(57)【要約】【課題】  正確かつ簡便であり、非侵襲的に細胞分裂を同定する方法、該方法を用いた細胞集団の増殖活性を測定する方法およびシステムを提供することを目的とする。【解決手段】  接着細胞の反射光強度の増強および増強前の強度への減衰を測定することにより接着細胞の細胞分裂を同定する方法などにより、上記課題が解決された。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着細胞の反射光強度の増強および増強前の強度への減衰を測定することにより、接着細胞の細胞分裂を同定する方法。
【請求項２】
反射光強度の増強から増強前の強度への減衰が、２０分以上２時間以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接着細胞の形態変化に起因する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
測定が、タイムラプス画像を用いて行なわれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
接着細胞集団の増殖活性を測定する方法であって、
単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記方法。
【請求項６】
さらに単位時間中に反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポットを計数するステップ、および、
計数された反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、計数された反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
反射光強度の増強から増強前の強度への減衰が、２０分以上２間以内である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
９０％以上コンフルエントの接着細胞集団における増殖活性を評価するための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
接着細胞の形態変化に起因する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
測定が、タイムラプス画像を用いて行なわれる、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
接着細胞集団の増殖活性を測定するためのシステムであって、
接着細胞集団の培養容器を収納する収納部、接着細胞の反射光の強度変化を測定するための測定部、前記測定結果を記憶するための記憶部、および前記測定部によって得られた結果を解析して培養容器中の接着細胞集団の増殖活性を算出する解析部を含み、
解析が、単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記システム。
【請求項１２】
解析が、さらに単位時間中に反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポットを計数するステップ、および、
計数された反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、計数された反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くステップを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
解析部が、さらに個々の接着細胞の細胞候補領域を検出する手段を含む、請求項１１または１２に記載のシステム。
【請求項１４】
収納部が、光源を備える、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
測定部が、撮像部を備える、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
撮像部が、タイムラプス画像を取得可能である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞分裂の同定方法ならびに当該方法を用いた細胞集団の増殖活性測定方法および増殖活性測定システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
【０００３】
このように、再生医療に基づく新たな治療方法が確立されたことで、種々の細胞を利用する機会が増加している。
従来、接着細胞の増殖活性は、培養細胞の細胞数を経時的に計数し、増殖曲線を作製するか、またはフローサイトメトリー等を使用して細胞集団における細胞数や各細胞周期の割合を測定し、かかる結果をもとに推定及び評価していた（非特許文献２）。また画像解析により細胞の輝度や形態、粒径、遊走速度、細胞数または培養容器における局在パターンなどをもとに、対象とする細胞集団の増殖活性や状態を把握する技術も開発されている（非特許文献３、特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２１８９９５号公報
【特許文献２】特開２０１７−１４０００６号公報
【特許文献３】特表２０１７−０２３０５５号公報
【特許文献４】特表２０１６−１８５１０６号公報
【特許文献５】特開２０１４−０８５９５０号公報
【特許文献６】特開２０１４−０８５９４９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48
【非特許文献２】Remvikos Y1 et al.,Br J Cancer. 1991 Sep; 64(3): 501-507.
【非特許文献３】Seungil Huh et al. IEEE Transactions on Medical Imaging. 2011 March: VOL. 30:NO. 3:586-596
