(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的な細胞培養を可能とすると共に、平易な構造で細胞培養が可能な細胞培養装置、及び、多能性幹細胞を用いた培養において、画像認識やロボットでの細胞選別機構を設けることなく、小型の装置で細胞の品質を保つことが可能な細胞培養装置の提供。【解決手段】培地を含む第１の容器と、細胞を培養するための第２の容器と、第２の容器から排出される液体を収容するための第３の容器と、第１の容器中の培地を第２の容器へ送液するための第１の送液管及び第１の送液機構と、第２の容器中の液体を第３の容器へ送液するための第２の送液管及び第２の送液機構と、第２の容器中の液体を加熱又は冷却するための第１の温度調節部と、を有し、第２の容器は（１）第２の容器が、温度応答性の細胞培養容器である、又は（２）第２の容器内部に、温度応答性の細胞培養基材を含む、のいずれか一方、又は両方であることを特徴とする、細胞培養装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を含む第１の容器と、細胞を培養するための第２の容器と、第２の容器から排出される液体を収容するための第３の容器と、第１の容器中の培地を第２の容器へ送液するための第１の送液管及び第１の送液機構と、第２の容器中の液体を第３の容器へ送液するための第２の送液管及び第２の送液機構と、第２の容器中の液体を加熱又は冷却するための第１の温度調節部と、を有し、
第２の容器は下記（１）又は（２）のいずれか一方、又は両方であることを特徴とする、細胞培養装置。
（１）第２の容器が、温度応答性の細胞培養容器である。
（２）第２の容器内部に、温度応答性の細胞培養基材を含む。
【請求項２】
送液機構が、送液ポンプによるものであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
酵素又はキレート剤を含有する液体を含む第４の容器と、第４の容器中の液体を第２の容器へと送液するための第３の送液管及び第３の送液機構と、を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
第１の容器と第２の容器との間に、第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第２の温度調節部を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項５】
第１の温度調節部と第２の温度調節部の熱源が、同一のものであることを特徴とする、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第３の温度調節部を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項７】
第２の容器を傾斜させるための第１の傾斜角度可変部を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項８】
第２の容器、又は第２の容器が含む細胞培養基材が、温度応答性セグメントを有するブロック共重合体による層を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項９】
第２の容器、又は第２の容器が含む細胞培養基材が、層厚５〜１００ｎｍの温度応答性高分子による層を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
細胞培養基材が多孔質基材であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
培養する細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的な細胞培養を可能とすると共に、平易な構造で細胞培養が可能な細胞培養装置、及び、多能性幹細胞を用いた培養において、画像認識やロボットでの細胞選別機構を設けることなく、小型の装置で細胞の品質を保つことが可能な細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。しかしながら、従来の手作業の細胞培養では、大量の細胞を得るために多大な作業が発生することや、細胞に雑菌が混入する等の生物学的汚染リスクが問題となっている。このために、細胞培養を自動化できる細胞培養装置が開発されている。例えば、特許文献１では、手作業の培養操作をロボットによって自動化した閉鎖系培養システムが開示されている。しかしながら、ロボットを用いた自動培養では、培養装置が複雑になるために装置のサイズが大きくなってしまうことや、装置自体の量産性に劣るという問題があった。
【０００３】
また近年、全ての組織細胞へと分化可能な細胞として胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞が注目を集めているが、これらの細胞では特に細胞培養の作業が複雑であるという問題がある。例えば、多能性幹細胞はコロニーと呼ばれる細胞集団を形成して増殖するために、細胞を培養容器から剥離回収する際に、培養容器の表面をセルスクレーパーと呼ばれる器具で擦る必要がある。また、多能性幹細胞は培養中に別の細胞に変化してしまうため、細胞の品質を保つためには細胞の分別作業が必要であり、培養装置にも細胞選別用の機構を備える必要がある（例えば、特許文献２）。このために、多能性幹細胞の培養装置は特に複雑な構造になり、装置が大型化するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−１９８０５３号公報
【特許文献２】特許第６３３０６５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、効率的な細胞培養を可能とすると共に、平易な構造で細胞培養が可能な細胞培養装置を提供することにある。また、多能性幹細胞を用いた培養において、画像認識やロボットでの細胞選別機構を設けることなく、小型の装置で細胞の品質を保つことが可能な細胞培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、以上の点を鑑み鋭意研究を重ねた結果、温度応答性の細胞培養容器又は細胞培養基材を備えた細胞培養装置によって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明の各態様は以下に示す［１］〜［１１］である。
