(57)【要約】【課題】少量のストレプトリジンＯを使用することにより、高い感度が得られる抗ストレプトリジンＯ測定試薬を提供する。【解決手段】緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなる抗ストレプトリジンＯ測定試薬であって、第１試薬の緩衝溶液中にポリビニルピロリドンを含有する抗ストレプトリジンＯ測定試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなる抗ストレプトリジンＯ測定試薬であって、第１試薬の緩衝溶液中にポリビニルピロリドンを含有する抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
【請求項２】
第１試薬の緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液およびＭＥＳ緩衝液からなる群より選択されるいずれかである請求項１に記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
【請求項３】
第１試薬の緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水である請求項２に記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
【請求項４】
第１試薬の緩衝溶液中に含有するポリビニルピロリドンの濃度が０．０５％から０．４％である請求項１から３のいずれかに記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ストレプトリジンＯ測定試薬（以下、「ＡＳＯ試薬」と表記することもある。）に関する。より詳しくは、ストレプトリジンＯを使用したラテックス凝集比濁法を測定原理とした抗ストレプトリジンＯ測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラテックス凝集比濁法を測定原理とした測定試薬を製造するためには、測定対象物質と結合する抗体もしくは抗原をラテックス粒子に感作する必要がある。例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するストレプトリジンＯ（以下、「ＳＬＯ」と表記することもある。）をラテックス粒子に感作すれば、ＳＬＯに対する抗体価（ＡＳＯ価）を測定することが可能であり、ＳＬＯは溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのＡＳＯ測定試薬の原料として広く使用されている。
【０００３】
従来はラテックス粒子とＳＬＯとの疎水性相互作用による物理的吸着法が広く採られ、得られたラテックス粒子とＳＬＯとの複合体をＢＳＡなどの免疫学的に不活性なタンパク質を溶解した緩衝液に懸濁した試薬の状態で保存するのが一般的であった（特許文献１）。しかし、このようにして調製された試薬では試薬を調製する条件により、担体同士の自己凝集が起こったり、感作したＳＬＯの脱離などが起こったりして試薬の反応性が低下し、本来の測定性能が発揮できない場合があった。そこで、ラテックス粒子とＳＬＯとを共有結合させることにより、ＳＬＯの脱離を防止して試薬の安定性を向上させる方法が提案されている（特許文献２、３）。
【０００４】
しかしながら、ＡＳＯ試薬の調製においてはラテックス粒子に感作させるＳＬＯが非常に高価であり、試薬の安定性のみならず、少量のＳＬＯで高い感度が得られるＡＳＯ試薬の調製方法を構築することが望まれていた。ただ、物理吸着法とは異なり、共有結合によるラテックス試薬の調製においては、共有結合の種類、ラテックス粒子の種類、抗体もしくは抗原を感作させる条件、ブロッキング条件、洗浄条件、ラテックス粒子の最終保存緩衝液の種類など試薬性能に与えるファクターが多数存在し、それらの条件を体系的に評価し、最適な条件を見出すことは非常に困難であった。これまでに、感度向上に関わる添加剤を第１試薬に添加する手法も報告されているが、いずれの試薬組成でも十分な効果があるとは限らず、逐一検討する必要があった（特許文献４、５，６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２０３６４２号公報
【特許文献２】特開２００３−３４４４１０号公報
【特許文献３】特許第４７０４６６２号公報
【特許文献４】特許第３８８６６３９号公報
【特許文献５】特開平１１−３４４４９２号公報
【特許文献６】特許第２９９６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる現状に鑑み創作されたものであり、その目的は少量のＳＬＯで、高い感度が得られるＡＳＯ試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、測定試薬の感度を高めるための化合物を鋭意探索した結果、ポリビニルピロリドンを第１試薬に添加することによりラテックス試薬の感度を高めることができることを見出した。さらに、ポリビニルピロリドンの添加濃度を最適化すれば、直線性を失うことなく、感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の列挙するものが例示される。
［項１］
緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなる抗ストレプトリジンＯ測定試薬であって、第１試薬の緩衝溶液中にポリビニルピロリドンを含有する抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
［項２］
第１試薬の緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液およびＭＥＳ緩衝液からなる群より選択されるいずれかである項１に記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
［項３］
