(57)【要約】【課題】動物を用いずに皮膚感作性物質の評価、又は、皮膚感作性物質に対する被験物質の皮膚感作性増強作用、又は、皮膚感作性抑制作用を評価すること。【解決手段】ＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ、抗酸化物質応答配列）を含む分泌型皮膚感作性物質応答性レポーターベクターを作製する工程と、ケラチノサイトにレポーターベクターを導入する工程と、該工程で得られたケラチノサイトを三次元培養する工程、及び、該工程で得られた三次元培養表皮モデルを用いて難溶性物質を含む被験物質の皮膚感作性の有無を評価する工程、を含む物質の皮膚感作性の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌型レポータータンパク質をコードする核酸配列の上流にプロモーター配列及びプロモーター配列の上流のエンハンサー領域にＡＲＥ配列を有するレポーターベクターを導入して形質転換することによって樹立された細胞株からなる三次元培養表皮モデル。
【請求項２】
前記レポーターがルシフェラーゼ（発光酵素）である、請求項１記載の三次元培養表皮モデル。
【請求項３】
前記レポーターが蛍光物質である、請求項１記載の三次元培養表皮モデル。
【請求項４】
以下の工程を含む、三次元培養表皮モデルの製造方法。
（１）エンハンサー領域にＡＲＥ配列を有することを特徴とする分泌型レポータープラスミドを編集、構築する工程。
（２）工程（１）で得られたレポータープラスミドベクターをケラチノサイトに導入する工程。
（３）工程（２）で得られたケラチノサイトを三次元培養する工程
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性増強作用を評価する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性抑制作用を評価する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルを含む、皮膚感作性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌型感作性物質応答性レポーターベクターを安定的に組み込み、形質転換した細胞を用いて三次元培養表皮モデルを作製し、作製した三次元培養表皮モデルと被験物質とをインキュベートした後の培地を用いた発光強度測定及び／又は蛍光強度測定を実施することを特徴とする、難溶性物質を含む被験物質の皮膚感作性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体において、アレルギーを誘発する物質（感作性物質）を正当に評価及び検出することは、極めて重要である。これまでに、皮膚感作性物質を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、その皮膚等に生じる反応を観察する方法が知られている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、これらの方法は、被験物質を評価する試験期間が長く、また、動物愛護等の見地からも短時間かつ動物を用いない皮膚感作性評価方法の開発が望まれている。
【０００３】
化学物質等により皮膚感作が成立する過程は、複数の段階からなる（非特許文献４、５）。まず、最初の段階では、皮膚感作性物質が生体内のタンパク質と結合し、本来生体内に存在しない物質へと修飾される。次に、抗原提示細胞は、このような物質を抗原として認識すると、細胞内で様々なシグナルが伝達され、細胞膜表面タンパク質の発現変化等を経て、活性化する。活性化した抗原提示細胞は、所属リンパ節へと移動し、その細胞表面に抗原を結合したＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩタンパク質を発現し、共刺激分子と呼ばれるタンパク質を介してＴ細胞と結合し、抗原提示を行う。また、この際、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γなどの多くのサイトカインやケモカインを産生する。このような抗原提示細胞としては、血液中の樹状細胞及び単球、皮膚中のランゲルハンス細胞等が知られている。活性化した抗原提示細胞により、抗原提示を受けたＴ細胞は、記憶Ｔ細胞となり、皮膚感作が成立する。さらに、皮膚におけるケラチノサイトのように、抗原提示に直接関わっていないが、感作性物質に反応して様々なサイトカインを分泌することで、皮膚感作の成立を促進する細胞も存在する。したがって、皮膚感作の成立過程は、複数の細胞が関与し、さらに多くのサイトカインが様々な効果を発揮することで成り立っており、極めて複雑な生体反応である。
【０００４】
皮膚感作の成立過程の複雑さから、動物を用いない感作性評価方法の開発は困難であった。しかし近年、皮膚感作の成立過程における３つの主要なメカニズムである（１）皮膚に浸透した皮膚感作性物質の生体タンパク質との結合、（２）生体タンパク質と結合した感作性物質に対する角化細胞の防御反応、（３）樹状細胞（ランゲルハンス細胞）の活性化のそれぞれの生体反応に基づいた評価法がそれぞれ開発されている。それら評価法の代表的なものとしてはそれぞれ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＤＰＲＡ）：ペプチド結合性試験（非特許文献６）、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ：角化細胞株レポーターアッセイ（非特許文献７）、ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ｈ−ＣＬＡＴ）（非特許文献８）が知られている。
【０００５】
ＤＰＲＡは、皮膚感作性成立の初期段階の反応であるハプテンとタンパク質の結合性を調べることにより、皮膚感作性の有無を予測する試験法である。皮膚内のタンパク質の代わりに７個のアミノ酸からなる合成ペプチドのシステイン含有ペプチドとリジン含有ペプチドの２種類を使用する。化学物質とそれぞれのペプチドを混合することにより反応させ、混合２４時間後における未反応のペプチド量をＨＰＬＣで分離定量する。化学物質の反応性は、測定ごとのペプチド減少率から平均値を算出し、皮膚感作性を予測評価する（非特許文献６）。
【０００６】
ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄは、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙを利用し、ケラチノサイト由来ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いたレポーターアッセイである。Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙは、転写因子Ｎｒｆ２、Ｎｒｆ２の抑制因子Ｋｅａｐ１及びＡＲＥが関係する遺伝子発現経路である。Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合し、ＡＲＥに依存して発現する遺伝子群の発現量を制御している。Ｋｅａｐ１のシステイン残基に求電子性の化学物質が結合すると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離し、核内に移行してＤＮＡ上のＡＲＥに結合する。その結果、下流の遺伝子群の発現が誘導され、化学物質による障害から細胞を保護するために機能する。皮膚感作性を有する多くの化学物質がＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙを活性化することが知られていることから、皮膚感作性評価法として利用されている。ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄでは、ＡＫＲ１Ｃ２遺伝子（樹状細胞において皮膚感作性物質により発現誘導される遺伝子の１つ）のＡＲＥを融合させたＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子のプラスミドを安定的に導入したＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト由来培養細胞株）を用いる。化学物質によりＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙが活性化されるとルシフェラーゼ遺伝子が発現する。基質を添加してルシフェラーゼが触媒する反応の発光強度を測定することにより、化学物質の皮膚感作性を評価する（非特許文献７）。
【０００７】
ｈ−ＣＬＡＴでは、樹状細胞のモデルとしてヒト単球系培養細胞であるＴＨＰ−１細胞を用い、被験物質がＴＨＰ−１細胞を活性化する能力を評価する。ＴＨＰ−１細胞に被験物質を添加して２４時間培養した後、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で蛍光標識したＣＤ８６及びＣＤ５４の特異抗体、及びｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーにより細胞表面分子ＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量、並びに細胞生存率を測定する。被験物質で処理した時のＣＤ８６及びＣＤ５４それぞれの平均蛍光強度を、溶媒のみを添加したコントロールと比較し、相対蛍光強度を算出する（非特許文献８）。
【０００８】
上記の３試験法は、すでにＯＥＣＤテストガイドラインとして承認されており、皮膚感作性試験代替法として妥当であることが認められている。しかし、適用できる被験物質等に関しては、課題が残されている。例えば、ＤＰＲＡは、ハプテンとタンパク質の結合反応が溶媒中で行われ、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄやｈ−ＣＬＡＴにおいては、培地中に浸漬させた細胞と被験物質との反応が必要となるため、いずれの方法においても被験物質を溶媒やバッファーあるいは培地に溶解させる必要があることより、難溶性物質については適用限界とされている。この課題を解決するため、難溶性物質の皮膚感作性を評価することのできる方法がいくつか開発されている（特許文献１、２）が、いずれの方法においても各測定の際に細胞を溶解する必要があったり、工程が煩雑だったりといった問題点が残されていた。このことから、培地中に被験物質を溶解させる必要がなく、細胞を溶解せずに生きたままの状態で測定を行い、簡便に皮膚感作性を評価することが望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９６９，５２，２６８−２７６
【非特許文献２】Ｓａｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，１９８１，７，２５５−２５７
【非特許文献３】Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｅ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １９６５，９１，１７１−１７７
【非特許文献４】多田富雄，免疫学イラストレイテッド  原書第５版，南江堂
【非特許文献５】Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２，２４５−２５２
【非特許文献６】ＪａＣＶＡＭ  新規試験法提案書  皮膚感作性試験代替法  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （ＤＰＲＡ）：ペプチド結合性試験  平成２７年３月  国立医薬品食品衛生研究所
【非特許文献７】ＪａＣＶＡＭ  新規試験法提案書  皮膚感作性試験代替法  角化細胞株レポーターアッセイに関する提案  平成２７年８月  国立医薬品食品衛生研究所
【非特許文献８】ＪａＣＶＡＭ  新規試験法提案書  皮膚感作性試験代替法  ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ｈ−ＣＬＡＴ）  平成２９年３月  国立医薬品食品衛生研究所
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１２−１７９０２０号公報
