(57)【要約】【課題】培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる培養装置及び培養方法を提供する。【解決手段】培養装置１００は、培養液中で細胞を培養するための培養槽１と、培養液を攪拌するための攪拌機２と、培養槽１内に新鮮培地を補充する補充装置（５，７）とを備え、培養槽１内の下部空間１１０は、上部空間１２０よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である。培養方法は、培養槽１内の下部空間１１０において培養液中で細胞を静置培養し、静置培養の後に、培養槽１内に新鮮培地を補充し、新鮮培地の補充により増量した培養液中で細胞を攪拌培養するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中で細胞を培養するための培養槽と、
前記培養液を攪拌するための攪拌機と、
前記培養槽内に新鮮培地を補充する補充装置と、を備え、
前記培養槽内の下部空間は、上部空間よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記培養槽内の下部空間は、前記下部空間に入れた前記培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］としたとき、次の数式（Ｉ）；
Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］  ・・・（Ｉ）
の関係を満たす形状である培養装置。
【請求項３】
請求項２に記載の培養装置であって、
前記培養槽内の下部空間は、錐体形状であり、
前記下部空間に入れた前記培養液の高さが、３／８ｃｍより大きい培養装置。
【請求項４】
請求項２に記載の培養装置であって、
前記培養槽内の下部空間は、柱体形状であり、
前記下部空間に入れた前記培養液の高さが、１／８ｃｍより大きい培養装置。
【請求項５】
請求項２に記載の培養装置であって、
前記培養槽内の下部空間は、球欠形状であり、
前記下部空間に入れた前記培養液の高さｈ［ｃｍ］が、前記下部空間に入れた前記培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］、前記球欠形状の半径をｒ［ｃｍ］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の半径をｃ［ｃｍ］としたとき、次の数式（Ｉ）、（II）及び（III）；
Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］  ・・・（Ｉ）
Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６  ・・・（II）
Ｓ＝π・ｈ（２ｒ−ｈ）  ・・・（III）
の関係を満たす培養装置。
【請求項６】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記攪拌機は、攪拌翼と、前記攪拌翼を回転させる回転軸と、を有し、
前記攪拌翼は、前記培養槽内の上部空間に位置し、
前記回転軸は、前記培養槽の上方から前記攪拌翼を支持している培養装置。
【請求項７】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記攪拌機は、攪拌翼と、前記攪拌翼を回転させる回転軸と、を有し、
前記攪拌翼は、前記培養槽内の上部空間に位置し、
前記回転軸は、前記培養槽の中心軸から偏心した前記培養槽の下方から前記攪拌翼を支持している培養装置。
【請求項８】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記攪拌機は、前記培養槽を支持する振盪台と、前記振盪台の振盪運動を駆動する回転部材と、前記回転部材の回転運動を前記振盪運動に変換する変換部材と、を有し、
前記振盪台に支持される前記培養槽の中心軸は、前記回転部材の中心軸から偏心している培養装置。
【請求項９】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記培養槽内から前記培養液及び前記細胞を引き抜くための引抜管と、
前記培養槽内から引き抜かれた前記培養液と前記細胞とを互いに分離する細胞分離装置と、
前記培養液から分離された前記細胞を前記培養槽内に戻すための返送管と、を備える培養装置。
【請求項１０】
培養槽内の下部空間において培養液中で細胞を静置培養し、
前記静置培養の後に、前記培養槽内に新鮮培地を補充し、
前記新鮮培地の補充により増量した培養液中で前記細胞を攪拌培養する培養方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記静置培養において、前記培養槽内の気相部のガス濃度を一定に制御する培養方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記攪拌培養において、前記培養槽内の上部空間に位置する攪拌翼により前記培養液を攪拌する培養方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記静置培養及び前記攪拌培養のうち少なくとも一方において、前記培養槽内の培養液量を新鮮培地の補充により拡大し、培養液量が互いに異なる培養を行う培養方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記静置培養及び前記攪拌培養のうち少なくとも一方において、前記培養槽内から前記培養液及び前記細胞を引き抜く共に、前記培養槽内に培養液を補充し、引き抜かれた前記培養液と前記細胞とを互いに分離し、分離された前記細胞を前記培養槽内に戻す灌流培養を行う培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の拡大培養に適した培養装置及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬をはじめとするバイオ医薬品は、細胞を培養し、細胞が産生した物質を夾雑物から分離・精製することによって製造されている。目的の物質を産生する細胞は、物質の生産に適した細胞数となるまで拡大培養された後、大スケールの培養液を用いる生産培養に供されている。一般に、抗体医薬等の生産には、ＣＨＯ細胞等を用いる浮遊細胞系が利用されている。
【０００３】
図１７は、従来の拡大培養の流れについて説明する図である。
図１７に示すように、従来一般的な拡大培養は、培養液の容量を、数ｍＬの小スケールから数千Ｌの大スケールまで、段階的に増やすことによって行われている。細胞は培養液中で増殖しながら目的の物質を産生し、最終的に、数千Ｌまで拡大された培養液中で目的の物質を大量生産している。
【０００４】
通常の回分培養では、細胞が増殖して培養液中の細胞密度が高くなると、栄養の枯渇や、細胞が分泌した老廃物の蓄積が原因で、細胞が死滅し易くなる。回分培養を続けると、増殖による細胞数の増加と死滅による細胞数の減少とが釣り合う状態になるため、培養液中の細胞密度が頭打ちになり、物質の生産に適した細胞数に増殖させるのが困難になる。
【０００５】
その一方で、培養スケールを段階的に拡大していく拡大培養によると、細胞を培養している培養液に、スケールアップ毎に新鮮培地を補充するため、栄養が補給されるし、分泌された老廃物が希釈される。拡大培養では、細胞が増殖し易い状態で培養スケールが拡大されていくため、培養液中の細胞密度が頭打ちになり難く、物質の生産に適した大量の細胞を得ることができる。
【０００６】
図１７に示すように、一般的な物質生産プロセスは、安全キャビネット中で手作業で培養操作を行う段階Ａと、バイオリアクタを利用して半自動的に培養操作を行う段階Ｂと、細胞に目的の物質を生産させる生産培養の段階Ｃとによって構成される。一般に、手作業による段階Ａや、半自動化された段階Ｂでは、それぞれ、複数回のスケールアップが行われている。
【０００７】
培養スケールを拡大する倍率は、複数回のスケールアップを通して、一定の倍率とするのが一般的である。培養スケールを拡大する倍率は、通常、５〜１０倍程度に設定されている。新鮮培地の補充によって細胞密度が低下し過ぎると、スケールアップ後の培養効率が悪くなるため、ある程度以上の細胞密度が保たれる倍率が設定される。
【０００８】
図１７に示すように、培養液量が数ｍＬから数百ｍＬ程度である拡大培養の初期には、培養容器を用いた小スケールの静置培養が行われている。培養容器としては、図に示すフラスコ５３の他に、ディッシュ、ボトル、ウェルプレート等も用いられている。バイアル５２等に用意された種細胞は、種々の大きさや種々の形状の培養容器に移し替えられて継代される。培養液量が数百ｍＬ程度に達すると、スピナーフラスコ５４を用いた攪拌培養や振盪培養が行われることもある。
【０００９】
一般に、フラスコ５３やスピナーフラスコ５４を用いた初期の拡大培養は、一定の培養温度、一定のガス濃度に制御されたインキュベータ内で行われている。ガス交換可能なキャップ、シリコ栓等を用いた培養容器が、庫内雰囲気が一定に制御されたインキュベータ内に静置されて、容器内の培養環境が調整されている。培養スケールを拡大する際には、安全キャビネット中で手作業による培養液の移し替えが行われている。
【００１０】
また、図１７に示すように、培養液の容量が数Ｌ程度に達した拡大培養の後期には、バイオリアクタ５５を用いた大スケールの攪拌培養が行われている。種々の容量のバイオリアクタ５５が用意され、バイオリアクタ５５同士は、鋼管、チューブ等で構成される輸送系で互いに接続されている。
【００１１】
一般に、バイオリアクタ５５を用いた後期の拡大培養は、培養温度やガス濃度が可変的に制御される培養環境で行われている。バイオリアクタ５５内の培養液は、強制的な通気下で、溶存酸素濃度や、二酸化炭素濃度が制御され、３７℃付近の培養温度に維持されている。培養スケールを拡大する際には、自動による培養液の移し替えが、鋼管、チューブ等で構成される輸送系によって無菌的に行われている。
