(57)【要約】      （修正有）【課題】治療細胞に関与するバイオプロセスのための迅速、効率的、かつ測定可能な媒体交換のためのシステムおよび方法の提供。【解決手段】治療細胞の分離および保持のために設計された少なくとも２つのバイオリアクター３０、３２および１つの外部の装置２０を用いて、細胞凝集体として、マイクロキャリアの表面上で、または懸濁された単一の細胞として成長する治療細胞に、最小限の損傷を伴う完全な媒体交換のための方法論を開示する。媒体交換中にバイオリアクター内に残っている治療細胞の代わりに、使用済み媒体中で、濃縮し、洗浄に使用された同一の媒体で調製された異なるバイオリアクターに戻す前に、それらを新鮮な媒体で十分に洗浄する外部分離および保持デバイスに除去される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞凝集体として成長させ、マイクロキャリアの表面に付着させ、または懸濁させた単一の細胞として成長させる治療細胞の細胞膨張の方法であって：
ａ．細胞凝集体、付着細胞を有するマイクロキャリア、または単一の細胞を含む治療細胞を、第１の作業容積を有する第１のバイオリアクター内の第１の媒体中に懸濁するステップ；
ｂ．前記第１のバイオリアクターにおいて前記治療細胞を膨張させるステップ；
ｃ．第２の作動体積を有する第２のバイオリアクターを第２の媒体で予備充填するステップ；
ｄ．前記第２の媒体を含む前記第２のバイオリアクターのプロセスパラメーターを予備調整するステップ；
ｅ．前記治療細胞を含む前記第１の媒体の全てを前記第１のバイオリアクターから分離および保持装置に移すステップ；
ｆ．前記第２の媒体を用いた前記分離および保持装置中の前記治療細胞を濃縮し、洗浄するステップ；
ｇ．前記濃縮し、洗浄した治療細胞を前記分離および保持装置から、予備充填され、予備調整された第２のバイオリアクターに移すステップ；
ｈ．前記治療細胞の所望の膨張が完了するまで、前記第２のバイオリアクター中で新鮮に移された治療細胞を膨張させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記第２のバイオリアクターおよび第２の媒体の代わりに第３のバイオリアクターおよび第３の媒体を用いてステップｃ．からｈ．を繰り返すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３のバイオリアクターが、ステップｃの前に予備充填され、予備調整された前記第１のバイオリアクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のバイオリアクターおよび第２の媒体の代わりに、１つ以上のその後のバイオリアクターおよびその後の新鮮な媒体を用いてステップｃ．からｈ．を１回以上繰り返すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
使用される前記バイオリアクターの全てが、同一の作業容積を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
順次使用される前記バイオリアクターの各々が、直前のバイオリアクターよりも大きな作業容積を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ．が単一の分離および保持装置のみを用いて実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ステップｅ．が実施されるたびに、異なる分離および保持装置が使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記移すステップが、ポンプまたは流体圧差を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞凝集体として、マイクロキャリアの表面上で、または懸濁された単一の細胞として成長する治療細胞の分化を指向する方法であって：
ａ．細胞凝集体、付着細胞を有するマイクロキャリア、または単一の細胞を含む治療細胞を、第１の作業容積を有する第１のバイオリアクター内に第１の成長因子を含む第１の分化媒体中に懸濁するステップ；
ｂ．前記第１のバイオリアクター中で細胞を分化させるステップ；
ｃ．第２の分化媒体で第２のバイオリアクターを予備充填し、次の分化ステップで使用される第２の成長因子を添加するステップ；
ｄ．前記第２のバイオリアクターのプロセスパラメーターを予備調整するステップ；
