(57)【要約】      （修正有）【課題】明確な基準に基づいて定められた閾値に基づいて出力データを分割することが可能な、ハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法の提供。【解決手段】特定コピー数の核酸を含む一以上の標準試料を用いてハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法であって、ａ）標準試料及びシーケンス試料に対し同一の条件においてライブラリー調製を行うステップ、ｂ）調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、標準試料及びシーケンス試料に由来するリードを含む出力データを得るステップ、及びｃ）出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、出力データ中のリードを閾値以下のリードと閾値以上のリードに分割するステップ、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定コピー数の核酸を含む一以上の標準試料を用いてハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法であって、
ａ）前記標準試料及びシーケンス試料に対し同一の条件においてライブラリー調製を行うステップ、
ｂ）ステップａ）で調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、前記標準試料及び前記シーケンス試料に由来するリードを含む出力データを得るステップ、及び
ｃ）前記出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、前記出力データ中のリードを前記閾値以下のリードと前記閾値以上のリードに分割するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ステップａ）の標準試料とシーケンス試料のライブラリー調製を、同一の反応系で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記閾値が、前記ステップｂ）で得た前記標準試料に由来するリード数に所定の係数をかけて得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップａ）において、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）における閾値を定めるための標準試料を選択するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップａ）において、複数のウェルを用いて同一のシーケンス試料を解析し、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）において、複数のウェル間でデータを正規化し、定めた閾値を複数のウェル間に適用して解析する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップｃ）において、複数の標準試料間で正規化したデータに基づいて、特定コピー数と出力リード数の関係式を導き、その逆関数を用いて出力リード数からコピー数を推定し、前記推定されたコピー数を基準に閾値を定める、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップａ）において、同一の特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）において、複数の標準試料のリード数の平均値又は中央値に基づいて閾値を定める、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記特定コピー数が、２００コピー以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記特定コピー数が、１０コピー以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップｃ）において、前記出力データ中の前記閾値以下のリードを除き、前記閾値以上のリードについてデータ解析を行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに行わせるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法、該方法を行うためのキット、及び該方法をコンピュータに行わせるためのプログラム等に関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンサー（ＮＧＳ）等のハイスループットシーケンサーは、多数のＤＮＡの塩基配列を並列的に解読する技術で、検体試料から抽出したＤＮＡから大量の塩基配列データを取得できることから、遺伝子検査等に広く使用されている。そのデータは「リード」と呼ばれる単位で管理される。例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社のシーケンサーの場合、１リードはフローセルの１クラスターから得られた塩基配列データに相当する。ハイスループットシーケンサーでは通常、ライブラリー調製時に核酸分子をＰＣＲで増幅しているため、増幅産物が複数のクラスターを形成し、複数のクラスターから同じ塩基配列が得られる。これを、「リード数」という単位で管理し、「配列ＡがＮリードある」又は「配列Ａのリード数はＮ本である」等と表現する。
【０００３】
ハイスループットシーケンサーにおいて、リード数の少ない配列を解析に使用するか否かは解析上の課題である。リード数の少ない配列は、例えば、シーケンス時に生じたエラーによる配列、ＰＣＲ後に混入したサンプル由来の配列、フローセル中に残っている前回のサンプル由来の配列（フローセルが再利用できるハイスループットシーケンサーの場合）等の種々のエラーソースに起因し得る。リード数がどの程度あればその配列が解析に使用する価値があると言えるのか、これまで明確な基準はなかった。解析を行う配列を選択するために、従来はｃｌｃｌｅａｎｓｅｑｖ、Ｖｓｅａｒｃｈ等のソフトウェアを用いて求めた閾値からデータを除去する方法が知られている。
【０００４】
また、特許文献１（特表２０１８−５１４２０７）には、種々のエラーソースが原因のシーケンシングの不正確性を抑制しつつ、少量および／または対立遺伝子頻度の低いＤＮＡ分子の配列を決定する方法を開発することを目的として、特異的分子インデックス（ＵＭＩ）を用いてサンプルの核酸断片配列を決定するための方法等が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のソフトウェアを用いて求めた閾値からデータを除去する方法は、出力データ上で閾値を予測し、これを基準にリードをトリミングしているにすぎなかった。したがって、この方法では、閾値とするリード数の値が適切であるか不明であり、明確な基準に基づいて出力データを分割することができなかった。
【０００６】
また、特許文献１に記載の発明は、シーケンス反応のエラーによるシーケンスの不正確性を抑制することのみを対象としており、解析する価値がない配列の発生理由を網羅できておらず、したがって解析する価値がない配列を除去するため等の閾値を決められないという問題は解消できない。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、明確な基準に基づいて定められた閾値に基づいて出力データを分割することが可能な、ハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、特定コピー数の核酸を含む一以上の標準試料を用いてハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法であって、ａ）前記標準試料及びシーケンス試料に対し同一の条件においてライブラリー調製を行うステップ、ｂ）ステップａ）で調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、前記標準試料及び前記シーケンス試料に由来するリードを含む出力データを得るステップ、及びｃ）前記出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、前記出力データ中のリードを前記閾値以下のリードと前記閾値以上のリードに分割するステップ、を含む方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、明確な基準に基づいて定められた閾値に基づいて、出力データを分割することが可能となる。これにより、例えば出力データから解析に使用すべきデータとそうでないデータの区別が可能となり、より信頼性の高い解析結果が得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例２におけるＮＧＳにより得られたリードの配列割合を示す。図１では、生データに加えて、生データからＤＮＡ６００−Ｇのリード数以下の配列をデータから除去したデータ（ゴースト除去後）も示している。図１は、１０コピーのＤＮＡ６００−Ｇのリード数を基準にそれ以下のリード数の配列を除くと、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓの２種類の微生物のリード、並びにその他のリードが除去されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜データ解析方法の概要＞
