(57)【要約】【課題】組換えタンパク質を可溶性タンパク質として発現する方法を提供する。【解決手段】目的タンパク質をβ-グルクロニダーゼとの融合タンパク質として発現させることを含む、例えば、目的タンパク質をコードする塩基配列とβ-グルクロニダーゼをコードする塩基配列とを含む遺伝子を含む発現ベクターを導入した大腸菌を培養することを含むタンパク質の発現方法、およびβ-グルクロニダーゼをコードする塩基配列、上記塩基配列の上流に機能的に連結されたプロモータ、および上記塩基配列の直下流のクローニングサイトを有する、タンパク質を可溶化発現するためのベクター。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をβ-グルクロニダーゼとの融合タンパク質として発現させることを含む、タンパク質の発現方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質において、β-グルクロニダーゼが目的タンパク質のＮ末端側にある請求項１に記載のタンパク質の発現方法。
【請求項３】
目的タンパク質をコードする塩基配列とβ-グルクロニダーゼをコードする塩基配列とを含む遺伝子を含む発現ベクターを導入した大腸菌を培養することを含む請求項１または２に記載のタンパク質の発現方法。
【請求項４】
β-グルクロニダーゼが、配列表の配列番号１のアミノ酸配列、または配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の発現方法。
【請求項５】
β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列が配列表の配列番号２で表される塩基配列であるかまたは、配列表の配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってかつＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である請求項４に記載のタンパク質の発現方法。
【請求項６】
前記目的タンパク質が酵素またはレクチンである請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質の発現方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質の発現方法を用いたタンパク質の製造方法。
【請求項８】
β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列、前記塩基配列の上流に機能的に連結されたプロモータ、および前記塩基配列の直下流のクローニングサイトを有する、タンパク質を可溶化発現するためのベクター。
【請求項９】
前記塩基配列の直上流にＨｉｓタグ対応塩基配列を有する請求項８に記載のタンパク質を可溶化発現するためのベクター。
【請求項１０】
配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼと硫酸基転移酵素との融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列表の配列番号１１で表される塩基配列からなる請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項１５】
配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼとレクチンとの融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１５に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１７】
配列表の配列番号１９で表される塩基配列からなる請求項１６に記載の遺伝子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の発現方法およびタンパク質発現用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の発現において、発現した組換えタンパク質が不溶性画分に凝集してしまうことがある。例えば封入体などの不溶化状態では組換えタンパク質の本来の機能は得られないため、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として回収するために、形質転換体の培養温度や培養時間などの検討が行われる。それでも可溶化しない組換えタンパク質については可溶性の高いタンパク質をタグとして融合させて発現することが知られている。このようなタグタンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が用いられており、このようなタンパク質を搭載したプラスミドベクターも市販されている。また、特定のベクターを用いて形質転換体を低温で培養するコールドショック発現系も知られている。しかし、このような方法を用いても可溶化しないタンパク質が依然として存在し、組換えタンパク質を所望の機能を示す可溶性タンパク質として得るための研究が続けられている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１６／２０４１９８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として発現する方法を提供することである。すなわち、本発明は可溶性組換えタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題の解決のための検討の過程で、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても、またコールドショック発現系を用いても、可溶化しない不溶性の組換えタンパク質を可溶化できるタグタンパク質を見出し、得られた知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は下記の［１］〜［１４］を提供するものである。
