(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養物を処理する方法および開回路濾過システムが提供される。【解決手段】哺乳動物細胞培養物を処理する方法であって、（ａ）開回路濾過システムを提供する工程であって、該システムは、哺乳動物細胞培養物を含むバイオリアクタと、第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニットと、バイオリアクタとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管と、バイオリアクタとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管と、該システムを通じて流体を流通させるための、該システム内に配置された少なくとも１つのポンプと、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物を処理する方法であって、
（ａ）開回路濾過システムを提供する工程であって、該システムは、細胞培養物を含むリザーバと、
第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニットと、
リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管と、
リザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管と、
該システムを通じて流体を流通させるための、該システム内に配置された少なくとも１つのポンプと、
を含み、
該システムは、
流体が、少なくとも１つのポンプを経由して、該システムを通じてリザーバから、またはリザーバに向かって、
第１と第２の導管およびＴＦＦユニットを通じて、反転可能に流通できるように、
濾過液が、ＴＦＦユニットから収集できるように構成されている、
工程と、
（ｂ）細胞培養物を、リザーバからＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第１の期間流通させる工程と、
（ｃ）第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第２の流れの向きで第２の期間流通させる工程と、
（ｄ）第２の流れの向きを反転させ、培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第３の期間流通させる工程と、
（ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を少なくとも２回繰り返す工程と、
（ｆ）濾過液を収集する工程と、
を含む前記方法。
【請求項２】
リザーバは、バイオリアクタである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リザーバは、冷蔵貯蔵タンクである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１および第２の導管の一方または両方は、生体適合性チューブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＦＦユニットは、単一のクロスフローフィルタを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単一のクロスフローフィルタは、管状クロスフローフィルタである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＴＦＦユニットは、２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
システムは、第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
クロスフローフィルタは、約０．２マイクロメートルの平均ポアサイズを有する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのポンプは、第１の導管もしくは第２の導管、またはその両方に配置さ
れている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのポンプは、任意の２つのＴＦＦユニットの間でシステム内に配置されている、請求項８に記載の方法
【請求項１２】
少なくとも１つのポンプは、リザーバ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのポンプは、低乱流ポンプ（ＬＴＰ）である、請求項１および１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＴＰは、蠕動ポンプである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
システムは、第１および第２のＬＴＰを含み、第１のＬＴＰは、細胞培養物を第１の方向に流通させ、第２のＬＴＰは、細胞培養物を第２の方向に流通させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
システムは、単一のＬＴＰを含み、該単一のＬＴＰは、細胞培養物を第１の方向で第１の期間および第３の期間中流通させ、細胞培養物を第２の方向で第２の期間中流通させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
第１、第２、および第３の期間は、約３０秒〜約１５分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つまたはそれ以上において、約０．５Ｌ／分〜約８０Ｌ／分の速度で流通する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つまたはそれ以上において、約３．０Ｌ／分〜約６０Ｌ／分の速度で流通する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｂ）および（ｃ）を単回反復すると、その結果、交換分画は５０％を上回る、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
濾過液は、哺乳動物細胞を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養物は、分泌型組み換えタンパク質を含み、濾過液は、該分泌型組み換えタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
分泌型組み換えタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、増殖因子、サイトカイン、もしくは酵素、またはその組合せである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
分泌型組み換えタンパク質を濾過液から単離する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
単離する工程は、少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）を通じて単離する工程を含む、一体化した連続的なプロセスを用いて実行される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
単離した組み換えタンパク質を、薬学的に許容される賦形剤またはバッファーと混合することにより、治療用原薬を処方する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養物もしくは濾過液、またはその両方は、滅菌状態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
約１４日間〜約８０日間、連続的に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
開回路濾過システムであって、
リザーバと、
第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニットと、
リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管と、
リザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管と、
該システム内に配置された少なくとも１つのポンプと、
を含み、
少なくとも１つのポンプを作動させると、流体は該システムを通じて反転可能に流通し、リザーバから、第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由して、リザーバに戻る前記システム。
【請求項３０】
リザーバは、バイオリアクタである、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３１】
リザーバは、冷蔵貯蔵タンクである、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３２】
第１および第２の導管の一方または両方は、生体適合性チューブを含む、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３３】
ＴＦＦユニットは、単一のクロスフローフィルタを含む、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３４】
単一のクロスフローフィルタは、管状クロスフローフィルタである、請求項３３に記載の開回路濾過システム。
【請求項３５】
ＴＦＦユニットは、２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含む、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３６】
第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３７】
クロスフローフィルタは、約０．２マイクロメートルの平均ポアサイズを有する、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の開回路濾過システム。
【請求項３８】
少なくとも１つのポンプは、第１の導管もしくは第２の導管、またはその両方に配置されている、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項３９】
少なくとも１つのポンプは、任意の２つのＴＦＦユニットの間でシステム内に配置されている、請求項３６に記載の開回路濾過システム。
【請求項４０】
少なくとも１つのポンプは、リザーバ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置されている、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項４１】
少なくとも１つのポンプは、低乱流ポンプ（ＬＴＰ）である、請求項２９および３８〜４０のいずれか１項に記載の開回路濾過システム。
【請求項４２】
ＬＴＰは、蠕動ポンプである、請求項４１に記載の開回路濾過システム。
【請求項４３】
第１および第２のＬＴＰを含み、
第１のＬＴＰは、細胞培養物を第１の流れの向きで流通させるように適用されており、
第２のＬＴＰは、第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を第２の流れの向きで流通させるように適用されている、請求項４１に記載の開回路濾過システム。
【請求項４４】
細胞培養物を第１および第２の流れの向きで反転可能に流通させるように適用された単一のＬＴＰを含む、請求項４１に記載の開回路濾過システム。
【請求項４５】
蠕動ポンプは、約２０ｍＬ〜約２５０ｍＬのポンプヘッド容積を有する、請求項４２に記載の開回路濾過システム。
【請求項４６】
濾過液貯蔵タンク、およびＴＦＦユニットと該濾過液貯蔵タンクとの間で流体連通している濾過液導管をさらに含む、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項４７】
生物学的製造システムをさらに含み、
該生物学的製造システムは、
少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）と、
入口と、
出口と、
ＴＦＦユニットと該生物学的製造システムの入口との間で流体連通している濾過液導管と、
を含み、
ここで、デバイスは、濾過液が、少なくとも１つのＭＣＣＳを通じて該生物学的製造システムの入口に流入し、該生物学的製造システムの出口を通じて該デバイスから退出するように構成されている、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【請求項４８】
ＴＦＦユニットは、ハウジング内に配置されている、請求項２９に記載の開回路濾過システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月１６日付け出願の米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に対する優先権を主張し、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、細胞培養物を処理する方法およびバイオテクノロジー、ならびにより具体的には、潅流バイオリアクタ内で細胞培養物を連続的に処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物細胞は、治療用タンパク質を製造するのに多くの場合用いられる。いくつかの処理法では、哺乳動物細胞は、潅流バイオリアクタ内で培養され、組み換えタンパク質を含むある容積の細胞培養物がバイオリアクタから除去され、そして新規培養培地が添加されてその容積に置き換わる。かかる潅流式培養法では、除去された細胞培養物は多くの場合濾過され、哺乳動物細胞がさらなる組み換えタンパク質製造用として、バイオリアクタ内で保持される一方、組み換えタンパク質を含む培養培地（時に「使用済み培地」と呼ばれる）が回収される。
【０００４】
潅流バイオリアクタから細胞培養物を濾過する従来の方法およびデバイスは、いくつかの欠点を有する。例えば、閉システムの交互タンジェントフロー濾過（ＡＴＦ）では、細胞培養物がバイオリアクタにより管理された増殖条件外で長時間（長期外部滞留時間）を費やすこととなり、また逆流を伴わない伝統的な一方向タンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）では、フィルタ汚損が生じる。したがって、従来の潅流バイオリアクタ法は、細胞培養物がバイオリアクタにより管理された増殖条件外で長時間を費やすことと多くの場合関係し、生存細胞密度、生存率（％）、および培養物の比生産性および容積生産性の低下を引き起こす。さらに、従来法は、多くの場合システムフィルタのフラッシングが不完全となり、フィルタ汚損を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願者らは、クロスフローフィルタ表面を横断する反転可能なタンジェント流体フローをもたらす開回路濾過システム（ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）は、従来型の一方向開回路または二方向閉回路濾過システムとは異なり、生存細胞密度の増加、生存細胞率（％）の増加、比生産性および／または容積生産性の増加、比グルコース消費量の増加、およびフィルタ汚損の低減をもたらすことを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に提示する開回路濾過システムは、例えば他の一方向開回路濾過システム（例えば、一方向ＴＦＦシステム）、または二方向閉回路濾過システム（閉回路ＡＴＦ（商標）システム）と比較して、組み換えタンパク質の生成および収率について、最適条件、例えば１つもしくはそれ以上の細胞培養物の外部容積（リザーバの外部）の減少、交換分画（例えば、第１の導管、ＴＦＦユニット、および第２の導管内）の増加、細胞培養物の外部（リザーバ外部）滞留時間の短縮、細胞培養物濾過中の剪断応力の低下、細胞培養物中の細胞生存率の改善、細胞培養物中の生存細胞密度の向上、および／またはフィルタ汚損の減少（フィルタのより良好なフラッシングに起因する）をもたらす。したがって、リザーバ（例えば、バイオリアクタ）、第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニット、リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管、ならびにリザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通してい
る第２の導管、ならびに少なくとも１つのポンプが作動すると、流体がシステムを通じて反転可能に流通し、リザーバから第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由してリザーバに戻るようにシステム内に配置された少なくとも１つのポンプを含む開回路濾過システムが本明細書で提供される。細胞培養物を処理する方法であって、（ａ）開回路濾過システム（例えば、本明細書に記載するいずれかの開回路濾過システム）を提供する工程、（ｂ）細胞培養物を、リザーバからＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第１の期間流通させる工程、（ｃ）第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第２の流れの向きで第２の期間流通させる工程、（ｄ）第２の流れの向きを反転させ、培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第３の期間流通させる工程、（ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を少なくとも２回繰り返す工程、および（ｆ）濾過液を収集する工程を含む、方法も提供される。
【０００７】
細胞培養物を処理する方法が本明細書で提供される。これらの方法は以下の工程を含む：（ａ）開回路濾過システムを提供する工程であって、該システムは、細胞培養物を含むリザーバ、第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニット、リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管、ならびにリザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管、ならびに該システムを通じて流体を流通させるための、該システム内に配置された少なくとも１つのポンプを含み、ここで、該システムは、流体が、少なくとも１つのポンプを経由して、システムを通じてリザーバから、またはリザーバに向かって、第１および第２の導管およびＴＦＦユニットを通じて、反転可能に流通可能できるように、濾過液が、ＴＦＦユニットから収集できるように構成されている、工程；（ｂ）細胞培養物を、リザーバからＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第１の期間流通させる工程、（ｃ）第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第２の流れの向きで第２の期間流通させる工程；（ｄ）第２の流れの向きを反転させ、培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第３の期間流通させる工程；（ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を少なくとも２回繰り返す工程；ならびに（ｆ）濾過液を収集する工程。いくつかの例では、リザーバは、バイオリアクタまたは冷蔵貯蔵タンクである。いくつかの例では、第１および第２の導管の一方または両方は、生体適合性チューブを含む。ＴＦＦユニットは、単一のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）を含んでもよく、２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含んでもよい。
【０００８】
いくつかの例では、システムは、第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む。いくつかの例では、クロスフローフィルタは、約０．２マイクロメートルの平均ポアサイズを有する。
【０００９】
いくつかの例では、少なくとも１つのポンプが、第１の導管または第２の導管、またはその両方に配置されている。さらなる例では、少なくとも１つのポンプが、任意の２つのＴＦＦユニット間でシステム内に配置されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポンプが、リザーバ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置されている。本明細書に記載するすべての方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのポンプは、低乱流ポンプ（ＬＴＰ）（例えば、蠕動ポンプ）である。いくつかの例では、システムは、第１および第２のＬＴＰを含み、第１のＬＴＰは、細胞培養物を第１の方向で流通させ、第２のＬＴＰは、細胞培養物を第２の方向で流通させる。いくつかの実施形態では、システムは、単一のＬＴＰを含み、該単一のＬＴＰは、細胞培養物を第１の方向で第１および第３の期間中流通させ、細胞培養物を第２の方向で第２の期間中流通させる。
【００１０】
本明細書に記載するどの方法でも、第１、第２、および第３の期間は、約３０秒〜約１５分である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つまたはそれ以上において、約０．５Ｌ／分〜約８０Ｌ／分（例えば、約３．０
Ｌ／分〜約６０Ｌ／分）の速度で流通する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、（ｂ）および（ｃ）を単回反復すると、その結果、交換分画は５０％を上回る。いくつかの例では、濾過液は、哺乳動物細胞を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、分泌型組み換えタンパク質を含み、濾過液は、分泌型組み換えタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、分泌型組み換えタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、増殖因子、サイトカイン、もしくは酵素、またはその組合せである。いくつかの実施形態は、分泌型組み換えタンパク質を濾過液から単離する工程をさらに含む。例えば、単離する工程は、少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）を通じて単離する工程を含む、一体化した連続プロセスを用いて実施可能である。いくつかの実施形態は、単離された組み換えタンパク質を薬学的に許容される賦形剤またはバッファーと混合することにより治療用原薬を処方する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物または濾過液またはその両方は、滅菌状態にある。いくつかの例では、方法は、約１４日間〜約８０日間、連続的に実施される。
【００１２】
リザーバ、第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニット、リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管、ならびにリザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管、ならびにシステム内に配置された少なくとも１つのポンプを含み、該少なくとも１つのポンプを作動すると、流体がシステムを通じて反転可能に流通し、リザーバから、第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由して、リザーバに戻る、開回路濾過システムも提供される。いくつかの例では、リザーバは、バイオリアクタまたは冷蔵貯蔵タンクである。いくつかの実施形態では、第１および第２の導管の一方または両方は、生体適合性チューブを含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＦユニットは、単一のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＦユニットは、２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含む。いくつかの例では、システムは、第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む。いくつかのシステムでは、クロスフローフィルタは、約０．２マイクロメートルの平均ポアサイズを有する。
