(57)【要約】【課題】管理等にコストのかからないＮｏｎ−ＲＩＡ法でありながら、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法と良好な相関、具体的には相関係数０．９３以上を示す測定法の提供。【解決手段】本発明の測定法は、（１）抗原として用いるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたときに下記[数１]式で表されるものを用い、［数１］４００≦Ｘ≦２０００Ｙ≧０．１０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４（２）抗原抗体反応後、液相と沈殿相を分離するＢ／Ｆ分離を行い、（３）Ｂ／Ｆ分離後、沈殿相ではなく液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定する、という３つの要素を同時に実行することにより、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法では初めてＦａｒｒ−ＲＩＡ法と相関が高い測定値を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、標識化ＤＮＡ断片量を測定することによる抗ＤＮＡ抗体の測定法であって、
（ａ）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、
（ｂ）反応後、反応液に沈殿剤を添加し、液相と沈殿相を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
（ｃ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定し、
（ｄ）ＤＮＡ断片量の測定結果から抗ＤＮＡ抗体量を算出する、
工程を含み、かつ
（ｅ）使用するＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内のものを使用し、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｆ）得られた測定結果と、同一検体を公知のＦａｒｒ−ＲＩＡ法で測定した結果を比較した際、両測定結果の相関係数が０．９３以上を示す、
ことを特徴とする、抗ＤＮＡ抗体の測定法。
【請求項２】
非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、標識化ＤＮＡ断片量を測定することによる抗ＤＮＡ抗体の測定法であって、
（ａ）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、
（ｂ）反応後、反応液に沈殿剤を添加し、液相と沈殿相を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
（ｃ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定し、
（ｄ）ＤＮＡ断片量の測定結果から抗ＤＮＡ抗体量を算出する、
工程を含み、かつ
（ｅ’）使用するＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数２］で表される範囲内のものを使用し、
［数２］
７００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．３５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｆ’）得られた測定結果と、同一検体を公知のＦａｒｒ−ＲＩＡ法で測定した結果を比較した際、両測定結果の相関係数が０．９５以上を示す、
ことを特徴とする、抗ＤＮＡ抗体の測定法。
【請求項３】
ＤＮＡ断片の標識に用いる非放射性化合物が、ビオチン（Biotin）、２，４−ジニトロフェノール（2,4-Dinitrophenol：DNP）、ジゴキシゲニン（Digoxigenin：DIG）、フルオロセイン（Fluorescein）、ＨｉＢｉＴタグ、およびそれらの誘導体より選ばれる、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
使用する沈殿剤が、硫酸アンモニウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定法。
【請求項５】
（ｇ）ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内である、非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｈ）液相と沈殿相を分離（Ｂ／Ｆ分離）するための沈殿剤、及び
（ｉ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定するための試薬
からなり、請求項１から４のいずれかに記載の測定法によって検体中の抗ＤＮＡ抗体量を測定するための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、標識化ＤＮＡ断片量を測定することで抗ＤＮＡ抗体の測定法であって、（ａ）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、（ｂ）反応後、反応液に沈殿剤を添加し、液相と沈殿相を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、（ｃ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定し、（ｄ）ＤＮＡ断片量の測定結果から抗ＤＮＡ抗体量を算出する、工程を含み、かつ（ｅ）使用するＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内のものを使用し、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｆ）得られた測定結果と、同一検体を公知のＦａｒｒ−ＲＩＡ法で測定した結果を比較した際、両測定結果の相関係数が０．９３以上を示す、ことを特徴とする、抗ＤＮＡ抗体の測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患の一つである全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者血清中にはＤＮＡと結合する自己抗体である抗ＤＮＡ抗体が存在し、この自己抗体がＳＬＥの患者に多発する糸球体腎炎の主な原因物質ではないかと考えられている。したがって、抗ＤＮＡ抗体の測定は、ＳＬＥの診断および活動性評価のための重要な指標とされている。
従来、抗ＤＮＡ抗体を測定する代表的な方法としては、ＤＮＡ断片を１２５Ｉで標識して標識化ＤＮＡを調製し、この標識化ＤＮＡを抗原として用い、検体中の抗ＤＮＡ抗体との間で抗原抗体反応させ、反応後、抗原抗体複合体と結合していない標識化ＤＮＡとを硫安沈殿法により分離し（Ｂ／Ｆ分離）、沈殿中に含まれる放射能を測定することにより検体中の抗ＤＮＡ抗体量を測定するＦａｒｒ−ＲＩＡ法（特許文献１）が知られている。
また、ＲＩＡ法以外にも、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法も数々知られており、担体にＤＮＡを固定化した固相化ＤＮＡを用いたＥＬＩＳＡ法・ＦＥＩＡ法（特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１）、ＣＬＩＡ法・ＣＬＥＩＡ法（非特許文献２）などが報告されている。
上記Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法は、高親和性の抗ＤＮＡ抗体を検出するが抗体クラスの区別ができない。一方で上記Ｎｏｎ−ＲＩＡ法は低親和性と高親和性の抗ＤＮＡ抗体をどちらも検出するが、抗体クラスの区別ができるといった違いがある。このことからＦａｒｒ−ＲＩＡ法とＮｏｎ−ＲＩＡ法は相関が低いことが知られており、求める用途（診断・病勢把握）や患者によって使い分けがなされている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２６４９１００号公報
【特許文献２】特開平９−３３５２９号公報
【特許文献３】特公平４−４０６６２号公報
【特許文献４】特開昭６０−２５３８６９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ann Rheum Dis, 61:1099-1102(2002)
【非特許文献２】Clinica Chimica Acta 424: 141-147 (2013)
【非特許文献３】Arthritis Rheum. 26(1):52-62. (1983)
【非特許文献４】日本内科学会雑誌  第９４巻  第１０号・平成１７年１０月１０日
