(57)【要約】【課題】ＯＳＰＡキメラおよびそのワクチンでの使用法の提供。【解決手段】本発明は、新規ライムワクチンにおいて使用するためのキメラＯｓｐＡ分子の開発に関する。より詳細には、キメラＯｓｐＡ分子は、１つのＯｓｐＡ血清型由来の近位部を、別のＯｓｐＡ血清型由来の遠位部と共に含み、親ポリペプチドの両方の抗原特性を保持したままである。キメラＯｓｐＡ分子は単独で、または組み合わされて送達され、様々なボレリア遺伝種に対する防御を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にはキメラOspAポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、これらの分子を含む組成物、その使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライム病は、ボレリアブルグドルフェリセンスラト（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ）（ｓ．ｌ．）により引き起こされるマダニ媒介疾患である。疾患は典型的にはダニ咬傷部位での拡大する赤い発疹の発症、その後に起こり得る全身合併症例えば、髄膜炎、心炎または関節炎により特徴づけられる。ライム病のほとんど全ての症例が、３つの遺伝種、ボレリアアフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリアガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）およびボレリアブルグドルフェリセンスストリクト（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）（ｓ．ｓ．）の１つにより引き起こされる。欧州では、ヒトに感染する３つの種すべてが見いだされている。しかしながら、北米では、唯一の種、ボレリアブルグドルフェリセンスストリクトのみが見いだされている。ボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）は、ボレリア属のスピロヘータクラスのグラム陰性菌種である。ライム病の抗生物質治療は通常、有効であるが、患者の中には関節または神経系に関連する疾患の慢性身体障害性形態を発症するものもおり、これは、非経口抗生物質療法後でさえも実質的には改善せず、よって、ハイリスク集団のためのワクチンの必要性が強調されている。
【０００３】
細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）は、イクソデスダニの中腸に存在するボレリアブルグドルフェリｓ．ｌ．種により発現される３１ｋＤａ抗原である。ＯｓｐＡは、北米においてライム病を防止するのに効果的であることが証明されている(非特許文献１（Steere
et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  339:  209-15,1998）;  非特許文献２（Sigal  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  339:216-22,  1998）;  erratum  in:  N.  Engl.  J.  Med.  339:571,  1998)。完全にプロセシングされたＯｓｐＡのアミノ末端は、タンパク質
を細菌膜の外表面に固着させる３つの脂肪−アシル鎖で翻訳後修飾されたシステイン残基である(非特許文献３（Bouchon  et  al.,  Anal.  Biochem.  246:  52-61,  1997）)。ＯｓｐＡの脂質付加は分子を安定化することが報告されており(Luft,  私信)、強いアジ
ュバントが存在しない場合の防御に必須である(非特許文献４（Erdile  et  al.,  Infect.  Immun.  61:  81-90,  1993）)。アミノ末端脂質膜アンカーを欠くタンパク質の可溶な組換え形態は、凝集マウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントと共結晶化されＯｓｐＡの構造を決定し、これは２１の逆平行β鎖、続いて単一α−へリックスを含むことが示された  (非特許文献５（Li  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  94:3584-9,  1997）)。
【０００４】
一価ＯｓｐＡ系ワクチン（ＬＹＭＥｒｉｘ（登録商標））がライム病の防止のために米国で市販された。しかしながら、欧州では、３つの遺伝種にわたるＯｓｐＡ配列の不均一性が、単一株由来のＯｓｐＡに基づくワクチンによる広い防御を妨げている(非特許文献
６（Gern  et  al.,  Vaccine  15:1551-7,  1997）)。７つの主要なＯｓｐＡ血清型がヨーロッパ分離株中で認識されている（指定血清型１〜７、非特許文献７（Wilske  et  al.,  J.  Clin.  Microbiol.  31:340-50,  1993）)。ＯｓｐＡ血清型は種と相関し；血清型１はＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．に対応し、血清型２はＢ．アフゼリに対応し、および血清型３〜７はＢ．ガリニに対応する。
【０００５】
ＯｓｐＡによる免疫化により獲得された防御免疫は、宿主の免疫応答と病原体の間の相互作用が宿主内で起こらず、マダニベクターの中腸で起こるので異常である。ライム病の場合、マダニは動物からヒトへのライム病の伝達に対するベクターまたは担体として機能する。感染したマダニによる摂食中に獲得されたＯｓｐＡ特異抗体は、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．の免疫化哺乳類宿主への伝達を防止する(非特許文献８（de  Silva  et  al.,  J.  Exp.  Med.  183:  271-5,  1996）)。防御は、抗体媒介であり、殺菌抗体によ
り主に与えられるが、スピロヘータのマダニ腸上皮の内膜上の受容体への付着をブロックする抗体もまた効果的であり得る(非特許文献９（Pal  et  al.,  J.  Immunol.  166:  7398-403,  2001）)。
【０００６】
有効ＯｓｐＡワクチンの合理的開発には、防御エピトープ、例えば防御モノクローナル抗体ＬＡ−２により規定されるものの同定が必要である(非特許文献１０（Golde  et  al.,  Infect.  Immun.  65:  882-9,  1997）)。Ｘ線結晶解析およびＮＭＲ分析がＯｓｐ
Ａにおける免疫学的に重要な高頻度可変ドメインを同定するために使用され、ＬＡ−２エピトープがアミノ酸２０３−２５７に位置づけされている(非特許文献１１（Ding  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  302:  1153-64,  2000）;非特許文献１２（Luft  et  al.  J  Infect  Dis.  185  (Suppl.  1):  S46-51,  2002）)。
当技術分野では、米国、欧州、および他の場所に存在するボレリアの様々な種に対し広い防御を提供することができるＯｓｐＡワクチンの開発が必要である。下記開示は、そのようなワクチンの明細を記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Steere  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  339:  209-15,1998
【非特許文献２】Sigal  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  339:216-22,  1998
【非特許文献３】Bouchon  et  al.,  Anal.  Biochem.  246:  52-61,  1997
【非特許文献４】Erdile  et  al.,  Infect.  Immun.  61:  81-90,  1993
【非特許文献５】Li  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  94:3584-9,  1997
【非特許文献６】Gern  et  al.,  Vaccine  15:1551-7,  1997
【非特許文献７】Wilske  et  al.,  J.  Clin.  Microbiol.  31:340-50,  1993
【非特許文献８】de  Silva  et  al.,  J.  Exp.  Med.  183:  271-5,  1996
【非特許文献９】Pal  et  al.,  J.  Immunol.  166:  7398-403,  2001
【非特許文献１０】Golde  et  al.,  Infect.  Immun.  65:  882-9,  1997
【非特許文献１１】Ding  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  302:  1153-64,  2000
【非特許文献１２】Luft  et  al.  J  Infect  Dis.  185  (Suppl.  1):  S46-51,  2002
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ライム病またはライムボレリア症の防止および治療に関連する当技術分野における１つ以上の要求に対処する。
【０００９】
本発明は、配列番号１、３、および５で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、３、および５で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子を含む。他の態様では、本発明は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。さらなる態様では、本発明は下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。さらに別の態様では、本発明は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明は、配列番号７、９、および１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号７、９、および１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子を含む。追加の態様では、本発明は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号７、配列番号９、または配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。さらなる態様では、本発明は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。さらに別の態様では、本発明は下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含む：（ａ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１１】
本発明は、本明細書で記載される宿主細胞を培養することによりポリペプチドを生成させるベクター、宿主細胞、およびプロセスを含む。いくつかの態様では、本発明は、本明細書で記載される核酸分子のいずれかを含むベクターを含む。他の態様では、本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、真核細胞である。他の態様では、宿主細胞は原核細胞である。様々な態様では、ポリペプチドを生成させるプロセスは、本明細書で記載される宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で培養することおよび任意でポリペプチドを培養物から単離することを含む。様々な態様では、本発明は、これらのキメラ核酸分子のいずれかまたはそのような核酸分子を含む任意のベクターおよび薬学的に許容される１つまたは複数の担体を含む組成物を含む。
【００１２】
本発明は、本明細書で記載される核酸分子のいずれか、または本明細書で記載されるベクターのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。いくつかの態様では、本発明は、本明細書で記載される核酸分子の少なくとも２つおよび薬学的に許容される担体を含み、核酸分子は異なるヌクレオチド配列を有する組成物を含む。特定の態様では、本発明は、配列番号１、３、および５で示されるヌクレオチド配列の組み合わせを含む組成物を含む。
【００１３】
本発明は、配列番号２、４、および６で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は配列番号２、４、および６で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチドを含む。追加の態様では、本発明は、少なくとも２００のアミノ酸残基を有し、配列番号２、４、および６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有する単離ポリペプチドを含む。さらなる態様では、本発明は配列番号８、１０、および１２で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む。さらに別の態様では、本発明は、配列番号８、１０、および１２で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は、少なくとも２００のアミノ酸残基を有し、配列番号８、１０、および１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列相同性を有する単離ポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明は、本明細書で記載されるポリペプチドのいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。いくつかの態様では、本発明は、本明細書で記載されるポリペプチドの少なくとも２つおよび薬学的に許容される担体を含み、ポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有する組成物を含む。特定の態様では、本発明は、配列番号２、４、および６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの組み合わせを含む組成物を含む。
【００１５】
本発明は、免疫原性組成物を含む。いくつかの態様では、本発明の免疫原性組成物は、本明細書で記載されるいずれかの組成物および薬学的に許容される担体を含む。様々な態様では、免疫原性組成物は、細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）タンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する。一定の態様では、免疫原性組成物は、ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する。特定の態様では、免疫原性組成物は、ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する特性を有する。一定の態様では、ボレリアは、ボレリアブルグドルフェリセンスラトである。特定の態様では、ボレリアは、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニまたはボレリアブルグドルフェリセンスストリクトである。さらなる態様では、ボレリアは、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤマトイまたはボレリアロネスタルである。いくつかの態様では、抗体は動物により産生される。さらなる態様では、動物は哺乳類である。さらに別の態様では、哺乳類はヒトである。
【００１６】
本発明は、ワクチン組成物を含む。いくつかの態様では、本発明のワクチン組成物は、本明細書で記載されるいずれかの免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む。様々な態様では、本発明は混合ワクチンを含む。一定の態様では、本発明の混合ワクチンは、本明細書で記載されるいずれかのワクチン組成物を少なくとも第２のワクチン組成物と共に含む。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、マダニ媒介疾患に対して防御する。様々な態様では、マダニ媒介疾患は、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症（ＨＭＥ）、ヒト顆粒球エーリキア症（ＨＧＥ）、南部ダニ関連発疹病（ＳＴＡＲＩ）、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Ｑ熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である。他の態様では、第２のワクチン組成物は下記からなる群より選択されるワクチンである：ダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチン。様々な態様では、第２のワクチン組成物は、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化に適合する季節的免疫化スケジュールを有する。
【００１７】
本発明は、被験体において免疫学的応答を誘導するための方法を含む。様々な態様では、そのような方法は、本明細書で記載される免疫原性組成物またはワクチン組成物のいずれかを被験体に、免疫学的応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む。一定の態様では、免疫学的応答は、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を含む。本発明は、本明細書で記載されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。
【００１８】
本発明は、被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法を含む。様々な態様では、そのような方法は、本明細書で記載されるワクチン組成物のいずれかまたは本明細書で記載される混合ワクチンのいずれかを被験体にボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む。他の態様では、そのような方法は、本明細書で記載される抗体のいずれかを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む。一定の態様では、そのような方法は、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のワクチン組成物で哺乳類を免疫化することにより生成された抗体またはそのフラグメントを被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む。いくつかの態様では、抗体またはそのフラグメントは、過免疫血清、過免疫血漿、またはその精製免疫グロブリン画分である。
【００１９】
本発明は、被験体においてボレリア感染またはライム病を受動的に防止するための方法であって、本明細書で記載されるワクチン組成物のいずれかで哺乳類を免疫化することにより生成された抗ＯｓｐＡ抗体またはそのフラグメントを被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含み、抗体またはそのフラグメントは精製免疫グロブリン調製物または免疫グロブリンフラグメント調製物である、方法を含む。
【００２０】
本発明は、被験体においてボレリア感染またはライム病を防止するための方法であって、本明細書で記載されるワクチン組成物のいずれかで被験体を免疫化した後生成された抗ＯｓｐＡモノクローナル抗体またはそのフラグメントを被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含む、方法を含む。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントはヒト化される。特定の態様では、モノクローナル抗体はＦ２３７／ＢＫ２である。
【００２１】
本発明は、薬剤の調製のための本発明の組成物の使用を含む。他の関連する態様もまた、本発明において提供される。
（項目１）
配列番号１、３、および５で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（項目２）
配列番号１、３、および５で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子。
（項目３）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子：
（ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。
（項目４）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。
（項目５）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
（項目６）
配列番号７、９、および１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（項目７）
配列番号７、９、および１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子。
（項目８）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子：
（ａ）配列番号７、配列番号９、または配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。
（項目９）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子：
（ａ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列。
（項目１０）
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
（ａ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目１２）
項目１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１３）
真核細胞である、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１４）
原核細胞である、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１５）
項目１２に記載の宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で培養し、任意で前記ポリペプチドを培養物から単離することを含む、ポリペプチドを生成させるプロセス。
（項目１６）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１１に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目１７）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも２つおよび薬学的に許容される担体を含み、前記核酸分子は異なるヌクレオチド配列を有する組成物。
（項目１８）
配列番号１、３、および５で示されるヌクレオチド配列の組み合わせを含む、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
配列番号２、４、および６で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目２０）
配列番号２、４、および６で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチド。
（項目２１）
少なくとも２００のアミノ酸残基を有し、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目２２）
配列番号８、１０、および１２で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目２３）
配列番号８、１０、および１２で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチド。
（項目２４）
少なくとも２００のアミノ酸残基を有し、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目２５）
項目１９〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目２６）
項目１９〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも２つおよび薬学的に許容される担体を含み、前記ポリペプチドは異なる配列を有する組成物。
（項目２７）
配列番号２、４、および６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの組み合わせを含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
項目１６〜１８および２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。
（項目２９）
項目１６〜１８および２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物および医薬担体を含み、細胞表層タンパク質（Ｏｓｐ）Ａタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。
（項目３０）
項目１６〜１８および２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含み、ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。（項目３１）
項目１６〜１８および２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含み、ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。
（項目３２）
ボレリアは、ボレリアブルグドルフェリセンスラトである、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３３）
ボレリアは、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニまたはボレリアブルグドルフェリセンスストリクトである、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３４）
ボレリアは、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤマトイまたはボレリアロネスタルである、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３５）
項目２８〜３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
（項目３６）
項目３５に記載のワクチン組成物を少なくとも第２のワクチン組成物と共に含む、混合ワクチン。
（項目３７）
前記第２のワクチン組成物は、マダニ媒介疾患に対して防御する、項目３６に記載の混合ワクチン。
（項目３８）
前記マダニ媒介疾患は、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症（ＨＭＥ）、ヒト顆粒球エーリキア症（ＨＧＥ）、南部ダニ関連発疹病（ＳＴＡＲＩ）、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Ｑ熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である、項目３７に記載の混合ワクチン。
（項目３９）
前記第２のワクチン組成物は下記からなる群より選択されるワクチンである、項目３７に記載の混合ワクチン：ダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチン。
（項目４０）
前記第２のワクチン組成物は、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化に適合する季節的免疫化スケジュールを有する、項目３６に記載の混合ワクチン。
（項目４１）
被験体において免疫学的応答を誘導するための方法であって、項目２８〜３４のいずれか一項に記載の組成物を被験体に、免疫学的応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目４２）
前記免疫学的応答は、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目３５または３６に記載のワクチン組成物を前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目４４）
項目１９〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
（項目４５）
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目４４に記載の抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目４６）
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目２８〜３４のいずれか一項に記載のワクチン組成物で哺乳類を免疫化することにより生成された抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目４７）
前記抗体またはそのフラグメントは、過免疫血清、過免疫血漿、またはその精製免疫グロブリン画分である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
被験体においてボレリア感染またはライム病を受動的に防止するための方法であって、項目２８〜３４のいずれか一項に記載のワクチン組成物で哺乳類を免疫化することにより生成された抗ＯｓｐＡ抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含み、前記抗体またはそのフラグメントは精製免疫グロブリン調製物または免疫グロブリンフラグメント調製物である、方法。（項目４９）
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止ための方法であって、項目２８〜３４のいずれか一項に記載のワクチン組成物で被験体を免疫化した後生成された抗ＯｓｐＡモノクローナル抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目５０）
前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントはヒト化される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記モノクローナル抗体はＦ２３７／ＢＫ２である、項目４９に記載の方法。
【００２２】
前記概要は、本発明の全ての態様を規定することを意図せず、追加の態様は、他のセクション、例えば下記詳細な説明で記載される。文書全体は統合された開示として関連することが意図され、本明細書で記載される特徴の全ての組み合わせが、例えその特徴の組み合わせがこの文書の同じ文章、段落、またはセクションにおいて一緒に見られなくても、企図されることが理解されるべきである。本発明の他の特徴および利点は、下記詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、例示により示されるにすぎないことが理解されるべきであり、というのも、本発明の精神および範囲内にある様々な変更および改変は、この詳細な記載から当業者に明らかになるであろうからである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】脂質付加されたＯｓｐＡキメラコンストラクトの調製のための概略図を示す。
【図２】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１（配列番号２）のアミノ酸配列である。
【図３Ａ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１のヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３Ｂ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１のヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図４】lｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４（配列番号４）のアミノ酸配列である。
【図５Ａ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４のヌクレオチド（配列番号  ３）および推定アミノ酸配列ｓ  （配列番号４）を示す図である。
【図５Ｂ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４のヌクレオチド（配列番号  ３）および推定アミノ酸配列ｓ  （配列番号４）を示す図である。
【図６】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３（配列番号６）のアミノ酸配列である。
【図７Ａ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３のヌクレオチド（配列番号５）および推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図７Ｂ】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３のヌクレオチド（配列番号５）および推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図８】高レベル発現のためのコドン使用頻度の最適化を示す図である。
【図９】脂質付加されたおよび脂質付加されていないコンストラクトの間の配列差を示す図である。
【図１０】Ｔ７発現系の描写である。
【図１１】誘導されたおよび誘導されていない培養物由来の新規組換えＯｓｐＡタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１２】プラスミドｐＵＣ１８の地図である。
【図１３】プラスミドｐＥＴ３０ａの地図である。
【図１４】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３  Ｋｐｎ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩフラグメントの作成のための戦略を示す図である。
【図１５】ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１におけるアミノ酸変化（配列番号３９）を強調するアライメントおよび変化を誘導するために使用されたＰＣＲプライマー配列（配列番号２１および４１）である（ｌｉｐＢ  ＯｓｐＡ  １／２  ｍｏｄ  （配列番号３８）；コンセンサス配列（配列番号４０）。
【図１６Ａ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ＢＰＢＰ／Ａ１の修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドは、オリジナル配列（配列番号４２）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号  ４３）である。注：配列の最初の３つの塩基（ＣＡＴ）は示されていない；それらはＮｄｅ  Ｉ部位ＣＡＴＡＴＧの一部を形成する。
【図１６Ｂ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ＢＰＢＰ／Ａ１の修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドは、オリジナル配列（配列番号４２）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号  ４３）である。注：配列の最初の３つの塩基（ＣＡＴ）は示されていない；それらはＮｄｅ  Ｉ部位ＣＡＴＡＴＧの一部を形成する。
【図１７Ａ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ＫＴの修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドはオリジナル配列（配列番号４４）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号４５）である。注：配列の最初の１つの塩基（Ｃ）は示されていない；それらはＮｄｅ  Ｉ部位ＣＡＴＡＴＧの一部を形成する。
【図１７Ｂ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ＫＴの修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドはオリジナル配列（配列番号４４）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号４５）である。注：配列の最初の１つの塩基（Ｃ）は示されていない；それらはＮｄｅ  Ｉ部位ＣＡＴＡＴＧの一部を形成する。
【図１８Ａ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ５／３の修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドはオリジナル配列（配列番号４６）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号４７）である。
【図１８Ｂ】Ｂｌｉｐ  ＯｓｐＡ  ５／３の修飾分子ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３とのＯｓｐＡ配列のアライメントである。上のストランドはオリジナル配列（配列番号４６）であり、下のストランドは最適化配列（配列番号４７）である。
【図１９】Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．Ｂ３１株による誘発前に３ｎｇのＯｓｐＡ  １／２で免疫化させた防御および感染動物間での抗体表面結合および増殖阻害アッセイにおける機能的抗ＯｓｐＡ応答の分布を示す図である。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐ値は、防御および感染動物間での機能的抗体含量の極めて大きな差を証明した。
【図２０】野生マダニによる誘発前に３ｎｇのＯｓｐＡ  １／２で免疫化させた防御および感染動物間での抗体表面結合および増殖阻害アッセイにおける機能的抗ＯｓｐＡ応答の分布を示す図である。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐ値は、防御および感染動物間での機能的抗体含量の極めて大きな差を証明した。
【図２１】３成分キメラＯｓｐＡワクチンの３つの投与による免疫化後のプールマウス血清における表面結合（平均蛍光強度（ＭＦＩ））および増殖阻害（ＧＩ−５０力価）を示す図である。効率的な表面結合および増殖阻害が、ワクチン（１−６型）におけるＯｓｐＡ型に相同的なＯｓｐＡ型を発現する６つ全てのボレリア株に対して検出された。
【図２２】表面結合アッセイ（ＳＢＡ）において、ｒＯｓｐＡワクチンの組み合わせで免疫化した個々のマウス由来の第４２日血清を用いて得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）力価を示す図である。結果は、Ｃ３Ｈマウスにおける６株全てに対し、３つ全てのｒＯｓｐＡ成分（１／２、６／４、および５／３）が表面結合ＩｇＧ抗体の高い力価を誘導する多価ワクチンにおいて必要とされることを示した。２成分ワクチンは、２欠損株を完全にはカバーしなかった。
【図２３】ｒＯｓｐＡワクチンの組み合わせで免疫化した個々のマウス（１０匹の群において）由来の第４２日血清を用いたボレリアの増殖阻害を示す図である。多価ワクチン（３つ全ての株を含むワクチン）のみが、動物（ｎ＝１０）の＞９０％において＞５０％増殖阻害を与えた。黒色棒（ベタな棒）は使用されたワクチンに相同的な株を示す。
【図２４】ＯｓｐＡの型内変異体を発現するボレリアのカバレッジを示す図である。表面結合は、強い（蛍光が＞１０倍増加）またはより弱い（蛍光が２−１０倍増加）に分類された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ライム病またはボレリア感染のための免疫原性組成物またはワクチン組成物として送達させることができる抗原として有用なキメラＯｓｐＡ分子を提供する。本発明の実施形態が詳細に説明される前に、本発明は、その適用において下記説明で示される、または図および実施例で示される成分の構成および配列の詳細に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用されるセクション見出しは、組織的目的にすぎず、記載された対象に限定するものと解釈されるべきではない。本出願において引用された参考文献は明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本発明は他の実施形態を含み、様々な様式で実施または実行される。また、本明細書で使用される表現および専門用語は説明のためのものであり、限定するものとみなすべきではないことが理解されるべきである。「含む」、「備える」または「有する」という用語およびその変形は、その後に列挙されたアイテムまたはその等価物ならびに追加のアイテムを包含することを意味する。
