(57)【要約】      （修正有）【課題】癌患者由来のホルマリン固定された組織におけるタンパク質を定量する、定量的なプロテオミクスに基づくアッセイのための方法を提供する。【解決手段】生体試料から調製されたタンパク質消化物中のタンパク質に由来する修飾された又は未修飾の１種又は２種以上の断片ペプチドを質量分析によって検出及び／又は定量すること、並びに試料中のタンパク質のレベルを算出することを含み、タンパク質が、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及びＤＬＬ４タンパク質からなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定された組織の生体試料中のタンパク質のレベルを測定する方法であって、
前記方法が、
前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の前記タンパク質に由来する修飾された又は未修飾の１種又は２種以上の断片ペプチドを質量分析によって検出及び／又は定量すること、並びに
前記試料中の前記タンパク質のレベルを算出することを含み、
前記タンパク質が、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及びＤＬＬ４タンパク質からなる群から選択される方法。
【請求項２】
前記修飾された又は未修飾の１種又は２種以上の断片ペプチドを検出及び／又は定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画工程が、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、イオントラップ／四重極複合型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／又は飛行時間型質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、及び／又はインテリジェント選択反応モニタリング（ｉＳＲＭ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がＤＬＬ１であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がＤＬＬ３であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号３及び／又は配列番号４のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がＪＡＧ１であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号５及び／又は配列番号６のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質がＪＡＧ２であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号７及び／又は配列番号８のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質がＮｏｔｃｈ１であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号９及び／又は配列番号１０のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質がＮｏｔｃｈ２であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号１１及び／又は配列番号１２のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質がＮｏｔｃｈ３であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号１３及び／又は配列番号１４のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質がＮｏｔｃｈ４であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号１５及び／又は配列番号１６のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質がＤＬＬ４であり、前記１種又は２種以上の断片ペプチドが配列番号１７及び／又は配列番号１８のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織がパラフィン包埋された組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織が腫瘍から取得された組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が原発性腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が続発性腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記１種又は２種以上の断片ペプチドの定量が、ある生体試料中の前記１種又は２種以上の断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一の１種又は２種以上の断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記１種又は２種以上の断片ペプチドの定量が、生体試料中の前記１種又は２種以上の断片ペプチドの量を、同一のアミノ酸配列を有する既知量の添加された内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ及びそれらの組み合わせから選択される同位体によって標識されたペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質消化物中の前記１種又は２種以上の断片ペプチドの検出及び／又は定量が、対応するタンパク質の存在、及び対象における癌の診断上のステージ／グレード／ステータスとの関係を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種又は２種以上の断片ペプチドの前記検出及び／又は定量の結果、あるいは前記対応するタンパク質の前記検出及び／又は定量の結果と、前記対象の癌の処置療法とを関連付けることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
