(57)【要約】【課題】本発明は、目的タンパク質を製造する際に発生した宿主細胞残渣を用いて成形した宿主細胞残渣成形体及びその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、上記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、上記宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、宿主細胞残渣成形体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
前記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
前記宿主細胞残渣は前記目的物質を前記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、前記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
【請求項２】
宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
前記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、
前記宿主細胞残渣は前記組換えタンパク質を前記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、前記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
【請求項３】
前記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、前記宿主細胞の膜タンパク質又はリボソームタンパク質を２０質量％以上含む、請求項１又は２に記載の宿主細胞残渣成形体。
【請求項４】
宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
前記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
前記宿主細胞残渣は前記目的物質を前記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、前記宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
【請求項５】
前記宿主細胞残渣が、その乾燥物の総質量に対し、前記宿主細胞由来の３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を２０質量％以上含む、請求項４に記載の宿主細胞残渣成形体。
【請求項６】
前記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、前記宿主細胞由来の３０ｋＤａ未満のタンパク質を２０質量％以上含む、請求項４又は５に記載の宿主細胞残渣成形体。
【請求項７】
前記宿主細胞は、大腸菌、酵母、バチルス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、糸状真菌、及び動物細胞からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞残渣成形体。
【請求項８】
樹脂、繊維又は糸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞残渣成形体。
【請求項９】
組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、組換えタンパク質と宿主細胞残渣とを分離し、宿主細胞残渣を回収する工程と、
前記回収された宿主細胞残渣を成形体に成形する工程と
を含み、前記宿主細胞残渣は前記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、宿主細胞残渣成形体の製造方法。
【請求項１０】
組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、沈殿画分として、前記組換えタンパク質と分離された宿主細胞残渣を回収し、前記沈殿画分を水溶液で洗浄し、洗浄上清として、宿主細胞残渣を回収する工程と、
前記回収された宿主細胞残渣を成形体に成形する工程と
を含み、前記宿主細胞残渣は前記宿主細胞由来の５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、宿主細胞残渣成形体の製造方法。
【請求項１１】
膜タンパク質を含む、樹脂成形体。
【請求項１２】
３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、樹脂成形体。
【請求項１３】
３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む複合成形体であって、前記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む、複合成形体。
【請求項１４】
前記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質の主成分が、膜タンパク質である、請求項１３に記載の複合成形体。
【請求項１５】
前記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質が、宿主細胞残渣に含まれるタンパク質であり、
前記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
前記宿主細胞残渣は前記目的物質を前記宿主細胞から回収した後の細胞残渣である、請求項１３又は１４に記載の複合成形体。
【請求項１６】
宿主細胞残渣を含む複合成形体であって、
前記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含み、
前記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
前記宿主細胞残渣は前記目的物質を前記宿主細胞から回収した後の細胞残渣である、複合成形体。
【請求項１７】
樹脂成形体である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の複合成形体。
【請求項１８】
３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む複合成形体であって、かつ、前記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体の製造方法であって、
３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質を含むタンパク質、及び機能付加材を準備する準備工程と、
前記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質及び前記機能付加材を成形し、少なくとも表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体にする成形工程と
を含む、製造方法。
【請求項１９】
前記成形工程が圧縮成形を含む工程である、請求項１８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞残渣成形体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的タンパク質を得るために、遺伝子工学的手法を用いて、目的タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入し、目的タンパク質を発現させたのちに、回収・精製することは一般的に行われている。その際、目的物でない宿主細胞由来の残渣が大量に発生する。この残渣は適切に処理し不活化したのち、ほとんど再利用されずに廃棄されてしまう。
【０００３】
宿主細胞由来の残渣の有効利用について、大腸菌の残渣を用いて、組換え大腸菌を培養し、トレオニンを生産する方法が報告されている。この有効利用は、大腸菌の生育に必要な窒素源と炭素源に着目している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｌａｅｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｈｓ，  Ｋ．，  ＆Ｆｌａｓｃｈｅｌ，  Ｅ．  （２００７）．  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １３２（４），  ４３１−４３７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、宿主細胞由来のタンパク質に着目し、宿主細胞由来の残渣を有効利用し、成形体とすることを検討してきた。すなわち、本発明は、目的タンパク質を製造する際に発生した宿主細胞残渣を用いて成形した宿主細胞残渣成形体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の［１］〜［４５］を提供する。
［１］  宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
上記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記目的物質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
［２］  宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
上記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
［３］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞の膜タンパク質又はリボソームタンパク質を２０質量％以上含む、［１］又は［２］の宿主細胞残渣成形体。
［４］  宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体であって、
上記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記目的物質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、
宿主細胞残渣成形体。
［５］  上記宿主細胞残渣が、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞由来の３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を２０質量％以上含む、［４］の宿主細胞残渣成形体。
［６］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞由来の３０ｋＤａ未満のタンパク質を２０質量％以上含む、［４］又は［５］の宿主細胞残渣成形体。
［７］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、３０質量％〜９０質量％の総タンパク質含み、かつ、上記組換えタンパク質を１０質量％以下含む、［１］〜［６］のいずれかの宿主細胞残渣成形体。