【００２６】
本発明の実施形態は、３つの異なる脂質付加されたＯｓｐＡ分子をコードする３つのキメラＯｓｐＡコード配列の設計および合成において例示され、これらは全て共通の特徴を共有する。各キメラコード配列は、２つのＯｓｐＡ血清型を表し、キメラコード配列は、安全で著しく免疫原性で、Ｂ．ブルグドルフェリセンスラト（ｓ．ｌ．）による感染に対する被験体防御を可能にする安定なキメラＯｓｐＡ分子をコードするように設計された。
【００２７】
１つの態様では、キメラＯｓｐＡ分子は、１つのＯｓｐＡ血清型由来の近位部を、別のＯｓｐＡ血清型由来の遠位部と共に含み、両方の親ポリペプチドの防御特性を維持したままである。キメラＯｓｐＡ核酸分子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、抗原を提供し、これは、混合ワクチンとして製剤化することができ、欧州におけるライム病またはボレリア感染と関連する６つ全ての流行性血清型（血清型１−６）に対する、および北米におけるライム病またはボレリア感染と関連する単一のＯｓｐＡ血清型に対する防御が提供される。血清型１−６を含むワクチンは、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．ガリニ、およびＢ．ブルグドルフェリに対する防御を提供するので、ワクチンは世界的利用のために設計される。
【００２８】
本発明はまた、１つの態様では、脂質付加されたＯｓｐＡ分子を生成するのに必要とされるリーダー配列をコードする核酸配列を除去することにより、３つの遺伝子の第１の組から誘導されるキメラＯｓｐＡコード配列の第２の組の調製を含む。２つの組のコンストラクト（脂質付加されたおよび脂質付加されていないポリペプチドを生じさせる）は、発酵槽における生成の容易さを評価するために（バイオマス、安定性、生成収率など）、異なる型の抗原がどれだけ容易に精製することができるかを評価するために、およびそれらの生物学的特性を比較するために（安全性プロファイルおよび防御能力）必要とされた。
【００２９】
本発明は、本発明のキメラＯｓｐＡ分子を含む免疫原性組成物を含む。本発明は同様に、そのようなＯｓｐＡ分子を含むワクチンおよびワクチンキット、免疫原性組成物およびワクチンを製造するためのプロセスおよびヒトおよび獣医学的医学療法および防止における免疫原性組成物およびワクチンの使用を含む。本発明はさらに、本明細書で記載されるＯｓｐＡ組成物を使用してライム病またはボレリア感染に対して免疫化する方法およびライム病またはボレリア感染の防止のための薬剤の製造におけるＯｓｐＡ組成物の使用を含む。
【００３０】
定義
別記されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。下記参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する：  Singleton,  et  al.,
DICTIONARY  OF  MICROBIOLOGY  AND  MOLECULAR  BIOLOGY  (2d  ed.  1994);  THE  CAMBRIDGE  DICTIONARY  OF  SCIENCE  AND  TECHNOLOGY  (Walker  ed.,  1988);  THE
GLOSSARY  OF  GENETICS,  5TH  ED.,  R.  Rieger,  et  al.  (eds.),  Springer  Verlag  (1991);およびHale  and  Marham,  THE  HARPER  COLLINS  DICTIONARY  OF  BIOLOGY  (1991)。
【００３１】
下記略称が全体にわたって使用される。
ＡＡ                    アミノ酸
Ａｍｐ                  アンピシリン
ｂｐ                    塩基対
Ｂ．アフゼリ            ボレリアアフゼリ
Ｂ．ブルグドルフェリ    ボレリアブルグドルフェリ
Ｂ．ガリニ              ボレリアガリニ
ＤＮＡ                  デオキシリボ核酸
ｄＮＴＰ                デオキシヌクレオチド三リン酸
Ｅ．ｃｏｌｉ            大腸菌
ＧＣ含量                グアニンおよびシトシン塩基を含む配列のパーセンテージ
ｈＬＦＡ−１            ヒト白血球機能関連抗原−１
ＨＰＬＣ                高速液体クロマトグラフィー
ＩＰ                    知的所有権
ＩＰＴＧ                イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
Ｋａｎ                  カナマイシン
ｋＤａ                  キロダルトン
ＬＢ                    ルリアブロス
Ｌｉｐ  Ｂ              細胞表層タンパク質Ｂ由来のリーダー配列
Ｍａｂ                  モノクローナル抗体
ＯＤ                    光学密度
ＯｓｐＡ                細胞表層タンパク質Ａ
ＯｓｐＢ                細胞表層タンパク質Ｂ
ＰＣＲ                  ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ                  リボ核酸
ｓ．ｌ．                センスラト
ｓ．ｓ．                センスストリクト
ＳＤＳ                  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＭＫ                  大腸菌のための増殖培地（ケトグルタル酸ソルビトール培地）ｔＲＮＡ                転移リボ核酸
ＷＣＢ                  ワーキングセルバンク
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に別記されない限り、複数の言及を含むことがここでは留意されるべきである。
【００３３】
本明細書では、下記用語は、別記されない限り、それらに属する意味を有する。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、１つ以上のポリペプチド、タンパク質または酵素の全てまたは一部を含むアミノ酸の配列をコードし、イントロン、および制御ＤＮＡ配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー配列、５’−非翻訳領域、または３’−非翻訳領域（例えば、遺伝子が発現される条件に影響する）を含むかまたは含まない可能性のあるＤＮＡ配列を示す。本開示では、ＯｓｐＡ遺伝子は細菌性であり、よって、イントロンはない。「コード配列」という用語は、アミノ酸の配列をコードするが、イントロンまたは制御配列を含まないＤＮＡ配列を示す。同様に、本開示では、ＯｓｐＡコード配列は制御配列を含まない。
【００３５】
「核酸」または「核酸配列」または「核酸分子」は一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマを示す。この用語は、周知のヌクレオチド類似体または修飾バックボーン残基または結合を含む核酸を含み、これらは合成、天然由来、および非天然由来であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される。そのような類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの周知の塩基類似体、例えば、限定はされないが４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸チルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンのいずれかから形成された分子を含む。
【００３６】
別記されない限り、特定の核酸配列はまた、暗にその保存的修飾変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示された配列を含む。具体的には、縮重コドン置換は、いくつかの態様では、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成させることにより達成される(Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.  19:5081  (1991);  Ohtsuka  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  260:2605-2608  (1985);  Rossolini  et  al.,
Mol.  Cell.  Probes  8:91-98  (1994))。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍ
ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと同じ意味で使用される。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書では、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基のポリマを表すために、同じ意味で使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然由来アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマ、ならびに天然由来アミノ酸ポリマおよび非天然由来アミノ酸ポリマに当てはまる。「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを示す。「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを示す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を用いて合成することができる。
【００３８】
「ＯｓｐＡ分子」または「キメラＯｓｐＡ分子」という用語は、１つの態様では、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号５（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号７（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号９（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１１（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のヌクレオチド配列を含む「ＯｓｐＡ核酸」、あるいは、別の態様では、配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列を含む「ＯｓｐＡポリペプチド」を示す。
【００３９】
「ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ分子」という用語は、１つの態様では、配列番号１（ｌｉｐＢ
ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号５（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のヌクレオチド配列を含む「ＯｓｐＡ核酸」、あるいは、別の態様では配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列を含む「ＯｓｐＡポリペプチド」を示す。配列番号７、９、および１１の核酸配列はｌｉｐＢ  リーダー配列（ＭＲＬＬＩＧＦＡＬＡＬＡＬＩＧ（配列番号１３）をコードする核酸配列を欠いている。加えて、配列番号７、９、および１１の核酸配列は、配列番号２、４および６におけるｌｉｐＢリーダー配列のカルボキシ末端に存在するシステイン残基の代わりに、配列番号８、１０、および１２のアミノ末端のメチオニン残基をコードする。  
【００４０】
「ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ分子」または「オリジナルｓＯｓｐＡ分子」という用語は、１つの態様では、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のヌクレオチド配列を含む「ＯｓｐＡ核酸」、あるいは、別の態様では、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列を含む「ＯｓｐＡポリペプチド」を示す。これらの「オリジナル」分子は、突然変異およびコドン最適化を有さないキメラコンストラクトである。
【００４１】
本発明は「脂質付加されたＯｓｐＡ」および「脂質付加されていないＯｓｐＡ」キメラ分子を含む。様々な態様では、脂質付加は、ＯｓｐＡにアジュバント特性を与える。本発明のいくつかの態様では、脂質付加されたＯｓｐＡ分子はＯｓｐＢリーダー配列を含む。本発明のいくつかの態様では、ＯｓｐＢリーダー配列は、アミノ酸ＭＲＬＬＩＧＦＡＬＡＬＡＬＩＧ（配列番号１３）を含む。他の態様では、ＯｓｐＢリーダー配列は他のアミノ酸を含む。
【００４２】
当技術分野で知られているように「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を示す。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列の列間の対応により決定される、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（もしあれば）によるより小さな２つ以上の配列間の同一対応パーセントを測定する。「実質的同一性」は、特定の配列にわたり、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有する配列を示す。いくつかの態様では、同一性は、少なくとも約５０−１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。他の態様では、同一性は、少なくとも約１００−２００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。他の態様では、同一性は、少なくとも約２００−５００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。一定の態様では、パーセント配列相同性は、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータプログラムを使用して決定される。
【００４３】
本明細書で列挙されるいずれの数値も、下の値から上の値までの全ての値を含むこと、すなわち、列挙された最低値および最高値間の数値の全ての可能な組み合わせは本出願において明確に記載されていると考えられるべきであることもまた具体的に理解される。例えば、濃度範囲が約１％〜５０％として記載される場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％、などの値は、明確に本明細書で列挙されることが意図される。上記で列挙された値は、具体的に意図されるものの例にすぎない。
【００４４】
範囲は、様々な態様では、本明細書では「約」または「およそ」１つの特定の値からおよび／または「約」または「およそ」別の特定の値までとして表現される。値が先行する「約」を使用して近似として表される場合、いくらかの量の変動が範囲内に含まれることが理解されるであろう。
【００４５】
「類似性」という用語は関連概念であるが、「同一性」とは対照的に、類似性の尺度を表し、同一対応および保存的置換対応の両方を含む。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０同一アミノ酸を有し、残りは全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性はどちらも５０％である。同じ例において、保存的置換が存在する位置がさらに５つ存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）となる。よって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性の程度は、２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００４６】
「単離された核酸分子」という用語は、（１）タンパク質、脂質、炭水化物または、総ＤＮＡが起源細胞から単離された場合、自然に見られる他の材料から任意の程度まで分離された、（２）「単離された核酸分子」が自然界で結合されるポリヌクレオチドの全てまたは一部に結合されていない、（３）自然界で結合されていないポリヌクレオチドに動作可能に結合されている、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として自然界で起こらない本発明の核酸分子を示す。本明細書では実質的に含まないは、その自然環境で見いだされ、ポリペプチド生成における使用またはその治療、診断、予防または研究的使用を妨害するいずれの他の汚染核酸分子（複数可）または他の汚染物質も含まないことを示す。
【００４７】
「単離されたポリペプチド」という用語は、（１）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または、源細胞から単離された場合、自然に見られる他の材料から任意の程度まで分離された、（２）「単離されたポリペプチド」が自然界で結合されるポリペプチドの全てまたは一部に（共有または非共有相互作用により）結合されていない、（３）自然界で結合されていないポリペプチドに動作可能に（共有または非共有相互作用により）結合されている、または（４）自然界で起こらない本発明のポリペプチドを示す。１つの態様では、単離されたポリペプチドは、その自然環境で見いだされ、その治療、診断、予防または研究的使用を妨害するいずれの他の汚染ポリペプチドまたは他の汚染物質も実質的には含まない。
【００４８】
本明細書では、ポリペプチドの「フラグメント」は、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さなポリペプチドの任意の部分を示す。フラグメントは、典型的には、１つ以上のアミノ酸残基が全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去されている全長ポリペプチドの欠失類似体である。したがって、「フラグメント」は、下記で記載される欠失類似体のサブセットである。
【００４９】
本明細書では、「類似体」は、場合によっては異なる程度までであるが、天然由来分子と構造が実質的に類似し、同じ生物活性を有するポリペプチドを示す。類似体は、類似体が誘導される天然由来ポリペプチドに比べ、下記を含む１つ以上の突然変異に基づき、そのアミノ酸配列の組成が異なっている：（ｉ）ポリペプチド（上記フラグメントを含む）の１つ以上の末端および／または天然由来ポリペプチド配列の１つ以上の内部領域での１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端での（典型的には「付加」類似体）および／または天然由来ポリペプチド配列の１つ以上の内部領域での１つ以上のアミノ酸の挿入または付加（典型的には「挿入」類似体）、または（ｉｉｉ）天然由来ポリペプチド配列における他のアミノ酸の代わりの１つ以上のアミノ酸の置換。置換は、置換されるアミノ酸と置換するアミノ酸の物理化学または機能的関連性に基づき保存的または非保存的である。
【００５０】
「保存的に修飾された類似体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された核酸は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を示す。遺伝コードの縮重のために、多くの機能的に同一の核酸が任意の一定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化され得る。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に修飾された類似体の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（これは通常、メチオニンに対する唯一のコドンである）およびＴＧＧ（これは通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）は修飾することができ、機能的に同一の分子が得られることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は各記載される配列において、潜在している。
【００５１】
アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または小さいパーセンテージのアミノ酸を変化、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、挿入、欠失、付加、またはトランケーションは、この変化によりアミノ酸の化学的に同様なアミノ酸との置換が得られる場合「保存的に修飾された類似体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野ではよく知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体、およびアレルに追加され、それらを排除しない。
【００５２】
下記８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1）        アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）        アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）        アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）        アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）        イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）        フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）        セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）        システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）(例えば、Creighton,  Proteins  (1984)を参照されたい）。
【００５３】
本明細書では、「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を含むポリペプチド、タンパク質またはその類似体を示し、ただし、変異体が天然ポリペプチドの生物活性を保持することを条件とする。
【００５４】
本明細書では、「アレル変異体」は、同じ遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の多形のいずれかを示す。アレル変異は、突然変異により自然に生じ、いくつかの態様では、集団内での表現型多形となる。一定の態様では、遺伝子突然変異はサイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化なし）、または、他の態様では、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。「アレル変異体」はまた、遺伝子アレル変異体のｍＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ、ならびにそれらによりコードされたタンパク質を示す。
【００５５】
「誘導体」という用語は、治療または診断薬への結合、ラベリング（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ポリマ共有結合例えばペグ化（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換により、共有結合により修飾されたポリペプチドを示す。いくつかの態様では、誘導体は、通常、分子の一部ではない追加の化学的部分を含むように修飾される。そのような部分は、様々な態様では、分子の溶解度、吸収、および／または生物学的半減期を調節する。その部分は、様々な他の態様では、また、分子の毒性を減少させ、分子のいずれの望ましくない副作用なども排除または減弱させる。そのような効果を媒介することができる部分はRemington's
Pharmaceutical  Sciences  (1980)において開示される。そのような部分を分子に結合するための手順は、当技術分野ではよく知られている。例えば、いくつかの態様では、ＯｓｐＡ誘導体はインビボでタンパク質により長い半減期を与える化学修飾を有するＯｓｐＡ分子である。１つの実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で知られている水溶性ポリマの付加により修飾される。関連する実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化、ペグ化、および／またはポリシアリル化により修飾される。
【００５６】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入または天然核酸またはタンパク質の変化により修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示す。よって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内では見られない遺伝子を発現し、またはそうでなければ異常に発現され、低発現され、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００５７】
本明細書では、「選択可能なマーカー」は、遺伝子が発現される細胞または生物に同定可能な表現型変化、例えば薬物、抗生物質または他の作用物質に対する抵抗性を与える酵素または他のタンパク質をコードする遺伝子を示し、よって、マーカーの発現または活性は、賛成（例えば、限定はされないが、陽性マーカー、例えばネオ遺伝子）または反対（例えば、限定はされないが、陰性マーカー、例えばジフテリア遺伝子）に対して選択される。「異種の選択可能なマーカー」は、通常は見い出されない動物のゲノム中に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を示す。
【００５８】
選択可能なマーカーの例としては、抗生物質抵抗性遺伝子、例えばネオマイシン（ｎｅｏ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）、ジフテリア毒素、ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、当技術分野で知られている任意の選択可能なマーカーが本明細書で記載される方法において有用であることを理解するであろう。
【００５９】
「異種」という用語は、核酸の部分に関連して使用される場合、核酸が自然界で互いに同じ関係で見いだされない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えで生成され、新規機能性核酸を生成するように配列された非関連遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの起源由来のプロモーターおよび別の起源由来のコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が自然界で互いに同じ関係で見いだされない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００６０】
本明細書では、「相同」という用語は、「共通の進化上の起源」を有するタンパク質、例えばスーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質および異なる種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖、など）の関係を示す(Reeck  et  al.,  Cell  50:667,  1987)。そのようなタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、それらの配列類似性により反映されるように、パーセント類似性または保存位置での特定の残基かそれともモチーフの存在の観点で、配列相同性を有する。
【００６１】
比較のための配列の最適アライメントは、例えば、限定はされないが、下記により実施される：Smith  et  al.,  Adv.  Appl.  Math.  2:482,  1981の局地的相同性アルゴリ
ズム;  Needleman  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  48:443,  1970の相同性アライメントアルゴリズム;  Pearson  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:2444,  1988の類似法の調査;これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin  Genetics  Software  Package,  Genetics  Computer  Group,  575  Science  Dr.,  Madison,  WI
におけるGAP,  BESTFIT,  FASTA,  およびTFASTA)、または目視検査(一般的にはAusubel
et  al.,  上記を参照されたい)。パーセント配列相同性および配列類似性を決定する
ために好適なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはAltschul
et  al.,  J.  Mol.  Biol.  215:403-410,  1990に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実
施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。パーセント配列相同性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:5873-5787,  1993を参照されたい)。
【００６２】
「ベクター」という用語は、コーディング情報を宿主細胞に伝達するのに使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を示すために使用される。
【００６３】
「クローニングベクター」は、外来ＤＮＡフラグメントを挿入することができるＤＮＡの小片である。フラグメントのクローニングベクターへの挿入は、媒体と外来ＤＮＡを同じ制限酵素で処理し、その後、フラグメントを共に連結することにより実施される。多くの型のクローニングベクターが存在し、全ての型のクローニングベクターが本発明で使用される。遺伝子操作されたプラスミドおよびバクテリオファージ（例えばファージλ）がおそらく最も一般にこの目的のために使用される。他の型のクローニングベクターとしては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
【００６４】
「発現ベクター」は、組換えでまたは合成的に、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素と共に作成された核酸コンストラクトである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部とすることができる。一定の態様では、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に結合され転写される核酸を含む。
【００６５】
「コード配列」という用語は、本明細書では、ｍＲＮＡに転写され、適切な制御配列の制御下に置かれるとポリペプチドに翻訳される核酸配列として規定される。コード配列の境界は、一般的にはＡＴＧ開始コドンにより決定され、これは通常、ｍＲＮＡの５’端のオープンリーディングフレームの開始およびｍＲＮＡの３’端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写終結配列である。コード配列としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様では、プロモーターＤＮＡ配列は、これに関連するコード配列の上流に位置するＤＮＡ配列であること、またはこのコード配列の発現を制御することができることにより規定される。
【００６６】
「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する核酸制御配列のアレイとして規定される。本明細書では、プロモーターは、転写の開始点付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素を含む。プロモーターはまた、任意で遠位エンハンサーまたはリプレッサ要素を含み、これらは転写開始点から数千もの塩基対離れて位置することができる。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生制御下で活性であるプロモーターである。
【００６７】
「動作可能に結合された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列の間の機能的結合を示し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【００６８】
「形質導入」という用語は、通常ファージによる１つの細菌から別の細菌への核酸の伝達を示すために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および伝達を示す。
【００６９】
「トランスフェクション」という用語は、外来または外因性ＤＮＡの細胞による取り込みを示すために使用され、細胞は外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された時に「トランスフェクト」される。多くのトランスフェクション技術が当技術分野でよく知られており、本明細書で開示される。例えば、Graham  et  al.、Virology、52:456  (1973);  Sambrook  et  al.、Molecular  Cloning、a  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratories、New  York、(1989);  Davis  et  al.、Basic  Methods  in  Molecular
Biology、Elsevier、(1986);  およびChu  et  al.、Gene、13:197  (1981)を参照されたい。そのような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入するために使用することができる。
【００７０】
本明細書では、「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を示し、細胞は、新規ＤＮＡを含むように修飾された場合、トランスフォームされた。例えば、細胞は、その天然状態から遺伝的に修飾された場合、トランスフォームされた。トランスフェクションまたは形質導入後、トランスフォームするＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことにより、細胞のそれと再結合し得る。場合によっては、ＤＮＡは、複製されずにエピソーム要素として一時的に維持され、またはプラスミドとして独立して複製する。細胞は、ＤＮＡが、細胞分裂と共に複製されると、安定にトランスフォームされたと考えられる。
【００７１】
「内因性」という用語は、自然に宿主生物において発現される、または細胞、組織または生物内で生じるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは他の化合物を示す。「外因性」は、細胞、組織または生物外で生じるポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の化合物を示す。
【００７２】
「作用物質」または「化合物」という用語は、本発明における生物学的パラメータに影響する能力を有する任意の分子、例えば、タンパク質または医薬品を表す。
【００７３】
本明細書では、「対照」は、活性、陽性、陰性またはビヒクル対照を示すことができる。当業者により理解されるように、対照は、実験結果の関連性を確立し、試験された条件に対する比較を提供するために使用される。
【００７４】
「重症度を減少させる」という用語は、ライムまたはライム病の症状に関する場合、症状が、発症の遅延、重症度の減少を有し、または被験体への損傷の減少を引き起こすことを意味する。一般的には、症状の重症度は、例えば、活性予防または治療組成物を受理しない対照と比較される。その場合、組成物は、症状が、対照の症状レベルに比べ、１０％、２５％、３０％、５０％、８０％、または１００％（すなわち、本質的に排除される）だけ減少された場合、ライムの症状の重症度を減少させるということができる。
【００７５】
「抗原」という用語は、選択的結合作用物質、例えば抗体により結合され、さらに各抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生させるのに被験体において使用することができる分子または分子の一部を示す。抗原は、様々な態様では、１つ以上のエピトープを有する。
【００７６】
「抗体」という用語は、ＯｓｐＡポリペプチドに対し特異性を有する１つまたは複数の分子を示す。本明細書では、「特異的」、「特異性」および「特異的に結合する」という用語は、抗体の、ＯｓｐＡポリペプチドに結合するが、非ＯｓｐＡポリペプチドには結合しない能力を示す。一定の態様では、抗体は「中和抗体」であり、ここで、抗体は、感染病原体と反応し、その感染性または病原性を破壊または阻害する。本発明は、ボレリアを「中和する」抗体を含む免疫原性組成物を含む。
【００７７】
本明細書では、「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物としてのＯｓｐＡポリペプチド、ＯｓｐＡ核酸分子またはＯｓｐＡ抗体の送達を達成または増強するのに好適な１つ以上の製剤材料を示す。
【００７８】
「安定剤」という用語は、物質またはワクチン賦形剤を示し、これは、ワクチンの免疫原性組成物を、例えば加熱または凍結中に起こる悪条件から保護する、および／または安定な免疫原性条件または状態における免疫原性組成物の安定性または有効期間を長くする。安定剤の例としては、糖、例えばスクロース、ラクトースおよびマンノース；糖アルコール、例えばマンニトール；アミノ酸、例えばグリシンまたはグルタミン酸；およびタンパク質、例えばヒト血清アルブミンまたはゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
「抗菌性保存剤」という用語は、免疫原性組成物またはワクチンに添加され、複数回投与バイアルの繰り返し穿刺で（そのような容器が使用される場合）導入され得る微生物の増殖を阻害する任意の物質を示す。抗菌性保存剤の例としては、チメロサール、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、およびフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
「免疫原性組成物」という用語は、抗原（例えば、キメラＯｓｐＡ分子）（これに対し抗原特異性抗体が産生される）、被験体宿主の免疫応答を刺激するアジュバント、および好適な免疫学的に不活性な、薬学的に許容される担体を含む組成物を示す。任意で、免疫原性組成物は、１つ以上の安定剤を含む。任意で、免疫原性組成物は、１つ以上の抗菌性保存剤を含む。
【００８１】
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、特定の疾患（例えば、ライム病またはボレリア感染）に対する免疫を改善する生物学的製剤を示す。ワクチンは、典型的には疾患を引き起こす微生物に似た作用物質（例えば、ボレリアのキメラＯｓｐＡ分子（抗原））を含む。作用物質は身体の免疫系を刺激し、作用物質を外来と認識させ、これを破壊させ、これを「記憶」させ、よって、免疫系は後に遭遇するこれらの微生物のいずれをもさらに容易に認識し、破壊することができるようになる。ワクチンは、様々な態様では、予防的（任意の天然または「野生」病原体による将来の感染の効果を防止または寛解させる）、または治療的（現在の感染に対するワクチン）である。上記のように、そのようなワクチン組成物としては、薬学的に許容される担体を含む製剤が挙げられる。任意で、ワクチンはまた、１つ以上の安定剤および／または１つ以上の抗菌性保存剤を含む。
【００８２】
「有効量」および「治療的有効量」という用語はそれぞれ、本明細書で記載されるＯｓｐＡポリペプチドの１つ以上の生物活性の観察可能なレベルを支持するために使用される核酸分子、ポリペプチド、組成物、または抗体の量を示す。例えば、有効量は、本発明のいくつかの態様では、ボレリア感染を防止する、中和する、または減少させるのに必要な量である。
【００８３】
