(57)【要約】【課題】非フコシル化抗ＣＤ４０抗体の投与量および投与の提供。【解決手段】本発明は、がんおよび慢性感染疾患を処置するために非フコシル化抗ＣＤ４０抗体を使用する方法に関する。この抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含み得、前記定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてＮ−グリコシド結合型糖鎖を有し、前記Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の５％未満が、フコース残基を含み得、０．１〜２０００μｇ／患者の体重１ｋｇの間の用量レベルで投与され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／０７２，０３１号および２０１５年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／１３４，９５５号の利益を主張しており、これら両方は、すべての目的のために参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、がんおよび慢性感染疾患を処置するために非フコシル化抗ＣＤ４０抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは、５０ｋＤａの見かけ上のＭＷを有する単鎖Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ４０は、いくつかのがん細胞、例えば、リンパ腫細胞、およびいくつかのタイプの固形腫瘍細胞で発現する。ＣＤ４０はまた、抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触依存的な双方向の相互作用を助長することによって免疫系を活性化するように機能する。いくつかの抗ＣＤ４０抗体が、臨床トライアルで試験されてきたが、これまでいずれも十分な活性を呈していない。本開示は、この問題および他の問題を解決するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の簡単な要旨）
本開示は、抗ＣＤ４０抗体をそのような処置を必要とする患者に投与することによってがんを処置する方法を提供する。抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含む。定常領域は、Kabatに示された
ＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてＮ−グリコシド結合型糖鎖を有し、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の５％未満が、フコース残基、すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）へのα１，６結合を介して糖鎖の還元末端に結合したフコースを含む。抗ＣＤ４０抗体の投与は、０．１〜３００μｇ／ｋｇ（患者の体重１キログラム当たりμｇの抗体）の間の用量レベルにおけるものである。一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、０．６〜１５０μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、１．０〜１００μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、５〜２５μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、８〜１２μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、約１０μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体の用量レベルは、１０μｇ／ｋｇである。
【０００５】
別の態様では、本開示は、抗ＣＤ４０抗体をそのような処置を必要とする患者に投与することによってがんを処置する方法を提供する。抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含む。定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてＮ−グリコシド結合型糖
鎖を有し、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の５％未満が、フコース残基、すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）へのα１，６結合を介して糖鎖の還元末端に結合したフコースを含む。抗ＣＤ４０抗体の投与は、０．１〜２０００μｇ／ｋｇ（患者の体重１キログラム当たりμｇの抗体）の間の用量レベルにおけるものである。一実施形態では、用量レベルは、１０〜１０００μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、用量レベルは、５０〜８００μｇ／ｋｇの間である。さらなる実施形態では、用量レベルは、７５〜６００μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態では、用量レベルは、１００〜５００μｇ／ｋｇの間である。さらなる実施形態では、用量レベルは、１００〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜９００μｇ／ｋｇ、および９００〜１１００μｇ／ｋｇから選択される範囲である。他の実施形態では、用量レベルは、１００〜１５０μｇ／ｋｇ、１５０〜２００μｇ／ｋｇ、２００〜２５０μｇ／ｋｇ、２５０〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜３５０μｇ／ｋｇ、３５０〜４００μｇ／ｋｇ、４００〜４５０μｇ／ｋｇ、４５０〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜５５０μｇ／ｋｇ、５５０〜６００μｇ／ｋｇ、６００〜６５０μｇ／ｋｇ、６５０〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜７５０μｇ／ｋｇ、７５０〜８００μｇ／ｋｇ、８００〜８５０μｇ／ｋｇ、８５０〜９００μｇ／ｋｇ、９００〜９５０μｇ／ｋｇ、９５０〜１０００μｇ／ｋｇ、１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、および１０５０〜１１００μｇ／ｋｇから選択される範囲である。さらなる実施形態では、用量レベルは、約６０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約４５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約５５０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約６５０μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約８５０μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約９５０μｇ／ｋｇ、約１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、約１０５０μｇ／ｋｇ、および１１１０μｇ／ｋｇから選択される。
【０００６】
一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、３週間毎に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、６週間毎に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、１０週間毎に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、１２週間毎に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、１５週間毎に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、１８週間毎に投与される。
【０００７】
別の実施形態では、患者は、ＣＤ４０陽性がんを有する。別の実施形態では、患者は、ＣＤ４０陰性がんを有する。さらなる実施形態では、患者は、固形腫瘍であるがんを有する。さらに別の実施形態では、患者は、血液がんであるがんを有する。別の実施形態では、がんは、メラノーマ、転移乳がんを含めた乳がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、または膵臓がんである。
【０００８】
さらなる態様では、本開示は、抗ＣＤ４０抗体、および免疫チェックポイントを阻止する抗体の組合せを患者に投与することによってがんを処置する方法を提供する。免疫チェックポイントを阻止する抗体の一例は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）抗体である。抗ＣＴＬＡ４抗体の例としては、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブが挙げられる。免疫チェックポイントを阻止する抗体の別の例は、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）抗体である。抗ＰＤ１抗体の例としては、例えば、ニボルマブ、ピジリズマブ、またはペンブロリズマブが挙げられる。免疫チェックポイントを阻止する抗体のさらなる例は、抗プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）抗体である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例としては、例えば、ＭＥＤＩ４７３６およびＭＰＤＬ３２８０Ａが挙げられる。
【０００９】
別の実施形態では、患者は、ＣＤ４０陽性がんを有し、抗ＣＤ４０抗体と免疫チェックポイントを阻止する抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せを用いて処置される。別の実施形態では、患者は、ＣＤ４０陰性がんを有し、抗ＣＤ４０抗体と免疫チェックポイントを阻止する抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せを用いて処置される。さらなる実施形態では、患者は、固形腫瘍であるがんを有し、抗ＣＤ４０抗体と免疫チェックポイントを阻止する抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せを用いて処置される。さらに別の実施形態では、患者は、血液がんであるがんを有し、抗ＣＤ４０抗体と免疫チェックポイントを阻止する抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せを用いて処置される。別の実施形態では、がんは、メラノーマ、転移乳がんを含めた乳がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、または膵がんであり、抗ＣＤ４０抗体と免疫チェックポイントを阻止する抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せを用いて処置される。
【００１０】
（定義）
「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、天然に生成されても、合成的に生成されても、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００１１】
「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド性成分も含み得る。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加される場合があり、細胞のタイプによって変動することになる。タンパク質は、そのアミノ酸骨格構造の観点から本明細書に定義され、炭水化物基などの置換基は、一般に指定されないが、それにもかかわらず存在し得る。
【００１２】
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」は、ポリペプチド内の位置を表すのに本明細書で使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近傍または相対的な位置を表すのにポリペプチドの特定の配列または部分を参照して使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置したある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端にある必要はない。
【００１３】
用語「抗体」は、抗原の存在に応答して体によって産生され、抗原、ならびに抗原結合断片およびこれらの操作されたバリアントに結合する免疫グロブリンタンパク質を表すのに本明細書で使用される。したがって、用語「抗体」は、全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含むインタクトなモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ技術を使用して生成される抗体）、ならびに抗原結合抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片などを含む。遺伝子操作されたインタクト抗体および断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Ｆｖ断片、単鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、線状抗体、多価または多重特異性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体なども含まれる。したがって、用語「抗体」は、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原に特異的に結合することができる任意のタンパク質を含むように広範に使用される。
【００１４】
「抗体の抗原結合部位」は、その抗原に結合するのに十分である抗体の部分である。最低限のこのような領域は、典型的には可変ドメインまたはその遺伝子操作されたバリアントである。単一ドメイン結合部位は、ラクダ抗体（MuyldermansおよびLauwereys、J.  Mol.  Recog.、１２巻：１３１〜１４０頁、１９９９年；Nguyenら、EMBO  J.、１９巻：９２１〜９３０頁、２０００年を参照）、または単一ドメイン抗体を生成するための他の種のＶＨドメイン（「ｄＡｂｓ」；Wardら、Nature、３４１巻：５４４〜５４６頁、１９８９年；Winterらの米国特許第６，２４８，５１６号を参照）から生成することができる。ある特定のバリエーションでは、抗原結合部位は、天然もしくは非天然に（例えば、突然変異を誘発された）存在する重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、またはこれらの組合せのわずか２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチド領域である（例えば、Pessiら、Nature、３６２巻：３６７〜３６９頁、１９９３年；Qiuら、Nature  Biotechnol.、２５巻：９２１〜９２９頁、２００７年を参照）。より一般に、抗体の抗原
結合部位は、共通エピトープに結合する重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの両方を含む。本発明の文脈の範囲内で、抗体は、抗原結合部位に加えて１つまたは複数の成分、例えば、抗体の第２の抗原結合部位（同じもしくは異なるエピトープ、または同じもしくは異なる抗原に結合し得る）、ペプチドリンカー、免疫グロブリン定常領域、免疫グロブリンヒンジ、両親媒性ヘリックス（PackおよびPluckthun、Biochem.
、３１巻：１５７９〜１５８４頁、１９９２年を参照）、非ペプチドリンカー、オリゴヌクレオチド（Chaudriら、FEBS  Letters、４５０巻：２３〜２６頁、１９９９年を参照）、細胞増殖抑制薬または細胞傷害性薬などを含み得、単量体または多量体のタンパク質であり得る。抗体の抗原結合部位を含む分子の例は、当技術分野で公知であり、これらとしては、例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、ｄＡｂ、ミニボディ、ナノボディ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合物、二重特異性（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、および二重特異性（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂが挙げられる。（例えば、Huら、Cancer  Res.、５６巻：３０５５〜３０６１頁、１９９６年；Atwellら、Molecular  Immunology、３３巻：１３０１〜１３１２頁、１９９６年；Carter
およびMerchant、Curr.  Opin.  Biotechnol.、８巻：４４９〜４５４頁、１９９７年；Zuoら、Protein  Engineering、１３巻：３６１〜３６７頁、２０００年；ならびにLuら、J.  Immunol.  Methods、２６７巻：２１３〜２２６頁、２００２年を参照）。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子（複数可）によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。免疫グロブリンの一形態は、脊椎動物における固有の（すなわち、天然の）抗体の基本構造単位を構成する。この形態は、四量体であり、各対が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなる。各対では、軽および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は一緒に、抗原への結合を主に担い、定常領域は、抗体エフェクター機能を主に担う。免疫グロブリンタンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）が、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧは、主要なクラスを構成し、それは通常、血漿中で見つかる２番目に最も豊富なタンパク質として存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４と指定された４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ語記号γを用いて特定される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含有する。それぞれの免疫グロブリン重鎖は、種における所与のサブクラスについて本質的に不変である定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３；ＩｇＧ３は、ＣＨ４ドメインも含有する）からなる定常領域を有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である。（例えば、Ellisonら、DNA、１巻：１１〜１８頁、１９８１年；Ellisonら、Nucleic  Acids  Res.
、１０巻：４０７１〜４０７９頁、１９８２年；Kentenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.
USA、７９巻：６６６１〜６６６５頁、１９８２年；Senoら、Nuc.  Acids  Res.、１１巻：７１９〜７２６頁、１９８３年；Riechmannら、Nature、３３２巻：３２３〜３２７
頁、１９８８年；Amsterら、Nuc.  Acids  Res.、８巻：２０５５〜２０６５頁、１９８
０年；RusconiおよびKohler、Nature、３１４巻：３３０〜３３４頁、１９８５年；Boss
ら、Nuc.  Acids  Res.、１２巻：３７９１〜３８０６頁、１９８４年；Bothwellら、Nature、２９８巻：３８０〜３８２頁、１９８２年；van  der  Looら、Immunogenetics、４２巻：３３３〜３４１頁、１９９５年；Karlinら、J.  Mol.  Evol.、２２巻：１９５〜
２０８頁、１９８５年；Kindsvogelら、DNA、１巻：３３５〜３４３頁、１９８２年；Breinerら、Gene、１８巻：１６５〜１７４頁、１９８２年；Kondoら、Eur.  J.  Immunol.