【００１２】
従来、培養スケールを段階的に拡大していく拡大培養に関して、培養液の移し替えに伴う問題への対策が検討されている。拡大培養時には、培養液の移し替えを手作業で行う必要があるため、作業の煩雑性の問題がある。また、培養液の移し替え中に、細胞にせん断力、圧力等が加わるため、細胞にダメージが加わる問題がある。また、安全キャビネット等の半開放的な空間で作業を行うため、コンタミネーションの問題がある。これらの問題を解消するために、培養液の移し替えを不要化する技術が提案されている。
【００１３】
特許文献１には、可撓性材料からなる容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切り、区画毎に細胞を培養した後に、区画を解消する細胞培養方法が記載されている。特許文献１では、可撓性材料からなる容器に生じさせた隆起を解消することにより、養生培養から拡大培養への移行を実現している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２０１６−１４０２９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞の拡大培養時には、特許文献１に記載されるような、培養液の移し替え作業の煩雑性に関する課題、細胞にダメージを与えないような培養液及び細胞の取り扱いに関する課題、培養液の移し替え時等のコンタミネーションに関する課題に加え、拡大培養の再現性に関する課題や、拡大培養に用いる設備上の課題もある。
【００１６】
例えば、手作業が必要な初期の拡大培養では、作業者の手技の違いにより、作業毎に、播種される細胞数や、移し替えられる細胞数が変わる。そのため、目的の物質の生産量や、目的の物質の純度、タンパクの非変性度をはじめとする生産物の品質に関して、ばらつきを生じることが問題となる。また、手作業が必要なため、安全キャビネット等の付帯設備が必要であり、封じ込めのための培養施設が大型化してしまう問題もある。
【００１７】
また、バイオリアクタを用いる後期の拡大培養では、培養スケール毎に、個別のバイオリアクタが必要になる。そのため、多数のバイオリアクタを設置する場所が必要になるという問題がある。バイオリアクタ同士を、鋼管、チューブ等で互いに接続する場合、これらを敷設する空間や、配管作業が必要になるし、配管中で、細胞が損傷したり、細胞が死滅したりするリスクが生じる。
【００１８】
一般に、浮遊細胞を培養対象とし、大スケールを最終目標として拡大培養を行う場合には、拡大培養の初期に、機械的ストレスが少ない静置培養を行い、培養スケールがある程度拡大した拡大培養の後期に、ガス交換効率や物質拡散に有利な攪拌培養を行うことが好ましい。そのため、拡大培養中には、培養液の移し替えだけでなく、培養方式の切り替えも望まれる。細胞の比増殖速度や生存率を高く保って良好な培養効率を維持しつつ、培養液量や培養方式を変えることができる技術が求められている。
【００１９】
そこで、本発明は、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる培養装置及び培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、鋭意研究した結果、培養槽の内部空間の形状・構造を適正化することにより、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、細胞の比増殖速度や生存率を大きく低下させることなく、一つの培養槽で段階的に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、前記課題を解決するために本発明に係る培養装置は、培養液中で細胞を培養するための培養槽と、前記培養液を攪拌するための攪拌機と、前記培養槽内に新鮮培地を補充する補充装置と、を備え、前記培養槽内の下部空間は、上部空間よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である。
【００２２】
また、本発明に係る培養方法は、培養槽内の下部空間において培養液中で細胞を静置培養し、前記静置培養の後に、前記培養槽内に新鮮培地を補充し、前記新鮮培地の補充により増量した培養液中で前記細胞を攪拌培養する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る培養装置及び培養方法は、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
【図２】培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
【図３】培養液の液面面積−体積比と細胞の生存率との関係を示す図である。
【図４】培養液の液面面積−体積比と細胞の増殖量との関係を示す図である。
【図５】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図６】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図７】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図８】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図９】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図１０】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図１１】培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
【図１２】培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
【図１３】培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
【図１４】本発明の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
【図１６】培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
【図１７】従来の拡大培養の流れについて説明する図である。
【図１８】単一の培養槽で拡大培養を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
＜培養装置（回分培養式）＞
はじめに、本発明の一実施形態に係る培養装置について、図を参照しながら説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
【００２６】
図１は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
図１に示すように、本実施形態に係る培養装置１００は、培養槽１と、攪拌機２と、散気装置３と、温度調節装置４と、培地タンク５と、バルブ６と、供給ポンプ７と、分析装置８と、制御装置９と、回収タンク１０と、供給管２０と、排出管２１と、を備えている。
【００２７】
培養装置１００は、細胞を拡大培養するための装置であり、拡大培養中の培養槽１に新鮮培地（培養液）を補充して培養スケールを拡大する機能を有している。培養装置１００では、培養槽１に新鮮培地を補充することにより、培養スケールが段階的に拡大されて、多段階の培養工程が行われる。図１に示す培養装置１００は、それぞれの培養工程を、培養中に培地を供給しない回分培養の形式で行う形態とされている。
【００２８】
培養装置１００では、培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替えることができる。そのため、大スケールを最終目標とした回分培養式の拡大培養を、単一の培養槽１で行うことができる。培養槽１としては、このような拡大培養の効率化のため、内部空間の形状・構造が適正化されたものを用いる。
【００２９】
培養装置１００で培養する細胞としては、特に制限されるものではないが、浮遊細胞に馴化された細胞や、接着性が低い細胞が好ましく用いられる。培養する細胞としては、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体等の各種のモノクローナル抗体や、各種の生理活性物質や、その他、医薬品原料、化学原料、食品原料等として有用な各種の有用物質を産生する細胞が好ましい。
【００３０】
培養する細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）、マウス骨髄腫細胞、その他の血球細胞等の動物細胞が挙げられる。但し、培養する細胞は、動物細胞に制限されるものではなく、昆虫細胞、植物細胞、微細藻類、ラン藻類、細菌、酵母、真菌、藻類、酵母等であってもよい。
【００３１】
培養槽１は、培養液中で細胞を培養するための槽であり、培養液を入れる空間が密閉される密閉型リアクタとされる。培養槽１は、ステンレス鋼、アルミニウム合金、プラスチック、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。或いは、培養槽１は、シングルユース式の可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、例えば、エチレンビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、低密度ポリエチレン、ポリアミド等の樹脂製の多層フィルムを用いて形成することができる。
【００３２】