［１］目的タンパク質をβ-グルクロニダーゼとの融合タンパク質として発現させることを含む、タンパク質の発現方法。
［２］上記融合タンパク質において、β-グルクロニダーゼが目的タンパク質のＮ末端側にある［１］に記載のタンパク質の発現方法。
［３］目的タンパク質をコードする塩基配列とβ-グルクロニダーゼをコードする塩基配列とを含む遺伝子を含む発現ベクターを導入した大腸菌を培養することを含む［１］または［２］に記載のタンパク質の発現方法。
［４］β-グルクロニダーゼが、配列表の配列番号１のアミノ酸配列、または配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法。
［５］β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列が配列表の配列番号２で表される塩基配列であるかまたは、配列表の配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってかつＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である［４］に記載のタンパク質の発現方法。
【０００７】
［６］上記目的タンパク質が酵素またはレクチンである［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法を用いたタンパク質の製造方法。
［８］β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列、上記塩基配列の上流に機能的に連結されたプロモータ、および上記塩基配列の直下流のクローニングサイトを有する、タンパク質を可溶化発現するためのベクター。
［９］上記塩基配列の直上流にＨｉｓタグ対応塩基配列を有する［８］に記載のタンパク質を可溶化発現するためのベクター。
［１０］配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼと硫酸基転移酵素との融合タンパク質。
［１１］［１０］に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［１２］配列表の配列番号１１で表される塩基配列からなる［１１］に記載の遺伝子。
［１３］［１１］または［１２］に記載の遺伝子を含むベクター。
［１４］［１３］に記載のベクターを含む形質転換体。
［１５］配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼとレクチンとの融合タンパク質。
［１６］［１５］に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［１７］配列表の配列番号１９で表される塩基配列からなる［１６］に記載の遺伝子。
［１８］［１６］または［１７］に記載の遺伝子を含むベクター。
［１９］［１８］に記載のベクターを含む形質転換体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として発現することのできる新規のタンパク質発現方法が提供される。本発明の発現方法により、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として得ることができる。さらに本発明により、上記の方法に用いることができるタンパク質を可溶化発現するためのベクターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】発現タンパク質の電気泳動の結果を示す図である。５はpET300-GUS-SbLGS1、４はpET300-SbLGS1、Ｍはサイズマーカーである。矢印が発現したタンパク質を示す。
【図２】可溶性発現タンパク質の精製物の電気泳動の結果を示す図である。５はpET300-GUS-SbLGS1、６はpET300-GUS、Ｍはサイズマーカーである。矢印が発現したタンパク質を示す。
【図３】pET300-GUS-SbLGS1を用いて得られた組換えGUS-SbLGS1タンパク質、基質、および硫酸供与体の反応生成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果を示す図である。
【図４】pET300-GUSを用いて得られた組換えＧＵＳタンパク質、基質、および硫酸供与体の反応生成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果を示す図である。
【図５】pET300-GUS-SbLGS1を用いて得られた組換えGUS-SbLGS1タンパク質、および基質の反応生成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果を示す図である。
【図６】4はpET300-SbLGS1により、5はpET300-GUS-SbLGS1により形質転換した大腸菌を培養したＬＢプレートの写真である。
【図７】発現タンパク質の電気泳動の結果を示す図である。６はpET300-GUS、９はpET300-GUS-CmRLec、Ｍはサイズマーカーである。矢印が発現したタンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者らは、実施例に示すように、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても可溶化しない不溶性の組換えタンパク質が、β−グルクロニダーゼ（以下、「ＧＵＳ」ということがある。）との融合タンパク質として発現させることによって可溶性のタンパク質として得られることを見出した。そして、この融合タンパク質において目的のタンパク質の活性が維持されていることを見出した。
可溶性のタンパク質とは、例えば形質転換体の細胞を破砕し、10,000×g程度で遠心分離したときの上清（可溶性画分）の中に得られるタンパク質であり、その沈殿物として得られる不溶性のタンパク質と比較して、目的タンパク質の所望の活性や本来の立体構造を維持した状態で得られるタンパク質である。
