(57)【要約】【課題】微細藻類の細胞を活性化させることにより、効率よく微細藻類を培養する方法等を提供すること。【解決手段】微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含むことを特徴とする微細藻類の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含むことを特徴とする微細藻類の培養方法。
【請求項２】
微小重力工程の前に、微細藻類を増加させる通常培養工程を含む請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
微小重力工程の後に、培養液をストレス環境におき、微細藻類に有用物質を産生させる環境ストレス付与工程を含む請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
微小重力工程での微小重力処理時間が、少なくとも１時間である請求項１、２又は３に記載の培養方法。
【請求項５】
微細藻類は、有用物質を産生するものである請求項１、２、３又は４に記載の培養方法。
【請求項６】
微細藻類は、トレボウクシア藻網、緑藻綱又はラビリンチュラ類に属する種である請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含むことを特徴とする活性化した微細藻類の製造方法。
【請求項８】
微小重力工程の前に、微細藻類を増加させる通常培養工程を含む請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５又は６に記載の培養方法、又は、請求項７又は８に記載の製造方法により得られた微細藻類。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、５又は６に記載の培養方法、又は、請求項７又は８に記載の製造方法により得られた微細藻類から、有用物質を取り出すことを特徴とする有用物質の製造方法。
【請求項１１】
有用物質は、アスタキサンチン、ＤＨＡ及びＥＰＡからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法、微細藻類の製造方法、活性化微細藻類、及び、有用物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオマス資源、バイオ燃料をはじめとする工業バイオ技術に関する「ホワイトバイオ（Ｗｈｉｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、草食性家畜や二枚貝のための飼料や環境浄化を目的とした農業、水産業、環境バイオ技術に関する「グリーンバイオ（Ｇｒｅｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、及び、医薬品、生理活性物質、機能性食材をはじめとする医療及び健康に関する「レッドバイオ（Ｒｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」が注目されている。
【０００３】
上記のうち、医療及び健康に関する「レッドバイオ」（Ｒｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、微細藻類が産生する有用物質に着目し、その利用を目指すものである。微細藻類が産生する有用性物質としては、例えば、高い抗酸化作用を有し、紫外線や血中脂質の過酸化から生体を防御するアスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）、血中のコレステロールを抑え動脈硬化を防止する物質として知られる不飽和脂肪酸のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））及びＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））等が挙げられる。
【０００４】
ここで、上記アスタキサンチンを含むカロテノイドは、植物が紫外線照射によって発生する活性酸素から細胞を防御するために生産する抗酸化物質である。カロテノイドの一部は微細藻類からの抽出によって生産されているが、通常の培養条件下で培養された微細藻類の藻体内に蓄積されるカロテノイド量は、一般的に多くない。微細藻類の多くは、紫外線や栄養不足等の環境ストレスが付与されることによってはじめて特定のカロテノイドを大量に蓄積するようになる。そのため、微細藻類を用いたカロテノイドの生産方法において、効果的にカロテノイドを大量生産させるためには、生育に影響を与えず、かつ適切な環境ストレスを付与できる条件が重要とされている。
【０００５】
例えば、有用物質としてアスタキサンチンを産生するヘマトコッカスを培養する場合、有用物質を産生させるために強い光を照射する等、ストレスを付与することが必要とされている。特許文献１には、アスタキサンチンを有用成分とする緑藻類培養方法が記載されており、赤色ＬＥＤ光と青色ＬＥＤ光とを同時に照射し、藻類にストレスを付与し、アスタキサンチンを製造することが記載されている。
しかし、このように微細藻類に対し、ストレスを付与する場合、ストレス付与過程で死滅する藻体が一定量存在し、微細藻類の培養の効率化、及び、有用物質の生産性の向上にあたり障害となっていた。
【０００６】