図１に示すように、培養槽１には、培養液を攪拌するための攪拌機２や、培養液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気するための散気装置３が、槽内に備えられる。散気装置３としては、リングスパージャ、マイクロスパージャ、焼結金属スパージャ、膜スパージャ、散気管等の各種の機器をガス供給装置に接続して用いることができる。培養槽１は、培養液に通気する散気装置３に加え、気相部に所定のガスを通気する不図示の散気装置を備えることもできる。
【００３３】
また、培養槽１には、槽内の温度を調節するための温度調節装置４が、周囲に備えられる。温度調節装置４としては、例えば、ウォータージャケット、エアージャケット、電熱ヒータ等の適宜の装置を用いることができる。
【００３４】
培養槽１は、槽内の培養条件や細胞の培養状態をオンラインで測定するために、不図示のセンサを備えることができる。センサとしては、例えば、熱電対等の温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ、静電容量計や吸光光度計等を用いたセルカウンタ、液面レベルセンサ等を備えることができる。センサが測定したデータは、分析装置８に出力することができる。また、培養槽１は、槽内の培養条件や細胞の培養状態をオフラインで測定するために、培養液の採取に用いるサンプリングポートを備えることができる。
【００３５】
図１に示すように、培養槽１には、槽内に新鮮培地を補充する補充装置（５，７）が備えられる。培養槽１には、培養槽１内に新鮮培地を供給するための供給管２０が接続される。供給管２０の他端には、補充装置を構成する培地タンク５が接続される。また、供給管２０には、補充装置を構成する供給ポンプ７が備えられる。
【００３６】
培地タンク５は、用意された滅菌済みの新鮮培地を、培養スケールを拡大する新鮮培地の補充時まで無菌的に貯留する。培養装置１００には、複数の培地タンク５を備えることができる。個々の培地タンク５には、供給管２０の管路を開閉するバルブ６が備えられる。
【００３７】
供給ポンプ７は、培地タンク５から培養槽１に向けて新鮮培地を供給するために備えられる。培養スケールを拡大する際には、複数のバルブ６のうち、一部のみを開放して、培養槽１内に新鮮培地を補充することができる。一部の培地タンク５のみを、順次用いることにより、新鮮培地の補充に伴うコンタミネーションのリスクを最小限に抑えることができる。
【００３８】
分析装置８は、培養槽１内で培養されている細胞の状態や培養槽１内の培養液の状態を分析するために備えられる。分析する項目としては、細胞の増殖と相関を有する状態量、培養液成分の濃度、浸透圧等が挙げられる。細胞の増殖と相関を有する状態量や、培養液成分の濃度を分析することにより、細胞の増殖状態を判定することができる。すなわち、或る培養スケールにおいて細胞が十分に増殖したかどうか、培養工程の進捗を判定することができる。
【００３９】
細胞の増殖と相関を有する状態量としては、細胞数密度、比増殖速度、生存率、細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度等）、細胞の累積代謝量（目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量等）、細胞周期（細胞集団中でＧ２期及びＭ期にある細胞の割合）等が挙げられる。また、培養液成分の濃度としては、グルコース、グルタミン、乳酸、アンモニア、アミノ酸、ビタミン類、代謝生成物、成長因子、血清成分等の濃度が挙げられる。
【００４０】
細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞数密度、比増殖速度、生存率は、細胞数を測定することによって求めることができる。細胞数は、血球計算盤等を用いた顕微鏡観察、乾燥重量法、濁度法、静電容量法や、酸化型ＮＡＤ＋や還元型ＮＡＤＨを定量するＮＡＤ測定や、フローサイトメトリー等の各種の測定法を用いて測定することができる。また、生細胞数や死細胞数は、トリパンブルー染色法による判別を利用して計数することができる。比増殖速度は、生細胞数の経時変化を測定して求めることができる。
【００４１】
また、細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度等）や、細胞の累積代謝量（目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量等）は、事前に実際の培養試験を行うことにより、次の方法で求めることができる。
【００４２】
目的物質の代謝生産速度は、産生される目的物質の濃度の経時変化を測定し、単位時間当たり、単位細胞数当たりの生産量に換算して求めることができる。目的物質の濃度は、例えば、目的物質がタンパクである場合、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法により定量することができる。測定対象のタンパクと抗原抗体反応を生じる抗体を使用し、標識の蛍光分析、酵素活性分析等を行う。ＥＬＩＳＡ法としては、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法等のいずれを用いてもよい。
【００４３】
栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度は、培養槽内の濃度の経時変化を測定し、単位時間当たり、単位細胞数当たりの変化量に換算して求めることができる。栄養素の濃度や老廃物の濃度は、高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography：ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィ質量分析（Liquid Chromatography-Mass spectrometry：ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィ質量分析（Gas Chromatography-Mass spectrometry：ＧＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィタンデム質量分析（ＧＣ／ＭＳ−ＭＳ）等に、細胞を除いた培養液を供して定量することができる。
【００４４】
目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量は、求めた代謝速度を時間積分する方法や、累積量を実測する方法で求めることができる。細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度）は、事前に実際の培養試験を行い、細胞内代謝フラックスを解析して求めることもできる。
【００４５】
また、細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞周期は、ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide：ＰＩ）染色法による判別を利用し、フローサイトメトリーを行うことによって求めることができる。
【００４６】
Ｇ２期やＭ期の細胞は、細胞分裂を開始しようとしている一方で、Ｇ１期やＧ０期の細胞は、細胞分裂までに時間があり、Ｇ０期は不定の長さである。細胞周期がＧ２期やＭ期にある細胞の割合が高い状態は、培養されている細胞の多くが細胞分裂を開始しようとしている状態であり、細胞が増殖し易い状態であるといえる。一方、細胞周期がＧ１期やＧ０期にある細胞の割合が高い状態は、培養されている細胞の多くが間期にある状態であり、細胞の増殖が抑制される状態であるといえる。
【００４７】
フローサイトメトリーで蛍光検出を行い、度数分布上の各曲線の積分面積を計算すると、Ｇ２期やＭ期にある細胞の細胞数や割合を知ることができる。このような細胞の細胞数や割合を、培養工程の進捗を判定する指標とすると、細胞集団が増殖し易い状態を優先させながら、時間的に効率良く培養スケールを拡大していくことができる。
【００４８】
制御装置９は、細胞の培養条件や培養装置１００の運転を制御するために備えられる。制御装置９は、攪拌機２の作動、停止、回転出力や、散気装置３の作動、停止、通気量や、温度調節装置４の作動、停止、調節温度や、バルブ６の開閉や、供給ポンプ７の作動、停止、吐出出力等を、ＰＩＤ制御、比例制御、オン・オフ制御等の適宜の制御方式で制御する。
【００４９】
制御装置９には、細胞の培養条件の制御に必要なデータを、細胞の種類や拡大培養の目的等に応じて予め設定して記憶させることができる。また、培養装置１００の運転の制御のために、予め定めた培養スケジュールを設定することができる。培養スケジュールは、拡大培養中に、指定した回数のサイズアップや、指定した時期の培養方式の切り替えが行われるように、細胞の目標培養量、目的の物質の目標生産量等に応じて定めることができる。
【００５０】
培養槽１内の培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える運転は、制御装置９が、各機器を制御することにより行う。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、この分析データに基づいて、各培養スケールの培養工程が終了したか判定し、その判定結果にしたがって、新鮮培地の補充による培養スケールのサイズアップや、攪拌機２の起動による静置培養から攪拌培養への切り替えを実行する。
【００５１】
回収タンク１０は、培養された細胞や、細胞が産生した物質を、回収するために備えられる。培養槽１には、槽内で培養された細胞や細胞が産生した物質を排出するための排出管２１が接続される。排出管２１の他端には、回収タンク１０が接続される。回収タンク１０に回収された細胞は、より大スケールの生産培養に供することができる。或いは、細胞が産生した物質と共に分離精製処理に供し、目的の物質を夾雑物から分離・精製することができる。
【００５２】
ここで、培養槽１の内部空間の形状・構造について具体的に説明する。
【００５３】