【非特許文献５】薬食発０１２０第１号  体外診断用医薬品の承認基準について  別添１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
数々の測定法の中でも、臨床的には、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法がＳＬＥの疾患活動性をより正確に反映していると認識されており（非特許文献１、非特許文献３）、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定値を追跡することによって、ＳＬＥ患者への治療の有効性を判断し、治療方針等を決定するために利用されている。
しかしながら、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法は、専用の測定機器が必要となり、放射性同位体の厳重な管理が要求され、コスト高となるなどの多くの課題を有している。
一方、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法は、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の問題を克服できるものの、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法と良好な相関性を示さず、ＳＬＥの病態を正確に把握できないなどの問題が指摘されていた。
一般に、ＳＬＥの診断に限らず、体外診断用医薬品等の分野においては、既存の測定法から新規測定法への置換を検討する際に、既存の測定法と新規測定法が相関を有するというためには、規定の統計処理を行った場合に両者間の相関係数が０．９０以上であるという非常に高い相関性が申請上要求され（非特許文献５）、実務上では相関係数０．９３以上という非常に高い相関係数がないとユーザーの要望を満足させることはできない。
したがって、本発明は、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法でありながら、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法と良好な相関を示す測定法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法でありながら、検体中の抗ＤＮＡ抗体をＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関良く測定するための測定法を開発すべく、相関を高めるためのポイントに関し、様々な観点から検討した結果、（１）抗原として用いるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたときに前記[数１]式で表されるものを用いることが必須であり、（２）抗原抗体反応後、液相と沈殿相を分離するＢ／Ｆ分離工程が必須であり、（３）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片を用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離後、沈殿相ではなく液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定することで、相関が良くなることを見出した。
このような知見を更にブラッシュアップすることで、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法と同等の抗ＤＮＡ抗体濃度の範囲において測定が可能であり、かつ、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法と良好な相関性を示す結果が得られることを確認した。本発明はかかる新規の知見に基づき完成されたものであって、以下の発明を提供するものである。
【０００７】
［１］
非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、標識化ＤＮＡ断片量を測定することによる抗ＤＮＡ抗体の測定法であって、
（ａ）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、
（ｂ）反応後、反応液に沈殿剤を添加し、液相と沈殿相を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
（ｃ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定し、
（ｄ）ＤＮＡ断片量の測定結果から抗ＤＮＡ抗体量を算出する、
工程を含み、かつ
（ｅ）使用するＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内のものを使用し、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｆ）得られた測定結果と、同一検体を公知のＦａｒｒ−ＲＩＡ法で測定した結果を比較した際、両測定結果の相関係数が０．９３以上を示す、
ことを特徴とする、抗ＤＮＡ抗体の測定法。
［２］
非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、標識化ＤＮＡ断片量を測定することによる抗ＤＮＡ抗体の測定法であって、
（ａ）非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片と検体とを反応させ、
（ｂ）反応後、反応液に沈殿剤を添加し、液相と沈殿相を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
（ｃ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定し、
（ｄ）ＤＮＡ断片量の測定結果から抗ＤＮＡ抗体量を算出する、
工程を含み、かつ
（ｅ’）使用するＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数２］で表される範囲内のものを使用し、
［数２］
７００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．３５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｆ’）得られた測定結果と、同一検体を公知のＦａｒｒ−ＲＩＡ法で測定した結果を比較した際、両測定結果の相関係数が０．９５以上を示す、
ことを特徴とする、抗ＤＮＡ抗体の測定法。
［３］
ＤＮＡ断片の標識に用いる非放射性化合物が、ビオチン（Biotin）、２，４−ジニトロフェノール（2,4-Dinitrophenol：DNP）、ジゴキシゲニン（Digoxigenin：DIG）、フルオロセイン（Fluorescein）、ＨｉＢｉＴタグ、およびそれらの誘導体より選ばれる、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］
使用する沈殿剤が、硫酸アンモニウムである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の測定法。
［５］
（ｇ）ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内である、非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｈ）液相と沈殿相を分離（Ｂ／Ｆ分離）するための沈殿剤、及び
（ｉ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定するための試薬
からなり、［１］から［４］のいずれかに記載の測定法によって検体中の抗ＤＮＡ抗体量を測定するための試薬キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の測定法は、（１）抗原として非放射性化合物で標識化された、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたときに前記[数１]式で表されるＤＮＡ断片を用い、（２）抗原抗体反応後、液相と沈殿相を分離するＢ／Ｆ分離を行い、（３）Ｂ／Ｆ分離後、沈殿相ではなく液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定する、という３つの要素を同時に実行するものである。上記要素を同時に実行することにより、Ｎｏｎ−ＲＩＡ法では初めてＦａｒｒ−ＲＩＡ法と相関が高い測定値を得ることができる様になった。
このため、本発明は従来のＮｏｎ−ＲＩＡ法とはその性能的に一線を画し、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法から置き換えることが可能な臨床診断においてＳＬＥの疾患活動性をより正確に反映している抗ＤＮＡ抗体のＮｏｎ−ＲＩＡ的測定方法を提供することができる。
