(57)【要約】【課題】優れたペプチドおよびタンパク質結合特性を備えたグラフトコポリマー賦形剤の生成の方法の提供。【解決手段】その生成物を化学的に完全に特徴付けることが困難であるセミランダムグラフトコポリマーを調製するプロセスが本明細書に提供されている。本開示の生成物は、１）ペプチドに結合すること、および２）生成物とペプチドとを動物へと同時投与する際に、本開示の生成物なしのペプチド単独の場合と比較して、生成物は、血液循環時間を延長し、ペプチドのレベルを上昇させるという独特で、有用な特性を有する。上記セミランダムグラフトコポリマーは、例えば、グルカゴン様ペプチド−１および／または心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびそれらの誘導体への結合に基づき選択され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
生理学的に活性なペプチドおよびタンパク質のための新規薬物製剤の開発は、生物学的活性を維持することに焦点があてられているが、これらでさえも、体内でのペプチドおよびタンパク質の本質的に短い半減期または不安定さにより制限されている。これは特に、約５ｎｍ未満の流体力学的径を有する小さなペプチドおよびタンパク質に当てはまる。急速に分解するペプチドもしくはタンパク質薬物を絶え間なく送達する注入デバイスを使用することによって、または皮膚下に、徐々に浸食される薬物デポーを提供することによって、体内でのペプチドおよびタンパク質のこのような短い半減期もしくは不安定さを緩和することが長きにわたって望まれてきた。体内および血液中でのペプチドおよびタンパク質の半減期を延ばす、および／または安定性を提供することができる賦形剤の開発は、研究の新規領域である。
【背景技術】
【０００２】
不安定な、または短い半減期の薬物を封じ込めるリポソームは、薬物が放出され得る前にリポソーム構造が分解されることに依存する。ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸粒子は、ポリマーの酵素分解に依存して薬物を放出する別の封じ込め技術である。薬物を封じ込めるよりむしろ結合するコポリマーをもたらす、２種またはそれ超のポリマーのセミランダムグラフトが行われた（米国特許出願第１１／６１３１８３号、１１／９７１４８２号、およびCastilloら、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁）。このようなコポリマーは、投与されるペプチドおよびタンパク質の血液安定性、半減期の延長、および血中レベルの持続性の上昇をもたらす（米国特許出願第１１／６１３１８３号、１１／９７１４８２号、およびCastilloら、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁）。
【０００３】
しかし、グラフトコポリマー生成物の製造プロセスおよび有効性を改善する能力（重量ベースでの、ペプチドに結合する能力）は、２種のポリマーが他のポリマーに、および互いに対してグラフトされる正確な構成、およびもしあるとすれば周期性を判定することができる技術が存在しないことにより制限される。コポリマー分子の成分の構成のプロセス誘発性決定因子が存在し、次いで、これが最終的なコポリマー生成物の組成および特性を規定するようにみえる。最終生成物の組成の構成は、既存の技術を使用して評価することができないので、生成物は、前記生成物を製造するために使用されたプロセス、および似ているが同一ではないプロセスを使用して作製された他の生成物から前記生成物を区別するその生成物に伴う特性によってのみ規定することができる。優れた生成物を作製するこのようなプロセスの識別は、生成物の原子の構成を明らかにする分析技術が欠如していること、および様々なプロセスの実験に依存していることから、それと分かるようなものではなく、最終生成物の有効性を評価することは、何年もの詳細な試行錯誤による実験を必要とし得る。最終生成物の組成の差異は、これらが作製されたプロセスにより規定され得るこれらの有効性によってのみ判定することができる。これは、ポリマーは大きく、共重合反応はランダムであり、反応が進行するにつれて、グラフトされているポリマーの立体構造が変化して、反応のタイムラインの任意の所与の瞬間における立体構造により決定される非ランダムな分布をもたらす可能性があるからである。この立体構造の変化は、ポリリジンに対して特に当てはまり、ポリリジンはアルファ螺旋から、ランダムコイル、ベータシートへと変化し、環境によっては逆もまた起こることが公知である（Arunkumarら、
１９９７年、Int.  J.  Biol.  Macromol.、２１巻（３号）：２２３〜２３０頁）。立体構造はまた、他の試薬（MirticおよびGrdadolnik、２０１３年、Biophys.  Chem.、１７５〜１７６巻、４７〜５３頁）、潜在的には触媒により影響を受けることもある。これらの影響は、反応が終了するまで動的なままである可能性がある。
【０００４】
以前に合成されたポリマーのいくつかの例を以下に記載する。
【０００５】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例６は、ポリリジンを２２％まで飽和させるために、ＭＰＥＧスクシンイミジル−スクシネートまたは予備活性化したＮ−ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）を使用することによって、メトキシポリ（エチレングリコール）（ＭＰＥＧ）で２２％飽和したポリリジンについて記載しており、これは、５０〜６０％まで飽和したポリリジンを生成する溶液Ｂを作製するためにＮＨＳＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート）およびＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）を使用して新たに活性化したＭＰＥＧ−カルボキシルを使用する本開示（以下を参照されたい）とは物質的に異なる。加えて、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例６は、精製後、残りの第１級アミノをラウリン酸で飽和することによって、０．０２２８ｍｍｏｌ（２０ｍｇ）の第１級アミノ当量、または前記生成物の２２％飽和に基づき０．１０４ｍｍｏｌの元の第１級アミノを改質した。飽和のプロセスは、元の第１級アミノの１．１×ｍｏｌと当量のＮＨＳＳおよび元の第１級アミノの５×ｍｏｌと当量のＥＤＣで活性化した、元の第１級アミノの２．４×ｍｏｌと当量のラウリン酸を使用した。したがって、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例６は、使用された試薬およびこれらの比に基づき、本開示（以下を参照されたい）と比較して完全に異なるプロセスである。生成物はまた、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を使用して第１級アミノ基を判定すると２２％のみのＰＥＧ飽和が得られるなど、分析により何が測定され得るかに基づくと、完全に異なる生成物である。
【０００６】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例７は、ポリリジンを２２％まで飽和させるためにＭＰＥＧスクシンイミジル−スクシネートまたは予備活性化したＮＨＳ−ＰＥＧを使用することによって、ＭＰＥＧで２２％飽和したポリリジンについて記載しており、これは、５０〜６０％まで飽和したポリリジンを生成するためにＮＨＳＳおよびＥＤＣ（溶液Ｂ）を使用して新たに活性化したＭＰＥＧ−カルボキシルを使用する本開示（以下を参照されたい）とは物質的に異なる。加えて、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例７は、精製後、残りの第１級アミノをステアリン酸で飽和することによって、０．０２２８ｍｍｏｌ（２０ｍｇ）の第１級アミノ当量、または前記生成物の２２％飽和に基づき０．１０４ｍｍｏｌの元の第１級アミノを改質した。飽和のプロセスは、元の第１級アミノの１．１×ｍｏｌと当量のＮＨＳＳおよび元の第１級アミノの５×ｍｏｌと当量のＥＤＣで活性化した、元の第１級アミノの１．７１×ｍｏｌと当量のステアリン酸を使用した。したがって、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例７は、使用された試薬およびこれらの比に基づき、本開示（以下を参照されたい）と比較して完全に異なるプロセスである。生成物はまた、ＴＮＢＳにより２２％のみのＰＥＧ飽和が得られるなど、分析により何が測定され得るかに基づくと、完全に異なる生成物である。
【０００７】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例８は、ポリリジンを２２％まで飽和させるためにＭＰＥＧスクシンイミジル−スクシネートまたは予備活性化したＮＨＳ−ＰＥＧを使用することによって、ＭＰＥＧで２２％飽和したポリリジンについて記載しており、これは、５０〜６０％まで飽和したポリリジンを生成するためにＮＨＳＳおよびＥＤＣ（溶液Ｂ）を使用して新たに活性化したＭＰＥＧ−カルボキシルを使用する本開示（以下を参照されたい）とは物質的に異なる。加えて、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例８は、精製後、残りの第１級アミノをカプリル酸で飽和することによって、０．０２２８ｍｍｏｌ（２０ｍｇ）の第１級アミノ当量、または前記生成物の２２％飽和に基づき０．１０４ｍｍｏｌの元の第１級アミノを改質した。飽和のプロセスは、元の第１級アミノの１．１×ｍｏｌと当量のＮＨＳＳおよび元の第１級アミノの５×ｍｏｌと当量のＥＤＣで活性化した、元の第１級アミノの３．３６×ｍｏｌと当量のカプリル酸を使用した。したがって、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例８は、使用された試薬およびこれらの比に基づき、本開示（以下を参照されたい）と比較して完全に異なるプロセスである。この生成物はまた、ＴＮＢＳにより２２％のみのＰＥＧ飽和が得られるなど、分析により何が測定され得るかに基づくと、完全に異なる生成物である。
【０００８】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例９は、ポリリジンを５５％まで飽和させるためにＭＰＥＧスクシンイミジル−スクシネートまたは予備活性化したＮＨＳ−ＰＥＧを使用することによって、ＭＰＥＧで５５％飽和したポリリジンについて記載しており、これは、５０〜６０％まで飽和したポリリジンを生成するためにＮＨＳＳおよびＥＤＣ（溶液Ｂ）を使用して新たに活性化したＭＰＥＧ−カルボキシルを使用する本開示（以下を参照されたい）とは物質的に異なる。加えて、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例９は、精製後、前記ＰＬＰＥＧ生成物の残りの第１級アミノをラウリン酸で飽和することによって、０．０３１８ｍｍｏｌ（４０ｍｇ）の第１級アミノ当量のポリリジン−ポリエチレングリコール（ＰＬＰＥＧ）、または前記ＰＬＰＥＧ生成物の５５％飽和に基づき０．４５０ｍｍｏｌの元の第１級アミノを改質した。飽和のプロセスは、元の第１級アミノの０．３４×ｍｏｌと当量のＮＨＳＳおよび元の第１級アミノの１．１６×ｍｏｌと当量のＥＤＣで活性化した、元の第１級アミノの１．８×ｍｏｌと当量のラウリン酸を使用した。したがって、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例９は、使用された試薬およびこれらの比に基づき、本開示（以下を参照されたい）と比較して完全に異なるプロセスである。この生成物はまた、ラウリン酸またはＣ１２の存在に基づき、完全に異なる生成物である。
【０００９】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例１２は、溶液Ａを作製するために１ｇのポリリジンを使用した。ＭＰＥＧ−スクシネート（５ｇ、元の第１級アミノの０．５９×ｍｏｌ当量）を、２５０ｍｇのＮＨＳＳ（１．１５ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの０．６８×ｍｏｌ当量）およびＥＤＣ（２．６ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの１．５３×ｍｏｌ当量）で１８〜２０分の間活性化することによって、溶液Ｂを作製した。溶液Ｃは溶液ＡとＢを混合することによって作製される。４時間後、第２の溶液Ｂを調製し、溶液Ｃに加え、反応物を一晩インキュベートさせた。これによって、ポリリジンのエプシロン第１級アミノ基の５５％までの飽和をもたらす。溶液Ｃに含有されていたＭＰＥＧ−スクシネート、ＮＨＳＳ、およびＥＤＣの最終的な量は、元の第１級アミノのそれぞれ１．１８×ｍｏｌ、１．３６×ｍｏｌ、および３．０６×ｍｏｌ当量である。本開示（以下を参照されたい）と比較して、このプロセスのこれらのステップは、試薬の添加の比およびタイミングが異なる。ＰＬＰＥＧ生成物を精製し、凍結乾燥し、精製されたＰＬＰＥＧを１４３ｍＬのジクロロメタンに、２ｍｍｏｌのトリエチルアミン（元の第１級アミノの０．７６×ｍｏｌ当量）と共に溶解し、ジメチルホルムアミド中の２ｍｍｏｌ（元の第１級アミノの０．７６×ｍｏｌ当量）の新たに活性化した粗製のＣ１８−ＮＨＳを加えることによって、残りの第１級アミノ基をステアリン酸で飽和した。得られた生成物を精製し、ＧＬＰ−１結合について試験すると、１０％ローディング量で３３％の遊離を有することが判明した（米国特許出願第１１／６１３１８３号の図３７を参照されたい）。本開示の生成物に１０％ローディング量でＧＬＰ−１をローディングした場合、遊離のＧＬＰ−１は観察されず（以下の表６１を参照されたい）、これは、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例１２に概説されているプロセスは、本開示とは異なる生成物を生成したことを示している。
【００１０】
米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例１３において、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例１２で使用された第１級アミノ基の５５％飽和を有する精製されたＰＬＰＥＧ（３ｇ）を、米国特許出願第１１／６１３１８３号の実施例１２と同様のプロセスを使用してリグノセリン酸で飽和した。この場合も同様に、プロセスおよびこのプロセスの生成物は、リグノセリン酸の存在に基づき本開示とは異なる。
【００１１】
米国特許出願第１１／９７１４８２号の実施例１〜３は、予備活性化したＮＨＳ−ＰＥＧを使用するプロセスを概説しており、したがって、これらは本開示とは異なるプロセスである。加えて、実施例１および３は、それぞれ２７％および２２％飽和を有し、したがって、生成物は、本開示のプロセスとは異なる。実施例２は５５％飽和を有するが、本開示の場合のようなＮＨＳＳの代わりにＮＨＳを使用して生成され、よって、これは異なるプロセスであり、生成物は、ポリリジン骨格に沿って異なるＰＥＧ分布を有し得る。
【００１２】
米国特許出願第１１／９７１４８２号の実施例４〜５は、１ｇのポリリジンを２．４ｍｍｏｌ第１級アミンと共に使用して、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中に溶液Ａを作製した。ＭＰＥＧ−カルボキシル（５ｇ、元の第１級アミノの０．４２×ｍｏｌ当量）を、２５０ｍｇのＮＨＳＳ（１．１５ｍｍｏｌ、または元の第１級アミノの０．４８×ｍｏｌ当量）および５００ｍｇのＥＤＣ（２．６ｍｍｏｌ、または元の第１級アミノの１．１×ｍｏｌ当量）で２０分の間活性化することによって、溶液Ｂを作製した。活性化した溶液Ｂを溶液Ａに加えることによって、溶液Ｃを作製した。２時間後、第２の溶液Ｂを調製し、溶液Ｃに加え、反応物を一晩インキュベートさせた。これにより、ポリリジンのエプシロン第１級アミノ基の５６％までの飽和をもたらす。溶液Ｃ中に含有されるＭＰＥＧ−カルボキシル、ＮＨＳＳ、およびＥＤＣの最終的な量は、それぞれ元の第１級アミノの０．８４×ｍｏｌ、０．９６×ｍｏｌ、および２．２×ｍｏｌ当量である。本開示（以下を参照されたい）と比較して、このプロセスのこれらのステップは、試薬添加の異なるタイミングに加えて、異なる溶液Ｃの最終比を有する。５６％飽和を有するＰＬＰＥＧ生成物を精製し、その部分を以下に記載されているようにベヘン酸およびステアリン酸で飽和させた。
【００１３】
米国特許出願第１１／９７１４８２号の実施例５は、本開示（以下を参照されたい）と異なるプロセスを使用してＰＬＰＥＧが作製された、ベヘン酸またはＣ２２飽和のためのプロセスについて記載している。元の第１級アミンの１．１と当量のＰＬＰＥＧを、３０ｍＬのジメチルホルムアミド：ジクロロメタン中の２００μＬまたは１．４４ｍｍｏｌのトリエチルアミン（元の第１級アミノの１．３×ｍｏｌ当量）および２．５ｍｍｏｌ（元の第１級アミノの２．３×ｍｏｌ当量）の新たに活性化した粗製のＣ２２−ＮＨＳと共に、５３ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｃ２２のこの添加を２回目のために繰り返し、一晩反応させ、生成物を精製した。このプロセスは、使用された試薬およびこれらの割合に基づき本開示（以下を参照されたい）と異なり、ベヘン酸を用いて、本開示（以下を参照されたい）の生成物と異なる生成物をもたらす。
【００１４】
米国特許出願第１１／９７１４８２号の実施例５は、ステアリン酸またはＣ１８飽和のためのプロセスについて記載しており、本開示（以下を参照されたい）と異なるプロセスを使用してＰＬＰＥＧを作製した。元の第１級アミンの１．１と当量のＰＬＰＥＧを、３０ｍＬのジメチルホルムアミド：ジクロロメタン中２００μＬまたは１．４４ｍｍｏｌのトリエチルアミン（元の第１級アミノの１．３×ｍｏｌ当量）および２．５ｍｍｏｌ（元の第１級アミノの２．３×ｍｏｌ当量）の新たに活性化した粗製のＣ１８−ＮＨＳと共に、５３ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｃ１８のこの添加を２回目のために繰り返し、一晩反応させ、生成物を精製した。このプロセスは、使用された試薬およびこれらの割合に基づき本開示と異なる。機能的には、ＧＬＰ−１を２％でローディングした場合、このプロセスの生成物が５％遊離ペプチドをもたらす（米国特許出願第１１／９７１４８２号の表１およびCastilloら、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁を参照されたい）のに対して、本開示は２％ローディング量で、０％遊離ペプチドをもたらす。実際には、５および１０％のローディング量でも、本開示の生成物は、０％遊離を依然として示し、これは、本開示の生成物がＧＬＰ−１結合に対して非常に高い能力を有することを示している（以下を参照されたい）。特性または結合能における差異は、組成における差異によってのみ説明することができることは確かである。
