(57)【要約】【課題】嗅覚受容体発現細胞を用いた匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法を提供することを課題とする。【解決手段】昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法であって、10〜100倍の希釈倍率で尿試料を希釈する工程を含む、尿試料の調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法であって、
10〜100倍の希釈倍率で尿試料を希釈する工程を含む、
尿試料の調製方法。
【請求項２】
前記嗅覚受容体タンパク質は、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53及びBmOR1から選択される1種又は2種以上である、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記昆虫細胞は、ガ由来の細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記昆虫細胞は、Sf21、Sf9、High Five及びTni由来細胞から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項５】
前記昆虫細胞は、細胞内イオン濃度の変化に基づいて蛍光を発する蛍光タンパク質を発現しており、
前記信号は、嗅覚受容体タンパク質と匂い物質との結合による細胞内イオン濃度の変化に基づいて、前記蛍光タンパク質が発する蛍光である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記匂い物質は、生体由来の揮発性有機化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項７】
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法により調製された尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
匂い物質の検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の検出方法により検出された匂い物質の量を、対照の試料の匂い物質の量と比較し、匂い物質の量を指標として疾患を判定する工程を含む、
疾患の検査方法。
【請求項９】
尿試料の匂い物質の量が、対照の尿試料の匂い物質の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定し、
尿試料の匂い物質の量が、対照の尿試料の匂い物質の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する、
請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記疾患は、がん、感染症及び糖尿病から選択される、請求項８又は９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記がんは、膀胱がん、肺がん及び乳がんから選択される、請求項１０に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿試料の調製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫は、触角で機能発現する嗅覚受容体によって、環境中に存在する、揮発性有機化合物（Volatile Organic Compounds：VOC）を含むさまざまな匂い物質を高感度かつ選択的に検出する。これまでに、本発明者らは、昆虫の嗅覚受容体を発現させた昆虫由来の培養細胞Sf21細胞を匂い検出素子として開発する技術を確立してきた（特許文献１及び２）。本技術に従い作出した細胞系統は、蛍光強度変化量として匂い物質を高感度かつ選択的に検出する匂い検出素子として利用できる。対象臭を検出する嗅覚受容体を発現させることで、受容体の応答特性に従った匂い検出素子が作出できる一方、これまでに生体試料への実用はなされていない。
【０００３】
他方、疾患の診断分野、予防・早期発見のためのヘルスケア分野では、簡便且つ、感度、特異性が高く、非侵襲的な検査技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2013-27376号公報
【特許文献２】特開2018-113957号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、嗅覚受容体発現細胞を用いた匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
採取の簡便性、取扱いの容易性等の観点から生体試料として、尿は有用である。そこで、本発明者らの作出した上記昆虫の嗅覚受容体タンパク質（以下、単に「嗅覚受容体」と言うことがある）を発現している細胞（以下、単に「嗅覚受容体発現細胞」または「センサ細胞」と言うことがある）を尿試料に適用したところ、尿試料に含まれる夾雑物質や匂い物質等が影響し、十分な感度等が得られないことがあることが判った。そこで、嗅覚受容体発現細胞へ適用するための尿試料の調製方法について鋭意検討したところ、尿試料を特定の希釈倍率で希釈することで、尿試料に含まれる夾雑物質や匂い物質等の影響を受けることなく、対象の匂い物質を適正に検出できることを知見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下に関する。
【０００７】
［１］
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法であって、
10〜100倍の希釈倍率で尿試料を希釈する工程を含む、
尿試料の調製方法。
［２］
前記嗅覚受容体タンパク質は、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53及びBmOR1から選択される1種又は2種以上である、［１］に記載の調製方法。
