(57)【要約】【課題】  複数種の細胞を含む溶液から標的細胞と特異的に結合することで当該標的細胞を分離可能な担体を製造する方法、特に前記溶液に含まれる希少細胞をロスせず標的細胞を分離可能な担体を製造する方法を提供すること。【解決手段】  担体が有する官能基を用いて標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と、残存した前記官能基をブロッキング剤で、当該ブロッキング剤が有する官能基と担体が有する官能基との静電相互作用によりブロッキングする工程（ただし、ブロッキング剤または担体が有する官能基の水中におけるｐＫａ値が５以下）とを含む方法により、標的細胞に結合可能な担体を製造することにより、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体が有する官能基とブロッキング剤が有する官能基とを静電相互作用させる工程を含む、担体をブロッキング剤でブロッキングする方法であって、
ブロッキング剤または担体が有する官能基が、水中におけるｐＫａ値５以下の官能基である、方法。
【請求項２】
担体が有する官能基を用いて標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と、残存した前記官能基を請求項１に記載の方法によりブロッキングする工程とを含む、標的細胞に結合可能な担体を製造する方法。
【請求項３】
ブロッキング剤または担体が有する官能基がスルホ基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的細胞に結合可能な物質が標的細胞が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ブロッキング剤がポリエチレングリコールおよび担体が有する官能基と静電相互作用可能な官能基を少なくとも含む化合物である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
担体が磁性粒子である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
標的細胞が白血球であり、標的細胞に結合可能な物質が白血球が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる希少細胞の検出方法。
（１）血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程
（２）前記（１）の工程後の溶液から、請求項７に記載の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程、
（３）（２）の工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程
【請求項９】
採取手段で請求項８に記載の方法で検出した希少細胞を回収する工程をさらに含む、血液試料中に含まれる希少細胞の採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に結合することで溶液中に含まれる当該細胞を分離可能な担体を製造する方法に関する。特に本発明は、複数種の細胞を含む溶液から標的細胞を特異的に分離可能な担体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁または分散して得られる組織標本試料や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、これら分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。一方、ＣＴＣは血球細胞１０８から１０９個あたり数個と、血液中に極めて少量しか存在していない。そのため、がん患者より採取した血液からＣＴＣを確実に採取するためには不要な血球細胞とＣＴＣとを分離する必要がある。
【０００３】
従来より血液試料中に含まれる血球細胞とＣＴＣとの分離に、標的細胞（例えば、白血球やＣＴＣ）が有する表面抗原と特異的に結合可能な抗体を修飾した磁性粒子が用いられている。しかしながら、血液試料中に共存する前記表面抗原以外のタンパク質や前記表面抗原を有さない細胞なども、前記磁性粒子に非特異的に吸着するため、ＣＴＣの回収率の低下や、多数の不要細胞の混入につながるおそれがあった。
【０００４】
これまでに知られている磁性粒子などの担体表面への非特異吸着を抑制するための方法として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの親水性タンパク質ならびに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーなどの親水性高分子からなる非特異吸着抑制高分子を、前記担体表面に修飾する方法がある。一例として特許文献１には、非特異吸着抑制高分子として末端にアミノ基やチオール基などの反応性官能基を有するポリエチレングリコールを用いた方法が開示されている。しかし特許文献１に記載の方法で非特異吸着を抑制した磁性粒子を用いても、血液試料中に含まれるＣＴＣなどの希少細胞を高効率に分離回収するのは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０１０５２９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、複数種の細胞を含む溶液から標的細胞と特異的に結合することで当該標的細胞を分離可能な担体を製造する方法、特に前記溶液に含まれる希少細胞をロスせず標的細胞を分離可能な担体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明の第一の態様は、
担体が有する官能基とブロッキング剤が有する官能基とを静電相互作用させる工程を含む、担体をブロッキング剤でブロッキングする方法であって、
ブロッキング剤または担体が有する官能基が、水中におけるｐＫａ値５以下の官能基である、方法である。
【０００９】
また本発明の第二の態様は、担体が有する官能基を用いて標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と、残存した前記官能基を請求項１に記載の方法によりブロッキングする工程とを含む、標的細胞に結合可能な担体を製造する方法である。
【００１０】
また本発明の第三の態様は、ブロッキング剤または担体が有する官能基がスルホ基である、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第四の態様は、標的細胞に結合可能な物質が標的細胞が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、前記第二または第三の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第五の態様は、ブロッキング剤がポリエチレングリコールおよび担体が有する官能基と静電相互作用可能な官能基を少なくとも含む化合物である、前記第一から第四のいずれかに記載の方法である。
【００１３】
また本発明の第六の態様は、粒子が磁性粒子である、前記第一から第五のいずれかに記載の方法である。
【００１４】
また本発明の第七の態様は、標的細胞が白血球であり、標的細胞に結合可能な物質が白血球が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、前記第四から第六のいずれかに記載の方法である。
【００１５】
さらに本発明の第八の態様は、（１）から（３）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる希少細胞の検出方法である。
（１）血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程
（２）前記（１）の工程後の溶液から、前記第七の態様に記載の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程、
（３）（２）の工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程
