(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の種の繁殖を制御することができる魚類乃至両生類の提供。【解決手段】ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類。前記魚類乃至両生類が、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをホモで有する態様。前記魚類乃至両生類が、養殖用、又は駆除の対象である態様。【選択図】図４
2020124150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有することを特徴とする魚類乃至両生類。
【請求項２】
前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをホモで有する請求項１に記載の魚類乃至両生類。
【請求項３】
養殖用、又は駆除の対象である請求項１から２のいずれかに記載の魚類乃至両生類。
【請求項４】
前記養殖用の魚類が、食用の海水魚、又は食用の淡水魚である請求項３に記載の魚類乃至両生類。
【請求項５】
前記駆除の対象である魚類が、オオクチバス、又はブルーギルである請求項３に記載の魚類乃至両生類。
【請求項６】
ゼブラフィッシュである請求項１から２のいずれかに記載の魚類乃至両生類。
【請求項７】
前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型が、配列番号３（ｋｌｆ１７−ｕｙ２１）、配列番号４（ｋｌｆ１７−ｕｙ２２）、及び配列番号５（ｋｌｆ１７−ｕｙ２３）のいずれかのＤＮＡ配列を有する請求項６に記載の魚類乃至両生類。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の魚類乃至両生類の製造方法であって、
魚類乃至両生類の受精卵にｋｌｆ１７遺伝子座への挿入乃至欠失変異を導入し、ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の胚を得ることと、
前記胚を育成及び交配して前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の系統を得ることと、
を含むことを特徴とする魚類乃至両生類の製造方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の魚類乃至両生類の受精卵を調製することと、
（ａ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去して、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能とすること；又は
（ｂ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去せず、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能としないこと
を含むことを特徴とする魚類乃至両生類の繁殖制御方法。
【請求項１０】
対象とする魚類乃至両生類の閉鎖水域外での繁殖防止方法であり、前記（ａ）を行う請求項９に記載の魚類乃至両生類の繁殖制御方法。
【請求項１１】
対象とする魚類乃至両生類の駆除方法であり、前記（ｂ）を行う請求項９に記載の魚類乃至両生類の繁殖制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｋｌｆ１７遺伝子が欠損した魚類乃至両生類、その製造方法、及び魚類乃至両生類の繁殖制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の外来魚などの外来種の駆除には、中型・大型魚の捕獲や卵、稚魚、幼魚を採取して死滅させる方法が用いられているが（非特許文献１〜２など参照）、これらの方法では外来種を根絶させることが難しく、時間経過とともに外来種の個体数が増えるので、根本的な解決法ではない。卵の捕獲には、フロート式人工産卵床や吊り下げ式人工産卵床などが開発されており、中型・大型魚の捕獲には、かけ上がり用刺網や電気曳き縄などが用いられているが、これらの手法の在来種へ与える影響も考える必要がある。
【０００３】
ゲノム編集技術（ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９など）の開発により、脊椎動物の受精卵にゲノム編集のツールを注入することにより、標的ゲノム配列近傍に挿入乃至欠失変異を導入することが可能な状況である（非特許文献３〜６、特許文献１〜２など参照）。標的遺伝子のコード領域に挿入乃至欠失変異が生じた場合、高い頻度で読み枠がずれ標的遺伝子に対する機能欠損変異体を作製することができる。
【０００４】
現在、ゲノム編集技術を用いて、病気に強い、肉質が多いなど有用な形質を持つ養殖魚の樹立（育種改良）が進められている。例えば、筋肉の発達を抑制するミオスタチン遺伝子を破壊したマダイやトラフグは、同じ生育環境下で１．５倍程の体重増加が認められている（非特許文献７〜９など参照）。この場合、外来遺伝子の挿入を伴わずミオスタチン遺伝子の破壊が誘導されるので、遺伝子組換え生物（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ：ＧＭＯ）の規制の範囲外となる可能性が高く、水産業において大変注目されている。
【０００５】
しかしながら、これらのゲノム編集を受けた養殖魚の環境への影響は不明であり、ゲノム編集された養殖魚の管理は、極めて重要である。したがって、ゲノム編集を受けた養殖魚が閉鎖水域から逃げ出した場合や交配による変異体アレルの拡散を防止する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第６２０３８７９号公報
【特許文献２】特許第６３４３６０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｅｚｏｎｏ  Ｙ，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ  Ｔ．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１９，２６３−２６７（２００４）
【非特許文献２】Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｑｕａｃｕｌｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．５３，１４５−１５５（２００５）
【非特許文献３】Ｊｉｎｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３３７，８１６−８２１（２０１２）
【非特許文献４】Ｍａｌｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３３９，８２３−８２６（２０１３）
【非特許文献５】Ｃｏｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３３９，８１９−８２３（２０１３）
【非特許文献６】Ｋｏｔａｎｉ  Ｈ，Ｔａｉｍａｔｓｕ  Ｋ，Ｏｈｇａ  Ｒ，Ｏｔａ  Ｓ，Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｖｏｌ．１０，ｅ０１２８３１９（２０１５）
【非特許文献７】日本水産学会秋季大会（２０１６年９月８日）２１７  ゲノム編集技術の養殖業への応用  メダカからマダイ、トラフグへ−、木下政人ら
【非特許文献８】日本水産学会秋季大会（２０１６年９月８日）２１８  ゲノム編集マダイのＦ１作出、鷲尾洋平ら
【非特許文献９】日本水産学会秋季大会（２０１６年９月８日）２２０  ゲノム編集技術を用いたダブルマッスルトラフグの作出、吉浦康寿ら
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の繁殖制御方法では、ゲノム編集をした養殖魚の管理、そして在来種の保護を含む生態系の維持が実現できなかった。その他の課題と新規な特徴は、本明細書の記述、及び添付の図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、魚類乃至両生類が、ｋｌｆ１７遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域が欠損したアレルを有することにより、特定の種の繁殖を制御することができることを見出した。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有することを特徴とする魚類乃至両生類である。
