(57)【要約】【課題】慣性液滴生成および粒子封入の提供。【解決手段】処理されている流体液滴内で、細胞とともに、所定の数のミクロスフェアまたはビーズを提供するためのマイクロ流体デバイスおよび方法が説明される。システムは、各液滴に単一のビーズおよび単一の細胞を提供してよく、ビーズは、そのビーズに関連付けられた特定の細胞を後で識別するためにＤＮＡまたは他の試薬を含んでよい。本発明は、マイクロフルイディクスの分野に関し、ビーズ、核酸断片、および細胞などの粒子の液滴への封入のためのデバイスおよび方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月１０日に出願された米国仮出願番号第６２／２５３，６０５号に基づく優先権を主張しており、この仮出願の内容は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、マイクロフルイディクス、ならびに生物学的反応および化学反応を実行するためのビーズ、核酸断片、および細胞などの粒子の液滴への封入の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
マイクロ流体デバイスは、狭いチャネルを通して流体を移動し、ある特定の診断上の反応または他の反応を実行するために使用され得る。これらのデバイスは、１つまたは複数の流体を受け入れるための入口と、外部デバイスまたは外部システムに流体を移送するための出口とを含むことができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
一態様では、本発明は、２つまたはそれよりも多いタイプの粒子を含む液体液滴を生成する方法を特徴とする。この方法は、その中にビーズを懸濁させたビーズ流体を第１のマイクロチャネル内のビーズの第１の整列されたストリームへと絞り込むこと、その中に細胞を懸濁させた細胞流体を第２のマイクロチャネル内の細胞の第２の整列されたストリームへと絞り込むこと、および前記第１の整列されたストリームを前記第２の整列されたストリームと合流して、各液滴内に所定の数の細胞とビーズとを有する複数の液滴を形成することを含む。一例では、第１のマイクロチャネルは最小断面寸法Ｄを有し、ビーズは、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する。細胞は、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する。第１の整列されたストリームと第２の整列されたストリームの合流は、第１の流体および第２の流体内の不混和性の第３の流体と接触させることを含む。ビーズを絞り込むことは、ビーズに第１のマイクロチャネルの第１の慣性絞込み部分を通過させることを含む。細胞を絞り込むことは、細胞に第２のマイクロチャネルの第２の慣性絞込み部分を通過させることを含む。
【０００５】
これらの方法のうちのいくつかでは、ビーズはヌクレオチド断片を含む。ヌクレオチド断片は、タグまたはバーコード領域と、インデックス領域と、捕捉領域とを含む。各ヌクレオチド断片のタグまたはバーコード領域は、長さが少なくとも約６ヌクレオチドとすることができる。各ヌクレオチド断片のインデックス領域は、長さが少なくとも約４ヌクレオチドとすることができる。捕捉領域は、ポリＴヌクレオチドを含み、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドとすることができる。
【０００６】
これらの方法のいくつかでは、細胞の所定の数は１であり、ビーズの所定の数は１である。ビーズのそれぞれのレイノルズ数（Ｒｅ）は少なくとも約１であり、ビーズのレイノルズ数は、
【数１】
2020091301.tif 000002
と定義され、上式で、ρが前記ビーズ流体の密度、Ｕｍが前記ビーズ流体の最大流れスピード、Ｈが前記ビーズ流体の水力直径、μが前記ビーズ流体の動的粘度である。細胞のそれぞれのレイノルズ数は少なくとも約１であり、細胞のレイノルズ数は、
【数２】
2020091301.tif 000003
と定義され、上式で、ρが前記細胞流体の密度、Ｕｍが前記細胞流体の最大流れスピード、Ｈが前記細胞流体の水力直径、μが前記細胞流体の動的粘度である。
【０００７】
これらの方法のいくつかでは、ｋ１ビーズとｋ２細胞とを含む複数の液滴の割合は（λ１ｋ１  ｅｘｐ（−λ１）／（ｋ１！））  （λ２ｋ２  ｅｘｐ（−λ２）／（ｋ２！））よりも大きく、上式で、λ１が液滴ごとのビーズの平均数、λ２が液滴ごとの前記細胞の平均数である。第１の整列されたストリームの流速は、少なくとも約１０μＬ／分であるか、または約１０〜１００μＬ／分であるか、または約４０〜７０μＬ／分であるか、または約４５〜６５μＬ／分であるか、または約５０〜６０μＬ／分であるか、または約５０μＬ／分であるか、または約６０μＬ／分である。第２の整列されたストリームの流速は、少なくとも約１０μＬ／分であるか、または約１０〜１００μＬ／分であるか、または約４０〜７０μＬ／分であるか、または約４５〜６５μＬ／分であるか、または約５０〜６０μＬ／分であるか、または約５０μＬ／分であるか、または約６０μＬ／分である。
【０００８】
一実施形態では、液滴生成システムは、基材内に配された第１の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第１の入口と、ビーズを含むビーズ流体を前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルに通すように構成された第１の流源と、前記基材内に配された第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第２の入口であって、前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルが、複数の液滴へと前記ビーズ流体および細胞流体を形成するために前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続される、第２の入口と、細胞を含む細胞流体を前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに通すように構成された第２の流源とを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、１つまたは複数の粒子チャネルは、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。一部の実施形態では、第１の粒子タイプＡ（ビーズなど）のための１つまたはすべてのチャネルは、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。一部の実施形態では、第２の粒子タイプＢ（細胞など）のための１つまたはすべてのチャネルは、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。湾曲した領域は、対称的に湾曲してよい。一部の実施形態では、湾曲した領域は、Ｓ字形、正弦曲線形、またはＳ字状形など、非対称的に湾曲してもよいし、螺旋パターンにおいて連続的に湾曲してもよい。一部の実施形態では、チャネルの一部またはすべての湾曲した領域は正弦曲線形である。一部の実施形態では、チャネルの一部またはすべての湾曲した領域は螺旋形である。一部の実施形態では、ビーズチャネル、または細胞チャネル、またはビーズチャネルと細胞チャネルの両方は、螺旋形領域を含む。一部の実施形態では、ビーズチャネル、または細胞チャネル、またはビーズチャネルと細胞チャネルの両方は、正弦曲線形領域を含む。一部の実施形態では、ビーズチャネルは螺旋領域を含み、細胞チャネルは正弦曲線形領域を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ビーズチャネル１０４は、チャネル内部のビーズ間間隔の調整を可能にする拡張／収縮領域を有してよい。一部の実施形態では、細胞チャネル１０８、１１０の一方または両方は、チャネル内部の細胞間の間隔の調整を可能にする拡張／収縮領域を有してよい。
【００１１】
任意選択で、第１の慣性絞込みマイクロチャネルは、不規則な形状（たとえば、側壁の線状性質における不連続性）を有する側壁を含む。任意選択で、第２の慣性絞込みマイクロチャネルは、不規則な形状を有する側壁を含む。任意選択で、不規則な形状は、不規則な形状を持つ慣性絞込みマイクロチャネルの長手方向軸から離れたベースライン表面から突き出す第１の不規則なものを含む。一部の例では、不規則なものは、長手方向軸に対してマイクロチャネルを狭くし、他の例では、不規則なものは、長手方向軸に対してマイクロチャネルを拡張する。任意選択で、各不規則な形状は独立に、台形、三角形、丸、および方形からなる群から選択される。一部の実施形態では、群は、楕円形形状または非対称的形状をさらに含む。一部の実施形態では、マイクロチャネルは、マイクロチャネルの一部分に沿って複数の不規則な形状を含む。不規則な形状は、同じ形状であってもよいし、異なる形状であってもよい。
【００１２】
一部の実施形態では、第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの一方または両方は、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、側壁は階段状表面を有する。一部の実施形態では、第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、側壁は曲面を有する。一部の実施形態では、第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、多くとも約３０のディーン数を有する湾曲した領域を有する。一部の実施形態では、第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの１つは、階段状表面を持つ側壁を有する。他の実施形態では、両方の慣性絞込みマイクロチャネルは、階段状表面を持つ側壁を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、液滴生成前のマイクロチャネル内の細胞およびビーズの分離、整列、および絞込みのためのシステムの一実施形態の斜視図である。
【００１４】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、異なるサイズのビーズチャネルを通してのビーズ絞込みを示す略図である。図２Ａは、矩形チャネルを通って流れるビーズを示す。図２Ｂは、２つのビーズが互いに隣接して流れることを可能にする断面寸法または流量を有する矩形チャネルを通って流れるビーズを示す。図２Ｃは、ビーズが存在する並行流（ｃｏ−ｆｌｏｗ）とビーズが存在しない並行流の存在によりビーズがビーズチャネル内の単一ファイルライン内を流れるようにビーズを絞り込む断面寸法または流量を有する矩形チャネルを通って流れるビーズを示す。図２Ｄは、デュアル入口並行流構成を有する慣性絞込みビーズチャネルの概略上面図である。
【００１５】
【図３】図３は、マイクロチャネル内の細胞およびビーズの分離、整列、および絞込みのための湾曲チャネルを使用するシステムの一代替実施形態の斜視図である。
【００１６】
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、慣性整列プロセスを提供するように構成された流れチャネルの実施形態の略図である。図４Ａは、非対称的な湾曲チャネルを用いた慣性整列プロセスの略図である。図４Ｂは、チャネル内部の整列されたビーズ間間隔を合わせるための流れチャネル内の拡張／収縮領域の使用を示す略図である。
【００１７】
【図５ＡＢ】図５Ａ〜図５Ｆは、マイクロチャネル内の細胞およびビーズの整列および絞込みのためのマイクロチャネル構成の異なる実施形態を示す。
【図５ＣＤ】図５Ａ〜図５Ｆは、マイクロチャネル内の細胞およびビーズの整列および絞込みのためのマイクロチャネル構成の異なる実施形態を示す。
【図５ＥＦ】図５Ａ〜図５Ｆは、マイクロチャネル内の細胞およびビーズの整列および絞込みのためのマイクロチャネル構成の異なる実施形態を示す。
【００１８】
【図６】図６は、単一細胞／単一ビーズ液滴の高効率形成を可能にするマイクロチャネル構成を示す。
【００１９】
【図７】図７は、細胞のためのデュアル入口並行流システムを使用する単一細胞／単一ビーズ液滴の高効率形成を可能にするマイクロチャネル構成を示す。
【００２０】
【図８】図８は、単一細胞シークエンシングのためのシステムの一実施形態の使用を示す。
【００２１】
【図９】図９は、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内の矩形チャネル内の４つの絞込み位置への３０μｍ直径ビーズの絞込みを示す実施形態によるデバイスの画像である。
【００２２】
【図１０】図１０は、液滴形成前の方形の直線マイクロチャネル内の４０μｍ直径ポリスチレンビーズの絞込みおよび整列を示す実施形態によるデバイスの画像である。
【００２３】
【図１１】図１１は、液滴形成前の方形の直線マイクロチャネル内の３０から４０μｍＰＭＭＡビーズの絞込みおよび整列を示す実施形態によるデバイスの画像である。
【００２４】
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、液滴形成前の直線方形マイクロチャネル内の３０から４０μｍセファロースゲルビーズの絞込みおよび整列を示す。図１２Ａは、機器から撮影された画像を示す。図１２Ｂは、セファロースゲルビーズのより容易な可視化を可能にするようにコントラストレベルが調整されていることを除いて、図１２Ａと同じ画像を示す。
【００２５】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、液滴形成前の螺旋方形マイクロチャネル内の３０から４０μｍセファロースゲルビーズの絞込みおよび整列を示す。図１３Ａは、機器から撮影された画像を示す。図１３Ｂは、セファロースゲルビーズのより容易な可視化を可能にするようにコントラストレベルが調整されていることを除いて、図１３Ａと同じ画像を示す。
【００２６】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、螺旋チャネルを含むシステムの２つの実施形態を示す。図１４Ａは、２つの隣接する螺旋チャネルと正弦曲線形曲線を含む１つのチャネルとを持つシステムを示す。図１４Ｂは、正弦曲線形領域を含む２つの同心チャネルを取り囲む、２つの螺旋チャネルをシステムの両端に持つシステムを示す。
【００２７】
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、２つの入口チャネルの集約後のチャネルの幅に対するマイクロ流体システムの構成を示す。図１５Ａは、ビーズチャネル（幅ｂ）へと送り、幅ｍの単一チャネルという結果になる、２つの細胞チャネルを示す。次いで、２つのオイル入口チャネルが集まり、幅ｄを持つ単一チャネルを生じる。図１５Ｂは、チャネル幅ｍおよびｄがチャネル幅ｂに対して増加される、図１５Ａに示される構成の一変形形態を示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、整列されたビーズを生ずるために凝集させられたビーズのプールを脱凝集させることができるチャネル内構造すなわち狭窄部がある、マイクロ流体システムの一実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面に対する参照がなされる。図面において、文脈が別段に規定しない限り、類似の記号は、一般的に、類似の構成要素を識別する。発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲において説明される例示的実施形態は、制限を意味するものではない。本明細書において提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてよく、他の変更がなされてよい。本明細書に一般に説明され、図に示される本開示の態様は、多種多様の異なる構成における整理、置き換え、組合せ、分離、および設計が可能であり、それらのすべては、本明細書において明示的に企図されることが容易に理解されよう。
【００３０】
実施形態は、マイクロフルイディクスの分野に関し、ビーズ、核酸断片、および細胞などの粒子の液滴への封入のためのデバイスおよび方法を含む。以下で説明されるさまざまな実施形態は、マイクロ流体チャネルを通る、オイルなどの流体の層流を使用して、流体中に懸濁された粒子の連続的で正確な自己整列という結果になる。以下で説明されるように、実施形態は、３つの空間次元に閉じ込められた整列された粒子の連続的なストリームを作製するために自己整列液体流れの利点に構成可能なさまざまな特定チャネル外形を有するマイクロ流体デバイスを含む。粒子は、流体チャネルのｙ−ｚ平面（すなわち断面平面）内で側方に整列し、流体流れの方向（すなわち、ｘ方向）に沿って長手方向に整列することもできる。回転整列の追加次元が、非対称的に成形された粒子のために発生することができる。
【００３１】
一実施形態は、マイクロチャネルデバイス内の液滴流れ内で反応を実行する方法およびデバイスを含む。たとえば、一実施形態では、マイクロチャネルデバイスは、１つの液滴内で単一細胞を単一ビーズと混合させるように設計される。マイクロチャネルデバイスに適用される各ビーズは１つまたは複数のヌクレオチド断片をもち、各ヌクレオチド断片は一意のＤＮＡタグを含む。ＤＮＡタグは、単一ビーズに結び付けられたすべての断片上に同じヌクレオチド配列を有するバーコードまたは他のＤＮＡ配列であってよい。ＤＮＡタグは、代替的に、単一ビーズ上の各断片に対して異なるヌクレオチド配列を有するインデックス配列であってよい。タグは、他のＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションによってタグを捕捉するために使用可能な捕捉領域も含んでよい。たとえば、一部の実施形態では、捕捉領域は、ポリＴテールを含んでよい。この構築物において、各ビーズは、デバイス内で使用されているすべての他のビーズと比較して一意にタグ付けされる。したがって、単一細胞および単一ビーズが、液滴へと封入され、溶解緩衝液に曝露されるとき（たとえば、溶解緩衝液は、封入が発生するとき液滴内に存在する、または、封入後に液滴に追加される）、細胞は溶解され、細胞内の各ポリアデニル化ｍＲＮＡは、それが封入されたビーズ上の捕捉領域のポリＴテールに結び付けられるようになる。次いで、ビーズが、逆転写酵素および適切なプライマーを使用するｃＤＮＡ反応に供される場合、細胞とともに封入されたビーズからの一意のタグと共に元のｍＲＮＡ配列を有するｃＤＮＡ鎖が形成される。これは、単一細胞からのｍＲＮＡのすべてが、ビーズからの一意のタグ配列を用いて標識されるという結果になる。この手順は、後でシークエンシング反応が大量に実行されることを可能にし、多数の細胞からのｃＤＮＡ試料が配列決定されるが、各々は、互いからソート可能であるように一意のタグを有する。インデックスは、増幅エラーを補正し、単一分子の複数回の計数を回避するために使用される。実験の終わりに、個々の細胞のｍＲＮＡ発現は、ｃＤＮＡを配列決定し、どのｍＲＮＡ母集団が各細胞内に存在したかどうか、およびそのｍＲＮＡの発現レベルを決定することによって決定可能である。
【００３２】
一実施形態では、マイクロチャネルデバイスは、各々が所定の数のビーズおよび細胞を持つ液滴の作製という結果になるチャネル流れ場内の絞込み位置に対してビーズのストリームを分離し、整列させ、絞り込むように構成される。絞込みは、少なくとも一部は、慣性揚力に基づくことが可能である。矩形チャネル内で、これは、たとえば、４つの矩形面の各々の中心から離れて等距離に離隔された絞り込まれた粒子の４つのストリームにつながることができる。方形外形の場合は、この４倍の対称性は、２倍対称性に減少可能であり、粒子のストリームは、チャネルの２つの対向する面の各々から離れて離隔される。
【００３３】
一部の実施形態では、デュアル入口並行流システムは、粒子Ａの第１の絞り込まれた、整列されたストリームおよび粒子Ｂの第２の絞り込まれた、整列されたストリームを作製する働きをし、粒子ＡおよびＢは異なるタイプである。一部の実施形態では、システムは、単一の絞り込まれたビーズストリームおよび単一の絞り込まれた細胞ストリームを作製する働きをする（たとえば、Ａ粒子はビーズであり、Ｂ粒子は細胞である）。一部の実施形態では、粒子の２つのストリームは、ビーズおよび細胞などの粒子ＡおよびＢを含む単一ストリームを作製するために、システム内で合流される。次いで、合流された粒子のストリームは、２つの粒子タイプを含む液滴を作製するために、オイルまたは他の不混和性流体と接触される。したがって、一部の実施形態では、２つのタイプの粒子を封入する働きをする第３の流体ストリームが導入される。一部の実施形態では、第３の流体ストリームは、第１のストリーム流体および第２のストリーム流体ならびに／または結合された第１の／第２のストリーム流体と不混和性または部分的に不混和性の担体流体を含む。
【００３４】
