(57)【要約】【課題】肝炎ウイルスとは無関係に、肝臓がん発症リスクを判定可能な、肝がん発症リスクの判定方法、及び肝がん発症リスクの判定キットを提供する。【解決手段】対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの判定方法。また、対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子の含有量を測定するための試薬を含む、肝臓がん発症リスクの判定キット。また、前記肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝臓がん発症リスクを低減するための医薬組成物であって、前記対象の大腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤を含む、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの判定方法。
【請求項２】
前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量と肝臓がん発症リスクとを相関させる工程をさらに含む、請求項１に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
【請求項３】
前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量の測定を、
（ａ１）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量の測定、
（ｂ１）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量の測定、及び
（ｃ１）前記糞便試料におけるゼラチナーゼ活性の測定、
からなる群より選択される少なくとも１種の測定により行う、請求項１又は２に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
【請求項４】
前記ｇｅｌＥ遺伝子が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｇｅｌＥである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
【請求項５】
対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定するための試薬を含む、肝臓がん発症リスクの判定キット。
【請求項６】
前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定するための試薬が、
（ａ２）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量を測定するための試薬、
（ｂ２）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量を測定するための試薬、及び
（ｃ２）前記糞便試料におけるゼラチナーゼ活性を測定するための試薬、
からなる群より選択される少なくとも１種の試薬を含む、請求項５に記載の判定キット。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝臓がん発症リスクを低減するための医薬組成物であって、
前記対象の腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤を含む、
医薬組成物。
【請求項８】
前記薬剤が、健常対象の腸内細菌を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記健常対象の腸内細菌が、前記健常対象の糞便に存在する細菌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓がん発症リスクの判定方法、肝臓がん発症リスクの判定キット、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）は、世界的に発生率が増加し続けており、がんによる死亡の主な要因の１つとなっている。Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ：ＨＣＶ）感染は、ＨＣＣ発生の最も一般的な危険因子の１つである。直接作用型抗ウイルス剤（Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ：ＤＡＡ）開発は、ＨＣＶ関連の慢性肝疾患患者において９０％を超える持続的ウイルス学的応答を可能にした。しかしながら、最近の研究では、ＤＡＡ治療によりウイルスが根絶された患者において、ＨＣＣの発症リスクが増加したことが報告されている（非特許文献１、２）。いくつかの報告によると、ＨＣＶ根絶後のＨＣＣ発生率は、１年あたり０．７４％から６ヶ月あたり３．１７％の範囲である（非特許文献１〜３）。したがって、持続的ウイルス学的応答達成の後においても、ＨＣＶ感染以外の他の原因が、ＨＣＣ発症に関与していると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ravi, S., et al. Unusually High Rates of Hepatocellular Carcinoma After Treatment With Direct-Acting Antiviral Therapy for Hepatitis C Related Cirrhosis. Gastroenterology 152, 911-912 (2017).
【非特許文献２】Conti, F., et al. Early occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma in HCV-related cirrhosis treated with direct-acting antivirals. J Hepatol 65, 727-733 (2016).
【非特許文献３】Li, D.K., et al. The short-term incidence of hepatocellular carcinoma is not increased after hepatitis C treatment with direct-acting antivirals: An ERCHIVES study. Hepatology 67, 2244-2253 (2018).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年、ウイルス性肝炎が背景にない肝臓からの肝がん発生が増加傾向にあることから、既存の肝炎ウイルススクリーニングによる肝がん高発がん危険群の同定とは独立して、肝炎ウイルスとは無関係に、肝がん高発がん危険群を同定する必要性が生じている。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、肝炎ウイルスとは無関係に、肝臓がん発症リスクを検査可能な、肝がん発症リスクの判定方法、及び肝がん発症リスクの判定キットを提供することを目的とする。また、前記肝癌発症リスクの判定方法により肝がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝がん発症リスクを低減するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの判定方法。
［２］前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量と肝臓がん発症リスクとを相関させる工程をさらに含む、［１］に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
［３］前記ｇｅｌＥ遺伝子の含有量又はその遺伝子産物の測定を、（ａ１）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量の測定、（ｂ１）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量の測定、及び（ｃ１）前記糞便試料におけるゼラチナーゼ活性の測定、からなる群より選択される少なくとも１種の測定により行う、［１］又は［２］に記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
［４］前記ｇｅｌＥ遺伝子が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｇｅｌＥである、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の肝臓がん発症リスクの判定方法。
［５］対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定するための試薬を含む、肝臓がん発症リスクの判定キット。
［６］前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定するための試薬が、（ａ２）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量を測定するための試薬、（ｂ２）前記糞便試料における前記ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量を測定するための試薬、及び（ｃ２）前記糞便試料におけるゼラチナーゼ活性を測定するための試薬、からなる群より選択される少なくとも１種の試薬を含む、［５］に記載の判定キット。
［７］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝臓がん発症リスクを低減するための医薬組成物であって、前記対象の腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤を含む、医薬組成物。
［８］前記薬剤が、健常対象の腸内細菌を含む、［７］に記載の医薬組成物。
［９］前記健常対象の腸内細菌が、前記健常対象の糞便に存在する細菌である、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］前記ｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓである、［７］〜［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、肝炎ウイルスとは無関係に、肝臓がん発症リスクを判定可能な、肝がん発症リスクの判定方法、及び肝がん発症リスクの判定キットが提供される。また、本発明によれば、前記肝癌発症リスクの判定方法により肝がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝がん発症リスクを低減するための医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、健常ドナー（ＨＤ）、ＨＣＣを有さないＨＣＶ感染慢性肝疾患患者（ＣＬＤ）、原発性ＨＣＣを有するＨＣＶ感染慢性肝疾患患者（ＨＣＣ）の腸内微生物叢を示す。図１Ａは、ＨＤ及びＣＬＤの糞便で、相対的に多い分類群を用いて線形識別分析（ｌｉｎｅａｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＬＤＡ）を行った結果を示す。Ｐ値＜０．０５のＬＤＡスコアを示した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＤ及びＨＣＣの糞便で、相対的に多い分類群を用いてＬＤＡを行った結果を示す。Ｐ値＜０．０５のＬＤＡスコアを示した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＬＤ及びＨＣＣの糞便で、相対的に多い分類群を用いてＬＤＡを行った結果を示す。Ｐ値＜０．０５のＬＤＡスコアを示した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、主座標分析により視覚化した、分類データを用いて計算したＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、主座標分析により視覚化した、各グループ間の糞便のＫＥＧＧ経路データを用いて計算したＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、各被験者グループの糞便を移植したマウスにおいて、肝臓腫瘍発生率及びｍＲＮＡ発現解析を行った結果を示す。図中、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１であり、以降の図でも同様である。図２Ａは、各被験者グループの糞便移植を行ったマウスにおける肝臓腫瘍陽性マウスの割合を示す。棒グラフの上の数値は、腫瘍陽性マウス数／全マウス数の比を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各被験者グループの糞便移植を行ったマウス１匹あたりの肝臓腫瘍数を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、特定被験者から糞便移植を受けた無菌マウスに、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、各被験者の糞便を移植したマウスにおける肝臓発癌試験において、マウス微生物叢をメタゲノム解析に基づき解析した結果を示す。図３Ａは、肝臓腫瘍陽性マウス及び肝臓腫瘍陰性マウスの糞便中で相対的に多く存在する微生物属を用いてＬＤＡを行った結果を示す。Ｐ値＜０．０５のＬＤＡスコアを示した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウス１匹あたり肝臓腫瘍数を、糞便中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の存在に基づきプロットした結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、マウス肝臓におけるｍＲＮＡ発現を、糞便中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の存在に基づきプロットした結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄ及び図３Ｅは、特定細菌種を経口又は直腸投与し、ＤＥＮ及びＣＣｌ４の注射により肝がん発生を誘導した、フローラ除菌マウスにおいて、腫瘍発生数及び肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。