(57)【要約】      （修正有）【課題】親アルブミンの変異体であって、その親と比べて特性が改善された変異体を提供する。【解決手段】アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、親アルブミン、その断片、又は、前記親アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有し、且つ、573、500、550、492、580、574、417、440、464、490、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、575、577、578、579、581、582及び584から選択されるある特定のアミノ酸配列の位置に対応する位置に置換を有するアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する親アルブミンをコードする核酸を用意する工程、
ｂ）以下から選択される配列番号２の置換に対応する１又は２以上の置換を有するアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードするように、工程ａ）の配列を修飾する工程、
Q417A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
H440A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A490C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y
E492A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
V493A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T.W,Y:
D494A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E495A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T496A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
P499A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K500A,C,D,E,F,G,H,I,,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
E501A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
N503A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A504C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E505A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T506A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
H510A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
H535A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K536A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
P537A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K538A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T540A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,,V,W,Y；
K541A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E542A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
D550A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K573A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K574A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
Q580A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
A581C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A582C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；又は
G584A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
ｃ）工程ｂ）で修飾した配列を適切な宿主細胞に導入する工程、
ｄ）前記細胞を、適切な成長培地において、前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドが発現される条件下で培養する工程、及び、
ｅ）前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを、成長培地から回収する工程を含み、
前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有する、方法。
【請求項２】
アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、親アルブミン、その断片、又は、前記親アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有し、且つ、573、500、550、492、580、574、417、440、464、490、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、575、577、578、579、581、582及び584から選択される配列番号２の位置に対応する位置に置換を有し、但し、前記変異体は、配列番号２において置換D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E又はK574Nを有する配列からなる変異体ではない、アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
親アルブミンよりも血漿中半減期が長い、請求項２に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２における以下の置換に相当する１又は２以上の置換を有する：K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D、K573P+K574N+A577T+A578R+S579C+Q580K+A581D+G584A、
K573P+A577E+A578S+Q580K+A582T、K573P+A578S+S579T+G584A、K573P+L575F+G584A、E492G、N503K、K500R N503H、D550E、K574N、Q580K及びE492G+N503K、E492G+N503H、E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E、E492G+K573A、E492G+N503K+K573A、E492G+N503H、E492G+K573P、E492G+N503K+K573P、E492G+N503H+K573P、
請求項３に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド
【請求項５】
親アルブミンよりも血漿中半減期が短い、請求項２に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２における以下の置換に相当する１又は２以上の置換を有する：K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R、D550N、H464Q、H510Q、H535Q、D494N,Q,A、E495Q,A、T496A、E492G+V493P、K541G,D、D494N+E495Q+T496A、E495Q+T496A、E492G+V493P+K538H+K541N+E542D、N503K,D P499A、K541A,N、D494E+Q417H、Q417A、E492T+N503D、A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D、K536A、P537A、E501A,Q、E492G+K538H+K541N+E542D、
請求項５に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド
【請求項７】
表面にチオ基を生じる１又は２以上の更なる改変を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドの配列番号２に対する配列同一性が、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、より好ましくは９６％超、よりいっそう好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、最も好ましくは９９％超である、請求項１〜７の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。アルブミンの変異体断片、又は、アルブミンの変異体断片を含む融合ポリペプチドであって、前記断片が、少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも３００アミノ酸、より好ましくは少なくとも４００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも５００アミノ酸である、請求項１〜７の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項２に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項２に記載の変異アルブミン又はその断片と、有用な治療用部位とを含むコンジュゲート。
【請求項１１】
請求項２に記載の変異アルブミン又はその断片と、有用な治療用部位とを含むアソシエート。
【請求項１２】
請求項２に記載の変異アルブミン又はその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
【請求項１３】
アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンの変異体を含むコンジュゲート、を含む組成物であって、ＦｃＲｎに対する結合が、対応するアルブミン又はその断片、又は、前記アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンを含むコンジュゲートよりも強い、組成物。
【請求項１４】
ＦｃＲｎに対する結合が、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する結合よりも強い、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンの変異体を含むコンジュゲートの、ＦｃＲｎに対する結合係数が、ＨＳＡに対して０．９Ｘ ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡに対して０．５Ｘ ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡに対して０．１Ｘ ＫＤ未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡに対して０．０５Ｘ ＫＤ未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡに対して０．０２Ｘ ＫＤ未満、最も好ましくはＨＳＡに対して０．０１Ｘ ＫＤ未満である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の変異アルブミン又はその断片、請求項１０に記載のコンジュゲート、請求項１１に記載のアソシエート、又は、請求項１２に記載の融合ポリペプチドを含む、請求項１２〜１５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の変異アルブミン又はその断片を含むとともに、ＡＢＤと医薬的に有用な部位とを含む化合物を更に含む、請求項１３〜１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬組成物である、請求項１３〜１７の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン、その断片、又は、アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドと比較して、半減期が変更された、アルブミンの変異体又はその断片、又は、変異アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルブミンは、哺乳類血漿中に天然に、且つ、最も豊富に存在するタンパク質である。所望の血液浸透圧の維持や、種々の物質の血流輸送に、重要な役割を担っている。
【０００３】
ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等、多数の生物種のアルブミンの特性付けがなされており、それらは配列及び構造上、高度の相同性を有する。
【０００４】
アルブミンはインビボ（in vivo）において、その受容体である新生児Ｆｃ受容体（neonatal Fc receptor：ＦｃＲｎ）「Brambell」に結合する。この相互作用は、アルブミンの血漿中半減期にとって重要であることが知られている。ＦｃＲｎは膜結合タンパク質であり、多数の細胞型及び組織型において発現されている。ＦｃＲｎは、細胞内分解されたアルブミンを再利用することが分かっている（Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725）。ＦｃＲｎは二官能性分子であり、人間等の哺乳類におけるＩｇＧ及びアルブミンの血清中レベルを高く維持するのに寄与している。
【０００５】
ＦｃＲｎ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）相互作用は従来から特性付けされてきたのに対し、ＦｃＲｎ−アルブミン相互作用の特性はそれほど分かっていない。主なＦｃＲｎ結合部位は DIII(381-585) 内に存在する（Andersen et al, (2010), Clinical Biochemistry, 43,367-372）。データによれば、ＩｇＧ及びアルブミンは、ＦｃＲｎ上の個別の部位に、非協調的に結合する（Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051；Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990）。
【０００６】
マウスＦｃＲｎはマウス及びヒト由来のＩｇＧに結合することが知られているが、ヒトＦｃＲｎはより特異性が高いように思われる（Ober et al. (2001) Int. Immunol 13, 1551-1559）。Andersen et al. (2010), Journal of Biological Chemistry 285(7):4826-36 は、ヒト及びマウスのＦｃＲｎの、マウス及びヒト各々のアルブミンに対する親和性を（可能なすべての組み合わせについて）記載する。生理ｐＨでは、何れの生物種のアルブミンによる、何れの受容体に対する結合も見られなかった。酸性ｐＨでは、結合親和性に１００倍の差が見られた。何れの場合も、各生物種のアルブミン及びＩｇＧの両受容体に対する結合は付加的であった。
【０００７】
ヒト血清アルブミン（human serum albumin：ＨＳＡ）は、５８５アミノ酸のポリペプチドとして、明確に特性付けされている。その配列は、Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3) に示されている。ヒト血清アルブミンは、その受容体ＦｃＲｎに対して、特徴的な結合を示す。ｐＨ６．０では結合するのに対し、ｐＨ７．４では結合しない。
【０００８】
ＨＳＡの血漿中半減期はおよそ１９日であることが分かっている。より短い血漿中半減期を有する天然変異体が特定されている（Peach, R. J. and Brennan, S. 0.,(1991) Biochim Biophys Acta.1097:49-54）。この変異体は置換D494Nを有し、この置換によって、野生型アルブミンには存在しないＮ−グリコシル化部位を有する。血漿中半減期の変化の原因が、グリコシル化にあるのか、それともアミノ酸の変化にあるのかは、分かっていない。
【０００９】
アルブミンは血漿中半減期が長く、この特性ゆえに、薬物送達における使用が示唆されてきた。アルブミンを医薬的に有用な化合物とコンジュゲートしたところ（国際公開第２０００／６９９０２Ａ号）、得られたコンジュゲートは、アルブミンの有する長い血漿中半減期を維持することが見出された。概して、このコンジュゲートの血漿中半減期は、有用な治療用化合物単独の血漿中半減期よりも、顕著に長かった。
【００１０】
更に、アルブミンを治療上有用なペプチドと融合したところ（国際公開第２００１／７９２７１Ａ号及び国際公開第２００３／５９９３４Ａ号）、得られた融合体は、概して、治療上有用なペプチドの活性を維持するとともに、その血漿中半減期は、治療上有用なペプチド単独の血漿中半減期よりも顕著に長い、という結果が得られた。
【００１１】
Otagiri et al (2009), Biol. Pharm, Bull. 32(4), 527-534 は、公知の７７のアルブミンの変異のうち、２５の変異がドメインIII内に存在することを開示している。カルボキシル末端の最後の１７５のアミノ酸を欠く天然変異体は、半減期が短縮されることが知られている（Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372）。Iwao et al.(2007) によれば、マウスモデルを用いて天然ヒトアルブミン変異体の半減期を調べたところ、K541E 及び K560E では半減期が短縮され、E501K 及び E570K では半減期が延長され、K573E は半減期に殆ど影響を与えないことが分かった（Iwao, et. al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590）。
【００１２】
Galliano et al (1993) Biochim. Biophys.Acta 1225, 27-32 は天然変異体 E505K を開示する。Minchiotti et al. (1990) は天然変異体 K536E を開示する。Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418 は天然変異体 K574N を開示する。Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417 は天然変異体 D550G を開示する。Carlson et al (1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229 は天然変異体 D550A を開示する。
【００１３】
アルブミンは数々のリガンドに結合する能力を有し、これらはアルブミンに連結される（連結する）。この特性は、アルブミンに非共有的に結合する能力を有する薬物の血漿中半減期の延長に利用されてきた。これは、アルブミン結合特性を殆どあるいは全く持たない医薬的に有用な化合物に対して、アルブミン結合特性を有する部位を連結することによっても達成される。概説 Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183 及びそこに引用される文献を参照のこと。
【００１４】
アルブミンは、医薬的に有用な化合物の調製物に使用される。斯かる調製物の例としては、限定されるものではないが、アルブミンのナノ粒子又はマイクロ粒子が挙げられる。これらの例では、医薬的に有用な化合物又は化合物の混合物の送達は、アルブミンの受容体に対する親和性の改変を通じて達成され、有用化合物は、送達の手段たるアルブミンと連結されていることが示されている。
【００１５】
形成された連結物（アソシエート：例としては、限定されるものではないが、Levemir（登録商標）、Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731）、コンジュゲート又は融合ポリペプチドの血漿中半減期が、何によって決定されるのかは明らかではないが、アルブミンと医薬的に有用な化合物／ポリペプチドとの組み合わせの結果によるものと思われる。所与のアルブミンのコンジュゲート、アソシエート、又はアルブミン融合ポリペプチドの血漿中半減期を制御し、それら連結、コンジュゲーション又は融合の要素により得られる血漿中半減期よりも延長又は短縮された血漿中半減期を達成できれば、治療対象とする適用の細目に応じた適切な薬物の設計が可能となり、望ましいであろう。
【００１６】
アルブミンは腫瘍で蓄積、分解されることが知られている。また、関節リウマチ患者の炎症関節に蓄積することも示されている。概説 Kratz (2008), Journal of Controlled Release 132, 171-183 及びそこに引用される文献を参照のこと。ＨＳＡ変異体のＦｃＲｎに対する親和性を増大することができれば、医薬的に有用な化合物の送達に有利であると予想される。
【００１７】
更には、Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2):1582 に記載のように、ＦｃＲｎに対して殆ど、或いは全く結合しないアルブミン変異体が得られれば、より短い半減期や、制御された血清中薬物動態を達成することができ、望ましいであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、親アルブミンの変異体であって、その親と比べて特性が改善された変異体を提供する。特に、本発明は、親アルブミンの変異体であって、その親と比べて血漿中半減期が改変された変異体を提供する。
【００１９】
本発明は、親アルブミンの単離された変異体又はその断片、又は、変異アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に相当する１又は２以上（数個）の位置に改変を含み、但し、配列番号２において置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎを有する配列からなる変異体ではない、変異体に関する。
【００２０】
上記の１又は２以上の位置における改変は、置換、挿入及び欠失から独立に選択されるが、置換が好ましい。
【００２１】
また、本発明は、前記変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター及び宿主細胞、並びに前記変異体を作製する方法にも関する。
【００２２】
また、本発明は、本発明に係る変異アルブミン又はその断片と、有用な治療用部位とを含むコンジュゲート又はアソシエート、及び、本発明の変異アルブミン又はその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチドにも関する。
【００２３】
更に、本発明は、前記アルブミンの変異体、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを、或いは、本発明に係る変異アルブミン又はその断片を含むコンジュゲートを、或いは、本発明に係る変異アルブミン又はその断片を含むアソシエートを含む組成物にも関する。前記組成物は医薬組成物であることが好ましい。
【００２４】
更に、本発明は、変異アルブミン、その断片、変異アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドを、或いは、前記アルブミンの変異体又はその断片を含むコンジュゲートを、或いは、前記アルブミンの変異体又はその断片を含むアソシエートを含む医薬組成物であって、前記の変異アルブミン、その断片、変異アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドが、或いは、前記アルブミンの変異体又はその断片を含むコンジュゲートが、或いは、前記アルブミンの変異体又はその断片を含むアソシエートが、対応するＨＳＡ又はその断片、ＨＳＡ又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、ＨＳＡ又はその断片を含むコンジュゲート又はアソシエートの血漿中半減期と比べて、改変された血漿中半減期を有する、医薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、発現プラスミドｐＤＢ４０８２の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、発現プラスミドｐＤＢ２３０５の制限酵素地図を示す。