また、他の有用物質を産生する微細藻類を培養する際にも、培地環境が微細藻類の生育や有用物質の生産に影響することが知られており（非特許文献１及び２）、例えば、特許文献２では、培地環境を改良することにより藻類の培養を効率化し、有用物質の生産性を向上させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１６−１１１９８４号公報
【特許文献２】特開２０１５−１９２６４９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，１２１−１２４，１９９２．
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  （２００５）  １７：３０９−３１５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、いずれの微細藻類の培養方法においても、微細藻類自体の活性化を図り、微細藻類の培養の効率化を図る方法や、有用物質の生産性を高める方法は検討されていなかった。
【００１０】
本発明は、上記現状に鑑み、微細藻類の細胞を活性化させることにより、効率よく微細藻類を培養する方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、微細藻類の培養液を微小重力状態におくことで、微細藻類の細胞機能が活性化され、生存率が向上し、効率よく微細藻類を培養できることを見出した。さらに、本培養方法から得られた微細藻類は、細胞機能が活性化されているため、生存率が高く、有用物質の生産性が向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
【００１２】
本発明は、微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含むことを特徴とする微細藻類の培養方法である。
上記微小重力工程の前に、微細藻類を増加させる通常培養工程を含むことが好ましい。
なお、上記通常培養工程では、光合成によって微細藻類を増加させることができる。
上記微小重力工程の後に、培養液をストレス環境におき、微細藻類に有用物質を産生させる環境ストレス付与工程を含むことが好ましい。
上記微小重力工程での微小重力処理時間が、少なくとも１時間であることが好ましい。
上記微細藻類は、有用物質を産生する微細藻類であることが好ましい。
上記微細藻類は、トレボウクシア藻網、緑藻綱又はラビリンチュラ類に属する種であることが好ましい。
【００１３】
本発明は、微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含むことを特徴とする活性化した微細藻類の製造方法でもある。
上記微小重力工程の前に、微細藻類を増加させる通常培養工程を含むことが好ましい。
なお、上記通常培養工程では、光合成によって微細藻類を増加させることができる。
【００１４】
本発明は、上記培養方法、又は、上記製造方法により得られた微細藻類でもある。
【００１５】
本発明は、上記培養方法、又は、上記製造方法により得られた微細藻類から、有用物質を取り出すことを特徴とする有用物質の製造方法でもある。
上記有用物質は、アスタキサンチン、ＤＨＡ及びＥＰＡからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
以下に、本発明を詳細に説明する。
なお、以下の説明において、本発明の微細藻類の培養方法、微細藻類の製造方法、及び、有用物質の製造方法の、本発明の方法を合わせて「本発明に係る方法」とも記載する。
【００１６】
本発明に係る方法は、微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含む。
本発明において微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いた藻類から、多細胞生物である海藻類を除いた微視的な構造を持つ藻類を指す（バイオディバーシティ・シリーズ（３）藻類の多様性と系統：千原光雄  編  裳華房（１９９９））。なお、微細藻類には、複数個の細胞が群体を形成するものも含まれる。本発明において、上記微視的な構造とは、具体的に、細胞サイズが直径１〜１００μｍのものをいう。なお、細胞サイズは、光学顕微鏡を用いて観察した細胞の長軸径である。
【００１７】
上記微細藻類には、油脂を貯蔵物質として蓄積するものがあることが知られている（Ｃｈｉｓｔｉ，  Ｙ．  ２００７．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．  ２５：  ２９４−３０６）。このような微細藻類としては、緑色植物門や不等毛植物門に属するものがよく知られている。
【００１８】
緑色植物門に属する微細藻類としては、例えば、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、トレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、プラシノ藻綱（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、アオサ藻綱（Ｕｌｖｏｐｈｙｃｅａｅ）、車軸藻綱（Ｃｈａｒｏｐｈｙｃｅａｅ）等の綱に属する藻類が挙げられる。
【００１９】
