡＡ＋モジュールに結合し得る。ミステリンのＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤としては、例えば、公知のＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤を用いることができる。
【００２６】
ミステリンはまた、そのユビキチンリガーゼ活性を阻害することによって、その細胞内局在を変更させることができ、これによって、その脂肪滴の安定化作用を阻害することができる。従って、本発明によれば、ミステリンのユビキチンリガーゼ活性の阻害剤を含む、脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物が提供される。ミステリンのユビキチンリガーゼ活性の阻害剤は、ミステリンに結合し得るものであり、例えば、ミステリンのリングフィンガードメインに結合し得る。ミステリンのユビキチンリガーゼ活性の阻害剤としては、例えば、公知のユビキチンリガーゼ阻害剤を用いることができる。
【００２７】
上記ミステリンの阻害剤はいずれも、もやもや病を処置することに用い得る。従って、本発明では、ミステリンの阻害剤を含む、もやもや病を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。本発明によれば、ミステリンの発現抑制剤、または、ＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤を含む、もやもや病を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、ミステリンの阻害剤に加えて、医学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤をさらに含んでいてもよい。「医学的に許容される」とは、対象に投与した場合に医学的に許容できない有害反応を引き起こさないことを意味する。典型的に、そのような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液として調製され、注射前の液体中での溶解または懸濁に好適な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもできる。
賦形剤、担体または希釈剤としては、例えば、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド、などが含まれる。リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシアルキレン系）といった例も挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野で周知である。任意の慣用の媒体または物質が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物でのその使用が想定される。
【００２９】
本発明の別の側面では、もやもや病を処置することに用いるための医薬組成物の製造におけるミステリンの阻害剤の使用が提供される。本発明の別の側面では、脂肪代謝を促進することに用いるための医薬組成物の製造におけるミステリンの阻害剤の使用が提供される。
【００３０】
本発明の別の側面では、もやもや病をそれを必要とする対象において処置する方法であって、ミステリンの阻害剤を当該対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明の別の側面では、脂肪代謝をそれを必要とする対象において促進する方法であって、ミステリンの阻害剤を当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の側面では、ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下または欠損させた非ヒト哺乳動物が提供される。ここで非ヒト哺乳動物としては、霊長類（例えば、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ボノボ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）、およびペット（イヌ、ネコ、マウス、リス、ウサギ、ハムスター）が挙げられる。ミステリンは、各動物において、UniProtKBにおいて登録番号：Q63HN8として登録されるアミノ酸配列を有するヒトミステリンのオーソログであり得る。また、ミステリンは、UniProtKBにおいて登録番号：Q63HN8-4として登録されるアミノ酸配列を有するヒトミステリンのオーソログであり得る。ミステリンの発現の低下は、遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックダウンによって行われ得る。遺伝子ノックダウンは、例えば、ミステリンに対するｓｈＲＮＡを発現するベクターによって行われ得る。遺伝子ノックアウトは、遺伝子欠損等により行われ得る。その他、dCas9やdCas9と転写抑制ドメインとを用いたCRISPR-OFFのような遺伝子発現を停止させる方法を用いてもよい。ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下または欠損させた非ヒト哺乳動物は、脂肪代謝異常モデル（例えば、脂質代謝亢進モデル）であり得る。従って、本発明によれば、ミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下または欠損させた非ヒト哺乳動物の脂肪代謝異常モデル（例えば、脂質代謝亢進モデル）としての使用が提供される。また、本発明では、変異ミステリンの凝集様構造形成にともなう細胞毒性に起因する個体機能障害モデルが提供される。変異ミステリンの凝集様構造形成にともなう細胞毒性に起因する個体機能障害モデルでは、C3997Y、H4014N、C4017S、およびC4032Rから選択される１以上の変異に相当する、当該モデル動物におけるアミノ酸の変異を有し得る。