さらに本発明の第九の態様は、採取手段で前記第八の態様に記載の方法で検出した希少細胞を採取する工程をさらに含む、血液試料中に含まれる希少細胞の採取方法である。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明における担体は親水性または疎水性の水不溶性物質であればよく、具体的にはアガロース系、デキストラン系、キトサン系やセルロース系などの多糖類、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコール系、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリル系、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ四フッ化エチレン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系、ポリアミド系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン系、ポリビニルホルマール系、ポリアリレート系やポリエーテルスルホン系などの有機合成高分子、ガラス系、チタン系、活性炭系、アルミナ、シリカもしくはヒドロキシアパタイトなどのセラミックス系や酸化鉄もしくは金などの金属系などの無機物があげられる。また担体の形態も特に限定はなく、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状、平板状など、公知の形状を用いることができる。中でも表面積が大きい点、均一かつ効率的に標的細胞に結合できる点、細胞に物理的な損傷を与えにくい点、損傷が生じにくい点、均一な担体が得やすい点などから、粒子状のものが好ましく、特に球形（真球のみならずほぼ球形を含む）の担体が好ましい。
【００１８】
本発明において担体の結合対象である標的細胞の一例として、未分化細胞、分化細胞、リンパ球、顆粒球、血液試料中に含まれる白血球や腫瘍細胞（ＣＴＣなど）があげられる。
【００１９】
本発明において担体に修飾させる標的細胞に結合可能な物質は、標的細胞表面（標的細胞膜も含む）のタンパク質などと結合する物質のことをいい、一例として、前記物質と結合可能な抗体、レクチン、ペプチド、脂質があげられる。中でも、前記物質（表面抗原）と特異的に結合可能な抗体が特異性の点で好ましい。標的細胞に結合可能な物質として、表面抗原と特異的に結合可能な抗体を用いる場合、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいが、得られる結果の安定性の点でモノクローナル抗体の方が好ましい。また特定の抗原と結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖなど）であってもよく、特定の抗原と結合する二重特異性抗体であってもよい。
【００２０】
標的細胞が血液試料中に含まれる白血球の場合、標的細胞に結合可能な物質の好ましい例として、白血球表面に発現し、かつ血液試料中に含まれる他の細胞表面には発現しない抗原（白血球特異的抗原）に特異的に結合可能な抗体があげられる。白血球特異的抗原の一例としては、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂがあげられる。中でも効果的に白血球と結合できる点から、ＣＤ４５やＣＤ１５が好ましい。
【００２１】
標的細胞に結合可能な物質を担体に修飾させるには、当該担体が有する官能基と共有結合や静電相互作用、好ましくはイオン結合で結合させればよい。
【００２２】
本発明は、標的細胞に結合可能な担体を製造する際、標的細胞に結合可能な物質の担体への修飾、および、当該担体に残存した官能基とブロッキング剤が有する官能基との静電相互作用による前記残存した官能基のブロッキングを行ない、かつ担体が有する（前記残存した）官能基またはブロッキング剤が有する官能基の水中におけるｐＫａ値が５以下であることを特徴としている。
【００２３】
本発明の製造方法で得られた担体を、血液試料中に含まれる希少細胞を検出するための前処理用途に用いる場合、前記担体は血液試料中に含まれる夾雑細胞とは結合する一方、希少細胞とは結合しない担体とする必要がある。しかしながら従来の方法で（例えば、夾雑細胞に結合可能な物質を担体に修飾後、ＢＳＡでブロッキングして）製造した担体を用いて、血液試料中に含まれる夾雑細胞の除去を試みたところ、血液試料中に共存する他の細胞やタンパク質などが前記担体に非特異吸着したため、希少細胞の検出が困難となった。
【００２４】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、担体に残存した官能基とブロッキング剤が有する官能基との静電相互作用でブロッキングを行ない、かつ担体またはブロッキング剤が有する官能基の水中におけるｐＫａ値が５以下とすることで、前記非特異吸着が抑制され、試料中に含まれる標的細胞の回収／除去効率が向上することを見出した。
【００２５】
ブロッキング剤が静電相互作用により担体を修飾（ブロッキング）すると、当該ブロッキング剤は修飾後であっても担体表面を移動できる状態であるため、より多くのブロッキング剤を担体表面に修飾でき、高密度な修飾が可能となる。一方、ブロッキング剤を担体に共有結合させて修飾（ブロッキング）する場合は、ブロッキング剤の結合に伴い立体障害が大きくなる。そのためブロッキング効率が低下し、ブロッキング剤が高密度に修飾されず、非特異吸着を効果的に抑制できない。
【００２６】
ｐＫａは、酸から水素イオンが放出される解離反応の平行定数Ｋａの負の常用対数として定義され、ｐＫａが小さいほど酸性度が強いことを意味する。また酸性度が強いとは、共役塩基の電子親和力が大きく共役塩基が安定していることを意味する。一般的に電子親和力が大きいほど電気陰性度も大きくなる傾向があるため、官能基のｐＫａが小さいほど共役塩基の電気陰性度が大きく、静電相互作用が強くなることが推定される。担体またはブロッキング剤が有する官能基の水中におけるｐＫａ値を５以下にすると、担体とブロッキング剤とが強く静電相互作用し、担体表面のブロッキング剤を維持できるため、非特異吸着が効果的に抑制される。一方、担体およびブロッキング剤が有する官能基の水中におけるｐＫａ値が５を超える場合、担体表面へのブロッキング剤の高密度修飾は可能であるものの、担体表面が有する官能基とブロッキング剤が有する結合部位との静電相互作用がｐＫａ値が５以下のときより弱くなるため、担体表面にブロッキング剤が維持できず、効果的に非特異吸着を抑制できなくなる。本明細書において、特に規定していない時のｐＫａ値は２５℃、水中での値とする。
【００２７】
また、担体とブロッキング剤との静電相互作用の強さは、溶液中の担体の表面電荷を意味するゼータ電位からも推定することができる。ゼータ電位の絶対値が大きいほど担体の有する電荷が大きく、ブロッキング剤と強く静電相互作用できると想定される。担体表面の官能基が酸性の官能基の場合、担体のゼータ電位は−２５ｍＶ以下が好ましく、−３０ｍＶ以下がより好ましく、−３５ｍＶ以下がさらに好ましい。なお、本明細書における担体のゼータ電位の値は、担体が粒子状の場合、当該担体を濃度２×１０６個／ｍＬで超純水に分散して得られた懸濁液での測定値としている。
【００２８】
本発明において担体およびブロッキング剤が有する官能基は、水中で電荷を有し、互いに静電相互作用可能な基のことをいう。担体が有する官能基とブロッキング剤が有する官能基は、互いに反対の荷電を有し、かついずれかの官能基の水中におけるｐＫａ値が５以下であれば特に限定はない。水中におけるｐＫａ値が５以下の官能基の例として、酸性の官能基である、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）（ｐＫａ４．７６（参考として酢酸のｐＫａ値））、ホスホン基（−ＰＯ（ＯＨ）２）（ｐＫａ１．５（参考としてホスホン酸のｐＫａ値））、ホスフィン基（−ＰＯ（ＯＨ））（ｐＫａ１．１（参考としてホスフィン酸のｐＫａ値））、リン酸基（−ＯＰＯ（ＯＨ）２）（ｐＫａ２．１５（参考としてリン酸のｐＫａ値））、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）（ｐＫａ−６．６２（参考として硫酸のｐＫａ値））があげられる。中でも水中でのｐＫａ値が２以下であるとより好ましく、ｐＫａ値が低いスルホ基は特に好ましい。なお、参考としていくつかの官能基のｐＫａ値をあげたが、ｐＫａ値は当該官能基を有する化合物の構造、担体表面への化合物の修飾密度などで変動し得る。それらの変動を考慮したうえで、当該担体のブロッキングの際、もしくは標的細胞と当該担体を結合させる際に、当該担体表面に存在する官能基またはブロッキング剤が有する官能基のｐＫａが５以下となればよい。水中におけるｐＫａ値が５以下の官能基を有した担体（またはブロッキング剤）と静電相互作用可能なブロッキング剤（または担体）が有する官能基は塩基性の官能基が好ましく、一例として、アミノ基（−ＮＨ３）、イミノ基（−ＮＨ−）、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、ピリダジル基、ピロリル基、イミダゾール基などの複素環からなる基などがあげられる。中でもアミノ基またはイミノ基が好ましい。
【００２９】
本発明におけるブロッキング剤は、前述した担体が有する官能基と静電相互作用可能な官能基と親水性高分子とを少なくとも含んでいればよい。親水性高分子の一例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（商品名）、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、多糖類、合成ポリアミノ酸があげられる。中でも免疫原性や細胞毒性が少なく、柔軟性が高いポリエチレングリコールが好ましい。本発明におけるブロッキング剤の好ましい一例として、タンパク質低吸着ポリマーであるＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲライフサイエンス社製）があげられる。