多重フォーマットにおいて他のタンパク質又は他のタンパク質由来のペプチドを検出及び／又は定量して、前記対象の癌の処置療法に関する追加の情報を提供することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２，８４２号の利益を主張し、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、いくつかの正常組織及び様々な癌において、増殖、分化、アポトーシス、細胞運命及び幹細胞の維持を推進する。Ｎｏｔｃｈシグナル経路は、胚発生の期間に最も活発である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の異常な活性化が、いくつかの腫瘍型において記載されており、活性化したＮｏｔｃｈ経路のタンパク質は、癌の進行及び治療上の耐性に関連している。
【０００３】
ＤＬＬ１（別名ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）は、ｄｅｌｔａ／ｓｅｒｒａｔｅ／ｊａｇｇｅｄファミリータンパク質の一つである。ＤＬＬ１は、血球新生の間の細胞運命決定を調節する役割を果たしており、細胞間情報伝達においても役割を果たしている可能性がある。ＤＬＬ１は多くの癌において過剰発現しており、ＤＬＬ１機能の阻害剤は癌治療のために開発中である。したがって、腫瘍細胞のＤＬＬ１タンパク質を定量可能なアッセイは、癌の治療計画（therapy regimen）の一環として有用であり、特に、ＤＬＬ１の発現レベルに関する情報を、特定の処置法の選択に使用することができる。
【０００４】
ＤＬＬ３（別名Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ３）は、通常は、神経発生の特定の期間に胎児の脳において発現している。この期間に、ＤＬＬ３は、Ｎｏｔｃｈ及びＤＬＬ１と相互作用することにより、シス及びトランス作用性のＮｏｔｃｈ経路の活性化を阻害し、それらを後期エンドソーム／リソソーム区画に向け直すか、又はゴルジ体に保持し、それによって、細胞表面へのそれらの局在を阻止する。さらに、ＤＬＬ３は、ＡＳＣＬ１タンパク質の直接の下流標的であると考えられる、いくつかのＮｏｔｃｈリガンドの１つである。合わせると、これらの知見によって、ＤＬＬ３が神経内分泌の表現型に関連しており、神経内分泌の腫瘍形成に寄与していることが示唆される。いくつかのＤＬＬ３阻害剤が開発されており、神経内分泌腫瘍の処置のために試験されている。ＤＬＬ３タンパク質の発現パターンは、高悪性度肺神経内分泌腫瘍、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ：small cell lung cancer）及び大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ：large cell neuroendocrine carcinoma）の診断及び処置を含む、腫瘍の同定及び癌治療の選択に関係している。したがって、腫瘍細胞のＤＬＬ１タンパク質を定量可能なアッセイは、癌の治療計画の一環として有用であり、特に、ＤＬＬ１の発現レベルに関する情報を、特定の処置法の選択に使用することができる。
【０００５】
ＪＡＧ１（別名ｊａｇｇｅｄ１）は、哺乳動物のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の受容体と相互作用する細胞表面タンパク質（リガンド）である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、多くの臓器系において細胞運命決定を確定し、制御する機能を有する高度に保存された経路である。ＪＡＧ１−ＮＯＴＣＨ（受容体−リガンド）相互作用が起きるとすぐに、タンパク質切断のカスケードが誘発され、癌化過程（cancer process）を開始し、促進する可能性がある下流標的遺伝子の転写活性化をもたらす。ＪＡＧ１とそのＮｏｔｃｈ受容体との相互作用を阻止する癌治療剤が開発されており、したがって、腫瘍細胞のＪＡＧ１タンパク質を定量可能なアッセイを、癌の処置法の選択に使用することができる。
【０００６】
ＪＡＧ２（別名ｊａｇｇｅｄ２）は、哺乳動物のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の受容体と相互作用する細胞表面タンパク質（リガンド）である。ＪＡＧ２の最もよく理解されている機能は、Ｎｏｔｃｈ２受容体と相互作用し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することであり、それによって、癌化過程の開始及び進行をもたらす可能性がある。ＪＡＧ２とＮｏｔｃｈ２受容体との相互作用を阻止する癌治療剤が開発されており、したがって、腫瘍細胞のＪＡＧ２タンパク質を定量可能なアッセイを、癌の処置法の選択に使用することができる。
【０００７】
Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４は、繰り返しの細胞外ＥＧＦドメイン及びｎｏｔｃｈ（又はＤＳＬ）ドメインを有する膜貫通タンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、胚発生における側方抑制に関わっており、異常に発現すると、癌細胞の増殖を推進する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ネットワークは、物理的な隣接細胞間の相互作用を制御する、進化的に保存された細胞間シグナル伝達経路である。この１型膜貫通タンパク質ファミリーのメンバーは、複数の上皮増殖因子様（ＥＧＦ：epidermal growth factor-like）リピートからなる細胞外ドメインと、複数の異なるドメイン型からなる細胞内ドメインとを含む構造上の特徴を共有している。これらのタンパク質は、トランスゴルジ網で切断され、ヘテロ二量体として細胞表面に存在し、細胞表面で血管、腎臓及び肝臓の発生において役割を果たしている膜結合型リガンドの受容体として機能する。複数のＮｏｔｃｈ受容体の阻害剤が、癌標的治療剤として開発されており、又は、開発中であり、したがって、４種のＮｏｔｃｈ受容体それぞれを定量可能なアッセイを、癌の処置法の選択に使用することができる。
【０００８】