本発明の別の側面では、ミステリンのタンパク質発現および／または機能を向上させた非ヒト哺乳動物が提供される。非ヒト哺乳動物としては、上述のものが含まれる。ミステリンのタンパク質発現を向上させるには、トランスジェニックなどの技術を用いて行いうる。その他、CRISPR-ONのような遺伝子発現を亢進する方法を用いてもよい。脂肪代謝異常モデル（例えば、脂質代謝抑制モデル）であり得る。従って、本発明によれば、ミステリンのタンパク質発現および／または機能を向上させた非ヒト哺乳動物の脂肪代謝異常モデル（例えば、脂質代謝抑制モデル）としての使用が提供される。
本発明の上記脂肪代謝異常モデルおよび個体障害モデルとしての使用には、例えば、研究用途でのモデルの使用、薬物のスクリーニング用途でのモデルの使用等が挙げられる。
【００３２】
本発明の別の側面では、脂肪代謝を調整する化合物のスクリーニング方法であって、
被検化合物とミステリンまたはその変異体とを接触させることを含む、方法が提供される。ミステリンの変異体としては、ミステリンのＡＡＡ＋モジュールにおける活性が喪失した変異体、ＡＡＡ＋モジュールが破壊された変異体、リングフィンガードメインにおける活性が喪失した変異体、リングフィンガードメインが破壊された変異体を用い得る。ミステリンの変異体としてはまた、ユビキチンリガーゼ活性およびＡＡＡ＋モジュールにおけるＡＴＰアーゼ活性のいずれかまたは両方を有するミステリンであって、ヒトミステリンのアミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するミステリンを用い得る。ミステリンの変異体としてはまた、ユビキチンリガーゼ活性およびＡＡＡ＋モジュールにおけるＡＴＰアーゼ活性のいずれかまたは両方を有するミステリンであって、ヒトミステリンのアミノ酸配列に対して、１〜３０個のアミノ酸の変異を有し、かつ、変異は、独立して、欠失、付加、挿入、及びまたは置換から選択される変異体を用いることができる。ミステリンとしては、非ヒト哺乳動物のオーソログを用いることができる。調整は、促進および／または抑制を含む意味で用いられる。
本発明のスクリーニング方法の接触工程は、被検化合物とミステリンまたはその変異体とを含む水溶液中で行うことができる。本発明のスクリーニング方法の接触工程は、被検化合物と、ミステリンまたはその変異体を発現した細胞とを接触させることによって行うことができる。本発明のスクリーニング方法の接触工程は、ミステリンまたはその変異体を発現した非ヒト哺乳動物に被検化合物を投与する（例えば、経口、静脈内、脳室内、腹腔内など）ことにより行うことができる。
本発明のスクリーニング方法の接触工程は、本発明のミステリンのタンパク質発現および／または機能を低下または欠損させた非ヒト哺乳動物や、本発明のミステリンのタンパク質発現および／または機能を向上させた非ヒト哺乳動物に、被検化合物を投与することによって行ってもよい。
スクリーニングの被検化合物ライブラリーとしては、特に限定されないが例えば、天然物ライブラリー、低分子化合物ライブラリー、ＡＴＰアーゼ活性阻害効果を有する化合物、キナーゼ活性の阻害剤等を含むライブラリーを用い得る。
【００３３】
また、ミステリンの発現抑制剤、または、ＡＡＡ＋  ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤は、疾患変異ミステリンによる異常な凝集様構造形成を解消できることから、このような異常凝集様構造が形成されることにより発揮される細胞毒性に起因する疾患の処置に用いることができる。疾患変異ミステリンが凝集様構造を形成することにより発揮する細胞毒性に起因する疾患として、例えば、もやもや病、高血圧、脳動脈瘤、心筋梗塞などが挙げられる。
【実施例】
【００３４】
材料と実験方法
［細胞、トランスフェクション、及び細胞の処理］
HeLa (Kyoto)、HEK293T、及びHepG2細胞を、10％ウシ胎児血清（Sigma）およびペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ、最終濃度100U／ｍLおよび100μｇ／ｍL；Nacalai Tesque）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；Gibco）中で7％CO2存在下で37℃で維持した。ヒト内臓の前脂肪細胞（Lonza）をPGM-2 Bullet Kit (Lonza)を製造者説明書に従って用いて維持し、成熟脂肪細胞へと分化させた。