［１］  培地を含む第１の容器と、細胞を培養するための第２の容器と、第２の容器から排出される液体を収容するための第３の容器と、第１の容器中の培地を第２の容器へ送液するための第１の送液管及び第１の送液機構と、第２の容器中の液体を第３の容器へ送液するための第２の送液管及び第２の送液機構と、第２の容器中の液体を加熱又は冷却するための第１の温度調節部と、を有し、
第２の容器は下記（１）又は（２）のいずれか一方、又は両方であることを特徴とする、細胞培養装置。
【０００８】
（１）第２の容器が、温度応答性の細胞培養容器である。
【０００９】
（２）第２の容器内部に、温度応答性の細胞培養基材を含む。
［２］  送液機構が、送液ポンプによるものであることを特徴とする、前記［１］に記載の細胞培養装置。
［３］  酵素又はキレート剤を含有する液体を含む第４の容器と、第４の容器中の液体を第２の容器へと送液するための第３の送液管及び第３の送液機構と、を有することを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  第１の容器と第２の容器との間に、第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第２の温度調節部を有することを特徴とする、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［５］  第１の温度調節部と第２の温度調節部の熱源が、同一のものであることを特徴とする、前記［４］に記載の細胞培養装置。
［６］  第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第３の温度調節部を有することを特徴とする、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［７］  第２の容器を傾斜させるための第１の傾斜角度可変部を有することを特徴とする、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［８］  第２の容器、又は第２の容器が含む細胞培養基材が、温度応答性セグメントを有するブロック共重合体による層を有することを特徴とする、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［９］  第２の容器、又は第２の容器が含む細胞培養基材が、層厚５〜１００ｎｍの温度応答性高分子による層を有することを特徴とする、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１０］  細胞培養基材が多孔質基材であることを特徴とする、前記［１］〜［９］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１１］  培養する細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする、前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、効率的な細胞培養を可能とすると共に、平易な構造で細胞培養が可能な細胞培養装置を提供することができる。また、多能性幹細胞を用いた培養において、画像認識やロボットでの細胞選別機構を設けることなく、小型の装置で細胞の品質を保つことが可能な細胞培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態における細胞培養装置の構成図である。
【図２】実施例１の細胞培養装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【００１３】
本明細書において、「温度応答性」とは、細胞培養容器又は細胞培養基材の表面について、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する性質を示す。細胞培養容器又は細胞培養基材の表面の親水性／疎水性の程度が変化することで、細胞培養容器又は細胞培養基材への細胞の接着性が変化する。また、本明細書において、親水性／疎水性の程度が変化する温度を「応答温度」という。細胞培養容器又は細胞培養基材の表面の親水性／疎水性の程度は、細胞培養容器又は細胞培養基材を水中に浸漬し、気泡の接触角を測定することにより評価することができる。また、水温を変化させて気泡の接触角を測定することで、温度応答性を有するか評価することができる。
【００１４】
また、本明細書において、「生体由来物質」とは、生物の体内に存在する物質であるが、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記生体由来物質をベースとして化学的に合成した物質であっても良い。生体由来物質に特に限定はないが、例えば、生体を構成する基本材料である核酸、タンパク質、多糖や、これらの構成要素であるヌクレオチドやヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖、あるいは脂質やビタミン、ホルモンである。
【００１５】
本発明の培養装置は、培地を含む第１の容器と、細胞を培養するための第２の容器と、第２の容器から排出された液体を収容するための第３の容器を有する。第１の容器は、第２の容器で使用する培地を保管する。培地の成分が劣化しないための低ガス透過性、培地成分の低吸着性等を第１の容器に付与してもよく、また、容器の形状に特に限定はなく、当業者の技術常識によって目的を考慮し作製可能である。また、第１の容器は、培地の種類を変更するため等の目的に応じて複数備えていてもよい。
【００１６】
第２の容器は下記（１）又は（２）のいずれか一方、又は両方である。
【００１７】
（１）第２の容器が、温度応答性の細胞培養容器である。
【００１８】
（２）第２の容器内部に、温度応答性の細胞培養基材を含む。
【００１９】
