(57)【要約】      （修正有）【課題】ステビア抽出物に含まれる物質の中でＯＰＨ活性増強作用に真に寄与する物質を見出し、増強作用に優れるＯＰＨ活性増強剤を提供する。【解決手段】ステビオール配糖体を有効成分として含有するＯＰＨ活性増強剤。また、かかるＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とするＯＰＨ活性増強用の食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品及び化粧品。前記ステビオール配糖体は、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ及びズルコシドＡのうちのいずれか一である、ＯＰＨ活性増強剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体を有効成分として含有することを特徴とするＯＰＨ活性増強剤。
【請求項２】
前記ステビオール配糖体は、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ及びズルコシドＡのうちのいずれか一である請求項１に記載のＯＰＨ活性増強剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用食品。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用食品添加物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用医薬品。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用医薬部外品。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用化粧品。
【請求項８】
ステビオール配糖体を有効成分として含有するとともにステビア抽出物のステビオール配糖体以外を含有しないことを特徴とするＯＰＨ活性増強剤。
【請求項９】
前記ステビオール配糖体は、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ及びズルコシドＡのうちのいずれか一である請求項８に記載のＯＰＨ活性増強剤。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用食品。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用食品添加物。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用医薬品。
【請求項１３】
請求項８又は９に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用医薬部外品。
【請求項１４】
請求項８又は９に記載のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化蛋白質を分解する生体内酵素である酸化蛋白質分解酵素（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ：ＯＰＨ）の活性を増強させるＯＰＨ活性増強剤、及び、当該ＯＰＨ活性増強剤を含有する飲食品や医薬品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＯＰＨは、蛋白のＮ末端アシル化アミノ酸を遊離するセリンプロテアーゼの一種で、アシルアミノ酸遊離酵素（ａｃｙｌａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ：ＡＡＲＥ）、アシル化ペプチド分解酵素（ａｃｙｌｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ：ＡＰＨ）などとも言われている。また、ＯＰＨは、アシル化だけでなく、ホルミル化（Ｆｏｒｍｙｌ）、アセチル化（Ａｃｅｔｙｌ）、ブチル化（Ｂｕｔｙｌ）、プロピル化（Ｐｒｏｐｙｌ）された蛋白質のＮ末端アミノ酸に対しても作用する。
【０００３】
ＯＰＨはブタ肝臓、ラット脳、ヒト血液、角層などの生体組織に広く存在している。ＯＰＨは酸化蛋白質や糖化蛋白質を優先的に分解するとともにプロテアソームと協働して老化蛋白質を分解すること、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβ蛋白質を減少させることが報告されている。またＯＰＨがＡＧＥｓ（終末糖化産物）を分解することも確認されている。これらのことから生体中のＯＰＨの活性を増強させることは、老化蛋白質の分解を促進し、老化や疾患を予防・治療できる可能性がある（特許文献１）。
【０００４】
また、ＯＰＨには血中の有機リン系農薬の分解作用（非特許文献１）や、前立腺がんの抑制作用（非特許文献２）、眼レンズ水晶体物質であるクリスタリンの重合抑制作用（非特許文献３）、骨髄腫の抑制作用（非特許文献４）、農薬（クロルフィリホス）による細胞死の抑制（非特許文献５）などがあることも報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２０１４／１２６１９９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gary B. Quistad, Rebecka Klintenberg, and John E. Casida,  Blood acylpeptide hydrolase activity is a sensitive marker for exposure to some organophosphate toxicants. TOXICOLOGICAL SCIENCES 86(2), 291-299 (2005)
【非特許文献２】Christopher A McGoldrick1, Yu-Lin Jiang, Victor Paromov, Marianne Brannon, Koyamangalath Krishnan and William L Stone,  Identification of oxidized protein hydrolase as apotential prodrug target in prostate cancer. http://www.biomedcentral.com/1471-2407/14/77
