(57)【要約】【課題】ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及び、ＴＧＦβ３を含む形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）に特異的な抗体のための材料及び方法、並びに、癌、目の疾患、状態又は障害、眼線維症又は目の線維症を含む線維症、及び、ＴＧＦβ発現に関連した他の状態又は障害を有する対象の治療におけるこれらの抗体の使用、の提供。【解決手段】ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及び、ＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）特定の配列を有する重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は、１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、特定の配列を有する重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は、１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、特定の配列を有する重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は、１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体とを含む、抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、
（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、抗体。
【請求項２】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、
（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と
を含む、抗体。
【請求項３】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、
（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と
を含む、抗体。
【請求項４】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列の少なくとも２つが、表１または配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列の３つが、表１または配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
表１または配列番号２、６および１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
表１または配列番号２、６および１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域における３つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
１つ以上の重鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のいずれか１つをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも２つを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも３つを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
（ａ）表１もしくは配列番号１６、２２および２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１７、２３および２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１８、２４および３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
（ａ）表１もしくは配列番号１６、２２および２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１７、２３および２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１８、２４および３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列の少なくとも２つが、表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載されている、請求項１３または１４に記載の抗体。
【請求項１６】
表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
（ｉ）軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、ならびに（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１６、２２および２８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７、２３および２９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１８、２４および３０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／あるいは
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１３、１９および２５もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４、２０および２６もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１５、２１および２７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、抗体。
【請求項２３】
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号２２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号２８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号３０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号２５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２６】
重鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域が、改変もしくは非改変のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
１つ以上の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている、請求項１３から２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１から選択される、請求項１から３、１３から１４、または２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
前記軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１３から２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
前記軽鎖定常領域が、改変もしくは非改変のラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
１０−６Ｍ以下の親和性ＫｄでＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
ＴＧＦβ３に対してよりも高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に結合する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
ＴＧＦβ３よりも高い程度までＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の活性を中和する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項３５】
発現制御配列に作用可能に結合した請求項３４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターまたは請求項３４に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３７】
重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含み、重鎖および軽鎖核酸が、別々の核酸で発現されるか、または同じ核酸上で発現される、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３６または３７に記載の宿主細胞を使用して抗体を生成する方法であって、好適な条件下で請求項３６または３７に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記抗体を回収する工程とを含む、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法により生成される、抗体。
【請求項４０】
請求項１〜３３および３９のいずれか一項に記載の抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物。
【請求項４１】
ＴＧＦβ発現に関連した疾患、状態または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項４０に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４２】
前記疾患、状態または障害が、癌、眼の疾患、状態または障害、眼線維症または目の線維症、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、および半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、移植レシピエントのシクロスポリン処置、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患（糖尿病性ネフロパシー）、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、肝硬変、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症（梗塞後心線維症）、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄、血管形成後の再狭窄、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病およびパーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患、状態または障害が、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、ならびに糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離からなる群から選択される眼の疾患、状態または障害である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患、状態または障害が、線維増殖性の眼疾患、状態もしくは障害、目の線維症、または眼線維症である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項４０に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４６】
前記抗体または組成物が、腫瘍内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させ、かつ／またはＮＫ細胞の細胞溶解活性を改善する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体または組成物が、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体または組成物が、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ機能を向上させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させ、かつ／またはＭＤＳＣ機能を阻害する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、腫瘍内の樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させ、かつ／または樹状細胞の寛容原性機能を阻害する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維性癌、神経膠腫および黒色腫からなる群から選択される、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
線維症を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項４０に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５３】
ＴＧＦβ発現に関連した状態または障害の治療における使用のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項４０に記載の薬学的組成物を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、概して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３を含む形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）に特異的な抗体のための材料および方法、ならびに、癌、目の疾患、状態または障害、目の線維症または眼線維症を含む線維症、およびＴＧＦβ発現に関連した他の状態もしくは障害を有する対象の治療におけるこれらの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーは、哺乳動物に見られる３つの異なるアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）からなる。ＴＧＦβタンパク質は、細胞増殖、炎症および心臓血管状態を含む疾患状態に影響する複数の遺伝子応答を活性化および調節する。ＴＧＦβは、元々、正常な線維芽細胞を足場非依存性成長が可能な細胞に変換する能力にちなんで命名された多機能性サイトカインである。ＴＧＦβ分子は、主に造血細胞および腫瘍細胞により生成され、様々な正常および新生物組織起源の両方からの細胞の成長および分化を調節、すなわち刺激または阻害することができ（Ｓｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５３２（１９８６）（非特許文献1））、様々な間質細胞の形成および増加を刺激することができる。
【０００３】
ＴＧＦβは、細胞増殖および分化、胚発生、細胞外基質形成、骨の発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫および炎症反応等の、多くの増殖および非増殖細胞プロセスに関与することが知られている。例えば、Ｐｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３６：３０−３７（１９８６）（非特許文献2）；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１：２０３−２１８（１９８９）（非特許文献3）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｐｏｒｎ，ｐｐ  ４１９−４７２  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ  Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ  ＆  Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９０）（非特許文献4）；Ｍａｓｓａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：５９７−６４６（１９９０）（非特許文献5）；Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１：７３８−７４５（１９９９）（非特許文献6）を参照されたい。また、ＴＧＦβは、腸粘膜の疾患の治療および予防に使用される（ＷＯ２００１／２４８１３（特許文献1））。ＴＧＦβはまた、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）阻害（Ｒａｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：９９１，１９８７）（非特許文献7）、Ｅｓｐｅｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：２３１２，１９８８）（非特許文献8）、Ｂ細胞リンパ球再生低下およびカッパ軽鎖発現（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１２９０，１９８７（非特許文献9））、造血の負の調節（Ｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７２：１５０４，１９８８（非特許文献10））、腫瘍細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の下方調節（Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：４２１７，１９８８（非特許文献11））、ならびにＢ細胞成長因子に応答する抗原活性化Ｂリンパ球の増殖の阻害（Ｐｅｔｉｔ−Ｋｏｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１１１，１９８８（非特許文献12））を含む、様々な免疫細胞型に対する強い免疫抑制作用を有することが知られている。また、米国特許第７，５２７，７９１号（特許文献2）も参照されたい。
【０００４】
ＴＧＦβに対する抗体は、特許文献２、米国特許第７，９２７，５９３号（特許文献3）、同第７，４９４，６５１号（特許文献4）、同第７，３６９，１１１号（特許文献5）、同第７，１５１，１６９号（特許文献6）、同第６，４９２，４９７号（特許文献7）、同第６，４１９，９２８号（特許文献8）、同第６，０９０，３８３号（特許文献9）、同第５，７８３，１８５号（特許文献10）、同第５，７７２，９９８号（特許文献11）、同第５，５７１，７１４号（特許文献12）、および同第７，７２３，４８６号（特許文献13）に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００１／２４８１３
【特許文献２】米国特許第７，５２７，７９１号
【特許文献３】米国特許第７，９２７，５９３号
【特許文献４】米国特許第７，４９４，６５１号
【特許文献５】米国特許第７，３６９，１１１号
【特許文献６】米国特許第７，１５１，１６９号
【特許文献７】米国特許第６，４９２，４９７号
【特許文献８】米国特許第６，４１９，９２８号
【特許文献９】米国特許第６，０９０，３８３号
【特許文献１０】米国特許第５，７８３，１８５号
【特許文献１１】米国特許第５，７７２，９９８号
【特許文献１２】米国特許第５，５７１，７１４号
【特許文献１３】米国特許第７，７２３，４８６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５３２（１９８６）
【非特許文献２】Ｐｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３６：３０−３７（１９８６）
【非特許文献３】Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１：２０３−２１８（１９８９）
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｐｏｒｎ，ｐｐ  ４１９−４７２  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ  Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ  ＆  Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９０）
【非特許文献５】Ｍａｓｓａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：５９７−６４６（１９９０）
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１：７３８−７４５（１９９９）
【非特許文献７】Ｒａｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：９９１，１９８７）
【非特許文献８】Ｅｓｐｅｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：２３１２，１９８８）
【非特許文献９】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１２９０，１９８７
【非特許文献１０】Ｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７２：１５０４，１９８８
【非特許文献１１】Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：４２１７，１９８８
【非特許文献１２】Ｐｅｔｉｔ−Ｋｏｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１１１，１９８８
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＴＧＦβ発現に関連した疾患または障害の治療のための方法および組成物を提供する。本開示は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体を提供する。本明細書に記載の抗体は、ＴＧＦβアイソフォームのいずれかまたは全てに対して差別的な親和性を有し得ることが記載される。さらに、本明細書において、開示されるＴＧＦβ特異的抗体が、予想外にも、腫瘍内の免疫細胞を調整（例えば腫瘍に浸潤）することが見出され、ＴＧＦβ発現に関連した腫瘍、およびＴＧＦβ発現に関連した他の状態または障害の治療に企図される。
【０００８】
一態様において、本開示は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖相補性決定反復（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体とを含む抗体を提供する。
【０００９】
関連する態様において、本開示は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む抗体を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本開示は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）表１もしくは配列番号１３、１９および２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１４、２０および２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む抗体を企図する。
【００１１】
ある特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列の少なくとも２つが、表１または配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載されている。関連する実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列の３つが、表１または配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載されている。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗体は、表１または配列番号２、６および１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むことが企図される。関連する実施形態において、抗体は、表１または配列番号２、６および１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
さらに他の実施形態において、抗体は、重鎖可変領域における３つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、１つ以上の重鎖フレームワークアミノ酸は、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている。
【００１５】
本明細書に記載の抗体は、表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のいずれか１つをさらに含むことが企図される。いくつかの実施形態において、抗体は、表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも２つを含む。他の実施形態において、抗体は、表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも３つを含む。
【００１６】
別の態様において、本明細書に記載の抗体は、（ａ）表１もしくは配列番号１６、２２および２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１７、２３および２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表１もしくは配列番号１８、２４および３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体とを含む。
【００１７】
代替の実施形態において、本明細書において企図される抗体は、（ａ）表１もしくは配列番号１６、２２および２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｂ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１７、２３および２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体と、（ｃ）独立して選択される、表１もしくは配列番号１８、２４および３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されたその変異体とを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列の少なくとも２つが、表１または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載されている。
【００１９】
さらに、本明細書に記載の抗体は、軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含むことが企図される。
【００２０】
一実施形態において、本明細書において企図される抗体は、表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。関連する実施形態において、抗体は、表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、表１または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２１】
さらなる実施形態において、本明細書に記載の抗体は、（ｉ）軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、ならびに（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の態様において、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）軽鎖可変領域は、配列番号１６、２２および２８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７、２３および２９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１８、２４および３０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／あるいは（ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１３、１９および２５もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４、２０および２６もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１５、２１および２７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、抗体を提供する。一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号１８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号１３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号１５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【００２３】
関連する実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号１９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【００２４】
ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号３０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号２５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【００２５】
上記抗体配列のいずれか１つの同一性パーセントは、本明細書に開示される重鎖もしくは軽鎖可変領域またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２もしくはＬＣＤＲ３のいずれかと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一となり得ることが企図される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、改変もしくは非改変のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００２７】
ある特定の実施形態において、１つ以上の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている抗体が提供される。
【００２８】
一態様において、本開示の抗体は、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択される。ＸＰＡ．４２．０８９の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６および８に記載されている。ＸＰＡ．４２．０６８の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および４に記載され、ＸＰＡ．４２．６８１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０および１２に記載されている。
【００２９】
一実施形態において、本明細書に記載の抗体は、前記軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、軽鎖定常領域は、改変もしくは非改変のラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００３０】
好ましい実施形態において、本開示は、１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄを有するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に特異的な抗体を提供する。例示的実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβの少なくとも１つのアイソフォームに、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたはそれ以下の親和性で結合し、あるいは、随意に、２つのＴＧＦβアイソフォーム、またはＴＧＦβ１、２、もしくは３の全てに、アイソフォームの１つ以上に対して１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下の親和性で結合する。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＴＧＦβ３への結合と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％高い親和性で結合する（例えば、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に優先的に結合する）。代替として、本明細書に記載の抗体は、ＴＧＦβアイソフォームＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のそれぞれに、互いの３倍、５倍または１０倍以内の親和性で結合する。ある特定の実施形態において、抗体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に、ＴＧＦβ３よりも大きい親和性で結合する。ある特定の実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴またはＫＩＮＥＸＡアッセイにより測定される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＴＧＦβ３よりも高い程度までＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の活性を中和する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％強力である。本明細書において企図される例示的な中和アッセイは、限定されないが、インターロイキン−１１放出アッセイおよびＨＴ−２細胞増殖アッセイを含む。さらに、本明細書において開示される抗体が、１つのＴＧＦβアイソフォームを優先的に阻害するかどうかを決定するために、ｐＳＭＡＤリン酸化アッセイまたはｒｈＬＡＰ結合アッセイを含むＴＧＦβ活性アッセイを行うことができる。さらなる実施形態において、抗体は、ＴＧＦβ３と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に対しより低いＩＣ５０（すなわち、より良好な結合、より大きな有効性）を有する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。
【００３３】
さらなる態様において、本開示は、発現制御配列に作用可能に結合した本明細書において企図される核酸分子を含む発現ベクターを提供する。また、本開示の発現ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞も企図される。ある特定の実施形態において、本開示は、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含み、重鎖および軽鎖核酸が、別々の核酸で発現されるか、または同じ核酸上で発現される、宿主細胞を提供する。
【００３４】
関連する態様において、本開示は、本明細書に記載の宿主細胞を使用して抗体を生成する方法であって、好適な条件下で宿主細胞を培養する工程と、前記抗体を回収する工程とを含む方法を提供する。また、本明細書において開示される方法により生成される抗体が提供される。
【００３５】
本開示は、さらに、本明細書において開示される抗体および薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物を企図する。
【００３６】
別の態様において、本開示は、ＴＧＦβ発現に関連した疾患、状態または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本明細書において企図される抗体または薬学的組成物を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、疾患、状態または障害は、癌、目の（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的）疾患、状態もしくは障害、線維症に関連した疾患、状態もしくは障害、例えば線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または、関連した線維症を有する疾患、状態もしくは障害からなる群から選択される。
【００３７】
線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患は、限定されないが、皮膚、肺、腎臓、心臓、脳および目を含む、体内の任意の器官または組織に影響するものを含む。線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患は、限定されないが、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、移植レシピエントのシクロスポリン処置を含む、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性ネフロパシー、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、全ての病因に起因する肝硬変、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症、梗塞後心線維症、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄、血管形成後の再狭窄、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、眼科手術、緑内障の処置、網膜復位術、水晶体摘出、または任意の種類のドレナージ術等に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症、角膜混濁に関連した線維症、小柱網の線維症、緑内障に関連した線維症、後眼部線維症、線維血管性瘢痕、目の網膜血管または脈絡膜血管における線維症、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症、加齢黄斑変性、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病、パーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成を含む。
【００３８】
例示的な目の疾患（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的疾患）、状態または障害は、限定されないが、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、眼科手術、例えば緑内障の治療、網膜復位術、水晶体摘出、または任意の種類のドレナージ術等に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００３９】
例示的な目の線維増殖性疾患、状態もしくは障害、目の線維症、眼球の線維症、または眼線維症は、限定されないが、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性に関連した線維症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷に関連した線維症、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００４０】
様々な実施形態において、目の線維増殖性疾患、状態または障害は、増殖性硝子体網膜症、眼科手術に関連した線維症、白内障手術後の水晶体の線維症、角膜実質の線維症およびアルカリ熱傷からなる群から選択される。
【００４１】
関連する態様において、本開示は、癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本明細書において企図される抗体または薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維性癌、神経膠腫および黒色腫からなる群から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、抗体または組成物は、腫瘍内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させる。様々な実施形態において、抗体または組成物は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性を増加させる。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、ＮＫ細胞によるパーフォリンおよびグランザイム産生を増加させる。一実施形態において、抗体は、ＸＰＡ．４２．０８９またはＸＰＡ．４２．６８１である。
【００４３】
様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、免疫反応を下方調節する、または免疫反応の部位に移動するＴｒｅｇの能力を阻害する。
【００４４】
様々な実施形態において、抗体または組成物は、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ活性を向上させる、例えばＣＴＬ活性を増進、増加もしくは促進する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、ＣＴＬによるパーフォリンおよびグランザイム産生を増加させ、ＣＴＬの細胞溶解活性を増加させる。一実施形態において、抗体は、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９またはＸＰＡ．４２．６８１である。
【００４５】
別の実施形態において、抗体または組成物は、腫瘍内の単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させ、かつ／またはＭＤＳＣ機能を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、免疫反応を抑制するＭＤＳＣの能力を阻害し、ＭＤＳＣの免疫抑制活性を阻害し、ならびに／またはＴｒｅｇの増加および／もしくは機能を促進するＭＤＳＣの能力を阻害する。様々な実施形態において、抗体は、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択される。
【００４６】
様々な実施形態において、抗体は、腫瘍内の樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させ、かつ／または樹状細胞の寛容原性機能（例えば寛容原性作用）を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、ＣＤ８＋樹状細胞の寛容原性作用を低下させる。一実施形態において、抗体は、ＸＰＡ．４２．０８９またはＸＰＡ．４２．６８１である。
【００４７】
別の態様において、本開示は、線維症を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本明細書において企図される抗体または薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
様々な実施形態において、抗体は、第２の薬剤とともに投与される。一実施形態において、第２の薬剤は、細胞外基質分解タンパク質、抗線維症薬、外科治療、化学療法、細胞傷害性薬、または放射線療法薬からなる群から選択される。例示的な第２の薬剤は、発明を実施するための形態においてより詳細に開示される。
【００４９】
様々な実施形態において、治療は、定期的に、例えば毎時間、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、またはそれより長い間隔で投与される。関連する実施形態において、例示的な治療では、本明細書に開示される抗体は、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日または１０００ｍｇ／日の用量で投与され得る。これらの濃度は、単回投薬形態として、または複数回投薬として投与され得る。
【００５０】
また、ＴＧＦβに結合する本開示の上記抗体もしくは組成物のいずれかを含む組成物、または、ＴＧＦβ発現に関連した本明細書に記載の障害のいずれかの治療のための医薬の調製におけるその使用が企図される。また、上記抗体または組成物のいずれかを含み、任意選択で好適な取扱説明書を有する、シリンジ、例えば使い捨てまたは事前に充填されたシリンジ、滅菌密閉容器、例えばバイアル、ボトル、槽、および／またはキットもしくはパッケージも企図される。
【００５１】
本明細書に記載のそれぞれの特徴もしくは実施形態、または組み合わせは、非限定的であり、本発明の態様のいずれかの実例であり、したがって、本明細書に記載される他の特徴もしくは実施形態、または組み合わせと組み合わせることができることを意図することが理解される。例えば、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、「具体的な例示的実施形態」、および／または「別の実施形態」等の言葉とともに特徴が説明される場合、これらの種類の実施形態のそれぞれは、全ての可能な組み合わせを列挙する必要なく、本明細書に記載の任意の他の特徴、または特徴の組み合わせと組み合わされることが意図される特徴の限定されない例である。そのような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のいずれにも適用される。範囲内に含まれる値の例が開示される場合、これらの例のいずれも、範囲の可能な端点として企図され、そのような端点の間のありとあらゆる数値が企図され、上の端点および下の端点のありとあらゆる組み合わせが想定される。
[本発明1001]
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）1、ＴＧＦβ2およびＴＧＦβ3に結合する抗体であって、
（ａ）表1もしくは配列番号13、19および25に記載の重鎖ＣＤＲ1アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号14、20および26に記載の重鎖ＣＤＲ2アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号15、21および27に記載の重鎖ＣＤＲ3アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、抗体。
[本発明1002]
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）1、ＴＧＦβ2およびＴＧＦβ3に結合する抗体であって、
（ａ）表1もしくは配列番号13、19および25に記載の重鎖ＣＤＲ1アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号14、20および26に記載の重鎖ＣＤＲ2アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号15、21および27に記載の重鎖ＣＤＲ3アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と
を含む、抗体。
[本発明1003]
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）1、ＴＧＦβ2およびＴＧＦβ3に結合する抗体であって、
（ａ）表1もしくは配列番号13、19および25に記載の重鎖ＣＤＲ1アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）独立して選択される、表1もしくは配列番号14、20および26に記載の重鎖ＣＤＲ2アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）独立して選択される、表1もしくは配列番号15、21および27に記載の重鎖ＣＤＲ3アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70％の同一性を有するその変異体と
を含む、抗体。
[本発明1004]
前記重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2またはＣＤＲ3アミノ酸配列の少なくとも2つが、表1または配列番号13〜15、19〜21および25〜27に記載されている、本発明1001から1003のいずれかの抗体。
[本発明1005]
前記重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3アミノ酸配列の3つが、表1または配列番号13〜15、19〜21および25〜27に記載されている、本発明1001から1003のいずれかの抗体。
[本発明1006]
