(57)【要約】【課題】本発明の課題は、精神神経疾患モデル動物の作製方法を提供することである。【解決手段】本発明者らは、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を設定された範囲まで誘導することにより、当該妊娠した非ヒト哺乳動物から出産された仔が精神神経疾患の特徴を有することを発見した。したがって、本発明は、精神神経疾患モデル動物の作製方法であって、（ａ）妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質であるＩＬ−６の血中濃度を、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する工程、及び（ｂ）前記妊娠した非ヒト哺乳動物から仔を出産させる工程を含み、出産された仔が精神神経疾患モデル動物となる、前記作製方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精神神経疾患モデル動物の作製方法であって、
（ａ）妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質であるＩＬ−６の血中濃度を、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する工程；及び
（ｂ）前記妊娠した非ヒト哺乳動物から仔を出産させる工程
を含み、出産された仔が精神神経疾患モデル動物となる、前記作製方法。
【請求項２】
前記免疫活性指標物質がＴＮＦ−αであり、血中濃度を１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫活性指標物質がＩＬ−１βであり、血中濃度を７５〜１７０ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する、請求項１、又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定し、前記血中濃度が設定値の範囲内ではなかった場合に、前記（ａ）工程を繰り返す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記（ａ）工程が、前記妊娠した非ヒト哺乳動物に免疫活性化剤を投与すること、又は前記妊娠した非ヒト哺乳動物にウイルスを感染させることによって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記（ａ）工程の前に、前記妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度が、前記設定値の範囲となる免疫活性化剤の投与量、又はウイルスの力価を決定する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫活性化剤が、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸、リポ多糖類、合成リポタンパク質、一本鎖ＲＮＡ、ロキソリビン、又はフラジェリンである、請求項５、又は６項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項５、又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記（ａ）工程の後に、前記免疫活性指標物質の血中濃度を指標として前記妊娠した非ヒト哺乳動物を選定する工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ａ）工程が、前記妊娠した非ヒト哺乳動物に卵黄嚢が存在する時期に行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト動物が、げっ歯類である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記精神神経疾患が、自閉症、統合失調症、又は双極性障害である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記精神神経疾患が、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上を特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された、精神神経疾患モデル動物。
【請求項１５】
プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する、請求項１４に記載の精神神経疾患モデル動物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を用いる、精神神経疾患の治療薬、検査薬、診断薬、又は鑑別法のスクリーニング方法。
【請求項１７】
精神神経疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程；
（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患治療薬の候補物質を投与する工程；
（ｉｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の中間表現型の試験を課す工程；及び
（ｉｖ）前記精神神経疾患治療薬の候補物質の投与前後において、前記試験の結果を比較する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項１８】
精神神経疾患のバイオマーカー、検査薬、又は診断薬のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程；
（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体試料を採取する工程；及び
（ｉｉｉ）前記生体試料中の生体物質の量を、対照のものと比較する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項１９】
精神神経疾患のバイオマーカーのスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程；
（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体信号を取得する工程；及び
（ｉｉｉ）前記生体信号を、対照のものと比較する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２０】
精神神経疾患の鑑別法のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程；
（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の候補鑑別法を課す工程；及び
（ｉｉｉ）前記候補鑑別法の結果を、対照のものと比較する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２１】
免疫活性指標物質であるＩＬ−６の血中濃度が、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、精神神経疾患モデル動物を作製するための、妊娠した非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
さらに、免疫活性指標物質であるＴＮＦ−αの血中濃度が、１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、請求項２１に記載の妊娠した非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
さらに、免疫活性指標物質であるＩＬ−１βの血中濃度が、７５〜１７０ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、請求項２１、又は２２のいずれか１項に記載の妊娠した非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神神経疾患モデル動物の作製方法、その作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物、その精神神経疾患モデル動物を作製するための非ヒト哺乳動物、及び、その作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を用いた精神神経疾患の検査薬、診断薬、コンパニオン診断薬、治療薬、又は鑑別法のスクリーニング方法に関するものである。更に詳しくは、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を、設定された範囲内にまで誘導し、その後、仔を出産させ、当該仔をそのモデル動物とする、精神神経疾患モデル動物の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
精神神経疾患は、幻覚、幻聴、社会的自閉、アンヘドニアなどの精神症候、並びに認知障害が長期間続くもののうちで、その症候の身体的基盤が明らかでないことを特徴とする。精神神経疾患の治療では、主に構造化面接に基づいて脳内神経伝達をコントロールする薬剤などを用いた薬物療法や心理社会療法などが行われており、症状の緩和が確認されることもあるが、多くの場合、通常の社会生活を送ることが困難であり、有効な治療方法が確立されていない。
【０００３】
