(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪アルコールおよび脂肪アルデヒドの半生合成的生産方法の提供。【解決手段】１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；ならびに１つまたは複数の不飽和脂質部分を還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程を含む方法。【選択図】図１
2020124206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の天然に存在する生物から前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；ならびに
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程を含む方法。
【請求項２】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の天然に存在する生物から前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の遊離脂肪酸（FFA）に化学的に変換する工程；
前記１つまたは複数のＦＦＡを１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）にエステル化する工程；ならびに
前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【請求項３】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の天然に存在する生物から前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程；ならびに前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の天然に存在する生物が昆虫である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の天然に存在する生物が昆虫ではない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の天然に存在する生物が、植物、藻類および細菌からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物が、ヤマモガシ科およびクロウメモドキ科からなる群から選択される科由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記植物が、Ｇｅｖｕｉｎａ属、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ属、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ属、Ｌｕｎａｒｉａ属、Ｃａｒｕｍ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ属、Ｍａｃａｄａｍｉａ属、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ属、Ｌｉｃａｎｉａ属、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ属、Ｒｉｃｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｙｌｕｓ属、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ属、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ属、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ属、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ属、Ｏｒｉｔｅｓ属、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ属、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ属、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ属、Ｅｐｈｅｄｒａ属、Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍ属、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ属および／またはＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ属由来の種を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記植物が、Ｇｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ、およびＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記藻類が緑藻類を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記緑藻類がＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ属由来の種を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記緑藻類がＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌がグラム陰性菌を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記グラム陰性菌がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記グラム陰性菌がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌がラン藻を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物において前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程；
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数の遊離脂肪酸（FFA）および／または１つもしくは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）に化学的に変換する工程；ならびに
前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、前記１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のために１つまたは複数の炭素源を使用する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の炭素源が糖、グリセロール、エタノール、有機酸、アルカン、および／または脂肪酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の炭素源が、アルカンおよび脂肪酸からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の組換え微生物がアルカンおよび／または脂肪酸に対して高い耐性を有する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の組換え微生物が脂質を蓄積する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の組換え微生物が１つまたは複数の細菌および／または真菌を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の真菌が含油性酵母である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記含油性酵母がＹａｒｒｏｗｉａ属および／またはＣａｎｄｉｄａ属由来の種を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記含油性酵母がＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよび／またはＣａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、１つもしくは複数のデサチュラーゼ、１つもしくは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ、１つもしくは複数のアシルグリセロールリパーゼもしくはステロールエステルエステラーゼ、１つもしくは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクロムレダクターゼ、１つもしくは複数のエロンガーゼ、１つもしくは複数のチオエステラーゼ、１つもしくは複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、１つもしくは複数のリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、１つもしくは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、および／または１つもしくは複数の脂質結合タンパク質から選択される１つまたは複数の外因性生合成酵素を含む、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つまたは複数のデサチュラーゼが、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼおよび脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクロムレダクターゼが、シトクロム−ｂ５レダクターゼおよびＮＡＤＰＨ依存性シトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つまたは複数のエロンガーゼが、ＥＬＯ１、ＥＬＯ２およびＥＬＯ３、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つまたは複数のチオエステラーゼが、アシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡチオエステラーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つまたは複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼが、デュアルグリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼが、ＳＬＣ１、ＡＬＥ１およびＬＯＡ１、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つまたは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、アシルＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼおよびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つもしくは複数の脂質結合タンパク質がステロールキャリアタンパク質２（SCP2）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の外因性生合成酵素が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ、Ｃｙｄｉａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ、Ｓｅｓａｍｉａ、Ｐｌｏｄｉａ、Ｂｏｍｂｙｘ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｒａｔｔｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ＰｌｕｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓからなる群から選択される属由来である、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の外因性生合成酵素が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ／Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｐｕｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｌａｔｉｐｅｎｎｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｏｖａｌｉｐｅｎｎｉｓ、Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｓｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓ  ａｎｙｎａｎａからなる群から選択される種由来である、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産を巡って前記生合成経路と競合する経路における、１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作されている、請求項１９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換え微生物が、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸長経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸長経路に関与している前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換え微生物が、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／またはリサイクリング経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／またはリサイクリング経路に関与している前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、トリアシルグリセロールリパーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ステリルエステルヒドロラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組換え微生物が、１つまたは複数の脂肪酸分解経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記脂肪酸分解経路がベータ酸化経路である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、多機能エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記脂肪酸分解経路がオメガ酸化経路である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、モノオキシゲナーゼ（CYP52）、脂肪アルコールオキシダーゼ、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換え微生物が、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
ペルオキシソーム生合成に関与している前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ８、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１５、ＰＥＸ１７、ＰＥＸ１８、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２１、ＰＥＸ２２、ＰＥＸ２５、ＰＥＸ２７、ＰＥＸ２８、ＰＥＸ２９、ＰＥＸ３０、ＰＥＸ３１、ＰＥＸ３２およびＰＥＸ３４、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される属由来である、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記１つまたは複数の内在性タンパク質が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ／Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉからなる群から選択される種由来である、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、補酵素の細胞内レベルを増加するようにさらに操作されている、請求項１９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記補酵素がＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質を発現するようにさらに操作されている請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質の前記発現が補助基質の補充と連結している、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つまたは複数の組換え微生物が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作されている、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分が、（Ｚ）−３−ヘキセン酸、（Ｚ）−３−ノネン酸、（Ｚ）−５−デセン酸、（Ｅ）−５−デセン酸、（Ｚ）−７−ドデセン酸、（Ｅ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−９−ドデセン酸、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン酸、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｚ）−１１−テトラデセン酸、（Ｅ）−１１−テトラデセン酸、（Ｚ）−７−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエン酸、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｚ）−１３−オクタデセン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９，１２，１５−トリコサペンタエン酸、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分が、（Ｚ）−９−テトラデセン酸（Ｚ９−１４：ＣＯＯＨ）、（Ｅ）−１１−テトラデセン酸（Ｅ１１−１４：ＣＯＯＨ）、（Ｚ）−１１−テトラデセン酸（Ｚ１１−１４：ＣＯＯＨ）、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸（Ｚ９−１６：ＣＯＯＨ）、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（Ｚ１１−１６：ＣＯＯＨ）、（Ｚ）−１３−オクタデセン酸（Ｚ１３−１８：ＣＯＯＨ）および（Ｚ）−１１−オクタデセン酸（Ｚ１１−１８：ＣＯＯＨ）からなる群から選択される、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが、１つまたは複数の昆虫フェロモン、香料、風味および／またはポリマー中間体を含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが、１つまたは複数の昆虫フェロモンを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
不飽和脂質部分の生産のために請求項１９〜６２のいずれか一項に記載の方法において使用される組換え微生物。
【請求項６４】
請求項６３に記載の組換え微生物を作製する方法。
【請求項６５】
前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程が、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を単離する工程、
任意選択により、特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する工程、および
前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分を処理する工程であって、脂肪酸誘導体を生産する、工程
をさらに含む、請求項２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程が、前記１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＦＡへの鹸化を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程が、前記１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＡＡＥへのエステル化を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する任意選択による工程が分離方法を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記分離方法が蒸留、クロマトグラフィーおよび／または蒸留を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分、前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つまたは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程が、前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分、前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の化学量論的還元剤に接触させる工程を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つまたは複数の化学量論的還元剤が、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムＶｉｔｒｉｄｅ（Ｒｅｄ−Ａｌ、Ｖｉｔｒｉｄｅ、ＳＭＥＡＨ）および／または水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分、前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程が、前記還元剤を改変するためのバルキーな環状窒素ルイス塩基を含む、請求項７０または請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記バルキーな環状窒素ルイス塩基が、１つまたは複数の脂肪アルデヒドの生産のための前記還元工程の選択性を与える、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分、前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の脂肪アルコールに還元する工程が、前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分、前記１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または前記１つもしくは複数のＦＡＭＥを１つまたは複数の遷移金属触媒に接触させる工程を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つまたは複数の遷移金属触媒が１つまたは複数の第ＶＩＩＩ族触媒を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
生産された前記脂肪アルコールが酸化工程により脂肪アルデヒドにさらに酸化される、請求項１〜７０または７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記酸化工程が１つまたは複数の部分的酸化方法を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記１つまたは複数の部分的酸化方法がＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記酸化工程が銅触媒好気性酸化を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが、分離手順によりさらに濃縮される、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法により生産される組成物。
【請求項８２】
前記１つまたは複数のデサチュラーゼが、配列番号３〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項８３】
前記１つまたは複数のデサチュラーゼが、配列番号１、２、２５〜３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項８４】
前記１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼが表３ａから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項８５】
前記１つまたは複数のアシルグリセロールリパーゼまたはステロールエステルエステラーゼが表３ｂから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項８６】
前記アシルトランスフェラーゼが、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１４０１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＢＬ０１１ｗ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＤＬ０５２ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ１７５Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＲ１３９Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＮＲ００８ｗ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ２４５ｃ、ならびにＣａｎｄｉｄａ  Ｉ５０３＿０２５７７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２６３０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．２５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．７８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．９４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０１６８７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１０４３、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．８６４５、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４７５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１３４３９、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４３９０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．６９４１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１４２０３、およびＣａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０６２０９からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項８７】
前記アシルＣｏＡオキシダーゼが、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ１（ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ２（ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ３（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ４（ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ５（ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ６（ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＯＸ１（ＹＧＬ２０５Ｗ）；Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ２（ＣａＯ１９．１６５５、ＣａＯ１９．９２２４、ＣＴＲＧ＿０２３７４、Ｍ１８２５９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ４（ＣａＯ１９．１６５２、ＣａＯ１９．９２２１、ＣＴＲＧ＿０２３７７、Ｍ１２１６０）、およびＣａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ５（ＣａＯ１９．５７２３、ＣａＯ１９．１３１４６、ＣＴＲＧ＿０２７２１、Ｍ１２１６１）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程が、前記１つまたは複数の脂肪アルコールを無水酢酸に接触させる工程を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つまたは複数の脂肪酢酸エステルが分離手順によりさらに濃縮される、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＦＡＡＥが脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む、請求項１〜８０または８２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のために、配列番号１、２、３２、３４、３６〜３８からなる群から選択される脂肪アシルデサチュラーゼに対して９５％の配列同一性を有する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むように操作されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物において前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）に化学的に変換する工程；ならびに
前記１つまたは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【請求項９３】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程が、
配列番号１、２、３２、３４、３６〜３８からなる群から選択される脂肪アシルデサチュラーゼに対して９５％の配列同一性を有する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子をＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物に導入するまたは発現させること；および
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産に適した炭素源を提供する供給原料を含有する培養培地において、操作された前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物を培養すること
をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物が、脂質動員において機能する、および／または前記１つもしくは複数の不飽和脂質部分の生産を巡って生合成経路と競合する経路における反応を触媒する、１つまたは複数の内在性酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物が、
（ｉ）ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ（ＰＯＸ１）、ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ（ＰＯＸ２）、ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ（ＰＯＸ３）、ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ（ＰＯＸ４）、ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ（ＰＯＸ５）、ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ（ＰＯＸ６）からなる群から選択される１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ；
（ｉｉ）ＹＡＬＩ０Ｆ０９６０３ｇ（ＦＡＤＨ）、ＹＡＬＩ０Ｄ２５６３０ｇ（ＡＤＨ１）、ＹＡＬＩ０Ｅ１７７８７ｇ（ＡＤＨ２）、ＹＡＬＩ０Ａ１６３７９ｇ（ＡＤＨ３）、ＹＡＬＩ０Ｅ１５８１８ｇ（ＡＤＨ４）、ＹＡＬＩ０Ｄ０２１６７ｇ（ＡＤＨ５）、ＹＡＬＩ０Ａ１５１４７ｇ（ＡＤＨ６）、ＹＡＬＩ０Ｅ０７７６６ｇ（ＡＤＨ７）からなる群から選択される１つまたは複数の（脂肪）アルコールデヒドロゲナーゼ；
（ｉｉｉ）（脂肪）アルコールオキシダーゼＹＡＬＩ０Ｂ１４０１４ｇ（FAO1）；
（ｉｖ）脂肪アシルＣｏＡシンセターゼ／脂肪酸輸送体ＹＡＬＩ０Ｅ１６０１６ｇ（FAT1）；および
（ｖ）細胞内トリアシルグリセロールリパーゼＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ（TGL3）
から選択される１つまたは複数の内在性酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
１つまたは複数の内在性アシルトランスフェラーゼ遺伝子が、表３ｃから選択される異種アシルトランスフェラーゼ遺伝子の１つまたは複数のバリアントで置き換えられている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分が、（Ｚ）−３−ヘキセン酸、（Ｚ）−３−ノネン酸、（Ｚ）−５−デセン酸、（Ｅ）−５−デセン酸、（Ｚ）−７−ドデセン酸、（Ｅ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−９−ドデセン酸、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン酸、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｚ）−１１−テトラデセン酸、（Ｅ）−１１−テトラデセン酸、（Ｚ）−７−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエン酸、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｚ）−１３−オクタデセン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９，１２，１５−トリコサペンタエン酸、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程が、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を単離する工程；
任意選択により特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する工程；ならびに
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥにエステル化するおよび／またはエステル交換する工程
をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する前記任意選択の工程が分離方法を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記分離方法が蒸留、クロマトグラフィーおよび／または蒸留を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つまたは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程が、前記１つまたは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の化学量論的還元剤に接触させる工程を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０２】
前記１つもしくは複数の化学量論的還元剤が、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムＶｉｔｒｉｄｅ（Ｒｅｄ−Ａｌ、Ｖｉｔｒｉｄｅ、ＳＭＥＡＨ）および／または水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪アルデヒドに酸化する工程をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０４】
酸化の工程が前記１つまたは複数の脂肪アルコールをＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯに接触させる工程を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程が、前記１つまたは複数の脂肪アルコールを無水酢酸に接触させる工程を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールを１つもしくは複数の対応する脂肪アルデヒドに酸化する工程；および／または
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールを１つもしくは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程；
をさらに含み、
前記１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸エステルが分離手順によりさらに濃縮される、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記１つまたは複数のＦＡＡＥが１つまたは複数の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記脂肪アシルデサチュラーゼが、配列番号４０、４１、４２および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む脂肪アシルデサチュラーゼを含まない、請求項９２に記載の方法。
【請求項１１０】
前記脂肪アシルデサチュラーゼが、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来デサチュラーゼから選択される脂肪アシルデサチュラーゼを含まない、請求項９２に記載の方法。
【請求項１１１】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物がＭＡＴＡ  ｕｒａ３−３０２：：ＳＵＣ２  Δｐｏｘ１  Δｐｏｘ２  Δｐｏｘ３  Δｐｏｘ４  Δｐｏｘ５  Δｐｏｘ６  Δｆａｄｈ  Δａｄｈ１  Δａｄｈ２  Δａｄｈ３  Δａｄｈ４  Δａｄｈ５  Δａｄｈ６  Δａｄｈ７  Δｆａｏ１である、請求項９２に記載の方法。
【請求項１１２】
請求項９２または請求項１０７に記載の方法により生産される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本出願は２０１６年６月６日提出の米国特許仮出願第６２／３４６，３３５号の優先権の利益を主張するものであり、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]  本出願に関連する配列表は紙コピーに代わってテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称はPRVI-017_01WO_SeqList_ST25.txt.である。テキストファイルは約１０３ＫＢであり、２０１７年６月５日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
[0003]  本出願は、１つもしくは複数の天然に存在する生物から１つもしくは複数の不飽和脂質部分を入手しまたは１つもしくは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つもしくは複数の組換え微生物において１つもしくは複数の不飽和脂質部分を生産し、１つもしくは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数の遊離脂肪酸（FFA）および／または１つもしくは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）に化学的に変換し、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元し、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産することにより、１つもしくは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法に関する。１つまたは複数の脂肪アルコールは１つまたは複数の対応する脂肪酢酸（fatty acetates）に化学的にさらに変換することが可能である。１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸は、昆虫フェロモン、香料、風味およびポリマー中間体として有用であり得る。本出願は、不飽和脂質部分の生合成で有用な組換え微生物ならびに１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを含む組成物にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  世界的な食糧需要が高まるに従って、効果的な有害生物防除に対する要求が増加している。従来の殺虫剤は、容易に入手でき、即効性があり、信頼性が高いために一番使われている化学的駆除剤の１つである。しかし、これらの化学物質の過度の使用、誤用および乱用のせいで抵抗性の有害生物が現れ、自然生態環境が変わり、一部の場合では、環境破壊がもたらされた。
【０００５】
[0005]  有害生物集団を抑制するための昆虫フェロモンの使用は、従来の殺虫剤に代わる実行可能で、安全で、環境にやさしい選択肢としてますます普及してきた。１９５０年代後半のその発見以来、これらの分子は、大量捕獲、誘引殺虫、および交信攪乱(mating disruption)を含む種々の方法を通じて昆虫集団を減少させるのに有効性を示してきた。最後の方法は特に有害生物防除の非毒性手段であり、天然に存在するフェロモンを遮蔽して、それにより混乱および交信攪乱を引き起こす合成フェロモンの能力を利用する。
【０００６】
[0006]  フェロモンは農業用の昆虫防除では著しい潜在力を有するが、現在利用できる技法を使用してフェロモンを合成するコストは非常に高く、そのために高価作物以外この持続可能な技術の広範囲にわたる使用は妨げられている。したがって、昆虫フェロモンならびに関連する香料、風味およびポリマー中間体のコスト効率の良い生産のための新規の技術を開発する既存の必要性がある。本発明者らは、低コスト供給原料由来の合成昆虫フェロモンを含む脂肪アルコールおよび／または脂肪アルデヒドの半生合成生産のための方法の開発によりこの必要性に取り組む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]  本出願は、生物源からの１つまたは複数の不飽和脂質部分の入手または生産を、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドへの１つまたは複数の不飽和脂質部分の非生物学的手段による変換と組み合わせることにより、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法に関する。本出願は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を有する組換え微生物にも関する。本明細書に記載される方法により生産される１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは、１つもしくは複数の昆虫フェロモン、１つもしくは複数の香料、１つもしくは複数の調味料、または１つもしくは複数のポリマー中間体であってもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]  一態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程、ならびに１つまたは複数の不飽和脂質部分を直接還元し、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する工程を含む。
【０００９】
[0009]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の遊離脂肪酸（FFA）に化学的に変換する工程；１つまたは複数のＦＦＡを１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）にエステル化する工程；ならびに１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００１０】
[0010]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程；ならびに１つまたは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００１１】
[0011]  一実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は昆虫である。別の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は昆虫ではない。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は、植物、藻類および細菌からなる群から選択される。一部の実施形態では、植物はヤマモガシ科およびクロウメモドキ科からなる群から選択される科由来である。ある特定の実施形態では、植物はＧｅｖｕｉｎａ属、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ属、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ属、Ｌｕｎａｒｉａ属、Ｃａｒｕｍ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ属、Ｍａｃａｄａｍｉａ属、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ属、Ｌｉｃａｎｉａ属、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ属、Ｒｉｃｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｙｌｕｓ属、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ属、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ属、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ属、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ属、Ｏｒｉｔｅｓ属、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ属、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ属、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ属、Ｅｐｈｅｄｒａ属、Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍ属、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ属および／またはＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ属由来の種を含む。いくつかの実施形態では、植物はＧｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ、およびＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａ由来の種を含む。一部の実施形態では、藻類は緑藻類を含む。ある特定の実施形態では、緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ属由来の種を含む。一部の実施形態では、緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘを含む。一部の実施形態では、細菌はグラム陰性菌を含む。一部の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓを含む。一部の実施形態では、細菌はラン藻を含む。一部の実施形態では、ラン藻はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む。
【００１２】
[0012]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物において１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数の遊離脂肪酸（FFA）および／または１つもしくは複数の脂肪酸メチルエステル（FAAE）に化学的に変換する工程；ならびに１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００１３】
[0013]  一実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のために１つまたは複数の炭素源を使用する。別の実施形態では、１つまたは複数の炭素源は糖、グリセロール、エタノール、有機酸、アルカン、および／または脂肪酸を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の炭素源はアルカンおよび脂肪酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はアルカンおよび／または脂肪酸に対して高い耐性を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は脂質を蓄積する。他の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は１つまたは複数の細菌および／または真菌を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の真菌は含油性酵母(Oleaginous yeast)である。一実施形態では、含油性酵母はＹａｒｒｏｗｉａ属および／またはＣａｎｄｉｄａ属由来の種を含む。別の実施形態では、含油性酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよび／またはＣａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ／ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓを含む。
【００１４】
[0014]  一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は、１つもしくは複数のデサチュラーゼ、１つもしくは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ、１つもしくは複数のアシルグリセロールリパーゼ、１つもしくは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクローム還元酵素、１つもしくは複数のエロンガーゼ、１つもしくは複数のチオエステラーゼ、１つもしくは複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、１つもしくは複数のリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、１つもしくは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、および／または１つもしくは複数の脂質結合タンパク質から選択される１つまたは複数の外因性生合成酵素を含む。別の実施形態では、１つまたは複数のデサチュラーゼは、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼおよび脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクローム還元酵素は、シトクロームｂ５還元酵素およびＮＡＤＰＨ依存性シトクロームＰ４５０還元酵素からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のエロンガーゼは、ＥＬＯ１、ＥＬＯ２およびＥＬＯ３、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のチオエステラーゼが、アシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡチオエステラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、デュアルグリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、１つまたは複数のリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼは、ＳＬＣ１、ＡＬＥ１およびＬＯＡ１、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼおよびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つもしくは複数の脂質結合タンパク質はステロールキャリアタンパク質２（SCP2）である。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性生合成酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ、Ａｇｒｏｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ、Ｃｙｄｉａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ、Ｓｅｓａｍｉａ、Ｐｌｏｄｉａ、Ｂｏｍｂｙｘ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｒａｔｔｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ＰｌｕｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓからなる群から選択される属由来である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性生合成酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄ���  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｐｕｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｌａｔｉｐｅｎｎｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｏｖａｌｉｐｅｎｎｉｓ、Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｓｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓ  ａｎｙｎａｎａからなる群から選択される属由来である。
【００１５】
[0015]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４炭素原子の鎖長を有する基質として脂肪アシルＣｏＡを利用することができるデサチュラーゼである。
【００１６】
[0016]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、脂肪酸または、例えば、脂肪酸ＣｏＡエステルなどのその誘導体においてＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３の位置に二重結合を作製することができる。
【００１７】
[0017]  １つの例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物から単離することが可能である。さらなるＺ１１デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉまたはＤｉａｐｈａｎｉａ  ｎｉｔｉｄａｌｉｓから単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ６７９２０９、ＪＸ９６４７７４、ＡＦ４１６７３８、ＡＦ５４５４８１、ＥＵ１５２３３５、ＡＡＤ０３７７５、ＡＡＦ８１７８７、およびＡＹ４９３４３８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号３、１１、１７および１９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号２５に示されているアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号４および９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号５および１６から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号２６および２７から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号６、１０および２３から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号７、１２、１８、２０および２４から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＳ．ｉｎｆｅｒｅｎｓ由来の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１６７３８、ＡＧＨ１２２１７．１、ＡＩＩ２１９４３．１、ＣＡＪ４３４３０．２、ＡＦ４４１２２１、ＡＡＦ８１７８７．１、ＡＦ５４５４８１、ＡＪ２７１４１４、ＡＹ３６２８７９、ＡＢＸ７１６３０．１およびＮＰ００１２９９５９４．１、Ｑ９Ｎ９Ｚ８、ＡＢＸ７１６３０．１およびＡＩＭ４０２２１．１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全または部分Ｚ１１デサチュラーゼは別のポリペプチドに融合されている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ終端天然リーダー配列は別の種由来のオレオシンリーダー配列に置き換えられている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは配列番号８、２１および２２から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
[0018]  ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｚ１１−１３：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，１１−１３：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１５：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１５：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−６，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−８，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１４−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ）−４，６，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−７，１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｚ）−４，６，１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１７：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−８，１１−１７：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１４−１８：アシルＣｏＡまたはそれらの組合せから選択される一または多価不飽和産物への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【００１９】
[0019]  別の例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、種Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｏｂｉｌａｌｉｓ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ、またはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａの生物から単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０５７８６２、ＡＦ２４３０４７、ＡＦ５１８０１７、ＥＵ１５２３３２、ＡＦ４８２９０６、およびＡＡＦ８１７８８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードしている核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＯｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＯｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＬａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＬａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
[0020]  ある特定の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｚ９−１１：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１３：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−４，９−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１５：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１５：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−６，９−１５：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１７：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−５，９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−９，１２，１５−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−１８：アシルＣｏＡまたはそれらの組合せから選択される一不飽和または多価不飽和産物への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【００２１】
[0021]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、Ｅ５−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１３−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１３−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ８−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ１０−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１２−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１４−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ７−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ７−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ５Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ７Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１３Ｚ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ６Ｅ８−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ８Ｅ１０−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ１０Ｅ１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１２Ｅ１４−１６：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ５Ｅ８−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ７Ｅ１０−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９Ｅ１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１１Ｅ１４−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１３Ｅ１６−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ３−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ５−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ７−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ３Ｚ５−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ５Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ７Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡおよびＺ１３Ｚ１５−１８：アシルＣｏＡから選択される一または多価不飽和中間体への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態では、組換え微生物は、２つの二重結合の続いて起こる不飽和化を触媒することができる二機能性デサチュラーゼを発現することができる。
【００２３】
[0023]  一部の実施形態では、組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡの対応する一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする１つよりも多い外因性核酸分子を発現することができる。例えば、組換え微生物は、Ｚ１１デサチュラーゼをコードする外因性核酸分子およびＺ９デサチュラーゼをコードする別の外因性核酸分子を発現することができる。
【００２４】
[0024]  一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は、所与のサイクルがそのサイクルでの開始一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡ基質と比べて２つの炭素切断を有する一または多価不飽和Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アシルＣｏＡ中間体を生産する、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性の１つまたは複数の連続するサイクルの後一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡの切断型の一または多価不飽和脂肪アシルＣｏＡへの変換を触媒するアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む。一部の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼは表３ａから選択される。
【００２５】
[0025]  一部の実施形態では、組換え微生物は、好ましくは＞Ｃ１６の、＞Ｃ１４の、＞Ｃ１２のまたは＞Ｃ１０のアシルグリセロール基質のエステル結合を加水分解するアシルグリセロールリパーゼおよび／またはステロールエステルエステラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの内在性または外因性核酸分子をさらに含む。一部の実施形態では、発現されているアシルグリセロールリパーゼおよび／またはステロールエステルエステラーゼ酵素は表３ｂから選択される。
【００２６】
[0026]  一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産を巡って生合成経路と競合する経路における、１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される属由来である。他の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ／Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉからなる群から選択される種由来である。
【００２７】
[0027]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸張経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸張経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡ還元酵素、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００２８】
[0028]  他の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／または再生利用経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／または再生利用経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、トリアシルグリセロールリパーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ステリルエステルヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンテターゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異される、および／またはその活性が低減されるトリアシルグリセロールリパーゼはＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ（TGL3）である。一部の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異される、および／またはその活性が低減される脂肪アシルＣｏＡシンテターゼ（脂肪酸輸送体）は、ＹＡＬＩ０Ｅ１６０１６ｇ（FAT1）である。
【００２９】
[0029]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪酸分解経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている。ある特定の実施形態では、脂肪酸分解経路はベータ酸化経路である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、アシルＣｏＡオキシダーゼ、多機能エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードしている微生物宿主の１つまたは複数の遺伝子は、所望の鎖長を超えた所望の脂肪アシルＣｏＡの切断を取り除くまたは低減するために欠落しているまたは下方調節されている。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ１（ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ２（ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ３（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ４（ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ５（ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ６（ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＯＸ１（ＹＧＬ２０５Ｗ）；Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ２（ＣａＯ１９．１６５５、ＣａＯ１９．９２２４、ＣＴＲＧ＿０２３７４、Ｍ１８２５９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ４（ＣａＯ１９．１６５２、ＣａＯ１９．９２２１、ＣＴＲＧ＿０２３７７、Ｍ１２１６０）、およびＣａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ５（ＣａＯ１９．５７２３、ＣａＯ１９．１３１４６、ＣＴＲＧ＿０２７２１、Ｍ１２１６１）からなる群から選択される１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【００３０】
[0030]  一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）、グリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼ（GPLAT）および／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）をコードする組換え微生物の１つまたは複数の遺伝子は欠落しているまたは下方調節されており、１つまたは複数の異種ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＬＡＴ、またはＤＧＡＴバリアントで置き換えられている。一部の実施形態では、１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼバリアントは表３ｃから選択される１つまたは複数の異種アシルトランスフェラーゼに由来している。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１４０１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇおよびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＢＬ０１１ｗ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＤＬ０５２ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ１７５Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＲ１３９Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＮＲ００８ｗおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ２４５ｃ、ならびに  Ｃａｎｄｉｄａ  Ｉ５０３＿０２５７７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２６３０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．２５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．７８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．９４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０１６８７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１０４３、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．８６４５、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４７５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１３４３９、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４３９０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．６９４１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１４２０３およびＣａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０６２０９からなる群から選択される１つまたは複数の内在性アシルトランスフェラーゼ酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【００３１】
[0031]  ある特定の実施形態では、脂肪酸分解経路はオメガ酸化経路である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、モノオキシゲナーゼ（CYP52）、脂肪アルコールオキシダーゼ、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ２５９８２ｇ（ＡＬＫ１）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ０１３２０ｇ（ＡＬＫ２）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ２３４７４ｇ（ＡＬＫ３）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ１３８１６ｇ（ＡＬＫ４）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ１３８３８ｇ（ＡＬＫ５）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ０１８４８ｇ（ＡＬＫ６）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ａ１５４８８ｇ（ＡＬＫ７）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１２１２２ｇ（ＡＬＫ８）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ０６２４８ｇ（ＡＬＫ９）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ２０７０２ｇ（ＡＬＫ１０）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１００５４ｇ（ＡＬＫ１１）およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ａ２０１３０ｇ（ＡＬＫ１２）からなる群から選択される１つまたは複数の内在性シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼの欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【００３２】
[0032]  他の実施形態では、組換え微生物は、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ８、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１５、ＰＥＸ１７、ＰＥＸ１８、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２１、ＰＥＸ２２、ＰＥＸ２５、ＰＥＸ２７、ＰＥＸ２８、ＰＥＸ２９、ＰＥＸ３０、ＰＥＸ３１、ＰＥＸ３２およびＰＥＸ３４またはその任意の組合せからなる群から選択される。
【００３３】
[0033]  別の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、補酵素の細胞内レベルを増加するようにさらに操作されている。ある特定の実施形態では、補酵素はＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質を発現するようにさらに操作されている。別の実施形態では、１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質の発現は補助基質の補充と連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作されている。
【００３４】
[0034]  一部の実施形態では、組換え微生物は１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素を発現し、１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作されている。一部の実施形態では、発現されている１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は、欠落しているまたは下方調節されている１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素とは異なっている。他の実施形態では、発現されている１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の鎖長を調節している。他の実施形態では、発現されている１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は表３ａから選択される。
【００３５】
[0035]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかにおいて使用される組換え微生物は本明細書に開示されている。
【００３６】
[0036]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかにおいて使用される組換え微生物を作製する方法は本明細書に開示されている。
【００３７】
[0037]  一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分は、（Ｚ）−３−ヘキセン酸、（Ｚ）−３−ノネン酸、（Ｚ）−５−デセン酸、（Ｅ）−５−デセン酸、（Ｚ）−７−ドデセン酸、（Ｅ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−９−ドデセン酸、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン酸（dodecadienoic acid）、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸（tetradecenoic acid）、（Ｚ）−１１−テトラデセン酸、（Ｅ）−１１−テトラデセン酸、（Ｚ）−７−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエン酸（hexadecadienoic acid）、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（Ｚ）−１３−オクタデセン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９，１２，１５−トリコサペンタエン酸（tricosapentaenoic acid）、またはこれらの任意の組合せから選択される。別の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分は、（Ｚ）−９−テトラデセン酸（Ｚ９−１４：ＣＯＯＨ）、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（Ｚ１１−１６：ＣＯＯＨ）および（Ｚ）−１１−オクタデセン酸（Ｚ１１−１８：ＣＯＯＨ）からなる群から選択される。別の実施形態では、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは、１つまたは複数の昆虫フェロモン、香料、風味および／またはポリマー中間体を含む。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは、１つまたは複数の昆虫フェロモンを含む。
【００３８】
[0038]  本明細書に記載される組換え微生物および方法を使用して作製することができる脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、または脂肪酢酸の形態での例示的な昆虫フェロモンは、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセニルアセテート、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエナール、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエナール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン−１−オル、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエニルアセテート、（Ｚ）−３−ノネン−１−オル、（Ｚ）−５−デセン−１−オル、（Ｚ）−５−デセニルアセテート、（Ｅ）−５−デセン−１−オル、（Ｅ）−５−デセニルアセテート、（Ｚ）−７−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−７−ドデセニルアセテート、（Ｅ）−８−ドデセン−１−オル、（Ｅ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−８−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−９−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセン−１−オル、（Ｚ）−１１−テトラデセン−１−オル、（Ｚ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｅ）−１１−テトラデセン−１−オル、（Ｅ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｚ）−７−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−７−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−９−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−１３−オクタデセン−１−オル、および（Ｚ）−１３−オクタデセナールを含むがこれらに限定されない。