一態様において、本発明は、特定コピー数の核酸を含む一以上の標準試料を用いてハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法に関する。
【００１２】
本明細書において、「特定コピー数」は、標準試料中に含まれる核酸のコピー数が所定の値であることを意図する。特定コピー数は、その値に対する幾らかの不確かさ（例えば、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±５％以内、±３％以内、又は±１％以内）の存在を許容し、不確かさは、本明細書に記載の「値付け」により決定することができる。
【００１３】
本明細書において、「核酸」及び「核酸分子」は互換的に使用され、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、これら核酸のアナログ等も含まれる。核酸は、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。また、核酸は、ゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡ又はその断片といった天然核酸、人工合成された核酸又はその断片といった人工核酸のいずれでもよい。
【００１４】
核酸分子としては、特に限定はされないが、核酸分子の溶液又は微小領域や担体によって微小区画化された分散液であっても良い。溶液又は分散液の媒質としては、水、エタノール、ＤＭＳＯ、アセトン、ＤＭＦといった水溶性の溶媒であってよい。担体としては、金属粒子、磁性粒子、セラミック粒子、高分子粒子、タンパク質粒子のようないずれの形態であってもよい。核酸分子を含む試料は、細胞、ウイルス、ドロップレット、及びエマルジョン等のいずれの形態であってもよい。
【００１５】
本明細書において、「標準試料」とは、特定コピー数の核酸を含む試料であり、後述する出力データを分割するステップにおいて、シーケンス試料に由来するリードを含む出力データを解析するための閾値を定めるための基準となる試料である。
【００１６】
標準試料としては、特に限定はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、上記核酸分子又は核酸を含む試料、例えば細胞であってよい。細胞としては、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。動物細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞等が挙げられる。分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；線維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞等が挙げられる。未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞等が挙げられる。真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、容器内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、全ての細胞について、細胞分裂による細胞内核酸量変化を低減化するために、死細胞であることがより好ましい。死細胞であると、細胞分裂が起こり、細胞内核酸量が変化することを防ぐことができる。
【００１８】
本明細書において、「シーケンス試料」とは、本発明の方法による解析の対象となる、核酸を含む試料を意味する。シーケンス試料は特に制限されないが、例えば、上記核酸分子又は核酸を含む試料、例えば細胞；血液、血漿、血清、唾液、髄液、組織浸出液等の体液；生体組織（例えば、生検組織又はFFPE等の組織標本）、尿、乳、及び毛髪；環境サンプル（海、川、土壌、大気等）；食品（例えば、畜肉又は魚肉）、サプリメント、医薬品（例えばバイオ医薬品）、及びこれらの製造器具；並びに医療器具が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、「ハイスループットシーケンス」とは、サンガーシーケンス等のいわゆる第一世代のシーケンスよりも大量のデータが得られるシーケンスを意味する。ハイスループットシーケンスでは、例えば、１０２以上、１０３以上、１０４以上、又は１０５以上の分子が同時にシーケンシングされる。本明細書において、ハイスループットシーケンスには次世代シーケンシンス（ＮＧＳ）が包含され、次世代シーケンシンスには、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるハイスループットシーケンスが包含される。次世代シーケンスでは、様々な市販のシーケンサーを利用することができ、例えば、第二世代シーケンスであれば、例えばＭｉｓｅｑ・Ｈｉｓｅｑ・ＮｅｘＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、第三世代シーケンスであれば、例えばＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ・Ｓｅｑｕｅｌ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、第四世代シーケンスであれば、例えばＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等のシーケンサーを利用することができる。なお、本明細書において、「第二世代シーケンス」とは、例えば、アダプター配列を介して基板に連結させ、アダプター配列をプライミング部位として反応を行うシーケンスを指す（詳細については、例えばＲｉｃｋ  Ｋａｍｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，２０１７，１８（２），ｐ．３０８を参照されたい）。また、本明細書において、「第三世代シーケンス」とは、例えば、ＳＭＲＴｂｅｌｌと呼ばれる、閉環上一本鎖環状ＤＮＡを鋳型とし、これをＺＭＷと呼ばれるシーケンスユニットに導入し、各ＺＭＷにおいて４つの蛍光標識ヌクレオチドを用いてポリメラーゼにより核酸複製反応を行い、これに伴って生ずる蛍光パルスに基づいて反応を行うシーケンスを指す（詳細については、例えばＡｎｔｈｏｎｙ  Ｒｈｏａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３，２０１５，ｐｐ．２７８〜２８９を参照されたい）。また、本明細書において、「第四世代シーケンス」とは、核酸分子がナノポアを通過又はナノポアに近づいた場合に生ずる電流の変化をデータとして得、これに基づきソフトウェア等を介して行うシーケンスを指す（詳細については、例えばＨｅｎｇｙｕｎ  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４，２０１６，ｐｐ．２６５〜２７９を参照されたい）。
【００２０】
＜データ解析方法に含まれるステップ＞
本発明のデータを解析する方法は、ａ）ライブラリー調製を行うステップ、ｂ）ステップａ）で調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、出力データを得るステップ、及びｃ）前記出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて出力データ中のリードを分割するステップを含む。また、本発明の方法は、前記ａ）のステップの前に、ｘ）試料を容器に充填するステップを任意に含み得る。本発明の方法に含まれ得る各ステップについて、以下で詳細に説明する。