ｅ．前記第１の分化媒体、成長因子、および治療細胞の全てを前記第１のバイオリアクターから外部の分離および保持装置に移すステップ；
ｆ．前記分離および保持装置において、前の成長因子を完全に除去するために、第２の分化媒体を用いて前記治療細胞を濃縮し、洗浄するステップ；
ｇ．前記濃縮し、洗浄した治療細胞を前記分離および保持装置から前記予備調整された第２のバイオリアクターに移すステップ；ならびに
ｈ．前記治療細胞の所望の分化が完了するまで、前記第２のバイオリアクターにおいて新たに移された治療細胞を分化させるステップ
を含む方法。
【請求項１１】
前記第２のバイオリアクターおよび第２の媒体の代わりに第３のバイオリアクターおよび第３の媒体を用いてステップｃ．からｈ．を繰り返すステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３のバイオリアクターが、ステップｃの前に予備充填され、予備調整された前記第１のバイオリアクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のバイオリアクターおよび第２の媒体の代わりに、１つ以上のその後のバイオリアクターおよびその後の新鮮な媒体を用いてステップｃ．からｈ．を１回以上繰り返すステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
使用される前記バイオリアクターの全てが、同一の作業容積を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｅ．が単一の分離および保持装置のみを用いて実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｅ．が実施されるたびに、異なる分離および保持装置が使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記移すステップが、ポンプまたは流体圧差を用いて行われる、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
著作権およびトレードドレスの通知
本特許文書の開示の一部には、著作権保護の対象となる材料が含まれている。この特許文献は、所有者のトレードドレスであるかまたはその可能性のある事項を表示および／または記載することができる。著作権およびトレードドレスの所有者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に見られるように、誰が特許開示をファクシミリで複製しても異議はないが、それ以外の場合は、すべての著作権およびトレードドレスの権利を留保する。
【０００２】
関連出願情報
本出願は、米国特許出願第１６／２８２，１２９号、２０１９年２月２１日出願の継続出願であり、米国特許出願第６２／６３４，０７７号、２０１８年２月２２日出願、発明の名称ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＥＬＬＳから優先権を主張するものであり、参照により本出願中に明示的に盛り込まれているものである。
【０００３】
発明の分野
バイオリアクターにおける細胞凝集体、付着細胞を有するマイクロキャリア、または単一の細胞を含む、治療細胞の膨張および指向性分化のための、特に大容量規模での、完全かつ効率的な媒体交換のためのシステムおよび方法。
【背景技術】
【０００４】
バイオリアクター内で混合しながら懸濁培養中で成長した細胞に関与するバイオプロセスは、広範囲の細胞および遺伝子治療用途のために開発されている。それらの型と特性に応じて、これらの治療細胞は凝集体として一緒に凝集しながら増殖し、マイクロキャリア（ＭＣ）の表面に付着し、または個々の細胞として懸濁する。上流プロセスの一部として、細胞が懸濁している液体媒体を交換する必要がある。すなわち、使用済み媒体を除去し、新鮮な媒体を加える。これは、栄養を補充するかまたは特定の成長ホルモンを供給するとともに、代謝老廃物およびその他の望ましくない副産物を除去するために必要である。媒体交換を必要とする上流のプロセスは、細胞の膨張（細胞の総数の増加）と方向性のある分化（多能性細胞を特定の細胞型に変えるよう指示する）である。
【０００５】