表1または配列番号2、6および10に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1001から1005のいずれかの抗体。
[本発明1007]
表1または配列番号2、6および10に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1001から1006のいずれかの抗体。
[本発明1008]
重鎖可変領域における3つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2およびＨＣＤＲ3の配列番号13〜15、19〜21および25〜27に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む、本発明1001から1003のいずれかの抗体。
[本発明1009]
1つ以上の重鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている、本発明1001から1008のいずれかの抗体。
[本発明1010]
表1または配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のいずれか1つをさらに含む、本発明1001から1009のいずれかの抗体。
[本発明1011]
表1または配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも2つを含む、本発明1001から1010のいずれかの抗体。
[本発明1012]
表1または配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも3つを含む、本発明1001から1011のいずれかの抗体。
[本発明1013]
（ａ）表1もしくは配列番号16、22および28に記載の軽鎖ＣＤＲ1アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号17、23および29に記載の軽鎖ＣＤＲ2アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、表1もしくは配列番号18、24および30に記載の軽鎖ＣＤＲ3アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、本発明1001から1009のいずれかの抗体。
[本発明1014]
（ａ）表1もしくは配列番号16、22および28に記載の軽鎖ＣＤＲ1アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｂ）独立して選択される、表1もしくは配列番号17、23および29に記載の軽鎖ＣＤＲ2アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と、
（ｃ）独立して選択される、表1もしくは配列番号18、24および30に記載の軽鎖ＣＤＲ3アミノ酸配列、または1つもしくは2つのアミノ酸が変更されたその変異体と
を含む、本発明1001から1009のいずれかの抗体。
[本発明1015]
前記軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2またはＣＤＲ3アミノ酸配列の少なくとも2つが、表1または配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載されている、本発明1013または1014の抗体。
[本発明1016]
表1または配列番号4、8および12に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1010から1015のいずれかの抗体。
[本発明1017]
表1または配列番号4、8および12に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1018]
表1または配列番号4、8および12に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1019]
表1または配列番号4、8および12に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、本発明1018の抗体。
[本発明1020]
軽鎖可変領域の3つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2およびＬＣＤＲ3の配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む、本発明1013から1015のいずれかの抗体。
[本発明1021]
（ｉ）軽鎖可変領域の3つ全てのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2およびＬＣＤＲ3の配列番号16〜18、22〜24および28〜30に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも70％同一であるアミノ酸配列、ならびに（ｉｉ）重鎖可変領域の3つ全てのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2およびＨＣＤＲ3の配列番号13〜15、19〜21および25〜27に記載のアミノ酸配列にわたり少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1013から1015のいずれかの抗体。
[本発明1022]
軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）1、ＴＧＦβ2およびＴＧＦβ3に結合する抗体であって、
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号16、22および28もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号17、23および29もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、ならびに／または配列番号18、24および30もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含み；かつ／あるいは
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号13、19および25もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号14、20および26もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、ならびに／または配列番号15、21および27もしくはそれと少なくとも80％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含む、抗体。
[本発明1023]
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号16もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号17もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号18もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号13もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号14もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号15もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含む、本発明1022の抗体。
[本発明1024]
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号22もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号23もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号24もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号19もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号20もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号21もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含む、本発明1022の抗体。
[本発明1025]
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号28もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号29もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号30もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含み；かつ／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号25もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ1、配列番号26もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ2、および配列番号27もしくはそれと少なくとも90％同一である配列から選択されるＣＤＲ3を少なくとも含む、本発明1022の抗体。
[本発明1026]
重鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域が、改変もしくは非改変のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、本発明1001から1025のいずれかの抗体。
[本発明1027]
1つ以上の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸で置き換えられている、本発明1013から1026のいずれかの抗体。
[本発明1028]
ＸＰＡ．42．089、ＸＰＡ．42．068およびＸＰＡ．42．681から選択される、本発明1001から1003、1013から1014、または1022のいずれかの抗体。
[本発明1029]
前記軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む、本発明1013から1028のいずれかの抗体。
[本発明1030]
前記軽鎖定常領域が、改変もしくは非改変のラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、本発明1029の抗体。
[本発明1031]
10−6Ｍ以下の親和性ＫｄでＴＧＦβ1、ＴＧＦβ2およびＴＧＦβ3に結合する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1032]
ＴＧＦβ3に対してよりも高い親和性でＴＧＦβ1およびＴＧＦβ2に結合する、本発明1001から1031のいずれかの抗体。
[本発明1033]
ＴＧＦβ3よりも高い程度までＴＧＦβ1およびＴＧＦβ2の活性を中和する、本発明1001から1032のいずれかの抗体。
[本発明1034]
本発明1001から1033のいずれかの重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
[本発明1035]
発現制御配列に作用可能に結合した本発明1034の核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1036]
本発明1035のベクターまたは本発明1034の核酸分子を含む、宿主細胞。
[本発明1037]
重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含み、重鎖および軽鎖核酸が、別々の核酸で発現されるか、または同じ核酸上で発現される、本発明1036の宿主細胞。
[本発明1038]
本発明1036または1037の宿主細胞を使用して抗体を生成する方法であって、好適な条件下で本発明1036または1037の宿主細胞を培養する工程と、前記抗体を回収する工程とを含む、方法。
[本発明1039]
本発明1038の方法により生成される、抗体。
[本発明1040]
本発明1001〜1033および1039のいずれかの抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物。
[本発明1041]
ＴＧＦβ発現に関連した疾患、状態または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本発明1001から1033のいずれかの抗体または本発明1040の薬学的組成物を投与するステップを含む方法。
[本発明1042]
前記疾患、状態または障害が、癌、眼の疾患、状態または障害、眼線維症または目の線維症、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、および半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、移植レシピエントのシクロスポリン処置、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患（糖尿病性ネフロパシー）、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、肝硬変、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症（梗塞後心線維症）、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄、血管形成後の再狭窄、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病およびパーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成からなる群から選択される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記疾患、状態または障害が、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、ならびに糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離からなる群から選択される眼の疾患、状態または障害である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記疾患、状態または障害が、線維増殖性の眼疾患、状態もしくは障害、目の線維症、または眼線維症である、本発明1042の方法。
[本発明1045]
癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本発明1001から1033のいずれかの抗体または本発明1040の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1046]
前記抗体または組成物が、腫瘍内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させ、かつ／またはＮＫ細胞の細胞溶解活性を改善する、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記抗体または組成物が、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する、本発明1045の方法。
[本発明1048]
前記抗体または組成物が、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ機能を向上させる、本発明1045の方法。
[本発明1049]
前記抗体が、腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させ、かつ／またはＭＤＳＣ機能を阻害する、本発明1045の方法。
[本発明1050]
前記抗体が、腫瘍内の樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させ、かつ／または樹状細胞の寛容原性機能を阻害する、本発明1044の方法。
[本発明1051]
前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維性癌、神経膠腫および黒色腫からなる群から選択される、本発明1045から1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
線維症を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本発明1001から1033のいずれかの抗体または本発明1040の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1053]
ＴＧＦβ発現に関連した状態または障害の治療における使用のための、本発明1001から1033のいずれかの抗体または本発明1040の薬学的組成物を含む、組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＴＧＦβ抗体によるｒｈＬＡＰに結合するＴＧＦβ１の競合を示すグラフである。
【図２】ＴＧＦβ抗体による細胞内でのｐＳＭＡＤシグナル伝達の中和を示すグラフである。（Ａ）ＴＧＦβ１；（Ｂ）ＴＧＦβ２；（Ｃ）ＴＧＦβ３。
【図３】ＴＧＦβ抗体による調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の阻害を示すグラフである。
【図４】ＴＧＦβ抗体による、異種移植マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図５】ＴＧＦβ抗体による、異種移植マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図６】ＴＧＦβ抗体による、同系マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図７】ＴＧＦβ抗体による、同系マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図８】ＴＧＦβ抗体による、同系マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図９】ＴＧＦβ抗体による、同系マウスモデルにおける腫瘍阻害を示すグラフである。
【図１０】同系マウス腫瘍モデルにおける、腫瘍内のナチュラルキラー細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。
【図１１】同系マウスモデルにおける、腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。
【図１２】同系マウス腫瘍モデルにおける、腫瘍内の樹状細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。
【図１３】同系マウス腫瘍モデルにおける、腫瘍内の調節性Ｔ細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。
【図１４】同系マウス腫瘍モデルにおける、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。
【図１５】ＮＫ細胞の細胞溶解活性に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を示すグラフである。
【図１６】Ｔ細胞増殖に対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【図１７】グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）（図１７Ａ）およびパーフォリン（図１７Ｂ）の発現により評価されるＣＴＬ活性化に対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【図１８】ＴＧＦβ抗体を投与されたＣｓＡ処理または対照動物における血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルに対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【図１９】ＴＧＦβ抗体を投与されたＣｓＡ処理または対照動物の尿中の、罹患腎臓における糸球体機能障害の特徴であるアルブミン蓄積に対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【図２０】ＴＧＦβ抗体を投与されたＣｓＡ処理または対照動物の尿中の、腎臓におけるＥＣＭ堆積および線維症の程度を反映する尿中ＩＶ型コラーゲンのレベルに対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【図２１】腎組織に対して行われた定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価される、線維症に関与する遺伝子の発現に対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。ＴＧＦ−β１発現（図２１Ａ）およびＩＩＩ型コラーゲン（図２１Ｂ）に対する効果が、ＴＧＦβ抗体を投与したＣｓＡ処理または対照動物において評価された。
【図２２】ＴＧＦβ１の投与後の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるｐＳＭＡＤ２の増加に対するＴＧＦβ抗体の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本開示は、ＴＧＦβ発現に関連した状態または障害、例えば癌および線維症を治療するための治療薬を提供する。本開示は、ＴＧＦβと相互作用して、例えばＴＧＦβの結合相手を介したシグナル伝達等のその機能的効果の１つ以上を阻害する、分子または薬剤を提供する。本明細書において開示される組成物は、腫瘍内の免疫細胞活性を調整する能力を有利に有し、それにより、一態様において、腫瘍の成長に直接的または間接的に影響する細胞集団に影響することにより癌を治療する方法を提供する。
【００５４】
本開示をより完全に理解することができるように、いくつかの定義を記載する。
【００５５】
本明細書において使用する際、「標的」または「標的抗原」は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含むＴＧＦ−β分子のいずれかまたは全てを指す。
【００５６】
本明細書において使用する際、「ＴＧＦβ」は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３またはその変異体を含む、ＴＧＦβのアイソフォームのいずれか１つ以上を指す。同様に、用語「ＴＧＦβ受容体」は、別段に指定されない限り、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームに結合する任意の受容体を指す。
【００５７】
本明細書において使用する際、抗標的抗体の「所望の生物活性」は、ＴＧＦβに結合し、その機能的効果の１つ以上を阻害する能力である。
【００５８】
本明細書において使用する際、「状態」または「標的発現に関連した障害」は、標的活性が有害である状態または障害であり、高レベルの標的が、障害の病態生理学の原因、もしくは障害の悪化に寄与する因子のいずれかである、またはそれが疑われることが示されている疾患および他の障害、ならびに高レベルの標的発現が望ましくない臨床的兆候または症状に関連している疾患および他の障害を含む。そのような障害は、例えば、分泌される、および／もしくは細胞表面上の標的のレベルの増加、ならびに／または障害を患っている対象の罹患細胞もしくは組織におけるシグナル伝達の増加により明らかとなり得る。標的レベルの増加は、例えば、本明細書に記載のような標的特異的抗体を使用して検出され得る。
【００５９】
ＴＧＦβに結合する抗体物質（例えば本開示の抗体）により処置され得るＴＧＦβ発現に関連した例示的な疾患、状態または障害は、癌、例えば肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維性癌、神経膠腫および黒色腫、目の（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的）疾患、状態もしくは障害、線維症に関連した疾患、状態もしくは障害、例えば、線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患、状態もしくは障害を含む。
【００６０】
線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患、状態もしくは障害は、限定されないが、皮膚、肺、腎臓、心臓、脳および目を含む、体内の任意の器官または組織に影響するものを含む。線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患は、限定されないが、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、および半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、移植レシピエントのシクロスポリン処置、例えばシクロスポリン処置を含む、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患（例えば糖尿病性ネフロパシー）、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、全ての病因に起因する肝硬変を含む過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、例えば鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症（例えば、梗塞後心線維症）、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄（例えば、血管形成後の再狭窄）、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、または緑内障の処置、網膜復位術、水晶体摘出、もしくは任意の種類のドレナージ術等の眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば、角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば、緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病、パーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成を含む。
【００６１】
例示的な目の疾患（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的疾患）、状態または障害は、限定されないが、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００６２】
例示的な目の線維増殖性疾患、状態もしくは障害、目の線維症、眼球の線維症、または眼線維症は、限定されないが、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性に関連した線維症、眼科手術、例えば緑内障の治療、網膜復位術、水晶体摘出、または任意の種類のドレナージ術等に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷に関連した線維症、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００６３】
様々な実施形態において、目の線維増殖性疾患、状態または障害は、増殖性硝子体網膜症、眼科手術に関連した線維症、白内障手術後の水晶体の線維症、角膜実質の線維症およびアルカリ熱傷からなる群から選択される。
【００６４】
「免疫グロブリン」または「天然抗体」は、四量体糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンでは、それぞれの四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０個、またはそれ以上のアミノ酸を有する可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸を有する「Ｊ」領域によって連結し、このとき重鎖は、約１０個以上のアミノ酸を有する「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりあらゆる目的で全体が援用される）を参照されたい。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００６５】
各重鎖は、一端（ＶＨ）に１つの可変ドメイン、続いて複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメイン、その他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。
【００６６】
免疫グロブリン可変ドメインは、同じ一般的構造の３つの超可変領域またはＣＤＲが連結した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖および重鎖はいずれもドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３，１９８９）の定義に従う。
【００６７】
抗体の超可変領域とは、抗原結合に関与する抗体のＣＤＲアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基［例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるように、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）］、および／または超可変ループからの残基（例えば、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］に記載されるような、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。また、ＣＤＲは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番に従い特定および番号付けされており（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））、これは軽鎖および重鎖可変ドメインにおけるＣＤＲ位置を以下のように説明している：ＣＤＲ１、約残基２７から３８；ＣＤＲ２、約残基５６から６５；およびＣＤＲ３、約残基１０５から１１６（生殖系列）または残基１０５から１１７（再配列））。一実施形態において、ＣＤＲは、本明細書において開示されるものとほぼ同様の長さの抗体重鎖または軽鎖の軽鎖可変ドメインの約残基２６〜３１（Ｌ１）、４９〜５１（Ｌ２）および８８〜９８（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの約残基２６〜３３（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）および９７〜１１１（Ｈ３）に位置することが企図される。しかしながら、当業者には、ＣＤＲ残基の実際の場所は、特定の抗体の配列が特定される際、上述の予測される残基から変動し得ることが理解される。
【００６８】
フレームワークすなわちＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６９】
「重鎖可変領域」とは、本明細書において使用する際、前記抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、前記抗体重鎖の１個、２個、または３個のＣＤＲを含み得る。
【００７０】
「軽鎖可変領域」とは、本明細書において使用する際、前記抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、前記抗体重鎖の１個、２個、または３個のＣＤＲを含み得、これは抗体によってカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかであり得る。
【００７１】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合し得る抗体断片（例えばＦａｂ'、Ｆ'（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、二特異性抗体）、および、上記を含む組み換えペプチド（ただしそれらは、所望の生物活性を示す）を含む。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」は、それぞれ可変領域および定常領域を含む、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる四量体糖タンパク質である。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術により、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的開裂により生成され得る。抗体断片または抗原結合部分は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲ−グラフト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、直鎖状抗体；キレート性組み換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物活性を保持する限り、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ配列等、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。
【００７２】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生突然変異以外は同一である。
【００７３】
「抗体変異体」とは、本明細書において使用する際、参照抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む抗体ポリペプチド配列を指す。変異体は、改変していない抗体と実質的に相同または実質的に同一であってよい。
【００７４】
「キメラ抗体」とは、本明細書において使用する際、典型的には異なる種を起源とする、２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体（例えば、米国特許４，８１６，５６７号を参照）を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよび齧歯動物の抗体断片、一般的にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００７５】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原の生物学的機能を排除するか、または著しく減少させることが可能な抗体分子である。したがって、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達等の生物学的機能を排除する、または著しく減少させることができる。
【００７６】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から特定、分離および回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げるであろう物質であり、これは酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法で測定したときに抗体の９５重量％を上回るまで、最も好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで精製される。単離抗体は、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含むが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しなくなるためである。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。
【００７７】
本明細書において使用する際、「特異的に結合する」、「標的特異的」である、標的に「特異的」である、または標的抗原と「免疫反応性」である抗体は、同様の抗原よりも大きな親和性で標的抗原に結合する抗体または抗体物質を指す。本開示の一態様において、標的結合ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしく誘導体は、他の標的、すなわち非ヒト種に対するその結合親和性と比較して、ヒト標的に対してより高い親和性で結合するが、標的の相同分子種を認識してそれに結合する結合ポリペプチドも、提供される範囲内である。
【００７８】
例えば、その同種抗原に「特異的な」その抗体または断片であるポリペプチドは、抗体の可変領域が、検出可能な優先性をもって対象ポリペプチドを認識しそれに結合する（すなわち、ファミリーメンバーの間の局所的な配列同一性、相同性、または類似性の存在の可能性にもかかわらず、結合親和性の測定可能な差異のために、対象ポリペプチドを同じファミリーの他の既知のポリペプチドと区別することができる）ことを示す。特定の抗体はまた、抗体の可変領域の外、特に分子の定常領域内の配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌タンパク質ＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用し得ることが理解される。本開示の方法における使用のための抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、周知であり、当該技術分野において習慣的に実践されている。そのようなアッセイの総合的な考察に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。方法における使用のための抗体は、当該技術分野において知られている任意の方法を使用して生成され得る。
【００７９】
「エピトープ」という用語は、抗原結合領域の１つまたは複数において、選択的結合剤が認識し、結合することができるあらゆる分子の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは、本明細書において使用する際、隣接または非隣接であってよい。さらに、エピトープは、抗体を生成するために使用されるエピトープと同一の三次元構造を含むが、抗体免疫反応を刺激するために使用された標的において見られるアミノ酸残基を含まないか、またはそのいくつかのみを含む、模倣剤（ミモトープ）であってもよい。本明細書において使用する際、ミモトープは、選択的結合剤が結合するエピトープとは異なる抗原であるとはみなされず、選択的結合剤は、エピトープおよびミモトープの同じ三次元構造を認識する。
【００８０】
「誘導体」という用語は、本開示の抗体物質およびポリペプチドに関連して用いる場合、ユビキチン化、治療薬または診断薬への複合体化、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等のポリマー共有結合、およびヒトタンパク質に通常存在しない、オルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換等の技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。誘導体は、本開示の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００８１】
「検出可能部分」または「標識」とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられているもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、それに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質、または標的と相補的な配列を有する核酸分子を含む。検出可能部分は、しばしば、試料中の結合した検出可能部分の量を定量化するために使用可能な放射性、発色性、または蛍光性のシグナル等の測定可能なシグナルを生成する。
【００８２】
「治療上効果的な量」という用語は、本明細書において、標的タンパク質発現に関連した疾患の症状または兆候を改良または低下させるのに効果的な、本開示の標的特異的組成物の量を示す。
【００８３】
「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、本明細書における方法に関して使用される場合、ＴＧＦβ発現に関連した事象、疾患または状態の臨床症状、発現または進行を、一時的または永久的に、部分的または完全に排除、低減、抑制または改善することを指す。そのような治療は、有用であるために絶対的である必要はない。
【００８４】
本開示は、表１に記載の例示的な配列を含み得る標的特異的抗体、その断片、変異体および誘導体、上に列挙された標的特異的抗体を含む薬学的製剤、薬学的製剤を調製する方法、ならびに薬学的製剤および化合物で患者を治療する方法を提供する。
【００８５】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てることができ、これらは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成が周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。本明細書において開示される抗体は、定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのいずれかであってもよい。
【００８６】
本開示の抗体は、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下、または約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下のＫｄの、１つ以上のＴＧＦβ抗原に対する結合親和性を示し得る。そのような親和性は、従来の技術を使用して、例えば平衡透析により、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器、製造者により概説された一般手順を使用）、１２５Ｉ標識化標的抗原を使用した放射免疫測定法により、または以下の実施例に記載の、もしくは当業者に知られた別の方法により、容易に決定され得る。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）の方法により分析され得る。
【００８７】
ＫｉｎＥｘＡ結合平衡除外アッセイもまた、抗体のその抗原に対する親和性を測定するために有用である。ＫｉｎＥｘＡ技術は、液相と固相との間の結合事象ではなく、液相における結合事象を測定する。さらに、結合事象を測定するための多くの方法は、少なくとも１つの反応物質が固定化または標識化により改変されることを必要とするが、ＫｉｎＥｘＡ法は、研究対象分子の改変を必要としない。ＫｉｎＥｘＡ法によって、現在利用可能な他の方法よりも広範囲の結合定数を測定することができると考えられている。ＫｉｎＥｘＡデバイスおよび抗体特性決定のための操作に関するさらなる説明は、製造者（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）から入手可能であり、公開された文献、例えば米国特許第６，６６４，１１４号、およびＤａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．"Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００４，２：６４７−６５７において見出すことができる。
【００８８】
形質転換成長因子β
ＴＧＦβは、分泌前に切断されて成熟ＴＧＦβを生成する約４００アミノ酸（ａａ）のプレプロタンパク質として合成される、ジスルフィド結合二量体である。「潜在関連ペプチド」（ＬＡＰ）としても知られるＮ末端切断断片は、二量体に非共有結合的な結合を維持し、それによりＴＧＦβを不活性化することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで単離されたＴＧＦβは、不活性な「潜在的」形態で主に見られ、すなわちＬＡＰに関連している。潜在的ＴＧＦβ複合体は、いくつかの様式で、例えば、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸／インスリン様成長因子ＩＩ受容体と呼ばれる細胞表面受容体への結合により活性化され得る。結合は、ＬＡＰ内のグリコシル化部位に結合したマンノース−６−リン酸残基を介して生じる。受容体への結合後、ＴＧＦβは、成熟形態で放出される。成熟した活性ＴＧＦβは、次いで、その受容体に自由に結合し、その生物学的機能を発揮する。ＩＩ型ＴＧＦβ受容体における主要なＴＧＦβ結合ドメインは、１９アミノ酸配列にマッピングされている（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２７５５，１９９６）。また、米国特許第７，８６７，４９６号も参照されたい。
【００８９】
現在、ＴＧＦβの５つのアイソフォームが知られており（ＴＧＦβ１からＴＧＦβ５；ＴＧＦβ１〜３は哺乳動物、ＴＧＦβ４はニワトリに見られ、ＴＧＦβ５はカエルに見られる）、それらの全ては、互いに相同であり（６０〜８０％の同一性）、約２５ｋＤａのホモ二量体を形成し、一般的なＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβ−ＲＩ、ＴＧＦβ−ＲＩＩ、ＴＧＦβ−ＲＩＩＢ、およびＴＧＦβ−ＲＩＩＩ）に作用する。ＴＧＦβおよびＴＧＦβ受容体の構造的および機能的態様は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｅｄｓ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，２００１を参照されたい）。ＴＧＦβは、種の間でよく保存される。例えば、ラットおよびヒト成熟ＴＧＦβ１のアミノ酸配列は、ほぼ同一である。米国特許第７，８６７，４９６号もまた参照されたい。
【００９０】
ＴＧＦβ１は、生物組織における創傷治癒のプロセスにおいて重要な役割を担う（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３３１，ｐ．１２８６，１９９４およびＪ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１９，ｐ．１０１７，１９９２）。創傷組織の部位において、炎症細胞および線維芽細胞の浸潤、細胞外基質（ＥＣＭ）の産生および血管新生、ならびにその後の組織再生に向けた細胞成長等の生体反応が生じて、損傷組織を修復する。米国特許第７，５７９，１８６号もまた参照されたい。
【００９１】
ＴＧＦβ２欠損マウスは、心臓、肺、頭蓋顔面、四肢、脊椎、目、耳および泌尿生殖器欠陥を含む、著しい発育障害を示す（Ｄｕｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  ２６７：６９８２−８，２００１）。ＴＧＦβ３欠損マウスは、出生後２４時間までにほぼ１００％の致死率を示す。これらのマウスは、著しい口蓋障害および肺発育遅延を示す（Ｄｕｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）。ＴＧＦβ２はまた、緑内障の発達（Ｌｕｔｈｅｎ−Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８１：１−４，２００５）、クローン病に関連した線維症（Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１０：５５−６０，２００４）、創傷治癒および糖尿病性ネフロパシー（Ｐｏｈｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９２：７４６−５６，２００９）にも関与が示されている。
【００９２】
多くのヒト腫瘍（ｄｅＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３６７３（１９８７）、Ｋｕｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：５６２（１９８８））および多くの腫瘍細胞系（Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：７０７（１９８７）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：５９４（１９８８））がＴＧＦβを産生することが観察されており、それらの腫瘍が通常の免疫監視を逃れる可能なメカニズムを示唆している。
【００９３】
癌におけるＴＧＦβアイソフォーム発現は、特に癌において異なる役割を有するＴＧＦβアイソフォームの異なる組み合わせにより、複雑で変動する。例えば、米国特許第７，９２７，５９３号を参照されたい。例えば、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、卵巣癌およびその進行においてＴＧＦβ２よりも大きな役割を担う可能性があり、一方ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２発現は、より高い悪性度の軟骨肉腫腫瘍においてＴＧＦβ３よりも著しい。ヒト乳癌においては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３が顕著に発現し、ＴＧＦβ３発現は、全体的な生存に関連するようであり、結節転移および陽性ＴＧＦβ３発現を有する患者は、予後および転帰の不良を有する。しかしながら、結腸癌においては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、ＴＧＦβ３よりも顕著に発現し、癌を有さない個体の場合よりも高い循環レベルで存在する。神経膠腫においては、ＴＧＦβ２は細胞移動に重要である。
【００９４】
