(57)【要約】【課題】  非蛍光性色素と結合したときに、速やかに蛍光を発生させるぺプチドアプタマーを取得すること、すなわち、蛍光プローブとなる前記ペプチドアプタマーを提供すること、及びそのプローブを用いた迅速蛍光測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】  所定の配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに、目的タンパク質に結合した蛍光団の蛍光を増強する、蛍光プローブを提供する。ここで、前記所定の配列は、配列番号１又は２に示す配列であり、前記蛍光消光団として働く色素は、非蛍光性有機色素であることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに、目的タンパク質に結合した蛍光団の蛍光を増強する、蛍光プローブ。
【請求項２】
前記所定の配列は、下記の配列番号１又は２に示すであることを特徴とする、請求項１に記載の蛍光プローブ。
（配列番号１）
SKVILFEGPAGWLDIQFTWIMWNPVVGAPGSKVILFE
（配列番号２）
SKVILFEGPAGVLRIWFLWILPCPFKGAPGSKVILFE
【請求項３】
前記蛍光消光団として働く色素は、非蛍光性有機色素であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
前記非蛍光性有機色素は、QSY9であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
蛍光消光団として働く色素を、蛍光団で標識した目的タンパク質と結合させて色素結合タンパク質を作製する色素結合タンパク質作製工程と；
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドアプタマーを、前記色素結合タンパク質作製工程で得られた色素結合タンパク質と結合させ、蛍光を直ちに増強させる蛍光増強工程と；
前記増強された蛍光を測定する蛍光測定工程と；
を備える、迅速蛍光測定方法。
【請求項６】
前記所定の配列は、下記の配列番号１又は２に示すであることを特徴とする、請求項５に記載の迅速蛍光測定方法。
（配列番号１）
SKVILFEGPAGWLDIQFTWIMWNPVVGAPGSKVILFE
（配列番号２）
SKVILFEGPAGVLRIWFLWILPCPFKGAPGSKVILFE
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光プローブ及びそのプローブを用いた迅速蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変技術の進歩により、容易に蛍光タンパク質との融合タンパク質が作製できるようになったこともあって、細胞のイメージングには、Green Fluorescent Protein(GFP）等の蛍光タンパク質が広く用いられてきた。
蛍光タンパク質には、特定の波長で励起することにより、赤色、緑色、青色、白色等、種々の蛍光を発するものがあり、目的に応じて使い分けられている。
【０００３】
一方で、蛍光タンパク質は分子量が大きい（〜30kDa）ために観察対象のタンパク質に影響を与える可能性が示唆されており、Texas Red と結合して蛍光が増強されるペプチドアプタマーを取得する技術が提案されている（非特許文献１、以下、「従来技術１」という。）。
そして、FlAsHといった蛍光標識テクノロジーも開発されている（非特許文献２、以下、「従来技術２」という。）。これらの技術的特徴は、ペプチドアプタマーと有機色素という低分子同士を結合させると、蛍光特性が変化するという点にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Griffin BA, et al., Science,281:269-272 (1998)
【非特許文献２】Matthias F. Langhorst, et al., Histochem Cell Biol (2006) 125: 743chem
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光タンパク質は、例えば、細胞表面等に発現した目的分子と結合した後に、所定の波長で励起されると発光するが、発光色団形成に時間を要する。
従来技術１は、明るい赤色の蛍光を発し抗体及びタンパク質と結合する蛍光標識剤であり、初期の発色は鮮やかであるものの、バッファー中での光安定性や褪色性の点でやや不足があった。一方、従来技術２は、部位特異的なタンパク質標識に二砒素試薬を使用して標識するという二砒素標識テクノロジーを応用し、チオール結合部位競合物としてβ−メルカプトエタノールを使用し、染色効率を向上させたという点では優れた発明である。しかし、細胞内に毒性の高いヒ素が蓄積されるという問題があった。
