(57)【要約】【課題】運動が制限される場合であっても、筋質の低下を予防し、また筋質を向上させることができ、無理のない程度の運動であっても、その効果を有効に増強させ得る筋質向上剤を提供する。【解決手段】フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、筋質向上剤とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、筋質向上剤。
【請求項２】
フコキサンチンの誘導体がフコキサンチノールである、請求項１に記載の筋質向上剤。
【請求項３】
フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を１ｎＭ〜１ｍＭ含有する、請求項１または２に記載の筋質向上剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の筋質向上剤を含有する、筋質向上用の医薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の筋質向上剤を含有する、筋質向上用の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運動の効果を高め、筋質を向上させ得る筋質向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化が進むのに伴い、メタボリックシンドローム（代謝症候群）、ロコモティブシンドローム（運動器症候群）、フレイル（健康な状態と要介護状態の中間の状態）といった身体機能の低下を伴う健康障害が社会問題となっている。
これに対して従来は、骨格筋量を増加させることを主眼に様々な取り組みが進められてきたが、骨格筋量の増加だけでは、筋力の回復には不十分であることが明らかになってきた。
また、これまでは、加齢による変化として捉えられていた筋肉の質、すなわち筋質の低下が、バランスの偏った食事や運動不足によっても惹起され、将来的には、ロコモティブシンドロームやフレイル等の深刻な状態に至ることがわかってきた。
かかる筋質の低下を改善し、または予防するには、運動が最も有効な手段であることが知られている。しかし、運動を行いたくても、加齢による身体機能の低下、疾患、負傷等による運動の制限等、種々の原因により、十分な運動を実施できないことも多い。
そこで、筋質の低下を予防し、また筋質を向上させることができ、無理のない範囲で実施できる運動であっても、その効果を有効に増強させ得る筋質向上剤の開発が望まれている。
【０００３】
ところで、昨今の健康志向の高まりにより、食品素材をはじめ可食性の成分に種々の生理活性を求める研究が進められている。
たとえば、褐藻類に含まれるカロテノイドであるフコキサンチンについて、脂肪の燃焼促進作用や抗腫瘍作用が報告され、糖尿病治療剤への応用も検討されている（特許文献１）。
しかしながら、フコキサンチンが筋質をはじめ筋肉の機能に及ぼす影響については、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３１４４５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、運動が制限される場合であっても、筋質の低下を予防し、また筋質を向上させることができ、さらに、無理のない程度の運動であっても、その効果を有効に増強させ得る筋質向上剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意検討した結果、フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上が、筋質の低下を予防し、または筋質を向上させる効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、筋質向上剤。
［２］フコキサンチンの誘導体がフコキサンチノールである、［１］に記載の筋質向上剤。
［３］フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を１ｎＭ〜１ｍＭ含有する、［１］または［２］に記載の筋質向上剤。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の筋質向上剤を含有する、筋質向上用の医薬。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載の筋質向上剤を含有する、筋質向上用の食品。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の筋質向上剤は、運動が制限される場合であっても、加齢等、種々の原因による筋質の低下を予防し、また、筋質を向上させることができる。さらに、無理のない程度の運動であっても、その効果を有効に増強させることができる。