【００２１】
ｘ）試料充填ステップ
試料を容器に充填するステップ（「試料充填ステップ」とも記載する）では、標準試料及び／又はシーケンス試料を容器に充填する。試料の充填方法は、特には限定されないが、例えばそれらを希釈せず直接、又はそれらの系列希釈によって作製された複数の溶液及び／又は分散液を規定量充填するか、含まれる核酸分子数が既知である微小領域及び担体の個数計測に基づいて充填することができる。充填方法の選択は、各水準に求められる充填精度や充填時間によって最良の方法を選択することができる。また、試料の充填後に、値付けを行ってもよい。本明細書において、値付けとは、実験により不確かさの値を決定することを意味する。値付けを行う場合、各充填部位に値付けられる不確かさは、前述の充填方法や系列希釈の作製方法について適切に算出することができる。試料の充填（及び含まれる場合、その後の値付け）は、例えば実施例に記載された通りに行うことができる。
【００２２】
試料充填容器
試料充填を行うための容器の形態としては、特に限定はされないが、少なくとも１つ以上の充填部位を有し、その充填部位の形状は、後のシーケンスステップを行うために、一般的なサーマルサイクラーの金型に一致するものとすることができる。充填容器の材質としては、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。充填部位の容積は、特に限定はされないが、一般的な核酸検出に用いられる試料量を考慮すると１μＬ〜１０００μＬの容積を有するものであってよい。充填容器の色は、透明、半透明、着色、完全遮光等の何れのものであってもよい。また、充填容器は、異物混入又は充填物の流出を防ぐために、密閉されていることが望ましい。密閉手段の形態としては、少なくとも１つの充填部位を密閉可能であり、一つ一つの充填部位を個別に密閉又は開封できるように切り離し可能なものであってもよく、又は切り離されていても良い。密閉手段の形状としては、容器内壁径と一致するキャップ状か充填部位開口部を被覆する接着フィルム状であってよい。例えば、全ての充填部位を一度に密閉可能なように接着フィルム状であってよい。また、使用者のミスを低減できるように再開封が必要な部位と不必要な部位との接着強度が異なるものであってよく、さらに、それらの間に切り取り線を有していてもよい。
【００２３】
本発明の方法が試料充填ステップを含まない場合、後述するライブラリー調製ステップでは、例えば試料が既に充填された容器を用いて、ライブラリー調製ステップを行うことができる。
【００２４】
ａ）ライブラリー調製ステップ
本発明の方法は、標準試料及びシーケンス試料に対し同一の条件においてライブラリー調製を行うステップ（「ライブラリー調製ステップ」とも記載する）を含む。
【００２５】
ライブラリー調製とは、後述するシーケンス反応に供するために核酸試料を前処理する工程である。ライブラリー調製工程の詳細は当業者に公知である。ライブラリー調製工程は、シーケンス法ごとに異なり得、限定するものではないが、例えば以下の工程の一以上又は全てを含む：１）シーケンサーのリード長に合わせた、核酸の酵素的又は機械的な断片化；２）ＰＣＲ等による、後のシーケンス工程に必要なアダプター配列の付加；３）任意に、上記２）の前又は後の、ＰＣＲ等による特定の核酸断片の増幅（遺伝子領域の増幅は、例えば４〜５０サイクルの増幅ステップにより行うことができる）；並びに４）核酸分子の精製。各工程は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば本願実施例に記載の条件を参照することができる。ライブラリー調製工程は、市販のキット、例えば、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲ−Ｆｒｅｅ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）ＡＣＣＥＬ−ＮＧＳ（商標）ライブラリー調製キット（Ｓｗｉｆｔ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ社）、Ｒａｐｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））等を用いて行うこともできる。
【００２６】
標準試料をシーケンス試料と同一の条件においてライブラリー調製を行うことで、後述するシーケンス反応において、標準試料に由来するリード数に基づいて閾値を定めることが可能となる。この閾値に基づいて、後述する分割ステップにおいて、出力データ中のリードを、例えば解析する価値のある配列と、エラーソースに起因し得る配列に分割することができる。
【００２７】
標準試料をシーケンス試料と同一の条件でライブラリー調製するとは、上記で例示したライブラリー調製の各工程の有無及び順序、並びにその条件（例えば、試薬濃度及び反応温度等）が完全又は本質的に同一であることを意図する。ここで、本質的に同一とは、標準試料に由来するリード数に基づいて閾値を定めるという目的に照らし、ライブラリー調製条件が、均等であるものの、本質的でない差異（例えば、実験誤差や反応条件の微差等）を許容することを意図する。
【００２８】
一実施形態において、ライブラリー調製を同一の反応系で行う。同一の反応系とは、例えば同一の溶液系でのライブラリー調製を含む。例えば、標準試料とシーケンス試料のライブラリー調製を、上記試料充填容器の同一のウェルにおいて行ってもよい。
【００２９】
ｂ）出力データを得るステップ
本発明の方法は、上記ステップａ）の後に、ステップａ）で調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、標準試料及びシーケンス試料に由来するリードを含む出力データを得るステップを含む。
【００３０】
シーケンス反応の詳細は当業者に公知である。シーケンス反応の詳細は、次世代シーケンスの種類に異なり得る。第二世代シーケンスでは、例えば、アダプター配列を介して基板に連結させ、アダプター配列をプライミング部位としてシーケンス反応が行われる（詳細については、例えばＲｉｃｋ  Ｋａｍｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，上掲を参照されたい）。また、第三世代シーケンスでは、例えば、ＳＭＲＴｂｅｌｌと呼ばれる、閉環上一本鎖環状ＤＮＡを鋳型とし、これをＺＭＷと呼ばれるシーケンスユニットに導入し、各ＺＭＷにおいて４つの蛍光標識ヌクレオチドを用いてポリメラーゼにより核酸複製反応を行い、これに伴って生ずる蛍光パルスに基づいてシーケンスを行う（詳細については、例えばＡｎｔｈｏｎｙ  Ｒｈｏａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，上掲を参照されたい）。第四世代シーケンスでは、核酸分子がナノポアを通過又はナノポアに近づいた場合に生ずる電流の変化をデータとして得、これに基づきソフトウェア等を介してシーケンスを行う（詳細については、例えばＨｅｎｇｙｕｎ  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，上掲を参照されたい）。
【００３１】
次世代シーケンスを行うためのシーケンサーとしては様々なものが提供されており、いずれも本発明のシーケンス反応において使用可能である。例えば、限定するものではないが、上記Ｍｉｓｅｑ・Ｈｉｓｅｑ・ＮｅｘＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ・Ｓｅｑｕｅｌ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に加えて、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及びＨｅｌｉＳｃｏｐｅ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）等を用いることができる。
【００３２】
シーケンス反応により、配列情報（リード）を集めたものが出力データとして得られる。出力されたデータをソフトウェア等によりさらに解析して、リード数等のより意味のある結果を導くことができる。
【００３３】
ｃ）出力データを分割するステップ
本発明の方法は、上記ステップｂ）の後に、ステップｂ）で得られた出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、前記出力データ中のリードを前記閾値以下のリードと前記閾値以上のリードに分割するステップ（「出力データを分割するステップ」とも記載する）を含む。
