(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞接着を形成することで血管内皮バリア機能を向上させるための、安全性の高い天然物を用いた血管内皮バリア機能向上用食品の提供。【解決手段】ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪、特にダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪から抽出した脂溶性成分である、血管内皮バリア機能向上用食品。【選択図】図１
2020130166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪を用いたことを特徴とする血管内皮バリア機能向上用食品。
【請求項２】
前記ダチョウ肉の抽出成分又は前記ダチョウの前記皮下脂肪の抽出成分が脂溶性成分であることを特徴とする請求項１に記載の血管内皮バリア機能向上用食品。
【請求項３】
細胞接着を形成することで血管内皮バリア機能が向上することを特徴とする請求項1又は請求項２に記載の血管内皮バリア機能向上用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管のバリア機能を向上させる血管内皮バリア機能向上用食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命がその活動を正常に維持するためには、各臓器へ十分な酸素や栄養を供給し、さらにその活動で生じる老廃物を適切に運搬・処理することが重要である。この機能を担う器官が血管である。
血管には、心臓から送り出された血液が流れる動脈、心臓へ戻る血液が通る静脈の他に、血管のうち９０%以上（人間の場合）を占める毛細血管がある。毛細血管は血管内皮細胞と血管壁細胞から構成されているが、特に血管内皮細胞が血管のバリアとして働き、物質の透過性すなわちバリア機能を調節することにより、生命の健康維持に重要な役割を担っていることが近年分かってきた。血管内皮バリア機能の障害により、末梢細胞への酸素、栄養の不足が生じるだけではなく、炎症、動脈硬化など様々な血管の病気の引き金となることが知られている。
毛細血管の構造安定化には、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ａｎｇ１）が関与している。血管内皮細胞の周囲を覆う壁細胞より恒常的に分泌され、血管構造の維持がなされている。Ａｎｇ１による血管構造の維持は、血管内皮細胞に発現するレセプター型チロシンキナーゼであるＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｌｇ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ−２）を活性化させ、内皮細胞間のＴｉｅ２の架橋による内皮−壁細胞、内皮−内皮細胞の接着性を高め、血管透過性の制御された血管構造を誘導することによる。しかし、Ａｎｇ１を産生する壁細胞が加齢や生活習慣病により内皮細胞から離脱したり、Ａｎｇ１の産生低下が壁細胞で生じると欠陥構造が破綻して血流の低下や、透過性の亢進、すなわちバリア機能の低下が生じてくる。長期的なバリア機能の低下は、組織深部の浸透圧を亢進させて、養分や酸素の運搬の妨げになり、末梢組織で障害が生じる。この障害の回復にはＡｎｇ１を工業的に生産して薬剤として血管修復に応用することは可能だが、コスト面において非現時的である。（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】大戸信明、高倉伸幸、  “血管構造の安定化に寄与するＴｉｅ２受容体の天然活性化食品香料素材”、  ＡＲＯＭＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  Ｎｏ．６２、  ２０１５年５月号、  Ｖｏｌ．１６、  Ｎｏ．  ２、  ｐ．１４４〜１４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前述における問題を解決するため、安全性の高い天然物を用いた血管内皮バリア機能向上用食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪によって、血管のバリア機能を向上させることを見出した。
さらに、本発明者らは、鋭意検討したところ、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪から脂溶性成分を抽出することにより、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪における血管のバリア機能向上効果を持たない成分を除去し、高い血管のバリア機能向上効果を示す有効成分を濃縮できることを見出した。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の血管内皮バリア機能向上用食品により、血管内皮バリア機能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ヘキサン画分によるダチョウ肉抽出物について血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図２】クロロホルム画分によるダチョウ肉抽出物について、血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図３】親水性画分によるダチョウ肉抽出物について、血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図４】図１から図３で示した３画分を等重量で混合し、血管のバリア機能を評価したグラフ