【００１３】
本明細書に記載するシステムのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのポンプが、第１の導管または第２の導管、またはその両方に配置される。他の実施形態では、少なくとも１つのポンプが、任意の２つのＴＦＦユニット間でシステム内に配置される。他の例では、少なくとも１つのポンプが、リザーバ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置される。本明細書に記載するどのシステムでも、少なくとも１つのポンプは、低乱流ポンプ（ＬＴＰ）（例えば、蠕動ポンプ）である。いくつかの実施形態では、システムは、第１および第２のＬＴＰを含み、第１のＬＴＰは、細胞培養物を第１の流れの向きで流通させるように適用されており、第２のＬＴＰは第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を第２の流れの向きで流通させるように適用されている。他の実施形態では、システムは、細胞培養物を第１および第２の流れの向きで反転可能に流通させるように適用された単一のＬＴＰを含む。いくつかの実施形態では、蠕動ポンプのポンプヘッド容積は、約２０ｍＬ〜約２５０ｍＬである。
【００１４】
本明細書に記載するシステムのいくつかの実施形態は、濾過液貯蔵タンク、およびＴＦＦユニットと濾過液貯蔵タンクとの間で流体連通している濾過液導管をさらに含む。本明細書に記載するシステムのいくつかの実施形態は、生物学的製造システムをさらに含み、同システムは、少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）および入口および出口、ＴＦＦユニットと生物学的製造システムの入口との間で流体連通している濾過液導管を含み、デバイスは、濾過液が、少なくとも１つのＭＣＣＳを通じて生物学的製造システムの入口に流入し、生物学的製造システムの出口を通じてデバイスから
退出するように構成されている。本明細書に記載するどのシステムでも、ＴＦＦユニットは、ハウジング内に配置される。
【００１５】
本明細書で用いる場合、名詞の前の単語「１つの（ａ）」または「複数の（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」は、１つまたはそれ以上の特定の名詞を表す。例えば、慣用句「哺乳動物細胞」は、「１つまたはそれ以上の哺乳動物細胞」を表し、慣用句「複数のマイクロキャリア」は、「１つまたはそれ以上のマイクロキャリア」を意味する。
【００１６】
用語「哺乳動物細胞」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、またはウサギ）から得られた細胞、またはそれに由来する任意の細胞を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、例えば、不死化細胞、分化細胞、または未分化細胞であり得る。
【００１７】
用語「細胞培養物」とは、液体培養培地（例えば、本明細書に記載するいずれかの液体培養培地）に懸濁した複数の哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載するいずれかの哺乳動物細胞）を意味する。細胞培養物の細胞密度は、細胞約０．１×１０６個／ｍＬ超（例えば、細胞約１×１０６個／ｍＬ超、細胞約５×１０６個／ｍＬ超、細胞約１０×１０６個／ｍＬ超、細胞約１５×１０６個／ｍＬ超、細胞約２０×１０６個／ｍＬ超、細胞約２５×１０６個／ｍＬ超、細胞約３０×１０６個／ｍＬ超、細胞約３５×１０６個／ｍＬ超、細胞約４０×１０６個／ｍＬ超、細胞約４５×１０６個／ｍＬ超、細胞約５０×１０６個／ｍＬ超、細胞約５５×１０６個／ｍＬ超、細胞約６０×１０６個／ｍＬ超、細胞約６５×１０６個／ｍＬ超、細胞約７０×１０６個／ｍＬ超、細胞約７５×１０６個／ｍＬ超、細胞約８０×１０６個／ｍＬ超、細胞約８５×１０６個／ｍＬ超、細胞約９０×１０６個／ｍＬ超、細胞約９５×１０６個／ｍＬ超、または細胞約１００×１０６個／ｍＬ超）であり得る。いくつかの例では、細胞培養物中に存在する哺乳動物細胞は、マイクロキャリア（例えば、本明細書に記載するいずれかのまたは当技術分野において公知のマイクロキャリア）に結合している。
【００１８】
用語「バイオリアクタ」とは、当技術分野で公知であり、液体培養培地中で哺乳動物細胞の維持または増殖を可能にする管理された一連の物理的条件下で、細胞培養物をインキュベーションすることができる容器を意味する。例えば、バイオリアクタは、細胞培養物中の哺乳動物細胞が組み換えタンパク質を生成および分泌できるようにする条件下で、細胞培養物をインキュベーションすることができる。例えば、バイオリアクタは、Ｏ２およびＮ２スパージ、保温ジャケット、１つまたはそれ以上の流体ポート、ならびに撹拌システムを一般的に含む。バイオリアクタの非限定的な例は、本明細書に記載されている。さらなるバイオリアクタの例は、当技術分野において公知である。
【００１９】
用語「開回路濾過システム」とは、リザーバ（例えば、バイオリアクタ）、およびリザーバより開始し、かつそこで終わる連続的な閉じた流体ループを意味し、同システムはＴＦＦユニットを含み、閉じた流体ループ内の流体（例えば、細胞培養物）は、ＴＦＦユニットを通じてリザーバ（第１または第２の流れの向きで）に流入およびそこから流出して、リザーバに戻ることができる。開回路濾過システムは、流体（例えば、細胞培養物）を、ＴＦＦユニットを通じてリザーバに、かつ／またはそこからポンプ搬送し、リザーバに戻すのに適する少なくとも１つのポンプも含む。
【００２０】
用語「タンジェントフロー濾過ユニット」または「ＴＦＦユニット」とは、当技術分野で公知あり、少なくとも１つのハウジング（シリンダー等）、およびフィルタ表面の大部分が、ユニットを経由する流体（例えば、細胞培養物）の流れと並行して位置するように、ハウジング内に位置する少なくとも１つのクロスフローフィルタを含むデバイスを意味する。ＴＦＦユニットは、当技術分野において周知であり、商業的に入手可能である。代
表的な市販のＴＦＦユニットとして、Ｍｉｎｉｍａｔｅ（商標）ＴＦＦカプセル（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｖｉｖａｆｌｏｗ（登録商標）５０および２００システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＢｉｏＣａｐ２５、Ｅ０１７０、Ｅ０３４０、およびＥ１０２０カプセル（３Ｍ）、ならびにＡＴＦ４フィルタ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。ハウジングは、例えば流体が第１の入口／出口を通過し、少なくとも１つのクロスフローフィルタを横断し、第２の入口／出口を通過できるように位置する第１の入口／出口および第２の入口／出口を含み得る。いくつかの例では、開回路濾過システムは、例えば直列および／または並列に接続された複数のＴＦＦユニットを含み得る。例えば、２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットを含むシステムは、システム内で隣接して対をなすＴＦＦユニットを流体連結する流体導管を含み得る。他の例では、システムは、流体導管により流体連結した２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットからなる２つまたはそれ以上のセットを含み得る。本明細書に記載するまたは当技術分野において公知のどのＴＦＦユニットも、第１の流れの向きおよび第２の流れの向きで流体を受け入れる能力を有する。
【００２１】
用語「クロスフローフィルタ」とは、当技術分野において公知であり、ＴＦＦユニット内に配置可能なように設計されたフィルタを意味し、同フィルタは、フィルタ表面の大部分が、流体（例えば、細胞培養物）の流れ（例えば、第１および第２の流れの向き）に対して並行となるように配置可能である。例えば、クロスフローフィルタは、タンジェントフロー濾過を可能にする任意の形状、例えば管状または長方形の形状を有し得る。特に有用なクロスフローフィルタは、流体がクロスフローフィルタの表面を横断して第１および第２の方向で流通する際に、流体（例えば、細胞培養物）にもたらされる流体の乱れまたは剪断応力の量が低くなるように設計される。クロスフローフィルタは、例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ、ＭｅｍｂｒａＰｕｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、およびＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。
【００２２】
用語「低乱流ポンプ」または「ＬＴＰ」とは、当技術分野において公知であり、流体（例えば、細胞培養物）を、単一の方向（例えば、第１または第２の流れの向き）で、システム内を移動させることができる、または流体（例えば、細胞培養物）内で相当量の剪断応力または流体の乱れを誘発することなく、流体（例えば、細胞培養物）を、２つの方向（第１および第２の流れの向き）でシステム内を反転可能に流通させることができるデバイスを意味する。ＬＴＰが、第１と第２の流れの向きを切り替えて流体（例えば、細胞培養物）を流通させるのに用いられる場合、第２の流れの向きは、第１の流れの向きとほぼ逆方向である。ＬＴＰの例として、蠕動ポンプが挙げられる。他のＬＴＰの例は、当技術分野において公知である。
【００２３】
用語「流れを反転させる」または「流れの向きを反転させる」は、当業者に周知である。例えば、当業者は、流体の流れを反転させるとは、流体の全体的な流れの向きを、全体的な流れの向き（例えば、本明細書に記載するあらゆる方法またはシステム内の細胞培養物の流れの向き）とは一般的に逆方向に変更することを意味すると認識する。
【００２４】
用語「交換分画」とは、第１の方向で第１の期間、流体をリザーバの外部にある開回路濾過システムの構成要素を通じて流通させ（例えば、第１の導管、少なくとも１つのＴＦＦユニット、および第２の導管を通じて）、流体を第２の方向で第２の期間流通させた後、リザーバに帰着する流体（例えば、細胞培養物）の割合を意味する。
【００２５】
用語「実質的に含まない」とは、特定の物質（例えば、哺乳動物細胞または宿主哺乳動物細胞タンパク質または核酸）に関して、少なくともまたは約９０％含まない（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％含まない、または約１００％含まない）組成物（例えば、液体または固体）を意味す
る。例えば、本明細書に記載する方法を用いて生成した濾過液は、哺乳動物細胞またはマイクロキャリアを実質的に含まないものとすることができる。別の例では、本明細書に記載するいずれかのプロセスを用いて単離された組み換えタンパク質は、宿主哺乳動物細胞タンパク質、核酸、および／または汚染性ウイルスを実質的に含まないものとすることができる。
【００２６】
用語「培養」または「細胞培養」とは、管理された一連の物理的条件下の液体培養培地中での哺乳動物細胞の維持または増殖を意味する。
【００２７】
用語「液体培養培地」とは、培地中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞が増殖するのを可能にする、十分な栄養分を含む流体を意味する。例えば、液体培養培地は、アミノ酸（例えば、２０種類のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、および他の必須微量金属、および重炭酸ナトリウムのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。液体培養培地は、哺乳動物由来の血清を含み得る。いくつかの事例では、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清または別の抽出物を含まない（定義された液体培養培地）。液体培養培地は、微量金属、哺乳動物の成長ホルモン、および／または哺乳動物の増殖因子を含み得る。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書に記載されており、追加の例は、当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。
【００２８】
用語「マイクロキャリア」とは、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載するまたは当技術分野において公知の哺乳動物細胞のいずれか）の付着を許容するまたは促進する表面を備える、サイズが２０μｍ〜約１０００μｍである粒子（例えば、有機ポリマー）を意味する。マイクロキャリアは、１つまたはそれ以上のポア（例えば、平均直径が約１０μｍ〜約１００μｍのポア）を含み得る。マイクロキャリアの非限定的な例は、本明細書に記載されている。マイクロキャリアの追加の例は、当技術分野において公知である。マイクロキャリアは、例えばポリマー（例えば、セルロース、ポリエチレングリコール、またはポリ−（乳酸−ｃｏ−グリコール酸））を含み得る。
【００２９】
用語「動物由来成分を含まない液体培養培地」とは、動物に由来するあらゆる成分（例えば、タンパク質または血清）を含まない液体培養培地を意味する。
【００３０】
用語「血清を含まない液体培養培地」とは、動物血清を含まない液体培養培地を意味する。
【００３１】
用語「血清含有液体培養培地」とは、動物血清を含む液体培養培地を意味する。
【００３２】
用語「化学的に定義された液体培養培地」とは、実質的にすべての化学成分が既知である液体培養培地を意味する。例えば、化学的に定義された液体培養培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含まないが、それは、これらの調製物は、アルブミンや脂質からなる複雑な混合物を一般的に含むためである。
【００３３】
用語「タンパク質を含まない液体培養培地」とは、タンパク質（例えば、検出可能なあらゆるタンパク質）を一切含まない液体培養培地を意味する。
【００３４】
用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）の少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のア
ミノ酸）からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸、および／または重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸を含み得る。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖフラグメントであり得る。免疫グロブリンは、二重特異性抗体または三重特異性抗体、または二量体、三量体、または多量体抗体、または二機能性抗体、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）でもあり得る。免疫グロブリンは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン（例えば、融合タンパク質）を含む工学的に作出されたタンパク質でもあり得る。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書に記載されており、免疫グロブリンの追加の例は、当技術分野において公知である。
【００３５】
用語「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」は、長さが少なくとももしくは約４個のアミノ酸、例えば少なくとももしくは約５個のアミノ酸、少なくとももしくは約６個のアミノ酸、少なくとももしくは約７個のアミノ酸、少なくとももしくは約８個のアミノ酸、少なくとももしくは約９個のアミノ酸、少なくとももしくは約１０個のアミノ酸、少なくとももしくは約１１個のアミノ酸、少なくとももしくは約１２個のアミノ酸、少なくとももしくは約１３個のアミノ酸、少なくとももしくは約１４個のアミノ酸、少なくとももしくは約１５個のアミノ酸、少なくとももしくは約１６個のアミノ酸、少なくとももしくは約１７個のアミノ酸、少なくとももしくは約１８個のアミノ酸、少なくとももしくは約１９個のアミノ酸、または少なくとももしくは約２０個のアミノ酸、または長さが２０個を超えるアミノ酸であるポリペプチド配列の一部分を意味する。組み換えタンパク質フラグメントは、本明細書に記載するいずれかの方法を用いて生成可能である。
【００３６】
用語「工学的に作出されたタンパク質」とは、生物（例えば、哺乳動物）内に存在する内因性の核酸により本来コードされたものではないポリペプチドを意味する。工学的に作出されたタンパク質の例として、酵素（例えば、工学的に作出された酵素の安定性および／または触媒活性の増加を引き起こす、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠損、挿入、または付加を伴う）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体、または二機能性抗体）、および少なくとも１つの組み換えスキャフォールディング配列を含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【００３７】
ある特定の文脈において、用語「単離する（ｉｓｏｌａｔｅ）」または「単離すること（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」とは、濾過液（例えば、本発明に記載されている方法を用いて生成される濾過液）中に存在する１つまたはそれ以上の他の成分、例えば濾過液中に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または他のタンパク質からなる１つまたはそれ以上の成分から、組み換えタンパク質を、少なくとも部分的に精製する、または精製する（例えば、重量として、少なくとももしくは約５％、例えば少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％純粋に）ことを意味する。濾過液からタンパク質を単離するための非限定的な方法は、本明細書に記載されており、他は当技術分野において公知である。
【００３８】
用語「分泌型タンパク質」または「分泌型組み換えタンパク質」とは、哺乳動物細胞内で翻訳された際に、少なくとも１つの分泌シグナル配列を当初含んでいたが、分泌シグナル配列が、少なくとも部分的に、哺乳動物細胞内で酵素的に切断されることにより、細胞外空間（例えば、液体培養培地）に少なくとも部分的に放出されるタンパク質または組み
換えタンパク質を意味する。
【００３９】
慣用句「グラジエント潅流（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）」とは、当技術分野で公知であり、培養期間中の増加性の期間（例えば、約２４時間、約１分〜約２４時間、または２４時間を上回る期間）における、当初の培養容積から除去され、またこれに添加されて培養培地容積に生じた増加性の変化（例えば、増加または減少）を指す（例えば、1日当たりの培養培地の再供給速度）。１日当たり、除去および置き換えられる培地
の分画は、培養される特定の細胞、初期の播種密度、および特定の時点における細胞密度に応じて変化し得る。
【００４０】
本明細書で用いられる「比生産率」または「ＳＰＲ」とは、１日当たり哺乳動物細胞１個から生成される組み換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組み換え抗体のＳＰＲは、質量／細胞／日として通常測定される。組み換え酵素のＳＰＲは、ユニット／細胞／日または（ユニット／質量）／細胞／日として通常測定される。
【００４１】
本明細書で用いられる「容積生産性率」または「ＶＰＲ」とは、１日当たり培養物１容積当たり（例えば、バイオリアクタ、容器、またはチューブ容積１Ｌ当たり）生成される組み換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組み換え抗体のＶＰＲは、質量／Ｌ／日として通常測定される。組み換え酵素のＶＰＲは、ユニット／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として通常測定される。
【００４２】
別段規定されていなければ、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。方法および材料は、本発明での使用を目的として本明細書に記載されている；当技術分野において公知の他の適する方法および材料も使用可能である。材料、方法、および例は単に説明目的であり、制限することを意図しない。本明細書に記載されるすべての出版物、特許出願、特許、配列、データベース登録、および他の参考資料を、そのまま参照によって組み入れる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が統制する。
【００４３】
本発明のその他の特徴および長所は、下記の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】細胞培養物を処理するのに使用可能である代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。示すようなシステムは、第１の導管６内に配置された単一のポンプ８を含む。
【図２】第２の導管７内に配置された単一のポンプ８を含む代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。
【図３】リザーバ２（例えば、バイオリアクタ）内で、第１の導管６の近位に配置された単一のポンプ８を含む代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。
【図４】２つのＴＦＦユニット３を含み、各ユニットは、２つのクロスフローフィルタ１２を含む代表的な開回路濾過システムを示す概略図であり、この場合、２つのＴＦＦユニット３は、第３の導管１４により流体連結しており、単一のポンプ８は、第３の導管１４内に配置されている。
【図５】第２の導管７内に配置された単一のポンプ８を含み、ならびにいくつかの圧力センサ１４、および流量計１５を含む代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。
【図６】第１の導管６内に配置されたポンプ８、および第２の導管７内に配置されたポンプ８を含む代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。
【図７】リザーバ２ならびに第１および第２のサブシステム１９を含む、代表的な開回路濾過システムを示す概略図である。
【図８】代表的なシステムの第１の流れの向きを示す概略図である。
【図９】第１の期間において第１の流れの向き、期間（ｔｒ１）において第１の流れの向きとは逆の細胞培養物の流れ、第２の期間（ｔ２）において第２の流れの向き、期間（ｔｒ２）において第２の流れの向きとは逆の細胞培養物の流れ、および第３の期間（ｔ３）において第１の流れの向きの細胞培養物の流れを示す図である。ダイアグラムＦでは、細胞培養物の流速（Ｌ／分）を示す。
【図１０】本明細書に記載する方法（ＧＣ２００８  Ｓｅｔ６  ＴＦＦ  Ｖ２４；グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（ＧＣ２００８  Ｓｅｔ５  ＡＴＦ（商標）Ｖ２１；黒）を用いて処理した細胞培養物における生存細胞密度のグラフである。
【図１１】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物中の生存細胞の割合のグラフである。
【図１２】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物のキャパシタンス（ｐＦ）のグラフである。
【図１３】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の平均生存細胞直径のグラフである。