【図３】図３は、発現プラスミドｐＤＢ４００５の制限酵素地図を示す。
【図４】図４は、１０μＭアルブミンをｓｈＦｃＲｎ ＨＳＡに注入したＳＰＲセンサーグラムを示す。ＨＳＡ（JTA）はSigma-Aldrich 社製脂肪酸不含有ＨＳＡ（A3782）であり、ＨＳＡ（Novozymes）は市販の組換ヒトアルブミン血清アルブミン（RECOMBUMIN）である。
【図５】図５は、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変異体（１００〜０．０４５μｇ／ｍｌ）に対するＥＬＩＳＡ結合を示す。ＷＴ、Ｄ４９４Ｎ、Ｄ４９４Ｑ及びＤ４９４ＡのｐＨ６．０及びｐＨ７．４における結合。ＷＴ、Ｄ４９４Ｎ、Ｄ４９４Ｎ／Ｔ４９６Ａ及びＴ４９６ＡのｐＨ６．０及びｐＨ７．４における結合。ＷＴ、Ｅ４９５Ｑ及びＥ４９５ＡのｐＨ６．０及びｐＨ７．４における結合。
【図６】図６は、０．２μＭのＨＳＡ変異体の固定化ｓｈＦｃＲｎ（〜４６００ＲＵ）に対する結合の代表的なセンサーグラムを示す。ＷＴ、Ｄ４９４Ｎ、Ｄ４９４Ｑ、Ｄ４９４Ａ、Ｄ４９４Ｎ／Ｔ４９６Ａ及びＴ４９６Ａ。
【図７】図７は、１μＭのＨＳＡ変異体の固定化ｓｈＦｃＲｎ（〜１４００ＲＵ）に対する結合の代表的なセンサーグラムを示す。ＷＴ、Ｄ４９４Ｎ、Ｄ４９４Ｑ、Ｄ４９４Ａ、Ｄ４９４Ｎ／Ｔ４９６Ａ及びＴ４９６Ａ。
【図８】図８は、（Ａ）図６及び（Ｂ）図７に示す２つの独立のＳＰＲ実験に基づくＷＴとの比較における、ＨＳＡ変異体の相対結合を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡを示す。（Ａ）ヒト、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びウサギ由来のアルブミンに対するｐＨ６．０でのｓｈＦｃＲｎの結合。（Ｂ）モルモット、ハムスター、ラット及びニワトリ由来のアルブミンに対するｐＨ６．０でのｓｈＦｃＲｎの結合。（Ｃ）ヒト、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びウサギ由来のアルブミンに対するｐＨ７．４でのｓｈＦｃＲｎの結合。（Ｄ）モルモット、ハムスター、ラット及びニワトリ由来のアルブミンに対するｐＨ７．４でのｓｈＦｃＲｎの結合。（Ｅ）種々のアルブミンの相対結合。ヒトアルブミンのｓｈＦｃＲｎに対する相対結合を１．０と定義した。ＥＬＩＳＡ値は二重試験の平均値を示す。
【図１０】図１０は、ＳＰＲを示す。複数生物種由来のアルブミンに対するｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴの結合。種々の生物種由来のアルブミン５．０μＭにおける結合を示す代表的なセンサーグラム。（Ａ）ヒト、（Ｂ）ロバ、（Ｃ）ウシ、（Ｄ）ヤギ、（Ｅ）ヒツジ、（Ｆ）ウサギ、（Ｇ）イヌ、（Ｈ）モルモット、（Ｉ）ハムスター、（Ｊ）ラット、（Ｋ）マウス、及び（Ｌ）ニワトリ。アルブミン変異体を固定化ＧＳＴタグ化ｓｈＦｃＲｎ（〜２１００ＲＵ）に注入した。注入は２５℃、流速４０μｌ／分で実施した。
【図１１】図１１は、選択されたＨＳＡミュータントのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。２０μＭの（Ａ）ＷＴ及びＰ４９９Ａ、（Ｂ）ＷＴ及びＫ５００Ａ、（Ｃ）ＷＴ及びＫ５３６Ａ、（Ｄ）ＷＴ及びＰ５３７Ａ、（Ｅ）ＷＴ及びＫ５３８Ａ、並びに（Ｆ）ＷＴ及びＫ５３７Ａを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ６．０（〜１５００ＲＵ）で注入した。
【図１２】図１２は、選択されたＨＳＡミュータントのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。１０μＭの（Ａ）ＷＴ及びＫ５７３Ａ、（Ｂ）ＷＴ及びＫ５７３Ｃ、（Ｃ）ＷＴ及びＫ５７３Ｆ、（Ｄ）ＷＴ及びＫ５７３Ｇ、（Ｅ）ＷＴ及びＫ５７３Ｌ、（Ｆ）ＷＴ及びＫ５７３Ｍ、（Ｇ）ＷＴ及びＫ５７３Ｑ、（Ｈ）ＷＴ及びＫ５７３Ｒ、（Ｉ）ＷＴ及びＫ５７３Ｔ、並びに（Ｊ）ＷＴ及びＫ５７３Ｖを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．５及びｐＨ７．４で注入した。注入は２５℃、流速８０μｌ／分で実施した。
【図１３】図１３は、選択されたＨＳＡミュータントのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。１０μＭの（Ａ）ＷＴ及びＫ５７３Ｄ、（Ｂ）ＷＴ及びＫ５７３Ｅ、（Ｃ）ＷＴ及びＫ５７３Ｈ、（Ｄ）ＷＴ及びＫ５７３Ｉ、（Ｅ）ＷＴ及びＫ５７３Ｎ、（Ｆ）ＷＴ及びＫ５７３Ｐ、（Ｇ）ＷＴ及びＫ５７３Ｓ、（Ｈ）ＷＴ及びＫ５７３＊、（Ｉ）ＷＴ及びＫ５７３Ｗ、並びに（Ｊ）ＷＴ及びＫ５７３Ｙを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．５及びｐＨ７．４で注入した。注入は２５℃、流速８０μｌ／分で実施した。
【図１４】図１４は、ＨＳＡミュータントのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。２０μＭの（Ａ）ＷＴ及びＥ４９２Ｇ＋Ｋ５３８Ｈ＋Ｋ５４１Ｎ＋Ｅ５４２Ｄ、（Ｂ）ＷＴ及びＥ４９２Ｔ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５４１Ａ、（Ｃ）ＷＴ及びＥ４９２Ｐ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５４１Ｇ＋Ｅ５４２Ｐ、（Ｄ）ＷＴ及びＥ４９２Ｈ＋Ｅ５０１Ｐ＋Ｎ５０３Ｈ＋Ｅ５０５Ｄ＋Ｔ５０６Ｓ＋Ｔ５４０Ｓ＋Ｋ５４１Ｅ、（Ｅ）ＷＴ及びＡ４９０Ｄ＋Ｅ４９２Ｔ＋Ｖ４９３Ｌ＋Ｅ５０１Ｐ＋Ｎ５０３Ｄ＋Ａ５０４Ｅ＋Ｅ５０５Ｋ＋Ｔ５０６Ｆ＋Ｋ５４１Ｄ、並びに（Ｆ）ＷＴ及びＥ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐ＋Ｋ５３８Ｈ＋Ｋ５４１Ｎ＋Ｅ５４２Ｄを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ６．０で注入した。注入は２５℃、流速８０μｌ／分で実施した。
【図１５】図１５は、ＨＳＡミュータントのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。１２μＭの（Ａ）ＷＴ、（Ｂ）Ｈ４４０Ｑ、（Ｃ）Ｈ４６４Ｑ及び（Ｄ）Ｈ５３５Ｑを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ６．０で注入した。注入は２５℃、流速８０μｌ／分で実施した。
【図１６】図１６は、ＨＳＡミュータントＫ５００ＥのＳＰＲセンサーグラムを、野生型ＨＳＡと比較して示す。１０μＭのＨＳＡミュータントＫ５００Ｅを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．７５で注入した。注入は２５℃、流速３０μｌ／分で実施した。
【図１７】図１７は、発現プラスミドｐＤＢ３０１７の制限酵素地図を示す。
【図１８】図１８は、発現プラスミドｐＤＢ３０２１の制限酵素地図を示す。
【図１９】図１９は、発現プラスミドｐＤＢ３０５６の制限酵素地図を示す。
【図２０】図２０は、発現プラスミドｐＤＢ３１６５の制限酵素地図を示す。
【図２１】図２１は、発現プラスミドｐＤＢ４１７２の制限酵素地図を示す。
【図２２】図２２は、発現プラスミドｐＤＢ４２６７の制限酵素地図を示す。
【図２３】図２３は、発現プラスミドｐＤＢ４２８５の制限酵素地図を示す。
【図２４】図２４は、ＷＴ ＨＳＡ及びミュータントＫ５７３Ｐ ＨＲＰコンジュゲートのｓｈＦｃＲｎ分析におけるＧＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。材料及び方法のランに記載のとおり、２５μＬをＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh Bioscience）に注入した。
【図２５】図２５は、フルオレセインをコンジュゲートしたアルブミンのＳＤＳ ＰＡＧＥ分離及び視認（Ａ）及び紫外線（Ｂ）の双方による検出を示す。ＨＳＡ：：Ｆ５Ｍ（レーン１）、Ｋ５７３Ｐ：：Ｆ５Ｍ（レーン２）及びｒＨＡ標準（レーン３）。
【図２６】図２６は、ＨＳＡ変異体のｓｈＦｃＲｎ結合特性を示す。１０μＭのＷＴ ｒＨＡ及びＥ４９２Ｔ（Ａ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＤ４９４Ｎ／Ｅ４９５Ｑ／Ｔ４９６Ａ（Ｂ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＮ５０３Ｄ（Ｃ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＮ５０３Ｋ（Ｄ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＥ４９２Ｔ／Ｎ５０３Ｄ（Ｅ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＥ４９５Ｑ／Ｔ４９６Ａ（Ｆ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＫ５３８Ｈ（Ｇ）、ＷＴ ｒＨＡ及びＥ４９２Ｄ（Ｈ）を、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．５で注入した。
【図２７】図２７は、ＨＳＡ変異体のｓｈＦｃＲｎ結合特性を示す。１０μＭのＷＴ ｒＨＡ及びＫ５４１Ａ（Ｉ）、並びにＷＴ ｒＨＡ及びＫ５４１Ｎ（Ｊ）を、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．５で注入した。
【図２８】図２８は、ｓｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を単独で、又は種々の量のＨＳＡ Ｋ５７３Ａ及びＫ５７３Ｐと予インキュベート後、固定化ＨＳＡ（〜２５００ＲＵ）に対してｐＨ６．０で注入して測定された、Ｋ５７３Ａ及びＫ５７３Ｐの競合結合を示す。
【図２９】図２９は、ｓｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を単独で、又は種々の量のＨＳＡ−ＦＬＡＧ変異体と共に、固定化ＨＳＡ（〜２５００ＲＵ）に対してｐＨ６．０で注入して測定された、ＨＳＡ−ＦＬＡＧ変異体の競合結合を示す。
【図３０】図３０は、ｓｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を単独で、又は種々の量のＨＳＡ−ＩＬ１Ｒａ変異体と共に、固定化ＨＳＡ（〜２５００ＲＵ）に対してｐＨ６．０で注入して測定された、ＨＳＡ−ＩＬ１Ｒａ変異体の競合結合を示す。
【図３１】図３１は、ｓｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を単独で、又は種々の量の（Ａ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＦＬＡＧ変異体若しくは（Ｂ）ＨＳＡ−ｓｃＦｖ−ＦＬＡＧ変異体と共に、固定化ＨＳＡ（〜２５００ＲＵ）に対してｐＨ６．０で注入して測定された、ｓｃＦｖ融合ＨＳＡ変異体の競合結合を示す。
【図３２】図３２は、ＨＳＡの一重、二重及び三重ミュータントのｓｈＦｃＲｎに対する結合を示す。１０μＭの各ＨＳＡ変異体のサンプルを、固定化ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ５．５又はｐＨ７．４で注入した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、親アルブミンの単離された変異アルブミン又はその断片、又は、変異アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上の（数個）位置に改変を含み、但し、配列番号２において置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎを有する配列からなる変異体ではない、変異体に関する。
【００２７】
前記の１又は２以上の位置における改変は、置換、挿入及び欠失から独立に選択されるが、置換が好ましい。
【００２８】
定義
・変異体：「変異体」（variant）との語は、親アルブミンに対して１又は２以上の改変、即ち置換、挿入、及び／又は欠失を、１又は２以上（数個）の位置に導入して得られたポリペプチドを意味する。置換（substitution）は、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失（deletion）とは、ある位置を占めるアミノ酸を除去することを意味し、挿入（insertion）とは、ある位置を占めるアミノ酸の隣に、１又は２以上、好ましくは１〜３のアミノ酸を付加することを意味する。
【００２９】
ミュータント：「ミュータント」（mutant）との語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３０】
・野生型アルブミン：「野生型」（wild-type：ＷＴ）アルブミンとの語は、動物又は人間において天然に見出されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。
【００３１】
・親又は親アルブミン：「親」（parent）又は「親アルブミン」との語は、本発明のアルブミン変異体を産生するように人為的に改変を加える対象となるアルブミンを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドであっても、その対立遺伝子（アレル：allele）でもよく、更にはその変異体でもよい。
【００３２】
・ＦｃＲｎ及びｓｈＦｃＲｎ：「ＦｃＲｎ」との語は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（human neonatal Fc receptor：ＦｃＲｎ）を意味する。ｓｈＦｃＲｎはＦｃＲｎの可溶性組換体である。
【００３３】
・ｓｍＦｃＲｎ：「ｓｍＦｃＲｎ」との語は、マウス新生児Ｆｃ受容体（mouse neonatal Fc receptor）の可溶性組換体を意味する。
【００３４】
・単離変異体：「単離変異体」（isolated variant）との語は、人為的に修飾された変異体であって、天然の状態で付随する少なくとも１つの成分から完全に又は部分的に分離された変異体を意味する。一側面によれば、斯かる変異体のＳＤＳ ＰＡＧＥ又はＧＰ−ＨＰＬＣにより決定される純度は、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、及び、少なくとも９０％である。
【００３５】
・実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）との語は、天然又は組換時に付随する他のポリペプチド物質の含量が、重量基準で最大１０％、最大８％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、及び最大０．５％である調製物を意味する。斯かる変異体は、調製物中に存在する総ポリペプチド物質に対する重量j基準の純度が、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、及び１００％であることが好ましい。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、周知の組換方法及び精製方法によって変異体を調製することにより達成される。
【００３６】
・成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）との語は、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た最終形態にあるポリペプチドを意味する。一側面によれば、成熟ポリペプチドは、任意の翻訳後修飾を含む、配列番号２のアミノ酸１〜５８５を有する。
【００３７】
・成熟ポリペプチドコーディング配列：「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）との語は、成熟アルブミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一側面によれば、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜１７５８である。
【００３８】
・配列同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性を「配列同一性」（sequence identity）というパラメーターで記載する。
【００３９】
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００４０】
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００４１】
・断片：「断片」（fragment）との語は、アルブミン及び／又はアルブミン内部領域のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は２以上（数個）のアミノ酸が欠失してなるポリペプチドであって、ＦｃＲｎに結合する能力を維持しているものを言う。断片は、ＨＳＡ由来の中断のない単一の配列からなっていてもよく、ＨＳＡ由来の２以上の配列を含んでいてもよい。本発明に係る断片のサイズは、アミノ酸残基数およそ２０超、好ましくはアミノ酸残基数３０超、より好ましくはアミノ酸残基数４０超、より好ましくはアミノ酸残基数５０超、より好ましくはアミノ酸残基数７５超、より好ましくはアミノ酸残基数１００超、より好ましくはアミノ酸残基数２００超、より好ましくは超３００アミノ酸残基数、よりいっそう好ましくはアミノ酸残基数４００超、最も好ましくはアミノ酸残基数５００超である。
【００４２】
・対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）：対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）」（allelic variant）との語は、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の夫々を指す。対立遺伝子変異（allelic variation）は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子多型とは、遺伝子の対立遺伝子多型によりコードされるポリペプチドである。
【００４３】
・コーディング配列：「コーディング配列」（coding sequence）との語は、そのポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は通常、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により画定される。オープン・リーディング・フレームは通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、組換ポリヌクレオチドの何れでもよい。
【００４４】
・ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」との語は、真核細胞から得られるスプライス後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写産物がｍＲＮＡの前駆体となり、これが一連の処理工程を経て、最終的にスプライス後に成熟ｍＲＮＡを生じる。
【００４５】
・核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）との語は、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な調節配列を含む場合、核酸コンストラクトは「発現カセット」（expression cassette）と同義となる。
【００４６】
・調節配列：「調節配列」（control sequence）との語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各調節配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、互いに同種でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付加してもよい。これにより斯かる調節配列と、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのコーディング領域との連結が容易になる。
【００４７】
・作動式に連結され：「作動式に連結され」（operably linked）との語は、ポリペプチドのコーディング配列が調節配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の調節配列がコーディング配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００４８】
・発現：「発現」（expression）との語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを意味する。斯かるステップとしては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
【００４９】
・発現ベクター：「発現ベクター」（expression vector）との語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする更なるヌクレオチドと作動式に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子として定義される。
【００５０】
・宿主細胞：「宿主細胞」（host cell）との語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という語には、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
【００５１】
・血漿中半減期：血漿中半減期（plasma half-life）は、適切な個体において、インビボで決定するのが理想的である。しかしながら、動物又は人間において実験を行うのは、時間及び費用がかかる上に、倫理的な問題が避けられないので、血漿中半減期が延長又は短縮されたことを確認するには、インビトロ（in vitro）アッセイを用いることが望ましい。アルブミンによるその受容体ＦｃＲｎへの結合は血漿中半減期にとって重要であり、受容体結合と血漿中半減期とは、アルブミンの受容体に対する親和性が高いほど血漿中半減期が長くなるという相関関係にあることが知られている。従って、本発明では、アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が高いほど、血漿中半減期が延長されたものと判断し、アルブミンの受容体に対する親和性が低いほど、血漿中半減期が低減されたものと判断する。
【００５２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、アルブミン受容体ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合を、親和性（affinity）という語、及び、「（より）強い」（stronger）又は「（より）弱い」（weaker）等の表現を用いて表す。即ち、ＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも高い分子は、ＨＳＡよりも強く（stronger）ＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも低い分子は、ＨＳＡよりも弱く（stronger）ＦｃＲｎに結合すると解される。
【００５３】
「（より）長い血漿中半減期」（longer plasma half-life）又は「（より）短い血漿中半減期」（shorter plasma half-life）、及びこれに類する表現は、対応する親アルブミン分子との関係で解釈すべきである。即ち、本発明の変異アルブミンが（より）長い血漿中半減期（longer plasma half-life）を有するとは、当該変異体が、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する位置における（１又は２以上の）改変の他は同一の配列を有する対応するアルブミンと比べて、より長い血漿中半減期を有することを意味する。
【００５４】
変異体の表示の規約
本発明の目的においては、配列番号２に開示の成熟ポリペプチドを用いて、別のアルブミンの対応するアミノ酸残基を決定する。別のアルブミンのアミノ酸配列を、配列番号２に開示の成熟ポリペプチドとアラインし、当該アラインメントに基づき、配列番号２に開示の成熟ポリペプチドの任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を決定する。掛かる作業は、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン3.0.0以降）で実行して行う。
【００５５】
別のアルブミンにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ClustalW」（Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23:2947-2948）を用いた多重ポリペプチド配列のアラインメントにより行うことができる。