【図５】マイルスアッセイによる結果を示す顕微鏡写真
【図６】マイルスアッセイによる結果を示す測定値
【図７】細胞間ジャンクション形成状態を示す顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の血管内皮のバリア機能向上用食品は、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪を用いるものである。本発明は、例えば、ミンチ状のダチョウ肉を凍結乾燥後、メタノールなどの極性が高めの有機溶媒を用いて疎水性成分を抽出後、その上清部分にヘキサン、クロロホルム、メタノールを順次加え分画することで脂溶性成分を取得し、取得した脂溶性成分を、又はダチョウの皮下脂肪層を加熱溶解し、一般的な脂質の粗精製を行った脂粗精製物を、例えば、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤、シロップ剤の形態で血管内皮バリア機能向上剤として経口摂取し、又は医薬品として経口投与して利用できる。また、摂取後の血管内皮のバリア機能向上効果を示す表示および広告を付した飲料、一般食品、サプリメント食品とすることができる他、加熱調理したダチョウ肉や脂粗精製物を経口摂取してもよい。ダチョウ肉や脂粗精製物を経口摂取する場合には、１食あたりダチョウ生肉３０〜３００gが適している。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（調整例）
ダチョウ肉としてモモ肉を用い、このモモ肉をミンチ状に加工した後、凍結乾燥した。生肉３５gに相当する凍結乾燥肉に７２ｍＬのメタノールを加え、５０℃に保持した恒温チャンバー内で静置した。その後、ろ紙を用いて固形分を分離し、抽出液を回収した。
このメタノール抽出液７５ｍＬに１５ｍＬの水を加え、その後、合計５８ｍＬのヘキサンを３回に分けて加え、都度分液しヘキサン層を回収した。これを減圧濃縮し、一晩減圧乾燥させた。以下、ここで得られた画分をヘキサン画分と呼ぶ。
さらに、残った分画に対し合計１５０ｍＬのクロロホルムを３回に分けて加え、都度分液しクロロホルム層を抽出した。回収したクロロホルム層に水を２５ｍＬ加え水洗し、親水性成分をより除去したクロロホルム層を得た。これを減圧濃縮し、一晩減圧乾燥させた。以下、ここで得られた画分をクロロホルム画分と呼ぶ。
さらに、クロロホルムを加えて分液した水層部、およびクロロホルム層を水洗した際に得られた水層部を混合し、減圧共沸濃縮後、凍結乾燥させた。以下、ここで得られた画分を親水性画分と呼ぶ。
（試験例１）
【００１０】
電極付９６ｗｅｌｌ培養皿（９６Ｗ２０Ｅ＋；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）をあらかじめ１０ｍＭＬシステインで酸化被膜を剥離し、２００μg／ｍＬコラーゲン溶液でコートした。本プレートにヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）を５×１０４個／３００μＬ（Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧＭ）に懸濁して播種した。２３時間後細胞がコンフレントであることを確認し、上澄みを回収した。その後、各サンプルを２０μＬ加えたＨｕｍｅｄｉａ  ＥＧＭ培地（ＤＭＳＯ最終濃度０．１２５％）を添加し、ＥＣＩＳ−Ｚθリアルタイム細胞解析装置により、インピーダンス（細胞間バリア）を約２２時間測定した。サンプルの最終濃度は、いずれのサンプルでも３．３あるいは３３．３μg／ｍＬである。本試験は、同様の実験を別日２回実施し、再現性が確認された。
【００１１】
結果を図１から図３に示す。図中の各群は、以下を示す。
Ｏｎｌｙ  ｃｅｌｌ：細胞のみで測定した群。陰性対照群（比較例１）。
Ａｎｇ１（３００ｎｇ／ｍＬ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１をサンプルとして培地に添加し測定した群。陽性対照群（比較例２）。
ＤＭＳＯ：培地のみで測定した群。陰性対照群（比較例３）。
ダチョウＨ（３３．３μｇ／ｍＬ）：ヘキサン画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。ヘキサン画分の高用量群（実施例１）。
ダチョウＨ（３．３μｇ／ｍＬ）：ヘキサン画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。ヘキサン画分の低用量群（実施例２）。
ダチョウC（３３．３μｇ／ｍＬ）：クロロホルム画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。クロロホルム画分の高用量群（実施例３）。
ダチョウC（３．３μｇ／ｍＬ）：クロロホルム画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。クロロホルム画分の低用量群（実施例４）。
ダチョウＷ（３３．３μｇ／ｍＬ）：親水性画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。親水性画分の高用量群（実施例５）。
ダチョウＷ（３．３μｇ／ｍＬ）：親水性画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。親水性画分の低用量群（実施例６）。
【００１２】