「組み合わせ」という用語は、本発明の２つ以上の核酸分子、または本発明の２つ以上のポリペプチドを示す。いくつかの態様では、本発明の分子の組み合わせが、本明細書で記載されるボレリアの６つの血清型（１−６）のうちの少なくとも４つに対して免疫を提供し、これらに起因する感染と闘うように投与される。様々な態様では、本発明の２つまたは３つの分子またはポリペプチドの組み合わせが使用される。一定の態様では、本発明の分子の組み合わせが被験体に投与され、本明細書で記載されるボレリアの６つ全ての血清型（１−６）に対して免疫が提供される。後者の組み合わせは、核酸分子またはポリペプチドの組み合わせにおいて存在しないＯｓｐＡ型を発現するボレリアの異種株に対する免疫を提供することが示されている。
【００８４】
「混合ワクチン」という用語は、１つ以上の疾患に対する１を超えるワクチン組成物または１を超える防御抗原を含むワクチン製剤を示す。本発明は、１つ以上の他の疾患に対する抗原に加えて、ライム病またはボレリアに対するＯｓｐＡキメラ抗原を含む混合ワクチンを含む。様々な態様では、１つ以上の他の疾患はマダニ媒介疾患である。一定の態様では、他のマダニ媒介疾患はロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症（ＨＭＥ）、ヒト顆粒球エーリキア症（ＨＧＥ）、南部ダニ関連発疹病（ＳＴＡＲＩ）、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Ｑ熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である。特定の態様では、本発明は、１つ以上のワクチン、例えばダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチンを含む混合ワクチンを含む。いくつかの態様では、混合ワクチンは、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化と適合する季節的免疫スケジュールを有するワクチン組成物を含む。さらに特定的な態様では、混合ワクチンは、これらの疾患が流行している地理的位置で使用するための複数疾患の防止に有用である。
【００８５】
「ボレリア」という用語は、ボレリア属のスピロヘータクラスのグラム陰性菌の種を示す。１つの態様では、「ボレリアブルグドルフェリセンスラト（ｓ．ｌ．）」は、より広義にボレリアブルグドルフェリを示す。ライム病またはボレリア症のほとんど全ての症例が、３つの遺伝種、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニおよびボレリアブルグドルフェリセンスストリクト（ｓ．ｓ．）（より厳密にＢ．ブルグドルフェリを示す）の１つにより引き起こされる。ボレリアのＯｓｐＡ血清型は種と相関し；血清型１はＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．に対応し、血清型２はＢ．アフゼリに対応し、および血清型３〜７はＢ．ガリニに対応する。様々な態様では、本発明の免疫原性またはワクチン組成物はまた、ボレリアの他の種、例えば、限定はされないが、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤマトイまたはボレリアロネスタルに対する防御を提供する。
【００８６】
「被験体」には、植物でなく、原生生物でない生物のその従来の意味が与えられる。ほとんどの態様では、被験体は動物である。特定の態様では、動物は哺乳類である。さらに特定的な態様では、哺乳類はヒトである。他の態様では、哺乳類はペットまたはコンパニオンアニマル、家畜、または動物園動物である。一定の態様では、哺乳類は、ネコ、イヌ、、ウマ、またはウシである。様々な他の態様では、哺乳類はシカ、マウス、シマリス、リス、オポッサム、またはアライグマである。
【００８７】
ライム病(ボレリア症またはライムボレリア症)
いくつかの態様では、本発明は、ライム病またはボレリア感染の防止におけるキメラＯｓｐＡ分子およびこれらの分子を含む組成物を含む。ライム病はまた、ボレリア症またはライムボレリア症として当技術分野で知られており、よって、これらの用語は全て本発明に含まれる。同様に、本発明は、本明細書で記載されるキメラＯｓｐＡ分子を投与することを含むライム病を防止または治療する方法を含む。ライム病、またはボレリア症はボレリア属に属する少なくとも３つの種のグラム陰性スピロヘータ細菌により引き起こされる感染症である。少なくとも１３のボレリア種が発見されており、そのうちの３つがライム関連であることが知られている。ライム病を引き起こすボレリア種はまとめてボレリアブルグドルフェリセンスラトとして知られており、多大な遺伝的多様性を示す。ボレリアブルグドルフェリセンスラト群は、おそらく大多数の症例の原因である３つの密接に関連する種から構成される。ボレリアブルグドルフェリセンスストリクトは、米国におけるライム病の主因である（しかし、欧州でも存在する）が、ボレリアアフゼリおよびボレリアガリニがほとんどの欧州の症例を引き起こす。いくつかの研究はまた、ボレリア種（例えば、ボレリアビセッティ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアルジタニエ、およびボレリアバライシアナ）が時として、ヒトに感染し得ることを提示している。これらの種は疾患の重要な原因であると考えられないが、これらの種に対する免疫原性防御もまた、本発明に含まれる。
【００８８】
ライム病は、北半球で最も一般的なマダニ媒介疾患である。疾患は、多くの症例が１９７５に同定されたコネティカット州ライム村にちなんで命名されたものである。ボレリアはイクソデス属の数種に属する感染したマダニ（「カタダニ」）の咬傷によりヒトに伝染する。初期症状としては、場合によっては、熱、頭痛、疲労、抑うつ、および遊走性紅斑と呼ばれる特徴的な円形皮疹が挙げられる。治療せずに放置すると、後期症状はしばしば、関節、心臓、および中枢神経系と関係する可能性がある。ほとんどの場合、感染およびその症状は、とりわけ病気が早期に治療された場合抗生物質により排除される。しかしながら、遅い、遅延した、または不十分な治療によって、より重篤な症状に至る可能性があり、これは身体障害性および治療困難となり得る。時折、関節炎などの症状が、感染が抗生物質により排除された後に持続する。
【００８９】
いくつかのグループは「慢性」ライム病は遅発ライム病の認識された症状を超えるある範囲の医学的に説明されていない症状の原因であり、追加の、長期抗生物質治療が必要とされることを主張している。しかしながら、長期治療は議論の余地があり、そのような治療に関する論争は、治療ガイドラインに対する法的行為に至っている。
【００９０】
ライム病は、齧歯類および鳥類を含む自然宿主からヒトへ、両方の組の宿主上で摂食するマダニによって伝染されるので人畜共通感染症として分類される。イクソデス属の硬い体のマダニが、ライム病の主ベクターである。ほとんどのヒト感染は、幼虫マダニは非常に小さく、長期間検出されずに摂食し得るので、幼虫段階のマダニにより引き起こされる。ダニ咬傷はしばしば、幼虫段階のマダニのサイズが小さいため、ならびに、宿主が咬傷によるいずれの痒みまたは疼痛も感じないようにするマダニ分泌物のために気付かれない。
【００９１】
ライム病は、症状、客観的な身体所見（例えば、遊走性紅斑、顔面神経麻痺、関節炎）、感染したマダニへの暴露可能性歴、ならびに血清学的血液検査に基づき臨床的に診断される。ライム病患者の約半数が特徴的な慢性遊走性紅斑を発症するが、多くがダニ咬傷を思い出せない。ライム病の症状を有さない人には、臨床試験は推奨されない。
【００９２】
研究室でボレリア細菌を培養するのは難しいので、ライム病の診断は典型的には臨床検査所見および流行ライム領域への暴露歴に基づく。遊走性紅斑（ＥＭ）発疹は、全ての症例の約５０％でしかおきないが、血清学的血液検査が陰性である場合であっても、ライム病の診断を確立するのに十分であると考えられる。血清学的試験は、臨床的に疑われる症例を支持するために使用することができるが、それ自体診断的ではない。後期ライム病の診断は、多くの他の疾患の症状によく似ている多くの多面的な外観のために、しばしば困難である。こういうわけで、評論家はライムを新規「グレートイミテーター」と呼んだ。ライム病は、場合によっては、多発性硬化症、関節リウマチ、線維筋痛症、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、ループス、または他の自己免疫および神経変性疾患として誤診されている。よって、当技術分野ではライム病を防止または治療するためのワクチンが非常に必要とされている。
【００９３】
ボレリアの細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）
様々な態様では、本発明は、ライム病またはボレリア感染の防止および治療におけるボレリアのキメラＯｓｐＡ分子およびこれらの分子を含む組成物を含む。このスピロヘータはマダニから哺乳類に伝染されるので、温度および／または哺乳類宿主特異シグナルにより上方制御されるいくつかのボレリア細胞表層タンパク質が、過去１０年にわたって同定されている。
【００９４】
ボレリアブルグドルフェリの主な細胞表層タンパク質、ＯｓｐＡは、ワクチン候補としてのその可能性のために特に興味深いリポタンパク質である。ボレリアの欧州および北米株両方由来のＯｓｐＡの血清型および遺伝子解析は、抗原および構造異種性を証明した。ＯｓｐＡは、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１４４８８号、Jiang  et  al.  (Clin.  Diagn.  Lab.  Immunol.  1:  406-12,  1994)において記載され、当技術分野で知られている。ＯｓｐＡは、マウス、ハムスターおよびイヌ誘発試験において防御免疫を誘導することが示されている。ヒトでの治験はＯｓｐＡ製剤がヒトにおいて安全であり、免疫原性であることを示す(Keller  et  al.,  JAMA  (1994)  271:1764  1768)。
【００９５】
ＯｓｐＡは、北米からのボレリアブルグドルフェリの臨床分離株の大部分において発現されるが、欧州の臨床ボレリア分離株の検査からは異なる像が現れた。欧州では、ライム病は主に、ボレリアの３つの遺伝種、すなわちＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニおよびＢ．アフゼリにより引き起こされる。本発明は、ボレリアの全ての遺伝種に対して防御免疫を提供するキメラＯｓｐＡ分子に関する。本発明は、共通の特徴を共有する３つの異なる脂質付加されたＯｓｐＡ分子をコードする３つのキメラＯspＡ遺伝子の設計および合成を記載する。各遺伝子は、２つのＯｓｐＡ血清型を表し、遺伝子は安全で高免疫原性であり、被験体にＢ．ブルグドルフェリセンスラト（ｓ．ｌ．）による感染に対する防御を提供する安定なＯｓｐＡ分子をコードするように設計された。本発明はまた、共通の特徴を共有する３つの異なる脂質付加されたＯｓｐＡ分子をコードする、突然変異を有さず、コドン最適化を有さない３つのオリジナルキメラＯｓｐＡ遺伝子を記載する。各遺伝子は、２つのＯｓｐＡ血清型を表し、被験体にＢ．ブルグドルフェリセンスラト（ｓ．ｌ．）による感染に対する防御を提供する分子をコードする。
【００９６】
７つの主要なＯｓｐＡ血清型は、欧州分離株間で認識されている（指定された血清型１〜７、Wilske  et  al.,  J.  Clin.  Microbiol.  31:340-50,  1993)。ＯｓｐＡ血清型は種と相関し；血清型１は、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓに対応し、血清型２はＢ．アフゼリに対応し、血清型３〜７はＢ．ガリニに対応する。欧州ボレリア分離株の疫学調査は、ＯｓｐＡ型１、２、３、４、５および６に基づくワクチンが欧州においてライム病の９８．１％ｅの理論的カバレッジを提供し、９６．７％の侵襲性疾患分離株をカバーすることを示す。本発明は、６つのキメラＯｓｐＡ核酸分子（配列番号１、３、および５、ならびに配列番号１６８、１７０、および１７２）および６つのキメラＯｓｐＡポリペプチド分子（配列番号２、４、および６、ならびに配列番号１６９、１７１、および１７３）を提供し、これらは、６つの全ての血清型１−６に対して防御免疫を提供することができる。６つの合成ＯＳＰＡ遺伝子は、ＯｓｐＡ血清型１および２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１  （配列番号１（核酸）および２（アミノ酸）ならびにｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ
１／２（配列番号１６８（核酸）および１６９（アミノ酸））；ＯｓｐＡ血清型６および４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４（配列番号３（核酸）および４（アミノ酸）ならびにｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４（配列番号１７０（核酸）および１７１（アミノ酸））；ならびにＯｓｐＡ血清型５および３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３（配列番号５（核酸）および６（アミノ酸）ならびにｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ５／３（配列番号１７２（核酸）および１７３（アミノ酸））由来の防御エピトープを有するＯｓｐＡ分子をコードするように設計された。キメラＯspＡ遺伝子は合成オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて作成された。これらの組換えタンパク質は、一定の態様では、高収率および純度で生成され、様々な態様では、所望の活性を最大化し、望ましくない活性を最小化するように操作される。
【００９７】
キメラＯｓｐＡ核酸分子およびポリペプチド分子
様々な態様では、本発明は、ボレリアのキメラＯｓｐＡ核酸およびポリペプチド分子を含む。本発明のＯｓｐＡ核酸は、配列番号１（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号５（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号７（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号９（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１１（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるヌクレオチド配列、または配列番号２（ｌｉｐＢ
ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成される核酸分子を含む。
【００９８】
配列番号７、９、および１１の核酸配列は、ｌｉｐＢリーダー配列（ＭＲＬＬＩＧＦＡＬＡＬＡＬＩＧ（配列番号１３）をコードする核酸配列を欠いている。加えて、配列番号７、９、および１１の核酸配列は、配列番号２、４、および６におけるｌｉｐＢリーダー配列のカルボキシ末端に存在するシステイン残基の代わりに、配列番号８、１０、および１２のアミノ末端のメチオニン残基をコードする。配列番号１、３、および５はｌｉｐＢ
ｓＯｓｐＡポリヌクレオチドであり、配列番号２、４、および６はｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡポリペプチドである。
【００９９】
いくつかの態様では、本発明は突然変異を有さず、コドン最適化を有さないボレリアのオリジナル（「ｏｒｉｇ」）キメラＯｓｐＡ核酸およびポリペプチド分子を含む。よって、本発明のＯｓｐＡ核酸は、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、もしくは配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるヌクレオチド配列、または配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成される核酸分子を含む。
【０１００】
キメラＯｓｐＡ分子に対するＤＮＡおよびアミノ酸配列に対する配列識別番号は、下記表１で示される。
【表１】
2020178719.tif 000002
lipB  sOspA  1/2251
【表１Ａ−１】
2020178719.tif 000003
lipB  sOspA  6/4
【表１Ａ−２】
2020178719.tif 000004
lipB  sOspA  5/3
【表１Ａ−３】
2020178719.tif 000005
sOspA  1/2251
【表１Ａ−４】
2020178719.tif 000006
sOspA  6/4
【表１Ａ−５】
2020178719.tif 000007
sOspA  5/3
【表１Ａ−６】
2020178719.tif 000008
Orig  sOspA  1/2
【表１Ａ−７】
2020178719.tif 000009
Orig  sOspA  6/4
【表１Ａ−８】
2020178719.tif 000010
Orig  sOspA  5/3
【表１Ａ−９】
2020178719.tif 000011
【０１０１】
本発明のＯｓｐＡポリペプチドは配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成されるポリペプチドおよび関連ポリペプチドを含む。関連ポリペプチドは、ＯｓｐＡポリペプチド類似体、ＯｓｐＡポリペプチド変異体およびＯｓｐＡポリペプチド誘導体を含む。いくつかの態様では、ＯｓｐＡポリペプチドは、それらが調製される方法によってアミノ末端メチオニン残基を有する。関連する態様では、本発明のＯｓｐＡポリペプチドはＯｓｐＡ活性を含む。
【０１０２】
１つの実施形態では、関連核酸分子は、配列番号１（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号５（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号７（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号９（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１１（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるヌクレオチド配列と約７０パーセント（７０％）同一または類似するヌクレオチド配列を含み、またはから構成され、一定の態様では、配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるポリペプチドと約７０パーセント（７０％）同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成される。様々な実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号３（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号５（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号７（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号９（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１１（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ
１／２）、配列番号１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるヌクレオチド配列と約７０パーセント、または約７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、もしくは７９パーセント、または約８０パーセント、または約８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、もしくは８９パーセント、または約９０パーセント、または約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であり、またはヌクレオチド配列は、配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ
５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）で示されるポリペプチド配列と約７０パーセント、または約７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、もしくは７９パーセント、または約８０パーセント、または約８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、もしくは８９パーセント、または約９０パーセント、または約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、配列相同性および／または類似性を決定するための方法は、試験される配列間で最大の対応を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで記載される。いくつかの態様では、２つの配列間の同一性および類似性を決定するコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えばＧＡＰ(Devereux  et  al.,  Nucl.  Acid.  Res.,
12:387  (1984);Genetics  Computer  Group,  University  of  Wisconsin,Madison,
WI,  BLASTP，  BLASTN,およびFASTA(Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  215:403-410  (1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは全
米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、および他の供給元（BLAST  Manual,  Altschul  et  al.  NCB/NLM/NIH  Bethesda,  MD  20894；  Altschul  et  al.,上記  (1990)）から公的に入手可能である。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用される。
【０１０４】
いくつかの態様では、２つのアミノ酸配列を整列させるための一定のアライメントスキームにより、２つの配列の短い領域のみの対応が得られ、この小さな整列された領域は、２つの全長配列間で著しい関係がない場合であっても、非常に高い配列相同性を有し得る。したがって、１つの実施形態では、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）により、標的ポリペプチドの少なくとも５０の近接アミノ酸におよぶアライメントが得られる。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いると、パーセント配列相同性が決定される２つのポリペプチドは、それらの個々のアミノ酸の最適な対応（アルゴリズムにより決定される「対応スパン」）のために整列される。ギャップオープニングペナルティ（これは平均ダイアゴナルの３倍として計算される；「平均ダイアゴナル」は、用いられる比較マトリクスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリクスにより、各々の完全アミノ酸対応に対して割り当てられるスコアまたは数のことである）およびギャップエクステンションペナルティ（これは通常、ギャップオープニングペナルティの１０分の１である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリクスが、このアルゴリズムと共に使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスに関してはDayhoff  et
al.,  Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure,  5(3)(1978)；ＢＬＯＳＵＭ
６２比較マトリクスに関してはHenikoff  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci  USA,  89:10915-10919  (1992)を参照されたい)もまた、アルゴリズムよって使用される。
【０１０５】
様々な態様ではポリペプチド配列比較のためのパラメータには以下が含まれる：
アルゴリズム:Needleman  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  48:443-453  (1970);
比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２、Henikoff  et  al.,  上記  (1992);
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【０１０６】
ＧＡＰプログラムは、以上のパラメータを用いると有用である。前述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータである（このほか、末端ギャップに関してはペナルティなしとする）。
【０１０７】
いくつかの態様では、核酸分子配列比較のためのパラメータには以下が含まれる:
アルゴリズム:  Needleman  et  al.,  上記  (1970);
比較マトリクス：対応＝＋１０、非対応＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
【０１０８】
ＧＡＰプログラムはまたは、以上のパラメータを用いると有用である。前述のパラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティ、ギャップエクステンションペナルティ、比較マトリクス、類似性の閾値、など、例えば、Program  Manual、Wisconsin  Package、Version  9
、September、1997で示されるものが当業者によって使用される。特定の選択は当業者に
明らかであり、実施される特定の比較、例えばＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質−対ＤＮＡ；さらに、比較がある配列対間か（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）、１つの配列と大きな配列データベース間か（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）に依存する。
【０１０９】
核酸配列の差は、いくつかの態様では、配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ
６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の保存的および／または非保存的修飾となる。
【０１１０】
配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ
５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列への保存的修飾（およびコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、天然由来ＯｓｐＡポリペプチドのものと類似する機能および化学特性を有するＯｓｐＡポリペプチドを生成させる。対照的に、ＯｓｐＡポリペプチドの機能および／または化学特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域での分子バックボーンの構造、例えば、シートまたはらせん形構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が著しく異なる配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号４（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号６（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号８（ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、配列番号１０（ｓＯｓｐＡ  ６／４）、配列番号１２（ｓＯｓｐＡ  ５／３）、配列番号１６９（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、配列番号１７１（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、または配列番号１７３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）のアミノ酸配列の置換を選択することにより達成される。
【０１１１】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、いくつかの態様では、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を含み、よってその位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど、あるいは全く影響がない。さらに、ポリペプチド中のいずれの天然残基も、一定の態様では、「アラニン系統的変異導入法」に対して前に記載されるように、アラニンと置換される。
【０１１２】
保存的アミノ酸置換はまた、非天然由来のアミノ酸残基を含み、これらは典型的には、生体システムにおける合成ではなく、ペプチド化学合成によって組み入れられる。これには、ペプチド模倣物、およびその他の逆転型または逆方向型のアミノ酸部分が含まれる。
【０１１３】
天然由来の残基は、様々な態様では、共通の側鎖特性に基づいて複数のクラスに分類される：
１）      疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）      中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）      酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）      塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）      鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）      芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１４】
例えば、非保存的置換には、いくつかの態様では、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換が含まれる。そのような置換残基は、様々な態様では、ＯｓｐＡポリペプチドオルソログと相同または類似するＯｓｐＡポリペプチドの領域に、または該分子の非相同領域内に導入される。
【０１１５】
このような変化を加える際に、アミノ酸の疎水性親水性指標がしばしば考慮される。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および荷電特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１１６】
相互作用性の生物機能をタンパク質に付与する際のアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当技術分野では理解されている。Kyte  et  al.,  1982,  J.  Mol.  Biol.  157:
105-131。一定のアミノ酸で、類似した疎水性親水性指標またはスコアを有する他のア
ミノ酸を置換してもよく、これは類似した生物活性を保持し続けることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化を加える際、一定の態様では、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、他の態様では、±１以内であるものが特に好ましく、様々な態様では、±０．５以内であるものが特により好ましい。
【０１１７】
また、それによって作製される生物学的に機能性等価のタンパク質またはペプチドを本明細書の場合のように、免疫学的実施形態において使用することがある程度意図される場合には特に、親水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換を効果的に行うことができることが、当技術分野では理解されている。それに隣接するアミノ酸の親水性に左右される、あるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性と、すなわちそのタンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１１８】
下記親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を加える際、ある態様では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、他の態様では、±１以内であるものが特に好ましく、様々な態様では、±０．５以内であるものが特により好ましい。当業者はまた、親水性に基づき一次アミノ酸配列からエピトープを同定する。これらの領域はまた、「エピトープ性コア領域」とも呼ばれる。
【０１１９】
所望のアミノ酸置換（保存的か非保存的に関係なく）は、そのような置換が要求される時に当業者により決定され得る。例えば、ＯｓｐＡポリペプチドの重要な残基を同定するために、または本明細書で記載されるそれらの基質に対するＯｓｐＡポリペプチドの親和性を増加または減少させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【０１２０】
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換は本発明に含められる。置換は１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、１〜１５０、および１〜２００ヌクレオチドを含む。同様に、置換は１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、および１〜１００アミノ酸を含む。置換は、様々な態様では、保存的または非保存的である。
例示的なアミノ酸置換が表２で示される。
【表２】
2020178719.tif 000012
【０１２１】
当業者は、よく知られている技術を用いて配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３で示されるポリペプチドの好適な類似体または変異体を決定することができる。活性を破壊せずに変化させることができる分子の好適な領域を同定するために、当業者は、活性に対し重要でないと考えられる領域を標的とすることができる。例えば、同じ種または他の種由来の類似の活性を有する類似のポリペプチドがわかっている場合、当業者はＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプチドと比較することができる。そのような比較を用いて、類似ポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定することができる。そのような類似ポリペプチドに対し保存されないＯｓｐＡポリペプチドの領域の変化は、ＯｓｐＡポリペプチドの生物活性および／または構造に悪影響を与える可能性が低いことは認識されるであろう。当業者はまた、比較的保存されている領域であっても、活性を保持しながら天然由来の残基を化学的に類似するアミノ酸と置換することができる（保存的アミノ酸残基置換）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチド変異体は、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３で示されるアミノ酸配列に比べ変化しているグリコシル化変異体を含む。１つの実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチド変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３で示されるアミノ酸配列よりも多くのまたは少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒにより特徴付けられ、ここで、Ｘと表されるアミノ酸残基はプロリン以外の任意のアミノ酸残基とすることができる。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合炭水化物鎖の付加のための潜在的新規部位を提供する。その代わりに、この配列を排除する置換は、既存のＮ結合炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（典型的には、天然由来）が排除され、１つ以上の新規Ｎ結合部位が作製されるＮ結合炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。追加のＯｓｐＡ変異体としては、システイン変異体が挙げられ、この場合、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３で示されるアミノ酸配列に比べ、１つ以上のシステイン残基が、欠失され、または別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されている。例えば不溶性封入体の単離後、ＯｓｐＡポリペプチドが生物学的に活性なコンホメーションにリフォールディングされなければならない場合、システイン変異体が有用である。システイン変異体は、一般的には天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的には不対システインに起因する相互作用を最小にするように偶数有する。
【０１２３】
本発明はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３で示されるタンパク質のエピトープを有する部分を含むポリペプチドを提供する。「エピトープ」という用語は、抗体が結合できるタンパク質の領域を示す。例えば、Geysen  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81:3998-4002  (1984)を参照されたい。エピトープは線形またはコンホメーションとすることができ、後者は、タンパク質のフォールディングでエピトープを形成するタンパク質の不連続領域から構成される。線形エピトープは、一般的には少なくとも６アミノ酸残基長である。タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは、通常、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発することができる。Sutcliffe  et  al.,  Science  219:660-666  (1983)を参照さ
れたい。短い、線形エピトープを認識する抗体は、変性タンパク質を使用する分析および診断用途、例えばＷｅｓｔｅｒｎブロッティングにおいて特に有用である。Tobin,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  76:4350-4356  (1979)を参照されたい。短いペプチドに
対する抗体は、場合によっては、天然コンホメーションのタンパク質も認識し、よって、例えば、ＥＬＩＳＡにより、または免疫沈降研究において、タンパク質発現およびタンパク質単離をモニタリングするのに、溶液中のＯｓｐＡタンパク質を検出する際に有用である。
【０１２４】
キメラＯｓｐＡ核酸分子およびポリペプチド分子の合成
核酸分子は、ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、限定はされないが、組換えＤＮＡ方法および化学合成を含む様々な方法で容易に得ることができる。
【０１２５】
組換えＤＮＡ方法は一般的にはSambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1989),  and/or  Ausubel  et  al.,  eds.,  Current  Protocols  in  Molecular
Biology,  Green  Publishers  Inc.  and  Wiley  and  Sons,  NY  (1994)で示され
るものである。以下で示される説明に従い実施される組換え発現技術は、様々な態様では、これらのポリヌクレオチドを生成させ、コードされたポリペプチドを発現するために従われる。例えば、ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することにより、当業者は容易に大量の所望のヌクレオチド配列を生成させることができる。配列はその後、検出プローブまたは増幅プライマーを作製するために使用され得る。その代わりに、ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター挿入することができる。発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、コードされた１つまたは複数のＯｓｐＡポリペプチドまたはＯｓｐＡポリペプチドが、いくつかの態様では、大量に生成される。
【０１２６】
