(57)【要約】      （修正有）【課題】リソソーム蓄積症の治療のための方法を提供する。【解決手段】治療的有効量の転写因子ＥＢのアップレギュレーションを仲介する薬剤を含有する組成物を投与する方法。一実施形態において、組成物は、フィブラート、例えばゲムフィブロジル又はフェノフィブラートを含有する。別の実施形態において、組成物は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する。【選択図】図１
2020100621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、転写因子EBのアップレギュレーションを仲介する薬剤を含有する組成物の治療的有効量を、そのような治療を必要とする被験体に投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
薬剤がスタチンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
スタチンがアトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
薬剤が、鎮痛剤、解熱剤、アスピリン、桂皮（cinnamon）代謝産物、桂皮酸、フェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
薬剤が脂質低下剤である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
脂質低下剤がフィブラートである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
フィブラートがゲムフィブロジル又はフェノフィブラートである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
組成物が更に治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
組成物がフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
組成物がフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡの相乗的組合せを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
リソソーム蓄積症が、神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）及びレビー小体型認知症（DLB）からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
リソソーム蓄積症がオートファジー経路の障害であり、薬剤がリソソームの生合成を増大させる、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症（Aspartylglucosaminuria）、コレステロールエステル蓄積症（Cholesteryl ester storage disease）、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、及びガラクトシアリドーシスからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
転写因子EBが、転写因子EB mRNAレベルの上昇、転写因子EBタンパク質レベルの上昇、又はPPARa-RXRaヘテロ二量体の活性化によってアップレギュレートされる、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、治療的有効量の薬剤を含有する組成物をそのような治療を必要とする被験体に投与することを含み、薬剤が転写因子EB活性を回復させるものである、上記方法。
【請求項１６】
薬剤がフィブラートである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
フィブラートがゲムフィブロジル又はフェノフィブラートである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
フィブラートをオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡと組み合わせて投与する場合にフィブラートの治療的有効量がより低い、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、遺伝子のアップレギュレートを仲介する薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、そのような治療を必要とする被験体に投与することを含み、遺伝子がTfeb遺伝子である、上記方法。
【請求項２０】
リソソーム蓄積症が、神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）及びレビー小体型認知症（DLB）からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
スタチン及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する医薬の組合せ。
【請求項２２】
製薬上許容される担体を更に含有する、請求項２１記載の医薬の組合せ。
【請求項２３】
医薬の組合せが相乗的な医薬の組合せである、請求項２１記載の医薬の組合せ。
【請求項２４】
薬剤がアスピリンである、請求項４記載の方法。
【請求項２５】
リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、及び遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病を含むバッテン病からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、及び遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病を含むバッテン病からなる群より選択される、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2014年11月19日に出願した米国特許仮出願第62/081,696号に基づく優先権を主張するものであり、上記出願の開示全体を参照により本明細書に組み入れる。
技術分野
本発明は、全体的にリソソーム蓄積症の治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームは、酸性環境中で活性の高い多くの加水分解酵素を含む膜結合性オルガネラである（1〜3）。リソソームは古典的には老廃物を管理するオルガネラとして同定され、発生における分解、プログラムされた細胞死、及び栄養反応等の主要な細胞内プロセスに関与することが示されている（2,4〜8）。リソソームの多様な役割及び異なる刺激に対する応答から、リソソーム遺伝子の発現の協調的な調節が示唆される（9,10）。近年の研究から、リソソーム遺伝子の調節に関する情報がもたらされた（11,12）が、リソソーム遺伝子のパターン発見解析から、bHLH（塩基性へリックス-ループ-へリックス）因子の小眼球症転写因子E（MiT/TFE）サブファミリーのメンバーである転写因子EB（TFEB）の潜在的結合部位である協調的なリソソームの発現及び調節（Coordinated Lysosomal Expression and Regulation (CLEAR)）エレメントの存在が明らかとなった。研究から、TFEBとリソソーム生合成とが関連する可能性が報告されている（9,10,12）。
【０００３】
Tfebの調節は複雑であり、かつ細胞の型及び刺激に依存しているようである。分化した破骨細胞において、RANKL依存性シグナル伝達経路によって、TFEB活性化誘導性のリソソーム生合成が誘導される（13）。飢餓又はストレス条件も、通常はmTORC1によって不活性化状態に維持されているTFEBを活性化し得る（14,15）。ある研究では、飢餓によって誘導されたTFEB活性が脂質代謝において重要な役割を果たしており、また活性化されたTFEBはそれ自身の遺伝子発現を自己調節することもできることが示されている（16）。
【０００４】
リソソーム蓄積症（LSD）は、リソソーム機能の欠陥に由来するおよそ50種のまれな遺伝性代謝障害のグループである。LSDの症状は、特定の疾患及び他の変動要因、例えば発症年齢に依存して異なり、軽度から重度のものであり得る。症状としては、発育遅延、運動障害、発作、認知症、難聴及び／又は盲を挙げることができる。LSDを有する人々の一部は、肝臓の肥大（肝腫大）、脾臓の肥大（脾腫）、肺及び心臓の疾患、及び異常に成長する骨を有している。
【発明の概要】
【０００５】
好ましい実施形態の概要
本発明の一態様は、LSDの治療方法を提供する。本方法は、転写因子EB（TFEB）のアップレギュレーションを仲介する薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含み得る。
【０００６】
一実施形態において、薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、又はシムバスタチンであり得る。薬剤はまた、例えば脂質低下剤、例えばフィブラートであり得る。一部の実施形態において、フィブラートはゲムフィブロジル又はフェノフィブラートである。他の実施形態において、薬剤は、鎮痛剤、解熱剤、アスピリン、桂皮（cinnamon）代謝産物、桂皮酸、フェニル酪酸ナトリウム又は安息香酸ナトリウムである。更に他の実施形態において、組成物は、上記薬剤の少なくとも2種の組合せを含有し得る。
【０００７】
組成物はまた、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡも含有し得る。例えば、組成物は、スタチン又はフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有し得る。薬剤とオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡとのこの組合せによって、オールトランス型レチノイン酸、ビタミンＡ又はフィブラート単独の投与よりも被験体においてより大きな治療効果がもたらされ得る。組合せは相乗的な組合せであり得る。TFEBはまた、転写因子EB mRNAレベルの上昇、転写因子EBタンパク質レベルの上昇、又はPPARa-RXRaヘテロ二量体の活性化によって、アップレギュレートされ得る。
【０００８】
LSDは、神経変性疾患、例えば神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患（Parkinson's plus diseases）を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）又はレビー小体型認知症（DLB）であり得る。別の実施形態において、LSDは、オートファジー経路の障害であり、薬剤はリソソームの生合成を増大させるものである。
【０００９】
他の実施形態において、LSDはテイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症（Aspartylglucosaminuria）、コレステロールエステル蓄積症（Cholesteryl ester storage disease）、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、又は遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病を含むバッテン病である。
【００１０】