さらに、（１）抗原として非放射性化合物で標識化された、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたときに前記[数２]式で表されるＤＮＡ断片を用い、（２）抗原抗体反応後、液相と沈殿相を分離するＢ／Ｆ分離を行い、（３）Ｂ／Ｆ分離後、沈殿相ではなく液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定する、という３つの要素を同時に実行することにより、検体中の抗ＤＮＡ抗体濃度が低濃度であっても感度良く検出でき、抗ＤＮＡ抗体濃度が高濃度であっても感度良く測り分けることができ、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法とより良い相関性を示す、抗ＤＮＡ抗体のＮｏｎ−ＲＩＡ的測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、免疫学的測定法によるＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡの測定感度を示した図である。グラフの横軸は標識化ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸はＲＬＵを表している。
【図２】図２は、Ｂ／Ｆ分離上清中標識化ＤＮＡ（４１８ｂｐ）測定による抗ＤＮＡ抗体の測定において、検体と反応させる標識化ＤＮＡ濃度の影響をＢ／Ｂ０％で示した図である。検討に供する標識化ＤＮＡの濃度として、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、３．２μｇ／ｍＬを用いた。グラフの横軸が抗ＤＮＡ抗体濃度（ＩＵ／ｍＬ）、縦軸がシグナル測定値（Ｂ／Ｂ０％）を表している。
【図３】図３は、本発明の測定系において好適な標識化ＤＮＡ濃度及び鎖長の範囲を表した図である。グラフ中、横軸がＤＮＡ鎖長（ｂｐ）を、縦軸がＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を表している。グラフ中にプロットされた点は、各点における測定系が、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価した場合に、「●：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「▲：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」のいずれであるかを表している。グラフ中色つきの部分が、評価として▲以上、かつ相関係数０．９３以上を示す、すなわち本発明の測定系において好適な標識化ＤＮＡ濃度及び鎖長の範囲であることを表している。
【図４】図４は、ＳＬＥ患者血清のＦａｒｒ−ＲＩＡ法とＢ／Ｆ分離上清中標識化ＤＮＡ測定法（本発明）の相関図である。横軸に市販Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法測定キットで測定した場合のサンプルの測定値を、縦軸に本発明（標識化ＤＮＡ長１１５９ｂｐ、濃度０．８μｇ／ｍＬ）の測定値をプロットし、両者の相関係数を算出している。
【図５】図５は、本発明の測定系において特に好適な標識化ＤＮＡ濃度及び鎖長の範囲を表した図である。グラフ中、横軸がＤＮＡ鎖長（ｂｐ）を、縦軸がＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を表している。グラフ中にプロットされた点は、各点における測定系が、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価した場合に、「●：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「▲：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」のいずれであるかを表している。グラフ中色つきの部分が、評価として●以上、かつ、相関係数０．９５以上を示す、すなわち本発明の測定系において特に好適な標識化ＤＮＡ濃度及び鎖長の範囲であることを表している。
【図６】図６は、ＳＬＥ患者血清のＦａｒｒ−ＲＩＡ法とＦＥＩＡ法との相関図である。横軸に市販Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法測定キットで測定した場合のサンプルの測定値を、縦軸に市販ＦＥＩＡ法測定キットで測定した場合のサンプルの測定値をプロットし、両者の相関係数を算出している。
【図７】図７は、Ｂ／Ｆ分離上清中標識化ＤＮＡ測定による抗ＤＮＡ抗体の測定において、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡとＢｉｏｔｉｎ・ＤＩＧ標識化ＤＮＡを用いた際の反応性について、Ｂ／Ｂ０％で示した図である。グラフの横軸が抗ＤＮＡ抗体濃度（ＩＵ／ｍＬ）を、縦軸がシグナル測定値（Ｂ／Ｂ０％）を表している。
【図８】図８は、ＳＬＥ患者血清のＦａｒｒ−ＲＩＡ法とＢ／Ｆ分離沈殿中標識化ＤＮＡ測定法（参考例２）の相関図である。横軸に市販Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法測定キットで測定した場合のサンプルの測定値を、縦軸にＢ／Ｆ分離沈殿中標識化ＤＮＡ測定法（標識化ＤＮＡ鎖長１１５９ｂｐおよび１２７４ｂｐ、濃度０．８μｇ／ｍＬ）をプロットし、両者の相関係数を算出している。
【図９】図９は、ＨｉＢｉＴシステムによるＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡの測定感度を示した図である。グラフの横軸は標識化ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸はＲＬＵを表している。
【図１０】図１０は、Ｂ／Ｆ分離上清中ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ測定による抗ＤＮＡ抗体の測定において、検体と反応させる標識化ＤＮＡ濃度の影響をＢ／Ｂ０％で示した図である。検討に供する標識化ＤＮＡの濃度として、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬを用いた。グラフの横軸が抗ＤＮＡ抗体濃度（ＩＵ／ｍＬ）、縦軸がシグナル測定値（Ｂ／Ｂ０％）を表している。
【図１１】図１１は、ＳＬＥ患者血清のＦａｒｒ−ＲＩＡ法とＢ／Ｆ分離上清中ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ測定法の相関図である。横軸に市販Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法測定キットで測定した場合のサンプルの測定値を、縦軸に本発明（ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ長１１５９ｂｐ、濃度０．８μｇ／ｍＬ）の測定値をプロットし、両者の相関係数を算出している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一態様は、抗ＤＮＡ抗体のＮｏｎ−ＲＩＡ的測定方法である。
【００１１】
本発明で測定対象とする検体は、ヒトの血清、血漿である。特に、ＳＬＥなどの自己免疫疾患患者の検体が測定の対象である。
【００１２】
本発明で用いる非放射性化合物で標識化されたＤＮＡ断片とは、非放射性の標識（化合物）が付加されたＤＮＡ断片のことを指す。
本発明で用いるＤＮＡ断片は二本鎖である。
また、１種類の長さのＤＮＡ断片のみを用いても良く、長さの異なる２種類以上のＤＮＡ断片の混合物を使用してもかまわない。
このようなＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法やプラスミドからの制限酵素処理等、公知の方法に従って目的の長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、ＤＮＡ断片の配列に制限はない。
【００１３】
本発明に用いる非放射性の標識化合物の種類は、用いる測定法の測定原理によって適宜選択可能である。また、標識種別数としては、一重標識ないし二重標識されていることが好ましい。ここで、一重標識とは一種の非放射性標識化合物によって標識された状態を、二重標識とは二種の非放射性標識化合物によって標識された状態を指す。
標識数は、１つのＤＮＡ断片に一箇所以上導入されていればよく、複数箇所導入されていてもよい。
二重標識ＤＮＡを用いる場合には、各ＤＮＡ末端につき一種の標識がされていることが好ましい。さらに、同種の標識によって、両端が標識されていてもよい。
【００１４】