また、ＴＧＦβ発現は、腎硬化、肺線維症および肝硬変等の様々な組織線維症の発症、ならびに慢性肝炎、関節リウマチ、血管再狭窄、および皮膚のケロイド等の様々な状態に関与することが示されている。疾患もしくは障害（例えば線維増殖性疾患もしくは障害）、または疾患もしくは障害の処置に関連した線維症を含む、企図される線維症は、限定されないが、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、および半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、移植レシピエントのシクロスポリン処置、例えばシクロスポリン処置を含む、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患（例えば糖尿病性ネフロパシー）、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、全ての病因に起因する肝硬変を含む過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、例えば鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症（例えば、梗塞後心線維症）、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄（例えば、血管形成後の再狭窄）、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障、網膜機能不全に関連した線維症の処置、網膜復位術、水晶体摘出、もしくは任意の種類のドレナージ術等の眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば、角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば、緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病、パーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成を含む。
【００９５】
肺線維症および腎硬化においては、ＴＧＦβの濃度が高く、線維症等の病的状態の進行をもたらす（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４５：９１６−２７，１９９４およびＷｅｓｔｅｒｇｒｅｎ−Ｔｈｏｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：６３２−７，１９９３）。持続性組織損傷は、ＴＧＦβを発現するためのシグナルを連続的に変換し、ＥＣＭによるＴＧＦβ発現に対するマイナスの調節シグナルを抑制するか、または、肺線維症および腎硬化において両方の事象を相乗的にもたらすと推測されている。ＴＧＦβの阻害剤を使用して、線維症疾患の診断および治療においてＴＧＦβ活性および細胞外基質蓄積を抑制することが、ＷＯ１９９１／０４７４８、ＷＯ１９９３／１０８０８およびＷＯ２０００／４０２２７において開示されている。抗ＴＧＦ−βを中和することが、実験的糖尿病性腎臓疾患の治療において使用されている（Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｚｉｙａｄｅｈ，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２３４−２３７（１９９９））。また、様々な適応症におけるＴＧＦβの阻害剤の使用をさらに記載している、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２７，７９１号を参照されたい。
【００９６】
例示的な目の疾患（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的疾患）、状態または障害は、限定されないが、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００９７】
例示的な目の線維増殖性疾患、状態もしくは障害、目の線維症、眼球の線維症、または眼線維症は、限定されないが、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性に関連した線維症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷に関連した線維症、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【００９８】
様々な実施形態において、目の線維増殖性疾患、状態または障害は、増殖性硝子体網膜症、眼科手術に関連した線維症、白内障手術後の水晶体の線維症、角膜実質の線維症およびアルカリ熱傷からなる群から選択される。
【００９９】
抗体ポリペプチド
本開示は、標的特異的抗体をコードするアミノ酸分子を包含する。例示的実施形態において、本開示の標的特異的抗体は、ヒトカッパ（κ）もしくはヒトラムダ（λ）軽鎖またはそれに由来するアミノ酸配列、あるいはヒト重鎖またはそれに由来する配列、あるいは重鎖および軽鎖の両方を一本鎖、二量体、四量体、または他の形態で一緒に含んでもよい。いくつかの実施形態において、標的特異的免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は、異なるアミノ酸分子である。他の実施形態において、同じアミノ酸分子が、標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ヒト抗標的抗体のアミノ酸配列は、表１または配列番号４、８および１２に記載の抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１、あるいはＣＤＲグラフト化、改変、ヒト化、キメラ、もしくはヒト操作抗体または本明細書に記載の任意の他の変異体を含むそれらの変異体の成熟（すなわちシグナル配列を有さない）軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＬは、上記抗体のいずれか１つの軽鎖のＣＤＲ１の始めからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
一実施形態において、標的特異的抗体は、それぞれが配列番号４、８および１２に記載のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立して選択される、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３（（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）、配列番号４、８、および１２に記載の、または配列番号３、７、および１１に記載のＶＬ領域をコードする核酸分子によりコードされるＶＨ領域をコードする核酸を含む。一実施形態において、Ｃｈｏｔｈｉａの付番に従い、軽鎖ＣＤＲ１は、約残基２４〜３４であり、ＣＤＲ２は、約残基５０〜５６であり、ＣＤＲ３は、約残基８９〜９７の範囲である。代替の実施形態において、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番に従い、重鎖ＣＤＲは、約残基２７から３８（ＣＤＲ１）、約残基５６から６５（ＣＤＲ２）、および約残基１０５から１１６（生殖系列）または残基１０５から１１７（ＣＤＲ３）に位置することが企図される。一実施形態において、軽鎖ＣＤＲは、本明細書において開示されるものとほぼ同様の長さの抗体軽鎖の軽鎖可変ドメインにおける約残基２６〜３１（Ｌ１）、４９〜５１（Ｌ２）および８８〜９７（Ｌ３）に位置することが企図される。標的特異的抗体のポリペプチドは、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択されるＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ヒト標的特異的抗体は、表１もしくは配列番号２、６および１０に記載の抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１またはそれらの変異体の成熟（すなわちシグナル配列を有さない）重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨは、上記抗体の重鎖のいずれか１つのＣＤＲ１の始めからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一実施形態において、標的特異的抗体は、それぞれが配列番号２、６および１０に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立して選択される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、配列番号２、６、および１０に記載の、または配列番号１、５、および９に記載のＶＨ領域をコードする核酸分子によりコードされるＶＨ領域をコードする核酸を含む。さらに、標的特異的抗体は、それぞれ配列番号２、６、および１０に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立して選択される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含むことが企図される。一実施形態において、重鎖ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａの付番に従うと、ＣＤＲ１は、約残基２６〜３５であり、ＣＤＲ２は、約残基５０〜５８であり、ＣＤＲ３は、約残基９５〜１０２（または９５〜１１１または９５〜１１８）の範囲である。代替の実施形態において、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番に従うと、重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、約残基２７から３８（ＣＤＲ１）、約残基５６から６５（ＣＤＲ２）、およびＣＤＲ３、約残基１０５から１１６（生殖系列）または残基１０５から１１７（ＣＤＲ３）に位置することが企図される。一実施形態において、重鎖ＣＤＲは、本明細書において開示されるものとほぼ同様の長さの抗体重鎖の重鎖可変ドメインにおける約残基２６〜３３（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）および９７〜１１１（Ｈ３）に位置することが企図される。標的特異的抗体のポリペプチドは、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択されるＶＨ領域のアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでもよい。
【０１０４】
別の実施形態において、抗体は、表１に記載のように随意に対形成した、上に開示されるような成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域を含む。
【０１０５】
例示的実施形態において、本開示は、以下を企図する：
【０１０６】
それぞれ配列番号１３、１９および２５；１４、２０および２６；１５、２１および２７、ならびに配列番号１６、２２および２８；１７、２３および２９；および１８、２４および３０のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを保持するモノクローナル抗体（随意にそのようなＣＤＲ（複数を含む）のいずれかにおける１つまたは２つの突然変異、例えば、保存的または非保存的置換を含み、随意に表１に記載のように対形成している）；
【０１０７】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、または配列番号１３、１９および２５；１４、２０および２６；ならびに１５、２１および２７のいずれか１つの重鎖可変領域の全てを保持するモノクローナル抗体（随意にそのようなＣＤＲ（複数を含む）のいずれかにおける１つまたは２つの突然変異を含み、随意に任意の好適な重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＥ、そのヒト配列、またはそのハイブリッドをさらに含む）；
【０１０８】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、または配列番号１６、２２および２８；１７、２３および２９；ならびに１８、２４および３０のいずれか１つの軽鎖可変領域の全てを保持するモノクローナル抗体（随意にそのようなＣＤＲ（複数を含む）のいずれかにおける１つまたは２つの突然変異を含み、随意に任意の好適な軽鎖定常領域、例えば、カッパもしくはラムダ軽鎖定常領域、そのヒト配列、またはそのハイブリッドをさらに含む）。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、抗体は、表１に記載のように対形成した、３つ全ての軽鎖ＣＤＲ、３つ全ての重鎖ＣＤＲ、または軽鎖および重鎖の６つ全てのＣＤＲを含む。いくつかの例示的実施形態において、抗体からの２つの軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体からの第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わされてもよい。代替として、１つの抗体からのＬＣＤＲ１は、特にＣＤＲが極めて相同である場合、異なる抗体からのＬＣＤＲ２、およびさらに別の抗体からのＬＣＤＲ３と組み合わされてもよい。同様に、抗体からの２つの重鎖ＣＤＲは、異なる抗体からの第３の重鎖ＣＤＲと組み合わされてもよく、または、１つの抗体からのＨＣＤＲ１は、特にＣＤＲが極めて相同である場合、異なる抗体からのＨＣＤＲ２、およびさらに別の抗体からのＨＣＤＲ３と組み合わされてもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、配列番号２、６、および１０に記載の重鎖可変領域と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一であるアミノ酸配列、ならびに／または配列番号４、８および１２に記載の軽鎖可変領域と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一であるアミノ酸配列アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供され、抗体は、さらに、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域に対する同一性パーセントを有するアミノ酸配列は、軽鎖ＣＤＲの１つ、２つまたは３つを含んでもよい。他の実施形態において、重鎖可変領域に対するパーセント同一性を有するアミノ酸配列は、重鎖ＣＤＲの１つ、２つまたは３つを含んでもよい。
【０１１１】
別の実施形態において、表１中の抗体配列の重鎖可変領域における３つ全てのＨＣＤＲ、配列番号１３、１９および２５；１４、２０および２６；ならびに１５、２１および２７に記載のＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１２】
関連する実施形態において、表１中の抗体配列の軽鎖可変領域における３つ全てのＬＣＤＲ、配列番号１６、２２および２８；１７、２３および２９；ならびに１８、２４および３０に記載のＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１３】
さらなる実施形態において、表１中の抗体配列の重鎖および軽鎖可変領域における６つ全てのＣＤＲ、配列番号１３、１９および２５；１４、２０および２６；および１５、２１、２７；１６、２２および２８；１７、２３および２９；ならびに１８、２４および３０に記載のＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１４】
本開示の抗体は、抗体のＣＤＲ領域に１つまたは２つ以上のアミノ酸置換、例えば非保存的または保存的置換を有してもよいことが企図される。
【０１１５】
関連する実施形態において、フレームワークの残基が改変される。改変され得る重鎖フレームワーク領域は、重鎖ＣＤＲ残基を包囲するＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３およびＨ−ＦＲ４で指定される領域内に存在してもよく、改変され得る軽鎖フレームワーク領域の残基は、軽鎖ＣＤＲ残基を包囲するＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４で指定される領域内に存在してもよい。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークにおいて特定される任意の好適なアミノ酸と置換されてもよい。
【０１１６】
例示的実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択されるＴＧＦβの少なくとも１つのアイソフォームに特異的に結合する。他の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、（ａ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３（「汎反応性抗体」または「汎結合抗体」）；（ｂ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；（ｃ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ならびに（ｄ）ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に特異的に結合する。例示的実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβの少なくとも１つのアイソフォームに、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下（より低い値は、より高い結合親和性を意味する）の親和性で結合し、または随意に、２つのＴＧＦβアイソフォームに、またはＴＧＦβ１、２、もしくは３の全てに、アイソフォームの１つ以上に対して１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下の親和性で結合する。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＴＧＦβ３への結合と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％高い親和性で結合する（例えば、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に優先的に結合する）。代替として、本明細書に記載の抗体は、ＴＧＦβアイソフォームＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のそれぞれに、互いの３倍、５倍または１０倍以内の親和性で結合する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％強力である。
【０１１８】
ＸＰＡ．４２．０８９の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６および８に記載されている。ＸＰＡ．４２．０６８の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および４に記載され、ＸＰＡ．４２．６８１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０および１２に記載されている。
【０１１９】
抗体核酸
本開示はまた、標的特異的抗体をコードするアミノ酸分子を包含する。いくつかの実施形態において、別々の核酸分子が、標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態において、同じ核酸分子が、標的特異的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする。一実施形態において、核酸は、本開示の標的特異的抗体、および本明細書に記載の核酸によりコードされたポリペプチドのいずれかをコードする。
【０１２０】
一態様において、本開示の核酸分子は、配列番号４、８および１２に記載の抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１のＶＬアミノ酸配列またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。関連する態様において、ＶＬアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。いくつかの実施形態において、核酸は、前記抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、前記一部は、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続部分である。一実施形態において、前記一部は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域の少なくとも１つ、２つまたは３つを、随意に異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークとともに、および随意に、３つのＣＤＲ全体において１つ、または２つまで、または３つまでの突然変異とともに含む。
【０１２１】
一実施形態において、本開示は、配列番号２、６および１０ならびに４、８および１２のいずれか１つに記載の可変領域アミノ酸配列を有する、機能的断片を含む抗原結合化合物を提供する。関連する実施形態において、上述の抗原結合化合物は、完全に組み立てられた四量体抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；多重特異性抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２；Ｆｖ；ｓｃＦｖもしくは一本鎖抗体断片；二特異性抗体；三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、直鎖状抗体；キレート性組み換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、または、１つ以上の本開示のＣＤＲ配列を含み、所望の生物活性を示すこれらの抗体のいずれか１つの変異体もしくは誘導体、または２つ以上の抗体の混合からなる群から選択される。本開示の抗原結合化合物は、表面プラズモン共鳴により測定して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の１つ以上に対し、好ましくは１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下の結合親和性を保持する。
【０１２２】
一態様において、本開示の抗体は、表１において対形成されるような、それぞれアミノ酸配列の配列番号２、６および１０ならびに配列番号４、８および１２に記載の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。さらに、抗体は、上記アミノ酸配列に記載の抗体の全てまたは一部を含んでもよいことが企図される。一実施形態において、抗体は、表１において対形成されるような、配列番号２、６および１０の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３の少なくとも１つ、または配列番号４、８および１２の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の少なくとも１つを含む。
【０１２３】
一実施形態において、重鎖は、重鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。そのような「重鎖ＣＤＲ３配列」（ＨＣＤＲ３）は、表１ならびに配列番号１５、２１および２７に記載の重鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。代替として、ＨＣＤＲ３配列は、表１において特定される任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換、挿入または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む。好ましい置換は、表１の別のＨＣＤＲ３内の対応する位置でのアミノ酸への置換を含む。代替として、ＨＣＤＲ３配列は、本明細書に記載のＨＣＤＲ３のコンセンサスアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１２４】
上述のＨＣＤＲ３配列を含む重鎖は、さらに、「重鎖ＣＤＲ１配列」（ＨＣＤＲ１）を含んでもよく、これは、配列番号１３、１９および２５ならびに表１におけるＨＣＤＲ１として特定されるアミノ酸配列、配列番号１３、１９および２５ならびに表１において特定される任意のＨＣＤＲ１と比較して１つ以上のアミノ酸の変更、好ましくは表１の別のＨＣＤＲ１内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列、または本明細書に記載のＨＣＤＲ１のコンセンサス配列のいずれかを含む。
【０１２５】
代替として、上述のＨＣＤＲ３配列を含む重鎖は、さらに、「重鎖ＣＤＲ２配列」（ＨＣＤＲ２）を含んでもよく、これは、配列番号１４、２０および２６ならびに表１におけるＨＣＤＲ２として特定されるアミノ酸配列、配列番号１４、２０および２６ならびに表１において特定される任意のＨＣＤＲ２と比較して１つ以上のアミノ酸の変更、好ましくは表１の別のＨＣＤＲ２内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列、または本明細書に記載のＨＣＤＲ２のコンセンサス配列のいずれかを含む。
【０１２６】
上述の重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖はまた、（ａ）上述の重鎖ＣＤＲ１配列および（ｂ）上述の本発明の重鎖ＣＤＲ２配列の両方を含んでもよい。
【０１２７】
本開示の一態様は、以下に記載の重鎖ＣＤＲ配列の任意の１つ、２つおよび／または３つを含む重鎖を含む標的抗原に結合する抗体を提供する。
【０１２８】
また、上述の重鎖ＣＤＲ配列のいずれも、ＣＤＲのいずれかの端部に追加されたアミノ酸を含んでもよい。親和性成熟またはアミノ酸類似体を含有する変異体もしくは誘導体の調製を含む、本発明の抗体および抗原結合化合物の変異体および誘導体の調製が、本明細書においてさらに詳細に説明される。例示的な変異体は、アミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的もしくは非保存的置換、または異なるヒト抗体配列の対応するアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを含有するものを含む。
【０１２９】
上述の重鎖のいずれか１つを含む抗体は、さらに、軽鎖、好ましくは標的抗原に結合する軽鎖、最も好ましくは以下に記載の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖を含んでもよい。
【０１３０】
本開示の別の態様は、以下に記載の軽鎖ＣＤＲ配列の任意の１つ、２つおよび／または３つを含む軽鎖を含む標的抗原に結合する抗体を提供する。
【０１３１】
好ましくは、軽鎖は、軽鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。そのような「軽鎖ＣＤＲ３配列」（ＬＣＤＲ３）は、表１および配列番号１８、２４および３０内の軽鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。代替として、軽鎖ＣＤＲ３配列は、表１において特定される任意の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換、挿入または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む。好ましい置換は、表１の別の軽鎖ＣＤＲ３内の対応する位置でのアミノ酸への置換を含む。
【０１３２】
上述の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、さらに、「軽鎖ＣＤＲ１配列」を含んでもよく、これは、配列番号１６、２２および２８または表１における軽鎖ＣＤＲ１として特定されるアミノ酸配列、配列番号１６、２２および２８または表１において特定される任意の軽鎖ＣＤＲ１と比較して１つ以上のアミノ酸の変更、好ましくは表１の別の軽鎖ＣＤＲ１内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列のいずれかを含む。
【０１３３】
代替として、上述の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、さらに、「軽鎖ＣＤＲ２配列」を含んでもよく、これは、配列番号１７、２３および２９または表１における軽鎖ＣＤＲ２として特定されるアミノ酸配列、表１において特定される任意の軽鎖ＣＤＲ２と比較して１つ以上のアミノ酸の変更、好ましくは配列番号１７、２３および２９または表１の別の軽鎖ＣＤＲ２内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列のいずれかを含む。
【０１３４】
関連する態様において、本開示は、配列番号１３〜１５、１９〜２１および２５〜２７の少なくとも１つのＨＣＤＲ、または配列番号１６〜１８、２２〜２４および２８〜３０のＬＣＤＲを含む精製ポリペプチドを企図し、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含む。別の実施形態において、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、異なるヒト抗体配列とより相同となるようにアミノ酸置換により化学的に改変される。例えば、各重鎖フレームワーク領域（Ｈ−ＦＲ１−４）内において、重鎖可変領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの天然フレームワーク領域残基が、アミノ酸置換により改変されており、各軽鎖フレームワーク領域（Ｌ−ＦＲ１−４）内において、軽鎖可変領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの天然フレームワーク残基が、アミノ酸置換により改変されている。
【０１３５】
上述の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖はまた、（ａ）上述の軽鎖ＣＤＲ１配列および（ｂ）上述の軽鎖ＣＤＲ２配列の両方を含んでもよい。
【０１３６】
上述の軽鎖可変領域のいずれか１つを含む抗体は、さらに、随意に表１に記載のように対形成された重鎖可変領域、好ましくは標的抗原に結合する重鎖可変領域、最も好ましくは上述の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号２、６および１０からなる群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号４、８および１２からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【０１３８】
関連する態様において、核酸分子は、配列番号４、８および１２の１つの軽鎖アミノ酸配列またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号３、７および１１のいずれか１つまたはその一部の軽鎖ヌクレオチド配列を含む。本開示の核酸分子は、さらに、配列番号１、３、５、７、９および１１の配列を含む全ての核酸配列を含み、核酸配列は、本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域、または本明細書に記載の、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２および１３〜３０に記載のような任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲのアミノ酸配列をコードする、遺伝コードの多様性に基づく縮重コドンを含み、また本明細書に記載のもの等の極めてストリンジェントな条件下で、本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域、または本明細書に記載の、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２および１３〜３０に記載のような任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲのアミノ酸配列をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号４、８および１２に記載のＶＬアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする。本開示の核酸分子は、本明細書に記載のもの等の極めてストリンジェントな条件下で、配列番号４、８および１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号３、７および１１の軽鎖可変領域核酸配列を有する核酸配列にハイブリダイズする核酸を含む。
【０１４０】
さらに、本開示の核酸分子は、抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１のいずれか１つのＶＨアミノ酸配列またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、前記抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、前記一部は、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続部分である。一実施形態において、前記一部は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域の少なくとも１つ、２つまたは３つを、随意に異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークとともに、および随意に、総合した３つのＣＤＲにおいて１つ、または２つまで、または３つまでの突然変異とともに含む。
【０１４１】
関連する態様において、核酸分子は、配列番号２、６および１０の重鎖の１つの重鎖アミノ酸配列またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号１、５および９またはその一部の重鎖ヌクレオチド配列を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号２、６および１０に記載のＶＨアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＶＨアミノ酸配列をコードする。関連する態様において、ＶＨアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、さらに、本明細書に記載のもの等の極めてストリンジェントな条件下で、配列番号２、６および１０の重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１、５および９のいずれか１つの重鎖可変領域核酸配列を有する核酸配列にハイブリダイズする核酸を含む。
【０１４３】
さらに、本開示の核酸は、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１から選択される抗体の全長軽鎖または重鎖をコードしてもよく、全長軽鎖または全長重鎖は、それぞれ軽鎖定常領域または重鎖定常領域を含み、軽鎖定常領域は、随意に、非改変または改変カッパまたはラムダ領域を含み、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のクラスのいずれかの非改変または改変定常領域を含む。
【０１４４】
一態様において、全長軽鎖抗体は、配列番号４、８および１２に記載の配列を含む。さらに、全長軽鎖をコードするヌクレオチドは、配列番号４、８および１２をコードし、配列番号３、７および１１に記載のヌクレオチド配列を含むことが企図される。
【０１４５】
一態様において、全長重鎖抗体は、配列番号２、６および１０のいずれか１つの配列を含む。さらに、全長重鎖をコードするヌクレオチドは、配列番号２、６および１０の配列重鎖をコードし、配列番号１、５および９のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むことが企図される。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体であって、（ａ）軽鎖可変領域は、配列番号１６、２２および２８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７、２３および２９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１８、２４および３０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／あるいは（ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１３、１９および２５もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４、２０および２６もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１５、２１および２７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む抗体を提供する。
【０１４７】
関連する実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号１８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号１３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号１５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【０１４８】
別の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号１９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【０１４９】
さらに別の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２９もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号３０もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み；かつ／または重鎖可変領域は、配列番号２５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号２７もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【０１５０】
例示的実施形態において、本開示の抗体は、ヒトカッパ（κ）もしくはヒトラムダ（λ）軽鎖またはそれに由来するアミノ酸配列、あるいはヒト重鎖またはそれに由来する配列、あるいは重鎖および軽鎖の両方を一本鎖、二量体、四量体、または他の形態で一緒に含む。
【０１５１】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、一般に極めて特異的であり、典型的には同じまたは異なる決定基（エピトープ）に対して特異化された異なる複数の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、単一の抗原部位に対して特異化され得る。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、異なる特異性および特性を有する他の免疫グロブリンにより汚染されない均質培養により合成されるという点で有利である。
【０１５２】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７，１９７５）により初めて説明されたハイブリドーマ法により作製することができ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））、または、組み換えＤＮＡ法により作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することができる。モノクローナル抗体を生成するためのさらなる方法は、当業者に周知である。
【０１５３】
上記方法により生成されるもの等のモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａセファロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／または親和性クロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０１５４】
さらに、本開示の抗体は、当該技術分野において周知の、および本明細書に記載の、抗体のより小さい抗原結合断片として使用され得ることが企図される。
【０１５５】
抗体断片
抗体断片は、無傷の全長抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖ断片；二特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体等の多重特異性抗体断片（例えば、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体）；ミニボディ；キレート性組み換え抗体；トリボディまたはバイボディ；細胞内抗体；ナノボディ；小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；ならびに抗体断片から形成される他のポリペプチドを含む。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１２６−３６（２００５））を参照されたい。
【０１５６】
抗体のパパイン分解により、それぞれ単一の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価断片である、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに残りの「Ｆｃ」断片（この名前は容易に結晶化するその能力を反映している）を生成する。ペプシン処理により、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有するヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）２断片が得られ、それらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のために望ましい構造を形成して一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をもたらすことを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、ＶＬおよびＶＨ領域は、それらが単一タンパク質鎖として生成されるのを可能とする合成リンカーを介して対となって一価分子を形成する（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ｓｃＦｖの検討に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．ｌ  １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
【０１５７】
さらなる抗体断片は、ＶＨ  ドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）を含む。二特異性抗体は、二価抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現しているが、同じ鎖上での２つのドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用しており、それによりドメインを強制的に別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３、およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照されたい）。二特異性抗体は、二重特異性または単一特異性となり得る。
【０１５８】
軽鎖を有さない機能的重鎖抗体は、テンジクザメ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３，１９９５）、オオセ（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６，２００１）およびラクダ科（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８，１９９３；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３，１９９８）、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマにおいて自然に発生する。抗原結合部位は、これらの動物において、単一のドメインであるＶＨＨドメインに縮退している。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成し、すなわちこれらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）。ラクダ科ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインが欠如したＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と再結合することが報告されている（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する定常領域と再結合する従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであり、一方ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインが欠如し、軽鎖を含有しない重鎖のみのアイソタイプである。ラクダ科ＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を有する（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２）ことが判明している。従来のＶＨのみの断片は、可溶性形態で生成することが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様となるように改変されれば、可溶性および特異的結合の改善を得ることができる。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１：２５−３８を参照されたい。）ラクダ科重鎖を有する抗体を生成するための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５０１３６０４９号および同第２００５００３７４２１号に記載されている。
【０１５９】
抗体重鎖の可変ドメインは、わずか１５ｋＤａの分子量を有する最小の完全機能的抗原結合断片であり、この物質は、ナノボディと呼ばれる（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリは、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７−１２，２００１）に記載のように、またはＲｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１１１−２４（２００５）に記載のように組み換え法を用いて、免疫化ヒトコブラクダから生成することができる。
【０１６０】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディに関して、ｓｃＦｖ分子はＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の１つまたは両方に融合し、例えば、２つのｓｃＦｖｓがＦａｂのＣ末端に融合したトリボディを生成し、一方バイボディにおいては、１つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合している。
【０１６１】
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、またはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合したｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−２３，２００４に記載されている。
【０１６２】
細胞内抗体は、細胞内発現を示す一本鎖抗体であり、細胞内タンパク質機能を操作することができる（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含む細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら（ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されているように生成することができる。透過抗体は、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞透過性抗体である（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）。
【０１６３】
さらに、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が企図される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能の実行に必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号および米国特許出願公開第２００３０１１８５９２号を参照されたい。
【０１６４】
