(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚組織の本来の機能を改善して、皮膚トラブルを予防及び/又は改善し、美肌を促進するための飲食品、医薬品等に利用することができるエラスターゼ阻害剤を提供する。【解決手段】オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟した種子の酵素分解物、抽出物、抽出残渣又はスプラウトを含有してなるエラスターゼ阻害剤及び経口組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有してなることを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項２】
前記種子が完熟種子である請求項１に記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項３】
前記加工物がオクラ種子の抽出物、抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトである請求項１又は２に記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項４】
前記抽出物が熱水抽出物である請求項１〜３のいずれか１項に記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項５】
前記酵素分解物がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼによる加水分解物である請求項１〜４のいずれか１項に記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項６】
エラスターゼが皮膚の線維芽細胞由来のものである請求項１〜５のいずれか１項に記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のエラスターゼ阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のエラスターゼ阻害剤を配合してなることを特徴とする経口用組成物。
【請求項９】
飲食品である請求項８に記載の経口用組成物。
【請求項１０】
皮膚組織のエラスターゼ阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものである請求項８又は９に記載の経口用組成物。
【請求項１１】
皮膚組織の老化症状改善用のものである請求項８〜１０のいずれか１項に記載の経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有してなることを特徴とするエラスターゼ阻害剤及び利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物や魚類の生体組織は、一般的に、皮膚の表皮や臓器の表面等の上皮組織、主に筋肉を構成する筋組織、全身に張り巡らされた神経の神経組織、及び、身体構造を保持し支えている結合組織に大別される。結合組織は支持組織とも呼ばれ、広義には骨や軟骨、血液、脂肪等も結合組織に分類されることがある。
【０００３】
このうち、上皮組織や支持組織については、皮膚、骨、脂肪等において古くから研究及び開発の取り組みがなされ、近年では、例えば、皮膚の老化症状の一環として肌の張りや弾力の低下（シワ・たるみ等）の発生メカニズムが解明されつつあり、肌のシワやたるみにはエラスチン（弾性線維）が大きく関与しているといわれている。
【０００４】
エラスチンは、結合組織に存在する線維状の高分子蛋白質の一種であり、高分子の蛋白質であるコラーゲン同士を格子状に結合させ、その隙間にヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類をはじめとする種々の細胞外成分が存在する細胞外マトリックス構造を形成している。この細胞外マトリックス構造は、細胞及び皮膚組織の支持、細胞間隙における保水、皮膚の潤滑性と柔軟性の保持、紫外線、乾燥環境、機械的刺激や損傷、微生物感染等の外的因子から皮膚組織を保護する等の役割を担っている。これらの蛋白質や細胞外成分は生体内において線維芽細胞により産生されることが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
生体組織中のエラスチン含有量は、一般に、項靱帯で約７８〜８０％、動脈で約５０％、肺で約２０％、真皮で約２〜５％程度と認識されている。また、エラスチンの特徴の１つとして、コラーゲンやヒアルロン酸とは異なり、ヒトの誕生時にはほぼ０％で成長とともに量が増え、２０歳代半ばごろにピークを迎える。その後減少に転じ、４０歳代を過ぎると５０％以下になるといわれている。これは、加齢にともなう代謝変化や紫外線やその他の要因によって生体組織中のエラスチンが分解あるいは変性される可能性を示唆し、その一因としてエラスチンを分解する酵素であるエラスターゼの活性亢進や過剰誘導等が推察される。
【０００６】
このような観点から、線維芽細胞の増殖を促進する有効成分としてオクラの種子から得た水性成分を利用することが開示されている（特許文献１）。また、真皮中のエラスチンやコラーゲン等の含量の低減を防止するために様々な検討がなされ種々の報告や提案があり、一例として、皮膚の老化（シワや弾力）を改善する化粧料の有効成分としてレチノール配糖体が開示されている（特許文献２）。しかし、レチノール誘導体には過剰投与による副作用も知られており、安全性の点で十分ではない。