プラスミドは、Polyethylenimine MAX (Polysciences)を用いて細胞にトランスフェクションし、siRNAは、RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)を用いて細胞にトランスフェクションした。オレイン酸（OA; Merck）は、使用前にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でウシ血清アルブミン（BSA；脂肪酸およびエンドトキシンフリー；Sigma）に対して6：1のモル比でコンジュゲートした。細胞は、最終濃度200〜400μMのOAを含むOA/BSA複合体または対応する濃度のBSA単独で16〜24時間処理した。トリアクシンC（Sigma）およびオルリスタット（AdooQ BioScience）は、DMSOに希釈し、それぞれ、最終濃度5μMで6〜24時間、及び最終濃度100μMで24〜48時間培地に添加した。インターフェロンν（PBL Assay Science）は図に表示された濃度で24時間添加した。ブレフェルジンＡ（Nacalai Tesque）は、5μｇ／ｍＬの最終濃度で6〜24時間添加した。
［プラスミドとｓｉＲＮＡ］
Ｃ末端に３つのタンデムのＦＬＡＧエピトープ（mst-3×FLAG）とＮ末端にＥＧＦＰ（EGFP-mst）を有する野生型及び変異型は、以前記載されたものである（(Liu et al., 2011; Morito et al., 2014）。C3997Y (TGCからTACへ)、H4014N (CACからAACへ)、C4017S (TGCからTCCへ)、及びC4032R (TGCからCGCへ)の変異体は、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (TaKaRa)を用いて作製した。より分かりやすい蛍光イメージング分析のため、野生型及び変異型のmst-3×FLAGをNheI及びNotI部位にて切断し、pIRESpuro4 n-mCherry (Dr. Shigeo Murata, Graduate School of Pharmaceutical Science, The University of Tokyoから提供)にサブクローニングした。このプラスミドのマルチクローニングサイト（MCS）は、ベクターにコードされるmCherryとサブクローニングされるmst-3×FLAGの読み枠を適合させるために事前に改変され（mCherryに続く改変されたMCSの配列は：配列番号１の通りであった）、サブクローニングに先だってXbaIとNotIとで切断された。peGFP-N1-ATGLは、Dr. Hidde Ploegh (Whitehead Institute, Massachusetts Institute of Technology)から提供された。TIP-47/PLIN3-GFPは、Dr. Stefan Honing (Institute of Biochemistry I, University of Cologne)から提供された。ヒトミステリンを標的とするｓｉＲＮＡは、Invitrogenから購入した（#1: PNPLA2HSS125980 (3_RNAI) ; #2: PNPLA2HSS183700 (3_RNAI); #3: PNPLA2HSS183701 (3_RNAI)）。
［抗体］
マウス抗ミステリンモノクローナル抗体（１Ｄ６および１Ｃ９）は、以前記載した通り（Kotani et al., 2017）に作製されたものをDr. Seiji Takashima, Graduate School of Medicine, Osaka University)から提供された。抗PLIN3抗体（Santa Cruz）、抗ATGL抗体（免疫染色用はSanta Cruz；免疫ブロット用はCell Signaling）、抗AUP1抗体（Atlas Antibodies）、抗チューブリン抗体（Millipore）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Hy Test）、及び抗FLAG M2抗体（Sigma）を用いた。
［CRISPR/Cas9システム］
ヒトミステリンのコード領域を標的とする短い二本鎖DNA（配列番号２および３）は、CRISPR Search and Design Tool (Thermo Fisher)を用いて決定し、pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0（Dr. Feng Zhangから提供された；Addgene plasmid #62988）にクローニングした。ベクターをHeLa細胞にトランスフェクションし、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン存在下で７日間維持した。生存した細胞を希釈して培養し、コロニーを形成した細胞を単離し、確認した（図Ｓ７Ａの＃１及び＃２）
［細胞の分取］
細胞の分取は、Lipid Droplet Isolation Kit (Cell Biolabs)を用いて製造者説明書に従って実施した。図５Ｈでは、１／２００（全容量）、１／６０（脂肪滴；ＬＤ）、１／２００（細胞質）、及び１／２００（膜／細胞骨格）を、図５Ｉでは、１／２５０（全容量）、１／３０（ＬＤ）、１／２５０（細胞質）、及び１／２５０（膜／細胞骨格）を、図５Ｊでは、、１／２００（全容量）、１／３０（ＬＤ）、１／２００（細胞質）、及び１／２００（膜／細胞骨格）を免疫ブロット分析に供した。
［免疫ブロット］
