(57)【要約】      （修正有）【課題】泌乳牛の乳におけるタンパク質含量の増加剤を提供する。【解決手段】アミノ酸の一種である５−ＡＬＡ、若しくはその誘導体又はそれらの塩であるＡＬＡ類を、コーティング等の処理を施すことなく、飼料に混合して泌乳牛に投与したところ、従来の飼料を摂取した乳牛群から採取した乳と比較して、泌乳量にはほぼ変化がなかったが、タンパク質、とりわけカゼインの割合（％）が有意に多い乳を得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する、泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤。
【化１】
2020130001.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２】
タンパク質が、カゼインであることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質含量増加剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質含量増加剤を添加した飼料。
【請求項４】
５−アミノレブリン酸換算で０．２００〜２ｍｇ／ｋｇ体重／日を泌乳牛に経口投与することを特徴とする泌乳牛の乳におけるタンパク質含量の増加方法。
【請求項５】
タンパク質が、カゼインであることを特徴とする、請求項４記載のタンパク質含量の増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤に関し、さらに詳しくは、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ＡＬＡ類」ともいう）を含む泌乳牛におけるタンパク質含量増加剤に関する。
【０００２】
わが国の牛乳消費量は、人口の増加や食の西洋化に伴い１９６６年の２０１万キロリットルから１９９６年の５０５万キロリットルへと増加の一途をたどった（例えば、非特許文献１参照）。しかし、近年は、少子高齢化や、飲料市場の多様化により、牛乳の消費量は微減傾向となっており、乳牛業界においては、消費量を維持するため、低コストでより高品質の牛乳や付加価値のある乳製品を提供するための努力が続けられている。
【０００３】
品質の向上した牛乳を生産するために、ｎ−３脂肪酸供給源：３０〜６０重量部、炭水化物供給源：７〜２０重量部、粉末乾草：３〜６重量部、乳化補助剤：３０〜５０重量部、抗酸化剤：０．０５〜０．１５重量部を含有することを特徴とする乳牛用飼料組成物（例えば、特許文献１参照）や、カシューナッツ殻油等、アナカルド酸、カルダノール及び／又はカルドールを含有することを特徴とする、反芻動物の乳量及び／又は乳質向上剤（例えば、特許文献２参照）や、少なくも約１２重量％の蛋白質量をもつ穀物基本混合物、補足飼料の約２乃至１２重量％の添加した実質的飽和脂肪及び補足飼料の約０．５乃至４．５重量％の非蛋白質窒素源よりなる乳牛用の補足飼料（例えば、特許文献３参照）が提案されている。
【０００４】
一方、牛や羊のような反芻動物では、摂取されたタンパク質やアミノ酸は、第一胃中の微生物によってアンモニアや炭酸ガスに急速に分解されることが知られており（例えば、非特許文献２及び３参照）、反芻動物にとって飼料中に含まれるタンパク質やアミノ酸の全てを効率良く利用することは非常に難しいとされている。そのため、コーティングをすることにより、反芻動物の第１胃の微生物の作用から保護された、リジン及びメチオニンを必須成分とする飼料添加物を、反芻動物の分娩予定日の６０日前から分娩後２９日の間で投与を開始し、泌乳期に入って３０日目から１５０日目までの何れかの日まで投与を継続することを特徴とする、反芻動物における泌乳量を増大させる方法（例えば、特許文献４参照）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０６−１５３８１６号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１２／０９３５３３号パンフレット
【特許文献３】特開昭６０−２５９１４８
【特許文献４】特開平６−２３７７０２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】独立行政法人農畜産業振興機構ウェブサイト（https://www.alic.go.jp/koho/kikaku03_000743.html）
【非特許文献２】Animal Science Journal, 84(1),42-47, 2013
【非特許文献３】Journal of Animal Science, 43(4), 910-929, 1976