同様に、核酸およびポリペプチドの化学合成は当技術分野ではよく知られており、例えば、Engels  et  al.,  Angew.  Chem.  Intl.  Ed.,  28:716-734  (1989)により記載されるものである。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。１つの態様では、そのような化学合成のための方法は、標準ホスホラミダイト化学を使用するポリマ担持合成である。典型的には、ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより大きな核酸は、これらの方法を使用していくつかのフラグメントとして合成される。その後、フラグメントは共に連結され、本発明の全長ヌクレオチド配列が形成される。特定の態様では、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントはＡＴＧを有し、これはメチオニン残基をコードする。
【０１２７】
本発明の特定の態様では、キメラＯｓｐＡコード配列は、合成オーバーラップオリゴヌクレオチドを使用して作製される。ボレリア細胞由来のＤＮＡは使用されないので、合成アプローチのさらなる利点は、ボレリア培地中に存在する動物起源の材料（すなわち血清または血清アルブミン）に含まれる外来病原体による汚染の回避である。この戦略はまた、実質的に、キメラ遺伝子を作製するのに必要とされる操作数を減少させる。というのも、配列変化、例えば発現の最適化（ＯｓｐＢリーダー配列）、クローニングを促進するための制限部位の導入、または潜在的な知的所有権問題の回避のための修飾は単一工程で実施されるからである。コドン使用頻度を大腸菌宿主に対し最適化させることも可能であり、というのも、大腸菌でめったに使用されないコドンの存在が、外来遺伝子の高レベル発現に対する潜在的妨害を示すことが知られているからである(Makoff  et  al.,  Nucleic
Acids  Res.  17:10191-202,  1989;  Lakey  et  al.,  Infect.  Immun.  68:233-8,
2000)。当業者に知られている他の方法が同様に使用される。
【０１２８】
ある実施形態では、核酸変異体は、ある宿主細胞でのＯｓｐＡポリペプチドの最適発現のために変化されたコドンを含む。特定のコドン変化は、ＯｓｐＡポリペプチド（複数可）および発現のために選択された宿主細胞（複数可）に依存する。そのような「コドン最適化」は、様々な方法により、例えば、ある宿主細胞において高度に発現した遺伝子で使用するために好ましいコドンを選択することにより、実施することができる。コドン出現頻度表、例えば高度に発現した細菌遺伝子のコドン優先度のための「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を組み入れるコンピュータアルゴリズムが、場合によっては使用され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにより提供される。他の有用なコドン出現頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【０１２９】
ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、一定の態様では、適切な発現ベクター中に、標準連結技術を用いて挿入される。ベクターは、典型的には使用される特定の宿主細胞中で機能するように選択される（すなわち、ベクターは宿主細胞機構と適合し、そのため、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得る）。ＯｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、様々な態様では、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）、および／または真核宿主細胞において増幅／発現される。宿主細胞の選択は、一つには、ＯｓｐＡポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるかどうかに依存する。そうであれば、酵母、昆虫、または哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの説明については、Meth.  Enz.,  vol.185,  D.V.  Goeddel,  ed.,  Academic  Press  Inc.,  San  Diego,  CA  (1990)を参照
されたい。
【０１３０】
クローニングベクターは、当技術分野で知られているもの全てを含む。例えば、Sambrook,  Fritsch  &  Maniatis,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Second
Edition.  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1989を参照されたい。１つの態様では、ｐＵＣ１８は全ての中間工程のためのクローニングベクターとして使用され、というのも、ベクターｐＥＴ３０ａよりもこのプラスミドを使用した方が遺伝子操作および配列決定がより容易になるからである。主要特徴は特に、塩基対１４９〜４６９のＬａｃＺ  αペプチドをコードするｌａｃＺ遺伝子フラグメント（塩基対５０７でのｌａｃプロモーター）、塩基対１６２９〜２４８６のアンピシリン耐性決定基をコードするｂｌａ遺伝子（塩基対２５２１でのｂｌａプロモーター）、塩基対８６７での複製開始点および塩基対１８５〜４５１の複数のクローニング部位である（図１２）。
【０１３１】
発現ベクターは、当技術分野で知られているものすべてを含み、例えば、限定はされないがコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる）およびウイルスが挙げられ、これらは組換えポリヌクレオチドを組み込む。発現ベクターは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために、当技術分野で知られている技術を使用して形質転換またはトランスフェクションを介して、適切な宿主細胞に（例えば、形質転換または形質導入を介して）挿入される。例えば、Sambrook,  Fritsch  &  Maniatis,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Second  Edition.  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1989を参照されたい。１つ
の態様では、ｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）が最終の完全ＯｓｐＡ遺伝子インサートのための発現ベクターとして使用される。ｐＥＴベクターでは、遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下でクローニングされ、発現は宿主細胞にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ源を提供することにより誘導される（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ源が供給されるまで発現は起こらない）。主要特徴は、塩基対４０４８〜４８６０でのカナマイシン耐性をコードする遺伝子（ｋａｎ）、８２６−１９０５のｌａｃＩ遺伝子塩基対、塩基対４９５６−５４１１でのＦ１複製開始点および塩基対１５８〜３４６の複数のクローニング部位である（図１３）。
【０１３２】
ベクターが構築され、ベクターの適切な部位にＯｓｐＡポリペプチドをコードする核酸分子が挿入された後に、完成したベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現用の好適な宿主細胞に挿入される。選択した宿主細胞へのＯｓｐＡポリペプチドのための発現ベクターの形質転換は、様々な態様では、よく知られている方法、例えばトランスフェクション、感染、塩化カルシウム媒介形質転換、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション法、もしくはＤＥＡＥ−デキストラン法、またはその他の公知の技術によって達成される。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の型の機能である。これら方法および他の好適な方法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook  et  al.,  上記に記載されている。
【０１３３】
宿主細胞は、いくつかの態様では原核宿主細胞（例えば大腸菌）または真核宿主細胞（例えば酵母、昆虫、または脊椎動物細胞）である。適切な条件下で培養された場合、宿主細胞はＯｓｐＡポリペプチドを合成し、次にこれを、（宿主細胞が培地中に分泌する場合）培地からまたは（分泌されない場合）産生している宿主細胞から直接、採取することができる。適切な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、活性のために望ましいまたは必要なポリペプチドの修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）、およびフォールディングして生物活性分子となることが容易かといった、さまざまな要素に依存する。そのような宿主細胞としては、細菌、酵母、真菌、ウイルス、無脊椎動物、および哺乳類源の宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような宿主細胞の例として、Maniatis
et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.  (1989)を参照されたい。追加の態様では、Maniatis（上記）マニュアルの公開から当技術分野で使用される宿主細胞もまた本発明で
使用される。
【０１３４】
１つの態様では、宿主細胞は大腸菌細胞である。大腸菌の好適な株としては、ＢＬ２１、ＤＨ５α、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＤＨ１０Ｂ、またはＥ．ＣＬＯＮＩ  １０Ｇ（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓ．）が挙げられるが、これらに限定されない、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベクターの形質転換効率および／または維持を増強するように操作される。
【０１３５】
１つの態様では、大腸菌株ＤＨ５α［遺伝子型：ｅｎｄ  Ａ１  ｈｓｄＲ１７  （ｒＫ−ｍＫ＋）  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ  （Ｎａｌｒ）  ｒｅｌＡ１  Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｄｅｏＲ  （Ｆ８０ｄｌａｃＤ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）が中間クローニング工程全てに対して使用される。この株は大腸菌株Ｋ１２、遺伝子工学において最も広く使用される宿主の１つに由来する。株は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）を含むベクターを有する形質転換体の選択を可能にするａｍｐ−である。
【０１３６】
別の態様では、大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）が、発現のための宿主として使用される。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）宿主細胞［遺伝子型：Ｆ−  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ  （ｒｋ１２−ｍｋ１２＋）  ＲｉｆＲ  （ＤＥ３）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）が、本明細書で記載される様々な実施例で、最終クローニング工程のために使用される。株は、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）を含むベクターを有する形質転換体の選択を可能にするｋａｎ−である。
【０１３７】
ＯｓｐＡポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者によく知られている標準培地を使用して培養される。培地は通常、細胞の増殖および生存に必要な栄養分を全て含む。大腸菌細胞を培養するのに好適な培地としては、例えば、ルリアブロス（ＬＢ）および／またはテリフィックブロス（ＴＢ）が挙げられる。真核細胞を培養するのに好適な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）、基礎培地（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらはすべて、場合によっては、培養される特定の細胞株により示される血清および／または増殖因子が補充される。昆虫培養物に対し好適な培地は、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解物および／またはウシ胎仔血清が、必要に応じて補充されたＧｒａｃｅ培地である。
【０１３８】
典型的には、抗生物質または形質転換細胞の選択的増殖に有用な他の化合物が、培地への補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞がこれによりトランスフォームされたプラスミド上に存在する選択可能なマーカー要素により指示されるであろう。例えば、選択可能なマーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。
【０１３９】
宿主細胞により産生されるＯｓｐＡポリペプチドの量は、当技術分野で知られている標準方法を使用して評価することができる。そのような方法としては、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット解析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、クロマトグラフィー分離例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫検出、例えば免疫沈降、および／または活性アッセイ、例えばＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
場合によっては、ＯｓｐＡポリペプチドは、単離されると生物学的に活性でなくなる。「リフォールディング」またはポリペプチドをその三次構造に変換するおよびジスルフィド結合を生成させるための様々な方法が、生物活性を回復させるために使用される。そのような方法は、可溶化ポリペプチドを、通常７を超えるｐＨに、特定の濃度のカオトロープの存在下で暴露することを含む。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択と非常に類似するが、通常、カオトロープは可溶化のために使用されるカオトロープより低い濃度で使用され、必ずしも同じではない。場合によっては、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤または還元剤＋その酸化形態を特定の比率で含み、特定の酸化還元電位が生じ、タンパク質のシステイン架橋（複数可）の形成においてジスルフィドシャッフリングが起こり得る。一般に使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第一銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。共溶媒がしばしば、リフォールディングの効率を増加させるために使用され、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４１】
封入体がＯｓｐＡポリペプチドの発現時にかなりの程度まで形成されない場合、ポリペプチドは細胞ホモジネートの遠心分離後、上清中で主に見られる。ポリペプチドはさらに、本明細書で記載される、またはそうでなければ当技術分野で知られているものなどの方法を用いて上清から単離される。
【０１４２】
ＯｓｐＡポリペプチドの溶液からの精製は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて達成することができる。ポリペプチドが、Ｈｅｘａヒスチジン（ＯｓｐＡポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）などのタグまたは他の小ペプチド、例えばＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、そのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに含むように合成される場合、ポリペプチドはしばしば、１工程プロセスで、カラムマトリクスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通過させることにより精製される。例えば、ポリヒスチジンは大きな親和性および特異性で、ニッケルに結合し；よって、ニッケルのアフィニティーカラム（例えばＱｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）がＯｓｐＡポリペプチド／ｐｏｌｙＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ausubel  et  al.,  eds.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Section  10.11.8,  John  Wiley  &  Sons,  New  York  (1993)を参照されたい。
【０１４３】
さらに、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡポリペプチドを特異的に認識し、結合することができるモノクローナル抗体の使用により精製され得る。よって、精製のための好適な手順としては、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（天然ゲル電気泳動を含む）、その後のゲル溶出、および分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、２つ以上の精製技術が組み合わされ、純度の増大が達成される。
【０１４４】
ＯｓｐＡポリペプチドはまた、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により、当技術分野で知られている技術、例えば、Merrifield  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  85:2149  (1963),  Houghten  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  82:5132  (1985),  and  Stewart  and  Young,  "Solid  Phase  Peptide  Synthesis  ",  Pierce
Chemical  Co.,  Rockford,  IL  (1984)において記載されているものを用いて調製さ
れる。そのようなポリペプチドはアミノ末端のメチオニンと共に、またはなしで合成される。化学的に合成されたＯｓｐＡポリペプチドは、いくつかの態様では、ジスルフィド架橋を形成するためのこれらの参考文献において示される方法を用いて酸化される。化学的に合成されたＯｓｐＡポリペプチドは組換えで生成された、または天然起源から精製された対応するＯｓｐＡポリペプチドに匹敵する生物活性を有することが予測され、よって、組換えＯｓｐＡポリペプチドと同じ意味で使用される。核酸およびポリペプチドを生成するための多くの追加の方法が当技術分野で知られており、それらの方法は、ＯｓｐＡポリペプチドを生成させるために使用することができることは認識される。
【０１４５】
ＯｓｐＡポリペプチド分子の化学誘導体
ＯｓｐＡポリペプチドの化学修飾誘導体は、本明細書において下記で説明される開示が与えられれば、当業者により調製される。ＯｓｐＡポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに自然に付着された分子の型または位置のいずれかが異なるように修飾される。誘導体は、いくつかの態様では、１つ以上の自然に付着された化学基の欠失により形成される分子を含む。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、または１７３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＯｓｐＡポリペプチド変異体は、１つの態様では、１つ以上のポリマの共有結合により修飾される。例えば、選択されるポリマは、典型的には水溶性であり、よって、これが付着されたタンパク質は、水性環境、例えば生理環境で沈殿しない。ポリマの混合物は好適なポリマの範囲に含まれる。一定の態様では、最終製品調製物の治療用途のために、ポリマは薬学的に許容される。
【０１４６】
ポリマはそれぞれ、様々な態様では、任意の分子量を有し分枝または非分枝である。ポリマはそれぞれ、典型的には約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマの調製において、いくつかの分子が定められた分子量より大きい、幾分少ない重量を有することを示す）。各ポリマの平均分子量は、様々な態様では、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、および約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａである。
【０１４７】
好適な水溶性ポリマまたはそれらの混合物としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ結合またはＯ結合炭水化物；糖；ホスフェート；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（タンパク質を誘導するために使用されたＰＥＧの形態を含む、例えばモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）；モノメトキシ−ポリエチレングリコール；デキストラン（例えば、約６ｋＤａの低分子量デキストランなど）；セルロース；または他の炭水化物系ポリマ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマ、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマ、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、もしくは１７３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＯｓｐＡポリペプチド変異体の共有結合により付着されたマルチマーを調製するために時として使用される二官能性架橋分子もまた本発明により含まれる。
【０１４８】
いくつかの態様では、化学誘導体化はタンパク質を活性化ポリマ分子と反応させるのに使用される任意の好適な条件下で実施される。ポリペプチドの化学誘導体を調製するための方法は、一般的には（ａ）ポリペプチドを活性化ポリマ分子（例えば、ポリマ分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、もしくは１７３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＯｓｐＡポリペプチド変異体が、１つ以上のポリマ分子に付着される条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（複数可）を得る工程を含む。最適反応条件は、周知のパラメータおよび所望の結果に基づき決定される。例えば、ポリマ分子：タンパク質の比が大きいほど、付着されるポリマ分子のパーセンテージが大きくなる。１つの実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチド誘導体は、単一のポリマ分子部分をアミノ末端に有する（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照されたい）。
【０１４９】
ポリペプチドのペグ化は、一定の態様では、例えば、下記参考文献において記載されるように、当技術分野で知られているペグ化反応のいずれかにより特定的に実施される:  
Francis  et  al.,  Focus  on  Growth  Factors,  3:4-10  (1992)；ＥＰ０１５４３１６号；ＥＰ０４０１３８４および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書で記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマ）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。アシル化反応では、選択されるポリマ（複数可）は、単一の反応性エステル基を有しなければならない。還元的アルキル化では、選択されるポリマ（複数可）は、単一の反応性アルデヒド基を有しなければならない。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（耐水性である）、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。
【０１５０】
別の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ビオチンに化学的に結合され、結合されたビオチン／ＯｓｐＡポリペプチド分子はその後、アビジンに結合することができ、四価アビジン／ビオチン／ＯｓｐＡポリペプチド分子が得られる。ＯｓｐＡポリペプチドはまた、共有結合によりジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に結合され、得られた複合物は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭにより沈殿し、結合価１０を有する十量体複合物が形成される。本明細書で開示されるＯｓｐＡポリペプチド誘導体は、一定の態様では、非誘導体化分子に比べ、追加の活性、増強または減少された生物活性または他の特性、例えば増加または減少した半減期を有する。
【０１５１】
免疫原性組成物、ワクチン、および抗体
本発明のいくつかの態様は、免疫原性組成物およびワクチンを含む。本発明の免疫原性キメラＯｓｐＡ分子は組み合わされて抗原（複数可）として使用され、被験体において抗ＯｓｐＡ免疫応答を誘発する（すなわち、ワクチンとして作用する）。例示的な免疫原性ＯｓｐＡポリペプチド（配列番号２、４、６、１６９、１７１、および１７３）は、組み合わされて送達され、ボレリアの血清型１−６のいずれか１つ以上に対し、より一般的には、本明細書で記載されるボレリアの多くの他の種に対し免疫応答を誘発する。免疫応答はまた、本発明のＯｓｐＡポリペプチドをコードするプラスミドベクターの送達（すなわち、「ネイキッドＤＮＡ」の投与）により上昇させることができる。いくつかの態様では、ＯｓｐＡ核酸分子（配列番号１、３、５、１６８、１７０、および１７２）は注射により、リポソームを介して、または本明細書で記載される他の投与手段により送達される。免疫化されるとすぐに、被験体は、ボレリアの血清型１−６のＯｓｐＡタンパク質に対し、およびボレリアの他の種に対し増大した免疫応答を誘発する。
【０１５２】
よって、上記で提示されるように、ＯｓｐＡポリペプチドおよびＯｓｐＡ核酸分子はどちらも本発明の免疫原性および／またはワクチン組成物において使用するための抗原として含められる。一定の態様では、核酸およびタンパク質はどちらも被験体に送達される。特定の態様では、核酸ワクチンに対する免疫応答は、同族タンパク質の同時投与により増強されることが提示されている（ＷＯ９９／３０７３３号を参照されたい）。核酸およびタンパク質は、同じ組成物中で投与される必要はない。どちらも単にタンパク質による免疫応答の誘導期中に投与されなければならず、いくつかの態様では、核酸が免疫系を刺激するまでマスクされ、または制止される。特定の態様では、ワクチンは、核酸およびタンパク質抗原を抗原提示細胞中に送達するように意図される（ＷＯ９７／２８８１８号を参照されたい）。様々な態様では、核酸およびタンパク質は、例えば、共有結合により複合体化される。さらなる態様では、リポソーム製剤がワクチン抗原の免疫原性を増強させるために含められる。
【０１５３】
一定の態様では、本発明の免疫原性組成物は、本明細書で記載されるＯｓｐＡ分子のいずれか１つ以上を医薬担体と組み合わせて含み、ここで、組成物は、細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）タンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する。いくつかの態様では、免疫原性組成物はまた、安定剤または抗菌性保存剤を含む。特定の態様では、免疫原性組成物は、ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する。他の態様では、組成物は、ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する。
【０１５４】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書で記載されるキメラＯｓｐＡ分子（抗原）を含む免疫原性組成物におけるアジュバントの使用を含む。一定の態様では、抗原がアジュバントと同時投与される場合、免疫原性は著しく改善される。いくつかの態様では、アジュバントは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．００１％〜５０％溶液として使用される。アジュバントは、抗原の免疫原性を増強するが、必ずしもそれ自体免疫原性ではない。
【０１５５】
アジュバントは、様々な態様では、ワクチン接種に対し多くのプラス効果を有する。場合によっては、アジュバントは、被験体において強い免疫応答の発生を促進する。アジュバントは、他の場合には、免疫応答のレベルを増加させ、その期間を引き延ばし、免疫記憶を改善する。アジュバントはしばしば、特定の被験体群(例えば、高齢または免疫抑制
患者)の弱った免疫を克服し、または特定の「危険群」(例えば、限定はされないが、非常に若いまたは高齢)の免疫原性を改善するために使用される。アジュバントの免疫増強効
果は、様々な場合において、防御反応を与える最終製剤中で必要とされる抗原の量の減少につながる(すなわち、用量節約)。
【０１５６】
一般に、アジュバントは、その主要な作用機序に基づき、２つの主な群に分類され：第１の群は、自然免疫系受容体またはセンサのアゴニスト、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｃ型レクチン受容体アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−１）様受容体（ＲＬＲ）アゴニスト、およびヌクレオチド結合ドメインおよびロイシンリッチリピート含有受容体（ＮＬＲ）アゴニストである。第２の群はＴＬＲ非依存性アジュバントとしても知られている、送達系として機能する物質である。ＴＬＲアゴニストアジュバントの例は下記である：ＡＳＯ４（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、市販のＢ型肝炎およびパピローマウイルスワクチンにおいてアジュバントとして使用される、ＴＬＲ−４アゴニスト；Ｖａｘｉｎａｔｅ、フラゲリン融合タンパク質ＴＬＲ−５アゴニスト；および多くのＴＬＲ−９アゴニストアジュバント、例えば二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびオリゴヌクレオチドＣｐＧまたはＯＤＮ１ａを使用するもの。アジュバントのこのカテゴリに含まれる他のＴＬＲ−アゴニストとしては、糖脂質（ＴＬＲ−１）、リポテイコ酸およびリポタンパク質（ＴＬＲ−１／ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−２／ＴＬＲ−６）リポ多糖、リポオリゴ糖およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＴＬＲ−４）、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ−３）；ペプチドグリカン（ＴＬＲ−６）、一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ−７）が挙げられる。２つのＣ型レクチン受容体アゴニストアジュバントの例としては、β−グルカン（デクチン−１）およびマンナン（デクチン−２）が挙げられ、どちらも真菌細胞壁に由来する。ＲＬＲ受容体アゴニストアジュバントは一本鎖ウイルスＲＮＡおよび二本鎖ウイルスＤＮＡを含み、ＮＬＲアゴニストアジュバントは、ペプチドグリカン分解生成物、微生物産物、および非感染性結晶粒子を含む。全ての場合において、アゴニストは自然免疫系受容体を直接活性化し、免疫増強炎症反応を引き起こすことにより作用する。第２の群のアジュバント、ＴＬＲ非依存性アジュバントはほとんど、送達系として作用し、抗原提示細胞による抗原取込みおよび提示を増強させる。場合によっては、これらのアジュバントはまた、抗原を投与部位の近くに局所的に保持することにより、抗原の免疫系細胞への遅い持続放出を促進するデポー効果を生成させるように作用することができる。アジュバントはまた、免疫系細胞を抗原デポーに引きつけ、そのような細胞を刺激して、免疫応答を誘発する。ＴＬＲ非依存性アジュバントの例としては、無機塩、例えば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（まとめてａｌｕｍと呼ばれる）およびリン酸カルシウム；水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９、ＡＳ０３およびＰｒｏＶａｘ）；油中水型エマルジョン（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、ＴｉｔｅｒＭａｘ）；バイオポリマ（Ａｄｖａｘ）；植物誘導体、とりわけサポニンの画分、Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｏｌｉｎａソープツリーキラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）の皮由来のトリテルペノイド抽出物（ＳＦＡ−１、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ）；サポニン画分、ステロールおよび、任意で、リン脂質から構成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭおよびＩＳＣＯＭマ���リクス）；様々なサイズおよび電荷を有するリン脂質球であるリポソーム（ＶａｘｆｅｃｔｉｎおよびＶａｘｉｓｏｍｅ）；ウイルス表面抗原、例えばインフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含むリポソームであるウイルス様粒子およびビロソーム；様々な組成物のナノ粒子；キトサン、ポリアルギニンなどのペプチドおよびＫＬＫペプチドとして知られるペプチドが挙げられる。
【０１５７】
本明細書において上記で列挙されるアジュバントは、単独でまたは組み合わされて使用される。ＴＬＲ依存性およびＴＬＫ非依存性アジュバントの組み合わせがしばしば好ましく、というのは、抗原およびＴＬＲ依存性アジュバントは、ＴＬＲ非依存性アジュバントにより抗原提示細胞へ輸送されると考えられるからであり、ＴＬＲ非依存性アジュバントはまた、取込みおよび安定性を刺激し、一方、ＴＬＲ依存性アジュバントは直接、ＴＬＲシグナリングの活性化により免疫を増強させる。
【０１５８】
ＴＬＲ依存性およびＴＬＲ非依存性アジュバントの組み合わせの例としては、ＡＳ０１：ＭＰＬ（ＴＬＲ−４アゴニスト）、リポソームおよびＱＳ−２１（どちらもＴＬＲ非依存性アジュバント）の混合物；ＡＳ０４：ＭＰＬ（ＴＬＲ−４アゴニスト）および水酸化／リン酸アルミニウム；ＩＣ３１：ＯＤＮ１ａ（ＴＬＲ−９アゴニスト）およびＫＬＫペプチド（ＴＬＲ非依存性アジュバント）；およびＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの膜抽出物（ＴＬＲ−４アゴニスト）および水中油型エマルジョン（ＴＬＲ非依存性アジュバント）が挙げられる。
【０１５９】
複数のＴＬＲ依存性アジュバントからなる組み合わせもまた、アジュバント処理されるワクチン製剤の免疫増強効果を最大にするために使用される。異なるアダプタータンパク質を使用するＴＬＲのアゴニストがしばしば組み合わされる（例えば、ＴＲＩＦ（ＩＮＦ−βを誘導するＴｏｌｌ／インターロイキン１受容体ドメイン含有アダプタータンパク質）アダプター経路を使用する細胞膜結合ＴＬＲ−３またはＴＬＲ−４受容体に対するアゴニストのＴＬＲ（ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９）（エンドソームまたはリソソームオルガネラにおいて発現され、ＭｙＤ８８（一次応答タンパク質を分化させるミエロイド）アダプタータンパク質経路を使用する）のアゴニストとの組み合わせ）。
【０１６０】
これらの免疫刺激薬またはアジュバントは、その上、ワクチンにおける宿主免疫応答を改善する。場合によっては、リポ多糖などの物質は、内因性アジュバントとして作用することができ、というのも、それらは、通常、ワクチンとして使用される死滅または減弱された細菌の成分であるからである。外因性アジュバント、例えば上記本明細書で列挙されるものは免疫調節物質であり、これらは典型的には非共有結合により抗原に結合され、宿主免疫応答を増強させるように製剤化される。
【０１６１】
広範囲の外因性アジュバントは、抗原に対し強力な免疫応答を誘発することができる。これらには、膜タンパク質抗原に複合体化されたサポニン（免疫刺激複合体）、鉱物油を有するプルロニックポリマ、鉱物油中の死滅させたマイコバクテリア、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント、細菌産物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびに脂質Ａ、およびリポソームが含まれる。体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞免疫（ＣＭＩ）を効率的に誘導するために、免疫源は、一定の態様では、アジュバント中で乳化される。
【０１６２】
理想的なアジュバントの望ましい特性としては、下記のいくつかまたは全てが挙げられる：毒性の欠如；長期にわたる免疫応答を刺激する能力；製造の容易さおよび長期貯蔵における安定性；様々な経路により投与される抗原へのＣＭＩおよびＨＩＲの両方を誘発する能力；他のアジュバントとの相乗作用；抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団と選択的に相互作用することができる能力；適切なＴＨ１またはＴＨ２細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力；および抗原に対して適切な抗体アイソタイプレベル（例えばＩｇＡ）を選択的に増加させる能力。
【０１６３】
米国特許第４，８５５，２８３号（参照により本明細書に組み込まれる）は、免疫調節物質またはアジュバントとして、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体（その各々は、糖残基においてアミノ酸により置換される）を教示する。米国特許第４，８５５，２８３号は、天然由来糖脂質に対し構造類似性を示すＮ−糖脂質類似体、例えばスフィンゴ糖脂質およびグリセロ糖脂質は、単純ヘルペスウイルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスワクチンの両方において強い免疫応答を誘発することができることを報告した。いくつかの糖脂質は、長鎖アルキルアミンおよびアノマー炭素原子を介して糖と直接結合された脂肪酸から合成され、天然由来脂質残基の機能を模倣する。
【０１６４】
いくつかの態様では、免疫原性組成物は、免疫源に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、アルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマ界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびに免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、例えば  Takahashi  et  al.  (Nature  344:873-875,  1990)により記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、アジュバントは合成アジュバントである。特定の態様では、合成アジュバントは、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）である。
【０１６５】
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含むワクチンである。上記本明細書で記載されるように、ワクチンは、一定の態様では、１つ以上の安定剤および／または１つ以上の保存剤を含む。
【０１６６】
１つの態様では、抗原をコードする核酸配列（本明細書で記載されるキメラＯｓｐＡポリペプチド）に動作可能に結合されたプロモーターを含む少なくとも１つの組換え発現コンストラクトおよびアジュバントを含むワクチンが提供される。１つの実施形態では、組換え発現コンストラクト（ＯｓｐＡポリヌクレオチドを含む発現ベクター）はウイルスベクター中に存在し、これは一定のさらなる実施形態ではアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスから選択されるウイルス中に存在する。