【図１４】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、およびＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物において検出された分泌型免疫グロブリン（ＩｇＧ）のグラフである。
【図１５】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、およびＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の容積生産性（ｇ／Ｌ／ｄ）のグラフである。
【図１６】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、およびＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の比生産性（ｐｇ／細胞／日）のグラフである。
【図１７】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の篩係数（％）のグラフである。
【図１８】本明細書に記載する方法（ＧＣ２００８  Ｓｅｔ６  ＴＦＦ  Ｖ２４）（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の比グルコース消費量（ｎｇ／細胞／日）のグラフである。
【図１９】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の比乳酸生成量（ｎｇ／細胞／日）のグラフである。
【図２０】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物の比好気性グルコース消費量（ｃｐｍｏｌ／細胞／時間）のグラフである。
【図２１】本明細書に記載する方法（グレー）を用いて、またはＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）濾過法（黒）を用いて処理した細胞培養物のグルコースからの乳酸収率（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
リザーバ、第１および第２の入口を有するＴＦＦユニット、リザーバとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管、ならびにリザーバとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管、ならびにシステム内に配置された少
なくとも１つのポンプを含む、開回路濾過システムであって、少なくとも１つのポンプが作動すると、流体は、システムを通じて反転可能に流通し、リザーバから流体導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由してリザーバに戻る、開回路濾過システムが本明細書で提供される。開回路濾過システム（例えば、本明細書に記載する任意の開回路濾過システムのいずれか）を使用する工程を含む、細胞培養物を処理する方法も提供される。本明細書に記載するシステムおよび方法は、例えば、細胞培養物を処理する間に、高い細胞生存率および／または細胞生存率（％）をもたらす。本明細書で提示するシステムおよび方法に関する追加の利点を以下に記載する。
【００４６】
開回路濾過システム
本明細書は、本明細書に記載する方法を実施するのに有用な代表的な開回路濾過システムを提示する。これらのシステムは、少なくとも１つのポンプ（システム内の）が作動すると、流体は、システムを通じて反転可能に流通し、リザーバから第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由してリザーバに戻るように設計される。
【００４７】
代表的な単一ポンプシステム
システム１の非限定的な例を、図１に記載する。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、例えば約０．２μｍのポアサイズを有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および流体導管７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。ＴＦＦユニット３は、図１に示すような単一のクロスフロー管状フィルタ１２、または２つもしくはそれ以上のクロスフローフィルタを含み得る。
【００４８】
図１のシステム１は、第１の導管６内に配置されたポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。作動すると、ポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。ＴＦＦユニット３のハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。システム１は、濾過液貯蔵タンク１０および濾過液出口１３と濾過液貯蔵タンク１０との間で流体連通している濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００４９】
少なくともＬＴＰがシステムの異なる部分に位置している点を除き、図１に示すシステムと類似した、別の代表的なシステム１を図２に示す。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、例えば約０．２μｍのポアサイズを有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および流体導管７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。ＴＦＦユニット３は、図２に示すような単一のクロスフロー管状フィルタ１２を含み得る、または２つもしくはそれ以上セットとなったクロスフローフィルタを含み得る。
【００５０】
図２のシステム１は、第２の導管７内に配置されたポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。作動すると、ポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。ＴＦＦユニット３のハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。
システム１は、濾過液貯蔵タンク１０および濾過液出口１３と濾過液貯蔵タンク１０との間で流体連通している濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００５１】
追加の代表的なシステム１を、図３に示す。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、例えば約０．２μｍのポアサイズを有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および流体導管７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。ＴＦＦユニット３は、図３に示すような単一のクロスフロー管状フィルタ１２を含み得る、または２つもしくはそれ以上セットになったクロスフローフィルタを含み得る。
【００５２】
図３のシステム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ内で、第１の導管６の近位に配置された単一のポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。作動すると、単一のポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。ＴＦＦユニット３のハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。システム１は、濾過液貯蔵タンク１０および濾過液出口１３と濾過液貯蔵タンク１０との間で流体連通している濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００５３】
少なくとも、システムが複数のＴＦＦユニットを含む点を除き、図１〜３で説明したシステムと類似した代表的なシステム１を図４に示す。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ、第１の導管６、第２の導管７、および２つのＴＦＦユニット３を含み、各ＴＦＦユニット３は以下を含む：ハウジング１１、第１の入口４、第２の入口５、および２つのクロスフローフィルタ１２。２つのＴＦＦユニット３は、第３の導管１４により流体連結している。クロスフローフィルタ１２のそれぞれは、例えば約０．２μｍのポアサイズを有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と２つのＴＦＦユニット３のうちの一方の第１の入口４との間で流体連通しており、第２の導管７は、リザーバ２と２つのＴＦＦユニット３のうちの他方の第２の入口５との間で流体連通している。第３の導管は、例えば図４に示すように、ＴＦＦユニット３の第２の入口５と他方のＴＦＦユニット３の第１の入口４との間で流体連通している。流体導管６、７、および１４は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。当業者なら理解できるように、ＴＦＦユニット３は、代替的に、単一のクロスフローフィルタ、例えば管状クロスフローフィルタを含み得る。
【００５４】
図４のシステム１は、第３の導管１４内に配置された単一のポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。作動すると、単一のポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第３の導管１４、他方のＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。２つのＴＦＦユニット３のそれぞれのハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。システム１は、２つの濾過液貯蔵タンク１０および２つの濾過液導管９も含む。単一の濾過液貯蔵タンク１０のそれぞれは、濾過液導管９によりＴＦＦユニット３内の濾過液出口１３と流体連結される。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００５５】
追加の代表的なシステム１を図５に示す。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリ
アクタ、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。クロスフローフィルタ１２は、例えば約０．２μｍのポアサイズ、約８３０ファイバ／フィルタのファイバカウントを有し、ＩＤが１ｍｍおよび長さが３０ｃｍのファイバを含み、０．７７ｍ２の濾過面積を有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。流体導管６および７は、内径（ＩＤ）が０．５インチの移送チューブであり得る。
【００５６】
図５のシステム１は、第２の導管７内に配置された単一のポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。ポンプ８は、ツインチャンネルＧＯＲＥ  Ｓｔａ−Ｐｕｒｅチューブ（１６ｍｍのＩＤ、４ｍｍの壁）を備えたＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプ６２０Ｄｕであり得る。作動すると、単一のポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から、第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。ＴＦＦユニット３のハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。システム１は、濾過液貯蔵タンク１０および濾過液出口１３と濾過液貯蔵タンク１０との間で流体連通する濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。システム１は、第１の導管６、濾過液導管９、および第２の導管７のそれぞれに配置された圧力センサ１４も含む。圧力センサ１４は、ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ  ＰｒｅｓｓｕｒｅＭＡＴ（商標）圧力センサであり得る。システム１は、第２の導管７内に配置された流量計１５も含む。流量計１５は、ＥＭ−ＴＥＣ  ＢｉｏＰｒｏＴＴ、非侵襲式リアルタイム流量計であり得る。
【００５７】
図５のシステム１は、ポート導管１６およびポート１７も含み、ポート導管１６は、第１の導管６とポート１７との間で流体連通している。システム１は、ポート導管１６内に配置されたクランプ１８も含み得る。ポート１７およびポート導管１６は、第１の導管６を通じてシステム１に流体を添加するのに使用可能である。
【００５８】
代表的な複数ポンプシステム
２つのポンプ８を含むシステム１の非限定的な例を図６に示す。システム１は、リザーバ２、例えばバイオリアクタ、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、約０．２μｍのポアサイズを有し得る。第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。ＴＦＦユニット３は、図６に示すような単一のクロスフロー管状フィルタ１２を含み得る、または２つもしくはそれ以上セットになったクロスフローフィルタを含み得る。
【００５９】
図６のシステム１は、第１の導管６内に配置されたポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）、および第２の導管７内に配置された蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）、ポンプ８も含む。作動すると、第１の導管６内に配置されたポンプ８は、流体を、システムを通じて第１の方向で流通させ、リザーバ２から、第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。作動すると、第２の導管７内に配置されたポンプ８は、流体を、システムを通じて第２の方向（第１の方向とは逆方向）で流通させ、リザーバ２から、第２の導管７、ＴＦＦユニット３、第１の導管６を経由してリザーバ２に戻す。ＴＦＦユニット３のハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。システム１は、濾過液貯蔵タンク１０、および濾過液出口１３と濾過液貯蔵タンク１０との
間で流体連通している濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００６０】
２つまたはそれ以上のサブシステムを含む代表的なシステム
当業者は、複数のサブシステムをシステムに付加可能である認識する。２つまたはそれ以上のサブシステム１９を含む代表的なシステム１を図７に示す。システム１は、図７に示すように、リザーバ２；ならびに第１および第２のサブシステム１９を含み、各サブシステム１９は、第１の導管６、第２の導管７、ならびにハウジング１１および単一のクロスフロー管状フィルタ１２、第１の入口４、および第２の入口５を含むＴＦＦユニット３を含む。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、約０．２μｍのポアサイズを有し得る。各サブシステムでは、第１の導管６は、リザーバ２と第１の入口４との間で流体連通している。各サブシステム内の第２の導管７は、リザーバ２と第２の入口５との間で流体連通している。流体導管６および７は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。ＴＦＦユニット３は、図７に示すように、単一のクロスフロー管状フィルタ１２をそれぞれ含み得る、または２つもしくはそれ以上セットになったクロスフローフィルタをそれぞれ含み得る。単一のクロスフロー管状フィルタ１２は、約０．２μｍのポアサイズを有し得る。
【００６１】
図７の各サブシステム１９は、第１の導管６内に配置された単一のポンプ８、例えば蠕動ポンプ等の低乱流ポンプ（ＬＴＰ）も含む。作動すると、各サブシステム１９内の単一のポンプ８は、流体を、システムを通じて反転可能に流通させ、リザーバ２から、第１の導管６、ＴＦＦユニット３、第２の導管７を経由してリザーバ２に戻す。２つのＴＦＦユニット３それぞれのハウジング１１は、濾過液出口１３を含む。各サブシステム１９は、濾過液貯蔵タンク１０およびＴＦＦユニット３と濾過液貯蔵タンク１０との間で流体連通している濾過液導管９も含む。濾過液貯蔵タンク１０は、例えば冷蔵貯蔵タンクであり得る。濾過液導管９は、任意の種類の生体適合性チューブ、例えばシリコーンチューブであり得る。
【００６２】
追加の代表的なシステム構造および特徴
リザーバ、導管、ＴＦＦユニット、ポンプ、濾過液貯蔵タンク、流量計、圧力センサ、クランプ、ポート、および生物学的製造システムで使用可能である非限定的な代表的構造を以下に記載する。
【００６３】
リザーバ
リザーバは、バイオリアクタであり得る。バイオリアクタは、例えば約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約５０Ｌ〜約５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０００Ｌ、約５００Ｌ〜約５０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約１００Ｌ、約１０Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約２，０００Ｌ、または約１０Ｌ〜約１，０００Ｌ）の容積を有し得る。本明細書に記載するバイオリアクタは、いずれも潅流バイオリアクタであり得る。代表的なバイオリアクタは、いくつかの異なる商業ベンダー（例えば、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）およびＨｏｌｌａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｕｒｒ  Ｒｉｄｇｅ、ＩＬ））から購入可能である。
【００６４】
二者択一的または付加的に、リザーバは、貯蔵タンクであり得る。例えば、かかる冷蔵貯蔵タンクは、組み換えタンパク質を含む細胞培養物を、約５分間〜約１週間（例えば、約５分間〜約６日間、約５分間〜約５日間、約５分間〜約４日間、約５分間〜約３日間、
約５分間〜約２日間、約５分間〜約３６時間、約５分間〜約２４時間、約５分間〜約１２時間）保持可能である。貯蔵タンク内の細胞培養物は、約１５℃〜約３７℃、約２０℃〜約３７℃、約２５℃〜約３７℃、約３０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約３０℃の温度に維持可能である。
【００６５】
導管
本明細書に記載する導管は、単純なチューブ、例えば生体適合性チューブであり得る。有用なチューブの非限定的な例として、シリコーンゴム、ポリウレタン、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（グリセロールセバケート）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、もしくはポリアンヒドリド、またはこれらを含むコポリマーまたは誘導体、および／または他のポリマーが挙げられる。二者択一的または付加的に、本明細書に記載する導管は、いずれもポリ塩化ビニルを含み得る。導管は、いずれも、例えば約５ｍｍ〜約５０ｍｍ（例えば、約１０ｍｍ〜約４０ｍｍ、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍ、または約１０ｍｍ〜約３０ｍｍ、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍ）の内径（ＩＤ）を有し得る。導管は、溶接可能な移送チューブであり得る。導管の追加の例、ならびに本発明のデバイスおよび方法で使用可能である、導管の特性は、当業者に周知である。
【００６６】
ＴＦＦユニットおよびクロスフローフィルタ
本明細書に記載するシステムもしくはサブシステム、または方法のいずれかで用いられるＴＦＦユニットは、１つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含み得る。例えば、本明細書に記載するＴＦＦユニットは、単一のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）を含み得る。他の例では、ＴＦＦユニットは、２つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、または６つ）のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）を含み得る。ＴＦＦユニット内の２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタは、同一であってもよく、異なってもよい（例えば、番号、種類、形状、表面積、またはポアサイズが異なる）。具体例では、ＴＦＦユニットは、２つの管状クロスフローフィルタを含み得る。ＴＦＦユニット中に存在する２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタは、湾曲した長方形の形状であり得る。
【００６７】
クロスフローフィルタは、約０．１μｍ〜約０．４５μｍ（例えば、約０．１５μｍ〜約０．４０μｍ、約０．１５μｍ〜約０．３５μｍ、約０．１５μｍ〜約０．３０μｍ、約０．１５μｍ〜約０．２５μｍ）、または約０．２０μｍの平均ポアサイズを有し得る。クロスフローフィルタは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から構成されるスペクトルフィルタであり得る。
【００６８】
クロスフローフィルタは、約０．１ｍ２〜約５ｍ２（例えば、約０．５ｍ２〜約４．５ｍ２、約０．５ｍ２〜約４．０ｍ２、約０．５ｍ２〜約３．５ｍ２、約０．５ｍ２〜約３．０ｍ２、約０．５ｍ２〜約２．５ｍ２、約０．５ｍ２〜約２．０ｍ２、約０．５ｍ２〜約１．５ｍ２、または約０．５ｍ２〜約１．０ｍ２）の表面積（濾過面積）を有し得る。クロスフローフィルタは、約５００ファイバ／フィルタ〜約２５００ファイバ／フィルタ（例えば、約５００ファイバ／フィルタ〜約２４００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約２３００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約２２００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約２１００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約２０００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１９００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１８００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１７００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１６００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１５００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１４００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１３００ファイバ／フィルタ、約５００ファイ