【００１１】
［ＧＵＳ］
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は、β−グルクロニドを加水分解しＤ−グルクロン酸を生成する約６８ｋＤａの酵素であり、大腸菌の他、動物細胞で認められる。ＧＵＳは、ＧＵＳ活性が認められない植物において、プロモータ配列に繋いで遺伝子発現を調べるレポーター遺伝子等として広く使われており、X-Gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)を基質としてインディゴ色素が生成することにより検出される。ＧＵＳは大腸菌において安定的に発現するため、組換えタンパク質発現系においてポシティブコントロールとして用いられることもある。
【００１２】
本発明の方法においてタグタンパク質として用いるＧＵＳとしては、特に限定されないが、大腸菌のＧＵＳであることが好ましい。ＧＵＳとしては具体的には、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ、β-グルクロニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることができる。
【００１３】
［目的タンパク質］
本発明の方法において可溶化される目的タンパク質は特に限定されず、酵素、抗体、サイトカイン、ホルモン、受容体、繊維状タンパク質などが挙げられる。酵素としては、硫酸基転移酵素などを挙げることができる。硫酸基転移酵素は古細菌以外のほとんどの生物が持っており、3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate（PAPS）のスルホニル基を基質（タンパク質、ペプチドや低分子化合物）の水酸基やアミノ基に転移させる反応を触媒する酵素である。また、目的タンパク質はレクチンであってもよい。レクチンは動物、植物、菌類が持っており、細胞膜上の糖鎖や糖タンパク質に結合活性を有するタンパク質である。目的タンパク質は、医薬や食品用途で製造されるものであってもよく、タンパク質の構造や機能解析などの研究目的で製造されるものであってもよい。
【００１４】
［ＧＵＳをコードする塩基配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子（融合タンパク質遺伝子）］
ＧＵＳをコードする塩基配列としては、いずれの種由来のＧＵＳをコードする塩基配列を用いてもよいが、大腸菌のＧＵＳをコードする塩基配列を用いることが好ましい。ＧＵＳをコードする塩基配列の例としては、配列表の配列番号２で表される塩基配列、配列表の配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってかつＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列、配列表の配列番号２で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ解析で９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であってＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列などが挙げられる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００１５】
ＧＵＳをコードする塩基配列を含む遺伝子の取得方法については特に制限はないが、例えば天然型の遺伝子を大腸菌由来のｃＤＮＡライブラリーなどから取得すればよい。適当なプライマーを設計し、それらを用いて取得した遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、所望のＧＵＳをコードする遺伝子を得ることができる。または、ＧＵＳをコードする塩基配列を全合成したものを用いてもよい。
【００１６】
ＧＵＳをコードする塩基配列からなる遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）は目的タンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子（目的タンパク質遺伝子）に連結して用いられる。融合タンパク質においてＧＵＳが目的タンパク質のＮ末側になるように連結してもＣ末側になるように連結してもよいが、ＧＵＳは目的タンパク質のＮ末側にあることが好ましい。
【００１７】
ＧＵＳをコードする塩基配列と目的タンパク質をコードする塩基配列とは直接連結してもよく、他の配列を介して連結してもよいが、他の配列を介して連結することが好ましい。介在させる他の配列は、例えば６〜１２０塩基、好ましくは１５〜６０塩基ほどの特定の機能を有さない配列であればよい。一方、介在させる配列にプロテアーゼが認識し切断するアミノ酸配列をコードする塩基配列（プロテアーゼ認識配列）を含めてもよい。プロテアーゼ認識配列を含む場合、発現産物をプロテアーゼ処理することによって、目的タンパク質をＧＵＳから分離することができる。プロテアーゼ処理後の目的タンパク質の精製のために、プロテアーゼ認識配列と目的タンパク質をコードする塩基配列との間にＨｉｓタグ対応塩基配列を設けていてもよい。なお、後述するように、Ｈｉｓタグ対応塩基配列は融合タンパク質のＮ末またはＣ末側に対応する部位に設けることも好ましい。
【００１８】
遺伝子の連結は、公知の方法をいずれも用いることができるが、例えば、公知のベクターのマルチクローニングサイトなどのクローニングサイト（ＤＮＡの制限酵素部位）にＧＵＳ遺伝子および目的タンパク質遺伝子をそれぞれ所望の配置となるように挿入して、ベクターに連結する方法などをとることが好ましい。また、予めＧＵＳ遺伝子が挿入されたベクターを用意し、任意の目的タンパク質遺伝子と連結させることができる。
【００１９】
［ベクター］
ベクターの種類は特に限定されず、宿主中で複製可能なものが適宜選択される。ベクターとしては、プラスミドベクターを用いることが好ましい。