図２は、培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
図２に示すように、培養装置１００に備えられる培養槽１は、内幅が高さ方向に一様でなく、槽内に、相対的に狭い内幅を有する下部空間１１０と、相対的に広い内幅を有する上部空間１２０と、を有している。図２に示す培養槽１では、下部空間１１０が、培養槽１の下方に向けて突出した錐体形状とされている。上部空間１２０は、内幅が高さ方向に一様とされているが、下部空間１１０は、上部空間１２０の下端よりも狭い内幅とされている。
【００５４】
培養槽１の下部空間１１０は、静置培養に用いられる。細胞を静置培養する培養工程において、培養槽１には、下部空間１１０内の所定の高さに液面がくるまで培養液が入れられる。下部空間１１０内における液面の高さは、図２にＩ線〜IV線で示すように、予め定めた培養スケジュールにしたがって、新鮮培地の補充により、段階的に切り上げていくことができる。
【００５５】
培養槽１の上部空間１２０は、攪拌培養に用いられる。細胞を攪拌培養する培養工程において、培養槽１には、上部空間１２０内の所定の高さに液面がくるまで培養液が入れられる。上部空間１２０内における液面の高さは、図２にＶ線〜VI線で示すように、予め定めた培養スケジュールにしたがって、新鮮培地の補充により、段階的に切り上げていくことができる。
【００５６】
図２に示すように、培養槽１には、機械攪拌式の攪拌機２を備えることができる。機械攪拌式の攪拌機２は、培養液を攪拌する攪拌翼２ａと、攪拌翼２ａを回転させる回転軸２ｂと、回転軸２ｂを回動させるモータ２ｃと、を備えている。攪拌翼２ａは、タービン翼、パドル翼、プロペラ翼、格子翼等の適宜の形状とすることができる。また、攪拌機２の翼段数、翼径、翼高さ等は、攪拌翼２ａが上部空間１２０に納まる限り、培養スケール等に応じて、適宜の条件にすることができる。
【００５７】
＜培養実験＞
ここで、培養槽１の内部空間の形状・構造と、細胞の培養効率との関係を、培養実験で確認した結果を示す。
【００５８】
細胞の培養においては、温度、溶存酸素濃度、その他ガス濃度等が環境因子として重要である。静置培養では、ガス交換が培養液と気相との界面を介してなされるため、細胞の培養効率は、培養液と気相との界面の面積Ｓや、培養液の体積Ｖに影響されると考えられる。このような予測の妥当性と、面積Ｓ・体積Ｖの適正範囲を調べるために、種々の培養条件で細胞を静置培養して、面積Ｓ・体積Ｖと細胞の生存率・細胞の増殖量との関係を調べた。
【００５９】
（実験方法）
供試細胞としては、浮遊細胞系であるＣＨＯ細胞を用いた。また、培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ培地）を用いた。培養容器としては、培養面の表面積が異なる２種類のフラスコ（Ｔ７５フラスコ，Ｔ２２５フラスコ）を用いた。
【００６０】
表１に示すように、２種類のフラスコのそれぞれに、培養液の液面面積Ｓ、及び、培養液量Ｖが種々の条件となるように液体培地を入れた。また、その培地に、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となるように供試細胞を播種した。そして、気相部のガス組成が大気中５％ＣＯ２、培養液の温度が３７℃、培養液の溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度に対して４０％となる培養条件に調整して、２日間にわたって静置培養した。
【００６１】
静置培養後、生死細胞オートアナライザ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ベックマン・コールター社製）を用いて生細胞数及び死細胞数を計数し、全細胞中の生細胞の割合（細胞の生存率）と、培養後の全生細胞数（細胞の増殖量）を求めた。
【００６２】
表１に、培養実験で使用した培養容器の種類、培養液の液面面積Ｓ（培養液と気相との界面の面積Ｓ）、培養液量Ｖ（培養液の体積Ｖ）、液面面積−体積比Ｓ／Ｖ（培養液と気相との界面の面積Ｓと、培養液の体積Ｖとの比Ｓ／Ｖ）を示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
（実験結果１）
図３は、培養液の液面面積−体積比と細胞の生存率との関係を示す図である。
図３において、横軸は、培養実験における培養液の液面面積−体積比Ｓ／Ｖ［ｃｍ−１］を示し、縦軸は、培養実験後に確認された細胞の生存率［％］を示す。●のプロットは、Ｔ７５フラスコを使用した培養実験の結果、▲のプロットは、Ｔ２２５フラスコを使用した培養実験の結果である。
【００６５】
図３に示すように、Ｔ７５フラスコを使用した場合、及び、Ｔ２２５フラスコを使用した場合のいずれにおいても、Ｓ／Ｖが小さいほど、細胞の生存率が高くなる傾向が確認された。培養容器の種類にかかわらず、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］の場合に、生存率が顕著に高くなり、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］の場合に、９０％を超える十分に高い生存率が得られた。
【００６６】
（実験結果２）
図４は、培養液の液面面積−体積比と細胞の増殖量との関係を示す図である。
図４において、横軸は、培養実験における培養液の液面面積−体積比Ｓ／Ｖ［ｃｍ−１］を示し、縦軸は、培養実験後に確認された生細胞数の相対値を示す。●のプロットは、Ｔ７５フラスコを使用した培養実験の結果、▲のプロットは、Ｔ２２５フラスコを使用した培養実験の結果である。
【００６７】
図４に示すように、Ｔ７５フラスコを使用した場合、及び、Ｔ２２５フラスコを使用した場合のいずれにおいても、Ｓ／Ｖが小さいほど、細胞の増殖量が多くなる傾向が確認された。培養容器の種類にかかわらず、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］の場合に、比増殖速度が高くなって生細胞数が増え易くなり、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］の場合に、最大の生細胞数が得られた。
【００６８】
これらの実験結果から、静置培養では、培養容器の大きさや形状にかかわらず、Ｓ／Ｖによって、培養成績が決まることが分かる。Ｓ／Ｖは、細胞の比増殖速度や生存率を高く保ち、良好な培養効率を実現する観点からは、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいといえる。
【００６９】
一般に、細胞の増殖は、高濃度の二酸化炭素によって阻害されることが知られている。通常の静置培養を続けた場合、培養液の二酸化炭素濃度が、気相部からの溶解や細胞の呼吸によって上昇するため、培養時間が経過するほど、細胞の増殖が阻害され易くなる。これに対し、Ｓ／Ｖが小さいと、二酸化炭素の気相部からの溶解や、二酸化炭素の培養液全体にわたる拡散に時間がかかる。そのため、細胞の比増殖速度が高くなると共に、対数期のピーク時に得られる生細胞数も多くなり、静置培養の培養効率が向上することになる。
【００７０】
したがって、培養槽１の下部空間１１０は、下部空間１１０に入れた培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、下部空間１１０に入れた培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］としたとき、液面面積−体積比Ｓ／Ｖが、次の数式（Ｉ）の関係を満たす形状であることが好ましい。
Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］  ・・・（Ｉ）
【００７１】
培養槽１の下部空間１１０が数式（Ｉ）の関係を満たす形状であると、培養槽１の大きさや形状にかかわらず、細胞の比増殖速度や生存率を高くすることができる。そのため、段階的にサイズアップさせる任意の培養スケールについて、静置培養の培養効率を向上させることができる。また、細胞の生存率が高くなり、培養液中に夾雑物が生じ難くなるため、細胞が産生した物質の分離精製効率や、生産物としての品質を向上させることができる。培養効率をより向上させる観点からは、より好ましくはＳ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］である。
【００７２】
＜培養槽の形状例＞
培養槽１の下部空間１１０は、上部空間１２０よりも狭い内幅を有し、培養槽１の下方に向けて突出した形状であれば、任意の形状に設けることができる。培養槽１の下部空間１１０は、数式（Ｉ）の関係を満たす形状であることが好ましいが、所定の培養液量を入れた状態のみで数式（Ｉ）の関係を満たす形状であってもよいし、任意の培養液量を入れた全ての状態で数式（Ｉ）の関係を満たす形状であってもよい。
【００７３】
培養槽１の下部空間１１０は、例えば、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が狭くなる形状に設けることができる。このような形状としては、例えば、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が段階的に狭くなる有段差形状や、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が連続的に狭くなるテーパ形状等が挙げられる。
【００７４】
図５、図６及び図７は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
図５、図６及び図７に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、錐体形状に設けることができる。図５は、逆円錐状の錐体形状を例示する図であり、図６は、逆四角錐状の錐体形状を例示する図であり、図７は、逆三角錐状の錐体形状を例示する図である。図５、図６及び図７において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示す。