【０００７】
また、エラスターゼの活性を阻害する物質を探索する試みも多く、これまでに植物由来成分や抽出物として、セイヨウトウキの抽出物（特許文献３）、フェニルエタノイド配糖体（エキナコサイド及びアクテオサイド）を含むハマウツボ科植物の抽出物（特許文献４）、ブドウの芽及び蔓から抽出したレスベラトロール類（特許文献５）、ザクロの花の粉末及び／又は抽出物（特許文献６）、マンネンタケの抽出物（特許文献７）、大豆タンパク加水分解物（特許文献８）、等が提案されている。
【０００８】
これら成分や抽出物は、化粧料や皮膚外用剤に配合して皮膚に塗布して利用する旨を記載している。しかしながら、化粧料や皮膚外用剤へ利用する場合は、成分の経皮吸収性や容易な洗浄性等の点で疑問や難点があり、皮膚の老化症状対策として望ましい効果が持続せず、皮膚組織の生理的機能を本質的に改善するものではなかった。また、ペプチド類を経口摂取する場合には胃腸内で変質や分解を受けるリスクがあり、実用面において有効性を発現し得るものは数少なかった。したがって、前述した肌の老化症状を改善し得る、実効性のある素材が求められていた。
【０００９】
なお、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）はアオイ科トロロアオイ属に属する植物であり、世界の熱帯〜温帯地域で生育し、野菜として栽培され食用に供されてきた長い歴史がある。通常、白色ないし黄白色の未熟な種子を内包する果実（莢）を生鮮野菜として摂食する。
【００１０】
オクラを加工して得られるエキスや成分を産業的に利用する試みとして、前記の特許文献１、オクラ抽出物を含むヒアルロン酸合成促進剤及び該剤を配合する化粧料や飲食品（特許文献９）、オクラ種子由来のオリゴペプチド及び特定植物抽出物を含有する老化防止用皮膚外用剤（特許文献１０）等が提案されている。しかしながら、オクラの種子や加工処理物とエラスチンやエラスターゼとの関連に言及するものは見当たらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】服部道広、「スキンケアの科学」、第６頁〜第１４頁及び第１５頁〜第８３頁、（株）裳華房、１９９７年２月２５日発行
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１８−１１５１４３号公報
【特許文献２】特開平１０−１５８２９０号公報（請求項１等）
【特許文献３】特開２０１２−２０１６１５号公報、
【特許文献４】特開２００９−２６３２７９号公報
【特許文献５】特開２００８−２３９５７６号公報
【特許文献６】特開２００５−５３８７３号公報
【特許文献７】特開２００５−２３０２１号公報
【特許文献８】特開２００４−１８２６８７号公報
【特許文献９】特開２００４−５１５３３号公報
【特許文献１０】特開２００８−７４７５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
かかる現状に鑑み、本発明は、紫外線や活性酸素等の外的要因、生体の代謝機能の低下等によって生じる生体組織中のエラスチンの低減を回復させ、皮膚の老化症状等を改善するためのエラスターゼ活性阻害剤及び産業上利用可能な組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するために、本発明者らは、線維芽細胞由来のエラスターゼの活性を阻害する素材とその加工方法について鋭意検討を重ねた結果、オクラの種子の加工物が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の主たる特徴は概ね次の点にある。
（１）オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有してなることを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
ここで、前記種子は完熟種子であることが望ましく、前記加工物はオクラ種子の抽出物、該抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトのいずれかであることが望ましく、前記抽出の処理は熱水抽出であることが望ましく、前記酵素分解の処理はアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼを用いる加水分解であることが望ましく、前記エラスターゼは皮膚の線維芽細胞由来のものであることが望ましい。
【００１６】
（２）前記のエラスターゼ阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法。
【００１７】
（３）前記のエラスターゼ阻害剤を配合してなることを特徴とする経口用組成物。