従って、加齢による身体機能の低下や、疾患、負傷等による運動の制限等により、従来筋質を向上させるのに必要とされていた運動を実施することが困難な者においても、筋質の低下を予防し、筋質を向上させるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、試験例１において実施した筋インスリンシグナルの評価の概要を示す図である。
【図２】図２は、試験例１において、フコキサンチノールが筋インスリンシグナルに及ぼす影響を示す図である。
【図３】図３は、試験例２において、フコキサンチノールが筋ミトコンドリア機能に及ぼす影響を示す図である。
【図４】図４は、試験例３の実験スケジュールを示す図である。
【図５】図５は、試験例３において、運動およびフコキサンチンの摂取が筋肉量に及ぼす影響を示す図である。
【図６】図６は、試験例３において、運動およびフコキサンチンの摂取が筋力に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、筋質向上剤を提供する。
本発明の筋質向上剤（以下、本明細書において「本発明の剤」とも称する）は、フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する。
【００１１】
ここで、「筋質」とは、上述した通り、筋肉の質、つまり筋肉の状態を意味する。筋肉は、筋線維と、水、脂肪、結合組織等の筋線維をとりまく組織の集合体であり、筋質が良好であると評価される筋肉では、筋線維が密に存在し、筋線維をとりまく組織が少ない状態であるが、筋線維の数が減少し、または筋線維が細くなり、筋線維以外の組織の割合が増加すると、筋質が低下したと評価される。これに加えて、筋ミトコンドリア機能、筋肉のインスリン感受性、筋肉の炎症、脂質代謝、タンパク質合成などの筋肉の有する機能も筋質の要素である。たとえば、筋肉が衰えてくると、脂質代謝機能が低下して脂肪が溜まりやすくなり、筋ミトコンドリア機能や筋タンパク質合成機能が低下するが、かかる機能の低下によっても、筋質が低下したと評価される。
それゆえ、「筋質の低下の予防」とは、筋線維が減少すること、筋線維が細くなること、筋線維の周りの脂肪や結合組織が増加することを防ぎ、また、筋ミトコンドリア機能を維持すること、筋肉のインスリン感受性を維持すること、筋肉の炎症や、筋肉の脂質代謝機能、タンパク質合成機能の低下を防ぐことをいい、「筋質の向上」とは、筋線維を増加させ、または筋線維を太くして密な状態とし、筋線維の周りの脂肪や結合組織を減少させ、筋肉の炎症やインスリン感受性を改善し、筋ミトコンドリア機能や脂質代謝機能、タンパク質合成機能等、筋肉の本来の代謝的機能を向上させて筋肉を良好な状態とすることをいう。
本発明における「筋質向上剤」は、上記した筋質の低下を予防する機能を有するもの、または筋質を向上させる機能を有するもの、あるいはそれらの両方の機能を有するものをいう。
【００１２】
本発明の剤に有効成分として含有されるフコキサンチンは、（１Ｓ，４Ｓ，６Ｒ）−１−［（３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｅ，１３Ｅ，１５Ｅ）−１８−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−２，６，６−トリメチル−２−ヒドロキシ−４−アセトキシシクロヘキサン−１−イリデン］−３，７，１２，１６−テトラメチル−２−オキソ−３，５，７，９，１１，１３，１５，１７−オクタデカオクタエン−１−イル］−２，２，６−トリメチル−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン−４−オールであり、褐藻（Phaeophyceae）等の不等毛藻（Heterokontophyta）中に存在する非プロビタミンＡ類のカロテノイドの１種であり、キサントフィルに属し、アレン構造、エポキシドおよびヒドロキシ基を有する。
フコキサンチンの誘導体としては、フコキサンチンより化学的または生理学的に誘導される誘導体であれば特に限定されないが、フコキサンチンの代謝生成物であるフコキサンチノール等が好ましい例として挙げられる。
フコキサンチンは、褐藻等から抽出し、精製する方法等、公知の方法に従って製造して用いることができ、フコキサンチンの誘導体は、フコキサンチンより、化学的または生理学的に誘導する方法により、製造して用いることができる。また、各社より提供されている市販の製品を用いることもできる。
本発明の剤には、フコキサンチンおよびその誘導体からなる群より１種または２種以上を選択して、含有させることができる。
本発明の剤におけるフコキサンチンおよびその誘導体からなる群より選択される１種または２種以上（以下、本明細書にて「フコキサンチン等」ということがある）の含有量は、通常１ｎＭ〜１ｍＭであり、好ましくは５ｎＭ〜５００μＭであり、より好ましくは１０ｎＭ〜３００μＭである。