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、現実の培養細胞の細胞数や細胞周期の計測は、生細胞と死細胞を判別できることから、正確な増殖活性を測定し得るが、培養経過に伴った複数のポイントで接着細胞を回収し、染色した後に顕微鏡やフローサイトメーターに供するため、煩雑な処理を要するだけでなく、細胞に損傷を与えたり、破壊するといった問題がある。一方、細胞像の輝度や形態などをもとにした画像解析により分裂細胞を同定する場合、死滅細胞やゴミまたは不純物がノイズとなり正確性に欠く。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、接着細胞が、分裂する際にその反射光強度を増強させ、分裂後にその強度を減衰させることに着目し、かかる性質を接着細胞の細胞分裂の指標とすることで、分裂細胞を死滅細胞、ゴミまたは不純物と峻別し得ることを見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、かかる指標を用いることで高密度条件下においても接着細胞の細胞分裂を正確に同定し得ること見出し、これにより正確、簡便かつ非侵襲的に細胞集団の増殖活性の測定を可能にし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
[１]  接着細胞の反射光強度の増強および増強前の強度への減衰を測定することにより、接着細胞の細胞分裂を同定する方法。
[２]  反射光強度の増強から増強前の強度への減衰が、２０分以上２時間以内である、[１]に記載の方法。
[３]  接着細胞の形態変化に起因する、[１]または[２]に記載の方法。
[４]  測定が、タイムラプス画像を用いて行なわれる、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]  接着細胞集団の増殖活性を測定する方法であって、
単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記方法。
[６]  さらに単位時間中に反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポットを計数するステップ、および、
計数された反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、計数された反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くステップを含む、[５]に記載の方法。
[７]  反射光強度の増強から増強前の強度への減衰が、２０分以上２間以内である、[５]または[６]に記載の方法。
[８]  ９０％以上コンフルエントの接着細胞集団における増殖活性を評価するための、[５]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９]  接着細胞の形態変化に起因する、[５]〜[８]のいずれかに記載の方法。
[１０]  測定が、タイムラプス画像を用いて行なわれる、[５]〜[９]のいずれかに記載の方法。
[１１]  接着細胞集団の増殖活性を測定するためのシステムであって、
接着細胞集団の培養容器を収納する収納部、接着細胞の反射光の強度変化を測定するための測定部、前記測定結果を記憶するための記憶部、および前記測定部によって得られた結果を解析して培養容器中の接着細胞集団の増殖活性を算出する解析部を含み、
解析が、単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記システム。
[１２]  解析が、さらに単位時間中に反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポットを計数するステップ、および、
計数された反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、計数された反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くステップを含む、[１１]に記載のシステム。
[１３]  解析部が、さらに個々の接着細胞の細胞候補領域を検出する手段を含む、[１１]または[１２]に記載のシステム。
[１４]  収納部が、光源を備える、[１１]〜[１３]のいずれかに記載のシステム。
[１５]  測定部が、撮像部を備える、[１１]〜[１４]のいずれかに記載のシステム。
[１６]  撮像部が、タイムラプス画像を取得可能である、[１１]〜[１５]のいずれかに記載のシステム。
【発明の効果】
【０００９】
培養細胞に混じる死滅細胞やゴミまたは不純物は、細胞分裂と同様に高い反射光強度を示すところ、本発明によれば、接着細胞の細胞分裂に由来する反射光強度の変化と、接着細胞の死滅や培養容器中の不純物に由来する反射光強度の変化とを区別することができ、これにより正確に細胞分裂の同定や細胞集団の増殖活性を測定することができる。したがって、研究や医療の現場において、煩雑な処理を要さずに正確な増殖活性等が測定でき、細胞集団に応じた適切な培養時間の選択が簡便となり、適切な治療に適用することが可能となる。死滅細胞が比較的多く存在する高密度条件化においても正確に細胞分裂または分裂期を測定できるため、過剰に培養する必要がなくなり、過剰な培養に起因する細胞品質の低下を防ぐことが出来る。さらに本発明の方法により、細胞分裂または分裂期を高い精度で非侵襲的に測定することが可能となるため増殖活性を測定した細胞集団をそのままシート状細胞培養物の形成など研究や医療の用に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、骨格筋芽細胞の接着培養を位相差顕微鏡で経時的に観察した図である。細胞分裂する際に反射光強度が増強し（３）、分裂後にその強度が減衰することを示す（４、５）。図中の破線は分裂前、波線は分裂中、直線は分裂後を示す。