【００７５】
下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝Ｓ・ｈ／３となり、培養液５０のＳ／Ｖは、３／ｈとなる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈは、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
【００７６】
下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、培養槽１の下部空間１１０は、培養液５０と同様にして、任意の高さにおける断面積ｓ［ｃｍ２］と、その高さよりも下側の体積ｖ［ｃｍ３］とが、ｓ／ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいといえる。よって、この条件の下で下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０の全高は、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
【００７７】
図８は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
図８に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、柱体形状に設けることもできる。図８は、直方体状の柱体形状を例示する図である。図８において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示す。
【００７８】
下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝Ｓ・ｈとなり、培養液５０のＳ／Ｖは、１／ｈとなる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈは、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
【００７９】
下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、培養槽１の下部空間１１０は、培養液５０と同様にして、任意の高さにおける断面積ｓ［ｃｍ２］と、その高さよりも下側の体積ｖ［ｃｍ３］とが、ｓ／ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいといえる。よって、この条件の下で下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０の全高は、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
【００８０】
図９は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
図９に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、部分球形状に設けることもできる。図９は、球欠形状を例示する図である。図９において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液５０を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｒは、球の半径を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示し、符号ｃは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の半径を示す。
【００８１】
下部空間１１０を球欠形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６となり、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積Ｓは、Ｓ＝π・ｈ（２ｒ−ｈ）となる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ−１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ−１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を球欠形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈ［ｃｍ］は、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積をＶ［ｃｍ３］、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］、球欠形状の半径をｒ［ｃｍ］、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の半径をｃ［ｃｍ］としたとき、前記の数式（Ｉ）に加え、次の数式（II）及び（III）の関係を満たすことが好ましい。
Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６  ・・・（II）
Ｓ＝π・ｈ（２ｒ−ｈ）  ・・・（III）
【００８２】
また、培養槽１の下部空間１１０は、錐体形状に設ける場合、図示した形状例の他に、逆五角錐状、逆六角錐状等のその他の多角錐状や、逆楕円錐状等に設けることもできる。また、これらの形状と実質的に同等な、角が丸い多角錐状や、辺が僅かに湾曲した多角錐状に設けることもできる。これらの形状については、培養液の高さや下部空間１１０の全高が、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましい。
【００８３】
また、培養槽１の下部空間１１０は、柱体形状に設ける場合、図示した形状例の他に、立方体状、三角柱状、五角柱状、六角柱状等のその他の多角柱状や、円柱状、楕円柱状等に設けることもできる。また、これらの形状と実質的に同等な、角が丸い多角柱状や、辺が僅かに湾曲した多角柱状に設けることもできる。これらの形状については、培養液の高さや下部空間１１０の全高が、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましい。
【００８４】
図１０及び図１１は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
図１０及び図１１に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、図示した錐体形状、柱体形状、球欠形状の他に、その他の不連続形状に設けることもできる。図８は、逆円錐の一部を切り欠いた逆円錐台状の不連続形状を例示する図である。図８は、互いに大きさが異なる直方体を組み合わせた多段凸状の不連続形状を例示する図である。
【００８５】
また、培養槽１の下部空間１１０は、その他、球の一部を平行な二面で切り欠いた球台形状や、逆多角錐、逆楕円錐等の一部を切り欠いた逆錐台状の不連続形状に設けることもできる。また、培養槽１の下部空間１１０は、互いに大きさが異なる多角柱、円柱、楕円柱、逆多角錐台、逆円錐台、逆楕円錐台、球台等を組み合わせた多段凸状の不連続形状に設けることもできる。
【００８６】
＜培養槽の構造例＞
培養槽１は、図２において、攪拌機２が上部側に配置された上部機械攪拌式とされている。上部機械攪拌式の攪拌機２は、全ての攪拌翼２ａが上部空間１２０に位置し、攪拌翼２ａの最下端が下部空間１１０よりも上方に位置するように設置されている。また、回転軸２ｂは、培養槽１の上方から攪拌翼２ａを支持している。回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸と平行であり、培養槽１の頂部の中央から上部空間１２０の中央に垂下し、攪拌翼２ａを上部空間１２０の中央の下部に固定している。
【００８７】
このような上部機械攪拌式の構造によると、下部空間１１０を用いる静置培養中、攪拌翼２ａや回転軸２ｂに、細胞が接着・凝集し難くなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。
【００８８】
但し、培養槽１は、図２に示すような上部機械攪拌式に代えて、その他の攪拌方式を適用することもできる。例えば、回転軸及びモータを備える機械攪拌式の他に、攪拌翼を磁力で回動させる磁力攪拌式とすることもできる。また、攪拌翼を備えない振盪攪拌式や、エアーフロー攪拌式とすることもできる。
【００８９】
図１２は、培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
図１２に示すように、培養槽１は、攪拌機２が下部側に配置された下部機械攪拌式とすることもできる。下部機械攪拌式の攪拌機２は、全ての攪拌翼２ａが上部空間１２０に位置し、攪拌翼２ａの最下端が下部空間１１０よりも上方に位置するように設置されている。一方、回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸から偏心した培養槽１の下方から攪拌翼２ａを支持している。回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸に対して傾斜しており、培養槽１の底部の中央から離隔した外側から下部空間１１０を貫通して上部空間１２０の中央側に延び、攪拌翼２ａを上部空間１２０の中央付近の下部に固定している。
【００９０】
このような下部機械攪拌式の構造によると、モータ２ｃを上部に固定しなくとも、下部空間１１０を用いる静置培養中に、攪拌翼２ａや回転軸２ｂに、細胞が接着・凝集し難くなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。