第２の容器は、容器内部で細胞を培養する。（１）では、第２の容器の内面が細胞の培養面となっている。この場合、第２の容器の形状に特に限定はなく、シャーレ、フラスコ、バッグ、ウェルプレート等、適宜選択できる。（２）では、第２の容器の内部に細胞培養基材を入れて分散又は固定化する。基材の形状に特に限定はなく、板、フィルム、糸、チューブ等、適宜選択できる。
【００２０】
また、細胞として多能性幹細胞を用いる場合、コロニーの内部まで培地に含まれる栄養を行き渡らせることで、細胞の純度を維持しやすいため、細胞培養基材が多孔質基材であり、多孔質基材の細孔径が培養する細胞よりも小さなものであることが好ましい。また、多孔質基材の細孔径が０．０１〜８μｍであることが好ましく、０．０１〜３μｍであることがさらに好ましく、０．０１〜１μｍであることが特に好ましく、０．１〜１μｍであることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「細孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
【００２１】
さらに、細胞として多能性幹細胞を用いる場合、温度応答による細胞の剥離性を高めるのに好適のため、多孔質基材の空隙率が、０．０１〜１０％であることが好ましく、０．１〜５％がさらに好ましく、０．０１〜３％が特に好ましく、０．０１〜１％が最も好ましい。また、細胞の純度を維持しやすいため、多孔質基材の空隙率が、１０〜９０％であることが好ましく、２０〜８０％がさらに好ましく、３０〜７０％が特に好ましく、４０〜６０％が最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「空隙率」とは、多孔質基材の基材面積当たりに存在する細孔の面積を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域において細孔の面積を求めることで算出することができる。なお、本発明において多孔質基材の「基材面積」とは、多孔質基材に細孔が存在しないと仮定した場合の、多孔質基材の一主面の表面積を示す。
【００２２】
また、前記細胞培養容器又は細胞培養基材の材質は特に限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、ガラス、セラミックス、金属類などを用いることができる。
【００２３】
第２の容器が温度応答性の細胞培養容器であるか、又は、第２の容器が温度応答性の細胞培養基材を含むことで、多能性幹細胞以外の細胞を培養する場合においては、酵素やキレート剤等の細胞剥離液で細胞を処理することなく、第２の容器の温度を変化させるだけで細胞を容器又は基材から剥離回収することができるため、細胞培養装置の構造を平易にすることができ、細胞培養装置を小型化することができる。また、多能性幹細胞を培養する場合においては、多能性幹細胞をセルスクレーパーで擦って剥離する機構を装置に設けることなく、第２の容器の温度を変化させるだけで細胞を容器又は基材から剥離回収することができるため、細胞培養装置の構造を平易にすることができ、細胞培養装置を小型化することができる。また、セルスクレーパーで擦って剥離する代わりに、温度応答によって多能性幹細胞を剥離する場合、温度応答の特性をうまく調整することによって、多能性幹細胞のみを選択的に剥離することができる。このために、純度の高い多能性幹細胞を識別する機構や、一部の細胞を機械的に分別する機構を設けることなく、高純度の多能性幹細胞を回収することができるため、細胞培養装置の構造を平易にすることができ、細胞培養装置を小型化することができる。第２の容器が（１）又は（２）のいずれでもない場合、細胞培養装置が複雑になり大型化する。また、複数種類の細胞を培養するため、又は、複数条件で細胞を培養する目的で、第２の容器を複数備えていてもよい。
【００２４】
第３の容器は、第２の容器から排出される液体を収容する。第２の容器から排出される液体としては、培地交換後の不要となった培地、細胞を洗浄した後に不要となった緩衝液、細胞を酵素やキレート剤等で処理した後に不要となった細胞剥離液、細胞培養後に剥離回収した細胞が分散した液体（細胞分散液）等を挙げることができる。目的に応じて、第３の容器は複数備えてもよく、例えば、不要となった培地、緩衝液、細胞剥離液等の廃液を収容するための容器と、細胞分散液を収容するための容器の、２つの容器を備えることが好ましい。
【００２５】
また、本発明の細胞培養装置は、必要に応じて、酵素又はキレート剤を含有する液体を含む第４の容器を備えていてもよい。
【００２６】
本発明の細胞培養装置は、第１の容器中の培地を第２の容器へ送液するための第１の送液管及び第１の送液機構と、第２の容器中の液体を第３の容器へ送液するための第２の送液管及び第２の送液機構を有する。送液管の材質に特に限定はなく、シリコン、ゴム、テフロン（登録商標）、ファーメド（登録商標）ＢＰＴ、ポリエチレン、ポリプロピレン等のプラスチックス、ＳＵＳ等の金属等、適宜選択できる。また、送液機構の種類に特に限定はなく、ポンプ等の吸引機によるものや加圧機によるもの等、適宜選択することができる。
【００２７】
前記送液機構としては、容器内を陽圧にする必要がなく、安全性の観点から好ましいため、送液ポンプによるものが好ましい。前記送液ポンプの種類としては特に限定はないが、ダイアフラムポンプ、シリンジポンプ、チューブポンプ、ギアポンプ、ロータリーポンプ、電磁ポンプ、電磁ダイアフラムポンプ等、適宜選択できる。
【００２８】
また、本発明の細胞培養装置は、第４の容器を備える場合、第４の容器中の液体を第２の容器へと送液するための第３の送液管及び第３の送液機構を有する。
【００２９】
前記送液機構のためのポンプや加圧機等は、各送液管ごとに設ける必要はなく、単一の機械で複数の送液機構を賄ってもよい。例えば、送液管や送気管に弁を設け、第１の容器に加圧機を接続して弁の開閉を制御することにより、第１の送液機構と第２の送液機構を単一の加圧機で備えることができる。
【００３０】
前記弁の種類としては特に限定はなく、ボール弁、ダイアフラム弁、ピンチ弁、仕切り弁等、適宜選択することができる。
【００３１】
本発明において、送液管や送気管には必要に応じてフィルターを設けてもよい。
【００３２】
