(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療における、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のネオアジュバント使用のための改善された方法及び組成物の提供。【解決手段】ＡＤＣはアントラサイクリンまたはカンプトテシンを含み、より好ましくは、ＳＮ−３８またはプロ−２−ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）を含む。ＡＤＣは、外科手術、放射線療法、化学療法、または免疫療法などの標準的な抗癌治療を用いる処置の前に、ネオアジュバントとして投与される。ＡＤＣのネオアジュバント使用は、標準的な抗癌治療の有効性を実質的に改善し、原発腫瘍を減量させ得るかまたは微小転移を除去し得る。最も好ましい実施形態では、ネオアジュバントＡＤＣは標準的な抗癌治療と併用されて、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）などの標準処置に耐性を示す癌の処置に成功する。【選択図】図１
2020105187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌のネオアジュバント処置のための方法であって、
ａ）抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、癌を有する対象に投与すること、ここで前記薬物は、アントラサイクリン及びカンプトテシンからなる群より選択される；及び
ｂ）外科手術、放射線療法、化学療法、及び免疫療法からなる群より選択される標準的な抗癌治療で前記対象を処置することを含み、前記ＡＤＣが、前記標準的な抗癌治療の前に投与される、前記方法。
【請求項２】
前記カンプトテシンが、ＳＮ−３８である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アントラサイクリンが、プロ−２−ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＤＣが、抗体、抗原結合性抗体断片、及び標的化ペプチドからなる群より選択される抗体部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体部分が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−ＭＥＴ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯ−β、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＬＩＶ−１、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、Ｄ−ＤＴ（Ｄ−ドパクロムトートメラーゼ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１６、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び発がん遺伝子産物からなる群より選択される腫瘍関連抗原に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体部分が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ−３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（エプラツズマブ、抗ＣＤ２２）、ｈＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＬ２４３  ＩｇＧ４Ｐ（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ａｂ１２４（抗ＣＸＣＲ４）及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４）からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖ断片からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合性抗体断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群より選択されるヒト定常領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、Ｇ１ｍ３重鎖アロタイプを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ｎＧ１ｍ１、２重鎖ヌルアロタイプを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、Ｋｍ３軽鎖アロタイプを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｐ２ＰＤｏｘが、ＳＭＣＣヒドラジド、アミノキシ、フェニルヒドラジド及び４−（ヒドラジノスルホニル）安息香酸からなる群より選択される架橋剤により前記抗体、抗体断片またはペプチドに付着する、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｐ２ＰＤｏｘが、マレイミド部分を含み、前記マレイミドとシステイン残基の反応により前記抗体、抗体断片またはペプチドに付着する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｐ２ＰＤｏｘが、前記抗体または抗原結合性抗体断片と分子内架橋を形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子内架橋が、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記コンジュゲートを安定化し、循環中への遊離薬物の放出を防止する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＤＣが、前記薬物を前記抗体に付着させるリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物がＳＮ−３８であり、前記リンカーがＣＬ２Ａである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療剤が、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、チロシンキナーゼ阻害剤、スフィンゴシン阻害剤、免疫調節剤、サイトカイン、ホルモン、二次抗体、二次抗体断片、イムノコンジュゲート、放射性核種、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤及び細胞毒性薬剤からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬物が、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスフェート、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、オラパリブ、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記毒素が、抗体または抗原結合性抗体断片に付着し、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記放射性核種が、抗体または抗原結合性抗体断片に付着し、１１１Ｉｎ、１１１Ａｔ、１７７Ｌｕ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１５２Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６１Ｈｏ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、５８Ｃｏ、８０ｍＢｒ、９９ｍＴｃ、１０３ｍＲｈ、１０９Ｐｔ、１１９Ｓｂ、１８９ｍＯｓ、１９２Ｉｒ２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２２１Ｆｒ、２５５Ｆｍ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２４Ａｃ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、２２７Ｔｈ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔ１、７６Ｂｒ及び１６９Ｙｂからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫調節剤が、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイトカインが、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝臓増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導性因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びリンホトキシンからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ及びＩＰ−１０からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗血管新生剤が、ＭＩＦ、Ｄ−ＤＴ及びＨＭＧＢ−１からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、固形腫瘍または造血性癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、ホジキン病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、結腸癌、胃癌、食道癌、甲状腺髄様癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、肝臓癌、皮膚癌、骨癌、脳癌、直腸癌、及び黒色腫からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫が、Ｂ細胞リンパ腫の緩徐進行型形態、Ｂ細胞リンパ腫の侵襲性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、毛髪様細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、転移性結腸癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性腎細胞癌腫、転移性胃癌、転移性前立腺癌、及び転移性小細胞肺癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、他の治療法に不応性であるが、ネオアジュバントＡＤＣを用いる治療には応答する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が、前記ネオアジュバントＡＤＣを用いる処置の前に、少なくとも１つの他の治療への応答に失敗している、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その文章全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年１０月７日に出願された仮米国特許出願第６２／０６０，８５８号の合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ウェブを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されている配列表を含み、同配列表はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年９月２３日に作製され、名称はＩＭＭ３５０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２３，２２６バイトである。
【０００３】
本発明は、ネオアジュバント療法におけるイムノコンジュゲートの使用に関する。好ましくは、イムノコンジュゲートは、抗体部分及びカンプトテシンまたはアントラサイクリン群の薬物から選択された薬物部分を含む。より好ましくは、抗体部分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。最も好ましくは、カンプトテシンはＳＮ−３８であるか、またはアントラサイクリンは２−ピロリノドキソルビシンのプロドラッグ形態（本明細書ではＰ２ＰＤｏｘと称する）である。抗体及び薬物部分は、治療有効性を増加させる細胞内で切断可能な結合を介して連結され得る。好ましくは、抗体部分と薬物部分を接合するリンカーは、ＣＬ２Ａであり、それは下記に示す通りである。特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、最適な有効性及び最小限の毒性を提供する特定の投与量及び／または投与計画で投与され得、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、転移性結腸癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性腎細胞癌腫、転移性胃癌、転移性前立腺癌、または転移性小細胞肺癌などの標準的な抗癌治療に耐性である癌の有効な処置を可能にする。好ましい実施形態は、ＴＮＢＣにおけるネオアジュバント使用に関する。ネオアジュバントイムノコンジュゲートは、外科手術、放射線療法、化学療法、または免疫療法などの標準的な抗癌治療の前に投与される。
【背景技術】
【０００４】
ネオアジュバント薬剤は、外科手術または放射線療法などの一次療法を用いる処置の前に患者に投与される（例えば、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ−Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙを参照されたい）。ネオアジュバント癌療法は、一次療法の前に患者の腫瘍（複数可）のサイズまたは程度を低下させることを目的とし、好ましくは、ネオアジュバント療法の不在下で必要とされ得るより広範囲にわたる処置の転帰の成否を改善する及び／または有害効果を低減させる（同書）。ネオアジュバント処置は、一次療法により影響されない可能性がある微小転移も標的とし得る（同書）。近年、ネオアジュバント療法は、新規化学療法をより迅速に検査する手段としての役割を増しており、それはネオアジュバント療法に対する応答が、迅速に比較的少数の患者で評価することができ、長期転帰を予測することができるからである（Ｒａｓｔａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：７７８−８５；Ｂａｒｄｉａ＆Ｂａｓｅｌｇａ，２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：６３６０−７０）。実際、ネオアジュバント試験からのエビデンスは、外科手術での病理学的完全奏効（ｐＣＲ）（すなわち、乳房及び腋窩における残存疾患がない）の決定が、２サイクルのネオアジュバント化学療法後でさえも長期臨床奏効を予測するということを示している。（Ｒａｓｔａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：７７８−８５；ｖｏｎ  Ｍｉｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３０：１７９６−１８０４；Ｈｕｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １２４：１３３−４０）。
【０００５】
癌におけるネオアジュバント処置の歴史は広範である。この分野における初期の研究の大部分は、外科的切除または放射線療法の前のネオアジュバント化学療法の使用に関連していた。Ｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４，Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  １１０：２４１−５）は、外科手術＋放射線療法または高用量単独放射線療法の前の、シスプラチン、ブレオマイシン及びメトトレキセートを用いた進行頭頸部癌のネオアジュバント化学療法を報告した。特にネオアジュバント療法が実質的な腫瘍減少をもたらした場合には、転帰においていくらか改善は見られたが、疾患の再発が一般的であった（Ｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４）。ネオアジュバント化学療法及び／または放射線療法は、骨形成肉腫（Ｒｏｓｅｎ＆Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ，１９８５，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１：３９−５１）、乳癌（Ｒａｇａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１：７７−８７）、食道癌（Ｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｅｍｉｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２：１７０−６）、肛門及び直腸癌（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ１５１：５７７−８０）、肺癌（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ７０：１２１９−２０）及び多くの他の形態の癌においても報告されている。ネオアジュバント療法を用いて転帰の改善がしばしば報告されているが、ネオアジュバント化学療法及び／または放射線療法が癌における長期患者生存率を改善する程度は、概して、まだ前向き研究によって確かめられていない（例えば、Ｂｉｔｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ  ２０１４：１８３８５２；Ｄｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  １１１：６２９−３１を参照されたい）。
【０００６】
近年、抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のネオアジュバント使用が乳癌において試みられている。ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）が研究されており、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌のネオアジュバント処置においてトラスツズマブ及びドセタキセルとの併用においてＦＤＡの承認を受けた（Ｓａｂａｔｉｅｒ＆Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，２０１４，Ｂｕｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １０１：７６５−７１；Ｅｓｓｅｒｍａｎ＆ＤｅＭｉｃｈｅｌｅ，２０１４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：３６３２−３６）。Ａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）は、強力な微小管阻害剤エムタンシンにコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体を含み、以前の治療に失敗した患者のためのＨＥＲ２陽性転移性乳癌における使用に対して承認されており、ネオアジュバント使用について研究されている（Ｃｏｒｒｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ［印刷物に先駆けたオンライン出版、２０１４年７月３１日］）。
【０００７】
これらの結果は有望であるが、抗ＨＥＲ２抗体は、例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＨＥＲ２の発現を欠くトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）においてほとんど使用されていない（例えば、Ｇｏｇｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５１：１６３−６）。ＴＮＢＣは、乳癌の約１０〜２０％を占め、この疾患の他の形態よりも、より侵攻性であり致死性であり、全身治療にもかかわらず、転移性ＴＮＢＣを有する女性のほぼ全てがこの疾患で最終的に死亡する。本分野において、イムノコンジュゲートをベースとするネオアジュバント癌療法のより有効な形態が、特にＴＮＢＣなどの標準的な抗癌処置に耐性である癌の形態に対して、必要とされている。
［発明の概要］
【０００８】
本発明は、カンプトテシン（例えば、ＳＮ−３８）またはアントラサイクリン（例えば、Ｐ２ＰＤＯＸ）などの薬物の抗体コンジュゲートを使用し、これらは、カリケアマイシン、メイタンシノイドまたはＭＭＡＥのような超毒性化学療法剤のナノモル濃度未満からピコモル濃度までの毒性と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナノモル濃度の毒性を有する。超毒性ではない薬剤の使用によって、遊離薬物の放出のために細胞内部移行を必要としないが、むしろ薬物のいくらかの細胞外放出を可能にする抗体−薬物リンカーの使用が可能となる。以下に記載するＣＬ２Ａリンカーでは、コンジュゲートした薬物の５０％が２４時間内に放出され、それにより、細胞外及び細胞内の両方で該薬物を遊離させることによって、該薬物のバイオアベイラビリティを増強させる。加えて、比較的非毒性の薬物の使用によって、より高投与量のＡＤＣの投与が可能となり、これはより良好な治療効果をもたらす。
【０００９】
本発明は、カンプトテシン−抗体またはアントラサイクリン−抗体イムノコンジュゲートなどのＡＤＣを調製及び投与するためのネオアジュバント方法及び組成物を提供することにより当該分野におけるまだ満たされていない必要性を解決する。好ましくは、カンプトテシンはＳＮ−３８であるかまたはアントラサイクリンはＰ２ＰＤＯＸである。本開示の方法及び組成物は、他の形態の治療に対して不応性であるか応答が低い癌のネオアジュバント処置のために使用される。不応性の癌には、トリプルネガティブ乳癌、転移性結腸癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性腎細胞癌腫、転移性胃癌、転移性前立腺癌、または転移性小細胞肺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
抗体は、様々なアイソタイプのもの、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であることができ、より好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常領域配列を含む。抗体またはその断片は、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体もしくはその抗原結合性断片、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４−１５５７）により記載されるような半ＩｇＧ４抗体、または市販されているような単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、ベルギー、ゲント）であることができる。より好ましくは、抗体またはその断片は、特定のアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように設計または選択され得、これはイムノコンジュゲートがヒト対象に投与されるときに免疫原生の低下をもたらし得る。投与に好ましいアロタイプには、非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）、例えば、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２が含まれる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群より選択される。
【００１１】
癌のネオアジュバント処置については、腫瘍細胞により発現されるかまたは他の方法で腫瘍細胞と関連する多くの抗原が当該分野で公知であり、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺性酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ��２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、発がん遺伝子マーカー及び発がん遺伝子産物を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３−３２；Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５−７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７−２０７を参照されたい）。好ましくは、抗体は、ＡＦＰ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＡＦＰ、ＭＵＣ５ａｃ、ＰＡＭ４抗原、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＨＬＡ−ＤＲに結合する。
【００１２】
利用してよい例示的な抗体としては、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、米国特許出願第１２／７２２，６４５号、２０１０年３月１２日出願）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第５，７８９，５５４号）、ｈＲＦＢ４（抗ＣＤ２２、米国仮特許出願第６１／９４４，２９５号、２０１４年２月２５日出願）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７２号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）、が挙げられるが、これらに限定されず、引用された各特許または出願の実施例の項は参照により本明細書に組み込まれる。より好ましくは、抗体は、ＩＭＭＵ−３１（抗ＡＦＰ）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＬ２４３もしくはＩＭＭＵ−１１４（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）またはｈＡ２０（抗ＣＤ２０）である。本明細書で用いるとき、エプラツズマブとｈＬＬ２という用語は互換可能であり、同様に、ベルツズマブとｈＡ２０、及びｈＬ２４３ｇ４Ｐ、ｈＬ２４３ガンマ４ＰとＩＭＭＵ−１１４も互換可能である。
【００１３】
使用する代替的な抗体としては、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、アバゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、ベンラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ、米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、ムロモナブＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）；抗ＴＮＦ−α抗体、例えば、ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１−８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州、ロックフォード）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルべニア州、マルバーン）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ、ベルギー、ブリュッセル）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、ベルギー、ブリュッセル）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、イリノイ州、アボットパーク）、及びベリムマブ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むが、これらに限定されない。近年、ヒトヒストンＨ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４に対するヒト化抗体が開示されており（米国特許出願第１４／１８０，６４６号）、本開示の方法及び組成物において利用し得る。
【００１４】
好ましくは、抗体部分は、少なくとも１つの薬物部分、より好ましくは１〜約５つの薬物部分、あるいは約６〜１２の薬物部分に連結する。様々な実施形態では、抗体部分は、４または６つの薬物部分、または５つ以下の薬物部分に付着し得る。抗体部分あたりの薬物部分の数は、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上であってよい。
【００１５】
例示的なカンプトテシンはＣＰＴ−１１である。広範な臨床データが、ＣＰＴ−１１の薬理学及び活性ＳＮ−３８へのそのｉｎ  ｖｉｖｏ変換に関して入手可能である（Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１−４３（１９９８）；Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：２１８２−２１９４（２００２）；Ｒｉｖｏｒｙ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９２２：２０５−２１５，２０００））。活性形態ＳＮ−３８は、ＣＰＴ−１１より約２〜３桁強力である。特定の好ましい実施形態では、本イムノコンジュゲートは、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−３−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８、ｈＩＭＭＵ−３１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＲ１−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬ２４３−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＦＢ４−ＳＮ−３８、ｈＭｕ−９−ＳＮ−３８またはｈＬＬ２−ＳＮ−３８コンジュゲートであってよい。より好ましくは、ＣＬ２Ａリンカーを、ＳＮ−３８を抗体部分にコンジュゲートするために使用する。
【００１６】
例示的なアントラサイクリンは、米国特許出願第１４／１７５，０８９に開示されているＮ−（４，４−ジアセトキシブチル）ドキソルビシンなどの２−ピロリノドキソルビシンのプロドラッグ形態（Ｐ２ＰＤｏｘ）である。驚くべきことに、Ｐ２ＰＤｏｘは、抗体ペプチド鎖と架橋が形成されるために、コンジュゲート抗体に密接に結合すると見いだされている。架橋は、循環中への遊離薬物の放出からもたらされ得る、毒性、例えば心毒性の最小化を助する。好ましくは、Ｐ２ＰＤｏｘは、プロドラッグ形態の間、鎖間ジスルフィドチオール基に付着する。プロドラッグ保護は、注射の直後にｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に除去され、結果得られるコンジュゲートの２−ＰＤｏｘ部分は、抗体のペプチド鎖を架橋し、分子内架橋を抗体分子内で形成する。これは、ＡＤＣを安定化させ、かつ循環中の他の分子への架橋を防ぐ。特定の好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートは、ｈＭＮ−１４−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＭＮ−３−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＭＮ−１５−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＩＭＭＵ−３ｌ−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＲ１−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＡ２０−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＰＡＭ４−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＬ２４３−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＲＦＢ４−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＭｕ−９−Ｐ２ＰＤｏｘまたはｈＬＬ２−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートであってよい。
【００１７】
様々な実施形態は、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、毛髪様細胞白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、骨癌ならびに皮膚癌を含むがこれらに限定されない癌を処置するための主題の方法及び組成物の使用に関し得る。癌腫には、口腔、食道、消化管、気道、肺、胃、結腸、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膀胱、膵臓、骨、脳、結合組織、肝臓、胆嚢、膀胱、腎臓、皮膚、中枢神経系及び精巣の癌腫が含まれ得る。
【００１８】
ある特定の実施形態では、薬物コンジュゲートは、外科手術、放射線療法、化学療法、裸抗体を用いる免疫療法、放射線免疫療法、免疫調節剤等を用いる処置の前にネオアジュバントとして使用され得る。これらのネオアジュバント療法は、与えられる各治療剤のより低い用量を可能にすることができ、ゆえにある特定の重度副作用を減らすか、または外科手術などの他の処置の有効性を改善することができる。
【００１９】
イムノコンジュゲートの好ましい最適投与量は、３ｍｇ／ｋｇから１８ｍｇ／ｋｇの間の投与量を含み得、好ましくは、週１回、週２回、隔週または３週間に１回のいずれかで与えられ得る。最適な投薬スケジュールには、２週連続の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休薬の処置サイクル、または治療及び休薬を週替わりで行う処置サイクル、または１週間の治療の後に２、３もしくは４週間の休薬の処置サイクル、または３週間の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休薬の処置サイクル、または４週間の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休薬の処置サイクル、または５週間の治療の後に１、２、３、４もしくは５週間の休薬の処置サイクル、または２週間に１回、３週間に１回もしくは１カ月に１回の投与の処置サイクルを含み得る。処置は任意のサイクル数、好ましくは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６サイクルに延長してよい。投与量は、最大で２４ｍｇ／ｋｇまでとしてよい。使用する例示的な投与量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇが含まれ得る。好ましい投与量は、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６または１８ｍｇ／ｋｇである。当業者は、年齢、全身の健康状態、特定の器官の機能または体重、ならびに特定の器官系（例えば、骨髄）に対する先行療法の効果などの種々の因子が、イムノコンジュゲートの最適な投与量を選択する上で考慮に入れられ得、投与量及び／または投与頻度は、治療経過中に増減してよいことを認識するだろう。投与量は、必要に応じて反復してもよく、腫瘍の縮小のエビデンスはわずか４〜８用量の後に観察され得る。本明細書に開示のネオアジュバント使用に最適化した投与量及び投与スケジュールは、予期せぬ優れた有効性及び毒性の低下をヒト対象において示し、このことは、動物モデル研究からは予測することができなかった。驚くべきことに、優れた有効性により、１つまたは複数の標準的な抗癌治療に対して耐性を示すと以前に見いだされた腫瘍の処置が可能となる。
【００２０】
特許請求する組成物及び方法に伴う意外な結果は、高用量の抗体−薬物コンジュゲートの予測されていなかった忍容性であり、反復注入でも、比較的低い等級の悪心及び嘔吐、または管理可能な好中球減少症のみが観察された。さらなる驚くべき結果は、化学療法薬をアルブミン、ＰＥＧまたは他の担体にコンジュゲートさせた他の生成物とは異なり、抗体−薬物コンジュゲートの蓄積が欠如していることである。蓄積の欠如は、反復した投薬または増量した投薬の後でさえ、改善された忍容性及び深刻な毒性の欠如と関連している。これらの驚くべき結果によって、予期せぬ高い有効性及び低い毒性で投与量及び送達スケジュールの最適化が可能となる。特許請求する方法は、すでに耐性のある癌を有する個体において固形腫瘍の大きさで（最長直径によって測定して）１５％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上の縮小をもたらす。当業者は、腫瘍の大きさは、総腫瘍体積、任意の寸法における腫瘍の最大の大きさまたはいくつかの寸法における大きさの測定値の組み合わせなど、様々な異なる技術によって測定してよいことを認識するだろう。このことは、コンピュータ断層撮影法、超音波検査法、及び／または陽電子放射断層撮影法など、標準的な放射線手順を伴い得る。大きさを測定する手段は、好ましくは腫瘍の除去を結果としてもたらすイムノコンジュゲート処置での腫瘍の大きさの縮小傾向の観察よりも重要性は低い。
【００２１】
イムノコンジュゲートを、周期的なボーラス注射として投与してよいが、代替的な実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの連続注入によって投与してよい。血中のイムノコンジュゲートのＣｍａｘを増加させ、ＰＫを広げるために、連続注入は、例えば留置カテーテルによって投与してよい。このような装置は、ＨＩＣＫＭＡＮ（登録商標）、ＢＲＯＶＩＡＣ（登録商標）またはＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）カテーテルなど、当該分野で公知であり（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  ３２：７４１−７４８，２０１０を参照されたい）、任意のこのような公知の留置カテーテルを使用してよい。様々な連続注入ポンプも当該分野で公知であり、任意のこのような公知の注入ポンプを使用してよい。連続注入のための投与量範囲は、１日当たり０．１から３．０ｍｇ／ｋｇの間であってよい。より好ましくは、これらのイムノコンジュゲートは、２〜５時間、より好ましくは２〜３時間の比較的短期間にわたって静脈内注入によって投与することができる。
【００２２】
特に好ましい実施形態では、イムノコンジュゲート及び投薬スケジュールは、標準的な治療に対して耐性を示す患者において有効であり得る。例えば、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８イムノコンジュゲートは、ＳＮ−３８の親薬剤であるイリノテカンを用いた以前の療法に応答しなかった患者へ投与してよい。驚くべきことに、イリノテカン耐性患者は、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８に対して部分奏功またはさらには完全奏功を示すことがある。腫瘍組織を特異的に標的とするイムノコンジュゲートの能力は、治療剤の標的化の改善及び送達の向上によって腫瘍耐性を克服し得る。あるいは、ｈＭＮ−１４などの抗ＣＥＡＣＡＭ５イムノコンジュゲートは、ｈＭＮ−３またはｈＭＮ−１５などの抗ＣＥＡＣＡＭ６イムノコンジュゲートと併用投与してよい。他の抗体−ＳＮ−３８または抗体−Ｐ２ＰＤｏｘイムノコンジュゲートは、代替的な標準的治療処置と比較して、同様の有効性の改善及び／または毒性の低減を示し得、異なるイムノコンジュゲートの組み合わせ、または放射性核種、毒素または他の薬物にコンジュゲートした抗体と組み合わせたＡＤＣは、さらなる有効性の改善及び／または毒性の低下を提供し得る。具体的な好ましい対象は、転移性結腸癌患者、トリプルネガティブ乳癌患者、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌患者、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、転移性膵臓癌患者、転移性腎細胞癌腫患者、転移性胃癌患者、転移性前立腺癌患者、または転移性小細胞肺癌患者であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】例示的な抗体−薬物コンジュゲートであって、細胞内で切断可能なＣＬ２Ａリンカーを介してＳＮ−３８カンプトテシン薬物にコンジュゲートしているｈＲＳ７抗ＴＲＯＰ−２抗体を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ドキソルビシンの構造である。「Ｍｅ」は、メチル基である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２−ピロリノドキソルビシン、（２−ＰＤｏｘ）の構造である。「Ｍｅ」は、メチル基である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２−ピロリノドキソルビシンのプロドラッグ形態、（Ｐ２ＰＤｏｘ）の構造である。「Ｍｅ」は、メチル基であり、「Ａｃ」は、アセチル基である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、抗体カップリングのための、Ｐ２ＰＤｏｘのマレイミド活性化形態の構造である。「Ｍｅ」は、メチル基であり、「Ａｃ」は、アセチル基である。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｃａｌｕ−３ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＯＬＯ２０５ヒト結腸癌異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓癌異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓癌異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト扁平上皮細胞肺癌異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒトＴＮＢＣ異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒトＴＮＢＣ異種移植片におけるＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。腫瘍を有するマウスを、最初に対照（非標的）ＡＤＣで処置した。腫瘍を自然に増殖させた後、マウスに、指示投与量のＩＭＭＵ−１３２を、７８日目に開始して投与した。腫瘍を大きなサイズまで自然に増殖させた後でさえも、ＩＭＭＵ−１３２は、腫瘍退縮を誘導するのに有効であった。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトＴＮＢＣ異種移植片における、ＩＭＭＵ−１３２のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＩＭＭＵ−１３２−０１治験に登録された１４人のＴＮＢＣ患者の最良奏効である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＩＭＭＵ−１３２−０１治験に登録された１４人のＴＮＢＣ患者の無増悪期間である。