試料は、細胞分画手順を用いてまたは1% NP-40を含む溶解緩衝液で溶解させた細胞から直接的に以前記載された通りに調製した。試料は、5%または、3%〜10%のグラージェントアクリルアミドゲル（ATTO）を用いてSDS-PAGEにより分離し、75V、4℃にて1.5時間にわたりPVDF膜（Merck Millipore, Hessen, Germany）に転写した。膜は、Blocking One（Nacalai Tesque）を用いて室温で１時間ブロッキングし、１次抗体（１／２００でほぼ用いられた）、及びCan Get Signal（TOYOBO）で希釈された２次抗体（１／１０００でほぼ用いられた）と逐次的にインキュベートした。検出は、化学発光法によって行った。
［免疫染色］
細胞を４％パラホルムアルデヒド（Nacalai Tesque）で室温で１０分間固定し、５０μｇ／ｍＬのジギトニンを用いて５分間透過処理をし、その後、PBSを用いて洗浄した。室温で１時間にわたってBlocking Oneでインキュベートした後に、細胞を１次抗体及び蛍光標識２次抗体と逐次的にインキュベートしたが、それぞれのインキュベーションの後にはPBSによる洗浄がなされた。脂肪滴（ＬＤ）は、２次抗体と同時に添加したBODIPY 493/503と、２次抗体と同時に添加又は細胞分取の後に添加したLipiDye（Funakoshi）で染色した。核は、Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific）を用いて染色した。蛍光像は、ZENソフトウェアを用いて、室温で共焦点顕微鏡（LSM 700, Carl Zeiss）で取得した。
［生細胞におけるFRAP測定］
FRAP測定は、ZENソフトウェアを用い、Plan-Apochromat 63×/1.4NA油浸対物レンズ（Carl Zeiss）を装着した共焦点顕微鏡（LSM 700, Carl Zeiss）上で実施した。HeLa細胞中のGFP-ATGL及びPLIN3-GFPを488 nmで励起し、488/555 nmで光退色させた。走行ビームスプリッター（MBS405/488/555/639）が用いられた。GFP又はｍCherryの蛍光は、変動第二ダイクロイックビームスプリッターを用いてそれぞれ493-1000 nm又は578-1000 nmで集められた。ピンホールの大きさは、GFPでは69μｍ、及びmCherryでは79μｍに設定した。X軸とY軸のスキャンサイズは、512ピクセルとした。画像取得の時間間隔は、10.0秒に設定した。光退色の時間は15秒とした。時間ｔにおける相対蛍光強度（RFI）はZENソフトウェアを用いて測定し、下記式［１］：
【数１】
2020105134.tif 000002
を用いて計算した。式［１］では、IBL(t)及びIbg(t)はそれぞれ、時間ｔにおける光退色領域とバックグラウンド領域で測定された強度である。式［１］ではまた、I'BL及びI'bgはそれぞれ、退色領域の光退色前、及びバックグラウンド領域の蛍光強度である。I'BL及びI'bgは、細胞のない領域において測定した。
FRIの回復曲線は、Origin 2017ソフトウェア（OriginLab Corp）１コンポーネント指数回復モデル、すなわち下記式［２］：
【数２】
2020105134.tif 000003
にフィットさせた。式［２］において、I(t)は、時間ｔにおける強度であり、I0は、ベースラインである。式［２］において、Aは、指数回復係数であり、ｋは回復率である。最大回復率（Imax）は、I0＋Aとして定義される。半回復時間（half-recovery time）は、-(ln 0.5)/kとして計算される。PLIN3とATGLの分析（図７−１Ｉおよび７−１Ｊ並びに図７−２ＫおよびＬ）において、光退色直後（ベースライン）の蛍光強度の最低の減少は、4％パラホルムアルデヒドで固定したPLIN3-GFP発現細胞を用いて決定された。可動部分を直接的に示すために、FRIは、最低蛍光強度で正規化された（正規化RFI）。
［比色分析によるトリグリセリド（TG）の定量］
3×106のHeLa細胞を1% Triton X-100を含む250μLのPBS中に懸濁した。上清を比色分析によるTG定量分析（Serum Triglyceride Quantification Kit, CELL BIOLABS, INC.）に供した。図６に示されるＴＧ密度は、上清におけるものである。
［定量及び統計分析］
ＬＤ（とその会合タンパク質）の数及び相対面積は、ImageJ (Wayne Rasband and NIH)を用いて分析した。全てのデータは、平均±ＳＥＭで表された。統計学的有意差は、Studentのｔ検定を用いて評価した。p < 0.05が統計学的に有意であるとされた。
【００３５】
結果と考察
