(57)【要約】【課題】術後後期における細菌感染に対して抗菌性を発揮する。【解決手段】銀イオンがβ-TCP中に取り込まれて結晶格子中に固溶しているものをつくり、骨再生用材料の生分解性繊維中に含有させる。骨再生用材料が体内にインプラントされた後、骨再生用材料を構成する生分解性繊維が吸収分解されるに従って、繊維に含有されていたβ-TCPが体液と接触してゆっくりと溶解・吸収されていき、その過程で、銀イオンがそれと共に溶けだして抗菌性を発揮する。【選択図】図12
2020130417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物であって、
前記抗菌性組成物は、銀イオンをβ-TCPの結晶格子中のカルシウムサイトに置換固溶させることによって合成された銀イオン固溶β-TCPの粒子であり、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界以内に制御することによって、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として実質的に析出していない、ことを特徴とする、
抗菌性組成物。
【請求項２】
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成することによって製造されている、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項３】
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の径は１〜１０μｍであることを特徴とする、請求項1
又は２に記載の抗菌性組成物。
【請求項４】
骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物であって、
前記抗菌性組成物は、銀イオンをβ-TCPの結晶格子中のカルシウムサイトに置換固溶させることによって合成された銀イオン固溶β-TCPの粒子であり、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界を超えるように制御することによって、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として析出していることを特徴とする、
抗菌性組成物。
【請求項５】
骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成し、
前記試料溶液の銀イオン濃度は、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として実質的に析出することがないように前記β-TCPの固溶限界以内に制御されている、ことを特徴とする、
抗菌性組成物の製造方法。
【請求項６】
前記試料溶液の銀イオン濃度は５〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、請求項５に記載の抗菌性組成物の製造方法。
【請求項７】
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の径は１〜１０μｍであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の抗菌性組成物の製造方法。
【請求項８】
骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状に噴霧して、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成し、
前記試料溶液の銀イオン濃度は、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として析出するように制御されている、ことを特徴とする、
抗菌性組成物の製造方法。
【請求項９】
銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、ポリ乳酸又は乳酸-グリコール酸共重合体と銀イオン固溶β-TCPの粒子を含み、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによってβ-TCPのカルシウムサイトに銀イオンを置換固溶させることによって合成されており、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界以内に制御することによって、銀が前記β-TCPの粒子の表面に銀ナノ粒子として実質的に析出しておらず、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子が前記生分解性繊維中に略均一に分散していることを特徴とする、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料。
【請求項１０】
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の径は約１〜１０μｍであることを特徴とする、請求項９に記載の骨再生用材料。
【請求項１１】
銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、ポリ乳酸、又は乳酸-グリコール酸共重合体と銀イオン固溶β-TCPの粒子を含み、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによってβ-TCPのカルシウムサイトに銀イオンを置換固溶させることによって合成されており、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界を超えるように制御することによって、銀が前記β-TCPの粒子の表面に銀ナノ粒子として析出しており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子が前記生分解性繊維中に略均一に分散していることを特徴とする、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料。
【請求項１２】
銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによって、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPの粒子を調製し、前記試料溶液の銀イオン濃度は前記銀イオン固溶β-TCPの固溶限界を超えずに銀が粒子の表面に析出することがない範囲に制御されており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子を生分解性樹脂に含有させて調製した紡糸溶液を用いて電界紡糸法によって生分解性繊維を製造する、工程を含む、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法。
【請求項１３】
前記試料溶液の銀イオン濃度は５〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、請求項１２に記載の抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法。
【請求項１４】
銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによって、銀がβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPの粒子を調製し、前記試料溶液の銀濃度は前記銀イオン固溶β-TCPの固溶限界を超えて銀が粒子の表面に析出する範囲に制御されており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子を生分解性樹脂に含有させて調製した紡糸溶液を用いて電界紡糸法によって生分解性繊維を製造する、工程を含む、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、術後後期の細菌感染に対する抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人工骨のようなインプラント材料を患部に埋め込む際の手術作業を行った際、細菌を原因とした術後感染が生じる恐れがある。そのための対策として、インプラント材に抗菌性を持たせる試みが行われている。抗菌物質としての銀は、抗生剤のように薬剤耐性菌（MRSA等）を生じさせず、さらには幅広い細菌に対して抗菌性を示す（抗菌スペクトルが広い）ことから、有望な抗菌処理方法として期待されている。
【０００３】
医療機器に抗菌性を持たせる方法として、材料を銀イオン等の抗菌イオンを含む溶液に浸漬することで、材料の表面に抗菌物質を担持させる方法が提案されている。この方法で調製された抗菌性インプラントは、術後2週間程度の早期感染に対応するものであり、その材料評価も長くても1か月程度であった。一方、臨床的には、6か月以上経過してからの感染も認められているので、早期感染に加えて後期感染に対応する技術も必要である。
【０００４】
後期感染に対する対応策として、骨再生用材料を構成する生分解性繊維の内部に銀イオン又は銀ナノ粒子を担持させて、人工骨が生体内にインプラントされた後に生分解性繊維の分解吸収と共に銀イオン又は銀ナノ粒子を溶出させる方法が考えられる。Flexible, silver containing nanocomposites for the repair of bone defects: antimicrobial effect against E. coli infection and comparison to tetracycline、Journal of Materials Chemistry 2008 Oliver D. Schneider et al. は、Agを担持させたリン酸三カルシウム（TCP）ナノ粒子をポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）に含有させたコンポジット繊維からなる綿状の骨修復材料を開示している。
【０００５】
上記Schneider et al. は、flame spray synthesis 法を用いて銀がドープされたリン酸カルシウムを合成している。しかし、この方法だと試料溶液を高温に加熱する時間が極めて短いためリン酸カルシウムは十分に結晶化せずアモルファス状態にしかならない。リン酸カルシウムが結晶構造をとらなければ、リン酸カルシウムのCaイオンと銀イオンとが置換固溶された置換型ＴＣＰを構成することはない。Schneider et al. の方法ではドープされた銀は早期にリン酸カルシウムから溶出してしまい、後期感染対策としては十分でないと考えられる。
【０００６】