１つ以上のＣＤＲが、共有結合的または非共有結合的に分子に組み込まれ、それを免疫アドヘシンとすることができる。免疫アドヘシンは、ＣＤＲ（複数を含む）を、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むことができ、ＣＤＲ（複数を含む）を別のポリペプチド鎖に共有結合させることができ、またはＣＤＲ（複数を含む）を非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、免疫アドヘシンを、特定の対象抗原に特異的に結合させることができる。
【０１６５】
したがって、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つ、および／または３つのＣＤＲ（例えば、単独もしくはタンデムの単一ＣＤＲ、２つ、３つ、もしくはＣＤＲの他の複数の反復；または単独もしくはタンデム反復の２つもしくは３つのＣＤＲの組み合わせ；随意に、ＣＤＲまたは反復の間のスペーサーアミノ酸配列を有する）を含む様々な組成物を、当該技術分野において知られた技術により生成することができる。
【０１６６】
多重特異性抗体
いくつかの実施形態において、同じまたは異なる分子の少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（例えば二重特異性）抗標的抗体を生成することが望ましくなり得る。例示的な二重特異性抗体は、標的分子の２つの異なるエピトープに結合することができる。代替として、標的特異的抗体アームは、細胞防御メカニズムを標的に集中させるように、細胞表面分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わされてもよい。二重特異性抗体はまた、標的を発現させる、または取り込む細胞に細胞傷害性薬を局在化させるために使用することができる。これらの抗体は、標的結合アーム、および細胞傷害性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１６７】
二重特異性抗体を作製するための別の手法によれば、抗体分子の対の間の界面を、組み換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化するように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、大きな側鎖（複数を含む）と同一または同様のサイズの代償的な「空隙」が、第２の抗体分子の界面上に形成される。これは、ホモ二量体等の他の望ましくない最終生成物よりも、ヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。ＷＯ９６／２７０１１を参照されたい。
【０１６８】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方はアビジンに結合し、他方はビオチンに結合することができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１６９】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３，１９８５）は、無傷の抗体をタンパク質分解により切断してＦ（ａｂ'）２断片を生成する手順を説明している。これらの断片は、隣接ジチオールを安定化して分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。生成されたＦａｂ'断片は、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢ誘導体の１つが、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。さらなる実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収されたＦａｂ'−ＳＨ断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的に結合させ、二重特異性抗体を形成することができる。（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））
【０１７０】
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ'）２分子の生成を説明している。各Ｆａｂ'断片が、大腸菌から別個に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的化学的結合に供され、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合するとともに、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘引することができた。
【０１７１】
組み換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を作製および単離するための様々な技術もまた説明されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモ二量体がヒンジ領域において還元されてモノマーを形成し、次いで再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の生成にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８，１９９３）により説明される「二特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片の作製のための代替的メカニズムを提供した。
【０１７２】
その断片は、同じ鎖上での２つのドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、強制的に別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対形成され、それにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の使用による二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１７３】
代替として、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５）に記載のように産生される「直鎖状抗体」であってもよい。直鎖状抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ  −ＣＨ１−ＶＨ  −ＣＨ１）の対を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性となり得る。
【０１７４】
さらなる実施形態において、二重特異性抗体は、キレート性組み換え抗体（ＣＲＡｂ）であってもよい。キレート性組み換え抗体は、標的抗原の隣接および非重複エピトープを認識し、両方のエピトープに同時に結合するのに十分柔軟性である（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。
【０１７５】
３以上の結合価を有する抗体もまた企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０，１９９１）。
【０１７６】
キメラおよびヒト化抗体
キメラまたはヒト化抗体は、親非ヒト（例えばマウス）モノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いため、それらははるかに低いアナフィラキシーの危険性を伴って人間の治療に使用することができる。
【０１７７】
非ヒト（例えばマウス）モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合したキメラモノクローナル抗体は、当該技術において知られた標準的手順を使用して生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５（１９８４）；およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６，（１９８４）を参照されたい）。
【０１７８】
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフトすること（当該技術分野において「ＣＤＲグラフト」によるヒト化と呼ばれるプロセス）、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによりヒト様表面でそれらを「被覆する」こと（当該技術分野において、「張り合わせ」と呼ばれるプロセス）、または、代替として、（３）抗原結合もしくはタンパク質折り畳みに悪影響を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境内で免疫原性を低減し得ると断定される位置でヒトアミノ酸を置換すること（例えばＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標））を含む、様々な方法により実現することができる。本開示において、ヒト化抗体は、「ヒト化」、「張り合わされた」、および「ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（商標）」抗体のいずれをも含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７（１９９４）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４，１９９４；Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６（１９９４）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７７３−７８３（１９９１）に開示されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
ＣＤＲグラフトは、マウス重鎖および軽鎖可変Ｉｇドメインからの６つのＣＤＲの１つ以上を、ヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入することを含む。この技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８））は、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を、主に抗原と接触するＣＤＲループを支持するための骨格として使用する。しかしながら、ＣＤＲグラフトの欠点は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与し得るため、およびＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響し得るため、元のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体をもたらし得ることである。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、ＣＤＲグラフト技術は、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も酷似したヒトフレームワーク領域を選択することにより、および抗原結合部位のコンピュータモデリングによって補助されたフレームワークまたはＣＤＲ内の単一アミノ酸の部位特異的突然変異誘発により（例えば、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６（１９９４））改善され得る。
【０１８０】
形質転換動物からのヒト抗体
標的タンパク質へのヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作された形質転換動物を使用して生成することができる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有する形質転換動物を開示しており、動物は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化に起因して、機能的内因性免疫グロブリンを産生しない。また、ＷＯ９１／００９０６は、免疫原に対する免疫反応を組み込むことができる形質転換非霊長類哺乳動物宿主を開示しており、抗体は、霊長類定常および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座は、置換または不活性化される。ＷＯ９６／３０４９８および米国特許第６，０９１，００１号は、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を改変する、例えば定常または可変領域の全てまたは一部を置き換えて改変抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、形質転換マウスを作製する方法を開示しており、マウスは、内因性重鎖を欠如し、１つ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。米国特許第６，１１４，５９８号、米国特許第６，６５７，１０３号および米国特許第６，８３３，２６８号もまた参照されたい。
【０１８１】
上述の形質転換動物を使用して、選択された抗原分子に対して免疫反応を生成することができ、抗体産生細胞が、動物から取り出され、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するため使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバント等は当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載のような形質転換マウスの免疫化に使用される。この公開公報は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素を含む様々な抗原分子に対するモノクローナル抗体を開示している。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理学的効果を阻害または中和する能力に関して試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫化された形質転換マウスの免疫細胞に由来するＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、好中球のＩＬ−８誘導機能をブロックしたことを開示している。形質転換動物を免疫化するために使用される抗原に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体はまた、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；ならびに米国特許出願第２００３００３１６６７号に開示されている。
【０１８２】
モノクローナル抗体を作製するのに有用なさらなる形質転換動物は、米国特許第５，７７０，４２９号およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６））に記載のＭｅｄａｒｅｘ  ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）を含み、これは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードする非再配列ヒト抗体遺伝子からの遺伝子配列を含有する。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化により、標的タンパク質に対する完全ヒトモノクローナル抗体の生成が可能になる。
【０１８３】
また、Ｉｓｈｉｄａら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２（２００２））は、ヒトＤＮＡのメガ塩基対サイズのセグメントを含み、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座全体を組み込んだＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を説明している。ＴＣＭＯＵＳＥ（商標）は、ｈＩｇの完全に多様なレパートリーを有し、ＩｇＧの全てのサブクラス（ＩｇＧ１〜Ｇ４）を含む。様々なヒト抗原によるＴＣＭＯＵＳＥ（商標）の免疫化は、ヒト抗体を含む抗体反応を生成する。
【０１８４】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；および米国特許出願公開第２００２０１９９２１３号も参照されたい。米国特許出願公開第２００３００９２１２５号は、動物の免疫反応を所望のエピトープに偏らせるための方法を説明している。また、ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞により生成することができる（米国特許第５，５６７，６１０号および米国特許第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０１８５】
ディスプレイ技術からのヒト抗体
組み換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術、および線維状バクテリオファージの表面上でのコード抗体断片のディスプレイの開発は、ヒト抗体を直接作製するための手段を提供した。ファージ技術により生成された抗体は、細菌内の抗原結合断片−通常はＦｖまたはＦａｂ断片−として生成され、したがってエフェクター機能を喪失している。エフェクター機能は、２つの戦略の１つにより導入することができ、すなわち、断片は、例えば、哺乳動物細胞における発現のために完全抗体に操作することができるか、または、エフェクター機能を誘引し得る第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片に操作することができる。
【０１８６】
本開示は、標的特異的抗体またはその抗原結合部分を生成するための方法であって、ファージ上でヒト抗体のライブラリを合成するステップと、ライブラリを標的タンパク質またはその一部でスクリーニングするステップと、標的に結合するファージを単離するステップと、ファージから抗体を得るステップとを含む方法を企図する。例として、ファージディスプレイ技術における使用のための抗体のライブラリを調製するための１つの方法は、標的抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座またはその抗原部分を含む非ヒト動物を免疫化して、免疫反応を生成するステップと、免疫化動物から抗体産生細胞を抽出するステップと、抽出された細胞からＲＮＡを単離するステップと、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成するステップと、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップと、抗体がファージ上で発現されるようにｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入するステップとを含む。本開示の組み換え標的特異的抗体は、このようにして得ることができる。
【０１８７】
別の例において、抗体産生細胞は、非免疫化動物から抽出することができ、抽出された細胞からＲＮＡが単離され、逆転写されてｃＤＮＡを生成し、これがプライマーを使用して増幅され、抗体がファージ上で発現されるようにファージディスプレイベクターに挿入される。ファージディスプレイプロセスは、線維状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーのディスプレイにより免疫選択を模倣し、続いて選択される抗原への結合によりファージが選択される。１つのそのような技術は、ＷＯ９９／１０４９４に記載されており、これは、そのような手法を用いたＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性および機能的作動性抗体の単離を説明している。本開示の抗体は、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製された、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリ、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリのスクリーニングにより単離することができる。そのようなライブラリを調製およびスクリーニングするための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい。ファージディスプレイライブラリを生成するための市販のキットがある（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングにおいて使用され得る他の方法および試薬がある（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）  ３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２を参照されたい）。
【０１８８】
一実施形態において、所望の特性を有する標的抗原に特異的なヒト抗体を単離するために、ヒトＶＨおよびＶＬライブラリが、所望の特異性を有する抗体断片の選択のためにスクリーニングされる。この方法において使用される抗体ライブラリは、好ましくは、本明細書において、および当技術分野において説明されているように調製およびスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリである（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３））。ｓｃＦｖ抗体ライブラリは、好ましくは、抗原として標的タンパク質を使用してスクリーニングされる。
【０１８９】
代替として、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）がＰＣＲにより別個にクローニングされ、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいてランダムに再結合され、次いでこれが特定抗原への結合に選択され得る。Ｆａｂ断片は、ファージ表面上で発現し、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に結合する。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂコード配列を同時に選択し、これは後に増幅され得る。パニングと呼ばれる手順である数ラウンドの抗原結合および再増幅により、抗原に特異的なＦａｂが濃縮され、最終的に単離される。
【０１９０】
１９９４年に、「誘導選択」と呼ばれる抗体のヒト化のための手法が説明された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレイ技術の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照されたい）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片をヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示させることができ、得られるハイブリッドＦａｂライブラリは、次いで抗原に関して選択され得る。それにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するための鋳型を提供する。その後、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わされる。得られるライブラリの選択により、完全ヒトＦａｂが得られる。
【０１９１】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を得るための様々な手順が説明されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）を参照されたい）。具体的には、ファージディスプレイライブラリから得られる抗体のｉｎ  ｖｉｒｏ選択および進化は、強力なツールとなった（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願公開第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７；米国特許出願公開第２００３０１９０３１７号；ならびに米国特許第６，０５４，２８７号および同第５，８７７，２９３号を参照されたい）。
【０１９２】
Ｗａｔｋｉｎｓ，"Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３（２００２）、および米国特許出願公開第２００３００４４７７２号（２００３年３月６日公開）は、キャプチャーリフトによるファージ発現抗体ライブラリまたは他の結合分子のスクリーニングのための方法、固体支持体上への候補結合分子の固定化を含む方法を説明している。
【０１９３】
Ｆｖ断片は、（例えばＭ１３遺伝子ＩＩＩとの）ファージタンパク質融合として発現する１つの鎖の会合により、ファージの表面上にディスプレイされ、相補的な鎖は、可溶性断片として発現する。ファージは、クラスＩファージ：ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｌｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆの１つ、ならびにクラスＩＩファージＸｆ、Ｐｆ１およびＰｆ３の１つ等の、線維状ファージであってもよいことが企図される。ファージは、Ｍ１３またはｆｄまたはそれらの誘導体であってもよい。
【０１９４】
最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントが選択されたら、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択するために、最初に選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対が標的結合に関してスクリーニングされる「ミックスアンドマッチ」実験が行われる。さらに、抗体の品質をさらに改善するために、自然免疫反応中の抗体の親和性突然変異を担うｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異プロセスに類似したプロセスにおいて、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域のいずれかにおいて、好ましいＶＬ／ＶＨ対（複数を含む）のＶＬおよびＶＨセグメントをランダムに突然変異させることができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性突然変異は、それぞれＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを使用したＶＬおよびＶＨ領域の増幅により達成することができ、得られるＰＣＲ生成物が、ランダム突然変異が導入されているＶＬおよびＶＨセグメントをＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ３領域にコードするように、これらのプライマーには、ある特定の位置において４つのヌクレオチド塩基のランダムな混合物が「注入」されている。これらのランダムに変異したＶＬおよびＶＨセグメントは、標的抗原への結合に関して再びスクリーニングすることができる。
【０１９５】
組み換え免疫グロブリンディスプレイライブラリからの標的特異的抗体のスクリーニングおよび単離の後、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージから（例えばファージゲノムから）回収し、標準組み換えＤＮＡ技術により他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。所望により、核酸をさらに操作して、以下で説明されるような本開示の他の抗体形態を形成することができる。コンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより単離された組み換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするＤＮＡは、組み換え発現ベクターにクローニングされ、本明細書に記載のような哺乳動物宿主細胞に導入される。
【０１９６】
ファージディスプレイ法は、細菌または宿主細胞の突然変異誘発株において行われてもよいことが企図される。突然変異誘発株は、その中で複製されるＤＮＡを、その親ＤＮＡに対して突然変異させる遺伝子欠陥を有する宿主細胞である。例示的な突然変異誘発株は、ＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５およびＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｔ１である。
【０１９７】
また、ファージディスプレイ法は、ヘルパーファージを使用して行われてもよいことが企図される。これは、欠陥ファージゲノムを含有する細胞を感染させるように使用され、欠陥を補うように機能するファージである。欠陥ファージゲノムは、遺伝子配列をコードするいくつかの機能が取り除かれたファージミドまたはファージであってもよい。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩ  ｎｏ．３；およびカプシドタンパク質に融合した結合分子をディスプレイまたはコードするファージである。
【０１９８】
抗体はまた、ＷＯ９２／０１０４７において開示されるように、階層的な二重コンビナトリアル手法を使用したファージディスプレイスクリーニング法により生成され、ＨまたはＬ鎖クローンを含有する個々のコロニーが、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリを感染させるために使用され、得られる２本鎖特異的結合メンバーは、当該文献に記載されるもの等のファージディスプレイ技術に従い選択される。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））にも開示されている。
【０１９９】
酵母、微生物および哺乳動物細胞の表面上でのペプチドのディスプレイのための方法もまた、抗原特異的抗体を特定するために使用されている。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号；同第５，７２３，２８７号；同第６，６９９，６５８号；Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３９５−９９（２００１）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１）  ４５−５２（２００３）；Ｓｕｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４（２００６）を参照されたい。抗体ライブラリは、凝集素等の酵母タンパク質に結合し、免疫系におけるＢ細胞による抗体の細胞表面ディスプレイを効果的に模倣することができる。
【０２００】
ファージディスプレイ方法に加えて、抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ法、ならびにリボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイを含む微生物細胞ディスプレイを使用して単離され得る（Ａｍｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４００−０５（２００１））。リボソームディスプレイを使用したポリペプチドの選択が、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：４９３７−４９４２（１９９７））およびＫａｗａｓａｋｉに対して発行された米国特許第５，６４３，７６８号および同第５，６５８，７５４号に記載されている。リボソームディスプレイはまた、抗体の迅速な大量突然変異分析に有用である。選択的突然変異誘発手法はまた、リボソームディスプレイ技術を使用して選択され得る改善された活性を有する抗体を生成する方法を提供する。
【０２０１】
アミノ酸配列変異体
抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、および／または６つのＣＤＲを含む改変ポリペプチド組成物が生成され、ＣＤＲが標的分子に対する増加した特異性または親和性を提供するように改変されることが企図される。抗体ＣＤＲ内の部位は、典型的には、例えば、第１の部位を保存的な選択肢で置換し（例えば、疎水性アミノ酸が非同一疎水性アミノ酸に置換される）、次いでより異なる選択肢で置換する（例えば、疎水性アミノ酸が荷電アミノ酸に置換される）ことにより連続して改変され、次いで、標的部位において欠失または挿入が行われてもよい。例えば、ＣＤＲを包囲する保存フレームワーク配列を使用して、これらのコンセンサス配列に相補的なＰＣＲプライマーが生成され、プライマー領域間に位置する抗原特異的ＣＤＲ配列を増幅する。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をクローニングするための技術は、当該技術分野において十分確立されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい］。増幅されたＣＤＲ配列は、適切なプラスミドに連結される。１つ、２つ、３つ、４つ、５つおよび／または６つのクローニングされたＣＤＲを含むプラスミドは、随意に、ＣＤＲに結合した追加のポリペプチドコード領域を含有する。
【０２０２】
改変ＣＤＲを含む抗体物質は、元の抗原に対する結合親和性に関してスクリーニングされる。加えて、抗体またはポリペプチドは、標的抗原の活性を中和するその能力に関してさらに試験される。例えば、本開示の抗体は、標的抗原の生物活性に干渉する能力を決定するために、実施例に記載のように分析されてもよい。
【０２０３】
改変は、以下でより詳細に説明される保存的または非保存的アミノ酸置換により行うことができる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１個から２０個のアミノ酸、より好ましくは１個から１０個のアミノ酸の範囲内である。組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体ポリペプチド分子内のアミノ酸の置換を系統的に行うことにより、および得られた変異体を活性に関して分析することにより、変異を導入することができる。核酸の改変は、異なる種からの核酸（可変位置）または極めて保存された領域（定常領域）において異なる部位に行うことができる。抗体配列を改変し、本開示において有用な抗体ポリペプチド組成物を発現させるための方法は、以下でより詳細に説明される。
【０２０４】
アミノ酸配列挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグもしくはサルベージ受容体エピトープに融合した抗体（抗体断片を含む）を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、例えばＮ末端またはＣ末端における、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２０５】
「エピトープタグ化」という用語は、エピトープタグに融合した抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、抗体の活性に干渉しないように十分短い。エピトープタグは、好ましくは、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分一意的である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基、通常は約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約９〜３０個の残基）を有する。例は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−１６（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３：５４７−５３（１９９０））を含む。他の例示的なタグは、ニッケルキレート化を使用してそのように標識化された化合物の単離を可能とする、概して約６個のヒスチジン残基のポリ−ヒスチジン配列である。当該技術分野において周知であり習慣的に使用される他の標識およびタグ、例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）が、本開示に包含される。
【０２０６】
本明細書において使用する際、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の増加を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０２０７】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されている。超可変もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のいずれかにおける置換突然変異誘発が企図される。保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの別のメンバーで置き換えることを含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーで置き換えることを含む。
【０２０８】
保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）を含み；極性中性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）を含み；正電荷（塩基性）アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）を含み；負電荷（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）を含む。
【０２０９】
また、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、抗体の適切な配座の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般にセリンと置換されてもよい。逆に、安定性を改善するために、システイン結合（複数を含む）が抗体に追加されてもよい（特に抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。
【０２１０】
親和性成熟
親和性成熟は、一般に、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異体を調製およびスクリーニングすることと、親抗体と比較して１つ以上の改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体を選択することとを含む。そのような置換変異体を生成するのに都合の良い方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟である。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させて、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成する。このようにして生成された抗体変異体を、線維状ファージ粒子から、各粒子内に封入されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合として一価の状態で提示させる。次いで、ファージ上で提示された変異体を、生物活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８およびＷＯ９３／１９１７２を参照されたい。
【０２１１】
現在の抗体親和性成熟方法は、確率論的および非確率論的の２つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローンＰＣＲ、突然変異誘発細菌株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９−６８（１９９６）  Ｉｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２，１２７−１４３（１９９６））、および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０（２０００）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，２６９−８５（２００２））は、確率論的な突然変異誘発法の典型的な例である（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：８４６６−７１（２００５））。非確率論的な技術は、しばしばアラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発を使用して、特定の変異体の限定された集合を生成する。いくつかの方法を以下でより詳細に説明する。
【０２１２】
パニング法による親和性成熟−組み換え抗体の親和性成熟は、一般的に、漸減量の抗原の存在下での候補抗体の数ラウンドのパニングによって行われる。ラウンド毎に抗原の量を減らすことにより、その抗原に対して最も高い親和性を有する抗体が選択され、それによって膨大な出発材料のプールから高親和性の抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈｕｌｓら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１（２００１））に記載されている。ファージディスプレイ技術を使用した親和性成熟の方法は、本明細書の別の箇所に記載されており、当該技術分野において知られている（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７：２０２９−３４（２０００）を参照されたい）。
【０２１３】
ルックスルー突然変異誘発−ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：８４６６−７１（２００５））は、抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭでは、２０個の天然アミノ酸によって提供される主要な側鎖化学を代表する９個のアミノ酸を選択して、抗体の６つ全てのＣＤＲ中のあらゆる位置における結合への官能性側鎖の寄与を分析する。ＬＴＭは、ＣＤＲ内に一連の位置的な単一突然変異を生成し、それぞれの「野生型」残基が、９個の選択されたアミノ酸のうちの１つで系統的に置換される。突然変異ＣＤＲを組み合わせて、全ての変異体の定量的ディスプレイを妨げることなく複雑性およびサイズが増加する、コンビナトリアル一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリを生成する。正の選択後、結合が改善されたクローンを配列決定し、有益な突然変異をマッピングする。
【０２１４】
エラープローンＰＣＲ−エラープローンＰＣＲは、異なる選択ラウンド間の核酸の無作為化を含む。無作為化は、使用するポリメラーゼの固有エラー率によって低い率で生じるが、転写中の高い固有エラー率を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６（１９９２））を用いたエラープローンＰＣＲによって増進することができる（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３（１９９９））。突然変異サイクル後、当該技術分野における習慣的方法を使用して、抗原に対する親和性が改善されたクローンを選択する。
【０２１５】
ＤＮＡシャフリング−核酸シャフリングは、より短いまたは小さいポリヌクレオチドのプールを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで相同組み換えして、変異体ポリヌクレオチドを生成するための方法である。ＤＮＡシャフリングは、米国特許第６，６０５，４４９号、米国特許第６，４８９，１４５号、ＷＯ０２／０９２７８０およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−５１（１９９４）に記載されている。一般に、ＤＮＡシャフリングは、３つのステップ、すなわちＤＮａｓｅ  Ｉによるシャッフルすべき遺伝子の断片化、断片のランダムハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＣＲ（セクシャルＰＣＲ）による断片化された遺伝子の再組み立てまたはフィリング、ならびに、再組み立てされた産物の従来のＰＣＲによる増幅からなる。
【０２１６】
ＤＮＡシャフリングは、逆の連鎖反応であるという点でエラープローンＰＣＲとは異なる。エラープローンＰＣＲでは、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数が、指数関数的に増加する。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再組み立てまたはシャフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではない）は、時間とともに減少する。
【０２１７】
抗体の場合、ＤＮＡシャフリングは、例えば、全てのＣＤＲ１と全てのＣＤＲ２と全てのＣＤＲ３との自由な組み合わせ関係を可能にする。複数の配列ファミリーを、同じ反応でシャッフルできることが想定される。さらに、シャフリングは、例えば、ＣＤＲ２の位置にＣＤＲ１が見られなくなるように、一般に相対的順序を保存する。シャフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、まれに多数の最良の（例えば、最高の親和性の）ＣＤＲを含み、これらの希少なシャフラントをその優れた親和性に基づいて選択することができる。
【０２１８】
ＤＮＡシャフリングで使用でき得る鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。それは、組み換えまたは再組み立てを行う遺伝子またはより短いもしくは小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて、様々な長さであってもよい。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。鋳型ポリヌクレオチドは、多くの場合二本鎖であるべきである。
【０２１９】
遺伝子選択の最初のステップにおいて、鋳型ポリヌクレオチドと同一の領域および鋳型ポリヌクレオチドと異種の領域を有する一本鎖または二本鎖の核酸ポリヌクレオチドを、鋳型ポリヌクレオチドに付加してもよいことが想定される。また、２つの異なるが関連するポリヌクレオチド鋳型を最初のステップにおいて混合してよいことも想定される。
【０２２０】
アラニンスキャニング−アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定するために行うことができる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。残基または標的残基の群が特定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ等の荷電残基）、中性または負電荷アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、アミノ酸の抗原との相互作用に影響する。次いで、置換への機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位で、または置換部位に対してさらなるまたは他の変異体を導入することにより精密化される。
【０２２１】
コンピュータ補助設計−代替として、または追加的に、抗体と抗原との間の接触点を特定するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析すること、またはコンピュータソフトウェアを使用してそのような接触点をモデル化することが有益となり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書において詳説される技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルが本明細書に記載のようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連したアッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発に選択され得る。
【０２２２】
代替として、または追加的に、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、特許出願公開ＷＯ２００９／０８８９３３；ＷＯ２００９／０８８９２８；ＷＯ２００９／０８８９２４；ならびにＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３，１９９２；Ｖｉｒｎｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５６００−５６０７，１９９４；Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３，１９９２；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３１０−３３１９，１９９５；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３，１９９６；およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３，１９９５に記載の技術を含む、当該技術分野において知られた様々な他の親和性成熟技術が使用されてもよい。
【０２２３】
改変されたグリコシル化
親抗体と比較して変更されたグリコシル化パターン、例えば、抗体中に見られる１つまたは複数の炭水化物部分の欠失、および／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を有する抗体変異体もまた生成され得る。