【００１５】
米国特許出願第１１／９７１４８２号の実施例６は、１ｇのポリリジンを２．４ｍｍｏｌ第１級アミンと共に使用することによって、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中に溶液Ａを作製した。ＭＰＥＧ−スクシネート（５ｇ、元の第１級アミノの０．４２×ｍｏｌ当量）を２５０ｍｇのＮＨＳＳ（１．１５ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの０．４８×ｍｏｌ当量）および５００ｍｇのＥＤＣ（２．６ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの１．１×ｍｏｌ当量）で２０分の間活性化させることによって、溶液Ｂを作製した。活性化した溶液Ｂを溶液Ａに加えて溶液Ｃを作製した。２時間後、第２の溶液Ｂを調製し、溶液Ｃに加え、反応物を一晩インキュベートさせた。これは、１４ｎｍの流体力学的径を有する、ポリリジンのエプシロン第１級アミノ基の５７％までの飽和をもたらす。溶液Ｃ中に含有されているＭＰＥＧ−カルボキシル、ＮＨＳＳ、およびＥＤＣの最終的な量は元の第１級アミノのそれぞれ０．８４×ｍｏｌ、０．９６×ｍｏｌ、および２．２×ｍｏｌ当量である。本開示（以下を参照されたい）と比較して、このプロセスは、溶液Ｃ中で異なる最終的な割合ならびに試薬添加の異なるタイミングを有し、したがってＰＬ骨格上のＰＥＧの厳密な構成は、ステアリン酸飽和後の最終生成物の特性に基づき異なるはずである。５７％飽和を有するＰＬＰＥＧ生成物を凍結乾燥し、５０ｍＬのジクロロメタンで４回抽出し、４００μＬまたは２．８８ｍｍｏｌのトリエチルアミン（元の第１級アミノの２．６×ｍｏｌ当量）の添加後、３０ｍＬの１：２ｖｏｌ／ｖｏｌのジメチルホルムアミド：ジクロロメタンに溶解した２×２．５ｍｍｏｌ（元の第１級アミノの２×ｍｏｌ当量）のＣ１８−ＮＨＳで飽和した。この生成物は、本開示（以下を参照されたい）と異なるプロセスを使用して作製しており、本開示の生成物（２％、５％、および１０％ローディング量でのＧＬＰ−１への結合は０％遊離を有する）と比較して、異なる有効性（２％ローディング量でのＧＬＰ−１への結合は５％遊離を有する。米国特許出願第１１／９７１４８２号の表１を参照されたい）を有する生成物を生成する。特性における差異は、生成物の組成における差異によってのみ説明することができることは確かである。
【００１６】
Castilloら、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁は、２５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に溶解した２．６ｍｍｏｌの第１級アミノと共に、１ｇポリリジンを使用して溶液Ａを作製した。メトキシポリエチレングリコールカルボキシメチル（２ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの０．７７×ｍｏｌ当量）を、４ｍｍｏｌのＮＨＳＳ（元の第１級アミノの１．５４×ｍｏｌ当量）と共に、２５ｍｌの１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ＝４．７に溶解し、一度溶解したら、撹拌しながらＥＤＣ（６ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの２．３×ｍｏｌ当量）を加えて、溶液Ｂを作製した。活性化を２０分の間進行させ、活性化したＭＰＥＧ−ＣＭを直接２０ＰＬ溶液に加えて、溶液Ｃを作製した。ＮａＯＨを使用して溶液のｐＨを７．７に調整し、室温で２時間撹拌した。アリコートを採取し、第１級アミノ基をＴＮＢＳで測定し、１４．４ｎｍの流体力学的径で５４％ＭＰＥＧ−ＣＭ飽和であると判明した。粗製のＰＬＰＥＧ生成物を凍結乾燥し、約１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、不溶性の沈殿物を除去し、約５０ｍｌのジクロロメタンでさらに抽出した。上清をプールし、磁気撹拌しながら、２０ｍＬのジクロロメタン中Ｃ１８−ＮＨＳ（元の第１級アミノの１．４×ｍｏｌ当量）をプールした上清に加え、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、元の第１級アミノの２．３×ｍｏｌ当量）を加え、４時間の間反応させた。追加のＣ１８−ＮＨＳ（３．６ｍｍｏｌまたは元の第１級アミノの１．４×ｍｏｌ当量；全部で、元の第１級アミノの２．８×ｍｏｌ当量のＣ１８−ＮＨＳを加えた）を加え、一晩反応させることによって、粗製のコポリマー生成物を得て、溶媒をエタノール−水に変更後、限外濾過法でこれを精製した。Castilloらにより、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁において記載されているこのプロセスは異なり、本開示と比較して、完全に異なる試薬の比を有する。加えて、得られた精製されたコポリマー生成物は、本開示の生成物と比較して（２％、５％、および１０％ローディング量でのＧＬＰ−１への結合は０％遊離を有する；表５９を参照されたい）、結合特性または有効性が異なり（２％ローディング量でのＧＬＰ−１への結合は５％遊離を有する）、独特な生成物の組成を示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Castilloら、Pharm.  Res.、２０１２年、２９巻（１号）３０６〜３１８頁
【非特許文献２】Arunkumarら、１９９７年、Int.  J.  Biol.  Macromol.、２１巻（３号）：２２３〜２３０頁
【非特許文献３】MirticおよびGrdadolnik、２０１３年、Biophys.  Chem.、１７５〜１７６巻、４７〜５３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（要旨）
一態様では、本発明は、セミランダムグラフトコポリマーを調製するプロセスであって、
（ａ）Ｗ量の遊離第１級アミノ基を含有する直鎖ポリアミン骨格を、緩衝範囲がｐＨ７〜８にわたる緩衝範囲を有する６．５超のｐＨを有する水性緩衝液に溶解するするステップであって、容量Ｙを有する溶液Ａを得るステップと、
（ｂ）Ｗ／（Ｙ＋Ｚ）＝３０〜５５ｍＭであるような最終容量Ｚを有する溶液Ｂを得るために、０．５〜１．２×Ｗの末端カルボキシル基を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の保護鎖を、水性緩衝液、ｐＨ４〜５．５中で１．７〜７．０×ＷのＮＨＳＳおよび１．５〜３．６×ＷのＥＤＣと混合することによって活性化するステップであって、活性化を０〜３０分の間進行させるステップと、
（ｃ）溶液Ｂと溶液Ａを混合するステップであって、溶液Ｃをもたらすステップと、
（ｄ）必要に応じて、溶液ＣのｐＨを６．５超に調整するステップと、
（ｅ）２〜３時間後、０．５〜１．５×Ｗの追加のＥＤＣを少量ずつまたは一度に全部、溶液Ｃに加えるステップであって、残りの第１級アミノが元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）であるまで待機するステップと、
（ｆ）残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％であるとき、１．０〜２．５容量当量（溶液Ｃの容量に対して）のアセトニトリルを加えることにより、溶液Ｃの総量を増加するステップであって、溶液Ｄを得て、溶液Ｄを４０〜７０℃に加熱するステップと、
（ｇ）０．５〜６×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、
（ｈ）４０〜７０℃のアセトニトリル中の、少なくとも０．７５×Ｗ当量のＣ１８−ＮＨＳを加えるステップであって、溶液Ｅを得て、この溶液を、室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌することによって、粗製の最終生成物を得るステップと、を含むプロセスを提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている方法により得ることが可能なセミランダムグラフトコポリマーを特徴とする。セミランダムグラフトコポリマーは、グルカゴン様ペプチド−１および／または心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびその誘導体から選択されるペプチドと混合することによって、セミランダムグラフトコポリマーおよびペプチド（複数可）の非共有結合複合体を含む組成物を形成することができる。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている方法により得ることが可能なセミランダムグラフトコポリマーを含む医薬組成物を特徴とする。
【００２１】
別の態様では、本発明は、その生成物を、完全に化学的に特徴付けることが困難である、セミランダムグラフトコポリマーを調製するプロセスに関する。本発明の生成物は、１）ペプチドに結合すること、および２）生成物とペプチドを動物へ同時投与する際に、本発明の生成物なしのペプチド単独の場合と比較して、生成物は、血液循環時間を延長し、ペプチドのレベルを上昇させるという独特で、有用な特性を有する。生成物にこのような特性をもたらすプロセスは、本開示に記載されているプロセスと有意に異なる他のいかなるプロセスによっても複製することができない。おそらく本開示のプロセスにおいて化学反応が生じるにつれて、骨格ポリマーの立体構造変化に混乱が生じることから、骨格に沿ったグラフトコポリマーの位置はプロセスにより大きく左右される。得られた生成物は、プロセスおよびプロセス中に起こり得る立体構造変化をモニターできる新規技術を開発するという挑戦なしに、他のプロセスを使用して生成される生成物から確実に化学的に区別することはできない。このような技術は現在存在しない。しかし、生成物は、１）ペプチドへのその優れた結合、および２）動物へ投与される際に、前記ペプチドに上昇した濃度レベルおよびより長期の血液循環時間をもたらすその能力というその特性に基づき、これに最も近い同様の従来技術の生成物から区別することができる。本開示はまた、本明細書に記載されているこのようなプロセスにより生成される生成物に関する。本開示で特許請求されているこのプロダクトバイプロセスは、これを製造するために使用されるプロセスまたは方法（操作ステップ）の点から生成物を規定する。以下に記載されているような、それを行うための多くの実験および試みが行われてきたが、生成物およびその公知の特性は、今日までの任意の他の公知のプロセスにより生成することができない。米国特許出願第１１／６１３１８３号および米国特許出願第１１／９７１４８２号の生成物の特性を本開示のものと比較した。米国特許出願第１１／６１３１８３号および米国特許出願第１１／９７１４８２号の生成物は、本開示の生成物と同じペプチドに結合するが、本生成物は、同じペプチドへの結合、ならびに動物への投与の時点で前記ペプチドに上昇したレベルおよびより長期の血液循環時間をもたらすことの両方においてずっと優れた特性を有する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
セミランダムグラフトコポリマーを調製する方法であって、
（ａ）Ｗモルの遊離第１級アミノ基を含有する直鎖ポリアミン骨格を、ｐＨ７〜ｐＨ８の緩衝範囲を有する水性緩衝液に溶解するステップであって、容量Ｙを有する溶液Ａを得るステップと、
ステップＢ１またはステップＢ２のいずれかを行うステップであって、
ステップＢ１が、
（ｂ）Ｗ／（Ｙ＋Ｚ）＝３０〜５５ｍＭとなるような最終容量Ｚを有する溶液Ｂを得るために、０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基を含有する保護鎖を、水性緩衝液、ｐＨ４〜５．５中で１．７〜７．０×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）および１．５〜３．６×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と混合することによって活性化することであって、前記活性化を０〜３０分の間進行させて、溶液Ｂを得ることと、
（ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加えることであって、溶液Ｃを生成することと、
（ｄ）溶液ＣのｐＨを６．５超に調整することと、を含み、
ステップＢ２が、
（ｂ〜ｄ）０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基、１．７〜７．０×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）および１．５〜３．６×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含有する保護鎖を溶液Ａに加えることであって、溶液Ｃを得ることと、
（ｅ）２〜３時間後、０．５〜１．５×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を溶液Ｃに加え、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）となるまで待機することと、を含む、方法。
（項目２）
項目１に記載のセミランダムグラフトコポリマーを調製する方法であって、
（ａ）Ｗの遊離の第１級アミノ基を含有する直鎖ポリアミン骨格を、ｐＨ７〜８を含む緩衝範囲で水性緩衝液に溶解するステップであって、容量Ｙを有する溶液Ａを得るステップと、
（ｂ）Ｗ／（Ｙ＋Ｚ）＝３０〜５５ｍＭとなるような最終容量Ｚを有する溶液Ｂを得るために、０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基を含有する保護鎖を、水性緩衝液、ｐＨ４〜５．５中で１．７〜７．０×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）および１．５〜３．６×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と混合することによって活性化するステップであって、前記活性化を０〜３０分の間進行させて溶液Ｂを得るステップと、
（ｃ）継続的に混合しながら溶液Ｂを溶液Ａに加えるステップであって、溶液Ｃをもたらすステップと、
（ｄ）溶液ＣのｐＨを６．５超に調整するステップと、
（ｅ）１〜３時間後、０．５〜１．５×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を溶液Ｃに加えるステップであって、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）となるまで待機するステップと、を含む方法。
（項目３）
（ｆ）残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％であるとき、溶液Ｃを冷凍および凍結乾燥するステップであって、１種または複数の有機溶媒中で前記凍結乾燥された物質を復元して溶液Ｄを得るステップと、
（ｇ）０．５〜６×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、
（ｈ）少なくとも０．７５×Ｗ当量の長鎖脂肪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を加えるステップであって、溶液Ｅを得て、前記溶液を、室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌して粗製の最終生成物を得るステップと、をさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
（ｆ）少なくともＷの強い求核試薬、例えば、ヒドロキシルアミンを溶液Ｃに加えるステップであって、生成物を限外濾過法で精製し、これに続いて凍結乾燥し、前記生成物をアセトニトリルに溶解して溶液Ｄを得るステップと、
（ｇ）０．５〜６×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、
（ｈ）少なくとも０．７５×Ｗ当量の長鎖脂肪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を加えるステップであって、溶液Ｅを得て、溶液Ｅを、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで、室温で少なくとも２時間撹拌して粗製の最終生成物を得るステップと、をさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目５）
（ｆ）残りの第１級アミノ基が元のアミノの５５〜４０％であるとき、１．０〜２．５容量当量のアセトニトリルを加えることによって、溶液Ｄを得るために溶液Ｃの総量を増加するステップであって、溶液Ｄを少なくとも１０分間４０〜７０℃に加熱し、強い求核試薬を加え、次いで、メトキシポリエチレングリコールがグラフトされたポリリジン（ＰＬＰＥＧ）生成物を限外濾過法および凍結乾燥によって精製し、そして、純粋な、メトキシポリエチレングリコールがグラフトされたポリリジン（ＰＬＰＥＧ）生成物を有する溶液Ｄを６６％アセトニトリル中で復元するステップと、
（ｇ）０．５〜６×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、
（ｈ）４０〜７０℃のアセトニトリル中の、少なくとも０．７５×Ｗ当量の長鎖脂肪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を加えるステップであって、溶液Ｅを得て、溶液Ｅを室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌して粗製の最終生成物を得るステップと、をさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目６）