＜２＞  前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをホモで有する前記＜１＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜３＞  養殖用、又は駆除の対象である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の魚類乃至両生類である。
＜４＞  前記養殖用の魚類が、食用の海水魚、又は食用の淡水魚である前記＜３＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜５＞  前記養殖用の両生類が、食用のカエルである前記＜３＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜６＞  前記駆除の対象である魚類が、オオクチバス、又はブルーギルである前記＜３＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜７＞  前記駆除の対象である両生類が、テキサスヒキガエル、又はアフリカツメガエルである前記＜３＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜８＞  ゼブラフィッシュである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の魚類乃至両生類である。
＜９＞  前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型が、配列番号３（ｋｌｆ１７−ｕｙ２１）、配列番号４（ｋｌｆ１７−ｕｙ２２）、及び配列番号５（ｋｌｆ１７−ｕｙ２３）のいずれかのＤＮＡ配列を有する前記＜８＞に記載の魚類乃至両生類である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の魚類乃至両生類の製造方法であって、
魚類乃至両生類の受精卵にｋｌｆ１７遺伝子座への挿入乃至欠失変異を導入し、ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の胚を得ることと、
前記胚を育成及び交配して前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の系統を得ることと、
を含むことを特徴とする魚類乃至両生類の製造方法である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の魚類乃至両生類の受精卵を調製することと、
（ａ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去して、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能とすること；又は
（ｂ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去せず、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能としないこと
を含むことを特徴とする魚類乃至両生類の繁殖制御方法である。
＜１２＞  対象とする魚類乃至両生類の閉鎖水域外での繁殖防止方法であり、前記（ａ）を行う前記＜１１＞に記載の魚類乃至両生類の繁殖制御方法である。
＜１３＞  対象とする魚類乃至両生類の駆除方法であり、前記（ｂ）を行う前記＜１１＞に記載の魚類乃至両生類の繁殖制御方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ｋｌｆ１７遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域が欠損したアレルを有することにより、特定の種の繁殖を制御することができる魚類乃至両生類を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、野生型Ｋｌｆ１７タンパク質と変異型Ｋｌｆ１７タンパク質の分子構造を示す模式図である。
【図２】図２は、ゼブラフィッシュ、ノーザンパイク（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）、及びアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＫｌｆ１７タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
【図３】図３は、ｋｌｆ１７変異体が孵化不全の表現型を示すことを示す図である。
【図４】図４は、コリオン膜を剥いだｋｌｆ１７変異体が１５日胚まで発生することを示す図である。
【図５】図５は、ｋｌｆ１７変異体において孵化腺細胞の形成不全が観察されることを示す図である。
【図６】図６は、図５の一部を拡大した図である。
【図７】図７は、ｋｌｆ１７変異体がＣａｔｈｅｐｓｉｎ  ｌ  １ｂ（Ｃｔｓｌ１ｂ）の発現を欠失していることを示す図である。
【図８】図８は、ｋｌｆ１７変異体において孵化腺のマーカー遺伝子の発現が認められないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜魚類乃至両生類＞
本発明の魚類乃至両生類は、ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する。
前記魚類乃至両生類は、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをホモで有することが好ましい。
本発明の魚類乃至両生類は、後述する本発明の魚類乃至両生類の製造方法により好適に得ることができる。
【００１４】
−ｋｌｆ１７遺伝子−
ｋｌｆ１７遺伝子は、ｂｉｋｌｆ遺伝子ともいい、本発明者が世界に先駆けてゼブラフィッシュから単離した新規のＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（Ｋｌｆ）ファミリーに属する転写因子Ｋｌｆ１７タンパク質をコードする遺伝子である（Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．２０００：配列番号１）。Ｋｌｆ１７タンパク質（配列番号２）のＣ末端側のジンク（Ｚｎ）フィンガードメインが、ＤＮＡ結合ドメインである（図１）。
ｋｌｆ１７遺伝子、及びＫｌｆ１７タンパク質は、当初発見されたゼブラフィッシュのみならず、魚類乃至両生類の間で非常に保存されているので（図２も参照）、その分子機能も種間で保存されている可能性が高い。
【００１５】
本発明の魚類乃至両生類は、ゼブラフィッシュｂｉｋｌｆ／ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の表現型解析から得られた本発明者による知見、すなわち、ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体では、形態学的に孵化腺の形成不全が観察され、孵化ができずコリオン膜の中で死滅する胚性致死の表現型であるという知見に基づくものである。
【００１６】
本発明者は、後述する実施例において詳細に示す通り、ゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりｋｌｆ１７遺伝子のコード領域に挿入乃至欠失変異を導入し、ゼブラフィッシュｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体を作製した。前記ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体は、ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有するｋｌｆ１７変異体である。ｋｌｆ１７変異体は、孵化することができず全て１５日胚前後で死滅することが明らかとなった。ｋｌｆ１７変異体は、孵化腺のマーカー遺伝子の発現が消失しており、孵化酵素の一つであるＣａｔｈｅｐｓｉｎ  ｌ  １ｂ（Ｃｔｓｌ１ｂ）のタンパク質の発現も認められなかった。組織切片の解析から野生型に認められる孵化腺がｋｌｆ１７変異体において完全に消失していることを見出した。ｋｌｆ１７変異体は胚性致死の表現型である一方、ｋｌｆ１７変異体胚のコリオン膜（卵の外側を取り囲む卵膜）を取り除くと死滅することなく発生が進行することを見出した。