［３］
前記昆虫細胞は、ガ由来の細胞である、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［４］
前記昆虫細胞は、Sf21、Sf9、High Five及びTni由来細胞から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の調製方法。
【０００８】
［５］
前記昆虫細胞は、細胞内イオン濃度の変化に基づいて蛍光を発する蛍光タンパク質を発現しており、
前記信号は、嗅覚受容体タンパク質と匂い物質との結合による細胞内イオン濃度の変化に基づいて、前記蛍光タンパク質が発する蛍光である、
［１］〜［４］のいずれかに記載の調製方法。
［６］
前記匂い物質は、生体由来の揮発性有機化合物である、［１］〜［５］のいずれかに記載の調製方法。
［７］
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、［１］〜［６］のいずれかに記載の調製方法により調製された尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
匂い物質の検出方法。
【０００９】
［８］
［７］に記載の検出方法により検出された匂い物質の量を、対照の試料の匂い物質の量と比較し、匂い物質の量を指標として疾患を判定する工程を含む、
疾患の検査方法。
［９］
尿試料の匂い物質の量が、対照の尿試料の匂い物質の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定し、
尿試料の匂い物質の量が、対照の尿試料の匂い物質の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する、
［８］に記載の検査方法。
［１０］
前記疾患は、がん、感染症及び糖尿病から選択される、［８］又は［９］に記載の検査方法。
［１１］
前記がんは、膀胱がん、肺がん及び乳がんから選択される、［１０］に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、嗅覚受容体発現細胞を用いた匂い物質の検出方法に使用するための尿試料の調製方法が提供される。また、本発明の調製方法により調製された尿試料を被検試料とした、嗅覚受容体発現細胞を用いた匂い物質の検出方法が提供される。また、同検出方法により検出された、疾患に特有な匂い物質の量を指標とした、疾患の検査方法が提供される。
本発明では、対象の匂い物質との細胞応答を妨げる尿試料に含まれる夾雑物質や匂い物質等を除去するための特別な前処理を行うことなく、簡易な希釈法で適正な反応をみることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ドデカナールに対するBmOR1細胞系統の蛍光強度の継時変化を示す図である。微細バブルで溶解したドデカナール、及びDMSOで溶解したボンビコールに対する蛍光変化率の継時変化を表す。Cont.1では気体のドデカナールの溶解に使用した純水を、Cont.2ではボンビコールの溶解に使用したDMSOを、それぞれ刺激に対するコントロールとして使用した。
【図２】図２は、嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞の対象臭に対する蛍光応答を示す図である。AgOR12-Or83bを導入したセンサ細胞（A）とAgOR16-Or83bを導入したセンサ細胞（B）の蛍光応答を示す。上図は蛍光変化率の継時変化、下図は各刺激後の蛍光変化率のピーク時の蛍光イメージを表す。コントロール（Cont.）は0.1%DMSOで、(Z)-2-nonenal、(E)-2-nonenal、nonanalは100μMに調製し、点線の時間に刺激した。蛍光変化率(%)は疑似カラーで示す。スケールバーは100μmを表す。それぞれの細胞は、(Z)-2-nonenalに強く応答することがわかる。
【図３】図３は、尿サンプルに対するセンサ細胞の蛍光変化率と生存率を示す図である。左図は尿サンプルの各希釈系列における蛍光変化率（棒グラフ）及び生存率（折れ線グラフ）を表す。右図は尿サンプル添加後のトリパンブルー染色の画像を示す。折れ線グラフは右図の画像から総細胞数及び染色された細胞数を計数し、（総細胞数-染色された細胞数）/総細胞数×100（%）により算出した。染色された細胞数は尿サンプルを添加・測定後に計数した。
【図４】図４は、センサ細胞による尿サンプル中の対象臭の検出結果を示す図である。対象臭を添加した尿サンプル（上）と添加していない尿サンプル（下）に対する蛍光変化率の継時変化を表す。対象臭としてジェオスミンを用いた。サンプル導入前の蛍光変化率は、0±2%であった。サンプル導入後、はじめの計測時点を0秒と設定し、それ以降20秒後、140秒後に計測を実施した。エラーバーは±SDを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について説明する。
＜尿試料の調製方法＞
本発明の一態様は、昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、匂い物質の検出方法（以下、「本発明が用いられる検出方法」ということがある）に使用するための尿試料の調製方法であって、10〜100倍の希釈倍率で尿試料を希釈する工程を含む、尿試料の調製方法（以下、「本発明の調製方法」ということがある）に関する。
【００１３】
本発明の調製方法では、嗅覚受容体発現細胞をセンサ細胞として、対象の匂い物質の検出を行う検出方法において、尿試料を特定の希釈倍率で希釈することで、尿試料に含まれる夾雑物質や匂い物質等の影響を低減する尿試料の調製を可能としたものである。本発明の調製方法により、簡便且つ高感度な、尿試料中の匂い物質の検出が可能となる。
【００１４】
（匂い物質）