バイオリアクターで媒体交換を行うための様々な技術がある。１つの一般的な方法は、撹拌を一時中断し、すべての細胞凝集体、その表面に成長する細胞をもつＭＣ、または懸濁した単一の細胞をバイオリアクターの底部に重力によって沈降させることである。沈降した細胞凝集体、付着した細胞をもつＭＣ、または単一の細胞の床が形成されると、使用済み媒体の上清を除去し、新鮮な媒体を加え、撹拌を再開して細胞凝集体、付着した細胞をもつＭＣ、または単一の細胞を再懸濁する。この方法には２つの潜在的な問題があり、バイオリアクターの作業容積が増加するにつれて悪化する。第１に、混合の一時的な停止によって、望ましくない凝集、栄養枯渇、ならびに温度、ｐＨ、および溶存酸素レベルのような重要なプロセスパラメーターの偏差を通して、細胞損傷がもたらされ得る。第２に、沈降した細胞凝集体、付着した細胞を有するＭＣ、または単一の細胞の床に近すぎる上清を引き抜くことは、細胞喪失をもたらす可能性があり、一方、濾過された保持装置を使用することは、凝集、閉塞、および細胞損傷をもたらす可能性があるため、全ての使用済み媒体を完全に除去することは困難である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）凝集体の多段階指向性分化のようなある種のプロセスは、以前に使用された残存媒体中に残存する成長因子が各分化ステップ間で完全に除去されない場合、効率および収率が低下する可能性がある。細胞への潜在的損傷を最小化しながら、大規模バイオリアクターで完全な媒体交換を達成できるプロセスは、細胞の膨張および分化のためのプロセスの収率および効率を大幅に改善し、従って、新興細胞および遺伝子治療の商業的製造のための非常に貴重なツールである。
【０００６】
ＰＳＣは、ヒト胚から、または成体の体細胞に多能性を誘導することによって由来し得る。ＰＳＣの識別特性は、人体において実質的にいかなる細胞型にも分化する能力であり、これによって、多種多様な異なる疾患徴候を潜在的に処置するための有望な細胞治療ツールとなる。さらに、ＰＳＣは、培養中の細胞凝集体として無限に成長することができ、これは、１人当たり数百万からさらには数十億の細胞に及ぶ可能性がある用量ニーズを満たすために極めて重要である。伝統的な２Ｄ製造プラットフォームを用いて、商業規模で膨大な規模の細胞を生産しようとする試みは、極めて費用がかかり、したがって実行不可能であろう。代わりに、バイオリアクター中の３Ｄ懸濁培養は、ＰＳＣバイオプロセスの開発およびスケールアップのための最良の選択肢を表す。
【０００７】
ＰＳＣ製造の１つの必要条件は、細胞を標的細胞型に変えるように誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる指向性分化段階である。第１に、細胞膨張局面は、バイオリアクターで起こる。分化局面は、膨張局面が完了したバイオリアクターにおけるｉｎ  ｓｉｔｕでの複数の媒体交換ステップを必要とする。完全な媒体交換は、研究開発現場では小規模で比較的容易かつ完全に達成できる一方、商業的製造のために大規模で達成することは大きな課題を提示する。
【０００８】
細胞治療生成物の商業的製造を成功に達成するためには、治療細胞に関与するバイオプロセスのための迅速、効率的、かつ測定可能な媒体交換技術が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本出願は、治療細胞の分離および保持のために設計された少なくとも２つのバイオリアクターおよび１つの外部の装置を用いて、細胞凝集体として、マイクロキャリアの表面上で、または懸濁された単一の細胞として成長する治療細胞に、最小限の損傷を伴う完全な媒体交換のための方法論を開示する。媒体交換中にバイオリアクター内に残っている治療細胞の代わりに、それらは、代わりに、使用済み媒体中で、濃縮し、洗浄に使用された同一の媒体で調製された異なるバイオリアクターに戻す前に、それらを新鮮な媒体で十分に洗浄する外部分離および保持デバイスに除去される。
【００１０】
このプロセスには、様々なタイプの分離および保持装置を使用することができる。それらの動作の方法は、遠心分離（従来のもしくは連続的な抗遠心力）、音響沈殿、または単純な濾過を含むことができる。これらの装置の主な目的は、細胞凝集体、付着細胞を有するＭＣ、または懸濁した単一の細胞などの治療細胞を単離、濃縮、洗浄することである。
【００１１】
この完全な媒体交換のための新規方法は、重力ベースの沈降に関連する問題を解消し、治療細胞の大規模製造を可能にする。この技術は、細胞凝集体として成長する多能性幹細胞（ＰＳＣ）の指向性分化に特に有用である。
【００１２】