ミステリンの細胞内分布を解明するために、Ｎ末端にmCherryを有するミステリン（mCherry-mst）を用いた高解像度蛍光顕微鏡法を実施した。一過的に発現したmCherry-mstは、HeLa細胞では、細胞質中に拡散した分布を示し、部分的に約１μｍの直径のドーナツ型パターンを呈した（図１Ｂ参照）。この様相は、ライソゾーム、エンドソーム、及びＬＤなどの中程度の大きさの細胞内小胞構造を想起させるものであった。これらのうち、ＬＤは多くの組織に存在する主要な脂肪貯蔵部位であり、代謝エネルギーと脂肪物質の供給源である（Walther and Farese, 2012）。この小さな液滴状オルガネラは、中性脂質トリグリセリド（ＴＧ）から主になる非水溶性コアとこれを包み込むＥＲとの連結をしばしば残すリン脂質単層膜と脂質生成機能、脂質分解機能、又は制御機能を有する表面タンパク質のセットとから構成される（図１Ｃ参照）。BODIPY 493/503を用いた中性脂質の蛍光染色は、HeLa細胞でmCherry-mstがＬＤの表面を覆っていることを明らかにした（図１Ｄ参照）。そして、この蛍光染色は、HeLa細胞、ヒト胎児腎臓293T（HEK293T）細胞、及びヒト肝細胞がんHepG2細胞にオレイン酸（OA；インビボでの主要な脂肪酸）を添加したときに、より安定して検出可能であった（脂肪生成が優勢な条件；図５Ａ〜Ｃ参照）。加えて、これらの細胞株及びヒト脂肪細胞は、内在的にミステリンを発現する（図５Ｄ参照）が、ＬＤに局在化したミステリンもまた検出可能である（図１Ｅおよび１Ｆ参照；以前に報告されたように（Kobayashi et al., 2015; Ohkubo et al., 2015）、また、図５Ｅ及びＦで再現されたように、内在性のミステリンの更なる良好な可視化はインターフェロン刺激によって発現上昇を必要とする）。細胞内分取は、過剰発現されたミステリンと内在性ミステリンが、HEK293T及びHepG2細胞において細胞質とＬＤに分布することを支持した（図５Ｇ〜Ｊ参照）。従って、ミステリンは、ＬＤに局在化するタンパク質である。
【００３６】
ＬＤに局在化するタンパク質に関して概ね２つの局在化経路が提案されている：ＥＲ−ＬＤの連結部位を介する（Ｉ型）及び細胞質から直接局在化する（ＩＩ型及びその他）（Kory et al., 2016）。前者の経路を通るいくつかのタンパク質は、疎水性ヘアピンモチーフによってＥＲ膜に最初に組み込まれ、その後、ＣＯＰＩ機構に依存した様式でＬＤに移送される（Soni et al., 2009; Wilfling et al., 2014）。mCherry-mstのＬＤへの分布は、ＣＯＰＩ機構の阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）に感受性ではなく（図１Ｇ）、このことは、ＡＴＧＬがＢＦＡに感受性のＬＤ分布を示すことと対照的である（図５Ｋ参照）。これらの結果は、ミステリンはＩ型のヘアピンモチーフを有するＬＤタンパク質ではないことを示唆する。むしろ、ミステリンの細胞質における相当量の分布（例えば、図１Ｂ及び５Ｈ参照）と膜画分における完全な欠如（図５Ｈ〜Ｊ参照）は、ミステリンが細胞質からＬＤに直接標的化されていることを示唆する。さらに、mCherry-mstは、ＬＤにおいて光退色後の相当量の蛍光回復（ＦＲＡＰ）を示した（図１Ｈ参照）。このことは、ＬＤに局在化したmCherry-mst（光退色した）と細胞質のmCherry-mst（光活性である）との間で分子交換が生じていることを示唆するものである。他のＬＤタンパク質（すなわち、ATGL、PLIN3/TIP-47、及びAUP1）と比較した場合、ＬＤにおけるmCherry-mstの比較的大きな最大回復率と短い半回復時間は、ＬＤへのミステリンの局在化が可逆的かつ迅速であることを示唆する（図４Ｌ及びＭ）。これらの結果から、ミステリンは、細胞質とＬＤとの間を直接的かつ迅速にシャトルしている可能性が高い。
【００３７】
mCherry-mstを一過的に過剰発現する細胞は、トランスフェクションされていない細胞よりも広範にわたってＬＤを形成した（図２Ａ参照）。ＬＤの定量分析によりＬＤの数とＬＤにより占められる面積は、ミステリン過剰発現細胞において顕著に増加することが明らかになった（図２Ｂ参照）。これに対して、CRISPR/Cas9媒介ノックアウト（ＫＯ）またはsiRNA媒介ノックダウンによるミステリンタンパク質の喪失は、ＯＡを添加されていても、ＬＤの有意な減少を起こした（図２Ｃ、２Ｄ、及び図６Ｃ参照；ノックアウト及びノックダウンの検証は、図６Ａ及びＢに示されている）。ＫＯ細胞株におけるＴＧ含有量の減少も又比色分析によるＴＧの定量により確認された（図６Ｄ参照）。これらの観察は、ミステリンが、細胞の脂肪貯蔵の維持に関係することを示唆する。
【００３８】
細胞の中性脂質の量は、細胞における脂肪生成と脂肪分解のバランスにより主に決定されており、そのいずれか又は両方がミステリンにより調節され得る。言い換えれば、ミステリンは、脂肪生成を促進する、及び／又は、脂肪分解を抑制して、脂肪の貯蔵を増加させる可能性がある。脂肪生成の阻害剤（トリアクシンＣ；脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素の阻害剤）又は脂肪分解の阻害剤（オルリスタット；一般的なリパーゼ阻害剤）の存在下でＬＤに対するミステリンの効果を再検証し、いずれの工程がミステリンにより影響を受けるのかを決定した。トリアクシンＣを添加することによってＴＧ合成の律速段階を遮断したときでも、mCherry-mstの過剰発現によるＬＤ増強に対する影響は維持された（図２Ｅ及び２Ｆ参照）。このことは、ＬＤに対するミステリンの効果は、主として脂質合成には依存しないことを示唆する。これに対して、オルリスタットによるＴＧ動員の阻害は、ＬＤに対するミステリンノックアウトの負の効果を大きく打ち消した（図２Ｇ及び２Ｈ参照）。このことは、ミステリンが、主に脂肪分解のプロセスに干渉することによってＬＤを増加させていることを示唆する。
【００３９】
