(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、H因子活性を有し、H因子を超える利点を有し又はH因子の不利な点を有さず、その活性は、H因子のものと比較して好ましくは保存又は改良される組換えタンパク質を提供することである。【解決手段】前記課題は、H因子の少なくともSCR1〜4(SCR1、SCR2、SCR3及びSCR4、この順序で)、SCR19及びSCR20を含む組換えタンパク質によって達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端からC末端へと、H因子の少なくともSCR1からSCR4を含む第1のアミノ酸配列、並びにH因子の少なくともSCR19及びSCR20を含む第2のアミノ酸配列を含む、H因子活性を有する組換えタンパク質であって、天然のH因子ではなく、但し第1の配列がSCR1からSCR4までからなり第2の配列がSCR19及びSCR20からなる場合には、リンカーが合成リンカーである、組換えタンパク質。
【請求項２】
第1及び/又は第2のアミノ酸配列が、H因子の1つ又は複数の他の再編成されたSCRドメインを更に含む、請求項1に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
第1及び第2のアミノ酸配列が、非天然リンカー、特にG-A-S-Gリンカーによって一緒に連結されている、請求項1又は2に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
第1若しくは第2のアミノ酸配列がH因子の少なくともSCR12、SCR13及びSCR14を含む、又は第1及び第2のアミノ酸配列がSCR12、SCR13及びSCR14のいずれも含まない、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
第1の配列がH因子のSCR1からSCR4を含み、第2の配列が
-  H因子のSCR16からSCR20、
-  SCR15からSCR20、
-  SCR10からSCR20、及び
-  SCR8からSCR20
からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
第1の配列がH因子のSCR1からSCR7を含み、第2の配列がH因子のSCR16からSCR20を含み、前記第2の配列が好ましくは
-  H因子のSCR15からSCR20;
-  SCR14からSCR20;
-  SCR11からSCR20;
-  SCR10からSCR20;
-  SCR9からSCR20;及び
-  SCR8からSCR20
からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
第1の配列がH因子のSCR1からSCR8を含み、第2の配列がH因子のSCR16からSCR20を含み、前記第2の配列が好ましくはH因子のSCR10からSCR20を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
第1の配列がH因子のSCR1からSCR4を含み、第2の配列がH因子のSCR16からSCR20を含み、H因子のSCR7を含む第3の配列が第1及び第2の配列の間にある、請求項1から7のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
第1のアミノ酸配列がN末端位置にシグナルペプチド、特に、H因子の天然シグナルペプチド(配列番号24)、H因子とは異なるタンパク質のシグナルペプチド、又は配列番号25の配列に表されるシグナルペプチドSP-MB7を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
配列番号26から84及び159に表される配列から選択される配列を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードしている核酸コンストラクト。
【請求項１２】
組換えタンパク質の第1及び第2のアミノ酸配列をコードしている2つの核酸配列の間に、固有の制限部位、特に、G-A-S-Gリンカーをコードしている部分に存在するNheI部位を含む、請求項11に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項11又は12に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項１４】
請求項11又は12に記載の核酸コンストラクト、又は請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項11又は12に記載の核酸コンストラクト、又は請求項13に記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、H因子活性を有する組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
H因子は155kDaの血漿タンパク質であり、その主な機能は補体副経路活性の調節である。H因子は、3から8個のアミノ酸の短いリンカー配列によって一緒に連結された約60個のアミノ酸の20のショートコンセンサスリピート(SCR)ドメイン(CCP又はSHUSHIドメインとも呼ばれる)からなる。SCRドメイン1〜4(SCR1〜4)は、C3及びC5転換酵素の解離を促進する活性並びにI因子を調節する活性を有し、これは、C3bタンパク質の不活性化を可能にする。これらのN末端ドメインは、液相中でC3転換酵素活性を調節するのに十分であるが、細胞表面におけるH因子活性にはSCR19〜20が必要である。他のH因子SCRもH因子活性に直接に多少寄与し得、いくつかは、ヘパラン硫酸及びグリコサミノグリカン、ペントラキシン(CRP、PTX3)、フィブロモジュリン又はマロンジアルデヒド等の他の分子の結合部位を含む。これらのドメインのうちのいくつかは、分子の半減期、及び組換え形態におけるその生成の有効性に寄与し得る、グリコシル化部位も含み、他のものは、例えば、特異的なヘアピン型のフォールディング構造をH因子に与える、SCR12、SCR13、SCR14のように、H因子の三次元高次構造に重要な役割を有し得る(Schmidtら、J Mol Biol.2010年1月8日;395(1):105〜122)。
【０００３】
H因子は、高密度のC3沈着物に又は補体活性化若しくは抑制不能な炎症に関連した多数の疾患の治療に有望な治療因子である。しかし、加齢黄斑変性(ARMD)、膜性増殖性糸球体腎炎(MPGN)II型、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)又は特定の自己免疫疾患等の特定の適応症において、H因子の使用は、以下の特定の不利な点のために制限され得る:生物学的利用能、薬物動態及び薬力学、免疫原性、ヘパラン硫酸に対する結合、未知のリガンドに対する結合、病原体が免疫系{肺炎球菌(S. pneumoniae)、髄膜炎菌(N. meningitidis)等}及びH因子自己会合を回避するのを可能にする、病原体に対する結合。これらの不利な点は、H因子の分子特性、及び従って、H因子のSCRドメインの構成と関連している。
【０００４】
H因子のSCR1からSCR4をSCR19及びSCR20と組み合わせたH因子誘導体(オンラインで公表されている、Hebeckerら、Journal of Immunology 2013年6月10日)が提唱されている。細胞表面上にH因子活性を導くために構築されたこのH因子誘導体において、補体調節及び表面認識の2つのドメインは、SCR4の4番目のシステイン及びSCR19の1番目のシステインの間に見出される6個の天然アミノ酸によって一緒に連結される。
【０００５】
しかし、H因子のものよりも優れた治療有効性を得るために、例えば、細胞に対するより良好な結合を得るために、FHの半減期を保存若しくは延長するために、又はFHの特徴的なヘアピン型フォールディングを保存若しくは促進するために、他のH因子ドメインも必要とされ得る。従って、H因子から誘導される分子が必要とされ、H因子から誘導される前記分子は、H因子活性を有し、H因子を超える利点を有し又はH因子の不利な点を有さず、その活性は、H因子のものと比較して好ましくは保存又は改良される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】PCT/2001/050544
【特許文献２】PCT/FR2011/050544
【特許文献３】EP 0 264 166
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Schmidtら、J Mol Biol.2010年1月8日;395(1):105〜122
【非特許文献２】Hebeckerら、Journal of Immunology 2013年6月10日
【非特許文献３】http://www.uniprot.org/uniprot/P08603
【非特許文献４】Carton JMら、Protein Expr Purif、2007
【非特許文献５】Chechetkin、J. of Theoretical Biology 242、2006 922〜934
【非特許文献６】P. Sanchez-Corral、C. Gonzalez-Rubio、S. Rodriguez de Cordoba及びM. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41 (2004) 81〜84
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願出願において、出願人は、H因子活性を保存する、H因子のSCRドメインの数及び構成の再編成を有する、H因子から誘導された組換えタンパク質を提唱することによって、その必要性に応える。本発明による組換えタンパク質は、H因子の少なくともSCR1〜4(SCR1、SCR2、SCR3及びSCR4、この順序で)、SCR19及びSCR20を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の一目的は、N末端からC末端へと、H因子の少なくともSCR1からSCR4を含む第1のアミノ酸配列、並びにH因子の少なくともSCR19及びSCR20を含む第2のアミノ酸配列を含む、H因子活性を有する組換えタンパク質に関し、前記組換えタンパク質は天然のH因子ではなく、但し第1の配列がSCR1からSCR4までからなり第2の配列がSCR19及びSCR20からなる場合には、リンカーは合成リンカーである。
【００１０】
本発明は、本発明による組換えタンパク質をコードしている核酸、このような核酸を含むベクター、このような核酸又はこのようなベクターを含む宿主細胞、及びゲノムにこのような核酸を含むトランスジェニック動物も一目的として有する。
【００１１】
本発明は、抑制不能な炎症又は抑制不能なC3転換酵素沈着に起因した疾患を治療するための、本発明による組換えタンパク質も一目的として有する。より一般的には、本発明による組換えタンパク質は、H因子の抗補体活性が有益であるあらゆる疾患の治療に有用であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、それらの数及びそれらの構成の両方の点で、SCRドメインの再編成を有する、H因子から誘導される組換えタンパク質に関し、前記組換えタンパク質は、H因子のSCR1〜4を含む第1のアミノ酸配列並びにH因子のSCR19及びSCR20を含む第2のアミノ酸配列をこの順序で含む。第1及び/又は第2のアミノ酸配列は、H因子の1つ又は複数の他の再編成されたSCRドメインを更に含んでいてもよい。