【００１７】
ｋｌｆ１７遺伝子は魚類乃至両生類の間で非常に保存され、ｋｌｆ１７に対するアンチセンス・モルフォリノを受精卵に一過的に注入し、ｋｌｆ１７の発現を部分的に抑制したｋｌｆ１７モルファント胚の表現型解析においては、ゼブラフィッシュと、アフリカツメガエルにおいて造血発生や孵化腺の発生に類似の不全を伴っていることが報告されているので（Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１；Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２００５；Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃ．Ｄｅｖ．２００７；Ｋｕｒａｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０）、その分子機能が種間で保存されている可能性が高い。
したがって、外来種などの駆除の対象となる魚類乃至両生類由来の受精卵にゲノム編集技術によりｋｌｆ１７変異体を作製し、それらの交配からｋｌｆ１７変異体外来種ホモ型が孵化不全の表現型を示すか否かを調べる。ｋｌｆ１７変異体外来種ホモ型が孵化不全の表現型を示す場合、その成魚を閉鎖水域に放流することでｋｌｆ１７変異体アレル（遺伝子座）の伝搬による外来種の根絶が誘導できる。
【００１８】
本発明の魚類乃至両生類は、外来種などの駆除の対象となる魚類乃至両生類の受精卵にｋｌｆ１７遺伝子を標的としたゲノム編集ツールを注入し樹立したｋｌｆ１７変異体由来の外来種成魚を閉鎖水域に放流し、数世代で外来種を特異的に死滅させることに好適に適用することができる。特に、ｋｌｆ１７変異体外来種ホモ型は孵化不全の表現型を示すことが予想されるが、ｋｌｆ１７変異体外来種ヘテロ型は生存や繁殖が可能であると考えられるため、ｋｌｆ１７変異体アレルに由来する孵化不全の表現型が短時間で広く伝搬され、最終的には最初に放流したｋｌｆ１７変異体アレルを持つ子孫が全て死滅することで収束することが期待される。
日本の湖沼では、湖の生態系を乱す外来魚の繁殖により在来種の捕獲量が激減していることが水産業における大きな問題となっているが、ｋｌｆ１７変異体外来種の放流は種が異なる在来種には全く影響がなく、外来種の選択的な根絶を誘導できることがメリットである。
【００１９】
また、本発明の魚類乃至両生類によれば、ゲノム編集技術による有用な養殖魚の作製過程でｋｌｆ１７遺伝子も標的にすることにより、養殖魚の孵化過程を人為的に制御することにより個体発生を進めることが可能となり、また、ｋｌｆ１７遺伝子破壊養殖魚同士の交配では次世代で死滅する丁度安全装置としての機能を付加できる。
【００２０】
前記魚類乃至両生類としては、養殖用、又は駆除の対象であることが好ましい。
前記養殖用の魚類としては、例えば、食用の海水魚、食用の淡水魚などが挙げられる。これらの中でも、マダイ、ヒラメ、トラフグ等の高級魚が、ゲノム編集技術による品種改良魚の環境への拡散防止の点で好ましい。
前記養殖用の両生類としては、例えば、食用のカエルなどが挙げられる。
前記駆除の対象である魚類としては、例えば、オオクチバス、ブルーギル、ノーザンパイク等の特定外来生物；ホワイトパーチ等の生態系被害防止外来種などが挙げられる。これらの中でも、オオクチバス、ブルーギルが、湖沼における漁場保全の確保の点で好ましい。
前記駆除の対象である両生類としては、例えば、テキサスヒキガエル等の特定外来生物；アフリカツメガエル等の生態系被害防止外来種などが挙げられる。
【００２１】
前記魚類乃至両生類は、ゼブラフィッシュであることが好ましく、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルが、配列番号３（ｋｌｆ１７−ｕｙ２１）、配列番号４（ｋｌｆ１７−ｕｙ２２）、及び配列番号５（ｋｌｆ１７−ｕｙ２３）のいずれかのＤＮＡ配列を有することが好ましい。
これらの配列番号１〜３のＤＮＡ配列を有するアレルを有する変異体では、図１に示すように、野生型Ｋｌｆ１７タンパク質におけるジンクフィンガードメインが欠損した変異型タンパク質（Ｋｌｆ１７−ｕｙ２１、Ｋｌｆ１７−ｕｙ２２、Ｋｌｆ１７−ｕｙ２３；配列番号６〜８）をコードする。
【００２２】
＜魚類乃至両生類の製造方法＞
本発明の魚類乃至両生類の製造方法は、本発明の魚類乃至両生類の製造方法であって、
魚類乃至両生類の受精卵にｋｌｆ１７遺伝子座への挿入乃至欠失変異を導入し、ｋｌｆ１７遺伝子におけるジンクフィンガードメインのコード領域が欠損したｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の胚を得ることと、
前記胚を育成及び交配して前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の系統を得ることと、を含む。
【００２３】
前記魚類乃至両生類の受精卵にｋｌｆ１７遺伝子座への挿入乃至欠失変異を導入する方法としては、特に制限はなく目的に応じて公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集技術が挙げられる。
前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の胚が得られたことは、例えば、一部採取した胚や得られた成体の一部組織から採取したゲノムＤＮＡを用いた、ｋｌｆ１７遺伝子座のゲノム配列の配列分析、ヘテロ二本鎖移動度分析（ＨＭＡ：Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）などにより評価することができる。
【００２４】
前記胚を育成する方法としては、対象とする魚類乃至両生類の特定の種に適した方法を適宜選択することができる。
前記胚を育成して得られた成体を交配する方法としては、対象とする魚類乃至両生類の特定の種に適した方法を適宜選択することができる。
前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルを有する魚類乃至両生類の系統が得られたことは、例えば、成体の一部組織から採取したゲノムＤＮＡを用いた、ｋｌｆ１７遺伝子座のゲノム配列の配列分析、ヘテロ二本鎖移動度分析などにより評価することができる。
【００２５】
前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをホモで有する魚類乃至両生類は、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型のアレルをヘテロで有する魚類乃至両生類を育成及び交配することにより、得ることができる。
【００２６】
＜魚類乃至両生類の繁殖制御方法＞
本発明の魚類乃至両生類の繁殖制御方法は、本発明の魚類乃至両生類の受精卵を調製することと、
（ａ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去して、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能とすること；又は
（ｂ）前記受精卵のコリオン膜乃至卵黄膜を除去せず、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化を可能としないこと
を含む。
本発明の魚類乃至両生類の繁殖制御方法は、ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体では、形態学的に孵化腺の形成不全が観察され、孵化ができずコリオン膜乃至卵黄膜の中で死滅する胚性致死の表現型であるという知見に基づくものである。なお、魚類の卵膜をコリオン膜といい、両生類の卵膜を卵黄膜という。
すなわち、ｋｌｆ１７変異体ホモ型の卵は孵化不全で胚性致死の表現型を示すが、ｋｌｆ１７変異体胚のコリオン膜や卵黄膜（卵の外側を取り囲む卵膜）を取り除くと死滅することなく発生が進行することから、前記受精卵のコリオン膜や卵黄膜の除去（剥離）の有無により、対象とする魚類乃至両生類の特定の種の孵化を制御し、繁殖を制御することができる。
【００２７】
＜＜繁殖防止方法＞＞
前記魚類乃至両生類の繁殖制御方法は、ある実施形態において、対象とする魚類乃至両生類の閉鎖水域外での繁殖防止方法であり、前記（ａ）を行う方法であることが好ましい。