【０２２４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、抗体に付加することができる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つと、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用可能である）との結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化部位は、元の抗体の配列に、１つまたは複数のセリンもしくはトレオニン残基を挿入または置換することによって、抗体に付加することができる。
【０２２５】
Ｆｃグリカンは、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑに対するＩｇＧの結合に影響し、したがってＩｇＧエフェクター機能に重要である。改変Ｆｃグリカンおよび改変されたエフェクター機能を有する抗体変異体が生成され得る。例えば、シアル酸、コアフコース、分岐Ｎ−アセチルグルコサミン、およびマンノース残基等の改変末端糖を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体への改変された結合および改変されたＡＤＣＣ活性を有し得る。さらなる例において、改変末端ガラクトース残基を有する抗体は、Ｃ１ｑへの改変された結合および改変されたＣＤＣ活性を有し得る（Ｒａｊｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７１−７８（２００８））。
【０２２６】
また、改善されたＡＤＣＣ活性を示す、フコシル化が不在または減少した抗体分子も想定される。これを達成するための様々な方法が、当分野で既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体との結合によって媒介され、これはＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、向上した親和性でこの受容体に結合し、天然のフコシル化抗体よりも効果的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を誘発する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠損させたＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組み換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍に増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２（２００４））。同様の効果は、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理によってこの酵素またはフコシル化経路の他の酵素の活性を減少させることによって、細胞系を操作して酵素を欠損させることによって、または選択的グリコシル化阻害剤とともに培養することによっても達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−２３（１９８９））。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３またはハイブリドーマＹＢ２／０細胞系は、より低いフコシル化レベルの抗体を自然に生成する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０（２００２）、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３（２００３））。ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で組み換えによって抗体を産生することによる分岐炭水化物のレベルの上昇も、ＡＤＣＣ活性を増加させることが確認されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−８０（１９９９））。２つのフコース残基のうちの１つのみの不在が、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ると予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：８５１−６１（２００６））。
【０２２７】
改変されたエフェクター機能を有する変異体
抗体の他の改変が企図される。一態様において、エフェクター機能に関して本開示の抗体を改変すること、例えば、癌の治療における抗体の有効性を向上させることが望ましくなり得る。エフェクター機能を改変するための１つの方法は、システイン残基（複数を含む）がＦｃ領域に導入されてもよく、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能とすることを教示している。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、ならびに／または増加した補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２））およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２））を参照されたい。また、向上した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３））に記載のようなヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製され得る。代替として、二重Ｆｃ領域を有する抗体が設計されてもよく、またそれにより向上した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９））を参照されたい。さらに、ＣＤＲ内の配列が、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞反応を誘引させ得ることが示されている。保存的置換は、抗体に、結合活性を保持するが、その望ましくないＴ細胞反応を誘引する能力を失わせることを可能にする。また、マウス可変領域がヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、およびガンマ４定常領域と連結したキメラ抗体を説明した、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８５：４８５２−５６（１９９８））を参照されたい。
【０２２８】
本開示のある特定の実施形態において、例えば腫瘍浸潤を増加させるために、無傷の抗体ではなく抗体断片を使用することが望ましくなり得る。この場合、例えばその血清半減期を増加させるために抗体断片を改変し、ＰＥＧまたは多糖類ポリマーを含む他の水溶性ポリマー等の分子を抗体断片に追加して半減期を増加させることが望ましくなり得る。これはまた、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの抗体断片への組み込みにより（例えば、抗体断片中の適切な領域の突然変異により、またはエピトープをペプチドタグに組み込み、次いでこれを、例えばＤＮＡもしくはペプチド合成によって抗体断片にいずれかの端部もしくは中間において融合させることにより）達成され得る（例えばＷＯ９６／３２４７８を参照されたい）。
【０２２９】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからのいずれか１つ以上のアミノ酸残基が抗体断片の類似部分に移入された領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの３つ以上の残基が移入される。さらにより好ましくは、エピトープが（例えばＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、または２つ以上のそのような領域に移入される。代替として、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、またはその両方に移入される。Ｆｃ変異体およびそのサルベージ受容体との相互作用を説明している、国際出願第ＷＯ９７／３４６３１号および国際出願第ＷＯ９６／３２４７８号もまた参照されたい。
【０２３０】
したがって、本開示の抗体は、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するそれらの変異体を含んでもよく、変異体は、ジスルフィド結合に関与するシステインが改変もしくは除去された、ならびに／または、ｍｅｔがＮ末端に付加された、および／もしくはＮ末端２０アミノ酸の１つ以上が除去された、ならびに／または補体と相互作用する領域、例えばＣ１ｑ結合部位が除去された、ならびに／または、ＡＤＣＣ部位が除去された変異体を含む［例えば、Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−９（１９９２）を参照されたい］。
【０２３１】
これまでの研究では、ＦｃＲのヒトおよびマウスＩｇＧ上の結合部位を、主に、ＩｇＧ残基２３３〜２３９からなるより低いヒンジ領域にマッピングしていた。他の研究は、追加的な広範なセグメント、例えばヒトＦｃ受容体ＩのＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩのＬｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６を提案し、または、より低いヒンジの外のいくつかの特異的残基、例えば、マウスＦｃ受容体ＩＩと相互作用するマウスＩｇＧ２ｂのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８を発見した。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片の３．２Å結晶構造の報告は、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２を、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合に関与するものとして説明した。結晶構造に基づき、より低いヒンジ（Ｌｅｕ２３４〜Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６〜３３０）およびＢＣ（残基２６５〜２７１）における残基が、Ｆｃ受容体ＩＩＡへの結合において役割を果たす可能性があることが示唆されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：６５９１−６０４（２００１））を参照されたい。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の突然変異は、改変されたエフェクター機能、例えば改変されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性、または改変された半減期をもたらし得る。上述のように、可能性のある突然変異は、１つ以上の残基の挿入、欠失または置換を含み、これは、アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるＩｇＧサブクラスからのものと同じ位置での対応するアミノ酸残基による置き換え（例えば、ＩｇＧ１残基の、その位置における対応するＩｇＧ２残基での置き換え）を含む。
【０２３２】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全てのヒトＦｃ受容体への結合に関与するＩｇＧ１残基が、ヒンジに近位のＣＨ２ドメインに位置し、以下のような２つのカテゴリーに含まれることを報告した：１）全てのＦｃＲと直接相互作用し得る位置は、Ｌｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（およびおそらくはＡｓｐ２６５）を含み；２）炭水化物の性質または位置に影響する位置は、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７を含む。Ｆｃ受容体ＩＩへの結合に影響したさらなるＩｇＧ１残基は、以下の通りである：（最も大きい効果）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、ならびに（より小さい効果）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは、結合を低減した。全てのＦｃＲに対する上で特定された残基に加え、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合を４０％以上低減したさらなるＩｇＧ１残基は、以下の通りである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８、およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合を改善した変異体は、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔを含む。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに対する結合の４０％の低減を示し、Ａｒｇ４１６は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対する３０％の低減を示し、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡに対する３０％の低減およびＦｃＲＩＩＢに対する４０％の低減を示し、Ｌｙｓ３６０は、ＦｃＲＩＩＩＡに対する２３％の改善を示した。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０，２００１）もまた参照されたいが、これは、特異的Ｆｃガンマ受容体（Ｒ）のみに対する結合を改善し、同時に１種類のＦｃガンマＲへの結合を改善し、別の種類への結合を低減したＩｇＧ１のＦｃ領域におけるいくつかの位置が発見されたことを記載している。次いで、ＦｃガンマＲＩＩＩａへの結合が改善された選択されたＩｇＧ１変異体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて試験され、末梢血単核細胞または天然キラー細胞が使用された場合にＡＤＣＣの向上を示した。
【０２３３】
例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９４，５５１号は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Ｋａｂａｔ付番を使用）において突然変異を含有する改変されたエフェクター機能を有する変異体を説明しており、そのいくつかは、低減したＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性を示す。別の例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，０５６号は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９（Ｋａｂａｔ付番を使用）において突然変異を含有する改変されたエフェクターまたはＦｃ−ガンマ−受容体結合を有する変異体を説明しており、そのいくつかは、低減したＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性に関連した受容体結合プロファイルを示す。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９における突然変異は、ＦｃＲＩへの結合を低減することが述べられ、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９における突然変異は、ＦｃＲＩＩへの結合を低減することが述べられ、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７における突然変異は、ＦｃＲＩＩＩへの結合を低減することが述べられている。
【０２３４】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２４，８２１号は、マウス抗体のＣｌｑ結合活性が、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を突然変異させることにより改変され得ること、および残基２９７（Ａｓｎ）の置き換えが溶解活性の除去をもたらすことを報告している。
【０２３５】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１３２１０１号は、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ付番を使用）または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ付番を使用）において突然変異を有する変異体を説明しており、そのうち位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２における突然変異は、ＡＤＣＣ活性を低減し得る、またはＦｃガンマ受容体への結合を低減し得る。
【０２３６】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈａｐｐｅｌら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８８：９０３６−４０（１９９１））は、ＩｇＧ１の細胞親和活性が、その重鎖ＣＨ２ドメインの固有特性であることを報告している。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４〜２３７のいずれかにおける単一点突然変異は、その活性を大幅に低下または無効化した。完全な結合活性を修復するためには、ＩｇＧ１残基２３４〜２３７（ＬＬＧＧ）の全てをＩｇＧ２およびＩｇＧ４に置換することが必要であった。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３〜２３８）を含有するＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１よりも活性であることが観察された。
【０２３７】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＩｓａａｃｓら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３８６２−９（１９９８））は、ＦｃガンマＲ結合に重要なモチーフ内の突然変異（グルタメート２３３からプロリン、ロイシン／フェニルアラニン２３４からバリン、およびロイシン２３５からアラニン）が、標的細胞の枯渇を完全に防止したことを報告している。グルタメート３１８からアラニンの突然変異は、マウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能を排除し、またヒトＩｇＧ４の有効性を低減した。
【０２３８】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｒｍｏｕｒら（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：５８５−９３（２００３））は、野生型ＩｇＧ１より少なくとも１０分の１低い効率で活性化受容体ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａと反応するが、阻害受容体ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂへの結合はわずか４分の１低減されるＩｇＧ１変異体を特定した。突然変異は、アミノ酸２３３〜２３６の領域ならびに／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１に形成された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９９／５８５７２もまた参照されたい。
【０２３９】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＸｕら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：３４６９−７４（１９９４））は、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１からＳｅｒへの突然変異が、Ｃ１ｑ結合を著しく減少させ、溶解活性を事実上排除したことを報告している。対照的に、ＩｇＧ４におけるＰｒｏからＳｅｒ３３１への置換は、ＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１変異体に部分的な溶解活性（４０％）を与えた。
【０２４０】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｃｈｕｕｒｍａｎら（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１−８（２００１））は、重鎖間結合形成に関与するヒンジシステインの１つであるＣｙｓ２２６からセリンへの突然変異が、より安定な重鎖間結合をもたらしたことを報告している。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓからＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの突然変異もまた、重鎖間の共有結合的相互作用を著しく安定化する。
【０２４１】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｎｇａｌら（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−８（１９９３））は、ＩｇＧ４におけるアミノ酸位置２４１からプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２におけるその位置に見られる）への突然変異が、均質な抗体の産生をもたらすとともに、元のキメラＩｇＧ４と比較して血清半減期を延長し、組織分布を改善したことを報告している。
【０２４２】
共有結合改変
抗体の共有結合改変もまた、本開示の範囲内に含まれる。それらは、妥当な場合は、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。抗体の他の種類の共有結合改変は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択される側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子内に導入される。
【０２４３】
最も一般的には、システイニル残基を、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルカプトベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０２４４】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化されるが、これは、この薬剤が比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行われる。
【０２４５】
リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬は、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応物を含む。
【０２４６】
アルギニル残基は、１種または複数の従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により改変される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、反応がアルカリ条件下で行われることが必要である。さらに、これらの試薬は、リシンの基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０２４７】
チロシル残基の特異的改変が行われてもよく、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、チロシル残基に分光標識を導入することが興味深い。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ化され、放射免疫測定法における使用のための標識化タンパク質が調製される。
【０２４８】
カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ'）（式中、ＲおよびＲ'は、異なるアルキル基である）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）が選択的に改変される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０２４９】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にたびたび脱アミド化される。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本開示の範囲に含まれる。
【０２５０】
他の改変は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２５１】
別の種類の共有結合改変は、グリコシドを抗体に化学的または酵素的に結合させることを含む。これらの手順は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に依存して、糖（複数を含む）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１））に記載されている。
【０２５２】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に暴露することを必要とする。この処理は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いて、ほとんどまたは全ての糖の切断をもたらしながら、抗体を無傷に保つ。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７））およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１））により説明されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７））により説明されているように、様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０２５３】
抗体の別の種類の共有結合改変は、抗体を様々な非タンパク質ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはポリサッカリドポリマー、例えばデキストランに結合させることを含む。そのような方法は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６号またはＥＰ３１５４５６を参照されたい。
【０２５４】
誘導体
上述のように、誘導体は、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等のポリマー共有結合、およびオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換等の技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。二重特異性抗体等の本発明の抗体物質の誘導体はまた、治療薬剤としても有用であり、本明細書における方法により生成され得る。
【０２５５】
コンジュゲート部分は、例えば放射性ヌクレオチド、もしくはストレプトアビジンにより認識されるビオチニル化ヌクレオチドの組み込み等、共有結合により、またはイオン結合、分子間力もしくは水素結合により抗体物質に組み込む、または結合させることができる。
【０２５６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、抗体物質に結合して、ｉｎ  ｖｉｖｏでより長い半減期を提供し得る。ＰＥＧ基は、都合の良い任意の分子量のものであってもよく、また直鎖または分岐鎖であってもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａから約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の天然または操作された反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を介した抗体物質上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアクリル化または還元アルキル化により、本開示の抗体物質に結合する。抗体物質へのＰＥＧ部分の付加は、当該技術分野において周知の技術を使用して行うことができる。例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／１１９５３号および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【０２５７】
抗体物質のＰＥＧとの連結は、通常、水相において生じ、逆相分析ＨＰＬＣにより容易に監視することができる。ＰＥＧ化物質は、分取ＨＰＬＣにより精製され、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザ脱離質量分析により特性決定される。
【０２５８】
抗体コンジュゲート
抗体は、「裸の」または非コンジュゲート化形態で投与され得るか、または、他の治療薬または診断薬に直接コンジュゲートされ得るか、または、そのような他の治療薬または診断薬を含む担体ポリマーに間接的にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、抗体は、細胞傷害性薬、例えば化学療法薬、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源、またはその断片の酵素活性毒素）あるいは放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされる。好適な化学療法薬は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）、上記参照）を含む。好適な毒素は、細菌毒素、例えばジフテリア毒素；植物毒素、例えばリシン；小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−８１（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３．７８６−９１（２００２））、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−２３（１９９６））、アウリスタチン（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−８４（２００３）およびカリケアミシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８（１９９８）；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））を含む。
【０２５９】
抗体は、放射性同位体、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光または発光もしくは生体発光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等の使用により検出可能に標識化され得る。そのような標識化を達成するための手順は、当該技術分野において周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照されたい。
【０２６０】
抗体部分のコンジュケート化は、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。また、一般的な技術が、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。この一般的方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または他の治療薬剤が投入された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、初期シッフ塩基（イミン）結合をもたらし、これは、２級アミンに還元して最終コンジュゲートを形成することにより安定化することができる。
【０２６１】
担体ポリマーは、例えば、少なくとも５０アミノ酸残基のアミノデキストランまたはポリペプチドであってもよい。薬物または他の薬剤を担体ポリマーにコンジュゲートするための様々な技術が、当該技術分野において知られている。アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用することができるが、ポリペプチド担体は、少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００アミノ酸残基を鎖内に有するべきである。アミノ酸の少なくともいくつかは、リシン残基またはグルタメートもしくはアスパルテート残基であるべきである。リシン残基のペンダントアミンならびにグルタミンおよびアスパルテートのペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫刺激剤、キレート剤、ホウ素付加物または他の治療薬剤を結合させるために好都合である。好適なポリペプチド担体の例は、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、およびこれらのアミノ酸と、得られる投入担体およびコンジュゲートに対し所望の溶解特性を付与するための他のもの、例えばセリンとの混合ポリマーを含む。抗体がコンジュゲートされ得る薬剤の例は、本明細書に記載の細胞傷害性または化学療法薬のいずれかを含む。
【０２６２】
代替として、コンジュゲート抗体は、抗体成分を治療薬剤と直接コンジュゲートさせることにより調製され得る。一般的手順は、コンジュゲート化の間接的方法と類似しているが、但し、治療薬剤が酸化抗体成分に直接結合する。例えば、抗体の炭水化物部分をポリエチレングリコールに結合させて、半減期を延長することができる。
【０２６３】
代替として、治療薬剤は、ジスルフィド結合形成により、またはヘテロ二官能性架橋剤、例えばＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合し得る。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲート化のための一般的技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，"ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタレルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の様々な二官能性タンパク質結合剤が当該技術分野において知られている。
【０２６４】
抗体融合タンパク質
抗体融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照されたい。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）、およびＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）により説明されている。さらに、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：１２９（１９９５））は、Ｆ（ａｂ'）２断片および腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質を説明している。抗体融合タンパク質のさらなる例は、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−６５（２００６）により説明されている。
【０２６５】
組み換え分子が１つ以上の抗体成分および毒素または化学療法薬を含む抗体−毒素融合タンパク質を作製する方法もまた、当業者に知られている。例えば、抗体−シュードモナス外毒素Ａ融合タンパク質が、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２）、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、およびＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）により説明されている。ジフテリア毒素部分を含有する抗体−毒素融合タンパク質が、Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、およびＶａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）により説明されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）は、ＲＮａｓｅ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質を説明しており、一方Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４）は、ＤＮａｓｅ  Ｉ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質を生成した。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ．，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ  １，ＢＩＯＴ００５の抗体−毒素融合タンパク質における毒素部分として、ゲロニンが使用された。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４）は、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａを含む抗体−毒素融合タンパク質を報告した。
【０２６６】
そのような融合タンパク質の調製に好適に使用される例示的な毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素である。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）を参照されたい。他の好適な毒素は、当業者に知られている。
【０２６７】
本開示の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートすることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０２６８】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫抱合体の酵素成分は、プロドラッグをより活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用することができる任意の酵素を含む。
【０２６９】
本開示において有用な酵素は、限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアルカリホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアリールサルフェート；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤、５−フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用な炭水化物切断酵素、例えばα−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用なβ−ラクタマーゼ；ならびに、アミン窒素において、それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼを含む。代替として、当該技術分野において抗体酵素としても知られる酵素活性を有する抗体を使用して、本開示のプロドラッグを、遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照されたい）。抗体酵素の腫瘍細胞集団への送達のために、抗体−抗体酵素コンジュゲートを本明細書に記載のように調製することができる。
【０２７０】
上記酵素は、上述のヘテロ二官能性架橋剤の使用等の当技術分野において周知の技術により、抗体に共有結合され得る。代替として、本開示の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質が、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照されたい）。
【０２７１】
抗体の組み換え産生
本開示の抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）単離および配列決定され得る。通常、これには、抗体をコードするＤＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡ（すなわちｃＤＮＡ）のクローニングが必要である。クローニングおよび配列決定は、標準的技術、例えばポリメラーゼ  連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）を参照されたい）等を使用して行われる。
【０２７２】
ヌクレオチドプローブ反応および他のヌクレオチドハイブリダイゼーション反応は、特定条件下で互いにハイブリダイズするポリヌクレオチドの特定を可能にする条件で行われる。１つの例示的な一連の条件は、以下の通りである：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８中、４２℃でのストリンジェントなハイブリダイゼーション；および１×ＳＳＣ中、５５℃で３０分間の洗浄。等価のハイブリダイゼーション条件の計算および／または所望のレベルのストリンジェンシーを達成するための他の条件の選択のための式は、周知である。当該技術分野において、等価のストリンジェンシーの条件は、温度および緩衝剤、または、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４），ｐｐ．６．０．３  ｔｏ  ６．４．１０に記載のような塩濃度の変動により達成することができることが理解されている。ハイブリダイゼーション条件における変更は、実験的に決定するか、または、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さおよびパーセンテージに基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９），ｐｐ．９．４７  ｔｏ  ９．５１に記載のように計算することができる。
【０２７３】
本明細書において使用する際、「単離」核酸分子または「単離」核酸配列は、（１）核酸の天然源において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から特定および分離された、または（２）対象核酸の配列が決定され得るようにバックグラウンドの核酸からクローニングされた、増幅された、タグ化された、もしくは別様に区別された核酸分子であり、単離されたとみなされる。単離核酸分子は、天然に見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離核酸分子は、天然細胞において存在するような核酸分子から区別される。しかしながら、単離核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある、通常抗体を発現する細胞に含有される核酸分子を含む。
【０２７４】
クローニングおよび配列決定に使用されるＲＮＡの１つの供給源は、形質転換マウスからＢ細胞を得、Ｂ細胞を不死化細胞に融合することにより生成されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらを容易にスクリーニングし、対象ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを容易に選択することができることである。代替として、ＲＮＡは、免疫化動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離され得る。ハイブリドーマ以外の供給源が使用される場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列に関してスクリーニングすることが望ましくなり得る。そのようなスクリーニングのための１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、本明細書においてさらに説明されており、また当技術分野において周知である。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＤｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−５４（１９９０））を参照されたい。ファージディスプレイ技術を使用した一実施形態において、免疫化形質転換マウスからのｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）が単離され、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えばＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列が増幅され、増幅された配列がファージベクターに挿入される。所望の結合特性を有する対象ペプチド、例えば可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡは、パニング等の標準的技術により特定される。
【０２７５】
典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が決定されるが、時折、可変領域の一部のみ、例えばＣＤＲコード部分のみを配列決定することで十分となる。典型的には、配列決定される部分は、少なくとも３０塩基の長さであり、より頻繁には、可変領域の長さの少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１の塩基コーディングが配列決定される。
【０２７６】
配列決定は、標準的技術を使用して行われる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７を参照されたい）。クローニングされた核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開されている配列と比較することにより、当業者は、配列決定される領域に依存して、（ｉ）免疫グロブリンポリペプチドの生殖系列セグメントの使用（重鎖のアイソタイプ含む）、ならびに（ｉｉ）Ｎ−領域付加および体細胞突然変異から生じる配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列を、容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄである。
【０２７７】
単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に入れることができ、次いで大腸菌、シミアンＣＯＳ細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞（例えば２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の、別様には免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体の組み換え産生は、当該技術分野において周知である。
【０２７８】
発現制御配列は、特定の宿主生物における作用可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、随意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０２７９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、作用可能に結合する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合し、プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作用可能に結合し、または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作用可能に結合する。一般に、作用可能に結合するとは、結合しているＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。結合は、好都合な制限酵素認識部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣習に従い使用される。
【０２８０】
細胞、細胞系、および細胞培養物は、しばしば交換可能に使用され、全てのそのような称号は、本明細書において後代を含む。形質転換体および形質転換細胞は、形質転換の数を問わず、初代対象細胞およびそこから得られた培養物を含む。また、全ての後代は、意図的な、または意図的でない突然変異により、ＤＮＡ含量において正確に同一でなくてもよいことが理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされるような同じ機能または生物活性を有する突然変異後代が含まれる。異なる称号が意図される場合、文脈から明らかとなる。
【０２８１】
代替の実施形態において、対象免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接的タンパク質配列決定により決定されてもよい。好適なコードヌクレオチド配列は、汎用コドン表に従い設計することができる。
【０２８２】
アミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更をコードＤＮＡに導入することにより、またはペプチド合成により調製され得る。そのような変異体は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または該残基への挿入、および／または該残基の置換を含む。最終構築物が所望の特性を有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達する。また、アミノ酸の変更は、分子の翻訳後プロセス、例えばグリコシル化部位の数または位置の変更を改変し得る。