【００３９】
[0039]  化学的変換工程を含む本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分を単離する工程、任意選択により特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する(enrich)工程、および１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程であって、脂肪酸誘導体を生産する、工程をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＦＡへの鹸化を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＡＡＥへのエステル化を含む。一実施形態では、特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する任意選択による工程は分離方法を含む。別の実施形態では、分離方法は蒸留および／またはクロマトグラフィーを含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００４０】
[0040]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程は、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の化学量論的還元剤に接触させる工程を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学量論的還元剤は、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムＶｉｔｒｉｄｅ（Red-Al, Vitride, SMEAH）および／または水素化ジイソブチルアルミニウム（DIBAL）を含む。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程は、還元剤を改変するためのバルキーな環状窒素ルイス塩基を含む。一実施形態では、バルキーな環状窒素ルイス塩基は１つまたは複数の脂肪アルデヒドの生産のための還元工程の選択性を与える。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００４１】
[0041]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の脂肪アルコールに還元する工程は、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の遷移金属触媒に接触させる工程を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遷移金属触媒は１つまたは複数の第ＶＩＩＩ族触媒を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【００４２】
[0042]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、生産された脂肪アルコールは酸化工程により脂肪アルデヒドにさらに酸化される。一部の実施形態では、酸化工程は１つまたは複数の部分的酸化方法を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分的酸化方法はＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯを含む。他の実施形態では、酸化工程は銅触媒好気性酸化を含む。
【００４３】
[0043]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、生産された１つまたは複数の脂肪アルコールは１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルにさらに化学的に変換される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程は、１つまたは複数の脂肪アルコールを無水酢酸に接触させる工程を含む。
【００４４】
[0044]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸を生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸は分離手順によりさらに濃縮される。
【００４５】
[0045]  別の態様では、本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸を生産する方法のいずれかにより生産される１つまたは複数の組成物が提供される。
【００４６】
[0046]  本開示の説明的な実施形態を以下の図面において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】[0047]脂肪アルコールおよび脂肪アルデヒドの半生合成生産の概念を説明する図である。
【図２】[0048]飽和および不飽和分子のアルコールおよびアルデヒドへの変換を説明する図である。
【図３】[0049]提案したバイオヒドロキシル化および（E）−５−デセンへの脂肪アシルＣｏＡ還元ルートを説明する図である。
【図４】[0050]１９７６年から２０１６年の予測までの１７種の商品油の生産を説明する図である（Gunstone, F.D. Vegetable Oils in Food Technology: Composition, Properties and Uses. Wiley-Blackwell, 2011）。
【図５】[0051]種々の植物油のクロマトグラムのオーバーレイを示す図である。Ｎｏ．５（青）のチリヘーゼルナッツ油のみが、メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートに対応する６．２分の保持時間にピークを示す。
【図６】[0052]ＴＭＳＨ（上）でエステル交換されたチリヘーゼルナッツ油と、アルカリ性メタノリシスで生産されたバイオディーゼル（下）の比較を示す図である。クロマトグラムは類似しているように見えるが、見かけのピーク面積に僅かな相違が見られる。
【図７】[0053]単一蒸留で収集された種々の分画のＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムのオーバーレイを示す図である。第１の分画（赤）は５５〜８２℃で収集され、Ｃ１６化合物の最大の分画を含む（約６分）。第２の分画（緑）は１２０〜１４６℃で収集された。物質の大部分は種々のＣ１８酸であるが、この分画にはまだ顕著な量のＣ１６が見られる。分画３（青）は種の残渣を含む。Ｃ１６は殆ど見られないが、長鎖ホモログ（約９〜１１分）の大部分が見られる。
【図８】[0054]改変Ｒｅｄ−Ａｌを用いるエステルのアルデヒドへの還元ならびにその調製を示す図である（Shin WKら、(2014) Bull. Korean Chem. Soc. 35: 2169-2171）。
【図９】[0055]基質および生成混合物のオーバーレイの一部を示す図である。基質（メチル(Z)-ヘキサデカ-11-エノエート、１１Ｚ−Ｃ１６：１−ＣＯＯＨ）のスペクトルを黒で示し、生成物（（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エナール、１１Ｚ−Ｃ１６：−ＣＨＯ；１２％（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エノール、１１Ｚ−Ｃ１６：１−ＣＨ２ＯＨ）のスペクトルを紫で示す。
【図１０】[0056]Ｖｉｔｒｉｄｅ還元に関する種々のスペクトルの集成を示す図である。図１０Ａ：真正標準［（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エナールおよび（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エノール］と、Ｖｉｔｒｉｄｅ還元反応で得られた生成混合物のオーバーレイ。図１０Ｂ：スペクトルに追加的なピークが存在することの観察。これは、ＢＳＴＦＡの代わりに誘導体化剤を用いなかった１か月経過後のスペクトルには見られなかった。図１０Ｃ：真正標準（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エノールの断片化パターン。図１０Ｄ：４．１分における生成物ピークの断片化パターン。図１０Ｅ：真正標準（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エナールの断片化パターン。図１０Ｆ：５．７５分における生成物ピークの断片化パターン。
【図１１】[0057]Ｖｉｔｒｉｄｅ還元によって得られた生成混合物のオーバーレイを示す図である。混合物を４０℃、真空下で濃縮している間に、主生成物（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エナール（５．７分）は時間とともに失われる。３０分後には比較的多い量が見られるが、１５０分後には約２５％しかない。これは初期の３０分間に真空中で生成物のいくらかが失われたことをも示している。このステップは精製目的のためにさらに検討することができる。
【図１２】[0058]コドン最適化Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼバリアントのみがＳＰＶ１４０スクリーンにおいて検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産することを示す図である。対照＝ＳＰＶ１４０のｐＰＶ１０１インテグラント、Ｔ．ｎｉ天然＝天然コドン使用Ｔ．ｎｉ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９５）、Ｔ．ｎｉ  ＨＳ  ｏｐｔ＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化Ｔ．ｎｉ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９６）、Ｔ．ｎｉ  ＨＳ  ｏｐｔ  Ｙｌリーダー＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化および交換したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１リーダー配列を有するＴ．  ｎｉ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９７）、Ｈ．ｚｅａ天然＝天然コドン使用Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９８）、Ｈ．ｚｅａ  ＨＳ  ｏｐｔ＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９９）、Ｈ．ｚｅａ  ＨＳ  ｏｐｔ  Ｙｌリーダー＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化および交換したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１リーダー配列を有するＨ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ２００）、Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ天然＝天然コドン使用Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ  Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ２０１）。全てのデータは３回の生物学的反復の平均である。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１３】[0059]コドン最適化Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼバリアントのみがＳＰＶ３００スクリーンにおいて検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産することを示す図である。ラベルは親株およびデサチュラーゼ発現カセットのプラスミドを示す。ｐＰＶ１０１＝ｈｒＧＦＰ対照、ｐＰＶ１９８＝天然コドン使用Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ１９９＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ２００＝Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化および交換したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１リーダー配列を有するＨ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ２０１＝天然コドン使用Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ  Ｚ１１デサチュラーゼ。
【図１４】[0060]ＳＰＶ１４０およびＳＰＶ３００バックグラウンドにおけるデサチュラーゼスクリーンのための最終細胞密度を示す図である。挿入したデサチュラーゼカセットを有するＳＰＶ３００株がより高い細胞密度に増殖した。
【図１５】[0061]Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼを発現するＳＰＶ１４０およびＳＰＶ３００株の個別の分離したＺ１１−ヘキサデセン酸タイターを示す図である。
【図１６】[0062]特徴付けしたΔ１１デサチュラーゼのＺ１１−１４酸（メチルミリステートを供給−１４ＭＥ）およびＺ１１−１６酸（メチルパルミテートを供給−１６ＭＥ）タイターを示す図である。ＳＰＶ３００＝デサチュラーゼライブラリー挿入ペアレント。ＳＰＶ２９８＝ＳＰＶ３００の原栄養性ペアレント、陰性対照。ＳＰＶ４５９＝現在最適なデサチュラーゼを有するＳＰＶ３００（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、配列番号１）、陽性対照。ＤＳＴ００６におけるデサチュラーゼはＳＰＶ４５９で発現されるＨ．ｚｅａデサチュラーゼと遺伝的に等価であり、内部ライブラリー対照として役立つ。
【図１７】[0063]メチルパルミテート（１６ＭＥ）またはメチルミリステート（１４ＭＥ）を供給したＳＰＶ２９８（陰性対照、親株）およびＳＰＶ４５９（Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼを有するＳＰＶ２９８系統、配列番号１）のＣ１４およびＣ１８生産プロファイルを示す図である。
【図１８】[0064]下流プロセス（ＤＳＰ）オーバービューを示す図である。ＤＳＰプロセスの個別の単位操作を示す。
【図１９】[0065]Ｚ１１−ヘキサデセノール出発物質のＧＣ−ＦＩＤトレースを示す図である。
【図２０】[0066]Ｚ１１−ヘキサデセノールからＺ１１−ヘキサデセナールへのＴＥＭＰＯ漂白酸化の酸化生成物のＧＣ−ＦＩＤトレースを示す図である。
【図２１】[0067]Ｚ１１−１６酸生産株の系統樹を示す図である。全株についての株系統を実施例６に記載する。ＳＰＶ１１９９とＳＰＶ１２００の遺伝子型は同一であるが、異なった親株から誘導された。
【図２２−１】[0068]図２２は、２８℃および３２℃の両方における高グルコース培地中の増殖速度およびＺ１１−１６酸の生産を示す図である。図２２Ａ：最初の基質添加の前の最初の７時間の間の初期増殖速度。オンライン細胞密度測定から計算した。図２２Ｂ：最大比生産性（７〜２３時間）。細胞密度はプレートリーダーを用いた独立の測定から取得する。
【図２２−２】図２２Ｃ：４８時間（観察した最大）Ｚ１１−１６酸タイター。挿入した数字は独立した測定の数を示す。
【図２３】[0069]グリセロールなしの高グルコース培地中の対照およびＧＵＴ２欠落株の初期増殖速度を示す図である。５ｇ／Ｌのグリセロールがない培地を用いて試験した４つの株全てで、初期増殖速度はより小さかった。
【図２４】[0070]高グルコース培地中における最大の比生産性の増加をデサチュラーゼコピー数とともに示す図である。ＳＰＶ９６３、ＳＰＶ９６８、およびＳＰＶ９６９系統におけるそれぞれの株の平均比生産性を点で表わしている。単一のコピー点はＳＰＶ４５８の平均比生産性である。ＳＰＶ４５９における隣接繰り返し配列の存在のため、正確なコピー数は不明である。ＳＰＶ４５９の平均比生産性を点線で示す。全てが３つのＨ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼコピーを有し、ＦＡＴ１欠落を含む株ＳＰＶ１０５６、ＳＰＶ１１９９、およびＳＰＶ１２００を赤の輪郭で示す。これらの株を３２℃で培養すると比生産性の低下を示した。図２４Ａ：デサチュラーゼコピー数の関数としての２８℃における平均比生産性。図２４Ｂ：デサチュラーゼコピー数の関数としての３２℃における平均比生産性。
【図２５−１】[0071]図２５は、高グルコース培地中のＺ１１−１６酸の性能指標の相関を示す図である。図２５Ａ：Ｚ１１−１６酸の４８時間タイターは観察された最大比生産性と中程度に相関する。相関は３２℃で改善される。図２５Ｂ：Ｚ１１−１６酸の４８時間タイターおよび選択性も中程度に相関する。図２５Ｃ：Ｚ１１−１６酸の２３時間および４８時間選択性は３２℃で弱く相関する。図２５Ｄ：Ｚ１１−１６酸の４８時間タイターと、推定脂質分画はあまりよく相関しない。
【図２５−２】図２５Ｅ：Ｚ１１−１６酸の２３時間タイターと選択性は強く密集している。図２５Ｆ：全脂質分画の推定は観察された最大比生産性と相関しない。
【図２６】[0072]高グルコース培地中、２８℃と３２℃の両方におけるＺ１１−１６酸の選択性および推定脂質分画を示す図である。図２６Ａ：４８時間の時点におけるＺ１１−１６酸の選択性。図２６Ｂ：脂質分画（全脂肪酸／乾燥細胞重量）は、測定した脂肪酸濃度を用い、測定したＯＤ６００細胞密度に前もって観察した係数０．７８ｇＤＣＷ／Ｌ／ＯＤ６００を掛けることによって推定した。挿入した数字は独立した測定の数を示す。ＴＦＡ＝全脂肪酸、ＤＣＷ＝乾燥細胞重量。
【図２７】[0073]高グルコースおよび高グリセロール培地を比較したＨＳＤ０６２の初期増殖速度を示す図である。両方の培地で初期増殖速度は同様であった。
【図２８−１】[0074]図２８は、２８℃における高グリセロール培地と高グルコース培地に対する株特異的応答を示す図である。図２８Ａ：７〜２３時間のＺ１１−１６酸の比生産性。図２８Ｂ：７〜４１．５時間のＺ１１−１６酸の比生産性。
【図２８−２】図２８Ｃ：４１．５時間におけるＺ１１−１６酸タイター。図２８Ｄ：４１．５時間におけるＺ１１−１６酸の選択性。図２８Ｅ：４１．５時間における推定脂質分画（全脂肪酸/乾燥細胞重量）。脂質分画は測定した脂肪酸濃度を用い、測定したＯＤ６００細胞密度に前もって観察した係数０．７８ｇＤＣＷ／Ｌ／ＯＤ６００を掛けることによって推定した。
【図２９】[0075]ＨＳＤ０６２からの脂肪酸タイターを示す図である。上列：高グルコース培地（ＦＥＲＭ１）中におけるタイター。下列：高グリセロール培地（ＦＥＲＭ３）中におけるタイター。
【図３０】[0076]ＨＳＤ０６２からの全脂肪酸（ＴＦＡ）タイターを示す図である。上列：高グルコース培地（ＦＥＲＭ１）中におけるＴＦＡタイター。下列：高グリセロール培地（ＦＥＲＭ３）中におけるＴＦＡタイター。
【図３１−１】[0077]図３１は、試料を採取した全てのウェルからのデータを含むＺ１１−１６酸Ｂｄの性能パラメーターを示す図である。個別のウェルのプレートシールの下側に基質／バイオフィルムが形成された場合には、いくつかの反復培養を低酸素条件下でインキュベートした。影響を受けたウェルは、溶存酸素濃度をオンラインで追跡することによって同定した。さらに、これらのウェルでは細胞密度と脂肪酸タイターが恒常的により低かった。ここで全ての実験にわたって全てのウェルについてのデータを提示する。挿入した数字は独立した測定の数を示す。図３１Ａ：（７〜２３時間の）最大比生産性。細胞密度はプレートリーダーを用いる独立した測定から取得する。図３１Ｂ：４８時間（観察された最大の）Ｚ１１−１６酸タイター。
【図３１−２】図３１Ｃ：４８時間のＺ１１−１６酸の選択性。図３１Ｄ：脂質分画（全脂肪酸/乾燥細胞重量）は、測定した脂肪酸濃度を用い、測定したＯＤ６００細胞密度に前もって観察した係数０．７８ｇＤＣＷ／Ｌ／ＯＤ６００を掛けることによって推定した。
【図３１−３】図３１Ｅ：ＨＳＤ０４３のカラム３ウェルの低酸素条件を示すオンラインの溶存酸素測定の例。全てのウェルは同じ条件下で開始し、同じ株を用いて接種した。シールは２３時間および３１時間で交換した。ウェルＤ０３、Ｅ０３、およびＦ０３は、基質の添加（７時間）の後と最初のサンプリング（２３時間）の期間、異なった継続時間で低酸素とした。
【図３２】[0078]アシルＣｏＡオキシダーゼ活性によって制御された選択的ベータ酸化によって生成したアシルＣｏＡ中間体の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
配列
[0079]  配列番号１〜配列番号４７の配列表は本出願の一部であり、参照により本明細書に組み込まれる。配列表は本文書の最後に提供される。
【００４９】
詳細な説明
定義
[0080]  以下の定義および略字は本開示の説明のために使用されることになる。
【００５０】
[0081]  本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「１つ（a）」、「１つ（an）」および「その（the）」は、文脈が他の方法で明白に示していなければ、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「フェロモン（a pheromone）」への言及は複数のそのようなフェロモンを含み、「微生物（the microorganism）」への言及は１つまたは複数の微生物への言及を含む、などである。
【００５１】
[0082]  本明細書で使用されるように、用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、「含有する（containing）」またはこの他の任意の変形は、非排他的包含に及ぶことが意図されている。要素の一覧表を含む組成物、混合物、プロセス、方法、項目、または器具は必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではないが、明確に収載されているわけでもまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、項目、もしくは器具に本来備わっているわけでもない他の要素を含むことがある。さらに、それとは反対であると明確に述べられていなければ、「または（or）」とは包含的「または（or）」のことであって、排他的「または（or）」のことではない。
【００５２】
[0083]  数値を修飾するのに本明細書で使用される用語「約（about）」および「およそ（around）」は、その明確な値を囲む近距離を示す。「Ｘ」が値であるとすると、「約Ｘ」または「およそＸ」は０．９Ｘから１．１Ｘまでの値、または、一部の実施形態では、０．９５Ｘから１．０５Ｘまでの値を示す。「約Ｘ」または「およそＸ」へのいかなる言及も具体的には少なくともＸ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、および１．０５Ｘの値を示す。したがって、「約Ｘ」および「およそＸ」は、例えば、「０．９８Ｘ」のようなクレーム限定に対する明細書のサポートを教示し提供することが意図されている。
【００５３】
[0084]  本明細書で使用されるように、用語「微生物の」、「微生物（microbial organism）」、および「微生物（microorganism）」は、古細菌界、細菌界または真核生物界であって、後者の界は酵母および線維状真菌、原生動物、藻類、または高等原生生物を含む、界内に含まれる微小な細胞として存在する任意の生物を含む。したがって、用語は、原核もしくは真核細胞または顕微鏡的大きさを有する生物を包含することが意図されており、あらゆる種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を含む。化学物質の生産のために培養することが可能ないかなる種の細胞培養物も含まれる。
【００５４】
[0085]  本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、組換え微生物は原核微生物である。一部の実施形態では、真核微生物は細菌である。「細菌」または「真正細菌」とは、原核生物の界である。細菌は以下のような少なくとも１１の異なる群：（１）グラム陽性（グラム＋）菌、その中には２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在する；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（大半の「一般的な」グラム陰性菌を含む）；（３）ラン藻、例えば、酸素発生型光合成生物（oxygenic phototrophs）；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）プランクトミセス属；（６）バクテロイデス属、フラボバクテリア綱；（７）クラミジア；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性小球菌および近縁種；（１１）テルモトガ門およびテルモシフォ好熱菌（Thermosipho thermophiles）を含む。
【００５５】
[0086]  「グラム陰性菌」は、球菌、非腸内桿菌（nonenteric rods）、および腸内桿菌（enteric rods）を含む。グラム陰性菌の属は、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｉｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む。
【００５６】
[0087]  「グラム陽性菌」は、球菌、非芽胞形成桿菌（nonsporulating rods）、および芽胞形成桿菌（sporulating rods）を含む。グラム陽性菌の属は、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。
【００５７】
[0088]  用語「組換え微生物」と「組換え宿主細胞」は本明細書では互換的に使用され、内在性酵素を発現するもしくは過剰発現する、ベクターに、組込み構築物に含まれる酵素などの異種酵素を発現するように遺伝子改変されている、または内在性遺伝子の発現に変更がある微生物のことである。「変更」とは、１つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは等価なＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が、発現、レベル、または活性が変更がない場合に観察されるよりも大きくなるまたは少なくなるように、上方調節されているまたは下方調節されていることを意味する。例えば、用語「変更する」は「阻害する」を意味することがあるが、単語「変更する」の使用はこの定義に限定されない。用語「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」とは、特定の組換え微生物だけではなく、そのような微生物の子孫または潜在的子孫のことでもあると理解されている。突然変異または環境の影響のせいである特定の改変が次の世代で生じることがあるので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではないことがあるが、それでも本明細書で使用される用語内に含まれている。
【００５８】
[0089]  遺伝子配列に関する用語「発現」とは、遺伝子の転写、および、必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳のことである。したがって、文脈から明らかになるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳から生じる。宿主細胞における所望の産物の発現のレベルは、細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択された配列によりコードされている所望の産物の量のどちらかに基づいて決定することができる。例えば、選択された配列から転写されるｍＲＮＡはｑＲＴ−ＰＣＲによりまたはノーザンハイブリダイゼーションにより定量化することが可能である（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年）参照）。選択された配列によりコードされるタンパク質は種々の方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、タンパク質の生物活性についてアッセイすることにより、またはタンパク質を認識して結合する抗体を使用して、そのような活性とは無関係なウェスタンブロッティングもしくは放射性免疫アッセイなどのアッセイを用いることにより定量化することが可能である。Sambrookら、１９８９年、上記参照。
【００５９】
[0090]  用語「ポリヌクレオチド」は本明細書では用語「核酸」と互換的に使用され、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖、センスもしくはアンチセンスデオキシリボ核酸（DNA）、および必要に応じて、ｓｉＲＮＡを含む、任意の長さの一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスリボ核酸（RNA）を含むがこれらに限定されない、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはこの類似物を含む２つ以上のモノマーで構成された有機ポリマーのことである。用語「ヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジン塩基におよびリン酸基に結合しているリボースまたはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本構造単位である数個の化合物のいずれかのことである。用語「ヌクレオシド」とは、デオキシリボースまたはリボースと組み合わされたプリンまたはピリミジン塩基からなり特に核酸中に見出される化合物（グアノシンまたはアデノシンとして）のことである。用語「ヌクレオチド類似物」および「ヌクレオシド類似物」とは、それぞれ、１つまたは複数の個々の原子が異なる原子でまたは異なる官能基で置き換えられているヌクレオチドまたはヌクレオシドのことである。したがって、用語ポリヌクレオチドは任意の長さの核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、この類似物および断片を含む。３つ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドはヌクレオチドオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【００６０】
[0091]  本明細書に記載されるポリヌクレオチドは「遺伝子」を含むことおよび本明細書に記載される核酸分子は「ベクター」または「プラスミド」を含むことが理解されている。したがって、用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも呼ばれるが、１つまたは複数のタンパク質または酵素のすべてまたは一部を構成するアミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドのことであり、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含むことがある。遺伝子の転写される領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域、ならびにコード配列を含むことができる。
【００６１】
[0092]  本明細書で使用される用語「酵素」とは、１つまたは複数の化学または生化学反応を触媒するまたは促進する任意の物質のことであり、この物質は通常、全体的にまたは部分的にポリペプチド（単数または複数）で構成されている酵素を含むが、ポリヌクレオチドを含む異なる分子で構成されている酵素を含むことが可能である。
【００６２】
[0093]  本明細書で使用されるように、用語「天然に存在しない」は、本開示の微生物に関連して使用される場合、微生物が、参照される種の野生型菌株を含む、参照される種の天然に存在する菌株には通常見出されない少なくとも１つの遺伝子変異を有することを意味することが意図されている。遺伝子変異は、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠落および／または微生物遺伝子物質の他の機能破壊を含む。そのような改変は、例えば、参照された種の異種、同種、または異種と同種の両方のポリペプチドのコード領域およびその機能的断片を含む。追加の改変は、例えば、改変により遺伝子またはオペロンの発現が変更される非コード調節領域を含む。例示的な天然に存在しない微生物は、本明細書に記載される不飽和脂質部分の生産のために工学的に操作された組換え微生物を含む。
【００６３】
[0094]  これとは対照的に、用語「天然に存在する」は、本開示の生物に関連して使用される場合、１つまたは複数の不飽和脂質部分の組換え生産のための遺伝子工学的に操作された生合成経路を含むように操作されていない生物を意味することが意図されている。
【００６４】
[0095]  種々の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関連して本明細書で使用される用語「外因性の」とは、自然状態の所与の酵母、細菌、生物、微生物、もしくは細胞には通常もしくは天然には見出されないおよび／またはこれらによって産生されない分子のことである。
【００６５】
[0096]  一方、種々の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関連して本明細書で使用される用語「内在性の」または「自然のままの」とは、自然状態の所与の酵母、細菌、生物、微生物、もしくは細胞には通常もしくは天然に見出されるおよび／またはこれらによって産生される分子のことである。
【００６６】
[0097]  改変された宿主細胞という文脈で本明細書で使用される用語「異種の」とは、以下の：（ａ）分子（複数可）は宿主細胞にとって外来性（「外因性」）である（すなわち、宿主細胞には天然には見出されない）；（ｂ）分子（複数可）は所与の宿主微生物もしくは宿主細胞に天然に見出される（すなわち、「内在性である」）が、細胞内の天然ではない位置でもしくは天然ではない量で産生される；および／または（ｃ）分子（複数可）はヌクレオチドもしくはアミノ酸配列が内在性のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列（複数可）とは異なり、内因的に見出される内在性のヌクレオチドもしくはアミノ酸とはヌクレオチドもしくはアミノ酸配列が異なる分子が細胞において非天然の（例えば、天然に見出されるよりも大きな）量でまたは細胞において非天然の（例えば、天然に見出されるよりも大きな）活性レベルで産生される、のうちの少なくとも１つが当てはまる、種々の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等のことである。
【００６７】
[0098]  第１の科または種の本来の酵素または遺伝子に関して本明細書で使用される用語「相同体」とは、第１の科または種の本来の酵素または遺伝子に一致する第２の科または種の酵素または遺伝子であると機能的、構造的、またはゲノム分析により判定される第２の科または種の異なる酵素または遺伝子のことである。相同体はほとんどの場合、機能的、構造的、またはゲノム類似性を有する。酵素または遺伝子の相同体を遺伝子プローブおよびＰＣＲを使用して容易にクローニングすることが可能である技法は公知である。クローン化された配列を相同体であると同定することは、機能アッセイを使用しておよび／または遺伝子のゲノムマッピングにより確認することが可能である。
【００６８】
[0099]  タンパク質は、遺伝子によりコードされているアミノ酸配列が第２の遺伝子のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に「相同性」を有するまたは「相同的」である。代わりに、タンパク質は、２つのタンパク質が「類似する」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に相同性を有する。したがって、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を有することを意味することが意図されている。ある特定の例では、２つのタンパク質間の相同性は、進化により関連付けられるその共通の先祖を示している。
【００６９】
[00100]  本明細書で使用される用語「脂肪酸」とは、構造Ｒ−ＣＯＯＨの化合物のことであり、ＲはＣ６からＣ２４飽和、不飽和、直鎖状、分岐または環状炭化水素であり、カルボキシル基は１位にある。特定の実施形態では、ＲはＣ６からＣ２４飽和または不飽和直鎖状炭化水素であり、カルボキシル基は１位にある。
【００７０】
[00101]  本明細書で使用される用語「脂肪アルコール」とは、式Ｒ−ＯＨを有する脂肪族アルコールのことであり、ＲはＣ６からＣ２４飽和、不飽和、直鎖状、分岐または環状炭化水素である。特定の実施形態では、ＲはＣ６からＣ２４飽和または不飽和直鎖状炭化水素である。
【００７１】
[00102]  用語「脂肪アシルＣｏＡ」とは、構造Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１を有する化合物のことであり、Ｒ１は補酵素Ａであり、用語「脂肪アシルＡＣＰ」とは構造Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１を有する化合物のことであり、Ｒ１はアシルキャリアタンパク質ＡＣＰである。
【００７２】
[00103]  本明細書で使用される用語「脂肪酸誘導体」とは、脂肪酸に由来する任意の有機分子実体のことである。脂肪酸誘導体は、飽和脂肪酸、一不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、分岐脂肪酸、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）および脂肪酸のアルキルエステルを含むがこれらに限定されない。
【００７３】
[00104]  本明細書で使用される用語「半生合成」とは、生物学的手段と非生物学的手段を組み合わせることにより産物を合成することである。一実施形態では、生物学的手段は、天然に存在する生物などの１つまたは複数の天然の供給源から１つまたは複数の化合物または分子を入手することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は、植物、細菌、藻類、酵母、および／または細胞培養物が可能である。別の実施形態では、生物学的手段は、化合物または分子を生産するように工学的に操作されている１つまたは複数の組換え微生物から１つまたは複数の化合物または分子を入手することを含む。これらの化合物または分子は、化学合成などの非生物学的手段により最終産物までにさらに改変することが可能である。化学合成は開始物質を使用して種々の化学反応を実施し、他の化学物質との反応によりその分子構造を変化させることによる化合物の調製である。有機合成の開始物質は、石油および天然ガスから取り除いた単純な化合物でもまたは植物および動物源から大量に単離されたもっと複雑な化学物質でも可能である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分からの１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドの半生合成は、１つもしくは複数の天然に存在する生物から１つもしくは複数の不飽和脂質部分を入手することまたは１つもしくは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つもしくは複数の組換え微生物において１つもしくは複数の不飽和脂質部分を生産すること；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および／または１つもしくは複数の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＡＥ）に化学的に変換すること、ならびに１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元し、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産することを含む。
【００７４】
[00105]  本明細書で使用される用語「不飽和脂質部分」とは、１つまたは複数の二重結合を有する脂質または脂質誘導体のことである。脂質は、水溶液には不溶性であり、有機溶媒には可溶性である生物学的分子である。不飽和脂質部分は、一不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、分岐不飽和脂肪酸および不飽和トリアシルグリセロール（不飽和トリグリセリド）を含むことが可能であるが、これらに限定されない。不飽和脂質部分は、脂肪、ステロール、ワックス、オイル、脂溶性ビタミン、リン脂質、スフィンゴ脂質、プラスマロゲン、エイコサノイド、テルペン、ならびに石鹸および界面活性剤を含むことが可能である。
【００７５】
[00106]  本明細書で使用される用語「非生物学的変換」とは、化学的手段を使用しての１つまたは複数の基質の１つまたは複数の産物への変換のことである。一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分は１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥに化学的に変換される。別の実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥは、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムＶｉｔｒｉｄｅ（Red-Al, Vitride, SMEAH）および／または水素化ジイソブチルアルミニウム（DIBAL）などの１つまたは複数の化学量論的還元剤に接触させることにより、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元される。さらに、バルキーな環状窒素ルイス塩基を使用すれば、１つまたは複数の脂肪アルデヒドの生産のための還元工程の選択性を与えるように還元剤を改変することが可能である。別の実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールに還元する工程は、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の第ＶＩＩＩ族触媒などの１つまたは複数の遷移金属触媒に接触させる工程を含む。別の実施形態では、生産される脂肪アルコールは酸化工程により脂肪アルデヒドにさらに酸化される。酸化工程はＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯなどの１つまたは複数の部分的酸化方法が可能である。他の実施形態では、酸化工程は銅触媒好気性酸化を含む。
【００７６】
導入
[00107]  本開示は、低コスト供給原料からの価値ある産物の費用効率の高い生産のための新規の技術の必要性に取り組む。具体的には、本発明者らは、生物源からの１つもしくは複数の不飽和脂質部分の入手または生産を、１つもしくは複数の不飽和脂質部分の１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドへの非生物学的手段による変換と組み合わせることにより、１つもしくは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法の開発によりこの必要性に取り組んできた。１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは、昆虫フェロモン、香料、風味および／またはポリマー中間体として有用であり得る。したがって、本開示の態様は、不飽和脂質部分は、天然に存在する生物から入手されるまたは低コスト供給原料から不飽和脂質部分を生産するように工学的に操作されている組換え微生物により生産することが可能であるという発見であって、昆虫フェロモン、香料、風味およびポリマー中間体を含むがこれらに限定されない種々の価値ある産物として有用である１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産するために従来の合成方法論と組み合わせることが可能な発明者らの発見に基づいている。
【００７７】
[00108]  本出願は、不飽和脂質部分の生合成に有用である組換え微生物、ならびに１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを含む組成物にさらに関する。したがって、本開示の様々な実施形態を使用すれば、脂肪アルコール、アルデヒド、および酢酸から選択される種々の昆虫フェロモンを合成することが可能である。さらに、本明細書に記載される実施形態は香料、風味およびポリマー中間体の合成にも使用することが可能である。
【００７８】
フェロモン
[00109]  上記のように、本開示の実施形態は、１つまたは複数の不飽和脂質部分からの１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドの半生合成を提供する。１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは昆虫フェロモンとして有用であり得る。フェロモンは、種内での化学的コミュニケーションの役目のために特定の昆虫により分泌される揮発性の化学物質である。すなわち、フェロモンは同じ種のメンバーにおいて社会的応答を誘発する分泌されたまたは排泄された化学的因子である。とりわけ、行動または生理に影響を及ぼす、警報フェロモン、食跡（food trail）フェロモン、性フェロモン、集合フェロモン、顕示フェロモン（epideictic pheromones）、触発フェロモン、プライマーフェロモン、および縄張りフェロモン（territorial pheromones）がある。
【００７９】
[00110]  本明細書に開示される組換え微生物および方法を使用して合成することが可能な昆虫フェロモンの非限定的な例は、表１に収載される直鎖状アルコール、アルデヒド、および酢酸を含む。
【００８０】
【表１−１】
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【００８１】
【表１−２】
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【００８２】
【表１−３】
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【００８３】
【表１−４】
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【００８４】
【表１−５】
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【００８５】
【表１−６】
2020124206.tif 000008
【００８６】
【表１−７】
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【００８７】
【表１−８】
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【００８８】
【表１−９】
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【００８９】
【表１−１０】
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【００９０】
【表１−１１】
2020124206.tif 000013
【００９１】
[00111]  一部の態様では、本開示で教示される方法により生産される１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは昆虫フェロモンとして有用であり得る。昆虫の行動を調節する例示的なフェロモンは表２に収載されている。しかし、本明細書に記載される方法および微生物は表１および表２に収載されるＣ６〜Ｃ２０フェロモンの合成に限定されない。むしろ、開示された方法および微生物は、香料、風味およびポリマー中間体を含む、種々の脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、および脂肪酢酸の合成にも利用することが可能である。
【００９２】
【表２−１】
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【００９３】
【表２−２】
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【００９４】
[00112]  大半のフェロモンは、終端水素が官能基で置換されている炭化水素骨格を含む（Ryan MF(2002年). Insect Chemoreception. Fundamental and Applied. Kluwer Academic Publishers）。表２ｂは、式、接頭辞および接尾辞と一緒にいくつかの一般的官能基を示す。隣接している炭素から水素が消失することにより生み出される１つまたは複数の二重結合の存在は、分子の不飽和度を決定し、−アン（ａｎｅ）（多重結合なし）から−エン（ｅｎｅ）まで炭化水素の名称を変える。２つおよび３つの二重結合の存在は、その名称をそれぞれ−ジエンおよび−トリエンで終わらせることにより示される。それぞれの二重結合の位置は、その二重結合が始まる炭素の位置に対応する数字により表され、それぞれの炭素は官能基に結合している炭素から番号が付けられている。官能基に結合している炭素は−１−と指定される。フェロモンは、１０（デカ−）、１２（ドデカ−）、１４（テトラデカ−）、１６（ヘキサデカ−）、または１８（オクタデカ−）炭素長と数える炭化水素鎖長を有する場合があるがこれらに限定されない。二重結合の存在は別の効果を有する。二重結合は、分子を２つの可能な立体配置のうちの１つに固定することにより分子の回転を妨げ、それぞれが異なる分子である幾何異性体を表す。これらは、Ｅ（ドイツ語のＥｎｔｇｅｇｅｎ、反対由来）またはＺ（Ｚｕｓａｍｍｅｎ、一緒に）と命名され、炭素鎖が二重結合の、それぞれ反対（トランス）側または同じ（シス）側で結合している。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
[00113]  本明細書に記載されるフェロモンは、ＩＵＰＡＣ命名法または当業者には公知である種々の略称もしくは変動を使用して言及することが可能である。例えば、（１１Ｚ）−ヘキサデセン−１−アールはＺ−１１−ヘキサデセン−１−アール、Ｚ−１１−ヘキサデセナール、Ｚ−１１−１６：Ａｌｄ、またはＺ−ｘ−ｙ：Ａｌｄとして書くことも可能であり、ｘは二重結合の位置を表しｙは炭化水素骨格の炭素の数を表す。炭化水素骨格上の官能基を同定するための本明細書で使用され当業者には公知である略称は、「Ａｌｄ」アルデヒドを示す、「ＯＨ」アルコールを示す、および「Ａｃ」アセチルを示す、を含む。その上、鎖中の炭素の数は書かれた名称を使用するよりは数字を使用して示すことが可能である。したがって、本明細書で使用されるように、１６炭素で構成された不飽和炭素鎖はヘキサデセンまたは１６として書くことが可能である。
【００９７】
[00114]  フェロモン前駆体を記載するために、類似する略称および語源が本明細書で使用される。例えば、（１１Ｚ）−ヘキサデセン−１−アールの脂肪アシルＣｏＡ前駆体は（１１Ｚ）−ヘキサデセニル−ＣｏＡまたはＺ−１１−１６：アシルＣｏＡとして同定することが可能である。カルボン酸官能基を表す略称は「ＣＯＯＨ」である。脂肪酸は長い炭化水素鎖を有するカルボン酸である。ＩＵＰＡＣ命名法では、カルボキシル炭素はＣ−１である。一般的命名法はＣ−１からα、β、γ、δ、ε等に言及し、カルボキシルからもっとも離れた炭素はωである。脂肪酸：全＃炭素：＃二重結合、Δ二重結合位置を記載する略記法が存在し、二重結合の位置はΔｎで示され、ｎは二重結合が存在するそれぞれの対の数字の少ないほうの炭素を示している。例えば、１８：３Δ８ｔ、Δ１０ｔ、Δ１２ｃは、炭化水素鎖の位置Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２に３つの二重結合がある１８炭素長である脂肪酸のことである。位置Ｃ８およびＣ１０の二重結合はトランス（ｔ）立体配置であり、位置Ｃ１２の二重結合はシス（ｃ）立体配置である。
【００９８】
[00115]  一態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手することを含む。
【００９９】
不飽和脂質部分の供給源としての天然に存在する生物
[00116]  一実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の昆虫である。別の実施形態では、１つまたは複数の昆虫は、鞘翅目、双翅目、膜翅目および鱗翅目を含む。
【０１００】
[00117]  別の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は昆虫ではない。
【０１０１】
[00118]  一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の植物を含む。一部の実施形態では、植物はダイズ、キャノーラ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、ヤシ、ココナツ、オリーブ、ゴマおよび／または
亜麻仁を含む。
【０１０２】
[00119]  一実施形態では、ダイズはＧｌｙｃｉｎｅ属のメンバーである。別の実施形態では、ダイズはＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。ダイズ油トリグリセリド中の主要な不飽和脂肪酸は、多価不飽和αリノレン酸（Ｃ１８：３、約７％〜約１０％）、およびリノール酸（Ｃ１８：２、約５１％）；および一不飽和オレイン酸（Ｃ１８：１、約２３％）である。ダイズ油は、飽和脂肪酸ステアリン酸（Ｃ１８：０、約４％）およびパルミチン酸（Ｃ１６：０、約１０％）も含有する。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１０３】
[00120]  一実施形態では、キャノーラはＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科のメンバーである。別の実施形態では、キャノーラはＢｒａｓｓｉｃａ属のメンバーである。ある特定の実施形態では、キャノーラは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａからなる群から選択される。キャノーラ油は、約６１％のオレイン酸、約２１％のリノール酸、約９％〜約１１％のαリノレン酸、約４％のパルミチン酸および約２％のステアリン酸を有することがあり、残りの割合は他の脂肪酸である。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。商業的食品グレードのキャノーラ油はエルカ酸（Ｃ２２：１）の含有量が２％未満になるように育てられる。
【０１０４】
[00121]  一実施形態では、ワタはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ属のメンバーである。別の実施形態では、ワタはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｔｕｍおよびＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｅｒｂａｃｅｕｍからなる群から選択される。ワタは硬い外皮で囲まれた含油穀粒を有する。綿実油は約５２％のリノール酸、約１７％のオレイン酸、および約２４％のパルミチン酸を有することがあり、残りの割合は他の脂肪酸である。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１０５】
[00122]  一実施形態では、ヒマワリはＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属のメンバーである。別の実施形態では、ヒマワリはＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｇｒｅｓｔｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｂｏｌａｎｄｅｒｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｂｒｅｖｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃｉｌｉａｒｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃｏｌｏｒａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃｕｓｉｃｋｉｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｉｆｆｕｓｅｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｄｉｖａｒｉｓｅｒｒａｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｄｏｒｏｎｉｃｏｉｄｅｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｅｇｇｅｒｔｉｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｅｘｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｇｌａｕｃｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｒａｃｉｌｅｎｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｒｏｓｓｅｓｅｒｒａｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｌａｃｉｎｉａｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｌａｅｔｉｆｌｏｒｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｌａｅｖｉｇａｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｌｕｘｕｒｉａｎｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｎａｖａｒｒｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｎｕｔｔａｌｌｉｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ × ｏｒｇｙａｌｏｉｄｅｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐｏｒｔｅｒｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｃｏｘ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｔｅｒｍｉｓｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｒａｄｕｌａ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｒｅｓｉｎｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ、Ｈｅ��ｉａｎｔｈｕｓ  ｓａｒｍｅｎｔｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｃａｂｅｒｒｉｍｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｉｌｐｈｉｏｉｄｅｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｅｃｉｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒｕｍｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｕｂｃａｎｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｕｂｔｕｂｅｒｏｓｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ、およびＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ×ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓからなる群から選択される。サンフラワー油は約５％のパルミチン酸、約６％のステアリン酸、約３０％のオレイン酸および約５９％のリノール酸を有することがある。しかし、高リノール酸、高オレイン酸および中間オレイン酸などの数種類のサンフラワー油が生産されている。中間オレイン酸サンフラワー油は典型的には、少なくとも６９％のオレイン酸を有する。高オレイン酸サンフラワー油は、少なくとも８２％のオレイン酸を有する。不飽和脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴と気候の両方から強い影響を受ける。
【０１０６】
[00123]  ピーナッツは落花生としても知られる。一実施形態では、ピーナッツはＡｒａｃｈｉｓ属のメンバーである。別の実施形態では、ピーナッツはＡｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａである。ピーナッツ油は約４６％〜約４７％のオレイン酸、約３３％のリノール酸および約１０％のパルミチン酸を有することがある。ピーナッツ油はステアリン酸、アラキジン酸（エイコサン酸、Ｃ２０：０）、ベヘン酸（ドコサン酸、Ｃ２２：０）、リグノセリン酸（テトラコサン酸、Ｃ２４：０）および他の脂肪酸も有することがある。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１０７】
[00124]  一実施形態では、ヤシはＡｒｅｃａｃｅａｅ科のメンバーである。別の実施形態では、ヤシはＥｌａｅｉｓ属のメンバーである。ある特定の実施形態では、ヤシは、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アフリカオイルパーム（Africa oil palm））およびＥｌａｅｉｓ  ｏｌｅｉｆｅｒａ（アメリカオイルパーム（American oil palm））からなる群から選択される。ヤシ油はその果実の中果皮、または赤みがかった果肉に由来する。ヤシ油は約４３．５％のパルミチン酸、約３６．６％のオレイン酸、約９．１％のリノール酸、約４．３％のステアリン酸、約１％のミリスチン酸（Ｃ１４：０）および約５．５％の他の脂肪酸を有することがある。その種子、またはパーム核（palm kernel）も油が豊富である。パーム核油はヤシ油よりも飽和されており、約４８％のラウリン酸（Ｃ１２：０）、約１６％のミリスチン酸、約１５％のオレイン酸、約８％のパルミチン酸、約３％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、約３％のカプリル酸（Ｃ８：０）、約２％〜約３％のステアリン酸および約２％のリノール酸を有することがある。残りの割合は他の脂肪酸を含む。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１０８】
[00125]  一実施形態では、ココナツはＡｒｅｃａｃｅａｅ科のメンバーである。別の実施形態では、ココナツはＣｏｃｏｓ属のメンバーである。ある特定の実施形態では、ココナツはＣｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａである。ココナツ油は約５１％のラウリン酸、約１９％のミリスチン酸、約８％〜約９％のパルミチン酸、約６％のカプリル酸、約６％のカプリン酸および約６％のオレイン酸を有することがある。残りの割合は他の脂肪酸を含む。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１０９】
[00126]  一実施形態では、オリーブはＯｌｅａｃｅａｅ科のメンバーである。別の実施形態では、オリーブはＯｌｅａ属のメンバーである。ある特定の実施形態では、オリーブはＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａである。オリーブ油は、主にオレイン酸（約５５％〜約８３％）とパルミチン酸（約７．５％〜約２０％）の混合トリグリセリドエステルおよび他の脂肪酸（リノール酸：約３．５％〜約２１％；ステアリン酸：約０．５％〜約５％）；αリノレン酸（約０％〜約１．５％）と微量のスクアレン（最大約０．７％）およびステロール（約０．２％のフィトステロールおよびトコステロール）とで構成されていることがある。組成は、栽培品種、地域、高度、収穫時期、および抽出工程により変動する。
【０１１０】
[00127]  一実施形態では、ゴマはＳｅｓａｍｕｍ属のメンバーである。別の実施形態では、ゴマはＳｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍである。ゴマ油は約４１％のリノール酸、約３９％のオレイン酸、約８％のパルミチン酸、約５％のステアリン酸を有し、残りの割合は他の脂肪酸で構成されていることがある。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１１１】
[00128]  亜麻仁は、亜麻または麻としても知られる。一実施形態では、亜麻仁はＬｉｎａｃｅａｅ科のメンバーである。別の実施形態では、亜麻仁はＬｉｎｕｍ属のメンバーである。ある特定の実施形態では、亜麻仁はＬｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍである。亜麻仁油は、フラックスシードオイル（flaxseed oil）としても知られるが、亜麻の乾燥し、熟した種子から得られる無色から黄色がかった油である。亜麻仁油は、その異常に大量のαリノレン酸（オメガ−３脂肪酸）、約５１．９％〜約５５．２％が特徴的である。亜麻仁油は飽和酸パルミチン酸（約７％）およびステアリン酸（約３．４％〜約４．６％）；一不飽和オレイン酸（約１８．５％〜約２２．６％）；二不飽和リノール酸（約１４．２％〜約１７％）も有することがある。脂肪酸プロファイルの変動は遺伝的特徴および／または気候のせいで起こることがある。
【０１１２】
[00129]  一部の実施形態では、植物はヤマモガシ科およびクロウメモドキ科からなる群から選択される科由来である。ヤマモガシ科は圧倒的に南半球に分布している顕花植物の科である。科は約８０の属、約１６００種を含む。ＰｌａｔａｎａｃｅａｅとＮｅｌｕｍｂｏｎａｃｅａｅを併せると、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ目を構成する。周知の属はＰｒｏｔｅａ、Ｂａｎｋｓｉａ、Ｅｍｂｏｔｈｒｉｕｍ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ、Ｈａｋｅａ、ＤｒｙａｎｄｒａおよびＭａｃａｄａｍｉａを含む。ニューサウスウェールズワラタ（waratah）（Ｔｅｌｏｐｅａ  ｓｐｅｃｉｏｓｉｓｓｉｍａ）、キングプロテア（Ｐｒｏｔｅａ  ｃｙｎａｒｏｉｄｅｓ）などの種ならびにＢａｎｋｓｉａ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ、およびＬｅｕｃａｄｅｎｄｒｏｎの種々の種は人気のある切り花であり、Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａの木の実は商業的に広く栽培され消費されている。オーストラリアおよび南アフリカは多様性の集中が最大である。Ｒｈａｍｎａｃｅａｅは顕花植物の大きな科であり、大半が樹木、灌木、および一部はツル植物であり、一般にクロウメモドキ科と呼ばれている。科は５０〜６０の属、おおよそ８７０〜９００の種を含有する。Ｒｈａｍｎａｃｅａｅは世界中に分布しているが、亜熱帯および熱帯地方のほうが一般的である。
【０１１３】
[00130]  ある特定の実施形態では、植物はＧｅｖｕｉｎａ属、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ属、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ属、Ｌｕｎａｒｉａ属、Ｃａｒｕｍ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ属、Ｍａｃａｄａｍｉａ属、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ属、Ｌｉｃａｎｉａ属、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ属、Ｒｉｃｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｙｌｕｓ属、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ属、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ属、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ属、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ属、Ｏｒｉｔｅｓ属、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ属、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ属、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ属、Ｅｐｈｅｄｒａ属、Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍ属、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ属および／またはＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ属由来の種を含む。
【０１１４】
[00131]  Ｃａｌｅｎｄｕｌａはヒナギク科Ａｓｔｅｒａｃｅａｅの一年生および多年生草本植物の約１５〜２０種の属であり、マリーゴールドとして知られることが多い。この植物はアジア南西部、西ヨーロッパ、マカロネシア、および地中海を原産とする。Ｃ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの油は抗炎症剤、抗腫瘍薬、および創傷を治癒するための治療薬として使用されている。Ｃａｌｅｎｄｕｌａの種はＣａｌｅｎｄｕｌａ  ａｒｖｅｎｓｉｓ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｅ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｅｃｋｅｒｌｅｉｎｉｉ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｉｎｃａｎａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｌａｎｚａｅ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｍａｒｏｃｃａｎａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｍｅｕｓｅｌｉｉ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｐａｌａｅｓｔｉｎａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔｅ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａおよびＣａｌｅｎｄｕｌａ  ｔｒｉｐｔｅｒｏｃａｒｐａを含む。
【０１１５】
[00132]  Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓは、Ｌｉｍｎａｎｔｈａｃｅａｅ科の基準属であり、一般にメドウフォーム（meadowfoams）として知られる一年生草本植物からなる。７つの種はすべて北アメリカ西部の沿岸および隣接地方（内陸渓谷、山麓および山岳）を原産とし、そこでこれらの種は典型的には、春の水たまりの縁などの湿地帯生育地で育つ。一部の種はカリフォルニアに特有である。この属は２つの亜属に分けられ、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓは萼片が果実成熟中に反り返り、Ｉｎｆｌｅｘａｅは萼片が成熟中の実の上に曲がる。Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ亜属はＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｂａｋｅｒｉ、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｍａｃｏｕｎｉｉおよびＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｖｉｎｃｕｌａｎｓを含む。Ｉｎｆｌｅｘａｅ節は、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ａｌｂａ、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｆｌｏｃｃｏｓｅおよびＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｍｏｎｔａｎａを含む。
【０１１６】
[00133]  ＬｕｎａｒｉａはＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科の顕花植物属であり、中央および南ヨーロッパ原産である。Ｌｕｎａｒｉａは４つの種を含み、一年生または二年生のＬｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ（Ｌ．ｂｉｅｎｎｉｓ）、Ｌｕｎａｒｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ、多年生のＬｕｎａｒｉａ  ｒｅｄｉｖｉｖａおよび希なバルカン種のＬｕｎａｒｉａ  ｔｅｌｅｋｉａｎａである。
【０１１７】
[00134]  ＣａｒｕｍはＡｐｉａｃｅａｅ科の約２０種の顕花植物の属であり、旧世界の温暖な地方原産である。もっとも重要な種はキャラウェイ（Ｃ．ｃａｒｖｉ）であり、その種子は料理用香料として広く使用されている。モンゴル植物相には、Ｃａｒｕｍ  Ｌ．属に所属する２つの種（Ｃ．ｃａｒｖｅ  Ｌ．、Ｃ．ｂｕｒｉａｔｉｃｕｍ  Ｔｕｒｃｚ．）がある。
【０１１８】
[00135]  ＤａｕｃｕｓはＡｐｉａｃｅａｅ科の草本植物の世界規模の属であり、そのうちもっともよく知られている種は栽培されているニンジンである。Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ  ＡｐｉａｃｅａｅのＤａｕｃｕｓ属は約２５種がある。その種はＤａｕｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｂｒｏｔｅｒｉ、Ｄａｕｃｕｓ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ、Ｄａｕｃｕｓ  ｄｕｒｉｅｕｉ、Ｄａｕｃｕｓ  ｆｏｌｉｏｓｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｇａｄｅｃｅａｕｉ、Ｄａｕｃｕｓ  ｇｕｔｔａｔｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｍｏｎｔａｎｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｍｕｒｉｃａｔｕｓ、Ｄａｕｃｕｓ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｄａｕｃｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓおよびＤａｕｃｕｓ  ｖｉｓｎａｇａを含む。
【０１１９】
[00136]  ＣｏｒｉａｎｄｒｕｍはＡｐｉａｃｅａｅ科のハーブの属であり、栽培種のＣｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（コリアンダー）および野生種のＣｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｔｏｒｄｙｌｉｕｍを含有する。Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍの葉および種子は料理に使用されている。その葉は北アメリカではコリアンダー葉と呼ばれることが多い。
【０１２０】
[00137]  Ｍａｃａｄａｍｉａは、オーストラリア原産の樹木の４つの種の属であり、ヤマモガシ植物科の構成部分である。この４つの種はニューサウスウェールズ州北東部およびクイーンズランド州中央および南東部原産である。その樹木は、その果実、マカダミアナッツで商業的に重要である。他の名称はクイーンズランドナッツ、ブッシュナッツ、マローチナッツ（maroochi nut）、バウプルナッツ（bauple nut）、およびハワイナッツを含む。Ｍａｃａｄａｍｉａ種はＭａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ、Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｊａｎｓｅｎｉｉ、Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｔｅｒｎｉｆｏｌｉａおよびＭａｃａｄａｍｉａ  ｔｅｔｒａｐｈｙｌｌａを含む。このナッツは大量の一不飽和脂肪（全量の５９％）を有する。マカダミア油はおおよそ２２％のオメガ７パルミトレイン酸を含有することで高く評価されており、そのためにマカダミア油はミンクオイルの植物代替物になっている。この比較的高含量のパルミトレイン酸プラスマカダミアの高い酸化安定度のおかげでマカダミア油は化粧品の望ましい成分になっている。
【０１２１】
[00138]  ＭｙｒｉｓｔｉｃａはＭｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａｅ科の樹木の属である。約１５０種がアジアおよび西太平洋に分布している。もっとも重要な商業種はＭｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓであり、香料ナツメグおよびメースの主要源である。Ｍｙｒｉｓｔｉｃａの種はＭ．ａｃｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍ．ａｇｕｓａｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ａｌｂａ、Ｍ．ａｌｂｅｒｔｉｓｉｉ、Ｍ．ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ａｍｐｌｉａｔａ、Ｍ．ａｍｐｌｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ａｍｙｇｄａｌｉｎａ、Ｍ．ａｎｃｅｐｓ、Ｍ．ａｎｄａｍａｎｉｃａ、Ｍ．ａｐｉｃｕｌａｔｅ、Ｍ．ａｒｃｈｂｏｌｄｉａｎａ、Ｍ．ａｒｆａｋｅｎｓｉｓ、Ｍ．ａｒｇｅｎｔｅａ、Ｍ．ａｒｕｅｎｓｉｓ、Ｍ．ａｔｒｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ａｔｒｏｃｏｒｔｉｃａｔａ、Ｍ．ａｔｔｅｎｕａｔｅ、Ｍ．ａｖｉｓ−ｐａｒａｄｉｓｉａｃａｅ、Ｍ．ｂａｅｕｅｒｌｅｎｉｉ、Ｍ．ｂａｎｃａｎａ、Ｍ．ｂａｓｉｌａｎｉｃａ、Ｍ．ｂａｔｊａｎｉｃａ、Ｍ．ｂｅｃｃａｒｉｉ、Ｍ．ｂｅｄｄｏｍｅｉ、Ｍ．ｂｉｖａｌｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｍｂｙｃｉｎａ、Ｍ．ｂｒａｃｈｉａｔｅ、Ｍ．ｂｒａｃｈｙｐｏｄａ、Ｍ．ｂｒａｓｓｉｉ、Ｍ．ｂｒｅｖｉｓｔｉｐｅｓ、Ｍ．ｂｕｃｈｎｅｒｉａｎａ、Ｍ．ｂｙｓｓａｃｅａ、Ｍ．ｃａｇａｙａｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｃａｎａｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍ．ｃａｎｔｌｅｙｉ、Ｍ．ｃａｒｒｉｉ、Ｍ．ｃａｓｔａｎｅｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｃｅｌｅｂｉｃａ、Ｍ．ｃｅｒｉｆｅｒａ、Ｍ．ｃｅｙｌａｎｉｃａ、Ｍ．ｃｈａｒｔａｃｅａ、Ｍ．ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌａ、Ｍ．ｃｉｍｉｃｉｆｅｒａ、Ｍ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ、Ｍ．ｃｌｅｍｅｎｓｉｉ、Ｍ．ｃｏａｃｔａ、Ｍ．ｃｏｌｉｎｒｉｄｓｄａｌｅｉ、Ｍ．ｃｏｌｌｅｔｔｉａｎａ、Ｍ．ｃｏｍｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｍ．ｃｏｎｃｉｎｎａ、Ｍ．ｃｏｎｓｐｅｒｓａ、Ｍ．ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｍ．ｃｏｎｔｒａｃｔａ、Ｍ．ｃｏｏｋｉｅ、Ｍ．ｃｏｒｉａｃｅａ、Ｍ．ｃｏｒｎｕｔｉｆｌｏｒａ、Ｍ．ｃｏｒｔｉｃａｔａ、Ｍ．ｃｏｒｔｉｃｏｓａ、Ｍ．ｃｏｓｔａｔａ、Ｍ．ｃｏｓｔｕｌａｔａ、Ｍ．ｃｒａｓｓａ、Ｍ．ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｃｒａｓｓｉｎｅｒｖｉｓ、Ｍ．ｃｒａｓｓｉｐｅｓ、Ｍ．ｃｕｃｕｌｌａｔａ、Ｍ．ｃｕｍｉｎｇｉｉ、Ｍ．ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｍ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｍ．ｄａｒｄａｉｎｉ、Ｍ．ｄａｓｙｃａｒｐａ、Ｍ．ｄｅｐｒｅｓｓａ、Ｍ．ｄｅｖｏｇｅｌｉｉ、Ｍ．ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｄｕｐｌｏｐｕｎｃｔａｔａ、Ｍ．ｄｕｔｈｉｅｉ、Ｍ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｍ．ｅｌｌｉｐｔｉｃａ、Ｍ．ｅｎｓｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｅｕｇｅｎｉｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｅｕｒｙｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｅｘｔｅｎｓａ、Ｍ．ｆａｌｌａｘ、Ｍ．ｆａｒｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｆａｒｑｕｈａｒｉａｎａ、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｅ、Ｍ．ｆａｔｕａ、Ｍ．ｆｉｌｉｐｅｓ、Ｍ．ｆｉｎｌａｙｓｏｎｉａｎａ、Ｍ．ｆｉｒｍｉｐｅｓ、Ｍ．ｆｉｓｓｉｆｌｏｒａ、Ｍ．ｆｉｓｓｕｒａｔａ、Ｍ．ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ、Ｍ．ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ、Ｍ．ｆｌｏｓｃｕｌｏｓａ、Ｍ．ｆｏｒｂｅｓｉｉ、Ｍ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｍ．ｆｒｕｇｉｆｅｒａ、Ｍ．ｆｕｇａｘ、���．ｆｕｒｆｕｒａｓｃｅｒｔｓ、Ｍ．ｆｕｓｃａ、Ｍ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍ．ｇａｍｂｌｅｉ、Ｍ．ｇａｒｃｉｎｉｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｇｅｍｉｎａｔｅ、Ｍ．ｇｉｂｂｏｓａ、Ｍ．ｇｉｇａｎｔｅａｎ、Ｍ．ｇｉｌｌｅｓｐｉｅａｎａ、Ｍ．ｇｌｏｂｏｓｅ、Ｍ．ｇｒａｃｉｌｉｐｅｓ、Ｍ．ｇｒａｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｇｒａｎｄｉｓ、Ｍ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ、Ｍ．ｇｕａｄａｌｃａｎａｌｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｇｕａｔｔｅｒｉｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｇｕｉｌｌａｕｍｉｎｉａｎａ、Ｍ．ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｉｉ、Ｍ．ｈｅｌｌｗｉｇｉｉ、Ｍ．ｈｅｒｉｔｉｅｒｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｈｏｌｌｒｕｎｇｉｉ、Ｍ．ｈｏｏｇｌａｎｄｉｉ、Ｍ．ｈｏｒｓｆｉｅｌｄｉａ、Ｍ．ｈｙｐａｒｇｙｒａｅａ、Ｍ．ｈｙｐｏｓｔｉｃｔａ、Ｍ．ｉｍｐｒｅｓｓａ、Ｍ．ｉｍｐｒｅｓｓｉｎｅｒｖｉａ、Ｍ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｍ．ｉｎｃｒｅｄｉｂｉｌｉｓ、Ｍ．ｉｎｅｒｓ、Ｍ．ｉｎｇｅｎｓ、Ｍ．ｉｎｇｒａｔｅ、Ｍ．ｉｎｏｐｉｎａｔａ、Ｍ．ｉｎｓｉｐｉｄａ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｍ．ｉｎｕｎｄａｔａ、Ｍ．ｉｎｕｔｉｌｉｓ、Ｍ．ｉｒｙａ、Ｍ．ｉｔｅｏｐｈｙｌｌａ、Ｍ．ｊｏｈｎｓｉｉ、Ｍ．ｋａｊｅｗｓｋｉｉ、Ｍ．ｋａｌｋｍａｎｉｉ、Ｍ．ｋｊｅｌｌｂｅｒｇｉｉ、Ｍ．ｋｏｏｒｄｅｒｓｉｉ、Ｍ．ｋｏｒｔｈａｌｓｉｉ、Ｍ．ｋｕｎｓｔｌｅｒｉ、Ｍ．ｋｕｒｚｉｉ、Ｍ．ｌａｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｌａｅｖｉｇａｔａ、Ｍ．ｌａｅｖｉｓ、Ｍ．ｌａｋｉｌａｋｉ、Ｍ．ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｌａｕｒｅｌｌａ、Ｍ．ｌａｕｒｉｎａ、Ｍ．ｌａｘｉｆｌｏｒａ、Ｍ．ｌｅｍａｎｎｉａｎａ、Ｍ．ｌｅｎｔａ、Ｍ．ｌｅｐｉｄｏｔａ、Ｍ．ｌｅｐｔｏｐｈｙｌｌａ、Ｍ．ｌｅｕｃｏｘｙｌａ、Ｍ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍ．ｌｏｎｇｉｐｅｓ、Ｍ．ｌｏｎｇｉｐｅｔｉｏｌａｔａ、Ｍ．ｌｏｗｉａｎａ、Ｍ．ｍａｃｇｒｅｇｏｒｉ、Ｍ．ｍａｃｒａｎｔｈａ、Ｍ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｍａｃｒｏｃａｒｙａ、Ｍ．ｍａｃｒｏｃｏｍａ、Ｍ．ｍａｃｒｏｔｈｙｒｓａ、Ｍ．ｍａｇｎｉｆｉｃａ、Ｍ．ｍａｉｎｇａｙｉ、Ｍ．ｍａｊｕｓｃｕｌｅ、Ｍ．ｍａｌａｂａｒｉｃａ、Ｍ．ｍａｌａｙａｎａ、Ｍ．ｍａｎｄａｈａｒａｎ、Ｍ．ｍａｒｋｇｒａｖｉａｎａ、Ｍ．ｍａｓｃｕｌａ、Ｍ．ｍａｘｉｍａ、Ｍ．ｍｅｄｉｏｖｉｂｅｘ、Ｍ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、Ｍ．ｍｉｃｒａｎｔｈａ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｍｉｌｌｅｐｕｎｃｔａｔａ、Ｍ．ｍｉｎｄａｎａｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｍｉｎｄｏｒｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｍｉｏｈｕ、Ｍ．ｍｏｕｃｈｉｏ、Ｍ．ｍｕｌｔｉｎｅｒｖｉａ、Ｍ．ｍｕｒｔｏｎｉ、Ｍ．ｍｙｒｍｅｃｏｐｈｉｌａ、Ｍ．ｎａｎａ、Ｍ．ｎｅｇｌｅｃｔａ、Ｍ．ｎｅｇｒｏｓｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｎｅｓｏｐｈｉｌａ、Ｍ．ｎｉｏｂｕｅ、Ｍ．ｎｉｏｈｎｅ、Ｍ．ｎｉｔｉｄａ、Ｍ．ｎｉｖｅａ、Ｍ．ｏｂｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｏｌｉｖａｃｅａ、Ｍ．ｏｒｉｎｏｃｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｏｒｎａｔｅ、Ｍ．ｏｖｉｃａｒｐａ、Ｍ．ｐａｃｈｙｃａｒｐｉｄｉａ、Ｍ．ｐａｃｈｙｐｈｙｌｌａ、Ｍ．ｐａｃｈｙｔｈｙｒｓａ、Ｍ．ｐａｌａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍ．ｐａｐｉｌｌａｔｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｐａｐｕａｎａ���Ｍ．ｐａｐｙｒａｃｅａ、Ｍ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ、Ｍ．ｐｅｃｔｉｎａｔｅ、Ｍ．ｐｅｄｉｃｅｌｌａｔａ、Ｍ．ｐｅｌｔａｔａ、Ｍ．ｐｅｎｄｕｌｉｎａ、Ｍ．ｐｅｒｌａｅｖｉｓ、Ｍ．ｐｅｔｉｏｌａｔｅ、Ｍ．ｐｈｉｌｉｐｐｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｐｉｌｏｓｅｌｌａ、Ｍ．ｐｉｌｏｓｉｇｅｍｍａ、Ｍ．ｐｉｎｎａｅｆｏｒｍｉｓ、Ｍ．ｐｌａｔｙｓｐｅｒｍａ、Ｍ．ｐｌｕｍｅｒｉｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｐｏｌｙａｎｔｈａ、Ｍ．ｐｏｌｙｓｐｈｅｒｕｌａ、Ｍ．ｐｓｅｕｄｏａｒｇｅｎｔｅａ、Ｍ．ｐｓｉｌｏｃａｒｐａ、Ｍ．ｐｕｂｉｃａｒｐａ、Ｍ．ｐｕｌｃｈｒａ、Ｍ．ｐｕｍｉｌａ、Ｍ．ｐｙｇｍａｅａ、Ｍ．ｑｕｅｒｃｉｃａｒｐａ、Ｍ．ｒａｃｅｍｏｓｅ、Ｍ．ｒａｄｊａ、Ｍ．ｒｅｓｉｎｏｓａ、Ｍ．ｒｅｔｕｓａ、Ｍ．ｒｉｄｌｅｙａｎａ、Ｍ．ｒｉｄｌｅｙｉ、Ｍ．ｒｉｅｄｅｌｉｉ、Ｍ．ｒｏｂｕｓｔａ、Ｍ．ｒｏｓｓｅｌｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ、Ｍ．ｒｕｂｒｉｎｅｒｖｉｓ、Ｍ．ｒｕｍｐｈｉｉ、Ｍ．ｓａｇｏｔｉａｎａ、Ｍ．ｓａｌｏｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｓａｎｇｏｗｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｓａｐｉｄａ、Ｍ．ｓａｒｃａｎｔｈａ、Ｍ．ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒｉ、Ｍ．ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚｉｉ、Ｍ．ｓｃｈｕｍａｎｎｉａｎａ、Ｍ．ｓｃｏｒｔｅｃｈｉｎｉｉ、Ｍ．ｓｃｒｉｐｔａ、Ｍ．ｓｅｒｉｃｅａ、Ｍ．ｓｅｓｑｕｉｐｅｄａｌｉｓ、Ｍ．ｓｉｍｉａｒｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｍ．ｓｉｎｃｌａｉｒｉｉ、Ｍ．ｓｍｙｔｈｉｅｓｉｉ、Ｍ．ｓｏｇｅｒｉｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｓｐａｎｏｇｈｅａｎａ、Ｍ．ｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍａ、Ｍ．ｓｐｈａｅｒｕｌａ、Ｍ．ｓｐｉｃａｔａ、Ｍ．ｓｐｒｕｃｅｉ、Ｍ．ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｍ．ｓｕａｖｉｓ、Ｍ．ｓｕｂａｌｕｌａｔａ、Ｍ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓａ、Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｍ．ｓｕｃｃｅｄａｎｅａ、Ｍ．ｓｕｃｃｏｓａ、Ｍ．ｓｕｌｃａｔａ、Ｍ．ｓｕｌｕｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｓｕｍｂａｖａｎａ、Ｍ．ｓｕｐｅｒｂａ、Ｍ．ｔａｍｒａｕｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｔｅｉｊｓｍａｎｎｉｉ、Ｍ．ｔｅｎｕｉｖｅｎｉａ、Ｍ．ｔｅｙｓｍａｎｎｉ、Ｍ．ｔｉｎｇｅｎｓ、Ｍ．ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ、Ｍ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｍ．ｔｒｉａｎｔｈｅｒａ、Ｍ．ｔｒｉｓｔｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｅ、Ｍ．ｔｕｂｉｆｌｏｒａ、Ｍ．ｕｌｔｒａｂａｓｉｃａ、Ｍ．ｕｍｂｅｌｌａｔｅ、Ｍ．ｕｍｂｒｏｓａ、Ｍ．ｕｎｃｉｎａｔａ、Ｍ．ｕｎｄｕｌａｔｉｆｏｌｉａ、Ｍ．ｕｒｄａｎｅｔｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｕｖｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍ．ｖａｌｉｄａ、Ｍ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｍ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ、Ｍ．ｖｉｌｌｏｓａ、Ｍ．ｖｉｎｋｅａｎａ、Ｍ．ｖｏｒｄｅｒｍａｎｎｉ、Ｍ．ｗａｌｌａｃｅａｎａ、Ｍ．ｗａｌｌｉｃｈｉｉ、Ｍ．ｗａｒｂｕｒｇｉｉ、Ｍ．ｗｅｎｚｅｌｉｉ、Ｍ．ｗｏｍｅｒｓｌｅｙｉ、Ｍ．ｗｒａｙｉ、Ｍ．ｗｙａｔｔ−ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓおよびＭ．ｚｅｙｌａｎｉｃａを含むことが可能である。