図１から図３に示すように、実施例１で示すヘキサン画分の高用量群、及び実施例３で示すクロロホルム画分の高用量群においては、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１と比べ非常に高いバリア機能が確認された。さらに、実施例２で示すヘキサン画分の低用量群、実施例４で示すクロロホルム画分の低用量群、実施例５で示す親水性画分の高用量群、及び実施例６で示す親水性画分の低用量群では、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１群よりもバリア機能は同等あるいは低かったものの、比較例１で示す陰性対照群であるＯｎｌｙ  ｃｅｌｌ群、及び比較例３で示すＤＭＳＯ群と比較するとその効果は高かった。
また、実施例１及び実施例２に示すヘキサン画分、実施例３及び実施例４に示すクロロホルム画分には用量依存性が確認されたことから、これらの両画分には特に高い血管内皮のバリア機能向上効果があることが明らかとなった。
（試験例２）
【００１３】
試験例１で用いた各画分を同重量ずつ混合し、同様の試験系を用いて血管内皮のバリア機能向上効果について評価した。すなわち、ヘキサン画分の高用量群、クロロホルム画分の高用量群、および水画分の高用量群を３３．３μｇ／ｍＬずつ混合し、最終濃度１００μｇ／ｍＬとし（実施例７）、ヘキサン画分の低用量群、クロロホルム画分の低用量群、および親水性画分の低用量群を３．３μｇ／ｍＬずつ混合し、最終濃度１０μｇ／ｍＬとした（実施例８）。
【００１４】
結果を図４に示す。図中の各群は、以下を示す。
Ｏｎｌｙ  ｃｅｌｌ：細胞のみで測定した群。陰性対照群（比較例１）。
Ａｎｇ１（３００ｎｇ／ｍＬ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１をサンプルとして培地に添加し測定した群。陽性対照群（比較例２）。
ＤＭＳＯ：培地のみで測定した群。陰性対照群（比較例３）。
混合品（１００μｇ／ｍＬ）：３画分の同重量混合品をサンプルとして培地に最終濃度１００μｇ／ｍＬ添加し測定した群。混合品の高用量群（実施例７）。
混合品（１０μｇ／ｍＬ）：３画分の同重量混合品をサンプルとして培地に最終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し測定した群。混合品の低用量群（実施例８）。
【００１５】
図４に示すように、実施例７で示すダチョウ混合品の高用量群では、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１群、比較例１で示す陰性対照群であるＯｎｌｙ  ｃｅｌｌ群、及び比較例３で示すＤＭＳＯ群と比較し、血管のバリア機能向上効果は高かったものの、その効果は図１及び図２で示した混合前のヘキサン画分およびクロロホルム画分単一の群の効果より低かった。これは、図３で示した親水性画分に含まれる血管のバリア機能向上効果を持たない、あるいは阻害する成分により、見た目の効果が低くなってしまったと推察される。このことから、ヘキサンおよびクロロホルムなどにより脂溶性成分を抽出することにより、ダチョウ肉から血管のバリア機能向上効果を高く示す成分を濃縮することができたと考えられる。
【００１６】
（調整例）
ダチョウの腹側から得られた皮下脂肪層（以下、腹脂と呼ぶ）を加熱溶解し、不純物を除くために脱ガム・脱臭・脱酸などの一般的な脂質の粗精製を行った。以下、ここで得られた検体を腹脂粗精製物と呼ぶ。
【００１７】
（試験例３）
麻酔下（ソムノペンチルを６．４８ｍｇ／ｍｌの濃度で２００μＬ腹腔内投与）のＢａｌｂ／ｃマウス８週齢♀に対して１００μＬの１%エバンスブルーを尾静脈内投与し、１５分後に、背部の皮内にサンプルを各１５μＬずつ注入した（各サンプル１スポットずつ５匹）。約３０分静置後にマウスをチオペンタールナトリウムの過剰投与により安楽死させ、サンプルを注入した付近の皮膚を回収した。皮下にしみ出した色素は、１）実体顕微鏡による写真撮影（図５）、２）切除された皮膚組織からフォルムアミドを用いて溶出し、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙで測定した。測定結果はＯＭＳ社の統計解析ソフト「Ｓｔａｔｃｅｌ２」を用いて、一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により、全ての群間について有意差があるかどうかを多重比較検定した（図６）。
【００１８】
結果を図５および図６に示す。図中の各サンプル番号（１〜８）は、以下を示す。
サンプル番号１（コントロール）：溶媒のみを１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（比較例４）。
サンプル番号２（ＶＥＧＦ）：血管透過性を亢進するＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（１００ｎｇ／ｍＬ）を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（比較例５）。
サンプル番号３（ダチョウ肉へキサン画分（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例９）。
サンプル番号４（ダチョウ肉へキサン画分（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１０）。
サンプル番号５（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１１）。
サンプル番号６（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１２）。