、２３巻：２４５〜２４９頁、１９９３年；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２２８を参照）。免疫グロブリンの構造および機能の総説については、Putnam、The  Plasma
Proteins、Ｖ巻、Academic  Press,  Inc.、４９〜１４０頁、１９８７年；およびPadlan、Mol.  Immunol.、３１巻：１６９〜２１７頁、１９９４年を参照。用語「免疫グロブリン」は、文脈に応じてインタクト抗体、その成分鎖、または鎖の断片を表すその一般的な意味について本明細書で使用される。
【００１６】
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、アミノ末端で可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸をコードする）によって、およびカルボキシル末端でカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸をコードする）、およびガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされ、後者は、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２またはそれ超のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は、約１０またはそれ超のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（一般に、Fundamental
Immunology（Paul編、Raven  Press,  N.Y.、第２版、１９８９年）、７章を参照）。
【００１７】
免疫グロブリン軽または重鎖可変領域（それぞれ、「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも本明細書で呼ばれる）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲを整列させる機能を果たす。したがって、用語「超可変領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合を主に担う抗体のアミノ酸残基を指す。アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＬおよびＶＨドメインはともに、以下のフレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat、Sequences  of  Proteins  of
Immunological  Interest（National  Institutes  of  Health、Bethesda、MD、１９
８７年および１９９１年）、またはChothia  &  Lesk、J.  Mol.  Biol.、１９６巻：９
０１〜９１７頁、１９８７年；Chothiaら、Nature、３４２巻：８７８〜８８３頁、１９
８９年の定義に従うものである。Kabatは、広く使用されている番号付け慣習（Ｋａｂａ
ｔ番号付け）も提供し、この慣習では、異なる重鎖間または異なる軽鎖間で対応する残基が同じ番号を割り当てられている。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２、および３は、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３とも本明細書で呼ばれ、ＶＨドメインのＣＤＲ１、２、および３は、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３とも本明細書で呼ばれる。
【００１８】
文脈による別段の指示のない限り、用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた単一クローンに由来し、それが生成される方法に由来しない抗体を指す。
【００１９】
用語「キメラ抗体」は、第１の種に由来する可変ドメインおよび第２の種に由来する定常領域を有する抗体を指す。キメラ免疫グロブリンまたは抗体は、例えば、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子操作によって構築することができる。用語「ヒト化抗体」は、以下に定義される通りであり、キメラ抗体を包含するように意図されていない。ヒト化抗体は、これらの構成においてキメラである（すなわち、タンパク質の１つを超える種由来の領域を含む）が、これらは、本明細書に定義したキメラ免疫グロブリンまたは抗体において見出されない追加の特徴（すなわち、ドナーＣＤＲ残基およびアクセプターフレームワーク残基を含む可変領域）を含む。
【００２０】
用語「ヒト化ＶＨドメイン」または「ヒト化ＶＬドメイン」は、完全または実質的に非ヒトドナー免疫グロブリン（例えば、マウスまたはラット）由来の一部またはすべてのＣＤＲ、および完全または実質的にヒト免疫グロブリン配列由来の可変領域フレームワーク配列を含む免疫グロブリンＶＨまたはＶＬドメインを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一部の事例では、ヒト化抗体は、適切な結合特性を増強するためにヒト可変ドメインフレームワーク領域内に非ヒト残基を保持する場合がある（例えば、フレームワーク中の突然変異が、抗体がヒト化されるとき、結合親和性を保存するのに要求され得る）。
【００２１】
「ヒト化抗体」は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの一方または両方を含む抗体である。免疫グロブリン定常領域（複数可）は、存在する必要はないが、これらが存在する場合、これらは、完全または実質的にヒト免疫グロブリン定常領域由来である。
【００２２】
抗体のその標的抗原への特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、少なくとも１種の無関係の標的に対して起こる非特異的結合よりも規模において検出可能な程度により高く、それと区別可能である。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的なフィット（例えば、ロックアンドキータイプ）の結果であり得、一方、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、モノクローナル抗体が結合する標的が、１つかつ１つのみであることを必ずしも暗示しない。
【００２３】
本明細書に記載のタンパク質に関して、配列番号によって指定されたものに対応するアミノ酸残基への言及は、このような残基の翻訳後修飾を含む。
【００２４】
用語「希釈剤」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の例示的または適切な１つまたは複数の濃度を変更または実現するのに適した溶液を指す。
【００２５】
用語「コンテナ」は、物体または液体を、例えば、貯蔵のために入れる、または閉じ込めることができるもの（例えば、ホルダー、入れ物、容器など）を指す。
【００２６】
用語「投与経路」は、例えば、非経口的、静脈内、筋肉内、または皮下などに治療タンパク質を送達するための当技術分野で認識されている投与経路を含む。がんを処置するための抗体の投与について、静脈内または皮下の投与による体循環への投与が望まれ得る。固形腫瘍によって特徴付けられるがんの処置について、投与は、そのように望まれる場合、腫瘍中に直接に局在化させることもできる。
【００２７】
用語「処置」は、疾患を治癒させ、癒し、軽減し、遅延させ、緩和し、変更し、矯正し、回復させ、改善し、または疾患に影響を与える目的を伴った、疾患を有する患者への治療剤の投与を指す。
【００２８】
用語「患者」は、予防的または治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【００２９】
用語「有効量」、「有効用量」、または「有効投与量」は、所望の効果を実現し、または少なくとも部分的に実現するのに十分である、例えば、疾患または障害の１つまたは複数の症状の出現を阻害し、またはその症状を回復させるのに十分である量を指す。有効量の医薬組成物は、「有効なレジーム」で投与される。用語「有効なレジーム」は、疾患または障害の予防的または治療的処置を達成するのに適切な投与される組成物の量および投与頻度の組合せを指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、指定された値からプラスまたはマイナス１０％のおよその範囲を表す。例えば、言い回し「約２０μｇ／Ｋｇ」は、１８〜２２μｇ／Ｋｇの範囲を包含する。本明細書で使用される場合、約は、厳密な量も含む。したがって、「約２０μｇ／Ｋｇ」は、「約２０μｇ／Ｋｇ」およびまた「２０μｇ／Ｋｇ」を意味する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
がんを処置する方法であって、前記方法は、このような処置を必要とする患者に抗ＣＤ４０抗体を投与するステップを含み、
前記抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含み、前記定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてＮ−グリコシド結合型糖鎖を有し、前記Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の５％未満が、フコース残基を含み、
前記抗ＣＤ４０抗体は、０．１〜２０００μｇ／患者の体重１ｋｇの間の用量レベルで投与される、方法。
（項目２）
前記用量レベルが、１０〜１０００μｇ／ｋｇの間である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記用量レベルが、５０〜８００μｇ／ｋｇの間である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記用量レベルが、７５〜６００μｇ／ｋｇの間である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記用量レベルが、１００〜５００μｇ／ｋｇの間である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記用量レベルが、１００〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜９００μｇ／ｋｇ、および９００〜１１００μｇ／ｋｇからなる群から選択される範囲である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記用量レベルが、１００〜１５０μｇ／ｋｇ、１５０〜２００μｇ／ｋｇ、２００〜２５０μｇ／ｋｇ、２５０〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜３５０μｇ／ｋｇ、３５０〜４００μｇ／ｋｇ、４００〜４５０μｇ／ｋｇ、４５０〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜５５０μｇ／ｋｇ、５５０〜６００μｇ／ｋｇ、６００〜６５０μｇ／ｋｇ、６５０〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜７５０μｇ／ｋｇ、７５０〜８００μｇ／ｋｇ、８００〜８５０μｇ／ｋｇ、８５０〜９００μｇ／ｋｇ、９００〜９５０μｇ／ｋｇ、９５０〜１０００μｇ／ｋｇ、１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、および１０５０〜１１００μｇ／ｋｇからなる群から選択される範囲である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記用量レベルが、約６０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約４５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約５５０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約６５０μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約８５０μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約９５０μｇ／ｋｇ、約１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、約１０５０μｇ／ｋｇ、および１１１０μｇ／ｋｇからなる群のメンバーである、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記抗ＣＤ４０抗体が、３週間毎に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記抗ＣＤ４０抗体が、６週間毎に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記患者が、ＣＤ４０陽性がんを有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記患者が、ＣＤ４０陰性がんを有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
がんを処置する方法であって、前記方法は、このような処置を必要とする患者に抗ＣＤ４０抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体を投与するステップを含み、
前記抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含み、前記定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてグリコシル化されており、前記グリコシル化されたものの５％未満が、フコース残基を含む、方法。
（項目１４）
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
がんを処置する方法であって、前記方法は、このような処置を必要とする患者に抗ＣＤ４０抗体および抗ＰＤ１抗体を投与するステップを含み、
前記抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含み、前記定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてグリコシル化されており、前記グリコシル化されたものの５％未満が、フコース残基を含む、方法。
（項目１６）
前記抗ＰＤ１抗体が、ニボルマブ、ピジリズマブ、およびペンブロリズマブからなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
がんを処置する方法であって、前記方法は、このような処置を必要とする患者に抗ＣＤ４０抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与するステップを含み、
前記抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２の軽鎖可変領域、ならびにヒト定常領域を含み、前記定常領域は、Kabatに示されたＥＵインデックスに従った残基Ｎ２９７においてグリコシル化されており、前記グリコシル化されたものの５％未満が、フコース残基を含む、方法。
（項目１８）
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＭＥＤＩ４７３６およびＭＰＤＬ３２８０Ａからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記がんが、血液学的がんである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記がんが、固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記がんが、血液学的がんである、項目１３、１５、または１７に記載の方法。
（項目２２）
前記がんが、固形腫瘍である、項目１３、１５、または１７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＰＢＭＣの表面に存在するヒトＣＤ４０タンパク質についてのＳＥＡ−ＣＤ４０（実線）およびダセツズマブ（点線）の結合を提供する。
【００３２】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＦｃγＩＩＩａ受容体バリアントについてのＳＥＡ−ＣＤ４０（白抜きの正方形および黒正方形）およびダセツズマブ（白抜きの円および黒円）の結合親和性を提供する。図２Ａは、グラフ表示を提供し、図２Ｂは、ＫＤ値を提供する。ＳＥＡ−ＣＤ４０の値は、左列に示されており、ダセツズマブ（decetuzumab）の値は、右列に示されている。
【００３３】
【図３】図３は、ＳＥＡ−ＣＤ４０で処置した結果としてのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＢ細胞枯渇の用量関係および経時変化を提供する。
【００３４】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＳＥＡ−ＣＤ４０またはアイソタイプ対照（ＳＥＡ−ｈ００）で処置して２４時間後のヒト全血による代表的なサイトカイン産生を実証する。抗体は、μｇ／ｍｌの単位で投与した。図４Ａは、腫瘍壊死因子−αの産生を示し、図４Ｂは、ＭＩＰ−１βの産生を示す。
【００３５】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＳＥＡ−ＣＤ４０またはアイソタイプ対照（ＳＥＡ−ｈ００）で処置して２４時間後のヒトＰＢＭＣによる代表的なサイトカイン産生を実証する。抗体は、μｇ／ｍｌの単位で投与した。図５Ａは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生を示し、図５Ｂは、ＭＩＰ−１βの産生を示す。
【００３６】
【図６】図６は、ＳＥＡ−ＣＤ４０（黒正方形）；ダセツズマブ（灰色円）；またはＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ’）２（灰色正方形）で処置した結果としてのヒトＰＢＭＣからのＢ細胞枯渇の経時変化を提供する。