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、泌乳牛の乳におけるタンパク質含量を増加させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、泌乳牛の乳におけるタンパク質含量を増加させるために、様々な飼料や飼料添加物について検討してきたが、アミノ酸の一種である５−ＡＬＡ、若しくはその誘導体又はそれらの塩であるＡＬＡ類を、コーティング等の処理を施すことなく、飼料に混合して泌乳牛に投与したところ、泌乳量にはほぼ変化がなく、また、採取された乳中の乳脂肪分、乳糖、全固形分、及び非脂肪固形分については従来の飼料を摂取した乳牛群から採取した乳と有意差がなかった。しかし、驚くべきことに採取された乳中のタンパク質、とりわけカゼインについては、従来の飼料を摂取した乳牛群から採取した乳よりも、有意に多くの割合（％）で含まれていることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する、泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤。
【化１】
2020130001.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
［２］タンパク質が、カゼインであることを特徴とする、上記［１］記載のタンパク質含量増加剤。
［３］上記［１］又は［２］記載のタンパク質含量増加剤を添加した飼料。
［４］５−アミノレブリン酸換算で０．２００〜２ｍｇ／ｋｇ体重／日を泌乳牛に経口投与することを特徴とする泌乳牛の乳におけるタンパク質含量の増加方法。
［５］タンパク質が、カゼインであることを特徴とする、上記［４］記載のタンパク質含量の増加方法。
【００１０】
本発明の他の態様としては、泌乳牛の乳におけるタンパク質の割合を増加させるための、タンパク質含量増加剤として使用するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩や、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、泌乳牛の乳におけるタンパク質の含量増加剤の調製における使用や、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、泌乳牛の乳におけるタンパク質の含量を増加させるための牛等反芻動物用の飼料の調製における使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤によると、第一胃に存在する微生物により摂取したアミノ酸が分解されることが知られている牛において、泌乳された乳におけるタンパク質の含有量、中でもカゼインの含有量を増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤としては、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する、泌乳牛の乳におけるタンパク質の含量の増加剤であれば特に制限されず、かかるタンパク質含量増加剤は、他の泌乳牛の乳におけるタンパク質含量増加剤や、豆類、穀類、脂質、非タンパク質窒素源や、ビタミンＡ、ビタミンＢ１，Ｂ２，Ｂ６，Ｂ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等の各種ビタミンなどと併用することもできる。
【００１３】
本発明において、泌乳牛の乳としては、雌牛の分娩後、泌乳刺激ホルモンが乳腺に作用することにより、乳腺から分泌される液体であれば特に限定されず、栄養価が非常に高く、子牛に免疫力をつけるために必要な成分が含まれている出産後５〜６日の初乳を必ずしも含む必要はなく、ヒト等が摂取する、牛乳、チーズ、ヨーグルト等の乳製品の生産のために使用される、いわゆる常乳に限定することができる。
【００１４】
本発明において、タンパク質は、上記乳に含まれる、生物の構成要素であって、アミノ酸がペプチド結合（アミノカルボニル結合）によって鎖状につながった高分子化合物であって、ｐＨが４．６まで下がった場合に沈殿、凝固するカゼイン；カゼインが凝固した際に残余成分として生成する、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、免疫グロブリン、乳清アルブミン、ラクトフェリン等の球状タンパク質の混合物を含むホエイプロテイン（乳清タンパク質）；に大別することができる。
【００１５】
本発明において、泌乳牛の乳におけるタンパク質の（総）含量を測定する方法としては、公知の測定方法であれば特に制限されず、例えば、被検試料を強酸下で熱分解後、強アルカリを添加してアルカリ性にした溶液を水蒸気蒸留し、発生したアンモニアを定量して窒素量を算出するケルダール法や、試料を高温で燃焼・還元し、発生した窒素ガスから窒素量を定量するデュマ法や、芳香族基を持つアミノ酸が２８０ｎｍ付近の紫外光を吸収する性質を有することを利用した紫外可視分光光度計を用いて測定する方法や、試料中の塩基性アミノ酸残基及び末端アミノ酸とトリフェニルメタン系色素であるクマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）との静電的相互作用を利用するブラッドフォード法や、試料中のトリペプチド以上のオリゴペプチド又はタンパク質中の窒素原子がＣｕ（II）に配位結合すると溶液の色が赤紫色に呈色することを利用したビウレット（Biuret）法や、ビウレット法を改良したローリー（Lowry）法、ＢＣＡ法を挙げることができる。