【０１６７】
本発明のさらなる態様は、本明細書で記載されるキメラＯｓｐＡ分子に対する抗体を含む。様々な態様では、本発明は、抗ＯｓｐＡ抗体を製造し、ボレリア感染に対して免疫を提供するキメラＯｓｐＡ分子を含む。いくつかの態様では、これらの抗ＯｓｐＡ抗体、例えば、マウス、ヒト、またはヒト化モノクローナル抗体または単鎖抗体は、被験体に投与され（例えば、受動免疫化）、ボレリアの血清型１−６のいずれか１つ以上のＯｓｐＡタンパク質に対し免疫応答を実施させる。本明細書では、「抗体」という用語は１つ以上のＯｓｐＡポリペプチドに対し特異性を有する分子を示す。好適な抗体は、当技術分野で知られている方法を用いて調製される。一定の態様では、ＯｓｐＡ抗体は、ＯｓｐＡポリペプチドのある部分に結合することができ、よって、ポリペプチドのＯｓｐＡポリペプチド受容体（複数可）への結合が阻害される。本発明のキメラＯｓｐＡポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメントは、本発明の範囲内にある。
【０１６８】
いくつかの態様では、本発明の抗体には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６９、１７１、および１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫化することにより生成される１つ以上のＯｓｐＡポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが含まれる。他の態様では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１６８、１７０、および１７２からなる群より選択される核酸配列によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。様々な態様では、抗体またはそのフラグメントはヒト、ヒト化、ポリクローナル、またはモノクローナルである。さらなる態様では、抗体はＦａｂまたはＦａｂ’抗体である。特定の態様では、抗体は検出可能な標識を含む。いくつかの態様では、抗体は、抗体の化学修飾誘導体である。
【０１６９】
本発明によるキメラＯｓｐＡ分子の投与は、ヒトまたは動物において免疫または抗体応答を刺激する。いくつかの態様では、３つのキメラＯｓｐＡ分子（例えば、脂質付加されたＯｓｐＡ  １／２２５１、脂質付加されたＯｓｐＡ  ６／４  ＯｓｐＡ、および脂質付加されたＯｓｐＡ５／３；またはオリジナルＯｓｐＡ  １／２、オリジナルＯｓｐＡ  ６／４、およびオリジナルＯｓｐＡ  ５／３）は、本明細書で記載される６つ全ての血清型（１−６）に対して抗体応答を誘発するために一緒に投与される。この抗体応答は、本発明の方法が、様々な態様では、単に免疫応答を刺激するために（防御反応でもあることとは対照的に）使用されることを意味し、というのも得られた抗体（防御なし）はそれにもかかわらず有用であるからである。誘発する抗体から、当技術分野ではよく知られている技術により、モノクローナル抗体が調製され；それらのモノクローナル抗体はよく知られている抗体結合アッセイ、診断キットまたは試験において、ボレリアブルグドルフェリｓ．ｌ．の有無を決定するためまたはスピロヘータへの免疫応答が単に刺激されただけかどうかを決定するために使用される。モノクローナル抗体は、一定の態様では、ボレリア抗原、例えばＯｓｐＡを回収または単離するために免疫吸着クロマトグラフィーにおいて使用される。
【０１７０】
本発明のＯｓｐＡ抗体は、様々な態様では、ポリクローナル、例えば単一特異性ポリクローナル、モノクローナル（ＭＡｂ）、組換え、キメラ、ヒト化、例えばＣＤＲグラフト化、ヒト、単鎖、および／または二重特異性、ならびにそのフラグメント、変異体または誘導体である。抗体フラグメントは、ＯｓｐＡポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のそれらの部分を含む。そのようなフラグメントの例としては全長抗体の酵素切断により生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては組換えＤＮＡ技術、例えば抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現により作製されたものが挙げられる。
【０１７１】
ＯｓｐＡポリペプチドに対して作られるポリクローナル抗体は、一般的には被験体（ウサギ、マウス、または他の動物もしくは哺乳類を含む）において、ＯｓｐＡポリペプチドおよびアジュバントの複数の皮下、筋肉内または腹腔内注射により生成される。一定の態様では、本発明のＯｓｐＡポリペプチドを免疫化される種において免疫原性である担体タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンシ、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに結合させることは有用である。また、アジュバント、例えばａｌｕｍが、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、血液試料が免疫化された被験体から引き出され、血清が抗ＯｓｐＡポリペプチド抗体力価に対しアッセイされる。
【０１７２】
ＯｓｐＡポリペプチドに対して作られるモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法により生成される。モノクローナル抗体を調製するための好適な方法の例としては、Kohler  et  al.,  Nature,  256:495-497  (1975)のハイブリドーマ法およびヒトＢ−細胞ハイブリドーマ方法、Kozbor,  J.  Immunol.,  133:3001  (1984)およびBrodeur  et  al.,  Monoclonal  Antibody  Production  Techniques  and  Applications,  pp.  51-63  (Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  1987)が挙げられる。本発明により、ＯｓｐＡポリペプチドと反応するモノクローナル抗体性
を産生するハイブリドーマ細胞株もまた提供される。
【０１７３】
本発明のモノクローナル抗体は、場合によっては、治療薬として使用するために修飾される。１つの実施形態は、重および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りは別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体である。そのような抗体のフラグメントもまた、所望の生物活性を示す限り含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号およびMorrison  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  81:6851-6855  (1985)を参照されたい。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野ではよく知られている（米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照されたい）。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からこれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当技術分野で記載される方法（Jones  et  al.,  Nature  321:522-525  (1986);  Riechmann  et  al.,  Nature  332:323-327  (1988);  Verhoeyen  et  al.,  Science  239:1534-1536  (1988))を用いて、ヒト抗体の対応する領域に対して齧歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を置換することにより実施することができる。
【０１７５】
別の実施形態では、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリから生成される(Hoogenboom  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  227:381  (1991)  and  Marks  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  222:581  (1991))。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイおよびその後の最適抗原へのそれらの結合によるファージの選択を介する免疫同定を模倣する。１つのそのような技術は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４号（Ａｄａｍｓら）に記載されており、これは、そのようなアプローチを使用するＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性および機能的アゴニスト抗体の単離を記載する。
【０１７６】
キメラ、ＣＤＲグラフト化、およびヒト化抗体は、典型的には組換え方法により生成される。抗体をコードする核酸が、本明細書で記載されるまたは当技術分野で知られている材料および手順を用いて、宿主細胞に導入され、発現される。１つの実施形態では、抗体は哺乳類宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において生成される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、様々な態様では、本明細書で記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞における発現により生成される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはフラグメントはヒト化される。特定の態様では、モノクローナル抗体は、本明細書で記載されるＦ２３７／ＢＫ２である。
【０１７７】
一定の態様では、本発明は、被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法を含み、方法は、本明細書で記載される抗体またはそのフラグメントを被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む。特定の態様では、抗体またはそのフラグメントは、過免疫血清、過免疫血漿、またはその精製免疫グロブリン画分である。他の態様では、抗体またはそのフラグメントは、精製免疫グロブリン調製物または免疫グロブリンフラグメント調製物である。
【０１７８】
本発明の抗ＯｓｐＡ抗体は、様々な態様では、ＯｓｐＡポリペプチドの検出および定量のための任意の周知のアッセイ方法、例えば競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ(Sola,  Monoclonal  Antibodies:  A  Manual  of  Techniques,  pp.  147-158(CRC  Press,  Inc.,  1987))において使用される。抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＯｓｐＡポリペプチドに結合する。
【０１７９】
診断または臨床適用のために、ある実施形態では、抗ＯｓｐＡ抗体は、検出可能な部分により標識される。検出可能な部分は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを生成させることができるいずれかにすることができる。例えば、一定の態様では、検出可能な部分は、放射性同位体、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ；蛍光または化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン；あるいは酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼである(Bayer  et  al.,  Meth.  Enzym.  184:138-163
(1990))。
【０１８０】
競合的結合アッセイは、標識された標準（例えば、ＯｓｐＡポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の、限定された量の抗ＯｓｐＡ抗体との結合に対し、試験試料分析物（ＯｓｐＡポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験試料中のＯｓｐＡポリペプチドの量は、抗体に結合する標準の量に逆比例する。結合する標準の量の決定を促進するために、抗体は、典型的には競合前または後に可溶化され、そのため、抗体に結合される標準および分析物は、結合されないままの標準および分析物から都合良く分離される。
【０１８１】
サンドイッチアッセイは、典型的には、各々が検出および／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合することができる２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は、典型的には固体サポートに固定された第１の抗体により結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性三部分複合体が形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体はそれ自体、場合によっては、検出可能な部分によって標識され（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定される（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの型のサンドイッチアッセイは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１８２】
抗ＯｓｐＡ抗体はまた、インビボイメージングにとって有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、一定の態様では、動物の血流に投与され、宿主中の標識された抗体の存在および位置がアッセイされる。抗体は、様々な態様では、核磁気共鳴、放射線学、または他の当技術分野で知られている検出手段に関係なく、動物において検出可能な任意の部分で標識される。本発明のいくつかの態様では、ＯｓｐＡ抗体は治療薬として使用される。
【０１８３】
キメラＯｓｐＡ組成物および投与
本明細書で記載されるＯｓｐＡキメラポリペプチドを被験体に投与するために、ＯｓｐＡポリペプチドは、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物中で製剤化される。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という句は、以下で記載されるように、当技術分野でよく知られている経路を用いて投与された場合、アレルギーまたは他の有害反応を生成させない分子部分および組成物を示す。「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。いくつかの態様では、組成物は、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成する。そのような溶媒和物もまた、含まれる。
【０１８４】
本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物は、様々な態様では、経口、局所、経皮、非経口、吸入噴霧、経膣、経直腸、または頭蓋内注射により投与される。本明細書では、非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入技術を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後、肺内注射およびまたは特定の部位での外科的移植による投与が同様に企図される。一般的には、組成物は、本質的に発熱物質、ならびにレシピエントにとって有害となり得る他の不純物を含まない。
【０１８５】
医薬組成物の製剤は、選択される投与経路によって変動する（例えば、溶液、エマルジョン）。投与される組成物を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製される。溶液またはエマルジョンでは、好適な担体としては、例えば、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば生理食塩水および緩衝媒質が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、いくつかの態様では、塩化ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加Ｒｉｎｇｅｒまたは固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルは、一定の態様では、様々な添加物、保存剤、または流体、栄養分または電解質補給物を含む。
【０１８６】
活性成分としてＯｓｐＡポリペプチドを含む本発明の化合物および方法において有用な医薬組成物は、様々な態様では、投与経路によって薬学的に許容される担体または添加物を含む。そのような担体または添加物の例としては水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンゴム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、限定はされないが上記またはそれらの組み合わせから、必要に応じて、本発明の剤形によって選択される。
【０１８７】
様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、または水性懸濁液は、様々な態様では、活性化合物を水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物で含む。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴム；分散または湿潤剤であり、場合によっては、天然由来ホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、エチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドの、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドの脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレアートである。水性懸濁液は、いくつかの態様では、１つ以上の保存剤、例えばエチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含む。
【０１８８】
いくつかの態様では、ＯｓｐＡ組成物は、貯蔵のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成される。この技術は、従来の免疫グロブリンでは有効であることが示されている。当技術分野で知られている任意の好適な凍結乾燥および再構成技術が使用される。凍結乾燥および再構成によって、様々な程度の抗体活性損失が引き起こされること、使用レベルが補償するためにしばしば調整されることが、当業者には認識される。
【０１８９】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁剤および１つ以上の保存剤との混合物中で活性化合物を提供する。好適な分散または湿潤剤および懸濁剤は、以上ですでに言及されたものにより例示される。
【０１９０】
一定の態様では、これらの製剤中のＯｓｐＡ濃度は広く、例えば約０．５重量％未満から、通常約１重量％または少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで変動し、主に液量、粘度、などに基づき、選択される特定の投与方法に従い選択される。よって、例えば、限定はされないが、非経口注射のための典型的な医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水、および５０ｍｇの血液凝固因子を含むように構成される。静脈内注入のための典型的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌Ｒｉｎｇｅｒ溶液、および１５０ｍｇの血液凝固因子を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に知られており、あるいは明らかであり、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  15th  ed.,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  Pa.  (1980)にお
いてより詳細に記載される。有効用量は通常、１回の投与あたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にある。
【０１９１】
様々な態様では、医薬組成物は滅菌された注射可能な水性、油性懸濁液、分散物または滅菌された注射可能な溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末の形態である。懸濁液は、いくつかの態様では、周知の技術に従い、上記で言及されているそれらの好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて、製剤化される。滅菌された注射可能な調製物は、一定の態様では、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌された注射可能な溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液である。いくつかの実施形態では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、それらの好適な混合物、植物油、Ｒｉｎｇｅｒ溶液および等張塩化ナトリウム溶液を含む溶媒または分散媒である。加えて、滅菌された固定油は、従来溶媒または懸濁媒として使用される。この目的のために、任意の無刺激固定油が使用され、様々な態様では、合成モノまたはジグリセリドが挙げられる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は注射液の調製において用途が見いだされる。
【０１９２】
全ての場合において形態は滅菌されなくてはならず、容易に注入できる程度まで流動性がなければならない。適正な流動性が、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散物の場合要求される粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を使用することにより維持される。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、などによりもたらされる。多くの場合、等張作用物質、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。一定の態様では、注射可能な組成物の長期吸収は、組成物における吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされる。
【０１９３】
投与に有用な組成物は、一定の態様では、それらの有効性を増加させるための取込みまたは吸収エンハンサーと共に製剤化される。そのようなエンハンサーとしては、例えば、サリチレート、グリココレート／リノレート、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプラートなどが挙げられる。例えば、Fix  (J.  Pharm.  Sci.,  85:1282-1285,  1996)およびOliyai  et  al.  (Ann.  Rev.  Pharmacol.  Toxicol.,  32:521-544,  1993)を参照されたい。
【０１９４】
加えて、本発明の化合物および方法において使用される組成物の親水性および疎水性の特性はうまくバランスがとられ、よって、インビトロおよびとりわけインビボでの使用の両方に対しそれらの有用性が増強され、そのようなバランスを欠く他の組成物は、実質的には有用性が低くなる。特定的には、本発明の組成物は、水性培地中で適切な溶解度を有し、これにより、体内での吸収およびバイオアベイラビリティを可能にし、一方、脂質中である程度の溶解度を有し、これによって化合物は、細胞膜を横切り、推定上の作用部位まで移動することができる。
【０１９５】
特定の態様では、本明細書で記載されるＯｓｐＡポリペプチドは、アジュバントを含むワクチン組成物中で製剤化される。当技術分野で知られている任意のアジュバントはワクチン組成物の様々な態様で使用され、例えば、油系アジュバント、例えばＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントおよびＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバント、ミコレート系アジュバント（例えば、トレハロースジミコール酸）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、または糖タンパク質、例えばＮ−Ｏｐａｃａ、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］、またはＭＤＰ類似体）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から抽出）、連鎖球菌調製物（例えば、ＯＫ４３２）、Ｂｉｏｓｔｉｍ（商標）（例えば、０１Ｋ２）、ＥＰ１０９  ９４２号、ＥＰ１８０  ５６４号およびＥＰ２３１  ０３９号の「Ｉｓｃｏｍｓ」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、中性油（例えばミグリオール）、植物油（例えば落花生油）、リポソーム、プルロニック（登録商標）ポリオール、Ｒｉｂｉアジュバント系（例えばＧＢ−Ａ−２  １８９  １４１を参照されたい）、またはインターロイキン、特に細胞免疫を刺激するものが挙げられる。アミコラ−タ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）、放線菌目内の細菌属の抽出物からなる別の天然アジュバントが、米国特許第４，８７７，６１２号において記載されている。さらに、専売アジュバント混合物が市販されている。使用されるアジュバントは、一部分において、レシピエント被験体に依存する。投与するアジュバントの量は、被験体の型およびサイズに依存する。最適用量は、ルーチン方法により容易に決定される。
【０１９６】
ワクチン組成物は、任意で医薬ビヒクル、賦形剤、媒質として機能するワクチン適合性の薬学的に許容される（すなわち、滅菌および無毒の）液体、半固体、または固体希釈剤を含む。当技術分野で知られている任意の希釈剤が使用される。例示的な希釈剤としては、、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギナート、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアゴム、リン酸カルシウム、鉱物油、カカオバター、およびカカオ脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
ワクチン組成物は、送達に好都合な形態にパッケージされる。組成物は、カプセル、カプレット、サシェ、カシェ、ゼラチン、紙、または他の容器内に封入される。これらの送達形態は、免疫原性組成物のレシピエント生物へのエントリと適合する場合、特に、免疫原性組成物が単位用量形態で送達される場合好ましい。用量単位が、例えば、錠剤、カプセル、坐剤、バイアル、またはカシェ中にパッケージされる。
【０１９８】
本発明は、哺乳類宿主におけるＯｓｐＡ抗体を含む、被験体において免疫学的応答を誘導するための方法を含み、有効量の本明細書で記載されるＯｓｐＡ組成物を投与することを含む。同様に、本発明は、被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法を含み、方法は、有効量の、本明細書で記載されるワクチン組成物を被験体に投与する工程を含む。
【０１９９】
ワクチン組成物は、本明細書で詳細に上記で記載される任意の従来の方法により免疫化される被験体に導入される。一定の態様では、組成物は、単回投与または複数回投与で、一定の期間にわたり投与される（下記でより詳細に記載される）。
【０２００】
免疫学的応答を誘導するためのキメラＯｓｐＡ組成物の投与／方法
投与される免疫原性組成物またはワクチン組成物の有用な用量は、薬物の作用を調節する様々な因子、例えば、被験体の年齢、状態、体重、性別および食餌、全ての感染の重症度、投与時間、投与方法、および他の臨床学的因子によって変動する。
【０２０１】
いくつかの態様では、本発明の製剤または組成物は、最初のボーラス、続いて一定期間が経過した後に、ブースター送達により投与される。一定の態様では、本発明の製剤は、最初のボーラス、続いて製剤の治療的循環レベルを維持する連続注入により、投与される。特定の態様では、本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物は、様々な期間後、ワクチン接種スキームで投与される。いくつかの態様では、ワクチン接種は、ボレリア感染の傾向のある領域への旅行者に対し迅速免疫化スキームで送達される。別の例として、本発明の組成物または製剤は、１回投与として投与される。当業者は容易に、適正な医療行為および個々の被験体の臨床状態により決定される有効用量および投与レジメンを最適化する。投与回数は、作用物質の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存する。
【０２０２】
医薬製剤は、当業者により、投与経路および所望の用量によって決定される。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  18th  Ed.  (1990,  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  PA  18042)  pages  1435-1712（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのような製剤は、場合によっては、投与される組成物の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、インビボでのクリアランス速度に影響する。投与経路によって、好適な用量が、特定の態様では、体重、体表面積または器官サイズに従い計算される。いくつかの態様では、適切な用量は、適切な用量応答データと共に血液レベル用量を決定するための確立されたアッセイを使用することより確認される。一定の態様では、個体の抗体力価が、最適用量および投与レジメンを決定するために測定される。最終投与レジメンは、主治医または医者により、医薬組成物の作用を修正する様々な因子、例えば組成物の特異的活性、被験体の応答性、被験体の年齢、状態、体重、性別および食餌、全ての感染または悪性状態の重症度、投与時間および他の臨床学的因子を考慮して決定される。研究が実施されるにつれ、さらなる情報が、関連状態の防止および／または治療のための適切な用量レベルおよび治療期間に関して現れてくるであろう。
【０２０３】
一定の態様では、ＯｓｐＡ免疫原性またはワクチン組成物は、被験体において免疫応答を誘起するのに十分な、任意の用量のＯｓｐＡ核酸分子（複数可）またはポリペプチド（複数可）を含む。治療的に使用されるＯｓｐＡ免疫原性またはワクチン組成物の有効量は、例えば、治療背景および目的に依存する。当業者であば、よって、ワクチン接種または治療に対する適切な用量レベルは、一部には、送達される分子、ＯｓｐＡ分子（複数可）が使用される適応、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または器官サイズ）および状態（年齢および全体的な健康）によって変動することを認識するであろう。したがって、臨床医は、場合によっては、用量を滴定し、投与経路を修正して、最適治療効果が得られるようにする。
【０２０４】
典型的な用量は、様々な態様では、上記因子によって、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。他の実施形態では、用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。例として、本発明において有用なＯｓｐＡポリペプチドの用量は、約１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、１３０μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１６０μｇ／ｍｌ、１７０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌ、１９０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２１０μｇ／ｍｌ、２２０μｇ／ｍｌ、２３０μｇ／ｍｌ、２４０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２６０μｇ／ｍｌ、２７０μｇ／ｍｌ、２８０μｇ／ｍｌ、２９０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３２０μｇ／ｍｌ、３４０μｇ／ｍｌ、３６０μｇ／ｍｌ、３８０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４２０μｇ／ｍｌ、４４０μｇ／ｍｌ、４６０μｇ／ｍｌ、４８０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５２０μｇ／ｍｌ、５４０μｇ／ｍｌ、５６０μｇ／ｍｌ、５８０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６２０μｇ／ｍｌ、６４０μｇ／ｍｌである。特定の態様では、典型的な用量は、１被験体あたり０．１〜５．０ｍｌを含む。さらに特定的な態様では、典型的な用量は、１被験体あたり０．２〜２．０ｍｌを含む。一定の態様では、用量は１被験体あたり０．５〜１．０ｍｌを含む。
【０２０５】
投与回数は、使用される製剤中のＯｓｐＡ分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する用量に到達するまで組成物を投与する。よって、組成物は、様々な態様では、単回投与として、または時間をかけて２回以上の投与（同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、または移植装置またはカテーテルを介する連続注入として投与される。適切な用量のさらなる精密化は、ルーチン的に当業者によりなされ、彼等によりルーチン的に実施されるタスクの範囲内にある。適切な用量はしばしば、ルーチン的に入手される適切な用量応答データの使用により確認される。
【０２０６】
キット
追加の態様として、本発明は、被験体への投与のための使用を容易にするようにパッケージされた、被験体にＯｓｐＡポリペプチド（複数可）を投与するための１つ以上の医薬製剤を含むキットを含む。
【０２０７】
特定の実施形態では、本発明は単回用量投与単位を生成させるためのキットを含む。キットは、様々な態様では、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含む。単一および複数チャンバを有する予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（lyosyringe）)を含むキットもまた、
本発明の範囲に含まれる。
【０２０８】
別の実施形態では、そのようなキットは、密閉ボトルまたはベッセルなどの容器にパッケージされた本明細書で記載される医薬製剤（例えば、治療タンパク質またはペプチドを含む組成物）を、容器に添付された、またはパッケージに含まれる、方法を実施する際の化合物または組成物の使用を記載するラベルと共に含む。１つの実施形態では、医薬製剤は容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上面との間の空気の量）が非常に小さくなるように容器にパッケージされる。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。
【０２０９】
１つの態様では、キットは、治療タンパク質またはペプチド組成物を有する第１の容器および組成物のための生理学的に許容される再構成溶液を有する第２の容器を含む。１つの態様では、医薬製剤は、単位剤形でパッケージされる。キットは任意でさらに、特定の投与経路にしたがって医薬製剤を投与するのに好適な装置を含む。いくつかの態様では、キットは、医薬製剤の使用を説明するラベルを含む。
【０２１０】
本明細書で引用される各出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、本開示と矛盾することのない程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのものにすぎず、これらを考慮すると様々な改変および変更が、当業者に示唆され、それらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは理解される。本明細書で引用される出版物、特許、特許出願はすべて、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２１２】
実施例
本発明の追加の態様および詳細は、下記実施例から明らかになるであろう。これらの実施例は、制限するものではなく、むしろ例示であることが意図される。
【０２１３】
実施例１：
ＯＳＰＡワクチン製剤の決定のための欧州ボレリアブルグドルフェリセンスラト株由来のＯＳＰＡの配列解析（分子疫学）
研究の目的は、欧州用のライム病ＯｓｐＡワクチンのための好適な製剤を決定することがであった。研究は、Ｂ．ブルグドルフェリセンスラトの大きな様々な株コレクション由来のＯｓｐＡ遺伝子の配列解析（分子疫学）（これは十分に欧州の広い地理的カバレッジを表す）、疾患と関連する様々な臨床症候群、およびライム病と関連する３つ病原性遺伝種（Ｂ．アフゼリ、Ｂ．ガリニおよびＢ．ブルグドルフェリｓｓ）の各々を基本とした。ライム病は、ボレリアブルグドルフェリセンスラトにより引き起こされ、これは、総計１３遺伝種を含み、そのうちの３つ（Ｂ．アフゼリ、Ｂ．ガリニおよびＢ．ブルグドルフェリ  ｓｓ）がヒトにおいて病原体であると認識されている。
【０２１４】
最初に、大規模な疫学調査（下記表３を参照されたい）を実施し、欧州の２１の国からの、（マダニ由来）ライム病患者由来のボレリアブルグドルフェリセンスラト株を評価した。１６の欧州国から収集した総計５５３欧州ボレリア分離株を研究した。各種をＰＣＲにより各種の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットを使用して決定した。
【０２１５】
欧州においてヒトライム病を引き起こすことが知られている３つのボレリア種の各々由来の分離株が十分表された：Ｂ．アフゼリ（ｎ＝３０９、５５．９％）、Ｂ．ブルグドルフェリセンスストリクト（ｎ＝６７、１２．１％）、およびＢ．ガリニ（ｎ＝１７３、３１．３％）。３５９のヒト分離株のうち、５６．８％がＢ．アフゼリであり、Ｂ．アフゼリは、ほとんどの場所においてヒト分離株から決定された主な種であった。同様に、Ｂ．アフゼリは、５４．１％のマダニ分離株から単離された。Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．は１１．７％のヒト株および１２．９％のマダニ分離株から単離された。Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．は、東南欧州、特にイタリア、ハンガリー、スロベニアおよびオーストリア由来のヒト分離株から単離された。Ｂ．ガリニ株は、３０．４％のヒト分離株から単離され、マダニ分離株の３３％を占めた。ヒトおよびマダニから単離されたＢ．ガリニ株は、欧州全体の地理的領域のほとんどから得られた。この研究からのデータは他の欧州研究から示されたデータとよく相関し、研究した分離株のコレクションは、欧州におけるライム病の正確な状況を表すことが示唆される。
【０２１６】
欧州に対する最適ワクチン製剤を決定するためにＯｓｐＡ配列決定を実施した。このデータに基づき、ＯｓｐＡ型１〜６を含むワクチンは、９８．１％の株および９６．７％の侵襲性疾患症例をカバーする。欧州ボレリア分離株の疫学調査結果は、ＯｓｐＡ型１、２、３、４、５および６に基づくワクチンは、９８％のライム病および９６．７％の侵襲性神経ボレリア症分離株の欧州での理論的カバレッジを提供することを示す。
【表３】
2020178719.tif 000013
【０２１７】
よって、それぞれ２つのＯｓｐＡ血清型を表す、３つの新規組換えＯｓｐＡ（１／２、６／４、および５／３）を含むワクチンは、欧州のライムボレリア症と関連する６つの流行性ＯｓｐＡ血清型（１−６）全てに対し、および米国のライムボレリア症に関連する単一ＯｓｐＡ血清型に対する防御に必要な主構造要素を保持する。
【０２１８】
Ｂ．ガリニＯｓｐＡ血清型５および３を表すＯｓｐＡ  ５／３コンストラクトの包含（ＯｓｐＡ血清型１／２および６／４と共に）は、９８．１％の疾患および９６．７％の侵襲性分離株に対し防御しなければならない。ＯｓｐＡ  ５／３のないワクチンは、約８８．９％のみの疾患、約７３．４％のみの侵襲性疾患に対し防御することが予測される。よって、６つの血清型全てを含むワクチンは、４つの血清型しか有さないワクチンよりもライム病防止においてより有効である。
【０２１９】
実施例２：
脂質付加されたＯＳＰＡをコードする合成ＯＳＰＡ遺伝子の構築のための戦略