【０１２２】
[00139]  ＬｉｃａｎｉａはＣｈｒｙｓｏｂａｌａｎａｃｅａｅ科の植物の属である。いくつかの種が観賞植物として使用されている。Ｌｉｃａｎｉａ実は多くの動物にとって重要な食糧であり、ヒトが食べることも可能である。Ｌｉｃａｎｉａの種はＬｉｃａｎｉａ  ａｒｂｏｒｅａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｃａｌｄａｓｉａｎａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｃｈｉｒｉｑｕｉｅｎｓｉｓ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｃｏｎｆｅｒｒｕｍｉｎａｔａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｅ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｇｒａｎｄｉｂｒａｃｔｅａｔａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｈｅｄｂｅｒｇｉｉ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｋｕｎｔｈｉａｎａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｌｏｎｇｉｃｕｓｐｉｄａｔａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｔａｌａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｍｉｃｈａｕｘｉｉ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｍｏｒｉｉ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｒｉｇｉｄａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｌｉｃａｎｉａ  ｖａｓｑｕｅｚｉｉおよびＬｉｃａｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉｎａを含む。
【０１２３】
[00140]  ＡｌｅｕｒｉｔｅｓはＥｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅの樹木状の顕花植物の小さな属である。Ａｌｅｕｒｉｔｅｓは、中国、インド亜大陸、東南アジア、パプアシア（Papuasia）、およびクイーンズランド原産である。Ａｌｅｕｒｉｔｅｓは、伝えられるところによれば、種々の島（太平洋およびインド洋、プラスカリブ海）ならびにアフリカ、南アメリカ、およびフロリダの点在する場所にも移植されている。これらの雌雄同体常緑樹は多年生または半多年生である。その実はかなり大きな石果であり多肉質の外果皮および薄い木質の内果皮がある。その果実は発達した子房室の数によって形状が変わる。その実は含油毒性種子を含有する。その油は、灯油、潤滑剤としてならびにニス、塗料および石鹸の成分として使用されてきた。毒性物質を取り除いた後は、その油は調理油として使用することが可能である。Ａｌｅｕｒｉｔｅｓの種はＡ．ｃｏｒｄａｔｕｓ、Ａ．ｅｒｒａｔｉｃｕｓ、Ａ．ｆｏｒｄｉｉ、Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａｓ、Ａ．ｌａｃｃｉｆｅｒ、Ａ．ｍｏｎｔａｎｕｓ、Ａ．ｐｅｌｔａｔｕｓ、Ａ．ｓａｐｏｎａｒｉｕｓ、Ａ．ｔｒｉｓｐｅｒｍｕｓ、Ａ．ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕｕｓおよびＡ．ｖｅｒｎｉｃｉｕｓを含む。
【０１２４】
[00141]  Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓは、トウゴマまたはヒマであり、トウダイグサ科、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅの顕花植物の種である。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓは、単一種属、Ｒｉｃｉｎｕｓ、および亜族、Ｒｉｃｉｎｉｎａｅの唯一の種である。その種子はトウゴマであり、その名称にもかかわらず、本物の豆ではない。トウゴマは地中海盆地南東部、東アフリカ、およびインド原産であるが、熱帯地方全体に広く行き渡っており（他の場所では観賞植物として広く栽培されている）。ヒマはヒマシ油の供給源であり、この油は広範囲な用途がある。種子は、トリグリセリドが豊富であり、主にリシノリンである４０％〜６０％の油を含油する。種子は水溶性毒素であるリシンも含有しており、この毒素はこの植物全体にももっと低濃度で存在する。
【０１２５】
[00142]  Ｃｏｒｙｌｕｓ（ハシバミ）は温暖な北半球原産の落葉樹で大きな灌木の属である。その属は通常、カバノキ科、Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅに置かれているが、一部の植物学者はハシバミを異なる科、Ｃｏｒｙｌａｃｅａｅに分ける。ハシバミの実はヘーゼルナッツである。その実は１〜２．５ｃｍ長および１〜２ｃｍ径であり、ナッツを部分的にから完全にまで取り囲んでいるさやで囲まれている。Ｃｏｒｙｌｕｓの種はＣｏｒｙｌｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｃｏｌｃｈｉｃａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｃｏｒｎｕｔａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｍａｘｉｍａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ  （Ｃ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ）、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｒｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｆａｒｇｅｓｉｉ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｊａｃｑｕｅｍｏｎｔｉｉ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｗａｎｇｉｉおよびＣｏｒｙｌｕｓ  ｆｅｒｏｘを含む。
【０１２６】
[00143]  Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａはヤマモガシ科の顕花植物の属である。この属は４つの種（Ｋ．ｅｌｌｉｐｔｉｃａ、Ｋ．ｐｒｏｎｙｅｎｓｉｓ、Ｋ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａおよびＫ．ｓｉｎｕａｔａ）を含みすべての種がニューカレドニアに特有である。Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａは最大３０ｍ高の樹木であり、樹幹は最大１ｍ径である。Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａはニューカレドニア本土の中央域に見出され、北部ではまれである。Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａは多少深い堆積物基層上の地面の平均標高以上の密生した熱帯多雨林で育つ。Ｋ．ｓｉｎｕａｔａは薄い黄金色または黄色の花を有し１０〜４５ｃｍの厚く丈夫な花序がある。その樹木は石果（４０〜５０×２５〜３０ｍｍ）を有する（www.endemia.nc）。Ａｓｃｉｅｐｉａｓ、トウワタ、は、１４０以上の既知の種を含有する草木多年生双子葉植物のアメリカ属である。Ａｓｃｉｅｐｉａｓはキョウチクトウ科Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅの亜科Ａｓｃｌｅｐｉａｄｏｉｄｅａｅに分類される。トウワタは乳のような樹液から名付けられ、この樹液はアルカロイドおよびカルデノリドを含むいくつかの他の複雑な化合物を含有するラテックスからなる。Ａｓｃｌｅｐｉａｓの種は、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ａｓｐｅｒｕｌａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｃｒｙｐｔｏｃｅｒａｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｃｕｒａｓｓａｖｉｃａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｃｕｒｔｉｓｓｉｉ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｅｒｉｏｃａｒｐａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｅｒｏｓａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｅｘａｌｔａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｈｕｍｉｓｔｒａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｉｎｃａｒｎａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｌｉｎａｒｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｍｅａｄｉｉ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｎｙｃｔａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｏｂｏｖａｔｅ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｑｕａｄｒｉｆｏｌｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｒｕｂｒａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｏｌａｎｏａｎａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｐｅｃｉｏｓｅ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｕｂｕｌａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｕｂｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｕｌｌｉｖａｎｔｉｉ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｔｕｂｅｒｏｓａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｕｎｃｉａｌｉｓ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｅ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｖｅｓｔｉｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌｏｒａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｖｉｒｉｄｉｓおよびＡｓｃｌｅｐｉａｓ  ｗｅｌｓｈｉｉを含む。
【０１２７】
[00144]  Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａは大きな樹木の唯一の記載された種の属であり、ヤマモガシ植物科の一部を構成する。種Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ（ノーザンシルキーオーク）は、オーストラリアのクイーンズランド北東の湿潤熱帯地方の熱帯雨林に特有である。他の一般名はブルオーク（bull oak）、ゴールデンスパングルウッド（golden spanglewood）、レースウッド（golden spanglewood）、オークおよびオオンガアリ（oongaary）を含む。この複葉は最大１７の小葉を有する。この複葉は白い花序続いて木質の実を生成し、これは林冠の外側に顕著に表示される。
【０１２８】
[00145]  Ｇｒｅｖｉｌｌｅａはヤマモガシ科の３４０近くの種の樹木および灌木の大きな属であり、これらの種はオーストラリアだけの原産であり、ニューカレドニアでは少ない(Bombarda Iら、(2010) J. Am. Oil Chem. Soc.  87: 981-986; Kato M and Kawakita A. (2004) Am. J. Bot. 91:1814-1827; Bailey LH and Miller W (1900) Cyclopedia of American Horticulture: Comprising Suggestions for Cultivation of Horticultural Plants, Descriptions of the Species of Fruits, Vegetables, Flowers, and Ornamental Plants Sold in the United States and Canada; Randy Stewart Landscape Design blog - rslandscapedesign.blogspot.com)。大半の種は有機堆積物もリンが豊富な土壌も好まない。リンまたはカリウムを含有する肥料は死滅させることが可能である。開花の後の剪定は活力を改善する。これらの種はシカ抵抗性であり、大半の種はひどい干ばつに耐えることが可能であり、多くが乾燥した夏のほうを好む。この花はハチドリを引き付ける。この種は、ドライアンドラ（dryandra）蛾およびモンシロチョウ（紋白蝶）を含む、一部のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種の幼虫により食用植物としても使用される。Ｐｈｙｔｏｐｈｏｒａ腐敗は夏の間水をやりすぎる地中海の種には厳しい問題である。この種はオーストラリアに存在するだけではなく、その種が栽培されているイタリアなどのその出生区域の外の場所でも見出されてきた。
【０１２９】
[00146]  Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌは小径木であり（他の出典はこの植物を灌木とも呼んでいる）、到達する最大サイズは３０フィートで、もっぱらニューカレドニアを原産とする少数のＧｒｅｖｉｌｌｅａｓの１つである。Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌはＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｒｏｂｕｓｔａの近縁である。縁が滑らかで浅裂ではないその葉は最大９インチ長であり、下はさび色または絹のような毛で覆われている。その白い花は、冬から夏にかけて長く歯ブラシ様の房に咲く。この植物は耐寒帯９〜１２の水はけのよい土壌では日向で繁茂する。亜種のＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａに関する情報は極めて少ない。Ｎｉ塩の存在下でのＧ．ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａの成長が調べられてきた。その種子は非休眠（ＮＤ）に分類されており、３０日未満で完全に成長した胚、透水性の種（または果実）皮。この植物の推定される花粉媒介者はミツバチまたはトリである。亜種ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａの葉のほうが広く、下はさびで染まった赤色である。その花はもっと大きな房に咲く。
【０１３０】
[00147]  Ｇ．ｅｘｕｌはＧ．ｒｏｂｕｓｔａの近縁であり、後者の方が入手できる情報が多い。Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｒｏｂｕｓｔａは速生育で、根深く、半常緑の大きな樹木であり、７０フィート以上に達し、オーストラリアのクイーンズランド南東部原産である。Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｒｏｂｕｓｔａは、サンティアゴ、チリ、カリフォルニアおよびフロリダを含む世界中の温暖な気候で日よけの木として育てられる。Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｒｏｂｕｓｔａは木材植物として高く評価され南アフリカでは商業的に栽培されている。その価値のある木材は飾り戸棚を作るのに使用されることが多い。その木質は抵抗性ではない。この種は耐寒帯８ｂ〜１２（米国ではＣＡ、ＴＸ、ＬＡ、ＦＬが該当すると考えられる）の日向で繁茂し、肥沃で粘度が主成分であるが水はけのよい土壌を好み、温暖な乾燥した夏が必要である。苗木は成熟植物体と比べるとずっと耐寒性ではない（anpsa.org.au）。
【０１３１】
[00148]  Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａは中型の直立の灌木で、２〜５ｍ高である。葉は狭く尖った形状または楕円形で皮のようなくすんだ灰色がかった緑色で、７〜１８ｃｍ×２．５〜７ｃｍあり、金赤色および密集した毛の多い新芽を有する。これは、そこが水はけのよい土壌である限り乾燥した熱帯地域でよく育つ色彩に富んだ植物である。この種は寒い、温暖な気候には適さない。この種は乱切りされた種子からが一番よく繁殖する。挿し木は成功してきたが、根付かせるのは困難なことがある。この種はＧ．ｒｏｂｕｓｔａの台木に接ぎ木して成功しており、接ぎ木苗は比較的涼しい地域でうまく育つ。一部の植物学者はこの植物をＧ．ｇｏｏｄｉｉの亜種と見なしている。
【０１３２】
[00149]  Ｏｒｉｔｅｓはヤマモガシ科の９つの既知の種の属である。７つの種はオーストラリア、２つは南アメリカの１つはチリアンデス、１つはボリビア原産である。この種はＯｒｉｔｅｓ  ａｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｅｘｃｅｌｓｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｆｉｅｂｒｉｇｉｉ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｍｅｇａｃａｒｐｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｍｉｌｌｉｇａｎｉｉ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅａおよびＯｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔｕｓを含む。
【０１３３】
[00150]  Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓはタスマニア西部の低地多雨林から高山帯の比較的低い部分（亜高山帯森林地帯）までに及ぶ普通種である（２ｍまでゆっくり成長する灌木で、霜および雪に強い）。その葉は極めて不定であるが、通常は幅が長さの２倍以上である。多雨林植物はおおよそ１０ｃｍ長の葉を有することが多く、風雨にさらされた亜高山地域由来の植物は約３〜５ｃｍ長である可能性が高い。腋生の穂状花序の魅力的な白い花は初夏に現われるが、開花期は不規則になることがある。この種の葉は全縁のこともあるが、尖った浅い裂片を有するほうが多い。葉の裏面は白粉をかぶっている。この種は十分堆肥になった土壌、十分な湿気および涼しい場所が必要である。この種は良好な条件では小径木を形成することが可能である。この種は部分的から完全な日陰で育つ（www.utas.edu.au;www.desertnorthwest.com;www.apstas.com;www.australianplants.com）。
【０１３４】
[00151]  Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔｕｓは、ニャローリーフオリテス（Narrow-Leaf Orites）としても知られ、タスマニア原産植物種である。スコットランドの植物学者ロバートブラウンは、１８１０年にセントクレア湖で収集した標本からロンドンリンネ協会の会報にこの種を正式に記載した。高山および亜高山荒野に豊富にあり、Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔｕｓは広がった茂みまたは直立した木質の灌木として、通常０．５〜１．５ｍ（１ｆｔ８ｉｎ〜４ｆｔ１１ｉｎ）高で育つ。分枝は密であり葉は茎で互生である。葉形は細く、頂部ではかなり丸く、７〜２０ｍｍ長で、１〜１．５ｍｍ幅であり、縁はきつく外巻で裏面は毛の多い表面である。開花は初夏から盛夏にかけて起こり、酸っぱい匂いのする花が頂生穂穂状花序に葉の長さの２倍まで立ち上がる。色は白で、花は５ｍｍ長であり、放射相称で両性であり４つの沿着おしべと上位子房がある。花冠は弁状で、芽は管状であり成熟すると裂ける。実は１５ｍｍまでの毛の多い袋果であり翼状の種子を含有する。ヤマモガシ科であり、Ｏ．ｒｅｖｏｌｕｔｕｓは、その領域内の蜜食（nectivorous）動物種に実質的な食糧源を提供する可能性が高い。この植物の領域内の平均年間気温は約８℃を前後し、降雨量は年間１７００にもまたは２０００ｍｍさえにもなる傾向がある。
【０１３５】
[00152]  Ｚｉｚｉｐｈｕｓはクロウメモドキ科、Ｒｈａｍｎａｃｅａｅの約４０の種のとげのある灌木および小径木の属であり、世界中の暖温帯および亜熱帯地方に分布している。一部の種は落葉性で、他の種は常緑性である。その実は食べられる石果で、黄褐色、赤色または黒色の球形または長方形で、１〜５ｃｍ（０．３９〜１．９７ｉｎ）長であり、非常に甘味があって糖状質であることが多く、ナツメヤシの食感と味わいを思い起こさせる。Ｚｉｚｉｐｈｕｓの種は、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ａｎｇｏｌｉｔｏ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ａｐｅｔａｌａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ａｔｔｏｐｅｎｓｉｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｂｕｄｈｅｎｓｉｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｃｅｌａｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｃｏｔｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｆｕｎｇｉｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｇｕａｒａｎｉｔｉｃａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｈａｖａｎｅｎｓｉｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｈｏｒｒｉｄａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｉｎｃｕｒｖｅ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｏａｚｅｉｒｏ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｌａｕｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｌｏｔｕｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍａｉｒｅｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍａｕｒｉｔｉａｎａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍｅｌａｓｔｏｍｏｉｄｅｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  Ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍｉｓｔｏｌ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍｏｎｔａｎａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｎｕｍｍｕｌａｒｉａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｏｅｎｏｐｌｉａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｏｘｙｐｈｙｌｌａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｐａｒｒｙｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｑｕａｄｒｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｒｕｇｏｓｅ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｓａｅｒｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｓｐｉｎａ−ｃｈｒｉｓｔｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｔａｌａｎａｉ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｔｒｉｎｅｒｖｉａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｘｉａｎｇｃｈｅｎｇｅｎｓｉｓおよびＺｉｚｉｐｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｙｒｕｓを含む。
【０１３６】
[00153]  Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂａは一般にナツメ（時にはジュジュバ（jujuba））、紅ナツメ、大ナツメ、コリアンナツメ（Korean date）、またはインドナツメと呼ばれる。Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂａは主に日よけの木として使用され実も結ぶ。この種は小型の落葉樹または灌木であり、５〜１２ｍの高さに届き、通常はとげの多い枝がある。この葉は光る緑色で卵型で尖っており、２〜７ｃｍ幅で１〜３ｃｍ広さがあり、基部には３つのはっきりした葉脈および細かい歯のある縁がある。この花は小型で５ｍｍ幅、５つの目立たない黄緑の花弁がある。この実は食べられる卵形の石果で、深さが１．５〜３ｃｍ、未熟時にはすべすべした緑色で、リンゴのような硬さと味があり、成熟中は茶色から紫がかった黒に、最後にはしわが寄って、小型のナツメヤシのように見える。オリーブの核に類似する１個の硬い核がある。果実収量は１００〜１５０ｇ／木である。栽植距離はおおよそ１０ｍである。果実中の脂質含量は約０．０６％〜０．１０％であり、乾燥果実では約１．１％である。ホホバと比べるとナツメ果実のほうが仁は小さく、脂質含量も少ない。したがって、ホホバとは対照的に、ナツメはバイオディーゼル供給原料ともみなされない。乾燥果実および油性抽出物は市販されている。
【０１３７】
[00154]  Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａはヤマモガシ科の２つの種の樹木の属である。これらの種はニューサウスウェールズ北部およびクイーンズランド南東の熱帯雨林原産である。これらの種は、その実の明赤色のおかげでレッドボップルナッツ（red bopple nut）またはビーフナッツ（beef nut）として一般的に知られている。この２つの種はＨｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｌｏｓａおよびＨｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａである。
【０１３８】
[00155]  Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａはオーストラリアのニューサウスウェールズおよびクイーンズランドの亜熱帯雨林原産の希少な種である。一般名は、レッドボップルナッツ、ピーナッツ、レッドナッツ（red nut）、ビーフナッツ、ローズナッツ（rose nut）およびアイボリーシルキーオーク（ivory silky oak）を含む。この木は春と夏の間に肉厚の赤い実を結ぶ。これらは食べられる種子を含有する。Ｈ．ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａの葉は複葉または羽状であり、４０〜１００ｃｍ長である。この植物は一般に冬期に開花する。レッドボップルナッツは春および夏期に肉厚の赤い実を結ぶ。実は食べられ、石果様で卵形であり、２〜４ｃｍ長で、非裂開性で、肉厚で、赤く、片側に縦溝があり、大きなアーモンドサイズの仁（ナッツ）を含有する。レッドボップルナッツはマカダミア属と同種の味わいがあり、類似の目的に使用してもよい。この木は比較的多量の高品質ナッツを実らせる。木の繁殖は種子によるが、種子は短期間しか生存できない。Ｈ．ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａは、実生が様々な障害の傾向があるために確立させるのは難しい。現実に、不十分な実生確立および不十分な成長がこの種の可能性を制限している（www.fruitandnuttrees.com）。この属はマカダミア属に類似しているがそれよりも劣ると見なされている。
【０１３９】
[00156]  Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ、シーバックソーン、はグミ科の落葉性の灌木である。Ｈｉｐｐｏｐｈａｅはサンドソーン（sandthorn）、スワローソーン（sallowthorn）またはシーベリー（seaberry）とも呼ばれる。Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ、一般的なシーバックソーン、は属の種の中では群を抜いてもっとも広がっており、その８つの亜種はヨーロッパの大西洋沿岸からモンゴル北西および中国北西まで広がっている。世界の天然のシーバックソーン生育地の９０％以上または約１，５００，０００ｈａが中国、モンゴル、ロシア、北ヨーロッパおよびカナダで見つかり、そこではこの植物は、土壌、水および野生生物保護砂漠化阻止目的で、ならびに消費製品に使用されている。この属に所属する種は中果皮に脂質を蓄積するので、油はその種子またはその実の果肉から抽出することが可能である。シーバックソーンの種子の含油量は平均で７〜１１％であり、果肉の含油量は約１．５〜３％である（新鮮重あたり）。種子油は多価不飽和脂肪酸の高含有量に特徴があり、果肉油は一不飽和脂肪酸およびカロテノイドを含有する。リノール酸およびαリノレン酸は種子油中の主要な脂肪酸であり、シーバックソーンの果肉油は、おおよそ６５％の一不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸と飽和脂肪酸であるパルミチン酸の混合を含有する。両方の油は、詰まった量のトコフェロール、トコトリエノールおよび植物ステロールも含有する。Ｈｉｐｐｏｐｈａｅの種は、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｇｏｎｉｏｃａｒｐａ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｇｙａｎｔｓｅｎｓｉｓ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｌｉｔａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｎｅｕｒｏｃａｒｐａ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａおよびＨｉｐｐｏｐｈａｅ  ｔｉｂｅｔａｎａを含む。
【０１４０】
[00157]  Ｅｐｈｅｄｒａは裸子植物の灌木の属であり、その科、マオウおよび目、マオウの唯一の属である。マオウの様々な種が多くの土地に広がっており、北アメリカ南西、南ヨーロッパ、アフリカ北部ならびに南西および中央アジア、中国北部、ならびに南アメリカ西部原産である。英語での一般名は、ジョイントパイン（joint-pine）、チュウマオウ（jointfir）、モルモンティー（Mormon-tea）またはブリガムティー（Brigham tea）を含む。Ｅ．ｓｉｎｉｃａおよび他を含むＥｐｈｅｄｒａ属の植物は、伝統的に喘息、枯草熱、および風邪の治療を含む種々の医療目的で先住民により使用されてきた。アルカロイドエフェドリンおよびプソイドエフェドリンは、Ｅ．ｓｉｎｉｃａおよびこの属の他のメンバーの活性成分である。これらの化合物は、刺激性および充血緩和性（decongestant qualities）のある交感神経興奮剤であり、化学的に置換されたアンフェタミンである。マオウの種はＥｐｈｅｄｒａ  ａｌａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ａｎｔｉｓｙｐｈｉｌｉｔｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ａｐｈｙｌｌａ、Ｅｐｈｅｄｒａ×ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ａｓｐｅｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｂｏｅｌｃｋｅｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｂｏｔｓｃｈａｎｔｚｅｖｉｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  Ｂｒｅａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｃｏｍｐａｃｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｃｏｒｙｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｃｕｔｌｅｒｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｄａｈｕｒｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｄａｗｕｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｄｉｓｔａｃｈｙａ、Ｅｐｈｅｄｒａ×ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｌｅｐｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｅｑｕｉｓｅｔｉｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｅｄｔｓｃｈｅｎｋｏａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｏｅｍｉｎｅａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｏｌｉａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｒｕｓｔｉｌｌａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｆｕｎｅｒｅａｌ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｇｅｒａｒｄｉａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｇｌａｕｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｈｏｌｏｐｔｅｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｅｐｈｅｄｒａ×ｉｎｔｅｒｍｉｘｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｋａｒｄａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｋｈｕｒｉｋｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｌａｒｉｓｔａｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｌｉｋｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｌｏｍａｔｏｌｅｐｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｍａｊｏｒ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｍｉｌｌｅｒｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｎｅｖａｄｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｏｃｈｒｅａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｏｘｙｐｈｙｌｌａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｐａｃｈｙｃｌａｄａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｐｅｎｔａｎｄｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｓｔａｃｈｙａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｒｅｇｅｌｉａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｒｈｙｔｉｄ��ｓｐｅｒｍａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｒｉｔｕｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓａｒｃｏｃａｒｐａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｏｍａｌｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｔｒｏｂｉｌａｃｅａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｕｍｌｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｉｌｈｏａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｏｒｒｅｙａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｒａｎｓｉｔｏｒｉａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｒｉａｎｄｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｒｉｆｕｒｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｔｗｅｅｄｉｅａｎａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓおよびＥｐｈｅｄｒａ  ｖｖｅｄｅｎｓｋｙｉを含む。
【０１４１】
[00158]  Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍは、ヤマモガシ植物科の一部を構成する、大きな木の単一種の属である。Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｃｏｒｉａｃｅｕｍ種は、オーストラリアのクイーンズランド北東の湿潤熱帯地方の雨林原産である。一般名はローズシルキーオーク（rose silky oak）およびプレートシーディドオーク（plate-seeded oak）を含む。
【０１４２】
[00159]  Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍはヤマモガシ植物科の６つの種の属である。６つの種はオーストラリア原産であり、高い灌木および樹木の形態で成長する。この属は、一般名ウッディペア（woody pear）をもつ少なくとも２つの種、オーストラリア東部の州のＸｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅおよびオーストラリア西部の州のＸｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅを含む。Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍの種は、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｂｅｎｔｈａｍｉｉ、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎｕｍ、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅおよびＸｙｌｏｍｅｌｕｍ  ｓｃｏｔｔｉａｎｕｍを含む。
【０１４３】
[00160]  ホホバは、植物の学名Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓを有するが、ゴートナッツ（goat nut）、ディアナッツ（deer nut）、ピグナット（pignut）、ワイルドハゼル（wild hazel）、キニーネナッツ（quinine nut）、コーヒーの木の実（coffeeberry）、およびグレイボックスブッシュ（gray box bush）としても知られる。ホホバは北アメリカ南西部原産である。Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓはＳｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｅａｅ科の唯一の種であり、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ目に置かれる。ホホバは、その種子から抽出される液体ワックスエステルであるホホバ油を生産するために商業的に育てられている。この油は、極めて長い（Ｃ３６〜Ｃ４６）直鎖ワックスエステルであり、トリグリセリドではなく、ホホバおよびその誘導体ホホバエステルは伝統的な植物油よりもヒト皮脂および鯨油のほうに類似している点で希である。ホホバは無臭であり温度非依存性である粘度を有するので産業には興味深い。応用は、エンジンの潤滑油から調理油まで変化する。ホホバワックスは圧倒的に医薬品に、特に皮膚製品に使用されている。バイオディーゼル燃料としてのその使用はますます重要になってきている。ホホバ油は２２〜４４炭素原子の長い直線状モノエステルからなり（トリグリセリドからなる大半の植物油とは反対に）、そのためにホホバ油はエネルギー密度の点からディーゼルに匹敵する。
【０１４４】
[00161]  Ｇｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａは、ハーディーマカダミア（Hardy Macadamia）、チリナッツ（Chile Nut）、およびスペイン語ではＡｖｅｌｌａｎｏとも呼ばれるが、チリ南部およびアルゼンチン原産であり、北半球ではほとんど栽培されておらず、知られてもいない（San B and Yildirim AN（2010年）J. Food Compos. Anal. 23: 706〜710頁）。Ｇｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａは、Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科の常緑広葉樹であり灌木から６０フィートの高さの木まで変化する。この植物は海面から海抜ほぼ２，３００フィート（７００メートル）まで育つ。その範囲は３５〜４４°南緯まで広がる。この植物は熱により悪影響を受けることがあり、北アメリカ内陸での冷たい凍結により枯れることがある。この植物は、アイルランド、スコットランド、イングランドの比較的温暖な部分、およびニュジーランドなどの場所で繁茂することができる。独立樹でも豊かなナッツを付けることが可能である。ナッツは毎年実らせることが可能である。ナッツは容易に殻を剥がせる。分析によれば、ナッツは約１２．５％のタンパク質、約４９．５％の油、および約２４．１％の炭水化物を含有することが示されている。チリでは高度にモノ飽和油も多様な使用に抽出されている。発芽した種子は齧歯動物により食べられやすい。その木は高度に多様な土壌および太陽レベルに適応性がある。この種はリンを用いた施肥を嫌がる（www.arthurleej.com）。一部の分類では、Ｇｅｖｕｉｎａは、オーストラリア（Gevuina bleasdalei）、ニューギニア（Gevuina papuana）のそれぞれ原産の３つの種、ならびにチリおよびアルゼンチン（Gevuina avellana）の１つの種で認識されている。他の分類学レポートは、オーストラリアおよびニューギニア種をＢｌｅａｓｄａｌｅａ属にまたはフィジー原産Ｔｕｒｒｉｌｌｉａ属に置き、ＧｅｖｕｉｎａにはＧｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａのみを残している。オーストラリアの植物相はこれら２つの種をＧｅｖｕｉｎａにとどめているが、つい最近の分類ではオーストラリアおよびニューギニア種をＢｌｅａｓｄａｌｅａ  ｂｌｅａｓｄａｌｅｉおよびＢ．ｐａｐｕａｎａと見なしている。
【０１４５】
[00162]  一部の実施形態では、植物はＧｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａおよびＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａからなる群から選択される。
【０１４６】
[00163]  一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の藻類を含む。本明細書に記載される種々の実施形態では、１つまたは複数の藻類は緑藻類、黄緑藻類および紅藻類から選択してもよい。
【０１４７】
[00164]  一部の実施形態では、１つまたは複数の藻類は１つまたは複数の緑藻類を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｉｓａｂｅｌｉｅｎｓｅを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＯｏｃｙｓｔｉｓ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＯｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｅｔｅｒｏｍｕｃｏｓａを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰｈａｃｏｔｕｓ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＰｈａｃｏｔｕｓ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｉｓを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＤａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＥｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＥｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｉｃｏｌａを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＤｉｃｒａｎｏｃｈａｅｔｅ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の緑藻類はＤｉｃｒａｎｏｃｈａｅｔｅ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓを含む。
【０１４８】
[00165]  一部の実施形態では、１つまたは複数の藻類は１つまたは複数の黄緑藻類を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の黄緑藻類はＨｅｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の黄緑藻類はＨｅｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒａｓｓｕｌｕｓを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の黄緑藻類はＨｅｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の黄緑藻類はＣｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の黄緑藻類はＣｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓを含む。
【０１４９】
[00166]  一部の実施形態では、１つまたは複数の藻類は１つまたは複数の紅藻類を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の紅藻類はＣｏｍｐｓｏｐｏｇｏｎ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の紅藻類はＣｏｍｐｓｏｐｏｇｏｎ  ｃｏｅｒｕｌｅｕｓを含む。
【０１５０】
[00167]  一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の鞭毛虫類を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の鞭毛虫類はＤｉｓｔｉｇｍａ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の鞭毛虫類はＤｉｓｔｉｇｍａ  ｃｕｒｖａｔａを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の鞭毛虫類はＧｙｒｏｐａｉｇｎｅ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の鞭毛虫類はＧｙｒｏｐａｉｇｎｅ  ｌｅｆｅｖｒｅｉを含む。
【０１５１】
[00168]  一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の珪藻類を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の珪藻類はＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属由来の種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の珪藻類はＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｓｕｂｓａｌｓｕｍを含む。
【０１５２】
[00169]  一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は１つまたは複数の細菌を含む。一部の実施形態では、細菌はグラム陰性菌を含む。一部の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓを含む。
【０１５３】
[00170]  一部の実施形態では、細菌はラン藻類を含む。一部の実施形態では、ラン藻類はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻類はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む。一部の実施形態では、ラン藻類はＣｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻類はＣｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ  ｆｒｉｔｓｃｈｉｉを含む。一部の実施形態では、ラン藻類はＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻類はＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈｅｇｅｗａｌｄｉｉを含む。一部の実施形態では、ラン藻類はＣｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻類はＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈｅｇｅｗａｌｄｉｉを含む。
【０１５４】
１つまたは複数の組換え微生物に導入する酵素および／またはタンパク質
[00171]  本開示は、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物において１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産することを含む方法に関する。一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は１つまたは複数の外因性生合成酵素を含む。
【０１５５】
デサチュラーゼ
[00172]  本開示は、脂肪アシル基質を対応する不飽和脂肪アシル基質に不飽和化する酵素を説明する。
【０１５６】
[00173]  一部の実施形態では、デサチュラーゼを使用して脂肪アシルＣｏＡまたはアシルＡＣＰの対応する不飽和脂肪アシルＣｏＡまたはアシルＡＣＰへの変換を触媒する。デサチュラーゼは、少なくとも２つの水素原子を取り除いて対応する不飽和脂肪酸／アシルを生成することにより、飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アシルＣｏＡまたは脂肪アシルＡＣＰ（本明細書では併せて「脂肪アシル」と呼ばれる）における炭素−炭素二重結合の形成を触媒する酵素である。デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端に対して末端近くの炭素または脂肪酸／アシルのカルボニル末端に対して末端近くの炭素での二重結合形成を選択的に触媒する酵素の能力に関して分類される。オメガ（ω）デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端に対して一定の末端近くの炭素での炭素−炭素二重結合の形成を触媒する。例えば、ω３デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端に対して３番目と４番目の炭素の間での二重結合の形成を触媒する。デルタ（Δ）デサチュラーゼは、脂肪酸のカルボキシル基または脂肪アシルＣｏＡのカルボニル基に対して特定の位置で炭素−炭素二重結合の形成を触媒する。例えば、Δ９は、脂肪酸のカルボキシル末端または脂肪アシルＣｏＡのカルボニル基に対してＣ９とＣ１０炭素の間での二重結合の形成を触媒する。
【０１５７】
[00174]  本明細書で使用されるように、デサチュラーゼは、それが二重結合の形成を触媒する位置および不飽和炭化水素の得られた幾何学的立体配置（すなわち、Ｅ／Ｚ）に関して記載することが可能である。したがって、本明細書で使用されるように、Ｚ９デサチュラーゼとは、脂肪酸／アシルのカルボニル末端に対してＣ９とＣ１０炭素の間での二重結合の形成を触媒し、それにより炭素−炭素二重結合の反対側の２つの炭化水素をシスまたはＺ立体配置に置くΔデサチュラーゼのことである。同様に、本明細書で使用されるように、Ｚ１１デサチュラーゼとは、脂肪酸／アシルのカルボニル末端に対してＣ１１とＣ１２炭素の間での二重結合の形成を触媒するΔデサチュラーゼのことである。
【０１５８】
[00175]  デサチュラーゼは保存された構造モチーフを有する。膜貫通デサチュラーゼのこの配列モチーフは［ＨＸ３−４ＨＸ７−４１（３非Ｈｉｓ）ＨＸ２−３（１非Ｈｉｓ）ＨＨＸ６１−１８９（４０非Ｈｉｓ）ＨＸ２−３（１非Ｈｉｓ）ＨＨ］を特徴とする。可溶性デサチュラーゼの配列モチーフは［Ｄ／ＥＥＸＸＨ］の２つの出現を特徴とする。
【０１５９】
[00176]  一部の実施形態では、デサチュラーゼは、脂肪アシルＣｏＡでの二重結合の形成を触媒する脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼである。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４炭素原子の鎖長を有する基質として脂肪アシルＣｏＡを利用することができる。したがって、組換え微生物において使用されるデサチュラーゼは、その基質の鎖長に基づいて選択することが可能である。
【０１６０】
[00177]  一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、不飽和脂肪アシルＣｏＡ上の終端ＣｏＡに対して所望の炭素での二重結合の形成を触媒することができる。したがって、一部の実施形態では、脂肪アシルＣｏＡ上のカルボニル基に関して３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３位での二重結合挿入を触媒するデサチュラーゼを組換え微生物において使用するために選択することが可能である。
【０１６１】
[00178]  一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、得られた不飽和脂肪アシルＣｏＡがシスまたはトランス（すなわち、ＺまたはＥ）幾何学的立体配置を有するように、飽和脂肪アシルＣｏＡにおいて二重結合の形成を触媒することができる。
【０１６２】
[00179]  一部の実施形態では、デサチュラーゼは、脂肪アシルＡＣＰにおいて二重結合の形成を触媒する脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼである。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４炭素原子の鎖長を有する基質として脂肪アシルＣｏＡを利用することができる。したがって、組換え微生物において使用されるデサチュラーゼは、その基質の鎖長に基づいて選択することが可能である。
【０１６３】
[00180]  一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼは、不飽和脂肪アシルＡＣＰ上の終端カルボニルに対して所望の炭素での二重結合の形成を触媒することができる。したがって、一部の実施形態では、脂肪アシルＡＣＰ上のカルボニル基に関して３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３位での二重結合挿入を触媒するデサチュラーゼを組換え微生物において使用するために選択することが可能である。
【０１６４】
[00181]  一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、得られた不飽和脂肪アシルＡＣＰがシスまたはトランス（すなわち、ＺまたはＥ）幾何学的立体配置を有するように、飽和脂肪アシルＣｏＡにおいて二重結合の形成を触媒することができる。
【０１６５】
[00182]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼである。ある特定の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＯＬＥ１である。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＧＬ０５５Ｗである。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｃ０５９５１ｇである。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１２５８３である。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５１１７である。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０５４７９である。
【０１６６】
[00183]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはオレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼである。ある特定の実施形態では、オレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼはＦＡＤ２である。一部の実施形態では、オレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｂ１０１５３ｇである。一部の実施形態では、オレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１１８である。一部の実施形態では、オレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．７７６５である。一部の実施形態では、オレオイルＣｏＡ  Δ１２デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０２９７５である。
【０１６７】
[00184]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはリノレオイルＣｏＡ  Δ１５デサチュラーゼである。ある特定の実施形態では、リノレオイルＣｏＡ  Δ１５デサチュラーゼはＦＡＤ３である。一部の実施形態では、リノレオイルＣｏＡ  Δ１５デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．４９３３である。一部の実施形態では、リノレオイルＣｏＡ  Δ１５デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１２３９９である。一部の実施形態では、ステアリルＣｏＡ  Δ９デサチュラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０３５８３である。
【０１６８】
[00185]  一例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物から単離することが可能である。さらなるＺ１１デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉまたはＤｉａｐｈａｎｉａ  ｎｉｔｉｄａｌｉｓから単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ６７９２０９、ＪＸ９６４７７４、ＡＦ４１６７３８、ＡＦ５４５４８１、ＥＵ１５２３３５、ＡＡＤ０３７７５、ＡＡＦ８１７８７、およびＡＹ４９３４３８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号３、１１、１７および１９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号４および９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号５および１６から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号２６および２７から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号６、１０および２３から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＡｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅ��ｐａ  ｚｅａ由来の配列番号７、１２、１８、２０および２４から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＳ．ｉｎｆｅｒｅｎｓ由来の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１６７３８、ＡＧＨ１２２１７．１、ＡＩＩ２１９４３．１、ＣＡＪ４３４３０．２、ＡＦ４４１２２１、ＡＡＦ８１７８７．１、ＡＦ５４５４８１、ＡＪ２７１４１４、ＡＹ３６２８７９、ＡＢＸ７１６３０．１およびＮＰ００１２９９５９４．１、Ｑ９Ｎ９Ｚ８、ＡＢＸ７１６３０．１およびＡＩＭ４０２２１．１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全または部分的Ｚ１１デサチュラーゼは別のポリペプチドに融合されている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ終端天然リーダー配列は別の種由来のオレオシンリーダー配列に置き換えられている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは配列番号８、２１および２２から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
[00186]  別の例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼ、またはそれをコードする核酸配列は、種Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｏｂｉｌａｌｉｓ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ、またはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａの生物から単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０５７８６２、ＡＦ２４３０４７、ＡＦ５１８０１７、ＥＵ１５２３３２、ＡＦ４８２９０６、およびＡＡＦ８１７８８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードしている核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＯｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＯｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＬａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＬａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
フラボタンパク質ピリジンヌクレオチドチトクロム還元酵素
[00187]  本開示は、１電子運搬体と２電子運搬ニコチンアミドジヌクレオチドの間の等価物を還元する相互交換を触媒する酵素を説明している。酵素は、フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋還元酵素（FNR）、植物および真菌ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素、ＮＡＤＨ：チトクロムｂ５還元酵素、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０還元酵素、ＮＡＤＰＨ：亜硫酸還元酵素、一酸化窒素シンターゼ、フタル酸ジオキシゲナーゼ還元酵素、および種々の他のフラボタンパク質を含むことが可能である。
【０１７１】
[00188]  一実施形態では、フラボタンパク質ピリジンヌクレオチドチトクロム還元酵素は、反応：２ａフェリチトクロムｂ５＋ＮＡＤＨ→２ａフェロチトクロムｂ５＋ＮＡＤ＋＋Ｈ＋を触媒するＮＡＤＨ：チトクロムＢ５還元酵素である。
【０１７２】
[00189]  ＮＡＤＨ：チトクロムＢ５還元酵素（CBR）は、遍在性電子運搬体であるチトクロムＢ５に対する電子供与体としての役目をするフラビタンパク質酸化還元酵素（flaviprotein oxidoreductase）である。チトクロムＢ５還元酵素は、ステロイドの生合成、脂肪酸の不飽和化および伸張、Ｐ４５０依存性反応ならびにメトヘモグロビン還元を含むがこれらに限定されない種々の代謝経路に関与している。
【０１７３】
[00190]  チトクロムＢ５還元酵素は、単一ｍＲＮＡの選択的スプライシングのせいで、可溶性酵素としても膜結合酵素としても存在している。可溶性型は主に赤血球に存在しておりメトヘモグロビンの還元に関与している。この酵素の膜結合型は主に小胞体およびミトコンドリア外膜に見出され、そこでこの酵素は脂肪酸の不飽和化、コレステロール生合成および薬物代謝に関与している。膜結合型では、Ｎ終端残基はミリストイル化されている。この酵素が欠損すると、メトヘモグロビン血症になることがある。
【０１７４】
[00191]  チトクロムＢ５還元酵素は、メトヘモグロビン還元酵素、ＮＡＤＨチトクロムＢ５還元酵素、ＮＡＤＨメトヘモグロビン還元酵素およびＮＡＤＨフェリヘモグロビン還元酵素としても知られている。
【０１７５】
[00192]  一実施形態では、フラボタンパク質ピリジンヌクレオチドチトクロム還元酵素はチトクロムＢ５還元酵素である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＩＬ０４３Ｃである。他の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０４９８３ｇである。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣａＯ１９．１８０１である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣａＯ１９．９３６７である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＣＴＲＧ＿０３８６５である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＨＱ８５２０５０である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＪＸ５６９７５６である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  ＨＱ６３８２２０である。一部の実施形態では、チトクロムＢ５還元酵素はＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  ＨＱ１９００４６である。別の実施形態では、フラボタンパク質ピリジンヌクレオチドチトクロム還元酵素はＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ１またはＮＣＰ１）である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＨＲ０４２Ｗである。他の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０４４２２ｇである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣａＯ１９．１０１８７である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣａＯ１９．２６７２である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＣＴＲＧ＿００４８５である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ  ＪＸ３１００７３である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＨＱ８５２０４９である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０還元酵素はＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  ＨＭ３４７７８５である。
【０１７６】
[00193]  一部の実施形態では、本明細書に記載されるチトクロム還元酵素を使用して、脂肪アシルＣｏＡまたはアシルＡＣＰの対応する不飽和脂肪アシルＣｏＡまたはアシルＡＣＰへの変換を触媒する。
【０１７７】
エロンガーゼ
[00194]  本開示は脂肪酸の鎖長を伸ばす酵素を説明する。
【０１７８】
[00195]  ２つの異なるタイプの脂肪酸伸張が異なる生物で起こる。これらの伸張経路は、アシルキャリアとして脂肪酸合成系ＦＡＳＩおよびＦＡＳＩＩのアシルキャリアタンパク質（ACP）ではなく補酵素Ａを使用する。第１のタイプ、ミトコンドリア脂肪酸伸張は脂肪酸酸化の逆転である。これは基質としてアセチルＣｏＡを利用し、２つの炭素で脂肪酸の鎖長を伸ばす。このプロセスは主にＣ１６よりも短いアシルＣｏＡに作用する。
【０１７９】
[00196]  第２のプロセスは小胞体の伸張経路であり、これは植物、哺乳動物、酵母および他の下等真核生物に存在する。これは４段階反応であり、それぞれが個別の酵素で触媒される。これらの酵素はベータケトアシルＣｏＡシンターゼ、ベータケトアシルＣｏＡ還元酵素、ベータヒドロキシアシルＣｏＡ脱水酵素およびトランス−２−エノイルＣｏＡ還元酵素である。この経路は主に鎖長Ｃ１６またはそれよりも大きなアシルＣｏＡを用いて作用し、極めて長い鎖の脂肪酸の生成に重要である。このプロセスは鎖伸張にアセチルＣｏＡではなくマロニルＣｏＡを利用する。マロニルＣｏＡとアシルＣｏＡの縮合を生じる第１の酵素（ベータケトアシルＣｏＡシンターゼ）もエロンガーゼと呼ばれる。
【０１８０】
[00197]  宿主生物に応じてエロンガーゼのいくつかの変異体が存在する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、３つの異なる遺伝子がエロンガーゼ（ELO1、ELO2（FEN1）およびELO3（FEN12））をコードしており、これらのエロンガーゼは異なる基質特異性を有する。ＥＬＯ１は比較的短い飽和脂肪酸（Ｃ１４〜Ｃ１６）を好み、ＥＬＯ２は長いほうの飽和および一不飽和脂肪酸を好み、ＥＬＯ３は一不飽和および多価不飽和脂肪酸を好む。これとは対照的に、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉは比較的短い脂肪酸に対する特異性を有する２つのエロンガーゼ遺伝子を有する（ＥＬＯ１はＣ４〜Ｃ１０伸張、ＥＬＯ２はＣ１０〜Ｃ１４伸張）。３つの酵母エロンガーゼ遺伝子のオルソログはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍとＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉの両方で同定され、これらのエロンガーゼは酵母のエロンガーゼに対して類似する基質特異性を有し得る。
【０１８１】
[00198]  一部の実施形態では、エロンガーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＬＯ１である（ＹＪＬ１９６Ｃ）。別の実施形態では、エロンガーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＬＯ２（ＦＥＮ１）である（ＹＣＲ０３４Ｗ）。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．６３４３である。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３６９９である。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０３５６３である。別の実施形態では、エロンガーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＬＯ３（ＦＥＮ１２）である（ＹＬＲ３７２Ｗ）。ある実施形態では、エロンガーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｂ２０１９６ｇである。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．８５２６である。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９０８である。ある実施形態では、エロンガーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１１７９である。
【０１８２】
[00199]  脂肪酸伸張に加えて、脂肪酸サルベージもこの経路に含まれている。アシルＣｏＡ結合タンパク質（ACBP）の作用により宿主から回収される脂肪酸は、ＥＲ局在化酵素ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（DGAT）およびステロールＯ−アシルトランスフェラーゼの作用でそれぞれトリアシルグリセリドおよびコレステロールエステルに変換することが可能であり、脂肪体に蓄えることが可能である。宿主からの脂肪酸の獲得を支持する強力な生化学上の証拠がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＴ．ｇｏｎｄｉｉには存在する。
【０１８３】
チオエステラーゼ
[00200]  本開示は、アシルＡＣＰまたはアシルＣｏＡから遊離脂肪酸を放出する酵素を説明する。
【０１８４】
[00201]  アシルＡＣＰチオエステラーゼは、新規の脂肪酸生合成から合成された、アシルＡＣＰから遊離脂肪酸を放出する。この反応は脂肪酸生合成を終結させる。植物では、脂肪酸生合成は色素体で起こり、したがって、色素体局在化アシルＡＣＰチオエステラーゼを必要とする。あらゆる植物の栄養組織で、アシルＡＣＰチオエステラーゼの主生成物はオレイン酸（Ｃ１８：０）であり、それよりも少ないが、パルミチン酸（Ｃ１６：０）である。放出された遊離脂肪酸は色素体外被で補酵素Ａに再エステル化されて色素体の外に運び出される。
【０１８５】
[00202]  アシルＡＣＰチオエステラーゼには２つのアイソフォーム、ＦａｔＡおよびＦａｔＢがある。これらのアイソフォームの基質特異性が植物中の飽和脂肪酸の鎖長およびレベルを決定する。ＦａｔＡのもっとも高い活性はＣ１８：１−ＡＣＰの場合である。ＦａｔＡはＣ１８：１−ＡＣＰと比べると、他のアシルＡＣＰに対する活性は非常に低い。ＦａｔＢはＣ１６：０−ＡＣＰの場合の活性がもっとも高い。ＦａｔＢはＣ１８：１−ＡＣＰ、続いてＣ１８：０−ＡＣＰおよびＣ１６：１−ＡＣＰとも有意に高い活性を有する。ＦａｔＡおよびＦａｔＢの動態研究によれば、異なるアシルＡＣＰとのその基質特異性はＫｍからというよりＫｃａｔ値から生じることが示されている。異なる基質との２つのアイソフォームのＫｍ値はマイクロモルの桁で類似している。ＦａｔＡおよびＦａｔＢのドメインスワッピングで、アイソフォームのＮ終端がその基質特異性を決定することが示されている。大部分が種子に中位の鎖長の飽和脂肪酸を蓄積する植物では、特殊化したＦａｔＢおよび／またはＦａｔＡチオエステラーゼと共に進化した(Voelker T, Kinney AJ (2001) Variations in the biosynthesis of seed-storage lipids. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 335-361)。例えば、ラウリン酸（１２：０）はココナッツ中の主たる種子油である。これに対応して、中位の鎖特異的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性はココナッツ種子中で検出された。
【０１８６】
[00203]  脂肪酸は細胞中でアシルｃｏＡの活性化された形態で見つかることが多い。アシルＣｏＡは多くの細胞産物および成分の生合成で使用される。植物では、アシルＣｏＡは、膜脂質、種子貯蔵脂質、ワックス、クチンおよびスベリンの生合成に関与している。
【０１８７】
[00204]  アシルＣｏＡチオエステラーゼは脂肪アシルＣｏＡを遊離脂肪酸に加水分解する。真核生物では、この酵素活性はサイトゾル、ＥＲ、ミトコンドリアおよびペルオキシソームで検出されている。原核生物では、この酵素活性は周辺質およびサイトゾルに局在化されている。原核生物では、アシルＣｏＡチオエステラーゼは異化反応に関与しており、唯一の炭素源として脂肪酸またはコンジュゲート脂肪酸での成長を支持している（Nie Lら、（2008年）A novel paradigm of fatty acid beta-oxidation exemplified by the thioesterase-dependent partial degradation of conjugated linoleic acid that fully supports growth of Escherichia coli. Biochemistry 47(36): 9618〜26頁）。真核生物におけるアシルＣｏＡチオエステラーゼの生理的役割は不明のままである。動物および酵母での研究により、脂肪酸酸化へのこの酵素の関与についての予備的手がかりが与えられる。ＡＣＨ２は最初のクローン化された植物アシルＣｏＡチオエステラーゼである（Tilton GBら、（2004年）Biochemical and molecular characterization of ACH2, an acyl-CoA thioesterase from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 279(9): 7487〜94頁）。この遺伝子は、脂肪酸ベータ酸化が主に起こる出芽実生よりはむしろ成熟組織で高度に発現される。これは、ＡＣＨ２の役割が脂肪酸酸化と関連していないことを示している。
【０１８８】
[00205]  一部の実施形態では、アシルＡＣＰチオエステラーゼはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＦａｔＢである（Gene ID AT1G08510）。一部の実施形態では、アシルＡＣＰチオエステラーゼはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＦａｔＡである（Gene ID AT3G25110）。
【０１８９】
[00206]  一部の実施形態では、アシルＣｏＡチオエステラーゼはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のｔｅｓＡである（Gene ID EG11542）。一部の実施形態では、アシルＣｏＡチオエステラーゼはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＣＨ２である（Gene ID AT1G01710）。
【０１９０】
グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ
[00207]  本開示は、次に示されるグリセロール３−リン酸のｓｎ−１位でのアシル化反応：
長鎖アシルＣｏＡ＋ｓｎ−グリセロール３−リン酸→１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸＋補酵素Ａ
を触媒する酵素を説明する。
【０１９１】
[00208]  グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）は、グリセロール３−リン酸のｓｎ−１位でのアシル化反応を触媒する。植物細胞は３つのタイプのＧＰＡＴを含有しており、これらは葉緑体、ミトコンドリアおよび細胞質に位置している。葉緑素中の酵素は可溶性であり、アシル−（アシルキャリアタンパク質）をアシル供与体として使用し、ミトコンドリアおよび細胞質中の酵素は膜に結合していてアシルＣｏＡをアシル供与体として使用する（Nishida Iら、（1993年）The gene and the RNA for the precursor to the plastid-located glycerol-3-phosphate acyltransferase of Arabidopsis thaliana.  Plant Mol Biol. 21(2): 267〜77頁; Murata N and Tasaka Y（1997年）Glycerol-3-phosphate acyltransferase in plants. Biochim Biophys Acta. 1348(1-2):10〜16頁）。
【０１９２】
[00209]  ８つのＧＰＡＴ遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓで同定されている（Zheng Zら、（2003年）Arabidopsis AtGPAT1, a member of the membrane-bound glycerol-3-phosphate acyltransferase gene family, is essential for tapetum differentiation and male fertility. Plant Cell 15(8):1872〜87頁）。ＧＰＡＴ１はミトコンドリア酵素をコードしていることが明らかにされた（Zhengら、2003年）。ＧＰＡＴ４、ＧＰＡＴ５よびＧＰＡＴ８はクチン生合成に不可欠であることが明らかにされた（Beisson Fら、（2007年）The acyltransferase GPAT5 is required for the synthesis of suberin in seed coat and root of Arabidopsis. Plant Cell 19(1): 351〜368頁; Li, Yら、（2007年）Identification of acyltransferases required for cutin biosynthesis and production of cutin with suberin-like monomers. Proc Natl Acad Sci USA 104(46): 18339〜18344頁）。ＧＰＡＴ２、ＧＰＡＴ３、ＧＰＡＴ６およびＧＰＡＴ７はまだ特徴付けられていない。
【０１９３】