【０２８３】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られた様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されないが、天然源からの単離（自然発生的アミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗体の以前に調製された変異体または非変異体形態のカセット突然変異誘発を含む。
【０２８４】
本開示はまた、宿主細胞により認識される制御配列に随意に作用可能に結合した、本開示の抗体をコードする単離核酸、核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに、核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程と、随意に、宿主細胞培養物または培養培地から抗体を回収する工程とを含み得る、抗体産生のための組み換え技術を提供する。抗体産生のための様々なシステムおよび方法が、Ｂｉｒｃｈ  ＆  Ｒａｃｈｅｒ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６７１−６８５（２００６））により考察されている。
【０２８５】
抗体の組み換え産生において、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターに挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般に、限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択的マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写停止配列の１つ以上を含む。
【０２８６】
（１）シグナル配列成分
本開示の抗体は、直接的だけでなく、好ましくはシグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端における特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組み換えにより産生され得る。好ましく選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識および処理（すなわち、シグナルペプチドにより切断）されるものである。原核宿主細胞が天然抗体シグナル配列を認識および処理しない場合、シグナル配列は、例えば、ペクチン酸リアーゼ（例えばｐｅｌＢ）、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択されるシグナル配列により置換され得る。酵母分泌においては、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセスおよびクリベロマイセスα因子リーダーを含む）、もしくは酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２８７】
そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、抗体をコードするＤＮＡに連結される。
【０２８８】
（２）複製起点成分
発現およびクローニングベクターは両方とも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスにおいて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は、酵母に好適であり、様々なウイルス起点は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（早期プロモーターを含有することだけを理由に、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得る）。
【０２８９】
（３）選択的マーカー成分
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択的遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ジェネティシン、ヒスチジノール、もしくはミコフェノール酸に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えばバチルス属に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０２９０】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子により成功裏に形質転換されたそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き残る。そのような優勢選択の例は、薬物メトトレキセート、ネオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
【０２９１】
哺乳動物細胞に対する好適な選択可能マーカーの別の例は、抗体コード核酸を取り込む能力を有する細胞の特定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
【０２９２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞は、まず、形質転換体の全てを、ＤＨＦＲの競合拮抗薬であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で培養することにより特定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠乏したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【０２９３】
代替として、本開示の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、および別の選択可能マーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）が、アミノグリコシド系抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８等の選択可能マーカーのための選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２９４】
酵母における使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１等のトリプトファン中で成長する能力が欠如した酵母の突然変異株に対する選択マーカーである。Ｊｏｎｅｓ，（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞におけるｔｒｐ１欠損の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換の検出に有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。Ｕｒａ３−欠損酵母株は、ｕｒａ３遺伝子を有するプラスミドにより補完される。
【０２９５】
さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から得られるベクターを、クリベロマイセス酵母の形質転換に使用することができる。代替として、組み換え仔牛キモシン大量生成のための発現系が、Ｋ．ラクチスに対して報告されたＶａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，(Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））。クリベロマイセスの工業用菌株による、成熟組み換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターもまた開示されている（Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））。
【０２９６】
（４）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、抗体コード核酸に作用可能に結合するプロモーターを含有する。原核宿主との使用に好適なプロモーターは、アラビノース（例えばａｒａＢ）プロモーターｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。また、細菌系における使用のためのプロモーターは、本開示の抗体をコードするＤＮＡに作用可能に結合したシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０２９７】
プロモーター配列は、真核生物において知られている。事実上全ての真核生物遺伝子が、転写が開始する部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始部から７０から８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであってもよいＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核生物遺伝子の３'端には、コード配列の３’端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであってもよいＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全てが、真核生物発現ベクターに好適に挿入される。
【０２９８】
酵母宿主との使用に好適なプロモーター配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターを含む。
【０２９９】
成長条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に好適なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０３００】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、Ａｂｅｌｓｏｎ白血球ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターにより制御されるが、但しそのようなプロモーターは宿主細胞系に適合する。
【０３０１】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修正は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関する、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。代替として、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復が、プロモーターとして使用され得る。
【０３０２】
（５）エンハンサー要素成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。その例は、複製起点（ｂｐ１００−２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素に関するＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５'または３'位でベクター中にスプライスされてもよいが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０３０３】
（６）転写停止成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核生物）において使用される発現ベクターは、転写の停止のために、またはｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列もまた含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５'、時には３'非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写停止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそれに開示される発現ベクターを参照されたい。別の転写停止成分は、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネーターである。
【０３０４】
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現させるための好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、または高等真核細胞である。この目的に好適な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）等の腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス菌（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているリケニホルミス菌４１Ｐ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）等の他の系統も好適である。これらの例は、限定ではなく例示である。
【０３０５】
原核生物に加えて、真核生物微生物、例えば糸状菌または酵母が、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般にパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッケルハミ（Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主等、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびクロコウジカビ（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）等の、多くの他の属、種および系統が一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
【０３０６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）等の宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、またそのようなウイルスは、具体的にはヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、本開示に従い本明細書のウイルスとして使用され得る。
【０３０７】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、タバコ、ウキクサ、および他の植物細胞もまた、宿主として利用することができる。
【０３０８】
有用な哺乳動物細胞系の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓系（２９３または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺臓細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３０９】
宿主細胞は、抗体産生のための上述の発現またはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切となるように改変された従来の栄養培地中で培養される。さらに、選択的マーカーにより隔てられた転写単位の複数の複製を有する新規ベクターおよびトランスフェクトされた細胞系が、標的に結合する抗体の発現に特に有用であり好ましい。
【０３１０】
（８）宿主細胞の培養
本開示の抗体を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）等の市販の培地が、宿主細胞．の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のいずれも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン薬）、微量元素（通常マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が添加されていてもよい。また、任意の他の必要な補助物質が、当業者に知られている適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞において以前に使用された条件であり、当業者には明らかである。
【０３１１】
（９）抗体の精製
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内、細胞周辺腔内で産生されるか、または微生物培養を含む培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子状破片が、例えば遠心分離または限外濾過により除去される。Ｂｅｔｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３，１９８８；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を説明している［Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）もまた参照されたい］。
【０３１２】
微生物または哺乳動物細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーまたは鳥交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）に基づき抗体を精製するために使用することができる。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔径制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るものよりも速い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ  ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィーにおけるアニオンもしくはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿等の他のタンパク質精製技術もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０３１３】
スクリーニング方法
効果的な治療法は、著しい毒性を有さない効果的薬剤の特定に依存する。抗体は、当該技術分野において知られた方法により、結合親和性に関してスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画化、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡ等を使用することができ、これらは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されている。
【０３１４】
本開示の一実施形態において、標的抗原の活性を調整する抗体のスクリーニングの方法は、試験抗体を標的ポリペプチドと接触させること、および抗体と標的リガンドとの間の複合体の存在に関して分析することを含む。そのようなアッセイにおいて、リガンドは、典型的には標識化されている。好適なインキュベーションの後、結合形態で存在するリガンドから遊離リガンドが分離され、遊離した非複合化標識の量が、標的リガンドに結合する特定の抗体の能力の指標となる。
【０３１５】
本開示の別の実施形態において、標的ポリペプチドに対する好適な結合親和性を有する抗体断片またはＣＤＲのハイスループットクリーニングが使用される。簡潔に述べると、多数の異なる小分子ペプチド試験化合物を、固体基板上に合成する。ペプチド試験抗体を、標的ポリペプチドと接触させ、洗浄する。次いで、結合したポリペプチドを、当該技術分野において周知の方法により検出する。また、本開示の精製抗体は、上述の薬物スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接コーティングされ得る。さらに、非中和抗体を使用して、標的を捕捉し、固体支持体上に固定化することがでる。
【０３１６】
ＴＧＦβおよび抗ＴＧＦβ抗体の中和生物活性を評価するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第７，８６７，４９６号を参照されたい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイの例は、（１）ＥＧＦの存在下、軟寒天中でのＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：５３３９−５３４３）；（２）軟骨表現型を発現させるための原始的間葉細胞の分化の誘導（Ｓｅｙｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：２２６７−２２７１）；（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：７９−８６）およびＢＢＣ−１サル腎臓細胞（Ｈｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５９８９−５９９２）の成長阻害；（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発阻害（Ｗｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１６３３−１６３６）；（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化阻害（Ｆｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１６５０９−１６５１３）；（６）フィブロネクチン産生の測定（Ｗｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｃｅｌｌ，７１：１００３−１０１４）；（７）ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害剤Ｉ（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：２７６−２８４）；（８）サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２：６１−７１）；ならびに（９）Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３（２４）：４３５５−４３５９に記載の細胞アッセイを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％強力である。
【０３１８】
ＴＧＦβの生物活性および中和（例えばＴＧＦβ抗体による）を評価するための追加的方法は、実施例に記載されている。例えば、中和は、中和アッセイにより測定され、ＩＣ５０値として表現され得る。ＩＣ５０値は、所与の分子に対して、第２の分子または細胞活性の最大生物学的反応の半分の阻害を引き出すために必要な分子の濃度を決定することにより計算され得る。ＩＣ５０が低い程、所与のタンパク質活性を阻害する分子の有効性が大きい。本明細書において企図される例示的な中和アッセイは、限定されないが、インターロイキン−１１放出アッセイおよびＨＴ−２／ＩＬ−４細胞増殖アッセイを含む。さらに、抗体が１つのＴＧＦβアイソフォームを優先的に阻害するかどうかを決定するために、ｐＳＭＡＤリン酸化アッセイまたはｒｈＬＡＰ結合アッセイを含むＴＧＦβ活性アッセイを行うことができる。さらなる実施形態において、抗体は、ＴＧＦβ３と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に対しより低いＩＣ５０（すなわち、より良好な結合、より大きな有効性）を有する。
【０３１９】
併用療法
一実施形態において、本開示の抗体は、本明細書に記載の疾患または障害の治療に有用な第２の薬剤とともに投与される。標的抗原への結合に効果的な２つ以上の抗体が特定される場合、標的抗原の異なるエピトープに対する、および／またはＴＧＦβの異なるアイソフォームに優先的に結合する２つ以上の抗体が、抗体同士の組み合わせが標的ポリペプチドに関連した状態または障害に対するさらに改善された効力を提供するように混合され得ることが企図される。本発明の１つ以上の抗体を含む組成物が、標的ポリペプチドに関連した治療されるべき状態または障害に罹患している、または罹患しやすい人物または動物に投与され得る。
【０３２０】
２種類の治療薬剤の併用投与は、薬剤がその治療効果を発揮している期間に重複が存在する限りは、薬剤が同時に、または同じ経路で投与されることを必要としない。同時または逐次投与が企図され、異なる日または週での投与もまた企図される。
【０３２１】
第２の薬剤は、サイトカイン、成長因子、他の標的抗原に対する抗体、抗炎症薬、抗凝固薬、細胞外基質産生を阻害する薬剤、血圧を低下または低減する薬剤、コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、もしくはリポタンパク質（ａ）を低減する薬剤またはＨＤＬを増加させる薬剤、コレステロール調節タンパク質のレベルを増加または低下させる薬剤、抗新生物薬または分子等の他の治療薬剤であってもよい。癌または腫瘍等の過剰増殖性障害を有する患者に対しては、放射線療法、化学療法、光線力学的療法、または手術等の第２の治療法との組み合わせもまた企図される。
【０３２２】
本開示の抗体および第２の薬剤は、同じ剤形で同時に投与されてもよいことが企図される。さらに、薬剤は、別個の剤形で投与され、同時に投与されることが企図されるが、同時とは、薬剤が互いに３０分以内に投与されることを指す。
【０３２３】
別の態様において、第２の薬剤は、抗体組成物の投与前に投与される。前投与とは、抗体による治療の１週間前から、抗体の投与の３０分前までの範囲内の第２の薬剤の投与を指す。さらに、第２の薬剤が、抗体組成物の投与の後に投与されることが企図される。後の投与とは、抗体処置の３０分後から抗体投与の１週間後の投与を示すことを意図する。
【０３２４】
さらに、適切な場合には他の補助療法が施されてもよいことが企図される。例えば、患者には、細胞外基質分解タンパク質、外科的療法、化学療法、細胞傷害性薬、または適切な場合には放射線療法が施されてもよい。
【０３２５】
さらに、抗体が第２の薬剤と組み合わせて投与される場合、例えば、第２の薬剤がサイトカインもしくは成長因子、または化学治療薬である場合、投与はまた、放射線治療薬または放射線療法の使用を含むことが企図される。抗体組成物と組み合わせて施される放射線療法は、処置する医師により決定されるように、および癌の処置を受けている患者に典型的に与えられる用量で施される。
【０３２６】
細胞傷害性薬は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、および／または細胞の破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法薬、および細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素または合成毒素等の毒素、あるいはそれらの断片を含むことを意図する。非細胞傷害性薬は、細胞の機能を阻害もしくは防止せず、および／または細胞の破壊をもたらさない物質を指す。非細胞傷害性薬は、細胞傷害性となるように活性化され得る薬剤を含み得る。非細胞傷害性薬は、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含み得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００２８０７１号および同第２００３／００３２９９５号を参照されたい）。そのような薬剤は、本開示による抗体とコンジュゲート、結合、連結または会合されてもよい。
【０３２７】
本開示の抗体との使用が企図される化学療法薬は、限定されないが、表Ｉに列挙されるものを含む。
【０３２８】
（表Ｉ）
2020014464.tif 000002
2020014464.tif 000003
2020014464.tif 000004
【０３２９】
また、第２の薬剤は、抗線維症薬であることが企図される。例示的な抗線維症薬は、限定されないが、１つ以上のＴＧＦ−βアイソフォームを標的化する抗体、ＴＧＦ−β受容体キナーゼＴＧＦＢＲ１（ＡＬＫ５）およびＴＧＦＢＲ２の阻害剤、ならびに受容体以降のシグナル伝達経路のモジュレーターを含む、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）の活性を低減する他の薬剤（限定されないが、ＧＣ−１００８（Ｇｅｎｚｙｍｅ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；レルデリムマブ（ＣＡＴ−１５２；Ｔｒａｂｉｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）；メテリムマブ（ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，）；ＬＹ−２１５７２９９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；ＡＣＵ−ＨＴＲ−０２８（Ｏｐｋｏ  Ｈｅａｌｔｈ）を含む）；ケモカイン受容体シグナル伝達；エンドセリン受容体ＡおよびＢの両方を標的化する阻害剤およびエンドセリン受容体Ａを選択的に標的化する阻害剤を含む、エンドセリン受容体拮抗薬（限定されないが、アンブリセンタン；アボセンタン；ボセンタン；クラゾセンタン；ダルセンタン；ＢＱ−１５３；ＦＲ−１３９３１７、Ｌ−７４４４５３；マシテンタン；ＰＤ−１４５０６５；ＰＤ−１５６２５２；ＰＤ１６３６１０；ＰＳ−４３３５４０；Ｓ−０１３９；シタキセンタンナトリウム；ＴＢＣ−３７１１；ジボテンタンを含む）；結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の活性を低減し（限定されないが、ＦＧ−３０１９、ＦｉｂｒｏＧｅｎを含む）、また他のＣＴＧＦ−中和抗体も含む薬剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤（限定されないが、ＭＭＰＩ−１２、ＰＵＰ−１およびチガポチドトリフルテートを含む）；限定されないが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＢＭＳ−６９０５１４、セツキシマブ、ＥＧＦ受容体を標的化する抗体、ＥＧＦ受容体キナーゼの阻害剤、および受容体以降のシグナル伝達経路のモジュレーターを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性を低減する薬剤；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の活性を低減し（これに限定されないが、イマチニブメシレート（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含む）、またＰＤＧＦ中和抗体、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）を標的化する抗体、ＰＤＧＦＲキナーゼ活性および受容体以降のシグナル伝達経路の阻害剤を含む薬剤；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を低減し（限定されないが、アキシチニブ、ベバシズマブ、ＢＩＢＦ−１１２０、ＣＤＰ−７９１、ＣＴ−３２２、ＩＭＣ−１８Ｆ１、ＰＴＣ−２９９、およびラムシルマブを含む）、またＶＥＧＦ−中和抗体、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１、Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２、ＫＤＲ）を標的化する抗体、ＶＥＧＦを中和するＶＥＧＦＲ１（ｓＦｌｔ）およびその誘導体の可溶化形態、ならびにＶＥＧＦ受容体キナーゼ活性の阻害剤を含む薬剤；複数の受容体キナーゼの阻害剤、例えば血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、および血小板由来成長因子の受容体キナーゼを阻害するＢＩＢＦ−１１２０；インテグリン機能に干渉し（限定されないが、ＳＴＸ−１００およびＩＭＧＮ−３８８を含む）、またインテグリン標的化抗体も含む薬剤；ＩＬ−４（限定されないが、ＡＥＲ−００１、ＡＭＧ−３１７、ＡＰＧ−２０��、およびｓＩＬ−４Ｒαを含む）およびＩＬ−１３（限定されないが、ＡＥＲ−００１、ＡＭＧ−３１７、アンルキンズマブ、ＣＡＴ−３５４、シントレデキンベスドトックス、ＭＫ−６１０５、ＱＡＸ−５７６、ＳＢ−３１３、ＳＬ−１０２、およびＴＮＸ−６５０を含む）の線維症促進活性に干渉し、またいずれかのサイトカインに対する中和抗体、ＩＬ−４受容体またはＩＬ−１３受容体を標的化する抗体、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方に結合し中和することが報告されているＩＬ−４受容体またはその誘導体の可溶化形態、ＩＬ−１３の全てまたは一部を含むキメラタンパク質および毒素、特にシュードモナス内毒素、ＪＡＫ−ＳＴＡＴキナーゼ経路を介したシグナル伝達を含む薬剤；ｍＴｏｒの阻害剤を含む上皮間葉移行に干渉する薬剤（これに限定されないが、ＡＰ−２３５７３を含む）；テトラチオモリブデート等の銅のレベルを低減する薬剤；Ｎ−アセチルシステインおよびテトラチオモリブデートを含む、酸化ストレスを低減する薬剤；ならびにインターフェロンガンマを含む。また、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）の阻害剤（これに限定されないが、ロフルミラストを含む）；ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の阻害剤（これに限定されないが、ミロデナフィル、ＰＦ−４４８０６８２、シルデナフィルシトレート、ＳＬｘ−２１０１、タダラフィル、ウデナフィル、ＵＫ−３６９００３、バルデナフィル、およびザプリナストを含む）；または、シクロオキシゲナーゼおよび５−リポキシゲナーゼ阻害剤（これに限定されないが、ジロイトンを含む）を含むアラキドン酸経路の調整剤である薬剤も企図される。さらに、プロリルヒドロラーゼ阻害剤（限定されないが、１０１６５４８、ＣＧ−００８９、ＦＧ−２２１６、ＦＧ−４４９７、ＦＧ−５６１５、ＦＧ−６５１３、フィブロスタチンＡ（武田）、ルフィロニル、Ｐ−１８９４Ｂ、およびサフィロニルを含む）ならびにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−ガンマ作動薬（限定されないが、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンを含む）を含む、組織改造または線維症を低減する化合物が企図される。
【０３３０】
企図される他の具体的な抗線維症薬は、リラキシン、ピルフェニドン、ウフィロニル、スリホニル、ＣＡＴ−１９２、ＣＡＴ−１５８；アンブリセンタン、セリン；ＦＧ−３０１９、ＣＴＧＦ抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤；タルセバ；ゲフィチニブ；ＰＤＧＦ抗体、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤；グリベック；ＢＩＢＦ−１１２０、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦ受容体阻害剤；抗インテグリン抗体；ＩＬ−４抗体；テトラチオモリブデート、銅キレート剤；インターフェロン−ガンマ；ＮＡＣ、システインプロドラッグ；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；ＫＧＦ；アンジオテンション受容体遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤；ＣＯＸおよびＬＯ阻害剤；ジロイトン；モンテルカスト；アバスチン；スタチン；ＰＤＥ５阻害剤、例えばシルデナフィル、ウデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、またはザプリナスト；ロフミラスト；エタネルセプト（エンブレル）；凝固促進剤；プロスタグランジン、例えばＰＧＥ２、ＰＲＸ−０８０６６、５ＨＴ２Ｂ受容体拮抗薬；シントレデキンベスドトックス、遺伝子操作されたシュードモナス外毒素にコンジュゲートしたキメラヒトＩＬ１３；ロフルミラスト、ＰＤＥ４阻害剤；ＦＧ−３０１９、抗結合組織成長因子ヒトモノクローナル抗体；ＧＣ−１００８、ＴＧＦ−βヒトモノクローナル抗体；トレプロスチニル、プロスタサイクリン類似体；インターフェロン−α；ＱＡＸ−５７６、ＩＬ１３モジュレータ；ＷＥＢ２０８６、ＰＡＦ−受容体拮抗薬；イマチニブメシレート；ＦＧ−１０１９；スラミン；ボセンタン；ＩＦＮ−１ｂ；抗ＩＬ−４；抗ＩＬ−１３；タウリン、ナイアシン、ＮＦ−κＢアンチセンスオリゴヌクレオチド；ならびに酸化窒素シンターゼ阻害剤を含む。
【０３３１】
障害の治療
別の実施形態において、本開示は、標的特異的抗体を、それを必要とする患者に投与することにより標的活性を阻害するための方法を提供する。本明細書に記載の抗体の種類のいずれも、治療的に使用することができる。例示的実施形態において、標的特異的抗体は、ヒト、キメラまたはヒト化抗体である。別の例示的実施形態において、標的はヒトであり、患者はヒト患者である。代替として、患者は、標的特異的抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する哺乳動物であってもよい。抗体は、獣医学目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物（すなわち霊長類）に投与され得る。そのような動物モデルは、本開示の標的特異的抗体の治療有効性を評価するために有用となり得る。
【０３３２】
一実施形態において、本開示は、ＴＧＦβ発現に関連した状態または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の本明細書に記載の抗体または薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０３３３】
ＴＧＦβに結合する抗体物質（例えば本開示の抗体）により治療され得るＴＧＦβ発現に関連した例示的な状態または障害は、癌、例えば肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維性癌、神経膠腫および黒色腫、目の（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的）疾患、状態もしくは障害、線維症に関連した疾患、状態もしくは障害、例えば、線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患、状態もしくは障害を含む。
【０３３４】
線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患は、限定されないが、皮膚、肺、腎臓、心臓、脳および目を含む、体内の任意の器官または組織に影響するものを含む。線維増殖性疾患、状態もしくは障害、または関連した線維症を有する疾患は、限定されないが、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、末梢気道疾患（例えば閉塞性細気管支炎）、肺気腫、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）；病原菌または毒物に起因する肺線維症；腎臓線維症、全ての病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫性ＧＮ、および半月体形成性ＧＮ、糸球体硬化症、尿細管間質損傷、腎間質線維症、腎線維症および腎間質線維症の全ての原因、移植レシピエントのシクロスポリン処置、例えばシクロスポリン処置を含む、薬物暴露の合併症からもたらされる腎線維症、ＨＩＶ関連ネフロパシー、移植ネクロパシー、糖尿病性腎臓疾患（例えば糖尿病性ネフロパシー）、腎性全身性線維症、糖尿病、特発性後腹膜線維症、強皮症、肝線維症、全ての病因に起因する肝硬変を含む過度の瘢痕および進行性硬化に関連した肝疾患、胆管の障害、感染症に起因する肝機能異常、線維嚢胞症、心血管疾患、例えば鬱血性心不全、拡張型心筋症；心筋炎；血管狭窄心線維症（例えば、梗塞後心線維症）、心筋梗塞後、左心室肥大、静脈閉塞症、再狭窄（例えば、血管形成後の再狭窄）、動静脈移植不全、アテローム性動脈硬化、高血圧、高血圧性心疾患、心臓肥大、肥大型心筋症、心不全、大動脈疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、ファシスト、レイノー症候群、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、または緑内障の処置、網膜復位術、水晶体摘出、もしくは任意の種類のドレナージ術等の眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば、角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば、緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離、ペイロニー病、全身性硬化症、脊髄損傷後、骨粗しょう症、カムラチ・エンゲルマン病、クローン病、瘢痕、マルファン症候群、早発閉経、アルツハイマー病、パーキンソン病、外科的切開または機械的外傷に起因する線維症、眼科手術に関連した線維症；ならびに、外傷または外科的創傷からもたらされる創傷治癒中に生じる真皮における過度または肥大性の瘢痕またはケロイド形成を含む。
【０３３５】
例示的な目の疾患（例えば、眼球、視覚性、眼もしくは眼科的疾患）、状態または障害は、限定されないが、線維増殖性障害、目の線維症、眼線維症、網膜機能不全、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷（例えば、角膜へのアルカリ熱傷）、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【０３３６】
例示的な目の線維増殖性疾患、状態もしくは障害、目の線維症、眼球の線維症、または眼線維症は、限定されないが、増殖性硝子体網膜症、任意の病因の硝子体網膜症、網膜機能不全に関連した線維症、滲出型または乾燥黄斑変性に関連した線維症、緑内障の処置、網膜再付着術、水晶体摘出術、または任意の種類のドレナージ術などの眼科手術に関連した線維症、角膜および結膜における瘢痕、角膜内皮における線維症、アルカリ熱傷に関連した線維症、白内障手術後の水晶体嚢の線維症、斜視手術における外眼筋周囲組織における過度の瘢痕、前嚢下白内障および後嚢混濁、前眼部線維症、角膜実質の線維症（例えば角膜混濁に関連）、小柱網の線維症（例えば緑内障に関連）、後眼部線維症、線維血管性瘢痕（例えば、目の網膜血管または脈絡膜血管における）、網膜線維症、網膜上線維症、網膜グリオーシス、網膜下線維症（例えば、加齢黄斑変性に関連）、網膜手術および緑内障手術後に関連した線維症、糖尿病性網膜症における組織の収縮に関連した牽引性網膜剥離を含む。
【０３３７】
様々な実施形態において、目の線維増殖性疾患、状態または障害は、増殖性硝子体網膜症、眼科手術に関連した線維症、白内障手術後の水晶体の線維症、角膜実質の線維症およびアルカリ熱傷からなる群から選択される。
【０３３８】
本発明による抗体物質で治療され得る例示的な癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、繊維性癌、神経膠腫および黒色腫等の癌を含む。
【０３３９】
多くのヒト腫瘍（ｄｅＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３６７３（１９８７）、Ｋｕｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：５６２（１９８８））および多くの腫瘍細胞系（Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：７０７（１９８７）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：５９４（１９８８））がＴＧＦβを産生することが観察されており、それらの腫瘍が通常の免疫監視を逃れる可能なメカニズムを示唆している。
【０３４０】
癌におけるＴＧＦβアイソフォーム発現は、特に癌において異なる役割を有するＴＧＦβアイソフォームの異なる組み合わせにより、複雑で変動する。ＴＧＦβ分子は、腫瘍抑制因子および腫瘍プロモーターの両方として機能し得る。例えば、動物におけるＴＧＦβシグナル伝達の欠失または下方調節は、乳癌、腸癌、膵臓癌、結腸癌および、扁平上皮細胞癌をもたらし得るが、これはＴＧＦβの存在が、腫瘍の進行を防止または抑制するために重要であることを示している（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２２０−２７，２０１０）。しかしながら、ＴＧＦβの過剰発現は、腫瘍形成促進性であることが知られており、多くの腫瘍型において増加した発現が検出されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）。
【０３４１】
また、さらなる複雑性が、米国特許第７，９２７，５９３号に開示されている。例えば、異なるＴＧＦβアイソフォームが、異なる種類の癌により関連していると思われる。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、卵巣癌およびその進行においてＴＧＦβ２よりも大きな役割を担う可能性があり、一方ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２発現は、より高い悪性度の軟骨肉腫腫瘍においてＴＧＦβ３よりも著しい。ヒト乳癌においては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３が顕著に発現し、ＴＧＦβ３発現は、全体的な生存に関連し、一方結節転移および陽性ＴＧＦβ３発現を有する患者は、予後および転帰の不良を有する。しかしながら、結腸癌においては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、ＴＧＦβ３よりも顕著に発現し、癌を有さない個体の場合よりも高い循環レベルで存在する。神経膠腫においては、ＴＧＦβ２は細胞移動に重要である。最近の研究からは、どのＴＧＦβアイソフォームが特定の癌をどの程度まで阻害するのに最も有用であるかは明らかではない。
【０３４２】
免疫細胞の腫瘍部位への浸潤は、腫瘍成長の一般的な要因であると考えられている。これらの免疫細胞浸潤物は、腫瘍を除去するのを助けることにより有益な効果を有し得るが、腫瘍抗原に対する耐性を可能とすることにより有害な効果もまた有し得る。ＴＧＦβは、腫瘍内の免疫細胞のレベルに影響し得ることが示されている（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２２０−２７，２０１０；Ｆｌａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：５５４−５６７，２０１０；Ｎａｇａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １９：７７−９１，２０１０を参照されたい）。例えば、ＴＧＦβは、体から腫瘍を除去するために腫瘍に浸潤するナチュラルキラー細胞を抑制する。ＴＧＦβはまた、腫瘍の除去を補助する細胞傷害性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性を抑制する（Ｙａｎｇ，上記参照）。ＴＧＦβはまた、例えば損傷部位への移動および免疫反応を促進するための抗原の提示を阻害することにより、樹状細胞活性の調節において役割を担う。樹状細胞は、ＴＧＦβに応答するとともにＴＧＦβを分泌する。例えば、樹状細胞は、腫瘍に浸潤して細胞を取り込み、ＴＧＦβを分泌して調節性Ｔ細胞を活性化し、一方でこれが腫瘍除去を防止し得る（Ｆｌａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。さらに、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、腫瘍の進行中に増加する骨髄由来細胞である。ＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖を阻害し、樹状細胞成熟を抑制し、ナチュラルキラー細胞活性を阻害し、それにより細胞が免疫反応を逃れるのを助ける（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：２４０−４９，２００９）。ＴＧＦβは、ナチュラルキラー細胞活性の阻害に対するＭＤＳＣの効果に寄与することが実証されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照；Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１２４：２６２１−３３，２００９）。これらの免疫プロセスのそれぞれにおける様々なＴＧＦβアイソフォームの役割は不明である。ＴＧＦβアイソフォームの選択的標的化および様々な程度でのそれらの阻害は、腫瘍と闘いそれを除去するための宿主免疫反応の調整に役立ち得る。
【０３４３】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の免疫細胞を調整する。いくつかの実施形態において、抗体または組成物は、腫瘍内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させ、および／またはＮＫ細胞の細胞溶解活性を増加させる。様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、免疫反応を下方調節する、または免疫反応の部位に移動するＴｒｅｇの能力を阻害する。
【０３４４】
様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ活性を向上させる、例えばＣＴＬ活性を増進、増加もしくは促進する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、ＣＴＬによるパーフォリンおよびグランザイム産生を増加させ、ＣＴＬの細胞溶解活性を増加させる。
