(57)【要約】【課題】培養対象物を適切に培養可能な培養システム、培養方法及び培養生産物の生産方法を提供する。【解決手段】培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養する培養容器１と、培養容器１において培養された培養対象物を含む培養液から培養対象物を分離する分離装置２と、分離装置２での培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定装置３と、分離装置２での培養対象物分離後の培地を培養容器１に供給する培地系統３４を備える培養システム１００、及びそれを用いた培養方法及び培養生産物の生産方法にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養する培養容器と、
前記培養容器において培養された前記培養対象物を含む培養液から前記培養対象物を分離する分離装置と、
前記分離装置での前記培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定装置とを備える
ことを特徴とする、培養システム。
【請求項２】
前記分離装置での前記培養対象物分離後の前記培地を前記培養容器に供給する第１培地供給系統を備える
ことを特徴とする、請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
前記第１培地供給系統は、前記培養対象物分離後の前記培地に酸素含有ガスを供給する第１ガス供給装置を備える
ことを特徴とする、請求項２に記載の培養システム。
【請求項４】
前記第１培地供給系統は、前記培養容器での前記培地の溶存酸素濃度を調整する溶存酸素濃度調整装置を備える
ことを特徴とする、請求項２又は３に記載の培養システム。
【請求項５】
前記培養容器と前記溶存酸素濃度測定装置との間に形成され、前記培養液又は前記培地の一方の媒体が流れるとともにガス透過性材料によって形成される媒体系統と、
前記溶存酸素濃度測定装置により測定された溶存酸素濃度と、前記媒体系統を流れる媒体の流れ条件とに基づいて、前記培養容器に供給される培地による酸素供給量を決定する酸素供給量決定部を備える演算装置を備える
ことを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の培養システム。
【請求項６】
前記流れ条件は、
前記媒体系統を構成する配管の構成材料、
前記媒体系統を構成する配管の内寸、
前記媒体系統の系統長、及び、
前記媒体系統を流れる媒体の流量、
のうちの少なくとも１つの条件を含む
ことを特徴とする、請求項５に記載の培養システム。
【請求項７】
前記ガス透過性材料は樹脂を含む
ことを特徴とする、請求項５又は６に記載の培養システム。
【請求項８】
前記培養容器に供給される培地を貯留する培地貯留容器と、
前記培地貯留容器に貯留された培地に酸素含有ガスを供給する第２ガス供給装置とを備える
ことを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載の培養システム。
【請求項９】
前記培養容器に供給される培地を貯留する培地貯留容器と、
前記培地貯留容器の培地流れ後段、かつ、前記培養容器の培地流れ前段に、前記培養容器に供給される培地に酸素含有ガスを供給する第３ガス供給装置とを備える
ことを特徴とする、請求項１〜８の何れか１項に記載の培養システム。
【請求項１０】
前記分離装置での前記培養対象物分離後の前記培地を前記培地貯留容器に供給する第２培地供給系統を備える
ことを特徴とする、請求項８又は９に記載の培養システム。
【請求項１１】
前記培養対象物はヒト細胞及び動物細胞のうちの少なくとも一種の細胞を含む
ことを特徴とする、請求項１〜１０の何れか１項に記載の培養システム。
【請求項１２】
培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養する培養ステップと、
前記培養ステップにおいて培養された前記培養対象物を含む培養液から前記培養対象物を分離する分離ステップと、
前記分離ステップでの前記培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定ステップとを含む
ことを特徴とする、培養方法。
【請求項１３】
培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養する培養ステップと、
前記培養ステップにおいて培養された前記培養対象物を含む培養液から前記培養対象物を分離する分離ステップと、
前記分離ステップでの前記培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定ステップとを含む
ことを特徴とする、培養生産物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養システム、培養方法及び培養生産物の生産方法
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬等のバイオ医薬品は、有効成分となるタンパク質を生産する細胞を培養することで、製造することができる。この場合、細胞から分泌されたタンパク質を精製することで、バイオ医薬品を製造できる。
【０００３】
細胞の培養方法として、例えば、回分培養、流加培養、連続培養に分類される。これらのうち、回分培養は、一回毎に新たな培地を用意し、用意した培地に細胞株を植えて収穫まで培地を加えない方法である。回分培養によると、培養毎に品質はバラつき易いが、コンタミネーションのリスクを分散したり低減したりできる。流加培養は、半回分培養ともいわれ、培養中に、培地自体又は培地中の特定成分を添加し、培養終了時までその生産物を抜き取らない培養方法である。流加培養は、通常は大型の生産設備を使用して行われる。
【０００４】
連続培養は、灌流培養ともいわれ、連続的に培養系に培地を供給すると同時に同量の培養液を抜き取る培養方法である。連続培養では、培養液抜き出しの際、目的物質だけでなく細胞増殖の障害となるアンモニア、乳酸等の老廃物も抜き出される。このため、細胞を高密度で培養できる。また、連続培養では、培養環境を一定に保ち易く、生産性を安定させることができる。
