(57)【要約】【課題】嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を治療または予防するための方法の提供。【解決手段】この方法は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象を選択する段階、ならびにセラミドを減少させるため、および上記病原体の感染を治療または予防するために有効な条件下で、上記選択された対象にセラミダーゼを投与する段階を包含する。この方法は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創の患者において、感染を減少させるか、セラミドを減少させるか、または肺機能を改善するために、他の薬物と組み合わせたセラミダーゼの使用もまた包含する。【選択図】図３
2020050668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を治療または予防するための方法であって、
嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象を選択する段階、ならびに
前記選択された対象においてセラミドを減少させ、かつ前記病原体の感染を治療または予防するための有効な条件下で、前記選択された対象にセラミダーゼを投与する段階
を包含する、方法。
【請求項２】
前記対象が、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有しない対象の参照レベルと比較して、上昇したセラミドレベルに基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択する段階が、肺上皮、鼻上皮、粘液、および／または開放創部位から単離された細胞におけるセラミドレベルに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与する段階が、前記対象の呼吸器上皮、粘液、または開放創部位の細胞におけるセラミドレベルを正常化するために有効な条件下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記セラミダーゼが酸性セラミダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
セラミドレベルを減少させる１種以上のさらなる剤が、前記セラミダーゼと組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１種以上のさらなる剤が、１種以上のさらなるセラミド減少剤、１種以上の酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤、感染を減少させるための１種以上の剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１種以上のさらなる剤が、感染を減少させるための１種以上の剤であり、かつ抗生物質、肺上皮への病原体の結合をブロックする試薬、粘液の粘度を減少させるための試薬、失われたタンパク質機能を増強するためのシャペロン試薬、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記セラミダーゼが、前記１種以上のさらなる剤と同時に、別々に、または逐次的に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与する段階が、経口、局所的、鼻内、腹腔内、静脈内、皮下、またはエアロゾル吸入による、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与する段階がエアロゾル吸入による、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記セラミダーゼが０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記病原体の感染が、ウイルス性、真菌性、プリオン性、または細菌性の感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記病原体の感染がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記シュードモナス感染が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記セラミダーゼが感染の発症の前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記セラミダーゼが感染の発症の後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択された対象が嚢胞性線維症を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択された対象がＣＯＰＤを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択された対象が開放創を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が参照により組み込まれる、２０１２年６月１日に出願された米国仮特許出願第６１／６５４，５１９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を予防および／または治療するためにセラミドレベルを正常化することに関する。
【背景技術】
【０００３】
嚢胞性線維症（「ＣＦ」）は、ヨーロッパおよび米国において最も一般的な常染色体劣性障害であり、西欧諸国において生まれた子供２５００人あたり１人に影響がある。これは、ＣＦ膜コンダクタンス制御タンパク質（「ＣＦＴＲ」）の変異によって引き起こされる疾患である。この遺伝子変異はいくつかの呼吸器、生殖器、および胃腸の合併症をもたらし、これらの対象における罹患率および死亡率の第１の原因は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））による慢性肺定着の破壊的な影響から生じる。医療記録は、ＣＦの患者の約８０％が２５歳までに緑膿菌に感染することを示す。Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ：Ａｎｎｕａｌ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔ（２０１０）（非特許文献１）を参照のこと。緑膿菌への感受性の増加に加えて、ＣＦ肺は、慢性炎症および進行性線維症によって特徴付けられる。現在のところ、ＣＦ疾患の特質、すなわち、感染感受性、炎症、および線維症を媒介する分子メカニズムの解釈が必要とされている。
【０００４】
上皮細胞の緑膿菌感染は、細胞表面との病原体の接触によって開始される。ＣＦＴＲ、フィブロネクチン、α５β１−インテグリン、およびアシアロ−ＧＭ１を含む糖脂質を含む、緑膿菌についてのいくつかの結合分子が同定されてきた。Ｐｉｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔ  ＣＦＴＲ  Ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｔｏ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１，６４−６７（１９９６）（非特許文献２）；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "ＣＦＴＲ  Ｉｓ  Ａ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＬＰＳ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｏ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ，"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，ｐｐ．６９０７−６９１２（２００２）（非特許文献３）；ｄｅＢｅｎｔｚｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１  Ｉｓ  Ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４（５）ｐｐ．１５８２−１５８８（１９９６）（非特許文献４）；ｄｅＢｅｎｔｚｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９  ｐｐ．２１４５−２１５０（１９９６）（非特許文献５）；Ｒｏｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ａｎｄ  α５β１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｔｏ  Ｒｅｐａｉｒｉｎｇ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１３  ｐｐ．１３０１−１３０９（１９９９）（非特許文献６）；Ｓａｉｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｐｉｌｉ  Ｂｉｎｄ  Ｔｏ  ＡｓｉａｌｏＧＭ１  Ｗｈｉｃｈ  Ｉｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２  ｐｐ．１８７５−１８８０（１９９３）（非特許文献７）；およびＤａｖｉｅｓ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｔｏ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−ＡｓｉａｌｏＧＭ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ；１３  ｐｐ．５６５−５７０（１９９９）（非特許文献８）を参照のこと。
【０００５】
従って、ＣＦにおいて特異的に変化しており、緑膿菌に対するこれらの対象の高い感染感受性に関与している緑膿菌の上皮受容体の同定は、ＣＦ、および同時に起こる病原体の感染の予防および治療のための新たなストラテジーの開発における重要な考慮すべき事項である。このような分子は、ＣＦ対象における、気管支上皮細胞との病原体の最初の接触を妨害するため、従って、感染を非常な初期に妨害するために、理想的な標的であるだろう。
【０００６】
疾患または状態に罹患した対象における疾患の病因を治療および予防する現在の方法には、毒性および有効性の懸念が生じている。
【０００７】
本発明は、例えば、気管支上皮細胞への細菌病原体の主要な結合分子の異常な発現を、独特な膜脂質媒介メカニズムを通してインビボで修正することによって、当該分野におけるこれらの欠陥を克服することに向けられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ：Ａｎｎｕａｌ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔ（２０１０）