他方、骨再生用材料に銀を担持させる場合、生体内で溶出される銀イオン又は銀ナノ粒子は細菌を死滅させる抗菌性を有するが、同時に、増殖する必要がある骨芽細胞や周辺の細胞に対して細胞毒性を発現する可能性がある。抗菌性も細胞毒性も、銀イオン濃度が上昇するほど効果が高くなるため、人工骨に対して抗菌性を付与するにあたり、これら二つの互いに相反する要請を同時に満たすことが最も重要な課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Flexible, silver containing nanocomposites for the repair of bone defects: antimicrobial effect against E. coli infection and comparison to tetracycline、Journal of Materials Chemistry 2008 Oliver D. Schneider et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のような状況下で、術後後期において抗菌性を発揮し、尚且つ細胞毒性を発現する恐れの少ない安全性の高い骨再生用材料とその製造方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者等は鋭意検討した結果、後期感染に対応するためには、銀がβ相リン酸三カルシウム（以下β-TCPと略記する）中に取り込まれて結晶格子中に固溶している粒子をつくり、β-TCP粒子が体液と接触してゆっくりと溶解・吸収されていく過程で、固溶されている銀イオンがそれと共に溶けだすという設計が、術後後期の抗菌性と生体への安全性とを両立させる上で最も望ましい、という結論に至った。
【００１０】
銀イオンが固溶されたβ-TCP粒子を製造する方法として、本発明の発明者等は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、その試料溶液を超音波によって霧状にして、その液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCP粒子を製造できることに想到した。
【００１１】
上記想到に基づき、本発明の発明者等は、骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物であって、
前記抗菌性組成物は、銀イオンをβ-TCPの結晶格子中のカルシウムサイトに置換固溶させることによって合成された銀イオン固溶β-TCPの粒子であり、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界以内に制御することによって、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として実質的に析出していない、ことを特徴とする、
抗菌性組成物、という発明に到達した。
【００１２】
本発明の発明者等はさらに、上記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成することによって製造されている、抗菌性組成物、という発明に到達した。
【００１３】
本発明の発明者等はさらに、上記イオン固溶β-TCPの粒子の径は１〜１０μｍであることを特徴とする、抗菌性組成物、という発明に到達した。
【００１４】
本発明の発明者等はさらに、骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物であって、
前記抗菌性組成物は、銀イオンをβ-TCPの結晶格子中のカルシウムサイトに置換固溶させることによって合成された銀イオン固溶β-TCPの粒子であり、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界を超えるように制御することによって、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として析出していることを特徴とする、
抗菌性組成物、という発明に到達した。
【００１５】
本発明の発明者等はさらに、骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成し、
前記試料溶液の銀イオン濃度は、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として実質的に析出することがないように前記β-TCPの固溶限界以内に制御されている、ことを特徴とする、
抗菌性組成物の製造方法、という発明に到達した。
【００１６】
本発明の発明者等はさらに、上記試料溶液の銀イオン濃度は５〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、抗菌性組成物の製造方法、という発明に到達した。
【００１７】
本発明の発明者等はさらに、上記銀イオン固溶β-TCPの粒子の径は１〜１０μｍであることを特徴とする、抗菌性組成物の製造方法、という発明に到達した。
【００１８】
本発明の発明者等はさらに、骨再生用材料に用いる生分解性繊維に含有する抗菌性組成物の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状に噴霧して、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に前記液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせて、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPを合成し、
