(57)【要約】【課題】乳酸菌は、代謝により乳酸を産生する細菌類の総称であり、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であってもそれぞれの乳酸菌によって異なる性質を有している。そこで、乳酸菌の抽出、研究、検討を重ね、エンテロコッカス・フェカリスに属する乳酸菌の標準品とは免疫活性等において異なる性質を有する乳酸菌を見出すに至った。【解決手段】本発明では、  受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌を提供するものである。また、本発明では、前記乳酸菌の死んだ状態の乳酸菌を提供するものである。さらに、本発明では、前記乳酸菌を含有する食品や抗菌組成物を提供するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌。
【請求項２】
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の死んだ状態の乳酸菌。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の乳酸菌を含有する食品。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載の乳酸菌を含有する抗菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌及び同乳酸菌を含有する食品・抗菌組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、従来よりヨーグルトや漬物などの乳酸発酵食品として広く食されており、近年では、健康維持・増進に寄与する機能を有することに注目されている。
【０００３】
乳酸菌の中でもエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌は、球菌であるために、多量に摂取するのに適しており、体内の狭小部分にまで行き届けることができることから、健康維持や増進を促進する乳酸菌として期待されている。しかも、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌は、死んだ状態の乳酸菌（死菌）であっても、腸内において免疫細胞の活性化に寄与することが分かってきている。
【０００４】
そのため、従来より、特定の乳酸菌を抽出し、その乳酸菌の性質を研究することが広く行われている（たとえば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５１１４７７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
乳酸菌は、代謝により乳酸を産生する細菌類の総称であり、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であってもそれぞれの乳酸菌によって異なる性質を有している。
【０００７】
そこで、本発明者らは、乳酸菌の抽出、研究、検討を重ね、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の標準品とは免疫活性等において異なる性質を有する乳酸菌を見出すに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る本発明では、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌を提供する。
【０００９】
また、請求項２に係る本発明では、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の死んだ状態の乳酸菌を提供する。
【００１０】
また、請求項３に係る本発明では、請求項１又は請求項２に記載の乳酸菌を含有する食品を提供する。
【００１１】
また、請求項４に係る本発明では、請求項１又は請求項２に記載の乳酸菌を含有する抗菌組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る乳酸菌は、Enterococcus faecalisの標準品とは免疫活性において異なる特有な性質を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一酸化窒素産生量と乳酸菌濃度との関係を示すグラフ。
【図２】TNF-α産生量と乳酸菌濃度との関係を示すグラフ。
【図３】IL-6産生量と乳酸菌濃度との関係を示すグラフ。
【図４】阻止円の大きさのDunnett検定の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［乳酸菌の単離・同定］
大分県産の梅（豊後梅）の花から乳酸菌を乳酸菌用のＭＲＳ培地で分離培養してコロニーを得て、そのコロニーを用いてカタラーゼ試験及び顕微鏡観察で乳酸菌の簡易同定を行い、乳酸菌のコロニーと同定されるものについて16SrDNA（16SrRNA遺伝子）塩基配列解析による乳酸菌の同定を行った。
【００１５】
まず、梅の花を０．８５％食塩水で懸濁し、懸濁液をＭＲＳ brothにて３０℃で３日間培養した後に、ＭＲＳ agarにて３０℃で３日間培養することで、コロニーを形成させた。
【００１６】
次に、形成されたコロニーについて３％過酸化水素水を用いて気泡の発生の有無によるカタラーゼ試験を行うとともに、サフラニンを用いて染色の有無によるグラム染色を行って顕微鏡による目視観察を行うことで、乳酸菌の簡易同定を行った。簡易同定により、カタラーゼ陰性・グラム陽性のコロニーを乳酸菌のコロニーとして選択した。
【００１７】
次に、選択されたコロニーについてアルカリ熱抽出法を用いてＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡの16SrDNA領域をＰＣＲ増幅させた後にＤＮＡ精製を行い、16SrDNA領域のシークエンス解析を行った。
【００１８】
得られた塩基配列について相同性検索を行ったところ、大分県産の梅（豊後梅）の花から抽出された乳酸菌は、Enterococcus属のE.faecalisと同定された。
【００１９】
この大分県産の梅（豊後梅）の花から抽出された乳酸菌については、下記のように寄託している。
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）特許微生物寄託センター（NPMD)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  郵便番号292-0818）
