(57)【要約】【課題】本発明は、ヒト乾癬の個体での解析を可能にするモデル動物を確立することを目的とする。【解決手段】本発明は、ＣＡＲＤ１４遺伝子のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン内に変異部位を含む、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有する、ヒト乾癬モデルマウスである。また、上記変異部位が、ＣＡＲＤ１４遺伝子のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域に位置することが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異部位を含む、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有する、ヒト乾癬モデルマウス。
【請求項２】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を、ヘテロ接合型又はホモ接合型で有する、請求項１に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項３】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型ＣＡＲＤ１４タンパクにおけるアミノ酸配列の２５０番目〜４０９番目に対応する位置に変異を有する、請求項１又は２に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項４】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型ＣＡＲＤ１４タンパクにおける３４２番目のロイシンがプロリンとなる変異を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項５】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項６】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項７】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの特徴を有する遺伝子である、請求項１から３のいずれか１項に記載のヒト乾癬モデルマウス。
（ａ）ゲノム上でエキソン９の３３番目のＧからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８７＿１１９，３２６，３３４ｄｅｌ）（Δ２４８ｂｐ）、
（ｂ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，４０７ｄｅｌ）（Δ３１９ｂｐ）、
（ｃ）ゲノム上でイントロン８の途中からエキソン９の４５番目のＡまで欠失している（１１９，３２５，６３６＿１１９，３２６，０９９ｄｅｌ）（Δ４６４ｂｐ）、
（ｄ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴと３６番目のＣの間に９塩基（ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）の挿入がある（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，０９０ｉｎｓ  ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）、
（ｅ）ゲノム上でエキソン９の３４番目のＴから３９番目のＧまで６塩基欠失（１１９，３２６，０８８＿１１９，３２６，０９３ｄｅｌ）し、６５番目のＡがＧに置換（１１９，３２６，１１９Ａ＞Ｇ）している、
（ｆ）ゲノム上でイントロン７の途中から、エキソン８とイントロン８を含み、エキソン９の１１１番目のＧまでかけた塩基欠失がある（１１９，３２４，７３０＿１１９３２６１６５ｄｅｌ）（Δ１４３６ｂｐ）。
【請求項８】
マウスにおいて、ＣＡＲＤ１タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする遺伝子領域内に変異を導入する工程を有する、ヒト乾癬モデルマウスの作製方法。
【請求項９】
対立遺伝子ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡを持つＭ２ＢＢｒＡＭ２ＢＢｒＡ系統マウスのＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡの遺伝子座の、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異を導入する工程を有する、ヒト乾癬モデルマウスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト乾癬モデルマウス及びヒト乾癬モデルマウスの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト乾癬は代表的な慢性皮膚病の一種であり、最重症型である乾癬性紅皮症では致死となる可能性がある。日本人の発症率は約０．１％であるが、他の先進国では１．５〜５％の有病率であり、それぞれ増加傾向にある（非特許文献１及び公益法人日本皮膚科学会ＨＰ： https://www.dermatol.or.jp/ 参照）。感染性はないものの、繰り返す病徴と周囲の視線への意識から、当該疾病は社会的でまた個人のＱｏＬを深く障害する疾病であり、正しい知識の啓発が切望されている。ＷＨＯによれば、当該疾病はその発症機構も不明で、いまだに対症療法しかない。一方で、乾癬にはすでに４０を数える原因遺伝子座候補が挙げられ（非特許文献２参照）、複雑な発症機構の解析には、個体での解析を可能にするモデル動物が渇望されてきた。しかしながら満足な系統が存在しないのが現状である（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】WHO Global Report on Psoriasis, 2016 (World Health Organization, Geneva, Switzerland)
【非特許文献２】Tsoi, LC. et al., Enhanced meta-analysis and replication studies identify five new psoriasis susceptibility loci. Nat Commun. 6:7001., 2015