[00210]  細胞質ＧＰＡＴはトリアシルグリセロールおよび非葉緑体膜リン脂質の合成の原因である。細胞質ＧＰＡＴは、パルミチン酸（Ｃ１６：０）およびオレイン酸（Ｃ１８：１）に対して基質選択性を有すると予測されている。なぜならば、これらの２つの脂肪酸は、植物トリアシルグリセロールのｓｎ−１位で見出されるもっとも一般的な脂肪酸だからである。細胞質ＧＰＡＴはアボカドから部分的に精製された（Eccleston VS and Harwood JL（1995年）Solubilisation, partial purification and properties of acyl-CoA: glycerol-3-phosphate acyltransferase from avocado （Persea americana）fruit mesocarp.Biochim Biophys Acta 1257(1):1〜10頁）。
【０１９４】
[00211]  Ｅ．ｃｏｌｉ由来の膜結合グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＰｌｓＢ）はリン脂質生合成の最初の関与段階を触媒し、それに続く酵素１−アシルグリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＰｌｓＣ）のすぐそばで機能すると考えられている(Kessels JM ら、(1983) Facilitated utilization of endogenously synthesized lysophosphatidic acid by 1-acylglycerophosphate acyltransferase from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 753(2): 227-235)。ＰｌｓＢはｓｎ−グリセロール３−リン酸の１位でのアシル化に特異的であり、脂肪アシルアシルキャリアタンパク質（アシルＡＣＰ）または脂肪アシル補酵素Ａ（アシルＣｏＡ）チオエステルをアシル供与体として利用して１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸を形成することが可能である。内因的に合成される脂肪酸はＡＣＰに結合しており、外因的に加えられる脂肪酸はＣｏＡに結合している。Ｅ．ｃｏｌｉリン脂質では、ｓｎ−１位は主にパルミチン酸またはシス−バクシネート（cis-vaccenate）により占められ、ｓｎ−２位は主に、パルミトレイン酸またはシスバクシネートである。これは、ＰｌｓＢおよびＰｌｓＣ酵素の基質選択性から生じると考えられている。
【０１９５】
[00212]  ｐｌｓＢ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼ、シグマ２４（シグマＥ）因子およびｐｐＧｐｐなどのストレス応答制御因子により調節されていることが明らかにされている(Wahl Aら、(2011) Antagonistic regulation of dgkA and plsB genes of phospholipid synthesis by multiple stress responses in Escherichia coli. Mol Microbiol 80(5): 1260-75。ＰｌｓＢはリン脂質合成のためのタンパク質ネットワークの一部であり、ホロ−［アシルキャリアタンパク質］（ACP）、エステラーゼ／チオエステラーゼ（ＹｂｇＣ）およびホスファチジルセリンシンターゼ（ＰｓｓＡ）と相互作用して内膜の細胞質側で複合体を形成する。
【０１９６】
[00213]  ｐｌｓＢは成長に不可欠である(Baba Tら、(2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2:2006-2008; Yoshimura M ら、(2007) Involvement of the YneS/YgiH and PlsX proteins in phospholipid biosynthesis in both Bacillus subtilis and Escherichia coli. BMC Microbiol 7: 69)。
【０１９７】
[00214]  部位特異的変異誘発および化学修飾研究により、触媒作用に不可欠であるインバリアントヒスチジン残基を含む、ＰｌｓＢにおける触媒的に重要なアミノ酸残基が示されている(Lewin TMら、(1999) Analysis of amino acid motifs diagnostic for the sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase reaction. Biochemistry 38(18): 5764-5771)。遺伝子研究により、ｐｌｓＢ遺伝子座が多剤耐性生残菌細胞の形成に関与していることが確認された。
【０１９８】
[00215]  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ酵素の特性は以前の研究で調べられた(Kito Mら、(1972) Inhibition of L-glycerol 3-phosphate acyltransferase from Escherichia coli by cis-9, 10-methylenehexadecanoic acid. J Biochem 71(1): 99-105; Okuyama H and Wakil SJ (1973) Positional specificities of acyl coenzyme A: glycerophosphate and acyl coenzyme A: monoacylglycerophosphate acyltransferases in Escherichia coli. J Biol Chem 248(14): 5197-5205; Kito M 、(1978) Function of phospholipids on the regulatory properties of solubilized and membrane-bound sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 529(2): 237-249)。
【０１９９】
[00216]  グリセロール−３−リン酸／ジヒドロキシアセトンリン酸二重基質特異的ｓｎ−１アシルトランスフェラーゼは脂質粒子およびＥＲに位置しており、脂質生合成においてグリセロール−３−リン酸およびジヒドロキシアセトンの段階的アシル化に関与している。もっとも保存されたモチーフおよび機能的に関連する残基はＥＲ管腔のほうに方向付けられている。
【０２００】
[00217]  二重グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（GAT）／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ（DHAT）をコードする遺伝子（ACT1）はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから同定され、クローニングされ、生化学的に特徴付けられた。きわめて低いＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性を示す酵母Δｇｐｔ１突然変異体では、プラスミドベクターを通じたＳＣＴ１の過剰発現によりＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性の増加が示され、グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼとしての提唱されている分子機能をはっきり示していた。アシル供与体に対するＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性は、パルミトレオイルＣｏＡの場合でもっとも高く、続いてパルミトイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡおよびステアロイルＣｏＡであった。ＳＣＴ１ｐはサイトゾルの膜に、九分通り小胞体に局在化していた。Δｓｃｔ１突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、４つのリン脂質全てに対する影響があることが実際に明らかにされたが、ホスファチジルエタノールアミンクラスでの１６：０脂肪酸の観察された減少は他の脂肪酸、特に１８：０分子種の増加により相殺された。ＳＣＴ１およびＧＰＴ２のヌル突然変異体は酵母では合成的に致死的であった（Zheng Z and Zou J（2001年）The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol 3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 276(45): 417104〜41716頁）。
【０２０１】
[00218]  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の二重グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（GAT）／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ（DHAT）をコードする遺伝子（GPT2）は同定され、クローニングされ、生化学的に特徴付けられた。ＧＰＴ２は、ＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性を欠くΔｐｌｓＢバックグラウンドでＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に発現され、ＧＡＴ活性の増加を示したが、おそらく膜でのＧＰＴ２の不正確な包埋のせいで突然変異体を救出することはできなかった。きわめて低いＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性を示す酵母Δｇｐｔ１突然変異体では、プラスミドベクターからのＧＰＴ２の過剰発現によりＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性の増加が示され、グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼとしての提唱されている分子機能をはっきり示していた。アシル供与体に対するＧＡＴ／ＤＨＡＴ活性は、オレオイルＣｏＡの場合がもっとも高く、続いてパルミトレオイルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、およびステアロイルＣｏＡであった。
【０２０２】
[00219]  ＧＰＴ２ｐはサイトゾルの膜に局在化していた。Δｇｐｔ２突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、全体脂肪酸プロファイルへのいかなる有意な影響も明らかにされなかったが、ホスファチジルエタノールアミンクラスでの１６：１脂肪酸の減少が観察され、これは１６：０および１８：１分子種の増加により補償された。ＧＡＴ活性が欠損している既知の酵母突然変異体ＴＴＡ１の分析により、ＴＴＡ１  ＧＰＴ２遺伝子がアシルトランスフェラーゼを表す保存されたモチーフＩＩＩで一ヌクレオチド変化しているミスセンス突然変異を有することが示された。ＳＣＴ１およびＧＰＴ２のヌル突然変異体は酵母では合成的に致死であった（Zheng and Zou 2001年）。
【０２０３】
[00220]  一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（At1g02390）由来のＧＰＡＴである。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のＰｌｓＢである（Gene ID EG10740）。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の二重グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（GAT）／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ（DHAT）ＳＣＴ１である（YBL011w）。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇである。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＩ５０３＿０２５７７である。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０２６３０である。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の二重グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（GAT）／ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ（DHAT）ＧＰＴ２である（YKR067w）。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５８１５である。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３２３７である。一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０２６３０である。
【０２０４】
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
[00221]  本開示はトリアシルグリセロールのｓｎ−２位のアシル化を触媒する酵素を説明する。
【０２０５】
[00222]  遺伝子ｐｌｓＣにコードされる膜結合１−アシルグリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼはリン脂質生合成の第２段階を触媒し、
遺伝子ｐｌｓＢにコードされる先行する酵素グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼのすぐそばで機能すると考えられている（Kessels JMら、1983年）。この酵素は１−アシル−ｓｎ−グリセロール  ３−リン酸のｓｎ−２位でのアシル化に特異的であり、アシルアシルキャリアタンパク質（アシルＡＣＰ）またはアシル補酵素Ａ（アシルＣｏＡ）を脂肪酸供与体として利用して１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール  ３−リン酸（ホスファチデート、ホスファチジン酸）を形成することが可能である。内因的に合成される脂肪酸はＡＣＰに結合しており、外因的に加えられる脂肪酸はＣｏＡに結合している(Greenway DL and Silbert DF (1983) Altered acyltransferase activity in Escherichia coli associated with mutations in acyl coenzyme A synthetase. J Biol Chem 258(21): 13034-13042)。Ｅ．ｃｏｌｉリン脂質では、ｓｎ−１位は主にパルミチン酸またはシスバクシネートにより占められ、ｓｎ−２位は主に、パルミトレイン酸またはシスバクシネートである。これは、ＰｌｓＢおよびＰｌｓＣ酵素の基質選択性から生じると考えられている（Rock COら、（1981年）Phospholipid synthesis in Escherichia coli. Characteristics of fatty acid transfer from acyl-acyl carrier protein to sn-glycerol 3-phosphate. J Biol Chem 256(2): 736〜742頁; Goelz SE and Cronan JE（1980年）The positional distribution of fatty acids in Escherichia coli phospholipids is not regulated by sn-glycerol 3-phosphate levels. J Bacteriol 144(1): 462〜464頁）。
【０２０６】
[00223]  部位特異的変異誘発研究により、スレオニン１２２をアラニンまたはロイシンに変えるとアシルＣｏＡ基質特異性が変化することが示された（Morand LZら、(1998) Alteration of the fatty acid substrate specificity of lysophosphatidate acyltransferase by site-directed mutagenesis. Biochem Biophys Res Commun 244(1): 79-84）。
【０２０７】
[00224]  Ｅ．ｃｏｌｉの工学的に操作された株では、ＰｌｓＣおよびＧａｌＵが過剰発現するとグリセロ糖脂質の生成が増加した（Mora-Buye Nら、（2012年）An engineered E. coli strain for the production of glycoglycerolipids. Metab Eng 14(5): 551〜559頁）。
【０２０８】
[00225]  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｐｌｓＣ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ酵素に相同の１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードする。この遺伝子はクローニングされＥ．ｃｏｌｉで発現され、この遺伝子を発現する膜は予想される機能を触媒することが示された（Lu YJら、（2006年）Acyl-phosphates initiate membrane phospholipid synthesis in Gram-positive pathogens. Mol Cell 23(5): 765〜772年）。
【０２０９】
[00226]  植物リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）はトリアシルグリセロールのｓｎ−２位のアシル化を触媒する。所与の植物種におけるＬＰＡＡＴの基質特異性は一般に、どの脂肪酸種がｓｎ−２位に組み込まれるかを決定する。ＬＰＡＡＴはトウモロコシおよびメドウフォームからクローニングされた。メドウフォームには２つのＬＰＡＡＴ遺伝子があり、トウモロコシには１つしかない。メドウフォームのＬＡＴ１とＬＡＴ２の両方の酵素活性がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで確かめられた。さらに、ＬＡＴ１はＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＡＡＴ欠損株を機能的に補完することが示された（Brown APら、（2002年）Limnanthes douglasii lysophosphatidic acid acyltransferases: immunological quantification, acyl selectivity and functional replacement of the Escherichia coli plsC gene. Biochem J 364(Pt 3):795〜805頁）。
【０２１０】
[00227]  ＬＡＴ１は、基質として１８：１−ＣｏＡのみを使用する高度に選択的なアシルトランスフェラーゼである。ＬＡＴ２はそれほど選択的ではない。もっとも高い活性は２２：１−ＣｏＡに対して示され、続いて１６：０−ＣｏＡおよび１８：１−ＣｏＡであった。ＬＡＴ１およびＬＡＴ２の基質特異性は、膜脂質生合成におけるＬＡＴ１および貯蔵脂質生合成におけるＬＡＴ２について、提唱されている役割に一致している。植物細胞膜は主に、Ｃ１６およびＣ１８不飽和脂肪酸を含有し、貯蔵脂質は、飽和脂肪酸および極めて長い鎖の不飽和脂肪酸を含む広範囲の脂肪酸を含有する。異なる植物組織におけるＬＡＴ１およびＬＡＴ２のタンパク質レベルは抗体により検出された。ＬＡＴ１は葉と発生中の種子の両方に存在しており、ＬＡＴ２は発生中の種子でのみ検出される。これは再びその提唱されている役割に一致している。トリアシルグリセロール生合成でのＬＡＴ２の役割は、通常はｓｎ−２位に２２：１−ＣｏＡを含有しないアブラナにおけるＬＡＴ２の形質転換によりさらに明らかにされた。メドウフォームＬＡＴ２の形質転換によりｓｎ−２位に２２：１−ＣｏＡが挿入された(Lassner MWら、(1995) Lysophosphatidic acid acyltransferase from meadowfoam mediates insertion of erucic acid at the sn-2 position of triacylglycerol in transgenic rapeseed oil. Plant Physiol 109(4): 1389-1394)。
【０２１１】
[00228]  スフィンゴ脂質生合成を欠く生存可能な突然変異Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を利用して、遺伝子ＳＬＣ１を単離しアシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードすることを実証した。１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼとして分類されるＥ．ｃｏｌｉのＰＬＳＣタンパク質との配列相同性は類似の機能を示した。ＳＬＣ１ｐのこの推定される分子機能は、Ｅ．ｃｏｌｉのΔｐｌｓＣ突然変異体を救出する能力により確証された。１３１位でＬグルタミンをＬ−ロイシンに変化させる単一ヌクレオチド変更は基質選択性をＣ１６およびＣ１８脂肪酸からＣ２６脂肪酸に形質転換し、これがｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型（SLC1）対突然変異体（SLC1-1）の対応する脂肪酸組成に反映されていることを示すことができた(Nagiec MMら、(1993) A suppressor gene that enables Saccharomyces cerevisiae to grow without making sphingolipids encodes a protein that resembles an Escherichia coli fatty acyltransferase. J Biol Chem 268(29): 22156-22163)。
【０２１２】
[00229]  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に発現され精製されたＳＬＣ１ｐを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、リゾホスファチジン酸およびオレオイルＣｏＡに対する基質選択性が明らかになったが、１−パルミトイルグリセロール  ３−リン酸および１−ステアロイル−ｓｎ−グリセロール  ３−リン酸も受け入れた。２．ΔＳＬＣ１（または２．ΔＳＬＣ４）と呼ばれるＳＬＣ１またはＳＬＣ４遺伝子を有するプラスミドを保有するΔｓｌｃ１、Δｓｌｃ４（もう１つの潜在的なアシルＣｏＡ：ホスファチジルアシルトランスフェラーゼ）およびダブル突然変異体Δｓｌｃ１Δｓｌｃ４などの突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、ＳＬＣ１がホスファチデートならびにホスファチジルイノシトールおよびジアシルグリセロールの生合成も促進することが示された。ＳＬＣ１はｉｎ  ｖｉｖｏでのグリセロリン脂質上での脂肪酸の交換によるリン脂質リモデリングに関与していることが示唆された（Benghezal Mら、（2007年）SLC1 and SLC4 encode partially redundant acyl-coenzyme A 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferases of budding yeast. J Biol Chem 282(42): 30845〜30855頁）。
【０２１３】
[00230]  既知のアシルトランスフェラーゼ酵素の候補オープンリーディングフレーム（ORF）を有する酵母ゲノムをスクリーニングし関連する欠損株を試験して、アシルＣｏＡ依存性リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ（ALE1）をコードする遺伝子を同定した。Δａｌｅ１株では、リゾホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ（LPEAT）活性の劇的減少が観察されたが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの主要なＬＰＡＡＴ、すなわち、ＳＬＣ１ｐが存在しないまたは不活性になっている場合、ＡＬＥ１ｐが重複性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）活性を与え得ることも実証することができた。ＡＬＥ１ｐは好ましくは、異なる長さの不飽和アシル鎖をリゾリン脂質のｓｎ−２位に結合させる。この酵素は高純度細胞分画を利用してミクロソームとミトコンドリア膜の両方にその位置を突き止められた。ＡＬＥ１は酵母における外来性リゾ脂質代謝（ELM）経路での主要名ＬＰＥＡＴであり得ることが提唱されてきたが、ＡＬＥ１は内在性ケネディ経路が効率的に機能するのにも必要とされる（Riekhof WRら、（2007年）Identification and characterization of the major lysophosphatidylethanolamine acyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 282(39): 28344〜28352頁）。
【０２１４】
[00231]  同時研究で、ＬＰＴ１（ALE1と同義である）は、合成遺伝子アレイ分析を適用することにより同定され、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有することが示された。この研究で、ＬＰＴ１（=ALE1）に対するもっともよい基質はリゾホスファチジルコリンであり、したがって、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（LPCAT）として作用し、以前報告されたＬＰＡＡＴとしての残存活性も、単一Δｌｐｔ1およびダブルΔｓｃｌ１Δｌｐｔ１突然変異体を使用して実証され、後者は生存不能であった。オレイン酸をホスファチジルコリンに組み込む率は、新規合成に対して７０％、リモデリングに対して３０％として判定された(Jain Sら、(2007) Identification of a novel lysophospholipid acyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 282(42): 30562-30569)。
【０２１５】
[00232]  リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（LPCAT）としてのＡＬＥ１（LCA1またはSLC4とも呼ばれる）の分子機能は、放射性標識リゾホスファチジルコリンおよび／またはパルミトイルＣｏＡのホスファチジルコリン（PC）への取込みを監視するもう１つの同時研究により確証された。この研究は、ＡＬＥ１ｐ（=本研究でのLCA1p）が様々なアシル供与体を受け入れていたが、リゾホスファチジルコリン種のアシル鎖（１６：０または１８：１）とは無関係にＬＰＣＡＴとしてもっとも高い活性を示した。さらに、０．１ｍＭより上の濃度では阻害性であり、もっと低い濃度（１０〜２５μＭ）では活性化するＺｎ２＋に対する高い感受性が観察された。ＡＬＥ１ｐ（=LCA1p）について測定された高いＰＣ代謝回転速度はＰＣの再アシル化に関与している重要な触媒としてのこの酵素を強調した(Chen Qら、(2007) The yeast acylglycerol acyltransferase LCA1 is a key component of Lands cycle for phosphatidylcholine turnover." FEBS Lett 581(28): 5511-5516)。
【０２１６】
[00233]  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの脂肪滴（LD）の形成での異常を引き起こす遺伝子の捜索によりアシルＣｏＡ依存性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＬＯＡ１（以前はＶＰＳ６６）が同定された。ＬＯＡ１ｐのｉｎ  ｖｉｖｏ分子機能は、野生型およびΔｌｏａ１酵母株のリピドームの比較を使用して決定された。分析によれば、ＬＯＡ１欠損突然変異体（Δloa1）では、ホスファチジン酸分子種を含有するオレイン酸のパーセンテージはかなり減少し、トリアシルグリセロール（TGA）の含有量は２０％低くなることが示された。そのタンパク質はＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に発現され、高度に濃縮された脂肪滴分画を得ることにより、およびマトリックスビーズにずっと結合しているＬＯＡ１ｐでの親和性クロマトグラフィーにより部分的に精製された。精製ＬＯＡ１ｐはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで特徴付けられ、ＬＯＡ１ｐがリゾホスファチジン酸およびオレオイルＣｏＡに対して特異的であり、したがって、酵母中でオレオイルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼとして作用することを実証した。この結果に基づいて、ＬＯＡ１ｐは過剰なオレイン酸含有ホスファチジン酸種をＴＡＧ生合成および脂肪滴（LD）の適切な成長に注ぐことに顕著に関与していると提唱された。ゲノムタギング構築物、細胞内分画、免疫組織化学および蛍光顕微鏡を利用して、ＬＯＡ１の位置を小胞体（ER）と脂肪滴（LD）に突き止めることができた(Ayciriex Sら、(2012) YPR139c/LOA1 encodes a novel lysophosphatidic acid acyltransferase associated with lipid droplets and involved in TAG homeostasis. Mol Biol Cell 23(2): 233-246)。
【０２１７】
[00234]  一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｐｌｓＣである（MetaCyc受託番号ID EG11377）。他の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｐｌｓＣである（MetaCyc受託番号ID G-10763）。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ由来のＬＡＴ１である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ由来のＬＡＴ２である（MetaCyc Accession ID G-9398）。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳＬＣ１である（YDL052c）。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇである。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．２５０である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．７８８１である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０２４３７である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＬＥ１である（YOR175C）。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｇである。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１８８１である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９４３７である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１６８７である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＬＯＡ１である（YPR139C）。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｃ１４０１４ｇである。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１０４３である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．８６４５である。一部の実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０４７５０である。
【０２１８】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
[00235]  本開示はアシル基をジアシルグリセロール（DAG）のｓｎ−３位に付加してトリアシルグリセロール（TAG）を形成する酵素を説明する。
【０２１９】
[00236]  ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）はトリアシルグリセロール生合成において唯一の独特の反応を触媒する。この酵素はアシル基をジアシルグリセロール（DAG）のｓｎ−３位に付加してトリアシルグリセロール（TAG）を形成し、この反応は以下のように示される。
【０２２０】
[00237]  アシルＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール→トリアシル−ｓｎ−グリセロール＋補酵素Ａ
【０２２１】
[00238]  ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＧＡＴについて実証されたように、ＤＧＡＴはＣ１８：１、Ｃ１８：２、およびＣ２０：１アシルＣｏＡを含む広範囲のアシルＣｏＡをアシル供与体として受け入れる（Jako Cら、（2001年）Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight. Plant Physiol 126(2): 861〜874頁）。昆虫細胞培養物でおよび酵母でＤＧＡＴのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡを発現させ、ならびに野生型ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでこのｃＤＮＡを過剰発現すると、アシル基をＤＡＧのｓｎ−３位に移す際のＤＧＡＴ活性が実証された（Hobbs DHら、（1999年）Cloning of a cDNA encoding diacylglycerol acyltransferase from Arabidopsis thaliana and its functional expression. FEBS Lett 452(3): 145〜149頁; Zou J et al.（1999年）The Arabidopsis thaliana TAG1 mutant has a mutation in a diacylglycerol acyltransferase gene. Plant J 19(6): 645〜653頁）。野生型ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡを過剰発現させると種子中で油堆積が増加し、この増加はＤＧＡＴのｍＲＮＡ発現レベルの増加と相関している。これにより、ＤＧＡＴがトリアシルグリセロール生合成経路の調節点であることが示される。
【０２２２】
[00239]  二機能性アシルＣｏＡ：アシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）をコードする遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてトリアシルグリセロール生合成にとっての主要な寄与体として同定された（Sandager Lら、（2002年）Storage lipid synthesis is non-essential in yeast. J Biol Chem 277(8): 6478〜6482頁）。この遺伝子（DGA1）はＤＧＡＴ２ファミリーに属し、このメンバーはアシルＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼとして特徴付けられている（Lardizabal KDら、（2001年）DGAT2 is a new diacylglycerol acyltransferase gene family: purification, cloning, and expression in insect cells of two polypeptides from Mortierella ramanniana with diacylglycerol acyltransferase activity." J Biol Chem 276(42): 38862〜38869頁）。ＤＧＡ１ｐが酵母ゲノムにおけるジアシルグリセロール（DAG）のトリアシルグリセロール（TAG）へのエステル化を触媒する唯一のアシルＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼであることは実証されている。これはＤＧＡ１（Δdga1）の欠損突然変異体においておよび酵母における重要なもう一方のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、すなわち、リン脂質アシル供与体を利用してＤＡＧをエステル化するＬＲＯ１（Δlro1）の欠損と組み合わせて明らかにされた。Δdga1Δlro1ダブル突然変異体では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのほぼすべてが失われておりＴＡＧ合成は消失していた。ＤＧＡ１遺伝子を保有するプラスミドは突然変異体におけるＴＡＧ合成欠損を救出することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏではＤＧＡ１はＴＡＧ生合成ルートに顕著に関与していることを示していた（Sorger D, Daum G（2002年）Synthesis of triacylglycerols by the acyl-coenzyme A:diacyl-glycerol acyltransferase Dga1p in lipid particles of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 184(2): 519〜524頁; Oelkers Pら、（2002年）The DGA1 gene determines a second triglyceride synthetic pathway in yeast. J Biol Chem 277(11): 8877〜8881頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏではオレオイルＣｏＡおよびパルミトイルＣｏＡに対するＤＧＡ１ｐの優先性が観察され、この優先性はリン脂質依存性アシルトランスフェラーゼＬＲＯ１ｐでは逆になる（Oelkersら、2002年）。
【０２２３】
[00240]  さらに、アシルＣｏＡ依存性モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（MGAT）としてのＤＧＡ１ｐの機能は、ＭＧＡＴ活性の６０％超を失っていたΔｄｇａ１突然変異体を利用してｉｎ  ｖｉｖｏで実証された。ＤＧＡ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＧＡＴ活性は、このプロセスでの１，２−ジオレオイルグリセロールをもたらす２−オレオイルグリセロールのオレオイルＣｏＡ依存性エステル化によって示された（Heier Cら、（2010年）Identification of Yju3p as functional orthologue of mammalian monoglyceride lipase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1801(9): 1063〜1071頁）。
【０２２４】
[00241]  ＤＧＡ１ｐの一次配列における配列モチーフの機能的重要性および形態上の配向についてのさらに多くの洞察は、インシリコ分析、シグネチャモチーフの部位特異的変異誘発およびＣおよびＮ末端の欠損突然変異により得られた。他のＤＧＡＴ２ファミリーメンバーで見出されたシグネチャモチーフに加えて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが、酵素活性を著しく調節することが明らかにされた独特の親水性ストレッチを有することを実証することができた。その上、４つの確定された膜貫通型ドメインのうちの２番目のヒスチジン残基１９５は酵素活性に不可欠であることが証明された。ＤＧＡ１のトポロジーによれば、ＣとＮ終端の両方が細胞質に直面しており、Ｃ終端はＤＧＡ１活性のためにはＮ終端よりも重要であることが明らかにされた（Liu Q ら、（2011年）Functional and topological analysis of yeast acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase 2, an endoplasmic reticulum enzyme essential for triacylglycerol biosynthesis. J Biol Chem 286(15): 13115〜13126頁）。
【０２２５】
[00242]  高度に精製された細胞断片および免疫ブロットを使用して、Sorgerら（2002年）and Liuら、（2011年）は、ＤＧＡ１の位置を脂肪滴およびミクロソーム膜、九分通り小胞体に突き止められることを実証した。
【０２２６】
[00243]  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌種ＡＤＰ１はワックスエステルシンターゼ（WS）とアシルｃｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）活性の両方を示す二機能性酵素を発現する（Kalscheuer R and Steinbuchel A (2003) A novel bifunctional wax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase mediates wax ester and triacylglycerol biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1. J Biol Chem 278(10): 8075〜8082頁）。このホモダイマーはＴＡＧおよびＷＥ生合成の最終段階を触媒する(Stoveken Tら、(2005) The wax ester synthase/acyl coenzyme A:diacylglycerol acyltransferase from Acinetobactersp. strain ADP1: characterization of a novel type of acyltransferase. J Bacteriol 187(4): 1369-1376)。このホモダイマーは、オキソエステルとチオエステル結合形成の両方を媒介し、広い基質範囲を有しており、中間鎖脂肪アルコールおよびアシルＣｏＡエステルならびにモノアシルグリセロール（MAG）を受け入れる（Uthoff Sら、（2005年）Thio wax ester biosynthesis utilizing the unspecific bifunctional wax ester synthase/acyl coenzyme A:diacylglycerol acyltransferase of Acinetobacter sp. strain ADP1. Appl Environ Microbiol 71(2): 790〜796頁）。
【０２２７】
[00244]  一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＡＧ１である（Gene ID AT2G19450）。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＤＧＡ１である（YOR245c）。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌種ＡＤＰ１由来のａｔｆＡである（MetaCyc受託番号ID ACIAD0832）。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇである。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．６９４１である。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１４２０３である。一部の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０６２０９である。
【０２２８】
[00245]  リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（PDAT）は以下の反応：ホスファチジルコリン＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール→トリアシル−ｓｎ−グリセロール＋１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを触媒する。
【０２２９】
[00246]  シロイヌナズナＰＤＡＴは、１０〜２２炭素鎖長のアシル基がどちらかのｓｎ−位にある異なるリン脂質を、アシル供与体として使用することが可能である（Stahl Uら、（2004年）Cloning and functional characterization of a phospholipid:diacylglycerol acyltransferase from Arabidopsis. Plant Physiol 135(3):1324〜1335頁）。しかし、ホスファチジルコリンのｓｎ−２位のアシル基はｓｎ−１位の３倍使用される。もっとも高い活性は、複数の二重結合、エポキシまたはヒドロキシ基を有するアシル基の場合である。試験されたものの中では、酵素活性はリシノレオイル（ricinoleoyl）の場合がもっとも高かった。１８：０および２２：１アシル基はもっとも低い酵素活性を与えた。異なるリン脂質種の中で、ホスファチジン酸またはホスファチジルコリンの場合よりも高い活性はホスファチジルエタノールアミンの場合である。
【０２３０】
[00247]  ＰＤＡＴ活性はトウゴマの種子マイクロソーム分画で検出された。放射標識リシノレオイルおよびベルノロイル（vernoloyl）基はホスファチジルコリンからＤＡＧに効果的に移されて、トリアシルグリセロールを形成する(Dahlqvist Aら、(2000) Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase: an enzyme that catalyzes the acyl-CoA-independent formation of triacylglycerol in yeast and plants. Proc Natl Acad Sci USA 97(12): 6487-6492)。
【０２３１】
[00248]  他の実施形態では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（PDAT）である。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来であるである（遺伝子ID AT5G13640）。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来である。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＬＲＯ１である（YNR008w）。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇである。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３４３９である。一部の実施形態では、ＰＤＡＴはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０４３９０である。
【０２３２】
[00249]  一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）、グリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼ（GPLAT）および／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）をコードする組換え微生物の１つまたは複数の遺伝子は欠落しているまたは下方調節されており、１つまたは複数の異種ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＬＡＴ、またはＤＧＡＴバリアントで置き換えられている。一部の実施形態では、１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼバリアントは、表３ｃから選択される１つまたは複数の異種アシルトランスフェラーゼに由来している。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇ、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇ、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｇ、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１４０１４ｇ、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、ａｎｄ  Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＢＬ０１１ｗ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＤＬ０５２ｃ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ１７５Ｃ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＲ１３９Ｃ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＮＲ００８ｗおよびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ２４５ｃならびにＣａｎｄｉｄａ  Ｉ５０３＿０２５７７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２６３０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．２５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．７８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．９４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０１６８７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１０４３、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．８６４５、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４７５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１３４３９、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４３９０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．６９４１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１４２０３およびＣａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０６２０９からなる群から選択される１つまたは複数の内在性アシルトランスフェラーゼ酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【０２３３】
[00250]
【表４−１】
2020124206.tif 000017
【０２３４】
【表４−２】
2020124206.tif 000018
【０２３５】
【表４−３】
2020124206.tif 000019
【０２３６】
【表４−４】
2020124206.tif 000020
【０２３７】
【表４−５】
2020124206.tif 000021
【０２３８】
【表４−６】
2020124206.tif 000022
【０２３９】
【表４−７】
2020124206.tif 000023
【０２４０】
【表４−８】
2020124206.tif 000024
【０２４１】
【表４−９】
2020124206.tif 000025
【０２４２】
【表４−１０】
2020124206.tif 000026
【０２４３】
脂質結合タンパク質
[00251]  本開示は、細胞膜の間をステロイド、リン脂質およびガングリオシドを移動させることが可能であるタンパク質を説明する。
【０２４４】
[00252]  ステロールキャリアタンパク質は非特異的脂質輸送タンパク質としても知られている。これらのタンパク質は植物非特異的脂質輸送タンパク質とは異なっているが、構造的にはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の未知の機能の小タンパク質に類似している。ヒトステロールキャリアタンパク質２（SCP2）は、コレステロールおよび種々の他の脂質の細胞内輸送に関与していると考えられている塩基性タンパク質である。
【０２４５】
[00253]  ＳＣＰ−２は、ＳＣＰ−Ｘ、ＳＣＰ−２、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＶ、ストマチン、ＵＮＣ−２４、およびメタロβ−ラクタマーゼ（lactomase）を含むＳＣＰ−２遺伝子ファミリーに属し、脊椎動物、昆虫、植物、酵母、細菌および真菌を含む多くの種で同定されている。
【０２４６】
[00254]  ステロールキャリアタンパク質は主に、脊椎動物および昆虫での幅広いコレステロール／脂質関連機能と関係があるとされてきた。最近の研究では、ＳＣＰ−２がコレステロール／脂質結合活性を有することが実証されている。ＳＣＰ−２はコレステロール、パルミチン酸、脂肪アシルＣｏＡ、酸性リン脂質および胆汁酸塩に結合することが可能である。コレステロールへのＳＣＰ−２の結合親和性は脂質の中ではもっとも強力である。
【０２４７】
[00255]  ＳＣＰ２は、ステロールに結合するその能力ならびにペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体、およびサイトゾルなどの複数のオルガネラへのその局在化のために可溶性ステロールキャリアであると考えられている。
【０２４８】
[00256]  細胞内脂質循環および代謝でのステロールキャリアタンパク質−２（SCP-2）の複数の作用はその遺伝子およびタンパク質構造に起源をもつ。ＳＣＰ−ｘ／ｐｒｏ−ＳＣＰ−２遺伝子は、１５ｋＤａ  ｐｒｏ−ＳＣＰ−２（酵素活性なし）および５８ｋＤａ  ＳＣＰ−ｘ（３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ）をコードする別々の開始部位を有する融合遺伝子である。両方のタンパク質が同一のｃＤＮＡおよびそのＣ終端に１３ｋＤａ  ＳＣＰ−２のアミノ酸配列を共有する。細胞１３ｋＤａ  ＳＣＰ−２は、１５ｋＤａ  ｐｒｏ−ＳＣＰ−２の完全な翻訳後切断からおよび５８ｋＤａ  ＳＣＰ−ｘの部分的な翻訳後切断から出ている。ＳＣＰ−２の推定生理的機能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、トランスフェクトした細胞での、および遺伝子操作された動物での、膜間脂質移動の増強（例えば、コレステロール、リン脂質）および脂肪アシルＣｏＡアシル基転移（コレステロールエステル、ホスファチジン酸）に関与する酵素の活性化に基づいて提唱されてきた。少なくとも４つの重要なＳＣＰ−２構造ドメインが同定され、特定の機能と関連付けられてきた。第１に、５８ｋＤａ  ＳＣＰ−ｘに存在する４６ｋＤａ  Ｎ終端プレ配列は分岐鎖アシルＣｏＡに対して特異的な３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼである。第２に、１５ｋＤａ  ｐｒｏ−ＳＣＰ−２のＮ終端２０アミノ酸プレ配列はＳＣＰ−２の二次および三次構造を劇的に調節し、ならびにＣ終端ペルオキシソームターゲティング配列にコードされるその細胞内ターゲティングを強める。第３に、Ｎ終端３２アミノ酸は両親媒性のαヘリックス領域を形成し、そのうちの一面は膜結合ドメインを表す。両親媒性へリックスの一面での正電荷アミノ酸残基によりＳＣＰ−２はアニオン性リン脂質を含有する膜表面に結合することができる。第４に、Ｎ終端両親媒性αヘリックスの疎水性表面は、β鎖４、５およびヘリックスＤと共に、複数のタイプの脂質（例えば、脂肪酸、脂肪アシルＣｏＡ、コレステロール、リン脂質、イソプレノイド）を収容することができるリガンド結合空洞を形成する（Stolowich NJら、（2002年）Sterol carrier protein-2: structure reveals function. Cell Mol Life Sci 59(2): 193〜212頁）。
【０２４９】
[00257]  一実施形態では、脂質結合タンパク質はステロールキャリアタンパク質である。別の実施形態では、ステロールキャリアタンパク質はＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のステロールキャリアタンパク質−２（SCP-2）である（NP_002970）。別の実施形態では、ステロールキャリアタンパク質はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のステロールキャリアタンパク質−２（SCP-2）である（YALI0E01298- CAG78989.1-SCP2）。別の実施形態では、ステロールキャリアタンパク質はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のステロールキャリアタンパク質である（CTRG_02171- EER33353.1）。
【０２５０】
脂肪酸シンターゼ複合体
[00258]  本開示は脂肪酸における炭素鎖の伸長を触媒する酵素を説明する。
【０２５１】
[00259]  一部の実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体を使用して、脂肪酸における炭素鎖の開始および伸張を触媒する。「脂肪酸シンターゼ複合体」とは、脂肪酸における炭素鎖の開始および伸張を触媒する一群の酵素のことである。ＡＣＰは脂肪酸シンターゼ（FAS）経路中の酵素と共に、生成される脂肪酸の長さ、飽和度、および分岐を制御する。この経路での段階は、脂肪酸生合成（fab）およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（acc）遺伝子ファミリーの酵素により触媒される。所望の産物に応じて、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数が減弱される、発現されるまたは過剰発現されることが可能である。例示的な実施形態では、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数が減弱される、欠失される、破壊されるおよび／または突然変異される。
【０２５２】
[00260]  脂肪酸シンターゼには２つの主要なクラスがある。Ｉ型（FASI）系は単一の大きな多機能性ポリペプチドを利用し哺乳動物にも真菌にも共通である（が、真菌および哺乳動物シンターゼの構造配置は異なる）。Ｉ型ＦＡＳ系はＣＭＮグループの細菌（コリネバクテリウム、マイコバクテリア、およびノカルジア）にも見つかる。ＩＩ型ＦＡＳ（FASII）は、脂肪酸合成のための別々の単機能酵素の使用を特徴とし、古細菌および細菌で見つかる。
【０２５３】
[00261]  ＦＡＳＩ多酵素ポリペプチドおよびＦＡＳＩＩ酵素のドメインは大部分が保存されているので、ＦＡＳＩおよびＦＡＳＩＩ伸張および縮小の機構は実質的に類似している。
【０２５４】
[00262]  脂肪酸は、アシルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからの一連の脱炭酸性クライゼン縮合反応により合成される。この経路の段階は、脂肪酸生合成（fab）およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（acc）遺伝子ファミリーの酵素により触媒される。この経路の説明では、例えば、Heathら、Prog. Lipid Res. 40:467, 2001年を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。理論により限定されることなく、細菌ではアセチルＣｏＡはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Acc、４つの別々の遺伝子によりコードされる多サブユニット酵素、ａｃｃＡＢＣＤ）によりカルボキシル化されて、マロニルＣｏＡを形成する。酵母では、アセチルＣｏＡはＡＣＣ１およびＡＣＣ２によりコードされるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵母等価物によりカルボキシル化される。細菌では、マロン酸基はマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）によりＡＣＰに移されてマロニルＡＣＰを形成する。酵母では、マロニルパルミチルトランスフェラーゼドメインはマロニルＣｏＡからＦＡＳ複合体のＡＣＰドメインにマロニルを付加する。次に、縮合反応が起こり、マロニルＡＣＰはアシルＣｏＡと混合して、βケトアシルＡＣＰが得られる。このようにして、炭化水素基質は２炭素伸張される。
【０２５５】
[00263]  伸張に続いて、βケト基は、ケト還元酵素（KR）、デヒドラターゼ（DH）、およびエノール還元酵素（ER）の連続作用により完全飽和炭素鎖に還元される。伸張された脂肪酸鎖は、ＡＣＰのホスホパンテテイン接合団に共有結合したままこれらの活性部位間を運ばれる。第１に、βケトアシルＡＣＰはＮＡＤＰＨにより還元されてβヒドロキシアシルＡＣＰを形成する。細菌では、この段階はβケトアシルＡＣＰ還元酵素（FabＧ）により触媒される。等価な酵母反応はＦＡＳのケト還元酵素（KR）ドメインにより触媒される。次に、βヒドロキシアシルＡＣＰは脱水されてトランス−２−エノイルＡＣＰを形成し、これは細菌ではβヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼ（FabA）もしくはβヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼ（FabZ）のいずれかまたは酵母ではＦＡＳのデヒドラターゼ（DH）ドメインにより触媒される。細菌ではＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ（それぞれ、FabI、FabK、およびFabL）および酵母ではＦＡＳのエノール還元酵素（ER）ドメインがトランス−２−エノイルＡＣＰを還元してアシルＡＣＰを形成する。次に続くサイクルは、βケトアシルＡＣＰシンターゼＩまたはβケトアシルＡＣＰシンターゼＩＩ（細菌では、それぞれFabBおよびFabF、または酵母ではベータケトアシルシンターゼ（KS）ドメイン）によるマロニルＡＣＰとアシルＡＣＰの縮合により開始される。
【０２５６】
[00264]  一部の実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体を使用すれば、脂肪アシルＡＣＰの、基質と比べて２炭素伸張した対応する脂肪アシルＡＣＰへの伸長を触媒することが可能である。
【０２５７】
[00265]  一部の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはＡＣＣ１である。ある特定の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＮＲ０１６Ｃである。ある特定の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｃ１１４０７ｇである。ある特定の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．７４６６である。ある特定の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１００７である。一部の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＦＡＳ１である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＫＬ１８２Ｗである。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｂ１５０５９ｇである。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９７９である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．８５９４である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、βサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０５２４１である。一部の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＦＡＳ２である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳ０００００６１５２である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｂ１９３８２ｇである。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３３７０−７２である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５９４９−５１である。ある特定の実施形態では、脂肪酸シンターゼ、αサブユニットはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０２５０１である。
【０２５８】
ペントースリン酸経路
[00266]  ペントースリン酸経路（PPP）は、真核細胞の細胞質に位置している炭水化物代謝の中心的および広く保存された代謝経路である。この経路は、巨大分子の生合成のための前駆体の生成およびＮＡＤＰＨの形態での還元当量の生成という２つの主要な機能を果たす。したがって、これら２つの役割はＰＰＰの２つの主要なフェーズに反映されており：「酸化フェーズ」では、グルコース６リン酸（G6P）は、ＮＡＤＰＨの生成と共にＧ６Ｐを６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ZWF1）；６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンをＤ−グルコン酸６−リン酸に変換する６−ホスホグルコノラクトナーゼ（SOL3、SOL40）；ＮＡＤＰＨの生成と共にＤ−グルコン酸６−リン酸をＲｕ５Ｐに変換する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（GND1、GND2）の連続作用を通じてリブロース５−リン酸（Ru5P）に変換される。「非酸化フェーズ」は、Ｒｕ５Ｐのリボース５−リン酸（R5Ｐ）への異性化、Ｒｕ５Ｐのキシルロース５−リン酸（X5P）へのエピマー化、ならびにトランスケトラーゼ（TKL1、TKL2）およびトランスアルドラーゼ（TAL1、NQM1）の作用を通じて、ペントースリン酸をフルクトース６リン酸（F6P）およびグリセルアルデヒド３リン酸（GAP）、これは両方とも解糖中間体である、およびエリトロース４−リン酸（E4P）に相互変換することが可能な一連の炭素骨格移動を実行する。非酸化フェーズの正味の効果は、巨大分子の生合成に必要なペントースとエネルギー管理に必要なヘキソースの間に平衡状態を生み出して、糖の２つのプールを容易に相互変換させることである。
【０２５９】
[00267]  酸化ブランチは正常な細胞状態下では大部分が不可逆であると考えられており、非酸化ブランチは可逆的である。ＰＰＰは、いくつかの炭素原子が解糖に再利用されるので単純な線形経路ではない。さらに、酵素トランスケトラーゼはこの経路において２つの異なる反応を触媒し、これらの反応の基質が互いに競合的阻害剤になる。ＰＰＰは３つの主要産物：酸化フェーズで生成され、生合成経路でおよび細胞の酸化レベルの維持に必要であるＮＡＤＰＨの形態での還元当量；すべての核酸の生合成のためのＲ５Ｐ；ならびに３つの芳香族アミノ酸の生合成のためのＥ４Ｐ、を有する。生理状態が異なれば異なる様式でのこの生化学的ネットワークの作用を必要とする：反応器内での培養成長中などの活発に成長している細胞では、この経路は十分な量の３つの産物全てを生成しなければならない。なぜならば、新しい細胞の構築にはすべてが必要となるからである。ストレス状態下では、成長は遅くなり、かなりの需要がある唯一の産物はＮＡＤＰＨである。
【０２６０】
１つまたは複数の補酵素のレベルを増加させるために発現させる酵素
[00268]  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD、NAD+およびNADHを含む）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP、NADP+およびNADPHを含む）は、エネルギー代謝、ミトコンドリア機能、カルシウム恒常性、抗酸化性／酸化ストレスの発生、遺伝子発現、免疫機能、老化、および細胞死を含む、種々の生物学的過程の基本的な共通媒介物に属する：ＮＡＤはエネルギー代謝およびミトコンドリア機能を媒介する；ＮＡＤＰＨは細胞抗酸化性系の重要な成分である；ミトコンドリアからのＮＡＤＨ依存性反応性酸素種（ROS）生成およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存性ＲＯＳ生成はＲＯＳ生成の２つの極めて重要な機構である；ＮＡＤおよびＮＡＤＰから生成される環状ＡＤＰリボースおよびいくつかの他の分子はカルシウム恒常性を媒介し得る；ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、ミトコンドリア透過性移行、エネルギー状態、ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ−１、およびアポトーシス誘発因子などの、細胞死における複数の重要な要因を調節する；ならびにＮＡＤおよびＮＡＤＰは、酸化ストレスおよびミトコンドリア活性などの老化に影響する要因に大きな影響を与え、ＮＡＤ依存性サーチュインも老化過程を媒介する。さらに、還元ニコチンアミドコファクター（NAD(P)H）のインサイチュ再生は組換え微生物での多くの重要な化学物質の実際的合成に必要である。
【０２６１】
[00269]  本開示は所与の基質の酸化および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NAD(P)H）の同時生成を触媒する酵素を説明する。ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨのプールの維持にはいくつかの酵素成分が関与している。ＮＡＤキナーゼ（NADK）はＮＡＤＰへのＮＡＤの直接リン酸化を触媒し、したがって、細胞ＮＡＤＰプールの生成に寄与している（Pollak Nら、（2007年）The power to reduce: pyridine nucleotides-small molecules with a multitude of functions. Biochem. J. 402: 205〜218頁; Agledal Lら、（2010年）The phosphate makes a difference: cellular functions of NADP. Redox Rep. 15: 2〜10頁）。一方、明期間の光合成細胞中のフェレドキシンＮＡＤＰ還元酵素（FNR）はＮＡＤＰＨの主要源と認識されている。しかし、光合成の暗期間の非光合成細胞では、ＮＡＤＰＨの形態での還元力（power reduction）を生み出すことができる主酵素は以下の通りである：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ、ＥＣ１．１．１．４９）および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ、ＥＣ１．１．１．４４）（両方ともペントースリン酸経路に属する）、ＮＡＤＰイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＩＣＤＨ、ＥＣ１．１．１．４２）およびＮＡＤ−またはＮＡＤＰリンゴ酸酵素（ＮＡＤＰ−ＭＥ、ＥＣ１．１．１．４０）、これはＮＡＤ−またはＮＡＤＰリンゴ酸デヒドロゲナーゼとしても知られる。
【０２６２】
[00270]  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、種々のＮＡＤ／ＮＡＤＰ種の相互変換性は細胞の酸化還元バランスを維持するのに最重要であり、この酸化還元バランスが今度は成長効率および代謝物排出を決定する（Marres CAら、（1991年）Isolation and inactivation of the nuclear gene encoding the rotenone-insensitive internal NADH: ubiquinone oxidoreductase of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem 195(3): 857〜62頁）。種々のピリジンヌクレオチド、特にＮＡＤＨはミトコンドリアの内膜を通過することができない。そうした理由で、ＮＡＤ＋と還元および／またはリン酸化誘導体のサイトゾルからミトコンドリアへのおよびその逆の直接横断交換は可能ではない。さらに、酵母はトランスヒドロゲナーゼをもたない。したがって、酵母はＮＡＤ＋およびＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＨに直接変換することができない（Bruinenberg PM（1986年）The NADP(H) redox couple in yeast metabolism. Antonie Van Leeuwenhoek 52(5): 411〜29頁）。その結果、それぞれのオルガネラで必要とされるＮＡＤ＋代謝物の入手可能性を保証するため、酵母は、種々の酵素反応を通じてあらゆるＮＡＤ＋タイプを供給する独立したセットの相互交換反応を発達させてきた。
【０２６３】
[00271]  細胞質では、ＮＡＤ＋をリン酸化する２つのＮＡＤキナーゼが特徴付けられている。主要なサイトゾルＮＡＤキナーゼはＵＴＲ１によりコードされている(Kawai Sら、(2001) Molecular cloning and identification of UTR1 of a yeast Saccharomyces cerevisiae as a gene encoding an NAD kinase. FEMS Microbiol Lett 200(2): 181-184; Shi Fら、(2005) Identification of ATP-NADH kinase isozymes and their contribution to supply of NADP(H) in Saccharomyces cerevisiae. FEBS J 272(13): 3337-3349)。ＮＡＤ＋のリン酸化のための第２の、重要性では劣るＮＡＤキナーゼ、すなわち、ＹＥＦ１も記載されておりＵＴＲ１の消失を補償することが示されている（Shiら、2005年）。ミトコンドリアＰＯＳ５とサイトゾルＵＴＲ１の両方が欠失すると酵母では致命的であり、ＹＥＦ１はＰＯＳ５がまだ機能しているときだけ補償することができる。これらの所見は、酵母の主要ＮＡＤＨキナーゼ、すなわち、ＰＯＳ５およびＵＴＲ１が互いのそれぞれの活性の消失を部分的に補償することが可能であるという考えを支持している（Bieganowski Pら、（2006年）Synthetic lethal and biochemical analyses of NAD and NADH kinases in Saccharomyces cerevisiae establish separation of cellular functions. J Biol Chem 281(32): 22439〜22445頁）。ＵＴＲ１とＹＥＦ１の両方がＮＡＤＨキナーゼ活性を示し、さらにＮＡＤＨをリン酸化する触媒能力を有する酵素のサイトゾルセットを提供することが明らかにされている。
【０２６４】
[00272]  種々の酵素反応が、生合成経路および抗酸化剤機能に必要とされるＮＡＤＰＨのサイトゾルへの提供を説明することが明らかにされている。ＡＬＤ６によりコードされるサイトゾルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Meaden PGら、（1997年）The ALD6 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a cytosolic, Mg(2+)-activated acetaldehyde dehydrogenase. Yeast 13(14): 1319〜1327頁; Wang Xら、（1998年）Molecular cloning, characterization, and potential roles of cytosolic and mitochondrial aldehyde dehydrogenases in ethanol metabolism in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 180(4): 822〜830頁）およびβ−Ｄ−グルコース６リン酸を６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するペントースリン酸経路の第１段階を触媒するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ZWF1）（Nogae I and Johnston M（1990年）Isolation and characterization of the ZWF1 gene of Saccharomyces cerevisiae, encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase. Gene 96(2): 161〜169頁; Grabowska D and Chelstowska A（2003年）The ALD6 gene product is indispensable for providing NADPH in yeast cells lacking glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. J Biol Chem 278(16): 13984〜13988頁; Minard KI and McAlister-Henn L（2001年）Antioxidant function of cytosolic sources of NADPH in yeast. Free Radic Biol Med 31(6): 832〜843頁）はＮＡＤＰＨの主要サプライヤーと見なされている。細胞質でＮＡＤＰＨを生成する第３の酵素はサイトゾルＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（IDP2）である（Loftus TMら、（1994年）Isolation, characterization, and disruption of the yeast gene encoding cytosolic NADP-specific isocitrate dehydrogenase. Biochemistry 33(32): 9661〜9667頁; Contreras-Shannon Vら、（2005年）Kinetic properties and metabolic contributions of yeast mitochondrial and cytosolic NADP+-specific isocitrate dehydrogenases. J Biol Chem 280(6): 4469〜4475頁）。ＺＷＦ１はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（IDP2）およびアセトアルデヒド酸化還元酵素（ALD6）と重複する機能を有することが実証されており、関与する反応の１つが作動できない場合には、ＮＡＤＰＨの欠損を補償することを示している（Minard KI and McAlister-Henn L（2005年）Sources of NADPH in yeast vary with carbon source. J Biol Chem 280(48): 39890〜39896頁）。
【０２６５】
[00273]  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生のために現在利用可能な酵素系は、ＮＡＤＨのためのギ酸／ギ酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨのためのイソプロパノール／アルコールデヒドロゲナーゼ（Pseudomonas種）、ＮＡＤＰＨのためのイソプロパノール／アルコールデヒドロゲナーゼ（T. brockii）、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの両方のためのＨ２／ヒドロゲナーゼ（M. thermoautotrophicum）、ＮＡＤＰＨのためのグルコース−６−リン酸／グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（L. mesenteroides）およびＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの両方のためのグルコース／グルコースデヒドロゲナーゼを含む（Hummel W（1999年）Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: Recent developments. Trends Biotechnol. 17:487〜492頁; Wichmann R and Vasic-Racki D（2005年）Cofactor regeneration at the lab scale. Adv Biochem Eng Biotechnol 92: 225〜260頁）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来の高度に安定で活性のある突然変異リン酸デヒドロゲナーゼの工学的操作および効果的なＮＡＤＰＨ再生系としてその潜在力の評価も記載されている（Johannes TWら、（2007年）Efficient regeneration of NADPH using an engineered phosphite dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering 96(1): 18〜26頁）。
【０２６６】
[00274]  一実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、補酵素の細胞内レベルを増加するように操作されている。別の実施形態では、補酵素はＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はデヒドロゲナーゼを発現する。
【０２６７】
[00275]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを発現する。一部の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＺＷＦ１である。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＺＷＦ１（YNL241C）である。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは細菌由来のｚｗｆである。ある特定の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｚｗｆ（NP_416366）である。
【０２６８】
[00276]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを発現する。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ１である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ１（YHR183W）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ２である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ２（YGR256W）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｇｎｄである。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｇｎｄ（NP_416533）である。
【０２６９】
[00277]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼを発現する。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＩＤＰ２である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｆ０４０９５ｇである。他の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．３７３３である。ある特定の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿００９０９である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＬＲ１７４Ｗである。
【０２７０】
[00278]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（リンゴ酸酵素）を発現する。一実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、リンゴ酸酵素は細菌由来のＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｍａｅＡ（NP_415996）である。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ由来のｍａｅＥ（CAQ68119）である。別の実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＡＥ１（YKL029C）である。別の実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは寄生線虫類由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＡｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ由来のＭ８１０５５である。一実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｍａｅＢ（NP_416958）である。一実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはトウモロコシ由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＺｅａ  ｍａｙｓ由来のｍｅ1である。
【０２７１】
[00279]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はアルデヒドデヒドロキナーゼを発現する。一実施形態では、アルデヒドデヒドロキナーゼはＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロキナーゼはＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、アルデヒドデヒドロキナーゼは細菌由来のＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＡ（NP_415933）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロキナーゼは酵母由来のサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＬＤ６（YPL061W）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロキナーゼは細菌由来のサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロキナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＢ（NP_418045）である。
【０２７２】
