(57)【要約】【課題】前眼房／後眼房容積の変化、硝子体液の変化、および／または網膜剥離を含む眼疾患を予防、遅延、または治療するための組成物を製造するために使用することができるコルディセプス・シカダ菌糸体活性物質の使用を提供する。【解決手段】コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法は、以下のステップを含む：（ａ）コルディセプス・シカダ菌糸体を、１５〜３５℃で５〜１４日間、プレート培地で培養するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）のコルディセプス・シカダ菌糸体をフラスコに接種し、菌糸体を１５〜３５℃で３〜７日間、ｐＨ２〜８にて培養するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）のコルディセプス・シカダ菌糸体を発酵槽に接種し、菌糸体を、１５〜３５℃で３〜５日間、ｐＨ２〜８にて撹拌しながら培養して、コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を含むコルディセプス・シカダ菌糸体発酵液を得るステップ。【選択図】図１
2020029448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前眼房／後眼房容積の変化、硝子体液の変化、および網膜剥離の少なくともいずれかを予防、遅延、または治療するための組成物を製造するための、コルディセプス・シカダ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｉｃａｄａｅ）菌糸体活性物質の使用であって、前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法が、
（ａ）コルディセプス・シカダ菌糸体を、１５〜３５℃で５〜１４日間、プレート培地で培養するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）のコルディセプス・シカダ菌糸体をフラスコに接種し、前記菌糸体を１５〜３５℃で３〜７日間、ｐＨ２〜８にて培養するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）のコルディセプス・シカダ菌糸体を発酵槽に接種し、前記菌糸体を、１５〜３５℃で３〜５日間、ｐＨ２〜８にて撹拌しながら培養して、前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を含むコルディセプス・シカダ菌糸体発酵液を得るステップ
を含む使用。
【請求項２】
前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法が、
（ｄ）前記コルディセプス・シカダ菌糸体発酵液を凍結乾燥し、その凍結乾燥産物を粉砕して、前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を含むコルディセプス・シカダ菌糸体粉末を得るステップ
をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法が、
（ｅ）前記コルディセプス・シカダ菌糸体粉末を溶媒で抽出して、前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を含むコルディセプス・シカダ菌糸体液体抽出物を得るステップ
をさらに含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法が、
（ｆ）前記コルディセプス・シカダ菌糸体液体抽出物を乾燥させて、前記コルディセプス・シカダ菌糸体活性物質を得るステップ
をさらに含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ステップ（ｅ）の溶媒が水またはアルコールから選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の培養が振とうフラスコ培養であり、振とう速度が１０〜２５０ｒｐｍである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ステップ（ｃ）の発酵槽に気体がさらに供給され、供給される気体が、空気、酸素、二酸化炭素、ヘリウム、またはそれらの組合せを含み、前記発酵槽の圧力が０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２であり、通気量が０．