本発明の別の態様は、Tfeb遺伝子のアップレギュレーションを仲介する薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、LSDの治療方法を提供する。更に別の態様は、TFEB活性を回復させる薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、LSDの治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ゲムフィブロジル及びレチノイン酸が脳細胞におけるTFEB mRNA及びタンパク質レベルをアップレギュレートすることを示す。（A, B）マウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F-12培地下で異なる濃度のゲムフィブロジル及びオールトランス型レチノイン酸（ATRA）で12時間処理した後、qRT-PCRによってTfebのmRNAレベル（A）、イムノブロットによってTFEBタンパク質レベル（B）をモニタリングした。（C）（β-アクチンと比較した）TFEBについてのイムノブロットのデンシトメトリー解析。（D, E）マウス初代星状細胞を同様の培養条件下でゲムフィブロジル（10μM）及びATRA（0.2μM）の組合せで4、6、12及び24時間処理した後、qRT-PCRによってTFEBのmRNAレベル（D）、イムノブロットによってタンパク質レベル（E）をモニタリングした。（F）TFEBについてのイムノブロットのデンシトメトリー解析。全ての結果は少なくとも3回の独立した実験セットの平均±SEMを示す。（G, I）マウス初代星状細胞（G）及びマウス初代ニューロン（I）を、無血清条件下でゲムフィブロジル及びレチノイン酸の組合せで24時間処理し、それぞれTFEB（赤）−GFAP（緑）及びTFEB（赤）−Map2（緑）で二重標識した。核染色のためにDAPIを使用した。スケールバー＝20μm（G）、高倍率画像でのスケールバー＝5μm（G）；スケールバー＝50μm（I）、高倍率画像でのスケールバー＝10μm（I）。（H, J）マウス初代星状細胞（H）及びマウス初代ニューロン（J）の全細胞及び核内でのTFEB免疫反応性（TFEB IR）を対照に対する倍率として算出した定量化を示す。3回の独立した実験セットから、ImageJを使用して条件毎に少なくとも25個の別個の画像を定量する。t：p＜0.05（未処置の対照に対して）。
【図２】TFEB mRNA及びタンパク質のフィブラート薬仲介型のアップレギュレーションにおけるPPARα及びRXRαの関与を示す。（A,B)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及び野生型マウスから単離したマウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F12中で24時間、ゲムフィブロジル（10μM）及びレチノイン酸（0.2μM）の組み合わせで処理した後、TfebのmRNA発現をリアルタイムPCR(A)で、TFEBのタンパク質レベルをイムノブロット(B)でモニタリングした。(C)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及び野生型星状細胞における（β-アクチンと比較した）TFEBレベルのデンシトメトリー解析を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照に対して有意ではない。(D)：WTマウスから単離したマウス初代星状細胞をGW9662で30分間前処理した後、同様の培養条件下でゲムフィブロジル及びレチノイン酸で処理し、続いてイムノブロットによりTFEBタンパク質発現のレベルをモニタリングした。(E)：（β-アクチンと比較した）TFEBのイムノブロットのデンシトメトリー解析を示す。t：p＜0.05（対照に対して）；ns：対照に対して有意ではない。(F)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及びWTマウスから単離したマウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F12中で24時間、10μMのゲムフィブロジル及び0.2μMのレチノイン酸で処理し、TFEB（赤）及びGFAP（緑）について二重標識した。核を染色するためにDAPIを使用した。UN：処理なし。スケールバー＝20μm。(G)：対照に対する倍率として算出した、マウス初代星状細胞におけるTFEB免疫反応性（TFEB IR）の定量化を示す。3回の独立した実験セットから、条件あたり少なくとも25個の別個の画像をImageJを使用して定量化した。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照に対して有意ではない。(H,I,J)：マウス初代星状細胞を、スクランブルsiRNA（1.0μg）又はRXRα siRNA（1.0μg）で36時間、トランスフェクトするかトランスフェクトせず、続いて無血清DMEM/F12培地中で24時間、RA（0.2μM）及びゲムフィブロジル（10μM）の組み合わせで処理した後、遺伝子サイレンシングのレベルをチェックするためにRXRαについてのRT-PCR(H)、TFEBについての定量的リアルタイムPCR(J)、及びTFEBについてのイムノブロット(J)を行った。(K)：（β-アクチンと比較した）TFEBについてのイムノブロットのデンシトメトリー解析を示す。＊：p＜0.05（未トランスフェクト対照に対して）；＊＊：p＜0.05（スクランブルsiRNAトランスフェクト対照に対して）；ns：RXRα siRNAトランスフェクト対照に対して有意ではない。全ての結果は少なくとも3回の独立した実験セットの平均±SEMを表す。
【図３】PPARαが処理条件下でTFEB発現を転写的に調節することを示す。(A)：TFEB-ルシフェラーゼプロモーター構築物の野生型及び変異型PPRE部位のマップを示す。(B)：BV2細胞をpTFEB(WT)-Lucで24時間トランスフェクトした後、異なる濃度のゲムフィブロジル及びレチノイン酸の単独及び組み合わせで処理し、ルシフェラーゼアッセイに供した。＊：p＜0.05（未処理対照に対して）。(C)：BV2細胞をpTFEB(WT)-Lucで24時間トランスフェクトした後、PPARα-、PPARβ-、PPARγ-アンタゴニストで前処理し、続いてゲムフィブロジル及びレチノイン酸で処理して、ルシフェラーゼアッセイに供した。＊：p＜0.05（未処理対照に対して）。#：p＜0.05（処理に対して）。(D)：PPARα-/-（中央）及びPPARβ-/-（右）及び野生型（左）マウスから単離したマウス初代星状細胞をpTFEB(WT)-Lucで24時間トランスフェクトした後、ゲムフィブロジル及びレチノイン酸で処理して、ルシフェラーゼアッセイに供した。＊：p＜0.05（未処理WT対照に対して）。#：未処理PPARα-/-対照に対して有意ではない。t：p＜0.05（未処理PPARβ-/-対照に対して）。(E,F)：BV2細胞(E)及びマウス初代星状細胞(F)をpTFEB(WT)-Luc及びpTFEB(Mu)-Lucで24時間トランスフェクトした後、ゲムフィブロジル及びレチノイン酸で処理して、ルシフェラーゼアッセイに供した。＊：p＜0.05（未処理pTFEB(WT)-Lucトランスフェクト対照に対して）。ns：未処理pTFEB(Mu)-Lucトランスフェクト対照に対して有意ではない。全ての結果は少なくとも6回の独立した実験セットの平均±SEMである。
【図４】PPARα-RXRα-PGC1α複合体によるTFEBの転写活性化を示す。(A)：コア配列を有するTFEBプロモーター上のPPREのマップ及びChIPのアンプリコン長を示す。(B,C)：マウス星状細胞をゲムフィブロジル（10μM）及びRA（0.2μM）の組み合わせで30、60、120、及び240分間処理し、TfebプロモーターのPPRE結合部位上へのPPARα（一番左）、RXRα（左から2番目）、PGC1α（右から2番目）及びRNAポリメラーゼ（一番右）のリクルートメントを、ChIPの後、RT-PCR(B)及びqRT-PCR(C)によってモニタリングした。正常IgGを対照として使用した。＊：p＜0.05（未処理対照に対して）。全ての結果は少なくとも3回の独立した実験セットの平均±SEMを表す。(D)：ペルオキシソーム増殖剤を活性化することによるリソソーム生合成の誘導の模式図を示す。
【図５】PPARα依存性のTFEBのアップレギュレーションがリソソーム生合成を誘導することを示す。(A,B)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及び野生型マウスから単離したマウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F12中で24時間、ゲムフィブロジル（10μM）及びレチノイン酸（0.2μM）の組み合わせで処理した後、リソソーム遺伝子（Lamp2(左)、Limp2(中央)、Npc1(右)）のmRNA発現をリアルタイムPCR(A)で、LAMP2のタンパク質レベルをイムノブロット(B)でモニタリングした。(C)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及び野生型星状細胞における（β-アクチンと比較した）LAMP2レベルのデンシトメトリー解析を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照に対して有意ではない。全ての結果は少なくとも3回の独立した実験セットの平均±SEMを表す。(D)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及びWTマウスから単離したマウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F12中で24時間、10μMのゲムフィブロジル及び0.2μMのレチノイン酸で処理し、LAMP2（赤）及びGFAP（緑）について二重標識した。核を染色するためにDAPIを使用した。(E)：対照に対する倍率として算出した、マウス初代星状細胞のLAMP2免疫反応性（Lamp2 IR）の定量化を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照に対して有意ではない。(F)：WTマウスから単離したマウス初代ニューロンを、無血清DMEM/F12中で24時間、10μMのゲムフィブロジル及び0.2μMのレチノイン酸で処理し、LAMP2（赤）及びMap2（緑）について二重標識した。核を染色するためにDAPIを使用した。(G)：対照に対する倍率として算出した、マウス初代ニューロンのLAMP2免疫反応性（Lamp2 IR）の定量化を示す。＊：p＜0.05（未処理対照に対して）。(H)：PPARα-/-及びPPARβ-/-及びWTマウスから単離したマウス初代星状細胞を、無血清DMEM/F12中で24時間、10μMのゲムフィブロジル及び0.2μMのレチノイン酸で処理し、リソトラッカーレッド（赤）及びGFAP（緑）について二重標識した。(I)：対照に対する倍率として算出した、マウス初代星状細胞のLAMP2免疫反応性（Lamp2 IR）の定量化を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照に対して有意ではない。UN：処理なし。スケールバー＝20μm（D,E＆Fについて）、高倍率画像でのスケールバー＝10μm（Eについて）。3回の異なる実験セットから条件あたり少なくとも25個の画像を、ImageJを使用して全ての画像定量データについて解析した。
【図６】ゲムフィブロジルの経口投与がWT及びPPARβ-/-マウスの皮質におけるTFEBをin vivoにおいてアップレギュレートするが、PPARα-/-マウスではしないことを示す。(A,D,G)：WT、PPARα-/-及びPPARβ-/-マウス（各群n=6）を、強制飼養によって7.5mg/kg体重/日のゲムフィブロジル及び0.1mg/kg体重のオールトランス型レチノイン酸（0.1％メチルセルロース中に溶解）又はベヒクル（0.1％メチルセルロース）で処理した。60日間の処理後、マウスを犠牲にし、皮質切片をTFEB（赤）及びNeuN（緑）について二重標識した。核を可視化するためにDAPIを使用した。(C,F,I)：処理群のマウス（WT,PPARα-/-及びPPARβ-/-）の皮質ニューロンにおけるTFEB及びNeuNの局在を示す高倍率画像を示す。(B,E,H)：面積％として表す、各群（WT,PPARα-/-及びPPARβ-/-）からの未処理及び処理サンプルにおけるTFEB免疫反応性（TFEB IR）の定量化を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照については有意ではない。各群から少なくとも12個の切片（動物あたり2個の切片）をImageJを使用して定量化した。スケールバー＝50μm及び10μm（高倍率画像について）。
【図７】ゲムフィブロジルの経口投与がWT及びPPARβ-/-マウスの皮質におけるLAMP2をin vivoにおいてアップレギュレートするが、PPARα-/-マウスではしないことを示す。(A,D,G)：WT、PPARα-/-及びPPARβ-/-マウス（各群n=6）を、強制飼養によって7.5mg/kg体重/日のゲムフィブロジル及び0.1mg/kg体重のオールトランス型レチノイン酸（0.1％メチルセルロース中に溶解）又はベヒクル（0.1％メチルセルロース）で処理した。60日間の処理後、マウスを犠牲にし、皮質切片をLAMP2（赤）及びNeuN（緑）について二重標識した。核を可視化するためにDAPIを使用した。(C,F,I)：処理群のマウス（WT,PPARα-/-及びPPARβ-/-）の皮質ニューロンにおけるLAMP2及びNeuNの局在を示す高倍率画像を示す。(B,E,I)：面積％として表す、各群（WT,PPARα-/-及びPPARβ-/-）からの未処理及び処理サンプルにおけるLAMP2免疫反応性（LAMP2 IR）の定量化を示す。a：p＜0.05（WT対照に対して）；b：p＜0.05（PPARβ-/-対照に対して）；ns：PPARα-/-対照については有意ではない。各群から少なくとも12個の切片（動物あたり2個の切片）をImageJを使用して定量化した。スケールバー＝50μm及び10μm（高倍率画像について）。