ＤＬＬ４（別名ｄｅｌｔａ  ｌｉｋｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ  ４）は、ＤＳＬドメイン、ＥＧＦリピート及び膜貫通ドメインを特徴とするＮｏｔｃｈリガンドとして機能するタンパク質である。ＤＬＬ４は、ＮＯＴＣＨ１及びＮＯＴＣＨ４を活性化する。ＤＬＬ４は、血管新生に関わっており、上皮細胞の増殖、遊走、及び血管新生の出芽を負に制御する。ＤＬＬ４は、網膜前駆細胞の増殖に必須であり、後期の網膜前駆細胞の桿体細胞の運命（rod fates）の抑制、及び他の型の網膜細胞の適切な発生に必要である。ＤＬＬ４の発現は、腫瘍化過程（tumor process）を推進することに関係しており、その結果、複数のＤＬＬ４阻害剤が開発中である。この観点において、腫瘍細胞のＪＡＧ２タンパク質を定量可能なアッセイを、癌の処置法の選択に使用することができる。
【発明の概要】
【０００９】
患者の腫瘍組織におけるＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４を含むＮｏｔｃｈシグナル伝達経路に関わる１種又は２種以上のタンパク質のタンパク質発現レベルを、全長タンパク質のそれぞれの配列に由来するペプチドを定量することにより決定することができる。各ペプチドを、質量分析に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Selected Reaction Monitoring）（多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Multiple Reaction Monitoring）とも称され、本明細書においてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイと記載する）等の質量分析技術を使用して検出することができる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、例えば、ホルマリン固定された癌組織等の、癌患者の組織から調達された細胞において、直接的に断片ペプチドを定量することに使用される。
【００１０】
定量は、相対的又は絶対的であってもよい。絶対定量が必要な場合、各ペプチドの測定レベルは、測定されるペプチドと同一のアミノ酸配列を有する既知量の標識された対照ペプチドと比較される。ペプチドは特定のタンパク質に特有であり、したがって、１つのペプチド分子は１つのタンパク質分子に由来し、ペプチドのモル量の測定によって由来となるタンパク質のモル量の直接的な測定が可能となる。タンパク質発現の測定を、癌、癌のステージ、癌の進行の予後、様々な癌の処置及び治療に対する臨床反応の可能性の予測等の診断に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
癌患者由来のホルマリン固定された組織におけるＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質を定量する、定量的なプロテオミクスに基づくアッセイのための方法が、提供される。これらのアッセイによるデータを使用して、例えば、癌治療の処置の決定を改善することができる。
【００１２】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用して、生体試料から取得された所与のタンパク質調製物中におけるＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質の相対定量的又は絶対定量的なペプチドレベルを測定することができる。より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって、患者の組織試料（例えば、ホルマリン固定された癌患者の組織）から調達された細胞から調製された複雑なタンパク質溶解試料において、直接的にこれらのペプチドを測定することができる。ホルマリン固定された組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている方法を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から市販されているＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）の試薬及びプロトコルを使用して、適宜実施することができる。
【００１３】
最も広範かつ有利に利用可能な、癌患者の組織由来の組織形態は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中で、癌組織試料を保存するのに最も一般的な方法であり、標準的な病理プラクティス（pathology practice）で受容されている慣例である。ホルムアルデヒド水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、酸化及び重合度を制限するために少量の安定剤（通常はメタノール）を含む、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（体積基準で約４０％又は質量基準で３７％）からなる。組織を保存するための最も一般的な方法は、組織全体を長期間（８〜４８時間）、ホルムアルデヒド水溶液（１０％中性緩衝ホルマリンと一般に称される）に浸漬し、その後、室温で長期保存のために、固定された組織全体をパラフィンワックスで包埋することである。このようなホルマリン固定された癌組織を解析する分子的な解析法は、癌患者の組織を解析するために最も受容され、頻繁に利用されている方法である。
【００１４】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生体試料）が回収及び保存されている患者又は対象の特定の組織試料（例えば、癌組織の試料）中の、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質の精密かつ正確な定量レベルの関係を相関させるために使用することができる。これは癌に関する診断情報を提供するのみならず、これを患者の処置法の改善の一環としても使用することができる。疾患組織又は他の患者の試料中のタンパク質の発現レベルに関する診断及び治療上の重要な情報を提供するようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれている。例えば、アッセイを、癌のステージ又は程度（degree）を診断し、患者が最もよく応答しそうな治療剤を決定するように設計することができる。
【００１５】