前記試料溶液の銀イオン濃度は、銀が前記銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として析出するように制御されている、ことを特徴とする、
抗菌性組成物の製造方法、という発明に到達した。
【００１９】
本発明の発明者等はさらに、銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、ポリ乳酸又は乳酸-グリコール酸共重合体と銀イオン固溶β-TCPの粒子を含み、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによってβ-TCPのカルシウムサイトに銀イオンを置換固溶させることによって合成されており、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界以内に制御することによって、銀が前記β-TCPの粒子の表面に銀ナノ粒子として実質的に析出しておらず、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子が前記生分解性繊維中に略均一に分散していることを特徴とする、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料、という発明に到達した。
【００２０】
本発明の発明者等はさらに、上記銀イオン固溶β-TCPの粒子の径は約１〜１０μｍであることを特徴とする、骨再生用材料、という発明に到達した。
【００２１】
本発明の発明者等はさらに、銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、ポリ乳酸、又は乳酸-グリコール酸共重合体と銀イオン固溶β-TCPの粒子を含み、前記銀イオン固溶β-TCPの粒子は、超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによってβ-TCPのカルシウムサイトに銀イオンを置換固溶させることによって合成されており、
前記銀イオンの量を前記β-TCPの固溶限界を超えるように制御することによって、銀が前記β-TCPの粒子の表面に銀ナノ粒子として析出しており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子が前記生分解性繊維中に略均一に分散していることを特徴とする、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料、という発明に到達した。
【００２２】
本発明の発明者等はさらに、銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによって、銀イオンがβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPの粒子を調製し、前記試料溶液の銀イオン濃度は前記銀イオン固溶β-TCPの固溶限界を超えずに銀が粒子の表面に析出することがない範囲に制御されており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子を生分解性樹脂に含有させて調製した紡糸溶液を用いて電界紡糸法によって生分解性繊維を製造する、工程を含む、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法、という発明に到達した。
【００２３】
本発明の発明者等はさらに、上記試料溶液の銀イオン濃度は５〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、上記抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法、という発明に到達した。
【００２４】
本発明の発明者等はさらに、銀イオン固溶β-TCPの粒子を含むことによって抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法であって、
超音波噴霧熱分解法を用いて、硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液及び硝酸を混合して試料溶液を調製し、前記試料溶液を超音波によって霧状にして、それによって生じた液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去、塩の析出、熱分解を起こさせることによって、銀がβ-TCPのカルシウムサイトに置換固溶された銀イオン固溶β-TCPの粒子を調製し、前記試料溶液の銀濃度は前記銀イオン固溶β-TCPの固溶限界を超えて銀が粒子の表面に析出する範囲に制御されており、
前記銀イオン固溶β-TCPの粒子を生分解性樹脂に含有させて調製した紡糸溶液を用いて電界紡糸法によって生分解性繊維を製造する、工程を含む、
抗菌性を付与された生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法、という発明に到達した。
【００２５】
銀イオンの量が固溶限界を超えると、銀はナノ粒子としてβ-TCPの表面に析出し、そのナノ粒子が硫化又は酸化することによって着色の原因となる。医療材料製品として着色を避ける上では本発明の実施態様の銀イオン固溶β-TCPは、β-TCPに対する銀イオンの量は固溶限界以内である10 mol%以下であることが好ましい。β-TCPに対する銀イオンの量を10 mol%以下に抑えるためには、例えば、試料溶液のカルシウムイオン濃度（0.90 mol/dm3）およびリン酸イオン濃度（0.60 mol/dm3）に対して、試料溶液の銀イオン濃度を0.03 mol/dm3以下に抑えればよい。一方、銀イオンの量が固溶限界を超えると、銀はナノ粒子としてβ-TCPの表面に析出するため、特に高い抗菌性を示す。医療材料製品として高い抗菌性を得る上では本発明の実施態様の銀イオン固溶β-TCPは、β-TCPに対する銀イオンの量は固溶限界である10 mol%よりも多いことが好ましい。