[00280]  ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はトランスヒドロゲナーゼを発現する。一実施形態では、トランスヒドロゲナーゼの発現はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを相互変換するように増加される。一部の実施形態では、トランスヒドロゲナーゼはピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは細菌由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｐｎｔＡＢ（ベータサブユニット: NP_416119; アルファサブユニット: NP_416120）である。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはヒト由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＮＮＴ（NP_036475）である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＳｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来である。
【０２７３】
[00281]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はグルコース−１−デヒドロゲナーゼを発現する。一部の実施形態では、グルコース−１−デヒドロゲナーゼは細菌由来である。ある特定の実施形態では、グルコース−１−デヒドロゲナーゼはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ（Gluconobacter suboxydans）（Q5FPE5）由来のＧＯＸ２０１５である。ある特定の実施形態では、グルコース−１−デヒドロゲナーゼはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のｇｄｈである（O93715）。ある特定の実施形態では、グルコース−１−デヒドロゲナーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｇｄｈである（P12310）。
【０２７４】
[00282]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はグリセロールデヒドロゲナーゼを発現する。ある特定の実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼはＨｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ（Trichoderma reesei）由来のＮＡＤＰ＋依存性グリセロール２−デヒドロキナーゼｇｌｄ２である（Q0GYU4）。ある特定の実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼはＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Aspergillus nidulans）由来のＮＡＤＰ＋依存性グリセロールデヒドロキナーゼｇｌｄＢである（Q7Z8L1）。
【０２７５】
[00283]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼＹＭＲ３１８Ｃである。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のアルコールデヒドロゲナーゼＣＡＥＴＨＧ＿０５５３である。
【０２７６】
[00284]  一部の実施形態では、表３由来のアルコールデヒドロゲナーゼはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生のために使用される。
【０２７７】
[00285]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は補酵素の細胞内レベルを増やすために上記酵素の組合せを発現する。一実施形態では、酵素の過剰発現はその酵素の補助基質の補充と連結して、補酵素の細胞内レベルを増加させる。
【０２７８】
[00286]
【表５−１】
2020124206.tif 000027
【０２７９】
【表５−２】
2020124206.tif 000028
【０２８０】
【表５−３】
2020124206.tif 000029
【０２８１】
【表５−４】
2020124206.tif 000030
【０２８２】
【表５−５】
2020124206.tif 000031
【０２８３】
【表５−６】
2020124206.tif 000032
【０２８４】
【表５−７】
2020124206.tif 000033
【０２８５】
【表５−８】
2020124206.tif 000034
【０２８６】
【表５−９】
2020124206.tif 000035
【０２８７】
【表５−１０】
2020124206.tif 000036
【０２８８】
【表５−１１】
2020124206.tif 000037
【０２８９】
【表５−１２】
2020124206.tif 000038
【０２９０】
【表５−１３】
2020124206.tif 000039
【０２９１】
【表５−１４】
2020124206.tif 000040
【０２９２】
アシルＣｏＡオキシダーゼ
[00287]  アシルＣｏＡオキシダーゼ（ACO）は８〜１８の鎖長を有する脂肪酸のＣｏＡ誘導体に作用する。アシルＣｏＡオキシダーゼはサブユニットあたり１つの非共有結合ＦＡＤを含有するフラビン酵素であり、ミトコンドリアアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼと同じスーパーファミリーに属する。ミトコンドリア脂肪アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ同様に、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼは、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化経路の開始および律速段階、すなわち、アシルＣｏＡのα，β脱水素を触媒し、還元半反応においてトランス−２−エノイルＣｏＡを生じる。ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼの酸化半反応では、還元ＦＡＤは分子酸素により再酸化され、過酸化水素を生成する。
【０２９３】
[00288]  アシルＣｏＡオキシダーゼはホモダイマーであり、サブユニットのポリペプチド鎖は、Ｎ終端アルファドメイン、ベータドメイン、およびＣ終端アルファドメインに折り畳まれる。ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼとミトコンドリアアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ間の機能上の違いはＦＡＤ環境での構造上の違いに帰せられる。
【０２９４】
[00289]  一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための組換え微生物および方法が提供される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分はＣ１８以下の炭素鎖長を有する。一部の実施形態では、短鎖不飽和脂質部分は長鎖不飽和脂質部分から生産される。適切な鎖短縮酵素の例は、ＦＡＤ依存性アシルＣｏＡオキシダーゼを含む。偶数の炭素を有する脂肪酸分子の場合、鎖短縮酵素は２炭素短縮された１分子のアセチルＣｏＡおよび脂肪アシルＣｏＡを生成する。奇数の炭素を有する脂肪酸分子は類似する様式で酸化され、炭素鎖長が５炭素に低減されるまで酸化のラウンドごとにアセチルＣｏＡ分子を生成する。酸化の最終サイクルでは、この５炭素アシルＣｏＡは酸化されてアセチルＣｏＡおよびプロピオニルＣｏＡを生成する。
【０２９５】
[00290]  アシルＣｏＡオキシダーゼが鎖長が異なる基質に対して変動する特異性を示すことは知られている（図３２）。したがって、脂肪アシルＣｏＡ切断の程度を制御することは、適切な酵素バリアントを工学的に操作するまたは選択することに依存する。この目的に適したアシルＣｏＡオキシダーゼの例は表３ａに収載されている。
【０２９６】
[00291]  １つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための組換え微生物および方法のいくつかの好ましい実施形態では、所望の鎖長を超えた所望の脂肪アシルＣｏＡの切断を除去するまたは低減するように、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする微生物宿主の１つまたは複数の遺伝子が欠落されるまたは下方調節される。そのような欠失または下方調節標的はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ１（ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ２（ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ３（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ４（ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ５（ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ６（ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＯＸ１（ＹＧＬ２０５Ｗ）；Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ２（ＣａＯ１９．１６５５、ＣａＯ１９．９２２４、ＣＴＲＧ＿０２３７４、Ｍ１８２５９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ４（ＣａＯ１９．１６５２、ＣａＯ１９．９２２１、ＣＴＲＧ＿０２３７７、Ｍ１２１６０）およびＣａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ５（ＣａＯ１９．５７２３、ＣａＯ１９．１３１４６、ＣＴＲＧ＿０２７２１、Ｍ１２１６１）を含むがこれらに限定されない。他の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異される、または下方調節される１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は１つまたは複数の不飽和脂質部分の鎖長を制御する。
【０２９７】
[00292]
【表６−１】
2020124206.tif 000041
【０２９８】
【表６−２】
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【０２９９】
【表６−３】
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【０３００】
【表６−４】
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【０３０１】
【表６−５】
2020124206.tif 000045
【０３０２】
【表６−６】
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【０３０３】
【表６−７】
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【０３０４】
【表６−８】
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【０３０５】
【表６−９】
2020124206.tif 000049
【０３０６】
【表６−１０】
2020124206.tif 000050
【０３０７】
【表６−１１】
2020124206.tif 000051
【０３０８】
アシルグリセロールリパーゼおよびステロールエステラーゼ
[00293]  一部の実施形態では、１つまたは複数の短鎖不飽和脂質部分の生産のための組換え微生物および方法が提供される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の短鎖不飽和脂質部分はＣ１８以下の炭素鎖長を有する。短鎖フェロモンを生産する方法の一部の好ましい実施形態では、長鎖アシルグリセロールのエステル結合を加水分解するほうを好む選ばれた酵素は１つまたは複数の脂肪アシルデサチュラーゼと一緒に同時発現される。そのような適切な酵素の良い例は異種または工学的に操作されたアシルグリセロールリパーゼである。この目的に適したアシルグリセロールリパーゼの例は表３ｂに収載されている。
【０３０９】
[00294]  カルボキシエステルヒドロラーゼ（EC3.1.1.-）はエステル結合の加水分解または合成を触媒する大きなクラスの酵素である。カルボキシエステルヒドロラーゼは、原核生物および真核生物のあらゆる生物領域で記載されてきた。カルボキシエステルヒドロラーゼの大部分がα／βヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、Ｈｉｓ、酸性アミノ酸およびＳｅｒ残基で形成され、高度に保存されたＧＸＳＸＧ配列に位置する保存された「触媒三残基」を有する。加水分解中、触媒作用のＳｅｒは三残基由来のその他の２つの残基の助けを借りて基質の求核攻撃を開始し、これらの残基は空間的に近接している。これらの残基は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼの機構に類似する機構によりエステルの加水分解を促進すると仮定されている。別の特徴的フィーチャは、その配列が触媒三残基の配列ほど保存されていないアミノ酸領域、オキシアニオンホールの存在であり、これは触媒中に生み出される遷移状態を安定化させるのに役立つ。さらに、これらの酵素は一般に補助因子を必要としない。アシルグリセロールリパーゼおよびステロールエステラーゼはカルボキシエステルヒドロラーゼファミリーに属する。
【０３１０】
[00295]  アシルグリセロールリパーゼ酵素は、水分子を使用して長鎖脂肪酸のグリセロールモノエステルを分解する化学反応を触媒する。この酵素クラスの系統名はグリセロールエステルアシルヒドロラーゼである。常用の他の名称は、モノアシルグリセロールリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、モノグリセリドリパーゼ、モノグリセリドヒドロラーゼ、脂肪アシルモノエステルリパーゼ、モノアシルグリセロールヒドロラーゼ、モノグリセリジルリパーゼ、およびモノグリセリダーゼを含む。この酵素はグリセロ脂質代謝に関与する。
【０３１１】
[00296]  ステロールエステラーゼ酵素は化学反応を触媒する。
【０３１２】
[00297]  ステリルエステル＋Ｈ２Ｏ  ＜＝＞  ステロール＋脂肪酸
【０３１３】
[00298]  したがって、この酵素の２つの基質はステリルエステルおよびＨ２Ｏであり、その２つの生成物はステロールおよび脂肪酸である。
【０３１４】
[00299]  この酵素クラスの系統名はステリルエステルアシルヒドロラーゼである。常用の他の名称は、コレステロールエステラーゼ、コレステリルエステルシンターゼ、トリテルペノールエステラーゼ、コレステリルエステラーゼ、コレステリルエステルヒドロラーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、コレステロールエステルヒドロラーゼ、コレステラーゼ、およびアシルコレステロールリパーゼを含む。この酵素は胆汁酸生合成に関与する。ステロールエステラーゼは自然界に広く行き渡っており、膵臓、腸管粘膜、肝臓、胎盤、大動脈、および脳などの哺乳動物の組織から糸状菌、酵母、および細菌までにおいて同定されている。
【０３１５】
[00300]  基質特異性という点で、多くのステロールエステラーゼは、アシルグリセロール、アリルエステル、および、一部の場合、アルコールエステル、シンナミルエステル、キサントフィルエステル、または合成ポリマーなどの、エステル結合を含有するかなり広範囲の他の基質の加水分解または合成を触媒することができる。
【０３１６】
[00301]
【表７−１】
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【０３１７】
【表７−２】
2020124206.tif 000053
【０３１８】
[00302]  一部の実施形態では、１つまたは複数のアシルグリセロールリパーゼまたはステロールエステルエステラーゼは組換え微生物において欠落される、破壊される、突然変異されるおよび／または活性が低減される。一部の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異されるおよび／または活性が低減されるトリアシルグリセロールリパーゼはＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ（ＴＧＬ３）である。
【０３１９】
組換え微生物
[00303]  本出願は、１つまたは複数の不飽和脂質部分であって、非生物学的手段により、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに変換される１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を有する組換え微生物に関する。
【０３２０】
[00304]  一実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のために１つまたは複数の炭素源を使用する。別の実施形態では、１つまたは複数の炭素源は糖、グリセロール、エタノール、有機酸、アルカン、および／または脂肪酸を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の炭素源は、アルカンおよび脂肪酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はアルカンおよび／または脂肪酸に対して高い耐性を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は脂質を蓄積する。
【０３２１】
[00305]  本開示は、種々の外来性酵素を発現するように工学的に操作することが可能である微生物を提供する。一実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作される。
【０３２２】
[00306]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つもしくは複数のデサチュラーゼ、１つもしくは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ、１つもしくは複数のアシルグリセロールリパーゼ、１つもしくは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクローム還元酵素、１つもしくは複数のエロンガーゼ、１つもしくは複数のチオエステラーゼ、および／または１つもしくは複数の脂質結合タンパク質から選択される１つまたは複数の外因性生合成酵素を含む。別の実施形態では、１つまたは複数のデサチュラーゼは、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼおよび脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のフラボタンパク質ピリジンヌクレオチドシトクローム還元酵素は、シトクロームｂ５還元酵素およびＮＡＤＰＨ依存性シトクロームＰ４５０還元酵素からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のエロンガーゼは、ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、ＥＬＯ３、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のチオエステラーゼは、アシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡチオエステラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の脂質結合タンパク質はステロールキャリアタンパク質２（SCP2）である。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性生合成酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ、Ａｇｒｏｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ、Ｃｙｄｉａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ、Ｓｅｓａｍｉａ、Ｐｌｏｄｉａ、Ｂｏｍｂｙｘ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｒａｔｔｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ＰｌｕｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓからなる群から選択される属由来である。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性生合成酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｐｕｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｌａｔｉｐｅｎｎｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｏｖａｌｉｐｅｎｎｉｓ、Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｓｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａおよびＢｉｃｙｃｌｕｓ  ａｎｙｎａｎａからなる群から選択される種由来である。
【０３２３】
[00307]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、脂肪アシルＣｏＡを６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４炭素原子の鎖長を有する基質として利用することができるデサチュラーゼである。
【０３２４】
[00308]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、脂肪酸または、例えば、脂肪酸ＣｏＡエステルなどのその誘導体のＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３位に二重結合を生み出すことができる。
【０３２５】
[00309]  一例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼ、またはこれをコードする核酸配列は、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物から単離することが可能である。さらなるＺ１１デサチュラーゼ、またはこれをコードする核酸配列は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉまたはＤｉａｐｈａｎｉａ  ｎｉｔｉｄａｌｉｓから単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ６７９２０９、ＪＸ９６４７７４、ＡＦ４１６７３８、ＡＦ５４５４８１、ＥＵ１５２３３５、ＡＡＤ０３７７５、ＡＡＦ８１７８７およびＡＹ４９３４３８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、種Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｖｅｌｕｔｉａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号３、１１、１７および１９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来の配列番号２５に記載されているアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号４および９から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ由来の配列番号２９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号５および１６から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の配列番号２６および２７から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号６、１０および２３から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ由来の配列番号２８に記載されているアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｚ１１デサチュ��ーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号７、１２、１８、２０および２４から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｓ．ｉｎｆｅｒｅｎｓ由来の配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１６７３８、ＡＧＨ１２２１７．１、ＡＩＩ２１９４３．１、ＣＡＪ４３４３０．２、ＡＦ４４１２２１、ＡＡＦ８１７８７．１、ＡＦ５４５４８１、ＡＪ２７１４１４、ＡＹ３６２８７９、ＡＢＸ７１６３０．１およびＮＰ００１２９９５９４．１、Ｑ９Ｎ９Ｚ８、ＡＢＸ７１６３０．１およびＡＩＭ４０２２１．１に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全または部分的Ｚ１１デサチュラーゼは別のポリペプチドに融合されている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ終端天然リーダー配列は、別の種由来のオレオシンリーダー配列で置き換えられている。ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、配列番号８、２１および２２から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０３２６】
[00310]  ある特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｚ１１−１３：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，１１−１３：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１５：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１５：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−６，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−８，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１４−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ）−４，６，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−７，１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｚ）−４，６，１１，１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１７：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−８，１１−１７：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１４−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡまたはそれらの組合せから選択される一または多価不飽和産物への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【０３２７】
[00311]  別の例示的な実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。本明細書に記載される種々の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼ、またはこれをコードする核酸配列は、種Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｏｂｉｌａｌｉｓ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｒｏｓａｃｅａｎａ、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ、またはＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａの生物から単離することが可能である。例示的な実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０５７８６２、ＡＦ２４３０４７、ＡＦ５１８０１７、ＥＵ１５２３３２、ＡＦ４８２９０６、およびＡＡＦ８１７８８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードする核酸配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ由来の配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号１４に記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｌａｍｐｒｏｎｉａ  ｃａｐｉｔｅｌｌａ由来の配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ由来の配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０３２８】
[00312]  ある特定の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、Ｚ９−１１：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，９−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１３：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−５，９−１３：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−４，９−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１５：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１５：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−６，９−１５：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１７：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−５，９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９−１８：アシルＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−９，１２，１５−１８：アシルＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，またはそれらの組合せから選択される一または多価不飽和産物への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【０３２９】
[00313]  一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＥ５−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１３−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１３−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ８−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ１０−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１２−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１４−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ７−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ７−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ５Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ７Ｚ９−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ９Ｚ１１−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１１Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡ、Ｅ１３Ｚ１５−１８：アシルＣｏＡ、Ｅ６Ｅ８−１０：アシルＣｏＡ、Ｅ８Ｅ１０−１２：アシルＣｏＡ、Ｅ１０Ｅ１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｅ１２Ｅ１４−１６：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ５Ｅ８−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ７Ｅ１０−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ９Ｅ１２−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ１１Ｅ１４−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１３Ｅ１６−１８：アシルＣｏＡ、Ｚ３−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ５−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ７−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ，Ｚ３Ｚ５−１０：アシルＣｏＡ、Ｚ５Ｚ７−１２：アシルＣｏＡ、Ｚ７Ｚ９−１４：アシルＣｏＡ、Ｚ９Ｚ１１−１６：アシルＣｏＡ、Ｚ１１Ｚ１３−１６：アシルＣｏＡおよびＺ１３Ｚ１５−１８：Ａｃｙｌ−ＣｏＡから選択される一または多価不飽和中間体への脂肪アシルＣｏＡの変換を触媒する。
【０３３０】
[00314]  一部の実施形態では、組換え微生物は、２つの二重結合の続いて起こる不飽和化を触媒することができる二機能性デサチュラーゼを発現することができる。
【０３３１】
[00315]  一部の実施形態では、組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡの対応する一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする１つよりも多い外因性核酸分子を発現することができる。例えば、組換え微生物は、Ｚ１１デサチュラーゼをコードする外因性核酸分子およびＺ９デサチュラーゼをコードする別の外因性核酸分子を発現することができる。
【０３３２】
[00316]  一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は、所与のサイクルがそのサイクルの開始の一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡ基質と比べて２個の炭素の切断のある一または多価不飽和Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アシルＣｏＡ中間体を生産する、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性の１つまたは複数の連続するサイクルの後に、一または多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシルＣｏＡの切詰め型の一または多価不飽和脂肪アシルＣｏＡへの変換を触媒するアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む。一部の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼは表３ａから選択される。
【０３３３】
[00317]  一部の実施形態では、組換え微生物は、好ましくは、＞Ｃ１６、＞Ｃ１４、＞Ｃ１２または＞Ｃ１０のアシルグリセロール基質のエステル結合を加水分解するアシルグリセロールリパーゼおよび／またはステロールエステルエステラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの内在性または外因性核酸分子をさらに含む。一部の実施形態では、発現されているアシルグリセロールリパーゼおよび／またはステロールエステルエステラーゼ酵素は表３ｂから選択される。
【０３３４】
[00318]  一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産を巡って生合成経路と競合する経路で１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作されている。
【０３３５】
[00319]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸張経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸張経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、βケトアシルＣｏＡ還元酵素、βヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡ還元酵素、またはその任意の組合せからなる群から選択される。
【０３３６】
[00320]  他の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／または再利用経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／または再利用経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、トリアシルグリセロールリパーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ステリルエステルヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンテターゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異される、および／または活性が低減されるトリアシルグリセロールリパーゼはＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ（TGL3）である。一部の実施形態では、欠落される、破壊される、突然変異される、および／または活性が低減される脂肪アシルＣｏＡシンテターゼ（脂肪酸輸送体）はＹＡＬＩ０Ｅ１６０１６ｇ（FAT1）である。
【０３３７】
[00321]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪酸分解経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、脂肪酸分解経路はベータ酸化経路である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、アシルＣｏＡオキシダーゼ、多機能エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、βケトアシルＣｏＡチオラーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする微生物宿主の１つまたは複数の遺伝子は、所望の鎖長を超えた所望の脂肪アシルＣｏＡの切断を取り除くまたは低減するために欠落されるまたは下方調節される。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ１（ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ２（ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ３（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ４（ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ５（ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＰＯＸ６（ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＯＸ１（ＹＧＬ２０５Ｗ）；Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ２（ＣａＯ１９．１６５５、ＣａＯ１９．９２２４、ＣＴＲＧ＿０２３７４、Ｍ１８２５９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ４（ＣａＯ１９．１６５２、ＣａＯ１９．９２２１、ＣＴＲＧ＿０２３７７、Ｍ１２１６０）およびＣａｎｄｉｄａ  ＰＯＸ５（ＣａＯ１９．５７２３、ＣａＯ１９．１３１４６、ＣＴＲＧ＿０２７２１、Ｍ１２１６１）からなる群から選択される１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【０３３８】
[00322]  一部の実施形態では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）、グリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼ（GPLAT）および／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）をコードする組換え微生物の１つまたは複数の遺伝子は欠落されているまたは下方調節されている、および１つまたは複数の異種ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＬＡＴ、またはＤＧＡＴバリアントで置き換えられている。一部の実施形態では、１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼバリアントは、表３ｃから選択される１つまたは複数の異種アシルトランスフェラーゼに由来する。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１４０１４ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇおよびＹ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＢＬ０１１ｗ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＤＬ０５２ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ１７５Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＲ１３９Ｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＮＲ００８ｗおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＯＲ２４５ｃおよびＣａｎｄｉｄａ  Ｉ５０３＿０２５７７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２６３０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．２５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．７８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０２４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１８８１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．９４３７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０１６８７、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１０４３、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．８６４５、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４７５０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１３４３９、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０４３９０、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．６９４１、Ｃａｎｄｉｄａ  ＣａＯ１９．１４２０３およびＣａｎｄｉｄａ  ＣＴＲＧ＿０６２０９からなる群から選択される１つまたは複数の内在性アシルトランスフェラーゼ酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【０３３９】
[00323]  ある特定の実施形態では、脂肪酸分解経路はオメガ酸化経路である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、モノオキシゲナーゼ（CYP52）、脂肪アルコールオキシダーゼ、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｙｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ２５９８２ｇ（ＡＬＫ１）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ０１３２０ｇ（ＡＬＫ２）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ２３４７４ｇ（ＡＬＫ３）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ１３８１６ｇ（ＡＬＫ４）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ１３８３８ｇ（ＡＬＫ５）、Ｙ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ０１８４８ｇ  （ＡＬＫ６）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ａ１５４８８ｇ（ＡＬＫ７）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１２１２２ｇ（ＡＬＫ８）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ０６２４８ｇ（ＡＬＫ９）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｂ２０７０２ｇ（ＡＬＫ１０）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｃ１００５４ｇ（ＡＬＫ１１）およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ａ２０１３０ｇ（ＡＬＫ１２）からなる群から選択される１つまたは複数の内在性シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼの欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む。
【０３４０】
[00324]  他の実施形態では、組換え微生物は、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質は、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ８、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１５、ＰＥＸ１７、ＰＥＸ１８、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２１、ＰＥＸ２２、ＰＥＸ２５、ＰＥＸ２７、ＰＥＸ２８、ＰＥＸ２９、ＰＥＸ３０、ＰＥＸ３１、ＰＥＸ３２およびＰＥＸ３４またはその任意の組合せからなる群から選択される。
【０３４１】
[00325]  別の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、補酵素の細胞内レベルを増加するようにさらに操作されている。ある特定の実施形態では、補酵素はＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質を発現するようにさらに操作されている。別の実施形態では、１つまたは複数の内在性または外因性タンパク質の発現は補助基質の補充と連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するようにさらに操作される。
【０３４２】
[00326]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素を発現し、１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素を欠落する、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。一部の実施形態では、発現されている１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は欠落されているまたは下方調節されている１つまたは複数の内在性アシルＣｏＡオキシダーゼ酵素とは異なっている。他の実施形態では、発現される１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は１つまたは複数の不飽和脂質部分の鎖長を調節する。他の実施形態では、発現されている１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ酵素は表３ａから選択される。
【０３４３】
[00327]  本明細書に記載される種々の実施形態では、組換え微生物は真核微生物である。一部の実施形態では、真核微生物は酵母である。例示的な実施形態では、酵母はＹａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、ＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａおよびＭｙｘｏｚｙｍａからなる群から選択される属のメンバーである。
【０３４４】
[00328]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物は脂質を蓄積する。例示的な実施形態では、本発明の組換え微生物は含油性酵母である。さらなる実施形態では、含油性酵母はＹａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎおよびＬｉｐｏｍｙｃｅｓからなる群から選択される群のメンバーである。さらなる実施形態では、含油性酵母はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＲ．ｇｒａｍｉｎｉｓから選択される種のメンバーである。
【０３４５】
[00329]  一部の実施形態では、組換え微生物は原核微生物である。例示的な実施形態では、原核微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群から選択される群のメンバーである。
【０３４６】
[00330]  一部の実施形態では、組換え微生物を使用して１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する。
【０３４７】
[00331]  したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換え微生物を使用して１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する方法を提供する。一実施形態では、方法は、１つまたは複数の不飽和脂質部分が生産されるまで炭素源を提供する供給原料を含有する培養培地において組換え微生物を培養することを含む。さらなる実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分が回収される。回収は、蒸留、膜ベースの分離ガスストリッピング、溶媒抽出、および拡張吸着流動床（expanded bed adsorption）などの当技術分野で公知の方法によることが可能である。
【０３４８】
[00332]  一部の実施形態では、供給原料は炭素源を含む。本明細書に記載されている種々の実施形態では、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、および一酸化炭素から選択してよい。さらなる実施形態では、糖はグルコース、フルクトース、およびサクロースからなる群から選択される。
【０３４９】
[00333]  一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え微生物はアルカンおよび／または脂肪酸に対して高い耐性を有する。
【０３５０】
[00334]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかで使用される組換え微生物が本明細書では開示される。
【０３５１】
脂肪アルコールおよび／またはアルデヒドを生産する方法
[00335]  上記の通り、一態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程ならびに、１つまたは複数の不飽和脂質部分を直接還元し、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが生産される工程を含む。
【０３５２】
[00336]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の遊離脂肪酸（FFA）に化学的に変換する工程；１つまたは複数のＦＦＡを１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（FAAE）にエステル化する工程；ならびに１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元し、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが生産される工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５３】
[00337]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の天然に存在する生物から１つまたは複数の不飽和脂質部分を入手する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程；および１つまたは複数のＦＡＡＥを還元し、その還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが生産される工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５４】
[00338]  一実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は昆虫である。別の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は昆虫ではない。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然に存在する生物は植物、藻類および細菌からなる群から選択される。一部の実施形態では、植物はヤマモガシ科およびクロウメモドキ科からなる群から選択される科由来である。ある特定の実施形態では、属Ｇｅｖｕｉｎａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ、Ｌｕｎａｒｉａ、Ｃａｒｕｍ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ、Ｍａｃａｄａｍｉａ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ、Ｌｉｃａｎｉａ、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｃｏｒｙｌｕｓ、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ、Ｏｒｉｔｅｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｐｌａｃｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｘｙｌｏｍｅｌｕｍおよび／またはＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ由来の種を含む。一部の実施形態では、植物はＧｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ、Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ、Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓ、Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ、Ｈｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａおよびＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａからなる群から選択される。一部の実施形態では、藻類は緑藻類を含む。ある特定の実施形態では、緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ属由来の種を含む。一部の実施形態では、緑藻類はＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘを含む。一部の実施形態では、細菌はグラム陰性菌を含む。一部の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、グラム陰性菌はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓを含む。一部の実施形態では、細菌はラン藻を含む。一部の実施形態では、ラン藻はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属由来の種を含む。ある特定の実施形態では、ラン藻はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む。
【０３５５】
[00339]  別の態様では、１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を含むように操作された１つまたは複数の組換え微生物において１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程；１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数の遊離脂肪酸（FFA）および／または１つもしくは複数の脂肪酸メチルエステル（FAAE）に化学的に変換する工程；ならびに１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドが生産される、工程を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５６】
[00340]  化学変換工程を含む、本明細書に開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥに化学的に変換する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分を単離する工程；任意選択により特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する工程；ならびに１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程であって、脂肪酸誘導体を生産する工程をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＦＡへの鹸化を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分を処理する工程は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の１つまたは複数のＦＡＡＥへのエステル化を含む。一実施形態では、特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する任意選択の工程は分離方法を含む。別の実施形態では、分離方法は蒸留および／またはクロマトグラフィーを含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５７】
[00341]  本明細書に開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程は、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の化学量論的還元剤に接触させる工程を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学量論的還元剤は、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムＶｉｔｒｉｄｅ（Red-Al, Vitride, SMEAH）および／または水素化ジイソブチルアルミニウム（DIBAL）を含む。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを還元する工程は、還元剤を改変するためのバルキーな環状窒素ルイス塩基を含む。一実施形態では、バルキーな環状窒素ルイス塩基は１つまたは複数の脂肪アルデヒドの生産のための還元工程の選択性を与える。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５８】
[00342]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の脂肪アルコールに還元する工程は、１つもしくは複数の不飽和脂質部分、１つもしくは複数のＦＦＡおよび／または１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の遷移金属触媒に接触させる工程を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遷移金属触媒は１つまたは複数の第ＶＩＩＩ族触媒を含む。一実施形態では、ＦＡＡＥは脂肪酸メチルエステル（FAME）を含む。
【０３５９】
[00343]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、生産された脂肪アルコールは酸化工程により脂肪アルデヒドにさらに酸化される。一部の実施形態では、酸化工程は１つまたは複数の部分的酸化方法を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分的酸化方法はＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯを含む。他の実施形態では、酸化工程は銅触媒好気性酸化を含む。
【０３６０】
[00344]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかの一実施形態では、生産された１つまたは複数の脂肪アルコールは１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルにさらに化学的に変換される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程は、１つまたは複数の脂肪アルコールを無水酢酸に接触させる工程を含む。
【０３６１】
[00345]  本明細書で開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または
１つもしくは複数の脂肪酢酸を生産する方法のいずれかの一実施形態では、１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸は分離手順によりさらに濃縮される。
【０３６２】
[00346]  別の態様では、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかで使用される１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産することができる組換え微生物を作り出す方法が本明細書で開示される。
【０３６３】
酵素工学的操作
[00347]  組換え微生物中の酵素は、生成物変換のための基質の１つまたは複数の側面を改良するように工学的に操作することが可能である。本開示の方法で使用するためにさらに工学的に操作することが可能である酵素の非限定的例は、デサチュラーゼ（例えば、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼまたは脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼ）、シトクローム−ｂ５還元酵素、エロンガーゼ、チオエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、脂質結合タンパク質、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、および／または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せを含む。これらの酵素は、改良された触媒活性、改良された選択性、改良された安定性、種々の発酵条件（温度、ｐＨ等）に対する改良された耐性、または種々の代謝基質、産物、副産物、中間体等に対する改良された耐性のために工学的に操作することが可能である。
【０３６４】
[00348]  デサチュラーゼ酵素は、不飽和基質の不飽和化での改良された触媒活性のため、改良された炭化水素選択性のため、Ｅ生成物に対するＺ生成物の、またはＺ生成物に対するＥ生成物の改良された選択性のために工学的に操作することが可能である。例えば、Ｚ９脂肪アシルデサチュラーゼは、飽和脂肪アシルＣｏＡの対応する不飽和脂肪アシルＣｏＡへの生成物変換のための基質の収量を改良するように、さらにまたは代わりに、対応するＺ−９脂肪アシルＣｏＡを生産するために９位での不飽和化の選択性を改良するように工学的に操作することが可能である。さらなる非限定的例では、シトクロームｂ５還元酵素は、１電子キャリアと２電子運搬ニコチンアミドジヌクレオチド間の還元当量の交換での触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；エロンガーゼ酵素は、脂肪酸基質の伸張の触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；チオエステラーゼはアシルＡＣＰまたはアシルＣｏＡの遊離脂肪酸への変換での触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、グリセロール−３−リン酸のｓｎ−１位でのアシル化の触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはトリアシルグリセロールのｓｎ−２位のアシル化での触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはトリアシルグリセロールを形成するためのジアシルグリセロールのｓｎ−３位へのアシル基の付加での触媒活性の改良のために工学的に操作することが可能であり；脂質結合タンパク質は、ステロール結合の改良のために工学的に操作することが可能であり；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、グルコース−６−リン酸の６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化での触媒活性の改良のために、さらにまたは代わりに、補酵素に対する酵素の選択性を変更するもしくは改良するように、工学的に操作することが可能であり；６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、リブロース５−リン酸へのＤ−グルコン酸６−リン酸の酸化での触媒活性の改良のために、さらにまたは代わりに、補酵素に対する酵素の選択性を変更するもしくは改良するように、工学的に操作することが可能である。
【０３６５】
[00349]  特定の酵素活性に関して本明細書で使用される用語「改良された触媒活性」とは、工学的に操作されていないデサチュラーゼ（例えば、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼまたは脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼ）、シトクロームｂ５還元酵素、エロンガーゼ、チオエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、脂質結合タンパク質、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼなどの比較可能な工学的に操作されていない酵素に対して測定された酵素活性よりも高いレベルの酵素活性のことである。例えば、特定の酵素の過剰発現により、その酵素についての細胞内での活性のレベルが増加することが可能である。デサチュラーゼ（例えば、脂肪アシルＣｏＡデサチュラーゼまたは脂肪アシルＡＣＰデサチュラーゼ）、シトクロームｂ５還元酵素、エロンガーゼ、チオエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、脂質結合タンパク質、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼに突然変異を導入して、触媒活性が改良されている工学的に操作された酵素を得ることが可能である。酵素活性を増加する方法は当業者には公知である。そのような技法はプラスミドコピー数を増やすことおよび／もしくはより強力なプロモーターの使用および／もしくは活性化リボスイッチの使用、酵素の負の調節を軽減する突然変異の導入、特定の活性を増加しおよび／もしくは基質についてのＫＭを減少する特定の突然変異の導入により、または定向進化により酵素の発現を増加することを含むことが可能である。例えば、Methods in Molecular Biology (vol. 231), ed. Arnold and Georgiou, Humana Press（2003年）参照。
【０３６６】
代謝工学的操作−増加した経路Ｆｌｕｘのための酵素過剰発現、および遺伝子欠落／下方調節
[00350]  本明細書に記載される種々の実施形態では、本明細書に記載される生合成経路に関与している組換え微生物中の外因性および内在性酵素を過剰発現することができる。
【０３６７】
[00351]  用語「過剰発現される」または「過剰発現」とは、基底レベルのｍＲＮＡを発現しているもしくは基底レベルのタンパク質を有する類似の対応する非改変細胞と比べた場合の細胞におけるタンパク質（複数可）をコードするｍＲＮＡのレベルの上昇（例えば、異常レベル）、および／またはタンパク質（複数可）のレベルの上昇のことである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）またはタンパク質（複数可）は、遺伝子ｍＲＮＡ、タンパク質、および／または活性の増加を示すように工学的に操作された微生物において少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、１５倍またはそれよりも多く過剰発現することができる。
【０３６８】
[00352]  一部の実施形態では、本開示の組換え微生物は、基質脂肪酸を合成する酵素的能力を含有する宿主から生み出される。この特定の実施形態では、例えば、ＦＦＡおよび／またはＦＡＡＥへの化学変換ならびに１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドへのそれに続く還元に利用可能な脂肪酸の量を増やすために、脂肪酸の合成または蓄積を増加するのは有用になり得る。
【０３６９】
[00353]  一部の実施形態では、補酵素の細胞内レベルを増やすために内在性または外因性酵素の発現を増加するのは有用になり得る。一実施形態では、補酵素はＮＡＤＨである。別の実施形態では、補酵素はＮＡＤＰＨである。一実施形態では、ペントースリン酸経路でのタンパク質の発現はＮＡＤＰＨの細胞内レベルを増やすために増加される。ペントースリン酸経路は還元当量を供給するために重要な異化経路であり生合成反応のために重要な同化経路である。一実施形態では、グルコース−６−リン酸を６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへ変換するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＺＷＦ１である。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＺＷＦ１（YNL241C）である。一実施形態では、Ｄ−グルコピラノース−６−リン酸を６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへ変換するグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは過剰発現される。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは細菌由来のｚｗｆである。ある特定の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｚｗｆ（ＮＰ＿４１６３６６）である。一実施形態では、６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンをＤ−グルコン酸６−リン酸に変換する６−ホスホグルコノラクトナーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ３である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＯＬ３（ＮＰ＿０１２０３３）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ４である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＯＬ４（ＮＰ＿０１１７６４）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは細菌のｐｇｌである。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＥ．ｃｏｌｉのｐｇｌ（ＮＰ＿４１５２８８）である。一実施形態では、Ｄ−グルコン酸６−リン酸をＤ−リブロース５−リン酸に変換する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ１である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ１（ＹＨＲ１８３Ｗ）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ２である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ２（ＹＧＲ２５６Ｗ）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｇｎｄである。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｇｎｄ（ＮＰ＿４１６５３３）である。一実施形態では、Ｄ−グリ���ルアルデヒド３−リン酸およびＤ−セドヘプツロース７リン酸をβ−Ｄ−フルクトフラノース６−リン酸およびＤ−エリトロース４−リン酸に相互交換するトランスアルドラーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＴＡＬ１である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＡＬ１（ＮＰ＿０１３４５８）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＮＱＭ１である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮＱＭ１（ＮＰ＿０１１５５７）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは細菌のｔａｌである。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔａｌＢ（ＮＰ＿４１４５４９）である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔａｌＡ（ＮＰ＿４１６９５９）である。一実施形態では、Ｄ−エリスローゼ４−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸をβ−Ｄフルクトフラノース６−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸に相互交換するならびに／またはＤ−セドヘプツロース７リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸をＤ−リボース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸に相互交換するトランスケトラーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ１である。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＫＬ１（ＮＰ＿０１５３９９）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ２である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＫＬ２（ＮＰ＿００９６７５）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは細菌のｔｋｔである。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔｋｔＡ（ＹＰ＿０２６１８８）である。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔｋｔＢ（ＮＰ＿４１６９６０）である。一実施形態では、Ｄ−リボース５−リン酸およびＤ−リブロース５−リン酸を相互交換するリボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼは酵母のＲＫｌ１である。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＫｌ１（ＮＰ＿０１４７３８）である。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼは細菌のｒｐｉである。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｉＡ（ＮＰ＿４１７３８９）である。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｉＢ（ＮＰ＿４１８５１４）である。一実施形態では、Ｄ−リブロース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸を相互交換するＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは過剰発現される。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは酵母のＲＰＥ１である。ある特定の��施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＰＥ１（ＮＰ＿０１２４１４）である。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは細菌のｒｐｅである。ある特定の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｅ（ＮＰ＿４１７８４５）である。
【０３７０】
[00354]  一実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼの発現は補酵素の細胞内レベルを増やすために増加される。一実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＤ−スレオイソクエン酸を２−オキソグルタル酸に酸化し、同時にＮＡＤＰＨが生成する。別の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＤ−スレオイソクエン酸を２−オキサロコハク酸に酸化し、同時にＮＡＤＰＨが生成する。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＩＤＰである。ある特定の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＩＤＰ２（ＹＬＲ１７４Ｗ）である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｉｃｄである。ある特定の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｉｃｄ（ＮＰ＿４１５６５４）である。
【０３７１】
[00355]  一部の実施形態では、リンゴ酸をピルビン酸に脱炭素し同時にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成するリンゴ酸酵素の発現は補酵素の細胞内レベルを増やすために増加される。一実施形態では、リンゴ酸酵素はＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素はＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、リンゴ酸酵素は細菌由来のＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｍａｅＡ（ＮＰ＿４１５９９６）である。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ由来のｍａｅＥ（ＣＡＱ６８１１９）である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素は酵母由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＡＥ１（ＹＫＬ０２９Ｃ）である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素は寄生線虫類由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＡｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ由来のＭ８１０５５である。一実施形態では、リンゴ酸酵素は細菌由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｍａｅＢ（ＮＰ＿４１６９５８）である。一実施形態では、リンゴ酸酵素はトウモロコシ由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＺｅａ  ｍａｙｓ由来のｍｅ１である。
【０３７２】
[00356]  一部の実施形態では、アルデヒドをカルボン酸に酸化し、同時にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成するアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現は補酵素の細胞内レベルを増やすために増加される。一実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは細菌由来のＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＡ（ＮＰ＿４１５９３３）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは酵母由来のサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＬＤ６（ＹＰＬ０６１Ｗ）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは細菌由来のサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＢ（ＮＰ＿４１８０４５）である。
【０３７３】
[00357]  一実施形態では、補酵素の細胞内レベルを増やすための酵素の過剰発現は補助基質の補充と酵素の過剰発現を連結させることを含む。一実施形態では、その酵素の補助基質の補充と連結された酵素の過剰発現は生化学経路を通じてｆｌｕｘを増加させる。一実施形態では、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼは補助基質と一緒に発現される。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはイソプロパノール補助基質と一緒に発現される。一実施形態では、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性グルコースデヒドロゲナーゼは補助基質と一緒に発現される。ある特定の実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼはグルコース補助基質と一緒に発現される。
【０３７４】
[00358]  一実施形態では、トランスヒドロゲナーゼの発現はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを相互交換するために増加される。一部の実施形態では、トランスヒドロゲナーゼはピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは細菌由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｐｎｔＡＢ（ベータサブユニット：ＮＰ＿４１６１１９；アルファサブユニット：ＮＰ＿４１６１２０）である。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはヒト由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＮＮＴ（ＮＰ＿０３６４７５）である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来である。ある特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはＳｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来である。
【０３７５】
[00359]  合成または蓄積の増加は、例えば、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための上記酵素のうちの１つまたは複数をコードする核酸の過剰発現により達成することが可能である。１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産に有用な酵素（単数または複数）の過剰発現は、例えば、内在性遺伝子（単数または複数）の発現の増加を通じて、または外因性遺伝子（単数または複数）の発現、もしくは発現の増加を通じて、起こることが可能である。したがって、天然に存在する生物は容易に改変して、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産に有用な１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の核酸分子の過剰発現を通じて１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する非天然微生物を生み出すことが可能である。さらに、内在性遺伝子を変異誘発して１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための経路における酵素の活性を増加させることにより、天然に存在しない生物を生み出すことが可能である。