［８］  上記宿主細胞残渣は、さらに上記宿主細胞由来の脂質、糖類、塩類及び／又は核酸を含む、［１］〜［７］のいずれかの宿主細胞残渣成形体。
［９］  上記宿主細胞は、大腸菌、酵母、バチルス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、糸状真菌、及び動物細胞からなる群より選択される、［１］〜［８］のいずれかの宿主細胞残渣成形体。
［１０］  樹脂、繊維又は糸である、［１］〜［９］のいずれかの宿主細胞残渣成形体。
［１１］  組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、組換えタンパク質と宿主細胞残渣とを分離し、宿主細胞残渣を回収する工程と、
上記回収された宿主細胞残渣を成形体に成形する工程と
を含み、上記宿主細胞残渣は上記宿主細胞由来の膜タンパク質を含む、宿主細胞残渣成形体の製造方法。
［１２］  上記宿主細胞残渣は、上記宿主細胞の膜タンパク質又はリボソームタンパク質を主成分として含む、［１１］の製造方法。
［１３］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞の膜タンパク質又はリボソームタンパク質を２０質量％含む、［１１］又は［１２］の製造方法。
［１４］上記宿主細胞残渣を沈殿画分として回収する、［１１］〜［１３］のいずれかの製造方法。
［１５］回収工程は、熱処理、酸凝集又はエタノール類凝集によって、上記宿主細胞残渣を沈殿させることを含む、［１１］〜［１４］のいずれかの製造方法。
［１６］  組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、沈殿画分として、上記組換えタンパク質と分離された宿主細胞残渣を回収し、上記沈殿画分を水溶液で洗浄し、洗浄上清として、宿主細胞残渣を回収する工程と、
上記回収された宿主細胞残渣を成形体に成形する工程と
を含み、上記宿主細胞残渣は上記宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、宿主細胞残渣成形体の製造方法。
［１７］  上記宿主細胞残渣が、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞由来の３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を２０質量％含む、［１６］の製造方法。
［１８］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、上記宿主細胞由来の３０ｋＤａ未満のタンパク質を２０質量％以上含む、［１６］又は［１７］の製造方法。
［１９］  上記宿主細胞残渣は、その乾燥物の総質量に対し、３０質量％〜９０質量％の総タンパク質含み、かつ、上記組換えタンパク質を１０質量％以下含む、［１１］〜［１８］のいずれかの製造方法。
［２０］  上記宿主細胞残渣は、さらに上記宿主細胞由来の脂質、糖類、塩類及び／又は核酸を含む、［１１］〜［１９］のいずれかの製造方法。
［２１］  上記宿主細胞は、大腸菌、酵母、バチルス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、糸状真菌、及び動物細胞からなる群より選択される、［１１］〜［２０］のいずれかの製造方法。
［２２］  樹脂、繊維又は糸である、［１１］〜［２１］のいずれかの製造方法。
［２３］  膜タンパク質を含む、樹脂成形体。
［２４］  さらにリボソームタンパク質を含む、［２３］の樹脂成形体。
［２５］  ３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、樹脂成形体。
［２６］  さらに３０ｋＤａ未満のタンパク質を含む、［２５］の樹脂成形体。
［２７］  ３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む複合成形体であって、上記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む、複合成形体。
［２８］  上記複合成形体の表面及び内側に機能付加材を含む、［２７］の複合成形体。
［２９］  上記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質の主成分が、膜タンパク質である、［２７］又は［２８］の複合成形体。
［３０］  さらにリボソームタンパク質、リポタンパク質及び／又は糖タンパク質を含む、［２７］〜［２９］のいずれかの複合成形体。
［３１］  さらに３０ＫＤａ未満のタンパク質を含む、［２７］〜［２９］のいずれかの複合成形体。
［３２］  上記複合成形体の全質量に対し、３０ＫＤａ未満のタンパク質が１０．６質量％超である、［３１］の複合成形体。
［３３］  上記３０ＫＤａ未満のタンパク質がリボソームタンパク質である、［３１］又は［３２］の複合成形体。
［３４］  上記機能付加材が、上記複合成形体の全質量対し、５質量％以上である、［２７］〜［３３］のいずれかの複合成形体。
［３５］  上記機能付加材が強度付加材である、［２７］〜［３４］のいずれかの複合成形体。
［３６］  上記強度付加材の耐熱温度が１００℃以上である、［３５］の複合成形体。
［３７］  上記強度付加材がセルロースである、［３５］又は［３６］の複合成形体。
［３８］  上記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質が、宿主細胞残渣に含まれるタンパク質であり、
上記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記目的物質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣である、［２７］〜［３７］のいずれかの複合成形体。
［３９］  宿主細胞残渣を含む複合成形体であって、
上記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含み、
上記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記目的物質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣である、複合成形体。
［４０］  宿主細胞残渣を含む複合成形体であって、
上記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含み、
上記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣である、複合成形体。
［４１］  樹脂成形体である、［２７］〜［４０］のいずれかの複合成形体。
［４２］  ３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む複合成形体であって、かつ、前記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体の製造方法であって、
３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質を含むタンパク質、及び機能付加材を準備する準備工程と、
上記３０ＫＤａ以上５０ＫＤａ以下のタンパク質及び上記機能付加材を成形し、少なくとも表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体にする成形工程と
を含む、製造方法。
［４３］  上記成形体工程が圧縮成形を含む工程である、［４２］の製造方法。
［４４］  上記圧縮成形の成形温度が１５０℃以下である、［４２］又は［４３］の製造方法。
［４５］
上記機能付加材が、上記複合成形体の全質量対し、５質量％以上である、［４２］〜［４４］のいずれかの製造方法。
［４６］
宿主細胞残渣を上記３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質として準備することを含み、
上記宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記目的物質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、
［４１］〜［４５］のいずれかの製造方法。
［４７］
宿主細胞残渣を上記３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質として準備することを含み、
上記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、
上記宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む、
［４１］〜［４５］のいずれかの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、目的タンパク質を製造する際に発生した宿主細胞残渣を有効利用することができる。本発明の宿主細胞残渣成形体は、宿主細胞由来のタンパク質を主成分とする。そのため、適宜な強度を有するとともに、生分解性もあるため、日用品から工業製品、ないし医薬分野など幅広い分野において利用され得る。また、従来廃棄される宿主細胞残渣の有効利用により、宿主細胞残渣を廃棄するための不活化等の処理も必要がなくなり、処理コストを低減でき、かつ、排水処理負担の低減による環境保護効果をもたらすこともできる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験例１の宿主細胞残渣が固形分として沈殿した状態の写真である。
【図２】試験例１の宿主細胞残渣におけるタンパク質の分析結果を示す写真である。
【図３】試験例１の宿主細胞残渣を解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂを用いて分子量解析を行った結果を示すグラフである。
【図４】実施例１〜５の宿主細胞残渣成形体を示す写真である。
【図５】吸水性評価における実施例４の２日目の写真である。
【図６】吸水性評価における１５日間にわたる実施例１〜５の重量と厚みの測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例１〜５の生分解性を評価したグラフである。
【図８】実施例６及び実施例７の変位（ひずみ）を示すグラフである。
【図９】実施例６及び実施例７の透光度を比較した写真である。
【図１０】実施例６及び実施例７の可視光の反射率を示すグラフである。
【図１１】紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。
【図１２】湿式紡糸によって製造された宿主細胞残渣繊維（残渣繊維）を示す写真である。
【図１３】乾式紡糸によって製造された宿主細胞残渣繊維（残渣繊維）を示す写真である。
【図１４】試験例２の廃棄遠心上清を、エタノールを含む溶媒で処理する前、処理後、及び一日放置後の状態を示す写真である。
【図１５】試験例２の宿主細胞残渣におけるタンパク質の分析結果を示す写真である。
【図１６】試験例３の宿主細胞残渣におけるタンパク質の分析結果を示す写真である。
【図１７】試験例４の宿主細胞残渣におけるタンパク質の分析結果を示す写真である。
【図１８】試験例２〜４の宿主細胞残渣を解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂを用いて分子量解析を行った結果を示すグラフである。