本明細書に記載のアッセイによって、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質に由来するペプチドの相対レベル又は絶対レベルが測定される。所与のタンパク質の相対定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によって、例えば、異なる試料中のタンパク質に由来する個々の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積（signature peak area）（例えば、シグネチャピーク面積又はフラグメントイオン強度の積分値）を比較することによって決定される。あるいは、各ペプチドがその独自の特定のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを有する場合、複数のシグネチャペプチド（signature peptide）に関する複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を比較することが可能であり、ある生体試料中の相対的なタンパク質量を、追加の又は異なる１つ又は複数の生体試料中の同一の１種又は２種以上のタンパク質の量に関して決定することが可能である。このようにして、対象の１種又は２種以上のタンパク質由来の特定の１種又は２種以上のペプチドの量、したがって、１種又は２種以上の選択された（designated）タンパク質の量が、同一の実験条件下で複数の生体試料にわたって、同一の１種又は２種以上のペプチドに対して相対的に決定される。加えて、相対量は、単一試料中の所与のタンパク質に由来する所与の１種又は２種以上のペプチドにおいて、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によりペプチドのシグネチャピーク面積を、生体試料からの同一タンパク質調製物における異なる１種又は２種以上のタンパク質に由来する他の異なる１種又は２種以上のペプチドのシグネチャピーク面積と比較することによって、決定可能である。このようにして、選択されたタンパク質由来の特定のペプチドの量、したがって、タンパク質の量は、同一試料中の一方に対する相対的なものとして決定される。これらの手法は、試料間及び試料中において、選択されたタンパク質に由来する個々の１種又は２種以上のペプチドの定量を、他の１種又は２種以上のペプチドに対して可能にする。その際、シグネチャピーク面積によって決定される量は、生体試料のタンパク質調製物において選択されるペプチドの容量に対する絶対重量又は重量に対する絶対重量に関わらず、一方に対する相対的なものである。異なる試料間における個々のシグネチャピーク面積に関する相対定量データは、試料当たりの解析されたタンパク質量に標準化される。相対定量を、単一試料中の及び／又は多くの試料にわたる複数のタンパク質及び１種又は２種以上の選択されたタンパク質に由来する多くのペプチドにわたって同時に実施することができ、例えば、複数のペプチド／タンパク質に対する、ある１種のペプチド／タンパク質等の相対的なタンパク質量に関する見識を得ることができる。
【００１６】
選択されたタンパク質の絶対定量レベルは、生体試料中の選択されたタンパク質の個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、スパイクされた（spiked）内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較して決定される。一実施形態において、内部標準は、１種又は２種以上の重同位体によって標識された１つ又は複数のアミノ酸残基を含む、選択されたタンパク質に由来する全く同一のペプチドの合成バージョンである。このような同位体標識された内部標準は、質量分析によって解析される際、標準が予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを生じ、そのピークは天然の（native）ペプチドのシグネチャピークと異なり、区別でき、そのピークを比較ピークとして使用することができるように合成される。したがって、内部標準が生体試料のタンパク質調製物に既知量でスパイクされ、質量分析によって解析される際、天然のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積は、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較され、この数値比較によって、生体試料の元の（original）タンパク質調製物中に存在する天然のペプチドの絶対モル濃度及び／又は絶対重量が示される。断片ペプチドの絶対定量データは、試料当たりの解析されたタンパク質量に従って表される。絶対定量を、単一試料中の及び／又は多くの試料にわたる多くのペプチド、したがって、多くのタンパク質にわたって同時に実施することができ、個々の生体試料及び個々の試料のコホート全体において絶対的なタンパク質量に関する見識を得ることができる。
【００１７】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法を、例えば、直接的に患者由来の組織（例えば、ホルマリン固定された組織）において、癌のステージの診断を補助するために使用することができ、どの治療剤が該患者を処置する際の使用に最も有利であるかを決定することに役立てることにより処置法の改善の一環として使用することができる。手術（例えば、部分的又は完全な腫瘍の治療的な切除）又は疑いのある疾患の存在又は非存在を決定するために実施された生検工程のいずれかによって患者から切除された癌組織を解析して、特定の１種又は２種以上のタンパク質が該患者の組織に存在するかどうか、及び該患者の組織に存在するタンパク質の形態を決定する。さらに、１種又は２種以上のタンパク質の発現レベルを決定して、健康な組織で見られる「正常」又は対照レベルと比較することができる。健康な組織で見られるタンパク質の正常又は対照レベルは、例えば、癌を有していない１又は複数の個体の対応する組織に由来していてもよい。あるいは、正常又は対照レベルは、癌を有する個体の、癌に影響されない対応する組織の解析によって取得されてもよい。１種の、いくつかの又は全ての選択されたタンパク質のタンパク質レベルのアッセイを、選択されたタンパク質のレベルを使用することにより、癌を有すると診断された患者又は対象における癌のステージの診断に使用することもできる。選択されたタンパク質に由来する個々のペプチドのレベルは、解析されたタンパク質溶解液の総量当たりのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定されるペプチドのモル量として定義される。そのため、１種又は２種以上の選択されたタンパク質に関する情報を、１種又は２種以上のタンパク質（又はタンパク質の断片ペプチド）のレベルを、正常組織で見られるレベルと比較することによって、癌のステージ又はグレードを決定する際の補助のために使用することができる。１種又は２種以上の選択されたタンパク質の定量的な量が、癌細胞において決定されると、その情報を、例えば、アッセイされた１種又は２種以上のタンパク質の異常な発現によって特徴付けられる癌組織を特異的に処置するために開発された（化学的及び生物学的）治療剤のリストに照合することができる。例えば、タンパク質のアッセイの情報を、選択されたタンパク質又は選択されたタンパク質を発現している細胞／組織を特異的に標的とする治療剤のリストに照合することは、疾患の処置への個別化医療アプローチと呼ばれ得るものを表す。本明細書に記載されたアッセイ方法は、診断上及び処置上の決定の情報源として患者自身の組織に由来するタンパク質の解析を使用することによる個別化医療アプローチの基礎を形成する。