【００２６】
好ましくは、本発明の実施態様の銀イオン固溶β-TCP粒子の粒子径は、1μｍ〜10μｍである。粒子の径は、超音波噴霧熱分解法において、超音波の周波数と試料溶液の界面張力を調整することによって、調整可能である。
【００２７】
好ましくは、本発明の実施態様の生分解性繊維は、銀イオン固溶β-TCP粒子に加えてケイ素溶出型バテライト相炭酸カルシウム粒子を含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の抗菌性を付与した骨再生用材料は、銀イオンを固溶させたβ-TCP粒子を生分解性繊維中に含有しているので、生分解性樹脂が吸収分解されて、繊維中に含有されているβ-TCP粒子が体液と接触することによってゆっくりと溶解・吸収される過程で、銀イオンが溶出されるので、術後後期の段階で抗菌性を発揮することができる。
【００２９】
超音波噴霧熱分解法を用いることで、超音波の周波数と試料溶液の界面張力を調整することによって、所望の粒径の銀イオン固溶β-TCP粒子を得ることができる。また、超音波噴霧熱分解法を用いて銀イオン固溶β-TCPを合成する過程では、リン酸銀が副生されない。リン酸銀は溶解性が低いので、合成の過程で副生されると銀イオンの溶出が抑制されて抗菌性が低下する。従って、超音波噴霧熱分解法を用いてリン酸銀が副生されないことは、材料の抗菌性にとってプラスに働くと考えられる。
【００３０】
本発明の抗菌性を付与した骨再生用材料は、超音波噴霧熱分解法を用いてβ-TCP粒子を合成する過程で、固溶される銀イオンの量を調整できるので、必要な抗菌性を保持しつつ、細胞毒性の発現を抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図1は、本発明の銀担持ＴＣＰを用いて製造された綿状の骨再生材料（Ag-TCP(5)を６重量％含有）の外観写真を示す。
【図２】図2は、本発明の銀担持ＴＣＰ粒子を含有した生分解性繊維の走査型電子顕微鏡（以下ＳＥＭと略記する）写真を示す（左：低倍率、右：高倍率）
【図３】図3は、リン酸三カルシウムに対するAg固溶量を20 mol%として調製したAg-TCP(20)を含有した生分解性繊維からなる綿状の骨再生材料の外観写真を示す。
【図４】図4は、本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPの粒子を合成するのに用いる試料溶液の調製の例を示す。
【図５】図5は、本発明の一つの実施態様に用いる超音波噴霧熱分解装置を示す。
【図６】図6は、本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPの粒子のＩＣＰ発光分析（以下ICP-AESと略記する）による化学組成を示す。
【図７】図7は本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPの粒子の粒子形態を示すＳＥＭ写真である。
【図８】図8は、本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCのP粒子のEDXスペクトルを示す。
【図９】図9は、中性条件下で本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCP粉体からの銀イオンの溶出量と溶出率を測定した結果を示す。
【図１０】図10は、酸性条件下で本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPの粉体からの銀イオンの溶出量と溶出率を測定した結果を示す。
【図１１】図11は、本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPの粒子から溶出した銀イオン濃度と大腸菌の増殖性の関係を示す。
【図１２】図12は、阻止円法による本発明の一つの実施態様における銀イオン固溶β-TCPのdiscの抗菌性評価を示す。
【図１３】図13は、骨組織と共に取り出した銀担持ＴＣＰ試験片のＸ線μＣＴ像を示す。
【図１４】図14は、骨組織と共に取り出した銀担持ＴＣＰ試験片のビラヌエバ骨染色による組織学的評価の結果を示す。
【図１５】図15は、β-TCPリン酸三カルシウムに対するAg固溶量を20mol%として調製したAg-TCP(20)を含有した生分解性繊維からなる綿状骨再生材料の抗菌性試験結果を示す。
【図１６】図16は、β-TCPリン酸三カルシウムに対するAg固溶量を20mol%として調製したAg-TCP(20)を含有した生分解性繊維からなる綿状骨再生材料の細胞毒性試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下本発明を実施するための好ましい形態について図面を用いて説明する。
本出願において、以下の用語は次の意味を有するものとして用いられる。
（１）骨再生用材料