【０３４５】
様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させ、かつ／またはＭＤＳＣ機能を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、免疫反応を抑制するＭＤＳＣの能力を阻害し、ＭＤＳＣの免疫抑制活性を阻害し、ならびに／またはＴｒｅｇの増加および／もしくは機能を促進するＭＤＳＣの能力を阻害する。
【０３４６】
様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、腫瘍内の樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させ、かつ／または樹状細胞の寛容原性機能（例えば寛容原性作用）を阻害する。例えば、様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体または組成物は、ＣＤ８＋樹状細胞の寛容原性作用を低下させる。
【０３４７】
様々な実施形態において、本明細書に記載の抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９もしくはＸＰＡ．４２．６８１またはそれらの変異体は、上述の免疫活性の１つ以上を調整する。
【０３４８】
前述のように、また、ＴＧＦβ発現は、腎硬化、肺線維症および肝硬変等の様々な組織線維症の発症、ならびに慢性肝炎、関節リウマチ、血管再狭窄、および皮膚のケロイド等の様々な状態に関与している。いくつかの例示的実施形態において、本明細書に記載の抗体は、線維症または線維性状態を治療するために使用される。例示的な線維症または線維性疾患は、限定されないが、糸球体腎炎、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、糖尿病、糖尿病性腎臓疾患、肝線維症、腎臓線維症、肺線維症、梗塞後心線維症、線維嚢胞性疾患、線維性癌、心筋梗塞後、左心室肥大、肺線維症、肝硬変、静脈閉塞症、脊髄損傷後、網膜手術および緑内障手術後、血管形成後の再狭窄、腎間質線維症、動静脈移植不全および瘢痕を含む。
【０３４９】
一実施形態において、これらの障害または状態のを必要とする動物における前記治療は、動物に、効果的な量の本明細書に記載の抗体または抗体を含む組成物を投与することを含む。
【０３５０】
本開示の方法により治療可能な状態は、好ましくは、哺乳動物において生じる。哺乳動物は、例えば、ヒトおよび他の霊長類、ならびにイヌおよびネコ等のペットまたはコンパニオンアニマル、ラット、マウスおよびウサギ等の実験動物、ならびにウマ、ブタ、ヒツジおよびウシ等の農業動物を含む。
【０３５１】
治療以外の用途
本開示の抗体は、標的用の親和性精製薬剤として、または標的タンパク質の診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織もしくは血清における発現の検出において使用されてもよい。抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイに使用されてもよい。一般に、これらの目的において、抗体は、免疫シンチグラフィーを使用して抗体が特定され得るように、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識化される。
【０３５２】
本開示の抗体は、任意の知られたアッセイ法、例えば競合的結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ならびに免疫沈降アッセイにおいて使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。抗体はまた、当該技術分野において知られている方法を使用して組織または細胞試料を標識化するために、免疫組織化学に使用され得る。
【０３５３】
標的特異的抗体は、全て当該技術分野において周知の技術である、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降法を制限なく含む、従来の免疫測定法において使用され得る。本開示の抗体は、ヒトおよび他の哺乳動物における標的を検出するために使用され得る。本開示は、生体試料における標的を検出するための方法であって、生体試料を本開示の標的特異的抗体と接触させることと、結合した抗体を検出することとを含む方法を提供する。一実施形態において、標的特異的抗体は、検出可能な標識で直接標識化される。別の実施形態において、標的特異的抗体（第１の抗体）は標識化されず、標的特異的抗体に結合し得る第２の抗体または他の分子は標識化される。当業者には周知であるように、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる第２の抗体が選択される。例えば、標的特異的抗体がヒトＩｇＧである場合、第２の抗体は抗ヒトＩｇＧであってもよい。抗体に結合し得る他の分子は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇを制限なく含み、それらは両方とも、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から市販されている。
【０３５４】
上に開示される免疫測定法は、多くの目的で使用されることが企図される。例えば、標的特異的抗体は、細胞培養物中の細胞内もしくは細胞表面上の標的、または組織培養培地中に分泌される標的を検出するために使用され得る。標的特異的抗体は、様々な化合物で処理された細胞表面上の標的または組織培養培地中に分泌された標的の量を決定するために使用され得る。この方法は、標的発現または分泌を阻害または活性化するのに有用な化合物を特定するために使用され得る。この方法によれば、細胞の１つの試料が試験化合物で一定期間処理され、一方別の試料が未処理とされる。標的の全レベルが測定される場合、細胞が溶解され、上述の免疫測定法の１つを使用して全標的レベルが測定される。未処理細胞に対する処理細胞における標的の全レベルが比較され、試験化合物の効果が決定される。
【０３５５】
標識
いくつかの実施形態において、抗体物質は、その検出を促進するために標識化される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、本開示における使用に好適な標識は、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えばハプテンもしくはペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができるか、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用可能なタンパク質を含む。
【０３５６】
本発明における使用に好適な標識の例には、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に使用される他の酵素）、および比色標識、例えばコロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５７】
標識は、当分野で周知の方法によるアッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合させてよい。好ましくは、一実施形態における標識は、本開示による作用物質のコンジュゲート化のためのイソシアネート試薬を用いてバイオポリマーに共有結合させてもよい。本開示の一態様では、本開示の二官能性イソシアネート試薬を使用して、標識をバイオポリマーとコンジュゲートして、作用物質をそれに結合させずに、標識バイオポリマーコンジュゲートを形成することができる。標識バイオポリマーコンジュゲートは、本開示による標識されたコンジュゲートの合成のための中間体として使用してもよく、あるいはバイオポリマーコンジュゲートを検出するのに使用してもよい。前述のように、多種多様な標識を使用することができ、この標識の選択は、要求される感度、アッセイの所望の成分とのコンジュゲート化の容易性、安定性要件、利用可能な器具、および廃棄設備に依存する。非放射性標識は、間接的手段によって結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）が、その分子に共有結合される。次にそのリガンドを本質的に検出可能であるか、または例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合した別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。
【０３５８】
また、本開示の化合物は、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲート化により、シグナル生成化合物と直接コンジュゲートされ得る。標識としての使用に好適な酵素は、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわちフルオロフォアは、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等を含むが、これらに限定されない。好適なフルオロフォアのさらなる例は、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニン、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等を含むが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な化学発光化合物は、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含むが、これらに限定されない。本開示の方法において使用することができる様々な標識化またはシグナル生成系の考察に関しては、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０３５９】
標識を検出するための手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーで使用する写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、その結果生じた蛍光を検出することによって、この標識を検出することができる。蛍光は、視覚的に、あるいは電子検出装置、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの使用などによって検出することができる。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供し、その結果生じた反応生成物を検出することによって検出することができる。比色標識または化学発光標識は、単に標識に関連する色を観察することによって検出することができる。本開示の方法における使用に好適な他の標識および検出系は、当業者に容易に認識されるであろう。このような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断に使用することができる。
【０３６０】
薬学的組成物の製剤化
本開示の抗体物質をヒトまたは試験動物に投与するには、抗体物質を、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物として製剤化することが好ましい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、後述のように当該技術分野において周知の経路を使用して投与された場合に、アレルギーまたは他の有害反応を生成しない分子的実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。
【０３６１】
さらに、化合物は、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。そのような溶媒和物も同様に企図される。
【０３６２】
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに、局所処置に望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段により投与される。非経口注入は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与を含む。さらに、抗体は、パルス注入により、特に抗体の用量を減少させて好適に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短時間であるか持続的であるかにある程度依存して、注射により、最も好ましくは静脈内または皮下注射により与えられる。局所的、特に経皮、経粘膜、経直腸、経口、または例えば所望の部位近くに留置されたカテーテルによる局所投与を含む他の投与方法が企図される。注射、特に静脈内注射が好ましい。
【０３６３】
活性成分として本開示の抗体物質を含有する本開示の薬学的組成物は、投与経路に依存して薬学的に許容される担体または添加剤を含有してもよい。そのような担体または添加剤の例は、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリルナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤等を含む。使用される添加剤は、これに限定されないが、本開示の投薬形態に依存して、適宜に上記またはそれらの組み合わせから選択される。
【０３６４】
薬学的組成物の製剤は、選択される投与経路により変動する（例えば、溶液、エマルジョン）。投与されるべき抗体を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製され得る。溶液またはエマルジョンの場合、好適な担体は、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性またはアルコール／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、様々な添加剤、保存料、または流体、栄養物もしくは電解質補給物を含み得る。
【０３６５】
様々な水性担体、例えば無菌リン酸緩衝生理食塩水、滅菌蒸留水、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等があり、穏やかな化学改変等に供される、向上した安定性のための他のタンパク質、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等を含んでもよい。
【０３６６】
抗体の治療製剤は、所望の純度を有する抗体を、随意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において被投与者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０３６７】
また、本明細書における製剤は、治療される特定の適応症に対して、必要に応じて２種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。そのような分子は、好適には、意図される目的に効果的な量で組み合わされて存在する。
【０３６８】
また、活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、例えば液滴形成技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に捕捉されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０３６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０３７０】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性化合物を含有してもよい。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり；分散または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪酸アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであってもよい。また、水性懸濁液は、１種以上の保存料、例えばエチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含有してもよい。
【０３７１】
本開示の抗体は、保存用に凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得る。この技術は、従来の免疫グロブリンとともに効果的であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の抗体活性損失をもたらす可能性があること、また使用レベルを調節してそれを補うことができることが、当業者には理解される。
【０３７２】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存料と混合された活性化合物を提供する。好適な分散または湿潤剤および懸濁化剤は、すでに上述されたものにより例示される。
【０３７３】
これらの製剤中の抗体の濃度は、例えば約０．５％未満、通常は少なくとも約１％から、１５または２０重量％程度の高い濃度まで広く変動することができ、選択される特定の投与形態に従い、主に流体体積、粘度等に基づいて選択される。したがって、非経口注射用の典型的な薬学的組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水および５０ｍｇの抗体を含有するように作製され得る。静脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル液および１５０ｍｇの抗体を含有するように作製され得る。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に周知である、または明白であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）により詳細に説明されている。抗体の効果的な用量は、投与当たり、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇから１０００ｍｇの範囲内である。
【０３７４】
薬学的組成物は、滅菌注射用水性、油性懸濁液、分散液、または、滅菌注射液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末の形態であってもよい。懸濁液は、既知の技術に従い、上述した好適な分散または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して製剤化され得る。また、滅菌注射用調合薬は、例えば１，３−ブタンジオール中溶液等の、非毒性の非経口用として許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な組み合わせ、植物油、リンゲル液および等張食塩水を含む、溶媒または分散媒であってもよい。さらに、溶媒または懸濁化媒体として、従来から滅菌不揮発性油が使用される。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の低刺激性の不揮発性油を使用することができる。また、オレイン酸等の脂肪酸が、注射製剤の調製に使用される。
【０３７５】
あらゆる場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的でなければならない。例えばレシチン等のコーティングを使用することにより、分散の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適正な流動性を維持することができる。これは製造および保管条件において安定でなければならず、細菌や真菌等の微生物の汚染作用に対し保護されなければならない。微生物の活動の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば砂糖または塩化ナトリウムを含めることが望ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン中での使用によりもたらすことができる。
【０３７６】
投与に有用な組成物は、その有効性を増加させるために、取り込みまたは吸収促進剤とともに製剤化されてもよい。そのような促進剤は、例えば、サリチレート、グリココレート／リノレエート、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプレート等を含む。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２−１２８５（１９９６））およびＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１−５４４（１９９３））を参照されたい。
【０３７７】
抗体組成物は、標的の同種受容体またはリガンドへの結合、標的媒介シグナル伝達等を含む標的活性を阻害するための使用に企図される。具体的には、組成物は、実質的に副作用のない濃度で阻害特性を示し、したがって広範な処置プロトコルに有用である。例えば、抗体組成物の別のより有毒な細胞傷害性薬との共投与は、患者における有毒な副作用を効果的に低減しながら、処置されている状態または疾患の有益な阻害を達成することができる。
【０３７８】
さらに、本開示における使用に企図される組成物の親水性および疎水性の特性は良好にバランスがとられ、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび特にｉｎ  ｖｉｖｏでの使用の両方における実用性が向上するが、そのようなバランスを欠いた他の組成物は、実質的により実用性が低い。具体的には、本開示における使用に企図される組成物は、体内での吸収およびバイオアベイラビリティを可能とする水性媒体に対する適度の溶解性を有する一方で、化合物が想定作用部位に向けて細胞膜を横断することを可能にする、脂質に対するある程度の溶解性も有する。したがって、企図される抗体組成物は、標的抗原活性の部位に送達することができれば最大限に効果的となる。
【０３７９】
投与および投薬
一態様において、本開示の方法は、薬学的組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、無菌組成物である。
【０３８０】
本開示の方法は、限定されないが、注射、経口摂取、鼻腔内、局所的、経皮、非経口、吸入スプレー、膣内または直腸内投与を含む、治療薬を直接的または間接的に哺乳動物対象に導入するための医学的に許容される手段を使用して実行することができる。非経口という用語は、本明細書において使用する際、皮下、静脈内、筋肉内、および嚢内注射、ならびにカテーテルまたは注入技術を含む。皮内、乳房内、腹腔内、くも膜下、眼球後方、肺内注射および／または特定部位への外科的移植による投与もまた企図される。
【０３８１】
一実施形態において、投与は、部位への直接注射により、または製剤を体内で送達し得る持続送達もしくは持続放出メカニズムにより、治療を必要とする癌、線維症または罹患組織の部位に行われる。例えば、組成物（例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）の持続送達が可能な生分解性ミクロスフェアもしくはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構成を、癌、線維症または罹患組織もしくは器官の部位に、またはその近くに移植される本開示の製剤に含めることができる。
【０３８２】
また、治療組成物は、複数の部位で患者に送達され得る。複数投与は、同時になされてもよく、または、ある期間にわたり投与されてもよい。ある特定の場合において、治療組成物の連続流を提供することが有益である。追加的な治療薬が、定期的に、例えば毎時間、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、またはそれより長い間隔で投与されてもよい。
【０３８３】
また、本開示において、複数の薬剤、例えば、限定されないが、化学療法薬または線維症の処置に有用な薬剤を含む本明細書に記載の第２の薬剤と併せた抗体組成物の投与が企図される。
【０３８４】
所与の用量における抗体組成物の量は、治療が施されている個体のサイズ、および治療されている障害の特性により変動し得る。例示的な治療において、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日または１０００ｍｇ／日を投与することが必要となり得る。これらの濃度は、単回投薬形態として、または複数回投薬として投与され得る。まず動物モデル、次いで臨床試験における標準的な用量反応試験により、特定の疾患状態および患者集団に対する最適用量が明らかになる。
【０３８５】
また、従来の治療薬が本開示の治療薬と組み合わせて投与される場合、投薬は修正され得ることが明らかである。
【０３８６】
キット
追加的態様として、本開示は、本開示の方法を実践するためのその使用を促進する様式でパッケージされた、１つ以上の化合物または組成物を備えるキットを含む。一実施形態において、そのようなキットは、密閉された瓶または槽等の容器内にパッケージされた、本明細書に記載の化合物または組成物（例えば、標的特異的抗体を単独で、または第２の薬剤と組み合わせて含む組成物）を含み、本方法の実践における化合物または組成物の使用を説明するラベルが、容器に貼付されているかまたはパッケージ内に含まれる。好ましくは、化合物または組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、特定の投与経路による組成物の投与、またはスクリーニングアッセイの実践に好適なデバイスをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、抗体組成物の使用を説明するラベルを含む。
【０３８７】
本開示の追加的態様および詳細は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例から明らかとなる。
【実施例】
【０３８８】
実施例１．抗体ファージディスプレイライブラリからの抗ＴＧＦβ抗体の単離
ヒトＴＧＦβの活性を中和することができる抗体のパネルを単離するために、ＴＧＦβタンパク質の３つのアイソフォーム、すなわちＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を、後述のようなヒト抗体ファージディスプレイライブラリのパニングに使用した。
【０３８９】
パニング：
まず、ＴＧＦβ抗原（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ  ＃１００−２１、１００−３５Ｂ、１００−３６Ｅ）を、製造者のプロトコルを使用して、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によるビオチニル化により調製した。簡潔に述べると、低ｐＨ緩衝液中で保存されたＴＧＦβ抗原を、２０×ＰＢＳを添加してｐＨを約６．０にすることにより中和した。３０倍モル過剰の上記の事前に活性化されたビオチンを添加および混合し、次いで室温で２０分間保持した。次いで、等体積の１０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を添加し、試料を、即座に、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に対する６〜８ｋＤａカットオフ透析ユニットを使用した透析に供した。Ｆａｂファージディスプレイライブラリ（ＸＯＭＡ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を、可溶性パニング法を用いてビオチニル化ＴＧＦβでパニングした。３回の選択ラウンドで各ＴＧＦβアイソフォームを別個にパニングした。カッパおよびラムダサブライブラリを別個にパニングした。
【０３９０】
ファージパニングの第１のラウンドにおいて、５０×ライブラリ当量（約２×１０１２ｃｆｕ）のライブラリを、氷上で１時間、１ｍＬの５％ミルク／ＰＢＳ中でブロックした。ブロックされたファージをストレプトアビジン被覆磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に添加し、回転させながら３０分間インキュベートすることにより、ストレプトアビジンへの結合剤を、ブロックされたファージから除外した。除外ステップをもう一度繰り返した。磁石を使用して、ファージからビーズを分離した。除外ステップと同時に、回転させながら室温で３０分間インキュベートすることにより、２００ｐモルのビオチニル化ＴＧＦβをストレプトアビジン被覆磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させた。結合後、５％ミルク−ＰＢＳでビオチニル化ＴＧＦβビーズを２回洗浄した。除外されたファージを、磁性ストレプトアビジンビーズに結合したビオチニル化ＴＧＦβに添加し、回転させながら１．５から２時間インキュベートすることにより、選択を行った。選択後、ビーズを迅速にＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで３回洗浄し、続いて迅速にＰＢＳでさらに３回洗浄するようにプログラムされたＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ磁性粒子プロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、未結合ファージをビーズから洗浄した。洗浄ステップの後に、１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、回転させながら室温で３０分間インキュベートすることにより、結合ファージをビーズから溶出した。溶出したファージを、等体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の添加により中和した。次いで、溶出した中和ファージを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ管（Ｆａｌｃｏｎ  Ｎｏ  ３５２０７０）に収集し、対数増殖ＴＧ１細菌細胞に感染させるために使用した（ＯＤ６００  約０．５）。感染は、振盪なしで３７℃で３０分間行い、続いて９０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞を、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび２％グルコースを添加した２ＹＴ培地（２ＹＴＣＧ）の寒天バイオアッセイプレート上に播種し、３０℃で一晩インキュベートして、一晩菌叢増殖させた。
【０３９１】
次のラウンドへの投入物としての使用に備えて、前のラウンドの生成物の１００×をＭＫ０７ヘルパーファージを使用した重感染によりレスキューした。これは、２ＹＴＣＧ培地を、前のパニングラウンド生成物から擦り落とした細胞で接種することにより行った。出発培養物に対してＯＤ６００ｎｍを測定し、約０．０５の出発ＯＤ６００ｎｍを反映するように調節した。細胞がＯＤ６００ｎｍ約０．５の対数増殖相に達するまで、細胞を振盪しながら３７℃で増殖させた。細胞を、振盪なしで３７℃で３０分間、感染効率（ＭＯＩ）＝約２０でＭＫ０７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）に感染させ、続いて１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３０分間さらにインキュベートした。３７℃での感染後、細胞をペレット化して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加した新たな２ＹＴ培地（２ＹＴＣＫ）に移した。培養物を２５℃で一晩増殖させた。遠心分離により細胞および残屑からファージを分離し、得られた上清を回収して、次のパニングラウンドへの投入物として使用した。各パニングラウンドに使用した投入物の量および得られたファージ生成物の滴定量により、選択濃縮を監視した。
【０３９２】
第２および第３のパニングラウンドにおいて、以下を除いてラウンド１で従った同じ溶液相プロトコルを使用した。パニングラウンド２および３において使用したファージ投入量は、約１．０×１０１１ｃｆｕであった。ラウンド２では、１００ｐモルのビオチニル化抗原を選択に使用し、ラウンド３では、５０ｐモルのビオチニル化抗原を使用した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒを使用して、選択後のビーズから未結合ファージを洗浄した。ラウンド２では、ビーズをＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで２分間、３回洗浄し、続いて１ｍｌ  ＰＢＳで２分間、３回洗浄を繰り返すようにＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒをプログラムした。ラウンド３パニングでは、ビーズをＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで６分間、３回洗浄し、続いてＰＢＳによる２回の４分間洗浄および１回の６分間洗浄を行った。
【０３９３】
ＴＧＦβ結合剤のスクリーニングにおける使用のための分泌抗体断片を含有する細菌ペリプラズム抽出物を、標準的方法により調製した。個々のコロニーを、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび０．１％グルコースを添加した２ＹＴＣ培地で満たした９６ウェルプレートに採取した。対数増殖相（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）に達するまで、培養物を振盪しながら３７℃で増殖させた。次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終）を添加することにより、可溶性断片抗体を産生するようにコロニーを誘導し、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。１：３体積比の氷冷ＰＰＢ溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）および完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠を含む再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）を添加する標準的方法を用いて、可溶性断片抗体を含有するペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）を、誘導した細胞から調製した。次いで、ＰＰＥをＴＧＦ−β結合剤のスクリーニングに使用した。
【０３９４】
スクリーニング：
３つ全てのＴＧＦβアイソフォームに結合するクローンを含み、それらの配列において一意的である、ＴＧＦβに結合するクローンを特定するために、２つの代替的スクリーニングアッセイ形式を使用した。第１のスクリーニングアッセイは、プレートベースの免疫アッセイを使用し、他方のスクリーニングアッセイは、ＳＰＲスクリーニング法を用いて行われた。プレートベースのアッセイは、不透明３８４ウェル白色ＥＩＡプレートを、１μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓ抗体クローンＡＤ．１．１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で、ＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍＬで、室温で４時間コーティングすることを含んだ。次いで、プレートを３回ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ中で洗浄し、次いで、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ中０．５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロックした。次に、３０μＬ／ウェルのビオチニル化ＴＧＦβを、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に対しては０．１μｇ／ｍＬ、ならびにＴＧＦβ３に対しては０．２μｇ／ｍＬ（ブロック緩衝液中で希釈）の間で添加した。次いで、３０μＬのペリプラズム抽出物を添加し、穏やかなプレート振盪器上で、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ中で３回洗浄し、次いで、ＤＥＬＦＩＡアッセイ希釈緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で希釈された５０μＬ／ウェルの２．５μｇ／ｍＬストレプトアビジン−ユーロピウム（ＳＡ−Ｅｕ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を各ウェルに添加し、振盪器上で室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで７回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ促進試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を添加し、室温で８分間振盪器上に置き、次いで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３プレートリーダで、２００〜１２００μｓ収集時間、ならびにＥｘｃ．＝３４５ｎｍ、Ｅｍｍ．＝６１８ｎｍ、およびカットオフ＝５９０ｎｍ、Ｈｉｇｈ  ＰＭＴ設定、２０読出し／ウェルのＴＲＦモードで読み出した。陰性ＰＰＥ対照シグナルよりも２．１倍超高いシグナルを有する試料を、陽性とみなした。
【０３９５】
ＳＰＲアッセイを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａ１００直接結合アッセイにより行った。このアッセイにおいて、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した標準アミン結合化学により、ＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥチップを調製した。ＴＧＦβ抗原をアセタート（ｐＨ４．０）中６μｇ／ｍＬに希釈し、７分間（ＴＧＦβ１であるスポット１）ならびに１０分間（ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３であるスポット２および４）注入した。これは、３４００から４８００ＲＵの間の各ＴＧＦβ抗原を固定化する。１Ｍエタノールアミンで試料を不活性化した。２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｔｅｋｎｏｖａ）でペリプラズム抽出物を１：１に希釈し、０．２ｕＭ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、次いで、３０μＬ／分で２４０秒間（３０秒の解離）注入した。各ＰＰＥ注入後の再生は、１０秒の１００ｍＭ  ＨＣｌであった。ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａ１００ソフトウェアにおける安定性初期報告ポイントを使用して、ＰＰＥ結合レベルを評価した。各ＴＧＦβアイソフォームに対して、バックグラウンドレベルを視覚的に超えるものとして、独立してカットオフレベルを決定した。ＲＵカットオフは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に対して、それぞれ２４５、１７５、および１２５であった。
【０３９６】
親和性成熟：
ＴＧＦβ３と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に対し大幅に高い結合および中和活性を有する１つの抗体ＸＰＡ．４２．０６８を、ＴＧＦβ３に対するその親和性および有効性を増加させるために親和性成熟に供した。親和性成熟から生成された配列変異体のライブラリを、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を使用してパニングし、生成クローンを主に改善されたＴＧＦβ３結合に関してスクリーニングした。
【０３９７】
スクリーニングのために、ＳＰＲアッセイを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａ１００直接結合アッセイにより行った。このアッセイにおいて、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキットを使用した標準アミン結合化学により、ＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥチップを調製した。ＴＧＦβ抗原をアセテート（ｐＨ４．０）中１μｇ／ｍＬに希釈し、５分間（それぞれＴＧＦβ３およびＴＧＦβ１であるスポット１および５）ならびに８分間（ＴＧＦβ２であるスポット２）注入した。これは、２００から４５０ＲＵの間の各ＴＧＦβを固定化する。１Ｍエタノールアミンで試料を不活性化した。２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋でペリプラズム抽出物を１：１に希釈し、０．２ｕＭ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、次いで、３０μＬ／分で２４０秒間（６００秒の解離）注入した。各ＰＰＥ注入後の再生は、１０秒の１００ｍＭ  ＨＣｌであった。参照を差し引いたデータをプロットし、より大きな安定性またはより高い結合レベルを有すると思われるクローンについて視覚的に検査した。ＴＧＦβ３への結合の向上を示したＸＰＡ．４２．６８１と指定される１つの誘導体クローンを、さらなる特性決定試験に含めた。
【０３９８】
選択されたクローンを、ＩｇＧ２抗体として再編成した。後述の試験を含むさらなる特性決定用の材料を生成するための標準的方法を使用して、選択されたＦａｂ断片の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅し、抗体定常領域配列を含有するプラスミドベクターにクローニングし、一時的に２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。
【０３９９】
実施例２．ＴＧＦβ抗体の結合親和性の測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、ＴＧＦβアイソフォームＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に対して、その結合親和性（ＫＤ）、オフ速度（ｋｄ）およびオン速度（ｋａ）について抗体を特性決定した。分析は、２つの方法を用いて行った。１つの方法は、ＴＧＦβタンパク質が低密度で表面に固定され、抗体が反応速度分析のために複数の濃度で注入される抗原直接固定化法であった。他方の方法は、様々な濃度の注入ＴＧＦβタンパク質の注入を使用した固定化抗体法であった。
【０４００】
固定化抗体反応速度法：
ＣＭ４センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で使用した。固定化の前に、それぞれ１００ｍＭ  ＨＣｌ、グリシン（ｐＨ２．０）、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、および流通緩衝液の５０μＬ／分の流速で２回の３０秒注入でチップを事前に調整した。固定化のための流通緩衝液は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の新たに混合した１：１溶液の１０μＬ／分での７分注入により、チップ表面を活性化した。活性化注入の後、アセテート（ｐＨ４．５）中１μｇ／ｍＬの抗ＴＧＦβ抗体を、１０μＬ／分で１分間注入し、注入は１２０ＲＵを目標とした。１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を８分注入して表面をブロックした。使用したＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔからのものであった。
【０４０１】
完全に脱気した形態の、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を添加した上記ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液の流通緩衝液を使用して、反応速度分析を行った。ＴＧＦβ試料注入は、５０μＬ／分で４分間（９００秒の解離時間）行った。各ＴＧＦβタンパク質（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）を、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．０８ｎＭ（５倍連続希釈の３５０ｎｇ／ｍＬ）で注入し、各濃度シリーズおよび４回の注入の間にブランクを注入した。次いで、それぞれ３Ｍ  ＭｇＣｌ２中の１００ｍＭ  ＨＣｌの３０秒の３回の注入、続いて最終的な３０秒のブランク緩衝液注入を行って再生を行った。
【０４０２】
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用してデータを分析し、ブランクフローセルデータおよび平均化した間のブランク注射の両方を差し引くことにより、二重参照した。（ＫＤ）をオフ速度（ｋｄ）およびオン速度（ｋａ）で同時にフィッティングすることによりデータをフィッティングしたが、これを以下の表２に示す。ＢＭ−１（１Ｄ１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ１８３５）で指定される以前に測定されたコンパレータ抗体のデータもまた表２に含まれている。ＢＭ−１データは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａ１００で生成した。簡潔に述べると、ＢＭ−１抗体は、高密度ウサギ抗マウスＦｃ  ＣＭ５チップ表面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、約１００ＲＵ密度で捕捉された。ＴＧＦβタンパク質は、３０μＬ／分で、上述と同じ濃度で注入した。これらのデータは、二重参照され、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａ１００ソフトウェアで分析された。
【０４０３】
（表２）固定化抗体および注入ＴＧＦβを利用したアッセイからの親和性データ
2020014464.tif 000005
【０４０４】
固定化抗体を使用したこのアッセイにおいて測定された親和性データは、ＸＰＡ．４２．６８１が、ＴＧＦβの３つのアイソフォームのそれぞれに対する抗体のいずれかの最も強い（最も強固な）結合を有すること、および同様の親和性でＴＧＦβアイソフォームのそれぞれに結合したことを示した。さらに、抗体ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９は、ＢＭ−１  抗体と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２アイソフォームに対して同様の、またはより強い結合を有したが、ＢＭ−１抗体と比較して、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２結合と比べて、ＴＧＦβ３アイソフォームに対して大幅に弱い結合を示した。
【０４０５】
固定化ＴＧＦβ親和性方法：
平面−ＣＯＯＨ表面を有するＣＭ１センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムで使用した。固定化の前に、それぞれ１００ｍＭ  ＨＣｌ、グリシン（ｐＨ２．０）、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ、および流通緩衝液の５０μＬ／分の流速で２回の３０秒注入でチップを事前に調整した。固定化のための流通緩衝液は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の新たに混合した１：１溶液の２０μＬ／分での４分注入により、チップ表面を活性化した。活性化注入の後、アセテート（ｐＨ４．０）中０．１μｇ／ｍＬのＴＧＦβの溶液を、２０μＬ／分で数分間注入した。ＴＧＦβ１がＦｃ２に、ＴＧＦβ２がＦｃ３に、ＴＧＦβ３がＦｃ４に固定化され、Ｆｃ１が活性化および非活性化ブランクとなるように、各ＴＧＦβは独自のフローセルで別個の活性化ステップを利用した。ＴＧＦβの注入は、１分から２分の一連の注入として行い、各注入の間の固定化レベルを観察した。各ＴＧＦβリガンドの目標固定化密度は、３０ＲＵであった。ＴＧＦβ固定化注入の後、１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５を４分注入して表面をブロックした。使用したＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔからのものであり、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのものであった。
【０４０６】
親和性分析のために、流通緩衝液を、完全に脱気した形態の、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を添加した上記ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液に切り替えた。抗体のそれぞれを、流通緩衝液中で５μｇ／ｍＬ（３３．３ｎＭ）に希釈し、続けて４回の５倍希釈物を調製し、それぞれ３３．３３ｎＭ、６．６７ｎＭ、１．３３ｎＭ、２６７ｐＭ、および５３ｐＭの濃度を設定した。次いで、Ｋｉｎｊｅｃｔ設定を使用して、これらを５０μＬ／分で４分注入した（９００秒の解離時間）。次いで、１００ｍＭ  ＨＣｌの５０μＬ／分で１２μＬ（１４．４秒）の注入、続いて１８秒の緩衝液注入で再生を行った。注入は、全てのフローセルにわたり同時に行い、試料を４回注入し、各抗体の減少濃度注入群の各セットの間にブランク注入を行った。これは、同じ試料が２回目に注入される前に、全ての抗体の全ての他の濃度が一度注入されたことを意味する。
【０４０７】
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用してデータを分析し、ブランクフローセルデータおよび平均化した間のブランク注射の両方を差し引くことにより、二重参照した。（ＫＤ）をオフ速度（ｋｄ）およびオン速度（ｋａ）で同時にフィッティングすることによりデータをフィッティングしたが、これを以下の表３に示す。