ここで、前記経口用組成物は飲食品の態様であることが望ましく、また、皮膚組織のエラスターゼ活性阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものであることが望ましく、更には、皮膚組織の老化症状改善用のものであることが望ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る、オクラの完熟種子から得た加工物である熱水抽出物、その残渣、蛋白質加水分解物及びスプラウトは、皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼに対して微量でも強力な阻害効果を奏する。このため、前記加工物を含む本発明のエステラーゼ阻害剤は皮膚のターンオーバーを促して皮膚トラブルや老化症状（シワ、シミ、くすみ、ソバカス、たるみ等）を改善し、美肌促進に寄与することが可能となる。また、皮膚組織中のエラスチンを増強させ、例えば、皮膚の損傷部位の再生を促進する等、肌の健康維持に役立つことが期待できる。
かかる効果は、本発明のエラスターゼ阻害剤を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。
したがって、本発明のエラスターゼ阻害剤はとりわけ飲食品、医薬品、動物飼料等の分野において、前記剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、皮膚改善のために有効利用することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明のエラスターゼ阻害剤は、生体組織とりわけ皮膚の真皮組織中に存在するエラスチンを分解する酵素であるエラスターゼを阻害する作用を有するものであり、オクラの種子の加工物を含有してなることを特徴とする。
【００２０】
オクラは、一般に、莢の形状が五角形、八角形、丸形等の品種があり、色が緑色、紫紅色、白色等の品種がある。本発明に係るオクラは、これらの種類に制限はなく、任意のものを使用することができる。
【００２１】
本発明では、前記オクラの完熟した種子を原料とすることが望ましい。完熟した種子とは、植物体が成長した果実（莢）から収穫したり自然発生的に飛散する種子を指し、濃緑色〜黒褐色で、直径５mm前後のサイズのものであり、播種すれば発芽する能力を有する。一方、未熟な種子は、成長途上にある莢の中に包含されており、白色〜黄白色の約２〜４mm径のものであり、通常は、莢とともに食用に供せられる。オクラの完熟種子は、オクラを栽培するために種苗会社から市販されており、これを用いるのが簡便である。
【００２２】
前記オクラ種子は以下に述べる加工物、すなわち、オクラ種子の抽出物、該抽出残渣、酵素加水分解物又はスプラウトとして採取することが望ましい。
【００２３】
オクラ種子の抽出物は、例えば、次のような加工処理により製造することができる。
脱皮若しくは非脱皮の種子を粗粉砕ないしは微粉砕し、水を加えて分散液とした後、常温あるいは加熱下、静置又は適宜に撹拌しながら、抽出処理を行なう。次いで、この抽出液を遠心分離、&#27818;過等の常法で処理して不溶物を除去し、より望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮及び乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することにより、本発明に係る抽出物を製造することができる。
【００２４】
なお、前述の抽出工程において、熱水抽出物を製造する場合は、水分散液を約３０〜約９０℃、より好ましくは約４０〜約６０℃に設定し、約１０分〜数日間、より好ましくは約３０分〜数時間抽出処理し、低温抽出物を製造する場合は、約１０〜約３０℃、より好ましくは約１５〜約２５℃に設定し、約３０分〜数日間、より好ましくは数時間〜１日浸漬して抽出処理すればよい。
【００２５】
オクラ種子の抽出残渣は、前記抽出工程で除去した不溶物を常法により濃縮乾燥あるいは凍結乾燥処理して製造することができる。この場合、乾燥の程度は、カビ等の発生による汚染を防止するために、水分含量を５質量％以下にすることが好ましい。なお、本発明の前記残渣は、本発明の所望の効果との関連において、前述の低温抽出物を製造する際に分離される残渣（低温抽出残渣）であることが望ましい。
【００２６】
オクラ種子の酵素分解物は、次のように加工処理して製造することができる。すなわち、オクラ種子を粉砕して水分散液とし、これに対種子当たり約０．１〜約５質量％、より好ましくは約０．５〜約２質量％の蛋白質加水分解酵素を添加して、常温ないしは加温（約３０〜約９０℃、より好ましくは約４０〜約６０℃）下、静置又は適宜に撹拌して、約１０分〜数日間、より好ましくは３０分〜数時間、加水分解処理を行わせる。該処理後、常法により酵素を加熱失活、次いで遠心分離又は&#27818;過処理して不溶物を分離し、望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮、乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することによって製造することができる。なお、本発明では、前記水分散液に代えて、前述のように処理して得られるオクラ種子の抽出物又は抽出残渣を水で溶解ないしは分散させたものを用いて、同様に酵素処理してもよい。
【００２７】
前記蛋白質加水分解酵素は、いかなる種類やタイプのものでも使用することが可能であるが、本発明においては、アルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼが好ましく、アルカリ性プロテアーゼがより一層望ましい。ここで、アルカリ性プロテアーゼは、基質のｐＨが概ね６．５〜１２で作用を示すものであれば使用することができ、中性プロテアーゼは、基質のｐＨが概ね５〜８で作用を示すものであれば差し支えない。また、各プロテアーゼは、１種のみならず２種以上を組み合わせて使用してもよく、後述するような市販品を用いるのが簡便である。