本発明が用いられる検出方法が対象とする匂い物質としては、尿試料中に含まれ、同匂い物質と結合する昆虫の嗅覚受容体が存在するものであれば限定されない。匂い物質は、生体由来の揮発性有機化合物（Volatile Organic Compounds：VOC）であってもよい。ここで揮発性有機化合物としては、常温で蒸発しやすい性質を有する有機化合物であって、沸点範囲が<0℃〜100℃の高揮発性有機化合物、沸点範囲が50℃〜260℃の揮発性有機化合物、及び沸点範囲が240℃〜400℃の準揮発性有機化合物を含む。好ましくは、沸点範囲が50℃〜260℃の揮発性有機化合物である。揮発性有機化合物の分子量は、特に限定されないが、例えば10〜400程度の分子量を有するものであってよい。本発明が用いられる検出方法が対象とする匂い物質としては、例えば、膀胱がんの対象臭である(S)-2-ヒドロキシプロパン酸、ヘプチルヒドロペルオキシド、2,3-ジヒドロキシプロパナール、塩化ノナノイル、ドデカナール、(Z)-2-ノネナール、4, 5-ジメチル-3(2H)-イソキサゾロン、(Z)-2-デセナール、トリクロロ酸3-トリデシルエステル、レボグルコサン、4-（ジメチルアミノ
）-3-メチル-2-ブタノン、4-メチル-1-ブテン-1-イルペンタン酸エステル、ジエチルフタル酸、1-クロロ-8-ヘプタデセン、ペンタデカン酸、1,2-ベンゼンジカルボン酸ブチルデシルエステル；肺がんの対象臭であるノナナール、1-ブタノール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、２−エチル-1-ヘキサノール、2-ペンタノン、テトラヒドロフラン、2-メチルピラジン；(E)-2-ノネナール等が挙げられる。
【００１５】
（昆虫細胞）
昆虫細胞は、昆虫の嗅覚受容体が機能可能に発現するものであれば、限定されず用いることができる。例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)等のガ由来の細胞であってもよい。ヨトウガ由来の細胞の例としては、Sf21及びSf9が挙げられる。Sf21細胞は、卵巣細胞由来である。Sf21細胞は、無限分裂し、導入した遺伝子を永続的に発現する安定発現系統を樹立することが可能である。また、Sf21細胞は、18℃から40℃の広い温度範囲で生存可能であり、培養液のpHを調整するための二酸化炭素も不要である。Sf21細胞は、本来、嗅覚受容体を有しないが、嗅覚受容体の遺伝子を導入することにより、嗅覚受容体を発現させることが可能である。Sf9細胞は、Sf21のクローンである。イラクサギンウワバ由来の細胞の例としては、High Five及びTniが挙げられる。Tni由来細胞は、卵巣細胞由来である。
【００１６】
あるいは、昆虫細胞は、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。ショウジョウバエ由来の細胞の例としては、Drosophila S2細胞が挙げられる。
【００１７】
（嗅覚受容体）
嗅覚受容体は、Gタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャンネル型受容体であってもよい。イオンチャネル型受容体は、匂い分子（生体由来の揮発性有機化合物等）であるリガンドと相互作用する部位と、イオンが流入する部位と、を有する。昆虫細胞のイオンチャンネル型受容体がリガンドと結合すると、昆虫細胞内にナトリウムイオンやカルシウムイオン等の陽イオンが流入する。昆虫細胞において、イオンの流入は、リガンドの結合から数10ミリ秒程度で生じ得る。流入するイオンの量は多く、1個のリガンドの結合に対し、細胞内に流入するイオンの量は107個ともいわれている。
【００１８】
一般に、特定の種類の嗅覚受容体は、特定の匂い分子に対する特異性を有する。昆虫細胞において、1種類の匂い分子に対応する1種類の嗅覚受容体のみを発現させてもよいし、複数種類の匂い分子に対応する複数種類の嗅覚受容体を発現させてもよい。また、発現させる嗅覚受容体の量を調整して、匂いセンサとしての検出感度を調整してもよい。
【００１９】
嗅覚受容体（Olfactory receptor: OR）の例としては、カイコガの性フェロモンであるボンビコール(Bombykol)の受容体であり、膀胱がんの対象臭であるドデカナールの受容体であるBmOR1、カイコガの性フェロモンであるボンビカール(Bombykal)の受容体であるBmOR3、ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)の受容体であって、膀胱がんの対象臭である(Z)-2-ノネナールの受容体であるAgOr12、AgOr16、AgOR50、AgOR53、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭である1-オクテン-3-オールの受容体であるOr13a、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭であるジェオスミンの受容体であるOr56a、キイロショウジョウバエの一般臭受容体であるOr85b、及びコナガの性フェロモン受容体であるPxOR1等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
遺伝子工学的に嗅覚受容体を昆虫細胞に発現させる場合は、例えば、嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせる。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚器官からmRNAを抽出し、cDNAを合成して単離することができる。単離されたcDNAから、PCRプライマーを用いて、嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部をPCR法にて増幅することが可能である。
【００２１】
嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖cDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してcDNAライブラリーを作製することによっても取得することができる。cDNAは、制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたcDNAを制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法によって、ベクターに組込むことができる。