緑藻綱に属する藻類としては、例えば、ネオクロリス・オレオアバンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）（Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ，  Ｔ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：  ４３５−４４０）等のネオクロリス属藻類、ナノクロリス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）（Ｔａｋａｇｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５４：  １１２−１１７）等のナノクロリス属藻類、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）等のクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属藻類、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属藻類、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属藻類を挙げることが出来る。
【００２０】
トレボキシア藻綱に属する藻類としては、例えば、クロレラ・ケッサレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）等のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属藻類を挙げることが出来る。
【００２１】
不等毛植物門に属する藻類としては、例えば、黄金色藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）、ディクチオカ藻綱（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｏｐｈｙｃｅａｅ）、ペラゴ藻綱（Ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｅａｅ）、ラフィド藻綱（Ｒｈａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、褐藻綱（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄緑藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）等の綱に属する藻類が挙げられる。珪藻綱に属する藻類としては、例えば、タラシオシラ・スードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（Ｔｏｎｏｎ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６１：  １５−２４）等のタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属藻類を挙げることが出来る。
【００２２】
上記緑藻網に属するネオクロリス・オレオアバンダンスとして、具体的には、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ  ＵＴＥＸ  １１８５株が挙げられる。ナノクロリス・エスピーとして、具体的には、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．  ＵＴＥＸ  ＬＢ  １９９９株が挙げられる。クロレラ・ケッサレリとして、具体的には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ  １１ｈ株（ＵＴＥＸ  ２６３）が挙げられる。タラシオシラ・スードナナとして、具体的には、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ＵＴＥＸ  ＬＢ  ＦＤ２株が挙げられる。これらの菌株は、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  （ＵＴＥＸ），  １  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ａ６７００，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ  ７８７１２−０１８３，  ＵＳＡ）より入手することができる。
【００２３】
また、ＤＨＡ（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）やＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）などの高度不飽和脂肪酸を高濃度に蓄積する単細胞の菌様原生生物であるラビリンチュラ類も微細藻類に分類される。ラビリンチュラ類には、具体的には、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属などが含まれる。ラビリンチュラ類は、光合成を行わず従属栄養条件にて培養を行うが、本発明の方法を適用することが可能である。
【００２４】
本発明に係る方法は、微細藻類の細胞を活性化することにより効率的に微細藻類を培養し、活性化した微細藻類を製造できるものであり、使用される微細藻類の種類は特に限定されず、有用物質を産生する微細藻類であることが好ましい。
【００２５】
なお、本発明において有用物質とは、微細藻類から抽出、精製されることによって得られる産業にとって有益な物質の総称である。このような物質として、医薬品、化粧品及び健康食品等の原料や中間体や最終生成物、化学合成物の原料や中間物や最終生成物、炭化水素化合物やトリグリセリドや脂肪酸化合物のようなオイル、アルコール化合物、水素やメタン等のエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やＤＨＡ及びＥＰＡ等の脂質化合物、アスタキサンチンなどを含む。