【００２８】
アルカリ性プロテアーゼとして以下の具体例を挙げることができる。但し、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
「プロチンＳＤ−ＡＹ１０」、「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」、「プロレザー（登録商標）ＦＧ−Ｆ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ」（ノボザイムズ社製）、「オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ」（エイチビィアイ（株）製）、「アロアーゼ（登録商標）ＸＡ−１０」（ヤクルト薬品工業（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＭＰ」（新日本化学工業（株）製）、「ビオプラーゼＯＰ、ＳＰ−２０ＦＧ、ＡＬ−１５ＦＧ、３０Ｇ、ＡＰＬ−３０及び３０Ｌ」（ナガセケムテックス（株）製）、「ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）ＰＲ８９Ｌ」、「ＭＡＬＴＩＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲ６Ｌ」（以上、ダニスコＵＳ社製）、「プロティナーゼＫ」、「キモトリプシン」（以上、ロシュ社製）等。
【００２９】
中性プロテアーゼとして次のものを例示することができるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
「Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）」、「ＰＲＯＴＡＭＥＸ（登録商標）ＭＧ」、「Ｎｅｕｔｒａｓｅ」（以上、ノボザイムズ社製）、「パンチダーゼ（登録商標）Ｐ及びＭＰ」、「アロアーゼ（登録商標）ＡＰ−１０、ＮＰ−１０及びＮＳ」（以上、ヤクルト薬品工業（株）製）、「ヌクレイシン（登録商標）」、「オリエンターゼ（登録商標）１０ＮＬ及び９０Ｎ」（以上、エイチビィアイ（株）製）、「プロチンＰ」（大和化成（株）製）、「プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ」、「パパインＷ４０」、「ブロメラインＦ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＬＰ及びＬＰＬ」（新日本化学工業（株）製）、「食品用精製パパイン」、「デナチームＡＰ」（以上、ナガセケムテックス（株）製）、「トリプシン」（ロシュ社製）等。
【００３０】
オクラ種子のスプラウトは、公知の方法により種子を発芽、かいわれ型に生育させ、緑葉が生じて茎丈が約５〜１５ｃｍになるまで栽培したものを収穫し、水洗後、乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することによって製造することができる。
【００３１】
前述のように処理して得られる前記加工物は、オクラ種子に含まれる蛋白質、多糖蛋白複合体、多糖等及び／又はこれらが加水分解されたペプチド類、アミノ酸類、オリゴ糖類、単糖ないしはオリゴ糖類とペプチド又はアミノ酸との結合体等のさまざまな成分を含有する極めて複雑な組成物であると推察している。
【００３２】
本発明では、前記のオクラ種子の加工物をそのまま、又は、デキストリン、セルロース、ゼラチン、精製水等の公知の賦形剤を併用して液体状、粉末状、顆粒状、カプセル状の本発明のエラスターゼ阻害剤を調製することができる。この剤におけるオクラ種子の加工物の含量は概ね２０質量％以上であり、これを下回ると本発明の所望の効果を発現し難くなるから、オクラ種子の加工物／賦形剤（質量割合）は１００〜約２０／０〜約８０が望ましく、１００〜約５０／０〜約５０がより一層望ましい。
【００３３】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、これを経口で摂取又は投与することにより、皮膚組織中のエラスターゼ作用を抑制してエラスチンの低減を防止するため、皮膚の前記トラブルを改善し、老化症状を回復し、美肌を促進するための美容手段として利用することができる。
【００３４】
この好適な態様として、本発明のエラスターゼ阻害剤を固体状（粉末や顆粒）、ゲル状（ゼリー）、ペースト状又は液体状（飲料やドリンク）に成形した飲食品、医薬品、動物飼料等の製品とすることが可能である。また、これらの製品を製造するために使用される公知の添加物（界面活性剤、増粘剤、酸化防止剤、着色剤、香料等）や本発明の趣旨に反しない公知の素材（線維芽細胞増殖促進作用、コラーゲンやヒアルロン酸等の細胞外成分産生促進作用、皮膚老化防止作用、美肌促進作用等が公知の動植物由来の素材等）を適宜に併用して常法により前記各種製品とすることが可能である。
【実施例】
【００３５】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部や％は質量基準である。
【００３６】
製造例１