【００５６】
配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、他のポリペプチド（又はタンパク質）が、従来の配列に基づく比較ではその関連性を検出できない程度にまで分化している場合（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、他の対配列比較アルゴリズムを使用することができる。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、PSI-BLAST プログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁のホモログを検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。着目するポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上（数個）の表現がタンパク質構造データベースに存在する場合には、更に高い感度が達成可能である。例えばGenTHREADER（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測（secondary structure prediction）、構造アラインメントプロファイル（structural alignment profiles）、及び溶媒和ポテンシャル（solvation potentials））をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列を SCOP データベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。これらのアラインメントを用いれば、更に着目するポリペプチドのホモロジーを生成することができる。斯かるモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
【００５７】
構造既知のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、幾つかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質の SCOP スーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。更には、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースにクエリーすれば、可能性のある構造的ホモログを発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。
【００５８】
本発明のアルブミン変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。
【００５９】
置換  アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。図では「／」も使用する。例えば「Ｅ４９２Ｔ／Ｎ５０３Ｄ」等。「／」は「＋」と相互交換可能に用いる。
【００６０】
欠失  アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置＊。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失は加算記号（「＋」）により区切る。例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」等。
【００６１】
挿入  アミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸＃１、新たに挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
【００６２】
斯かる場合において、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基の番号付けは、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。即ち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【表０】
2020100633.tif 000002
【００６３】
多重改変  多重改変を含む変異体は（「＋」）により区切る。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のチロシン及び位置１９５のグルタミン酸の、夫々アルギニン及びグリシンによる置換を表す。
【００６４】
異なる置換  ある位置に２種以上の異なる置換を導入し得る場合、これらの異なる置換はカンマにより区切る。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸による置換を表す。即ち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」を指す。
【００６５】
親アルブミン
アルブミンは、哺乳類血漿の最も豊富な構成要素であるタンパク質の総称である。多数の哺乳類由来のアルブミンが、生化学的手法及び／又は配列情報により特定されている。幾つかのアルブミン（例えばヒト血清アルブミン（human serum albumin：ＨＳＡ）等）については、結晶学的特性及び構造も決定されている。
【００６６】
本発明における好ましいアルブミンであるＨＳＡは、５８５のアミノ酸残基からなるタンパク質であり、その分子量は６７ｋＤａである。天然の形態ではグリコシル化されていない。ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号２に示す。当業者には周知であるが、ＨＳＡと本質的に同一の特性を有するが、配列番号２に比べて１又は２以上のアミノ酸が異なる、天然の対立遺伝子が存在する場合がある。本発明者等は、斯かる天然対立遺伝子についても、本発明に係る親アルブミンとしての使用を考慮するものである。
【００６７】
一般に、アルブミンの血漿中半減期は長く、凡そ２０日又はそれ以上である。例えば、ＨＳＡの場合、血漿中半減期は１９日である。ＨＳＡが有する長い血漿中半減期は、その受容体であるＦｃＲｎとの相互作用により媒介されることが知られている。しかしながら、ＨＳＡの長い半減期の背後にある正確な機序についての理解や知識は、本発明においては重要ではない。
【００６８】
本発明によれば、「アルブミン」との語は、ＨＳＡと同一又は極めて類似の三次元構造 を有し、且つ長い血漿中半減期を有するタンパク質を意味する。本発明に係るアルブミンタンパク質の例としては、ヒト血清アルブミン、霊長類血清アルブミン（例えばチンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン等）、齧歯類血清アルブミン（例えばハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、マウスアルブミン及びラット血清アルブミン等）、ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ロバ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン及びブタ血清アルブミン等が挙げられる。本発明に係るアルブミンとしては、配列番号２に開示のＨＳＡ又はその任意の天然対立遺伝子が好ましい。
【００６９】
本発明に係る親アルブミン、その断片、又はアルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分は、配列番号２に示すＨＳＡの配列と、通常は少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７０】
親は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、又は当該配列からなることが好ましい。別の観点によれば、親は、配列番号２の成熟ポリペプチドを含み、又は当該配列からなる。
【００７１】
別の態様によれば、親は、配列番号２の成熟ポリペプチドの対立遺伝子多型である。
【００７２】
第２の観点によれば、親は、極めて低いストリンジェンシー条件、低いストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、やや高いストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、又は極めて高いストリンジェンシー条件の下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（iii）（ｉ）若しくは（ii）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【００７３】
異なる属又は種の生物から親をコードするＤＮＡを特定及びクローン化するべく、当業界で周知の方法により、配列番号１のポリヌクレオチド若しくはその下位配列、又は、配列番号２のアミノ酸配列若しくはその断片を用いて核酸プローブを設計してもよい。特に、斯かるプローブを用い、標準的なサザンブロッティングの手順に従って、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うことにより、対応する遺伝子を同定及び単離することが可能である。斯かるプローブは全長配列よりもずっと短くてよいが、少なくとも１４、例えば少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さを有するべきである。斯かる核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの双方が使用可能である。対応する遺伝子を検出するために、斯かるプローブは通常（例えば３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン又はアビジン等で）標識される。斯かるプローブも本発明に包含される。
【００７４】
上述したプローブにハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡを、斯かる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングしてもよい。斯かる他の生物由来のゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動等の分離手法により分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離されたＤＮＡを、ニトロセルロース又は他の適切な担体材料に移し、固定化してもよい。配列番号１又はその下位配列と相同なクローン又はＤＮＡを同定するには、斯かる担体材料を用いてサザンプロットを行う。
【００７５】
本発明の目的においては、ハイブリダイゼーションによって、ポリヌクレオチドが、配列番号１に示すポリヌクレオチド、その相補鎖、又はその下位配列に対応する標識ヌクレオチドプローブと、低いストリンジェンシー条件ないし極めて高いストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズすることを示す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムや、当業界で周知の他の任意の検出法を用いて検出することができる。
【００７６】
一側面によれば、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の観点によれば、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド１〜１７８５である。別の観点によれば、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその断片である。別の観点によれば、核酸プローブは配列番号１である。
【００７７】
少なくとも１００ヌクレオチド長を有する長いプローブの場合、極めて低いストリンジェンシーから極めて高いストリンジェンシーまでの条件は、以下のように定義される。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、４２℃、５×ＳＳＰＥ中、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、及び、極めて低いストリンジェンシー及び低いストリンジェンシーの場合は２５％ホルムアミド、中程度のストリンジェンシー及びやや高いストリンジェンシーの場合は３５％ホルムアミド、高いストリンジェンシー及び極めて高いストリンジェンシーの場合は５０％ホルムアミドの存在下、標準的なサザンブロッティング手順に従って、好適には１２〜２４時間行う。最後に担体材料を各々１５分ずつ３回、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、４５℃（極めて低いストリンジェンシー）、５０℃（低いストリンジェンシー）、５５℃（中程度のストリンジェンシー）、６０℃（やや高いストリンジェンシー）、６５℃（高いストリンジェンシー）、又は７０℃（極めて高いストリンジェンシー）で洗浄する。
【００７８】
約１５ヌクレオチドから約７０ヌクレオチド長を有する短いプローブの場合、ストリンジェンシー条件は以下のように定義される。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、約５℃から約１０℃、且つ、Bolton及びMcCarthy（1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390）に従って計算されたＴｍ以下の温度で、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ NP-40、１×デンハート液（Denhardt's solution）、１ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ リン酸一ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１ｍｌ当たり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡの存在下、標準的なサザンブロッティング手順に従って、好適には１２〜２４時間行う。最後に担体材料を、５℃から１０℃且つ計算されたＴｍ以下の温度で、６×ＳＣＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて１５分１回、続いて６×ＳＳＣを用いて１５分ずつ２回洗浄する。
【００７９】
第３の観点によれば、親は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、アルブミンとして機能し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされる。一態様によれば、親は、配列番号１を含み、又は配列番号１からなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８０】
変異体の調製物
更なる観点によれば、本発明は、アルブミン、その断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分の中で、アルブミンのＦｃＲｎへの結合にとって重要な１又は２以上のアミノ酸残基位置を特定し、
ｂ）前記アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分をコードする核酸を用意し、
ｃ）ｂ）で用意した核酸について、ａ）で特定された位置の１又は２以上（数個）のアミノ酸残基が欠失し、又は異なるアミノ酸によって置換され、又は異なるアミノ酸が挿入されるように修飾し、
ｄ）修飾された核酸を適切な宿主細胞内で発現させ、
ｅ）前記の変異アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを回収する
工程を含む、方法に関する。
【００８１】
アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分の中における、アルブミンのＦｃＲｎへの結合にとって重要な１又は２以上のアミノ酸残基位置の特定は、幾つかの方法で達成できる。例としては、これらに限定されるものではないが、ランダム変異誘発後、生成されたミュータントを分析し、変異を有さない親分子と比較する方法や、構造を考慮した特定後、任意により、特定された改変を有する変異体を生成し、変異を有さない親分子と比較する方法等が挙げられる。
【００８２】
天然のＨＳＡと比較してＦｃＲｎに対する結合が改変された変異体ＨＳＡを調製するために変更すべき、１又は２以上のアミノ酸残基位置を特定するための好ましい方法は、
ｉ）ＦｃＲｎに対して異なる結合特性を有する非ヒトアルブミンを特定し、
ii）ＦｃＲｎと相互作用するヒト血清アルブミンのアミノ酸残基を特定し、
iii）工程ii）で特定されたアミノ酸残基について、工程ｉ）で特定された非ヒトアルブミンとヒト血清アルブミンとの間で一次及び／又は三次構造を比較し、前記非ヒトアルブミンとヒト血清アルブミンとの間で異なるアミノ酸残基を、観測された結合の相違に関与するものとして特定し、
iv）任意により、工程iii）で特定された位置におけるＨＳＡの変異体を調製し、調製された変異体をＨＳＡと比較して、ＦｃＲｎに対する結合が改変されたか否か確認する、
工程を含む。
【００８３】
上記工程ｉ）は、例えば以下に記載のＳＰＲアッセイを用いて実施することができる。しかしながら、当業者であれば理解するように、他の手法を用いて、ＦｃＲｎに対する結合特性がＨＳＡと異なる非ヒトアルブミンを特定してもよく、上記方法は、ＦｃＲｎに対する結合特性が異なる非ヒトアルブミンをどのように特定するかには依存しない。
【００８４】
好ましい態様によれば、特定される非ヒトアルブミンは、ＦｃＲｎに対する結合がＨＳＡよりも強い。ＦｃＲｎに対する結合がＨＳＡよりも強い非ヒトアルブミンの例としては、ロバ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、及びラット血清アルブミンが挙げられる。ＦｃＲｎ、ＨＳＡ、及びこれら２つの結合複合体の構造を考慮することにより、工程ii）を達成することができる。結合複合体の構造が入手できない場合は、ＨＳＡ構造がＦｃＲｎ構造内に格納された構造のモデルを用いることにより、ＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのアミノ酸残基を特定することが可能である。
【００８５】
別の好ましい態様によれば、特定される非ヒトアルブミンは、ＦｃＲｎに対する結合がＨＳＡよりも弱い。ＦｃＲｎに対する結合がＨＳＡよりも弱い非ヒトアルブミンの例としては、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、及びニワトリ血清アルブミンが挙げられる。ＦｃＲｎ、ＨＳＡ、及びこれら２つの結合複合体の構造を考慮することにより、工程ii）を達成することができる。結合複合体の構造が入手できない場合は、ＨＳＡ構造がＦｃＲｎ構造内に格納された構造のモデルを用いることにより、ＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのアミノ酸残基を特定することが可能である。
【００８６】
本発明及び請求項において、ＦｃＲｎと相互作用すると判断されるＨＳＡのアミノ酸残基とは、ＦｃＲｎ内のアミノ酸から１０Å未満に位置するＨＳＡの任意のアミノ酸残基、或いは、ＦｃＲｎ内のアミノ酸から１０Å未満に位置するアミノ酸残基との水素結合、塩橋、又は、極性若しくは非極性の相互作用に関与する任意のアミノ酸残基である。ＨＳＡ残基内のアミノ酸は、ＦｃＲｎ内のアミノ酸から１０Å未満、より好ましくはＦｃＲｎ内のアミノ酸から６Å未満、最も好ましくはＦｃＲｎ内のアミノ酸から３Å未満に位置することが好ましい。
【００８７】
工程iii）及びiv）は当業者に周知の手法を用いて実施できる。
【００８８】
また、本発明は、変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含むアソシエートを取得する方法であって、（ａ）変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドに対して、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上（数個）の位置に改変を導入し、（ｂ）変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを回収する工程を含む方法にも関する。
【００８９】
変異体は、当業者であれば、当業界で公知の変異誘発手順、例えば部位特異的変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャッフリング等を用いて作成することができる。
【００９０】
部位特異的変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチド内の１又は２以上の所定の位置に、１又は２以上（数個）の変異を形成する手法である。
【００９１】
部位特異的変異誘発は、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、インビトロで実施することができる。また、部位特異的変異誘発は、カセット変異誘発によっても、インビトロで実施することができる。斯かる手法は、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位を制限酵素で切断した後、ポリヌクレオチド内に変異を含むオリゴヌクレオチドを連結することにより行う。通常、プラスミドを消化する制限酵素と同一の制限酵素を用いてオリゴヌクレオチドを消化することにより、プラスミドとの連結及び相互の挿入が可能となる。例えば、Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966 を参照のこと。
【００９２】
また、部位特異的変異誘発は、当業界で公知の手法により、インビボでも実施可能である。例えば、米国特許出願公報第２００４／０１７１１５４号；Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776；Kren et al., 1998、Nat. Med. 4: 285-290；及びCalissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16 を参照のこと。
【００９３】
本発明では任意の部位特異的変異誘発を使用可能である。変異体の調製に使用し得るキットは多々市販されている。
【００９４】
合成遺伝子構築（synthetic gene construction）は、所望のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド分子を設計し、これをインビトロで合成するものである。遺伝子合成は数々の手法を用いて実施可能である。例としては、Tian, et. al.が報告する多重マイクロチップ法（multiplex microchip-based technology）（Tian, et. al., Nature 432:1050-1054）や、類似の手法が挙げられる。これらの手法は、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で、オリゴヌクレオチドを合成、構築するものである。
【００９５】
単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成・検証するには、公知の変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングを用いた後、適切なスクリーニング法、例えば Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号等に開示の手法を用いればよい。他の使用可能な方法としては、エラープローン（error-prone）ＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（phage display）（例えば Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号等）及び領域特異的変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）等が挙げられる。
【００９６】
変異誘発／シャッフリング法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出することが可能となる（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。当業界の標準法により、活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、即時に配列決定することができる。これらの手法により、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。
【００９７】