【００２０】
ベクターは、融合タンパク質遺伝子の挿入部位の上流にプロモータが機能的に連結された発現ベクターであることが好ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモータは宿主で作動可能なプロモータであれば特に限定されず、例えば大腸菌を宿主として用いる場合、Ｔ７プロモータ、ｃｓｐプロモータ、Ｔ３プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、またはｔａｃプロモータ、などを用いることができる。プロモータおよび上記挿入部位の間にはリボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）が含まれていることが好ましい。
【００２１】
ベクターはターミネータを含むことが好ましい。ベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列などを有していてもよい。その他、スプライシングシグナルなどを含むように調製することもできる。ベクターは宿主内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよい。
【００２２】
ベクターはさらに選択マーカーを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えば、カルベニシリン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンＢのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
ベクターが、融合タンパク質遺伝子挿入部位の直上流または直下流部位にＨｉｓタグなどの精製用タグ対応塩基配列を有していてもよい。このようなベクターを用いることにより発現した融合タンパク質については、精製用タグを利用した発現タンパク質のアフィニティー精製を行うことができる。
【００２４】
プラスミドとしては、市販のプラスミドを用いてもよく、全合成してもよい。市販のプラスミドの例としては、pET21a、pET300、pDEST、pET39b、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）, pUC118、pUC119, pColdI（いずれもタカラバイオ社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）などが挙げられる。
【００２５】
実施例で示すように、まず市販のエントリーベクターを用いて、ＧＵＳ遺伝子および目的タンパク質遺伝子を連結させたエントリークローンを作製し、次いでデスティネーションベクターと組換え反応を行って発現ベクターを作製してもよい。
【００２６】
［可溶化発現用ベクター］
上述のように、予めＧＵＳ遺伝子が挿入されたベクターは、任意の目的タンパク質を可溶化発現するためのベクターとして用いることができる。本明細書において、「可溶化発現」とは、タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることを意味する。具体的には、可溶化発現用ベクターは、ＧＵＳ遺伝子、該ＧＵＳ遺伝子の上流に機能的に連結されたプロモータ、および上記ＧＵＳ遺伝子の直下流もしくは直上流のマルチクローニングサイトなどのクローニングサイトを有するベクターであり、これを用いて、任意の目的タンパク質が導入された発現ベクターを作製することができる。可溶化発現用ベクターはさらに上述のように、リボソーム結合配列、精製用タグ対応塩基配列やプロテアーゼ認識配列を有していることが好ましい。例えば、可溶化発現用ベクターは、ＧＵＳ遺伝子の直上流であって、プロモータの下流にＨｉｓタグ対応配列を有するものであってもよい。可溶化発現用ベクターは上記のベクターの項目で説明した追加の要素を含んでいてもよい、
【００２７】
［形質転換体］
発現ベクターを宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌細胞、および昆虫、植物、または動物の細胞などの真核細胞等が挙げられ、大腸菌が好ましい。
【００２８】
得られた形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
【００２９】
本発明の方法により、目的タンパク質は、ＧＵＳと結合した融合タンパク質として発現し、その少なくとも一部が、細胞内に溶解状態で得られる。溶解状態のタンパク質は、例えば、以下の手順で回収、精製することができる。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、可溶性である目的の融合タンパク質を得ることができる。この上清について通常のタンパク質の単離精製法を行えばよい。単離精製法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法が挙げられる。これらは、単独で行っても組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
アフィニティークロマトグラフィー法はタグタンパク質であるＧＵＳに特異的に結合する抗体などを用いて行ってもよい。また、Ｈｉｓタグなどの精製用タグを有するように発現したタンパク質はこれを利用して精製を行うことができる。
【００３１】
また、実施例で示すように、本発明者らは、ＧＵＳと結合した融合タンパク質においても、X-Glucの存在下での呈色があることを見出した。すなわち、融合タンパク質も、β−グルクロニドを加水分解しＤ−グルクロン酸を生成するβ-グルクロニダーゼ活性を示すことを見いだした。したがって、本発明の方法は、上記の呈色を利用して目的タンパク質の発現クローンの選抜を行うことができるという利点がある。
【００３２】