【００１６】
また、試料におけるタンパク質中の第一級アミンと反応するフルオレスカミン（Fluorescamine）；２−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下で試料におけるタンパク質中の第一級アミンと反応するオルトフタルアルデヒド（o−Phthalaldehyde：ＯＰＡ）；シアン化物イオン存在下、試料におけるタンパク質中の第一級アミンと反応する３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド（3-(4carboxybenzoyl) quinoline-2-carbox-Aldehyde：ＣＢＱＣＡ）；等が発する蛍光を検出する蛍光法を挙げることができる他、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いてタンパク質の定量を行う方法も挙げることができる。
【００１７】
本発明において、泌乳牛の乳においてタンパク質含量が増加する場合とは、ＡＬＡ類を含むタンパク質含量増加剤を投与した泌乳牛から採取された乳の組成におけるタンパク質の割合が、ＡＬＡ類を含むタンパク質含量増加剤を投与していない泌乳牛から採取された被検乳の乳組成におけるタンパク質の割合よりも、０．０１％以上、好ましくは０．０２％以上、好ましくは０．０３％以上、より好ましくは０．０４％以上多くなる場合をいう。
【００１８】
前記カゼインとしては、牛乳中の全タンパク質の約８０％を占め、２０℃でｐＨ４．６に調整すると沈殿する、アミノ酸（セリン）とリン酸が結合したリンタンパク質を挙げることができる。カゼインは、さらにα−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼインに分類することができ、α−カゼインは、αＳ１−カゼイン，αＳ２−カゼインにさらに分類することができるが、乳中ではこれらの個々のカゼインは、分離して単独で行動しているのではなく、相互作用しながら巨大なコロイド粒子として懸濁している。
【００１９】
本発明において、泌乳牛の乳におけるカゼインの含量を測定する方法としては、被検乳試料に酸を加えてｐＨ４．６以下に調整することにより沈殿したカゼイン試料を調製の上、前記タンパク質の含量を測定する各方法のいずれかを適用することにより、被検乳試料中のカゼインの含有量を算出する方法を挙げることができるが、タンパク質、ラクトース、非脂肪固形分、総固形分、ＭＵＮ、体細胞数等の他の項目とともに、乳試料の組成を分析できる市販の自動分析機を用いて分析することもできる。
【００２０】
本発明において、泌乳牛の乳においてカゼインが増加する場合とは、ＡＬＡ類を含むタンパク質含量増加剤を投与した泌乳牛から採取された乳の乳組成におけるカゼインの割合が、ＡＬＡ類を含むタンパク質含量増加剤を投与していない泌乳牛から採取された被検乳の乳組成におけるカゼインの割合よりも、０．００５％以上、好ましくは０．０１％以上、好ましくは０．０２％以上多くなる場合をいう。
【００２１】
本発明のタンパク質含量増加剤の適用対象としては、ウシ亜科（Bovinae）、ウシ属（Bos）に属する、家畜化された又は野生の牛であれば特に制限されず、家畜化された牛としては、肉用牛、乳用牛、乳肉兼用牛、役用牛を例示することができ、具体的には、アバディーン・アンガス種、ヘレフォード種、ショートホーン種、シャロレー種、リムジン種、黒毛和種、褐毛和種、日本短角種、無角和種等の肉用牛；ブラウンスイス種、ガンジー種、ホルスタイン種、ジャージー種、ケリー種、ミルキングデボン種、ノルウェイジャンレッド種等の乳用牛；これらの交雑種の牛；を挙げることができるが、ブラウンスイス種、ガンジー種、ホルスタイン種、ジャージー種、ケリー種、ミルキングデボン種、ノルウェイジャンレッド種等の乳用牛が好ましい。また、本発明における泌乳牛としては、繁殖年齢に達した牛であって、泌乳している牛であれば特に制限されず、乳においてタンパク質が含有する割合を増加させる必要がある牛を例示することができる。なお、本発明において、泌乳牛には、実際には未だ泌乳していないが、分娩をひかえ、泌乳期において乳におけるタンパク質含量を増加する必要のある泌乳前の牛を便宜上含めることができる。
【００２２】
前記ＡＬＡ類の中でも式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子の場合である５−ＡＬＡ又はその塩を好適に例示することができる。５−ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。また、５−ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基又はアラルキル基である、５−ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。