【図８】TFEBのアップレギュレーションによって正常及びLINCL患者の線維芽細胞の双方のリソソーム生合成が誘導されることを示す。健常個体（WT#1-3）及びLINCL患者（NCL#1-5）及びLINCL保因者（NCL/C）の線維芽細胞を、低血清（2％）DMEM培地中で24時間、ゲムフィブロジル（10μM）及びレチノイン酸（0.2μM）で処理した後、リソトラッカーレッド（赤）で染色した。細胞の形態を検出するために明視野顕微鏡を使用した。スケールバー＝20μm。対応する箱ひげ図は、各細胞型における対照に対する処理群のリソトラッカー陽性シグナルの倍数変化を表す。＊：p＜0.05（未処理対照に対して）。ROI-白色の点線は細胞の領域を表す。倍率変化は、対照に対する処理群の細胞あたり単位面積あたりのLyso T陽性シグナルとして計算した。細胞型あたり条件あたりで少なくとも25個の個々の画像をImageJを使用して定量化した。
【図９】(A)-(D)は、コレステロール低下剤（シムバスタチン及びプラバスタチン）、アスピリン（鎮痛剤及び解熱剤）、ケイ皮酸（桂皮の代謝産物）、及び尿素サイクル異常症に対する薬剤（フェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム）によるマウス星状細胞におけるTFEB mRNA発現のアップレギュレーションを示す。
【図１０】初代マウス星状細胞におけるアスピリンによるリソソーム生合成の増大を示す。細胞を無血清条件下で24時間、異なる濃度のアスピリンで処理した後、リソトラッカー染色を行った。結果は3回の独立した実験を表す。
【図１１】(A)-(D)は初代マウス星状細胞におけるアスピリンによるLAMP2発現のアップレギュレーションを示す。11(A)：細胞を、無血清条件下で異なる時間、5μMのアスピリンで処理した後、リアルタイムPCRでLAMP2のmRNA発現をモニタリングした。結果は3回の異なる実験の平均＋SDである。a：p＜0.05（対照に対して）；b：p＜0.001（対照に対して）。11(B)：細胞を、無血清条件下で24時間、異なる濃度のアスピリンで処理した後、LAMP2についてウェスタンブロットを行った。11(C)：細胞を、無血清条件下で異なる時間、5μMのアスピリンで処理した後、LAMP2についてウェスタンブロットを行った。11(D)：アスピリン処理の24時間後、細胞をLAMP2及びGFAPについて二重標識した。結果は3回の独立した実験を表す。
【図１２】(A)-(C)は初代マウス星状細胞におけるアスピリンによるTPP1の増加を示す。12(A)：細胞を、無血清条件下で24時間、異なる濃度のアスピリンで処理した後、TPP1についてウェスタンブロットを行った。12(B)：細胞を、無血清条件下で異なる時間、5μMのアスピリンで処理した後、TPP1についてウェスタンブロットを行った。ハウスキーピング分子としてアクチンを泳動した。12(C)：細胞を、無血清条件下で24時間、異なる濃度のアスピリンで処理した後、5μgの総タンパク質を含む細胞抽出物及び基質としてAla-Ala-Phe7-アミド-4-メチルクマリンを使用してTPP1活性アッセイを行った。結果は3回の独立した実験を表す。
【図１３】(A)-(C)は初代マウス星状細胞におけるアスピリンによるTFEBのアップレギュレーションを示す。13(A)：細胞を無血清条件下で12時間、異なる濃度のアスピリンで処理した後、TFEBについてウェスタンブロットを行った。ハウスキーピング分子としてアクチンを泳動した。13(B)：細胞を無血清条件下で12時間、5μMのアスピリンで処理した後、GFAP及びTFEBで二重標識した。これらの結果は2回の独立した実験の平均である。13(C)：細胞をp(WT)Tfeb-Lucプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後、細胞を異なる用量のアスピリンで刺激した。4時間後、全細胞抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性を測定した。結果は3回の異なる実験の平均＋SDである。a：p＜0.001（対照に対して）。
【図１４】(A)-(B)は初代マウス星状細胞におけるアスピリンによるPPARαの活性化を示す。14(A)：細胞を5μMのアスピリンで異なる時間（分）処理した後、核抽出物を単離し、プローブとしてTfebプロモーターのPPARα-結合部位を使用してPPARαのDNA結合活性をモニタリングするための電気泳動移動度シフトアッセイを行った。14(B)：野生型、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞をPPARルシフェラーゼレポーター（PPRE-x3-TK-luc）プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後、細胞を異なる用量のアスピリンで刺激した。4時間後、全細胞抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性を測定した。結果は3回の異なる実験の平均＋SDである。a：p＜0.001（対照に対して）。
【図１５】(A)-(C)は、アスピリンがPPARαを介して星状細胞におけるTFEBのレベルを増大させることを示す。WT 15(A)、PPARα(-/-) 15(B)及びPPARβ(-/-) 15(C)マウスから単離した星状細胞を、5μMのアスピリンで12時間、無血清条件下で処置した後、TFEB及びGFAPについて二重標識した。結果は3回の独立した実験を表す。
【図１６】(A)-(B)は、アスピリンがPPARαを介して星状細胞におけるLAMP2のレベルを増大させることを示す。WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから単離した星状細胞を、異なる濃度のアスピリンで24時間、無血清条件下で処置した後、LAMP2についてウェスタンブロット解析した（16(A)）。ハウスキーピング分子としてアクチンを泳動した。バンドをスキャンして対照と比較して表した（16(B)）。結果は3回の異なる実験の平均＋SDである。a：p＜0.05（対照に対して）；b：p＜0.001（対照に対して）。ns：有意でない。
【図１７】(A)-(C)は、アスピリンがPPARαを介して星状細胞におけるリソソーム生合成を増大させることを示す。WT 17(A)、PPARα(-/-) 17(B)及びPPARβ(-/-) 17(C)マウスから単離した星状細胞を、5μMのアスピリンで24時間、無血清条件下で処置した後、リソトラッカー染色した。結果は3回の独立した実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
他に定義のない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。相反する場合には、本明細書中の定義を含む記載が優先する。好ましい方法及び物質をを以下に記載するが、本発明の実施又は試験において、本明細書中に記載したものと類似又は等価の方法及び物質を使用することができる。
【００１３】
本発明を記載する文脈（特に下記の請求項の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び類似の用語の使用は、本明細書中で他に示さない限り、又は文脈によって明らかに矛盾のない限り、単数及び複数の双方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書中で他に示さない限り、単にその範囲内に含まれるそれぞれ別個の数値への個々の言及の省略法として機能するものであることが意図され、それぞれ別個の数値は、本明細書中に個々に記載されているように明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に示さない限り、又は文脈によって明らかに矛盾のない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中に提供する任意及び全ての例、又は例示的な語句（「等の」、「例えば」等）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図するものであり、他に主張のない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。明細書中のいかなる語句も、請求項に記載のない要素を本発明の実施に必須のものとして示すものと解釈されるべきではない。
【００１４】
本明細書において使用する用語「被験体」はヒト又は動物（veterinary）被験体をいう。本明細書において使用する用語「治療効果」は、被験体の疾患、例えばLSDと関連する病的症状、疾患の進行若しくは生理学的状態における改善、又は疾患に対する抵抗性、を誘導する、軽減する、あるいは引き起こす効果を意味する。薬剤に関連して使用する用語「治療的有効量」は、被験体に治療効果を与える薬剤の量を意味する。
【００１５】
用語「相乗」、「相乗性」又は「相乗的」は、ある組み合わせで予測される相加的効果より大きいことを意味する。相乗的効果は、活性成分が(1)組み合わされた単位投与製剤に共に製剤化されて同時に投与若しくは送達されるか、(2)別個の製剤として交互に若しくは並行して送達されるか、又は(3)他のレジメンによる、場合に達成し得る。
【００１６】
リソソーム蓄積症治療のための組成物及び方法
本発明の原理の理解を促進する目的で、以下で実施形態について言及し、その一部は図面に示し、これを説明するために特定の用語を使用する。しかしながら、これらによって本発明の範囲を制限することが意図されるものではないことが理解されるであろう。記載された実施形態における任意の変更及び更なる改変、及び本明細書に記載した本発明の原理の任意の更なる応用が、本発明が関連する分野の熟練者によって通常行われるように想定される。
【００１７】
本発明の一態様は、リソソーム蓄積症（LSD）の治療方法に関連する。LSDは、例えばテイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、又は遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病を含むバッテン病であり得る。LSDはまた、オートファジー-リソソーム経路に関与する神経変性疾患、例えば神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）又はレビー小体型認知症（DLB）であり得る。神経変性疾患は不完全なオートファジー（defective autophage）によって特徴づけることができる。そのような疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンチントン病が挙げられる。
【００１８】
一実施形態は、Tfeb遺伝子からの発現をアップレギュレートするか又は増大させる薬剤をLSDに罹患している被験体に投与することを含む。アップレギュレーションはTfebのmRNAレベルを上昇させることを含み得る。本発明の方法はまた、TFEBをアップレギュレートさせるか又はTFEB活性を回復させる薬剤をLSDに罹患している被験体に投与することを含む。アップレギュレーションは、TFEBのmRNAレベルを上昇させる、TFEBタンパク質レベルを上昇させる、又はTFEB活性を上昇させることを含み得る。PPARα/RXRαヘテロ二量体の活性化はTFEBのアップレギュレーションをもたらす。本発明者等はまた、驚くべきことに、PPARαの活性又は関与を通してTFEBがアップレギュレートされるが、PPARβ又はPPARγではアップレギュレートされないことを示した。
【００１９】