【０００５】
近年、生産設備を小型化可能な連続培養が着目されている。連続培養に関する技術として、特許文献１に記載の技術が知られている。特許文献１には、細胞を増殖させるための装置であって、細胞培養のための少なくとも一つのバイオリアクタ、培養培地のための少なくとも一つの容器、該バイオリアクタ及び該容器を液体連絡させる培養培地及び／又は細胞培養物を循環させるための手段、及び酸素を供給するための少なくとも一つの手段を有することを特徴とする装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５２１８７７号公報（特に図１参照）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、細胞等の培養対象物の密度（濃度）により、単位培養液当たりの酸素消費量が異なる。具体的には例えば、培養対象物が低密度であれば、単位培養液あたりの酸素消費量は少なく、培養対象物が高密度であれば、単位培養液あたりの酸素消費量は多い。そこで、培養対象物密度に適した溶存酸素濃度になるように溶存酸素濃度を制御することが好ましい。
【０００８】
しかし、特に培養対象物が高密度の場合、培養対象物を含む培養液と溶存酸素濃度測定装置（通常は溶存酸素濃度測定装置に備えられる電極部）とを接触させると、上記電極部に培養対象物が付着し易くなる。この結果、付着した培養対象物によって培養液の溶存酸素と上記電極部とが接触し難くなり、溶存酸素濃度の測定精度が低下する。これにより、培養対象物を含む培養液の溶存酸素濃度を適切に評価できず、不適切な溶存酸素濃度制御に起因して培養対象物の培養に影響が生じる可能性がある。
【０００９】
本発明は、培養対象物を適切に培養可能な培養システム、培養方法及び培養生産物の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養する培養容器と、前記培養容器において培養された前記培養対象物を含む培養液から前記培養対象物を分離する分離装置と、前記分離装置での前記培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定装置とを備えることを特徴とする、培養システムに関する。その他の解決手段は発明を実施するための形態において後記する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培養対象物を適切に培養可能な培養システム、培養方法及び培養生産物の生産方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態の培養システムの系統図である。
【図２】酸素含有ガス中の酸素含有割合に対する飽和溶存酸素濃度を示すグラフである。
【図３】図１に示す培養システムに備えられる演算装置のブロック図である。
【図４】流れ条件データベースの内容を示す図である。
【図５】第１実施形態の培養方法を示すフローチャートである。
【図６】模擬培養試験に使用した培養システムの系統図である。
【図７】窒素供給量に対する空気供給量を示すグラフである。
【図８】試験時間に対する溶存酸素濃度変化を示すグラフであり、培養容器への窒素通気量が３０ｍＬ／分のときのグラフである。
【図９】試験時間に対する溶存酸素濃度変化を示すグラフであり、培養容器への窒素通気量が５０ｍＬ／分のときのグラフである。
【図１０】培養日数に対する溶存酸素濃度（培養対象物分離後の培地、及び、培養液）及び生物細胞密度の変化を示すグラフである。
【図１１】第２実施形態の培養システムの系統図である。
【図１２】第３実施形態の培養システムの系統図である。
【図１３】第４実施形態の培養システムの系統図である。
【図１４】第５実施形態の培養システムの系統図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態を、図面を参照しながら説明する。ただし、本発明は以下の例に何ら制限されず、本発明の要旨を損なわない範囲で任意に変形して実施できる。また、各実施形態は任意に組み合わせて実施できる。また、同じ装置及び系統については同じ符号を付すものとし、重複する説明は省略する。
【００１４】
図１は、第１実施形態の培養システム１００の系統図である。培養システム１００は、例えば、ヒト細胞及び動物細胞のうちの少なくとも一種の細胞を含む培養対象物を培養するためのシステムである。ヒト細胞及び動物細胞のうちの少なくとも一種の細胞は、例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を含む。ただし、培養対象物は、これらの細胞に限定されるものではなく、例えば微生物（細菌、酵母等）を含んでもよい。
【００１５】
培養システム１００では、培養対象物は培地で培養される。そして、培養対象物の培養により、培養対象物は培養生産物を生産する。培地は、培養対象物を培養可能なものであれば任意であるが、培養対象物が例えばＣＨＯ細胞の場合、培地は例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を含む。また、培養生産物は、培養対象物により生産される例えば目的タンパク質を含む。目的タンパク質の生成により、例えばバイオ医薬品（抗体医薬）を生産できる。
【００１６】
なお、本明細書においては、培養対象物を含む培地（培養された培養対象物を含む培地）のことを「培養液」という。そして、培養液から培養対象物を除去した液体は、培養対象物による栄養消費によって厳密には培養使用前の培地とは成分が異なるが、便宜的に「培地」というものとする。
【００１７】
培養システム１００は、培養容器１と、分離装置２と、溶存酸素濃度測定装置３とを備える。また、培養システム１００は、培養液系統３１と、培地系統３２，３４，３５と、培養対象物系統３３と、媒体系統３６とを備える。さらに、培養システム１００は、灌流培養を行うためのシステムであり、分離装置２での培養対象物分離後の培地を培養容器１に供給する培地系統３４（第１培地供給系統）を備える。培地系統３４により、培地の栄養を無駄なく使用できるとともに、外部への培地の排出量を減らし、排液処理コストを削減できる。