研究の目的は、レシピエントをこれらのいくつかのボレリア株のいずれかにより引き起こされるライム病から防御するワクチンを製造するために、ボレリアのいくつかの株から脂質付加されたＯｓｐＡキメラコンストラクトを調製することであった。一般的な戦略を図１にまとめて示し、下記で説明する。
【０２２０】
各新規ＯｓｐＡ遺伝子に対し、４つの組の３０−６０塩基のオリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは、８−１２の相補的なオーバーラップオリゴヌクレオチドから構成された。各組からのオリゴヌクレオチドを、別々の実験で、共にアニールさせ、いずれかの端に特異的な制限酵素認識部位を有する二本鎖ＤＮＡフラグメント、すなわちフラグメントＮ−Ｈ（Ｎｄｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、Ｈ−Ｋ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｋｐｎ  Ｉ）、Ｋ−Ｅ（Ｋｐｎ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ）およびＥ−Ｂ（ＥｃｏＲ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）を生成させた。４つのフラグメントの各々を、独立してｐＵＣ１８にクローニングさせ、対応する制限酵素で切断し、大腸菌宿主ＤＨ５α中にトランスフォームさせ、その後、クローニングされたフラグメントの配列を確認した。
【０２２１】
大腸菌株ＤＨ５α［遺伝子型：ｅｎｄ  Ａ１  ｈｓｄＲ１７  （ｒＫ−ｍＫ＋）  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ  （Ｎａｌｒ）  ｒｅｌＡ１  D（ｌａｃ
ＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｄｅｏＲ（F８０ｄｌａｃD（ｌａｃＺ）Ｍ１５］（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を、全ての中間クローニング工程に対して使用した。この株は、大腸菌株Ｋ１２、遺伝子工学で最も広く使用される宿主に由来する。株はａｍｐ−であり、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）を含むベクターにより形質転換体の選択が可能である。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を発現のための宿主として選択した。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）宿主細胞［遺伝子型：Ｆ−  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ（ｒｋ１２−ｍｋ１２＋）  ＲｉｆＲ  （ＤＥ３）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、最終クローニング工程のために使用した。株はｋａｎ−であり、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）を含むベクターにより形質転換体の選択が可能である。
【０２２２】
ｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を全ての中間工程のためのクローニングベクターとして使用した。というのも、遺伝子操作および配列決定が、このプラスミドを用いた場合にｐＥＴ３０ａよりも容易であったからである。主要特徴は特に、塩基対１４９〜４６９のＬａｃＺαペプチドをコードするｌａｃＺ遺伝子フラグメント（塩基対５０７のｌａｃプロモーター）、塩基対１６２９〜２４８６のアンピシリン耐性決定基をコードするｂｌａ遺伝子（塩基対２５２１のｂｌａプロモーター）、塩基対８６７の複製開始点および塩基対１８５〜４５１の複数のクローニング部位である（図１２）。
【０２２３】
ｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、最終完全ＯｓｐＡ遺伝子インサートのための発現ベクターとして使用した。ｐＥＴベクターでは、遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下でクローニングさせ、発現は、宿主細胞にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ源を提供することにより誘導させた（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ源が提供されるまで発現は起こらない）。主要特徴は、塩基対４０４８〜４８６０のカナマイシン耐性（ｋａｎ）をコードする遺伝子、ｌａｃｌ遺伝子塩基対８２６−１９０５、塩基対４９５６−５４１１のＦ１複製開始点および塩基対１５８〜３４６の複数のクローニング部位である（図１３）。
【０２２４】
全長ＯｓｐＡ遺伝子を作製するために必要とされる４つのフラグメントをＤＮＡミニプレップから切除した。ＤＮＡを、オリジナルクローニング工程のために使用された同じ制限酵素を使用して４つのクローンの各々から単離した。ＤＮＡフラグメントを精製し、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断したｐＵＣ１８  ＤＮＡと共に連結し、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフォームさせた。ｐＵＣ１８でクローニングさせた全長ＯｓｐＡ遺伝子を配列決定し、この工程で誤差が導入されていないことを確認した。
【０２２５】
ＯｓｐＡ遺伝子をその後、制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉを用いてｐＥＴ−３０ａ発現ベクターにサブクローニングさせ、大腸菌宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）にトランスフォームさせた。ｐＥＴ３０ａベクターでは、ＯｓｐＡ遺伝子は、バクテリオファージＴ７プロモーターにより制御される。
【０２２６】
３つの合成ＯＳＰＡ遺伝子を、ボレリアの血清型１および２ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、血清型６および４  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）ならびに血清型５および３  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）由来の防御エピトープを有するＯｓｐＡ分子をコードするように設計した。これらの分子の一次アミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、および６）を、図２−８で示し、それらの設計に組み込まれた主特徴の詳細な説明と共に、本明細書で説明する。
【０２２７】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２コンストラクトに対するオリゴヌクレオチドを社内で、ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機において合成した。ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３およびｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４コンストラクトに対するオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＸｐｒｅｓｓ（Ｗｉｅｎｅｒ  Ｎｅｕｄｏｒｆ、オーストリア）から購入し、ＨＰＬＣ精製した。
【表４−１】
2020178719.tif 000014
【表４−２】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表６】
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【０２２８】
大腸菌コンピテント細胞の調製
単一コロニーを使用して、５ｍｌ改変ＬＢブロス（５．５ｇＮａＣｌ、５ｇ酵母抽出物、１０ｇ大豆ペプトン（動物または遺伝的に修飾された植物源から入手されなかった）−１ｌの水あたり）に播種した。培養物を濁るまでインキュベートし、その後、培養物を予熱改変ＬＢブロスで希釈して、２５ｍｌの体積とした。培養物を、０．２〜０．６のＯＤ６００ｎｍに到達するまで（４０−６０分）さらにインキュベートし、希釈して１２５ｍｌの体積とし、５００ｍｌフラスコに移し、０．６のＯＤ６００ｎｍに到達するまでインキュベートした。培養物を５分間、氷浴中穏やかに振盪させることにより直ちに冷却し、細胞を直接ペレット化し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心機、４０００ｒｐｍで１０分）、ＴｆＢＩ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）（３０ｍＭＫ−アセテート、５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣＬ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  １５％グリセロール）で注意深く洗浄し、５ｍｌのＴｆＢＩＩ  （１０ｍＭ  Ｎａ−ＭＯＰＳ、７５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣＬ、１５％グリセロール）に再懸濁させ、氷上で１５分間保持した。細胞をその後、ピペットでとり１００μｌアリコートとし、直接ドライアイス中で急速凍結させた。
【０２２９】
ＯｓｐＡ遺伝子フラグメントを形成させるためのオリゴヌクレオチド混合物のアニーリング（ｄｅ  ｎｏｖｏ合成）
３つの合成ＯＳＰＡ遺伝子を血清型１および２  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、血清型６および４  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）ならびに血清型５および３  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）由来の防御エピトープを有するＯｓｐＡ分子をコードするように設計した。各新規ＯｓｐＡ遺伝子（脂質付加）に対し、４つの組の３０−６０塩基対のオリゴヌクレオチドを合成した（表４−６を参照されたい）。図１６−１８は、公開された配列から予測されたヌクレオチド配列と整列させたコンストラクトの各々に対するコドン最適化配列を示す）。各オリゴヌクレオチド組は、８−１２の相補的なオーバーラップオリゴヌクレオチドから構成された。各組からのオリゴヌクレオチドを、別々の実験で、共にアニールさせ、いずれかの端に特異的な制限酵素認識部位を有する二本鎖ＤＮＡフラグメント、すなわちフラグメントＮ−Ｈ（Ｎｄｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、Ｈ−Ｋ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｋｐｎ  Ｉ）、Ｋ−Ｅ（Ｋｐｎ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ）およびＥ−Ｂ（ＥｃｏＲ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）を生成させた。
【０２３０】
凍結乾燥させたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再構成させ、ＯＤ２６０ｎｍを測定し、濃度を１０μＭに調節した。各ＯｓｐＡフラグメントに対し、２μｌの各オリゴヌクレオチドを１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１０ｘ）と共に混合し、混合物を室温で３０分間インキュベートし、オリゴをリン酸化させた（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４コンストラクトでは、オリゴはすでにリン酸化されているので、この工程は省略された）。混合物を９５℃まで１分間加熱し（変性工程）、その後、混合物を室温まで徐々に冷却させることによりオリゴをアニールさせた。アニールさせた混合物を直接連結に使用し、または、−２０℃でさらに必要とされるまで貯蔵した。
【０２３１】
ＯｓｐＡ遺伝子フラグメントのクローニング
個々の合成ＯｓｐＡ遺伝子を構成するのに必要とされる４つのフラグメントの各々を、独立してｐＵＣ１８にクローニングさせ、大腸菌宿主ＤＨ５αにトランスフォームさせた（図１を参照されたい）。
【０２３２】
各新規ＯｓｐＡ遺伝子に対し、４つの組の３０−６０塩基のオリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチド組は、８−１２の相補的なオーバーラップオリゴヌクレオチドから構成された。各組からのオリゴヌクレオチドを、別々の実験で、共にアニールさせ、いずれかの端に特異的な制限酵素認識部位を有する二本鎖ＤＮＡフラグメント、すなわちフラグメントＮ−Ｈ（Ｎｄｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、Ｈ−Ｋ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｋｐｎ  Ｉ）、Ｋ−Ｅ（Ｋｐｎ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ）およびＥ−Ｂ（ＥｃｏＲ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）を生成させた。４つの（４）フラグメントの各々を、独立して、対応する制限酵素で切断されたｐＵＣ１８にクローニングさせ、大腸菌宿主ＤＨ５αにトランスフォームさせ、その後、クローニングされたフラグメントの配列を確認した。
【０２３３】
プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１８）を、一晩中、大腸菌培養物（ＬＢブロス）から、ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製系により、製造者プロトコルに従い精製した。ベクターＤＮＡをその後、製造者プロトコルに従い制限酵素対で消化させた；Ｎｄｅ  Ｉ＆  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ＆Ｋｐｎ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ＆ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ＆ＢａｍＨ  Ｉ。消化させた試料を０．８％アガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。直線化されたベクターＤＮＡを切除し、市販のゲル溶出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者プロトコルに従い溶出させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、アニールさせたオリゴヌクレオチド混合物に連結させた。連結生成物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞にトランスフォームさせ、プラスミドを含む形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で選択した。
【０２３４】
クローニングベクター、ｐＵＣ１８中の予測されるサイズのインサートの存在を、プラスミドＤＮＡを精製し、ＤＮＡをクローニングのために使用された酵素により消化させ、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により、前に記載された手順を使用して分析することにより確認した。クローニングされたＤＮＡフラグメントは、精製プラスミドＤＮＡをＤＮＡ鋳型としておよび配列決定プライマー５’−ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧ−３（配列番号１４）および５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴ（配列番号１５）（ｐＵＣ１８ベクター中、複数のクローニング部位の外側に存在し、それぞれ、ｂｐ１３０−１５０およびｂｐ５３０−５１５である）を使用して配列決定した。配列決定反応を自動配列決定装置（ＡＢＩ３１０）上で実施した。配列は、配列エディタを用いて編集させ、配列を分析のためにベクターＮＴＩに移入した。正確な配列を有するクローンのみを、全長ＯｓｐＡ遺伝子を構成するための構成単位として使用した。
【０２３５】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３遺伝子のために、異なる戦略を使用した。というのも、好適なユニークな内部部位が、Ｋｐｎ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉフラグメント内で見いだされず、アミノ酸配列は内部ＥｃｏＲ  Ｉ部位の使用を認めなかったからである（図１４を参照されたい）。Ｐｖｕ  ＩＩ部位はＫｐｎ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉフラグメント内に存在するが、しかしながらｐＵＣ１８ベクターには２つのＰｖｕ  ＩＩ部位が存在し、これは、フラグメントのｐＵＣ１８への直接クローニングが可能ではないことを意味する。よって、コンストラクトのためのオリゴは、Ｐｖｕ  ＩＩ部位の外側に、これに近接されて挿入されたＥｃｏＲ  Ｉ部位を有するように設計され、Ｋｐｎ  Ｉ−ＥｃｏＲ  ＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨ  ＩフラグメントのｐＵＣ１８へのクローニングが可能になった。その後の、挿入フラグメントのＫｐｎ  Ｉ、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉによる消化により、フラグメントが生成し、これらはその後、Ｐｖｕ  ＩＩにより消化された。Ｐｖｕ  ＩＩ消化フラグメント（Ｋｐｎ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩおよびＰｖｕ  ＩＩ−ＢａｍＨＩ）をその後、Ｋｐｎ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断されたｐＵＣ１８ベクターＤＮＡとのトリプル連結で使用され、Ｋｐｎ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉフラグメントが生成した。
【０２３６】
全長ＯＳＰＡ遺伝子の構築
次の工程では、個々の合成ＯｓｐＡ遺伝子を構築するのに必要とされる４つのフラグメントの各々を、ｐＵＣ１８ベクターから切除し、単一工程で、ｐＵＣ１８ベクターに再クローニングし、全長ＯｓｐＡ遺伝子を作製した（図１を参照されたい）。
【０２３７】
全長遺伝子を作製するために必要とされる４つのフラグメントをミニプレップから切除した。ＤＮＡをオリジナルクローニング工程のために使用された同じ制限酵素を使用して単離した。消化された試料をアガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。個々の４つのインサートフラグメントのそれぞれに対するＤＮＡを切除し、市販のゲル溶出キット（ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット）を用いて製造者プロトコルに従い溶出させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化された直線化されたベクターＤＮＡに連結させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットを用いて精製した。連結ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞にトランスフォームさせ、プラスミドを含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で選択した。コロニーを、予測されるサイズ（約８３０ｂｐ）のインサートの存在に対しＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２３８】
単一コロニーを、１０Ｘ緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメーゼ、４００ｎＭ順方向プライマー５’−ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧ−３（配列番号１４）および４００ｎＭ逆方向プライマー５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴ（配列番号１５）を含むＰＣＲ反応において鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ反応条件は下記の通りとした；９４℃で５分、３５ｘ（９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分３０秒）、続いて７２℃で５分の浸漬および４℃で維持。ＰＣＲ産物を直接使用し、またはさらなる使用まで≦１５℃で貯蔵した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により、正しいサイズ（約９８０ｂｐ）のインサートの存在に対し分析した。正しいサイズのインサートの配列決定を実施し、誤差が導入されていないことを確認し、すなわち配列決定反応を一晩培養物（ＬＢ  ａｍｐブロス）由来の単離されたプラスミドＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キット）を用いて、およびクローニング部位に隣接する配列決定プライマー（それぞれ、５’−ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１４）および５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１６）、ｂｐ１３０−１５０および５３０−５１０）を用いて設定した。配列決定反応を自動配列決定装置（ＡＢＩ３１０）上で実施した。配列は、配列エディタを用いて編集させ、配列を分析のためにベクターＮＴＩに移入した。
【０２３９】
新規ＯｓｐＡ遺伝子のｐＥＴ３０ａ発現ベクターへのサブクローニング
全長ＯｓｐＡ遺伝子がｐＵＣ１８において確認された時点で、ＯｓｐＡ遺伝子をその後、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨ  Ｉを用いてｐＥＴ−３０ａ発現ベクターにサブクローニングし、大腸菌宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）にトランスフォームさせた。
【０２４０】
正しい配列を有するｐＵＣ１８クローン由来のミニプレップＤＮＡを、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化させた。同様にｐＥＴ３０ａベクターＤＮＡを、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化させた。消化させたＤＮＡをアガロースゲル上で移動させ、電気泳動的に分離した。約８３０ｂｐのインサートフラグメントおよび直線化されたベクターＤＮＡを前に記載されるように切除し、精製した。ベクターおよびインサートＤＮＡを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、連結生成物を、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のコンピテント細胞にトランスフォームさせた。形質転換体をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上に蒔いた。単一コロニーをＰＣＲにより、プライマー５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）を用いてスクリーニングした。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。正確なサイズ（約１ｋｂ）の生成物を産生したコロニーをその後一晩中培養物を設定するために使用し、これからミニプレップＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キットを用い、製造者プロトコルに従い単離した。配列を再び、（プライマー５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）、それぞれ、ｂｐ６５−８６および３９５−３７３を使用して）確認し、コロニーを発現試験のために選択した。
【０２４１】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２からのｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１の作製
単一のアミノ酸をｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２コンストラクトにおいて変化させ、すなわち２５１位のアミノ酸アラニンを、アスパラギン残基に変化させ、免疫原性を増強させた。アミノ酸変化は、ＰＣＲにより導入した。最初に、ＰＣＲを外部順方向プライマーおよび内部逆方向プライマーを用いて設定し、導入されたアミノ酸変化を有する約７３０ｂｐの生成物を産生させた（図１５を参照されたい）。第２に、ＰＣＲを、内部順方向プライマーおよび外部逆方向プライマーを用いて設定し、導入されたアミノ酸変化を有する１００ｂｐの生成物を産生させた。２つのＰＣＲ産物は、配列がオーバーラップしており、その後、外部順方向および外部逆方向プライマーによる最終ＰＣＲ反応において鋳型ＤＮＡとして使用され、導入されたアミノ酸変化を含む最終全長ＯｓｐＡ生成物が産生された。
【０２４２】
ｐＥＴ３０ａコンストラクトを鋳型ＤＮＡ源として使用した。１０Ｘ緩衝液［１５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメーゼ、および４００ｎＭの各プライマー対（プライマー対５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＧ
ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＣＴ（配列番号１９）＆５’−ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＴＣＧ（配列番号２０）およびプライマー対５’−ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＣ（配列番号２１）＆５’−ＣＴＧ−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ（配列番号２２））を含むＰＣＲ反応を設定した。ＰＣＲ反応を、下記条件を用いて設定した；９４℃で５分、３５ｘ（９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分３０秒）、続いて７２℃で５分の浸漬および４℃で維持。反応により２つの別個のオーバーラップ生成物が産生し、２つの生成物を、外部プライマー５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ
ＣＧＧ  ＣＴ（配列番号１９）および５’−ＣＴＧ−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ
ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ（配列番号２２）（Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉに対する制限部位を組み入れた）を使用する、第３のＰＣＲ反応において鋳型ＤＮＡとして使用した。反応条件は、９４℃で６０秒、続いて３５サイクル（３０秒  ９４℃、６０秒  ４９℃、９０秒  ７２℃）、続いて７２℃で５分とした。増幅産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の仕様書に従い精製し、生成物をＮｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化させ、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断されたｐＥＴ３０ａベクターＤＮＡに連結させた。連結生成物を、大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞にトランスフォームさせた。形質転換体をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上に蒔いた。単一コロニーを、ＰＣＲにより、プライマー５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）を用いてスクリーニングした。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。正しいサイズ（約１ｋｂ）の生成物を産生したコロニーをその後一晩中培養物を設定するために使用し、これからミニプレップＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製系を用い、製造者プロトコルに従い単離した。配列を（プライマー５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）を使用して）確認し、得られたコンストラクトを、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞にトランスフォームさせ、得られた陽性形質転換体を、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１と命名した。
【０２４３】
リーダー配列を有さないコンストラクトの作製
コンストラクトを、ｌｉｐＢリーダー配列を用いて調製したが、これには脂質部分が典型的にはアミノ末端システイン残基で付着されている。組換え脂質付加ＯｓｐＡの実験的試験は、脂質部分の存在を確認した。しかしながら、ｌｉｐＢリーダー配列を含まないコンストラクトもまた調製した。ｌｉｐＢリーダー配列を含まないコンストラクトは、ＰＣＲ増幅により、３つのｌｉｐＢコンストラクト（ｐＥＴ３０ａ中）の各々から、リーダー配列をコードする核酸配列を有さず、システイン残基のためのコドンがメチオニン残基のためのコドンと置換されている、７６９−７７１ｂｐの最終生成物を作製するように選択されたプライマーを使用して作製させた。
【０２４４】
ＰＣＲ反応は、１０Ｘ緩衝液［１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメーゼ、４００ｎＭ順方向プライマー５’−ＣＧＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号２３）および４００ｎＭ逆方向プライマー５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡ−３’（配列番号２２）および鋳型ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ条件は下記の通りとした；９４℃で５分、３５ｘ（９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分３０秒）、続いて７２℃で５分の浸漬および４℃で維持。ＰＣＲ反応物を直接使用し、またはさらなる使用まで≦１５℃で貯蔵した。
【０２４５】
ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化させたｐＥＴ３０ａベクターＤＮＡに連結させた。連結混合物を使用して、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）をトランスフォームし、組換えプラスミドを含むコロニーを、そのカナマイシン耐性により選択し、配列をＰＣＲ産物から確認した。
【０２４６】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）における発現の評価
選択したコロニーを、それらの個々の新規ＯｓｐＡタンパク質を発現する能力に対して試験した。各場合において、単一コロニーを使用してカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢブロスに播種し、３７℃で１〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）値が０．６超、１未満に到達するまで、インキュベートした。この時点で、培養物の１試料を保持し（誘導されていない試料を表す）、培養物の残りを１ｍＭの最終濃度となるまでＩＰＴＧを添加することにより誘導させた。誘導されていない試料（１ｍｌ）を遠心分離し、ペレットを保持し、−２０℃で貯蔵した。誘導された培養物を、さらに３時間増殖させ、その後、１ｍｌの試料を取り、ＯＤ（６００ｎｍ）を測定し、試料を遠心分離し、ペレットを保持し、−２０℃で貯蔵した。
【０２４７】
初代細胞の調製
初代細胞を３つの脂質付加されたコンストラクトの各々および３つの脂質付加されていないコンストラクトの各々に対し調製した。初代細胞は、個々のＯｓｐＡを発現するｐＥＴ３０ａプラスミドを有する大腸菌細胞（ＨＭＳ１７４（ＤＥ３））を含んだ。初代細胞の調製では、個々のストック由来の単一のコロニーをカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）およびリファンピシン（２００μｇ／ｍｌ）を含むプレートから採取し、これを使用して５００μｌのＳＭＫ培地（ＳＯＰ８１１４）に播種し、一晩中インキュベートした。１００μｌのこの培養物をその後使用して、１００ｍｌのＳＭＫ培地に播種し（２通り）、培養物を１７〜２０時間、３７℃で振盪しながらインキュベートした。滅菌グリセロールをその後、培養物に、最終濃度１５％で添加し、材料を５００μｌ量のアリコートでピペットでとり、６０アンプルとし、よって、６０アンプルの初代細胞を得、これを直接−８０℃で貯蔵した。
【０２４８】
３つの合成ＯspＡ遺伝子を、血清型１および２  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）、血清型６および４  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）ならびに血清型５および３  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）由来の防御エピトープを有するＯｓｐＡ分子をコードするように設計した。これらの分子の一次アミノ酸配列およびそれらの設計に組み込まれる主特徴は、下記実施例において記載する。
【０２４９】
実施例３：
脂質付加された１／２２５１ＯＳＰＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯＳＰＡ１／２２５１）の説明
この研究の目的は、血清型１および２を含む新規ＯｓｐＡ抗原、脂質付加された１／２２５１  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）を設計することであった。ＬｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１は、血清型２配列（株Ｐｋｏ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ４８３２２）の遠位部に融合された血清型１  ＯｓｐＡ配列（株Ｂ３１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１４４０７）の近位部を含む。２型血清型にユニークな配列の開始は、２１６位のリシン（Ｋ）残基である。コンストラクトは、元々、２５１位のアミノ酸アラニン（Ａ）をコードするように設計された。しかしながら、コンストラクトはその後、ＰＣＲにより、アスパラギン（Ｎ）残基（Ｐｋｏから公表された配列中の実際の残基）をコードするように変化され、免疫原性が増強され、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１と命名された。
【０２５０】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１の二次特徴を図２のｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１のアノテートされたアミノ酸配列において示し、これは下記を含む：
●  分子の近位部（アミノ酸１６１〜１８５）における、推定関節炎誘発性エピトープ(Gross  et  al.，  1998)、ｈＬＦＡ−１（ＹＶＬＥＧＴＬＴＡ）（配列番号２４）の、血清型２  ＯｓｐＡ配列（株Ｐｋｏ；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ４８３２２）由来の等価配列（イタリック体およびフランキング配列で示される）：ｈＬＦＡ−１エピトープとは異なる配列による置換；
●  ＯｓｐＢリーダー配列（図２のアミノ酸１〜１５）および先行技術を回避するための様々な置換。４４および４６位のアスパラギン（Ｎ）およびアスパラギン酸（Ｄ）残基は、それぞれ、アスパラギン酸（Ｄ）およびアスパラギン（Ｎ）で置換され、配列ＫＥＫＤＫＮ（配列番号２５）が生成された。７８および７９位のアラニン（Ａ）およびアスパラギン酸（Ｄ）残基は、それぞれ、スレオニン（Ｔ）およびアスパラギン（Ｎ）により置換され、配列ＫＴＮＫＳＫ（配列番号２６）が生成された；
●  国際特許公開第ＷＯ０２／１６４２１Ａ２号（Ｌｕｆｔ＆Ｄｕｎｎ）に記載される安定化突然変異。例えば、メチオニン（Ｍ）がアミノ酸１３６でアルギニン（Ｒ）に取って代わり（Ｒ１３９Ｍ）；チロシン（Ｙ）がアミノ酸１５７でグルタミン酸（Ｅ）に取って代わり（Ｅ１６０Ｙ）；メチオニン（Ｍ）がアミノ酸１８６でリシン（Ｋ）に取って代わった（Ｋ１８９Ｍ）；ならびに
●  追加の安定化突然変異。例えば、スレオニン（Ｔ）がアミノ酸１７３でバリン（Ｖ）に取って代わった（開示のａａ１７６）。推定関節炎誘発性エピトープ（１６１−１８５位）の、Ｂ．ブルグドルフェリ配列をＢ．アフゼリ配列で置換することによる除去は、アミノ酸１７３と１７４の間の水素結合を妨害した（開示のａａ１７６と１７７）。これは、防御モノクローナル抗体への結合を減少させた（１０５．５およびＬＡ−２(Jiang  et  al.,  J.  Immunol.  144:  284-9,  1990;  Golde  et  al.,  Infect.  Immun.  65:  882-9,  1997;  およびDing  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  302:  1153-64,  2000)
。１７３位で、バリン（Ｖ）の代わりに、スレオニン（Ｔ）が導入されると水素結合が回復し、防御モノクローナル抗体１０５．５およびＬＡ２への反応性が増加した。
【０２５１】
加えて、アミノ酸１６−２５（成熟タンパク質の開始）は、ＯｓｐＢ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７４８１０）と同一である。
【０２５２】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図３に示す。リーダー配列（緑）は、タンパク質分泌中に切断される。成熟ＯｓｐＡタンパク質の配列は、システイン残基（下線）で開始し、これはタンパク質の脂質アンカーのための付着部位を形成する。
【０２５３】
実施例４：
脂質付加された６／４  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯＳＰＡ  ６／４）の説明
この研究の目的は、血清型４および６を含む新規ＯｓｐＡ抗原、脂質付加されたｓＯｓｐＡ  ６／４  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）を設計することであった。ＬｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４は、血清型４配列（株ｐＴｒｏＢ；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｉ４００８９）の遠位部に融合された血清型６  ＯｓｐＡ配列（株Ｋ４８、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｉ４００９８）の近位部を含む。型４血清型にユニークな配列の開始は、２１７位のアスパラギン（Ｎ）残基である。二次特徴を、図４でのｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４のアノテートされたアミノ酸配列において示し、下記を含む：
●  国際特許出願第ＷＯ０２／１６４２１Ａ２(ＬｕｆｔおよびＤｕｎｎ)号で記載される安定化突然変異：アミノ酸１３６でのアルギニン（Ｒ）の代わりのメチオニン（Ｍ）、アミノ酸１５７でのグルタミン酸（Ｅ）の代わりのチロシン（Ｙ）、およびアミノ酸１８７でのリシン  （Ｋ）の代わりのメチオニン（Ｍ）；ならびに
●  上記ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１のように、ＯｓｐＢリーダー配列が使用され（図４のアミノ酸１〜１５）、アミノ酸１６−２５は、ＯｓｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７４８１０）由来の配列と同一である。
【０２５４】
ペプチド配列ＫＥＫＮＫＤ（配列番号２７）は、親ＯｓｐＡ６型配列（ＫＥＫＤＫＤ）（配列番号２８）にはなかったが、４６位のアスパラギン酸（Ｄ）残基は、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１コンストラクトにおいて生成された等価変化に従ってアスパラギン残基（Ｎ）と置換され、配列ＫＥＫＤＫＮ（配列番号２５）が生成された。