【００３０】
ブロッキング剤を構成する親水性高分子の長さは、担体に修飾させる標的細胞に結合可能な物質の大きさを考慮して適宜決定すればよい。例えば親水性高分子がＰＥＧであって、標的細胞に結合可能な物質が標的物質が有する表面抗原に特異的に結合可能なＩｇＧ抗体である場合、ＰＥＧの分子量は数平均分子量として６００以上であればよく、好ましくは６００から１０万までの間とすると好ましく、６００から１万までの間とするとより好ましく、６００以上５０００未満とするとさらに好ましい。また親水性高分子がＰＥＧであって、標的細胞に結合可能な物質が標的物質が有する表面抗原に特異的に結合可能なＩｇＭ抗体である場合、ＰＥＧの分子量としては、数平均分子量として６００以上であればよく、６００から５０万までの間とすると好ましく、６００から１０万までの間とするとより好ましく、６００から５万までの間とするとさらに好ましい。親水性高分子としてＰＥＧ以外の高分子を用いる場合、上記ＰＥＧの分子量に相当する長さを有していればよい。
【００３１】
本発明において、標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と、ブロッキング剤によりブロッキングする工程は、修飾工程の後にブロッキング工程を行なってもよいし、修飾工程とブロッキング工程とを同時に行なってもよいが、修飾工程の後にブロッキング工程を行なう方が好ましい。
【００３２】
本発明の製造方法で得られる標的細胞を結合可能な担体は、標的細胞を含む溶液に添加することで当該標的細胞と結合し、結果、前記標的細胞を溶液から分離させることができる。標的細胞と結合可能な担体が粒子状である場合、前記溶液からの標的細胞と結合した担体の分離方法としては、前記担体と結合していない細胞とのサイズの違いを利用して分離するフィルター法や、前記担体と結合していない細胞との比重差を利用して分離する比重法が例示できる。
【００３３】
フィルター法は、試料をフィルターに通すことで担体と結合していない細胞をフィルター通過させ、担体と結合した細胞をフィルターに捕捉し、分離する方法である。フィルターに形成する貫通孔は、使用用途によって適宜調整することができるが、開口部は円形となるものが好ましく、貫通孔の数や配置については特に制限はないが、多数の貫通孔を設けることが担体分離効率を向上する上で好ましい。多数の貫通孔を設ける場合、貫通孔間の距離（ある貫通孔の開口部の中心から、他の貫通孔の開口部の中心点までの距離）をなど間隔とすることが好ましい。貫通孔間の距離は貫通孔の孔径を考慮して適宜決定することができる。
【００３４】
比重法は、標的細胞と結合した担体と前記担体と結合していない細胞との比重差を用いて分離する方法である。具体的には、密度勾配溶液が入った遠沈管に生物試料を重層した後、遠心分離操作をすることで、標的細胞と結合した担体と前記担体と結合していない細胞とを比重差に基づき分離させればよい。密度勾配溶液は、それ自身で又は遠心分離によって密度勾配を形成する液体状の物質であり、担体の密度（比重）を特定し、その分離に適当なものを選択して使用すればよい。具体的にはショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール、ニコデンツ（商品名、Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＳ社製）などのイオン性又は非イオン性のものが例示できる。市販されている密度勾配溶液として、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製のＦｉｃｏｌｌ（フィコール）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ及びＰｅｒｃｏｌｌ（いずれも商品名）、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ社製のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ及びＯｐｔｉＰｒｅｐ（いずれも商品名）が例示できる。
【００３５】
なお標的細胞と結合可能な担体が磁性粒子の場合、磁力によって当該担体を捕捉し、分離する方法が利用できる。本方法は分離操作が容易かつ短時間である点、高精度に細胞を分離できる点で好ましい。
【００３６】
前述した方法で、溶液から分離した、標的細胞を結合した担体は、その後前記結合を切断することで標的細胞を回収してもよく、前記担体を系外に排出することで標的細胞を除去してもよい。
【００３７】
本発明の製造方法で得られた担体は例えば、血液試料中に含まれる特定細胞の回収または除去に利用可能である。血液試料の具体例としては、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの血液由来成分を含み得る試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前述した試料または組織懸濁液より分離して得られる、試料または組織由来の細胞を含む画分、などがあげられる。このうち試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００３８】
特に本発明の製造方法で得られた担体は、血液試料中に含まれる希少細胞を検出するための前処理、すなわち血液試料中に含まれる夾雑細胞を除去するのに好ましい担体である。前記夾雑細胞の一例としては、血液試料中に多く含まれる白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）、赤血球、血小板があげられる。このうち前記夾雑細胞として最も好ましいのは白血球である。赤血球は塩化アンモニウムなどで容易に破砕（溶血）でき、血小板は核を有しておらず核染色試薬で容易に検出対象から除外できるからである。前記希少細胞の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、各種幹細胞があげられる。
【００３９】
本発明の製造方法で得られた担体を用いることで、血液試料中に含まれる希少細胞を少ないロスで検出できる。具体的には、
血液試料中に含まれる赤血球を破砕（溶血）または除去する工程と、
前記赤血球の破砕／除去工程後の溶液から、本発明の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程と、
白血球除去工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程と、
を含む方法で行なえばよい。
【００４０】
赤血球の破砕／除去工程は、その後の効率的な白血球除去および希少細胞の明瞭な検出のために実施する工程である。赤血球を破砕（溶血）する場合は、例えば、血液試料に塩化アンモニウム、界面活性剤、低張溶液などを添加して行なえばよい。中でも塩化アンモニウムを用いた破砕は希少細胞に対する損傷が少ない点で好ましい。赤血球を除去する場合は、赤血球と他の細胞とのサイズの違いを利用した濾過や、比重の違いを利用した分離などにより除去すればよい。
【００４１】
希少細胞を光学的に検出する工程は、例えば、スライドに塗布したり、顕微鏡や光学検出器などで観察したり、フローサイトメトリーを用いたりして検出すればよい。なお顕微鏡や光学検出器などで観察して希少細胞の検出を行なう場合、前記細胞を含む懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察するとよい。保持部の例として、前記細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。また細胞を保持部に保持させる際、誘電泳動力を用いると、保持部に細胞を効率的に保持できる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００４２】
以下、本発明の製造方法により得られた担体を利用した、血液試料中に含まれる希少細胞の検出および採取方法の一例として、血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出および採取する方法を用いて詳細に説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
【００４３】
（１）がんの疑いのある患者から血液試料を採取する。なお血液試料を採取する際、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤に代表される抗凝固剤を添加すると好ましい。
【００４４】