【図６Ａ】図６Ａは、用量レベルの関数としてのＩｇＧ及びＡＤＣのＩＭＭＵ−１３２ピーク血清濃度である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、患者体重に正規化したときの、用量レベルの関数としてのＩｇＧ及びＡＤＣのＩＭＭＵ−１３２ピーク血清濃度である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＭＭＵ−１３２総ＩｇＧ対総ＩＭＭＵ−１３２の薬物動態である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＭＭＵ−１３２総ＳＮ−３８対遊離ＳＮ−３８の薬物動態である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＥＬＩＳＡまたは血清中のＳＮ−３８濃度に基づくＩＭＭＵ−１３２のクリアランスである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌腫異種移植片における異なるＩＭＭＵ−１３２投薬レジメンである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌異種移植片における異なるＩＭＭＵ−１３２投薬レジメンである。
【図９Ａ】図９Ａは、１μＭの遊離ＳＮ−３８または当量のＩＭＭＵ−１３２に曝露されたＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌腫におけるＩＭＭＵ−１３２媒介性アポトーシスシグナル伝達である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ４８６乳癌細胞におけるＩＭＭＵ−１３２媒介性ＰＡＲＰ切断である。
【図１０】膵臓癌異種移植モデルにおけるＩＭＭＵ−１３２対イリノテカンの薬理毒性学試験である。
【図１１】ＴＮＢＣにおけるパクリタキセル＋／−ＩＭＭＵ−１３２のためのネオアジュバント処置レジメンである。
【図１２】皮下ヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける治療であり、Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腺癌異種移植片を有するヌードマウス（ｎ＝５）において２．２５ｍｇ／ｋｇタンパク質用量（０．０６４ｍｇ／ｋｇの薬物用量）のＭＡｂ−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートを週２回×２週間使用する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、複数回の注射を用いるｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＭＴＤ試験である。マウスに、ｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘ（ｑ４ｄ×４）を２５μｇ静脈内／用量で投与した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、複数回の注射を用いるｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＭＴＤ試験である。マウスに、ｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘ（ｑ４ｄ×４）を５０μｇ静脈内／用量で投与した。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、複数回の注射を用いるｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＭＴＤ試験である。マウスに、ｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘ（ｑ４ｄ×４）を１００μｇ静脈内／用量で投与した。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、複数回の注射を用いるｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＭＴＤ試験である。マウスに、ｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘ（ｑ４ｄ×４）を１５０μｇ静脈内／用量で投与した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、食塩水対照を投与した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、４５μｇのｈＡ２０−Ｐ２ＰＤｏｘを矢印により示すように投与した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、４５μｇのｈＭＮ−１５−Ｐ２ＰＤｏｘを矢印により示すように投与した。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、４５μｇのｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを矢印により示すように投与した。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、４５μｇのｈＬＬ１−Ｐ２ＰＤｏｘを矢印により示すように投与した。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性である。マウスに、４５μｇのｈＭＮ−１４−Ｐ２ＰＤｏｘを矢印により示すように投与した。
【図１５】ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌腫異種移植片を有するヌードマウスにおける生存に及ぼすｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの異なる投薬スケジュールの影響。
【図１６】ヒト胃癌腫異種移植片の増殖に及ぼすｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの異なる単回用量の影響。
【図１７】ヒト胃癌腫異種移植片を有するマウスの生存に及ぼすｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの異なる単回用量の影響。
【図１８】様々なｈＲＳ７−ＡＤＣ対ｈＲＳ７  ＩｇＧのＡＤＣＣ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下の説明では、いくつかの用語を使用し、以下の定義は、特許請求する主題事項の理解を容易にするために提供される。本明細書で明確に定義されていない用語は、当該用語の平易かつ通常の意味に従って使用する。
【００２５】
別段の指定がない限り、［ａ］または［ａｎ］は「１つまたは複数」を意味する。
【００２６】
［約］という用語は、ある値の±１０パーセント（１０％）を意味するものとして本明細書で使用する。例えば、「約１００」は、９０から１１０の間の任意の数を指す。
【００２７】
［抗体］は、本明細書で用いるとき、全長（すなわち、天然に生じるまたは正常な免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体断片などの免疫グロブリン分子の抗原結合部分を指す。抗体または抗体断片は、特許請求する主題事項の範囲内でコンジュゲートされてよいかさもなければ誘導体化されてよい。このような抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（及びＩｇＧ４の下位形態）、ならびにＩｇＡアイソタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
［抗体断片］は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）等の抗体の一部であり、先に挙げたＩｇＧ４の半分子を含む（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７（１４  Ｓｅｐｔ）：１５５４−１５５７）。ナノボディ（ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、ベルギー、ゲント）と称される単一ドメイン抗体の市販の形態は、以下にさらに詳細に考察する。構造にかかわらず、使用する抗体断片は、インタクト抗体によって認識されるものと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質も含む。例えば、抗体断片は、重鎖及び軽鎖可変領域からなる「Ｆｖ」断片などの可変領域からなる単離された断片、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびにＣＤＲなどの超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。Ｆｖ断片は、異なる方法で構築されて、多価及び／または多重特異性結合形態を生じ得る。多価の場合、Ｆｖ断片は、特定のエピトープに対して１つを超える結合部位を有するのに対し、多重特異性形態の場合、１つを超えるエピトープ（同じ抗原のものかまたは１つの抗原及び異なる抗原に対するものかのいずれか）が結合される。
【００２９】
［裸抗体］は一般に、治療剤にコンジュゲートしていない全（完全長）抗体である。これがそうであるのは、抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解を結果として生じ得る機構を作用させる、補体結合及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などのエフェクタ機能または免疫学的機能を提供するからである。しかしながら、Ｆｃ部分は、抗体の治療機能に必要でない場合があり、むしろアポトーシス、抗血管新生作用、抗転移活性、ヘテロタイプまたはホモタイプの接着の阻害などの抗接着活性、及びシグナル伝達経路における干渉などの他の機序が機能するようになり疾患の進行を妨げ得る。裸抗体は、マウス抗体を含む、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方及びその断片、ならびにある特定の組換え抗体、例えばキメラ、ヒト化またはヒト抗体及びその断片を含む。本明細書で用いるとき、「裸」は、「未コンジュゲート」と同義であり、治療剤に連結またはコンジュゲートしていないことを意味する。
【００３０】
［キメラ抗体］は、１つの種由来の抗体、好ましくは齧歯類抗体、より好ましくはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、重鎖及び軽鎖抗体鎖の両方の可変ドメインを含有するが、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のそれに由来する、組換えタンパク質である。獣医学的用途のために、キメラ抗体の定常ドメインは、霊長類、ネコまたはイヌなどの他の種に由来してよい。
【００３１】
［ヒト化抗体］は、１つの種に由来する抗体、例えばマウス抗体、からのＣＤＲが、マウス抗体の重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン（フレームワーク領域）へと移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のそれに由来する。いくつかの場合では、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列に接触しているまたは近接する残基は、改変されてよく、例えば、元のマウス、齧歯類、ヒトより下位の霊長類、または他の抗体からの対応する残基と置換されてよい。
【００３２】
［ヒト抗体］は、例えば、抗原攻撃に応答してヒト抗体を産生するよう「操作」されているトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術において、ヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子座のエレメントは、内因性重鎖及び軽鎖の遺伝子座の標的化破壊を含有する胚性幹細胞、ＥＳ細胞株に由来するマウス系統へと導入される。トランスジェニックマウスは、様々な抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、当該マウスを使用してヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって説明されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子もしくは染色体のトランスフェクション法、ならびにファージディスプレー技術によっても構築することができ、これらは全て当該分野で公知である。例えば、免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーに由来するヒト抗体及びその断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかへとインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として表示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づいた選択は、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。この方法で、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは、様々な形式で実施することができ、これらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞によっても生成され得る。米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたく、これらの各々の実施例項は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
［治療剤］は、結合性部分、例えば、抗体または抗体断片とは別個に、同時にまたは連続して投与される分子または原子であり、疾患の処置に有用である。治療剤の例としては、抗体、抗体断片、コンジュゲート、薬物、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤、毒素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含む）、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤もしくは色素、放射性同位体もしくは放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉性ＲＮＡ、ペプチド、抗血管新生剤、化学療法剤、サイオカイン（ｃｙｏｋｉｎｅ）、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
［イムノコンジュゲート］は、治療剤にコンジュゲートした抗体、抗体断片または他の抗体部分である。本明細書で用いるとき、「コンジュゲート」及び「イムノコンジュゲート」という用語は互換可能に使用される。
【００３５】
本明細書で用いるとき、［抗体融合タンパク質］という用語は、１つまたは複数の天然抗体、一本鎖抗体または抗体断片が、タンパク質もしくはペプチド、毒素、サイトカイン、ホルモン等の、別の部分へ連結している組換え産生された抗原結合性分子である。ある特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、同じエピトープ、同じ抗原上の異なるエピトープ、または異なる抗原に結合し得る、２つ以上の、同じもしくは異なる抗体、抗体断片または一本鎖抗体を１つに融合して含んでよい。
【００３６】
［免疫調節剤］は、存在する場合、身体の免疫系を変化、抑制または刺激する治療剤である。典型的には、使用する免疫調節剤は、免疫細胞を刺激して、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞などの免疫応答カスケードにおいて増殖または活性化させる。本明細書で記載する免疫調節剤の例はサイトカインであり、特定の抗原と接触する際に１つの細胞集団（例えば、薬物刺激されたＴリンパ球）によって放出されるおおよそ５〜２０ｋＤａの可溶性小分子タンパク質であり、細胞間で細胞間メディエーターとして作用する。当業者であれば理解するように、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロンなどのいくつかの関連シグナル伝達分子が挙げられる。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。ある特定のインターロイキン及びインターフェロンは、Ｔ細胞または他の免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００３７】
［ＣＰＴ］は、カンプトテシンの略語である。本出願で用いるとき、ＣＰＴは、カンプトテシンそれ自体またはカンプトテシンの類似体もしくは誘導体を表す。カンプトテシン及びその類似体のうちの一部の構造は、番号が付され、環が文字Ａ〜Ｅで標識されている、以下のチャート１の式１に提供される。
【００３８】
【化１】
2020105187.tif 000003
【００３９】
カンプトテシンコンジュゲート
抗体または抗原結合性抗体断片に付着したカンプトテシン治療剤を含むイムノコンジュゲートを調製するための非限定的な方法及び組成物を以下に説明する。好ましい実施形態では、薬物の溶解度は、規定されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（すなわち、規定数の単量体単位を含有するＰＥＧ）を薬物と抗体の間に配置することによって向上し、ここで規定されたＰＥＧは、低分子量ＰＥＧであり、好ましくは１〜３０単量体単位を含有し、より好ましくは１〜１２単量体単位を含有する。
【００４０】
好ましくは、第一のリンカーは、一端で薬物を接続しており、他端ではアセチレン基またはアジド基で終了してよい。この第一のリンカーは、アジド基またはアセチレン基を有する規定されたＰＥＧ部分を一端で、カルボン酸基またはヒドロキシル基などの異なる反応性基を他端で有して含み得る。前記二官能性の規定されたＰＥＧは、アミノアルコールのアミン基に付着し得、後者のヒドロキシル基は、炭酸塩の形態で薬物上のヒドロキシル基に付着し得る。あるいは、前記規定された二官能性ＰＥＧの非アジド（またはアセチレン）部分は、Ｌ−アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端に付着するとともに、Ｃ末端はアミノアルコールのアミノ基に付着し得、後者のヒドロキシ基は、それぞれ、炭酸塩またはカルバミン酸塩の形態で薬物のヒドロキシル基に付着し得る。
【００４１】
第二のリンカーは、第一のリンカーのアジド（またはアセチレン）基に対して相補的な抗体カップリング基及び反応基を含み、すなわちアセチレン（またはアジド）であり、薬物−（第一のリンカー）コンジュゲートと、アセチレン−アジド付加環化反応を介して反応して、疾患標的抗体へのコンジュゲートに有用な最終二官能性薬物産物を供給し得る。抗体カップリング基は、好ましくは、チオールまたはチオール反応性基のいずれかである。
【００４２】
アセチレン−アジド「クリックケミストリー」カップリングでは、銅（＋１）触媒性付加環化反応が、アセチレン部分及びアジド部分の間で生じる（Ｋｏｌｂ  ＨＣ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００３；８：１１２８−３７）が、クリックケミストリーの代替の形態も公知であり使用してよい。反応には、ジクロロメタンなどの非極性有機溶媒における高度に効率的なカップリングを可能にするために臭化銅及びトリフェニルホスフィンの混合物を使用する。クリックケミストリーの利点は、それが化学選択的であり、チオール−マレイミド反応などの他の周知のコンジュゲーション化学反応を補完することである。以下の考察では、コンジュゲートが抗体または抗体断片を含む場合、標的化ペプチドなどの別の型の結合部分が置換されてよい。
【００４３】
ＳＮ−３８などのＣＰＴ類似体を必然的に含む薬物−リンカー前駆体の調製におけるＣ−２０炭酸塩の存在下での１０−ヒドロキシル基の選択的再生のための方法を以下に提供する。ＳＮ−３８のフェノール性ヒドロキシルなどの薬物内の反応性ヒドロキシル基に対する他の保護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルも使用してよく、これらは、抗体−カップリング部分への誘導体化された薬物の連結の前にテトラブチルアンモニウムフルオリドによって脱保護されてよい。ＣＰＴ類似体の１０−ヒドロキシル基はあるいは、「ＢＯＣ」以外のエステルまたは炭酸塩として保護され、それにより二官能性ＣＰＴはこの保護基の先行する脱保護なしで抗体にコンジュゲートする。保護基は、該生体コンジュゲートが投与された後に生理学的ｐＨ条件下で容易に脱保護され得る。
【００４４】
ＡＤＣの例示的な実施形態を図１に示し、これはＳＮ−３８カンプトテシンに細胞内で切断可能なＣＬ２Ａリンカーを介してコンジュゲートされたｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）の構造を示す。
【００４５】
様々な実施形態では、抗体及び薬物のコンジュゲートは、数百グラムのコンジュゲートを精製するために２５〜３０透析濾過容量のコンジュゲート製剤緩衝液を用いて５０，０００Ｄａの分子量のカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）法によって精製され得る。この方法は、サイズ排除及び疎水性クロマトグラフィーカラム上での高価かつ扱いにくいクロマトグラフィー精製を採用する必要性を除去する。
【００４６】
他の実施形態では、コンジュゲートは、６〜７．０のｐＨのグッドの生物学的緩衝液中で製剤化され、保存のために凍結乾燥される。好ましくは、グッドの緩衝液は、６〜７のｐＨ範囲、好ましくは６．５〜７のｐＨ範囲で、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭの緩衝液濃度の、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及び１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）からなる群から選択される。最も好ましい製剤緩衝液は、２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５である。
【００４７】
さらなる実施形態では、精製されたコンジュゲートは、トレハロース及びポリソルベート８０などの賦形剤と組み合わされ、凍結乾燥され、−２０℃〜８℃の温度範囲で凍結乾燥体として保存される。
【００４８】
アントラサイクリンコンジュゲート
図２は、ＡＤＣを形成するためのコンジュゲーションに使用する例示的なアントラサイクリンである、プロ−２−ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）を示す。親化合物である、２−ピロリノドキソルビシンは、１９９６年Ｓｃｈａｌｌｙのグループにより最初に記載され、彼らは、後にそれを前臨床探索のために多くの受容体標的化ペプチドにコンジュゲートするために使用した（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：７２６９−７３；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：２４６４−９；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６５２−６；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１７９４−９）。これはドキソルビシンの誘導体であり、５員エナミンに組み込まれたダウノサミン窒素を有し、極めて強力なアルキル化剤となり、ドキソルビシンの５００〜１０００倍の細胞毒性を有する。この薬物の超毒性は、安全性のため、アイソレーター内で特別に扱う必要がある。
【００４９】
２−ピロリノドキソルビシンのプロドラッグ形態が別のグループにより調査され、彼らは、Ｎ−（４，４−ジアセトキシブチル）ドキソルビシンと称したドキソルビシンの誘導体を開示した（Ｆａｒｑｕｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１：９６５−７２；米国特許第５，１９６，５２２号；同第６，４３３，１５０号）。この誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで２−ピロリノドキソルビシンに変換可能である。この誘導体は、４，４−ジアセトキシブチルアルデヒドでのドキソルビシンの還元性アルキル化により調製された。しかしながら、このプロドラッグは、ジスルフィド還元型抗体のチオールで、切断可能なリンカーとしてヒドラゾンなどの酸に不安定な基を使用して抗体または他の標的化分子に付着しなかった。
【００５０】
以下の様々な実施例は、ネオアジュバント使用のためのＡＤＣにおける薬物としてＰ２ＰＤｏｘを使用する。この物質には、（ｉ）プロドラッグのみを扱うことにより、安全性の懸念を軽減すること；（ｉｉ）原材料のドキソルビシン（Ｄｏｘ）がｃＧＭＰグレードにて量的に入手可能であること、（ｉｉｉ）Ｄｏｘを活性化Ｐ２ＰＤｏｘ（Ｐ２ＰＤｏｘ）に変換する化学は、数ステップの合成のみを含むこと、のいくつかの利点がある。図２Ａ〜２Ｄは、Ｄｏｘ、２−ＰＤｏｘ、Ｐ２ＰＤｏｘ（Ｐ２ＰＤｏｘ）、及び活性化Ｐ２ＰＤｏｘの構造を示す。ＩｇＧへのカップリングについては、本発明者らは、Ｐ２ＰＤｏｘをＳＭＣＣ−ヒドラジドで活性化させた。これは酸に不安定なヒドラゾンならびにマレイミド基を導入する手法であり、マレイミド基は穏やかに還元した抗体のチオールのコンジュゲーションに用いる。
【００５１】
ＡＤＣネオアジュバント使用のための薬物のうちの１つとしての２−ピロリノドキソルビシン、特にＭＡｂにコンジュゲートするためのそのプロドラッグ形態の選択により、迅速にイムノコンジュゲートを開発でき、それは原材料のドキソルビシンがｃＧＭｐグレードで容易に入手可能であるためである。Ｐ２ＰＤｏｘ上のケトンは、単一ステップで酸に不安定なヒドラゾン及び抗体結合性マレイミド基を組み込むためのハンドルを提供する。２−ＰＤｏｘの場合のドキソルビシンのアミノ基の誘導体化は、先行文献（Ｆａｒｑｕｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，４１：９６５−７２；Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｄ＆Ｕｒｉ，２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：３６１３−２１）に基づき、ドキソルビシンに伴う複数の薬剤抵抗性を克服するものであるべきである。この設計は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成される活性２−ピロリノドキソルビシン構造に影響を与えることなく、目的物質を放射性標識する、及び／または投与可能な用量をさらに調節するため、必要な場合には、リンカーまたはＮ−アルキル部に親水基を付加する選択肢を提供する。
【００５２】
他者により現在試験されているＡＤＣの大部分は、チューブリンに作用し、毒性の極めて高い、マイタンシノイド及びオーリスタチンを組み込み、これらは細胞周期相に特異的である。通例、トラスツズマブ−ＤＭ１を除き、これらのＡＤＣは、臨床的に固形癌において比較的狭い治療指数を呈するとされる。２−ＰＤｏｘなどのＤＮＡ−アルキル化剤は、細胞周期相に非特異的である。本提案のＡＤＣは、異なる細胞殺傷機序、ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂなどの他の多くよりも高い癌特異性を示す内部移行抗体、及び連結の化学により作用する薬剤成分に基づき、他の超毒性ＡＤＣからの逸脱した利点を提供し、改善した治療指数を提供する。以下に示すように、膵臓癌、乳癌、及び胃癌の侵攻性異種移植モデルにおいて現在までに行われた前臨床試験は、ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートが低く安全な用量で非常に活性であり、完全な退縮をもたらすことを示す。ヒト血液腫瘍及び固形腫瘍を有するマウスを、このような腫瘍を標的化し、Ｐ２ＰＤｏｘとコンジュゲートする様々な抗体で処置した試験もまた、通常５％未満の死亡率をもたらす用量である、最大耐量（ＭＴＤ）より低くあるように用量を調節することにより制御される、好中球減少症に主に起因する用量制限毒性を伴う、低頻度用量でさえも、優れた腫瘍制御（対照群と比較して、増殖の遅延または後退）を示す。本試験は、抗体−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートのネオアジュバント使用を支持する。
【００５３】
一般的な抗体技術
事実上あらゆる標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製するための技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ，１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡潔には、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射すること、脾臓を取り出してＢリンパ球を得ること、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養すること、及び抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによって得ることができる。
【００５４】
キメラ抗体またはヒト化抗体の産生などの様々な技術は、抗体のクローニング及び構築の手順を必然的に含み得る。目的の抗体に関する抗原結合性Ｖκ（可変軽鎖）配列及びＶＨ（可変重鎖）配列は、様々な分子クローニング手順、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングによって得られ得る。マウス抗体を発現する細胞由来の抗体のＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローニングされ、配列決定することができる。それらの確実性を確認するために、クローニングしたＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））により記載されるように、キメラＡｂとして細胞培養物中で発現することができる。Ｖ遺伝子配列に基づき、ヒト化抗体は次に、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））により記載されるように設計及び構築されることができる。
【００５５】
ｃＤＮＡは、一般的な分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ（１９８９））によりマウス抗体を産生する任意の公知のハイブリドーマ株またはトランスフェクトした細胞株から調製することができる。抗体に関するＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））により記載される伸長したプライマーセットを用いて増幅され得る。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））により記載されるマウスＩｇＧの定常部にアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。ヒト化Ｖ遺伝子は、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））により記載されるように、長いオリゴヌクレオチド鋳型合成及びＰＣＲ増幅の組み合わせによって構築することができる。
【００５６】
ＶκについてのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列及び好都合な制限部位を含有する、ｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターであるＶＫｐＢＲなどのステージングベクター中にサブクローニングすることができる。ＶＨについてのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳなどの同様のステージングベクター中にサブクローンニングすることができる。プロモーター及びシグナルペプチド配列とともにＶκ配列及びＶＨ配列を含有する発現カセットは、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切り出して、それぞれｐＫｈ及びｐＧｌｇなどの、適切な発現ベクター中にライゲートすることができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、適切な細胞内に同時トランスフェクトすることができ、上清液は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生についてモニターされることができる。あるいは、Ｖκ及びＶＨ発現カセットは、切り出して、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９））により記載され、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）においても示されるように、ｐｄＨＬ２などの単一発現ベクター中にサブクローンニングすることができる。
【００５７】
代替的な実施形態では、発現ベクターは、無血清培地中でのトランスフェクション、増殖及び発現にあらかじめ適応している宿主細胞へとトランスフェクトされ得る。使用してよい例示的な細胞株としては、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦ及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株が挙げられる（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号；同第７，５３７，９３０号及び同第７，６０８，４２５号を参照されたく；これらの各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。これらの例示的な細胞株は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株をベースとし、突然変異体Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子でトランスフェクトされ、メトトレキサートに曝露されてトランスフェクトした遺伝子配列を増幅し、タンパク質発現のために無血清細胞株にあらかじめ適応している。
【００５８】
キメラ及びヒト化抗体
キメラ抗体とは、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域により置き換えられている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されたとき、低減した免疫原性及び増加した安定性を呈する。キメラ抗体を構築するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９）。
【００５９】
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト抗体の対応する可変ドメインへとマウスＣＤＲを移植することによってヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置き換えられる。ヒト化モノクローナルの安定性及び抗原特異性を保存するために、１つまたは複数のヒトＦＲ残基がマウス対応物残基により置き換えられ得る。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療的処置のために使用してよい。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照されたい）。
【００６０】
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関し得る。ヒヒにおける治療上有用な抗体を生じるための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）において、及びＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）において見出され得る。別の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。このような抗体は、以下に考察するように、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を産生するように操作されているトランスジェニックマウスから得られ得る。
【００６１】
ヒト抗体
組み合わせアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いて形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０；各々参照により本明細書に組み込まれる）。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を呈し、本質的に内在性のヒト抗体としてｉｎ  ｖｉｖｏで機能すると期待される。ある特定の実施形態では、特許請求する方法及び手順は、このような技術によって産生されるヒト抗体を利用し得る。
【００６２】
ある代替では、ファージディスプレー技術を使用して、ヒト抗体を生成してよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。ヒト抗体は、正常なヒトから、または癌などの特定の疾患状態を呈するヒトから生成されてよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。罹患した個体からヒト抗体を構築する利点は、循環中の抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体へと偏っている可能性があることである。
【００６３】
この方法論の１つの非限定的な例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレーライブラリを構築した。概して、総ＲＮＡを循環血リンパ球から獲得した（同書）。組換えＦａｂをμ、γ及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングし、ファージディスプレーライブラリ中に挿入した（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡへ変換し、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用いてＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリを作成するために使用した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１  ｔｏ  ９．２２内）に従って実施した。最終Ｆａｂ断片は、制限エンドヌクレアーゼで消化され、バクテリオファージゲノム中に挿入されて、ファージディスプレーライブラリを作成した。このようなライブラリは、標準的なファージディスプレー法によってスクリーニングされてよい。当業者は、この技術が例示であるに過ぎず、ファージディスプレーによるヒト抗体または抗体断片を作成及びスクリーニングするための任意の公知の方法が利用されてよいことを認識するだろう。
【００６４】
別の代替では、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されているトランスジェニック動物を使用して、上に考察した標準的な免疫化プロトコルを用いて、本質的にあらゆる免疫原性標的に対する抗体を生成し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により記載されている。このような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（カリフォルニア州、フリーモント）製のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物では、マウス抗体遺伝子は、不活性化されており、機能的ヒト抗体遺伝子により置き換えられているが、マウス免疫系の残りはインタクトなままである。
【００６５】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び制御配列とともに可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨ及びＩｇカッパ遺伝子座の複数の部分を含有する生殖細胞系列により構成されたＹＡＣ（酵母人工染色体）を用いて形質転換された。ヒト可変領域レパートリーを使用して、抗体産生性Ｂ細胞を生成してよく、これを公知の技術によりハイブリドーマへと処理してよい。標的抗原で免疫化したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によりヒト抗体を産生し得、これは、上に考察した標準的な技術によって回収及び／または産生され得る。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が入手可能であり、これらの各々は、異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入により産生されたヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態特性を保有しながら、治療可能性を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、特許請求する組成物及び方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されるのではなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作された任意のトランスジェニック動物を利用し得ることを認識するだろう。
【００６６】
抗体断片の産生
抗体断片は、例えば、従来法によって抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得られ得る。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓ断片を提供するようにペプシンによる抗体の酵素的切断により産生されてよい。この断片は、チオール還元剤を、及び任意で、ジスルフィド連結の切断から結果的に生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いてさらに切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を産生し得る。あるいは、ペプシンを用いる酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ断片及びＦｃ断片を産生する。抗体断片を産生するための例示的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）において開示されている。