【図２】図２は、約３０％コンフルエントな骨格筋芽細胞を位相差顕微鏡で経時的に観察した図である。個々の接着細胞が細胞分裂する際に反射光強度が増強し、分裂後にその強度が減衰することを示す。図中の破線は分裂前、波線は分裂中、直線は分裂後を示す。
【図３】図３は、約９０％コンフルエントな骨格筋芽細胞を位相差顕微鏡で経時的に観察した図である。コンフルエントが高い条件においても細胞分裂する際に反射光強度が増強し、これにより細胞分裂が同定できることを示す図である。図中の波線は分裂中の細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１２】
接着細胞の反射光強度を測定することにより接着細胞の細胞分裂を同定する方法に関する。
本発明者らは、接着細胞の反射光強度が分裂期に変化することを見出した。接着細胞を一定の入射光の照射下で観察すると、分裂期に向けて接着細胞からの反射光強度が増強し、分裂時に反射光の強度がピークとなり、分裂後に反射光強度が減衰することを確認した。
【００１３】
培養基材に対して平面方向に伸展した接着細胞は、細胞分裂（分裂期）に向けて徐々に丸みを帯びた立体的な形態へと変化する。かかる形態変化により、接着細胞が鉛直方向の長さを有することになり、その結果、接着細胞上面の輪郭に沿って光の反射が生じ、さらに丸みを帯びるにつれて、かかる反射光が一層増強される。このように接着細胞は、細胞分裂に際して、丸みを帯びた立体的な形態をとるため、かかる形態変化を反射光強度の増強として捉えることが出来る。また、細胞分裂により生じた娘接着細胞が、平面方向に伸展することにより、細胞分裂前の形態に戻り、これにより増強した反射光が細胞分裂前の強度まで減衰する。
【００１４】
一方、接着細胞が死滅し、培養基材から剥がれると、丸みを帯びた形態で培養液中に浮遊するため、死滅した細胞も細胞分裂と同様に反射光を増強することになる。また死滅した細胞だけでなく培養液中に浮遊するゴミまたは不純物が、観察視野に新たに入った場合も、やはり細胞分裂と同様に反射光を増強することになる。しかしながら、分裂細胞は、接着細胞の死滅やゴミまたは不純物とは異なり、上述のとおり反射光の増強後、娘細胞の発生に伴い減衰する。したがって反射光の増強後に減衰した対象を細胞分裂由来の反射光と同定することができ、これを利用することにより、接着細胞の細胞分裂に由来する反射光変化と、接着細胞の死滅や培養容器中の不純物に由来する反射光変化とを区別することができる。
【００１５】
本発明において、「接着細胞」または「接着細胞集団」とは、培養容器に播種し、インキュベートすることにより培養基材に接着培養できる細胞または細胞集団を指す。これらに限定するものではないが、例えば体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血液細胞など）、体性幹細胞（例えば、心臓幹細胞、間葉系幹細胞等）、多能性幹細胞、（胚性幹細胞、iPS（induced pluripotent stem）細胞等）および芽細胞（線維芽細胞、骨格筋芽細胞、骨芽細胞等）などが挙げられる。
【００１６】
培養容器は、接着細胞が増殖し得るものであれば特に限定されず、当該技術分野において通常用いられるものを用い得る。かかる基材の基材としては、これに限定するものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。培養基材には、培養容器の一面（例えば容器の底面）の他、細胞培養用スキャフォールドの表面なども含まれ得る。
【００１７】
培養基材の表面は、細胞接着性を高めるための加工、剥離を容易にするための加工などを含む、シート状細胞培養物の製造において有利となるような加工が施されていてもよい。このような加工としては、これに限定するものではないが、例えばコロナ放電処理、紫外線照射処理、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物によるコーティング、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などによるコーティング、例えば温度や光などの刺激に応答して物性が変化する材料によるコーティングなどが挙げられる。
【００１８】
本発明において「反射光強度の増強」とは、反射光強度の測定において、反射光強度が初期値に対して増加したものを指す。初期値に対する増加は、設定した値以上に反射光強度が増加することを指し、一例として、細胞の画像データを８ビットグレースケール処理、すなわち２５６階調処理した場合に、初期の階調値に対して所定値以上を示したもの指し、これらに限定されるものではないが、例えば初期の階調値に対して１０以上、２０以上、３０以上、４０以上などであってよい。また初期値に対する増加は、例えば、初期値に対して特定の倍率以上に反射光強度が増加することであり、これらに限定されるものではないが、例えば初期値に対して少なくとも１．２倍以上、少なくとも１．５倍以上、少なくとも１．８倍以上などであってよい。
【００１９】
本発明において「増強前の強度への減衰」とは、反射光強度がピークから増強前の強度に向けて減衰することを意味する。減衰の程度は、増強前の反射光強度と完全に同一強度である必要はなく、例えば「反射光強度の増強」として定めた所定値以下に減衰したものや、特定の倍率以下に減衰したものであってよい。
本発明において「増強した反射光強度が維持された」とは、増強した反射光強度が、ピークから殆ど変化しないか、または、ピークからの減衰の程度が低いものである。減衰の程度が低いとは、例えば「反射光強度の増強」として定めた所定値以下に減衰しないものや、特定の倍率以下に減衰しないものであってよい。
【００２０】