【００１８】
選択されたタンパク質に由来する適切な断片ペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されているＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅのプロトコルの使用を含む様々な方法によって生成することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅのプロトコル及び試薬によって、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織から、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク質消化により、質量分析による解析に適切なペプチド試料を作製することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅのプロトコルにおいて、組織／生体試料を、緩衝液中で長期間加熱して（例えば、約１０分〜約４時間の期間、約８０℃〜約１００℃）、タンパク質のクロスリンクを逆転させるか又は解除する。使用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベースの緩衝液又は界面活性剤を含む緩衝液）である。熱処理の後、組織／生体試料を、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを含むが、これらに限定されない１種又は２種以上のプロテアーゼによって、生体試料の組織及び細胞構造を破壊するのに十分な時間、処理する。加熱及びタンパク質分解の結果として、液体で可溶性の希釈可能な生体分子溶解液が得られる。
【００１９】
原理的には、例えば、特異性既知のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）による消化によって調製された、選択されたタンパク質由来のあらゆる予測されるペプチドを、サロゲートレポーター（surrogate reporter）として使用して、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用する試料において選択されたタンパク質の量を決定することができる。同様に、選択されたタンパク質において修飾される可能性があると知られる部位のアミノ酸残基を含むあらゆる予測されるペプチドの配列を、試料中の選択されたタンパク質の修飾の程度をアッセイするのに使用することができる可能性もある。
【００２０】
しかしながら、驚くことに、上記されたタンパク質の多くの潜在的なペプチド配列は、容易には明らかにならない理由によって、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおける使用には適切でないか、又は非効率的であることが見出された。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに適切なペプチドを予測することができなかったため、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における修飾及び非修飾のペプチドを実験的に同定し、各選択されたタンパク質の信頼性のある精密なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する必要があった。いかなる理論に縛られることを望まないものの、例えば、あるペプチドは、あまりイオン化しないか、又は他のタンパク質と区別することができる断片を生じないために、質量分析によって検出することが困難であると考えられている。また、ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）においてあまり分離しないか、又はガラスもしくはプラスチック製品に吸着することもあり得る。
【００２１】
表１に記載のペプチドは、ホルマリン固定された癌組織から調達された細胞から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液内の全てのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質から得られた。ある実施形態において、癌組織は、例えば、原発性腫瘍又は続発性腫瘍等の腫瘍である。特に断りの無い限り、各例において、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を質量分析によって解析して、質量分析によって検出され、解析される選択されたタンパク質由来のペプチドを決定した。質量分析による解析のための特定の好ましい一群のペプチドの同定は、１）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液の質量分析による解析において、イオン化されたタンパク質に由来する１種又は２種以上のペプチドの実験的な決定、及び２）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を調製する際に使用されるプロトコル及び実験的な条件を通して残存するためのペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、試料調製の間に修飾された形態で残存するためのペプチドの修飾されたアミノ酸残基の能力にまで拡大される。
【実施例】