【００２６】
例えば、微細藻類は、窒素源が枯渇すると油脂を藻体内に蓄積することが知られている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＧＡ  Ｊｒ．  １９９６．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １３０２：  １７−４５）。そのため、油脂の生産性を向上させるためには、微細藻類の培養にあたり窒素源の濃度を制限した環境下におくことが従来からなされている。このような環境下では、一定量の藻体が有用物質の産生を行うことなく死滅する可能性が生じる。しかしながら、本発明に係る方法によれば、微細藻類細胞を活性化することができ、藻体の生存率を向上させ、効率よく有用物質を産生することができる。
【００２７】
本発明に係る方法において使用される上記微細藻類としては、レッドバイオ関連で利用される有用物質を産生する微細藻類がより好ましい。本発明に係る方法では、微細藻類の培養液を微小重力状態におく微小重力工程を含んでおり、本工程を経て得られる微細藻類の量的観点から、ホワイトバイオ及びグリーンバイオ関連で利用される有用物質を産生するには費用が高額化する恐れがあるためである。
【００２８】
具体的に、本発明に係る方法において使用される微細藻類としては、トレボウクシア藻網、緑藻綱、ラビリンチュラ類に属する微細藻類が好ましい。レッドバイオ関連で利用される有用物質である、アスタキサンチン、ＥＰＡ及びＤＨＡからなる群より選択される少なくとも一種を産生するためである。
【００２９】
また、上記トレボウクシア藻綱に属する微細藻類としては、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、カワノリ目（Ｐｒａｓｉｏｌａｌｅｓ）又はワタナベア系統群（Ｗａｔａｎａｂｅａ−ｃｌａｄｅ）に属する種であることが好ましい。
上記緑藻網に属する微細藻類としては、ボルボックス目、ヨコワミドロ目に属する種であることが好ましい。
【００３０】
上記ボルボックス目に属する微細藻類としては、ヘマトコッカス属であることが好ましく、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．  ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．  ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．  ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）又はヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．  ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）であることがより好ましく、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）又はヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．  ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）であることがさらに好ましい。
上記ヨコワミドロ目に属する微細藻類としては、イカダモ科（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍａｃｅａｅ）、ムリエラ属（Ｍｕｒｉｅｌｌａ）又はグラエシエラ属（Ｇｒａｅｓｉｅｌｌａ）に属する種であることが好ましい。
【００３１】
また、上記ラビリンチュラ類に属する微細藻類としては、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属又はウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属に属する種であることが好ましい。
これらの中でも上記微細藻類は緑藻網に属するヘマトコッカス属に属する種であることが好ましい。
【００３２】
ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）としては、ＵＴＥＸ２５０５株、Ｋ００８４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．  ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）としては、ＮＩＥＳ１４４株、ＡＴＣＣ３０４０２株、ＡＴＣＣ３０４５３株、ＩＡＭ  Ｃ−３９２株、ＩＡＭ  Ｃ−３９３株、ＩＡＭ  Ｃ−３９４株、ＩＡＭ  Ｃ−３３９株、ＵＴＥＸ  １６株、ＵＴＥＸ２９４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．  ｃａｐｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．  ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）としては、ＵＴＥＸ  ５５株が挙げられる。
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．  ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