【００１３】
一実施形態では、1つ又は複数のH因子のSCRドメインは、数コピーで存在していてもよい。例えば、本発明による組換えタンパク質は、1、2、3、又は3を超えるコピーの同じSCR、例えば、1、2、3又は3を超えるコピーのH因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含んでいてもよい。特定の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、1、2、3又は3を超えるコピーのH因子のSCR7、特に、H因子のY402バリアントのSCR7を含む。別のバリアントは、複数コピーのSCRドメインのセットを含む組換えタンパク質を含む。例えば、本発明による組換えタンパク質は、1、2、3又は3を超えるリピートのSCR1からSCR4を含んでいてもよく、すなわち、該タンパク質は、モチーフ(SCR1〜SCR4)nを有し、nは1、2、3又は3を超えるものと等しい整数であり、特に、nは1、2又は3と等しい。別の実施形態では、数コピーで存在するドメイン又はドメインのセットは、ドメイン又はドメインのセットのリピートではなく、他のSCRドメインによって分離されて組換えタンパク質中に存在していてもよい。換言すれば、本発明は、特に、SCR1〜SCR4、SCR7、SCR7及びSCR19〜SCR20、若しくはSCR1〜SCR4、SCR7、SCR1〜SCR4、及びSCR19〜20、又はこれらのドメインの任意の他の可能な組合せをこの順序で含む組換えタンパク質に関する。
【００１４】
本発明によるタンパク質が誘導されるH因子は、その活性が天然のH因子のものであるいずれのH因子であってもよい。特に、本明細書において、「H因子」とは、天然のヒトH因子又は別の種(例えば、ウシ、ブタ、イヌ科動物、ネズミ科動物)からのH因子のアミノ酸配列を有するあらゆるタンパク質を意味する。好ましくは、組換えタンパク質は、ヒトH因子から誘導される。この用語は、天然のH因子と実質的に相同な配列を有するあらゆる組換え体、誘導体又は変異体も含む。「と実質的に相同な配列」という表現は、好ましくは保存的な、1つ又は複数の置換、付加及び/又は欠損を受けたあらゆる配列を含む。「保存的な置換、付加及び/又は欠損」という表現は、H因子の一般的な高次構造及び/又は生物活性の大きな変化なく、アミノ酸残基の別のものとの任意の置換、付加又は除去を指す。保存的な置換は、同様の特性(例えば、形状、極性、水素結合ポテンシャル、酸性度、塩基性度、疎水性等)を有するアミノ酸との置換を含むが、これに限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野においてよく知られている。「H因子」という用語は、同種の個体において天然に見出されるH因子の天然の対立遺伝子バリエーション及び/又はアイソフォーム、並びに任意の形態又は程度のグリコシル化又は他の翻訳後修飾を更に含む。「H因子」という用語には、野生型及び/又は少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するものの活性と比較して同じ活性、又は優れた生物活性を有する、H因子のホモログ又は誘導体も含まれる。
【００１５】
本発明の組換えタンパク質を設計するために使用されるH因子バリアントは、特に、インターネットサイトhttp://www.uniprot.org/uniprot/P08603において言及されているバリアントであってもよい。
【００１６】
H因子の抗補体活性は、基礎レベルのC3b分子を維持することによって補体副経路の調節に変換される。H因子は、C3bに対する結合についてB因子と競合し、すでに形成された代替のC3転換酵素(C3bBb)の解離を促進する。それは、細胞表面に遊離又は結合したC3bのタンパク質分解においてI因子補因子として働き、これは、不活性型C3biをもたらす。従って、補体成分C3bと、又は補体副経路を活性化する因子(細菌表面、感染細胞、酵母、寄生虫、リポ多糖、エンドトキシン)と会合した抗原抗体複合体からなる免疫複合体は、もはやその後の補体カスケード(成分C5〜C9)を活性化することができない。従って、本明細書において、H因子の「生物活性」という用語は、結果として補体カスケード活性化の阻害をもたらす、C3転換酵素を阻害する能力及び/又はI因子補因子として役割を果たす能力を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト血漿H因子の生物活性を保存している。
【００１８】
ヒト血漿H因子の生物活性は、I因子活性の調節、代替のC3転換酵素の形成の阻害及びC3転換酵素の解離の促進を含む。
【００１９】
上記の生物活性を決定するための方法は、当業者に知られている。
【００２０】
より特定の実施形態では、前記組換えタンパク質は、C3転換酵素の解離を促進するためのヒト血漿H因子の生物活性を保存している。解離したC3転換酵素の量は、添加された組換えタンパク質の濃度の関数として決定され得る。IC50は、可変勾配のシグモイドについて算出される方程式から決定される。
【００２１】
別のより特定の実施形態では、前記組換えタンパク質は、I因子活性を制御するための血漿H因子の生物活性を保存している。
【００２２】
更に、H因子の生物活性は、現況技術においてよく知られた手順により、補体によって赤血球を溶解から保護する活性を測定することによって評価され得る。
【００２３】
配列番号1の配列は、402位のアミノ酸がチロシンであるヒトH因子のY402バリアントのアミノ酸配列を表す。この配列は、シグナルペプチドを含まない。配列番号2の配列は、402位のアミノ酸がヒスチジンであるヒトH因子のH402バリアントのアミノ酸配列を表す。この配列は、シグナルペプチドを含まない。一実施形態では、本発明による組換えタンパク質の1つ又は複数のSCRドメインは、これらの2つのバリアントのいずれかから誘導される。特定の実施形態によれば、組換えタンパク質は、H因子のY402バリアントのSCR7を含む。この実施形態のバリアントによれば、組換えタンパク質の第1の配列は、H因子のSCR1からSCR7、SCR1からSCR8又はSCR1からSCR9を含み、この第1の配列中のSCR7は、H因子のY402バリアントのSCR7である。これらのバリアントの実施形態では、他のSCRドメインは、H因子のY402バリアントから又はH因子の別のバリアントから誘導され得る。更に、第1の配列は、特に、H因子のSCR19及びSCR20、SCR18からSCR20、SCR17からSCR20又はSCR16からSCR20を含む第2のアミノ酸配列と組み合わされてもよく、第2のアミノ酸配列は、特に、H因子のY402バリアント又はH402バリアントから誘導される。これらの組換えタンパク質は、SCR7に存在するY402多型を含む。
【００２４】
一実施形態では、本発明による組換えタンパク質は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR19及びSCR20をこの順序で含む。この実施形態では、SCR4及びSCR19は、2個から20個の間のアミノ酸を含む配列からなる非天然(又は合成)リンカーによって一緒に連結される。「非天然(又は合成)リンカー」とは、特に、SCR4の4番目のシステイン及びSCR19の1番目のシステインの間に見出される配列に対応しないリンカーを意味する。特に、リンカーのアミノ酸配列は、クローニング及び/又は発現ベクター中に導入される場合に、固有の制限部位(下記参照)を含む核酸によってコードされるというような方法で選択される。例えば、リンカーは、配列GASG(配列番号3)を有していてもよい。
【００２５】
一実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質の第1又は第2のアミノ酸配列は、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17及びSCR18から選択される1つ又は複数の更なるH因子のSCRドメインを含む。組換えタンパク質中のこれらのドメインの順序は、天然のH因子における同ドメインの順序に対応し得る。代替的に、これらのドメインの順序は、天然のH因子のものとは異なっていてもよい。
【００２６】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR1(アミノ酸21から80)のアミノ酸配列は、配列番号4(CNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR1の配列は、配列番号4の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR1の配列は、配列番号4の配列に表されるものである。
【００２７】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR2(アミノ酸85から141)のアミノ酸配列は、配列番号5(CGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPIC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR2の配列は、配列番号5の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR2の配列は、配列番号5の配列に表されるものである。
【００２８】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR3(アミノ酸146から205)のアミノ酸配列は、配列番号6(CLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR3の配列は、配列番号6の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR3の配列は、配列番号6の配列に表されるものである。
【００２９】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR4(アミノ酸210から262)のアミノ酸配列は、配列番号7(CKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR4の配列は、配列番号7の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR4の配列は、配列番号7の配列に表されるものである。
【００３０】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR5(アミノ酸266から320)のアミノ酸配列は、配列番号8(CDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR5の配列は、配列番号8の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR5の配列は、配列番号8の配列に表されるものである。
【００３１】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR6(アミノ酸325から385)のアミノ酸配列は、配列番号9(CDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR6の配列は、配列番号9の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR6の配列は、配列番号9の配列に表されるものである。