（ｆ）残りの第１級アミノ基が元のアミノの５５〜４０％であるとき、１．０〜２．５容量当量のアセトニトリルを加えることによって、溶液Ｄを得るために溶液Ｃの総量を増加するステップであって、溶液Ｄを４０〜７０℃に加熱するステップと、
（ｇ）０．５〜６×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、
（ｈ）４０〜７０℃のアセトニトリル中の、少なくとも０．７５×Ｗ当量の長鎖脂肪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を加えるステップであって、溶液Ｅを得て、溶液Ｅを室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌して粗製の最終生成物を得るステップと
をさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目７）
前記直鎖ポリアミン骨格が、光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、３５〜１５０の重合度を有するポリリジンであり、
保護鎖が、単一のカルボキシル末端を有するメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）鎖であり、ゲル浸透クロマトグラフィーに基づき、４〜１２ｋＤａの数平均分子量またはＭｎを有し、
長鎖脂肪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）が、存在する場合、ステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
ポリリジンの重合度が、光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、３５〜８５であり、ＰＥＧ保護鎖が、ゲル浸透クロマトグラフィーに基づき、４〜６ｋＤａの数平均分子量またはＭｎを有する、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ステップ「ｅ」において、０．５〜１．２×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩ＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、
存在する場合、ステップ「ｆ」において、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％に到達したとき、Ｃの１．５〜２．０容量当量のアセトニトリルが加えられる、項目３から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５〜１．１×Ｗのカルボキシル基、１．７〜３．７×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、１．５〜３．３×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
ステップ「ｅ」において、０．５〜１．１×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられる、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５〜１．０×Ｗのカルボキシル基、１．７〜３．４×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、および１．５〜３．０×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
ステップ「ｅ」において、０．５〜１．０×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられる、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ「ａ」において溶液Ａが、０．１〜０．１４Ｍの間の濃度の第１級アミンを有し、
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．８５〜０．９５×Ｗのカルボキシル基、２．６〜３．２×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．５〜２．９×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
溶液ＢのｐＨが４．５〜４．９であり、
活性化を１８〜２２分の間進行させ、
溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、
存在する場合、ステップ「ｅ」において、０．８５〜０．９５×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
存在する場合、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられる、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．９×Ｗのカルボキシル基、２．７×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．７×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
ステップ「ｅ」において、０．９×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．７５〜０．８５×Ｗのカルボキシル基、２．３〜２．８×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．３〜２．６×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
溶液ＢのｐＨが４．５〜４．９であり、
活性化を１８〜２２分の間進行させ、
溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、
存在する場合、ステップ「ｅ」において、０．７５〜０．８５×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
ステップ「ｇ」において、存在する場合、１〜３×ＷのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）または他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられる、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．８×Ｗのカルボキシル基、２．４×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．４×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
溶液ＢのｐＨが４．５〜４．９であり、
活性化を１８〜２２分の間進行させ、
溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、
ステップ「ｅ」において、０．７５〜０．８５×Ｗの追加の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
ステップ「ｅ」において、少なくとも０．７５×Ｗのステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）が溶液Ｄに加えられる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップ「ａ」において、溶液Ａが、第１級アミンの濃度０．１０〜０．１４Ｍを有し、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．６５〜０．７５×Ｗのカルボキシル基、２．０〜２．５×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．０〜２．３×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
活性化を１５〜２５分の間進行させ、
存在する場合、ステップ「ｅ」において、１〜３時間後、０．６５〜０．７５×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
存在する場合、ステップ「ｇ」において、１〜３×Ｗの第３級アミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が溶液Ｄに加えられ、
前記方法が、０．７５〜１．２５×Ｗ当量のステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）が溶液Ｄに加えられるステップ「ｈ」をさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
ステップ「ａ」において、溶液Ａが第１級アミンの濃度０．１０〜０．１４Ｍを有し、
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．７×Ｗのカルボキシル基、２．１×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、２．１×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
活性化を１５〜２５分の間進行させ、
ステップ「ｅ」において、１〜３時間後、０．６５〜０．７５×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
ステップ「ｈ」において、０．７５〜１．２５×Ｗ当量のステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）が溶液Ｄに加えられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ステップ「ａ」において、溶液Ａが第１級アミンの濃度０．１０〜０．１４Ｍを有し、
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５５〜０．６５×Ｗのカルボキシル基、１．７〜２．２×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、１．７〜２．０×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
活性化を１５〜２５分の間進行させ、
存在する場合、ステップ「ｅ」において、１〜３時間後、０．５５〜０．６５×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
存在する場合、ステップ「ｆ」において、１．６〜１．９容量当量のアセトニトリルが加えられ、
存在する場合、ステップ「ｇ」において、１〜３×Ｗの第３級アミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が溶液Ｄに加えられ、
前記方法が、０．７５〜１．２５×Ｗ当量のステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）が溶液Ｄに加えられるステップ「ｈ」をさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
ステップ「ａ」において、溶液Ａが第１級アミンの濃度０．１０〜０．１４Ｍを有し、
ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．６×Ｗのカルボキシル基、１．８×ＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、１．８×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を有し、
活性化を１５〜２５分の間進行させ
ステップ「ｅ」において、１〜３時間後、０．６×Ｗの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が溶液Ｃに加えられ、
ステップ「ｆ」において、１．６〜１．９容量当量のアセトニトリルが加えられ、
ステップ「ｈ」において、０．７５〜１．２５×Ｗ当量のステアリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）が溶液Ｄに加えられる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
（ｉ）酢酸エチルを使用して、前記アセトニトリルおよび過剰の脂肪酸を溶液Ｅ中の前記粗製の最終生成物から抽出するステップであって、前記酢酸エチルの層を廃棄し、水層の抽出を少なくとも１回繰り返すステップと、
（ｊ）エタノールと水を少なくとも１０容量換えることによって、前記最終生成物を含有する前記水層を限外濾過法で洗浄するステップと、をさらに含む、項目３から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記最終生成物を凍結するステップ（ｋ）をさらに含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記最終生成物を凍結乾燥するステップ（ｋ）をさらに含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
（ｉ）前記最終生成物を含有する溶液Ｅ中の前記有機溶媒を、水に交換するステップと、（ｊ）エタノールと水を少なくとも１０容量換えることによって、前記最終生成物を限外濾過法で洗浄するステップと、をさらに含む、項目３から１９、２１、および２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
項目１から２３のいずれか一項に記載の方法により得ることが可能なセミランダムグラフトコポリマーを含む組成物。
（項目２５）
前記セミランダムグラフトコポリマーが、グルカゴン様ペプチド−１および／または心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびそれらの誘導体への結合に基づき選択される、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
項目２４または項目２５に記載のセミランダムグラフトコポリマーを含む、医薬組成物。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、本明細書に記載されているようなセミランダムグラフトコポリマーを調製するための方法を提供する。
【００２３】
例えば、セミランダムグラフトコポリマーを調製するプロセスは、多くの場合、（ａ）Ｗ量の遊離第１級アミノ基を含有する直鎖ポリアミン骨格を、ｐＨ７〜８にわたる緩衝範囲をもつ、６．５超のｐＨを有する水性緩衝液に溶解するステップであって、容量Ｙを有する溶液Ａを得るステップと、（ｂ）Ｗ／（Ｙ＋Ｚ）＝３０〜５５ｍＭであるような最終容量Ｚを有する溶液Ｂを得るために、０．５〜１．２×Ｗの末端カルボキシル基を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の保護鎖を、水性緩衝液、ｐＨ４〜５．５中で１．７〜７．０×ＷのＮＨＳＳおよび１．５〜３．６×ＷのＥＤＣと混合することによって活性化するステップであって、活性化を０〜３０分の間進行させるステップと、（ｃ）溶液Ｂと溶液Ａを混合するステップであって、溶液Ｃをもたらすステップと、（ｄ）必要に応じて、溶液ＣのｐＨを６．５超に調整するステップと、（ｅ）２〜３時間後、０．５〜１．５×Ｗの追加のＥＤＣを少量ずつまたは一度に全部、溶液Ｃに加えるステップであって、残りの第１級アミノが元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）であるまで待機するステップと、（ｆ）残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％となったとき、１．０〜２．５容量当量（溶液Ｃの容量に対して）の極性有機溶媒（例えば、アセトニトリル）を加えることにより溶液Ｃの総量を増加するステップであって、溶液Ｄを得て、溶液Ｄを４０〜７０℃に加熱するステップと、（ｇ）０．５〜６×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンを溶液Ｄに加えるステップと、（ｈ）４０〜７０℃で、極性有機溶媒（例えば、アセトニトリル）中の、少なくとも０．７５×Ｗ当量のＣ１８−ＮＨＳを加えるステップであって、溶液Ｅを得て、この溶液を、室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌することによって、粗製の最終生成物を得るステップと、を含む。
【００２４】
本発明の方法は、本明細書に記載されているような直鎖ポリアミン骨格の反応を含む。ポリアミン骨格は、本明細書で規定されたような複数の第１級アミン基を含む。ポリアミン骨格の反応に使用されるべき異なる試薬の量は、本明細書に記載されているようなポリアミン骨格上のアミン基の総モル量を参照して定量化される。ポリアミン基のこの総数は「Ｗ」で表され、モル（ｍｏｌ）の単位で与えられる。
【００２５】
当業者であれば認識しているように、本明細書に記載されている方法において使用される試薬の量はポリアミン骨格内の第１級アミン基の量に従い拡大縮小することができる。したがって、本明細書に記載されているようなプロセスにおいて使用される様々な試薬の量は、本明細書で規定されたような「Ｗ」の倍数で提供され、記号「Ｚ×Ｗ」（式中、Ｚは、Ｗに掛ける係数である）を使用して表現される。
【００２６】
本発明のプロセスは拡張可能である。したがって、Ｗの値は、特に限定されないことを、当業者であれば認識されよう。多くの場合、Ｗは、約０．１μｍｏｌ〜１０００ｍｏｌの範囲であり、より多くの場合にはＷは約１０μｍｏｌ〜約１ｍｏｌの範囲であり、さらにより多くの場合には、Ｗは約１００μｍｏｌ〜約１００ｍｍｏｌの範囲である。
【００２７】
本発明のプロセスにおいて、直鎖ポリアミン骨格は典型的には水性緩衝液に溶解される。直鎖ポリアミン骨格は、好ましくは本明細書に記載されているようなポリリジンである。
【００２８】