【００１８】
培養容器１は、培養対象物を培地で培養するためのものである。培養容器１は、連続的に培養可能なものである。培養容器１には、培地系統３５を通じて、培地貯留容器４から培地が供給される。また、培養容器１で培養された培養対象物を含む培養液は、培養液系統３１を通じて、分離装置２に供給される。
【００１９】
培養容器１は、図示の例では、攪拌翼７を備えた攪拌槽型の培養容器（例えばステンレス容器）を含む。ただし、培養容器１は、攪拌槽型の培養容器に限定されず、例えば、振とう、揺動等の動作により攪拌可能な振揺攪拌型の培養容器（例えば樹脂製の培養バッグ）等であってもよい。
【００２０】
培養容器１は、培養容器１内の培養液に酸素含有ガスを供給するためのガス供給装置５と、培養液を攪拌するための攪拌翼７とを備える。培養中、ガス供給装置５による酸素含有ガスが供給されながら、攪拌翼７の駆動により培養液が攪拌される
【００２１】
ガス供給装置５は、例えば液中通気装置を含み、より具体的には例えばスパージャを含む。スパージャにより、ガスの溶液中への溶け込み効率を高くすることができる。スパージャとしては、例えばリングスパージャ、焼結スパージャ等の任意の一種以上が使用可能である。ただし、ガス供給装置５はスパージャに限定されず、例えば散気管等でもよい。また、ガス供給装置５が液中通気装置に限定されず、液面通気装置でもよい。液面通気装置は、例えば、培地液面への酸素供給が可能な装置、ガス交換膜を備える膜面通気装置等の任意の一種以上が使用可能である。
【００２２】
なお、ガス供給装置５での酸素含有ガスの供給量（単位時間あたりの通気量）は、例えば、後記する培地貯留容器４でのガス供給装置６による酸素含有ガスの供給量（単位時間当たりの通気量）よりも少なくできる。即ち、主にガス供給装置６（第２ガス供給装置）によって培地への供給を行いつつ、補助的にガス供給装置５によって培養液への供給を行うことができる。このようにすることで、培養液に接触する気泡を減らし、培養対象物への影響を小さくできる。また、培地貯留容器４において培養対象物を含まない培地へのガス供給により、十分量の酸素を培地に供給できる。
【００２３】
ガス供給装置５，６により供給される酸素含有ガスは、例えば空気のような、酸素を一部に含むガスのほか、酸素のみからなるガス（純酸素）等であってもよい。酸素含有ガスとしては、培養生産物の生産コストの観点からは空気が好ましいが、高い分圧によって溶存酸素濃度を高められる観点からは純酸素が好ましい。
【００２４】
図２は、酸素含有ガス中の酸素含有割合に対する飽和溶存酸素濃度を示すグラフである。このグラフは、例えばヒト、動物細胞の培養に好適な３７℃での結果を示したものである。図２における破線は、空気を水に溶解させたときの飽和溶存酸素濃度（６．８６ｍｇ／Ｌ）である。横軸において酸素含有割合が１００％のガスが純酸素である。
【００２５】
黒丸プロットで示すように、酸素含有ガスにおける酸素含有割合に比例して、飽和溶存酸素濃度が大きくなる。従って、酸素含有割合が高い酸素含有ガス（例えば純酸素）を供給する（溶解させる）ことで、効果的に溶存酸素濃度を上げることができる。特に、培養対象物による培養液での呼吸のため、培養液での溶存酸素は消費され、溶存酸素濃度が低下する。そして、特に培養対象物密度が高まるほど、溶存酸素の消費速度が速まる。そのため、酸素含有割合が高い酸素含有ガスを用いることで、消費速度が速い場合でも速やかに溶存酸素濃度を回復でき、効果的な制御が可能になる。
【００２６】
図１に戻り、培養システム１００では、ガス供給装置５，６による酸素含有ガスの供給量は、培養対象物の密度、培養時間等に基づいて制御されていない。しかし、ガス供給装置５，６による供給量（いずれか一方のみでもよい）は、例えば後記する図１２及び図１４に示すように、培養対象物の密度、培養時間等に基づいて制御されるようにしてもよい。
【００２７】
培養容器１には、培地系統３５を通じて、培地貯留容器４に貯留された培地が供給される。従って、培地貯留容器４は、培養システム１００に備えられ、培養容器１に供給される培地を貯留するためのものである。また、培養システム１００は、培地貯留容器４に貯留された培地に酸素含有ガスを供給するガス供給装置６（第２ガス供給装置）を備える。培地貯留容器４は攪拌翼８を備えており、培地中での攪拌翼８の駆動により、ガス供給装置６から供給された酸素含有ガス中の酸素が培地全体に速やかに溶解する。そして、酸素溶解により酸素富化状態の培地が得られ、酸素富化状態の培地が培養容器１に供給される。
【００２８】
培地貯留容器４に貯留される培地には培養対象物が含まれないことから、培地貯留容器４でのガス供給により、培養対象物への気泡の影響を抑制できる。また、培養対象物を含まない培地への酸素含有ガスの供給のため、培養対象物への影響を考慮することなく、培地への酸素含有ガスの供給が可能になる。これにより、培地の溶存酸素濃度を設定値に制御し易くできる。
【００２９】
培養容器１への培地供給量は、インバータ制御されるポンプ１３の回転速度制御により調整される。また、例えば、通常は媒体系統３６（後記する）を通じた媒体の循環を主として行い、培養容器１での培養時間が長くなり、培養容器１での培養液中の栄養が不足した場合にのみ、培養容器１への培地供給を行うことができる。
【００３０】
分離装置２は、培養容器１において培養された培養対象物を含む培養液から培養対象物を分離するためのものである。即ち、培養対象物と培養対象物により生産された培養生産物とを含む培養液から、分離装置２により、培養対象物と、培養生産物を含む培地とが分離される。培養容器１から分離装置２への培養液の供給は、培養液系統３１に備えられたポンプ１１の駆動により行われる。培養生産物は通常は培地に可溶である一方で、培養対象物は通常はスラリー状である。従って、分離装置２において、培養対象物と、培養生産物を含む培地とを分離できる。分離された培養対象物は、培養対象物系統３３を通じて、培養容器１に戻される。一方で、分離された培地は液体であり、液体の培地は、培地系統３２を通じて溶存酸素濃度測定装置３（後記する）に供給される。