得られたＧＵＳが融合している目的タンパク質は、ＧＵＳが目的タンパク質の用途や機能に影響しないものである場合は、そのまま融合タンパク質として使用することができる。例えば、後述の実施例で示すように、目的タンパク質が硫酸基転移酵素である例では、ＧＵＳ融合タンパク質においても目的タンパク質の酵素活性を有しており、このまま酵素として用いることも可能である。
ＧＵＳと目的タンパク質との間にプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質については、その配列を認識するプロテアーゼを作用させて目的タンパク質とＧＵＳを分離してもよい。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の趣旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
＜＜ＧＵＳと硫酸基転移酵素との融合タンパク質＞＞
＜発現ベクターの構築＞
配列表の配列番号２のＧＵＳの塩基配列からストップコドンのみを除いたＯＲＦ配列を以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅した。
ＧＵＳのＰＣＲプライマー
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCCATGGTCCGTCCTGTAGAAAC（配列表の配列番号３）
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGCTTGTTTGCCTCCCTGCTG（配列表の配列番号４）
（下線はインフュージョン反応のためのベクター配列）
【００３５】
イネ科植物ソルガム（Sorghum bicolor）の硫酸基転移酵素（配列表の配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質）は細胞質局在の可溶性タンパク質であるが、本発明者らの検討において、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても、また、コールドショック発現系を用いても、可溶化しなかったタンパク質である。このタンパク質の遺伝子のSbLGS1のＯＲＦ配列（配列表の配列番号６）を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
SbLGS1のＰＣＲプライマー
SbLGS1-F4: CACCATGAACGTACAGGAGAGGAG（配列表の配列番号７）
SbLGS1-R2: TTACACGGATATGGAGTCGGCAAAG（配列表の配列番号８）
【００３６】
上記ＰＣＲ増幅産物をインビトロジェン社のエントリーベクターpENTR/D-TOPO（登録商標）（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020）のクローニングサイトに、メーカーのプロトコルにしたがって挿入し、プラスミド１（pENTR-SbLGS1）を得た。
【００３７】
プラスミド１（pENTR-SbLGS1）をクローニングサイト上流の制限酵素部位NotIで切断した。上記のＧＵＳのＰＣＲ増幅産物をプラスミド１のNotI切断部位にインフュージョン反応により挿入し、プラスミド２（pENTR-GUS-SbLGS1）を得た。
【００３８】
インビトロジェン社のGateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mix（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019）を用い、メーカーのプロトコルにしたがって、プラスミド１（pENTR-SbLGS1）およびプラスミド２（pENTR-GUS-SbLGS1）それぞれのattL領域をデスティネーションベクターpET300/NT-DEST（インビトロジェン社：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001）のattB領域（上流にＨｉｓタグ配列を含む）に組み換えるＬＲ組換え反応を行い、プラスミド４（pET300-SbLGS1）およびプラスミド５（pET300-GUS-SbLGS1）を得た。Gateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mixに付属しているポシティブコントロールであるpENTR-GUS（プラスミド３）についても同様にＬＲ組換え反応を行い、プラスミド６（pET300-GUS）を得た。なお、プラスミド４〜６の塩基配列を確認したところ、発現遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号９、１１、１３であった。また、形質転換大腸菌で発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１０、１２、１４のアミノ酸配列となる。
【００３９】
＜タンパク質発現＞
プラスミド４，５，６をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）（http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen,EMD_BIO-71403）に導入した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地１５０ｍＬ（抗生物質カルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含む）に入れ、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。２５℃で３０分間培養したのち、IPTG（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）を０．１ｍＭになるように加えてタンパク質の発現を誘導した。２５℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が２．５〜３．０になるまで培養した。８，０００×ｇ、５分間の遠心により大腸菌を回収して、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５ｍＬで懸濁した。超音波で大腸菌を破砕した後、懸濁液を４℃、２０，４００×ｇ、５分間の遠心にかけ、上清（可溶性画分）とペレット（不溶性画分）に分けた。不溶性画分は８Ｍ尿素１．５ｍＬで溶解した。