本発明に用いる標識としては、ビオチン（Biotin）、２，４−ジニトロフェノール（2,4-Dinitrophenol:DNP）、ジゴキシゲニン（Digoxigenin：DIG）、フルオロセイン（Fluorescein）、５−ブロモデオキシウリジン（Bromodeoxyuridine）などの低分子化合物、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨｉＢｉＴタグなどのペプチドタグ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素、およびそれらの誘導体の中から選択することができる。
上記化合物の中でも、Ｂ／Ｆ分離工程にて沈殿しにくいという点から、ビオチン（Biotin）、２，４−ジニトロフェノール（2,4-Dinitrophenol:DNP）、ジゴキシゲニン（Digoxigenin：DIG）、フルオロセイン（Fluorescein）、ＨｉＢｉＴタグ、およびそれらの誘導体が好ましい。
当該標識を用いてＤＮＡを標識する方法としては、それぞれの標識化合物で通常使用されている常法によって調製することができる。たとえば、実施例において例示されているビオチン・ＤＮＰによる二重標識化ＤＮＡを例に挙げると、５’−ビオチン標識Ｆプライマーと５’−ＤＮＰ標識Ｒプライマーを用いてＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、取得する方法を例示できる。ただし、調製方法は上記方法に制限されない。
【００１５】
標識化ＤＮＡと検体との反応は、通常の抗原抗体反応を行い得る公知の条件を用いればよい。測定対象検体と接触させる標識化ＤＮＡの濃度は、用いるＤＮＡ断片長に応じて適宜選択可能である。
【００１６】
より具体的に標識化ＤＮＡ断片の鎖長と濃度の関係を説明すれば、本発明に用いる標識化ＤＮＡは、量及び鎖長が特定の範囲内であることが好ましい。特定の範囲内とは、標識化ＤＮＡの濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で規定される範囲である。
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
なお、長さの異なる２種類以上のＤＮＡ断片の混合物を使用した場合、上記の鎖長とは、平均鎖長のことを指す。また、長さの異なる２種以上のＤＮＡ断片の混合物を使用する場合でも、それぞれのＤＮＡ断片の長さは上記の範囲内であることが好ましい。
【００１７】
標識化ＤＮＡ断片の濃度及び鎖長が上記範囲であることによって、抗ＤＮＡ抗体濃度が低濃度である場合であっても感度良く検出することができ、抗ＤＮＡ抗体濃度が高濃度である場合であっても、感度良く測り分けることができる。そして、上記標識化ＤＮＡを用いた場合の本発明は、既存のＦａｒｒ−ＲＩＡ法と高い相関性、具体的には相関係数０．９３以上を示す。
【００１８】
標識化ＤＮＡ断片の濃度及び鎖長は、より好ましくは、以下の［数２］で規定される範囲である。
［数２］
７００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．３５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
用いる標識化ＤＮＡ断片の濃度及び鎖長が上記範囲内であることにより、本発明は検体中の抗ＤＮＡ抗体濃度が低濃度であっても感度良く検出でき、抗ＤＮＡ抗体濃度が高濃度であっても感度良く測り分けることができ、さらに、既存のＦａｒｒ−ＲＩＡ法とより高い相関性、具体的には相関係数０．９５以上を示す。
【００１９】
上記［数１］ないし［数２］に規定する範囲内であれば良好な感度で測定できることについては、明確な理由づけは不明であるが、測定系中の標識化ＤＮＡの物質量が重要であることが推測される。しかし、後述の実施例の結果からも分かる通り、たとえ同程度の物質量であっても、鎖長によって測定系の感度等が変動する。これは、標識化ＤＮＡ長が長くなるにつれて、１つの断片に２つの抗体が結合するなど、測定系中での振る舞いに変化が生じるためであると推測される。
上記のような理由から、本発明に用いる好適な標識化ＤＮＡ条件については、測定系中の最終モル濃度等で規定できず、前記［数１］のような複雑な形式でしか記述できない。
なお、長さの異なる２種類以上のＤＮＡ断片の混合物を使用した場合、上記の鎖長とは、平均鎖長のことを指す。
【００２０】
反応後に添加する沈殿剤としては、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、トリクロロ酢酸、アセトン、エタノールなどが挙げられる。上記沈殿剤の中でも硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールが好ましく、硫酸アンモニウムが特に好ましい。沈殿剤の添加量は、選択する沈殿剤に応じて適宜設定可能である。例えば沈殿剤として硫酸アンモニウムを選択した場合、硫安沈殿の方法は自体公知であり、反応溶液中の濃度が４０〜６０％飽和、特に４５〜５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加するのが好ましい。４０％飽和以上であれば沈殿が生じ、６０％以下であればＦａｒｒ−ＲＩＡ法と良好な相関性を有する。
Ｂ／Ｆ分離は、静置、デカンテーション、ろ過、遠心分離等の公知の方法によって行うことができる。たとえば遠心分離であれば、１８００×ｇ、４℃、３０分の条件で実施することができるが、当該条件は適宜設定可能である。
【００２１】
次に、Ｂ／Ｆ分離後の液相（上清）中の標識化ＤＮＡ断片量を測定する。当該上清は、そのまま測定に供してもよく、必要に応じて適宜希釈、濃縮、ｐＨ調整等の操作を行ってもよい。後述の実施例から明らかなように、Ｂ／Ｆ分離後の液相（上清）中の標識化ＤＮＡ断片量を測定することによって、本発明の求める相関係数０．９３以上を達成することができ、一方で、Ｂ／Ｆ分離後の沈殿中では相関係数０．９３以上を達成することができない。
【００２２】
標識化ＤＮＡ断片量を測定する方法としては、標識化合物に対応した自体公知の方法であればよく、特に限定されない。特に、操作性が簡便で、低コストな方法として、分子間の特異的親和性を利用した手法が好適であり、具体的にはＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、ＦＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＥＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ラテックス凝集法、免疫比濁法、免疫比ろう法、表面プラズモン共鳴法、ＨｉＢｉＴシステムなどが例示される。
上記測定法の中でも、標識剤に対応した検出システム、具体的にはビオチン-ストレプトアビジン系、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体系、ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体系、などを利用したＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、ＦＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＥＣＬＩＡ、ＦＩＡや、高親和性ペプチド（ＨｉＢｉＴペプチドタグ：アミノ酸配列ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ）と相補的ルシフェラーゼによるホモジニアス発光測定系であるＨｉＢｉＴシステムが好ましいものとして例示されるが、これらに限定されない。
【００２３】
測定した液相中の標識化ＤＮＡ断片量から検体中の抗ＤＮＡ抗体量を算出する。すなわち、任意の濃度の抗ＤＮＡ抗体と標識化ＤＮＡ断片を反応させ、Ｂ／Ｆ分離により抗ＤＮＡ抗体と結合しなかった標識化ＤＮＡ断片の量を測定することで、抗ＤＮＡ抗体濃度と反比例したシグナルが得られることを利用して検量線を描き、この検量線を用いて抗ＤＮＡ抗体濃度を算出することができる。
また、測定した液相中の標識化ＤＮＡ断片量から検体中の抗ＤＮＡ抗体量を算出する本発明の副次的な利点として、既存のＦａｒｒ−ＲＩＡ法よりも高濃度、たとえば２００ＩＵ／ｍＬ以上の抗ＤＮＡ抗体高濃度条件下において、感度よく測定可能となることが挙げられる。これは、既存Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の放射性標識化ＤＮＡのシグナル増加を測定し抗ＤＮＡ抗体量を算出する方法では、抗ＤＮＡ抗体高濃度条件下ではシグナルがプラトーに達し感度よく測り分けできなくなるのに対し、本発明においては、シグナルの低下より抗ＤＮＡ抗体量を算出するため、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法よりも抗ＤＮＡ抗体高濃度条件下で測り分けが容易であることに起因する。
