(57)【要約】      （修正有）【課題】ＡＤ及び他の神経変性疾患を治療するためにｔａｕ凝集体及びタウオパシー進行を防ぐ治療法を提供する。【解決手段】特定の配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号３６又は３８
の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体。
【請求項２】
前記ＶＨの前記抗原結合部位は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２
（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）が、それぞれ配列番号７、８、及び９又は１３、１
４、及び１５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬの前記抗原結合
部位は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）が、それ
ぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２
及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨ
Ｆ−ｔａｕに結合する、請求項１又は２に記載の単離抗体。
【請求項４】
前記ＶＨの前記抗原結合部位は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が、それぞれ
配列番号７、８、及び９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬの前
記抗原結合部位は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、
１１、及び１２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の単離
抗体。
【請求項５】
配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列番号３８のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨ
Ｆ−ｔａｕに結合する請求項１又は２に記載の単離抗体。
【請求項６】
前記ＶＨの前記抗原結合部位は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が、それぞれ
配列番号１３、１４、及び１５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記Ｖ
Ｌの前記抗原結合部位は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号
１６、１７、及び１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項５に記載
の単離抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ヒト化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項８】
配列番号３５のＶＨの抗原結合部位及び配列番号３６のＶＬの抗原結合部位、又は配列
番号３７のＶＨの抗原結合部位及び配列番号３８のＶＬの抗原結合部位を含むモノクロー
ナル抗体とＰＨＦ−ｔａｕとの結合に競合する単離抗体又は断片。
【請求項９】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号７、８、及び９、又はそ
れぞれ配列番号１３、１４、及び１５である、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を
含む抗体ＶＨをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２、
又はそれぞれ配列番号１６、１７、及び１８である、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤ
Ｒ３を含む抗体ＶＬをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生される抗体を回収す
ることを含む、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年１２月２０日出願の米国仮出願第６１／５７７，８１７号の利益を
主張し、その内容全体を参照することにより本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、抗ＰＨＵ−ｔａｕ抗体、並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至ら
しめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴と
する、退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者の進行性精神機能不全（認知症）の非常に一
般的な原因であり、米国では４番目に多い死亡の医学的原因を表すと考えられている。Ａ
Ｄは、世界中の民族で観察され、現在及び未来の主たる公衆衛生の問題を提示する。
【０００４】
ＡＤ個体の脳は、老人性（又はアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管におけるアミ
ロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数
、特にアミロイド斑及び対らせん状細線維の神経原線維変化は、一般にＡＤ患者の記憶及
び認知機能に重要なヒトの脳の幾つかの領域で見られる。
【０００５】
ＡＤ及び幾つかの他の神経変性疾患における神経原線維変性の主なタンパク質成分は、
高リン酸化形態の微小管結合タンパク質ｔａｕである。ｔａｕ凝集体を予防又はクリアラ
ンスする治療法の開発は、長年にわたって関心の対象であるが、抗凝集化合物及びキナー
ゼ阻害剤を含む候補薬物は、臨床試験が始まったばかりである（Ｂｒｕｎｄｅｎ等．Ｎａ
ｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ８：７８３〜９３，２００９）。
【０００６】
最近、ｔａｕについての能動及び受動免疫が治療可能性を有している可能性があるとい
う前臨床的エビデンスが、トランスジェニックｔａｕマウスモデルにおいて得られた（Ｃ
ｈａｉ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３４４５７〜６７，２０１１，Ｂｏｕｔａ
ｊａｎｇｏｕｔＣｈａｉ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １１８：６５８〜６７，２０１１
，ＢｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔＣｈａｉ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０：１６５５９〜６
６，２０１０，ＡｓｕｎｉＣｈａｉ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：９１１５〜２９，
２００７）。最近、タウオパシーの伝達及び拡散仮説が報告されたが、これは、ヒト脳に
おけるタウオパシー進行のＢｒａａｋ段階と前臨床的ｔａｕモデルにおけるｔａｕ凝集体
を注射した後のタウオパシー拡散に基づいている（ＦｒｏｓｔＣｈａｉ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  ２８４：１２８４５〜５２，２００９，ＣｌａｖａｇｕｅｒａＣｈａｉ等、
Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：９０９〜１３，２００９）。したがって、ＡＤ及び
他の神経変性疾患を治療するためにｔａｕ凝集体及びタウオパシー進行を防ぐ治療法が必
要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位
と配列番号３６又は３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕ
に結合する単離抗体である。
【０００８】
本発明の別の態様は、特定の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域を含むＰＨＦ−ｔａｕに結
合する単離抗体である。
【０００９】
本発明の別の態様は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原
結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。
【００１０】
本発明の別の態様は、配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列番号３８のＶＬの抗原
結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。
【００１１】
本発明の別の態様は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原
結合部位とを含むか、又は配列番号３７のＶＨの抗原結合部位及び配列番号３８のＶＬの
抗原結合部位を含むモノクローナル抗体とＰＨＦ−ｔａｕとの結合について競合する単離
抗体又は断片である。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドである
。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生される抗
体を回収することを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を製造する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＡＴ８の競合を示す。
【図２】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＰＴ１の競合を示す。
【図３】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＰＴ３の競合を示す。
【図４】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＡＴ１００の競合を示す。
【図５】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＨＴ７の競合を示す。