【０３７６】
[00360]  本開示があれば、当業者は本明細書に記載される組換え微生物を容易に構築することができる。なぜならば、本開示の組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための経路の酵素をコードしている少なくとも１つの核酸を１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産するのに十分な量で外因的に発現する、当技術分野で公知であり上に例示される方法を使用して構築することが可能だからである。
【０３７７】
[00361]  １つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する天然には存在しない宿主を構築しその発現レベルを試験するための方法は、例えば、当技術分野で周知である組換えおよび検出方法により実施することが可能である。そのような方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York（2001年）; Ausuboら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md.（1999年）に記載されているのを見ることができる。
【０３７８】
[00362]  当技術分野で公知の多様な機構を使用すれば、外因性または内在性遺伝子を発現する、または過剰発現することが可能である。例えば、本明細書に例示される１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産するための生合成経路で有用である酵素をコードし、宿主生物において機能的な発現制御配列に作動可能に連結されている１つまたは複数の核酸を宿す発現ベクター（単数または複数）を構築することが可能である。本発明の微生物宿主生物での使用に適用可能な発現ベクターは、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームならびに宿主染色体中への安定的組込みのために操作可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含む、人工染色体を含む。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する抵抗性を与える、栄養要求欠損を補完する、または培養培地においてではなく重要な栄養分を供給する選択可能マーカー遺伝子も含めることが可能である。発現制御配列は、当技術分野では周知である構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター等を含むことが可能である。２つ以上の外因性コード核酸が同時発現されることになる場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターにまたは別個の発現ベクターに挿入することが可能である。単一ベクター発現では、コード核酸は１つの共通の発現制御配列に作動可能に連結されるまたは１つの誘導性プロモーターおよび１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結されることが可能である。代謝または合成経路に関与している外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して確かめることが可能である。
【０３７９】
[00363]  発現制御配列は当技術分野では公知であり、例えば、宿主細胞においてポリヌクレオチド配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位（IRES）等を含む。発現制御配列は転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatisら、Science, 236: 1237〜1245頁（1987年））。例示的な発現制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185巻, Academic Press, San Diego, Calif.（1990年）に記載されている。
【０３８０】
[00364]  種々の実施形態では、発現制御配列はポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」とは、ポリヌクレオチド配列及び発現制御配列（複数可）が、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列（複数可）に結合している場合に遺伝子発現を可能にするように連結されていることを意味する。作動可能に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向に関して選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置している。作動可能に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部、または下流に位置することが可能である。
【０３８１】
[00365]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産を巡って生合成経路と競合する経路の１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。
【０３８２】
[00366]  一部の実施形態では、組換え微生物は、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つまたは複数の内在性酵素を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素はＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、ＸＰ＿５００２７３、ＢＡＡ０２０４１、ＣＡＡ３９３６６、ＣＡＡ３９３６７、ＢＡＡ０２２１０、ＢＡＡ０２２１１、ＢＡＡ０２２１２、ＢＡＡ０２２１３、ＢＡＡ０２２１４、ＡＡＯ７３９５２、ＡＡＯ７３９５３、ＡＡＯ７３９５４、ＡＡＯ７３９５５、ＡＡＯ７３９５６、ＡＡＯ７３９５８、ＡＡＯ７３９５９、ＡＡＯ７３９６０、ＡＡＯ７３９６１、ＡＡＯ７３９５７、ＸＰ＿００２５４６２７８、ＢＡＭ４９６４９、ＡＡＢ８０８６７、ＡＡＢ１７４６２、ＡＤＬ２７５３４、ＡＡＵ２４３５２、ＡＡＡ８７６０２、ＣＡＡ３４６１２、ＡＢＭ１７７０１、ＡＡＡ２５７６０、ＣＡＢ５１０４７、ＡＡＣ８２９６７、ＷＰ＿０１１０２７３４８またはその相同体からなる群から選択される。
【０３８３】
[00367]  一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素はモノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ５２）である。一部の実施形態では、モノオキシゲナーゼはＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡＬＫ８、ＡＬＫ９、ＡＬＫ１０、ＡＬＫ１１およびＡＬＫ１２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、モノオキシゲナーゼは、ＹＡＬＩ０Ｂ１３８３８ｇ、ＹＡＬＩ０Ａ１５４８８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０１８４８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ１３８１６ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ２３４７４ｇ、ＹＡＬＩ０Ａ２０１３０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｃ１２１２２ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ２５９８２ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０６２４８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ０１３２０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ２０７０２ｇおよびＹＡＬＩ０Ｃ１００５４ｇからなる群から選択されるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａモノオキシゲナーゼである。ある特定の実施形態では、モノオキシゲナーゼはＣａＯ１９．１０、ＣａＯ１９．７６８３、ＣａＯ１９．７５１２、ＣａＯ１９．１３１５０、ＣａＯ１９．１３９２７およびＣａＯ１９．６５７４からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓモノオキシゲナーゼである。ある特定の実施形態では、モノオキシゲナーゼはＣＴＲＧ＿０３１１５、ＣＴＲＧ＿０３１２０、ＣＴＲＧ＿０１０６１、ＣＴＲＧ＿０１０６０、ＣＴＲＧ＿０２７２５、ＣＴＲＧ＿０３１１４およびＣＴＲＧ＿０４９５９からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓモノオキシゲナーゼである。
【０３８４】
[00368]  一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素は脂肪アルコールオキシダーゼである。一部の実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼはＦＡＯ１およびＦＡＯ２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＹＡＬＩ０Ｂ１４０１４ｇである。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼはＣａＯ１９．６１４３およびＣａＯ１９．１３５６２からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ脂肪アルコールオキシダーゼである。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼはＣＴＲＧ＿０３０６２およびＣＴＲＧ＿０３０６３からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ脂肪アルコールオキシダーゼである。
【０３８５】
[00369]  一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素は脂肪アルコールデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼはＦＡＤＨである。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｆ０９６０３ｇである。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼはＩ５０３＿０６４１１およびＣａＯ１９．７６００からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ脂肪アルコールデヒドロゲナーゼである。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ脂肪アルコールデヒドロゲナーゼＣＴＲＧ＿０５８３６である。
【０３８６】
[00370]  一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７およびＡＤＨ８からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＹＡＬＩ０Ｅ０７７６６ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ２５６３０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１７７８７ｇ、ＹＡＬＩ０Ａ１６３７９ｇ、ＹＡＬＩ０Ａ１５１４７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１５８１８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ０２１６７ｇおよびＹＡＬＩ０Ｃ１２５９５ｇからなる群から選択されるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａアルコールデヒドロゲナーゼである。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＣａＯ１９．１１４８０、ＣａＯ１９．１２５７９、ＣａＯ１９．５１１３、ＣａＯ１９．４２８７、ＣａＯ１９．１１７６３、ＣａＯ１９．１０１３９、ＣａＯ１９．２６０８、ＣａＯ１９．１１９８１、ＣａＯ１９．４５０４、ＣａＯ１９．１１９８０、ＣａＯ１９．１２９６３およびＣａＯ１９．５５１７からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓアルコールデヒドロゲナーゼである。ある特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼはＣＴＲＧ＿０６１１３、ＣＴＲＧ＿０５４８２、ＣＴＲＧ＿０５１２７およびＣＴＲＧ＿０５１９７からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼである。
【０３８７】
[00371]  一部の実施形態では、脂肪酸のωヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素は脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼはＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３およびＦＡＬＤＨ４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼはＹＡＬＩ０Ａ１７８７５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１５４００ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０１２９８ｇおよびＹＡＬＩ０F２３７９３ｇからなる群から選択されるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼである。ある特定の実施形態では、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼはＣａＯ１９．１３８７１、ＣａＯ１９．６５１８、ＣａＯ１９．１３４８７およびＣａＯ１９．６０６６からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼである。ある特定の実施形態では、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼはＣＴＲＧ＿０５０１０、ＣＴＲＧ＿０４４７１およびＣＴＲＧ＿０４４７３からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【０３８８】
[00372]  他の実施形態では、組換え微生物は、脂肪アシルＣｏＡのα，β−エノイルＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の内在性酵素を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。一部のそのような実施形態では、脂肪アシルＣｏＡのα，β−エノイルＣｏＡへの変換を触媒する酵素はＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、ＣＡＧ７９２１４、ＡＡＡ３４３２２、ＡＡＡ３４３６１、ＡＡＡ３４３６３、ＣＡＡ２９９０１、ＢＡＡ０４７６１、ＡＡＡ３４８９１、ＡＡＢ０８６４３、ＣＡＢ１５２７１、ＢＡＮ５５７４９、ＣＡＣ４４５１６、ＡＤＫ１６９６８、ＡＥＩ３７６３４、ＷＰ＿０００９７３０４７、ＷＰ＿０２５４３３４２２、ＷＰ＿０３５１８４１０７、ＷＰ＿０２６４８４８４２、ＣＥＬ８０９２０、ＷＰ＿０２６８１８６５７、ＷＰ＿００５２９３７０７、ＷＰ＿００５８８３９６０，またはその相同体からなる群から選択される。
【０３８９】
[00373]  一部の実施形態では、脂肪アシルＣｏＡのα，β−エノイルＣｏＡへの変換を触媒する酵素はアシルＣｏＡオキシダーゼである。一部の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、ＰＯＸ６およびＰＸＰ２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＧＬ２０５Ｗである。ある特定の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはYＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇおよびＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇからなる群から選択されるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａアシルＣｏＡオキシダーゼである。ある特定の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはＣａＯ１９．１６５５、ＣａＯ１９．９２２４、ＣａＯ１９．１６５２、ＣａＯ１９．９２２１、ＣａＯ１９．５７２３およびＣａＯ１９．１３１４６からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓアシルＣｏＡオキシダーゼである。ある特定の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはＣＴＲＧ＿０２３７４、ＣＴＲＧ＿０２３７７およびＣＴＲＧ＿０２７２１からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓアシルＣｏＡオキシダーゼである。ある特定の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼはＭ１８２５９、Ｍ１２１６０およびＭ１２１６１からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉアシルＣｏＡオキシダーゼである。
【０３９０】
[00374]  一部の実施形態では、脂肪アシルＣｏＡのα，β−エノイルＣｏＡへの変換を触媒する酵素は多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼはＦＯＸ２（MFE1）である。ある特定の実施形態では、多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＫＲ００９Ｃである。ある特定の実施形態では、多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１５３７８ｇである。ある特定の実施形態では、多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣａＯ１９．１８０９である。ある特定の実施形態では、多機能性エノイルＣｏＡヒドラターゼ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＣＴＲＧ＿０５５０６である。
【０３９１】
[00375]  一部の実施形態では、脂肪アシルＣｏＡのα，β−エノイルＣｏＡへの変換を触媒する酵素はβ−ケトアシルＣｏＡチオラーゼである。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼはＰＯＴ１およびＦＯＸ３からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＩＬ１６０Ｃである。ある特定の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ１８５６８ｇである。ある特定の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼはＣａＯ１９．７５２０、ＣａＯ１９．１７０４およびＣａＯ１９．９２７１からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓβ−ケトアシルＣｏＡチオラーゼである。ある特定の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡチオラーゼはＣＴＲＧ＿０１０６８およびＣＴＲＧ＿０２１６８からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓβ−ケトアシルＣｏＡチオラーゼである。
【０３９２】
[00376]  一部の実施形態では、組換え微生物は、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。そのような実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＸＰ＿５０５７５４、ＸＰ＿５０１９８６、ＸＰ＿５０１３１１、ＸＰ＿５０４８４５、ＸＰ＿５０３３２６、ＸＰ＿５０４０２９、ＸＰ＿００２５４９８６８、ＸＰ＿００２５４７１５６、ＸＰ＿００２５４５２２７、ＸＰ＿００２５４７３５０、ＸＰ＿００２５４６９９０、ＥＩＷ１１５３９、ＥＩＷ０８０９４、ＥＩＷ１１４７２、ＥＩＷ０９７４３、ＥＩＷ０８２８またはその相同体からなる群から選択される。
【０３９３】
[00377]  一部の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ８、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１５、ＰＥＸ１７、ＰＥＸ１８、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２１、ＰＥＸ２２、ＰＥＸ２５、ＰＥＸ２７、ＰＥＸ２８、ＰＥＸ２９、ＰＥＸ３０、ＰＥＸ３１、ＰＥＸ３２およびＰＥＸ３４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ２である。一部の実施形態では、ＰＥＸ２はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＪＬ２１０Ｗである。一部の実施形態では、ＰＥＸ２はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｆ０１０１２ｇである。一部の実施形態では、ＰＥＸ２はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１１０３０である。一部の実施形態では、ＰＥＸ２はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．３５４６ある。一部の実施形態では、ＰＥＸ２はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１６５７である。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１２である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１２はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＭＲ０２６Ｃである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１２はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｄ２６６４２ｇである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１２はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．２００９である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１２はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９５６０である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１２はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１２９６である。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１０である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１０はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＤＲ２６５Ｗである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１０はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｃ０１０２３ｇである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１０はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３１０５である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１０はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５６６０である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１０はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿００００８である。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＫＬ１９７Ｃである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｃ１５３５６ｇである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１３８１８である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．６４６０である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０４８６９である。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ２２である。一部の実施形態では、ＰＥＸ２２はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＡＬ０５５Ｗである。一部の実施形態では、ＰＥＸ２２はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｆ０６２２６ｇである。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１６である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１６はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｅ１６５９９ｇである。ある特定の実施形態では、ペルオキシソーム生合成に関与している１つまたは複数のタンパク質はＰＥＸ１４である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１４はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＧＬ１５３Ｗである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１４はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０＿Ｅ０９４０５ｇである。一部の実施形態では、ＰＥＸ１４はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１８０５である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１４はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９３７１である。一部の実施形態では、ＰＥＸ１４はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿００５４１である。
【０３９４】
[00378]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪体貯蔵および／または再利用経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質はトリアシルグリセロールリパーゼである。一実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＧＬ３（YMR313c）である。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇである。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＷ５Ｑ＿０３３９８である。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０００５７である。別の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＧＬ４（YKR089c）である。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｆ１００１０ｇである。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５４２６である。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１２８８１である。一部の実施形態では、トリアシルグリセロールリパーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０６１８５である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、脂肪酸を含有するトリアシルグリセリドからの脂肪アシル移動を媒介するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼである。一実施形態では、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＧＬ５（YOR081c）である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、脂肪酸を含有するステロールエステルの加水分解を媒介するステリルエステルヒドロラーゼである。一実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＧＬ１（YKL140w）である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｅ３２０３５ｇである。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．２０５０である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９５９８である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１１３８である。一実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＥＨ１（YLL012W）である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｅ００５２８ｇである。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１８８７である。一部の実施形���では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．９４４３である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０１６８３である。一実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＥＨ２（YLR020C）である。一部の実施形態では、ステリルエステルヒドロラーゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０４６３０である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、脂肪アシル部分を脂肪アシルＣｏＡチオエステルに再活性化するアシルＣｏＡシンセターゼである。一実施形態では、アシルＣｏＡシンセターゼはＦＡＴ１（AAC17118）である。
【０３９５】
[00379]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の不飽和脂肪アシルＣｏＡ中間体を巡って生合成経路と競合する経路での反応を触媒する１つまたは複数の内在性酵素を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。一実施形態では、１つまたは複数の内在性酵素は１つまたは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物という文脈では、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇおよびＣＴＲＧ＿０６２０９、またはその相同体からなる群から選択される１つまたは複数のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように工学的に操作される。別の実施形態では、１つまたは複数の内在性酵素は１つまたは複数のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物という文脈では、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇおよびＣＴＧ＿０４３９０、またはその相同体からなる群から選択される１つまたは複数のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように工学的に操作される。別の実施形態では、１つまたは複数の内在性酵素は１つまたは複数のアシルＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物という文脈では、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１７６４およびＣＴＲＧ＿０１７６５、またはその相同体からなる群から選択される１つまたは複数のアシルＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼを欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように工学的に操作される。
【０３９６】
[00380]  一部の実施形態では、組換え微生物は、１つまたは複数の脂肪酸伸張経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ケトアシルＡＣＰを生じるマロニルＡＣＰとアシルＣｏＡの縮合を触媒するβ−ケトアシルＣｏＡシンターゼである。一実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡシンターゼは酵母ＦＡＳのβ−ケトアシルＣｏＡシンターゼドメインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、マロニルＡＣＰとアシルＡＣＰを縮合させてβ−ケトアシルＡＣＰを形成するβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼＩである。一実施形態では、β−ケトアシルＡＣＰシンターゼＩは細菌由来のＦａｂＢである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、マロニルＡＣＰとアシルＡＣＰを縮合させてβ−ケトアシルＡＣＰを形成するβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼＩＩである。一実施形態では、β−ケトアシルＡＣＰシンターゼＩＩは細菌由来のＦａｂＦである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ケトアシルＡＣＰのβ−ケト基をＮＡＤＰＨで還元してβ−ヒドロキシアシルＡＣＰを形成するβ−ケトアシルＡＣＰ還元酵素である。一実施形態では、β−ケトアシルＡＣＰ還元酵素は細菌由来のＦａｂＧである。別の実施形態では、β−ケトアシルＡＣＰ還元酵素は酵母ＦＡＳのケト還元酵素（KR）ドメインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素である。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（YBR159W）由来のＩＦＡ３８である。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ａ０６７８７ｇである。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１１３４０である。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．３８５９である。一部の実施形態では、β−ケトアシルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿００６２０である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ヒドロキシアシルＡＣＰを脱水してトランス−２−エノイルＡＣＰを形成するβ−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼである。一実施形態では、デヒドラターゼはβ−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼである。別の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼは細菌由来のＦａｂＡである。一実施形態では、デヒドラターゼはβ−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼである。別の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラターゼは細菌由来のＦａｂＺである。別の実施形態では、デヒドラターゼは酵母ＦＡＳのデヒドラターゼ（DH）ドメインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒド��ターゼである。一部の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（YJL097W）由来のＰＨＳ１（TPL1）である。一部の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ｆ１１９３５ｇである。一部の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．５１５６である。一部の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１２６２３である。一部の実施形態では、β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０５２２４である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、トランス−２−エノイルＡＣＰを還元してアシルＡＣＰを形成するエノイルＡＣＰ還元酵素である。一実施形態では、還元酵素はＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素Ｉである。別の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素Ｉは細菌由来のＦａｂＩである。一実施形態では、還元酵素はＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素ＩＩである。別の実施形態では、還元酵素はＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素ＩＩは細菌由来のＦａｂＫである。一実施形態では、還元酵素はＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素ＩＩＩである。別の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイルＡＣＰ還元酵素ＩＩＩは細菌由来のＦａｂＬである。別の実施形態では、還元酵素は酵母中のＦＡＳのエノール還元酵素（ER）ドメインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、エノイルＣｏＡ還元酵素である。一部の実施形態では、エノイルＣｏＡ還元酵素はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（YDL015C）由来のＴＳＣ１３である。一部の実施形態では、エノイルＣｏＡ還元酵素はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＹＡＬＩ０Ａ０４９８３ｇである。一部の実施形態では、エノイルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．１０８０３である。一部の実施形態では、エノイルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＣａＯ１９．３２９３である。一部の実施形態では、エノイルＣｏＡ還元酵素はＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のＣＴＲＧ＿０４４０６である。
【０３９７】
[00381]  別の実施形態では、組換え微生物は、ペントースリン酸経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質を欠落させる、破壊する、突然変異する、および／またはその活性を低減するように操作される。一部の実施形態では、ペントースリン酸経路でのタンパク質の発現は、ＮＡＤＨの細胞内レベルを増やすために減少される。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、グルコース−６−リン酸を６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＺＷＦ１である。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＺＷＦ１（YNL241C）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−グルコピラノース−６−リン酸を６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼである。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは細菌由来のｚｗｆである。ある特定の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｚｗｆ（NP_416366）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンをＤ−グルコン酸６−リン酸に変換する６−ホスホグルコノラクトナーゼである。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ３である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＯＬ３（NP_012033）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ４である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＯＬ４（NP_011764）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは細菌のｐｇｌである。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはＥ．ｃｏｌｉのｐｇｌ（NP_415288）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−グルコン酸６−リン酸をＤ−リブロース５−リン酸に変換する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ１である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ１（YHR183W）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ２である。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＮＤ２（YGR256W）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｇｎｄである。ある特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来のｇｎｄ（NP_416533）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびＤ−セドヘプツロー��７−リン酸をβ−Ｄ−フルクトフラノース６−リン酸およびＤ−エリトロース４−リン酸に相互変換するトランスアルドラーゼである。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＴＡＬ１である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＡＬ１（NP_013458）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＮＱＭ１である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮＱＭ１（NP_011557）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは細菌のｔａｌである。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔａｌＢ（NP_414549）である。ある特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔａｌＡ（EP_416959）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−エリトロース４−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸をβ−Ｄ−フルクトフラノース６−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸に相互変換するならびに／またはＤ−セドヘプツロース７−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸をＤ−リボース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸に相互変換するトランスケトラーゼである。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ１である。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＫＬ１（NP_015399）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ２である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＫＬ２（NP_009675）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは細菌のｔｋｔである。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔｋｔＡ（YP_026188）である。ある特定の実施形態では、トランスケトラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｔｋｔＢ（NP_416960）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−リボース５−リン酸およびＤ−リブロース５−リン酸を相互変換するリボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼである。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼは酵母のＲＫＩ１である。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＫＩ１（NP_014738）である。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼは細菌のｒｐｉである。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｉＡ（NP_417389）である。ある特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｉＢ（NP_418514）である。一実施形態では、１つまたは複数の内在性タンパク質は、Ｄ−リブロース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸を相互変換するＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼである。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは酵母のＲＰＥ１である。ある特定の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの���ＰＥ１（NP_012414）である。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは細菌のｒｐｅである。ある特定の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼはＥ．ｃｏｌｉのｒｐｅ（NP_417845）である。
【０３９８】
[00382]  一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を導入するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物はＨ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦ  ΔＵＲＡ３である。ΔＰはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでのアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子（POX 1〜6）の欠落を表す。ΔＡはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでの（脂肪）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（FADH、ADH1〜7）の欠落を表す。ΔＦはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでの（脂肪）アルコールオキシダーゼ遺伝子（FAO1）の欠落を表す。ΔＵＲＡ３はＵＲＡ３遺伝子の欠落を表し、酵母はウラシル栄養要求体になる。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を導入するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物はＨ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦである。一部の実施形態では、１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のための生合成経路を導入するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物は、ＭＡＴＡ  ｕｒａ３−３０２：：ＳＵＣ２  Δｐｏｘ１  Δｐｏｘ２  Δｐｏｘ３  Δｐｏｘ４  Δｐｏｘ５  Δｐｏｘ６  Δｆａｄｈ  Δａｄｈ１  Δａｄｈ２  Δａｄｈ３  Δａｄｈ４  Δａｄｈ５  Δａｄｈ６  Δａｄｈ７  Δｆａｏ１である。
【０３９９】
[00383]  酵母Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの、好ましくはＨ２２２株の野生型単離菌は、本開示に従った株の構築のための開始株として使用することが可能である。Ｈ２２２株は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従って番号ＤＳＭ２７１８５下ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig）に２９．０４．２０１３で寄託された。さらなる遺伝的処理のための株の使用には選択マーカーが必要とされる。この選択マーカーは、それ自体、例えば、ウラシル栄養要求体の形態で知られている様式で株中に導入することが可能である。代わりに、既知のウラシル栄養要求体株、好ましくはＨ２２２−Ｓ４株を使用することが可能である（Mauersberger S, Wang HJ, Gaillard in C, Barth G & Nicaud JM （2001年）J Bacterial 183: 5102〜5109頁）。それぞれの欠落カセット（例えば、POX 1〜6、ＦＡＤＨ、ADH 1〜7、FAO1）はＰＣＲまたは制限により得られ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｈ２２２−Ｓ４に形質転換され、このＨ２２２−Ｓ４は、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（Barth G & Gaillardin C（1996年）Yarrowia lipolytica. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York）に従ってＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｈ２２２から作製することが可能である（Mauers-bergerら、（2001年））。Ｈ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦ  ΔＵＲＡ３の創造はＷＯ２０１５／０８６６８４に記載さており、この特許文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株Ｈ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦは、本開示においてデサチュラーゼの導入のための開始微生物として使用する（例えば、実施例３、４および６参照）。
【０４００】
天然に存在する生物由来のまたは微生物合成由来の産物の化学変換
[00384]  本開示は、１つもしくは複数の天然に存在する生物から得られるまたは１つもしくは複数の組換え微生物により合成される産物を１つまたは複数の下流産物に変換するのに使用可能な化学変換を説明する。
【０４０１】
[00385]  一部の実施形態では、１つもしくは複数の天然に存在する生物から得られるまたは１つもしくは複数の組換え微生物により生産される１つまたは複数の不飽和脂質部分は、それに続いて化学変換を受けて、１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産することが可能である。１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドは、フェロモン、香料、風味、ポリマー、またはポリマー中間体として使用される。化学変換の非限定的例は、鹸化、エステル化、還元、酸化、メタセシス、および重合化を含む。
【０４０２】
[00386]  不飽和脂肪カルボン酸は当技術分野で公知の方法によりエステル化することが可能である。例えば、フィッシャーエステル合成反応を使用すれば脂肪カルボン酸を対応する脂肪エステルに変換することが可能である。例えば、Komura, K.ら、Synthesis 2008年. 3407〜3410頁参照。
【０４０３】
[00387]  エステルは鹸化を受けて、水と塩基を用いた反応によりカルボン酸イオンとアルコールを形成することが可能である。鹸化法は、熱鹸化、冷鹸化、マイクロ波鹸化および超音波アシスト鹸化を含む。
【０４０４】
[00388]  炭素鎖の伸長は、不飽和脂肪アルコールをその伸長された誘導体に変換する既知の方法により実施することが可能である。オレフィンメタセシス触媒（Olefin metastasis catalysts）を実施すれば、脂肪炭素鎖上の炭素の数を増やし、対応する不飽和産物にＺまたはＥ立体化学を分け与えることが可能になる。
【０４０５】
[00389]  一般に、反応条件下で安定であり脂肪基質（例えば、アルコール、エステル、カルボン酸、アルデヒド、またはアセテート）上の官能基とは反応しないいかなるメタセシス触媒も本開示と一緒に使用可能である。そのような触媒は、例えば、Ｇｒｕｂｂｓにより記載された触媒であり（Grubbs, R.H.,「Synthesis of large and small molecules using olefin metathesis catalysts.」PMSE Prepr., 2012年）、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。オレフィンの所望のアイソマーに応じて、シス選択的メタセシス触媒、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈａｈａｎｅら、（Shahane, S.ら、ChemCatChem, 2013年. 5(12): 3436〜3459頁）に記載された触媒の１つを使用してもよい。シス選択性を示す特定の触媒１〜５は下に示されており（スキーム１）、(Khan, R.K.,ら、J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(28): p. 10258-61; Hartung, J. ら、J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(28): p. 10183-5.; Rosebrugh, L.E.,ら、J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(4): p. 1276-9.; Marx, V.M.,ら、J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(1): p. 94-7.; Herbert, M.B.,ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2013. 52(1): p. 310-4; Keitz, B.K., ら、J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(4): p. 2040-3.; Keitz, B.K.,ら、J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(1): p. 693-9.; Endo, K.ら、J. Am. Chem. Soc., 2011. 133(22): p. 8525-7)に既に記載されている。
【０４０６】
【化１】
2020124206.tif 000054
【０４０７】
[00390]  追加のＺ選択性触媒は（Cannon and Grubbs 2013年; Bronnerら、 2014年; Hartungら、2014年; Pribiskoら、2014年; Quigley and Grubbs 2014年）に記載されており、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その優れた安定性および官能基耐性のせいで、一部の実施形態では、メタセシス触媒は中性ルテニウムまたはオスミウム金属カルベン錯体を含むがこれらに限定されず、これらの錯体は形式的には＋２酸化状態である金属中心を有し、電子数１６を有し、五配位であり、一般式ＬＬ’ＡＡ’Ｍ＝ＣＲｂＲｃまたはＬＬ’ＡＡ’Ｍ＝(Ｃ＝)ｎＣＲｂＲｃ（Pederson and Grubbs 2002年）であり；
Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；
ＬおよびＬ’はそれぞれ独立して任意の中性電子供与体配位子であり、ホスフィン、スルホン化ホスフィン、亜リン酸エステル、亜ホスフィン酸エステル、亜ホスホン酸エステル、アルシン、輝安鉱、エーテル、アミン、アミド、イミン、スルホキシド、カルボキシル、ニトロシル、ピリジン、チオエーテル、または複素環式カルベンから選択され；
ＡおよびＡ’は、ハロゲン、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシド、アリールオキシド、Ｃ２〜Ｃ２０アルコキシカルボニル、アリールカルボン酸塩、Ｃ１〜Ｃ２０カルボン酸塩、アリールスルホニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルフィニルから独立して選択されるアニオン配位子であり、それぞれの配位子は任意選択によりＣ１〜Ｃ５アルキル、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシで；または任意選択によりハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ５アルコキシで置換されているフェニル基で置換されており；ＡおよびＡ’は共に任意選択により二座配位子を含んでいてもよく；
ＲｂおよびＲｃは、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ２０カルボン酸塩、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルホニルおよびＣ１〜Ｃ２０アルキルスルフィニルから独立して選択され、ＲｂおよびＲｃのそれぞれは任意選択によりＣ１〜Ｃ５アルキル、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシでまたは任意選択によりハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ５アルコキシで置換されているフェニル基で置換されている。
【０４０８】
[00391]  「はっきり定義された触媒」などの他のメタセシス触媒も使用することが可能である。そのような触媒は、Ｇｒｕｂｂｓら、（Tetrahedron 1998年, 54: 4413〜4450頁）により記載されているシュロックモリブデンメタセシス触媒、２，６−ジイソプロピルフェニルイミドネオフィリデンモリブデン（VI）ビス（ヘキサフロロ−ｔ−ブトキシド）およびCouturier, J. L.ら（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992年, 31: 628頁）により記載されているバセータングステンメタセシス触媒を含むがこれらに限定されない。
【０４０９】
[00392]  本開示の方法において有用である触媒は、Peryshkov,ら、J. Am. Chem. Soc. 2011年, 133: 20754〜20757頁; Wang,ら、Angewandte Chemie, 2013年, 52: 1939〜1943頁; Yu,ら、J. Am. Chem. Soc., 2012年, 134: 2788〜2799頁; Halford. Chem. Eng. News, 2011年, 89 (45): 11頁; Yu,ら、Nature, 2011年, 479: 88〜93頁; Lee. Nature, 2011年, 471: 452〜453頁; Meek,ら、Nature, 2011年: 471, 461〜466頁; Flook,ら、J. Am. Chem. Soc. 2011年, 133: 1784〜1786頁; Zhao,ら、Org Lett., 2011年, 13(4): 784〜787頁; Ondi,ら、“High activity, stabilized formulations, efficient synthesis and industrial use of Mo- and W-based metathesis catalysts” XiMo Technology Updates, 2015年: http://www.ximo-inc.com/files/ximo/uploads/ download/Summary _3.11.15.pdf; Schrock,ら、Macromolecules, 2010年: 43, 7515〜7522頁; Peryshkov,ら、Organometallics 2013年: 32, 5256〜5259頁; Gerber,ら、Organometallics 2013年: 32, 5573〜5580頁; Marinescu,ら、Organometallics 2012年: 31, 6336〜6343頁; Wang,ら、Angew. Chem. Int. Ed. 2013年: 52, 1939〜1943頁; Wang,ら、Chem. Eur. J. 2013年: 19, 2726〜2740頁; and Townsendら、J. Am. Chem. Soc. 2012年: 134, 11334〜11337頁により記載される触媒も含む。
【０４１０】
[00393]  本開示の方法において有用である触媒は、国際公開WO２０１４／１５５１８５号；国際公開WO２０１４／１７２５３４号；米国特許出願公開第２０１４／０３３００１８号；国際公開WO２０１５／００３８１５号；国際公開WO２０１５／００３８１４号に記載される触媒も含む。
【０４１１】
[00394]  本開示の方法において有用である触媒は、米国特許第４，２３１，９４７号；米国特許第４，２４５，１３１号；米国特許第４，４２７，５９５号；米国特許第４，６８１，９５６号；米国特許第４，７２７，２１５号；国際公開ＷＯ１９９１／００９８２５号；米国特許第５，０８７７，１０号；米国特許第５，１４２，０７３号；米国特許第５，１４６，０３３号；国際公開ＷＯ１９９２／０１９６３１号；米国特許第６，１２１，４７３号；米国特許第６，３４６，６５２号；米国特許第８，９８７，５３１号；米国特許出願公開第２００８／０１１９６７８号；国際公開ＷＯ２００８／０６６７５４号；国際公開ＷＯ２００９／０９４２０１号；米国特許出願公開第２０１１／００１５４３０号；米国特許出願公開第２０１１／００６５９１５号；米国特許出願公開第２０１１／００７７４２１号；国際公開ＷＯ２０１１／０４０９６３号；国際公開ＷＯ２０１１／０９７６４２号；米国特許出願公開第２０１１／０２３７８１５号；米国特許出願公開第２０１２／０３０２７１０号；国際公開ＷＯ２０１２／１６７１７１号；米国特許出願公開第２０１２／０３２３０００号；米国特許出願公開第２０１３／０１１６４３４号；国際公開ＷＯ２０１３／０７０７２５号；米国特許出願公開第２０１３／０２７４４８２号；米国特許出願公開第２０１３／０２８１７０６号；国際公開ＷＯ２０１４／１３９６７９号；国際公開ＷＯ２０１４／１６９０１４号；米国特許出願公開第２０１４／０３３００１８号；および米国特許出願公開第２０１４／０３７８６３７号に記載される触媒も含む。
【０４１２】
[00395]  本開示の方法において有用である触媒は、国際公開ＷＯ２００７／０７５４２７号；米国特許出願公開第２００７／０２８２１４８号；国際公開ＷＯ２００９／１２６８３１号；国際公開ＷＯ２０１１／０６９１３４号；米国特許出願公開第２０１２／０１２３１３３号；米国特許出願公開第２０１３／０２６１３１２号；米国特許出願公開第２０１３／０２９６５１１号；国際公開ＷＯ２０１４／１３４３３３および米国特許出願公開第２０１５／００１８５５７号に記載される触媒も含む。
【０４１３】
[00396]  本開示の方法において有用である触媒は、以下の表に記載される触媒も含む。
【０４１４】
【表８−１】
2020124206.tif 000055
【０４１５】
【表８−２】
2020124206.tif 000056
【０４１６】
【表８−３】
2020124206.tif 000057
【０４１７】
【表８−４】
2020124206.tif 000058
【０４１８】
【表８−５】
2020124206.tif 000059
【０４１９】
【表８−６】
2020124206.tif 000060
【０４２０】
[00397]  本開示の方法において有用である触媒は、米国特許出願公開第２００８／０００９５９８号；米国特許出願公開第２００８／０２０７９１１号；米国特許出願公開第２００８／０２７５２４７号；米国特許出願公開第２０１１／００４００９９号；米国特許出願公開第２０１１／０２８２０６８号；および米国特許出願公開第２０１５／００３８７２３号に記載される触媒も含む。
【０４２１】
[00398]  本開示の方法において有用である触媒は、国際公開ＷＯ２００７／１４０９５４号；米国特許出願公開第２００８／０２２１３４５号；国際公開ＷＯ２０１０／０３７５５０号；米国特許出願公開第２０１０／００８７６４４号；米国特許出願公開第２０１０／０１１３７９５号；米国特許出願公開第２０１０／０１７４０６８号；国際公開ＷＯ２０１１／０９１９８０号；国際公開ＷＯ２０１２／１６８１８３号；米国特許出願公開第２０１３／００７９５１５号；米国特許出願公開第２０１３／０１４４０６０号；米国特許出願公開第２０１３／０２１１０９６号；国際公開ＷＯ２０１３／１３５７７６号；国際公開ＷＯ２０１４／００１２９１号；国際公開ＷＯ２０１４／０６７７６７号；米国特許出願公開第２０１４／０１７１６０７号；および米国特許出願公開第２０１５／００４５５５８号に記載される触媒を含む。
【０４２２】
[00399]  触媒は典型的には反応混合物において準化学量論的な量（例えば、触媒量）で提供される。ある特定の実施形態では、その量は、どの試薬が化学量論的に過剰であるかに応じて、化学反応の限定試薬に関して約０．００１〜約５０モル％の範囲である。一部の実施形態では、触媒は限定試薬と比べて約４０モル％以下で存在する。一部の実施形態では、触媒は限定試薬と比べて約３０モル％以下で存在する。一部の実施形態では、触媒は限定試薬と比べて、約２０モル％未満、約１０モル％未満、約５モル％未満、約２．５モル％未満、約１モル％未満、約０．５モル％未満、約０．１モル％未満、約０．０１５モル％未満、約０．０１モル％未満、約０．００１５モル％未満、またはそれよりも少なく存在する。一部の実施形態では、触媒は限定試薬と比べて、約２．５モル％〜約５モル％の範囲で存在している。一部の実施形態では、反応混合物は約０．５モル％触媒を含有する。触媒錯体の分子式が１つよりも多い金属を含む場合には、反応で使用される触媒錯体の量はそれに合うように調整してよい。
【０４２３】
[00400]  一部の場合には、本明細書に記載される方法は溶媒（例えば、ニート）の非存在下で実施することが可能である。一部の場合には、方法は１つまたは複数の溶媒の使用を含むことが可能である。本開示で使用するのに適し得る溶媒の例は、ベンゼン、ｐ−クレゾール、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、グリコール、ジエチルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、クロロヘキサン、ペンタン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジオキサン、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、酢酸エチル、ピリジン、トリエチルアミン、ピコリン等、ならびにその混合物を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、溶媒はベンゼン、トルエン、ペンタン、塩化メチレン、およびＴＨＦから選択される。ある特定の実施形態では、溶媒はベンゼンである。
【０４２４】
[00401]  一部の実施形態では、方法は減圧下で実施される。これは、メタセシス反応が進行中にエチレンなどの揮発性副産物が生成されることがある場合には有利となることがある。例えば、反応容器からエチレン副産物を取り除くとメタセシス反応の平衡を所望の産物の形成のほうに有利に移動させ得る。一部の実施形態では、方法は約７６０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約７００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約６５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約６００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約５５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約５００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約４５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約４００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約３５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約３００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約２５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約２００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１００未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約９０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約８０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約７０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約６０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約５０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約４０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約３０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約２０未満トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約２０トルの圧力で実施される。
【０４２５】
[00402]  一部の実施形態では、方法は約１９トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１８トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１７トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１６トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１５トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１４トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１３トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１２トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１１トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１０トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１０トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約９トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約８トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約７トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約６トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約５トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約４トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約３トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約２トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、方法は約１トル未満の圧力で実施される。
【０４２６】
[00403]  一部の実施形態では、２つのメタセシス反応物は等モル量で存在する。一部の実施形態では、２つのメタセシス反応物は等モル量では存在しない。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約１０対１のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約７対１のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約５対１のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約２対１のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約１対１０のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約１対７のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約１対５のモル比で存在する。ある特定の実施形態では、２つの反応物は約１対２のモル比で存在する。
【０４２７】
[00404]  一般に、本明細書に開示されるメタセシス触媒の多くを用いた反応は１５％よりもよい、５０％よりもよい、７５％よりもよい、または９０％よりもよい収率を提供する。さらに、反応物と生成物は、沸点が少なくとも５℃差、２０℃よりも大きな差、または４０℃よりも大きな差を提供するように選択される。さらに、メタセシス触媒の使用により副生生物よりもはるかに速い生成物形成が可能になり、これらの反応を現実的に可能な範囲で速やかに実行するのが望ましい。特に、反応は約２４時間未満、１２時間未満、８時間未満、または４時間未満で実施される。
【０４２８】
[00405]  当業者であれば、時間、温度および溶媒は互いに依存することがあり、本開示の方法ではピレスロイド生成物および中間体を調製するためには１つを変化させるとその他も変化させる必要があり得ることを認識するであろう。メタセシス工程は多様な温度および時間で進行することが可能である。一般に、本開示の方法での反応は数分〜数日の反応時間を使用して行われる。例えば、約１２時間〜約７日間までの反応時間を使用することが可能である。一部の実施形態では、１〜５日間の反応時間を使用することが可能である。一部の実施形態では、約１０分〜約１０時間までの反応時間を使用することが可能である。一般に、本開示の方法での反応は約０℃〜約２００℃までの温度で行われる。例えば、反応は１５〜１００℃で行なうことが可能である。一部の実施形態では、反応は２０〜８０℃で行なうことが可能である。一部の実施形態では、反応は１００〜１５０℃で行なうことが可能である。
【０４２９】
[00406]  不飽和脂肪エステルは、エステルを対応するアルデヒドまたはアルコールに選択的に還元するが二重結合は還元しない適切な還元剤を使用して還元することが可能である。不飽和脂肪エステルは水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）またはＶｉｔｒｉｄｅ（登録商標）を使用して対応する不飽和脂肪アルデヒドに還元することが可能である。不飽和脂肪アルデヒドは、例えば、ＤＩＢＡＬまたはＶｉｔｒｉｄｅ（登録商標）で対応する脂肪アルコールに還元することが可能である。一部の実施形態では、不飽和脂肪エステルはＡＩＨ３または９−ボラビシクロ（3.3.1）ノナン（9-BBN）を使用して対応する脂肪アルコールに還元することが可能である（Galatis, P. Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis. 2001年. New York: John Wiley & Sons; and Carey & Sunderburg. Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, 第5版. 2007年. New York. Springer Sciences.参照）。
【０４３０】
[00407]  一部の実施形態では、アルコールへの過還元なしでのアルデヒドへのエステルの部分的還元はアルデヒドの合成には有用である。部分的還元剤はリチウムジイソブチル−ｔ−ブトキシアルミニウムヒドリド（LDBBA）（Kim MSら、（2007年）Tetrahedron Lett. 48: 5061頁）およびナトリウムジイソブチル−ｔ−ブトキシアルミニウムヒドリド（SDBBA）（Song JI and An DK（2007年）Chem. Lett. 36: 886頁）を含む。二級アミン（例えば、モルフォリン、Ｎ−メチルピペラジン、またはピロリジン）のＲｅｄ−Ａｌ（ナトリウムビス［２−メトキシエトキシ］アルミニウムヒドリド）誘導体はエステルまたはジエステルの部分的還元に使用することが可能である。ある特定の実施形態では、還元剤は、不飽和脂肪エステルの脂肪アルデヒドへの選択的還元を可能にするバルキーな環状窒素ルイス塩基を含む。一部の実施形態では、改変Ｒｅｄ−Ａｌは、市販のＲｅｄ−Ａｌをシス−２，６−ジメチルモルフォリンと反応させることにより調製される（Shin WKら、（2014年）Bull. Korean Chem. Soc. 35: 2169頁）。
【０４３１】
[00408]  エステルの対応するアルコールへの還元は遷移金属触媒を使用する水素化分解を通じても達成することが可能である。均一な水素化分解触媒の例は、その全体が本明細書に組み込まれる、Goussevら、（ＵＳ  ２０１６００２３２００  Ａ１）により記載されている第ＶＩＩＩ族触媒を含むがこれに限定されない。
【０４３２】
[00409]  Goussevら、により開示されている触媒またはプレ触媒は式ＩＶまたはＶの遷移金属錯体の形態が可能であり、
Ｍ（ＰＷＮＮ）ＸｋＹ  （ＩＶ）
Ｍ（ＰＷＮＷＰ）ＸｋＹ  （Ｖ）
Ｍは遷移金属であり；
それぞれのＸは同時にまたは独立して水素もしくハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５アルキルラジカル、ヒドロキシル基、またはＣ１〜Ｃ７アルコキシラジカルを表し；
ＹはＣＯ、ＮＯ、カルベン、イソニトリル、ニトリル、亜リン酸エステル、亜ホスフィン酸エステル、またはＰＭｅ３、ＰＰｈ３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｉＰｒ）３などのホスフィンであり；
ｋは整数１または２であり；
ＰＷＮＮおよびＰＷＮＷＰは式Ａにより表される配位子であり、
【０４３３】
【化２】
2020124206.tif 000061
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立してＨ、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ８〜Ｃ１２アルキルなどの）、置換もしくは非置換環状Ｃ３〜Ｃ１２アルキル（環状Ｃ３〜Ｃ８アルキルまたは環状Ｃ８〜Ｃ１２アルキル）、置換もしくは非置換Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル（Ｃ３〜Ｃ８アルケニルまたはＣ８〜Ｃ１２アルケニル）、または置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基、またはこれらの化合物が結合している原子と一緒にすると、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４基のうちの任意の２つは任意選択による置換飽和もしく部分的飽和シクロアルキル、または任意選択によるアリールもしくはヘテロアリールを形成し；
Ｗは酸素原子またはＮＨ基であり；
Ｗ’は酸素または窒素原子であり；
破線は存在していて二重結合の１つの結合の存在を表す、または存在しておらず；
Ｒは存在していない、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ８〜Ｃ１２アルキルなどの）、置換もしくは非置換環状Ｃ３〜Ｃ１２アルキル（環状Ｃ３〜Ｃ８アルキルまたは環状Ｃ８〜Ｃ１２アルキルなどの）、置換もしくは非置換Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル（Ｃ３〜Ｃ８アルケニルまたはＣ８〜Ｃ１２アルケニルなどの）、または置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基であり；
Ｒ’はＨ、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ８〜Ｃ１２アルキルなどの）、置換もしくは非置換環状Ｃ３〜Ｃ１２アルキル（環状Ｃ３〜Ｃ８アルキルまたは環状Ｃ８〜Ｃ１２アルキルなどの）、置換もしくは非置換Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル（Ｃ３〜Ｃ８アルケニルまたはＣ８〜Ｃ１２アルケニルなどの）、または置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基、ＰＲ２またはＲ５およびこれらの化合物が結合している原子と一緒にすると、置換もしくは非置換ヘテロアリール（この非限定的例はピリジル、フラニル、イミダゾリル、ピラゾリルまたはオキサゾリル）を形成し；
ｎおよびｍはそれぞれ独立して整数１または２であり；
ＰＷＮＮ配位子では、Ｗは窒素原子であり、ＰＷＮＷＰ配位子ではＷは酸素または窒素原子であり、Ｒ’はＰＲ２であり；
式ＩＶまたはＶの金属錯体は中性であるまたはカチオン性である。
【０４３４】
[00410]  Goussevら、（ＵＳ  ２０１６００２３２００  Ａ１）により開示されている触媒の他の実施形態も本出願に包含される。
【０４３５】
[00411]  エステルの対応するアルコールへの還元のための均一な水素化分解触媒の他の例示的な実施形態はSaudanら、（米国特許第８，１２４，８１６号)に開示されており、この文献はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４３６】
[00412]  Saudanら、により開示されているルテニウム錯体の触媒またはプレ触媒は、イオンまたは中性種の形態が可能である。本発明の実施形態に従えば、ルテニウム錯体は一般式
［Ｒｕ（Ｌ４）Ｙ２］  （１）
［Ｒｕ（Ｌ４）（Ｘ）ｎ（Ｙ）２−ｎ］（Ｚ）ｎ  （２）
が可能であり、
Ｌ４は、配位基が少なくとも１つのアミノまたはイミノ基および少なくとも１つのホスフィノ基からなる四配座配位子を表し；
それぞれのＹは、同時にまたは独立して、ＣＯ、水素もしくはハロゲン原子、ヒドロキシル基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシもしくはカルボン酸ラジカル、またはＢＨ４もしくはＡＬＨ４基も表し；
ＸはＣ３〜Ｃ３０モノホスフィンまたは溶媒を表し；
Ｚは非配位性アニオンを表し；
ｎは０、１または２である。
【０４３７】
特に、Ｌ４は、配位基が２つのアミノまたはイミノ基および２つのホスフィノ基からなる、Ｃ８〜Ｃ４５化合物などの四配座配位子を表し、特にアミノ基は一級（すなわち、ＮＨ２）または二級（すなわち、ＮＨ）アミノ基である。
【０４３８】
本発明の特定の実施形態では、式（１）または（２）において、それぞれのＹは、同時にまたは独立して、水素もしくは塩素原子、ヒドロキシラジカル、メトキシ、エトキシもしくはイソプロポキシラジカルなどのＣ１〜Ｃ６アルコキシラジカル、またはＣＨ３ＣＯＯもしくはＣＨ３  ＣＨ２ＣＯＯラジカルなどのＣ１〜Ｃ６アシルオキシラジカルを表す。さらに好ましくは、それぞれのＹは、同時にまたは独立して、水素もしくは塩素原子、メトキシ、エトキシもしくはイソプロポキシラジカル、またはＣＨ３ＣＯＯもしくはＣＨ３  ＣＨ２ＣＯＯラジカルを表す。
【０４３９】
本発明の特定の実施形態では、式（２）において、Ｘは式ＰＲｄ３のモノホスフィンを表し、Ｒｄは任意選択により置換された直鎖状、分岐または環状アルキル、アルコキシまたはアリールオキシ基、置換または非置換フェニル、ジフェニルまたはナフチルもしくはジナフチル基などのＣ１〜Ｃ１２基である。とりわけ、Ｒｄは置換または非置換フェニル、ジフェニルまたはナフチルもしくはジナフチル基を表してもよい。
【０４４０】
Ｘは溶媒でもよく、用語「溶媒」は当技術分野での通常の意味に従って理解されなければならず、錯体の調製においてまたは本発明の過程中に希釈剤として使用される化合物を含み、非限定的例はジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アルコール（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルコール）、またはその上ＴＨＦ、アセトン、ピリジンまたはＣ３〜Ｃ８エステルまたは本発明の過程の基質である。