【０２５５】
ペプチド配列ＫＡＤＫＳＫ（配列番号２９）は親ＯｓｐＡ６型配列（ＫＴＤＫＳＫ）（配列番号３０）にはなかったが、７９位のアスパラギン酸（Ｄ）残基は、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１コンストラクトにおいて生成された等価変化に従ってアスパラギン残基（Ｎ）と置換され、配列ＫＴＮＫＳＫ（配列番号２６）が生成された。
【０２５６】
アミノ酸３７は、親配列（株Ｋ４８；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｉ４００９８）に存在するように、グルタミン酸（Ｅ）からバリン（Ｖ）に変化された。というのも、ほとんど全ての６型配列はこの位置にバリンを有するからである。
【０２５７】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図５に示す。リーダー配列（緑）は、タンパク質分泌中に切断される。成熟ＯｓｐＡタンパク質の配列は、システイン残基（下線、図５を参照されたい）で開始し、これはタンパク質の脂質アンカーのための付着部位を形成する。
【０２５８】
実施例５．
脂質付加された５／３  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）の説明
この研究の目的は、血清型３および５を含む新規ＯｓｐＡ抗原、脂質付加されたｓＯｓｐＡ  ５／３  ＯｓｐＡ（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）を設計することであった。ＬｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３は、配列番号５および６で示されるように修飾を有する、血清型３配列（株ＰＢｒ；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８０２５６、Ｂ．ガリニＯｓｐＡ  遺伝子）の遠位部に融合された血清型５  ＯｓｐＡ配列［Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｅｍｂ｜Ｘ８５４４１｜ＢＧＷＡＢＯＳＰＡ、Ｂ．ガリニＯｓｐＡ遺伝子（ＷＡＢＳｏｕ  ｓｕｂ株）］の近位部を含む。型３血清型にユニークな配列の開始は、２１６位のアスパラギン（Ｄ）残基である。二次特徴を、図６でのｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３のアノテートされたアミノ酸配列において示し、これは下記を含む：
●  国際特許出願第ＷＯ０２／１６４２１Ａ２（ＬｕｆｔおよびＤｕｎｎ）号で記載される安定化突然変異：アミノ酸１３６でのアルギニン（Ｒ）の代わりのメチオニン（Ｍ）、アミノ酸１５７でのグルタミン酸（Ｅ）の代わりのチロシン（Ｙ）、およびアミノ酸１８７でのリシン（Ｋ）の代わりのメチオニン（Ｍ）；ならびに
●  上記ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１およびｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４のように、ＯｓｐＢリーダー配列が使用され（図６のアミノ酸１〜１５）、アミノ酸１６−２５は、ＯｓｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７４８１０）由来の配列と同一である。
【０２５９】
ペプチド配列ＫＥＫＮＫＤ（配列番号２７）は、親ＯｓｐＡ型５配列（ＫＥＫＤＫＤ）（配列番号２８）にはなかったが、４６位のアスパラギン酸（Ｄ）残基は、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１コンストラクトにおいて生成された等価変化に従ってアスパラギン残基（Ｎ）と置換され、配列ＫＥＫＤＫＮ（配列番号２５）が生成された。
【０２６０】
ペプチド配列ＫＡＤＫＳＫ（配列番号２９）は親ＯｓｐＡ型５配列（ＫＴＤＫＳＫ）（配列番号３０）にはなかったが、７９位のアスパラギン酸（Ｄ）残基は、ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１コンストラクトにおいて生成された等価変化に従ってアスパラギン残基（Ｎ）と置換され、配列ＫＴＮＫＳＫ（配列番号２６）が生成された。
【０２６１】
ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図７に示す。リーダー配列（緑）は、タンパク質分泌中に切断される。成熟ＯｓｐＡタンパク質の配列は、システインコドン（下線、図７を参照されたい）で開始し、これはタンパク質の脂質アンカーのための付着部位を形成する。
【０２６２】
実施例６：
大腸菌における高レベル発現のためのコドン使用頻度の最適化
大腸菌においてめったに使用されないコドンの存在が、外来遺伝子の高レベル発現を妨げる可能性があることが知られているので、使用率の低いコドンは、大腸菌において高度に発現される遺伝子により使用されるコドンと置換させた。新規ＯｓｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、高度に発現されたクラスＩＩ、大腸菌遺伝子(Guerdoux-Jamet  et.  al.,
DNA  Research  4:257-65,1997)の中で最もしばしば見いだされるコドン（好ましいコ
ドン）を使用するように設計された。新規ＯｓｐＡ遺伝子間のコドン使用頻度、および高度に発現したクラスＩＩ大腸菌遺伝子に対するデータを表７および８にまとめて示す。ｔＲＮＡ分子が律速となる可能性が低い、より頻度の低いアミノ酸に対するデータ（表７）を、最もしばしば起こるアミノ酸に対するデータ（表８）と別々に示す。
【表７】
2020178719.tif 000019
【表８】
2020178719.tif 000020
【０２６３】
新規ＯｓｐＡ遺伝子（一般的なアミノ酸のみ）に対して選択されるコドン使用頻度および大腸菌クラスＩＩ遺伝子間の高い一致度は明らかである（すなわち、クラスＩＩ遺伝子に対する表８からのパーセンテージ値の個々の新規ＯｓｐＡ遺伝子に対するプロット；図８を参照されたい）。３つの脂質付加されたコンストラクトでは、オリジナル配列は３２．８％〜３３．８％の範囲のＧＣ含量を有したが、コドン−最適化配列は、４３．８％〜４６．８％の範囲のＧＣ含量を有し、これは、大腸菌の５０％ＧＣ含量に類似する。
【０２６４】
実施例７：合成による脂質付加されていないＯＳＰＡ遺伝子の構築
ｌｉｐＢリーダー配列を含まないコンストラクトもまた調製した。２組のコンストラクト（脂質付加された、および脂質付加されていない）が、発酵槽における生成の容易さを評価するために（バイオマス、安定性、生成収率、など）、どれくらい容易に異なる型の抗原を精製することができるか評価するために、それらの生物学的特性（安全性プロファイルおよび防御能力）を比較するために、必要である。
【０２６５】
コンストラクト（配列番号７、９、および１１）を、３つのｌｉｐＢ  ＯｓｐＡコンストラクト（配列番号１、３、および５）の各々から制限部位が組み込まれたＰＣＲプライマーを用いて作製した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、消化させたｐＥＴ３０ａベクターＤＮＡに連結させた。連結混合物を使用して、大腸菌ＤＨ５αをトランスフォームし、ＯｓｐＡ配列を確認した。ミニプレップＤＮＡを調製し、単離し、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）宿主細胞をトランスフォームするために使用した。脂質付加されていない誘導体の配列は、リーダー配列をコードする最初の４５塩基対を欠き、脂質付加されたバージョンにおけるシステインコドンにとって代わるメチオニンコドンを含むＮｄｅ  Ｉ部位を含むことを除き、脂質付加されたバージョンと同一である（図９を参照されたい）。
【０２６６】
実施例８：新規組換えＯＳＰＡ抗原の発現
抗原目的のための新規組換えＯｓｐＡ遺伝子の発現／生成のために、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより制御された大腸菌発現系(Studier  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  189:113-30、1986)を使用した。この発現系では、新規ＯｓｐＡ遺伝子を、ｐＥＴシリーズプラスミドの１つ（例えば、ｐＥＴ３０ａ）中の複数のクローニング部位にクローニングさせた。外来遺伝子の発現は、バクテリオファージＴ７プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識されない）の制御下にあるので、発現はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ源に依存する。この酵素は、組換えプラスミドが適切な発現宿主、例えば大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む）中に移行された時に提供される。染色体に取り込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあり、これはイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはラクトースの付加によりスイッチオンすることができる（すなわち、誘導される）（図１０を参照されたい）。結果として、外来遺伝子の発現はまた、インデューサー分子の付加により調節される。
【０２６７】
細胞を後期対数期に誘導し、誘導後３−４時間で収集した。誘導された細胞において、キメラＯｓｐＡ抗原は細胞可溶化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるように、最も高度に発現したタンパク質であった。ＯｓｐＡキメラのほとんどが上清中で見いだされた。混入する大腸菌タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにより除去し、空隙容量に溶出したキメラＯｓｐＡタンパク質を限外濾過により濃縮した。
【０２６８】
コンストラクトの各々からの新規組換えＯｓｐＡタンパク質の発現を試験し、誘導されたおよび誘導されていない培養物からの試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で移動させた（図１１）。脂質付加された（配列番号２、４、および６）および脂質付加されていない（配列番号８、１０、および１２）抗原では、約３１ｋＤａのバンドがそれぞれの場合に観察された（図１１を参照されたい）。タンパク質を特徴づけし、決定した分子量は末端メチオニンが切断されたと推定する理論分子量と相関（＋／−０．５ダルトン）した。図１１は、発現された組換えの脂質付加されたＯｓｐＡタンパク質は、少なくとも１０％の総タンパク質収率を含むことを示し、コンストラクトは、それらの本来の目的に有用であることが確認される。
【０２６９】
実施例９：
単一の組換えＯｓｐＡ抗原（ＲＯＳＰＡ  １／２）は、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．およびＢ．アフゼリによる感染に対し防御する
この研究の目的は、ＯｓｐＡ血清型１および２の防御特性を保持するように設計された単一の組換え抗原（ｒＯｓｐＡ  １／２；配列番号２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）を含むポリペプチド）が、マウスをＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．（ＯｓｐＡ血清型１）またはＢ．アフゼリ（ＯｓｐＡ血清型２）のいずれかによる感染に対し防御する抗体応答を誘導することができるかを決定することであった。追加のｒＯｓｐＡ抗原の含有は、ｒＯｓｐＡ  １／２抗原により提供される防御免疫に対し拮抗効果を有さなかったこを示す証拠が提供される。
【０２７０】
ｒＯｓｐＡ  １／２の設計および構築
外来病原体の導入の危険を排除するために、相補的なオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドを使用して、共に連結されベクターｐＥＴ３０ａにクローニングされたＤＮＡフラグメントを作製し、配列を確認した。このアプローチにより、コドン使用頻度を、ＯｓｐＡ遺伝子を発現するために使用される大腸菌宿主ＨＭＳ１７４  （ＤＥ３）に対し最適化させることが可能になった。新規遺伝子は、血清型−２配列（アミノ酸２１９〜２７３、株ＰＫｏ；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＳ４８３２２）の遠位部に融合された血清型−１  ＯｓｐＡ配列（アミノ酸２９〜２１８、株Ｂ３１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１４４０７）の近位部に基づく。Ｂ．ブルグドルフェリ株Ｂ３１由来の２５アミノ酸フラグメント（ａａ１６４〜１８８）を、Ｂ．アフゼリ株ＰＫｏ由来の配列（ａａ１６４〜１８８）と置換した。というのは、Ｂ３１  ＯｓｐＡ（ａａ１６５−１７３）のこの領域は、ｈＬＦＡ−１エピトープ（ａａ３３２−３４０）を含む領域に高度に関連するからである。脂質付加されたタンパク質の発現を最適化するために、リーダー配列および最初の１１アミノ酸を含むＮ末端配列を、ＯｓｐＢ（株Ｂ３１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＸ７４８１０）から誘導した。ｒＯｓｐＡ１／２分子の免疫原性およびコンホメーション安定性を改善するために他の特定のアミノ酸変化を実施し、ｒＯｓｐＡ  １／２（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２２５１）の配列を配列番号２で設定する。
【０２７１】
動物試験
異なるＯｓｐＡ抗原を発現する、ボレリアの２つの種による感染を防止する単一の組換えＯｓｐＡ抗原（ｒＯｓｐＡ  １／２）の能力を、０．２％（ｗ／ｖ）水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いて製剤化した精製ＯｓｐＡ抗原（０．１μｇまたは０．０３μｇ用量）により皮下に（０および２８日）免疫化したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて評価した。マウスをブースター免疫化後２週間で、皮内注射（針誘発；７ｘ１０４細胞）または感染の自然経路（マダニ誘発）のいずれかにより誘発した。後者の実験では、８匹の幼虫マダニを、マウス１匹あたりに適用し、５日まで摂食させた。幼虫は、ライム病がよく見られる地域であるＢｕｄｗｅｉｓ（チェコ共和国）近辺で収集した。これらのマダニの大多数が、ＰＣＲにより摂食させていないマダニを試験することにより決定されるようにＢ．アフゼリに感染した。マウスの感染状態を４週間後に決定した。マダニ誘発実験では、ボレリアの存在は、培養（膀胱）により、およびリアルタイムＰＣＲ（心臓）によるボレリアＤＮＡの検出により確認した。動物実験を動物実験に関するオーストリアの法律および国際ガイドライン（ＡＡＡＬＡＣおよびＯＬＡＷ）に従い実施し、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による再調査を受け、オーストリア規制当局による承認を受けた。免疫原性。ｒＯｓｐＡ  １／２抗原に対する抗体応答（μｇ  ＩｇＧ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡにより、ｒＯｓｐＡ  １／２をコーティング抗原として、規定されたＩｇＧ含量を有するＯｓｐＡ特異的モノクローナル抗体（室内調製）を標準として使用して決定した。
【０２７２】
診断手順
針誘発実験では、表面露出リポタンパク質ＶｌｓＥタンパク質中の保存エピトープ（Ｃ６  ＥＬＩＳＡ；Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｃ６  Ｌｙｍｅ  ＥＬＩＳＡ（商標）からのコートプレート）またはＯｓｐＡ免疫源以外のボレリア抗原（Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング）に対する抗体の存在を、感染の診断に使用した。Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングは、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株ＺＳ７から調製した細胞可溶化物を使用した。というのも、これが誘発生物であったからである。動物は、両方のアッセイにおいて陽性であった場合、感染したと見なした。
【０２７３】
マダニ誘発実験では、Ｃ６  ＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロッティングをまた実施した。しかしながら、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングは、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．ＺＳ７、Ｂ．アフゼリＡＣＡ１およびＢ．ガリニＫＬ１１由来の可溶化物を使用した。というのも、感染生物の同一性がわかっていなかったからである。動物は、どちらのアッセイも陽性であった場合にのみ、セロコンバージョンを受けたと考えた。加えて、ボレリア感染を、膀胱由来の培養およびＯｓｐＡの５’−領域を標的とするリアルタイムＰＣＲアッセイおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づくアッセイを用いた、心臓組織から抽出したゲノムＤＮＡ中のＢ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．核酸の検出により評価した。動物は、両方のアッセイによりＰＣＲ産物が検出された場合にのみ、ＰＣＲ−陽性としてスコア化した。全体として、動物を感染したと判断するためには、マウス培養、ＰＣＲまたは血清学のいずれかにより陽性である必要があった。
【０２７４】
感染ボレリアのキャラクタリゼーション
可能であれば、感染生物を培養し、ＯｓｐＡ配列および推定アミノ酸配列を、ＯｓｐＡ
残基３８−２６２（Ｂ．アフゼリＶＳ４６１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０８７）に対して決定した。この情報を、ＯｓｐＡ参照配列と比較し、よって、ＯｓｐＡ型およびボレリア種を推測することができる。単一のＯｓｐＡ血清型を発現する種では、種に対する株型に対するＯｓｐＡ配列を、参照、例えば、Ｂ．アフゼリＶＳ４６１またはＢ．バライシアナＶＳ１１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０８７；ＡＦ０９５９４０）として選択した。Ｂ．ガリニは複数のＯｓｐＡ型を有するので、ＯｓｐＡ遺伝子型３−７に対するＯｓｐＡ配列を使用した（すなわち、株ＰＢｒ、ＰＴｒｏｂ、ＷＡＢＳｏｕ、ＴｌｓＩおよびＴ２５；それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ８０２５６、Ｘ８０１８６、Ｘ８５４４１、Ｘ８５４４０およびＸ８０２５４）。リアルタイムＰＣＲに基づくタイピングでは、ＧｅｎＢａｎｋに預けられた１２４Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．種のＯｓｐＡ遺伝子の配列アライメントを血清型特異的配列に対して検査し、好適なプライマー−プローブ組み合わせを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した。全てのアッセイはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００ＨＴ配列決定ユニットで、普遍的サイクリング条件を用いて実施した。
【０２７５】
ｒＯｓｐＡ  １／２による免疫化によるＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ（ＯｓｐＡ血清型−１）感染の防止
低用量の２つの異なるロットのｒＯｓｐＡ  １／２抗原で免疫化したマウスはすべて、ＥＬＩＳＡにより決定されるように免疫源に特異的なＩｇＧ抗体を発現した。水酸化アルミニウムを含むワクチン製剤緩衝液で処理した対照マウスでは抗体は検出されなかった。この免疫応答のＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、血清型−１  ＯｓｐＡをコードする種による感染を防止する能力を評価するために、マウスに、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株ＺＳ７の７ｘ１０４細胞を皮内注射した。アジュバントを含む緩衝液で処理した対照マウスは全て、Ｃ６  ＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロッティングにより示されるように、感染の血清学的証拠を示した。ｒＯｓｐＡ  １／２抗原で免疫化したマウスは感染せず、これらのマウス由来の血清はどちらのアッセイでも陰性であった。アジュバントとして水酸化アルミニウムと共に製剤化し、２つの用量免疫化レジメンで投与した場合、０．０３μｇという少量のｒＯｓｐＡ  １／２抗原が病原性Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株ＺＳ７による針誘発に対し１００％防御を与えた（Ｐ＜０．０００１、Ｆｉｓｈｅｒ直接両側検定）。
【０２７６】
ｒＯｓｐＡ  １／２による免疫化によるＢ．アフゼリ（ＯｓｐＡ血清型２）感染の防止
ｒＯｓｐＡ  １／２抗原による免疫化の、Ｂ．アフゼリ、血清型２  ＯｓｐＡをコードする種による感染を防止する能力を評価するために、マウスを、２つの別々の実験で、同じ上記針誘発実験で使用したのと抗原ロットおよび研究設計を用いて免疫化した。しかしながら、この場合、免疫化マウスは、主にＢ．アフゼリに感染したことが知られている野生マダニ（幼虫）により誘発した。これらの野生マダニのＢ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．をマウスに伝染させる能力は、非免疫化対照動物を誘発することにより確認した。
【０２７７】
対照マウスのほとんど（総計１１／１４、７９％）が感染した。感染した対照動物は、２つの非依存性リアルタイムＰＣＲアッセイ（１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびＯｓｐＡ遺伝子）によりボレリアＤＮＡに対し陽性であった。１０／１１の場合、膀胱の培養によりボレリアを単離することが可能であった。残りのマウスは血清学およびＰＣＲにより陽性であった。１０の培養分離株のうち９で、ＯｓｐＡ配列が回収され、全てがＢ．アフゼリとして分類された（＞９９％ＯｓｐＡ配列相同性）。さらに、全ての感染生物は、特異的に血清型２  ＯｓｐＡ遺伝子を標的とするリアルタイムＰＣＲアッセイを用いた心臓から抽出したＤＮＡのＰＣＲ分析により、Ｂ．アフゼリとして分類された。これらのデータにより、Ｂ．アフゼリは、感染した野生マダニからそれらのマウス宿主に伝染される主なボレリア種であることが確認された。
【０２７８】
ｒＯｓｐＡ  １／２（総計  ３／３２、９％）で免疫化したマウスはほとんど感染しなかった。これらの３匹のマウスのうち、１匹は３つ全ての診断基準（血清学、ＰＣＲおよび培養）により決定されるように感染し、配列解析により、感染生物はＢ．ガリニ血清型６（＞９９％  ＯｓｐＡ配列相同性）であることが明らかになった。感染したとみなされた残りの２匹の動物は、３つの基準のうち２つのみで陽性であった。１匹のマウスは、血清学およびＰＣＲにより陽性であった。しかしながら、感染生物は、培養において回収できなかった。それにもかかわらず、この生物は、血清型７  ＯｓｐＡ遺伝子に特異的なＰＣＲを使用する、心臓から抽出したＤＮＡのＰＣＲ解析によりＢ．ガリニ血清型７として分類することができる。第３のマウスはＰＣＲおよび培養陽性であったが、血清学的に陰性であった。このマウスから培養した分離株は、配列決定により決定されるようにＢ．バライシアナであった（Ｂ．バライシアナ株ＶＳ１１６とのＯｓｐＡ配列相同性）。重要なことに免疫化マウスのいずれも（０／３２）Ｂ．アフゼリに感染しなかった。アジュバントとして水酸化アルミニウムと共に製剤化し、２つの用量免疫化レジメンで投与した場合、０．０３μｇという少量のｒＯｓｐＡ  １／２抗原が野生マダニにより伝染されるＢ．アフゼリに対し完全防御を与えた。
【０２７９】
結論
２つの異なるＯｓｐＡ血清型（１および２）由来の防御要素を含むように設計された単一の組換え細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）抗原は、マウスを、Ｂ．ブルグドルフェリセンスストリクト（ＯｓｐＡ血清型１）またはＢ．アフゼリ（ＯｓｐＡ血清型２）のいずれかによる感染に対して防御する抗体応答を誘導することができた。Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株ＺＳ７による感染に対する防御は、針誘発モデルにおいて証明された。Ｂ．アフゼリ種に対する防御は、野生マダニを使用するマダニ誘発モデルで見られた。両方のモデルにおいて、０．０３μｇという少量の抗原が、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いる２つの用量免疫スケジュールで投与すると、標的とされる種に対する完全防御を提供するのに十分であった。予想されるように、この新規抗原により認められる防御は、抗原がＢ．ガリニおよびＢ．バライシアナ株による感染に対し防御を提供することができないことから証明されるように、他のボレリア種に及ばなかった。この原理研究の証拠は、防御エピトープの情報は、より少ないＯｓｐＡ抗原を必要とする有効な遺伝子組換えワクチンの合理的設計のために使用することができることを証明し、このアプローチが、世界的利用のためのＯｓｐＡワクチンの開発を促進し得ることを示唆する。
【０２８０】
実施例１０：マウス抗ＯＳＰＡ抗体が生ボレリアの表面に結合するまたはその増殖を阻害する効率は、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．型１株を使用する針誘発に対する防御と相関する
この研究の目的は、ボレリアブルグドルフェリセンスストリクトＯｓｐＡ型１株を使用する針誘発モデルにおいて、ｒＯｓｐＡ  １／２抗原により免疫化されたマウスに対する防御の関連要因を確立することであった。分析したパラメータは、生ボレリアの表面に結合する、またはボレリアの増殖を阻害する抗ＯｓｐＡ抗体の効力であった。
【０２８１】
９８匹のマウスを、刺激−ブースターレジメンで、準最適３ｎｇ用量のｒＯｓｐＡ  １／２抗原で、０．２％ＡＩ（ＯＨ）３をアジュバントとして使用して、計画的に免疫化し（実施例９で使用した低用量よりも１０倍低かった）、よって、誘発されると、防御および感染動物の両方が観察された。ワクチン接種を、皮下で０、１４および２８日に１００μｌの用量体積を用いて実施した。３８日に、誘発前血清試料ｓを９６匹のマウスから取り、動物を１０日後、１９．４ｘＩＤ５０の培養増殖されたＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．ＺＳ７で誘発し、感染状態を４週間後に決定した。９６匹のマウスのうち７１（７２％）が、この低用量の抗原による免疫化後防御されることが見いだされた。
【０２８２】
誘発後４週間の血液を採り、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株ＺＳ７の膜画分に対し、それらの血清をＷｅｓｔｅｒｎブロッティングすることにより感染したマウスを同定した。使用した誘発用量では、感染したマウスのみがＯｓｐＡ以外の株ＺＳ７の膜抗原に対する抗体応答を有した（ワクチンにより誘導されたＯｓｐＡに対する応答はスコア化しなかった）。
【０２８３】
生ボレリアの表面へ結合するＯｓｐＡ抗体の定量
このアッセイでは、ＯｓｐＡ型１を発現するＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株Ｂ３１を、補体活性化を防止するためにＥＤＴＡの存在下、室温で誘発前マウス血清と共に固定希釈（１：１００）でインキュベートした。洗浄して非結合抗体を除去した後、細胞表面に特異的に結合した抗体を、処理細胞をｒ−フィコエリトリン結合抗マウスＩｇポリクローナル抗体とインキュベートすることにより標識した。その後、赤色蛍光を発し、よって、検出を増強するＤＮＡ染色（ＬＤＳ−７５１）を使用し、細菌をその後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞表面に付着された抗体分子の数と相関する蛍光強度を、少なくとも２，０００個体ボレリアに対し記録し、蛍光強度（ＭＦＩ）の平均を計算した。正常マウス血清は抗体の非特異的表面結合の程度を評価するための陰性対照として機能し、ＯｓｐＡ血清型１特異的ｍＡｂは、ＯｓｐＡ型の同一性を確認し、細菌培養における細胞のＯｓｐＡ発現レベルを確認するための陽性対照として機能した。
【０２８４】
細菌増殖阻害アッセイ
誘発前血清の、ボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、ＯｓｐＡ型１を発現するＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株Ｂ３１を３３℃で段階希釈の熱不活性化誘発前または非免疫マウス血清（陰性対照）の存在下、補体（正常モルモット血清）の存在下培養した。非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌を十分増殖させた場合、顕微鏡的に決定されるように、正確な細胞カウントは、フローサイトメトリー分析により実施した。細胞培養物を、明確な数の蛍光標識ビーズを含む溶液と混合し、ＤＮＡ染料をボレリア細胞を蛍光標識するために添加した。試料を、１００ビーズがカウントされるまでＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて処理し、ビーズを規定するゲートにおけるイベント数を、ボレリアを規定するゲートにおけるものと比較することにより絶対細胞濃度を計算した（細胞／ｍｌ）。細菌増殖を５０％阻害した血清希釈を、ＮＭＳ対照と比較して計算し、ＧＩ−５０力価として報告した。標準血清調製物を使用して異なるアッセイ間で力価を正規化した。測定した血清パラメータの分布を感染および防御動物間で、ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓ．５．０）により比較した。
【０２８５】
この研究の結果（図１９を参照されたい）により、誘発時の免疫血清の機能的抗体含量とＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．（ＺＳ７）の高用量（１９．４ｘＩＤ５０）針誘発による感染に対する防御との間には極めて大きな相関があることが明確に証明される。ＯｓｐＡ型１を発現する生ボレリアのＦＡＣＳに基づく蛍光強度測定は、細胞表面に付着された抗ＯｓｐＡ抗体分子の数を反映し、固定希釈での誘発前血清との細菌のインキュベーション後に実施されたが、これは防御と最もよく相関した（ｐ＜０．０００１マンホイットニーＵ検定）。しかしながら、増殖阻害力価もまた、極めて大きく防御と相関した（ｐ＝０．０００２マンホイットニーＵ検定、図１９）。
【０２８６】
実施例１１：
マウス抗ＯＳＰＡ抗体が生ボレリアの表面に結合するまたはその増殖を阻害する効率は、Ｂ．アフゼリ型２株を使用するマダニ誘発に対する防御と相関する
この研究の目的は、マダニ誘発モデルにおいてキメラＯｓｐＡ  １／２抗原で免疫化したマウスの防御の関連要因を確立することであったが、この場合、マウスに感染させるためにチェコ共和国のＢｕｄｗｅｉｓから収集した野生マダニを使用することによる自然感染経路を使用する。この流行地由来の幼虫マダニは、主にＢ．アフゼリに感染するので、Ｂ．アフゼリＯｓｐＡ型２株誘発を提供すると考えられる。実施例１０で示されるように、分析したパラメータは、生ボレリアの表面に結合する、またはボレリアの増殖を阻害する抗ＯｓｐＡ抗体の効力であり、これらはどちらもボレリアブルグドルフェリｓ．ｓ．による針誘発に対しよく相関することが示された。よって、この研究は、Ｂ．アフゼリ、欧州において最も顕著なヒト疾患関連遺伝種の自然感染に対する防御の関連要因として２つのパラメータを使用する適用性を拡大するように機能する。
【０２８７】
４０匹のマウスを、刺激−ブースターレジメンで、準最適３ｎｇ用量のｒＯｓｐＡ  １／２抗原で、０．２％Ａｌ（ＯＨ）３をアジュバントとして使用して、免疫化した（実施例９で使用した低用量よりも１０倍低かった）。実施例１０のように、この準最適用量は、防御および感染動物の両方が誘発後に確実に観察されるように選択した。ワクチン接種を、皮下で０、１４および２８日に１００μｌの注射体積を用いて実施した。４０日に、個々の血液試料をマウスから取り誘発前血清を生成させた。入手可能なマダニの数は限られており、４０匹全てのマウスを誘発することはできなかったので、広範囲の応答をカバーするために表面結合および抗２型ＩｇＧ濃度に基づいて２０匹のマウスを選択した。８匹のマダニを各マウスに適用し、マウス上で５日間摂食させた。誘発４週間後、マウスを屠殺し、免疫化および対照マウスの感染状態をＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリおよびＢ．ガリニ由来の膜抗原に対する血清のＷｅｓｔｅｒｎブロッティング；膀胱由来のボレリア生物の培養；および膀胱から抽出したＤＮＡからのボレリアのリアルタイムＰＣＲ検出により決定した。
【０２８８】
生ボレリアの表面へ結合するＯｓｐＡ抗体の定量
このアッセイでは、ＯｓｐＡ型２を発現するＢ．アフゼリ株Ａｒｃｏｎを、補体活性化を防止するためにＥＤＴＡの存在下、室温で誘発前マウス血清と共に固定希釈（１：１００）でインキュベートした。洗浄して非結合抗体を除去した後、細胞表面に特異的に結合した抗体を、処理細胞をｒ−フィコエリトリン結合抗マウスＩｇポリクローナル抗体とインキュベートすることにより標識した。アッセイにおけるその後の工程はすべて、実施例１０で記載されるものと類似した。正常マウス血清は非特異的抗体結合のための陰性対照として機能した。高力価マウス血清は３成分ｒＯｓｐＡワクチン製剤に対し産生され、ＯｓｐＡ血清型２特異的ｍＡｂｓと共に、陽性対照として機能し、ＯｓｐＡ血清型特異性および細菌培養物における細胞のＯｓｐＡ発現レベルが確認された。
【０２８９】
細菌増殖阻害アッセイ
誘発前血清の、ボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、ＯｓｐＡ型２を発現するボレリア、Ｂ．アフゼリ株Ａｒｃｏｎを３３℃で段階希釈の熱不活性化誘発前または非免疫マウス血清（陰性対照）の存在下、補体なしで培養した。非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌を十分増殖させた場合、顕微鏡的に決定されるように、正確な細胞カウントは、フローサイトメトリー分析により実施した。細菌をカウントするために使用する手順は、実施例１０において増殖阻害アッセイにおいて前に記載したものに類似した。細菌増殖を５０％阻害した血清希釈を、ＮＭＳ対照と比較して計算し、ＧＩ−５０力価として報告した。標準血清調製物を使用して異なるアッセイ間で力価を正規化した。
【０２９０】
統計分析
測定した血清パラメータの分布を感染および防御動物間で、ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）により比較した。
【０２９１】
結果
０．００３ｐｇのｒＯｓｐＡ  １／２で３回免疫化し、８匹の野生マダニで誘発させた２０匹の動物のうち、７／２０（３５％）が感染したことが見いだされた。マダニ入手可能性が制限されているため、非免疫化マウスの対照群を誘発することによる、誘発の正確な感染率を決定することができなかった。しかしながら、この誘発は本研究の目的のために要求されず、典型的には７０−８０％の感染率が、Ｂｕｄｗｅｉｓからの野生マダニによる誘発実験において達成されている。
【０２９２】
表面結合（ｐ＝０．００７）および増殖阻害（ｐ＝０．０３）アッセイの結果について、防御および感染群の間で著しい差が検出された（図２０）。
【０２９３】
結論
この研究では、誘発時のマウス血清中の機能的抗体含量と１匹のマウスあたり８匹のマダニを適用する野生マダニ誘発による感染に対する防御の間には統計学的に有意の相関が存在することが示される。ＯｓｐＡ型２を発現する生ボレリアのＦＡＣＳに基づく蛍光強度測定は、細菌を誘発前血清と固定希釈でインキュベートした後に実施した細胞表面に付着された抗ＯｓｐＡ抗体分子の数を反映し、防御と最もよく相関した。増殖阻害力価もまた、防御とよく相関した。効率的な死滅のために補体が必要とされるボレリアブルグドルフェリｓ．ｓ．株とは対照的に、ｒＯｓｐＡ１／２抗原は、補体が存在しなくても、ボレリア増殖を効果的に阻害する抗体を誘導した。
【０２９４】
実施例１０および１１で示される研究の結果は、まとめると、生ボレリアへの表面結合抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および免疫マウス血清ＧＩ−５０力価のインビトロパラメータを、能動的マウス防御モデルが現在利用できる両方の例（例えば、すなわち、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．ＯｓｐＡ型１株のための針誘発モデルおよびＢ．アフゼリＯｓｐＡ型２株のためのマダニ誘発モデル）における「防御の関連要因」として確立させる。さらに、ＯｓｐＡ型３−６を発現する相同Ｂ．ガリニ株に対する防御を評価するための信頼できる能動的防御モデルがない場合、推論によって、前述のモデルをワクチン相同ＯｓｐＡ型全てを発現する株のため、さらに異種ＯｓｐＡ型を発現するもののための様々なワクチン製剤の防御可能性および交差株カバレッジを評価するためのインビトロ「防御の代替マーカー」として使用することができる。実際、機能的免疫応答アッセイを使用する研究を３成分キメラｒＯｓｐＡワクチン製剤で免疫化したマウス由来の免疫血清に対し実施した場合、同等なＭＦＩおよびＧＩ−５０力価がＢ．ガリニ（ＯｓｐＡ型３、４、５、６）が得られ（実施例１３を参照されたい）、よって、これらの防御の代替マーカーにより、防御反応が、現在能動的マウス防御モデルが存在しない株に対しても達成されたことが示される。さらに（ａ）個々のキメラｒＯｓｐＡ抗原；（ｂ）可能な２−成分キメラｒＯｓｐＡ抗原ワクチン製剤組み合わせのいずれか１つ；または（ｃ）３成分キメラｒＯｓｐＡ抗原製剤のいずれかで免疫化したマウスの免疫応答を比較することにより、後者の３成分ワクチンがＯｓｐＡ型１−６を発現する株を最適にカバーするのに要求されることを示すことが可能であった（実施例１４）。さらに、これらのインビトロ代替マーカーアッセイの使用により、３成分キメラｒＯｓｐＡワクチン製剤（ｒＯｓｐＡ  １／２、ｒＯｓｐＡ
６／４およびｒＯｓｐＡ  ５／３）でマウスを免疫化した後に生成される免疫応答は、ワクチン内に存在する相同ＯｓｐＡ型１−６（実施例１６を参照されたい）以外に、今まで試験された型１、２、３、５、および６の型内変異体（またはサブタイプ）全てに（実施例１５を参照されたい）およびさらに異種ＯｓｐＡ型に対する機能的免疫応答を誘導することを示すことが可能であった。
【０２９５】
実施例１２：
３つの抗原（１／２、６／４、および５／３）を含む多価組換えＯＳＰＡ製剤はマウスにおいて高度に免疫原性である
多価ＯｓｐＡワクチン（ｒＯｓｐＡ  １／２、ｒＯｓｐＡ  ５／３、およびｒＯｓｐＡ
６／４）をマダニ誘発モデルにおいて評価した。ＯｓｐＡ血清型１および２（配列番号２）、ＯｓｐＡ血清型６および４（配列番号４）、ならびにＯｓｐＡ血清型５および３（配列番号６）由来の防御エピトープを含む３つの組換えＯｓｐＡ抗原を１つのワクチン内で組み合わせた。
【０２９６】
１０匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（免疫化年齢：１１週）の群を、０および２８日に、一定用量の０．３μｇの多価ワクチン（０．１μｇの各ｒＯｓｐＡ  １／２、ｒＯｓｐＡ
５／３、およびｒＯｓｐＡ  ６／４）で皮下に免疫化した。マダニ誘発を、上記本明細書で記載されるように、Ｂｕｄｗｅｉｓ、チェコ共和国由来のマダニを用いて実施した。野生マダニのＢ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．をマウスに伝染させる能力は、非免疫化対照動物を誘発することにより確認した。誘発させたマウスの感染状態は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、リアルタイムＰＣＲ、および培養により決定した。
【０２９７】
中間血液試料を４１日に眼窩穿刺により採った。最終血液試料（７０／７１日）を心臓穿刺により収集した。個々の血清を全血から遠心分離（１０分；１０００−２０００ｘＧ；ＲＴ）により調製した。血清を£−２０℃で使用するまで貯蔵した。
【０２９８】
この実験では、マウスを誘発するために使用された同じバッチからとった摂食させていないマダニを特徴付けし、全体の感染率を決定し、感染生物の種を確認した。８０匹の幼虫マダニを、１６Ｓ  ｒＲＮＡリアルタイムＰＣＲにより、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．ＤＮＡの存在について試験し、３２．５％（２６／８０）が感染したことが見いだされた。ＯｓｐＡ−血清型は２６匹の感染した幼虫のうち２２匹に対しＰＣＲ−ＥＬＩＳＡにより決定することができ；８６％（１９／２２）は、Ｂ．アフゼリとして、１４％（３／２２）はＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．として分類した。
【０２９９】
非免疫化対照マウスはすべて（１００％；１０／１０）感染し、一方、多価ｒＯｓｐＡワクチンで免疫化したマウスの１匹だけが感染した（１０％；１／１０）。感染したマウスを同定するために使用した異なる方法間で１００％一致した。多価ｒＯｓｐＡワクチンでは、対照群に比べ、統計的に極めて大きな防御が得られた（ｐ＝０．０００１２；Ｆｉｓｈｅｒ直接両側検定）。