（２）（１）で採取した血液試料（または希釈した血液試料）に、ＣＴＣを安定化させるための保存剤であるホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤を添加する。なお、（１）で抗凝固剤を添加せずに血液試料を採取した場合は抗凝固剤も添加する。前記添加の際、本発明の保存剤を構成する全ての物質を一度に添加してもよく、各成分を含む溶液をそれぞれ添加してもよい。また、血液保存剤として、ポリエチレングリコールをさらに入れるとＣＴＣの形体安定化に寄与するためよい。さらに（１）で抗凝固剤が添加される状態で血液試料を採取し、本工程でホルムアルデヒドドナー化合物および抗血小板剤を含む溶液を血液試料に添加する場合、血液試料中に含まれる抗凝固剤の濃度を維持するために、本工程で抗凝固剤を追加してもよい。血液試料への保存剤の添加量は、血液試料１ｍＬあたり０．０１ｍＬから１０ｍＬの間であればよく、０．０４ｍＬから２ｍＬの間であればより好ましい。アルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加した血液試料は、室温で少なくとも５日間は安定に保存が可能である。
【００４５】
（３）血液保存剤を添加した血液試料（保存処理した血液試料）に含まれる赤血球を、塩化アンモニウムを用いて破砕する。塩化アンモニウムでの赤血球の破砕は、赤血球と他の細胞とのイオン取り込み能の違いを利用した破砕方法であり、他の細胞への損傷を抑えながら赤血球を破砕できるため、好ましい赤血球破砕方法である。
【００４６】
（４）赤血球破砕処理後、遠心分離することで血液成分を除去し、血液試料中に含まれるＣＴＣを含む細胞をペレット状にした後、適切な溶液を用いて当該細胞を懸濁させる。なお前記細胞を懸濁させる溶液に、親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ）を含ませてもよい。当該タンパク質を含ませるとＣＴＣの回収効率が向上するため好ましい。親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液でのタンパク質の終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）の間であれば好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましい。
【００４７】
（５）（４）で調製したＣＴＣを含む細胞懸濁液に、本発明の製造方法で得られた白血球に結合可能な磁性粒子（例えば、抗ＣＤ４５抗体または抗ＣＤ１５抗体を修飾した磁性粒子）を添加し、当該磁性粒子を分散させた後、前記磁性粒子を磁力で回収する。本操作により、前記懸濁液中に含まれるＣＴＣのロスを最小限にしつつ、白血球を分離回収できる。
【００４８】
（６）磁性粒子を除去したＣＴＣを含む細胞懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含む細胞ペレットを回収する。なお必要に応じ、前記回収したペレットを親水性高分子を結合したタンパク質を含む溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
【００４９】
（７）（６）で得られたＣＴＣを含む細胞懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察することで血液試料中に含まれるＣＴＣを検出する。ＣＴＣの検出は、例えば、明視野像によるＣＴＣと夾雑細胞（例えば、白血球などの血液成分）との大きさや形状の違いに基づき検出してもよく、サイトケラチンやＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などＣＴＣで発現するタンパク質に対する標識抗体および／または夾雑細胞で発現するタンパク質（夾雑細胞が白血球の場合はＣＤ４５など）に対する標識抗体で細胞を染色し当該染色結果に基づき検出してもよい。
【００５０】
（８）（７）で検出したＣＴＣを採取手段で採取する。採取手段の一例として、ノズルによる吸引吐出により採取する手段があげられ、具体例として特開２０１６−１４２６１６号公報に開示の装置があげられる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、担体が有する官能基を用いて標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と残存した前記官能基をブロッキング剤によりブロッキングする工程とを含む標的細胞に結合可能な担体を製造する方法において、担体が有する官能基のブロッキング剤によるブロッキングを当該ブロッキング剤が有する官能基と担体が有する官能基との静電相互作用により行ない、ブロッキング剤または担体が有する官能基が水中におけるｐＫａ値５以下の官能基であることを特徴としている。
【００５２】
本発明により、ブロッキング剤が粒子に高密度かつ強い結合力で修飾され、担体の標的細胞以外への非特異吸着を抑制できる。また本発明の製造方法で得られた担体は、高密度に修飾したブロッキング剤による、修飾した標的細胞に結合可能な物質（例えば、標的細胞が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体）の配向性制御により、結合した前記物質の標的細胞への結合能が向上する。したがって前記担体を用いた標的細胞の分離方法は、特に複数種の細胞を含む血液試料から標的細胞を分離する場合において有用な方法である。また前記細胞分離方法を利用することで、血液試料中に含まれる希少細胞を少ないロスで検出できる。
【００５３】
一例として本発明を、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出に適用することで、高効率に夾雑細胞（白血球など）を分離除去し、ＣＴＣを高精度に検出できるため、患者への採血量を少なくすることができ、患者への負担を低減させることができる。また、がんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、がんを精度高く検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例６で使用した細胞保持装置を示す図である。
【図２】図１に示す装置の正面図である。
【図３】スルホ基を有した担体（実施例８）、カルボキシ基を有した担体（実施例９）、およびヒドロキシ基を有した担体（比較例３）を、超純水にそれぞれ分散して得た懸濁液（担体濃度として２×１０６個／ｍＬ）のゼータ電位測定結果（ｎ＝３測定の平均値）を示す図である。なおエラーバーは±ＳＤを意味する。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
（１）  ＢＳＡ修飾磁性粒子の作製（その１）
（１−１）表面にカルボキシ基を有した磁性粒子溶液（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、１．０％スラリー、ＪＳＲライフサイエンス社製）４５０μＬを０．０１Ｍ  ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ６．０）５５０μＬに添加した。
【００５７】
（１−２）当該磁性粒子溶液を磁石に近づけて３分放置後、溶液を除去し、０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬを添加して磁性粒子を再懸濁する洗浄操作を２回行なった後、磁性粒子を０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー４５０μＬに再懸濁した。
【００５８】
（１−３）１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）を含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー５０μＬを添加し、３７℃で１時間振とうすることで磁性粒子表面のカルボキシ基にＥＤＣを結合させた。当該操作により、磁性粒子表面のカルボン酸とタンパク質などが有するアミノ基とのＥＤＣを介した共有結合が可能となる。
【００５９】
（１−４）ＥＤＣを結合させた磁性粒子を０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬで１回洗浄し、０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１８０μＬに再懸濁後、１０μｇ／１００μＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液２０μＬを添加し、３７℃で３時間振とうすることでＥＤＣを介してＢＳＡと磁性粒子とを共有結合させた（すなわち磁性粒子にＢＳＡを修飾させた）。
【００６０】