【００３１】
分離装置２は、図示の例では分離膜を含む。分離膜による分離は、例えばタンジェンシャルフローフィルトレーション方式（ＴＦＦ方式）、アルタネィティブタンジェンシャルフローフィルトレーション方式（ＡＴＦ方式）等の一種以上を使用した装置を用いて行ってもよい。ただし、分離装置２は、分離膜に限定されず、例えば、重力により培養対象物を沈降させる重力沈降装置、遠心力によって培養対象物を培地から分離させる遠心分離装置、スピンフィルタ等の一種以上であってもよい。
【００３２】
溶存酸素濃度測定装置３は、分離装置２での培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定するためのものである。溶存酸素濃度測定装置３は培地系統３２に備えられる。即ち、培地系統３２は溶存酸素濃度測定装置３を備える。培養液ではなく培地の溶存酸素濃度を測定することで、培養対象物の影響を受けずに培養液の溶存酸素濃度を測定できる。特に、培養対象物の高密度での長時間培養により、培養対象物からの分泌物、死んだ培養対象物等により、溶存酸素濃度測定装置３（具体的には、溶存酸素濃度測定装置３に通常備えられる電極部）への汚れが付着し易くなる。この結果、溶存酸素濃度の測定精度が低下する。しかし、培養対象物を含む培養液ではなく、培養対象物を含まない培地の溶存酸素濃度を測定することで、培養対象物、老廃物等に起因する汚れの影響を受けることなく、培地の溶存酸素濃度を精度よく測定できる。
【００３３】
溶存酸素濃度測定後の培地は、培地系統３２を通じて、培養生産物とともに系外に取り出される。培養生産物を含む培地の取り出しは、培地系統３２に備えられたポンプ１２の駆動により、連続的に行われる。
【００３４】
溶存酸素濃度測定装置３は、例えばポーラログラフ方式、ガルバニ電池方式等の任意の方式の溶存酸素濃度測定装置を適用できる。溶存酸素濃度測定装置３により測定された溶存酸素濃度は、後記する演算装置２１に入力される。
【００３５】
上記の分離装置２で分離された培地の一部は、分離装置２での培養対象物分離後の培地を培養容器１に供給する培地系統３４（第１供給系統）を通じて、培養容器１に供給される。培地系統３４は、培地系統３２の分岐部Ａから分岐して形成される。培地系統３４は、培養対象物分離後の培地に酸素含有ガスを供給するガス供給装置１５（第１ガス供給装置）を備える。具体的には、ガス供給装置１５で酸素含有ガスが供給されることにより流れる培地に酸素が溶解し、酸素を溶解した培地は、培地系統３４を流れて培養容器１に供給される。
【００３６】
ガス供給装置１５は、例えば上記のガス供給装置５，６と同じ方式を適用できる。ガス供給装置１５による酸素含有ガスの供給量は、例えば、培地系統３４を流れる培地における溶存酸素濃度が飽和になるようにすることができる。従って、培養容器１での培地の溶存酸素濃度は、例えば、培地系統３４に備えられるとともに、インバータ制御されるポンプ１４（溶存酸素濃度調整装置）の回転速度制御により調整することができる。即ち、培地系統３４（第１供給系統）は、培養容器１での培地の溶存酸素濃度を調整するポンプ１４（溶存酸素濃度調整装置）を備える。ポンプ１４により、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度を調整できる。具体的な調整方法は、図２を参照しながら後記する。
【００３７】
培養システム１００は、培養容器１と溶存酸素濃度測定装置３との間に形成され、培養液又は培地の一方の媒体が流れる媒体系統３６を備える。ここで、培養システム１００において媒体系統３６は媒体が循環するように形成されている。そのため、媒体系統３６は、培養容器１から溶存酸素濃度測定装置３に向かって流れる系統と、溶存酸素濃度測定装置３から培養容器１に向かって流れる系統とを含む。
【００３８】
媒体系統３６は、培養容器１と分離装置２との間に形成される培養液系統３１と、分離装置２と溶存酸素濃度測定装置３との間に形成される培地系統３２と、培地系統３２のうち溶存酸素濃度測定装置３と分岐部Ａとの間に形成される培地系統３２と、分岐部Ａと培養容器１との間に形成される培地系統３４とを含む。そして、媒体系統３６は、例えばガス透過性材料の配管（チューブでもよい）により形成される。
【００３９】
ガス透過性材料は例えば樹脂を含む。樹脂は、例えばポリスチレン、ポリサルフォン、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン等の一種以上を含む。樹脂は焼却が容易であるため、培養システム１００において培養対象物の種類を変更する場合に使用済みの媒体系統３６をそのまま焼却処理し、新たなガス透過性材料を使用することで、変更前の残渣によるコンタミネーションのリスクを低減できる。
【００４０】
ところで、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度は、上記のようにポンプ１４によって調整できる。具体的には、上記のように、ポンプ１４の回転速度制御により、培養液の溶存酸素濃度が調整できる。そして、ポンプ１４の回転速度制御は、図１中破線矢印で示す電気信号線を通じて制御装置２２から入力される信号に基づき行われる。制御装置２２は、演算装置２１での演算結果に基づいて、ポンプ１４の駆動信号を生成するものである。また、制御装置２２でのポンプ１４の駆動信号の生成は、図１中破線矢印で示す電気信号線を通じて演算装置２１から入力される信号に基づいて行われる。ここで、図３を参照しながら演算装置２１について説明する。
【００４１】
図３は、図１に示す培養システム１００に備えられる演算装置２１のブロック図である。演算装置２１は、測定部２１ａと、酸素供給量決定部２１ｂと、信号送信部２１ｃと、流れ条件データベース２１ｄとを備える。測定部２１ａは、溶存酸素濃度測定装置３（図１参照）によって培地の溶存酸素濃度を測定するためのものである。測定された溶存酸素は、酸素供給量決定部２１ｂに入力される。
【００４２】