このため、発光するまでの時間をできる限り短くするとともに、毒性のない化合物を用いて、リアルタイムでの観察が行えるようにすることについて、強い社会的要請があった。
【０００６】
一方で、通常は蛍光を発生しない低分子化合物（例えば、色素。以下、「非蛍光性有機色素」ということがある。）を、アプタマーと結合させたときに、短時間のうちに蛍光を発生させることができれば、リアルタイムの観察を行うことが可能となる。
すなわち、蛍光消光団として働く色素と結合することにより蛍光特性を変化させるペプチドアプタマーの取得による新規蛍光プローブに対する強い社会的要請があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者は、上記のような状況の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したものである。すなわち、本発明は、非蛍光性色素と結合したときに、速やかに蛍光を発生させるぺプチドアプタマーを取得すること、すなわち、蛍光プローブとなる前記ペプチドアプタマーを提供すること、及びそのプローブを用いた迅速蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明のある態様は、所定の配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに蛍光を増強する、蛍光プローブである。ここで、前記所定の配列は、下記表１に示す配列番号１又は２に示す配列であることが好ましい。
【０００９】
【表１】
2020076673.tif 000002
【００１０】
また、前記蛍光消光団として働く色素は、非蛍光性有機色素であることが好ましく、前記非蛍光性有機色素は、QSY9であることがさらに好ましい。
【００１１】
本発明の別の実施態様は、蛍光消光団として働く色素を目的タンパク質と結合させて色素結合タンパク質を作製する色素結合タンパク質作製工程と；上記のペプチドアプタマーを、前記色素結合タンパク質作製工程で得られた色素結合タンパク質と、所定の配列を有するぺプチドアプタマーとを結合させ、直ちに蛍光測定する蛍光測定工程と；を備える、迅速蛍光測定方法である。
【００１２】
ここで、前記所定の配列は、上記表１に示す配列番号１又は２に示す配列であることが好ましい。そして、前記各配列はcDNAディスプレイ法によって得られるものであることが好ましい。
【００１３】
ここで、前記cDNAディスプレイ法は、IVV（mRNAディスプレイ）法のmRNAを逆転写したcDNA及びmRNAハイブリッドと新生タンパクとの結合体による、遺伝子型表現型対応付け技術をいう。具体的には、（ａ１）前記コンストラクトから転写によってmRNAを調製するmRNA調製工程と；（ａ２）得られたmRNAをピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体である、リンカー−mRNA複合体を形成させる第１複合体形成工程と；（ａ３）翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させて、第２複合体である、ペプチド−リンカー−mRNA複合体を形成させる第２複合体形成工程と；
【００１４】
（ａ４）前記第２複合体を磁性粒子に結合させる粒子結合工程と；（ａ５）前記磁性粒子に結合した第２複合体のmRNAを逆転写してcDNAを形成させ、第３複合体である、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAを形成させる第３複合体形成工程と；（ａ６）前記第３複合体形成工程で得られた第３複合体である、cDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させる第３複合体遊離工程と；（ａ７）前記遊離された第３複合体を、リポソームを結合させて選択する選択工程と、を備えることが上記（ａ１）〜（ａ７）の工程を１サイクルとして所望のサイクル数を行なうことにより、所望のペプチドを選択的に得られることから好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、蛍光消光団である低分子化合物と結合し、短時間のうちに蛍光を発するペプチドアプタマーが提供される。また、前記低分子化合物と前記ペプチドアプタマーとが結合した蛍光増剤が提供される。さらに、前記蛍光増強剤を用いた、目的タンパク質の迅速な検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、配列番号１及び２のペプチド（FEPA-2及びFEPA-４）の溶出液のゲル電気泳動電気泳動像である。