【特許文献２】特開２０１３−２３００９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、上述した実情に鑑み、難溶性物質の皮膚感作性の有無及び強弱を、細胞を溶解することなく、生きたままの状態で、簡便に評価することができる系及び三次元培養表皮モデルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターを導入したケラチノサイトを作製し、このケラチノサイトを用いて三次元培養表皮モデルを作製し、この三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露した後の培地を基質と反応させて発光強度及び／又は蛍光強度を測定することにより、細胞を溶解せずに生きたままの状態で皮膚感作性を簡便に評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］分泌型レポータータンパク質をコードする核酸配列の上流にプロモーター配列及びプロモーター配列の上流のエンハンサー領域にＡＲＥ配列を有するレポーターベクターを導入して形質転換することによって樹立された細胞株からなる三次元培養表皮モデル。
［２］前記レポーターがルシフェラーゼ（発光酵素）である、［１］記載の三次元培養表皮モデル。
［３］前記レポーターが蛍光物質である、［１］記載の三次元培養表皮モデル。
［４］以下の工程を含む、三次元培養表皮モデルの製造方法。
（１）エンハンサー領域にＡＲＥ配列を有することを特徴とする分泌型レポータープラスミドを編集、構築する工程。
（２）工程（１）で得られたレポータープラスミドベクターをケラチノサイトに導入する工程。
（３）工程（２）で得られたケラチノサイトを三次元培養する工程
［５］［１］〜［３］のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する方法。
［６］［１］〜［３］のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性増強作用を評価する方法。
［７］［１］〜［３］のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性抑制作用を評価する方法。
［８］［１］〜［３］のいずれか一項記載の三次元培養表皮モデルを含む、皮膚感作性評価用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙを利用して皮膚感作性を評価することのできる、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターを安定的に導入した三次元培養表皮モデル及びその製造方法が提供される。本発明の分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデルは、難溶性物質の皮膚感作性を評価する場合に、細胞溶解といった煩雑な作業を行うことなく、生きたままの状態で簡便に測定でき、同じ三次元培養表皮モデルを用いて細胞生存率などの情報を取得できる。また、本発明の分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデルでは、細胞を溶解することなく測定を行うことが可能であるため、一定間隔をおいた連続した測定により、被験物質に対する細胞の時間経過に伴う反応を測定することも可能である。また、被験物質を組み合わせることによって、皮膚感作性増強作用や皮膚感作性抑制作用を評価することもできる。よって、本発明の分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデルは、難溶性物質を含む被験物質の皮膚感作性評価のほか、皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用等の有効性評価などに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデル
本発明の分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデルは、ＡＲＥ応答性レポーターを培地中に分泌することを特徴とする。
【００１６】
ＡＲＥとは、遺伝子上流に存在する抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）又は親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）のことであり、感作性物質応答遺伝子の上流に存在することが知られている。ＡＲＥはレポータープラスミド内に１つ用いてもよく、２つ以上を用いてもよい。
【００１７】
分泌型レポーターには分泌シグナル配列が付加されおり、発現したルシフェラーゼ及び／又は蛍光タンパク質は細胞外に分泌される。分泌シグナル配列としては、細胞外への分泌を誘導するものであれば特に限定はされないが、例えば、ＩＬ−６分泌シグナル配列などが挙げられる。
【００１８】
２．三次元培養表皮モデルの製造方法
本発明の分泌型レポーター安定発現三次元培養表皮モデル作製方法は、（１）ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミドを構築する工程と、（２）工程（１）で得られた分泌型レポータープラスミドをケラチノサイトに導入する工程と、（３）工程（２）で得られたケラチノサイトを三次元培養する工程を含む。
【００１９】
まず、工程（１）では、ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミドを構築する。レポーターとしては、蛍光発光、化学発光又は比色反応のいずれか１種類以上の測定系で検出できれば特に限定はされないが、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。ルシフェラーゼとしては、生細胞に対して毒性がなく、定量性に優れたものであれば特に限定はされないが、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（ＮａｎｏＬｕｃ；登録商標）などが挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等が挙げられる。これらのレポーターは、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。プロモーターとしては、例えば、ｍｉｎＰ（ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＨＳＶ−ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｈｅｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等でもよいが、ｍｉｎＰが望ましい。