酸素供給量決定部２１ｂは、溶存酸素濃度測定装置３により測定された溶存酸素濃度と、媒体系統３６を流れる媒体の流れ条件とに基づいて、培養容器１に供給される培地による酸素供給量を決定するためのものである。上記のように媒体系統３６は、コンタミネーション抑制の観点から例えばガス透過性材料により形成される。そのため、培養容器１と溶存酸素濃度測定装置３との間で外気中の酸素が培地に吸収され、培地の溶存酸素濃度が変動する可能性がある。
【００４３】
そこで、培養システム１００では、このような変動を考慮して、培養容器１での培地への酸素供給量（飽和溶存酸素濃度の培地の供給量）が調整される。例えば、媒体系統３６を流れる培地が外気の影響を受け易い（ガスを吸収し易い）場合には、培養液についての溶存酸素濃度の設定値よりも低溶存酸素濃度の培地が供給される。一方で、外気の影響を受け難い（ガスを吸収し難い）場合には、培養液についての溶存酸素濃度の設定値に近い（設定値通りでもよい）の溶存酸素濃度の培地が供給される。そして、外気の影響を受け易いか否かは、以下に示す流れ条件に基づいて判断される。流れ条件に基づいて酸素供給量を決定することで、外気の影響を考慮した溶存酸素濃度制御が可能になり、精度の高い溶存酸素濃度制御が可能になる。
【００４４】
流れ条件は、媒体系統３６を構成する配管の構成材料（厚さを含んでもよい）、内寸、媒体系統３６を構成する配管の系統長（配管長）、及び、媒体系統３６を流れる媒体の流量、のうちの少なくとも１つの条件を含む。ここでいう内寸は、媒体系統３６での媒体流れ方向に垂直な方向への断面での内寸である。内寸は、例えば配管が円管である場合には配管の内径に相当し、例えば配管が角管である場合には配管の各辺の長さに相当する。また、配管の内寸により、媒体流れ方向に垂直な方向への断面における配管内の断面積（流路断面積）が決定される。
【００４５】
上記条件に関して、例えば、ガス透過性材料の中でも、ガスを比較的透過させ易い構成材料もあれば、比較的透過し難い構成材料もある。さらに、ガス透過量は、媒体系統３６を構成する配管の内寸によっても異なる。即ち、内寸から算出される流路断面積によっても、媒体中のガス濃度が変化する。そこで、媒体系統３６の構成材料、内寸を考慮して、酸素供給量の調整が行われる。
【００４６】
また、媒体系統３６の系統長が比較的長ければ酸素の吸収量が増え、媒体系統３６の系統長が比較的短ければ酸素の吸収量が減る。そこで、媒体系統３６の系統長を考慮して、酸素供給量の調整が行われる。なお、媒体中のガス濃度は、上記内寸と系統長とに基づいて決定される媒体系統３６の内部体積により変化する。さらに、媒体系統３６を流れる媒体の流量が多ければ酸素の吸収量が増え、媒体系統３６を流れる媒体の流量が少なければ酸素の吸収量が減る。そこで、媒体系統３６を流れる媒体の流量を考慮して、酸素供給量の調整が行われる。
【００４７】
流れ条件は、試運転、実験等により予め決定され、例えば流れ条件データベース２１ｄとして記憶される。流れ条件データベース２１ｄについて、図４を参照しながら説明する。
【００４８】
図４は、流れ条件データベース２１ｄの内容を示す図である。流れ条件データベース２１ｄには、媒体系統３６を構成する配管の構成材料、媒体系統３６を構成する配管の内寸、媒体系統３６の系統長、及び媒体系統３６を流れる媒体の流量ごとに、培養容器１での培地の溶存酸素濃度設定値との差分が記憶されている。例えば、一例として、媒体系統３６の構成材料がＸ１であり、媒体系統３６の内寸がＹ１であり、媒体系統３６の系統長がＺ１であり、媒体系統３６を流れる媒体の流量がＰ１であるときには、酸素供給量は、培養容器１での培養液についての溶存酸素濃度設定値からＱ１だけ減らした量の溶存酸素濃度になるように、ポンプ１４の回転速度制御が行われる。同様に、流量がＰ２のときには、溶存酸素濃度目標値からＱ２だけ減らした量の溶存酸素濃度になるように、ポンプ１４の回転速度制御が行われる。さらには、流量がＰ３のときには、溶存酸素濃度目標値からＱ３だけ減らした量の溶存酸素濃度になるように、ポンプ１４の回転速度制御が行われる。
【００４９】
また、もし、該当する条件が存在しない場合には、流れ条件データベース２１ｄのうちの最も近い流れ条件に対応する差分が使用される。なお、流れ条件データベース２１ｄに代えて、例えば流れ条件に関する実験等データの統計処理（多変量解析等）基づく数式を算出し、算出された式に基づくポンプ１４の回転速度制御が行われてもよい。
【００５０】
図３に戻って、信号送信部２１ｃは、酸素供給量決定部２１ｂにより決定された酸素供給量になるようなポンプ１４の回転速度信号を生成し、ポンプ１４に送信するためのものである。ポンプ１４への回転速度信号の送信により、ポンプ１４が所望の回転速度で駆動する。
【００５１】
なお、演算装置２１は、いずれも図示しないが、ＣＰＵと、ＲＯＭと、ＲＡＭと、Ｉ／Ｆとを備える。そして、ＲＯＭに記録されたプログラムがＣＰＵによって実行されることで、演算装置２１が具現化される。
【００５２】
図５は、第１実施形態の培養方法を示すフローチャートである。図５に示すフローチャートは、上記の図１に示す培養システム１００において行われる。そこで、図５の説明は、図１を適宜参照しながら行う。
【００５３】
第１実施形態の培養方法は、培養ステップＳ１と、分離ステップＳ２と、溶存酸素濃度測定ステップＳ３と、制御ステップＳ４とを含む。培養ステップＳ１は、培養生産物を生産する培養対象物を培地で培養するものである。培養生産物及び培養対象物は、図１を参照しながら説明した培養生産物及び培養対象物と同義であるため、説明は省略する。培養ステップＳ１での培養は、培養容器１において行われる。
【００５４】
分離ステップＳ２は、培養ステップＳ１において培養された培養対象物を含む培養液から培養対象物を分離するものである。分離ステップＳ２は、分離装置２において行われる。分離された培養対象物は培養容器１に戻される。また、培養対象物分離後の培養液、即ち残った培地は、上記のように溶存酸素濃度測定装置３に供給される。
【００５５】
溶存酸素濃度測定ステップＳ３は、分離ステップＳ２での培養対象物分離後の培地の溶存酸素濃度を測定するものである。溶存酸素濃度測定ステップＳ３は、溶存酸素濃度測定装置３により行われる。
【００５６】