【００３７】
【図７】図７は、ＳＥＡ−ＣＤ４０（黒正方形）；ダセツズマブ（灰色円）；またはＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ’）２（灰色正方形）で処置した結果としてのＰＢＭＣによるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）産生を提供する。
【００３８】
【図８】図８は、ＳＥＡ−ＣＤ４０（黒正方形）；ダセツズマブ（灰色円）；またはＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ’）２（灰色正方形）で処置した結果としてのＰＢＭＣによる抗原提示細胞成熟のマーカーとしてのＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ／ＤＰの誘導を実証する。
【００３９】
【図９】図９は、様々な濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０で処置されたＰＢＭＣでの免疫活性化マーカーの濃度対正規化された応答の曲線を提供する。
【００４０】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＥＡ−ＣＤ４０またはダセツズマブとともにインキュベートされたＰＢＭＣによるＭ１  ｆｌｕペプチドに対する免疫応答を比較する。図１０Ａは、抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージのレベルを示し、図１０Ｂは、ＩＦＮ−γ産生のレベルを示す。
【００４１】
【図１１】図１１は、ＳＥＡ−ＣＤ４０と抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＰＤ−１抗体との組合せとともにインキュベートされたＰＢＭＣによるＭ１  ｆｌｕペプチドに対する免疫応答の増強を実証する。ＩＦＮγレベルが図１１に示されている。
【００４２】
【図１２】図１２は、ＳＥＡ−ＣＤ４０と抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＰＤ−１抗体との組合せとともにインキュベートされたＰＢＭＣによるＭ１  ｆｌｕペプチドに対する免疫応答の増強を実証する。抗原特異的Ｔ細胞のレベルが図１２に示されている。
【００４３】
【図１３】図１３は、一般的な腫瘍抗原ペプチド（ＭＡＧＥＡ１／ＭＡＧＥ３／ＮＹ−ＥＳＯ）に対するがんを有するドナー由来のＰＢＭＣの免疫応答（ＩＦＮγ産生）を提供する。ＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０またはＳＧＮ−４０の存在または非存在下で５日間インキュベートした。
【００４４】
【図１４】図１４は、一般的な腫瘍抗原ペプチド（ＭＡＧＥＡ１／ＭＡＧＥ３／ＮＹ−ＥＳＯ）に対するがんを有するドナー由来のＰＢＭＣの免疫応答（ＩＦＮγ産生）を提供する。ＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０および／または一定濃度の抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＰＤ１阻止抗体の存在または非存在下でインキュベートした。
【００４５】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、フコシル化および非フコシル化抗マウスＣＤ４０抗体のマウスＦｃγ受容体への結合を実証する。Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ（図１５Ａ）またはＦｃγＲＩＶ（図１５Ｂ）であった。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、フコシル化および非フコシル化抗マウスＣＤ４０抗体のマウスＦｃγ受容体への結合を実証する。Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ（図１５Ａ）またはＦｃγＲＩＶ（図１５Ｂ）であった。
【００４６】
【図１６】図１６は、マウスＢ１６メラノーマモデルにおけるフコシル化および非フコシル化抗ＣＤ４０抗体サロゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を実証する。
【００４７】
【図１７】図１７は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、およびＣＤ４０六量体リガンドのＢ細胞活性化活性を実証する。実験は、精製Ｂ細胞培養物を使用して実施した。
【００４８】
【図１８】図１８は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、およびＣＤ４０六量体リガンドのＢ細胞活性化活性を実証する。実験は、ＰＢＭＣ培養物を使用して実施した。
【００４９】
【図１９】図１９は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、ダセツズマブ、およびＳＥＡ−アイソタイプ対照の単球／マクロファージ活性化活性を実証する。
【００５０】
【図２０】図２０は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、ダセツズマブ、またはＳＥＡ−アイソタイプ対照によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルの誘導を実証する。
【００５１】
【図２１】図２１は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、ダセツズマブ、またはＳＥＡ−アイソタイプ対照によるインターロイキン１０（ＩＬ１０）レベルの誘導を実証する。
【００５２】
【図２２】図２２は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、またはダセツズマブによるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルの誘導を実証する。インキュベーションは、ｆｌｕペプチドの存在下で行った。
【００５３】
【図２３】図２３は、ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、またはダセツズマブによるｆｌｕ抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導を実証する。
【００５４】
【図２４】図２４は、ｆｌｕペプチド、およびＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、またはダセツズマブとともにＰＢＭＣをインキュベートした後のＩＬ１０レベルの変化を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
（詳細な説明）
本開示は、非フコシル化抗ＣＤ４０抗体、ＳＥＡ−ＣＤ４０の活性を記載するものである。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、アゴニスト抗体であり、Ｆｃγ受容体ＩＩＩへの増強された結合性を有し、驚くべきことに、ＣＤ４０シグナル伝達経路の増強された活性化を呈する。ＣＤ４０経路のその増強された活性化のために、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫系の強力な活性化因子であり、がんを処置するのに、または感染疾患、特に慢性ウイルス性疾患、例えば、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス、およびヒトパピローマウイルスなどを処置するのに使用することができる。他の感染疾患としては、例えば、結核が挙げられる。免疫系の活性化の増強により、ＳＥＡ−ＣＤ４０をフコシル化親抗体と比較して低レベルで投薬することが可能になる。
【００５６】
（ＣＤ４０の記載および機能。）
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは、５０ｋＤａの見かけ上のＭＷを有する単鎖Ｉ型膜貫通タンパク質である。その成熟したポリペプチドコアは、２３７アミノ酸からなり、このうち１７３アミノ酸は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特徴的である４システインリッチリピートに組織化された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を構成する。２つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が、ＥＣＤの膜近位領域内に存在し、一方、潜在的なＯ結合型グリコシル化部位は存在しない。２２アミノ酸膜貫通ドメインが、ＥＣＤをＣＤ４０の４２アミノ酸細胞質尾部と接続する。ＣＤ４０媒介シグナル伝達に関与する配列モチーフが、ＣＤ４０細胞質尾部において同定された。これらのモチーフは、ＴＮＦ−Ｒ関連因子（ＴＲＡＦ）と呼ばれる細胞質性因子と相互作用して、ＭＡＰキナーゼおよびＮＦκＢの活性化を含めた多数の下流事象の誘因となり、これらの事象は、ひいては様々な炎症、生存、および増殖関連遺伝子の転写活性をモジュレートする。例えば、van  KootenおよびBanchereau、J.  Leukoc.  Biol.、６
７巻：２〜１７頁（２０００年）；Elguetaら、Immunol.  Rev.、２２９巻：１５２〜１
７２頁（２００９年）を参照。
【００５７】
造血系内で、ＣＤ４０は、分化の多数の段階のＢ細胞、単球、マクロファージ、血小板、濾胞樹状細胞、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、および活性化Ｔ細胞上に見い出すことができる。正常な非造血組織では、ＣＤ４０は、腎上皮細胞、ケラチノサイト、滑膜および皮膚起源の線維芽細胞、ならびに活性化された内皮上に検出されている。ＣＤ４０の可溶性バージョンは、場合により一次転写物のディファレンシャルスプライシングまたはメタロプロテイナーゼＴＮＦα変換酵素による限定されたタンパク質分解によってＣＤ４０発現細胞から放出される。放たれたＣＤ４０は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を妨害することによって免疫応答を潜在的に修正することができる。例えば、van  KootenおよびBanchereau、J.  Leukoc.  Biol.、６７巻：２〜１７頁（２０００年）；Elguetaら、Immunol.
Rev.、２２９巻：１５２〜１７２頁（２００９年）を参照。
【００５８】
ＣＤ４０の内因性リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ１５４としても公知の３９ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質である。ＣＤ４０Ｌは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、細胞表面上で三量体として発現する。ＣＤ４０Ｌは、活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびγδＴ細胞上で一過性に発現する。ＣＤ４０Ｌはまた、精製された単球、活性化されたＢ細胞、上皮および血管内皮細胞、平滑筋細胞、ならびにＤＣ上で多様なレベルで検出されるが、これらの細胞型に対するＣＤ４０Ｌ発現の機能的な関連性は、明確に定義されていない（van  Kooten、２０００年；Elgueta、２００９年）。しかし、活性化された血小板上のＣＤ４０Ｌの発現は、血栓性疾患の病因に結びつけられている。例えば、Ferroniら、Curr.  Med.  Chem.、１４巻：２１７０〜２１８０頁（２００７年）を参照
。
【００５９】
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用の最もよく特徴付けられた機能は、抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触依存的な双方向の相互作用におけるその役割である。例えば、van  KootenおよびBanchereau、J.  Leukoc.  Biol.、６７巻：２〜１７頁（２０００年）；Elguetaら、Immunol.  Rev.、２２９巻：１５２〜１７２頁（２００９年）を参照。活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌが抗原−活性化Ｂ細胞上のＣＤ４０に結合すると、Ｂ細胞が急速に増えるように駆動するだけでなく、メモリーＢ細胞または血漿細胞に分化するためのＢ細胞の本質的なシグナルももたらす。ＣＤ４０シグナル伝達は、胚中心の形成を担い、胚中心では、Ｂ細胞は、親和性成熟およびアイソタイプスイッチングを起こして、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥアイソタイプの高親和性抗体を産生する能力を取得する。例えば、Kehry、J.  Immunol.、１５６巻：２３４５〜２３４８頁（１９９６年）を参照。したがって、機
能的なＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を妨げるＣＤ４０Ｌ遺伝子座位中の突然変異を有する個体は、循環ＩｇＭの割合が過剰になること、ならびにＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを産生することができないことによって特徴付けられる原発性免疫不全Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群に罹患する。これらの患者は、抑制された二次体液性免疫応答、再発性発熱性感染症への感受性の増大、ならびにより高い頻度の癌およびリンパ腫を示す。ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ遺伝子座を不活化するためのマウスにおける遺伝子ノックアウト実験は、Ｘ連鎖高ＩｇＭ患者に見られる主要な欠陥を再現する。これらのＫＯマウスは、障害性抗原特異的Ｔ細胞プライミングも示し、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用が、細胞媒介免疫応答を開始するための極めて重要な要因でもあることを示唆する。例えば、Elguetaら、Immunol.
Rev.、２２９巻：１５２〜１７２頁（２００９年）を参照。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０によるＣＤ４０ライゲーションの免疫刺激効果は、同系腫瘍に対する免疫応答と相関した。例えば、Frenchら、Nat.  Med.、５巻：５４８〜５５３頁（１９９９年）を参照。腫瘍細胞に対する不十分な免疫応答は、免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４などの発現、ＭＨＣ抗原の発現の低下、腫瘍関連抗原、適切な接着、または共刺激分子の芳しくない発現、および腫瘍細胞によるＴＧＦβのような免疫抑制タンパク質の産生などの要因の組合せから生じ得る。抗原提示細胞および形質転換細胞上のＣＤ４０ライゲーションは、接着タンパク質（例えば、ＣＤ５４）、共刺激分子（例えば、ＣＤ８６）、およびＭＨＣ抗原、ならびに炎症性サイトカイン分泌を上方制御し、それによって抗腫瘍性免疫応答、ならびに腫瘍細胞の免疫原性を潜在的に誘導ならびに／または増強する。例えば、Gajewskiら、Nat.  Immunol.、１４巻：１０１４〜１０２２頁（２０１３年）を参照。
【００６１】
ＣＤ４０架橋による主要な結果は、ＤＣ活性化（ライセンシングと呼ばれることが多い）、ならびにＴ細胞に腫瘍関連抗原をプロセシングし、提示する骨髄細胞およびＢ細胞の能力の相乗作用である。先天性免疫応答を活性化する直接の能力を有することに加えて、ＣＤ４０シグナル伝達のユニークな結果は、「クロスプライミング」として公知のプロセスにおけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）前駆体への腫瘍由来抗原のＡＰＣ提示である。腫瘍特異的エフェクターＣＴＬへの成熟ＤＣによるＣＴＬ前駆体のこのＣＤ４０依存的活性化および分化は、腫瘍細胞に対する細胞媒介免疫応答を増強し得る。例えば、Kurtsら、Nat.  Rev.  Immunol.、１０巻：４０３〜４１４頁（２０１０年）を参照。
【００６２】
ダセツズマブ、ＳＥＡ−ＣＤ４０親分子を含めたアゴニストＣＤ４０ｍＡｂは、単一作用物質および組合せ化学療法設定において期待の持てる臨床活性を示した。ダセツズマブは、ＮＨＬの第１相研究およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の第２相研究においていくつかの臨床活性を実証した。例えば、Advaniら、J.  Clin.  Oncol.
、２７巻：４３７１〜４３７７頁（２００９年）、およびDe  Vosら、J.  Hematol.  Oncol.、７巻：１〜９頁（２０１４年）を参照。さらにＣＰ−８７０，８９３、ＣＤ４０に
対するヒト化ＩｇＧ２アゴニスト抗体は、パクリタキセルまたはカルボプラチンまたはゲムシタビンと組み合わせたとき、固形腫瘍徴候において期待の持てる活性を示した。これらの研究では、抗原提示細胞の活性化、サイトカイン産生、および抗原特異的Ｔ細胞の生成が見られた。例えば、Beattyら、Clin.  Cancer  Res.、１９巻：６２８６〜６２９５
頁（２０１３年）、およびVonderheideら、Oncoimmunology、２巻：ｅ２３０３３頁（２
０１３年）を参照。
【００６３】
（抗ＣＤ４０抗体）
免疫機能におけるその役割のために、ＣＤ４０抗原に対して抗体が産生誘導されてきた。このような抗体は、３つの群、ＣＤ４０活性を阻害するアンタゴニスト抗体、ＣＤ４０活性を部分的に誘導する部分アゴニスト抗体、およびＣＤ４０活性を完全に刺激する完全アゴニスト抗体に分類することができる。群のそれぞれのメンバーは、臨床トライアルにおいて試験されており、これまでどれも承認されていない。
【００６４】
（ＳＥＡ−ＣＤ４０）
本開示は、非フコシル化ｈＳ２Ｃ６抗体、ＳＥＡ−ＣＤ４０を提供する。Ｓ２Ｃ６は、ｍＳ２Ｃ６と本明細書で呼ばれる、ヒト膀胱癌に対して産生誘導されたマウスモノクローナル抗体として最初に単離された。例えば、Paulieら、Cancer  Immunol.  Immunother.