鹿児島県指宿産オクラの完熟種子をミルで粗粉砕し、この１００ｇに蒸留水３００ｍＬを加えて撹拌しながら５８℃に加熱して分散液（ｐＨ７．５）を調製し、これに蛋白質分解酵素（エイチビィアイ（株）製、商品名：「オリエンターゼ２２ＢＦ」、アルカリ性プロテアーゼ）１部を添加して５時間ゆるやかに撹拌を続けた。この後、酵素を失活させ（８０℃で３０分間）、不溶物を遠心分離で除去し、凍結乾燥して酵素分解物（試料１）を得た。
【００３７】
比較試料１
比較試料１として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるライチ種子由来の市販品（オリザ油化（株）製、商品名：「ライチ種子エキス−WSP」）を用いた。
比較試料２
比較試料２として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるレスベラトロール含有組成物の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「レスベラトロール−ε」）を用いた。
【００３８】
比較試料３
比較試料３として、植物由来の公知素材であるボタンボウフウ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ボタンボウフウ葉粉末」）を用いた。
【００３９】
比較試料４
比較試料４として、植物由来の公知素材であるゴマ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ゴマ葉粉末」）を用いた。
【００４０】
比較試料５
比較試料５として、オクラ由来の公知素材であるオクラ種子粉末の市販品（販売者：(株)松本交商、商品名：「マイオキシノール  ＬＳ  ９７３６」）を用いた。
【００４１】
製造例２
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、８０〜９０℃で６０分間加熱した後、室温まで冷却し、精密濾過（濾紙）して濾液を採取した。この濾過残渣に再度水６００ｍＬを加えて同様に処理して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料２）を製造した。
【００４２】
製造例３
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、１５〜２５℃で一晩浸漬後、精密濾過（濾紙）して濾液を採取し、減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料３）を製造した。
【００４３】
製造例４
製造例３に記載した濾過後の残渣を凍結乾燥及び粉砕して抽出残渣（試料４）を製造した。
【００４４】
製造例５
製造例１と同じ完熟種子を０℃&#12316;室温の水に８&#12316;２０時間浸漬して水を除いた後、栽培容器に播種し、室温&#12316;３０℃、湿度７５&#12316;９０％の暗室に保存し、適宜に水を散布することで発芽させた。発芽後ハウスに移して太陽光下、室温２５&#12316;３０℃、適宜に水を散布しながら、５&#12316;７日後にカイワレ型のスプラウトを得た。これを水洗し、凍結乾燥及び粉砕してスプラウト粉砕物（試料５）を製造した。
【００４５】
比較製造例１
製造例１において、完熟種子を未熟種子に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料６）を得た。
【００４６】
比較製造例２
製造例１において、完熟種子をオクラ可食部（未熟種子を内包する莢。以下同じ。）由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料７）を得た。
【００４７】
比較製造例３
製造例２において、完熟種子をオクラ可食部由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して抽出物（比較試料８）を得た。
【００４８】
試験例
前記の各試料がエラスターゼ活性に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。
【００４９】
試験例１：エラスターゼ阻害作用（その１）
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の試料１、比較試料１〜３を用いた。各試験試料を１００ｍＭ トリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、終濃度４０.０&#12316;１０００．０μｇ／ｍｌの試験溶液を調製した。この際、溶解し難い場合には、１０％以内でＤＭＳＯを添加した。 
９６マイクロプレートにこの試験溶液２５μｌとヒト皮膚線維芽細胞由来エラスターゼ溶液（ここで、前記エラスターゼ溶液は、ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ(株)社製）をコンフルエントになるように前培養し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養したのちＰＢＳ（‐）で２回洗浄後、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、超音波処理にて溶解させた。この溶解液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収し、凍結乾燥した粉末を粗酵素粉末とし、各試験において都度、緩衝液にて溶解させた。）２５μｌを混合し、３７℃で５分間予加温した。