【００１３】
本発明の剤には、他の栄養成分や抗疲労剤を含有させることもできる。かかる栄養成分等としては、具体的には、グルコース、デキストラン等の糖質製剤、精製大豆油、精製卵黄レシチン等の脂肪乳剤、カゼイン、ホエイタンパク等のタンパク質製剤、カフェイン、ビタミン類、ミネラル類、ポリフェノール類等が挙げられる。
【００１４】
本発明の剤は、錠剤、被覆錠剤、チュアブル錠、丸剤、（マイクロ）カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、エリキシル剤、リモナーゼ剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、経口ゼリー剤等の経口製剤、溶液状、懸濁液状、乳液状等の注射剤、用時溶解または懸濁して用いる固形状の注射剤、輸液剤、持続性注射剤等の注射用製剤等の剤形とすることができる。
【００１５】
上記剤形の本発明の剤は、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により、調製することができる。
その際、必要に応じて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用添加剤を配合することができる。当該添加剤は、本発明の剤の剤形に応じて適宜選択することができるが、たとえば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、基剤、溶剤、希釈剤、溶解補助剤、可溶化剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、無痛化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、矯味剤、風味剤、甘味剤、香料、着色剤等が挙げられる。
【００１６】
具体的には、たとえば賦形剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、糖類（ラクトース等）、糖アルコール（マンニトール等）、カゼイン等が挙げられる。
結合剤としては、ゼラチン、澱粉、セルロースおよびその誘導体等が挙げられる。
崩壊剤としては、クロスポビドン、結晶セルロース等が挙げられる。
滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
被覆剤としては、メタクリル酸メチル・メタクリル酸ブチル・メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体等が挙げられる。
基剤としては、動物油、植物油、炭化水素油（流動パラフィン等）、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
溶剤としては、精製水、注射用水、一価アルコール（エタノール等）、多価アルコール（グリセリン等）等が挙げられる。
乳化剤または分散剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
安定化剤としては、アジピン酸、β−シクロデキストリン等が挙げられる。
粘稠剤としては、水溶性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等）、多糖類（アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、トラガント等）等が挙げられる。
無痛化剤としては、アミノ安息香酸エチル、クロロブタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール等が挙げられる。
等張化剤としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、生理食塩液等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、乳酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、α−トコフェロール、エリソルビン酸等が挙げられる。
防腐剤または保存剤としては、パラベン（メチルパラベン等）、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
矯味剤または風味剤としては、アスコルビン酸、エリスリトール、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム等が挙げられ、甘味剤としては、アスパルテーム、カンゾウエキス、サッカリン等が挙げられる。
香料としては、ｌ−メントール、ｄ−カンファー、シネオール等が挙げられる。
着色剤としては、タール色素（赤色２号、青色１号、黄色４号等）、無機顔料（ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄等）、天然色素（アナトー色素、ウコン色素、β−カロテン等）等が挙げられる。