これらの中でも、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
【００３３】
本発明において微小重力とは、地上の１Ｇ未満の重力であって、好ましくは、１０−５〜１０−１Ｇである。本発明において微小重力状態は、例えば、宇宙ステーションの重力環境（１０−３Ｇ）や、模擬微小重力環境（１０−３Ｇ）におくことで得られる状態である。
【００３４】
上記模擬微小重力環境は、例えば、３Ｄ−クリノスタットを用いて作り出すことができる。３Ｄ−クリノスタットとは、試料を三次元で回転させることにより、重力を均等に分散させ、模擬的に微小重力環境を作る装置である。３Ｄ−クリノスタットを用いれば、時間軸で積分された重力ベクトルが宇宙環境と同じく微小であるような（例えば１０−３Ｇであるような）環境を作り出すことができる。３Ｄ−クリノスタットとしては、市販の装置を用いることができ、例えば、重力制御装置（Ｇｒａｖｉｔｅ（登録商標）株式会社スペース・バイオ・ラボラトリーズ）、微小重力環境細胞培養装置（Ｚｅｒｏｍｏ（登録商標）株式会社北川鉄工所製）等を用いて模擬微小重力環境を作り出すことができる。
【００３５】
本発明に係る方法では、微小重力工程での微小重力処理時間が、少なくとも１時間であることが好ましく、少なくとも２時間であることがより好ましく、少なくとも３時間であることがさらに好ましい。
なお、微小重力処理時間は、所望の微小重力状態（例えば、１０−３Ｇ）に維持されている時間をいう。
なお、微小重力工程を４８時間以上に設定する場合は、微小重力工程においても使用される微細藻類に適した培養条件に整えるとしてもよい。この場合、培養条件として、例えば、光量（光の照射強度）、温度、及びＣＯ２と栄養素の供給を、培養対象となる微細藻類の種類に応じて変更することができる。
【００３６】
本発明において、「微細藻類の培養液」とは、培地で培養した微細藻類（培養細胞）を含む液をいう。また、「培地」とは、微細藻類の培養に用いることができる培地を意味する。微細藻類の培養については多くの知見があり、上述した微細藻類の種類に応じた培地を選択し使用することができる。
【００３７】
本発明に係る方法は、上記微小重力工程の前に、微細藻類を増加させる通常培養工程を含むことが好ましい。上述の通り、微細藻類の培養については多くの知見があるため、微細藻類の種類に応じた通常培養工程を含むことができる。また、通常培養工程では、光合成により微細藻類を増加させることができる。
【００３８】
上記通常培養は、培養される微細藻類に適した培養条件（ｐＨ、温度、ＣＯ２通気量、光の照射強度、栄養供給量）とすることができる。
例えば、微細藻類がヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）である場合、培養液のｐＨは４〜１０であってよく、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８に保たれる。また、培養中はｐＨ調整を行わないことが多いが、必要に応じてｐＨ調整を行ってもよい。培養温度は、例えば１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃のうちの一定温度に制御される。培養液には、空気を吹き込むことが好ましい。通気無しでも培養は可能であるが、培養液中の微細藻類の良好な生育のためには培養液体積当たりの１分間の通気量として、０．０１−３．０ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）がよく用いられる。培養液には、さらにＣＯ２を吹き込んでもよい。ＣＯ２を吹き込むことにより、微細藻類の生育が早まることが期待される。（また、ＣＯ２を吹き込むことにより、ｐＨの制御も可能となる。）ＣＯ２は、通気量に対して、０．１〜５％程度の量で吹き込むのが好ましい。光合成を利用した培養を行う場合、培養系に光を照射する。微細藻類の種類によって光の至適照射強度が異なるが、培養される微細藻類に適した強度で光を照射すればよい。例えば、１０〜１，０００μｍｏｌ／  ｍ２  ／ｓ１程度がよく用いられる。光源としては、屋内では白色の蛍光灯を用いることが一般的であるが、これに制限されず、ＬＥＤ等を用いてもよい。また、光源としては、屋外では太陽光を用いることも可能である。また、必要に応じて、培養液を適切な強度で撹拌または循環することもある。培養時間は、特に制限されないが、例えば、１〜４０日間であってよい。
【００３９】
本発明に係る方法は、上記微小重力工程を経た培養液をストレス環境におき、微細藻類に有用物質を産生させる環境ストレス付与工程を含むことが好ましい。上記環境ストレス付与工程におけるストレス環境は、培養される微細藻類に応じて適宜設定することができる。例えば、微細藻類がヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）であり、有用物質としてアスタキサンチンを産生させるためのストレス環境としては、強光照射を行うことが挙げられる。このように強光照射によりストレス付加を行う場合、本発明の属する技術分野において一般的に用いられる方法及び条件で、光照射を行うことができる。
本発明において、環境ストレス付与工程は、光照射により行われてもよく、また、光照射工程を含んでもよい。
【００４０】