図３Ｄは、マウス１匹あたりの肝臓腫瘍数を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、図２に示す試験で用いたマウスにおいて、糞便中のｇｅｌＥの存在に基づいて、マウス１匹あたりの肝臓腫瘍数をプロットした結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｇは、糞便中のゼラチナーゼ活性及び消化管透過性を解析した結果を示す。図４Ａは、各被験者グループの糞便のゼラチナーゼ活性を測定した寒天プレートの代表的な写真を示す。−，透明層半径＜３ｍｍ；＋，３ｍｍ≦透明層半径＜６ｍｍ；＋＋，透明層半径≧６ｍｍ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、各被験者グループにおいて、糞便中のゼラチナーゼ活性が前記範囲内である被験者の割合を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、糞便中のｇｅｌＥの存在に応じて分類した被験者において、糞便中のゼラチナーゼ活性が前記範囲内である被験者の割合を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、各被験者グループにおける糞便中のＭＭＰ９濃度を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、糞便中のゼラチナーゼ活性の程度に応じて分類した被験者における糞便中のＭＭＰ９濃度を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、各被験者グループの糞便を移植し、ＤＥＮ注射１回、ＣＣｌ４注射２回を行った後、ＦＩＴＣ−デキストランを経口投与したマウスにおいて、血漿ＦＩＴＣ−デキストラン濃度を測定した結果を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、各被験者グループの糞便を移植し、ＤＥＮ注射１回、ＣＣｌ４注射２回を行った後、血漿ＬＰＳ濃度を測定した結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓのｇｅｌＥが、消化管透過性の上昇と肝臓発癌の促進に必要であることを示す図である。図５Ａは、各Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株を投与したフローラ除菌マウス１匹当たりの肝臓腫瘍数をプロットした結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、各Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株を投与したフローラ除菌マウスにおいて、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、各Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株を投与した無菌マウスにおいて、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＤＥＮ注射１回、ＣＣｌ４注射２回を行った後、ＦＩＴＣ−デキストランを経口投与したＶ５８３定着ノトバイオートマウスにおいて、血漿ＦＩＴＣ−デキストラン濃度を測定した結果を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、Ｖ５８３定着フローラ除菌結果を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ＣＬＤ及びＨＣＣの被験者グループにおいて、肝臓における新規腫瘍又は再発性腫瘍の発生率を追跡した結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｅは、慢性肝機能障害は微生物叢の異常及びデオキシコール酸の産生減少をもたらし、腸内でのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの定着を可能にすることを示す図である。図６Ａは、各被験者グループにおける糞便中胆汁酸濃度を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３野生株を種々の胆汁酸を含有するＢＨＩブロス中で６時間培養した後、ＣＦＵをカウントした結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、フローラ除菌マウスに、ＰＢＳ若しくはＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（左）、又はＨＤ患者２６若しくはＨＤ患者５５の糞便微生物叢を定着させた後、Ｖ５８３野生株を投与し、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓのＣＦＵをＥＦ寒天プレート上でカウントした結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの定着後、Ｖ５８３を投与したマウスにおいて、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＨＤ患者２６の糞便微生物叢又はＨＤ患者５５の糞便微生物叢の定着後、Ｖ５８３を投与したマウスにおいて、ＤＥＮ注射を１回、ＣＣｌ４注射を２回行った後、マウスを安楽死させ、リアルタイムＰＣＲにより肝臓におけるｍＲＮＡ発現を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［肝がん発症リスクの判定方法］
一実施形態において、本発明は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程（以下、「工程（ｉ）」ともいう）を含む、肝臓がん発症リスクの判定方法を提供する。
【００１０】
＜工程（ｉ）＞
本実施形態の判定方法は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む。
【００１１】
≪ｇｅｌＥ遺伝子≫
ｇｅｌＥ遺伝子は、細菌のゼラチナーゼをコードする遺伝子である。「ゼラチナーゼ」とは、ゼラチンを加水分解する活性（ゼラチナーゼ活性）を有する酵素である。ｇｅｌＥ遺伝子が由来する細菌は、特に限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌が挙げられ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｃｏｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ等が例示される。中でも、ｇｅｌＥ遺伝子は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに由来するものであることが好ましい
ｇｅｌＥ遺伝子及び当該遺伝子がコードするタンパク質の配列は公知であり、その遺伝子配列及びアミノ酸配列は、公知のデータベースから取得することができる。例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのｇｅｌＥ遺伝子配列の一例として、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．Ｍ３７１８５．１で登録された配列等が挙げられる。前記アクセッションＮｏ．で登録された塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍのｇｅｌＥ遺伝子の一例としてはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＦＪ８５８１４６．１、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｃｏｒｕｍのｇｅｌＥ遺伝子の一例としてはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＫＹ６１３９３１．１（ｐａｒｔｉａｌ  ＣＤＳ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅのｇｅｌＥ遺伝子の一例としてはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＥＵ４２３２７４．１（ｐａｒｔｉａｌ  ＣＤＳ）で登録された配列等が挙げられる。ｇｅｌＥ遺伝子は、前記配列を有するものに限定されず、それらのホモログ（オーソログ、パラログ）、及びそれらの変異体を包含する。
【００１２】
ｇｅｌＥ遺伝子には、例えば、以下のものも包含される。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（３）配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４）配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
上記（１）において、欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸の数は、結果として生じるポリペプチドがゼラチナーゼ活性を有する限り、特に限定されない。記（３）において、欠失、置換、付加、又は挿入される塩基の数は、結果として生じるポリヌクレオチドが、ゼラチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、特に限定されない。欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸又は塩基の数は、例えば１〜８０個であることができ、１〜６０個が好ましく、１〜５０個がより好ましく、１〜３０個がさらに好ましい。欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸又は塩基の数としては、さらに、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１個又は２個等が例示される。
上記（２）又は（４）において、配列同一性は、８０％以上である限り、特に限定されない。配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列又は塩基配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、対応するアミノ酸又は塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体又は塩基配列全体に対する一致したアミノ酸又は塩基の割合として求められる。アミノ酸配列同士又は塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
上記（５）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。
【００１４】
≪対象の糞便試料≫
本実施形態の判定方法において用いる糞便試料の対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、特に限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ペット動物（イヌ、ネコ、ウサギなど）、家畜動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなど）等が挙げられる。対象は、好ましくはヒトである
また、本実施形態で用いる糞便試料が由来する対象は、肝臓がん以外の肝臓疾患（たとえあ、慢性肝疾患）に罹患した対象であってもよい。あるいは、肝臓がんの既往歴があり、肝臓がんが寛解に至った対象であってもよい。あるいは、多量飲酒、喫煙などの生活習慣を有していたり、肥満、糖尿病などの肝臓がんのリスク因子を有していたりする対象であってもよい。
【００１５】
糞便試料は、糞便をそのまま用いてもよいし、後述するｇｅｌＥ遺伝子の含有量の測定方法に応じて、適宜処理を行ってもよい。例えば、ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸の含有量を測定する場合、糞便をＰＢＳ等の適当なバッファーに懸濁してホモジナイズし、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。また、例えば、ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物の含有量を測定する場合、遺伝子産物がｍＲＮＡである場合には、糞便を適当なバッファーに懸濁してホモジナイズし、市販のＲＮＡ抽出キット等を用いて、ＲＮＡを抽出してもよい。遺伝子産物がタンパク質である場合には、糞便をＰＢＳ等の適当なバッファーに懸濁し、フィルター濾過や遠心分離等を行って、固形物を除去してもよい。ゼラチナーゼ活性を測定する場合も同様に、糞便をＰＢＳ等の適当なバッファーに懸濁し、フィルター濾過や遠心分離等を行って、固形物を除去してもよい。
糞便試料には、糞便そのものに加えて、糞便に上記のような各種処理を行ったものも包含される。
【００１６】
≪ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量の測定≫
ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量（以下、単に「ｇｅｌＥ遺伝子含有量」という場合がある。）の測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。ｇｅｌＥ遺伝子含有量の測定は、例えば、下記（ａ１）〜（ｃ１）からなる群より選択される少なくとも１種の測定方法により行うことができる。
（ａ１）糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量の測定
（ｂ１）糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量の測定
（ｃ１）糞便試料におけるゼラチナーゼ活性の測定
【００１７】
（測定方法（ａ１））
糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸は、より具体的にはｇｅｌＥ遺伝子をコードするＤＮＡ（以下、「ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡ」という。）である。ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡ含有量の測定は、糞便をそのまま用いて行ってもよいし、上記のように糞便からＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡ抽出試料を用いて行ってもよい。
ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡ含有量の測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマーを用いる方法、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いる方法等が挙げられる。
【００１８】
〔プライマーを用いる方法〕
ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマーは、ｇｅｌＥ遺伝子配列に基づいて、設計することができる。「特異的に増幅可能」とは、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの少なくとも一部を増幅可能であるが、他のＤＮＡは増幅しないことを意味する。プライマーは、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡにアニーリングし、ｇｅｌＥ遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なものであれば特に限定されない。プライマーの例としては、例えば、下記のものを挙げることができる（Vankerckhoven, V., et al. J Clin Microbiol 42, 4473-4479 (2004).）が、これに限定されない。
フォワードプライマー：5'-TATGACAATGCTTTTTGGGAT-3'  （配列番号３）
リバースプライマー：5'-AGATGCACCCGAAATAATATA-3'  （配列番号４）
【００１９】
例えば、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを増幅可能なプライマーセット（例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーのセット）を用いて、糞便試料においてＰＣＲ法や等温増幅法（ＬＡＭＰ法）等による核酸増幅反応を行い、増幅断片の有無又は増幅断片の量を確認することにより、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの含有量を測定することができる。ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを定量可能な核酸増幅方法としては、特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲ等の定量ＰＣＲ法等が挙げられる。
【００２０】
〔プローブを用いる方法〕
ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブは、ｇｅｌＥ遺伝子配列に基づいて、設計することができる。「特異的にハイブリダイズする」とは、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズするが、他のＤＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。
例えば、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、糞便試料においてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしたプローブの有無及び量を確認することにより、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの含有量を測定することができる。プローブを用いたｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの定量方法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ法等が挙げられる。
【００２１】
（測定方法（ｂ１））
糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物は、より具体的にはｇｅｌＥ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ（以下、「ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡ」という。）、及びｇｅｌＥ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質（以下、「ｇｅｌＥタンパク質」という。）である。ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡ含量の測定は、糞便をそのまま用いて行ってもよいし、上記のように糞便からＲＮＡを抽出し、当該ＲＮＡ抽出試料を用いて行ってもよい。ｇｅｌＥタンパク質含量の測定は、糞便をそのまま用いて行ってもよいし、上記のようにフィルター濾過や遠心分離により固形分を除去し、当該液体試料を用いて行ってもよい。
【００２２】
ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡ量の測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ｇｅｌＥ遺伝子−ｍＲＮＡを特異的に増幅可能なプライマーを用いる方法、ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いる方法等が挙げられる。これらのプライマー及びプローブは、上記測定方法（ａ１）の場合と同様に、ｇｅｌＥ遺伝子配列に基づき設計することができる。ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡの定量方法としては、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ｃＤＮＡマイクロアレイ法等が挙げられる。
【００２３】
ｇｅｌＥタンパク質含量の測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合物質を用いる方法が挙げられる。「特異的結合物質」とは、ｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合性を有する物質である。「ｇｅｌＥタンパク質に特異的結合性を有する」とは、ｇｅｌＥタンパク質に対して高い結合親和性を有し、他の物質に対しては結合親和性が低いことを意味する。特異的結合物質の具体例としては、ｇｅｌＥタンパク質に特異的結合性を有する抗体（抗ｇｅｌＥタンパク質抗体）、又はｇｅｌＥタンパク質に特異的結合性を有するアプタマー（抗ｇｅｌＥタンパク質アプタマー）が挙げられる。
【００２４】
抗ｇｅｌＥタンパク質抗体は、ｇｅｌＥタンパク質又はその断片を抗原として、公知の方法（ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法など）により作製することができる。抗ｇｅｌＥタンパク質抗体は、必ずしもインタクトな抗体である必要はなく、抗体断片であってもよい。抗ｇｅｌＥタンパク質抗体は、改変抗体（キメラ抗体等）であってもよく、抗体断片（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）であってもよい。抗ｇｅｌＥタンパク質抗体は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
【００２５】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合性を有する物質であり、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。抗ｇｅｌＥタンパク質アプタマーは、核酸アプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーであってもよい。抗ｇｅｌＥタンパク質核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponentialenrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、抗ｇｅｌＥタンパク質ペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００２６】
例えば、ｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合物質を用いて、糞便試料において結合反応を行い、結合した特異的結合物質の有無及び量を確認することにより、糞便試料中のｇｅｌＥタンパク質の含有量を測定することができる。抗ｇｅｌＥタンパク質抗体を用いたｇｅｌＥタンパク質の定量方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免測定法（ＲＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）等が挙げられる。
【００２７】
（測定方法（ｃ１））
ｇｅｌＥタンパク質は、ゼラチナーゼ活性を有する。また、ｇｅｌＥタンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）の前駆体（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を切断し、ゼラチナーゼ活性を有する活性型にすることが知られている。そのため、糞便試料のゼラチナーゼ活性を測定することにより、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子の含有量を測定することができる。
【００２８】
ゼラチナーゼ活性の測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。具体例としては、例えば、実施例に記載の方法等が例示される。例えば、糞便を適当なバッファーに懸濁してフィルター濾過を行うことにより糞便試料を調製し、当該糞便試料をゼラチン含有寒天プレートにスポットしてインキュベートする。数時間〜数日間インキュベートした後、プレートを塩化第二水銀試薬、塩酸等で処理し、ゼラチンの分解による透明な帯状の変化の範囲を測定することにより、ゼラチナーゼ活性を測定することができる。
【００２９】
ｇｅｌＥ遺伝子含有量の測定は、上記測定方法（ａ１）〜（ｃ１）のいずれか１種の方法で行ってもよく、上記測定方法（ａ１）〜（ｃ１）のいずれか２種以上の方法を組み合わせておこなってもよい。２種以上の測定方法で同様の結果が得られた場合、当該結果に基づく肝がん発症リスクの判定は信頼性がより高いといえる。
【００３０】
＜他の工程＞
本実施形態の判定方法は、上記工程（ｉ）に加えて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、前記工程（ｉ）で測定された、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量と肝臓がん発症リスクとを相関させる工程（以下、「工程（ｉｉ）」という。）等が挙げられる。
【００３１】
≪工程（ｉｉ）≫
後述する実施例で示すように、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量は、肝がん発症リスクと相関する。そのため、本実施形態の判定方法では、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量と肝がん発症リスクとを相関させて、糞便試料が由来する対象における肝がん発症リスクを判定することができる。
具体的には、上記工程（ｉ）において測定されたｇｅｌＥ遺伝子含有量を、健常対象の糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子含有量と比較して、前記工程（ｉ）で測定されたｇｅｌＥ遺伝子含有量の方が高い場合に、前記工程（ｉ）で用いた糞便試料が由来する対象（以下、「判定対象」という場合がある。）を、肝がん発症リスクが高いと判定する。
【００３２】
本明細書において、「健常対象」とは、一般的に健常とみなされる対象を意味し、例えば、後述する実施例に記載する「健常人ドナー」としての試験対象患者基準に合格した対象（ボディ・マス・インデックス＜２５ｋｇ／ｍ２、正常血圧、正常血清コレステロール、正常血糖及びＨｂＡ１ｃ、正常血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、貧血なし、超音波検査で脂肪肝なし、及びがんの既往歴なし）等が挙げられる。健常対象は、肝疾患に罹患しておらず、肝機能に異常がなく、肝炎ウイルスに感染しておらず、肝臓がんを含む肝疾患の既往歴がない対象であることが好ましい。健常対象の糞便試料（以下、「陰性対照糞便試料」という場合がある。）は、判定対象の糞便試料と同様に処理された試料を用い、判定対象の糞便試料と同様の方法でｇｅｌＥ遺伝子含有量を測定する。健常対象は、判定対象と同じ種に属する生物であり、判定対象がヒトであれば、健常対象もヒトである。
陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量は、１個体のものであってもよく、複数個体の平均値であってもよい。あるいは、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量は、複数個体のｇｅｌＥ遺伝子含有量を統計処理して算出された基準値であってもよい。そのような基準値は、ｇｅｌＥ遺伝子陰性基準値ということもできる。好ましくは、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量は、複数個体のｇｅｌＥ遺伝子含有量の平均値又は複数個体のｇｅｌＥ遺伝子含有量を統計処理して算出された基準値である。
【００３３】