【００６７】
重鎖の分離など、抗体を切断して、一価の軽鎖−重鎖断片を形成する他の方法、断片のさらなる切断または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術も、インタクト抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、使用してよい。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９において記載されるように、非共有結合であることができる。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されてよいか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋されてよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００６８】
好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続したＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合性タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって接続するＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターへと挿入され、これはその後、大腸菌などの宿主細胞へと導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて一本鎖ポリペプチドを合成する。ｓｃＦｖを産生するための方法は、当該分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００６９】
抗体断片の別の形態は、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）であり、時に一本鎖抗体と称される。単一ドメイン抗体を産生するための技術は当該分野で周知である（例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００７，５１：２５３−２５９；Ｓｈｕｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ０６，４３：１９１２−１９；Ｔａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２４７７４−７８０を参照されたい）。他の型の抗体断片は、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって得ることができる。Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ  １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ｉｎｃ．）を参照されたい。
【００７０】
抗体変動
ある特定の実施形態では、抗体のＦｃ部分などの抗体の配列は、血清中の半減期など、コンジュゲートの生理学的特徴を最適化するように変動してよい。タンパク質におけるアミノ酸配列を置換する方法は、当該分野で広く公知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発による（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９）。好ましい実施形態では、変動はＦｃ配列中の１つまたは複数のグリコシル化部位の付加または除去を必然的に含み得る（例えば、その実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２５４，８６８号）。他の好ましい実施形態では、Ｆｃ配列における特定のアミノ酸置換がなされ得る（例えば、Ｈｏｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４１：３５５−６２；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６−５６；Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９−６９；米国特許第７，２１７，７９７号；各々参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
抗体アロタイプ
治療用抗体の免疫原性は、注入反応の危険性の増加及び治療応答の持続時間の低減と関係している（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２−０８）。治療用抗体が宿主において免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって一部決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置にあるアミノ酸配列の変動と関連する。重鎖γ型定常領域を含有するＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプと命名されている（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６−５９）。
【００７２】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体について、最も優勢なアロタイプは、Ｇ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプもコーカサス人種において頻繁に生じる（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｇ１ｍ３患者など、非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）レシピエントに投与したとき免疫応答を誘導する傾向があるアロタイプ配列をＧ１ｍ１抗体が含有することが報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与したとき、それほど免疫原性ではない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００７３】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列におけるＫａｂａｔ位置３５６でアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８でロイシンのアミノ酸を含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、アミノ酸のグルタミン酸をＫａｂａｔ位置３５６で、メチオニンをＫａｂａｔ位置３５８で含む。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプは両方とも、グルタミン酸残基をＫａｂａｔ位置３５７で含み、アロタイプは、ＤＥＬ及びＥＥＭアロタイプと称されるときもある。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体での重鎖定常領域配列の非限定的な例を、例示的な抗体リツキシマブ（配列番号１）及びベルツズマブ（配列番号２）について以下に示す。
【００７４】
【化２】
2020105187.tif 000004
【００７５】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９，ＭＡｂｓ  １：１−７）は、ＩｇＧアロタイプの配列変動特徴及び免疫原性に及ぼすそれらの効果を概説している。彼らは、Ｇ１ｍ３アロタイプが、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおけるＫａｂａｔ２１４のリジン残基と比較して、Ｋａｂａｔ位置２１４のアルギニン残基を特徴とすると報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンを特徴とした。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のロイシン及びＫａｂａｔ位置４３１のグリシンを特徴とした。重鎖定常領域配列変異体に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）は、Ｋａｂａｔ位置１５３のバリン及びＫａｂａｔ位置１９１のロイシンを特徴とするＫｍ１アロタイプ、Ｋａｂａｔ位置１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位置１９１のロイシンによるＫｍ１，２アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ位置１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位置１９１のバリンを特徴とするＫｍ３アロタイプを有するカッパ軽鎖定常領域におけるアロタイプ変異体を報告した。
【００７６】
治療用抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブはそれぞれ、広範な血液学的悪性腫瘍の治療のために使用する、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１抗体及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１は、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較する。表１に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、リツキシマブにおいてリジン対ベルツズマブにおいてアルギニンの、Ｋａｂａｔ位置２１４（重鎖ＣＨ１）での追加的な配列変動を有する。対象における免疫原性がベルツズマブはリツキシマブよりも低いことが報告されており（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６−５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２−７０；Ｒｏｂａｋ  ａｎｄ  Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３−２５を参照されたい）、これはヒト化抗体とキメラ抗体の間の差に起因している効果である。しかしながら、ＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプの間のアロタイプにおける差も、ベルツズマブの比較的低い免疫原性の原因である可能性がある。
【００７７】
【表１】
2020105187.tif 000005
【００７８】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療用抗体の免疫原性を低下させるために、Ｋａｂａｔ２１４のアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプならびにＫａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプに対応するように抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復皮下投与は、有意な免疫応答を結果として生じなかったことが見出された。代替的な実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと同様にヒトＩｇＧ４重鎖は、アルギニンをＫａｂａｔ２１４で、グルタミン酸をＫａｂａｔ３５６で、メチオニンをＫａｂａｔ３５９で、及びアラニンをＫａｂａｔ４３１で有する。免疫原性は、これらの位置の残基に少なくとも一部関連しているように思われるため、治療用抗体のためのヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列の使用も好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体の組み合わせも、治療用投与のために使用され得る。
【００７９】
既知の抗体
様々な実施形態では、特許請求する方法及び組成物は、当該分野で公知の様々な抗体のうちのいずれかを利用してよい。使用する抗体は、いくつかの公知の源から商業的に得てよい。例えば、様々な抗体分泌性ハイブリドーマ株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがこれらに限定されない様々な疾患標的に対する多数の抗体は、ＡＴＣＣに寄託されており、かつ／または可変領域配列を公開しており、特許請求する方法及び組成物における使用に利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２，８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０号、同第６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６号；同第６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８号を参照されたく、この各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる。これらは、例示的であるに過ぎず、広範な他の抗体及びそれらのハイブリドーマは当該分野で公知である。当業者は、ほぼあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌性ハイブリドーマを、目的の選択された疾患関連標的に対する抗体について、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースを簡単に検索することによって得られ得ることを認識するだろう。クローニングされた抗体の抗原結合性ドメインを、当該分野で周知の標準的な技術を用いて、増幅し、切除し、発現ベクターにライゲートし、適応させた宿主細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生のために使用し得る（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号；同第７，５３７，９３０号；同第７，６０８，４２５号及び同第７，７８５，８８０号を参照されたく、これらの各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８０】
本特許請求の方法及び組成物の範囲内で使用され得る具体的な抗体には、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツクスマブ（ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１、ＴＲＯＰ−２としても知られる））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（ともに抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても知られる）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗アルファ−フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡダイマー）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（アカクリバツズマブ（ａｋａ  ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、抗ムチン）及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６４２，２３９号；及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号；同第２００６０１９３８６５号；同第２００６０２１０４７５号；同第２００７００８７００１号；それぞれの実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。使用する特定の公知の抗体には、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第５，７８９，５５４号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７２号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲ１（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特��第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が含まれ、各記載の特許または出願の文書は、図及び実施例項に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本明細書に記載のコンジュゲートを使用して標的化され得る他の有用な抗原には、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、
ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺性酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、発がん遺伝子マーカー及び発がん遺伝子産物が含まれる（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３−３２；Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５−７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７−２０７を参照されたい）。
【００８２】
好適な抗原の包括的な分析（クラスター指定またはＣＤ）は、フローサイトメトリーによって示すように、造血器悪性細胞を標的としており、薬物とコンジュゲートする免疫療法に好適な抗体を選択するためのガイドであることができ、２００８年１月１５日にオンラインで事前公開した、Ｃｒａｉｇ  ａｎｄ  Ｆｏｏｎ，Ｂｌｏｏｄ；ＤＯＬ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−１１−１２０５３５である。
【００８３】
ＣＤ６６抗原は、類似の構造を有する５つの異なる糖タンパク質であるＣＤ６６ａ−ｅからなり、それぞれ癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバー、ＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１及びＣＥＡによりコードされる。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は主に、顆粒球、消化管の正常上皮細胞及び様々な組織の腫瘍細胞において発現する。また、癌に好適な標的として含まれているのは、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの癌精巣抗原（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１−７）、ならびに骨髄性白血病における（Ｋｏｚｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２−７）及びＢ細胞疾患にもおけるＣＤ７９ａ、ならびに非ホジキンリンパ腫についてのＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６−６２３）である。いくつかの上述の抗原は、２００２年１１月１５日に出願された“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”という表題の米国仮特許出願第６０／４２６，３７９号に開示されている。より治療抵抗性の高い前駆体悪性細胞集団であることが原因であるとされている癌幹細胞（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５−４０）は、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５−７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５−９１）、及び神経膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０−５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８−６３）、膵臓癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０−７）、及び頭頸部扁平上皮癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３−８）におけるＣＤ４４などのある特定の癌種において標的とすることができる抗原を有する。乳癌治療のための別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１−９）により記載されるＬＩＶ−１抗原である。
【００８４】
多発性骨髄腫治療については、適切な標的化抗体が、例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１−１２）：３４５−３４６、Ｔａｓｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８−９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，同書）、ＣＳ１（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９−３７）、ならびにＣＤ４０（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８−５９０６）に対して記載されている。
【００８５】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、先天性及び適応性の免疫及びアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４は、ＭＩＦについての内在性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦ媒介性細胞内経路に及ぼすアンタゴニスト性抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌及び慢性リンパ球性白血病（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ＆Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）などの広範な疾患状態の処置に使用され得る。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介性疾患の処置のために治療的に使用される例示的な抗ＣＤ７４抗体である。
【００８６】
抗ＴＮＦ−α抗体は、当該分野で公知であり、癌の処置のために使用され得る。ＴＮＦ−αに対する公知の抗体には、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１−８５）；マウス抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ及びＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州、ロックフォード）；インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルバニア州、マルバーン）；セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ、ベルギー、ブリュッセル）；及びアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、イリノイ州、アボットパーク）が含まれる。これら及び多くの他の公知の抗ＴＮＦ−α抗体が、特許請求する方法及び組成物において使用され得る。
【００８７】
チェックポイント阻害剤抗体は、主に癌療法において使用されている。免疫チェックポイントは、自己免疫寛容を維持し、末梢組織損傷を最小限にするよう免疫系応答の程度を調節する責任を担う免疫系における阻害経路を指す。しかしながら、腫瘍細胞も、免疫系チェックポイントを活性化させて腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を低減することができる。細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られる）及びプログラムされた細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）に対する例示的なチェックポイント阻害剤抗体は、一つまたは複数の他の薬剤と併用で使用されて癌細胞または組織に対する免疫応答の有効性を向上させ得る。例示的な抗ＰＤ１抗体には、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）、及びピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨＬＴＤ．）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。例示的な抗ＰＤ−Ｌｌ抗体には、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌｌ抗体は、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から市販されている。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えばＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、及びＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは、近年、転移性黒色腫の処置に対してＦＤＡの承認を受けている（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、迅速に内部移行し、その後に再発現し、処理され、細胞表面上に提示され、細胞による持続的な取込み及び循環コンジュゲートの癒着を可能にする抗体が使用される。最も好ましい抗体／抗原対の例は、ＬＬ１、抗ＣＤ７４  ＭＡｂ（インバリアント鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）である（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号；同第７，３１２，３１８号を参照されたく；各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、ある特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸癌、肺癌、及び腎癌、神経膠芽腫、ならびにある特定の他の癌で高度に発現する（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６−３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用に関する概説は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｓｅｐ  １５；１３（１８  Ｐｔ  ２）：５５５６ｓ−５５６３ｓに含有される。
【００８９】
抗ＣＤ７４抗体を用いて好ましく処置される疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺癌、腎癌、結腸癌、多形膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、組織球腫、骨髄性白血病、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。標的細胞の表面上での短期間にわたるＣＤ７４抗原の持続的な発現、それに続く抗原の内部移行、及び抗原の再発現によって、標的化ＬＬ１抗体は、それが運ぶ任意の化学療法部分とともに、内部移行することが可能になる。このことは、高い、治療濃度のＬＬ１−化学療法薬コンジュゲートがこのような細胞の内側に蓄積されることを可能にする。内部移行したＬＬ１−化学療法薬コンジュゲートは、リソソーム及びエンドソームを循環し、化学療法部分は、標的細胞内で活性形態にて放出される。
【００９０】
腫瘍関連抗原に対する上述の抗体及び他の公知の抗体は、特許請求する方法及び組成物の実践においてイムノコンジュゲートとして使用されてよい。
【００９１】
二重特異性及び多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多くの生物医学用途において有益である。例えば、腫瘍細胞表面抗原及びＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞により特定の腫瘍細胞の溶解をもたらすことができる。神経膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者の脳腫瘍の処置での使用に成功している（Ｎｉｔｔａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８−３７１）。ある特定の実施形態では、本明細書に開示する治療剤コンジュゲーションのための技術及び組成物は、二重特異性または多重特異性抗体を抗体部分として共に使用してよい。
【００９２】
二重特異性または多重特異性抗体を産生するための多くの方法が知られており、例えば、その実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４０５，３２０号において開示されている。二重特異性抗体は、２つの異なるハイブリドーマの融合を必然的に含む、クアドローマ法により産生でき、これは、それぞれ異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００９３】
二重特異性抗体を産生するための別の方法は、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に繋留するためにヘテロ二官能性架橋剤を使用する（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４−３５６）。また、二重特異性抗体は、それぞれ半分の分子に対して２つのモノクローナル親抗体のそれぞれを還元することにより産生することもでき、次いで、これを混合し再び酸化させてハイブリッド構造が得られる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替案は、適切なリンカーを使用して、２つまたは３つの別々に精製したＦａｂ’断片を化学的に架橋することを必然的に含む（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号を参照されたい）。
【００９４】
他の方法には、レトロウイルス由来のシャトルベクターを介して別個の選択可能なマーカーをそれぞれの親ハイブリドーマに遺伝子導入する（続いてそれらは融合される）ことによりハイブリッドハイブリドーマの生成効率を改善すること（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）；または異なる抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドを用いるハイブリドーマ細胞株のトランスフェクションが含まれる。
【００９５】
同族ＶＨ及びＶＬドメインは、適切な組成及び長さ（通常１２超のアミノ酸残基からなる）のペプチドリンカーと接合して、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖを製造する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，１３２，４０５号に開示されており、その各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる。１２アミノ酸残基未満へのペプチドリンカー長さの減少は、同一鎖上のＶＨ及びＶＬドメインの対合を防ぎ、他の鎖上の相補的ドメインとのＶＨ及びＶＬドメインの対合を強要し、これは機能的多量体の形成を結果もたらす。３〜１２アミノ酸残基のリンカーと接合しているＶＨ及びＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主として二量体（ダイアボディと称する）を形成する。０〜２アミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディと称する）及び四量体（テトラボディと称する）が好都合であるが、オリゴマー形成の正確なパターンは、リンカー長さに加えて、Ｖ−ドメインの組成ならびに配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に依存するとみられる。
【００９６】
多重特異性または二重特異性抗体を産生するためのこれらの技術は、その技術の収率の低さ、精製の必要性、安定性の低さまたは労力の大きさに関して様々な難点を呈する。より近年では、「ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）」（ＤＮＬ（商標））として知られる二重特異性構築物が、事実上あらゆる所望の抗体、抗体断片、及び他のエフェクタ分子の組み合わせを産生するために使用されている（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号及びＵＳＳＮ１１／９２５，４０８を参照されたく、その各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。この技術は、アンカードメイン（ＡＤ）及び二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）とも称される相補的タンパク質結合性ドメインを利用し、これらは互いに結合し、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体の範囲の複合体構造の組立を可能にする。これらは、安定した複合体を高収率で形成し、大規模な精製を必要としない。この技術は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体の組立を可能にする。二重特異性または多重特異性抗体を作成するために当該分野で公知である技術はいずれも、本発明で特許請求する方法の実践において利用してよい。
【００９７】
癌療法に好まれるような、使用の組み合わせには、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２２抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）抗体、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ−１（例えば、ＲＳ−７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋ＥＧＦＲ抗体が含まれる。そのような抗体は、併用でのみ使用される必要はないが、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等の様々な形態の融合タンパク質として組み合わされることができ、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０８３，４７７号；同第６，１８３，７４４号及び同第６，９６２，７０２号ならびに米国特許出願公開第２００３０１２４０５８号；同第２００３０２１９４３３号；同第２００４０００１８２５号；同第２００４０２０２６６６号；同第２００４０２１９１５６号；同第２００４０２１９２０３号；同第２００４０２３５０６５号；同第２００５０００２９４５号；同第２００５００１４２０７号；同第２００５００２５７０９号；同第２００５００７９１８４号；同第２００５０１６９９２６号；同第２００５０１７５５８２号；同第２００５０２４９７３８号；同第２００６００１４２４５号及び同第２００６００３４７５９号に記載されている。
【００９８】
前標的化
二重特異性または多重特異性抗体は、前標的化技術においても利用され得る。前標的化は、多段階プロセスであり、元々は、骨髄などの正常組織への望ましくない毒性に寄与する、抗体を直接標的化する際の血液クリアランスの遅さを解決するために開発された。前標的化により、放射性核種または他の治療剤は、数分で血液から排泄される小さな送達分子（標的可能な構築物）に付着する。前標的化二重特異性または多重特異性抗体は、標的可能な構築物ならびに標的抗原に対する結合部位を有し、最初に投与され、遊離抗体は循環から排泄され、次いで標的可能構築物が投与される。
【００９９】
前標的化方法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；同第７，０１１，８１２号；同第７，３００，６４４号；同第７，０７４，４０５号；同第６，９６２，７０２号；同第７，３８７，７７２号；同第７，０５２，８７２号；同第７，１３８，１０３号；同第６，０９０，３８１号；同第６，４７２，５１１号；同第６，９６２，７０２号；及び同第６，９６２，７０２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
対象において疾患または障害を処置または診断する前標的化法は、（１）対象に二重特異性抗体または抗体断片を投与すること；（２）該対象にクリアリング組成物を任意で投与し、該組成物が循環から抗体を排泄することを可能にすること；及び（３）ＳＮ−３８またはＰ２ＰＤｏｘなどの１つまたは複数のキレート化剤または化学的に結合した治療剤もしくは診断剤を含有する標的可能な構築物を該対象に投与することにより提供され得る。前標的化技術は、ネオアジュバント療法の１つのステップとして使用され得る。
【０１０１】
標的可能な構築物
ある特定の実施形態では、前標的化での使用のために１つまたは複数の治療剤または診断剤で標識されている標的可能な構築物ペプチドは、標的可能な構築物ペプチドに対する１つまたは複数の結合部位及び疾患または状態に関連する標的抗原に対する１つまたは複数の結合部位を有する二重特異性抗体に結合するように選択され得る。二重特異性抗体は、前標的化技術において使用され得、ここで抗体は、対象に最初に投与され得る。二重特異性抗体が標的抗原に結合し、未結合抗体が循環から排泄されるために十分な時間が許容され得る。次いで、標的可能な構築物、例えば、標識されたペプチドが、対象に投与され、二重特異性抗体への結合が可能になり、疾患細胞または組織で局在化し得る。
【０１０２】
このような標的可能な構築物は、多様な構造であることができ、標的可能な構築物に高い親和性で結合する抗体または断片の利用可能性だけでなく、前標的化法及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体内で使用される時の迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスに関して選択される。強力な免疫応答を引き出すには疎水性の薬剤が最良であるが、迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスのためには親水性の薬剤が好ましい。ゆえに、疎水性と親水性の特徴の平衡が確立される。これは、一部には、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺するために親水性キレート剤を用いることにより、成し遂げられ得る。また、逆の溶液特性を有する標的可能な構築物のサブユニット、例えば、いくらかは疎水性でありいくらかは親水性であるアミノ酸を含有するペプチドが選択され得る。
【０１０３】
わずか２個のアミノ酸残基を有する、好ましくは、２〜１０個の残基を有するペプチドが用いられてよく、キレート剤などの他の部分にカップリングされてもよい。リンカーは、低分子量コンジュゲートあるべきであり、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する。より一般的には、標的可能な構築物ペプチドは、例えば、二重特異性抗体に結合するための４個以上の残基及び１つまたは複数のハプテンを有するだろう。例示的なハプテンは、Ｉｎ−ＤＴＰＡ（インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）を含み得る。標的可能な構築物は、１つまたは複数のキレート部分、例えば、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカネル，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イルエチル］−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）または他の公知のキレート部分も含み得る。キレート部分は、例えば、治療用及びまたは診断用放射性核種、常磁性イオンまたは造影剤に結合するために使用され得る。
【０１０４】
標的可能な構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの安定性を増加させるために、非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸を骨格構造に含んでもよい。代替の実施形態では、非天然アミノ酸またはペプトイドから構築されるものなどの他の骨格構造が用いられてよい。
【０１０５】
標的可能な構築物として使用されるペプチドは、固相支持体ならびに反復直交脱保護及びカップリングの標準技術を使用する、自動ペプチド合成器で好都合に合成される。後にキレート部分または他の薬剤のコンジュゲーションに使用される、ペプチド内の遊離アミノ基は、Ｂｏｃ基などの標準的な保護基で有利にブロックされる一方で、Ｎ末端残基は、血清安定性を増加させるためにアセチル化され得る。かかる保護基は、当業者に周知である。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ペプチドが、二重特異性抗体系内での後の使用のために調製されるとき、ｉｎ  ｖｉｖｏでのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、それらは樹脂から有利に切断されて対応するＣ末端アミドを生成する。
【０１０６】
二重特異性抗体を伴う前標的化を使用する場合、抗体は、標的組織により産生されるか、または標的組織と関連する抗原に対する第一の結合部位、及び標的可能な構築物上のハプテンに対する第二の結合部位を含有するだろう。例示的なハプテンは、これに限定されないが、ＨＳＧ及びＩｎ−ＤＴＰＡを含む。ＨＳＧハプテンに対して作製される抗体は、公知であり（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体に容易に組み込むことができる（実施例項に関して参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第６，９６２，７０２号；同第７，１３８，１０３号及び同第７，３００，６４４号を参照されたい）。しかしながら、他のハプテン及びこれらに結合する抗体は、当該分野において公知であり、Ｉｎ−ＤＴＰＡ及び７３４抗体などが使用されてよい（例えば、実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５３４，４３１号）。
【０１０７】
ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））
好ましい実施形態では、二価または多価抗体が、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成される（例えば、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５５０，１４３号及び同第７，６６６，４００号を参照されたく、その各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。通常、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、様々なＡＫＡＰタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列との間に生じる特異的及び高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチドまたは他の分子に付着し得る。ＤＤＤ配列が自発的に二量体化し、ＡＤ配列に結合するため、本技術は、ＤＤＤまたはＡＤ配列に付着し得る任意の選択された分子間の複合体の形成を可能にする。
【０１０８】
標準的なＤＮＬ（商標）複合体は、１つのＡＤ連結分子に付着する２つのＤＤＤ連結分子を有する三量体を含むが、複合体構造における変動により、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及び他の多量体の形成が可能になる。いくつかの実施形態では、ＤＮＬ（商標）複合体は、２以上の抗体、抗体断片または融合タンパク質を含み得、これらは同一の抗原決定基または２つ以上の異なる抗原に結合する。ＤＮＬ（商標）複合体は、１つまたは複数の他のエフェクタ、例えば、タンパク質、ペプチド、免疫調節剤、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合性タンパク質、ペプチドリガンド、担体タンパク質、毒素、オンコナーゼなどのリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチド、抗原もしくは異種抗原、ＰＥＧなどのポリマー、酵素、治療剤、ホルモン、細胞毒性薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤または任意の他の分子もしくは凝集体も含み得る。
【０１０９】
ＰＫＡは、セカンドメッセンジャーｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合により引き起こされる最良に試験されているシグナル伝達経路の１つにおいて中心的な役割を果たしており、１９６８年に最初にウサギ骨格筋から単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態に保持された２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは、２つの型のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）を伴って見いだされ、各型はα及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。ゆえに、ＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。以下に考察するように、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の同様の部分は、二量体化及びドッキングに関与しており、それぞれ調節サブユニットのＮ末端の近くに位置している。ｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合は、広域スペクトルのセリン／トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒サブユニットの放出をもたらし、これは、ＡＫＰとのそのドッキングを介したＰＫＡの区画化を通して選択された基質に向けられる（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【０１１０】
最初のＡＫＡＰである、微小管関連タンパク質−２が１９８４年に特徴解析されて（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）以来、形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む、様々な細胞内部位に局在する５０超のＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種で多様な構造を有することが同定されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間で大きく異なり、ＲＩＩ二量体について報告された結合親和性の範囲は、２〜９０ｎＭである（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットにのみ結合するだろう。ヒトのＲＩＩαについては、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成される疎水性表面に結合する。（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）．したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同一のＮ末端の４４個のアミノ酸配列内にあり（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、この配列を本明細書ではＤＤＤと称する。
【０１１１】
本発明者らは、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを、以後Ａ及びＢと称する任意の２つの実体をドッキングさせて非共有結合複合体にするためのリンカーモジュールの優れたペアとして利用するためのプラットフォーム技術を開発した。非共有結合複合体は、ジスルフィド結合の形成を促進するためにＤＤＤ及びＡＤの両方の戦略的位置にシステイン残基を導入することによりにＤＮＬ（商標）複合体へとさらにロックされることができた。この手法の一般的な方法は以下の通りである。実体Ａを、Ａの前駆体にＤＤＤ配列を連結することにより構築し、以後ａと称する第１の構成要素を生じさせる。ＤＤＤ配列が二量体の自発的形成に影響し得るため、Ａは、ａ２から構成され得る。実体Ｂは、Ｂの前駆体にＡＤ配列を連結することにより構築され、以後ｂと称する第２構成要素を生じさせる。ａ２に含有されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含有されるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を作製し得、それにより、ａ２とｂの素早い会合を促進して、ａ２ｂから構成される２成分の三量体複合体を形成させる。この結合事象は、ジスルフィド架橋を介して２つの実体を共有結合的に固定するための次の反応で不可逆的になる。これは、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に生じるが、それは最初の結合相互作用がＤＤＤとＡＤの両方の上に配置された反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするはずであるからである。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の様々な組み合わせを使用することで、異なる化学量論の広範なＤＮＬ（商標）構築物が産生及び使用され得る（例えば、米国第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号及び同第７，６６６，４００号を参照されたい）。
【０１１２】
ＤＤＤ及びＡＤを、２つの前駆体の官能基から離れた所で付着させることにより、そのような部位特異的ライゲーションが２つの前駆体の本来の活性を保持することも期待される。この手法は、本質的にモジュール方式であり、潜在的には、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片及び広範囲の活性を有する他のエフェクタ部分を含む、広範囲の物質を、部位特異的及び共有結合的に連結するために適用することができる。以下の実施例に記載されるＡＤ及びＤＤＤコンジュゲートエフェクタを構築する融合タンパク質法を活用して、事実上あらゆるタンパク質またはペプチドがＤＮＬ（商標）構築体内に組み込まれ得る。しかしながら、該技術は非限定的であり、他のコンジュゲーション方法を利用してよい。
【０１１３】
目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生するための、核酸合成、ハイブリダイゼーション及び／または増幅を含めた融合タンパク質を作製するための様々な方法が公知である。そのような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学的技術により融合タンパク質の産生のために発現ベクター内に挿入してよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９を参照されたい）。かかる好ましい実施形態では、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分は、エフェクタタンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付着してよい。しかしながら、当業者は、エフェクタ部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の付着の部位が、エフェクタ部分及びその生理学的活性に関与するエフェクタ部分の一部（複数可）の化学的性質によって異なり得るということを認識するだろう。様々なエフェクタ部分の部位特異的付着は、当該分野において公知の技術を用いて、例えば二価の架橋試薬の使用及び／または他の化学的コンジュゲーション技術により実施されてよい。
【０１１４】
代替のＤＮＬ（商標）構造
ある特定の代替の実施形態では、ＤＮＬ（商標）構築物は、代替的に構築された抗体または抗体断片を使用して形成されてよく、ここでＡＤ部分は、重鎖上のＦｃのＣ末端の代わりに、カッパ軽鎖（Ｃｋ）のＣ末端で付着されてよい。代替的に形成されたＤＮＬ（商標）構築物は、各々の文書全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号（２０１２年６月１日に出願）、同第６１／６６２，０８６号（２０１２年６月２０日に出願）、同第６１／６７３，５５３号（２０１２年７月１９日に出願）及び同第６１／６８２，５３１号（２０１２年８月１３日に出願）に開示されるように調製され得る。軽鎖コンジュゲートしたＤＮＬ（商標）構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで向上したＦｃ−エフェクタ機能活性、及びｉｎ  ｖｉｖｏで改善した薬物動態、安定性及び抗リンパ腫活性を呈した（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：６３−７１）。
【０１１５】
Ｃｋ−コンジュゲートＤＮＬ（商標）構築物は、米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号、同第６１／６６２，０８６号、同第６１／６７３，５５３号、及び同第６１／６８２，５３１号に開示されるように調製され得る。簡潔には、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧは、組換え遺伝子操作により生成され、それによりＡＤ２ペプチドをカッパ軽鎖のＣ末端に融合した。ＣＫの天然Ｃ末端がシステイン残基であり、それがＣＨ１に対してジスルフィド架橋を形成するため、１６−アミノ酸残基「ヒンジ」リンカーを、ＣＫ−ＶＨ１ジスルフィド架橋からＡＤ２を離すために使用した。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブに対する哺乳類発現ベクターは、以前に相同ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの発現のために使用したｐｄＨＬ２ベクターを使用して構築した。２２０８塩基対のヌクレオチド配列を、ＶＫ／ＣＫイントロン内のＢａｍ  ＨＩ制限部位からＣｋイントロンのＸｈｏ  Ｉ制限部位３’の範囲のｐｄＨＬ２ベクター配列を含んで合成し、ＣＫのコード配列の３末端でインフレームで、ヒンジリンカー及びＡＤ２に対するコード配列を挿入した。この合成配列を、ベルツズマブ及びエプラツズマブのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクター内へとＢａｍ  ＨＩ及びＸｈｏ  Ｉ制限部位を介して挿入した。ＳｐＥＳＦＸ−１０を用いる産生物クローンの生成を、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールについて記載されているように実施した。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを、バッチ・ローラーボトル培養にて安定的にトランクフェクトされた産生物クローンにより産生し、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して単一ステップで上清液から精製した。
【０１１６】
ファージディスプレー
特許請求する組成物及び／または方法のある特定の実施形態は、様々な標的分子、細胞または組織の結合性ペプチド及び／またはペプチド模倣物に関し得る。結合性ペプチドは、ファージディスプレー技術を含むがこれに限定されない当該分野で公知の任意の方法により同定され得る。ペプチドの多様な集団を産生するための様々な方法のファージディスプレー及び技術が当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，６２２，６９９号及び同第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製するための方法を開示する。ファージディスプレー技術は、低分子ペプチドがバクテリオファージの表面上に発現することができるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを必然的に含む（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８−２５７）。ペプチドに加えて、一本鎖抗体などのより大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面上に呈され得る（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０）。
【０１１７】
所与の臓器、組織、細胞型または標的分子に選択的である標的化アミノ酸配列は、パンニングにより単離され得る（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２）。簡潔には、仮想標的化ペプチドを含有するファージのライブラリをインタクトな生物または単離された臓器、組織、細胞型または標的分子に投与し、結合したファージを含有する試料を回収する。標的に結合するファージは、標的臓器、組織、細胞型または標的分子から溶出され得、次いで、それらを宿主細菌内で成長させることにより増幅する。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、ファージは、数ラウンドのパンニング間で、宿主細菌内で繁殖し得る。ファージにより溶解されるよりむしろ、細菌は、代わりに特定の挿入物を示すファージの複数のコピーを分泌し得る。必要に応じて、増幅したファージは、標的臓器、組織、細胞型または標的分子に再度曝露されてよく、さらなる数ラウンドのパンニングのために回収してよい。複数ラウンドのパンニングが選択的または特異的結合物の集団が得られるまで行われ得る。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム内の標的化ペプチド挿入物に対応するＤＮＡを配列決定することにより決定され得る。同定された標的化ペプチドは、次いで、標準的なタンパク質化学技術により合成ペプチドとして産生され得る（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、サブトラクションプロトコルを使用して、バックグラウンドのファージ結合をさらに減少させてよい。サブトラクションの目的は、目的の標的以外の標的に結合するファージをライブラリから除去することである。代替的な実施形態では、ファージライブラリは、対照の細胞、組織、または臓器に対してプレスクリーニングされてよい。例えば、腫瘍結合性ペプチドは、対照の正常な細胞株に対するライブラリのプレスクリーニングの後に同定されてよい。サブトラクションの後に、目的の分子、細胞、組織、または臓器に対してライブラリをスクリーニングしてよい。サブトラクションプロトコルの他の方法は、例えば、米国特許第５，８４０，８４１号、同第５，７０５，６１０号、同第５，６７０，３１２号、及び同第５，４９２，８０７号に開示されるように知られており、特許請求する方法の実践において使用してよい。
【０１２０】
ナノボディ
ナノボディは、約１２〜１５ｋＤナノボディは、標的抗原を用いるａの大きさ（約１１０の長さのアミノ酸）の単一ドメイン抗体である。ナノボディは、フルサイズ抗体のように、標的抗原に選択的に結合でき、抗原と同様の親和性を有する。しかしながら、サイズが非常に小さいため、ナノボディは、固形腫瘍により良好に浸透することができ得る。この小さなサイズは、ナノボディの安定性にも寄与しており、フルサイズ抗体よりもｐＨ及び温度に対する耐性が高くなる（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １４３１：３７−４６）。当初、単一のドメイン抗体は、ラクダ類（ラクダ、アルパカ、ラマ）が、軽鎖を伴わずに完全に機能的な抗体を有するとの発見に従って開発された（例えば、Ｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１３−２２）。重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。抗体のように、ナノボディは、多価及び／または二重特異性の構築物として開発及び使用され得る。ＩＬ−６Ｒ、ｖＷＦ、ＴＮＦ、ＲＳＶ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７Ａ＆Ｆ及びＩｇＥ（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、ベルギー、ヘント）などの様々な標的抗原に標的化されたナノボディのヒト化形態が商業的に開発されており、癌において臨床的に使用される可能性がある（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８：６００−８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７）。
【０１２１】
ナノボディの血漿半減期は、フルサイズ抗体のそれよりも短く、腎経路により主に排出される。ナノボディはＦｃ領域が欠損しているため、補体依存性細胞傷害を示さない。
【０１２２】
ナノボディは、標的抗原を用いるラクダ、ラマ、アルパカ、またはサメの免疫化、次いで、ｍＲＮＡの単離、ライブラリへのクローニング、及び、抗原結合性についてのスクリーニングにより産生され得る。ナノボディ配列は、標準的な技術によりヒト化され得る（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４）。ヒト化は、ラクダ化ＦＲ配列及びヒトＦＲ配列の間での高い相同性のため、比較的単純である。
【０１２３】
様々な実施形態では、主題のイムノコンジュゲートは、コンジュゲートした薬物の細胞、組織または臓器への標的送達のためのナノボディを含み得る。使用するナノボディは、例えば、米国特許第７，８０７，１６２号；同第７，９３９，２７７号；同第８，１８８，２２３号；同第８，２１７，１４０号；同第８，３７２，３９８号；同第８，５５７，９６５号；同第８，６２３，３６１号及び同第８，６２９，２４４号に開示されており、各々の実施例項は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２４】
コンジュゲーションプロトコル
好ましいコンジュゲーションプロトコルは、中性または酸性ｐＨで容易である、チオール−マレイミド、チオール−ビニルスルホン、チオール−ブロモアセトアミド、またはチオール−ヨードアセトアミド反応をベースとする。これは、例えば、活性エステルを使用するときに必要とされるだろうコンジュゲーションのためのより高いｐＨ条件の必要性を取り除く。例示的なコンジュゲーションプロトコルのさらなる詳細を以下に実施例項にて記載する。
【０１２５】
治療的処置
別の態様では、本発明は、対象を処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の治療用コンジュゲートを対象に投与することを含む、前記方法に関する。本明細書に記載の治療用コンジュゲートを用いて処置され得る疾患には、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、毛髪様細胞白血病）を含むがこれに限定されず、例えば、別のＣＤ２２エピトープ（ｈＲＦＢ４）に対するｈＬＬ２  ＭＡｂ（エプラツズマブ、米国特許第６，１８３，７４４を参照されたい）などの抗ＣＤ２２抗体、またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０またはＨＬＡ−ＤＲなどの他のＢ細胞抗原に対する抗体を使用する。他の疾患には、内胚葉由来消化系上皮の腺癌、乳癌及び非小細胞肺癌などの癌、ならびに他の癌腫、肉腫、グリア系腫瘍、骨髄性白血病等を含むが、これらに限定されない。具体的には、悪性固形腫瘍または造血器腫瘍、例えば、消化管、胃、結腸、食道、肝臓、肺、乳房、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、精巣、脳、骨もしくはリンパ系腫瘍、肉腫または黒色腫により産生されたまたはこれに関連する抗原、例えば、癌胎児性抗原に対する抗体は、有利に使用される。そのような治療剤は、疾患状態及びコンジュゲートの忍容性に応じて、１回または反復して与えられることができ、外科手術、外照射、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子療法等の他の治療様式と任意で組み合わせて使用することもできる。各組み合わせは、腫瘍のタイプ、ステージ、患者の状態及び以前の治療ならびに担当医により考慮される他の因子に適合されるだろう。
【０１２６】
本明細書で用いるとき、「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳類を含むがこれらに限定されない任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）を指す。該用語は、特定の年齢または性別に限られるものではない。したがって、雄または雌にかかわらず、成体及び新生児対象、ならびに胎児が本用語により包含される。本明細書で提供する用量はヒト用であるが、体重または平方メートルサイズに従って、他の哺乳類、ならびに小児の大きさに調整することができる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、ｈＲＳ７  ＭＡｂなどの抗ＥＧＰ−１（抗ＴＲＯＰ−２）抗体を含む治療用コンジュゲートは、その実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２３８，７８５号；同第７，５１７，９６４号及び同第８，０８４，５８３号に記載されるように、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓ならびに前立腺の癌腫などの癌腫を処置するために使用することができる。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号３）；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号４）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号５）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号６）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号７）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号８）を含むヒト化抗体である。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（例えば、ｈＭＮ−１４、ラブレツズマブ（ｌａｂｒｅｔｕｚｕｍａｂ））及び／または抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体（例えば、ｈＭＮ−３またはｈＭＮ−１５）を含む治療用コンジュゲートは、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２８７，８６５号；同第７，９５１，３６９号；同第５，８７４，５４０号；同第６，６７６，９２４号及び同第８，２６７，８６５号に開示されるような、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する様々な癌のいずれかを処置するために使用され得る。抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、またはこの２つの組み合わせを使用して処置され得る固形腫瘍には、乳房、肺、膵臓、食道、甲状腺髄様、卵巣、結腸、直腸、膀胱、口腔及び胃癌が含まれるがこれらに限定されない。消化管、呼吸器、尿生殖器及び乳癌を含む癌腫の大半は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現し、主題のイムノコンジュゲートを用いて処置され得る。ｈＭＮ−１４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ；配列番号９）、ＣＤＲ２（ＷＴＳＴＲＨＴ；配列番号１０）、及びＣＤＲ３（ＱＱＹＳＬＹＲＳ；配列番号１１）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＴＹＷＭＳ；配列番号１２）、ＣＤＲ２（ＥＩＨＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ；配列番号１３）及びＣＤＲ３（ＬＹＦＧＦＰＷＦＡＹ；配列番号１４）を含むヒト化抗体である。
【０１２９】
ｈＭＮ−３抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１５）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１６）及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ、配列番号１７）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１８）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１９）及びＣＤＲ３（ＫＧＷＭＤＦＮＳＳＬＤＹ、配列番号２０）を含むヒト化抗体である。
【０１３０】
ｈＭＮ−１５抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＳＡＳＳＲＶＳＹＩＨ（配列番号２１）；ＧＴＳＴＬＡＳ（配列番号２２）；及びＱＱＷＳＹＮＰＰＴ（配列番号２３）；ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＤＹＹＭＳ（配列番号２４）；ＦＩＡＮＫＡＮＧＨＴＴＤＹＳＰＳＶＫＧ（配列番号２５）；及びＤＭＧＩＲＷＮＦＤＶ（配列番号２６）を含むヒト化抗体である。
【０１３１】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ７４抗体（例えば、ｈＬＬ１、ミラツズマブ、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，４０３号；同第７，３１２，３１８号；同第７，７７２，３７３号；同第７，９１９，０８７号及び同第７，９３１，９０３号に開示される）を含む治療用コンジュゲートは、腎臓、肺、腸、胃、乳房、前立腺または卵巣癌、ならびに多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びホジキンリンパ腫などのいくつかの血液癌を含むがこれらに限定されないＣＤ７４を発現する様々な癌のいずれかを処置するために使用され得る。ｈＬＬ１抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ；配列番号２７）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ；配列番号２８）、及びＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ；配列番号２９）ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ；配列番号３０）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ；配列番号３１）、及びＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ；配列番号３２）を含むヒト化抗体である。
【０１３２】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ２２抗体（例えば、ｈＬＬ２、エプラツズマブ、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８９，５５４号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１８７，２８７号；同第６，３０６，３９３号；同第７，０７４，４０３号及び同第７，６４１，９０１号に開示される、またはキメラもしくはヒト化ＲＦＢ４抗体）を含む治療用コンジュゲートは、緩慢性形態のＢ細胞リンパ腫、侵攻性形態のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫またはびまん性Ｂ細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されないＣＤ２２を発現する様々な癌のいずれかを処置するために使用され得る。ｈＬＬ２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＡＮＨＫＹＬＡ、配列番号３３）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号３４）、及びＣＤＲ３（ＨＱＹＬＳＳＷＴＦ、配列番号３５）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＷＬＨ、配列番号３６）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＲＮＤＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ、配列番号３７）、及びＣＤＲ３（ＲＤＩＴＴＦＹ、配列番号３８）を含むヒト化抗体である。
【０１３３】
好ましい実施形態では、ｈＭｕ−９  ＭＡｂなどの抗ＣＳＡｐ抗体を含む治療用コンジュゲートは、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９６２，７０２号；同第７，３８７，７７２号；同第７，４１４，１２１号；同第７，５５３，９５３号；同第７，６４１，８９１号及び同第７，６７０，８０４号に開示されるように、結腸直腸、ならびに膵臓及び卵巣癌を処置するために使用することができる。ｈＭｕ−９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号３９）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号４０）、及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＲＶＰＹＴ、配列番号４１）、ならびに重鎖可変ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＥＹＶＩＴ、配列番号４２）、ＣＤＲ２（ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫ、配列番号４３）、及びＣＤＲ３（ＥＤＬ、配列番号４４）を含むヒト化抗体である。
【０１３４】
ｈＰＡＭ４  ＭＡｂを含む治療用コンジュゲートは、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２３８，７８６号及び同第７，２８２，５６７号に開示されるように、膵臓癌または他の固形腫瘍を処置するために使用することができる。ｈＰＡＭ４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列（ｓｅｑｕｅｎｃｓ）ＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号４５）；ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号４６）；及びＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号４７）；ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４８）；ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号４９）及びＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号５０）を含むヒト化抗体である。
【０１３５】
別の好ましい実施形態では、ＩＭＭＵ３１などの抗ＡＦＰ  ＭＡｂを含む治療用コンジュゲートは、その実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３００，６５５号に開示されるように、肝細胞癌腫、胚細胞腫瘍、及び他のＡＦＰ産生腫瘍をヒト化、キメラ及びヒト抗体形態を使用して処置するために使用することができる。ＩＭＭＵ３１抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＩＨ、配列番号５１）、ＣＤＲ２（ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５２）及びＣＤＲ３（ＳＧＧＧＤＰＦＡＹ、配列番号５３）ならびに軽鎖ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧ、配列番号５４）、ＣＤＲ２（ＹＴＳＡＬＬＰ、配列番号５５）及びＣＤＲ３（ＬＱＹＤＤＬＷＴ、配列番号５６）を含むヒト化抗体である。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、ｈＬ２４３などの抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｍａｂを含む治療用コンジュゲートは、その実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６１２，１８０号に開示するように、リンパ腫、白血病、皮膚、食道、胃、結腸、直腸、膵臓、肺、乳房、卵巣、膀胱、子宮内膜、子宮頸部、精巣、腎臓、肝臓の癌、黒色腫または他のＨＬＡ−ＤＲ産生腫瘍を処置するために使用することができる。ｈＬ２４３抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号５７）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号５８）、及びＣＤＲ３（ＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹ、配列番号５９）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ、配列番号６０）、ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＬＡＤ、配列番号６１）、及びＣＤＲ３（ＱＨＦＷＴＴＰＷＡ、配列番号６２）を含む、ヒト化抗体である。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、ベルツズマブ（ｈＡ２０）、１Ｆ５、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、またはリツキシマブなどの抗ＣＤ２０  ＭＡｂを含む治療用コンジュゲートは、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４３５，８０３号または同第８，２８７，８６４号に開示するように、リンパ腫、白血病、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病を処置するために使用することができる。ｈＡ２０（ベルツズマブ）抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号６３）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号６４）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号６５）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号６６）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号６７）及びＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号６８）を含む、ヒト化抗体である。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、ｈＡ１９などの抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む治療用コンジュゲートは、各々の実施例項が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１０９，３０４号、同第７，４６２，３５２号、同第７，９０２，３３８号、同第８，１４７，８３１号及び同第８，３３７，８４０号に開示するように、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病または急性リンパ芽球性白血病などのＢ細胞関連リンパ腫及び白血病を処置するために使用することができる。ｈＡ１９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号６９）；ＣＤＲ２  ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号７０）；及びＣＤＲ３ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号７１）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＳＹＷＭＮ（配列番号７２）；ＣＤＲ２  ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号７３）及びＣＤＲ３  ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号７４）を含むヒト化抗体である。
【０１３９】
抗テネイシン抗体を含む治療用コンジュゲートは、造血器及び固形腫瘍を処置するために使用することができ、テネイシンに対する抗体を含むコンジュゲートは、固形腫瘍、好ましくは、神経膠芽腫のような脳癌を処置するために使用することができる。
【０１４０】
好ましくは、ヒト疾患の処置において使用される抗体は、抗体のヒトまたはヒト化（ＣＤＲ移植）版であるが；抗体のマウス及びキメラ版を使用することができる。送達剤として同種のＩｇＧ分子が免疫応答を最小化するために大部分で好ましい。これは、反復処置を考慮する際に特に重要である。ヒトについては、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者からの抗ＩｇＧ免疫応答を生成する可能性が低い。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上の内部移行抗原に結合した後に迅速に内部移行するが、これは、運ばれている化学療法薬も同じく細胞内も迅速に内部移行されることを意味する。しかしながら、内部移行の速度が遅い抗体も選択的治療を有効にするために使用することができる。
【０１４１】
当業者は、抗体または抗体断片にコンジュゲートしたカンプトテシンまたはアントラサイクリンを含む主題のイムノコンジュゲートが、単独でまたは１つもしくは複数の他の治療剤、例えば、二次抗体、二次抗体断片、第二のイムノコンジュゲート、放射性核種、毒素、薬物、化学療法剤、放射線療法、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡと併用されてよいことを認識するだろう。そのような追加の治療剤は、主題の抗体−薬物イムノコンジュゲートと別々に、併用で、または付着して投与されてよい。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートと併用して使用される治療剤は、１つまたは複数の同位体を含み得る。罹患した組織を処置するために有用である放射性同位体は、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７Ｔｈ及び２１１Ｐｂを含むが、これらに限定されない。治療用放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体で２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体で１００〜２，５００ｋｅＶの範囲、アルファ放射体で４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放射粒子で実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２。有用なベータ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。また、アルファ粒子の生成で実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種には、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７、及びＦｍ−２５５が含まれるが、これらに限定されない。有用な粒子を放射する放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは、３，０００ｋｅＶ〜８，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは、４，０００ｋｅＶ〜７，０００ｋｅＶである。さらに使用される可能性のある放射性同位体には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが含まれる。
【０１４３】