精神神経疾患の原因は様々提唱されており、遺伝的要因、薬物接収、高ストレス、胎児期のストレス、胎児期の母体の感染症による過剰免疫活性化や脳内免疫障害などが知られている。
【０００４】
精神神経疾患における有効な治療薬やコンパニオン診断薬などを探索するうえで、生体内での生体内利用率、脳内移行性、生理的反応などを検討する必要があり、個体レベルで解析可能な精神神経疾患モデル動物が不可欠である。また、精神神経疾患モデル動物は、複雑な発症メカニズムを有する精神神経疾患を解明するうえでも重要となる。
精神神経疾患発症要因の一つであると考えられている胎児期の母体の感染症による過剰免疫活性化を模倣したモデル動物として、母体の免疫機構を刺激するポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ｐｏｌｙｒｉｂｏｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｒｉｂｏｃｙｔｉｄｉｌｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）を用いた作製方法が知られている（非特許文献１）。
【０００５】
精神神経疾患の症候としては、自閉症、統合失調症、双極性障害などがあり、これらに特徴的な生体内分子の変化（中間表現型）としては、プレパルス抑制障害、脳内モノアミン関連分子、フラクタルカイン、及びフラクタルカイン受容体が挙げられる。例えば、非特許文献２、３、４では、自閉症、統合失調症、双極性障害などにおいてプレパルス抑制の低下が報告されている。非特許文献５では、統合失調症患者の脳においてモノアミンの一つであるドーパミン関連分子の低下が報告されている。非特許文献６、７では自閉症、統合失調症、双極性障害において介在神経細胞の機能低下が報告されている。非特許文献８では、統合失調症や自閉症患者において健常人と比較して免疫機構に関与するフラクタルカイン受容体であるＣＸ３ＣＲ１の伝達機能が有意に低いこと、及び非特許文献９では、変異型フラクタルカイン受容体はフラクタルカインによるシグナル伝達を変化していることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Serena B. Gumusogle et al., Maternal inflammation and neurodevelopmental programming: A review of preclinical outcomes and implications for translational psychiatry., Biological psychiatry 2018; 85(2): 107-121
【非特許文献２】Chia-Hsiung Cheng et al., Meta-analysis of sensorimotor gating in patients with autism spectrum disorders., Psychiatry research 2018; 262: 413-419
【非特許文献３】Masatsugu Moriwaki et al., Prepulse inhibition of the startle response with chronic schizophrenia: A replication study., Neuroscience research 2009; 65(3): 259-262
【非特許文献４】Stella G. Giakoumaki et al., Evidence of disrupted prepulse inhibition in unaffected siblings of bipolar disorder patients., Biological psychiatry 2007; 62(12): 1418-1422
【非特許文献５】Ryosuke Arakawa et al., Increase in thalamic binding of [(11)C]PE2I in patients with schizophrenia: a positron emission tomography study of dopamine transporter., Journal of psychiatric research 2009; 43(15): 1219-1223
【非特許文献６】Jason W. Lunden et al., Cortical interneuron function in autism spectrum condition., Pediatric research 2019; 85(2): 146-154
【非特許文献７】Lilah Toker et al., Transcriptomic evidence for alterations in astrocytes and parvalbumin interneurons in subjects with bipolar disorder and schizophrenia., Biological psychiatry 2018; 84(11): 787-796
【非特許文献８】Aurelie Bergon et al., CX3CR1 is dysregulated in blood and brain from schizophrenia patients., Schizophrenia research 2015; 168(1-2): 434-443
【非特許文献９】Kanako Ishizuka et al., Rare genetic variants in CX3CR1 and their contribution to the increased risk of schizophrenia and autism spectrum disorders., Translational psychiatry 2017; 7(8): e1184
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
精神神経疾患モデル動物は、従来、特定の分子や遺伝子を阻害することによって作製されている。しかしながら、精神神経疾患は単一の原因によって起こるものではなく、多因子疾患であると考えられていることから、これらの精神神経疾患の特徴（中間表現型）を備えたモデル動物を作製する方法が求められている。
【０００８】
すなわち、本発明は、前記精神神経疾患の特徴（中間表現型）を備えたモデル動物を作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を、特定の設定された範囲まで誘導することによって、当該非ヒト哺乳動物から出産される仔が、精神神経疾患にみられる特徴（中間表現型）を示すこと、及び前記特定の設定された範囲外に誘導した場合と比較して効率よく前記仔を作製できることを発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２３］を提供する。
【００１０】
［１］精神神経疾患モデル動物の作製方法であって、（ａ）妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質であるＩＬ−６の血中濃度を、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する工程、及び（ｂ）前記妊娠した非ヒト哺乳動物から仔を出産させる工程を含み、出産された仔が精神神経疾患モデル動物となる、前記作製方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、出産される仔は、精神神経疾患にみられる中間表現型を露呈する。
［２］前記免疫活性指標物質がＴＮＦ−αであり、血中濃度を１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する、［１］に記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、出産される仔は、精神神経疾患にみられる中間表現型を露呈する。
［３］前記免疫活性指標物質がＩＬ−１βであり、血中濃度を７５〜１７０ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導する、［１］、又は［２］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、出産される仔は、精神神経疾患にみられる中間表現型を露呈する。
［４］前記妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定し、前記血中濃度が設定された範囲内ではなかった場合に、前記（ａ）工程を繰り返す、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、免疫活性指標物質の血中濃度を確実に設定された範囲とすることができるので、モデル動物の作製における成功率を向上させることができる。
［５］前記（ａ）工程が、前記妊娠した非ヒト哺乳動物に免疫活性化剤を投与すること、又は前記妊娠した非ヒト哺乳動物にウイルスを感染させることによって行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、出産される仔は、精神神経疾患にみられる中間表現型を露呈する。