、１７巻：１６５〜１７９頁（１９８４年）を参照。Ｓ２Ｃ６抗体は、ＣＤ４０シグナル伝達経路の部分アゴニストであり、したがって、以下の活性を有する：ヒトＣＤ４０タンパク質への結合、カニクイザルＣＤ４０タンパク質への結合、ＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化、ＣＤ４０のそのリガンド、ＣＤ４０Ｌとの相互作用の相乗作用。例えば、米国特許第６，９４６，１２９号を参照。
【００６５】
開発の次のステップとして、Ｓ２Ｃ６がヒト化された。このヒト化抗体は、本明細書でヒト化Ｓ２Ｃ６、代わりにダセツズマブ、またはフコシル化ヒト化Ｓ２Ｃ６（ｆｈＳ２Ｃ６）、またはＳＧＮ−４０と呼ばれる。例えば、ＷＯ２００６／１２８１０３を参照。ＳＧＮ−４０は、ヒト臨床トライアルにおいて試験され、さらなる開発を正当化するのに十分活性でないことが判明した。
【００６６】
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、非フコシル化ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体である。ＳＥＡ−ＣＤ４０の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２として開示されている。重鎖の可変領域は、配列番号１のアミノ酸１〜１１３由来であり、軽鎖の可変領域は、配列番号２のアミノ酸１〜１１３由来である。ＳＥＡ−ＣＤ４０の抗体骨格の生成は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００６／１２８１０３で開示されている。
【００６７】
本開示は、ｎｆ  ｈＳ２Ｃ６またはＳＥＡ−ＣＤ４０と本明細書で呼ばれる非フコシル化、ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体を提供する。Ｆｃ受容体への結合の増強に加えて、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、親抗体、ダセツズマブと比較してＣＤ４０経路の活性も増強する。したがって、ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体は、より低い用量で、かつ投与の異なるスケジュールを使用して患者に投与される。
【００６８】
（非フコシル化抗体）
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、非フコシル化抗体であり、ＦｃγＩＩＩ受容体への結合の増強、および驚くべきことに、免疫細胞内のＣＤ４０シグナル伝達経路を活性化する能力の増強を呈する。
【００６９】
（非フコシル化抗体を作製する方法）
本開示は、コアフコシル化が低減されたヒト化Ｓ２Ｃ６抗体を調製するための組成物および方法を提供する。本明細書で使用される場合、「コアフコシル化」は、Ｎ結合型グリカンの還元末端でのＮ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）へのフコースの付加（「フコシル化」）を指す。
【００７０】
ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体骨格のＦｃ領域（またはドメイン）に結合した複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖は、そのフコシル化が低減されている。本明細書で使用される場合、「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」は、典型的には、アスパラギン２９７（Kabat、「Sequences
of  Immunological  Interest」、第５版、刊行物番号91-3242、U.S.  Dept.  Health
&  Human  Services、NIH、Bethesda、MD、１９９１年に示されたＥＵインデックスに
よる）に結合している。本明細書で使用される場合、複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖は、以下の構造：
【化１】
2020050677.tif 000002
（式中、±は、糖分子が存在することも、または存在しないこともあることを示し、数値は、糖分子同士間の連結の位置を示す）を主に有する二分岐複合糖鎖を有する。上記構造では、アスパラギンに結合する糖鎖末端は、還元末端と呼ばれ（右において）、反対側は、非還元末端と呼ばれる。フコースは通常、典型的にはα１，６結合（ＧｌｃＮＡｃの６位がフコースの１位に連結している）によって還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）に結合している。「Ｇａｌ」は、ガラクトースを指し、「Ｍａｎ」は、マンノースを指す。
【００７１】
「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」としては、１）コア構造の非還元末端側が、ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（「ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ」とも呼ばれる）の１つもしくは複数の分岐を有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、任意選択で、シアル酸、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンなどを有する複合型、または２）コア構造の非還元末端側が、高マンノースＮ−グリコシド結合型糖鎖および複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の両方の分岐を有するハイブリッド型が挙げられる。
【００７２】
一部の実施形態では、「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」として、コア構造の非還元末端側が、ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（「ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ」とも呼ばれる）のゼロ、１つまたは複数の分岐を有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、任意選択で、シアル酸、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンなどの構造をさらに有する複合型が含まれる。
【００７３】
本方法によれば、典型的には、少量のフコースのみが、ＳＥＡ−ＣＤ４０分子の複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖（複数可）中に組み込まれる。例えば、様々な実施形態では、抗体の約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約３％未満が、フコースによるコアフコシル化を有する。一部の実施形態では、抗体の約２％が、フコースによるコアフコシル化を有する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、少量のフコース類似体（またはフコース類似体の代謝産物もしくは産物）のみが、複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖（複数可）中に組み込まれる。例えば、様々な実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体の約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約３％未満が、フコース類似体、またはフコース類似体の代謝産物もしくは産物によるコアフコシル化を有する。一部の実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体の約２％が、フコース類似体、またはフコース類似体の代謝産物もしくは産物によるコアフコシル化を有する。
【００７５】
抗体産生細胞をフコース類似体とともにインキュベートすることによって非フコシル化抗体を作製する方法は、例えば、ＷＯ／２００９／１３５１８１に記載されている。簡単に言えば、ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体を発現するように操作された細胞が、フコース類似体、またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物の存在下でインキュベートされる。本明細書で使用される場合、細胞内代謝産物は、例えば、ＧＤＰ修飾類似体、または完全もしくは部分的に脱エステル化された類似体であり得る。産物は、例えば、完全または部分的に脱エステル化された類似体であり得る。一部の実施形態では、フコース類似体は、フコースサルベージ経路において酵素（複数可）を阻害し得る。例えば、フコース類似体（またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物）は、フコキナーゼ、またはＧＤＰ−フコース−ピロホスホリラーゼの活性を阻害し得る。一部の実施形態では、フコース類似体（またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物）は、フコシルトランスフェラーゼ（好ましくは１，６−フコシルトランスフェラーゼ、例えば、ＦＵＴ８タンパク質）を阻害する。一部の実施形態では、フコース類似体（またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物）は、フコースの新規合成経路内の酵素の活性を阻害し得る。例えば、フコース類似体（またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物）は、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼおよび／またはＧＤＰ−フコース合成酵素の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、フコース類似体（またはフコース類似体の細胞内代謝産物もしくは産物）は、フコーストランスポーター（例えば、ＧＤＰ−フコーストランスポーター）を阻害し得る。
【００７６】
一実施形態では、フコース類似体は、２−フルオロフコース（flurofucose）である。
増殖培地中のフコース類似体および他のフコース類似体を使用する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ／２００９／１３５１８１に開示されている。
【００７７】
コアフコシル化を低減するために細胞株を操作するための他の方法は、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含んでいた。遺伝子ノックアウトでは、ＦＵＴ８（アルファ１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素）をコードする遺伝子が不活化される。ＦＵＴ８は、ＧＤＰ−フコースからＮ−グリカンのＡｓｎ−結合型（Ｎ結合型）ＧｌｃＮａｃの６位へのフコシル残基の移動を触媒する。ＦＵＴ８は、Ａｓｎ２９７でＮ結合型二分岐炭水化物へのフコース付加を担う唯一の酵素であることが報告されている。遺伝子ノックインは、ＧＮＴＩＩＩまたはゴルジアルファマンノシダーゼＩＩなどの酵素をコードする遺伝子を加える。細胞内のこのような酵素のレベルの増大は、モノクローナル抗体をフコシル化経路からそらし（コアフコシル化を低下させる）、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンの量を増大させる。ＲＮＡｉも、典型的には、ＦＵＴ８遺伝子発現を標的とし、ｍＲＮＡ転写レベルを低下させ、または遺伝子発現を完全にノックアウトする。これらの方法のいずれも、非フコシル化抗体、例えば、ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体を産生することができる細胞株を生成するのに使用することができる。
【００７８】
当業者は、多くの方法が、抗体上のフコシル化の量を判定するのに利用可能であることを認識するであろう。方法としては、例えば、ＰＬＲＰ−Ｓクロマトグラフィーを介したＬＣ−ＭＳ、およびエレクトロスプレーイオン化四重極ＴＯＦ  ＭＳが挙げられる。
【００７９】
非フコシル化抗体、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、患者に投与されるとき、マクロファージへの単球成熟の活性化を誘導し、かつ免疫系チャレンジに対するロバストなＴ細胞応答を誘発する、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含めたサイトカイン、およびケモカインの産生を誘導する。抗体２４．４．１．などの完全アゴニスト抗体と異なり、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）などの免疫減衰性（immune-dampening）サイトカインの産生を誘導しない。ＩＬ−１０は、ひいては、免疫応答を減衰させるＴ制御性細胞の活性を誘導する。したがって、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、Ｔ制御性細胞の活性を促進することを伴わないロバストなＴ細胞媒介免疫応答の誘導に有用である。
【００８０】
（ＳＥＡ−ＣＤ４０の投与量および投与）
非経口投与用医薬組成物は、好ましくは滅菌され、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投与量）で提供することができる。医薬組成物は、１種または複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存する。注射について、抗体は、水溶液中に、好ましくは、注射部位における不快感を低減するために生理学的に互換性の緩衝液中に製剤化することができる。溶液は、製剤化剤（formulatory  agent）、例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などを含有し得る。代わりに、抗体は、使用前に適当なビヒクル、例えば、滅菌無発熱物質水で構成するための凍結乾燥形態にあり得る。
【００８１】
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、静脈内に投与される。他の実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、皮下に投与される。さらなる実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、腫瘍の部位で皮下に投与される。
【００８２】
非フコシル化ＳＥＡ−ＣＤ４０抗体は、驚くべきことに、その親抗体、ダセツズマブと比較して増強された免疫活性化活性を有する。したがって、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、ダセツズマブと比較してより低い用量で、異なるスケジュールで患者に投与することができる。
【００８３】