半合成遺伝子構築（semi-synthetic gene construction）は、合成遺伝子構築、及び／又は部位特異的変異誘発、及び／又はランダム変異誘発、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることにより実施される。半合成構築の代表的なプロセスは、合成ポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法と組み合わせたものである。即ち、例えば遺伝子の所定の領域を新規合成し、他の領域は部位特異的突然変異プライマー等を用いて増幅し、更に別の領域についてはエラープローン（error-prone）ＰＣＲや非エラープローン（non-error-prone）ＰＣＲ増幅等を用いることができる。その後、ポリヌクレオチド断片をシャッフルしてもよい。
【００９８】
変異体
本発明は、親アルブミンの変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであって、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上（数個）の位置に改変を含み、各改変は各々独立に、置換、挿入又は欠失であり、但し、当該変異体は、配列番号２において置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎを有する変異体ではないものも提供する。
【００９９】
本発明に係る変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分は、通常、配列番号２に示すＨＳＡの配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１００】
一側面によれば、本発明の変異体における改変の数は、１〜２０、例えば１〜１０、１〜５、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の改変である。
【０１０１】
変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、対応する親アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有する。
【０１０２】
特定の好ましい態様によれば、親アルブミンはＨＳＡであり、変異アルブミン、その断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、ＨＳＡ、対応する断片、又は、ＨＳＡ又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有する。
【０１０３】
アルブミンのその受容体への結合と血漿中半減期との相関は、本発明者等により、ＨＳＡの天然の対立遺伝子Ｄ４９４Ｎに基づいて発見された。本発明者等は、この対立遺伝子を分析したところ、その受容体ＦｃＲｎに対する親和性がより低いことを見出した。
【０１０４】
更に、天然のマウスＦｃＲｎがヒトＦｃＲｎで置換されたトランスジェニックマウスが、正常マウスと比べてより高い血清アルブミンを示すことが報告された（J Exp Med. (2003) 197(3):315-22 参照）。本発明者等は、ヒトＦｃＲｎのマウス血清アルブミンに対する親和性が、マウスＦｃＲｎのマウス血清アルブミンに対する親和性よりも高いこと、惹いては、前記のトランスジェニックマウスについて観察された血清アルブミンの上昇が、血清アルブミンとその受容体との親和性の高さに対応するものであることを見出し、アルブミンのＦｃＲｎに対する結合と血漿中半減期との相関を確認した。加えて、ＦｃＲｎに対して殆ど或いは全く結合しないアルブミンの変異体が、マウスモデルにおいて短縮された半減期を示すことを見出した（Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2): 1582）。
【０１０５】
変異アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が親アルブミンと比べて高いか低いかを決定する方法の一つは、後述する表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）アッセイの使用である。当業者であれば理解するように、変異アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が、親アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性と比べて高いか低いかを決定するのに、他の方法が有用な場合もある。例えば、結合定数ＫＤの決定及び比較が挙げられる。即ち、天然のＨＳＡの場合のＫＤよりも低いＫＤを有する本発明に係る変異アルブミンは、ＨＳＡよりも高い血漿中半減期を有すると考えられ、天然のＨＳＡの場合のＫＤよりも高いＫＤを有する本発明に係る変異アルブミンは、ＨＳＡよりも低い血漿中半減期を有すると考えられる。
【０１０６】
アルブミン、又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの変異体は、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群より選択される位置に対応するＨＳＡの１又は２以上（数個）の位置に、１又は２以上の改変、例えば置換、欠失又は挿入を有する。置換は、天然のアルブミン配列におけるアミノ酸が、残る19種の天然のアミノ酸から選択される異なるアミノ酸によって置換されるものであれば、任意の置換とすることができる。
【０１０７】
一側面によれば、変異体は、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上（数個）の位置に改変を含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４の何れかに対応する２つの位置に改変を含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４の何れかに対応する３つの位置に改変を含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する各位置に改変を含む。
【０１０８】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｑ４１７Ａ，Ｈを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４４０Ｑを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４６４Ｑを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ４９０Ｄを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９２Ｇ、Ｔ，Ｐ，Ｈを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ４９３Ｐ，Ｌを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ，Ｅ，Ｐを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９５Ｑ，Ａを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ４９６Ａを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｐ４９９Ａを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５００Ｅ，Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｎ，Ｗ，Ｔ，Ｍ，Ｙ，Ｖ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｒを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０１Ａ，Ｐ，Ｑを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ５０３Ｋ，Ｄ，Ｈを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５０４Ｅを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０５Ｋ，Ｄを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５０６Ｆ，Ｓを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５１０Ｑを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５３５Ｑを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３６Ａを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｐ５３７Ａを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３８Ａ，Ｈを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５４０Ｓを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５４１Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｎ，Ｅを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５４２Ｐ，Ｄを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｄ５５０Ｎを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７３Ｙ，Ｗ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｄを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７４Ｎを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｌ５７５Ｆを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７７Ｔ，Ｅを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７８Ｒ，Ｓを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｓ５７９Ｃ，Ｔを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８１Ｄを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８２Ｔを含む。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｇ５８４Ａを含む。
【０１０９】
一側面によれば、変異体は、位置４１７に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４１７に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａ又はＨｉｓにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｑ４１７Ａ，Ｈを含む。
【０１１０】
別の観点によれば、変異体は、位置４４０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４４０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４４０Ｑを含む。
【０１１１】
別の観点によれば、変異体は、位置４６４に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４６４に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４６４Ｑを含む。
【０１１２】
別の観点によれば、変異体は、位置４９０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ４９０Ｇを含む。
【０１１３】
別の観点によれば、変異体は、位置４９２に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９２に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＧｌｙにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９２Ｇを含む。
【０１１４】
別の観点によれば、変異体は、位置４９３に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９３に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＰｒｏにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ４９３Ｐを含む。
【０１１５】
別の観点によれば、変異体は、位置４９４に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９４に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａを含む。
【０１１６】
別の観点によれば、変異体は、位置４９５に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９５に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＧｌｎ又はＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９５Ｑ又はＡを含む。
【０１１７】
別の観点によれば、変異体は、位置４９６に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９６に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ４９６Ａを含む。
【０１１８】
別の観点によれば、変異体は、位置４９９に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置４９９に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｐ４９９Ａを含む。
【０１１９】
別の観点によれば、変異体は、位置５００に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５００に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５００Ｅ，Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｎ，Ｗ，Ｔ，Ｍ，Ｙ，Ｖ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｒを含む。
【０１２０】
別の観点によれば、変異体は、位置５０１に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５０１に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換され、好ましくは親和性を低減すべくＡｌａ又はＧｌｎにより置換され、親和性を向上すべくＰｒｏにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０１Ａ，Ｑ，Ｐを含む。
【０１２１】
別の観点によれば、変異体は、位置５０３に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５０３に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｓｐ又はＬｙｓ又はＨｉｓにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ５０３Ｄ，Ｋ，Ｈを含む。
【０１２２】
別の観点によれば、変異体は、位置５０４に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５０４に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５０４を含む。
【０１２３】
別の観点によれば、変異体は、位置５０５に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５０５に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０５Ｄを含む。
【０１２４】
別の観点によれば、変異体は、位置５０６に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５０６に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５０６Ｓ，Ｆを含む。
【０１２５】
別の観点によれば、変異体は、位置５１０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５１０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＧｌｎにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５１０Ｑを含む。
【０１２６】
別の観点によれば、変異体は、位置５３５に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５３５に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＧｌｎにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５３５Ｑを含む。
【０１２７】
別の観点によれば、変異体は、位置５３６に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５３６に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３６Ａを含む。
【０１２８】
別の観点によれば、変異体は、位置５３７に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５３７に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｐ５３７Ａを含む。
【０１２９】
別の観点によれば、変異体は、位置５３８に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５３８に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３８Ｈ，Ａを含む。
【０１３０】
別の観点によれば、変異体は、位置５４０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５４０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５４０Ｓを含む。
【０１３１】
別の観点によれば、変異体は、位置５４１に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５４１に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＧｌｙ、Ａｓｐ又はＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５４１Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｎを含む。
【０１３２】
別の観点によれば、変異体は、位置５４２に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５４２に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｓｐ又はＰｒｏにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５４２Ｄ，Ｐを含む。
【０１３３】
別の観点によれば、変異体は、位置５５０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５５０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌによりにより置換され、好ましくは親和性を減ずるべくＡｓｎにより、また、好ましくは親和性を増ずるべくＧｌｕにより置換される。
【０１３４】
別の観点によれば、変異体は、位置５７３に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７３に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ。Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｐにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７３Ｙ，Ｗ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｄを含む。
【０１３５】
別の観点によれば、変異体は、位置５７４に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７４に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｓｎにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７４Ｎを含む。
【０１３６】
別の観点によれば、変異体は、位置５７５に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７５に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＰｈｅにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｌ５７５Ｆを含む。
【０１３７】
別の観点によれば、変異体は、位置５７７に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７７に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＴｈｒ又はＧｌｕにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７７ＴＥを含む。
【０１３８】
別の観点によれば、変異体は、位置５７８に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７８に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｒｇ又はＳｅｒにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７８Ｒ，Ｓを含む。
【０１３９】
別の観点によれば、変異体は、位置５７９に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５７９に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＣｙｓ又はＴｈｒにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｓ５７９Ｃ，Ｔを含む。
【０１４０】
別の観点によれば、変異体は、位置５８０に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５８０に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＬｙｓにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。
【０１４１】
別の観点によれば、変異体は、位置５８１に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５８１に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｓｐにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８１Ｄを含む。
【０１４２】
別の観点によれば、変異体は、位置５８２に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５８２に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＴｈｒにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８２Ｔを含む。
【０１４３】
別の観点によれば、変異体は、位置５８４に対応する位置に改変を含む。別の観点によれば、位置５８４に対応する位置のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより、好ましくはＡｌａにより置換される。別の観点によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの置換Ｇ５８４Ａを含む。