バ／フィルタ〜約１２００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１１００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約１０００ファイバ／フィルタ、約５００ファイバ／フィルタ〜約９００ファイバ／フィルタ、約６００ファイバ／フィルタ〜約９００ファイバ／フィルタ、約７００ファイバ／フィルタ〜約９００ファイバ／フィルタ、または約８００ファイバ／フィルタ〜約９００ファイバ／フィルタ）のフィルタ１つ当たりの合計ファイバ数を有し得る。いくつかの例では、クロスフローフィルタ内のファイバは、約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍ（例えば、約０．１ｍｍ〜約９ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約８ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約７ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約６ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約４ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約２．５ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約２．０ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、または約０．７５ｍｍ〜約１．２５ｍｍ）の内径を有する。クロスフローフィルタ中に存在するファイバは、約０．２ｃｍ〜約２００ｃｍ（例えば、約０．２ｃｍ〜約１９０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１８０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１７０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１６０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１５０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１４０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１３０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１２０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１１０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約１００ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約９０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約８０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約７０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約６０ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約５５ｃｍ、約０．２ｃｍ〜約５０ｃｍ、約１ｃｍ〜約４５ｃｍ、約１ｃｍ〜約４０ｃｍ、約１ｃｍ〜約３５ｃｍ、約１ｃｍ〜約３５ｃｍ、約１ｃｍ〜約３０ｃｍ、約１ｃｍ〜約２５ｃｍ、約１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約１ｃｍ〜約１５ｃｍ、約１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約５ｃｍ、約２０ｃｍ〜約４０ｃｍ、または約２５ｃｍ〜約３５ｃｍ）の長さを有し得る。クロスフローフィルタは、フィルタの大部分の表面積が、システム内の流体（例えば、細胞培養物）の流れに対して並行に位置するように、任意の形状を有し得る。例えば、クロスフローフィルタは、管状形状または湾曲した長方形の形状、またはドーナッツ形状を有し得る。本明細書に記載するシステムで使用可能であるクロスフローフィルタの例として、ＡＴＦ４フィルタ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。追加のクロスフローフィルタは本明細書に記載されており、当技術分野において公知である。
【００６９】
当業者なら理解できるように、ＴＦＦユニット内のクロスフローフィルタは、ケーシング（例えば、硬質プラスチックまたは金属ケーシング）内に収容可能である。ハウジングは、任意の形状、円筒状または長方形の形状であり得、１つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを保持できるように設計可能である。ハウジングは、１つまたはそれ以上のクロスフローフィルタをハウジングに挿入、またはそこから除去できるようにする面を含み得る。
【００７０】
いくつかのシステムは、直列または並列で配置された２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットを含む。例えば、２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットが直列で配置されているシステムでは、流体導管は、２つの隣接したＴＦＦユニット（例えば、本明細書に記載するまたは当技術分野において公知の代表的なＴＦＦユニットのいずれか）を流体連結させるのに使用可能である。システム内の２つのＴＦＦユニットに関する１つのかかる代表的な配置を図４に示す。直列で配置されている２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットは、システム内の少なくとも１つのポンプが作動して、細胞培養物の反転可能な流れを引き起こし、リザーバ、例えばバイオリアクタから、第１の導管、２つまたはそれ以上のＴＦＦユニット、隣接したＴＦＦユニット間に位置する１つまたはそれ以上の導管、第２の導管を経由してリザーバ、例えばバイオリアクタに戻す限り、任意の方法で設計可能である。２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットは、同一（例えば、クロスフローフィルタの番号および種類が同一）であっても異なってもよい（例えば、クロスフローフィルタの番号および種類が異なる）。いくつかの例では、２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットそれぞれは、単一の管状クロスフローフィルタを含む。各ＴＦＦユニットは、ＴＦＦユニットから流出した濾過液が、濾過液貯蔵タンク（例えば、本明細書に記載する濾過液貯蔵タンクのいずれか
）に流入できるようにする濾過液導管と流体連結し得る。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットが、単一のハウジング（例えば、本明細書に記載する任意のまたは当技術分野において公知の代表的種類のハウジングのいずれか）内に配置可能である。
【００７１】
ポンプ
本明細書に記載するシステムは、１つまたはそれ以上のポンプを含み得る。いくつかの例では、１つまたはそれ以上のポンプは、低乱流ポンプ（ＬＴＰ）である。ＬＴＰは、流体（例えば、細胞培養物）内で相当量の剪断応力および／または流体の乱れを誘発することなく、単一の方向（例えば、第１もしくは第２の流れの向き）で流体（例えば、細胞培養物）を移動させる、または流体（例えば、細胞培養物）を、２つの方向（第１および第２の流れの向き）で反転可能に移動させることが可能なポンプである。ＬＴＰが、第１および第２の流れの向きを切り替えて、流体（例えば、細胞培養物）を流通させるのに用いられる際には、第２の流れの向きは、第１の流れの向きとほぼ逆方向ある。
【００７２】
ＬＴＰポンプの例として蠕動ポンプが挙げられる。蠕動ポンプは、容積が約２０ｍＬ〜約２５０ｍＬ（例えば、約２０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約２０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約５０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約３０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約３０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約３０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約４０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約４０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約４０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約５０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約５０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約７５ｍＬ、約６０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約６０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約６０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約７０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約７０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約８０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約８０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約９０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約９０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約９０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約２４０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約２２０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１４０ｍＬ、または約１００ｍＬ〜約１２０ｍＬ）のポンプヘッドを有し得る。蠕動ポンプは、内径が約５ｍｍ〜約４００ｍｍ（例えば、約５ｍｍ〜約３８０ｍｍ、約５ｍｍ〜約３６０ｍｍ、約５ｍｍ〜約３４０ｍｍ、約５ｍｍ〜約３２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約３００ｍｍ、約５ｍｍ〜約２８０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２６０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２４０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２００ｍｍ、約５ｍｍ〜約１８０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１６０
ｍｍ、約５ｍｍ〜約１４０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１００ｍｍ、約５ｍｍ〜約８０ｍｍ、約５ｍｍ〜約６０ｍｍ、約５ｍｍ〜約５５ｍｍ、約５ｍｍ〜約５０ｍｍ、約５ｍｍ〜約４５ｍｍ、約５ｍｍ〜約４０ｍｍ、約５ｍｍ〜約３５ｍｍ、約５ｍｍ〜約３０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２５ｍｍ、約５ｍｍ〜約２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１５ｍｍ、約５ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１０ｍｍ〜約６０ｍｍ、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍ、約１０ｍｍ〜約２５ｍｍ、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍ、約２０ｍｍ〜約６０ｍｍ、約２０ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約３０ｍｍ〜約５０ｍｍ）のチューブを有し得る。蠕動ポンプ内のチューブの壁直径は、約１ｍｍ〜約３０ｍｍ（例えば、約１ｍｍ〜約２５ｍｍ、約１ｍｍ〜約２０ｍｍ、約１ｍｍ〜約１８ｍｍ、約１ｍｍ〜約１６ｍｍ、約１ｍｍ〜約１４ｍｍ、約１ｍｍ〜約１２ｍｍ、約１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約８ｍｍ、約１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍ）であり得る。本発明のシステムおよび方法で使用可能である蠕動ポンプの例として、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ６２０、およびＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ８００ポンプが挙げられる。本明細書に記載するどの蠕動ポンプも、ツインチャンネルを有し、および／またはＧＯＲＥ  Ｓｔａ−Ｐｕｒｅチューブ（例えば、内径が１６ｍｍ、および壁が４ｍｍのチューブ）を含み得る。
【００７３】
ＬＴＰポンプの追加の例は、米国特許第４，０３７，９８４号；同第５，０３３，９４３号；および同第５，４５８，４５９号；米国特許出願公開第２００９／０１９９９０４号、および国際特許出願番号ＷＯ０６／０２１８７３号に記載されている。ＬＴＰポンプの他の例として、回転容積移送式真空ポンプ、ローブポンプ、内接ギアポンプ、およびプログレッシブキャビティポンプが挙げられる。当業者は、他の種類のＬＴＰが市販されており、本明細書に記載するどのシステムおよび方法でも使用可能であることを認識する。
【００７４】
いくつかの例では、少なくとも１つのポンプが、第１または第２の導管、またはその両方に配置される。他の例では、少なくとも１つのポンプが、リザーバ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置される。２つまたはそれ以上のＴＦＦユニットを含むシステムでは、少なくとも１つのポンプは、２つの隣接したＴＦＦユニット間に配置された導管（例えば、図４に示す導管１４）内に配置可能である。少なくとも１つのポンプが作動すると、その結果、流体がシステムを通じて反転可能に流通し、リザーバから、第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由してリザーバに戻る、または２つもしくはそれ以上のＴＦＦユニットを備えるシステムでは、流体がシステムを通じて反転可能に流通し、リザーバから、第１の導管、２つもしくはそれ以上のＴＦＦユニット、隣接したＴＦＦユニット間の１つもしくはそれ以上の導管、第２の導管を経由して、リザーバに戻る限り、少なくとも１つのポンプが、本明細書に記載するシステム内のどこでも配置可能である。
【００７５】
濾過液貯蔵タンク
濾過液貯蔵タンクは、場合により、例えば濾過液を収納するためにシステムに含めることができる。例えば、濾過液は、約１時間〜約１週間（例えば、約１時間〜約６日間、約１時間〜約５日間、約１時間〜約４日間、約１時間〜約３日間、約１時間〜約２日間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約２０時間、約１時間〜約１６時間、約１時間〜約１２時間、または約１時間〜約６時間）収納可能である。濾過液貯蔵タンクの内部容積は、約５０ｍＬ〜約５０Ｌ（例えば、約５０ｍＬ〜約４５Ｌ、約５０ｍＬ〜約４０Ｌ、約５０ｍＬ〜約３５Ｌ、約５０ｍＬ〜約３０Ｌ、約５０ｍＬ〜約２５Ｌ、約５０ｍＬ〜約２０Ｌ、約５０ｍＬ〜約１８Ｌ、約５０ｍＬ〜約１６Ｌ、約５０ｍＬ〜約１４Ｌ、約５０ｍＬ〜約１２Ｌ、約５０ｍＬ〜約１０Ｌ、約５０ｍＬ〜約９Ｌ、約５０ｍＬ〜約８Ｌ、約５０ｍＬ〜約７Ｌ、約５０ｍＬ〜約６Ｌ、約５０ｍＬ〜約５Ｌ、約５０ｍＬ〜約４．５Ｌ、約５０ｍＬ〜約４．０Ｌ、約５０ｍＬ〜約３．５Ｌ、約５０ｍＬ〜約３．０Ｌ、約５０ｍＬ〜約２．５Ｌ、約５０ｍＬ〜約２．０Ｌ、約５０ｍＬ〜約１．５Ｌ、約５０ｍＬ〜約１．０Ｌ、約１００ｍＬ〜約１．０Ｌ、または約５００ｍＬ〜約１．０Ｌ）であり得る。濾過液貯蔵タンクの内部表面は、生体適合性材料（例えば、当技術分野に
おいて公知の任意の生体適合性材料）を含み得る。濾過液貯蔵タンクは、約１０℃〜約３５℃（例えば、約１０℃〜約３０℃、約１０℃〜約２５℃、約１０℃〜約２０℃、約１０℃〜約１５℃、または約１５℃〜約２５℃）の温度で、濾過液を収納する能力を有する冷蔵貯蔵タンクであり得る。当業者なら理解できるように、いくつかの異なる市販貯蔵タンクが、本明細書に記載するシステムおよび方法において濾過液貯蔵タンクとして使用可能である。
【００７６】
流量計
本明細書に記載するシステムのいくつかの例は、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の流量計を含み得る。例えば、１つまたはそれ以上の流量計は、システム内の１つまたはそれ以上の任意の導管内に配置可能である（例えば、第１の導管、第２の導管、隣接したＴＦＦユニット間の１つもしくはそれ以上の導管、および／または濾過液導管）。例えば、流量計は、２つの隣接したＴＦＦユニット間に配置可能である。いくつかの例では、流量計は、非侵襲的である。当業者は、本発明のシステムおよび方法で使用可能である多様な市販の流量計を理解する。例えば、ＥＭ−ＴＥＣ  ＢｉｏＰｒｏＴＴ非侵襲式リアルタイム流量計、ＰＴ８７８超音波流量計（Ｒｓｈｙｄｒｏ）、およびＳｏｎｏ−Ｔｒａｋ超音波非侵襲式流量計（ＥＭＣＯ）が、本発明のシステムおよび方法で使用可能な市販の流量計である。
【００７７】
圧力センサ
本明細書に記載するシステムは、１つまたはそれ以上の圧力センサを含み得る。例えば、１つまたはそれ以上の圧力センサは、システム内の導管のいずれか（例えば、第１の導管、第２の導管、隣接したＴＦＦユニット間の１つもしくはそれ以上の導管、および／または濾過液導管）内に配置可能である。例えば、圧力センサは、システム内の２つの隣接したＴＦＦユニット間に配置可能である。当業者は、本発明のシステムおよび方法で使用可能である多様な市販の圧力センサを理解する。本明細書に記載するシステムおよび方法で使用可能である圧力センサの非限定的な例として、ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ  ＰｒｅｓｓｕｒｅＭＡＴ圧力センサが挙げられる。
【００７８】
クランプ／ポート
本明細書に記載するどのシステムも、場合により、第１または第２の導管と、第１または第２の導管それぞれをポートと流体連結させる該ポートとの間にポート導管を含むことができる。ポートは、流体（例えば、細胞培養物または洗浄溶液）をシステムに送達する、またはシステムから除去する（第１または第２の導管それぞれを通じて）のに使用可能である。クランプは、ポート導管内に配置可能である。多様な、適するクランプが、当技術分野において公知である（例えば、スクリュークランプ）。ポート導管は、導管について上記した特徴の任意の組合せを有し得る。ポートは、当技術分野において一般的に公知の任意の種類のポートであり得る。例えば、ポートは注入ポートであり得る、またはリブ付きスレッド（ｒｉｂｂｅｄ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）を有し得る。
【００７９】
生物学的製造システム
本明細書に記載するどのデバイスも、入口および出口を有する少なくとも１つ（例えば、２、３、または４つ）のマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）、ならびにＴＦＦユニットまたは濾過液貯蔵タンクの間の濾過液導管を含む、生物学的製造システムを含み得るが、この場合、該デバイスは、濾過液が、生物学的製造システムの入口に流入し、少なくとも１つのＭＣＣＳを通過し、生物学的製造システムの出口を通じて該デバイスから退出するように構成される。ＭＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフ用メンブレン、または少なくとも１つのクロマトグラフィカラムと少なくとも１つのクロマトグラフ用メンブレンとの組合せを含み得る。非限定的な例では、ＭＣＣＳは、４つのクロマトグラフ用カラム、３つのク
ロマトグラフ用カラムとクロマトグラフ用メンブレン、３つのクロマトグラフ用カラム、２つのクロマトグラフ用カラム、２つのクロマトグラフ用メンブレン、および２つのクロマトグラフ用カラムと１つのクロマトグラフ用メンブレンを含み得る。クロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフ用メンブレンの組合せの追加の例が、非限定的に、ＭＣＣＳで用いられるものと、当業者は想像可能である。ＭＣＣＳ中に存在する個々のクロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフ用メンブレンは、同一であってもよく（例えば、形状、容積、樹脂、捕捉機構、およびユニット操作が同一）、異なってもよい（例えば、形状、容積、樹脂、捕捉機構、およびユニット操作が１つまたはそれ以上異なる）。ＭＣＣＳ中に存在する個々のクロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフ用メンブレンでは、実施するユニット操作（例えば、捕捉、精製、ポリッシング、ウイルスの不活性化、組み換え治療用タンパク質を含む流体のイオン濃度および／もしくはｐＨの調整、または濾過のユニット操作）は同一であってもよく、異なってもよい（例えば、捕捉、精製、ポリッシング、ウイルスの不活性化、組み換え治療用タンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調整、ならびに濾過等からなる群より選択されるユニット操作が異なる）。
【００８０】
１つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４）の異なる種類のバッファーが、本明細書に記載する生物学的製造デバイスのいずれかにおいて、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に利用可能である。当技術分野において公知なように、本明細書に記載する生物学的製造システムが用いる１つまたはそれ以上のＭＣＣＳで用いられる１つまたはそれ以上の種類のバッファーは、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１および第２のＭＣＣＳ）のクロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフ用メンブレン中に存在する樹脂、組み換え治療用タンパク質、ならびに１つまたはそれ以上のＭＣＣＳの特定のクロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフィメンブレンにより実施されるユニット操作（例えば、本明細書に記載する代表的なユニット操作のいずれか）に依存する。また、本明細書に記載する生物学的処理デバイスのいずれかにおいて、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に利用される容積およびバッファーの種類についても、当業者は決定可能である。例えば、本明細書に記載するプロセスのいずれかにおいて、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に利用されるバッファーの容積および種類は、得られる単離された組み換えタンパク質（例えば、医薬品）に関する下記事項の１つまたはそれ以上について最適化するために選択可能である：組み換え治療用タンパク質の全体的な収率、組み換え治療用タンパク質の活性、組み換え治療用タンパク質の純度レベル、および組み換え治療用タンパク質を含む流体からの生物学的汚染物質除去（例えば、活性なウイルス、マイコバクテリア、酵母菌、細菌、または哺乳動物細胞がないこと）。
【００８１】