【００３２】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR7(アミノ酸389から442)のアミノ酸配列は、配列番号10(CYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR7の配列は、配列番号10の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR7の配列は、配列番号10の配列に表されるものである。
【００３３】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR8(アミノ酸448から505)のアミノ酸配列は、配列番号11(CSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR8の配列は、配列番号11の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR8の配列は、配列番号11の配列に表されるものである。
【００３４】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR9(アミノ酸509から564)のアミノ酸配列は、配列番号12(CDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPIC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR9の配列は、配列番号12の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR9の配列は、配列番号12の配列に表されるものである。
【００３５】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR10(アミノ酸569から623)のアミノ酸配列は、配列番号13(CELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPIC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR10の配列は、配列番号13の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR10の配列は、配列番号13の配列に表されるものである。
【００３６】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR11(アミノ酸630から674)のアミノ酸配列は、配列番号14(CGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR11の配列は、配列番号14の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR11の配列は、配列番号14の配列に表されるものである。
【００３７】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR12(アミノ酸691から744)のアミノ酸配列は、配列番号15(CGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR12の配列は、配列番号15の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR12の配列は、配列番号15の配列に表されるものである。
【００３８】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR13(アミノ酸753から803)のアミノ酸配列は、配列番号16(CKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR13の配列は、配列番号16の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR13の配列は、配列番号16の配列に表されるものである。
【００３９】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR14(アミノ酸811から864)のアミノ酸配列は、配列番号17(CPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR14の配列は、配列番号17の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR14の配列は、配列番号17の配列に表されるものである。
【００４０】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR15(アミノ酸869から926)のアミノ酸配列は、配列番号18(CSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR15の配列は、配列番号18の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR15の配列は、配列番号18の配列に表されるものである。
【００４１】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR16(アミノ酸931から984)のアミノ酸配列は、配列番号19(CKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR16の配列は、配列番号19の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR16の配列は、配列番号19の配列に表されるものである。
【００４２】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR17(アミノ酸989から1043)のアミノ酸配列は、配列番号20(CLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR17の配列は、配列番号20の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR17の配列は、配列番号20の配列に表されるものである。
【００４３】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR18(アミノ酸1048から1102)のアミノ酸配列は、配列番号21(CVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR18の配列は、配列番号21の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR18の配列は、配列番号21の配列に表されるものである。
【００４４】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR19(アミノ酸1109から1163)のアミノ酸配列は、配列番号22(CGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKC)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR19の配列は、配列番号22の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR18の配列は、配列番号22の配列に表されるものである。
【００４５】
ヒトH因子のY402バリアントのSCR20(アミノ酸1167から1231)のアミノ酸配列は、配列番号23(CVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR)の配列によって表される。本発明によるタンパク質中に導入されるSCR18の配列は、配列番号23の配列と少なくとも85%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、特に少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質中に導入されるSCR20の配列は、配列番号23の配列に表されるものである。
【００４６】
一実施形態では、第1又は第2のアミノ酸配列は、H因子の少なくともSCR12、SCR13及びSCR14を含む。別の実施形態では、SCR12、SCR13及びSCR14のいずれも、本発明による組換えタンパク質中に存在しない。本発明のバリアントの実施形態は、SCRドメインが、この順序で、SCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR12、SCR13、SCR14、SCR19及びSCR20からなる組換えタンパク質に関する。このようなタンパク質は、配列番号142の配列に表される。
【００４７】
第1又は第2のアミノ酸配列に含まれる各SCRドメインは、必要であれば、前記SCRドメイン間に見出される天然リンカーによって隣接の1つ又は複数のSCRと連結され得る。代替的に、組換えタンパク質の各SCRドメイン間のリンカーは、非天然リンカーであってもよい。非天然リンカーは、2個から20個の間のアミノ酸、特に3個から8個の間のアミノ酸を含む配列からなり得る。
【００４８】
更に、第1及び第2のアミノ酸配列間の連結は、第1のアミノ酸配列のC末端位置又は第2のアミノ酸配列のN末端位置に存在する天然又は合成リンカーによって生成され得る。例えば、第1及び第2のポリペプチドは、配列GASG(配列番号3)を有するリンカーによって一緒に連結され得る。更に、第1及び第2のアミノ酸配列は、第1の配列の最後のドメイン(即ち、第1の配列のC末端位置のドメイン)に続く天然リンカー配列を組み合わせているリンカー及びリンカーGASG等の合成リンカーによって一緒に連結され得る。H因子のSCRドメインのそれぞれのC末端位置に見出される天然リンカーは、例えば、SCR1についてのQKRP(配列番号143);SCR2についてのEVVK(配列番号144);SCR3についてのVEIS(配列番号145);SCR4についてのEEKS(配列番号146);SCR5についてのTLKP(配列番号147);SCR6についてのLRK;SCR7についてのIRVKT(配列番号148);SCR8についてのIKS;SCR9についてのYERE(配列番号149);SCR10についてのKEQVQS(配列番号150);SCR11についてのIVEEST(配列番号151);SCR12についてのVAIDKLKK(配列番号152);SCR13についてのSMAQIQL(配列番号153);SCR14についてのVEKIP(配列番号154);SCR15についてのEGLP(配列番号155);SCR16についてのIKTD(配列番号156);SCR17についてのRDTS(配列番号157);SCR18についてのKDSTGK(配列番号158);SCR19についてのLHPである。
【００４９】
一実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3及びSCR4を含む。
【００５０】
一実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4及びSCR5を含む。
【００５１】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5及びSCR6を含む。
【００５２】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6及びSCR7を含む。
【００５３】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7及びSCR8を含む。
【００５４】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8及びSCR9を含む。