【図２】図２は、FEPA-２(A)及びFEPA-４(B)の蛍光強度の増強を示すグラフである。
【００１７】
【図３】図３は、図２に示すFEPA-２(A)及びFEPA-４(B)の蛍光強度が、非蛍光性有機色素（QSY9）の存在によって変化したことを示す表である。
【図４】図４は、QSY9の濃度変化によるFEPA-４の蛍光強度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、上記表１に示す配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに蛍光を増強する、蛍光プローブである。ここで、「蛍光プローブ」とは、「観測対象分子と特異的に反応するか、又は相互作用し、蛍光特性が大きく変化する機能性分子」をいう。
【００１９】
また、「蛍光消光団」とは、GFPその他の蛍光団（蛍光を発する化合物）と結合したときに、クエンチングにより蛍光発光を消光させる化合物をいう。例えば、QSY-7、QSY-2１その他のQSY色素（ThermoFisher SCIENTIFIC社）、BHQ-2、BHQ-3その他のブラックホールクエンチャー（BIO EARCH TECHNOLOGIES社）等が市販されている。
一般的には、蛍光団に結合している消光団を酵素的に分離させることによって、蛍光を増強させる（J. Am. Chem. Soc., 137 4759）。
【００２０】
これに対し、本発明の蛍光プローブは、前記蛍光消光団と蛍光団との酵素的解離を必要としない点に特徴がある。すなわち、本発明の蛍光プローブを使用する際には、目的とするタンパク質を蛍光団で標識するとともに、蛍光消光団として機能する低分子化合物上記目的とするタンパク質に結合させる。蛍光団と蛍光消光団とが結合した状態では、蛍光団が発生させた蛍光を蛍光消光団がクエンチするため、目的とするタンパク質を蛍光によって検出することはできない。ここで使用する蛍光消光団としては、例えば、QSY9を挙げることができる。
【００２１】
ここに、上記配列を有するペプチドアプタマーを結合させると、蛍光消光団によるクエンチングが打ち消され、FLET効果によって蛍光団の蛍光が大幅に増幅され、目的とするタンパク質を蛍光検出することが可能となる。こうしたペプチドアプタマーとしては、上記表１に示すFEPA-2及びFEPA-4等を挙げることができる。
【００２２】
上記ペプチドアプタマーは、以下の手順で行うcDNAディスプレイによって選択することができる。上記ｃDNAディスプレイ法は、図２に示すように、（ａ１）mRNA調製工程と；（ａ２）第１複合体形成工程と；（ａ３）第２複合体形成工程と；（ａ４）粒子結合工程と；（ａ５）第３複合体形成工程と；（ａ６）第３複合体遊離工程と；（ａ７）選択工程と、を備えている。
【００２３】
まず、（ａ１）mRNA調製工程では、前記のコンストラクトから転写によってmRNAを調製する。そして、（ａ２）第１複合体形成工程において、前記mRNA調製工程で得られたmRNAを、ピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体を形成させる。ここで形成される第１複合体は、上記の通り、リンカー−mRNA複合体である。次に、（ａ３）第２複合体形成工程において、翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させる。すなわち、この工程で形成される第２複合体は、ペプチド−リンカー−mRNA複合体である。
【００２４】
次いで、（ａ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られた第２複合体を、磁性粒子に結合させる。引き続き、（ａ５）第３複合体形成工程において、前記磁性粒子と結合した第２複合体のmRNAを逆転写し、cDNAを形成させる。このため、ここで形成される第３複合体は、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAとなる（以下、「cDNAディスプレイ」ということがある）。次に、（ａ６）複合体遊離工程において、前記第３複合体形成工程で得られたcDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させ、引き続き、（ａ７）選択工程において、前記遊離された第３複合体をリポソームと結合させて選択する。
【００２５】
無細胞翻訳系として、市販のキット、例えば、Retic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用してもよい。このキットのプロトコルに従って、無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心し、氷上に置く。反応液は、20〜50μLスケールとし、次のような順番で混合して調製し、反応させることができる。