【０４４１】
本発明の特定の実施形態では、式（２）において、Ｚはハロゲン原子、ヒドロキシル基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ、フェノキシもしくはカルボン酸ラジカルを表す。
【０４４２】
式（１）の錯体は、一般に実際的な理由で、本発明の好ましい実施形態を表す。
【０４４３】
[00413]  Ｌ４四配座配位子の実施形態はSaudanら、に記載される通りである。Saudanら、（米国特許第８，１２４，８１６号)に開示され触媒の他の実施形態は本出願に包含される。
【０４４４】
[00414]  脂肪アルコールは酸化工程により脂肪アルデヒドに酸化することが可能である。一部の実施形態では、酸化工程は１つまたは複数の部分的酸化方法を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分的酸化方法はＮａＯＣＩ／ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）を含む。酸化は、短時間酸化を実行することによりアルデヒド段階で停止させることが可能である。代わりに、酸化は、酸化の大きな加速を引き起こす相間移動触媒を添加することによりカルボン酸段階まで進めることが可能である。米国特許第６，１２７，５７３号は、ＣａＣｌＯ３およびＮａＣｌＯを使用するＴＥＭＰＯ触媒で一級アルコールをカルボン酸に酸化する方法を記載しており、この文献はその全体が本明細書に組み込まれる。Zhaoら、Organic Synthesis, 81巻, 195頁（2005年）は、ＴＥＭＰＯおよび漂白剤により触媒される塩化ナトリウムを用いた一級アルコールのカルボン酸への酸化を記載している。
【０４４５】
[00415]  ＴＥＭＰＯ酸化では、二次オキシダントは、一次オキシダントとして機能するオキソアンモニウム塩においてＴＥＭＰＯ、または関連する安定なラジカルを変換し、アルコールを対応するアルデヒドに変換する。これによりＴＥＭＰＯラジカルに酸化されるヒドロキシルアミンが形成され、したがって、触媒サイクルが完了する。
【０４４６】
【化３】
2020124206.tif 000062
【０４４７】
[00416]  アルデヒドへの一次アルコールのＴＥＭＰＯ媒介変換でもっとも一般的な化学量論的オキシダントは、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）（Anelli’s oxidation, Anelli PLら、（1987年） J.Org.Chem. 52: 2559頁）；亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）（Zhao’s modification of Anelli’s oxidation, Zhao Mら、（1999年） J.Org.Chem. 64: 2564頁）；およびＰｈｌ（ＯＡｃ）２（oxidation of Epp and Widlanski, Epp JB and Widlanski TS（1999年） J.Org.Chem. 64: 293頁）である。使用されているがそれほど一般的ではない他の化学量論的オキシダントは、ＭＣＰＢＡ（Cella JAら、（1975年） J.Org.Chem. 40: 1860頁）；Ｃａ（ＣｌＯ）２（swimming pool bleach, Ying L and Gervay-Hague J（2003年）Carbohydr. Res. 338: 835頁）；ｔ−ＢｕＯＣｌ（Li K and Helm RF（1995年）Carbohydr. Res. 273: 249頁; Rye CS and Withers SG（2002年）J.Am.Chem.Soc. 124: 9756頁）；ＣｕＣｌ−Ｏ２（Semmelhack MFら、（1984年） J.Am.Chem.Soc. 106: 3374頁）；ＮａＢｒＯ２（Inokuchi Tら、（1990年） J.Org.Chem. 55: 462頁）；Ｃｌ２（Merbouh Nら、（2002年） J.Carbohydr. Res. 21: 65頁）；Ｂｒ２（Merbouhら、2002年）；およびトリクロロイソシアヌル酸（De Luca Lら、（2003年） J.Org.Chem. 68: 4999頁）を含む。触媒ＴＥＭＰＯの存在のもと電気化学的条件下で酸化を実施することが可能である（Schnatbaum K and Schafer HJ （1999年）Synthesis 5: 864頁）。
【０４４８】
[00417]  一部の実施形態では、４，４−ジメチルオキサゾリジン−Ｎ−オキシル（DOXYL）、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（PROXYL）および４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯおよびその誘導体などの他のジ−ｔ−アルキルニトロキシルならびにＷＯ  ９５／０７３０３に記載されるニトロキシルをＴＥＭＰＯに代わりに使用することが可能である。
【０４４９】
[00418]  他の実施形態では、酸化工程は、McCann and Stahl 2015年（McCann SD and Stahl SS（2015年）Acc. Chem. Res. 48: 1756〜1766頁）により記載される銅触媒好気性酸化を含み、この文献はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４５０】
フェロモン組成物およびその使用
[00419]  一態様では、本明細書に開示される１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法のいずれかにより生産される１つまたは複数の組成物が提供される。
【０４５１】
[00420]  本明細書に記載される組換え微生物および方法を使用して作製することができる脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、または脂肪酢酸の形態での例示的な昆虫フェロモンは、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセニルアセテート、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエナール、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエナール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン−１−オル、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエニルアセテート、（Ｚ）−３−ノネン−１−オル、（Ｚ）−５−デセン−１−オル、（Ｚ）−５−デセニルアセテート、（Ｅ）−５−デセン−１−オル、（Ｅ）−５−デセニルアセテート、（Ｚ）−７−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−７−ドデセニルアセテート、（Ｅ）−８−ドデセン−１−オル、（Ｅ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−８−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−ドデセン−１−オル、（Ｚ）−９−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセン−１−オル、（Ｚ）−１１−テトラデセン−１−オル、（Ｚ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｅ）−１１−テトラデセン−１−オル、（Ｅ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｚ）−７−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−７−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−９−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン−１−オル、（Ｚ）−１３−オクタデセン−１−オル、および（Ｚ）−１３−オクタデセナールを含むがこれらに限定されない。
【０４５２】
[00421]  上記の通り、本明細書に記載される方法を通じて作られる産物はフェロモンである。本発明の方法に従って調製されるフェロモンは昆虫防除組成物として使用するために製剤することが可能である。フェロモン組成物は、担体を含む、および／またはディスペンサーに含有することが可能である。担体は不活性液体または固体で可能であるが、これらに限定されない。
【０４５３】
[00422]  固体担体の例は、カオリン、ベントナイト、ドロマイト、炭酸カルシウム、タルク、粉末マグネシア、フラー土、ワックス、石膏、珪藻土、ゴム、プラスチック、カオリンなどの充填剤、シリカ、シリカゲル、ケイ酸、アタクレイ（attaclay）、石灰石、チョーク、黄土、粘土、ドロマイト、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、土合成材料などの鉱物土、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、チオ尿素および尿素などの肥料、シリアルミール、樹皮ミール、木粉および木の実の殻ミールなどの野菜起源の産物、セルロース粉、アタパルジャイト、モンモリロナイト、雲母、バーミキュライト、合成シリカおよび合成珪酸シリカ、またはこれらの組成物を含むがこれらに限定されない。
【０４５４】
[00423]  液体担体の例は、水；エタノール、ブタノールまたはグリコールなどのアルコール、ならびにメチルグリコールアセテートなどのそのエーテルもしくはエステル；アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、またはイソフォロンなどのケトン；ヘキサン、ペンタン、またはヘプタンなどのアルカン；キシレンまたはアルキルナフタレンなどの芳香族炭化水素；鉱物または植物油；トリクロロエタンまたは塩化メチレンなどの脂肪族塩素化炭化水素；クロロベンゼンなどの芳香族塩素化炭化水素；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはＮ−メチルピロリドンなどの水溶性または強い極性溶剤；液体ガス；蜜蝋、ラノリン、セラック蝋、カルナウバロウ、フルーツワックス（西洋ヤマモモまたはサトウキビ蝋などの）、カンデリラロウなどのワックス、微晶質、鉱物蝋、セレシン、またはモンタンなどの他のワックス；モノエタノールアミン塩、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、二リン酸水素アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素アンモニウムナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウムまたはカルバミン酸アンモニウムおよびその混合物などの塩を含むがこれらに限定されない。ベイトまたは摂食刺激物質も担体に添加することが可能である。
【０４５５】
相乗剤
[00424]  一部の実施形態では、フェロモン組成物は相乗効果が得られるように活性な化学薬剤と組み合わせる。教示されている方法により得られる相乗効果は、コルビーの式（すなわち、（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ−（Ｘ＊Ｙ／１００））に従って定量化することが可能である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Colby, R. S.「Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations」、1967年 Weeds, 15巻, 20〜22頁を参照されたい。したがって、「相乗的」により、その存在のおかげで添加量以上に所望の効果を増やす成分が意図されている。本方法のフェロモン組成物およびアジュバンドは、農業活性化合物その上農業補助化合物の有効性を相乗的に増やすことが可能である。
【０４５６】
[00425]  したがって、一部の実施形態では、フェロモン組成物は相乗剤と一緒に製剤することが可能である。本明細書で使用される用語「相乗剤」とは、少なくとも１種の昆虫を引き付けるためのフェロモン用量を低減するまたはフェロモンの有効性を増強するためにフェロモンと一緒に使用することが可能な物質のことである。相乗剤は、フェロモンが非存在下で昆虫の独立した誘引剤であってもそうでなくてもよい。
【０４５７】
[00426]  一部の実施形態では、相乗剤は少なくとも１種の鱗翅類を引き付ける揮発性植物性化学物質である。本明細書で使用される用語「植物性化学物質」とは、植物種において天然に存在する化合物を意味する。特定の実施形態では、相乗剤は、β−カリオフィレン、イソカリオフィレン、α−ムフレン、イナロール（inalool）、Ｚ３−ヘキセノール／イルアセテート、β−ファルネセン、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、およびそれらの組合せを含む群から選択される。
【０４５８】
[00427]  フェロモン組成物はフェロモンと相乗剤を混合したもしくは他の方法で組み合わせた形態で含有することが可能であり、またはフェロモン組成物はフェロモンと相乗剤を独立して非混合形態で含有してもよい。
【０４５９】
殺虫剤
[00428]  フェロモン組成物は１つまたは複数の殺虫剤を含むことが可能である。一実施形態では、殺虫剤は当業者に公知の化学殺虫剤である。化学殺虫剤の例は、
シフルトリン、ペルメトリン、シペルメトリン、ビフィントリン（bifinthrin）、フェンバレレート、フルシトリネート、アジンホスメチル、メチルパラチオン、ブプロフェジン、ピリプロキシフェン、フロニカミド、アセタミプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、アセフェート、マラチオン、キノルホス（quinolphos）、クロロピリホス（chloropyriphos）、プロフェノホス（profenophos）、ベンジオカルブ、ビフェントリン、クロルピリホス、シフルトリン、ダイアジノン、ジョチュウギク、フェンプロパスリン、キノプレン、殺虫性石鹸または油、ネオニコチノイド、ジアミド、エバーメクチンおよび誘導体、スピノサドおよび誘導体、アザジラクチン、ピリダリン、ならびにその混合物を含むがこれらに限定されない、ピレスロイドまたは有機リン殺虫剤の１つまたは複数を含む。
【０４６０】
[00429]  別の実施形態では、殺虫剤は当業者に公知の１つまたは複数の生物学的殺虫剤である。生物学的殺虫剤の例は、アザジラクチン（インドセンダン油）、天然ピレトリン由来の毒素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｃｉｓおよびＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ、ウイルス（例えば、CYD-X（商標）、CYD-X HP（商標）、Germstar（商標）、Madex HP（商標）、およびSpod-X（商標））、ペプチド（Spear-T（商標）、Spear-P（商標）、およびSpear-C（商標））を含むがこれらに限定されない。
【０４６１】
[00430]  別の実施形態では、殺虫剤は神経および筋肉を標的にする殺虫剤である。例は、カルバメート（例えば、メトミルおよびチオジカルブ）および有機リン（例えば、クロルピリホス）などのアセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤、シクロジエン有機塩素（例えば、エンドスルファン）およびフェニルピラゾール（例えば、フィプロニル）などのＧＡＢＡ作動性塩素イオンチャネルアンタゴニスト、ピレトリン（pyrethrins）およびピレスロイド（例えば、シペルメトリンおよびλ−シハロトリン）などのナトリウムチャネル調節剤、ネオニコチノイド（例えば、アセタミプリド、チアクロプリド（tiacloprid）、チアメトキサム）などのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）アゴニスト、スピノシン（例えば、スピノーズ（spinose）およびスピネトラム）などのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）アロステリック調節剤、エバーメクチンおよびミルベマイシン（例えば、アバメクチン、エマメクチン安息香酸塩）などの塩素イオンチャネル活性化剤、ベンスルタップおよびカルタップなどのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）ブロッカー、インドキサカルブおよびメタフルミゾンなどの電位依存性ナトリウムチャネルブロッカー、ジアミド（例えば、クロラントラニリプロールおよびフルベンジアミド）などのリアノジン受容体調節剤を含む。別の実施形態では、殺虫剤は呼吸を標的にする殺虫剤である。例は、クロルフェナピルおよびミトコンドリア複合体Ｉ電子伝達阻害剤などのプロトン勾配の破壊を介して酸化的リン酸化を脱共役させる化学物質を含む。
【０４６２】
[00431]  別の実施形態では、殺虫剤は中腸を標的にする殺虫剤である。例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓなどの昆虫中腸膜の微生物攪乱物質を含む。
【０４６３】
[00432]  別の実施形態では、殺虫剤は成長および発生を標的にする殺虫剤である。例は、幼若ホルモン類似物（例えば、フェノキシカルブ）などの幼若ホルモン模倣物、キチン生合成の阻害剤、ベンゾイル尿素（例えば、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、およびノバルロン）などのＴｙｐｅ０、およびジアシルヒドラジン（例えば、メトキシフェノジドおよびテブフェノジド）などのエクジソン受容体アゴニストを含む。
【０４６４】
安定化剤
[00433]  本開示の別の実施形態に従えば、フェロモン組成物は組成物の安定性を増強する１つまたは複数の添加剤を含んでもよい。添加剤の例は、例えば、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ベニバナ油、キャノーラ油、およびそれらの組合せなどの脂肪酸および植物油を含むがこれらに限定されない。
【０４６５】
充填剤
[00434]  本開示の別の実施形態に従えば、フェロモン組成物は１つまたは複数の充填剤を含んでもよい。充填剤の例は、１つまたは複数の鉱物粘土（例えば、アタパルジャイト）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、誘引組成物は１つまたは複数の有機増粘剤を含んでもよい。そのような増粘剤の例は、メチルセルロース、エチルセルロース、およびその任意の組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４６６】
溶媒
[00435]  別の実施形態に従えば、本開示のフェロモン組成物は１つまたは複数の溶媒を含むことが可能である。使用者がフェロモンコーティングをしたいと考えている基材（例えば、疑似餌）に液体組成物をブラシで塗る、浸す、ローラーで延ばす、噴霧する、または他の方法で塗布することにより適用してもよい液体組成物を使用者が用いることになる場合、溶媒を含有する組成物は望ましい。一部の実施形態では、使用される溶媒（複数可）は、フェロモン組成物の１つまたは複数の成分を可溶化する、または実質的に可溶化するように選択される。溶媒の例は、水、水性溶媒（例えば、水とエタノールの混合物）、エタノール、メタノール、塩素化炭化水素、石油系溶媒、テレピン、キシレン、およびその任意の組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４６７】
[00436]  一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は有機溶媒を含む。有機溶媒は主に乳剤、ＵＬＶ製剤、およびそれほどではないが顆粒状製剤に使用される。溶媒の混合物が使用される場合もある。一部の実施形態では、本開示は、灯油または精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン油を含む溶媒の使用を教示する。他の実施形態では、本開示は、キシレンおよびＣ９およびＣ１０芳香族溶媒のさらに高分子量画分などの芳香族溶媒の使用を教示する。一部の実施形態では、塩素化炭化水素は、製剤が水中に乳化される場合に結晶化を防ぐ共溶媒として有用である。アルコールも溶解力を増やす共溶媒として使用される場合もある。
【０４６８】
可溶化剤
[00437]  一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は可溶化剤を含む。可溶化剤は界面活性物質であり、これは臨界ミセル濃度を超える濃度で水中でミセルを形成する。次に、ミセルは、その疎水性部分内部で水不溶性物質を溶解するまたは可溶化することができる。可溶化に通常使用される界面活性物質のタイプは非イオン性物質；ソルビタンモノオレイン酸；ソルビタンモノオレイン酸エトキシレート；およびオレイン酸メチルエステルである。
【０４６９】
結合剤
[00438]  本開示の別の実施形態に従えば、フェロモン組成物は１つまたは複数の結合剤を含んでもよい。結合剤を使用すればフェロモン組成物と、前記組成物が被覆されている物質の表面との会合を促進することが可能である。一部の実施形態では、結合剤を使用すれば、添加物（例えば、殺虫剤、昆虫成長調節剤、および同類の物）のフェロモン組成物および／または物質の表面への会合を促進することが可能である。例えば、結合剤は、典型的にはペンキおよび塗料に使用される合成または天然樹脂を含むことが可能である。これらは、被覆表面が、そのコーティングの構造統合性はまだ維持しつつ、昆虫が噛み切って組成物の成分（例えば、殺虫剤、昆虫成長調節剤、および同類の物）を摂取することができるほどもろくなるように改変してもよい。
【０４７０】
[00439]  結合剤の非限定的な例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、部分的に加水分解されたポリビニルアセテート、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマーおよびポリビニルアセテート、またはこれらの組成物；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、タルクもしくはポリエチレングリコール、またはこれらの組合せなどの潤滑剤；シリコーンエマルジョン、長鎖アルコール、リン酸エステル、アセチレンジオール、脂肪酸または有機フッ素化合物などの消泡剤；ならびにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の塩、トリニトリロトリ酢酸の塩もしくはポリリン酸の塩、またはこれらの組合せなどの錯化剤を含む。
【０４７１】
[00440]  一部の実施形態では、結合剤は充填剤および／または増粘剤の役も務める。そのような結合剤の例は、シェラック、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、アルキド、ポリウレタン、亜麻仁油、きり油、およびその任意の組合せの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
【０４７２】
[00441]  一部の実施形態では、フェロモン組成物は界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は液体農業用組成物に添加される。他の実施形態では、界面活性剤は固形剤、特に適用前に担体で希釈されるように設計された固形剤に添加される。したがって、一部の実施形態では、フェロモン組成物は界面活性物質を含む。界面活性物質は、標的上でのフェロモンの生物学的性能を改良するために、単独でまたはスプレータンク混合物へのアジュバンドとしての鉱物もしくは植物油などの他の添加物と一緒に使用する場合もある。界面活性剤は性質がアニオン性でもカチオン性でも非イオン性でも可能であり、乳化剤、湿潤剤、懸濁剤として、または他の目的で用いることが可能である。一部の実施形態では、界面活性物質は、アルキルエトキシレート、直鎖状脂肪族アルコールエトキシレート、および脂肪族アミンエトキシレートなどの非イオン性物質である。製剤技術で従来使用され、本製剤で使用してもよい界面活性物質はMcCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, N.J.,1998年, and in Encyclopedia of Surfactants, Vol. I-III, Chemical Publishing Co., New York, 1980〜81年に記載されている。一部の実施形態では、本開示は、アルカリ金属、アルカリ土類金属または芳香族スルホン酸、例えば、リグノ−、フェノール−、ナフタレン−およびジブチルナフタレンスルホン酸の、ならびにアリールスルホン酸の脂肪酸の、アルキルエーテルの、ラウリルエーテルの、脂肪アルコール硫酸のおよび脂肪アルコールグリコールエーテル硫酸のアンモニウム塩、スルホン化ナフタレンおよびその誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレンまたはナフタレンスルホン酸とフェノールおよびホルムアルデヒドとの縮合物、フェノールまたはフェノールスルホン酸とホルムアルデヒドの縮合物、フェノールとホルムアルデヒドおよび亜硫酸ナトリウムとの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチル−、オクチル−もしくはノニルフェノール、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、エトキシル化ヒマシ油、エトキシル化トリアリールフェノール、リン酸化トリアリールフェノールエトキシレートの塩、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニン亜硫酸塩廃液もしくはメチルセルロース、またはこれらの組合せを含む、界面活性物質の使用を教示する。
【０４７３】
[00442]  一部の実施形態では、本開示は、ジエタノールアンモニウムラウリル硫酸などのアルキル硫酸の塩；ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩；ノニルフェノール−Ｃ１８エトキシレートなどのアルキルフェノール−アルキレンオキシド付加生成物；トリデシルアルコール−Ｃ１６エトキシレートなどのアルコール−アルキレンオキシド付加生成物；ステアリン酸ナトリウムなどの石鹸；ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルナフタレンスルホン酸塩；ジ（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートナトリウムなどのスルホサクシネート塩のジアルキルエステル；ソルビトールオレイン酸塩などのソルビトールエステル；ラウリルトリメチルアンモニウムクロリドなどの四級アミン；ステアリン酸ポリエチレングリコールなどの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル；エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー；モノおよびジアルキルリン酸エステルの塩；ダイズ油、ナタネ／キャノーラ油、オリーブ油、ヒマシ油、ヒマワリ種子油、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、キリ油および同類の物などの植物油；ならびに上記植物油のエステル、特にメチルエステルを含む、他の適切な界面活性剤を教示する。
【０４７４】
湿潤剤
[00443]  一部の実施形態では、フェロモン組成物は湿潤剤を含む。湿潤剤とは、液体に添加されると、液体とその液体が広がっている表面の間の界面張力を低減することにより、液体の拡張または浸透力を増加する物質のことである。湿潤剤は、加工および製造中に、可溶性液体または懸濁濃縮物用の濃縮物を作るために水中での粉末の湿潤速度を高める、ならびにスプレータンクまたは他の容器中で生成物と水の混合中に、浸潤性粉末のぬれ時間を低減するおよび水の水分散性顆粒中への浸透を改良するという農薬製剤における２つの主要な機能のために使用される。一部の実施形態では、湿潤性粉末、懸濁濃縮物、および水分散性顆粒製剤を含む、本開示のフェロモン組成物で使用される湿潤剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルフェノールエトキシレート、および脂肪族アルコールエトキシレートである。
【０４７５】
分散剤
[00444]  一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は分散剤を含む。分散剤とは、粒子の表面に吸着して粒子の分散状態を保存する役に立ち、粒子が再凝集するのを防ぐ物質のことである。一部の実施形態では、分散剤は本開示のフェロモン組成物に添加されて、製造中の分散および懸濁を促進し、確実に粒子がスプレータンク中で水に再分散するようにする。一部の実施形態では、分散剤は、湿潤性粉末、懸濁濃縮物、および水分散性顆粒で使用される。分散剤として使用される界面活性物質は、粒子表面に強く吸着し、粒子の再凝集に対する荷電または立体的障壁を提供する能力を有する。一部の実施形態では、もっとも一般的に使用される界面活性物質はアニオン性、非イオン性、またはその２つのタイプの混合物である。
【０４７６】
[00445]  一部の実施形態では、湿潤性粉末製剤では、もっとも一般的な分散剤はリグニンスルホン酸ナトリウムである。一部の実施形態では、懸濁濃縮物は、ナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド濃縮物などの多価電解質を使用して極めて良好な吸着および安定化を提供する。一部の実施形態では、トリスチリルフェノールエトキシル化リン酸エステルも使用される。一部の実施形態では、アルキルアリールエチレンオキシド濃縮物およびＥＯ−ＰＯブロックコポリマーなどを、懸濁濃縮物用の分散剤としてアニオン性物質と組み合わせる場合もある。
【０４７７】
ポリマー界面活性物質
[00446]  一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物はポリマー界面活性物質を含む。一部の実施形態では、ポリマー界面活性物質は非常に長い疎水性「骨格」および「コーム」型界面活性物質の「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖を有する。一部の実施形態では、これらの高分子量ポリマーは懸濁濃縮物に非常に良好な長期安定性を与えることが可能である。なぜならば、疎水性骨格は粒子表面に多くの係留点を有するからである。一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物で使用される分散剤の例は、リグニンスルホン酸ナトリウム、ナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド濃縮物、トリスチリルフェノールエトキシル化リン酸エステル、脂肪族アルコールエトキシレート、アルキルエトキシレート、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、およびグラフトコポリマーである。
【０４７８】
乳化剤
[00447]  一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は乳化剤を含む。乳化剤とは、別の液相中での１つの液相の液滴の懸濁を安定化する物質である。乳化剤がなければ、２つの液体は２つの混ざらない液相に分離すると考えられる。一部の実施形態では、もっとも一般的に使用される乳化剤ブレンドは、１２またはそれよりも多いエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノールまたは脂肪族アルコールおよびドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩を含む。８〜１８までの親水性−新油性バランス（「HLB」）値の範囲は通常、良好な安定したエマルジョンを与えることになる。一部の実施形態では、エマルジョン安定性は少量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー界面活性物質の添加により改良できる場合がある。
【０４７９】
ゲル化剤
[00448]  一部の実施形態では、フェロモン組成物はゲル化剤を含む。増粘剤又はゲル化剤は主に、液体のレオロジーまたは流れ特性を改変し、分散した粒子または液滴の分離および沈降を防ぐための懸濁濃縮物、エマルジョン、およびサスポエマルジョン（suspoemulsions）の製剤で使用される。増粘、ゲル化、および抗沈降剤は一般に２つの範疇、すなわち、水不溶性粒子および水可溶性ポリマーに分かれる。粘土およびシリカを使用して懸濁濃縮物製剤を作製することが可能である。一部の実施形態では、フェロモン組成物は、モンモリロナイト、例えば、ベントナイト；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；およびアタパルジャイトを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の増粘剤を含む。一部の実施形態では、本開示は、増粘剤として多糖の使用を教示する。もっとも一般的に使用される多糖のタイプは、種子および海藻の天然抽出物またはセルロースの合成誘導体である。一部の実施形態はキサンタンを利用し、一部の実施形態はセルロースを利用する。一部の実施形態では、本開示は、グアーガム；ローカストビーンガム；カラゲナン（carrageenam）；アルギン酸；メチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム（SCMC）；ヒドロキシエチルセルロース（HEC）を含むがこれらに限定されない増粘剤の使用を教示する。一部の実施形態では、本開示は、加工デンプン、ポリアクリル酸塩、ポリビニルアルコール、およびポリエチレンオキシドなどの他のタイプの抗沈降剤の使用を教示する。別の良好な抗沈降剤はキサンタンガムである。
【０４８０】
消泡剤
[00449]  一部の実施形態では、界面活性物質の存在は、界面張力を低下するが、製造でのおよびスプレータンクを通じた適用での混合操作中に水ベースの製剤に泡立てさせることがある。したがって、一部の実施形態では、泡立つ傾向を低減するために、生産段階中またはビン／スプレータンクに満たす前に消泡剤が添加されることが多い。一般に、２つのタイプの消泡剤、すなわち、シリコーンおよび非シリコーンがある。シリコーンは通常、ジメチルポリシロキサンの水性エマルジョンであり、非シリコーン消泡剤は、オクタノール、ノナノール、またはシリカなどの水不溶性油である。どちらの場合でも、消泡剤の機能は界面活性物質を気液界面から移動させることである。
【０４８１】
保存剤
[00450]  一部の実施形態では、フェロモン組成物は保存剤を含む。
【０４８２】
追加の活性剤
[00451]  本開示の別の実施形態によれば、フェロモン組成物は１つまたは複数の昆虫摂食刺激物質を含んでもよい。昆虫摂食刺激物質の例は、生の綿実油、フィトールの脂肪酸エステル、ゲラニルゲラニオールの脂肪酸エステル、他の植物アルコールの脂肪酸エステル、植物抽出物、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４８３】
[00452]  本開示の別の実施形態によれば、フェロモン組成物は１つまたは複数の昆虫成長調節剤（「IGR」）を含んでもよい。ＩＧＲは、昆虫の成長を変化させ奇形の昆虫を生じるのに使用してもよい。昆虫成長調節剤の例は、例えば、デミリン（dimilin）を含む。
【０４８４】
[00453]  本開示の別の実施形態によれば、誘引剤組成物は、捕捉された昆虫を不妊にするまたは他の方法で昆虫の生殖能を遮断し、それによって次世代の個体数を低減する１つまたは複数の昆虫不妊剤を含んでもよい。一部の状況では、不妊昆虫に生き延びさせ、交尾相手を巡って捕捉されていない昆虫と競合させれば昆虫を即死させるよりも効果が大きい。
【０４８５】
噴霧可能組成物
[00454]  一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は噴霧可能組成物（すなわち、噴霧可能フェロモン組成物）として製剤することが可能である。水性溶媒、例えば、水または水とアルコール、グリコール、ケトン、もしくは他の水混和性溶媒の混合物を噴霧可能組成物で使用することが可能である。一部の実施形態では、そのような混合物の水含有量は少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。一部の実施形態では、噴霧可能組成物は濃縮物、すなわち、水性溶媒中のフェロモンおよび他の添加物（例えば、ろう質物、安定化剤、および同類の物）の濃縮懸濁液であり、溶媒（例えば、水）の添加により最終使用濃度に希釈することが可能である。
【０４８６】
[00455]  一部の実施形態では、ろう質物は噴霧可能組成物においてフェロモンおよびその位置異性体用の担体として使用することが可能である。ろう質物は、例えば、蜜蝋、カルナウバ蝋、および同類の物などの生分解性ワックス、カンデリラ蝋（炭化水素蝋）、モンタン蝋、シェラックおよび類似の蝋、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸またはステアリン酸などの飽和または不飽和脂肪酸、脂肪酸アミドおよびエステル、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル脂肪酸エステルなどのヒドロキシル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ならびにポリアルキレンコハク酸塩などの低分子量ポリエステルが可能である。
【０４８７】
[00456]  一部の実施形態では、安定化剤を噴霧可能フェロモン組成物と一緒に使用することが可能である。安定化剤を使用すれば、濃縮物の粒子サイズを調節できおよび／またはフェロモン組成物の安定な懸濁液の調製が可能になる。一部の実施形態では、安定化剤はヒドロキシルおよび／またはエトキシル化ポリマーから選択される。例は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドポリマー、デンプン、マルトデキストリンおよび他の可溶性炭水化物またはそのエーテルもしくはエステルを含む多価アルコール、セルロースエーテル、ゼラチン、ポリアクリル酸ならびにその塩および部分的エステル並びに同類の物を含む。他の実施形態では、安定化剤は、部分的に加水分解されたポリビニル酢酸などのポリビニルアルコールおよびそのコポリマーを含むことが可能である。安定化剤は、粒子サイズを調節しおよび／または安定な懸濁液を調製するのに十分なレベルで、例えば、水溶液の０．１％〜１５％の間で使用してもよい。
【０４８８】
[00457]  一部の実施形態では、結合剤を噴霧可能フェロモン組成物と一緒に使用することが可能である。一部の実施形態では、結合剤は、分散液をさらに安定化しおよび／または標的位置（例えば、罠、疑似餌、植物、および同類の物）への噴霧された分散液の付着を改良するように作用することが可能である。結合剤は、アルギン酸などの多糖、セルロース誘導体（アセテート、アルキル、カルボキシメチル、ヒドロキシアルキル）、デンプンまたはデンプン誘導体、デキストリン、ガム（アラビア、ガウア、イナゴマメ、トラガカント、カラゲナン、および同類の物）、サクロース、および同類の物が可能である。結合剤は、ポリビニルピロリドンなどの非炭水化物水溶性ポリマー、または酸および／もしくは塩の形態でのポリアクリル酸もしくはポリメタクリル酸などのアクリルポリマー、またはそのようなポリマーの混合物も可能である。
【０４８９】
マイクロカプセル化フェロモン
[00458]  一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は、Ill’lchev, ALら、J. Econ. Entomol. 2006年;99(6):2048〜54頁; and Stelinki, LLら、J. Econ. Entomol. 2007年;100(4):1360〜9頁に開示されるようなマイクロカプセル化フェロモンとして製剤することが可能である。マイクロカプセル化フェロモン（MEC）はポリマーカプセル内に封入された小滴のフェロモンのことである。カプセルは、周囲の環境へのフェロモンの放出速度を制御し、スプレー殺虫剤で使用されるのと同じ方法で適用できるほど小さい。マイクロカプセル化フェロモン製剤の効果的なフィールド耐用時間は、なかんずく、気候条件、カプセルサイズおよび化学的特性に応じて、数日から１週間をわずかに超えるまでの範囲が可能である。
【０４９０】
徐放性製剤
[00459]  フェロモン組成物は大気中への徐放を提供するようにおよび／または放出に続く分解から保護されるように製剤することが可能である。例えば、フェロモン組成物は、マイクロカプセル、生分解性フレークおよびパラフィンワックスをベースとするマトリックスなどの担体に含むことが可能である。代わりに、フェロモン組成物は徐放噴霧可能物として製剤することが可能である。
【０４９１】
[00460]  ある特定の実施形態では、フェロモン組成物は、当業者に公知である１つまたは複数の高分子剤を含んでもよい。高分子剤は環境への組成物の放出速度を制御することができる。一部の実施形態では、高分子誘引剤組成物は環境条件に影響されない。高分子剤は、組成物を環境に持続した様式で放出させられる持続性放出剤であってもよい。
【０４９２】
[00461]  高分子剤の例は、セルロース、カゼインなどのタンパク質、フッ化炭素ベースのポリマー、水素化ロジン、リグニン、メラミン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート（PVAC）などのビニルポリマー、ポリカーボネート、ポリビニリデンジニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリアミドアルデヒド、ポリビニルアルデヒド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリビニリデン、シリコーン、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。セルロースの例は、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースプロピオネート、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４９３】
[00462]  徐放または持続性放出製剤で使用することが可能である他の薬剤は、脂肪酸エステル（セバシン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはアラキジン酸エステルなどの）または脂肪アルコール（ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、トリデセノール、テトラデカノール、テトラデセノール、テトラデカジエノール（tetradecadienol）、ペンタデカノール、ペンタデセノール、ヘキサデカノール、ヘキサデセノール、ヘキサデカジエノール（hexadecadienol）、オクタデセノールおよびオクタデカジエノール（octadecadienol））を含む。
【０４９４】
[00463]  本発明の方法に従って調製されるフェロモン、ならびにフェロモンを含有する組成物を使用すれば、種々の環境において昆虫の行動および／または成長を制御することが可能である。フェロモンを使用すれば、例えば、雄または雌昆虫を、特定の標的領域にまたはから引き付けるまたは追い払うことが可能である。フェロモンを使用すれば、攻撃されやすい作物域から昆虫を引き離すことが可能である。フェロモンを使用すれば、例えば、昆虫監視、大量捕獲、疑似餌／誘引殺虫または交信攪乱のための戦略の一部として昆虫を引き付けることが可能である。
【０４９５】
疑似餌
[00464]  本開示のフェロモン組成物は、疑似餌上に被覆するもしくは噴霧してもよい、または疑似餌にフェロモン組成物を他の方法で染み込ませてもよい。
【０４９６】
罠
[00465]  本開示のフェロモン組成物は、任意の昆虫種、例えば、鱗翅目の昆虫を引き付けるのに一般的に使用されている罠などの罠で使用してもよい。そのような罠は当業者には周知であり、多くの州および国で昆虫根絶計画に一般的に使用されている。一実施形態では、罠は、フェロモン組成物を保持するための１つまたは複数の隔壁、容器、または貯蔵容器を含む。したがって、一部の実施形態では、本開示は少なくとも１つのフェロモン組成物が充填された罠を提供する。したがって、本開示のフェロモン組成物を罠で使用すれば、例えば、昆虫監視、大量捕獲、交信攪乱、または、例えば、罠の中に毒性物質を組み込んで、捕獲した昆虫を死滅させることによる疑似餌／誘引殺虫のための戦略の一部として昆虫を引き付けることが可能である。
【０４９７】
[00466]  大量捕獲は、作物が損害を受ける前に高い割合の昆虫が取り除かれるように、保護される作物中に高密度に罠を置くことを含む。疑似餌／誘引殺虫技法は、昆虫が引き付けられたのち、殺滅剤にさらされる以外は類似している。殺滅剤が殺虫剤である場合、ディスペンサーは、昆虫を誘って有効量の殺虫剤を摂食させる囮のエサまたは摂食刺激物質も含有することが可能である。殺虫剤は当業者に公知である殺虫剤でもよい。殺虫剤は誘引剤組成物と混合してもよく、または罠の中に別々に存在していてもよい。混合物は、昆虫を引き付けて死滅させるという二重の機能を果たしてもよい。
【０４９８】
[00467]  そのような罠はいかなる適切な形態でもとることができ、殺滅罠は必ずしも毒性物質を組み込む必要はなく、昆虫は任意選択により、溺死または感電死などの他の手段により死滅される。代わりに、罠は昆虫を、後に昆虫を死滅させる真菌またはウイルスで汚染することが可能である。昆虫が死滅されない場合でも、罠は、繁殖を防ぐために雌昆虫の地域から雄昆虫を取り除くのに役立つことが可能である。
【０４９９】
[00468]  多様な異なる罠が可能であることは当業者であれば認識するであろう。そのような罠の適切な例は、水トラップ、粘着トラップ、および一方向トラップを含む。粘着トラップは多くの種類がある。粘着トラップの一例は、段ボール建造物で、三角形またはくさび形の断面を有し、その内側表面は不乾性粘着物質で被覆されている。昆虫は粘着表面に接触して捕捉される。水トラップは、昆虫を捕えるのに使用される水と洗剤の皿を含む。洗剤は水の表面張力を破壊し、皿に引き付けられる昆虫を水に溺れさせる。一方向トラップは昆虫が罠に入るのを許すが、出て行くのを妨げる。本開示の罠は、昆虫をさらに引き付けるために鮮やかな色を塗ることが可能である。
【０５００】
[00469]  一部の実施形態では、組成物を含有するフェロモントラップは他の種類のトラッピング機構と組み合わせてもよい。例えば、フェロモン組成物に加えて、罠は、蛾を引き付けるための１つもしくは複数の開花灯、１つもしくは複数の粘着基材および／または１つもしくは複数の着色表面を含んでもよい。他の実施形態では、組成物を含有するフェロモントラップは他の種類のトラッピング機構がなくてもよい。
【０５０１】
[00470]  罠は野に１年のいかなる時期に設置してもよい。当業者であれば特定の罠で使用する組成物の適量を容易に決定することが可能であり、保護するべき農地のエーカーあたりの罠の適切な密集度を決定することも可能である。
【０５０２】
[00471]  罠は、昆虫がはびこる（または潜在的にはびこる）場所に配置することが可能である。一般に、罠は樹木または植物に接してまたはその近くに置かれる。フェロモンの匂いが昆虫を罠に引き付ける。次に、昆虫は捕捉され、罠内で動かなくされるおよび／または、例えば、罠に存在する殺滅剤により死滅される。
【０５０３】
[00472]  罠は、雄が雌の位置をどうしても突き止めることができないように、雌が放つフェロモンを圧倒するよう果樹園の内部に設置してもよい。この点に関して、罠は、簡単な装置、例えば、フェロモンを分配する保護された芯にすぎないことが必要である。
【０５０４】
[00473]  本開示の罠は既成の形態で提供してもよく、その場合、本開示の化合物は既に適用されている。そのような例では、化合物の半減期に応じて、化合物は露出させてもよく、または、他の芳香ディスペンサーでは標準であるように、従来の様式で密封してもよく、シールは罠が所定の位置に置かれた後にはじめて外される。
【０５０５】
[00474]  代わりに、罠は別々に販売されており、本開示の化合物は、罠が所定の位置に置かれた後にある量が罠に適用されるように、分配可能な方式で提供されてもよい。したがって、本開示は化合物を小袋または他のディスペンサーで提供してもよい。
【０５０６】
ディスペンサー
[00475]  フェロモン組成物は、特定の環境での組成物の放出用のディスペンサーと併せて使用することが可能である。当技術分野で公知のいかなる適切なディスペンサーでも使用可能である。そのようなディスペンサーの例は、エアゾールエミッター、手作業用ディスペンサー、それを通じてフェロモンがゆっくり放出される浸透性バリアー、フェロモン組成物を染み込ませているゴム、プラスチック、皮、綿、生綿、木材または木材製品で構成されているパッド、ビーズ、チューブロッド、らせん形または球状のもの付きの貯水槽を備えたバブルキャップを含むがこれらに限定されない。例えば、フェロモン組成物が蒸発していく塩化ポリビニル製積層板、ペレット、顆粒、ロープもしくはらせん状のものまたはゴム隔壁。当業者であれば、所望の適用、貯蔵、輸送または取扱い様式に適した担体および／またはディスペンサーを選択することができる。
【０５０７】
[00476]  別の実施形態では、雄昆虫をフェロモン物質そのものを含有する粉末で汚染する装置を使用してもよい。次に、汚染された雄は飛び去って、大気にフェロモン物質を広めることにより、または他の雄を本物の雌ではなく汚染された雄に引き付けることにより、交信攪乱の供給源を提供する。
【０５０８】
行動変容
[00477]  本明細書に開示される方法に従って調製されるフェロモン組成物を使用すれば、昆虫の行動を制御するまたは調節することが可能である。一部の実施形態では、なかんずく、昆虫が特定の場所に引き付けられるが前記場所には接触しないまたは昆虫が前記場所に実際に接触するように、組成物中のフェロモン対位置異性体の比を変化させることにより、標的昆虫の行動を、調整できる様式で調節することが可能である。したがって、一部の実施形態では、フェロモンを使用すれば、攻撃されやすい作物域から昆虫を引き離すことが可能である。したがって、本開示は昆虫を場所に引き付けるための方法も提供する。この方法は、フェロモン組成物の有効量を場所に与えることを含む。
【０５０９】
[00478]  交信攪乱の方法は、補足された昆虫の総数または量を定期的に監視することを含んでもよい。監視は、例えば、毎日、毎週、２週間ごとに、毎月、３か月に１回、または監視者が選択する任意の他の期間などの所定の期間補足された昆虫の数を計測することにより実施してもよい。補足された昆虫のそのような監視は、その特定の期間中の昆虫の個体数を推定するのに役に立ち、それによって、統合された有害種管理システムでの防除の特定のタイプおよび／または用量を決定するのに役立つことができる。例えば、高い昆虫個体数が発見されれば、昆虫の除去のための方法の使用が必要になることがある。新しい生息場所での来襲の早期警戒により、個体数が手に負えなくなる前に措置を講じることが可能になる。反対に、発見される昆虫の個体数が少なければ、個体数を監視し続けるだけで十分であるという決定を下せる。昆虫の個体数は、それがある特定の閾値に到達したときだけ制御されるように定期的に監視することが可能である。これにより、昆虫の費用効果のある制御が提供され、殺虫剤の使用の環境への影響が低減される。
【０５１０】
交信攪乱
[00479]  本開示の方法に従って調製されるフェロモンを使用すれば、交配を攪乱することも可能である。交信攪乱は、昆虫を混乱させ、交尾相手の所在／求愛行動を攪乱し、それによって交尾を妨げ生殖周期を遮断する人工刺激物（例えば、本明細書で開示されるフェロモン組成物）を導入することにより害虫を制御するように設計された害虫管理技法である。
【０５１１】
[00480]  鱗翅目の種などの農業にとり目的の多くの昆虫種では、雌は、その種の性フェロモンを構成する特定の化学ブレンドの空中臭跡を放つ。この空中臭跡はフェロモンプルームと呼ばれる。その種の雄はフェロモンプルームに含有される情報を使用して臭いを放つ雌（「呼出し（calling）」雌として知られる）の位置を突き止める。交信攪乱は、合成フェロモンを昆虫の生息地に導入することによりプルームを追いかける雄昆虫の自然な反応を利用し、この合成フェロモンは雌昆虫が生成する性フェロモンを模倣するように設計されている。したがって、一部の実施形態では、交信攪乱で利用される合成フェロモンは、標的昆虫により生成されない性フェロモンおよびその位置異性体の化学構造を有するフェロモンを含む合成的に誘導されるフェロモン組成物である。
【０５１２】
[00481]  交信攪乱の一般的効果は、天然のフェロモンプルームを遮蔽することにより雄の昆虫を混乱させ、雄に交配の相手を見つけることを犠牲にして「偽りのフェロモン臭跡」を追いかけさせ、「呼出し」雌に反応する雄の能力に影響を与えることである。その結果、雄の集団は、雌の位置を首尾よく突き止めて交配する確率の低下を経験し、そのために繁殖は最終的に停止し昆虫来襲は崩壊する。
【０５１３】
[00482]  交信攪乱の戦略は混乱、臭跡遮蔽および偽りの臭跡追跡を含む。昆虫を高濃度のフェロモンに絶えず曝露しておくと、雄の昆虫は雌の昆虫が放出する通常レベルのフェロモンに反応できなくなることがある。臭跡遮蔽はフェロモンを使用して雌が放出するフェロモンの臭跡を破壊する。偽りの臭跡追跡は、数多くのスポットのフェロモンを高濃度で置き雄に追跡するべき多くの偽りの臭跡を提示することにより実行される。十分多量に放出されると、雄の昆虫は性フェロモンの天然の源（雌の昆虫）を見つけることができず、交配は起こることができない。
【０５１４】
[00483]  一部の実施形態では、芯または罠は、小昆虫の繁殖期（複数可）に少なくとも対応する期間フェロモンを放出して、交信攪乱を引き起こすように適合させてもよい。小昆虫が長い繁殖期、または繰り返される繁殖期を有する場合は、本開示は、ある期間、特に、約２週間、一般的には、約１〜４週間、最長６週間フェロモンを放出することができる芯または罠を提供し、この芯または罠はそれに続く類似の罠と交替させるまたは取り替えてもよい。フェロモン組成物を含有する複数の罠を、例えば、作物畑に隣接する場所に置いてもよい。罠の位置、および地面からの罠の高さは当業者に公知である方法に従って選択することができる。
【０５１５】
[00484]  代わりに、フェロモン組成物は、害虫の交配を攪乱するために一般に使用されているように、マイクロカプセルまたはツィストタイ（twist-ties）などの製剤から分配してもよい。
【０５１６】
誘引殺虫
[00485]  誘引殺虫法は、大量殺滅および最終的な個体数抑制のために、標的種の昆虫を殺虫性化学物質、表面、装置等におびき寄せる性フェロモンなどの誘引剤を利用し、大量捕捉と同じ効果をもつことが可能である。例えば、誘引殺虫戦略において合成雌性フェロモンを使用して雄害虫、例えば、蛾をおびき寄せた場合、多数の雄蛾は長期間にわたって殺滅されて、交配および繁殖を低減し、最終的に害虫個体数を抑制するに違いない。誘引殺虫アプローチは大量捕捉の有益な代替案であり得る。なぜならば、罠の修理または他の頻繁な維持管理を必要としないからである。本明細書に記載される種々の実施形態では、組換え微生物は、（ｉ）昆虫フェロモンの生産のための経路および（ｉｉ）昆虫にとって有害なタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは小分子を同時発現することが可能である。このようにして、組換え微生物は誘引殺虫アプローチで使用するのに適した物質を同時生産することが可能である。
【０５１７】
[00486]  当業者には明らかになるように、特定の適用のために使用されるフェロモンまたはフェロモン組成物の量は、来襲のタイプおよびレベル；使用される組成物のタイプ；活性成分の濃度；組成物の提供の仕方、例えば、使用されるディスペンサーのタイプ；取り扱うことになる場所のタイプ；その方法が使用されることになる期間などのいくつかの要因；ならびに気温、風速および風向、降雨量および湿度などの環境要因に応じて変動することが可能である。当業者であれば、所与の適用において使用するためのフェロモンまたはフェロモン組成物の有効量を決定することができるであろう。
【０５１８】
[00487]  本明細書で使用されるように、「有効量」とは、所望の結果に影響を及ぼすのに十分である開示されたフェロモン組成物の量を意味する。有効量は、１つまたは複数の投与で与えることが可能である。例えば、組成物の有効量とは、所与の昆虫を所与の場所に引き付けるのに十分なフェロモン組成物の量のことでもよい。さらに、組成物の有効量は、所与の場所において目的の特定の昆虫集団の交配を攪乱するのに十分なフェロモン組成物の量のことでもよい。
【実施例】
【０５１９】
実施例１：天然源からの脂肪酸前駆体の調達
[00488]  脂肪アシルＣｏＡ還元酵素（FAR）を発現する細胞による脂肪酸の還元は、提案された昆虫フェロモンのバイオヒドロキシル化による合成に代わる合成ルートである。図３を参照されたい。脂肪酸のアルコールへの還元は末端ヒドロキシル化よりずっと容易であると予想される。それは、（i）ずっと多くのＦＡＲ配列が公知で、これはこれらの酵素の天然の反応であり、（ii）不均一触媒による酸のアルコールへの水素化はよく確立されているからである。適当な不飽和基を有する標的脂肪酸を調達する能力が、このアプローチへの主たる課題である。
【０５２０】
[00489]  天然源からの標的昆虫フェロモンの脂肪酸前駆体を調達する可能性を理解するため、種油脂肪酸データベース（sofa.mri.bund.de）、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの培養コレクション（SAG）からの微細藻類株の報告された脂肪酸プロファイル（Lang IKら、(2011)Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae: a comprehensive analysis of more than 2000 strains from the SAG culture collection. BMC Plant Biol. 11:124）および一般の文献を調査した。
【０５２１】
[00490]  昆虫フェロモンのための前駆体として使用可能な１４種の脂肪酸を検討した（表4参照）。これら１４種の脂肪酸のうち、Ｚ−１１−オクタデセン酸、Ｚ−１３−オクタデセン酸、およびＺ−１１−ヘキサデセン酸の３種のみが種油中に見られることが報告されていた。これらの脂肪酸のそれぞれについて最も純度が高いものを生産する植物は、Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  Ｓｙｒｉａｃａ：Ｚ−１１−オクタデセン酸（44.9%）（Kuemmel DF、Chapman LR (1968) 9-hexadecenoic and 11-octadecenoic acid content of natural fats and oils. Lipids 3:313-316)；Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ：Ｚ−１３−オクタデセン酸（22%）（Vickery JR (1971) The fatty acid composition of the seed oils of proteaceae: A chemotaxonomic study. Phytochemistry 10: 123-130)である。Ｚ−１１−ヘキサデセン酸を含む植物はＫｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ（40.3%）（Vickery 1971）；Ｇｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａ（25.4%）（B. San, A. N. Yildirim, J Food Compos. Anal.2010, 23, 706-710）；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ  ｖａｒ．ｉｎｅｒｍｉｓ（33.3%）（B. San, A. N. Yildirim, J. Food Compos. Anal. 2010, 23, 706-710）；Ｏｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａ（35.6%）（G. Hill, RS、およびJordan、Pap. Proc. R. Soc. Tasmania 1996, 130, 9-15）；Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ（45.6%）（I. Bombarda、C. Zongo、C. R. McGill、P. Doumenq、B. Fogliani、J. Am. Oil Chem. Soc. 2010, 87, 981-986、およびM. Kato, A. Kawakita, Am J. Bot. 2004, 91, 1814-1827）である。同様に微細藻類については１４種の脂肪酸のうちＰｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘによって作られるＺ−１１−オクタデセン酸（68%）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓによって作られるＺ−１１−ヘキサデセン酸（35%）の２種のみがデータベース中で同定されている。一般の文献の検索においては、ノニ果実の果汁から２Ｅ，４Ｚ，７Ｚ−デカトリエン酸が同定され（Basar S,およびWestendor J (2011) Identification of (2E,4Z,7Z-decatrienoic acid in Noni fruit and its use in quality screening of commercial Noni products. Food Anal. Meth. 4:57-65）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕ６１０５から単離されている（7.7mg/L）（Maier Aら、(1999) (2E,4Z)-decadienoic acid and (2E,4Z,7Z)-decatrienoic acid, two herbicidal metabolites from Streptomyces viridochromogenes Tu 6105. Pestic. Sci. 55:733-739）。
【０５２２】
[00491]
【表９−１】
2020124206.tif 000063
【０５２３】
【表９−２】
2020124206.tif 000064
【０５２４】
[00492]  一般商品として生産されている種油から調達できる脂肪酸を決定するため、文献を検索して一般商品の種油およびその組成を同定した。１９７６年〜２０００年に生産された、および２００６年〜２０２０年に予想される主な種油を図４にまとめる。主な種油はダイズ、綿実、落花生（ピーナツ）、ヒマワリ、キャノーラ、ゴマ、トウモロコシ、オリーブ、ヤシ、ヤシ核、ココナツ、亜麻仁、ヒマシ、および獣脂である。これらの油の脂肪酸組成を表５にまとめる。一般商品の種油の主な成分は、ラウリン酸（12:0）：ココナツ（47.8%）およびヤシ核（48.4%）、パルミチン酸（16:0）：ヤシ（44%）および綿（24.7%）、オレイン酸（18:1Δ9c）：キャノーラ（64.1%）、ピーナツ（46.5%）、ヤシ（39.2%）、オリーブ（76.9%）およびゴマ(40.6%）、リノール酸（18:2Δ9c,Δ12c）：ダイズ(53.2%）、綿（53.3%）、ヒマワリ（68.2%）、ピーナツ（31.4%）、およびゴマ（42.6%）、ならびにリノレン酸（18:3Δ9c,Δ12c,Δ15c）：亜麻仁（47.4%）である。基礎的作物に加えて、特定の脂肪酸の含量を増加させるために改変作物が工学的に操作されている。改変ダイズおよびキャノーラ作物の例を表６にまとめる。これらの作物の中で、オレイン酸からのフェロモンが同定できれば、７５％を超える高純度のオレイン酸の生産が最も期待できる供給原料であろう。
【０５２５】
[00493]  主な一般商品の種油に見られる脂肪酸に加えて、興味ある脂肪酸組成を有する副作物を表７にまとめる。これらの副作物は独特のモノエン、２０：Δ５ｃ、２２：Δ９ｃ、１８：１Δ６ｃ、１６：１Δ９ｃ；トリエン、１８：３Δ８ｔ，Δ１０ｔ，Δ１２ｃ、１８：３Δ９ｃ，Δ１１ｔ，Δ１３ｔ；および酸化トリエン、１８：３Δ９，Δ１１，Δ１３，４−オキソ、１８：１Δ９ｃ，Δ１２−ヒドロキシを生産する。
【０５２６】
[00494]
【表１０−１】
2020124206.tif 000065
【０５２７】
【表１０−２】
2020124206.tif 000066
【０５２８】
[00495]
【表１１−１】
2020124206.tif 000067
【０５２９】
【表１１−２】
2020124206.tif 000068
【０５３０】
[00496]
【表１２−１】
2020124206.tif 000069
【０５３１】
【表１２−２】
2020124206.tif 000070
【０５３２】
[00497]  以下の脂肪酸は植物および微細藻類によって生産される。Ｚ−１１−オクタデセン酸：Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  Ｓｙｒｉａｃａ（44.9%）、Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘ（68%）；Ｚ−１３オクタデセン酸：Ｃａｒｄｗｅｌｌｉａ  ｓｕｂｌｉｍｉｓ（22%）；およびＺ−１１−ヘキサデセン酸：Ｋｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａ（40.3%）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ（35%）。一般商品の種油の主な成分は、ラウリン酸（12:0）：ココナツ(47.8%)およびヤシ核(48.4%)；パルミチン酸（16:0）：ヤシ(44%)および綿(24.7%)；オレイン酸（18:1Δ9c）：キャノーラ（64.1%）、ピーナツ（46.5%）、ヤシ（39.2%）、オリーブ（76.9%）およびゴマ（40.6%）；リノール酸（18:2Δ9c,Δ12c）：ダイズ（53.2%）、綿（53.3%）、ヒマワリ(68.2%）、ピーナツ(31.4%）およびゴマ（42.6%）；ならびにリノレン酸（18:3Δ9c，Δ12c，Δ15c）：亜麻仁（47.4%）である。一般商品の種油は大部分、飽和脂肪酸とモノエンからなっている。
【０５３３】
[00498]  副作物（キンセンカ、メドウフォーム、ギンセンソウ、キャラウェイ、ニンジン、コリアンダー、マカダミア、ナツメグ、オイティシカ、バターノキ、およびカスター）は、独特のモノエン２０：Δ５ｃ、２２：Δ９ｃ、１８：１Δ６ｃ、１６：１Δ９ｃ、トリエン１８：３Δ８ｔ，Δ１０ｔ，Δ１２ｃ、１８：３Δ９ｃ，Δ１１ｔ，Δ１３ｔおよび酸化トリエン１８：３Δ９，Δ１１，Δ１３，４−オキソ、１８：１Δ９ｃ，Δ１２−ヒドロキシを生産する。
【０５３４】
実施例２：天然生産油の半還元による（Z)−ヘキサデカ−１１−エナールの生産
背景および論拠
[00499]  標的フェロモンは天然に存在する脂肪酸と極めて類似しているが、標的フェロモンの生産のための基質としての天然に存在する脂肪酸の使用は明確にされていなかった。十分な量の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む植物油がこの目的に使用可能かを決定するため、基質側における特定の植物についてのより多い情報が必要であった。
【０５３５】
[00500]  かなりの量の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む市販の唯一の植物油であるチリヘーゼルナッツ油を、（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールの生産のための供給原料として用いた。
【０５３６】
[00501]  全体の反応スキームを説明する概略を図１に示す。天然源から脂質を単離した後、これらをエステル交換反応に供する。バイオディーゼルの生産のためにはメチルエステルの調製が標準的手順である。反応は酸触媒反応または塩基触媒反応であってよい。酸性条件下では二重結合が異性化しやすいので、このアプローチにはアルカリ条件が好ましかった（Li H-Yら、(2005) Chem. Phys. Lett. 404:384-388）。
【０５３７】
[00502]  原料によっては、得られる混合物は標的物質の一分画のみを含む。引き続く還元反応に必要な還元当量を最小化するため、前駆体の酸の精製または少なくとも富化が好ましいと思われる。実行可能な選択肢の中には、たとえば蒸留および擬似移動床（SMB）クロマトグラフィーがある。予備的精製の課題は別の課題であるので、目的の化合物の高温での安定性を調べるために小スケールの蒸留を行なった。次のステップで、精製したメチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートを対応するアルデヒドへの還元に供する。この目的のための可能性のある試薬はＶｉｔｒｉｄｅ水素化（ビス(2-メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム）（Abe, Tら、(2001) Tetrahedron 57: 2701-2710）であろう。ＶｉｔｒｉｄｅはＤＩＢＡＬ（水素化ジイソブチルアルミニウム）と同様の反応プロファイルを有する水素化アルミニウム系還元剤である。ＤＩＢＡＬと異なり、Ｖｉｔｒｉｄｅは空気に触れても自然発火性がなく、水との反応もより穏やかであるので、取扱いがより安全かつ容易である。文献における既知の他の部分還元剤とＶｉｔｒｉｄｅを比較すると、他の還元剤が−７８℃を必要とするのに対してこの還元剤は０℃で用いることができ、同様の基質に対して高い選択性を示し、過還元副産物がごく僅かである（Shin WKら、 (2014) Bull. Korean Chem. Soc. 35:2169-2171）。
【０５３８】
アプローチの概要
[00503]  高含量（>20%）の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む報告された種々の植物を比較した。関連するパラメーターは含油量、栽培条件、全収率および市場入手性であった。
【０５３９】
[00504]  代表的な植物油試料（Gevuina avellana-チリヘーゼル）を購入して分析した。
【０５４０】
[00505]  塩基触媒エステル交換反応を行ない、植物油脂肪酸のメチルエステルを生産した（バイオディーゼルの生産）。
【０５４１】
[00506]  メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートの小スケール精製／基質の富化を蒸留によって達成した。
【０５４２】
[00507]  Ｖｉｔｒｉｄｅの改変バリアント（2,6-ジメチルモルホリン改変水素化ビス[2-メトキシエトキシ]アルミニウムナトリウム）を用いてメチルエステルの半還元を行ない、（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールを生産した。
【０５４３】
結果
[00508]  研究は天然油の調達の一般的な実施可能性およびこれを還元してフェロモンにすることに集中した。主な標的は（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールであるので、この化合物を検討の中心とした。ＳＯＦＡ（Seed Oil Fatty Acids）およびＳＡＧ（Culture Collection of Algae at Goettingen University）データベースを再調査した（実施例１参照）。
【０５４４】
[00509]  レポートのパートＩは、フェロモンの生産のための前駆体として好適な普通でない脂肪酸の高い含量を有する植物の同定に集中した。パートＩＩはフェロモンを生産するための油の利用のための原理の裏付けを示した。パートＩによって候補植物の以前の探索が確認された。微生物脂質等の他の脂質源が全く同様の手順によって処理されるので、全体の技術の検討は意味があると思われた。中間体生産プラットフォームの開発のルートを図１に示す。
【０５４５】
１．１  植物油調達の詳細
[00510]  高含量の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む植物は、植物油の普通でない脂肪酸プロファイルを検討した多くの研究に引用されている（Aitzetmuller K、J. Am. Oil Chem. Soc. 81:721-723）。興味深いことに、Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ科に属するＺｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅを除いて、２０％を超える（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸分画を含む他の全ての植物はＰｒｏｔｅａｃｅａｅ科に属している。
【０５４６】
[00511]  油の収率および栽培条件に関する情報は極めて少ない。しかし、植物の可能性を評価するために他のパラメーターを用いることができる。研究は２つの植物に集中した。第１に、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａは種油中に４５．６％と、これまで報告された全ての植物の中で最大量の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を有している。報告によっては、Ｇ．ｅｘｕｌは灌木または高さ３０フィートまでの低木で、ニューカレドニアのみに固有である。Ｇ．ｒｏｂｕｓｔａおよび一般にＧｒｅｖｉｌｌｅａ属等の密接に関連した他の種についてのみ、さらなる情報が得られている。一般的な耐寒ゾーンは９〜１２で、たとえば南カルフォルニアに適している。これは干ばつや鹿の害に抵抗性があり、成長が速いが、肥料に影響されやすい。生産性または油の収率に関する情報は得られなかった。多くのＧｒｅｖｉｌｌｅａ種は、ドリアンドラ蛾等のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種によって食用植物として用いられている。
【０５４７】
[00512]  目的の第２の植物はチリヘーゼルである。それは、この植物油が天然に約２５％の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含み、市販されているからである。この植物は広く栽培されてはいない。
【０５４８】
１．２  いくつかの植物油のＧＣ−ＦＩＤによる比較
[00513]  チリヘーゼルナッツ油はその日光保護特性により、多くのローションに用いられている。多くの場合に脂肪酸の異なった位置異性体は小売商によって区別されていない。チリヘーゼルナッツ油とヨーロッパヘーゼルナッツ油を比較した。結果を表８にまとめ、異なったＧＣ−ＦＩＤのオーバーレイを図５に示す。（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む唯一の油はチリヘーゼルナッツ油である。２２．５％の分画は、文献に報告された約２２．７％および約２３．８３％の値に近い（Bertoli Cら、J. Am. Oil Chem. Soc. 75: 1037-1040; Medel F、Carillo T in Acta Hortic., International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium, 2005, pp.631-638）。他の源について完全には研究していないが、他の市販の油が同様に高い（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含んでいる可能性は低い。ヨーロッパヘーゼル（Corylus avellana）が全く異なるという事実は驚くことではない。それは、これがチリヘーゼル（Gevuina avellana）と関連していないからである。驚くべきことに、マカダミアナッツ油は僅か０．５９％のパルミトレイン酸しか示さなかった。通常はより高い１６〜３４％の含量が観察される。一方、オレイン酸の含量はやや高かった。これは通常、４１〜５９％が見出される。約３％のＺ１１−Ｃ１８：１も通常存在する（Kaijser Aら、(2000) Food Chem. 71: 67-70）。これらのパラメーターのいずれも報告されたデータと一致せず、この油が純粋なマカダミアナッツ油でないという結論に至る。
【０５４９】
[00514]
【表１３】
2020124206.tif 000071
【０５５０】
２．（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸のエステル交換反応および精製
[00515]  本研究において検討した生産ルートは、対応する脂肪酸誘導体の半還元によるアルデヒドの直接生産である。同じく遊離脂肪酸から出発できる全還元と対照的に、半還元にはメチルエステルが必要である。メチルエステルは一般に沸点が約２０Ｋ低く、そのため蒸留による精製が容易である。したがって、このアプローチで達成しようとしたルートでは、鹸化の代わりにエステル交換反応を、クロマトグラフィーの代わりに蒸留を利用した。
【０５５１】
２．１  メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエート／チリヘーゼルナッツバイオディーゼルの調製
[00516]  亜麻仁油からのバイオディーゼルの生産のためのＵｌｌａｈら（2013）の最適化プロトコル（Ullah Fら、(2013) Polish J. Chem. Technol. 15: 74）を用いて、チリヘーゼルナッツ油をエステル交換した。用いた試薬の実際の組成を表９および図６にまとめる。詳細なプロトコルは材料および方法の部に記載する。
【０５５２】
[00517]
【表１４】
2020124206.tif 000072
【０５５３】
[00518]  反応物を６５℃で１８０分撹拌し、収率８８％で明黄色の液体８．９７ｇを得た。バイオディーゼルの組成を表１０に示し、ＴＭＳＨを元のチリヘーゼルナッツ油とともに用いる直接メチル化と比較する。
【０５５４】
[00519]  直接メチル化したヘーゼルナッツ油と比較したバイオディーゼルの組成はやや変化していた（表10）。メチルＺ１１−ヘキサデセノエートについては、２．８５％の明らかな減少があった。他の化合物、特に長鎖化合物の相対量は１０．６３％増加した。全体として本方法はトリアシルグリセリドに結合したＺ１１−Ｃ１６：１酸をメチル誘導体に転化するために好適であることが証明された。
【０５５５】
[00520]
【表１５】
2020124206.tif 000073
【０５５６】
２．２  メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートの蒸留
[00521]  メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートの量を富化し、これらの必要な条件下における化合物の安定性を評価するためにも、混合物を蒸留に供した。蒸留は５インチのＶｉｇｒｅｕｘカラムを用いて分画法で行なった。油を２１０℃に加熱した。圧は０．９５〜１．２２ｍｂａｒで一定に保った。２時間の経過にわたって、カットＩ（2.21g、ヘッド温度55〜82℃）とカットII（2.25g、ヘッド温度１２０〜１４６℃）の２つの分画を収集した。粗混合物とも比較した異なった分画の組成を表１１に示す。
【０５５７】
[00522]  最初に用いた装置では必要な高いヘッド温度に達しないので、第２の分画を収集する前にＶｉｇｒｅｕｘカラムを除いた。
【０５５８】
[00523]  メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートの最初の含量２３．４％から出発して、比較的単純な蒸留によって濃度を６０％まで富化することができた。５５〜８２℃の温度枠は５つの異なったヘッド温度（55〜60℃、63℃、68℃、79℃および82℃）からなっていたので、より小さな分画を収集することも可能であったと思われる。分画にわたる詳細な概観を表１１および図７に示す。
【０５５９】
[00524]
【表１６】
2020124206.tif 000074
【０５６０】
３．メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートのＶｉｔｒｉｄｅ還元
[00525]  次いで最大量のメチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートを含む分画を用い、Ｖｉｔｒｉｄｅの改変バージョンを用いる部分還元を行なった。この目的のため、試薬の改変バリアントを用いた。図８に示すように、反応は２つのステップを含む。第１のステップでは窒素塩基、この場合には２，６−ジメチルモルホリンを用いて改変還元剤を調製しなければならない。第２のステップでは実際の基質を還元するためにこの試薬を用いる。
【０５６１】
[00526]  水素化ジイソブチルアルミニウムほど敏感ではないものの、試薬は湿気に弱く、不活性ガスならびに乾燥した溶媒の使用が重要である。したがって、不活性雰囲気としてアルゴンを用い、乾燥した溶媒のみを用いた。反応は材料および方法の部に記載したように行なった。粗混合物を用いたので、第１の反応について収率を計算することはできない。基質と生成物の混合物のオーバーレイの一部を図９に示す。基質は定量的に転換された。メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートに関連する唯一の生成物は、８８％の（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールと１２％の（Z)−ヘキサデカ−１１−エノールである。
【０５６２】
[00527]  生成物は保持時間と断片パターンに関する真正標準との比較によって同定した（図10A〜図10F）。
【０５６３】
[00528]  さらに、１１Ｚ−Ｃ１６：１アルデヒドは、極めて遅い速度ではあるが、４０℃、完全真空下で蒸発するために十分な揮発性を有することが観察された。ロータリーエバポレーターを用いた溶媒除去の間の種々の時点における比較を図１１に示す。同じ量の基質を用いたが、真空下における追加の２時間の後、生成物の約２４％のみが残った。反応を行なう際には完全な除去は避けるべきである。５．４分のピークはヘキサデカナールに相当する。この観察は、比較的容易で穏和な精製法の開発に利用することができる。
【０５６４】
[00529]  結果として、Ｚ１１−ヘキサデセナールはこのルートにより良好な選択性で生産できることが主張できる。
【０５６５】
４．高含量の「パルミトバクセン酸」を含む植物
[00530]  既に行なったＳＯＦＡおよびＳＡＧデータベースの検索にも拘わらず、時とともに現われた種々の些細な名称を用いて検索をＳｃｉＦｉｎｄｅｒおよびＧｏｏｇｌｅ  Ｓｃｈｏｌａｒに拡張した。系統的名称の１１Ｚ−ヘキサデセン酸の他に、以下の些細な名称も用いた。リコポディウムオレイン酸（Arch. Pharm. 227, 241, 289, 625 (1889)、これは混合物であると反証されたが、後にRiebsomerおよびJohnsonによって再度導入された（Riebsomer JLおよびJohnson JR (1933) J. Am. Chem. Soc. 55: 3352-3357））。時には些細な名称としてタナセツモオレイン酸およびパルミトバクセン酸も用いたが、パルミトバクセン酸が最も目立つ些細な名称であった。
【０５６６】
[00531]  可能な場合には、植物愛好家、植物協会、種苗店およびウィキペディアのいくつかのブログからも追加的な情報を収集した。
【０５６７】
[00532]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｅｘｕｌ  ｖａｒ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａは種油中に４５．６％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５６８】
[00533]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＫｅｒｍａｄｅｃｉａ  ｓｉｎｕａｔａは種油中に４０．３％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５６９】
[00534]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＯｒｉｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｓは種油中に３５．６％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７０】
[00535]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＯｒｉｔｅｓ  ｒｅｖｏｌｕｔａは種油中に３５．６％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７１】
[00536]  Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ科のＺｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ  ｖａｒ．ｉｎｅｒｍｉｓは、種油中に３３．３％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７２】
[00537]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＨｉｃｋｓｂｅａｃｈｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａは種油中に２８．５％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７３】
[00538]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＧｅｖｕｉｎａ  ａｖｅｌｌａｎａは種油中に２５．４％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７４】
[00539]  Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ科のＧｒｅｖｉｌｌｅａ  ｄｅｃｏｒａは種油中に２１．４％の１１Ｚ−ヘキサデセン酸を有している。
【０５７５】
結論
[00540]  大量の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む植物の殆ど全てはＰｒｏｔｅａｃｅａｅ科に属する。種および場所によっては、標本は灌木または小木から比較的大きな木として成長する。
【０５７６】
[00541]  チリヘーゼルは、大量（22.5%）の（Z）−ヘキサデカ−１１−エン酸を含む、容易に入手できる油源である。
【０５７７】
[00542]  エステル交換反応／バイオディーゼル生産は、容易に実施できる確立された化学プロセスである。１０ｇのスケールで、反応は８８％の収率で実施することができる。
【０５７８】
[00543]  理論段数が少ないので、小スケールの蒸留は困難である。しかし、メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートは、元の２３．４％から６０％まで富化することができる。データは、二重結合の立体配置が高温で長時間（200℃で30分）安定であり、実質的な富化が比較的容易に達成できることを示している。
【０５７９】
[00544]  ２モル当量のＶｉｔｒｉｄｅ／２，６−ジメチルモルホリンを用いて、半還元を定量的に行なうことができる。複雑な混合物を用いたので、この段階では実際の収率を計算することはできない。結果は、（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールがこのルートによって生産できることを証明している。メチル（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートから誘導される化合物の生産分布（相対的選択性）は、８８％の（Z）−ヘキサデカ−１１−エナールおよび１２％の（Z）−ヘキサデカ−１１−エノールである。
【０５８０】
[00545]  植物源に加えて、（Z）−ヘキサデカ−１１−エノエートが多い遺伝子工学的に操作された微生物（Candida tropicalisおよびYarrowia lipolytica等）も、この方法を用いる昆虫脂肪アルコール／アルデヒド合成の好適な基質である。微生物の培養は容易にスケールアップできるプロセスであるので、微生物バイオマスからの油の生産は、植物から油を調達するより有利であり得る。植物の栽培と異なり、微生物の培養は空気と土地の利用可能性、気候、潅水、および肥料に依存しない。
【０５８１】
材料および方法
【０５８２】
[00546]
【表１７】
2020124206.tif 000075
【０５８３】
分析
[00547]  １．８ｍＬのスクリューキャップ付きＧＣガラスバイアル中で、４５０μｌのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルに１０μＬの植物油を溶解した。ＧＣ−ＦＩＤ分析を仕上げる前に、５０μｌのメタノール中０．２Ｍトリメチルスルホニウムヒドロキシド溶液を加えた。この手順はＢｕｔｔｅら、１９８３（Butte W (1983) J. Chromatogr. A261: 142-145）のプロトコルに基づくＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（出願番号213060）から誘導される。用いたＧＣプログラムは以下のパラメーター（表13）を有するＫＯ−ＤＥＳＡＴＵＲ０１．Ｍであった。
【０５８４】
[00548]
【表１８】
2020124206.tif 000076
【０５８５】
[00549]  １０μＬのバイオディーゼルを１ｍＬのクロロホルムに溶解し、同じＧＣ−ＦＩＤ法を用いてバイオディーゼルを分析した。１０μＬの基質または生成混合物を１ｍＬのクロロホルムに溶解することによって、Ｖｉｔｒｉｄｅ反応を分析した。１％のトリメチルシリルクロリドを含む１００μＬのＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドの添加の後、試料をＧＣ−ＦＩＤによって分析した。ＧＣ−ＭＳ分析のため、同じ温度プログラムを用い、ＭＳをスキャンモードで構成した。
【０５８６】
チリヘーゼルナッツ油のエステル交換反応