（１−５）ＢＳＡ修飾反応終了後、５００ｍＭタウリンを含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー５０μＬを添加し、３７℃で１時間振とうすることで、磁性粒子表面に残存したＥＤＣにタウリンを結合させ、スルホ基に変換した。振とう後は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬで１回洗浄を行なった。
【００６１】
（１−６）ＢＳＡを修飾し残存カルボキシ基をスルホ基に変換した磁性粒子に、下記に示すいずれかの溶液を用いてブロッキングを行なった。ブロッキングは以下に示すいずれかの溶液１ｍＬで２回洗浄後、当該溶液５００μＬで再懸濁し、３７℃で一晩（１７から２４時間）振とうすることで行なった。なおこれら溶液によるブロッキングは、磁性粒子が有するスルホ基とタンパク質低吸着ポリマーが有するアミノ基との静電相互作用によるブロッキングである。
［ａ］１．８％（ｗ／ｖ）タンパク質低吸着ポリマー（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０、分子量５０００、ＪＳＲライフサイエンス社製）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｂ］１．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｃ］０．６％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｄ］０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｅ］１．８％（ｗ／ｖ）タンパク質低吸着ポリマー（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０、分子量２０００、ＪＳＲライフサイエンス社製）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｆ］０．９％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｇ］０．４５％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
（１−７）ブロッキング終了後、以下に示すいずれかの保存液を用いてＢＳＡ修飾磁性粒子を保存した。保存は以下に示すいずれかの保存液１ｍＬで１回洗浄後、当該保存液１８４μＬで再懸濁した。
［ａ］から［ｄ］０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｅ］から［ｇ］０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
（２）ＢＳＡ修飾磁性粒子への非特異吸着の検討
（２−１）以下に示す方法により、本検討に用いる試料を調製した。
（２−１−１）インフォームドコンセントを取得した健常者血液３ｍＬに安定化剤０．４５ｍＬを添加し、室温で１０分以上放置した。なお前記安定化剤は、イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２．３ｇ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）３０ｍｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解することで調製した。
（２−１−２）前記放置後の試料に対して、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で９０ｍＬまでメスアップ後、９００×ｇで１０分間、２５℃で遠心分離した。当該操作により赤血球が破壊（溶血）される。（２−１−３）遠心後の上清を除去した後、細胞を含むペレットを、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３０ｍＬで再懸濁した。なお前記ＰＥＧ−ＢＳＡは、一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を２５℃近傍で３時間撹拌し、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なうことで調製した。なお前記調製の際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。
（２−１−４）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））を含むＰＢＳで懸濁することで、本検討に用いる試料を得た。試料中に含まれる白血球数は、白血球数算定用染色液（チュルク染色液、ナカライテスク社製）を用いて算出した。
【００６２】
（２−２）白血球数が２００万個となるよう、（２−１）で調製した試料を採取し、（１）で作製したＢＳＡ修飾磁性粒子１２μＬをそれぞれ添加後、５分間転倒撹拌した。
【００６３】
（２−３）磁石に近づけることで、添加したＢＳＡ修飾磁性粒子と結合した白血球を除去し、残存試料を回収した。
【００６４】
（２−４）残存試料中の白血球数を、チュルク染色液を用いて算定し、ＢＳＡ修飾磁性粒子と混合した白血球数（２００万個）で除することで白血球の残存率を算出した。
【００６５】
比較例１
（１）ＢＳＡ修飾磁性粒子の作製（その２）
（１−１）実施例１の（１−１）から（１−３）に記載の方法で調製したＥＤＣを結合させた磁性粒子を０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬで１回洗浄し、０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１８０μＬに再懸濁後、１０μｇ／１００μＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液２０μＬを添加し、３７℃で３時間振とうすることでＥＤＣを介してＢＳＡと磁性粒子とを共有結合させた（すなわち磁性粒子にＢＳＡを修飾させた）。
【００６６】
（１−２）ＢＳＡを修飾した磁性粒子に、以下に示すいずれかの溶液を用いてブロッキングを行なった。ブロッキングは以下に示すいずれかの溶液１ｍＬで２回洗浄後、当該溶液５００μＬで再懸濁し、３７℃で一晩（１７から２４時間）振とうすることで行なった。
［ｈ］２．０％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）（磁性粒子にＢＳＡが物理吸着することでブロッキング）
［ｉ］１．８％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）（磁性粒子に残存しているＥＤＣがＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーによりヒドロキシ基に変換され、当該ヒドロキシ基とＣＥ５１０が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキング）
［ｊ］１．８％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０および２．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）（前記［ｈ］と［ｉ］とが合わさったブロッキング）
［ｋ］１．８％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー（磁性粒子に残存しているＥＤＣとＣＥ５１０が有するアミノ基との共有結合によりブロッキング）
［ｌ］０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）（ブロッキングなし）
（１−３）ブロッキング終了後、以下に示すいずれかの保存液を用いてＢＳＡ修飾磁性粒子を保存した。保存は以下に示すいずれかの保存液１ｍＬで１回洗浄後、当該保存液１８４μＬで再懸濁した。
［ｈ］０．２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｉ］から［ｋ］０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
［ｌ］０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）
（２）ＢＳＡ修飾磁性粒子への非特異吸着の検討
実施例１（２−１）に記載の方法で調製した試料を、実施例１（２−２）から（２−４）に記載と同様な方法で白血球の残存率を算出した。
【００６７】