サンプル番号７（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１３）。
サンプル番号８（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１４）。
【００１９】
図５および図６に示すように、実施例９で示すヘキサン画分の低用量群、実施例１０で示す同高用量群、実施例１２で示すクロロホルム画分の高用量群、実施例１３で示す腹脂粗精製物の低用量群、および実施例１４で示す同高用量群においては、比較例５で示す対照群であるＶＥＧＦと比べ、有意差を持った非常に高い血管透過性の抑制効果が確認された。
【００２０】
（試験例４）
φ３ｃｍのガラスボトムプレートに、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を１x１０４個播種し、細胞がほぼコンフレントになるまで２〜３日間Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２  Ｍｅｄｉｕｍを用いて培養した。コンフレントであることが確認された時点で、各サンプルを添加した。培養開始から５時間で培養を中止し、細胞を４%パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１%Ｔｒｉｔｏｎ−X−１００で薬剤浸透性を高める処置を行った。細胞は、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ−抗体で細胞接着の状態を解析し（緑色）、また細胞骨格の状態はｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ａｃｔｉｎをｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色して観察した（赤色）。個々の細胞を認識するために、細胞核をＴＯＰＲＯ３にて染色した（青色）。サンプルを添加したことにより、培養細胞全体の領域において、線状接着帯形成など細胞接着がどのように変化しているのかを解析した。
【００２１】
結果を図７に示す。図中の各サンプル番号（１〜９）は、以下を示す。
サンプル番号１（コントロール）：培地のみで培養し解析した群（比較例６）。
サンプル番号２（リゾホスファチジン酸）：細胞間結合を亢進するリゾホスファチジン酸を陽性コントロールとして最終濃度４．３６μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し解析した群（比較例７）。
サンプル番号３（アンジオポエチン−１）：細胞間結合を亢進するアンジオポエチン−１を陽性コントロールとして最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し解析した群（比較例８）。
サンプル番号４（ダチョウ肉へキサン画分（Ｌ））：ヘキサン画分をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１５）。
サンプル番号５（ダチョウ肉へキサン画分（Ｈ））：ヘキサン画分をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１６）。
サンプル番号６（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｌ））：クロロホルム画分をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１７）。
サンプル番号７（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｈ））：クロロホルム画分をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１８）。
サンプル番号８（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｌ））：ダチョウ腹脂粗精製物をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１９）。
サンプル番号９（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｈ））：ダチョウ腹脂粗精製物をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例２０）。
【００２２】
図７に示すように、実施例１５で示すヘキサン画分の低用量群、実施例１６で示す同高用量群においては、ジャンクション領域とそれに沿ったａｃｔｉｎの重合が増加していた。また、実施例１７で示すクロロホルム画分の低用量分では変化が認められなかったが、実施例１８で示す同高用量群においては、ジャンクション領域の増加傾向が見られた。実施例１９で示す腹脂粗精製物の低用量群、実施例２０で示す同高用量群でも一部において強いジャンクション形成が見られた。
以上のことから、ジャンクション形成により、すなわち細胞接着が形成されることによって、血管内皮バリア機能が向上することが分かった。      
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪を血管内皮バリア機能向上用食品として利用できる他に、例えば、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤、シロップ剤の形態で血管内皮バリア機能向上剤として経口摂取し、又は医薬品として経口投与して利用でき、又は注射剤として体内投与して利用することができる。