一例として、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、０．１〜２０００μｇ／ｋｇ（患者の体重１キログラム当たりμｇでの抗体）の間のレベルで患者に投与することができる。他の可能な投与量範囲は、１０〜１０００μｇ／ｋｇ、５０〜８００μｇ／ｋｇ、７５〜６００μｇ／ｋｇ、１００〜５００μｇ／ｋｇである。他の可能な投与量範囲は、１００〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜９００μｇ／ｋｇ、および９００〜１１００μｇ／ｋｇである。なおさらなる用量範囲は、１００〜１５０μｇ／ｋｇ、１５０〜２００μｇ／ｋｇ、２００〜２５０μｇ／ｋｇ、２５０〜３００μｇ／ｋｇ、３００〜３５０μｇ／ｋｇ、３５０〜４００μｇ／ｋｇ、４００〜４５０μｇ／ｋｇ、４５０〜５００μｇ／ｋｇ、５００〜５５０μｇ／ｋｇ、５５０〜６００μｇ／ｋｇ、６００〜６５０μｇ／ｋｇ、６５０〜７００μｇ／ｋｇ、７００〜７５０μｇ／ｋｇ、７５０〜８００μｇ／ｋｇ、８００〜８５０μｇ／ｋｇ、８５０〜９００μｇ／ｋｇ、９００〜９５０μｇ／ｋｇ、９５０〜１０００μｇ／ｋｇ、１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、および１０５０〜１１００μｇ／ｋｇである。他の可能な投与量範囲は、０．３〜２００μｇ／ｋｇ、０．６〜１５０μｇ／ｋｇ、１．０〜１００μｇ／ｋｇ、２〜５０μｇ／ｋｇ、５〜２５μｇ／ｋｇ、７．５〜１５μｇ／ｋｇ、および８〜１２μｇ／ｋｇである。
【００８４】
他の実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、０．６μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、２．５μｇ／ｋｇ、５．０μｇ／ｋｇ、７．５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、または２００μｇ／ｋｇで患者に投与される。好適な実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、１０μｇ／ｋｇで患者に投与される。
【００８５】
さらなる実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、約６０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約４５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約５５０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約６５０μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約８５０μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約９５０μｇ／ｋｇ、約１０００〜１０５０μｇ／ｋｇ、約１０５０μｇ／ｋｇ、および１１１０μｇ／ｋｇで患者に投与される。
【００８６】
一部の実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫疲弊の見込みを低減する様式で投与される。例えば、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、３週間間隔、６週間間隔、８週間間隔、１０週間間隔、１２週間間隔、または１４週間間隔で投与することができる。間隔はまた、毎月のスケジュール、例えば、１カ月間隔、２カ月間隔、または３カ月間隔であり得る。
【００８７】
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫系を活性化して腫瘍関連抗原に対して応答するので、その使用は、ＣＤ４０を発現するがんに限定されない。したがって、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、ＣＤ４０陽性およびＣＤ４０陰性がんの両方を処置するのに使用することができる。
【００８８】
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、好ましくは、特にがんが、低レベルのＣＤ４０を発現し、またはＣＤ４０を検出可能な程度に発現しない場合、免疫応答性であることが分かっている腫瘍を処置するのに使用される。免疫応答性のがんとしては、例えば、メラノーマ；膀胱がん；肺がん、例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん；卵巣がん；腎がん；膵がん；乳がん；子宮頸がん；頭頸部がん、前立腺がん；神経膠芽腫；非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ球性白血病；肝細胞癌；または多発性骨髄腫が挙げられる。
【００８９】
別の実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、固形腫瘍を処置するのに使用される。さらなる実施形態では、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、血液がん、例えば、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；慢性リンパ球性白血病；または多発性骨髄腫を処置するのに使用される。
【００９０】
（ＳＥＡ−ＣＤ４０組合せ療法）
その免疫刺激機能のために、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫系を活性化する他の治療剤と組み合わせて使用することができる。免疫刺激機能を有する薬物としては、例えば、免疫チェックポイント阻害剤を含めたＴ細胞モジュレーター；免疫活性化因子；および免疫原性細胞死を誘導する化学療法剤が挙げられる。一例として、ある特定の抗体は、Ｔ細胞で免疫チェックポイントとして機能を果たす分子の活性を阻止することによって機能する。したがって、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体と組み合わせて使用することができる。
【００９１】
（Ｔ細胞モジュレーター）
Ｔ細胞は、体からがんを認識および排除する免疫系の能力において役割を果たす。Ｔ細胞モジュレーターは、免疫チェックポイントの機能を阻止する抗体を含む。例えば、Pardoll、Nature  Rev.  Cancer、１２巻：２５２〜２６４頁（２０１２年）を参照。免疫チ
ェックポイントを阻止する抗体としては、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体が挙げられる。他のチェックポイント阻害剤／活性化因子として、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３が挙げられる。一部のタンパク質に対する抗体、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０に対する抗体を、Ｔ細胞活性をモジュレートし、または好ましくはＴ細胞活性を活性化するのに使用することができる。他のＴ細胞モジュレーターとしては、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤が挙げられる。
【００９２】
抗ＣＴＬＡ４抗体は、分化１５２またはＣＤ１５２のクラスターとしても公知のタンパク質の細胞傷害性リンパ球４（ＣＴＬＡ−４）を認識する。ＣＴＬＡ−４タンパク質は、Ｔ細胞上で発現し、これは、免疫系による攻撃に適している抗原を認識する。ＣＴＬＡ−４が活性化すると、免疫応答が減衰する。例えば、NirschiおよびDrake、Clin.  Cancer
Res.、１９巻：４９１７〜４９２４頁（２０１３年）を参照。ＣＴＬＡ−４に特異的であり、その活性を阻止する抗体は、がんに対する免疫応答を上方制御することによってがんを処置するのに使用されている。ＣＴＬＡ−４抗体の例としては、イピリムマブまたはトレメリムマブが挙げられる。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、がんを処置するのにイピリムマブまたはトレメリムマブと組み合わせて投与することができる。
【００９３】
抗ＰＤ１抗体は、タンパク質のプログラム死−１（ＰＤ−１）を認識する。ＣＴＬＡ−４のように、ＰＤ−１は、Ｔ細胞上で発現し、免疫応答を減衰させる。例えば、Nirschi
およびDrake、Clin.  Cancer  Res.、１９巻：４９１７〜４９２４頁（２０１３年）を参照。ＰＤ−１に特異的であり、その活性を阻止する抗体は、がんに対する免疫応答を上方制御することによってがんを処置するのに使用されている。ＰＤ−１抗体の例としては、ＭＥＤＩ０６８０、ＡＭＰ−２２４、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブが挙げられる。チェックポイント阻害剤として作用し、ＳＥＡ−ＣＤ４０と組み合わせて使用され得る他のＰＤ−１結合タンパク質として、例えば、Ｂ７−ＤＣ−Ｆｃが挙げられる。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、がんを処置するのにＭＥＤＩ０６８０、ＡＭＰ−２２４、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピジリズマブと組み合わせて投与することができる。
【００９４】
ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１タンパク質のリガンドである。ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞上で発現し、ＰＤ−１とのその相互作用により、ＰＤ−Ｌ１発現がん細胞が免疫系を免れることが可能になる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、がんを処置するのに生成および使用されている。ＰＤ−Ｌ１抗体の例としては、例えば、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、およびＭＰＤＬ３２８０Ａが挙げられる。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、がんを処置するのにＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはＭＰＤＬ３２８０Ａと組み合わせて投与することができる。
【００９５】
免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻止する他の抗体には、例えば、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３に対する抗体が含まれ、これらは、ＳＥＡ−ＣＤ４０と組み合わせて使用することができる。
【００９６】
４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０に対する抗体は、Ｔ細胞活性を活性化するのに使用され、ＳＥＡ−ＣＤ４０と組み合わせて使用することができる。ＯＸ４０抗体としては、例えば、ＭＥＤＩ６４６９およびＭＥＤＩ６３８３が挙げられる。アゴニスト抗ＣＤ２７抗体の一例は、ＣＤＸ−１１２７であり、これは、ＳＥＡ−ＣＤ４０と組み合わせて使用することができる。
【００９７】
酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、アミノ酸トリプトファンの分解を触媒する。ＩＤＯの阻害剤は、低分子、例えば、ロスマリン酸、ＣＯＸ−２阻害剤、およびアルファ−メチル−トリプトファンなどであり得る。
【００９８】
（免疫原性細胞死を誘導する化学療法剤）
ほとんどのヒトにおいて、何百万の細胞がアポトーシスを介して死に、免疫応答を生じさせることなく除去される。しかし、一部の化学療法剤で処置した後に、免疫細胞が、腫瘍を浸潤することが観察された。したがって、化学療法剤によって殺される一部の腫瘍細胞は、ワクチンとして作用し、腫瘍特異的免疫応答を起こす。この現象は、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）と呼ばれる。例えば、Kroemerら、Annu.  Rev.  Immunol.、３１巻：５１〜７２頁（２０１３年）を参照。ＩＣＤを誘導する化学療法剤の能力は、実験的に判定することができる。２つの基準が満たされなければならない。第１に、化学療法剤を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置されてきたがん細胞を免疫適格性マウスに注射すると、補助剤の非存在下で腫瘍抗原に特異的である防御免疫反応が誘発されなければならない。第２に、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、潜在的なＩＣＤ誘導化学療法剤を使用して処置されたマウス同系モデルで起こるＩＣＤは、免疫系に依存する腫瘍内の免疫応答を推進しなければならない。
【００９９】
ＩＣＤを誘導する化学療法剤としては、例えば、アントラサイクリン、抗ＥＧＦＲ抗体、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、ゲムシタビン、腫瘍の照射、およびオキサリプラチンが挙げられる。ＳＥＡ−ＣＤ４０を、これらの作用物質のいずれかと組み合わせて使用して、患者における免疫応答の増強を生じさせ、がんを処置することができる。
【０１００】
（免疫活性化）
がんは、免疫系を直接刺激する作用物質を投与することによっても処置され得る。このような作用物質としては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン−２、ＧＶＡＸ、およびＴＬＲ９アゴニストが挙げられる。他の免疫活性化因子としては、例えば、がんワクチン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、非特異的免疫賦活剤（例えば、イミキモド）、およびＣＡＲ−Ｔ細胞のような細胞療法が挙げられる。ＳＥＡ−ＣＤ４０を、これらの作用物質のいずれかと組み合わせて使用して、患者における免疫応答の増強を生じさせ、がんを処置することができる。
【０１０１】
（他の組合せ）
ＳＥＡ−ＣＤ４０との他の組合せも、がんを処置するのに使用することができる。例としては、例えば、抗ＰＤ１抗体、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、もしくはＡＭＰ−２２４と組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ−４０；パクリタキセルもしくはシスプラチンもしくはオキサリプラチンの有無にかかわらず、ゲムシタビンと組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ−４０；ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ベムラフェニブもしくはダブラフェニブと組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ−４０；またはシクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン（ＣＨＯＰ）、もしくはリツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチン、およびエトポシド（etopiside）（Ｒ
ＩＣＥ）、もしくはリツキシマブ、ゲムシタビン、デキサメタゾン、およびシスプラチン（ＲＧＤＰ）と組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ４０が挙げられる。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、例示するために提供され、特許請求の範囲に記載される発明を限定するためのものではない。
（実施例１）
非フコシル化ｈＳ２Ｃ６抗体の合成