制御ステップＳ４は、溶存酸素濃度測定装置３により測定された溶存酸素濃度に基づき、培養容器１への酸素供給量（即ち、培養容器１における培養液の溶存酸素濃度）を制御するものである。培養容器１への酸素供給量調整は、ポンプ１４の回転速度制御により行われる。また、酸素供給量調整は、溶存酸素濃度測定装置３により測定された溶存酸素濃度と、媒体系統３６を流れる媒体の流れ条件とに基づいて行われる。流れ条件は、上記の図４を参照しながら説明した内容と同様であるため、説明は省略する。
【００５７】
また、上記の培養方法によって培養対象物を培養することで、培養対象物を用いた培養生産物の生産ができる。即ち、第１実施形態の培養生産物の生産方法は、上記の培養ステップＳ１と、上記の分離ステップＳ２と、上記の溶存酸素濃度測定ステップＳ３とを少なくとも含むものである。そして、培養生産物は、培地とともに培地系統３２を通じて培養システム１００から取り出すことができる。
【００５８】
ここで、培養容器１での溶存酸素濃度を一定にするために、培養容器１に供給される培地への酸素供給量がどのように変化するのかを評価するために、上記培養システム１００を用いた培養システム５０を用いて模擬培養試験を行った。
【００５９】
図６は、模擬培養試験に使用した培養システム５０の系統図である。実験例１に係る模擬培養試験では、培養対象物による酸素消費に代えて、培地に窒素を供給して酸素を培地から追い出すことで、培養対象物の培養を模した。そのため、培養容器１には、酸素含有ガスを供給するガス供給装置５に加え、窒素を供給するガス供給装置９（ガス供給装置５と同様の構成のもの）が備えられる。
【００６０】
また、培地に代えて、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。さらに、培養対象物が含まれないため分離装置２を備えず、培養容器１から抜き出した培養液（ＰＢＳ）は溶存酸素濃度測定装置測後、そのまま培地貯留容器４に戻した。実験の簡略化のために、培地系統３５及び媒体系統３６はガス不透過性の材料（ステンレス）により形成した。
【００６１】
まず、培養容器１に７００ｍＬのＰＢＳを入れ、培地系統３５により、培養容器１を十分量のＰＢＳが貯留された培地貯留容器４に接続した。培地貯留容器４にはガス供給装置６が備えられ、ガス供給装置６による空気の供給により、培地貯留容器４でのＰＢＳを酸素富化状態（飽和溶存酸素濃度）にした。そして、ポンプ１１，１３の回転速度を同じにして、等流量でＰＢＳを循環させた。そして、培養容器１内のガス供給装置９からの窒素供給は一定流量で行い、溶存酸素濃度測定装置３により測定される溶存酸素濃度が一定（設定値として３．２ｍｇ／Ｌ）になるように、ガス供給装置６からＰＢＳに空気を供給した。
【００６２】
また、実験例２として、培地系統３５、媒体系統３６及び培地貯留容器４を備えない、即ち、媒体の循環は行わないこと以外は実験例１と同様にして、模擬培養試験を行った。
【００６３】
図７は、窒素供給量に対する空気供給量を示すグラフである。黒丸は実験例１、黒三角は実験例２を示す。縦軸の空気供給量は、実験例２における窒素供給量を１としたときの相対値として示している。また、空気供給量は、一定量で窒素を供給したときの空気供給量の総和である。実験例１及び２のいずれにおいても、窒素供給量が増える、即ち培養対象物密度が増えると、溶存酸素濃度を一定にするための空気供給量も増加した。しかし、実施例１では、実験例２と比べて、窒素供給量が同じ場合における空気供給量が少なかった。
【００６４】
特に、窒素供給量が３０ｍＬ／分のときには、空気供給量に優位な差がみられた。具体的には、媒体系統３６により酸素富化状態の培地を循環させた実験例１では空気供給量は０．５であったのに対し、酸素富化状態の培地を循環させない実験例２では空気供給量は０．８４であった。そのため、酸素富化状態の培地を循環させることで、空気供給量を０．６倍程度に減らせることがわかった。従って、培地の循環により少ない空気量で溶存酸素濃度を設定値にできることから、溶存酸素濃度制御が容易なことがわかった。
【００６５】
図８は、試験時間に対する溶存酸素濃度変化を示すグラフであり、培養容器１への窒素通気量が３０ｍＬ／分のときのグラフである。実験例１及び２のいずれにおいて、溶存酸素濃度は設定値である３．２ｍｇ／Ｌ付近で推移した。従って、窒素通気量が３０ｍＬ／分のときには、培地の循環の有無に関わらず、培地の溶存酸素濃度を設定値に近づけることができることがわかった。
【００６６】
図９は、試験時間に対する溶存酸素濃度変化を示すグラフであり、培養容器１への窒素通気量が５０ｍＬ／分のときのグラフである。実験例１及び２のいずれにおいて、溶存酸素濃度は設定値である３．２ｍｇ／Ｌよりもやや小さな値で推移した。ただし、培地の循環を行った実験例１では、培地の循環を行わない実験例２とは異なり、溶存酸素濃度が設定値にまで上昇できることがあった（例えば、図９のＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅの部分）。通常は、設定値に対して１０％〜２０％程度の変動は許容できるため、設定値よりも２０％小さな２．５ｍｇ／Ｌ以上となる実験例２でも、十分許容できる。しかし、培地の循環によって、培地の溶存酸素濃度を設定値に対して十分に近付けることができることがわかった。
【００６７】
図８及び図９に示すように、培地の溶存酸素濃度には変動がある。そして、培養対象物を実際に培養する際、培養液の溶存酸素濃度を直接測ろうとすれば、培養対象物に起因する溶存酸素濃度測定装置３への影響により、溶存酸素濃度の測定値は大きく変動すると考えられる。この結果、溶存酸素濃度が設定値から大きくずれ易くなる（図１０を参照しながら後記する）。しかし、培養対象物分離後の培養液、即ち培地について溶存酸素濃度を測定することで、培養対象物の影響を抑制できる。この結果、培地の溶存酸素濃度を測定した図８及び図９に示すように、培養液の溶存酸素濃度を長時間安定して測定できる。これにより、培地の溶存酸素濃度を精度よく制御でき、培養対象物の適切な培養、及び培養生産物の効率的な生産が可能になる。
【００６８】
次に、実際に培養対象物の培養を行い、培養対象物による溶存酸素濃度測定装置３への影響を評価した。