例えば、抗体またはコンジュゲートに付着しているキレート基を使用して、放射性核種および他の金属を送達し得る。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡなどの大環状キレート剤は、様々な金属及び放射性金属を伴って、とりわけ、それぞれ、ガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種を伴って使用される。そのような金属−キレート複合体は、環サイズを目的の金属に仕立てることにより非常に安定的に作成されることができる。２２３Ｒａを複合体化するための大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤を使用してよい。
【０１４４】
本明細書に記載のイムノコンジュゲートと併用で使用する治療剤には、例えば、化学療法剤、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、タキサン、代謝拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害薬、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤及びアポトーシス促進剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、他のカンプトテシン、ならびに抗癌剤のこれら及び他のクラス由来の他のもの等も含まれる。他の癌化学療法薬には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモン、等が含まれる。好適な化学療法剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、及びＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬物などの他の好適な化学療法剤は、当業者に公知である。
【０１４５】
使用される例示的な薬物には、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスフェート、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、オラパリブ、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９が含まれるがこれらに限定されない。このような薬剤は、本明細書に記載のコンジュゲートの一部であり得るか、またあるいは本記載のコンジュゲートと併用して、そのコンジュゲートの前、同時または後に投与され得る。あるいは、当該分野で公知である１つまたは複数の治療用裸抗体は、本記載のコンジュゲートと併用して使用され得る。例示的な治療用裸抗体は、上述している。
【０１４６】
イムノコンジュゲートと調和して使用され得る治療剤は、標的化部分にコンジュゲートした毒素も含み得る。これに関して使用され得る毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素が含まれる（例えば、Ｐａｓｔａｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１，及びＳｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；５６（４）：２２６−４３を参照されたい）。本明細書での使用に好適な追加の毒素は、当業者に公知であり、Ｕ．Ｓ．６，０７７，４９９に開示されている。
【０１４７】
治療剤のなおも別のクラスは、１つまたは複数の免疫調節剤を含み得る。使用される免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン及びそれらの組み合わせから選択されてよい。特に有益なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロンα、β、γまたはλなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子である。サイトカインの中に含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロンα、β、γ及びλなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５などの、インターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びリンホトキシン（ＬＴ）である。本明細書で用いるとき、サイトカインという用語は、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質及び未変性配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０１４８】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ及びＩＰ−１０が含まれる。
【０１４９】
製剤及び投与
コンジュゲートの好適な投与経路には、経口、非経口、皮下、直腸、経粘膜、腸投与、筋肉内、髄内、くも膜下腔内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼球内注射が含まれるが、これらに制限されるものではない。好ましい投与経路は、非経口である。あるいは、例えば、固形腫瘍内に直接化合物を注射することを介して、全身様式よりむしろ局所にて化合物を投与してよい。
【０１５０】
イムノコンジュゲートは、薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化されることができ、それによりイムノコンジュゲートは薬学的に好適な賦形剤と共に混合物中に組み合わされる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、及びそれらの改訂版を参照されたい。
【０１５１】
好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）；及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を使用するグッドの生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）中で製剤化される。より好ましい緩衝液は、ＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは、２０〜１００ｍＭの範囲、より好ましくは約２５ｍＭの濃度である。最も好ましいものは、２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５である。本製剤は、２５ｍＭトレハロース及び０．０１％ｖ／ｖポリソルベート８０を賦形剤としてさらに含んでよく、最終緩衝液濃度は、賦形剤を添加した結果２２．２５ｍＭへと修正される。保存の好ましい方法は、コンジュゲートの凍結乾燥製剤としてであり、−２０℃〜２℃の温度範囲で保存し、最も好ましくは、２〜８℃で保存される。
【０１５２】
イムノコンジュゲートは、例えば、ボーラス注射、低速注入または持続注入を介する静脈内投与用に製剤化することができる。好ましくは、本発明の抗体は、約４時間未満の期間にわたって、及びより好ましくは、約３時間未満の期間にわたって注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇは、３０分以内、さらに好ましくは１５分以内で注入され得、残りが次の２〜３時間にわたって注入され得る。注射用の製剤は、添加保存剤を伴って単位財形、例えば、アンプルまたは複数用量容器で存在することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおいて懸濁剤、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／または分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に、例えば滅菌パイロジェン不含水などの好適なビヒクルと共に構成するための粉末形態であることができる。
【０１５３】
追加の薬学的方法を採用して、治療用コンジュゲートの作用の持続期間を制御してよい。制御放出調製物は、イムノコンジュゲートを複合体化するまたは吸収するためにポリマーを使用して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）のマトリックスならびにステアリン酸二量体及びセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスを含む。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。このようなマトリックスからのイムノコンジュゲートの放出速度は、イムノコンジュゲートの分子量、マトリックス内のイムノコンジュゲートの量、及び分散粒子の大きさに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，上記。他の固形剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにこれらの改訂版に記載される。
【０１５４】
一般的に、ヒトに投与されるイムノコンジュゲートの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身健康状態、及び既往歴などの因子に応じて変動するだろろう。単回静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲のイムノコンジュゲートの投与量をレシピエントに提供することが望ましくあり得るが、状況に応じてより低いまたは高い投与量が投与されてもよい。１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量とは、例えば、７０ｋｇの患者に７０〜１，４００ｍｇ、または１．７ｍの患者に４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。投与量は、例えば、４〜１０週間にわたり週１回、８週間にわたり週１回、４週間にわたり週１回、必要に応じて反復してよい。維持療法において必要に応じて、頻度を減らして与えてもよく、例えば、数カ月にわたって隔週、または多くの月にわたって月１回または年に４回などである。好ましい投与量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇが含まれるが、これらに限定されない。１〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量が使用されてよい。この投与量は、好ましくは、複数回、週に１回または２回投与される。４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間またはより長い最小投薬スケジュールを使用してよい。投与のスケジュールは、（ｉ）週１回；（ｉｉ）隔週；（ｉｉｉ）１週間の治療の後、２、３、または４週間の休薬、（ｉｖ）２週間の治療の後、１、２、３、または４週間の休薬、（ｖ）３週間の治療の後、１、２、３、４、または５週間の休薬、（ｖｉ）４週間の治療の後、１、２、３、４、または５週間の休薬、（ｖｉｉ）５週間の治療の後、１、２、３、４、または５週間の休薬、及び（ｖｉｉｉ）月１回からなる群より選択されるサイクルでの週１回または２回の投与を含んでよい。このサイクルは、４、６、８、１０、１２、１６または２０回またはそれ以上反復されてよい。
【０１５５】
あるいは、イムノコンジュゲートは、２または３週間ごとに１投与量として投与されてよく、合計で少なくとも３投与量にわたって反復されてよい。または、週２回を４〜６週間。投与量が、おおよそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２まで低くなると（１．７ｍ患者に対して投与量あたり３４０ｍｇ、または７０ｋｇ患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）、それは、４〜１０週間にわたって週１回またはさらには週２回投与されてよい。あるいは、投与量スケジュールは低減され、すなわち、２〜３カ月にわたって２または３週毎になってよい。しかしながら、１２ｍｇ／ｋｇを週１回または２〜３週間に１回などのさらに高い用量を、低速静脈内注入により反復投薬サイクルにわたって投与することができると決定されている。投薬スケジュールは、他の間隔で任意で反復することができ、投与量は、用量及びスケジュールを適切に調節して、様々な非経口経路を通して与えられ得る。
【０１５６】
好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートは、癌の治療に使用される。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、黒色腫、肉腫、及び白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性腫瘍を含むが、これに限定されない。そのような癌のより具体的な例は以下に記され、扁平上皮癌（例えば、上皮の扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、消化管癌を含む胃部または胃癌、膵臓癌、多形性神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝がん、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化型甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎部または腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭頚部癌を含む。「癌」という用語は、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、元々の悪性細胞または腫瘍部位以外の対象の体内の部位にその細胞が移入していないもの）及び二次悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、元々の腫瘍の部位と異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移入から生じるもの）を含む。
【０１５７】
癌または悪性腫瘍の他の例には、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部及び視覚路膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体及びテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚路及び視床下部膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、外分泌膵臓癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼の癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、毛髪様細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、原発転移性扁平上皮性頸部癌、転移性扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、境界悪性卵巣腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、移行性腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に挙げた臓器系に位置す��新生物のほかの任意の他の過剰増殖疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
本明細書に記載及び特許請求する方法及び組成物は、悪性または前悪性状態を処置するため、及び上記の障害を含むがこれらに限定されない新生物または悪性状態への進行を防ぐために使用してよい。そのような使用は、新生物または癌への先行進行が知られているまたは疑われる状態において示され、具体的には、過形成、化生、また特に、異形成からなる非新生物細胞増殖が生じている場合である（そのような異常増殖状態の概説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照されたい）。
【０１５９】
異形成は、しばしば癌の前兆であり、主に上皮に見られる。異形成は、非新生物細胞増殖のうちの最も障害が重い形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造的な定位の喪失を必然的に含む。異形成は、特徴的に慢性刺激または炎症の存在する場所で起こる。処置することができる異形成障害には、無汗性外胚葉性異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頚部上異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋骨異形性、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根骨足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成症、骨幹異形成、外胚葉性異形成、エナメル質異形成、脳眼形成不全症、骨端異形成半肢症、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮性異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨性異形成、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉性異形成、発汗減少症性外胚葉性異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳房異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディニ異形成、単発性線維性異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼底下顎骨異形成、根尖端セメント質異形成、多発性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
処置することができる追加の前新生物障害には、良性異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性病態状態、組織肥大、腸ポリープまたはアデノーマ、及び食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、太陽性口唇炎、及び日光角化症が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６１】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、特に上に挙げる癌における、癌の増殖、進行、及び／または転移を阻害するために使用される。
【０１６２】
追加の過剰増殖性疾患、障害、及び／または状態には、悪性腫瘍及び関連する障害、例えば、白血病（急性白血病；例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球白血病［骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病を含む］）及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄球［顆粒球性］白血病及び慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺腫、皮脂腺腫、乳頭腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌腫、肝がん、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない固形癌の、進行、及び／または転移を含むがこれらに限定されない。
【０１６３】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）
特定の実施形態では、本発明は、トリプルネガティブ乳癌のネオアジュバント処置のためのＡＤＣイムノコンジュゲートの使用に関する。ＴＮＢＣは、用語が示すように、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体（ＥＲ、ＰＲ）、ならびにＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の発現を欠いている乳癌を指す。この種は、全侵襲性乳癌の約１５〜２０％を構成し、非常に悪性である。ＴＮＢＣ患者は、他の乳癌と比較して遠隔再発及び死亡の割合が高く（Ｍｉｌｌｉｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２００８；１０９：１２３−１３９）、転移性疾患を伴うこれらの生存期間中央値はたった１３カ月である（Ｋａｓｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；９：２９−３３）。罹病率に関しては、ＴＮＢＣは、若年患者、ＢＲＣＡ１突然変異保有者、ならびに特定の民族、例えばアフリカ系アメリカ人及びヒスパニック系の女性においてより頻繁にみられる（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２００７，１０９：１７２１−１７２８；Ｓｏｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３，１００：８４１８−８４２３；２６−２８；Ｆｏｕｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０，３６３：１９３８−１９４８）。これは、生殖細胞系列遺伝的背景が、ＴＮＢＣの転写及び分化において役割を果たしていることを示す。組織学的に、大半のＴＮＢＣ腫瘍は、侵襲性乳管腫であり、組織学的グレードが高く、腫瘍サイズが大きく、診断時にはリンパ節転移陽性であることが非常に多い（Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７，１３：４４２９−４４３４）。予後は、転移の挙動に関連し、サブタイプにより転移のパターンは異なる。乳癌は、一般的に、骨に転移するが、基底様疾患は、脳、肺、及び遠隔リンパ節への転移が多数を占める（Ｋｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０，２８：３２７１−３２７７；Ｓｉｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１，１３：Ｒ８７）。非基底形態は、類似したパターンの転移を示すが、肝臓への転移がより頻繁である。
【０１６４】
Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１１，１２１（７）：２７５０−２７６７）は、ＴＮＢＣに対する６つの特定の分子サブタイプを提案した：２つの基底様、ＢＬ１及びＢＬ２、これは最も罹患率が高く、基底様内因性サブタイプに類似しているためにこの命名を受け、遺伝子の発現は、サイトケラチン５、６または１７などこのような細胞により発現される；３つ目は、免疫調節系サブタイプ；間葉系（Ｍ）及び間葉系幹細胞様（ＭＳＬ）サブタイプ；ならびに６つ目は、管腔アンドロゲン受容体（ＬＡＲ）である。
【０１６５】
基底様腫瘍は、ＴＰ５３の高度な増殖及び頻繁な突然変異を示し、ＢＲＣＡ１突然変異状態に関連する。そのような腫瘍は、ＢＲＣＡ突然変異保有者においてＢＲＣＡの不活性化を伴う相同組換えにおける欠失によりＤＮＡ修復が調節不能になっていると考えられる（Ｒｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０，７：７１８−７２４）。ＢＬ１サブ系統は、シスプラチンに優先的に応答することが見出されており、これはグアニン架橋の形成を通してＤＮＡ損傷を引き起こす。いくつかの臨床治験が、基底様ＴＮＢＣにおけるプラチナ製剤の役割を評価している及び評価を継続している（Ａｄｅｍｕｙｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｎｃ  ２０１３；２０１３：２１９８６９）。ＬＡＲ型は、抗アンドロゲン受容体処置に応答する可能性があるが、これは臨床評価中である。
【０１６６】
ＴＮＢＣの処置は、典型的な乳癌と同様、現在利用可能な標的療法がないため、外科手術、放射線療法、及び化学療法を必然的に含む。最も有効な化学療法剤は、アントラサイクリン及びタキサンである。７つのネオアジュバント臨床治験のメタアナリシスは、病理学的完全奏効（乳房及びリンパ節における侵襲性乳癌の不在）がアントラサイクリン及びタキサンを用いた治療を受けた患者の３６％で達成されたことを示した（ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２，３０（１５）：１７９６−１８０４）。ＴＮＢＣにおけるネオアジュバント療法の様々な治験の概要は、様々な組み合わせで与えられた、ドキソルビン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｎ）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ゲムシタビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｃｉｔａｂｉｎｅ）、ビンクリスチン、シスプラチン、及びカルボプラチン、などの一般的な癌に対する薬物が、１００人を超える患者を含む治験において、２８〜５２％のｐＣＲ率をもたらしたことを示している（Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１３  Ｏｃｔ；１８３（４）：１０６４−１０７４）。プラチナ含有レジメンは乳癌において有効であるが、ＴＮＢＣでは、かかるレジメンは同等に優れているわけではないという結果を示している（Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１３  Ｏｃｔ；１８３（４）：１０６４−１０７４）。エピルビシン、シクロホスファミド、及びドカタキセル（ｄｏｃａｔａｘｅｌ）のレジメンにカルボプラチンを加えても、ネオアジュバント設定におけるカルボプラチン添加の利点を示さなかった（Ａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１２  Ｎｏｖ；１３６（２）：４８７−４９３）。
【０１６７】
一般に、ＴＮＢＣを有する患者は、ＥＲ陽性、ＨＥＲ２陰性腫瘍を有する患者よりも化学療法に対する応答が高いが、逆説的にＴＮＢＣを有する患者の転帰の方が不良である（Ｃａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ａｐｒ  １５；１３（８）：２３２９−２３３４）。ＴＮＢＣにおけるｐＣＲ率は２０％またはそれより高くあることができ（Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１３  Ｏｃｔ；１８３（４）：１０６４−１０７４）、応答しているものは良好な長期転帰を有するが、ＴＮＢＣ患者の大半はｐＣＲを達成せず、ゆえに、ＥＲ＋疾患を有する患者よりも侵攻して進行する（Ｃａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ａｐｒ  １５；１３（８）：２３２９−２３３４；Ｌｉｅｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００８  Ｍａｒ  １０；２６（８）：１２７５−１２８１）。ｐＣＲを達成しないＴＮＢＣ患者については、再発率は、５年の期間にわたって４０から５０％の間であり（ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２，３０（１５）：１７９６−１８０４；Ｌｉｅｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００８  Ｍａｒ  １０；２６（８）：１２７５−１２８１）、これはＴＮＢＣ患者の化学療法感受性が高いにもかかわらず転帰が不良であることを実証する。これは、ＴＮＢＣにおいてより高いｐＣＲ率を達成するための新規化学療法剤に対する、まだ満たされていない重大な必要性を強調する。
【０１６８】
ＰＡＲＰ阻害剤及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤などの生物学的治療剤も、ＴＮＢＣを有する患者において評価されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５；２３（８）：１７８２−１７９０；ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６６（４）：２９９−３０９）。実際、ＴＮＢＣがＢＲＣＡ関連乳癌に対して臨床的類似性を有するため、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＴＮＢＣの治療について魅力的な候補であるが、これはまだ実証されていない。しかしながら、ＩＭＭＵ−１３２は、トポイソメラーゼＩ阻害剤と同様の作用機序を有し（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）、転移性ＴＮＢＣを有する患者、ならびにＴＮＢＣ細胞株において単独療法として臨床的退縮を示している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９及び以下の実施例）。
【０１６９】
ＴＮＢＣネオアジュバント療法におけるＩＭＭＵ−１３２
ある特定の実施形態は、抗ＴＲＯＰ−２  ｈＲＳ７抗体に付着しているＳＮ−３８カンプトテシン型薬物の多数のコピーを含むＡＤＣである、ＩＭＭＵ−１３２のＴＮＢＣにおけるネオアジュバント使用に関する。ＳＮ−３８は、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）の活性代謝産物であり、乳癌における標準的な薬物ではないが、ＴＮＢＣにおいて固有の治療的利益を提供し得る。ＢＲＣＡ１突然変異を発現する癌に対してＴＮＢＣがその表現型において類似しており、それゆえ、ＢＲＣＡに伴うＤＮＡ修復機序における欠失に起因して、かかるＢＲＣＡ１患者において有効である、プラチナ製剤及びアルキル化剤、ならびにトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、トポテカン及びイリノテカンのようなカンプトテシン）などの、薬剤に反応性である可能性があると想定されている。これらは、二重鎖ＤＮＡの切断を誘導し、ＤＮＡ修復に影響を与え、細胞死を引き起こすことにより作用する（Ｈａｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：７９７０−７９８０）。ポリ（アデノシン二リン酸リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を阻害する同様の作用機序は、ＢＲＣＡ同様、ＤＮＡ修復においても重要な役割を果たすが、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＤＮＡの１つの鎖に損傷を引き起こし、これは、ＢＲＣＡ突然変異及びＰＡＲＰ阻害のために、相同組換えにより修復することができない。
【０１７０】
本発明者らは、ＴＮＢＣ（及び他の上皮癌）において発現が増強されているタンパク質（ＴＲＯＰ−２）を選択的に標的とするヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）にコンジュゲートした、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ−３８を含むイムノコンジュゲートＩＭＭＵ−１３２が、ＰＡＲＰ阻害を介してＤＮＡ鎖を切断する同様の効果を有することを見出している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）。それゆえ、このイムノコンジュゲートは、ＴＮＢＣの併用療法において高い毒性を有する、プラチナ及び他のＤＮＡ損傷薬物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）を置き換え得る。転移性ＴＮＢＣを含む転移性固形癌を有する患者におけるＩＭＭＵ−１３２を用いた現在の結果は、親イリノテカン薬物よりも忍容性が良好であることを示しており、これは、イリノテカンが与えられときよりも制御しやすい毒性を伴うその明らかに高い治療指数のためである。イリノテカン及びトポイソメラーゼＩ阻害剤が、ＴＮＢＣを含む乳癌において活性であると知られていないものの、ＩＭＭＵ−１３２を用いるＴＮＢＣにおける現在の治験は、それが転移性ＴＮＢＣにおいて有効であることを示しており（Ｓｔａｒｏｄｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：５ｓ，２０１４（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ３０３２））、これは、おそらく、ＴＮＢＣ細胞細胞上のＴＲＯＰ−２タンパク質に対するキャリア抗体の選択的結合により、イリノテカンが与えられるときよりも腫瘍部位を標的とするこのＤＮＡ損傷薬物の割合が高いためである（以下の実施例において記載される前臨床知見に基づく）。実際、本発明者らの前臨床試験は、ＴＮＢＣ異種移植モデルにおけるＩＭＭＵ−１３２の活性を実証している。ＩＭＭＵ−１３２の他の特性は、それが内部移行抗体（ＲＳ７）を必然的に含み、ゆえに、標的癌細胞内に、毒性薬、つまりＳＮ−３８を選択的に組み込むことである。さらに、ＩＭＭＵ−１３２の標的である、ＴＲＯＰ−２は、カルシウムシグナル伝達タンパク質であり、多くの上皮癌により正常細胞よりも高量で発現され、いくつかの癌において、悪性腫瘍の増加の予後指標であると示されている。様々な進行固形癌、ならびにＴＮＢＣの両方におけるＩＭＭＵ−１３２を用いる現在の実験は、以下に記載し、一部公表されている（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）、前臨床ヒト癌異種移植片試験の結果を実証する。
【０１７１】
ＴＲＯＰ−２は、ＩＭＭＵ−１３２イムノコンジュゲートの標的抗原であり、３６−ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、肺、乳房、結腸直腸、膵臓、前立腺及び卵巣を含む様々なヒト癌腫上で発現される（例えば、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１；７８：５１４７−５１５０；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９０；５０：１３３０−１３３６；Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９９２；１１：５３９−５４５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７：２８０−２８５；Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９；１７９６：３０９−３１４を参照されたい）。それは、カルシウムシグナル伝達物質として機能し（Ｒｉｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７６：６７１−６７６）、細胞移入及び足場非依存性増殖につながると示されている（Ｈａｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：７９７０−７９８０）。重要なことに、ＴＲＯＰ−２の高発現は、疾患の侵攻及び予後の不良に関連し、それにより癌療法の理想的な標的となっている（Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００５；９６：６６８−６７５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７：２８０−２８５；Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９；１７９６：３０９−３１４）。
【０１７２】
ＳＮ−３８は、水性媒体におけるその不溶性のためにそのまま使用することはできない。活性薬物であるＳＮ−３８へのイリノテカンの生体変換は、非常に非効率的であり、患者変動性でもある。ＳＮ−３８を標的部位に直接利用可能にするために、ＳＮ−３８の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、抗ＴＲＯＰ−２（ｈＲＳ７）抗体と共に調製した。多くのリンカーを調査し、１つ、「ＣＬ２Ａ」を最適に作用するリンカーであるとした選出した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９；Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８．５１，６９１６−６９２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：６０５２−６０６１；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２０１３  Ｊｕｎ；１２（６）：９６８−９７８）。コンジュゲーション部位及び薬物切断部位を示すＳＮ−３８誘導体のコンジュゲートである、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を図１に示す。穏やかに還元されたｈＲＳ７へのＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のコンジュゲーションは記載されている（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８．５１，６９１６−６９２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：６０５２−６０６１）、ＴＲＯＰ−２＋細胞株への抗原結合性は、ＡＤＣにて保存され、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏで多くのＴＲＯＰ−２＋細胞株にて、遊離薬物へのそれに類似する一桁のナノモル強度も呈する。平均薬物−抗体置換率（ＤＡＲ）は、質量スペクトル測定により７．６であると決定され、これは吸光度測定によって裏付けられた。非コンジュゲート遊離薬物のレベルは５％未満であり、臨床グレードの調製物の規格限界以内である。
【０１７３】
ＡＤＣの大規模調製物は、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８成分及びＡＤＣの両方のｃＧＭＰ条件及びＱＡ監視下で、２００グラム規模の抗体で実施されている。現在までにコンジュゲートの８つのかかる調製物（８×２００グラム）を調製し、生成物を１００ｍｇのアリコートにして凍結乾燥調製物として２〜８℃で保存した。保管に対する調製物の安定性は、現在３年間にわたって文書化されている。
【０１７４】
３７℃、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト血清において、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、約２４時間内に５０％の遊離薬物を放出すると示されている。ＣＬ２Ａリンカーは、異なる、非常に安定した、リンカーを有するコンジュゲートと比較して、遥かに高いバイオアベイラビリティの遊離薬物をもたらす。これは、遊離薬物の遊離が抗体コンジュゲートの内部移行及びその後の細胞処理に左右されないためであり、これが腫瘍表面上の抗原密度が低い状況においてもそれを魅力的にする。
【０１７５】
ＴＮＢＣにおける代替エンドポイントとしての病理学的完全奏効（ｐＣＲ）
ｐＣＲは、ＴＮＢＣを有する患者におけるネオアジュバント療法治験の容認エンドポイントとなっている（Ｂａｒｄｉａ＆Ｂａｓｅｌｇａ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３  Ｄｅｃ  １；１９（２３）：６３６０−６３７０；Ａｄｅｍｕｙｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｎｃ  ２０１３；２０１３：２１９８６９；Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ。業界用ドラフトガイダンス：Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｕｓｅ  ａｓ  ａｎ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏｖａｌ．Ｍａｙ  ２０１２）。ｐＣＲは、ＦＤＡガイダンス書類において「ネオアジュバント全身療法の完了後に、摘出した乳房検体及び［全ての採取した］同側リンパ節のヘマトキシリン・エオシン評価上でいずれの侵襲性癌も残存しない（すなわち、現行のＡＪＣＣ病期分類システムにおいてｙｐＴ０ｙｐＮ０である）として」既定されている（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．業界用ドラフトガイダンス：Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｕｓｅ  ａｓ  ａｎ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏｖａｌ．Ｍａｙ  ２０１２）（イタリック強調を追加）［訳者注：［全ての採取した］が強調されている箇所である］。これにより、転移性疾患の設定よりも比較的少数の患者で素早く薬物を検査することが可能になるが、ネオアジュバント療法の開始後６カ月以内またはそれより早期の外科手術の結果に基づく迅速な（暫定的な）薬物承認をもたらす可能性がある外科手術での有効性の評価、治療成功期間（ＥＦＳ）及び全生存（ＯＳ）率を決定するための経過観察は、最終的な薬物承認につながる臨床的利益を実証するために依然として必要とされている。承認の迅速化のためのこの道筋は、遥かに早く一般使用に薬物を利用可能にし、様々な臨床試験及び設定におけるその包含を拡大し、これがＴＮＢＣの外科手術に直面している女性に非常に迅速な利益を提供することができることを意味する。ＩＭＭＵ−１３２の毒性プロファイルが、同様の作用機序を扱うプラチナ製剤及びＰＡＲＰ薬物よりも真に優れているならば、この新規治療剤の追加は、ＴＮＢＣ治療のネオアジュバントにおける（ならびに、おそらく補助剤及び転移性設定でも）パラダイムシフトを引き起こす可能性がある。また、ＩＭＭＵ−１３２の標的であるＴＲＯＰ−２が、非トリプルネガティブ（ＴＮ）腫瘍においても高率で発現されるため、この薬剤は、これらの他の乳癌型においても特有の活性を示し得る。転移性及び早期ＴＮＢＣの治療における有望な結果は、非ＴＮ癌を有する患者においてもこの薬剤の研究を奨励するだろう。
【０１７６】
１つのメタアナリシスで検討されたＴＮＢＣに対するネオアジュバント治験のうち、３つの治験のみが、長期無病生存期間及びＯＳを報告し、これらは、プラチナ系ネオアジュバント療法を受けた患者に対して優れていた（Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１４；１４４：２２３−２３２）。ｐＣＲを乳房及び腋窩にて達成した（ｙｐＴ０Ｎ０）ＴＮＢＣを有する患者は、疾患が残存している患者よりも良好な治療成功期間を有した。１１，９５５人の患者を含む１２件の国際治験のなおも別の分析では、ＴＮＢＣにおけるｐＣＲが、改善されたＥＦＳ及びＯＳに対する代替エンドポイントであると証明された（Ｃｏｒｔａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４  Ｊｕｌ  １２；３８４（９９３８）：１６４−１７２）。ＥＦＳに関して、例えば３年で、非ｐＣＲのＴＮＢＣ患者の約６０％に対して、ｐＣＲ患者は９０％の割合を示した（Ｃｏｒｔａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４  Ｊｕｌ  １２；３８４（９９３８）：１６４−１７２）。
【０１７７】