【図１９】宿主細胞残渣樹脂成形体の写真、並びに、外見観察及び樹脂化程度評価の結果を示す表である。
【図２０】木屑残渣複合樹脂成形体の写真、及び外見観察の結果を示す表である。
【図２１】木屑残渣複合樹脂成形体の曲げ強度を示すグラフである。
【図２２】木屑残渣複合樹脂成形体の曲げ試験後の破壊程度、及び外見考察の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔宿主細胞残渣成形体〕
宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体は、宿主細胞残渣を用いて成形することによって得られた成形体である。
【００１０】
一実施形態において、宿主細胞は目的物質を産生する宿主細胞であり、宿主細胞残渣は目的物質を宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、宿主細胞由来の膜タンパク質を含む。宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であってよく、この場合、宿主細胞残渣は組換えタンパク質を宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、宿主細胞由来の膜タンパク質を含む。
【００１１】
別の実施形態において、宿主細胞は、目的物質を産生する宿主細胞であり、宿主細胞残渣は目的物質を宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含むものである。宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であってよく、この場合、宿主細胞残渣は組換えタンパク質を宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、宿主細胞由来の３０ＫＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む。
【００１２】
（目的物質）
本発明は、目的物質を産生する宿主細胞残渣の有効利用を提供する。宿主細胞が生産する「目的物質」とは、細胞が産生する化合物であれば特に限定はない。有機物でも無機物でもよく、細胞中に保持される物でも細胞外に分泌される物でもよく、合成による物、分解による物の別を問わない。例えば、核酸、アミノ酸、糖、糖タンパク質、脂肪酸、ビタミン、ペプチド、抗体、ホルモン等が挙げられる。目的物質は、好ましくは核酸、アミノ酸、又は組換えタンパク質であり、組換えタンパク質が可溶性であっても、不溶性であってもよい。
【００１３】
（組換えタンパク質）
本実施形態の組換えタンパク質は、目的タンパク質生産系において生産される組換えタンパク質であっても、宿主細胞において目的物質を生産するために必要な組換えタンパク質であってもよく、その種類は特に限定されない。目的タンパク質は例えば、生体構造を構築する構造タンパク質であってもよく、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質であってもよい。また、宿主細胞内において発現されるタンパク質であってもよく、宿主細胞外へ分泌されるタンパク質であってもよい。さらに、組換えタンパク質が可溶性であっても、不溶性であってもよい。機能タンパク質として、酵素などの触媒作用を有するタンパク質、ホルモン、神経伝達物質、リプレッサーなどの調節作用を有するタンパク質、抗体、フィブリン等の生体防御作用を有するタンパク質、ヘモグロビン、ミオグロビン、アルブミン等の物質運搬に関与するタンパク質などが挙げられる。目的物質を産生するために必要な組換えタンパク質は、構造タンパク質であっても、機能タンパク質であってもよく、宿主細胞で作用する酵素などが挙げられる。
【００１４】
例えば、構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラーゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質は、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００１５】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００１６】
クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
【００１７】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００１８】
構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，２９５巻，ｐｐ．４７２−４７６参照）。
【００１９】
組換えフィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２０】
大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。
【００２１】
コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００２２】
レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００２３】
エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２４】
ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。
【００２５】
酵素としては、例えばポリメラーゼ、グルタミナーゼ等が挙げられ、ホルモンとしては、例えばインシュリン、メラトニンが等挙げられ、抗体としては、例えば免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ等が挙げられる。
【００２６】
例えば、後述の方法によって、組換えタンパク質をコードする核酸（「組換えタンパク質遺伝子」という場合もある）を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞において組換えタンパク質を発現させることができる。
【００２７】
（宿主細胞）
本発明における「宿主細胞」は、目的物質を産生する宿主細胞をいい、「目的物質を産生する」こととは、細胞を培地で培養した際、目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、細胞が遺伝子工学的に改変された宿主細胞であり、当該細胞の野生株又は非改変株よりも、多量の目的物質を生産する能力を有することをいう。宿主細胞は好ましくは組換え宿主細胞であり、例えば組換えタンパク質遺伝子が宿主細胞に導入することによって得られる。
【００２８】
宿主細胞は、組換えタンパク質の発現機構を備えている、組換えタンパク質を発現する組換え宿主細胞であってよい。組換えタンパク質の発現機構とは、組換えタンパク質を選択的に発現させるための機構で、周知の組換えタンパク質発現機構を用いることができる。組換えタンパク質発現機構を備えることで、組換えタンパク質を大量に発現させることができる。組換えタンパク質発現機構を備える目的物質生産細胞は、例えば、組換えタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することにより得ることができる。
【００２９】
本実施形態の宿主細胞は、外来タンパク質である組換えタンパク質を発現できる細胞であり、遺伝子工学的手法によって、組換えタンパク質遺伝子が宿主細胞に導入することによって得られる。なお、本明細書において、宿主細胞は組換えタンパク質遺伝子によって組み換えられた組換え細胞を指すが、明らかに混同しない場合に限って、組換えタンパク質遺伝子によって組み換えられる前の細胞も宿主細胞という場合がある。
【００３０】
組換えタンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、改変フィブロインをコードする核酸の場合、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、所望の核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【００３１】
調節配列は、宿主細胞における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、組換えタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００３２】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主細胞の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００３３】
遺伝子組換えに用いられる宿主細胞の種類は、遺伝子組換えに用いられるものであれば、特に限定されないが、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。例えば、大腸菌、酵母、バチルス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、糸状真菌、及び動物細胞からなる群より選択されてもよい。
【００３４】
原核生物の宿主細胞の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【００３５】
原核生物を宿主細胞とする場合、タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００３６】
真核生物の宿主細胞としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００３７】
真核生物を宿主細胞とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００３８】
発現ベクターで形質転換された宿主細胞による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００３９】
組換えタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主細胞を培養培地中で培養する方法は、宿主細胞の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００４０】
宿主細胞が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主細胞が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主細胞の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４１】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００４２】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００４３】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４４】