【００４０】
プラスミド４，５それぞれを用いて得られた上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図１に示す。
図１に示す結果から、ＧＵＳをタグにすることによりSbLGS1の可溶化発現が促進されていることがわかる。
【００４１】
プラスミド５，６それぞれを用いて得られた上清（可溶性画分）につき、アフィニティーカラムHis GraviTrap（GEヘルスケア社）（https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1129.html）を用いてＨｉｓタグ精製を行い、３ｍＬで溶出した。得られた溶出物それぞれの６μＬおよび１２μＬと未精製の上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬについて同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図２に示す。図２に示す結果から、融合蛋白質（GUS-SbLGS1）の回収率はＧＵＳのみを発現させたものに比べて低いが、Ｎ末に付加したＨｉｓタグによりアフィニティーカラム精製も可能であることがわかる。
【００４２】
＜酵素活性実験＞
pET300-GUS-SbLGS1（プラスミド５）を用いて得られた組換えタンパク質（GUS-SbLGS1タンパク質）について、SbLGS1の酵素活性の有無を調べた。Ｈｉｓタグ精製して得られた上記溶出物２００μＬに以下の溶液を加え、２８℃で１時間放置した。
・５００μＭ  硫酸供与体3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate（ＰＡＰＳ）６μＬ
・１００ｎｇ／μＬ  基質rac-18-hydroxycarlactonoic acid（１８−ＨＯ−ＣＬＡ）１μＬ
【００４３】
放置後の溶液を酢酸エチル２００μＬで３回抽出した。抽出液に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、ろ過して硫酸ナトリウムを除いた。ろ過液に、窒素を吹きつけて濃縮した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（QTRAP5500、AB Sciex社）を用いて分析した。結果を図３に示す。比較として、pET300-GUS（プラスミド６）を用いて得られた組換えタンパク質を用いて同様の反応および分析を行った結果を図４、GUS-SbLGS1タンパク質を用い、基質のみを加え硫酸供与体を加えずに、同様の反応および分析を行った結果を図５に示す。
【００４４】
図３〜５において、ＴＩＣは選択した総イオン、１８−ＨＯ−ＣＬＡは基質、１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０は推定代謝物である１８−ＨＯ−ＣＬＡの硫酸エステル、４ＤＯ／５ＤＳ: 推定代謝物である4-deoxyorobanchol/5-deoxystrigolを示す。矢印は基質１８−ＨＯ−ＣＬＡのピークを示し、４ＤＯ／５ＤＳにおいてアステリスクは代謝物のピークではない。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析はＭＲＭ法（多重反応検出法）で行い、検出イオン（プリカーサー；プロダクト）は、１８−ＨＯ−ＣＬＡ（３４７；１１３，６９）、１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０（４２７；１１３，６９）、４ＤＯ／５ＤＳ（３３１；２３４，２１６，９７）である。
【００４５】
図４、５において顕著な１８−ＨＯ−ＣＬＡのピークは図３においては確認できず、GUS-SbLGS1タンパク質、基質および硫酸供与体を混合して反応させた例のみにおいて、酵素によるrac-18-hydroxycarlactonoic acid（１８−ＨＯ−ＣＬＡ）からの産物として4-deoxyorobanchol（４ＤＯ）および5-deoxystrigol（５ＤＳ）のピークが現れている。なお、以下に示すように１８−ＨＯ−ＣＬＡに硫酸基が付加した18-HO-CLA sulfate(１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０）は不安定なため速やかに４ＤＯおよび５ＤＳに変換する。
得られた結果から、GUS-SbLGS1タンパク質は酵素機能を有しており、硫酸供与体ＰＡＰＳ依存的に１８−ＨＯ−ＣＬＡから４ＤＯと５ＤＳを生成していることがわかる。
【００４６】
【化１】
2020130167.tif 000003
【００４７】
＜ＧＵＳ融合タンパク質発現クローンの検出＞
プラスミド４，５をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）に導入した。ＬＢプレート（１．５％寒天）にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬ、IPTGを０．１ｍＭ、X-Glucを１００μｇ／ｍＬになるように加えた。そのＬＢプレートに形質転換した大腸菌を広げ、３７℃で１６時間培養した。結果を図６に示す。図６において、５はpET300-GUS-SbLGS1（プラスミド５）を用いて培養したものであり、４はpET300-SbLGS1（プラスミド４）を用いて培養したものである。５においてコロニーに青色の呈色が観測された。
【００４８】