水性緩衝液は特に限定されない。緩衝液は、任意の適切な緩衝液であってよい。適切な緩衝液として、例えば、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＢＥＳ（（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（本明細書で規定されている）、ＤＩＰＳＯ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＯＡ（本明細書で規定されている）などが挙げられる。特に適切な緩衝液として、以下に規定されているようなＨＥＰＥＳおよびＴＥＯＡが挙げられる。適切な緩衝液は、典型的には、ｐＨ７〜８の範囲の緩衝液である。緩衝液中の緩衝塩の典型的な濃度は、５０〜２５０ｍＭ、例えば１００ｍＭである。例えば、緩衝液は、２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたは１００ｍＭ  ＴＥＯＡであってよい。
【００２９】
本発明のプロセスのステップ（ａ）において、直鎖ポリアミン骨格を水性緩衝液に溶解することによって、溶液Ａを得る。溶液Ａの容量は「Ｙ」で表される。溶液ＡのｐＨは、所望の最終ｐＨを有するために、標準的な技術、例えば、緩衝塩の酸または共役塩基の添加などを使用して調整することができる。溶液Ａの最終ｐＨは、典型的には、ｐＨ６．５超、例えば、ｐＨ６．５〜ｐＨ９、例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である。
【００３０】
本プロセスは、ステップ（Ｂ１）またはステップ（Ｂ２）をさらに含む。ステップＢ１およびステップＢ２は、ステップ（ｂ）〜（ｄ）をそれぞれ含む。ステップＢ１では、本発明のプロセスは、本明細書に記載されているような溶液Ｂの形成を含み、この溶液を溶液Ａに加えることによって、溶液Ｃを形成する。ステップＢ２では、ステップＢ１において溶液Ｂを形成するために使用される試薬を、溶液Ａに直接加えることによって、溶液Ｃを形成し、溶液Ｂは作製しない。特に述べられていない限り、以下の考察はステップＢ１とステップＢ２の両方に適用される。
【００３１】
本発明のプロセスのステップ（ｂ）において、保護鎖を、ＥＤＣおよびＮＨＳＳ（スルホ−ＮＨＳ）で活性化する。保護鎖は、本明細書に記載されているような任意の適切なポリマーであってよい。保護鎖として使用するのに適切な典型的なポリマーとして、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーが挙げられる。保護鎖は、鎖の一方の末端においてカルボキシル部分を有する。保護鎖は、鎖の他方の末端において、例えば、メトキシル化またはエトキシ化など、アルコキシ化されていても、いなくてもよい。好ましい保護鎖として、メトキシル化ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）が挙げられる。保護鎖の平均分子質量は特に限定されない。多くの場合、保護鎖の分子質量は、２〜２０ｋＤａ、または４〜１２ｋＤａ、またはより多くの場合４〜６ｋＤａである。典型的には、平均分子質量は、本明細書に記載されているようなゲル浸透技術を使用して決定される。
【００３２】
典型的には、ステップ（ｂ）において使用される保護鎖の量は、０．５×Ｗ〜１．２×Ｗの末端カルボキシル基に対応し、より多くの場合、保護鎖の量は、０．５×Ｗ〜１．１×Ｗの末端カルボキシル基に対応し、さらにより多くの場合、０．５×Ｗ〜１．０×Ｗの末端カルボキシル基に対応する。例えば、保護鎖の量は、０．８５×Ｗ〜０．９５×Ｗ（例えば、０．９×Ｗ）、または０．７５×Ｗ〜０．８５×Ｗ（例えば、０．８×Ｗ）、または０．６５×Ｗ〜０．７５×Ｗ（例えば、０．７×Ｗ）、または０．５５×Ｗ〜０．６５×Ｗ（例えば、０．６×Ｗ）であってよい。最も典型的には、保護鎖の量は、０．８×Ｗ〜１×Ｗ、例えば、０．８２×Ｗ〜０．９５×Ｗなど、例えば、０．８３×Ｗ〜０．９３×Ｗなどであってよい。
【００３３】
保護鎖は、ＥＤＣおよびＮＨＳＳとの反応により活性化される。
【００３４】
典型的には、使用されるＥＤＣの量は、１．５×Ｗ〜３．６×Ｗ、例えば、１．５×Ｗ〜３．３×Ｗ、例えば１．５×Ｗ〜３．０×Ｗである。例えば、ステップ（ｂ）において使用されるＥＤＣの量は、２．５×Ｗ〜２．９×Ｗ（例えば、２．７×Ｗ）、または２．３×Ｗ〜２．６×Ｗ（例えば、２．４×Ｗ）、または２．０×Ｗ〜２．３×Ｗ（例えば、２．１×Ｗ）、または１．７×Ｗ〜２．０×Ｗ（例えば、１．８×Ｗ）であってよい。最も典型的には、使用されるＥＤＣの量は、２．５×Ｗ〜２．９×Ｗ、例えば、２．５×Ｗ〜２．８×Ｗなどである。
【００３５】
典型的には、使用されるＮＨＳＳの量は、１．７×Ｗ〜７．０×Ｗ、例えば、１．７×Ｗ〜４．０×Ｗなど、例えば、１．７×Ｗ〜３．７×Ｗなど、通常、１．７×Ｗ〜３．４×Ｗである。例えば、ステップ（ｂ）において使用されるＮＨＳＳの量は、２．６×Ｗ〜３．２×Ｗ（例えば、２．７×Ｗ）、または２．３×Ｗ〜２．８×Ｗ（例えば、２．４×Ｗ）、または２．０×Ｗ〜２．５×Ｗ（例えば、２．１×Ｗ）、または１．７×Ｗ〜２．２×Ｗ（例えば、１．８×Ｗ）であってよい。最も典型的には、使用されるＮＨＳＳの量は、２．３×Ｗ〜２．８×Ｗ、例えば、２．５×Ｗ〜２．８×Ｗなどである。
【００３６】
したがって、例えば、使用される保護鎖の量は０．５〜１．２×Ｗであってよく、ＥＤＣの量は１．５〜３．６×Ｗであってよく、ＮＨＳＳの量は１．７〜７．０×Ｗまたは１．７〜４．０×Ｗであってよい。さらに典型的には、使用される保護鎖の量は０．５〜１．１×Ｗであってよく、ＥＤＣの量は１．５〜３．３×Ｗであってよく、ＮＨＳＳの量は１．７〜３．７×Ｗであってよい。またさらに典型的には、使用される保護鎖の量は、０．５〜１．０×Ｗであってよく、ＥＤＣの量は１．５〜３．０×Ｗであってよく、ＮＨＳＳの量は１．７〜３．４×Ｗであってよい。最も典型的には、保護鎖の量は、０．８×Ｗ〜１×Ｗであってよく、ＥＤＣの量は２．５×Ｗ〜２．９×Ｗであってよく、ＮＨＳＳの量は２．３×Ｗ〜２．８×Ｗであってよい。
【００３７】
ステップＢ１では、本発明のプロセスのステップ（ｂ）の保護鎖の活性化を水性緩衝液中で行うことによって、溶液Ｂを生成する。使用することができる緩衝液は特に限定されず、任意の適切な緩衝液を使用することができる。適切な緩衝液は、典型的には、ｐＨ４〜５．５の範囲の緩衝液である。適切な緩衝系として、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）を挙げることができる。溶液のｐＨは、通常４．０〜５．５、例えば、ｐＨ４．２〜ｐＨ５．２、例えば、ｐＨ４．４〜ｐＨ５．０など、例えば、４．５〜４．９などである。緩衝液中の緩衝塩の典型的な濃度は、１〜１００ｍＭ、例えば、１０ｍＭである。例えば、緩衝液は、１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．７であってよい。
【００３８】
水性緩衝液中の活性化した保護鎖の容量は容量Ｚとして表される。容量Ｚは、典型的には、Ｗ／（Ｙ＋Ｚ）が約３０ｍＭ〜約５５ｍＭ、例えば、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば、約４５ｍＭなどであるような容量である。容量ＹおよびＺは典型的には同じ単位で与えられる。例えば、両方のＹとＺは、典型的にはリットル（Ｌ）単位で与えられる。当業者であれば、用語「リットル」は、標準的な変形、例えば、μＬ（１０−６Ｌ）、ｍＬ（１０−３Ｌ）、ｃＬ（１０−２Ｌ）などを含むことを理解している。
【００３９】
活性化プロセスのための反応時間は、典型的には、３０分間未満、例えば、０〜３０分など、例えば、２〜２５分、多くの場合１０〜２４分、例えば、１８〜２２分など、例えば約２０分である。
【００４０】
本発明のプロセスのステップ（ｃ）では、本明細書に記載されているような溶液Ａは、溶液Ｂ、またはその中に含まれる、本明細書に記載されているような試薬と混合することによって、溶液Ｃを得る。試薬は、多くの場合、沈殿を回避するような方式で、激しい撹拌下で加える。通常、連続的な撹拌を使用して、溶液をかき混ぜる。連続的な撹拌は、任意の適切な技術、例えば、磁気撹拌機または混合器などにより、または例えば、撹拌棒を用いた手動の撹拌により達成し得る。典型的な撹拌（回転）スピードは、５０〜２０００ｒｐｍ（例えば、２００〜１５００ｒｐｍ）である。激しい撹拌は、多くの場合、沈殿（本明細書に記載されている通り）を回避するために必要とされ、より高い回転スピード、例えば、５００〜２０００ｒｐｍ（例えば、１０００〜２０００ｒｐｍ）などが多くの場合使用される。試薬および溶液は典型的には、ゆっくりと、例えば、０〜５０ｍＬ／分、さらに典型的には、０〜２０ｍｌ／分（例えば、０〜１０ｍＬ／分）で加える。溶液のゆっくりとした添加は、標準的な技術、例えば、滴下ピペットまたは蠕動ポンプなどを使用して達成することができる。他の適切な方法は当業者には公知である。固体試薬のゆっくりとした添加は、任意のステップで加えるべき全部の試薬の一部分を添加し、次の部分の添加前に時間をおく（例えば、１０ｓ〜１０分など）ことによって達成される。代わりに、固体試薬のゆっくりとした供給は、例えば、漏斗または当業者が熟知している他の標準的な技術を使用して達成することもできる。
【００４１】
本発明のプロセスのステップ（ｄ）は、任意選択であり、存在しても、しなくてもよい。存在する場合、ステップ（ｄ）は、所望の最終ｐＨを有するために、標準的な技術、例えば、緩衝塩の酸または共役塩基の添加などを使用して、溶液ＣのｐＨを調整することに対応する。溶液Ｃの最終ｐＨは典型的には、ｐＨ６．５超、例えば、ｐＨ６．５〜ｐＨ９、例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８などである。
【００４２】
本発明のステップ（ｅ）では、追加のＥＤＣを溶液Ｃに加える。追加のＥＤＣを加える手法は特に限定されていない。例えば、追加のＥＤＣは、１回の投与で加えてもよいし、または複数のアリコートのＥＤＣを、最終的な所望量のＥＤＣが溶液Ｃに加えられるまで別々に加えてもよい。したがって、追加のＥＤＣは、１つまたは複数の部分に分けて加えてもよい。追加のＥＤＣは、典型的には、溶液Ｃの形成直後に溶液Ｃに加えず、むしろ、溶液Ｃは、多くの場合、本明細書に記載されているようなその形成後、２〜３時間、例えば、約２．５時間など（例えば、約２時間）の間反応させてから、追加のＥＤＣを加える。
【００４３】
典型的には、０．５×Ｗ〜１．５×Ｗの追加のＥＤＣを溶液Ｃに加え、さらに典型的には、０．５×Ｗ〜１．２×Ｗの追加のＥＤＣを加え、またさらに典型的には、０．５×Ｗ〜１．１×Ｗ、例えば、０．５×Ｗ〜１．０×Ｗなどの追加のＥＤＣを加える。例えば、加える追加のＥＤＣの量は、０．８５×Ｗ〜０．９５×Ｗ（例えば、０．９×Ｗ）、または０．７５×Ｗ〜０．８５×Ｗ（例えば、０．８×Ｗ）、または０．６５×Ｗ〜０．７５×Ｗ（例えば、０．７×Ｗ）、または０．５５×Ｗ〜０．６５×Ｗ（例えば、０．６×Ｗ）であってよい。したがって、溶液Ｃ中のＥＤＣの総量は、モルで、典型的には、２×Ｗ〜５．１×Ｗ、さらに典型的には、２×Ｗ〜４．８×Ｗ、さらに典型的には、２×Ｗ〜４．４×Ｗ、またさらに典型的には、２×Ｗ〜４×Ｗ、例えば、３×Ｗ〜３．９×Ｗなど、例えば、約３．４×Ｗ〜約３．８×Ｗである。
【００４４】
一旦追加のＥＤＣを加えたら、直鎖ポリアミン骨格上の残りの第１級アミノ基の量が元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）であることが必要とされ得る任意のさらなる反応ステップへと進行する前に、典型的には十分な時間を充てる。追加のＥＤＣを加える前、または追加のＥＤＣを加えた直後のいずれかに、溶液Ｃを凍結または凍結乾燥することは一般的に望ましくない。しかし、追加のＥＤＣを加え、直鎖ポリアミン骨格上の残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）となった後、溶液Ｃを凍結または凍結乾燥することができる。したがって、追加のＥＤＣを加える前、または追加のＥＤＣを加えた後、直鎖ポリアミン骨格上の残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％（４５〜６０％飽和）であるまで、溶液Ｃは凍結乾燥または凍結しないことが好ましい。
【００４５】
本発明はまた、本明細書に記載されているようなステップ（ａ）〜（ｅ）を含み、本明細書に記載されているようなステップ（ｆ）〜（ｈ）をさらに含む方法を提供する。
【００４６】
ステップ（ｆ）は、存在する場合、本明細書に記載されているような溶液Ｃから溶液Ｄを得ることを含む。ステップ（ｆ）は、
ｉ）残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）から得られる溶液）を凍結および凍結乾燥することであって、有機溶媒（複数可）中で凍結乾燥された物質を復元し、溶液Ｄを得ること、または
ｉｉ）少なくともＷの強い求核試薬（例えば、ヒドロキシルアミンなど）を、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）から得られる溶液）に加えることであって、生成物を限外濾過法で精製し、これに続いて凍結乾燥し、生成物を有機溶媒（複数可）に溶解して、溶液Ｄを得ること、または
ｉｉｉ）１．０〜２．５容量当量の有機溶媒（複数可）を加えて、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）から得られる溶液）の総量を増加することであって、溶液Ｄを得て、溶液Ｄを少なくとも１０分間４０〜７０℃（端数を含む）に加熱し、強い求核試薬を加え、次いで、生成物を限外濾過法および凍結乾燥で精製し、次いで純粋なＰＬＰＥＧ生成物を有する溶液Ｄを有機溶媒（複数可）中で復元させること、または
ｉｖ）１．０〜２．５容量当量の有機溶媒（複数可）を加えることにより、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）から得られる溶液）の総量を増加させることであって、溶液Ｄを得て、溶液Ｄを４０〜７０℃（端数を含む）に加熱すること、を含み得る。
【００４７】
適切な有機溶媒として、アセトニトリル、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよび１−メチル−２−ピロリジノンが挙げられ、アセトニトリルが特に適切である。アセトニトリルは溶媒として、水または他の適切な溶媒に、１００％未満のアセトニトリル、例えば、１０％〜９０％アセトニトリル、例えば、３０％〜７０％アセトニトリルなど、典型的には、５０％〜７０％アセトニトリル、例えば、６０％〜７０％アセトニトリルなどの最終濃度まで希釈してもよく、例えば、多くの場合、約６６％アセトニトリル（すなわち：水中６６％アセトニトリル）が使用される。一部の実施形態では、アセトニトリルは、最終濃度６４％まで水中で希釈することができる。
【００４８】
ステップ（ｆ）がオプション（ｉ）による場合、適切な有機溶媒として、アセトニトリル、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、および１−メチル−２−ピロリジノンが挙げられ、アセトニトリルが特に適切である。溶液Ｄを得るために凍結乾燥された物質を復元するのに使用される溶媒の量は、当業者により容易に決定することができる。多くの場合、凍結乾燥された物質がその中で復元される溶媒の量は、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）で得られる溶液）の容量の１．０〜２．５容量当量である。
【００４９】
ステップ（ｆ）がオプション（ｉｉ）による場合、使用される強い求核試薬は特に限定されないが、例えば、本明細書に記載されているような任意の強い求核試薬を挙げることができる。特に適切な強い求核試薬として、ＮＨ２ＯＨ、ＮａＯＲ、ＬｉＲ、ＮａＯＨまたはＫＯＨ、ＮａＣＮまたはＫＣＮ、ＮａＣＣＲ（アセチリドアニオン）、ＮａＮＨ２、ＮａＮＨＲ、ＮａＮＲ２、ＮａＩ、ＬｉＢｒ、ＫＩ、およびＮａＮ３が挙げられる。一部の実施形態では、Ｒは、本明細書で規定されたようなＣ１〜Ｃ６アルキル基またはＣ２〜Ｃ６アルケニル基である。ステップ（ｆ）がオプション（ｉｉ）による場合、限外濾過法は、本明細書に記載されているように行うことができる。多くの場合、凍結乾燥された物質がその中で復元されるアセトニトリルの量は、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）から得られる溶液）の容量の１．０〜２．５容量当量である。
【００５０】
ステップ（ｆ）がオプション（ｉｉｉ）による場合、その中に得られる溶液Ｄは、典型的には、４０〜７０℃、例えば、５０〜６５℃、例えば、５５〜６０℃などに加熱する。加熱は、典型的には、１０〜６０分間、例えば、１０〜３０分間など、例えば１０〜２０分間行う。強い求核試薬は、特に限定されないが、例えば、本明細書に記載されているような任意の強い求核試薬、例えば、上記ステップ（ｆ）のオプション（ｉｉ）に対して記載されているような強い求核試薬などを挙げることができる。溶液Ｄを復元するのに使用されるアセトニトリルの量は、当業者により容易に決定することができる。多くの場合、凍結乾燥された物質がその中で復元されるアセトニトリルの量は、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％である溶液Ｃ（すなわち、本明細書に記載されているようなステップ（ｅ）で得られる溶液）の容量の１．０〜２．５容量当量である。誤解を避けるため、ステップ（ｆ）がオプション（ｉｉｉ）による場合、ＰＬＰＥＧ生成物という用語は、凍結乾燥ステップの生成物を指す。
【００５１】
ステップ（ｆ）がオプション（ｉｖ）による場合、この中で得られる溶液Ｄは、典型的には、４０〜７０℃、例えば、５０〜６５℃など、例えば、５５〜６０℃に加熱する。加熱は、典型的には、１０〜６０分間、例えば、１０〜３０分間など、例えば１０〜２０分間行う。
【００５２】
ステップ（ｇ）は、存在する場合、０．５〜６×Ｗの第３級アミンを溶液Ｄに加えることを含む。任意の適切な第３級アミン、例えば、トリメチルアミン（ＴＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびトリフェニルアミンなどを使用することができる。ＤＩＰＥＡは特に適切である。
【００５３】