【００２０】
次に、工程（２）では、ケラチノサイトにレポーターベクターを導入する。ケラチノサイトは、不死化ケラチノサイトでも正常ケラチノサイトでもよいが、不死化ケラチノサイトが好ましい。不死化ケラチノサイトは購入しても作製してもよい。不死化方法については、ケラチノサイトなどの上皮細胞の培養細胞を不死化させ、かつ細胞死を誘導しない方法であれば限定はされないが、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ウイルス遺伝子（ＳＶ４０Ｔ、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７、ＥＢＶ等）による方法などが挙げられる。細胞の由来は哺乳動物であれば特に限定はされず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられるが、ヒトであることが好ましい。
【００２１】
レポーターの種類は、前述のとおりである。レポータープラスミドのケラチノサイトへの導入は、工程（１）で構築したレポーターベクター（ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミド）をエレクトロポレーション法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いてケラチノサイトに導入することにより行うことができる。
【００２２】
次に、工程（３）では、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターベクターを導入したケラチノサイトを用いて三次元培養を行う。三次元培養は、ケラチノサイトを空気暴露により重層化させ皮膚を再構成させるという、当分野で一般的に用いられている下記の三次元培養皮膚の作製方法に従って行うことができる。
【００２３】
三次元培養皮膚の作製は、細胞の増殖培養工程と分化誘導工程からなる。増殖培養工程においては、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターベクターを導入したケラチノサイト（以下、単にケラチノサイトという）を、培養インサート等の培養容器内で底面にコンフルエントになるまで増殖培養させる。具体的には、ケラチノサイトを細胞増殖用培地に分散し、この細胞分散液を、液透過性膜を底面に有する培養インサートに播種し、培養インサートの外部も同じ細胞増殖用培地で満たして、液透過性膜上のケラチノサイトが細胞増殖用培地中に浸漬した状態で培養する。液透過性膜によって、培養インサートの内部と外部とは培地が透過可能なように連通している状態が維持される。ここで、細胞培養インサートに添加するケラチノサイトの数は、特に限定されないが、通常１５×１０４〜１２０×１０４細胞／ｃｍ２が好ましく、３０×１０４〜９０×１０４細胞／ｃｍ２がより好ましい。
【００２４】
培養インサートの液透過性膜は、播種したケラチノサイトが接着又は固定され、その上でケラチノサイトが増殖でき、支持体となりうるものであれば、特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等の膜が挙げられる。また、当該膜にコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックスやポリＬ−リジン等の細胞の接着を補助するものをコーティングしてもよい。
【００２５】
さらに、支持体として培養インサートを用いる他に、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジもしくは上皮や線維芽細胞が除去された無細胞化真皮を用いてもよい。これらを支持体として用いる場合には、適宜線維芽細胞を組み込んでもよい。また、これらの支持体には支持体表面にガラスリングを設置し、その中にケラチノサイトの細胞懸濁液を添加するのが好ましい。
【００２６】
増殖培養は、例えば１〜６日間、好ましくは２〜４日間行う。また、この間、培地を適宜交換してもよい。培養インサートにおいて増殖したケラチノサイトがコンフルエントの状態にあるかどうかは、ＣｎＴ−ＳＴ−１００  ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（ＣＥＬＬｎ  ＴＥＣ社製）等の細胞染色試薬により確認することができる。また、培養インサート内の培養液の液面が、培養インサート外の培養液の液面よりも高くなったときに、ケラチノサイトがコンフルエントになったと判断することもできる。
【００２７】
次に、分化誘導工程では、培養インサートの内部及び外部の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に変更し、当該培地にてケラチノサイトを６〜４８時間程度浸漬培養した後、培養インサートの内部及び外部のすべての培地をアスピレーターで除去し、インサート外部に細胞分化用培地を添加し、培養インサート内部のケラチノサイトは空気（大気）に暴露し、５〜１２日間培養して、重層化した表皮細胞に分化誘導する。
【００２８】
上記の細胞増殖用培地としては、例えば、ケラチノサイトの増殖や継代培養に適した基本培地であれば、特に限定はされないが、無血清・低カルシウム濃度の基本培地であることが好ましく、例えば、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）等の市販の培地を使用すればよい。上記培地には、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）等が含有されていてもよい。また、増殖速度を増大させるために、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｌ−グルタミン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメントが含有されてもよい。また、必要に応じて、抗生物質を添加してもよい。細胞増殖用培地のカルシウム濃度は、約０．０３〜０．１５ｍＭが好ましい。