【図１】
2020130166.tif 000003
【図２】
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【図３】
2020130166.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2020130166.tif 000008
【図７】
2020130166.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月22日(2019.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管のバリア機能を向上させる血管内皮バリア機能向上用食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命がその活動を正常に維持するためには、各臓器へ十分な酸素や栄養を供給し、さらにその活動で生じる老廃物を適切に運搬・処理することが重要である。この機能を担う器官が血管である。
血管には、心臓から送り出された血液が流れる動脈、心臓へ戻る血液が通る静脈の他に、血管のうち９０%以上（人間の場合）を占める毛細血管がある。毛細血管は血管内皮細胞と血管壁細胞から構成されているが、特に血管内皮細胞が血管のバリアとして働き、物質の透過性すなわちバリア機能を調節することにより、生命の健康維持に重要な役割を担っていることが近年分かってきた。血管内皮バリア機能の障害により、末梢細胞への酸素、栄養の不足が生じるだけではなく、炎症、動脈硬化など様々な血管の病気の引き金となることが知られている。
毛細血管の構造安定化には、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ａｎｇ１）が関与している。血管内皮細胞の周囲を覆う壁細胞より恒常的に分泌され、血管構造の維持がなされている。Ａｎｇ１による血管構造の維持は、血管内皮細胞に発現するレセプター型チロシンキナーゼであるＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｌｇ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ−２）を活性化させ、内皮細胞間のＴｉｅ２の架橋による内皮−壁細胞、内皮−内皮細胞の接着性を高め、血管透過性の制御された血管構造を誘導することによる。しかし、Ａｎｇ１を産生する壁細胞が加齢や生活習慣病により内皮細胞から離脱したり、Ａｎｇ１の産生低下が壁細胞で生じると欠陥構造が破綻して血流の低下や、透過性の亢進、すなわちバリア機能の低下が生じてくる。長期的なバリア機能の低下は、組織深部の浸透圧を亢進させて、養分や酸素の運搬の妨げになり、末梢組織で障害が生じる。この障害の回復にはＡｎｇ１を工業的に生産して薬剤として血管修復に応用することは可能だが、コスト面において非現時的である。（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】大戸信明、高倉伸幸、  “血管構造の安定化に寄与するＴｉｅ２受容体の天然活性化食品香料素材”、  ＡＲＯＭＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  Ｎｏ．６２、  ２０１５年５月号、  Ｖｏｌ．１６、  Ｎｏ．  ２、  ｐ．１４４〜１４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前述における問題を解決するため、安全性の高い天然物を用いた血管内皮バリア機能向上用食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ダチョウ肉の抽出成分又はダチョウの皮下脂肪の抽出成分によって、血管のバリア機能を向上させることを見出した。
さらに、本発明者らは、鋭意検討したところ、ダチョウ肉の抽出成分又はダチョウの皮下脂肪の抽出成分から脂溶性成分を抽出することにより、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪における血管のバリア機能向上効果を持たない成分を除去し、高い血管のバリア機能向上効果を示す有効成分を濃縮できることを見出した。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の血管内皮バリア機能向上用食品により、血管内皮バリア機能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ヘキサン画分によるダチョウ肉抽出物について血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図２】クロロホルム画分によるダチョウ肉抽出物について、血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図３】親水性画分によるダチョウ肉抽出物について、血管のバリア機能を評価した試験結果のグラフ
【図４】図１から図３で示した３画分を等重量で混合し、血管のバリア機能を評価したグラフ
【図５】マイルスアッセイによる結果を示す顕微鏡写真
【図６】マイルスアッセイによる結果を示す測定値