１つまたはそれ以上のＭＣＣＳは、周期的向流分配クロマトグラフィシステム（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＣＣＳ）であり得る。ＰＣＣＳは、例えば２つまたはそれ以上のクロマトグラフィカラム（例えば、３つのカラムまたは４つのカラム）を含むことができ、そのようなカラムは、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィカラムから組み換え治療用タンパク質を連続的に溶出可能となるように切り替えられる。ＰＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフ用メンブレン、または少なくとも１つのクロマトグラフ用カラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフ用メンブレンを含み得る。カラム操作は、負荷、洗浄、溶出、および再生工程から一般的に構成される。ＰＣＣＳでは、複数のカラムが、循環しながら個別におよび連続的に同一の工程を行うのに用いられる。カラムは、連続的に操作されるので、１つのカラムからの通過画分と洗浄部分は、別のカラムにより捕捉される。このＰＣＣＳの特有の特徴は、樹脂を、バッチモードのクロマトグラフィにおいて一般的なように、動的結合容量（ｄｙｎａｍ
ｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）ではなく、その静的結合容量（ｓｔａｔｉｃ
ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）近傍で負荷できるようにする。連続的な循環および溶出の結果として、ＰＣＣＳに流入する流体は、連続的に処理され、組み換え治療用タンパク質を含む溶出物が連続的に生成される。
【００８２】
生物学的製造システム内の少なくとも１つのＭＣＣＳが実施可能な１つまたはそれ以上のユニット操作は、例えば組み換え治療用タンパク質を捕捉する工程、組み換え治療用タンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化する工程、組み換え治療用タンパク質を精製する工程、組み換え治療用タンパク質をポリッシングする工程、組み換え治療用タンパク質を含む流体を保持する工程（例えば、ブレークタンクを用いて）、組み換え治療用タンパク質を含む流体から微粒子状物質を濾過または除去する工程、ならびに組み換え治療用タンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調整する工程を含む。
【００８３】
捕捉する工程のユニット操作は、例えば捕捉機構を利用する少なくとも１つのクロマトグラフィカラムおよび／またはクロマトグラフィ樹脂を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳを用いて実施可能である。捕捉機構の非限定的な例として、タンパク質Ａ結合捕捉機構、抗体または抗体フラグメント結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、アプタマー結合捕捉機構、タグ結合捕捉機構（例えば、ポリ−Ｈｉｓタグに基づく捕捉機構）、および補助因子結合捕捉機構が挙げられる。捕捉は、陽イオン交換もしくは陰イオン交換クロマトグラフィ、または分子篩クロマトグラフィを実施するのに使用可能である樹脂を用いても実施可能である。組み換え治療用タンパク質を捕捉するのに使用可能である樹脂の例は、当技術分野において公知である。
【００８４】
組み換え治療用タンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化する工程のユニット操作は、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳを用いて実施可能であり、同ＭＣＣＳは、例えばクロマトグラフィカラム、クロマトグラフィメンブレン、または約３．０〜５．０（例えば、約３．５〜約４．５、約３．５〜約４．２５、約３．５〜約４．０、約３．５〜約３．８、または約３．７５）のｐＨにて、少なくとも３０分間（例えば、約３０分間〜１．５時間、約３０分間〜１．２５時間、約０．７５時間〜１．２５時間、または約１時間）、組み換え治療用タンパク質を含む流体をインキュベーションする能力を有する貯蔵タンクを含む。
【００８５】
組み換えタンパク質を精製する工程のユニット操作は、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳを用いて実施可能であり、同ＭＣＣＳは、例えば樹脂を含むクロマトグラフィカラムまたはクロマトグラフ用メンブレンを含み、該樹脂は、例えば捕捉システムを利用する。捕捉機構の非限定的な例として、タンパク質Ａ結合捕捉機構、抗体または抗体フラグメント結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、アプタマー結合捕捉機構、タグ結合捕捉機構（例えば、ポリ−Ｈｉｓタグに基づく捕捉機構）、および補助因子結合捕捉機構が挙げられる。精製する工程も、陽イオン交換もしくは陰イオン交換クロマトグラフィ、または分子篩クロマトグラフィを実施するのに使用可能である樹脂を用いて実施可能である。組み換え治療用タンパク質を精製するのに使用可能である樹脂の例は、当技術分野において公知である。
【００８６】
組み換えタンパク質をポリッシングする工程のユニット操作は、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳを用いて実施可能であり、同ＭＣＣＳは、例えば樹脂を含むクロマトグラフィカラムまたはクロマトグラフ用メンブレンを含み、該樹脂は、例えば陽イオン交換、陰イオン交換、または分子篩クロマトグラフィを実施するのに使用可能である。組み換え治療用タンパク質をポリッシングするのに使用可能である樹脂の例は、当技術分野において公知である。
【００８７】
組み換え治療用タンパク質を含む流体を保持する工程のユニット操作は、ＭＣＣＳを用
いて実施可能であり、同ＭＣＣＳは、生物学的製造システム内の１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ内には、少なくとも１つのリザーバ（例えば、ブレークタンク）または最大１、２、３、４、または５つのリザーバ（例えば、ブレークタンク）を含む。例えば、このユニット操作を達成するのに使用可能であるリザーバ（例えば、ブレークタンク）は、約１ｍＬ〜約１Ｌ（例えば、約１ｍＬ〜約８００ｍＬ、約１ｍＬ〜約６００ｍＬ、約１ｍＬ〜約５００ｍＬ、約１ｍＬ〜約４００ｍＬ、約１ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３００ｍＬ、約１０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、および約１０ｍＬ〜約１００ｍＬ）の容積をそれぞれ有し得る。本明細書に記載する生物学的製造システムで用いられるリザーバ（例えば、ブレークタンク）の容量は、例えば１ｍＬと約３００ｍＬとを含めてこれらの間、例えば１ｍＬと約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬ、または約１０ｍＬとを含めこれらの間であり得る。生物学的製造システム内のリザーバ（例えば、ブレークタンク）は、それぞれ、少なくとも１０分間（例えば、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、または少なくとも６時間）組み換え治療用タンパク質を含む流体を保持することができる。他の例では、生物学的製造システム内のリザーバ（例えば、ブレークタンク）は、総時間として、例えば約５分と約６時間未満とを含めこれらの間、例えば、約５分と約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、または約３０分とを含めこれらの間、治療用タンパク質を保持するに過ぎない。生物学的製造システム内のリザーバ（例えば、ブレークタンク）は、組み換え治療用タンパク質を含む流体の保持および冷蔵（例えば、２５℃未満、１５℃未満、または１０未満の温度）の両方で使用可能である。リザーバは、円形シリンダー、楕円形シリンダー、またはほぼ長方形の封止されたおよび非透過性のバッグを含む任意の形状を有し得る。
【００８８】
組み換え治療用タンパク質を含む流体を濾過する工程のユニット操作は、例えばフィルタ、または分子篩樹脂を含むクロマトグラフィカラムもしくはクロマトグラフ用メンブレンを含むＭＣＣＳを用いて実施可能である。当技術分野において公知なように、多様なサブミクロンフィルタ（例えば、ポアサイズが１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、約０．２μｍ、０．２μｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、または１０ｎｍ未満のフィルタ）が当技術分野において入手可能であり、これは、任意の析出物質および／または細胞（例えば、析出した、折り畳まれていないタンパク質；析出した望ましくない宿主細胞タンパク質；析出した脂質；細菌；酵母菌細胞；真菌細胞；および／またはマイコバクテリア）を除去する能力を有する。ポアサイズが約０．２μｍまたは０．２μｍ未満のフィルタは、組み換え治療用タンパク質を含む流体から細菌を除去するのに有効であることが公知である。当技術分野において公知なように、分子篩樹脂を含むクロマトグラフィカラムまたはクロマトグラフ用メンブレンは、組み換え治療用タンパク質を含む流体を濾過する工程のユニット操作を実施するのにＭＣＣＳでも使用可能である。
【００８９】
組み換え治療用タンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調整する工程のユニット操作は、ＭＣＣＳを用いて実施可能であり、同ＭＣＣＳは、組み換え治療用タンパク質を含む流体に、新規バッファー溶液を添加するバッファー調整リザーバ（例えば、インライン式バッファー調整リザーバ）を含み、利用する（例えば、単一のＭＣＣＳ内のカラムの間、または最後から２番目のＭＣＣＳ内の最後のカラムの後、および組み換え治療用タンパク質を含む流体が次のＭＣＣＳ（例えば、第２のＭＣＣＳ）の第１のカラムに供給される前）。当技術分野において認識可能なように、インライン式バッファー調整リザーバは、任意のサイズ（例えば、１００ｍＬを上回る）であり得、また任意の緩衝液を収納し得る（例えば、下記事項のうち１つまたはそれ以上に該当する緩衝液：組み換え治療用タンパク質を含む流体と比較して、それよりもｐＨが高いもしくは低い、組み換え
治療用タンパク質を含む流体と比較して、それよりもイオン（例えば、塩）濃度が高いもしくは低い、および／またはＭＣＣＳ（例えば、第１または第２のＭＣＣＳ）内の少なくとも１つのクロマトグラフ用カラム、もしくは少なくとも１つのクロマトグラフ用メンブレン中に存在する樹脂に結合する組み換え治療用タンパク質と競合する薬剤の濃度が高いもしくは低い）。
【００９０】
ＭＣＣＳは、２つまたはそれ以上のユニット操作を実施することができる。例えば、ＭＣＣＳは少なくとも下記のユニット操作を実施することができる：組み換え治療用タンパク質を捕捉し、組み換え治療用タンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化する；組み換え治療用タンパク質を捕捉し、組み換え治療用タンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化し、組み換え治療用タンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調整する；組み換え治療用タンパク質を精製し、組み換え治療用タンパク質をポリッシングする；組み換え治療用タンパク質を精製し、組み換え治療用タンパク質をポリッシングし、組み換え治療用タンパク質を含む流体を濾過する、または組み換え治療用タンパク質を含む流体から析出物および／または微粒子状の物体を除去する；ならびに組み換え治療用タンパク質を精製し、組み換え治療用タンパク質をポリッシングし、組み換え治療用タンパク質を含む流体を濾過し、または組み換え治療用タンパク質を含む流体から析出物および／または特定の物体を除去し、組み換え治療用タンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調整する。
【００９１】
本発明のデバイスおよび方法で使用可能である生物学的製造システムの追加の代表的な特徴は、２０１３年３月８日付け出願の米国特許出願第６１／７７５，０６０号、および２０１３年７月１９日出願の米国特許出願第６１／８５６，３９０号に記載されている。
【００９２】
本発明のシステムにより提供される利点
本明細書に記載するシステムは、下記の利点のうちの１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）を有する細胞培養物の連続濾過をもたらす：他の一方向開回路濾過システム（例えば、一方向ＴＦＦシステム）または二方向閉回路濾過システム（閉回路ＡＴＦ（商標）システム）と比較したときの、細胞培養物の外部容積（リザーバの外部）の低減、交換分画（第１の導管、ＴＦＦユニット、および第２の導管内）の増加、細胞培養物の外部滞留時間（リザーバ外部）の短縮、細胞培養物濾過中の剪断応力の低下、細胞培養物の細胞生存率の改善、細胞培養物の生存細胞密度の向上、およびフィルタ汚損の減少。
【００９３】
本明細書に記載するシステムの交換分画および外部滞留時間は、下記の式１および２を用いて計算可能である。
交換分画＝交換容積／外部容積    （式１）
外部滞留時間＝外部容積／（交換速度×交換分画）    （式２）
【００９４】
例えば、本発明のシステムの、リザーバ、第１の導管、第２の導管、およびＴＦＦユニット内の細胞培養物の総容積に対する、細胞培養物の総外部容積が占め得る割合は、約１％〜約７％（例えば、約１．０％〜約６．５％、約１％〜約６．０％、約１％〜約５．５％、または約１％〜約５．０％）に過ぎない。本明細書に提示するシステムは、リザーバ外の細胞培養物の滞留時間も、約１秒〜約６０秒（例えば、約１秒〜約５５秒、約１秒〜約５０秒、約１秒〜約４５秒、約１秒〜約３０秒、約１秒〜約２５秒、約１秒〜約２０秒、約１秒〜約１５秒、約１秒〜約１３秒、約１秒〜約１０秒、約１秒〜約８秒、約１秒〜約５秒、または約１０秒〜約１４秒）に短縮可能である（外部滞留時間の低下）。下記の表１は、実施例に記載されている代表的なシステムと閉じたシステムの交互タンジェント濾過（ＡＴＦ４）の外部滞留時間について比較する。
【００９５】
【表１】
2020124204.tif 000002
【００９６】
本発明のシステムは、交換分画について、約５０％を上回る（例えば、約５５％を上回る、約６０％を上回る、約６５％を上回る、約７０％を上回る、約７５％を上回る、約８０％を上回る、または約８５％を上回る）改善をもたらすことができる。本明細書に記載するシステムは、細胞培養物中で高生存細胞密度を、例えば細胞約３０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３２×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３４×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３６×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３８×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４２×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４４×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４６×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４８×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５２×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５４×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５６×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５８×１０６個／ｍＬを上回る、または細胞約６０×１０６個／ｍＬを上回る生存細胞密度をもたらすことができる。本明細書に記載するシステムは、細胞約６５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約７０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約７５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約８０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約８５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約９０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約９５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１００×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１０５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１１０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１１５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１２０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１２５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１３０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１３５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１４０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１４５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１５０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１５５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１６０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１６５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１７０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１７５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１８０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１８５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１９０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２００×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２１０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２２０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２３０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２４０×１０６個／ｍＬを上回る、または細胞約２５０×１０６個／ｍＬを上回る生存細胞密度をもたらすことができる。
【００９７】
本明細書に提示するシステムは、最適化された交換速度（本明細書では流速とも呼ばれる）も提供する。当業者なら理解できるように、交換速度が高すぎると、細胞増殖および細胞培養性能に悪影響を及ぼすレベルの剪断応力を引き起こすおそれがあり、交換速度が低すぎると、フィルタ汚損および細胞培養物の外部滞留時間の長期化を引き起こすおそれがある。本明細書に提示するシステムは、本明細書に記載する代表的な流速のいずれかを実現可能にする。
【００９８】
本明細書に提示するシステムは、最適化された交換速度（ＸＲ）と潅流速度（ＰＲ）との比も提供する。当業者なら理解できるように、ＸＲ：ＰＲの比が高いシステムおよび方法は、より効率的な細胞培養製造法をもたらす（例えば、潅流プロセス中に利用される細胞培養培地はより少ない）。いくつかの例では、本明細書の代表的なデバイスおよび方法は、約２を上回る（例えば、約３を上回る、約４を上回る、約５を上回る、約６を上回る
、約７を上回る、約８を上回る、約９を上回る、約１０を上回る、約１１を上回る、約１２を上回る、約１３を上回る、約１４を上回る、約１５を上回る、約１６を上回る、約１７を上回る、約１８を上回る、約１９を上回る、約２０を上回る、約２１を上回る、約２２を上回る、約２３を上回る、約２４を上回る、約２５を上回る、約５０を上回る、約７５を上回る、約１００を上回る、約１２５を上回る、約１５０を上回る、約１７５を上回る、約２００を上回る、約２２５を上回る、約２５０を上回る、約２７５を上回る、約３００を上回る、約３２５を上回る、約３５０を上回る、約３７５を上回る、約４００を上回る、約４２５を上回る、約４５０を上回る、約４７５を上回る、約５００を上回る、約５２５を上回る、約５５０を上回る、約５７５を上回る、または約６００を上回る）、または約５〜約６００（例えば、約１０〜約５５０、約１０〜約５００、約１０〜約４５０、約１０〜約４００、約１０〜約３５０、約１０〜約３００、約１０〜約２５０、約１０〜約２００、約１０〜約１５０、約１０〜約１００、または約１０〜約５０）のＸＲ：ＰＲ比をもたらす。
【００９９】
細胞培養物処理法
細胞培養物を処理する方法であって、（ａ）開回路濾過システムを提供する工程（例えば、本明細書に記載する開回路濾過システムのいずれか）、（ｂ）細胞培養物を、リザーバからＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第１の期間、流通させる工程、（ｃ）第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第２の流れの向きで第２の期間、流通させる工程、（ｄ）第２の流れの向きを反転させ、そして培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第３の期間、流通させる工程、（ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を少なくとも２回（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００回、または１００回超）繰り返す工程、および（ｆ）濾過液を収集する工程を含む方法も提供される。これらの方法の様々な代表的な態様を以下に記載する。
【０１００】
細胞培養物
本明細書に提示する方法において処理される細胞培養物は、液体培養培地中に複数の任意の種類の哺乳動物細胞を含み得る。本明細書に記載するすべての方法のいくつかの例では、哺乳動物細胞は、懸濁培養で増殖する細胞である。他の例では、哺乳動物細胞は、接着細胞（例えば、潅流バイオリアクタ内で増殖するのに、マイクロキャリア等の固体基質を必要とする細胞）である。細胞培養物中に存在し得る哺乳動物細胞の非限定的な例として、下記の細胞が挙げられる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｓｐ２．０、ミエローマ細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３ＥおよびＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、およびＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ（コッカー・スパニエル）腎上皮細胞（ＭＤＣＫ）。細胞培養物中に存在し得る追加の哺乳動物細胞は、当技術分野において公知である。