【００２３】
式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。
【００２４】
式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。
【００２５】
式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシル基等の炭素数３〜１２のシクロアルキル基を挙げることができる。
【００２６】
式（Ｉ）におけるシクロアルケニル基としては、シクロプロペニル（例えば、１−シクロプロペニル）、シクロブテニル（例えば、１−シクロブテニル）、シクロペンテニル（例えば、１−シクロペンテニル）、シクロヘキセニル（例えば、１−シクロヘキセニル）、シクロヘプテニル（例えば、１−シクロヘプテニル）、シクロオクテニル（例えば、１−シクロオクテニル）、シクロデセニル（例えば、１−シクロデセニル）、シクロドデセニル（例えば、１−シクロドデセニル）基等の炭素数３〜１２のシクロアルケニル基を挙げることができる。
【００２７】
式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル（例えば、１−ナフチル）、アントリル（例えば、１−アントリル）、フェナントリル（例えば、１−フェナントリル）、ピレニル（例えば、１−ピレニル）基等の炭素数６〜１８のアリール基を挙げることができる。
【００２８】
式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。
【００２９】
上記ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましく、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せなどを好適に例示することができる。
【００３０】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）の５−ＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるため各種の塩の形として投与したり、消化管吸収性、組織移行性、組織選択性、化学的安定性等を向上するために、あるいは副作用を軽減するために生体内の酵素で代謝されてから作用を及ぼすプロドラッグ（前駆体）の形（例えば、エステル）として投与することができる。例えば、５−ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【００３１】
以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、５−ＡＬＡ、及び５−ＡＬＡメチルエステル、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩であり、５−ＡＬＡ塩酸塩や５−ＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。
【００３２】
上記ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３３】
本発明のタンパク質含量増加剤の使用態様としては、顆粒状、粒状、粉末状、溶液状にして、通常牛に与えている飼料に混合して投与することもできるが、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤等の経口投与製剤；液剤、用時溶解型粉末剤等の注射製剤等の製剤の形態で用いることもできる。上記製剤の投与方法は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔投与、経皮投与、経直腸投与等を挙げることができる。
【００３４】
本発明のタンパク質含量増加剤の、経口投与の場合の投与量としては、本発明の効果を奏する限り特に制限されないが、例えば、牛の体重１ｋｇあたりアミノレブリン酸換算で、０．０２〜２ｍｇ／日、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／日、より好ましくは０．０７５〜０．７５ｍｇ／日、さらに好ましくは０．１〜０．６ｍｇ／日、特に好ましくは０．２〜０．４ｍｇ／日を例示することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質含量増加剤を飼料に添加して使用する場合の、飼料の給餌方法としては、１日２〜４回給餌を行う分離給餌法や、特定の給与時間を設けないで自由に摂取させる不断給餌等の給与方法を挙げることができる。なお、ＡＬＡ類を添加する飼料としては、一般的に牛に給与するために使用されている飼料であれば特に制限されず、トウモロコシ、大豆ミール、アルファルファ、もみ殻、小麦ふすま、米ぬか、アルファルファ、オーツヘイ、綿実油ミール、骨粉、石灰、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、尿素、糖蜜等の従来公知の飼料原料から調製された飼料を用いることができ、市販されている牛用の飼料を使用できる。