【図６】図に示す通り生理食塩水、マウスＩｇＧ１、ＰＴ３、又はＡＴ８で処理した５月齢のメスのＰ３０１Ｌトランスジェニック動物、又は未処理非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の脳幹ホモジネート（画分Ｐ１）におけるリン酸化ｔａｕの分析である。捕捉抗体としてＡＴ８（左のパネル）又はＡＴ１００（右のパネル）、次いでビオチン化−ＨＴ７及びアビジン−ＨＲＰを用いてＥＬＩＳＡを行った。非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の平均サンプルと同じＥＬＩＳＡシグナルを提供するＡＤ脳ホモジネートの相対量（ｎｇ／ｍＬ）としてＥＬＩＳＡシグナルをプロットする。平均＋／−Ｓ．Ｄ．と共にデータを個々にプロットし、ＰＴ３処理動物とＩｇＧ１処理動物との間の差についてのｐ値を示す。（Ｂ）は、ＡＴ１００を用いた、ＩｇＧ１処理動物又はＰＴ３処理動物由来の脳幹ホモジネート画分Ｐ１のウエスタンブロットである。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ１０）で処理した１０匹の動物、及びＰＴ３（ＰＴ３−１、ＰＴ３−２、ＰＴ３−７〜ＰＴ３−１０）で処理した７匹の動物のホモジネートから得られたシグナルを示す。アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図７】図に示す通りＰＴ３又はアイソタイプ対照（ＩｇＧ）で処理した５月齢のメスのＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスに由来するサルコシル可溶性（ｐＴ４可溶性）皮質ホモジネート中の合計ｔａｕレベル、不溶性（ｐＴ４不溶性）皮質ホモジネート中の合計ｔａｕレベル、及び不溶性（ＡＴ８不溶性）皮質ホモジネート中のリン酸化ｔａｕレベルである。レベルは、平均＋／−ＳＤと共に個々にプロットされたＥＬＩＳＡのシグナルの尺度として示す。サンプル１ｍ  ｉｎｊは、ｔａｕ凝集体を注射したＰ３０１Ｌマウス脳に由来するポジティブコントロールサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「抗体」は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒ
ト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並び
に抗体断片を含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
【００１８】
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖であ
る。抗体の構造は、周知である。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列をも
とに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類すること
ができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及
びＩｇＧ４のアイソタイプに更に分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常
領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイ
プのうちの１つに分類することができる。
【００１９】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を意味する。抗体断片の例としては、Ｆ
ａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片、ＣＤＲ，抗原結合部位、重鎖又は軽鎖可
変領域、二重特異性抗体、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つのインタクトな抗体又はそ
の断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００２０】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワ
ーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下の様々な表現を使用して定義されている。（
ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜５０，１９７０）。一般的に、抗原結合部位は、各
可変領域（重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並
びに軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に３つの
ＣＤＲを有する（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａ
ｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔ
ｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」
、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによって定義されている通り構造が超可
変的である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ  Ｍ
ｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１〜１７，１９８７）。一般的に、抗原結合部位は、各Ｖ
Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。Ｃ
ｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼ん
でいる。ＣＤＲ及びＨＶの付番体系及び注釈は、最近、Ａｂｈｉｎ及びＭａｒｔｉｎによ
り改訂された（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５
：３８３２〜９，２００８）。（ｉｉｉ）免疫グロブリン由来のＶドメインとＴ細胞受容
体との比較に基づいた、抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌ
ｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）に
より提案されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（Ｉ
ＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これら領域の
標準的な付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの記述間の対応につい
ては、Ｌｅｆｒａｎｃ等の上記に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は特異性決定残
基の使用（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２
〜４３，２００４）に基づいて概説することもできる。特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗
原との接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
【００２１】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位の配列であると定義
されるもの以外の、抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は
、上述したような様々な表現により決定され得るため、正確なフレームワーク配列は、抗
原結合部位の定義に依存する。
【００２２】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質な抗体の集団
から得られる抗体（又は抗体断片）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高
く、通常、単一の抗原決定基に対する。
【００２３】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分
を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は多糖類側鎖等の部
分の化学的に活性な（例えば、極性、非極性又は疎水性の）表面分類からなり、特定の３
次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは事実上直鎖状であってもよく
、又はアミノ酸の直線状の配列ではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関
係によって形成される不連続エピトープ（例えば、立体構造エピトープ）であってもよい
。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間
で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。
【００２４】
ｔａｕは、多数の周知のアイソフォームを有する豊富な中枢及び末梢神経系タンパク質
である。ヒトのＣＮＳでは、オルタナティブスプライシングによって３５２〜４４１のサ
イズの６種の主なｔａｕアイソフォームが存在する（Ｈａｎｇｅｒ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍ
ｏｌ  Ｍｅｄ  １５：１１２〜９，２００９）。これらアイソフォームは、０〜２個のＮ
末端挿入及び３又は４個のタンデムに配置された微小管結合反復配列が制御されて含まれ
ることにより互いに異なっており、０Ｎ３Ｒ（配列番号１）、１Ｎ３Ｒ（配列番号２）、
２Ｎ３Ｒ（配列番号３）、０Ｎ４Ｒ（配列番号４）、１Ｎ４Ｒ（配列番号５）、及び２Ｎ
４Ｒ（配列番号６）と呼ばれる。用語「コントロールｔａｕ」とは、本明細書で使用され
るとき、リン酸化及び他の翻訳後修飾を受けていない配列番号６のｔａｕアイソフォーム
を指す。
【００２５】
ｔａｕは、微小管に結合し、ｔａｕのリン酸化によって調節され得るプロセスである、
細胞を通じたカーゴの輸送を制御する。ＡＤ及び関連する疾患においては、ｔａｕの異常
リン酸化が広く生じ、これは、ｔａｕの対らせん状細線維（ＰＨＦ）と呼ばれる原線維へ
の凝集の前に生じるか又は前記凝集を誘発すると考えられる。ＰＨＦの主な成分は、高リ
ン酸化ｔａｕである。用語「対らせん状細線維−ｔａｕ」又は「ＰＨＦ−ｔａｕ」は、本
明細書で使用されるとき、対らせん状細線維における周知のｔａｕ凝集体を指す。ＰＨＦ
構造における２つの主な領域であるファジーコート及びコアフィラメントは、電子顕微鏡
で明らかであり、ファジーコートは、タンパク質分解に対して感受性であり、かつフィラ
メントの外側に位置し、フィラメントのプロテアーゼ耐性コアは、ＰＨＦの骨格を形成す
る（Ｗｉｓｃｈｉｋ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８５：４
８８４〜８，１９８８）。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体」は、ウエスタンブロット
で評価したときにＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を指す。典型的に、ＰＨＦ−ｔａｕに結
合する抗体は、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）ＴＢＳ−Ｔ、０．０５％  Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で１時間ブロッキングした後、約５００ｎｇのＰＨＦ−ｔａｕをクマシー染色し