【００２２】
昆虫培養細胞発現用ベクターには、好ましくは、嗅覚受容体タンパク質と複合体を形成して細胞内にイオンを流入させるとされているOrcoファミリー受容体（Olfactory receptor co-receptor）[例えばOr83bファミリータンパク質をコードする遺伝子（アクセッション番号：AY567998）]が組み込まれる。
【００２３】
（信号の検出）
嗅覚受容体と匂い物質との結合に基づいて、昆虫細胞が発する信号は、限定されないが、嗅覚受容体と匂い物質との結合に基づく細胞内イオン濃度の変化等に基づく膜電位、蛍光強度等の変化として検出され得る。昆虫細胞が発する信号の検出は、電位測定器、光センサ等により検出することができる。
【００２４】
昆虫細胞において、嗅覚受容体とともに蛍光タンパク質が発現されていてもよい。例えば昆虫細胞において、イオンチャンネル型嗅覚受容体に匂い物質が結合すると、昆虫細胞内にカルシウムイオン等のイオンが流れる。したがって、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現させる遺伝子を昆虫細胞に導入することにより、蛍光強度の変化から、昆虫細胞が匂い物質を検出しているか否かを確認することが可能となる。蛍光タンパク質の例としては、限定されないが、GCaMP3、GCaMP6s及びエクオリン等が挙げられる。
【００２５】
蛍光タンパク質は細胞内で光を発することから、検出される蛍光強度は蛍光タンパク質の発現量に依存することになる。そのため、その発現量を高くするために、蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、嗅覚受容体タンパク質をコードする遺伝子やOr83bタンパク質ファミリーをコードする遺伝子とは別のベクターに組み込むことが好ましい。
【００２６】
なお、嗅覚受容体発現細胞に蛍光タンパク質を共発現させずに、当該細胞に、カルシウムイオン依存性蛍光色素を添加してもよい。カルシウムイオン依存性蛍光色素を共存させることにより、当該受容体が対象となる匂い物質と結合すると細胞内のカルシウムイオン濃度が変化し、蛍光を発する。かかる蛍光色素としては、例えば、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等を用いることができる。
【００２７】
嗅覚受容体発現細胞は、容器等に保持され培養した状態で、匂い物質の検出方法に使用することができる。細胞は接着又は付着細胞が好ましい。培養液は、嗅覚受容体発現細胞を培養可能な、炭素源、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む通常の培地であればよく、培養条件も二酸化炭素の存在を必要としない。培養液のpHは、嗅覚受容体発現細胞が生育し得る範囲のpHであればよく、pH 6.0〜7.4程度に調整するのが好適である。培養温度は、嗅覚受容体発現細胞が生育し得る温度であればよく、通常25〜30℃程度に調整するのが好ましい。
【００２８】
嗅覚受容体発現細胞を保持する容器の数は1個であってよいが、容器の数は特に制限されず、複数個であってもよい。
【００２９】
複数個の容器を有する態様として、細胞を格納するための複数の容器（マイクロウェル）を有するマイクロウェルアレイとすることもできる。
このような複数個の容器を有する態様では、各容器に、対象となる異なる種類の匂い物質と結合する嗅覚受容体をそれぞれ発現している細胞を保持することができる。このような態様では、対象となる匂い物質を接触させた時の、容器ごとに異なる蛍光強度を示すその応答パターンを確認することにより、同匂い物質を検出することができる。また、このような態様の系を用いれば、同一のアレイ上で複数の種類の匂い物質を同時に検出することができる。
【００３０】
嗅覚受容体と匂い物質との結合に基づいて、昆虫細胞が発する信号が、蛍光等の光強度の変化として光センサによって検出される場合、センサは、例えば、細胞の裏面側に配置され、２次元アレイ状に光電変換素子が配置されたセンサと、センサ上に容器の像を結合する結像光学系とを有する。細胞とセンサとの間にバンドパスフィルタをさらに備えてもよい。フィルタは、細胞が発する蛍光が持つ波長の光を透過し、その他の波長の光を透過しないものが好ましい。なお、センサは、細胞の表面側に配置してもよい。
【００３１】
センサが有する光電変換素子は、例えば、CCD型イメージセンサ又はCOMS型イメージセンサとすることができる。センサは、例えば、撮影領域が300万画素以上の解像度を持ち、細胞1つ当たりの蛍光を撮影素子の4画素以上で捕らえることができる機能を持つものであることが好ましい。そして、センサは、容器の像が特定の領域に写った蛍光画像を生成する。容器内に含まれる細胞が発光すると、細胞の像が写っている画素の輝度が増加する。
【００３２】
センサにより生成した蛍光画像を判定器に渡してもよい。
判定器は、プロセッサ、半導体メモリ及び周辺回路を有し、センサから出力された蛍光画像に基づいて対象となる匂い物質を検出する。判定器は、センサから出力された蛍光画像において、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる匂い物質が接触する前の、その容器が写っている領域の平均輝度値と、化合物が接触した後の、その領域の平均輝度値とを比較し、後者の平均輝度値が、例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上増加している場合に、その容器において対象となる化合物を検出できたと判定する。
【００３３】