想定される実施形態は、治療細胞の分離および保持のために設計された少なくとも２つのバイオリアクターおよび１つの外部の装置を利用する。第１のバイオリアクターにおいて膨張または分化プロセスステップが完了した後、治療細胞を含む使用済み媒体を分離および保持装置に移し、そこで治療細胞を収集し、濃縮する。次いで、それらは、次のプロセスステップに必要とされる新しい媒体で洗浄され、次いで、すでに同一の媒体で予備充填され、温度、ｐＨ、および溶存酸素などの必要なパラメーターのために予備調整された第２のバイオリアクターに直ちに移される。
【００１３】
細胞成長中の遅延局面が長引くと、全体的な膨張効率に有害となる可能性があるため、治療細胞が分離および保持装置を離れた後、治療細胞が直ちに戻る準備ができた予備調整されたバイオリアクターを有することが望ましい。バイオリアクターの予備充填および予備調整までの総時間は、特にバイオリアクターの容積がより大きい場合には、分離および保持装置の濃度および洗浄段階よりも長くかかる可能性が高い。したがって、第１のバイオリアクターで膨張ステップが進行中に、第２バイオリアクターの予備充填および予備調整を開始することができる。すべての治療細胞が第１のバイオリアクターから離れた後、順番に第３のバイオリアクターとして予備充填し、予備調整できるようになる。ここでの「第３の」（以前は第１の）バイオリアクターは、第２のバイオリアクターから分離および保持装置へ移動し、装置から戻ってきた後に治療細胞を受け取る準備ができているべきである。あるいは、第１のバイオリアクターが時間内に準備できない場合、完全に新しい、第３のバイオリアクターを代わりに予備充填し、予備調整することができる；あらゆる数のバイオリアクターを、バイオリアクターの予備充填および予備調整に必要な時間によって指示されるように使用することができる。この時間は、細胞製造プロセスとバイオリアクター容積が拡大するにつれてのみ増加するであろう。バイオリアクター間のサイクルへの橋渡しとして分離および保持装置を用いることにより、大規模であっても、複数の完全な媒体交換ステップを効率的かつ迅速に達成することができる。
【００１４】
別の実施形態は、ただ１つのバイオリアクターおよび１つの外部の分離装置を利用する。外部の装置における治療細胞の濃縮および洗浄に必要な時間に応じて、単一のバイオリアクターを、完全な媒体交換のために使用することができる。すべての使用済み媒体をバイオリアクターから取り出した後、治療細胞が濃縮され、外部の装置で洗浄され終わり、戻される準備が完了する前に、それを再充填し、調整しなければならない。そうでなければ、細胞が適切な混合培養条件なしにアイドル状態である、沈殿法に関連する同一の問題が起こりうる。しかし、バイオリアクター容積が増加するにつれて、媒体で充填し、予備調整するのに必要な時間も過度に増加する。したがって、２つ以上のバイオリアクターを有する方法と比較して、この方法を用いて治療細胞への負の衝撃を回避することはより困難である可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインスリン産生膵臓β細胞の発生のための多段階指向性分化プロセスを示す；
【図２】図２は、細胞凝集体、その表面に細胞が付着したマイクロキャリア（ＭＣ）、または懸濁された単一の細胞のような治療細胞の分離および保持のために設計された外部の装置の２つの垂直ホイールバイオリアクターならびに１つの一般的な例による本出願のシステムを示す；
【図３】図３は、治療細胞の分離および保持のために設計された複数の垂直ホイールバイオリアクターならびに分離および保持装置による本出願のシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願は、完全な媒体交換を用いて、凝集体として、ＭＣの表面上で、またはバイオリアクター中の単一懸濁細胞として成長された細胞の膨張および分化のためのシステムおよび方法を提供する。典型的な実施形態では、２つのバイオリアクターの動作が交互に行われ、外部の分離および保持装置がそれらの間の橋渡しとして作用する。しかしながら、本明細書に記載される概念は、複数の分離および保持装置と同様に、２つより多いバイオリアクターを使用することも容易にすることができる。
【００１７】
さらに、本明細書に記載される媒体交換技術は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の大規模な分化に特に有用であるが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはマイクロキャリア上で成長させたヒト初代細胞または細胞凝集体のような他の足場依存性細胞の膨張にも利用することができる。