実施形態は、選択された数のＡ粒子およびＢ粒子を液滴内に封入するマイクロチャネルデバイスを含む。たとえば、デバイスは、たった１つのＡ粒子およびたった１つのＢ粒子を単一液滴内に封入するように構成されてもよいし、最高１つのＡ粒子および１つのＢ粒子を単一液滴内に封入するように構成されてもよいし、１つのＡ粒子および１つのＢ粒子を単一液滴内に封入するように構成されてもよい。２つのＡ粒子および１つのＢ粒子、または１つのＡ粒子および２つのＢ粒子を含むが、それに限定されない、単一液滴内の、より少ない、またはより多い、Ａ粒子と、より少ない、またはより多い、Ｂ粒子の構成も企図される。
【００３５】
実施形態は、選択された数のビーズおよび細胞を液滴へと配置するマイクロチャネルデバイスにも関する。たとえば、デバイスは、たった１つのビーズおよびたった１つの細胞を単一液滴内に封入するように構成されてもよいし、最高１つのビーズおよび１つの細胞を単一液滴内に封入するように構成されてもよいし、１つのビーズおよび１つの細胞を単一液滴内に封入するように構成されてもよい。２つのビーズおよび１つの細胞、または１つのビーズおよび２つの細胞を含むが、それに限定されない、単一液滴内の、より少ない、またはより多い、ビーズと、より少ない、またはより多い、細胞の構成も企図される。一実施形態では、デバイスは、１つのビーズおよび１つの細胞を単一液滴内に封入するように構成されてよい。２つのビーズおよび１つの細胞、または１つのビーズおよび２つの細胞、または１つのビーズおよび複数の細胞、または複数のビーズおよび１つの細胞を含むが、それに限定されない、液滴ごとのより少ないまたはより多いビーズおよび細胞の他の構成も企図される。このプロセスは、一般的には、ビーズを含む流体のストリームを、細胞を含む流体のストリームと合流することによって行われる。次いで、合流されたビーズおよび細胞のストリームは、ビーズおよび細胞を含む液滴を作製するために、オイルまたは他の不混和性流体と接触される。
【００３６】
これらの構成は、ビーズを持つ非常に高い濃度の単一液滴を生じさせ、１に近いλを有し、ここで、λは、液滴へと封入されるビーズのポアソン分布の平均であるが、複数のビーズ占有（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）を持つ液滴を有するのを回避する−したがって、過小分散されたポアソン分布、たとえば、λの平均分布を持つが、λよりも小さい、理想的にはφは０に近い、φの分散を持つポアソン分布を作製する。単一ビーズ占有を持つこの液滴の高濃度は、そのような液滴を必要とするシステム（高スループット単一細胞システムなど）が、整列されたストリームがエラーレートの減少（たとえば、望ましくない数のビーズまたは細胞を持つ液滴の数の減少）とともに使用されないシステムに対してスループットを１０〜２０倍改善することを可能にする。同様に、細胞の捕捉効率は、同じ桁に改善可能である。したがって、ビーズと細胞の両方のための、以下で説明される慣性絞込みなどの絞込みを用いる実施形態は、ダブルポアソン統計量において、両方のポアソン分布すなわちビーズのためのポアソン分布および細胞のためのポアソン分布を克服し、したがって、スループットにおける１００倍よりも大きい改善を達成し得る。実施形態は、連続的に動作されてよく、カスケーディング出力を伴う高い体積流量で、さらに依然として、液滴当たり所望の数のビーズおよび細胞を有する液滴を生じさせる。
【００３７】
システムおよび方法は、高スループットならびに細胞および粒子の動きの正確なマイクロスケール制御のための慣性マイクロ流体技術に関してよい。これらのシステムおよび方法は、ロングリードＤＮＡシークエンシング、ペアエンドシークエンシング、および単一細胞シークエンシングを含む任意のタイプの核酸配列解析における適用に適してよい。各々がたとえば１つのビーズおよび１つの細胞を持つ液滴の生成は、単一細胞の連続解析およびシークエンシングを可能にする。
【００３８】
マイクロ流体チャネル内での細胞およびビーズなどの粒子の自己整列および粒子の封入のためのシステムにおいて可能な多数の構成があるが、そのようなマイクロ流体システム１００の一実施形態が図１に示されている。示されるように、マイクロ流体システム１００は、全体的に、３つの入口、すなわち、ビーズチャネル１０４に接続するビーズ入口１０２と、ビーズチャネル１０４の２つの側面上の２つの細胞チャネル１０８、１１０に接続する細胞入口１０６と、システム１００の最も外側のチャネルであり、細胞チャネル１０８、１１０隣にあり、ビーズチャネル１０４から離れて側方に離隔された２つのオイルチャネル１１４、１１６に接続するオイル入口１１２とを含む。マイクロ流体システム１００は、全体的に、１つのシステム出口１１８を有する。マイクロ流体システム１００は、微細加工チップ１２０上に設けることが可能であり、さまざまなチャネルがチップ１２０内に形成される。
【００３９】
ビーズ入口１０２は、ビーズ流体１２４中に懸濁されたビーズ１２２をマイクロ流体システム１００へと導入するために構成される。ビーズ１２２は、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。チップ１２０内に形成されたビーズチャネル１０４は、以下で詳細に説明される多数の構成を有することができる。一般に、ビーズチャネル１０４は、ビーズ１２２を分離し、整列させ、液滴生成接合部１２６に入るときチャネル内の所定の側方位置に絞り込むように設計された指定された外形を有することができる。これらの側方場所は、絞り込まれると、ビーズ１２２がより大きいまたはより小さい類似のスピードで移り、間隔を維持して、全体的に互いに交差しないように、ビーズ流体１２４の速度プロファイルにおける類似の流速に対応する。ビーズチャネル１０４は、示されるように、直線であってよい。マイクロ流体システム内で使用されるビーズチャネルは、以下で詳述される、流体中に懸濁された所定のサイズのビーズを絞り込むためのさまざまな外形および断面を有することができる。たとえば、ビーズチャネル１０４は、矩形断面を有してよい。
【００４０】
一般に、ビーズチャネル１０４のサイズは、チャネル内で使用されることが意図されたビーズ１２２のサイズに関連する。たとえば、以下で言及されるように、８０〜１２５μｍ直径ビーズチャネルは、サイズが３０〜５０μｍであるビーズを分離し、整列させ、絞り込むために使用されるのに成功した。チャネルのサイズがビーズサイズに近いほど、分離、絞込み、および整列がより高速で効率的であることがわかった。
【００４１】
細胞チャネル１０８、１１０はそれぞれ、長い蛇行領域１０９、１１１を有する。オイルチャネル１１４、１１６もそれぞれ、長い蛇行領域１１５、１１７を有する。これらの長い蛇行領域は、対応するチャネルの両方の分岐上での流体流れの等しい分布を保証する流体抵抗として働く。
【００４２】
一部の実施形態では、ビーズチャネル１０４は、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。一部の実施形態では、細胞チャネル１０８、１１０の一方または両方は、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。湾曲した領域は、対称的に湾曲してよい。一部の実施形態では、湾曲した領域は、Ｓ字形、正弦曲線形、またはＳ字状形など、非対称的に湾曲してよい。一部の実施形態では、ビーズチャネル１０４は、チャネル内部のビーズ間間隔の調整を可能にする拡張／収縮領域を有してよい。一部の実施形態では、細胞チャネル１０８、１１０の一方または両方は、チャネル内部の細胞間の間隔の調整を可能にする拡張／収縮領域を有してよい。
【００４３】
図１に示されるように、細胞入口１０６は、細胞流体１３２中に懸濁された細胞１３０を、細胞チャネル１０８、１０９を通してマイクロ流体システム１００へと導入するために構成される。オイル入口１１２は、液滴生成オイル１３４を、オイルチャネル１１４、１１６を通して液滴生成接合部１２６に導入するために構成される。液滴生成オイル１３４の２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部１２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体１２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、液滴生成オイル１３４の２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部１２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体１３２のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口１１８では、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス１００を出て、あらゆる液滴は、一般に、図１に示される特定の設計において１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。
【００４４】
チップ１２０は、絞り込まれた粒子の解析、絞り込まれた粒子の収集のための、および／またはストリームラインを再結合するための、出口領域におけるチャネルの直線セクションも含むことができる。
慣性絞込み
【００４５】
マイクロ流体システム内で使用されるビーズチャネルは、流体中に懸濁された所定のサイズのビーズを絞り込むために、さまざまな外形および断面を有することができる。図２Ａ〜図２Ｄは、有限レイノルズ数流れ内での動的ビーズ自己組立てを示す。すべての図は、チャネル断面幅に沿った位置の違いが視覚化可能であるように、ビーズチャネル２０４より上からである。慣性移動は、ビーズを横断方向平衡位置に絞り込む。ビーズは、定義された平衡位置、たとえば、矩形チャネル内の４つ（図２Ａ）および方形チャネル内の２つ（図２Ｂ）に移動する。図２Ａに示される一実施形態では、実質的に１対１のアスペクト比を持つ矩形断面を有する直線チャネルが設けられる。そのようなチャネル外形内を流れる所定のサイズのビーズは、分離され、整列され、図２Ａの断面図に示される４つの絞込み位置へと絞り込まれる。これらの４つの絞込み位置は、４つのチャネル壁の各面から距離のところにある４つの平衡点すなわち電位最小値に対応する。
【００４６】
１よりも大きいアスペクト比（本明細書では、断面の短い方の側面に対する長い方の側面の比と定義される）を持つチャネルを設計することによって、絞込み位置の数は、４から２に減少されるのに成功することができる。一実施形態では、アスペクト比は約１．２よりも大きくてよいが、約１．１、１．３、１．４、１．５、またはそれよりも大きい他のアスペクト比も企図される。図２Ｂに示される一実施形態では、実質的に２対１のアスペクト比を持つ方形断面を有する直線ビーズチャネルが設けられる。そのようなチャネル外形内を流れる所定のサイズのビーズは、分離され、整列され、チャネルの幅にわたって幅広い方の側壁に沿って２つの平衡点すなわち電位最小値に対応する２つの絞込み位置へと絞り込み可能である。一部の実施形態では、チャネルの幅広い方の側面は、それぞれチャネルの上下または左右のどちらかにおけるビーズ絞込みに至るｙ方向またはｚ方向のどちらかと平行とすることができる。側方方向ビーズ絞込みのプロセスを通して、ビーズは、互いと相互作用し、それ自体を長手方向にも整列する。ビーズは、側方に絞り込まれる（ｙ−ｚ平面内）および／または長手方向に整列される（ｘ方向に）の両方であってよい。ビーズ間相互作用は、チャネルに沿ってそれらを離隔するビーズペア間の斥力を作製し、ビーズ格子の作製に至る。
【００４７】
図２Ｃに示される単一絞込み位置を取得するために、図２Ｄに示されるｚ方向（断面図における左右絞込みに至る）幅広い方の側面を持つ方形慣性絞込みビーズチャネル２０４を持つデュアル入口並行流システム２００は、使用可能である。ビーズチャネル２０４に接続された２つのビーズ入口２０２、２０３を使用して、チャネルの１つの側面上でのみビーズ流体１２４内にビーズを注入し、他のストリームは流体のみを含む（ビーズを含まない）ことによって、絞込み位置は、１にさらに減少可能である。これは、チャネルに沿ったビーズのより効率的な整列につながる。ビーズのない流体とともに並行流は、マイクロチャネルの１つの側面上でビーズを閉じ込め、規則的で繰返し可能な間隔を持つビーズの単一ラインという結果になることがわかった。類似の概念は、細胞および他のタイプの粒子の絞込みにも使用可能である。
【００４８】
図２Ｄは、２入口ビーズチャネルを含む動的自己組立てビーズシステムの概略図である。ランダムに分散されたビーズは、慣性揚力および流体力学的ビーズ−ビーズ相互作用を通して自己組立てされる。デュアル入口並行流システム２００は、１つの絞込み位置２２８において、単一の実質的に軸方向に位置合わせされたストリームへとビーズ２２２を絞り込むことによって、自由度を減少させる（図２Ｄ）。ビーズ流体２２４内の未加工ビーズ２２２は、「下側」ビーズ入口２０２を通って流される。ビーズのない流体２２５は、「上側」ビーズ入口２０３を通って流される。その結果、ビーズ２２２が１つの絞込み位置２２８において位置合わせするように、ビーズのない流体２２５は、ビーズチャネル２０４の「上側」半分内を通って流れ、ビーズ２２２は、ビーズチャネル２０４の「下側」半分に閉じ込められる。この平衡状態は、一次元システムになり、ビーズ間間隔は、たとえば、流れパラメータ、流体パラメータ、および幾何学的パラメータに依存する従属変数である。
【００４９】
一般に、「絞込み（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）」は、ビーズの束が通過するチャネルの断面の面積の減少を指す。一部の実施形態では、ビーズは、ビーズのせいぜい１．０１倍、１．０５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の幅という幅を有するエリア内に局在化可能である。局在化は、チャネルの妨げられていない部分内を含む、チャネル内の任意の場所において発生することができる。たとえば、局在化は、断面積における５０％よりも小さい、４０％よりも小さい、３０％よりも小さい、２０％よりも小さい、１０％よりも小さい、５％よりも小さい、２％よりも小さい、１％よりも小さい、または０．１％よりも小さい減少を有するチャネルの一部分において発生することができる。ある特定の実施形態では、局在化は、実質的に一定の断面積を有するチャネル内で発生することができる。
【００５０】
マイクロチャネル内の慣性絞込みは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４巻：１８８９２〜９７頁（２００７年）に記載されている。手短に言えば、自己組立てシステムは、一般に、ビーズシステムに対して引力および斥力として実現される、正のフィードバックおよび負のフィードバックを含む複数の相互作用を必要とする。閉じ込めによって誘発される粘性の逆流する伴流（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｗａｋｅ）は、隣接するビーズを無限性に押し戻すが、揚力の形をとる流体慣性は、ビーズを有限距離のところに維持するように働く。有限レイノルズ数チャネル流内のマイクロスケールビーズの動的自己組立てのこの仕組みは、ビーズストリーム自己組立てを制御するためのパラメータを提供し、マイクロチャネルシステム内での拡張されたビーズ制御を可能にする。そのような制御は、ビーズ間隔に対するローパス空間フィルタリングなどの適用例にとって有用である。マイクロ流体デバイスは、ビーズ間間隔を操作し、絞込み解除（ｄｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）を減少させるために、ビーズ−ビーズ相互作用およびビーズ−壁相互作用を制御するように設計および動作可能である。
【００５１】
ストークス流（たとえば、Ｒｅ＝０）仮定は、マイクロ流体システム内での慣性効果を解析する際に広く認められているが、マイクロ流体チャネル内のレイノルズ数は、多くの場合、約１に到達し、いくつかの極端な場合では約数１００にすら到達する。レイノルズ数すなわちＲｅは、
【数３】
2020091301.tif 000004
によって決定され、上式で、ρは流体の密度、Ｕｍは最大流れスピード、Ｈは水力直径、μは流体の動的粘度である。多数の慣性効果は、そのようなレイノルズ数において、マイクロ流体デバイス内で観察されている。１つの例は、矩形チャネルおよび方形チャネル内のビーズの慣性移動である。ランダムに分散されたビーズは、慣性揚力によりストリームラインにわたって移動し、この慣性揚力は、ビーズを壁の方へ押す剪断勾配リフトとビーズをチャネルの中心の方へ押す壁効果リフトの組合せである。これらの慣性揚力は、チャネル対称性によって決定される４つ（図２Ａ）または２つ（図２Ｂ）の動的「横断方向平衡点」にビーズを絞り込む。システムは、エネルギーを常に放散する非平衡システムであり、横断方向平衡点は、慣性揚力がチャネルの断面においてゼロになるところである。本明細書において使用されるとき、「絞込み位置」は、これらの横断方向平衡点を指す。
【００５２】
チャネルを下る間、ビーズは、慣性揚力によって側方（ｙ方向およびｚ方向）に絞り込まれ、同時にビーズ−ビーズ相互作用によって長手方向（ｘ方向）に自己組立てされる。絞込みは、マイクロチャネルの幅および高さに沿って発生し、組立ては、マイクロチャネルの長手方向軸に沿って発生する。最終的な組織化された状態では、ビーズのシステムは、２つの自由度すなわちビーズ間の間隔および絞込み位置を有する。ビーズ間の間隔は、流体パラメータおよび流れパラメータ（Ｕｍ、ρ、μ）ならびに幾何学的パラメータ（ビーズ直径（ａ）、チャネル幅（ｗ）、および高さ（ｈ））によって決定される。これらのパラメータは、ビーズスケールにおける剪断レートに基づいて、ビーズレイノルズ数
【数４】
2020091301.tif 000005
を構成し、ビーズ間間隔は、Ｒｐの増加とともに減少する。
【００５３】
ビーズが、１つの絞込み位置に位置合わせされるとき、流れパラメータおよび幾何学的パラメータの任意の所与のセットに対するデフォルトのビーズ間間隔が存在する。しかしながら、１つよりも多い絞込み位置では、異なるチャネル横断間隔および単一ストリーム間隔が出現する。ビーズ間間隔は、チャネルアスペクト比に対する強い依存を示さない。ビーズのための絞込み位置の選択は、本質的に、ランダムなイベントであり、これによって、組織化された構造における多様なパターンがもたらされる。しかしながら、追加絞込み位置の形をとる追加の自由度は、結果として生じるビーズストリームをより複雑にする。
チャネル外形
【００５４】
ビーズチャネル外形は、図１に示される直線チャネル外形とは対照的に、さまざまな外形を有することができる。図３は、湾曲したビーズチャネル３０４を持つマイクロ流体システム３００の別の実施形態を示す。示されるように、マイクロ流体システム３００は、全体的に、３つの入口、すなわち、ビーズチャネル３０４に接続するビーズ入口３０２と、ビーズチャネル３０４の２つの側面上の２つの細胞チャネル３０８、３１０に接続する細胞入口３０６と、システム３００の最も外側のチャネルであり、細胞チャネル３０８、３１０隣にあり、ビーズチャネル３０４から離れた２つのオイルチャネル３１４、３１６に接続するオイル入口３１２とを含む。マイクロ流体システム３００は、全体的に、１つのシステム出口３１８を有する。マイクロ流体システム３００は、微細加工チップ３２０上に設けることが可能であり、さまざまなチャネルがチップ３２０内に形成される。
【００５５】
ビーズ入口３０４は、ビーズ流体３２４中に懸濁されたビーズ３２２をマイクロ流体システム３００へと導入するために構成される。ビーズ３２２は、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。チップ３２０内に形成されたビーズチャネル３０４は、以下で詳細に説明される多数の構成を有することができる。一般に、ビーズチャネル３０４は、ビーズ３２２を分離し、整列させ、液滴生成接合部３２６に入るときチャネル内の所定の側方位置に絞り込むように設計された指定された外形を有することができる。これらの側方場所は、絞り込まれると、ビーズ３２２がより大きいまたはより小さい類似のスピードで移り、間隔を維持して、全体的に互いに交差しないように、ビーズ流体３２４の速度プロファイルにおける類似の流速に対応する。ビーズチャネル３０４は、示されるように、湾曲であってよい。湾曲チャネルは、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために使用可能である。
【００５６】
細胞チャネル３０８、３１０はそれぞれ、蛇行領域３０９、３１１を有する。オイルチャネル３１４、３１６もそれぞれ、長い蛇行領域３１５、３１７を有する。
【００５７】
一実施形態では、方形断面を有するＳ字形ビーズチャネル、正弦曲線形ビーズチャネル、またはＳ字状形ビーズチャネルなどの、対称的に湾曲したチャネル、非対称的に湾曲したチャネル、または連続的に湾曲したチャネルを設けることが可能である。そのようなチャネル外形内を流れる所定のサイズのビーズは、一般に、チャネルの左側面および右側面からある距離のところにある１つまたは２つの平衡点すなわち電位最小値に対応する２つの絞込み位置へと絞り込まれる。Ｓ字状チャネルのアスペクト比は、実質的に１対１とすることができ、および／または、その長さに沿って変化することができる。たとえば、Ｓ字状チャネルのアスペクト比は、選ばれた構成に応じて、チャネルの長さにわたって１対１から２対１の間で変化することができる。