本発明の細胞培養装置は、第２の容器中の液体を加熱又は冷却するための第１の温度調節部を有する。温度としては、第２の容器中で細胞を培養する際は、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４５℃がさらに好ましく、３０〜４０℃が特に好ましく、３５〜３９℃が最も好ましい。また、細胞培養容器又は細胞培養基材の温度応答により細胞を剥離する際は、応答温度以下に冷却することが好ましく、１〜３０℃がさらに好ましく、４〜２５度が特に好ましく、１０〜２０℃が最も好ましい。ここで、第１の温度調節部における加熱又は冷却のための熱源としては特に限定はなく、電熱器等の抵抗加熱、赤外線放射加熱、ヒートポンプ、ウォーターバス等の熱交換器、ペルチェ素子等の熱移動素子等、適宜選択できる。
【００３３】
本発明において、第１の容器と第２の容器との間に、第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第２の温度調節部を有することが好ましい。第２の温度調節部を有することにより、第１の容器の培地を第２の容器に送液する際、培地を事前に培養温度に加熱しておくことができるため、培地交換における細胞へのダメージを低減することができる。また、第１の容器中の培地の温度が細胞培養容器又は細胞培養基材の応答温度以下の場合、第２の温度調節部で培地を加熱することにより、意図せず細胞が剥離してしまうことを抑制することができる。第２の温度調節部における加熱又は冷却のための熱源としては特に限定はなく、前述の第１の温度調節部と同様に適宜選択できる。
【００３４】
前記第２の温度調節部を設置する場所としては、第１の容器と第２の容器との間であること以外に特に限定はないが、例えば、第１の送液管に設置することができる。この時、第１の送液管を螺旋状に巻くこと等により、第２の温度調節部が占有する空間を小さくしつつ、培地を加熱するために十分な距離の送液管を設置することができる。
【００３５】
また、第２温度調節部には、大量の培地を一度に加熱又は冷却するために、第５の容器を備えていても良い。
【００３６】
また、第１の温度調節部と第２の温度調節部の両方を加熱／又は冷却することができるように熱源を配置することで、第１の温度調節部と第２の温度調節部の熱源が同一のものとすることが、細胞培養装置を小型化できるため好ましい。
【００３７】
本発明において、第１の容器中の培地を加熱又は冷却するための第３の温度調節部を有することが好ましい。第３の温度調節部を有することにより、第１の容器中で培地を保管する際の保管温度を自由に設定することができるため、室温で保管することが難しい培地に対しても成分の劣化等の悪影響を及ぼすことなく、保管が可能となる。第３の温度調節部における加熱又は冷却のための熱源としては特に限定はなく、前述の第１の温度調節部と同様に適宜選択できる。
【００３８】
本発明において、第２の容器を傾斜させるための第１の傾斜角度可変部を有することが好ましい。第１の傾斜角度可変部を有することにより、第２の容器中の液体を送液する際に、第２の容器を傾けることができ、傾斜角度可変部を有しない場合と比べて、より多くの液体を送液することができる。傾斜角度可変部の機構としては特に限定はなく、モーターやエアシリンダー等、適宜選択することができる。
【００３９】
本発明の細胞培養装置は、第１〜第３の容器中の炭酸ガス濃度を一定に保つための、送気管を備えていてもよい。炭酸ガス濃度としては、０．１〜１０％が好ましい。また、送気管には必要に応じてフィルターを設けてもよい。送気管に設けるフィルターの孔径としては、微生物の通過を防ぐため１μｍ以下が好ましく、０．５μｍ以下がさらに好ましく、０．１μｍ以下が特に好ましい。
【００４０】
本発明において、第２の容器、又は、第２の容器が含有する細胞培養基材に温度応答性を付与する方法としては、特に限定はなく、温度応答性の物質を表面に被覆する方法、温度応答性の物質で容器又は細胞培養基材を作製する方法を挙げることができる。容器又は細胞培養基材の量産性に優れることから、温度応答性の物質を表面に被覆する方法が好ましい。また、温度応答性の物質としては、特に限定はないが、温度応答性の高分子が好ましい。
【００４１】
前記温度応答性の高分子を表面に被覆する方法としては、例えば、温度応答性のモノマーを基材に塗布して基材上で電子線重合又はリビングラジカル重合を行う方法、温度応答性の高分子を塗布する方法を挙げることができる。温度応答性の高分子を塗布する場合、温度応答性高分子の培地への溶出を抑制するために好適であることから、少なくとも温度応答性セグメントを有するブロック共重合体であることが好ましく、温度応答性セグメントと、疎水性セグメント又は化学反応性セグメントの、少なくとも２つのセグメントを有するブロック共重合体がさらに好ましい。
前記温度応答性の高分子又は温度応答セグメントを構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−  ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができ、応答温度を０〜５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、ブロック共重合体の応答温度を室温よりも低い温度とするのに好適であることから、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミドが好ましい。
【００４２】
前記疎水性セグメントを構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−デシルアクリレート、ｎ−デシルメタクリレート、ｎ−ドデシルアクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−テトラデシルアクリレート、ｎ−テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。
【００４３】
前記化学反応性セグメントを構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、４−アジドフェニルアクリレート、４−アジドフェニルメタクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。
【００４４】