薬剤は、フィブラート等の脂質低下剤であり得る。フィブラートは、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、又はクロフィブラートであり得る。薬剤は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡであり得る。驚くべきことに、また予想外なことに、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡと組み合わせてフィブラートを被験体に投与すると、フィブラート又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを単独で投与するよりもTFEBをよりアップレギュレートし得る。フィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを被験体に一緒に投与した場合、TFEBのアップレギュレーションを共同的に促進してTFEBを相乗的にアップレギュレートし得る。より高用量のフィブラートを被験体に投与した場合にのみ生じるのと同じ程度のTFEBアップレギュレーションを達成するために必要とされ得るフィブラートの用量は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡの存在下ではより低い。フィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡの組み合わせは相乗的な組み合わせであり得る。
【００２０】
別の実施形態において、脂質低下剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、又はこれらの薬剤の少なくとも2種の組み合わせであり得る。1種以上のスタチンを単独で、又はフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸若しくはビタミンＡと組み合わせて使用し得る。更に別の実施形態において、薬剤は、鎮痛剤又は解熱剤、例えばアスピリン；フェニルブチレート；安息香酸ナトリウム；又は桂皮代謝産物、例えばケイ皮酸であり得る。このような薬剤も、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡと組み合わせて使用することができ、TFEBのアップレギュレーションを共同的に促進するために被験体に一緒に投与して、TFEBを相乗的にアップレギュレートし得る。
【００２１】
脂質低下剤は、被験体の血液中を循環するトリグリセリドのレベルを低減する薬剤であり得る。更に、脂質低下剤は、脂質異常症のリスクを低下させる薬剤であり得る。フィブラートはPPARαを介してTFEBのアップレギュレーションを仲介し得るが、PPARβ及びPPARγを介しては仲介しない。TFEBのアップレギュレーションの間、PPARαはRXR-αとヘテロ二量体を形成し、RXRα/PPAR-aヘテロ二量体は、RXR結合部位を介してTfeb遺伝子のプロモーターにリクルートされる。
【００２２】
TFEBのアップレギュレーションはまた、オールトランス型レチノイン酸によっても仲介され得る。オールトランス型レチノイン酸は、ATRA、レチノイン酸、トレチノイン、及びビタミンA酸としても知られている。オールトランス型レチノイン酸は、レチノイドX受容体-α（RXR-α）を介してTFEBのアップレギュレーションを仲介し得る。TFEBのアップレギュレーションの間、RXR-αはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-a（PPAR-α）とヘテロ二量体を形成し、RXR-α/PPAR-αヘテロ二量体は、RXR結合部位を介してTfeb遺伝子のプロモーターにリクルートされる。
【００２３】
TFEBのアップレギュレーションを仲介する組成物は、薬剤、例えば脂質低下剤と、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンAとの組み合わせを含有し得る。このような組み合わせは、薬剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA単独の投与と比較して、TFEBのアップレギュレーションを共同的に仲介又は増大し得る。この組み合わせは、脂質低下剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA単独の投与と比較して、TFEBのアップレギュレーションを約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は約10倍共同的に増大し得る。特に、この組み合わせは、脂質低下剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA単独の投与と比較して、TFEBのアップレギュレーションを約3倍共同的に増大し得る。
【００２４】
本発明の別の態様は、少なくとも1種の上記の薬剤を含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンAも含有し得る。例えば、医薬組成物は、ゲムフィブロジル、又はゲムフィブロジルとオールトランス型レチノイン酸若しくはビタミンAとの組み合わせ、又はアスピリンとオールトランス型レチノイン酸若しくはビタミンAとの組み合わせを含有し得る。
【００２５】
医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、糖衣錠、ハードゲル及びソフトゲルカプセル、顆粒、ペレット、水性、脂質性、油性若しくは他の溶液、水中油型エマルジョン等のエマルジョン、リポソーム、水性若しくは油性の懸濁液、シロップ、エリクシル（alixier）、固形エマルジョン、固形分散液又は分散性粉末の形態であり得る。経口投与のための医薬組成物では、薬剤は、一般的に知られ、使用されている助剤及び賦形剤、例えばアラビアガム、タルク、デンプン、糖類（例えばマンニトース(mannitose)、メチルセルロース、ラクトース）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水性若しくは非水性溶媒、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤、風味剤（例えばエーテル油）、溶解促進剤（例えば安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール）又はバイオアベイラビリティー促進剤（例えばGELUCIRE）と、混合することができる。医薬組成物において、薬剤はまた、微粒子、例えばナノ粒子状の組成物中に分散していても良い。
【００２６】
非経口投与の場合、薬剤、又は薬剤の医薬組成物は、生理学的に許容される希釈剤、例えば水、緩衝液、可溶化剤を含むか含まない油、界面活性剤、分散剤又は乳化剤中に溶解又は懸濁させることができる。油としては、限定するものではないが、例えばオリーブ油、落花生油、綿実油、大豆油、ヒマシ油及びゴマ油を使用し得る。より一般的には、非経口投与では、薬剤、又は薬剤の医薬組成物は、水性、脂質性、油性若しくは他の種類の溶液又は懸濁液の形態であることができ、あるいはリポソーム若しくはナノ懸濁液の形態で投与することもできる。
【００２７】
投与方法
上記の薬剤、又はこれらの薬剤を含有する医薬組成物は、治療的有効量の薬剤を被験体に送達することを可能とする任意の方法によって投与することができる。投与方法としては、限定するものではないが、経口、局所、経皮及び非経口経路、並びに組織への直接注入、及びカテーテルによる送達を挙げることができる。非経口経路としては、限定するものではないが、皮下、皮内、関節内、静脈内、腹腔内、及び筋肉内経路が挙げられる。一実施形態において、投与経路は、例えばローション、クリーム、パッチ、注射、インプラントデバイス、移植片（graft）又は他の制御放出担体による、局所又は経皮投与によるものである。投与経路には、任意の非経口経路を含む、（例えば注射によって）体循環に組成物を直接送達する任意の経路が含まれる。
【００２８】
本発明の方法の一実施形態は、LSDの発症を予防する、又はLSDの程度を低減するのに十分な投与量、濃度及び時間で、少なくとも1種の薬剤、例えばゲムフィブロジル又はゲムフィブロジルとATRAとの組み合わせを投与することを含む。特定の実施形態は、被験体の体重1kgあたり約0.1μg〜約100mg、被験体の体重1kgあたり約0.1μg〜約10mg、被験体の体重1kgあたり約0.1μg〜約1mgの投与量で少なくとも1種の薬剤を全身投与することを含む。この方法の実施において、薬剤、又は薬剤を含有する治療用組成物は、単回の一日用量で、又は一日あたり複数回の投与量で投与することができる。この治療方法は長期間の投与を必要とし得る。投与される用量中の量又は総投与量は医師によって決定され、患者の体重、患者の年齢及び全身状態、及び化合物に対する患者の耐性等の因子に依存するであろう。
【００２９】
本発明の実施形態を以下の実施例で更に記載するが、これらは請求の範囲に記載される発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００３０】
［実施例１−材料及び方法］
試薬：DMEM/F-12 50/50 1x、ハンクス液（HBSS）及び0.05％トリプシンはMediatech（Washington, DC）から購入した。ウシ胎児血清（FBS）はAtlas Biologicals（Fort Collins, CO）から入手した。抗生物質、抗真菌薬、ゲムフィブロジル及びオールトランス型レチノイン酸（ATRA）はSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から入手した。
【００３１】
マウス初代星状膠細胞の単離：星状膠細胞は、Giulian及びBakerの方法（26）に従って、記載されたように（24、25）混合グリア細胞培養物から単離した。簡潔に説明すると、9日目に混合グリア細胞培養物をダルベッコ改変イーグル培地/F-12で3回洗浄し、ロータリーシェイカーで37℃で2時間、240rpmで振とうしてミクログリアを除去した。2日後、乏突起膠細胞の除去のために24時間振とうを繰り返し、全ての非星状膠細胞の完全な除去を確実にした。付着した細胞を更なる試験のために新しいプレートにまいた。
【００３２】
マウス初代ニューロンの単離：マウス胎児（E18-E16）のニューロンを、先の記載（27）に改変を加えて調製した。脳全体を取り出し、細胞を1200rpmで10分間の遠心分離を3回行って洗浄し、ペレットを解離させ、ポリ-D-リシン（Sigma, St. Louis, MO）で2時間超前処理した8-ウェルチャンバースライドに10％コンフルエンスで細胞を播種した。4分後、非接着細胞の懸濁液を吸引し、2％ B27を添加した500mlの完全Neurobasal培地（Invitrogen）を各ウェルに添加した。実験前に4日間細胞をインキュベートした。β-チューブリン、及びGFAP又はCD11bの二重標識免疫蛍光から、ニューロンが98％超純粋であることが明らかとなった（データは示さない）。2％ B27を添加し、抗酸化剤を含まないNeurobasal培地（Invitrogen）中、ゲムフィブロジルで細胞を24時間刺激し、メタノール固定及び免疫染色を行った。
【００３３】
半定量的逆転写酵素共役ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）：マウス初代星状細胞及びヒト初代星状細胞から、RNA-Easy Qiagen（Valencia, CA）キットを使用し、製造業者のプロトコルに従って、全RNAを単離した。半定量的RT-PCRは、プライマーとしてのオリゴ（dT）12-18、及び20μlの反応混合液中のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV-RT, Invitrogen）を使用して、先に記載されているように（28）実施した。得られたcDNAをPromega Master Mix（Madison, WI）及びマウスの遺伝子のための以下のプライマー（Invitrogen）を使用して適切に増幅した：
【００３４】
マウスTfeb：センス、5’-AAC AAA GGC ACC ATC CTC AA-3’（配列番号１）；アンチセンス、5’-CAG CTC GGC CAT ATT CAC AC-3’（配列番号２）；マウスLamp2：センス、5’-GGT GCT GGT CTT TCA GGC TTG ATT-3’（配列番号３）；アンチセンス、5’-ACC ACC CAA TCT AAG AGC AGG ACT-3’（配列番号４）；マウスLimp2：センス、5’-TGT TGA AAC GGG AGA CAT CA-3’（配列番号５）；アンチセンス、5’-TGG TGA CAA CCA AAG TCG TG-3’（配列番号６）；マウスNpc1：センス、5’-GGG ATG CCC GTG CCT GCA AT-3’（配列番号７）；アンチセンス、5’-CTG GCA GCT ACA TGG CCC CG-3’（配列番号８）；マウスGapdh：センス、5’-GCA CAG TCA AGG CCG AGA AT-3’（配列番号９）；アンチセンス、5’-GCC TTC TCC ATG GTG GTG AA-3’（配列番号１０）。
【００３５】