発現させた組換えタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、宿主細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、酵素処理法、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００４５】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４６】
（宿主細胞残渣）
本実施形態の宿主細胞残渣は、目的物質（目的物質が組換えタンパク質の場合、組換えタンパク質）を宿主細胞から回収した後の細胞残渣である。組換えタンパク質の回収方法は、上述のように、組換えタンパク質の状態（溶解状態か不溶体か）によって、その単離・精製方法が異なる場合があるものの、通常宿主細胞由来の成分、特に宿主細胞由来のタンパク質が不純物として混入されないように、組換えタンパク質と宿主細胞由来のタンパク質とを分離する工程を含む。したがって、組換えタンパク質を回収した後に残った細胞残渣は、宿主細胞由来成分を主成分とし、特に宿主細胞由来の膜タンパク質、リボソームタンパク質等を含む。
【００４７】
宿主細胞由来の膜タンパク質は、特に限定されないがＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢなどが挙げられる。膜タンパク質の分子量は、宿主細胞の種類によって異なるが、例えば大腸菌などの場合、約３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下の分子量を有する。リボソームタンパク質は、約３０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００４８】
一実施形態の宿主細胞残渣は、宿主細胞由来のタンパク質を含み、その主成分が宿主細胞由来の膜タンパク質又はリボソームタンパク質である。宿主細胞の種類や分離工程によって異なるものの、宿主細胞残渣は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、宿主細胞の膜タンパク質を２０質量％以上含み、例えば、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上含み、また、例えば、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下含むものである。また、一実施形態の宿主細胞残渣は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、宿主細胞のリポソームタンパク質を２０質量％以上含み、例えば、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上含み、また、例えば、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下含むものである。
【００４９】
別の実施形態の宿主細胞残渣は、宿主細胞由来の５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む。宿主細胞由来の５０ｋＤａ以下のタンパク質としては、例えば宿主細胞由来の膜タンパク質、リボソームタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などが挙げられる。該５０ｋＤａ以下のタンパク質は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、好ましくは５０質量％以上、例えば、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上含まれる。また、該５０ｋＤａ以下のタンパク質は、宿主細胞残渣の総タンパク質に対して、好ましくは４０質量％以上含み、例えば、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、又は９０質量％以上含まれる。
【００５０】
別の実施形態の宿主細胞残渣は、３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下の宿主細胞由来のタンパク質を含んでもよく、該３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質としては、膜タンパク質が挙げられる。該３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、好ましくは２０質量％以上、例えば、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上含まれ、また、例えば、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下含まれる。該３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質は、宿主細胞残渣の総タンパク質に対して、好ましくは４０質量％以上含み、例えば、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、又は９０質量％以上含まれる。
【００５１】
別の実施形態の宿主細胞残渣は、また３０ｋＤａ未満の宿主細胞由来のタンパク質を含んでもよく、該３０ｋＤａ未満のタンパク質としては、リボソームタンパク質が挙げられる。該３０ｋＤａ未満のタンパク質は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、５質量％以上、例えば、１０質量％以上、２０質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上含まれ、また、例えば、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下含まれる。該３０ｋＤａ未満のタンパク質は、宿主細胞残渣の総タンパク質に対して、好ましくは４０質量％以上含み、例えば、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、又は９０質量％以上含まれる。
【００５２】
宿主細胞残渣は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、２０質量％〜９０質量％の総タンパク質を含み、例えば、３０質量％〜８５質量％、４０質量％〜８０質量％、４０質量％〜７０質量％又は５０質量％〜９０質量％の総タンパク質を含む。総タンパク質において、宿主細胞由来の膜タンパク質、リボソームタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などの宿主細胞由来のタンパク質の他、少量に残っている組換えタンパク質を含み得る。
【００５３】
宿主細胞残渣は、宿主細胞残渣の乾燥物の総質量に対し、組換えタンパク質を１０質量％以下、５質量％以下含み、例えば、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下又は０．５質量％以下含む。宿主細胞残渣は、組換えタンパク質を０質量％超含み、その含有量が検出限界よりも少ない量であり得る。
【００５４】
宿主細胞残渣は、タンパク質の他に、様々細胞由来成分を含み得る。例えば、宿主細胞由来の脂質、糖類、塩類及び／又は核酸を含み得る。脂質としては、細胞膜由来のリン脂質を主成分として、そのほかに飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸も含み得、さらに脂質の測定方法によって、リポタンパク質も脂質として検出される場合がある。大腸菌の細胞膜中のリン脂質プロフィールは主に三種類であり、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）０〜６０％程度、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＧ）０〜３０％程度、Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（ＣＬ）０〜１７％程度である。この脂質の化学構造は全てグリセリンという可塑剤の成分が含まれている。国際公開ＷＯ／２０１７／０４７５０４号で、タンパク質樹脂成形体を製作する際、水の含有率を一定量にコントロールし、可塑剤として働いている。そのため脂質の含有量は、宿主細胞残渣の細胞膜リン脂質（ＰＥ、ＰＧ、ＣＬ）が同じ可塑剤として働き、宿主細胞残渣を含む成形体の成形温度に影響を与える可能性は極めて高いと考えられる。糖類としては、グルコース、フルクトース、リボース、グリセルアルデヒドなどを含み得る。核酸としては、デオキシリボ核酸、リボ核酸を含み得る。宿主細胞残渣は、例えば５質量％〜２０質量％の脂質、０．１質量％〜５質量％の糖類、０．１質量％〜５質量％の核酸、０．１質量％〜５質量％の塩類を含み得る。タンパク質以外の宿主細胞残渣由来の核酸類、糖類などは加熱などにより成形体の着色性に影響を与える可能性がある。着色の原理としては、メイラード反応などが考えられる。
【００５５】
（宿主細胞残渣成形体）
宿主細胞残渣からなる宿主細胞残渣成形体は、宿主細胞残渣を用いて成形することによって得られた成形体である。成形体の形態は、成形できれば特に限定されないが、樹脂、繊維、又は糸等が挙げられる。成形体は、後述の成形方法によって得ることができる。宿主細胞残渣成形体は、宿主細胞残渣を、成形体の総質量に対し、５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、又は１００質量％含む。また、宿主細胞残渣成形体は、宿主細胞由来のタンパク質を、成形体の総質量に対し、５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％含む。
【００５６】
〔宿主細胞残渣成形体の製造方法〕
本実施形態の宿主細胞残渣成形体の製造方法は、目的物質を産生する宿主細胞を破砕し、目的物質と宿主細胞残渣とを分離し、宿主細胞残渣を回収することを含む。宿主細胞が組換えタンパク質を発現する宿主細胞である場合、該組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、組換えタンパク質と宿主細胞残渣とを分離し、宿主細胞残渣を回収する工程（回収工程）と、回収された宿主細胞残渣を成形体に成形する工程（成形工程）とを含む。
【００５７】
（回収工程）
組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製については、上述のとおりです。組換えタンパク質を発現させるための宿主細胞培養が終了した後、宿主細胞を遠心分離等により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、破砕する。破砕方法は特に限定されないが、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等が挙げられるが、例えば高圧ホモジナイザーが用いてもよい。
【００５８】
得られた破砕物における組換えタンパク質と宿主細胞残渣とを分離する方法は、組換えタンパク質の性質によって異なる。組換えタンパク質が、宿主細胞内に溶解状態した状態で発現される場合は、宿主細胞を破砕した後に得られた無細胞抽出液を遠心分離することによって、組換えタンパク質を含む上清画分と、宿主細胞残渣を含む沈殿画分とに分離する。一方、組換えタンパク質が宿主細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕した後、遠心分離を行うことにより、組換えタンパク質の不溶体を含む沈殿画分と、宿主細胞残渣を含む上清画分とに分離する。