ヒト化抗ＣＤ４０抗体、配列番号１および２の重鎖および軽鎖を有するＳ２Ｃ６をＣＨＯ細胞に発現させた。フコシル化阻害剤、２−フルオロフコースを抗体の産生中に細胞培養培地に含め、非フコシル化抗体、ＳＥＡ−ＣＤ４０をもたらした。例えば、Okeleyら、Proc.  Nat’l  Acad.  Sci.、１１０巻：５４０４〜５４０９頁（２０１３年）を参照。細胞増殖のためのベース培地は、フコースを含まず、２−フルオロフコースを培地に添加してタンパク質フコシル化を阻害した。同書。抗体中へのフコースの組込みは、ＰＬＲＰ−Ｓクロマトグラフィーを介したＬＣ−ＭＳ、およびエレクトロスプレーイオン化四重極ＴＯＦ  ＭＳによって測定した。同書。データを示さず。
【０１０３】
（実施例２）
非フコシル化ｈＳ２Ｃ６抗体の特徴付け
ＳＥＡ−ＣＤ４０のＣＤ４０結合親和性判定：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、ヒト全血がＡｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって供給された。簡単に言えば、血液はヘパリンチューブ中に収集され、抜き取りから４時間以内にＳｅａｔｔｌｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓに送達された。到着した後、血液を、５０ｍｌ円錐管（ｆａｌｃｏｎ）中に分取し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ（Ａ−４−６２ローター）で２００ｇにて、間断なく２５℃で２０分間スピンして血小板リッチ画分を分離した。遠心分離後、３つの別個の層が形成された：最下層、赤血球（全体積の５０〜８０％を占める）；中間層、白血球の非常に薄いバンド；最上層、麦わら色の血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）。
【０１０４】
血小板に富んでいる上の麦わら色の層を１ｍｌピペットで除去した。血小板リッチ血漿を除去した後、血液を等体積の滅菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ロット１６１８４３５、ｅｐｔ２０１６−０７）で希釈した。室温に加温したＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ、ロット番号ＲＮＢＤ２９６５、Ｅｘｐｔ．５／２０１７）１５ｍｌを、血液の下に重層化した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ試料を１５００ｒｐｍで間断なく２５℃で２５分間スピンした。遠心分離後、３つの層が再び形成される：最下層、赤血球（全体積の５０〜８０％を占める）；中間層、白血球の厚いバンド（「バフィーコート」とも呼ばれる）；最上層、ＰＢＳおよび残っている血小板。
【０１０５】
上のＰＢＳ／血小板層を１ｍｌピペットで除去し、廃棄した。白血球の厚いバンドを穏やかに取り出し、清潔な５０ｍｌの滅菌した円錐管中に入れた。チューブを５０ｍｌまで満たし、細胞を８００ｇで１０分間スピンした。洗浄液を除去し、ペレットをＡＣＫ赤血溶解緩衝液（red  blood  lysis  buffer）（Ｇｉｂｃｏ、ロット１６１８４８８）１０
ｍｌ中に１０分間再懸濁させた。次いで５０ミリリットル円錐管を滅菌ＰＢＳ  ３５ｍｌで満タン以上に満たし、細胞を８００ｇで１０分間スピンした。洗浄液を除去し、ペレットをＰＢＳ  ５０ｍｌ中に再懸濁させた。試料５００μｌを取り出し、ＰＢＭＣを、Ｖｉ−ｃｅｌｌ−ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてカウントした。細胞を８００ｇで１０分間再びスピンした。洗浄液を除去し、ペレットをＦＡＣｓ染色液（ＢＤ）中に１×１０６／ｍｌで再懸濁させた。再懸濁されたＰＢＭＣ  １００μｌを９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔き、氷上に配置した。非特異的なＦｃγＲＩＩＩａ結合を阻止するために、ＰＢＭＣを１００μｇ／ｍｌのヒトＦｃ−断片（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３０分間前処理した。ビオチン化ＳＥＡ−ｈ００（非フコシル化対照抗体）、ＳＥＡ−ＣＤ４０、またはＳＧＮ−４０の１０倍連続希釈液を調製して、（１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１μｇ／ｍｌ）の希釈系列を作製した。
【０１０６】
試料を、氷冷ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、氷上の飽和濃度のＰＥ−ストレプトアビジン（ＢＤ）とともに３０分間インキュベートした。試料を、氷冷ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣｓ緩衝液２００μｌ中に再懸濁させた。結合を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩおよびＤＩＶＡソフトウェアを使用して評価した。ＦＣＳを、ＦｌｏｗＪｏで分析し、陽性染色された細胞のＧｅｏＭｅａｎ蛍光を、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄで判定およびプロットした。Ｐｒｉｓｍにおいて１つの結合部位を仮定してデータを非線形回帰に対してフィッティングし、結合ＫＤ値を、μｇ／ｍｌの計算値をＳＥＡ−ＣＤ４０の分子量で除すことによって計算した。
【０１０７】
結果：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上のＣＤ４０へのＳＥＡ−ＣＤ４０および親抗体ダセツズマブの結合親和性を、フローサイトメトリーによって判定した。適切なアイソタイプ対照のバックグラウンド結合を減じ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を抗体濃度に対してプロットした。結果を図１に示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０および親抗体ダセツズマブは、実質的に重なる結合曲線を与え、いずれも１．１７ｎＭの濃度でＰＢＭＣを飽和した。これらのデータは、フコシル化の変化は、ＣＤ４０に対するＳＥＡ  ＣＤ４０の親和性に影響しないことを示唆する。
【０１０８】
ＳＥＡ−ＣＤ４０のＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性判定：高い（１５８Ｖ）または低い（１５８Ｆ）バージョンのヒトＦｃｙＲＩＩＩａを発現するＣＨＯ細胞を生成した。２０×１０６細胞を遠心分離し、１×ＰＢＳ  ２０ｍｌで１回洗浄し、ＢＤ染色緩衝液８ｍｌ中に再懸濁させた。細胞を、体積１００μｌ中２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で分取した。０．２０×１０６細胞を各ウェルに分取した。細胞を１２５０ｒｐｍで室温にて５分間遠心分離した。
抗体を０．１４μｇ／ｍｌ（ＳＧＮ）または０．０４μｇ／ｍｌ（ＳＥＡ）に希釈した。希釈液を表１に提供する。
【表１】
2020050677.tif 000003
スピンした細胞から上清を吸引し、対応する抗体希釈液６０μｌを多チャネルピペットで添加した。対応する濃度は、１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１４ｍｃｇ／ｍｌであった。試料を４℃で１時間インキュベートした。試料を遠心分離し、１ウェル当たりＢＤ染色緩衝液２００μｌで２回洗浄した。ストレプトアビジン−ＰＥ  １ミリリットルをＢＤ染色緩衝液２０ｍｌ（２°過剰）に添加してストレプトアビジン緩衝液を作製した。ストレプトアビジン緩衝液１００μｌを各試料に添加し、これらを暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。次いで試料を遠心分離し、１ウェル当たりＢＤ染色緩衝液２００μｌで２回洗浄した。試料を、ＬＳＲＩＩのＨＴＳモードでのフローサイトメトリーによって分析し、ＭＦＩをグラフ化してＰＲＩＺＭでＫｄを計算した。
【０１０９】
結果：ＦｃγＲＩＩＩａの低（１５８Ｆ）または高（１５８Ｖ）親和性形態を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのＳＥＡ−ＣＤ４０および親抗体ダセツズマブの結合を評価した。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、同様の親和性（それぞれＫＤ  ２７．５ｎＭおよび５．２ｎＭ）で、ＦｃγＲＩＩＩａの低い（１５８Ｆ）および高い（１５８Ｖ）形態の両方に結合した。低親和性（１５８Ｆ）形態へのＳＥＡ−ＣＤ４０の結合は、フコシル化親抗体ダセツズマブより有意に良好であり（ＫＤ
３０２．７ｎＭ）、ＳＥＡ−ＣＤ４０はさらに、フコシル化ダセツズマブ親抗体より良好に高親和性１５８Ｖ形態に結合した（それぞれ５．２ｎＭ対３７．９ｎＭ）。
【０１１０】
ＳＥＡ−ＣＤ４０媒介ＡＤＣＣ活性：ヒトＰＢＭＣを、上記の通り単離し、様々な濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０またはＳＥＡ−アイソタイプ対照（ＳＥＡ−ｈ００）で６、２４、または４８時間にわたって処置した。培養物をＣＤ１９＋Ｂ細胞について染色し、細胞数をフローサイトメトリーによって定量化した。
【０１１１】
結果：ヒトＰＢＭＣ培養物を、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、もしくは０．０００１μｇ／ｍＬのＳＥＡ  ＣＤ４０、または非結合性ＳＥＡ−アイソタイプ対照（ＳＥＡ−ｈ００）で６、２４、および４８時間にわたって処置し、次いでＣＤ４０陽性細胞の数を評価した。結果を図４に示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０処置は、用量および時間依存様式で、低サブμｇ／ｍＬの濃度さえまで、ＣＤ４０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の有意な低下をもたらした。単球／ＤＣ数に対するＳＥＡ−ＣＤ４０の有意な効果はなかった（単球／ＤＣデータを図示せず）。
【０１１２】
ヒト全血またはＰＢＭＣでのサイトカイン産生の評価：ヒト全血は、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって供給された。簡単に言えば、血液１００ｍｌをヘパリンチューブ中に収集し、抜き取ってから４時間以内にＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓに送達した。血液の半分を全血培養のために取っておき、一方、他方の半分を、上述したようにＰＢＭＣを単離するのに使用した。全血１００μｌを３−９６平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に分取した。単離したＰＢＭＣをＶｉａｃｅｌｌでカウントし、１０％  ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、１×ペニシリン／ｓｔｒｅｐＡ、および×グルタミンを含有するＤＭＥＭ（ＰＢＭＣ培地）中１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＰＢＭＣに対し、再懸濁し、精製したＰＢＭＣ  １００μｌを３−９６平底組織培養プレート中に分取した。ＳＥＡ−ｈ００およびＳＥＡ−ＣＤ４０の１０×連続希釈液をＰＢＭＣ培地中に作製し、全血および単離したＰＢＭＣ培養物を、降下濃度のＳＥＡ−ｈ００またはＳＥＡ−ＣＤ４０（１００、１０、１．０、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、または０μｇ／ｍｌ）で処置した。ＳＥＡ−ＣＤ４０処置は、それぞれの時点で全血およびＰＢＭＣ培養物の両方について２通りに実施した。所定の時点（６、２４、および４８時間）のそれぞれにおいて、全血または精製したＰＢＭＣを含有する９６ウェルプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒで、プレートアダプターを用いて８００ｒｐｍで５分間スピンした。血清または組織培養上清を取り出し、９６ストリップチューブラックに移し、試料を、処理するまで−８０℃で凍結させた。
【０１１３】
凍結組織培養上清および血清を４℃で終夜解凍し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｋｉｔを使用してサイトカイン産生のために処理した。特注キットを、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ｓＣＤ４０Ｌを分析するために設計した。以前の研究でダセツズマブ（dacetuzemab）を用いて観察されたサイトカインに基づいて分
析物を選択した。組織培養上清および血清試料を製造者の指示に従って処理した。簡単に言えば、アッセイプレートを１ウェル当たり洗浄緩衝液２００μＬで洗浄し、その後、各ウェルに標準物質または緩衝液２５μＬ、マトリックスまたは試料２５μＬ、および多重分析物ビーズ（multiplexed  analyte  bead）２５μＬを添加した。試料を、４℃で激しく振盪して終夜インキュベートした。アッセイプレートを洗浄緩衝液で２回洗浄する。検出抗体２５μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）２５μＬを添加し、試料を室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で２回洗浄し、ビーズをシース液１５０μＬで再懸濁させた。試料を、Ｘｐｏｎｅｎｔソフトウェアシステムと組み合わせてＬｕｍｉｎｅｘ
ＭａｇＰｉｘシステムを使用して分析した。サイトカインレベルを検量線から計算した。
【０１１４】
結果：ヒト全血培養物を、ＳＥＡ−アイソタイプ対照またはＳＥＡ−ＣＤ４０（１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、もしくは０．０００１μｇ／ｍＬ）で６、２４、または４８時間処置した。血清または組織培養上清を収集し、炎症性サイトカインを多重Ｌｕｍｉｎｅｘ分析によって評価した。データを、ＳＥＡ−アイソタイプ対照と比較してサイトカイン産生の倍増としてプロットする。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、以下の表２に示したように全血中で６、２４、および４８時間においてＩＦＮγ、ＭＩＰ１β、およびＴＮＦαのロバストな産生を刺激した。ＳＥＡ−ＣＤ４０レベルは、最左列に提供されている。活性は、０．０１０μｇ／ｍＬのＳＥＡ−ＣＤ４０という低いレベルで観察された。２４時間におけるＭＩＰ１βおよびＴＮＦαの刺激を、図４Ａおよび４Ｂに示す。
【表２】
2020050677.tif 000004
【０１１５】
ヒトＰＢＭＣを、ＳＥＡ−アイソタイプ対照またはＳＥＡ−ＣＤ４０（１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、もしくは０．０００１μｇ／ｍＬ）で６、２４、または４８時間処置した。血清または組織培養上清を収集し、炎症性サイトカインを多重Ｌｕｍｉｎｅｘ分析によって評価した。データを、ＳＥＡ−アイソタイプ対照と比較してサイトカイン産生の倍増としてプロットする。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、以下の表３に示したように、６、２４、および４８時間においてＰＢＭＣでのＩＦＮγ、ＭＩＰ１β、およびＴＮＦαのロバストな産生を刺激した。μｇ／ｍＬでのＳＥＡ−ＣＤ４０レベルは、最左列に提供されている。活性は、０．０１０μｇ／ｍＬのＳＥＡ−ＣＤ４０という低いレベルで観察された。２４時間におけるＭＩＰ１βおよびＴＮＦαの刺激を、図５Ａおよび５Ｂに示す。
【表３】
2020050677.tif 000005
【０１１６】