０１〜１．５ＶＶＭである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記組成物が、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントをさらに含む医薬組成物である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が食品添加物である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物の投与が、経口薬物、滴剤、または坐剤の形態での投与を含む、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイド誘導性眼疾患を予防、遅延、または治療するためのコルディセプス・シカダ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｉｃａｄａｅ）（Ｃ．シカダ（Ｃ．ｃｉｃａｄａｅ））菌糸体活性物質およびその組成物の使用に関し、特に、前眼房／後眼房容積の変化、硝子体液の変化、および／または網膜剥離を予防、遅延、または治療するための組成物を製造するためのコルディセプス・シカダ菌糸体活性物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルディセプス・シカダ（Ｃ．シカダ）
説明および分布
コルディセプス・シカダは、子嚢菌類門、クラリシピヤレス（Ｃｌａｒｉｃｉｐｉｙａｌｅｓ）目、バッカクキン（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）科、コルディセプス真菌属である。コルディセプス種は、もっぱら、シカダ・フラマーテ（Ｃｉｃａｄａ  ｆｌａｍｍａｔｅ）、プラティプレウラ・ケンペリ（Ｐｌａｔｙｐｌｅｕｒａ  ｋａｅｍｐｆｅｒｉ）、クリプトティンパナ・プスツラータ（Ｃｒｙｐｔｏｔｙｍｐａｎａ  ｐｕｓｔｕｌａｔａ）、プラティロミア・ピエリ（Ｐｌａｔｙｌｏｍｉａ  ｐｉｅｌｉ）、およびさらに多数の幼虫に寄生する昆虫−真菌複合体である。寄生した後、コルディセプス属は、幼虫の前方端部またはセミの頭部に花芽状の子座を形成する。Ｃ．シカダ、Ｃ．ソボリフェラ（Ｃ．ｓｏｂｏｌｉｆｅｒａ）、およびＣ．シカジコラ（Ｃ．ｃｉｃａｄｉｃｏｌａ）が、最も一般的なタイプのコルディセプスであり、それらが生息する宿主に基づいて分類される。この属は、揚子江南部の亜熱帯および熱帯地方、つまり中国の福建、浙江、四川、雲南、および江蘇に主に分布している。野生Ｃ．シカダの子実体は、台湾のある山岳地方にも見出される。
【０００３】
ペシロマイセス・シカダ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃａｄａｅ）の有性段階は、Ｃ．シカダと呼ばれる。それは、宿主の頭部から突出する茶色の棒状または角状の孤立子座または子座集塊を担持する。しかしながら、最も広く分布している種はペシロマイセス・シカダであり、Ｃ．シカダは依然として稀少である。
【０００４】
１．ステロイドおよび眼科学におけるそれらの使用
ステロイドは、強力な抗炎症および免疫調節効果を発揮することができ、脈管炎などの炎症性疾患、喘息、アレルギー性疾患、慢性湿疹、アナフィラキシー、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患（エリテマトーデス、皮膚筋炎、多発性筋炎、糸球体腎炎、炎症性関節炎、および硬皮症など）、脳水腫、ある種の炎症性ニューロパシー、およびがん（リンパ腫など）の治療に非常に有益である。一般的なタイプのステロイドとしては、オキシメトロン、テストステロンウンデカン酸エステル、オキサンドロロン、デヒドロメチルテストステロン、メピチオスタン、およびスタノゾロールなどが挙げられる。多くのタイプのステロイド含有製剤が存在し、注射により、経口的に、経鼻的に、または局所的に投与することができる。
【０００５】