【００５８】
図４Ａに示される別の実施形態では、ビーズチャネル４０４は、湾曲領域４３８を有する。非対称的に湾曲したチャネルは、特定の適用例に対して必要とされるさまざまな形状および構成を有することができるが、一実施形態では、非対称的ビーズチャネルは、一般に、大きいターンおよび小さいターンを有する波の形状を有することができ、湾曲の半径は、波の各変曲点後に変化することができる。各大きいターンおよび小さいターンは、ターンに関連付けられた、指定された幅のチャネルを有することができる。非対称的に湾曲したチャネルは、長手方向整列と側方方向絞込みの両方を可能にする。
【００５９】
一実施形態では、チャネル波の波長の２分の１は、大きな湾曲部を有することができるが、チャネル波の波長の２分の１は、小さな湾曲部を有することができる。次いで、これらの湾曲部は、指定された長さのチャネルに非対称的な湾曲部を提供するために、必要に応じて何度でも繰り返され、各変曲点の後に変化することができる。非対称的に湾曲したビーズチャネル４０４は、湾曲部における非対称性に応じてチャネル長さわたって必要に応じて変化することができるアスペクト比を持つ方形断面を有することもできる。一実施形態では、アスペクト比は、１対１から２対１の間で変化することができる。この場合、チャネル４０４内の単一平衡点すなわち電位最小値に対応するビーズの単一絞り込まれたストリームが作製される。
【００６０】
他の実施形態では、非対称的な湾曲ビーズチャネル、たとえば、拡張する螺旋形チャネルが設けられ、実質的に２対１のアスペクト比を持つ方形断面を有することができる。このアスペクト比は変化してよい。この場合、ビーズは、チャネル内の単一平衡点すなわち電位最小値に対応するチャネルの内壁から離れたある距離、単一ストリームラインへと絞り込まれる。螺旋チャネルを含むシステムの例は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている。一部の実施形態では、チャネルの螺旋部分は、２から１０ｍｍ、または約３から７ｍｍ、または約５ｍｍ、または約１０ｍｍの外径を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、単一チップは、異なるチャネル外形を持つビーズチャネルを有してよい。図４Ｂは、変化する直径を有するビーズチャネル４０５を持つ別の実施形態を示す。ビーズ絞込み領域（上流、図示されず）の後の拡張／収縮領域４４０は、チャネル内部のビーズ間の間隔の調整を可能にする。たとえば、ビーズ絞込み領域（上流、図示されず）の後の拡張／収縮領域４４０は、チャネル内部のビーズ４２２Ａ〜Ｄ間の間隔を増加させるために使用されてよい（図４Ｂ）。代替的に、ビーズ絞込み領域の後の拡張／収縮領域は、チャネル内部のビーズ間の間隔を減少させるために使用されてよい。一部の実施形態では、チャネル寸法は、試料のフィルタリングを容易にするために、または流体抵抗を作製するなどの適用例に固有の他の理由のために、チップの長さにわたって減少することができる。チャネル寸法は、フォークもしくはバルブシステムがチャネル内に配置され得ることを可能にするために、または複数のストリームラインが分離され、解析もしくは収集のために異なる場所に向けられることを可能にするために、入口エリアにおいて、または出口エリアにおいて、大きくすることができる。類似の手段では、さまざまなチャネルの断面も、特定の適用例のために絞り込まれたビーズのストリームラインを操作するために、単一チップ内で必要に応じて変化可能である。一般に、チャネル外形、チャネル断面、およびチャネル寸法の任意の組合せは、所定のサイズのビーズまたは複数の所定のサイズのビーズをソート、分離し、整列させ、絞り込むために、必要に応じて単一チップ上に含まれ得る。たとえば、異なるチャネル外形および流量は、ビーズ流体および細胞流体のストリームが液滴生成の前に各ストリーム内での所望の絞込みおよび整列を保証するために使用可能である。
【００６２】
一実施形態では、ビーズチャネルの直線セクションは、ビーズがマイクロ流体システムへと導入されるとき流れラインを輸送および分割するためにチップ内で入口付近に形成される。各チャネルの直線セクションは、必要に応じて所定のサイズのビーズを絞り込むために、任意の数の対照的な湾曲チャネルおよび／または非対称的な湾曲チャネルに移行することができる。
【００６３】
図３に示されるように、ビーズチャネル３０４は、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域３０５を有する。一部の実施形態では、細胞チャネル３０８、３１０の一方または両方は、図４Ａに示されるように、必要とされる絞込み長さを減少させるために、およびデバイス底面積を減少させるために、湾曲した領域を有してよい。湾曲した領域は、対称的に湾曲してよい。一部の実施形態では、湾曲した領域は、Ｓ字形、正弦曲線形、またはＳ字状形など、非対称的に湾曲してよい。
【００６４】
一実施形態では、方形断面を有するＳ字形ビーズチャネル、正弦曲線形ビーズチャネル、またはＳ字状形細胞チャネルなどの、対称的に湾曲したチャネル、非対称的に湾曲したチャネル、または連続的に湾曲したチャネルを設けることが可能である。そのようなチャネル外形内を流れる所定のサイズの細胞は、一般に、チャネルの左側面および右側面からある距離のところにある１つまたは２つの平衡点すなわち電位最小値に対応する２つの絞込み位置へと絞り込まれる。Ｓ字状チャネルのアスペクト比は、実質的に１対１とすることができ、および／または、その長さに沿って変化することができる。たとえば、Ｓ字状チャネルのアスペクト比は、選ばれた構成に応じて、チャネルの長さにわたって１対１から２対１の間で変化することができる。
【００６５】
湾曲領域４３８を有する図４Ａにおけるビーズチャネル４０４と同様に、細胞チャネル３１０、３０８は、それぞれ湾曲領域を有してもよい。非対称的に湾曲したチャネルは、特定の適用例に対して必要とされるさまざまな形状および構成を有することができるが、一実施形態では、非対称的細胞チャネルは、一般に、大きいターンおよび小さいターンを有する波の形状を有することができ、湾曲の半径は、波の各変曲点後に変化することができる。各大きいターンおよび小さいターンは、ターンに関連付けられた、指定された幅のチャネルを有することができる。非対称的に湾曲したチャネルは、長手方向整列と側方方向絞込みの両方を可能にする。
【００６６】
一実施形態では、チャネル波の波長の２分の１は、大きな湾曲部を有することができるが、チャネル波の波長の２分の１は、小さな湾曲部を有することができる。次いで、これらの湾曲部は、指定された長さのチャネルに非対称的な湾曲部を提供するために、必要に応じて何度でも繰り返され、各変曲点の後に変化することができる。非対称的に湾曲した細胞チャネルは、湾曲部における非対称性に応じてチャネル長さわたって必要に応じて変化することができるアスペクト比を持つ方形断面を有することもできる。一実施形態では、アスペクト比は、１対１から２対１の間で変化することができる。この場合、チャネル内の単一平衡点すなわち電位最小値に対応する細胞の単一絞り込まれたストリームが作製される。
【００６７】
他の実施形態では、非対称的な湾曲細胞チャネル、特に、拡張する螺旋形チャネルが設けられ、実質的に２対１のアスペクト比を持つ方形断面を有することができる。このアスペクト比は変化してよい。この場合、細胞は、チャネル内の単一平衡点すなわち電位最小値に対応するチャネルの内壁から離れたある距離、単一ストリームラインへと絞り込まれる。螺旋チャネルを含むシステムの例は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている。一部の実施形態では、チャネルの螺旋部分は、２から１０ｍｍ、または約３から７ｍｍ、または約５ｍｍ、または約１０ｍｍの外径を有する。
【００６８】
本明細書において説明されるマイクロ流体デバイスは、当業者に公知の任意の適切な技術を使用して製造されてよい。たとえば、そのようなデバイスおよびシステムは、ソフトリソグラフィ技法と組み合わされた種型を使用して製造されてよい。別の例として、マイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイスのいくつかの構成要素は、３次元印刷技術を使用して製造可能である。
【００６９】
一部の実施形態では、チャネルは、形状が方形である。方形形チャネルは、直線チャネルおよび湾曲したチャネルなどの、本明細書において説明されるさまざまな外形へと形成されてよい。チャネル高さ対幅のアスペクト比は、粒子整列を最適化するために選択されてよい。一部の実施形態では、方形チャネルアスペクト比は、７：１、または５：１、または４：１、または３：１、または２：１である。一部の実施形態では、チャネル高さは、約０．５μｍから約２００μｍの範囲内にあることができる。
【００７０】
一部の実施形態では、単一チップは、異なるチャネル外形を持つ細胞チャネルを有してよい。変化する直径を有する図４Ｂにおけるビーズチャネル４０５と同様に、細胞チャネル３０８、３１０の一方または両方は、変化する直径を有することができる。細胞絞込み領域の後の拡張／収縮領域は、チャネル内部の細胞間の間隔の調整を可能にする。たとえば、細胞絞込み領域の後の拡張／収縮領域は、チャネル内部の細胞間の間隔を増加させるために使用されてよい（図４Ｂ）。代替的に、細胞絞込み領域の後の拡張／収縮領域は、チャネル内部の細胞間の間隔を減少させるために使用されてよい。一部の実施形態では、チャネル寸法は、試料のフィルタリングを容易にするために、または流体抵抗を作製するなどの適用例に固有の他の理由のために、チップの長さにわたって減少することができる。チャネル寸法は、フォークもしくはバルブシステムがチャネル内に配置されることを可能にするために、または複数のストリームラインが分離され、解析もしくは収集のために異なる場所に向けられることを可能にするために、入口エリアにおいて、または出口エリアにおいて、大きくすることができる。類似の手段では、さまざまなチャネルの断面も、特定の適用例のために絞り込まれた細胞のストリームラインを操作するために、単一チップ内で必要に応じて変化可能である。一般に、チャネル外形、チャネル断面、およびチャネル寸法の任意の組合せは、所定のサイズの細胞または複数の所定のサイズの細胞をソート、分離し、整列させ、絞り込むために、必要に応じて単一チップ上に含まれ得る。たとえば、異なるチャネル外形および流量は、細胞流れおよび細胞流体のストリームが液滴生成の前に各ストリーム内での所望の絞込みおよび整列を保証するために使用可能である。
【００７１】
一実施形態では、細胞チャネルの直線セクションは、細胞がマイクロ流体システムへと導入されるとき流れラインを輸送および分割するためにチップ内で入口付近に形成される。各チャネルの直線セクションは、必要に応じて所定のサイズの絞込み細胞のために、任意の数の対照的な湾曲チャネルおよび／または非対称的な湾曲チャネルに移行することができる。
【００７２】
一部の実施形態では、ビーズチャネル３０４は、チャネル内部のビーズ間間隔の調整を可能にする図４Ｂに示すような拡張／収縮領域を有してよい。一部の実施形態では、細胞チャネル３０８、３１０の一方または両方は、チャネル内部のビーズ間の間隔の調整を可能にする拡張／収縮領域を有してよい。
【００７３】
図３に示されるように、細胞入口３０６は、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム３００へと導入するために構成される。オイル入口３１２は、液滴生成オイルを、オイルチャネル３１４、３１６を通して液滴生成接合部３２６に導入するために構成される。オイルの２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部３２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体３２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部３２６に到達するのと同じ頻度で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口３１８では、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス３００を出て、あらゆる液滴は、一般に、図３に示される特定の設計において１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。一部の実施形態では、あらゆる液滴は、一般に、ゼロよりも多いまたはこれに等しい所定の数のビーズおよびゼロよりも多いまたはこれに等しい所定の数の細胞を封入する。例えば、各液滴は、各液滴は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００のビーズを有してよく、各液滴は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の細胞を有してよい。一部の実施形態では、ビーズの統計分布は、最適よりも少ない、たとえば、液滴当たり１よりも少ないビーズである。一部の実施形態では、細胞の統計分布は、最適よりも少ない、たとえば、液滴当たり１よりも少ない細胞である。
【００７４】
チップ３２０は、絞り込まれた粒子の解析、絞り込まれた粒子の収集のための、および／またはストリームラインを再結合するための、出口領域におけるチャネルの直線セクションも含むことができる。
【００７５】
当業者によって諒解されるように、任意の数の湾曲部または直線セクションは、ビーズチャネル３０４、細胞チャネル３０８、３１０のうちの１つまたは複数のために、チップ内に必要に応じて含まれ得る。チャネルの追加の湾曲したセクションは、絞り込まれたビーズストリームが、ビーズに関連付けられた標識またはタグに基づいて、追加分離を容易にするための、「オフランプ」として働くことができる。チャネルフォークまたはスプリットは、さまざまな適用例のために必要に応じて絞り込まれたビーズの操作をさらに容易にするために、チャネル内の任意の位置において含まれ得る。
【００７６】
直線、対称的、および非対称的を含む、上記および本明細書において説明されるすべてのチャネルのアスペクト比は、チャネルのコースにわたって、適用例によって、および／または必要に応じて何度でも、必要に応じて変化することができる。図１〜図４に示される実施形態では、アスペクト比は、１対１および１対２と示されている。しかしながら、当業者は、さまざまなアスペクト比が用いられ得ることを認識するであろう。さらに、アスペクト比は、第１の断面チャネル寸法対第２の断面チャネル寸法の比と受け取り可能であるので、アスペクト比を決定するための基準としての幅対高さの選定は、やや恣意的であり、方形チャネルの場合、これは、幅対高さまたは高さ対幅のどちらかであり得る。さらなる例として、図２Ｂのチャネルのアスペクト比は、２対１または１対２のどちらかと表現可能である。
【００７７】
上記で述べられた外形の各々において、他のチャネル断面も含まれ得る。チャネル断面は、円形、三角形、ダイヤモンド、および半球状を含むことができるが、それに限定されない。所定のサイズのビーズは、これらの例示的な断面の各々において絞り込み可能であり、絞込み位置は、チャネルの外形に依存する。たとえば、円形断面または半球状断面を有する直線チャネルでは、絞り込まれたビーズの環または円弧は、チャネル内で形成可能である。三角形断面またはダイヤモンド断面を有する直線チャネルでは、ビーズは、外形における各壁の平坦面からある距離のところにある絞込み位置に対応するストリームへと絞り込み可能である。上記で述べられた例示的な断面の各々を有する対称的な湾曲チャネルおよび非対称的な湾曲チャネルが含まれるので、絞込みストリームおよび絞込み位置は、一般に、上記で方形断面を有するチャネルに関して説明されたものに対応することができる。
【００７８】
一般に、試料中に懸濁されたビーズにとって最適な整列条件および絞込み条件に至る直線マイクロ流体チャネル、対称的マイクロ流体チャネル、および非対称的なマイクロ流体チャネル内のいくつかのパラメータが存在する。これらのパラメータは、たとえば、チャネル外形、チャネル外形に対するビーズサイズ、マイクロ流体チャネルを通る流体流れの性質、および層流条件の下のマイクロ流体チャネル内のビーズ流れに関連付けられた力を含むことができる。ビーズに対して働く力は慣性力と呼ばれることがあるが、他の力が絞込み挙動および整列挙動に寄与することが可能である。例示的な慣性力は、チャネル壁から離れた慣性リフトダウン剪断勾配、ディーン抵抗（粘性抵抗）、ディーン流れからの圧力抵抗、および個々のビーズに対して働く遠心力を含むことができるが、それに限定されない。
１つのチップ内の複数のビーズチャネル
【００７９】
任意の数のマイクロ流体ビーズチャネルが、任意の数の手段でチップ内に形成可能である。例示的な一実施形態では、単一ビーズチャネルが、チップ上に、その中にビーズを絞り込むために形成される。他の例示的な実施形態では、複数のビーズチャネルが、ビーズを絞り込むためのネットワークのさまざまな構成においてチップ内に形成可能である。たとえば、２つ、４つ、６つ、８つ、１０、１２、およびこれよりも多くのチャネルがチップ内に形成可能である。任意の数の層もシステムの微細加工チップ内に含むことができ、各層は、その中に形成された複数のビーズチャネルを有する。
１つのチップ内の複数の細胞チャネル
【００８０】
任意の数のマイクロ流体細胞チャネルが、任意の数の手段でチップ内に形成可能である。例示的な一実施形態では、単一細胞チャネルが、チップ上に、その中にビーズを絞り込むために形成される。他の例示的な実施形態では、複数の細胞チャネルが、細胞を絞り込むためのネットワークのさまざまな構成においてチップ内に形成可能である。たとえば、２つ、４つ、６つ、８つ、１０、１２、およびこれよりも多くのチャネルがチップ内に形成可能である。任意の数の層もシステムの微細加工チップ内に含むことができ、各層は、その中に形成された複数の細胞チャネルを有する。
ビーズチャネル長
【００８１】
チャネルサイズ、ビーズサイズ、流量、および流体性質を含む異なるパラメータ間の相互影響が、ビーズ絞込みのために必要とされる長さに影響を与える。チャネル内のこの相互影響は、以下の式によって決定される。
【数５】
2020091301.tif 000006
上式で、Ｌｆはビーズ絞込みのために必要とされる長さ、μは流体の動的粘度、ｈはビーズチャネルのサイズ（または水力寸法、またはチャネルの別の重要な寸法）、ρは流体の密度、Ｕｍは最大流れスピード、ａはビーズ直径、ｆＬは係数であり、ほとんどの場合０．０２〜０．０５の範囲内にある。ビーズチャネル長に影響を与える他の係数としては、壁の特徴、壁の外形、壁のコーティング、流体タイプ、ビーズ以外の流体中の構成要素のタイプおよび濃度、ビーズの形状、ビーズのコーティング、ならびにビーズの重量がある。
【００８２】
表１は、水の性質に近い性質を持つ水性液中の高スループット単一細胞実験に関連のある３０〜５０μｍビーズに対するビーズの分離、絞込み、および整列のための長さの例を示す。絞込み位置の数は、入口構成（単一入口対デュアル入口）およびそれらの相対的流量に依存する。その列における第１の数は、単一入口を有する標準的なケースに対応する。
【表１】
2020091301.tif 000007
【００８３】
図５Ａに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ａは、寸法が１２５×１２５μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ａは、３つの入口、すなわち、単一ビーズチャネル５０４Ａに接続するビーズ入口５０２Ａ、ビーズチャネル５０４Ａの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ａ、５１０Ａに接続する細胞入口５０６Ａ、およびシステム５００Ａの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ａから離れて細胞チャネル５０８Ａ、５１０Ａの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ａ、５１６Ａに接続するオイル入口５１２Ａを含む。マイクロ流体システム５００Ａは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ａを有する。
【００８４】
ビーズ入口５０２Ａは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ａへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０２Ａは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ａに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ａを有してよい。ビーズフィルタ５４２Ａ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ａを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ａを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ａ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【００８５】