【０１０１】
本明細書に記載するいずれかの方法を用いて処理される細胞培養物は、細胞約０．５×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約３５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約４５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約５５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約６０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約６５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約７０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約７５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約８０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約８５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約９０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約９５．０×１０
６個／ｍＬを上回る、細胞約１００．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１０５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１１０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１２０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１２５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１３０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１３５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１４０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１４５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１５０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１５５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１６０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１７０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１７５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１８０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１８５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１９０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約１９５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２００．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２０５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２１０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２１５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２２０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２２５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２３０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２３５．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２４０．０×１０６個／ｍＬを上回る、細胞約２４５．０×１０６個／ｍＬを上回る、または約細胞２５０．０×１０６個／ｍＬを上回る生存細胞密度を含み得る。いくつかの例では、細胞培養物は、細胞約３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１００×１０６個／ｍＬ（例えば、細胞約３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約９５×１０６個／ｍＬ、細胞約３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約９０×１０６個／ｍＬ、細胞約３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約８５×１０６個／ｍＬ、細胞約３５×１０６個／ｍＬ〜細胞約８０×１０６個／ｍＬ、細胞約４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約８０×１０６個／ｍＬ、細胞約４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約６０×１０６個／ｍＬ、または細胞約６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約８０×１０６個／ｍＬ）の生存細胞濃度を有する。いくつかの例では、細胞培養物は、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ（例えば、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１７０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１６０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／��Ｌ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１７０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１６０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１７０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１６０×１０６個／ｍＬ、細胞約１３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×
１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１７０×１０６個／ｍＬ、細胞約１４０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１６０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１５０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１７０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１６０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１８０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１７０×１０６個／ｍＬ〜細胞約１９０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約１８０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２００×１０６個／ｍＬ、細胞約１９０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約１９０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約１９０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約１９０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約１９０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２１０×１０６個／ｍＬ、細胞約２００×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約２００×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞
約２００×１０６個／ｍＬ〜細胞約２３０×１０６個／ｍＬ、細胞約２００×１０６個／ｍＬ〜細胞約２２０×１０６個／ｍＬ、細胞約２１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ、細胞約２１０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、細胞約２２０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２４０×１０６個／ｍＬ、または細胞約２３０×１０６個／ｍＬ〜細胞約２５０×１０６個／ｍＬ）の生存細胞濃度を有する。
【０１０２】
システム内の細胞培養物の総量（濾過液導管および濾過液貯蔵タンクを例外とする）は、０．２Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約０．２Ｌ〜約９，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約９，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約８，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約８，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約７，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約７，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約６，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約６，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約５，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約４，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約４，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約３，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約３，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約２，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約２，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約１，５００Ｌ、約０．２Ｌ〜約１，０００Ｌ、約０．２Ｌ〜約５０
０Ｌ、約０．２Ｌ〜約４００Ｌ、約０．２Ｌ〜約３００Ｌ、約０．２Ｌ〜約２００Ｌ、約０．２Ｌ〜約１５０Ｌ、約０．２Ｌ〜約１００Ｌ、約０．２Ｌ〜約５０Ｌ、または約０．２Ｌ〜約１０Ｌ）であり得る。
【０１０３】
細胞培養物中に存在する哺乳動物細胞は、組み換えタンパク質（例えば、哺乳動物細胞により分泌される組み換えタンパク質）をコードする組み換え核酸（例えば、哺乳動物細胞のゲノム内で安定的に一体化した核酸）を含み得る。組み換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学において公知の多様な方法を用いて、哺乳動物細胞に導入可能である。非限定的な例として、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、トランスダクション（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションが挙げられる。いくつかの事例では、組み換えタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞の染色体に安定的に一体化されないが（一過性のトランスフェクション）、一方他の事例では、核酸は一体化される。二者択一的または付加的に、組み換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド中、および／または哺乳動物の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）中に存在し得る。二者択一的または付加的に、核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター）を用いて細胞に導入可能である。核酸は、プロモーター配列（例えば、強力なプロモーター、例えばβ−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーター、または誘導性プロモーター）と作動可能に結合し得る。可溶性組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、組み換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に位置する分泌シグナルペプチドをコードする配列を含み得るが、同ペプチドは、哺乳動物細胞中に存在する酵素により切断され、その後培養培地中に放出される。核酸を含むベクターは、所望の場合には、選択マーカーも含み得る（例えば、哺乳動物細胞にハイグロマイシン、ピュロマイシン、またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子）。
【０１０４】
細胞培養物中の哺乳動物細胞により分泌されると考えられる組み換えタンパク質の非限定的な例として、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む）、抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、本明細書に記載する抗体フラグメントのいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、α−ガラクトシダーゼ）、ミオザイム、もしくはセレザイム）、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、もしくはインターフェロンαもしくはβ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンで用いられるタンパク質）が挙げられる。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質は、少なくとも１つの多官能性組み換えタンパク質スキャフォールドを含む工学的に作出された抗原結合ポリペプチドである（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．第１３巻：２４５〜２５５頁、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（そのまま参照によって本明細書に組み入れる）に記載されている組み換え抗原結合タンパク質を参照）。抗体である組み換えタンパク質の非限定的な例として、以下のタンパク質が挙げられる：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アポリズマブ、アチヌマブ、トシリズマブ、バシリチマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デンスマブ（densumab）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、およびトラスツズマブ。本明細書に記載する方法により製造可能な治療用抗体の追加の例は、当技術分野において公知である。細胞培養物中の哺乳動物細胞により分泌されると考えられる組み換えタンパク質の追加の非限定的な例として下記のタンパク質が挙げられる：アルグルコシダーゼα、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルス
ルファーゼ、ルトロピンα、抗血友病因子、アガルシダーゼβ、インターフェロンβ−１ａ、ダルベポエチンα、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固因子ＩＸ、卵胞刺激ホルモン、イミグルセラーゼ、ドルナーゼα、エポエチンα、およびアルテプラーゼ。
【０１０５】
液体培養培地は、当技術分野において公知である。液体培養培地には、哺乳動物の血清（例えば、ウシ胎仔血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子）を補充することができる。二者択一的または付加的に、液体培養培地は、化学的に定義された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、血清を含まない液体培養培地、または血清含有液体培養培地であり得る。化学的に定義された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、血清液を含まない体培養培地、および血清含有液体培養培地の例は、商業的に入手可能である。
【０１０６】
液体培養培地は、エネルギー源（例えば、グルコース等の炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、基本セットの２０種類のアミノ酸とシステイン）、ビタミン、および／または低濃度の必要な他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を一般的に含む。液体培養培地には、所望の場合には、例えば、哺乳動物のホルモンまたは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩およびバッファー（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸の塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解産物、ならびに／またはこれらの任意の組合せ、または他の添加剤を補充することができる。
【０１０７】
液体培養培地の非限定的な例として、例えばＣＤ  ＣＨＯ、Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ、およびＦｏｒｔｉ  ＣＨＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからすべて入手可能）、Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ＣＤ  ＣＨＯ融合培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、およびＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ、スイス）が挙げられる。やはり液体培養培地中に存在し得る培地成分として、化学的に定義された（ＣＤ）加水分解産物、例えばＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２つまたはそれ以上のアミノ酸）、およびＣＤ増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。液体組織培養培地および培地成分の追加の例は、当技術分野において公知である。
【０１０８】
接着性哺乳動物細胞を含む細胞培養物は、例えばマイクロキャリアを用いて、潅流バイオリアクタ内で増殖可能である。使用可能である非限定的な代表的マイクロキャリアとして、ＣｙｔｏＰｏｒｅ（商標）１およびＣｙｔｏＰｏｒｅ（商標）２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州から入手可能）が挙げられる。使用可能であるマイクロキャリアの追加の例は、公的に入手可能および当技術分野において公知である。
【０１０９】
代表的な開回路濾過システムの使用
本明細書に記載するどの開回路濾過システムも、提供される細胞培養物処理法で使用可能である。例えば、本明細書に記載する方法で用いられる開回路濾過システム内のバイオリアクタは、バイオリアクタ（例えば、当技術分野において公知の任意の潅流バイオリアクタ）であっても冷蔵貯蔵タンクであってもよい。本方法で用いられる開回路濾過システムは、生体適合性チューブである１つまたはそれ以上の導管（例えば、第１の導管、第２の導管、隣接したＴＦＦユニット間の１つもしくはそれ以上の導管、および／または濾過液導管）を含み得る。いくつかの例では、開回路濾過システムは、リザーバおよび２つまたはそれ以上のサブシステム（本明細書に記載するような）を備える。
【０１１０】
本方法で用いられる開回路濾過システムは、本明細書に記載するように、単一のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）または２つもしくはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のクロスフローフィルタ（例えば、管状クロスフローフィルタ）を有するＴＦＦユニットを含み得る。他の例では、用いられる開回路濾過システムは、２つまたはそれ以上（例えば、２、３、または４つ）のＴＦＦユニットを含む場合があり、この場合、隣接したＴＦＦユニットの各対は、流体導管により流体連結している。ＴＦＦユニットは、約０．１ｍ２〜約１５０ｍ２（例えば、約０．１ｍ２〜約１４５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１４０ｍ２、約０．１ｍ２〜約１３５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１３０ｍ２、約０．１ｍ２〜約１２５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１２０ｍ２、約０．１ｍ２〜約１１５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１１０ｍ２、約０．１ｍ２〜約１０５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１００ｍ２、約０．１ｍ２〜約９５ｍ２、約０．１ｍ２〜約９０ｍ２、約０．１ｍ２〜約８５ｍ２、約０．１ｍ２〜約８０ｍ２、約０．１ｍ２〜約７５ｍ２、約０．１ｍ２〜約７０ｍ２、約０．１ｍ２〜約６５ｍ２、約０．１ｍ２〜約６０ｍ２、約０．１ｍ２〜約５５ｍ２、約０．１ｍ２〜約５０ｍ２、約０．１ｍ２〜約４５ｍ２、約０．１ｍ２〜約４０ｍ２、約０．１ｍ２〜約３５ｍ２、約０．１ｍ２〜約３０ｍ２、約０．１ｍ２〜約２５ｍ２、約０．１ｍ２〜約２０ｍ２、約０．１ｍ２〜約１５ｍ２、約０．１ｍ２〜約１０ｍ２、または約０．１ｍ２〜約５ｍ２）の総濾過面積を提供することができる。ＴＦＦユニット中に存在するフィルタは、本明細書に記載するポアサイズ（例えば、約０．２μｍ）、形状、ファイバ内径、および／またはファイバ長さの任意の組合せを有し得る。