ＰＢＭＣ上の活性化マーカーの評価：共刺激分子表面発現を、上述したサイトカイン分析から残っている細胞ペレットに対して評価した。細胞ペレットをＢＤ  ＦＡＣｓ緩衝液５０ｍｌ中に再懸濁させ、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートに移した。Ｆｃ受容体を、ヒト１００μｇ／ｍｌ  Ｆｃ−断片（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて氷上で３０分間ブロックした。１：１００で希釈したＰＥ−ＣＤ８６（ＢＤ）およびＭＨＣＩＩ（汎（pan）抗ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ抗体ＢＤ）から構成されるマスターミックスを、１００ｍｇ／
ｍｌのヒトＦｃ断片を含有するＢＤ  ＦＡＣｓ緩衝液中に調製した。マスターミックス５μｌを、９０μｌを含有する各ウェルに添加し、試料を氷上で１時間インキュベートした。次いで細胞を、予冷したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心機で、４００ｇで５分間スピンした。上清を除去し、細胞をＢＤ  Ｆａｃｓ緩衝液２００ｍｌで洗浄した。細胞を２回洗浄し、次いでＦＡＣｓ緩衝液２００ｍｌ中に再懸濁させた。次いで試料を、ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＳＲＩＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＣＤ８６およびＭＨＣＩＩの幾何平均（geo  mean）蛍光
を、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを使用して評価した。ＳＥＡ−ｈ００とＳＥＡ−ＣＤ４０との間の比を計算し、倍率変化を使用してＳＥＡ−ＣＤ４０効力の範囲を計算した。
【０１１７】
結果：ＣＤ４０の活性化は、サイトカイン産生の誘発に加えて、抗原提示細胞の成熟を促進する。ＤＣ成熟の後に、ＣＤ８６およびＭＨＣＩＩを含めた活性化マーカーの上方制御が続き得る。ヒトＰＢＭＣ培養物を、ＳＥＡ  ＣＤ４０およびＳＥＡ−アイソタイプ対照で６、２４、または４８時間にわたって刺激し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ  ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）およびＣＤ８６の表面発現を評価した。ＳＥＡ−ＣＤ４０刺激は、０．０１μｇ／ｍＬという低い濃度でＭＨＣＩＩ（表４）およびＣＤ８６（データを示さず）の両方の有意な増大をもたらしたが、アイソタイプ対照はもたらさなかった。
【表４】
2020050677.tif 000006
【０１１８】
ＳＥＡ−ＣＤ４０による免疫活性化におけるフコースの役割：ヒトＰＢＭＣを上述したように単離した。ＰＢＭＣを、様々な濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０、親抗体ＳＧＮ４０、またはＳＥＡ−ＣＤ４０のＦ（ａｂ）’２バージョンで処置し、２４時間インキュベートした。Ｂ細胞枯渇を評価するために、ＢＰＭＣ培養物をＰＥ−ＣＤ１９で染色し、Ｂ細胞数をフローサイトメトリーによって定量化した。サイトカイン産生を評価するために、ＰＢＭＣ組織培養上清を収集し、サイトカイン産生を、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームで多重分析によって評価した。ＩＦＮγ産生を図７に示す（ｎｇ／ｍＬ）。同様の傾向が、他のサイトカインについて見られた。抗原提示細胞成熟を評価するために、ＰＢＭＣを、２４時間インキュベートした後に収集し、ａＰＥ−抗ＣＤ８６またはＡＰＣ−汎ＭＨＣクラスＩＩ抗原（ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ）抗体で染色し、パーセント陽性細胞をフローサイトメトリーによって評価した。データは、汎ＭＨＣマーカーについて平均蛍光強度として示されている。
【０１１９】
結果：Ｂ細胞枯渇を評価するために、ヒトＰＢＭＣ培養物を、多数の濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０、ダセツズマブ、またはＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ’）２で２４時間にわたって処置した。結果を図６に示す。Ｂ細胞のＡＤＣＣ媒介枯渇は、ダセツズマブ処置培養物と比較してＳＥＡ−ＣＤ４０処置培養物において有意により高く、この活性は、ＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ）’２では失われた。
【０１２０】
さらに、免疫活性化エンドポイント（サイトカインおよびＡＰＣ活性化／成熟マーカー）を、２４時間刺激されたＳＥＡ−ＣＤ４０、ダセツズマブ、およびＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ’）２  ＰＢＭＣ培養物において評価した。サイトカイン産生（図７）およびＡＰＣ成熟（図８）の両方のＳＥＡ−ＣＤ４０刺激は、ダセツズマブまたはＳＥＡ−ＣＤ４０  Ｆ（ａｂ）’２のものより有意に高かった。これらのデータは、ＩｇＧドメイン上のフコースの欠如は、ＣＤ４０結合を変化させないが、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を増大させ、ＣＤ４０活性の増大をもたらし、最終的にＣＤ４０免疫調節活性の増大をもたらすことを実証する。
【０１２１】
（実施例３）
非フコシル化ｈＳ２Ｃ６抗体の免疫調節活性
ＳＥＡ−ＣＤ４０の活性用量の同定：ＳＥＡ−ＣＤ４０は、抗原提示細胞を活性化する用量レベルで活性であることが提案されており、それは、活性化マーカー、例えば、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ、またはＣＤ８６などの上方制御によって特徴付けることができる。様々な濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０で６〜４８時間処置した後のＰＢＭＣ上の活性化マーカーを、上述したように評価した（ＰＢＭＣ上の活性化マーカーの評価）。それぞれの活性化マーカーについてアイソタイプ対照ＳＥＡ−ｈ００およびＳＥＡ−ＣＤ４０を用いた処置間の差異を計算し、ＳＥＡ−ＣＤ４０濃度および処置時間に対してプロットした。最も急勾配の応答−濃度曲線が、ＣＤ８６およびＭＨＣＩＩについて２４時間で、ＭＨＣＩについて４８時間で観察された。応答−濃度データ（２４時間  ＣＤ８６、２４時間  ＭＨＣＩＩ、および４８時間  ＭＨＣＩ）を、以下の式を使用して非線形回帰によってフィッティングした。この場合、０％および１００％の応答は、それぞれの活性化マーカーについてのデータセット中の最小値および最大値として定義する。ＥＣ５０は、５０％の応答を与えるＳＥＡ−ＣＤ４０の濃度である。
【数２】
2020050677.tif 000007
【０１２２】
結果：活性化マーカーについての正規化された応答対ｌｏｇ（濃度）および非線形フィッティングした回帰線を、図９に例示する。ＭＨＣＩ、ＣＤ８６、およびＭＨＣＩＩの推定ＥＣ５０値は、それぞれ０．０１１、０．１４、および０．４１μｇ／ｍＬであった。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、０．２μｇ／ｍＬで、それぞれＭＨＣＩ、ＣＤ８６、およびＭＨＣＩＩのおよそ９０％、６０％、および３０％の最大上方制御を誘導すると推定される。０．２μｇ／ｍＬは、ヒトにおいて１０μｇ／ｋｇのＩＶ用量によって達成可能な理論血漿Ｃｍａｘに対応する。この用量を理論的な第１の予測される活性用量として提案する。
【０１２３】
（実施例４）
非フコシル化ｈＳ２Ｃ６抗体の免疫調節活性
ＳＥＡ−ＣＤ４０によって生じるＴ細胞応答：抗Ｍ１  Ｔ細胞株を、Ｍ１  ｆｌｕペプチドに対して高度に反応性であることが示されたＨＬＡ−Ａ２ドナーからＡｓｔａｒｔｅ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓで生成した。これらの細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、自己ＰＢＭＣと組み合わせた。培養物を、漸減濃度（１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌ）のＳＥＡ−ＣＤ４０またはダセツズマブの存在または非存在下で５日にわたって１０μｇ／ｍｌのＭ１  ｆｌｕペプチドで刺激した。培養物上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームで多重分析によってサイトカインについて分析し、抗原特異的Ｔ細胞をＭ１特異的四量体結合によって同定した。
【０１２４】
結果：Ｍ１  ｆｌｕペプチドに対して高度に反応性であることが示されたＨＬＡ−Ａ２ドナー由来のＰＢＭＣを、漸減濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０またはダセツズマブの存在または非存在下で５日にわたってＭ１  ｆｌｕペプチドで刺激した。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０で刺激された培養物は、ＩＦＮγ産生の増大によって見られるＭ１  ｆｌｕ抗原に対する応答の増大、および四量体結合の増大によって判定される抗原特異的Ｔ細胞の増加を示した。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、０．１μｇ／ｍｌまで抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激し、この活性は、ダセツズマブに関連した応答よりロバストであった。
【０１２５】
抗免疫チェックポイント阻害剤抗体と組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ４０によって生じるＴ細胞応答：抗Ｍ１  Ｔ細胞株を、Ｍ１  ｆｌｕペプチドに対して高度に反応性であることが示されたＨＬＡ−Ａ２ドナーからＡｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓで生成した。これらの細胞をＣＦＳＥで標識し、自己ＰＢＭＣと組み合わせた。培養物を、漸減濃度（１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌ）のＳＥＡ−ＣＤ４０、および／または１μｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＰＤ−１抗体の存在または非存在下で５日にわたって１０μｇ／ｍｌのＭ１  ｆｌｕペプチドで刺激した。培養上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームで多重分析によってサイトカインについて分析し、抗原特異的Ｔ細胞をＭ１特異的四量体結合によって同定した。
【０１２６】
結果：Ｍ１  ｆｌｕペプチドに対して高度に反応性であることが示されたＨＬＡ−Ａ２ドナー由来のＰＢＭＣを、漸減濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０および／または一定濃度の抗ＣＴＬＡ４阻止抗体もしくは抗ＰＤ−１抗体の存在または非存在下で、Ｍ１  ｆｌｕペプチドで刺激した。結果を図１１および１２に示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０、抗ＣＴＬＡ４抗体、および抗ＰＤ−１抗体単独は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激した一方、ＩＦＮ−γ産生の増大によって見られるＭ１  ｆｌｕ抗原に対する応答の増大（図１１）、および四量体結合の増大によって判定される抗原特異的Ｔ細胞の増加（図１２、ＭＢＬからの四量体／ＡＰＣ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１インフルエンザ−Ｍ１（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）四量体を使用する）が、ＳＥＡ−ＣＤ４０および抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ−１抗体を組み合わせたとき観察された。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、０．１μｇ／ｍｌまで抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激し、この活性は、免疫チェックポイント抗体との組合せによって増強された。
【０１２７】
がん患者由来のＰＣＭＣでＳＥＡ−ＣＤ４０によって生じるＴ細胞応答：抗ＣＤ４０抗体単独を評価するために、ＰＢＭＣを腫瘍患者血液１０ｍｌから単離し、２５万細胞を２４ウェルプレートに蒔いた。試料を、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０のみ、またはＭａｇｅＡ１／ＭａｇｅＡ３／ＮＹ−ＥＳＯを含有する１μｇ／ｍｌの組み合わせたペプチドプール、および漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０もしくはＳＧＮ−４０で処置した。試料を１０％
ＣＯ２中で３７℃にて５日間培養し、組織培養上清を収集し、ＩＮＦ−γレベルを評価した。
【０１２８】
免疫チェックポイント阻止抗体と組み合わせたＳＥＡ−ＣＤ４０を評価するために、ＰＢＭＣを、乳がん、膵がん、またはメラノーマがんと診断された患者由来の血液１０ｍｌから単離し、２５万細胞を２４ウェルプレートに蒔いた。試料を、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０、ＭａｇｅＡ１／ＭａｇｅＡ３／ＮＹ−ＥＳＯを含有する１μｇ／ｍｌの組み合わせたペプチドプール、および１μｇ／ｍｌの抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４で処置した。試料を１０％  ＣＯ２中で３７℃にて５日間培養し、組織培養上清を収集し、ＩＮＦ−γレベルを評価した。
【０１２９】
結果：ドナー由来のＰＢＭＣを、上述したように全血から単離した。ドナーは、メラノーマと診断された３人の患者、乳がんと診断された３人の患者、および膵がんと診断された３人の患者であった。ドナーＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０またはＳＧＮ−４０の存在または非存在下で５日にわたって一般的な腫瘍抗原タンパク質のペプチドのプール（ＭＡＧＥＡ１／ＭＡＧＥ３／ＮＹ−ＥＳＯ）で刺激した。組織培養上清を収集し、ＩＮＦ−γ産生を評価した。結果を図１３に示す。９人の患者のうちの６人は、抗原依存的ＩＮＦ−γ応答を呈し、それは、ＳＧＮ−４０での処置と比較してＳＥＡ−ＣＤ４０処置によって有意に増強された。ＳＥＡ−ＣＤ４０で処置されたＰＢＭＣでは、刺激は、１０μｇ／ｍｌという低い濃度で観察された。
【０１３０】
ドナー由来のＰＢＭＣを上述したように全血から単離した。上記の通り、ドナーは、メラノーマと診断された３人の患者、乳がんと診断された３人の患者、および膵がんと診断された３人の患者であった。ドナーＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０および／または一定濃度の抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＰＤ１阻止抗体の存在または非存在下で一般的な腫瘍抗原タンパク質のペプチドのプール（ＭＡＧＥＡ１／ＭＡＧＥ３／ＮＹ−ＥＳＯ）で刺激した。結果を図１４に示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０ならびにチェックポイント阻止標的ＰＤ１およびＣＴＬＡ４に対する抗体は、抗原特異的Ｔ細胞応答のみを刺激したが、ＳＥＡ−ＣＤ４０を抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１抗体と組み合わせると、ＩＮＦ−γ産生として測定される、腫瘍抗原に対するロバストなシグナルが観察された。