［６］前記（ａ）工程の前に、前記妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度が、前記設定値の範囲内となる免疫活性化剤の投与量、又はウイルスの力価を決定する工程を更に含む、［５］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物を処理する免疫活性化剤の投与量を事前に設定することによって、実際に妊娠した非ヒト哺乳動物に対して免疫活性化剤を投与したとき、又はウイルスを感染させたときの免疫活性指標物質の血中濃度の確認作業を軽減できるので、精神神経疾患モデル動物の作製における作業効率を向上させることができる。
［７］前記免疫活性化剤が、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸、リポ多糖類、合成リポタンパク質、一本鎖ＲＮＡ、ロキソリビン、又はフラジェリンである、［５］、又は［６］に記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物に投与する免疫活性化剤として、入手が容易なポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸などを採用することにより、当該精神神経疾患モデル動物の作製方法の実施を簡便にすることができる。
［８］前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、［５］、又は［６］に記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物に感染させるウイルスとして、入手が容易なインフルエンザウイルスを採用することにより、当該精神神経疾患モデル動物の作製方法の実施を簡便にすることができる。
［９］前記（ａ）工程の後に、前記免疫活性指標物質の血中濃度を指標として前記妊娠した非ヒト哺乳動物を選定する工程を更に含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、免疫活性指標物質の血中濃度が設された範囲にした妊娠非ヒト哺乳動物を選択できるので、モデル動物の作製における成功率を向上させることができる。
［１０］前記（ａ）工程が、前記妊娠した非ヒト哺乳動物に卵黄嚢が存在する時期に行われる、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物に卵黄嚢が存在する時期に免疫活性化剤を投与することによって、モデル動物作製効率を向上させることができる。
［１１］前記非ヒト動物が、げっ歯類である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物として入手が容易なげっ歯類を採用することにより、当該精神神経疾患モデル動物の作製方法の実施を簡便にすることができる。
［１２］前記精神神経疾患が、自閉症、統合失調症、又は双極性障害である、［１］〜［１１］のいずれに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、自閉症、統合失調症、又は双極性障害のモデルとなる精神神経疾患モデル動物を作製することができる。
［１３］前記精神神経疾患が、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上を特徴とする、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
この精神神経疾患モデル動物の作製方法によれば、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加を特徴とする精神神経疾患モデル動物を作製することができる。
【００１１】
［１４］［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された、精神神経疾患モデル動物。
この精神神経疾患モデル動物によれば、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製して提供することができる。
［１５］プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する、［１４］に記載の精神神経疾患モデル動物。
この精神神経疾患モデル動物によれば、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加を特徴とする精神神経疾患モデル動物を提供することができる。
【００１２】
［１６］［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を用いる、精神神経疾患の治療薬、検査薬、診断薬、又は鑑別法のスクリーニング方法。
このスクリーニング方法によれば、精神神経疾患に対するより効果的な治療薬、検査薬、診断薬、又は鑑別法を選択することができる。
［１７］精神神経疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、（ｉ）［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患治療薬の候補物質を投与する工程、（ｉｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の中間表現型の試験を課す工程、及び（ｉｖ）前記精神神経疾患治療薬の候補物質の投与前後において、前記試験の結果を比較する工程を含む、前記スクリーニング方法。
このスクリーニング方法によれば、精神神経疾患に対するより効果的な治療薬を選択することができる。
［１８］精神神経疾患のバイオマーカー、検査薬、又は診断薬のスクリーニング方法であって、（ｉ）［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体試料を採取する工程、及び（ｉｉｉ）前記生体試料中の生体物質の量を、対照のものと比較する工程を含む、前記スクリーニング方法。
このスクリーニング方法によれば、精神神経疾患に対するより効果的なバイオマーカー、検査薬、又は診断薬を選択することができる。
［１９］精神神経疾患のバイオマーカーのスクリーニング方法であって、
（ｉ）［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体信号を取得する工程、及び（ｉｉｉ）前記生体信号を、対照のものと比較する工程を含む、前記スクリーニング方法。
このスクリーニング方法によれば、精神神経疾患に対するより効果的なバイオマーカーを選択することができる。
［２０］精神神経疾患の鑑別法のスクリーニング方法であって、（ｉ）［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の候補鑑別法を課す工程、及び（ｉｉｉ）前記候補鑑別法の結果を、対照のものと比較する工程を含む、前記スクリーニング方法。
このスクリーニング方法によれば、精神神経疾患に対するより効果的な鑑別法を選択することができる。
【００１３】
［２１］前記免疫活性指標物質であるＩＬ−６の血中濃度が、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、精神神経疾患モデル動物を作製するための、妊娠した非ヒト哺乳動物。
この妊娠した非ヒト哺乳動物から、精神神経疾患モデル動物を効率的に作製することができる。
［２２］さらに、免疫活性指標物質であるＴＮＦ−αの血中濃度が、１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、［２１］に記載の妊娠した非ヒト哺乳動物。
この妊娠した非ヒト哺乳動物から、精神神経疾患モデル動物を効率的に作製することができる。
［２３］さらに、免疫活性指標物質がＩＬ−１βの血中濃度が、７５〜１７０ｐｇ／ｍｌの範囲内に誘導された、［２１］〜［２２］のいずれかに記載の妊娠した非ヒト哺乳動物。
この妊娠した非ヒト哺乳動物から、精神神経疾患モデル動物を効率的に作製することができる。
【００１４】
また、本発明は、以下の確認方法も提供する。
［２４］妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、妊娠した非ヒト哺乳動物の血中ＩＬ−６濃度が１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌ以上であることを確認する、血中免疫活性指標物質濃度の確認方法。
この血中免疫活性指標物質濃度の確認方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、血中のＩＬ−６濃度を指標に免疫刺激強度を最適化することができるので、出産される仔が精神神経疾患の中間表現型を示す割合を向上させることができる。
［２５］妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、妊娠した非ヒト哺乳動物の血中ＴＮＦ−α濃度が１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌであることを確認する、血中免疫活性指標物質濃度の確認方法。
この血中免疫活性指標物質濃度の確認方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、血中のＴＮＦ−α濃度を指標に免疫刺激強度を最適化することができるので、出産される仔が精神神経疾患の中間表現型を示す割合を向上させることができる。
［２６］妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、妊娠した非ヒト哺乳動物の血中ＩＬ−１β濃度が７５〜１７０ｐｇ／ｍｌであることを確認する、血中免疫活性指標物質濃度の確認方法。