【非特許文献３】Michelle A. et al., Immunology of Psoriasis. Annu Rev Immunol. 32, 227-255., 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のような状況の中、本発明は、ヒト乾癬の個体での解析を可能にするモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、大規模突然変異体作製プロジェクトにより当初毛色変異体として記録されたマウスの解析の過程で、これらのマウスがヒト乾癬様の症状を呈することを見出し、ヒト乾癬モデルマウスの系統の樹立に成功した。さらに、ゲノム編集の技術を用い、複数のヒト乾癬モデルマウスの系統を樹立した。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
【０００６】
［１］ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインをコードする領域内に変異部位を含む、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有する、ヒト乾癬モデルマウス。
［２］上記変異部位が、ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域に位置する、［１］に記載のヒト乾癬モデルマウス。
［３］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を、ヘテロ接合型又はホモ接合型で有する、［１］又は［２］に記載のヒト乾癬モデルマウス。
［４］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型ＣＡＲＤ１４タンパクにおけるアミノ酸配列の２５０番目〜４０９番目に対応する位置に変異を有する［１］から［３］のいずれかに記載のヒト乾癬モデルマウス。
［５］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型における３４２番目のロイシンがプロリンとなる変異を有する、［１］から［４］のいずれかに記載のヒト乾癬モデルマウス。
［６］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を有する、［１］から［５］のいずれかに記載のヒト乾癬モデルマウス。
［７］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列を有する、［１］から［６］のいずれかに記載のヒト乾癬モデルマウス。
［８］変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの特徴を有する遺伝子である、［１］から［３］のいずれかに記載のヒト乾癬モデルマウス。
（ａ）ゲノム上でエキソン９の３３番目のＧからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８７＿１１９，３２６，３３４ｄｅｌ）（Δ２４８ｂｐ）、
（ｂ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，４０７ｄｅｌ）（Δ３１９ｂｐ）、
（ｃ）ゲノム上でイントロン８の途中からエキソン９の４５番目のＡまで欠失している（１１９，３２５，６３６＿１１９，３２６，０９９ｄｅｌ）（Δ４６４ｂｐ）、
（ｄ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴと３６番目のＣの間に９塩基（ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）の挿入がある（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，０９０ｉｎｓ  ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）、
（ｅ）ゲノム上でエキソン９の３４番目のＴから３９番目のＧまで６塩基欠失（１１９，３２６，０８８＿１１９，３２６，０９３ｄｅｌ）し、６５番目のＡがＧに置換（１１９，３２６，１１９Ａ＞Ｇ）している、
（ｆ）ゲノム上でイントロン７の途中から、エキソン８とイントロン８を含み、エキソン９の１１１番目のＧまでかけた塩基欠失がある（１１９，３２４，７３０＿１１９３２６１６５ｄｅｌ）（Δ１４３６ｂｐ）。
［９］マウスにおいて、ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする遺伝子領域内に変異を導入する工程を有する、ヒト乾癬モデルマウスの作製方法。
［１０］対立遺伝子ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡを持つＭ２ＢＢｒＡＭ２ＢＢｒＡ系統マウスのＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡの遺伝子座の、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異を導入する工程を有する、ヒト乾癬モデルマウスの作製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のヒト乾癬モデルマウスは、ヒト乾癬様の症状を呈することから、乾癬の発症や維持、周期的な病徴の基盤となる新しい分子機構の解明のために利用することができる。また、乾癬治療薬の開発において、薬剤のスクリーニング、個体での効果の確認、安全性の確認等のためにも有効であり大きな貢献が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡ／Ｍ２ＢＢｒＡホモ接合体（左）と同腹の野生型（右）マウスである。下図は前肢胴体部の拡大図である。
【図２】ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡ対立遺伝子の変異部位を模式的に示した図である。
【図３】ゲノム編集により得られたマウスの耳（Ｂ、Ｃ）を野生型（Ａ）と比較した図である。
【図４−１】Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ８系統のマウスの皮膚切片の組織染色像である。