【非特許文献２】Ｐｉｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔ  ＣＦＴＲ  Ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｔｏ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１，６４−６７（１９９６）
【非特許文献３】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "ＣＦＴＲ  Ｉｓ  Ａ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＬＰＳ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｏ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ，"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，ｐｐ．６９０７−６９１２（２００２）
【非特許文献４】ｄｅＢｅｎｔｚｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１  Ｉｓ  Ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４（５）ｐｐ．１５８２−１５８８（１９９６）
【非特許文献５】ｄｅＢｅｎｔｚｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９  ｐｐ．２１４５−２１５０（１９９６）
【非特許文献６】Ｒｏｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ａｎｄ  α５β１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｔｏ  Ｒｅｐａｉｒｉｎｇ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１３  ｐｐ．１３０１−１３０９（１９９９）
【非特許文献７】Ｓａｉｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｐｉｌｉ  Ｂｉｎｄ  Ｔｏ  ＡｓｉａｌｏＧＭ１  Ｗｈｉｃｈ  Ｉｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２  ｐｐ．１８７５−１８８０（１９９３）
【非特許文献８】Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｔｏ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−ＡｓｉａｌｏＧＭ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，"  Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ；１３  ｐｐ．５６５−５７０（１９９９）
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１つの態様は、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を治療または予防するための方法に向けられる。この方法は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象を選択する段階、ならびに上記選択された対象においてセラミドを減少させるため、および上記病原体の感染を治療または予防するための有効な条件下で、上記選択された対象にセラミダーゼを投与する段階を包含する。
【００１０】
本発明の別の態様は、セラミドを減少させるため、または感染を減少させるために、他の剤と組み合わせて、セラミダーゼを対象に投与することに関する。このような剤は、抗生物質、粘液の粘度を減少させるための試薬、嚢胞性線維症膜貫通タンパク質（ＣＦＴＲ）の機能を増強するためのシャペロン剤、または酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤が含まれてもよいがこれらに限定されない。
【００１１】
本発明の別の態様は、対象の細胞、組織、もしくは体液におけるセラミドのレベル、および／または内因性のセラミダーゼ酵素のレベルに基づいて上記対象を選択することに関する。
[本発明1001]
嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を治療または予防するための方法であって、
嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象を選択する段階、ならびに
前記選択された対象においてセラミドを減少させ、かつ前記病原体の感染を治療または予防するための有効な条件下で、前記選択された対象にセラミダーゼを投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1002]
前記対象が、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有しない対象の参照レベルと比較して、上昇したセラミドレベルに基づいて選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記選択する段階が、肺上皮、鼻上皮、粘液、および／または開放創部位から単離された細胞におけるセラミドレベルに基づく、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記投与する段階が、前記対象の呼吸器上皮、粘液、または開放創部位の細胞におけるセラミドレベルを正常化するために有効な条件下で実行される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記セラミダーゼが酸性セラミダーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
セラミドレベルを減少させる1種以上のさらなる剤が、前記セラミダーゼと組み合わせて投与される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記1種以上のさらなる剤が、1種以上のさらなるセラミド減少剤、1種以上の酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤、感染を減少させるための1種以上の剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記1種以上のさらなる剤が、感染を減少させるための1種以上の剤であり、かつ抗生物質、肺上皮への病原体の結合をブロックする試薬、粘液の粘度を減少させるための試薬、失われたタンパク質機能を増強するためのシャペロン試薬、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記セラミダーゼが、前記1種以上のさらなる剤と同時に、別々に、または逐次的に投与される、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記投与する段階が、経口、局所的、鼻内、腹腔内、静脈内、皮下、またはエアロゾル吸入による、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記投与する段階がエアロゾル吸入による、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記セラミダーゼが0．001ｍｇ／ｋｇ〜500ｍｇ／ｋｇの量で投与される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記病原体の感染が、ウイルス性、真菌性、プリオン性、または細菌性の感染である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記病原体の感染がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記シュードモナス感染が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記セラミダーゼが感染の発症の前に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記セラミダーゼが感染の発症の後に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記選択された対象が嚢胞性線維症を有する、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記選択された対象がＣＯＰＤを有する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記選択された対象が開放創を有する、本発明1001の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂはマウス肺のパラフィン包埋切片を示す。図１Ａは、Ｃｙ３抗セラミド抗体で染色し、次いで共焦点顕微鏡によって分析した、野生型マウス、ＣｅｒＳ２欠損マウス、および嚢胞性線維症マウスの肺の代表的な切片である。図１Ｂは、マウスに酸性セラミダーゼ（「ＡＣ」）を単回吸入させ２時間後に同じ抗体で染色した、野生型マウス、ＣｅｒＳ２欠損マウス、および嚢胞性線維症マウスの肺の代表的な切片である。群あたり少なくとも６匹のマウスでの結果を表す。
【図２】組換え酸性セラミダーゼが、セラミドを蓄積しているマウスの肺において緑膿菌感染を予防することを実証する。２つのマウスモデルを使用した。１つ（ＣｅｒＳ２−／−）はセラミド産生酵素、セラミドシンターゼ２の遺伝子ノックアウトである。もう１つ（Ｃｆｔｒ−／−）は嚢胞性線維症膜貫通タンパク質遺伝子の変異を有し、嚢胞性線維症のモデルである。野生型、ＣｅｒＳ２−／−、またはＣｆｔｒ−／−マウスに、生理食塩水（明灰色）または酸性セラミダーゼ（暗灰色）のいずれかを単回吸入させ、次いで、緑膿菌を感染させた。２時間後、これらを屠殺し、マウス肺の中に残っている緑膿菌の力価を決定した。
【図３】１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）の緑膿菌菌株７６２またはＡＴＣＣ  ２７８５３での鼻内感染の３０〜４５分前に、０．８ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ中の１００μｇ  ＡＣを吸入したマウスの結果を示す。肺を感染の４時間後に取り出し、ホモジナイズし、５ｍｇ／ｍＬサポニン中で１０分間溶解し洗浄した。アリコートをＬＢプレート上にプレーティングし、一晩増殖させた。ＬＢプレート上のＣＦＵを計数し、肺の中の緑膿菌の細菌数を決定した。４回の独立した実験の平均±ｓ．ｄ．が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの従来的な技術が使用される。これらの技術は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７））；およびＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｅｄｓ．，においてそれぞれ説明されており、これらのすべてはそれらの全体が参照により組み込まれる。ポリペプチドの遺伝子発現産物のレベル、すなわち、遺伝子翻訳レベルを検出および測定するための方法は当該分野において周知であり、これには、抗体の検出および定量の技術などのポリペプチド検出方法の使用が含まれる。全体が参照により組み込まれる、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ＆  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）もまた参照のこと。
