(57)【要約】      （修正有）【課題】メラニン生成促進活性を示すペプチドを提供する。【解決手段】本発明のペプチドはチロシナーゼの活性及び発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子の発現を増加させることによって、メラニン生成において優れる効果を示す。本発明のペプチドはメラニン低色素症の予防、改善、及び治療用途に利用できる。前述した本発明のペプチドの優れる活性及び安定性は、医薬、医薬外品、及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示す、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）及びＴＲＰ１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）からなる群から選択されるメラニン合成関連因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、チロシナーゼの発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、メラニン低色素症の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記メラニン低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症であることを特徴とする、請求項６に記載のメラニン低色素症の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、メラニン低色素症の予防または改善用化粧品組成物。
【請求項９】
前記メラニン低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症であることを特徴とする、請求項８に記載のメラニン低色素症の予防または改善用化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善及び／又は治療用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚細胞は紫外線や環境汚染、その他の外部要因の刺激に対して防御機転として表皮基底層に存在するメラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）のメラニン小体（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）でメラニンを生成する。メラニンは動物の皮膚、瞳、髪の毛の色を決定する重要な要因である。低色素症は皮膚癌の危険因子とも知られている。東洋人らはメラニンが過多に生成されることに敏感で、メラニン生成を抑制する美白関連の研究が多く遂行された。しかしながら、最近にはメラニン生成が抑制されて表れる白斑症（Ｖｉｔｉｌｉｇｏ）に対する要求も増加しているので、これに対する研究も進められている。
【０００３】
白斑症はメラニン細胞の死滅や怪死によるさまざまな大きさ及び形態の白色斑が皮膚に表れる後天性脱色素疾患である。全世界的に人口の約１％で表れる比較的ありふれた疾患で、人種や地域に従う差はない。発生年齢は１０〜３０歳に最も多く、９５％の場合、４０歳以前に発病し、患者の３０％で家族力がある。
【０００４】
白斑症が生じる原因に対してまだ正確に判明したところがないが、自家免疫説、神経体液説、メラニン細胞自家破壊説など、さまざまな説が提示されている。自家免疫説はメラニン細胞系抗原に対する自家抗体の発現によりメラニン細胞の破壊または機能異常がもたらされるか、または細胞毒性リンパ球や活性化されたリンパ球が分泌したリンフォカインにメラニン細胞が破壊されるという説である。神経体液説は、カテコールアミン生合成の異常とモノアミン酸化酵素の増加などによってストレスと関連した過酸化水素が作られて、これによってメラニン細胞が破壊されるという説であって、白斑症が神経節に沿って発生するか、または神経損傷やストレス後に発病することもある。メラニン細胞自家破壊説は、メラニン形成過程で生じる中間代謝物質や最終代謝物質であるフェノール複合体がメラニン細胞内に蓄積されて細胞を破壊するという説である。その他、固有細胞欠損（ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｆｅｃｔ）、遺伝要因、細胞死滅、カルシウム代謝異常などの多様な因子が提示されている。
【０００５】
メラニンは、メラニン生成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）から合成され、紫外線照射や毒性物質と化学物質を吸収することによって、皮膚を保護することに重要な役割をする。したがって、メラニン合成が正常に起こらない人々では全ての皮膚が白色になるよりは部分的に白色に変わって斑が生じる外形的な問題点もあり、外部刺激に敏感になることがさらに問題である。
【０００６】
メラニン合成に重要な酵素であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＴＲＰ−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＴＲＰ−２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）は、酸化的反応に触媒として作用する（非特許文献１）。
【０００７】
チロシナーゼは、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に、ＤＯＰＡをＤＯＰＡキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）に酸化させる作用をし、ＴＲＰ−１はジヒドロキシインドルカルボキシル酸オキシダーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ）にて５，６−ジヒドロキシインドル−２−カルボキシル酸（５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＨＩＣＡ）をインドル−５，６−キノン−２−カルボキシル酸（ｉｎｄｏｌ−５，６−ｑｕｉｎｏｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に変化させることに関与する。また、ＴＲＰ−１はチロシナーゼを安定化させて活性を調節する役割をする。ＴＲＰ−２はＤＯＰＡクロムタウトメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）にてＤＯＰＡクロムをＤＨＩＣＡに変化させてメラニン細胞をなすユーメラノン（ｅｕｍｅｌａｎｏｎ）とフェオメラノン（ｐｈｅｏｍｅｌａｎｏｎ）を形成し、これらの割合によって皮膚、髪の毛、瞳の色などが決定される。
【０００８】
メラニン合成は、紫外線照射とＭＳＨ（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）によって活性化される。α−ＭＳＨはペプチドホルモンで紫外線により生成され、脳下垂体及び皮膚を含んだいろいろな細胞で作られるものとして知られている。
【０００９】
α−ＭＳＨは側分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）によりメラニン生成細胞のＭＣＲ（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に作用して転写因子であるＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の活性を調節してメラニン合成に重要な役割をするチロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ＤＨＩＣＡ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＴＲＰ−２（ＤＯＰＡｃｈｒｏｍｅ  ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）などの活性を調節する（非特許文献２）。