【図４−２】Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ８系統のマウスの耳切片の組織染色像である。
【図５−１】Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２７系統のマウスの皮膚切片の組織染色像である。
【図５−２】Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２７系統のマウスの耳切片の組織染色像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明のヒト乾癬モデルマウス及びヒト乾癬モデルマウスの作製方法について詳細に説明する。
【００１０】
＜ヒト乾癬モデルマウス＞
本発明のヒト乾癬モデルマウスは、ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインをコードする領域内の、特にＣ末端側をコードする領域に変異部位を含む、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有する。本発明のヒト乾癬モデルマウスは、このような変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有することで、ヒトの乾癬と同様の症状を示すことから、ヒト乾癬モデルマウスとして使用することができる。なお、本発明のヒト乾癬モデルマウスは、上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子のヘテロ接合型であってもよいし、ホモ接合型であってもよい。
【００１１】
ＣＡＲＤ１４は、膜結合グアニレートキナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリーに属し、プラズマ膜の領域に特化してマルチタンパク質複合体のアセンブリを形成する分子足場として機能する分子として知られている。また、ＣＡＲＤ１４はＣＡＲＤファミリーに属しており、特定のカスパーゼリクルートメントドメイン（Caspase Recruitment Domain：ＣＡＲＤ）を有しており、ＢＣＬ１０との特異的相互作用及びＢＣＬのリン酸化、ＮＦ−κＢ活性化及び細胞アポトーシスの正の調節因子として機能することも知られている。また、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインも有している。
【００１２】
本発明のヒト乾癬モデルマウスが有する変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子における変異部位は、ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン内の、特にＣ末端側をコードする領域に存するが、ここでＣ末端側とは、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのうち、その中心よりＣ末端に近い領域をいい、マウスＣＡＲＤ１４タンパクのアミノ酸配列の２５０番目〜４０９番目の領域内であることが好ましく、２８０番目〜４００番目の領域内であることがより好ましく、２８０番目〜３５０番目であることがさらに好ましい。ここでの変異部位における変異とは、特定の塩基配列の欠失、付加、置換等を含む。このような変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
【００１３】
本発明のヒト乾癬モデルマウスの系統としては、特に限定されないが、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ等は好ましい系統として挙げられる。
【００１４】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の一例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＬＱＦＲＫＴＱＶＤＣＥＰＹ）をコードする塩基配列（配列番号２：ＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＡＣ）を有するものが挙げられる。野生型における対応する領域の配列は、それぞれ配列番号３（ＬＱＦＲＫＴＱＶＤＣＥＬＹ）、及び配列番号４（ＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＴＡＴＡＣ）で表される。即ち、ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型における３４２番目のロイシンがプロリンとなる変異を有するものである。
【００１５】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ３＿１）として、ゲノム上でエキソン９の３３番目のＧからイントロン９の途中まで欠失（１１９，３２６，０８７＿１１９，３２６，３３４ｄｅｌ）（Δ２４８ｂｐ）したものが挙げられる。
【００１６】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ３＿２）として、ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴからイントロン９の途中まで欠失（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，４０７ｄｅｌ）（Δ３１９ｂｐ）したものが挙げられる。
【００１７】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ４）として、ゲノム上でイントロン８の途中からエキソン９の４５番目のＡまで欠失（１１９，３２５，６３６＿１１９，３２６，０９９ｄｅｌ）（Δ４６４ｂｐ）したものが挙げられる。
【００１８】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ８）として、ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴと３６番目のＣの間に９塩基（ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）挿入（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，０９０ｉｎｓ  ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）があるため、Ｑ３３２とＦ３３３の間に３残基（ＬＴＶ）（ｐ．Ｑ３３２＿Ｆ３３３ｉｎｓＬＴＶ）が挿入されているものが挙げられる。