受託日：２０１８年１０月３日
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９
【００２０】
［乳酸菌の免疫活性評価］
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７８９で寄託されているエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌（以下、「本乳酸菌」という。）について、乳酸菌の調整や細胞培養を行った後に、生細胞率や一酸化窒素産生量やサイトカイン量（TNF-α産生量とIL-6産生量）を測定することで乳酸菌の免疫活性の評価を行った。なお、免疫活性の評価においては、ヒトの腸由来のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の標準品と本乳酸菌とを比較した。
【００２１】
まず、乳酸菌の濃度を、市販されている乳酸菌飲料に含有されている菌数を参考にして、１０６cpm，１０７cpm，１０８cpmに調整し、６５℃で３０分間の熱不活処理を行い、４ｘ１０５cpmのRAW264.7マクロファージ細胞株に添加して５％二酸化炭素環境下で３７℃で２４時間培養した。
【００２２】
培養した細胞について生細胞率を測定したところ、濃度依存無く生細胞率が９５％以上であり、また、無添加の場合の生細胞率との差が確認されなかった。このことから、本乳酸菌には、細胞傷害性が無いことが分かった。
【００２３】
また、培養した細胞についてGriess法を用いて一酸化窒素産生量を測定したところ、図１に示すように、本乳酸菌の一酸化窒素産生量は、標準品と同様に濃度に依存して増加しており、免疫活性化が認められた。また、本乳酸菌では、標準品と比べると濃度依存度が低く、低い濃度であっても標準品よりも多く一酸化窒素を産生し、濃度を高めても標準品よりも一酸化窒素の産生を抑制し得ることが分かった。
【００２４】
また、培養した細胞についてELISA法を用いて２４時間後の細胞上清液中のTNF-α産生量を測定したところ、図２に示すように、本乳酸菌のTNF-α産生量は、標準品と同様に濃度に依存して増加しているが、本乳酸菌では、標準品と比べると濃度依存度が若干高く、低い濃度では標準品よりもTNF-αの産生を抑制し、高い濃度では標準品よりもTNF-αの産生を促成し得ることが分かった。
【００２５】
また、培養した細胞についてELISA法を用いて２４時間後の細胞上清液中のIL-6産生量を測定したところ、図３に示すように、本乳酸菌のIL-6産生量は、標準品と同様に濃度に依存して増加しているが、本乳酸菌では、標準品と比べると濃度依存度が低く、低い濃度であっても標準品よりも多くIL-6を産生し、濃度を高めても標準品よりもIL-6の産生を抑制し得ることが分かった。
【００２６】
このように、本乳酸菌では、サイトカイン量（TNF-α産生量とIL-6産生量）が濃度に依存して増加しており、Th1型細胞を活性化し、免疫力を強化し得ることが確認された。
【００２７】
［内生代謝物解析］
本乳酸菌について、メタボローム解析を用いて、内生代謝物を解析した。なお、内生代謝物の解析においても、標準品と本乳酸菌とを比較した。
【００２８】
本乳酸菌の内生代謝物には、標準品の内生代謝物と比べて、クエン酸とバリン・イソロイシン・セリン等のアミノ酸が多く、乳酸やフマル酸やリンゴ酸やコハク酸やロイシン・グリシン等のアミノ酸が少ないことが分かった。特に、本乳酸菌では、クエン酸の濃度が標準品の場合のクエン酸の濃度に比べて１６３％であり、クエン酸の内生代謝が標準品と比べて顕著に多いことが分かった。
【００２９】
以上に説明したように、本乳酸菌は、免疫活性（一酸化窒素産生量やサイトカイン量（TNF-α産生量とIL-6産生量））や内生代謝物においてEnterococcus faecalisの標準品とは異なる特有な性質を有していることが分かった。
【００３０】
そのため、本乳酸菌は、新たに医薬品や食品や健康補助食品などに適用することもできる。
【００３１】
また、本乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であることから、死んだ状態（死菌）であっても免疫活性の効果を有しており、加工を加えても品質を保持することができる。
【００３２】
［乳酸菌の抗菌性評価］
本乳酸菌について、乳酸菌の調整や細胞培養を行った後に、皮膚常在菌であるStaphylococcus epidermidisに対する抗菌性の評価を行った。
【００３３】
抗菌性の評価は、濃度を１０5cpm，１０6cpm，１０7cpmに調整した乳酸菌についてペーパーディスク法を用いて行った。
【００３４】
まず、純水、１０7cpmのStaphylococcus epidermidis、１０6cpmのStaphylococcus epidermidisそれぞれをMRS寒天培地に播き、それぞれの培地にペーパーディスクを置き、それぞれの濃度の本乳酸菌を50μLずつ添加して、培養した。
【００３５】
その後、金の薬剤感受性を示す阻止円がペーパーディスクに形成されるかを観察した。
【００３６】
その結果、純水培地では阻止円が形成されなかったが、Staphylococcus epidermidisを播いた培地では、阻止円が形成された。
【００３７】
そこで、形成された阻止円について大きさを測定し、Dunnett検定を行った。その結果を図４に示す。
【００３８】
図４に示すように、１０5cpm，１０6cpm，１０7cpmの本乳酸菌について、いずれも純水培地の場合に比べて有意差が見られ、また、いずれでも大きな阻止円が形成されており、本乳酸菌の濃度が高いほど大きな阻止円が形成される傾向であることが分かった。
【００３９】
このことから、本乳酸菌は、Staphylococcus epidermidisに対して抗菌作用を有することが分かる。
【００４０】
Staphylococcus epidermidisは、グラム陽性の皮膚常在菌であり、汗や皮脂からグリセリンや脂肪酸を産生することが知られている。そして、グリセリンが皮膚バリア機能の維持に関与し、脂肪酸が雑菌の増殖抑制に関与することから、Staphylococcus epidermidisは、肌を健康な状態に保つのに重要な役割を担う菌である。
【００４１】
そのため、本乳酸菌は、抗菌作用を発揮する化粧品や抗菌剤などの抗菌組成物に適用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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