【００１７】
本発明の剤の摂取量または投与量は、本発明の剤が適用される対象（以下、本明細書において「適用対象」ともいう）における筋質の状態または筋質低下の程度、性別、年齢、体重、剤形、投与方法等により適宜決定されるが、適用対象がヒト成人である場合、フコキサンチンに換算した量として、１日あたり、通常０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．００5ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００１８】
上記の１日あたりの摂取量または投与量は、１回で摂取させまたは投与してもよく、あるいは２回以上（たとえば、２〜５回）に分けて摂取させまたは投与することもできる。
【００１９】
本発明の剤の摂取または投与の時期は特に制限されず、食事の前または後、あるいは食事とともに摂取させまたは投与することができ、運動を実施させる場合は、運動開始前、運動中、運動終了後等のいずれの時期に摂取させまたは投与してもよい。
本発明の剤の摂取または投与の回数は特に制限されないが、筋質の向上を要する時に、少なくとも１回（１回または２回以上）である。
本発明の剤を摂取させまたは投与する回数が２回以上である場合、本発明の剤を摂取させまたは投与する期間（最初の摂取または投与から、最後の摂取または投与までの期間）は特に限定されないが、通常６時間〜４週間であり、より本発明の効果が発揮される観点から、好ましくは１日間〜２週間であり、より好ましくは３日間〜１週間である。
なお、本発明の剤に含有されるフコキサンチン等は、食経験の豊かな成分であり、安全性が高いため、本発明の剤は、連続して摂取させまたは投与することもできる。特に、筋質の低下を予防するためには、長期間（たとえば２週間以上）摂取させ、または投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の剤は、単位包装形態とすることができる。本明細書において「単位包装形態」とは、特定量（たとえば、１回あたりの摂取量等）を１単位とし、該１単位または２単位以上が一つの容器または包装体に収容された形態をいい、たとえば、１回あたりの摂取量を１単位とする単位包装形態は、「１回あたりの摂取量単位の包装形態」と称する。単位包装形態に用いられる容器または包装体は、本発明の剤の形態等に応じて適宜選択し得るが、たとえば、紙製の容器または袋体、プラスチック製の容器または袋体、パウチ、アルミ缶、スチール缶、ガラス瓶、ペットボトル、ＰＴＰ（press through pack）包装シート等が挙げられる。
【００２１】
本発明の剤の適用対象としては、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、サル等）や、鳥類（ニワトリ等）が挙げられる。なお、本発明の剤をヒト以外の適用対象動物（以下、単に「対象動物」ともいう）に適用する場合、本発明の剤の摂取量または投与量は、対象動物の種類、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。
【００２２】
本発明の剤は、運動が制限される場合であっても、加齢等、種々の原因による筋質の低下を予防し、また、筋質を向上させることができる。さらに、無理のない程度の運動であっても、その効果を有効に増強させることができる。
従って、本発明の剤は、加齢により身体機能が低下した高齢者、疾患、負傷等により運動が制限される者等、従来筋質を向上させるのに必要とされていた運動を実施することが困難な者において、筋質の低下の予防や筋質の向上に好ましく用いられる。
【００２３】
また、本発明の剤は、そのまま、またはさらに上記した賦形剤、溶剤、希釈剤等の添加剤を加えて、筋質向上用の医薬（以下、本明細書において「本発明の医薬」とも称する）とすることができる。
本発明の医薬におけるフコキサンチン等の含有量は、フコキサンチンに換算した量で通常０．０００１重量％〜１００重量％であり、好ましくは０．０００５重量％〜１００重量％であり、より好ましくは０．００１重量％〜１００重量％である。
本発明の医薬の投与量は、本発明の医薬が投与される患者の筋質低下の状態および程度、患者の年齢、性別、体重等により適宜定めることができるが、フコキサンチン等の投与量が、上記した１日あたりの投与量となるように設定することができる。
【００２４】
本発明の医薬は、第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等、製剤の分野で周知の製剤化手段により、製造することができる。
【００２５】
本発明の医薬は、高齢者、患者、要介護者等において、筋質の低下が認められ、または筋質の低下のおそれのある者に好適に投与され得る。