【００１０】
メラニン形成細胞がＵＶまたはα−ＭＳＨによって刺激されれば、各々ｐ３８やＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）によりチロシナーゼが活性化されると報告された。ところで、この２つ経路のうち、特にα−ＭＳＨ−＞ｃＡＭＰ−＞ＰＫＡ過程がメラニン合成に重要な役割をするが、ｃＡＭＰの増加はＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）リン酸化を促進させ、これが転写因子であるＭＩＴＦの発現を増加させ、これはチロシナーゼの活性を向上させ、チロシナーゼｍＲＮＡ発現を増加させるという報告がある（非特許文献３〜４）。
【００１１】
一方、我が国をはじめとする東洋人らは誰でも真っ白い皮膚色を有することを願うため、メラニン生成を抑制する美白成分に対する研究を多く遂行してきた。しかしながら、メラニンは皮膚のメラニン生成細胞から合成され、紫外線照射や毒性物質と化学物質を吸収することによって、皮膚を保護することに重要な役割をする。メラニンの正常な合成が表れない場合は、皮膚が外部刺激に敏感で、外形的にも非正常的に見えるので、メラニン合成が正常化できるように治療することが必要であり、これに対する研究も遂行されたものがある。しかしながら、まだメラニン合成を促進させることに対する技術開発が十分に遂行されていない。
【００１２】
本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １４  （６）：  ４３７４４
【非特許文献２】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．  ２７３，  Ｎｏ．  ３１，  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ３１，  ｐｐ．  １９５６０９５６５，  １９９８
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０  （１４）：  ３０９６１０６
【非特許文献４】Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ２１  （６）：  ６６５７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、メラニン生成を促進させることができるペプチドを開発するために努力しており、その結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが優れるメラニン生成促進活性を示すということを確認し、これらがメラニン低色素症の予防及び治療に有用に使用できることを究めることによって、本発明を完成するに至った。
【００１５】
したがって、本発明の目的は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示すペプチドを提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的及び利点は、以下の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示すペプチドに関するものである。
【００２０】
本発明者らはメラニン生成を促進させることができるペプチドを開発するために努力しており、その結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが優れるメラニン生成促進活性を示すということを確認し、これらがメラニン低色素症の改善、予防、及び／又は治療に有用に使用できることを究めた。
【００２１】
本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むものであって、例えば、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるものでありうる。
【００２２】
本発明のペプチドは本発明者が保有しているペプチドライブラリーのうち、遺伝子及びタンパク質発現変化などに対する実験を通じてメラニン形成促進効能が優れるペプチドをスクリーニングしたものであって、総２種が本発明のペプチドに提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に関するものであって、本発明のペプチドはチロシナーゼの活性及び発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子の発現を増加させることによって、メラニン生成において優れる効果を示し、優れる活性及び安定性により医薬、医薬外品、及び化粧品に非常に有利に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】図１ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのメラニン形成増加効果を確認した結果である。
【図１ｂ】図１ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドのメラニン形成増加効果を確認した結果である。
【図２ａ】図２ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりチロシナーゼの活性が増加することを確認した結果である。
【図２ｂ】図２ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりチロシナーゼの活性が増加することを確認した結果である。
【図３ａ】図３ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した結果である。
【図３ｂ】図３ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した結果である。
【図４ａ】図４ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ及びチロシナーゼのタンパク質発現が増加することを確認した結果である。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりチロシナーゼのタンパク質発現が増加することを確認した結果である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＲＥＢのリン酸化増加を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４（１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ．  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１（１９８４））、または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）により製造できる。
【００２６】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部の部位を選定し、その活性を増加させるためにペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に変形を誘導することができる。
【００２７】
例えば、前記Ｃ−末端変形はペプチドのＣ−末端がヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アザイド（−ＮＨＮＨ２）などに変形されるものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
また、前記Ｎ−末端変形はペプチドのＮ−末端がアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択された１種以上の保護基が結合されるものでありうるが、これに限定されるものではない。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２９】