別の実施態様では、判定器は、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる匂い物質が接触する前の輝度値よりも、化合物が接触した後の輝度値が、所定の輝度閾値以上（例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上）高くなった画素数が、その容器に対応する領域に含まれる画素数の所定の割合以上、例えば1/1000〜1/100以上検出された場合に、その容器において対象となる化合物が検出されたと判定してよい。
【００３４】
容器の数が1個の場合には、センサは、フォトダイオード又はフォトマルを用いてもよい。一方、容器の数が複数の場合には、センサは、容器ごとにフォトダイオードと集光光学系とを有してもよい。これらの場合には、センサは1つの容器について細胞が発する光の蛍光強度に対応した強度を有する1つの信号を出力する。この場合、判定器は、各容器に対応するフォトダイオード又はフォトマルから出力された信号強度が、匂い物質が接触する前よりも接触した後に5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上増加していれば、化合物が検出されたと判定してよい。
【００３５】
匂い物質の検出方法においては、判定器を有さず、センサからの信号をそのまま出力してもよい。
【００３６】
（尿試料）
本発明の調製方法に用いられる尿試料は、匂い物質を含む可能性がある、被検体から採取された尿試料であれば特に限定されない。
被検体は、ヒトを含む哺乳類が挙げられる。例えば、ヒト以外の哺乳類として、限定されないがマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ウマ、ウシ等を対象とする。
また、被検体としては、がん等の疾患の疑いがない対象、疾患が疑われる対象、すでに何らかの疾患を患っている対象、がん組織の外科的切除後等の疾患の治療後の対象等のいずれであってもよい。
【００３７】
（希釈）
本発明の調製方法においては、尿試料を通常10〜100倍、好ましくは10〜50倍、より好ましくは10〜20倍の希釈倍率で希釈することを特徴とする。希釈倍率とは、希釈前の対象尿試料成分濃度と希釈後の対象尿試料成分濃度の比（希釈倍率＝希釈前の対象尿試料成分濃度／希釈後の対象尿試料成分濃度）である。これにより、夾雑物質や匂い物質等を含む尿試料のセンサ細胞への影響を低減し、高感度の検出が可能である。
本発明において用い得る希釈液は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、細胞に物理化学的ダメージを与えないものが好ましい。希釈液の具体例としては、限定されないが、例えば、ハンクス平衡塩溶液、HEPES、PIPES、PBS等の緩衝液、生理食塩水等の等張液、蒸留水等が挙げられる。また、さらに細胞の維持等に必要な他の成分（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩及びグルコース等の炭素源等）が添加されていてもよい。希釈液として、例えば、実施例に記載のアッセイバッファー等の嗅覚受容体発現細胞によるアッセイに適したバッファー等を用いることができる。
希釈液は、通常浸透圧が100〜1000 mOsm／L（好ましくは360〜375 mOsm／L）、pHが6.0〜7.4（好ましくはpH 6.2〜7.2）とすることができる。また、希釈液は、カルシウムイオンやナトリウムイオン等のカチオンを含むことが好ましい。
【００３８】
本発明が用いられる匂い物質の検出方法は、対象となる匂い物質をpptレベルの高感度でかつ高い識別能で検出でき、また、本発明が用いられる検出方法に使用するセンサ細胞は長期間にわたり使用可能であり、しかも携帯性を有する。さらに、センサ細胞は、6ケ月間以上凍結保存することもできる。また、センサ細胞は、洗浄することによって再利用可能である。したがって、本発明が用いられる検出方法は、医療機関・健診での検査や個人向けの検査等のためのさまざまな場面での利用が期待される。例えば、医療機関・健診での検査であれば、がんや感染症等の検査時間の短縮、コスト削減、非侵襲的且つ高感度の検査方法への移行、感染症等の原因菌の迅速特定等、個人向け検査であれば、がんや感染症等の疾患や、ストレス、口臭・体臭、生活習慣病等の簡便且つ非侵襲的な検査、健康モニタリング、病気の早期発見・重症化予防等への応用が期待される。また、本発明の尿試料の調製方法を匂い物質の検出方法に適用することで、特別な前処理を行うことなく、より高感度で再現性よく匂い物質を検出することが可能であり、さらに有用である。
【００３９】
＜匂い物質の検出方法＞
本発明の別の一態様は、昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、本発明の調製方法により調製された尿試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と尿試料に含まれる匂い物質との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、匂い物質の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ということがある）に関する。ここで、本発明の検出方法における昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞、尿試料の接触工程及び信号の検出工程等の態様は、上記＜尿試料の調製方法＞において、「本発明が用いられる検出方法」として説明した態様と同じである。
【００４０】
＜疾患の検査方法＞
本発明の別の一態様は、本発明の検出方法により検出された匂い物質の量を、対照の尿試料の匂い物質の量と比較し、匂い物質の量を指標として疾患を判定する工程を含む、疾患の検査方法（以下、「本発明の検査方法」ということがある）に関する。
【００４１】
いくつかの疾患では、患者は疾患に特有な対象臭として、生体由来の揮発性有機化合物等の匂い物質を発することが知られており、疾患マーカーとして使用できる可能性が示唆されている。すなわち、被検体が、疾患の症状を有する又は疾患状態の変化を示す場合には、被検体から採取された試料（例えば尿等）における疾患に特有の匂い物質の濃度等の量に変動が生じる。
【００４２】