オフタルミン酸ステロイドは、副腎グルココルチコイドに由来するコルチコステロイドである。副腎グルココルチコイドは、一般的にコルチゾールおよびコルチコステロンが挙げられるが、副腎皮質により分泌され、通常は、安定濃度レベルで血液中に存在する。身体が経験する外部ストレスが大きくなるにつれて、より多くの副腎グルココルチコイドが血液中に分泌される（「ストレスホルモン」とも呼ばれる所以である）。副腎グルココルチコイドのこのような分泌増加は、炎症に対処すること、血圧レベルを維持すること、血糖レベルを上昇させること、カルシウムを吸収すること、胃酸を分泌すること、ならびにタンパク質、脂肪、炭水化物、電解質、および水の代謝を調節することを含む種々の生理学的反応を強化することにより、ストレスレベルとの闘いを支援する。
【０００６】
ステロイドは、主にコルチコステロイドが、様々な炎症関連症状および後遺症を緩和することができるだけでなく、種々の状況下で身体に生じる炎症性免疫応答を抑制することができるため、眼疾患の治療に使用される。コルチコステロイドは、前房炎または眼自己免疫疾患を有する患者、または角膜移植を受けた患者に好適である。眼科用ステロイドは、抗炎症効果の点では、典型的には以下の順にランク付けされる：ベタメタゾン≧デキサメタゾン＞＞トリアムシノロン＞プレドニゾロン＞＞ヒドロコルチゾン。
【０００７】
２．ベタメタゾン
本発明で使用されるステロイドは、１９６１年に米国で医療用に承認されたコルチコステロイドの一種であるベタメタゾンである。ベタメタゾンは、関節リウマチおよび全身性エリトマトーデスなどのリウマチ性疾患、皮膚炎および乾癬などの皮膚疾患、ならびに喘息および血管浮腫などのアレルギー性疾患を含む広範な疾患の治療に有用である。また、ベタメタゾンは、クローン病、白血病、およびフルドロコルチゾンとの併用時には副腎不全を治療するだけでなく、早産児の肺発育を刺激するために使用することができる。ベタメタゾンは、経口で、筋肉内注射により、または軟膏の形態で局所的に投与することができる。ＷＨＯ必須医薬品モデルリストに含まれているものの中でも、ベタメタゾン軟膏は、公衆衛生システムにとって不可欠である最も効果的で最も安全な薬物の１つであり、ジェネリック医薬品として使用することができる。
【０００８】
ステロイド誘導性副作用
ステロイド誘導性副作用は、用量および使用期間に直接関連し、この薬物が長期間または高用量で使用される場合に生じる可能性がより高い。ステロイドの長期使用は、副腎不全をもたらす場合がある。その一方で、ステロイド過剰投与は、副腎皮質の機能停止および最終的には萎縮をもたらす視床下部−下垂体−副腎皮質（ＨＰＡ）軸椎異常をもたらし、身体をステロイド依存性にする場合がある。重度副作用としては、以下のものが挙げられる：心血管障害、肝不全、糖尿病、皮膚障害、情緒不安、胃腸障害、感染症のリスク増加、筋無力症、月経周期の変化、男性の性機能低下、および重度アレルギー。
【０００９】
ステロイド誘導性副作用は、目の細胞免疫機能を阻害し、元々存在する微生物感染症を悪化させる場合がある。したがって、ステロイド目薬は、典型的には抗生物質との併用で使用される。加えて、ステロイド目薬は、角膜上皮創傷の治癒を阻害する場合があり、長期間にわたって使用されると、眼圧上昇および白内障などの他の眼疾患をもたらす場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／０３１２１７６号明細書
【特許文献２】台湾特許出願公開第２０１８１６１１６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｉｃａｄａｅ”，Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  ２０１５，５：４３２
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１７，５（５），３２０−３３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記に照らして、身体に生じる場合があるステロイド誘導性副作用を低減することは、喫緊の課題になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの実施形態によると、前眼房／後眼房容積の変化、硝子体液の変化、および／または網膜剥離を予防、遅延、または治療するための組成物を製造するための、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質の使用が提供される。Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法は、以下のステップを含む。
【００１４】