ステップ（ｈ）は、存在する場合、４０〜７０℃のアセトニトリル、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、および／または１−メチル−２−ピロリジノン中で少なくとも０．７５×Ｗ当量の長鎖脂肪酸−ＮＨＳを、ステップ（ｇ）の生成物に加えることによって、溶液Ｅを得て、この溶液を室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌することによって、粗製の最終生成物を得ることを含む。
【００５４】
典型的には、０．７５×Ｗ〜２×Ｗ当量の長鎖脂肪酸−ＮＨＳが加えられ、さらに典型的には、０．８×Ｗ〜１．５×Ｗが加えられ、またさらに典型的には、０．８５×Ｗ〜１．２×Ｗが加えられ、例えば、約０．９×Ｗ〜約１．１×Ｗなど、例えば約１×Ｗ当量の長鎖脂肪酸−ＮＨＳが加えられてもよい。
【００５５】
長鎖脂肪酸−ＮＨＳは、カルボキシル基がＮＨＳでエステル化されている任意の適切な長鎖脂肪酸であってよい。適切な長鎖脂肪酸は本明細書に記載されており、１３〜２１個の炭素原子を含む脂肪族テールを有するものが挙げられる。本プロセスにおいて使用するのに適切な長鎖脂肪酸−ＮＨＳ基を生成するためにＮＨＳでエステル化することができる長鎖脂肪酸の例として、本明細書に記載されているものが挙げられる。
【００５６】
長鎖脂肪酸−ＮＨＳを、有機溶媒、例えば、極性有機溶媒など、例えばアセトニトリル中で、ステップ（ｇ）の生成物に加える。有機溶媒は、典型的には、４０〜７０℃、例えば、５０〜６５℃など、例えば、５５〜６０℃である。脂肪酸化（ｆａｔｙｌａｔｉｏｎ）反応は、少なくとも２時間、例えば、２〜２４時間、例えば、２時間〜１２時間など、例えば６〜１２時間の間進行させる。反応は、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで、したがって粗製の最終生成物を生成するまで進行させる。
【００５７】
本明細書に記載されているような最終的な粗生成物は、標準的な技術を使用して精製および単離することができる。例えば、最終生成物中の残りの有機溶媒および／または過剰の脂肪酸は、酢酸エチルなどの溶媒を使用して抽出することができる。典型的には、前記抽出は、１回より多く、例えば、２回またはそれ超などにわたり行われる。次いで、抽出した生成物は、限外濾過法で精製することができる。一部の実施形態では、最終的な粗生成物は、有機溶媒を水に交換し、典型的には、エタノールと水を少なくとも１０容量換えることによって、限外濾過法により最終生成物を洗浄することにより精製することができる。最終生成物は、凍結することができ、および／または凍結乾燥することができる。
【００５８】
本発明の一態様では、ステップ「ｂ」における溶液Ｂは、０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基、１．７〜６．０×ＷのＮＨＳＳ、および１．５〜３．６×ＷのＥＤＣを有する。
【００５９】
本発明の別の態様では、ステップ「ｂ」における溶液Ｂは、０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基、１．７〜５．０×ＷのＮＨＳＳ、および１．５〜３．６×ＷのＥＤＣを有する。
【００６０】
本発明の別の態様では、ステップ「ｂ」における溶液Ｂは、０．５〜１．２×Ｗのカルボキシル基、１．７〜４．０×ＷのＮＨＳＳ、および１．５〜３．６×ＷのＥＤＣを有する。
【００６１】
以下の表１は、プロセスの規模に関係なく、試薬の互いの典型的な関係を示す。表１は、ステップ（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）における本発明の例示的な態様として、アセトニトリル、ＤＩＰＥＡおよびＣ１８−ＮＨＳをそれぞれ指しているが、しかし、これらの成分は、例として与えられたもので、本発明はこれらの成分に限定されず、他の適当な成分は、本明細書に記載されている通りであることを当業者であれば認識されよう。同様のコメントが以下の表２〜１２に適用される。
【表１】
2020076111.tif 000002
【００６２】
多くの場合、直鎖ポリアミン骨格は、光散乱または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に基づき、３５〜１５０の重合度を有するポリリジンである。通常、直鎖ポリアミン骨格は、光散乱または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に基づき、３５〜８５の重合度を有するポリリジンである。
【００６３】
典型的には、ＰＥＧ保護鎖は、単一のカルボキシル末端を有するメトキシＰＥＧ（ＭＰＥＧ）であり、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）に基づき、４〜１２ｋＤａの数平均分子量またはＭｎを有する。多くの場合、ＰＥＧ保護鎖は、単一のカルボキシル末端を有するメトキシＰＥＧ鎖であり、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）に基づき、４〜６ｋＤａの数平均分子量またはＭｎを有する。
【００６４】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｅ」において、０．５〜１．２×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｆ」において、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％に到達したとき、１．５〜２．０容量当量の極性有機溶媒（例えば、アセトニトリル）が加えられるようなプロセスである。以下の表２は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表２】
2020076111.tif 000003
【００６５】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５〜１．１×Ｗのカルボキシル基、１．７〜３．７×ＷのＮＨＳＳおよび１．５〜３．３×ＷのＥＤＣを有し、ステップ「ｅ」において、０．５〜１．１×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられるようなプロセスである。以下の表３は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表３】
2020076111.tif 000004
【００６６】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５〜１．０×Ｗのカルボキシル基、１．７〜３．４×ＷのＮＨＳＳ、１．５〜３．０×ＷのＥＤＣを有し、活性化を５〜２５分の間進行させ、ステップ「ｅ」において、０．５〜１．０×Ｗの追加のＥＤＣが溶液Ｃに加えられるようなプロセスである。以下の表４は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表４】
2020076111.tif 000005
【００６７】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において溶液Ｂが、０．８５〜０．９５×Ｗのカルボキシル基、２．６〜３．２×ＷのＮＨＳＳ、２．５〜２．９×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、ステップ「ｅ」において、０．８５〜０．９５×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられるようなプロセスである。以下の表５は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表５】
2020076111.tif 000006
【００６８】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが０．９×Ｗのカルボキシル基、２．７×ＷのＮＨＳＳ、２．７×ＷのＥＤＣを有し、溶液ｂのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．９×Ｗの追加のＥＤＣが溶液Ｃに加えられるようなプロセスである。以下の表６は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表６】
2020076111.tif 000007
【００６９】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．７５〜０．８５×Ｗのカルボキシル基、２．３〜２．８×ＷのＮＨＳＳ、および２．３〜２．６×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．７５〜０．８５×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられるようなプロセスである。以下の表７は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表７】
2020076111.tif 000008
【００７０】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．８×Ｗのカルボキシル基、２．４×ＷのＮＨＳＳ、２．４×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．８×Ｗの追加のＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｅ」において、少なくとも０．７５×ＷのＣ１８−ＮＨＳが加えられるようなプロセスである。以下の表８は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表８】
2020076111.tif 000009
【００７１】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．６５〜０．７５×Ｗのカルボキシル基、２．０〜２．５×ＷのＮＨＳＳ、２．０〜２．３×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．６５〜０．７５×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられるようなプロセスである。以下の表９は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表９】
2020076111.tif 000010
【００７２】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．７×Ｗのカルボキシル基、２．１×ＷのＮＨＳＳ、２．１×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．７×Ｗの追加のＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられるようなプロセスである。以下の表１０は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表１０】
2020076111.tif 000011
【００７３】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．５５〜０．６５×Ｗのカルボキシル基、１．７〜２．２×ＷのＮＨＳＳ、１．７〜２．０×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップｅにおいて、０．５５〜０．６５×ＷのＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｇ」において、１〜３×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンが溶液Ｄに加えられる。以下の表１１は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表１１】
2020076111.tif 000012
【００７４】
本発明の別の態様では、上述のプロセスは、ステップ「ｂ」において、溶液Ｂが、０．６×Ｗのカルボキシル基、１．８×ＷのＮＨＳＳ、１．８×ＷのＥＤＣを有し、溶液ＢのｐＨが４．４〜５．０であり、活性化を１８〜２２分の間進行させ、溶液ＣのｐＨが７〜８に調整され、ステップ「ｅ」において、０．６×Ｗの追加のＥＤＣが溶液Ｃに加えられ、ステップ「ｅ」において、少なくとも０．７５×ＷのＣ１８−ＮＨＳが加えられるようなプロセスである。以下の表１２は、プロセスの規模に関係なく、ちょうど記載されたプロセスにおける試薬の互いの関係を示している。
【表１２】
2020076111.tif 000013
【００７５】
本明細書に記載されているように、本発明は、上述のプロセスのステップ（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）内に代替形態を含み、この中で、（ｆ）は、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５５〜４０％であるとき、溶液Ｃを凍結および凍結乾燥することを含み、水不混和性の有機溶媒、例えば、ジクロロメタンまたは水混和性と水不混和性の有機溶媒混合物で、凍結乾燥された物質を復元し、溶液Ｄを得ることを含み、（ｇ）は、０．５〜６×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンを溶液Ｄに加えることを含み、（ｈ）は、少なくとも０．７５×Ｗ当量のＣ１８−ＮＨＳを直接、または例えば、ジクロロメタンなどの適当な溶媒中で加えることを含み、溶液Ｅを得て、この溶液を、室温で少なくとも２時間、残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌することによって、粗製の最終生成物を得ることを含む。
【００７６】
溶液Ｅ中の最終生成物が有機溶媒中にある上述のプロセスは、粗生成物中の有機溶媒を水に交換するステップであって、エタノールと水の少なくとも１０の交換を使用して、限外濾過法により生成物を洗浄するステップ（ｉ）をさらに含んでもよい。
【００７７】
本明細書に記載されているように、本発明は、上述のプロセスのステップ（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）内にさらなる代替形態を含み、この中で、（ｆ）は、強い求核試薬（元の第１級アミノの少なくとも１×Ｗ当量）例えば、ヒドロキシルアミンなどを溶液Ｃに加えることを含み、生成物を以下に記載されているような限外濾過法で精製し、これに続いて凍結乾燥し、極性有機溶媒（例えば、アセトニトリル）に溶解することによって、溶液Ｄを得ることを含み、（ｇ）は、０．５〜６×ＷのＤＩＰＥＡまたは他の第３級アミンを溶液Ｄに加えることを含み、（ｈ）は、少なくとも０．７５×Ｗ当量のＣ１８−ＮＨＳを加えることを含み、溶液Ｅを得て、この溶液を、室温で少なくとも２時間、または残りの第１級アミノ基が元の第１級アミノの５％未満であるまで撹拌して、粗製の最終生成物を得ることを含む。
【００７８】
溶液Ｅ中の最終生成物が水と水混和性有機溶媒の混合物中にある上述のプロセスは、極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）を使用して、溶液Ｅ中の粗製の最終生成物から水混和性有機溶媒および過剰の脂肪酸を抽出するステップであって、極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）層を廃棄し、水層の抽出を少なくとも１回繰り返し、これに続いて、エタノールと水の少なくとも１０の交換を使用して限外濾過法により生成物を洗浄するステップ（ｉ）をさらに含んでもよい。
【００７９】
定義
便宜のため、本開示のさらなる記載の前に、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲の中で採用されている特定の用語がここに収集されている。これらの定義は、本開示の残りを考慮して読み取られ、当業者によるように理解されるべきである。他に規定されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。他に指摘されていない限り、数を四捨五入する一般的な数学的法則は、多分散でない分子、例えば、Ｈ２Ｏ、ＮＨＳＳ、ＥＤＣなどの分子量を除いて、本明細書中のすべての数に適用される。ポリマーは多分散分子である。数が与えられた場合にはいつでも、その数の最後の桁は確実性の境界と考えられ、所与の数の最後の桁の位で数の範囲を四捨五入した結果である。例えば、「５ｋＤａポリマー」とは、４．５１〜５．４９ｋＤａを千の位で四捨五入したものが５ｋＤａとなるので、４．５ｋＤａ〜５．５ｋＤａの間の範囲を意味する。別の例は、２．１ｍｍｏｌが２．０５〜２．１５ｍｍｏｌの間の範囲であることである。別の例は、５．０ｋＤａポリマーが４．９５〜５．０５ｋＤａの間の範囲であることである。
【００８０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、この冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「保護鎖」とは、１つの保護鎖または１つより多くの保護鎖を意味する。
【００８１】
用語「ＡＮＰ」は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（当技術分野で公知の規則に基づく配列：配列番号１−ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹであり、ペプチド内ジスルフィド結合を有する）である。このペプチドは、本明細書の目的のため、様々なプロセスにより生成されるグラフトコポリマー間の差異を区別するために使用された。
【００８２】
用語「ＢＮＰ」は、Ｂタイプのナトリウム利尿ペプチド（当技術分野で公知の規則に基づく配列：配列番号２−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲ  ＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧ  ＬＧＣＫＶＬＲＲＨであり、ペプチド内ジスルフィド結合を有する）である。このペプチドは、本明細書の目的のため、様々なプロセスにより生成されるグラフトコポリマー間の差異を区別するために使用された。
【００８３】