第１試薬の緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水である項２に記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
［項４］
第１試薬の緩衝溶液中に含有するポリビニルピロリドンの濃度が０．０５％から０．４％である項１から３のいずれかに記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡＳＯ試薬は、少量のＳＬＯを用いた場合であっても、感度の高い測定を可能とする点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例２において、低分子添加剤によるＡＳＯ試薬の測定感度への影響を検討した結果を示す図である。
【図２】実施例３において、高分子添加剤によるＡＳＯ試薬の測定感度への影響を検討した結果を示す図である。
【図３】実施例４において、ポリビニルピロリドンによる測定感度向上の効果を検討した結果を示す図である。
【図４】実施例５において、ポリビニルピロリドンによる測定感度向上の効果を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ＳＬＯ）
本発明に用いるＳＬＯとしては、特に限定されず、例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するＳＬＯや組換え大腸菌などを用いて生産された遺伝子組換えのＳＬＯ、また、一部のアミノ酸配列を欠損させた改変型のＳＬＯ、さらにはＭＢＰなどを融合させた融合型ＳＬＯを使用しても良い。例えば、ＷＯ２０１７／２０４３２５に開示されているＳＬＯが具体的に例示される。
【００１２】
（ラテックス粒子）
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されないが、例えば、スチレンスルホン酸、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸エステルなどを共重合させたポリスチレン粒子にカルボキシル基を導入した共有結合法向けのラテックス粒子が挙げられる。また、物理吸着を抑制するため、つまり、親水度を高めるためにポリアクリルアミドを含んだラテックス粒子を使用することもできる。好ましくは、アクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられ、さらに好ましくはポリアクリルアミドにより親水度が高められたアクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられる。
【００１３】
カルボキシル基の導入効率は適宜選択されるが、好ましくは５０μｅｑ／ｇ〜３００μｅｑ／ｇ、より好ましくは７０μｅｑ／ｇ〜２５０μｅｑ／ｇ、さらに好ましくは９０μｅｑ／ｇ〜２００μｅｑ／ｇの割合でカルボキシル基が導入されたラテックス粒子である。
【００１４】
使用するラテックス粒子の平均粒径は、目的・用途に応じて適宜選択されるが、本発明においては、自動分析機向けであれば、好ましくは５０ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくは６０ｎｍ〜２００ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍ〜１５０ｎｍの粒径のラテックス粒子であることが好ましい。また、目視判断用の試薬向けであれば、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ、よりこのましくは２００ｎｍ〜４００ｎｍのラテックス粒子であることが好ましい。
【００１５】
（ＳＬＯをラテックス粒子へ感作する方法）
ラテックス粒子の表面に有するカルボキシル基にＳＬＯのアミノ基を結合させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミドが使用できる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを併用して、不安定なアシルイソ尿素中間体を、アミンと反応しやすいより安定したスクシンイミジルエステルに変換させてもよい。
【００１６】
（ブロッキング）
また、本発明の免疫測定試薬においては、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、例えば、アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、これら蛋白質の分解物、アミノ酸、界面活性剤等の１種類もしくは２種類以上を前記不溶性担体に更に担持させても良い。ブロッキング剤の濃度は適宜決められるが、好ましくは０．１％〜５％、さらに好ましくは１％〜３％である。処理温度についても適宜決められるが、好ましくは４℃〜３０℃、さらに好ましくは４℃〜２０℃である。処理時間についても適宜決められるが、好ましくは０．５時間〜２４時間、さらに好ましくは１時間〜１６時間である。
【００１７】
（洗浄）
ブロッキング反応後の洗浄工程においては、各種界面活性剤を含む緩衝液での洗浄を実施することが望ましい。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ、デオキシコール酸などが挙げられる。使用濃度は適宜決められるが、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などが好適である。
【００１８】
（測定試薬）
本発明において、ＡＳＯ試薬は、２つの試薬から構成されてなり、緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなるものである。そして、第１試薬の緩衝溶液中にポリビニルピロリドンを含有することを特徴とする。
【００１９】