【００２９】
上記の細胞分化用培地としては、ケラチノサイトの分化誘導に適した基本培地であれば、特に限定はされないが、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ  ３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎ  ＴＥＣ社製）等の市販の培地を使用すればよい。また、細胞分化用培地のカルシウム濃度は、約１．２〜１．５ｍＭが好ましい。
【００３０】
増殖及び分化誘導のための培養温度は、細胞の由来により異なるが、例えばヒト由来の場合３０℃〜４０℃が好ましく、３６〜３８℃がより好ましい。また、ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％が好ましく、約２〜５％がより好ましい。
【００３１】
上記の遺伝子改変したケラチノサイトを培養して重層化した表皮細胞を作製する工程は、ミリセルセルカルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ケラチノサイト三次元培養スターターキット（フナコシ社製）等の市販の培養表皮作製用キットを利用してもよく、該キットに梱包された培地、培養インサートを用いて該キットに添付の指示書に従って行うことができる。
【００３２】
本発明の上記三次元培養表皮モデルは、キット化してもよく、当該キットには、例えば、表皮細胞の培養に適した培地や容器、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることができる。
【００３３】
３．皮膚感作性物質の評価方法
本発明の皮膚感作性物質の評価方法は、（１）分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露する工程と、（２）工程（１）で被験物質を暴露した三次元培養表皮モデルの培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度を測定する工程を含む。
【００３４】
まず、工程（１）では、培地中の分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルに被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下にて、６〜４８時間、好ましくは１６〜２４時間培養する。また、皮膚感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価においては、培地中の分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルに既知の感作性物質と被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下にて、６〜４８時間、好ましくは１６〜２４時間培養する。
【００３５】
次に、工程（２）では、培養終了後、分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルによって培地中に分泌されたルシフェラーゼ及び／又は蛍光タンパク質の発現量を測定する方法として、プレートリーダーを用いたルシフェラーゼアッセイ等を用いることができる。
【００３６】
ルシフェラーゼアッセイに用いる基質としては、ライセンスプログラムに基づき、ルシフェラーゼレポーターベクターに適した、購入元指定の試薬キットを用いることができる。
【００３７】
４．分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルの使用方法
本発明の分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルは、動物実験の代替法として、化粧品や皮膚外用剤、化学物質（洗剤、衣服用染料等）の有効性や安全性の評価に用いることができる。例えば、安全性の評価には、皮膚感作性の有無等が挙げられ、有効性の評価としては、皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用の有無等が挙げられる。
【００３８】
本発明において、化粧品や医薬品の有効性や安全性の評価、及びスクリーニングは、本発明の分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルに被験物質を暴露し、該細胞の被験物質への応答性を発光又は蛍光イメージングによって観察することによって行うことができ、発光強度及び／又は蛍光強度の変化が評価の指標となる。この際、被験物質を暴露しない本発明の分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルを対照とし、その観察結果と比較することで正確な評価が可能となる。また、被験物質の皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用の有無を調べる際には、被験物質を既知の感作性物質と混合して暴露し、一定時間後に発光強度及び／又は蛍光強度を測定し、既知の感作性物質のみを暴露した際のものと比較することによって評価することができる。被験物質は、被験物質原体を直接もしくはアセトン等に溶解させ、分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルに上部より暴露する。
【００３９】
被験物質は、主に化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物など）；及び天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物）；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。
【００４０】
発光の測定は、発光プレートリーダー等を用いて行うことができる。発光プレートリーダーは、発光測定用に市販されている発光測定装置であれば特に限定はされない。ある一定の時間でのみ測定してもよいが、一定の時間間隔で経時的にレポーターが分泌された培地を採取し測定することにより、細胞によるレポーター発現の変化を観察することができる。
【００４１】