【００２２】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定された組織から直接調達された細胞のタンパク質溶解液を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを使用して調製した。そのプロトコルは、組織の顕微解剖を経て、細胞を試料管に回収し、次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ緩衝液中で細胞を長期間加熱することを伴う。ホルマリン誘導性のクロスリンクを逆に作用させて、次いで、組織／細胞を、例えば、プロテアーゼであるトリプシンを含むが、それに限定されないような、プロテアーゼを使用して予測可能な方法で完全に消化した。各タンパク質溶解液を、プロテアーゼによるインタクトなポリペプチドの消化によって一群のペプチドに変換した。各Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を（例えば、イオントラップ質量分析によって）解析し、ペプチドの複数の包括的プロテオミクス調査を実施し、データを各タンパク質溶解液に存在する全ての細胞性タンパク質の質量分析によって同定可能な限り多くのペプチドを同定したものとして提示した。単一の複雑なタンパク質／ペプチド溶解液から可能な限り多くのペプチドを同定するために、イオントラップ質量分析又は包括的なプロファイリングを実施可能な他の形態の質量分析を、一般的には使用する。
【００２３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、又は三連四重極を含む、いずれのタイプの質量分析計において開発及び実施することができるが、有利には、三連四重極機器のプラットフォームを使用する。このタイプの質量分析計によって、細胞内に含まれる全てのタンパク質の数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る、非常に複雑なタンパク質溶解液中の単一の分離された標的ペプチドを解析することができる。記載の方法を使用して、１）各選択されたタンパク質の質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに使用することができる、各選択されたタンパク質の候補ペプチドを同定し、２）比較するための選択されたタンパク質に由来する標的ペプチドに対する個々の１つ又は複数のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発し、３）定量的なアッセイを癌診断及び／又は適切な治療の選択に適用した。
【００２４】
Ｎｏｔｃｈタンパク質アッセイのために、できる限り多くのペプチドを、使用された条件下で単一溶解液の単一ＭＳ解析において同定すると、次いで、そのペプチドのリストを照合し、該溶解液において検出されたタンパク質の決定に使用した。その工程を、複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において繰り返し、ペプチドの非常に大きなリストを単一のデータセットに照合した。このタイプのデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）解析された生体試料のタイプ、具体的には、生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出することができるペプチドを表すものと見なすことができ、よって、各選択されたタンパク質に由来するペプチドを含んでいる。
【００２５】
ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、及び／又はＤＬＬ４タンパク質の絶対量又は相対量の決定に有用であるとして同定されたトリプシンペプチドを、表１に記載する。これらの各ペプチドは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における質量分析によって検出された。よって、各ペプチドを、ホルマリン固定された患者組織を直接に含む、ヒトの生体試料において選択されたタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに使用することができる。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１に記載のトリプシンペプチドは、通常、例えば、前立腺、結腸及び乳房等を含む、異なるヒトの器官の複数の異なるホルマリン固定された組織の複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液から検出された。
【００２８】
アッセイ方法
１．タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ候補断片ペプチドの同定
ａ．ホルマリン固定された生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液を調製し、１種又は２種以上の（トリプシンを含んでいても、含んでいなくてもよい）プロテアーゼを使用し、タンパク質を消化する。
ｂ．個々の断片ペプチドが、リン酸化又はグリコシル化等のいかなるペプチド修飾も含まない場合、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における全てのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計によって解析し、選択されたタンパク質に由来する全ての断片ペプチドを同定する。
ｃ．Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における全てのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計によって解析し、例えば、リン酸化又はグリコシル化残基等のペプチド修飾を有するタンパク質に由来する全ての断片ペプチドを同定する。
ｄ．完全な全長タンパク質の特定の消化方法によって生成される全てのペプチドを測定することができる可能性があるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定された生体試料から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液において直接的に質量分析によって同定されたペプチドである。
【００２９】
２．選択されたタンパク質に由来する断片ペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液において同定された個々の断片ペプチドの三連四重極質量分析計に関するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、選択されたタンパク質に由来するペプチドに適用する：