本発明において、多能性幹細胞を培養する場合、前記ブロック共重合体中の温度応答ブロックセグメントの構成単位比率は、６０ｗｔ％以上が好ましく、７０ｗｔ％以上がさらに好ましく、８０ｗｔ％以上が特に好ましく、９０ｗｔ％を超えることが最も好ましい。ブロック共重合体中の温度応答ブロックセグメントが前記範囲にあることで、細胞培養装置において多能性幹細胞を培養した場合に、温度応答による細胞の剥離に際し、純度の低い細胞を剥離せず、純度の高い多能性幹細胞を選択的に剥離することができるため、画像認識やロボットでの細胞選別機構を設けることなく、小型の細胞培養装置で細胞の品質を保つことができ、好ましい。
【００４５】
本発明において、ブロック共重合体が細胞へ混入することを抑制するのに好適であることから、ブロック共重合体が含有する数平均分子量５０００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。また、数平均分子量１００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。さらに、数平均分子量３００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。ブロック共重合体に含まれる特定分子量以下の成分の含有量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００４６】
本発明におけるブロック共重合体の分子量としては特に制限はないが、ブロック共重合体の強度を高めるのに好適のため、数平均分子量で１０００〜１００万であることが好ましく、２０００〜５０万であることがさらに好ましく、５０００〜３０万であることが特に好ましく、１万〜２０万であることが最も好ましい。
【００４７】
本発明において、温度応答による細胞の剥離性を高め、さらに、培養中に意図せず細胞が剥離してしまうことを抑制するのに好適であることから、温度応答性高分子による層の層厚が、１〜５００ｎｍが好ましく、５〜１００ｎｍがさらに好ましく、１０〜５０ｎｍが特に好ましく、１５〜４０ｎｍが最も好ましい。ここで、本発明において温度応答性高分子による層の「層厚」とは、容器又は基材と温度応答性高分子による層の界面から、温度応答性高分子による層の表面構造における山部分までの面外方向の長さを示す。層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作製した培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。
【００４８】
本発明において、温度応答性高分子による層は、前記層上に固定化された生体由来物質を有していてもよい。前記生体由来物質としては特に限定はないが、例えば、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン等を挙げることができる。
【００４９】
これら生体由来物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質をベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。
【００５０】
本発明において、前記マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品としては例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
【００５１】
前記ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１又はラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いることができる。前記ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ラミニンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（株式会社ニッピ製）を好適に用いることができる。
【００５２】
前記ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ビトロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）やｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ−Ｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
【００５３】
前記フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記フィブロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）やＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ株式会社製）を好適に用いることができる。
【００５４】
前記コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲンを用いることができる。前記コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記コラーゲンをベースとした合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やコラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を好適に用いることができる。
【００５５】
本発明において、生体由来物質の変性を抑制することができるため、生体由来物質は共有結合ではなく非共有結合により固定化されていることが好ましい。ここで、本発明において「非共有結合」とは、静電相互作用、水不溶性相互作用、水素結合、π−π相互作用、双極子−双極子相互作用、ロンドン分散力、その他のファンデルワールス相互作用等、分子間力に由来する共有結合以外の結合力を示す。生体由来物質の固定化は、単一の結合力によるものであっても、複数の組み合わせであってもよい。生体由来物質の固定化方法は特に限定されるものではないが、例えば、生体由来物質の溶液を所定時間塗布することで固定化させる方法や、培地中に生体由来物質を添加することで培地共に細胞培養容器又は細胞培養基材に添加し、固定化する方法を好適に用いることができる。