【００２４】
同一検体に対する既存Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定結果をＸ軸、本発明の測定結果をＹ軸に取り、測定値（Ｘ，Ｙ）をプロットし、統計処理を行うことで、相関係数を求めることができる。本発明の相関係数は、０．９３以上であることが求められる。
【００２５】
本発明の一態様は、抗ＤＮＡ抗体量を測定するための試薬キットである。
【００２６】
本発明の試薬キットは、  
（ｇ）非放射性化合物で標識化された、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で表される範囲内のＤＮＡ断片、
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
（ｈ）液相と沈殿相を分離（Ｂ／Ｆ分離）するための沈殿剤、及び
（ｉ）Ｂ／Ｆ分離後、液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定するための試薬
からなり、上述した本発明の測定法によって検体中の抗ＤＮＡ抗体量を測定するための試薬キットである。
このようなキットの中で、標識化ＤＮＡ断片量を測定するための試薬としては、使用した標識の検出に常用されている試薬を用いることができ、その中から最良の組み合わせを適宜選択すればよい。一例として、標準液、標識化ＤＮＡ液、Ｂ／Ｆ分離剤、希釈液、ＡＬＰ標識ＤＮＰ抗体液、ストレプトアビジン磁性粒子液、発光試薬、洗浄液のようなキット構成が考えられる。
【００２７】
本発明のＮｏｎ−ＲＩＡ的抗ＤＮＡ抗体の測定方法は、（１）抗原として非放射性化合物で標識化された、ＤＮＡ断片の濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたときに前記[数１]式で表されるＤＮＡ断片を用い、（２）抗原抗体反応後、液相と沈殿相を分離するＢ／Ｆ分離を行い、（３）Ｂ／Ｆ分離後、沈殿相ではなく液相中の標識化ＤＮＡ断片量を測定すること、を最大の特徴としている。この３つの要素を同時に実行することにより、後述する実施例で実証されているように、検体中の抗ＤＮＡ抗体濃度を既存のＦａｒｒ−ＲＩＡ法と高い相関性、すなわち相関係数０．９３以上で、好ましくは０．９５以上、さらに好ましくは相関係数０．９７以上で測定することができる。この高い相関が得られるため、本発明を用いて、既存のＦａｒｒ−ＲＩＡ法に基づくＳＬＥの診断法の代わりに被験者がＳＬＥであるかを診断すること、また疾患活動性評価を行うことができる。
【００２８】
なお、本発明において採用されうるＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、ＦＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＥＣＬＩＡ、ＦＩＡなどの分子間の特異的親和性を利用した測定法などの詳細については、たとえば下記の文献を参照すればよい。
(b)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(c)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(d)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
(e)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A)）
(f)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(g)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)）
(h)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D:Selected Immunoassay)）
(i)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［（ｅ）〜（ｉ）はアカデミックプレス社発行］
(j)生物化学的測定研究会（小林典裕ら）編「免疫測定法」（（株）講談社、２０１４年１２月２０日発行）
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
（１−１）非放射性標識化ＤＮＡ断片を用いたＮｏｎ−ＲＩＡ測定系の構築
[試薬調製]
５’−Ｂｉｏｔｉｎ標識Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’末端にＢｉｏｔｉｎ標識を有する配列１：５’−ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ−３’のプライマー）と５’−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）標識Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’末端にＤＮＰ標識を有する配列２：５’−ＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧ−３’のプライマー）を発注、ｐＵＣ１９から４１８ｂｐをＰＣＲで増幅させ、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡを約１００μｇ取得した。Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）, １ｍＭ  ＥＤＴＡで０．０００１〜１０００００ｎｇ／ｍＬに調製した。Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ＤＮＰ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＢＥＴＨＹＬ，Ａ１５０−１１７Ａ） をＡＬＰ標識キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ, 同仁化学、ＬＫ１３） にて標識し、ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体を取得した。
【００３１】
[標識化ＤＮＡ測定]
検体の代わりに、様々な濃度のＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡを含有する第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２））３０μＬと第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体）３０μＬを３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合し、更に３７℃で十分に反応させた。反応後、洗浄し、発光基質を１００μＬ加えて発光強度を測定することで、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡを検出した。
【００３２】
結果を図１に示す。図１に示されているように、ＤＮＡ ０ｎｇ／ｍＬと０．３２ｎｇ／ｍＬでＲＬＵ差を認めたことから、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ量が０．３２ ｎｇ／ｍＬ以上であれば検出可能と判断した。また、２００ｎｇ／ｍＬ程度までは、ＤＮＡ量に対してＲＬＵ値が良好な直線性を示した。以上の結果より、反応溶液中のＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ濃度が０．３２〜２００ ｎｇ／ｍＬの範囲内であれば、測定可能であることが示された。
【００３３】
（１−２）Ｂ／Ｆ分離後の上清中の標識化ＤＮＡの測定
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、これを試験管に２５μＬ加え、０．２〜３．２μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（４１８ｂｐ）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。
反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００３４】
得られた遠心分離後上清 １０μＬと第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）） ３０μＬ及び第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体）３０μＬを混合し、３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合、３７℃で十分に反応させた。反応後、洗浄し、発光基質を１００μＬ加えて発光強度を測定することで、上清中の標識化ＤＮＡを検出した。