【図７】細胞間ジャンクション形成状態を示す顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の血管内皮のバリア機能向上用食品は、ダチョウ肉の抽出成分又はダチョウの皮下脂肪の抽出成分を用いるものである。本発明は、例えば、ミンチ状のダチョウ肉を凍結乾燥後、メタノールなどの極性が高めの有機溶媒を用いて疎水性成分を抽出後、その上清部分にヘキサン、クロロホルム、メタノールを順次加え分画することで脂溶性成分を取得し、取得した脂溶性成分を、又はダチョウの皮下脂肪層を加熱溶解し、一般的な脂質の粗精製を行った脂粗精製物を、例えば、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤、シロップ剤の形態で血管内皮バリア機能向上剤として経口摂取し、又は医薬品として経口投与して利用できる。また、摂取後の血管内皮のバリア機能向上効果を示す表示および広告を付した飲料、一般食品、サプリメント食品とすることができる他、加熱調理したダチョウ肉や脂粗精製物を経口摂取してもよい。ダチョウ肉や脂粗精製物を経口摂取する場合には、１食あたりダチョウ生肉３０〜３００gが適している。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（調整例）
ダチョウ肉としてモモ肉を用い、このモモ肉をミンチ状に加工した後、凍結乾燥した。生肉３５gに相当する凍結乾燥肉に７２ｍＬのメタノールを加え、５０℃に保持した恒温チャンバー内で静置した。その後、ろ紙を用いて固形分を分離し、抽出液を回収した。
このメタノール抽出液７５ｍＬに１５ｍＬの水を加え、その後、合計５８ｍＬのヘキサンを３回に分けて加え、都度分液しヘキサン層を回収した。これを減圧濃縮し、一晩減圧乾燥させた。以下、ここで得られた画分をヘキサン画分と呼ぶ。
さらに、残った分画に対し合計１５０ｍＬのクロロホルムを３回に分けて加え、都度分液しクロロホルム層を抽出した。回収したクロロホルム層に水を２５ｍＬ加え水洗し、親水性成分をより除去したクロロホルム層を得た。これを減圧濃縮し、一晩減圧乾燥させた。以下、ここで得られた画分をクロロホルム画分と呼ぶ。
さらに、クロロホルムを加えて分液した水層部、およびクロロホルム層を水洗した際に得られた水層部を混合し、減圧共沸濃縮後、凍結乾燥させた。以下、ここで得られた画分を親水性画分と呼ぶ。
（試験例１）
【００１０】
電極付９６ｗｅｌｌ培養皿（９６Ｗ２０Ｅ＋；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）をあらかじめ１０ｍＭＬシステインで酸化被膜を剥離し、２００μg／ｍＬコラーゲン溶液でコートした。本プレートにヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）を５×１０４個／３００μＬ（Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧＭ）に懸濁して播種した。２３時間後細胞がコンフレントであることを確認し、上澄みを回収した。その後、各サンプルを２０μＬ加えたＨｕｍｅｄｉａ  ＥＧＭ培地（ＤＭＳＯ最終濃度０．１２５％）を添加し、ＥＣＩＳ−Ｚθリアルタイム細胞解析装置により、インピーダンス（細胞間バリア）を約２２時間測定した。サンプルの最終濃度は、いずれのサンプルでも３．３あるいは３３．３μg／ｍＬである。本試験は、同様の実験を別日２回実施し、再現性が確認された。
【００１１】
結果を図１から図３に示す。図中の各群は、以下を示す。
Ｏｎｌｙ  ｃｅｌｌ：細胞のみで測定した群。陰性対照群（比較例１）。
Ａｎｇ１（３００ｎｇ／ｍＬ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１をサンプルとして培地に添加し測定した群。陽性対照群（比較例２）。
ＤＭＳＯ：培地のみで測定した群。陰性対照群（比較例３）。
ダチョウＨ（３３．３μｇ／ｍＬ）：ヘキサン画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。ヘキサン画分の高用量群（実施例１）。
ダチョウＨ（３．３μｇ／ｍＬ）：ヘキサン画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。ヘキサン画分の低用量群（実施例２）。
ダチョウC（３３．３μｇ／ｍＬ）：クロロホルム画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。クロロホルム画分の高用量群（実施例３）。
ダチョウC（３．３μｇ／ｍＬ）：クロロホルム画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。クロロホルム画分の低用量群（実施例４）。
ダチョウＷ（３３．３μｇ／ｍＬ）：親水性画分をサンプルとして培地に最終濃度３３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。親水性画分の高用量群（実施例５）。
ダチョウＷ（３．３μｇ／ｍＬ）：親水性画分をサンプルとして培地に最終濃度３．３μｇ／ｍＬ添加し測定した群。親水性画分の低用量群（実施例６）。
【００１２】
図１から図３に示すように、実施例１で示すヘキサン画分の高用量群、及び実施例３で示すクロロホルム画分の高用量群においては、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１と比べ非常に高いバリア機能が確認された。さらに、実施例２で示すヘキサン画分の低用量群、実施例４で示すクロロホルム画分の低用量群、実施例５で示す親水性画分の高用量群、及び実施例６で示す親水性画分の低用量群では、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１群よりもバリア機能は同等あるいは低かったものの、比較例１で示す陰性対照群であるＯｎｌｙ  ｃｅｌｌ群、及び比較例３で示すＤＭＳＯ群と比較するとその効果は高かった。