[00550]  Ｕｌｌａｈら（2013）の最適化プロトコルに基づいて、メタノール／ＴＡＧ（トリアシルグリセリド）のモル比６：１でエステル交換反応を行なった。磁気撹拌棒を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに１０．２２ｇのチリヘーゼルナッツ油（10.84mmol）を入れた。メタノール中５％ＮａＯＨ１ｍＬを２ｍＬのメタノールと混合して丸底フラスコに加えた。混合物を６５℃で１８０分、激しく撹拌した。２０ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで２回抽出する前に、混合物を２０ｍＬの水で希釈した。有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮した。反応により８．９７ｇの淡黄色液体が得られ（収率88%）、これをＧＣ−ＦＩＤで分析した。
【０５８７】
チリヘーゼルナッツバイオディーゼルの蒸留
[00551]  磁気撹拌棒を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに８．６２ｇのバイオディーゼルを入れた。フラスコに５インチのＶｉｇｒｅｕｘカラムを取り付け、これに水冷式の５．５インチの短路蒸留ヘッドを連結した。凝縮器に三方ガラスレシーバーを連結し、これに３個の１０ｍＬガラス丸底フラスコを取り付けた。Ｖｉｇｒｅｕｘカラムはアルミニウムホイルで断熱した。ヘッド温度は、ＪＫＥＭモデル２１０温度コントローラーに連結したＰＴＦＥコートＴ型熱電対を用いて監視した。圧力は熱電対圧力トランスデューサーを（Mastercool Model 98061）を用いて監視した。種油メチルエステルを含む丸底フラスコを油浴に入れ、磁気ホットプレートスターラーで撹拌しながら注意深く２１０℃に加熱した。２時間の経過にわたって２つの異なった分画を収集した。第１の分画（カットI-2.21g）は５５〜８０℃の温度範囲で収集し、第２の分画（カットII-2.25g）は１２０〜１４６℃で収集した。Ｖｉｇｒｅｕｘカラムを用いてカットIIの高いヘッド温度に達することはできなかったので、第２の分画を収集する前にこれを除いた。蒸留手順の後、２５ｍＬの丸底フラスコ中に３．５４ｇが残った。種々の分画をＧＣ−ＦＩＤによって分析した。
【０５８８】
最大含量のメチル（Ｚ）−ヘキサデカ−１１−エノエートを含む第１カット−粗分画のＶｉｔｒｉｄｅ還元
[00552]  還元剤（シス-2,6-ジメチルモルホリン改変Red-Al）の調製
[00553]  乾燥した３口フラスコに乾燥した滴下ロート、磁気撹拌棒およびセプタムを取り付けた。アルゴンで４回ポンプパージした後、フラスコを氷浴に入れた。１４ｍＬの無水テトラヒドロフランと１．１７ｍＬ（9.54mmol）を入れた。混合物を０℃まで放冷した後、トルエン中水素化ビス（2-メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウムの３．５Ｍ溶液(2.48mL、8.67mmol）を滴下し、１時間撹拌して無色澄明の均一な溶液を得た。
【０５８９】
[00554]  チリヘーゼルナッツバイディーゼルのカットIの部分還元
[00555]  乾燥した３口フラスコに滴下ロート、磁気撹拌棒およびセプタムを取り付けた。アルゴンで４回ポンプパージした後、フラスコを氷浴に入れた。２０ｍＬの無水テトラヒドロフランと０．９７ｇのチリヘーゼルナッツバイディーゼルのカットI（3.81mmol、11Z-C16:1-COOMeのみと推定）を入れた。カニューラ輸送により、予め調製したシス-2,6-ジメチルモルホリン改変Ｒｅｄ−Ａｌを滴下ロートに取り付けた。混合物を０℃に冷却した後、改変Ｒｅｄ−Ａｌを滴下した（試薬はこの段階では冷却しなかった）。混合物を３０分撹拌して室温に戻した。８０ｍＬの２Ｎ塩酸によって反応を停止し、生成物を５０ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで２回抽出した。有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮した。還元した混合物をＧＣ−ＭＳで分析し、メチル(Ｚ)-ヘキサデカ−１１−エノエートから誘導された生成物を保持時間および断片パターンについて真正標準と比較することによって同定した。
【０５９０】
実施例３：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける膜貫通デサチュラーゼの発現
背景および論拠
[00556]  不飽和脂質部分の微生物生産を工学的に操作するには合成経路の機能的発現が必要である。そのような経路の１つは、脂肪アシルＣｏＡの位置特異的および立体特異的不飽和脂肪アシルＣｏＡへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼを含む。これらの酵素をコードする多くの遺伝子が、いくつかの昆虫ならびにいくつかの微細藻類で見つかっている。位置特異的および立体特異的デサチュラーゼは、脂肪酸前駆体に富んだ微生物油を生産するために用いることができる。次いで微生物油を誘導体化し、還元して活性成分とすることができる。不飽和脂質部分の単一物またはブレンドの高レベルの合成が可能な経路の創造を可能にする酵素活性を同定するために、多くの遺伝子バリアントがスクリーニングされた。さらに、これらの膜貫通タンパク質の最適な発現のために好適な宿主の発見に向けて探索を最適化するため、多数の宿主（Saccharomyces cerevisiae、Candida viswanathii (tropicalis)、およびYarrowia lipolytica）にわたってこれらの酵素がスクリーニングされた。
【０５９１】
[00557]  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ（tropicallis）におけるデサチュラーゼの初期スクリーニングによって、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ．から３つの活性Ｚ１１−Ｃ１６：１デサチュラーゼバリアントが同定された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのスクリーニングには、全長の昆虫Ｚ１１デサチュラーゼ配列に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｏｌｅ１ｐ  Ｚ９デサチュラーゼのＮ末端リーダー配列を有するコーディング配列を用いた。この戦略は以前にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける真核デサチュラーゼを発現するために科学文献において用いられてきた。上記のデサチュラーゼの３種全ては、ＯＬＥ１欠落バックグラウンドで発現した場合にＯｌｅ１ｐリーダー融合を有するＺ１１デサチュラーゼ活性を示した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｏｌｅ１ｐリーダー配列を含む同様の設計を、Ｈ．ｚｅａのＺ１１デサチュラーゼについて用いた。活性ではあるが、このＯｌｅ１ｐ−Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼ融合はＺ１１−ヘキサデセン酸のタイターを顕著には増加させなかった。さらに、保存的に最適化したＡ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ  Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉの両方で活性であった。以下の研究は、２つの異なったＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株、即ちＳＰＶ１４０およびＳＰＶ３００におけるＨ．ｚｅａ、Ｔ．ｎｉ、およびＡ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａのＺ１１デサチュラーゼの機能発現を試験することに集中した。Ｈ．ｚｅａおよびＴ．ｎｉデサチュラーゼについては天然およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化配列を用い、Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａについては天然配列のみを用いた。最後に、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｏｌｅ１ｐ  Ｚ９ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼのＮ末端は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＯｌｅ１ｐのＮ末端よりも昆虫デサチュラーゼにより近接して整列している。この整列に基づいて、２つの追加的なデサチュラーゼバージョンを作製した。推定されるリーダー配列をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｏｌｅ１ｐからＴ．ｎｉおよびＨ．ｚｅａデサチュラーゼに交換した。
【０５９２】
アプローチの要旨
[00558]  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉのいずれかにおいて活性が観察されたＺ１１デサチュラーゼの重点的ライブラリー（昆虫起源:Amyelois transitella、Helicovera zea、Trichoplusia ni）を、ＵＲＡ３選択マーカーとともにＸＰＲ２遺伝子座を標的とする二重クロスオーバーカセットにクローニングした。タンパク質コーディング配列には、天然昆虫配列（配列番号17,18）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ最適化コーディング配列（配列番号19,20）、またはＮ末端８４塩基（H. zea、配列番号22）もしくは８１塩基（T. ni、配列番号21）をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１（YALI0C05951）遺伝子のＮ末端９６塩基と交換したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ最適化配列のいずれかを用いる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉのスクリーニングの場合と異なり、リーダー配列キメラにおいては、宿主リーダー配列を全長のデサチュラーゼコーディング配列のＮ末端に連結する代わりにリーダー配列の直接交換を検討する。Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａデサチュラーゼについては天然のコーディング配列のみを用いた（配列番号23）。
【０５９３】
[00559]  ７種のデサチュラーゼ構築物のそれぞれをＳＰＶ１４０（PO1f）およびＳＰＶ３００（H222 ΔP ΔA ΔF ΔURA3）に形質転換し、部位特異的インテグラントを確認した。
【０５９４】
[00560]  デサチュラーゼ活性は、ＹＰＤ培地中におけるヘキサデカン酸（パルミチン酸）の（Z）−１１−ヘキサデセン酸（パルミトバクセン酸）へのｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換によって試験した。
【０５９５】
[00561]  代謝物の同定および定量のため、ＧＣ−ＦＩＤ分析を用いた。
【０５９６】
結果
株の構築
[00562]  デサチュラーゼバリアントを、ＸＰＲ２遺伝子座への挿入を標的とするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現カセットを含むｐＰＶ１０１ベクターにクローニングした。
【０５９７】
[00563]  Ｔ．ｎｉおよびＨ．ｚｅａのデサチュラーゼをそれぞれ、天然の昆虫配列（配列番号17,18）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓについてコドン最適化した全長の昆虫配列（配列番号19,20）、またはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１デサチュラーゼのリーダー配列で置換した推定のリーダー配列（配列番号21,22）を用いて合成した。Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａデサチュラーゼも、天然の昆虫コーディング配列（配列番号23）を用いて合成した。７種のデサチュラーゼバリアント全てをＳＰＶ１４０に形質転換した。以前の活性結果に基づき、Ｈ．ｚｅａおよびＡ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａデサチュラーゼバリアントのみをＳＰＶ３００に形質転換した。
【０５９８】
機能性発現アッセイ
[00564]  機能活性を、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ  ＳＰＶ０５３における膜貫通デサチュラーゼ発現に用いたプロトコルを改変することによって評価した。簡単には、昆虫デサチュラーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＳＰＶ１４０およびＳＰＶ３００から誘導した株をリッチ（YPD）中で培養して、バイオマスを生産した。ＹＰＤによって生産したバイオマスを用い、パルミチン酸を含む小スケール（2ml）の培養で、深い２４ウェルのプレートで合計４８時間培養した（詳細は材料および方法を参照）。
【０５９９】
[00565]  Ｔ．ｎｉ、Ｈ．ｚｅａ、およびＡ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａのバリアントの初期スクリーニングで、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓについてコドン最適化したＨ．ｚｅａデサチュラーゼバリアントのみが検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産した（図12）。天然のＨ．ｚｅａデサチュラーゼの発現により、１００±５ｍｇ／ＬのＺ１１−ヘキサデセン酸の生産が得られ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＬＥ１リーダー配列を有するバージョンは８３±１１ｍｇ／Ｌを生産した。図１２に見られるように、他の主な脂肪酸種の分布は機能性デサチュラーゼ発現によって比較的影響を受けなかった。活性株においては、Ｚ１１−ヘキサデセン酸は脂肪酸種の約１０％（g/g）を占めていた（外部細胞表面に吸着され得るパルミチン酸基質を含む）。
【０６００】
[00566]  ＳＰＶ１４０バックグラウンドにおける活性バリアントをＳＰＶ３００から誘導したデサチュラーゼ株と比較するフォローアップ実験を行なった。ｈｒＧＦＰを発現する親ＳＰＶ３００およびＳＰＶ１４０を陰性対照として用いた。同じ生物変換アッセイプロトコルを用いた。ＳＰＶ１４０の場合と同様に、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ最適化バリアントのみが検出可能な活性を生産した（図13）。ＳＰＶ３００株はより高い最終細胞密度にまで増殖した（SPV300  OD600=26〜28）、SPV140  OD600=19〜22）（図14）。最大のタイターは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化を行なった天然のＨ．ｚｅａ  Ｚ１１−デサチュラーゼを発現する株で観察された（pPV199）。再試験したＳＰＶ１４０株は１１３±１ｍｇ／Ｌ（5.5±0.2mg/L/OD）のＺ１１−ヘキサデセン酸を生産し、これは１回目の実験で観察されたタイターより１３％大きかった（図15）。同じデサチュラーゼを発現するＳＰＶ３００株はより広い範囲の生産性を生じた。これらは平均して８９±１８ｍｇ／Ｌ（3.3±1.2mg/L/OD）のＺ−１１ヘキサデセン酸を生産したが、１つのクローンは１２４ｍｇ／Ｌ（4.6mg/L/OD）のＺ１１−ヘキサデセン酸を生産した（図15）。
【０６０１】
[00567]  まとめると、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化を行なったＨ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼバリアントのみが検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産した。現在のアッセイ条件下では、ＳＰＶ３００に対してＳＰＶ１４０バックグラウンドで僅かに高いタイターが観察された。Ｚ１１−ヘキサデセン酸タイターを表１４にまとめる。
【０６０２】
[00568]
【表１９】
2020124206.tif 000077
【０６０３】
[00569]  ＳＰＶ３００において、ｐＰＶ２００の１つの非部位特異的インテグラント（Homo sapiensコドン最適化を行なったY. lipolytica OLE1-H. zea Z11デサチュラーゼ）を試験した。このインテグラントは検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産しなかったが、２つの部位特異的インテグラントは５５±１ｍｇ／Ｌを生産した。
【０６０４】
[00570]  ＳＰＶ１４０またはＳＰＶ３００誘導株のペレットからは主なヒドロキシまたは二酸ピークは観察されず、ＳＰＶ３００におけるベータ酸化／オメガ酸化遺伝子の欠落は現在のアッセイ条件（比較的低い基質濃度、富栄養培地）下ではＺ１１−ヘキサデセン酸の蓄積を増加させなかった。
【０６０５】
結論
[00571]  Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼは活性であり、約５００ｍｇ／Ｌのパルミチン酸基質から約１００ｍｇ／ＬのＺ１１−ヘキサデセン酸の生産を生じる。３つの陽性インテグラントおよび２４ウェルプレートアッセイにおける反復実験から、機能性発現が証明された。
【０６０６】
[00572]  Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける活性のためにコドン最適化（Homo sapiensまたはおそらくY. lipolytica）を必要とした。
【０６０７】
[00573]  Ｔ．ｎｉ  Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で活性であるが、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ中で検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生産しない。
【０６０８】
[00574]  Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株についてのアッセイの再現性は、グリセロールストックから出発して確認することができる。
【０６０９】
[00575]  Ａ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａデサチュラーゼは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドン最適化することができる。
【０６１０】
[00576]  Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは候補となる生産宿主であるので、活性デサチュラーゼのさらなるコピーをＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに挿入することができ、生物変換を改善するための培養条件を確定することができ、基質変換を定量化することができる。
【０６１１】
材料および方法
株の構築
[00577]  全てのデサチュラーゼ遺伝子は合成した（Genscript）。天然の配列またはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓコドン最適化のいずれかを用いた。合成した遺伝子をｐＰＶ１０１にサブクローンした。プラスミドはＺｙｐｐｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Zymo Research, Irvine, CA）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＥＰＩ４００から形質転換し、調製した。Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて約１〜２μｇの直鎖化ＤＮＡを形質転換した。形質転換混合物全体をＣＭ−グルコース−ｕｒａ寒天プレートに入れた。陽性インテグラントは部位特異的であることが分かり、チェックＰＣＲによって遺伝子タイピングを行なった。
【０６１２】
機能発現アッセイ
[00578]  ＹＰＤにおけるパルミチン酸補充
[00579]  陽性の分離株をＹＰＤ上に再パッチし、一夜増殖させ、次いで４℃で保存した。株をパッチプレートから深い２４ウェルのプレート（四角形のウェル、ピラミッド状の底）中の２ｍｌのＹＰＤに接種した。それぞれのデサチュラーゼバリアントについて３つの陽性クローンを接種した。ＳＰＶ１４０中のｐＰＶ１０１の３つの分離株および親のＳＰＶ３００を陰性対照として用いた。深いウェルのプレートをＩｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ冷蔵フラスコシェーカー中、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、それぞれの培養の体積１ｍｌを５００×ｇの遠心によってペレット化した。それぞれのペレットを２ｍｌのＹＰＤに再懸濁した。エタノール中９０ｇ／Ｌのストック溶液から５００ｍｇ／Ｌのパルミチン酸を培養に加えた。その結果、パルミチン酸基質を含む０．５％エタノールの添加となった。全ての培養を終点サンプリングの前に４８時間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ｐｒｏプレートリーダーを用いて最終細胞密度を測定した。それぞれの培養の０．７５ｍｌまたは０．８ｍｌを１．７ｍｌミクロ遠心チューブに移してペレット化した。上清を除去し、下記のようにしてペレットを処理した。
【０６１３】
代謝物の抽出およびＧＣ−ＦＩＤ分析
[00580]  全脂質組成ならびに（Z）−１１−ヘキサデセン酸の定量はＭｏｓｓら(1982）（Moss, C.W., Shinoda, T, Samuels, J.W. Determination of cellular fatty acid compositions of various yeasts by gas-liquid chromatography. J. Clin. Microbiol. 16: 1073-1079 (1982)）およびYousufら (2010)（Yousuf, A., Sannino, F., Addorisio, V., Pirozzi,D., Microbial Conversion of Olive Oil Mill Wastewaters into Lipids Suitable for Biodiesel Production. J. Agric. Food Chem. 58: 8630-8635 (2010)）の改変手順に基づいた。通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（1.5mLのプラスチックチューブ中）を、５％（w/w）の水酸化ナトリウムを含むメタノール中に再懸濁した。アルカリ性の細胞懸濁液を１．８ｍＬのクリンプバイアルに移した。混合物をヒートブロック中、９０℃で１時間加熱した。４００の２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前にバイアルを室温まで放冷した。１ｍＭのメチルヘプタデカノエートを含む５００μＬのクロロホルムを加え、混合物を激しく撹拌し、次いで水相と有機相の両方を１．５ｍＬのプラスチックチューブに移した。混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心し、その後、４５０μＬの有機相をＧＣバイアルに移した。脂質の分析および脂肪酸の定量のため、０．２ＭのＴＭＳＨ（メタノール中トリメチルスルホニウムヒドロキシド）５０μLを加え、試料をＧＣ−ＦＩＤによって分析した。
【０６１４】
実施例４：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ中におけるＺ１１−１４酸の生産
背景および論拠
[00581]  標的ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａフェロモンＺ１１−１４Ａｃの前駆体であるＺ１１−１４酸を生産させるため、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを工学的に操作した。
【０６１５】
[00582]  Ｚ１１−１４Ａｃ、Ｚ７−１２Ａｃ、Ｚ９Ｅ１２−１４Ａｃ、Ｅ８Ｅ１０−Ｃ１２ＯＨおよびＺ９Ｅ１１−１４Ａｃを含む可能なフェロモンを標的とするため、７３種のデサチュラーゼのライブラリーを選択した。全てのデサチュラーゼは、Ｈ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（SPV300）バックグラウンドで試験した。
【０６１６】
[00583]  文献から１１種のデサチュラーゼがΔ１１活性を有すると確定された（DST001〜DST009、DST030、およびDST039、表15）。全てのデサチュラーゼを、メチルパルミテート（C16）、メチルミリステート（C14）、またはメチルラウレート（C12）を基質として供給することによってスクリーニングし、ＧＣ分析によって全体の生成物プロファイルを決定した。
【０６１７】
[00584]  Δ１１デサチュラーゼライブラリーとされたもの、およびΔ１１化合物、特にＺ１１−１４酸を生産することが示されたその他のデサチュラーゼから得られた活性について論じる。
【０６１８】
[00585]
【表２０】
2020124206.tif 000078
【０６１９】
結果
[00586]  ２ｇ／Ｌのメチルミリステートをデサチュラーゼライブラリーに供給すると、６９ｍｇ／ＬまでのＺ１１−１４酸の生産が観察された（図16）。現在最良のデサチュラーゼであるＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（Hz）ＤＳＴ（配列番号1のアミノ酸配列、配列番号20のヌクレオチド配列によってコードされるSPV459）は、デサチュラーゼＤＳＴ００１〜ＤＳＴ００７、ＤＳＴ０３０およびＤＳＴ０３９に加えて、１６ｍｇ／Ｌ〜６９ｍｇ／Ｌの範囲のある量のＺ１１−１４酸を生産する。ＤＳＴ００１（A. velutinana）、ＤＳＴ００４（M. sexta）、およびＤＳＴ０３９（A. transitella）は、Ｚ１１−１６酸の生産よりもＺ１１−１４酸の生産により特異的であるが、これらのデサチュラーゼは約２０ｍｇ／ＬのＺ１１−１４酸を生産する。より高いＺ１１−１４酸タイターを生産する株はメチルミリステート基質から２０〜３０ｍｇ／ＬでＺ９−１４酸も生産したが、これは陰性対照のＳＰＶ２９８と比較して少ない。ＳＰＶ２９８と比較したＨｚ  ＤＳＴ（SPV459）のＣ１４〜Ｃ１８生産プロファイルを図１７に示す。
【０６２０】
[00587]  Ｚ１１−１４酸の合成の概念の裏付けを示す。Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ  ＤＳＴに比べて改善されたＺ１１−１６酸のタイターまたは生産特異性を有する酵素を同定する試みを行なった（Z11-16酸  1.05g/L；Z11-14酸  69mg/L）。Ｈｚ  ＤＳＴ（SPV459）よりも高い生産を有するデサチュラーゼはなかったが、ＤＳＴ００３（配列番号2）はＨｚＤｅｓａｔ株と同様の生産表現型を有し、ＤＳＴ００２およびＤＳＴ００５は同様のＺ１１−１６酸生産と低減したＺ１１−１４酸生産を有していた。ＤＳＴ００６のデサチュラーゼはＳＰＶ４５９で発現したＨ．ｚｅａデサチュラーゼと遺伝的に等価で、ライブラリー対照としての役割を果たした。ＤＳＴ００６はメチルパルミテートを供給すれば等価レベルのＺ１１−１６酸を生産したが、この株はメチルミリステートではより低いタイターのＺ１１−１４酸を生産した。株のバックグラウンドにおける遺伝的変化が、観察された相違の原因であろう。
【０６２１】
[00588]  ＤＳＴ０３９（A. transitella）は、異なった条件下で以前スクリーニングした。富栄養培地では天然のＡ．ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａコーディング配列によるＺ１１−１６酸の生産は観察されなかった。Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ最適化配列を試験したが、富栄養培地条件下では活性はやはり観察されなかった。このスクリーニングではＤＳＴ０３９を窒素制限条件下でＨｓ最適化配列によって試験し、対応する基質で２３５ｍｇ／ＬのＺ１１−１６酸の生産および２１ｍｇ／ＬのＺ１１−１４酸の生産という結果となった。
【０６２２】
[00589]  ＳＰＶ３００バックグラウンドにおけるＤＳＴ００８（Drosophila melanogaster）またはＤＳＴ００９（Spodoptera littoralis）からのΔ１１生成物は観察されなかった。
【０６２３】
概要
[00590]  １０種のデサチュラーゼにおいて１６ｍｇ／Ｌ〜６９ｍｇ／Ｌの範囲のタイターでＺ１１−１４酸の生産が観察された（メチルミリステート2g/L供給）。
【０６２４】
[00591]  （配列番号1のアミノ酸配列、配列番号20のヌクレオチド配列でコードされた）Ｈ．ｚｅａ  ＤＳＴが依然として最良のＺ１１−１６酸生産株であった（メチルパルミテートを供給すれば>1g/L）。
【０６２５】
[00592]  ＤＳＴ００３（S. inferens、配列番号2）はＨ．ｚｅａ  ＤＳＴと最も類似した表現型を有している。
【０６２６】
[00593]  ＤＳＴ００２（S. litura）およびＤＳＴ００５（O. nubialis）は、Ｚ１１−１６酸の生産についてＨ．ｚｅａ  ＤＳＴよりも特異的である（Z11-14酸の生産が低減）。
【０６２７】
[00594]  ＤＳＴ００１（A. velutinana）、ＤＳＴ００４（M. sexta）、およびＤＳＴ０３９（A. transitella）は、Ｚ１１−１４酸の生産についてＨ．ｚｅａ  ＤＳＴよりも特異的である。
【０６２８】
結論
[00595]  Ｚ１１−１４酸は、メチルミリステートを供給すればＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける特異的デサチュラーゼの異種発現によって生産することができる。
【０６２９】
[00596]  Ｚ１１−１４酸タイター、生成物特異性、および遺伝的安定性の増大のため、デサチュラーゼの多数のコピー（同一の配列または配列の組合せ）が改善された株バックグラウンドに挿入される。
【０６３０】
材料および方法
ライブラリーの生成
[00597]  Ｐａｃｌ／Ｓａｐｌ制限消化を用いるｐＰＶ２６６（TEFプロモーターおよびターミネーターを有するXPR2遺伝子座挿入ベクター）へのコドン最適化（Homo sapiens発現生物）クローニングのため、デサチュラーゼ配列をＧｅｎｓｃｒｉｐｔに提供した。凍結乾燥したＤＮＡならびにＥＰＩ４００寒天スタブを提供した。デサチュラーゼ構築物を表１６にまとめる。
【０６３１】
[00598]  構築物はＰｍｅｌ制限酵素を用いて直鎖化し、宿主株ＳＰＶ３００に直接形質転換した。形質転換体はＸＰＲ２挿入ジャンクションの外側でｐＴＥＦプロモーターの内部のプライマーを用いるチェックＰＣＲによって検証した。
【０６３２】
[00599]
【表２１】
2020124206.tif 000079
【０６３３】
プラスミド消化
[00600]  約１０μｇの凍結乾燥ＤＮＡをＧｅｎｓｃｒｉｐｔに発注した。ＤＮＡを５０μＬの水に再懸濁して最終濃度を約２００ｎｇ／μＬとした。１０μＬのＤＮＡを１．２５μＬの１０倍ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒおよび１．２５μＬのＰｍｅｌ制限酵素と混合した（反応容積12.5μL）。反応物をＰＣＲ装置内、３７℃で１．５時間インキュベートし、６５℃、３０分で熱不活化した。
【０６３４】
形質転換
[00601]  ＳＰＶ３００コンピテント細胞を、バッフル付きフラスコ中、０．００１ＯＤでＹＰＤ培養を接種し、０．５〜１．０ＯＤまで増殖させることによって増殖させた。細胞を８００×ｇで収穫し、０．２５倍容積の酵母用Ｚｙｍｏ  Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキットの溶液１で洗浄した。細胞を１０００倍濃度のオリジナル培養容積で溶液２に再懸濁し、スチロフォーム容器で断熱しながら−８０℃でゆっくりと凍結した（凍結細胞は新鮮細胞よりも良好な形質転換効率を有し得る）。最初に５０μＬの細胞を１２．５μＬの消化反応液と混合し（クリーンアップは不要）、次いで５００μＬの溶液３と混合した。形質転換物を２８℃で３時間、振盪せずにインキュベートし、その後、完全形質転換混合物を適当な選択的寒天培地にプレートした。コロニーが現われるまでペトリ皿を３〜４日インキュベートした。
【０６３５】
チェックＰＣＲ
[00602]  形質転換コロニーを採取してＰＣＲプレート中の７μＬの水に移した。５μＬの細胞をマルチチャネルでパッチして選択的オムニトレイに移し、一夜増殖させた。残った２μＬの細胞を２分間マイクロウェーブにかけ、１５μＬのＰＣＲマスター混合物を加えた。
【０６３６】
【表２２】
2020124206.tif 000080
【０６３７】
[00603]  ＰＣＲサイクル
【０６３８】
【表２３】
2020124206.tif 000081
【０６３９】
コロニーパッチング
[00604]  陽性クローンを、アッセイ対照を含む２４ウェルフォーマットのＹＰＤオムニトレイに再パッチした。オムニトレイを２８℃で一夜増殖させ、バイオアッセイ培養を接種するために用いた。
【０６４０】
バイオアッセイ
[00605]  陽性の形質転換体（構築物あたりN=4クローン）を２４ウェル培養プレート中の１ｍＬのＹＰＤに接種し、２８℃、１０００ｒｐｍで振盪しながらＩｎｆｏｒｓ  ＨＴ  Ｍｕｌｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏで２４時間インキュベートした。細胞を８００×ｇでペレット化し、５μＬの基質（濃度約2g/L）を含むＳ２培地に再懸濁した。４８時間の生物変換の後、２５０μＬの培養物をガラスクリンプトップバイアルに採取した。
【０６４１】
Ｓ２培地
[00606]  ２ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｇ／Ｌペプトン、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ａａ、ＮＨ４なし１．７ｇ／Ｌ  ＹＮＢ、６０ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌグリセロール
【０６４２】
ＧＣ試料処理
[00607]  フロント入口／検出器
システム  ６８９０ＧＣ、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖ．Ｂ．０３．０２（341）
カラム  Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−２３  ３０ｍ×２５ｍｍ×２５μｍ
ランタイム＝１４．４分
入口  ヒーター＝２４０℃、圧＝９．０ｐｓｉ、全流量｛H2｝＝３６．２ｍＬ／分
キャリア  Ｈ２＠１．０ｍＬ／分、９．０ｐｓｉ、３５ｃｍ／秒
シグナル  データレート＝２Ｈｚ／０．１分
オーブン  １５０℃、１分
勾配  １２℃／分〜２２０℃、保持３分
勾配  ３５℃／分〜２４０℃、保持４分
平衡時間：２分
注入      スプリット、２４０℃
スプリット比−３０：１；２９．１ｍＬ／分
検出器    ＦＩＤ、２４０℃
Ｈ２＠３５．０ｍＬ／分、空気＠３５０ｍＬ／分
エレクトロメーター｛Litオフセット｝＠２．０ｐＡ
試料      注入体積＝１μＬ
【０６４３】
[00608]  バック入口／検出器
システム  ６８９０ＧＣ、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖ．Ｂ．０３．０２（341）
カラム  Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−２３  ３０ｍ×２５ｍｍ×２５μｍ
ランタイム＝１４．４分
入口  ヒーター＝２４０℃、圧＝９．８ｐｓｉ、全流量｛H2｝＝４０．１ｍＬ／分
キャリア  Ｈ２＠１．１ｍＬ／分、９．８ｐｓｉ、３８ｃｍ／秒
シグナル  データレート＝２Ｈｚ／０．１分
オーブン  １５０℃、１分
勾配  １２℃／分〜２２０℃、保持３分
勾配  ３５℃／分〜２４０℃、保持４分
平衡時間：２分
注入      スプリット、２４０℃
スプリット比−３０：１；３２．３ｍＬ／分
検出器    ＦＩＤ、２４０℃
Ｈ２＠３５．０ｍＬ／分、空気＠３５０ｍＬ／分
エレクトロメーター｛Litオフセット｝＠２．０ｐＡ
試料      注入体積＝１μＬ
【０６４４】
[00609]  ＴＭＳＨ：トリメチルスルホニウムヒドロキシド（メタノール中0.2mol/L）−ＶＷＲ  ＴＣＴ１５７６−０２５ＭＬ
【０６４５】
実施例５：脂肪酸メチルエステル（Z11-16FAME）前駆体のＺ１１−１６Ａｌｄへの変換
背景および論拠
[00610]  Ｚ１１−１６Ａｌｄは本開示における目的の活性成分（AI）の１つである。このＡＩの合成に関する研究開発は４つの主な領域、即ち１．バイオ触媒工学的操作、２．発酵プロセス開発、３．下流プロセス（DSP）開発（微生物で生産されたZ11-16前駆体の精製Z11-16FAMEへの変換）、４．ＦＡＭＥ前駆体の標的ＡＩ（アセテートまたはアルデヒド）への最終化学変換を中心としている。
【０６４６】
[00611]  ＤＳＰは、Ｚ１１−１６酸を含む微生物脂質をＺ１１−１６ＦＡＭＥに変換する工程、および引き続く蒸留による富化およびＺ１１−１６Ａｌｄへの化学変換を含む。粗Ｚ１１−１６ＦＡＭＥを得るための設計されたプロセスの説明を図１８に示す。最初に、それぞれのステージにおけるＤＳＰの複数の選択を探索した。最も効率的な方法およびそれぞれのステージにおける工業用設備との適合性を決定した。方法の選択を、フェロモンの全体の製造コストにおける推定コスト寄与に基づいても評価した。
【０６４７】
[00612]  この実施例はＺ１１−１６ＦＡＭＥ前駆体のＺ１１−１６Ａｌｄへの最終化学変換の概念の裏付けに集中している。
【０６４８】
結果
Ｚ１１−１６ＦＡＭＥの生成
[00613]  １．加熱殺滅発酵、および２．細胞の分離
[00614]  ＳＰＶ４５９の発酵培養を７０℃に加熱して３時間保ち、細胞および不活性リパーゼを加熱殺滅した。濾過の前に濾過助剤を加えた。Ｓｅｉｔｚフィルターケーシングにフィルタークロスを取り付けた。Ｓｅｉｔｚフィルターを満たして０．５ｂａｒの圧力を加えた直後、約２５０ｍＬの最初の濾液を集めて濾過を中止した。濁った濾液をＳｅｉｔｚフィルターに再び満たし、１ｂａｒのＮ２で濾過を継続した。
【０６４９】
[00615]  ３．押出し
[00616]  ケークを羽根に押し付け、ペレットを形成するため、発生中の酵母ペレットをスパチュラで掻き取った。
【０６５０】
[00617]  ４．乾燥
[00618]  乾燥は通気オーブン中で行なった。ペレットを金属トレイ上に均一に単層で分配し、通気オーブン中、３６℃で２０時間乾燥した。
【０６５１】
[00619]  ５．ＴＡＧ抽出、６．デブリ分離、７．蒸発
[00620]  ５００ｍＬの三口フラスコに６５ｇの細胞ペレットを入れ、機械的攪拌器、温度計、および還流凝縮器を取り付けた。３３０ｍＬのｎ−へプタンを加えた後、混合物を７０℃に加熱し、４０ｒｐｍで撹拌した。混合物を３時間７０℃に保った。最初の細胞濾過に用いた同じ２０ミクロンの濾布を用いて、まだ熱い混合物をＳｅｉｔｚ圧力フィルターを通して直接濾過した。最初の濾過の後、空の三口フラスコを５０ｍＬのｎ−へプタンで洗い出した。洗浄へプタンを用いてフィルターをフラッシュし、これを最初の濾液と同じフラスコに集めた。濾過の後、ペレットを前と同じフラスコに戻し、濾液を５０℃で減圧下に蒸発させた。抽出物の重量を測定し、ＧＣおよび酸価の分析のために抽出物の試料を取った。
【０６５２】
[00621]  第２の抽出工程のため、２５０ｍＬのｎ−ヘプタンを加え、混合物を１．５時間撹拌した。ワークアップおよびサンプリングは第１の抽出工程と同じであった。第３の抽出を、抽出時間を２時間に延長したことを除いて第２の抽出とほぼ同じに行なった。
【０６５３】
[00622]  ８．エステル化、９．エステル交換反応、１０．分離／蒸発、１１．乾燥
[00623]  ５００ｍＬの三口フラスコに１７．３６ｇのＴＡＧ抽出物および１００ｍｌのメタノールを入れ、機械的攪拌器、温度計、および還流凝縮器を取り付けた。０．５０６ｇのｐ−トルエンスルホン酸モノハイドレート（2.66mmol）を加えた後、混合物を６０℃（設定温度60℃、実温度53.8℃）に加熱し、１８０ｒｐｍで撹拌した。最終温度に到達した後、撹拌を２４０ｒｐｍに増加し、３ｍＬのトリメチルオルソアセテート（23.57mmol）を加えた。反応をＴＬＣで監視した。６０分後、ＴＬＣは全てのパルミチン酸の残りが変換されたことを示した。１ｍＬのナトリウムメトキシド溶液（メタノール中25%、4.36mmol）を加える前に、２ｍＬのトリメチルオルソアセテート（15.71mmol）をさらに加えた。混合物をさらに８０分撹拌し、ＴＬＣで監視した。全てのＴＡＧが変換された後、０．４ｍＬの酢酸で反応を停止させた。混合物を１００ｍｌのｎ−ヘプタンで抽出した。有機相を分離し、水相をさらに２０ｍＬのｎ−ヘプタンで抽出した。有機相を合わせて３０ｍＬのｄＨ２Ｏで洗浄した。有機相を真空で濃縮した。
【０６５４】
[00624]  １２．蒸留
[00625]  １００ｍＬの丸底フラスコに３０ｇの粗ＦＡＭＥを満たした。ポットの内容物に磁気撹拌棒を入れた。留出物を分画収集するため、フラスコにＶｉｇｒｅｕｘカラムを取り付け、ミクロ蒸留可変還流蒸留ヘッドを連結した。蒸留ヘッドに温度計、冷却器、収集フラスコ、および真空ラインを取り付けた。装置を断熱した。蒸留は約５００ｍｔｏｒｒの減圧下、２５０℃までの温度で行なった。種々の分画を集めてＧＣで分析した。
【０６５５】
還元
[00626]  簡単には（Bazant, V.ら、「Properties of sodium-bis-(2-methoxyethoxy) aluminiumhydride. I. Reduction of some organic functional groups.」、Tetrahedron Letters 9.29 (1968): 3303-3306）および（筆者不明（2014））のプロトコルに基づき、乾燥した三口フラスコに滴下ロート、磁気撹拌棒、およびセプタムを取り付けた。フラスコをアルゴンでパージした後、フラスコを氷浴に入れた。フラスコに１０ｍＬの無水テトラヒドロフランと２．３６ｇのＺ１１−１６ＦＡＭＥ（純度約70%）を入れた。滴下ロートに２０ｍＬの無水テトラヒドロフランと３．１３ｍＬ（21.98mmol）のトルエン中６０％のＳＭＥＡＨ試薬を入れた。混合物を０℃に冷却した後、ＳＭＥＡＨ溶液を３０分かけて滴下した。ＳＭＥＡＨを加えた後、氷浴を置き換えて混合物を４時間撹拌した。５ｍＬの１０％硫酸で反応を停止させ、生成物を２０ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで２回抽出した。有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮した。
【０６５６】
Ｚ１１−ヘキサデセノールのＺ１１−ヘキサデセナールへのＴＥＭＰＯ漂白酸化
[00627]  ５０ｍＬの緩衝溶液（10.08gのNaHCO3、15.3gのNa2HPO4、および1.44gのNaH2PO4を500mLのH2Oに溶解、pH=7.8）を含む２５０ｍLのガラスビーカーに、硫酸水素テトラブチルアンモニウム（TBAH）（407mg）、２．８９ｇのＺ１１−ヘキサデセノール（純度54.3%）を含む３０ｍＬのトルエン、および１ｍＬのＨＯ−ＴＥＭＰＯ溶液（トルエン中207mg/mL）を加えた。混合物をＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーで４０００ｒｐｍ、３０秒撹拌し、その後、２５ｍＬの４．４％漂白溶液（pH8.58）を、シリンジポンプを通して９０秒で加えた。撹拌しながら、反応液の温度およびｐＨを８分にわたって監視した。８分の撹拌後、５５０μＬの濃ＨＣｌを加えて反応液を中和し、測定ｐＨを７．０６とした。反応混合物を分液ロートに移してトルエンで抽出した。有機層を集めて真空で濃縮した。
【０６５７】
[00628]  Ｚ１１−ヘキサデセノール出発物質のＧＣ−ＦＩＤトレースを図１９に示す。
【０６５８】
[00629]  酸化反応の経過にわたるｐＨおよび温度を以下に示す。
【０６５９】
【表２４】
2020124206.tif 000082
【０６６０】
[00630]  酸化生成物のＧＣ−ＦＩＤトレースを図２０に示す。
【０６６１】
[00631]
反応結果を以下に示す。
【０６６２】
【表２５】
2020124206.tif 000083
【０６６３】
[00632]  生成物濃度の計算
【０６６４】
[00633]
【数１】
2020124206.tif 000084
【０６６５】
[00634]  １−テトラデカノール内部標準に基づく較正曲線
【０６６６】
【表２６】
2020124206.tif 000085
【０６６７】
[00635]  分析
[00636]  全ての試料はＪ＆Ｗ  ＤＢ−２３カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣで分析した。漂白酸化試料の分析のため、以下の温度プログラムを用いた。１００℃で１分、勾配５℃／分で２００℃まで、３分保持、勾配３５℃／分で２４０℃まで、１０分保持。他の全ての試料はＫＯＨ／Ｈ２ＳＯ４で誘導体化し、以下のプログラムで分析した。１５０℃で１分、勾配１２℃／分で２２０℃まで、３分保持、勾配３５℃／分で２４０℃まで、４分保持。
【０６６８】
実施例６：改善されたＺ１１−１６酸生産株
背景および論拠
[00637]  Ｚ１１特異的昆虫デサチュラーゼの小さなライブラリーのスクリーニングによって、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａのバリアントが１６酸基質におけるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｈ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦバックグラウンドで最も活性が高いと同定された（実施例3参照）。Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼの３つのインテグラントをスクリーニングし、ＳＰＶ４５８、ＳＰＶ４５９、およびＳＰＶ４６０として株データベースに保存した。最初のスクリーニングでＳＰＶ４５９は姉妹株ＳＰＶ４５８およびＳＰＶ４６０よりも高いタイターを生産し、さらなるプロセス開発のために選択された。ＳＰＶ４５９もさらなる株の工学的操作のために最初に選択されたが、選択マーカーは株から安定に除去できなかった。ＳＰＶ４５８は株の工学的操作の目的のためにＳＰＶ４５９を置き換えるように選択され、マーカーはＳＰＶ４５８から成功裡にレスキューされた。全部で２２種のプラスミド構築物をＳＰＶ７３９に挿入し、マーカーはＳＰＶ４５８のデセンダントをレスキューした。Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼのさらなるコピーを有する株は、増加したＺ１１−１６酸タイターを生産した。これらの株のうち４つを、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ小スケールアッセイおよびＤＡＳＧＩＰ  １Ｌ発酵器における改善された性能について評価した。さらなるデサチュラーゼコピーを有する株は、そのＳＰＶ４５８親株よりも良好に機能したが、ＳＰＶ４５９を上回ることはなかった。これらの結果に基づいて２つの株、ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ９６９をさらなる工学的操作のために選択した。これらの２つの株をマーカーレスキューし、追加のＤＮＡカセットを挿入して、Ｚ１１デサチュラーゼの２つまたは３つのコピーを有し、キーとなる脂質代謝遺伝子を欠落した株の小さなライブラリーを作製した（図21）。
【０６６９】
[00638]  Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒアッセイを改善するため、さらにいくつかの変更を行なった。一般には１Ｌスケールで株の性能は予測できるが、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒアッセイではより低い細胞密度と最大のタイターが観察された。細胞密度を増加し、タイターを向上させ、発酵性能との相関を改善するため、発酵バッチプロセスｖ１．１（SOP026.2）で用いたセミデファインド培地を選択した。現在の発酵プロセスも３２℃のインキュベーション温度を使用している。新たな培地を用いて２８℃と３２℃の温度を比較した。最後に、現在の発酵供給バッチプロセスは高グリセロール濃度と低グルコース濃度の初期バッチ相を採用している。６０ｇ／Ｌのグリセロールと４０ｇ／Ｌのグルコースを用いる代替のＢｉｏｌｅｃｔｏｒバッチ培地を試験した。
【０６７０】
[00639]  脂質動員遺伝子の遺伝子欠落とＺ１１−１６酸デサチュラーゼのさらなるコピーの挿入によって、改善されたＺ１１−１６酸Ｂｄ（バイオデサチュレーション）株を同定した。
【０６７１】
[00640]  共基質組成（グリセロールとグルコースの濃度）の相違に対する改善されたＺ１１−１６酸Ｂｄ株の応答を検討した。
【０６７２】
アプローチ
[00641]  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａデサチュラーゼ（配列番号1のアミノ酸配列、配列番号20のコドン最適化ヌクレオチド配列）またはＳｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ  Ｚ１１デサチュラーゼ（配列番号2のアミノ酸配列、配列番号39のコドン最適化ヌクレオチド配列）のいずれかを発現する直鎖状ＤＮＡカセットを、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｈ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（SPV298）誘導株に多数の遺伝子座で挿入した。
【０６７３】
[00642]  得られた株をＭ２Ｐ  Ｌａｂｓ  Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ中の４８ウェルフラワープレートを用いる７００μｌ生物変換でアッセイした。
【０６７４】
[00643]  ２つのインキュベーション温度、２８℃および３２℃を試験した。
【０６７５】
[00644]  株のサブセットについて２つの培地組成を試験した。培地はグルコースとグリセロールの含量を除いて同一であった。両方の培地は硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない１．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、３．３ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、および８．５ｍｇ／Ｌの硫酸鉄を含んでいた。全体で２０ｇ／Ｌの１６ＭＥ（メチルパルミテート）を２つの１０ｇ／Ｌボーラスとして加えた。共基質濃度は以下の通りであった。
[00645]  高グルコース一次培地：１２０ｇ／Ｌのグルコースおよび５ｇ／Ｌのグリセロール
[00646]  高グリセロール培地：４０ｇ／Ｌのグルコースおよび６０ｇ／Ｌのグリセロール
[00647]  増殖速度、Ｚ１１−１６酸の比生産性、最大のＺ１１−１６酸のタイター、およびＺ１１−１６酸の選択性を、株の間で比較した。
【０６７６】
[00648]  選択性は以下のように定義される。
【０６７７】
【数２】
2020124206.tif 000086
【０６７８】
[00649]  ここでｇ１６酸Ｓは未変換の基質であり、ｇ１６酸Ｉは内部化され、トリアシルグリセリドまたは別の細胞内脂質として貯えられる１６酸である。
【０６７９】
結果
[00650]  第１世代の対照ＳＰＶ４５８およびＳＰＶ４５９に加えて、９種の第２および第３世代の株を試験した。全ての構築物は、Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼの１コピーおよび第１世代のデサチュラーゼライブラリー（DSTg1）で同定されたＳ．ｉｎｆｅｒｅｎｓ  Ｚ１１デサチュラーゼの１コピーを含むＳＰＶ１０６０を除いて、Ｈ．ｚｅａ  Ｚ１１デサチュラーゼのコピーを含んでいた（実施例4参照）。いくつかの株は脂質代謝におけるキー遺伝子、ＦＡＴ１（脂肪アシルCoAシンセターゼ/脂肪酸トランスポーター）、ＴＧＬ３（細胞内トリアシルグリセロールリパーゼ）、およびＧＵＴ２（グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）の欠落をも含んでいた。Ｇｕｔ２ｐデヒドロゲナーゼはグリセロール利用経路における第２の反応を触媒し、グリセロール−３−ホスフェートをＤＨＡＰに変換する。高濃度のグリセロールの存在下で増殖したＧＵＴ２ノックアウトは、異化作用を異常調節することがある高濃度のグリセロール−３−ホスフェートの蓄積を起こす可能性がある。これは第２世代の株のスクリーニングにおいて観察された。この増殖阻害を避けるため、グリセロールを含まない培地中でＧＵＴ２欠落株を増殖させた（材料および方法参照）。
【０６８０】
[00651]  高グルコース培地における２８℃と３２℃の培養温度の比較（HSD036、HSD043、HSD055、HSD056、およびHSD061）
[00652]  増殖速度
[00653]  高グルコース培地中、２８℃と３２℃の両方で、５つの独立した実験を行ない、生物変換を試験した。１１種の株全てを少なくとも１つの温度条件で試験した。初期増殖速度は遺伝子型に関わらず同様であった（図22A）。２８℃で増殖速度は０．２１〜０．２３ｈ−１であった。３２℃ではいくつかの株で増殖速度はやや速く、全体の範囲は０．２３〜０．２４ｈ−１であった。ＨＳＤ０４３で用いたグリセロールなしの高グルコース培地でインキュベートした株はより遅い速度（０．１３〜０．１４ｈ−１）で増殖し、５ｇ／Ｌのグリセロールでも増殖速度に顕著な好影響を与え得ることを示した（図23）。
【０６８１】
[00654]  比生産性
[00655]  高グルコース培地中で、最大の比生産性（gZ11-16酸/L/OD-h）は、２３時間における最初のサンプリングで観察された（基質添加は7時間目）。いくつかの場合では、特に３２℃では、比生産性はその後の時点も保持されていた。２８℃では、ＳＰＶ４５８から誘導された第２および第３世代の株の両方は、ＳＰＶ４５９よりも高い比生産性を示した（図22B）。最初の２つのデサチュラーゼコピーについては、デサチュラーゼのコピー数に対する比生産性のほぼ直線的な依存性（約2mg/L-OD-h-コピー数）が観察された。第３のデサチュラーゼコピーを添加すると比生産性が少し増加する。
【０６８２】
[00656]  ３２℃では、ＳＰＶ１０５６、ＳＰＶ１１９９、およびＳＰＶ１２００の３株を除いて全ての株でより高い比生産性が観察された（図22B、図24B）。これら３株は全て、Ｈ．ｚｅａデサチュラーゼの３コピーを有する株であり、全てＦＡＴ１欠落を含んでいる。ＳＰＶ１１９９とＳＰＶ１２００はＴＧＬ３欠落を含む同一の遺伝子型を有しているが、それぞれ個別の系統、ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ９６９から誘導されている（図21）。観察された低下はＦＡＴ１の欠落の存在のみによるものではない。それは、ＳＰＶ１０５６およびＳＰＶ１１９９の親株であるＳＰＶ９６８がＦＡＴ１の欠落を含んでおり、３２℃でより高い平均比生産性を示すからである（図22B、図24B）。比生産性のデサチュラーゼコピー数への同じ直線的依存性が３２℃で観察された（図24B）。勾配は約２．５（mg/L-OD-h-コピー数）に増加した。
【０６８３】
[00657]  Ｚ１１−１６酸タイター
[00658]  最大のＺ１１−１６酸タイターが、最後の４８時間のサンプリングで持続的に観察された。最大の比生産性は４８時間のタイターとほぼ相関する（図25A）。生産性がどの程度持続するかの変動によってデータが散らばる。
【０６８４】
[00659]  ＴＧＬ３の欠落を含むＳＰＶ９６９系統の３株はより長く生産性を持続し、タイターが高くなった（図22C）。ＳＰＶ９６９は３２℃で５．０６±０．１７ｇ／Ｌを生産した。３つのＨ．ｚｅａデサチュラーゼコピーを有する株ＳＰＶ１０５８は一貫して生産性を持続し、観察された最大のタイター、２８℃で５．７９±０．０１ｇ／Ｌ、３２℃で６．１±０．０８ｇ／Ｌを生産した。ＳＰＶ９６９の第２のデセンダントであるＳＰＶ１０５９はＴＧＬ３およびＧＵＴ２の両方の欠落を含んでいた。グリセロールなしの高グルコース培地で培養すると、ＳＰＶ１０５９の単一反復はシールの目詰まりによる低酸素にならずに生存し、５．３９ｇ／Ｌのタイターに達した（シールの目詰まりの説明については材料および方法を参照）。
【０６８５】
[00660]  株ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６は２８℃でＳＰＶ９６９系統における株と同様の最大比生産性を示したが、生産性はより急速に減少し、４８時間のタイターはそれぞれ２．２７±０．０７ｇ／Ｌおよび３．０９±０．２３ｇ／Ｌとなった。３２℃では生産性はより長く持続し、最終タイターはより高くなった。ＳＰＶ９６８は３．５５±０．２２ｇ／ＬのＺ１１−１６酸を生産した。ＳＰＶ１０５６は３２℃で３．８０±０．０９ｇ／Ｌの最終４８時間タイターに達した。対照のＳＰＶ４５９は２８℃で２．３６±０．０３ｇ／Ｌ、３２℃で３．７０±０．３３ｇ／Ｌを生産した（図22C）。
【０６８６】
[00661]  選択性および脂質含量
[00662]  株の性能を評価するために４８時間における選択性も用いた。上で定義したように、選択性は、バイオ触媒が他の脂肪酸生成物に対してどれほど選択的にＺ１１−１６酸を生産するか、および１６酸基質がどの程度良好に生成物に変換されるかの両方を示す。大部分の株について、選択性は３２℃で高かった（図26A）。天然の脂肪酸タイターは両方の温度で一貫しており、比較的低いので、これは一次的には１６酸からＺ１１−１６酸への変換が持続していることによる。結果として、選択性はＺ１１−１６酸タイターとほぼ相関する（図25B）。大部分の株について、選択性は２３時間と４８時間とで比較的一定であった（図25C）。２８℃では、複数のデサチュラーゼコピーを有する第２および第３世代の株はＳＰＶ４５９よりも有意に高い選択性を示した。ＳＰＶ１０５８およびＳＰＶ１０５９について最大の選択性は約５９％で観察された（図26A）。３２℃では選択性の差異が減少し、ＳＰＶ４５９では４５％のＺ１１−１６酸、ＳＰＶ１０５８では再び５９％であった（図26A）。
【０６８７】
[00663]  ＯＤ６００吸光度によって細胞密度を測定した一方、中程度に肥満したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞についての係数０．７８ｇＤＣＷ／Ｌ−ＯＤを用いて吸光度を乾燥細胞重量（DCW）に変換することによって、バイオマスの脂質分画を推定した。脂肪酸タイターの合計をこの乾燥細胞重量濃度のこの推定値で割ることによって、脂質分画を計算した。一般には、これらの推定した脂質分画は４８時間で全細胞重量の３０％〜４０％になった。ＳＰＶ９６９およびＳＰＶ１０５８は３２℃で最大の脂質分画、それぞれ４４％および４３％を有していた（図26B）。ＳＰＶ４５９およびＳＰＶ１０５６の両方は３２℃でより低い脂質分画を有していた（図26B）。逆に、ＳＰＶ１０５８は３２℃でやや高い分画を生産した（図26B）。
【０６８８】
[00664]  脂質分画は測定された他のパラメーターとは独立に制御されているようであり、全脂質貯蔵が独立して調節されていることを示している。この仮説は、ＤＡＳＧＩＰ発酵器の実験でＳＰＶ４５９が１６酸を取り込み、最初に１６酸とＺ１１−１６酸の組合せを貯蔵した後に１６酸分画をＺ１１−１６酸にさらに変換するという観察と一致している。Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒアッセイにおいて、Ｚ１１−１６酸の生産性と最終脂質分画との間に観察された相関はなく、Ｚ１１−１６酸への増大した流束は脂質貯蔵に影響しないことを示している（図25F）。脂質分画はまた、試験した株についてＺ１１−１６酸のタイターとよく相関しない（図25Dおよび図25E）。上述のように、脂質分画は全ての株について同様で、Ｚ１１−１６酸のタイターにおける相違は一次的には１６酸のＺ１１−１６酸への変換の程度の関数である。Ｚ１１−１６酸のタイターのさらなる増加は、細胞の脂質含量を増加させることによって達成できよう。
【０６８９】
[00665]  ２８℃における高グルコース培地と高グリセロール培地の性能の比較（HSD062）
[00666]  実験ＨＳＤ０６２において、一次高グルコース培地を、ＳＰＶ４５９を用いる現在の供給バッチ発酵プロセスのバッチ相で用いた高グリセロール培地と比較した（培地組成については材料および方法を参照）。高グルコース培地と高グリセロール培地の唯一の相違は、グルコースとグリセロールの共基質の濃度であった。高グルコース培地は１２０ｇ／Ｌのグルコースと５ｇ／Ｌのグリセロールを含む一方、高グリセロール培地は４０ｇ／Ｌのグルコースと６０ｇ／Ｌのグリセロールを含む。実験ＨＳＤ０６２における初期増殖速度は高グルコース培地と高グリセロール培地で同様であった（図27）。
【０６９０】
[00667]  比生産性
[00668]  比生産性は株、培地、および時点の関数として変化した。高グルコース培地中のＳＰＶ４５９の２３時間の試料に用いたウェルはシールの目詰まりによって失われ、比生産性の正確な測定ができなかった。高グリセロール条件での２３時間における比生産性は高グルコース値で以前に観察されたものより低かった（2.4±0.1mg/L-OD-h）（図28A）。初期比生産性が低いにも関わらず、ＳＰＶ４５９は高グリセロール培地で後にＺ１１−１６酸の生産が増加した。４１．５時間の時点で計算した比生産性は、高グリセロール培地で４．２±０．２ｍｇ／Ｌ−ＯＤ−ｈ、高グルコース培地で２．１±０．５ｍｇ／Ｌ−ＯＤ−ｈであった（図28B）。
【０６９１】
[00669]  高グルコース培地で以前に観察されたように、ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６は生物変換の初期により高い比生産性を有していた（図28A）。高グルコース培地と比較すると、両方の株は高グリセロール培地中でより低い初期比生産性を有していたが、４１．５時間の時点までこの低い生産性を持続していた（図28Aおよび図28B）。
【０６９２】
[00670]  Ｚ１１−１６酸のタイター
[00671]  上述の比生産性パターンにより、Ｚ１１−１６酸のタイターは株および培地によって変動した。ＳＰＶ４５８およびＳＰＶ４５９は高グリセロール培地中でより多くのＺ１１−１６酸を生産したが、ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６のタイターは両方の培地で同様であった（図28C）。
【０６９３】
[00672]  選択性および脂質含量
[00673]  選択性および脂質含量の培地に対する依存性は株によっても変動した。Ｚ１１−１６酸のタイターの有意な相違にも関わらず、ＳＰＶ４５９の選択性は２つの培地で等価であった（図28D）。ＳＰＶ４５８の選択性は高グリセロール培地で３５％高い一方、Ｚ１１−１６酸のタイターは５６％高かった（図28Dおよび図28C）。Ｚ１１−１６酸の選択性におけるより僅かな増加が、ＳＰＶ９６８（17%）およびＳＰＶ１０５６（6%）で観察された（図28D）。
【０６９４】
[00674]  ＳＰＶ４５９は高グリセロール培地中でより高いタイターの１６酸、Ｚ９−１８酸、およびＺ９Ｚ１２−１８酸を蓄積し、高グルコース培地について観察されたＺ１１−１６酸の選択性とタイターとの相関は高グリセロール培地には持ち越されなかった。株ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６は、高グリセロール培地中で１６酸の蓄積を低減させる一方、Ｚ９−１８酸およびＺ９Ｚ１２−１８酸のタイターを増加させることによって同様の選択性を保っていた（図29）。
【０６９５】
[00675]  推定した脂質含量における傾向は、Ｚ１１−１６酸のタイターおよび選択性に関する観察と一致していた。高グリセロール培地におけるＳＰＶ４５９およびＳＰＶ４５８の推定脂質含量は、それぞれ９５％および５６％高かった（図28Ｅ、図30）。ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６は両方の培地中で同様の脂質含量を蓄積した。
【０６９６】
要旨
[00676]  まとめると、これらの結果は、ＳＰＶ４５９およびＳＰＶ４５８におけるより高い１６酸の取り込み速度はデサチュラーゼの基質のより高い細胞内濃度およびその結果としてより高いＺ１１−１６酸のタイターをもたらすという仮説を支持している。ＳＰＶ９６８およびＳＰＶ１０５６は高グリセロール培地中で増加した１６酸を蓄積せず、これらの株において取り込み速度がグリセロールおよびグルコースの濃度に依存しないことと一致していた。ＳＰＶ９６８とＳＰＶ１０５６の両方はＦＡＴ１欠落を有しており、これは培地の変更に影響されないことを説明するものであろう。ＦＡＴ１は脂質動員に関連する脂質体／ペルオキシソーム脂肪酸輸送体として同定されている（Dulermo, R., Gamboa-Melendez, H., Ledesma-Amaro, R., Thevenieau, F., & Nicaud, J. M. (2015) Unraveling fatty acid transport and activation mechanisms in Yarrowia lipolytica. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 1851(9): 1202-1217）。いかなる１つの理論にも縛られるわけではないが、Ｆａｔ１ｐはある条件下では培地依存的に異なった様式で異なった膜を標的として、脂肪酸の取り込みに寄与している可能性がある。或いは、これは細胞内の脂肪酸の活性化に寄与し得る。全ての株における天然Ｃ１８脂肪酸の増加は、高グリセロール培地中におけるｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸合成またはＣｏＡ伸長の速い速度を支持している。
【０６９７】
[00677]  一次高グルコース培地中で増殖した主な株の生産性、最大タイター、および選択性を以下の表１７に示す。データからいくつかの重要な観察が得られる。
【０６９８】
[00678]  ２８℃において比生産性はデサチュラーゼのコピー数とともに増加する。増加は非線形であり、第３のデサチュラーゼコピーの添加により僅かな増加が観察される。
【０６９９】
[00679]  インキュベーション温度を２８℃から３２℃に上昇すると、大部分の株において比生産性が増加する。例外はＳＰＶ１０５６、ＳＰＶ１１９９、およびＳＰＶ１２００である。これらの株は全てＨ．ｚｅａデサチュラーゼの３つのコピーおよびＦＡＴ１の欠落を有している。
【０７００】
[00680]  Ｚ１１−１６酸のタイターは一般にデサチュラーゼのコピー数とともに増加する。ＴＧＬ３欠落株であるＳＰＶ９６９およびＳＰＶ１０５８は４８時間で最大のタイター（5〜6g/L）を生産した。
【０７０１】
[00681]  Ｚ１１−１６酸のタイターは全ての株にわたって３２℃でより高い。
【０７０２】
[00682]  選択性はＺ１１−１６酸のタイターと相関する。最大の再現可能な選択性はＳＰＶ１０５６（0.57±0.02）およびＳＰＶ１０５８（0.59±0.01）で観察された。
【０７０３】
[00683]
【表２７】
2020124206.tif 000087
【０７０４】
[00684]  実験ＨＳＤ０６２では、２８℃で高グルコースおよび高グリセロール培地条件におけるＳＰＶ４５９、ＳＰＶ４５８、ＳＰＶ９６８、およびＳＰＶ１０５６の性能を比較した（表18）。
【０７０５】
[00685]  高グリセロール培地で培養すると、ＳＰＶ４５８およびＳＰＶ４５９はより高い全脂肪酸タイター（それぞれ7.8および10.6gTFA/L）、Ｚ１１−１６酸タイター（2.1および3.8gZ11-16酸/L）、および脂質分画（0.47および0.52gZ11-16酸/gTFA）を示した。
【０７０６】
[00686]  ＳＰＶ９６８およびＳＰ１０５６は高グルコース培地中、最初の２３時間でより高い比生産性を示した。全体の性能はＳＰＶ１０５６では両方の培地で同様で、ＳＰＶ９６８では高グルコース培地の方が良好であった。
【０７０７】
[00687]
【表２８】
2020124206.tif 000088
【０７０８】
[00688]  一次高グルコース培地中で増殖した全ての株の観察された比生産性、推定された比生産性、最大タイター、および選択性を以下の表１９に示す。
【０７０９】
[00689]
【表２９】
2020124206.tif 000089
【０７１０】
結論
[00690]  高グルコース培地中：
[00691]  Ｚ１１デサチュラーゼの追加的なコピーはＺ１１−１６酸の比生産性を増加させた。
[00692]  脂質代謝の欠落はＺ１１−１６酸のタイターを増加させた。
【０７１１】
[00693]  ＳＰＶ１０５８における追加的なデサチュラーゼコピーと細胞内リパーゼＴＧＬ３の欠落の組合せは、ＳＰＶ４５９（3.7g/L、3.7mg/L-OD-h）と比較してＺ１１−１６酸のタイターの約６５％の増加（6.1g/L）および比生産性の約５５％の増加（5.7mg/L-OD-h）をもたらした。
【０７１２】
[00694]  高グリセロール培地への変更の影響は株によって異なる。ＳＰＶ４５９およびＳＰＶ４５８は、７００μｌスケールで高グルコース培地と比較して高グリセロール培地で有意により高いＺ１１−１６酸タイターを生産する。ＳＰＶ１０５６は両方の培地で同様に機能する。
【０７１３】
[00695]  ＳＰＶ１０５６および／またはＳＰＶ１０５８はプロセス開発のための第２世代の株として役立つであろう。
【０７１４】
[00696]  第２世代のプロセスの開発では共基質組成を考慮に入れる。
【０７１５】
[00697]  脂肪酸の貯蔵量（gTFA/gDCW）を増加するため、組換えアシルトランスフェラーゼ発現を試験する。現在の株はＢｉｏｌｅｃｔｏｒ  ７００μｌアッセイで４０〜５０％の脂肪酸を示す。
【０７１６】
材料および方法
[00698]  Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ株スクリーニング生物変換
[00699]  Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株をＹＰＤ寒天パッチから接種し、２ｍｌのＹＰＤシード培養で、２８℃、１０００ｒｐｍでＯＤ６００＝１０まで１６時間増殖させた（Inforsプレートインキュベーター）。シード培養をペレット化し、新鮮なＹＰＤ中でＯＤ６００＝８０まで濃縮した。Ｍ２Ｐｌａｂｓ４８ウェルフラワープレートで、１．５〜２．５％の接種を用いて新鮮な培地をシードした。３２℃で６００μｌと７００μｌの体積の両方を試験した実験ＨＳＤ０６１を除いて、一般には７００μｌの体積を用いた。ＧＵＴ２欠落と対照株がグリセロールなしの高グルコース培地を用いた実験ＨＳＤ０４３および高グリセロール培地中で株を培養した実験ＨＳＤ０６２を除いて、一般には高グルコース培地を用いた（下の表20）。Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ中、２８℃または３２℃、１５００ｒｐｍで７時間増殖させた後、プレートを取り出し、８．４μｌの３７℃のメチルパルミテートを液体としてそれぞれのウェルに加え、プレートを再シールし、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒに戻した。接種後２３時間でＡ列とＢ列から２５０μｌの試料を取り出し、ガラスクリンプトップＧＣバイアルに移した。試料バイアルを凍結し、−８０℃に保存した。サンプリングの後、追加の８．４μｌの３７℃メチルパルミテートをそれぞれのウェルに加えた。フラワープレートシールを戻してさらに８時間インキュベートした（31時間の時点）。次いでＡ列およびＢ列について述べたようにＣ列およびＤ列からサンプリングした。次いでプレートを１７時間インキュベートし（48時間の時点）、Ｅ列およびＦ列から試料を取り出した。それぞれのサンプリングにおいてＴｅｃａｎ  Ｍ２００  Ｐｒｏプレートリーダーで細胞密度を測定した。ＨＳＤ０６２は、３１時間で試料を取り出さず、接種の４１．５時間後にＣ列〜Ｆ列から４つの反復試料を取り出したことを除いて上述のように行なった。
【０７１７】
[00700]  全ての実験において、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒプレート上の酸素感受性オプトードを用いて溶存酸素（DO）を監視した。いくつかの実験の反復は、プレートシールを目詰まりさせるバイオフィルムによる低酸素条件のために失なわれた（たとえば図31A〜図31Eを参照）。ＤＯデータに基づけば、目詰まりは変化し、増殖速度およびＺ１１−１６酸の生産の摂動の程度を変化させる可能性がある。酸素移動が持続した反復データのみを分析に用いた。全てのデータのプロットを図３１Ａ〜図３１Ｅに示す。
【０７１８】
[00701]
【表３０】
2020124206.tif 000090
【０７１９】
[00702]  ＧＣ試料処理−凍結乾燥試料
[00703]  ２５０μＬの培養液を開放ガラスクリンプトップバイアル中で少なくとも３時間、凍結乾燥した。５００μＬのＴＭＳＨをバイアルに加え、クリンプキャップでシールした。これらのバイアルをラックに並べ、２５０ｒｐｍで２時間、２８℃のプレートシェーカーに入れた。これらの乾燥細胞と誘導体化試薬とを混合した後、バイアルを８５℃で１時間、ヒートブロック中でインキュベートして細胞膜を溶解させた。最後に、メチル化した試料の液体部分を、ＧＣ分析の間に固体デブリがカラムを目詰まりさせることを防止するためのガラスインサートとともに清潔なＧＣバイアルに移した。ＰＲＯＶＩＶＩ＿００２＿ＤＵＡＬ＿ＥＸＴＲＡＷＡＳＨ＿１．Ｍ法を用いるＧＣ−ＦＩＤで試料を測定した。そのパラメーターを以下に示す。
【０７２０】
[00704]  フロント入口／検出器
システム  ６８９０ＧＣ、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖ．Ｂ．０３．０２（341）
カラム  Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−２３  ３０ｍ×２５ｍｍ×２５μｍ
ランタイム＝１４．４分
入口  ヒーター＝２４０℃、圧＝９．０ｐｓｉ、全流量｛H2｝＝３６．２ｍＬ／分
キャリア  Ｈ２＠１．０ｍＬ／分、９．０ｐｓｉ、３５ｃｍ／秒
シグナル  データレート＝２Ｈｚ／０．１分
オーブン  １５０℃、１分
勾配  １２℃／分〜２２０℃、保持３分
勾配  ３５℃／分〜２４０℃、保持４分
平衡時間：２分
注入      スプリット、２４０℃
スプリット比−３０：１；２９．１ｍＬ／分
検出器    ＦＩＤ、２４０℃
Ｈ２＠３５．０ｍＬ／分、空気＠３５０ｍＬ／分
エレクトロメーター｛Litオフセット｝＠２．０ｐＡ
試料      注入体積＝１μＬ
【０７２１】
[00705]  バック入口／検出器
システム  ６８９０ＧＣ、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖ．Ｂ．０３．０２（341）
カラム  Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−２３  ３０ｍ×２５ｍｍ×２５μｍ
ランタイム＝１４．４分
入口  ヒーター＝２４０℃、圧＝９．８ｐｓｉ、全流量｛H2｝＝４０．１ｍＬ／分
キャリア  Ｈ２＠１．１ｍＬ／分、９．８ｐｓｉ、３８ｃｍ／秒
シグナル  データレート＝２Ｈｚ／０．１分
オーブン  １５０℃、１分
勾配  １２℃／分〜２２０℃、保持３分
勾配  ３５℃／分〜２４０℃、保持４分
平衡時間：２分
注入      スプリット、２４０℃
スプリット比−３０：１；３２．３ｍＬ／分
検出器    ＦＩＤ、２４０℃
Ｈ２＠３５．０ｍＬ／分、空気＠３５０ｍＬ／分
エレクトロメーター｛Litオフセット｝＠２．０ｐＡ
試料      注入体積＝１μＬ
【０７２２】
[00706]  ＴＭＳＨ：トリメチルスルホニウムヒドロキシド（メタノール中0.2mol/L）−ＶＷＲ  ＴＣＴ１５７６−０２５ＭＬ
【０７２３】
[00707]
【表３１−１】
2020124206.tif 000091
【０７２４】
【表３１−２】
2020124206.tif 000092
【０７２５】
【表３１−３】
2020124206.tif 000093
【０７２６】
【表３１−４】
2020124206.tif 000094
【０７２７】
【表３１−５】
2020124206.tif 000095
【０７２８】
【表３１−６】
2020124206.tif 000096
【０７２９】
【表３１−７】
2020124206.tif 000097
【０７３０】
【表３１−８】
2020124206.tif 000098
【０７３１】
【表３１−９】
2020124206.tif 000099
【０７３２】
【表３１−１０】
2020124206.tif 000100
【０７３３】
【表３１−１１】
2020124206.tif 000101
【０７３４】
【表３１−１２】
2020124206.tif 000102
【０７３５】
【表３１−１３】
2020124206.tif 000103
【０７３６】
【表３１−１４】
2020124206.tif 000104
【０７３７】
【表３１−１５】
2020124206.tif 000105
【０７３８】
【表３１−１６】
2020124206.tif 000106
【０７３９】
【表３１−１７】
2020124206.tif 000107
【０７４０】
【表３１−１８】
2020124206.tif 000108
【０７４１】
【表３１−１９】
2020124206.tif 000109
【０７４２】
【表３１−２０】
2020124206.tif 000110
【０７４３】
[00708]  以上の詳細な説明は理解を明確にするためにのみ提示され、当業者には改変は明白であるので、それから不必要な制限を理解すべきではない。
【０７４４】
[00709]  本開示をその特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる改変が可能であり、本出願は一般に本開示の原理に従い、本開示が関連する技術の範囲内にある既知のまたは慣習的な実施に含まれ、およびこれまでに説明した本質的な特徴および以下に添付した特許請求の範囲に適用することができる本開示からの逸脱を含む本開示の任意の変形、使用、または適応を包含することを意図していることが理解されよう。
【０７４５】
参照による組み込み
[00710]  本明細書に引用した全ての参考文献、論文、出版物、特許、特許公開、および特許出願は、全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【０７４６】
[00711]  しかし、本明細書に引用したいずれの参考文献、論文、出版物、特許、特許公開、および特許出願の言及も、これらが有効な先行技術を構成し、または世界のいずれの国でも普遍的な一般的知識の一部を形成することを認めるものでも、いかなる形態でも示唆するものでもなく、そのように受け取るべきでもない。
【図１】
2020124206.tif 000111
【図２】
2020124206.tif 000112
【図３】
2020124206.tif 000113
【図４】
2020124206.tif 000114
【図５】
2020124206.tif 000115
【図６】
2020124206.tif 000116
【図７】
2020124206.tif 000117
【図８】
2020124206.tif 000118
【図９】
2020124206.tif 000119
【図１０】
2020124206.tif 000120
【図１１】
2020124206.tif 000121
【図１２】
2020124206.tif 000122
【図１３】
2020124206.tif 000123
【図１４】
2020124206.tif 000124
【図１５】
2020124206.tif 000125
【図１６】
2020124206.tif 000126
【図１７】
2020124206.tif 000127
【図１８】
2020124206.tif 000128
【図１９】
2020124206.tif 000129
【図２０】
2020124206.tif 000130
【図２１】
2020124206.tif 000131
【図２２−１】
2020124206.tif 000132
【図２２−２】
2020124206.tif 000133
【図２３】
2020124206.tif 000134
【図２４】
2020124206.tif 000135
【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
2020124206.tif 000138
【図２７】
2020124206.tif 000139
【図２８−１】
2020124206.tif 000140
【図２８−２】
2020124206.tif 000141
【図２９】
2020124206.tif 000142
【図３０】
2020124206.tif 000143
【図３１−１】
2020124206.tif 000144
【図３１−２】
2020124206.tif 000145
【図３１−３】
2020124206.tif 000146
【図３２】
2020124206.tif 000147
【配列表】
2020124206000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月28日(2020.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
１つまたは複数の不飽和脂質部分の生産のために、配列番号１、２、３２、３４および３６〜３８からなる群から選択される脂肪アシルデサチュラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むように操作されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物において前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）にエステル化するおよび／またはエステル交換する工程；ならびに
前記１つまたは複数のＦＡＡＥを還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【請求項２】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物が、
（ｉ）ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ（ＰＯＸ１）、ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ（ＰＯＸ２）、ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ（ＰＯＸ３）、ＹＡＬＩ０Ｅ２７６５４ｇ（ＰＯＸ４）、ＹＡＬＩ０Ｃ２３８５９ｇ（ＰＯＸ５）、ＹＡＬＩ０Ｅ０６５６７ｇ（ＰＯＸ６）からなる群から選択される１つまたは複数のアシルＣｏＡオキシダーゼ；
（ｉｉ）ＹＡＬＩ０Ｆ０９６０３ｇ（ＦＡＤＨ）、ＹＡＬＩ０Ｄ２５６３０ｇ（ＡＤＨ１）、ＹＡＬＩ０Ｅ１７７８７ｇ（ＡＤＨ２）、ＹＡＬＩ０Ａ１６３７９ｇ（ＡＤＨ３）、ＹＡＬＩ０Ｅ１５８１８ｇ（ＡＤＨ４）、ＹＡＬＩ０Ｄ０２１６７ｇ（ＡＤＨ５）、ＹＡＬＩ０Ａ１５１４７ｇ（ＡＤＨ６）、ＹＡＬＩ０Ｅ０７７６６ｇ（ＡＤＨ７）からなる群から選択される１つまたは複数の（脂肪）アルコールデヒドロゲナーゼ；
（ｉｉｉ）（脂肪）アルコールオキシダーゼＹＡＬＩ０Ｂ１４０１４ｇ（ＦＡＯ１）；
（ｉｖ）脂肪アシルＣｏＡシンセターゼ／脂肪酸輸送体ＹＡＬＩ０Ｅ１６０１６ｇ（ＦＡＴ１）；および
（ｖ）細胞内トリアシルグリセロールリパーゼＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ（ＴＧＬ３）
から選択される１つまたは複数の内在性酵素の欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数のＦＡＡＥにエステル化するおよび／またはエステル交換する工程が、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を単離する工程；および
任意選択により特定の鎖長を有する１つまたは複数の不飽和脂質部分を濃縮する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
任意選択により濃縮される前記１つまたは複数の不飽和脂質部分が、（Ｚ）−３−ヘキセン酸、（Ｚ）−３−ノネン酸、（Ｚ）−５−デセン酸、（Ｅ）−５−デセン酸、（Ｚ）−７−ドデセン酸、（Ｅ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−８−ドデセン酸、（Ｚ）−９−ドデセン酸、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン酸、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｚ）−１１−テトラデセン酸、（Ｅ）−１１−テトラデセン酸、（Ｚ）−７−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエン酸、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｚ）−１３−オクタデセン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９，１２，１５−トリコサペンタエン酸およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程が、前記１つまたは複数のＦＡＡＥを１つまたは複数の化学量論的還元剤または触媒的な還元剤に接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化学量論的還元剤が、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムまたは水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪アルデヒドに酸化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酸化工程が銅触媒好気性酸化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化する工程が、前記１つまたは複数の脂肪アルコールを次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）および２，２，６，６−テトラメチルピペリジン  １−オキシル（ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つもしくは複数のＦＡＡＥを１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドに還元する工程が、１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の遷移金属触媒に接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の遷移金属触媒が１つまたは複数の第ＶＩＩＩ族触媒を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の脂肪アルコールを１つまたは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程が、前記１つまたは複数の脂肪アルコールをアシル化剤と接触させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アシル化剤が、無水酢酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物が外因性エロンガーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物が、１つまたは複数の望ましくない脂肪酸伸長経路に関与している１つまたは複数の内在性タンパク質の、欠落、破壊、突然変異、および／またはその活性の低減を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物がＭＡＴＡ  ｕｒａ３−３０２：：ＳＵＣ２  Δｐｏｘ１  Δｐｏｘ２  Δｐｏｘ３  Δｐｏｘ４  Δｐｏｘ５  Δｐｏｘ６  Δｆａｄｈ  Δａｄｈ１  Δａｄｈ２  Δａｄｈ３  Δａｄｈ４  Δａｄｈ５  Δａｄｈ６  Δａｄｈ７  Δｆａｏ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールを１つもしくは複数の対応する脂肪アルデヒドに酸化する工程；および／または
前記１つもしくは複数の脂肪アルコールを１つもしくは複数の対応する脂肪酢酸エステルに化学的に変換する工程；
をさらに含み、
前記１つもしくは複数の脂肪アルコール、１つもしくは複数の脂肪アルデヒドおよび／または１つもしくは複数の脂肪酢酸エステルが分離手順によりさらに濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数の不飽和脂質部分から１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むように操作されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ微生物において前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を生産する工程、
前記１つまたは複数の不飽和脂質部分を１つまたは複数の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）にエステル化するおよび／またはエステル交換する工程；ならびに
前記１つまたは複数のＦＡＡＥを水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム（Ｖｉｔｒｉｄｅ）で還元する工程であって、前記還元により１つもしくは複数の脂肪アルコールおよび／または１つもしくは複数の脂肪アルデヒドを生産する、工程
を含む方法。
【外国語明細書】
2020124206000001.pdf