本発明の免疫測定法としては、本発明のＡＳＯ試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を、光学的に観察または目視により観察する。抗原抗体反応のｐＨの好ましい下限は５、上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９である。反応の温度の好ましい下限は４℃、上限は５０℃であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃である。反応時間は適宜決められるが、第２試薬と混合後、１〜１０分間程度反応させることが望ましい。目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを、判定板上にて室温で混合し、１〜５分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる
【００２０】
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。係る緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液等の緩衝液が好適に挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
上記媒体は、反応の感度を高めるために、水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ−，Ｉ−，ＳＣＮ−等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。
【００２２】
本発明においては、特に第１試薬においてポリビニルピロリドンを使用することを特徴とする。第１試薬に添加するポリビニルピロリドンの濃度としては、第１試薬溶液の最終濃度として、０．０５％〜０．４％、より好ましくは０．０７％〜０．３６％、さらに好ましくは０．０９％〜０．３３％、特に好ましくは０．１％〜０．３％が望ましい。
【００２３】
（ＡＳＯ試薬の評価方法）
ＡＳＯ試薬の性能としては、検出感度、測定範囲、測定精度、再現性、安定性などの項目が挙げられる。本発明によれば、第１試薬にポリビニルピロリドンを添加すれば、測定試薬の感度が向上する。ＡＳＯ試薬における測定レンジの上限としては、６００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは８００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは１０００ＩＵ／ｍｌ、特に好ましくは１２００ＩＵ／ｍｌである。尚、ＩＵ／ｍｌとは、世界保健機関（ＷＨＯ）が定めた抗ストレプトリジンＯ抗体の国際単位に基づいたものである。このため、ＡＳＯ試薬の感度評価においては、上記の測定レンジを考慮することが好ましい。
【００２４】
本発明におけるＡＳＯ試薬は、感度並びに広い範囲での定量性を有するものである。
【００２５】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は、実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［実施例１］ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製
メルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０−２１）０．１４ｍＬを遠心分離し、上清を抜き取った。次に５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を１ｍＬ添加し、十分に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い、上清を抜き取った。さらに、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を０．７ｍＬ添加した。これに４％カルボジイミド（ＥＤＣ）０．３５ｍＬ及び２．４％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．３５ｍＬを加えて、ラテックス粒子の１％濃度とした状態で、２５℃で１５分撹拌し、カルボキシル基を活性化した後、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ  カリウムリン酸緩衝液（以下、「ＫＰＢ」と示す。）（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、再び、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、超音波にて分散させることで、活性化ラテックス粒子とした。ＷＯ／２０１７／２０４３２５の実施例２に記載の方法で調製したストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を３．０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるよう５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解した。次に、活性化ラテックス粒子０．７ｍＬとＳＬＯ溶液０．７ｍＬを混合し、２５℃にて２時間撹拌混合することで、ＳＬＯをラテックス粒子に共有結合させた。
【００２７】
次に、遠心分離を行い、上清を除去した後、ブロッキンング溶液（２％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））で２ｍＬに再懸濁した。再び、遠心分離により、上清を除去し、１．４ｍＬのブロッキング溶液を添加し、超音波にて分散させた後、４℃で一晩、撹拌した。その後、遠心分離を行い、上清を除去し、最終緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））１．４ｍＬに再懸濁した。続いて、超音波にて分散させた後、４℃で１時間、撹拌した。再び、遠心分離により、上清を除去し、２ｍＬの最終緩衝液を添加し、超音波にて十分に分散させた後、２．６７ｍＬの最終緩衝液を添加して、第２試薬とした。
【００２８】
［実施例２］測定感度を向上させる低分子化合物の探索