【００５５】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9及びSCR10を含む。
【００５６】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10及びSCR11を含む。
【００５７】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10、SCR11及びSCR12を含む。
【００５８】
別の実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、H因子のSCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10、SCR11、SCR12及びSCR13を含む。
【００５９】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR19及びSCR20を含む。
【００６０】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６１】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６２】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６３】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６４】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６５】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６６】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６７】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６８】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００６９】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR9、SCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００７０】
一実施形態によれば、第2のアミノ酸配列は、H因子のSCR8、SCR9、SCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19及びSCR20を含む。
【００７１】
別の実施形態によれば、H因子活性を有する組換えタンパク質は、以下のtable 1(表1)に挙げられている第1及び第2のアミノ酸配列を含み、これらの配列は、リンカー、特に人工のリンカー、特にリンカーGASG(配列番号3)によって分離されている。
【００７２】
【表１Ａ】
2020014468.tif 000002
【００７３】
【表１Ｂ】
2020014468.tif 000003
【００７４】
特定の実施形態によれば、H因子活性を有する組換えタンパク質は、以下のtable 2(表2)に挙げられている第1及び第2のアミノ酸配列を含み、これらの配列は、リンカー、特に人工のリンカー、特にリンカーGASG(配列番号3)によって分離されている。
【００７５】
【表２】
2020014468.tif 000004
【００７６】
本発明の好ましいバリアントによれば、第1の配列はH因子のSCR1からSCR7を含み、第2の配列は
-  H因子のSCR9からSCR20、
-  SCR11からSCR20;及び
-  SCR14からSCR20
からなる群から選択される。
【００７７】
別の好ましいバリアントによれば、第1の配列はSCR1からSCR8を含み、第2の配列はSCR10からSCR20を含む。
【００７８】
別の好ましいバリアントによれば、第1の配列はH因子のSCR1からSCR4を含み、第2の配列はH因子のSCR16からSCR20を含み、H因子のSCR7を含む第3の配列は第1及び第2の配列の間にあり、より詳細には、上記のものなどのリンカーによって後者から分離されている。
【００７９】
一実施形態によれば、第1のアミノ酸配列は、N末端位置にシグナルペプチド(SP)を含む。シグナルペプチドは、H因子の天然シグナルペプチド(MRLLAKIICLMLWAICVA-配列番号24)、H因子とは異なるタンパク質のシグナルペプチド、又は出願PCT/2001/050544に記載されているシグナルペプチド、特に、ペプチドMRWSWIFLLLLSITSANA(配列番号25;又は、以下、SP-MB7とも呼ばれる)であり得る。ヒトH因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドは、免疫グロブリンの、EPOのような増殖因子の、インスリンのようなホルモンの、トリプシノゲンのような酵素の、プロトロンビン等の凝固因子のシグナルペプチドのような、真核生物において、特に哺乳動物において、より詳細にはヒトにおいて分泌される全てのタンパク質のシグナルペプチドから選択されるシグナルペプチドであり得る。シグナルペプチドの存在は、培養培地中の組換えタンパク質の分泌を高める。
【００８０】
一実施形態によれば、本発明は、第1のアミノ酸配列がN末端にこのようなシグナルペプチド、特に、配列番号24の配列を有するH因子の天然ペプチド又は配列番号25の配列を有するシグナルペプチドSP-MB7を含む、table 1(表1)のペプチドのうちの1つに関する。別の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、table 1(表1)のタンパク質のうちの1つから選択され、第1及び第2の配列は、リンカー、特にGASGリンカー(配列番号3)によって分離されている。
【００８１】
特定の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、第1のアミノ酸配列が配列番号25の配列を有するシグナルペプチドを含み、第1及び第2の配列が配列GASG(配列番号3)を有するリンカーによって分離されている、以下のtable 3(表3)に挙げられているタンパク質のうちの1つから選択される。
【００８２】
【表３Ａ】
2020014468.tif 000005
【００８３】
【表３Ｂ】
2020014468.tif 000006
【００８４】
特定の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、H因子のSCR1からSCR4を含む第1の配列、並びに
-  H因子のSCR16からSCR20、
-  SCR15からSCR20;
-  SCR10からSCR20;及び
-  SCR8からSCR20
からなる群から選択される第2の配列を含む。
【００８５】
別の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、H因子のSCR1からSCR7を含む第1の配列、及びH因子のSCR16からSCR20を含む第2の配列を含み、前記第2の配列は、好ましくは、
-  H因子のSCR15からSCR20;
-  SCR14からSCR20;
-  SCR11からSCR20;
-  SCR10からSCR20;
-  SCR9からSCR20;及び
-  SCR8からSCR20
からなる群から選択される。
【００８６】
別のバリアントによれば、本発明は、上記のような組換えタンパク質に関し、第1の配列は、H因子のSCR1からSCR8を含み、かつ第2の配列は、H因子のSCR16からSCR20を含み、前記第2の配列は、好ましくは、H因子のSCR10からSCR20を含む。
【００８７】
別の実施形態によれば、本発明による組換えタンパク質は、H因子のSCR1からSCR4を含む第1の配列及びH因子のSCR16からSCR20を含む第2の配列を含み、H因子のSCR7を含む第3の配列は、第1及び第2の配列の間にある。
【００８８】
本発明のバリアントによれば、第1の配列は、配列番号25の配列を有するシグナルペプチド及びH因子のSCR1からSCR7を含み、第2の配列は、
-  H因子のSCR9からSCR20;
-  SCR11からSCR20;及び
-  SCR14からSCR20
からなる群から選択される。
【００８９】
このバリアントの特定の実施形態では、第1及び第2の配列は、配列GASGを有するリンカーによって分離されている。
【００９０】
別の好ましいバリアントによれば、第1の配列は、配列番号25の配列を有するシグナルペプチド及びSCR1からSCR8を含み、第2の配列は、SCR10からSCR20を含む。このバリアントの特定の実施形態では、第1及び第2の配列は、配列GASGを有するリンカーによって分離されている。
【００９１】
別の好ましいバリアントによれば、第1の配列は、配列番号25の配列を有するシグナルペプチド及びH因子のSCR1からSCR4を含み、第2の配列は、H因子のSCR16からSCR20を含み、H因子のSCR7を含む第3の配列は、第1及び第2の配列の間にあり、上記のものなどのリンカーによって後者から分離されている。このバリアントの特定の実施形態では、第1及び第3の配列、並びに第3及び第2の配列は、配列GASGを有するリンカーによって分離されている。このような配列は、配列番号159に表される。
【００９２】
本発明は、本発明による組換えタンパク質を含む医薬組成物にも関する。
【００９３】
本発明は、一目的として、上記のようなH因子活性を有する組換えタンパク質をコードする核酸コンストラクトも有する。
【００９４】
有利なことには、本発明による組換えタンパク質をコードしている核酸は、コドン最適化の対象であった。
【００９５】
コドン最適化の目的は、天然コドンを、アミノ酸を運ぶトランスファーRNA(tRNA)が当該の細胞型において最も高頻度であるコドンと置き換えることである。頻繁に遭遇するtRNAを動員することは、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳の速度を上昇させ、従って最終滴定濃度を上昇させる大きな利点を有する(Carton JMら、Protein Expr Purif、2007)。配列最適化は、リボソーム複合体による読取りを減速し得るmRNA二次構造の予測にも影響する。配列最適化は、G/C百分率にも影響を有し、これは、mRNAの半減期及び従ってそれらが翻訳される可能性に直接関連する(Chechetkin、J. of Theoretical Biology 242、2006 922〜934)。
【００９６】
コドン最適化は、哺乳動物用の、より詳細にはヒト(Homo sapiens)用のコドン使用表を使用して天然コドンの置換によって行われ得る。合成遺伝子の供給業者(DNA2.0社、GeneArt社、MWG社、Genscript社)によって入手可能にされたアルゴリズムがインターネット上にあり、この配列最適化を行うことを可能にする。
【００９７】
単に例示に基づき、コドン最適化の対象になっている配列は、配列番号85の配列によって表される。この配列は、H因子の天然シグナルペプチドを含む。
【００９８】
本発明による核酸は、本発明による組換えタンパク質の第1及び第2のアミノ酸配列をコードしている2つの核酸配列の間に固有の制限部位を含んでいてもよい。この固有の制限部位は、特に、GASGリンカーをコードしている部分(核酸配列:GCCGCTAGCGCC(配列番号86)に存在するNheI部位に対応してもよく、下線部は上記のアミノ酸ASに対応するNheI部位に対応する。この固有の制限部位は、特に、前記制限部位に対応するタンパク質配列における1つ又は複数の更なるSCRドメインの導入促進によって、又はSCRドメインとは異なるアミノ酸配列の導入によって、産生される組換えタンパク質の改良の予想を可能にする。それは、特に、天然のH因子に属していない別のタンパク質ドメイン、又は異なるサイズ及び配列のリンカー(特に、より長いリンカー)であり得る。