実施例１および比較例１の結果をまとめて表１に示す。ブロッキングを、磁性粒子に残存する官能基とブロッキング剤が有する官能基との静電相互作用により行なった場合（［ａ］から［ｇ］および［ｉ］から［ｊ］）は、白血球残存率が約９０％以上と高く、ＢＳＡ修飾磁性粒子への白血球の非特異吸着が高効率に抑制できることが確認された。さらに、白血球残存率は、磁性粒子が有するスルホ基とタンパク質低吸着ポリマー（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０）が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキングを行なったＢＳＡ修飾磁性粒子（［ａ］）の方が、磁性粒子が有するヒドロキシ基とＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキングを行なったＢＳＡ修飾磁性粒子（［ｉ］）よりも高かった。この理由として、磁性粒子が有するスルホ基とＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキングを行なったＢＳＡ修飾磁性粒子（［ａ］）では、磁性粒子が有するスルホ基の水中でのｐＫａ値が−６．６２と低く、ブロッキングの際、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０と強く静電相互作用できたため、ＢＳＡ修飾磁性粒子への白血球の非特異吸着がより高効率に抑制できたと考えられる。一方、磁性粒子が有するヒドロキシ基とＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキングを行なったＢＳＡ修飾磁性粒子（［ｉ］）では、磁性粒子が有するヒドロキシ基のｐＫａ値が１５．７４と高く、ブロッキングの際、タンパク質低吸着ポリマーと強く静電相互作用できなかったため、わずかに非特異吸着が生じたと考えられる。一方、ＢＳＡ修飾磁性粒子への物理吸着（［ｈ］）または共有結合（［ｋ］）でブロッキングを行なった場合は、静電相互作用でブロッキングを行なった場合と比較し、低下しており、ＢＳＡ修飾磁性粒子への白血球の非特異吸着が示唆された。物理吸着の場合、ブロッキング剤として用いたＢＳＡの表面電荷が負であるため、表面がヒドロキシ基の磁性粒子と静電反発し、ブロッキング効果が低くなったことが考えられる。共有結合の場合、ＢＳＡ修飾磁性粒子表面にタンパク質低吸着ポリマーが結合されるにつれて立体障害が大きくなり、前記粒子表面をブロッキング剤で完全に覆うことができなかったため、非特異吸着の抑制効果が低下したと考えられる。
【００６８】
【表１】
2020076762.tif 000002
【００６９】
実施例２
（１）実施例１（１−１）から（１−３）に記載の方法で作製したＥＤＣを結合させた磁性粒子を、０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬで１回洗浄し、ＭＥＳバッファー１８０μＬに再懸濁後、白血球が有する表面抗原であるＣＤ１５に対する抗体（ＩｇＭ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を２μｇ（１０μｇ／１００μＬ水溶液として２０μＬ）を添加し、３７℃で３時間振とうすることでＥＤＣを介して前記抗体と磁性粒子とを共有結合させた（すなわち磁性粒子に前記抗体を修飾させた）。
【００７０】
（２）抗体修飾反応終了後、５００ｍＭタウリンを含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー５０μＬを添加し、３７℃で１時間振とうすることで、磁性粒子表面に残存したＥＤＣにタウリンを結合させ、スルホ基に変換した。振とう後は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー１ｍＬで１回洗浄を行なった。
【００７１】
（３）抗ＣＤ１５抗体を修飾し残存カルボキシ基をスルホ基に変換した磁性粒子に、１．８％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（タンパク質低吸着ポリマー、ＪＳＲライフサイエンス社製）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）１ｍＬで２回洗浄後、当該溶液５００μＬで再懸濁し、３７℃で一晩（１７から２４時間）振とうすることでブロッキングを行なった。
【００７２】
（４）ブロッキング終了後、保存液（０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０））１ｍＬで１回洗浄を行ない、保存液１８４μＬに再懸濁した。
【００７３】
（５）実施例１（２−１）に記載の方法で調製した試料を、実施例１（２−２）から（２−４）に記載と同様な方法で白血球の残存率を算出した。
【００７４】
比較例２
（１）実施例２（１）に記載の方法で磁性粒子に抗ＣＤ１５抗体を修飾させた後、１．８％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０および２．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）１ｍＬで２回洗浄（本操作により磁性粒子に残存したＥＤＣはヒドロキシ基に変換される）後、当該溶液５００μＬで再懸濁し、３７℃で一晩（１７から２４時間）振とうすることでブロッキングを行なった。
【００７５】
（２）ブロッキング終了後、保存液（０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０））１ｍＬで１回洗浄を行ない、保存液１８４μＬに再懸濁した。
【００７６】
（３）実施例１（２−１）に記載の方法で調製した試料を、実施例１（２−２）から（２−４）に記載と同様な方法で白血球の残存率を算出した。
【００７７】
実施例２および比較例２の結果をまとめて表２に示す。実施例２および比較例２で作製した抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子を用いることで白血球残存率が低下したことから、これら例で作製した抗体修飾磁性粒子は共に白血球に結合可能な粒子であることが確認された。一方、白血球の残存率は、磁性粒子が有するスルホ基とタンパク質低吸着ポリマーが有するアミノ基との静電相互作用でブロッキングして得られた抗体修飾磁性粒子（実施例２、残存率５７．０％）の方が、磁性粒子が有するヒドロキシ基とタンパク質低吸着ポリマーが有するアミノ基との静電相互作用およびＢＳＡの物理吸着でブロッキングして得られた抗体修飾磁性粒子（比較例２、残存率６４．５％）よりも低かった（すなわち抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が高かった）。この理由として、タンパク質低吸着ポリマー（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０）が高密度に修飾されたことで、磁性粒子表面の抗ＣＤ１５抗体の配向性（すなわち抗原認識部位の抗原への露出の度合い）が改善し、抗原認識能が高くなったため、抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が向上したと考えられる。一方、比較例２では、物理吸着したＢＳＡにより抗体修飾磁性粒子表面のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０の密度が低下し、磁性粒子表面の抗ＣＤ１５抗体の配向性が効果的に制御できなかったため、実施例２と比較して抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が低くなったことが考えられる。
【００７８】
以上の結果から、標的細胞に結合可能な担体を製造する際、当該担体の官能基のブロッキングをタンパク質低吸着ポリマーで行なうことで、当該担体に修飾した標的細胞に結合可能な物質の配向性を制御でき、前記担体の標的細胞への結合率が向上することがわかる。
【００７９】
【表２】
2020076762.tif 000003
【００８０】
実施例３
実施例２（１）で添加する抗体として、白血球が有する表面抗原であるＣＤ４５に対する抗体（ＩｇＧ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を２０μｇ（１００μｇ／１００μＬ水溶液として２０μＬ）を、実施例２（３）でブロッキングに用いる溶液として、０．９％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０（タンパク質低吸着ポリマー、ＪＳＲライフサイエンス社製）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を、実施例２（４）で用いる保存液として、０．２％（ｗ／ｖ）  Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を、それぞれ用いた以外は、実施例２と同様の方法で抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子を作製し、白血球の残存率を算出した。
【００８１】
実施例４
実施例２（１）で添加する抗体として、実施例３で用いた抗ＣＤ４５抗体（ＩｇＧ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）２０μｇ（１００μｇ／１００μＬ水溶液として２０μＬ）を用いた以外は、実施例２と同様の方法で抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子を作製し、白血球の残存率を算出した。