例えば、上記強光照射に用いられる光源としては、特に限定されないが、例えば、水銀灯、蛍光灯、ハロゲンランプ及びＬＥＤ等を用いることができる。また、光量（光の照射強度）としては、特に限定されないが、例えば、３００〜１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの光量とすることができる。また、上記環境ストレス付与工程の期間は、微細藻類の種類、及び／又は、ストレス強度に応じて、微細藻類が有用物質の産生に要する期間に設定することができる。
【００４１】
本発明に係る方法で用いられる微細藻類が、ヘマトコッカス属に属する微細藻類である場合、上記環境ストレス付与工程は、光照射工程であることが好ましい。上記光照射工程における光量は、３００〜１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃであることが好ましく、５００〜１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃであることがより好ましい。
【００４２】
本発明に係る方法は、微細藻類の培養液を微小重力状態におくことにより微細藻類の細胞を活性化さるため、微細藻類にストレスを付与することで有用物質を産生させる場合に特に有用である。
【００４３】
本発明は、本発明の培養方法及び製造方法から得られた微細藻類でもある。本発明の培養方法及び製造方法から得られた微細藻類は、藻体が活性化しており、ストレス環境におかれた場合の生存率が高く、微細藻類による有用物質の産生に好適に用いることができる。
【００４４】
本発明の培養方法及び製造方法から得られた微細藻類から、有用物質を取り出す方法としては、本技術分野において一般的に用いられる精製、抽出、分画方法等を用いることができる。
【００４５】
本発明における有用物質としては、アスタキサンチン、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）又はＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）が好ましく、アスタキサンチンがより好ましい。
【発明の効果】
【００４６】
本発明によると、微細藻類の細胞を活性化させることにより、効率よく微細藻類を培養することができる。
また、本発明の培養方法及び製造方法によると、微細藻類の細胞が活性化されるため、得られた微細藻類を有用物質産生のためにストレス状態においても致死率が低い（生存率が高い）為、有用物質を効率的に産生できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例１に係る培養液を、有用物質誘導のための光照射直前、及び、直後で、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である（（ａ）光照射直前の写真、（ｂ）光照射直後の写真）。写真中の矢印は、アスタキサンチンを産生し赤色に変化している藻体を示す。写真中の矢印は、アスタキサンチンを産生し赤色に変化している藻体を示す。
【図２】比較例１に係る培養液を、有用物質誘導のための光照射直前、及び、直後で、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である（（ａ）光照射直前の写真、（ｂ）光照射直後の写真）。写真中の矢印は、アスタキサンチンを産生し赤色に変化している藻体を示す。
【図３】実施例２に係る培養液と比較例２に係る培養液とを、有用物質誘導のための光照射（５日間）終了直後に、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である（（ａ）実施例２に係る培養液の写真、（ｂ）比較例２に係る培養液の写真）。
【図４】実施例３に係る培養液と比較例３に係る培養液とを、有用物質誘導のための光照射（１日間）終了直後に、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である（（ａ）実施例３に係る培養液の写真、（ｂ）比較例３に係る培養液の写真）。
【図５】実施例４に係る培養液と比較例４に係る培養液とを、有用物質誘導のための光照射開始から４日目に、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である。（（ｂ）実施例４に係る培養液の光照射開始から４日目の写真、（ｃ）比較例４に係る培養液の光照射開始から４日目の写真）。なお、（ａ）は、通常培養で得られた培養液を、顕微鏡観察した際の顕微鏡写真である。
【図６】実施例４に係る培養液と比較例４に係る培養液とを、有用物質産生のための光照射後にサンプリングし、４７２ｎｍで吸光度を測定した際の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例４に係る培養液と比較例４に係る培養液とを、有用物質産生のための光照射後にサンプリングし、藻体乾燥重量を測定した際の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本実施例では、ヘマトコッカス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ＮＩＥＳ−１４４株）を用いた本発明の実施例を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
＜ヘマトコッカスの通常培養＞
ＭＢＭ液体培地を調製した。下記表１に培地組成を示す。
【００５０】
【表１】
2020074723.tif 000002
【００５１】