【００５９】
宿主細胞残渣は、遠心分離によって組換えタンパク質と分離された上清画分又は沈殿画分として回収する。一実施形態において、宿主細胞残渣が、遠心分離によって、上清画分として、沈殿画分の組換えタンパク質と分離される。この場合、組換えタンパク質は不溶性である。得られた上清画分である宿主細胞残渣を熱処理、酸凝集、又はエタノール類凝集によって、宿主細胞残渣を沈殿させて、沈殿画分として回収してもよい。また、沈殿画分として回収されたのち、適宜に洗浄してもよい。回収した宿主細胞残渣は、成形する前にさらに精製してもよい。精製としては、アルカリ又は酸で洗浄等によって行うことが可能です。さらに、保存の観点から、回収された宿主細胞残渣を凍結乾燥粉末としてもよい。
【００６０】
別の実施形態において、宿主細胞残渣が、遠心分離によって、沈殿画分として、上清画分の組換えタンパク質と分離される。この場合、組換えタンパク質は水溶性である。当該沈殿画分をそのまま使用してもよく、沈殿画分を洗浄して、洗浄上清として回収した後、再度沈殿させてもよい。このような回収工程は、例えば、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を破砕し、沈殿画分として、組換えタンパク質と分離された宿主細胞残渣を回収し、沈殿画分を水溶液で洗浄し、洗浄上清として、宿主細胞残渣を回収する工程であってよい。組換えタンパク質と宿主細胞残渣との分離は、例えば遠心分離によって行ってよい。得られた沈殿画分を洗浄するときは、水又は水溶液で洗浄してもよく、水溶液は例えば界面活性剤を含む水溶液であってよい。界面活性剤としては、カチオン界面活性、アニオン界面活性剤、中性界面活性剤などが挙げられる。好ましくは、アニオン界面活性である。アニオン界面活性剤としては、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型などが挙げられ、硫酸エステル型としてラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アルキル硫酸エステル塩（ＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（ＡＥＳ）が挙げられる。好ましくは、硫酸エステル型としてラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。界面活性剤による洗浄は、宿主細胞残渣に含まれるタンパク質以外の成分、例えば脂質の含有量に影響を与え、脂質を部分的に洗浄上清に含めることができる界面活性剤を用いることが好ましい。洗浄上清として回収した後、例えば熱処理、酸凝集、又はエタノール類凝集によって凝集させ、宿主細胞残渣を沈殿画分として回収してもよい。
【００６１】
回収又は精製された宿主細胞残渣は、成形しやすい状態にしてもよい。例えば、乾燥粉末、溶液、顆粒、ペレット、フィルム等にしてもよい。乾燥方法としては、凍結乾燥、凍結真空乾燥、熱風乾燥などが挙げられる。凍結乾燥は、例えば、凍結乾燥機  ＦＤＵ−１２００型（ＥＹＥＬＡ  東京理化器械株式会社）を用いて行うことが可能である。
【００６２】
（成形工程）
樹脂に成形する場合は、例えば国際公開ＷＯ／２０１７／０４７５０４号等の方法によって成形することができる。例えば、宿主細胞残渣を加圧・加熱状況において、所望の形状に成形させることが挙げられる。加圧の圧力（成形圧）は特に限定されず、１０Ｐａ〜１００Ｐａであればよく、例えば２０Ｐａ〜８０Ｐａ、又は３０Ｐａ〜５０Ｐａであってよい。加熱温度（成形温度）も特に限定されず、例えば１００℃以上、１１０℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上であってよく、また、２００℃以下、１７０℃以下、１５０℃以下であってよく、例えば、１１０℃〜１７０℃、又は１３０℃〜１５０℃であることが好ましい。
【００６３】
繊維及び糸に成形する場合は、上述した宿主細胞残渣を紡糸したものであり、膜タンパク質又はリボソームタンパク質を主成分とする。宿主残渣繊維は、公知の紡糸方法によって製造することができる。すなわち、例えば、膜タンパク質又はリボソームタンパク質を主成分として含む繊維を製造する際には、まず、上述した方法に準じて製造した宿主細胞残渣をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、又はヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、必要に応じて、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解してドープ液を作製する。次いで、このドープ液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸又は溶融紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して、宿主残渣繊維を得ることができる。好ましい紡糸方法としては、湿式紡糸又は乾湿式紡糸を挙げることができる。
【００６４】
図１１は、宿主残渣繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図１１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。
【００６５】
紡糸装置１０を使用した紡糸方法を説明する。まず、貯槽７に貯蔵されたドープ液６が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ラボスケールにおいては、ドープ液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。次いで、押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給され、溶媒が除去されて、改変フィブロインが凝固し、繊維状凝固体が形成される。次いで、繊維状凝固体が、延伸浴槽２１内の温水１２中に供給されて、延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。その後、延伸された繊維状凝固体が、乾燥装置４に供給され、糸道２２内で乾燥されて、宿主残渣繊維３６が、巻糸体５として得られる。１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。
【００６６】
凝固液１１としては、脱溶媒できる溶液であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０〜３０℃であることが好ましい。口金９として、直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２〜６．０ｍｌ／時間が好ましく、１．４〜４．０ｍｌ／時間であることがより好ましい。凝固した改変フィブロインが凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００〜５００ｍｍである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、１〜２０ｍ／分であってよく、１〜３ｍ／分であることが好ましい。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であることが好ましい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。凝固液槽２０は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段  、又は特定の段で行ってもよい。
【００６７】
なお、宿主残渣繊維を得る際に実施される延伸は、例えば、上記した凝固液槽２０内で行う前延伸、及び延伸浴槽２１内で行う湿熱延伸の他、乾熱延伸も採用される。
【００６８】
湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、スチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１〜１０倍延伸することができ、２〜８倍延伸することが好ましい。
【００６９】
乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃〜２７０℃であってよく、１６０℃〜２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、０．５〜８倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。
【００７０】
湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
【００７１】
最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
【００７２】
〔タンパク質樹脂成形体〕
一実施形態の樹脂成形体は、膜タンパク質を含み、好ましくはリボソームタンパク質をさらに含む。タンパク質樹脂成形体は、成形体の総質量に対し、総タンパク質を２０質量％〜９０質量％含んでよく、また、膜タンパク質を２０質量％以上含んでよく、リボソームタンパク質を２０質量％以上含んでよい。
【００７３】
別の実施形態の樹脂成形体は、５０ｋＤａ以下のタンパク質を含み、好ましくは３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質、及び／又は、３０ｋＤａ未満のタンパク質を含む。タンパク質樹脂成形体は、成形体の総質量に対し、総タンパク質を２０質量％〜９０質量％含んでよく、また、３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質を２０質量％以上含んでよく、３０ｋＤａ未満のタンパク質を２０質量％以上含んでよい。
【００７４】
〔複合成形体〕
本実施形態の複合成形体は、５０ｋＤａ以下のタンパク質を含む複合成形体であって、上記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体である。好ましくは、複合成形体の表面及び内側の両方に機能付加材を含む。ここで、５０ｋＤａ以下のタンパク質と機能付加材とが混在して、一体となって複合成形体を形成していることが好ましい。複合成形体は好ましくは樹脂成形体である。
【００７５】
一実施形態において、５０ＫＤａ以下のタンパク質の主成分が、膜タンパク質又はリボソームタンパク質であることが好ましく、さらにリポタンパク質及び／又は糖タンパク質を含んでもよい。
【００７６】
別の実施形態において、５０ＫＤａ以下のタンパク質の主成分が、３０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のタンパク質、又は３０ＫＤａ未満のタンパク質であることが好ましく、該３０ＫＤａ未満のタンパク質がリボソームタンパク質であってもよい。また、複合成形体の全質量に対し、３０ＫＤａ未満のタンパク質が１０．６質量％超であることが好ましい。
【００７７】