【００９１】
図１３は、培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
培養槽１は、攪拌翼のない振盪攪拌式とすることもできる。図１３に示す振盪攪拌式の攪拌機２は、回転軸２ｂを回転させるモータ２ｃと、培養槽１を支持する振盪台２ｄと、振盪台２ｄの振盪運動を回転運動によって駆動するハブ（回転部材）２ｅと、ハブ２ｅの回転運動を振盪運動に変換する偏心ピン（変換部材）２ｆと、回転軸２ｂの回転運動をハブ２ｅに伝達するベルト２ｇ（伝達部材）と、を備えている。ハブ２ｅは、振盪台２ｄの下方に位置しており、不図時の軸受によって回転自在に支持されている。振盪台２ｄは、ハブ２ｅ及び偏心ピン２ｆや、ハブ２ｅ及び偏心ピン２ｆと同様に構成される不図示の支持部材によって振盪可能な状態で支持される。
【００９２】
振盪台２ｄに支持される培養槽１の中心軸は、ハブ（回転部材）２ｅの中心軸から偏心している。偏心ピン２ｆは、ハブ２ｅの上面にハブ２ｅの中心軸から偏心して設けられており、偏心ピン２ｆの先端は、振盪台２ｄに回転自在に接続されている。ハブ２ｅとモータ２ｃに接続された回転軸２ｂには、プーリが備えられており、ベルト２ｇが架け渡されている。モータ２ｃが作動すると、回転軸２ｂの回転によってハブ２ｅが回転運動して、偏心ピン２ｆがハブ２ｅの中心軸の周りを運動する。振盪台２ｄは、この偏心ピン２ｆの運動で旋回振盪運動や往復振盪運動し得るように、不図示のガイドによって軌道を案内することができる。
【００９３】
このような振盪攪拌式の構造では、培養槽１の中心軸と振盪台２ｄの回転軸とが一致せず、位置や方向がずらされていることで培養槽１が偏心し、培養槽１内の液が混合される。培養槽１内に攪拌翼や回転軸を設置する必要がないため、攪拌翼や回転軸に、細胞が接着・凝集しなくなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。また、培養槽１として、シングルユース式の培養バッグを用いる場合等に、攪拌機２への脱着や培養槽１の密閉が容易になる。
【００９４】
なお、図１３に示す振盪攪拌式の攪拌機２は、培養槽１を、ハブ２ｅ、偏心ピン２ｆ等を利用して振盪攪拌する方式とされているが、攪拌機２は、振盪台２ｄの振盪運動を駆動する回転部材の回転運動を振盪運動に変換する機構として、スライダ・クランク機構、カム機構等、その他の機構や、それらの組合せを利用してもよい。また、振盪攪拌式の攪拌機２としては、水平往復運動、上下往復運動、二次元的又は三次元的な周回運動、シーソ型等の傾斜揺動等、その他の振盪運動を行う装置を備えてもよい。
【００９５】
＜培養方法（回分培養式）＞
次に、本発明の一実施形態に係る培養方法について、培養装置１００を用いた場合の処理と共に、図を参照しながら説明する。
【００９６】
図１４は、本発明の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
図１４には、目的の物質を産生する細胞を、培養装置１００を用いて拡大培養する流れを例示する。培養装置１００では、培養槽１内の培養液量を新鮮培地の補充により段階的に拡大し、培養液量が互いに異なる複数の培養工程を段階的に行う。その途中には、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、静置培養と、新鮮培地の補充により増量した培養液中における攪拌培養とを、単一の培養槽１で段階的に行う。
【００９７】
培養装置１００には、はじめに、細胞の培養に必要な培養条件を設定する（ステップＳ１０）。培養装置１００では、段階的に培養スケールを拡大していく拡大培養を、指定した回数のサイズアップや、指定した時期の培養方式の切り替えが行われるように、予め定めた培養スケジュールにしたがって実施する。
【００９８】
設定する培養条件の項目としては、培養スケジュール、例えば、静置培養や攪拌培養毎の細胞の目標継代数（サイズアップの回数の目標値）や、段階的な培養工程毎の培養槽１の培養液量（培養スケール）が挙げられる。また、培養温度、静置培養時の気相部のガス組成、攪拌培養時の攪拌機２の回転速度、溶存酸素濃度、ｐＨ等が挙げられる。また、各培養工程の進捗を判定するために、培養工程毎の細胞の目標状態量（細胞数密度等の目標値）、又は、培養工程毎の目標培養時間、又は、培養工程毎の培養液成分の目標濃度を設定することができる。
【００９９】
続いて、拡大培養する目的の細胞を培地に播種する（ステップＳ２０）。培養槽１内には、下部空間１１０内の所定の高さに液面がくるまで新鮮培地を入れる。そして、設定した培養条件になるように散気装置３、温度調節装置４等を制御し、適切な細胞数密度に希釈した細胞懸濁液を無菌的に投入する。培養槽１には、下部空間１１０内の所定の高さに、細胞を播種するための投入口を設けておくことが好ましい。
【０１００】
続いて、培養槽１の下部空間１１０において培養液中で細胞を静置培養する（ステップＳ３０）。静置培養は、攪拌機２を停止した状態で、液面が下部空間１１０内の所定の高さとなる培養スケールを維持して行う。
【０１０１】
静置培養中には、空気、酸素、二酸化炭素、窒素等の通気によって、培養槽１内の気相部のガス濃度・ガス組成を一定に制御する。また、培養液の温度を一定に制御する。このような一定制御によると、細胞が撹乱され難くなり、所定の細胞密度まで安定に増殖させることができる。気相部のガス濃度・ガス組成は、通常用いるインキュベータの庫内雰囲気と一致させることが好ましい。
【０１０２】
続いて、静置培養中に、細胞の増殖状態を表す指標値を取得する（ステップＳ４０）。細胞の増殖状態を表す指標値としては、細胞の増殖と相関を有する状態量、例えば、細胞数密度、比増殖速度、生存率、細胞の代謝反応速度、細胞の累積代謝量、細胞周期等を、分析装置８による実測で取得することができる。実測は、センサを用いてオンラインで行ってもよいし、培養液をサンプリングしてオフラインで行ってもよい。
【０１０３】
或いは、細胞の増殖状態を表す指標値としては、培養工程毎の培養時間を、タイマによって取得してもよい。また、培養工程毎の培養液成分の濃度を、分析装置８による実測で取得してもよい。細胞の増殖状態との関係が予め確認されている場合、細胞の状態量だけでなく、或る培養スケールの培養工程を開始した後の培養時間の経過や、培養液成分の濃度変化も、細胞の増殖状態の指標として用いることができる。
【０１０４】
静置培養中、細胞の増殖状態を表す指標値が取得されると、静置培養されている細胞が目標増殖状態に達したか否かについて判定が行われる（ステップＳ５０）。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている目標値と、を比較する。実測で取得された指標値が目標値を超えているか否かに基づいて、培養工程の進捗を判定することができる。
【０１０５】
判定の結果、目標増殖状態に達していないと（ステップＳ５０；Ｎｏ）、培養槽１の下部空間１１０で、同じ培養スケールの静置培養を続ける（ステップＳ３０）。
【０１０６】
一方、判定の結果、目標増殖状態に達していると（ステップＳ５０；Ｙｅｓ）、培養方式の切り替えに必要な切替条件が充足されたか否かについて判定が行われる（ステップＳ６０）。制御装置９は、静置培養における実際の継代数（サイズアップの回数）と、培養スケジュールとして定めた目標継代数と、を比較する。実際の継代数を表すパラメータが目標継代数値に達したか否かにより、培養方式の切り替えを行うことができる。
【０１０７】
例えば、下部空間１１０内における液面の高さを、図２にＩ線〜IV線で示すように切り上げていく場合、静置培養中の継代数は４回となる。継代数との関係が予め確認されている場合には、細胞の状態量、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている静置培養における目標値と、を比較してもよい。実測で取得された指標値が静置培養における目標値を超えているか否かに基づいて、継代の進捗を判定して、培養方式の切り替えを行うこともできる。
【０１０８】
判定の結果、目標継代数に達していないと（ステップＳ６０；Ｎｏ）、供給ポンプ７を作動し、培地タンク５から培養槽１内に所定量の新鮮培地を補充して、次段階の培養スケールまで培養液量を拡大する（ステップＳ７０）。このとき、制御装置９は、実際の継代数を表すパラメータを加算する。そして、培養槽１の下部空間１１０で、拡大された培養スケールの静置培養を続ける（ステップＳ３０）。
【０１０９】
一方、判定の結果、目標継代数に達していると（ステップＳ６０；Ｙｅｓ）、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、攪拌機２を作動し、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０において新鮮培地の補充により増量した培養液中で細胞を攪拌培養する（ステップＳ８０）。攪拌培養は、培養槽１内の上部空間１２０に位置する攪拌翼２ａにより培養液を攪拌すると共に、液面が上部空間１２０内の所定の高さとなる培養スケールを維持して行う。
【０１１０】
攪拌培養中には、温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ等によって培養状態をモニタリングする。培養温度は、温度調節装置４で所定の範囲に制御する。また、培養液の溶存酸素濃度や二酸化炭素濃度は、散気装置２による空気、酸素、二酸化炭素、窒素等の通気で所定の範囲に制御する。また、培養液のｐＨは、アルカリ溶液の添加や二酸化炭素の通気で制御する。
【０１１１】
続いて、攪拌培養中に、細胞の増殖状態を表す指標値を取得する（ステップＳ９０）。細胞の増殖状態を表す指標値としては、静置培養における処理（ステップＳ４０参照）と同様に、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度を取得することができる。