【００５６】
本発明の細胞培養装置は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法に特に限定はないが、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、γ線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌等を用いることができる。
【００５７】
本発明において、温度応答性高分子による層を形成させる方法としては特に限定はないが、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
【００５８】
本発明の細胞培養装置を用いて培養される細胞としては、特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の株化細胞に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、間葉系幹細胞、骨髄細胞、Ｍｕｓｅ細胞のように種々の組織に存在する幹細胞、さらにはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞（多能性幹細胞）、それらから分化誘導した細胞等を用いることができる。
【００５９】
また、幹細胞の培養においては、細胞を増殖させるための培養や、細胞からスフェロイド（細胞凝集塊）を形成するための培養、細胞を分化させるための培養等、目的に応じて所望の培養を実施可能である。
本発明の細胞培養装置で用いる培地としては、特に限定はなく、一般的な基礎培地を用いる事ができる他、培養する細胞に応じて添加物を含有するものを用いてもより。例えば、多能性幹細胞の培養においては、幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２−メルカプトメタノールを添加した培地を用いることが好ましい。
【００６０】
前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（株式会社ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素株式会社製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（株式会社ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（株式会社ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（株式会社ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（株式会社ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ株式会社製）、ＧＳ２−Ｍ（タカラバイオ株式会社製）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ株式会社製）等を挙げることができる。
【００６１】
前記培地としてはまた、幹細胞の生存を維持するのに好適であることから、前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地にさらにＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることもできる。特にヒトの幹細胞を用いる場合であって、ヒトの幹細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの幹細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（富士フイルム和光純薬工業株式会社製Ｙ−２７６３２）、１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（富士フイルム和光純薬工業株式会社製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ〜５０μＭであり、より好ましくは３μＭ〜２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ〜１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ〜１２μＭである。
【００６２】
本発明の細胞培養装置において、第４の容器に含まれる酵素としては、トリプシンやトリプシン由来の酵素を挙げることができる。ここで、本発明において「トリプシン」とは、膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素の「ＥＣ．３．４．２１．４」、又は該タンパク質分解酵素と同等の特性を有する分解酵素を示す。市販品としては例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＳＥＬＥＣＴ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥＸＰＲＥＳ（いずれもサーモフィッシャー社製）等を挙げることができる。
【００６３】