本発明の一つの実施態様において、骨再生用材料とは、β-TCP等の骨形成因子を生分解性樹脂に含有させた複合繊維からなる骨欠損部充填材料をいう。好ましい実施態様において、骨再生材料は電界紡糸法で防止された生分解性繊維からなる綿形状物である。骨欠損部に骨再生用材料を充填することで、骨リモデリングによる骨形成を促進する。図1は、本発明の銀担持ＴＣＰを用いて製造された綿状の骨再生材料の外観写真を示す。
【００３３】
（２）熱混練法
本発明の一つの実施態様において、生分解性繊維を電界紡糸法を用いて紡糸するための紡糸溶液中に銀イオン固溶β-TCP粒子を分散させる方法として、熱混練法を用いる。熱混練法では、溶融又は軟化した生分解性樹脂と無機粒子を熱混練装置（ニーダー）で混合して混練することによって、生分解性樹脂と無機粒子の複合体を作製し、そのようにして作製された複合体をクロロホルム等の溶剤を用いて溶かすことによって電界紡糸法に用いる紡糸溶液を作製する。 
【００３４】
（３）生分解性繊維
本発明の一つの実施態様において、骨再生用材料に用いる銀を含有させた生分解性繊維は、ポリ乳酸、又は乳酸-グリコール酸共重合体を好適なマトリクス樹脂として、電界紡糸法を用いて紡糸して製造される。繊維の外径は１０〜１００μｍ、より好ましくは２０〜５０μｍが十分な量のカルシウム化合物粒子を繊維の内部に含有させる上で好ましい。図2は、本発明の銀担持ＴＣＰ粒子を含有した生分解性繊維のＳＥＭ写真を示す（左：低倍率、右：高倍率）。繊維1本1本の表面に銀担持ＴＣＰの粒が練り込まれているのが確認できる。
【００３５】
（４）超音波噴霧熱分解法
本発明の一つの実施態様において、銀イオン固溶β-TCP粒子を製造するために超音波噴霧熱分解法を用いる。超音波噴霧熱分解法とはセラミックス原料粉体の合成法のひとつであり、試料溶液を超音波により霧状にして、この液滴を加熱した電気炉中に導入して瞬時に液滴からの溶媒の除去・塩の析出・熱分解を起こさせて目的とする化学組成の粉体（微粒子）を得ることができる。分子レベルで十分に混合された原料溶液を噴霧させて、得られた微小液滴の熱分解により、化学量論的に制御された目的の微粒子を連続的に得ることができる。
【００３６】
（５）銀イオン固溶β-TCP
本発明の一つの実施態様において、抗菌性組成物となる銀イオン固溶β-TCPとは、β-TCPの結晶格子中のカルシウムサイトがAg+で置換固溶されたβ相リン酸三カルシウムをいう。本発明の一つの実施態様では、超音波噴霧熱分解法を用いて用いる試料溶液（Ca2+:0.9 mol/dm3, PO43-: 0.6 mol/dm3）中の銀イオンの濃度を0.03 mol/dm3以下に抑えることによって、銀イオンの量をβ-TCPの固溶限界（約10 mol%）以内に抑えている。固溶限界を超えるとβ-TCP粒子の表面に銀ナノ粒子が析出し、そのナノ粒子が硫化又は酸化することにより、茶色に着色する原因となる。図3は、銀イオンの量をβ-TCPの固溶限界を超えて20 mol%として製造したAg-TCP粉体（Ag-TCP(20))を生分解性繊維に含有させて作製した綿状骨再生用材料の外観写真を示す。図3のモノクロ写真画像からは着色が明らかでないが、Ag-TCP(20)の含有量が多くなるほど、繊維が茶色に着色する。
本発明において、銀が銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面にナノ粒子として実質的に析出していないとは、このような着色が見られない、又は透過型電子顕微鏡で観察した際に、銀イオン固溶β-TCPの粒子の表面に銀のナノ粒子が殆ど観察されないことを言う。一方、銀イオンの量がβ-TCPの固溶限界を超えた場合には、β-TCP粒子の表面に銀ナノ粒子が析出し、特に高い抗菌性を示す。
【本発明の好ましい実施形態】
【００３７】
Ｉ．銀イオン固溶β-TCP粒子の作製
図5は、本発明の銀イオン固溶β-TCP粒子の作製に用いる超音波噴霧熱分解装置の例である。硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液、硝酸を用いて調製した試料溶液を超音波発生装置にかけて霧状に噴霧する。噴霧された試料溶液は下部電気炉と上部電気炉を通って銀イオン固溶β-TCP粒子として析出し、円筒濾紙に回収される。
【００３８】
ＩＩ．銀イオン固溶β-TCP粒子含有生分解性繊維からなる骨再生用材料の作製
１）混練
上記で得られた銀イオン固溶β-TCP粒子を、ニーダーで加熱して溶融又は軟化させた生分解性樹脂と混合して、混練することによって、生分解性樹脂と銀イオン固溶β-TCP粒子の複合体を作製する。生分解性樹脂と銀イオン固溶β-TCP粒子の組成比は、３０〜５０重量％：７０〜３０重量％が好ましい。
【００３９】
２）紡糸溶液の調製
上記で得られた複合体を溶剤で溶かすことによって、紡糸溶液を調製する。紡糸溶液の樹脂濃度は電界紡糸法による紡糸の容易さという観点からは６〜１２重量％程度が好ましい。
【００４０】
３）抗菌性を付与した骨再生用材料の製造
上記で得られた紡糸溶液を用いて電界紡糸法で銀イオン固溶β-TCP粒子を含有した生分解性繊維を紡糸して電界紡糸装置のコレクターに堆積させる。紡糸された繊維をエタノール液を満たしたコレクターに堆積させることで、紡糸された繊維を綿状に回収することが可能になる。
【００４１】
ＩＩＩ．銀イオン固溶β-TCP粒子含有生分解性繊維からなる骨再生用材料の抗菌性