【００１４】
本技術の実質的な理解を提供するために、本発明のある特定の態様、様式、実施形態、バリエーション、および特色が様々な詳細なレベルで以下に説明されることが認められるべきである。本明細書中で使用されるようなある特定の用語の定義は以下に提供される。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
根底にある疾患状態は、対象を急性および／または慢性の病原体の感染にかかりやすくし得る。本明細書で使用される場合、「疾患状態」とは、対象が保有している任意の種類または起源の、病原体による疾患または状態をいう。従って、疾患状態には、例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない、以下の疾患および／または用語によって特定される対象が挙げられる：呼吸器疾患、肺疾患、嚢胞性線維症（「ＣＦ」）、慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）、肺気腫、喘息、肺線維症、慢性気管支炎、肺炎、肺高血圧、肺癌、サルコイドーシス、壊死性肺炎、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、急性侵襲性無気肺、好酸球性肺炎、胸水、塵肺、ニューモシスチス症、気胸、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺動静脈奇形、肺水腫、肺塞栓、肺ヒスチオサイトーシスＸ（好酸球性肉芽腫）、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞症、リウマチ性肺疾患、および／または開放創。このような疾患により、典型的には、病原体の感染について対象の感受性の増加が、すなわち、疾患状態に罹患していない対象と比較して、増加が生じる。
【００１６】
例えば、ＣＦ、ＣＯＰＤ、および／または開放創に罹患している対象は、例えば、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性、および／またはプリオン性の病原体の感染などの急性および／または慢性の病原体の感染にかかる高い感受性を保有し得る。細菌性病原体には、非限定的に、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｔｈｅｒｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ型および分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス属の種（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、シゲラ属の種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属の種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスB群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂ）、Ａ群β溶血性ストレプトコッカス、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。ある実施形態において、病原体の感染はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染である。ある実施形態において、シュードモナス感染は緑膿菌感染である。
【００１７】
ウイルス病原体には、非限定的に、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｄｉａｅ）（例えば、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、単純ヘルペスウイルス５、および単純ヘルペスウイルス６）、レビウイルス科（例えば、レビウイルス、腸内細菌ファージＭＳ２、アロレビウイルス（ａｌｌｏｌｅｖｉｒｕｓ））、ポックスウイルス科（ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（例えば、コードポックスウイルス亜科（ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ）、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、およびエントモポックスウイルス亜科（ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ））、パポバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１）、麻疹ウイルスなどのモビリウイルス、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルスなど）、ニューモウイルス科（ｐｎｅｕｍｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）、メタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルス）、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヒトＡ型肝炎ウイルスなどのヘパトウイルス、カルジオウイルス、およびアプトウイルス）、レオウイルス科（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジーウイルス、フィトレオウイルス、およびオリザウイルス）、レトロウイルス科（例えば、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、トリＣ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルスグループ、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス）、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１およびヒト免疫不全ウイルス２；ならびにスプマウイルスなど）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、シンドビスウイルスなどのアルファウイルスおよび風疹ウイルスなどのルビウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、ベシキュロウイルス、リッサウイルス、エフェメラウイルス、サイトラブドウイルス、およびネクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イピーウイルス、およびラッサウイルス）、ならびにコロナウイルス科（例えば、コロナウイルスおよびトロウイルス）、サイトメガロウイルス（単核球症）、デングウイルス（デング熱、ショック症候群）、エプスタイン‐バーウイルス（単核球症、バーキットリンパ腫）、１型ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（Ｔ細胞白血病）、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型インフルエンザ（呼吸器疾患）、日本脳炎ウイルス（肺炎、脳障害）、ポリオウイルス（麻痺）、ライノウイルス（風邪）、風疹ウイルス（胎児の先天異常）、ワクシニアウイルス（全身感染症）、黄熱病ウイルス（黄疸、腎不全、および肝不全）、ならびに水痘帯状疱疹ウイルス（水痘ウイルス）が挙げられる。
【００１８】
病原性真菌には、非限定的に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、アスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｅｓ））、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えば、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）属、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属、頭部白癬菌（Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、爪白癬菌（Ｔｉｎｅａ  ｕｎｇｕｉｓ）、スポロトリクス シェンケニ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、およびニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）が挙げられる。病原性原生動物には、非限定的に、トリパノゾーマ属の種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｐｐ．）、リーシュマニア属の種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、プラスモジウム属の種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、エントアメーバ属の種（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．）、およびランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）などのジアルジア属の種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００１９】
疾患状態に罹患した対象における病原体の感染に対する感受性の増加を誘起する分子メカニズムは十分に理解されていないので、細胞接着および内部移行に関して、例えば、緑膿菌の病理を解明することは、このような感染にかかる傾向がある対象を予防および治療するための重要な考慮すべき事項である。
【００２０】
インテグリンは、例えば、付着および接着に関する細胞プロセスを協調させるように機能する受容体分子である。しかし、インテグリンは、正常で健常な気管支上皮細胞の管腔表面で特徴的に発現するわけではなく、上皮細胞層の密着結合は、インテグリンが典型的に存在する上皮細胞の側底極との気管支病原体の接触を妨害する。
【００２１】