判定対象の肝臓がん発症リスクを判定するためには、上記工程（ｉ）で測定された判定対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量を、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量と比較する。その結果、判定対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量よりも高い場合には、判定対象の肝臓がん発症リスクが高いと判定される。例えば、判定対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量の１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上である場合、判定対象の肝臓がん発症リスクが高いと判定される。一方、判定対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量と同程度かより低い場合には、判定対象の肝臓がん発症リスクが低いと判定される。例えば、判定対象の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量の１．２倍未満、好ましくは１．１倍以下、より好ましくは１倍以下である場合、判定対象の肝臓がん発症リスクが低いと判定される。
【００３４】
通常、健常対象では、糞便試料中にｇｅｌＥ遺伝子はほとんど存在しないため、前記工程（ｉ）においてｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物が検出された場合には、当該糞便試料が由来する対象は、肝臓がん発症リスクが高いと判定してもよい。また、前記工程（ｉ）で測定されたｇｅｌＥ遺伝子含有量に基づいて、肝がん発症リスクのクラス分けを行ってもよい。
【００３５】
本実施形態の判定方法によれば、肝炎ウイルスとは無関係な肝がん発症リスクも評価することができるため、従来の肝炎ウイルスのスクリーニングによる方法では検出できなかった肝臓がん高リスク群を検出することができる。さらに、本実施形態の判定方法は、糞便試料のｇｅｌＥ遺伝子含有量を測定するという侵襲性の低い、簡易な方法により実施することができるため、多くの被験者に対して幅広く検査を実施することができる。
【００３６】
本実施形態の判定方法は、さらに、肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に対しては、肝臓がんの検査を定期的（例えば、１〜６カ月に１回）に実施する工程等を含んでいてもよい。前記肝臓がんの検査方法としては、例えば、コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＣＴ）や超音波検査による画像スクリーニング等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に対して、前記のような画像スクリーニングによる肝臓がんの検査を１〜６カ月に１回、好ましくは約３か月に１回程度実施することが例示される。
【００３７】
［肝臓がん発症リスクの判定キット］
一実施形態において、本発明は、被験者の糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定するための試薬を含む、肝臓がん発症リスクの判定キットを提供する。
【００３８】
＜ｇｅｌＥ遺伝子の含有量又はその遺伝子産物を測定するための試薬＞
ｇｅｌＥ遺伝子含有量の測定するための試薬は、特に限定されない。ｇｅｌＥ遺伝子含有量を測定するための試薬は、例えば、下記（ａ２）〜（ｃ２）からなる群より選択される少なくとも１種の試薬を含むことができる。
（ａ２）糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸含有量を測定するための試薬
（ｂ２）糞便試料におけるｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物含有量を測定するための試薬
（ｃ２）糞便試料におけるゼラチナーゼ活性を測定するための試薬
【００３９】
（試薬（ａ２））
ｇｅｌＥ遺伝子をコードする核酸（ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡ）含有量を測定するための試薬としては、前記「（測定方法（ａ１））」で挙げたｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマー、ｇｅｌＥ遺伝子遺伝子ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ等が挙げられる。
【００４０】
試薬がプライマーである場合、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡを増幅可能なフォワードプライマーとリバースプライマーを少なくとも１セット含むことが好ましい。プライマーの長さは、増幅反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば、１０〜５０塩基程度が例示され、１５〜４０塩基程度が好ましく、１８〜３０塩基程度がより好ましい。
また、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの含有量を測定するための試薬として、プライマーに加えて、核酸増幅反応に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。核酸増幅反応に必要な試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰ等が例示される。さらに、定量ＰＣＲ等に用いるＤＮＡ結合色素、蛍光プローブ等を含んでいてもよい。
【００４１】
試薬がプローブである場合、プローブは、標識化されたものであってもよい。標識化のための標識物質は、特に限定されず、公知のものを用いればよい。標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７などの蛍光標識；ヨウ素１２５などの放射性同位体標識；ルテニウム錯体などの電気化学発光標識；ビオチン；金属ナノ粒子等が挙げられる。プローブの標識化は、標識物質の種類に応じて、適宜、公知の方法を選択して行うことができる。なお、標識物質としてビオチンを用いる場合には、本実施形態のキットは、さらに、標識化されたアビジンを含んでいてもよい。アビジンの標識物質としては、上記例示した標識物質のうちビオチン以外の標識物質が例示される。
プローブは、２本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、１本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。また、プローブは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物であってもよい。また、プローブは、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
プローブの長さは、ハイブリダイゼーション反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば、５０〜５００塩基程度、５０〜３００塩基程度、５０〜２００塩基程度、５０〜１００塩基程度等が挙げられる。
また、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡの含有量を測定するための試薬として、プローブに加えて、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬を含んでいてもよい。そのような試薬としては、例えば、バッファー類（ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、ハイブリダイゼーションバッファー等）、プローブ標識の検出試薬等が例示される。
また、試薬は、ｇｅｌＥ遺伝子ＤＮＡのプローブを含むＤＮＡマイクロアレイであってもよい。
【００４２】
（試薬（ｂ２））
ｇｅｌＥ遺伝子の遺伝子産物（ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡ又はｇｅｌＥタンパク質）含有量を測定するための試薬としては、前記「（測定方法（ｂ１））」で挙げたｇｅｌＥ遺伝子−ｍＲＮＡを特異的に増幅可能なプライマー、ｇｅｌＥ遺伝子−ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、ｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合物質等が挙げられる。
【００４３】
ｇｅｌＥ遺伝子−ｍＲＮＡを特異的に増幅可能なプライマー、及びｇｅｌＥ遺伝子−ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブは、上記試薬（ａ２）と同様のものを用いることができる。
また、ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡの含有量を測定するための試薬として、前記プライマー又はプローブに加えて、前記試薬（ａ２）で挙げたものと同様の試薬等を含んでいてもよい。ｇｅｌＥ−ｍＲＮＡを核酸増幅反応により測定する場合には、さらに逆転写酵素等を含んでいてもよい。
【００４４】
試薬がｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合物質である場合、抗ｇｅｌＥタンパク質抗体であってもよく、抗ｇｅｌＥタンパク質アプタマーであってもよい。これらは、標識化されたものであってもよく、標識化のための標識物質としては、前記試薬（ａ２）で挙げたものと同様のものが挙げられる。
また、ｇｅｌＥタンパク質の含有量を測定するための試薬として、ｇｅｌＥタンパク質に対する特異的結合物質に加えて、ｇｅｌＥタンパク質と特異的結合物質との結合反応に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。結合反応に必要な試薬としては、例えば、バッファー類（ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、反応バッファー等）、二次抗体、標識物質の検出試薬等が例示される。
【００４５】
（試薬（ｃ２））
ゼラチナーゼ活性を測定するための試薬としては、例えば、ゼラチンが挙げられる。その他、アガロース、Ｌ−システイン等のゼラチンプレートの作製に必要な試薬を含んでいてもよい。あるいは、作製済みのゼラチンプレートを含んでいてもよい。
さらに、塩化第二水銀試薬、塩酸等のゼラチン分解の検出試薬等を含んでいてもよい。
【００４６】
（その他）
本実施形態のキットは、さらに、ＤＮＡ抽出試薬、ＲＮＡ抽出試薬、濾過フィルター、糞便を懸濁するためのバッファー類、標準試薬、陰性対照糞便試料、使用説明書等を含んでいてもよい。
【００４７】
本実施形態のキットは、上記態様の肝臓がん発症リスクの判定方法の実施に使用することができる。
【００４８】
［肝がん発症リスクを低減するための医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に投与される、肝臓がん発症リスクを低減するための医薬組成物であって、前記対象の大腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００４９】
＜肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象＞
本実施形態の医薬組成物は、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝がん発症リスクが高いと判定された対象（以下、「肝臓がん高リスク対象」という場合がある）に投与されるものである。肝臓がん発症リスクの判定は、上記「［肝臓がん発症リスクの判定方法］」の項で説明したように行うことができる。例えば、陰性対照糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量と比較して、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が高い場合、当該糞便試料が由来する対象は、肝がん発症リスクが高いと判定され、本実施形態の医薬組成物の投与対象となる。あるいは、通常、健常対象では、糞便試料中にｇｅｌＥ遺伝子はほとんど存在しないため、糞便試料中でｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物が検出された場合には、当該糞便試料が由来する対象を肝癌発症リスクが高いと判定し、本実施形態の医薬組成物の投与対象としてもよい。
【００５０】
＜対象の大腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤＞
本実施形態の医薬組成物は、対象の大腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる薬剤を含む。
糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量は、腸内のｇｅｌＥ陽性の細菌（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３）の密度と相関しており、糞便試料中のｇｅｌＥ遺伝子含有量が高いことは、腸内にｇｅｌＥを有する細菌（以下、「ｇｅｌＥ陽性細菌」ともいう。）の密度が高いことを意味している。後述する実施例で示すように、腸内におけるｇｅｌＥ陽性細菌の存在は、腸透過性を高め、肝臓がんの発症を促進すると考えられる（例えば、図５Ａ〜５Ｆ）。そのため、腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させる薬剤を肝臓がん高リスク対象に投与して、当該対象の腸内におけるｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させることにより、当該対象の肝臓がん発症リスクを低減することができる。
ｇｅｌＥ陽性細菌は、ｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌であれば特に限定されないが、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌が挙げられ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｃｏｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ等が例示される。
【００５１】
腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させる薬剤は、そのような作用を有する薬剤であれば、特に限定されない。例えば、後述する実施例で示すように、健常対象の腸内細菌叢を腸内に移植すると、糞便試料中のｇｅｌＥ陽性細菌の数が減少し、肝臓における増殖遺伝子の発現が抑制される（例えば、図６Ｃ，図６Ｅ）。したがって、前記薬剤の好ましい例としては、健常対象の腸内細菌を含む薬剤が挙げられる。「腸内細菌」とは、腸に生息する細菌であり、１種であってもよく、２種以上であってもよく、腸内に生息する細菌群集（腸内フローラ又は腸内細菌叢）であってもよい。本実施形態の医薬組成物が、健常対象の腸内細菌を含む薬剤を含む場合、当該薬剤が含む健常対象の腸内細菌は、２種以上の細菌群集であることが好ましく、健常対象の腸内細菌叢であることがより好ましい。
【００５２】
健常対象の腸内細菌は、健常対象の腸内から採取してもよいが、腸内からの採取は侵襲性が高いため、健常対象の糞便試料から採取されることが好ましい。すなわち、健常対象の腸内細菌は、健常対象の糞便中に存在する細菌であることが好ましい。
例えば、健常者の糞便を、１０倍容量（ｗ／ｖ）程度の適切な緩衝液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）に懸濁し、滅菌フィルター又は滅菌したこし器等で濾過することにより、健常対象の腸内細菌を含む薬剤を調製することができる。
【００５３】
本実施形態の医薬組成物の投与方法は、特に限定されず、医薬品の投与方法として一般的に用いられる方法で投与することができる。本実施形態の医薬組成物が、健常対象の腸内細菌を含む場合、投与方法には、便移植に一般的に用いられる方法を利用することができる。そのような方法としては、例えば、全結腸内視鏡ファイバー等を用いた腸管内投与が挙げられる。例えば、肝臓がん高リスク対象に対して、腸管洗浄液による腸管洗浄を行った後、全結腸内視鏡ファイバーを盲腸まで挿入し、盲腸から全結腸内視鏡ファイバーを用いて本実施形態の医薬組成物を散布することにより、本実施形態の医薬組成物の投与を行ってもよい。
【００５４】
本実施形態の医薬組成物の投与量は、治療的有効量とすることができる。本明細書において、「治療的有効量」とは、肝臓がん高リスク対象の腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させることが可能な量を意味する。治療的有効量は、例えば、糞便試料中のｇｅｌＥ陽性細菌の密度を１０％以上減少させる量であることができ、２０％以上減少させる量であることが好ましい。治療的有効量は、より好ましくは、糞便試料中にｇｅｌＥ陽性細菌が検出されなくなるような量である。
本実施形態の医薬組成物が健常対象の腸内細菌を含む場合、治療的有効量は、当該腸内細菌が、肝臓がん高リスク対象の腸内で定着可能な量であってもよい。健常対象の腸内細菌が肝臓がん高リスク対象の腸内で定着したか否かは、例えば、当該肝臓がん高リスク対象の糞便試料中の細菌群集を調査することにより確認することができる。例えば、健常対象の糞便約５０ｇを生理食塩水約５００ｍＬに浮遊させ、滅菌したこし器等によりろ過して薬剤を調製した場合、当該薬剤の約２５０ｍＬを治療的有効量として肝臓がん高リスク対象への腸管内投与に用いることができる。
【００５５】
本実施形態の医薬組成物の投与間隔は特に限定されず、腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させる薬剤の種類、投与方法等によって適宜選択すればよい。本実施形態の医薬組成物が健常対象の腸内細菌を含む場合、投与は通常１回でよい。また、１回の投与で肝臓がん高リスク対象の腸内に健常対象の腸内細菌が定着しなかった場合には、再度、本実施形態の医薬組成物の投与を行ってもよい。その場合、２回目の投与に用いる健常対象の腸内細菌は、１回目の投与と同じ健常対象から得られた腸内細菌であってもよいし、１回目の投与とは異なる健常対象から得られた腸内細菌であってもよい。例えば、図６Ｃに示すように、健常対象の個体によって、腸内細菌の効果が異なる場合がある。そのため、１回目の投与で効果が見られなかった場合には、１回目の投与とは異なる健常対象から得られた腸内細菌を用いることも可能である。
【００５６】
本実施形態の医薬組成物によれば、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に対して、肝臓がん発症リスクを低減するため処置を提供することができる。そのため、本実施形態の医薬組成物を、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法と組み合わせて用いることにより、肝臓がん発症のリスク管理を適切に行うことが可能となる。
【００５７】
［肝臓がん発症リスクを低減する方法］
一実施形態において、本発明は、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に対して、腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる処置を行う工程を含む、肝臓がん発症リスクを低減する方法を提供する。
【００５８】
＜腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる処置＞
本実施形態の肝臓がん発症リスクを低減する方法では、肝臓がん高リスク対象に対して、腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させる処置を行う。当該処置は、肝臓がん高リスク対象の腸内のｇｅｌＥ陽性細菌の数を減少させる処置であれば、特に限定されない。そのような処置としては、例えば、上記実施形態の医薬組成物の投与、腸管洗浄液による腸管洗浄、抗生物質の投与等が挙げられる。
【００５９】
本実施形態の方法で行う処置が、健常対象の糞便に存在する細菌を含む医薬組成物の投与である場合、当該処置は、健常対象の便移植であるということもできる。上記実施形態の医薬組成物の投与、又は健常対象の便移植は、上記「［肝がん発症リスクを低減するための医薬組成物］」で記載したように、全結腸内視鏡ファイバー等を用いて行うことができる。
【００６０】
本実施形態の方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｖ）を含んでいてもよい：
対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程（ｉ）；
前記工程（ｉ）で測定された、前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量と、肝臓がん発症リスクと、を相関させる工程（ｉｉ）；
前記工程（ｉｉ）の結果に基づいて、前記対象の肝臓がん発症リスクを判定する工程（ｉｉｉ）；及び
前記工程（ｉｉｉ）で肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象に対して、腸内のｇｅｌＥ遺伝子を有する細菌の数を減少させる処置を行う工程（ｉｖ）。
【００６１】
＜他の態様＞
他の態様において、本発明は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの検査方法を提供する。
他の態様において、本発明は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの予測方法を提供する。
他の態様において、本発明は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクの高い糞便試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、対象の糞便試料において、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程を含む、肝臓がん発症リスクを診断するためのデータの収集方法を提供する。
他の態様において、本発明は、肝臓がん発症リスクマーカーとしてのｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物を提供する。
他の態様において、本発明は、肝臓がん発症リスクマーカーとしての、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物からなる肝がん発症リスクマーカーを提供する。
他の態様において、本発明は、対象の糞便試料の検査方法であって、前記糞便試料のｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量を測定する工程と、前記ｇｅｌＥ遺伝子又はその遺伝子産物の含有量と肝臓がん発症リスクとを相関させる工程とを含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象において、肝臓がん発症リスクを低減するための医薬組成物を製造するための、健常対象の腸内細菌の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、上記実施形態の肝臓がん発症リスクの判定方法により肝臓がん発症リスクが高いと判定された対象において、肝臓がん発症リスクを低減するための、健常対象の腸内細菌を含む医薬組成物を提供する。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
［材料及び方法］
（臨床研究の母集団）
調査対象母集団は、２０１３年６月から２０１４年１１月までの間に金沢大学病院に入院し、臨床研究への参加の同意前に書面及び口頭で情報を受け取った２８人のＨＣＶ感染慢性肝疾患患者を含む。入院の直前又は直後に、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）又は磁気共鳴画像（ＭＲＩ）画像による肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）のスクリーニングを行い、対象を慢性肝疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＬＤ）グループ又はＨＣＣグループに割り当てた。１３人の患者はＨＣＣを有さず（ＣＬＤグループ）、１５人の患者は原発性ＨＣＣの精密検査のために入院した（ＨＣＣグループ）。ＨＣＣグループの１５人の患者全員が原発性ＨＣＣを患っており、臨床研究への登録後に抗癌治療を受けた。１５人の患者のうち１２人は、肝カテーテル摘出術又は高周波アブレーションのような根治的治療を経カテーテル動脈化学塞栓療法の有無にかかわらず受けたが、３人の患者はレンバチニブ又は肝動脈注入化学療法による化学療法を受けた。根治治療を受けた１２人のＨＣＣ及びすべてのＣＬＤ患者は、１年に２回以上のＣＴ、ＭＲＩ又は超音波検査などの肝臓造影により、新規又は再発ＨＣＣの発生率について２０１７年１１月まで追跡調査された。腸内微生物叢、糞便タンパク質及び代謝産物の存在を調べるために、登録の直後に、糞便のサンプルを採取し、−８０℃で保存した。健常人は、最初に試験対象患者基準に合格するか否かを確かめるために試験された；ボディ・マス・インデックス＜２５ｋｇ／ｍ２、正常血圧、正常血清コレステロール、正常血糖及びＨｂＡ１ｃ、正常血清ＡＳＴ及びＡＬＴ、貧血なし、超音波検査で脂肪肝なし、及びがんの既往歴なし。１６人が基準に合格し、健常ドナーとして登録された（ＨＤ）。同意の直後に、糞便が集められて貯蔵された。
【００６４】
（糞便ＲＮＡの全ゲノムショットガン及び１６ＳリボゾマルＲＮＡアンプリコンの配列解析）
ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ単離キットを製造元の指示に従って使用し、−８０℃で保存した糞便から糞便ＤＮＡを抽出した（ＭＯ  ＢＩＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。糞便をホモジナイズするためのビーズを、０．７ｍｍガーネットビーズから０．１ｍｍガラスビーズ（ＭＯ  ＢＩＯ）に変更した。
全ゲノムショットガンシークエンシングのために、５５℃で５分間の反応で、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＤＮＡのタグ付けを行った。ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（ＺＹＭＯ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて生成物をクリーンアップした後、Ｎｅｘｔｅｒａインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、７２℃で３分間及び９８℃で３０秒間、その後、９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間及び７２℃で３分間のサイクルを５回繰り返して、インデックス付けＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、オリゴＤＮＡ混入物から精製し、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して定量した。ライブラリーをプールし、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ３（６００サイクル；Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＭｉｓｅｑで配列決定を行った。
【００６５】
得られた配列の前処理は以下のようにして行った。得られた配列の末端から低品質スコアを有する塩基をトリミングした後、配列をＦＡＳＴＸ  ＴｏｏｌｋｉｔによりＱスコアカットオフ２０でフィルタリングした。ペアエンド結合は、ＭａｃＱＩＩＭＥ  ｖ１．９．１を使用して行った。得られた配列を、ｂｏｗｔｉｅ２  バージョン２．２．４により、ＵＣＳＣヒトゲノムリファレンスｈｇ１９にマッピングした後、ヒトゲノム配列をＳＡＭｔｏｏｌｓ−１．２により除去した。最後に、ＰＣＲ複製物を、ＰＲＩＮＳＥＱバージョン０．２０．４を用いて除去した。
最終出力ｆａｓｔａファイルを、ＭｅｔａＰｈｌＡｎ２  バージョン２．０．０を使用して糞便サンプルの分類を同定するために使用した。配列中に存在する代謝経路も、ＨＵＭＡｎＮ２  バージョン０．１．９を使用して、ｆａｓｔａファイルで分析した。ＫＥＧＧバージョン５６データベースを、ＤＩＡＭＯＮＤ  バージョン０．７．５を使用して生成し、ＨＵＭＡｎＮ２分析に使用した。１００万回のリードによる存在量の正規化の後、グループ間の比較を、ＬＥｆＳｅを用いた線形判別分析により行った。分類又は代謝経路データに基づいて、腸内細菌叢群集のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を計算し、得られた距離を主座標分析によって視覚化した。