【００６９】
培養対象物の培養は、上記の図１に示す培養システム１００を用いて行った。ただし、評価の簡略化のため、媒体系統３６を含む全系統はガス不透過性の材料（ステンレス）により形成した。培養対象物はＣＨＯ細胞、培地はＤＭＥＭ培地（１０％血清入り。ｐＨ７．２）を使用した。培養容器１には７００ｍＬの培地を入れ、培養容器１への培養対象物の播種密度は０．２ｃｅｌｌｓ／ｍＬにした。
【００７０】
媒体系統３６に備えられるポンプ１４の回転速度制御により、媒体系統３６を流れる培地の流量（培地の循環量）は１０ｍＬ／分にした。分離装置２は、膜を用いたＴＦＦ方式の分離装置を使用した。培養対象物の培養は３７℃で行い、培養容器１での溶存酸素濃度の設定は２．７ｍｇ／Ｌ、灌流率を１ｖｖｄで培養を行った。「ｖｖｄ」は１日当たりに入れ替わる培養容器１内部の培養液量を表し、１ｖｖｄは、培養容器１内部の培養液全体が新たな培地に１回入れ替わることを意味する。
【００７１】
培養は培地を循環させながら連続的に３０日間行った。培養中、一定時間ごとに、培養対象物分離後の培地についての溶存酸素濃度（溶存酸素濃度測定装置３により測定）を測定した。また、比較のために、溶存酸素濃度測定装置３による測定時、培養容器１内部の培養液についての溶存酸素濃度（図示しない溶存酸素濃度測定装置により測定）も測定した。さらに、溶存酸素濃度測定時の生培養対象物数密度（生きた培養対象物（生細胞）数密度）も測定した。この結果を図１０に示す。
【００７２】
図１０は、培養日数に対する溶存酸素濃度（培養対象物分離後の培地、及び、培養液）及び生培養対象物数密度の変化を示すグラフである。グラフ中、横軸は培養日数、左側の縦軸は溶存酸素濃度、右側の縦軸は生培養対象物数密度（精細胞数密度）を示す。太実線で示すグラフは培養対象物分離後の培地についての溶存酸素濃度（実施例）、細実線で示すグラフは培養液についての溶存酸素濃度（比較例）を示す。また、プロットは、生培養対象物数密度を示す。図１０では、培養日数が２５日を超えると生培養対象物数密度の低下傾向がみられたので、２５日以降の溶存酸素濃度及び生培養対象物数密度のそれぞれ一部の図示を省略している。
【００７３】
培養日数の経過により生培養対象物数密度は増加し、およそ２５日までには高密度の状態になった。しかし、生培養対象物数密度はおよそ２５日で上限に達した後、減少に転じた。また、培養対象物分離後の培地についての溶存酸素濃度（太実線で示す実施例）は、培養の全期間において、設定値である２．７ｍｇ／Ｌ近傍の値として測定された。しかし、培養液についての溶存酸素濃度（細実線で示す比較例）は、培養日数が短い時期（例えば０日〜１５日程度）では設定値である２．７ｍｇ／Ｌに近い値として測定されたが、例えば１５日で低下に転じ、１５日以降では溶存酸素濃度は設定値から大幅にずれた値として測定された。特に、生培養対象物数密度が最も高い２５日目には、培養液についての溶存酸素濃度の測定値は１．３ｍｇ／Ｌであり、設定値の半分以下の値であった。従って、特に生培養対象物数密度が高密度になることで、培養液の溶存酸素濃度は影響を受け、測定値の精度が低下することがわかる。
【００７４】
特に、この評価では、上記のように全系統がガス不透過性の材料により形成されており、外気中の酸素は培地に吸収されない。そして、培地の溶存酸素濃度は、全期間を通じて設定値付近であったことから、ガス供給装置１５による酸素は、培養対象物の呼吸により消費された酸素量と同等程度が供給されたといえる。そのため、過剰の空気供給に起因する培養対象物への影響を抑制できる。また、過不足の少ない空気供給により、運転コストを抑制できる。そして、これらの効果は特に培養日数が経過するほど大きくなり、長期間に亘って安定した培養行うことができる。
【００７５】
以上の培養システム１００、及び、例えば上記の培養システム１００を用いた培養方法及び培養生産物の生産方法によれば、培養対象物分離後の培地について溶存酸素濃度を測定できる。これにより、培養液中の培養対象物密度によらず、安定して溶存酸素濃度を測定できる。この結果、溶存酸素濃度を精度よく測定でき、培養液に対して適切な酸素供給量制御が可能になる。そして、培養対象物を適切に培養でき、培養生産物を効率よく生産できる。
【００７６】
図１１は、第２実施形態の培養システム２００の系統図である。上記の培養システム１００（図１参照）では、演算装置２１は、制御装置２２を介して、ポンプ１４の回転速度を制御していた。しかし、図１１に示す培養システム２００では、演算装置２１は、制御装置２２を介して、ガス供給装置１５による酸素含有ガスの供給量を制御する。従って、培地系統３４（第１培地供給系統）は、培養容器１での培地の溶存酸素濃度を調整するガス供給装置１５（溶存酸素濃度調整装置）を備える。そして、培養システム２００でのポンプ１４は、一定の回転速度（即ち一定の流量）で駆動する。従って、培養システム２００では、溶存酸素濃度測定装置３により測定される培地の溶存酸素濃度に基づいて、媒体系統３６を通じて培養容器１に供給される培地への酸素供給量が制御される。
【００７７】
培養システム２００では、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度を高くしたい場合には、ガス供給装置１５による酸素含有ガスの供給量を増加させる制御が行われる。一方で、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度を低くしたい場合には、ガス供給装置１５による酸素含有ガスの供給量を減少させる制御が行われる。
【００７８】
このようにしても、培養容器１内の培養液についての溶存酸素濃度を制御できる。
【００７９】
図１２は、第３実施形態の培養システム３００の系統図である。上記の培養システム１００は、培養容器１の内外で培地を循環させる媒体系統３６を備えていた。従って、分離装置２での分離後の培地は、媒体系統３６を通じて培養容器１に供給されていた。しかし、図１２に示す培養システム３００は、媒体系統３６に代えて、分離装置２での培養対象物分離後の培地を培地貯留容器４に供給する媒体系統３７（第２培地供給系統）を備える。従って、分離装置２での分離後の培地は、媒体系統３７、培地貯留容器４、及び培地系統３５を通じて、培養容器１に供給される。