前記ペプチドのＮ−末端及び／又はＣ−末端変形はペプチドの安定性を格段に改善する作用をし、このような変形を通じて本発明のペプチドは生体内投与時の半減期を増加させて高い半減期を有することができる。
【００３０】
本明細書で、用語“安定性”は、イン・ビボ安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。
【００３１】
本発明の一態様によれば、本発明のペプチドはメラニン形成細胞でメラニン生成を増加させ、メラニン合成を調節する酵素であるチロシナーゼの活性及び発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ、ＴＲＰ１の発現を増加させ、ＣＲＥＢのリン酸化を増加させる。
【００３２】
このような結果は本発明のペプチドがメラニン生成を増加させることによって白斑症が緩和されるようにする効果を有するということを意味する。したがって、本発明のペプチドはメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に利用できる。
【００３３】
本発明で、メラニン低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、及び／又は点状白皮症のものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の他の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【００３５】
本発明の組成物は前述した本発明のペプチドを有効成分として含むため、この２つの間の共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３６】
本発明の組成物が薬剤学的組成物に製造される場合、前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。
【００３７】
また、前記薬剤学的組成物は薬剤学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は前述したペプチドの効能または活性を達成することに十分な量を意味する。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム、及び／又はミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口で投与することが好ましく、例えば皮膚局所投与により投与することができる。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医者は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．００１−１０００ｍｇ／ｋｇである。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または油化液形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、またはゲル（例えば、ハイドロゲル）形態であって、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４４】
本発明の更に他の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物に関するものである。
【００４５】
本発明の組成物が化粧品組成物に製造される場合、前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。
【００４６】
また、前記化粧品組成物は化粧品学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は前述した本発明の組成物の効能を達成することに十分な量を意味する。
【００４８】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及び／又はスプレーなどに剤形化できるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、及び／又はパウダーの剤形に製造できる。
【００４９】
前記化粧品組成物の剤形がペースト、クリーム、またはゲルの場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、及び／又は酸化亜鉛が利用できるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
前記化粧品組成物の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが用いられることができ、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、及び／又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００５１】
前記化粧品組成物の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、及び／又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５２】
前記化粧品組成物の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール、及び／又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及び／又はポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー、及び／又はトラガカントなどが利用できるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
前記化粧品組成物の剤形が界面−活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、及び／又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分の以外に、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含むものでありうるが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び／又は香料のような通常的な補助剤を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
以下、実施形態を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施形態はただ本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施形態により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【００５６】
実施形態