ＴＧの脂肪分解は、３つのＬＤ表面のリパーゼであるATGL、HSL（ホルモン感受性リパーゼ）、及びMGL（モノアシルグリセロールリパーゼ）によって段階的に進んでいる(Walther and Farese, 2012）。これらの中で、ATGLは、律速であり、かつ最も影響力のあるリパーゼである（(Zimmermann et al., 2004; Zechner et al., 2017）。mCherry-mstを過剰発現する細胞は、ＬＤと会合したATGLの顕著な減少を示した（図３Ａ、o/eで示された細胞）が、多くのトランスフェクションされていない細胞は、ATGLによって高度に被覆されたＬＤを示した（図３Ａ、星印で示された細胞）。これと首尾一貫して、ミステリンＫＯ細胞は、ＬＤに付着したATGLの顕著な増加を示した（図３Ｂ及び３Ｃ参照）が、ＫＯ細胞において、ATGLそれ自体のタンパク質レベルには変動はなかった（図７−１Ａ参照）。従って、ミステリンは、細胞におけるATGLの総量ではなく、その分布に干渉した。PLIN3及びAUP1などの他のＬＤタンパク質は、mCherry-mstと部分的に共局在を示した（図３Ｄ及び図７−１Ｂ〜Ｄ参照）が、ATGLはミステリンとはそのような共局在を示すことはなかった（図３Ｅ参照）。過剰発現の条件下ではより大きな差が観察された。ミステリンは、常に（100％）過剰発現したPLIN3及びAUP1と共局在した（図７Ｅ及びＦ参照）が、過剰発現したATGLとは決して（0%）共局在を示さなかった（図７−２Ｍ参照。）従って、ＬＤ表面タンパク質に対するミステリンの除去効果は、少なくともある程度、特異的であると言える。ATGLのＬＤ分布は、ＬＤからの流入と流出によって主に決定されるはずである。そこで、ＢＦＡの添加によってＬＤへのATGLの流入を選択的に阻害することによって、ＬＤにおけるATGLの消失（流出）をモニターした。すると、ミステリンＫＤ細胞においては、ATGLの流出において明確な遅延は見いだせなかった（図７−１Ｇ参照）。このことは、ミステリンによるATGLの除去は、ＬＤからのATGLの流出の加速によるものではないことを示唆する。次に、ＢＦＡ除去後のATGLの回復（流入）についても確かめた。HeLa細胞は、ＢＦＡで２４時間前処理され、ＬＤからATGLが完全に除去された。ＢＦＡ除去後のATGLの回復は、ミステリンＫＤ細胞においてより顕著であった（図７−１Ｈ参照）。このことは、ミステリンはＬＤへのATGLの流入を防ぐことによってATGLを除去することを示唆する。この点は、FRAP測定によってより正確に評価された。GFP-ATGLの光退色後の蛍光の回復は、ミステリンＫＯ細胞において顕著に増大したが、ＬＤにおけるATGLの分子交換がミステリンＫＯ細胞においてより早いことを示すものである（図７−１Ｉ及び７−１Ｊ参照）。このことは、ＬＤにおけるATGLの流入、流出のいずれか、及び流入と流出の両方がＫＯ細胞においてより早いことを意味する。ミステリンの除去がＬＤにおけるATGLの蓄積に正に影響することを考えると、ATGLの流出ではなく流入がＫＯ細胞において主に加速していると考えられる（すなわち、内在性ミステリンは、ＬＤへのATGLの流入を妨げることによってＬＤにおけるATGLをおそらく低下させている）。対照的に、PLIN3-GFPは、野生細胞及びミステリンＫＯのHeLa細胞において、同様の蛍光回復曲線を示したが、このことはミステリンによる除外効果が非特異的なものではないことを示唆するものである（図７−２Ｋ及びＬ参照）。驚くべきことに、ミステリンとATGLとの間に生じる特異的な除外イベントは一方向性ではなかった。ATGLの過剰発現は、ＬＤからミステリンを逆に除去したが（図７−２Ｍ参照）、このような効果は、過剰発現させたPLIN3またはAUP1では認められなかった（図７−１Ｅ及び７−１Ｆ参照）。従って、ミステリンとATGLとは、ＬＤ局在に関して互いに特異的に競合する可能性が高い（図７−２Ｎ参照）。しかしながら、ミステリンとATGLとの間の物理的相互作用については認められていない（図７−２Ｏ参照）。このことは、ミステリンとATGLとは第三の因子を介して互いに干渉している可能性を示唆する（例えば、両タンパク質のＬＤへの局在を促進する共通のアンカータンパク質に関する競合など）。ミステリンのノックアウトは、図２に示されるようにＬＤを有意に不安定化させた。しかし、この効果は、siRNAによるATGLの追加的ノックダウンによって打ち消された（図３Ｆ；ノックダウン効率は図７−２Ｐに示される）。これらの結果は、ミステリンによるＬＤの安定化効果は、ＬＤからの律速となるリパーゼであるATGLの特異的除去に起因することを示唆する。
【００４０】
ミステリンは、２つのＡＡＡ＋ドメインとＲＩＮＧフィンガードメインにおいてＡＴＰアーゼ活性とユビキチンリガーゼ活性とをそれぞれ発揮する（Liu et al., 2011; Morito et al., 2014）。そこで、ＬＤ形成におけるこれらの活性の関与について検証した。図４Ａは、この研究において用いられた酵素学的な変異を図解したものである。Ａ１Ａ２は、ＡＴＰ結合モチーフ（Ａモチーフ）において２つの本質的変異を有し、Ｂ１Ｂ２は、ＡＴＰの加水分解に必須のＭｇ結合モチーフ（Ｂモチーフ）において２つの本質的変異を有する。従って、これらの変異体は、ＡＴＰ結合活性を失うか（Ａ１Ａ２）、ＡＴＰの加水分解活性を失う（Ｂ１Ｂ２）ものである（Morito et al., 2014）。Ｎ末端にmCherryを有するこれらの変異体はいずれも、ＬＤに局在化することはなく、細胞質全体に分散した（図４Ｂ）。このことは、ミステリンのＬＤへの局在化には、ＡＴＰ結合活性及び加水分解活性が本質的に関与していることを示すものである。ある種のＡＡＡ＋タンパク質（例えば、カタニンやVps4）とのアナロジーを考慮すると、ミステリンのＬＤへの会合と解離は、おそらくＡＴＰの結合と加水分解のサイクルとシンクロナイズしている。