【００３４】
本明細書において、「分割」は、出力データ中のリードを、閾値以上のリード数を有するリードの群と閾値以下のリード数を有するリードの群に分けることを意味する。なお、閾値と同値のリードが存在する場合は、該リードは閾値以上のリードの群と閾値以下のリードの群のどちらに分類してもよい。
【００３５】
閾値は、単一であってもよいし、複数設定してもよい。閾値が単一であれば出力データを２つの群に分割でき、閾値を複数設定すれば、出力データを３つ以上の群に分割することができる。
【００３６】
閾値は、例えば標準試料に由来するリード数それ自体であってもよいし、又は該リード数に所定の係数をかけて得られるものであってもよい。所定の係数をかけることにより、解析目的に応じて、標準試料に由来するリード数に基づいて閾値を柔軟に設定することができる。所定の係数は解析前に決定してもよいし、解析結果を参照しながら決定してもよい。所定の係数は、当業者であれば解析目的、及び／又は標準試料及びシーケンス試料の種類等に応じて、適宜設定することができる。例えば、解析対象から不要な配列をより多く除きたい場合は所定の係数を高く設定し、必要な配列が除かれるリスクを下げたい場合は所定の係数を低く設定することができる。限定するものではないが、所定の係数は、例えば０．０１以上、０．０５以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．７５以上、０．８以上、又は０．９以上とすることができる。また、所定の係数は１００以下、５０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、１．５以下、１．２以下、又は１．１以下とすることができる。例えば、所定の係数は、０．０１〜１００、０．１〜１０、０．３〜４、０．５〜２、０．８〜１．２又は０．９〜１．１であってよい。
【００３７】
一実施形態において、本発明の方法は、前記ステップａ）において、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用いる。本実施形態の方法は、前記ステップｂ）の後、かつ前記ステップｃ）の前に、前記ステップｃ）における閾値を定めるための標準試料を選択するステップをさらに含んでもよい。本実施形態の方法は、解析目的に応じて、閾値を定めるための標準試料を、異なるコピー数の核酸を含む複数の試料から選択することができ、したがって閾値の選択の幅が広がるという効果を奏し得る。また、異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用いることで、閾値が高くなりすぎたり、又は低くなりすぎたりするリスクを低減し得る。
【００３８】
一実施形態において、本発明の方法は、前記ステップａ）において、複数のウェルを用いて同一のシーケンス試料を解析し、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）において、複数のウェル間で正規化したデータを用い閾値を定める。正規化は通常の方法にしたがって行うことができ、例えば各ウェルの全体のリード数が同数又は実質的に同数になるように、各シーケンス試料のリード数に特定の値をかける（又はリード数を特定の値でわる）ことによって行うことができる。または、各ウェルに含まれる同一の特定コピー数の標準試料に由来するリード数が同数または実質的に同数になるように正規化してもよい。各ウェルに加えたシーケンス試料の量が同一であれば、シーケンス試料に由来するリード数の総和が同数または実質的に同数になるように正規化してもよい。シーケンス試料をもとに正規化する場合、標準試料とシーケンス試料を同一のウェルで行うウェルが1つ以上あれば、他のウェルには標準試料を含めなくてもよい。正規化を行うことによって、各ウェル間のリード数を比較することが可能となり、異なるウェルの標準試料に由来するリード数を基準に閾値を定めることができる。一実施形態において、本発明の方法は、前記ステップｃ）において、複数の標準試料間で正規化したデータに基づいて、特定コピー数と出力リード数の関係式を導き、その逆関数を用いて出力リード数からコピー数を推定し、前記推定されたコピー数を基準に閾値を定める。関係式は、限定するものではないが、例えば、ｙ＝ａｘ＋ｂとして表すことができ、ここで、ｙは出力リード数、ｘはコピー数、ａ及びｂは定数を意味し、ｂは０であってもよい。本実施形態において、閾値となるコピー数は、限定するものではないが、例えば２００コピー以下、１５０コピー以下、１００コピー以下、５０コピー以下、例えば２０コピー以下、１０コピー以下、５コピー以下、４コピー以下、３コピー以下、２コピー以下、又は１コピーであってよい。
【００３９】
本明細書において、「複数」の範囲は限定しないが、例えば２以上、３以上、４以上、５以上、又は１０以上であってよく、また１００以下、５０以下又は２０以下であってよい。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法は、前記ステップａ）において、同一の特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用いる。本実施形態の方法は、前記ステップｃ）において、複数の標準試料に由来するリード数の平均値又は中央値に基づいて閾値を定めてもよい。本実施形態の方法は、同一の特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料に由来するリード数に基づいて閾値を定めることによって、より信頼性の高い閾値を得ることができるという効果を奏し得る。
【００４１】
標準試料に含まれる核酸の特定コピー数の範囲は限定されず、当業者であれば解析目的に応じて設定することができる。例えば、解析対象から不要な配列をより多く除きたい場合は特定コピー数を高く設定し、必要な配列が除かれるリスクを下げたい場合は特定コピー数を低く設定することができる。特定コピー数は、限定するものではないが、例えば２００コピー以下、１５０コピー以下、１００コピー以下、５０コピー以下、例えば２０コピー以下、１０コピー以下、５コピー以下、４コピー以下、３コピー以下、２コピー以下、又は１コピーであってよい。
【００４２】
例えば、（１コピーの核酸を含む標準試料に由来するリード数以下のリードの様に）リード数の少ない配列は、シーケンス時に生じたエラーによる配列、ＰＣＲ後に混入したサンプル由来の配列、フローセル中に残っている前回のサンプル由来の配列（フローセルが再利用できるハイスループットシーケンサーの場合）等の種々のエラーソースに起因し得る。これらはＰＣＲ中、又はＰＣＲ後にサンプルに混入するエラーであり、増幅反応にほとんど関わっていない。このため、少ないリード数として出力される。したがって、特定コピー数の核酸を含む標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて出力データ中のリードを分割することによって、例えばこれらのエラーに起因する配列とそうでない配列とを区別することが可能となる。
【００４３】
一実施形態において、本発明の方法は、前記ステップｃ）において、出力データ中の閾値以下のリードを除かず、閾値以下のリードを含めたまま出力データの解析を行う。別の実施形態において、本発明の方法は、前記ステップｃ）において、出力データ中の閾値以下のリードを除き、閾値以上のリードについてデータ解析を行う。閾値以下のリードを除かないか除くかは、解析の目的に応じて自由に定めることができる。閾値以下のリードを除く場合、例えば種々のエラーソースに起因し得る解析不要な配列を除くことができる。例えば、シーケンス試料由来のリードは１コピーの核酸分子由来のリード数以下のリード数を取りえない。したがって、標準試料が１コピーの核酸分子を含む場合、標準試料に由来するリード数又はこれを基準に定められる閾値以下の配列は、全て解析する価値のない配列として除いてもよい。本明細書において、上記のような種々のエラーソース由来の解析する価値のない配列を「ゴーストリード」とも記載し、「ゴーストリード」を解析対象から除くことを「ゴースト除去」とも記載する。
【００４４】
＜キット＞
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法を行うためのキットに関する。本発明のキットは、特定コピー数の核酸を含む標準試料を少なくとも一つのウェル中に含むプレート；ライブラリー調製及び／又はシーケンス反応に必要な試薬（例えば、プライマー、バッファー、酵素）；及び説明書の少なくとも一つを含んでよい。