本発明において、培養中の反射光強度を測定する方法は、接着細胞の反射光の変化を測定することができれば、限定されることなく、例えば位相差型顕微鏡など、接着細胞からの反射光を観察または測定し得る任意の装置を使用することができる。本発明において「接着細胞」は、文字通りの意味での接着細胞のみならず、それと同等と見なせる接着細胞像なども包含され得、したがって接着細胞の反射光強度を取得可能なデータであればいかなる形式で表されてもよく、装置に依存して変化し得る。したがって接着細胞の反射光強度は、これに限定するものではないが例えば、画像データであってもよいし数値データであってもよい。例えば、測定装置が、タイムラプス撮像装置である場合は、反射光はタイムラプス画像データとして取得されるし、例えば測定装置が反射光強度を測定する装置である場合には、例えば単位時間あたりの反射光強度の増強および減衰したスポットの数といった数値データとして取得されることになる。
【００２１】
本発明の方法は、接着細胞の反射光強度の変化を測定することが可能であれば、いかなる細胞密度においても測定することができる。これに限定されるものではないが、細胞密度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上のコンフルエントであってよい。細胞の形態や輪郭が十分に観察し得なくとも正確に測定し得る観点から８０％以上のコンフルエントが好ましく、死滅細胞が生じ得る観点から９０％以上のコンフルエントがさらに好ましい。
【００２２】
本発明の一態様において、発生した死滅細胞が時間経過とともに分解され得る。これもまた反射光の増強および減衰として捉えられ得るところ、接着細胞の細胞分裂を、死滅細胞の発生および分解と、明確に区別する観点から、「反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰した」時間は、例えば、２０分以上２時間以内、３０分以上１時間３０分以内であり、より正確性を付与する観点から３０分以上１時間以内であることが好ましい。
【００２３】
本発明の別の側面は、上記方法を利用した細胞集団の増殖活性を測定する方法を包含する。かかる方法としては、単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記方法が含まれる。細胞集団の「増殖活性」とは、単位時間当たりに増殖（増加）した接着細胞数を意味する。具体的には、これに限定するものではないが、例えば細胞集団の単位時間当たりの細胞分裂回数は、換言すると単位時間当たりに増加した細胞数に対応するため、単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰した細胞を計数することにより、増殖活性を測定し得る。細胞集団中の接着細胞は、必ずしも明確な細胞や細胞像として認識されている必要はなく、反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットとして認識されていればよい。
【００２４】
細胞の増殖は、様々な条件、例えば播種細胞数（播種細胞密度）、培養環境、培地の組成などにより左右されるため、これらの条件を一致させた複数の細胞集団を使用し、各細胞集団サンプルにおける単位時間当たりの細胞分裂回数を比較することによりサンプル間の増殖活性を比較することができる。例えば、位相差型顕微鏡の一視野における単位時間当たりの細胞分裂回数を、反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数し、この値を培養容器全体に当てはめることにより、増殖活性のみならず、培養容器中の全細胞数を推測することができる。さらに、培養容器中の予測された全細胞数と増殖活性をもとに培養容器中の細胞集団が、コンフルエントになるまでの時間を予測することができる。当業者であれば、公知の方法を用いて、得られた細胞増殖率から各技術分野で必要な培養に関する情報を算出することができる。
【００２５】
本発明の一態様において、細胞集団の正味の増殖活性を測定する方法を包含する。接着細胞集団における正味の増殖活性は、単位時間における分裂細胞数から死滅した細胞数を除いたものであるところ、分裂細胞数は、反射光強度の増強および減衰したスポットとして測定され、死滅した細胞数は反射光強度が増強後に維持されたスポットとして測定されるため、反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くことで正味の増殖活性を測定できる。
かかる態様は、患者から採取した細胞を用いてシート状細胞培養物を作成する場合、各患者に応じて細胞の性質が大きく異なり、培養回数に応じて発生する死滅細胞の量も異なるため、正味の増殖活性の測定が有利である。
【００２６】
本発明の方法は、接着細胞の反射光強度の変化を測定することが可能であれば、いかなる細胞密度においても測定することができる。これに限定されるものではないが、細胞密度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上のコンフルエントであってよい。特に、死滅細胞が、多く発生し始める観点から９０％以上のコンフルエントが好ましい。
【００２７】
本発明の一態様において、「反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰した」時間は、例えば２０分以上２時間以内、３０分以上１時間３０分以内であり、より正確性を付与する観点から３０分以上１時間以内であることが好ましい。
【００２８】
本発明の一態様において、「増強した反射光強度が維持された」時間は、死滅細胞を特定し得る時間であれば特に限定されず、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上であり、細胞分裂に関するスポットと明確に区別する観点から６時間以上が好ましく、ゴミや不純物と区別する観点から１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内であり、明確に区別する観点から３０時間以内が好ましい。
【００２９】