【００４１】
ＲＩＮＧフィンガーユビキチンリガーゼドメインを欠損した変異体（ΔＲＩＮＧ）も、分布を変化させた。しかし、その様相はＡＴＰａｓｅ変異体で観察されたものとは異なっていた。Ｎ末端にmCherryを有するΔＲＩＮＧ変異体（mCherry-ΔRING）は、異常な凝集体様のパターンを示し、多くの細胞（〜８０％）においてＬＤ局在能を喪失した（図４Ｃの左パネル）。ＬＤに上手く局在化したΔRING変異体は、ATGLに対して排他的効果を維持していた（図８Ａ参照）。このことは、ATGLの除去は、ミステリンによるATGLのユビキチン化を介して生じるものではないことを示唆する。むしろ、ミステリンのユビキチンリガーゼ活性は、適切なＬＤへの分布のための自身の維持又は制御に関与しているようであった。ミステリンのユビキチンリガーゼ活性は、自身に対して発揮され（自己ユビキチン化）、ΔRING変異体では失われるとのこれまでの知見（Liu et al., 2011）は、ミステリンの自己維持又は自己制御モデルを支持し得る。
【００４２】
期待されるように、ミステリンのＬＤへの分布とその脂肪安定化効果は、相互に関連していた。Ａ１Ａ２変異体及びＢ１Ｂ２変異体は、ＬＤに対して正の効果を示さなかった（図４Ｄ）。ΔRING変異体は、凝集体様パターン（ａｇｇ）を示すが、ＬＤに対する正の効果を失った一方で、少数の細胞で認められたＬＤへの局在（ＬＤ）を維持した変異体は、一定のＬＤ安定化効果を示した（図４Ｄ）。従って、ミステリンのこの２つの酵素活性は、その脂肪安定化機能にいずれも関与するものであると言える。
【００４３】
ミステリンの代謝機能におけるＲＩＮＧフィンガードメインの関与は、もやもや病（MMD）の病因論を考えると特に重要である。ＲＩＮＧフィンガードメイン内の保存されたシステイン／ヒスチジン残基の４つの変異が、白色人種のＭＭＤ症例において最近同定された（C3997Y, H4014N, C4017S, 及びC4032R）（図４Ｅ参照）（Guey et al., 2017; Raso et al., 2016; Cecchi et al., 2014）。Ｃ末端に３×ＦＬＡＧタグを有する４つの変異体全てがＬＤ局在を失ない、かつ、ΔＲＩＮＧ変異体で観察されたのと非常に似た凝集体様構造形成を示すことが明らかとなった（図４Ｆ参照）。これらの変異体は代謝効果も失っていた（図４Ｇ）。このことは、白色人種のＭＭＤにおける異常なＬＤ代謝の病原性の関連を示唆するものである。これに対して、他のＭＭＤにおいて変異体である、推定される機能構造を有しないＣ末端領域の東アジア人のR4810K、及びRINGフィンガードメインにおける非保存的残基である東アジア人／白色人種のD4013N（(Liu et al., 2011）は、検出可能な異常を引き起こさなかった（図８Ｂ及びＣ参照）。そのような効果の欠失は、これらの推定上の構造的に非本質的位置に起因する可能性が高い。加えて、これらの変異体の分子的効果の不均質な強度は、ＭＭＤにおけるこれらの多様な病原性効果を説明しうる。
【００４４】
考察
ミステリンの細胞内分布の詳細な分析によって、ミステリンがＬＤへ標的化されること、及びＬＤからのATGLの選択的な除去による細胞の脂肪貯蔵の正の制御因子として機能することが明らかとなった。ATGLにより開始される多段階のＴＧの動員は、細胞の／生命体のエネルギー代謝における重要な位置を占め、カテコールアミン及びインスリンにより刺激された因子／経路を含む、複数の因子／経路によって制御されている（Zechner et al., 2017）。内在性のミステリンのノックダウン／ノックアウトが細胞における有意な脂肪の喪失を引き起こしたことは、インビボにおける脂肪貯蔵の維持にミステリンが関与していることを示唆する。
【００４５】
ミステリンのＬＤ局在及び脂肪安定化効果は、その酵素活性を必要とする。安定なオリゴマー（６量体と思われる）を形成する多くのＡＡＡ＋タンパク質とは異なり、ミステリンは、動的にそのオリゴマー状態（６量体と思われる）を変更する。ミステリンは、第１のＡＡＡ＋モジュールでＡＴＰに結合するとオリゴマーを形成し、第２のＡＡＡ＋モジュールにおいて別のＡＴＰが加水分解すると解離した（図８Ｄ参照）（Morito et al., 2014）。ミステリンＡ１Ａ２変異体及びＢ１Ｂ２変異体は、これらのＡＴＰ結合活性及び加水分解活性をそれぞれ喪失しており、それぞれモノマー及びオリゴマー状態において部分的にオリゴマー形成／解離サイクルが停止する（Morito et al., 2014）。これらの変異体においては、共通してＬＤへの局在化が損なわれており（図４Ｂ参照）、このことは、ミステリンのＬＤへの局在化は、静的状態（すなわち、モノマー又はオリゴマー）によって単に決定されるのではなく、ＡＴＰ結合／加水分解の動的サイクルを介して制御されていることを示唆するものである。ミステリンのオリゴマー化サイクルは、いくつかの例外的なＡＡＡ＋メンバーと類似していた。カタニン及びＶｐｓ４はＡＴＰと結合した状態で、それぞれ微小管及びESCRT-IIIなどの標的タンパク質複合体上でオリゴマー化する（図４Ｈ参照）（Ogura and Wilkinson, 2001）。