【００４５】
＜プログラム＞
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法をコンピュータに行わせるためのプログラム、又は本明細書に記載の方法を行うためのソフトウェアに関する。
【００４６】
本明細書に記載の方法を行うためのコンピュータは、ハードウェア構成上、取得した出力データを処理するＣＰＵ、メインメモリであるＲＡＭ、取得した出力データをバッファするための不揮発性メモリ、外部装置との間での情報の通信や電力の需要を行うためのインターフェースで構成されていてもよい。コンピュータは、必要に応じて出力データを表示するディスプレイを有していてもよい。
【００４７】
本明細書に記載の方法をコンピュータに行わせる例示的な方法は以下の通りである。まず、ＣＰＵが不揮発性メモリから本発明のプログラムをＲＡＭ上に呼び出す。本発明のプログラムは、標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、出力データを閾値以下のリードと閾値以上のリードに分割し、任意に出力データ中の閾値以下のリードを除くプログラムであり、不揮発性メモリに予め入力されている。次に、ＣＰＵは例えばシーケンサー等のインターフェースから出力データを取得し、ＲＡＭに格納して、アドレスを付した後に不揮発性メモリにバッファする。続いて、ＣＰＵはＲＡＭ上に展開された前記プログラムを順次実行することで、前記格納された出力データの加工、蓄積、出力を行う。以上によって、本実施形態のプログラム又はソフトウェアを実現できる。
【００４８】
限定されるものではないが、本発明は、以下の実施形態を包含する。
（１）特定コピー数の核酸を含む一以上の標準試料を用いてハイスループットシーケンス反応のデータを解析する方法であって、ａ）前記標準試料及びシーケンス試料に対し同一の条件においてライブラリー調製を行うステップ、ｂ）ステップａ）で調製されたライブラリーをシーケンス反応に供し、前記標準試料及び前記シーケンス試料に由来するリードを含む出力データを得るステップ、及びｃ）前記出力データ中の標準試料に由来するリード数を基準に定められる閾値に基づいて、前記出力データ中のリードを前記閾値以下のリードと前記閾値以上のリードに分割するステップ、を含む、方法。
（２）前記ステップａ）の標準試料とシーケンス試料のライブラリー調製を、同一の反応系で行う、（１）に記載の方法。
（３）前記核酸がＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記閾値が、前記ステップｂ）で得た前記標準試料に由来するリード数に所定の係数をかけて得られる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ステップａ）において、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）における閾値を定めるための標準試料を選択するステップをさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記ステップａ）において、複数のウェルを用いて同一のシーケンス試料を解析し、同一の、又は異なる特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）において、複数のウェル間でデータを正規化し、定めた閾値を複数のウェル間に適用して解析する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記ステップｃ）において、複数の標準試料間で正規化したデータに基づいて、特定コピー数と出力リード数の関係式を導き、その逆関数を用いて出力リード数からコピー数を推定し、前記推定されたコピー数を基準に閾値を定める、（６）に記載の方法。
（８）前記ステップａ）において、同一の特定コピー数の核酸を含む複数の標準試料を用い、前記ステップｃ）において、複数の標準試料のリード数の平均値又は中央値に基づいて閾値を定める、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記特定コピー数が、２００コピー以下である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記特定コピー数が、１０コピー以下である、（９）に記載の方法。
（１１）前記ステップｃ）において、前記出力データ中の前記閾値以下のリードを除き、前記閾値以上のリードについてデータ解析を行う、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
（１３）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法をコンピュータに行わせるためのプログラム。
【００４９】
以下では、実施例の記載を参照して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
＜実施例１：容器への試料の充填＞
（材料と方法）
低濃度核酸試料系列用酵母懸濁液の作製
遺伝子組換え酵母
出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ  ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ製、ＡＴＣＣ４００１４０８）を１コピーの特定核酸配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。核酸として、ＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ  ＣＲＭ  ６２０５−ａ）と選択マーカーとしたＵＲＡ３とがタンデムに並ぶように作出したプラスミドを、キャリア細胞のＢＡＲ１領域を対象に、相同組換えによって酵母ゲノムＤＮＡに導入し、１コピーの核酸を含む遺伝子組換え酵母を作製した。
【００５１】
使用したプラスミドは、委託合成会社（ＦＡＳＭＡＣ社）に製造及び解析を依頼した。
手短には、所望の配列の人工合成核酸を大腸菌に導入して、常法に従い培養、抽出、及び精製して製造した。製造されたプラスミドは、シーケンサーを用いて全長の配列を決定し、プラスミド１分子中に標的塩基配列が１コピーのみ挿入されていることを確認した（データ示さず）。
【００５２】
シーケンサーによるゲノム解析により、酵母ゲノムＤＮＡ中の相同組み換えが可能な部位は１コピーのみであることを確認した（データ示さず）。また、プラスミド配列の挿入部位の外側からＰＣＲを行い、その増幅産物をシーケンサーによって読むことで、挿入部位にプラスミド配列が１コピーのみ挿入されたことを確認した（データ示さず）。
【００５３】
培養及び細胞周期制御
５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ―６３０４０９）で培養した上記遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０−１４４、以下、「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したα１−Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１−５ＭＧ、以下αファクター）を９００μＬ添加し、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ−２３ＦＨ）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得た。
【００５４】
固定化
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ−５０Ｒ）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度：３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
【００５５】
核染色