増幅産物を2％アガロース（Invitrogen）ゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド（Invitrogen）染色によって可視化した。グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapdh）mRNAをローディング対照として使用して、各サンプルから同量のcDNAが合成されていることを確認した。
【００３６】
定量的リアルタイムPCR：mRNAの定量化は、ABIPrism7700配列検出システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用し、SYBR Select master mix（Applied Biosystems）を用いて実施した。標的化遺伝子のmRNA発現をGapdh mRNAのレベルに正規化し、ABI Sequence Detection System 1.6ソフトウェアによってデータを処理した。
【００３７】
細胞の免疫染色：免疫細胞化学は、先に報告されているように実施した（29）。簡単に記載すると、マウス初代星状細胞、マウスニューロンを含む8ウェルのチャンバースライドを70〜80％コンフルエンスになるまで培養し、冷メタノール（Fisher Scientific, Waltham, MA）で一晩かけて固定し、ろ過したPBSで短時間で2回洗浄した。サンプルを、Tween20（Sigma）及びTritonX-100（Sigma）を含有するPBS中の2％ BSA（Fisher Scientific）で30分間ブロックし、以下の抗マウス一次抗体：TFEB (1:1000; Abcam)、GFAP、(1:1000; DAKO)、LAMP2 (1:500, Abcam)、NeuN (1:500, Millipore)、及びMAP2 (1:200, Millipore)を含むPBS中で2時間、室温で振とう条件下でインキュベートした。ろ過したPBS中で15分間の洗浄を4回行った後、スライドを、Cy2又はCy5標識二次抗体（全て1:200；Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）と共に同様の振とう条件下で更に1時間インキュベートした。ろ過したPBSで15分間の洗浄を4回行った後、細胞を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI, 1:10,000; Sigma）と共に4-5分間インキュベートした。サンプルをEtOH及びキシレン（Fisher）勾配中で流し、マウントし、Olympus BX41蛍光顕微鏡下で観察した。
【００３８】
組織切片の免疫染色：処置の60日後にマウスを犠牲にし、その脳を固定し、包埋し、処理した。異なる脳の領域から切片を作製し、新鮮凍結切片での免疫蛍光染色のために抗マウスTFEB（1:500）、抗マウスLAMP2（1:200）及び抗マウスNeuN（1:500）を使用した。サンプルを載せ、Olympus BX41蛍光顕微鏡（30）下で観察した。
【００３９】
リソトラッカー（LysoTracker）染色：70-80％コンフルエンスまで培養した線維芽細胞を、血清量を減らした（2％）DMEM培地中で様々な刺激にかけ、続いて75nMのリソトラッカーレッド（LysoTracker Red）DND99（Invitrogen）と共に45分間インキュベートした。次いで、細胞をろ過したPBSで完全に洗浄し、ガラススライド上に載せてBX41蛍光顕微鏡で観察した。
【００４０】
免疫ブロッティング：ウェスタンブロッティングは先の記載（31、32）に改変を加えて実施した。簡単に説明すると、細胞を1×RIPAバッファー中でこすり取り（scraped）、Bradford試薬を使用してタンパク質を測定し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）バッファーを添加してNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)4-12％ Bis-Trisゲル（Invitrogen）上で電気泳動し、Thermo-Pierce Fast Semi-Dry Blotterを使用してタンパク質をニトロセルロース膜（Bio-Rad）上に転写した。
【００４１】
次いで膜をTBS plus Tween20（TBST）中で15分間洗浄し、BSAを含有するTBST中で1時間ブロックした。次に、以下の一次抗体：TFEB（1:1000、Abcam）、LAMP2（1:500、Abcam）及びβ-アクチン（1:800、Abcam, Cambridge, MA）を用いて振とう条件下、4℃で一晩膜をインキュベートした。翌日、膜をTBST中で1時間洗浄し、一次抗体に対する二次抗体（全て1:10,000；Jackson ImmunoResearch）と共に室温で1時間インキュベートし、更に1時間洗浄して、Odyssey(登録商標)Infrared Imaging System（Li-COR, Lincoln, NE）下で可視化した。
【００４２】
マウスTfebプロモーター駆動性レポーター構築物の構築：初代マウス星状細胞から単離されたマウスゲノムDNAをPCRの鋳型として使用した。マウスTFEB（-916/+61）遺伝子の5’隣接配列をPCRによって単離した。プライマーは遺伝子バンクの配列から設計した。Tfeb：センス：5’-acgcgt CCA GGA GCC AGG GAC GGG GTA CAT CTC-3’（配列番号１１）；アンチセンス：5’-agatct AAG GAG AAA CTG AGT CCG GGC AGA AGG-3’（配列番号１２）。センスプライマーはMlu1制限酵素部位でタグ付けし、アンチセンスプライマーはBglIIでタグ付けした。Advantage-2 PCRキット（Clontech）を使用して、製造業者の説明書に従ってPCRを実施した。得られた断片をゲル精製し、PGEM-TEasyベクター（Promega）中にライゲートした。これらの断片を、対応する制限酵素による消化及び配列決定による確認（ACGT Inc. DNA Sequencinc Services）の後、更にPGL-3エンハンサーベクター中にサブクローニングした。
【００４３】
Tfebプロモーターのクローニング及び部位特異的突然変異誘発：部位特異的突然変異誘発は、部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, USA）を使用して行った。反対方向の2つのプライマーを使用して、一回のPCR反応で変異したプラスミドを増幅した。変異したプロモーター部位に対するプライマー配列は以下の通り：変異型：センス：5’-GCA ACA GCA AGT GCG GAT TTG AGG GGG GGG GAC GGT GGG-3’（配列番号１３）；アンチセンス：5’-CCC ACC GTC CCC CCC CCT CAA ATC CGC ACT TGC TGT TGC-3’（配列番号１４）。PCR産物をエタノールで沈殿させ、次いでT4キナーゼでリン酸化した。リン酸化断片をT4 DNAリガーゼで自己ライゲート（self-ligated）させ、制限酵素DpnIで消化して変異していない鋳型を除いた。変異したプラスミドをクローニングし、大腸菌（DH5-α株）コンピテント細胞中で増幅した。
【００４４】
Tfebプロモーター駆動性レポーター活性アッセイ：12-ウェルプレート中に50-60％コンフルエンスでまいた細胞に、Lipofectamine Plus（Invitrogen）を使用して、0.25μgのpTFEB(WT)-Luc、pTFEB(Mu)-Lucを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、無血清条件下で6時間、異なる薬剤で細胞を刺激した。先に記載されているようにして（33、34）、Luciferase Assay Systemキット（Promega）を使用して、細胞抽出物中のホタルルシフェラーゼ活性をTD-20/20 Luminometer（Turner Designs）で分析した。
【００４５】
クロマチン免疫沈降アッセイ：Nelson等が記載した方法（35）に一部改変を加えて使用してChIPアッセイを実施した。簡単に記載すると、マウス初代星状細胞を10μMゲムフィブロジル及び0.5μM RAで6時間刺激した後、ホルムアルデヒド（最終体積の1.42％）で固定し、125mM グリシンでクエンチした。細胞をペレット化し、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM EDTA、NP-40 (0.5％ vol/vol)、Triton X-100 (1.0％ vol/vol)を含有するIPバッファー中で溶解した。500 mlに対して、4.383 gのNaCl、25 mlの100 mM EDTA (pH 8.0)、25 mlの1 M Tris-HCl (pH 7.5)、25 mlの10％ (vol/vol) NP-40、及び以下の阻害剤を含む50 mlの10％ (vol/vol) Triton X-100を添加した：10 μg/ml ロイペプチン、0.5 mM フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)、30 mM p-ニトロフェニルホスフェート、10 mM NaF、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM Na2MoO4及び10 mM β-グリセロホスフェート。
【００４６】
1.0mlのIPバッファーで1回洗浄した後、ペレットを1mlの（全ての阻害剤を含有する）IPバッファーに再懸濁し、超音波処理して、せん断したクロマチンを2つの画分に分けた（一方をインプットとして使用する）。残りの画分を4℃で一晩、回転させながら5〜7μgの抗PPARα若しくは抗RXRα抗体又は抗PGC1α若しくはRNApol若しくは正常IgG（Santa Cruz）と共にインキュベートし、続いてProtein G-アガロース（Santa Cruz）と共に4℃で2時間、回転させながらインキュベートした。次いでビーズを冷IPバッファーで5回洗浄し、合計100μlの10％Chelex（10g/100ml H2O）を洗浄したprotein Gビーズに直接添加してボルテックスした。10分間沸騰させた後、Chelex/protein Gビーズ懸濁液を室温まで冷ました。次いでプロテイナーゼK（100μg/ml）を添加し、ビーズを55℃で30分間振とうしながらインキュベートした後、10分間の沸騰をもう一回行った。懸濁液を遠心分離し、上清を回収した。Chelex/protein Gビーズ画分を別の100μlの水と共にボルテックスし、再び遠心分離して、第1及び第2の上清を合わせた。溶出液をPCRの鋳型としてそのまま使用した。
【００４７】
以下のプライマーを使用して、マウスTfebプロモーター中のRXR結合エレメントを挟む（flanking）断片を増幅した：セット1：センス：5’-GAA CAT TCC AGG TGG AGG CA-3’（配列番号１５）、アンチセンス：5’-CCC CCA ACA CAT GCT TCT CT-3’（配列番号１６）；セット2：センス：5’-GAG TCT CTC GGA GGA GGT GA-3’（配列番号１７）、アンチセンス：5’-ACT CCA GGC ATG CTT TCT CC-3’（配列番号１８）。PCRは様々なサイクル数及び異なる量の鋳型で繰り返し、結果がPCRの線形範囲内にあることを確認した。qRT-PCRは同じプライマーとSYBR select mastermixを使用して実施した。データはインプット及び非特異的IgGに対して正規化し、対照に対する増加倍率を算出した。
【００４８】
デンシトメトリー解析：タンパク質ブロットはImageJ（NIH, Bethesda, MD）を使用して解析し、バンドはそれぞれのβ-アクチンローディング対照に対して正規化した。データは、3回の独立した実験セットからの条件毎に少なくとも25個の異なる画像についての対照に対する平均倍率変化を示す。
【００４９】
統計学：数値は少なくとも3回の独立した実験の平均±SEMとして示す。差についての統計解析はスチューデントT検定で実施した。統計的有意性についての基準はp<0.05とした。
【００５０】
［実施例２−PPARα及びRXRαの活性化はマウス初代脳細胞におけるTFEBの発現を誘導する］