「レベルの上昇」または「より高いレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、対照対象または正常対象からの比較可能なサンプルにおいて正常に観察されたもの、すなわち、参照値または対照レベルまたは正常化レベルよりも高い、測定可能なマーカー、分子、またはタンパク質、例えば、セラミドなどのレベルをいう。ある実施形態において、「対照レベル」すなわち、正常レベルとは、疾患状態を有しない対象からのサンプル中で観察されることが通常予想される範囲をいう。対照レベルは、下記でさらに詳述されるように、比較目的のための「参照レベル」として使用されてもよい。従って、「レベルの上昇」とは、対照レベルの範囲よりも上であるレベルをいう。「レベルの上昇」または「対照レベル」として受け入れられた範囲は、いくつもの因子に依存する。当業者は、関連のある因子を考慮すること、および本発明の「対照値」および「上昇値」についての適切な参照範囲を確立することが可能である。例えば、対照対象およびＣＦと診断された対象からの一連のサンプルは、「正常」または「対照」レベルである範囲、および対照の範囲またはレベルと比較して、「上昇し」または「高い」範囲を確立するために使用できる。
【００２２】
セラミダーゼは、セラミドを加水分解して脂肪酸とスフィンゴイド塩基（スフィンゴシン）にすることが可能な酵素であり、これは、細胞増殖および細胞内シグナル伝達に関与している。セラミダーゼは、酵素活性化後に、個々の脂肪酸およびスフィンゴシン成分へのセラミド加水分解を容易にする。Ｇａｔｔ，  "Ｅｎｚｙｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：３１３１-３（１９６３）；Ｇａｔｔ，  "Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．１．Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｒａｍｉｄｅｓ  ｂｙ  ａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：３７２４-３１（１９６６）；Ｈａｓｓｌｅｒ  ＆  Ｂｅｌｌ，  "Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ：Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｏｌｅｓ，"  Ａｄｖ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．２６：４９-５７（１９９３）を参照のこと、これらのすべてはそれらの全体が参照により組み込まれる。スフィンゴシンを生成するための細胞にとってのデノボ経路は存在せず、従って、これは、セラミダーゼの酵素作用に従うセラミド加水分解によってのみ生成される。
【００２３】
本発明の１つの態様は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象における病原体の感染を治療または予防するための方法に向けられている。本発明のこの方法は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有する対象を選択する段階、ならびに選択された対象においてセラミドを減少させ、かつ上記病原体の感染を治療または予防するための有効な条件下で、上記選択された対象にセラミダーゼを投与する段階を包含する。
【００２４】
本明細書に記載される場合、「開放創」とは、上皮層、すなわち、皮膚が、裂け、切断され、および／または穿刺されている一種の損傷をいう。ある実施形態において、開放創は、皮膚の真皮に損傷を与え、同時に感染にかかる可能性を高める鋭器損傷をいう。「開放創」という用語は熱傷もまた包含する。
【００２５】
本発明の方法は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、および／または開放創を有しない対象についての参照レベルと比較して、上昇したセラミドレベルに基づいて、対象を選択する段階をさらに包含する。本明細書において使用される場合、「参照レベル」という用語は、比較目的のために関心対象になり得る物質、例えば、セラミドのレベルをいう。ある実施形態において、参照レベルは、健常（疾患がなく、および／または病原体がない）対象の対照集団のサンプルからのレベルまたは濃度の平均として表現されるタンパク質のレベルまたは濃度であってもよい。他の実施形態において、参照レベルは、対象が疾患、疾患状態、および／または病原体の感染を発症する前、例えば、セラミダーゼ治療などの治療を開始する前、または治療におけるより初期に決定されたレベルなどの、異なる時間、例えば、本発明が利用される前の同じ対象におけるレベルであってもよい。
【００２６】
対象と参照レベルとの間のセラミドレベルを比較する例示的な方法には、非限定的に、下記にさらに記載されるような１つ以上のタンパク質アッセイの結果に基づいて、検出されたセラミドレベルの違いを比較することが挙げられる。ある実施形態において、セラミドレベルは、本明細書に記載されるような疾患状態の存在下でより高い。参照レベルと比較してより低い検出されたセラミドレベルを有する対象、またはそれを保有するサンプルは、その対象が、セラミダーゼ治療を必要としないかもしれず、および／またはその対象が上記に記載されたような疾患状態を有していないかもしれないことを示す。
【００２７】
本発明の方法はさらに、肺上皮、鼻上皮、粘液、および／または開放創部位から単離された細胞の中のセラミドレベルに基づいて対象を選択することに関する。ある実施形態において、投与する段階は、対象の呼吸器上皮、粘液、または開放創部位における細胞の中のセラミドレベルを正常化するために有効な条件下で実行される。ある実施形態において、セラミダーゼは、以下の表１に列挙される酸性セラミダーゼ（「ＡＣ」）などの酸性セラミダーゼ（「ＡＣ」）であるがこれらに限定されない。
【００２８】
酸性セラミダーゼ（Ｎ−アシルスフィンゴシンデアシラーゼ、Ｉ．Ｕ．Ｂ．Ｍ．Ｂ．酵素番号ＥＣ  ３．５．１．２３）は、セラミドの異化の原因である１つの特定のセラミダーゼである。ヒトの遺伝子障害であるファーバー脂肪肉芽腫症における関与により、ＡＣはセラミダーゼ酵素ファミリーの最も広範に研究されたメンバーの１つである。このタンパク質はいくつかの供給源から精製されており、ヒトおよびマウスのｃＤＮＡおよび遺伝子が得られている。Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１０９８-１０２（１９９５）；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｓｉｏｎ  Ｃａｕｓｉｎｇ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１１：３３１１０-５（１９９６）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ，"  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５０：２６７-７４（１９９８）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  Ｇｅｎｅ（ＡＳＡＨ）：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，"  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２：２２３-３１（１９９９）を参照のこと、これらのすべてはそれらの全体が参照により組み込まれる。
【００２９】
上記のように、ＡＣは、セラミドのスフィンゴシンおよび遊離脂肪酸への加水分解を触媒するセラミダーゼである。Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９）：１１０９８-１０２（１９９５）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。成熟ＡＣは、αサブユニット（約１３ｋＤａ）およびβサブユニット（約４０ｋＤａ）から構成される約５０ｋＤａタンパク質である。Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９）：１１０９８-１０２（１９９５）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。これは、ＡＣ前駆体タンパク質の切断を通して産生され（Ｆｅｒｌｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ：Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３８）：３５３５２-６０（２００１）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる）、このタンパク質は、Ａｓａｈ１遺伝子（ＮＣＢＩ  ＵｎｉＧｅｎｅ  ＧｅｎｅＩＤ番号４２７、これはその全体が参照により組み込まれる）の産物である。
【００３０】
ＡＣの機能および／または活性は、さらに、周囲のｐＨに直接的に関連する。実際、これは約４．５の酸性ｐＨを有するリソソーム中に通常は見い出され、ファーバー脂肪肉芽腫症の患者におけるＡＣ活性の非存在下で、セラミドはリソソーム中に蓄積する。
【００３１】
加えて、最近の研究は、細胞内区画ｐＨの増加がＡＣ活性／機能を最大９０％まで減少させることを示してきた。Ｔｅｉｃｈｇｒaｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４（４），ｐｐ．３８２−３９１（２００８）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。いくつかの点で、これらの結果は、ＡＣの欠損によって引き起こされ、セラミドの蓄積を生じるファーバー病に類似している。Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３２９７８-３２９８６（２００３）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。さらに、ｐＨ  ５．９において、ＡＣは、セラミドを消費する代わりにセラミドを産生する逆活性を保有することが示されてきた。同上を参照のこと。肺胞ｐＨレベルの増加において損なわれたＡｓｍ機能と合わせたこの活性は、セラミドの正味の蓄積を生じ得る。Ｔｅｉｃｈｇｒaｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４（４），ｐｐ．３８２−３９１（２００８）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００３２】
他の研究は、肺胞マクロファージのＣＦＴＲ欠損がｐＨ  ４．５から少なくともｐＨ  ５．９までのリソソームのｐＨシフトを生じることを示してきた。Ｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  "ＣＦＴＲ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｓ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，  "  Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８，９３３-９４４（２００６）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。然るに、本発明は、驚くべきことに、ＣＦ患者において病原体の感染を予防および／または治療するように機能し、これは少なくとも、リソソームｐＨが増加したＣＦ患者における上昇したセラミドレベルをＡＣが減少させることが予想されていなかったのが理由である。さらに、ＡＣは、肺上皮細胞膜におけるセラミドの蓄積に対して機能することが予想されていない。