【０３００】
これらのデータは、ｒＯｓｐＡ  １／２抗原を含む多価ｒＯｓｐＡワクチンによる免疫化は、Ｂ．アフゼリ、血清型２  ＯｓｐＡを発現するボレリア種による感染を防止することができることを示す。さらに、追加のｒＯｓｐＡ抗原を含んでも、ｒＯｓｐＡ  １／２抗原により与えられる防御免疫に拮抗作用を有する証拠はない。
【０３０１】
このワクチンは、ＯｓｐＡ  １／２抗原により見られるものと等価であるＢ．アフゼリによるマダニ媒介性感染に対する防御を提供した；０．２％Ａｌ（ＯＨ）３と共に製剤化され、２つの用量スケジュールで投与された０．３μｇのワクチン（０．１μｇの各抗原）は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、ボレリアの培養およびＰＣＲによるボレリアＤＮＡの検出により決定されるように、９０％防御を提供した。
【０３０２】
実施例１３：３成分ワクチン（ＯＳＰＡ  １／２、ＯＳＰＡ  ６／４、およびＯＳＰＡ  ５／３）を含むワクチンは、ＯＳＰＡ型１−６を発現するボレリア株に結合し、その増殖を阻害する高レベルの機能的抗ＯｓｐＡ抗体を誘導する
表面結合（ＭＦＩ）および増殖阻害（ＧＩ−５０力価）はどちらも、針誘発（Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．）モデル（実施例１０）およびマダニ誘発（Ｂ．アフゼリ）マウスモデル（実施例１１）において良好な防御の関連要因であることが示されているので、本研究は、ワクチンの有効性を調査するために有効なインビボ防御モデルがない、Ｂ．ガリニＯｓｐＡ血清型３−６に対する３成分キメラｒＯｓｐＡ抗原ワクチン製剤により等価な機能的免疫応答が誘導されるかどうかを決定するために着手した。
【０３０３】
マウス免疫化
１０匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの群を皮下に３回（０日、１４日、２８日）、ｒＯｓｐＡ−１／２、ｒＯｓｐＡ−６／４およびｒＯｓｐＡ−５／３）の１：１：１混合物により、３つの異なる用量で（１用量あたり１、０．１、０．０３μｇタンパク質）、０．２％Ａｌ（ＯＨ）３をアジュバントとして併用して免疫化した。血清を４０日に採った血液試料から生成させた。
【０３０４】
生ボレリアの表面へ結合するＯｓｐＡ抗体の定量
このアッセイでは、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的なボレリア株（Ｂ．ブルグドルフェリセンスストリクトＢ３１／ＯｓｐＡ−１；Ｂ．アフゼリＡｒｃｏｎ／ＯｓｐＡ−２；Ｂ．ガリニＰＢｒ／ＯｓｐＡ−３；Ｂ．ガリニＤＫ６／ＯｓｐＡ−４；Ｂ．ガリニＷ／ＯｓｐＡ−５；およびＢ．ガリニＫＬ１１／０ｓｐＡ−６）のインビトロで増殖させた培養物を、ピーク力価マウス血清のプールによる固定希釈（１：１００）で、室温で、補体活性化を防止するためにＥＤＴＡの存在下でインキュベートした。その後の洗浄、ラベリング、検出および分析手順は、実施例１０で記載されるものと類似した。正常マウス血清は、抗体の非特異的結合のための陰性対照として機能した。
【０３０５】
細菌増殖阻害アッセイ
誘発前血清がボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的な株（Ｂ３１、Ａｒｃｏｎ、ＰＢｒ、ＤＫ６、Ｗ、およびＫＬ１１）を、３３℃で、熱不活性化ピーク力価血清プールまたは非免疫マウス血清（陰性対照）の段階希釈の存在下培養した。Ｂ３１を補体（モルモット血清）の存在下で培養し、他の５つの株は補体なしで試験した。再び、増殖阻害アッセイを実施例１０で記載されるように実施した。標準血清調製物を使用して、異なるアッセイ間の力価を正規化した。
【０３０６】
抗ＯｓｐＡ抗体応答の表面結合および増殖阻害効率
３成分ワクチンの１：１００希釈での異なる免疫化用量群（１用量あたり１．０、０．１および０．０３μｇタンパク質）由来の３つの血清プールを用いて試験した場合、５０〜２００の範囲のＭＦＩ値を有する強い蛍光染色が、６つ全てのボレリア株に対し観察された（図２１）。３つの用量群由来の血清プールをそれらの細菌増殖を阻害する能力に対して試験した場合、３成分ワクチンはまた、６つ全てのＯｓｐＡ型株に対し、１０００（型４株、０．０３μｇ用量）〜２０，０００（型６株）の範囲の強いＧＩ−５０力価を誘導したことが見いだされた。
【０３０７】
結論
まとめると、これらの結果はｒＯｓｐＡ抗原が高度に免疫原性であり、大量の機能的抗体を誘導し、これは生ボレリアの表面に結合し、ボレリアの増殖を阻害することができることを証明する。試験した６つの株の間のカバレッジは、高い蛍光強度および高い増殖阻害力価が検出され、ＯｓｐＡ型１および２で観察されたレベルに匹敵するので完全であった。要するに、この研究で示される結果は、３成分ｒＯｓｐＡワクチン（１／２＋５／３＋６／４）により誘導された抗体応答は、Ａｌ（ＯＨ）３と製剤化された場合、ＯｓｐＡ型１−６を発現する株による感染を防止し、これは、疫学調査が示しているように、理論的には欧州および北米においてヒト疾患を引き起こす分離株の９９％をカバーし、よって、ライムボレリア症を防止するのに非常に有効である。
【０３０８】
実施例１４：
３成分ワクチン（ＯＳＰＡ  １／２、ＯＳＰＡ  ６／４、およびＯＳＰＡ  ５／３）を含むワクチンは、ＯｓｐＡ型１−６を発現するボレリアを最適にカバーするために要求される
この研究の目的は、ｒＯｓｐＡライムボレリア症ワクチンの単一および多成分製剤により誘導された機能的表面結合および／または増殖阻害抗体の免疫原性および交差株カバレッジを、再び、抗ＯｓｐＡ抗体の生ボレリアの表面に結合するおよびインビトロでのボレリアの増殖を阻害する効率を防御の関連要因として使用して、調査、比較することであった。
【０３０９】
マウスの免疫化
１群あたり１０匹の雌マウス（Ｃ３Ｈ）を、０．１μｇの、ｒＯｓｐＡ  １／２抗原、ｒＯｓｐＡ  ６／４抗原、またはｒＯｓｐＡ  ５／３抗原を含む単一成分ワクチン；０．１μｇの、１／２＋５／３抗原、１／２＋６／４抗原、または５／３＋６／４抗原両方を含む２成分ワクチン；または０．１μｇの、３つ全ての１／２＋５／３＋６／４抗原の組み合わせをアジュバントととして０．２％ＡＩ（ＯＨ）３と共に含む３成分ワクチンにより、刺激−ブースターレジメンで免疫化した。ワクチン接種を、２００μｌの用量体積を使用して、０、１４および２８日に皮下に実施した。４２日に、個々の血液試料をマウスから取り、血清を生成させた。
【０３１０】
抗体表面結合および増殖阻害アッセイ
表面結合アッセイのわずかに修正したバージョンを使用して、抗ＯｓｐＡ  ＩｇＧの生ボレリアの表面に結合する効率を決定した。明確なＭＦＩ力価を有する血清プールの段階希釈を分析で含み、標準曲線を作製し、これから、試験血清の相対力価を、非線形回帰曲線を用いて補間した後に読み取った。ＯｓｐＡ型１−６を発現する個々の株に対する標準血清のＭＦＩ力価は、ボレリアの蛍光強度が正常マウス血清で観察される蛍光強度を少なくとも３倍超える最高希釈として規定された。全ての定量は２通りで実施した。
【０３１１】
図２２で示される散布図は、単一ｒＯｓｐＡ抗原またはｒＯｓｐＡ抗原組み合わせのいずれかで免疫化した後の個々のＣ３Ｈマウスの免疫血清に対し観察される相同ＯｓｐＡ型を発現する６つの株に対するＭＦＩ力価を比較する。結果から、３つ全てのｒＯｓｐＡ抗原（１／２、５／３および６／４）を含む製剤は、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つ全てのボレリア株に対して高ＭＦＩ力価を誘導するのに必要であったこと、２つのｒＯｓｐＡ抗原からなる製剤（すなわち４つの株をカバーする）は、製剤中に存在しない２つのＯｓｐＡ型を発現する株を完全にはカバーしなかったことが示された。
【０３１２】
様々なワクチン組み合わせの、増殖阻害抗体を誘導する効力を決定するために、それぞれ、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的なボレリア株（Ｂ３１、Ａｒｃｏｎ、ＰＢｒ、ＤＫ６、Ｗ、ＫＬ１１）を、３３℃で、熱不活性化免疫または非免疫マウス血清プールの存在下で培養した。全ての血清を単一希釈で試験した。下記希釈を使用した：Ｂ３１、ＰＢｒおよびＫＬ１１  １：２００、Ａｒｃｏｎ、ＤＫ６およびＷ  １：１００。ＰＢｒを２０％補体なしで培養したが、他の５つの株は補体存在下で試験した。仔ウサギ補体をＤＫ６、ＷおよびＫＬ１１で使用したが、モルモット血清をＢ３１およびＡｒｃｏｎでは使用した。顕微鏡によって決定されるように、非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌が十分増殖した時に、正確な細胞カウントを前に記載したように実施した（実施例１０を参照されたい）。細菌増殖阻害のパーセンテージを、正常マウス血清対照に対して試験血清で観察された細胞カウントから計算した。試験した異なる製剤に対して観察される全体の増殖阻害をその後、５０％を超える増殖阻害を示した１０匹のＣ３Ｈマウスの異なる群間の動物の数として示した（図２３）。結果から、３成分製剤が、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つ全ての代表的な株に対して高力価の増殖阻害抗体を誘導することができる唯一の製剤であることが証明された（図２３）。全ての場合において、３成分ワクチン製剤は、＞９０％の免疫化動物において＞５０％増殖阻害を提供した。２成分ワクチン製剤は、ワクチン中に存在しないＯｓｐＡ型を発現する２つの株を完全にはカバーしなかった。ｒＯｓｐＡ  １／２＋６／４を含む製剤は、型３株をカバーせず；ｒＯｓｐＡ  １／２＋５／３製剤を含む製剤は、型４または６をカバーせず；ｒＯｓｐＡ  ５／３＋６／４を含む製剤は型１をカバーしなかった。
【０３１３】
実施例１５：多価ＯＳＰＡワクチン製剤は、ＯＳＰＡ型１−６の型内変異体またはサブタイプを発現するボレリアをカバーする
ボレリアＯｓｐＡ型１−６を、多価ｒＯｓｐＡワクチンの設計および構築のための基礎として選択したが、型１、２、３、５、および６のＯｓｐＡタンパク質変異体を発現するボレリアもまた単離されている。これらの変異体は、同じ型内にあると分類されるが、わずかに変化したヌクレオチド遺伝子配列およびアミノ酸タンパク質配列を有する。よって、型内変異体またはサブタイプがＯｓｐＡ型１、２、３、５、および６の間に存在する（図２４を参照されたい）。ＯｓｐＡ型４では、型内変異体またはサブタイプがまだ観察されていない。
【０３１４】
この研究の目的は、３成分多価ｒＯｓｐＡワクチンでマウスを免疫化することにより生成された免疫血清が、これらの型内変異体またはサブタイプを発現する生ボレリアの表面に結合することができる機能的抗体を含むことを確認することであった。
【０３１５】
この研究のために、プールしたマウス免疫血清を、７０匹の雌Ｃ３Ｈマウスを３回、０．３μｇの３成分多価ｒＯｓｐＡワクチンで、０、１４および２８日日に免疫化することにより生成させた。４２日に、マウスを出血させ、血清を採取し、プールした。プールした免疫血清をその後使用して、生ボレリア表面への抗体の結合について試験した。ボレリア培養物を、免疫血清プールまたは対照正常マウス血清と１：１００で２通り、インキュベートし、細菌への抗ＯｓｐＡ抗体の結合を測定するボレリアの蛍光強度を、上記本明細書で記載されるようにＦＡＣＳ分析によりモニタした。
【０３１６】
１：１００の血清希釈での高レベルの表面結合抗体（非免疫化マウス対照血清に対して観察されるものの１０倍超の蛍光強度として規定される）が、ＯｓｐＡサブタイプ１−６を発現する株のほとんどに対して検出された。特に、高レベルの抗体結合が、ＯｓｐＡサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｆ、１ｈ、１Ｊ、１ｋ、および１ｌ；２ａ、２ｂ、２ｅ、２ｇ、２ｋ、２ｌ、および２ｎ；３ａ、３ｃ、３ｄ、および３ｅ；５ａおよび５ｃ；ならびに６ａ、６ｅ、６ｆ、６ｇ、および６ｋを発現するボレリア株で観察された（図２４）。より弱い結合（非免疫化マウス対照血清に対して観察されるものの２−１０倍の蛍光強度として規定される）が、ＯｓｐＡサブタイプ１ｇ、２ｊ、２ｍ、３ｂ、５ｄ、および６ｌを発現するボレリア株で観察された（図２４）が、このより弱い結合は、主に使用した増殖条件下でのＯｓｐＡタンパク質の低い発現によるものであった。
【０３１７】
結論
３成分キメラｒＯｓｐＡワクチンは、Ｃ３Ｈマウスにおいて、ＯｓｐＡ型１、２、３、５、および６の全ての型内変異体またはサブタイプに対して機能的、表面結合抗体を誘導する。
【０３１８】
実施例１６：
多価ＯＳＰＡワクチン製剤は、ＯＳＰＡ型１−６を発現するものに加えてボレリアの他の型に対する防御を提供する
この研究の目的は、３成分キメラｒＯｓｐＡ抗原ワクチン製剤（３つ全てのキメラ抗原１／２、６／４、および３／５を含む）が相同ＯｓｐＡ型１−６以外のＯｓｐＡ型を発現するボレリアに対しても防御を提供することができるかを決定することであった。４０Ｃ３Ｈマウスを３回、０．３μｇの３成分ワクチンで、０、１４および２８日に免疫化した。４２日に、マウスを出血させ、血清プールを作製し、これを使用して、異種ＯｓｐＡ型を発現する株に対する表面結合および増殖阻害の効率を評価した。
【０３１９】
この研究の結果は、３成分キメラｒＯｓｐＡワクチンが、ボレリアの表面に結合し、ボレリアの他の型、例えばＢ．スピエルマニ、Ｂ．バライシアナ、Ｂ．ルジタニエおよびＢ．ジャポニカの株（表９を参照されたい）の増殖を阻害する抗体を誘導することを示した。ＯｓｐＡ型７を発現するＢ．ガリニの場合、弱い表面結合のみが観察され、増殖阻害はほとんどまたは全く観察されなかった；しかしながら、この弱い結合および少量の増殖阻害は、免疫血清抗体の結合の欠如よりも、使用されるインビトロ培養条件下でのＯｓｐＡの低い発現レベルによるものであり得る。
【表９】
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【０３２０】
実施例１７：多価ＯＳＰＡワクチン製剤は、全てのＯｓｐＡを発現するボレリア株に対する防御に寄与することができる、ＯＳＰＡ分子のＮ末端の共通エピトープに対する抗体を誘導する
多価キメラｒＯｓｐＡ製剤の防御効率を調査する過程中、モノクローナル抗体が（Ｆ２３７／ＢＫ２）が、ｒＯｓｐＡ−１／２およびｒＯｓｐＡ−６／４を含む２成分ｒＯｓｐＡワクチンに対して生成された。Ｆ２３７／ＢＫ２は、抗ＯｓｐＡ  ＥＬＩＳＡにより、これまで調査した全てのＯｓｐＡ型（ＯｓｐＡ型１−７）、ならびに３つのキメラｒＯｓｐＡ抗原（ｒＯｓｐＡ−１／２、ｒＯｓｐＡ−５／３およびｒＯｓｐＡ−６／４）に結合することが示された。そのような結果から、Ｆ２３７／ＢＫ２が全てのＯｓｐＡ分子上で見られる共通エピトープを認識することが示される。さらに、予備的エピトープマッピング研究は、この共通エピトープは分子のより可変性の低いＮ末端半分（すなわち、アミノ酸１３０のＮ末端）に位置し、そこではＯｓｐＡ配列相同性が最も普通に観察されることを示す。
【０３２１】
興味深いことに、Ｆ２３７／ＢＫ２はまた、Ｃ末端型特異的エピトープに対して作られるモノクローナル抗体よりも効率が低いが、相同ＯｓｐＡ型１−６および異種ＯｓｐＡ型、例えばＢ．スピエルマニ、Ｂ．バライシアナおよびＢ．ジャポニカにより発現されるものを発現するボレリアの表面に結合することが示された。前の実施例で記載されるものと同様の方法を用いて、Ｆ２３７／ＢＫ２はまた、ＯｓｐＡ型１、２、４、５および６を発現する代表的な株の増殖を阻害することが見いだされた。
【０３２２】
Ｆ２３７／ＢＫ２をマウスにおいてインビボ受動防御モデルで試験した場合、Ｆ２３７／ＢＫ２は、Ｂ．アフゼリ型２誘発に対応する野生マダニ誘発に対して防御を与えることが観察された。マダニは、Ｗｕｎｄｓｃｈｕｈ（Ｓｔｙｒｉａ、オーストリア）において収集し、これは、主にＢ．アフゼリにより感染されていることが知られている。１０匹の雌Ｃ３Ｈマウスに、５００μｇのアフィニティ精製ｍＡｂ  Ｆ２３７／ＢＫ２を腹腔内注射した。２時間後、１匹の動物あたり８匹のマダニを、１０匹の受動免疫化マウスならびに１０匹の偽免疫化動物に適用した。４日後、摂食させたマダニを除去した。９０日に、上記本明細書で記載されるように、マウスを屠殺し、血清学的試験、ＰＣＲ解析およびボレリア培養により感染について分析した。Ｆ２３７／ＢＫ２で処理した群では、動物は感染していなかったが、対照群では５匹の動物（５０％）がＢ．アフゼリに感染した。よって、モノクローナル抗体Ｆ２３７／ＢＫ２は、偽免疫化対照マウスに比べ、マダニ誘発に対し統計学的に有意の（ｐ＝０．０３２５）受動防御を提供した。分子のＮ末端半分上の共通エピトープに結合するモノクローナル抗体が、防御に関与していることが報告されたのはこれが初めてである。さらに、ワクチンがこの共通エピトープを認識する抗体を誘導することができる場合、そのような抗体はワクチンの交差防御効率に確実に寄与するであろう。
【０３２３】
そのような抗体が実際に３成分キメラｒＯｓｐＡワクチン製剤により誘導されたか試験するために、ペルオキシダーゼ標識Ｆ２３７／ＢＫ２を使用してモノクローナル抗体阻害ＥＬＩＳＡを実施した。これらの実験では、ＧＳＴ−ＯｓｐＡ型３タンパク質をコーティング抗原として使用し、正常マウス血清または３回、３成分キメラｒＯｓｐＡワクチンで免疫化したＣ３Ｈマウス由来の血清プールのいずれかをウェルに１：１００の希釈で添加した。６０分後、ペルオキシダーゼ標識Ｆ２３７／ＢＫ２を、予め最適化した濃度で添加し、最終的には非阻害正常マウス血清対照に対し約１の光学密度（ＯＤ）値を与え、インキュベーションをさらに６０分続けた。最後に、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＴＭＢ基質で発現させた。
【０３２４】
このモノクローナル抗体阻害ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、３成分キメラｒＯｓｐＡ製剤が実際、ｍＡｂ  Ｆ２３７／ＢＫ２により認識されるエピトープと同一のまたはすぐ近くのエピトープに結合する抗体を誘導することが証明されるであろう。ＯＤ値は、非阻害正常マウス血清対照に比べ、抗ＯｓｐＡ免疫血清により著しく減少した（例えば、典型的には２０−３０％）。
【０３２５】
結論
この研究は、３成分キメラｒＯｓｐＡワクチンが型特異的および広い交差防御免疫応答の両方を誘導することができることを示す。
【０３２６】
実施例１８：追加の合成ＯＳＰＡ核酸およびポリペプチド分子
この研究の目的は、それぞれ、血清型１および２、６および４、ならびに５および３を含む追加の新規ＯｓｐＡ抗原を設計することであった。３つの合成ＯｓｐＡ遺伝子（配列番号１６８（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、１７０（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）、および１７２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３））を、ボレリアのＯｓｐＡ血清型１および２（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２）、ＯｓｐＡ血清型６および４（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）ならびにＯｓｐＡ血清型５および３（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）に由来する防御エピトープを有するＯｓｐＡポリペプチド分子をコードするように設計した。これらの分子の一次アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１６９、１７１、および１７３）を表１で提供する。これらの配列はオリジナルキメラコンストラクトを含み、すなわち変異およびコドン最適化を有さない。
【０３２７】
実施例１９：
３つの抗原（１／２、６／４、および５／３）を含む多価組換えＯＳＰＡ製剤は、マウスにおいて免疫原性である
コドン最適化および変異を有さないオリジナルコンストラクト製剤（ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  １／２、ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  ５／３、およびｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  ６／４）を含む多価ＯｓｐＡワクチンを、マダニ誘発モデルにおいて評価する。ＯｓｐＡ血清型１および２（配列番号１６９）、ＯｓｐＡ血清型６および４（配列番号１７１）、ならびにＯｓｐＡ血清型５および３（配列番号１７３）由来の防御エピトープを含む３つの組換えＯｓｐＡ抗原を１つのワクチン内で組み合わせる。
【０３２８】
１０匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（免疫化年齢：１１週）の群を、０および２８日に、一定用量の０．３μｇの多価ワクチン（０．１μｇの各ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  １／２、ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  ５／３、およびｏｒｉｇ  ＯｓｐＡ  ６／４）で皮下に免疫化する。マダニ誘発を、上記本明細書で記載されるように、Ｂｕｄｗｅｉｓ、チェコ共和国由来のマダニを用いて実施する。野生マダニのＢ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．をマウスに伝染させる能力は、非免疫化対照動物を誘発することにより確認する。誘発させたマウスの感染状態は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、リアルタイムＰＣＲ、および培養により決定する。
【０３２９】
中間血液試料を４１日に眼窩穿刺により採る。最終血液試料（７０／７１日）を心臓穿刺により収集する。個々の血清を全血から遠心分離（１０分；１０００−２０００ｘＧ；ＲＴ）により調製する。血清を£−２０℃で使用するまで貯蔵する。
【０３３０】
この実験では、マウスを誘発するために使用した同じバッチからとった摂食させていないマダニを特徴付けし、全体の感染率を決定し、感染生物の種を確認する。
【０３３１】
実施例２０：
３成分ワクチン（ＯＲＩＧ  ＯＳＰＡ  １／２、ＯＲＩＧ  ＯＳＰＡ  ６／４、およびＯＲＩＧ  ＯＳＰＡ  ５／３）を含むワクチンは、ＯＳＰＡ型１−６を発現するボレリア株に結合し、その増殖を阻害する高レベルの機能的抗ＯｓｐＡ抗体を誘導する
実施例１３で示される結果は、３成分ｒＯｓｐＡワクチン（ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  １／２＋ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ５／３＋ｌｉｐＢ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）により誘導される抗体応答は、Ａｌ（ＯＨ）３と共に製剤化された場合、ＯｓｐＡ型１−６を発現する株による感染を阻害し、よって、ライムボレリア症を防止するのに有効である。よって、本研究は、等価な機能的免疫応答がキメラオリジナル（ｏｒｉｇ）ＯｓｐＡ抗原（Ｏｒｉｇ
ｓＯｓｐＡ  １／２＋Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３＋Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）を含む３成分ＯｓｐＡワクチンにより誘導されるかを決定するために実施される。
【０３３２】
マウス免疫化
１０匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの群を皮下に３回（０日、１４日、２８日）、Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２＋Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３＋Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４）の１：１：１混合物により、３つの異なる用量で（１用量あたり１、０．１、０．０３μｇタンパク質）、０．２％Ａｌ（ＯＨ）３をアジュバントとして併用して免疫化する。血清を４０日に採った血液試料から生成させる。
【０３３３】
生ボレリアの表面へ結合するＯｓｐＡ抗体の定量
このアッセイでは、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的なボレリア株（Ｂ．ブルグドルフェリセンスストリクトＢ３１／ＯｓｐＡ−１；Ｂ．アフゼリＡｒｃｏｎ／ＯｓｐＡ−２；Ｂ．ガリニＰＢｒ／ＯｓｐＡ−３；Ｂ．ガリニＤＫ６／ＯｓｐＡ−４；Ｂ．ガリニＷ／ＯｓｐＡ−５；およびＢ．ガリニＫＬ１１／０ｓｐＡ−６）のインビトロで増殖させた培養物を、ピーク力価マウス血清のプールによる固定希釈（１：１００）で、室温で、補体活性化を防止するためにＥＤＴＡの存在下でインキュベートする。その後の洗浄、ラベリング、検出および分析手順は、実施例１０および１３で記載されるものと類似する。正常マウス血清は、抗体の非特異的結合のための陰性対照として機能する。
【０３３４】
細菌増殖阻害アッセイ
誘発前血清がボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的な株（Ｂ３１、Ａｒｃｏｎ、ＰＢｒ、ＤＫ６、Ｗ、およびＫＬ１１）を、３３℃で、熱不活性化ピーク力価血清プールまたは非免疫マウス血清（陰性対照）の段階希釈の存在下培養する。Ｂ３１を補体（モルモット血清）の存在下で培養し、他の５つの株は補体なしで試験する。増殖阻害アッセイを実施例１０および１３で記載されるように実施する。標準血清調製物を使用して、異なるアッセイ間の力価を正規化する。
【０３３５】
抗ＯｓｐＡ抗体応答の表面結合および増殖阻害効率
３成分ワクチンの１：１００希釈での異なる免疫化用量群（１用量あたり１．０、０．１および０．０３μｇタンパク質）由来の３つの血清プールを用いて試験した場合、蛍光染色を６つ全てのボレリア株に対し測定する。
【０３３６】
実施例２１：
３成分ワクチン（ＯＳＰＡ  １／２、ＯＳＰＡ  ６／４、およびＯＳＰＡ  ５／３）を含むワクチンは、ＯＳＰＡ型１−６を発現するボレリアを最適にカバーするために要求される
この研究の目的は、Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡライムボレリア症ワクチンの単一および多成分製剤により誘導された機能的表面結合および／または増殖阻害抗体の免疫原性および交差株カバレッジを、抗ＯｓｐＡ抗体の生ボレリアの表面に結合するおよびインビトロでのボレリアの増殖を阻害する効率を防御の関連要因として使用して、調査、比較することである。
【０３３７】
マウスの免疫化
１群あたり１０匹の雌マウス（Ｃ３Ｈ）を、０．１μｇの、Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２抗原、Ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３抗原、またはＯｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４抗原を含む単一成分ワクチン；０．１μｇの、１／２＋５／３抗原、１／２＋６／４抗原、または５／３＋６／４抗原両方を含む２成分ワクチン；または０．１μｇの、３つ全ての１／２＋５／３＋６／４抗原の組み合わせをアジュバントとして０．２％ＡＩ（ＯＨ）３と共に含む３成分ワクチンにより、刺激−ブースターレジメンで免疫化する。ワクチン接種を、２００μｌの用量体積を使用して、０、１４および２８日で皮下に実施する。４２日に、個々の血液試料をマウスから取り、血清を生成させる。
【０３３８】
抗体表面結合および増殖阻害アッセイ
上記表面結合アッセイのわずかに修正したバージョンを使用して、抗ＯｓｐＡ  ＩｇＧの生ボレリアの表面に結合する効率を決定する。明確なＭＦＩ力価を有する血清プールの段階希釈を分析で含み、標準曲線を作製し、これから、試験血清の相対力価を、非線形回帰曲線を用いて補間した後に読み取る。ＯｓｐＡ型１−６を発現する個々の株に対する標準血清のＭＦＩ力価は、ボレリアの蛍光強度が正常マウス血清で観察される蛍光強度を少なくとも３倍超えると決定される最高希釈として規定される。全ての定量は２通りで実施する。
【０３３９】
様々なワクチン組み合わせの、増殖阻害抗体を誘導する効力を決定するために、それぞれ、ＯｓｐＡ型１−６を発現する６つの代表的なボレリア株（Ｂ３１、Ａｒｃｏｎ、ＰＢｒ、ＤＫ６、Ｗ、ＫＬ１１）を、３３℃で、熱不活性化免疫または非免疫マウス血清プールの存在下で培養する。全ての血清を単一希釈で試験する。下記希釈を使用する：Ｂ３１、ＰＢｒおよびＫＬ１１  １：２００、Ａｒｃｏｎ、ＤＫ６およびＷ  １：１００。ＰＢｒを２０％補体なしで培養するが、他の５つの株は補体存在下で試験する。仔ウサギ補体をＤＫ６、ＷおよびＫＬ１１で使用するが、モルモット血清をＢ３１およびＡｒｃｏｎでは使用する。顕微鏡によって決定されるように、非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌が十分増殖した時に、正確な細胞カウントを前に記載したように実施する（実施例１０を参照されたい）。細菌増殖阻害のパーセンテージを、正常マウス血清対照に対して試験血清で観察された細胞カウントから計算する。試験した異なる製剤に対して観察される全体の増殖阻害をその後、５０％を超える増殖阻害を示した１０匹のＣ３Ｈマウスの異なる群間の動物の数として示す（図２３）。
【０３４０】
実施例２２：多価ＯＳＰＡワクチン製剤は、ＯＳＰＡ型１−６の型内変異体またはサブタイプを発現するボレリアをカバーする
この研究の目的は、３成分多価ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡワクチン（ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  １／２、ｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ６／４、およびｏｒｉｇ  ｓＯｓｐＡ  ５／３）でマウスを免疫化することにより生成された免疫血清が、これらの型内変異体またはサブタイプを発現する生ボレリアの表面に結合することができる機能的抗体を含むことを確認することであった。
【０３４１】
この研究のために、プールマウス免疫血清を、７０匹の雌Ｃ３Ｈマウスを３回、０．３μｇの３成分多価ｏｒｉｇ  ＯｓｐＡワクチンで、０、１４および２８日日に免疫化することにより生成させる。４２日に、マウスを出血させ、血清を採取し、プールする。プールした免疫血清をその後使用して、生ボレリア表面への抗体の結合について試験する。ボレリア培養物を、免疫血清プールまたは対照正常マウス血清と１：１００で２通り、インキュベートし、細菌への抗ＯｓｐＡ抗体の結合を測定するボレリアの蛍光強度を、上記本明細書で記載されるようにＦＡＣＳ分析によりモニタする。
【０３４２】
本発明について、本発明の実施のための特定の様式を含むことが見いだされた、またはそのように提案された特定の実施形態の観点から説明してきた。記載した発明の様々な改変および変更が本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態と関連させて説明してきたが、主張される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、関連分野の当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月10日(2020.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、以下：
（１）以下からなる群から選択される核酸分子：
（ａ）配列番号１もしくは配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号１もしくは配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号７で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号１もしくは配列番号７を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｃ）配列番号１もしくは配列番号７で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号１もしくは配列番号７の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｄ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｅ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｆ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｇ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｈ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／もしくはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーションもしくはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る；ならびに
（ｊ）（ａ）−（ｉ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（２）以下からなる群から選択される核酸分子：
（ａ）配列番号３もしくは配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号３もしくは配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号９で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号３もしくは配列番号９を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号９で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号３もしくは配列番号９の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｄ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｅ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｆ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｇ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｈ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／もしくはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｉ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーションもしくはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；ならびに
（ｊ）（ａ）−（ｉ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（３）以下からなる群から選択される核酸分子：
（ａ）配列番号５もしくは配列番号１１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号５もしくは配列番号１１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｂ）配列番号５もしくは配列番号１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号５もしくは配列番号１１を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｃ）配列番号５もしくは配列番号１１で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号５もしくは配列番号１１の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｄ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｅ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｆ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｇ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｈ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／またはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、１〜２５のアミノ酸のＣおよび／もしくはＮ末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；
（ｉ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーションもしくはＮ末端トランケーションから選択される１〜２５のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る；ならびに
（ｊ）（ａ）−（ｉ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（４）アジュバント；ならびに、
（５）薬学的に許容される担体
を含み、ここで該核酸分子は、異なるヌクレオチド配列を有する、免疫原性組成物。
【請求項２】
免疫原性組成物であって、以下：
（１）ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号２もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る、ポリペプチド；
（２）ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る、ポリペプチド；
（３）ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号６もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも９１パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る、ポリペプチド；
（４）アジュバント；ならびに、
（５）薬学的に許容される担体
を含み、ここで該ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する、免疫原性組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫原性組成物であって、該組成物は、
（ａ）細胞表層タンパク質（Ｏｓｐ）Ａタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物；
（ｂ）ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物；および
（ｃ）ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物
からなる群より選択される、免疫原性組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の免疫原性組成物であって、
（ａ）ボレリアは、ボレリアブルグドルフェリセンスラトである；
（ｂ）ボレリアは、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニまたはボレリアブルグドルフェリセンスストリクトである；あるいは
（ｃ）ボレリアは、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤモトイまたはボレリアロネスタルである、
免疫原性組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項６】
請求項５に記載のワクチン組成物を少なくとも第２のワクチン組成物と共に含む、混合ワクチン。
【請求項７】
前記第２のワクチン組成物は、マダニ媒介疾患に対して防御する、請求項６に記載の混合ワクチン。
【請求項８】
前記マダニ媒介疾患は、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症（ＨＭＥ）、ヒト顆粒球エーリキア症（ＨＧＥ）、南部ダニ関連発疹病（ＳＴＡＲＩ）、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Ｑ熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である、請求項７に記載の混合ワクチン。
【請求項９】
前記第２のワクチン組成物は下記からなる群より選択されるワクチンである、請求項７に記載の混合ワクチン：ダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチン。
【請求項１０】
前記第２のワクチン組成物は、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化に適合する季節的免疫化スケジュールを有する、請求項６に記載の混合ワクチン。
【請求項１１】
免疫学的応答を誘導するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記免疫学的応答は、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ボレリア感染またはライム病を防止または治療するための、請求項５に記載のワクチン組成物または請求項６〜１０のいずれか一項に記載の混合ワクチン。
【外国語明細書】
2020178719000001.pdf