そして、ＡＴＰの加水分解の際にこれらの標的複合体の分解を媒介した後、拡散するモノマー形態に戻る（図４Ｈ参照）。ミステリンは、ＡＴＰの結合／加水分解サイクルと共役して標的ＬＤ上（又は表面タンパク質上）で同様に集合し、解離しうる（図４Ｉ参照）。カタニン及びＶｓｐ４においては、これらの基質複合体に直接的に結合してこれらの解離を媒介するが、ミステリンとATGLとの間には何らの物理的相互作用は認められず（図７−２Ｏ参照）、ＬＤにおいて既に存在しているATGLの流出についての明らかな促進は認められなかった（図７Ｇ参照）。仮にミステリンがカタニン及びＶｓｐ４と同様の活性を発揮するとしても、その直接的な標的はATGLでは無いはずである。合理的なシナリオとしては、ミステリン及びATGLは、両タンパク質のＬＤへの局在を促進する共通のアンカータンパク質への結合に関して互いに競合するというものである（図７−２Ｎ参照）。ミステリンは、そのＡＡＡ＋活性を用いて推定されるアンカータンパク質に影響し得、ＬＤへのATGLの流入を防ぐ。逆に、ATGLは、アンカータンパク質を独占し得て、ＬＤからミステリンを除去する。
ミステリンのＬＤへの標的化は、そのユビキチンリガーゼ活性により影響を受ける。ΔＲＩＮＧ変異体と白色人種のモヤモヤ病システイン／ヒスチジン変異体は、ＬＤからの実質的な脱離を示し、凝集体様パターンの形成を示した（図４Ｃ及び４Ｆ）。このことは、ミステリンの自身に対するユビキチンリガーゼ活性（自己ユビキチン化）が、他のユビキチンリガーゼにおいて見出されるのと同様（Baldridge and Rapoport, 2016）自己維持又は自己制御機能を発揮することを示唆する。
【００４６】
もやもや病の観点からは、今回の知見は、事前に予測することは困難であった。従前の病因論研究では、肥満や脂質異常症などの代謝異常ともやもやの関連は想定されていなかった（Scott and Smith, 2009）。組織病理学研究では、病変部において血管平滑筋細胞の肥厚化と血管内腔での血栓形成などが認められるが、アテローム硬化性の変化は典型的には認められていない（Scott and Smith, 2009）。従って、もやもや病は、脂質代謝と密接に関連するとはこれまで考えられてこなかった。しかしながら、RINGフィンガードメインにおける複数のもやもや病変異がミステリンの代謝機能を損なわせたという今回の知見は、もやもや病と脂肪異常との潜在的な関連を示唆するものである。心血管障害を含むヒトの障害の範囲は、様々な細胞／組織におけるＬＤの機能異常及び／又は制御異常（変異ＬＤタンパク質によりしばしば引き起こされる）と関連している（Krahmer et al., 2013）。しかし、もやもや病においては、いずれの細胞／組織（例えば、血管内皮、平滑筋、内皮前駆細胞、又は免疫細胞）が主要な障害を形成するのかは知られていない（Scott and Smith, 2009）。ミステリン変異体の異常な凝集様構造は、多くの神経変性疾患において見られるように細胞傷害作用を発揮すると考えられ（Labbadia and Morimoto, 2015）、もやもや病と脂質代謝異常の関連がほとんど報告されていないことを踏まえて、この細胞障害がもやもや病の主因であると考えられる。
ＲＩＮＧフィンガードメインにおける白色人種のシステイン／ヒスチジン変異体の顕著な局在／機能異常とは異なり、推定される非本質的部位における東アジア人のR4810K変異体及び東アジア人／白色人種のD4013N変異体は、ミステリンの代謝機能を明確には変化させなかった。この事実は、これらの変異体の遺伝浸透度の度合いを説明し得る。R4810K及びD4013Nの保有者は、もやもや病に感受性であるが、常に発症するわけではないが（すなわち、遺伝浸透度がとても低い／不完全である）、システイン／ヒスチジン変異体の保有者は常にもやもや病を発症した（すなわち、その遺伝浸透度は、とても高い／完全である）（Raso et al., 2016; Liu et al., 2011; Kamada et al., 2011; Guey et al., 2017; Cecchi et al., 2014）。R4810K及びD4013Nは、ミステリンの代謝機能に対して中程度又は非常に軽微な効果のみを発揮し得、これまでの病因論及び遺伝学的研究において繰り返し議論されてきたように、追加の環境的及び／又は遺伝的要因（例えば、炎症）があった場合にのみ、もやもや病発症の切っ掛けとなると考えられる（Scott and Smith, 2009; Koizumi et al., 2016）。
【００４７】
今回の結果から、ミステリンは、中性脂肪の貯蔵のために特化した、偏在的オルガネラである脂肪滴を包み込み、脂肪滴表面からＡＴＧＬリパーゼの除去を介して脂肪滴を安定化することが示された。ミステリンの正しい脂肪滴への局在化には、ＡＴＰアーゼ活性とユビキチンリガーゼ活性の両方が必要である。ミステリンの正しい脂肪滴への局在化は、ユビキチンリガーゼドメインにおける白人のもやもや病変異によって顕著に障害される。これらの知見から、ミステリンが細胞内の脂肪貯蔵機構の新しい構成要素であることが明らかとなった。また、もやもや病の発症と遺伝的変異などを原因とするミステリンの異常凝集様構造形成との関連が示唆される。
【００４８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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