【００１８】
さらに、細胞の膨張および分化のために、種々のタイプのバイオリアクターを使用することができる。好ましい実施形態では、垂直ホイールバイオリアクターは、足場依存性細胞への潜在的な損傷を最小限にする、その比較的低いせん断速度のために使用される。しかしながら、撹拌型インペラーのような代替の撹拌方法を有する他のバイオリアクター構成を用いることができる。
【００１９】
前述したように、ＰＳＣ製造の独特の必要条件は、細胞を標的細胞型に変えるように誘導する方向性をもった分化ステップである。例えば、図１は、様々な成長因子が、インスリン産生膵臓β細胞が産生されるまでの様々な工程を通して多能性細胞を誘導するために使用される、４つのステップの配列を示す。
【００２０】
一般的に、分化局面は、膨張局面が完了した同一バイオリアクターにおいて、ｉｎ  ｓｉｔｕで複数の媒体交換ステップを必要とする。各分化ステップ間に、ＰＳＣ凝集体が容器の底部に沈降し、使用済み媒体が除去され、特異的な成長因子とともに新しい媒体が次の分化ステップのために加えられる。すでに述べたように、２つの課題がある。第１に、バイオリアクターの底部に細胞凝集体が沈降すると、細胞損傷につながる可能性がある。第２に、沈降した細胞凝集体のレベルを上回る上清からであろうと、濾過された細胞保持装置を介してであろうと、使用済み媒体を完全に取り出すことは困難である。前の分化ステップからの任意のキャリーオーバー媒体は、全く異なる媒体を用いて、その後の分化段階の効率を低下させる可能性がある。理想的には、もはや望まれなくなった成長因子およびあらゆる残存副産物は、次の分化ステップのために新しい成長因子をもつ別の媒体を加える前に、完全に除去する必要がある。
【００２１】
細胞凝集体の大規模分化に固有の問題を解決するために、完全な媒体交換を必要とする指向性分化を、外部の分離および保持装置と併せて垂直ホイールバイオリアクターシステムで行うことができる。細胞凝集体を沈降させる代わりに、培養媒体を、垂直ホイールバイオリアクターの外側に接続した装置に取り出す。分離および保持装置内で、細胞凝集体を濃縮し、次の分化段階のために緩衝液および新たな媒体で洗浄することができ、これにより、使用済み媒体、陳旧性成長因子、および副産物が完全に除去される。次いで、濃縮され、洗浄された細胞凝集体を、洗浄に使用されたのと同じ分化媒体で予備充填し、次の分化段階の準備ができた異なる垂直ホイールバイオリアクターに直ちに戻す。このようにして、ＰＳＣ凝集体は、細胞を損傷することなく、大きい容積で迅速かつ効率的に分化することができる。この新しい大規模分化プロセスは、標的細胞生産の全体的な収率ならびに商業規模での分化した細胞の製造性を改善するであろう。
【００２２】
このプロセスには、遠心分離（従来のまたは連続的な抗遠心力）、音響沈殿、または単純な濾過のような種々の分離および保持装置を使用することができる。これらの装置のいずれも、完全な媒体交換を可能にするために垂直ホイールバイオリアクターと容易に結合することができ、従って、大規模でも細胞の膨張または分化の収率および効率を改善する。細胞膨張および指向性分化局面を含む全細胞製造プロセスは、単回使用の垂直ホイールバイオリアクターにおいて大規模に実施され、最適化され得る。
【００２３】
図２は、分離および保持装置２０ならびに２つのバイオリアクター３０、３２の一般的な例による本出願のシステムを示す。例示した実施形態では垂直ホイールバイオリアクターである第１のバイオリアクター３０は、例えば、膨張媒体中のＰＳＣ凝集体を成長させるために使用される。垂直ホイールバイオリアクターの低せん断湿環境は、これらの凝集体が膨張局面中に大規模（例えば５０Ｌ作業容積）で高い細胞密度に達することを可能にする。
【００２４】
膨張局面から分化局面へ移行する際には、ＰＳＣ凝集体を第１のバイオリアクター３０から採取し、分離および保持装置２０に移すことができる。このプロセスには、様々なタイプの分離および保持装置を使用することができる。それらの動作の方法は、遠心分離（従来の、もしくは連続的な抗遠心力）、音響沈殿、または単純な濾過を含むことができる。これらの装置の主な目的は、細胞凝集体、付着した細胞を有するＭＣ、または懸濁した単一の細胞を単離、濃縮および洗浄することである。分離および保持装置の一例は、ドイツＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨから入手可能なｋＳｅｐ測定可能単回使用自動遠心システムである。
【００２５】