【００３３】
本発明の状況において使用できるＡＣには、非限定的に、以下の表１に示されるものが挙げられる。本発明のすべての態様において、ＡＣは、治療される組織、細胞、および／または対象に対して、同種（すなわち、同じ種に由来する）または異種（すなわち、異なる種に由来する）であり得る。
【００３４】
（表１）例示的な酸性セラミダーゼファミリーのメンバー
2020050668.tif 000003
【００３５】
ある実施形態において、セラミドおよび／またはＡＣの濃度および／または活性のレベルを決定することが、治療の前に実行される。セラミド濃度および／またはセラミダーゼのレベルもしくは活性を決定するために適切なアッセイは、当業者には容易に明らかである。適切な方法には、例えば、活性アッセイ（Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，"  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２１（７）：１４０３-９（２００７）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる）、およびサンプル中に存在するセラミダーゼタンパク質および／または活性の相対量を決定するためのウェスタンブロッティングなどの周知の技術が挙げられる（ここで、より多い量のセラミダーゼタンパク質はより高いセラミダーゼ活性レベルと相関する）。Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，"  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２１（７）：１４０３-９（２００７）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「アッセイ」という用語は、所定の体液のサンプル中のセラミドおよび／またはセラミダーゼの存在または非存在を検出するためのアッセイをいう。サンプル中の物質の量を測定する定量アッセイもまた含まれる。本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語はその最も広い意味で使用される。１つの意味において、これは、生物学的サンプルから得られた試料または培養物を含むことを意味する。体液サンプルは、血清、滑液、脳脊髄液、および腹水からなる群より選択される。特に関心対象のものは血清であるサンプルである。当業者は、血漿または全血あるいは全血の細画分もまた使用されてもよいことを認識するであろう。生物学的液体のサンプルは、動物（ヒトを含む）から得られてもよく、これには、血漿、血清などの血液製剤が挙げられる。ある実施形態において、サンプルは、一定レベルのセラミドまたはセラミダーゼを含有し、これは、本明細書に記載される方法、および当該分野において周知である方法によって容易に確認できる。
【００３７】
イムノアッセイは、それらの最も単純かつ直接的な意味において、抗体と抗原との間の結合に関わる結合アッセイである。多くの種類および形式のイムノアッセイが公知であり、すべてが、例えば、セラミドレベルの検出のために適切である。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、酵素結合免疫スポットアッセイ（「ＥＬＩＳＰＯＴ」）、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）（Ｆｅｒｌｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ：Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３８）：３５３５２-６０（２００１）を参照のこと。これは、そのそれらの全体が、参照により組み込まれる）、放射性免疫沈殿アッセイ（「ＲＩＰＡ」）、イムノビーズ捕捉アッセイ、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、蛍光顕微鏡法、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）、および光退色後の蛍光回復／局在（「ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ」）である。様々な有用な免疫検出方法のステップは、例えば、Ｍａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１９８７）およびＮａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，  "Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，"  Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７．１−２７．２０（１９８６）などの科学文献に記載されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
一般的に、イムノアッセイは、関心対象の分子またはタンパク質（セラミドおよび／またはセラミダーゼなど）を含有することが疑われているサンプルを、免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、その関心対象の分子またはタンパク質に対する抗体と接触させることを包含する。この点に関して、当業者は、所定のサンプル中の関心対象の特定の分子またはタンパク質の存在およびまたはレベルを評価することが可能である。
【００３９】
イムノアッセイは、サンプル中の関心対象の分子またはタンパク質の量を検出または定量する方法を含むことができ、この方法は、一般的に、結合プロセスの間に形成された任意の免疫複合体の検出または定量を包含する。一般的に、免疫複合体形成の検出は当該分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通して達成できる。これらの方法は、一般的には、放射性、蛍光、生物学的タグもしくは酵素タグのいずれか、または任意の他の既知の標識などの標識またはマーカーの検出に基づいている。例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号を参照のこと、これらの各々は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
総タンパク質を検出するために使用される１つの特に有効な非特異的アッセイは、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイである。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，  "Ａ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，"  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８-２５４（１９７６）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００４１】
Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ（Ｃ．Ｉ．＃  ４２６５５）（１００ｍｇ）の色素ストックを使用し、これは５０ｍＬのメタノールに溶解される。この溶液は、１００ｍＬの８５％  Ｈ３ＰＯ４に加えられ、そして水で２００ｍＬまで希釈されて、暗赤色を生じる。アッセイの最終試薬濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ、２５％  メタノール、および４２．５％  Ｈ３ＰＯ４である。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイのアッセイ試薬は、色素ストック１対蒸留水４の割合で希釈することによって調製される。生じる色はｐＨ  １．１で茶色であるはずである。一連のタンパク質標準は、標準アッセイのために、０、２５０、５００、７５０、および１５００μｇ／ｍＬの濃度のウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を使用して、アッセイされるサンプルと同じ緩衝液中で調製される。吸光度は、標準アッセイ手順については５９５ｎｍで、マイクロアッセイについては４５０ｎｍで読み取られ（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）、そして５９５ｎｍ／４５０ｎｍの吸光度の比率が標準曲線の計算のために使用された。Ｚｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，  "Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｉｔｓ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，"  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：３０２-３０８（１９９６）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００４２】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＡＣ前駆体タンパク質を投与することによって実行され、これは、次には、細胞によって活性酸性セラミダーゼタンパク質に転換される。特に、ＡＣ前駆体タンパク質は、自己タンパク質切断を受けて活性型（αサブユニットおよびβサブユニットから構成される）になる。これは、細胞内環境によって促進され、そして種にわたって高度に保存されたＡＣ前駆体タンパク質の切断部位の配列に基づいて、すべてではないとしても、大部分の細胞型において起こることが予測される。適切な酸性セラミダーゼ前駆体タンパク質には、上記の表１に示されたものが挙げられる。当業者に明らかであるように、この前駆体タンパク質は、細胞が曝露される培養培地の中に任意に含有されることができる。従って、前駆体タンパク質が、関心対象の宿主対象または細胞によって取り込まれ、活性酸性セラミダーゼに転換される実施形態が企図される。
【００４３】
本発明のタンパク質またはポリペプチド剤、例えば、ＡＣを投与するためのさらに別のアプローチは、その全体が参照により組み込まれる、Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，への米国特許第５，８１７，７８９号に従うキメラタンパク質の調製を包含する。キメラタンパク質は、リガンドドメインおよびポリペプチド剤（例えば、ＡＣ、ＡＣ前駆体タンパク質）を含むことができる。このリガンドドメインは、標的細胞上に位置する受容体に特異的である。従って、キメラタンパク質が対象、細胞、および／または培養培地に送達されるとき、キメラタンパク質は内部移行される。