変動は、例えば、疾患に特有の匂い物質の濃度上昇、濃度減少、消失、出現等の1種又は2種以上を含む概念である。
この変動は、被検体から採取された試料の1種又は2種以上の匂い物質の量と、対照（健常者、疾患に罹患する以前の対象、疾患の治療前の対象等）の試料の匂い物質の量とを比較することにより、容易に確認することができる。
【００４３】
例えば、被検体から採取された試料の匂い物質の量を、対照の試料の匂い物質の量と比較し、被検体から採取された試料の匂い物質の量が、対照の試料の匂い物質の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定する。
限定されないが、例えば、被検体から採取された試料の匂い物質の量が、対照の試料の匂い物質の量に対し、例えば1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは5倍以上、よりさらに好ましくは10倍以上の場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定する。
【００４４】
また、例えば、被検体から採取された試料の匂い物質の量を、対照の試料の匂い物質の量と比較し、被検体から採取された試料の匂い物質の量が、対照の試料の匂い物質の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する。
限定されないが、例えば、被検体から採取された試料の匂い物質の量が、対照の試料の匂い物質の量に対し、例えば0.1倍以下、好ましくは0.2倍以下、より好ましくは0.5倍以下、さらに好ましくは0.8倍以下、よりさらに好ましくは1倍以下の場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する。
【００４５】
一般的には、健常者又は患者由来の試料中の匂い物質の量又は発現パターンを対照とすることにより容易に変動を確認することができる。なお、予め、健常者又は患者由来の試料中の匂い物質の量又は発現パターンの測定結果を標準結果とし用意しておき、その標準結果と比較して有意差の有無を判定してもよい。このような態様も本発明の方法に包含される。
なお、試料の匂い物質の量は、匂い物質の量と相関する値（例えば、蛍光強度の測定値等）により比較してもよい。
【００４６】
2種以上の匂い物質の量を指標として用いる場合、2種以上の匂い物質の量の合計量として判定してもよいし、各匂い物質の量（いずれかの化合物に重みづけをすることを含む）に基づいて総合して判定してもよい。
また、2種以上の匂い物質の量を指標として疾患を判定する場合は、対照の試料の匂い物質の発生パターンとの一致に基づいて、疾患の種類等を判定することができる。
【００４７】
すなわち、被検体から採取された試料の1種又は2種以上の匂い物質の量の変動結果から、疾患の判定（疾患の有無）、疾患の種類（がんの種類又は部位、感染症の原因菌）、疾患の程度（治療効果、疾患の予後の診断等）を診断する目的で使用することが可能である。
【００４８】
（疾患）
本発明の検査方法の対象とする疾患は、疾患に特有の生体由来の揮発性有機化合物等の
匂い物質を有し、同匂い物質が昆虫嗅覚受容体により検出可能であれば、特に限定されず、膀胱がん、肺がん及び乳がん等のがん、感染症、糖尿病等の生活習慣病から選択される1種又は2種以上であってよい。対象とする疾患として好ましくは、膀胱がんである。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜参考例１＞
(カイコガの行動、触角電位図による対象臭検出嗅覚受容体の特定)
膀胱がん患者に特徴的な対象臭の一つとして、ドデカナールが報告されている。ドデカナールは炭素数12の直鎖アルデヒドであり、ある種のガ類の性フェロモン成分として利用される化合物である（Pherobase -Database of Pheromones and Semiochemicals；http://www.pherobase.com/）。カイコガ（Bombyx mori）も同様に性フェロモンによる雌雄間交信を行っており、性フェロモン成分の一つであるボンビコール（E,Z,-10,12-hexadecadienol）を触角で検出すると、配偶行動が解発されることが報告されている(Butenandtet al., 1959)。ドデカナールは、性フェロモン成分として利用されていること、またボンビコールと比較的化学構造が類似していることから、カイコガはドデカナールに応答を示す可能性がある。そこで、本項目では、カイコガ成虫で機能する嗅覚受容体がドデカナールに応答するかどうかを調査するため、カイコガ成虫を用いて、行動レベル及び触角レベルでドデカナールに対する応答性を取得・評価した。
【００５１】
まず、カイコガの配偶行動を指標にドデカナールに対する応答性を調査した。ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide; DMSO）単独、及びDMSOに溶解したドデカナール（100mM）を用いて、各試料20μLを濾紙に滴下し、それぞれ別のパスツールピペットにセットした。濾紙から各成分をパスツールピペット内に十分に揮発させた後、オスカイコガ成虫の触角へ刺激した結果、DMSO単独では配偶行動を示さなかった。一方、DMSOに溶解したドデカナールには、羽ばたき、探索行動、そして腹曲げ行動といった一連の配偶行動を示した。これらの結果から、ドデカナールは、カイコガの配偶行動を解発することが分かった。
【００５２】
次に、ドデカナールでの配偶行動の解発が触角で機能発現する嗅覚受容体によるものかどうかを調査するため、触角電図（electroantennogram; EAG）によりドデカナールに対するオスカイコガの触角応答を取得した。カイコガの触角には、性フェロモン受容体であるBmOR1が機能発現しており、その活性化によって配偶行動が引き起こされることが明らかにされている(Sakurai et al., 2004)。DMSO単独、及びDMSOに溶解したドデカナールで刺激した結果、DMSO単独では触角電位が変化しない一方、ドデカナールに対して約1.5mVの明確な触角電位の変化を示すことが分かった。この応答は、ヘキサンで希釈した1μgのボンビコールと同程度の電位変化量であった。以上の結果から、ドデカナールはカイコガオスの触角で受容されており、その応答により配偶行動が解発される、すなわちBmOR1がドデカナールを検出していることが示唆された。