この血中免疫活性指標物質濃度の確認方法によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物を用いる精神神経疾患モデル動物の作製において、血中のＩＬ−１β濃度を指標に免疫刺激強度を最適化することができるので、出産される仔が精神神経疾患の中間表現型を示す割合を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を精神神経疾患モデル動物が出産される設定された範囲内に誘導することにより、精神神経疾患の中間表現型を示す精神神経疾患モデル動物を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の代表的な精神神経疾患モデル動物の作製方法を示す図である。
【図２】ラットにおけるポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸投与量に対する血中の免疫活性指標物質濃度について示す図である。（Ａ）血中ＩＬ−６濃度について示す図である。（Ｂ）血中ＴＮＦ−α濃度について示す図である。（Ｃ）血中ＩＬ−１β濃度について示す図である。
【図３】当該モデル動物におけるプレパルス抑制試験の結果を示す。
【図４】当該モデル動物における脳内フラクタルカイン量について示す図である。
【図５】当該モデル動物における脳内パルブアルブミン陽性介在神経細胞密度について示す図である。
【図６】当該モデル動物における脳内ドーパミン代謝について示す図である。
【図７】Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与量に対する免疫グロブリン遊離κ鎖の血中量について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照しつつ本発明に係る精神神経疾患モデル動物の作製方法の実施態様を詳細に説明する。
なお、実施態様に記載する精神神経疾患モデル動物の作製方法などについては、本発明に係る精神神経疾患モデル動物の作製方法を説明するために例示したに過ぎず、これに限定されるものではない。
【００１８】
＜１．定義＞
本明細書中において、「精神神経疾患」は、中枢神経系における分子細胞生物学的な変化、主に神経伝達機能の変化、及び神経細胞の変化を伴う、知覚、記憶、学習、思考、判断などの認知過程、並びに情動などの高次脳機能に障害をきたす疾患を意味する。精神神経疾患の例としては、これらに限定はされないが、自閉症、統合失調症、アルツハイマー病、うつ病、及び双極性障害、依存症、うつ病、解離性障害、強迫性障害、睡眠障害、摂食障害、適応障害、認知症、パーソナリティー障害、発達障害、パニック障害、不安障害PTSD、性同一性障害、てんかんなどがある。一実施態様において、「精神神経疾患」は、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ以上）を特徴とする。
本明細書中において、「中間表現型」とは、精神神経疾患のうち、特に自閉症、統合失調症、及び双極性障害において観察される精神症候を除く行動学的・分子細胞生物学的な異常所見を意味する。
本明細書中において、「精神神経疾患モデル動物」は、ヒトの精神神経疾患の中間表現型を露呈する実験動物を意味する。
【００１９】
本明細書中において、「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを含まない、卵母細胞を有する非ヒト哺乳動物の雌性動物の全てを意味する。例えば、非ヒト哺乳動物としては、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが挙げられる。
【００２０】
本明細書中において、「妊娠」は、子宮内、又は外への受精卵の着床を意味する。
本明細書中において、「妊娠期間」は、交尾後、又は受精卵の着床から、出産するまでの期間、或いは体内に受精卵、又はそれが発育した胎児を包容している期間を意味する。
本明細書中において、「母親」、及び「母体」は、妊娠させる非ヒト哺乳動物、又は妊娠した非ヒト哺乳動物を意味する。「父親」は、母親の妊娠に必要な精子を提供する非ヒト哺乳動物を意味する。
本明細書中において、「胎児」は、母胎内で生育中の幼体を意味する。
本明細書中において、「仔」は、母親から生まれた子を意味し、母胎内の胎児と区別される。
本明細書中において、「卵黄嚢が存在する時期」は、妊娠初期の卵黄嚢が形成されなくなるまでの期間を意味する。
本明細書中において、「出産」は、流産や死産なく子が出生することを意味する。
【００２１】
本明細書中において、「免疫を活性化」、又は「免疫活性化」は、体内の免疫を活性化することを指し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）などの炎症性サイトカイン産生を増加させることをいう。
本明細書中において、「免疫活性化剤」は、個体の免疫活性化を誘導する物質を意味する。
本明細書中において、「免疫活性指標物質」は、個体の免疫が活性化していることを示す指標となる物質を意味する。
本明細書中において、「フラクタルカイン」は、フラクタルカイン受容体であるＣＸ３ＣＲ１のリガンドを意味し、ＣＸ３ＣＬ１やニューロタクチンと同一の分子である。
本明細書中において、「フラクタルカイン受容体」は、フラクタルカインをリガンドとする受容体であるＣＸ３ＣＲ１を意味する。
【００２２】
本明細書中において、「精神神経疾患治療薬」は、精神神経疾患を治療、予防、改善、又は管理することができる薬剤を意味する。精神神経疾患治療薬の候補物質としては、公知の中枢神経作用物質、脳内免疫に作用する物質、例えば、ドーパミン受容体に対して拮抗作用を有する物質や脳内免疫細胞に作用する物質などが挙げられる。
【００２３】
本明細書中において、「対照」は、精神神経疾患モデル動物と同種である一般的な正常状態にある動物を意味する。
【００２４】
＜２．本発明の精神神経疾患モデル動物の作製方法＞
本発明は、精神神経疾患モデル動物の作製方法（本明細書中において、「本発明の作製方法」ともいう。）を提供する。本発明の作製方法は、胎児期の母体免疫刺激を用いる。本発明の作製方法は、（ａ）妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を、設定された範囲内に誘導する工程、（ｂ）前記妊娠した非ヒト哺乳動物から仔を出産させる工程を含む。この出産された仔が当該モデル動物となり得る。
【００２５】
（妊娠した非ヒト哺乳動物）
本発明の作製方法で使用する非ヒト哺乳動物は、任意の方法によって準備、又は提供される。当該非ヒト哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に制限されるものではない。例えば、非ヒト哺乳動物としては、繁殖が容易で生物サイクルの短いげっ歯類が好ましい。更に好ましくは、Ｃ５７ＢＬ／６系統やＢＡＬＢ／ｃ系統などのマウス、又はＷｉｓｔａｒ系統やＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系統のラットなどである。
妊娠した非ヒト哺乳動物は、父親と母親とを交尾させたものを用いてもよいし、人工授精させたものを用いてもよいし、体外授精させた受精卵を雌性個体の子宮に移植することによって得られたものを用いてもよいし、既に妊娠した非ヒト哺乳動物を購入したものを用いてもよい。
【００２６】
父親と母親との交尾は、当業者に公知の方法であれば特に制限されるものではない。例えば、交尾前の父親と母親とを別々の檻で飼育し、その後、繁殖期に一緒の檻で飼育することで交尾させる。繁殖期の父親と母親は、それぞれ１匹を常時同居方式で飼育することが好ましい。
また、飼育中の非ヒト哺乳動物の飼育管理や給餌給水は、当業者に知られている通常の方法でよい。
【００２７】
妊娠の判定方法は、妊娠を確認できれば特に限定されるものではない。例えば、妊娠の判定方法としては、膣内の精子確認、プラグチェック、妊娠に伴い体重増加や子宮増大が起きるので、体重の測定、子宮の触診、腹部超音波検査などが挙げられる。好ましくは膣内の精子確認である。
【００２８】
上記方法によって準備、又は提供された妊娠した非ヒト哺乳動物は、精神神経疾患モデル動物を作製するために用られる。精神神経疾患モデル動物を作製するために、妊娠した非ヒト哺乳動物は、免疫活性指標物質の血中濃度が設定された範囲内になるように誘導される。
【００２９】
（免疫活性指標物質、その設定された範囲、及び当該設定された範囲への誘導方法）
妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性化の指標となる免疫活性指標物質は、当該非ヒト動物の免疫活性化を確認できる生体物質であれば特に制限されるものではない。例えば、免疫活性指標物質としては、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βなどが挙げられる。好ましくは、免疫活性指標物質は、ＩＬ−６である。設定された範囲内に誘導される免疫活性指標物質は、１種であっても、複数（例えば、２、又は３）種類であってもよい。
血中ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αの濃度などの免疫活性指標物質の測定は、当業者に公知の方法で行えばよく、特に制限されるものではない。例えば、血中ＩＬ−６濃度などの測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）などが挙げられる。