上記のキットを使用する場合には、0.5〜1μLの20 X Translation Mix minus-Met、0.5〜1μLの20 X Translation Mix minus-Leu、及び15〜20μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングして混合する。
【００２６】
この混合液を25〜50μLのサンプル溶液中に添加し、反応液が所望の量、例えば、20〜30μLになるようにDEPC水を加える。そして、泡が立たないように再度丁寧に混合し、30℃にて20分間、翻訳反応をさせる。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に15〜25μＬの２〜４Ｍの塩化カリウム、及び４〜８μLの0.5〜２Mの塩化マグネシウムを加え37℃にて30〜50分間反応させる。
【００２７】
上記の溶液中に80〜100pmol相当のcDNAディスプレイ分子がある場合、50〜70μLの量の磁性ビーズ、例えば、ダイナル社製のDynabead MyOne C1を加え、室温で、15〜30分間インキュベートし、リンカーのピューロマイシンに合成されたペプチドが付加された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド連結体）を磁性ビーズの表面にリンカー部分で結合させる。なお、蛍光分子が結合されているリンカーを使用すると、蛍光のリポソーム表面での局在を確認することができる。
【００２８】
次いで、例えば、ReverTra Ace（東洋紡製）を用いて、40〜44℃にて、30分間反応させ、この連結体に結合しているmRNAの逆転写を行い、cDNAが連結された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド−cDNA連結体）を得る。
引き続き、適当な酵素、例えば、RNase T1、を用いて、約35〜38℃にて、10分間反応させ、cDNAが連結された連結体（cDNAディスプレイ）を磁性ビーズから遊離させる。
ここで使用する蛍光分子としては、フルオレセイン、GFP等を挙げることができる。
以上のようにして、本発明のペプチドアプタマーを製造することができる。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）スクリーニング用リンカーの調製
スクリーニング用リンカーを、PEGスペーサー、切断用のrG又はイノシン、dTビーズでの精製用のPolyA等を含まない必要最低限の構造となるように設計し（配列番号３）、化学合成はつくばオリゴサービス（株）に委託した。必要最低限の構造となっている点で、従来のリンカーとは構造的に大きく相違するものとなっている。
下記の配列中、Bはビオチン‐トリエチレングリコールを、Kは3-シアノビニルカルバゾールを、Pはピューロマイシンを、FはFITC-dTをそれぞれ表す。このリンカーの構造を図１に模式的に示す。
【００３０】
［配列番号３］
5’-（B）AAAAATT（F)TCCAKGCCGCCCCCCGTCCTCCP-3’
【００３１】
（実施例２）色素結合DNAコンストラクトの構築
（１）Trp固定ライブラリの構築
鋳型DNA作製用に、下記のDNAフラグメントを使用した。
【００３２】
【表２】
2020076673.tif 000003
【００３３】
本実施例では、鋳型DNAを作製するために、5´末端にT7プロモーター配列、5’Cap配列、Ω配列、Kozak配列、SKVILFE配列、2つのランダム配列に挟まれたTrp配列、SKVILFE配列、3´末端にヒスチジンタグ配列を有するDNAライブラリ（配列番号5）を使用した。上記DNAライブラリをTrp固定ライブラリ（298 bp）という（配列番号12）。当該配列中のヌクレオチド番号と領域名との関係を下記表３に示した。
【００３４】
［配列番号12］
5’- GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GGTGGCAGTA AAGTTATCCT ATTTGAGGGT CCAGCTGGAN NBNNBNNBNN BNNBNNBNNB TGGNNBNNBN NBNNBNNBNN BNNBGGTGCT CCAGGAAGCA AGGTCATATT ATTCGAAGGG GGAGGCAGCC ATCATCATCA TCATCACGGC GGAAGCAGGA CGGGGGGCGG CGTGGAAA -3’
【００３５】
【表３】
2020076673.tif 000004
【００３６】