本発明のＡＳＯ試薬におけるベースの第１試薬としては、０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を調製した。続いて、測定感度の向上に効果が知られる低分子化合物、硫酸ナトリウム（ナカライテスク製）及びリンゴ酸（ナカライテスク製）を第１試薬の添加剤として評価した。
【００２９】
次に、自動分析装置日立７１８０（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各ラテックス粒子を用いた場合の感度比較を実施した。まず、第１試薬１２０μｌに各濃度（８００、４００ＩＵ／ｍｌ）のＡＳＯ標準液１．５μｌを添加撹拌し、３７℃で適時保持した後、第２試薬３０μｌを添加撹拌し、この後、３００秒後から６００秒後間の波長５４６ｎｍでの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を評価した。結果は、表１及び図１に示した。第１試薬（０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））に添加剤を加えていない条件Ａに対して、５％の硫酸ナトリウムを添加した条件Ｂ、５％のリンゴ酸を添加した条件Ｃ、いずれの条件でも、顕著な感度上昇は見られなかった。
【００３０】
【表１】
2020076691.tif 000002
【００３１】
［実施例３］測定感度を向上させる高分子化合物の探索
実施例２の低分子化合物に加えて、測定感度の向上に効果が知られる高分子化合物、ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク製）、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ナカライテスク製）、ポリビニルピロリドンＫ−９０（ナカライテスク製）を第１試薬の添加剤として評価した。次に、自動分析装置日立７１８０（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各ラテックス粒子を用いた場合の感度比較を実施した。まず、第１試薬１２０μｌに各濃度（８００、４００ＩＵ／ｍｌ）のＡＳＯ標準液１．５μｌを添加撹拌し、３７℃で適時保持した後、第２試薬３０μｌを添加撹拌し、この後、３００秒後から６００秒後間の波長５４６ｎｍでの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を評価した。
【００３２】
結果を、表２及び図２に示した。第１試薬（０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））に添加剤を加えていない条件ａに対して、０．２％のＰＥＧ６０００を添加した条件ｂでは顕著な変化は見られなかった。また、０．１％の塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を添加した条件ｄでは、大幅なブランクアップが見られ使用できないことが分かった。一方、０．１％のポリビニルピロリドンを添加した条件ｃでは、ブランクアップも見られず、感度が上昇することを見出した。
【００３３】
【表２】
2020076691.tif 000003
【００３４】
［実施例４］ポリビニルピロリドンによる感度上昇の確認
実施例３の通り、ポリビニルピロリドンによる感度上昇の効果を確認できたため、再度、実施例１に記載の方法で、第１試薬を調製し、第２試薬としては各濃度（０．５％、０．３％及び０．１％）のポリビニルピロリドンＫ−９０（ナカライテスク製）及び０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を調製し、実施例３と同様にして感度評価を行った。その結果、０．１％のポリビニルピロリドンを含む第２試薬を用いた場合では、実施例３の結果を再現し、わずかな感度上昇を確認した。また、０．３％のポリビニルピロリドンを含む第２試薬を用いた場合では、さらに感度が上昇することを明らかにした。０．５％のポリビニルピロリドンを含む第２試薬を用いた場合では、感度がさらに上昇するものの、８００（ＩＵ／ｍｌ）の点では感度が定常になっていることを確認した。つまり、０．１％から０．３％のポリビニルピロリドンを第１試薬に添加することで、直線性を損なわずに、感度を上昇させることができることを見出した。
【００３５】
【表３】
2020076691.tif 000004
【００３６】
［実施例５］ポリビニルピロリドンによる感度上昇の汎用性確認
市販されているＹａｓｈｒａｊ社製組換えストレプトリジンＯ（製品番号：ＦｒＳＬＯ−２９）を用いて、実施例１に記載されている方法で、第２試薬を作成した。尚、上記市販のストレプトリジンＯの製品組成は、実施例１でＳＬＯを溶解するのに用いた緩衝液とは異なったため、５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）へバッファー置換した後、使用した。続いて、実施例４と同様にポリビニルピロリドンの影響を確認したところ、このストレプトリジンＯにおいても、ポリビニルピロリドンによる感度上昇を確認することができた。さらに、実施例４と同様、ポリビニルピロリドンを０．５％濃度まで添加した際には８００ＩＵ／ｍｌで定常になる現象が見られた。
【００３７】
実施例１で使用した組換えストレプトリジンＯは、ＷＯ／２０１７／２０４３２５に記載の通り、Ｃ末端領域を欠損した改変型のＳＬＯである。また、本実施例で使用した組換えストレプトリジンＯは全長型の分子量約６９ｋＤａのＳＬＯであり、ラテックスに感作したポリペプチド配列は完全に同一ではないが、抗ストレプトリジンＯの測定試薬の第１試薬におけるポリビニルピロリドンの同様な役割を見出すことできた。
【００３８】
【表４】
2020076691.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、測定感度に優れた診断薬として、特に医療分野において有用な技術を提供するである。
【図１】
2020076691.tif 000006
【図２】
2020076691.tif 000007
【図３】
2020076691.tif 000008
【図４】
2020076691.tif 000009