用語「Ｃ１２−ＮＨＳ」、「Ｃ１３−ＮＨＳ」、「Ｃ１４−ＮＨＳ」、「Ｃ１５−ＮＨＳ」、「Ｃ１６−ＮＨＳ」、「Ｃ１７−ＮＨＳ」、「Ｃ１８−ＮＨＳ」、「Ｃ１９−ＮＨＳ」、「Ｃ２０−ＮＨＳ」、「Ｃ２１−ＮＨＳ」などは、カルボキシル基がＮＨＳでエステル化されている１２〜２１個の炭素の脂肪族テールを有する脂肪酸を指す。以下の「脂肪酸」を参照されたい。特に述べられていない限り、Ｃ１２はラウリン酸を指し、Ｃ１４はミリスチン酸を指し、Ｃ１６はパルミチン酸を指し、Ｃ１８はステアリン酸を指し、Ｃ２０はアラキジン酸を指す。
【００８４】
用語「誘導体」または「類似体」は、本明細書で使用される場合、そのコア構造が親化合物のものと同じであるか、または密に類似しているが、化学的または物理的修飾、例えば、異なるまたは追加の基などを有する化合物を指す。この用語はまた、親ペプチドと少なくとも８０％の配列同一性（すなわちアミノ酸置換は２０％未満）を有するペプチドも含む。この用語はまた、親ペプチドと比較して、それに結合している追加の基、例えば、脂肪酸および／または追加のアミノ酸などを有するペプチドも含む。この用語はまた、親ポリマーと比較して、それに結合している追加の基（複数可）、例えば、保護基の場合、アルコキシ基などを有するポリマーを含む。この用語はまた、親の保護鎖と比較して、それに結合している追加のメトキシまたはエトキシ基（複数可）を有するメトキシル化またはエトキシ化された保護鎖を含む。
【００８５】
用語「ＤＩＰＥＡ」は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、またはヒューニッヒ塩基、またはＤＩＥＡ、有機化合物およびアミンを指す。有機化学において、これは塩基として使用される。窒素原子は２つのイソプロピル基およびエチル基により遮蔽されているので、プロトンのみが、容易にフィットする位十分に小さい。２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの様に、この化合物は良好な塩基であるが、弱い求核試薬であることから、有用な有機試薬となる。
【００８６】
用語「ＥＤＣ」は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌを指し、これはまた、ＥＤＡＣまたはＥＤＣＩと呼ぶこともでき、分子量：１９１．７０Ｄａを有する。このカルボジイミド試薬は、カルボキシル基の活性化のために必要な式Ｎ＝Ｃ＝Ｎからなる官能基を含有する。この基は、保護鎖および脂肪酸上のカルボキシル基を活性化するのに重要である。カップリング反応のプロセスの間、活性化したカルボキシル基Ｏ−アシルイソウレア−中間体は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドのいずれかと共にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成することによって安定化することができる。
【００８７】
用語「脂肪酸」とは、飽和または不飽和のいずれかである、長い脂肪族テールまたは鎖を有するカルボン酸である。大部分の天然に存在する脂肪酸は、４〜２８個の偶数の炭素原子のテールを有する。これらが他の分子に結合していない場合、これらは「遊離」脂肪酸として公知である。炭素炭素二重結合を有する脂肪酸は不飽和として公知であり、二重結合を有さないものは飽和として公知である。脂肪酸鎖は長さが異なり、多くの場合短いものから非常に長いものとして分類される。短鎖脂肪酸は、６個未満の炭素の脂肪族テールを有する脂肪酸（すなわち酪酸）である。中鎖脂肪酸は、６〜１２個の炭素の脂肪族テールを有する脂肪酸（Ｃ６〜Ｃ１２脂肪酸とも呼ばれ、この場合数は炭素の数を指す）である。長鎖脂肪酸は、１３〜２１個の炭素の脂肪族テールを有する脂肪酸（Ｃ１３〜Ｃ２１脂肪酸とも呼ばれる）である。極長鎖脂肪酸は、２２個の炭素より長い脂肪族テールを有する脂肪酸（≧Ｃ２２脂肪酸とも呼ばれる）である。本明細書の目的のため、用語「脂肪酸」は、上記のすべてを網羅し、脂肪酸の種のそれぞれは、１つより多くの一般名称を有することができる。飽和脂肪酸の例として、カプリル酸（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ）、カプリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯＯＨ）、ラウリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨ）、ミリスチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯＯＨ）、パルミチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯＯＨ）、ステアリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯＯＨ）、アラキジン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１８ＣＯＯＨ）、ベヘン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２０ＣＯＯＨ）、リグノセリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２２ＣＯＯＨ）、セロチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２４ＣＯＯＨ）が挙げられる。不飽和脂肪酸の例として、ミリストレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、パルミトレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、サピエン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ）、オレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、エライジン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、バクセン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）９ＣＯＯＨ）、リノール酸（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、リノエライジン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、α−リノレン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、アラキドン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ）、エイコサペンタエン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ）、エルカ酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）１１ＣＯＯＨ）、ドコサヘキサエン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ）が挙げられる。
【００８８】
用語「脂肪酸−ＮＨＳ」は、カルボキシル基がＮＨＳでエステル化している脂肪酸を指す。用語「長鎖脂肪酸−ＮＨＳ」は、カルボキシル基がＮＨＳでエステル化している、１３〜２１個の炭素の脂肪族テールを有する長鎖脂肪酸または脂肪酸を指す（Ｃ１３〜Ｃ２１脂肪酸とも呼ばれ、この場合数は炭素の数を指す）。同様の命名は、脂肪酸が６〜１２個の炭素の脂肪族テールを有する「短い長鎖脂肪酸−ＮＨＳ」に適用される。また、同様の命名は、脂肪酸が２２個およびそれ超の炭素の脂肪族テールを有する「極長鎖脂肪酸−ＮＨＳ」にも適用される。
【００８９】
用語「脂肪酸化（ｆａｔｙｌａｔｉｏｎ）」は、脂肪酸をポリアミン骨格に加えるステップまたは化学的プロセスを指す。
【００９０】
用語「ＧＬＰ−１」は、グルカゴン様ペプチド−１を指す（配列、配列番号３−ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ  Ｇ）。このペプチドは、本明細書の目的のため、様々なプロセスにより生成されるグラフトコポリマー間の差異を区別するために使用された。
【００９１】
用語「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指し、ｐＨ６．５〜８．５の間で高い緩衝能力を有する双性イオン有機化学緩衝剤である。
【００９２】
用語「直鎖ポリアミン骨格」は、第１級アミノ基の繰り返しを有する直鎖非タンパク質ホモポリマーまたはヘテロ−ポリマーを指し、自然の起源であっても、合成の起源であってもよい。非タンパク質とは、細胞活性に関連する三次元構造を有するように生命体により作製されたタンパク質ではないことを意味する。「直鎖ポリアミン骨格」は「線状ポリマー骨格」と交換可能なように使用され、本明細書の中で溶液Ａの成分である。好ましいまっすぐな「直鎖ポリアミン骨格」はポリリジンであり、本明細書中ではＰＬとも呼ばれる。「直鎖ポリアミン骨格」は、ＤキラリティーもしくはＬキラリティー、または両方を有していてもよい他のポリアミノ酸であることがあり、この場合アミノ酸の側基（Ｒ−基として公知）は第１級アミンを含有する。多くの場合、ポリマー骨格は、光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、５〜９５ｋＤａの平均数分子量（Ｍｎ）または２２〜４５０の重合度（ＤＰｎ）を有することができる。好ましいポリマー骨格は光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、７〜３２ｋＤａのＭｎまたは３５〜１５０のＤＰｎを有する。最も好ましいポリマー骨格は、光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、７〜１８ｋＤａのＭｎまたは３５〜８５のＤＰｎを有する。粘度測定により上記に与えられたＤＰｎは、どの標準が使用されたかにより、同じ物質に対して２倍高くなる可能性がある。第１級アミノ基の繰り返しを有する他のポリマー骨格はまた、このような炭水化物ポリマーまたは他の合成ポリマーを使用することもできる。ポリマー骨格は、保護鎖および脂肪酸が結合できる複数の第１級アミノ基を提供する。
【００９３】
用語「％ローディング」は、生理学的または近生理学的な緩衝液中で、ペプチド：コポリマーの規定された重量対重量比で、ペプチドがセミランダムグラフトコポリマー生成物と混合される結合特性として規定され、例えば、１０％ローディングは、１重量部のペプチドと、１０重量部のコポリマーからなる。特定のローディングでの遊離ペプチドのパーセンテージは、様々なプロセスにより生成されるグラフトコポリマー間の差異を区別するために使用される。
【００９４】
用語「保護的な側鎖」とは、本明細書で使用される場合、鎖に沿って水と広く結合するか、または水を吸収する能力を有する親水性ポリマー分子を指し、溶液Ｂの成分である。結合するか、または吸収することは、大きな分子構造の空間またはチャンネル、例えば、スポンジ、樹脂、またはゲルなどへの取り込みを指す吸収とは異なる。水分子とのこの大規模な結合のために、保護鎖は高い水溶性を有し、これはまた、それが連結している他のポリマーの水溶性も増加させる。保護的な側鎖は、顕著な量の電荷を有さず、一般的に非免疫原性である。これはまた、保護鎖が、さもなければあまり水溶性ではないであろう組成物に親水性の特性を提供することも意味する。用語「保護鎖」および「保護的な側鎖」は、本明細書において交換可能なように使用される。本発明の組成物の保護鎖として、典型的には、一方の末端ではアルコキシ化されていてもいなくてもよいが（例えば、メトキシまたはエトキシなど）、他方の末端ではカルボキシル部分で終了する、ポリエチレングリコールとも呼ばれる、ポリオキシエチレングリコールが挙げられる。保護鎖は、同様にまたは代わりに、一方の末端ではアルコキシ化されていてもいなくてもよいが（例えば、メトキシまたはエトキシなど）、すべてがカルボキシル部分で終了するポリプロピレングリコールまたはポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーであってもよい。好ましい保護鎖は、カルボキシル末端を有し、同じまたは同様の物質で標準化したゲル浸透クロマトグラフィーに基づき、サイズが２〜２０ｋＤａの範囲である、直鎖のメトキシル化ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧまたはメトキシＰＥＧ）である。さらに好ましいサイズは４〜１２ｋＤａであり、最も好ましいサイズは４〜６ｋＤａである。本発明の組成物の保護鎖はまた、帯電していない多糖およびこれらの誘導体、例えば、エトキシ化またはメトキシル化された多糖などを含む。この文脈において、帯電していないとは、鎖の本体が正電荷または負電荷を有さないことを意味する。
【００９５】
用語「ＭＰＥＧ−ＣＭ」は、メトキシポリエチレングリコール−カルボキシルを指し、一方の末端にメトキシ基および他方の末端にカルボキシル基を有する直鎖のＰＥＧである。これは予備活性化されていない形態のＰＥＧである。
【００９６】
用語「ＭＰＥＧ−ＳＣＭ」は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネートを指し、一方の末端にメトキシ基を有し、他方の末端には、ＮＨＳに連結したカルボニル基を有する、ＮＨＳ予備活性化した形態の直鎖のＰＥＧである。
【００９７】
用語「ＮＨＳ」は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを指し、分子量：１１５．１０Ｄａを有する。
【００９８】
用語「ＮＨＳＳ」は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを指し、分子量：２１７．１４Ｄａを有する。
【００９９】
用語「非水混和性有機溶媒」は、５０％重量／重量未満で水と混合するか、または水に溶解する有機溶媒を意味する。例えば：ジクロロエタン、ベンゼン、酢酸ブチル、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジ−イソプロピルエーテル、ジクロロメタン、酢酸エチル、エチルベンゼン、メチルエチルケトン、メチルブチルエーテル、ｎ−ブタノール、ペンタン、ｎ−ヘキサン、ヘプタン、トルエン、テトラクロロエチレン、およびキシレンである。
【０１００】
用語「ペグ化」は、ＰＥＧまたはその誘導体をポリアミン骨格に加えるステップまたは化学的プロセスを指す。
【０１０１】
用語「第１級アミン」とは、１つのアルキルまたは芳香族環および２個の水素原子に結合している窒素を指す。言い換えると、それは、３つの水素部位の１つが有機置換基で置き換えられている窒素である。本明細書の目的のため、重要な第１級アミンは、直鎖ポリアミン骨格に沿って繰り返す第１級アミン部分である。ポリリジンの場合、それは、ポリリジンポリマーに沿った、リシンのエプシロン第１級アミノ基である。
【０１０２】
用語「Ｓｏｌ」は、溶液を指し、本明細書の目的のため、Ｓｏｌ  Ａ〜Ｓｏｌ  Ｅと命名されたＡ〜Ｅの様々な液体溶液を指す。
【０１０３】
用語「強い求核試薬」は、容易に脱プロトン化して、完全な負電荷を有するアニオンを与える試薬を指し、これは、ナトリウム、リチウム、またはカリウム対イオンの存在により容易に認識可能であり、ＳＮ２−タイプの置換に参加する。強い求核試薬の例として、ＮＨ２ＯＨ、ＮａＯＣＨ３（任意のＮａＯＲ）、ＬｉＣＨ３（任意のＬｉＲ）、ＮａＯＨまたはＫＯＨ、ＮａＣＮまたはＫＣＮ、ＮａＣＣＲ（アセチリドアニオン）、ＮａＮＨ２、ＮａＮＨＲ、ＮａＮＲ２、ＮａＩ、ＬｉＢｒ、ＫＩ、およびＮａＮ３が挙げられる。強い求核試薬は、本開示のＳｏｌ  Ｃ中の反応を停止して、中間体の精製および／または評価のための特定のステージにおいてプロセスを中断するために使用することができる。
【０１０４】
用語「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンを指し、これは、式Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３を有する化学化合物であり、一般的にＥｔ３Ｎと略記する。これはまたＴＥＡとも略記されるが、しかしこの略語は、ＴＥＡが同様に共通の略語でもある、トリエタノールアミンまたはテトラエチルアンモニウムとの混乱を回避するために慎重に使用しなければならない。ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基）のように、トリエチルアミンは有機合成において一般的に遭遇する。
【０１０５】
用語「ＴＥＯＡ」は、トリエタノールアミンまたは２，２’，２”−トリヒドロキシ−トリエチルアミンまたはトリス（２−ヒドロキシエチル）アミンを指し、ＴＥＡとも略記され、第３級アミンとトリオールの両方である粘性の有機化合物である。
【０１０６】
用語「第３級アミン」は、３つの水素部位が３つの有機置換基で置き換えられている窒素を指す。例として、トリメチルアミン（ＴＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびトリフェニルアミンが挙げられる。
【０１０７】
用語「ＴＮＢＳ」は、ニトロ−アリール酸化酸であるトリニトロベンゼンスルホン酸（Ｃ６Ｈ３Ｎ３Ｏ９Ｓ）を指す。本明細書の目的のため、ＴＮＢＳを利用するアッセイを使用して、Spadaro、A.C.らに従い、溶液Ａ、Ｃ、およびＥ中の第１級アミンを測定する（A
convenient  manual  trinitrobenzenesulfonic  acid  method  for  monitoring  amino  acids  and  peptides  in  chromatographic  column  effluents.、Anal.  Biochem.、１９７９年、９６巻（２号）：３１７〜２１頁）。第１級アミンのためのＴＮＢＳ
アッセイの使用は、反応を次のステップへ進めることができるように、溶液Ｃの第１級アミノ基の飽和を判定するためのものである。
【０１０８】
用語「水混和性有機溶媒」は、５０％重量／重量またはそれ超で水と混合するか、または水に溶解する有機溶媒、例えば酢酸、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、およびテトラヒドロフランを意味する。
【０１０９】