た後に評価することができる。ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体は、コントロールｔａｕ及
びＰＨＦ−ｔａｕの両方がＰＨＦ−ｔａｕエピトープに対する選択性を有しないｔａｕ抗
体（例えば、抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
））によって等しく検出される抗原ローディング条件下で試験したときにウエスタンブロ
ットによって測定すると、場合によっては、コントロールｔａｕ（配列番号６）に結合し
ない。（Ｍｅｒｃｋｅｎ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ５８：５４８〜５３，１９９２）
。このような例示的な抗原ローディング条件は、５００ｎｇのＰＨＦ−ｔａｕ及び２００
ｎｇのコントロールｔａｕである。
【００２７】
本明細書では、従来周知のアミノ酸の１文字表記及び３文字表記を用いる。
【００２８】
物質の組成
本発明は、抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体及びこのような抗体の使用に関する。このような抗Ｐ
ＨＦ−ｔａｕ抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕのリン酸化エピトープに結合する特性を有していて
もよく、ＰＨＦ−ｔａｕの非リン酸化エピトープに結合する特性を有していてもよい。抗
ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、治療法として、或いは生物学的サンプル、例えば、組織又は細胞
においてＰＨＦ−ｔａｕを検出するための研究又は診断試薬として有用であり得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態は、配列番号３５若しくは３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原
結合部位、又は配列番号３６若しくは３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含む
ＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。表１は、例示的な重鎖及び軽鎖可変領域に加
えてＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに従って定義した本発明の例示的な抗体の抗原結合部
位残基を示す。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の抗体のＶＨの抗原結合部位は、それぞれ配列番号７、８、
及び９又は１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２
（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）を含む、或いは本発明の抗体のＶＬの抗原結合部
位は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１
（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）を含む。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部
位、及び配列番号３６又は３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含むＰＨＦ−ｔ
ａｕに結合する単離抗体である。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の抗体のＶＨの抗原結合部位は、それぞれ配列番号７、８、
及び９又は１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２
（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）を含む、或いは本発明の抗体のＶＬの抗原結合部位
は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１ 
（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）を含む。
【００３３】
【表１】
2020105179.tif 000002
【００３４】
実施例で説明する実施形態は、１つは重鎖に由来し、１つは軽鎖に由来する１対の可変
領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖の可変領域を単
独で有してもよいということを認識するであろう。１つの可変領域を用いて、例えばＰＨ
Ｆ−ｔａｕに結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することが可能
な可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、
国際特許公開第９２／０１０４７号に開示される階層的二重コンビナトリアルアプローチ
を用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。こ
のアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他
方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリを感染させ、得られた二本
鎖特異的抗原結合ドメインを上述のようなファージディスプレイ法に従って選択する。
【００３５】
本発明の別の態様は、配列番号３５の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号
３６の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体
である。
【００３６】
本発明の別の態様は、配列番号３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号
３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体
である。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、それぞれ配列番号７、８、及び９の重鎖相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号
１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤ
Ｒ３）とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領
域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配
列番号１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３ 
（ＬＣＤＲ３）とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。
【００３９】
前述の実施形態のいずれかでは、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体をヒト化してもよ
い。
【００４０】
本発明の抗体は、多様な方法により、例えば、ハイブリドーマ法等の様々な技術によっ
て作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２
５６：４９５〜７，１９７５）。アクセプター抗体（通常、別の哺乳動物種、例えば、ヒ
ト）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域と関連してドナー抗体（通常、マウス）に由来する
軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開
示されている方法によって調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（通常、
マウス）に由来するＣＤＲと１以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グ
ロブリン由来部分とを有するＣＤＲグラフトｍＡｂは、米国特許第５，２２５，５３９号
に開示されているような当業者に公知の技術によって調製することができる。任意の非ヒ
ト配列も有さない完全なヒトｍＡｂは、（Ｌｏｎｂｅｒｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８
５６〜９，１９９４，Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４
５〜５１，１９９６，Ｍｅｎｄｅｚ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６〜５６，１９
９７）に参照される技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製
することができる。また、ヒトｍＡｂは、ファージディスプレイライブラリから調製及び
最適化することもできる（Ｋｎａｐｐｉｋ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８
６，２０００，Ｋｒｅｂｓ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４：６７〜８
４，２００１，Ｓｈｉ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０）。
【００４１】
抗体のヒト化は、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、特異性決定残基リサー
フェシング（ＳＤＲＲ）（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、リサーフ
ェシング（Ｐａｄｌａｎ等、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜９８，１９９１）
、超ヒト化（国際公開第０４／００６９５５号）、及びヒト繊維含量最適化（米国特許第
７，６５７，３８０号）である。グラフト化／ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は
、当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。選択されたフレーム
ワークは、Ｑｕｅｅｎ等（Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  
Ｓ  Ａ  ８６：１００２９〜３３，１９８９）又は米国特許出願公開第２０１１／００９
２３７２号に開示されている技術等の技術によって結合親和性を保存又は増強するために
更に修飾してもよい。
【００４２】
免疫用抗原又は単離抗体として用いるためのＰＨＦ−ｔａｕのファージディスプレイラ
イブラリからの調製は、任意の好適な技術を用いて行うことができる。例示的な方法では
、ＰＨＦ−ｔａｕは、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎ
ｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：５８２