【００９９】
本発明による組換えタンパク質をコードしている核酸は、分子生物学の当業者に知られる任意の方法によって構築され得る。しかし、有利には、前記核酸は、本発明に適切な方法による2つの工程で構築される。例えば、クローニングベクター又は発現ベクター中にクローニングされた核酸のバンクが集成され得る。このバンクの各ベクターは、本発明による組換えタンパク質を構成している第1又は第2のアミノ酸配列のうちの1つをコードしている配列を含む。従って、H因子の少なくともSCR1からSCR4の配列を含む第1のアミノ酸配列をコードしている配列を含むベクター(即ちN-Terベクター)が記載されている。H因子の少なくともSCR19及びSCR20の配列を含む第2のアミノ酸配列をコードしている配列を含むベクター(即ちC-Terベクター)も記載されている。
【０１００】
N-Ter及びC-Terベクターは、単一ベクターにおいて組換えタンパク質の各部分をコードしている核酸断片の切出し及びその後の集成に有用な固有の制限部位を含むように設計される。上記のtable 2(表2)にあるタンパク質の発現を可能にするコンストラクトは、8種のN-Terベクター及び10種のC-Terベクターからこのようにして生成され得る。この戦略は、以下の実施例に記載されている。
【０１０１】
本発明による核酸は、任意の有用な配列、特に、組換えタンパク質の発現若しくは分泌の最適化を可能とする、又は本発明の核酸のクローニング及びサブクローニングを容易にするための任意の配列も含んでいてもよい。例えば、核酸は、固有の制限部位、コード配列及び/又はシグナルペプチドをコードしている配列を5'端に含み得る。3'端に、組換えタンパク質の標識又は精製に有用なアミノ酸モチーフをコードしている配列、例えば、ヒスチジンタグ、及び1つ又は複数の制限部位を導入することは特に有用であり得る。
【０１０２】
一実施形態では、本発明による核酸コンストラクトは、
-  配列番号87の配列によって表され、H因子の天然シグナルペプチドをコードしている核酸、又は
-  配列番号88の配列によって若しくは配列番号88の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列によって表され、H因子シグナルペプチド(最適化された天然SP)をコードしている核酸、又は
-  H因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドをコードしている核酸、又は
-  (出願PCT/FR2011/050544に記載されている)配列番号89の配列によって若しくは配列番号89の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列によってコードされるシグナルペプチドをコードしている核酸
から選択されるシグナルペプチドをコードしている配列を含む。
【０１０３】
配列番号88の配列、又は配列番号88の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列は、配列番号87の配列から開始するコドン最適化によって得られた配列である。
【０１０４】
配列番号89の配列によって又は配列番号89の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列によって表される核酸は、上記の人工シグナルペプチドSP-MB7をコードする。
【０１０５】
一実施形態では、本発明による組換えタンパク質をコードしている核酸コンストラクトは、
-  シグナルペプチドをコードしている核酸、特に、配列番号87の配列によって表され、H因子の天然シグナルペプチドをコードしている核酸、又は配列番号88の配列によって若しくは配列番号88の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列によって表され、H因子シグナルペプチド(最適化された天然SP)をコードしている核酸若しくはH因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドをコードしている核酸、又は(出願PCT/FR2011/050544に記載されている)配列番号89の配列によって若しくは配列番号89の配列と少なくとも85%、特に90%、とりわけ95%の配列同一性を有する配列によってコードされるシグナルペプチドをコードしている核酸;
-  H因子の少なくともSCR1、SCR2、SCR3及びSCR4をコードしている核酸;
-  リンカー、特にGASGリンカー(配列番号3)をコードしている核酸、前記核酸は、固有の制限部位、特にNheI部位を含むリンカーをコードしている;
-  H因子の少なくともSCR19及びSCR20をコードしている核酸
を含む、又はこれらからなる。
【０１０６】
一実施形態によれば、核酸コンストラクトは、配列番号26から配列番号84の配列のうちの1つから選択される組換えタンパク質の発現を可能にする。
【０１０７】
本発明は、前記核酸の発現制御配列に機能的に連結される、上記の核酸コンストラクトを含む発現ベクターにも関する。制御配列は、特に、プロモーター(特に、CMVプロモーター)、エンハンサー、及び真核細胞、特に哺乳動物細胞において組換えタンパク質の発現を可能にするのに有用な、当業者に知られている任意の配列を含み得る。
【０１０８】
そのために、本発明は、本発明による核酸コンストラクト又は発現ベクターによって形質転換された、組換え真核細胞、特に哺乳動物細胞、より詳細には、非ヒト細胞(例えば、CHO)又はヒト細胞に更に関する。本発明の有利な実施形態では、上記のような組換えタンパク質は、PER.C6(登録商標)細胞系又はHEK細胞系、特にHEK 293F細胞系において産生される。
【０１０９】
PER.C6(登録商標)細胞系は、E1A遺伝子及びE1B遺伝子を両方とも含むアデノウイルスDNA断片Ad5がベクターによって細胞内に挿入される、ヒト初代網膜細胞から生じる。このアデノウイルスDNA断片は、p53タンパク質を阻害するE1Bタンパク質を介して、それが挿入される細胞を不死化する。次いで、E1Aタンパク質は、ウイルスプロモーターhCMVに向性を有し、そのトランス活性化、及び後者の3'端で挿入されることになり本発明による組換えタンパク質となり得る遺伝子配列の増強を可能にする。
【０１１０】
本発明は、H因子活性を有する組換えタンパク質、特に、配列番号26から配列番号84の配列を有するタンパク質のうちの1つを調製する方法を実施するためのPER.C6(登録商標)細胞系の使用に特に関する。
【０１１１】
本発明は、本発明による組換えタンパク質、特に、配列番号26から配列番号84の配列のうちの1つによって表される組換えタンパク質のうちの1つを調製する方法を実施するためのHEK 293F細胞系の使用にも特に関する。
【０１１２】
本発明は、H因子活性を有する組換えタンパク質を産生する方法にも関する。本発明、特に、配列番号26から84の配列によって表されるタンパク質のうちの1つによる方法は、前記組換えタンパク質をコードしている本発明による核酸コンストラクトを含むベクターによって形質転換された本発明による組換え細胞を培養する工程を含む。
【０１１３】
このような核酸を含むベクターは、当業者に知られている真核細胞系用のいかなる発現ベクターであってもよい。
【０１１４】
細胞系の形質転換は、エレクトロポレーション、AMAXA型ヌクレオフェクション、「遺伝子銃」を使用して、又は当業者に知られているトランスフェクション剤、例えば、陽イオン性薬剤、リポソーム又はフェクチン若しくはPEI剤等のポリマーを使用して実施され得る。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明による方法は、以下の工程を含む:
(i)トランスフェクト細胞を得るために、組換えタンパク質をコードしている核酸コンストラクトを含む発現ベクターで真核細胞をトランスフェクトする工程、
(ii)培養培地中で組換えタンパク質の発現を得るために、前記トランスフェクト細胞を培養する工程。
【０１１６】
前記発現ベクターは、目的のタンパク質を安定に産生する細胞の樹立中にトランスフェクト細胞の選択を可能にするための抗生物質耐性遺伝子を含み得る。
【０１１７】
一実施形態では、本発明による組換えタンパク質は、バッチ様式での7日間の産生後に、培養液上清のELISAによって検出されるように、10mg/L以上の濃度で産生される。
【０１１８】
組換えタンパク質の精製は、1工程、2工程又は数工程のクロマトグラフィー技術によって実施され得る。1工程の精製は、イオン交換カラム又は親和性カラム(ヘパリン、H因子リガンド又は抗H因子抗体)であり得る。2工程の精製は、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程及びその後の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程、又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程及びその後の陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程、又はイオン交換カラムクロマトグラフィーの工程及びその後の親和性カラムクロマトグラフィーの工程、又は親和性カラムクロマトグラフィーの工程及びその後のイオン交換カラムクロマトグラフィーの工程であり得る。2工程を超えて採用している精製は、これらの多様なクロマトグラフィーの組合せによって行われ得る。ダイアフィルトレーション、限外濾過又はゲル濾過の工程が更に行われてもよい。このような精製後の産物の純度は、99%精製された産物に到達し得る。
【０１１９】
本発明によるタンパク質は、ヤギ、ウサギ、雌ヒツジ、雌ウシ又はブタ等の、非ヒトトランスジェニック動物の乳中にも産生され得る。この場合、トランスジェニック哺乳動物の乳中でのこれらの分泌を可能にする、乳腺によるタンパク質の分泌は、組織依存的な方法で本発明によるタンパク質の発現を制御することを含む。このような制御の方法は、当業者によく知られている。発現は、動物の特定の組織に対してタンパク質の発現を可能にしている配列によって制御される。これらは、特に、WAP、ベータ-カゼイン及びベータ-ラクトグロブリンプロモーター配列並びにシグナルペプチド配列である。トランスジェニック動物の乳から目的のタンパク質を抽出するための方法は、特許EP 0 264 166に記載されている。
【０１２０】
本発明の別の態様は、医薬製品としての本発明による組換えタンパク質の使用にも関する。
【０１２１】
本発明は、望ましくない又は不適切な補体活性に関係している疾患の治療、特に、抑制不能な炎症又は抑制不能なC3b沈着に起因した疾患の治療を目的とした医薬製品の製造のための本発明による組換えタンパク質の使用にも関する。本発明は、このような治療を必要とする患者に本発明による組換えタンパク質を投与する工程を含む、望ましくない又は不適切な補体活性に関係している疾患を治療する方法にも関する。「治療」という用語には、疾患の治癒的治療及び予防的治療の両方が含まれる。治癒的治療は、治癒をもたらす治療、又は疾患の症状若しくはそれによって生じる苦しみを軽減、改善及び/若しくは排除、減少及び/若しくは安定化する治療として定義される。予防的治療には、疾患の予防をもたらす治療、並びに疾患の発生率又はその発生のリスクを低下及び/又は遅延させる治療の両方が含まれる。本発明は、加齢黄斑変性(ARMD)、歯周炎、紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎(MPGN)、乾癬、多発性硬化症、及び腎虚血/再潅流から生じる損傷からなる群から選択される疾患を治療することに特に関する。