【００３６】
本発明のタンパク質含量増加剤を飼料に添加して使用する場合の、飼料の給餌期間としては、本発明の効果を得ることができる限りにおいて特に制限されないが、１日〜３月、好ましくは３日〜２月、より好ましくは１週間〜１月、さらに好ましくは１０日〜２０日、特に好ましくは１２日〜１６日を例示することができる。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
以下の試験は国立大学法人東京農工大学の動物実験小委員会の認可を得て行った。
【００３９】
５−ＡＬＡが泌乳牛の乳組成に及ぼす影響を検討した。６頭の泌乳ホルスタイン乳牛（平均体重６９８±１８ｋｇ、平均乳生産量２４．１±１．６ｋｇ／ｄ，平均泌乳日数（days-in-milk：ＤＩＭ）２０９±３４日、平均授乳数２．９±０．４）が自由厩舎に収容された。７日間の猶予期間後、６頭の牛を無作為にＡ区とＢ区とに割り当てた（各群ｎ＝３）。Ａ区は猶予期間後、１４日間のＡＬＡ投与期（ＡＬＡ摂取群Ａ）、７日間の調整期間を間に挟み、その後の１４日間のＡＬＡ未投与期（コントロール群Ａ）とし、Ｂ区は猶予期間後、１４日間のＡＬＡ未投与期（コントロール群Ｂ）、７日間の調整期間を間に挟み、その後の１４日間のＡＬＡ投与期（ＡＬＡ摂取群Ｂ）とするクロスオーバー法により、実験が行なわれた。詳細は以下の表１のとおりである。なお、上記猶予期間、調整期間及びＡＬＡ未投与期間中は、従来から使用している混合飼料（ＴＭＲ）（表２参照）を給餌し、ＡＬＡ投与期間中は、混合飼料（ＴＭＲ）１ｋｇ当たり１０ｍｇの５−ＡＬＡを添加した飼料を給餌した。
【００４０】
【表１】
2020130001.tif 000003
【００４１】
５−ＡＬＡはネオファーマジャパン社から提供された。各飼料と水は自由に与えられたが、各群の飼料摂取量は、ドライベースで、コントロール群は一頭当たり２３．４ｋｇ／日、ＡＬＡ群は１頭当たり２３．６ｋｇ／日であった。したがって、ＡＬＡ群における５−ＡＬＡの一日当たりの摂取量は、０．３２９.６ｍｇ〜０．３４７.１ｍｇ／ｋｇｂ．ｗ．／日となった。各乳牛は０９：００と１７：００に搾乳され、搾乳後に各飼料を自由摂取した。
【００４２】
【表２】
2020130001.tif 000004
【００４３】
（乳試料採取）
各牛からの搾乳量はオートミルクレコーダー（オリオン機械製）によって、毎日自動的に記録された。また、Ａ区、Ｂ区の各群について１４日間のＡＬＡ投与期及び１４日間の未投与期のそれぞれ最後の２日間において一日に２回、各期の牛から５０〜１００ｍＬ採取して、データ分析用乳試料として使用した。乳組成等を分析するまで、乳試料は−３０℃にて保存された。
【００４４】
上記各牛由来の採取された乳試料を用いて、乳脂肪、タンパク質、カゼイン、乳糖、全固形分（total solid:ＴＳ）、固形分非脂肪（Solid not fat:ＳＮＦ）、乳尿素−窒素（Milk Urea Nitrogen：ＭＵＮ）及び体細胞数（somatic cell count：ＳＣＣ）等の乳組成について、半固体赤外分光法（Ｍｉｌｋｏ−Ｓｃａｎ、１３３Ｎ、Foss Electric,Hill-erod社（デンマーク）製）を用いて測定した。各牛におけるデータは、２日間で採取された４回の乳試料の平均値として算出した。その結果を表３に示す。Ａ区、Ｂ区の各群について、ＡＬＡ投与期（ＡＬＡ群Ａ及びＡＬＡ群Ｂ）のデータの平均をＡＬＡ摂取群の項目で示し、未投与期（コントロール群Ａ及びコントロール群Ｂ）のデータの平均をコントロール群の項目で示した。なお、データは、ＳＰＳＳ（ＰＡＳＷ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１８．０，ＩＢＭ社製）の混合手順を用いてクロスオーバー設計として統計的に解析された。各結果の統計解析は混合モデルにより行い、ｐ＜０．０５（＊）を統計学的有意差があるとした。なお、有意性への傾向はｐ＜０．１０で考慮された。
【００４５】
【表３】
2020130001.tif 000005
【００４６】
（結果）
表３から明らかなとおり、５−ＡＬＡを添加した飼料を摂取した泌乳牛において、タンパク質及びカゼイン含量が有意に増加した（ｐ＜０．０５）。しかし、乳量、乳脂肪、ラクトース、非脂肪固形分、総固形分、ＭＵＮについては、コントロール群と比較して特に差異は確認できなかった。また、Ａ区のコントロール群Ａと、Ｂ区のコントロール群Ｂとの値に有意差は確認されず、ＡＬＡ投与が、微生物及び原虫等のルーメンへの影響があるとしても、その影響は、７日間の調整期間を置くことにより、除かれることが確認された。