【０１４４】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置４９４及び４９６に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１４５】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置位置４９２及び４９３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１４６】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置位置４９４及び４１７に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１４７】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置位置４９２及び５０３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１４８】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置位置４９２及び５７３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１４９】
別の観点によれば、変異体は、配列番号２の位置位置４９２、５０３、及び５７３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１５０】
一態様によれば、本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、配列番号２における４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群より選択されるＨＳＡ上の位置に対応する位置に置換を有する。但し、当該変異アルブミンは、配列番号２における置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎからなる変異体ではない。本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、ＨＳＡの他の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置に、更なる置換、挿入又は欠失を有していてもよい。
【０１５１】
別の態様によれば、本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の置換を、配列番号２の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群より選択される位置に対応するＨＳＡの位置に含む。本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、ＨＳＡの他の位置に、更なる置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。
【０１５２】
更なる態様によれば、本発明に係るアルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン、その断片、又は、親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも長い血漿中半減期を有する。斯かる態様の例としては、配列番号２の位置４９２、５０３、５４２、５５０、５７３、５７４、５８０、５８１、５８２又は５８４に対応する位置に置換を含む、アルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドが挙げられる。本発明のこの態様に係る好ましい置換としては、配列番号２の位置４９２に対応する位置のアミノ酸残基のＧ残基による置換、配列番号２の位置５０３に対応する位置のアミノ酸残基のＨ又はＫ残基による置換、配列番号２の位置５５０に対応する位置のアミノ酸残基のＥ残基による置換、配列番号２の位置５７３に対応する位置のアミノ酸残基のＹ，Ｗ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｌ又はＤによる置換、配列番号２の位置５７４に対応する位置のアミノ酸残基のＮ残基による置換、又は配列番号２の位置５８０に対応する位置のアミノ酸残基のＫ残基による置換が挙げられる。他の好ましい変異体は、配列番号２の位置４９２に対応する位置のアミノ酸残基のＧ残基による置換、及び、配列番号２の位置５７３に対応する位置のアミノ酸残基のＡ又はＰ残基による置換を有する。他の好ましい変異体は、配列番号２の位置４９２に対応する位置のＨ残基による、位置５０３に対応する位置に幾つかの置換を有する。
【０１５３】
他の好ましい変異体は、配列番号２の位置４９２に対応する位置のＧ残基による置換、及び、配列番号２の位置５０３に対応する位置のＨ又はＫによる置換、及び、配列番号２の位置５７３に対応する位置のＡ又はＰ残基による置換を有する。
【０１５４】
更なる態様によれば、本発明に係るアルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン、その断片、又は、親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも短い血漿中半減期を有する。この態様の例としては、配列番号２の位置４１７、４４０、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５３６、５３７、５３８、５４１、４９４＋４９６又は４９２＋４９３に対応する位置に置換を有する、アルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドが挙げられる。好ましい置換としては、配列番号２のＱ４１７Ａ、Ｈ４４０Ｑ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ、又は、Ｐ４９９Ａ、Ｋ５００Ａ、Ｅ５０１Ａ、Ｅ５０１Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ、Ｋ５４１Ａ、Ｋ５４１Ｄ又はＤ５５０Ｎに対応する置換が挙げられる。
【０１５５】
別の態様によれば、本発明に係るアルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、ＦｃＲｎに対して結合する能力を喪失している。ここで、アルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドが、ＦｃＲｎに対して結合する能力を喪失しているとは、後述のＳＰＲアッセイにより測定される変異体のレゾナンス単位が、対応する親アルブミン又はその断片について測定されるレゾナンス単位の１０％未満であることをいう。この態様の例としては、配列番号２の位置４６４、５００、５１０又は５３５に対応する位置に置換を有する、アルブミンの変異体、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドが挙げられる。好ましい置換としては、配列番号２のＨ４６４Ｑ、Ｋ５００Ａ，Ｐ，Ｃ，Ｓ，Ａ，Ｄ，Ｇ、Ｈ５１０Ｑ又はＨ５３５Ｑに対応する置換が挙げられる。
【０１５６】
配列番号２の位置４１７、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上の位置における１又は２以上の置換に加えて、本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、更なる置換、欠失又は挿入を、分子内の他の位置に有していてもよい。斯かる更なる置換、欠失又は挿入は、当該分子の他の特性を改変するのに有用な場合がある。例としては、限定されるものではないが、グリコシル化の改変、表面へのチオール基等の反応性基の導入、カルバモイル化部位の除去／生成、等が挙げられる。
【０１５７】
反応性残基を表面に供するべく改変可能な残基であって、本発明に有利に適用可能な残基としては、未公開特許出願、国際公開第２０１０／０９２１３５号（引用により組み込まれる）に開示されている。特に好ましい残基としては、配列番号２の位置に対応する位置の残基が挙げられる。
【０１５８】
反応性チオール基を表面に供するべく、配列番号２又は他のアルブミンの対応する位置に加えることが可能な改変としては、配列番号２の以下の改変に対応する改変が挙げられる：Ｌ５８５Ｃ、Ｄ１Ｃ、Ａ２Ｃ、Ｄ５６２Ｃ、Ａ３６４Ｃ、Ａ５０４Ｃ、Ｅ５０５Ｃ、Ｔ７９Ｃ、Ｅ８６Ｃ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ５４９Ｃ、Ａ５８１Ｃ、Ｄ１２１Ｃ、Ｅ８２Ｃ、Ｓ２７０Ｃ、Ａ５７８Ｃ、Ｌ５９５ＬＣ、Ｄ１ＤＣ、Ａ２ＡＣ、Ｄ５６２ＤＣ、Ａ３６４ＡＣ、Ａ５０４ＡＣ、Ｅ５０５ＥＣ、Ｔ７９ＴＣ、Ｅ８６ＥＣ、Ｄ１２９ＤＣ、Ｄ５４９ＤＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ｄ１２１ＤＣ、Ｅ８２ＥＣ、Ｓ２７０ＳＣ、Ａ５７９ＡＣ、Ｃ３６０＊、Ｃ３１６＊、Ｃ７５＊、Ｃ１６８＊、Ｃ５５８＊、Ｃ３６１＊、Ｃ９１＊、Ｃ１２４＊、Ｃ１６９＊及びＣ５６７＊。或いは、アルブミンのＮ又はＣ末端にシステイン残基を付与してもよい。
【０１５９】
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の変異体をコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。
【０１６０】
核酸コンストラクト
本発明は、本発明の変異体をコード化するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに作動式に連結された１又は２以上（数個）の調節配列とを含み、前記調節配列が、前記調節配列に適合する条件下、適切な宿主細胞において、前記コーディング配列の発現を指示する、核酸コンストラクトにも関する。
【０１６１】
変異体の発現を提供するべく、種々の方法によりポリヌクレオチドを操作してもよい。ポリヌクレオチドはベクターへの挿入前に操作することが望ましく、発現ベクターによっては斯かるベクターへの挿入前の操作が必須である。組換ＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを操作する技術は当業界では周知である。
【０１６２】
調節配列としては、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識される、適切なプロモーター配列が挙げられる。プロモーター配列は、変異プロテアーゼ変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なる核酸配列であってもよく、ミュータント型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよい。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする何れの遺伝子から取得されたものでもよい。
【０１６３】
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＡ（PRA1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＢ（PRB1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）転写延長因子（TEF1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）転写延長因子（TEF2）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1、ADH2/GAP）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。
【０１６４】
調節配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
【０１６５】
酵母宿主細胞の場合に好ましいターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０１６６】
調節配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列を使用することができる。
【０１６７】
酵母宿主細胞に適したリーダー配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）由来のリーダー配列が挙げられる。
【０１６８】
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、ポリペプチドをコードする配列の３’末端に作動式に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０１６９】
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。
【０１７０】
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異プロテアーゼ変異体のアミノ末端に連結され、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するためのアミノ酸配列をコードする配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、分泌される変異プロテアーゼ変異体をコードするコーディング領域のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング領域が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング領域を有さない場合である。或いは、変異プロテアーゼ変異体の分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング領域により、生来のシグナルペプチドコーディング領域をそのまま置換してもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用できる。
【０１７１】
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼが挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０１７２】
ポリペプチドのアミノ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合には、ポリペプチドのアミノ末端の隣にプロペプチド領域が配置され、プロペプチド領域のアミノ末端の隣にシグナルペプチド領域が配置される。
【０１７３】
作製方法
本発明の変異体は、当業者に周知の手法を用いて調製することが可能である。便宜な手法としては、親アルブミン、又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする核酸をクローン化し、配列番号２の位置４１７、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４及び５８０に対応する１又は２以上（数個）の位置に所望の置換を導入するよう、前記核酸を修飾し（ここで得られる変異体は、配列番号２における置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎからなる変異体ではない）、修飾された核酸が適切な調節遺伝要素（例えばプロモーター、ターミネーター、活性化部位、リボゾーム結合部位等）と作動式に連結されるような位置に配置された適切な遺伝子コンストラクトを調製し、前記遺伝子コンストラクトを適切な宿主生物内に導入し、形質転換された宿主生物を変異体の発現を生じる条件下で培養し、得られた変異体を回収する、という手法が挙げられる。これらの手法は何れも当業界で公知であり、平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る具体的な変異体を調製するための適切な方法を設計することが可能である。
【０１７４】
本発明の変異ポリペプチドにシグナル配列を連結し、形質転換された宿主生物の培養時に、変異ポリペプチドが成長培地中に分泌されるようにしてもよい。変異ポリペプチドを成長培地中に分泌されるようにすると、一般に回収及び精製が容易になるので好ましい。
【０１７５】
変異ポリペプチドを調製する手法は、国際公開第２００９０１９３１４号（引用により組み込まれる）にも開示されており、これらの手法を本発明にも適用可能である。
【０１７６】
アルブミンはこれまで、種々の宿主において、組換タンパク質として首尾よく発現されてきた。例としては、真菌類（例えば、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）（ＷＯ０６０６６５９５）、クリベロミセス（Kluyveromyces）（Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi, 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262）及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46）等）、細菌（Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285））、動物（Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276）及び植物（例えば、これらに限定されるものではないが、ジャガイモ及びタバコ（Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 及び Farran 2002, Transgenic Research 11、337-346）等）が挙げられる。本発明の変異ポリペプチドは、適切な宿主細胞において、遺伝子組換えにより作製されることが好ましい。原則として、適切な量のポリペプチドを産生することが可能な任意の宿主細胞を使用することができ、平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る適切な宿主細胞を選択することが可能である。好ましい宿主生物は酵母であり、好ましくはサッカロミセス属（Saccharomycacae）より選択され、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１７７】
本発明の変異ポリペプチドは、公知の分離法（例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、及びアフィニティー分離法等）を組み合わせて用いることにより、成長培地から回収・精製することができる。平均的な当業者の技量があれば、斯かる公知の分離工程を具体的に組み合わせて、本発明の変異体を精製することが可能である。本発明の変異体に適用可能な精製法の例としては、ＷＯ００４４７７２に教示されている手法を挙げることができる。
【０１７８】
本発明の変異ポリペプチドは、治療上有用な化合物を、それを必要とする動物又はヒト個体に送達するために使用できる。斯かる治療上有用な化合物としては、これらに限定されるものではないが、診断（例えば種々のイメージング法）に使用される標識や易検出性化合物；医薬活性化合物（例えば薬物等）、又は特異的結合部分（例えば抗体等）等が挙げられる。本発明の変異体を更に、２以上の異なる治療上有用な化合物（例えば抗体及び薬物）と組み合わせることにより、斯かる組み合わせ分子に所望の標的への特異的結合能を付与し、惹いては特定の標的における前記薬剤の濃度を高めることも可能である。
【０１７９】
融合ポリペプチド
本発明に係るアルブミンの変異体又はその断片を、非アルブミンポリペプチド融合パートナーと融合させてもよい。斯かる融合パートナーは、原則としてはどのようなポリペプチドでもよいが、通常は治療又は診断特性を有するポリペプチドであることが好ましい。アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドは当業界では公知である。斯かるアルブミン又はその断片と融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチドは、融合されていない融合パートナーポリペプチドと比べて、血漿中半減期が延長されることが判明している。本発明によれば、従来の対応する融合ポリペプチドと比較して、本発明に係る融合ポリペプチドの血漿中半減期を改変することが可能である。
【０１８０】
１又は２以上の治療ポリペプチドを、アルブミンのＮ末端やＣ末端に連結してもよく、アルブミン構造のループ内に挿入してもよく、これらを組み合わせてもよい。また、融合ポリペプチドの種々の要素を分離するリンカー配列を有してもよく、有しなくてもよい。
【０１８１】
アルブミン又はその断片の融合に関する教示は当業界では公知であり、当業者であれば斯かる教示を本発明に適用することも可能である。また、国際公開第２００１／７９２７１Ａ号及び国際公開第２００３／５９９３４Ａ号には、アルブミン又はその断片に融合可能な治療ポリペプチドの例が記載されており、これらの例を本発明に適用することも可能である。
【０１８２】
コンジュゲート
本発明に係るアルブミンの変異体又はその断片は、当業界で公知の手法により、第２の分子にコンジュゲートされてもよい。前記第２の分子は、診断部位を有していてもよく、この態様によれば、得られるコンジュゲートは、例えば診断ツールとして、例えばイメージングに有用である。或いは、第２の分子は、治療用化合物であってもよく、この態様によれば、得られるコンジュゲートは、例えば治療目的に有用である。この場合、コンジュゲートは、治療用化合物の治療特性に加えて、アルブミンの長い血漿中半減期を兼ね備えることになる。アルブミンと治療分子とのコンジュゲートは当業界では公知であり、斯かるコンジュゲートは、コンジュゲートされていない遊離状態の治療分子単独の場合と比べて、長い血漿中半減期を有することが確認されている。斯かるコンジュゲートは、周知の化学法を用いて、ＨＳＡの表面に存在する遊離状態のチオ基（成熟ＨＳＡのアミノ酸残基３４）を介して連結することが可能である。
【０１８３】
ある特定の好ましい観点によれば、変異アルブミン又はその断片は、有用な治療用化合物にコンジュゲートされ、斯かるコンジュゲートは、それを必要とする患者における、選択された特定の治療用化合物に対して感受性の状態を処置するために使用される。斯かる治療用化合物を変異アルブミン又はその断片にコンジュゲートする手法は当業界では公知である。国際公開第２００９／０１９３１４号には、治療用化合物をポリペプチドにコンジュゲートするのに適した手法の例が開示されており、斯かる手法を本発明に適用することも可能である。更に、国際公開第２００９／０１９３１４号には、置換トランスフェリンにコンジュゲートし得る化合物及び部分の例が開示されておりこれらの例を本発明に適用することも可能である。国際公開第２００９／０１９３１４号の教示は引用により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
天然形態のＨＳＡは遊離チオール基を一つ有しており、これをコンジュゲーションに遊離に使用することが可能である。この観点における具体的な態様として、変異アルブミン又はその断片を更に修飾し、表面に更なる遊離チオール基を供してもよい。これによって変異アルブミン又はその断片のペイロードを増加させることができるという利点がある。これにより、変異アルブミン又はその断片の各分子に対して、２分子以上の治療用化合物をコンジュゲートさせることができる。或いは、変異アルブミン又はその断片の各分子に対して、２種以上の異なる治療用化合物（例えば標的化特性を有する化合物（例えば腫瘍特異的抗体）と細胞毒性薬等）をコンジュゲートさせることが可能となり、惹いては腫瘍に対して極めて特異性の高い薬を提供することが可能となる。更なる遊離チオール基を表面に供するべく修飾可能な具体的な残基については、例えば、同時係属中の特許出願である国際公開第２０１０／０９２１３５号（これは引用により組み込まれる）に開示されている。
【０１８５】
アソシエート
更に、アルブミンの変異体又はその断片は、「アソシエート」の形態で使用することも可能である。ここで、「アソシエート」（associates）という語は、アルブミンの変異体又はその断片と、非共有結合により当該変異アルブミン又はその断片に結合又は関連付け（associated）された別の化合物とを含む化合物を意味する。斯かるアソシエートの例としては、変異アルブミンと、前記アルブミンに疎水性相互作用によって関連付けされた資質とからなるアソシエートが挙げられる。斯かるアソシエートは当業界で公知であり、周知の手法によって調製可能である。本発明に係る好ましいアソシエートの例としては、変異アルブミンとパクリタキセルとを含むアソシエートが挙げられる。
【０１８６】
他の用途
本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン、又はその断片、又は親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、血漿中半減期が改変されたという利点を有する。これにより、本発明に係る変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は変異アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート、又は変異アルブミン若しくはその断片を含むアソシエートの血漿中半減期を、具体的な治療目的に応じて選択し得るという利点がある。
【０１８７】