さらなる実施形態において、５０ＫＤａ以下のタンパク質が、宿主細胞残渣に含まれるタンパク質であり、宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であることが好ましく、上記宿主細胞残渣が上述の本実施形態の宿主細胞残渣であることが好ましい。複合成形体は、宿主細胞残渣を、成形体の総質量に対し、５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、又は１００質量％未満含む。
【００７８】
機能付加材とは、複合成形体に機能を付加するための材料であり、上記機能は例えば、強度（特に曲げ強度）を付加するための強度付加剤、保水性・吸水性を付加するための吸水剤、消臭効果を付加するための消臭剤などが挙げられる。機能付加材として具体的に、例えば木屑等のセルロースであってよく、木炭、活性炭、多孔質体などであってよく、多孔質体としては、シリカ、セラミックス（廃材）、炭酸カルシウム（貝殻）、ポーラスコンクリートなどの無機系多孔質体であってよい。機能付加材が強度付加材であることが好ましく、該強度付加剤の耐熱温度が１００℃以上であればよく、例えば１１０℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上であることが好ましい。機能付加材が、上記複合成形体の全質量対し、５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、又は１００質量％未満である。
【００７９】
さらなる別の実施形態の宿主細胞残渣を含む複合成形体は、複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含み、宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であってもよい。
【００８０】
〔複合成形体の製造方法〕
一実施形態の、５０ｋＤａ以下のタンパク質を含み、かつ、前記複合成形体は少なくともその表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体の製造方法では、
５０ＫＤａ以下のタンパク質を含むタンパク質、及び機能付加材を準備する準備工程と、
上記５０ＫＤａ以下のタンパク質及び上記機能付加材を成形し、少なくとも表面及び／又は内側に機能付加材を含む複合成形体にする成形工程と
を含む。ここで、機能付加材は上述のとおりであり、５０ｋＤａ以下のタンパク質と機能付加材とが混在して、一体となって複合成形体を形成していることが好ましい。好ましくは、複合成形体の表面及び内側の両方に機能付加材を含む。
【００８１】
上記成形体工程が圧縮成形を含む工程であることが好ましく、上記圧縮成形の成形温度が１００℃以上、１１０℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上であってよく、また、２００℃以下、１７０℃以下、１５０℃以下であってよく、例えば、１１０℃〜１７０℃、又は１３０℃〜１５０℃であることが好ましい。加圧の圧力（成形圧）は特に限定されず、１０Ｐａ〜１００Ｐａであればよく、例えば２０Ｐａ〜８０Ｐａ、又は３０Ｐａ〜５０Ｐａであってよい。
【００８２】
一実施形態において、上記５０ｋＤａ以下のタンパク質は、宿主細胞残渣として準備し、上記宿主細胞は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞であり、上記宿主細胞残渣は上記組換えタンパク質を上記宿主細胞から回収した後の細胞残渣であり、かつ、上記宿主細胞由来の５０ｋＤａ以下のタンパク質を含むことが好ましい。上記宿主細胞残渣は、本実施形態の宿主細胞残渣であることが好ましい。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術思想を逸脱しない限り、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００８４】
＜製造例１＞
（１）目的構造タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。
【００８５】
次に、ＰＲＴ７９９をコードする遺伝子を合成委託した。その結果、遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び３’末端直下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した遺伝子を得た。当該遺伝子をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした後、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組み換えた。
【００８６】
（２）目的構造タンパク質の発現
上記で得られたＰＲＴ７９９をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、表１に示すシード培養用培地１００ｍＬに、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコにて、さらに約１５時間培養を行い、シード培養液を得た。
【００８７】
【表１】
2020124187.tif 000002
【００８８】
得られたシード培養液を、表２に示す生産培地５００ｍＬを添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定になるように制御し、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにして培養した。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。
【００８９】
【表２】
2020124187.tif 000003
【００９０】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、酵母エキス１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
【００９１】
（３）構造タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
【００９２】
（４）目的構造タンパク質を発現した宿主細胞残渣の再精製
破砕細胞溶液の遠心上清から得られた宿主細胞残渣
上記の高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓａｏｖｉ社製の「Ｐａｎｄａ  Ｐｌｕｓ  ２０００」）で細胞を破砕し、目的タンパク質が沈殿するよう、遠心分離機（クボタ社製の「Ｍｏｄｅｌ７０００」）を用いて、室温で１１，０００ｇ、１０分遠心分離し、宿主細胞残渣を含む遠心上清を回収した。得られた遠心上清を８０℃で２時間不活化処理し、宿主細胞残渣が固形分として沈殿した（図１）。固形分を、室温で１１，０００ｇ、１０分で遠心分離によって回収し、イオン交換水に再懸濁し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨが７前後となるように中和し、室温で２時間スターラーで撹拌した。その後遠心分離し、固形分をイオン交換水に再懸濁し、３Ｍクエン酸を用いて、ｐＨ３．５に調整し、固形分中のタンパク質を凝集させ、遠心分離機を用いて、室温で１１，０００ｇ、１０分遠心分離し、凝集タンパク質を含む沈殿物を回収した。次にイオン交換水を用いて沈殿物を洗浄し、遠心分離し沈殿物を回収する洗浄工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、試験例１（ＰＲＴ７９９）の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を得た。
【００９３】
（５）宿主細胞残渣の定性及び定量分析
（ａ）タンパク質関連成分
得られた宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末におけるタンパク質の濃度をＢＣＡ法にて測定した。なお、ＢＣＡ法によるタンパク質の測定には、タカラバイオ社製のＰｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた。測定した結果、試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末が、約８１．５±３．７質量％のタンパク質を含んでいた。
【００９４】
同時に、試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。Ｏｒｉｏｌｅ染色によりタンパク質の存在を確認し、解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて画像解析することにより、メインバンドは約３７ｋＤａのタンパク質であることを確認した（図２）。文献によれば、宿主細胞残渣の主成分である約３９ｋＤａのタンパク質（測定条件によって３７〜３９ｋＤａの間に変動し得る）は、分子量３９ｋＤａのＯｍｐＦ（Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆ）及び分子量３８ｋＤａのＯｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）の膜タンパク質であると推測される。
【００９５】
試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末に含まれるタンパク質の組成を確認するため、解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂを用いて分子量の解析を行った。その結果を図３に示す。図３の上のグラフは宿主細胞残渣タンパク質Ｏｒｉｏｌｅ染色のバンドの発光強度の結果を示し、下のグラフはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動プロフィールのバンド相対位置を示すに示す。図３から、約３９ｋＤａのタンパク質（ＯｍｐＦ／ＯｍｐＣ）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約４０質量％を占める一方で、目的構造タンパク質は宿主細胞残渣における全タンパク質の約０．４質量％であったことが確認された。
【００９６】
（ｂ）脂質関連成分
得られた試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末５００ｍｇを秤量し、１０ｍＬバイアルに入れた。バイアルにマグネティックスターラーを挿入し、クロロホルム系溶媒６．５ｍＬをガラスピペットで添加した。バイアルの蓋を締め、ヒートブロックで加熱回転させ、Ｏリング、サポートフィルター、ＰＴＦＥフィルターの順に重ねクランプし漏斗を組み立て、ゴム管を挿入した１００ｍＬ濾過瓶に差し込み、真空ポンプを接続し減圧濾過する。その後、バイアルをクロロホルム系溶媒０．５ｍＬで共洗い後、減圧濾過し、濾液を新しい１０ｍＬバイアルへデカントした。濾過瓶の内壁を再度クロロホルム系溶媒０．５ｍＬで共洗し、バイアルへデカントした。バイアルを局所排気装置内でヒートブロックにより加熱し濾液を揮発させ、残渣を得た。濾液が揮発したバイアルに石油エーテルを添加し、よく撹拌し、１５ｍＬチューブへデカントした。その後、遠心分離し、上清のエーテル層を新しいバイアルへデカントし、蓋を開放した状態で、ヒートブロックで加熱し、石油エーテルを完全に揮発させ、室温まで冷却させた後、得られた純化した脂質関連成分の重さを測定した。その結果、試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末が約１７．７質量％の脂質を含んでいたことが確認された。そのうち、全脂質は１１．３％を占め、残りは脂質関連タンパク質（主に、リボソームタンパク質）である。