７〜３１，１９９０）に記載のような周知のプロトコールを用いてＡＤ患者の脳から単離
される。ＰＨＦ−ｔａｕは、アルツハイマー患者の死後皮質から単離してもよい。単離Ｐ
ＨＦ−ｔａｕは、その純度及びＰＨＦ−ｔａｕと反応することが知られている抗体による
過剰リン酸化状態を特徴とする。典型的なＰＨＦ−ｔａｕ調製では、ウエスタンブロット
における約６０、６４、６８、及び７２ｋＤａで移動する過剰リン酸化バンド（Ｓｐｉｌ
ｌａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：４
２８〜３３，１９９８）は、過剰リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕに特異的に結合するが、脱リン
酸化ＰＨＦ−ｔａｕには結合しないＡＴ８抗体によって検出される。
【００４３】
本発明の抗体は、配列番号６のコントロールｔａｕには結合しないという特徴を有し得
る。このような抗体は、上記方法を用い、ウエスタンブロットにおいてコントロールｔａ
ｕに結合しないかことについて抗体を試験し、次いで、上記の通りクマシー染色すること
により作製してもよい。コントロールｔａｕは、組換え的に発現させ、標準的な方法を用
いて精製してもよい。ＰＨＦ−ｔａｕに結合するが、コントロールｔａｕには結合しない
例示的な抗体は、抗体ＰＴ１及びＰＴ３である。本発明の抗体は、コントロール及びＡＤ
脳切片において、例えば、免疫組織化学を用いて、その特異性について更に評価してもよ
い。
【００４４】
本発明の抗体は、解離定数（ＫD）が約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、
又は１０-12Ｍ以下であるＰＨＦ−ｔａｕに対する親和性を有し得る。ＰＨＦ−ｔａｕに
対する所与の分子の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる
。このような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ、ＰｒｏｔｅＯｎ又はＫｉｎＥｘＡ
装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用してもよい。
【００４５】
本発明の別の態様は、配列番号３５の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位及び配列番
号３６の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位、又は配列番号３７の重鎖可変領域（ＶＨ
）の抗原結合部位及び配列番号３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含むモノク
ローナル抗体とＰＨＦ−ｔａｕ結合について競合する単離抗体又は断片である。
【００４６】
ＰＨＦ−ｔａｕに対する結合間の競合は公知の方法によってインビトロでアッセイする
ことができる。例えば、未標識抗体の存在下におけるＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−タグ（商標）
ＮＨＳ−エステル標識抗体のＰＨＦ−ｔａｕに対する結合は、イムノアッセイ、次いで、
電気化学発光検出を用いて評価することができる。
【００４７】
競合的結合に加えて、幾つかの周知の方法を用いて、本発明の抗体の結合エピトープを
決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、イン
シリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定す
ることができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによっ
て抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点
突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することが
できる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与す
る残基を特定することができる。
【００４８】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＭアイソタイプのモノクローナル
抗体であってもよい。本発明の抗体は、二重特異的又は多重特異的であってもよい。例示
的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕの２つの異なるエピトープに結合することができ
るか、又はＰＨＦ−ｔａｕ及びアミロイドベータ（Ａβ）に結合することができる。別の
例示的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕと、インスリン受容体、トランスフェリン受
容体、インスリン様成長因子−１受容体、及びリポタンパク質受容体等の内因性血液脳関
門トランスサイトーシス受容体とに結合することができる。例示的な抗体は、ＩｇＧ１タ
イプである。
【００４９】
本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者には周知の技術により、Ｆｃ修飾によ
って強化又はサイレンシングさせることも可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性
細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受
容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等のＦｃエフェクター
機能は、これら活性に関与するＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は制御す
ることができる。また、薬物動態特性は、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を
突然変異させることによって強化することができる（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：６８５〜９１，２００９）。
【００５０】
更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、又は脱グリコシル化等の反応によって
、或いはポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化等の自然界では生じな
い共有結合修飾等の反応によって翻訳後修飾してもよい。このような修飾は、インビボ又
はインビトロで行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと複合
体化（ＰＥＧ化）することによって薬物動態特性を向上させることができる。複合体化は
、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧとの複合体化は、
機能に干渉することなく薬効を強化することが示されている（Ｋｎｉｇｈｔ等、Ｐｌａｔ
ｅｌｅｔｓ  １５：４０９〜１８，２００４，Ｌｅｏｎｇ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：
１０６〜１９，２００１，Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １６：７６１〜７０，
２００３）。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、又はその
補体、又はその断片である。例示的な単離ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号７、
８、及び９又は１３、１４、及び１５に示す免疫グロブリン重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１
、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むポリペプチド、或いはそれぞれ配列番号１０、１１、
及び１２又は１６、１７、及び１８に示す免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、
ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに本
発明の抗体可変領域をコードする配列番号３１〜３４に示す配列を有するポリヌクレオチ
ドである。遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本
発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の単
離核酸は、周知の組換え又は合成技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗
体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に単離され、配
列決定される。ハイブリドーマを作製する場合、かかる細胞は、かかるＤＮＡ源として機
能し得る。或いは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等のコード配
列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡
略化される。ファージ選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト
抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を作製するために用い、哺乳類細
胞、昆虫細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターで
ある。かかるベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基
づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本
発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってもよい。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞である
。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってもよい
。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。
哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、
ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣＮｏ．８
５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  Ｃ
ＲＬ−１５８０）マウス細胞株等のハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株等の不死化細胞株が
挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−