本発明の抗菌性を付与した骨再生用材料は、銀イオンを固溶させたβ-TCP粒子を生分解性繊維中に含有しているので、生体内に骨再生用材料をインプラントした後、生分解性樹脂が吸収分解されると、繊維中に含有されているβ-TCP粒子が露出して体液と接触することによってゆっくりと溶解・吸収され、その過程で銀イオンが徐放されるので、術後後期の段階で抗菌性を発揮することができる。体内で細菌が活性化すると、その周辺の体内環境は酸性に傾くが、β-TCPは酸性環境下でより溶解が進むので、それと共に固溶された銀イオンが溶出される量が増えて細菌に対して積極的にアタックするので、効果的な抗菌作用が得られる。
【実施例】
【００４２】
＜銀イオン固溶β-TCP粒子サンプルの調製＞
試料溶液を硝酸カルシウム水溶液、リン酸水素二アンモニウム水溶液、硝酸銀水溶液、硝酸を用いて調製し、生成するリン酸カルシウムに対してAgを0, 1, 5, 10, 20 mol%添加した（図4）。これによって調製した5種類の各試料溶液のそれぞれを図5に示す超音波発生器を用いて霧化し、下部電気炉300℃、上部電気炉1000℃に設定した加熱部に導入し、液滴の乾燥およびそれに続く熱分解を起こさせることによって、銀イオン含有量の異なる5種類の銀担持ＴＣＰ（Ag-TCP）粉体を合成した。
【００４３】
図4において、生成するリン酸カルシウムに対するAgモル濃度をそれぞれ、Ag-TCP(0)は0 mol%、Ag-TCP(1)は１mol%、Ag-TCP(5)は5 mol%、Ag-TCP(10)は10 mol%、Ag-TCP(20) は20 mol% として得られたサンプルを示す。合成したままの粉体には原料由来の硝酸イオンが含まれていたため、超純水で3回、ついでアセトンで3回洗浄した。 
【００４４】
上記の5種類の銀担持ＴＣＰの結晶相をＸ線回折によって調べたところ、結晶相はβ相が優占していた。FT-IRを用いて、これらの粉体の官能基を調べたところ、TCPに特徴的なオルトリン酸イオン(PO43-)の他に硝酸イオン(NO3-)も検出された。そこで、硝酸イオンを除去するため、純水で洗浄したところ、硝酸イオンに由来するピークは検出されなくなった。図6に洗浄前後における合成粉体および洗浄粉体の化学組成を比較して示す。図6において、洗浄粉体であることを示す略号としてwを用いる。例えば、銀イオン濃度10mol%で合成して洗浄したAg-TCP粉体はAg-TCP(10)-wとして示す。
【００４５】
図7及び8は、銀担持ＴＣＰ(10)-wの粒子形態およびEDXスペクトルをそれぞれ示す。
図7より、銀担持ＴＣＰ-wはいずれも球状粒子から構成されていることが分かる。また、図8に示すEDXスペクトルから、この粉体にはTCPの主成分であるカルシウムとリンの他に銀が含有されていることが分かる。レーザー散乱法により、この粉体の粒径(メジアン径)を調べたところ、約2 μmであり、その粒度分布は一つのピークであり、狭く分布しており、ポリマーに充填する無機フィラーとして好適な粒子形態であることが分かった。図7のSEM像には2 μmを超える球状粒子が一部観察されたが、これは超音波照射により発生した液滴が乾燥・熱分解を受ける前に合体し、液滴径が増大したためであると推察される。銀担持ＴＣＰ(10)-wの比表面積をBET法により決定したところ、約6 m2/gであった。データは省略するが、他の銀担持ＴＣＰ粉体もほぼ同様のメジアン径、粒度分布、比表面積であった。
【００４６】
＜銀担持ＴＣＰからのイオンの溶出＞
銀含有量の異なる5種類の銀担持ＴＣＰ粉体（Ag-TCP(0), Ag-TCP(1), Ag-TCP(5), Ag-TCP(10)）, Ag-TCP(20)を20 mM HEPESバッファー(10 mL)に懸濁し、37℃で1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28日間インキュベートし、粉体からの溶出される銀イオンをICP-AESにより測定した結果を図9及び図10に示す。
【００４７】
図9は、中性条件下でのAg-TCP粉体からの銀イオンの溶出測定試験を示し、図10は、酸性条件下でのAg-TCP粉体からの銀イオンの溶出測定試験を示す。Ag-TCP粉体からの銀イオンの溶出量、溶出率共に、中性条件下よりも酸性条件下の方が多いことが確認された。また、Ag-TCP(10)及びAg-TCP(20)の実験の上澄みの銀イオン濃度は14日までの全回収期間において2.0ppmを上回っていた。細菌は種類にもよるが、2.0ppm以上の銀濃度で死滅するため、抗菌性を発現していると考えられる。
【００４８】
＜得られた材料の抗菌性評価＞
銀担持ＴＣＰ粉体の抗菌性評価を調査するため、銀担持ＴＣＰ（Ag-TCP(1), Ag-TCP(5), Ag-TCP(10)）粉体を20 mM HEPES緩衝液に懸濁し、銀イオンをリリースさせた溶液を調製した。そこへ1×105 CFU/mＬとなるよう大腸菌を懸濁させ、24時間培養した後に分光光度計を用いて、600 nmにおける吸光度を測定することで抗菌性を評価した。その結果を図11に示す。
【００４９】
図11に示す通り、銀イオン濃度が1, 5, 10 mol%となるよう合成された銀担持ＴＣＰ(（Ag-TCP(1), Ag-TCP(5), Ag-TCP(10)）粉体からの溶出液はいずれも抗菌性を発現することが明らかになった。このとき，緩衝液中の銀イオン濃度は合成粉体の銀イオン仕込み量に依存して増加した。大腸菌の銀イオンの発育阻止濃度(MIC)は1.0 ppm程度であり、銀担持ＴＣＰ(5, 10)粉体はこれを越えており、抗菌性を発現する条件を満たしていると判断できる。
【００５０】
銀イオン濃度の異なる銀担持ＴＣＰ粉体(銀担持ＴＣＰ(0, 1, 5, 10))を金型成形器(φ15 mm)へ充填し、加圧成形することによりdisc状試料片を作製した。試料片を乾熱滅菌(180℃, 1.5 h)した後に先述した「阻止円法」により抗菌性を評価した。その結果を図12に示す。