【００８２】
実施例３および実施例４の結果をまとめて表３に示す。抗ＣＤ１５抗体を修飾したとき（実施例２および比較例２）と同様、実施例３および実施例４で作製した抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子を用いることで白血球残存率が低下したことから、これら例で作製した抗体修飾磁性粒子も共に白血球に結合可能な粒子であることが確認された。
【００８３】
一方、ブロッキング剤としてＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０（分子量２０００）を用いて作製した抗体修飾磁性粒子（実施例３、残存率６３．５％）を用いたときの方が、ブロッキング剤としてＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（分子量５０００）を用いて作製した抗体修飾磁性粒子（実施例４、残存率８６．０％）を用いたときよりも、白血球残存率が低かった（すなわち抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が高かった）。さらに、ブロッキング剤として同じＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を用いても、抗ＣＤ１５抗体を修飾した磁性粒子（実施例２、残存率５７．０％）の方が、抗ＣＤ４５抗体を修飾した磁性粒子（実施例４、残存率８６．０％）よりも、白血球残存率が低かった（すなわち抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が高かった）。
【００８４】
実施例３および実施例４で用いた抗ＣＤ４５抗体はＩｇＧ（分子量１５０ｋＤａ）であり、実施例２および比較例２で用いた抗ＣＤ１５抗体はＩｇＭ（分子量９００ｋＤａ）である。分子量の低い抗体（ＩｇＧ）に対し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の長いＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０を用いてブロッキングを行なうと、抗体がＰＥＧ鎖に埋もれてしまい、抗体が有する抗原認識能が低下するため、白血球の結合率が低下した（残存率が上昇した）と考えられる。一方、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の短いＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０を用いてブロッキングを行なう場合は、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０と比較し、抗体がＰＥＧ鎖に埋もれる確率が下がるため、抗体が有する抗原認識能の低下も抑えられ、白血球の結合率が向上した（残存率が低下した）と考えられる。
【００８５】
【表３】
2020076762.tif 000004
【００８６】
実施例５
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離した。
【００８７】
（２）（１）で剥離したＰＣ９細胞の懸濁液を、実施例１（２−１−３）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で再懸濁し、トリパンブルー染色により細胞数を算定した。
【００８８】
（３）ＰＣ９細胞数が２００万個となる量の（２）の細胞懸濁液を採取し、実施例３で作製した抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子１８μＬを添加後、５分間転倒撹拌した。
【００８９】
（４）（３）の溶液を磁石に近づけて抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子と結合したＰＣ９細胞を除去し、細胞懸濁液を回収した。
【００９０】
（５）（４）で回収した細胞懸濁液中のＰＣ９細胞数を、トリパンブルーを用いて算定し、抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子と混合したＰＣ９細胞数（２００万個）で除することでＰＣ９細胞の残存率を算出した。
【００９１】
実施例６
磁性粒子として実施例２で作製した抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子を用いた以外は、実施例５と同様の方法で、ＰＣ９細胞の残存率を算出した。
【００９２】
実施例５および実施例６の結果をまとめて表４に示す。実施例５および実施例６で作製した磁性粒子に修飾した抗体は、いずれも白血球が有する表面抗原（ＣＤ１５およびＣＤ４５）に対する抗体であり、当該表面抗原はＰＣ９細胞には存在しない。したがって、非特異吸着がなければ、ＰＣ９細胞の残存率は１００％に近い結果となる。今回検討した抗体修飾磁性粒子（実施例５および実施例６）は、いずれもＰＣ９細胞の残存率が約９０％以上であり、白血球以外の細胞であるＰＣ９細胞の抗体修飾磁性粒子への非特異吸着を抑制できていることが確認された。なお抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子（実施例６）を用いたときの方が、抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例５）を用いたときよりＰＣ９細胞の残存率がやや低下しているが、ＢＳＡ修飾磁性粒子（実施例１［ａ］で作製）を用いた同様な試験での結果が残存率１００％（表４）であることから、磁性粒子とＰＣ９細胞との非特異吸着ではなく、抗ＣＤ１５抗体とＰＣ９細胞との非特異反応が原因であると考えられる。
【００９３】
【表４】
2020076762.tif 000005
【００９４】
実施例７
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ［５−  ｏｒ  ６−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ３’，６’−ｄｉａｃｅｔａｔｅ］、同仁化学研究所社製）で標識した。
【００９５】
（２）インフォームドコンセントを取得した健常者血液３ｍＬに、実施例１（２−１−１）に記載の方法で調製した安定化剤０．４５ｍＬ、および（１）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、室温で１０分以上放置した。
【００９６】
（３）放置後の試料に対して、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で９０ｍＬまでメスアップ後、９００×ｇで１０分間、２５℃で遠心分離した。当該操作により赤血球が破壊（溶血）され、分離回収したＰＣ９細胞の観察が良好になる。
【００９７】
（４）遠心後の上清を除去した後、ＰＣ９細胞を含むペレットを、実施例１（２−１−３）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３０ｍＬで再懸濁した。
【００９８】
（５）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、以下に示す組成の抗体修飾磁性粒子を添加後、磁石を用いてＣＤ１５および／またはＣＤ４５を発現している白血球を除去した。
［Ａ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）１．８×１０８個
［Ｂ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）２．７×１０８個
［Ｃ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）１．８×１０８個および抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子（実施例２）１．２×１０８個
［Ｄ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）２．７×１０８個および抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子（実施例２）０．１２×１０８個
［Ｅ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）２．７×１０８個および抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子（実施例２）０．２４×１０８個