ｉ．ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー（nanoreversed phase liquid chromatography）、高速液体クロマトグラフィー、又は逆相高速液体クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない最適なクロマトグラフィー条件における断片ペプチドの最適な保持時間を決定する；
ｉｉ．各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆物質電荷状態、各ペプチドの前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドのｍ／ｚ遷移イオン、及び各断片ペプチドの各遷移イオンのイオン型を決定する；
ｉｉｉ．次いで、各ペプチドが特徴的かつ特有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを有し、そのピークが三連四重極質量分析において実行される特有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを正確に規定する場合、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、三連四重極質量分析において（ｉ）及び（ｉｉ）の情報を使用して実施することができる。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析による解析の特有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の関数（function）として、検出されるタンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解液におけるタンパク質の相対量及び絶対量の両方を示すことができるようにＳＲＭ／ＭＲＭ解析を実行する。
ｉ．相対定量は、以下によって達成され得る：
１．１つのホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出された所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４又はそれを超えるホルマリン固定された生体試料からの少なくとも第２、第３、第４又はそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における同一の断片ペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する；
２．ペプチド断片の２試料間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の比較を各試料において解析されたタンパク質の量に対して標準化する場合、１つのホルマリン固定された生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出された所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、異なる別個の生体試料源に由来する他の試料における他のタンパク質に由来する断片ペプチドから開発されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と、比較することにより選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する；
３．タンパク質のレベルの変化を、様々な細胞条件下で発現レベルが変化しない他のタンパク質のレベルによって標準化するために、所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の異なるタンパク質由来の他の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する；
４．修飾がリン酸化及び／又はグリコシル化を含むが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルが非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の方法で決定される場合、これらのアッセイを、タンパク質の非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドの両方に適用することができる。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対定量は、個々の生体試料における選択されたタンパク質に由来する所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、該生体試料のタンパク質溶解液にスパイクされた内部標準断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより達成されてもよい：
１．内部標準とは、試験している選択されたタンパク質に由来する断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この内部標準を試料に既知量でスパイクし、内部標準断片ペプチド及び天然の断片ペプチドの両方のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、別個に決定することができ、次いで両方のピーク面積を比較することができる；
２．これを、修飾がリン酸化及び／又はグリコシル化を含むが、これらに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルを、非修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同一の方法で決定することができる場合、タンパク質の非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用することができる。
【００３０】
３．癌診断及び処置に対する断片ペプチド定量の適用
ａ．選択されたタンパク質の断片ペプチドのレベルの相対定量及び／又は絶対定量を実行し、癌分野においてよく理解されているような、選択されたタンパク質の発現と患者の腫瘍組織における癌のステージ／グレード／ステータスとの以前に決定された関係が確認されることを実証する。