１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）の
ようなチャイニーズハムスターに由来する卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＤＧ４４が挙げられる
。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生され
た抗体を回収することを含む、ＰＨＦ−ｔａｕと結合する抗体の製造方法である。抗体を
製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００５５】
治療方法
本発明の抗体の抗原結合部位を含むＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片、又は抗体
を含む本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体又はその断片を用いて、ＡＤ又は任意の他のタウオ
パシーに罹患している患者等、脳内にｔａｕの病理学的凝集体を含む神経変性疾患を有す
る患者における症状を治療、低減、又は予防することができる。任意の特定の理論に束縛
されるものではないが、本発明の抗体は、病理学的ｔａｕ凝集体を低減し、ひいては脳に
おけるＰＨＦ−ｔａｕの量を低減することによって有益な効果を発揮し得る。本発明の抗
体を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。かかる動物の例として
は、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜等の哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の
抗体は、ＡＤの治療のための薬剤の調製においても有用であり、前記薬剤は、本明細書に
定められる投薬量で投与するために調製される。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、ｔａｕの凝集体を低減するのに十分な時間、治療的に有効な
量の本発明の単離抗体を患者に投与することを含む、それを必要としている患者における
ｔａｕの凝集体低減する方法である。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、神経変性疾患の症状を治療又は低減するのに十分な時間、治
療的に有効な量の本発明の単離抗体を患者に投与することを含む、患者におけるｔａｕの
凝集体を伴う神経変性疾患の症状を治療又は低減する方法である。
【００５８】
上記実施形態のいずれかでは、ｔａｕの凝集体を伴う神経変性疾患は、タウオパシーで
ある。
【００５９】
上記実施形態のいずれかでは、単離抗体は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列
番号３６のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を含む。
【００６０】
上記実施形態のいずれかでは、単離抗体は、配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列
番号３８のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を含む。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「タウオパシー」は、脳内のｔａｕの病理学的凝集体を伴う
任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び特発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパ
シーは、１７番染色体に連鎖しているパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴ
ＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性、ピック病、進行性皮質下グリオーシ
ス、神経原線維型痴呆症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀性グレイン認知
症、筋萎縮性側索硬化症パーキンソン認知症症候群、ダウン症候群、ゲルストマン・スト
ロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェ
ルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロ
イド血管症、亜急性硬化性全脳炎、筋緊張性ジストロフィ、神経原線維変化を伴う非グア
ナミン運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、及び慢性外傷性脳症、例えば、ボ
クサー痴呆（ボクシング病）である（Ｍｏｒｒｉｓ等、Ｎｅｕｒｏｎ  ７０：４１０〜２
６，２０１１）。
【００６２】
タウオパシーに関連する行動的表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、
感情鈍麻、無為症、無言症、失行症、反復症、常同運動／挙動、口愛過度、無秩序、連続
タスクを予定又は計画する能力の欠如、利己的行動／無神経、反社会的特徴、共感の欠如
、一貫性の欠如、錯誤的誤りは頻繁にあるが比較的理解力は保たれている失文症的な話し
方、理解障害、及び換語欠陥、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒
、非レボドパ反応性軸剛性、核上性注視麻痺、方形波痙攣、緩徐な垂直断続性運動、仮性
球麻痺、四肢失行症、筋緊張異常、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【００６３】
治療の影響を受けやすい患者としては、現在症状を示している患者に加えて、ＡＤ又は
他のタウオパシーのリスクを有する無症候性個体が挙げられる。治療の影響を受けやすい
患者としては、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク因子の存在等、ＡＤの公知
の遺伝的リスクを有する個体が挙げられる。例示的なリスク因子は、特に、位置７１７、
並びに位置６７０及び６７１におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異
（それぞれ、Ｈａｒｄｙ及びＳｗｅｄｉｓｈ突然変異）である。他のリスク因子は、プレ
セニリン遺伝子、ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における突然変異、高コレステロ
ール血症又は粥状硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している個体は、上記リスク因
子の存在によって特徴的な認知症から認識することができる。更に、ＡＤを有する個体を
同定するために利用可能な多数の診断試験が存在する。これらとしては、脳脊髄液のｔａ
ｕレベル及びＡβ４２レベルの測定が挙げられる。ｔａｕレベルの上昇及びＡβ４２レベ
ルの低下は、ＡＤの存在を表す。また、ＡＤに罹患している個体は、アルツハイマー病関
連障害協会の基準によって診断することもできる。
【００６４】
投与／医薬組成物
本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、ＡＤ又は他のタウオパシー等、ｔａｕの病理学的凝
集を伴う神経変性疾患を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方に好適である。
無症候性患者では、治療は何歳から開始してもよい（例えば、約１０、１５、２０、２５
、３０歳）。しかし、通常、患者が約４０、５０、６０、又は７０歳に達するまで治療を
始める必要はない。治療は、典型的に、ある期間にわたる複数回投与を含む。治療は、経
時的に治療剤に対する抗体、又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞を評価することによってモ
ニタリングしてもよい。反応が低下した場合、追加投与が指示される。
【００６５】
予防用途では、医薬組成物又は薬剤は、疾患の生化学的、組織学的、及び／又は挙動的
症状、その合併症、並びに疾患の発現中に提示される中間病理学的表現型を含む、疾患の
リスクをなくす又は低減する、重篤度を低下させる、又は疾患の発症を遅らせるのに十分
な量で、ＡＤに罹患しやすいか又は他の点でＡＤのリスクを有する患者に投与される。治
療用途では、組成物又は薬剤は、疾患の症状（生化学的、組織学的、及び／又は挙動的）
のいずれかを低減、阻止、又は遅延させるのに十分な量で、かかる疾患が疑われるか又は
既に罹患している患者に投与される。治療薬の投与により、特徴的なアルツハイマー病状
を未だ発現していない患者における軽度の認知障害を低減又はなくすことができる。治療
又は予防的処置を達成するのに適切な量は、治療的に又は予防的に有効な用量として定義
される。予防的及び治療的レジメンにおいて、組成物又は薬剤は、通常、十分な免疫反応
が得られるまで何回か投与される。
【００６６】
本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体又はその断片は、関連する神経変性疾患の治療に有効な
他の剤と併用投与してもよい。ＡＤの場合、本発明の抗体は、アミロイドベータ（Ａβ）
の沈着を低減又は予防する剤と併用投与してもよい。ＰＨＦ−ｔａｕ及びＡβ病理は相乗
的である可能性がある。したがって、同時にＰＨＦ−ｔａｕとＡβ及びＡβ関連病理のク
リアランスを標的とする併用療法は、それぞれを個々に標的とするよりも有効である場合
がある。
【００６７】
パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、α−シヌクレインタンパク質の凝集
形態をクリアランスするための免疫修飾も新たに開発された治療法である。ｔａｕ及びα
−シヌクレインタンパク質のクリアランスを標的とする併用療法は、同時に、いずれかの
タンパク質を個々に標的とするよりも有効であり得る。
【００６８】
本発明の方法では、タウオパシーの治療又は症状の改善における抗体の「治療的に有効
な量」は、標準的な研究技術によって決定することができる。例えば、抗体の用量は、当
該技術分野において周知の関連する動物モデルに剤を投与することによって決定すること
ができる。
【００６９】
更に、場合により、インビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができ
る。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの要因の考慮に基づいて（例えば、
臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は予防しようとす
る疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の要因が
含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医
師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビト
ロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
【００７０】