細胞入口５０６Ａは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ａへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ａは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ａ、５１０Ａに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ａを有してよい。細胞フィルタ５４４Ａ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ａ、５１０Ａを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ａを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ａ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【００８６】
オイル入口５１２Ａは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ａ、５１６Ａを通して液滴生成接合部５２６Ａに導入するために構成される。オイル入口５１２Ａは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ａ、５１６Ａに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ａを有してよい。オイルフィルタ５４６Ａ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ａ、５１６Ａを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ａを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ａ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【００８７】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ａに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ａのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ａに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ａでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００を出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。設計および入口濃度は、必要な場合すべての液滴が単一ビーズまたは細胞を有するとは限らないように調整可能である。例えば、各液滴は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００のビーズを有してよく、各液滴は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００細胞を有してよい。一部の実施形態では、ビーズの統計分布は、最適よりも少ない、たとえば、液滴当たり１よりも少ないビーズである。一部の実施形態では、細胞の統計分布は、最適よりも少ない、すなわち、液滴当たり１よりも少ない細胞である。
【００８８】
図５Ｂに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ｂは、寸法が１２５×１２５μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ｂは、４つの入口、すなわち、ビーズチャネル５０４Ｂに接続する２つのビーズ入口５０２Ｂ、５０３Ｂ（両方の入口がビーズ溶液を有するが、それらの一方のみがビーズを含み、他方はビーズを含まない）、ビーズチャネル５０４Ｂの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ｂ、５１０Ｂに接続する細胞入口５０６Ｂ、およびシステム５００Ｂの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ｂから離れて細胞チャネル５０８Ｂ、５１０Ｂの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ｂ、５１６Ｂに接続するオイル入口５１２Ｂを含む。デュアル入口並行流の設計は、効率的なビーズ整列という結果になる。このデュアル入口並行流システム内の２つの細胞チャネル５０８Ｂ、５１０Ｂは、両方のマイクロ流体システムが１２５×１２５μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ａに示される２つの細胞チャネル５０８Ａ、５１０Ａと比較されると、長さが長い。このデュアル入口並行流システム内の２つのオイルチャネル５１４Ｂ、５１６Ｂは、両方のマイクロ流体システムが１２５×１２５μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ａに示される２つのオイルチャネル５１４Ａ、５１６Ａと比較されると、長さが長い。マイクロ流体システム５００Ｂは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ｂを有する。
【００８９】
ビーズ入口５０２Ｂは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ｂへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０３Ｂは、いずれのビーズも含まない流体を導入するために構成されている。ビーズ入口５０２Ｂ、５０３Ｂは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ｂに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ｂ、５４３Ｂをそれぞれ有してよい。ビーズフィルタ５４２Ｂ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ｂを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ｂ、５４３Ｂを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ｂ、５４３Ｂ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【００９０】
このデュアル入口並行流システム５００Ｂは、チャネルに沿ったビーズのより効率的な整列につながる。ビーズのない流体とともに並行流は、マイクロチャネルの１つの側面上でビーズを閉じ込め、規則的な間隔を持つビーズの単一ラインという結果になる。細胞入口５０６Ｂは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ｂへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ｂは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ｂ、５１０Ｂに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ｂを有してよい。細胞フィルタ５４４Ｂ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ｂ、５１０Ｂを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ｂを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ｂ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【００９１】
オイル入口５１２Ｂは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ｂ、５１６Ｂを通して液滴生成接合部５２６Ｂに導入するために構成される。オイル入口５１２Ｂは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ｂ、５１６Ｂに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ｂを有してよい。オイルフィルタ５４６Ｂ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ｂ、５１６Ｂを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ｂを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ｂ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【００９２】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ｂに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ｂのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ｂに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ｂでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００を出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入することが見出された。
【００９３】
５０μＬ／分のビーズ流体流量および１２５×１２５μｍでは、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、１．４〜３．６ｃｍおよび０．５〜１．３ｃｍを必要とした。６０μＬ／分のビーズ流体流量では、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、１．２〜３ｃｍおよび０．４〜１．１ｃｍを必要とした。チャネルの長さは、流体密度または粘度の変化による絞込み長さの変更に対応するために、任意の異なるビーズ溶液に対して調整可能である。
【００９４】
図５Ｃに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ｃは、寸法が１２５×１００μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ｃは、３つの入口、すなわち、ビーズチャネル５０４Ｃに接続するビーズ入口５０２Ｃ、ビーズチャネル５０４Ｃの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ｃ、５１０Ｃに接続する細胞入口５０６Ｃ、およびシステム５００Ｃの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ｃから離れて細胞チャネル５０８Ｃ、５１０Ｃの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ｃ、５１６Ｃに接続するオイル入口５１２Ｃを含む。マイクロ流体システム５００Ｃは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ｃを有する。
【００９５】
ビーズ入口５０４Ｃは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ｃへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０２Ｃは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ｃに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ｃを有してよい。ビーズフィルタ５４２Ｃ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ｃを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ｃを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ｃ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【００９６】
細胞入口５０６Ｃは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ｃへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ｃは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ｃ、５１０Ｃに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ｃを有してよい。細胞フィルタ５４４Ｃ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ｃ、５１０Ｃを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ｃを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ｃ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【００９７】
オイル入口５１２Ｃは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ｃ、５１６Ｃを通して液滴生成接合部５２６Ｃに導入するために構成される。オイル入口５１２Ｃは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ｃ、５１６Ｃに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ｃを有してよい。オイルフィルタ５４６Ｃ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ｃ、５１６Ｃを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ｃを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ｃ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【００９８】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ｃに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ｃのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ｃに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ｃでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００Ｃを出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。
【００９９】
図５Ｄに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ｄは、寸法が１２５×１００μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ｄは、４つの入口、すなわち、ビーズチャネル５０４Ｄに接続する２つのビーズ入口５０２Ｄ、５０３Ｄ、ビーズチャネル５０４Ｄの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ｄ、５１０Ｄに接続する細胞入口５０６Ｄ、およびシステム５００Ｄの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ｄから離れて細胞チャネル５０８Ｄ、５１０Ｄの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ｄ、５１６Ｄに接続するオイル入口５１２Ｄを含む。デュアル入口並行流の設計は、効率的なビーズ整列という結果になる。このデュアル入口並行流システム内の２つの細胞チャネル５０８Ｄ、５１０Ｄは、両方のマイクロ流体システムが１２５×１００μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ａに示される２つの細胞チャネル５０８Ｃ、５１０Ｃと比較されると、長さが長い。このデュアル入口並行流システム内の２つのオイルチャネル５１４Ｄ、５１６Ｄは、両方のマイクロ流体システムが１２５×１００μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ｃに示される２つのオイルチャネル５１４Ｃ、５１６Ｃと比較されると、長さが長い。マイクロ流体システム５００Ｄは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ｄを有する。
【０１００】
ビーズ入口５０２Ｄは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ｄへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０３Ｄは、いずれのビーズも含まない流体を導入するために構成されている。ビーズ入口５０２Ｄ、５０３Ｄは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ｄに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ｄ、５４３Ｄをそれぞれ有してよい。ビーズフィルタ５４２Ｄ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ｄを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ｄ、５４３Ｄを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ｄ、５４３Ｄ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１０１】
このデュアル入口並行流システム５００Ｄは、チャネルに沿ったビーズのより効率的な整列につながる。ビーズのない流体とともに並行流は、マイクロチャネルの１つの側面上でビーズを閉じ込め、規則的な間隔を持つビーズの単一ラインという結果になる。細胞入口５０６Ｄは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ｄへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ｄは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ｄ、５１０Ｄに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ｄを有してよい。細胞フィルタ５４４Ｄ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ｄ、５１０Ｄを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ｄを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ｄ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１０２】
オイル入口５１２Ｄは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ｄ、５１６Ｄを通して液滴生成接合部５２６Ｄに導入するために構成される。オイル入口５１２Ｄは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ｄ、５１６Ｄに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ｄを有してよい。オイルフィルタ５４６Ｄ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ｄ、５１６Ｄを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ｄを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ａ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【０１０３】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ｄに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ｄのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ｄに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ｄでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００Ｄを出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。