【００３０】
免疫活性指標物質の血中濃度の設定された範囲は、精神神経疾患モデル動物の作製に資するものであれば特に制限されるものではない。
例えば、血中ＩＬ−６濃度の設定された範囲は、１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌである。好ましくは、血中ＩＬ−６濃度は、１５００〜３５００ｐｇ／ｍｌ、１６００〜３４００ｐｇ／ｍｌ、１７００〜３３００ｐｇ／ｍｌ、更に好ましくは１８００〜３２００ｐｇ／ｍｌ、１９００〜３１００ｐｇ／ｍｌ、特に好ましくは２０００〜３０００ｐｇ／ｍｌである。
【００３１】
また、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性化の指標は、ＴＮＦ−α、又はＩＬ−１βの血中濃度であってもよい。例えば、血中ＴＮＦ−α濃度の設定された範囲としては、１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌであれば特に制限されることはない。好ましくは１２００〜３６００ｐｇ／ｍｌ、１９００〜３４００ｐｇ／ｍｌ、２０００〜３２００ｐｇ／ｍｌ、更に好ましくは２１００〜３０００ｐｇ／ｍｌ、２２００〜２８００ｐｇ／ｍｌ、特に好ましくは２３００〜２６００ｐｇ／ｍｌである。
血中ＩＬ−１β濃度の設定された範囲としては、７５〜１７０ｐｇ／ｍｌであれば特に制限されることはない。好ましくは７５〜１５０ｐｇ／ｍｌ、８０〜１４０ｐｇ／ｍｌ、９０〜１２０ｐｇ／ｍｌ、特に好ましくは１００ｐｇ／ｍｌである。
【００３２】
妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を設定された範囲内に誘導する方法は、当業者に公知の方法であってよく、特に制限されるものではない。例えば当該誘導は、妊娠した非ヒト哺乳動物に免疫活性化剤を投与する、又はインフルエンザウイルスなどのウイルスに感染させることによって行われる。
妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を設定された範囲内に誘導する時期は、卵黄嚢が存在する時期であれば特に限定されるものではない。例えば、妊娠したマウスやラットの場合への免疫活性化剤の投与時期としては、妊娠９日目から１８日目である。好ましくは、妊娠した非ヒト哺乳動物に卵黄嚢が存在する時期である。
【００３３】
本発明の作製方法は、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定する工程を含むことができる。当該免疫活性指標物質の血中濃度を測定することにより、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度が、設定された範囲内であるか否かを判断することができる。前記血中濃度が設定された範囲内ではなかった場合には、前記設定された範囲内に誘導する工程を繰り返すことができる。
【００３４】
妊娠した非ヒト哺乳動物に投与される免疫活性化剤は、妊娠した非ヒト哺乳動物の免疫を活性化できるものであれば特に制限されるものではない。例えば、免疫活性化剤としては、化合物、又はウイルス由来の抗原物質などが挙げられる。具体的には、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、リポ多糖類、合成リポタンパク質、一本鎖ＲＮＡ、ロキソリビン、又はフラジェリンなどが挙げられる。好ましくは、免疫活性化剤は、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃである。
【００３５】
免疫活性化剤の投与は、妊娠した非ヒト哺乳動物の免疫を刺激することができれば特に制限されるものではない。例えば、免疫活性化剤の投与としては、経口投与、非経口投与、腹腔内投与、静脈投与、経皮投与、筋肉内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、経鼻投与などが挙げられる。好ましくは、腹腔内投与である。
【００３６】
免疫活性化剤の投与量は、前記免疫活性化指標の設定された範囲内になる投与であれば限定されるものではない。例えば、免疫活性化剤の投与量としては、１日あたり１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上４０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下であってもよい。１日あたりの下限値としては、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、更に好ましくは５ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、特に好ましくは７ｍｇ／ｋｇ（体重）以上である。一方、１日あたりの上限値としては、好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、更に好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、特に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下である。免疫活性化剤の種類によっては、投与量が多くなると流産の危険性が上昇するので、免疫活性化剤であれば、１日あたりの投与量は、４−１０ｍｇ／ｋｇ（体重）程度が望ましい。なお、非ヒト哺乳動物の種類により、免疫活性化剤の投与量を変更することができる。
【００３７】
前記免疫活性化剤は複数回投与してもよい。例えば、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定し、免疫活性指標物質の血中濃度が設定された範囲内ではなかった場合に、免疫活性化剤を追加投与することができる。免疫活性化剤を分割投与する場合は、例えば、２回、３回、４回、５回に分けて投与することができる。また、分割量で投与する場合の投与間隔は、例えば、１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間とすることができる。
【００３８】
免疫活性化剤の投与期間は、妊娠した非ヒト哺乳動物の免疫を十分に刺激することができれば特に制限されるものではない。妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定しながら、投与期間を決定することができる。例えば、免疫活性化剤の投与期間としては、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間などであってもよい。また、投与期間中の投与は連日投与でもよいし、隔日投与であってもよい。好ましくは、５日間の連日投与である。なお、非ヒト哺乳動物の種類により、投与期間や投与間隔を変更することができる。
【００３９】
また、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を、設定された範囲内に誘導する方法として、インフルエンザウイルスなどのウイルスを用いることができる。ウイルスの感染方法や力価は、ウイルスを感染させ、免疫活性化指標が設定された範囲内に上昇すれば特に制限されるものではない。例えば、ウイルスの感染方法としては、経口内投与、鼻腔内投与である。
【００４０】
感染させるウイルスの力価は、１日あたり１×１０３ｐｆｕ〜１×１０４ｐｆｕであってもよい。１日あたりの下限値としては、好ましくは２×１０３ｐｆｕ以上、更に好ましくは４×１０３ｐｆｕ以上、特に好ましくは６×１０３ｐｆｕ以上である。一方、１日あたりの上限値としては、好ましくは９×１０３ｐｆｕ以下、更に好ましくは８×１０３ｐｆｕ以下、特に好ましくは７×１０３ｐｆｕ以下である。
【００４１】
ウイルスの感染は、上記の感染量を１度に感染させてもよいし、分割量で複数回感染させてもよい。例えば、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定し、免疫活性指標物質の血中濃度が設定された範囲内ではなかった場合に、ウイルスを追加感染させることができる。ウイルスを分割量で感染させる場合は、例えば、２回、３回、４回、５回に分けて感染させることができる。また、分割量で感染させる場合におけるウイルスの感染間隔は、例えば、１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間とすることができる。
【００４２】
ウイルスの感染期間は、妊娠した非ヒト哺乳動物の免疫を十分に刺激することができれば特に制限されるものではない。妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を測定しながら、感染期間を決定することができる。例えば、ウイルスの感染期間としては、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間などであってもよい。また、当該感染は、連日で行ってもよいし、隔日投与で行ってもよい。好ましくは、５日間の連日で感染させる。なお、非ヒト哺乳動物の種類により、感染期間や感染間隔を変更することができる。
【００４３】