５Ｌ容培養フラスコに、５Ｌの培地を入れ、オートクレーブで滅菌処理した後、ヘマトコッカスＮＩＥＳ−１４４株を接種し、ヘマトコッカスＮＩＥＳ−１４４株の培養に用いた。ここにエアーポンプを用いて空気を供給し、白色ＬＥＤを用い、光合成有効光量子密度（ＰＰＥＤ）が、培養フラスコの照射面で３０〜１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓとなるように調整し（光量子計  ＭＱ−２００（ＡＰＯＧＥＥ社））、２４時間連続で光照射を行ない、２２℃にて７日間培養を行ったものを培養液とした。得られた培養液について顕微鏡観察を行った。なお、得られた培養液は、１週間毎に新たな培地に植え継ぎを行なった。
【００５２】
また、上記通常培養工程で得られた培養液から、１ｍＬサンプリングし、１．５ｍＬのサンプル管に入れて遠心分離（φ８０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）し、藻体を回収した。回収した藻体を、メノウ乳鉢を用いてアセトン中で１分以上すり潰すことで、藻体からアスタキサンチン及びクロロフィルを抽出し、吸光度を測定した。アスタキサンチンは４７２ｎｍ、クロロフィル（葉緑素）は６６２ｎｍに最大吸光度を有することを確認した。
【００５３】
＜微小重力処理＞
上記通常培養工程で得られた培養液のうち４０ｍＬを２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ビオラモ細胞培養フラスコ２５ｃｍ２  アズワン株式会社）に充填し、重力制御装置（Ｇｒａｖｉｔｅ（登録商標）株式会社スペース・バイオ・ラボラトリーズ）に設置した。上記細胞培養容器が模擬微小重力環境（１．０×１０−３Ｇ）に維持された後、５日間経過後、上記細胞培養容器を上記重力制御装置から取り外した。なお、模擬微小重力環境におかれている間、上記細胞培養容器の表面の光合成有効光量子密度（ＰＰＥＤ）が、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓとなるように調整し（光量子計（ＭＱ−２００（ＡＰＯＧＥＥ社製））、連続光照射を行った。また、ＣＯ２ガスを３５ｍｌ／ｄａｙ投与した。
【００５４】
＜有用物質産生のための光照射＞
光合成有効光量子密度（ＰＰＥＤ）が、培養フラスコの照射面で１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓとなるように調整し（光量子計（ＭＱ−２００（ＡＰＯＧＥＥ社製））、２４時間連続で光照射を行ない、２２℃にて１日間培養を行った。
【００５５】
＜評価（吸光度測定）＞
光照射工程終了後、得られた培養液から１ｍＬサンプリングし、これを１．５ｍＬのサンプル管に入れて遠心分離（φ８０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）し藻体を回収した。回収した藻体は、メノウ皿を用いて、アセトンを添加しながら１分以上粉砕し、藻体内のアスタキサンチン及びクロロフィルを含む抽出液を得た。得られた抽出液をアセトンで定容し全量を１ｍＬとし、４７２ｎｍ及び６６２ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記測定により得られたアスタキサンチン吸光度（ＯＤ４７２ｎｍ）とクロロフィル吸光度（６６２ｎｍ）との比を赤味指数とし、アスタキサンチン産生効率の目安とした。赤味指数を下記表２に示す。
また、光照射工程終了後、得られた培養液の顕微鏡写真を図１（ｂ）に示す。
【００５６】
（比較例１）
上記微小重力処理の代わりに振盪培養処理５日間行ったこと以外は、実施例１と同様に培養を行った。なお、振盪培養処理は８０ｒｐｍで行い、温度、光照射は、微小重力処理と同様の条件で行った。光照射工程終了後、実施例１と同様に評価し、結果を表２に示す。また、光照射工程終了後、得られた培養液の顕微鏡写真を図２（ｂ）に示す。
【００５７】
（実施例２）
微小重力処理時間を、１日（２４時間）とし、有用物質産生のための光照射を５日間とした以外は、実施例１と同様にして培養液を得た。得られた培養液の顕微鏡写真を図３（ａ）に示す。
【００５８】
（比較例２）
振盪培養処理時間を、１日（２４時間）とし、有用物質産生のための光照射を５日間とした以外は、比較例１と同様にして培養液を得た。得られた培養液の顕微鏡写真を図３（ｂ）に示す。
【００５９】
（実施例３）
微小重力処理時間を、１日（２４時間）とし、微小重力処理時に光照射を行わず、さらに有用物質産生のための光照射を５日間としたこと以外は、実施例１と同様にして培養液を得た。得られた培養液の顕微鏡写真を図４（ａ）に示す。また、実施例１と同様にして測定した赤味指数を下記表２に示す。
【００６０】
（比較例３）
振盪培養処理時間を、１日（２４時間）とし、振盪培養処理時に光照射を行わず、さらに有用物質産生のための光照射を５日間としたこと以外は、比較例１と同様にして培養液を得た。得られた顕微鏡写真を図４（ｂ）に示す。また、実施例１と同様にして測定した赤味指数を下記表２に示す。
【００６１】
【表２】
2020074723.tif 000003
【００６２】
（実施例４）
上記微小重力処理時間を３時間とし、さらに微小重力処理時に光照射もＣＯ２ガスの供給も行わず、さらに、有用物質産生のための光照射を８日間（５００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）としたこと以外は、実施例１と同様にして培養液を得た。なお、有用物質産生のための光照射工程において適宜サンプリングし、顕微鏡観察を行った。４日目におけるサンプルの顕微鏡写真を図５（ｂ）に示す。