用語「Ｗ」は、本プロセスの、溶液Ａ中の開始ポリアミン骨格、または溶液Ａ中の元のアミノ基の中に存在する第１級アミノ基の総モル数を指す。この用語の使用は、本プロセスを工業的規模まで増加させることを可能にする。明瞭さの目的のため、本明細書における重要な試薬は、「Ｗ」の分数または倍数として表現される。
【０１１０】
用語「×Ｗ」は、Ｗの倍数を指し、通常、先行する数にＷを掛けることによって、必要とされる重要な試薬の特定の値または量が得られる。例えばＷが２．６ｍｍｏｌと等しく、保護鎖がカルボキシル当量の０．９×Ｗを有する場合、その量は、０．９×２．６ｍｍｏｌ、または２．３４ｍｍｏｌである。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝のアルキル基である。典型的には、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、これは、１〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分枝のアルキル基である。Ｃ１〜Ｃ４アルキル基は多くの場合、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基である。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。Ｃ１〜Ｃ３アルキル基は、典型的にはＣ１〜Ｃ２アルキル基である。Ｃ１〜Ｃ２アルキル基はメチルまたはエチルであり、典型的にメチルである。誤解を避けるため、２つのアルキル基が存在する場合、これらのアルキル基は同じでも異なっていてもよい。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝のアルケニル基であり、１つまたは複数、例えば１つまたは２つの二重結合を有する。典型的には、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基はＣ２〜Ｃ４アルケニル基、例えば、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル基である。Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基の例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニルが挙げられる。誤解を避けるため、２つのアルケニル基が存在する場合、このアルケニル基は同じでも異なっていてもよい。
【０１１３】
例として、本発明の方法において、直鎖ポリアミン骨格は、多くの場合、光散乱または核磁気共鳴分析に基づき、２２〜４５０、より多くの場合３５〜１５０、さらにより多くの場合３５〜８５の重合度を有するポリリジンである。保護鎖は、多くの場合、ゲル浸透クロマトグラフィーに基づき、２〜２０ｋＤａ、より多くの場合４〜１２ｋＤａ、さらにより多くの場合４〜６ｋＤａの数平均分子量またはＭｎを有する、単一のカルボキシル末端を有するメトキシＰＥＧ鎖であり、長鎖脂肪酸−ＮＨＳは多くの場合Ｃ１８−ＮＨＳである。
【０１１４】
以下の実施例は本発明を例示する。しかしこれらは、決して本発明を制限するものではない。この関連で、実施例セクションに使用された特定のアッセイは、ペプチドの結合能の指標を提供するためだけに設計されていることを理解することが重要である。このような能力を決定するために利用可能な多くのアッセイが存在し、したがって、任意のある特定のアッセイにおける悪い結果は決定的なものではない。
【実施例】
【０１１５】
本明細書の実施例は、心房性ナトリウム利尿ペプチドと呼ばれるモデルペプチド（ＡＮＰ；当技術分野で公知の規則に基づく配列：配列番号１  ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹであり、ペプチド内ジスルフィド結合を有する）の効率的な結合剤であるセミランダムグラフトコポリマー生成物を与える合成のプロセスについて記載している。用語「効率的な結合剤」とは、生理学的または近生理学的な緩衝液中で、ペプチドがセミランダムグラフトコポリマー生成物と、１：１０の重量比（ペプチド：コポリマー、重量：重量）で混合された場合、遊離ペプチドの量（以下に記載されているように評価）が１２％未満であるような結合特性と規定される。このような結合剤は、本開示の開示以前には存在しない。
【０１１６】
いずれの所与のコポリマー結合剤に対しても、コポリマーに対するペプチドの重量比が増加するにつれて遊離ペプチドの量は増加し、逆に、コポリマーに対するペプチドの重量比が低減するにつれて、遊離ペプチドの量は低減することを注目されたい。これは、本開示の主題であるコポリマーは、許容量を含む特性を有する可逆的結合剤だからである。より高いローディングに起因して許容量がペプチドで飽和した場合、いずれの追加のペプチドも結合しない。本開示の主題であるコポリマーの基の構造の複雑性により、組成における差異を区別する唯一の方法は、これらの測定可能な特性を比較することによる。
【０１１７】
概要
試薬
他に指摘されていない限り、試薬はさらに精製せずに使用した。加えて、使用した試薬は市販のものであり、これらの合成は当技術分野で周知である。
【０１１８】
ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（ＰＬ）（ＮＭＲによるＤＰｎ  ５５、ＮＭＲによるＭｍ  １１，５００、ＧＰＣによるＰＤＩ  １．０４）は、Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）製であり、メトキシポリエチレングリコール−カルボキシル（ＭＰＥＧ−ＣＭ）、ＭＷ  ５ｋＤａは、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ（Ａｒａｂ、ＡＬ）製であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドスルフェート（ＮＨＳＳ）、ＭＷ  ２１７Ｄａは、ＣｈｅｍＰｅｐ（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、ＦＬ）製であり、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート（ＭＰＥＧ−ＳＣＭ）、ＭＷ  ５ｋＤａは、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ｐｌａｎｏ、ＴＸ）製であり、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ＭＷ  １９２ＤａはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）製であった。ステアリン酸（Ｃ１８）、ＭＷ  ２８４Ｄａは、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ  ＭＡ）製であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ＭＷ  １１５Ｄａは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）製であり、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ＭＷ  ２０６ＤａはＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）製であった。
【０１１９】
一般的技術
Lapidotら［Lapidot,  Y.、Rappoport,  S.およびWolman,  Y.（１９６７年）、J.  Lipid  Res.、８巻、１４２頁］から改変した方法を使用して、ステアリン酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（Ｃ１８−ＮＨＳ）、ＭＷ  ３８２Ｄａを調製した。２３０ｍＬの酢酸エチル中のステアリン酸（ＭＷ  ２８４Ｄａ、１７ｇｍ、６０ｍｍｏｌ）をＮＨＳ（ＭＷ  １１５Ｄａ、６．９ｇ、６０ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（ＭＷ  ２０６Ｄａ、９．６ｍＬ、１２．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）で活性化し、一晩インキュベートした。ウレア沈殿物を濾過で除去した。次いで、濾液を乾燥させ、エタノールを使用して再結晶化した。生成物Ｃ１８−ＮＨＳを濾取し、減圧下で乾燥させ、乾燥凍結して保存した。
【０１２０】
緩衝液を脱イオン化蒸留水中に調製した。ｐＨ計を使用して反応ｐＨの調整を実施した。
【０１２１】
ＰＥＧおよびＣ１８によるＰＬ修飾の程度を、ＴＮＢＳアッセイを使用して遊離第１級アミノ基の消費を査定することによって測定した（Sparadoら、（１９７９年）Anal.  Biochem.、９６巻、３１７頁）。マイクロプレートリーダーを使用して試料の可視光吸光度を測定した。
【０１２２】
生成物を、１００ｋＤａまたは５０ｋＤａのカットオフ膜を介して限外濾過法により洗浄した。ＱｕｉｘＳｔａｎｄシステム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）に取り付けた膜カートリッジ（ＵＦＰ−１００−ＥまたはＵＦＰ−５０−Ｅ、ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｃｏｒｐ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して限外濾過法を実施した。典型的な洗浄条件は、１０容量−当量（洗浄されている溶液の容量に対して）の９０％アルコール、１０〜１５容量の８０％アルコールおよび１０容量の水を使用する。次いで生成物をフィルター滅菌し、凍結乾燥した。
【０１２３】
グラフトコポリマーの流体力学的径を、球状タンパク質標準物質を使用して較正したＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬ  ＨＰＬＣカラムを使用するゲル浸透クロマトグラフィーで査定した。ｐＨ７．３５のリン酸緩衝生理食塩水または１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．３５中で対応するペプチドと共にコポリマーを２時間インキュベートし、これに続いて、遠心分離による、１００ｋＤａ  分子量カットオフ膜フィルター（再生セルロースフィルター、ＹＭ−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ製）を介した濾過により、様々なプロセスのグラフトコポリマー生成物のペプチドへの結合を評価した。これらの２種の緩衝液間で、グラフトコポリマー生成物に対するペプチド結合における差異は観察されなかった。
【０１２４】
遊離（未結合の）ペプチドを含有する濾液は、０％Ｂで１分および２５〜５０％Ｂで１〜５分（Ａは０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリルであり、Ｂは０．１％ＴＦＡを含む１００％アセトニトリル）の勾配を使用して、１．５ｍＬ／分の流速で流れ、２２０ｎｍでモニターされた、逆相ＨＰＬＣ（Ｓｙｎｅｒｇｉ  ２．５ｕｍ  Ｍａｘ、０．４×２ｃｍ）で定量化した。コポリマーを含まず、ペプチドを含有する対照チューブからの濾液を、結合のために利用可能なペプチドの総量とした。結合ペプチドの量は、同じ濃度のペプチドが入っているが、グラフトコポリマーを含まない対応する対照から、フィルターを通過した遊離ペプチドの濃度を差し引くことによって計算することができる。２、５、および１０％ローディングが、１：５０、１：２０、および１：１０のペプチド重量対コポリマー重量の比を表すような様々な比で結合を試験した。
【０１２５】
方法
他に指摘されていない限り、一連の溶液（Ｓｏｌ  Ａ、Ｓｏｌ  Ｂ、Ｓｏｌ  Ｃ、Ｓｏｌ  ＤおよびＳｏｌ  Ｅ）を調製し、これらを組み合わせることによって、または化学的プロセスのペグ化および脂肪酸化ステップの間に試薬をこれらに加えることによって、グラフトコポリマーの合成を実施した。Ｓｏｌ  Ａは、緩衝液（２５０もしくは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；または１００ｍＭ  ＴＥＯＡ）に溶解したＰＬを含有し、Ｓｏｌ  Ｂは、室温で、ＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．７）中でＮＨＳＳおよびＥＤＣで活性化したｍＰＥＧ−ＣＭを含有した。Ｓｏｌ  Ｃは、ＰＬのペグ化が生じる反応液であり、Ｓｏｌ  ＡとＳｏｌ  Ｂを組み合わせることにより、または試薬（ＮＨＳＳ、ＥＤＣまたはＰＥＧ−ＳＣＭ）を直接Ｓｏｌ  Ａに加えることによって（したがってゼロ分間の予備活性化を有し、Ｓｏｌ  Ｂを有さない）、室温で調製した。溶液Ｂのないことは、０分の予備活性化を行った溶液Ｂを有することとは異ならない。ＴＮＢＳによって測定した第１級アミノ基が４１〜６２％であると判明したとき、有機溶媒（アセトニトリル、アセトン、またはジクロロメタン）を溶液Ｃに加え、５５〜６０℃に加熱することによって、Ｓｏｌ  Ｄを調製した。Ｓｏｌ  Ｅは、脂肪酸化が生じる反応液であり、Ｃ１８−ＮＨＳ、およびＤＩＰＥＡをＳｏｌ  Ｄに加えることによって調製した。Ｓｏｌ  Ｅを室温まで冷却させておき、２時間から一晩撹拌した。Ｓｏｌ  Ｅの容量とほぼ等しい容量の水をＳｏｌ  Ｅに加え、溶液を、２容量の極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で２〜３回抽出した。次いで生成物を含有する水相を蒸留した脱イオン水で希釈し、上に記載されている限外濾過法で洗浄した。化学的プロセスは、ＰＥＧ−ＳＣＭ、ＥＤＣまたはＮＨＳＳをＳｏｌ  Ａに加えてＳｏｌ  Ｃを生成する場合のように、Ｓｏｌ  Ｂを必要としない場合がある。全ての場合において、ＰＬの出発第１級アミノ含有量に対して、試薬の当量が報告されている。
【０１２６】
（実施例１）
（試料１−Ａ、１−Ｂ、および１−Ｃ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー１−Ａ、１−Ｂ、および１−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでのアミノ基の５９、５３、および５４％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２および３時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ
Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。以下の表は、生成物の特性生成物の特性および合成中に使用された試薬のそれぞれの比を提供する。
【表１３】
2020076111.tif 000014
【０１２７】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。したがって、このプロセスのために使用した試薬の比は、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表１４】
2020076111.tif 000015
【表１５】
2020076111.tif 000016
【表１６】
2020076111.tif 000017
【０１２８】
（実施例２）
（試料２−Ａ、２−Ｂ、および２−Ｃ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー２−Ａ、２−Ｂ、および２−Ｃ（５ＫＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の４５、４４、および４４％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２および３時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。
【表１７】
2020076111.tif 000018
【０１２９】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。したがって、このプロセスに対して使用した試薬の比は、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表１８】
2020076111.tif 000019
【表１９】
2020076111.tif 000020
【表２０】
2020076111.tif 000021
【０１３０】
（実施例３）
（試料３−Ａ、３−Ｂ、および３−Ｃ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー３−Ａ、３−Ｂ、および３−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５４、６０、および５６％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２および３時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。
【表２１】
2020076111.tif 000022
【０１３１】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。したがって、このプロセスのために使用した試薬の比は、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表２２】
2020076111.tif 000023
【表２３】
2020076111.tif 000024
【表２４】
2020076111.tif 000025
【０１３２】
（実施例４）
（試料４−Ａ、４−Ｂ、および４−Ｃ）
予備活性化なしで、ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー４−Ａ、４−Ｂ、および４−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５３、５１、および４７％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂは調製しなかった。試薬を直接Ｓｏｌ  Ａに加えた。
【表２５】
2020076111.tif 000026
【０１３３】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディング量において、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。したがって、このプロセスのために使用した試薬の比および添加の方法は、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表２６】