【００４４】
物質、例えば、セラミド、および／またはセラミダーゼのレベルまたは活性に依存して、１種以上のさらなる剤が、本発明の方法に従って、セラミダーゼ、例えば、ＡＣと組み合わせて投与されてもよい。ある実施形態において、１種以上のさらなる剤は、１種以上のさらなるセラミド減少剤、１種以上のスフィンゴミエリナーゼ阻害剤、感染を減少させるための１種以上の剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。感染を減少させるために適切な剤には、抗生物質（例えば、吸入されたトブラマイシン、ＴＯＢＩ）、病原体の肺上皮への結合をブロックする試薬、粘液の粘度を減少させる試薬（例えば、ドルナーゼアルファ、プルモザイム）、失われたタンパク質機能を増強するためのシャペロン試薬（例えば、アイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）、カリデコ（Ｋａｌｙｄｅｃｏ）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ある実施形態において、セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、１種以上のさらなる剤と同時に、別々に、または逐次的に投与される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「同時」治療的使用という用語は、同じ経路による、同時または実質的に同時の少なくとも２種の活性成分の投与をいう。本明細書で使用される場合、「別々の」治療的使用という用語は、異なる経路による、同時または実質的同時の少なくとも２種の活性成分の投与をいう。本明細書で使用される場合、「逐次的」治療的使用という用語は、異なる時点での、投与経路が同一または異なる、少なくとも２種の活性成分の投与をいう。より具体的には、逐次的使用とは、単数または複数の他の投与が開始する前の、１種の活性成分の全投与をいう。従って、単数または複数の他の活性成分を投与する前、数分間、数時間、または数日間にわたって、１種の活性成分を投与することが可能である。この場合、同時治療は存在しない。
【００４６】
投与は、対象への全身投与を介して、または罹患した組織、器官、および／もしくは細胞への標的化投与を介してのいずれかで達成できる。治療剤（すなわち、ＡＣ、ＡＣ前駆体タンパク質、ＡＣ／ＡＣ前駆体タンパク質をコードする核酸）は、標的とされた組織、器官、または細胞への治療剤の移動（および／または組織、器官、または細胞による治療剤の取り込み）を容易にする１種以上の剤とともに、標的とされていない領域に投与されてもよい。さらに、および／または代替的に、当業者に明らかであるように、治療剤それ自体を修飾して、所望の組織、器官、または細胞へのその輸送（および組織、器官、または細胞による取り込み）を容易にすることができる。
【００４７】
剤の送達のための任意の適切なアプローチが、本発明のこの態様を実施するために利用できる。典型的には、治療剤は、標的の細胞、組織、または器官に治療剤（複数可）を送達するビヒクル中で患者に投与される。例示的な投与の経路には、非限定的に、気管内接種、吸引、気道点滴、エアロゾル化、噴霧化、鼻内滴下、口腔もしくは経鼻胃滴下、腹腔内注射、血管内注射、局所的、経皮的、非経口的、皮下、静脈内注射、動脈内注射（肺動脈を経由するなど）、筋肉内注射、胸膜内注入、脳室内、病巣内、粘膜（鼻、咽喉、気管支、生殖器、および／または肛門の粘膜など）への適用による、または持続放出ビヒクルの移植によるものが挙げられる。
【００４８】
ある実施形態において、セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、経口、局所的、鼻内、腹腔内、静脈内、皮下、またはエアロゾル吸入によって投与される。ある実施形態において、セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、エアロゾル吸入を介して投与される。ある実施形態において、セラミダーゼおよび／またはさらなる剤は、本明細書に記載されるような、投与のために適切な薬学的組成物に取り込むことができる。
【００４９】
本発明の剤、例えば、ＡＣは、例えば、不活性希釈剤とともに、もしくは吸収可能な可食性キャリアとともに経口投与されてもよく、またはこれらはハードもしくはソフトシェルカプセル中に封入されてもよく、またはこれらは錠剤に圧縮されてもよく、またはこれらは日々の食事の食物に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、これらの活性化合物は、賦形剤に組み込まれてもよく、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップなどの形態で使用されてもよい。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の剤を含有するべきである。当然、これらの組成物中の剤のパーセンテージは変動してもよく、好都合に単位重量の約２％から約６０％の間にあってもよい。このような治療的に有用な組成物中の剤の量は、適切な投薬量が得られるようなものである。
【００５０】
錠剤、カプセルなどはまた、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カリウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味料を含有してもよい。投薬単位剤型がカプセルであるとき、これは、上記の種類の材料に加えて、脂肪油などの液体キャリアを含有してもよい。
【００５１】
剤、例えば、ＡＣはまた、非経口的に投与されてもよい。この剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中で調製できる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のこれらの混合物の中で調製できる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油である。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に、注射溶液のために好ましい液体キャリアである。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を妨害するために保存剤を含有する。
【００５２】
注射用途のために適切な薬学的形態には、滅菌注射溶液または懸濁液の即時調製のための滅菌水溶液または懸濁液、および滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、この形態は、滅菌されなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度まで流動性がなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【００５３】
本発明に従う剤、例えば、ＡＣはまた、エアロゾルの形態で直接気道に投与されてもよい。エアロゾルとしての使用のために、溶液または懸濁液中の本発明の化合物は、従来的なアジュバントと共に適切な噴霧剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴霧剤とともに、加圧エアロゾル容器中にパッケージされてもよい。本発明の材料はまた、加圧されていない形態で投与されてもよい。
【００５４】
例示的な送達デバイスには、非限定的に、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム（アクティブ薬物送達技術とパッシブ薬物送達技術の両方を含む）（Ｗａｎｇ  ＆  Ｈｕａｎｇ，  "ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｔａｒｇｅｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ，"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１-５（１９８７）；Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｉｖａｌｅｎｔ  Ｉｏｎｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  Ｌａｍｅｌｌａｅ  ｏｆ  Ｓｗｏｌｌｅｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，"  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８-５２（１９６５）；Ｈｓｕへの米国特許第５，６５３，９９６号；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，６４３，５９９号；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，８８５，６１３号；Ｄｚａｕ  ＆  Ｋａｎｅｄａへの米国特許第５，６３１，２３７号；およびＬｏｕｇｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，０５９，４２１号；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｔｈｙ１  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｏ  ＡＫＲ−Ａ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，"  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：２５９-７３（１９８４）、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）、経皮パッチ、移植物、移植可能なまたは注射可能なタンパク質デポー組成物、およびシリンジが挙げられる。当業者に公知である他の送達系もまた、所望の器官、組織、または細胞への治療剤の所望の送達を達成するために利用できる。
【００５５】
投与は、必要とされる頻度で、および病原体に対して有効な予防または効力を提供するために適切である期間の間、実行できる。例えば、投与は、単回の持続放出投薬製剤または複数回の日々の用量を用いて実行できる。
【００５６】
投与される量は、当然、治療計画に依存して変動する。一般的には、剤は、病原体のクリアランスを改善するために有効な量を達成するために投与される。従って、治療有効量は、少なくとも部分的に病原体の感染を予防および／または治療することが可能である量であり得る。これには、非限定的に、感染の発症を遅らせることが挙げられる。有効量を得るために要求される用量は、剤、製剤、および剤が投与される個人に依存して変動する可能性がある。
【００５７】