【００５３】
(カイコガフェロモン受容体を発現させたセンサ細胞による対象臭の検出)
オスカイコガの行動試験、及び触角電位の応答測定の研究（前項）から、オスカイコガの触角で機能発現する性フェロモン受容体（BmOR1）はドデカナールを受容する可能性が示唆された。これまでに本発明者らは、BmOR1を、共受容体BmOrco及びカルシウム感受性蛍光タンパク質（GCaMP6s）とともにSf21細胞で共発現させることにより、性フェロモン成分であるボンビコールを蛍光強度変化量として検出する細胞系統（以下、BmOR1細胞系統と呼ぶ）を作出してきた(Mitsuno et al., 2015, Termtanasombat et al., 2016)。そこで、本項目では、ドデカナールに対するBmOR1細胞系統をセンサ細胞として、その蛍光
応答を取得することにより、ドデカナールの受容体としてBmOR1の利用可能性を検証した。
【００５４】
まず、DMSO単独、及びDMSOに溶解したドデカナール（30μM）で刺激した結果、BmOR1細胞系統はDMSO単独には蛍光応答を示さなかったが、ドデカナールに対してはわずかに蛍光応答を示した。しかし、その蛍光変化率は数％程度であり、また調製した刺激液中で結晶の析出が確認されたことから、難水溶性有機化合物であるドデカナールの溶液中への溶解率は低く、計算した濃度の刺激液が調製できていない可能性が示唆された。
【００５５】
そこで、すでに本発明者らにより確立した、微細バブルによる気体の難水溶性有機化合物の液中への溶解技術を活用し、気体のドデカナールを純水に効率的に溶解することでドデカナール溶解サンプルを調製し、細胞応答試験に供した。溶解したドデカナールをアッセイバッファー（140 mM NaCl、5.6 mM KCl、4.5 mM CaCl2、11.26 mM MgCl2、11.32mM MgSO4、9.4 mM D-glucose、5 mM HEPES、pH 7.2）で希釈し蛍光応答を測定した。その結果、BmOR1細胞系統は12.4μMのドデカナールに対して約20％の蛍光強度変化を示し、ポジティブコントロールとして刺激した100μMのボンビコールに対しても約50％の蛍光強度変化を示した（図１）。前項に加えて、これらの結果は、BmOR1細胞系統がドデカナールに蛍光応答を示す可能性を示しており、BmOR1が膀胱がんの一つの対象臭を検出する嗅覚受容体として利用できることが示唆された。
【００５６】
＜参考例２＞
（嗅覚受容体を導入したセンサ細胞の対象臭検出性能の評価）
膀胱がん患者に特徴的な対象臭は、ドデカナールのほかに、(Z)-2-ノネナールが含まれる。2-ノネナールは、膀胱がんの対象臭であることに加えて、加齢臭の成分として同定された物質である（Haze et al., 2001）。しかし、ドデカナールと同様、(Z)-2-ノネナールに対する嗅覚受容体は現在までに同定されていないことから、当該嗅覚受容体を検出素子として利用するためには、対象となる嗅覚受容体を選定・単離し、細胞発現系にて受容体の機能を同定する必要がある。そのような状況の中、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）では、嗅覚受容体の応答特性がDoOR；Database of Odorant Responses（http://neuro.uni-konstanz.de/DoOR/default.html）と呼ばれるデータベースで集約されており、特定の対象臭を選択することで、応答を示す嗅覚受容体を検索することができる（Munch et al., 2016）。また、ハマダラカ（Anopheles gambiae）では、嗅覚受容体の網羅的な応答特性解析が行われており、論文ベースでそれら嗅覚受容体の応答特性が利用できる（Carey et al., 2010、Wang et al., 2010）。そこで、本項目では、(Z)-2-ノネナールと化学構造が類似した化合物に応答する嗅覚受容体を選抜し、Sf21細胞を用いた細胞発現系で、嗅覚受容体の応答特性を評価することにより、(Z)-2-ノネナールに対する嗅覚受容体の同定を目指した。
【００５７】
DoORによると、キイロショウジョウバエの嗅覚受容体のうち、Or74aは(Z)-2-ノネナールの類似物質である1-ノネナールに、Or19aは(Z)-2-ノネン-1-オールに応答することが報告されている（Munch et al., 2016）。そこで、まずこれらの嗅覚受容体をSf21細胞で発現させて、(Z)-2-ノネナールに対する蛍光応答を取得した。すなわち、これらの嗅覚受容体をコードする遺伝子を合成し、参考例１のBmOR1細胞系統において、BmOR1に換えて発現させることでOr74a発現細胞、Or19a発現細胞を作出し、蛍光応答を測定した。その結果、Or74a発現細胞、Or19a発現細胞は(Z)-2-ノネナールに対してほとんど応答を示さなかった。
【００５８】
次に、ハマダラカの嗅覚受容体の応答特性をもとに、嗅覚受容体の選定を行った。ハマダラカの嗅覚受容体のうち、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53の4種類の嗅覚受容体が(Z)-2-ノネナールの類似化合物であるノナナールに強く応答することが報告されている（Wan