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；  ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，  Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れてメチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れてＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かして、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、また１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、各々３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＡｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れてＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ、及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡを分画に２回に亘って入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れて１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で前記と同様に２回脱保護反応させてＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを遂行した後、前記と同様に以下のアミノ酸付着実験を遂行した。選ばれたアミノ酸配列に基づいてＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間の間アセチル化を遂行した後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ、及びメタノールで各々３回を洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルロ化酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々揺らしながら２時間反応を維持した。フィルタ��ングを行ってレジンを濾して、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合せた。減圧を用いて全体ボリュームが半分位残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、もう２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して精製前Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎペプチド１を０．６５ｇ合成した（収率：９２．０％）。分子量測定機を用いて測定時、分子量１１５７．３（理論値：１１５７．３３）を得ることができた。また、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドも前記のような方法により合成を進行した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施形態１：メラニン形成アッセイ
６−ウェル培養用平板にメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地に取替後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養した後、培養液を除去し、細胞を剥がした後、１．５ｍｌチューブに移して１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上層液を除去し、細胞ペレットを回収してメラニンを観察した。細胞ペレットを２Ｍ  ＮａＯＨ  １５０ｕｌずつ入れて６０℃で３０分間細胞内メラニンを溶解させた。９６−ウェル平板の各ウェルに溶解させて得た上層液を１００ｕｌずつ入れて４９０ｎｍで吸光度を測定して、図１ａ及び図１ｂに示した。
【００５９】
図１ａ及び図１ｂから確認できるように、マウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、メラニン形成増加が確認された。
【００６０】
実施形態２：チロシナーゼ活性試験
黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）細胞を６−ウェル培養用平板に２４時間培養し、濃度別ペプチドを処理して７２時間培養した。氷の上に６−ウェル培養用平板を上げて、冷たいＰＢＳで洗浄した後、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含まれた０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．８、溶解バッファ）を３００ｕＬ入れて、細胞を１．５ｍＬチューブに集めて−２７０℃に急速冷凍させた後、解凍させる反応を５回繰り返して細胞膜を破壊した。１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上層液を他の１．５ｍＬチューブに集めて、この試料のタンパク質を定量した。試料のタンパク質濃度が同じ濃度になるように希薄して９６−ウェル培養用平板に３個のウェルずつ株分けし、１０ｍＭ  Ｌ−ｄｏｐａ  ２０ｕＬを添加して３７℃で１時間培養後、４７５ｎｍで吸光度を測定した。
【００６１】
図２ａ及び図２ｂから確認できるように、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、細胞内チロシナーゼの活性が増加した。
【００６２】
実施形態３：メラニン生成関連遺伝子ＲＴ−ＰＣＲ
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養された細胞のＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを製作した。メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ及びチロシナーゼに対する各々の特異的なプライマーを用いてＰＣＲして各遺伝子の発現変化を観察して、その結果を図３ａ及び図３ｂに示した。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
図３ａ及び図３ｂから確認できるように、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、メラニン形成過程に関与する転写因子であるＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現が増加した。
【００６５】
実施形態４：メラニン生成関連タンパク質ウェスタンブロッティング
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ及びチロシナーゼの発現を特異的な抗体（２種類全てＳａｎｔａｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットにより確認して、その結果を図４ａ及び図４ｂに示した。
【００６６】
図４ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、メラニン形成過程に関与する転写因子であるＭＩＴＦ及び酵素であるチロシナーゼのタンパク質発現が増加した。
【００６７】
また、図４ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、メラニン形成過程に関与するチロシナーゼのタンパク質発現が増加した。
【００６８】
実施形態５：メラニン生成関連タンパク質活性試験
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間細胞を培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する信号伝達物質であるＣＲＥＢのリン酸化程度を特異的な抗体（ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットにより確認して、その結果を図５に示した。
【００６９】
図５から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをマウスメラニン細胞株Ｂ１６Ｆ１０に処理時、メラニン形成過程に関与する因子であるＣＲＥＢのリン酸化レベルが増加した。
【００７０】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善及び／又は治療用途に関するものである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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