固定化済みの酵母懸濁液を２００μＬ分取し、ＤＰＢＳで一回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。２０μＬの２０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８−０６３９１）を添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。その後、２５μＬの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社製、ＴＫＲ−９０３４）を添加し、プチクール（ワケンビーテック株式会社製、プチクール  ＭｉｎｉＴーＣ）を用いて５０℃で２時間インキュベートした。最後に、６μＬの５ｍＭ  ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、Ｓ７０２０）を加えて、遮光下で３０分間染色した。
【００５６】
分散
染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力：３０％，１０秒間分散処理して酵母懸濁液を得た。
【００５７】
低濃度核酸試料系列の充填酵母懸濁液の個数計測分注
以下のようにして、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）して、各ウェルに１細胞ずつ吐出して細胞数が既知のプレートを作製した。具体的には、液滴形成装置（リコー社製）を用いて、９６プレート（商品名：ＭｉｃｒｏＡｍｐ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（リコー社製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁液を順次吐出した。
【００５８】
吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ（東京インスツルメンツ株式会社製、ｓＣＭＯＳ  ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて撮影した。光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ）を用い、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数し、各ウェル中に１つの細胞を含むプレート（以下、「細胞数既知プレート」とも記載する）を作製した。
【００５９】
核酸抽出
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１  ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）を５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製し、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ）１００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
【００６０】
作製した細胞数既知プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７．２℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解（核酸抽出）後、９５℃で２分間熱処理した。
【００６１】
次に、細胞数既知プレートから得られる結果の信頼性を調べるために、細胞数既知プレートを製造し、１細胞数における不確かさを算出した。なお、以下に示す方法を用いることにより、１コピーの場合と同様に、様々なコピー数における不確かさを算出することができる。
【００６２】
不確かさの算出
本実施例では、不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の核酸コピー数（細胞周期）、ウェル内の細胞数、コンタミネーションを用いた。
【００６３】
液滴中の細胞数は、吐出手段より吐出された液滴の画像を解析し計数した液滴中の細胞数と、吐出手段で吐出した液滴をスライドガラスに着弾させ着弾した液滴毎に顕微鏡観察し得られた細胞数とを用いた。
【００６４】
細胞中の核酸コピー数（細胞周期）は、細胞周期のＧ１期に該当する細胞の割合（９９．５％）と、Ｇ２期に該当する細胞の割合（０．５％）とを用いて算出した。具体的には、培養した酵母を核染色剤（ＳＹＴＯＸＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて染色し、その蛍光輝度を測定した。Ｇ１期の細胞には１コピーのＤＮＡが、Ｇ２期の細胞は２コピーのＤＮＡが入っておりＧ２期のほうが輝度が高いため、輝度に基づき細胞中の核酸コピー数を算出した。
【００６５】
ウェル内の細胞数は、吐出した液滴がウェル内に着弾する数を計数したが、９６サンプルの計数において全ての液滴がウェル内に着弾していたため、ウェル内の細胞数の要因は不確かさの計算から除外した。
【００６６】
コンタミネーションは、細胞懸濁液４μＬをリアルタイムＰＣＲで細胞中の核酸以外の核酸が懸濁液中に混入していないか３回の試行を行い確認した。その結果、３回全てにおいて検出下限値となったため、コンタミネーションの要因についても不確かさの掲載から除外した。
【００６７】
各要因の測定値から標準偏差を求め、感度係数を乗じて測定量の単位に統一した標準不確かさを用いて平方和法により合成標準不確かさを求めた。なお、合成標準不確かさでは、正規分布の約６８％の範囲の値しか含まれないため、合成標準不確かさを２倍した拡張不確かさとすることにより正規分布の約９５％の範囲を考慮した不確かさを得ることができる。
【００６８】
（結果）
以下の表１のバジェットシートに結果を示す。
【００６９】
【表１】
2020124185.tif 000003
【００７０】
表１中、「記号」とは、不確かさの要因に対応付けた任意の記号を意味する。
表１中、「値（±）」とは、平均値の実験標準偏差であり、算出した実験標準偏差をデータの数の平方根の値で除したものである。
【００７１】
表１中、「確率分布」とは、不確かさの要因がもつ確率分布であり、Ａタイプの不確かさ評価の場合には空欄とし、Ｂタイプの不確かさ評価には、正規分布又は矩形分布のいずれかを記入する。本実施例においてはＡタイプの不確かさ評価のみを行っているため、幾つかの確率分布の欄は空欄となっている。
【００７２】
表１中、「除数」とは、各要因から得られる不確かさを正規化する数を意味する。
表１中、「標準不確かさ」とは「値（±）」を「除数」で除した値である。
表１中、「感度係数」とは、測定量の単位に統一するために用いられる値を意味する。
【００７３】
次に、ウェルに充填した様々なコピー数を有する核酸試料について、平均特定コピー数及び不確かさを算出した。結果を表２に示す。変動係数ＣＶ値は不確かさの値を平均特定コピー数で除することにより算出した。
【００７４】
【表２】
2020124185.tif 000004
【００７５】
上記方法において、特定コピー数が１、即ち、１コピーの核酸試料（１つの酵母）をウェルに分注する精度は、±０．１２８１コピーであることが分かった。ウェルに１コピー以上を充填する場合には、特定コピー数の核酸試料が充填される精度は、この精度の積み重ねにより決定される。
【００７６】
以上の結果から、得られた拡張不確かさを測定のばらつきの指標として、デバイスのデータとして記憶させることで、実験で使用する者が不確かさの指標をウェル毎の測定結果の信頼性の判断基準として用いることができることが示された。上記の信頼性の判断基準を用いることにより、分析検査の性能評価を高精度に行うことができる。
【００７７】
各充填部位への不確かさの値付け
前述の算出された不確かさ（又は変動係数）を各ウェルへ値付けした。以上より、低濃度核酸試料系列の平均核酸コピー数とその不確かさ及び変動係数を算出し、各ウェルへの値付けをすることができた。
【００７８】
＜実施例２：ＮＧＳによるシーケンス反応におけるゴーストリード除去１＞
実施例２では、微生物の混合ＤＮＡ試料（ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ社））を用いた微生物叢の計測を行った。
【００７９】
１ｓｔ  ＰＣＲ反応
試料充填用ウェルにＤＮＡ６００−Ｇを含む酵母を、前記実施例１と同様の手順で充填した。この際核酸コピー数が１コピーのウェル（１個の酵母細胞を含む）と１０コピーのウェル（１０個の酵母細胞を含む）をそれぞれ用意した。前記微生物の混合ＤＮＡ試料を、前記試料充填用ウェルに２．０μＬ充填した。この際、核酸が１コピーのウェルには０．５ｐｇ／μＬの前記微生物の混合ＤＮＡ試料を添加し、１０コピーのウェルには５ｐｇ／μＬの前記微生物の混合ＤＮＡ試料を添加した。すなわち、混合ＤＮＡ試料１０ｐｇと１０コピーのＤＮＡ６００−Ｇを含むウェル、並びに混合ＤＮＡ試料１ｐｇと１コピーのＤＮＡ６００−Ｇを含むウェルをそれぞれ用意した。