尚、対照として、当該エラスターゼ溶液に１００ｍＭトリス・塩酸バッファー及びＤＭＳＯのみを加えた混合液も、同様に処理した。
次に、基質としてN-サクシニル-トリアラニル‐Ｐ−ニトロアニリドを含む溶液（基質を最小量のＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭ トリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えて５ｍＭとしたもの）５０μｌを加え、反応を開始させた。２時間経過後に、エラスターゼの作用によって遊離してくるニトロアニリンを、分光光度計（コロナ電気(株)製、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＳＨ９０００  Ｌａｂ）を用いて４０５ｎｍ波長光として測定し、試験試料を添加しない対照の吸光度に対する検体の吸光度からエラスターゼ阻害率を算出した。エラスターゼ阻害率は次の計算式から求めた。
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１−（対照−試料）／（対照−ブランク）｝×１００
【００５０】
この結果を表１に示す。同表において、線維芽細胞由来のエラスターゼ阻害率の度合は、同時に実施した対照試験の値を０としたときの相対値で表した。
同表のデータから、完熟種子を酵素処理した場合（試料１）は試験試料のいずれの濃度においても極めて高いエラスターゼ阻害作用を示した。これに対して、エラスターゼ阻害作用が既に知られているライチ種子エキス（比較試料１）やレスベラトロール含有組成物（比較試料２）は、高濃度の場合に阻害作用が高まるが低濃度では阻害作用が小さいこと、また、植物由来のボタンボウフウ葉粉末（比較試料３）及びゴマ葉粉末（比較試料４）では、いずれの濃度においても阻害作用が弱いことを確認した。
【００５１】
【表１】
2020050601.tif 000002
【００５２】
試験例２：エラスターゼ阻害作用（その２）
本試験例では、オクラ種子の酵素分解物以外の加工物及び完熟種子以外の加工物がエラスターゼ阻害作用に及ぼす影響を調べた。ここで、エラスターゼ阻害活性の測定や該阻害作用の度合いの評価は試験例１と同じ方法で実施したが、試験溶液の終濃度は０.４&#12316;１０．０μｇ／ｍｌに設定した。また、試験試料は前記の試料１、試料２〜５、比較試料５〜７→8を用いた。
【００５３】
この結果を表２に示す。同表において、エラスターゼ阻害作用の度合（阻害率）は、同時に実施した対照試験の値を０としたときの相対値で表した。
同表のデータから、オクラの完熟種子の加工物である抽出物（試料２、３）、抽出残渣（試料４）及びスプラウト（試料５）は酵素分解物（試料１）と同程度の強力なエラスターゼ阻害作用を示すこと、一方、オクラの種子由来粉末の場合（比較試料５）はエラスターゼ阻害作用が劣り、未熟種子を酵素分解した場合（比較試料６）、可食部（未熟種子を含む莢）を酵素処理した場合（比較試料７）及び熱水抽出した場合（比較試料８）は、エラスターゼ阻害作用がほとんど認められないことを確認した。
【００５４】
【表２】
2020050601.tif 000003
【００５５】
試験例３：ヒトモニター試験
以下の試験に同意を得たボランティアの成人女性４０名（３０歳〜５５歳、平均年齢：
４４．５歳）を対象とし、１群２０名に分かれてもらい、１群は試料１（１００ｍｇ）もう１群はプラセボ（デキストリン１００ｍｇ）、を１日２回経口摂取してもらい、これを４週間続けた。摂取する前後の肌の変化について、肌の乾燥・シミ・シワ・はり・すくみ・たるみ・ほうれい線・化粧のり・毛穴の開き等の項目を用い、改善の有無についてアンケート調査を行ない、評価した。
【００５６】
この結果、試料１群においては、摂取前と比べ肌が改善した：１７名、変化しなかった：２名、改悪した１名、プラセボ群においては肌が改善した：２名、変化しなかった：１４名、改悪した４名、であった。肌の変化した１７名は、特にシワ・はり・たるみ・ほうれい線の項目について２つ以上の改善の選択があった。また、プラセボ群には見られなかった、肌の乾燥や毛穴の開きの改善についても選択されていた。
結果より、本発明に係る完熟種子がエラスターゼを阻害することによる肌の改善に有用であることを示唆する。
【００５７】
試作例１：ハードカプセル製剤
前記の試料１をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が１００ｍｇの
ゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。ハードカプセル製剤（製造例１の完熟オクラ種子を配合したもの）をモニター試験で経口摂取してもらったところ、肌の改善に有用である知見を得た。したがって、本錠剤は肌の改善のための経口摂取可能な栄養補助食品、医薬品又は動物用飼料として利用することができる。
【００５８】
試作例２：錠剤
以下に示す原料を常法により打錠して錠剤を試作した。ここで、完熟オクラ種子としては、前記の試料１〜５のいずれか１種を使用した。これらの錠剤はいずれも安定で服用し易いものであり、栄養補助食品や医薬品として利用することができる。
（配合原料）                          （１錠当たりの質量（ｍｇ））