［Ｆ］抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（実施例３）２．７×１０８個および抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子（実施例２）０．６０×１０８個
（６）（５）で白血球を除去したＰＣ９細胞を含む懸濁液を、実施例１（２−１−３）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２８０ｍＭスクロースを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
【００９９】
（７）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、再度、ＰＣ９細胞を含むペレットを、実施例１（２−１−３）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭスクロースを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血小板を含む血液成分を除去し、目的とするＰＣ９細胞を濃縮するための操作である。
【０１００】
（８）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去したＰＣ９細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞保持装置１００に導入し、信号発生器５０から電極基板３１・３２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を３分間印加することで前記装置が有する保持部６０にＰＣ９細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞保持装置１００は、直径３０μｍの貫通孔１２ａを複数有した絶縁体１２と直径３０μｍの貫通孔１１ａを複数有した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と電極基板３１とを上から絶縁体１２−遮光部材１１−電極基板３１の順に密着して設け、さらに絶縁体１２の上面に試料の導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する厚さ１ｍｍのスペーサー２０を、スペーサー２０の上面に電極基板３２を、それぞれ密着して設けてなる装置である。なお貫通孔１１ａ／１２ａおよび電極基板３１により、直径３０μｍ、深さ３０μｍからなる細胞７０を保持可能な保持部６０が形成されている。
【０１０１】
（９）保持部６０に保持されたＰＣ９細胞数を計測し、（２）で添加したＰＣ９細胞数で除することで回収率を算出した。
【０１０２】
（１０）健常者血液３ｍＬ中の白血球数および（８）で上清を除去した後のＰＣ９細胞を含む懸濁液中の白血球数を、白血球数算定用染色液（チュルク染色液、ナカライテスク社製）を用いて算定し、懸濁液中の白血球数を健常者血液３ｍＬ中の白血球数で除することで白血球の残存率を算出した。
【０１０３】
結果を表５に示す。白血球の残存率は４．９％（［Ｆ］）から２５．１％（［Ａ］）であり、本発明の方法で製造した抗体修飾磁性粒子（実施例２および実施例３）により白血球が概ね除去（すなわち、大部分の白血球が抗体修飾磁性粒子に結合）されていることがわかる。なお、抗体修飾磁性粒子を組み合わせて添加する（［Ｃ］から［Ｆ］）および／または抗体修飾磁性粒子量を増やす（［Ｂ］、［Ｅ］および［Ｆ］）ことで白血球の残存率が減少（抗体修飾磁性粒子への白血球の結合率が向上）することがわかる。
【０１０４】
ＰＣ９細胞の残存率は今回検討したいずれの系でも約７０％以上を示し、本発明の方法で製造した抗体修飾磁性粒子（実施例２および実施例３）の白血球以外の細胞（ＰＣ９細胞）への非特異吸着は少ないことがわかる。なお、［Ｃ］の系でＰＣ９細胞の残存率が比較的低い（６９．７％）結果となったが、これは実施例６の結果と同様、抗ＣＤ１５抗体とＰＣ９細胞との非特異結合が原因と考えられる。
【０１０５】
以上の結果から、本発明の方法で製造した標的細胞（白血球）に結合可能な担体を用いることで、複数種の細胞を含む溶液から、存在量の少ない希少細胞（ＰＣ９細胞）をロスせず標的細胞（白血球）を選択的に回収できることが確認された。
【０１０６】
【表５】
2020076762.tif 000006
【０１０７】
実施例８
（１）実施例１（１−１）から（１−３）に記載の方法で作製したＥＤＣを結合させた磁性粒子を、０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）１ｍＬで１回洗浄し、ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）２００μＬに再懸濁後、５００ｍＭタウリンを含む０．０１Ｍ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）５０μＬを添加し、３７℃で１時間振とうすることで、タウリンと磁性粒子とを共有結合させ、磁性粒子表面のカルボキシ基をスルホ基に変換した。
【０１０８】
（２）磁性粒子表面のカルボキシ基をスルホ基に変換後、超純水１ｍＬで３回洗浄を行ない、２×１０９個／ｍＬの濃度となるよう超純水に再懸濁した。
【０１０９】
（３）（２）で得た磁性粒子を２×１０６個／ｍＬの濃度となるよう超純水に懸濁後、ゼータ電位測定装置（大塚電子社製ＥＬＳＺ）の標準セルに導入し、２５℃におけるゼータ電位を測定した。なお磁性粒子のゼータ電位は、当該粒子について測定を３回行ない、得られたゼータ電位の平均値とした。
【０１１０】
実施例９
表面にカルボキシ基を有した磁性粒子溶液（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、１．０％スラリー、ＪＳＲライフサイエンス社製）４５０μＬを、超純水１ｍＬで３回洗浄を行ない、２×１０９個／ｍＬの濃度となるよう超純水に再懸濁後、実施例８（３）と同様な方法でゼータ電位を測定した。
【０１１１】
比較例３
（１）実施例１（１−１）から（１−３）に記載の方法で作製したＥＤＣを結合させた磁性粒子を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）１ｍＬで１回洗浄し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）２００μＬに再懸濁後、３７℃で１時間振とうすることで、Ｔｒｉｓと磁性粒子とを共有結合させ、磁性粒子表面のカルボキシ基をヒドロキシ基に変換した。
【０１１２】
（２）磁性粒子表面のカルボキシ基をヒドロキシ基に変換後、超純水１ｍＬで３回洗浄を行ない、２×１０９個／ｍＬの濃度となるよう超純水に再懸濁した。
【０１１３】
（３）（２）で得た磁性粒子を実施例８（３）と同様な方法でゼータ電位を測定した。
【０１１４】
実施例８、実施例９および比較例３の結果をまとめて表６ならびに図３に示す。各粒子のゼータ電位は、表面がスルホ基の磁性粒子（実施例８）で−３７．２８ｍＶ、表面がカルボキシ基の磁性粒子（実施例９）で−２８．５２ｍＶ、表面がヒドロキシ基の磁性粒子（比較例３）で−２３．９９ｍＶと、官能基のｐＫａが低いほど、ゼータ電位も低くなった。ゼータ電位の大きさは表面電荷の強さに対応しているため、この結果から、磁性粒子表面の官能基のｐＫａを下げることで磁性粒子とブロッキング剤であるアミノ基を有するタンパク質低吸着ポリマー（Ｂｌｏｃｋｍａｓｕｔｅｒ  ＣＥ５１０またはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ２１０）とがより強く静電相互作用できることがわかる。
【０１１５】
【表６】
2020076762.tif 000007
【０１１６】
表面がヒドロキシ基の磁性粒子（比較例１）よりも、表面がスルホ基の磁性粒子（実施例１）の方が白血球との非特異吸着が少ないことが示されている（表１）。表１および表６に示す結果から、磁性粒子と細胞との非特異吸着の程度は粒子のゼータ電位から予測でき、磁性粒子のゼータ電位が低いほど、前記非特異吸着が低減することが推測できる。したがって、表面がヒドロキシ基の磁性粒子（比較例３）よりもゼータ電位が低い、表面がカルボキシ基の磁性粒子（実施例９）は、表面がヒドロキシ基の磁性粒子（比較例３）よりも標的細胞との非特異吸着が少なくなることが示唆される。
【０１１７】
なおカルボキシ基のｐＫａは４．７６（酢酸のｐＫａ）であることから、ｐＫａが５以下の官能基を表面に有する担体のゼータ電位は−２５ｍＶ程度となることが予想される。そのため、担体のゼータ電位を静電相互作用の強さの指標とする場合は、−２５ｍＶ以下かどうかを確認すればよい。
【符号の説明】
【０１１８】
１００：細胞保持装置
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
【図１】
2020076762.tif 000008
【図２】
2020076762.tif 000009
【図３】
2020076762.tif 000010