また、上記Trp固定化ライブラリ中のN及びBで表したヌクレオチドの部位に、A、T、G及びCがどのような頻度で出現するか（塩基出現率）を、下記表４及び図1に示すようにデザインした。
【００３７】
【表４】
2020076673.tif 000005
【００３８】
cDNA ディスプレイ法によって大きな多様性（1013/mL）を持つライブラリを作製し、これを次世代シーケンサーによってシーケンスし、これらの中から、蛍光消光団に結合する可能性のある配列を有するペプチドアプタマーを検索した。上記蛍光消光団となる色素として、非蛍光性色素QSY（登録商標）9（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製造）を使用した。
【００３９】
（２）Trp固定ライブラリの作製方法
まず、プライマーとして、T7 omega new及びΩnew-SKとを用いて、エクステンションPCRを行い、PCR産物1を得た。次いで、プライマーとしてSKVILFE-ランダム-Trp-ランダム-SK及びGAPG-SKVILFE-GGGS-His(Ytag cnvK)とを用いて、エクステンションPCRを行い、PCR産物2を得た。上記PCR産物1及び2を常法に従って精製し、これらを鋳型として、さらにエクステンションPCRを行い、PCR産物3を得た。
PCR産物3を常法に従って精製した後に、精製PCR産物3を鋳型とし、プライマーとしてNewleft及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてPCRを行い、PCR産物4を得た。
PCR産物4を精製し、DNAコンストラクトとして使用した。
【００４０】
（３）転写
上記のようにして得られたDNAコンストラクトを、RiboMAX Large Scale RNA Production Systemsを用いてmRNAに転写した。下記表５にバッファー組成を示す。
【００４１】
【表５】
2020076673.tif 000006
【００４２】
まず、上記表４に示す組成の反応液を調製し、37 ℃にて3 時間インキュベートした。引き続き、この反応液にRQ1 RNase-Free DNaseを2μL加え、37 ℃にて30 分インキュベートした。その後、RNeasy MinElute Cleanup Kit（QUIAGEN社製）を用いて転写産物を精製した。得られた精製物を8 M 尿素変性ゲル電気泳動（PAGE）に供し、転写産物及び上記DNAライブラリを確認した。結果を図3に示す。
また各ラウンドで転写に用いたDNAテンプレートの量は下記表６に示す通りとした。なお、上記表５に示す反応組成中のxは、使用したDNAテンプレートの量に応じて変更した。
【００４３】
【表６】
2020076673.tif 000007
【００４４】
（４）光架橋
RNAとcnvK Linkerとを光架橋によって連結した。反応溶液の組成および手順は下記表７に示すとおりとした。なおmRNAとcnvK Linkerの比率は5:4とした。
【００４５】
【表７】
2020076673.tif 000008
【００４６】
まず、上記組成の反応溶液を調製し、この反応液を入れたチューブをT3 Thermocyclerにセットしてアニーリングを行った。その後、CL-1000 Ultraviolet Crosslinker （フナコシ（株））を用いて、波長365 nm (405 mJ/cm2)の紫外線を１分間照射し、光架橋させて光架橋産物（mRNA-Linker連結体）を得た。この後、この反応液を8 M 尿素変性PAGEに供し、得られた光架橋産物とmRNAとを確認した。結果を図3に示す。
【００４７】
（５）翻訳
上記mRNA-Linker連結体を、無細胞翻訳系で翻訳し、mRNA-ペプチド連結体を形成した。下記表８に反応溶液の組成と手順とを示す。
【００４８】
【表８】
2020076673.tif 000009
【００４９】
まず、上記組成の反応液を調製し、この反応液を入れたチューブを30℃で20 分間インキュベートした。その後、24μLの3 M KCl、6μLの1 M MgCl2をこのチューブに加え、37℃で90 分間インキュベートした。次に、0.5 M EDTA (pH 8.0)を18μL 加え、37℃で5 分間インキュベートし、その後、2 x 結合バッファーを98μL加えた。
また、この後、別のチューブに、60μLのDynabeads MyOne Streptavidin C1を入れ、6 pmol のmRNA-ペプチド連結体を加えた。次に、Dynabeads MyOne Streptavidin C1の入ったチューブを磁気スタンドに静置し、上清を捨てた。その後、1 x 結合バッファーを100μL加え、ビーズを再懸濁させて上清を捨てた（洗浄）。洗浄を終えたDynabeads MyOne Streptavidin C1にmRNA-ペプチド連結体を加え、25℃にてローターで撹拌しながら30分間反応させ、mRNA-ペプチド連結体とDynabeads MyOne Streptavidin C1とを、結合させた。