また、実施例１及び実施例２に示すヘキサン画分、実施例３及び実施例４に示すクロロホルム画分には用量依存性が確認されたことから、これらの両画分には特に高い血管内皮のバリア機能向上効果があることが明らかとなった。
（試験例２）
【００１３】
試験例１で用いた各画分を同重量ずつ混合し、同様の試験系を用いて血管内皮のバリア機能向上効果について評価した。すなわち、ヘキサン画分の高用量群、クロロホルム画分の高用量群、および水画分の高用量群を３３．３μｇ／ｍＬずつ混合し、最終濃度１００μｇ／ｍＬとし（実施例７）、ヘキサン画分の低用量群、クロロホルム画分の低用量群、および親水性画分の低用量群を３．３μｇ／ｍＬずつ混合し、最終濃度１０μｇ／ｍＬとした（実施例８）。
【００１４】
結果を図４に示す。図中の各群は、以下を示す。
Ｏｎｌｙ  ｃｅｌｌ：細胞のみで測定した群。陰性対照群（比較例１）。
Ａｎｇ１（３００ｎｇ／ｍＬ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１をサンプルとして培地に添加し測定した群。陽性対照群（比較例２）。
ＤＭＳＯ：培地のみで測定した群。陰性対照群（比較例３）。
混合品（１００μｇ／ｍＬ）：３画分の同重量混合品をサンプルとして培地に最終濃度１００μｇ／ｍＬ添加し測定した群。混合品の高用量群（実施例７）。
混合品（１０μｇ／ｍＬ）：３画分の同重量混合品をサンプルとして培地に最終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し測定した群。混合品の低用量群（実施例８）。
【００１５】
図４に示すように、実施例７で示すダチョウ混合品の高用量群では、比較例２で示す陽性対照群であるＡｎｇ１群、比較例１で示す陰性対照群であるＯｎｌｙ  ｃｅｌｌ群、及び比較例３で示すＤＭＳＯ群と比較し、血管のバリア機能向上効果は高かったものの、その効果は図１及び図２で示した混合前のヘキサン画分およびクロロホルム画分単一の群の効果より低かった。これは、図３で示した親水性画分に含まれる血管のバリア機能向上効果を持たない、あるいは阻害する成分により、見た目の効果が低くなってしまったと推察される。このことから、ヘキサンおよびクロロホルムなどにより脂溶性成分を抽出することにより、ダチョウ肉から血管のバリア機能向上効果を高く示す成分を濃縮することができたと考えられる。
【００１６】
（調整例）
ダチョウの腹側から得られた皮下脂肪層（以下、腹脂と呼ぶ）を加熱溶解し、不純物を除くために脱ガム・脱臭・脱酸などの一般的な脂質の粗精製を行った。以下、ここで得られた検体を腹脂粗精製物と呼ぶ。
【００１７】
（試験例３）
麻酔下（ソムノペンチルを６．４８ｍｇ／ｍｌの濃度で２００μＬ腹腔内投与）のＢａｌｂ／ｃマウス８週齢♀に対して１００μＬの１%エバンスブルーを尾静脈内投与し、１５分後に、背部の皮内にサンプルを各１５μＬずつ注入した（各サンプル１スポットずつ５匹）。約３０分静置後にマウスをチオペンタールナトリウムの過剰投与により安楽死させ、サンプルを注入した付近の皮膚を回収した。皮下にしみ出した色素は、１）実体顕微鏡による写真撮影（図５）、２）切除された皮膚組織からフォルムアミドを用いて溶出し、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙで測定した。測定結果はＯＭＳ社の統計解析ソフト「Ｓｔａｔｃｅｌ２」を用いて、一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により、全ての群間について有意差があるかどうかを多重比較検定した（図６）。
【００１８】
結果を図５および図６に示す。図中の各サンプル番号（１〜８）は、以下を示す。
サンプル番号１（コントロール）：溶媒のみを１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（比較例４）。
サンプル番号２（ＶＥＧＦ）：血管透過性を亢進するＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（１００ｎｇ／ｍＬ）を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（比較例５）。
サンプル番号３（ダチョウ肉へキサン画分（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例９）。
サンプル番号４（ダチョウ肉へキサン画分（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１０）。
サンプル番号５（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１１）。
サンプル番号６（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１２）。
サンプル番号７（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｌ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３．３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１３）。
サンプル番号８（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｈ））：ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプル（３３３μｇ／ｍＬ（ｆｉｎａｌ））を１スポットあたり１５μＬ皮下注射した（実施例１４）。