【００９７】
（ｃ）水分
得られた試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末１ｇを秤量し、加熱乾燥式水分計ＭＸ−５０（エーアンドデイ株式会社）を用いて水分量を測定した。測定した結果、水分率が約３．８％であった。
【００９８】
上記測定した試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末の組成を表３にまとめた。
【表３】
2020124187.tif 000004
【００９９】
（６）宿主細胞残渣成形体（樹脂）の作製
上記で得られた試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を０．７ｇ秤量し、サンプルとした。サンプルを、厚みが均等になるように加圧成形機の金型の貫通孔内に導入した。使用された金型は、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する円柱形状の金型であった。サンプルを貫通孔内に導入した後、金型の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（商品名：ＮＴ−１００  Ｈ−Ｖ０９、ＮＰａシステム株式会社製）を用いて、上側ピンと下側ピンを貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が４５ｋＮ（約３１ＭＰａ）となるように制御した。サンプルの温度が１３０℃になった時点で加熱を中止し、スポットクーラー（商品名：ＴＳ−２５ＥＰ−１、トラスコ中山株式会社製）で、アニール時間が５分で３０℃まで冷却した。サンプルを取り出し、バリ取りを行い、３５ｍｍ×１５ｍｍ×１ｍｍの直方体形状の宿主細胞残渣成形体を５個（実施例１〜５）得た（図４）。
【０１００】
（７）宿主細胞残渣成形体の吸水性評価
上記得られた実施例１〜５の宿主細胞残渣成形体を、恒温恒湿槽（ｅｓｐｅｃ社製、ＬＨＬ−１１３）に３０℃、９３％の条件下で１５日静置した。目視で観察した結果、１日目にはすでに表面にひび割れが観察された。実施例４の２日目の写真は図５に示す。図５から、形状がほぼ変わっていないものの、表面に複数の亀裂が発生した。また、１５日間にわたる実施例１〜５の重量と厚みを測定し、測定結果は図６に示す。図６から１週間後重さと厚みは環境と動的平衡になったことが分かった。
【０１０１】
（８）宿主細胞残渣成形体の生分解性評価
上記吸水性評価を行った後、実施例１〜５の宿主細胞残渣成形体を２５ｍＬのイオン交換水に浸漬し、１日目、７日目、１４日目、２９日目、及び６４日目において、５００μＬずつサンプリングし、アンモニウムイオンとリン酸イオン濃度を測定した。測定結果は図７に示す。実施例１〜５の試験片は、生分解性を有し、かつ、経時的に環境に窒素とリン素を徐放していたことが分かった。本発明の成形体が肥料などの植物の栄養源として、利用可能性が示唆された。
【０１０２】
（９）宿主細胞残渣成形体の曲げ強度試験
（６）と同じ作製方法で、断面が３５ｍｍ×２５ｍｍの長方形、厚みが１．７５ｍｍの宿主細胞残渣成形体（実施例６及び実施例７）を作成した。サンプルの加圧条件が７３ｋＮ（約５０ＭＰａ）であり、加熱温度（成形温度）はそれぞれ１３０℃（実施例６）及び１５０℃（実施例７）であった。
【０１０３】
実施例６及び７の宿主細胞残渣成形体を、オートグラフ（島津製作所株式会社製、ＡＧ−Ｘ）で籠治具を用いて、三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであった。この際、三点曲げの支点間距離を２７ｍｍに固定し、測定速度を１ｍｍ／分とした。また、モールド成形体のサイズをマイクロノギスで測定し、治具に設置し測定を行った。曲げ弾性率は０．０５〜０．２５％までの変位（ひずみ）から求めた。その結果を図８に示す。実施例６の最大応力は２４．０１ＭＰａであり、実施例７の最大応力は１８．５４ＭＰａであった。
【０１０４】
（１０）宿主細胞残渣成形体の透光度
実施例６及び実施例７の宿主細胞残渣成形体の透光度は、強い光源（ＬＥＤプッシュライト  ＤＯＰ−９０５Ｌ（エルパ［ＥＬＰＡ］朝日電器株式会社製））で観察した（図９）。実施例６と実施例７とを比較すると、加熱温度が低い場合、透光度が高い。同時に、分光測色計ＣＭ−５（コニカミノルタ株式会社）を利用し、波長３６０ｎｍから７４０ｎｍ（可視域）の反射率を測定した。測定を二回繰り返しし、それぞれ実施例６−１及び実施例６−２、実施例７−１及び実施例７−２として記録した。その結果を図１０に示す。実施例６の宿主細胞残渣成形体は、可視域の中央部での反射はほぼないため、実施例７と比べて、実施例６の宿主細胞残渣成形体が光を通りやすい性質を有すると認められた。
【０１０５】
（１１）宿主細胞残渣成形体（糸）の作製
上記で得られた試験例１の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を用いて、ドープ液（紡糸原液）を作成した。凍結乾燥粉末の濃度が２０質量％（湿式紡糸）、２４質量％（乾式紡糸）になるように、凍結乾燥粉末にギ酸を添加した。ローテーターで１４時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。これをドープ液（紡糸原液）とした。
【０１０６】
公知の図１１に示す紡糸装置を使用し、エアポンプでドープ液（ドープ液中のタンパク質濃度：２０質量％）を、凝固液（メタノール）へ吐出させた。湿式紡糸条件は下記に示すとおりとした。これにより、宿主細胞残渣成形体として、宿主細胞残渣繊維（残渣繊維）を得た（図１２）。
湿式紡糸条件
ドープ液温度：２５℃
ホットローラー（ＨＲ）温度：６０℃
延伸倍率：２（実施例８）、３倍（実施例９）
【０１０７】
公知の図１１に示す紡糸装置を使用し、エアポンプでドープ液（ドープ液中のタンパク質濃度：２８質量％）を、空中に吐出させた（凝固液なし）。乾式紡糸条件は下記に示すとおりとした。これにより、宿主細胞残渣成形体として、実施例１０の宿主細胞残渣繊維（残渣繊維）を得た（図１３）。
乾式紡糸条件
ドープ液温度：２５℃
ホットローラー（ＨＲ）温度：６０℃
延伸倍率：１（実施例１０）
【０１０８】
＜製造例２＞
（１）目的タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、不溶性タンパク質である組換えフィブロイン（ＰＲＴ７９９）を設計した。同様に、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列）を付加して、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有し、可溶性タンパク質である組換えインターフェロンγ（以下、「ＰＲＴ６６２」ともいう。）、及び、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、不溶性タンパク質である組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ６４３」ともいう。）を設計した。次に、ＰＲＴ７９９、ＰＲＴ６６２及びＰＲＴ６４３をコードする遺伝子をそれぞれ合成委託し、製造例１の（１）と同様にタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組み換えた。
【０１０９】
（２）目的タンパク質の発現
上記で得られたＰＲＴ７９９、ＰＲＴ６６２又はＰＲＴ６４３をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。製造例１の（２）と同様に培養し、シード培養液を得た。さらに、得られたそれぞれのシード培養液を製造例１の（２）と同様に維持培養し、さらに発現誘導し、目的とするタンパク質の発現を確認した。
【０１１０】
（３）目的タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）を用いて菌体を繰り返し破砕した。破砕した細胞を遠心分離機（クボタ社製の「Ｍｏｄｅｌ７０００」）で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、又は、界面活性剤である３ｗ／ｖ％ＳＤＳで洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
【０１１１】
（４）目的タンパク質を発現した宿主細胞残渣の抽出及び再精製
（ａ）洗浄廃液から得られた宿主細胞残渣
ＰＲＴ６４３をコードする遺伝子で形質転換された大腸菌について、上記の破砕した細胞沈殿物（ＰＲＴ６４３を含むの沈殿物）を洗浄する際、３％界面活性剤を用いた。洗浄した細胞を遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）により、廃棄遠心上清を得た。この洗浄廃棄遠心上清を８０℃で２時間不活化処理し、さらに同体積のクリンソルブＰ−７（日本アルコール販売（株））を加えて、一日放置し、タンパク質を含めた沈殿物を得た（図１４）。その後遠心分離機を用いて、室温で１１，０００ｇ、１０分遠心分離し、凝集タンパク質を含む沈殿物を回収した。次にイオン交換水を用いて沈殿物を洗浄し、遠心分離し沈殿物を回収する洗浄工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、試験例２（ＰＲＴ６４３）の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１２】
（ｂ）細胞破砕液の遠心上清から得られた宿主細胞残渣
ＰＲＴ６６２、ＰＲＴ７９９に組み換えられた宿主細胞について、上記の高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓａｏｖｉ社製の「Ｐａｎｄａ  Ｐｌｕｓ  ２０００」）で細胞を破砕し、目的タンパク質が沈殿するよう、遠心分離機（クボタ社製の「Ｍｏｄｅｌ７０００」）を用いて、室温で１１，０００ｇ、１０分遠心分離し、宿主細胞残渣を含む遠心上清を回収した。得られた遠心上清を８０℃で２時間不活化処理し、宿主細胞残渣が固形分として沈殿した（図１）。固形分を、室温で１１，０００ｇ、１０分で遠心分離によって回収し、イオン交換水に再懸濁し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨが７前後となるように中和し、室温で２時間スターラーで撹拌した。その後遠心分離し、固形分をイオン交換水に再懸濁し、３Ｍクエン酸を用いて、ｐＨ３．５に調整し、固形分中のタンパク質を凝集させ、遠心分離機を用いて、室温で１１，０００ｇ、１０分遠心分離し、凝集タンパク質を含む沈殿物を回収した。次にイオン交換水を用いて沈殿物を洗浄し、遠心分離し沈殿物を回収する洗浄工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、試験例３（ＰＲＴ６６２）の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末、及び試験例４（ＰＲＴ７９９）の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１３】