例えば、動物又は人間のイメージング用途に使用されるコンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドであって、イメージング部分が極めて短い半減期を有し、ＨＳＡを含むコンジュゲート又は融合ポリペプチドが、イメージング目的に必要とされるよりもはるかに長い血漿中半減期を有する場合、親アルブミン又はその断片よりも短い血漿中半減期を有する本発明の変異アルブミン又はその断片を用いて、イメージング目的には十分に長いものの、投与された患者の体外に十分に排出される程度に短い血漿中半減期を有する融合ポリペプチドのコンジュゲートを提供することができるという利点がある。
【０１８８】
別の例として、それを必要とする患者において、ある特定の状態を処置又は軽減するのに有効な治療用化合物を含むコンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドの場合、親アルブミン又はその断片よりも長い血漿中半減期を有する変異アルブミン又はその断片を用いることにより、より長い血漿中半減期を有するアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドを提供できるという利点がある。即ち、斯かる本発明のアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドによれば、親アルブミン又はそのアソシエート又はその断片を用いた場合と比べて、必要な投与頻度又は用量を低減して副作用を軽減することができるという点で有利である。
【０１８９】
更なる観点によれば、本発明は、本発明に係る変異アルブミン、そのアソシエート若しくはその断片、変異アルブミン断片若しくはそのアソシエート、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。斯かる組成物は医薬組成物であることが好ましい。斯かる組成物は、当該分野で周知の手法、例えば医薬分野で認められている教科書に開示の手法を用いて調製することができる。
【０１９０】
特定の態様によれば、斯かる組成物は、本発明に係る変異アルブミン又はその断片と、医薬的に有用な部位及びアルブミン結合ドメイン（albumin binding domain：ＡＢＤ）を含む化合物とを含む。本発明において、ＡＢＤとは、アルブミンをインビボにおいて循環させることができ、これによりＡＢＤ及び前記ＡＢＤに結合された任意の化合物又は部分の循環による運搬を可能とする部位、部分又は領域を意味する。ＡＢＤは当業界で公知であり、アルブミンに対して極めて強固に結合することが示されている。よって、アルブミンに結合したＡＢＤ含有化合物は、ある程度は単一の分子としての挙動を示すはずである。本発明者等は、発明に係る変異アルブミン又はその断片を、医薬的に有用な部位とＡＢＤとを有する化合物と組み合わせて使用することにより、それを必要とする患者に前記化合物を単独で注射し、又は天然のアルブミン又はその断片を含む製剤として投与した場合と比べて、医薬的に有用な部位及びＡＢＤを含む化合物の血漿中半減期を改変することが可能であることを見出した。
【０１９１】
本発明に係る変異アルブミン若しくはその断片、変異アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は変異アルブミン又はその断片を含むアソシエートを、当業界で周知の手法を用いて、ナノ又はマイクロ粒子内に組み込んでもよい。斯かるナノ又はマイクロ粒子を調製するための好ましい方法であって、本発明に係る変異アルブミン又はその断片に適用可能な方法は、国際公開第２００４／０７１５３６号に開示されており、本文献は引用により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
組成物
本発明は、本発明に係るアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートの、医薬組成物の製造における使用であって、前記のアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートが、ＨＳＡ若しくは対応するその断片、又は、ＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、ＨＳＡを含むコンジュゲートと比べて、改変された血漿中半減期を有する使用も対象とする。
【０１９３】
ここで、対応するＨＳＡの断片とは、比較対象となる変異アルブミンの断片とアラインされ、且つ、変異アルブミンの断片と同数のアミノ酸を有する、ＨＳＡの断片を意味する。同様に、対応するＨＳＡを含む融合ポリペプチド又はＨＳＡを含むコンジュゲートとは、比較対象となる変異アルブミンを含むコンジュゲートの融合ポリペプチドと同じサイズ及び同じアミノ酸配列を有する分子を意味する。
【０１９４】
前記のアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲートは、ＨＳＡ若しくは対応するその断片、又は、ＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも高い血漿中半減期を有することが好ましい。
【０１９５】
或いは、前記のアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、アルブミンの変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミンの変異体若しくはその断片を含むコンジュゲートは、ＨＳＡ若しくは対応するその断片、又は、ＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの対応するＫＤよりも、ＦｃＲｎに対するＫＤが低い、と言い換えることも可能である。前記のアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡのＫＤの０．９倍未満、より好ましくはＨＳＡのＫＤの０．５倍未満、より好ましくはＨＳＡのＫＤの０．１倍未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡのＫＤの０．０５倍未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡのＫＤの０．０２倍未満、最も好ましくはＨＳＡのＫＤの０．０１倍未満であることが好ましい。
【０１９６】
アルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲートは、本発明に係るアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲートであることが好ましい。
【０１９７】
本発明を以下の実施例に即して更に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１９８】
材料及び方法
ＥＬＩＳＡ：
ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により別記の濃度に希釈された野生型ＨＳＡ又は変異体により被覆し、４℃で一晩インキュベートし、次に４％スキムミルク（Acumedia）により室温で１時間ブロックした。次に、ウェルを、FEBS J. 2008 Aug;275(16):4097-110の記載に従って、ＰＢＳ/０．００５％ TWEEN（登録商標）20（ＰＢＳ／Ｔ）ｐＨ６．０、続いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ｓｈＦｃＲｎ（０．５μｇ／ｍｌ）により４回洗浄し、ヤギ由来のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗ＧＳＴ（１：５０００；GE Healthcare）と共に予インキュベートし、４％スキムミルクに希釈し、ＰＢＳ／０．００５％ TWEEN（登録商標）20（ＰＢＳ／Ｔ）ｐＨ６．０を各ウェルに添加し、室温で１．５時間インキュベートし、続いてＰＢＳ／Ｔ（ｐＨ６．０）により４回洗浄した。１００μlの基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Calbiochem）を各ウェルに添加し、４５分間インキュベートし、続いて１００μlの０．２５ＭのＨＣｌを添加した。吸光度を、Sunrise TECAN分光光度計（TECAN, Maennedorf、スイス）を用いて４５０ｎｍで測定した。同じＥＬＩＳＡをＰＢＳ／Ｔ（ｐＨ７．４）を用いて反復した。
【０１９９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
ＳＰＲ実験をBiacore 3000 装置（GE Healthcare）を用いて実施した。CM5センサーチップの流動細胞を、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（〜１４００−５０００ＲＵ）により、メーカー提供のプロトコールに記載のアミンカップリング化学を用いてカップリングした。このカップリングは、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０（GE Healthcare）中、１０μｇ/ｍｌのタンパク質の注入により実施した。リン酸緩衝液（６７ｍＭのリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％ TWEEN（登録商標）２０（ｐＨ６．０））を、実行緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。表面の再生を、ｐＨ７．４でのHBS-EP緩衝液（０．０１Ｍ のＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）（Biacore AB）の注入を用いて達成した。固定されたｓｈＦｃＲｎ-ＧＳＴへの結合については、１．０〜０．５μＭの各ＨＳＡ変異体を、２５℃で一定の流速（４０μｌ/ｍｌ）で前記表面上に注入した。何れの実験でも、データをゼロ点調整し、参照細胞を減算した。データ評価は、BIAevaluation 4.1ソフトウェア（BIAcore AB）を用いて実施した。
同じＳＰＲアッセイを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液ｐＨ７．４を用いて反復した。
【０２００】
本特許の目的においては、別途記載しない限り、ＨＳＡ、ＷＴ ＨＳＡ、ｒＨＡとしては、市販の組換ヒトアルブミン血清アルブミン登録商標名RECOMBUMIN（Novozymes Biopharma UK Ltd, Nottingham UKから入手可能）を使用した。
【０２０１】
他の生物種由来の血清アルブミン：これらのアルブミンは、別途記載しない限り、組換品であり、一般利用可能なデータベースから提供される配列を用いて作製した。或いは商業的供給者から購入した。
【０２０２】
ＦｃＲｎ：可溶性ヒト（ｓｈＦｃＲｎ）及びマウス（ｓｍＦｃＲｎ）ＦｃＲｎの発現及び精製：ｓｈＦｃＲｎ及びｓｍＦｃＲｎ発現プラスミドの生成方法、並びに、各ヘテロダイマーの発現及び精製方法は、例えば Berntzen et al. (2005) J. Immunol に記載されている。或いは、ｓｈＦｃＲｎ ＦｃＲｎへテロダイマーは、GeneArt AG （独国）により製造された。ヘテロダイマーの２つのサブユニットの配列は、例えば配列番号３及び４に示すとおりである。可溶性受容体は、ＨＥＫ２９３細胞を用いて発現させ、Ni-HiTrapクロマトグラフィーカラムを用いて培養上清液から精製した。
【０２０３】
実施例１．変異体の調製
特定のＨＳＡムテイン発現プラスミドの調製
ＨＳＡ変異体及びＨＳＡ融合変異体の発現方法としては、数種の手法を用いて製造した。標準的な分子生物学の手法（例えばSambrook, J. and D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載の手法等）を、全体を通じて使用した。
【０２０４】
方法１．表１に詳述するＨＳＡのアミノ酸置換
翻訳されたタンパク質内に所望のアミノ酸置換を導入するべく、ＨＳＡコーディング遺伝子（配列番号１）内に点突然変異を含む合成ＤＮＡのNcoI/SacI断片（８５９ｂｐ）を、遺伝子アセンブリー（GeneArt AG, Germany）により生成した。ＨＳＡコーディング遺伝子内にアミノ酸置換を導入するべく使用したコドンを表２に詳述する。未変更アミノ酸（即ち野生型）をコードする合成断片のヌクレオチド配列は、pDB2243（国際公開００／４４７７２号に記載）の配列と同一とした。合成ヌクレオチド断片を、NcoI/SacIにより消化したｐＤＢ２２４３に連結し、プラスミドpDB3876-pDB3886（表１）を生成した。発現プラスミドを作製すべく、pDB3876〜pDB3886（表１参照）を各々NotI及びPvuIにより消化し、得られたＤＮＡ断片を０．７％（ｗ／ｖ）ＴＡＥゲルを通して分離し、２９９２ｂｐの断片（PRB1プロモーター、融合リーダー（ＦＬ）配列をコードするＤＮＡ（国際公開第２０１０／０９２１３５号開示）、ＨＳＡ及びADH1ターミネーターをコードするヌクレオチド配列を含む「NotIカセット」；図１参照）を、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて、メーカーの説明書に従って、アガロースゲルから精製した。この「NotIカセット」を、（欧州特許出願第２８６４２４号に開示及びSleep, D.,et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187に記載の）NotI／エビアルカリホスファターゼ（Roche）で処理された「分解」（disintegration）プラスミドpSAC35中に連結した。連結混合物を用いて、ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）DH5αを形質転換した。「NotIカセット」を含む発現プラスミドpDB3887〜pDB3897、pSAC35誘導体を、標準法を用いて同定した。分解プラスミドpDB3887〜pDB3897及びpDB2244（野生型ＨＳＡの発現については国際公開第００／４４７７２号に記載）（表１）を用いて、（前述の国際公開第２００１／０７９９４８０号に従い）後述の通りにＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を形質転換した。
【０２０５】
【表１】
2020100633.tif 000003
【０２０６】
【表２】
2020100633.tif 000004
【０２０７】
方法２．ＨＳＡ変異体Ｄ４９４Ｎ＋Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ及びＥ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａの生成
QuickChange Lightening Kit（Statagene）を用いたＰＣＲに基づく方法を用いて、ＨＳＡ内に点突然変異を導入した。オリゴヌクレオチド対xAP094（配列番号５）／xAP095（配列番号６）及びxAP096（配列番号７）／xAP097（配列番号８）を用いて、２種のＨＳＡ変異体（それぞれ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ及びＥ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ）を生成した。プラスミドｐＤＢ３９２７（国際公開第２０１０／０９２１３５号に開示）を鋳型ＤＮＡとして使用し、キットのメーカーが推奨する方法に従った。得られたプラスミドをpDB3995及びpDB3996（それぞれＨＳＡ Ｄ４９４Ｎ＋Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ 及び Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ発現カセットを含む）と命名した。pDB3995及びpDB3996をBstEII/BsrBIで消化し、線状化されたＤＮＡ分子を標準法を用いて精製した。QiagenＰＣＲ精製キットを用いてメーカーの説明書に従って精製された各１００ｎｇのBstEII/BsrBI消化ＤＮＡをそれぞれ、１００ｎｇのAcc65I/BamHI消化pDB3936（国際公開第２０１０／０９２１３５号に開示)と混合し、後述のSigma Yeast形質転換キットを用いて、後述のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を直接形質転換した。
【０２０８】
方法３．表３に詳述するＨＳＡのアミノ酸置換
成熟ＨＳＡタンパク質内のアミノ酸置換に応じて、プラスミドpDB3927（国際公開第２０１０／０９２１３５号に開示）（pDB2243と同一のＨＳＡコードヌクレオチド配列を含む）を操作した。翻訳されたタンパク質配列内に所望のアミノ酸置換を導入するための点突然変異をＨＳＡコーディング遺伝子内に含む合成ＤＮＡ断片を生成した（GeneArt AG（独国）又は DNA2.0 Inc.（米国））（NcoI/Bsu36I、AvrII/SphI又はSacI/SphI断片)。ＨＳＡコーディング遺伝子内にアミノ酸置換を導入するべく使用したコドンを表２に詳述する。未変更アミノ酸（即ち野生型）をコードする合成断片のヌクレオチドは、pDB3927における配列と同一とした。合成ＤＮＡ断片をNcoI/Bsu36I、AvrII/SphI、SacI/Sph消化pDB3927（PCT 11527.204-WOに記載）内にサブクローン化し、pDB4006〜pDB4010、pDB4083〜pDB4101及びpDB4103〜pDB4111、並びにpDB4194、pDB4200、pDB4202（表３参照）を生成した。
【０２０９】
同様に、ＨＳＡをコードするヌクレオチド配列内に点突然変異を含むBamHI/SalI断片を、遺伝子アセンブリー（DNA 2.0 Inc, USA）により生成し、BamHI/SalI消化pDB3964（国際公開第２０１０／０９２１３５号に記載）内に連結し、プラスミドpDB3986〜pDB3989を生成した（表３）。
【０２１０】
ＨＳＡ中の位置５７３〜５８５（ＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ）（配列番号９）由来のアミノ酸のＣ末端鎖を、マカクザル（ＰＫＦＶＡＡＳＱＡＡＬＡ）（配列番号１０）、マウス（ＰＮＬＶＴＲＣＫＤＡＬＡ）（配列番号１１）、ウサギ（ＰＫＬＶＥＳＳＫＡＴＬＧ）（配列番号１２）及びヒツジ（ＰＫＬＶＡＳＴＱＡＡＬＡ）（配列番号１３）血清アルブミンの対応するアミノ酸に対して変異誘発した。各アミノ酸置換の導入に使用したコドンを表２に示す。合成ＤＮＡ断片（SacI/SphI）を、遺伝子アセンブリー（DNA2.0 Inc、米国）により生成し（未変更アミノ酸（即ち野生型）をコードする合成断片のヌクレオチド配列は、ｐＤＢ３９２７の配列と同一とした）、SacI/SphI消化pDB3927内にサブクローン化し、プラスミドpDB4114〜4117（表３）を生成した。
【０２１１】
プラスミドpDB3883（表１）、pDB4094及びpDB4095（表３）をNcoI/SacIにより消化し、各消化物から８５７ｂｐの断片を精製した後、NcoI/SacI消化pDB4006又はpDB4110（８．６８８ｋｂ）（表３）内に連結し、pDB4156〜pDB4161を生成した。
【０２１２】
発現プラスミドをインビボ生成（即ち、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の相同組換による；通称ギャップ修復又はインビボクローニング法 〜 Orr-Weaver & Szostak. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4417-4421参照）した。表３に示す修飾プラスミドをBstE2/BsrBI消化し、線状化されたＤＮＡ分子を標準法を用いて精製した。Qiagen ＰＣＲ精製キットを用いてメーカーの説明書に従って精製された、各１００ｎｇのBstE2/BsrBI消化ＤＮＡをそれぞれ、１００ｎｇのAcc65I/BamHI消化pDB3936（国際公開第２０１０／０９２１３５号に開示）と混合し、後述のSigma Yeast形質転換キットを用いて、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を直接形質転換した。
【０２１３】
【表３】
2020100633.tif 000005
【０２１４】
【表４】
2020100633.tif 000006
【０２１５】
【表５】
2020100633.tif 000007
【０２１６】
方法４．ＨＳＡ K500及びK573順列ライブラリー
ＰＣＲを用いて２つの順列ライブラリーを製造した。本ライブラリーでは、成熟ＨＳＡのアミノ酸５００又は５７３をコードするコドンを、他の非野生型アミノ酸及び終止コドン（K5XXSTOP）に変更（変異）させた。ＨＳＡコーディングＤＮＡが増幅され、所望の変更が導入されるように、変異誘発オリゴヌクレオチド（表４及び５）を設計した。即ち、位置５００での変更については、pDB4082（図１）を鋳型ＤＮＡとして使用した。pDB4082は、pDB2305（欧州特許出願第１７８８０８４号に開示）の誘導体であり、以下のように作製した。pDB2305（図２）をNsiI/SpeIにより消化し、得られる８．７７９ｋｂのNsiI断片を自己連結し、pDB4005（図３）を作製した。遺伝子アセンブリー（DNA2.0 Inc, USA）により作製された合成ＤＮＡ断片（BsaI/SphI）（配列番号１）（PRB1プロモーターの３’領域、修飾された融合リーダー配列、ＨＳＡをコードするヌクレオチド配列、及び修飾されたADH1ターミネーターの５’領域を含む）を、Hind3/SphI消化pDB4005（図３）内に連結し、pDB4082を作製した。注：PRB1プロモーター部位のHindIII部位は除去され、ＨＳＡコーディングヌクレオチド配列内にSacII部位が導入されている。
【０２１７】
ＨＳＡの位置５００の順列ライブラリーについては、SalI/HindIII部位間のヌクレオチド配列に対応するＨＳＡコーディングヌクレオチド配列（プラスミド地図pDB4082、図１参照）を、New England Biolabs Phusionキット（表６）及び表４に列挙されるオリゴヌクレオチドを用いて生成した。使用したＰＣＲ法を表７に記す。
【０２１８】
ＨＳＡ内のアミノ酸位置５７３の順列ライブラリーを、鋳型ＤＮＡとしてpDB3927を用いて生成するとともに、表５に記載されるオリゴヌクレオチドを用いて、NcoI部位とBsu361部位との間のＤＮＡに対応するアルブミンコーディングＤＮＡを増幅した。
【０２１９】
【表６】
2020100633.tif 000008
【０２２０】
【表７】
2020100633.tif 000009
【０２２１】
位置５００及び５７３のアルブミン変異体については、各ＰＣＲ生成物を、Qiagen ＰＣＲ−クリーンアップキットを用いて（メーカーの説明書に従って）精製し、SalI/HindIII（位置５００ライブラリー）又はNcoI/Bsu36I（位置５７３ライブラリー）により消化した。次に、消化されたＤＮＡを、Qiagen ＰＣＲ−クリーンアップキットを用いて精製し、夫々SalI/HindIII又はNcoI/Bsu36Iで消化されたpDB4082又はpDB3927中に連結し、対応する内在配列を置換した。連結体を用いて大腸菌（E. coli）DHSαを形質転換し、続いてプラスミドを、Qiagenミニプレプキットを用いて（メーカーの説明書に従って）形質転換体から単離し、正しいコンストラクトを制限分析により同定した。こうして、位置５００又は５７３のアミノ酸のコドンに対応する配列（それぞれ表４及び５）のみが異なるアルブミン遺伝子を含むプラスミドpDB4204〜pDB4222（位置５００ライブラリー）及びpDB4173〜pDB4190（位置５７３ライブラリー）の集合を取得した。各プラスミドにおける具体的な変化を配列決定により確認した。
【０２２２】
得られたプラスミドを用いて、上記のインビボクローニングにより、発現プラスミド及びアルブミン融合体生成酵母を生成した。即ち、１００ｎｇのBestEII/BsrBI消化ＨＳＡ変異体含有プラスミド及び１００ｎｇのAcc65I/BamHI消化pDB3936の混合物を用いて、後述のSigma Yeast形質転換キットによりＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を形質転換した。
【０２２３】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の形質転換：
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10 cir0（上述の国際公開第２００１／０７９４８０号を参照）又は菌株A Ciro（国際公開第２００５／０６１７１８号に記載）を、YEPDプレート（１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１．５％寒天）上に画線培養し、３０℃で４日間増殖させてから形質転換に供した。１μgの完全プラスミド（即ち環状プラスミド）又は、ギャップ修復用に、１００ｎｇのBstEII/BsrBI又はNsiI/PvuI消化ＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合体含有プラスミド、及び１００ｎｇのAcc65I/BomHI消化pDB3936を用いて、改良された酢酸リチウム法を用いたSigma Yeast 形質転換キット（Sigma yeast transformation kit YEAST-1, protocol 2; Ito et al. (1983) J. Bacteriol., 153, 16; Elble, (1992) Biotechniques, 13, 18）により、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）を形質転換した。前記プロトコールを僅かに変更し、ヒートショックの前、室温で４時間、前記形質転換物をインキュベートした。ヒートショックに続いて、細胞を軽く遠心分離してから、２００μlの１Ｍソルビトールに再懸濁し、BMMD寒天プレート上に展開した。BMMDの組成はSleep et al., (2001), Yeast, 18, 403に記載される。プレートを３０℃で４日間インキュベートした後、各コロニーを新鮮なBMMDプレート上にパッチした。酵母株番号を表１に詳述する。