ｂ．選択されたタンパク質の断片ペプチドレベルの相対定量及び／又は絶対定量を実行し、異なる処置戦略による臨床転帰との相関を実証する。この場合、この相関は、患者のコホート及びこれらの患者からの組織にわたる相関研究を通じて、該分野で既に実証されている、あるいは、将来において実証することができる。以前に確立された相関又は将来において導き出される相関のいずれかが、このアッセイによって確認されると、次いで、このアッセイ方法を使用して、最適な処置戦略を決定することができる。
【００３１】
各選択されたタンパク質に由来する特定の断片ペプチドに関する特定かつ特有の特性を、イオントラップ及び三連四重極質量分析計の両方における全ての断片ペプチドの解析によって明らかにした。その情報は、ホルマリン固定された試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において直接的に候補となるあらゆるＳＲＭ／ＭＲＭペプチドにおいて実験的に決定される必要がある。なぜなら、興味深いことに、あらゆる選択されたタンパク質に由来する全てのペプチドを、本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭを使用する該溶解液において検出することができるとは限らないためであり、検出されない断片ペプチドを、ホルマリン固定された試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において直接的にペプチド／タンパク質を定量する際に使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する候補ペプチドと見なすことはできないということを示す。
【００３２】
断片ペプチドの特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、三連四重極質量分析計において実行する。特定のタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって解析される実験的な試料は、例えば、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液である。そのようなアッセイのデータは、ホルマリン固定された試料におけるこの断片ペプチドに特有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークの存在を示す。
【００３３】
このペプチドに関する特異的な遷移イオンの特性を使用して、ホルマリン固定された生体試料における特定の断片ペプチドを定量的に測定する。これらのデータは、解析されたタンパク質溶解液のマイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として、この断片ペプチドの絶対量を示す。ホルマリン固定された患者由来の組織の解析に基づく組織中の対応するタンパク質のレベルの評価は、特定の患者それぞれに関する診断、予後、及び治療に関連する情報を提供することができる。一実施形態において、この開示によって、生体試料において表１に記載の各タンパク質のレベルを測定する方法であって、この方法は質量分析を使用して該生体試料から調製されたタンパク質消化物における修飾又は非修飾の１種又は２種以上の断片ペプチドを検出及び／又は定量することを含み、該試料における修飾又は非修飾のタンパク質のレベルを算出し、該レベルは相対レベル又は絶対レベルである、方法を記載する。関連する実施形態において、１種又は２種以上の断片ペプチドの定量は、既知量添加される内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料中の断片ペプチドそれぞれの量を決定することを含み、この場合、生体試料中の１種又は２種以上の断片ペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態において、内部標準は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はそれらの組合せから選択される１種又は２種以上の重安定同位体を含む、同位体的に標識された内部標準ペプチドである。
【００３４】
本明細書に記載の生体試料中の選択されたタンパク質（又はそれらの代わりとなる断片ペプチド）のレベルを測定する方法を、患者又は対象の癌の診断上の指標として使用してもよい。一実施形態において、選択されたタンパク質のレベルの測定結果を使用して、組織において見られる選択されたタンパク質のレベルを、正常組織及び／又は癌組織又は前癌状態の組織で見られる選択されたタンパク質のレベルと相関させる（例えば、比較する）ことによって、癌の診断上のステージ／グレード／ステータスを決定してもよい。
【００３５】
核酸及びタンパク質の両方を、同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ生体分子調製物から解析することができるため、疾患の診断及び薬物処置の決定に関するさらなる情報を、プロテオミクス解析に使用した同一試料の核酸から得ることができる。例えば、選択されたタンパク質がある細胞により高レベルで発現される場合、ＳＲＭによって解析した際、データは細胞の状態、並びに制御できない増殖、潜在的な薬剤耐性及び癌の発生の可能性に関する情報を提供することができる。同時に、対応する遺伝子並びに／又はそれらがコードする核酸及びタンパク質の状態（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベル又はスプライス変異）に関する情報を、同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ生体分子調製物に存在する核酸から取得することができる。同一の生体分子調製物に存在する、選択されたタンパク質でない任意の遺伝子及び／又は核酸を、選択されたタンパク質のＳＲＭ解析と同時に評価することができる。一実施形態において、選択されたタンパク質及び／又は１種、２種、３種、４種又はより多くの追加のタンパク質に関する情報を、それらのタンパク質をコードする核酸を試験することによって評価してもよい。例えば、それらの核酸を、シークエンス法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型解析、欠損もしくは挿入の同定、及び／又は一塩基対の多型、転移、塩基転換又はそれらの組合せを含むが、それらに限定されない変異の存在の判定のうち１種以上、２種以上、又は３種以上によって試験することができる。
【配列表】
2020106519000001.app
【外国語明細書】
2020106519000001.pdf