１．オクラ完熟種子                                  １００
２．デキストリン                                    １００
３．バレイショデンプン                                ４９
４．微結晶セルロース                                  ２０
５．合成ケイ酸アルミニウム                            ３０
６．ステアリン酸カルシウム                              １
【００５９】
試作例３：栄養補助食品
前記試料１を１００ｍｇ、ロイシンを４００ｍｇ、イソロイシンを２５０ｍｇ、バリンを２００ｍｇ、アルギニンを３００ｍｇとし、これらの混合、篩過した粉末を包装充填し、栄養補助食品を試作した。この栄養補助食品はヒトのみならずペットフードにも利用することができる。
【００６０】
試作例４：食品（麺類）
前記の試料１を１０ｇ、そば粉を３５０ｇ、強力粉を１５０ｇとし、これらを混ぜ合わ
せながら、篩にかけ、水を１５０ｍｌ混合して、そばを試作した。これは市販品と比べて
風味や食感に違和感のないものであった。
【００６１】
試作例５：清涼飲料水、ドリンク剤
市販の清涼飲料水及びドリンク剤１００ｍＬに前記試料１又は試料２を５００ｍｇ又は
１００ｍｇ加えて十分に混合し飲料を試作した。この飲料は元の清涼飲料水及びドリンク
剤と比較して風味及び保存安定性で何ら遜色のないものであった。これは清涼飲料又はド
リンク剤として利用することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
オクラの完熟種子から得られる加工物は、線維芽細由来のエラスターゼ活性を阻害する作用を有するため、これを経口的に摂取又は投与することにより、皮膚の本来の生理機能を回復させ、皮膚トラブルの改善、美肌の促進、皮膚損傷の早期回復等に役立つ飲食品、医薬品、動物飼料等として有効利用が可能となる。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月27日(2019.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟種子の加工物を含有してなる、皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼ阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法（但し、ヒトの治療による処置方法を除く。）。
【請求項２】
前記加工物がオクラ種子の抽出物、抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物が熱水抽出物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素分解物がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼによる加水分解物である請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
オクラ種子の抽出物は、例えば、次のような加工処理により製造することができる。
脱皮若しくは非脱皮の種子を粗粉砕ないしは微粉砕し、水を加えて分散液とした後、常温あるいは加熱下、静置又は適宜に撹拌しながら、抽出処理を行なう。次いで、この抽出液を遠心分離、濾過等の常法で処理して不溶物を除去し、より望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮及び乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することにより、本発明に係る抽出物を製造することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
オクラ種子の酵素分解物は、次のように加工処理して製造することができる。すなわち、オクラ種子を粉砕して水分散液とし、これに対種子当たり約０．１〜約５質量％、より好ましくは約０．５〜約２質量％の蛋白質加水分解酵素を添加して、常温ないしは加温（約３０〜約９０℃、より好ましくは約４０〜約６０℃）下、静置又は適宜に撹拌して、約１０分〜数日間、より好ましくは３０分〜数時間、加水分解処理を行わせる。該処理後、常法により酵素を加熱失活、次いで遠心分離又は濾過処理して不溶物を分離し、望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮、乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することによって製造することができる。なお、本発明では、前記水分散液に代えて、前述のように処理して得られるオクラ種子の抽出物又は抽出残渣を水で溶解ないしは分散させたものを用いて、同様に酵素処理してもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
製造例５
製造例１と同じ完熟種子を０℃〜室温の水に８〜２０時間浸漬して水を除いた後、栽培容器に播種し、室温〜３０℃、湿度７５〜９０％の暗室に保存し、適宜に水を散布することで発芽させた。発芽後ハウスに移して太陽光下、室温２５〜３０℃、適宜に水を散布しながら、５〜７日後にカイワレ型のスプラウトを得た。これを水洗し、凍結乾燥及び粉砕してスプラウト粉砕物（試料５）を製造した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