【０１２２】
本発明は、以下に提供される図面及び実施例において例示される。これらの図面及び実施例は、いかなる形であっても本発明の範囲を制限することが意図されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明による組換えタンパク質のN末端断片を構築するための戦略を表しているダイアグラムである。
【図２】本発明による組換えタンパク質のC末端断片を構築するための戦略を表しているダイアグラムである。
【図３Ａ】最大産生能を有するH因子断片についてのC3転換酵素の解離の促進の活性を示しているグラフである。
【図３Ｂ】最大産生能を有するH因子断片についてのC3転換酵素の解離の促進の活性を示しているグラフである。
【図３Ｃ】最大産生能を有するH因子断片についてのC3転換酵素の解離の促進の活性を示しているグラフである。
【実施例】
【０１２４】
(実施例1)
pCEP4プラスミドにおけるH因子のN-ter及びC-ter断片の構築
目的は、最適化されたバージョンのH因子のY402バリアントのN末端及びC末端断片をpCEP4発現ベクター中に多様な形態でサブクローニングすることである。両方の断片は、5'端においてNotI部位、コザック配列及びシグナルペプチドで、3'端においてHisタグ及びそれに続くBamHI部位で補われることになり、相違は、N-ter断片では3'端に、C-ter断片では5'端に位置するNheI部位である。説明のためのダイアグラムは、以下に提供されるプロトコールに記載されることになる。
【０１２５】
I/pCEP4-N-terベクターの構築
1/N-ter断片の構築
N-ter断片は、PCRによってpCDNA2001neo-MD3Yベクターから構築される。このベクターは、配列番号90の配列によって表される核酸を含むpCDNA2001neoベクターに対応し、これは、人工シグナルペプチドSP-MB7を含むH因子のY402バリアントをコードしている最適化された配列である。この構築戦略は、図1に表されている。
【０１２６】
以下のプライマーが使用される:
センスプライマー:
P1-NT-FCTH 5'-CTCTAGCGGCCGCGCGCCACC-3'(配列番号91)
(この配列のヌクレオチド6から13は、NotI制限部位を定義する)
アンチセンスプライマー(又はP2-NT-Xプライマー):
これらのプライマーのそれぞれは、BamHI部位、2つの停止コドン、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー(GS)、NheI部位、及びH因子に特異的な配列を、5'から3'へとこの順序で含む。これらのエレメントは、図1に表されている。
P2-NT-4(配列番号92)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGATTTTTCCTCGCAGGAAGGCAG      75bp
P2-NT-7(配列番号93)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGTTTTCACGCGGATGCACCTTG      74bp
P2-NT-8(配列番号94)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGACTTGATGCAGGTAGGCTGG      73bp
P2-NT-9(配列番号95)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTCCCGCTCATAGCAGATGGGCAG      75bp
P2-NT-10(配列番号96)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGCTCTGCACCTGCTCCTTGCAAATAG      77bp
P2-NT-11(配列番号97)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGGTGGATTCCTCGACGATGCAC      73bp
P2-NT-12(配列番号98)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTTCTTCAGTTTGTCAATGGCGAC      75bp
P2-NT-13(配列番号99)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCCAGCTGGATCTGTGCCATAGAGCAG      76bp
【０１２７】
このP2-NT-X(X、変数)プライマー系列は、アセンブリPCRによって得られる。
【０１２８】
・  以下のP2NTプライマー及びP2-X(X、変数)プライマーの間のアセンブリPCR:
これは、以下のプライマーによって行われる:
1-P2NT(配列番号100)
CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGC
2-P2-4(配列番号101)
CTGCCTTCCTGCGAGGAAAAATCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-7(配列番号102)
CAAGGTGCATCCGCGTGAAAACTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-8(配列番号103)
CCAGCCTACCTGCATCAAGTCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-9(配列番号104)
CTGCCCATCTGCTATGAGCGGGAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-10(配列番号105)
TATTTGCAAGGAGCAGGTGCAGAGCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-11(配列番号106)
GTGCATCGTCGAGGAATCCACCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-12(配列番号107)
GTCGCCATTGACAAACTGAAGAAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-13(配列番号108)
CTGCTCTATGGCACAGATCCAGCTGGGCGCTAGCGGCAGCCAC
【０１２９】
目的の断片の増幅:
【０１３０】
【表４】
2020014468.tif 000007
【０１３１】
2/ベクターの構築
・  インサートのNotI/BamHI消化:
【０１３２】
【表５】
2020014468.tif 000008
【０１３３】
・  pCEP4ベクターのNotI/BamHI消化:
→24及び10162bpの2つの断片が得られる
NucleoSpin Extract II(Clontech社)
【０１３４】
・  ライゲーション及びTOP10細菌内への形質転換
・  PCRスクリーニング:CMV1/MD2-1Rev→594bpのアンプリコンが得られる
CMV1プライマー-配列番号109:5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3'
MD2-1rev-配列番号110:5'-tgtcacactcgcggtagttg-3'
【０１３５】
3/シークエンシング
CMV1及びSV40-3'UTRプライマーは、全てのベクターのシークエンシングのために使用される。ベクターpCEP4-1NTer11、pCEP4-1NTer12及びpCEP4-1NTer13だけが、MD2-3プライマーでの更なるシークエンシングを有する。
SV40-3'UTRプライマー-配列番号111:5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTGGT-3'
【０１３６】
II/pCEP4-C-terベクターの構築
1/C-ter断片のコンストラクト
C-ter断片は、PCRによってpCDNA2001neo-MD3Yベクターから構築される。このベクターは、配列番号90の配列によって表される核酸を含むpCDNA2001neoベクターに対応する。この構築戦略は、図2に表されている。
【０１３７】
以下のプライマーが使用される:
センスプライマー(又はP1-CT-Xプライマー):
これらのプライマーのそれぞれは、NotI部位、コザック配列(KS)、シグナルペプチド(SP)、NheI部位、及びH因子に特異的な配列を、5'から3'へとこの順序で含む。これらのエレメントは、図2に表されている。
P1-CT-19(配列番号112)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCCCCTCCACCCATC
P1-CT-16(配列番号113)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAAGAGTCCTCCAGAGATTTCACA
P1-CT-15(配列番号114)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAGCCAGCCCCCTCAGATC
P1-CT-14(配列番号115)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCCCACCACCTCCACAGATTC
P1-CT-13(配列番号116)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCAAGTCCTCTAATCTGATCATTC
P1-CT-12(配列番号117)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGCGATATTCCAGAACTGG
P1-CT-11(配列番号118)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCACCTCCAGAACTGC
P1-CT-10(配列番号119)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGAGCTGCCAAAAATTGATG
P1-CT-9(配列番号120)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGACATTCCAGTGTTTATGAACG
P1-CT-8(配列番号121)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTTCTAAGAGCAGCATCGACATTG
アンチセンスプライマー(P2-CT-FCTH)
このプライマーは、5'から3'方向に、BamHI部位、2つの停止コドン、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー(GGSG)、及びH因子の特異的な配列を含む。
P2-CT-FCTH(配列番号122)
GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCGCCTCTCTTAGCACAAGTAGGGTATTCCAG      74bp