【０２２４】
各酵母株のストックを次の手順で調製した。BMMDブイヨンに各酵母パッチをヘビーループ（heavy loop）により接種し、２００ｒｐｍのオービタル振盪下、３０℃で２４時間増殖させた。細胞をSorval RT600遠心分離機により１９００×ｇで５分間遠心分離して収穫し、１５ｍｌの上清液を除去し、トレハロース４０％（ｗ／ｖ）で置換した。細胞を再懸濁し、低温用バイアル（１ｍｌ）に移して−８０℃で貯蔵した。
【０２２５】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の振盪フラスコ増殖：
BMMD（レシピ、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを有さない０．１７％（ｗ／ｖ）の酵母窒素基質（Difco）、３７．８ｍＭの硫酸アンモニウム、２９ｍＭのクエン酸、１４２ｍＭのオルトリン酸水素ニナトリウム二水和物ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）グルコース）培地（１０ｃｍｌ）に、各酵母株を接種し、２００ｒｐｍのオービタル振盪下、３０℃で１２時間増殖させた。各開始培養物のアリコート（４ｍｌ）を２×２００ｍｌのBMMD培地に接種し、２００ｒｐｍのオービタル振盪下、３０℃で３６時間増殖させた。GF-Dプレフィルター（Whatman）を備えた０．２μｍの真空フィルター膜（Stericup, Millipore）を用いた濾過により細胞を収穫し、上清液を精製用に取得した。
【０２２６】
初期濃度：
取得された培養物上清液を、トランスメンブラン圧２０ｐｓｉ及び循環速度１８０ｍｌ・分−１で、Omega 10KD（０．０９３ｓｑ．ｍ２）フィルター（LV CentramateTM カセット, Pall Filtron）を備えたPall Filtron LVシステムを用いた接線流濾過（Tangential Flow Filtration）を用いて濃縮した。
【０２２７】
発酵：
１０ＬのSartorius Biostat C発酵器を用い、３０℃で流加発酵（fed-batch fermentation）を実施した。ｐＨをモニターし、アンモニア又は硫酸の添加により適宜調節した。アンモニアは培養物の窒素源としても利用した。溶解酸素のレベルをモニターし、撹拌速度に反映させて、２０％以上の飽和レベルを維持した。接種物を緩衝化最少培地（レシピ）を含む振盪フラスコ内で増殖させた。バッチ相については、培養物を、２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む発酵培地（発酵器体積の約５０％）中に接種した。供給段階は、溶解酸素レベルの急激な上昇により自動的に開始した。供給速度を所定の名目増殖速度に調節することにより、スクロースを増殖制限濃度に維持した。供給物の構成は５０％（ｗ／ｖ）スクロースを含む発酵培地であった。何れもCollins（Collins, S.H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, pp. 61-77）に記載のとおりである。
【０２２８】
ＧＰ−ＨＰＬＣ定量化：
精製されたアルブミン変異体、融合体及びコンジュゲートを、以下の手順でＧＰ−ＨＰＬＣ及び定量化分析した。長さ７．８ｍｍ ｉｄ × ３００ｍｍのTSK G3000SWXLカラム（Tosoh Bioscience）及び長さ６．０ｍｍ ｉｄ × ４０ｍｍのTSK SWガードカラム（Tosoh Bioscience）に、それぞれ２５μｌを注入した。サンプルを、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、1００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分でクロマトグラフィー処理した。サンプルを、２８０ｎｍのＵＶ検出により、ピーク面積に基づき、既知濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）の組換ヒトアルブミン標準を基準として定量化し、相対的消衰係数を補正した。
【０２２９】
振盪フラスコからのアルブミン変異体の精製：
振盪フラスコ（培養物上清液又は濃縮培養物上清液の何れか）から、アルブミン親和性マトリックス（AlbuPure（登録商標）- ProMetic BioSciences, Inc.）を用いた単一クロマトグラフィー工程を用いて、アルブミン変異体を精製した。クロマトグラフィーは常時一定線速度２４０ｃｍ／時で実施した。培養物上清液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で前平衡化された層高６ｃｍ、２．０ｍｌの充填層に負荷した。負荷後、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液、次に５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）（１０ＣＶ）で洗浄した。生成物を、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタノエートｐＨ８．０、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、３０ｍＭ オクタン酸ナトリウム、２００ｍＭ 塩酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、又は２００ｍＭ チオシアン酸カリウムの何れかにより溶出した。カラムを、０．５ＭのＮａＯＨ（３ｃｖ）及び２０ｍＭ ＮａＯＨ（３．５ｃｖ）により洗浄した。各アルブミン変異体由来の溶出物画分を濃縮し、１０体積部の５０ｍＭ 塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレートした（任意のダイアフィルトレーションカップを備えたVivaspin20 10,000 MWCO PES、Sartorius）。精製されたアルブミン変異体を、上記に従ってＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化した。
【０２３０】
振盪フラスコからのアルブミン融合変異体の精製：
振盪フラスコ培養物上清液から、アルブミン親和性マトリックス（AlbuPure（登録商標）- ProMetic BioSciences, Inc.）を用いた単一クロマトグラフィー工程を用いて、アルブミン融合変異体を精製した。クロマトグラフィーは常時一定線速度２４０ｃｍ／時で実施した。培養物上清液又は濃縮された培養物上清液を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で前平衡化された層高６ｃｍ、２．０ｍｌの充填層に負荷した。負荷後、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液、次に５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）（１０ＣＶ）で洗浄した。生成物を、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタノエートｐＨ８．０、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、３０ｍＭ オクタン酸ナトリウム、２００ｍＭ 塩酸ナトリウムｐＨ７．０、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１００ｍＭ オクタン酸ナトリウム又は２００ｍＭ チオシアン酸カリウムの何れかにより溶出した。カラムを、０．５Ｍ ＮａＯＨ（３ｃｖ）及び２０ｍＭ ＮａＯＨ（３．５ｃｖ）により洗浄した。各アルブミン変異体融合物由来の溶出物画分を濃縮し、ｓ１０体積部の５０ｍＭ 塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレートした（任意のダイアフィルトレーションカップを備えたVivaspin20 10,000 MWCO PES、Sartorius）。精製されたアルブミン融合変異体を、上記に従ってＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化した。
【０２３１】
発酵物からのアルブミン変異体の精製：
アルブミン変異体を、Sorvall RC 3C遠心分離機（DuPont）を用いた遠心分離により分離した後、高細胞密度流加発酵上清液から精製した。培養物上清液を、上記に従って、注文合成されたアルブミン親和性マトリックス（AlbuPure（登録商標） - ProMetic BioSciences, Inc.）を充填した層高１１ｃｍ、充填層８．６ｍｌのカラムを通してクロマトグラフィー処理した。生成物を、流速１２０ｃｍ／時で、上記溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出物画分をＧＰ−ＨＰＬＣ（上記）及び純度についての還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、必要に応じて濃縮し（Vivaspin20 10,000 MWCO PES）、２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．４）中、流速３９ｃｍ／時で、Supardox75を充填した２．４×９６ｃｍカラムに導入した。ピークを分取し、ＧＰ−ＨＰＬＣでアッセイし、所望のモノマータンパク質をプールして取得した。プールされた画分を濃縮した（Vivaspin20 10,000 MWCO PES, Sartorius）。
【０２３２】
受容体（ＦｃＲｎ）結合特性及び／又は他の分析用にアッセイされるタンパク質は、何れも上記に従ってＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化し、相対的消衰係数を補正した。
【０２３３】
実施例２．血液由来ＨＳＡ及び組換ヒトアルブミンの受容体（ｓｈＦｃＲｎ）結合特性の決定
実質的に脂肪酸を有さないＨＳＡ（Sigma-Aldrich）を、Andersen et al. (2010), J. Biol. Chem. 285, (7), 4826-4836の記載に従って、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。１０μＭノモノマーＨＳＡ及びｒＨＡを、上記に従ってＳＰＲを用いて分析した。データを図４に示す。
【０２３４】
ＨＳＡ（血液由来）を、組換ヒトアルブミン（Recobumin）と同濃度（１０μＭ）で直接比較したところ（図４Ａ及び４Ｂ）、両サンプルの固定ｓｈＦｃＲｎ（それぞれｐＨ６．０、ｐＨ７．４）への結合は可逆性且つｐＨ依存性であった。また、ＨＳＡを、Bosse et al. (2005), J. Clin. Pharmacol. 45; 57-67による組換ヒトアルブミンと比較したところ、インビボでのヒトの研究の場合と同等の半減期を示した。
【０２３５】
実施例３．アルブミン変異体の受容体（ｓｈＦｃＲｎ）結合特性の決定
確立された２種のＦｃＲｎ結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用した。これらのアッセイには大きな違いがある。ＥＬＩＳＡ系では、ウェルをＨＳＡで直接被覆し、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴを溶液として添加する。一方、ＦＰＲアッセイでは、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴをＣＭ５チップに固定し、ＨＳＡを溶液として注入する。何れの系でもｐＨは可変である。
【０２３６】
ＥＬＩＳＡを用いて変異体をｐＨ６．０及びｐＨ７．４で分析した。結果を図５に示す。ＥＬＩＳＡ値は二重試験の平均を表す。
【０２３７】
ＳＰＲ分析を用いて変異体をｐＨ６．０及びｐＨ７．０で分析した。代表的な数種の変異体について、図６では変異体濃度０．２μＭの場合の結果を、図７では変異体濃度１μＭの場合の結果を示す。
【０２３８】
図６及び７に示すＳＰＲデータを正規化した。各濃度での変異体の相対的結合を、それぞれ図８Ａ及びＢに示す。
【０２３９】
分析結果によれば、試験した変異体は何れも、ｐＨ６．０では受容体に顕著な結合を示すが、ｐＨ７．４では結合を示さない。変異体Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、及びＤ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａは、ＨＳＡと比較して、受容体への結合が低下していた。
【０２４０】
実施例４．アルブミン変異体の受容体（ｓｈＦｃＲｎ／ｓｍＦｃＲｎ）結合特性の決定
ＨＳＡ及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）のヒト及びマウスＦｃＲｎへの結合について、下記ＳＰＲ分析法を用いて、会合定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ及び結合定数ＫＤを計算した（表８）。
【０２４１】
ＳＰＲ分析−  ＳＰＲ分析は、CM5チップを用いて、BIAcore 3000機器（GE Healthcare）により実施した。ｓｍＦｃＲｎ−ＧＳＴ及びｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ変異体又はｓｍＦｃＲｎの固定化は、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いて実施した。タンパク質サンプル（１０μｇ/ｍｌ）は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で（GE Healthcare）、何れもメーカーの指示に従って注入した。表面上の未反応分を、１Ｍのエタノールアミンによりブロックした。何れの実験でも、ｐＨ６．０又は７．４でのリン酸緩衝液（６７ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ TWEEN（登録商標）２０）、又はｐＨ７．４でのＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤P20）を、泳動用緩衝液又は希釈用緩衝液として用いた。動態測定（kinetic measurement）は、低密度固定化表面（１００〜２００共鳴単位（ＲＵ））を用いて実施した。ｈＩｇＧ１(２０００．０〜３１．２ｎＭ)、ｍＩｇＧ１（１０００．０〜１５．６ｎＭ）、ＭＳＡ（２０．０〜０．３μＭ）及びＨＳＡ（２００．０〜３．１μＭ）の段階希釈溶液を、ｐＨ６．０又はｐＨ７．流速４、５０μｌ／分、２５℃で注入した。次に、ＨＳＡ（１０μＭ）、ＭＳＡ（５μＭ）、ｈＩｇＧ１（１００ｎＭ）又はｍＩｇＧ１（１００ｎＭ）のうち１種又は２種を、２５℃、２０μｌ／分、ｐＨ６．０で、固定されたｓｈＦｃＲｎ（約６００ＲＵ）又はｓｍＦｃＲｎ（約６００ＲＵ）上に注入し、付加結合を記録した。更に、ｓｈＦｃＲｎ（５０ｎＭ）又はｓｍＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を単独で、又は異なる量のＨＳＡ又はＭＳＡ（１０．０〜０．０５μＭ）と一緒に、固定されたＨＳＡ（約２６００ＲＵ）又はＭＳＡ（約２０００ＲＵ）上に注入し、競合結合を測定した。何れの場合も、非特異的結合及びバルク緩衝効果を補正するために、対照表面及びブランク注入から得られた応答を、各相互作用曲線から減算した。運動速度値を、BIAevaluation 4.1ソフトウェアにより供される事前定義モデル（Langmuir 1:1リガンドモデル、異種リガンドモデル及び定常状態親和性モデル）を用いて計算した。平均二乗を表す統計値χ２で記述される適合近似は、何れの親和性評価でも２．０未満であった。
【０２４２】
【表８】
2020100633.tif 000010
【０２４３】
ＫＤはBIAevaluation 4.1ソフトウェアを用いて生成した。全てにおいてLangmuir 1:1リガンドモデルを使用した。速度値は三重反復試験の平均を表す。ＮＤ：測定されず（not determined）。ＮＡ：取得されず（not acquired）。
【０２４４】
実施例５：ヒトＦｃＲｎへの他生物種由来アルブミンの結合
市販の動物アルブミン（Sigma-Aldrich又はCalbiochemの何れか）を、Andersen et al., (2010). J.Biol.Chem. 285, (7), 4826-4836の記載に従って更に精製した。ロバ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、 ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ラット血清アルブミン及びニワトリ血清アルブミンのｓｈＦｃＲｎへの結合を、材料及び方法の欄に記載の手法を用いて決定した。ＥＬＩＳＡの結果を図９Ａ〜Ｄに示す。相対的結合を図９Ｅに要約する。
【０２４５】
ＳＰＲ結果を図１０に示す。ここでは各アルブミン種のｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合を示す。表１０に、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを用いて測定した相対結合応答の概要を示す。
【０２４６】
【表１０】
2020100633.tif 000011
【０２４７】
最強から最弱までの結合の順位は次の通りである。モルモット＝／＞ウサギ＞ハムスター／イヌ＞ラット／マウス＞ロバ＞ヒト＞ウシ＞ヤギ＞ヒツジ＜ニワトリ。このデータは、動物アルブミンのｓｈＦｃＲｎに対する親和性が異なっていることを示す。
【０２４８】
実施例６．ｓｈＦｃＲｎに対するＨＳＡ変異体の動態（Kinetics）
本発明の変異体の結合定数を、材料及び方法の欄に記載の方法に従って決定した。
【０２４９】
【表１１】
2020100633.tif 000012
【０２５０】
ＫＤはBIAevaluation 4.1ソフトウェアを用いて生成した。全てにおいてLangmuir 1:1リガンドモデルを使用した。動態値（kinetic values）は三重反復試験の平均を表す。ＮＤは測定されず（not determined）の意。
【０２５１】
これらの結果は、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡのデータに基づく実施例３での結論に整合している。更に、Ｅ４９２Ｇの受容体に対する親和性が向上したことも示している。
【０２５２】
実施例７．ＨＳＡ変異体の競合分析
実施例１で調製されたＨＳＡ変異体及びＷＴ ＨＳＡの競合分析を、実施例４に記載の方法を用いて実施した。結果を図１５に示す。これらの結果は、変異体Ｅ４９２Ｇが、Ｅ４９２Ｈ Ｅ４９２Ｐ及びＥ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐとは異なり、ＨＳＡよりもｓｈＦｃＲｎに対してより強い結合性を有することを示している。
【０２５３】
実施例８．Ｑ４１７置換の分析
実施例１の方法を用いて、置換Ｑ４１７Ａ及びＤ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈを有するＨＳＡの変異体を構築した。これらの変異体の動態特性（kinetic properties）を、材料及び方法の欄に記載の方法を用いて試験した。結果を表１２に示す。
【０２５４】
【表１２】
2020100633.tif 000013
【０２５５】
これらのデータは、変異体Ｑ４１７Ａ及びＤ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈが、野生型ＨＳＡと比べて受容体に対する結合が弱いことを示す。
【０２５６】
実施例９．位置４９９、５００、５３６、５３７、５３８及び５７３のＨＳＡ変異体の分析
実施例１の方法を用いて、置換Ｐ４９９Ａ、Ｋ５００Ａ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ及びＫ５７３Ａを有するＨＳＡの変異体を構築した。これらの変異体の受容体結合特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。結果を図１１に示す。
【０２５７】
これらのデータは、変異体Ｐ４９９Ａ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ及びＫ５３８ＡのＨＳＡに対する結合親和性が減少していたことを示す。変異体Ｋ５００Ａは、ＳｈＦｃＲｎに結合するその能力をほぼ完全に失っていた。Ｋ５７３Ａは、ＨＳＡよりもｓｈＦｃＲｎに対する結合親和性の方が高かった。
【０２５８】
実施例１０．ＨＳＡの位置５０１における変異体の分析
実施例１の方法を用いて、置換Ｅ５０１Ａ及びＥ５０１Ｑを有するＨＳＡの変異体を構成した。それらの変異体の動態特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。
【０２５９】
【表１３】
2020100633.tif 000014
【０２６０】
データは、変異体Ｅ５０１Ａ及びＥ５０１ＱがＨＳＡに対してよりもｓｈＦｃＲｎ対してわずかに低められた結合親和性を有することを示す。
【０２６１】
実施例１１．位置５７３でのＨＳＡ変異体の分析
実施例１の方法を用いて、位置５７３に置換を有するＨＳＡの変異体を構成した。位置５７３における全変異体の生成、及びそれらの変異体の受容体結合特性の試験は、材料及び方法の欄の記載に従って行ったが、ｐＨ５．５でのＳＰＲ分析を追加した。結果を下記表１４並びに図１２及び１３に示す。
【０２６２】
【表１４】
2020100633.tif 000015
【０２６３】
これらの結果によれば、位置５７３に置換を有する変異体の全てが、ＷＴ ＨＳＡと比較して、ｓｈＦｃＲｎに対する結合性が改善されていた。特に、変異体Ｋ５７３Ｆ、Ｋ５７３Ｈ、Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ｗ及びＫ５７３Ｙは、ｓＡＦｃＲｎに対するＫＤが親ＨＳＡの１０分の１未満であった。変異体Ｋ５７３ＳＴＯＰは、位置５７３に停止コドンを有する切断型アルブミンである。Ｋ５７３ＳＴＯＰ変異体のセンサーグラムは、ＷＴ ＨＳＡと比べて有意に低減された結合性を示すと共に、高いＫＤを生成した。変異体Ｋ５７３Ｅは、Otagiri (2009). Biol.Pharm. Bull. 32(4) 527-534において同定された天然変異体であるが、親和性の向上が示されたことから、インビボでの半減期は延長されることが予測される。
【０２６４】
実施例１２．更なるＨＳＡ変異体の分析
実施例１の方法を用いて、置換Ｅ４９２Ｇ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｈ、Ｎ５０３Ｈ、Ｄ５５０Ｅ、Ｅ４９２Ｇ+Ｎ５０３Ｋ、Ｅ５４２Ｐ、Ｈ４４０Ｑ、Ｋ５４１Ｇ、Ｋ５４１Ｄ、Ｄ５５０Ｎ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５３８Ｈ＋Ｋ５４１Ｎ＋Ｅ５４２Ｄ、Ｅ４９２Ｔ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５４１Ａ、Ｅ４９２Ｐ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５４１Ｇ＋Ｅ５４２Ｐ、Ｅ４９２Ｈ＋Ｅ５０１Ｐ＋Ｎ５０３Ｈ＋Ｅ５０５Ｄ＋Ｔ５０６Ｓ＋Ｔ５４０Ｓ＋Ｋ５４１Ｅ、Ａ４９０Ｄ＋Ｅ４９２Ｔ＋Ｖ４９３Ｌ＋Ｅ５０１Ｐ＋Ｎ５０３Ｄ＋Ａ５０４Ｅ＋Ｅ５０５Ｋ＋Ｔ５０６Ｆ＋Ｋ５４１Ｄ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐ＋Ｋ５３８Ｈ＋Ｋ５４１Ｎ＋Ｅ５４２Ｄを有するＨＳＡの変異体を構成した。それらの変異体の受容体結合特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。結果を表１５及び図１４に示す。
【０２６５】
【表１５】
2020100633.tif 000016
【０２６６】
これらの結果が示すとおり、位置５５０をＥに置換した場合、ｐＨ６．０でのｓｈＦｃＲｎに対する親和性は増加したのに対し、Ｎに置換した場合、当該親和性は低下した。しかし、この分析をｐＨ５．５、Ｄ５５０Ｅ置換について反復したところ、親和性の上昇は観察されなかった。酸性アミノ酸（Ｅ）で置換した場合、結合性は維持及び改善される。しかし、非荷電アミドアミノ酸残基で置換した場合、ｐＨ６．０での結合性は低減される。斯かる観察によれば、塩基性アミノ酸（Ｈ、Ｋ及びＲ）への置換が結合のさらなる低下をもたらすことを予測する。
【０２６７】
実施例１３．Ｈｉｓ残基への変異誘発
次の変異体を、実施例１に記載される方法を用いて生成した。Ｈ４４０Ｑ、Ｈ４６４Ｑ、Ｈ５１０Ｑ及びＨ５３５Ｑ。材料及び方法の欄の記載に従って得られた、これらの変異体とｓｈＦｃＲｎとの相互作用のＳＰＲセンサーグラムを図１５に示す。