本発明の剤または組成物の投薬量、毒性、および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比率が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表現できる。高い治療指数を示す化合物が望ましい可能性がある。毒性副作用効果を示す組成物が使用されてもよいが、感染していない細胞に対する潜在的な損害を最小化し、それによって副作用を減少させるために、罹患した組織の部位にこのような組成物を標的化する送達系が設計されるよう注意が払われるべきである。
【００５８】
このようなものとして、セラミダーゼは、ある実施形態において、治療有効量で投与される。本明細書で使用される場合、剤、タンパク質、化合物、および／または組成物の「治療有効量」、「有効量」または「薬学的に有効な量」という用語は、所望の治療的および／または予防的な効果を達成するために十分な量、例えば、治療されている疾患に付随する症状の予防、またはその減少を生じる量である。
【００５９】
対象に投与される本発明の剤または組成物の有効量は、疾患の種類および重篤度、ならびに、一般的健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐容性などの個体の特徴に依存する。これはまた、疾患の程度、重篤度、および種類に依存する。当業者は、これらおよび他の要因に依存して、適切な投薬量を決定することが可能である。本発明の組成物はまた、１種以上のさらなる治療化合物と組み合わせて投与できる。
【００６０】
典型的には、この治療剤は、治療剤ならびに任意の薬学的に受容可能なアジュバント、キャリア、賦形剤、および／または安定剤を含む薬学的製剤として投与され、錠剤、カプセル、散剤、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの固体剤型または液体剤型であり得る。これらの組成物は、好ましくは、約０．０１〜約９９重量パーセント、より好ましくは、約２〜約６０重量パーセントの治療剤を、アジュバント、キャリア、および／または賦形剤とともに含有する。ある実施形態において、有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ対象体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ対象体重の範囲である。ある実施形態において、剤の有効量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１もしくは２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００６１】
本発明の剤、例えば、ＡＣは、様々な時点で投与することができる。セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、ある実施形態において、感染の発症の前に投与される。他の実施形態において、セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、感染の発症の後で投与される。なおさらに、セラミダーゼ、例えば、ＡＣは、本発明のある実施形態に従って、感染の発症の前および後で投与されてもよい。
【００６２】
本発明の別の態様は、病原体の感染および根底にある疾患状態を有する対象において治療の有効性をモニタリングする方法に関する。この方法は、対象を選択する段階、治療前の選択された対象からの体液サンプル中のベースラインセラミドレベルを提供する段階、および療法を用いて病原体の感染を治療する段階を含み、例えば、この療法は、例えば、ＡＣなどのセラミダーゼの治療的投与であり得る。この方法はさらに、治療後の選択された対象からの体液サンプル中の治療後セラミドレベルを検出する段階、ベースラインセラミドレベルを治療後セラミダーゼレベルと比較する段階、ならびにこの比較および／または病原体の感染の病理に基づいて、治療が有効であったか否かを特定する段階を含む。
【００６３】
本発明の別の態様における、本発明の療法を使用または投与するためのキットまたは試薬システム。このようなキットは、本明細書に開示される方法に従うアッセイを実施するために要求される特定の要素を含む試薬の組み合わせを含有する。この試薬システムは、組成物または混合物としての商業パッケージ型で提供され、ここでは、試薬の適合性が、試験デバイス配置において、またはより典型的には、試験キットとして、すなわち、１つ以上の容器、デバイスなどのパッケージされた組み合わせ中で必要な試薬を保持することを許容し、そして好ましくは、アッセイの実施のために書かれた指示書を含む。このキットは、アッセイの任意の構成のために適合されてもよく、本明細書に記載された様々なアッセイのいずれかを実施するための組成物を含んでもよい。
【００６４】
開示された方法のために有用な試薬は溶液中に保存でき、または凍結乾燥できる。凍結乾燥されたとき、試薬のいくつかまたはすべては、再構成後の容易な使用のためにマイクロタイタープレートウェルの中で容易に保存できる。当該分野において公知である試薬を凍結乾燥させるための任意の方法が、開示された方法のために有用なドライダウンされた試薬を調製するために適切であることが企図される。
【００６５】
ここで本発明を一般的に説明してきたが、例示の目的で提供され、特定されない限り本発明を限定することは意図されない以下の実施例に対する参照を通して、本発明は、より容易に理解される。
【実施例】
【００６６】
実施例１−マウス
Ｂ６．１２９Ｐ２（ＣＦ／３）−ＣｆｔｒＴｇＨ（ｎｅｏｉｍ）Ｈｇｕ（「ＣＦＭＨＨ」）コンジェニックマウスが、Ｃｆｔｒ遺伝子のエキソン１０における挿入変異誘発によって生成されたオリジナルのＣｆｔｒＴｇＨ（ｎｅｏｉｍ）Ｈｇｕ変異型マウスの同系交配を通して産生された。Ｃｈａｒｉｚｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｉｎ  ＣｆｔｒＴｇＨ（ｎｅｏｉｍ）Ｈｇｕ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ，"  ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ．５  ｐ．６（２００４）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。次いで、このコンジェニックＣｆｔｒＭＨＨ系統は、Ｂ６バックグラウンドに戻し交配された。これらのマウスは、なお低レベルのＣＦＴＲを発現しており、従って、標準マウス食を与えることができた。これらは、正常な発生を示したが、しかし、ＣＦに典型的な肺病理もまた示した。これらは、本明細書では「ＣＦ」マウスと称する。Ｔｅｉｃｈｇｒaｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４（４），ｐｐ．３８２−３９１（２００８）；Ｗｏｌｂｅｌｉｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｈｅａｄ−ｏｕｔ  Ｓｐｉｒｏｍｅｔｅｒｙ  Ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｓ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ８０：３４０−６（２０１０）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。同質遺伝子Ｂ６マウスは対照として使用された。
【００６７】
ある実験については、Ｃｆｔｒｔｍ１Ｕｎｃ−Ｔｇ（ＦＡＢＰＣＦＴＲ）マウス（「Ｃｆｔｒ−／−」、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから購入）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと、１０世代より多く戻し交配させた。脂肪酸結合タンパク質（「ＦＡＢＰ」）プロモーターの制御下にあるヒトＣＦＴＲを発現する腸以外のすべての器官において、マウスは、Ｃｆｔｒを完全に欠損している。この導入遺伝子は腸閉塞を予防し、正常食を与えられることを可能にする。再度、Ｂ６マウスは対照として使用された。Ｃｆｔｒ−／−系統とＣｆｔｒＭＨＨ系統の両方を利用する実験において、大きな違いは観察されなかった。
【００６８】
他の実験については、酵素セラミドシンターゼ２が欠損しているマウスが使用された。これらのマウス（ＣｅｒＳ２−／−）は、ＣｅｒＳ２マウス遺伝子の第１イントロンの破壊によって生成された。これらは、約１６ヶ月を超えて生存せず、多くの組織の中にＣ１６セラミドを蓄積する（Ｐｅｗｚｎｅｒ−Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  Ｉ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ，"  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１０９０２（２０１０）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる）。
【００６９】
マウスは、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｉｓｂｕｒｇ−Ｅｓｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙの動物施設における単離されたケージの中に収容され、飼育された。これらは、ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓの２００２年の推奨に従って、共通のマウス病原体のパネルについて繰り返し評価された。マウスはあらゆる病原体を含まなかった。動物に対して実施された手順は、Ｂｅｚｉｒｋｓｒｅｇｉｅｒｕｎｇ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙによって認可された。
【００７０】
実施例２−抗体および試薬
すべてのセラミド染色は、モノクローナルマウス抗セラミド抗体クローンＳ５８−９（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して実施し、これは、Ｃｙ３ロバ抗マウスＩｇＭ  Ｆ（ａｂ）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃７１５−１６６−０２０）またはＣｙ５結合ロバ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃７１５−１７６−０２０）を用いて可視化した。組換えヒト酸性セラミダーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞中で産生し、以前に記載されたように培地から精製した。Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３２９７８−８６（２００３）、これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００７１】
実施例３−細菌