（ａ）Ｃ．シカダ菌糸体を、１５〜３５℃で５〜１４日間、プレート培地で培養するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）のＣ．シカダ菌糸体をフラスコに接種し、菌糸体を１５〜３５℃で３〜７日間ｐＨ２〜８にて培養するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）のＣ．シカダ菌糸体を発酵槽に接種し、菌糸体を、１５〜３５℃で３〜５日間ｐＨ２〜８にて撹拌しながら培養して、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を含むＣ．シカダ菌糸体発酵液を得るステップ。
【００１５】
１つの実施形態では、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法は、Ｃ．シカダ菌糸体発酵液を凍結乾燥し、凍結乾燥産物を粉砕して、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を含むＣ．シカダ菌糸体粉末を得るステップ（ｄ）をさらに含む。
【００１６】
１つの実施形態では、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法は、Ｃ．シカダ菌糸体粉末を溶媒で抽出して、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を含むＣ．シカダ菌糸体液体抽出物を得るステップ（ｅ）をさらに含む。
【００１７】
１つの実施形態では、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法は、Ｃ．シカダ菌糸体液体抽出物を乾燥して、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を得るステップ（ｆ）をさらに含む。
【００１８】
１つの実施形態では、ステップ（ｅ）の溶媒は、水またはアルコールから選択される。
１つの実施形態では、ステップ（ｂ）の培養は、振とうフラスコ培養であり、振とう速度は、１０〜２５０ｒｐｍである。
【００１９】
１つの実施形態では、ステップ（ｃ）の発酵槽に気体をさらに供給し、供給される気体は、空気、酸素、二酸化炭素、ヘリウム、またはそれらの組合せを含む。発酵槽の圧力は、０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２であり、通気量は、０．０１〜１．５ＶＶＭである。
【００２０】
１つの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントをさらに含む医薬組成物である。
１つの実施形態では、組成物は、食品添加物である。
【００２１】
１つの実施形態では、組成物を投与する経路としては、経口薬物、滴剤、または坐剤の形態での投与が挙げられる。
本発明の上記および他の態様をさらに示すために、添付の図面を参照して、幾つかの例示的な実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施例２による各群に由来するラットの目のＨ＆Ｅ染色組織学的切片の顕微鏡写真を示す図である。
【図２】本発明の実施例２による各群に由来するラットの目のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真を示す図である。
【図３】本発明の実施例２による各群に由来するラットの網膜のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真を示す図である。
【図４】本発明の実施例２による各群に由来するラットの水晶体のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を調製するための方法
コルディセプス・シカダ菌糸体の供給源
本発明のコルディセプス・シカダ（Ｃ．シカダ）菌糸体は、以下のステップにより得られる：天然台湾Ｃ．シカダ株を収集するステップ、その菌糸体を分離するステップ、および二次培養物をプレート培地で保存するステップ。菌株の遺伝子配列は、台湾食品工業発展研究所によりＣ．シカダと確認されている。しかしながら、本発明のＣ．シカダ菌糸体活性物質は、この属に由来するものに限定されないことが留意されるべきである。
【００２４】
液体培養