【００２６】
さらに、本発明の剤は、各種食品に添加して使用することができる。本発明の剤が添加される食品は特に制限されず、一般的に食事やデザート等に供される形態の食品であれば如何なるものでもよい。たとえば、本発明の剤を飲料に添加し、所望により適当な風味を加えて、ドリンク剤（たとえば、清涼飲料等）とすることができる。より具体的には、本発明の剤は、たとえば、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー、ヨーグルト、飴等に添加することができる。
【００２７】
本発明の剤は、１日に摂取される量の食品に対し、フコキサンチン等の摂取量が、上記した１日あたりの摂取量となるように添加され得る。
【００２８】
本発明はまた、本発明の剤を含有する、筋質向上用の食品（以下、「本発明の食品」ともいう）を提供する。
本発明の食品は、本発明の剤と、必要に応じて、製造用剤、増粘安定剤、ガムベース、乳化剤、保存料、酸化防止剤、光沢剤、ｐＨ調整剤、甘味料、苦味料、酸味料、着色料、香料等の食品添加物を含有し、あるいは、本発明の剤と、食品もしくは食品原材料とを含有し、たとえばジュース類、清涼飲料水、茶類等の飲料；乳酸菌飲料、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂乳等の乳製品；ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の畜肉製品；蒲鉾、竹輪、さつま揚げ等の魚肉練り製品；だし巻き、卵豆腐等の卵製品；クッキー、ゼリー、チューイングガム、キャンディー、スナック菓子、冷菓等の菓子類；その他パン類、麺類、漬物類、燻製品、干物、佃煮、塩蔵品、スープ類、調味料等、種々の形態で提供することができ、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルトパウチ食品とすることもできる。また、粉末状、顆粒状、シート状、カプセル状、タブレット状、ゼリー状等の形態とすることもできる。
【００２９】
本発明の食品は、筋質の低下のおそれのある、または筋質の向上の求められる高齢者、要介護者、患者等に好適に摂取させ得る。
また、本発明の食品は、高齢者ではないが筋質の低下の予防や筋質の向上を望む中・壮年者、介護は要しないが、疾患、負傷等のために運動の実施が制限される者等、筋質の向上を希望する者に幅広く摂取させることができる。
【００３０】
従って、本発明の食品は、筋質の低下の予防または筋質の向上用の特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の保健機能食品、病者用食品、高齢者用食品等の特別用途食品、健康補助食品等としても提供され得る。
【００３１】
さらに、本発明の剤を、濃厚流動食や、食品補助剤に添加して使用することも可能である。
「濃厚流動食」とは、１ｋｃａｌ／ｍＬ程度の濃度に調整され、長期間これのみを摂取する場合であっても、著しい栄養素の過不足が生じないように、各栄養素の質的構成が十分に考慮され、１日の栄養所要量をもとに設計された総合栄養食品（液体状食品）である。
本発明における「食品補助剤」とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなどもこれに含まれる。本発明の剤を食品補助剤に添加する場合、所望により他の栄養成分や添加剤を加えて、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。
【００３２】
上記した本発明の食品は、本発明の剤に、必要に応じて食品添加物を加えて、あるいは、食品または食品原材料中に本発明の剤を添加し、一般的な食品の製造方法を用いることにより、加工し、製造することができる。
【００３３】
本発明の食品におけるフコキサンチン等の含有量は、食品の種類もしくは形態、当該食品の摂取により期待される筋質向上効果の程度等に応じて適宜設定され得るが、食品の総重量に対し、フコキサンチンに換算した量として、通常０．０００１重量％〜１００重量％程度であり、好ましくは０．０００５重量％〜１００重量％程度であり、より好ましくは０．００１重量％〜１００重量％程度である。
【００３４】
また、本発明の食品の１日あたりの摂取量は、本発明の剤について上述した１日あたりの摂取量のフコキサンチン等を摂取できる量として設定され得る。
【００３５】
本発明はまた、本発明の剤、並びに、本発明の剤を筋質の向上に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージをも提供する。
【００３６】
さらに本発明は、筋質を向上させる必要のある対象動物の筋質の向上方法（以下、本明細書において「本発明の方法」ともいう）をも提供する。
【００３７】
本発明の方法は、筋質を向上させる必要のある対象動物に、当該対象動物の筋質を向上させるのに有効な量のフコキサンチン等を摂取させること、または投与することを含む。