本発明の別の側面は、上記方法を利用した細胞集団の増殖活性を測定するシステムを包含する。かかるシステムとしては、接着細胞集団の培養容器を収納する収納部、接着細胞の反射光の強度変化を測定するための測定部、前記測定結果を記憶するための記憶部、および前記測定部によって得られた結果を解析して培養容器中の接着細胞集団の増殖活性を算出する解析部を含み、解析が、単位時間中に反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポットを計数するステップを含む、前記システムが含まれる。
【００３０】
本発明のシステムの一態様において、細胞集団の正味の増殖活性を測定するシステムを包含する。当該システムは、本発明のシステムに加えて、解析が、単位時間中に反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポットを計数するステップ、および、計数された反射光強度が増強し、増強前の強度まで減衰したスポット数から、計数された反射光強度が増強し、増強した反射光強度が維持されたスポット数を引くステップをさらに含む、前記システムが含まれる。
【００３１】
本発明のシステムは、接着細胞集団の培養容器を収納する収納部を含む。収納部は、接着細胞の光学的性質の変化を観察するための任意の光源を備えることができる。光源は、目的とする光学的性質に応じて、例えば可視光、赤外光または紫外光などから任意に選択することができ、汎用性や試料への非侵襲性などの観点から可視光が好ましい。
【００３２】
本発明のシステムは、細胞集団における個々の接着細胞の光学的性質の変化を測定するための測定部を含む。かかる測定部は、接着細胞の光学的性質の変化が得られる測定装置を含むものであればいかなるものであってもよく、これに限定するものではないが例えば撮像装置、反射光検出器、透過光検出器などが挙げられ、データの汎用性や処理の多様性、試料への非侵襲性などの観点から、測定部が撮像部を含み、接着細胞の反射光強度変化がタイムラプス画像として取得されることが好ましい。
【００３３】
解析部で行われる解析は、得られる接着細胞のデータの形式によって変化し得、これに限定するものではないが、例えば得られた画像データを処理して計数された分裂細胞数の検量線を描いてもよいし、例えば、これをもとに全細胞数を推定してもよいし、一視野中の個々の接着細胞の細胞候補領域を検出する細胞候補領域を検出し、得られた分裂細胞の画像と重ね合わせることでバイアビリティーを推定してもよい。
【００３４】
本発明の一態様において、「増強した反射光強度が維持された」時間は、
死滅細胞を特定し得る時間であれば特に限定されず、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上であり、細胞分裂に関するスポットと明確に区別する観点から６時間以上が好ましく、ゴミや不純物と区別する観点から１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内であり、明確に区別する観点から３０時間以内が好ましい。
【００３５】
細胞密度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上のコンフルエントであってよい。特に、死滅細胞が多く発生し始める９０％以上において有利である。
【００３６】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
例１．反射光強度を用いた一細胞における細胞分裂の同定
培養皿（１７５cm2フラスコ、Thermo Fisher Scientific Inc.）に、２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Thermo Fisher Scientific Inc.）に懸濁した骨格筋芽細胞および３．５ｘ１０4個／フラスコとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養を行った。培養皿への接着後、位相差型顕微鏡で同細胞のタイムラプス画像を取得した。タイムラプス画像によると同細胞は、分裂期に向けて接着細胞からの反射光が増強し、分裂時に反射光の強度がピークとなり、細胞分裂後に反射光が減衰した。反射光の増強から減衰までは４０分程度であった。結果を図１に示す。
【００３８】
例２．反射光強度を用いた細胞集団中の分裂細胞の同定
例１と同じ条件で、３０％コンフルエントになるように５日間培養を行い、位相差型顕微鏡で同細胞集団のタイムラプス画像を取得した。タイムラプス画像によると細胞集団中の各細胞は、分裂期に向けて接着細胞からの反射光が増強し、分裂時に反射光の強度がピークとなり、細胞分裂後に反射光が減衰した。各細胞における反射光の増強から減衰までは２０分から２時間であり、最頻値は４０分程度であった。また反射光の増強を伴わずに分裂をした細胞は確認できなかった。したがって、反射光の増強および減衰を指標にすることで細胞集団中の細胞分裂または分裂期の細胞の同定が可能であり、反射光の増強および減衰を示したスポットをカウントすることで細胞集団の増殖活性が測定できることがわかった。結果を図２に示す。
【００３９】
例３．反射光強度を用いたコンフルエントな細胞集団中の分裂細胞の同定
例２と同じ条件で、９０％コンフルエントになるように１０日間培養を行い位相差型顕微鏡で同細胞集団のタイムラプス画像を取得した。細胞の形態が不明瞭であるコンフルエントな状態においても例２と同様に分裂時に反射光の強度がピークとなり、細胞分裂後に反射光が減衰した。各細胞における反射光の増強から減衰までは２０分から２時間であり、最頻値は４０分程度であった。また反射光の増強を伴わずに分裂をした細胞はないと考えられた。したがって、９０％コンフルエントな状態において、反射光の増強および減衰を指標にすることで細胞集団中の細胞分裂または分裂期の細胞の同定が可能であり、反射光の増強および減衰を示したスポットをカウントすることで細胞集団の増殖活性が測定できると考えられた。結果を図３に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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