【００８０】
その後、前記微生物の混合ＤＮＡ試料と前記ＤＮＡ６００−Ｇとを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  ６．３μＬ、１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．０μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）１．６μＬ、微生物１６Ｓ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（配列番号１、１０μＭ）１．０μＬ、微生物１６Ｓ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（配列番号２、１０μＭ）１．０μＬ、ＤＮＡ６００−Ｇ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（配列番号３、１０μＭ）１．０μＬ、ＤＮＡ６００−Ｇ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（配列番号４、１０μＭ）１．０μＬ、微生物の混合ＤＮＡ試料２．０μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔ／μＬ）０．１μＬ、ＤＮＡ６００−Ｇを含む酵母ＤＮＡ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  ０．４Ｕを含む）４．０μＬの合計２０μＬであった。
【００８１】
核酸増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９４℃で２分間のインキュベートを行った。その後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３ステップからなる２３回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【００８２】
ビーズによるＰＣＲ産物の精製
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬（ベックマン・コールター社）を用いてＰＣＲ産物の精製を行った。まず、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を使用前に３０分以上室温で静置した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を１分以上転倒混和したのち、ＰＣＲ反応を行った各ウェルに２０μＬずつ加えた。ピペッティングを１０回繰り返し、ＰＣＲ反応溶液とＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を十分混和した。その後、室温で５分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、２分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、ＡＭ  Ｐｕｒｅ  ＸＰ試薬に含まれていた磁性ビーズに触れないようにピペットを用いてＰＣＲ反応溶液を取り除いた。各ウェルに２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒間静置した。その後、エタノールを取り除き、磁性ビーズを洗浄した。前記洗浄ステップをもう一度繰り返した。前記洗浄ステップは各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま行った。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅから外し、２０  ｕＬの溶出バッファ（精製水、トリス酢酸ｐＨ  ８．０、又はＴＥ）を各ウェルに添加し、ピペッティングを１０回繰り返し、磁性ビーズと溶出バッファを十分に混和した。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、１分間静置した。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、溶出バッファを回収し、別の容器へ移し替えた。
【００８３】
２ｎｄ  ＰＣＲ反応
前記増幅産物の両端にシーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加する反応をＰＣＲ反応を用いて行った。反応液の組成は、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  １０．３μＬ、１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．０μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）１．６μＬ、２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）１．０μＬ、２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）１．０μＬ、１ｓｔＰＣＲ産物４．０μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔ／μＬ）０．１μＬの合計２０μＬであった。用いたプライマーは、Ｆ−１（配列番号５）、Ｆ−２（配列番号６）、Ｆ−３（配列番号７）、Ｆ−４（配列番号８）、Ｆ−５（配列番号９）、Ｆ−６（配列番号１０）、Ｆ−７（配列番号１１）、Ｆ−８（配列番号１２）、Ｒ−１（配列番号１３）、及びＲ−２（配列番号１４）である。
【００８４】
核酸の増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９４℃で２分間のインキュベートを行った。その後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３ステップからなる８回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。その後、１ｓｔＰＣＲ後に行った方法と同一の工程によりＰＣＲ産物の精製を行った。
【００８５】
核酸試料の濃度測定
バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ／μＬになるようＴＥで希釈した。４つのウェルから得られた前記希釈した２ｎｄＰＣＲ産物を同一の反応液に混合した。
【００８６】
＜ＮＧＳによるシーケンス反応＞
Ｍｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、前記２ｎｄＰＣＲ産物をシーケンス反応に供した。得られたデータはＱｉｉｍｅ２を用いて配列とリード数の情報を得た。
【００８７】
＜特定コピー数のリード数を基準に閾値設定および解析＞
得られたリードは表３にまとめた（なお、リードのうち、明確にコンタミネーションに由来すると思われるリードについては予め除いてある）。
【００８８】
【表３】
2020124185.tif 000005
【００８９】
表３には、生データに加えて、生データからＤＮＡ６００−Ｇのリード数以下の配列をデータから除去したデータ（ゴースト除去後）も示している。なお、ゴースト除去とは、種々のエラーソースに起因する解析不要のリードを除去することを意味する。
【００９０】
前記生データには、前記微生物の混合ＤＮＡ試料に含まれる８種類の微生物（表１中、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまで）以外の配列も多数含まれていたが、１０コピーのＤＮＡ６００−Ｇのリード数を基準にそれ以下の配列を除くと、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓの２種類の微生物のリード、並びにその他のリードが除去された。配列の割合を積み上げ棒グラフとしたものを図１に示した。
【００９１】
また、１コピーのＤＮＡ６００−Ｇのリード数を基準にした場合についても、その他のリードが除去された（データ示さず）。また、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓの２種はＤＮＡ６００−Ｇのリード数と同等レベルであったので、ＤＮＡ６００−Ｇのリード数に係数として２．０〜３．０をかけた場合、除くことができた（データ示さず）。
【００９２】
＜実施例３：ＮＧＳによるシーケンス反応におけるゴーストリード除去２＞