結論として、ネオアジュバント化学療法は、ＴＮＢＣを有する患者の反応性サブグループの標準治療となっているが、事実、好ましいとして確立されている特定の治療レジメンはなく；タキサン及びアントラサイクリンの使用だけが標準的な様式であるとみられている。以前の全身処置に失敗している転移性ＴＮＢＣ患者において良好な活性を示す新規の標的療法剤を加えることが、ネオアジュバント設定において最良及び最速で評価され得、ここでそれは従来の併用療法に加えられ、この候補治療剤を伴わない同一治療と比較される。比較対照薬治験における新規薬剤の検査は、標準療法を確立することを助け得、また他のサブグループにまで反応性タイプの拡大を可能にし、患者に対して高レベルの毒性で現在達成されているレベルを超えてｐＣＲ奏効率を増加させる可能性がある。タキサン及びシクロホスファミドと組み合わせたアントラサイクリンがＴＮＢＣにおいて高いｐＣＲ率を提供することは通常合意されている（ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ＆Ｆｏｎｔａｎｅｌｌａ，Ｂｒｅａｓｔ  ２０１３  Ａｕｇ；２２  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１４９−Ｓ１５１）が、これは高い毒性を伴う。シスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ製剤の添加も、調査中である。以下の試験は、ＩＭＭＵ−１３２を、トポイソメラーゼＩ阻害剤として、ＴＡＣレジメンに添加することを評価しており、それはカルボプラチンがＴＡＣと併用すると毒性が増加するためである。この取り組みは、より多くの乳房保存、より忍容性のある処置、及び治癒率の増加をもたらすはずである。
【０１７８】
キット
様々な実施形態は、患者を処置するために好適な構成要素を含有するキットに関し得る。例示的なキットは、本明細書に記載の少なくとも１つのコンジュゲートされた抗体または他の標的化部分を含有してよい。投与するための成分を含有する組成物が、経口送達によるものなどの消化管を介する送達用に製剤化されていない場合、いくつかの他の経路を通してキット構成要素を送達することができるデバイスが含まれ得る。非経口送達などの用途のためのデバイスの１タイプは、組成物を対象の体内に注入するために使用されるシリンジである。吸入デバイスも使用してよい。
【０１７９】
キット構成要素は、一緒に包装されてよいか、または２つ以上の容器に分離されてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に好適な組成物の滅菌された凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってよい。キットは、他の試薬の再構成及び／または希釈に好適な１つまたは複数の緩衝液も含有してよい。使用され得る他の容器には、パウチ、トレイ、箱、管等が含まれるがこれらに限定されない。キット構成要素は、包装されて容器内で滅菌されて維持され得る。含むことができる別の構成要素は、キットを使用する人のための使用説明書である。
【実施例】
【０１８０】
本発明の様々な実施形態を、以下の実施例により説明するが、本発明の範囲を限定しない。
【０１８１】
実施例１．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８イムノコンジュゲートの調製
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の合成のための好ましい反応スキームでは、ＥＥＤＱ（０．３８２ｇ）を、市販されているＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨ（０．９４３ｇ）及びｐ−アミノベンジルアルコール（０．１９０ｇ）の混合物を含む塩化メチレン（１０ｍＬ）に、室温で加え、４時間撹拌した。抽出処理、その後フラッシュクロマトグラフにより、１．０５１ｇの物質を白色泡状物として得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ７４５．８（Ｍ＋Ｈ）及びｍ／ｅ７８０．３（Ｍ＋Ｃｌ−）で示し、これは構造と一致した。Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ中間体（０．９３ｇ）を、ジエチルアミン（１０ｍＬ）中に溶解し、２時間撹拌した。溶媒除去後、残渣をヘキサン中で洗浄して、０．６ｇの中間体を無色沈査として得た（ＨＰＬＣにより９１．６％純度）。ＨＰＬＣ保持時間：２．０６分。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ５２３．８（Ｍ＋Ｈ）、ｍ／ｅ５４６．２（Ｍ＋Ｎａ）及びｍ／ｅ５２２．５（Ｍ−Ｈ）で示した。
【０１８２】
この粗中間体（０．５６５ｇ）を、市販のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコール（「ＰＥＧ−Ｎ３」、０．６２７ｇ）と、ＥＥＤＱを含む塩化メチレン（１０ｍＬ）を使用してカップリングした。溶媒除去及びフラッシュクロマトグラフィーにより、０．９９ｇのアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ中間体を（淡黄色油状物で；８７％収率）得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ１０６１．３（Ｍ＋Ｈ）、ｍ／ｅ１０８２．７（Ｍ＋Ｎａ）及びｍ／ｅ１０５８．８（Ｍ−Ｈ）で示し、これは構造と一致した。中間体３（０．９２ｇ）を、１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８−２０−Ｏ−クロロぎ酸を含む塩化メチレン（１０ｍＬ）と１０分間アルゴン下で反応させた。混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、０．９４４ｇのアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢ−Ｏ−ＳＮ−３８−ＴＢＤＭＳ（収率＝６８％）を淡黄色油状物として得た。この中間体（０．９４ｇ）を含む塩化メチレン（１０ｍＬ）に、ＴＢＡＦ（１Ｍを含むＴＨＦ、０．８８５ｍＬ）及び酢酸（０．０８５ｍＬ）の混合物を含む塩化メチレン（３ｍＬ）を加え、次いで１０分間撹拌した。混合物を、塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム及びブラインで洗浄した。溶媒除去により０．８３５ｇのアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢ−Ｏ−ＳＮ−３８を黄色油状生成物として得た（９９％純度）。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ１４７８（Ｍ＋Ｈ）、ｍ／ｅ１５００．６（Ｍ＋Ｎａ）、ｍ／ｅ１４７６．５（Ｍ−Ｈ）、ｍ／ｅ１５９０．５（Ｍ＋ＴＦＡ）で示し、これは構造と一致した。
【０１８３】
このアジド誘導体化ＳＮ−３８中間体（０．８０３ｇ）を、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−Ｎ−（２−プロピニル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド（「ＭＣＣ−ｙｎｅ」；０．２３３ｇ）を含む塩化メチレン（１０ｍＬ）と、ＣｕＢｒ（０．００８３ｇ）、ＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ）及びトリフェニルホスフィン（０．０１５ｇ）の存在下で、１８時間反応させた。０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（１０ｍＬ）での洗浄を含む抽出処理、及びフラッシュクロマトグラフィーにより、０．８９１ｇのＭＣＣ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢ−Ｏ−ＳＮ−３８中間体（収率＝９３％）を黄色泡状物として得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ１７５３．３（Ｍ＋Ｈ）、ｍ／ｅ１７５１．６（Ｍ−Ｈ）、１８６４．５（Ｍ＋ＴＦＡ）で示し、これは構造と一致した。最終的に、ジクロロ酢酸（０．３ｍＬ）及びアニソール（０．０３ｍＬ）の混合物を含む塩化メチレン（３ｍＬ）を用いる脱保護、その後エーテルを用いる沈殿により、０．１８ｇ（９７％収率）のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８最終生成物を淡黄色の粉末として得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、ピークをｍ／ｅ１４８０．７（Ｍ＋Ｈ）、１４７８．５（Ｍ−Ｈ）で示し、これは構造と一致した。
【０１８４】
抗体へのコンジュゲーション
抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化ＭａｂであるｈＭＮ−１４、抗ＣＤ２２ヒト化ＭａｂであるｈＬＬ２、抗ＣＤ２０ヒト化ＭａｂであるｈＡ２０、抗ＥＧＰ−１ヒト化ＭａｂであるｈＲＳ７、及び抗ムチンヒト化ＭａｂであるｈＰＡＭ４を、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを調製した。各抗体を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含むリン酸緩衝液で７〜７．４の範囲のｐＨで穏やかに還元し、ｐＨを６．５に調整し、約１０倍モル過剰のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と、ＤＭＳＯを５〜１０％ｖ／ｖで共溶媒として使用して反応させ、２０分間にわたって周囲温度でインキュベートした。抗体に関して１０倍モル過剰で水溶液として使用されるＮ−エチルマレイミドで過剰チオールはいずれもキャップした。
【０１８５】
コンジュゲートをタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により、２０〜３０ダイアフィルトレーション容量の最終製剤緩衝液、２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５を使用して精製した。この方法は、サイズ排除及び疎水性カラムでの厄介な一連の精製を回避し、それにより、数百グラムのコンジュゲートを容易な様式で精製することが可能になる。生成物をＳＮ−３８に対して、３６６ｎｍでの吸光度及び標準値との相関によりアッセイした。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度から演繹し、この波長でのＳＮ−３８吸光度のスピルオーバーに対して補正した。これらから、ＳＮ−３８／ＭＡｂ置換比率（ＤＡＲ）を決定した。精製したコンジュゲートを、ガラスバイアル中で凍結乾燥製剤として保存し、真空下で蓋をし、−２０℃の冷凍庫で保存した。薬物−抗体比率（ＤＡＲ）は、典型的には５〜７の範囲であった（すなわち、抗体部分あたり、５〜７薬物部分）。
【０１８６】
上述のＡＤＣを精製し、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．５で緩衝液交換し、トレハロース（２５ｍＭ最終濃度）及びポリソルベート８０（０．０１％ｖ／ｖ最終濃度）でさらに製剤化し、最終緩衝液濃度は、賦形剤添加の結果として２２．２５ｍＭとなった。製剤化したコンジュゲートを凍結乾燥し、密封バイアル中に保存し、２℃−８℃で保存した。凍結乾燥したイムノコンジュゲートは、保存条件下で安定であり、その生理学的活性を維持した。
【０１８７】
実施例２．ＩＭＭＵ−１３２で処置した様々な固形腫瘍における前臨床試験
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴づけ−ＴＲＯＰ−２陽性ヒト前立腺癌腫細胞株である、ＰＣ−３を標的として使用して、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧと比較してＩＭＭＵ−１３２による抗原結合における潜在的な変化を評価した。３つの別々の場合で測定したとき、ＩＭＭＵ−１３２及び非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧの結合性の間で有意差はなかった（ＫＤ値、それぞれ、０．６５８±０．１４０ｎＭ対０．５６４±０．０５５ｎＭ）。
【０１８８】
ヒト新生児受容体（ＦｃＲｎ）結合性を、低密度ＦｃＲｎバイオセンサーチップを使用して表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣｏｒｅ）分析により決定した。各試験薬剤について５つ希釈液の３つの別々のセットを使用する３つの結合実行により、ＳＮ−３８のｈＲＳ７  ＩｇＧへのコンジュゲーションは、ＦｃＲｎに対するその結合親和性に有意に影響しなかったことが実証された（ＫＤ値、それぞれ、９２．４±５．７ｎＭ及び１９１．９±４７．６ｎＭ；Ｐ＝０．０７）。
【０１８９】
ＴＲＯＰ−２は、ＴＮＢＣ細胞株を含む広範なヒト固形腫瘍細胞株において発現される（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−２６８）。発現レベルは、腫瘍型間及び型内で異なる（表２）。例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較して、おおよそ１０倍多くのＴＲＯＰ−２がＭＤＡ−ＭＢ−４６８により発現されているが、ＨＥＲ２＋ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍株と比較したときに差異はない。全てのこれらの腫瘍型は、細胞毒性効果ＩＭＭＵ−１３２に感受性である。５０％増殖阻害を引き起こすために必要な濃度（ＩＣ５０値）は、低ナノモル濃度範囲にある。これらのアッセイでは、遊離ＳＮ−３８は、ＡＤＣよりも細胞毒性である傾向があるが、これは、ＩＭＭＵ−１３２が細胞に結合して細胞により取り込まれるためにかかる時間に対し、遊離形態での薬物の容易な利用能に起因する可能性が高い。ＴＲＯＰ−２発現レベル及びＳＮ−３８に対する感受性の間に相関関係があるように見えない。ＢｘＰＣ−３は、最高発現レベルのＴＲＯＰ−２を有するが、遊離ＳＮ−３８及びＩＭＭＵ−１３２間のＩＣ５０値において４倍差があり、一方でＣＯＬＯ２０５は比較においておおよそ８倍低くＴＲＯＰ−２を発現したが、ＩＣ５０値において呈する差は２倍のみである。
【０１９０】
【表２】
2020105187.tif 000006
【０１９１】
様々な固形腫瘍におけるＩｎ  ｖｉｖｏ有効性−ＩＭＭＵ−１３２の最初の有効性試験を、複数の固形腫瘍異種移植モデルにおいて行った（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）。これらには、膵臓、肺、結腸、及び胃癌を含んだ（図３；用量は、ＳＮ−３８当量で示す）。検査した全６種の固形腫瘍では、ＩＭＭＵ−１３２は、食塩水対照と比較したとき、腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０４３、曲線下面積ＡＵＣ）。６種のうち５種で、特異的ＩＭＭＵ−１３２療法が、非腫瘍標的化対照ＡＤＣと比較したとき、有意な抗腫瘍応答を提供した（Ｐ＜０．０５、ＡＵＣ）。加えて、ＩＭＭＵ−１３２は、１０倍当量多いＳＮ−３８をイリノテカンの形態で投与されたマウスと比較したとき、有意に大きな抗腫瘍効果を提供した（図３Ａ、Ｃ、＆Ｄ）。イリノテカンのＭＴＤが動物に投与されたときのみ、これらの実験で達成されたＡＤＣと同等であった（図３Ｂ＆Ｅ）。しかしながら、マウスに与えられたイリノテカンレジメンに含有される総ＳＮ−３８当量は合計で約２，４００μｇであり、これはＩＭＭＵ−１３２処置レジメンで投与されたＳＮ−３８当量（６４μｇ）より３７．５倍多かった。重要なことに、マウスは、イリノテカンをＳＮ−３８に、ヒトより５〜１０倍ほども高く効率的に変換する。（Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６０（１５）：４２０６−４２１０；Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９９；１７（６）：１８１５−１８２４；Ｚａｍｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８；４（２）：４５５−４６２）。ゆえに、マウスにおいてこのイリノテカンの大きな利点があっても、ＩＭＭＵ−１３２は同等の抗腫瘍効果を提供する。
【０１９２】
実施例３．ＩＭＭＵ−１３２で処置されたＴＮＢＣにおけるＩｎ  ｖｉｖｏ試験
ＩＭＭＵ−１３２を、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＴＮＢＣ腫瘍を有するマウスにおいて評価した（図４Ａ；用量は、ＳＮ−３８当量で示す）。ＩＭＭＵ−１３２（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、食塩水、イリノテカン（６ｍｇ／ｋｇ）、または対照抗ＣＤ２０  ＡＤＣ、ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比較したとき、有意な腫瘍退縮を引き起こした（Ｐ＜０．００１２、ＡＵＣ）。用量を０．１２ｍｇ／ｋｇまで低下させたときでさえ、ＩＭＭＵ−１３２は、マウスにおいて有意に腫瘍体積を減少させた（Ｐ＜０．００１７、ＡＵＣ）。重要なことに、この低量のＩＭＭＵ−１３２で与えられたＳＮ−３８当量の総量は、たった９．６μｇであり、一方でマウスに投与された６ｍｇ／ｋｇは６２．５倍の利益を表した（６００μｇ累積用量）。しかしながら、イリノテカン群における最初のマウスが疾患進行のために失われたとき、ＩＭＭＵ−１３２（０．１２ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおける腫瘍体積（ＴＶ）は、イリノテカンで処置したマウスのものよりも有意に小さかった。（それぞれ、ＴＶ＝０．１７±０．１２ｃｍ３対０．５３±０．２９ｃｍ３；Ｐ＝０．００９４、両側Ｔ検定）。他の固形腫瘍モデルにおいて見いだされるように、ＩＭＭＵ−１３２を用いる腫瘍に対する少量のＳＮ−３８の特異的標的は、遥かに多い用量の非標的薬物よりも遥かに有効である。
【０１９３】
治療５６日目（移植後７８日）に、低用量ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＣＤ２０）対照群（０．１２ｍｇ／ｋｇ）におけるマウスの腫瘍は、食塩水対照マウスと差がない点まで進行した（それぞれ、ＴＶ＝０．７４±０．４１ｃｍ３対０．６３±０．３７ｃｍ３）。その時点で、これらの腫瘍が、かなり大きなサイズへのそれらの進行にもかかわらず、ＩＭＭＵ−１３２処置に応答し得るかどうかを判定することを決定した（図４Ｂ）。全てのマウスが、陽性反応を実証し、腫瘍は、７８日目にＩＭＭＵ−１３２を用いた治療を開始したときより５週間後には有意に小さくなっており（それぞれ、ＴＶ＝０．１４±０．１４ｃｍ３対０．７４±０．４１ｃｍ３；Ｐ＝０．００３１、両側Ｔ検定）、ＩＭＭＵ−１３２処置の開始時点で１．０ｃｍ３より大きかった腫瘍でさえ、８８％よりも多く退縮した（１．３２ｃｍ３が０．０６ｃｍ３まで退縮し、１．０８ｃｍ３が０．１３ｃｍ３まで退縮した）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において観察された効果とは対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ腫瘍を有するマウスは、ＩＭＭＵ−１３２処置に応答しなかった（図４Ｃ）が、これはこの腫瘍の非常に迅速な増殖及び／またはその非常に低いＴＲＯＰ−２の発現に関連する可能性がある。
【０１９４】
実施例４．ＩＭＭＵ−１３２を用いるヒト臨床治験
ＩＭＭＵ−１３２は、最近の治療後に再発して中央値で３つの治療を以前に受けた、多様な転移性固形癌を有する２５人の患者における用量設定第Ｉ相試験を完了している。２５人のうち２３人は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりＲＥＣＩＳＴ１．１について評価可能であり、知見は以下の通りであった。（１）８〜１０ｍｇ／ｋｇ／用量を与える２１日間のサイクルの１日目及び８日目の処置の用量スケジュールは、忍容性を示し、有効であった。（２）Ｇ−ＣＳＦ造血支持は最低限必要であるが、時折の投与遅延及び／または用量減少を伴って、最大１０カ月までさえも、反復サイクルを投与することができる。（３）治療の反復施行にもかかわらず、抗薬物抗体または抗抗体抗体は感受性ＥＬＩＳＡ試験によって検出されなかった。（４）主要な毒性は、好中球減少症、下痢、及び脱毛症であり、単独で与えられるときのＳＮ−３８の親化合物であるイリノテカンのそれと一致しているが、ＩＭＭＵ−１３２ではより管理可能であった。（５）ＩＭＭＵ−１３２は、１３人の患者で安定疾患、３例で部分奏効（ＴＮＢＣ、小細胞肺癌、及び結腸直腸癌）、７例で進行性疾患を、最良奏効として達成することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト対象において抗腫瘍活性を示した。最長無増悪期間は、第Ｉ相試験で転移性ホルモン難治性前立腺癌を有する患者における、約５７週間であった。
【０１９５】
これらの結果は、第ＩＩ相試験において確認されており、この試験は、すでに１００人を超える多様な転移性固形癌を有する患者が登録されており、８または１０ｍｇ／ｋｇ用量が２１日間のサイクルの１日目及び８日目に与えられ、患者の状態及び忍容性が許す限りの頻度で反復した。副作用は、第Ｉ相実験における経験と差はなかったが、特に転移性ＴＮＢＣ患者における有効性は非常に奨励されるものである。
【０１９６】
現在、１４人のＣＴで評価可能なＴＮＢＣ患者のうち、４人は、部分奏効を経験しており、６人の疾患は安定しており（１人は、ＲＥＣＩＳＴ１．１により２７％退縮を示している）、４人は進行性疾患を最良奏効として示している（図５Ａ〜Ｂ）。この治験におけるＴＮＢＣの登録は、２０人の患者を安全性及び応答性について評価するだろうことを期待して、継続されている。これらのＴＮＢＣ患者は、１〜９個の治療を以前に受けており、登録前の最近のものに再発している。ＰＲを示している患者１２〜１４が、登録される前に２〜６個の治療を以前に受けていることは注目に値する。
【０１９７】
第Ｉ相部にて応答している最初の患者は、治療の前後で皮膚への転移において優れた奏効を示した（図示せず）。第ＩＩ相部にて部分奏効を有する他の患者は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、及び膀胱癌を含む。
【０１９８】
これらの結果は、ＩＭＭＵ−１３２がイリノテカンよりも良好な治療指数を有することを実証し、それはＩＭＭＵ−１３２が低毒性用量で活性であるためであり、このことは、抗ＴＲＯＰ−２抗体により選択的に標的されるより高用量のＳＮ−３８が、このトポイソメラーゼＩ阻害剤により十分な選択的ＤＮＡ損傷を提供して、このクラスの薬剤に応答すると知られているよりも多くの癌型において奏効を達成することを示す。それぞれの連続的な治療で応答が縮小することが周知であるために、転移性ＴＮＢＣの患者において、彼らが繰り返し以前の療法に失敗した後で、高い奏効率が観察されたことは驚くべきことである。免疫組織化学による評価は、この治験において記録した腫瘍検体のほとんど全てが標的抗原であるＴＲＯＰ−２を発現したことを示している。ＴＮＢＣ及び非ＴＮＢＣの腫瘍マイクロアレイの個別の試験で、本発明者らは、９０％超がＴＲＯＰ−２を発現し、そのうち６５％超が強度２＋及び３＋染色を有することを実証した。従って、本発明者らは、ＴＮＢＣが、及びおそらくは非ＴＮＢＣも、これらの癌においてＴＲＯＰ−２を標的とするこのＳＮ−３８とコンジュゲートした抗体に対して感受性の新生物であり、ゆえに、ＴＮＢＣに対する最初の腫瘍標的療法を代表すると結論付けた。
【０１９９】
他の薬剤と併用したときの用量制限毒性及び潜在的な懸念事項
忍容可能な好中球減少症（神経障害またはアドリアマイシン、タキサン、及びプラチナ薬剤に顕著な他の副作用のエビデンスがない）は、特に、ネオアジュバント設定において処置未経験患者で、ＩＭＭＵ−１３２がこれらの薬剤のうちの１つまたは複数と併用できることを示す。ドキソルビシン＋シクロホスファミドの前後でのパクリタキセルの長期使用を考えると、本発明者らは、ＩＭＭＵ−１３２がパクリタキセルと併用して１２週間にわたって与えられるべきだと考えた。この場合、ＩＭＭＵ−１３２の典型的なサイクルは、８ｍｇ／ｋｇを２１日毎の１日目及び８日目に与えるものである。パクリタキセル±ＩＭＭＵ−１３２の１２週間処置レジメンを完了後、ドキソルビシン及びシクロホスファミドを、４コースにわたって、隔週で投与し、使用される標準的なプロトコルに従う（下記例）。ＩＭＭＵ−１３２が追加される治験群と同じように、対照群は、パクリタキセル、ドキソルビシン＋シクロホスファミドを用いる治療のみを受ける。好中球減少症を制限し、発熱性好中球減少症を回避するために、そのレジメンにおけるＩＭＭＵ−１３２の用量減少は、併用により経験される好中球減少症の等級及び持続期間に従って許容される。現在の経験におけるように、パクリタキセルも減少が必要である場合があり、Ｇ−ＣＳＦ（例えば、ニューポジェン）を用いた造血支持の選択肢が、最初の治療コースについて担当医の裁量にゆだねられる。しかしながら、本発明者らは、ドキソルビシン＋シクロホスファミドの第二群の開始後の予防的Ｇ−ＣＳＦ療法を要求する（共同研究者の推奨に基づく）。
【０２００】
複数のコースの治療法で現在まで処置された１２５人を超える転移性癌患者におけるＩＭＭＵ−１３２を用いた本発明者らの経験に基づき、そして、患者が以前に多くの細胞毒性療法を受けていた場合、以下のＩＭＭＵ−１３２用量及びスケジュールを使用する。いくつかの治療を以前に受けた患者は、８、１０、及びさらには１２ｍｇ／ｋｇでのＩＭＭＵ−１３２の複数用量に忍容性を示したが、本発明者らは、８ｍｇ／ｋｇをこの併用に使用する。それは、この用量レベルでは、複数用量後であってもグレード２を超える好中球減少症はほとんど起こらず、このレベルで治療的に活性であるからである。本発明者らが、好中球減少効果がパクリタキセルで生じると予測する一方、８．０ｍｇ／ｋｇ用量レベルのＩＭＭＵ−１３２は、この併用においてより重度な転帰を緩和する。
【０２０１】
実施例５．ＩＭＭＵ−１３２を受ける多様な進行癌を有する患者の薬物動態及び免疫原性
上述の第Ｉ相試験では、血清試料を、各処置について、「ピーク」レベルを表す注入終了の３０分以内に（ほとんどの注入は２〜３．５時間続いた）、次いで「トラフ」レベルを表す次の用量の直前に回収した。２回のＥＬＩＳＡアッセイを使用してピーク及びトラフ血清試料を測定した。一方のアッセイは、抗ＳＮ−３８抗体で被覆されたプレート（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された）を使用してインタクトなコンジュゲート（ＡＤＣ）に付着したＳＮ−３８を結合することにより生成物を捕捉する。結合した生成物を、次いで、特異的抗イディオタイプ抗体（すなわち、抗ｈＲＳ７  ＩｇＧ）を使用して目的の抗体であるとして同定する。ゆえに、このアッセイは、インタクトなコンジュゲートを測定する。他方のアッセイは、血清中のｈＲＳ７  ＩｇＧを検出するように構成される。図６Ａは、４つの用量レベルにおけるＩｇＧ及びＡＤＣピークレベルを示す。ピークレベルを患者の体重に正規化するとき（すなわち、μｇ／ｍＬ／ｋｇ）、用量が増加するにつれて濃度が増加する傾向が見られる（図６Ｂ）。
【０２０２】
代表的な患者の血清における２つの生成物の濃度を複数用量にわたって分析したところ、ピークレベルは同様のレベルで維持され、用量が減少したときにはより低く調整されたことが示された（図示せず）。トラフ試料のいずれにもＡＤＣは存在しなかったが、低濃度のＩｇＧは前回用量の７〜１４日間以内に検出することはできた（図示せず）。この知見は、約１日でＳＮ−３８の５０％がＩｇＧから放出されることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性データと一致する（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）。
【０２０３】
治験の第Ｉ相部に登録された患者からの選択ピーク及びトラフ血清試料を、逆相ＨＰＬＣによる分析を用いて、血清を抽出することによりＳＮ−３８決定に供した。分析は、２部に分けて行われ、一方は抽出した血清中の未結合型ＳＮ−３８（遊離）を検出し、他方のプロセスは、その後総ＳＮ−３８（すなわち、結合型＋遊離ＳＮ−３８）の一部として測定されるだろう、ＩｇＧに結合したＳＮ−３８を放出する（総合）抽出前の酸加水分解ステップを含んだ。未結合型ＳＮ−３８の決定を伴う５人の患者で、そのレベルは血清中に見いだされるＳＮ−３８の総量の３％未満であった（表３）。ゆえに、血清中のＳＮ−３８の９７％超が注入終了の３０分以内にＩｇＧに結合していた。
【０２０４】
【表３】
2020105187.tif 000007
【０２０５】
治験の拡大部分に登録された選択患者では、さらなるＰＫ試料を、最初及び二回目の用量の１、２、３日後に収集して、ＩｇＧ、コンジュゲート、及びＳＮ−３８のクリアランス速度をより注意深く調べた。図７は、８ｍｇ／ｋｇを受けた代表的な患者を示し、さらなる試料を最初の２処置のそれぞれの１及び２日後に収集した。図７Ａは、最初の２用量でのＩｇＧ及びＩＭＭＵ−１３２のクリアランス、及び次のサイクル（２１日目及び２８日目）について収集されたピーク／トラフ試料をプロットする。これらのデータは、インタクトなコンジュゲートがＩｇＧより素早く排泄されることを実証するが、これも、ＳＮ−３８が放出されているために生じる。７日目までに、ＳＮ−３８の全てが放出され得、それゆえＩＭＭＵ−１３２は検出されなかったが、一方で依然として少量のＩｇＧが存在していた。図７Ｂは、総ＳＮ−３８及び遊離ＳＮ−３８の対応する濃度を提供する。再度、試料中で、遊離ＳＮ−３８の量は、総ＳＮ−３８の１．８〜６．１％のみであった。７日目までに、微量のＳＮ−３８のみが血清中に残存する。図７Ｃは、検出のＥＬＩＳＡ法または血清中のＳＮ−３８濃度に基づくＩＭＭＵ−１３２のクリアランスをプロットする。両セットのデータが重複し、ＥＬＩＳＡが、血清中のＳＮ−３８の大半がＩｇＧに結合しているという事実を反映するＳＮ−３８クリアランスに対する合理的な代理的決定であることのエビデンスを提供する。
【０２０６】
ＩＭＭＵ−１３２は、数カ月に及ぶ反復注射の後でさえも、免疫原生を欠く。ｈＲＳ７  ＩｇＧまたはＳＮ−３８に対する抗体応答を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイは、試験の開始前及び処置期間を通して、４〜６週間毎に行われる。現在まで試験された１人の患者のみが、ｈＲＳ７  ＩｇＧに対して陽性のベースライン抗体を有した（すなわち、５０ｎｇ／ｍＬ超）。しかしながら、現在までのいずれの患者においても処置の経過にわたって抗ｈＲＳ７  ＩｇＧまたは抗ＳＮ−３８抗体応答は検出されておらず、これは、３０回もの注射を受けている患者のものである。
【０２０７】
実施例６．臨床投薬スキーム
臨床的に、ＩＭＭＵ−１３２は、８ｍｇ／ｋｇで投与されている（すなわち、約０．１６μｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８当量）。ヒト用量の８ｍｇ／ｋｇは、マウス用量にすると、９８．４ｍｇ／ｋｇまたは２０ｇのマウスに対しておおよそ２ｍｇである。この用量は、３つのうちの１つ異なる投薬スキームに分割され、動物の１群は２回の１ｍｇのＩＭＭＵ−１３２用量（１及び１５日目）を受け、これは隔週投薬レジメンを表し、１群は、４用量の５００μｇ（１、８、２２、及び２９日目）を与えられ、これは２１日間の処置サイクルにおける２週間にわたる週１回を表し、最後の群は、８用量の２５０μｇ（１、４、８、１１、２２、２５、２９、及び３２日目）を与えられ、これは２１日間の処置サイクルにおける２週間にわたる週２回を表す。これらの投薬スキームを、ヒト胃癌腫及び膵臓腺癌異種移植モデルにおいて試験した（図８）。
【０２０８】
ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌腫異種移植片を有する動物では（図８Ａ）、全３つの（２×１ｍｇ、４×０．５ｍｇ、及び８×０．２５ｍｇ）投与量は、未処置対照動物と比較したとき有意な抗腫瘍効果を提供した（Ｐ＜０．０００１；ＡＵＣ）。生存率において有意差はなかったものの、４×０．５ｍｇ及び８×０．２５ｍｇ群は両方とも８８％及び１００％陽性反応率をもたらし、それに対し２×１ｍｇ群では２２％のみであった。加えて、４９日目（２×１ｍｇ群の最初のマウスが１．０ｃｍ３を超える腫瘍体積に達した日）、腫瘍は、４×０．５ｍｇ群において有意に小さかった（それぞれ、平均ＴＶ＝０．６３７±０．２７４ｃｍ３対０．３４１±０．２５５ｃｍ３；Ｐ＝０．０２５９）。全体では、９８日目に試験が終了したとき、４×０．５ｍｇ群においては、８匹中３匹のマウスがまだ生存しており、まだ陽性反応を示していたが、２×１ｍｇ群では９匹中０であった。
【０２０９】
同様に、ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌異種移植モデルでは（図８Ｂ）、全３つの（２×１ｍｇ、４×０．５ｍｇ、及び８×０．２５ｍｇ）投与量は、未処置対照動物と比較したとき腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０００９；ＡＵＣ）。４×０．５ｍｇ及び８×０．２５ｍｇ群は両方とも治療３２日目で、２×１ｍｇ処置群と比較したとき、有意に小さい腫瘍をもたらした（最初のマウスを疾患進行のために安楽死させた日；Ｐ＜０．００９３）。全体で、４×０．５ｍｇのＩＭＭＵ−１３２で処置されたマウスは、２×１ｍｇ処置群と比較したとき、有意な抗腫瘍効果を実証した（Ｐ＝０．０３５７）。生存に関しては、２×１ｍｇ群と４×０．５ｍｇ群の間で差はなかった（生存中央値＝それぞれ、３５日及び４６日）。しかしながら、８×０．２５ｍｇで処置したマウスは、他の２つの処置群と比較したとき、優れた延命効果を実証した（ＭＳＴ＝５３日；Ｐ＜０．０３４９；ログランク）。全３つは、７０％を超える陽性反応率を有し、腫瘍進行時間に有意差はなかった。全体で、これらのデータは、用量を分割することが、大用量ボーラスを隔週で与えるよりも良好な増殖制御を提供することを示す。これは、臨床的に履行されている週１回投薬を支持する。
【０２１０】
実施例７．忍容性
マウス及びカニクイザルを両方とも活用して、ＩＭＭＵ−１３２の毒性動力学を評価した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて、４、８、または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８当量（２５０、５００、または７５０ｍｇ／ｋｇタンパク質用量）での２用量のＩＭＭＵ−１３２を、３日間離して投与した。体重減少がないことから示されるように動物にて毒性の明白な兆候は観察されなかった（結果はファイル上）。造血器毒性は生じておらず、血清化学はアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルが二回目の注射の７日後に上昇したことを明らかにしたのみであった。しかしながら、これらの酵素は正常に戻り、病理組織検査で肝病変のエビデンスはなかった。
【０２１１】
ＩＭＭＵ−１３２が、マウスにより発現されるＴＲＯＰ−２と交差反応しないため、二つ目の試験は、カニクイザルモデルにおいて行われ、カニクイザルのＴＲＯＰ−２は、ＩＭＭＵ−１３２により認識される。この実験では、６匹のサルの１つの群（３雄及び３雌）は、０．９６ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８当量（６０ｍｇ／ｋｇタンパク質用量）のＩＭＭＵ−１３２を受け、６匹の第二の群は１．９２ｍｇ／ｋｇ（１２０ｍｇ／ｋｇタンパク質用量）を受けた。用量は３日間空けて投与した。２回の０．９６ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ−１３２用量に全てのサルが忍容性を示し、一過性の血球数の低減のみを伴ったが、その全てが正常範囲内に留まった。体重低下は、８％未満であり、これは注射後１５日以内にベースラインに戻った。病理組織学は、２回目の注射の８日後に、最小限から中程度の微視的変化を造血器及び消化管臓器ならびに雌の生殖器官に示したのみであった。これらは全て、回復期の終わりである３２日目までに正常に戻った。対照的に、２回の１．９２ｍｇ／ｋｇ用量（１２０ｍｇ／ｋｇタンパク質用量）は、サルに対して有毒だと証明された。１匹の動物は、消化管合併症及び重度の骨髄抑圧の結果として死亡した。この群の残りの動物も同様に、０．９６ｍｇ／ｋｇ用量を受けたサルにおいて観察されたものと同様の臓器毒性を示したが、レベルは遥かに重度であった。これらの最終臓器毒性は、イリノテカンと一致するが、最も重要なことは、ＴＲＯＰ−２を発現する多くの異なる正常組織においてＴＲＯＰ−２標的毒性のエビデンスがなかったことである。この試験は、ＩＭＭＵ−１３２の２回注射に対する最大耐量が０．９６から１．９２ｍｇ／ｋｇの間であることを示し、ヒト当量用量は２０から４０ｍｇ／ｋｇ（タンパク質用量）の間であるだろう。
【０２１２】
実施例８．作用機序
一般に、癌細胞は、外因性または内因性アポトーシス経路と称される２つの主経路のうちの１つを介してアポトーシスを起こすことができる（Ｆｕｌｄａ＆Ｄｅｂａｔｉｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５（３４）：４７９８−４８１１）。外因性経路は、細胞表面の細胞死受容体（例えば、ＴＮＦファミリー受容体）の係合を特徴とし、これはカスパーゼ−８の活性化をもたらし、これがカスパーゼ３などの下流カスパーゼの活性化をもたらし、最終的にポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を切断し、ＤＮＡを断片化し、細胞死をもたらす。反対に、内因性経路は、ミトコンドリアから細胞質内へのシトクロムｃ放出をもたらす直接的なＤＮＡ損傷（例えば、電離放射線）または他の細胞のストレス（例えば、細胞周期停止）のいずれかにより引き起こされることができる。シトクロムｃは、次いで、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（ＡＰＡＦ−１）と複合体を形成し、これがカスパーゼ−９を活性化するプラットフォームとして作用し、その後カスパーゼ−３及び−７を含むカスパーゼ活性化カスケードを開始し、ＰＡＲＰ切断、ならびに細胞死がもたらされる。
【０２１３】
ＳＮ−３８は、細胞のＤＮＡに重大な損傷を引き起こす公知のトポイソメラーゼ−Ｉ阻害剤である。これは、早期アポトーシス促進性タンパク質である、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を仲介し、カスパーゼ活性化及びＰＡＲＰ切断をもたらす（Ｃｕｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；６１：３５３５−３５４０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２００９；２７４：４７−５３；Ｌａｇａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；９８：３３５−３４４；Ｗｈｉｔａｃｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５：６６５−６７２）。ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の発現は、細胞周期のＧ１停止を伴い、ゆえに内因性経路の顕著な特徴である（Ｓｈｅｒｒ＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９５；９：１１４９−１１６３）。本発明者らは、ＩＭＭＵ−１３２も同様に、早期アポトーシス促進性シグナル伝達事象（ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）の上方制御を仲介し、結果としてＮＳＣＬＣ（Ｃａｌｕ−３）及び膵臓（ＢｘＰＣ−３）細胞株においてＰＡＲＰ切断をもたらし得ることを以前に実証した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３１５７−３１６９）。
【０２１４】
ＩＭＭＵ−１３２により活用されるアポトーシス経路をより良好に規定するために、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌腫細胞株を１μＭの遊離ＳＮ−３８または当量のＩＭＭＵ−１３２に曝露した（図９Ａ）。遊離ＳＮ−３８及びＩＭＭＵ−１３２は両方ともｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を仲介するが、ＳＮ−３８に対しＩＭＭＵ−１３２に曝露された細胞の間で上方制御の量が同じになるには４８時間かかる。これは、培養細胞に、単に遊離薬物が添加されときの容易な利用能と比較して、ＳＮ−３８の取込み及びＡＤＣからのＳＮ−３８の放出における遅延に起因する可能性がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＭＭＵ−１３２と比較してイリノテカンの迅速なクリアランスを考えると、以下に薬理−毒性学試験において実証されるように、ＩＭＭＵ−１３２を用いるときの腫瘍内のＳＮ−３８蓄積の利点が予想されるだろう。
【０２１５】
カスパーゼ活性化に関して、遊離ＳＮ−３８及びＩＭＭＵ−１３２は両方とも曝露の４８時間以内でのカスパーゼ−９及び−７の切断を実証する。この結果は、１０ｎＭで、７２時間の暴露後にカスパーゼ９の切断を引き起こしたＨＴ−２９結腸細胞株における以前の報告と一致する（Ｌａｇａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；９８：３３５−３４４）。しかしながら、その同じ報告においてカスパーゼ−３切断は観察されなかったが、本発明者らは切断を示す。これが７２時間では検出されない早期事象であるからか、または彼らが使用したＳＮ−３８の量（１０ｎＭ）が、本発明者らのアッセイにおいて本発明者らが使用した１μＭと比較してこれを示すのに十分に高くなかった可能性がある。最終的に、遊離ＳＮ−３８及びＩＭＭＵ−１３２は両方ともＰＡＲＰ切断を仲介した。これは、２４時間で最初に明らかになり、４８時間で切断が増加した。まとめると、これらのデータは、ＩＭＭＵ−１３２に含有されるＳＮ−３８が遊離ＳＮ−３８と同じ活性を有すること、及び内因性アポトーシス経路がこのＡＤＣにより誘導されることを実証する。
【０２１６】
微小管阻害剤である、パクリタキセルは、ヒト乳癌においてｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の誘導を仲介する（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５；５５：４６２３−４６２６）。この誘導は、ｐ５３状態から独立していることができる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６；５６：５０５５−５０６２）。加えて、パクリタキセルは、ヒト乳癌細胞においてカスパーゼ２を活性化すると示されており、これがカスパーゼ活性化カスケード及びＰＡＲＰ切断を開始する（Ｊｅｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ  ２０１３；１３：４２）。図示するように（図９Ｂ）、ＩＭＭＵ−１３２も同様に、ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を含む２つの異なるヒト乳癌細胞株においてＰＡＲＰ切断を仲介すると示された。ほぼ完全な切断が１μＭ遊離ＳＮ−３８または当量のＩＭＭＵ−１３２への曝露の４８時間以内に明らかになった。加えて、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１は、突然変異ｐ５３を含有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８において上方制御された。継続中の実験は拡大されて、ＩＭＭＵ−１３２により乳癌細胞においてどのカスパーゼが活性化されるか、及び、あれば、どれがパクリタキセルと重複し得るかを決定するだろう。