使用済み膨張媒体が分離および保持装置２０に流入するにつれて、ＰＳＣ凝集体は、圧縮されることなく、理想的には少量の使用済み媒体に濃縮されるであろう。凝集体が濃縮されたら、使用済み媒体の流体流れを、第１の分化媒体に置き換える。このようにして細胞凝集体を洗浄し、古い膨張媒体を完全に除去し、分化媒体で置き換える。
【００２６】
最後に、ＰＳＣ凝集体は、分離および保持装置２０から、第１の分化媒体で既に予備充填され、予備調整されている第２のバイオリアクター３２に排出される。予備調整とは、次のプロセスステップに必要な温度、ｐＨ、および溶存酸素などの重要なパラメーターについてバイオリアクターを補正することを意味する。通常、予備調整には分離および保持装置中で濃縮し、洗浄するのに要する時間よりも長い時間がかかるため、ＰＳＣ凝集体が第１のバイオリアクターから離れる前に、第２のバイオリアクターが予備充填および予備調整プロセスを開始することができる。したがって、予備充填および予備調整された第２のバイオリアクター３２は、分離および保持装置２０を離れた直後に洗浄されたＰＳＣ凝集体を接種する準備が整うであろう。
【００２７】
分化ステップが第２のバイオリアクター３２において完了すると、ＰＳＣ凝集体（ここでは、異なる細胞型からなる）は、分離および保持装置２０を使用して、同じ様式で濃縮および洗浄され得、さらに別の分化媒体で予備充填され、予備調整された第１のバイオリアクター３０に戻され得る。分離および保持装置２０を介して２つのバイオリアクター間で前後交互に行うことにより、細胞の生存性、品質、多能性、または収率に悪影響を及ぼすことなく、多ステップ分化プロセスを通して完全な媒体交換を連続的に達成することができる。この前後のプロセスは、図１の順序を実行するように、必要な限り何回も実行することができる。
【００２８】
バイオリアクターを予備調整するまでの時間が、濃縮および洗浄ステップに必要な時間よりも短い場合、単一のバイオリアクターを、当該特定の膨張および／または分化ステップに使用することができる。バイオプロセスの異なる規模ステップのための予備調整時間要件に応じて、任意の数のバイオリアクターおよび外部の装置を、特に大規模製造のために、必要に応じて異なる組み合わせで使用することができる。
【００２９】
１つの潜在的なプロセス変動は、特定の中間細胞型の細胞凝集体が産生されるまで、前述の分化プロセスに従うことを含み得る。この時点で、細胞凝集体の一部のみが特定の成長因子にさらされ、残りの部分は異なる成長因子にさらされる。この結果、異なる最終的な標的細胞型で終了する２つの分化経路が生じるであろう。
【００３０】
例えば、図３は、複数の分離および保持装置ならびにバイオリアクターを有する本出願のシステムを示す。この場合、各々の平行する経路は、図２を参照して記載した交互媒体交換プロセスのために、少なくとも２つのバイオリアクターならびに１つの分離および保持装置を必要とするであろう。
【００３１】
より具体的には、第１のバイオリアクター５０を用いて、ＰＳＣ凝集体のバッチを成長させることによってプロセスを開始する。凝集体は、分離および保持装置５２の第１の一般的な例に移される。凝集体のバッチを第１の分化媒体Ａで洗浄し、次いでその一部を、媒体Ａで予備充填された第２のバイオリアクター６０に移す。その後、分離および保持装置５２内の残りの凝集体を、第２の分化媒体Ｂで洗浄し、媒体Ｂで予備充填された第３のバイオリアクター６２に移す。次に、第２のバイオリアクター６０および第３のバイオリアクター６２を、それぞれの分化工程を行うために並行して操作する。
【００３２】
続いて、第２および第３のバイオリアクター６０、６２内のＰＳＣ凝集体は、それぞれ分離および保持装置７０、７２に移される。第１の装置５２が、装置７０、７２、またはその両方として機能することが可能である。すなわち、濃縮ステップと洗浄ステップのタイミングがずれていれば、複数の分化経路で単一の分離および保持装置を使用することができる。しかしながら、明確性を維持するために、２つの平行する経路における分離および保持装置７０、７２は、図３において独特に同定される。
【００３３】