また、第４の容器に含まれるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、１，３−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，３−ジアミノ−２−プロパノール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、イミノ二酢酸、エチドロン酸、クエン酸、ムギネ酸、ビピリジン、ポルフィリン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル、サイクレン、１８−クラウン−６、デフェロキサミン、ドータオクトレオテート、ニコチアナミン、ジメルカプロール、シデロホア等を挙げることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子株式会社製、商品名ＪＮＭ−ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカー製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー株式会社製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー株式会社製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロー２−イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．製）を用いた。
＜重合体の層厚＞
基材に被覆された重合体の層厚は、透過型電子顕微鏡を用い、ミクロトームで切断した基材断面を観察し、重合体の層厚を測定した。
【００６５】
実施例１
［ブロック共重合体の合成］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００６６】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドからなるブロックセグメントの組成比は９６ｗｔ％、ブロック共重合体の数平均分子量は７万であった。
［ブロック共重合体が被覆された細胞培養基材の作製］
前記ブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．６ｗｔ％溶液とした。平均孔径０．４μｍの細孔を有する直径６ｃｍのポリエチレンテレフタレート多孔質フィルム（ｉｔ４ｉｐ製ｉｐＰＯＲＥ（登録商標））にこの溶液を４００μＬ滴下し、２０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥することで、層厚３０ｎｍのブロック共重合体が被覆されたフィルムを作製した。このフィルムをリングで固定化することで、細胞培養基材を作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を水中に浸漬し、２０〜４５℃の範囲で、５℃間隔で気泡接触角（θ）（°）を測定し、各温度における対水接触角（１８０−θ）（°）を求め、中点法により応答温度を算出した。なお、θは協和界面科学（株）製接触角計ＤＭ３００を用いて、水中、３μＬの気泡の接触角を測定した。応答温度は３３℃であった。
［細胞培養装置の作製］
図２に示す構成の細胞培養装置を作製した。第２の容器内には、上記で作製したブロック共重合体による層を有する細胞培養基材を入れた。第１〜第３の容器はＳＣＨＯＴＴ製のガラス製容器を、第１及び第２の送液機構にはツカサ電工株式会社製チューブポンプ及びサンゴバン株式会社製ファーメドＢＰＴチューブを、第１及び第２の送液管及び送気管はメルク製シリコンチューブを、第１〜第３の温度調節部に使用する熱源にはタイテック株式会社製恒温槽ＷＴＢシリーズを、クリーンベンチは松定プレシジョン株式会社製ＣＬＴシリーズをそれぞれ使用した。なお、第１及び第２の温度調節部に使用する熱源には、同一のものを使用した。また、送気管には微生物の混入を防ぐため、メルク製フィルターのマイレックス−ＶＶ（孔径０．１μｍ、親水性ポリフッ化ビニリデン製）を使用した。また、送液の制御のために高砂電気工業株式会社製ピンチ弁ＰＳＫ−１０１５ＮＣを設置した。５％炭酸ガスの送風のため、ＳＵＮＯＮ製軸流ファンを設置した。傾斜角度調節部には、ＳＭＣ株式会社製エアシリンダーを用いた。
［細胞培養装置での多能性幹細胞の培養］
第２の容器に細胞培養基材より上の液面の高さが４ｍｍになるように培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社製）を加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を６５０個／ｃｍ２、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（株式会社ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度、Ｙ−２７６３２（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）を１０μＭの濃度でそれぞれ加えることで、細胞を播種した。第１及び第２の温度調節部の温度を３７℃に設定し、５％炭酸ガス下で培養を行った。また、第１の容器にＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎを入れ、第３の温度調節部を４℃に設定して培地を保管した。細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間経過した際に、第２の容器の培地を第３の容器へ送液した後、第１の容器から第５の容器を経由して第２の容器に新しい培地を送液することで培地交換を行った。この際、第５の容器で一度培地を静置することで、４℃で保管されている培地を３７℃に予熱してから、第２の容器へ送液した。
【００６７】
細胞播種から１６８時間経過した後、第１及び第２の温度調節部の温度を１５℃に変更することで、細胞培養基材から細胞を剥離した。細胞は細胞培養基材から剥離し、ヒトｉＰＳ細胞を回収することができた。また、フローサイトメーターで測定したヒトｉＰＳ細胞の純度は９６％であり、画像認識による細胞の識別及びロボットによる細胞の分取を行わずとも、高い純度のヒトｉＰＳ細胞を回収することができた。
【符号の説明】
【００６８】
１  細胞培養装置
１１  第１の容器
１２  第２の容器
１３  第３の容器
１４  第４の容器
１５  第５の容器
２１  第１の送液機構
２２  第２の送液機構
２３  第３の送液機構
３１  第１の送液管
３２  第２の送液管
３３  第３の送液管
４１  第１の温度調節部
４２  第２の温度調節部
４３  第３の温度調節部
５０  傾斜角度調節部
１００  温度応答性の細胞培養基材
【図１】
2020130052.tif 000003
【図２】
2020130052.tif 000004