【００３８】
本発明の方法における対象動物としては、ヒトおよび、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、サル等のヒト以外の哺乳動物、ならびにニワトリなどの鳥類が挙げられる。
ヒトの場合、本発明の方法は、筋質の低下が認められる者や、筋質の低下の予防または筋質の向上を望む者に対して幅広く適用することができるが、特に身体機能の低下の認められる高齢者や要介護者、疾患、負傷等により運動が制限される者等、十分な運動を実施することのできない患者等に好適に適用される。
本発明の方法におけるフコキサンチン等の摂取量または投与量は、対象動物の種類、年齢、体重、筋質の低下の状態、程度等に応じて適宜設定されるが、本発明の剤において、ヒトおよびヒト以外の対象動物について、上記した摂取量または投与量と同様の量を、上記した回数および期間にて摂取させまたは投与することができる。
さらに、本発明の方法におけるフコキサンチン等の摂取または投与の方法としては、経口摂取または経口投与、経腸経管投与、輸液による投与等が挙げられるが、医療機関にて医師の指導監督下に行う必要がなく、簡便に行うことができることから、経口摂取または経口投与が好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下、試験例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００４０】
［試験例１］筋インスリンシグナル低下に対するフコキサンチン誘導体の作用の検討
フコキサンチン誘導体として、フコキサンチンの代謝生成物であるフコキサチノールを用い、筋同化シグナルをインスリンシグナルでモニターし、そのインスリンシグナル低下に対するフコキサンチノールの作用を評価した。
評価は、下記の通り、マウス由来の筋細胞株C2C12に飽和脂肪酸を暴露させることにより、インスリンシグナル低下をもたらす評価系を用いて実施した。
【００４１】
（１）C2C12筋管細胞（Myotubes）への分化誘導
マウスC3H 骨格筋筋芽細胞（muscle myoblast）(C2C12)細胞(ＤＳファーマバイオメデカル株式会社)を用いて、本評価を実施した。
筋管細胞（Myotubes）への分化誘導は、筋芽細胞（Myoblasts）の継代数が１２〜１８である細胞を用いて行った。筋芽細胞（Myoblasts）を0.3×105〜0.5×105/wellの細胞数で１２ウェル(直径＝３ｃｍ)プレートに蒔種し、細胞増殖の状態が９０％コンフルーエントになったのを確認した後、２（ｗ／ｖ）％ ウマ血清 (ＨＳ)、１（ｗ／ｖ）％ ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培養液（２（ｗ／ｖ）％ＨＳ、１（ｗ／ｖ）％Ｐ／Ｓ、１（ｗ／ｖ）％Ｇｌｎ／ＤＭＥＭ）に交換し、筋管細胞（Myotubes）への分化を誘導した。筋管細胞（Myotubes）への分化を確認した後、筋インスリンシグナル評価系の構築、および構築した評価系を用いてフコキサンチノールの作用の評価を行った。
【００４２】
（２）筋インスリンシグナルの評価
筋インスリンシグナルの評価の概要を図１に示した。
筋管細胞（Myotubes）を用いて、０．５ｍＭのパルミチン酸（ＦＦＡ）／０．５（ｗ／ｖ）％アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ培養液中で一晩（１７時間〜２４時間）、３７℃にて、５（ｖ／ｖ）％二酸化炭素存在下で培養した。
一晩培養後、ＤＭＥＭ（ＢＳＡ／ＦＦＡ無添加）で約２時間プレインキュベーションし、１００ｎＭのインスリンによりインキュベーション（１５分間〜２０分間）して刺激した後、筋管細胞を回収した(各ｎ＝３)。回収した細胞から、ＲＩＰＡ（Radio-Immunoprecipitation Assay）バッファー（セルシグナリングテクノロジーズ社（Cell Signaling Technologies Inc.））によりタンパク質を抽出し、タンパク質の最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように調整し、試料とした。
上記試料について、リン酸化Ａｋｔ（pAkt）（Ser473）（# 9271S；セルシグナリングテクノロジーズ社（Cell Signaling Technologies Inc.）)、および全Ａｋｔ（total Akt）（#9272S；セルシグナリングテクノロジーズ社（Cell Signaling Technologies Inc.））の発現量を、ウエスタンブロッティング(ＷＢ)法で定量した。各タンパク質の発現量はウェスタンブロット−化学発光イメージングシステム（フージョン（Fusion）ＦＸ）（ヴィルバー−ルーマット社（Vilber-Lourmat Inc.））を用いて定量した。