FDAで承認されている薬剤であるゲムフィブロジル等のPPAR活性化剤を、マウス脳細胞におけるTFEBの発現をアップレギュレートすることができるかどうかを決定するために検討した。PPARα及びRXRαが転写的に活性のある複合体を形成することが知られているため（21、36、37）、我々は、ゲムフィブロジル、及びRXRαを活性化するATRAの双方を使用して、二重の処理によって何らかの相加的効果があるか否かをチェックした。マウス初代星状細胞（MPA）を無血清培地中で単回用量のゲムフィブロジル及びATRA、及び組み合わせでも処置した。定量的リアルタイムPCRデータから、3つの群の全てでTfebの発現の上昇が示され、上昇は併用処理でわずかに高かった（が、個々の処理に対して統計的に有意ではなかった）（図1A）。ゲムフィブロジル及びATRAの双方の組み合わせを使用した場合、我々は、25μMのゲムフィブロジル及び0.5μMのATRAと比較して双方の化合物がずっと低い用量（それぞれ10μM及び0.2μM）でTfebの同様のレベルの発現を達成することができた。併用処理を用いた時点分析（time point analysis）から、Tfeb発現が早期の6時間から24時間まで誘導できることが示された（図1D）。用量及び時間の双方についてのqRT-PCRデータをウェスタンブロットによって評価したところ、TFEBレベルの上昇の同様のパターンが示された（図1B、1C、1E＆1F）。
【００５１】
更に、我々はマウス初代星状細胞及び初代ニューロンを使用し、これらを無血清培地中で24時間、ゲムフィブロジル及びATRAの組み合わせで処理し、免疫細胞化学を実施した。データから、星状細胞及びニューロンの双方におけるTFEBレベルの明らかな上昇、並びに核内及びその周囲でのTFEBの局在が示された（図1G＆1I）。TFEB免疫反応性をImageJを使用して定量化し、TFEBの全体レベルの約4倍の上昇と、処理後の核内のTFEBの局在の約5〜6倍の上昇を観察した（図1H及び1J）。飢餓状態及び栄養欠乏状態がTFEBの活性化に到ることが先に示されており、従って本試験では未処理の細胞の全てを処理時間中、同様に無血清条件下で維持し、TFEBレベルのベースラインの変化が群間で同じであるようにした。
【００５２】
［実施例３−PPARα及びRXRαは薬剤仲介性のTFEBのアップレギュレーションに関与する］
RXRαと併用したPPARαが薬剤仲介性のTFEBのアップレギュレーションに関与できるという仮説を、PPARα(-/-)動物由来のマウス初代星状細胞を使用し、WTマウス初代星状細胞のRXRαをノックダウンすることによって試験した。WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)動物から得られたMPAを上記と同様の条件下で処理し、TFEBのmRNA及びタンパク質発現についてチェックした。TFEBについてのリアルタイムPCR及びウェスタンブロットの双方から、TFEBがWT及びPPARβ(-/-)の星状細胞でアップレギュレートされることができたが、PPARα(-/-)の星状細胞では同じレベルではなかった（図2A、2B＆2C）。この知見は、WT及びPPARβ(-/-)でTFEBレベルのほぼ3〜4倍の上昇が観察されたがPPARα(-/-)では観察されなかった免疫細胞化学によって更に確認された（図2F＆2G）。
【００５３】
PPARγ補助活性化因子-1a（PGC1A）がTfebの転写活性化に関与できることが報告されているため、我々は、PPARγがこの特定の薬剤仲介性TFEB発現に関与しているか否かをPPARγ阻害剤を使用して試験した。薬剤で処理する前にPPARγ特異的阻害剤での前処理を行った場合のTFEBのウェスタンブロットから、ゲムフィブロジル及びATRAがTFEBのアップレギュレーションのためにPPARγ仲介性の経路を利用していない可能性が示される（図2D＆2E）。PPARα及びRXRαは転写複合体を形成することが知られており、我々のデータは、ATRAの存在下でのTFEBのわずかな上昇を示した。我々はATRAがRXRαを介してその効果を発揮するか否かを知りたかった。WT MPAをRXRα特異的siRNAで処理した後にゲムフィブロジル及びATRAの組み合わせで処理し、mRNA及びタンパク質双方の分析を実施した。データから、RXRα遺伝子のノックダウンの成功と、その結果、薬剤の効果がRXRαの不在下で部分的に取り消されたことが示され、これはRXRαサイレンシング後のTfeb mRNAレベルから明らかであった（図2H＆2I）。ウェスタンブロットからも、スクランブルsiRNAの処理後と比較して、RXRαサイレンシングした細胞でTFEBレベルが有意に低い同様の結果が示された（図2J＆2K）。まとめると、これらのデータから、PPARα及びRXRαがゲムフィブロジル及びATRAによるTFEBのアップレギュレーションに関与し得ることが示される。
【００５４】
［実施例４−PPARα/RXRαヘテロ二量体は処置条件下でTFEB発現を転写的に制御する］
PPARα及びRXRαは一緒に転写複合体を形成するため、これらの受容体はTfebをアップレギュレートするであろうと判断し、我々はこの受容体がTfeb発現を転写的に制御するか否かを試験した。Tfebのプロモーター部位の分析後、我々は、Tfebの転写開始部位（TSS）から約480bp上流にペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（Peroxisomal Proliferator Response Element、PPRE）の存在を見出した。PEROを含むTfebプロモーター（pTFEB(WT)）をpGL3エンハンサーベクター中にクローニングした。我々はまた、PPREのコア配列を変異させ、変異したプロモーター構築物（pTFEB(Mu)）もPGL3ベクター中にクローニングした。野生型ルシフェラーゼ構築物は、BV2細胞にトランスフェクトすると、ルシフェラーゼ活性の顕著な上昇を示した（図3B）。pTFEB(WT)ルシフェラーゼ構築物を含む細胞をPPARα-アンタゴニスト（GW6471; 250nM）、PPARβ-アンタゴニスト（GSK0660; 250nM）、PPARγ-アンタゴニスト（GW9662; 5nM）で処理すると、PPARα-アンタゴニストで処理した細胞では未処理の細胞と同様のルシフェラーゼ活性が観察されたが、PPARβ-又はPPARγ-アンタゴニストで処理した細胞では観察されなかった（図3C）。
【００５５】
WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)動物から単離されたマウス初代星状細胞では、WT及びPPARβ(-/-)細胞におけるルシフェラーゼ活性の上昇が観察されたが、PPARα(-/-)では観察されなかった（図3D）。更に、変異型PPRE部位を有する構築物（pTFEB(Mu)-Luc）をBV2及びマウス初代星状細胞にトランスフェクトすると、変異型構築物を含む細胞でルシフェラーゼ活性の劇的な低下が見出された（図3E＆3F）。まとめると、これらのデータから、ゲムフィブロジル及びレチノイン酸での処理後のTfebの誘導においてPPARαの活性化が重要な役割を果たしていることが示される。
【００５６】
最後に、我々は、この状況でTfebプロモーターに対するPPARαの実際のDNA結合の役割を調べることにした。PPARαの活性化の後、RXRα及びPGC1αが複合体を形成し、これが多くの遺伝子の転写活性化を開始することが示されており（38〜42）；我々はここでも同様であるかを検討した。30分〜240分の様々な時点でゲムフィブロジル及びレチノイン酸で処理したマウス初代星状細胞を、抗-PPARα、-RXRα、及び-PGC1α抗体でクロマチン断片を免疫沈降させることによってChIP解析に供し、抗-RNA Pol及び正常IgGを対照として用いた。半定量的PCR及び定量的RT-PCRの双方から、特定の抗体によるプルダウンでアンプリコンの濃縮が経時的に増大することが示された（図4B＆4C）。免疫沈降に次ぐ正常IgGを用いたPCRではRT-PCRでほとんど検出できないバンドが示され、全断片化DNAを用いたPCRではRT-PCRで均一なシグナルが示され、結果の均一性及び特異性が示された。リアルタイムPCRでは、Ct値をインプットに対する％に正規化し、更にIgGシグナルを用いて正規化してノイズ値を超えるシグナルを得、結果の特異性を実証した。実験は同じ条件及びサイクルで少なくとも3回繰り返し、PCR産物の希釈はデータがPCRの線形範囲内になるように調整した。これまでの知見の全てはPPARα及びRXRα受容体の活性化が実際にTfebの発現を転写的に直接調節できることを示している。
【００５７】
［実施例５−TFEBのアップレギュレーションはリソソーム生合成の増大につながる］
TFEBはリソソーム遺伝子の発現及び生合成の主たるレギュレーターであるため（9、12、16）、我々はTFEBのアップレギュレーションと共にリソソームマーカーの生合成の上昇を予想した。同じ条件下で処理したMPAを、いくつかのリソソームマーカー、例えばLamp2、Limp2及びNpc1についてmRNA解析した。予想された通り、データから、WT及びPPARβ(-/-)細胞での処理条件下でこれらの遺伝子のレベルの上昇が示されたが、PPARα(-/-)細胞では示されなかった（図5A）。WT及びK.O.細胞でのLAMP2についてのウェスタンブロット解析及び免疫細胞化学からも、同様のタンパク質発現パターンが示された（図5B、5C＆5D）。LAMP2のレベルの上昇はマウス初代ニューロンでも観察された（図5E）。更に、細胞をリソトラッカーレッドで染色すると、薬剤で処理したWT及びPPARβ(-/-)細胞の場合に細胞あたりのリソソーム含量の増加が観察されたが、PPARα(-/-)では観察されず（図5F）、これはTFEB及び他のリソソームマーカーについての我々の以前の知見と合致している。これらのデータから、ゲムフィブロジル及びATRAがPPARα/RXRα経路を介してTFEB発現を誘導することができ、これが最終的にはリソソームの生合成の増大につながることが示唆される。
【００５８】
［実施例６−PPARα及びRXRαのアゴニストは野生型及びPPARβ/-マウスのCNSにおけるin vivoでのリソソーム生合成を誘導するが、PPARα-/-マウスでは誘導しない］
フィブラート仲介性のTFEBのアップレギュレーションでPPARαの関与が確認されたため、我々は更に、in vivoの状況で同じ結果が再現できるか否かをチェックした。同じバックグラウンドのWT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスに、ベヒクルとしても使用する0.1％メチルセルロースに溶解した7.5mg/kg体重/日のゲムフィブロジル及び0.1mg/kg体重のATRAを60日間経口投与した。処置の最後にマウスを犠牲にし、大脳皮質を切片化し、TFEBの存在について免疫蛍光を実施した。ベヒクル対照と比較してPPARα(-/-)処理した動物の皮質でTFEBレベルの顕著な上昇を観察しなかったが、WT及びPPARβ(-/-)動物で著しい応答が観察され（図6A、6D＆6G）、このin vivoの免疫組織化学データから、我々の細胞培養での知見が認証された。
【００５９】
我々は更に、群あたり少なくとも12個の切片におけるTFEB陽性シグナルを定量化し、数値を総面積のパーセンテージとして表した。定量的解析から、WT及びPPARβ(-/-)動物でのTFEB陽性シグナルの有意な増大が確認されたが、PPARα(-/-)動物では確認されなかった（図6B、6E＆6H）。同じ動物の皮質の他の切片を、LAMP2の存在についての免疫組織化学に供した。その結果から、WT及びPPARβ(-/-)動物におけるLAMP2免疫反応性の上昇が示されるが、PPARα(-/-)動物では示されない（図7A、7D＆7G）。定量的データからも、WT及びPPARβ(-/-)においてLAMP2陽性シグナルが有意に増大するが、PPARα(-/-)動物では増大しないことが示唆された（図7B、7E＆7H）。
【００６０】
［実施例７−ゲムフィブロジル及びATRAはLINCL患者の線維芽細胞におけるリソソーム生合成を誘導した］
患者の細胞で同様の結果を再現できるか否かを試験するために、我々は正常及びLINCL罹患患者から皮膚線維芽細胞を取得し、低血清培地（reduced serum media）（2％血清）中で同様の濃度のゲムフィブロジル及びATRAで細胞を処理した。血清の欠乏（starvation）のために生じ得る変化を説明するために、未処理の細胞を処理時間中（24時間）同様の血清条件下で維持した。その後、線維芽細胞をリソトラッカーレッドで染色し、ボード全体で細胞中のリソソーム蓄積の増大の類似のパターンを観察した。正常線維芽細胞（WT#1〜WT#3）及びCln2変異を有するLINCL患者由来の線維芽細胞（NCL#1〜NCL#5）並びにLINCL保因者（NCL/C）の線維芽細胞で、細胞あたりのリソソームの同様の増大が示された（図８）。画像中の細胞の数及びサイズについて正規化するために、我々は、細胞あたり単位面積あたりのリソトラッカー陽性シグナルを算出し、対照に対する倍率を分析した（fold over control analysis）。群あたり少なくとも25個の視野でリソトラッカー陽性シグナルについて分析し、データから、疾患状態に関わらず全ての線維芽細胞で有意な上昇が示唆されたが、細胞中のリソソームの基底レベル、及び上昇のレベルは細胞毎に異なっていた。このデータから、処理の効果がLINCL患者の疾患状態に依存しないことが示唆される。