【００１９】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２１＿１）として、ゲノム上でエキソン９の３４番目のＴから３９番目のＧまで６塩基欠失（１１９，３２６，０８８＿１１９，３２６，０９３ｄｅｌ）し、６５番目のＡがＧに置換（１１９，３２６，１１９Ａ＞Ｇ）しているため、Ｆ３３３から２残基欠失し、かつＹ３４３Ｃとなっているものが挙げられる。
【００２０】
上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子の別の例（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２７）として、ゲノム上でイントロン７の途中からエキソン８とイントロン８を含み、エキソン９の１１１番目のＧまでかけた巨大な塩基欠失（１１９，３２４，７３０＿１１９３２６１６５ｄｅｌ）（Δ１４３６ｂｐ）があるものが挙げられる。
【００２１】
変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子のホモ接合型においては、致死を示すもの、生後１週間までは生存してその後死亡するもの、生後５日目や生後９〜１４日目に乾癬様症状が出てきて、その後も生存するものなど様々である。一方、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子のヘテロ接合型では、乾癬の症状は見られないものも一部あるが、生後７〜１０日で発症するもの、老齢になってから発症するもの、３〜４週で若干発症しその後消失するもの等がある。例えば、ホモ接合型で、生後５日目や生後９〜１４日目に乾癬様症状が出てきて、その後も生存するもの、ヘテロ接合型で生後７〜１０日で発症するもの、老齢になってから発症するもの等は、ヒト乾癬モデルマウスとして、非常に有用である。なお、生後１週間までしか生存しないホモ接合型のマウスの場合でも、胎生期及び生後１週間までのマウス胎児をヒト乾癬モデルマウスとして使用することも可能である。以上のとおり、本発明のヒト乾癬モデルマウスは、乾癬の様々な症状、ステージの疾患モデルとして有用である。
【００２２】
＜ヒト乾癬モデルマウスの作製方法＞
本発明のヒト乾癬モデルマウスの作製方法は、マウスにおいて、ＣＡＲＤ１４のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする遺伝子領域内に変異を導入する工程を有することを特徴とする。変異の導入は、常法に従い、当業者に公知の方法により行うことができる。中でも、ゲノム編集の技術を用い、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて、ＣＡＲＤ１４遺伝子内に所望の変異を導入する方法が好ましい。具体的には、対立遺伝子ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡを持つＭ２ＢＢｒＡＭ２ＢＢｒＡ系統マウスのＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡの遺伝子座の、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異を導入する工程を有する方法がより好ましい。
【００２３】
マウスの系統は特に限定されないが、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ等は好ましい系統として挙げられる。
【００２４】
本発明のヒト乾癬モデルマウスの作製方法は、上記変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を含むＤＮＡ断片、或いは変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を導入したベクターを、マウスの全能性細胞に導入する工程を有するものであってもよい。全能性細胞としては、例えば、受精卵、初期胚の他、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。ＤＮＡ断片又はベクターの細胞への導入の方法は特に限定されないが、例えばエレクトロポーレーション法等により行うことができる。
【００２５】
次いで、変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を導入した細胞を、レシピエントマウスの胚盤胞に移植する。発生した個体から、体細胞及び生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とする変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスを得ることができる。トランスジェニックマウスに変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が導入されていることを確認し、該マウスを正常マウスと交配し、Ｆ１マウスを得る。ヘテロ接合体は、選択された生殖系列キメラを同種の野生型と交雑することによって得られる、いわゆるＦ１動物から選択できる。ヘテロ接合体の選択は、例えば、Ｆ１動物より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定できる。
【００２６】
＜乾癬治療剤のスクリーニング方法＞
本発明は、上述の本発明のヒト乾癬モデルマウスを用いた乾癬治療剤のスクリーニング方法も含む。本発明のヒト乾癬モデルマウスは、ヒトの乾癬と同様の症状を呈するため、ヒト用の乾癬治療外用剤、乾癬治療内服剤の候補物質のスクリーニングに有用である。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
【００２８】
１．大規模突然変異体作製プロジェクトにより得られた毛色変異体マウスの解析
Ｍ２ＢＢｒＡは、旧理化学研究所ゲノム科学総合センター個体遺伝情報研究チーム（現：理研バイオリソースセンター新規変異マウス研究開発チーム）の“ＥＮＵに基づく遺伝子主導ｇｅｎｅ−ｄｒｉｖｅｎミュータジェネシス”という、大規模なプロジェクトから生まれてきた系統のマウスに対して、本発明者らが何代も交配を重ねて確立した系統である。