【００３５】
図２及び表１に結果を示す。
なお、以下の表１における「評価」とは、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価した場合に、「○：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「△：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」、の基準によって評価を行っている。
表１中「○」は後述する図３中「●」に、表１中「△」は図３中「▲」に、表１中「×」は図３中「×」に、それぞれ対応している。
△（ないし▲）は、グラフ中で○（ないし●）と差別化するために選択された記号であり、実際には実用的な水準を満たしていることを意味している。そのため、○評価と×評価の中間的評価であること以外に、否定的な意味を有していないことを明記する。
【００３６】
【表１】
2020076725.tif 000002
【００３７】
Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ濃度が０．１〜０．４μｇ／ｍＬの場合、０〜２００ＩＵ／ｍＬの全体において、抗ＤＮＡ抗体の濃度依存的なシグナル低下が観察された。このことから、本発明によって抗ＤＮＡ抗体を測定可能である旨が明らかとなった。
標識化ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／ｍＬ以上の場合、抗ＤＮＡ抗体２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となり、抗ＤＮＡ抗体高濃度域においても測り分けできることが明らかとなった。
Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／ｍＬ以下の場合、抗ＤＮＡ抗体１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となり、抗ＤＮＡ抗体濃度が低濃度域であっても、良好な感度で測り分けられることが明らかとなった。
以上総合すると、標識化ＤＮＡ長４１８ｂｐの場合、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ濃度が０．１〜０．４μｇ／ｍＬの場合において抗ＤＮＡ抗体の測定が可能であり、中でも０．２μｇ／ｍＬが好適であることが明らかとなった。
【００３８】
（実施例１−３）ＤＮＡ断片の濃度及び鎖長の関係の検討
５’−Ｂｉｏｔｉｎ標識Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’末端にＢｉｏｔｉｎ標識を有する配列１：５’−ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ−３’のプライマー）と５’−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）標識Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’末端にＤＮＰ標識を有する配列３：５’−ＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ−３’のプライマー）を用いて、ｐＵＣ１９から１１５９ｂｐをＰＣＲで増幅させ、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡを約１００μｇ取得した。Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、これを試験管に２５μＬ加え、０．２〜０．８μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（１１５９ｂｐ）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。
反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００３９】
得られた遠心分離後上清 １０μＬと第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）） ３０μＬ及び第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体）３０μＬを混合し、３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合、３７℃で十分に反応させた。反応後、洗浄し、発光基質を１００μＬ加えて発光強度を測定することで、上清中の標識化ＤＮＡを検出した。
【００４０】
上記０．２〜０．８μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（１１５９ｂｐ）を０．２〜１．２μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（１８６２ｂｐ）に替え、同様の検討を行った。ＰＣＲの増幅には、ｐＵＣ１９をテンプレートとし、５’−Ｂｉｏｔｉｎ標識Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’末端にＢｉｏｔｉｎ標識を有する配列１：５’−ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ−３’のプライマー）と５’−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）標識Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’末端にＤＮＰ標識を有する配列４：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧ−３’のプライマー）を用いた。
【００４１】
本実施例の結果、以下の表２に示す結果が得られた。なお、以下の表２における「評価」は、表１と同様に、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価した場合に、「○：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「△：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」、の基準によって評価を行っている。
【００４２】
【表２】
2020076725.tif 000003
【００４３】
標識化ＤＮＡ鎖長１１５９ｂｐの場合、全ての標識化ＤＮＡ濃度において、抗ＤＮＡ抗体濃度依存的なシグナル低下が観察され、かつ、抗ＤＮＡ抗体１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下であり、良好な感度を示した。中でも、標識化ＤＮＡ濃度が０．４μｇ／ｍＬ以上の場合、抗ＤＮＡ抗体２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となり、抗ＤＮＡ抗体高濃度域においても良好に測り分けが可能であった。
【００４４】
標識化ＤＮＡ長１８６２ｂｐの場合、標識化ＤＮＡ濃度０．４μｇ／ｍＬ以下において、抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％と抗ＤＮＡ抗体２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が区別できず、抗ＤＮＡ抗体高濃度域において濃度依存的なシグナル低下が観察できなかった。一方標識化ＤＮＡ濃度０．８μｇ／ｍＬ以上において、抗ＤＮＡ抗体濃度依存的なシグナル低下が観察され、抗ＤＮＡ抗体１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下、かつ抗ＤＮＡ抗体２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となり、良好な感度で測り分けすることができた。
なお、標識化ＤＮＡ長１１５９ｂｐ・０．２μｇ／ｍＬの結果及び標識化ＤＮＡ長１１５９ｂｐ・０．４μｇ／ｍＬの結果と、標識化ＤＮＡ長１８６２ｂｐ・０．４μｇ／ｍＬの結果とを比較すると、１１５９ｂｐにおいてはどちらも良好な感度を示しているのに対し、１８６２ｂｐでは感度が不良であることから、たとえ標識化ＤＮＡの物質量を同程度とした場合であっても、標識化ＤＮＡの鎖長が異なる場合には、感度等の面で差が生じることが明らかとなった。
【００４５】
実施例１−２及び１−３の結果から、本発明に用いる標識化ＤＮＡの濃度及び鎖長の関係について、解析を行った。