【００６１】
［実施例８−実施例２〜７の考察］
リソソームは、細胞の廃棄物処理機構として機能するのみでなく、抗原提示、特定のホルモンの制御、骨のリモデリング、ネクローシス細胞死、細胞表面の修復、及び発生及び他のシグナル伝達経路等の他の生物学的プロセスにおいても重要な役割を果たす細胞内の主要な器官の一つである（2、43〜47）。これらの様々な機能を果たすために、リソソームの生合成及び活性は厳密に調節される必要がある。近年の知見によれば、TFEBはリソソーム生合成の主要なレギュレーターである（9、12、15）。長年にわたり、異なるグループが異なる疾患の状況でのリソソームの役割を強調してきた（48〜53）。リソソーム関連遺伝子はグレーブス眼症に罹患している患者の眼窩脂肪体で密接に調節されていることが報告されており、一方リソソームでのプロセシングのダウンレギュレーションによって、PEG化リポポリプレックス（lipopolyplex）仲介型の遺伝子のトランスフェクションが改善されている（53、54）。リソソーム生合成の増大は、必ずしも全ての疾患及び細胞型において有益であると証明されないかも知れないが、一部の場合では、オートファジー-リソソーム経路の誘導が毒性廃棄物の細胞からのクリアランスのために役立ち得るであろう（55、56）。
【００６２】
過去数年間にわたり、TFEBはいくつかのリソソーム関連疾患の潜在的治療標的として浮上してきた。Taiji Tsunemi等は、PGC1αを介して転写因子EB（TFEB）を活性化することによって、httのターンオーバーの上昇及びタンパク質凝集物の排除がもたらされ得ることを報告した（57、58）。α-シヌクレイン毒性及びTFEBの機能障害との関係を示唆する報告があり、PDにおける神経保護療法のための標的としてTFEBを同定している（59）。TFEBの活性化は、ゴーシェ病における不安定化グルコセレブロシダーゼ（GC）変異型のフォールディング、トラフィッキング及び活性を促進することが示されている。もう一つのLSDであるテイ・サックス病の場合、TFEBはβ-ヘキソサミニダーゼ変異体の活性を回復させることが示されている。これらの知見では、TFEBがリソソームのタンパク質恒常性の特定のレギュレーター、及びLSDにおける酵素のホメオスタシスを回復させるための治療標的として記載されている（60、61）。
【００６３】
また、TFEBの過剰発現によるリソソームのエキソサイトーシスの誘導によって、LSDにおける病的な貯蔵を回復させ、正常な細胞形態に回復させ得ることも報告されている（62）。LSDとは別に、TFEBは脂質の異化及びクリアランスを誘導することが示されており、マウスにおいて肥満及びメタボリックシンドロームを治療できている（15、16）。全体的に見て、近年、TFEBは、その役割のために、リソソーム生合成だけでなく、その関連性のために疾患状態における治療標的としても、重要な転写因子の可能性を有するものとなっている。TFEB活性を標的とする治療的に使用可能な化合物は多くは同定されていないが、近年、FDAで認可された賦形剤である2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）が、LINCLに罹患した患者の細胞におけるプロテオリピドの凝集物のTFEB仲介性のクリアランスを促進することが示された（56）。また、別の研究において、ムコ多糖症（MPS）のための基質削減療法（SRT）における使用のための潜在的薬剤であるゲニステイン（5,7-ジヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4-オン）によって、TFEBレベル及び活性、並びにリソソーム生合成が誘導されることが明らかになった（63）。
【００６４】
近年の研究から、TFEB、リソソーム生合成及びオートファジーが脂質代謝と関連づけられている（14〜16、55、64、65）。TFEBと脂質代謝との相互作用の可能性から、我々は、脂質代謝における2つの重要な因子であるPPARα及びRXRαの潜在的活性化剤であるゲムフィブロジル及びATRAの役割を調べることにした。「Lopid」として販売されているゲムフィブロジルは、脂質異常症に対して処方されるFDA認可された薬剤である（17、19）が、複数の有益な効果を有することが示されている（22）。ゲムフィブロジルが血液脳関門（BBB）を通過できる能力は既に報告されている（20）。我々は以前、ATRAと組み合わせたゲムフィブロジルが脳細胞におけるCln2遺伝子のレベルを誘導できることを報告した（66）。我々は更に、リソソーム生合成の主要なレギュレーターであるTFEBが、薬剤によって影響を受け得るか否かを見るために検討した。我々のデータから、ゲムフィブロジルが、単独若しくはATRAと組み合わせて脳細胞におけるTFEBの発現を効果的に誘導できたことが示される。
【００６５】
更なる研究から、このプロセスにおけるPPARαの潜在的な役割が示唆されている。PPARαは、様々な調節性経路において重要な役割を果たしていることが示されている（67〜71）。特定の多価不飽和脂肪酸及び酸化型誘導体、及びフェノフィブラート及びゲムフィブロジルを含むフィブラートファミリーの脂質修飾薬が、PPARαを活性化することが知られている。フィブラート薬はサイトゾル中でPPARαを隔離するHSP90リプレッサー複合体を置き換え、PPARαの転写活性の回復に役立つ（21）。従って、我々は、この現象における受容体のPPAR群の役割を評価した。我々のデータから、ゲムフィブロジルによるTFEBのアップレギュレーションのプロセスにおいて、PPARαが関与しているが、PPARβ及びPPARγは関与しないことが明確に示される。このin vitroの研究は、PPARα及びPPARβのノックアウトマウスを使用したin vivoの研究によって更に検証された。我々のin vivoの結果も細胞培養のデータを支持するものであった。
【００６６】
TFEBのアップレギュレーションのメカニズムを説明するために、Tfeb遺伝子のプロモーター領域の分析を行った。マウスTfebプロモーターにPERO部位並びにRXR結合部位が見出された。以前の研究によれば、PPAR/RXRヘテロ二量体はDNA結合活性を示した（70）。また、PPAR/RXRヘテロ二量体は、その産物が脂質のホメオスタシス、細胞増殖、及び分化に関与する遺伝子の転写を調節する（69、72）。Tfebアップレギュレーションの経路はPPAR及びRXR双方の共同的な作用を必要とすることが観察された。更に、ゲムフィブロジル及びRA双方の効果は、RXRα又はPPARαのいずれかの不在下では取り消された。Tfebプロモーター上のPEROのWT及び変異型ルシフェラーゼ構築物を使用したルシフェラーゼアッセイの結果から、WT構築物で刺激後にTfebプロモーター依存性の活性の増大が示された。しかしながら、pTFEB(WT)-Luc構築物でトランスフェクトされたPPARα(-/-)細胞、及びpTFEB(Mu)-Luc構築物でトランスフェクトされたWT細胞は、ルシフェラーゼ活性の有意な上昇を示さなかった。最後に、ChIPデータから、PGC1α及びRNA Polと共にPPARα及びRXRαのTFEBプロモーターのPERO部位上へのリクルートメントが示された。実験データは、知見の特異性を確実にするために、適切な対照を組み込んで厳密に解析された。
【００６７】
総合すると、これらのデータは、PPARαの活性化剤であるゲムフィブロジルと、RXRαのアゴニストであるATRAとが、PPARα/RXRαヘテロ二量体を介して脳細胞におけるTFEBを一緒にアップレギュレートする独特なメカニズムを説明する。ある研究ではPPARγ-ヌルのトロホブラスト幹（TS）細胞が分化4日目に低レベルのTFEBを有すると報告されているが、脳細胞における強力な公知のPPARγアンタゴニストであるGW9662を用いた研究ではPPARγの実質的な関与は明らかにされなかった（73）。これは細胞型の違い、すなわち分化しているTS細胞と成熟した初代脳星状細胞／ニューロンの違い、又はPPARαの活性化のためのポテンシャルのレベルの相違によるものである可能性がある。Settembre等によるある包括的な研究によれば、著者等は、PPARα及びPGC1αが飢餓によって誘導されるストレス下でTFEBの標的であること、及び飢餓ストレスの場合にTFEBが自己制御されていることを報告しているが、Tsunemi等による別の研究ではハンチントン病の状況下でTFEBの上流にPGC1αが置かれている。TFEBが、いずれも脂質代謝の調節において非常に重要な役割を有するPPARα及びPGC1αを介して脂質代謝を調節する可能性が十分ある。しかしながら、一方で本出願のデータは、PPARαの直接的な刺激がPPARα-RXRα-PGC1α複合体のTFEBプロモーター上へのリクルートメントを誘導し、それによってリソソーム生合成に影響し得ることを示している。
【００６８】
ストレス応答はTFEB機能を直接制御するが、本知見は、PPARα並びにRXRαの外部刺激による活性化もTFEBを調節することができ、これが次にPPARα又は脂質代謝に関わる他の遺伝子の発現を制御し得ることを示唆する。しかしながら、そのようなフィードフォワード制御メカニズムの存在、及び脂質代謝とリソソーム生合成との見かけ上の二方向性の相互作用を解釈するためには、より詳細な研究が必要とされる。
【００６９】
まとめると、本研究では、ゲムフィブロジル等の脂質低下剤がPPARα仲介型のTFEBの活性化を介して脳細胞中のリソソーム生合成をアップレギュレートすることができるという新規な仮説を試験した。特定の疾患状況においてTFEBが果たす重要な役割を考慮すると、治療標的としてのTFEBの同定に関心が高まりつつある。本研究の結果は、PPARαの未知の性質を明らかにし、LSDに対する新たな治療選択肢を記載し、TFEBのより劇的な調節を明らかにし、脂質代謝経路とリソソーム生合成との関係の理解に対する関心を高める。
【００７０】
［実施例９−マウス星状細胞におけるTFEB mRNA発現のコレステロール低下剤によるアップレギュレーション］
図９は、コレステロール低下剤（シムバスタチン及びプラバスタチン）、アスピリン（鎮痛剤及び解熱剤）、ケイ皮酸（桂皮代謝産物）、及び尿素サイクル異常症のための薬剤（フェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム）によるマウス星状細胞におけるTFEB mRNA発現のアップレギュレーションを示す。マウス初代星状細胞を様々な濃度（図９参照）のシムバスタチン及びプラバスタチン(A)、(B)、ケイ皮酸(C)、及びフェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム(D)と共に無血清条件下で5時間インキュベートした後、半定量的RT-PCRでTFEBのmRNA発現をモニタリングした。フェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウムの陰性対照としてギ酸ナトリウム(D)を使用した。
【００７１】
［実施例１０−アスピリンは初代マウス星状細胞におけるリソソーム生合成を誘導する］  世界で最も広く使用されている薬剤の一つであるアスピリンがマウスの脳細胞におけるリソソーム生合成をアップレギュレートできるか否かを検討した。星状細胞を、無血清培地中で様々な用量のアスピリンで処理した後、リソトラッカー（lyso-tracker）染色を行った。リソトラッカー染色の増大から明らかなように、アスピリンは2及び5μMの用量で星状細胞におけるリソソーム生合成を顕著に増大させた（図10）。しかしながら、10μMの用量では、アスピリンはリソソーム生合成の増大においてそれ程強力ではなかった（図10）。
【００７２】
［実施例１１−アスピリンは初代マウス星状細胞におけるLAMP2の発現を増大させる］
LAMP2は、新しいリソソームの形成において鍵となる役割を果たす重要なリソソーム膜タンパク質である。我々は、星状細胞においてアスピリンによるLAMP2 mRNA（図11A）及びタンパク質（図11C）発現の経時的な増大を観察した。用量依存性試験からも、2及び5μMの用量のアスピリンでLAMP2タンパク質発現の上昇が示された（図11B）。アスピリンによるLAMP2の上昇は、免疫染色によって更に確認された（図11D）。
【００７３】
［実施例１２−アスピリンは初代マウス星状細胞におけるTPP1の発現及び活性をアップレギュレートさせる］