【０１０４】
５０μＬ／分のビーズ流体流量および１２５×１００μｍのチャネル寸法では、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、０．７〜１．８ｃｍおよび０．２〜０．７ｃｍを必要とする。６０μＬ／分のビーズ流体流量では、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、０．６〜１．５ｃｍおよび０．２〜０．６ｃｍを必要とする。
【０１０５】
図５Ｅに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ｅは、寸法が１２５×１００μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ｅは、３つの入口、すなわち、単一ビーズチャネル５０４Ｅに接続するビーズ入口５０２Ｅ、ビーズチャネル５０４Ｅの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ｅ、５１０Ｅに接続する細胞入口５０６Ｅ、およびシステム５００Ｅの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ｅから離れて細胞チャネル５０８Ｅ、５１０Ｅの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ｅ、５１６Ｅに接続するオイル入口５１２Ｅを含む。マイクロ流体システム５００Ｅは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ｅを有する。
【０１０６】
ビーズ入口５０４Ｅは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ｅへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０２Ｅは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ｅに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ｅを有してよい。ビーズフィルタ５４２Ｅ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ｅを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ｅを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ｅ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１０７】
細胞入口５０６Ｅは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ｅへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ｅは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ｅ、５１０Ｅに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ｅを有してよい。細胞フィルタ５４４Ｅ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ｅ、５１０Ｅを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ｅを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ｅ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１０８】
オイル入口５１２Ｅは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ｅ、５１６Ｅを通して液滴生成接合部５２６Ｅに導入するために構成される。オイル入口５１２Ｅは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ｅ、５１６Ｅに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ｅを有してよい。オイルフィルタ５４６Ｅ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ｅを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ｅ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【０１０９】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ｅに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ｅのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ｅに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ｅでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００Ｅを出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。
【０１１０】
図５Ｆに示される一実施形態では、マイクロ流体システム５００Ｆは、寸法が１２５×１００μｍである１つの直線ビーズチャネルを有する。マイクロ流体システム５００Ｆは、４つの入口、すなわち、ビーズチャネル５０４Ｆに接続する２つのビーズ入口５０２Ｆ、５０３Ｆ、ビーズチャネル５０４Ｆの２つの側にある２つの細胞チャネル５０８Ｆ、５１０Ｆに接続する細胞入口５０６Ｆ、およびシステム５００Ｆの最も外側のチャネルでありビーズチャネル５０４Ｆから離れて細胞チャネル５０８Ｆ、５１０Ｆの隣にある２つのオイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆに接続するオイル入口５１２Ｆを含む。デュアル入口並行流の設計は、効率的なビーズ整列という結果になる。このデュアル入口並行流システム内の２つの細胞チャネル５０８Ｆ、５１０Ｆは、両方のマイクロ流体システムが１２５×８０μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ｅに示される２つの細胞チャネル５０８Ｅ、５１０Ｅと比較されると、長さが長い。このデュアル入口並行流システム内の２つのオイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆは、両方のマイクロ流体システムが１２５×８０μｍという同じビーズチャネル寸法を有する場合であっても、図５Ｅに示される２つのオイルチャネル５１４Ｅ、５１６Ｅと比較されると、長さが長い。マイクロ流体システム５００Ｆは、全体的に、１つのシステム出口５１８Ｆを有する。
【０１１１】
ビーズ入口５０２Ｆは、ビーズ流体中に懸濁されたビーズをマイクロ流体システム５００Ｆへと導入するために構成される。ビーズは、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。ビーズ入口５０３Ｆは、いずれのビーズも含まない流体を導入するために構成されている。ビーズ入口５０２Ｆ、５０３Ｆは、埃などの望ましくない粒子がビーズチャネル５０４Ｆに入って、これを詰まらせることを防止するビーズフィルタ５４２Ｆ、５４３Ｆをそれぞれ有してよい。ビーズフィルタ５４２Ｆ間の間隔は、すべてのビーズが、ビーズチャネル５０４Ｆを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４２Ｆ、５４３Ｆを通って流れることができるように、ビーズのサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、ビーズフィルタ５４２Ｆ、５４３Ｆ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、ビーズサイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１１２】
このデュアル入口並行流システム５００Ｆは、チャネルに沿ったビーズのより効率的な整列につながる。ビーズのない流体とともに並行流は、マイクロチャネルの１つの側面上でビーズを閉じ込め、規則的な間隔を持つビーズの単一ラインという結果になる。細胞入口５０６Ｆは、細胞流体中に懸濁された細胞を、マイクロ流体システム５００Ｆへと導入するために構成される。細胞入口５０６Ｆは、埃などの望ましくない粒子が細胞チャネル５０８Ｆ、５１０Ｆに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４４Ｆを有してよい。細胞フィルタ５４４Ｆ間の間隔は、すべてのビーズが、細胞チャネル５０８Ｆ、５１０Ｆを詰まらせるというリスクなしにビーズフィルタ５４４Ｆを通って流れることができるように、細胞のサイズの少なくとも２〜３倍であるべきである。たとえば、細胞フィルタ５４４Ｆ間の間隔は、３００μｍ、たとえば、細胞サイズの約５〜１０倍であってよい。
【０１１３】
オイル入口５１２Ｆは、液滴生成オイルを、オイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆを通して液滴生成接合部５２６Ｆに導入するために構成される。オイル入口５１２Ｆは、埃などの望ましくない粒子がオイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆに入って、これらを詰まらせることを防止する細胞フィルタ５４６Ｆを有してよい。オイルフィルタ５４６Ｆ間の間隔は、オイルが、オイルチャネル５１４Ｆ、５１６Ｆを詰まらせるというリスクなしにオイルフィルタ５４６Ｆを通って流れることができるように、粘度などの、使用されるオイルの特性に依存する。たとえば、オイルフィルタ５４６Ｆ間の間隔は、３００μｍであってよい。
【０１１４】
オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、ビーズが液滴生成接合部５２６Ｆに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体５２４Ｆのストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、慣性絞込みのため、細胞が液滴生成接合部５２６Ｆに到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体のストリームから液滴を引っ張る。デバイス出口５１８Ｆでは、液滴は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス５００Ｆを出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズおよび／または１つの細胞を封入する。
【０１１５】
５０μＬ／分のビーズ流体流量および１２５×８０μｍのチャネル寸法では、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、０．７〜１．８ｃｍおよび０．２〜０．７ｃｍを必要とする。６０μＬ／分のビーズ流体流量では、３０μｍビーズと５０μｍビーズの分離はそれぞれ、０．６〜１．５ｃｍおよび０．２〜０．６ｃｍを必要とする。
細胞チャネル長
【０１１６】
チャネルサイズ、細胞サイズ、流量、および流体性質を含む異なるパラメータ間の相互影響が、細胞絞込みのために必要とされる長さに影響を与える。チャネル内のこの相互影響は、以下の式によって決定される。
【数６】
2020091301.tif 000008
上式で、Ｌｆは細胞絞込みのために必要とされる長さ、μは流体の動的粘度、ｈは細胞チャネルのサイズ（または水力寸法、またはチャネルの別の重要な寸法）、ρは流体の密度、Ｕｍは最大流れスピード、ａは細胞直径、ｆＬは、ほとんどの場合０．０２〜０．０５の範囲内にある、係数である。細胞チャネル長に影響を与える他の係数としては、壁の特徴、壁の外形、壁のコーティング、流体タイプ、細胞以外の流体中の構成要素のタイプおよび濃度、細胞の形状、細胞表面のコーティング、ならびに細胞の状態がある。
ビーズ対体積比
【０１１７】
システムの別の態様では、ビーズ対体積比が、任意選択で、チャネル内での質量の保存のために操作または調整可能である。一般に、ビーズの分離、整列、および絞込みは、一部は、チャネル内のビーズ間間隔ならびにビーズサイズ対チャネルの流体力学的サイズの比に依存する。本明細書において説明されるさまざまなチャネル外形は、必要とされるビーズ間間隔を達成し、それによって、そのビーズの整列および絞込みを維持するために、絞り込まれるビーズの所定のビーズ対体積比を必要とすることがある。特に、流体中に懸濁されるビーズのビーズ対体積比は、特定のチャネル外形内で絞込みを達成するために、必要に応じて計算および調整可能である。一般に、特定のビーズサイズおよびチャネル外形に対する最大ビーズ対体積比は、方形チャネルおよび重複しない絞込み位置を仮定して、式
【数７】
2020091301.tif 000009
を使用して決定可能であり、上式で、Ｎはチャネル内の絞込み位置の数、ａは絞り込まれたビーズ直径、ｈはチャネルの高さ、ｗはチャネルの幅である。したがって、ビーズは、システムへのビーズの導入前および／またはその最中に所定の比を成し遂げるように希釈または濃縮可能である。さらに、いくつかの例示的なシステムは、ビーズがチャネルへと導入された後に比が調整されることを必要としてよい。
【０１１８】
本明細書において説明されるチャネル内のビーズのビーズ対体積比は、ビーズの整列および絞込みを可能にするのに十分な任意の値を有することができる。一般に、ビーズ対体積比は、約５０％よりも小さいとすることができる。他の実施形態では、ビーズ対体積比は、約４０％、３０％、２０％、１０％、８％、または６％よりも小さいとすることができる。より具体的には、一部の実施形態では、ビーズ対体積比は、約０．００１％から約５％の範囲内にあるとすることができ、約０．０１％から約４％の範囲内にあるとすることができる。代替的に、比は、約０．１％から約３％の範囲内にあるとすることができる。代替的に、比は、約０．５％から約２％の範囲内にあるとすることができる。当業者によって諒解されるように、絞り込まれるビーズとは別の、追加のビーズまたはビーズ内の外来ビーズのビーズ対体積比は、必ずしも考慮または調整される必要はない。当業者によってさらに諒解されるように、任意の数のビーズが、システムへの導入の前、その最中、および／またはその後に、絞り込まれるビーズのビーズ対体積比に対する調整を必要としないことがある。
【０１１９】
ビーズ対体積比を調整するためにビーズを希釈または濃縮するためのさまざまな一般に使用される技法が、本明細書で開示される実施形態において使用可能である。たとえば、ビーズは、最終的にビーズが、入口を通って導入される前に必要とされる比を有するシステムへと導入されるように、システムへの導入前にバッチで希釈または濃縮可能である。他の実施形態では、システムは、希釈または濃縮を遂行するために、希釈剤または濃縮物と同時にビーズを導入するための、２つまたはそれよりも多い入口を含むことができる。このようにして、ビーズ対体積比は、ビーズおよび希釈剤または濃縮物がチャネルに入る前にチャンバ内で調整が発生するにせよ、調整がチャネル内でビーズと希釈剤または濃縮物との混合によって発生するにせよ、システム内で調整可能である。別の実施形態では、希釈剤または濃縮物は、未調整ビーズがチャネル内である程度の距離を進んだ後に、さまざまな適用例によって必要とされ得るチャネルの中心部分、フォーク、または分岐部へと導入可能である。当業者は、本明細書において説明される実施形態における、ビーズのビーズ対体積比を調整するための可能な変形形態を諒解するであろう。
細胞対体積比
【０１２０】
システムの別の態様では、細胞対体積比が、任意選択で、チャネル内での質量の保存のために操作または調整可能である。一般に、細胞の分離、整列、および絞込みは、一部は、チャネル内の細胞間間隔ならびに細胞サイズ対チャネルの流体力学的サイズの比に依存する。本明細書において説明されるさまざまなチャネル外形は、必要とされる細胞間間隔を達成し、それによって、その細胞の整列および絞込みを維持するために、絞り込まれる細胞の所定の細胞対体積比を必要とすることがある。特に、流体中に懸濁される細胞の細胞対体積比は、特定のチャネル外形内で絞込みを達成するために、必要に応じて計算および調整可能である。一般に、特定の細胞サイズおよびチャネル外形に対する最大細胞対体積比は、方形チャネルおよび重複しない絞込み位置を仮定して、式
【数８】
2020091301.tif 000010
を使用して決定可能であり、上式で、Ｎはチャネル内の絞込み位置の数、ａは絞り込まれた細胞直径、ｈはチャネルの高さ、ｗはチャネルの幅である。したがって、細胞は、システムへの細胞の導入前および／またはその最中に所定の比を成し遂げるように希釈または濃縮可能である。さらに、いくつかの例示的なシステムは、細胞がチャネルへと導入された後に比が調整されることを必要としてよい。
【０１２１】
本明細書において説明されるチャネル内の細胞の細胞対体積比は、細胞の整列および絞込みを可能にするのに十分な任意の値を有することができる。一般に、細胞対体積比は、約５０％よりも小さいとすることができる。他の実施形態では、細胞対体積比は、約４０％、３０％、２０％、１０％、８％、または６％よりも小さいとすることができる。より具体的には、一部の実施形態では、細胞対体積比は、約０．００１％から約５％の範囲内にあるとすることができ、約０．０１％から約４％の範囲内にあるとすることができる。代替的に、比は、約０．１％から約３％の範囲内にあるとすることができる。代替的に、比は、約０．５％から約２％の範囲内にあるとすることができる。当業者によって諒解されるように、絞り込まれる細胞とは別の、追加の細胞または細胞内の外来細胞の細胞対体積比は、必ずしも考慮または調整される必要はない。当業者によってさらに諒解されるように、任意の数の細胞が、システムへの導入の前、その最中、および／またはその後に、絞り込まれる細胞の細胞対体積比に対する調整を必要としないことがある。
【０１２２】
細胞対体積比を調整するために細胞を希釈または濃縮するためのさまざまな一般に使用される技法が、本明細書で開示される実施形態において使用可能である。たとえば、細胞は、最終的に細胞が、入口を通って導入される前に必要とされる比を有するシステムへと導入されるように、システムへの導入前にバッチで希釈または濃縮可能である。他の実施形態では、システムは、希釈または濃縮を遂行するために、希釈剤または濃縮物と同時に細胞を導入するための、２つまたはそれよりも多い入口を含むことができる。このようにして、細胞対体積比は、細胞および希釈剤または濃縮物がチャネルに入る前にチャンバ内で調整が発生するにせよ、調整がチャネル内で細胞と希釈剤または濃縮物との混合によって発生するにせよ、システム内で調整可能である。別の実施形態では、希釈剤または濃縮物は、未調整細胞がチャネル内である程度の距離を進んだ後に、さまざまな適用例によって必要とされ得るチャネルの中心部分、フォーク、または分岐部へと導入可能である。当業者は、本明細書において説明される実施形態における、細胞の細胞対体積比を調整するための可能な変形形態を諒解するであろう。
慣性絞込みおよび液滴生成
【０１２３】
一部の実施形態では、ビーズの慣性絞込みは、液滴生成と組み合わされて、極めて高濃度の液滴と１に近いビーズλを生じさせるが、複数のビーズ占有を持つ液滴を有すことを回避する。λは、１つの単一ビーズを持つ液滴などの事象が発生する確率であるポアソン分布の平均である。液滴に基づくマイクロフルイディクスを使用した単一細胞解析およびソーティングに対するポアソン分布の影響が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｚｕｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８巻：８７０〜９１頁（２０１３年）に記載されている。単一ビーズ占有を持つこの高濃度の液滴は、そのような液滴を必要とするシステム（高スループット単一細胞システムなど）が、他の封入方法と比較すると、たとえば２〜２５倍、または５〜２５倍、または５〜１０倍、または１０〜２０倍スループットを改善することを可能にし、エラーレートが減少する（たとえば、複数のビーズを持つ液滴の割合が減少する）。
【０１２４】