【００１９】
図５および図６に示すように、実施例９で示すヘキサン画分の低用量群、実施例１０で示す同高用量群、実施例１２で示すクロロホルム画分の高用量群、実施例１３で示す腹脂粗精製物の低用量群、および実施例１４で示す同高用量群においては、比較例５で示す対照群であるＶＥＧＦと比べ、有意差を持った非常に高い血管透過性の抑制効果が確認された。
【００２０】
（試験例４）
φ３ｃｍのガラスボトムプレートに、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を１x１０４個播種し、細胞がほぼコンフレントになるまで２〜３日間Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２  Ｍｅｄｉｕｍを用いて培養した。コンフレントであることが確認された時点で、各サンプルを添加した。培養開始から５時間で培養を中止し、細胞を４%パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１%Ｔｒｉｔｏｎ−X−１００で薬剤浸透性を高める処置を行った。細胞は、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ−抗体で細胞接着の状態を解析し（緑色）、また細胞骨格の状態はｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ａｃｔｉｎをｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色して観察した（赤色）。個々の細胞を認識するために、細胞核をＴＯＰＲＯ３にて染色した（青色）。サンプルを添加したことにより、培養細胞全体の領域において、線状接着帯形成など細胞接着がどのように変化しているのかを解析した。
【００２１】
結果を図７に示す。図中の各サンプル番号（１〜９）は、以下を示す。
サンプル番号１（コントロール）：培地のみで培養し解析した群（比較例６）。
サンプル番号２（リゾホスファチジン酸）：細胞間結合を亢進するリゾホスファチジン酸を陽性コントロールとして最終濃度４．３６μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し解析した群（比較例７）。
サンプル番号３（アンジオポエチン−１）：細胞間結合を亢進するアンジオポエチン−１を陽性コントロールとして最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し解析した群（比較例８）。
サンプル番号４（ダチョウ肉へキサン画分（Ｌ））：ヘキサン画分をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１５）。
サンプル番号５（ダチョウ肉へキサン画分（Ｈ））：ヘキサン画分をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１６）。
サンプル番号６（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｌ））：クロロホルム画分をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１７）。
サンプル番号７（ダチョウ肉クロロホルム画分（Ｈ））：クロロホルム画分をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１８）。
サンプル番号８（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｌ））：ダチョウ腹脂粗精製物をサンプルとして最終濃度３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例１９）。
サンプル番号９（ダチョウ腹脂粗精製物（Ｈ））：ダチョウ腹脂粗精製物をサンプルとして最終濃度３３．３μｇ／ｍＬとなるよう添加し解析した群（実施例２０）。
【００２２】
図７に示すように、実施例１５で示すヘキサン画分の低用量群、実施例１６で示す同高用量群においては、ジャンクション領域とそれに沿ったａｃｔｉｎの重合が増加していた。また、実施例１７で示すクロロホルム画分の低用量分では変化が認められなかったが、実施例１８で示す同高用量群においては、ジャンクション領域の増加傾向が見られた。実施例１９で示す腹脂粗精製物の低用量群、実施例２０で示す同高用量群でも一部において強いジャンクション形成が見られた。
以上のことから、ジャンクション形成により、すなわち細胞接着が形成されることによって、血管内皮バリア機能が向上することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、ダチョウ肉又はダチョウの皮下脂肪を血管内皮バリア機能向上用食品として利用できる他に、例えば、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤、シロップ剤の形態で血管内皮バリア機能向上剤として経口摂取し、又は医薬品として経口投与して利用でき、又は注射剤として体内投与して利用することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダチョウ肉の抽出成分又はダチョウの皮下脂肪の抽出成分を用い、
前記ダチョウ肉の前記抽出成分又は前記ダチョウの前記皮下脂肪の前記抽出成分が脂溶性成分である
ことを特徴とする血管内皮バリア機能向上用食品。
【請求項２】
細胞接着を形成することで血管内皮バリア機能が向上することを特徴とする請求項1に記載の血管内皮バリア機能向上用食品。