各濃度のフコキサンチンはＦＦＡと同時に添加し、筋インスリンシグナルの回復を指標に、筋質向上効果を検討した。フコキサンチノールの最終濃度は１μＭ、３μＭおよび１０μＭになるように調整した。また、ポジティブコントロールとして、抗酸化活性物質であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）５ｍＭを用いた。
【００４３】
（３）評価結果
リン酸化Ａｋｔ（Ser473）および全Ａｋｔの発現量の測定結果から、インスリン刺激のない場合のリン酸化Ａｋｔと全Ａｋｔの比に対するインスリン刺激時のリン酸化Ａｋｔと全Ａｋｔの比［(pAkt/Total Akt) Insulin+]/[(pAkt/Total Akt) Insulin-]を求め、リン酸化指数（stimulation index）として図２に示した。図２中、リン酸化指数は、各試料について、平均値±標準誤差にて示した。
図２において、ＢＳＡを添加して培養した筋管細胞において、インスリン刺激によってＡｋｔのリン酸化の上昇が認められた。０．５ｍＭのＦＦＡを添加して培養した細胞では、インスリン刺激によるＡｋｔのリン酸化作用は抑制されており、筋インスリンシグナルの低下が示唆された。
一方、フコキサンチノールは、ＦＦＡによる筋インスリンシグナルの低下を、用量依存的に回復させることが認められた。また、フコキサンチノールは、ＮＡＣより低濃度で、ＮＡＣと同等以上の作用を示すことが認められた。
本試験例の結果から、フコキサンチンが筋インスリンシグナルの上昇をもたらす成分として有用である可能性が示唆された。
【００４４】
［試験例２］フコキサンチン誘導体の筋ミトコンドリア機能に対する作用の検討
フコキサンチン誘導体として、フコキサンチンの代謝生成物であるフコキサチノールを用い、筋ミトコンドリアの機能低下に対する作用を評価した。
評価は、マウス由来の筋細胞株C2C12を用い、下記の通り、飽和脂肪酸を暴露させることにより、骨格筋の質の変化として観察される筋ミトコンドリア機能の低下を、酸素消費量を指標として観察することにより実施した。細胞外酸素消費量は、細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４ (プライムテック株式会社)を用いて測定した。
【００４５】
細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４測定用プレート(ＦｌｕｘＰａｋ−ＸＦｅ２４ アッセイパック／ＰＳ：102340-100)に、C2C12筋芽細胞（myoblast）（1.8×104 cells/well/100μL）を播種し、３〜４日後に分化培地（２（ｗ／ｖ）％ＨＳ、１（ｗ／ｖ）％Ｐ／Ｓ、１（ｗ／ｖ）％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン）(35050-061、gibco)、０．３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）／ＤＭＥＭ）に交換して培養し、筋管細胞（Myotubes）に分化したことを確認した後、０．５ｍＭのパルミチン酸（ＦＦＡ）／０．５（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培養液中でさらに一晩（１７時間〜２４時間）培養し、筋ミトコンドリア機能の評価を実施した。
フコキサンチノールは、ＦＦＡと同時に、最終濃度が１００ｎＭとなるように添加した。
フラックスアナライザーＸＦｅ２４における筋ミトコンドリア機能の評価は、プライムテック社より提唱されている測定方法に準じて、３．０μＭのオリゴマイシン(ＡＴＰ合成酵素阻害剤；75351、シグマ（Sigma）社）、３．０μＭのカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）(脱共役剤；C2920、シグマ（Sigma）社）、０．５μＭのアンチマイシンＡ(ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤；A8674、シグマ（Sigma）社)、０．５μＭのロテノン(ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤；R8875、シグマ（Sigma）社）を順次添加し、酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定して行った。
【００４６】
評価結果は、図３に示した。図３中、ＯＣＲは各試料について、平均値±標準誤差にて示した。
図３において、ＦＣＣＰ添加後のＯＣＲ値と、アンチマイシンＡおよびロテノン添加後のＯＣＲ値から求められる筋ミトコンドリアの最大呼吸量は、０．５ｍＭのＦＦＡに暴露することにより低下した。一方、１００ｎｍのフコキサンチノールの添加により、低下した最大呼吸量の回復が認められた。