【非特許文献３】R. Senthilkumar, P. Neelakanta Reddy AND K. Krishna Sharma,  Studies on trypsin-modified bovine and human lens acylpeptide hydrolase. Exp. Eye Res. (2001) 72, 301±310
【非特許文献４】Rosanna Palumbo, Marta Gogliettino , Ennio Cocca, Roberta Iannitti, Annamaria Sandomenico, Menotti Ruvo, Marco Balestrieri, Mose Rossi and Gianna Palmieri,  APEH inhibition affects osteosarcoma cell viability via downregulation of the proteasome. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1614
【非特許文献５】Diana Cardona, Caridad Lopez-Granero, Fernando Canadas, Jordi Llorens, Pilar Flores, Floria Pancetti and Fernando Sanchez-Santed,  Does-dependent regional brain acetylcholinesterase and acylpeptide hydrolase inhibition without cell death after chlorpyrifos administration. The Journal of Toxicological Sciences Vol.38, No.2, 193-203, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ある種の植物の抽出物にＯＰＨ活性増強作用があることも報告されている（特許文献１）。一方で、それら抽出物には多種多様な物質が含まれており、ＯＰＨ活性を減弱させる物質が含まれることも少なくない。つまり、ＯＰＨ活性増強作用を示す植物抽出物に含まれる物質のうち、いずれの物質がＯＰＨ活性増強作用に寄与する物質であるかということは多くの場合不明である。
【０００８】
例えば、特許文献１にはステビアの抽出物にＯＰＨ活性増強作用があることが示されている。しかし、当該抽出物に含まれる物質の中でＯＰＨ活性増強作用に寄与する物質は示されていない。そこで、本発明は、ステビア抽出物に含まれる物質の中でＯＰＨ活性増強作用に真に寄与する物質を見出し、ステビア抽出物に対してＯＰＨ活性増強作用に優れるＯＰＨ活性増強剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、ステビオール配糖体を有効成分として含有するＯＰＨ活性増強剤を提供する。
【００１０】
また、ステビオール配糖体を有効成分として含有するとともにステビア抽出物のステビオール配糖体以外を含有しないことを特徴とするＯＰＨ活性増強剤を提供する。
【００１１】
また、前記いずれか一のＯＰＨ活性増強剤を含有することを特徴とする、ＯＰＨ活性増強用食品、ＯＰＨ活性増強用食品添加物、ＯＰＨ活性増強用医薬品、ＯＰＨ活性増強用医薬部外品及びＯＰＨ活性増強用化粧品を提供する。
【００１２】
本発明により、酸化蛋白質を分解する生体内酵素であるＯＰＨの活性を増強させるＯＰＨ活性増強剤などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】既知のステビオール配糖体とステビオールを示す表
【図２】ステビオール骨格と、その１９位の炭素と４３位の炭素に結合される糖の構造
【図３】各試料となったステビオール配糖体とそれぞれの溶解溶媒及びＯＰＨ活性増強作用を示す表
【図４】ステビオール配糖体を試料として行った試験を市販の２種のステビア抽出物の溶液に対して行った結果を示す表
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施形態＞
＜構成＞
【００１５】
本実施例に係るＯＰＨ活性増強剤は、ステビオール配糖体を有効成分として含有するＯＰＨ活性増強剤である。「ＯＰＨ活性増強剤」とは、酸化蛋白質の分解酵素であるＯＰＨの酸化蛋白質分解活性（以下、単にＯＰＨ活性）を増強させる剤を意味する。
【００１６】
「ステビオール配糖体」は、ステビオール骨格を有する配糖体である。図１に、現在において既知のステビオール配糖体とステビオールを示す。表中のＲ１（Ｃ１９）はステビオール骨格の１９位の炭素と結合される糖であり、Ｒ２（Ｃ４３）はステビオール骨格の４３位の炭素と結合される糖である。
【００１７】
図２に、ステビオール骨格と、その１９位の炭素と４３位の炭素に結合される糖の構造を示す。結合される糖は、グルコース（Glucose）、ラムノース（Rhamnose）及びキシロース（Xylose）である。
【００１８】
本実施例におけるＯＰＨ活性増強剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該ＯＰＨ活性増強剤を含有するＯＰＨ活性増強用の食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。
【００１９】
例えば、医薬品とする場合には、本実施例のＯＰＨ活性増強剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて製造することができる。また、食品とする場合には、各植物を適宜乾燥や破砕をし、湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態に整形して食品として提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品にＯＰＨ活性増強剤を添加した態様で提供することもできる。
【００２０】
また、美容液、クリーム、ローションなどの化粧品とすることもできる。例えば、美容液とする場合には、本実施例のＯＰＨ活性増強剤の他、水、コメヌカ油、ペンチレングリコール、グリセリン、スクワラン、パルミチン酸セチル、ダイマージリノール酸などを主成分とし、ヒアルロン酸Ｎａ、水添ナタネ油アルコール、カルボマー、キサンタンガム、水酸化カリウム、ジメチコン、ポリソルベート−６０、ステアリン酸グリセリル、水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、尿素、アルギニン、アルブチン、クエン酸などを添加剤とする。そして、各成分を水溶性原料・油溶性原料に分けて溶解してから、それらを加熱して混合・乳化する。これを冷却しながらエキスなどの添加物を配合し、さらに低温になったところで精油や香料などの揮発性の高いものを添加する。その後、所定の安全性の検査（菌、ｐＨ、温度安定性、粘度等）を行い、瓶などに充填して製品として提供することができる。