【０１３８】
P1-CT-X(X、変数)プライマー系列及びP2-CT-FCTHプライマーは、アセンブリPCRによって得られる。
【０１３９】
・  以下のプライマーを得るためのアセンブリPCR:
P2-CT-FCTHプライマーを得るために使用されるプライマー
1-P2-CT-FCTH-for(配列番号123)
GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCG
2-P2-CT-FCTH-rev(配列番号124)
CTGGAATACCCTACTTGTGCTAAGAGAGGCGGAAGCGGCCACCAC
P1-CT-Xプライマーを得るために使用されるプライマー
PCR1:
1-P1-CT-FCTH1(配列番号125)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTG
1-P1-CT-FCTH2(配列番号126)
CGTTAGCAGAAGTGATAGACAGCAGCAGCAGAAAAATCCAAGACCATCGCATG
断片PCR1:P1-CT-FCTH-PCR1(配列番号127)
CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTCTATCACTTCTGCTAACG      73bp
【０１４０】
【表６】
2020014468.tif 000009
【０１４１】
PCR2:
2-P1-CT-19(配列番号128)
GATGGGTGGAGGGGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-16(配列番号129)
TGTGAAATCTCTGGAGGACTCTTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-15(配列番号130)
GATCTGAGGGGGCTGGCTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-14(配列番号131)
GAATCTGTGGAGGTGGTGGGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-13(配列番号132)
GAATGATCAGATTAGAGGACTTGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-12(配列番号133)
CCAGTTCTGGAATATCGCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-11(配列番号134)
GCAGTTCTGGAGGTGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-10(配列番号135)
CATCAATTTTTGGCAGCTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-9(配列番号136)
CGTTCATAAACACTGGAATGTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-8(配列番号137)
CAATGTCGATGCTGCTCTTAGAACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
【０１４２】
【表７】
2020014468.tif 000010
【０１４３】
・  目的の断片の増幅:
【０１４４】
【表８】
2020014468.tif 000011
【０１４５】
2/ベクターの構築
・  インサートのNotI/BamHI消化:
【０１４６】
【表９】
2020014468.tif 000012
【０１４７】
・  pCEP4ベクターのNotI/BamHI消化:
→24及び10162bpの2つの断片が得られる
NucleoSpin Extract II
【０１４８】
・  ライゲーション及びTOP10細菌の形質転換
・PCRスクリーニング:CMV1/P2-MB7→259bpのアンプリコンが得られる
Seq P2-MB7-配列番号138:5'-TGGTGATGCTCAGCAGCAGCAGGAAGATCCAGCTCCATCG-3'
【０１４９】
3/シークエンシング
CMV1及びSV40-3'UTRプライマーは、全てのベクターのシークエンシングのために使用される。pCEP4-9Cter20及びpCEP4-8Cter20ベクターだけが、MD2-5プライマーでの補助的なシークエンシングを有することになる。
Seq MD2-5-配列番号139:5'-GGATTCACACCGTGTGCATTAATG-3'
【０１５０】
(実施例2)
N-ter及びC-terドメインを組み合わせているH因子ベクターの構築
8種のpCEP4-1NTXベクター及び10種のpCEP4-XCT20ベクターから、本発明者らは、分子の中央の部分に可変の数のSCRドメインが付加される、少なくともSCR1〜4のN末端ドメイン及びSCR19〜20のC末端ドメインを義務的に含む、N-ter及びC-ter断片を組み合わせた59種のベクターを構築する。
【０１５１】
最初に、本発明者らは、pCEP4プラスミド中に存在する1NTX断片を(NotI/BamHI消化によって)pCDNA2001neoベクター中に導入する。
【０１５２】
次に、本発明者らは、XCT20断片を(NheI/BamHI消化によって)pCDNA2001neo-1NTXベクター中に導入する。
【０１５３】
本発明者らは、このようにして、FH断片の59種の1NTX-XCT20の組合せに対応する59種のプラスミドコンストラクトを得る。これらの配列は、PER.C6細胞系においてこれらの分子の安定な発現を可能にする、pCDNA2001neoベクター中に存在する。スクリーニング及び産生の作業を容易にするために、59種のFH 1NTX-XCT20断片がNotI/BamHI消化によってpCDNA2001neoベクターから抽出されて、HEK293F細胞における一過的発現を可能にする、pCEP4ベクター中にクローニングされる。
【０１５４】
I/pCEP4-N-terベクターからのpCDNA2001neo-N-Terベクターの構築:
・  NotI/BamHIによるpCEP4-1NT Xベクターの消化:
目的の断片のゲル精製及びその後のNucleoSpin Extract II。
・  NotI/BamHIによるpCDNA2001neoベクターの消化。
NucleoSpin Extract II。
・  ライゲーション及びTOP10形質転換。
・  PCRスクリーニング:CMV1/MD2-1REV:706bpの断片が得られる。
・  NotI/BamHI消化対照:インサートの存在の確認。
【０１５５】
II/PER.C6細胞系における産生のためのpCDNA2001neo-1NTX/XCT20ベクターの構築:
【０１５６】
【表１０】
2020014468.tif 000013
【０１５７】
・  NheI/BamHIによるpCEP4-XCT20ベクターの消化:
-  pCEP4-19CT20     414bp
-  pCEP4-16CT20     948bp
-  pCEP4-15CT20     1131bp
-  pCEP4-14CT20     1308bp
-  pCEP4-13CT20     1482bp
-  pCEP4-12CT20     1668bp
-  pCEP4-11CT20     1851bp
-  pCEP4-10CT20     2034bp
-  pCEP4-9CT20      2214bp
-  pCEP4-8CT20      2397bp
【０１５８】
目的の断片のゲル精製及びその後のNucleoSpin Extract II。
・  NheI/BamHIによるpCDNA2001neoベクター-1NTXの消化。
NucleoSpin Extract II。
・  ライゲーション及びTOP10形質転換。
・  PCRスクリーニング:MD2-6/2BGHPA:373bpの断片が得られる。
NotI/BamHI及びNheI/BamHI消化対照。
Seq MD2-6-配列番号140:5'-AGGGAAACAAGCGCATCACCT-3'
Seq 2BGHPA-配列番号141:5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3'
【０１５９】
1NTX/XCT20断片は、次いで、NotI/BamHI消化によって抽出され、pCEP4ベクター中に再導入される。
【０１６０】
III/HEK 293 Freestyle細胞系における産生のためのpCEP4-1NTX/XCT20ベクターの構築:
・  NotI/BamHIによるpCEP4ベクターの消化(10162及び24bp)
NucleoSpin Extract II。
・  NotI/BamHIによるpCDNA2001neo-1NTX/XCT20ベクターの消化(断片サイズは、以下の表中にある。)
ゲル精製
NucleoSpin Extract II。
【０１６１】
【表１１Ａ】
2020014468.tif 000014
【０１６２】
【表１１Ｂ】
2020014468.tif 000015
【０１６３】
・  ライゲーション及びTOP10形質転換。
・  PCRスクリーニング:CMV1/MD2-1REV:594bpの断片が得られる。
・  CMV1及びSV40-3'UTRによるジャンクションシークエンシング。
【０１６４】
(実施例3)
バッチ様式での7日間の産生後のHEK 293F細胞の上清中に存在するFH断片の濃度及び分子量の決定
3.1:  組換えFH断片の一過的産生のためのHEK 293F細胞内への一過的トランスフェクション。
1-  一過的トランスフェクション:
一過的トランスフェクションの前日に、HEK 293F細胞を、7E5vc/mlの細胞濃度で継代培養する。HEK293F細胞の細胞密度及び生存率を、トランスフェクションの当日に測定する。30E6cv/mlに対応する量の培養物を遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを28mlのF17培養培地(Invitrogen社)中で取り出し、250mlエルレンマイヤーフラスコに移して37℃でインキュベートする。
【０１６５】
2-  トランスフェクション剤/DNA複合体の2:1の比での形成:
トランスフェクション剤、及びFH断片配列のうちの1種を含むpCEP4ベクターに対応するDNAを、OptiMEM培地(Invitrogen社)中で以下のように調製する:
-  1mlのOptiMEM中の30μgのDNAの添加
-  1mlのOptiMEM中の60μlのFectin又は60μlのPEIの添加
これらの2種の調製物を別々に室温で5分間インキュベートし、次いで、トランスフェクション剤を含む溶液を、DNAを含む溶液に穏やかに添加する。この混合物を、事前に調製した28mlのHEK 293F細胞に添加する前に室温で25分間インキュベートする。次いで、これらの細胞を、125rpmで振盪しながら37℃でインキュベートする。
【０１６６】
3-  H因子の一過的産生:
これらの細胞を、培養物中で7日間、培養培地を添加せず、新しくすることもなく維持する。7日目に、細胞を3000gで15分間遠心分離する。細胞ペレットを捨て、組換えFH断片を含む細胞上清を、0.22μmフィルターに通して濾過し、次いで、-20℃で凍結させる。
【０１６７】
3.2:ELISAによる、培養培地中でのヒトFH断片のアッセイ
コーティング抗体:ヒツジ抗ヒトH因子免疫グロブリン(The Binding Site社)を、3.5から5.5μg/mlの濃度を得るために、pH7.4のPBSバッファー中に新たに希釈する。