【００５０】
（６）逆転写
以上のようにして得られたmRNA-ペプチド連結体を結合したDynabeads MyOne Streptavidin C1を磁気スタンドに静置して上清を捨て、200μL の1 x 結合バッファーを加えて再懸濁させ、その後、再び磁気スタンドに静置して上清を捨てた（Dynabeads MyOne Streptavidin C1の洗浄）。この洗浄をさらに2回行った。
次に、100μL の1 x ReverTra バッファーで同様に洗浄を1回行い、上清を捨てた。ここに、下記表９に示す組成の反応溶液を加え、42℃にてローターで撹拌しながら30 分間インキュベートした。
【００５１】
【表９】
2020076673.tif 000010
【００５２】
逆転写の終了後、磁気スタンド上に上記組成の反応液を喰えたチューブを静置し、上清を捨て、100μL の1 x His-tag 結合バッファーで１回洗浄し、上清を捨てた後に、39.8μL の1 x His-tag 結合バッファーと0.2μL のRNase T1とを加え、37℃にてローターで15 分間撹拌しながらインキュベートした。
【００５３】
（７）His-タグ精製
次にHis-タグによる精製を行なった。なお、後述するセレクションの1stラウンドでは、His-タグ精製は行わなかった。
まず、逆転写用とは異なるチューブにHis Mag セファロース Niを20μL入れ、磁気スタンド状に静置して上清を捨てた。その後、1 x His-タグ結合バッファー 100μLで洗浄した。洗浄の際の上清を捨て、予めインキュベートしておいたcDNA ディスプレイ分子をこのチューブに40μL加えて、25℃にてローターで撹拌しながら1 時間反応させた。
反応が終了後、このチューブを磁気スタンド上に静置して上清を捨てた。その後、1 x His-タグ洗浄バッファー 100μLを加えて再懸濁し、その後、磁気スタンド上に静置して上清を捨てた。次に、1 x His-タグ溶出バッファー 40μLを加え、25℃でローターを使用して15 分間インキュベートした。インキュベーション終了後、磁気スタンドにこのチューブを静置して上清を回収した。
【００５４】
（８）プレセレクション
2ラウンド以降は、各ラウンドで使用する固定担体（セレクション前にQSY9を固定化していない）に、cDNA ディスプレイ分子を30分間（〜3ラウンド目まで）または60分間（4ラウンド目以降）インキュベートし、フロースルー画分を回収してセレクションを行った。
【００５５】
（９）セレクション
（９−１）カラムを用いたセレクション
まず、1 x セレクションバッファーで、QSY9を固定化してあるEAH セファロース4Bをチューブ内で3回洗浄した。その後、cDNA ディスプレイ分子をこのチューブに加え、室温で1 時間インキュベートした。インキュベート中は、20 分ごとにタッピングを行った。その後、QSY9と結合しなかったであろうcDNA ディスプレイ分子を含む溶液をフロースルー画分として回収した。
【００５６】
次に、1mL の1 x セレクションバッファーで洗浄し、その洗浄廃液をWashとして回収した。洗浄は1stラウンドでは4回、2ndラウンドでは8回行った。洗浄終了後に、1 mL の1% SDSを加え、室温にて30 分間溶出させた。なお、1% SDSによる溶出は2回行った。
【００５７】
（９−２）磁性ビーズを用いたセレクション
まず、QSY9を固定化してある磁性ビーズを1 x セレクションバッファーで3回洗浄した。その後、cDNA ディスプレイ分子を加え、室温で1 時間、ローテーターにてインキュベートした。その後、QSY9と結合しなかったであろうcDNA ディスプレイ分子を含む溶液をフロースルー画分として回収した。
【００５８】
次に、100μL の1 x セレクションバッファーで洗浄を行い、その洗浄廃液をWashとして回収した。洗浄は5回行った。洗浄終了後に、100μL の1% SDSを加え、室温にて30 分間溶出を行った。なお1% SDSによる溶出は2回行った。
【００５９】
（10）セレクション後の結果の確認
下記表9に示す各ラウンドの産物について、セレクションの結果を確認した。
【００６０】
【表１０】
2020076673.tif 000011
【００６１】
（10-１）PAGEによるセレクション結果の確認
上記表9に示す溶出画分についてエタノール沈殿を行った。得られたエタノール沈殿物を鋳型とし、プライマーとしてT7 omega new及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてPCRを行った。得られたPCR産物を、4% PAGEに供してセレクション結果を確認した。