上記のように、融合タンパク質を発現したコロニーにおいて呈色があり、融合タンパク質がＧＵＳ酵素活性を有していることが確認された。本発明の方法においてタグタンパク質として用いるＧＵＳはストップコドンを除いただけであるためと考えられる。このように、ＧＵＳ融合タンパク質を発現するプラスミドを形質転換した大腸菌はX-Gluc存在下で青色に呈色したことから、発現クローンの選抜を行うことが可能であった。
【００４９】
＜＜ＧＵＳとレクチンとの融合タンパク質＞＞
＜発現ベクターの構築＞
配列表の配列番号２のＧＵＳの塩基配列からストップコドンのみを除いたＯＲＦ配列を以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅した。
ＧＵＳのＰＣＲプライマー
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCCATGGTCCGTCCTGTAGAAAC（配列表の配列番号３）
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGCTTGTTTGCCTCCCTGCTG（配列表の配列番号４）
（下線はインフュージョン反応のためのベクター配列）
【００５０】
菌類のサナギタケ（Cordyceps militaris）のレクチン（配列表の配列番号１５のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本発明者らの検討において、コールドショック発現系や可溶化が期待される大腸菌を用いても、可溶化しなかったタンパク質である。このタンパク質の遺伝子のCmRLecのＯＲＦ配列（配列表の配列番号１６）を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
CmRLecのＰＣＲプライマー
pENTR_RLec_fw: CACCATGGCCGGCACGCACTTTCTCAACCACAC（配列表の配列番号１７）
CM41A.3544_RLec_rv: TCAACTATAGCACCCCTCAATCGCAG（配列表の配列番号１８）
【００５１】
上記ＰＣＲ増幅産物をインビトロジェン社のエントリーベクターpENTR/D-TOPO（登録商標）（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020）のクローニングサイトに、メーカーのプロトコルにしたがって挿入し、プラスミド７（pENTR-CmRLec）を得た。
【００５２】
プラスミド７（pENTR-CmRLec）をクローニングサイト上流の制限酵素部位NotIで切断した。上記のＧＵＳのＰＣＲ増幅産物をプラスミド７のNotI切断部位にインフュージョン反応により挿入し、プラスミド８（pENTR-GUS-CmRLec）を得た。
【００５３】
インビトロジェン社のGateway（登録商標） LR Clonase（登録商標） Enzyme Mix（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019）を用い、メーカーのプロトコルにしたがって、プラスミド８（pENTR-GUS-CmRLec）のattL領域をデスティネーションベクターpET300/NT-DEST（インビトロジェン社：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001）のattB領域（上流にＨｉｓタグ配列を含む）に組み換えるＬＲ組換え反応を行い、プラスミド９（pET300-GUS-CmRLec）を得た。Gateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mixに付属しているポシティブコントロールであるpENTR-GUS（プラスミド３）についても同様にＬＲ組換え反応を行い、プラスミド６（pET300-GUS）を得た。なお、プラスミド６、９の塩基配列を確認したところ、発現遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１３、１９であった。また、形質転換大腸菌で発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１４、２０のアミノ酸配列となる。
【００５４】
＜タンパク質発現＞
プラスミド６、９をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）（http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen,EMD_BIO-71403）に導入した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地１５０ｍＬ（抗生物質カルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含む）に入れ、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。２５℃で３０分間培養したのち、IPTGを０．１ｍＭになるように加えてタンパク質の発現を誘導した。２５℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が２．５〜３．０になるまで培養した。８，０００×ｇ、５分間の遠心により大腸菌を回収して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５ｍＬで懸濁した。超音波で大腸菌を破砕した後、懸濁液を４℃、２０，４００×ｇ、５分間の遠心にかけ、上清（可溶性画分）とペレット（不溶性画分）に分けた。不溶性画分は８Ｍ尿素１．５ｍＬで溶解した。
【００５５】
プラスミド６，９それぞれを用いて得られた上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図７に示す。
図７に示す結果から、ＧＵＳをタグにすることによりCmRLecが可溶性画分に発現していることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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