免疫活性化剤の投与量、及び投与方法、又はウイルスの力価、及び感染方法については、図１に示すように、妊娠した非ヒト哺乳動物に免疫活性化剤を投与、又はウイルスを感染させる前に検討することが望ましい。具体的には、免疫活性化剤を投与する、又はウイルスを感染させる妊娠した非ヒト哺乳動物とは異なる同種の非ヒト哺乳動物を用いて、当該非ヒト哺乳動物において、免疫活性指標物質であるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βなどの血中濃度が設定された範囲内に到達する免疫活性化剤の投与量、及び投与方法、又はウイルスの力価、及び感染方法を最適化することである。
これにより、妊娠した非ヒト哺乳動物に対して免疫活性化剤を投与したときの免疫活性指標物質の血中濃度の確認作業を軽減できるので、精神神経疾患モデル動物の作製における作業効率を向上させることができる。
【００４４】
また、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性化の指標となる免疫活性指標物質の血中濃度が設定された範囲内に達していない場合は、設定された範囲内になるまで免疫活性化剤を追加で投与、又はウイルスを追加で感染させてもよい。
これにより、免疫活性指標物質の血中濃度を確実に設定値以上とすることができるので、精神神経疾患モデル動物の作製における成功率を向上させることができる。
【００４５】
また、免疫活性化剤を投与した妊娠した非ヒト哺乳動物においては、免疫活性化の指標となる免疫活性指標物質の血中濃度が、設定された範囲内に上昇した母体から、出生した個体を当該モデル動物として選定してもよい。
これにより精神神経疾患モデル動物の作製における成功率を向上させることができる。
【００４６】
（妊娠した非ヒト哺乳動物からの仔の出産、及び出産された仔）
出産方法は、妊娠期間後に胎児を正常に出産させることができれば特に制限されるものではない。自然分娩ができない個体では、開腹手術、吸引分娩、鉗子分娩などの人為的手段により仔を取りだすことが望ましい。
【００４７】
本発明の作製方法における非ヒト哺乳動物から出産された仔が、精神神経疾患モデル動物となり得る。当該モデル動物は、雄であっても雌であってもよい。仔は、当業者の公知の方法により飼育することができる。
出産された仔は、精神神経疾患にみられる特徴（中間表現型）を有する。一態様において、出産された仔は、プレパルス抑制の低下、脳内フラクタルカインの低下、介在神経細胞数の低下、脳内ドーパミン代謝物質の増加、及び血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の増加からなる群から選択される１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ以上）の特徴を有する。
【００４８】
前記の出生児が精神神経疾患モデル動物として適格であるか確認する方法としては、精神神経疾患の中間表現型の試験、例えば、精神神経疾患の代表的な生物学的指標であるドーパミン代謝能の亢進や介在神経細胞の低下、及び代表的な行動学的中間表現型であるプレパルス抑制の低下を確認することなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
なお、精神神経疾患モデル動物と判断されるプレパルス抑制については、正常動物に比べて、０．８倍以下であれば特に制限されるものではない。例えば、好ましくは０．７倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、更に好ましくは０．３倍以下、０．２倍以下である。また、精神神経疾患モデル動物と判断される介在神経細胞の低下については、前頭葉、又は海馬において正常動物に比べて、７０％以下であれば特に制限されない。好ましくは、６０％以下、５０％以下、４０％、３０％以下、特に好ましくは５０％以下である。
【００４９】
本発明の作製方法は、精神神経疾患の中間表現型を複数同時に備えた精神神経疾患モデル動物の作製を可能にし、更に効率的な作製を可能にする。
【００５０】
本発明の精神神経疾患モデル動物の週齢は、特に制限されるものではなく、動物の種類や薬剤のスクリーニング方法に応じて適宜変更すればよい。週齢は、例えば、１〜３０週齢、５〜２５週齢、７〜２０週齢、９〜１８週齢、９〜１２週齢、１２〜１６週齢、又は１２〜１５週齢などである。
また、当該モデル動物の飼育管理や給餌給水は、当業者に知られている通常の方法でよいし、薬剤のスクリーニング方法に応じて適宜変更してもよい。
【００５１】
＜３．精神神経疾患の治療薬、バイオマーカー、検査薬、又は鑑別法のスクリーニング方法＞
本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を、精神神経疾患の治療薬、バイオマーカー、検査薬、診断薬、又は鑑別法のスクリーニング方法に用いることができる。精神神経疾患の治療薬、バイオマーカー、検査薬、診断薬、又は鑑別法などのスクリーニングとして当該モデル動物の体液、脳波、生体信号が利用可能であるが、特に制限されない。例えば、血中分子や脳波からバイオマーカーをスクリーニングする方法があげられる。当業者であれば、本発明の作製方法により作製した精神神経疾患モデル動物を用いて、様々なスクリーニング方法を考えることができる。例えば、本発明の作製方法により作製した精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の治療薬の候補物質を投与し、行動課題を課し、その結果から、精神神経疾患の治療薬を選別することができる。
【００５２】
例えば、精神神経疾患の治療薬のスクリーニング方法は、（ｉ）本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患治療薬の候補物質を投与する工程、（ｉｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の中間表現型の試験を課す工程、及び（ｉｖ）前記精神神経疾患治療薬の候補物質の投与前後において、前記試験の結果を比較する工程を含む。工程（ｉｖ）において、精神神経疾患治療薬の候補物質の投与後の結果が、投与前の結果と比べて、改善されていた場合、その候補物質を、精神神経疾患の治療薬として使用することができる。
【００５３】
精神神経疾患治療薬の候補物質の投与は、対象に候補物質を導入できれば特に制限されるものではない。例えば、精神神経疾患治療薬の候補物質の投与としては、経口投与、非経口投与、腹腔内投与、静脈投与、経皮投与、筋肉内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、経鼻投与などが挙げられる。
精神神経疾患治療薬の候補物質の投与量は、特に制限されず、候補物質の種類、スクリーニング時に行う行動課題の種類、精神病モデル動物の種類などにより変更してもよい。例えば、精神神経疾患治療薬の候補物質の投与量としては、１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上２０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下であってもよい。投与量の下限値としては、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、特に好ましくは５ｍｇ／ｋｇ（体重）以上である。一方、投与量の上限値としては、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、更に好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、特に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下である。
【００５４】
スクリーニング時に行う精神神経疾患の中間表現型の試験は、精神神経疾患に特徴的な中間表現型の変化を確認できるものであれば特に制限されるものではない。例えば、プレパルス抑制試験、運動量測定試験、社会性行動試験、強制水泳試験、又はＴ型迷路課題などの行動課題；或いは、脳内ドーパミン代謝測定、脳内フラクタルカイン伝達機能測定、又は介在神経細胞数の測定などの脳機能検査；或いは免疫グロブリン遊離κ鎖の測定などが挙げられる。免疫グロブリン遊離κ鎖の測定は、例えば、血液（全血、血漿、又は血清）、又は尿中の免疫グロブリン遊離κ鎖の量を測定する。好ましくは、プレパルス抑制試験、又は脳内フラクタルカイン伝達測定である。
【００５５】
また、例えば、精神神経疾患のバイオマーカー、検査薬、又は診断薬のスクリーニング方法は、（ｉ）本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体試料を採取する工程、及び（ｉｉｉ）前記生体試料中の生体物質の量を測定し、対照のものと比較する工程を含む。前記量が、対照のものと比較して、有意に増加、又は低下している場合、その生体物質を、精神神経疾患のバイオマーカーとして使用することができる。また、その生体物質を検出することができる物質を、精神神経疾患の検査薬、又は診断薬として使用することができる。工程（ｉｉ）における生体試料は、例えば、血液（全血、血漿、又は血清）、又は尿などである。
【００５６】
また、例えば、精神神経疾患のバイオマーカーのスクリーニング方法は、（ｉ）本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物から生体信号を取得する工程、及び（ｉｉｉ）前記生体信号を、対照のものと比較する工程を含む。前記信号が、対照のものと比較して、有意に変動している場合、その信号を、精神神経疾患のバイオマーカーとして使用することができる。生体信号は、例えば、脳波などである。
【００５７】