【００６６】
１６Ｓ配列解析のために、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ３及びＶ４領域を標的とする配列及びイルミナアダプターオーバーハングヌクレオチド配列からなるプライマーを使用してＰＣＲアンプリコンを調製した。プライマー配列を以下に示す。
フォワードプライマー
5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'（配列番号５）
リバースプライマー
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'（配列番号６）
ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、９５℃で３分間のイニシャルステップ、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の２５サイクル、及び７２℃で５分間のファイナルステップにより、ＰＣＲ反応を行った。精製後、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、９５℃で３分間のイニシャルステップ、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の８サイクル、及び７２℃で５分間のファイナルステップによりインデックスＰＣＲを行った。ライブラリーをプールし、ＰｈｉＸ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と混合し、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ３（６００サイクル；  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＭｉｓｅｑで配列決定を行った。配列の下流処理は、ＭａｃＱＩＩＭＥ  ｖ１．９．１を用いて行った。配列のペアエンド結合及び低品質配列のトリミング後、得られた配列は４４２〜４６４ｂｐの範囲の長さを有していた。オペレーショナル分類単位（ＯＴＵ）を、ＵＣＬＵＳＴを使用して選択した。ＯＴＵ解析のために、配列をクラスター化し、９７％を超える類似性を有する配列を同じＯＴＵにまとめた。ＯＴＵにおける代表的な配列の分類を、９７％の同一性でクラスター化されたＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓリファレンスデータベースを使用して、ＲＤＰ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒにより割り当てた。属レベルの分類法を要約し、その後の分析に使用した。系統樹を計算した後、腸内細菌叢群集の重み付けされていないＵｎｉｆｒａｃ距離を計算し、得られた距離を主座標分析によって視覚化した。
【００６７】
（マウス肝臓発癌試験）
従来の又は無菌のＣ５７ＢＬ６Ｎマウスを、日本ＣＬＥＡ（東京、日本）から購入した。４週齢の０日目及び３日目にＤＥＮ（２５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を２回腹腔内注射し、続いて四塩化炭素（ＣＣｌ４；０．５ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、コーン油に溶解）を２０回にわたって週１回注射することによって肝腫瘍を誘発した。目に見える肝腫瘍の数を数えるために、マウスを最初のＤＥＮ注射の８ヶ月後に安楽死させた。遺伝子発現実験のために、マウスをＤＥＮ注射後１回、続いてＣＣｌ４の２回の注射後に安楽死させ、肝臓をＲＮＡｌａｔｅｒで採取した。
【００６８】
（リアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成は以前に記載されたように実施した（Iida, N., et al. Cancer Res 70, 6556-6565 (2010).）。リアルタイムＰＣＲに使用したＴａｑＭａｎプローブは以下の通である；ｋｉ６７  Ｍｍ０１２７８６１７、ｃｃｎｂ１  Ｍｍ０３０５３８９３、ｅｒｅｇ  Ｍｍ００５１４７９４、ｃｏｌ１ａ１  Ｍｍ００８０１６６６、ｔｎｆ  Ｍｍ００４４３２５８、ｉｌ１ｂ  Ｍｍ００４３４２２８、ｉｌ６  Ｍｍ００４４６１９０、ｃｃｌ２  Ｍｍ０３０５３８９３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ＰＣＲに利用可能なＤＮＡ量の変動を制御するために、各サンプル中の標的遺伝子発現を、内在性対照１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の発現に対して正規化した。糞便ＤＮＡ中のｇｅｌＥ遺伝子の相対量を、ｇｅｌＥプライマー（Vankerckhoven, V., et al. J Clin Microbiol 42, 4473-4479 (2004).）及びＳＹＢＲグリーン（ＱＩＡＧＥＮ、Ｌｉｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ反応は、９５℃で１５分間のイニシャルステップ、続いて９４℃で１５秒間、５６℃で１分間、７２℃で３０秒間の４０サイクル、及び５３℃で１５秒間のファイナルステップにより行った。ｇｅｌＥ遺伝子の存在量は、ユニバーサル１６Ｓリボソーム遺伝子のプライマーを用いて取得した値で標準化した（Iida, N., et al. Science 342, 967-970 (2013).）。
【００６９】
（糞便移植及び細菌接種）
凍結した糞便ストックを、嫌気性チャンバー（ＲＵＳＫＩＮＮ，Ｂｒｉｄｇｅｎｄ，ＵＫ）内での嫌気条件（８０％Ｎ２、１０％Ｈ２、１０％ＣＯ２、又はＮ２充填）下で解凍し、０．１％レサズリン（ｗ／ｖ）及び０．０５％Ｌ−システイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１０倍容量（ｗ／ｖ）の還元ＰＢＳに懸濁し、１００μｍ孔径ナイロンメンブレンフィルターで濾過した。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、腸内細菌叢の除菌のために、ドリペネム水和物（０．２５ｇ／Ｌ；シオノギ，日本）及びバンコマイシン塩酸塩（０．５ｇ／Ｌ；シオノギ）を含む抗生物質水を４週間与えた。抗生物質中止後１日目及び２日目に、チューブによる経口投与及び直腸投与により、糞便懸濁液をフローラ除菌マウスまたは無菌マウスに接種した。細菌接種試験のために、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｖ５８３、ＡＴＣＣ７００８０２としても入手可能；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＨＣＣ対象の糞便から単離したクローンＨＣ５ａ）、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ３３３９７）、Ｌサリバリウス（ＡＴＣＣ１１７４１）又はＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ（ＡＴＣＣ１２７５５）を１００μｌのＰＢＳ中２．５×１０８細胞で調製し、糞便懸濁液の接種と同様に、フローラ除菌マウス又は無菌マウスに接種した。フローラ除菌マウスは、糞便又は特定の細菌株を接種した後、個々に分離された分離装置に収容された。発癌のためのＤＥＮ注射を、糞便又は細菌懸濁液の最初の接種の少なくとも４日後に開始した。ＧｅｌＥ欠失のＥ．フェカリスＶ５８３株は、以前に記載されたように作製した（Steck, N., et al. Gastroenterology 141, 959-971 (2011)。無菌又はノトバイオートマウスを、金沢大学の動物施設の無菌アイソレーター（ＩＣＭ、つくば、日本）に収容した。
【００７０】
（ゼラチナーゼ活性アッセイ）
糞便を１容量（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁し、１００μｍ孔径ナイロンメンブランで濾過し、ゼラチン寒天プレート［Ｔｒｙｏｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）３ｇ；アガロース（Ｗａｋｏ、大阪、日本）１．５ｇ；ゼラチン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）４ｇ；Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．０５ｇ；蒸留水１００ｍＬ］にスポットした。１日間のインキュベーション後、プレートを塩化第二水銀試薬［塩化第二水銀１２．５ｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、塩酸１６．８ｍｌ、及び脱イオン水８３．２ｍｌから製造］で満たした。ゼラチナーゼ活性が陽性である場合、透明な帯状の変化がコロニー周囲に観察される。ゼラチナーゼ活性は透明層の半径に従って、−から＋＋に分類した；−，層半径＜３ｍｍ；＋，３ｍｍ≦半径＜６ｍｍ；＋＋，半径≧６ｍｍ。
【００７１】
（糞便のＭＭＰの測定）
対象の糞便を３容量（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁した。ＭＭＰ９の濃度を、製造者の指示に従って、ヒトＭＭＰ−９活性アッセイ（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）を使用して測定した。希釈したサンプルをＭＭＰ−９抗体でコーティングした９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、検出酵素及び基質の混合物を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。０時間及び４時間での波長４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳｕｎｒｉｓｅＴＭ，Ｔｅｃａｎ，スイス）で測定した。最後に、ＭＭＰ−９の濃度を、線形回帰モデルを用いた標準曲線分析により決定した。
【００７２】
（プラズマＬＰＳの測定）
ＬＰＳフリーの針、シリンジ及び１．５ｍｌチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いて、心臓穿刺によりマウスから採血し、１３００ｇで２分間遠心分離して血漿を採取した。次いで、製造業者の指示にわずかに変更を加えて、ＥｎｄｏＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡベースの内毒素定量アッセイキット（Ｈｙｇｌｏｓ，Ｂｅｒｎｒｉｅｄ  ａｍ  Ｓｔａｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｓｅｅ，ドイツ）を使用して、血漿中のＬＰＳを測定した。血漿を９容量のＬＰＳフリー水で希釈し、ＬＰＳ特異的バクテリオファージでコートした９６ウェルプレート中で振とうしながら、３７℃で９０分間インキュベートした。バクテリオファージは、ＬＰＳの保存された炭水化物構造と特異的に結合する受容体タンパク質を有する。インキュベーション後、アッセイを阻害する物質を洗浄により除去した。合成組換えＣ因子をウェルに添加し、ＬＰＳにより活性化した。Ｃ因子のプロテアーゼ活性は、ウェルに添加された基質を修飾し、蛍光を発生する。蛍光を、蛍光分光計（Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，ドイツ）により、励起波長３８０ｎｍ及び発光波長４４０ｎｍで検出した。最後に、ＬＰＳの濃度を、線形回帰モデルを用いた標準曲線分析により決定した。
【００７３】
（ｉｎ  ｖｉｖｏ消化管透過性アッセイ）
６時間絶食したマウスに、強制経口投与（５００ｍｇ／ｋｇ体重）により４０００Ｄａの蛍光デキストラン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を与えた。３時間後、血液を採取し、４℃、１５００ｇで１５分間遠心して血漿を採取した。血漿を４容量の蒸留水で希釈し、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍで、蛍光分光計（Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１）を用いてデキストラン−ＦＩＴＣの濃度について分析した。
【００７４】
（細菌培養）
Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ及びＳ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓを、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（栄研化学、日本）中で増殖させた。胆汁酸による増殖阻害試験では、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡまたはＬＣＡをＤＭＳＯに溶解し、ＣＡ及びＣＤＣＡについては０．２ｍＭ、ＤＣＡ及びＬＣＡについては２ｍＭの最終濃度で、ＢＨＩブロスに添加した。次に、１×１０９個のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３を、２０ｍｌのＢＨＩブロス中で、３７℃で一晩培養し、１ｍｌの前培養したＶ５８３懸濁液を胆汁酸含有ＢＨＩブロスに添加した。３７℃で６時間インキュベートした後、懸濁液をＥＦ寒天プレート（ニッスイ、日本）上で培養して、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓのみが増殖し、Ｅ．ｆｅａｃａｌｉｓが紫色のコロニーを示すＣＦＵを計数した。