蛍光イメージングによる細胞の観察及び測定は、蛍光を可視化できる顕微鏡又は蛍光プレートリーダー等を用いて行うことができる。蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡本体、及び検出器を備え、生細胞観察用に市販されている蛍光イメージング装置であれば特に限定はされない。観察は、蛍光を直接肉眼で行ってもよく、又は写真撮影をして画像を取得し、該画像に基づいて行ってもよい。写真撮影により得られた画像に基づいて観察する場合、ある一定の時間でのみ撮影して画像を取得してもよいが、一定の時間間隔で経時的に連続撮影（タイムラプス撮影）を行って画像を取得することにより、細胞の変化の動的可視化を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）分泌型レポーター導入三次元培養表皮モデルを用いた難溶性物質の皮膚感作性評価
まず、ｐＮＬ２．３［ｓｅｃＮｌｕｃ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のマルチクローニングサイトにｍｉｎＰを、さらにｍｉｎＰの上流のエンハンサー領域にＡＫＲ１Ｃ２遺伝子のＡＲＥを挿入してＡＲＥ応答性分泌型レポーターベクターを構築した。
【００４３】
次に、細胞不死化試薬（Ｌｅｎｔｉ−ｈＴＥＲＴ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）により、正常ヒトケラチノサイト（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫ、クラボウ社製）を製造者のプロトコールに従って不死化した。以降の実施例に記載するＨＥＫは全てこの不死化ＨＥＫである。ＨＥＫは、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて培養した。
【００４４】
次に、構築したＡＲＥ応答性分泌型レポーターベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いてＨＥＫにトランスフェクション法により遺伝子導入した。薬剤選択により安定発現株を樹立し、皮膚感作性物質に反応すると分泌型レポーターの発現が増強する細胞を樹立した。
【００４５】
次に、当該細胞を用いて定法により三次元培養表皮を作製した。具体的には、上記ＨＥＫをミリセルセルカルチャーインサート（２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ用）に２０万個播種し、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭにて３日間培養後（培地量はインサート内４００μＬ、インサート外１０００μＬ）、インサート内外の培地を除き、分化培地であるＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ  ３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社製）に交換した（培地量はインサート内４００μＬ、インサート外１０００μＬ）。翌日、インサート内外の培地を除き、インサート外部にのみＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ  ３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍを７００μＬ添加し、空気暴露を１０日間行い、三次元培養表皮を作製した。
【００４６】
被験物質は、アセトンとオリーブ油を４：１の比率（ｖ／ｖ）で混合した溶媒（ＡＯＯ）にて適切な濃度に希釈した。希釈した被験物質１０μＬを作製した三次元培養表皮角質層側に全体に広がるように適用した。被験物質としては、皮膚感作性陽性物質として公知の感作性物質であるシンナムアルデヒド（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を最終濃度０．０５、０．１、０．２％（ｗ／ｖ）、培地へ難溶かつ皮膚感作性陽性物質として公知の感作性物質である１２−ブロモ−１−ドデカノール（東京化成工業社製）を最終濃度０．５、１％（ｗ／ｖ）、皮膚感作性陰性物質としてグリセロール（和光純薬工業社製）を最終濃度０．０５、０．１、０．２％（ｗ／ｖ）、又は最終濃度０．５、１％（ｗ／ｖ）となるように調整したもの及び溶媒対照（ＡＯＯ）を用いた。３７℃のＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養後、それぞれ培地を５０μＬずつ採取し同量の発光基質であるＮａｎｏ  Ｌｕｃ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、５分間インキュベート後、プレートリーダーにて発光強度を測定した。測定結果を解析した結果、シンナムアルデヒド暴露群（表１）及び１２−ブロモ−１−ドデカノール暴露群（表２）では、溶媒対照群と比較して、発光強度の濃度依存的な増強が認められた。一方、グリセロール暴露群では、コントロール群と比較して、発光強度の増強は見られなかった（表１、２）。
【００４７】
【表１】
2020074690.tif 000002
【００４８】
【表２】
2020074690.tif 000003
【００４９】
以上の結果から、当該三次元培養表皮を用いれば、皮膚感作性物質であるか否かの評価が非常に詳細にかつ簡便にできることが明らかとなった。また、本評価法は、細胞が生きたまま測定できるので、例えば本評価の後に細胞生存率の測定などを同一サンプルを用いて行うことができる。これに対し、従来法では、発光強度の測定には、細胞溶解処理が必要であり、経時的な観察を行うためには、各日数ごとにサンプルを用意しなければならず、また同一サンプルの経時的な観察を行うことはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のＡＲＥ応答性分泌型レポーター導入三次元培養表皮を用いた皮膚感作性評価法は、培地等に難溶な被験物質にも適用でき、細胞を溶解することなく皮膚感作性の指標となる発光強度を測定し、皮膚感作性の有無を判定することができる。従って、本発明のＡＲＥ応答性分泌型レポーター導入三次元培養表皮を用いた皮膚感作性評価法によれば、動物実験を行わずに医薬品や化粧品原料の安全性や有効性の評価試験を行うことができ、当該細胞は、化粧品や医薬品の製造分野、皮膚科学研究分野などに利用できる。