【００５１】
図12に示す通り、銀担持ＴＣＰ(1, 5)において大腸菌を培養した場合、disc周囲には菌が増殖し、阻止円の形成はほとんど認められなかった。しかし，discの真上には菌が僅かにしか存在しなかったことから、材料の最表面には抗菌性があり、細菌の接着を抑制しているものと考えられる。このような表面特性は細菌によるバイオフィルム形成を防止することにつながると推察される。一方，銀担持ＴＣＰ(10)粉体から作製されたdiscを用いた場合は、試料片周辺に形成された大腸菌のコロニー数が減少しており、阻止帯の形成が観察された。これらの結果は，銀担持ＴＣＰ(1,5)からLB寒天培地中へリリースされる銀イオンは大腸菌の発育を十分に阻害できる濃度ではなかったが、銀担持ＴＣＰ(10)粉体を用いることで抗菌性を発現させることが可能であることを示唆している。以上の結果より，銀担持ＴＣＰ粉体はそれ単味での抗菌性の発現には合成時に10 mol%以上の銀イオンが含まれていることが必須であると考えられる。
【００５２】
＜材料の硬組織適合性＞
銀含有量の異なる銀担持ＴＣＰの硬組織適合性を明らかにするため、ウサギ脛骨へのインプラント実験を行なった。埋入試料片は銀担持ＴＣＰ(0, 1, 5, 10)-w粉体に混練液として、2.5 mass%リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)溶液を固液比が1/0.3 [w/w]となるように混練したのち、円柱状に成形して直径4 mm, 高さ7-8 mmの試験片を作製した。作製した試験片をEOG滅菌してインプラント実験に使用した。使用した実験動物は日本白色家兎(♂)であり、体重は約3 kgで統一した。全身麻酔下のウサギの脛骨端部に直径4.1 mmのドリルで欠損を作製し、そこに前述した試験片を埋入した。4週間後に犠牲にしたのち、周囲の骨組織とともに試験片を取り出し、X線μ-CTによる内部観察を行なった。図13は4種類の試験片のX線μCT像である。試験片の周囲に骨組織が存在しており、いずれも試料片も材料と生体骨とが接触している様子が観察できた。また、図14は、図13と同じ試験片のビラヌエバ骨染色による組織学的評価の結果を示したものである。銀の担持の有無および銀含有量によらず、材料周囲で良好な骨形成が観察され、骨と直接結合している箇所も散見された。
【００５３】
＜銀担持ＴＣＰを含む抗菌性綿形状人工骨補填材の抗菌性および細胞毒性＞
銀担持ＴＣＰを生分解性樹脂に練り込んで試作した抗菌性綿形状人工骨補填材の抗菌性を調べた結果を図15に示す。この試験に使用した試料は、銀を20 mol%担持させた銀担持ＴＣＰ（Ag-TCP(20))を綿形状人工骨に対して0, 1.5, 3, 5, 10 重量％となるように添加して作製した。この銀担持ＴＣＰを含む綿形状人工骨0.1 gを10倍希釈したLB培地 10 mLに加え、37℃で24時間静置させ、その上清を回収し、上清中の銀イオン濃度をICP-AESで決定した。また、その溶出液を5 mLに大腸菌と黄色ブドウ球菌をそれぞれ1 x 105 個/mLとなるように添加して24時間培養した。この結果より、銀担持TCPを5 重量%以上添加すると、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれにも十分な抗菌効果を発揮することが分かった。
また、図15と同じ試料を用いて、細胞毒性を評価した。その結果を図16に示す。この試験に使用した試料は、銀を20 mol%担持させた銀担持ＴＣＰ（Ag-TCP(20)）を綿形状人工骨に対して0, 1.5, 3, 5, 10 重量％となるように添加して作製した。この銀担持ＴＣＰを含む綿形状人工骨0.1 gをMEM培地 10 mLに加え、37℃で24時間静置させ、その上清を回収し、上清中の銀イオン濃度をICP-AESで決定した。また、その溶出液(5 mL)をそのまま培養液として用いて、株化骨芽細胞MG-63を24時間培養した。この結果より、銀を担持したＴＣＰを含む綿形状人工骨補填材は、銀含有量とともに溶出する銀濃度は増加するが、細胞毒性を発現しないことが分かった。本発明による「銀担持綿ＴＣＰを含む綿形状人工骨補填材」は細胞毒性を示さずに抗菌性を発現することが分かった。
【符号の説明】
【００５４】
１    試料溶液
２    超音波発生器
３    下部電気炉
４    上部電気炉
５    温度コントローラー
６    円筒濾紙
７    冷却管
８    アスピレーター
【図１】
2020130417.tif 000003
【図２】
2020130417.tif 000004
【図３】
2020130417.tif 000005
【図４】
2020130417.tif 000006
【図５】
2020130417.tif 000007
【図６】
2020130417.tif 000008
【図７】
2020130417.tif 000009
【図８】
2020130417.tif 000010
【図９】
2020130417.tif 000011
【図１０】
2020130417.tif 000012
【図１１】
2020130417.tif 000013
【図１２】
2020130417.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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