【００６２】
（10-２）qPCRによるセレクション結果確認
上記（10-1）と同様に、各溶出画分についてエタノール沈殿を行い、得られたエタノールノーツ沈殿物を鋳型とし、プライマーとしてqPCR-SKV及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてqPCRを行い、セレクション結果を確認した。7ラウンド後のDNAライブラリについては、次世代シーケンサーを用いて配列の解析を行った。
【００６３】
（11）プルダウンアッセイによるQSY9との結合能の評価
上記表9に示すように、７ラウンドまではアフィニティによるセレクションを行った。アフィニティセレクションによって得られたライブラリから得られた次世代シーケンスの結果に基づいて、上位10個のペプチド配列についてプルダウンアッセイを行ない、QSY9との結合能の評価を行った。
【００６４】
まず、上述した手順に従って、上記10個のペプチド配列に対してそれぞれcDNAディスプレイ分子を作製し、Hisタグ精製を行って、Hisタグ精製物1を得た。得られたHisタグ精製物1とQSY9固定化ビーズとを室温で1時間インキュベートさせ、その後、1% SDSにて溶出を行い、SDS溶出物1を得た。上記SDS溶出物1についてSDS PAGEにより生成物を確認した。確認の結果、未結合であったペプチド配列を除いて、Hisタグ精製を行うことなくcDNAディスプレイ分子を作製した。
【００６５】
上記の各１％SDS溶出物とQSY9固定化ビーズとを室温で1時間インキュベートさせ、１％SDSにて溶出をさせ、SDS溶出物2を得た。その後、SDS溶出物2をSDS PAGEに供して生成物を確認した。結合している可能性のあった配列に対してリンカーペプチド複合体を作製し、上述した手順でHisタグ精製を行い、Hisタグ精製物1を得た。
【００６６】
Hisタグ精製物とQSY9固定化ビーズとを室温で1時間インキュベートさせ、その後、1% SDSにて溶出させて、SDS溶出物3を得た。各溶出物について、SDS PAGEにより確認を行った。以上の結果から、結合の可能性のある配列に対して、上記と同様にリンカーペプチド複合体を作製し、Hisタグ精製を行ってHisタグ精製物2を得た。
【００６７】
次いで、QSY9固定化ビーズおよびQSY9を固定化していないビーズを、それぞれ同量ずつの上記Hisタグ精製物2と室温で1時間インキュベートさせた。その後、１％ SDSにて溶出を行いってSDS溶出物4を得た。SDS溶出物4をSDS PAGEに供し、生成物を確認した。
【００６８】
（12）蛍光増強能アッセイ
プルダウンアッセイの結果より得られた二つのペプチドの配列は次の通りであった。
【００６９】
【表１１】
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【００７０】
ペプチドの終濃度が1 mMとなるように、ペプチドを溶解させた。その際、溶媒量の10 v/v％ (FEPA-2)又は20 v/v％ (FEPA-4)のDMFで溶解させ、その後、milliQ水で目的の濃度までメスアップを行った。
次いで、上記2つのペプチドとQSY9とをインキュベートし、蛍光分光光度計により蛍光強度の変化を観察した。ペプチドの濃度はいずれも10μM、QSY9の濃度は1μMとし、室温で1時間インキュベートした後に測定した。
その後、励起光560 nmで蛍光スペクトルを測定し、ピークの見られた604 nmでの蛍光強度比を求めた。次に、FAPA-4について、1μM、10μM、又は100μMの濃度で、10μMのQSY9と室温で1時間インキュベートし、励起光560 nmで蛍光スペクトルを測定し、ピークの見られた596 nmでの蛍光強度比を求めた。その結果100μMのFEPA-4とインキュベートさせた場合には2.1倍の蛍光の増強が確認された。
【００７１】
以上から、QSY9 で修飾したビーズと修飾していないビーズとから回収されたcDNAディスプレイ分子の量を比較すると、32 倍の差が見られた。このことから、QSY9と結合する可能性のあるcDNAディスプレイ分子が取得できたものと考えられた。
また、その後アフィニティセレクションにより得られたDNAライブラリを次世代シーケンサーにより解析を行った結果、最大で10%の重複が確認できQSY9 と結合する可能性のあるペプチド配列が得られたと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、医学、分子生物学、生化学等の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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