本発明の抗体を治療的に使用するための投与方法は、薬剤を受容者に送達する任意の好
適な経路であってもよい。これら抗体の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、
静脈内、皮下、鼻内、又は頭蓋内等非経口投与に有用であるか、脳又は脊髄の脳脊髄液に
投与してもよい。
【００７１】
本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体内の活性成分として、有効な量の抗体を含有
する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、抗体と一緒に投与
される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は溶媒を指す。こうした医薬用賦形剤は、落花生油、
大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油等の液体であ
ってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる
。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来の公
知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、ｐＨ調整
剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤等の生理学的条件に近づけるために
必要とされる薬学的に許容できる助剤を含有してもよい。かかる医薬製剤中の本発明の抗
体の濃度は、約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か、最大
で１５又は２０重量％までと広く変動してもよく、選択される特定の投与方法に従って、
主として必要とされる用量、流体の体積、粘度等に基づいて選択される。
【００７２】
治療は、単回投与スケジュール、又は複数回投与スケジュールで行ってもよく、複数回
投与計画では、一次処置過程が１〜１０回の別個の投与と、応答を維持し及び又は強化す
るのに必要な後続の時間間隔で他の投与とを行い、例えば第２の投与が１〜４ヶ月後、ま
た必要であれば、次の投与を数ヶ月後に行う。好適な治療スケジュールの例としては、（
ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、
（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾患症状を低減する、又は疾患の重篤度を低下させると予測
される所望の反応を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。
【００７３】
このように、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発
明の抗体を含むように調製してもよい。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、
約２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、又は５ｍｇ〜約２５ｍｇ
の本発明の抗体を含むように調製してもよい。非経口投与可能な組成物を調製する実際の
方法は周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。
【００７４】
本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体中で再構成させるこ
とができる。この技術は、抗体及び他のタンパク質調製物に有効であることが示されてお
り、当該技術分野において公知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【００７５】
診断方法及びキット
本発明の抗体は、被験体におけるＡＤ又は他のタウオパシーを診断する方法で使用する
ことができる。この方法は、本発明の抗体又はその断片等の診断試薬を用いてＰＨＦ−ｔ
ａｕの存在を被験体において検出することを含む。
【００７６】
ＰＨＦ−ｔａｕは、生物学的サンプルと診断抗体試薬とを接触させ、被験体由来のサン
プルにおける診断抗体試薬のＰＨＦ−ｔａｕに対する結合を検出することによって、被験
体由来の生物学的サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液）において検出することができ
る。検出を実施するためのアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブ
ロット、又はインビボイメージング等の周知の方法が挙げられる。例示的な診断抗体は、
本発明の抗体ＰＴ１及びＰＴ３であり、また、ＩｇＧ１、κ型である。
【００７７】
診断抗体又は類似の試薬は、上に例示した通り剤を受容者に送達する任意の好適な経路
によって患者の身体又は脳に直接静脈内注射することによって投与してもよい。抗体の用
量は、治療方法と同じ範囲内でなければならない。典型的に、抗体は標識されるが、同じ
方法において、ＰＨＦ−ｔａｕに対して親和性を有する一次抗体は未標識であり、二次標
識剤は、一次抗体に結合させるために用いられる。標識の選択は、検出手段に依存する。
例えば、蛍光標識は、光学検出に好適である。常磁性標識の使用は、外科的介入のないト
モグラフィー検出に好適である。また、放射標識は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて検出
され得る。
【００７８】
診断は、被験体由来のサンプル又は被験体における標識ＰＨＦ−ｔａｕ、ｔａｕ凝集体
、及び／又は神経原線維変化の数、大きさ、及び／又は強度を対応するベースライン値と
比較することによって行われる。ベースライン値は、非罹患個体の集団における平均レベ
ルを表し得る。また、ベースライン値は、同じ被験体において決定された以前の値を表す
。
【００７９】
また、上記診断方法は、治療前、治療中、又は治療後の被験体におけるＰＨＦ−ｔａｕ
の存在を検出することによって治療に対する被験体の応答をモニタリングするために用い
ることもできる。ベースラインに対する値の減少は、治療に対する陽性応答を示す。また
、値は、病理学的ｔａｕが脳からクリアランスされたとき生物学的流体において一時的に
増加する場合がある。
【００８０】
本発明は、更に、上記診断及びモニタリング方法を実施するためのキットに関する。典
型的に、このようなキットは、本発明の抗体等の診断試薬と任意追加的に検出可能な標識
とを含有する。診断抗体自体は、直接検出可能であるか又は二次反応（例えば、ストレプ
トアビジンとの反応）を介して検出可能である検出可能な標識（例えば、蛍光標識、ビオ
チン等）を含有してもよい。或いは、検出可能な標識を含有する第２の試薬を利用しても
よく、この場合、第２の試薬は、一次抗体に対する結合特異性を有する。生物学的サンプ
ルにおけるＰＨＦ−ｔａｕを測定するのに好適な診断キットでは、キットの抗体は、マイ
クロタイターディッシュのウェル等の固相に予め結合して供給され得る。
【００８１】
本出願全体を通して引用された全ての参照文献（文献、発行済み特許、公開された特許
出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照することにより本明細書に全文
が明示的に援用される。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
対らせん状細線維−ｔａｕ（ＰＨＦ−ｔａｕ）の精製
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：５８２７〜３１，１９９０
）変法によってＰＨＦ−ｔａｕを部分的に精製した。簡潔に述べると、組織学的に確認さ
れたアルツハイマー患者から得られた皮質の死後組織を部分的に精製した。典型的に、１
０００ｒｐｍのガラス／テフロンポッター組織ホモジナイザー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉ
ｎｃ；Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて前頭皮質５ｍｇを１０体積の冷バッフ
ァＢｕｆｆｅｒ  Ｈ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、
及び１０％スクロース／ｐＨ  ７．４）中でホモジナイズした。ホモジナイズされた材料
をＳｏｒｖａｌｌローターＳＳ３４内で２０分間２６４．８Ｎ（２７０００ｇ）で遠心分
離した。ペレットを廃棄し、上清を１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン及び１％（
ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールの最終濃度に調整し、３７℃で２時間インキュベート
した。次いで、上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ６０Ｔｉローター内で２０℃にて３５分間１０
５９．１Ｎ（１０８０００ｇ）で遠心分離した。ペレットを慎重にＰＢＳで洗浄し、ＰＢ
Ｓに懸濁させた。上記の通り上清を２回目の遠心分離にかけ、最後のペレットを溶解させ
、分注し、−８０℃で冷凍した。ＰＨＦ−ｔａｕ調製物の量を、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅと、抗ｔａｕ抗体ＡＴ８及びＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）を用いたウエスタンブロットとで評価した。ＡＴ８は、Ｓ２０２／Ｔ２０
５においてリン酸化されたＰＨＦ−ｔａｕを検出するが、非リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕ及び
野性型ｔａｕには結合しない。ＨＴ７は、（配列番号６の）Ｔａｕアミノ酸１５９〜１６
３における非リン酸化エピトープに結合し、ｔａｕ及びＰＨＦ−ｔａｕを認識する。優れ
た品質のＰＨＦ−ｔａｕ調製物は、ＡＴ８等の過剰リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕと反応する抗
体で検出された、ウエスタンブロット上の約６０、６４、６６、及び７２ｋＤａの分子量
を有する４本のバンドからなる。同等の量及び純度を有する２つの別々のＰＨＦ−ｔａｕ
調製物を同じ脳サンプルから作製した。調製物１を免疫に用いた。
【００８３】
（実施例２）
ＰＨＦ−ｔａｕに対するモノクローナル抗体の作製
正常Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて標準的なハイブリドーマ技術を用いて抗ＰＨＦ−ｔａ
ｕ抗体を作製した（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：
４９５〜７，１９７５）。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレートに播種し、１０
日後に、下記の通り２５ｎｇ／ウェルでコーティングされたＰＨＦ−ｔａｕにおいて直接
ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性細胞を、大腸菌ＢＬ２１細胞で発現させ、熱処理
及び硫酸アンモニウム沈殿で精製したコントロールｔａｕ（配列番号６）でコーティング