実施例３では、魚類筋肉組織より抽出したＤＮＡ試料を用いたＮＧＳ解析を行った。
【００９３】
ＤＮＡの抽出反応
魚類筋肉組織としてマダイ（Ｐａｇｒｕｓ  ｍａｊｏｒ）、サーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、マイワシ（Ｓａｒｄｉｎｏｐｓ  ｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓ）の３種を用意し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００９４】
１ｓｔ  ＰＣＲ反応
試料充填用ウェルに人工１２Ｓ配列を含む酵母を、前記実施例１と同様の手順で充填した。前記人工１２Ｓ配列はＧＣ含有率約５０％、且つ、６０℃において高次構造を取らず、繰り返し配列をもたない１３０ｂｐの塩基配列であって、その両末端にプライマーＭｉＦｉｓｈ−Ｕ（Ｍ．Ｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｒ．Ｓｏｃ．Ｏｐｅｎ  Ｓｃｉ．，２２：２（７）参照、製造会社名：ファスマック株式会社、配列番号２０及び２１参照）が結合可能な塩基配列を有するように核酸合成した人工塩基配列（配列番号１５〜１９参照）である。人工塩基配列の両末端にプライマーＭｉＦｉｓｈ−Ｕと結合可能な塩基配列を有していることにより、解析対象核酸に含まれる魚類の１２Ｓ  ｒＲＮＡを解析する際に、同じ塩基配列を有するプライマーを用いて標準核酸及び解析対象核酸を解析することができる。充填の際、核酸コピー数が１コピーのウェル（１個の酵母細胞を含む）と５コピーのウェル（５個の酵母細胞を含む）、１０コピーのウェル（１０個の酵母細胞を含む）、５０コピーのウェル（５０個の酵母細胞を含む）をそれぞれ用意した。それぞれのウェルには各３種ずつの人工１２Ｓ配列を含む酵母を充填した。すなわち、核酸コピー数が１コピーのウェルには配列番号１５を含む酵母細胞１個、配列番号１６を含む酵母細胞１個、配列番号１７を含む酵母細胞が１個、それぞれ含まれる。他のウェルも同様である。その後、前記魚類筋肉組織由来ＤＮＡ試料を、各前記試料充填用ウェルに５．０μＬ充填した。
【００９５】
その後、前記魚類筋肉組織由来ＤＮＡ試料と前記人工１２Ｓとを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  １．６μＬ、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）１２．０μＬ、１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）０．７μＬ、１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）０．７μＬ、魚類筋肉組織由来ＤＮＡ試料５．０μＬ、酵母ＤＮＡ（配列番号１５、１６、１７、およびＺｙｍｏｌｙａｓｅ  ０．４Ｕを含む）４．０μＬの合計２４μＬであった。１ｓｔＰＣＲ用プライマーは、ＭｉＦｉｓｈ−Ｕに２ｎｄＰＣＲ用のプライマーがアニーリング反応を行える配列を付加したものである。
【００９６】
核酸増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の３ステップからなる３５回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【００９７】
２ｎｄ  ＰＣＲ反応
前記増幅産物の両端にシーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加する反応をＰＣＲ反応を用いて行った。反応液の組成は、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  ６．０μＬ、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）１０．０μＬ、２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）１．０μＬ、２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）１．０μＬ、前記増幅産物２．０μＬの合計２０μＬであった。用いたプライマーは、Ｆ−１（配列番号５）、Ｆ−２（配列番号６）、Ｆ−３（配列番号７）、Ｆ−４（配列番号８）、Ｆ−５（配列番号９）、Ｆ−６（配列番号１０）、Ｆ−７（配列番号１１）、Ｆ−８（配列番号１２）、Ｒ−１（配列番号１３）、及びＲ−２（配列番号１４）である。
【００９８】
核酸の増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、７２℃で１５秒間の２ステップからなる１２回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【００９９】
アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の精製
２％アガロースゲルを用いて１００Ｖ２０分間の電気泳動を行った。３３０〜４００ｂｐまでにみられたバンドを切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いてＰＣＲ産物の精製を行った。
【０１００】
核酸試料の濃度測定
バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ／μＬになるようＴＥで希釈した。４つのウェルから得られた前記希釈した２ｎｄＰＣＲ産物を同一の反応液に混合した。
【０１０１】
＜ＮＧＳによるシーケンス反応＞
Ｍｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、前記２ｎｄＰＣＲ産物をシーケンス反応に供した。得られたデータはＱｉｉｍｅ２を用いて配列とリード数の情報を得た。
【０１０２】
＜特定コピー数のリード数を基準に閾値設定および解析＞
得られたリードは表４にまとめた。
【０１０３】
【表４】
2020124185.tif 000006
【０１０４】
前記生データには、前記魚類筋肉組織由来のＤＮＡ試料に含まれる３種類の魚種（マダイ、サーモン、マイワシ）以外の配列も多数含まれていたが、そのリード数は前記人工ＤＮＡ１コピーのリード数以下であった。これをゴーストリードと判定し、除去することができた。
【０１０５】
＜実施例４：ＮＧＳによるシーケンス反応におけるゴーストリード除去３＞
実施例４では、相模川における環境ＤＮＡを用いた魚類相の計測を行った。
まず、相模川より水のサンプルを採取し、フィルターを用いてろ過をした。ろ過したフィルターを細かく刻み、ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ試料（解析対象核酸）はＱｕｂｉｔ  ４  フルオロメーター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて核酸の濃度を定量した。
その後の手順は実施例３に従い、相模川の水のサンプルから、配列とリード数の情報を得た。
【０１０６】
＜特定コピー数のリード数を基準に閾値設定および解析＞
得られたリードは表５にまとめた。
【０１０７】
【表５】
2020124185.tif 000007
【０１０８】
表５に示される魚種のうち、前記人工ＤＮＡ１コピーのリード数の平均（５５０．７リード）を基準にそれ以下の配列を除くことができた。
【０１０９】
前記人工１２Ｓ以外のリードの総和を１０万リードとして正規化したものを表６に示した。前記人工ＤＮＡ１コピーのリード数の平均（１０５０リード）を下回るリード数を太字で示した。
【表６】
2020124185.tif 000008
【０１１０】
表６の配列１５，１６，１７のリード数をもとにコピー数（ｘ）と出力リード数（ｙ）の関係式を導くとｙ＝１２２３．９ｘという式を得た（決定計数Ｒ２＝０．９８８４）。この式をもとに各魚種のコピー数を推定し、表７を得た。推定されたコピー数が１コピー未満のものを太字で示した。
【０１１１】
【表７】
2020124185.tif 000009
【０１１２】
以上の通り、本発明の方法により、種々のエラーソース由来の配列を明確な基準をもって除くことができることが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１３】
【特許文献１】特表２０１８−５１４２０７
【図１】
2020124185.tif 000010
【配列表】
2020124185000001.app