すなわち、前記受精卵のコリオン膜や卵黄膜を除去すると、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化が可能となり、対象とする魚類乃至両生類の閉鎖水域内での繁殖が可能となる一方、対象とする魚類乃至両生類の閉鎖水域外での繁殖が防止される。
対象とする魚類乃至両生類としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができるが、養殖用の魚類乃至両生類や、観賞用の魚類乃至両生類であることが好ましく、これらの中でも、ゲノム編集技術を用いて形質（例えば、有用な形質）が付加された系統であることがより好ましい。前記系統は、環境への影響が不明であり、閉鎖水域外への拡散を防ぐことが望まれるためである。
前記繁殖防止方法によれば、前記形質が付加された魚類乃至両生類（有用養殖魚など）の樹立の際に、ｋｌｆ１７遺伝子の破壊を同時に行うことにより、樹立した系統の閉鎖水域外（外来環境）における繁殖を防止することができる。
【００２８】
前記繁殖防止方法によれば、例えば、以下のように、ゲノム編集技術で作製した養殖魚の生態系への拡散を防止することができる。
日本の漁業・養殖魚生産量がピークであった昭和６３年の養殖魚の占める割合は１０％程であったが、平成２４年における養殖魚の占める割合は２２％程と倍増している。水産資源は食料供給源として世界的に需要が増大しており、また、天然水産資源は有限であるので、今後、養殖魚の総生産量に占める割合は増加すると考えられる。これまでの養殖用種苗は天然の幼魚を捕獲して育てていたが、マダイ、ヒラメ、トラフグなどの高級魚は人工種苗生産の開発が進んでいる。現在、ゲノム編集技術を用いた有用養殖魚の育種が進められており、筋肉の発達を抑制するミオスタチン遺伝子を破壊したマダイやトラフグは、同じ生育環境下で１．５倍程の体重増加が観察されている。ゲノム編集技術の応用範囲は広く、筋肉増量だけでなく、高成長、耐病性、機能性成分の増加やアレルゲンの破壊などへの応用が期待されている。
今後、取り組まなければならない課題は、環境への安全性であり、受精卵や個体が環境へ流出した際の安全対策が極めて重要である。本発明においてゲノム編集技術による有用な養殖魚の作製過程でｋｌｆ１７遺伝子の破壊を行う。ｋｌｆ１７遺伝子破壊養殖魚の受精卵は、適切な発生時期にコリオン膜や卵黄膜を除去して孵化させて成魚へと育て出荷することが可能と考えられる。コリオン膜や卵黄膜を除去しなかった受精卵は孵化できず、例えこの状態で閉鎖水域外に放出されても死滅する。また、コリオン膜や卵黄膜の除去の有無で孵化過程を制御することにより個体発生を進めることが可能であり、ｋｌｆ１７遺伝子破壊養殖魚が閉鎖水域外に逃げ出した場合、それらの交配から得られた受精卵は孵化できないのでゲノム編集を受けた変異体アレルは最終的に死滅すると考えられる。このようにｋｌｆ１７遺伝子破壊養殖魚は、養殖魚の生態系への拡散防止に応用できる。
【００２９】
＜＜駆除方法＞＞
前記魚類乃至両生類の繁殖制御方法は、別の実施形態において、対象とする魚類乃至両生類の駆除方法であり、前記（ｂ）を行う方法であることが好ましい。
すなわち、前記受精卵のコリオン膜や卵黄膜を除去しないと、前記ｋｌｆ１７遺伝子変異型アレルをホモで有する魚類乃至両生類の孵化が可能とならず、対象とする魚類乃至両生類の繁殖が防止される。駆除の効率の点、回帰魚などの近隣諸国に対する環境への影響の点から、閉鎖水域内での駆除方法に適用することが好ましい。
対象とする魚類乃至両生類としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができるが、特定外来生物、生態系被害防止外来種などの駆除の対象である魚類乃至両生類が好ましい。
【００３０】
前記駆除方法は、例えば、以下のように、閉鎖水域における外来魚の効率的な駆除に好適に応用することができる。
国外外来種の移入は、オオクチバス（ブラックバス）などの意図的な放流によって増加しているが、外来種が一旦定着すると在来種に与える影響は極めて大きく、また、その後の外来種の駆除は極めて難しい。本発明では、標的魚類のｋｌｆ１７遺伝子をゲノム編集技術でゲノム改変し、ｋｌｆ１７遺伝子破壊外来種を作製する。それらの交配によりｋｌｆ１７遺伝子破壊外来種ホモ型が孵化不全の表現型を示すことを確認した後に、閉鎖水域に放流することで数世代の内に標的外来種を選択的に根絶させる。オオクチバス、ブルーギルなどの外来種は、日本の河川や湖沼で様々な水産業における問題を引き起こしており、それらに対するｋｌｆ１７遺伝子破壊外来種の作製は外来種の効率的な駆除に有用であると考えられる。
２０１４年、山梨県漁場計画では山中湖、河口湖、西湖においてオオクチバスが漁業権魚種になったが、その後、西湖漁協は２０２３年の更新の際にオオクチバスを漁業権魚種から外すことを決定した。今後、西湖においてオオクチバスの駆除に舵を切る可能性があり、山梨県において本発明を基盤とした外来種の効率的な駆除法が確立される意義は大きい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００３２】
＜方法＞
本実施例において用いた方法は、以下の通りである。なお、実験材料、及び試薬調整方法については、＜方法＞の末尾に示した。
【００３３】
１．合成ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、組換えＣａｓ９タンパク質及びマイクロインジェクション
標的とするｋｌｆ１７遺伝子を破壊するために、ＣＲＩＳＰＥＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び組換えＣａｓ９ヌクレアーゼからなるＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムを使用した。合成ｃｒＲＮＡ（表１〜２）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ＩＤＴ）から入手した。合成ｋｌｆ１７−ｃｒＲＮＡ１（２５ｐｇ）、ｋｌｆ１７−ｃｒＲＮＡ２（２５ｐｇ）、及びｔｒｅｃｒＲＮＡ（１００ｐｇ）と組換えＣａｓ９ヌクレアーゼ（１ｎｇ）を１細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入した。
なお、ｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は、以下の通りである。
５’−ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ−３’（配列番号９）
【００３４】
本実施例で使用した合成ｃｒＲＮＡは、以下の通りである。併せて標的遺伝子の配列も示した。
【００３５】
【表１】
2020124150.tif 000003
【００３６】
【表２】
2020124150.tif 000004
【００３７】
２．ゲノムＤＮＡの調整
採卵したゼブラフィッシュ胚、又はトリカインに浸して麻酔をかけたゼブラフィッシュ成魚からカミソリで切り取った尾ひれの先端を０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに移し、１０８μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨを加えてサーマルサイクラーにて反応（９８℃、１０分間）させた後に１６℃でインキュベートした。続いて、１２μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、−３０℃で保存した。
【００３８】
３．ヘテロ二重鎖移動度分析（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
下記のＰＣＲ反応を行ったサンプルを１２．５％ポリアクリルアミドゲル（１２．５％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１×ｔｒｉｓ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１０％  ＡＰＳ、１％  ＴＥＭＥＤ）にて電気泳動（１０ｍＡ、１００分間／１枚）した。
＜ＰＣＲ反応液＞
１０×ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ          ０．８μＬ
ｋｌｆ１７−ＨＭＡ−Ｆ１（１０μＭ）        ０．２μＬ