また、例えば、精神神経疾患の鑑別法のスクリーニング方法は、（ｉ）本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物を提供する工程、（ｉｉ）前記精神神経疾患モデル動物に、精神神経疾患の候補鑑別法を課す工程、及び（ｉｉｉ）前記候補鑑別法の結果を、対照のものと比較する工程を含む、前記スクリーニング方法。前記結果が、対照のものと比較して、有意に変動している場合、その鑑別法を、精神神経疾患の鑑別法として使用することができる。
【００５８】
以上の特徴により、本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物は、精神神経疾患治療薬、バイオマーカー、検査薬、診断薬、又は鑑別法のスクリーニングに用いることができる。これにより、精神神経疾患の治療薬を提供することができる。
【実施例】
【００５９】
＜４．実施例＞
以下に本発明の精神神経疾患モデル動物の作製方法における例示的実施例を記載する。当該実施例は、本発明の特許請求の範囲に関する理解を深めるために記載しているものであり、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の特許請求の範囲を逸脱しない範囲において、本発明の主題を達成し得る様々な態様、修飾、及び変更が可能である。
【００６０】
［実施例１：免疫刺激により誘導された精神神経疾患モデル動物］
（ラットの飼育）
成体のＷｉｓｔａｒ系統ラット（ＪＡＰＡＮ  ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）は、普通固形飼料（ＭＦ，Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ，Ｊａｐａｎ）、及び水を自由に摂取できる環境で飼育した。
また、雌性ラットより出産された新生児ラットは、生後２１日目まで母親と同一の檻で飼育し、生後２２日目から母親とは異なる檻に移して普通固形飼料、及び水を自由に摂取できる環境で飼育した。
【００６１】
（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与量の設定）
Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃの投与量は、妊娠していない９〜１２週齢の雌性ラットを用いて設定した。前記ラットの腹腔内に１．５〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを投与した後に採血して、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βを測定した。ＩＬ−６の血中濃度はＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）、ＴＮＦ−αやＩＬ−１βの血中濃度はＥＬＩＳＡキット（ＭＡＧＰＩＸ、バイオラット）を用いて測定した。
【００６２】
その結果、実施例で用いた上記Ｗｉｓｔａｒ系統ラットでは、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを投与することで、血中ＩＬ−６濃度が１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌ、血中ＴＮＦ−α濃度が１２００〜３８００ｐｇ／ｍｌ以上、血中ＩＬ−１β濃度が７５〜１７０ｐｇ／ｍｌに収まった（図２（Ａ）〜（Ｃ））。そこで、精神神経疾患モデル動物を出産させるための妊娠ラットに対するＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃの投与方法は、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを４日間連続で１日１回の投与に設定した。
【００６３】
（妊娠ラットのＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ処理）
妊娠ラットは、１２〜１５週齢の雄性ラットと雌性ラットを同一の檻で飼育して交尾させることによって作製した。妊娠して卵黄嚢が存在する雌性ラットには、雄性ラットと同一の檻で飼育を開始した１４日目から４日間連続で４ｍｇ／ｋｇ（体重）、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを１日１回投与した。なお、対照群は生理食塩水を投与した。
妊娠した雌性ラットの出産は自然分娩にて行い、新生児ラットが生後２１日目になるまで同一の檻で飼育した。
【００６４】
（精神神経疾患中間表現型の確認（ｉ）：プレパルス抑制試験）
プレパルス抑制試験では、ラットの驚愕反応を検出する圧電式加速度計とチャンバーを搭載した驚愕反応システム（ＳＲ−ＬＡＢＡＢＳシステム，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を用いた。まず、１２〜１６週齢のラットを試験箱に入れ１０分間慣れさせた後に、５分間背景音を聞かせて新しい環境に順応させた。
驚愕反応試験は、１２０ｄＢ（持続時間：４０ｍｓ）の強音驚愕刺激のみを与えたときと、強音驚愕刺激前に７０ｄＢ（持続時間：２０ｍｓ）、又は８０ｄＢ（持続時間：２０ｍｓ）の先行弱音刺激を与えたときの強音刺激に対する驚愕反応の大きさを荷重の増加で測定した。
驚愕反応抑制率は、次の式（１）により算出した。
式（１）：Ｃ（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
ここで、Ｃは驚愕反応抑制率、Ａは強音驚愕刺激のみを与えたときの驚愕反応の大きさ、Ｂは先行弱音刺激を与えたときの強音刺激に対する驚愕反応の大きさである。
【００６５】
（精神神経疾患中間表現型の確認(ｉｉ)：脳内フラクタルカインの測定）
脳内フラクタルカインの測定には、１２〜１６週齢の当該モデルラットを断頭した後に、速やかに摘出した線条体、大脳皮質、海馬の脳組織をホモジネート処理し、４℃、１５，０００×ｇの条件で３０分間遠心分離した上清を用いた。脳組織ホモジネートの上清分画に含まれるフラクタルカインは、ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏ，ＵＳＡ）を用いて測定した。脳組織ホモジネートの上清分画に含まれるタンパク質は、ＢＣＡ法を用いて測定した。
脳内のフラクタルカイン量は、脳内タンパク質の全量に対する比率として算出した。
【００６６】
（精神神経疾患中間表現型の確認（ｉｉｉ）：介在神経細胞数の測定)
１２〜１６週齢の当該モデルラットを深麻酔し、脳を灌流固定後、凍結脳スライス切片を作成し、介在神経細胞の一つであるパルブアルブミン陽性神経細胞を認識する一次抗体（Ａｎｔｉ−ＰＶ  ｓｅｒｕｍ、スワント）によって免疫染色し、ＢＺ−Ｘ８００(キーエンス)によって染色像を取り込み、染色された細胞の数をカウントした。
【００６７】
（精神神経疾患中間表現型の確認（ｉｖ）：脳内ドーパミン代謝産物の測定）
ドーパミン代謝産物の測定には、１２〜１６週齢の当該ラットを断頭した後に、速やかに摘出した前頭葉と側頭葉の脳組織をホモジネート処理し、４℃、１５，０００×ｇの条件で３０分間遠心分離した上清を用いた。脳組織ホモジネートの上清分画に含まれるドーパミン、及び３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）やホモバニリン酸（ＨＶＡ）などのドーパミン代謝産物は、逆相Ｃ１８カラム（ＳＣ−５０ＤＳ，ＥｉＣＯＭ，Ｊａｐａｎ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び電気化学的検出器からなるＨＴＥＣ−５００システム（ＥｉＣＯＭ，Ｊａｐａｎ）によって定量化した。
脳内のドーパミン代謝産物量は、ドーパミンに対する比率として算出した。
【００６８】
（統計解析）
統計解析は、統計処理ソフトＪＭＰ（ＪＭＰ５．１．２；ＳＡＳ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。ＡＮＯＶＡで有意差が認められた場合、２群間の比較をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により行った。Ｐ値が０．０５未満である場合に有意差ありと判定し、値は平均±標準偏差で示した。
【００６９】
（結果１：プレパルス抑制）
本発明により作製された１２〜１６週齢の精神神経疾患モデルラットにおけるプレパルス抑制の低下を確認するためにプレパルス抑制試験を行った。図３は、対照群（ｎ＝９）と当該モデルラット（ｎ＝８）における驚愕反応の抑制率を示したグラフである。なお、図３中の＊は、Ｐ値が０．０５未満であることを表す。
【００７０】
７０ｄＢのプレパルス音量を与えた当該モデルラットにおけるプレパルス抑制の割合は２８．２±６．８％であるのに対して、対照群では５４．３±６．５％であった。また、８０ｄＢのプレパルス音量を与えた当該モデルラットにおける驚愕反応の抑制率は６１．２±６．５％であるのに対して、対照群では７９．１±４．８％であった。
当該モデルラットは、対照群に比べて７０ｄＢ、及び８０ｄＢのプレパルス音量に対する驚愕反応の抑制率について有意な低下が認められた。この驚愕反応の抑制率の低下は、精神神経疾患において特徴的な反応である。
【００７１】
（結果２：脳内フラクタルカイン量）