【０２６８】
変異体Ｈ４４０ＱがＨＳＡに匹敵する親和性で結合したことが見出された。対照的に、Ｈ４６４Ｑ、Ｈ５１０Ｑ及びＨ５３５Ｑは、ｓｈＦｃＲｎに対する親和性が有意に低減された。これらの結果は、ヒスチジン残基の変異誘発によって、ＨＳＡのｓｈＦｃＲｎへの結合性が有意に低減されるという従来の知見（Wu et al. (2010). PEDS, 23(10)789-798）を支持している。Wu et al.は、マウスにおける二重特異的抗体（ｓｃＦｖ-ＤIII）２の半減期の短縮を、除去の最も遅いものから最も早いものまで以下の順序で示している。Ｄｂ−ＤIII ＷＴ＞Ｈ５３５Ａ＞Ｈ５１０Ａ＞Ｈ４６４Ａ＞Ｄｂ。ｓｈＦｃＲｎに対する親和性に基づいて、ＳｍＦｃＲｎ（実施例５）と比較した場合、ヒトにおけるクリアランスの順序は（グルタミン（Ｑ）置換に関して）ＷＴ＞Ｈ４４０Ｑ＞Ｈ５１０Ｑ＞Ｈ４６４Ｑ＞Ｈ５３５Ｑの順になると予測される。
【０２６９】
実施例１４．追加の変異体
以下の変異体を、実施例１に記載の方法を用いて生成した。ＨＳＡのＫ５７４Ｎ及びＱ５８０Ｋ。これらの変異体のＦｃＲｎへの結合を、材料及び方法の欄に記載のＳＰＲアッセイを用いて試験した。結果を表１６に示す。これらの結果は、変異体Ｋ５７４Ｎ及びＱ５８０Ｋが、ｓｈＦｃＲｎに対して強く結合したことを示す。
【０２７０】
【表１６】
2020100633.tif 000017
【０２７１】
実施例１５．位置５００のＨＳＡ変異体の分析
実施例１の方法を用いて、位置５００に置換を有するＨＳＡの変異体を構成した。位置５００における全変異体の生成、及びこれらの変異体の受容体結合特性の試験を行った。何れの分析でも、Biacore X、 Biacore X100 及び Sensor Chip CM5を用いた。これらは何れもGE Healthcareにより提供される。GeneArt AG（独国）により生成されるｓｈＦｃＲｎ（１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）により１０μｇ／ｍｌに希釈（GE Healthcare））を、流動細胞２（ＦＣ２）に対して、標準アミンカップリングにより、メーカーの説明書（GE Healthcare）に従って１６００〜２２００応答単位（ＲＵ）のレベルまで固定した。流動細胞１（ＦＣ１）にはブランクの固定化を実施し、対照細胞として使用した。アッセイの安定化のため、まずランニングバッファー（６７ｍＭ リン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Tween 20（ｐＨ５．７５±０．２５））のみを用いて３〜５回の始動サイクルを実施し、続いて再生を行った。ＷＴ ｒＨＡ及びK500ライブラリー変異体を、２５℃、一定流速（３０μｌ／分）で９０秒間、種々の濃度（１μＭ〜１５０μＭ）で注入し、続いて、初期基線ＲＵが概ね回復されるまで（通常は１２秒パルスで十分）、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液ｐＨ７．４（GE Healthcare）を用いて表面を再生した。
結果を表１７及び図１６に示す。
【０２７２】
【表１７】
2020100633.tif 000018
【０２７３】
これらの結果は、変異体Ｋ５００Ｒ及びＫ５００Ｉが各々、ＷＴ ＨＳＡと比較して、ｓｈＦｃＲｎに対する親和性が同等又はより高かったことを示している。変異体Ｋ５００Ｅは固定化ｓｈＦｃＲｎに強固に結合したが、そのＦｃＲｎ相互作用は依然として特徴的なｐＨ依存性を示した。この複合体は非常に安定であり、動態分析は不可能であった（図１６）。他の変異体は何れも、ｓｈＦｃＲｎに対する結合性がｗｔ ｒＨＡよりも低い。
【０２７４】
全変異体がｐＨ５．５でｓｈＦｃＲｎに（ある程度）結合した。Ｋ５００ライブラリー変異体のｓｈＦｃＲｎへの結合は、ｐＨ７．４では検出できなかった。
【０２７５】
実施例１６. 融合ペプチド
アルブミンムテインを含むアルブミン融合体の生成：
ｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）生成用の発現カセットを、ＨＳＡのＮ末端又はＣ末端の一方又は両方に、遺伝子的手法で融合したプラスミド（Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124に記載）を、アルブミン融合体を生成し得るようインビボクローニング（上述）で修飾した。即ち、pDB3017（図１７）、pDB3021（図１８）、pDB3056（図１９）をNsiI/SpeIにより消化し、それぞれ９．５１１ｋｂ、９．５６９ｋｂ及び８．７９５ｋｂに対応するNsiI断片を、標準法を用いて精製した。精製HsiI断片を自己連結し、それらを用いてケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）DHSαを形質転換することにより、それぞれpDB4168、pDB4169及びpDB4170を生成した（表１８）。
【０２７６】
同様に、pDB3165（二価融合体を含む）（図２０）をNotIにより消化し、発現カセット（４．５０６ｋｂの断片）を精製後、NotI消化pDB3927内に連結し、pDB4172（図２１、表１８）を生成した。
【０２７７】
翻訳されたアルブミンのタンパク質配列に、Ｋ５００Ａ、又はＤ５５０Ｎ又はＫ５７３Ｐに対応するアミノ酸置換を導入するべく、アルブミンコーディングヌクレオチド配列内に点突然変異を含む合成SalI/Bsu36I ＤＮＡ断片（２６９ｂｐ）を、遺伝子アセンブリー（GeneArt AG, Germany）により生成した。SalI/Bsu36I断片をそれぞれ、SalI/Bsu36I消化pDB4168〜pDB4170及びpDB4172内に連結し、標準法を用いてケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）DH5αを形質転換し、プラスミドpDB4265〜pDB4276を生成した（表１８）。
【０２７８】
【表１８】
2020100633.tif 000019
【０２７９】
同様に、翻訳されたアルブミンタンパク質配列にＫ５７３Ａ置換を導入するべく、ＤＮＡ断片をＰＣＲにより（標準法を用いて）生成した。鋳型ＤＮＡとしてpDB4267（図２２）を用い、更にオリゴヌクレオチドxAP238（配列番号５３）及びxAP239（配列番号５４）を用いて、New England Biolabs PhusionキットによりＰＣＲを実施した。
ＰＣＲサイクルを表１９に示す。
【０２８０】
【表１９】
2020100633.tif 000020
【０２８１】
ＰＣＲ生成物を精製し、SalI/Bsu36Iで消化し、単離された断片（２６９ｂｐ）を、SalI/Bsu36I消化pDB4168〜pDB4170及びpDB4172内に連結し、ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）DH5αを形質転換した。得られたプラスミド（pDB4277〜pDB4280）を表１８に示す。
【０２８２】
FLAG標識をコードするヌクレオチド配列を、プラスミドpDB4168及びpDB4268〜4270（ｓｃＦｖ発現用プラスミドをそれぞれＨＳＡ及びＨＳＡムテインＫ５００Ａ、Ｄ５５０Ｎ及びＫ５７３ＰにＮ末端融合したもの）から除去した。pDB4168及びpDB4268〜4270（表１８）をBsu36I/SphIにより消化し、ＨＳＡコーディング遺伝子の３’領域、FLAG標識をコードするヌクレオチド配列及びADH1ターミネーターの５’領域を含む、２３１ｂｐの産物を除去した。pDB4181由来のＨＳＡコーディング遺伝子の３’領域及びmADH1ターミネーター（配列番号１）の５’領域を含むBsu36I/SphI断片（２０７ｂｐ）を、標準法を用いて、Bsu36I/SphI消化pDB4168及びpDB4268〜pDB4270内に連結した。連結混合物を用いて、標準法を用いてケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）DH5αを形質転換し、プラスミドpDB4281〜pDB4284（表１８）を生成した。
【０２８３】
pDB4265〜pDB4284をBstE2/BsrBIで消化し、線状化されたＤＮＡ分子を標準法を用いて精製した。１００ｎｇのBstE2/BsrBI ＤＮＡサンプルを、１００ｎｇのAcc65I/BamHI消化pDB3936と混合し、これを用いて、後述のSigma Yeast形質転換キットによりＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を形質転換した。何れの場合でも、発現プラスミドは酵母において、アルブミン融合体含有プラスミド（pDB4265〜pDB4280）（表１８）とpDB3936との間の相同組換（インビボクローニング）により生成した。
【０２８４】
プラスミド（pDB3017、pDB3021、pDB3056及びpDB3165）（Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124に記載の野生型ＨＳＡ融合体）を用いて、後述のSigma Yeast形質転換キットにより、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）株Acir0（国際公開第２００５／０６１７１８号記載）を形質転換した。
【０２８５】
ヒトＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１受容体アンダゴニスト）（受託番号CAA59087）をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子アセンブリーにより合成可能である。７０８ｂｐの合成断片（Bsu 36I/SphI断片）のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。本配列は、ＨＳＡをコードする遺伝子の３’領域、ＧＳリンカーをコードするヌクレオチド配列、ヒトＩＬ−１ＲＡをコードするヌクレオチド配列（Ｎ連結グリコシル化モチーフを破壊するためのＮ８４Ｑ）、及びADH1ターミナルの５’領域を含む。合成ＤＮＡ断片を、Bsu36I/SphI消化pDB3927内に連結し、pDB2588を生成した。
【０２８６】
ＩＬ−１ＲＡ生成用の発現カセットをＨＳＡ及びＨＳＡ変異体Ｋ５００Ａ、Ｄ５５０Ｎ、Ｋ５７３Ａ及びＫ５７３ＰのＣ末端に遺伝子的手法で融合したプラスミドは、以下の手順で調製した。pDB2588をBsu35I/SphIで消化し、ＨＳＡコーディング遺伝子の３’領域、ＧＳリンカーをコードするヌクレオチド配列、ヒトＩＬ１−ＲＡ（Ｎ８４Ｑ）をコードするヌクレオチド配列、及び修飾されたＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ADH1ターミナル（配列番号３）の５’領域を含む７０５ｂｐの断片を、標準法を用いて精製した後、Bsu36I/SphI消化pDB4006（ＨＳＡ Ｋ５７３Ａ発現カセットを含む）、pDB4010（ＨＳＡ Ｄ５５０Ｎ発現カセットを含む）、pDB4086（ＨＳＡ Ｋ５００Ａ発現カセットを含む）、pDB4110（ＨＳＡ Ｋ５７３Ｐ発現カセットを含む）内に連結し、それぞれpDB4287、pDB4286、pDB4285及びpDB4288を生成した（例として図２３を参照）。pDB4285〜pDB4288をNsiI/PvuIで消化し、線状化されたＤＮＡ分子を標準法を用いて精製した。１００ｎｇのNsiI/PvuI消化ＤＮＡ分子を、１００ｎｇのAcc65I/BamHI消化pDB3936（９７２１ｂｐ）と混合し（即ち、インビボクローニング）、これを用いて、後述のSigma Yeast形質転換キットにより（即ち、インビボクローニングにより）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）を形質転換した。
【０２８７】
野生型ＨＳＡをＧＳリンカー及びＩＬ１−ＲＡ（Ｈ８４Ｑ）（表１８参照）に遺伝子的手法で融合した融合体を発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株を、下記方法によって調製することも実施である。
【０２８８】
融合ペリペプチドを、上記ＳＰＲ方法を用いて、ＦｃＲｎへのそれらの結合について分析し、そして次の結果を得た。
【０２８９】
【表２０】
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【０２９０】
実施例８では、Ｋ５００Ａ変異体がｓｈＦｃＲｎに対して有意に結合しないことが示され、実施例１０では、Ｋ５７３Ｐ及びＫ５７３Ａ変異体がＨＳＡよりもｓｈＦｃＲｎに対する結合が強いことが示され、実施例１１では、Ｄ５５０Ｎ変異体がＨＳＡよりもＦｃＲｎに対する結合が弱いことが示された。
【０２９１】
本実施例では、上記観察された結合特性の相違が、以下の異なる構成を有する融合ポリペプチドにも反映されていることが示された。即ち、小型部分を有するＣ末端融合体（ＨＳＡ−ＦＬＡＧ）；大型のポリペプチドを有するＣ末端融合体（ＨＳＡ−ＩＬ１ＲＡ）；ポリペプチドを有するＮ末端融合体（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ）；Ｎ及びＣ末端融合体（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＦＬＡＧ及びｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ−ＦＬＡＧ）。
【０２９２】
実施例１７.アルブミン及びＫ５７３Ｐ変異体へのホースラディッシュペルオキシダーゼタンパク質のコンジュゲート
コンジュゲート分析では、市販の組換アルブミン（Recombumin（登録商標））を対照分子として使用した。この実施例では、流加発酵から、最終量２００ｍｇ／ｍｌの本発明のアルブミンＫ５７３Ｐ変異体を、材料及び方法の欄に記載の手段で精製した。
【０２９３】
精製は二段階で実施した。
第一段階では、AlbuPure（登録商標）マトリックス（ProMetic）を充填したカラム（層体積約４００ｍｌ、層高１１ｃｍ）を使用した。これを５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で平衡化し、新鮮な培養上清液を、約ｐＨ５．５〜６．５で、約２０ｍｇ／ｍｌマトリックスとなるように充填した。次にカラムを、約５カラム体積の５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）によりそれぞれ洗浄した。結合されたタンパク質を、約２カラム体積の５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタノエート（ｐＨ７．０）を用いて溶出した。全精製を通じて流速は１５４ｍｌ／分とした。
【０２９４】
第二段階では、第一段階の溶出物を水で約２倍に希釈し、酢酸でｐＨ５．３±０．３に調節したところ、導電性は２．５±０．５ｍＳ／ｃｍとなった。これを、８０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ オクタノエート（ｐＨ５．５）により平衡化されたDEAE-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）カラム（層体積約４００ｍｌ、層高１１ｃｍ）に負荷した。負荷は約３０ｍｇタンパク質／ｍｌマトリックスであった。カラムを約５カラム体積の８０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ オクタノエート（ｐＨ５．５）、続いて約１０カラム体積の１５．７ｍＭ カリウム四ホウ酸塩（ｐＨ９．２）により洗浄した。結合されたタンパク質を、２カラム体積の１１０ｍＭ カリウム四ホウ酸塩、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（約ｐＨ９．０）を用いて溶出した。流速は、負荷及び洗浄時は１８３ｍｌ／分、溶出時は１６９ｍｌ／分とした。
【０２９５】
流出物を濃縮し、Pall Centramate Omega 10,000 Nominal MWCO膜を用いて、１４５ｍＭ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレートし、最終タンパク質濃度約２００ｍｇ／ｍｌを得た。
【０２９６】
ｒＨＡ及びＫ５７３Ｐ変異体アルブミンの何れも２００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて５ｍｇ／ｍｌに希釈し、ｐＨを６．５〜６．７に調節した。これによって、EZ-Link（登録商標）マレイミド活性化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Thermo Scientific）のマレイミド反応基が、遊離スルフィドリルと反応し、安定したチオエステル結合を形成する上で好ましいｐＨ環境を確保した。２ｍｇのEZ-Link（登録商標）マレイミド活性化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのｒＨＡ又はＫ５７３Ｐ変異体アルブミンと混合した。この混合によって、アルブミン又はＫ５７３Ｐ変異体アルブミンは約２倍のモル過剰となった。この混合物を４℃で２４時間微小インキュベートした。次に、反応混合物におけるコンジュゲートを、ＧＰ−ＨＰＬＣを用いて調べた。
【０２９７】
非コンジュゲート種（ｒＨＡ、又はアルブミン変異体Ｋ５７３Ｐ及び未反応ＨＲＰ）を対応するコンジュゲート種から分離するべく、サンプルをまず濃縮し（Vivaspin20, 10,000 MWCO PES, Sartorius）、次に個別にTricorn Superdex（登録商標）200、10/300 GLカラム（GE Healthcare）に、ＰＢＳ中、流速４５ｃｍ／時で通過させた。溶出ピークを分別し、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析した。コンジュゲート種を含む画分をプールし、濃縮し、５０ｍＭ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレートし、ＧＰ−ＨＰＬＣで分析した（図２４）。
【０２９８】
次にこれらのサンプルを、本明細書に記載のBiacore法を用いて分析した（表２１）。本実施例は、Ｋ５７３Ｐが、ＷＴＣ ＨＳＡと比べて、ｓｈＦｃＲｎに対する親和性が高い状態で維持されることを示す。
【０２９９】
実施例１８．アルブミン及びＫ５７３Ｐ変異体へのフルオレセインのコンジュゲート
実施例１７で使用した２種のアルブミンサンプル、即ち約２００ｍｇ／ｍｌのｒＨＡ又はＫ５７３Ｐアルブミン変異体を、本実施例でも出発材料として用いた。
【０３００】
フルオレセイン−５−マレイミド（Themo Scientific）（Ｆ５Ｍ）をジメチルホルムアミドに溶解し、２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。次にこれを１８ｍｌのＰＢＳで更に希釈し、ｐＨを約６．５に調節した。この溶液に、１ｍｌの２００ｍｇ／ｍｌ ｒＨＡ又は１ｍｌの２００ｍｇ／ｍｌ Ｋ５７３Ｐ変異体を添加した。これにより、約２０倍の最終モル過剰のＦ５Ｍを得た。これらのサンプルをインキュベートし、暗室において４℃で一晩コンジュゲートさせることにより、Ｆ５Ｍ上のマレイミド基を、両アルブミン種に存在する遊離スルフィドリルと優先的に反応させた。
【０３０１】
一晩のインキュベーションの後、反応混合物のアリコートを５０ｍＭ ＮａＣｌに対して広範にダイアフィルトレートし、未コンジュゲートＦＳＭを除去した（Vivaspin20, 10,000 MWCO PES, Sartorius）。コンジュゲートは、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥに従い、コンジュゲート化フルオレセイン：：アルブミンの紫外線可視化により確認した（図２５）。
【０３０２】
次に、ダイアフィルトレートされたサンプルを、本明細書に記載のBiacore法を用いてアッセイした（表２１）。本実施例は、小分子のｒＨＡ又は変異体（例えばＫ５７３Ｐ等）へのコンジュゲートが、ｓｈＦｃＲｎへの結合親和性の傾向に影響を与えないことを示す。
【０３０３】
【表２１】
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【０３０４】
実施例１９．追加のアルブミン変異体
実施例１に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。Ｅ４９２Ｔ、Ｎ５０３Ｄ、 Ｅ４９２Ｔ＋Ｎ５０３Ｄ、Ｋ５３８Ｈ、Ｅ５４２Ｄ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ、Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ、Ｎ４０３Ｋ、Ｋ５４１Ａ及びＫ５４１Ｎ。実施例１５の記載に従ってＳＰＲ分析を実施した。結果を図２６及び２７に示す。
【０３０５】
図３０Ａ及び３０Ｂは、アルブミン変異体のｓｈＦｃＲｎ結合に対する効果を示す。ＨＳＡ内の置換Ｎ５０３Ｄ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａ、Ｅ４９２Ｔ＋Ｎ５０３Ｄ、Ｅ４９５Ｑ＋Ｔ４９６Ａは、ｐＨ５．５でのｓｈＦｃＲｎへの結合に対して負の影響を有した。
【０３０６】
実施例２０．Ｃ末端のアルブミンの変異体
実施例１に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。ｓｈＦｃＲｎに対する結合性を、材料及び方法の欄の記載に従って決定した。結果を表２２に示す。
【０３０７】
【表２２】
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【０３０８】
本実施例は、試験された全てのヒトアルブミンＣ末端スワップについて、ドナーアルブミンに対する結合性の上昇が観察されたことを示す。何れのドナー配列も、結合性を有意に向上させることが示されているＫ５７３Ｐ置換を含むが、Ｋ５７３Ｐ単独では結合性は低い（表２０）。
【０３０９】
実施例２１．変異体アルブミン融合体の競合結合分析
実施例１の記載に従って調製された変異体アルブミン融合体及び変異体アルブミンの選択を用いて、実施例４の記載に従って競合結合試験を実施した。結果を図２８〜３１に示す。
【０３１０】
競合結合の順位は、ＨＳＡ−ＦＬＡＧ及びＮ＋Ｃ末端ｓｃＦｖ ＨＳＡ−ＦＬＡＧの変異体融合については、個々のＨＳＡ変異体（融合の有無を問わず）の親和性データの順位と同一であった。ＩＬ１Ｒａに関して、変異体Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ａ及びＫ５００Ａは予測通りであったが、Ｄ５５０ＮはＷＴ融合体よりも効率的に阻害するように思われる。
【０３１１】
実施例２２．追加のＨＳＡ変異体
実施例１に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ａ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５７３Ａ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｈ＋Ｋ５７３Ａ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ｐ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５７３Ｐ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｈ＋Ｋ５７３Ｐ。材料及び方法の欄の記載に従ってＳＰＲ分析を実施した。その結果（図３２）は、全てのＨＳＡ変異体が、野生型ＨＳＡと比較して、ｓｈＦｃＲｎに対するｐＨ５．５での結合がより強かったことを示している。
【０３１２】
ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｈ＋Ｋ５７３Ａとは異なり、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ａ、ＨＳＡ Ｅ４９２Ｇ＋Ｎ５０３Ｋ＋Ｋ５７３Ａは、ＨＳＡ Ｋ５７３Ａの結合性よりもわずかに改善された結合性を有した。Ｋ５７３Ｐを含む組合せの変異体は、Ｋ５７３Ｐのみの変異体と比べて、より改善された結合性を示さなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月6日(2020.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、親アルブミン、その断片、又は、前記親アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有し、且つ、573、500、550、492、580、574、417、440、464、490、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、575、577、578、579、581、582及び584から選択される配列番号２の位置に対応する位置に置換を有し、但し、前記変異体は、配列番号２において置換D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E又はK574Nを有する配列からなる変異体ではない、アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
【外国語明細書】
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