【０２１７】
２つの化学療法剤を併用するときの最良のシナリオは、相乗効果の達成であるだろう。これをなすためには、２つの薬剤は、同じ結果をもたらす２つの独立した経路により作用するか、調和して作用して単一経路を増幅させるかのいずれかであるべきである。ＴＮＢＣにおけるこの一例は、メチルセレニン酸をパクリタキセルと併用したときに示された（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１２；７：ｅ３１５３９）。両薬剤は、カスパーゼ−３を活性化しＰＡＲＰ切断を誘導することが単独で可能であるが、併用すると、これらはこの活性化の程度を増加させ、細胞増殖を相乗的に阻害する結果を伴った。メチルセレニン酸のように、ＩＭＭＵ−１３２もまた、これらの同じアポトーシス経路の多くを使用し、それゆえ、これらのシグナルを増幅させるようにパクリタキセルと相乗的に作用する可能性もある。
【０２１８】
パクリタキセルと５−ＦＵ、ゲムシタビン、及びカルボプラチンの併用は、正しい順番で投与されなければ拮抗的であると示されている（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１２；７：ｅ３１５３９；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；３：１７３９−１７４５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５：２５５９−２５６５；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；５：１０１５−１０２１；Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００７；６：１０６７−１０７３）。ゲムシタビン及びカルボプラチンの場合、これらの他の薬剤の前にパクリタキセルを投与することが、拮抗作用を防ぐために必要である（Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；５：１０１５−１０２１；Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００７；６：１０６７−１０７３）。しかしながら、５−ＦＵについては、順番はこの拮抗作用転帰を変化させなかった（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５：２５５９−２５６５）。５−ＦＵがｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１のパクリタキセル誘導を遮断することが重要な発見であった。興味深いことに、ＳＮ−３８が５−ＦＵと併用されたとき、拮抗作用は５−ＦＵがＳＮ−３８の前に加えられた場合またはこれらが同時に加えられた場合に観察された。細胞がＳＮ−３８に最初に曝露されたときのみ、５−ＦＵを加えて相乗効果を達成することができた（Ｔｏｒｉｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ．ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；２９：２０８３−２０９０）。ＩＭＭＵ−１３２が、パクリタキセルと同様、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を仲介し、同様のアポトーシス経路を使用し、両方とも同様の拮抗作用問題を５−ＦＵと有したことを考えると、この２つの薬剤が相乗的に作用し得る可能性はある。継続中の実験は、ＩＭＭＵ−１３２療法とパクリタキセルを併用することの利益の可能性を調べている。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシスシグナル伝達事象及びＴＮＢＣのｉｎ  ｖｉｖｏモデルを含み、ここでマウスは、ＩＭＭＵ−１３２とパクリタキセルの併用を用いて処置されている。
【０２１９】
実施例９．膵臓癌異種移植モデルにおけるＩＭＭＵ−１３２対イリノテカンの薬理毒性学試験
組織におけるＳＮ−３８のクリアランス及び取込みを、４０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン（７７３μｇ；総ＳＮ−３８当量＝４４８μｇ）またはＩＭＭＵ−１３２（１．０ｍｇ、ＤＡＲ＝７．６、ＳＮ−３８当量＝２０μｇ）を静脈内注射されたＣａｐａｎ−１膵臓癌異種移植片（約０．０６〜０．２７ｇ）を有するヌードマウスにおいて調べた。イリノテカン用量は、マウスのＭＴＤであり、ヒトでは３．２５ｍｇ／ｋｇまたは約１２６ｍｇ／ｍ２が当量である。マウスにおいてＩＭＭＵ−１３２用量はＭＴＤを十分に下回り、約４ｍｇ／ｋｇ  ＩＭＭＵ−１３２のヒト当量用量を表す（８０μｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８当量）。動物の群（ｎ＝３）を５つの間隔で病理解剖した；イリノテカンについては、５分、１時間、２時間、６時間、及び２４時間ならびにＩＭＭＵ−１３２については、１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間。動物から採取した血清を水中で１：２に希釈し、次いで、等分のメタノール：エチレングリコール：１Ｍ  ＺｎＳＯ４で抽出した。この培地では、ＳＮ−３８、ＳＮ−３８Ｇ（グルクロン酸抱合）、及びイリノテカンは有機相に取込まれ、一方でタンパク質は沈殿する。ゆえに、ＩｇＧに結合したＳＮ−３８はいずれも沈殿し、検出されなくなる。
【０２２０】
ＩｇＧに結合したＳＮ−３８を検出するために、血清試料を、まず６Ｍ  ＨＣｌで酸加水分解し、次いで、抽出培地を添加する前に中和しなければならなかった。このプロセスは、全てのＩｇＧ結合ＳＮ−３８を放出し、これは、抽出培地の有機相にて単離され得、試料中のあらゆる未結合型（すなわち、遊離）ＳＮ−３８を伴う。酸加水分解された抽出試料は、試料中のＳＮ−３８の総量を測定するといわれるが、抽出されただけの試料は試料中の未結合型または遊離ＳＮ−３８を測定する。ＩｇＧ結合ＳＮ−３８の量は、総合から遊離を引くことにより得ることができる。ＩＭＭＵ−１３２処置動物由来の血清及び組織ホモジネートは、それゆえ、非加水分解／抽出されて、未結合型ＳＮ−３８と、総ＳＮ−３８を与える酸加水分解／抽出された試料とを単離するという２つのプロセスで処理される。腫瘍、肝臓、及び小腸内容物は、まず、水中で均質化される（１０部の水に対し１部の組織）。抽出前の全ての試料を、内部標準である、１０−ヒドロキシル−カンプトテシン（１０−ＯＨ  ＣＴ）でスパイクし、これが定量化及び回復のモニタリングを助する。少量（例えば、５〜５０μＬ）の抽出物の有機相を、目的の生成物のそれぞれから標準で予め較正した分析用のＣ−１８ＨＰＬＣカラムに適用する。各生成物ピーク（すなわち、ＳＮ−３８、ＳＮ−３８Ｇ、イリノテカン、及び１０−ＯＨ  ＣＴ）のＡＵＣを決定する。生成物ピークと内部標準ピークとの比率を算出し、各薬剤について１０〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の標準曲線に対してプロットした。線形回帰を使用して対数変換したデータを適合させた。血清試料に対するアッセイの感受性は２０ｎｇ／ｍＬであり、これは試料を分析用に２：１に希釈したためであり、一方で組織試料に対する感受性は１１０ｎｇ／ｍＬであり、これはホモジネートを１１：１（１部の組織に対し１０部の水）に希釈したためである。
【０２２１】
イリノテカン処置動物では、ＳＮ−３８は、５分、１時間、及び２時間）でのみ検出できたが、イリノテカン及びＳＮ−３８Ｇはこれらの同じ試料及び６時間試料において検出された。（図１０）；これらの生成物はいずれも２４時間試料では検出されなかった。高レベルのイリノテカンを腫瘍内に有するにもかかわらず、ＳＮ−３８またはＳＮ−３８Ｇの濃度は非常に低かった。例えば、２時間で、平均で１０１．６±５８．６μｇ／ｇのイリノテカンが腫瘍内にあって、それぞれ１．６±１．０（１．６％）及び１．３±１．２μｇ／ｇ（１．３％）のＳＮ−３８及びＳＮ−３８Ｇのみが腫瘍内にあった。ゆえに、かなりの量のイリノテカンがＣａｐａｎ−１腫瘍内に非常に素早く取り込まれる一方、ＳＮ−３８に変換される腫瘍内のイリノテカンは非常に乏しかった。
【０２２２】
ＩＭＭＵ−１３２を受けている動物については、検出可能レベルの未結合型ＳＮ−３８またはＳＮ−３８Ｇは腫瘍内になかった；しかしながら、高レベルのＳＮ−３８［総］が検出された。未結合型ＳＮ−３８またはＳＮ−３８Ｇが検出されなかったため、これはＩＭＭＵ−１３２処置動物の腫瘍内のＳＮ−３８の全てがＩｇＧに結合したことを意味し、生成物完全性が保持され、腫瘍へのコンジュゲートの結合によりＳＮ−３８が排他的に腫瘍に送達されていることを示す。ＩＭＭＵ−１３２と共に注射されたＳＮ−３８のモル当量は、イリノテカンを注射された動物中に含有されるＳＮ−３８のモル当量のほんの一部分であることを念頭におくことが重要である（例えば、４４８μｇ  ＳＮ−３８、または２５％変換率に基づくと、約１１５μｇに対し、ＩＭＭＵ−１３２では２０μｇ）。
【０２２３】
イリノテカンで腫瘍に送達されるＳＮ−３８のＡＵＣ（３．９μｇ／ｇ・ｈ）と、ＩＭＭＵ−１３２での腫瘍内のＳＮ−３８［総］のＡＵＣ（４７４μｇ／ｇ・ｈ）を比較すると、この試験のように、イリノテカンより２２倍少ないＳＮ−３８当量がＩＭＭＵ−１３２で動物に与えられたとしても（４４８対２０μｇ）、ＩＭＭＵ−１３２が、イリノテカンよりもほぼ１２０倍多くのＳＮ−３８をＣａｐａｎ−１腫瘍に送達する能力を有することが見出される。
【０２２４】
同様の分析を、無関係な、非標的抗体コンジュゲートを与えられたＣａｐａｎ−１腫瘍を有する動物において行った。ＩＭＭＵ−１３２の腫瘍／血液濃度は、非標的ＳＮ−３８抗体コンジュゲートを与えられた動物において見いだされた比率よりも４倍高く、これは、腫瘍に特異的に結合するコンジュゲートを使用することの利益を実証した。
【０２２５】
肝臓及び糞便の分析：ＩＭＭＵ−１３２を与えられた動物の肝臓内の未結合型ＳＮ−３８レベルは非常に低く、１時間で平均１３０±５８ｎｇ／ｇであり、その後検出可能レベルは見いだされなかった。ＳＮ−３８［総］濃度さえも比較的低く、それぞれ、１、６、及び２４時間で平均が１０２３±２０２、９０９±１８６、及び２０３±２９ｎｇ／ｇであり、４８時間及び７２時間で肝臓内の検出可能レベルは見いだされなかった。これは、小腸から単離した糞便中の比較的低い濃度の未結合型ＳＮ−３８と良好に一致する（１時間及び６時間で全体含量において４４２±１０３ｎｇ及び９１２±３７３ｎｇ）。総合したプロセス済試料（結合型＋未結合型）におけるＳＮ−３８濃度は、遊離プロセスされた試料（未結合型）より微かに高かったのみであり、インタクトなコンジュゲートが腸内へと胆汁排出経路を横切らないことを実証する。
【０２２６】
イリノテカン処置動物では、ＳＮ−３８濃度は遥かに高く、肝臓において５分でピークに達し（３，５１１±４７６ｎｇ／ｇ）、１時間で１２９６±５０５ｎｇ／ｇまで低減し（このとき、ＩＭＭＵ−１３２を与えられた動物における未結合型ＳＮ−３８より１０倍近く高い）、最終的に、６時間で６３８ｎｇ／ｇが測定され、その後２４時間で検出不可能になった。驚くべきことに、ＳＮ−３８は、わずかに５分という早さで小腸内容物中で検出することができ（７９９±５５０ｎｇ／ｇ）、６時間にわたって約１０，０００ｎｇ／ｇのレベルを維持し、その後２４時間で検出不可能になった。これは、イリノテカンがＳＮ−３８及びＳＮ−３８Ｇにいかに素早く変換されるかを示す。前述している通り、血液クリアランスデータは、生成物の９８％超が、たった５分以内で血液から排泄されたことを示した。
【０２２７】
実施例１０．ＣＤ７４＋ヒト癌を処置するための抗ＣＤ７４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲート
ＣＤ７４は、内部移行し、抗体結合の後に再循環するので、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のための魅力的な標的である。ＣＤ７４の多くは、血液癌に関連しているが、固形癌でも発現される。従って、ＣＤ７４を発現する固形腫瘍の治療に関するヒト化抗ＣＤ７４抗体、ミラツズマブと調製されたＡＤＣの有用性を調べた。ミラツズマブ−ドキソルビシン及び２つのミラツズマブ−ＳＮ−３８コンジュゲートを、切断可能リンカー（ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅ）と共に調製したが、これらは血清におけるその安定性及びどのようにＳＮ−３８をリソソーム中に放出するかにおいて異なる。ＣＤ７４発現を、フローサイトメトリー及び免疫組織学により決定した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性及びｉｎ  ｖｉｖｏ治療試験をヒト癌細胞株Ａ−３７５（黒色腫）、ＨｕＨ−７及びＨｅｐ−Ｇ２（肝がん）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓）、及びＮＣＩ−Ｎ８７（胃）、及びＲａｊｉバーキットリンパ腫において行った。ミラツズマブ−ＳＮ−３８ＡＤＣを抗ＴＲＯＰ−２及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体と調製したＳＮ−３８ＡＤＣとそれらの標的抗原を発現している異種移植片において比較した。
【０２２８】
ミラツズマブ−ドキソルビシンは、リンパ腫モデルにおいて最も有効であったが、一方でＡ−３７５及びＣａｐａｎ−１では、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のみが治療的利益を示した。ＣＤ７４の表面発現がＴＲＯＰ−２またはＣＥＡＣＡＭ６よりも遥かに低いにもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｃａｐａｎ−１において抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と同様の有効性を有した。しかし、ＮＣＩ−Ｎ８７では、抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗ＴＲＯＰ−２コンジュゲートが優れていた。単回用量レベルでの２つの肝がん細胞株における試験は、食塩水処置動物よりも有意な利益を示したが、無関係なＩｇＧコンジュゲートに対してはそうでなかった。ＣＤ７４は、いくつかの固形腫瘍異種移植片ではＡＤＣに対して好適な標的であり、有効性はＣＤ発現の均一性により大きく影響を受け、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８コンジュゲートが最良の治療応答を提供した。
【０２２９】
材料及び方法
ヒト腫瘍細胞株。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫、Ａ−３７５（黒色腫）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓腺癌）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌腫）、Ｈｅｐ−Ｇ２肝がん及びＭＣ／ＣＡＲ骨髄腫細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州、マナサス）から購入した。ＨｕＨ−７肝がん細胞株を日本ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）（日本、大阪府）から購入した。全ての細胞株は、加湿されたＣＯ２インキュベーター（５％）内、３７℃で、１０％〜２０％仔牛血清及びサプリメントを含有する推奨培地内で培養した。細胞を５０回未満で継代し、マイコプラズマについて定期的に検査した。
【０２３０】
抗体及びコンジュゲーション方法。ミラツズマブ（抗ＣＤ７４  ＭＡｂ）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、及びｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅリンカー及びそれらのＳＮ−３８誘導体を、上記実施例に記載のように調製し、抗体にコンジュゲートした。ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートを、前述のように調製した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１）。全てのコンジュゲートをＩｇＧのジスルフィド還元により調製し、その後これらのリンカーの対応するマレイミド誘導体と反応させた。分光分析により、薬物：ＩｇＧモル置換比率は５〜７であると推定された（１．０ｍｇのタンパク質が、約１６μｇのＳＮ−３８または２５μｇのドキソルビシン当量を含有する）。
【０２３１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合及び細胞毒性。抗原陽性細胞に対する未コンジュゲートとコンジュゲートミラツズマブの細胞結合を比較するためのアッセイ及び細胞毒性検査に、ＭＴＳ色素還元法を使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）。
【０２３２】
フローサイトメトリー及び免疫組織学。膜のみ結合抗原または膜及び細胞質抗原の評価を提供する様式でフローサイトメトリーを行った。皮下腫瘍異種移植片のホルマリン固定、パラフィン包埋切片で、抗原回収法を用いずに染色して、抗ヒトＩｇＧコンジュゲートで明らかになった１０μｇ／ｍＬで抗体を使用して、免疫組織学を行った。
【０２３３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験。雌ヌードマウス（４〜８週齢）または雌ＳＣＩＤマウス（７週齢）をＴａｃｏｎｉｃ（ニューヨーク州、ジャーマンタウン）から購入し、１週間の検疫後に使用した。食塩水対照を含む全ての薬剤を週２回４週間にわたって腹腔内投与した。具体的な用量は結果に示す。毒性を、週１回の体重測定により評価した。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫モデルについては、ＳＣＩＤマウスに０．１ｍＬ媒地中２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。５日後に、動物に、単回静脈内注射（０．１ｍＬ）のコンジュゲートまたは食塩水を投与した（Ｎ＝１０／群）。マウスを、苦悩及び麻痺の徴候について毎日観察し、後肢麻痺の発症、開始時体重の１５％を超える低下、または他の場合には、瀕死（代替生存エンドポイント）のいずれかの場合に安楽死させた。
【０２３４】
皮下腫瘍を二次元でキャリパーによって測定し、腫瘍体積（ＴＶ）をＬ×ｗ２／２として算出した。式中、Ｌは最長直径であり、ｗは最短直径である。測定は、少なくとも週１回行い、腫瘍が１．０ｃｍ３まで成長したら、動物を死亡させた（すなわち、代替生存エンドポイント）。Ａ−３７５黒色腫細胞株（０．２ｍＬ中に６×１０６個の細胞）をヌードマウスに移植し、腫瘍が平均で０．２３±０．０６ｃｍ３（Ｎ＝８／群）となったときに、治療を開始した。Ｃａｐａｎ−１をヌードマウスに皮下移植し、それには、組織培養物からの８×１０６個の細胞と組み合わせた、連続継代腫瘍からの腫瘍懸濁液（０．３ｍＬの１５％ｗ／ｖ腫瘍懸濁液）の組み合わせを使用した。ＴＶが平均で０．２７±０．０５ｃｍ３（Ｎ＝１０／群）となったときに処置を開始した。ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍異種移植片を、マトリゲルと最終培養物からの１×１０７個の細胞の０．２ｍＬの１：１（ｖ／ｖ）混合物を皮下注射することにより開始した。ＴＶが平均で０．２４９±０．０４５ｃｍ３（Ｎ＝７／群）となったときに、治療を開始した。同じ手順に従ってヌードマウスにおいてＨｅｐ−Ｇ２及びＨｕＨ−７肝がん異種移植片を発生させた。Ｈｅｐ−Ｇ２が平均で０．３６４±０．０６２ｃｍ３（Ｎ＝５／群）となり、ＨｕＨ−７が平均で０．２９８±０．０５５ｃｍ３（Ｎ＝５／群）となったときに、治療を開始した。
【０２３５】
有効性をカプランマイヤー生存曲線において表現し、生存時間中央値を決定するために上述の代替エンドポイントを使用する。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（カリフォルニア州、ラホヤ）を使用してログランク（マンテル・コックス）検定により分析を行い、有意性はＰ＜０．０５とした。
【０２３６】
結果
ヒト腫瘍細胞株及び異種移植片におけるＣＤ７４発現。固形腫瘍細胞株における膜のみのＣＤ７４のＭＦＩが、バックグラウンドＭＦＩよりも非常に頻繁に２倍未満で高かったため（Ａ−３７５黒色腫細胞株を除く）、４つの異なる固形腫瘍型に由来する６つの細胞株を、透過処理した細胞の分析に主に基づいてＣＤ７４陽性であると同定した（表４）。Ｒａｊｉにおける表面ＣＤ７４発現は、固形腫瘍細胞株よりも５倍超高かったが、透過処理したＲａｊｉ細胞における総ＣＤ７４は、固形腫瘍細胞株の大半と同様であった。
【０２３７】
【表４】
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【０２３８】
免疫組織学は、Ｒａｊｉ皮下異種移植片が大きく均一で強い染色を、顕著な細胞表面標識を伴って有したことを示した（図示せず）。Ｈｅｐ−Ｇ２肝がん細胞株は、固形腫瘍の最も均一な取込みを有し、中程度に強かったが、主として細胞質で染色を有し（図示せず）、その後Ａ−３７５黒色腫細胞株はいくらか均一でない染色をより強く、ただ、ほぼ細胞質の発現を有した（図示せず）。Ｃａｐａｎ−１膵臓（図示せず）及びＮＣＩ−Ｎ８７（図示せず）胃癌腫細胞株は、中程度（Ｃａｐａｎ−１）から強い（ＮＣＩ−Ｎ８７）ＣＤ７４染色を有したが、均一に分布していなかった。ＨｕＨ−７肝がん細胞株（図示せず）は、最も均一でなく、最も弱い染色を有した。
【０２３９】
コンジュゲートの免疫反応性。未コンジュゲートミラツズマブ、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートのＫｄ値は有意差がなく、それぞれ平均で０．７７ｎＭ、０．５９ｎＭ、及び０．８０ｎＭであった。ＭＣ／ＣＡＲ多発性骨髄腫細胞株において測定した未コンジュゲート及びドキソルビシン−コンジュゲートミラツズマブのＫｄ値は、それぞれ、０．５±０．０２ｎＭ及び０．８±０．２ｎＭであった（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８−９６）。
【０２４０】
コンジュゲートのＩｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出及び血清安定性。メルカプトエタノールでキャップしたＣＬ２Ａ及びＣＬ２ＥリンカーからのＳＮ−３８の放出機序を、リソソーム条件を部分的にシミュレートする環境、すなわち低ｐＨ（ｐＨ５．０）で、及びカテプシンＢの存在下または不在下で決定した。ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８基質は、酵素の不在下ｐＨ５では不活性であったが（図示せず）、カテプシンＢの存在下では、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ部位での切断が素早く進行し、半減期は３４分であった（図示せず）。活性ＳＮ−３８の形成には、ＳＮ−３８の１０番目の位置で結合したカルバメートの分子内環化が必要とされ、これは、よりゆっくりと生じ、半減期は１０．７時間であった（図示せず）。
【０２４１】
予想通り、カテプシンＢは、ＣＬ２Ａリンカーにおける活性ＳＮ−３８の放出に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＣＬ２Ａは、切断可能なベンジル炭酸塩結合を有し、ｐＨ５．０でＣＬ２Ｅリンカーと同様の速度で活性ＳＮ−３８を放出し、半減期は約１０．２時間であった（図示せず）。ｐＨ感受性アシルヒドラゾン結合を有するミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートの半減期は、ｐＨ５．０で７〜８時間であった（図示せず）。
【０２４２】
リソソームに関連する条件下でこれらのリンカーの全てが薬物を比較的同様の速度で放出する一方、それらの血清中の安定性は非常に異なる。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、２１．５５±０．１７時間で遊離ＳＮ−３８の５０％を放出し（図示せず）、これは他のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートと一致した。ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、しかしながら、非常に不活性で、半減期は約２１００時間と推定された。ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートは、９８時間でドキソルビシンの５０％を放出し、これは２つの他の抗体−ドキソルビシンコンジュゲートと同様であった（図示せず）。
【０２４３】
細胞毒性。これらのコンジュゲートの評価に関連する重大な問題は、造血器及び固形腫瘍細胞株における遊離ドキソルビシン及びＳＮ−３８の相対作用強度であった。本発明者らのグループは、ＳＮ−３８がいくつかのＢ細胞リンパ腫及び急性白血病細胞株において活性であり、その作用強度は、０．１３〜２．２８ｎＭの範囲であったことを以前に報告した（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）。その後ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療試験に使用された４つの固形腫瘍細胞株におけるＳＮ−３８作用強度は、２．０〜６ｎＭの範囲であった（図示せず）。ドキソルビシンは、混合反応を有し、Ｒａｊｉリンパ腫及びＡ−３７５黒色腫細胞株における作用強度は３〜４ｎＭであったが、Ｃａｐａｎ−１、ＮＣＩ−Ｎ８７、及びＨｅｐ  Ｇ２細胞株に対しては１０倍近く弱かった。ＳＮ−３８とドキソルビシンの作用強度を比較する他の試験では、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌、１８対１８（それぞれ、ＳＮ−３８対ドキソルビシンのｎＭ作用強度）；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌、２対２ｎＭ；ＳＫ−ＯＶ−４卵巣癌、１８対９０ｎＭ；Ｃａｌｕ−３肺腺癌、３２対５８２ｎＭ；Ｃａｐａｎ−２膵臓癌、３７対２２１ｎＭ；及びＮＣＩ−Ｈ４６６小細胞肺癌、０．１対２ｎＭを見出した。ゆえに、ＳＮ−３８は、これらの６細胞株のうちの４つでドキソルビシンよりも５から２０倍強力であり、ＬＳ１７４Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１では作用強度は同様であった。まとめると、これらのデータは、ドキソルビシンがＳＮ−３８よりも固形腫瘍に対して有効性が低く、一方で、ＳＮ−３８は固形腫瘍及び造血器腫瘍において同等に有効であると思われることを示す。
【０２４４】
予想通り、３つのコンジュゲート形態は多くの場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遊離薬物よりも数桁効力が弱く、これは、両薬物が細胞内に容易に輸送されると予想されるのに対して、薬物コンジュゲートは、薬物を細胞内部に輸送するために抗体結合を必要とするためである（図示せず）。ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８コンジュゲートは例外であり、それはＳＮ−３８の９０％超が４日間のアッセイ期間にわたって、コンジュゲートから培地内へと放出されるためである（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）。ゆえに、コンジュゲートが迅速に内部移行したとしても、遊離薬物とＣＬ２Ａ連結薬物の間の相違を識別することは難しいだろう。
【０２４５】
安定したＣＬ２Ｅ連結ＳＮ−３８は、遊離ＳＮ−３８と比較して、比較的良好にＲａｊｉ細胞株において機能するが、４つの固形腫瘍細胞株において実質的に（７〜１６倍）低い作用強度を有し、これは、相対的に低いＣＤ７４の表面発現が、これらの固形腫瘍において薬物輸送を最小化する役割を担っている可能性を示す。ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートは、全ての細胞株において遊離ドキソルビシンと比較したときにその作用強度において実質的な差異を有したが、これは、固形腫瘍細胞株における遊離ＳＮ−３８に対するＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートと同様の程度であった。
【０２４６】
上述の６つの追加の細胞株では、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートよりも９〜６０倍効力が強かったが（図示せず）、この場合も、この結果はＣＬ２Ａ連結コンジュゲートが４日間のインキュベーション期間にわたってそのＳＮ−３８の大半を培地中に放出する一方でドキソルビシンコンジュゲートが同じ時間にわたって多くてもその薬物の５０％しか放出しないという事実により大きく影響を受けた。ＣＬ２Ｅ連結ミラツズマブは、これらの他の細胞株では調べなかった。
【０２４７】
ヒト腫瘍異種移植片のＩｎ  ｖｉｖｏ治療。様々な抗体を用いて調製されたミラツズマブ−ドキソルビシンまたはＳＮ−３８コンジュゲートを用いた以前のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、これらが、その最大耐量よりも遥かに低い用量で有効であったことを示しており（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７−６４；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１；Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）、ゆえに、ｉｎ  ｖｉｖｏ検査は、同様の、しかし固定量の各コンジュゲートをそれらが十分に忍容性を示すレベルで比較することに焦点を当てた。
【０２４８】
初めの試験は、まず、ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートが２つのＳＮ−３８コンジュゲートにどの程度匹敵するかを測るために、リンパ腫の播種性Ｒａｊｉモデルにおいてドキソルビシン及びＳＮ−３８コンジュゲートを調べた（図示せず）。全ての特異的なコンジュゲートは、２０日間のみの生存中央値を有した、非標的ラベツズマブ−ＳＮ−３８コンジュゲートまたは食塩水処置動物よりも有意に良好であった（Ｐ＜０．０００１）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験が、ＲａｊｉにおいてＳＮ−３８コンジュゲートについて８倍もの優位性を示すにもかかわらず、最良生存率は、ミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートで見られ、ここで単回１７．５ｍｇ／ｋｇ（３５０μｇ）用量を与えられた全動物、及び２．０ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ）を与えられた動物の７／１０が研究の終了時（１１２日目）で生存していた（例えば、１７．５ｍｇ／ｋｇ用量のミラツズマブ−ドキソルビシン対ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、Ｐ＝０．００１２）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、両コンジュゲートが、内部移行したときに同様の速度で活性ＳＮ−３８を放出するだろうと示されていたが、生存率は、より安定したＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートについて有意に低かった（それぞれ、ＣＬ２Ａ対ＣＬ２ＥでＰ＜０．０００１及びＰ＝０．０１９７、１７．５及び２．０ｍｇ／ｋｇ用量）。
【０２４９】
５つの固形腫瘍細胞株を調べた。ドキソルビシン及びＳＮ−３８の両方に対して最良のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答を有したため、Ａ−３７５黒色腫細胞株で開始した。Ａ−３７５異種移植片は迅速に増殖し、食塩水処置対照動物は１０．５日間のみの生存中央値を有した（図示せず）。１２．５ｍｇ／ｋｇ（０．２５ｍｇ／動物）で週２回用量のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、生存を２８日間まで延長させ（Ｐ＝０．０００６）、これは、１７．５日間の生存中央値を有する対照エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートよりも有意に良好であり（Ｐ＝０．００８９）、後者は食塩水処置動物と有意差はなかった（Ｐ＝０．１９６７）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａコンジュゲートは、対照エプラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートと同一の１４日間の生存中央値を有したミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８コンジュゲートよりも有意に長い生存を提供した（Ｐ＝０．００１４）。ＳＮ−３８コンジュゲートよりも２倍高い用量のミラツズマブ−ドキソルビシンを与えたにもかかわらず、生存中央値は、食塩水処置動物よりも良好ではなかった（１０．５日間）。
【０２５０】
Ａ−３７５黒色腫モデルと同様に、Ｃａｐａｎ−１において、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８コンジュゲートのみが有効であり、生存中央値は３５日間であり、未処置動物とは有意に差があり（Ｐ＜０．０３６）（図示せず）、これはより低い用量（５ｍｇ／ｋｇ；１００μｇ／動物）であっても有意に差があった（Ｐ＜０．０２）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ｅもしくは非標的エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲート、または２倍高い用量のミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートはいずれも、何らの生存優位性を提供しなかった（Ｐ＝０．４４対食塩水）。同じ用量の内部移行性抗ＴＲＯＰ−２  ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲート（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８；ＩＭＭＵ−１３２）を与えられた動物を用いる同じ試験で、生存中央値が、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と等しかったことは注目に値する（図示せず）。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、様々な固形腫瘍を処置するための目的のＡＤＣとして以前に同定されていた（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。Ｃａｐａｎ−１での表面結合性ｈＲＳ７のＭＦＩは、ミラツズマブでの２２（表４を参照されたい）に比較して、２３７であった（図示せず）。ゆえに、実質的に低い表面抗原発現を有するにもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、このモデルにおいて、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートと同じく良好に機能した。
【０２５１】
２つの固形腫瘍異種移植片において劣った治療結果を有するミラツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートでは、ミラツズマブ−ＳＮ−３８コンジュゲートを、多くの固形腫瘍の表面上でより高く発現されるＴＲＯＰ−２（ｈＲＳ７）またはＣＥＡＣＡＭ６（ｈＭＮ−１５）に対する他のヒト化抗体で調製されたＳＮ−３８コンジュゲートと比較することに焦点を変更した（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：２；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８−４６）。３つの追加の異種移植モデルを調べた。
【０２５２】
胃腫瘍モデル、ＮＣＩ−Ｎ８７では、１７．５ｍｇ／ｋｇ／用量（３５０μｇ）のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を与えられた動物は、生存において多少の改善を示したが、食塩水処置動物と（３１日間対１４日間；Ｐ＝０．０７６０）または非結合性ベルツズマブ抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ３９コンジュゲート（２１日間；Ｐ＝０．３１２８）（図示せず）と比較して、統計学的な有意性を満たすことはできなかった。しかしながら、ｈＲＳ７−及びｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａコンジュゲートは、生存中央値をそれぞれ６６日間及び６３日間まで有意に改善した（Ｐ＝０．０００１）。表面発現されるＴＲＯＰ−２及びＣＥＡＣＡＭ６のＭＦＩは、それぞれ７９５及び１１２３であり、たった５であったＣＤ７４よりも遥かに高かった（表４を参照されたい）。免疫組織学は、この細胞株の異種移植片におけるＣＤ７４の比較的強い細胞質発現を示したが、重要なことに、これは散在しており、腫瘍内の画定されたポケット内のみに出現した（図示せず）。ＣＥＡＣＡＭ６及びＴＲＯＰ−２は、ＣＤ７４よりも均一に発現され（図示せず）、ＣＥＡＣＡＭ６は、細胞質及び膜上の両方により強く提示され、ＴＲＯＰ−２は主に膜上で見出された。ゆえに、抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗ＴＲＯＰ−２コンジュゲートで改善された生存はおそらく、ＮＣＩ−Ｎ８７におけるより高い抗原密度とより均一な発現の両方を反映している。
【０２５３】
Ｈｅｐ−Ｇ２肝がん細胞株（図示せず）では、免疫組織学は、ＣＤ７４の中程度の細胞質染色を伴う非常に均一な発現を示し、フローサイトメトリーは、比較的低い表面発現を示した（ＭＦＩ＝９）。ｈＭＮ−１５でのＭＦＩは１７５であり、免疫組織学は、非常に強い膜染色の単離ポケットを伴う、ＣＥＡＣＡＭ６のかなり均一な膜及び細胞質発現を示した（図示せず）。Ｈｅｐ−Ｇ２異種移植片を有する動物における試験により、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、食塩水処置群での２１日間に比較して、生存を４５日間まで延長した（Ｐ＝０．００４８）一方で、ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートが、生存を３５日間まで改善したことが見出された。ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８よりもミラツズマブコンジュゲートが優位である傾向があったが、これは、統計的な有意性は達成しなかった（４６日間対３５日間；Ｐ＝０．０８０２）。しかしながら、非結合性ベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、ミラツズマブコンジュゲートと類似した生存優位性を提供した。本発明者らは、非結合性コンジュゲートを用いた治療結果は、特に比較的高いタンパク質用量で特異的ＣＬ２Ａ連結コンジュゲートに類似し得ることを以前に観察したが、特異的及び対照コンジュゲートの力価測定は通常、選択的に明らかにした。ゆえに、特異的コンジュゲートはいずれも、この細胞株でこれらの用量においては、選択的な治療優位性を提供しなかった。
【０２５４】
ＨｕＨ−７肝がん細胞株を使用する別の試験（図示せず）は、Ｈｅｐ−Ｇ２と類似の表面発現、ただしやや低い細胞質レベルを有し（表４を参照されたい）、ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８コンジュゲートがミラツズマブ−ＣＬ２Ａコンジュゲートよりも長いが（３５日間対１８日間）、有意差はない生存優位性を提供することを見出した（Ｐ＝０．２９４４）。ｈＭＮ−１５及びミラツズマブコンジュゲートは両方とも、食塩水処置動物よりも有意に良好であったが（それぞれＰ＝０．００８及び０．００９）、この場合も、コンジュゲートはいずれも、この用量レベルでは、非標的ベルツズマブ−ＳＮ−３８コンジュゲートと有意差はなかった（それぞれＰ＝０．４６０２及び０．９０３３）。ＣＥＡＣＡＭ６表面発現は、この細胞株においては比較的低く（ＭＦＩ＝８１）、免疫組織学は、ＣＤ７４（図示せず）及びＣＥＡＣＡＭ６（図示せず）は両方とも、非常にわずかで、また高度に散在していることを示した。
【０２５５】
これらの試験は、ＳＮ−３８抗体−薬物コンジュゲートのネオアジュバント使用が抗ＴＲＯＰ２（ｈＲＳ７）抗体に限定されず、ＣＤ７４などの異なる抗原標的に対する抗体も利用してもよいことを示す。
【０２５６】
実施例１１．治療難治性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）を処置するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
患者は、ｍＣＲＣを有する６２歳の女性であり、２０１２年１月に転移性疾患を最初に呈した。女性は、診断の数週間後に最初の治療として腹腔鏡下での回腸横行結腸切除術を受け、次いで、４サイクルのＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン）化学療法をネオアジュバント設定で受け、その後、肝臓の右葉にある転移性病変を除去するために２０１２年３月に右肝切除を受けた。この後、合計で１２サイクルのＦＯＬＦＯＸにわたるアジュバントＦＯＬＦＯＸレジメンを２０１２年６月に再開した。８月に、オキサリプラチンを、悪化する神経毒性のために、レジメンから除去した。女性の５−ＦＵの最後のサイクルは２０１２年９月２５日であった。
【０２５７】
２０１３年１月に行われたＣＴは、肝転移を示した。そして、女性は、ＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）治験に参加する良好な候補として評価された。女性の病歴における併存症は、喘息、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、心雑音、裂孔ヘルニア、甲状腺機能低下症、手根管症候群、緑内障、うつ病、下肢静止不能症候群、及び神経障害が含まれた。女性の術歴には、卵管結紮（１９７５）、甲状腺除去（１９８３）、胆のう摘出術（２００１）、手根管除去（２００８）、及び緑内障外科手術が含まれる。
【０２５８】
この治験への参加の時点で、女性の標的病変は、肝臓の左葉内で３．１ｃｍ腫瘍であった。非標的病変には、肝臓内のいくつかの低弱毒化腫瘤が含まれていた。女性のベースラインＣＥＡは７８１ｎｇ／ｍであった。
【０２５９】