ヒト糞便からのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ株の単離のために、まず糞便をＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ選択寒天培地、ＥＣＳ寒天プレート（Ｅｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）上に画線した。次に、コロニーを選択し、ＥＦ寒天プレート上で培養した。ＥＦ寒天プレート上では、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは紫色のコロニーを示し、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍはオレンジ色のコロニーを示す。紫色のコロニーを選択した後、クローンをＢＨＩブロス中で増殖させた。コロニーの種は、以前に記載されたようにＤＮＡ  ＰＣＲ法によって決定された（Ryu, H., et al. Appl Environ Microbiol 79, 196-204 (2013)）。最後に、全ゲノムショットガン配列解析により、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの種であることを確認した。
【００７５】
（糞便中胆汁酸の測定）
糞便中胆汁酸の測定は、以前に記載されているように実施した（Kakiyama, G., et al. J Lipid Res 55, 978-990 (2014)）。胆汁酸を、前述の方法を若干修正した方法用いて、糞便試料及び腸内容物から抽出した。糞便試料（１００ｍｇ）をジルコニアビーズと共に２ｍｌチューブに入れ、９００μｌの５０ｍＭ冷酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）／エタノール混合物（１：３、ｖ／ｖ）に懸濁し、ボルテックスし、８０℃で３０分間加熱した。試料を、ＦａｓｔＰｒｅｐ２４（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて５ｍ／ｓで４５秒間ボルテックスし、１，３００ｇで１０分間遠心分離した。上清（２００μｌ）を２ｍｌチューブ中で８００μｌのＭｉｌｌｉＱと混合した。試料をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８カートリッジ（５００ｍｇ／６ｍｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に適用した。カートリッジを１０％エタノール（５ｍｌ）で洗浄し、次いで胆汁酸をエタノール（５ｍｌ）で溶出した。溶媒を蒸発させ、残渣を１ｍｌのエタノールに溶解した。溶液を５０％エタノールで希釈し、０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濾過した後、バイアルに移した。エレクトロスプレーイオン化プローブを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦ質量分析計と連結したＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、孔径１．７μｍ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムで、胆汁酸の定量を行った。注入量は５μｌとした。移動相Ａは水であり、移動相Ｂはアセトニトリルであり、両方とも０．１％ギ酸を含有させた。流速は０．４ｍｌ／分とした。オートサンプラーの温度は、それぞれ６０℃と１０℃に保った。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦをネガティブモードで実行した（毎秒０．３スキャンの速度で５０〜８５０ａｍｕをスキャンする）。以下の機器条件を使用した：キャピラリー、０．５ｋＶ；供給源温度、１５０℃；サンプリングコーン、２０Ｖ；コーンガス、１００ｌ／ｈ；脱溶媒和ガス流量、４５０ｌで１，０００ｌ／ｈ。質量精度と再現性を保証するために、ロイシンエンケファリンを参照ロック質量（ｍ／ｚ５５４．２６１５）としてマススプレーで使用した。
【００７６】
（統計解析）
微生物叢間の分類及びＫＥＧＧ経路の比較に関する統計分析は、ＬＥｆＳｅを用いた線形判別分析によって行った。２つの値の間の統計学的差異は、Ｇｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を用いたＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって分析した。腫瘍陽性マウス又はゼラチナーゼ陽性対象の百分率の統計学的差異は、Ｅｘｃｅｌのχ２検定によって分析した。グループ間の累積腫瘍発生率を比較するために、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用し、Ｇｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を用いたログランク検定によってグループ間の差を評価した。Ｐ値＜０．０５は統計的有意性を示すとみなした。糞便中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ又はｇｅｌＥ遺伝子の存在量間のＳｐｅａｒｍａｎの順位相関係数、及び対象における様々なファクターを、Ｇｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して計算した。
【００７７】
［結果］
（慢性肝機能障害患者の腸内細菌叢は、口腔内及び小腸に存在する細菌による腸内毒素症を示す）
ＨＣＣの有無にかかわらず慢性肝機能障害のある患者と健常人との間の腸内細菌叢の分類学的及び機能的な差異を調べるために、１６人の健康ドナーの糞便（ＨＤグループ）、１３人のＨＣＣを有さないＨＣＶ感染慢性肝疾患患者（ＣＬＤグループ）、及び１５人の原発性ＨＣＣを有するＨＣＶ感染慢性肝疾患患者（ＨＣＣグループ）の糞便を採取した。ＣＬＤ患者及びＨＣＣ患者の両方とも、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが高く、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）及びＨ２受容体アンタゴニスト（Ｈ２ＲＡ）を含む胃酸減少剤の投与率が高い肝炎を患っていた。全ゲノムショットガン配列決定により、糞便ＤＮＡの１５又は４１の分類群が、ＨＤとＣＬＤ、又はＨＤとＨＣＣとの間で、それぞれ有意に異なることが明らかになった（図１Ａおよび図１Ｂ）。これらの分類群のうち、６種の連鎖球菌種、４種の乳酸桿菌種、及び２種のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ種、並びにＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｏｔｈｉａ属及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属は、ＨＤと比較してＨＣＣ微生物叢において有意に豊富であった（図１Ｂ）。ＣＬＤでは、２種類の連鎖球菌種、１種類の乳酸桿菌種、１種類のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ種、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属も、ＨＤと比較して豊富でした（図１Ａ）。これらの種は、通常口腔や小腸に豊富に存在する細菌であり、この結果は、肝硬変患者の腸内細菌叢に関する報告とよく類似していた（Qin, N., et al. Nature 513, 59-64 (2014)）。ＣＬＤとＨＣＣとの間の差異は、ＨＤと比較した差異よりも小さかったが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属の１種が、ＨＣＣ中に多く存在していた（図１Ｃ）。腸内微生物叢の代謝経路の分析において、２２、６９または１５のＫＥＧＧ経路は、それぞれＨＤとＣＬＤ、ＨＤとＨＣＣ、又はＣＬＤとＨＣＣとの間で、有意に異なっていた。酸化的リン酸化の経路は、ＣＬＤ及びＨＣＣの両方と比較して、ＨＤにおいて豊富であったが、解糖の経路は、ＨＤと比較して、ＣＬＤ及びＨＣＣにおいて豊富であった。Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離計量及び主座標分析（ＰＣｏＡ）は、ＨＣＣ微生物叢がＨＤと比較して、分類学的に（図１Ｄ）及び機能的に（図１Ｅ）、異なるプロットを構築したことを表した。ＣＬＤ微生物叢は、ＨＤとＨＣＣとの間の比較的中間の位置にプロットされた（図１Ｄ及び図１Ｅ）。胃酸減少剤は、腸内細菌叢の組成に影響を与えるため、プロトンポンプ阻害薬（ＰＰＩ）やＨ２受容体拮抗薬（Ｈ２ＲＡ）の投与を受けていないＨＤ患者とＣＬＤ／ＨＣＣ患者との比較も行った。ＰＰＩ／Ｈ２ＲＡ薬を投与されていない１５人の慢性肝疾患患者（８人のＣＬＤ患者及び７人のＨＣＣ患者）の微生物叢は、ＨＤと比較してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の３種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の１種及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が豊富であった。この結果は、全被験者による分析と部分的に類似していた（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＰＰＩを服用しているＣＬＤ／ＨＣＣ患者の実際のフローラの組成は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎ��ｓｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅファミリー、及びＲｏｔｈｉａ属の存在によって特徴付けられ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属とは関係がなかった（データは示さず）。総合すると、フローラの腸内異常は、胃酸減少剤の部分的な影響を伴う慢性肝機能障害によって引き起こされていた。したがって、ＣＬＤ及びＨＣＣ微生物叢は、口腔又は小腸型細菌及びＨＤ微生物叢とは異なるエネルギー代謝による肝機能障害に関連する腸内微生物叢異常を有していた。
【００７８】
（慢性肝機能障害患者の糞便微生物叢はマウスにおける肝発癌を促進する）
各被験者の糞便微生物叢を１〜３匹のフローラ除菌Ｃ５７ＢＬ６マウスに移植し、ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）と四塩化炭素（ＣＣｌ４）の組み合わせによって誘発される肝腫瘍の発生率を観察した。糞便移植後の糞便微生物叢の縦断的分析によれば、被験者の微生物叢の組成は移植されたマウスでは完全には回復しなかったが、マウス微生物叢の組成は被験者のフローラに応じて変化し、移植８ヶ月後も安定であった（データは示さず）。そこで、マウスモデルにおける各患者のフローラ由来の独自の細菌叢が肝発癌に及ぼす影響を評価した。ＨＤ微生物叢の移植は、２７匹のマウスのうち３匹において肝臓腫瘍を発症させたが、腫瘍担持マウスの数は、糞便移植を受けなかった対照マウスと同数であった（図２Ａ）。ＣＬＤ又はＨＣＣ微生物叢は、ＨＤよりも多くのマウスにおいて肝腫瘍を引き起こし（ＣＬＤ、１６匹のマウスのうち１１匹；ＨＣＣ、２４匹のマウスのうち２２匹；図２Ａ）、肝臓腫瘍の数は、ＨＤよりもＣＬＤ又はＨＣＣの微生物叢を移植したマウスで、有意に多かった（図２Ｂ）。このマウスモデルでの腫瘍促進効果は、観察の終期段階ではなく、ＤＥＮ及びＣＣｌ４を注射したときの初期段階から中期段階で観察されたため、ＤＥＮ及びＣＣｌ４の注射コースの間の肝臓の遺伝子発現を評価した。増殖遺伝子ｋｉ６７及びｅｒｅｇの発現は、ＨＤと比較して、ＨＣＣ微生物叢移植マウスの肝臓において上方制御された（図２Ｃ）。炎症性ケモカインｃｃｌ２の発現は、ＨＤよりＣＬＤ−微生物叢移植マウスにおいて高かった。患者の微生物叢組成は、フローラ除菌マウスでは完全に再現されなかったので、選択した微生物叢を無菌マウスに移植した。ＣＬＤ患者１３又はＨＣＣ患者１２の糞便を移植したマウスは、ＨＤ患者５５の微生物叢を移植したマウスと比較して、肝臓において増殖性遺伝子ｋｉ６７及びｃｃｎｂ１の発現上昇を示した（図２Ｄ）。炎症遺伝子ｔｎｆ及びｃｃｌ２の発現は、ＨＤ患者５５のフローラを有するマウスと比較して、ＣＬＤ患者１３のフローラを有するマウスにおいて上昇した。したがって、特定のＣＬＤ患者またはＨＣＣ患者の糞便微生物叢を無菌および除菌マウスに移植すると、肝臓における増殖性または炎症性遺伝子の発現が上昇した。しかし、フローラの組成が患者によって異なるため、全てのＣＬＤ患者およびＨＣＣ患者の微生物叢がこれらの遺伝子の発現を上昇させることはなかった。末期の肝線維症の程度もまた患者に依存していた。ＣＬＤまたはＨＣＣの微生物叢を移植した特定のマウスは、肝臓で架橋線維症を示したが、ＨＤ微生物叢を移植したマウスの大部分は重度の線維症を示さなかった（データは示さず）。
【００７９】
（腸内のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓは肝発癌を促進する）