トリペプチジルペプチダーゼ1（TPP1）は、このタンパク質の活性が遅発型小児性バッテン病において欠損しているため、この疾患における標的分子である。我々は、アスピリンが星状細胞においてTPP1をアップレギュレートさせることができるか否かを検討した。用量依存性試験から、低用量のアスピリン（2及び5μM）でTPP1タンパク質の増大が示された（図12A）。5μMのアスピリンに応答したTPP1タンパク質の増大は2時間で早くも明らかであり、12時間のインキュベーションで最大となった（図12B）。今回も、我々は2及び5μMのアスピリンでTPP1活性の上昇を観察したが、10μMでは観察されなかった（図12C）。
【００７４】
［実施例１３−アスピリンは初代マウス星状細胞におけるTFEBの発現をアップレギュレートする］
近年の知見によれば、TFEBはリソソーム生合成の主要なレギュレーターである（9、12、15）。長年にわたり、異なるグループが異なる疾患の状況でのリソソームの役割を強調してきた（48、49、52、53）。リソソーム関連遺伝子はグレーブス眼症に罹患している患者の眼窩脂肪体で密接に調節されていることが報告されており、一方リソソームでのプロセシングのダウンレギュレーションによって、PEG化リポポリプレックス仲介型の遺伝子のトランスフェクションが改善される（53、54）。リソソーム生合成の増大は、必ずしも全ての疾患及び細胞型において有益であると証明されないかも知れないが、一部の場合では、オートファジー-リソソーム経路の誘導が毒性廃棄物の細胞からのクリアランスのために役立ち得るであろう（55、56）。過去数年間にわたり、TFEBはいくつかのリソソーム関連疾患の潜在的治療標的として浮上してきた。Tsunemi等によれば（57）、PGC1αを介して転写因子EB（TFEB）を活性化することによって、httのターンオーバーの上昇及びタンパク質凝集物の排除がもたらされ得る。α-シヌクレイン毒性及びTFEBの機能障害との関係を示唆し、PDにおける神経保護療法のための標的としてTFEBを同定する報告がある（59）。TFEBの活性化は、ゴーシェ病における不安定化グルコセレブロシダーゼ（GC）変異型のフォールディング、トラフィッキング及び活性を促進することも示されている。もう一つのLSDであるテイ・サックス病の場合、TFEBはβ-ヘキソサミニダーゼ変異体の活性を回復させることが示されている。これらの知見では、TFEBがリソソームのタンパク質恒常性の特定のレギュレーター、及びLSDにおける酵素のホメオスタシスを回復させるための治療標的として記載されている（60、61）。
【００７５】
従って、我々は、星状細胞においてアスピリンがTFEBをアップレギュレートできるか否かを検討した。用量依存性の研究から、アスピリンが2及び5μMの用量でTFEBのタンパク質レベルを増大させることができることが示された（図１３Ａ）。免疫蛍光分析によって、アスピリンによるTFEBのアップレギュレーションを更に確認した（図１３Ｂ）。我々は又、TfebプロモーターをpGL3エンハンサーベクター中にクローニングし、Tfebプロモーターによって駆動されるレポーター活性を調べた。興味深いことに、アスピリンは星状細胞においてTfebプロモーターで駆動されるルシフェラーゼ活性を誘導し（図１３Ｃ）、アスピリンがTfeb遺伝子の転写を増大させることが示唆された。
【００７６】
［実施例１４−アスピリンは初代マウス星状細胞においてPPARαの活性化を誘導する］
近年、我々は、PPARαがTfebの転写において重要な役割を果たしていることを発見した。従って、我々はここで、アスピリンが星状細胞においてPPARαの活性化を誘導できるか否かを検討した。まず、我々はPPARαのDNA結合活性をモニタリングするために、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用い、アスピリンによるPPARα活性化の経時的上昇を見出した（図14A）。これらの結果を確認するために、我々はWT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから星状細胞を単離し、PPARの転写活性をモニタリングした。興味深いことに、アスピリンはWT及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるPPRE-駆動性ルシフェラーゼ活性を上昇させたが、PPARα(-/-)マウスでは上昇させず（図14B）、アスピリンはPPARαの活性化を誘導することができるが、PPARβの活性化は誘導することができないことが示唆された。
【００７７】
［実施例１５−アスピリンはPPARαを介して初代マウス星状細胞におけるTFEBをアップレギュレートする］
WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞を5μMのアスピリンで処理し、続いてTFEBの免疫蛍光分析を行った。図15は、アスピリンが、WT及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるTFEBの発現を誘導したが、PPARα(-/-)マウスでは誘導しなかったことを示す。これらの結果から、アスピリンが星状細胞においてTFEBを増大させるためにはPPARαを必要とするが、PPARβは必要としないことが示される。
【００７８】
［実施例１６−アスピリンはPPARαを介して初代マウス星状細胞におけるリソソームの生合成を増大させる］
TFEBはリソソーム遺伝子の発現及び生合成の主たるレギュレーターであるため（9, 12, 16）、我々はリソソーム生合成に対するアスピリンの効果を検討した。WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞を異なる用量のアスピリンで処置した後、LAMP2のレベルをモニタリングした。図16A-Bから明らかなように、アスピリンはWT及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるLAMP2のレベルを用量依存的に上昇させたが、PPARα(-/-)マウスでは上昇させなかった。我々はまた、リソトラッカー染色によってリソソームの状態を検討した。LAMP2の結果と同様に、アスピリンはWT及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるリソソーム生合成を増大させたが、PPARα(-/-)マウスでは増大させなかった（図17）。
【００７９】
［実施例１７−実施例１０〜１６の考察］
リソソーム蓄積症のための他の利用可能な治療法と比較してアスピリンにはいくつかの利点がある。一方で、アスピリンは世界中で数十年間鎮痛剤として広く使用されてきた。他方では、アスピリンは、最も痛みの少ない経路である経口によって服用することができる。アスピリンは高用量ではいくつかの毒性作用（胃潰瘍、胃内出血、及び耳鳴り等）を示すことが報告されているが（74）、我々の研究では、アスピリンは低用量（2及び5μM）でリソソーム生合成を促進しており、低用量ではアスピリンは毒性を有さない可能性がある。しかしながら、アスピリンが低用量においても何らかの毒性作用（例えば胃潰瘍）を示す場合には、その副作用を低減する方法が存在する。例えば、経口的使用のために、かつ胃での分解を回避するために、腸溶性被覆したアスピリンが利用可能である。ランダム化非盲検（open）試験において、徐放性製剤中の低用量のアスピリンが顕著な副作用のない抗血小板薬として効果を示している（75）。ある研究（76）では体内で天然に形成されるアミノ酸であるS-アデノシル-メチオニン（SAM）を使用しており、高用量のアスピリン（1300mg）と共に500mg SAMの用量を投与して、胃の損傷を90％低減させることが見出されている。
【００８０】
まとめると、我々は、広く使用されている鎮痛剤であるアスピリンがPPARα介在性のTFEBのアップレギュレーションを介して星状細胞におけるリソソーム生合成を増大させることを実証した。これらの結果は、この薬剤が遅発型小児性バッテン病及び他のLSDにおける治療的介入のための主たる治療又は補助的治療として使用できることを強調する。
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本発明をその具体的な例示的実施形態を参照して記載及び説明したが、本発明がこれらの例示的実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者であれば、添付する請求の範囲によって規定される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく変更及び改変が可能であることを認識するであろう。従って、そのような変更及び改変の全てが添付する請求の範囲及びその等価物の範囲内に含まれるように本発明に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積症の治療のための組成物であって、転写因子EBのアップレギュレーションを仲介する薬剤の治療的有効量を含有する、上記組成物。
【請求項２】
薬剤が脂質低下剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
脂質低下剤がフィブラートである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
フィブラートがゲムフィブロジル、フェノフィブラート及びクロフィブラートからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
組成物が更に治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
薬剤がフィブラートであり、フィブラートの治療的有効量が、治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡの不存在下でフィブラートを投与する場合よりも低い、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症（Aspartylglucosaminuria）、コレステロールエステル蓄積症（Cholesteryl ester storage disease）、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、神経セロイドリポフスチン症、遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
リソソーム蓄積症が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）及びレビー小体型認知症（DLB）からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
転写因子EBが、転写因子EB mRNAレベルの上昇、転写因子EBタンパク質レベルの上昇、又はPPARa-RXRaヘテロ二量体の活性化によってアップレギュレートされる、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
治療的有効量の薬剤を含有するリソソーム蓄積症の治療のための組成物であって、薬剤が転写因子EB活性を回復させるものである、上記組成物。
【請求項１１】
薬剤がフィブラートである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
フィブラートがゲムフィブロジル、フェノフィブラート及びクロフィブラートから成る群より選択される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が更に治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡを含有する、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
フィブラートの治療的有効量が、治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンＡの不存在下でフィブラートを投与する場合よりも低い、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、神経セロイドリポフスチン症、遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病からなる群より選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
リソソーム蓄積症が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多系統萎縮症（MSA）等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）及びレビー小体型認知症（DLB）からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【外国語明細書】
2020100621000001.pdf