された１０ｎｇ／ウェルにおける交差反応性について試験し、直ちにサブクローニングし
、陽性クローンを液体窒素で冷凍した。１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｅｕｒｏ
ｐｅ）、ハイブリドーマフュージョンクローニングサプリメント（２％）（Ｒｏｃｈｅ，
Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）２％  ＨＴ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１ｍＭのピル
ビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、並びに
ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地で全ての
ハイブリドーマを増殖させた。
【００８４】
抗体可変領域を、選択したハイブリドーマ細胞からマウスＩｇＧ１／ＩｇＧ２／κバッ
クグラウンドにクローニングし、発現させ、常法を用いて精製した。
【００８５】
抗体選択のための直接ＥＬＩＳＡ
５０μＬ／ウェルのコーティングバッファ（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、
及び１０ｍＭのＮａＮ３、ｐＨ  ８．５）において、２５ｎｇ／ウェルのＰＨＦ−ｔａｕ
を、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）平底高結合９
６ウェルマイクロタイタープレートにて４℃で一晩コーティングした。次の日、室温で６
０分間７５μＬ／ウェルのＰＢＳ中０．１％カゼインでプレートをブロッキングした。次
に、５０μＬのハイブリドーマ上清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄
後、３７℃で１時間、５０μＬ／ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼと複合体化し
ているヒツジ抗マウスＩｇＧで検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ）。両試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳで希釈した。プレートを洗浄し、０．
４２ｍＭ  ３，５，３’，５’−テトラメチル−ベンジジン、０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ
2Ｏ2の１００ｍＭクエン酸及び１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ  ４．３）溶液
５０μＬを基質として添加した。室温でプレートシェーカー上に最大１５分間反応を進行
させ、その後、５０μＬ／ウェルの２  Ｎ  Ｈ2ＳＯ4で顕色を停止させ、４５０ｎｍにて
マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ）でプレートを読み取った。
【００８６】
モノクローナル抗体の特異性
ハイブリドーマのスクリーニングから得られた選択抗体を、組換え的に発現させたコン
トロールｔａｕ（配列番号６）との交差反応性について試験した。５００ｎｇのＰＨＦ−
ｔａｕ及び２００ｎｇのコントロールｔａｕを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（
登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％ゲルにロードし、製造業者の指示に従ってｉＢ
ｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用によってニトロセルロースメンブレン上
にブロットした。脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）（５％  ｗ／ｖ；Ｂｉｏｒａｄ）を含有するトリ
ス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ；１Ｍ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣ
ｌ、及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ８．５）で１時間メンブレンをブロッキ
ングした。ＴＢＳ−Ｔ含有ＮＦＤＭ（５％  ｗ／ｖ）で希釈した一次対照抗体（１μｇ／
ｍＬ）ＨＴ７、ＡＴ８、ＡＴ１００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ）、及びＢＴ２と共に４℃で一晩インキュベートした。ハイブリドーマのスク
リーニングから選択されたＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、及びＰＴ５モノクローナル
抗体を、１０％  ＦＣＳを含有する培養上清に添加した。Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ（登録商標
）増強化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＨＲＰＯ
（ＴＢＳ−Ｔ中１：２００００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と複合体
化しているヒツジ抗マウスＩｇを用いて一次抗体を検出した。Ｌｕｍｉ−ｉｍａｇｉｎｇ
システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）によってシグナルを捕捉した。ウエスタ
ンブロットにおいて、ＰＴ１及びＰＴ３は、ＰＨＦ−ｔａｕと反応したが、コントロール
ｔａｕとは反応しなかった。ＰＴ２は、両タンパク質と反応した。ＨＴ７及びＡＴ８の結
合プロファイルは、上記の通りである。ＡＴ１００は、リン酸化Ｓｅｒ２１２／Ｔｈｒ２
１４に結合し、ＰＨＦ−ｔａｕに結合するが、野性型ｔａｕには結合しない。ＢＴ２は、
Ｓ１９９／Ｓ２０２を含む非リン酸化エピトープを認識し、したがって、野性型ｔａｕは
認識するが、ＰＨＦ−ｔａｕは認識しなかった。
【００８７】
競合的エピトープ結合
モノクローナル抗体ＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、ＰＴ５、ＡＴ８（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ＡＴ１００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、及びＨＴ７（ＭＮ１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ＰＨＦ−ｔａｕ又はリン酸化ｔ
ａｕペプチドに対する競合結合について評価した。製造業者の指示に従って、ＭＳＤ（登
録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ  ＮＨＳエステル（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅ
ｒｙ）を用いて抗体を標識した。
【００８８】
標識ＰＴ１、ＰＴ３、ＡＴ１００、及びＨＴ７との競合の場合、５μＬ（５０μｇ／ｍ
Ｌ）／ウェルの富化されているＰＨＦ−ｔａｕタンパク質（上記の通り精製）を室温（Ｒ
Ｔ）で２時間ＭＳＤ  ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖ
ｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にコーティングした。ＡＴ８との競合の場合
、コントロールｔａｕにおけるＳ２０２／Ｔ２０５に相当する残基がリン酸化されている
コントロールｔａｕ（配列番号６）の残基１９４〜２１１に相当する合成ビオチン化及び
ＰＥＧ化ペプチドＲＳＧＹＳＳＰＧ（ｐＳ）ＰＧ（ｐＴ）ＰＧＳＲＳＲ−ＯＨ（Ｎｅｗ  
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＬＬＣ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）（配列番号３９）
（０．１ｍｇ／ウェル）２５μＬをストレプトアビジン帯電プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａ
ｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にコーティングした。コ
ーティング後、室温で２時間５％  ＭＳＤブロッカーＡバッファ１５０μＬでウェルをブ
ロッキングし、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した。標識さ
れた個々の抗ｔａｕ抗体（１０ｎＭ又は５０ｎＭ）と様々な未標識競合抗体（１ｎＭ〜２
μＭ）の希釈系列との混合物２５μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪さ
せながらＲＴで２時間インキュベートし、上記の通り３回洗浄した。１５０μＬ／ウェル
の希釈ＭＳＤ  ＲｅａｄバッファＴを添加し、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でプレ
ートを読み取った。
【００８９】
抗Ｔａｕ  ｍＡｂ  ＨＴ７、ＡＴ１００、及びＡＴ８の非重複エピトープは、上記の通
りである。公開されているデータに基づいて、Ｔａｕタンパク質又はペプチドに対する結
合において、これら抗体は互いに競合するとは予測されなかった。
【００９０】
実施した競合アッセイに基づいて、結合について互いに競合した抗体は存在せず、これ
は、これらが全て異なるエピトープに結合することを示す。各実験において、自己阻害の
みが観察された。図１〜５は、それぞれ、標識されたＡＴ８、ＰＴ１、ＰＴ３、ＡＴ１０
０、及びＨＴ７との競合アッセイの結果を示す。
【００９１】
（実施例３）
抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、インビボにおいてＰＨＦ−ｔａｕの蓄積を減少させる。
５月齢のメスのＰ３０１Ｌマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，ｃａｔ＃００２５０８）を５ヶ月
間マウスＩｇＧ１、生理食塩水、ＰＴ３（５００μｇ／マウス）又はＡＴ８（ハイブリド
ーマＥＣＡＣＣから発現、寄託番号９１１００８６）で週１回処理した。マウスに麻酔を
かけ、冷ＰＢＳで灌流し、氷上で脳を解剖した。各マウスについて、１つの脳半球を１０
体積のＨ−バッファ中でホモジナイズし、次いで、４℃で２０分間２０５．９Ｎ（２１，
０００ｇ）で遠心分離した。得られた上清を、６０分間２０５．９Ｎ（１００，０００ｇ
）で更に遠心分離した。遠心分離後、ペレット（画分Ｐ１）を回収し、Ｃｈａｉ等、Ｊ  
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３４４５７〜６７，２０１１に記載の通りウエスタン及び
ＥＬＩＳＡ分析用にリシスバッファに再懸濁させた。皮質サンプルの場合、画分Ｐ１を更
に１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンで処理し、超遠心して、ペレット中のＰＨＦ
−ｔａｕを更に富化させた。オスのＰ３０１Ｌマウスは、トランスジーンの発現が少ない