腸内細菌叢の組成とその遺伝子発現および発がん性への影響は、ＣＬＤグループまたはＨＣＣグループにおいても多様であった。したがって、ＨＤ、ＣＬＤまたはＨＣＣからの糞便の移植後に、肝腫瘍が発生したマウスの腸内微生物叢の特徴を調べた。肝臓腫瘍担持マウスと腫瘍非担持マウスとの間の比較において、１６属が有意に異なっていた（図３Ａ）。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｒｉｔｅｎｓｅｎｅｌｌａ属、およびＥｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ属は、腫瘍が存在しないマウスと比較して、腫瘍が存在するマウスのフローラに多く存在した。これらの属のうち、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属は、被験者ＨＤ微生物叢と比較して、ＣＬＤおよびＨＣＣの微生物叢においても多い唯一の属であった（図１Ａおよび図１Ｂ）。腸球菌が存在するマウスは、腸球菌を含まないマウスよりも多くの肝腫瘍を有していた（図３Ｂ）。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が存在するマウスは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が存在しないマウスと比較して、肝臓においてｋｉ６７、ｃｃｎｂ、ｔｎｆおよびｃｃｌ２の発現上昇を示した（図３Ｃ）。特定のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種の発癌性を調べるために、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３株またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを口腔内および直腸内に強制投与し、フローラ除菌マウスの腸内に定着させた。ＣＬＤおよびＨＣＣの微生物叢に多く存在するため（図１ＡおよびＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓも他のマウスに強制投与した。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ定着マウスは、Ｅ．ｃａｓｓｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、またはＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ定着マウスよりも有意に多くの肝腫瘍を有していた（図３Ｄ）。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ定着マウスにおける肝腫瘍の数は、ＨＣＣ患者１１の微生物叢を移植したマウスと同様であった。増殖遺伝子ｋｉ６７、ｃｃｎｂ１およびｅｒｅｇ、ならびに線維症遺伝子ｃｏｌ１ａ１の発現は、他の細菌種が定着したマウスと比較して、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ定着マウスの肝臓において有意に上昇した（図３Ｅ）。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３とＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓとの間の消化管臓器における病原性の相違の１つが、ゼラチナーゼ活性であるため、ＨＤ、ＣＬＤまたはＨＣＣ微生物叢の移植を受けたマウスの糞便におけるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのｇｅｌＥ遺伝子の存在を、糞便ＤＮＡのＰＣＲにより確認した。糞便ｇｅｌＥ陽性マウスは、糞便ｇｅｌＥ陰性マウスよりも、肝臓腫瘍が多かった（図３Ｆ）。このように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の多さおよび糞便中のｇｅｌＥ遺伝子の存在は、肝腫瘍の高い発生率と関連しており、ｇｅｌＥ陽性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３の腸内での定着は、実際に肝臓発癌を促進した。
【００８０】
（慢性肝機能障害患者の糞便は高いゼラチナーゼ活性を有し、腸透過性を上昇させる）
糞便中のｇｅｌＥ遺伝子の存在が実際にゼラチナーゼ活性を誘導するかどうかを調べるために、患者の糞便をゼラチン含有寒天プレート上でインキュベートした（図４Ａ）。糞便ゼラチナーゼ活性の陽性率は、ＣＬＤまたはＨＤよりもＨＣＣにおいて有意に高かった（＋または＋＋の割合；ＨＤ  ５０．０％、ＣＬＤ  ６９．１％、ＨＣＣ  ９３．３％；図４ＡおよびＢ）。糞便にｇｅｌＥが存在する患者は、ｇｅｌＥが存在しない患者と比較して、ゼラチナーゼ陽性率が高かった（＋または＋＋の割合；糞便ｇｅｌＥ陽性患者８７．５％、糞便ｇｅｌＥ陰性患者、６０．７％；図４Ｃ）。ゼラチナーゼ活性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を含む種々のプロテアーゼにより発現され、ｇｅｌＥが、ｐｒｏ−ＭＭＰを切断し、活性化することが報告されている（Shogan, B.D., et al. Sci Transl Med 7, 286ra268 (2015)）。糞便中の活性ＭＭＰ９の濃度は、ＨＤよりもＨＣＣの糞中で高く（図４Ｄ）、ゼラチナーゼ陰性の糞便よりもゼラチナーゼ陽性の糞便で高かった（図４Ｅ）。フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン転移試験によれば、高いゼラチナーゼ活性を有するＣＬＤ患者１３およびＨＣＣ患者１２の糞便を、フローラ除菌マウスに移植すると、腸透過性が増加した（図４Ｆ）。ＨＣＣ微生物叢を移植したマウスの血漿中には、ＨＤよりも高濃度のリポ多糖（ＬＰＳ）が検出された（図４Ｇ）。まとめると、慢性肝機能障害患者の糞便は、高濃度の活性型ＭＭＰ９を伴う高いゼラチナーゼ活性を示し、消化管透過性が高まり、その結果、血漿中に高レベルのＬＰＳが存在した。
【００８１】
（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓのＧｅｌＥは腸の透過性を高め、肝臓の発癌を促進するのに必要である）
ｇｅｌＥ遺伝子が肝臓発癌の原因であるかどうかを調べるために、ｇｅｌＥ陽性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３株およびｇｅｌＥ欠失Ｖ５８３株を、フローラ除菌マウスに強制投与した。Ｖ５８３からのｇｅｌＥ遺伝子の欠失は、この株の腫瘍形成能の喪失をもたらし、Ｖ５８３野生株と比較して肝臓腫瘍の数を減少させた（図５Ａ）。増殖遺伝子ｋｉ６７およびｃｃｎｂ１、ならびに線維症遺伝子ｃｏｌ１ａ１の肝臓での発現は、Ｖ５８３からのｇｅｌＥの欠失によって下方制御された（図５Ｂ）。さらに、ｇｅｌＥ陽性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＨＣ５ａをＨＣＣ患者の糞便から単離し、マウスに強制投与した。ＨＣ５ａ株は、肝臓において、Ｖ５８３野生株と同程度に、多数の腫瘍を誘導し、ｋｉ６７およびｃｃｎｂ１の高発現を誘導した（図５Ａおよび図５Ｂ）。ノトバイオートマウスを、Ｖ５８３野生株またはｇｅｌＥ欠失Ｖ５８３株の無菌マウスへの強制投与によって作製した場合、肝臓におけるｋｉ６７、ｃｃｎｂ１およびｃｏｌ１ａ１の発現の差異はなかった（図５Ｃ）。ノトバイオートＶ５８３野生株定着マウスは、ｇｅｌＥ欠失株定着マウスと比較して、腸透過性を増加させたため（図５Ｄ）、他の細菌種とＥ．ｆａｅｃａｌｉｓとの協働が肝臓におけるｇｅｌＥ介在性増殖遺伝子発現を誘導するために必要かもしれない。実際に、Ｖ５８３野生株をフローラ欠失マウスにおいて定着させた場合、ｇｅｌＥ欠失Ｖ５８３株を定着させたマウスと比較して、血漿中でＬＰＳが高濃度で検出された（図５Ｅ）。さらに、結腸タイトジャンクションタンパク質Ｚｏ−１の局在化は、Ｖ５８３野生株定着マウスにおけるＺｏ−１の存在および内在化の減少で特徴付けられるように調節不全であった（データは示さず）。ＣＬＤまたはＨＣＣにおける新規肝細胞癌の発生率を、この研究における糞便採取後に追跡した。ＨＣＣ患者に関して、ＨＣＣの根治治療を受けた患者は、新規または再発性ＨＣＣの出現について追跡された。ＨＣＣ発生率は、糞中ｇｅｌＥ陰性患者と比較して、糞便ｇｅｌＥ陽性ＣＬＤ患者またはＨＣＣ患者で有意に高かった（図５Ｆ；Ｐ＝０．０４２７）。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓのｇｅｌＥは、他の細菌種と協働して腸の透過性と肝発癌を増加させるために必要とされる。
【００８２】
（慢性肝機能不全は微生物叢の嚥下障害およびデオキシコール酸の産生減少をもたらし、腸内でのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの定着を可能にする）
Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓとｇｅｌＥ遺伝子は、マウス及びヒトの肝臓発癌において重要な役割を果たしたが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が、ＣＬＤ及びＨＣＣの微生物叢中に多く存在した理由は依然として不明である。二次胆汁酸生合成の代謝経路は、ＨＤ患者よりもＣＬＤおよびＨＣＣ患者の微生物叢において少なかったため（データは示さず）、次に糞便中の胆汁酸濃度を測定した。デオキシコール酸（ＤＣＡ）のみがＨＤと比較してＣＬＤおよびＨＣＣの糞便中で有意に減少したが、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）などの他の胆汁酸の糞便濃度は、ＣＬＤ／ＨＣＣとＨＤとの間で異ならなかった。（図６Ａ）。糞便中の一次胆汁酸、ＣＡおよびＣＤＣＡの中央濃度は、二次胆汁酸、ＤＣＡおよびＬＣＡより低かった（中央値；ＣＡ、０．１６２μｍｏｌ／ｇ；ＣＤＣＡ、０．０９４μｍｏｌ／ｇ；ＤＣＡ１．０７μｍｏｌ／ｇ；ＬＣＡ、１．４６μｍｏｌ）。Ｅ．ｆｅａｃａｌｉｓ  Ｖ５８３を中央値の糞便濃度と同程度の濃度のこれらの胆汁酸とともに培養した場合、ＤＣＡのみがＶ５８３の増殖を阻害した（図６Ｂ）。次に、糞便性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属の存在量と、糞便中の胆汁酸濃度、抗生物質の使用、入院頻度、胃酸低減薬の投薬および毎日のアルコール摂取量などの様々な微生物叢を制御する要因との相関関係を分析した。その結果、入院頻度は糞便中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の相対存在量と正の相関があった（データは示さず）。糞便中のｇｅｌＥ遺伝子の存在量は、ＤＣＡおよびＬＣＡの糞便濃度と負の相関を示したが、ＣＡおよびＣＤＣＡの濃度と正の相関を示した（データは示さず）。高濃度の二次胆汁酸、特にＤＣＡは、腸内でのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの定着および増殖を阻害し、ＣＬＤおよびＨＣＣ患者における糞便ＤＣＡ濃度の減少ならびに頻繁な入院は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属の定着を促進するようであった。
腸内微生物叢は１００を超える種を含むため、特定の腸内環境におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属の存在量の原因を調べるためには、細菌間相互作用を考慮する必要がある。ＣＬＤおよびＨＣＣ微生物叢では、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓも多かった（図１Ａおよび図１Ｂ）。まず、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓをフローラ除菌マウスに最初に定着させ、次にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３をマウスに強制投与した。しかしながら、あらかじめ定着させたＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓは、ＤＥＮおよびＣＣｌ４注射後のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属の定着にも肝臓の遺伝子発現にも影響を及ぼさなかった（図６Ｃおよび図６Ｄ）。次に、ＨＤ患者２６またはＨＤ患者５５の微生物叢をフローラ除菌マウスに定着させ、次いで、Ｖ５８３をマウスに強制投与した。興味深いことに、ＨＤ患者２６の微生物叢はマウス糞便中のＶ５８３の増殖を阻害し、ＨＤ患者５５はＨＤ患者２６よりもＶ５８３の増殖を阻害した（図６Ｃ）。ＨＤ患者２６ではなくＨＤ患者５５の微生物叢は、肝臓における増殖遺伝子ｋｉ６７およびｃｃｎｂ１、ならびに線維症遺伝子ｃｏｌ１ａ１の発現を有意に減少させた（図６Ｅ）。したがって、健常人の微生物叢は、腸内でのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの定着および増殖を阻害する。まとめると、糞便中のデオキシコール酸濃度の低下および健常人に特異的な微生物叢の喪失、ならびに頻繁な入院は、おそらく腸内でのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの定着を可能にする。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、肝炎ウイルスとは無関係に、肝臓がん発症リスクを判定可能な、肝がん発症リスクの判定方法、及び肝がん発症リスクの判定キットが提供される。
【図１Ａ】
2020130013.tif 000002
【図１Ｂ】
2020130013.tif 000003
【図１Ｃ】
2020130013.tif 000004
【図１Ｄ】
2020130013.tif 000005
【図１Ｅ】
2020130013.tif 000006
【図２Ａ】
2020130013.tif 000007
【図２Ｂ】
2020130013.tif 000008
【図２Ｃ】
2020130013.tif 000009
【図２Ｄ】
2020130013.tif 000010
【図３Ａ】
2020130013.tif 000011
【図３Ｂ】
2020130013.tif 000012
【図３Ｃ】
2020130013.tif 000013
【図３Ｄ】
2020130013.tif 000014
【図３Ｅ】
2020130013.tif 000015
【図３Ｆ】
2020130013.tif 000016
【図４Ａ】
2020130013.tif 000017
【図４Ｂ】
2020130013.tif 000018
【図４Ｃ】
2020130013.tif 000019
【図４Ｄ】
2020130013.tif 000020
【図４Ｅ】
2020130013.tif 000021
【図４Ｆ】
2020130013.tif 000022
【図４Ｇ】
2020130013.tif 000023
【図５Ａ】
2020130013.tif 000024
【図５Ｂ】
2020130013.tif 000025
【図５Ｃ】
2020130013.tif 000026
【図５Ｄ】
2020130013.tif 000027
【図５Ｅ】
2020130013.tif 000028
【図５Ｆ】
2020130013.tif 000029
【図６Ａ】
2020130013.tif 000030
【図６Ｂ】
2020130013.tif 000031
【図６Ｃ】
2020130013.tif 000032
【図６Ｄ】
2020130013.tif 000033
【図６Ｅ】
2020130013.tif 000034
【配列表】
2020130013000001.app