【００２１】
なお、本実施形態のＯＰＨ活性増強剤は、ステビオール配糖体を有効成分として含有するとともにステビア抽出物のステビオール配糖体以外を含有しないことが好ましい。後述する試験によって示すが、ステビア抽出物のステビオール配糖体以外の物質にはＯＰＨ活性を減弱させる物質も含まれるからである。
＜試験＞
【００２２】
本試験において、ステビオール配糖体のＯＰＨ活性の増強作用について測定する。本測定ではＯＰＨとその反応基質であるＮ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ  ｐ−ｎｉｔｒｏ−ａｎｉｌｉｄｅ（ＡＡＰＡ）との反応系に試料溶液を添加し、ＯＰＨの酵素反応への影響を評価した。
【００２３】
本試験において試料として用いたステビオール配糖体は、図１に示した既知のステビオール配糖体のうち市販され入手可能であるステビオールビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｌｂｉｏｓｉｄｅ）、ステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ａ）、レバウジオシドＢ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｂ）、レバウジオシドＣ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｃ）、レバウジオシドＤ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｄ）、レバウジオシドＦ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｆ）及びズルコシドＡ（ＤｕｌｃｏｓｉｄｅＡ）である。このうちステビオシドは東京化成工業株式会社製で、その他は富士フィルム和光純薬株式会社製である。なお、ステビオールモノシド（Ｓｔｅｖｉｏｌｍｏｎｏｓｉｄｅ）については入手することができず試料とすることはできなかった。また、ルブソシド（Ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ）のＯＰＨ活性増強作用については、本発明者らにより既に示されている（特開２０１８−２６３１号公報）ため、本試験の試料とはせず、ポジティブコントールとした。
＜測定方法＞
【００２４】
ＯＰＨとしてａｃｙｌａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＡＲＥ）（タカラバイオ社）を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて０．０２５Ｕ／ｍＬに調製した。また、反応基質としてＡＡＰＡ溶液（ＢＡＣＨＥＭ社）を、５０％エタノール液で２５ｍｍｏｌ／Ｌに調製した。
【００２５】
反応緩衝液として、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた。また、ポジティブコントロールとして１ｍｇ／ｍＬのルブソシド、ネガティブコントロールとして１ｍｇ／ｍＬのＥＧＣｇ（エピガロカテキンガレート）を用いた。
【００２６】
そして、マイクロプレート１ウェルに、試料１０ｕＬ、０．０２５Ｕ／ｍＬ ＯＰＨ １０ｕＬ、反応緩衝液２１０ｕＬを入れて、３７℃で６０分間予備加温（プレインキュベーション）した。一旦、室温に戻してから、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＡＰＡ溶液（基質液）２０ｕＬを加え、よく混合してＯＰＨ反応を開始した。反応は３７℃の恒温槽で行った。
【００２７】
３０分、あるいは６０分間隔でマイクロプレートを恒温槽から取り出し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、ＯＰＨ反応によって生じるｐＮＡ（パラニトロアニリン）を測定した。
【００２８】
そして、ＯＰＨの活性の増強作用は、１時間当たりの吸光度変化量（反応速度）を求めるとともに、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｒｅｆ）として試料無添加時の反応速度を求め、下式に従ってＲｅｆの反応速度を１００％とした時の活性増強作用を算出した。
（式）ＯＰＨ活性増強作用（％）＝（試料のＯＰＨ反応速度／ＲｅｆのＯＰＨ反応速度）×１００
＜測定結果＞
【００２９】
図３は、各試料となったステビオール配糖体とそれぞれの溶解溶媒及びＯＰＨ活性増強作用（％表示、平均値±標準偏差）を示すものである。図示するように、いずれのステビオール配糖体もポジティブコントロールであるルブソシドに対して優れたＯＰＨ活性増強作用を有することが分かった。
【００３０】
また、図４は、上記試験を市販の２種のステビア抽出物の溶液に対して行った結果を示すものである。試料は、それぞれの抽出溶液の原液、１０倍希釈、１００倍希釈とした。
【００３１】
図示するように、いずれの試料においても１０倍希釈した最終濃度０．４％のＯＰＨ活性増強作用がもっとも優れていた。しかしながら、ポジティブコントロールのルブソシドのＯＰＨ活性増強作用に対して劣るものであり、ルブソシドに対して優れたＯＰＨ活性増強作用を示したステビオール配糖体との優劣は明らかである。
【００３２】
また、いずれの試料についても最終濃度４％におけるＯＰＨ活性増強作用は、最終濃度０．４％のＯＰＨ活性増強作用に対して劣っている。すなわちステビア抽出物にはＯＰＨ活性増強作用を有する物質を含む一方で、これに反する作用を有する物質が含まれることが分かる。
【００３３】
これらの結果により、ステビア抽出物に含まれる物質のなかでＯＰＨ活性増強作用に寄与する物質がステビオール配糖体であることが明らかになった。そして、単なるステビア抽出物に対してＯＰＨ活性増強作用に優れるＯＰＨ活性増強剤を提供することが可能となった。
【００３４】
したがって、本実施形態のＯＰＨ活性増強剤は、ステビオール配糖体を有効成分として含有するとともにステビア抽出物のステビオール配糖体以外を含有しないことが好ましい。
＜効果＞
【００３５】
本実施形態により、ステビオール配糖体を有効成分として含有するＯＰＨ活性増強剤などを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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