ＰＳＣ凝集体は、濃縮および洗浄のために第２のバイオリアクター６０から分離および保持デバイス７０に移され、次いで、分化のために第４のバイオリアクター８０に移される。ＰＳＣ凝集体は、第３のバイオリアクター６２から分離および保持デバイス７２に移され、次いで、第５のバイオリアクター８２に移される。バイオリアクター５０が十分に予備充填され、前もって予備調整されていれば、第４または第５のバイオリアクター８０、８２のいずれかが、プロセスを開始するために使用された第１のバイオリアクター５０であってもよい。同様に、凝集体を第４および第５のバイオリアクター８０、８２に移す代わりに、制御装置７０、７２からの生産物を、第２および第３のバイオリアクター６０、６２に戻すことができる。読者は、各バイオリアクターを予備充填し、予備調整するのに必要な時間によって、または利用可能なバイオリアクターの数によってのみ制限される、利用可能な種々の変形を理解するであろう。複数の中間前駆細胞型から分岐する複数の分化経路も可能であり、各経路はそれ自体の独自の成長因子、バイオリアクター、分離および保持装置を必要とし、異なる最終的な標的細胞で終了する。
【００３４】
考慮すべき１つの要因は、バイオリアクターと分離および保持装置との間の媒体移送の方法である。蠕動ポンプは、柔軟なプラスチック管を通して液体媒体を移動させるために一般的に使用される。しかし、ポンプの物理的な圧搾作用により、直径が４００マイクロメートルを超える細胞凝集体が破砕されるか、またはＭＣの互いに対する粉砕が発生し、表面に結合した細胞が損傷を受ける可能性がある。浮遊した単一の細胞の生存性は、個々の細胞が流体乱流の渦サイズおよび絞り出した管類の内側間の間隙の両方よりも小さいため、有意に影響を受ける可能性は低い。
【００３５】
ポンプを使用する代わりに、バイオリアクターと分離および保持装置との間に内圧の差を作り出すことにより、媒体移送を行うことができる。差圧による液体移動は、容器が内圧に耐えるためにステンレス鋼のような材料で構成されている場合に、比較的容易に達成することができる。柔軟なプラスチックフィルム容器を密閉するための硬いフレームを有する単回使用バイオリアクターも、操作上の危険のリスクなしにうまく加圧することができる。媒体移送に備えて、バイオリアクターの収穫弁は、固定したプラスチック管類を介して分離および保持装置に無菌的に連結される。その後、ガスを、バイオリアクターのヘッドスペースに送り込んで加圧する。クランプを開くと、細胞凝集体または細胞が付着したＭＣを含む液体が、低圧外部装置に流れることになる。伝達速度は、バイオリアクターに加えられるガス圧を調節することにより制御できる。分離および保持装置を第２のバイオリアクターに連結する第２の管類は、この第１の加圧転写ステップの間、固定されたままである。
【００３６】
媒体移送のための別の方法は、互いに対してバイオリアクターの高さを変化させるために使用できるリフトのシステムを含む。したがって、一方のバイオリアクターが他方のバイオリアクターに比べて十分に高く上げられた場合、重力は、治療細胞を、上げられたバイオリアクターから下方のバイオリアクターへ管類を通して落下させることになる。
【００３７】
細胞凝集体または付着細胞を有するＭＣが洗浄されると、分離および保持装置を加圧することができ、次いで、第２のクランプを開いて装置からの流出を可能にする。この技術を利用することにより、凝集体およびＭＣは、物理的送り込みの潜在的な損傷効果を回避することができる。
【００３８】
本明細書で使用される「複数」は、２つ以上を意味する。本明細書で使用される項目の「組」は、そのような項目の１つ以上を含み得る。書面による説明または特許請求の範囲において本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」などの用語は、無制限である、つまり、含むがこれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。特許請求の範囲に関しては、それぞれ「からなる」および「から本質的になる」移行句のみが、閉鎖式のまたは半閉鎖式の移行句である。特許請求の範囲において、「第１」、「第２」、「第３」等の順序語を使用することは、特許請求の範囲の要素を単に変更するために、方法の作用が行われる他の要素または時間的順序に対する１つの特許請求の範囲の要素の優先、先行または順序を示すものではなく、特許請求の範囲の要素を区別するために同じ名称（ただし、順序語を使用するため）を有する別の要素からの名称を特定の特許請求の範囲の要素と区別するための標識としてのみ使用される。本明細書で使用する「および／または」とは、列挙された項目が選択肢であることを意味するが、選択肢には、列挙された項目の任意の組み合わせも含まれる。
【図１】
2020130177.tif 000003
【図２】
2020130177.tif 000004
【図３】
2020130177.tif 000005
【外国語明細書】
2020130177000001.pdf