試験例１：エラスターゼ阻害作用（その１）
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の試料１、比較試料１〜３を用いた。各試験試料を１００ｍＭ トリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、終濃度４０.０〜１０００．０μｇ／ｍｌの試験溶液を調製した。この際、溶解し難い場合には、１０％以内でＤＭＳＯを添加した。
９６マイクロプレートにこの試験溶液２５μｌとヒト皮膚線維芽細胞由来エラスターゼ溶液（ここで、前記エラスターゼ溶液は、ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ(株)社製）をコンフルエントになるように前培養し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養したのちＰＢＳ（‐）で２回洗浄後、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、超音波処理にて溶解させた。この溶解液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収し、凍結乾燥した粉末を粗酵素粉末とし、各試験において都度、緩衝液にて溶解させた。）２５μｌを混合し、３７℃で５分間予加温した。
尚、対照として、当該エラスターゼ溶液に１００ｍＭトリス・塩酸バッファー及びＤＭＳＯのみを加えた混合液も、同様に処理した。
次に、基質としてN-サクシニル-トリアラニル‐Ｐ−ニトロアニリドを含む溶液（基質を最小量のＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭ トリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えて５ｍＭとしたもの）５０μｌを加え、反応を開始させた。２時間経過後に、エラスターゼの作用によって遊離してくるニトロアニリンを、分光光度計（コロナ電気(株)製、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＳＨ９０００  Ｌａｂ）を用いて４０５ｎｍ波長光として測定し、試験試料を添加しない対照の吸光度に対する検体の吸光度からエラスターゼ阻害率を算出した。エラスターゼ阻害率は次の計算式から求めた。
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１−（対照−試料）／（対照−ブランク）｝×１００
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
【表１】
2020050601.tif 000004
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
試験例２：エラスターゼ阻害作用（その２）
本試験例では、オクラ種子の酵素分解物以外の加工物及び完熟種子以外の加工物がエラスターゼ阻害作用に及ぼす影響を調べた。ここで、エラスターゼ阻害活性の測定や該阻害作用の度合いの評価は試験例１と同じ方法で実施したが、試験溶液の終濃度は０.４〜１０．０μｇ／ｍｌに設定した。また、試験試料は前記の試料１、試料２〜５、比較試料５〜８を用いた。
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月2日(2019.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟種子の加工物を含有してなる、皮膚の線維芽細胞由来エラスターゼの阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法（但し、ヒトの治療による処置方法を除く。）。
【請求項２】
前記加工物がオクラ種子の抽出物、抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物が熱水抽出物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素分解物がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼによる加水分解物である請求項２に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月10日(2019.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟種子の加工物を含有してなる、皮膚の線維芽細胞由来エラスターゼの阻害用経口組成物。
【請求項２】
前記加工物がオクラ種子の抽出物、抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物が熱水抽出物である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素分解物がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼによる加水分解物である請求項２に記載の組成物。