【００２９】
連鎖解析とエクソーム解析等により、このマウス変異系統の原因遺伝子のヒトオルソログが、これまで多数報告されているヒト乾癬原因候補遺伝子の有力な１遺伝子・ＣＡＲＤ１４であることが判明した。この変異体（系統名をＭ２ＢＢｒＡＭ２ＢＢｒＡその原因遺伝子をＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡとする）は、ホモ接合体において致死を示すものの、一部の個体は生後１週間まで生存した。そしてその個体は激しい乾癬症状を示すことがわかった（図１）。なお、この遺伝子はヒトではケラチノサイト（表皮角化細胞）で発現することが報告されており（Van Nuffel E. et al., CARD14-Mediated Activation of Paracaspase MALT1 in Keratinocytes, Implications for Psoriasis. J. Invest. Dermatol. 137, 569-575, 2017）、ケラチノサイトの過増殖による特徴的な激しい皮膚の肥厚と落屑を説明する。当該マウス変異体も、ホモ接合体により同様の表現型を再現できることから、新たなヒト乾癬モデル動物として乾癬発症機構の解析に利用することが可能であると考えられた。なお、本タンパク質には複数の機能ドメインが知られているが、当該マウスの変異部位はその中でタンパク質間の相互作用に関わるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末側をコードする領域に位置することが明らかとなった（図２）。
【００３０】
上記変異を有する領域は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＬＱＦＲＫＴＱＶＤＣＥＰＹ）を有し、これをコードする塩基配列は、配列番号２で表される（ＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＡＣ）。野生型における対応する領域の配列は、それぞれ配列番号３（ＬＱＦＲＫＴＱＶＤＣＥＬＹ）、及び配列番号４（ＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＴＡＴＡＣ）で表される。即ち、Ｍ２ＢＢｒＡＭ２ＢＢｒＡにおいては、ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型における３４２番目のロイシンがプロリンとなる変異を有する。
【００３１】
また、このマウスのＣＡＲＤ１４変異体のｃｄｓを常法に従って決定した（配列番号５）。
【００３２】
２．ゲノム編集によるヒト乾癬モデルマウス系統の樹立
この遺伝子座にゲノム編集により当該変異部位周辺に新たな変異を導入したところ、同様の乾癬症状を示す変異体が複数得られた。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法により、所望の変異体を作製した。
【００３３】
当該のゲノム編集マウス系統（Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ３、Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ４等）のＣＡＲＤ遺伝子変異部位と乾癬に関する表現型は表１のとおりである。またゲノム編集により得られたマウスに乾癬の症状が出ている様子を図３に示す。野生型（Ａ）に比して、ゲノム編集により得られたマウス（Ｂ、Ｃ）では、耳介に激しい乾癬様症状が見られた。
【００３４】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ３＿１では、エキソン９の３３番目のＧからイントロン９の途中まで欠失（１１９，３２６，０８７＿１１９，３２６，３３４ｄｅｌ）（Δ２４８ｂｐ）があるため、Ｑ３３２より後ろの配列が予測できない。もし発現するとすれば３３２Ｑより後の配列はＨＴＱＱＧＴＧＰＲＷＲＦＬＳＡＷＷＲＲＭＰＦＡＧＥＣＳＳ（Ｓｔｏｐ）となる。
【００３５】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ３＿２では、ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴからイントロン９の途中まで欠失（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，４０７ｄｅｌ）（Δ３１９ｂｐ）があるため、Ｑ３３２より後ろの配列が予測できない。もし発現するとすれば３３２Ｑより後の配列はＣＩＨＳＫＧＱＧＰＤＧＤＦＳＡＰＧＧＥＧＣＰＳＱＥＳＶＲＡＤＧＡＧＬ（Ｓｔｏｐ）となる。
【００３６】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ４では、ゲノム上でイントロン８の途中からエキソン９の４５番目のＡまでかけた欠失（１１９，３２５，６３６＿１１９，３２６，０９９ｄｅｌ）（Δ４６４ｂｐ）があるため、Ｑ３２１より後ろの配列が予測できない。ゲノムの配列が発現すれば３２２Ｙから３３６Ｔまでアミノ酸欠損となる。
【００３７】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ８では、ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴと３６番目のＣの間に９塩基（ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）挿入（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，０９０ｉｎｓ  ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）があるため、Ｑ３３２とＦ３３３の間に３残基（ＬＴＶ）（ｐ．Ｑ３３２＿Ｆ３３３ｉｎｓＬＴＶ）が挿入されている。Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ８マウスの皮膚切片、耳切片の組織染色像を野生型と比較した結果を図４−１（皮膚切片）及び図４−２（耳切片）に示す。