一部の実施形態では、細胞の慣性絞込みは、液滴生成と組み合わされて、極めて高濃度の液滴と１に近い細胞λを生じさせるが、複数の細胞占有を持つ液滴を有すことを回避する。細胞のλは、液滴が単一の細胞のみを有する確率である。単一細胞占有を持つこの高濃度の液滴は、そのような液滴を必要とするシステム（高スループット単一細胞システムなど）が、他の封入方法と比較すると、たとえば２〜２５倍、または５〜２５倍、または５〜１０倍、または１０〜２０倍スループットを改善することを可能にし、エラーレートが減少する（たとえば、複数の細胞を持つ液滴の割合が減少する）。
【０１２５】
一部の実施形態では、慣性絞込みなどの絞込みが、ダブルポアソン統計量において、２つのポアソン分布、たとえばビーズのためのポアソン分布および細胞のためのポアソン分布を克服するために、ビーズと細胞などのＡ粒子とＢ粒子の両方に対して用いられる。この方法は、２倍の過小分散されたポアソン統計量を持つシステムと、整列されないシステムに対するスループットのさらに強化された改善（たとえば、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、または１００倍）を生む。本発明の実施形態は、連続的に、カスケーディング出力を伴う高い体積流量で、動作されてよい。本発明はまた、機械的フィルタまたは障害物との相互作用を必要とせず、非常に長いメンテナンスを必要とする。
【０１２６】
一部の実施形態では、ビーズ、核酸断片、および細胞などの粒子は、正規分布、対数正規分布、パレート分布、離散一様分布、連続一様分布、ベルヌーイ分布、二項分布、負の二項分布、幾何分布、超幾何分布、ベータ二項分布、カテゴリカル分布、多項分布、多変量超幾何分布、対数ポアソン分布、指数分布、ガンマ分布、レイリー分布、ライス分布、カイ二乗分布、スチューデントのｔ分布、Ｆ分布、ベータ分布、ディリクレ分布、およびウィシャート分布などの、ポアソン以外の統計分布を有してよい。
【０１２７】
特定のビーズ（たとえば３０〜５０μｍ）に対して適切なチャネル外形および流量が決定されると、ビーズ濃度が、大きなλ（依然として１よりも小さい）を取得するために調製可能である。次いで、ビーズ流体が、あらかじめ指定された流量（たとえば、６０μＬ／分）で、ビーズチャネルに接続されたビーズ入口へと注入される。その後、細胞が、あらかじめ指定された流量（たとえば、６０μＬ／分）で、細胞チャネルに接続された細胞入口へと注入される。最後に、液滴生成オイルが、適切な流量（たとえば、１５０〜２５０μＬ／分）で、オイルチャネルに接続されたオイル入口へと注入される。第３のストリーム（たとえば、オイル）の流量は、ビーズ流体および細胞流体の流量と同じであってもよいし、これらよりも大きくてもよい。
【０１２８】
類似の原理が、細胞チャネル内の細胞を絞り込み、整列させるために使用可能である。その結果、細胞の捕捉効率を、ビーズのための効率と同じ桁に増加させることができる。２つの整列されたストリームおよびそれらの改善された効率を組み合わせることからの最終結果は、元のダブルポアソン統計量における両方のポアソン分布が克服され、スループットにおけるより大きな改善（たとえば、５０倍または１００倍）を達成することである。
【０１２９】
図６は、マイクロ流体システム６００という別の実施形態を示す。示されるように、ビーズチャネル６０４は、湾曲してもよいし、直線であってもよい。ビーズチャネル６０４に接続された１つまたは２つのビーズ入口が存在してよい。マイクロ流体システム６００は、全体的に、３つの入口、すなわち、ビーズチャネル６０４に接続するビーズ入口、ビーズチャネル６０４の２つの側にある２つの細胞チャネル６０８、６１０に接続する細胞入口、およびシステム６００の最も外側のチャネルでありビーズチャネル６０４から離れて細胞チャネル６０８、６１０の隣にある２つのオイルチャネル６１４、６１６に接続するオイル入口を含む。マイクロ流体システム６００は、全体的に、１つのシステム出口６１８を有する。マイクロ流体システム６００は、微細加工チップ上に設けることが可能であり、さまざまなチャネルがチップ内に形成される。
【０１３０】
ビーズ入口は、ビーズ流体６２４中に懸濁されたビーズ６２２をマイクロ流体システム６００へと導入するために構成される。ビーズ６２２は、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。一般に、ビーズチャネル６０４は、ビーズ６２２を分離し、整列させ、液滴生成接合部６２６に入るときチャネル内の所定の側方位置に絞り込むように設計された指定された外形を有することができる。これらの側方場所は、絞り込まれると、ビーズ６２２が類似のスピードで移り、間隔を維持して、互いに交差しないように、ビーズ流体６２４の速度プロファイルにおける類似の流速に対応する。マイクロ流体システム内で使用されるビーズチャネルは、流体中に懸濁された所定のサイズのビーズを絞り込むためのさまざまな外形および断面を有することができる。たとえば、ビーズチャネル６０４は、矩形断面を有してよい。
【０１３１】
細胞入口は、細胞流体中に懸濁された細胞６３０をマイクロ流体システム６００へと導入するために構成される。オイル入口は、液滴生成オイル６３２を、オイルチャネル６１４、６１６を通して液滴生成接合部６２６に導入するために構成される。オイルの２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部６２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体６２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部６２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体６３４のストリームから液滴を引っ張る。ビーズ６２２は、液滴生成接合部６２６に入る前に整列される。細胞６３０は、液滴生成接合部６２６に入る前に整列される。ビーズ６２２と細胞６３０の両方ための慣性強制（ｆｏｒｃｉｎｇ）と液滴生成を組み合わせることによって、各々が１つのビーズと１つの細胞とを持つ液滴６３４が形成される。この実施形態は、確率的（ポアソン）ローディングから可能であろうよりも多くの単一粒子液滴（たとえば、１つの細胞および１つのビーズ）と、可能であろうよりも少ない、何も入っていない液滴または複数粒子液滴（たとえば、２つのビーズおよび１つの細胞）を生成する。
【０１３２】
図７は、マイクロ流体システム７００という別の実施形態を示す。示されるように、ビーズチャネル７０４は、湾曲してもよいし、直線であってもよい。ビーズチャネル７０４に接続された１つまたは２つのビーズ入口が存在してよい。マイクロ流体システム７００は、全体的に、３つの入口、すなわち、ビーズチャネル７０４に接続するビーズ入口、ビーズチャネル７０４の２つの側にある２つの細胞チャネル７０８、７１０に接続する２つの細胞入口、およびシステム７００の最も外側のチャネルでありビーズチャネル７０４から離れて細胞チャネル７０８、７１０の隣にある２つのオイルチャネル７１４、７１６に接続するオイル入口を含む。マイクロ流体システム７００は、全体的に、１つのシステム出口７１８を有する。マイクロ流体システム７００は、微細加工チップ上に設けることが可能であり、さまざまなチャネルがチップ内に形成される。
【０１３３】
ビーズ入口は、ビーズ流体７２４中に懸濁されたビーズ７２２をマイクロ流体システム７００へと導入するために構成される。ビーズ７２２は、さまざまな材料から構成された任意の密度とすることができる。一般に、ビーズチャネル７０４は、ビーズ７２２を分離し、整列させ、液滴生成接合部７２６に入るときチャネル内の所定の側方位置に絞り込むように設計された指定された外形を有することができる。これらの側方場所は、絞り込まれると、ビーズ７２２が類似のスピードで移り、間隔を維持して、互いに交差しないように、ビーズ流体７２４の速度プロファイルにおける類似の流速に対応する。マイクロ流体システム内で使用されるビーズチャネルは、流体中に懸濁された所定のサイズのビーズを絞り込むためのさまざまな外形および断面を有することができる。たとえば、ビーズチャネル７０４は、矩形断面を有してよい。
【０１３４】
一つの細胞入口は、細胞流体中に懸濁された細胞７３０を、細胞チャネル７０８を通してマイクロ流体システム７００へと導入するために構成される。別の細胞入口は、細胞を含まない流体をマイクロ流体システム７００へと導入するために構成される。オイル入口は、液滴生成オイル７３２を、オイルチャネル７１４、７１６を通して液滴生成接合部７２６に導入するために構成される。オイルの２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部７２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体７２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部７２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体７３４のストリームから液滴を引っ張る。ビーズ７２２は、液滴生成接合部７２６に入る前に整列される。細胞７３０は、液滴生成接合部７２６に入る前に整列される。ビーズ７２２と細胞７３０の両方ための慣性強制（ｆｏｒｃｉｎｇ）と液滴生成を組み合わせることによって、各々が１つのビーズと１つの細胞とを持つ液滴７３４が形成される。この実施形態は、確率的（ポアソン）ローディングから可能であろうよりも多くの単一粒子液滴（たとえば、１つのビーズおよび１つの細胞）と、可能であろうよりも少ない、何も入っていない液滴または複数粒子（たとえば、２つのビーズおよび１つの細胞）液滴を生成する。
チャネル集約における流体チャネルの幅
【０１３５】
考慮する設計パラメータは、ビーズチャネルと細胞チャネルが合流した後の、および液滴形成接合部前の、流体チャネルの幅、たとえば、図１５Ａにおける幅ｍである。この領域内のビーズ流体は、細胞流体によって圧迫および希釈され、これによって、ビーズ間の距離が増加し、液滴内のビーズの占有率を低下させる。したがって、幅ｍは、この現象を補償し、次に、液滴内のビーズの封入効率を増加させるように調整可能である。
【０１３６】
これに対処するために、チャネルの幅ｍは、ビーズ流体と細胞流体の流量の比に比例して増加された。一例では、ビーズ流体のための流量は３０μＬ／分であり、細胞流体のための流量は３０μＬ／分であった。この例では、ビーズ流体が細胞流体と結合された後にビーズ間の同じ距離を維持するために、チャネル幅の比ｍ／ｂが２００％増加された（合計ビーズ流体および細胞流体流量とビーズ流体流量の比＝６０／３０のため）。さらに、液滴生成接合部後の流体チャネルの幅、たとえば、幅ｄも、図１５Ｂに示されるように、約２００％幅が広かった。チャネル幅の比ｍ／ｂは、ビーズ流体および細胞流体の流量に応じて、１から３まで変化することができる。
ビーズ凝集に対処するためのチャネルの修正
【０１３７】
凝集させられたビーズは、単一ビーズ液滴率に悪影響を与えることがある。さらに、凝集させられたビーズは、ビーズ整列を達成するために、より長いチャネル長を必要とすることがある。したがって、一実施形態では、凝集させられていないビーズは、ビーズ流体チャネルに送られる。凝集させられていないビーズを送ることは、ビーズの凝集塊を破壊するためにビーズ入口において、またはビーズチャネルの先端部において構造すなわち狭窄部を導入することによって達成可能である。たとえば、図１６では、チャネル間狭窄部が、波状構造として示されている。この例では、狭窄部におけるチャネル幅は、ビーズ直径よりも大きいが、ビーズ直径の２倍より小さい。
核酸シークエンシング
【０１３８】
ビーズ、細胞、および核酸に対する慣性強制および液滴生成の適用は、ロングリードＤＮＡシークエンシングおよび単一細胞シークエンシングを含む任意のタイプのＤＮＡ配列解析における適用に適している。各々が１つのビーズと１つの細胞とを持つ液滴の生成は、単一細胞の連続的な高スループット解析およびシークエンシングを可能にする。
【０１３９】
図８に示される一実施形態では、マイクロチャネルデバイスは、各々が単一細胞と単一ビーズとを含む液滴を生成するように設計される。ステップ１、マイクロチャネルデバイスは、バーコード付きビーズのストリームを分離し、整列させ、チャネル流れ場内の１つまたは複数の絞込み位置に絞り込むように構成される。ステップ２、マイクロチャネルデバイスは、細胞のストリームを分離し、整列させ、チャネル流れ場内の１つまたは複数の絞込み位置に絞り込むように構成される。ステップ３、マイクロチャネルデバイスは、オイルを別の入力として受け入れる。ステップ４、整列されたバーコード付きビーズ、整列された細胞、およびオイルを組み合わせることによって、マイクロチャネルデバイスは、２倍の過小分散されたポアソン統計量を持つ液滴を生成し、各液滴は、１つのビーズと１つの細胞とを含む。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスの設計、ビーズ、細胞、ビーズ流体および細胞流体の他の構成要素の濃度、オイルのタイプ、ならびにビーズ流体、細胞流体、およびオイルの流量は、マイクロ流体デバイスが、液滴当たり任意の所望の数のビーズおよび細胞を持つ液滴を生成するように設計される。一部の実施形態では、ビーズの統計分布は、最適よりも少ない、たとえば、液滴当たり１よりも少ないビーズである。一部の実施形態では、細胞の統計分布は、最適よりも少ない、たとえば、液滴当たり１よりも少ない細胞である。この比は、集合させられた液滴の高い割合が１つの細胞と１つのビーズとを含み、液滴の低い割合が、１つの細胞を含み、ビーズを含まない、１つのビーズを含み、細胞を含まない、または何も含まないので、単一細胞シークエンシング適用例にとって有益である。したがって、細胞の高い割合が配列決定される。
【０１４０】
図８に示される各バーコード付きビーズは多数のヌクレオチド断片を含み、各ヌクレオチド断片は、ポリＴテールを含む捕捉領域に加えて、一意のＤＮＡタグ（たとえば、バーコード、単一ビーズ上のすべての断片上では同じ）と、インデックス（たとえば、一意の分子識別子、単一ビーズ上の各断片によって異なる）とを含む。この構築物は、各ビーズを、デバイス内で使用されているすべての他のビーズと比較して一意にタグ付けされるようにする。たとえば、図８に示される４つの液滴の各々は、１つのバーコード付きビーズと、１つの細胞とを含む。４つのバーコード付きビーズの各々は、他の３つのバーコード付きビーズと比較して一意にタグ付けされる。一部の実施形態では、ポリＴ領域は、ヌクレオチド断片のテール領域ではなく、ヌクレオチド断片の内部領域にあってよい。
【０１４１】
一部の実施形態では、ビーズ流体は溶解緩衝液を含む。ステップ５、細胞およびビーズが液滴へと封入されるようになり、液滴が溶解緩衝液を含むとき、細胞が溶解される。ステップ６において細胞溶解後、各細胞内の各ポリアデニル化ｍＲＮＡは、ビーズ上のヌクレオチド断片のポリＴテールに結び付けられるようになる、たとえば、ビーズ上のヌクレオチド断片とｍＲＮＡとの間のハイブリダイゼーション。インデックス領域のために、細胞からの各ｍＲＮＡは、細胞からの他のｍＲＮＡ配列と比較して一意にタグ付けされる。さらに、一意のＤＮＡタグのために、細胞からの各ｍＲＮＡは、他の細胞からの他のｍＲＮＡと比較して一意にタグ付けされる。
【０１４２】
ステップ７では、液滴のエマルジョンが壊され、ハイブリダイズされたヌクレオチド断片およびｍＲＮＡを持つビーズを溶液へと放出する。エマルジョンの溶液は、化学的手段、物理的手段、または電気分解による手段によってなど、任意の適切な手段によって達成されてよい。手段は、システム内の粒子に適合するように選ばれてもよいし、シークエンシングなどのその後の解析を可能にするために一方または両方の粒子タイプを劣化させるように選ばれてもよい。
【０１４３】
ステップ８では、ハイブリダイズされたヌクレオチド断片およびｍＲＮＡが、ｃＤＮＡを生成するために、逆転写酵素を使用する逆転写に供される。
【０１４４】
ステップ９では、ｃＤＮＡが、適切なプライマーおよびポリメラーゼを使用した増幅に供される。したがって、形成される各ｃＤＮＡ鎖は、細胞とともに封入されたビーズの一意のＤＮＡタグおよびビーズ上のヌクレオチド断片からの一意のインデックスに加えて、元のｍＲＮＡ配列を有する。
【０１４５】
ステップ１０では、増幅されたｃＤＮＡが、Ｎｅｘｔｅｒａライブラリ調製などのライブラリ調製に供される。
【０１４６】
ステップ１１では、ライブラリ内のヌクレオチドが、ペアエンドシークエンシングなどのシークエンシングに供される。細胞からの各ｍＲＮＡは、同じ細胞からの他のｍＲＮＡおよび他の細胞からのｍＲＮＡと比較して一意にタグ付けされるので、ライブラリのシークエンシング反応は、一括で実行可能であり、多数の細胞からのｃＤＮＡ試料が配列決定されるが、各々は、互いからソート可能であるように一意にタグ付けされる。各ライブラリ配列は、一意のＤＮＡタグまたはバーコードと、インデックスと、ポリＴ領域を含む捕捉領域とを有する。インデックスは、増幅エラーを補正し、単一分子の複数回の計数を回避するために使用可能である。シークエンシング後、個々の細胞のｍＲＮＡ集団および発現レベルが決定可能である。
【０１４７】
当業者は、本明細書において説明される逆転写ステップ、増幅ステップ、およびシークエンシングステップが、当分野公知の方法を使用して達成され得ることを認識するであろう。
【０１４８】
これらの方法のうちのいくつかでは、ビーズはヌクレオチド断片を含む。ヌクレオチド断片は、バーコード領域と、インデックス領域と、ポリＴテールを含む捕捉領域とを含む。各ヌクレオチド断片のバーコード領域は、長さが少なくとも約６ヌクレオチドである、長さが約６から８ヌクレオチドである、または長さが約６ヌクレオチドである。各ヌクレオチド断片のインデックス領域は、長さが少なくとも約４ヌクレオチドである、長さが約４から１０ヌクレオチドである、または長さが４ヌクレオチドである。捕捉領域は、ポリＴヌクレオチドを含み、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドである、または長さが約１０から２０ヌクレオチドである、または長さが約１０ヌクレオチドである。
粒子解析
【０１４９】
別の実施形態では、解析領域は、粒子の局在化および絞り込まれたストリームを監視、ソート、計数、撮像、または解析するために、出口チャネルの近傍に設けられる。一実施形態では、チップは、粒子数え上げシステムまたはその一部とすることができる。特に、粒子が絞り込まれ、整列されている解析領域は、粒子を計数する目的のために検出器による検査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）に供されてよい。さまざまな検出器が以下で説明され、検出のために粒子をタグ付けするためのシステムも説明されるが、これらの要素は、数え上げにも使用可能である。
粒子のタイプ
【０１５０】
任意の数の異なるタイプの粒子が、粒子絞込みのためのシステムへと導入可能であり、本明細書において説明されるそれらの粒子タイプに限定されるべきではない。粒子は、さまざまな材料から作製するまたは得ることが可能であり、水以上またはこれよりも低い密度などの異なる性質を有することができる。
【０１５１】
試料中に懸濁される粒子は、本明細書において説明されるマイクロ流体チャネル内に粒子が整列され、絞り込まれることが可能である任意のサイズを有することができる。たとえば、粒子は、約１００ミクロンから約０．０１ミクロンの範囲内にある流体力学的サイズを有することができる。代替的に、粒子は、約２０ミクロンから約０．１ミクロンの範囲内にある流体力学的サイズを有することができる。代替的に、粒子は、約１０ミクロンから約１ミクロンの範囲内にある流体力学的サイズを有することができる。粒子サイズはチャネル外形のみによって制限され、上記で説明された範囲よりも大きい粒子とこれよりも小さい粒子の両方が、層流条件を有する所定のチャネル外形内で整列および絞り込み可能であることが理解されるであろう。
【０１５２】
粒子は、細胞または核酸とすることができる。細胞および核酸は、動物、細菌、ウイルス、真菌、または植物などの任意の生物学的システム、および水、食物、土壌、または空気などの任意の源から得ることが可能である。
【０１５３】
一部の実施形態では、固体試料は、目的の粒子の源として働く。組織試料または土壌試料などの固体試料が取得される場合、固体試料は、システムへのその後の導入の前に液化または可溶性にすることができる。気体試料が取得される場合、その試料も、液化または可溶性にされてよい。たとえば、試料は、オイルまたは水溶液中に懸濁された粒子のような他の種類の液体の泡からなってよい。
【０１５４】
一部の実施形態では、試料は、哺乳動物などの動物から得ることが可能である。哺乳動物は、ヒトとすることができる。動物から得られた粒子を含む例示的な流体試料は、全血、分画された（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）血液、血液成分、汗、涙、耳の流動液（ｅａｒ