【０１１２】
攪拌培養中、細胞の増殖状態を表す指標値が取得されると、攪拌培養されている細胞が目標増殖状態に達したか否かについて判定が行われる（ステップＳ１００）。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている培養工程毎の目標値と、を比較する。実測で取得された指標値が培養工程毎の目標値を超えているか否かに基づいて、培養工程の進捗を判定することができる。
【０１１３】
判定の結果、目標増殖状態に達していないと（ステップＳ１００；Ｎｏ）、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０で、同じ培養スケールの攪拌培養を続ける（ステップＳ８０）。
【０１１４】
一方、判定の結果、目標増殖状態に達していると（ステップＳ１００；Ｙｅｓ）、培養の終了に必要な終了条件が充足されたか否かについて判定が行われる（ステップＳ１１０）。制御装置９は、攪拌培養における実際の継代数（サイズアップの回数）と、培養スケジュールとして定めた目標継代数と、を比較する。実際の継代数を表すパラメータが目標継代数値に達したか否かにより、拡大培養の継続・終了を決める。
【０１１５】
例えば、上部空間１２０内における液面の高さを、図２にＶ線〜VI線で示すように切り上げていく場合、攪拌培養中の継代数は２回となる。継代数との関係が予め確認されている場合には、細胞の状態量、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている攪拌培養における目標値と、を比較してもよい。実測で取得された指標値が攪拌培養における目標値を超えているか否かに基づいて、継代の進捗を判定して、拡大培養の継続・終了を決めることもできる。
【０１１６】
判定の結果、目標継代数に達していないと（ステップＳ１１０；Ｎｏ）、供給ポンプ７を作動し、培地タンク５から培養槽１内に所定量の新鮮培地を補充して、次段階の培養スケールまで培養液量を拡大する（ステップＳ１２０）。このとき、制御装置９は、実際の継代数を表すパラメータを加算する。そして、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０で、拡大された培養スケールの攪拌培養を続ける（ステップＳ８０）。
【０１１７】
一方、判定の結果、目標継代数に達していると（ステップＳ１１０；Ｙｅｓ）、攪拌機２を停止し、拡大培養を終了する（ステップＳ１３０）。その後、目的の物質を大量生産する生産培養の工程、又は、細胞が産生した物質の回収・精製を行う分離精製工程に移行する。
【０１１８】
以上の培養装置１００や培養方法によると、所定の形状・構造の培養槽内に新鮮培地を補充することができるため、培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽１を用いて行うことができる。一般的な培養容器やバイオリアクタは、底部が平面であることが多く、形状・構造が最適化されていないところ、培養槽１の下部空間１１０を、数式（Ｉ）の関係を満たす形状とし、適切な攪拌方式の構造とすると、細胞の比増殖速度や生存率が高くなる。よって、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、良好な培養効率を維持して、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
【０１１９】
特に、以上の培養装置１００や培養方法によると、培養液の移し替えを不要化することができるため、培養液の移し替え作業の煩雑性に関する問題や、培養液及び細胞の取り扱い性に関する問題や、培養液の移し替え時等のコンタミネーションに関する問題を解消することができる。培養装置１００によると、全培養工程を完全閉鎖系で自動化させて行うことも可能であり、手作業が介在し難くなるため、培養の再現性や、目的の物質の生産量・品質を向上させることができる。また、培養スケール毎に個別のバイオリアクタを用意する必要がないため、培養装置や培養施設を小型化することができる。また、回分培養式の拡大培養を行うため、灌流培養式と比較して、培養環境を容易に安定させることができる。
【０１２０】
＜培養装置（灌流培養式）＞
次に、培養方式が異なる本発明の別の実施形態について、図を参照しながら説明する。
【０１２１】
図１５は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
図１５に示すように、本実施形態に係る培養装置２００は、培養槽１と、攪拌機２と、散気装置３と、温度調節装置４と、培地タンク５と、バルブ６と、供給ポンプ７と、分析装置８と、制御装置９と、回収タンク１０と、細胞分離装置１１と、引抜ポンプ１２と、吸引ポンプ１３と、供給管２０と、引抜管２２と、返送管２３と、回収管２４と、を備えている。
【０１２２】
培養装置２００は、前記の培養装置１００と同様に、細胞を拡大培養するための装置であり、拡大培養中の培養槽１に新鮮培地（培養液）を補充して培養スケールを拡大する機能を有している。培養装置２００では、培養槽１に新鮮培地を補充することにより、培養スケールが段階的に拡大されて、多段階の培養工程が行われる。図１５に示す培養装置２００は、それぞれの培養工程を、培養中に連続的に培地を供給し、且つ、同量の培地を連続的に排出する灌流培養（連続培養）の形式で行う形態とされている。
【０１２３】
培養装置２００では、培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替えることができる。そのため、大スケールを最終目標とした灌流培養式の拡大培養を、単一の培養槽１で行うことができる。培養装置２００の構成や、主な運転方法は、細胞分離装置１１や、これに対応するポンプ・配管を除いて、前記の培養装置１００と略同様である。
【０１２４】
図１５に示すように、培養装置２００の培養槽１には、培養槽１内から培養液及び培養された細胞を引き抜くための引抜管２２が接続される。引抜管２２の他端には、培養槽１内から引き抜かれた培養液と細胞とを互いに分離する細胞分離装置１１が接続される。引抜管２２には、培養槽１から細胞分離装置１１に培養液及び培養された細胞を引き抜く引抜ポンプ１２が備えられる。
【０１２５】
細胞分離装置１１には、培養液から分離された細胞を培養槽１内に戻すための返送管２３が接続される。返送管２３の他端は、培養槽１に接続される。また、細胞分離装置１１には、細胞を分離された培養液を回収するための回収管２４が接続される。回収管２４の他端には、回収タンク１０が接続される。回収管２４には、細胞分離装置１１から培養液を吸引する吸引ポンプ１３が備えられる。
【０１２６】
細胞分離装置１１は、例えば、分離膜に直交する方向に液体を流すタンジェンシャルフロー膜分離（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）方式、分離膜に直交する方向に液体を流し、分離膜に対する吸引と放出とを交互に繰り返すオルタネーティングタンジェンシャルフロー膜分離（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）方式、重力沈降分離方式、大きさや密度の違いを超音波振動で分ける音波分離方式等の各種の方式とすることができる。
【０１２７】
図１６は、培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
図１６に示すように、培養装置２００に備えられる培養槽１は、内幅が高さ方向に一様でなく、槽内に、相対的に狭い内幅を有する下部空間１１０と、相対的に広い内幅を有する上部空間１２０と、を有している。引抜管２２は、培養槽１の下方に向けて突出した下部空間１１０の底部に接続している。
【０１２８】
＜培養方法（灌流培養式）＞
次に、本発明の一実施形態に係る培養方法について、培養装置２００を用いた場合の処理と共に、図を参照しながら説明する。
【０１２９】
培養装置２００では、前記の培養装置１００と同様に、培養槽１内の培養液量を新鮮培地の補充により段階的に拡大し、培養液量が互いに異なる複数の培養工程を段階的に行う。その途中には、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、静置培養と、新鮮培地の補充により増量した培養液中における攪拌培養とを、単一の培養槽１で段階的に行う。培養装置２００を用いた灌流培養式の拡大培養は、前記の培養装置１００と同様に、図１４に示す流れで行うことができる。
【０１３０】
培養装置２００において、灌流培養は、静置培養の培養工程（図１４のステップＳ３０参照）のみで行ってもよいし、攪拌培養の培養工程（図１４のステップＳ８０参照）のみで行ってもよいし、これらの両方で行ってもよい。また、静置培養の培養工程、及び、攪拌培養の培養工程のうち、所定の培養スケールの培養工程のみで行ってもよい。灌流培養を行わない培養工程は、回分培養の方式で運転することができる。
【０１３１】
培養装置２００には、前記の培養装置１００と同様に、細胞の培養に必要な培養条件を設定することができる。設定する培養条件の項目としては、前記の培養装置１００の項目に加え、灌流培養を行う培養工程を定めた培養スケジュールや、培養工程毎の灌流量が挙げられる。
【０１３２】
灌流培養中には、引抜ポンプ１２を作動させて、培養槽１内から培養液及び培養された細胞を引き抜く。また、供給ポンプ７を作動させて、培地タンク５から培養槽１内に培養液を補充する。そして、細胞分離装置１１で、引き抜かれた培養液と細胞とを互いに分離する。その後、分離された細胞を培養槽内に戻すと共に、吸引ポンプ１３を作動させて、細胞が産生した物質を含む培養液を回収タンク１０に回収する。
【０１３３】