【００３８】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２１＿１では、ゲノム上でエキソン９の３４番目のＴから３９番目のＧまで６塩基欠失（１１９，３２６，０８８＿１１９，３２６，０９３ｄｅｌ）し、６５番目のＡがＧに置換（１１９，３２６，１１９Ａ＞Ｇ）しているため、Ｆ３３３から２残基欠失し、かつＹ３４３Ｃとなっている。
【００３９】
Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２７では、ゲノム上でイントロン７の途中からエキソン８とイントロン８を含み、エキソン９の１１１番目のＧまでかけた巨大な塩基欠失（１１９，３２４，７３０＿１１９３２６１６５ｄｅｌ）（Δ１４３６ｂｐ）があるため、Ｌ２８１より後ろの配列が予測できない。ゲノムの配列が発現すれば、２８２Ｖから３５８Ｑまでアミノ酸欠損となる。Ｍ２ＢＢｒＡｅｍ２７マウスの皮膚切片、耳切片の組織染色像を野生型と比較した結果を図５−１（皮膚切片）及び図５−２（耳切片）に示す。
【００４０】
上述のとおり、それぞれの変異系統は、ＣＡＲＤ１４Ｍ２ＢＢｒＡ変異部位の周辺に異なる塩基配列を持ち、その病徴もさまざまであり、ヒト乾癬モデルマウスとして有用である。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
ヒトでは、当該疾病を発症する当該ドメインの変異サイトは、ほとんどＮ末側をコードする領域に報告されている。最近、このＮ末端側のヒト変異サイトのマウス対応塩基をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてヒトと同じにした解析が始まったばかりであり、ヒトでの解析結果の再現性とより詳細な分子機構の解析が進められようとしている（Mellett M. et al., CARD14 gain-of-function mutation alone is sufficient to drive IL-23/IL-17-mediated soriasiform skin inflammation in vivo. J. Invest. Dermatol. doi: 0.1016/j.jid.2018.03.1525.,2018）。
【００４３】
ホモ接合体による致死効果からも、上記変異マウスは、当該変異部位と相互作用する重要な未知のタンパク質とその機序の解明を可能にする重要な実験モデルマウスとして貢献できる。当該遺伝子をゲノム編集して得た多くのファウンダーマウスは、ヘテロで当該の症状を示すもの、ホモにするとオリジナルの変異体同様激しい乾癬様症状を示して生後すぐに致死となるもの、ホモにおいても生存し、症状も示すもの等々、様々な系統に分離することができた。これらは全て同じドメインに異なる配列を持ち、当該疾病発症機構の詳細な解析に重要な資源となりうる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のヒト乾癬モデルマウスは、ヒト乾癬様の症状を呈することから、乾癬の発症や維持、周期的な病徴の基盤となる新しい分子機構の解明のために利用することができる。また、乾癬治療薬の開発において、薬剤のスクリーニング、個体での効果の確認、安全性の確認等のためにも有効であり大きな貢献が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異部位を含む、マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有し、上記マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子において、野生型ＣＡＲＤ１４タンパクにおける３４２番目のロイシンがプロリンとなる変異を有するヒト乾癬モデルマウス。
【請求項２】
ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異部位を含む、マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有し、上記マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を有する、ヒト乾癬モデルマウス。
【請求項３】
上記マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列を有する、請求項２に記載のヒト乾癬モデルマウス。
【請求項４】
ＣＡＲＤ１４タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインのＣ末端側をコードする領域内に変異部位を含む、マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子を有し、上記マウス変異型ＣＡＲＤ１４遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの特徴を有する遺伝子である、ヒト乾癬モデルマウス。
（ａ）ゲノム上でエキソン９の３３番目のＧからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８７＿１１９，３２６，３３４ｄｅｌ）（Δ２４８ｂｐ）、
（ｂ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴからイントロン９の途中まで欠失している（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，４０７ｄｅｌ）（Δ３１９ｂｐ）、
（ｃ）ゲノム上でイントロン８の途中からエキソン９の４５番目のＡまで欠失している（１１９，３２５，６３６＿１１９，３２６，０９９ｄｅｌ）（Δ４６４ｂｐ）、
（ｄ）ゲノム上でエキソン９の３５番目のＴと３６番目のＣの間に９塩基（ＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）の挿入がある（１１９，３２６，０８９＿１１９，３２６，０９０ｉｎｓＡＡＣＴＧＴＣＴＴ）、
（ｅ）ゲノム上でエキソン９の３４番目のＴから３９番目のＧまで６塩基欠失（１１９，３２６，０８８＿１１９，３２６，０９３ｄｅｌ）し、６５番目のＡがＧに置換（１１９，３２６，１１９Ａ＞Ｇ）している、
（ｆ）ゲノム上でイントロン７の途中から、エキソン８とイントロン８を含み、エキソン９の１１１番目のＧまでかけた塩基欠失がある（１１９，３２４，７３０＿１１９３２６１６５ｄｅｌ）（Δ１４３６ｂｐ）。