ｋｌｆ１７−ＨＭＡ−Ｒ１（１０μＭ）        ０．２μＬ
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ                      １μＬ
Ｐｒｉｍｅ  ｔａｑ                          ０．０５μＬ
ＤＤＷ                                      ６．７５μＬ
Ｔｏｔａｌ                                １０μＬ
＜ＰＣＲ反応条件＞
９４℃、２分間
（以下のサイクルを４０回繰り返す）
９８℃、１０秒間
５５℃、３０秒間
７２℃、３０秒間
【００３９】
本実施例で使用したプライマーは、以下の通りである。
【表３】
2020124150.tif 000005
【００４０】
４．ゲノム配列決定
ゲノムＤＮＡの調整後、上記のＰＣＲ反応条件で標的部位を増幅させた。得られたＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ゲノム配列を配列分析により決定した。
【００４１】
５．ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色
ヘモグロビンの産生を評価するために、以下の手順により、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性をｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色により調べた（図３参照）。
（１）３６時間胚を遮光して反応液に浸した（室温、１５分間）。
（２）反応液をＰＢＳＴに置換し、反応を止めた。
【００４２】
６．胚の固定、包埋、及び切片の作製
以下の手順により、胚の固定、包埋、及び切片の作製を行った。
（１）４８時間胚をブアン固定液にて固定（８時間）し、８０％  ｅｔｈａｎｏｌ／ＰＢＳＴで脱水した。
（２）２％低融点アガロース／ＰＢＳＴを用いて型（モールド）に胚を包埋した。
（３）胚の周りの余分なアガロースをカミソリでトリミングし、アガロース片を１００％  ｅｔｈａｎｏｌに浸して脱水したのち、ｈａｒｄｅｎｅｒＩ溶液に浸した（４℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）。
（４）アガロース片をモールドに置き、ｈａｒｄｅｎｅｒＩ溶液：ｈａｒｄｅｎｅｒＩＩ溶液＝２５：１（容量比）に混合した溶液を流し込み、空気が入らないようにフィルムを乗せ、樹脂化した。
（５）Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２１２５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社）を用いて厚み６μｍの切片にしてスライドガラス上に乗せた。
【００４３】
７．ＨＥ染色、及び封入
組織切片の形態学的評価を行うために、以下の手順により、細胞核と核以外の組織成分をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により染め分けた（図５〜６参照）。
（１）スライドガラスにヘマトキシリン溶液を滴下した（８分間）。
（２）流水水洗を行った（１０分間）。
（３）ペーパータオルでスライドガラスの水分を軽くとり、Ｅｏｓｉｎを滴下した（３分間）。
（４）Ｅｔｈａｎｏｌで段階的に脱水し（７０％、９０％、１００％、各２秒間）、ｘｙｌｅｎｅにて透徹を行った。ｘｙｌｅｎが乾かないうちにＥＵＫＩＴＴ液をスライドガラスに滴下し、空気が入らないようにカバーガラスを載せて封入した。
【００４４】
８．免疫染色
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ  １ｂタンパク質の発現を観察するために、以下の手順により、免疫染色を行った（図７参照）。
（１）ゼブラフィッシュの４８時間胚をａｎｔｉ−ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ  １ｂ（ＧｅｎｅＴｅｘ社）と共に５％  ｓｈｅｅｐ  ｓｅｒｕｍ含有のＰＢＳＴｗを加えたリン酸緩衝食塩水中でインキュベートした（４℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）。
（２）ＰＢＳＴｗで４回洗浄し、胚をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＰＢＳＴｗ中でインキュベートした（室温、４時間）。その後、ＰＢＳＴｗで４回洗浄した。
【００４５】
９．Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＳＨ）法
孵化腺マーカー遺伝子の発現を観察するために、以下の手順により、ＷＩＳＨ法を行った（図８参照）。
（１）各遺伝子のコード領域の全長配列（ｈｅ１．１、ｃｔｓｌ１ｂ、ｃｄ６３、及びｋｌｆ１７：それぞれ、配列番号１４〜１６、及び配列番号１）に基づき、ＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＤＩＧで標識した４種類のａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｂｅを調製した。
（２）ゼブラフィッシュの２５時間胚（２５ｈｐｆ）を４％ＰＦＡで固定（４℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）した。
（３）ＰＢＳＴｗで２回（１０分間／回）洗浄後、さらにｍｅｔｈａｎｏｌで置換（５０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ／ＰＢＳＴｗ、３０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ／ＰＢＳＴｗ、各５分間）した。
（４）あらかじめ−２０℃に冷やしておいたアセトンに浸し（８分間）、ＰＢＳＴｗで２回（５分間／回）洗浄した。
（５）固定胚をＨＹＢ  ｂｕｆｆｅｒに浸し、シェーカーで穏やかに振盪させた（６５℃、２時間）。
（６）ｐｒｏｂｅを含んだＨＹＢ  ｂｕｆｆｅｒに置換し、ウォーターバスで熱を加え（８５℃、５分間）、その後、氷水中に浸して急冷した（１０分間）。
（７）ｐｒｏｂｅを含んだＨＹＢ  ｂｕｆｆｅｒに固定胚を浸し（６５℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩの順に置換して洗浄（６５℃、シェーカー上、各２回、３０分間／回）し、最後にＭＡＢ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄（室温、１５分間）した。
（８）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに浸し（室温、２時間）、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで５，０００倍希釈したａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）溶液に浸してインキュベーションした（室温、４時間以上）。
（９）ＰＢＳＴｗで洗浄（２回、２０分間／回）した後、静置（４℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）した。
（１０）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄（２回、５分間／回）後、基質ＢＭ  Ｐｕｒｐｌｅを加え、３７℃で発色を開始させた。
（１１）ＰＢＳＴｗで洗浄し、発色反応を停止させた後、４％ＰＦＡで固定（ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）した。
【００４６】
＜実験材料、及び試薬調製方法＞
＜＜試薬＞＞
なお、本実施例において使用した実験試薬は、以下の通りである。
・１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＧＥＮＥＢＩＯ社）
・１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥＮＥＢＩＯ社）
・２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ１−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ１（以下、Ｔｒｉｓ）（富士フイルム和光純薬株式会社）