静置培養の培養工程（図１４のステップＳ３０参照）で灌流培養を行う場合には、攪拌機２を停止した状態で、液面が下部空間１１０内の所定の高さとなる培養スケールを維持しながら、一定に制御した培養条件の下で灌流培養を行う。静置培養の培養工程を灌流培養とすると、栄養の枯渇や、細胞が分泌した老廃物の蓄積が、起こり難くなる。そのため、所定の培養スケールあたり、より高い細胞密度まで増殖させることができる。最終的な細胞数が増えるため、培養槽１自体を小型化することも可能になる。
【０１３４】
一方、攪拌培養の培養工程（図１４のステップＳ８０参照）で灌流培養を行う場合には、培養液を攪拌すると共に、液面が上部空間１２０内の所定の高さとなる培養スケールを維持しながら、可変的に制御される培養条件の下で灌流培養を行う。攪拌培養の培養工程を灌流培養とすると、所定の培養スケールあたり、より高い細胞密度まで増殖させることができるだけでなく、細胞が培養液中に分泌した物質を連続的に回収することができる。細胞の増殖が阻害され難い状態で、目的の物質を連続生産させることができるため、高い生産性を実現することができる。
【０１３５】
以上の培養装置２００や培養方法によると、所定の形状・構造の培養槽内に新鮮培地を補充することができるため、前記の回分培養式の培養装置１００や培養方法と同様に、培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽１を用いて行うことができる。培養槽１の下部空間１１０を、数式（Ｉ）の関係を満たす形状とし、適切な攪拌方式の構造とすると、細胞の比増殖速度や生存率が高くなる。よって、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、良好な培養効率を維持して、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
【０１３６】
特に、以上の培養装置２００や培養方法によると、灌流培養式の拡大培養を行うため、回分培養式と比較して、より高い細胞密度まで増殖させることが可能であり、培養装置や培養施設を、より容易に小型化することができる。細胞が増殖を阻害する物質を大量に分泌するような場合であっても、サイズアップの回数を減らした培養スケジュールを設定して、多量の細胞や多量の目的物質を得ることができる。
【０１３７】
以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態や変形例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態や変形例が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態や変形例の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態や変形例の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態や変形例の構成の一部を省略したりすることができる。
【０１３８】
例えば、前記の培養装置１００，２００は、培地タンク５の個数、その他の機器の配置、配管の接続等が、制限されるものではない。培養槽１は、形状例や構造例に示される適宜の形態とすることが可能であり、攪拌機２だけでなく、散気装置３の配置や配管の接続位置についても、攪拌機２と同様に、最適化することができる。
【０１３９】
また、前記の培養装置１００，２００は、散気装置３に加え、気相部に所定のガスを通気するための不図示の散気装置を備えることもできる。このような場合、培養液に対して散気を行う散気装置３は、下部空間１１０及び上部空間１２０のいずれに開口させてもよい。
【０１４０】
また、前記の培養装置１００，２００は、培養槽１と補充装置（５，７）とが、予め接続されたものであってもよいし、培養時に接続されるものであってもよい。培養槽１としてシングルユース式の培養バッグを用いる場合、攪拌機２は、所定の配置となるように予め固定してもよいし、所定の位置に培養時に固定してもよい。
【０１４１】
また、前記の培養装置１００，２００は、補充装置として、培地タンク５と、供給ポンプ７と、を備えている。しかしながら、新鮮培地の供給には、供給ポンプ７に代えて、重力や圧力差を利用してもよい。このような場合、補充装置としては、重力や圧力差を利用して新鮮培地を補充する培地タンク５のみを備えてもよい。培地タンク５としては、各種の容器や、可撓性のバッグ等を備えてもよい。
【０１４２】
また、前記の培養装置１００，２００を用いる培養方法（図１４参照）は、培養槽１における拡大培養の終了後に、生産培養を行うものとしている。しかしながら、生産培養の工程は、培養槽１を使用して行ってもよいし、培養槽１や回収タンク１０から別の培養槽に移し替えて行ってもよい。
【０１４３】
また、前記の培養装置１００，２００を用いる培養方法（図１４参照）は、静置培養の培養工程や、攪拌培養の培養工程を、それぞれ、一段階の培養工程とする培養スケジュールとしてもよい。前記の培養方法においては、供給ポンプ７や攪拌機２の作動・停止の時期を、適宜の条件に変更してもよいし、培養スケールが大きく変化しない範囲で流加培養式の拡大培養を行ってもよい。
【実施例】
【０１４４】
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【０１４５】
培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽を用いて行い、回分培養式の場合と、灌流培養式の場合とで、培養成績を比較した。
【０１４６】
（実験方法）
供試細胞としては、浮遊細胞系であるＣＨＯ細胞を用いた。また、培地としては、ＤＭＥＭ培地の液体培地を用いた。凍結されているＣＨＯ細胞を、３７℃のウォータバス中で融解し、新鮮培地を加えることによって、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液５ｍＬを培養槽に入れて、気相部のガス組成が、大気中５％ＣＯ２、培養液の温度が、３７℃となるように調整し、拡大培養を開始した。
【０１４７】
拡大培養の培養スケール、サイズアップの回数、攪拌方式を切り替える時期等は、図１７に示す従来例と同様とした。拡大培養の培養スケジュールの概要を表２に示す。
【０１４８】
【表２】
2020124169.tif 000004
【０１４９】
表２に示すように、培養工程Ｉから培養工程IIIまでは、静置培養とした。培養工程IVから培養工程IXまでは、攪拌培養とした。培養スケールの拡大は、予め設定した培養時間が経過した時点で、３７℃の新鮮培地を培養液量が設定どおりになるように補充して行った。培養工程IXの終了後には、細胞が産生した物質の回収・精製を行う分離精製工程に移行した。
【０１５０】
各培養スケールの培養工程が終了した時点で、生細胞数と細胞の生存率を求めた。そして、全培養工程を回分培養式とした場合と、全培養工程を灌流培養式とした場合とについて、培養結果の比較を行った。
【０１５１】
図１８は、単一の培養槽で拡大培養を行った結果を示す図である。
図１８において、左軸は、培養槽内で確認された生細胞の数密度［×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］、右軸は、培養槽内で確認された細胞の生存率［％］、横軸は、培養時間［日］を示す。▲のプロットは、回分培養式における生細胞の数密度の結果、△のプロットは、回分培養式における生存率の結果、●のプロットは、灌流培養式における生細胞の数密度の結果、○のプロットは、灌流培養式における生存率の結果である。
【０１５２】
図１８に示すように、回分培養式、及び、灌流培養式のいずれにおいても、高い生存率と、ある程度の生細胞数が得られることが確認された。回分培養式の結果と、灌流培養式の結果とを比較すると、灌流培養式の場合に、生細胞の数密度の最大値が５倍以上に高くなることが確認された。
【０１５３】
この結果は、図１７に示すような拡大培養を行う場合、７５Ｌから２０００Ｌまでのスケールアップを一段階で行うことが可能であり、４００Ｌ規模の培養槽を省略することができることを意味する。培養槽としては、従来法の場合よりも小型化された単一の槽を用いることができるといえる。また、灌流培養式の場合には、継代中に生存率の低下は見られず、回分培養式と比較して、より優れた培養効率を実現できるといえる。
【符号の説明】
【０１５４】
１００  培養装置
２００  培養装置
１      培養槽
２      攪拌機
２ａ    攪拌翼
２ｂ    回転軸
２ｃ    モータ
２ｄ    振盪台
２ｅ    ハブ（回転部材）
２ｆ    偏心ピン（変換部材）
２ｇ    ベルト
３      散気装置
４      温度調節装置
５      培地タンク
６      バルブ
７      供給ポンプ
８      分析装置
９      制御装置
１０    回収タンク
１１    細胞分離装置
１２    引抜ポンプ
１３    吸引ポンプ
２０    供給管
２１    排出管
２２    引抜管
２３    返送管
２４    回収管
５０    培養液
５２    バイアル
５３    フラスコ
５４    スピナーフラスコ
５５    バイオリアクタ
１１０  下部空間
１２０  上部空間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020124169.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2020124169.tif 000016
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020124169.tif 000019
【図１６】
2020124169.tif 000020
【図１７】
2020124169.tif 000021
【図１８】
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