ｆｌｏｗ）、痰、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、脳液、脳脊髄液、唾液、粘液、膣液、精液、腹水、乳汁、気道、腸管、および尿生殖路の分泌物、ならびに羊水を含むことができるが、それに限定されない。他の実施形態では、例示的な試料は、消毒洗浄、気管支肺胞洗浄、胃洗浄、腹膜洗浄、頸部洗浄、関節鏡視下洗浄、管洗浄、鼻洗浄、および耳洗浄などの洗浄のすべての形態を含めて、人体へと導入され、次いで解析のために再度取り出される流体を含むことができる。例示的な粒子は、本明細書において述べられた流体内に含まれる任意の粒子を含むことができ、剛性と変形可能の両方とすることができる。特に、粒子は、成人赤血球、胎児赤血球、栄養芽層、胎児線維芽細胞、白血球、上皮細胞、腫瘍細胞、がん細胞、造血幹細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、原生生物、植物細胞、好中球、Ｔリンパ球、ＣＤ４＋細胞、Ｂリンパ球、単球、好酸球、ナチュラルキラー、好塩基球、樹状細胞、循環血管内皮（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）、抗原特異的Ｔ細胞、および真菌細胞などの、生きているまたは固定された、細胞を含むことができるが、それに限定されない。一部の実施形態では、粒子は、ウイルス、細胞小器官、またはリポソームを含んでもよいし、これらから得られてもよい。
【０１５５】
粒子は、非細胞性アイテムもしくは非生物アイテム、またはビーズ、液滴、ナノ粒子、もしくは分子錯体などを含む合成アイテムとすることができる。異なる粒子形態は、固体ビーズ、多孔性固体ビーズ、ヒドロゲルビーズ、ダブルエマルジョンまたはマルチエマルジョン、変形可能ビーズまたは変形不能ビーズ、球状または複雑な形状のビーズを含むが、それに限定されない。一部の実施形態では、粒子は、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシング適用例に適したビーズなどのビーズである。ビーズは、ポリスチレン、セファロース、アガロース、ポリアクリルアミド、キトサン、ゼラチンなどのビーズなどの、合成ポリマービーズであってよい。ビーズは、磁気ビーズも含んでよい。ビーズは、１０から１００μｍ、または１０から２０μｍ、または２５から５０μｍ、または３０μｍ、または４０μｍなどの任意の直径であってよい。
【０１５６】
粒子は、少なくとも１つのタイプの粒子、細胞、液滴を持つ任意の懸濁液、液体、および／または流体中に全体的に懸濁されてもよいし、その中に配されてもよい。さらに、絞込みは、サイズに基づいて第１の粒子が豊富な粒子の束を生じさせることができる。
【０１５７】
一部の実施形態では、細胞などの１つまたは複数の粒子は、試料内で互いに固着してもよいし、集まってもよいし、凝集してもよい。そのような構成では、粒子のグループ化すなわち凝集は、本発明のシステムの目的のために「粒子」であると考えられ得る。より具体的には、粒子のグループ化すなわち凝集は、本明細書において説明される本発明のチャネル内で単一粒子として働き、それとして扱われてよく、したがって、単一粒子と同じ手段でソート、整列、分離、および絞り込み可能である。
【０１５８】
非生物試料からの粒子は、たとえば、粒子の分離、整列、および絞込みに適した任意の数のさまざまな工業用試料および商業用試料を含むことができる。システムへと導入可能な粒子を含む例示的な工業用試料は、エマルジョン、２相化学溶液（たとえば、固体−液体化学プロセス試料、液体−液体化学プロセス試料、および気体−液体化学プロセス試料）、廃水、バイオプロセス微粒子、および果汁、果肉、種などの食品産業試料を含むことができるが、それに限定されない。同様に、粒子を含む例示的な商業用試料は、細菌／寄生虫の混入された水、コーヒーの出しがらおよび茶の粒子、化粧品、潤滑剤、および色素などの微粒子を持つ水を含むことができるが、それに限定されない。
【０１５９】
一部の実施形態では、動物から取得された流体試料からの粒子は、本明細書において説明されるシステムに直接的に適用されるが、他の実施形態では、試料は、本発明のシステムに送達される前に前処理または加工される。たとえば、動物から採取された流体は、システムへの送達の前に１つまたは複数の試薬を用いて処理可能である、または、そのような試薬があらかじめローディングされた容器へと収集可能である。例示的な試薬は、安定化試薬、防腐剤、固定剤（ｆｉｘａｎｔ）、溶解試薬、希釈剤、抗アポトーシス性試薬、抗凝固試薬、抗血栓試薬、磁気的性質調節試薬もしくは電気的性質調節試薬、サイズ変更試薬、緩衝液試薬、オスモル濃度調節試薬、ｐＨ調節試薬、および／または架橋結合剤を含むことができるが、それに限定されない。
【０１６０】
粒子チャネルのための適切な担体流体は、水溶液、水、緩衝液、塩系溶液、およびこれらの混合物を含む。粒子が細胞である場合、水性の緩衝液、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水などの、細胞担体流体は、細胞に適合する。粒子がビーズである場合、担体流体は、水であってもよいし、所望の量のポリマービーズの拡張を提供する化学剤を任意選択でさらに含む水溶液であってもよい。他の実施形態では、ビーズ流体は、細胞溶解緩衝液を含む。
【０１６１】
適切なオイルは、オリーブオイルもしくは植物オイルなどの有機オイル、または鉱物性オイル、またはシリコーンオイル（オクタメチルトリシロキサンの誘導体など）、または全フッ素置換オイル（フロリナートＦＣ−４０など）、またはオレイン酸もしくはフタル酸ジオクチルなどの長鎖炭化水素酸を含む。第３のストリーム内で使用されるオイルは、安定剤または界面活性剤も含んでよい。
【０１６２】
第１の粒子ストリームのための流量と第２の粒子ストリームのための流量は、同じであってもよいし、異なってもよい。流量は、約１０から７５μＬ／分、または約１０から５０μＬ／分、または約１０から３５μＬ／分、または約４０から７５μＬ／分の範囲内にあってもよいし、約１０μＬ／分、約１５μＬ／分、約２０μＬ／分、約２５μＬ／分、約３０μＬ／分、約３５μＬ／分、約４０μＬ／分、約４５μＬ／分、約５０μＬ／分、約５５μＬ／分、約６０μＬ／分、約６５μＬ／分、または約７５μＬ／分であってもよい。一部の実施形態では、ビーズストリーム流量は、細胞ストリーム流量よりも高い。
【０１６３】
特定の粒子濃度を持つ粒子流体が、システムに導入されてよい。たとえば、粒子は、μＬ当たり１００から３５００、またはμＬ当たり１００から７５０、またはμＬ当たり１００から６００、またはμＬ当たり１００から３００、またはμＬ当たり５００から３０００、またはμＬ当たり１０００から３０００の濃度で、粒子流体内に存在してよい。一部の実施形態では、粒子は細胞であり、μＬ当たり１００から７５０、またはμＬ当たり１００から３００の濃度で、細胞流体内に存在する。一部の実施形態では、粒子はビーズであり、μＬ当たり５００から３０００、またはμＬ当たり１０００から３０００の濃度で、ビーズ流体内に存在する。
【０１６４】
一部の実施形態では、本明細書において説明されるシステムによって生じさせられる液滴のための粒子Ａ占有率またはビーズ占有率は、少なくとも、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％である。一部の実施形態では、本明細書において説明されるシステムによって生じさせられる液滴のための粒子Ｂ占有率または細胞占有率は、少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。
【実施例】
【０１６５】
以上で説明される実施形態の一部の態様は、以下の例においてさらに詳細に開示されているが、この例は、決して本開示の範囲を制限することを意図したものではない。
（実施例１）
ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内の直線矩形チャネル内の４つの絞込み位置への３０μｍ直径ビーズの絞込み
【０１６６】
この例は、矩形チャネル内の４つの絞込み位置への３０μｍ直径ビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。
【０１６７】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、異なるサイズのビーズが液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列させることを可能にするマイクロ流体デバイスのセットが設計された。図９を参照すると、６０μＬ／分の流量で入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で３０μｍ直径ビーズを４つの絞込み位置に絞り込む、１２５×１２５μｍの直線ビーズチャネル９０４を持つマイクロ流体デバイス９００が造られた。２０μＬ／分のビーズ流体９２４の流量では、粒子整列は観察されず、ビーズは、液滴生成接合部においてランダムに分散された。６０μＬ／分のビーズ流体９２４の流量では、ビーズ９２２は、液滴生成接合部９２６に入る前に整列された。デバイス出口９１８では、液滴９３４は、整然とした様式でマイクロ流体デバイス９００を出て、あらゆる液滴は、一般に、１つのビーズを封入した。ビーズチャネル寸法、流量の組合せは、確率的（ポアソン）ローディングから可能であろうよりも多くの単一粒子液滴と、可能であろうよりも少ない、何も入っていない液滴または複数粒子液滴を生成した。
【０１６８】
全体的に、これらのデータは、矩形チャネル内の４つの絞込み位置への３０μｍ直径ビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
（実施例２）
液滴当たり１つのビーズを達成するための≦４０μｍ直径ビーズの絞込み
【０１６９】
この例は、方形マイクロチャネル内の２つの絞込み位置への≦４０μｍ直径ビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。デバイスのこの構成は、液滴の大半が液滴当たり１つのビーズを含むという結果になった。
【０１７０】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、４０μｍまたはこれよりも小さい（例えば、２０〜４０μｍまたは３０μｍ）ビーズがマイクロ流体デバイスの液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列することを可能にするマイクロ流体デバイスが設計された。入口から約１．２〜３ｃｍの長さ以内でビーズを２つの絞込み位置に絞り込むマイクロ流体デバイスは、１００×１２５μｍの断面寸法を持つビーズチャネルを有した。ビーズ溶液の流量および細胞溶液は５０μＬ／分に設定された。オイルの流量は３００μＬ／分に設定され、これは、毎秒約４０００滴が作製されるという結果になった。これらの流量では、明白なビーズ整列が観察され、ビーズの整列されたストリームが、液滴生成接合部に入るのが観察された。結果として生じる液滴の約０．６％のみが、液滴内の複数のビーズと、ポアソン統計量と比較して９０％の減少を有した。
【０１７１】
全体的に、これらのデータは、方形チャネル内の２つの絞込み位置へのビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
（実施例３）
液滴当たり１つのビーズを達成するための４０μｍ直径ポリスチレンビーズの絞込み
【０１７２】
この例は、方形マイクロチャネル内の２つの絞込み位置への４０μｍ直径ポリスチレンビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。図１０に示されるように、デバイスのこの構成は、液滴の大半が液滴当たり１つのビーズを含むという結果になった。
【０１７３】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、４０μｍまたはこれよりも小さいビーズがマイクロ流体デバイスの液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列することを可能にするマイクロ流体デバイスが設計された。入口から約１．２〜３ｃｍの長さ以内でビーズを２つの絞込み位置に絞り込むマイクロ流体デバイスは、７５×１２５μｍの断面寸法を持つビーズチャネルを有した。ビーズ溶液の流量は５０μＬ／分に設定され、細胞溶液は１０μＬ／分に設定された。入力されるビーズ濃度は、２０００ビーズ／μＬに設定された。オイルの流量は２５０μＬ／分に設定され、これは、毎秒約２０００滴が作製されるという結果になった。これらの流量では、明白なビーズ整列が観察され、ビーズの整列されたストリームが、液滴生成接合部に入るのが観察された（図１０）。結果として生じる液滴の約２．７％のみが、液滴内の複数のビーズと、ポアソン統計量と比較して８３．３％の減少を有した。他の流量条件のための液滴内部のビーズの分布の結果が、表２に示されている。
【表２】
2020091301.tif 000011
【０１７４】
全体的に、これらのデータは、方形チャネル内の２つの絞込み位置への４０μｍ直径ポリスチレンビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
（実施例４）
液滴当たり１つのビーズを達成するための４０μｍ直径ポリメチルメタクリレートビーズの絞込み
【０１７５】
この例は、方形マイクロチャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。図１１に示されるように、デバイスのこの構成は、液滴の大半が液滴当たり１つのビーズを含むという結果になった。
【０１７６】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、４０μｍまたはこれよりも小さいＰＭＭＡビーズがマイクロ流体デバイスの液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列することを可能にするマイクロ流体デバイスが設計された。入口から約１．２〜３ｃｍの長さ以内でビーズを２つの絞込み位置に絞り込むマイクロ流体デバイスは、７５×１２５μｍの断面寸法を持つビーズチャネルを有した。ビーズ溶液の流量は６０μＬ／分に設定され、細胞溶液は１０μＬ／分に設定された。入力されるビーズ濃度は、１５００ビーズ／μＬに設定された。オイルの流量は２６０μＬ／分に設定され、これは、毎秒約２０００滴が作製されるという結果になった。これらの流量では、図１１に示されるように、明白なビーズ整列が観察され、ビーズの整列されたストリームが、液滴生成接合部に入るのが観察された。表３に示されるように、結果として生じる液滴の約５．３％のみが、液滴内の複数のビーズと、ポアソン統計量と比較して６７．３％の減少を有した。
【表３】
2020091301.tif 000012
【０１７７】
全体的に、これらのデータは、方形チャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径ＰＭＭＡビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
（実施例５）
液滴当たり１つのビーズを達成するための４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込み
【０１７８】
この例は、直線方形マイクロチャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、デバイスのこの構成は、液滴の大半が液滴当たり１つのビーズを含むという結果になった。同じ手法は、ポリアクリルアミド、アガロース、キトサン、ゼラチンなどの多孔性ポリマーゲルビーズの場合、他のタイプに使用可能である。
【０１７９】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、４０μｍまたはこれよりも小さいビーズがマイクロ流体デバイスの液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列することを可能にするマイクロ流体デバイスが設計された。入口から約１．２〜３ｃｍの長さ以内でビーズを２つの絞込み位置に絞り込むマイクロ流体デバイスは、７５×１２５μｍの断面寸法を持つビーズチャネルを有した。ビーズ溶液の流量は６０μＬ／分に設定され、細胞溶液は１０μＬ／分に設定された。入力されるビーズ濃度は、２１００ビーズ／μＬに設定された。オイルの流量は２７０μＬ／分に設定され、これは、毎秒約２５００滴が作製されるという結果になった。図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、これらの流量では、明白なビーズ整列が観察され、ビーズの整列されたストリームが、液滴生成接合部に入るのが観察された。表４に示されるように、結果として生じる液滴の約６．１％のみが、液滴内の複数のビーズと、ポアソン統計量と比較して６２．３％の減少を有した。
【表４】
2020091301.tif 000013
【０１８０】
全体的に、これらのデータは、方形チャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
（実施例６）
液滴当たり１つのビーズを達成するための４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込み
【０１８１】
この例は、方形マイクロチャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成されたことを示す。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、デバイスのこの構成は、液滴の大半が液滴当たり１つのビーズを含むという結果になった。同じ手法は、ポリアクリルアミド、アガロース、キトサン、ゼラチンなどの多孔性ポリマーゲルビーズの場合、他のタイプに使用可能である。
【０１８２】
ビーズチャネル内の流体−ビーズ相互作用およびビーズ−ビーズ相互作用の性質を使用して、４０μｍまたはこれよりも小さいゲルビーズがマイクロ流体デバイスの液滴生成接合部に入る前に絞り込み、整列することを可能にする螺旋マイクロ流体デバイスが設計された。入口から約１．２〜３ｃｍの長さ以内でビーズを２つの絞込み位置に絞り込むマイクロ流体デバイスは、７５×１００μｍの断面寸法を持つビーズチャネルを有した。ビーズ溶液の流量は５０μＬ／分に設定され、細胞溶液は１０μＬ／分に設定された。入力されるビーズ濃度は、１８００ビーズ／μＬに設定された。オイルの流量は１８０μＬ／分に設定され、これは、毎秒約２０００滴が作製されるという結果になった。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、これらの流量では、明白なビーズ整列が観察され、ビーズの整列されたストリームが、液滴生成接合部に入るのが観察された。表５に示されるように、結果として生じる液滴の約５．２％のみが、液滴内の複数のビーズと、ポアソン統計量と比較して６７．９％の減少を有した。
【表５】
2020091301.tif 000014
【０１８３】
全体的に、これらのデータは、方形チャネル内の２つの絞込み位置への３０〜４０μｍ直径３０〜４０μｍ直径セファロースゲルビーズの絞込みが、ビーズ流体入口から１．２〜３ｃｍの長さ以内で達成可能であることを示す。
【０１８４】
前に説明された実施形態の少なくとも一部では、一実施形態において使用される１つまたは複数の要素は、そのような置き換えが技術的に実現不可能でない限り、別の実施形態において互換的に使用可能である。さまざまな他の省略、追加、および修正が、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、上記で説明された方法および構造に対してなされてよいことは、当業者によって諒解されよう。すべてのそのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、主題の範囲内に含まれることが意図される。
【０１８５】
本明細書における実質的にすべての複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、状況および／または用途に適切なように、複数形から単数形に、および／または単数形から複数形に変換することができる。さまざまな単数形／複数形の置き換えは、理解しやすいように、本明細書で明確に説明され得る。
【０１８６】
通常、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（たとえば、添付の特許請求の範囲の本体部）において使用される用語は、全体を通じて「オープンな（ｏｐｅｎ）」用語として意図されていることが、当業者には理解されよう（たとえば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ
ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「含むがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきである、など）。
【０１８７】