各標識化ＤＮＡの濃度及び鎖長における結果を、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価し、「●：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「▲：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」、の３つに分類し、当該結果を図３の表中にプロット点の形状として表した。
この結果から、本発明にあっては、標識化ＤＮＡの濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、以下の［数１］で規定される範囲である場合に、抗ＤＮＡ抗体０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて、濃度依存的に、感度よく測定することができることが明らかとなった。
［数１］
４００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．４５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
上記［数１］で規定される範囲を、図３の表中に色つきで示した。
【００４６】
（１−４）本発明法とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関試験
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、またＳＬＥ患者血清（Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法、ＦＥＩＡ法にて値付け済み）を２５μＬ加え、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（４１８ｂｐは０．２μｇ／ｍＬ、１１５９ｂｐは０．８μｇ／ｍＬ、１８６２ｂｐは１．２μｇ／ｍＬ）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００４７】
得られた遠心分離後上清 １０μＬと第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）） ３０μＬ及び第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体）３０μＬを混合し、３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合、３７℃で十分に反応させた。
反応後、洗浄し、発光基質を１００μＬ加えて発光強度を測定することで、標識化ＤＮＡを検出した。
標識化ＤＮＡ量より算出した本発明の抗ＤＮＡ抗体量と、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法によって測定した抗ＤＮＡ抗体量を統計処理によって比較することによって、本発明とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関を算出した。算出方法の一例として１１５９ｂｐの結果を図４に、各標識化ＤＮＡ長における相関係数の結果をまとめて表３に示す。
【００４８】
【表３】
2020076725.tif 000004
【００４９】
ＳＬＥ患者血清による測定の結果、表３の通り、本発明の測定系は、いずれの標識化ＤＮＡ長であっても、０．９３以上という高い相関を示した。特に、標識化ＤＮＡ長が１１５９ｂｐのとき、相関係数０．９７５８と最も良好な相関性であった。また、上記４１８ｂｐ及び１１５９ｂｐの結果から、本発明において相関係数が０．９５以上となるには、用いる標識化ＤＮＡ長として、６７２ｂｐ以上が必要であることが分かった。
換言すると、本実施例の結果から、標識化ＤＮＡが標識化ＤＮＡの濃度をＹ（μｇ／ｍＬ）、鎖長をＸ（ｂｐ）としたとき、前記[数１]の関係式を満たす場合には、本発明の前記評価は△以上となり、かつ、本発明とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関係数が０．９３以上となり、さらに、下記 [数２] の関係式を満たす場合には、本発明の前記評価は○以上となり、かつ、相関係数が０．９５以上となることが明らかとなった。
［数２］
７００≦Ｘ≦２０００
Ｙ≧０．１
０．０００６Ｘ−０．３５９５≦Ｙ≦０．０００５Ｘ＋０．３７４４
なお、上記 [数２] の関係式を満たす範囲について、図５に示す。
【００５０】
（参考例１）既存Ｎｏｎ−ＲＩＡ法とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関試験
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、ＦＥＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（エリアｄｓＤＮＡ、ファディア社）を用いて抗ＤＮＡ抗体濃度を測定した。両者の測定値を統計処理によって比較し、ＦＥＩＡ法とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関を算出した。その結果を図６に示す。
【００５１】
図６に示すように、ＦＥＩＡ法とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関係数は０．６７であり、良好な相関性を示しているとは言えなかった。
【００５２】
（実施例２）標識の種類による反応性の比較
実施例１−３に記載の方法により、１１５９ｂｐのＢｉｏｔｉｎ・ＤＩＧ標識化ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた。また、５’−Ｂｉｏｔｉｎ標識Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’末端にＢｉｏｔｉｎ標識を有する配列５：５’−ＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣ−３’のプライマー）と５’−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）標識Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’末端にＤＩＧ標識を有する配列６：５’−ＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧ−３’のプライマー）を用いてｐＵＣ１９から１２７４ｂｐのＢｉｏｔｉｎ・ＤＩＧ標識化ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた。
【００５３】
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、これを試験管に２５μＬ加え、０．２〜０．８μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＩＧ標識化ＤＮＡ溶液（１１５９ｂｐおよび１２７４ｂｐの等物質量混合物）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。
反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００５４】
得られた遠心分離後上清 １０μＬと第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．２)） ３０μＬ及び第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＩＧ抗体）３０μＬを混合し、３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合、３７℃で十分に反応させた。反応後、洗浄し、発光基質を１００μＬ加えて発光強度を測定することで、上清中の標識化ＤＮＡを検出した。
【００５５】
本実施例の結果、０．４μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＩＧ標識化ＤＮＡにおいて、０．８μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡと同等の反応性を示した（図７）。
このことから、本発明は、用いる標識の種類に依存せず測定可能であることが明らかとなった。
【００５６】
（参考例２）Ｂ／Ｆ分離後、上清ではなく、沈殿中の標識化ＤＮＡを測定したときの相関試験
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、またＳＬＥ患者血清（Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法、ＦＥＩＡ法にて値付け済み）を２５μＬ加え、Ｂｉｏｔｉｎ・ＤＮＰ標識化ＤＮＡ溶液（１１５９ｂｐおよび１２７４ｂｐ、０．８μｇ／ｍＬ）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００５７】