飽和バッファー:PBS - 1% BSA(w/v)
洗浄バッファー:PBS - 0.1% Tween-20(v/v)
希釈バッファー:PBS - 0.1% Tween-20(v/v) - 0.1% BSA(w/v)
標準溶液:ヒトH因子キャリブレーターNL(The Binding Site社)
試料:範囲の第1ポイントのものに近い濃度を得るために、試料を予め希釈する。次いで、1/2で1/2に希釈する。
抗H因子モノクローナル抗体:精製されたマウスモノクローナル抗ヒトH因子免疫グロブリン(SEROTEC社)
検出抗体:ペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG免疫グロブリン(Jackson Immuno Research Laboratories社)。
検出溶液:TMBキット(Pierce社)
停止溶液:4N又は2Mの硫酸(Fisher Scientific社)。
【０１６８】
手順
固相の感作:
マイクロタイタープレート中で、100μlの希釈されたコーティング抗体をウェル毎に分配する。次いで、このプレートを、接着性フィルムで覆い、+4℃で一晩インキュベートする。次いで、プレートを、逆さにすることによって空にする。
【０１６９】
固相の飽和:
120μlの飽和溶液をウェル毎に分配する。次いで、このプレートを、接着性フィルムで覆い、20℃で1時間インキュベートする。次いで、洗浄バッファーで洗浄を3回行う。
【０１７０】
抗原捕捉:
標準及び試料の各希釈物の、100μlの希釈バッファー(ブランク)をウェル毎に分配する。次いで、このプレートを、接着性フィルムで覆い、20℃で1時間30分間インキュベートする。次いで、洗浄バッファーで洗浄を5回行う。
【０１７１】
モノクローナル抗体による抗原の認識:
100μlのモノクローナル抗体を各ウェル中に分配する。このプレートを、接着性フィルムで覆い、次いで、20℃で1時間30分間インキュベートする。次いで、洗浄バッファーで洗浄を5回行う。
【０１７２】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートでの標識:
100μlの検出抗体を分配し、プレートを、接着性フィルムで覆い、次いで、20℃で1時間インキュベートする。ウェルを洗浄バッファーで5回洗浄する。
【０１７３】
酵素反応:
基質を含む、1ウェル当たり100μlのTMBを、規則的な時間間隔で分配し、いかなる強い光からも離す。次いで、室温で5から15分間インキュベーションを行う。この時間は、全てのアッセイポイントについて同一でなければならない。
【０１７４】
反応の停止:
1ウェル当たり100μlの4NのH2SO4を、規則的な時間間隔で分配する。
【０１７５】
結果は、以下の表で報告される。
【０１７６】
【表１２Ａ】
2020014468.tif 000016
【０１７７】
【表１２Ｂ】
2020014468.tif 000017
【０１７８】
(実施例4)
培養液上清中に存在する組換えFH断片のSDS-PAGEによる特徴付け(図6A、図6B及び図7)。
ELISAによって決定される組換えFH断片の濃度の値に基づき、1μgの組換えH因子に対応する量を2×Laemmliバッファー中で1/2に希釈して、95℃で5分間加熱し、次いで、10%のポリアクリルアミド直鎖状ゲル上に沈着させる。移動後、ゲル中に含まれるタンパク質をクマシーブルーで染色する。
【０１７９】
ポリアクリルアミドゲルの分析により、組換えFH断片が、予想される見かけ上の分子量に従って移動することが示される。
【０１８０】
(実施例5)
培養液上清中に存在し、最大産生能を有する組換えFH断片のC3転換酵素の解離の促進の活性の決定:
ELISAによって決定される組換えH因子の濃度に基づき、組換えFH断片を、20μg/mlの最終濃度に希釈する。このチューブから、一範囲は、以下の連続希釈によって調製される:1/2;1/10;1/4;1/4;1/4;1/4;1/40。濃度を漸減させたこの範囲のFH断片を96ウェルプレートのウェル中で形成されたC3転換酵素複合体に添加し、これを、次いで、+34℃で32から34分間インキュベートする。数回の洗浄後に、ウェルの底に固定化されたC3分子と依然として複合体形成しているB因子を、次いで、ELISA型の免疫酵素的反応によってアッセイする。添加されたFH断片の濃度の関数として得られた吸光度値は、次いで、各試料のIC50値を決定するために、非線形モデリング系(可変勾配のシグモイド)で処理される。このモデルを算出するための方程式は、以下の通りである:
Y:Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)*ヒル勾配)
Xは、濃度(μg/ml)の対数である。
Yは、応答(OD)である。
Yは、ベースライン(Bottom)で出発してシグモイド形で最上部(Top)に行く。ヒル勾配は、勾配である。
【０１８１】
細胞上清中で決定される活性は、最大産生能を有する断片について、図3A、図3B及び図3Cに示されている。
【０１８２】
(実施例6)
精製された組換えFH断片のC3転換酵素の解離の促進の活性の決定
FH断片を、タンパク質のC末端に付加されたヘキサヒスチジンタグによって精製した。ポリヒスチジンに対して強力な親和性及び特異性を有するレジンを含むHisTALONカラム(Clontech社)を使用して1工程の親和性クロマトグラフィーで精製を行った。精製は、供給業者の推奨(HisTALON Gravity Column Purification Kit User Manual)に従って行われた。
【０１８３】
精製後、試料を、PBSに対して透析し、4℃で保存する。
【０１８４】
精製された組換えFH断片の濃度は、280nmでODを測定することによって決定される。精製された組換えFH断片は、150nMの最終濃度まで希釈され、次いで、このチューブから、一範囲は、以下の連続希釈によって調製される:1/2;1/10;1/4;1/4;1/4;1/4;1/40。濃度を漸減させたこの範囲のFH断片を96ウェルプレートのウェル中で形成されたC3転換酵素複合体に添加し、これを、次いで、+34℃で32から34分間インキュベートする。数回の洗浄後に、ウェルの底に固定化されたC3分子と依然として複合体形成しているB因子を、次いで、反応基質として3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)又はオルト-フェニレンジアミン(OPD)を使用して、ELISA型の免疫酵素的反応によってアッセイする。添加されたFH断片の濃度の関数として得られた吸光度値は、次いで、各試料のIC50値を決定するために、非線形モデリング系(可変勾配のシグモイド)で処理される。このモデルを算出するための方程式は、以下の通りである:
Y:Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)*ヒル勾配)
Xは、濃度(μg/ml)の対数である。
Yは、応答(OD)である。
Yは、ベースライン(Bottom)で出発してシグモイド形で最上部(Top)に行く。ヒル勾配は、勾配である。
【０１８５】
得られたIC50値は、以下の表に示されている。
【０１８６】
【表１３Ａ】
2020014468.tif 000018
【０１８７】
【表１３Ｂ】
2020014468.tif 000019
【０１８８】
PER.C6又はHEK細胞において産生され、精製された組換えH因子全体の活性を、活性対照として使用した。PER.C6細胞において産生されたH因子全体のC3活性は、HEK細胞において産生されたH因子全体のものと同等である。
【０１８９】
(実施例7)
改変されたSanchez-Corral試験を使用した、ヒツジ赤血球の溶解の保護の活性の決定。
この試験は、機能的なH因子が枯渇又は欠乏した血清によって誘導される溶解からヒツジ赤血球を保護するその能力を評価することによって、治療用バッチの発現中に精製された組換えヒトH因子のC末端部分の機能活性を測定することを可能にする。この試験は、溶血性尿毒症症候群を有する患者の血漿中に存在するH因子の抗溶血活性を測定するための「Sanchez-Corral」法から適合させたものである(P. Sanchez-Corral、C. Gonzalez-Rubio、S. Rodriguez de Cordoba及びM. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41 (2004) 81〜84)。
【０１９０】
この場面において、特異的な溶解の状態を生じさせるために、H因子が枯渇した血清及びヒト血漿プールの混合物を等しい割合で調製する。精製された組換えヒトH因子の添加は、補体によって誘導される溶解に対してのヒツジ赤血球の保護(細胞溶解のないこと)をもたらす。
【０１９１】
この試験は、本発明によるH因子断片の赤血球の溶解の保護の活性を決定するためにここで使用された。
【０１９２】
溶解百分率の決定:
40μlのヒツジ赤血球の懸濁液(1×108赤血球/ml)に、20μlの反応バッファー(10mM HEPES、144mM NaCl、7mM MgCl2、10mM EGTA、pH7.2)、0から44.74pMの濃度に対応する変動量のFH断片又はFH全体(0〜30μl)、次いで、9μlのヒト血漿プール、その後、FHが枯渇した9μlのヒト血漿を連続的に添加する。110μlの最終量を得るために、反応量をPBSで補う。37℃で30分間のインキュベーション後、400μlの冷却したHBS-EDTAバッファー(10mM HEPES、144mM NaCl、2mM EDTA、pH7.2)を使用して反応を停止させる。1730gで5分間の遠心分離後、414nmで吸光度を測定するために、200μlの上清を取り出してマイクロタイタープレート中に沈着させる。
【０１９３】
溶解百分率は、以下の式によって決定される:
【０１９４】
【数１】
2020014468.tif 000020
【０１９５】
「100%溶解」対照は、水の存在下で認められたヒツジ赤血球の最大溶解に対応する。
【０１９６】
ブランク対照は、反応バッファー+50mM EDTAを含み、ヒツジ赤血球の自然溶解に対応する。
【０１９７】
CFHなしで、赤血球の自然溶解は約30%である。
【０１９８】
以下の表において、分析は、100%血漿H因子(FH LP03 0pm)に対して得られた値を正規化することによって行われる。得られた負の値は、0%の値に正規化される。
【０１９９】
【表１４Ａ】
2020014468.tif 000021
【０２００】
【表１４Ｂ】
2020014468.tif 000022
【０２０１】
試験結果は、rFH PER.C6(14-HFACEX-1446-042)及びrFH HEK(12-HFACEX-1446-072)試料で同様であり、血漿FH(対照LP03):最大H因子濃度における溶血反応の完全保護での用量-効果と一致する。
【０２０２】
本発明による多様なH因子断片は、試験される最低濃度から、rFH全体よりも優れた特異的な溶解の阻害を有し、非常に有効であることが示される。2つの断片、1NT9-16CT20及び1NT7-16CT20では、極めて興味深い様式で、血漿H因子LP03により近いプロファイルが認められる。
【図１】
2020014468.tif 000023
【図２】
2020014468.tif 000024
【図３Ａ】
2020014468.tif 000025
【図３Ｂ】
2020014468.tif 000026
【図３Ｃ】
2020014468.tif 000027
【配列表】
2020014468000001.app
【外国語明細書】
2020014468000001.pdf