導入される請求項で具体的な数の記載が意図される場合、そのような意図は、当該請求項において明示的に記載されることになり、そのような記載がない場合、そのような意図は存在しないことが、当業者にはさらに理解されよう。たとえば、理解の一助として、添付の特許請求の範囲は、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」という導入句を使用して請求項の記載を導くことがある。しかしながら、そのような句の使用は、同一の請求項が、「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」という導入句および「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載の導入が、そのように導入される請求項の記載を含む任意の特定の請求項を、単に１つのそのような記載を含む実施形態に限定する、ということを示唆していると解釈されるべきではない（たとえば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味すると解釈されるべきである）。同じことが、請求項の記載を導入するのに使用される定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、導入される請求項の記載で具体的な数が明示的に記載されている場合でも、そのような記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることが、当業者には理解されよう（たとえば、他の修飾語なしでの「２つの記載（ｔｗｏ  ｒｅｃｉｔａｔｉｏｎｓ）」の単なる記載は、少なくとも２つの記載、または２つまたはそれよりも多くの記載を意味する）。そのうえ、「Ａ、Ｂ、およびＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている事例では、一般に、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（たとえば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢをともに、ＡおよびＣをともに、ＢおよびＣをともに、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣをともに、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている事例では、通常、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（たとえば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢをともに、ＡおよびＣをともに、ＢおよびＣをともに、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣをともに、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。２つまたはそれよりも多くの代替用語を提示する事実上いかなる離接する語および／または句も、明細書、特許請求の範囲、または図面のどこにあっても、当該用語の一方、当該用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者にはさらに理解されよう。たとえば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されよう。
【０１８８】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループに関して説明される場合、当業者は、本開示が、それによって、マーカッシュグループの任意の個々のメンバまたはメンバのサブグループに関しても説明されることを認識しよう。
【０１８９】
当業者によって理解されるように、明細書を提供することなどに関するあらゆる目的のために、本明細書で開示されるすべての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に説明し、可能にするとして容易に認識可能である。非限定的な例として、本明細書において説明される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、および上位３分の１などへと容易に分解可能である。また、当業者によって理解されるように、「最高」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「よりも小さい」などのすべての言い回しは、記載された数を含み、その後、上記で説明された部分範囲へと分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、各個々のメンバを含む。したがって、たとえば、１つ〜３つの物品を有するグループは、１つ、２つ、または３つの物品を有するグループを指す。同様に、１つ〜５つの物品を有するグループは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの物品を有するグループを指し、以下同様である。
【０１９０】
さまざまな態様および実施形態が本明細書において開示されてきたが、他の態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書において開示されるさまざまな態様および実施形態は、例示を目的としており、制限を意図するものではない。真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
（項目１）
２つまたはそれよりも多いタイプの粒子を含む液体液滴を生成する方法であって、
その中にビーズを懸濁させたビーズ流体を第１のマイクロチャネル内のビーズの第１の整列されたストリームへと絞り込むこと、
その中に細胞を懸濁させた細胞流体を第２のマイクロチャネル内の細胞の第２の整列されたストリームへと絞り込むこと、および
前記第１の整列されたストリームを前記第２の整列されたストリームと合流して、各液滴内に所定の数の細胞とビーズとを有する複数の液滴を形成すること
を含む方法。
（項目２）
前記第１のマイクロチャネルが最小断面寸法Ｄを有し、前記ビーズが、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の整列されたストリームと前記第２の整列されたストリームの合流が、前記第１の整列されたストリームおよび前記第２の整列されたストリームを第１の流体および第２の流体内の不混和性の第３の流体と接触させることを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ビーズを絞り込むことが、前記ビーズに前記第１のマイクロチャネルの第１の慣性絞込み部分を通過させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞を絞り込むことが、前記細胞に前記第２のマイクロチャネルの第２の慣性絞込み部分を通過させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ビーズを絞り込むことが、前記ビーズに前記第１のマイクロチャネルの第１の慣性絞込み部分を通過させることを含み、前記細胞を絞り込むことが、前記細胞に前記第２のマイクロチャネルの第２の慣性絞込み部分を通過させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１のマイクロチャネルの前記第１の慣性絞込み部分および前記第２のマイクロチャネルの前記第２の慣性絞込み部分のうちの少なくとも１つが、湾曲した領域を有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
各湾曲した領域が、独立して、Ｓ字形、Ｓ字状、正弦曲線形、または螺旋形である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ビーズがヌクレオチド断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ヌクレオチド断片が、バーコード領域と、インデックス領域と、捕捉領域とを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
各ヌクレオチド断片の前記バーコード領域は、長さが少なくとも約６ヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
各ヌクレオチド断片の前記インデックス領域は、長さが少なくとも約４ヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記捕捉領域が、ポリＴヌクレオチドを含み、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
細胞の前記所定の数が１であり、ビーズの前記所定の数が１である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
各ビーズが少なくとも約１のレイノルズ数を有し、
ビーズの前記レイノルズ数が、
【数９】
2020091301.tif 000015
と定義され、上式で、ρが前記ビーズ流体の密度、Ｕｍが前記ビーズ流体の最大流れスピード、Ｈが前記ビーズ流体の水力直径、μが前記ビーズ流体の動的粘度であり、
各細胞が少なくとも約１のレイノルズ数を有し、
細胞の前記レイノルズ数が、
【数１０】
2020091301.tif 000016
と定義され、上式で、ρが前記細胞流体の密度、Ｕｍが前記細胞流体の最大流れスピード、Ｈが前記細胞流体の水力直径、μが前記細胞流体の動的粘度である、
項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ｋ１ビーズとｋ２細胞とを含む前記複数の液滴の割合が（λ１ｋ１  ｅｘｐ（−λ１）／（ｋ１！））  （λ２ｋ２  ｅｘｐ（−λ２）／（ｋ２！））よりも大きく、上式で、λ１が液滴ごとの前記ビーズの平均数、λ２が液滴ごとの前記細胞の平均数である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の整列されたストリームの流量が少なくとも約１０μＬ／ｍｉｎである、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第２の整列されたストリームの流量が少なくとも約１０μＬ／ｍｉｎである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
基材内に配された第１の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第１の入口と、
ビーズを含むビーズ流体を前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルに通すように構成された第１の流源と、
前記基材内に配された第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第２の入口であって、前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルが、複数の液滴へと前記ビーズ流体および細胞流体を形成するために前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続される、第２の入口と、
細胞を含む細胞流体を前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに通すように構成された第２の流源と
を含む液滴生成システム。
（項目２１）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルが、不規則な形状を有する側壁を含む、項目２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記不規則な形状が、前記不規則な形状を持つ前記慣性絞込みマイクロチャネルの長手方向軸から離れたベースライン表面から突き出す第１の不規則なものを含む、項目２１に記載のシステム。
（項目２３）
各不規則な形状が、台形、三角形、丸、および方形からなる群から選択される、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルが、不規則な形状を有する側壁を含む、項目２０に記載のシステム。
（項目２５）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、前記側壁が階段状表面を有する、項目２０に記載のシステム。
（項目２６）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、前記側壁が曲面を有する、項目２０に記載のシステム。
（項目２７）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、湾曲した領域を有する、項目２０に記載のシステム。
（項目２８）
各湾曲した領域が、独立して、Ｓ字形、正弦曲線形、Ｓ字状、または螺旋形である、項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
前記湾曲した領域が、多くとも約３０のディーン数を有する、項目２７に記載のシステム。
（項目１Ａ）
２つまたはそれよりも多いタイプの粒子を含む液体液滴を生成する方法であって、
その中にビーズを懸濁させたビーズ流体を慣性絞込みによって第１のマイクロチャネル内のビーズの第１の整列されたストリームへと絞り込むこと、
その中に細胞を懸濁させた細胞流体を慣性絞込みによって第２のマイクロチャネル内の細胞の第２の整列されたストリームへと絞り込むこと、および
前記第１の整列されたストリームを前記第２の整列されたストリームと合流して、各液滴内に所定の数の細胞とビーズとを有する複数の液滴を形成すること
を含む方法。
（項目２Ａ）
前記第１のマイクロチャネルが最小断面寸法Ｄを有し、前記ビーズが、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する、項目１Ａに記載の方法。
（項目３Ａ）
前記細胞が、少なくとも約０．１Ｄである断面寸法を有する、項目２Ａに記載の方法。
（項目４Ａ）
前記第１の整列されたストリームと前記第２の整列されたストリームの合流が、前記第１の整列されたストリームおよび前記第２の整列されたストリームを第１の流体および第２の流体内の不混和性の第３の流体と接触させることを含む、項目２Ａに記載の方法。
（項目５Ａ）
前記ビーズを絞り込むことが、前記ビーズに前記第１のマイクロチャネルの第１の慣性絞込み部分を通過させることを含み、前記細胞を絞り込むことが、前記細胞に前記第２のマイクロチャネルの第２の慣性絞込み部分を通過させることを含む、項目１Ａに記載の方法。
（項目６Ａ）
前記第１のマイクロチャネルの前記第１の慣性絞込み部分および前記第２のマイクロチャネルの前記第２の慣性絞込み部分のうちの少なくとも１つが、湾曲した領域を有する、項目５Ａに記載の方法。
（項目７Ａ）
各湾曲した領域が、独立して、Ｓ字形、Ｓ字状、正弦曲線形、または螺旋形である、項目６Ａに記載の方法。
（項目８Ａ）
前記ビーズがヌクレオチド断片を含む、項目１Ａに記載の方法。
（項目９Ａ）
前記ヌクレオチド断片が、バーコード領域と、インデックス領域と、捕捉領域とを含む、項目８Ａに記載の方法。
（項目１０Ａ）
各ヌクレオチド断片の前記バーコード領域は、長さが少なくとも約６ヌクレオチドである、項目９Ａに記載の方法。
（項目１１Ａ）
各ヌクレオチド断片の前記インデックス領域は、長さが少なくとも約４ヌクレオチドである、項目９Ａに記載の方法。
（項目１２Ａ）
前記捕捉領域が、ポリＴヌクレオチドを含み、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目９Ａに記載の方法。
（項目１３Ａ）
細胞の前記所定の数が１であり、ビーズの前記所定の数が１である、項目１Ａに記載の方法。
（項目１４Ａ）
各ビーズが少なくとも約１のレイノルズ数を有し、
ビーズの前記レイノルズ数が、
【数１１】
2020091301.tif 000017
と定義され、上式で、ρが前記ビーズ流体の密度、Ｕｍが前記ビーズ流体の最大流れスピード、Ｈが前記ビーズ流体の水力直径、μが前記ビーズ流体の動的粘度であり、
各細胞が少なくとも約１のレイノルズ数を有し、
細胞の前記レイノルズ数が、
【数１２】
2020091301.tif 000018
と定義され、上式で、ρが前記細胞流体の密度、Ｕｍが前記細胞流体の最大流れスピード、Ｈが前記細胞流体の水力直径、μが前記細胞流体の動的粘度である、
項目１３Ａに記載の方法。
（項目１５Ａ）
ｋ１ビーズとｋ２細胞とを含む前記複数の液滴の割合が（λ１ｋ１  ｅｘｐ（−λ１）／（ｋ１！））  （λ２ｋ２  ｅｘｐ（−λ２）／（ｋ２！））よりも大きく、上式で、λ１が液滴ごとの前記ビーズの平均数、λ２が液滴ごとの前記細胞の平均数である、項目１４Ａに記載の方法。
（項目１６Ａ）
前記第１の整列されたストリームの流量が少なくとも約１０μＬ／ｍｉｎである、項目１Ａに記載の方法。
（項目１７Ａ）
前記第２の整列されたストリームの流量が少なくとも約１０μＬ／ｍｉｎである、項目１Ａに記載の方法。
（項目１８Ａ）
基材内に配された第１の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第１の入口と、
ビーズを含むビーズ流体を前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルに通して慣性絞込みによって前記ビーズ流体を絞り込むように構成された第１の流源と、
前記基材内に配された第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続された第２の入口であって、前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルが、複数の液滴へと前記ビーズ流体および細胞流体を形成するために前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに接続される、第２の入口と、
細胞を含む細胞流体を前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルに通して慣性絞込みによって前記細胞流体を絞り込むように構成された第２の流源と
を含む液滴生成システム。
（項目１９Ａ）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルが、不規則な形状を有する側壁を含む、項目１８Ａに記載のシステム。
（項目２０Ａ）
前記不規則な形状が、前記不規則な形状を持つ前記慣性絞込みマイクロチャネルの長手方向軸から離れたベースライン表面から突き出す第１の不規則なものを含む、項目１９Ａに記載のシステム。
（項目２１Ａ）
各不規則な形状が、台形、三角形、丸、および方形からなる群から選択される、項目２０Ａに記載のシステム。
（項目２２Ａ）
前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルが、不規則な形状を有する側壁を含む、項目１８Ａに記載のシステム。
（項目２３Ａ）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、前記側壁が階段状表面を有する、項目１８Ａに記載のシステム。
（項目２４Ａ）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、側壁を有する拡張／収縮領域を有し、前記側壁が曲面を有する、項目１８Ａに記載のシステム。
（項目２５Ａ）
前記第１の慣性絞込みマイクロチャネルおよび前記第２の慣性絞込みマイクロチャネルのうちの少なくとも１つが、湾曲した領域を有する、項目１８Ａに記載のシステム。
（項目２６Ａ）
各湾曲した領域が、独立して、Ｓ字形、正弦曲線形、Ｓ字状、または螺旋形である、項目２５Ａに記載のシステム。
（項目２７Ａ）
前記湾曲した領域が、多くとも約３０のディーン数を有する、項目２５Ａに記載のシステム。
【図１】
2020091301.tif 000019
【図２】
2020091301.tif 000020
【図３】
2020091301.tif 000021
【図４】
2020091301.tif 000022
【図５ＡＢ】
2020091301.tif 000023
【図５ＣＤ】
2020091301.tif 000024
【図５ＥＦ】
2020091301.tif 000025
【図６】
2020091301.tif 000026
【図７】
2020091301.tif 000027
【図８】
2020091301.tif 000028
【図９】
2020091301.tif 000029
【図１０】
2020091301.tif 000030
【図１１】
2020091301.tif 000031
【図１２】
2020091301.tif 000032
【図１３】
2020091301.tif 000033
【図１４】
2020091301.tif 000034
【図１５】
2020091301.tif 000035
【図１６】
2020091301.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月12日(2020.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2020091301.tif 000037
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2020091301.tif 000038
【外国語明細書】
2020091301000001.pdf