ことが見出され、分析には含まれていなかった。
【００９２】
本質的にＣｈａｉ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３４４５７〜６７，２０１１
に記載の通り、リン酸化ｔａｕを、捕捉抗体として抗体ＡＴ８及びＡＴ１００を用いてサ
ンドイッチＥＬＩＳＡで脳幹ホモジネート（画分Ｐ１）にて測定し、次いで、ビオチン化
ＨＴ７及びアビジン−ＨＲＰによって検出し（図６Ａ及び６Ｂ）、ウエスタンブロットで
はＡＴ１００を用いて検出した（図６Ｃ）。簡潔に述べると、Ｐ１ペレットをリシスバッ
ファ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で再懸濁させた。Ｐ１ペレットサンプルをＡＴ８
又はＡＴ１００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予めコーティングされている
ウェル及びビオチン標識されているＨＴ−７抗体においてインキュベートした。次いで、
サンプルをバッファで５回洗浄し、次いで、１時間アビジン−ＨＲＰと共にインキュベー
トした。この後、サンプルを、３０分間１段階ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）と共にインキュベートし、次いで、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4と共にインキュベートした
。最後に、反応を４５０ｎｍで読み取り、脳内のＡＴ８−又はＡＴ１００−反応性ｔａｕ
の量をヒトＡＤ脳ホモジネートから得られた標準曲線を用いて決定し、ＡＤ脳ホモジネー
トの相対量（ｎｇ／ｍＬ）としてプロットし、非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の
平均サンプルと同じＥＬＩＳＡシグナルを得た。
【００９３】
リン酸化を検出するためにＡＴ１００（ｐ＝０．０５７）又はＡＴ８（ｐ＝０．０４７
５）を用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、アイソタイプコントロールを投与した動物と
比べて、ＰＴ３で処理したＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスではリン酸化ｔａｕにお
ける統計的に有意な減少又は有意性に向かう傾向が見られた（ＥＬＩＳＡシグナル：生理
食塩水（１１３５±２２８．８）；ＩｇＧ１群（１３４４±２４５．６）；ＰＴ３群（６
６０．５±１３４．５）；ＡＴ８群（１２７１±２７４））。
【００９４】
ＥＬＩＳＡで得られたデータを確認するために、ＡＴ１００抗体を用いてＰＨＦ−ｔａ
ｕを検出することによって、ＩｇＧ１−又はＰＴ３−処理動物由来の脳幹ホモジネート（
画分Ｐ１）をウエスタンブロットで分析した。ローディングコントロールとして抗アクチ
ン抗体を用いてフィルタをブロットした（図６Ｂ）。ウエスタンブロットは、ＩｇＧ１で
処理した動物と比べて、ＡＴ１００抗体で検出したＰＨＦ−ｔａｕ量の減少を示した。
【００９５】
皮質分析では、サルコシル可溶性（可溶性ｔａｕを表す）及び不溶性（ＰＨＦ−ｔａｕ
を表す）皮質画分を、捕捉用にｐａｎ−ｔａｕ抗体（ＰＴ４）又はホスホ−ｔａｕ抗体（
ＡＴ８）を用い、次いで、ビオチン−ｐａｎ−ｔａｕ抗体（ｈＴａｕ１０）、次いで、Ｈ
ＲＰ−アビジンを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。ＰＴ３で処理した動
物は、アイソタイプコントロールＩｇＧ１で処理した動物に比べて合計ｔａｕレベルが類
似していた。より低いＰＨＦ−ｔａｕレベルに向かう傾向は、Ｎ−ラウロイルサルコシン
不溶性画分におけるアイソタイプコントロールと比べたときＰＴ３で処理した動物におい
て明らかであった（ＰＴ４を用いたＥＬＩＳＡ捕捉：ＩｇＧ群：８５１０２６±２６１１
９８及びＰＴ３群：５８５６３９±１２０４９８；ＥＬＩＳＡ、ＡＴ８で捕捉：ＩｇＧ群
：１１２５８８６±２８６２４０（Ｎ＝１０）、及びｐＴ３群：７４６５８２±１２４９
７０（Ｎ＝７））。
【００９６】
（実施例４）
抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体の特性評価
親和性の決定
モノクローナル抗体ＰＴ１及びＰＴ３と組換えヒト可溶性ｔａｕ又はＰＨＦ−ｔａｕと
の相互作用をＰｒｏｔｅＯｎによって試験した。ランニング又はシステムバッファとして
３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳ（ｐＨ  ７．４
）を用いて２５℃で全ての相互作用を試験した。２つの異なる実験フォーマットを用いた
。１つは、組換え的に発現させたコントロールｔａｕとの相互作用ののものであり、他方
は、ＰＨＦ−ｔａｕとの相互作用のためのものであった。これら実験では、ＨＴ７（Ｐｉ
ｅｒｃｅ、カタログ番号ＭＮ１０００）、マウス抗ｔａｕ抗体をポジティブコントロール
として用いた。
【００９７】
組換え的に発現させたコントロールｔａｕとの相互作用を試験するために、アミノカッ
プリング化学（約５０００応答単位（ＲＵ））用に各製造業者の指示に従ってＧＬＣ（Ｐ
ｒｏｔｅＯｎ）センサチップの表面に抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的抗体
（Ａｂ）をカップリングさせることによってバイオセンサ表面を調製した。カップリング
バッファは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．５）であった。抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体
をランニングバッファで希釈し、注入して、６０〜１３０ＲＵのキャプチャーを得た。抗
ＰＨＦ−ｔａｕ  ｍＡｂの捕捉後、溶液（０．１〜７５ｎＭ、５倍希釈）中に組換え的に
発現させたコントロールｔａｕ（Ｔａｕ−４４１、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０５７６−
５０μｇ）を注入した。２分間会合をモニタリングした（４０μｇ／分で８０μＬを注入
）。１０分間解離をモニタリングした。０．８５％  Ｈ3ＰＯ4、又は０．８５％  Ｈ3Ｐ
Ｏ4、次いで５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いてセンサ表面を再生した。１：１結合モデルを用
いてデータをフィッティングした。１：１結合モデルを用いてデータをフィッティングし
た。
【００９８】
【表２】
2020105179.tif 000003
*  ＰＨＦ−ｔａｕについて、これは、ＫＤが二価結合モデルを用いて実施したフィッ
ティングに由来するｋｆｆ１／ｋｏｎ−１の比として得られる場合、みかけの固有親和性
である。
**  有意な結合無し
***５実験中４実験で結合無し
【００９９】
ＰＨＦ−ｔａｕとの相互作用を試験するために、捕捉試薬としてＨＴ７を用いて捕捉−
カップリングＰＨＦ−ｔａｕによってバイオセンサ表面を調製した。流体に入る不溶性材
料の量を制限するために、ＰｒｏｔｅＯｎでは上記ＰＨＦ−ｔａｕの更なる調製が必要で
あった。５℃で１０分間４９Ｎ（５０００ｇ）で２回遠心分離することによって上記ＰＨ
Ｆ−ｔａｕを更に調製し、ここで、２回目の遠心分離から得られた上清を、次いで、ラン
ニングバッファで１／２０又は１／４０希釈した。チップを調製するために、アミノカッ
プリング化学（約３０００応答単位（ＲＵ））用の各製造業者の指示に従ってＧＬＣ（Ｐ
ｒｏｔｅＯｎ）センサチップの表面にＨＴ７を共有結合で固定した。カップリングバッフ
ァは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．５）であった。ＨＴ７固定後、ＰＨＦ−ｔａ
を注入し、ＨＴ７によって捕捉（約３００ＲＵ）した。捕捉後、アミノカップリング化学
用の各製造業者の指示に従ってチップの活性化によってＰＨＦ−ｔａｕをセンサチップに
共有結合で固定した。最後に、エタノールアミンを注入することによって、残りの反応部
位をブロックした。ＰＨＦ−ｔａｕ修飾表面及び参照表面（抗原を含有しない）の調製及
び安定化後、抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体をランニングバッファで希釈し、溶液中に注入した（
０．１〜７５ｎＭ、５倍希釈）。３分間会合をモニタリングした（４０μｇ／分で１２０
μＬを注入）。１０又は１５分間解離をモニタリングした。１０ｍＭ  Ｇｌｙ（ｐＨ  ２
）を用いてセンサ表面を再生した。二価結合モデルを用いてデータをフィッティングし、
ここでは、みかけの固有親和性をｋｏｆｆ−１／ｋｏｎ−１比で報告した。
【０１００】
ＰｒｏｔｅＯｎ実験に基づいて、３２２ｐＭの親和性でＰＴ１はＰＨＦ−ｔａｕに結合
し、試験した条件下ではコントロールＴａｕに対する結合を示さなかった（表２）。ＰＴ
３は１８±２ｐＭの親和性でＰＨＦ−ｔａｕに結合し、試験した条件下では５回の実験の
うちの４回でコントロールＴａｕに対する結合を示さなかった。５回のＰｒｏｔｅＯｎ実
験のうちの１回で、測定は、用いたコントロールＴａｕの最高濃度に基づいて＞７５ｎＭ
の親和性を推定するために用いることができた弱い結合を示した。
【０１０１】
以上、本発明の全容を述べたが、付属の特許請求の範囲の趣旨又は範囲を逸脱すること
なく本発明に多くの変更及び改変をなし得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１】
2020105179.tif 000004
【図２】
2020105179.tif 000005
【図３】
2020105179.tif 000006
【図４】
2020105179.tif 000007
【図５】
2020105179.tif 000008
【図６】
2020105179.tif 000009
【図７】
2020105179.tif 000010
【配列表】
2020105179000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月11日(2020.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号３６又は３８
の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月17日(2020.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７、８及び９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体。
【請求項２】
前記抗体が、１×１０−９Ｍ以下の解離定数でヒトＰＨＦ−ｔａｕに結合する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ヒト化されている、請求項１又は２に記載の単離抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗体に含まれるＶＨ及びＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生される抗体を回収することを含む、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を製造する方法。
【外国語明細書】
2020105179000001.pdf