Ｃ．シカダ菌糸体を、１５〜３５℃（好ましくは、２５℃）で５日〜２週間、プレート培地に接種する。その後、菌糸体の菌株を、プレートからこすり落とし、フラスコに接種する。接種した菌糸体を、１５〜３５℃（好ましくは、２５℃）、ｐＨ２〜８（好ましくはｐＨ４〜７、より好ましくはｐＨ４．５）、および１０〜２５０ｒｐｍの振とう速度で３〜７日間、フラスコ中でインキュベートする。培養物を、さらに発酵槽（培養フラスコに類似したもの）に接種し、１０〜１５０ｒｐｍで撹拌するかまたは気泡撹拌し、その際、環境温度は１５〜３５℃（好ましくは、２５℃）に設定され、タンク圧力は０．５〜１．０ｋｇ（ｃｍ２）に設定され、ｐＨ値は２〜８に設定される。一方で、空気（空気、酸素、二酸化炭素、ヘリウム、またはそれらの組合せに置き換えてもよいが、好ましくは空気である）を、０．０１〜１．５ＶＶＭの通気量でタンクに供給する。得られた培養物を、３〜５日間インキュベートし、Ｃ．シカダ菌糸体発酵液を得る。発酵液は、菌糸体および上清を含む。上記培養条件は、例示に過ぎず、ユーザの必要性に応じて調整することができる。
【００２５】
本発明による培養フラスコおよび発酵槽のレシピは、以下の成分を含むことができる。
【００２６】
【表１】
2020029448.tif 000003
【００２７】
上記の成分中、炭素源および窒素源混合物は、穀物（小麦粉など）または豆科植物（大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）粉末または緑豆粉末など）であってもよく、無機塩は、硫酸マグネシウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、および硫酸鉄（ＩＩＩ）などであってもよく、炭水化物は、グルコース、フルクトース、マルトース、およびスクロースなどであってもよい。本発明で使用される培地のレシピは、上記の成分または割合に限定されず、実際の必要性に応じて調整することができることが留意されるべきである。
【００２８】
発酵液の乾燥
さらに、Ｃ．シカダ菌糸体の発酵液を、凍結乾燥粉末または他の剤形を得るための乾燥法に供する。乾燥法は、これらに限定されないが、噴霧乾燥、熱風乾燥、ドラム乾燥、および凍結乾燥などを含む。
【００２９】
抽出−水抽出
乾燥法によりＣ．シカダ菌糸体の発酵液から製作した凍結乾燥粉末は、蒸留水に溶解することができる。得られた溶液を、９０〜１２１℃で２０〜１２０分間加熱し、冷却後に、減圧濃縮または上記乾燥法の１つを使用して乾燥して、Ｃ．シカダ菌糸体の水抽出物を得ることができる。
【００３０】
抽出−アルコール抽出
乾燥法によりＣ．シカダ菌糸体の発酵液から製作された凍結乾燥粉末は、アルコール溶媒（１〜１００％メタノールまたはエタノールなど）に溶解してもよい。得られた溶液を、浸漬抽出、撹拌抽出、かき混ぜ抽出、または超音波抽出を含むが、これらに限定されない様々な方法を使用して抽出し、減圧濃縮または上記乾燥法の１つを使用して２０〜１２０分間乾燥して、Ｃ．シカダ菌糸体のアルコール抽出物を得ることができる。
【００３１】
Ｃ．シカダ菌糸体の上記発酵液、凍結乾燥粉末、水抽出物、およびアルコール抽出物の各々は、本発明のＣ．シカダ菌糸体活性物質を含む。上記方法を使用したＣ．シカダ菌糸体活性物質の調製、ならびに調製した物質の効果を評価するために実施された動物実験を、以下の実施例にて説明する。
【００３２】
実施例１：Ｃ．シカダ菌糸体活性物質の調製
Ｃ．シカダ菌糸体の菌株：この例で使用したＣ．シカダ株は、現在、台湾食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）に公的に寄託されている（ＢＣＲＣ番号：ＭＵ３０１０６）。しかしながら、本発明のＣ．シカダ菌糸体活性物質は、そのような菌株から調製された物質に限定されない。
【００３３】
プレート培養：Ｃ．シカダ菌糸体を、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）のプレート培地に接種し、その後２５℃で５日間インキュベートした。
フラスコでの培養：Ｃ．シカダ菌糸体株を、プレートからこすり落とし、フラスコに接種した。培養物を、以下のレシピを使用して、３日間、２５℃およびｐＨ４．５で、１２０ｒｐｍの振とうインキュベーターで増殖させた。
【００３４】
【表２】
2020029448.tif 000004
【００３５】