g et al., 2010）。そこで、これら嗅覚受容体を対象に嗅覚受容体をコードする遺伝子合成を行い、参考例１のBmOR1細胞系統において、BmOR1に換えてSf21細胞による発現系に適用することで、センサ細胞として、これら嗅覚受容体を発現する細胞を作出し、(Z)-2-ノネナールに対する蛍光応答を測定した。その結果、4種類の嗅覚受容体のうち、AgOR12、AgOR16をキイロショウジョウバエのOrco（ここではOr83bと呼ぶ）及びGCaMP6sとともに共発現させたSf21細胞は、(Z)-2-ノネナールに蛍光応答を示し、それぞれ約6%、約10%の蛍光強度変化を示した（図２のA、B）。また、嗅覚受容体の選択性を評価するために、(Z)-2-ノネナールに加えて、化学構造の類似する2種類の匂い物質（(E)-2-ノネナール、ノナナール）で刺激した。その結果、各受容体はノナナールにほとんど応答を示さない一方、(Z)-2-ノネナール、及び(E)-2-ノネナールには蛍光応答を示し、(Z)-2-ノネナールに対して強く蛍光応答を示すことが分かった（図２のA、B）。以上の結果から、AgOR12及びAgOR16は、膀胱がんの対象臭の一つである(Z)-2-ノネナールを検出する嗅覚受容体として利用できる可能性が示された。
【００５９】
＜実施例１＞
（センサ細胞による尿サンプルの適用方法）
嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞が対象臭を選択的に検出する素子として利用でき、本技術をカイコガやハマダラカのある種の嗅覚受容体へと発展させることにより、膀胱がん患者に特徴的な対象臭を検出できる素子の開発が可能であることを示してきた（前項）。これらの素子を用いて膀胱がんの患者の尿中の対象臭を検出するためには、センサ細胞を用いた尿中の対象臭検出の技術を確立する必要がある。これまでに、本発明者らは、センサ細胞の細胞懸濁液から簡便に蛍光応答を取得する技術を確立してきた。そこで、本項目では、尿サンプル中の対象臭の検出技術の確立のために、センサ細胞懸濁液の応答検出手法を用いて、健常者の尿サンプルの調製手法の確立を試みた。
【００６０】
まず、尿サンプルに含まれる夾雑物質や匂い物質等のセンサ細胞への影響を調査するために、匂い物質を添加していない尿サンプルに対するセンサ細胞の蛍光変化量を測定した。尿サンプルとしては、研究室に所属する健常者の尿を用いた。センサ細胞として、嗅覚受容体Or56aをコードする遺伝子合成を行い、参考例１のBmOR1細胞系統において、BmOR1に換えてSf21細胞による発現系に適用することで、Or56aを発現する細胞を作出した。センサ細胞のアッセイバッファー（140 mM NaCl、5.6 mM KCl、4.5 mM CaCl2、11.26 mM MgCl2、11.32mM MgSO4、9.4 mM D-glucose、5 mM HEPES、pH 7.2）を用いて、希釈無し（×1）、10倍希釈（×10）、100倍希釈（×100）の希釈系列を調製し、180μLのOr56a細胞系統の懸濁液（1×106細胞/mL）中へ各希釈サンプルを20μL添加することにより、センサ細胞の蛍光変化率を測定した。その結果、希釈無し（×1）では約48％の蛍光変化を示したのに対して、10倍希釈（×10）、100倍希釈（×100）では蛍光変化率の増加が確認されず、液の添加に伴う細胞密度減少による蛍光変化率の低下（それぞれ-8%、-12%）が確認された（図３）。このことから、少なくとも10倍以上の希釈を行うことで、尿中の夾雑物質や匂い物質による影響を低減でき、蛍光変化率の増加が確認されないことが示された。
次に、各尿サンプルのセンサ細胞の生死に与える影響を調査するため、各希釈系列におけるセンサ細胞の生存率をトリパンブルー染色により計数した。その結果、希釈無し（×1）、10倍希釈（×10）、100倍希釈（×100）でそれぞれ83%、82%、84%の生存率を示し、いずれの尿サンプルについても高い生存率を示した（図３）。また、各希釈系列で生存率はほぼ同程度であり、いずれの倍率で希釈した尿サンプルにおいてもセンサ細胞を生存した状態で維持できることが分かった。このことから、少なくとも10倍以上希釈したサンプルでは、センサ細胞による匂い応答測定に利用できることが示された。そこで、以下項目において、センサ細胞による尿サンプル中の匂い物質の検出へと展開した。
【００６１】
＜実施例２＞
（センサ細胞を用いた尿サンプル中の匂い物質の検出）
尿サンプルをセンサ細胞懸濁液へと添加して検出する手法を示してきた（前項）。一定の濃度まで尿を希釈することにより、尿サンプル中の夾雑物質や匂い物質による偽陽性の蛍光変化が計測されないことが分かってきた。しかし、本計測手法により、尿サンプル中の対象臭のセンサ細胞による検出が可能かどうか未だ分かっていない。そこで、本項目では、嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞を用いて、尿サンプル中の対象臭の検出の可能性を検証した。
【００６２】
ここでは、カビ臭であるジェオスミンを検出する嗅覚受容体Or56aを発現させたセンサ細胞として実施例１で作製したOr56a細胞を用いて、尿サンプル中に人為的に混入したジェオスミンに対するセンサ細胞の蛍光応答を取得した。前述の通り、10倍以上で希釈した場合、尿に対する偽陽性の応答が観察されないことから、10倍希釈した尿サンプルへ人為的に100μMのジェオスミンを添加し、センサ細胞の蛍光強度変化量を取得した。まず、尿サンプルのみを導入した結果、前項と同様、2.7%〜5.3%の蛍光変化率の低下が確認された（図４）。次に、対象臭を添加した尿サンプルを導入した結果、導入後（0秒）に導入前と比較して9.4%、20秒後、140秒後でそれぞれ9.5％、8.4%の蛍光変化率の増加が確認された。尿サンプルのみの場合では、細胞懸濁液が希釈されることにより、蛍光量の絶対量が減少するため、蛍光変化率の低下が確認される一方、対象臭を添加した尿サンプルの場合には、明確な蛍光変化率の増加が確認されたことから、センサ細胞に由来する応答である可能性が高い。以上の結果から、一定濃度以上の対象臭が混入していれば、尿中の夾雑物質や匂い物質によってセンサ細胞の応答が阻害されることなく、蛍光変化率として対象臭の検出可能であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、がん等の疾患の検査等の診断・ヘルスケア分野等に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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