（５）宿主細胞残渣の定性及び定量分析
得られた試験例２〜４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末におけるタンパク質の濃度をＢＣＡ法にて測定した。なお、ＢＣＡ法によるタンパク質の測定には、タカラバイオ社製のＰｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた。測定した結果、試験例２の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は約６１．５±１．５質量％のタンパク質、試験例３の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は約５７．２±５．０質量％のタンパク質を、試験例４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は約８１．５±３．７質量％のタンパク質を含んでいた。
【０１１４】
同時に、試験例２〜４の凍結乾燥粉末に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。Ｏｒｉｏｌｅ染色によりタンパク質の存在を確認し、解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（Ｂｉｏ  −  ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて画像解析することにより、メインバンドは約３９ｋＤａのタンパク質であることを確認した（図１５：試験例２、図１６：試験例３、図１７：試験例４）。文献（例えば、Ｍｅｕｓｋｅｎｓ，  Ｉ．ら、Ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，４６４（２０１７））によれば、宿主細胞残渣の主成分である約３９ｋＤａのタンパク質は、分子量約３９ｋＤａのＯｍｐＦ  （Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆ）及びＯｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）の膜タンパク質であると推測される。他の可能の膜タンパク質、例えばＬａｍＢ（＜４９ｋＤａ）、ＯｍｐＡ（＜３５ｋＤａ）なども推測される。一方で、宿主細胞残渣の他の成分である、分子量約４〜３０ｋＤａのタンパク質は、宿主細胞のリボソームタンパク質であると推測される。
【０１１５】
試験例２〜４の宿主細胞残渣に含まれるタンパク質の組成と分布を確認するため、解析ソフ卜Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂを用いて分子量分布の解析を行った。その結果を図１８に示す。図１８の（ａ）は試験例２、（ｂ）は試験例３、（ｃ）は試験例４の宿主細胞残渣の分子量分布百分率と発光強度の結果を示す。図１８から、試験例２の中、約３９ｋＤａのタンパク質（ＯｍｐＦ／ＯｍｐＣ）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約３８質量％を占める一方で、分子量約４〜３０ｋＤａのタンパク質（リボソームタンパク質）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約５６質量％であったこと、並びに、目的タンパク質は宿主細胞残渣における全タンパク質の２質量％以下であったことが確認された。試験例３の中、約３９ｋＤａのタンパク質（ＯｍｐＦ／ＯｍｐＣ）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約７５質量％を占める一方で、分子量約４〜３０ｋＤａのタンパク質（リボソームタンパク質）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約１９質量％であったこと、並びに、目的タンパク質は宿主細胞残渣における全タンパク質の１質量％以下であったことが確認された。試験例４の中、約３９ｋＤａのタンパク質（ＯｍｐＦ／ＯｍｐＣ）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約３５質量％を占める一方で、分子量約４〜３０ｋＤａのタンパク質（リボソームタンパク質）は、宿主細胞残渣における全タンパク質の約５７質量％であったこと、並びに、目的タンパク質は宿主細胞残渣における全タンパク質の１質量％以下であったことが確認された。
【０１１６】
上記測定した試験例２〜４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末の組成を表４にまとめた。
【表４】
2020124187.tif 000005
【０１１７】
（６）宿主細胞残渣成形体の製造及び評価
（ａ）宿主細胞残渣成形体の製造方法
上記で得られた試験例２〜４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末を０．７ｇ秤量し、サンプルとした。サンプルを、厚みが均等になるように加圧成形機の金型の貫通孔内に導入した。使用された金型は、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する円柱形状の金型であった。サンプルを貫通孔内に導入した後、金型の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（商品名：ＮＴ−１００  Ｈ−Ｖ０９、ＮＰａシステム株式会社製）を用いて、上側ピンと下側ピンを貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が４５ｋＮ（約３１ＭＰａ）となるように制御した。サンプルの温度が図１９に示す成形温度になった時点で加熱を中止し、スポットクーラー（商品名：ＴＳ−２５ＥＰ−１、トラスコ中山株式会社製）で、アニール時間が５分で３０℃まで冷却した。サンプルを取り出し、バリ取りを行い、３５ｍｍ×１５ｍｍ×１ｍｍの直方体形状の実施例１１−１、実施例１２−１〜１２−３、実施例１３−１〜１３−３の宿主細胞残渣成形体を得た（図１９）。
【０１１８】
（ｂ）成形温度と樹脂化程度及び透光度との関係
上記得られた宿主細胞残渣成形体の写真、外見考察及び樹脂化程度の評価は図１９に示す。なお、樹脂化程度の評価基準は以下のとおりである。
Ａ：均一
Ｂ：小さい粉状の塊がある
Ｃ：大きい粉状の塊がある
Ｄ：大きい粉状の塊が複数ある
【０１１９】
図１９から、同じ加熱成形温度と外部圧力の実験条件で、実施例１１−１の宿主細胞残渣成形体は照明の中央部での反射はほぼないため、実施例１２−１と比べて、実施例１１−１の宿主細胞残渣成形体が光を通りやすい性質を有すると認められた。実施例１２−１、１２−２と１２−３を比較すると、成形温度が高い場合、樹脂化程度が向上する一方で、透光度が低下することが認められた。実施例１２−１、１２−２と１２−３を比較すると、成形温度が低い場合、透光度が高いことが認められた。
【０１２０】
試験例２の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は不溶性の細胞遠心沈殿物の洗浄廃液から得られた宿主細胞残渣であり、一方で試験例４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は細胞破砕液の可溶性遠心上清から得られた宿主細胞残渣である。この二つ凍結乾燥粉末はタンパク質含有率、タンパク質以外の残留物質（脂質、糖類、塩基など）の含有率が異なり、これらの含有率の相違によって、完全樹脂化のための最低成形温度及び透光度の相違がもたらされたことが示唆された。本発明の宿主細胞残渣成形体の最低成形温度、すなわち１３０℃、公知文献（例えば、ＷＯ２０１７／０４７５０４）の一般的なタンパク質成形体の成形温度と比べて、低いことが分かった。宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末の添加によると、タンパク質成形体の成形温度を下げられることが示唆された。
【０１２１】
試験例３の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末は細胞破砕液の可溶性遠心上清から得られた宿主細胞残渣であるものの、同じ抽出・精製方法によって得られた試験例４の宿主細胞残渣に比べて、タンパク質の分子量分布及び組成が異なることが分かった。３０ｋＤａ以下の分子量のタンパク質（例えばリボソームタンパク質）が少ない場合、宿主細胞残渣成形体の完全樹脂化のための最低成形温度もしくは外部圧力は高くなることが示唆された。一方で、目的タンパク質の分子量、疎水度なども宿主細胞残渣の組成に影響を与えることが示唆された。
【０１２２】
（７）木屑残渣複合成形体の製造及び評価
（ａ）基材と宿主細胞残渣との混合割合及び成形温度の検討
基材の木屑は一般用ミキサー（岩谷産業ミルサー８００ＤＧ  ＩＦＭ−８００ＤＧ）を用いて、５ｍｍ×５ｍｍ×１ｃｍのヒノキの工作材を破砕することによって準備した。準備した木屑と試験例４の宿主細胞残渣の凍結乾燥粉末とを、図２０に示す混合割合にしたがって混ぜ合わせ、（６）の（ａ）の製造方法に従って、１３０℃又は１５０℃の成形温度で、比較例１−１及び比較例１−２の木屑基材圧縮成形体、並びに、実施例１４−１、１４−２、１５−１及び１５−２の木屑残渣複合成形体を作製した。得られた成形体の写真及び外見考察は図２０に示す。
【０１２３】
（ｂ）基材と宿主細胞残渣との混合割合による曲げ強度に対する影響
上記（ａ）の製造方法にしたがって、外部加圧条件が７３ｋＮ（約５０ＭＰａ）、成形温度が１３０℃で、３５ｍｍ×２５ｍｍ×１．７５ｍｍの直方体形状の成形体を作製した。成形体における木屑／宿主細胞残渣の割合比率は、それぞれ１００／０（比較例１−３）、８０／２０（実施例１４−３）、５０／５０（実施例１５−３）、０／１００（実施例１３−４）であった。
【０１２４】
得られた成形体を、オートグラフ（島津製作所株式会社製、ＡＧ−Ｘ）で籠治具を用いて、三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであった。この際、三点曲げの支点間距離を２７ｍｍに固定し、測定速度を１ｍｍ／分とした。また、モールド成形体のサイズをマイクロノギスで測定し、治具に設置し測定を行った。曲げ弾性率は０．０５〜０．２５％までの変位（ひずも）から求めた。その結果を図２１に示す。実施例１３−４の宿主細胞残渣成形体の曲げ強度は１単位として、実施例１４−３の最大応力は１．４３単位であり、実施例１５−３の最大応力は１．６６単位であった。比較例１−３の木屑基材圧縮成形体の最大応力は１．３７単位であった。曲げ試験後の破壊程度及び表面の外観考察は図２２に示す。
【符号の説明】
【０１２５】
１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、５…巻糸体、６…ドープ液、７…貯槽、８…ギアポンプ、９…口金、１０…紡糸装置、１１…凝固液、１２…温水、１３…供給ニップローラ、１４…引き取りニップローラ、１９…エアギャップ、２０…凝固浴槽、２１…延伸浴槽、３６…宿主残渣繊維。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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