・４０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
・Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（富士フイルム和光純薬株式会社）
・Ａｃｅｔｏｎｅ（ナカライテスク株式会社）
・Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（以下、ＡＰＳ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
・Ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｒｏｃｈｅ社）
・Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）
・ＢＭ  Ｐｕｒｐｌｅ  ＡＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ（Ｒｏｃｈｅ社）
・Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（以下、ＢＳＡ）（Ｒｏｃｈｅ社）
・Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＣａＣｌ２）（ナカライテスク株式会社）
・Ｅｏｓｉｎ  Ｙ（富士フイルム和光純薬株式会社）
・Ｅｔｈａｎｏｌ（９９．５％）（ナカライテスク株式会社）
・ＥＵＫＩＴＴ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（ＯＲＳＡｔｅｃ社）
・Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｏｒｍａｌｉｎ）（ナカライテスク株式会社）
・Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ナカライテスク株式会社）
・ＨａｒｄｅｎｅｒＩ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ社）
・Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ（以下、Ｈ２Ｏ２）（３０％）（ナカライテスク株式会社）
・Ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｇａｒｏｓｅ（ナカライテスク株式会社）
・Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＭｇＣｌ２）（ナカライテスク株式会社）
・Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、ＭｇＳＯ４）（ナカライテスク株式会社）
・Ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ｐＨ  ７．５）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｌｕｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｅｒｃｋ社）
・Ｍｅｔｈａｎｏｌ（ナカライテスク株式会社）
・ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（以下、ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・Ｐｉｃｒｉｃ  ａｃｉｄ（ナカライテスク株式会社）
・Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｔｅｓｔｅｄ（以下、Ｔｗｅｅｎ  ２０）（ナカライテスク株式会社）
・Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＫＣｌ）（富士フイルム和光純薬株式会社）
・Ｐｒｉｍｅ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＥＮＥＢＩＯ社）
・Ｓｈｅｅｐ  ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ  ４．７）（以下、ＮａＯＡｃ）
・Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＮａＣｌ）（ナカライテスク株式会社）
・Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ８１００  ｂａｓｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ社）
・Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ８１００  ｈａｒｄｅｎｅｒＩＩ（以下、ｈａｒｄｅｎｅｒＩＩ溶液）（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ社）
・Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（以下、ＴＥＭＥＤ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
・Ｔｏｒｕｌａ  ＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）
・Ｔｒｉｃａｉｎｅ（３−ａｍｉｎｏ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ａｌｓｏ  ｃａｌｌｅｄ  ｅｔｈｙｌ  ３−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ナカライテスク株式会社）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（富士フイルム和光純薬株式会社）
・Ｘｙｌｅｎｅ（ナカライテスク株式会社）
【００４７】
＜＜試薬調製方法＞＞
本実施例において使用した試薬の調製方法は、以下の通りである。
（１）ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色に使用する試薬
（ａ）ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色液
０．６ｍｇ／ｍＬ  ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ、０．０１Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．６５％  Ｈ２Ｏ２、４０％  Ｅｔｈａｎｏｌとなるように混合した。
（ｂ）反応液
４０％  ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色液、３Ｍ  ＮａＯＡｃ、３０％  Ｈ２Ｏ２となるようにＤＤＷに溶解した。
【００４８】
（２）切片作成に使用する試薬
（ａ）飽和ピクリン酸溶液
ピクリン酸５ｇを２００ｍＬ試薬瓶中に入れ２００ｍＬの超純水（ＤＤＷ：ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）を加えた。マグネチックスターラーで撹拌（室温、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）し、静置した。使用する際は上清を採取した。
（ｂ）ブアン固定液
Ｆｏｒｍａｌｉｎ：ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：飽和ピクリン酸溶液＝５：１：１５（容量比）となるように混合した。
（ｃ）１×ＰＢＳ
１０×ＰＢＳ（１３７０ｍＭ  ＮａＣｌ、２７ｍＭ  ＫＣｌ、８１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１４．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）をＤＤＷで１０分の１に希釈した。
（ｄ）ＰＢＳＴ
Ｔｗｅｅｎ  ２０を０．１質量％になるように１×ＰＢＳに希釈した。
（ｅ）ＨａｒｄｅｎｅｒＩ溶液
Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ８１００  ｂａｓｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００ｍＬに対し１袋のｈａｒｄｅｎｅｒＩを溶解した。
（ｆ）Ｅｏｓｉｎ
０．０１ｇ／ｍＬ  Ｅｏｓｉｎ  Ｙ、０．１％  Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄとなるようにＲＯ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｏｓｍｏｓｉｓ）水に溶解した。
【００４９】
（３）免疫染色に使用する試薬
（ａ）ＰＢＳＴｗ
０．２質量％ＢＳＡとなるようにＰＢＳＴに溶解した。
【００５０】
（４）Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法に使用する試薬
（ａ）４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＦＡ
１×ＰＢＳに４質量％のＰＦＡを加え、６５℃で溶解後、室温に戻した。
（ｂ）２０×ＳＳＣ
３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅとなるようにＤＤＷに溶解した。
（ｃ）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（以下、ＨＹＢ  ｂｕｆｆｅｒ）
１ｍｇ／ｍＬ  ｔｏｒｕｌａ  ＲＮＡ、５×ＳＳＣ、５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍＬ  ｈｅｐａｒｉｎとなるようにＤＤＷに溶解した。
（ｄ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
２％  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔとなるようにＭＡＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１Ｍ  ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＤＤＷ）に加え加熱して溶解し、室温に戻し５％  ｓｈｅｅｐ  ｓｅｒｕｍとなるように溶解した。
（ｅ）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＴｗｅｅｎとなるようにＤＤＷに希釈した。
（ｆ）Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒＩ
５０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、２×ＳＳＣ、０．１％  ＴｗｅｅｎとなるようにＤＤＷに溶解した。
（ｇ）Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒＩＩ
２×ＳＳＣ、０．１％  ＴｗｅｅｎとなるようにＤＤＷに溶解した。
（ｈ）Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒＩＩＩ
０．２×ＳＳＣ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  となるようにＤＤＷに溶解した。
（ｉ）ＭＡＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．１Ｍ  ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、１５０ｍＭ  ＮａＯＨとなるようにＤＤＷに溶解した。
（ｊ）脱色液
１％  ＫＯＨ、１％  Ｈ２Ｏ２となるようにＤＤＷに溶解した。
【００５１】
（５）トリカイン溶液
（ａ）Ｅ３  ｍｅｄｉｕｍ
５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１７ｍＭ  ＫＣｌ、０．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３３ｍＭ  ＭｇＳＯ４となるようにＲＯ水に溶解した。
（ｂ）Ｔｒｉｃａｉｎｅ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
４ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＤＷに溶解し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．０になるように調整した。
（ｃ）トリカイン
０．１７ｍｇ／ｍＬとなるようにＴｒｉｃａｉｎｅ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎをＥ３  ｍｅｄｉｕｍに溶解した。
【００５２】
＜実験＞
１．ゼブラフィッシュｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の作製
Ｋｌｆ１７のＮ末付近に対するコード領域に結合する２種類のｃｒＲＮＡをデザインし、ｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とともにゼブラフィッシュの受精卵（１細胞期）にインジェクションした。１日胚からゲノムＤＮＡを抽出してＨＭＡ解析を行い、高頻度でｋｌｆ１７遺伝子座への挿入乃至欠失変異が導入されていることを確認した。それらの胚を成魚まで育て、その次世代から図１に示す３系統のｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体を樹立した。
図１に、野生型Ｋｌｆ１７タンパク質と変異型Ｋｌｆ１７タンパク質の分子構造を示す。野生型Ｋｌｆ１７タンパク質（Ｋｌｆ１７−ＷＴ、配列番号２）は、Ｃ末にＤＮＡ結合ドメインであるＺｎフィンガードメインを持つ４０９アミノ酸からなるＫｌｆファミリーに属する転写因子である。変異型Ｋｌｆ１７タンパク質は、９２アミノ酸と１１ミスセンスアミノ酸（Ｋｌｆ１７−ｕｙ２１、配列番号６）、９８アミノ酸と１３ミスセンスアミノ酸（Ｋｌｆ１７−ｕｙ２２、配列番号７）、９８アミノ酸と２９ミスセンスアミノ酸（Ｋｌｆ１７−ｕｙ２３、配列番号８）である（図１）。
樹立した３系統の変異体において、孵化腺の形成不全の表現型が観察されており、Ｋｌｆ１７のＺｎフィンガードメインを含むコード領域のほとんどを欠損していることから機能欠損変異体であると考えられた。
【００５３】
ゼブラフィッシュのＫｌｆ１７タンパク質、ノーザンパイク（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）のＫｌｆ１７タンパク質、及びアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＫｌｆ１７タンパク質について、それらのアミノ酸配列（配列番号２、１７、及び１８）を比較した（図２）。なお、解析には、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）にて利用可能なＣｌｕｓｔａｌ  ＷプログラムのＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔを用いた。その結果、Ｋｌｆ１７タンパク質の全体（特に、Ｃ末端側のＺｎフィンガードメインのアミノ酸配列）が、種を越えて高く保存されていることがわかった。
【００５４】
２．ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の表現型解析
図３は、ｋｌｆ１７変異体が孵化不全の表現型を示すことを示す図である。
ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色により、野生型アレルを持つ胚（ヘテロ型）（図３ａ）とｋｌｆ１７変異体胚（図３ｂ；スケールバー：２００μｍ）では、ヘモグロビンの産生（矢頭）が検出された（３６時間胚）。野生型アレルを持つ胚（ヘテロ型）は３日までに孵化したが、ｋｌｆ１７変異体胚は６日においても孵化しないことが明らかとなった（図３ｃ、ｄ；スケールバー：１ｍｍ）。
【００５５】
図４は、コリオン膜を剥いだｋｌｆ１７変異体が１５日胚まで発生することを示す図である。
野生型胚（図４ａ；スケールバー：２ｍｍ）とコリオン膜を剥いだｋｌｆ１７変異体胚（図４ｂ）は、１５日胚においても顕著な発生異常を示さず生育する。一方、ｋｌｆ１７変異体胚（図４ｃ）は、孵化できず１５日においてコリオン膜内で死滅した。