【０１１１】
本明細書で用いられる開回路濾過システムは、第１の導管または第２の導管、またはその両方に配置された少なくとも１つのポンプを含み得る。少なくとも１つのポンプは、システム内の１つもしくはそれ以上の導管（例えば、１つまたはそれ以上の第１の導管、第２の導管、および／または隣接したＴＦＦユニット間の１つもしくはそれ以上の導管）内にも配置可能である。用いられるシステムは、リザーバ内で、第１または第２の導管の近位（例えば、ポンプから第１の導管または第２の導管がバイオリアクタと連結する位置までの距離として、０．０１ｃｍ〜５ｃｍ（例えば、０．０１ｃｍ〜４ｃｍ、０．０１ｃｍ〜３ｃｍ、０．０１ｃｍ〜２ｃｍ、または０．０１ｃｍ〜１ｃｍ））に配置された少なくとも１つのポンプを含み得る。いくつかのシステムは、細胞培養物を、第１の方向で第１の期間および第３の期間中流通させ、細胞培養物を第２の方向で第２の期間中流通させる単一のポンプのみを含む。他のシステムは、第１および第２のポンプを含み、この場合、第１のポンプは、細胞培養物を第１の方向で流通させ、第２のポンプは、細胞培養物を第２の方向で流通させる。
【０１１２】
本方法で用いられるどのシステムでも、少なくとも１つのポンプ（例えば、１、２、３、または４つのポンプ）は、ＬＴＰ（例えば、蠕動ポンプ等の、本明細書に記載するＬＴＰのいずれか）であり得る。本方法で用いられるシステム中に存在する少なくとも１つのポンプ（例えば、少なくとも１つのＬＴＰ）は、本明細書に記載するポンプ（例えば、ＬＴＰ）の特徴または特性（例えば、ポンプヘッド容積、種類、および／またはチューブ）の任意の組合せを有し得る。方法の一部では、少なくとも１つのポンプが、約１０ＲＰＭ〜約１００ＲＰＭ（例えば、約１０ＲＰＭ〜約９５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約９０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約８５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約６０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約５５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約５０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約４５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約４０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約３５ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約３０ＲＰＭ、約１０ＲＰＭ〜約２５ＲＰＭ、または約１０ＲＰＭ〜約２０ＲＰＭ）のポンプスピード（ＲＰＭ）で用いられる。いくつかの例では、本方法は、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約４０Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約３５Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約３０Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約２５Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約２０Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間
〜約１５Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約１０Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約９Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約８Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約７Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約６Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約５Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約４Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約３Ｌ／ｍ２／時間、約０．５Ｌ／ｍ２／時間〜約２Ｌ／ｍ２／時間、または約０．８Ｌ／ｍ２／時間〜約１．２Ｌ／ｍ２／時間の潅流フラックス速度をもたらす。いくつかの例では、少なくとも１つのポンプを使用すると、システム内の剪断速度は、約５０ｓ−１〜約１０００ｓ−１（例えば、約５０ｓ−１〜約９５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約９００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約８５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約８００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約７５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約７００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約６５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約６００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約５５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約５００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約４５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約４００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約３５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約３００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約２５０ｓ−１、約５０ｓ−１〜約２００ｓ−１、約５０ｓ−１〜約１５０ｓ−１、または約５０ｓ−１〜約１００ｓ−１）となる。これらの方法で使用可能であるポンプの具体例として、１６ｍｍチューブを備えたＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  ６２０蠕動ポンプ、または４０ｍｍチューブを備えたＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  ８００蠕動ポンプが挙げられる。
【０１１３】
当業者なら理解できるように、システム内の細胞培養物の総容積（濾過液導管および濾過液貯蔵タンク内の濾過液容積を除く）、少なくとも１つのＴＦＦユニットにより提供される総濾過面積、および流速（例えば、第２および第３の期間中の）は、本発明において提供されるシステムおよび方法の１つまたはそれ以上の利点を可能にするしかるべき比（例えば、本明細書に記載する代表的な数値およびパラメータ）で実施される必要がある。
【０１１４】
フローサイクル
本明細書に記載する方法では、第１、第２、および／または第３の期間は、約２０秒〜約１５分（例えば、約３０秒〜約１５分、約２０秒〜約１４分、約２０秒〜約１３分、約２０秒〜約１２分、約２０秒〜約１１分、約２０秒〜約１０分、約２０秒〜約９分、約２０秒〜約８分、約２０秒〜約７分、約２０秒〜約６分、約２０秒〜約５分、約２０秒〜約４分、約２０秒〜約３分、約２０秒〜約２分、約２０秒〜約１１５秒、約２０秒〜約１１０秒、約２０秒〜約１０５秒、約２０秒〜約１００秒、約２０秒〜約９５秒、約２０秒〜約９０秒、約２０秒〜約８５秒、約２０秒〜約８０秒、約２０秒〜約７５秒、約２０秒〜約７０秒、約２０秒〜約６５秒、約２０秒〜約６０秒、約２０秒〜約５５秒、約２０秒〜約５０秒、約２０秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２０秒〜約３５秒、約２０秒〜約３０秒、約２０秒〜約２５秒、約３０秒〜約９０秒、約３５秒〜約８５秒、約４０秒〜約８０秒、約４５秒〜約７５秒、約５０秒〜約７０秒、約５５秒〜約６５秒、約３０秒〜約１４分、約３０秒〜約１３分、約３０秒〜約１２分、約３０秒〜約１１分、約３０秒〜約１０分、約３０秒〜約９分、約３０秒〜約８分、約３０秒〜約７分、約３０秒〜約６分、約３０秒〜約５分、約３０秒〜約４分、約３０秒〜約３分、約３０秒〜約２分、約３０秒〜約９０秒、約３０秒〜約１分、約１分〜約１５分、約１分〜約１４分、約１５分〜約１３分、約１分〜約１２分、約１分〜約１１分、約１分〜約１０分、約１分〜約９分、約１分〜約８分、約１分〜約７分、約１分〜約６分、約１分〜約５分、約１分〜約４分、約１分〜約３分、約１分〜約２分、または約１分〜約９０秒）であり得る。いくつかの例では、第１、第２、および第３の期間は、ほぼ同一である。他の例では、第１、第２、および第３の期間は、同一でない。
【０１１５】
いくつかの例では、第１の期間の第１の流れの向きは、細胞培養物を、リザーバから少なくとも１つのポンプ（例えば、単一のポンプ）が配置された第１または第２の導管を通じて、次に少なくとも１つのＴＦＦユニットを通じて流通させ、次に他の導管を通じてリ
ザーバに戻す（例えば、約３０秒〜約６０分間、約３０秒〜約５０分間、約３０秒〜約４０分間、約３０秒〜約３０分間、約３０秒〜約２０分間、約３０秒〜約１５分間、約３０秒〜約１０分間、または約３０秒〜約５分間）。かかる例では、第１の期間中の流れは、システム内の少なくとも１つのＴＦＦユニット（およびその中の少なくとも１つのクロスフローフィルタ）を平衡化するのに用いられる。図８は、システム内の少なくとも１つのＴＦＦユニットの平衡化を目的とする、第１の流れの向きでの細胞培養物の流れを示す概略図である。
【０１１６】
図９は、細胞培養物を、第１の流れの向きで第１の期間（ｔ１）、リザーバからＴＦＦユニットを通じて流通させ、期間（ｔｒ１）において第１の流れの向きを反転させ、細胞培養物を、第２の流れの向きで第２の期間（ｔ２）、ＴＦＦユニットを通じて流通させ、期間（ｔｒ２）において第２の流れの向きを反転させ、培養物を、第１の流れの向きで第３の期間（ｔ３）、ＴＦＦユニットを通じて流通させる工程の例を示す。例えば、ｔｒ１および／またはｔｒ２は、約１秒〜約１分間（例えば、約１秒〜約５５秒間、約１秒〜約５０秒間、約１秒〜約４５秒間、約１秒〜約４０秒間、約１秒〜約３５秒間、約１秒〜約３０秒間、約１秒〜約２５秒間、約１秒〜約２０秒間、約１秒〜約１５秒間、約１秒〜約１０秒間、約１秒〜約５秒間、約５秒〜約６０秒間、約５秒〜約５５秒間、約５秒〜約５０秒間、約５秒〜約４５秒間、約５秒〜約４０秒間、約５秒〜約３５秒間、約５秒〜約３０秒間、約５秒〜約２５秒間、約５秒〜約２０秒間、約５秒〜約１５秒間、約５秒〜約１０秒間、または約２秒〜約１０秒間、約２秒〜約８秒間、約２秒〜約６秒間、または約２秒〜約４秒間）であり得る。
【０１１７】
第１および／または第２の方向の流れ（例えば、第１、第２、および／または第３の期間のいずれか）は、約０．５Ｌ／分〜約１２０Ｌ／分（例えば、約０．５Ｌ／分〜約１１５Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約１１０Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約１０５Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約１００Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約９５Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約９０Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約８５Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約８０Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約７５Ｌ／分、約０．５Ｌ／分〜約７０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約６５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約６０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約５５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約５０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約４５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約４０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約３５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約３０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約２５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約２０Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約１５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分〜約１０Ｌ／分、または約０．１Ｌ／分〜約５Ｌ／分）の流速をもたらし得る。
【０１１８】
（ｉ）細胞培養物を第１の流れの向きで第１の期間において流通させる工程、および（ｉｉ）細胞培養物を第２の流れの向きで第２の期間において流通させる工程を１回繰り返すと、交換分画は約４０％〜約９５％（例えば、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約７５％、約４５％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約５５％〜約７５％、約６０％〜約８５％、約７０％〜約９５％、または約７０％〜約８５％）となり得る。
【０１１９】
本明細書に提示する方法では、システム内の細胞培養物の容積（濾過液導管、濾過液貯蔵タンク、および／または生物学的製造システムを除く）は、約０．１Ｌ〜約５０Ｌ（例えば、約０．１Ｌ〜約４５Ｌ、約０．１Ｌ〜約４０Ｌ、約０．１Ｌ〜約３５Ｌ、約０．１Ｌ〜約３０Ｌ、約０．１Ｌ〜約２５Ｌ、約０．１Ｌ〜約２０Ｌ、約０．１Ｌ〜約１８Ｌ、約０．１Ｌ〜約１６Ｌ、約０．１Ｌ〜約１４Ｌ、約０．１Ｌ〜約１２Ｌ、約０．１Ｌ〜約１０Ｌ、約０．１Ｌ〜約８Ｌ、約０．１Ｌ〜約６Ｌ、約０．１Ｌ〜約４Ｌ、約０．１Ｌ〜約３Ｌ、約０．１Ｌ〜約２Ｌ、または約０．１Ｌ〜約１Ｌ）であり得る。本明細書に記載する方法において、細胞培養物がリザーバ（例えば、潅流バイオリアクタ）外部で費やす時間は、５秒〜４５秒（例えば、約５秒〜約４０秒、約５秒〜約３５秒、約５秒〜約３０
秒、約５秒〜約２５秒、約５秒〜約２０秒、約５秒〜約１５秒、約５秒〜約１０秒）であり得る。
【０１２０】
本明細書に提示する方法のいくつかの実施形態は、哺乳動物細胞を含まない濾過液を生成する。本明細書に提示する方法は、分泌型組み換えタンパク質を含む細胞培養物から分泌型組み換えタンパク質（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、増殖因子、サイトカイン、または酵素）を含む濾過液も生成し得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物および／または濾過液は滅菌状態にある。
【０１２１】
本発明の方法は、単位時間当たり、より大容積の細胞培養物を濾過するために、スケールアップまたはスケールダウン可能である。当業者なら理解できるように、より大型のポンプヘッド容積を有する少なくとも１つのポンプ、およびより大型のチューブ、および／またはＴＦＦユニット内により多数のクロスフローフィルタ、またはより多数のＴＦＦユニット（例えば、より広い総濾過面積）を組み込むことにより、より大容積の細胞培養物が単位時間当たりに処理可能である。これらの変更は、本明細書に記載する方法を実施するのに用いられる開回路濾過システムで実施可能であり、より大スケールのシステムが下記の利点のうちの１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）を有することを保証するために、試験可能である：他の一方向開回路濾過システム（例えば、一方向ＴＦＦシステム）または二方向閉回路濾過システム（閉回路ＡＴＦTMシステム）と比較したときの、細胞培養物の外部容積（リザーバ外部）の減少、交換分画（例えば、第１の導管、ＴＦＦユニット、および第２の導管内）の増加、細胞培養物の外部滞留時間（リザーバ外部）の短縮、細胞培養物濾過中の剪断応力の低下、細胞培養物中の細胞生存率の改善、細胞培養物中の生存細胞密度の向上、およびフィルタ汚損の減少。３つの異なる代表的な方法および各方法を実施するのに用いられる開回路濾過システムに関する物理的および機能的パラメータの例を表２に示す（下記）。
【０１２２】
本明細書に記載するどの方法も、約１４日間〜約１００日間（例えば、約１４日間〜約９０日間、約１４日間〜約８０日間、約１４日間〜約７０日間、約１４日間〜約６０日間、約１４日間〜約５０日間、約１４日間〜約４０日間、約１４日間〜約３０日間、約１４日間〜約２０日間、約２０日間〜約１００日間、約２０日間〜約９０日間、約２０日間〜約８０日間、約２０日間〜約７０日間、約２０日間〜約６０日間、約２０日間〜約５０日間、約２０日間〜約４０日間、約２０日間〜約３０日間、約３０日間〜約１００日間、約３０日間〜約９０日間、約３０日間〜約８０日間、約３０日間〜約７０日間、約３０日間〜約６０日間、約３０日間〜約５０日間、約３０日間〜約４０日間、約４０日間〜約１００日間、約５０日間〜約９０日間、約５０日間〜約８０日間、約５０日間〜約７０日間、約５０日間〜約６０日間、約６０日間〜約１００日間、約６０日間〜約９０日間、約６０日間〜約８０日間、または約６０日間〜約７０日間）、連続的に実施可能である。
【０１２３】
【表２】
2020124204.tif 000003
【０１２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴＦＦユニット内の１つもしくはそれ以上のクロスフローフィルタ内のフィルタファイバに沿った圧力変化、および／または少なく
とも１つのＴＦＦユニットの１つもしくはそれ以上のクロスフローフィルタ内のフィルタメンブレンを横切る圧力変化は、およそ、例えば約１時間〜約１００日の期間（例えば、約１時間〜約９５日の期間、約１時間〜約９０日の期間、約１時間〜約８５日の期間、約１時間〜約８０日の期間、約１時間〜約７５日の期間、約１時間〜約７０日の期間、約１時間〜約６５日の期間、約１時間〜約６０日の期間、約１時間〜約５５日の期間、約１時間〜約５０日の期間、約１時間〜約４５日の期間、約１時間〜約４０日の期間、約１時間〜約３５日の期間、約１時間〜約３０日の期間、約１時間〜約２５日の期間、約１時間〜約２０日の期間、約１時間〜約１５日の期間、約１時間〜約１０日の期間、約１時間〜約５日の期間、約１日〜約１００日の期間、約１日〜約９０日の期間、約１日〜約８５日の期間、約１日〜約８０日の期間、約１日〜約７５日の期間、約１日〜約７０日の期間、約１日〜約６５日の期間、約１日〜約６０日の期間、約１日〜約５５日の期間、約１日〜約５０日の期間、約１日〜約４５日の期間、約１日〜約４０日の期間、約１日〜約３５日の期間、約１日〜約３０日の期間、約１日〜約２５日の期間、約１日〜約２０日の期間、約１日〜約１５日の期間、約１日〜約１０日の期間、約５日〜約１００日の期間、約５日〜約９５日の期間、約５日〜約９０日の期間、約５日〜約８５日の期間、約５日〜約８０日の期間、約５日〜約７５日の期間、約５日〜約７０日の期間、約５日〜約６５日の期間、約５日〜約６０日の期間、約５日〜約５５日の期間、約５日〜約５０日の期間、約５日〜約４５日の期間、約５日〜約４０日の期間、約５日〜約３５日の期間、約５日〜約３０日の期間、約５日〜約２５日の期間、約５日〜約２０日の期間、約５日〜約１５日の期間、約５日〜約１０日の期間、約１０日〜約１００日の期間、約１０日〜約９５日の期間、約１０日〜約９０日の期間、約１０日〜約８５日の期間、約１０日〜約８０日の期間、約１０日〜約７５日の期間、約１０日〜約７０日の期間、約１０日〜約６５日の期間、約１０日〜約６０日の期間、約１０日〜約５５日の期間、約１０日〜約５０日の期間、約１０日〜約４５日の期間、約１０日〜約４０日の期間、約１０日〜約３５日の期間、約１０日〜約３０日の期間、約１０日〜約２５日の期間、約１０日〜約２０日の期間、約１５日〜約１００日の期間、約１５日〜約９５日の期間、約１５日〜約９０日の期間、約１５日〜約８５日の期間、約１５日〜約８０日の期間、約１５日〜約７５日の期間、約１５日〜約７０日の期間、約１５日〜約６５日の期間、約１５日〜約６０日の期間、約１５日〜約５５日の期間、約１５日〜約５０日の期間、約１５日〜約４５日の期間、約１５日〜約４０日の期間、約１５日〜約３５日の期間、約１５日〜約３０日の期間、約１５日〜約２５日の期間、または約１５日〜約２０日の期間）、本方法を実施している間、実質的に同一のままである（例えば、本方法開始時のフィルタファイバを横切る、またはフィルタメンブレンを横切る初期の圧力変化の約±２０％以内、約±１９％以内、約±１８％以内、約±１７％以内、約±１６％以内、約±１５％以内、約±１４％以内、約±１３％以内、約±１２％以内、約±１���％以内、約±１０％以内、約±９％以内、約±８％以内、約±７％以内、約±６％以内、約±５％以内、約±４％以内、約±３％以内、約±２．５％以内、約±２．０％以内、約±１．５％以内、約±１．０％以内、または約±０．５％以内）。フィルタファイバまたはフィルタメンブレンを横切る圧力変化が有意に増加すれば、それはシステムの少なくとも１つのＴＦＦユニット内の少なくとも１つのクロスフローフィルタの汚損を示す。
【０１２５】
リザーバ内の細胞培養物をインキュベーションする工程
いくつかの実施形態は、哺乳動物細胞が組み換えタンパク質を組織培養培地中に分泌できるようにする条件下で、リザーバ（例えば、潅流バイオリアクタ）内の細胞培養物をインキュベーションする工程をさらに含む。例えば、リザーバ中の細胞培養物は、約３２℃〜約３９℃の温度でインキュベーション可能である。当業者は、温度は、インキュベーション中の特定の時点において（例えば、時間毎または日毎に）変更可能であると認識する。例えば、温度は、細胞培養物をリザーバ中に配置した後、約１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、または約２０日間以上経過
した時点で、変更またはシフト可能である（例えば、上昇または低下））。例えば、温度は上方にシフト可能である（例えば、最大または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０．０℃の変化）。例えば、温度は、下方にシフト可能である（例えば、最大または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０℃の変化）。リザーバ内の細胞培養物をインキュベーションする工程は、最大でまたは約１％〜１５％のＣＯ２（例えば、最大でもしくは約１４％のＣＯ２、１２％のＣＯ２、１０％のＣＯ２、８％のＣＯ２、６％のＣＯ２、５％のＣＯ２、４％のＣＯ２、３％のＣＯ２、２％のＣＯ２、または最大でもしくは約１％のＣＯ２）を含む雰囲気中でも実施可能である。さらに、本明細書に記載するどの方法も、加湿された雰囲気（例えば、少なくとももしくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％の湿度、または約１００％の湿度）中で、細胞培養物をインキュベーションする工程を含み得る。