2020076111.tif 000027
【表２７】
2020076111.tif 000028
【表２８】
2020076111.tif 000029
【０１３４】
（実施例５）
（試料５−Ａ、５−Ｂ、および５−Ｃ）
予備活性化なしで、ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー５−Ａ、５−Ｂ、および５−Ｃ（５ＫＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５７、６１、および５５％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂは調製しなかった。試薬を直接Ｓｏｌ  Ａに加えた。
【表２９】
2020076111.tif 000030
【０１３５】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディング量において、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。したがって、このプロセスのために使用した試薬の比および添加の方法は、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表３０】
2020076111.tif 000031
【表３１】
2020076111.tif 000032
【表３２】
2020076111.tif 000033
【０１３６】
（実施例６）
（試料６−Ａ、６−Ｂ、および６−Ｃ）
予備活性化なしで、ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー６−Ａ、６−Ｂ、および６−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の９９、９８、および９７％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂは調製しなかった。試薬を直接Ｓｏｌ  Ａに加えた。
【表３３】
2020076111.tif 000034
【０１３７】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。実験６の試料について使用した試薬の比は、許容される結合特性（実験７、８、および９の試料を参照されたい）を生成したグラフトコポリマーロットについて使用した試薬の比と同様であったが、６Ｃのみが、ＡＮＰ結合基準を満たすレベルに近かった。加えて、％ＰＥＧ飽和は、沈殿に起因して制御するのが困難であり、一般的手順に記載されている６２％の範囲より遥か上に到達した。ＰＬが沈殿すると、ＰＬのアミノ基は、ＴＮＢＳによる検出に対して利用不可能となるため、明らかな飽和は沈殿の人工産物となり得る。恐らく、Ｓｏｌ  Ｂの調製（ｐＨ４．０〜５．５において、ＭＥＳ緩衝液中、ＮＨＳＳおよびＥＤＣでＰＥＧ−ＳＣＭを予備活性化）は、適切な結合特性を有するグラフトコポリマーを再現性よく調製するために必要である。したがって、このプロセスは、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらしたが、ただし、激しい撹拌条件下で溶液Ａに粉末試薬を加えること（失敗した実施例６（試料６−Ａ、６−Ｂ、および６−Ｃ）とは異なるプロセス）によって、沈殿をもたらす条件を回避した場合、許容される生成物を生成することができると考えられる。
【表３４】
2020076111.tif 000035
【表３５】
2020076111.tif 000036
【表３６】
2020076111.tif 000037
【０１３８】
（実施例７）
（試料７−Ａ、７−Ｂ、および７−Ｃ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー７−Ａ、７−Ｂ、および７−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５８、５５、および５５％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは個々のロットに対する比の表で報告されている）。
【表３７】
2020076111.tif 000038
【０１３９】
合成したグラフトコポリマーは、１０％ペプチドローディング量において、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量という結合結果をもたらした。したがって、本開示におけるプロセスに対して使用した試薬の比は、許容される生成物をもたらした。
【表３８】
2020076111.tif 000039
【表３９】
2020076111.tif 000040
【表４０】
2020076111.tif 000041
【０１４０】
（実施例８）
（試料８−Ａ、８−Ｂ、および８−Ｃ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー８−Ａ、８−Ｂ、および８−Ｃ（５ＫＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５９、５１、および４１％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。
【表４１】
2020076111.tif 000042
【０１４１】
合成したグラフトコポリマーは、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量という結合結果をもたらした。したがって、本開示におけるプロセスに対して使用した試薬の比は、許容される生成物をもたらした。
【表４２】
2020076111.tif 000043
【表４３】
2020076111.tif 000044
【表４４】
2020076111.tif 000045
【０１４２】
（実施例９）
（試料９−Ａ、９−Ｂ、９−Ｃ、９−Ｄ、９−Ｅ、および９−Ｆ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー９−Ａ、９−Ｂ、９−Ｃ、９−Ｄ、９−Ｅ、および９−Ｆ（５ＫＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の６２、５８、５５、５３、５６および５６％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。
【表４５】
2020076111.tif 000046
【０１４３】
合成したグラフトコポリマーは、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量という結合結果をもたらした。したがって、本開示におけるプロセスに対して使用した試薬の比は、許容される生成物をもたらした。
【表４６】
2020076111.tif 000047
【表４７】
2020076111.tif 000048
【表４８】
2020076111.tif 000049
【表４９】
2020076111.tif 000050
【表５０】
2020076111.tif 000051
【表５１】
2020076111.tif 000052
【０１４４】
（実施例１０）
（試料１０−Ａ、１０−Ｂ、および１０−Ｃ）
ペグ化およびペグ化後の抽出のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用した、グラフトコポリマー１０−Ａ、１０−Ｂ、および１０−Ｃ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の４９、５６および５６％飽和および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。２、３、および４時間後、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。ペグ化反応後、Ｓｏｌ  Ｃを極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で抽出し、抽出の水相からＳｏｌ  Ｄを調製した。
【表５２】
2020076111.tif 000053
【０１４５】
合成したグラフトコポリマーの弱い結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。合成したグラフトコポリマーの弱い結合特性は、極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）でＳｏｌ  Ｃを抽出することによりプロセスを破壊したことが原因の可能性がある。この仮説は、中程度の結合特性を有するグラフトコポリマーを生成する同じ比の試薬を用いた同様のプロセス（実験１、２、および３の試料を参照されたい）と比較することにより支持される。したがって、このプロセスのために使用した試薬の比およびＳｏｌ  Ｃの抽出によるプロセスの破壊が、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表５３】
2020076111.tif 000054
【表５４】
2020076111.tif 000055
【表５５】
2020076111.tif 000056
【０１４６】
（実施例１１）
（試料１１−Ａ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＣＭを使用し、脂肪酸化前にプロセスを停止した、グラフトコポリマー１１−Ａ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧでの第１級アミノ基の５７％飽和、および残りの第１級アミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。Ｓｏｌ  Ｂの活性化を２０分間進行させた。Ｓｏｌ  Ｃを１．７５時間の反応時間で氷上に配置した。２時間の時点で、Ｓｏｌ  Ｃを室温に戻し、追加のＥＤＣをＳｏｌ  Ｃに加えた（全ＥＤＣは、個々のロットに対する比の表で報告されている）。合計３．７５時間の時間で第１級アミノ基の５７％の飽和に到達するまで、Ｓｏｌ  Ｃを継続して反応させた。Ｓｏｌ  Ｃを凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した材料をＳｏｌ  Ｃからジクロロメタンに溶解することでＳｏｌ  Ｄを調製し、Ｓｏｌ  Ｄは加熱しなかった。
【表５６】
2020076111.tif 000057
【０１４７】
合成したグラフトコポリマーの中程度の結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。合成したグラフトコポリマーの中程度の特徴は、Ｓｏｌ  Ｃの凍結乾燥によりプロセスを破壊したことが原因の可能性がある。この仮説は、許容される結合特性を有するグラフトコポリマーを生成する同じ比の試薬を用いた同様のプロセス（実験７、８、および９の試料を参照されたい）と比較することにより支持される。Ｃ１８−ＮＨＳ対ＤＩＰＥＡの比は本開示のプロセスと同様ではないが、プロセスのその部分は、列挙したロットのすべてがクリアした最低限の必要条件を有することに注意されたい。したがって、Ｓｏｌ  Ｃの凍結乾燥によりプロセスを停止したこと、およびＳｏｌ  Ｄを加熱しなかったことが、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。
【表５７】
2020076111.tif 000058
【０１４８】
（実施例１２）
（試料１２−Ａ、ＰＥＧ−ＳＣＭ）
ペグ化反応のためにＭＰＥＧ−ＳＣＭを使用した、グラフトコポリマー１２−Ａ（５ｋＤａ  ＭＰＥＧ−ＳＣＭ；２０ｋＤａ  ＰＬ；ＰＥＧを用いたアミノ基の５３％飽和、および残りのアミノ基をステアリン酸で改質）の合成。他に特定されていない限り、合成は、一般セクションに記載されている通り実施した。ＰＬを５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．７に溶解した。Ｓｏｌ  ＢはＰＥＧ−ＳＣＭとして使用せず、Ｓｏｌ  Ａに直接加えた。ペグ化後Ｓｏｌ  Ｃを凍結した。Ｃ１８−ＮＨＳをアセトンに溶解した。
【表５８】
2020076111.tif 000059
【０１４９】
合成したグラフトコポリマーの弱い結合は、１０％ペプチドローディングにおいて、遊離ＡＮＰに対して許容される１３％またはそれ未満の量の範囲内にはなかった。合成したグラフトコポリマーの非常に弱い結合特性は、ＮＨＳＳおよびＥＤＣで予備活性化したＰＥＧ−ＣＭとは対照的に、ＰＥＧ−ＳＣＭ（５ＫＤａ  ＰＥＧのＮＨＳエステル）試薬の使用が原因の可能性がある。この仮説は、同様のレベルのＰＥＧ飽和を有するグラフトコポリマーを生成し、中程度から許容される結合特性を有するグラフトコポリマーをもたらす異なるプロセス（試料１−Ｂ、４−Ａ、および９−Ｃを参照されたい）と比較することにより支持される。潜在的には、ＰＥＧ−ＳＣＭは、ＮＨＳＳエステルとして活性化されたＰＥＧ−ＣＭとは異なる速度でＰＬをアシル化し、ＡＮＰの結合に最終的に影響するＰＬ上のＰＥＧ組織化に影響を及ぼす。したがって、ペグ化のための試薬としてＰＥＧ−ＳＣＭを使用したプロセスは、本開示におけるプロセスにより生成された生成物よりも劣る生成物をもたらした。ＭＰＥＧ−ＣＭのＮＨＳ活性化を使用して合成したグラフトコポリマーに対してＡＮＰ結合は観察されなかった。
【０１５０】
ＧＬＰ−１およびＢＮＰペプチドの結合におけるＰＧＣの評価
本開示のプロセスを使用して合成したＰＧＣをＧＬＰ−１およびＢＮＰに対するこれらの結合においても評価した。以下の表を参照されたい。ＡＮＰに対する許容される結合に加えて、ＰＧＣはまた、ＧＬＰ−１とＢＮＰの両方への許容される結合、１０％ローディングにおいて０〜６％の遊離ペプチド、ならびにそれぞれ５％および２％のローディングにおいて０％の遊離ペプチドをもたらした。このデータは、本開示におけるプロセスは、以前の公報に記載されているプロセス（Castilloら：ＧＬＰ−１に対して、２％ローディング量において５％の遊離を示す）とは異なり、優れていることを支持している。加えて、発明者らのデータは、本開示におけるプロセスは、米国特許出願第１１／６１３１８３号および米国特許出願第１１／９７１４８２号特許出願（ＧＬＰ−１に対して、１０％ローディングにおいて３３％の遊離を示す）に記載されているプロセスとは異なり、優れていることを支持している。
【表５９】
2020076111.tif 000060
【０１５１】
２ステッププロセス（ＥＤＣがクエンチする、ＰＬ−ＰＥＧ単離）
グラフトコポリマーの合成は、脂肪酸化反応以前にペグ化反応を停止し、得られたＰＬ−ＰＥＧ生成物を精製することができるものにプロセスを変化させることによって遂行することができる。このプロセスは、一連の溶液（Ｓｏｌ  Ａ、Ｓｏｌ  Ｂ、Ｓｏｌ  Ｃ、Ｓｏｌ  ＤおよびＳｏｌ  Ｅ）を調製し、化学的プロセスのペグ化および脂肪酸化ステップ中にこれらを組み合わせること、または試薬をこれらに加えることからなる。Ｓｏｌ  Ａは、緩衝液（ＨＥＰＥＳまたはＴＥＯＡ）に溶解したＰＬを含有し、Ｓｏｌ  Ｂは、ＭＥＳ緩衝液中、ＮＨＳＳおよびＥＤＣで活性化したｍＰＥＧ−ＣＭを含有する。Ｓｏｌ  Ｃは、ＰＬのペグ化が生じる反応液であり、Ｓｏｌ  ＡとＳｏｌ  Ｂを組み合わせることにより、または試薬（ＮＨＳＳ、ＥＤＣまたはＰＥＧ−ＳＣＭ）を直接Ｓｏｌ  Ａに加えることによって（したがってゼロ分間の予備活性化を有し、またはＳｏｌ  Ｂを有さない）調製される反応液である。ＰＥＧ−ＳＣＭをＳｏｌ  Ａに加えて、Ｓｏｌ  Ｃを生成する場合のように、化学的プロセスがＳｏｌ  Ｂを必要としない場合もある。Ｓｏｌ  Ｄは、有機溶媒（アセトニトリル、アセトンまたはジクロロメタン）を溶液Ｃに加え、５５〜６０℃に加熱することによって調製される。次いで、強い求核試薬をＳｏｌ  Ｄに加えて、残りのＥＤＣをクエンチすることができる。Ｓｏｌ  Ｄ中アセトニトリルは、（脂肪酸化後のアセトニトリルの除去のための一般的手順のように）水性／有機抽出で除去する。次いで、ＰＬ−ＰＥＧ生成物を含有する水相を水で希釈し、限外濾過法を介して精製することができる。次いで、精製されたＰＬ−ＰＥＧ生成物を使用して、生成物を６６％アセトニトリルに溶解し、５５〜６０℃に加熱し、その後Ｃ１８−ＮＨＳ、およびＤＩＰＥＡを加えることによって、溶液Ｅを作製することができる。
【０１５２】
ペグ化反応をクエンチまたは停止する前のＳｏｌ  Ｄの加熱は、本開示におけるプロセスと同様の反応速度を保持し、許容される結合特性を有する生成物を生成するために必要不可欠である。実施例１０および１１においてＰＧＣを合成するために使用したプロセス（試料１０−Ａ、１０−Ｂ、１０−Ｃ、および１１−Ａを参照されたい）は、有機溶媒の添加および加熱以前にペグ化反応が停止した場合の好ましくない結果を例示している。これらのプロセスは、許容される結合を有さないＰＧＣをもたらした。したがって、ＰＧＣ合成を成功させるための２ステップ手順のために、ペグ化反応をクエンチする前のＳｏｌ
Ｄの加熱は、プロセスの一部でなければならない。
【０１５３】
本明細書で引用された特許および公報のすべては、これらの全体において、参照により本明細書に援用されている。
【０１５４】
当業者であれば、本明細書に記載されている開示の特定の実施形態に対する多くの同等物について認識しているか、または単なる規定通りの実験を使用して、これらを確かめることができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。他に指摘されていない限り、数を四捨五入する一般的な数学的法則は、多分散でない分子、例えば、Ｈ２Ｏ、ＮＨＳＳ、ＥＤＣなどの分子量を除いて、本明細書中のすべての数に適用される。ポリマーは多分散分子である。数が与えられた場合にはいつでも、その数の最後の桁は確実性の境界であると考えられ、所与の数の最後の桁に位で数の範囲を四捨五入した結果である。例えば「５ｋＤａポリマー」とは、４．５１〜５．４９ｋＤａを千の位で四捨五入したものが５ｋＤａとなるので、４．５ｋＤａ〜５．５ｋＤａの間の範囲を意味する。別の例は、２．１ｍｍｏｌが２．０５〜２．１５ｍｍｏｌの間の範囲であることである。別の例は、５．０ｋＤａポリマーが４．９５〜５．０５ｋＤａの間の範囲であることである。
【配列表】
2020076111000001.app
【外国語明細書】
2020076111000001.pdf