【００６３】
＜有用物質の抽出＞
上記光照射を８日間行った後、得られた培養液から１ｍＬをサンプリングし、これを１．５ｍＬのサンプル管に入れて遠心分離（φ８０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）し藻体を回収した。回収した藻体は、メノウ皿を用いて、アセトンを添加しながら粉砕し、藻体内の赤色色素（アスタキサンチン）を抽出した。抽出液を回収し、アセトンで定容し全量を１ｍＬとし、波長４７２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定結果を下記表３及び図６に示す。
なお、アスタキサンチンの量は、吸光度にアスタキサンチン吸光係数Ｅ１％１ｃｍ＝２，２００を乗じて、算出することができる。従って、吸光度とアスタキサンチン量とは、比例関係にあり、一般的に吸光度が高いとアスタキサンチン量が多いと考えられる（参照：“シロザケ肉食の品質評価に関する研究”北水試研報  ７２，３１−３５（２００７））。
【００６４】
＜乾燥重量の測定＞
予め重量を測定したガラスフィルターに、上記光照射を８日間行った後、得られた培養液から、２０ｍＬをサンプリングし、これを吸引濾過し、１０５℃で２４時間乾燥後重量を測定した。上記培養液２０ｍＬ中の乾燥重量から、培養液１Ｌ当たりの乾燥重量に換算したものを藻体乾燥重量（ｇ／Ｌ）として、下記表３及び図７に示す。
【００６５】
（比較例４）
微小重力処理を行わなかったこと以外は、実施例４と同様に培養を行った。なお、有用物質産生のための光照射過程において適宜サンプリングし、顕微鏡観察を行った。４日目におけるサンプルの顕微鏡写真を図５（ｃ）に示す。
また、波長４７２ｎｍにおける吸光度を下記表３及び図６に示す。また、実施例４と同様にして測定した乾燥重量を下記表３及び図７に示す。
【００６６】
【表３】
2020074723.tif 000004
【００６７】
実施例１で得られた培養液と比較例１で得られた培養液とを顕微鏡観察した結果、微小重力処理がなされた実施例１で得られた培養液におけるヘマトコッカス微細藻類は、赤色化が進んでいることが目視で確認された。さらに、吸光度を測定したところ赤味指数も、比較例１で得られた培養液における赤味指数よりも０．９ポイント高く、微小重力培養におけるアスタキサンチン誘導効果が確認された。
【００６８】
また、実施例２で得られた培養液と比較例２で得られた培養液とを顕微鏡観察した図３を確認すると、微小重力処理を１日行った場合にも、顕微鏡観察において、実施例２で得られた培養液の方が明らかに赤味を呈しており、微小重力処理時間が１日であっても、アスタキサンチン産生効率が向上することが確認された。
さらに、実施例３の結果と比較例３の結果から、微小重力処理時に光照射を行わなかった場合にも、微小重力処理を行った実施例３で得られた培養液の方が、赤味指数が高く、アスタキサンチン産生誘導効果が高いことが確認された。
【００６９】
さらに、実施例４の結果と比較例４の結果から、光照射を行わない微小重力処理が３時間の場合でも充分にアスタキサンチン産生誘導効果を示すことが確認された。ここで、図５（実施例４及び比較例４における有用物質産生のための光照射開始から４日目における顕微鏡写真）を確認すると、比較例４における培養液には、脱色素した微細藻類細胞が多数確認される。ここで、脱色素した細胞はその後死滅し溶解するため、有用物質であるアスタキサンチンを産生することなく死滅し、アスタキサンチンの産生効率が悪くなる。一方、光照射前に微小重力処理がなされた実施例４における培養液には、色素を有する微細藻類細胞が多数存在し、脱色素した細胞はほとんど確認されない。従って、微小重力処理が行われることにより、ヘマトコッカス微細藻類の細胞が活性化し、その後の生存率が向上したことが確認できる。
従って、実施例４及び比較例４で測定した吸光度を比較した図６を確認しても、実施例４における吸光度は比較例４における吸光度の２倍程度大きく、最終的に得られたアスタキサンチン量も、２倍程度大きいことが確認でき、高いアスタキサンチン産生誘導効果が確認された。
また、図７を確認すると、実施例４における藻体乾燥重量は、比較例４における藻体乾燥重量よりも２倍程度大きく、微小重力処理は３時間であっても、充分に高い藻体の生存率を示したことが確認できた。
アスタキサンチンは、微細藻類が光などのストレスに対し拮抗機能を発揮することで得られる物質である。微細藻類を有する培養液を微小重力状態におくことで、光照射に対し速やかにアスタキサンチンを合成し、光ストレスに対抗した結果、脱色素する微細藻類の細胞（藻体）が減少し、アスタキサンチンの産生量が増加したものと考えられる。
【００７０】
以上、実施例１〜４及び比較例１〜４の結果から、微細藻類を微小重力状態におくことで、微細藻類の細胞が活性化し、生存率が向上し、微細藻類を効率よく培養できることが確認された。さらに、微細藻類の生存率が向上するため、有用物質の生産性を高めることが確認できた。
【図１】
2020074723.tif 000005
【図２】
2020074723.tif 000006
【図３】
2020074723.tif 000007
【図４】
2020074723.tif 000008
【図５】
2020074723.tif 000009
【図６】
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【図７】
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