【０１２６】
第１、第２、および第３の期間を繰り返す間に、リザーバ（例えば、潅流バイオリアクタ）内の細胞培養物をインキュベーションする工程は、ある容積の液体培養培地をバイオリアクタに添加する工程を含み得る。例えば、その容積の液体培養培地をバイオリアクタに添加することは、濾過液としてシステムから除去される液体培養培地の損失分を補填し得る。液体培養培地をリザーバに添加する工程は、連続的または定期的に（例えば、３日毎に１回、１日おき、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、もしくは１日６回以上）、または任意のこれらの組合せで実施可能である。リザーバにその容積の液体培養培地を添加する場合、かかる添加は、いくつかの事例では、システム内の細胞培養物の開始容積（濾過液導管および濾過液貯蔵タンク中に存在する濾過液の容積を除く）が２４時間の各期間または本方法が実施される全期間にわたり、ほぼ同一であるように実施可能である。当技術分野において公知なように、液体培養培地が濾過液としてシステムから除去される速度（容積／単位時間）およびその容積の液体培養培地がリザーバに添加される速度（容積／単位時間）は、異なってもよい。液体培養培地が濾過液としてシステムから除去される速度（容積／単位時間）およびその容積の液体培養培地が添加される速度（容積／単位時間）は、ほぼ同一であってもよく、異なってもよい。
【０１２７】
あるいは、濾過液としてシステムから除去される容積、およびリザーバに添加される容積は、本方法の実施中に、２４時間（あるいは、０．１時間〜約２４時間の増加期間、または２４時間を上回る増加期間）の各期間において変更（例えば、漸増）可能である。例えば、本方法の実施において、２４時間の各期間（あるいは、約１時間〜２４時間を超える増加期間、または２４時間を上回る増加期間）内に濾過液としてシステムから除去される液体培養培地の容積、および添加される液体培養培地の容積は、例えばリザーバ容積または本方法の実施開始時の細胞培養物の総容積の０．５％〜約２０％の容積からリザーバ容積または本方法の実施開始時の細胞培養物の総容積の約２５％〜約１５０％まで増加可能である（例えば、漸増または千鳥式の増加により）。当業者なら理解できるように、２４時間の各期間内に、濾過液としてシステムから除去される容積およびリザーバに添加される容積は、好ましくは、リザーバ容積または本方法の実施開始時の細胞培養物の総容積の約１００％〜約４００％（例えば、約１００％〜約３５０％、約１００％〜約３００％、約１００％〜約２５０％、約１００％〜約２００％、約１００％〜約１５０％、約１５０％〜約４００％、約１５０％〜約３５０％、約１５０％〜約３００％、約１５０％〜約２５０％、約１５０％〜約２００％、約２００％〜約４００％、約２００％〜約３５０％、約２００％〜約３００％、または約２００％〜約２５０％）である。
【０１２８】
当業者は、濾過液としてシステムから除去される液体培養培地、およびリザーバに添加される液体培養培地は、同一種類の培地であり得ると認識する。他の事例では、濾過液としてシステムから除去される液体培養培地、およびリザーバに添加される液体培養培地は、実質的に異なってもよい。液体培養培地の容積は、手作業によりまたは自動化されたシステムを用いて、例えば潅流ポンプにより添加可能である。
【０１２９】
濾過液から組み換えタンパク質を単離する工程
本明細書に記載するどの方法も、濾過液から分泌型組み換えタンパク質（例えば、本明細書に記載する組み換えタンパク質のいずれか）を単離する工程をさらに含み得る。流体からポリペプチド（例えば、分泌型ポリペプチド）を単離するための多くの方法が、当技術分野において公知である。例えば、組み換えタンパク質を単離するための方法は、以下の１つまたはそれ以上の工程を含み得る：組み換えタンパク質を含む流体を捕捉する工程、精製する工程、ポリッシングする工程、および／または濾過する工程。当技術分野において周知のように、組み換えタンパク質を単離するのに用いられる具体的な方法は、組み換えタンパク質の生物物理学的な特性に依存する。例えば、組み換え抗体は、タンパク質Ａ樹脂を用いて抗体を捕捉する工程を用い、ある程度精製可能である。
【０１３０】
いくつかの例では、濾過液中に存在する組み換えタンパク質は、少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、本明細書に記載する１つまたはそれ以上のＭＣＣＳのいずれか）を通じて単離する工程を含む、一体化した連続的なプロセスを用いて単離される。一体化した連続的なプロセスは、本明細書に記載する代表的な生物学的製造システムのいずれかを用いて実施可能である。組み換えタンパク質を単離するための代表的な一体化した連続的プロセス、およびかかるプロセスで用いられる生物学的製造システムは、２０１３年３月８日付け出願の米国特許出願第６１／７７５，０６０号、および２０１３年７月１９日付け出願の米国特許出願第６１／８５６，３９０号に記載されている。
【０１３１】
その結果、単離された組み換えタンパク質は、少なくとももしくは約５０重量％純粋、例えば少なくとももしくは約５５重量％純粋、少なくとも６０重量％純粋、少なくとも６５重量％純粋、少なくとも７０重量％純粋、少なくとも７５重量％純粋、少なくとも８０重量％純粋、少なくとも８５重量％純粋、少なくとも９０重量％純粋、少なくとも９５重量％純粋、少なくとも９６重量％純粋、少なくとも９７重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、または少なくとももしくは約９９重量％純粋、または９９重量％超純粋であり得る。
【０１３２】
いくつかの方法は、単離した組み換えタンパク質を薬学的に許容される賦形剤またはバッファーと混合することにより治療用原薬を処方する工程をさらに含む。混合は、単離した組み換えタンパク質を含む流体を緩衝液と混合することにより実施可能である。他の例では、混合は、固体緩衝剤を、緩衝液と共に、単離した組み換えタンパク質を含む流体に添加することにより実施可能である。本明細書に包含される混合の別の形態は、単離した組み換えタンパク質を含む固体組成物（例えば、凍結乾燥された粉末またはケーキ）を、緩衝液（例えば、注射用滅菌生理食塩水）と共に溶解することである。治療用原薬は、当技術分野において公知の任意の投与経路（例えば、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、髄腔内投与、または吸入）について処方可能である。
【０１３３】
実施例
本発明は、下記の実施例にさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１３４】
本明細書に提示する開回路濾過システムにより達成される処理と、ＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により達成される処理との比較
本明細書に提示する開回路濾過システムにより達成される細胞培養物処理と、ＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（閉回路流通方向切り替え型タンジェント濾過システム）により達成される細胞培養物処理とを比較するために、一連の実験を実施した。これらの実験を実施するのに用いたデバイスを、図５に一般的に示す。特に、開回路濾過システムで用いたリザーバは、Ｂｒｏａｄｌｙ−Ｊａｍｅｓ  １５Ｌバイオリアクタであり、第１の導管および第２の導管は、生体適合性、内径０．５インチの溶接可能な移送チューブであり、ＴＦＦユニットは、単一の管状クロスフローフィルタ（長さ３０ｃｍおよび内径１ｍｍであり、ならびに平均ポアサイズ０．２μｍｍ、ファイバ密度８３０ファイバ／フィルタ、および濾過面積０．７７ｍ２を有するポリエーテルスルホンファイバから構成される）を含み、少なくとも１つのポンプは、第１および第２の流れの向きで流体を流通させる能力を有する単一のＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプであり、そのポンプヘッド容積は５０ｍＬ〜１００ｍＬであり、内径１６ｍｍおよび壁直径４ｍｍを有するツインチャンネルＧＯＲＥ  Ｓｔａ−Ｐｕｒｅチューブを備えた。
【０１３５】
材料および方法
本発明において提供される開回路濾過システムと、Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製ＡＴＦ（商標）により達成される処理工程の比較で用いられた実験パラメータの要約を表３および４にまとめる（下記）。これらの実験を実施するのに用いられた方法のさらに詳細な要約を下記に提示する。
【０１３６】
【表３】
2020124204.tif 000004
【０１３７】
【表４】
2020124204.tif 000005
【０１３８】
潅流バイオリアクタを稼働させるのに用いた条件を表３に列記する。バイオリアクタは、作動容積として１０Ｌを用い、ＣＤ−ＣＨＯ培養培地により２リアクタ容積／日で置き
換えながら、細胞４０×１０６個／ｍＬに維持した。本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムは、ＡＴＦ４と同一のフィルタおよびハウジングを備えたが、本システム（図５に示す）および開回路システム（ＡＴＦ４で用いた閉じたシステムではない）を通じて細胞培養物を反転可能に流通させるために、ポンプヘッド容積が５０ｍＬ〜１００ｍＬのＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプ６２０Ｄｕを、培養再循環ポンプとして用いた。ＡＴＦ４バイオリアクタの潅流速度を、培養２０日目に、２リアクタ容積／日から１リアクタ容積／日に変更し、一方、本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムの潅流速度を、３２日目に、２リアクタ容積／日から１リアクタ容積／日に変更し、１０％のＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も補給した。
【０１３９】
結果
本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムの生存細胞密度は、９日目および１０日目で細胞４０×１０６個／ｍＬに到達したが、対応するＡＴＦシステムよりも早期に細胞４０×１０６個／ｍＬの細胞密度に到達した（図１０）。本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムの生存細胞の割合（％）は、培養が細胞４０×１０６個／ｍＬに到達したとき約９０％であったが、７０％で安定化するまで３週間にわたり継続的に減少した（図１１）。本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システム内の細胞培養物のキャパシタンスは、ＡＴＦシステム内の細胞培養物と比較して上昇したが（図１２）、本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムの細胞培養物およびＡＴＦシステムの細胞培養物に由来する平均生存細胞直径は類似した（図１３）。
【０１４０】
本明細書に提示する開回路濾過システム内の細胞培養物、およびＡＴＦシステムの細胞培養物の生産性プロファイルを、図１４、図１５、図１６、および図１７に示す。本明細書に提示する開回路濾過システム内の細胞培養物により産生されるＩｇＧの濃度は、ＡＴＦシステムと比較して、より遅延した時点において増加した（図１４）。本明細書に提示する開回路濾過システム内の細胞培養物の容積生産性および比生産性は、ＡＴＦシステム内の細胞培養物と比較して増加した（それぞれ図１５および図１６）。本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システム内の細胞培養物の篩係数は、３週間培養後、約９０％に留まり、ＡＴＦシステム内の細胞培養物の篩係数を上回った（図１７）。
【０１４１】
試験対象となった各システムのグルコースおよび乳酸生成プロファイルを図１８、図１９、図２０、および図２１に示す。本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システムの細胞培養物の比グルコース消費速度および比乳酸生成速度は、ＡＴＦシステム内の細胞培養物の比グルコース消費速度および比乳酸生成速度を上回った（それぞれ図１８および図１９）。さらに、比好気性グルコース消費速度およびグルコースからの乳酸収率については、ＡＴＦシステム内の細胞培養物の比好気性グルコース消費速度およびグルコースからの乳酸収率よりも、本明細書に提示する試験対象の開回路濾過システム内の細胞培養物の方が高かった（それぞれ図２０および図２１）。
【０１４２】
これらのデータから、本発明において提供される開回路濾過システムは、別の閉回路タンジェント濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製ＡＴＦ（商標）システム）と比較して、同等または改善した細胞培養物の特性、例えば同等または向上したキャパシタンス、同等または向上した容積生産性および比生産性、同等または向上した篩係数、ならびに同等または向上した比グルコース消費量を有する細胞培養物を提供することが示される。
【実施例２】
【０１４３】
開回路濾過システムに認められた生存細胞密度
本明細書に提示する開回路濾過システムを用いて達成される最高の生存細胞密度を決定
するために、また場合により、決定された生存細胞密度を、ＡＴＦ（商標）（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（閉回路流通方向切り替え型タンジェント濾過システム）を類似した条件下で用いて達成される生存細胞密度と比較するために、実験を実施した。これらの実験で用いたデバイスを、図５に一般的に示す。特に、開回路濾過システムで用いたリザーバは、Ｂｒｏａｄｌｙ−Ｊａｍｅｓ  １５Ｌバイオリアクタであり、第１の導管および第２の導管は、生体適合性、内径０．５インチの溶接可能な移送チューブであり、ＴＦＦユニットは、単一の管状クロスフローフィルタ（長さ３０ｃｍおよび内径１ｍｍであり、ならびに平均ポアサイズ０．２μｍｍ、ファイバ密度８３０ファイバ／フィルタ、および濾過面積０．７７ｍ２を有するポリエーテルスルホンファイバから構成された）を含み、少なくとも１つのポンプは、第１および第２の流れの向きで流体を流通させる能力を有する単一のＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプであり、そのポンプヘッド容積は５０ｍＬ〜１００ｍＬであり、内径１６ｍｍおよび壁直径４ｍｍを有するツインチャンネルＧＯＲＥ  Ｓｔａ−Ｐｕｒｅチューブを備えた。
【０１４４】
材料および方法
本発明において提供される開回路濾過システム（および、場合によりＲｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製ＡＴＦ（商標））を用いて達成することができる最高細胞密度を決定するための実験パラメータの要約を表５に示す。これらの実験で用いられた方法のさらに詳細な要約を下記に提示する。
【０１４５】
【表５】
2020124204.tif 000006
【０１４６】
潅流バイオリアクタを稼働させるのに用いた条件を表５に列記する。作動容積として１０Ｌを用いて、細胞をバイオリアクタ内で増殖させ、ＣＤ−ＣＨＯ培養培地で十分置き換えて、細胞固有の潅流速度として０．０５ｎＬ／細胞−日を維持した。開回路濾過システムは、ＡＴＦ４と同一のフィルタおよびハウジングを備えたが、本システム（図５に示す）および開回路システム（ＡＴＦ４で用いた閉じたシステムではない）を通じて細胞培養物を反転可能に流通させるために、培養再循環ポンプとしてポンプヘッド容積が５０ｍＬ〜１００ｍＬのＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプ６２０Ｄｕを使用した。細胞培養物の生存細胞密度を、細胞培養物プロセスの稼働期間中、１日１回測定した。
【０１４７】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、上記説明は、説明を目的としており、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義されるものと理解されたい。他の態様、長所、および修正形態も、下記の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
2020124204.tif 000007
【図２】
2020124204.tif 000008
【図３】
2020124204.tif 000009
【図４】
2020124204.tif 000010
【図５】
2020124204.tif 000011
【図６】
2020124204.tif 000012
【図７】
2020124204.tif 000013
【図８】
2020124204.tif 000014
【図９】
2020124204.tif 000015
【図１０】
2020124204.tif 000016
【図１１】
2020124204.tif 000017
【図１２】
2020124204.tif 000018
【図１３】
2020124204.tif 000019
【図１４】
2020124204.tif 000020
【図１５】
2020124204.tif 000021
【図１６】
2020124204.tif 000022
【図１７】
2020124204.tif 000023
【図１８】
2020124204.tif 000024
【図１９】
2020124204.tif 000025
【図２０】
2020124204.tif 000026
【図２１】
2020124204.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月17日(2020.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞培養物を処理する方法であって、
（ａ）開回路濾過システムを提供する工程であって、該システムは、哺乳動物細胞培養物を含むバイオリアクタと、
第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニットと、
バイオリアクタとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管と、
バイオリアクタとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管と、
該システムを通じて流体を流通させるための、該システム内に配置された少なくとも１つのポンプと、
を含み、
該システムは、
流体が、少なくとも１つのポンプを経由して、該システムを通じてバイオリアクタから、またはバイオリアクタに向かって、
第１と第２の導管およびＴＦＦユニットを通じて、反転可能に流通できるように、
濾過液が、ＴＦＦユニットから収集できるように構成されている、
工程と、
（ｂ）哺乳動物細胞培養物を、バイオリアクタからＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第１の期間流通させる工程と、
（ｃ）第１の流れの向きを反転させ、哺乳動物細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第２の流れの向きで第２の期間流通させる工程と、
（ｄ）第２の流れの向きを反転させ、哺乳動物細胞培養物を、ＴＦＦユニットを通じて、第１の流れの向きで第３の期間流通させる工程と、
（ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を少なくとも２回繰り返す工程と、
（ｆ）濾過液を収集する工程と、
を含む前記方法。
【請求項２】
ＴＦＦユニットは、管状クロスフローフィルタのような単一のクロスフローフィルタを
含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＦＦユニットは、２つまたはそれ以上のクロスフローフィルタを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
システムは、第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのポンプは、第１の導管もしくは第２の導管、またはその両方に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのポンプは、任意の２つのＴＦＦユニットの間でシステム内に配置されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのポンプは、バイオリアクタ内で、第１または第２の流体導管の近位に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのポンプは、蠕動ポンプのような低乱流ポンプ（ＬＴＰ）である、請求項１および５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
システムは、単一のＬＴＰを含み、該単一のＬＴＰは、哺乳動物細胞培養物を第１の方向で第１の期間および第３の期間中流通させ、哺乳動物細胞培養物を第２の方向で第２の期間中流通させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）濾過液は、哺乳動物細胞を含まない；および／または
（ｉｉ）哺乳動物細胞培養物は、分泌型組み換えタンパク質を含み、濾過液は、該分泌型組み換えタンパク質を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
分泌型組み換えタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、増殖因子、サイトカイン、もしくは酵素、またはその組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素はα−ガラクトシダーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
分泌型組み換えタンパク質を濾過液から単離する工程をさらに含み；
場合により、単離する工程は、少なくとも１つのマルチカラムクロマトグラフィシステム（ＭＣＣＳ）を通じて単離する工程を含む、一体化した連続的なプロセスを用いて実行される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
単離した組み換えタンパク質を、薬学的に許容される賦形剤またはバッファーと混合することにより、治療用原薬を処方する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞培養物もしくは濾過液、またはその両方は、滅菌状態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
開回路濾過システムであって、
バイオリアクタと、
第１および第２の入口を有するタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）ユニットと、
バイオリアクタとＴＦＦユニットの第１の入口との間で流体連通している第１の導管と、
バイオリアクタとＴＦＦユニットの第２の入口との間で流体連通している第２の導管と、
該システム内に配置された少なくとも１つのポンプと、
を含み、
少なくとも１つのポンプを作動させると、流体は該システムを通じて反転可能に流通し、バイオリアクタから、第１の導管、ＴＦＦユニット、第２の導管を経由して、バイオリアクタに戻る、前記システム。
【請求項１７】
第１の導管、第２の導管、またはその両方に配置された１つまたはそれ以上の追加のＴＦＦユニットを含む、請求項１６に記載の開回路濾過システム。
【請求項１８】
少なくとも１つのポンプは、第１の導管もしくは第２の導管、またはその両方に配置されている、請求項１６に記載の開回路濾過システム。
【請求項１９】
少なくとも１つのポンプは、蠕動ポンプのような低乱流ポンプ（ＬＴＰ）である、請求項１６または１８に記載の開回路濾過システム。
【請求項２０】
哺乳動物細胞培養物を第１および第２の流れの向きで反転可能に流通させるように適用された単一のＬＴＰを含む、請求項１９に記載の開回路濾過システム。
【請求項２１】
濾過液貯蔵タンク、およびＴＦＦユニットと該濾過液貯蔵タンクとの間で流体連通している濾過液導管をさらに含む、請求項１６に記載の開回路濾過システム。
【外国語明細書】
2020124204000001.pdf