この患者がインフォームドコンセントにサインした後に、ＩＭＭＵ−１３２を、週１回のスケジュールで注入により連続２週間与え、その後１週間休薬し、これが、１つの処置サイクルを構成した。これらのサイクルを、忍容される限り反復した。ＩＭＭＵ−１３２（８ｍｇ／ｋｇ）の最初の注入は２０１３年２月１５日に開始し、特筆すべき事象もなく完了した。女性は、第一サイクルの経過中に悪心（グレード２）及び疲労（グレード２）を経験したが、それ以降大きな有害事象を伴わなかったために処置を継続している。女性は、脱毛症及び便秘を２０１３年３月に報告した。２０１３年４月８日に行われた一回目の奏効評価（６用量の後）では、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）により標的病変の２９％の縮小が示された。女性のＣＥＡレベルは、２０１３年３月２５日に２３０ｎｇ／ｍｌまで低減した。２０１３年５月２３日に行われた二回目の奏効評価（１０用量の後）では、標的病変は３９％縮小しており、ゆえにＲＥＣＩＳＴ判定基準による部分奏効を成した。女性は、２０１３年６月１４日現在、処置を継続しており、８ｍｇ／ｋｇでの１２用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）からなる６サイクルを受けている。女性の全体的な健康及び臨床的症状は、この治験処置を開始して以来、顕著に改善された。
【０２６０】
実施例１２．治療難治性転移性乳癌を処置するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
患者は、５７歳の女性であり、ステージＩＶ、トリプルネガティブ、乳癌（ＥＲ／ＰＲネガティブ、ＨＥＲ−ｎｅｕネガティブ）を有し、２００５年に最初に診断された。女性は、２００５年に左乳房の腫瘍摘出手術を受け、その後、２００５年９月に投与集中ＡＣＴをアジュバント設定で受けた。次いで、女性は、放射線療法を受け、これは１１月に完了した。２０１２年初期に患者が対側（右）乳房にしこりを触診したときに疾患の局所再発が認められ、その後ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル）化学療法を用いて処置された。女性の疾患は同年に再発し、胸壁の皮膚の転移性病変を伴った。次いで、女性は、カルボプラチン＋ＴＡＸＯＬ（登録商標）化学療法レジメンを受け、その間に、血小板減少症が生じた。女性の疾患は進行し、女性は週１回ドキソルビシンを開始し、これを６用量にわたって継続した。皮膚疾患も進行していた。ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを２０１２年９月２６日に行い、胸壁上への疾患の進行及び固形腋窩結節の肥大が示された。患者は疼痛制御のためにオキシコドンを投与された。
【０２６１】
女性は、ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標）を２０１２年１０月から２０１３年２月まで（２週間毎に４カ月にわたって）投与された。このとき、胸壁病変が開き、出血した。その後、女性はＸＥＬＯＤＡ（登録商標）を投与されたが、これは女性の手足における神経障害、ならびに便秘のために十分に忍容性を示さなかった。皮膚病変は進行性であったため、女性はインフォームドコンセントを受けたあとにＩＭＭＵ−１３２治験に登録された。患者は、甲状腺機能亢進症及び視覚障害の病歴も有し、ＣＮＳ疾患の高いリスクを有した（しかし、脳のＭＲＩはＣＮＳ疾患について陰性であった）。この治験に登録された時点で、女性の右乳房の皮膚病変（標的）は、最大直径で４．４ｃｍ及び２．０ｃｍと測定された。女性は、別の非標的病変を右乳房に、及び左右の腋窩に１つずつ肥大したリンパ節を有していた。
【０２６２】
最初のＩＭＭＵ−１３２注入（１２ｍｇ／ｋｇ）は、２０１３年３月１２日に開始され、これは十分に忍容性を示した。女性の二回目の注入は、予定注入日にグレード３の絶対好中球数（ＡＮＣ）の減少（０．９）があったために、１週後に遅延された。一週間遅延し、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）を受けた後、女性の二回目のＩＭＭＵ−１３２が投与されたが、用量は２５％減少させて９ｍｇ／ｋｇとした。その後女性は、週１回を２週間、その後１週間の休薬というプロトコルに従って計画通りにＩＭＭＵ−１３２を受けている。２０１３年５月１７日の一回目の女性の奏効評価は、３治療サイクル後であり、標的病変の長径の合計において４３％低減を示し、ＲＥＣＩＳＴ判定基準による部分奏効を成した。女性は処置を９ｍｇ／ｋｇ用量レベルで継続している。女性の全体的な健康及び臨床的症状は、ＩＭＭＵ−１３２を用いて処置を開始して以来、顕著に改善された。
【０２６３】
実施例１３．ＴＮＢＣを処置するためのＩＭＭＵ−１３２のネオアジュバント使用
本試験は、手術可能なＴＮＢＣ、ステージＩＩ及びＩＩＩを有する１８歳以上の女性を対象とする。適格な患者が登録され、コンピュータによって２つの治療群のうちの１つに無作為化される。この治療群は、一方の群が、以下の処置レジメンに示すように、併用療法の最初のコースでＩＭＭＵ−１３２をパクリタキセルに追加する点を除いて同一である（図１１）。用量減少及び用量遅延のルールは、ＩＭＭＵ−１３２について、毒性が先行治験から予測されるそれを超えた場合に、可能であればパクリタキセルを処方量に維持するように、確立された。Ｇ−ＣＳＦなどの骨髄増殖因子の使用は、治験群のこの最初の併用コースについては担当医師の裁量にあるが、患者が、最後の化学療法コースとして外科手術の前にドキソルビシン及びシクロホスファミドの併用を受けているときは、発熱性好中球減少症のリスクを低下させるためにＧ−ＣＳＦの予防的投与が義務づけられる。
組み入れ基準
１．１８歳以上で侵襲性乳癌と診断された女性により記載されたインフォームドコンセント。
２．コア針生検または切開（摘出でない）生検により組織学的に確認された侵襲性乳癌。身体検査または放射線検査により臨床ステージＴ２−４Ｎ０−２またはＴ１Ｎ１−２。
３．乳癌遺伝子（ＢＲＣＡ）生殖細胞系列突然変異検査の記述。
４．エストロゲン受容体（ＥＲ）−ネガティブ、プロゲステロン受容体−ネガティブ、及びヒト上皮成長因子（ＨＥＲ２）−ネガティブ（トリプル−ネガティブ）乳癌。
５．ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０−１。
６．登録の１カ月以内でのＥＣＧ及び心臓エコー（ＬＶＥＦまたは左室内径短縮率）により確認された正常な心機能。
７．ＣＢＣ及びＨｇｂレベルにより反映される十分な骨髄機能。
８．無作為化の前に、妊娠の可能性がないまたは陰性血清妊娠反応。
除外基準
１．現在の乳癌に対する治療目的を有する治験剤を含む、以前の全身または局所領域的抗癌治療。
２．この治験に含まれる薬剤のいずれかを用いた以前の処置。
３．転移性乳癌
４．無作為化の時点で卵巣補充療法もしくはホルモン剤を用いるまたは任意のエストロゲン受容体調節因子を用いる同時処置。
５．試験登録の１２カ月以内のてんかん発作の病歴。
６．グレード１を超える任意の原因からの既存神経障害。
７．既存する異常に低い値の白血球（好中球）、血小板、赤血球またはヘモグロビン。
８．Ｉｎ  ｓｉｔｕでの子宮頸癌または皮膚の基底細胞癌以外の癌の５年以内の病歴。
９．ネオアジュバント療法に対する不耐性を示す医学的状態（未制御肺疾患、糖尿病、重度汗腺、活動性消化性潰瘍、凝固障害、結合組織疾患、骨髄抑制性疾患）。
１０．不十分な肝臓または腎臓機能。
１１．デキサメタゾンまたは高用量のコルチコステロイドの使用に対する禁忌。
１２．うっ血性心不全またはコントロール不良の高血圧を含む他の重篤な心臓状態の病歴。
１３．妊娠または授乳。
１４．本試験処置を開始する３０日以内のいずれかの治験薬物を用いた処置。
【０２６４】
安全性及び忍容性−安全性及び忍容性を、有害事象、標準的な安全性検査（ＣＢＣ、白血球分画及び血小板数、血清化学及び尿分析）、身体検査、バイタルサイン、及びＥＫＧから評価する。ドキソルビシン療法のための標準治療により必要とされる追加の心臓モニタリングを行う。有害事象は、ＭｅｄＤＲＡシステムにより分類し、全ての有害事象及び異常検査値をＮＣＩ  ＣＴＣＡＥｖ４．０毒性グレードを使用して重症度について分類する。治験群におけるＩＭＭＵ−１３２及びさらにパクリタキセルに関する薬物動態（ＰＫ）を患者の代表的な群において評価した。結果を、標準的なＰＫパラメータにより特徴づけ、それには、ピーク及びトラフ値、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、及びＴ１／２を含む。ＩＭＭＵ−１３２の免疫原性を、患者の血中の抗ＲＳ７及び抗ＳＮ−３８力価を測定するＥＬＩＳＡ検査により評価した。
【０２６５】
統計学的計画及びデータ分析−本発明者らは、ＩＭＭＵ−１３２を追加することで臨床的意義があるように少なくとも２０パーセント点（５７％増加）のｐＣＲ率における増加を達成することを目的とした。検定力計算のため、本発明者らは、ＩＭＭＵ−１３２を用いない対照群において３５％及びＩＭＭＵ−１３２を用いる群で５５％のｐＣＲ率を想定する。１：１無作為化、及び比率を比較する標準的な統計学を用いて、各群において最小で９４人の患者が、この優位性が２つの群の間で存在するかどうかを９５％の信頼度で検出するための８０％の検定力を提供するだろう。ゆえに、このエンドポイントのために必要とされる最小試料サイズは、おおよそ２００人の患者であるだろう。
【０２６６】
加えて、患者を、５年まで再発及び生存について追跡する。ＩＭＭＵ−１３２の追加による治療成功期間（ＥＦＳ）または全生存期間（ＯＳ）において１０％点改善すれば、臨床的に有意な利益を提供するとして認められる。ＴＮＢＣのいくつかの試験は、標準的なネオアジュバント化学療法を用いて６０〜８０％の３年ＥＦＳ率を示している。算出のために、本発明者らは、１１５７人のＴＮＢＣ患者（４３）の大規模メタアナリシスから決定されているため、対照群において７０％、それゆえ、ＩＭＭＵ−１３２を用いる群で８０％と想定する。想定するＥＦＳは、おおよそ指数関数的に減衰する関数であり、ＥＦＳ中央値は、対照群において５．８年及びＩＭＭＵ−１３２を用いる群で９．４年であり、処置群間のハザード比（ＨＲ）は０．６２である。少なくとも３年にわたる自然増加の想定と、少なくとも４年にわたる経過観察の分析で、各群において約２００人の患者が、このＥＦＳ差が２群間で存在するかどうかを９５％信頼度で検出するための８５％検定力を提供するだろう。ゆえに、臨床的に有意な利益を実証するためにＥＦＳを使用することで、このエンドポイントのために必要とされる試料サイズは、おおよそ４００人の患者であるが、１０％の過剰分を離脱者に当てるとして、本発明者らは、４４０人の患者をこの治験に登録すると推定した。
【０２６７】
ＴＮＢＣにおけるネオアジュバント療法の試験の大半は、生存ではなく、再発エンドポイントを考慮する。この試験がＯＳについて検定されていない一方で、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎの試験（Ｌｉｅｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００８  Ｍａｒ  １０；２６（８）：１２７５−１２８１）は、５年でのＯＳ率は、その３年でのＰＦＳ率に近かったと報告した。これは、おおよそ２年の追加の経過観察の後に、ＯＳに基づいて臨床的に有意な利益の同じ１０％点改善測定を実証する同様の検定力を有するのに十分な事象が生じているだろうことを示す。
【０２６８】
実施例１４．不応性、転移性、非小細胞肺癌を処置するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
６０歳の男性を非小細胞肺癌と診断している。その後、患者は、６．５×４ｃｍと測定される左縦隔腫瘤及び胸水を示す。インフォームドコンセントにサインした後に、患者に、ＩＭＭＵ−１３２を１８ｍｇ／ｋｇの用量で、隔週で投与する。最初の２回の注射の間に、短期間の好中球減少症及び下痢が経験され、４時間以内に４回の腸運動を伴うが、これらは、２日以内に解消するか、対症薬物療法に応答する。合計６回のＩＭＭＵ−１３２の注入の後に、インデックス病変のＣＴ評価は、２２％の減少を示し、これは部分奏効に少し満たないが、明確な腫瘍縮小である。患者は、この治療をさらに２カ月継続し、この時、インデックス病変の直径の合計の４５％腫瘍縮小の部分奏効がＣＴによって認められ、ＲＥＣＩＳＴ判定基準による部分奏効を成している。
【０２６９】
患者は、その後、カルボプラチン、ベバシズマブの化学療法レジメンを６カ月にわたって与えられ、応答を示し、次いで、進行の後に、カルボプラチン、エトポシド、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、及びゲムシタビンを用いる化学療法のさらなるコースを受ける。縦隔腫瘍は、化学療法と（ｗｈｉｔｈ）併用されるＡＤＣのネオアジュバント使用で除去される。
【０２７０】
実施例１５．抗ＭＵＣ５ａｃ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８イムノコンジュゲートを用いる転移性膵臓癌の処置
この４４歳の患者は、転移性膵臓癌腫の病歴を有し、膵頭部に膵管腺癌を伴い、左右の肝葉への転移を示し、前者の測定値は３×４ｃｍであり、後者の測定値は２×３ｃｍである。患者は、１コースのゲムシタビンを与えられたが、客観的な奏効を示さない。４週後に、男性は、ｈＰＡＭ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を静脈内に８ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間とその後１週間の休薬を、その後、さらに２サイクルにわたって反復して与えられる。ＣＴ試験が１週間後に行われ、転移の除去及び原発腫瘍量における３２％の減少（部分奏功）を示すとともに、男性の血中ＣＡ１９−９力価がベースラインの２２０からＸ線診断評価の時点で７５まで低下する。患者は、抗体−薬物コンジュゲートを用いた各処置の後にグレード１の悪心及び嘔吐のみを、ならびに、最後の処置サイクルの終了時に、グレード２の好中球減少症を示すが、これは４週後に解消する。転移性病変の除去及び原発腫瘍のサイズ減少により、以前には手術不可能であった腫瘍量の外科的除去が可能になる。外科処置の６カ月後、患者は、膵臓癌腫の再発の兆候を示さない。
【０２７１】
実施例１６．プロ−２−ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）の産生及び使用
合成−Ｐ２ＰＤｏｘの合成経路における中間体の構造、ならびに抗体もしくは他のタンパク質もしくはスルフヒドリル含有ペプチドへのコンジュゲーションに好適なＰ２ＰＤｏｘのマレイミド誘導体を本明細書に開示する。例示的なＰ２ＰＤｏｘを産生するための一般的なスキームを以下のスキーム１に示す。本発明者らは、１ｇ規模の反応を実施して、約４０％の収率で１ｇ超の４，４−ジアセトキシブチルアルデヒドを生成している。シアン化物で生成物を汚染し得る可能性があるシアノ水素化ホウ素ナトリウムの使用を回避するため、還元剤を還元アルキル化においてナトリウムトリアセトキシボロヒドリドに変更した。探索スケールでは、ドキソルビシンのＰ２ＰＤｏｘへの８０％を超える変換が記録された。これを２ｇ規模まで増加させて、１ｇ超のＰ２ＰＤｏｘを生成した（スキーム１）。４，４−ジアセトキシブチルアルデヒドを、報告されている方法（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１７９４−９）を改変して調製したが、これは、危険なオゾン分解ステップを避けるために必要であった。無水酢酸及び塩化インジウム触媒を用いる市販の４−ペンテン−１−アールのジアセトキシ化、それに続く、塩化ルテニウム及び過ヨウ素酸ナトリウム組み合わせ（Ｙａｎｇ＆Ｚｈａｎｇ，２００１，６６：４８１４−８）によるオレフィンの酸化切断により、４，４−ジアセトキシブチルアルデヒドを得て、これをドキソルビシンに還元的にカップリングして、Ｐ２ＰＤｏｘを得た。
【０２７２】
以下のステップを必然的に含んだ：（ｉ）無水酢酸（７．４５ｍＬ）及び塩化インジウム（０．５６ｇ）の混合液を含むジクロロメタン（２０ｍＬ）に５．０５ｇの４−ペンテン−１−アールを加えた。１０〜３０分後、反応混合物を２５％酢酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で処理し、有機層をブラインで洗浄して乾燥させた。溶媒除去により１５．３ｇの液体生成物を得て、これを次のステップに用いた；（ｉｉ）３．５ｍＭ塩化ルテニウム原液を含む水（６９．４ｍＬ）を、ステップ（ｉ）生成物の溶液を含むジクロロメタンに６：１アセトニトリル−水（３５０ｍＬ）中で加えた。過ヨウ素酸ナトリウム（２９．７ｇ）を少しずつ加えた。ＴＬＣ分析により判断されるように、反応の完了後、反応混合物を３０ｍＬの飽和チオ硫酸ナトリウムで処理し、セライトのパッドを通して濾過し、アセトニトリルを蒸発させた。残存する水層を酢酸エチルで抽出し、２５％酢酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄し、乾燥させた。粗物質をクロマトグラフィーによりシリカゲル上で、溶出のために酢酸エチル−ヘキサン混合物を使用して精製した。純生成物を次のステップでのドキソルビシンの還元アルキル化のために使用した；（ｉｉｉ）１．５グラムの塩酸ドキソルビシンを、１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロイソプロパノール（１９５ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍＬ）に溶解し、ステップ（ｉｉ）からの３．４ｇ（７倍モル過剰）のアルデヒド及び０．６６ｇのナトリウムトリアセトキシボロヒドリドと反応させた。反応は１０分で完了し、生成物をシリカゲル上で溶出のために塩化メチレン−イソプロパノール混合物を使用して精製して、０．９６ｇの純生成物を得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、生成物の構造と一致する、ｍ／ｚ  ７１６．２５７０（Ｍ＋Ｈ）での質量を示した。この構造は、プロトン及びＣ−１３ＮＭＲスペクトルによっても確認された。（ｉｖ）ステップｉｉｉからのＰ２ＰＤｏｘをＭＣＣヒドラゾンへと、ＳＭＣＣヒドラジドを以下のように使用して変換させた：０．６ｇのＰ２ＰＤｏｘを７５ｍＬの無水メタノール中に溶解し、使用されたＰ２ＰＤｏｘの量の分光測光定量に基づき１．８倍過剰になるように計算した、０．３４ｇのＳＭＣＣヒドラジドで処理した。変換率（％）は、ＨＰＬＣにより８８％と判定された。ＬＣ−ＭＳ分析は、生成物ピークを９４９．３７３４（Ｍ＋Ｈ）のｍ／ｚで示し、これは９４９．３７１３（Ｍ＋Ｈ）の算出質量（ｍ／ｚ）と一致した。物質は、溶媒除去の後、誘導体化されていない出発物質がコンジュゲートせず、コンジュゲート精製プロセスの間に除去されたため、コンジュゲーションのためにそのまま使用された。
【０２７３】
【化３】
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【０２７４】
小規模のコンジュゲート調製−コンジュゲート調製は、ＩｇＧの鎖間ジスルフィドを、ＴＣＥＰを用いてＰＢＳ中で穏やかに還元し、その後１０倍過剰の活性化Ｐ２ＰＤｏｘにカップリングするという一般的な方法論に従って行われた。コンジュゲートを、ｐＨ６．８、２５ｍＭの３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）上、遠心分離したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、その後疎水性カラムを通過させて精製した。生成物を、トレハロース及びポリソルベート８０を用いて製剤化し、凍結乾燥させた。コンジュゲートした生成物は、４〜７薬物／ＩｇＧの範囲の置換を伴い、サイズ排除ＨＰＬＣにより単一ピークとして溶出され、典型的に逆相ＨＰＬＣにより１％未満の未コンジュゲート遊離薬物を含有した。
【０２７５】
規模を大きくしたコンジュゲート調製−ヒト化抗ＴＲＯＰ−２抗体のコンジュゲートである、ｈＲＳ７を、５ｇ及び１０ｇ規模で、抗体のＴＣＥＰ還元、その後、ＤＭＳＯを共溶媒（５％ｖ／ｖ）として用いて１２倍過剰の活性化Ｐ２ＰＤｏｘを使用するｉｎ  ｓｉｔｕコンジュゲーションにより調製した。生成物をタンジェンシャルフローろ過により、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．８を、精製のための２０ダイアフィルトレーション容量と共に使用して、精製した。生成物は、２５ｍＭトレハロース及び０．０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を用いて製剤化され、２０ｍｇまたは１００ｍｇロットに分割し、凍結乾燥した。
【０２７６】
【表５】
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【０２７７】
コンジュゲートは、ｈＰＡＭ４−Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＬＬ２−Ｐ２ＰＤｏｘ及びＲＦＢ４−Ｐ２ＰＤｏｘについても調製されており、同様のタンパク質回収及び純度を伴った（図示せず）。
【０２７８】
実施例１７．Ｐ２ＰＤｏｘを用いるＩｎ  ｖｉｔｒｏ前臨床試験
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合性試験−抗体結合の保持は、非コンジュゲート抗体に対するコンジュゲートの結合を比較する細胞結合性アッセイによって確認された（Ｃｈａｒｉ，２００８，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ４１：９８−１０７）。コンジュゲートの作用強度は、適切な標的細胞を使用して４日間のＭＴＳアッセイにおいて検査された。ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートは、胃（ＮＣＩ−Ｎ８７）、膵臓（Ｃａｐａｎ−１）、及び乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）ヒト癌細胞株において０．３５〜１．０９ｎＭのＩＣ５０値を呈し、遊離薬物は、同じ細胞株において０．０２〜０．０７ｎＭ作用強度を呈した。
【０２７９】
血清安定性−原型のＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートである、ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの血清安定性を、ヒト血清中、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度、３７℃でインキュベートすることにより決定した。インキュベート物は、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを使用するＨＰＬＣにより分析し、ここで、遊離薬物によるピークとコンジュゲートまたはより高い分子量種によるピークとの間で良好な保持時間分離があった。この分析は、コンジュゲートからの遊離薬物の放出がなかったことを示しており、このことは、コンジュゲートの高い血清安定性を示している。同じ実験を、ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘと同じ切断可能リンカーを含有するｈＲＳ７−ドキソルビシンコンジュゲートで繰り返したとき、及び遊離薬物が９６時間の半減期で放出されると独立して検証された場合、遊離薬物ピーク、すなわちドキソルビシンピークの明確な形成が、ＨＩＣ  ＨＰＬＣ上で見られた。
【０２８０】
驚くべきことに、Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートが、抗体のペプチド鎖を一緒に架橋するため、抗体にしっかりと保持されていることが決定された。架橋は、抗体への薬物の付着を安定化させるため、薬物は、抗体が代謝された後に細胞内でのみ放出される。架橋は、循環中への遊離薬物の放出の結果生じるだろう毒性、例えば心毒性を最小限に抑えることを助ける。２−ＰＤｏｘペプチドコンジュゲートの以前の使用は失敗したが、それは薬物がペプチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏで他のタンパク質またはペプチドに架橋したためである。本発明のコンジュゲートでは、Ｐ２ＰＤｏｘは、プロドラッグ形態の間に鎖間ジスルフィドチオール基に付着する。プロドラッグ保護は、注射の直後にｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に除去され、結果得られるコンジュゲートの２−ＰＤｏｘ部分は、抗体のペプチド鎖を架橋し、抗体分子内での分子内架橋を形成する。これは、ＡＤＣを安定化させ、かつ循環中の他の分子への架橋を防止する。
【０２８１】
実施例１８：Ｐ２ＰＤｏｘを用いるＩｎ  ｖｉｖｏ前臨床試験
一般−腫瘍サイズを長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）のキャリパー測定で、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２として算出することにより決定した。週２回、腫瘍を測定し、マウスの体重を測定した。マウスは、その腫瘍が１ｃｍ３を超えるサイズに達した、その開始時体重の１５％超が低下した場合、またあるいは瀕死になった場合に安楽死させた。腫瘍増殖データについての統計学的分析は、曲線下面積（ＡＵＣ）及び生存時間に基づいた。個別の腫瘍増殖のプロファイルは、線形曲線モデリングを通して得た。ｆ検定を採用して、群間の等分散性を決定してから増殖曲線の統計学的分析をおこなった。両側ｔ検定を使用して、全ての様々な処置群と非特異的対照の間の統計学的有意性を評価した。食塩水対照の分析については、片側ｔ検定を使用して有意性を評価した。生存試験を、カプランマイヤープロット（ログランク分析）を使用して分析し、これには、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ｖ４．０３）ソフトウェアパッケージ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；カリフォルニア州エンシニータス）を使用した。前臨床実験における全ての用量は、抗体量で表した。薬物に関しては、２０ｇのマウスにおける１００μｇの抗体（５ｍｇ／ｋｇ）は、例えば、３〜６薬物／ＩｇＧでＡＤＣを使用するとき、１．４μｇ〜２．８μｇ（０．１４〜０．１７ｍｇ／ｋｇ）のＰ２ＰＤｏｘ当量用量を有する。
【０２８２】
３００μｇ以上［約１０μｇのＰ２ＰＤｏｘ］のコンジュゲートの単回静脈内用量は、致死性であったが、２週間で与えた４用量の４５μｇは、全ての動物に忍容性を示した。この投薬レジメンを使用して、本発明者らは、２つのヒト腫瘍異種移植モデル、Ｃａｐａｎ−１（膵臓癌）及びＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌）におけるｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの治療効果を調べた。治療は、ヌードマウスにて腫瘍移植の７日後に開始した。定着した、７日齢の、Ｃａｐａｎ−１モデルにおいて、定着腫瘍の１００％が素早く退縮し、再増殖のエビデンスはなかった（図１２）。この結果は、反復実験において再現された（図示せず）。同様の知見が、定着したＮＣＩ−Ｎ８７モデルにおいても成され（図示せず）、ここで治療の２回目のコースは７０日目の後に投与され、これは安全に忍容性を示し、残存腫瘍のさらなる退縮をもたらした（図示せず）。Ｔｒｏｐ−２を標的とする、内部移行するｈＲＳ７−ＳＮ−３８コンジュゲートは、あまり内部移行しない抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体であるｈＭＮ−１４のコンジュゲートよりも良好な治療応答を提供した（図２）。非標的抗ＣＤ２０  ＡＤＣであるｈＡ２０−Ｐ２ＰＤｏｘは有効でなく、これは選択的治療の有効性を示している（図２）。乳癌異種移植片（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）及び第二の膵臓癌異種移植片からのデータ（図示せず）は、コンジュゲートの特異的及び有意な抗腫瘍効果の同じ傾向を繰り返す。
【０２８３】
６．８または３．７薬物／ＩｇＧの置換を伴うｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘのＰＫ及び毒性−８もの超毒性薬物／ＭＡｂを有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、未改変ＭＡｂより早く排泄し、オフターゲット毒性を増加させることが知られており、４以下の薬物置換を使用する現在の傾向をもたらしている発見である（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７０６３−７０）。コンジュゲートを調製し、約６：１及び約３：１の平均薬物／ＭＡｂ置換率（ＭＳＲ）で評価した。正常マウスの群（ｎ＝５）に、単回用量の未改変ｈＲＳ７または６．８もしくは３．７の薬物置換を伴うｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘ（同じタンパク質用量）を静脈内投与し、血清試料を注射後３０分、４時間、２４時間、７２時間、及び１６８時間で回収した。これらをＥＬＩＳＡにより抗体濃度について分析した。様々な時間で血清濃度に有意差はなく、これは、これらが同様に排泄したことを示す。ＰＫパラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、等）は同様であった。高低いずれかの薬物置換を伴うコンジュゲートは、同じ用量のコンジュゲート薬物で投与されたとき、ヌードマウスにおいて同様の忍容性を有した。
【０２８４】
最小有効量（ＭＥＤ）での治療有効性−抗ＴＲＯＰ−２抗体コンジュゲートであるｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を有するヌードマウスにおいて、９ｍｇ／ｋｇ、６．７５ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの単回ボーラスタンパク質用量を投与することにより評価した。治療は、平均腫瘍体積（ｍＴＶ）が０．２５６ｃｍ３となったときに開始した。２１日目に、食塩水対照群（非処置群）におけるｍＴＶは、０．８０１±０．１８１ｃｍ３であり、これは、９、６．７５、４．５、または２．２５ｍｇ／ｋｇ用量で処置されたマウスにおける、それぞれ、０．２１１±０．０４２ｃｍ３、０．２３９±０．０．０５４ｃｍ３、０．２６４±０．０８７ｃｍ３、及び０．５６７±０．１７９ｃｍ３、のｍＴＶより有意に大きかった（Ｐ＜０．００４７、片側ｔ検定）。これらから、最小有効量は、２．２５ｍｇ／ｋｇであると判定され、一方で９ｍｇ／ｋｇはＭＴＤを表した。
【０２８５】
実施例１９．抗体−Ｐ２ＰＤｏｘのＭＴＤ
マウスにおいて、原型抗体であるｈＬＬ１の２−ＰＤｏｘ及びＰ２ＰＤｏｘコンジュゲートを比較するＭＴＤ試験は、Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートが遥かに強力であることを実証した（図示せず）。単回静脈内注射のＭＴＤは、１００から３００μｇの間であった。その後、４日間毎に合計４回（ｑ４ｄ×４）のスケジュールでの複数回注射のＭＴＤを、注射毎に２５μｇから１５０μｇの間のタンパク質用量を使用して、決定した。これらの用量で、１００から６００μｇの間の累積用量が動物に与えられた。以下の表５は、様々な群の概要である。
【０２８６】
【表６】
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【０２８７】
体重低下を示すグラフを図１３Ａ〜Ｄに示す。２５μｇ  Ｐ２ＰＤｏｘ−ＡＤＣで処置されたマウスのみが、継続して毒性の兆候を示さなかった。これは、１００μｇの累積用量であり、単回注射として投与されたときにも忍容性を示した用量であった（図示せず）。それゆえ、マウスにおけるＰ２ＰＤｏｘ−ＡＤＣの複数回注射でのＭＴＤは、この実験から２５μｇ  ｑ４ｄ×４である。データの注意深い分析及び実験の反復が、分割投薬でのＭＴＤを、４日毎に２週間投与される４５μｇのタンパク質用量（４５μｇ、ｑ４ｄ×４スケジュール）のコンジュゲートであると確立した。
【０２８８】
実施例２０．Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートを用いたさらなる試験
ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌腫細胞に対する抗体部分の結合において、未コンジュゲートｈＲＳ７と抗体あたり６分子のＰ２ＰＤｏｘにコンジュゲートしたＰ２ＰＤｏｘ−ｈＲＳ７との間に有意差は観察されなかった（図示せず）。標的抗原に対する抗体結合に与えるコンジュゲーションの影響の欠如がＰ２ＰＤｏｘ−ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｐ２ＰＤｏｘ−ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）及びＰ２ＰＤｏｘ−ｈＭＮ−２４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）コンジュゲートについて実証された。抗体へのＰ２ＰＤｏｘのコンジュゲーションは、抗体−抗原結合活性に影響しないと結論付けられた。
【０２８９】
標的細胞にコンジュゲートするＰ２ＰＤｏｘ−ｍＡｂコンジュゲートの細胞毒性を調べた。ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘ及びｈＭＮ−１５−Ｐ２ＰＤｏｘは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡＧ  Ｓ、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＣａｐａｎ−１固形腫瘍細胞株に対して細胞毒性であった（図示せず）。ｈＭＮ−１４−Ｐ２ＰＤｏｘは、Ｃａｐａｎ−１、ＢｘＰＣ−３及びＡｓＰＣ−１ヒト膵臓腫瘍株及びＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＬＳ１４７Ｔヒト胃及び結腸腫瘍株に対して細胞毒性であった（図示せず）。ｈＬＬ２−Ｐ２ＰＤＯｘは、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ及びＪＶＭ−３造血器腫瘍株に対して細胞毒性であった（図示せず）。コンジュゲートのＩＣ５０値は、ナノモル濃度範囲であった（図示せず）。
【０２９０】
さらなるＩｎ  ｖｉｖｏ有効性試験を、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を移植されたヌードマウスにおいて行った（図１４Ａ〜Ｆ）。４×４５μｇのｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを用いる１回の処置サイクルは、迅速に全ての腫瘍を退縮させた（図１４Ｄ）。２回目の処置サイクルは、最初のサイクルの終了の約２カ月後に開始され、ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘで処置された動物の１つを除く全ての完全な退縮をもたらした。ｈＡ２０、ｈＬＬ１及びｈＭＮ−１４コンジュゲートは、腫瘍進行にほとんど影響しなかった（図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｅ及び１４Ｆ）。Ｐ２ＰＤｏｘ−ｈＭＮ−１５の投与は、胃癌の退縮を遅れてもたらし、これはｈＲＳ７コンジュゲートよりも効果は低かった。
【０２９１】
抗腫瘍有効性に及ぼす投与スケジュールの変動の影響を調べた（図１５）。実験は、腫瘍移植の９日後に開始し、このとき全群での平均腫瘍体積は０．３８３ｃｍ３であり、９３日目に終了した（治療開始の８４日後）。この試験では、１８０μｇの単回用量、９０μｇの２回の週１回用量、及び４５μｇのｑ４ｄ×４は、全て有意に向上された生存をもたらした（図１５）。食塩水対照については、９匹中０匹のマウスが生存した（図示せず）。４５μｇ  ｑ４ｄ×４のｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを受けているマウスについては、９匹中８匹のマウスが９４日目で生存していた（図示せず）。９０μｇ週１回×２のｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを受けているマウスについては、９匹中９匹のマウスが９４日目で生存していた（図示せず）。１８０μｇの単回用量のｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘを受けているマウスについては、９匹中７８匹のマウスが９４日目で生存していた（図示せず）。
【０２９２】
同じ投薬スケジュールで、対照ｈＡ２０コンジュゲートは、生存に影響を及ぼさなかった（図１５）。毒性試験は、３つの投薬スケジュールのｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘは、同様に低レベルの毒性をもたらしたことを示した（図示せず）。
【０２９３】
ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートは、Ｃａｐａｎ−１膵臓癌においても有効であり（図示せず）、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８コンジュゲートよりも腫瘍増殖の阻害に有効であった（図示せず）。ｈＰＡＭ４−Ｐ２ＰＤｏｘコンジュゲートも、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８コンジュゲートよりもＣａｐａｎ−１ヒト膵臓癌の増殖の阻害に有効であった（図示せず）。Ｃａｐａｎ−１腫瘍注射の６３日後（治療は、接種の１日後に開始）、１０匹中０匹のマウスが食塩水対照で生存しており、１０匹中１０匹のマウスが週２回×２週間４５μｇのｈＰＡＭ４−Ｐ２ＰＤｏｘを用いて処置されたマウスで生存しており、１０匹中２匹のマウスが週２回×２週間４５μｇのｈＡ２０−Ｐ２ＰＤｏｘで処置されたマウスで生存しており、１０匹中０匹のマウスが週２回×４週間２５０μｇのｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８を用いて処置されたマウスで生存しており、１０匹中０匹のマウスが週２回×４週間２５０μｇのｈ２０−ＳＮ−３８を用いて処置されたマウスで生存していた。
【０２９４】
ｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘは、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８よりもＰｘＰＣ−３膵臓癌の増殖の阻害に実質的に有効であり（図示せず）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌の増殖の阻害にｈＲＳ７−ＳＮ−３８よりも微かに有効であった（図示せず）。
【０２９５】
ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌腫異種移植片の増殖に及ぼす異なる単回用量のｈＲＳ７−Ｐ２ＰＤｏｘの影響を図１６に示す。単回用量を使用して、腫瘍増殖に及ぼす最大効果は、９０μｇまたはそれ以上で観察された（図１６）。単回用量の４５μｇは、食塩水対照と比較して有意な生存利益を観察するために必要とされる最小値であった（図１７）。
【０２９６】
様々なｈＲＳ７−ＡＤＣコンジュゲートのＡＤＣＣ活性をｈＲＳ７  ＩｇＧと比較して決定した（図１８）。ＰＢＭＣをニュージャージー州の血液センターから購入した血液から精製した。Ｔｒｏｐ−２陽性ヒト膵臓腺癌細胞株（ＢｘＰＣ−３）を、標的細胞株として使用し、エフェクタ対標的比は１００：１とした。ｈＲＳ７  ＩｇＧにより媒介されるＡＤＣＣを、ｈＲＳ７−Ｐｒｏ−２−ＰＤｏｘ、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、及び還元されてキャップされたｈＲＳ７−ＮＥＭと比較した。全て３３．３ｎＭで使用した。
【０２９７】
結果を図１８に示す。全体的な活性は低かったが、有意であった。ｈＲＳ７  ＩｇＧでは８．５％特異的溶解があり、これはｈＲＳ７−Ｐｒｏ−２−ＰＤｏｘと有意差はなかった。両方ともｈＬＬ２対照及びｈＲＳ７−ＮＥＭ及びｈＲＳ７−ＳＮ−３８より有意に良好であった（Ｐ＜０．０２、両側ｔ検定）。ｈＲＳ７−ＮＥＭとｈＲＳ７−ＳＮ−３８の間に差はなかった。
【０２９８】
実施例２１．Ｐ２ＰＤｏｘ−ｈＲＳ７  ＡＤＣを用いるトリプルネガティブ乳癌の処置
Ｐ２ＰＤｏｘ−ｈＲＳ７  ＡＤＣは、上記実施例に記載のように調製される。少なくとも２つの標準療法に失敗したトリプルネガティブ乳癌を有する患者は、３サイクルの７０ｍｇ  Ｐ２ＰＤｏｘ−ｈＲＳ７を３週間毎に静脈内注射された。客観的奏効が、この用量レベルのＰ２ＰＤｏｘ−ｈＲＳ７で観察され、２サイクルの治療後、平均で腫瘍体積において３５％低減した。ヒト抗ｈＲＳ７抗体（ＨＡＨＡ）について評価した全ての血清試料は陰性であった。腫瘍量の減少のあと、腫瘍を外科的に除去した。
＊＊＊
【０２９９】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び改変を行って、様々な使用及び条件に過度の実験を伴わずに適合させることができる。本明細書で引用した全ての特許、特許出願及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月3日(2020.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌のネオアジュバント処置のための組成物であって、前記組成物は、
Ｔｒｏｐ−２を発現する癌を有する対象に投与するためのものであり、
抗Ｔｒｏｐ−２抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含み、
前記ＡＤＣはカンプトテシン薬物にコンジュゲートした抗Ｔｒｏｐ−２抗体部分を含み、
前記組成物が、化学療法又は放射線療法の前に投与されるためのものである、組成物。
【請求項２】
化学療法の前に投与されるためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
放射線療法の前に投与されるためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カンプトテシンが、ＳＮ−３８である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体部分が、ｈＲＳ７である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体部分が、ＩｇＧ抗体または抗原結合性抗体断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群より選択されるヒト定常領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体部分が、非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）、Ｇ１ｍ３及びＫｍ３からなる群から選択されるアロタイプを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＡＤＣが、前記薬物を前記抗体部分に付着させるリンカーを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記薬物がＳＮ−３８であり、前記リンカーがＣＬ２Ａである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が、結腸癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、前立腺癌、及び直腸癌からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、転移性結腸癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性腎細胞癌腫、転移性胃癌、転移性前立腺癌、及び転移性小細胞肺癌からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記癌が、他の治療法に不応性であるが、ネオアジュバントＡＤＣを用いる治療には応答する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【外国語明細書】
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