上記試験例の結果から、フコキサンチンは筋ミトコンドリア機能の低下を回復させる効果を有することが示唆された。
【００４７】
［試験例３］フコキサンチンの筋量および筋機能に対する作用の検討（in vivo評価）
フコキサンチンの摂取が、筋量および筋機能に及ぼす影響を、下記の通り評価した。
評価は、高脂肪食摂取によって筋量の低下や筋機能の低下を呈するモデル動物を用いて実施した。
６週齢の正常Sprague-Dawley（ＳＤ）雄性ラット（日本チャールス・リバー株式会社（神奈川）より購入）を馴化飼育し、９週齢の時点で表１に示す通り４群に分け、通常餌（Ｎｏｒｍａｌ）および３０重量％の脂肪を含む餌（ＨＦ）の各実験食の供与と、運動およびフコキサンチンの投与を開始した。フコキサンチンは、０．２重量％の含有量となるように餌に混ぜて供与した。
実験スケジュールを図４に示した。運動を行わせる群（ＨＦ／ＥＸ群およびＨＦ／ＥＸ＋Ｆｃｏ群）については、週に１回運動を実施した。
ＨＦ供与５週目の時点で、筋機能(筋力)の測定を行い、ＨＦ供与６週目に剖検し、筋重量を測定した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
運動は、ラットの左脚を用いて、局所のレジスタンス運動負荷を行って実施した。小動物用足関節運動装置（バイオリサーチセンター株式会社）に、イソフルラン麻酔下のラットを静置し、前脛骨筋に皮膚刺激電極を装着し、電気刺激により収縮させた。同時に前脛骨筋が収縮した方向とは反対方向へ牽引し、伸張負荷をかけた。運動負荷設定条件は以下の通りである。
（ｉ）収縮(電気)負荷条件：４ｍＡ〜５ｍＡ、１００Ｈｚ、１１００ｍｓｅｃ
（ｉｉ）伸張負荷条件：左脚関節の角度を９０°から１３５°へ速度＝１００ｄｅｇ／ｓｅｃにて伸張
（ｉｉｉ）運動負荷頻度および回数：１０秒毎に１０回を１セットとし、５セット繰り返して実施（合計５０回）、各セットごとに６０秒間の休憩をはさむ
【００５０】
筋力の測定は、小動物用足関節運動装置（バイオリサーチセンター株式会社）を用いて、イソフルラン麻酔下で行った。ラットの左脚関節と左膝関節の角度を９０°に固定し、固定した左前脛骨筋上に皮膚刺激電極を装着した。装着後、２．２ｍＡの電気刺激 (収縮刺激)に対する最大不随意筋力を筋力として算出した。
【００５１】
筋量（前脛骨筋の重量）の測定結果を図５に、２．２ｍＡの電気刺激 (収縮刺激)時の筋力の測定結果を図６に示した。各測定結果は、平均値±標準誤差にて示した。また、各測定結果について、Ｎｏｒｍａｌ群およびＨＦ／Ｖｅｈｉｃｌｅ群との間でチューキー−クラマー（Tukey-Kramaer）の検定を実施した。
図中、「＊」は、Ｎｏｒｍａｌ群との間にｐ＜０．０５にて有意差があることを示す。また、「＋＋」および「＋＋＋」は、ＨＦ／Ｖｅｈｉｃｌｅ群との間にそれぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１にて有意差があることを示す。
【００５２】
図５において、ＨＦ／Ｖｅｈｉｃｌｅ群の前脛骨筋（運動刺激部位）の相対的重量は、Ｎｏｒｍａｌ群に対し、有意に低下したことが認められた。一方、運動を行った群（ＨＦ／ＥＸ群）では、ＨＦ／Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べて筋重量が有意に増加したが、運動に加えてフコキサンチンを摂取させた群（ＨＦ／ＥＸ＋Ｆｃｏ群）では、筋重量がさらに増加したことが認められた。
【００５３】
図６において、ＨＦ／Ｖｅｈｉｃｌｅ群の筋力は、Ｎｏｒｍａｌ群に比べて低下し、筋機能が低下した可能性が示唆された。高脂肪食摂取による前記筋力の低下は、運動を行ったＨＦ／ＥＸ群で抑制される傾向が認められた。運動に加えてフコキサンチンを摂取させたＨＦ／ＥＸ＋Ｆｃｏ群では、高脂肪食の摂取により低下した筋力が有意に向上したことが認められ、運動に加えてフコキサンチンを摂取させることにより、低下した筋機能をより改善し得ることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上詳述したように、本発明により、運動が制限される場合であっても、加齢等、種々の原因による筋質の低下を予防し、また、筋質を向上させることができ、さらに、無理のない程度の運動であっても、その効果を有効に増強させることができる筋質向上剤を提供することができる。
本発明の筋質向上剤は、加齢による身体機能の低下や、疾患、負傷等により運動が制限される者等、従来筋質を向上させるのに必要とされていた運動を実施することが困難な者においても、筋質の低下の予防や筋質の向上に有効に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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