本発明により作製された１２〜１６週齢の精神神経疾患モデル動物ラットにおける脳内のフラクタルカインの低下を確認するために、脳内フラクタルカイン量を測定した。図４は、対照群（ｎ＝４）と精神神経疾患モデルラット（ｎ＝５）の線条体、大脳皮質における全タンパク質量に対するフラクタルカイン量を示したグラフである。なお、図４中の＊＊＊は、Ｐが０．０００１未満、＊＊はＰ値が０．０１未満であることを表す。
【００７２】
精神神経疾患モデルラットは、線条体、及び大脳皮質における全タンパク質量に対するフラクタルカイン量が、対照群と比べて有意に低下した。
【００７３】
（結果３：介在神経細胞数）
本発明により作製された１２〜１６週齢の精神神経疾患モデルラットにおける前頭前野の介在神経細胞の異常を確認するためにパルブアルブミン陽性神経細胞数をカウントした。図５は対照群（ｎ＝４）と当該モデルラット（Ｎ＝４）の前頭葉における単位面積あたりのパルブアルブミン陽性細胞数を示した図である。なお、図５中の＊＊は、Ｐが０．００１未満であることを表す。
【００７４】
当該モデルラットの前頭葉における単位面積当たりのパルブアルブミン陽性細胞数は９．９±１．５個／１００μｍ２であるのに対して、対照群では１５．６±１．７個／１００μｍ２であった。当該モデルラットは、対照群に比べて、前頭葉における介在神経細胞の優位な減少が認められた。このドーパミン代謝異常は、精神神経疾患において特徴的な症状である。
【００７５】
（結果４：ドーパミン代謝）
本発明により作製された１２〜１６週齢の精神神経疾患モデルラットにおけるドーパミン代謝異常を確認するために、前頭葉と側頭葉におけるドーパミンとドーパミン代謝産物を測定した。図６は、対照群（ｎ＝４）と当該モデルラット（ｎ＝５）の前頭葉と側頭葉におけるドーパミンに対するドーパミン代謝産物の割合を示したグラフである。なお、図６中の＊＊は、Ｐが０．００１未満、＊はＰ値が０．０５未満であることを表す。
【００７６】
当該モデルラットの前頭葉におけるドーパミンに対するドーパミン代謝産物の比は０．６５±０．１５％であるのに対して、対照群では０．３４±０．００６であった。また、当該モデルラットの側頭葉におけるドーパミンに対するドーパミン代謝産物の比は０．３１±０．０５％であるのに対して、対照群では０．２１±０．００４であった。
当該モデルラットは、対照群に比べて、前頭葉と側頭葉におけるドーパミンに対するドーパミン代謝産物の割合について有意な増加が認められた。このドーパミン代謝異常は、精神神経疾患において特徴的な症状である。
【００７７】
以上の結果１〜４から、本発明により作製された動物は、精神神経疾患における中間表現型が複数一致するので、精神神経疾患モデル動物として利用することが可能となる。
【００７８】
［実施例２：バイオマーカーのスクリーニング］
免疫グロブリン遊離κ鎖は、精神神経疾患病態の一つである統合失調症の血液バイオマーカーであると考えられている（Arata Oh-Nishi et al., Neuroscience research 2016; 113: 63-70）。そこで、本発明により作製された上記モデル動物を用いて、血中免疫グロブリン遊離κ鎖が統合失調症における有用なマーカーとして同定されるか検証した。
【００７９】
（血中免疫グロブリン遊離κ鎖の測定）
血中免疫グロブリン遊離κ鎖の測定は、１２〜１６週齢のラットから採血した全血から分離処理を行った血清を用いてウェスタンブロット法により行った。血清に含まれる免疫グロブリン遊離κ鎖は、２Ｍチオ尿素、及び０．１Ｍジチオトレイトールを含有するタンパク質抽出緩衝液と血清を混合し、１０〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）を用いた電気泳動により分離した。電気泳動したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）に転写し、ＥｚＢｌｏｃｋ  ＢＳＡ（ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）を用いてブロッキング処理を施した。
【００８０】
ブロッキング処理をしたＰＶＤＦ膜は、１次抗体としてウサギ抗ラットＩｇκ軽鎖抗体、又はウサギ抗ラットアルブミン抗体（Ａｓｓａｙｐｒｏ，ＵＳＡ）、２次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）で処理し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ  Ｚｅｔａ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）、又はＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ  Ｂａｓｉｃ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を用いて化学発光させた。
【００８１】
化学発光シグナルは、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて検出し、シグナル強度はＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して定量した。
免疫グロブリン遊離κ鎖量は、アルブミンに対する百分率として算出した。
【００８２】
なお、ウサギ抗ラットＩｇκ軽鎖抗体は、ラット免疫グロブリン遊離κ鎖の５４番目から７３番目のアミノ酸配列（ＳＶＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＳＬ）のアミノ末端にキーホールリンペットヘモシアニンを連結した免疫ペプチドをウサギに皮下投与することにより、ポリクローナル抗体として作製した。
【００８３】
（結果５：血中ＩＬ−６濃度と血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の関係）
妊娠ラットにおける血中ＩＬ−６濃度と本発明により作製された統合失調症モデルラットにおける血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度の関係を明らかにするために、新生児ラットの血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度を測定した。図７は、対照群（ｎ＝４）、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与により血中ＩＬ−６濃度が１５００ｐｇ／ｍｌ未満の妊娠ラット（ｎ＝２）、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与により血中ＩＬ−６濃度が１５００ｐｇ／ｍｌ以上の妊娠ラット（ｎ＝２）から、それぞれ出産された新生児ラットにおける血中アルブミンに対する血中免疫グロブリン遊離κ鎖の割合を示したグラフである。図７中の＊＊は、Ｐ値が０．０1未満であることを表す。なお、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与により血中ＩＬ−６濃度が４０００ｐｇ／ｍｌ以上では４頭中４頭が流産し、出生時を得ることが出来なかった。
【００８４】
Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与により血中ＩＬ−６濃度が１５００〜４０００ｐｇ／ｍｌの妊娠ラットから出産された新生児ラットは、対照群やＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与によりの血中ＩＬ−６濃度が１５００ｐｇ／ｍｌ未満の妊娠ラットから出産された新生児ラットに比べて、血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度が精神疾患患者と同様に２倍以上増加した。この結果から、血中免疫グロブリン遊離κ鎖は精神神経疾患の検査薬、診断薬として有用であることが明らかになった。
【００８５】
なお、対照群、及びＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ投与により血中ＩＬ−６濃度が１５００ｐｇ／ｍｌ未満の妊娠ラットの血中ＴＮＦ−α濃度、血中ＩＬ−β１濃度は、それぞれ１２００ｐｇ／ｍｌ未満、７５ｐｇ／ｍｌ未満であったのに対して、血中免疫グロブリン遊離κ鎖濃度が対照群の２倍以上になった統合失調症モデルラットでは、血中ＴＮＦ−α濃度が１２００ｐｇ／ｍｌ以上、血中ＩＬ−β１濃度が７５ｐｇ／ｍｌ以上であった。
【００８６】
以上の結果５から、本発明により作製された動物は、統合失調症におけるバイオマーカーを同定するために用いることが可能であることが示された。また、同様に、本発明により作製された動物は、精神神経疾患の検査薬、診断薬、コンパニオン診断薬、治療薬、又は鑑別法のスクリーニングに用いることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、妊娠した非ヒト哺乳動物における免疫活性指標物質の血中濃度を所定範囲に誘導することにより、当該妊娠した非ヒト哺乳動物から出産された仔が精神神経疾患に特徴的な複数の中間表現型を示すことから、適切な精神神経疾患モデル動物を提供することができる。
また、本発明の作製方法により作製された精神神経疾患モデル動物は、精神神経疾患に対する治療薬、検査薬、診断薬、コンパニオン診断薬、又は鑑別法をスクリーニングする際に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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