発酵槽での培養：フラスコ中の培養物を、上記レシピを含む発酵槽にさらに接種し、１０〜１５０ｒｐｍで撹拌するかまたは気泡撹拌し、その際、環境温度を２５℃に設定し、タンク圧力を０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２に設定し、ｐＨ値を４．５に設定した。一方で、空気を０．５〜１．０ＶＶＭの通気量でタンクに供給した。得られた培養物を、３日間インキュベートし、Ｃ．シカダ菌糸体発酵液を得た。その後、発酵液を凍結乾燥して、Ｃ．シカダ菌糸体の凍結乾燥粉末を得た。
【００３６】
抽出物の調製：
１．水抽出：Ｃ．シカダ菌糸体の凍結乾燥粉末を、２０倍容積の蒸留水に溶解した。溶液を、１００℃で３０分間加熱し、冷却した後で凍結乾燥して、Ｃ．シカダ菌糸体の水抽出物を得た。
【００３７】
２．アルコール抽出：Ｃ．シカダ菌糸体の凍結乾燥粉末を、２０倍容積のエタノールに溶解し、溶液を、超音波浴で１時間抽出した。その後、抽出懸濁液を遠心分離し、上清を減圧濃縮して、Ｃ．シカダ菌糸体のアルコール抽出物を得た。
【００３８】
結果：発酵槽で培養した２０メトリックトンのＣ．シカダ菌糸体発酵液を凍結乾燥し、およそ１１０ｋｇの凍結乾燥粉末に加工した（収率：０．５５％）。その後の抽出プロセス後、およそ４０ｋｇの水抽出物または１５ｋｇのアルコール抽出物を得た。以下の実施例では、Ｃ．シカダ菌糸体の水抽出物およびアルコール抽出物を使用して動物実験を実施した。
【００３９】
実施例２：ステロイド誘導性眼疾患の動物モデルおよび染色組織切片の分析
目のステロイド誘導性病理学的変化を有するラット動物モデルの作製
１．１  実験動物および群分け 
この例では、７〜８週齢のＳＤ雄ラットを使用した。水および研究餌（ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）５００１げっ歯動物餌、Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ  ＬＬＣ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を自由に与えた。動物はすべて、２２±２℃に管理された温度および１２時間の明／暗サイクル下に置かれた。
【００４０】
ラットを、６匹の４群に分割した：ブランク対照群、陰性対照群、水抽出物群、およびアルコール抽出物群。試験した物質はすべて、ラットの右眼に投与した。ラットはすべて、ブランク対照のラット以外は、結膜下注射でベタメタゾンを３週間投与して、眼疾患を誘導した。誘導および観察された眼疾患は、前眼房／後眼房容積および硝子体液の病理学的変化、水晶体変性、ならびに網膜剥離を含む。本明細書に記載のステロイド薬物はベタメタゾンに限定されないことが留意されるべきである。
【００４１】
１．２  投薬および実験手順
実験中、ブランク対照群および陰性対照群には、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を投与しなかった。一方、水抽出物群およびアルコール抽出物群には、５０ｍｇ／ｋｇ体重のこれら物質を、栄養管により４週間経口投与した。
【００４２】
実験の終了時に、ラットにＣＯ２で麻酔をかけ、腹大動脈から血液試料を採取し、放血により犠牲にした。右眼球を採取し、肉眼観察および病理組織学的検査で分析した。
目の種々の部分の損傷重症度の検査
２．１  染色組織切片の検査
ラットにＣＯ２で麻酔をかけ、血液試料を、腹大動脈からの放血により採取した。その後、右眼球を採取し、デビットソン液（ＤＦ）に浸漬した。固定液で４８時間固定した後、眼球を１０％中性緩衝ホルマリンに入れて、１週間固定した。その後、病理組織学的検査のために、固定組織のパラフィン切片を調製した。固定組織を、パラフィン包埋機（Ｈｉｓｔｏｅｍｂｅｄｄｅｒ、Ｌｅｉｃａ社、ドイツ）を使用してパラフィン包埋組織塊に加工し、その後、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社、ＲＭ−２１４５、ドイツ）を使用して、５μｍ切片に切断した。切片をＨ＆Ｅ染色で染色し、自動染色機（Ｓａｋｕｒａモデル、ＤＲＳ−６０Ａ）を使用して、アラビアゴムにマウントした。前眼房／後眼房容積および硝子体液の変化、水晶体変性、ならびに網膜剥離レベルを含む、組織病理学的変化を観察するために、マウントした切片を、光学顕微鏡検査（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ社、東京、日本）で検査した。検査の結果は、図１〜４に示されている。図中、Ａ群はブランク対照群であり、Ｂ群は陰性対照群であり、Ｃ群は水抽出物群であり、Ｄ群はアルコール抽出物群である。