【００８０】
また、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度制御に関して、培養システム３００では、培地貯留容器４での培地に対して直接的に酸素含有ガスの供給が行われる。即ち、培養システム３００では、培地貯留容器４に備えられたガス供給装置６により、培養容器１での培養液の溶存酸素濃度制御が行われる。培養容器１へは、培地貯留容器４の培地が供給されることから、培地貯留容器４での培地に対して直接的に酸素含有ガスを供給することでも、培養容器１内の培養液についての溶存酸素濃度を制御できる。
【００８１】
図１３は、第４実施形態の培養システム４００の系統図である。上記の培養システム１００〜３００では、媒体系統３６又は培地貯留容器４での培地に酸素含有ガスが供給されていた。しかし、培養システム４００では、培地に酸素含有ガスを供給するためのガス供給容器４１が備えられる。また、培養システム４００では、培地貯留容器４の培地流れ後段、かつ、培養容器１の培地流れ前段に、培養容器１に供給される培地に酸素含有ガスを供給するガス供給装置４２（第３ガス供給装置）とを備える。ガス供給装置４２は、培養システム４００では、ガス供給容器４１の内部に備えられる。ただし、ガス供給装置４２は、培地系統４５（後記する）及び培地系統４６（後記する）のいずれか少なくとも一方に備えられてもよい。
【００８２】
ガス供給容器４１と培地貯留容器４とは、培地系統４５により接続される。また、ガス供給容器４１と培養容器１とは、培地系統４６により接続される。従って、培地系統４５を通じ、培地貯留容器４からガス供給容器４１に培地が供給される。そして、ガス供給容器４１において、供給された培地に酸素含有ガスが供給される。酸素含有ガスが供給され、酸素を溶解した培地は、培地系統４６を通じて、培養容器１に供給される。なお、培地系統４６を通じた培養容器１への培地の供給は、培地系統４６に備えられるポンプ４７により行われる。
【００８３】
ガス供給容器４１は攪拌翼４３を備え、酸素含有ガス供給中、攪拌翼４３の駆動により培地が攪拌される。これにより、ガス供給容器４１内部の培地全体に満遍なく酸素を溶解できる。また、ガス供給容器４１の内容積は、培地貯留容器４の内容積よりも小さい。内容積が比較的小さなガス供給容器４１での酸素含有ガスの供給により、内容積が比較的大きな培地貯留容器４での酸素含有ガスの供給と比べて、培地への溶存酸素濃度を速やかに上昇させることができる。これにより、溶存酸素濃度測定装置３に基づく溶存酸素濃度変化への追従性を高めることができる。
【００８４】
図１４は、第５実施形態の培養システム５００の系統図である。上記培養システム１００〜４００では、培養容器１に備えられたガス供給装置５を介した酸素供給は特に制御されていなかった。具体的には、ガス供給装置５では、溶存酸素濃度測定装置３による測定値に関わらず、培養対象物へのダメージを抑制可能な程度の流量で酸素含有ガスが供給されているに過ぎなかった。しかし、図１４に示す培養システム５００では、培地貯留容器４でのガス供給装置６を介した酸素供給量制御に加え、培養容器１でのガス供給装置５を介した酸素供給量制御も行われる。ただし、上記のように、培養容器１でのガス供給装置５を介した単位時間当たりの酸素含有ガス量は、培地貯留容器４でのガス供給装置６を介した単位時間当たりの酸素含有ガス量よりも少なくなっている。
【００８５】
このようにすることで、ガス供給装置６により培地貯留容器４での培地を酸素富化状態にできる一方で、培養容器１でのガス供給装置５により培養液に対しても直接的に酸素含有ガスを供給できる。ガス供給装置５による培養液への直接的な酸素供給により、溶存酸素濃度測定装置３に基づき溶存酸素の濃度変化への追従性を高めることができる。さらには、培養液への酸素含有ガスの供給量は、培地への酸素含有ガスの供給量よりも少ないため、培養液中の培養対象物へのダメージを抑制できる。
【符号の説明】
【００８６】
１  培養容器
１００  培養システム
１１  ポンプ
１２  ポンプ
１３  ポンプ
１４  ポンプ（溶存酸素濃度調整装置）
１５  ガス供給装置（第１ガス供給装置、溶存酸素濃度調整装置）
２  分離装置
２００  培養システム
２１  演算装置
２１ａ  測定部
２１ｂ  酸素供給量決定部
２１ｃ  信号送信部
２１ｄ  流れ条件データベース
２２  制御装置
３  溶存酸素濃度測定装置
３００  培養システム
３１  培養液系統
３２  培地系統
３４  培地系統（第１培地供給系統）
３５  培地系統
３６  媒体系統
３７  媒体系統（第２培地供給系統）
４  培地貯留容器
４００  培養システム
４１  ガス供給容器
４２  ガス供給装置（第３ガス供給装置）
４３  攪拌翼
４５  培地系統
４６  培地系統
４７  ポンプ
５  ガス供給装置
５００  培養システム
６  ガス供給装置（第２ガス供給装置）
７  攪拌翼
８  攪拌翼
９  ガス供給装置
Ａ  分岐部
Ｓ１  培養ステップ
Ｓ２  分離ステップ
Ｓ３  溶存酸素濃度測定ステップ
Ｓ４  制御ステップ
【図１】
2020124172.tif 000003
【図２】
2020124172.tif 000004
【図３】
2020124172.tif 000005
【図４】
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【図５】
2020124172.tif 000007
【図６】
2020124172.tif 000008
【図７】
2020124172.tif 000009
【図８】
2020124172.tif 000010
【図９】
2020124172.tif 000011
【図１０】
2020124172.tif 000012
【図１１】
2020124172.tif 000013
【図１２】
2020124172.tif 000014
【図１３】
2020124172.tif 000015
【図１４】
2020124172.tif 000016