緑膿菌の実験室菌株Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２７８５３、および以前に記載された緑膿菌臨床分離株（「７６２」）を使用した。細菌は、新鮮なトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の凍結ストックからプレーティングし、３７℃で１４〜１６時間増殖させ、４０ｍＬの３７℃にあたためたトリプシンダイズブロス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で、５５０ｎｍで０．２２５の光学密度まで再懸濁した。次いで、細菌懸濁液を、初期の対数増殖期の細菌を取得するために、１２５ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で１時間インキュベートした。Ｇｒａｓｓｍe  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｈｏｓｔ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ−Ｒｉｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｒａｆｔｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９（３）：３２２−３３０（２００３）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。次いで、細菌を２回洗浄し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したあたためたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＲＰＭＩ＋ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁した。細菌の最終濃度は、分光光度計によって定量した。
【００７２】
実施例４−インビボ免疫組織化学
マウス気管支上皮細胞の免疫組織化学評価のために、マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、すぐに氷冷生理食塩水を用いて、低圧で２分間、右心を経由して灌流を行った。これに続き、１０〜１５分間、４％  ＰＢＳ緩衝化ＰＦＡを用いる心灌流を行った。この初期の血液のクリアランスおよび固定の後、肺が取り出され、２４〜３６時間の間、４％  ＰＦＡ中でさらに固定された。この組織を、エタノール対キシロールのグラジエントを使用して連続的に脱水し、次いで、パラフィンに包埋した。
【００７３】
次いで、サンプルを７μｍに切片化し、脱ワックス処理し、再水和し、３７℃で１５分間ペプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理した。次いで、サンプルを水およびＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間、ＰＢＳおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）および１％  ＦＣＳでブロッキングした。次いで、サンプルを、室温で４５分間、Ｈ／Ｓ＋１％  ＦＣＳ中の一次抗体で連続的に染色した。サンプルを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２回、そしてＰＢＳで１回、染色の間に洗浄した。組織は、暗所で３０分間、Ｈ／Ｓ＋１％  ＦＣＳ中の蛍光結合二次抗体で二次標識した。組織を、再度、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２回、ＰＢＳで１回洗浄し、最後に、Ｍｏｗｉｏｌ中に包埋した。以下に記載されるように、共焦点顕微鏡を使用してサンプルを評価した。
【００７４】
実施例５−吸入およびインビボ感染
緑膿菌を上記のように調製し、ＲＰＭＩ−１６４０プラス１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中で、２０μＬ培地中１×１０８ＣＦＵの最終濃度に再懸濁した。次いで、これらを、鼻の中に２ｍｍ挿入されたプラスチックコートされた３０ゲージ針を使用して接種した。マウス肺の中での細菌数を、感染の２時間後に定量した。マウスを屠殺し、肺を取り出し、ホモジナイズし、そして５ｍｇ／ｍＬサポニン中で溶解して、細胞内細菌が放出された。次いで、サンプルを滅菌ＰＢＳで洗浄し、希釈し、そしてＴＳＡプレート上で二連で、１２時間プレーティングした。細菌数を計数し、全肺サンプル中の細菌の数を示した。この感染の様式は、気管内感染などの他の肺感染モデルよりも、粘膜毛様体クリアランスをより正確に評価する。Ｔｅｉｃｈｇｒaｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４（４）：３８２−３９１（２００８）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｏｆ  Ｒａｓ−１  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１７（３）：３４１−３４６（２０１１）を参照のこと、これらは、それらの全体が参照により組み込まれる。
【００７５】
実施例６−統計学
データを算術平均±ＳＤとして表現し、示されたように統計学的分析を実施した。すべての値が正規分布していたので、一元ＡＮＯＶＡを適用した。有意性は図面の中で星印を付して示される。
【００７６】
実施例７−共焦点顕微鏡法および考察
１００×オイルイマージョンレンズを装着したＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５  共焦点顕微鏡を用いてサンプルを調べ、Ｌｅｉｃａ  ＬＣＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて画像を分析した。すべての比較サンプルは、同一の設定を用いて測定された。
【００７７】
セラミドはＣＦ対象およびマウスの肺において増加しており（図１Ａ）、ＣＦマウスの緑膿菌感染への感受性における重要な要因である。Ｇｒａｓｓｍe  ｅｔ．ａｌ．，  "ＣＦＴＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−Ｈｏｓｔ  Ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，"  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３００（８）：５７８−８３（２０１０）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。以前の研究は、酸性スフィンゴミエリナーゼの薬理学的阻害または酸性スフィンゴミエリナーゼ遺伝子の遺伝的ヘテロ接合性がマウスＣＦ肺におけるセラミドレベルを正常化するために十分であることを実証した。Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  "Ａｃｉｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，"  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４２（６）：７１６−２４（２０１０）を参照のこと。これは、その全体が参照により組み込まれる。
【００７８】
加えて、ＣＦＭＨＨＣｆｔｒ欠損マウスは、セラミドを加水分解する酸性セラミダーゼを吸入した。この吸入は、ＣＦマウスの気管支上皮細胞におけるセラミドレベルを修正した（図１Ｂ）。溶媒、すなわち、０．９％  ＮａＣｌの吸入は、セラミドレベルに影響を与えなかった。
【００７９】
別の例において、Ｃｆｔｒ−／−、ＣｅｒＳ２、または正常マウスは、生理食塩水または酸性セラミダーゼを吸入し、次いで、緑膿菌に感染した（図２）。正常マウスと比較して、ＣＦＭＨＨＣｆｔｒ欠損マウスおよびＣｅｒＳ２マウスは、セラミドをそれらの肺に蓄積する。吸入の２時間後、これらを屠殺し、肺に残っている細菌を定量した。野生型マウスは、緑膿菌を効果的にクリアしていたのに対して、生理食塩水を吸入したＣｆｔｒ−／−マウスまたはＣｅｒＳ２−／−マウスはクリアできず、多量の残存細菌を有していた。対照的に、酸性セラミダーゼを吸入したＣｆｔｒ−／−マウスまたはＣｅｒＳ２−／−マウスは、正常マウスと同様に、非常に低い細菌力価を有していた。
【００８０】
未処置のＣＦ気道における不規則性の同定は、ＣＦ対象における感染の予防のための新規な概念を提供する。本実施例は、感染を阻止し、そしてＣＦを有する対象の死亡の主要な要因を治療するためのいくつかのアプローチを提供する。
【００８１】
実施例８−ＡＣ吸入はシュードモナス感染に対して保護する
マウスは、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）の緑膿菌菌株７６２またはＡＴＣＣ  ２７８５３を用いる鼻内感染の３０〜４５分前に、０．８ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ中の１００マイクログラムの組換え酸性セラミダーゼ（ＡＣ）を吸入した。肺を感染の４時間後に取り出し、ホモジナイズし、５ｍｇ／ｍＬサポニン中で１０分間溶解し、そして洗浄した。アリコートをＬＢプレート上にプレーティングし、一晩増殖させた。ＬＢプレート上のＣＦＵを計数し、肺の中の緑膿菌細菌の数を決定した。４回の独立した実験の平均±標準偏差が示される。
【００８２】
ＡＣの単回吸入は、２種の異なる菌株のＰ．ａｅｕｒｇｉｎｏｓａを用いるＣＦマウスの感染を予防した（図３）。臨床菌株７６２はもともと尿路感染から得られたのに対して、ＡＴＣＣ  ２７８５３菌株は実験室菌株である。生理食塩水単独の吸入は対照として使用された。
【００８３】
ＣＦマウスは、組換え酸性セラミダーゼ（０．８ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ中１００マイクログラム）を吸入した。生理食塩水を対照として使用した。すべての場合において、マウスは、臨床的緑膿菌菌株７６２を用いる吸入の３０〜４５分前に吸入し、次いで、４時間後に屠殺された。肺を感染の４時間後に取り出し、ホモジナイズし、５ｍｇ／ｍＬサポニン中で１０分間溶解し、そして洗浄した。アリコートをＬＢプレート上にプレーティングし、一晩増殖させた。ＬＢプレート上のＣＦＵを計数して、肺の中の緑膿菌の細菌数を決定した。
【００８４】
ＣＦマウスの組換え酸性セラミダーゼの吸入は、臨床菌株７６２  緑膿菌を用いる感染を同様の程度、予防した（図３）。
【００８５】
好ましい実施形態が示され、本明細書において詳細に説明されてきたが、様々な改変、付加、置換などは、本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができ、それゆえに、これらは、後に続く特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲内にあるとみなされることが関連分野の当業者には明らかである。
【図１】
2020050668.tif 000004
【図２】
2020050668.tif 000005
【図３】
2020050668.tif 000006