なお、コリオン膜を剥いだｋｌｆ１７変異体胚を引き続き飼育したところ、孵化後１月後において生存することを確認した（図示せず）。
【００５６】
図５は、ｋｌｆ１７変異体において孵化腺細胞の形成不全が観察されることを示す図であり、図６は、その一部を拡大した図である。
野生型胚（図５ａ、及び図６ａ；スケールバー：それぞれ１００μｍ、及び３０μｍ）は、矢頭の領域に孵化腺細胞が観察される。一方、ｋｌｆ１７変異体胚（図５ｂ、ｃ、及び図６ｂ、ｃ）は、孵化腺細胞を欠失している（４８時間胚）。
【００５７】
図７に、野生型、及びｋｌｆ１７変異体の２５時間胚における免疫染色により、孵化酵素の一つであるＣａｔｈｅｐｓｉｎ  ｌ  １ｂ（Ｃｔｓｌ１ｂ）のタンパク質の発現を調べた結果を示す。
野生型胚（図７ａ；スケールバー：２００μｍ）は、矢頭の領域に孵化酵素Ｃｔｓｌ１ｂの発現が観察される。一方、ｋｌｆ１７変異体胚（図７ｂ、ｃ）はＣｔｓｌ１ｂの発現が全く観察されない（２５時間胚）。
【００５８】
図８に、Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＳＨ）法により、ｋｌｆ１７に加え、以下の３種類の孵化線マーカー遺伝子の発現を調べた結果を示す。
・孵化酵素の一つをコードするｈａｔｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ１．１遺伝子（ｈｅ１．１）
・孵化酵素の一つをコードするＣａｔｈｅｐｓｉｎ  ｌ  １ｂ遺伝子（ｃｔｓｌ１ｂ）
・膜タンパク質の一つをコードするｃｄ６３遺伝子（ｃｄ６３）
野生型アレルを持つ胚（図８ａ、ｃ、ｅ、ｇ）は、矢頭の領域に孵化腺マーカー遺伝子の発現が認められる。一方、ｋｌｆ１７変異体胚（図８ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）は、孵化腺マーカー遺伝子の発現が全く観察されない（２５時間胚；スケールバー：２００μｍ）。
【００５９】
＜結果及び考察＞
ｋｌｆ１７遺伝子は、初期発生過程で孵化腺と血島に特異的に発現が観察されている（Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．２０００）。ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の３６時間胚において、赤血球の循環とヘモグロビンの産生が検出された（図３）。
これまでのｋｌｆ１７遺伝子の機能に関する解析としては、ｋｌｆ１７に対するアンチセンス・モルフォリノを受精卵に一過的に注入し、ｋｌｆ１７の発現を部分的に抑制したｋｌｆ１７モルファント胚の表現型解析が行われていた。前記ｋｌｆ１７モルファント胚は、１次造血における赤血球マーカー遺伝子、及び孵化腺マーカー遺伝子の発現抑制が報告されている（Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１，Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２００５，Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃ．Ｄｅｖ．２００７）。しかしながら、ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の機能解析に関しては、これまでに報告されておらず、本実施例が初めての報告となる。
ｋｌｆ１７モルファント胚では顕著な赤血球の分化異常が認められているので、両者で表現型の違いが観察されている。ゼブラフィッシュの血島には、ｋｌｆ１、ｋｌｆ２ａ、ｋｌｆ３、ｋｌｆ６ａ、及びｋｌｆ８の発現が観察されており、これらのＫｌｆファミリーが相補的に機能している可能性が考えられる。
したがって、本実施例によって、ｋｌｆ遺伝子ファミリーの中でもｋｌｆ１７遺伝子のみを特異的に破壊することにより初めて、顕著な赤血球の分化異常が認められることなく、コリオン膜乃至卵黄膜の除去（剥離）の有無により、１５日胚まで顕著な発生異常を示さず生育することを観察している。
【００６０】
ｋｌｆ１７モルファント胚においても、孵化腺マーカー遺伝子の発現が抑制されることから、孵化腺におけるｋｌｆ１７の機能が示唆されている。ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体の組織切片の解析から、形態学的に孵化腺が形成されていないことが明らかとなった（図５〜６）。
孵化酵素の一つであるＣａｔｈｅｐｓｉｎ  ｌ  １ｂ（Ｃｔｓｌ１ｂ）のタンパク質の発現もｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体胚で欠失していた（図７）。
さらに、孵化腺マーカー遺伝子の発現を調べてみると（図８）、ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体胚において、ｈｅ１．１（孵化酵素）、Ｃｔｓｌ１ｂ（孵化酵素）、ｃｄ６３（膜タンパク質）、ｋｌｆ１７の発現が認められなかった。孵化腺ではｋｌｆ１７が強く、ｋｌｆ３が弱く発現しているが、それら以外のｋｌｆファミリー遺伝子は発現が認められず、ｋｌｆ１７遺伝子が孵化腺の発生に必要不可欠であると考えられた。
【００６１】
一過性の発現阻害を基盤とするｋｌｆ１７モルファント胚の解析では、３日胚くらいが限界であるので、それ以降の表現型は調べられていない。そこで、樹立したｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体を用い発生過程を通じてのｋｌｆ１７遺伝子が破壊された時の表現型を解析した。ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体胚のコリオン膜（卵膜）を剥ぎ取ると１５日胚においても顕著な発生異常を示さず生育することが明らかとなった（図３）。これは、ｋｌｆ１７遺伝子破壊変異体胚のコリオン膜乃至卵黄膜をタンパク質分解酵素処理などにより除去（剥離）することにより、胚性致死の表現型を制御できることを示している（生態系への解散防止に応用可能である）。
【００６２】
ゼブラフィッシュのＫｌｆ１７タンパク質に加え、特定外来生物に指定されている魚類であるノーザンパイク（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）のＫｌｆ１７タンパク質、及び生態系被害防止外来種に指定されている両生類であるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＫｌｆ１７タンパク質のアミノ酸配列の比較により、Ｋｌｆ１７タンパク質の全体、特にＣ末端側のＺｎフィンガードメインのアミノ酸配列が、種を越えて高く保存されていることがわかった（図２）。
したがって、ゼブラフィッシュ以外の魚類乃至両生類に対しても、本実施例と同じように、Ｋｌｆ１７タンパク質のＮ末付近に対するコード領域に結合するｃｒＲＮＡをデザインすれば、ｋｌｆ１７遺伝子破壊を誘導することができると考察される。
【００６３】
これらの知見から、魚類乃至両生類で保存されているｋｌｆ１７遺伝子をゲノム編集技術で破壊することにより、孵化不全の表現型を示すｋｌｆ１７変異体を様々な魚種乃至両生類で作製することができると考えられる。それらのｋｌｆ１７変異体を外来魚の効率的な駆除あるいはゲノム編集技術で作製した養殖魚の生態系への拡散防止に応用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の魚類乃至両生類、及びその製造方法は、ｋｌｆ１７遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域が欠損したアレルを有する特定の種の魚類乃至両生類、及びその製造方法を提供することにより、当該特定の種の魚類乃至両生類の繁殖を制御することができる魚類乃至両生類、及びその製造方法として好適に利用可能である。
本発明の魚類乃至両生類の繁殖制御方法は、コリオン膜や卵黄膜の除去有無により魚類乃至両生類の繁殖を制御することができるので、標的とする特定の種の魚類乃至両生類の駆除方法、養殖用の魚類乃至両生類閉鎖水域外での繁殖防止方法などに好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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