【００４３】
図１は、ラットの目のＨ＆Ｅ染色組織学的切片の顕微鏡写真（２０×）を示す。図中、Ｂ群は、網膜剥離、および前眼房／後眼房容積の中程度の変化を示し、硝子体液の変化を伴っている。一方で、Ａ、Ｃ、およびＤ群は、網膜および前眼房／後眼房容積に可視的な組織病理学的変化を示していない。
【００４４】
図２は、目のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真（４０×）を示す。図中、Ｂ群は、前眼房／後眼房容積の中程度の変化を示し、硝子体液の変化を伴っている。一方で、Ａ、Ｃ、およびＤ群は、前眼房／後眼房容積に可視的な組織病理学的変化を示していない。
【００４５】
図３は、網膜組織のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真（４００×）を示す。図中、Ｂ群は、網膜厚の低減、網膜神経節細胞の形態学的異常、内顆粒層の核間の著しい空き空間を示すが、Ａ、Ｃ、およびＤ群は、網膜組織に可視的な組織病理学的変化を示していない。
【００４６】
図４は、水晶体組織のＨ＆Ｅ染色組織学的切片のより高倍率な顕微鏡写真（４００×）を示す。図中、Ｂ群は、水晶体に亀裂を示すが、Ａ、Ｃ、およびＤ群は、水晶体組織に可視的な組織病理学的変化を示していない。
【００４７】
２．２  眼球の病理組織学的検査
誘導性眼疾患の損傷重症度を５つの等級に分類する：等級１＝最小限（＜１％）；等級２＝軽度（＜１〜２５％）；等級３＝中程度（２６〜５０％）；等級４＝中程度／重度（５１〜７５％）；および等級５＝重度／高度（７６〜１００％）。眼球組織の各部分の病理組織学的検査の結果に基づいて、病理学的スコアの表を以下のように作成する。表中、眼球組織は、前眼房／後眼房、硝子体液、角膜、脈絡膜、強膜、網膜、および水晶体を含む。
【００４８】
【表３】
2020029448.tif 000005
【００４９】
上記の病理学的スコアの表に示されているように、ブランク対照群は、眼球組織のいずれの部分にも組織病理学的変化を示さない。陰性対照群は、以下のような、眼球組織の各部分の組織病理学的変化を示す：前眼房／後眼房における変化は中程度で、スコアは３であり；硝子体液における変化は中程度で、スコアは３であり；角膜における変化は中程度で、スコアは３であり；脈絡膜および強膜における変化は重度で、スコアは４であり；網膜における変化は最小限で、スコアは１であり；水晶体における変化は最小限で、スコアは１である。その一方で、水抽出物群およびアルコール抽出物群は、眼球組織のいずれの部分にも組織病理学的変化を示さず、これらの群と陰性対照群との差異は統計的に有意である。
【００５０】
上記の結果は、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質が、前眼房／後眼房容積および硝子体液の変化、ならびに網膜剥離、特にステロイドにより誘導される組織病理学的変化を含む眼疾患を予防、遅延、または治療することができることを示す。
【００５１】
実施例２では、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を、ラットに経口投与した。Ｃ．シカダ菌糸体活性物質はそれ自体、薬剤、栄養補助食品、または食品添加物として使用することができる。しかしながら、本発明のＣ．シカダ菌糸体活性物質の投与経路は、経口薬物に限定されず、注射、滴剤、および坐剤などが挙げられる。
【００５２】
要約すると、本発明の実施形態に開示されているように、Ｃ．シカダ菌糸体発酵液、Ｃ．シカダ菌糸体凍結乾燥粉末、Ｃ．シカダ菌糸体水抽出物およびアルコール抽出物、ならびにそれらから製造された医薬組成物はすべて、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を含んでおり、前眼房／後眼房容積および硝子体液の変化ならびに網膜剥離を含む眼疾患の予防、遅延、または治療に有用である。このように、Ｃ．シカダ菌糸体活性物質を含む発酵液、凍結乾燥粉末、水抽出物、およびアルコール抽出物を、当技術分野で公知の食品生産方法を使用して、上記眼疾患を予防または遅延するための栄養補助食品に加工することができる。
【図１】
2020029448.tif 000006
【図２】
2020029448.tif 000007
【図３】
2020029448.tif 000008
【図４】
2020029448.tif 000009