得られた遠心分離後沈殿を第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２））で再溶解し、溶解液１０μＬ、第１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）） ３０μＬ及び第２試薬（ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体）３０μＬを混合し、３７℃で十分に反応させた後、第３試薬（ストレプトアビジン磁性粒子）３０μＬを加え混合、３７℃で十分に反応させた。
【００５８】
その結果を図８に示す。
図８に示されているように、遠心分離後の沈殿を測定したときのＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関係数は０．８９であり、相関的には満足いく結果ではなかった。
（実施例３）
（３−１）ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ断片を用いたＮｏｎ−ＲＩＡ測定系の構築
[試薬調製]
アルキンを導入したＤＮＡ断片（ｐＵＣ１９由来、実施例１−３及び実施例２と同様の配列をもつプライマーのアルキン標識体を用いてＰＣＲで１１５９ｂｐおよび１２７４ｂｐのＤＮＡ断片を作製）と末端アジド標識したＨｉＢｉＴタグをクリック反応により結合、ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ断片を作製した。
【００５９】
[標識化ＤＮＡ測定]
９６ｗｅｌｌ  ｈａｌｆ  ａｒｅａ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｎｒｉｎｇ）に種々の濃度のＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ（１１５９ｂｐおよび１２７４ｂｐの等物質量混合物）を２５μＬ分注した。Ｎａｎｏ  Ｇｌｏ  ＨｉＢｉＴ  Ｌｙｔｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマニュアルに従って調製した検出試薬を２５μＬ加え、６００ｒｐｍで３分間攪拌した後、１０分間遮光静置した。ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ）で発光強度を検出した。
【００６０】
結果を図９に示す。図９に示されているように、ＤＮＡ ０  ｎｇ／ｍＬと１  ｎｇ／ｍＬでＲＬＵ差を認めたことから、ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ量が１ ｎｇ／ｍＬ以上であれば検出可能と判断した。また、１０００ｎｇ／ｍＬ程度までは、ＤＮＡ量に対してＲＬＵ値が良好な直線性を示した。
以上の結果より、反応溶液中のＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ濃度が１〜１０００ ｎｇ／ｍＬの範囲内であれば、測定可能であることが示された。
【００６１】
（３−２）Ｂ／Ｆ分離後の上清中のＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡの測定
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、これを試験管に２５μＬ加え、０．２〜０．８μｇ／ｍＬのＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ溶液を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。
反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００６２】
得られた遠心分離後上清 ２５μＬとＮａｎｏ  Ｇｌｏ  ＨｉＢｉＴ  Ｌｙｔｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマニュアルに従って調製した検出試薬を２５μＬ加え、６００ｒｐｍで３分間攪拌した後、１０分間遮光静置した。  ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ）で発光強度を検出した。
【００６３】
図１０及び表４に結果を示す。なお、表４における「評価」は、表１，２と同様に、（ｉ）０〜２００ＩＵ／ｍＬにおいて濃度依存的なシグナル低下が観察される、（ｉｉ）１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０％以下となる、（ｉｉｉ）２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となる、の３つの評価基準で評価した場合に、「○：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全ての基準を満たした」、「△：（ｉ）を満たしたが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれか（あるいは両方）を満たさなかった」、「×：（ｉ）を満たさなかった」、の基準によって評価を行っている。
【００６４】
【表４】
2020076725.tif 000005
【００６５】
ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ濃度０．２〜０．８μｇ／ｍＬの範囲において、抗ＤＮＡ抗体の濃度依存的なシグナル低下が観察された。このことから、ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡによっても抗ＤＮＡ抗体を測定可能である旨が明らかとなった。
中でも標識化ＤＮＡ濃度が０．４及び０．８μｇ／ｍＬの場合、抗ＤＮＡ抗体１３．７ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が９０%以下となり、抗ＤＮＡ抗体低度域においての測り分けが良好であり、かつ、抗ＤＮＡ抗体２１８．２ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％が抗ＤＮＡ抗体１３１．８ＩＵ／ｍＬのＢ／Ｂ０％の２倍以上となり、抗ＤＮＡ抗体高度域においても良好な感度で測り分けすることができることが明らかとなった。
【００６６】
（３−３）ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡによる本発明法とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関試験
Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法の測定原理に基づく市販キット（セティ社）で値付け済みの、ウシ血清で適宜希釈したＳＬＥ患者血清を標準液として、またＳＬＥ患者血清（Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法、ＦＥＩＡ法にて値付け済み）を２５μＬ加え、ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡ溶液（０．８μｇ／ｍＬ）を２００μＬ加えて混和し、３７℃２時間インキュベートした。反応後、冷えた硫酸アンモニウム（６１．２５％飽和）を反応溶液中の硫酸アンモニウム濃度が５０％となるように１０００μＬ加え、混和した。２０００×ｇ, ４℃, １５分間遠心分離した。
【００６７】
得られた遠心分離後上清 ２５μＬとＮａｎｏ  Ｇｌｏ  ＨｉＢｉＴ  Ｌｙｔｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマニュアルに従って調製した検出試薬を２５μＬ加え、６００ｒｐｍで３分間攪拌した後、１０分間遮光静置した。  ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ）で発光強度を検出した。
標識化ＤＮＡ量より算出した本発明の抗ＤＮＡ抗体量と、Ｆａｒｒ−ＲＩＡ法によって測定した抗ＤＮＡ抗体量を統計処理によって比較することによって、本発明とＦａｒｒ−ＲＩＡ法との相関を算出した。結果を図１１に示す。
【００６８】
相関試験の結果、ＨｉＢｉＴ標識化ＤＮＡを用いても、本発明に規定するＤＮＡ断片の濃度と鎖長の関係式を満たしている場合には、０．９８という高い相関を示すことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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