【０１３１】
（実施例５）
非フコシル化抗ＣＤ４０抗体の活性についてのマウスモデル
マウスモデルは、新しいがん治療薬の有効性および機構を評価する上で非常に有用であることが証明されている。がんのマウスモデルにおけるＳＥＡ−ＣＤ４０の研究は、ＳＥＡ−ＣＤ４０がマウスＣＤ４０を認識しないので困難であった。したがって、非フコシル化抗ＣＤ４０抗体の活性を評価するために、同系マウス腫瘍モデルが開発された。ヒトＩｇＧ１およびヒトＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６のマウスの機能的等価物は、それぞれマウスＩｇＧ２ａおよびＦｃγＲＩＶであり、マウスＩｇＧ２ａがマウスＦｃγＲＩＶに結合するとＡＤＣＣが媒介される。例えば、Bruhns、Blood、１１９巻：５６４０〜５６４９頁
（２０１２年）およびNimmeriahnら、Immunity、２３巻：４１〜５１頁（２００５年）を参照。ラット抗体１Ｃ  １０を、ＳＥＡ−ＣＤ４０のサロゲートを生成するのに使用した。例えば、Heathら、Eur.  J.  Immunol.、２４巻：１８２８〜１８３４頁（１９９４年
）を参照。簡単に言えば、マウスＣＤ４０を認識するラットモノクローナル抗体、１Ｃ１０抗体のＶＬおよびＶＨ遺伝子断片を、それぞれマウスＣｋａｐｐａおよびマウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３断片の５’にインフレームでクローニングした。得られた遺伝子がＣＨＯ細胞で発現することにより、ラットＶＬおよびＶＨドメイン、ならびにＩｇＧ２ａアイソタイプのマウス軽鎖および重鎖ドメインを有するキメラ１Ｃ１０抗体（ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０）が生成された。ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０を、実施例１に記載の方法を使用してＣＨＯ細胞増殖培地中で２−フルオロフコースの存在下で発現させて、ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０の非フコシル化形態（ｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ  １Ｃ１０）を生成した。フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０およびｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ  １Ｃ１０を、マウスＢ１６メラノーマモデルを使用して抗腫瘍活性について試験した。
【０１３２】
非フコシル化マウス抗体のマウスＦｃγ受容体への結合の評価：マウスＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＶを安定に発現するＣＨＯ細胞を、漸増濃度のフコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０または非フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０（ｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ−１Ｃ１０）とともにインキュベートした。試料を洗浄し、飽和量のＰＥ−抗マウスＩｇＧを添加し、氷上で試料とともに３０分間インキュベートした。試料を再び洗浄し、標識した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１３３】
結果：サロゲート抗ＣＤ４０抗体のマウスＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＶ（ヒトＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６のマウス等価物）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への結合を評価した。結果を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。予期されたように、ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０は、ｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ  １Ｃ１０と同様の親和性でＦｃγＲ１に結合した。例えば、図１５Ａを参照。しかし、非フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ  １Ｃ１０は、フコシル化親抗体ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０より有意に高い親和性でＦｃγＲＩＶに結合した。例えば、図１５Ｂを参照。
【０１３４】
マウス腫瘍モデルにおける非フコシル化抗ＣＤ４０抗体の評価：２５０．０Ｅ＋３  Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに、皮下に与えた。マウスを、それぞれ平均でおよそ５０ｍｍ３の腫瘍サイズを有するコホートにランダム化した。次いでマウスに、合計３回の用量について１日おきにアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ）、フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０、または非フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０（ｍＩｇＧ２ａ
ＳＥＡ  １Ｃ１０）を腹膜間（interperitoneal）注射した。マウスを、腫瘍サイズが
１０００ｍｍ３に到達するまで監視し、その時点でマウスを屠殺した。
【０１３５】
結果：Ｂ１６Ｆ１０同系メラノーマモデルを使用して、本発明者らの非フコシル化抗ＣＤ４０抗体サロゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を移植し、次いでｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０、または非フコシル化ｍＩｇＧ２ａ  １Ｃ１０（ｍＩｇＧ２ａ  ＳＥＡ  １Ｃ１０）で処置した。全身腫瘍組織量を監視し、腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に到達したとき、マウスを屠殺した。結果を図１６に示す。非フコシル化ＳＥＡ−１Ｃ１０  ｍＩｇＧ２ａで処置したマウスは、有意な生存利益を示した。腫瘍は、フコシル化親１Ｃ１０  ＩｇＧ２ａ抗体と比較して遅延する。
【０１３６】
（実施例６）
ＳＥＡ−ＣＤ４０は、Ｂ細胞を枯渇させ、Ｔ細胞活性化を促進する
ＳＥＡ−ＣＤ４０活性を、関連したフコシル化抗体、および完全アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、クローン２１．４．１と比較した。抗体２１．４．１は、ＣＰ−８７０，８９３の親クローンであるヒト抗ＣＤ４０  ＩｇＧ２ｋアゴニスト抗体、現在、ＰＤＬ１と組み合わせて固形腫瘍の臨床トライアルで試験されている抗体である。抗体２１．４．１のアミノ酸配列情報については、例えば、すべての目的で本明細書に組み込まれている米国特許第７，３３８，６６０号を参照。３つの機能的なエリアを抗体について試験した：ヒトＢ細胞分化、活性化、および枯渇を推進する能力、初代ヒトＰＢＭＣ培養物を活性化する能力、ならびに抗原特異的応答を推進する能力。
【０１３７】
抗ＣＤ−４０抗体によるＢ細胞活性化の評価：実験は、新鮮なヒト全血またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の精製Ｂ細胞を使用して実施した。Ｂ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ単離キットを使用して新鮮なヒト全血から単離した。単離、精製したＢ細胞を、漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、または六量体ＣＤ４０リガンド、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１０、１、０．１、０．０１、または０．００１μｇ／ｍＬ）とともに２４時間培養した。Ｂ細胞活性化を、フローサイトメトリーによるＣＤ８０の上方制御として評価した。
【０１３８】
ＰＢＭＣを上述したように単離し、次いで漸増濃度のＳＥＡ−ＣＤ４０、抗体２１．４．１、または六量体ＣＤ４０Ｌ（１０、１、０．１、０．０１、または０．００１μｇ／ｍＬ）とともに２４時間培養した。Ｂ細胞の総数を、フローサイトメトリーによって評価したＣＤ１９染色で評価した。
【０１３９】
結果：ＳＥＡ−ＣＤ４０免疫調節活性は、抗体のＦｃ部分およびＣＤ１６であるＦｃγＲＩＩＩ受容体とのその相互作用に依存する。結果を図１７に示す。ＳＥＡ−ＣＤ４０は、ＳＥＡ−ＣＤ４０の架橋に必要なＦｃγ受容体を発現する細胞を欠く精製Ｂ細胞培養物においてＢ細胞活性化を誘導しない。これは、純粋なＢ細胞培養物中で、ＣＤ４０リガンドと同様のＢ細胞活性化を推進することができるＣＤ４０活性化抗体２１．４．１とは異なる。
【０１４０】
ＰＢＭＣは、Ｆｃγ受容体を発現する細胞を含む。その細胞集団の結果を図１８に示す。ＰＢＭＣ培養物について、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、Ｂ細胞のＡＤＣＣ枯渇を促進することができた一方、抗体２１．４．１処置は、Ｂ細胞を枯渇させなかった。
【０１４１】
抗ＣＤ−４０抗体による単球／マクロファージ活性化の評価：ヒトＰＢＭＣ培養物を上述したように単離した。ＰＢＭＣ培養物を、漸増濃度（０．０、０．００１、０．０１、０．１、１．０、または１０μｇ／ｍＬ）のＳＥＡ−ＣＤ４０、ダセツズマブ、抗体２１．４．１、またはＳＥＡ−アイソタイプ対照で２４時間刺激した。ＣＤ８０の上方制御は、単球成熟のマーカーである。ＣＤ８０の表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１４２】
結果：結果を図１９に示す。ＰＢＭＣのＳＥＡ−ＣＤ４０処置は、ＣＤ８０上方制御によって測定した場合、単球／マクロファージのロバストな活性化を誘導し、この活性は、ＣＤ４０活性化抗体２１．４．１で見られる活性化と同等である。
【０１４３】
抗ＣＤ４０抗体によるサイトカイン誘導の評価：ヒトＰＢＭＣ培養物を上述したように単離した。ＰＢＭＣ培養物を、漸増濃度（０．０、０．００１、０．０１、０．１、１．０、または１０μｇ／ｍＬ）のＳＥＡ−ＣＤ４０、ダセツズマブ、抗体２１．４．１、またはＳＥＡ−アイソタイプ対照で２４時間刺激した。刺激した後、組織培養上清を収集し、炎症性サイトカインを多重Ｌｕｍｉｎｅｘ分析によって評価した。
【０１４４】
結果：結果を図２０および図２１に示す。図２０は、ＳＥＡ−ＣＤ４０およびＣＤ４０活性化抗体２１．４．１が、ロバストなＴ細胞応答を誘発するのに重要なサイトカインＩＦＮ−γおよびケモカインを誘導することを示す。図２１は、抗体によるインターロイキン１０（ＩＬ１０）の誘導を示す。ＩＬ１０産生を促進する抗体２１．４．１と対照的に、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、免疫減衰性サイトカインＩＬ−１０のレベルを低減する。
【０１４５】
抗ＣＤ４０抗体によるＴ細胞誘導の評価：ヒトＰＢＭＣ培養物を上述したように単離した。１×１０６ＰＢＭＣをＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で培養し、Ｍ１  ｆｌｕペプチド５μｇ、および漸増濃度（０．０、０．００１、０．０１、０．１、１．０、または１０μｇ／ｍＬ）のＳＥＡ−ＣＤ４０、ダセツズマブ、または抗体２１．４．１とともに５日間インキュベートした。次いで細胞および細胞培養物上清を収集した。ＩＦＮ−γレベルを上清中で評価した。ｆｌｕ抗原特異的Ｔ細胞を、フローサイトメトリーを使用して四量体染色によって評価した。パーセントＴ制御性細胞、細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７低集団を、フローサイトメトリーを使用して判定した。
【０１４６】
結果：結果を図２２〜２４に示す。５日のインキュベーション後、ＳＥＡ−ＣＤ４０は、ダセツズマブまたは抗体２１．４．１と比較してより高いレベルのＩＦＮ−γを誘導した。例えば、図２２を参照。図２３は、ＳＥＡ−ＣＤ４０が、抗体２１．４．１で見られるものと同様のロバストなｆｌｕ抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することを示す。しかし、図２４は、ＳＥＡ−ＣＤ４０はまた、ｆｌｕペプチド刺激後に存在する免疫阻害性Ｔ制御性細胞の数を低減することを示す。この活性は、ＳＥＡ−ＣＤ４０でＰＢＭＣを処置した後に見られるＩＬ１０産生の低下におそらく関係付けられる。対照的に、抗体２１．４．１とともにインキュベートした後、ＰＢＭＣは、図２４に実証したように、Ｔ制御性細胞の数の増加を示した。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示的な目的のみのためであり、当業者は、これらを鑑みて様々な改変または変更についての示唆を得るはずであり、これらの改変または変更も本願の趣旨および認識範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の射程内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【化２】
2020050677.tif 000008
【化３】
2020050677.tif 000009
【図１】
2020050677.tif 000010
【図２】
2020050677.tif 000011
【図３】
2020050677.tif 000012
【図４】
2020050677.tif 000013
【図５】
2020050677.tif 000014
【図６】
2020050677.tif 000015
【図７】
2020050677.tif 000016
【図８】
2020050677.tif 000017
【図９】
2020050677.tif 000018
【図１０】
2020050677.tif 000019
【図１１】
2020050677.tif 000020
【図１２】
2020050677.tif 000021
【図１３】
2020050677.tif 000022
【図１４】
2020050677.tif 000023
【図１５Ａ】
2020050677.tif 000024
【図１５Ｂ】
2020050677.tif 000025
【図１６】
2020050677.tif 000026
【図１７】
2020050677.tif 000027
【図１８】
2020050677.tif 000028
【図１９】
2020050677.tif 000029
【図２０】
2020050677.tif 000030
【図２１】
2020050677.tif 000031
【図２２】
2020050677.tif 000032
【図２３】
2020050677.tif 000033
【図２４】
2020050677.tif 000034
【配列表】
2020050677000001.app
【外国語明細書】
2020050677000001.pdf