【０４０８】
（表３）固定化ＴＧＦβおよび注入抗体を利用したアッセイからの親和性データ
2020014464.tif 000006
【０４０９】
表２からの固定化抗体の結果と一致して、固定化抗原を使用したアッセイにおいて測定された親和性データ（表３）もまた、ＸＰＡ．４２．６８１が、ＴＧＦβアイソフォームのそれぞれに対して同様の親和性で、ＴＧＦβの３つのアイソフォームのそれぞれに対する抗体のいずれかの最も強い（最も強固な）結合を有することを示した。さらに、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９は、ＢＭ−１と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２アイソフォームに対して同様の、またはより強い結合を有したが、ＢＭ−１抗体と比較して、またはＴＧＦβ１結合と比べて、ＴＧＦβ３アイソフォームに対して大幅に弱い結合を有した。固定化抗原アッセイに対する固定化抗体を使用して測定された速度定数の差は、系の固有の複雑性に起因する可能性があるが、それにもかかわらず、それぞれ、比較的高品質の反応速度データ、ならびにＴＧＦβアイソフォームにわたる、および抗体間の互いに対する結合特性の一貫性を提供する。
【０４１０】
実施例３．ＴＧＦβ抗体による受容体競合の測定
ＴＧＦβ受容体に対する３つのＴＧＦβリガンドのそれぞれの結合を阻害またはブロックする能力に関して、ＳＰＲ競合アッセイにおいて抗体を特性決定した。ＴＧＦβは、セリントレオニンキナーゼ膜貫通タンパク質であって、活性化にはＴＧＦβ受容体１型タンパク質（ＴＧＦβ−Ｒ１）の細胞質会合を必要とする、ＴＧＦβＩＩ型受容体（ＴＧＦβ−ＲＩＩ）を介してシグナル伝達する。ＴＧＦβ−ＲＩのリガンド結合の役割は明らかではなく、ＴＧＦβ−ＲＩの組み換え形態は、試験された濃度においては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２もしくはＴＧＦβ３リガンド、またはそれらのリガンドのＴＧＦβ−ＲＩＩ結合形態のいずれに対してもいかなる結合も示さず、したがって受容体競合実験において評価することができなかった。ＴＧＦβＩＩＩ型受容体（ＴＧＦβ−ＲＩＩＩ）は、膜結合および可溶性形態の両方を有し、ＴＧＦβシグナル伝達には関与しないと考えられている。ＴＧＦβ−ＲＩＩｂは、Ｎ末端の近くに２６アミノ酸挿入を含有し、ＴＧＦβアイソフォームの３つ全てに対し良好な親和性で結合する独特の特性を有するスプライス変異体である。ＴＧＦβ−ＲＩＩは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３リガンドのみに強固に結合し、ＴＧＦβ−ＲＩＩＩは、ＴＧＦβ２リガンドに最も良好に結合する。
【０４１１】
ＣＭ５センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムで使用した。固定化の前に、それぞれ１００ｍＭ  ＨＣｌおよび５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μＬ／分の流速で数回の３０秒注入でチップを事前に調整した。固定化のための流通緩衝液は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の新たに混合した１：１溶液の１０μＬ／分での７分注入により、チップ表面を活性化した。活性化注入の後、アセテート（ｐＨ４．５）中５μｇ／ｍＬのＴＧＦβ−ＲＩＩ、ＴＧＦβ−ＲＩＩｂ、またはＴＧＦβ−ＲＩＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、２０μＬ／分で４分間注入すると、ＴＧＦβ受容体のそれぞれに対し１０００−４０００ＲＵの固定化が得られた。次いで、１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を８分注入して表面をブロックした。使用したＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔからのものであった。Ｆｃ１は、活性化および不活性化対照であった。
【０４１２】
完全に脱気した形態の、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを添加した上記ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液の流通緩衝液を使用して、競合アッセイを行った。ブランク対照以外、全ての注入においてＴＧＦβリガンドを１００ｎｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）から４０ｎｇ／ｍＬ（４ｎＭ）で使用し、１０μｇ／ｍＬ（６６．６ｎＭ）の競合物および対照抗体を用いて調製した。ＢＩＡＣＯＲＥ操作を開始する前に、試料を室温で４０分間平衡化させた。次いで、平衡化試料を１０μＬ／分で２分間注入した。ｐＨ２．５グリシンの５０μＬ／分で９．６秒（８μＬ）の１回の注入により、サイクル毎に再生を行った。少なくとも２回試料を試験し、結合したＴＧＦβのレベルを分析した。
【０４１３】
以下の表４に示されるように、抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１およびＢＭ−１コンパレータに対する結果は、これらの抗体のそれぞれが、３つ全てのＴＧＦβリガンドのＴＦＧβ−ＲＩＩおよびＴＧＦβ−ＲＩＩＩ受容体に対する会合をブロックすること、ならびに明確な区別はなされなかったことを示唆している。この受容体競合パターンは、試験された他の抗体の全ての間で普遍的ではないが、そのデータは本開示には示されていない。
【０４１４】
（表４）受容体競合アッセイＥＣ５０（ｎＭ抗体）
2020014464.tif 000007
【０４１５】
受容体競合におけるＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１およびＢＭ−１抗体の有効性は、概して、ＴＧＦβの様々なアイソフォームに対するその親和性と相関していた。
【０４１６】
実施例４．ＴＧＦβ抗体間のエピトープ競合の測定
ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９抗体がＴＧＦβタンパク質上の独立または重複エピトープに結合する能力を評価した。この対分析は、ＴＧＦβの異なるアイソフォーム間での抗体の様々な親和性、およびホモ二量体当たり２つのＩｇＧの比での結合（例えば、自己対形成）をもたらすＴＧＦβリガンドの共有結合性ホモ二量体化に起因して単純ではなかったが、可溶性競合ベースアッセイを開発した。
【０４１７】
ＣＭ５センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムで使用した。固定化の前に、１００ｍＭ  ＨＣｌの５０μＬ／分の流速で４回の３０秒注入でチップを事前に調整した。固定化のための流通緩衝液は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の新たに混合した１：１溶液の１０μＬ／分での７分注入により、チップ表面を活性化した。活性化注入の後、アセテート（ｐＨ４．５）中１μｇ／ｍＬの抗体ＸＰＡ．４２．０８９を、１０μＬ／分で数分間注入した。注入を順次監視して行い、３００ＲＵに極めて近い固定化レベルを確立した。１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を８分注入して表面をブロックした。使用したＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔからのものであった。Ｆｃ１は、活性化および不活性化対照であった。
【０４１８】
完全に脱気した形態の、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを添加した上記ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液の流通緩衝液を使用して、競合アッセイを行った。ブランク対照以外、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を全ての注入において０．１μｇ／ｍＬ（４ｎＭ）で使用し、２０μｇ／ｍＬ（１３３ｎＭ）の競合抗体を用いて調製した。ＴＧＦβ−ＲＩＩｂ−Ｆｃ組み換え受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）もまた、競合物として含めた。ＢＩＡＣＯＲＥ操作を開始する前に、試料を室温で４０分間平衡化させた。次いで、フローセルの全てにわたり、平衡化試料を３０μＬ／分で３分間注入した。５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μＬ／分で６秒（５μＬ）の１回の注入、続いて３０秒の緩衝液注入により、サイクル毎に再生を行った。２回試料を試験し、３分の最後に結合したＴＧＦβのレベルを分析した。
【０４１９】
（表５）結合競合（固定化ＸＰＡ．４２．０８９）
2020014464.tif 000008
【０４２０】
上記表５に示されるように、データは、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９が、ＴＧＦβアイソフォームのそれぞれの結合に対して互いに強い競合を示したことを示している。値は、複合体の注入中に測定された平均ＲＵまたはＴＧＦβ結合のシグナル強度を表す。これは、複合化抗体が存在する場合シグナルが大きく低減されることを示す。注入中の複合体のいかなる解離も、遊離または一価結合ＴＧＦβにＸＰＡ．４２．０８９捕捉抗体が結合するのを可能にし得る。ＴＧＦβ２とのＴＧＦβ−ＲＩＩｂの相互作用は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３タンパク質よりもはるかに弱く、速いオフ速度は、高親和性ＸＰＡ．４２．０８９に対するＴＧＦβ２の比較的低い競合を可能にすることが示されている。ＸＰＡ．４２．０６８から得られるＸＰＡ．４２．６８１抗体は、競合アッセイにおいて試験しなかった。
【０４２１】
実施例５．ＴＧＦβ抗体によるｒｈＬＡＰ競合の測定
抗体がＴＧＦβの潜在的形態とも相互作用するかどうかを決定するために、更なる競合アッセイを行った。ＴＧＦβ前駆タンパク質は、フューリン様転換酵素により、ゴルジ内でＮ末端２４９アミノ酸潜在関連ペプチドおよびＣ末端１１２アミノ酸成熟ＴＧＦβ１に切断される。
【０４２２】
ＣＭ５センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムで使用した。固定化の前に、それぞれ１００ｍＭ  ＨＣｌおよび５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μＬ／分の流速で数回の３０秒注入でチップを事前に調整した。固定化のための流通緩衝液は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の新たに混合した１：１溶液の１０μＬ／分での７分注入により、チップ表面を活性化した。活性化注入の後、アセテート（ｐＨ４．５）中２μｇ／ｍＬの組み換えヒトＴＧＦβ１潜在関連ペプチド（ｒｈＬＡＰ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１０μＬ／分で４分間注入すると、ｒｈＬＡＰの４００ＲＵの固定化が得られた。１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を８分注入して表面をブロックした。Ｆｃ１は、活性化および不活性化対照であった。
【０４２３】
完全に脱気した、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを添加した上記ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液の流通緩衝液を使用して、ｒｈＬＡＰ競合アッセイを行った。ブランク対照以外、全ての注入においてＴＧＦβ１を０．２５μｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）で使用し、１０μｇ／ｍＬ（６６．６ｎＭ）の競合物および対照抗体を用いて調製した。ＢＩＡＣＯＲＥ操作を開始する前に、試料を室温で４０分間平衡化させた。次いで、対照およびｒｈＬＡＰ表面にわたり平衡化試料を４０μＬ／分で２分間注入した。１００ｍＭ  ＨＣｌの１００μＬ／分で９．６秒（１６μＬ）の２回の注入により、サイクル毎に再生を行った。２回試料を試験し、結合したＴＧＦβ１のレベルを分析した。
【０４２４】
抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＢＭ−１コンパレータを、それぞれｒｈＬＡＰ競合アッセイにおいて試験した。ＸＰＡ．４２．０６８から得られるＸＰＡ．４２．６８１抗体は試験しなかった。図１に示されるように、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＢＭ−１はそれぞれ、ｒｈＬＡＰとの高レベルの競合を示したが、これは、抗体がＴＧＦβの活性形態と相互作用し、潜在的ＴＧＦβを認識しないことを示している。
【０４２５】
実施例６．ＨＴ−２アッセイにおけるＴＧＦβ抗体による中和の測定
抗体がＴＧＦβアイソフォームを機能的に中和するかどうかを決定するために、Ｒｕｅｇｅｍｅｒら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：１７６７−７６；１９９０）のアッセイ方法を適合させ、ＨＴ−２マウスＴ細胞を、ＩＬ−４とともに、およびＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３の添加あり、またはなしで増殖させる。ＴＧＦβアイソフォームは、細胞周期停止を促進する遺伝子のトランス活性化により、ＨＴ−２細胞のＩＬ−４依存性増殖を阻害する。ＩＬ−４は、ｃ−ｍｙｃおよびＧＭ−ＣＳＦ等の標的を活性化することにより分裂促進遺伝子発現プログラムをトランス活性化し、一方ＴＧＦβシグナル伝達は、ｃ−ｍｙｃおよびＧＭ−ＣＳＦ発現を抑制する遺伝子をトランス活性化する。抗体を中和することによりＴＧＦβシグナル伝達が無効化されれば、ＨＴ−２細胞が増殖する。増殖の差は、ＡＴＰを代謝活性細胞の計測値として測定するＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７１）生存能力アッセイによりスコア化した。
【０４２６】
ＨＴ−２マウスＴ細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭグルタミン、５０μＭ  ２−ＭＥ中で、２〜３日毎に１．５ｅ４〜２．５ｅ４細胞／ｍＬで分裂することにより維持した。濃縮ストックから、新鮮な組み換えマウスＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２００ＩＵ／ｍＬで各フラスコに添加した。１日目に、細胞を培地中で洗浄してＩＬ−２を除去し、不透明９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞で２０００  ＩＵ／ｍｌ組み換えマウスＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で分注した。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃１００−２１、１００−３５Ｂ、１００−３６Ｅ）を、滴定シリーズにわたり、抗体あり、または抗体なしでの１時間のプレインキュベーション後に添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、製造者の推奨に従い、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）を使用して、生存細胞集団をＭＤＳ  Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３でスコア化した。
【０４２７】
（表６）ＨＴ−２細胞中和アッセイ
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【０４２８】
抗体を、まずＴＧＦβ２活性の中和に関して、ＨＴ−２アッセイにおける単一１０μｇ／ｍＬ希釈点で試験したが、抗体のそれぞれは陽性であり、抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１は、試験された単一点においてＢＭ−１コンパレータ抗体よりも高い有効性を有することが確認された。次いで、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の中和を決定し、６点希釈シリーズにわたり各抗体のＩＣ５０を計算した。この場合も、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１のそれぞれが、ＴＧＦβ１中和に関してＢＭ−１コンパレータよりも高い有効性を示したが、ＸＰＡ．４２．６８１だけが、より高い有効性のＴＧＦβ３中和を示すことが判明し、したがって、最も有効なＴＧＦβの汎阻害剤であった（表６）。ＸＰＡ．４２．６８１は、このアッセイにおいて向上した有効性を示し、試験した最も低い濃度でＴＧＦβ１を著しく阻害し、したがって特定のＩＣ５０計算は行うことができなかった。
【０４２９】
実施例７．ＩＬ−１１放出アッセイにおけるＴＧＦβ抗体による中和の測定
第２の中和アッセイは、肺線維芽細胞および上皮細胞における線維症促進反応の一部である、Ａ５４９肺癌細胞からのＩＬ−１１のＴＧＦβ媒介分泌をスコア化した。ＴＧＦβはまた、骨への転移を促進するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのＩＬ−１１の分泌を媒介する。このアッセイは、線維症および転移疾患に寄与するＴＧＦβ媒介生物学的反応をモデル化する。ＩＬ−１１放出アッセイは、Ｒａｐｏｚａら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１６：１８−２６；２００６）から適合され、Ａ５４９細胞は、９６ウェルプレート内に播種され、翌日、細胞を、中和抗体あり、またはなしでプレインキュベートしたＴＧＦβアイソフォームありまたはなしで処理した。ＩＬ−１１放出は、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清中でスコア化された。
【０４３０】
このアッセイにおいて、Ａ５４９細胞をＦ１２＋１０％血清中で増殖させた。分析の前日、細胞をヴェルセンで剥離し（受容体発現を保持するため）、９６ウェル平底プレート内に４０，０００細胞／ウェルで播種した。翌日、細胞への添加前に、希釈シリーズにわたり、ＥＣ８０のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３を、抗体あり、またはなしで１時間プレインキュベートした。対照として、ＴＧＦβのみ、ＴＧＦβ＋抗ＫＬＨ−Ｇ２対照抗体、または培地のみをプレートに添加した。３７℃で２４時間後、上清を採取し、製造者の推奨に従い、ＩＬ−１１  Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＩＬ−１１をＥＬＩＳＡによりスコア化した。
【０４３１】
（表７）ＩＬ−１１放出アッセイ−ＩＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）
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【０４３２】
上記表７に示されるように、またＨＴ−２アッセイに類似して、ＩＬ−１１放出アッセイ結果は、ＴＧＦβの３つのアイソフォームのそれぞれに対して、ＸＰＡ．４２．６８１が抗体のうち最も効果的であることを示した。ＨＴ−２アッセイとは対照的に、ＸＰＡ．４２．６８１抗体は、ＩＬ−１１放出に対して用量依存的な効果を示し、これがＩＣ５０決定を可能にし、また各ＴＧＦβアイソフォームに対し概して類似したＩＣ５０を明確に示した。また、抗体ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２アイソフォームの良好な中和を示した（ＢＭ−１コンパレータよりも有効）が、ＢＭ−１抗体と比較して、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の中和と比べて、ＴＧＦβ３の中和は大幅に低かった。
【０４３３】
実施例８．ｐＳＭＡＤ２アッセイにおけるＴＧＦβ抗体による中和の測定
抗体をさらに特性決定するために、ホスホ−ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）アッセイを開発し、ＴＧＦβＲＩＩ／ＴＧＦβＲＩ受容体複合体を介したＴＧＦβシグナル伝達の中和をスコア化した。Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞をＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ中に維持した。細胞をヴェルセンで剥離し、６ウェル皿内にウェル当たり５００，０００細胞で播種した。翌日、細胞を無血清ＩＭＤＭ中で３時間血清飢餓状態としてから、抗体あり、またはなしで１時間プレインキュベートしたＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３に３０分暴露した。３７℃で３０分後、細胞を溶解し、検出のための製造者の推奨に従い、市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用して、ｐＳＭＡＤ２および全ＳＭＡＤ２をＥＬＩＳＡによりスコア化した。ｐＳＭＡＤ２のパーセンテージを全ＳＭＡＤ２に正規化し、抗ＫＬＨ対照に対する正規化％ｐＳＭＡＤ２から、各クローンに対してパーセント阻害を計算した（図２）。Ｔ検定（両側）は、ＸＰＡ．４２．６８１抗体が、全てのＴＧＦβアイソフォームにわたり、ｐＳＭＡＤシグナル伝達の中和において、ＢＭ−１コンパレータ抗体よりも有意に有効であることを示した（ｐ＜０．０５）。さらに、ＸＰＡ．４２．０６８は、ＢＭ−１コンパレータと比べてＴＧＦβ２に対して有意に有効であった。
【０４３４】
実施例９．調節性Ｔ細胞アッセイにおけるＴＧＦβ抗体活性の測定
内因性ＴＧＦβに対する抗体の活性を特性決定するために、Ｔｒａｎら（Ｂｌｏｏｄ  １１０：２９８３−２９９０；２００７）と同様の方法に基づき調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞アッセイを確立した。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を使用して、ヒトＰＢＭＣの凍結バイアルからＴ細胞を単離した。プレート結合抗ヒトＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を１０μｇ／ｍＬで、および可溶性抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を２μｇ／ｍＬで用いて、Ｔ細胞を活性化した。また、細胞を、同時に１５μｇ／ｍＬのＴＧＦβ抗体または対照で処理した。４日後、細胞を、４℃で３０分間、抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ヒトＣＤ２５−Ａ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。細胞を室温で２０分間ＦＯＸＰ３固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定し、室温で１５分間ＦＯＸＰ３透過処理緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で透過処理した。細胞を、１：２５希釈の抗ヒトＦＯＸＰ３−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）システムで分析した。ＣＤ４＋細胞をゲートし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋亜集団をＦｌｏｗｊｏソフトウェアで定量化した。このアッセイにおいて、４つまたは５つの異なるＰＢＭＣドナーを使用して抗体を評価したが、２つのドナーからの代表的なデータを示す（図３）。
【０４３５】
細胞集団におけるドナー依存的差異に起因して、活性の幅が見られたが、概して、ＸＰＡ．４２．６８１およびＢＭ−１コンパレータ抗体は、Ｔｒｅｇ細胞集団を阻害し、一方でＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９抗体は、このアッセイにおいて部分活性を提供した。
【０４３６】
実施例１０．ＥＭＴアッセイにおけるＴＧＦβ抗体活性の測定
上皮間葉移行（ＥＭＴ）は、腫瘍細胞の自己再生を可能にし、癌の浸潤および転移を促進する。ＥＭＴの誘発は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含むサイトカインにより誘導され、３つ全てのアイソフォームは、組織型に依存してＥＭＴにおいて順次に関与し得る（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：５３０−５４５，１９９９；Ｂｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：２７−３６，２００１；Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４８：１７０−１８１，２００２）。ＥＭＴアッセイを、Ｍａｎｉら（Ｃｅｌｌ  １３３：７０４−７１５；２００８）と同様に、抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのプロセスを阻害するかどうかを決定するために、初代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を使用して開発した。
【０４３７】
ヒト乳房上皮細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、ＭＥＧＭ完全培地（Ｌｏｎｚａ）中で、製造者により推奨されるように増殖させた。継代培養のために、細胞をトリプシン処理し、トリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａ）で処理してから播種した。ＨＭＥＣ細胞を、８ウェルチャンバースライド内で３５００細胞／ｃｍ２で播種し、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβあり、またはなしで処理し、抗体あり、またはなしで３０分間プレインキュベートした。細胞を３７℃で８日間インキュベートし、４日後に新鮮な培地＋試薬を添加した。８日目に、細胞を室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中で２回濯ぎ、ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１０分間透過処理してから、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ＋１０％ヤギ血清で３０分間ブロックした。間葉マーカーには抗ヒトビメンチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用して、上皮マーカーには抗ヒトＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して（それぞれ１：２００または１：５００に希釈）、細胞を４℃で一晩染色した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、ブロック溶液中で希釈した適切な２次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で室温で１時間インキュベートし、光から保護した。スライドを洗浄し、Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅ／ＤＡＰＩを設置してから、蛍光顕微鏡法を行った。
【０４３８】
抗ＫＬＨ対照抗体の存在下でのＨＭＥＣ細胞のＴＧＦβへの暴露は、増加したビメンチン染色および全細胞密度の低減をもたらし、ＴＧＦβ媒介増殖停止および間葉表現型への分化と一致する。ＴＧＦβ１媒介ＥＭＴの中和は、低減したビメンチン染色に基づき明らかであったが、これは、ＸＰＡ．４２．６８１、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９抗体に対する増加した細胞密度に相関し、一方で、ＢＭ−１コンパレータに対して、ビメンチン染色が存在する場合、中間的反応が観察されたが、抗ＫＬＨ対照と同じ程度ではなかった（データは示さず）。さらに、抗体のそれぞれは、ＴＧＦβ２により誘導されるＥＭＴを阻害したが、ＢＭ−１コンパレータ抗体は、ビメンチンシグナル強度、Ｅ−カドヘリン染色および増加した細胞密度に基づき、より有効性が低いようであった。ＴＧＦβ３媒介ＥＭＴの中和のためには、ＸＰＡ．４２．６８１抗体が最も有効であり、続いてＢＭ−１およびＸＰＡ．４２．０６８が有効であり、一方ＸＰＡ．４２．０８９は、抗ＫＬＨ対照と変わらないようであった。
【０４３９】
実施例１１．異種移植マウスモデルにおけるＴＧＦβ抗体による腫瘍阻害
抗体ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９を、ヒト咽頭癌細胞系であるＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２から得られた異種移植片モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力について評価した（Ｖａｎ  Ａａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：５６１−７０；２００８）。８から９週齢のＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の左下腹部領域に、動物当たりＢＤ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：１、２００ｕＬ）中の５×１０６のＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞を皮下移植した。動物を、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＸＰＡ．４２．０６８（１、３もしくは１０ｍｇ／ｋｇ用量）、ＸＰＡ．４２．０８９（１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ用量）、ＢＭ−１コンパレータ（３ｍｇ／ｋｇ）、またはマウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ）の、それぞれ１２匹のマウスの試験群に無作為割り当てをした。投薬および腫瘍体積測定を週２回行った（図４）。動物を最後の投薬後の日（２８日目）、抗体処置の７回の投薬後に動物を致死させた。全ての測定において、統計的有意性は、片側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により決定した。
【０４４０】
図４に示されるように、ＸＰＡ．４２．０８９で処置された腫瘍は、ＸＰＡ．４２．０６８で処置された腫瘍よりも小さい傾向にあり、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２対照と比較するとより高い投薬レベルにおいて有意な差があった。全ての試験群において、２８日目にパーセント腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）をＩｇＧ対照抗体と比較した。ＸＰＡ．４２．０６８（３および１０ｍｇ／ｋｇ）、ＸＰＡ．４２．０８９（３および１０ｍｇ／ｋｇ）、さらにＢＭ−１コンパレータ（３ｍｇ／ｋｇ）処置群からの腫瘍は、２８日目において、１ｍｇ／ｋｇ処置群よりも有意に小さかった（Ｐ値＜０．０５）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇでのＸＰＡ．４２．０６８ならびに３および１０ｍｇ／ｋｇでのＸＰＡ．４２．０８９は、ＴｕｋｅｙのＡＮＯＶＡ検定を使用すると、ＩｇＧ対照と比較して有意な差を示した（表８）。
【０４４１】
（表８）異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍成長阻害
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【０４４２】
抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１を使用して、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２異種移植片モデルにおけるさらなる評価を行った。８から９週齢のＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の左下腹部領域に、動物当たりＢＤ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：１、２００ｕＬ）中の５×１０６のＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞を皮下移植した。動物を、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照（３ｍｇ／ｋｇ）、ＸＰＡ．４２．０６８（１または３ｍｇ／ｋｇ用量）、ＸＰＡ．４２．０８９（１または３ｍｇ／ｋｇ用量）、ＸＰＡ．４２．６８１（１または３ｍｇ／ｋｇ用量）、ＢＭ−１コンパレータ（１または３ｍｇ／ｋｇ）の、それぞれ１２匹のマウスの試験群に無作為化した。投薬および腫瘍体積測定を週２回行った（図５）。動物を最後の投薬後の日（３０日目）、抗体処置の７回の投薬後に動物を致死させた。全ての測定において、統計的有意性は、片側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により決定した。
【０４４３】
図５および表９に示されるように、ＸＰＡ．４２．６８１、ＸＰＡ．４２．０８９、およびＢＭ−１コンパレータで３ｍｇ／ｋｇで処置された腫瘍は、３０日目におけるパーセントＴＧＩおよび平均腫瘍体積において、対照抗体と比較して有意な差を示した。これらの群の間の比較は、ＴｕｋｅｙのＡＮＯＶＡ検定を使用すると、有意な差を示さなかった。
【０４４４】
（表９）異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍成長阻害
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【０４４５】
実施例１２．同系マウスモデルにおけるＴＧＦβ抗体による腫瘍阻害
抗体ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９を、さらに、Ｎａｍら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：３９１５−２３；２００８）から適合させたプロトコルを用いて、４Ｔ１乳癌細胞を使用して同系モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力について評価した。０日目に、８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの第４乳房脂肪体に、２５０，０００  ４Ｔ１細胞を皮下移植した。動物を、それぞれ１２匹のマウスの試験群に無作為割り当てをし、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、ＢＭ−１コンパレータ、またはマウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１を用い、１０ｍｇ／ｋｇの単回投薬レベルで週３回抗体を投与した（１日目に開始）。実験を通して腫瘍体積を週２回測定したが、データを図６に示す。試験最後の腫瘍体積データは、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．０８９の両方が、ＫＬＨ対照抗体と比較して腫瘍成長を有意に阻害したことを示した。
【０４４６】
さらに、最終試験日（２３日目）に動物を致死させ、腫瘍を取り出して腫瘍重量を測定した。ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８およびＢＭ−１抗体はそれぞれ、ヒトまたはマウス対照抗体に比べて腫瘍質量を有意に低減した（図７）。
【０４４７】
抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１を使用して、４Ｔ１同系モデルにおけるさらなる評価を行った。０日目に、８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスの第４乳房脂肪体に、２５０，０００  ４Ｔ１細胞を皮下移植した。動物を、それぞれ１２匹のマウスの試験群に無作為割り当てをし、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１、ＢＭ−１、またはマウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１を用い、１０ｍｇ／ｋｇの単回投薬レベルで週３回抗体を投与した（１日目に開始）。実験を通して腫瘍体積を週２回測定したが、データを図８に示す。試験最後の腫瘍体積データは、抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１およびＢＭ−１がそれぞれ、ヒトまたはマウス対照抗体と比較して腫瘍成長を有意に阻害することを示した。
【０４４８】
さらに、最終試験日（２１日目）に動物を致死させ、腫瘍を取り出して腫瘍重量を測定した。ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．６８１およびＢＭ−１抗体はそれぞれ、ヒトまたはマウス対照抗体に比べて腫瘍質量を有意に低減した（図９）。
【０４４９】
実施例１３．マウス腫瘍モデルにおける、ＮＫ細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＧＦβ抗体が腫瘍に存在するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対してｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調整効果を示したかどうかを評価するために、上記４Ｔ１同系モデル実験におけるマウスから取り出した分離腫瘍を消化させ、単一細胞懸濁液を生成した。簡潔に述べると、新しく採取された腫瘍を細かくし、ＨＢＳＳ中２．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩおよび２．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ中で消化させた（３７℃で１５分）。細胞を計数し、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３および１０μｇ／ｍＬの２．４Ｇ２抗マウスＦｃ遮断抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に２ｅ６／ｍＬで再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で洗浄した後、フローサイトメトリー分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による免疫蛍光染色のためにコンジュゲートした抗ＣＤ３３５（抗ＮＫｐ４６）抗体で、細胞を４℃で３０分間染色した。ＮＫｐ４６としても知られるＣＤ３３５は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にのみ発現する細胞表面マーカーであり、ＮＫ細胞の普遍的マーカーであるとされている。新しく調製した２％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）システムで分析した。比較のために、単一色対照もまた調製した。図１０に示されるように、ＸＰＡ．４２．０８９抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マウスから取り出された腫瘍内のＮＫ細胞マーカーＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）の発現を有意に増加させた。ＢＭ−１、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は、ＮＫｐ４６の同様の増加をもたらさなかった。
【０４５０】
実施例１４．マウス腫瘍モデルにおける、ＭＤＳＣに対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＧＦβ抗体が腫瘍に存在する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋）に対してｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調整効果を示したかどうかを評価するために、４Ｔ１同系モデル実験におけるマウスから取り出した分離腫瘍を上記のように調製し、フローサイトメトリー分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による免疫蛍光染色のためにコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂおよび抗Ｇｒ１抗体で、４℃で３０分間染色した。αＭ−インテグリンとしても知られるＣＤ１１ｂ、およびＬｙ６Ｇとしても知られる骨髄細胞系分化抗原Ｇｒ１は、ＭＤＳＣ上に同時発現する細胞表面マーカーである。新しく調製した２％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）システムで分析した。比較のために、単一色対照もまた調製した。図１１に示されるように、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マウスから取り出された腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ、ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋）の蓄積を有意に減少させた。ＢＭ−１コンパレータ抗体は、ＭＤＳＣの同様の減少を示さなかった。
【０４５１】
実施例１５．マウス腫瘍モデルにおける、樹状細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＧＦβ抗体が腫瘍に存在する樹状細胞（ＤＣ）に対してｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調整効果を示したかどうかを評価するために、４Ｔ１同系モデル実験におけるマウスから取り出した分離腫瘍を上記のように調製し、フローサイトメトリー分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による免疫蛍光染色のためにコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｃ抗体で、４℃で３０分間染色した。αＸインテグリンとしても知られるＣＤ１１ｃは、ＤＣ上に見られる細胞表面マーカーである。新しく調製した２％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）システムで分析した。比較のために、単一色対照もまた調製した。図１２に示されるように、ＸＰＡ．４２．０８９抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マウスから取り出された腫瘍内のＤＣマーカーＣＤ１１ｃの発現を有意に減少させた。ＢＭ−１、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は、ＣＤ１１ｃの同様の減少を示さなかった。
【０４５２】
実施例１６．マウス腫瘍モデルにおける、調節性Ｔ細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＧＦβ抗体が腫瘍に存在する調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対してｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調整効果を示したかどうかを評価するために、４Ｔ１同系モデル実験におけるマウスから取り出した分離腫瘍を上記のように調製し、フローサイトメトリー分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による免疫蛍光染色のためにコンジュゲートした抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５および抗ＦＯＸＰ３抗体で、４℃で３０分間染色した。Ｌ３Ｔ４としても知られるＣＤ４、および低親和性ＩＬ−２Ｒαとしても知られるＣＤ２５、さらにＦｏｒｋｈｅａｄボックスタンパク質Ｐ３としても知られるＦＯＸＰ３は、それぞれＴｒｅｇ細胞上に見られる細胞表面マーカーである。新しく調製した２％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）システムで分析した。比較のために、単一色対照もまた調製した。図１３に示されるように、ＸＰＡ．４２．０６８抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マウスから取り出された腫瘍内のＴｒｅｇ細胞の蓄積を有意に減少させた。ＢＭ−１、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は、Ｔ−ｒｅｇ細胞の同様の減少を示さなかった。
【０４５３】
実施例１７．マウス腫瘍モデルにおける、細胞傷害性Ｔ細胞に対するＴＧＦβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＧＦβ抗体が腫瘍に存在する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対してｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調整効果を示したどうかを評価するために、４Ｔ１同系モデル実験におけるマウスから取り出した分離腫瘍を上記のように調製し、フローサイトメトリー分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による免疫蛍光染色のためにコンジュゲートした抗ＣＤ８抗体で、４℃で３０分間染色した。ＣＤ８は、ＣＴＬ上に見られる細胞表面マーカーである。新しく調製した２％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）システムで分析した。比較のために、単一色対照もまた調製した。図１４に示されるように、ＸＰＡ．４２．０６８抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マウスから取り出された腫瘍内のＣＴＬのレベルを有意に増加させた。ＢＭ−１、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は、ＣＴＬの同様の減少を示さなかった。
【０４５４】
上記の結果は、本明細書において開示される抗ＴＧＦβ抗体が、腫瘍体積サイズを減少させるとともに、腫瘍に浸潤して腫瘍成長に寄与する免疫細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで調整する能力を有することを実証している。これは、本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体が、癌の治療において、具体的には上記実施例における免疫細胞の任意の１つ以上が腫瘍細胞に浸潤する癌において、治療上の利益を提供することを示唆している。
【０４５５】
実施例１８．ＮＫ細胞の細胞溶解活性の改善
ＮＫ細胞の細胞溶解活性を改善する抗ＴＧＦβ抗体の能力を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞と腫瘍細胞との間の慢性的相互作用を模倣するようにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞共培養系を開発した。ＴＧＦβ産生マウス乳癌細胞系、４Ｔ１を使用した。正常Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓からＮＫ細胞を精製し、６ウェルプレート内で、ＣＦＳＥ標識化４Ｔ１腫瘍細胞とともに４８時間、ＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で共培養した。抗ＴＧＦβおよび対照抗体を共培養系に添加し、４８時間後にＮＫ細胞を採取した。ＮＫ細胞のＩＦＮγ産生を、細胞内染色により共培養の直後に測定した。ＮＫ細胞をＣＦＳＥ陰性細胞として分類し、その細胞溶解活性を、Ｙａｃ−１腫瘍細胞系に対する標準的な死滅アッセイにより分析した。ＮＫ細胞を、２０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間、９６ウェル丸底プレート内でＣＦＳＥ標識化Ｙａｃ−１細胞と共培養した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して細胞死をマーキングした。
【０４５６】
ＮＫ細胞は、抗ＫＬＨ標的化群と比較して、抗体標的化群の間でＩＦＮγ産生の上昇を示したが、有意な増加を示さなかった。死滅アッセイにおいて、２０：１のエフェクター：標的比で、ＢＭ−１抗体ならびにＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体の両方は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性を有意に改善した（図１５）。さらに、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は両方とも、標的腫瘍細胞を死滅させるＮＫ細胞の能力を９７．８％および９６．７％まで増加させたが、これらのレベルは、基準コンパレータよりも有意に高いレベルであった（Ｐ＜０．０００１）。この結果は、本開示のＴＧＦβ中和抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＧＦβ産生腫瘍細胞との慢性相互作用により減衰するＮＫ細胞の細胞溶解活性を有意に改善し得ることを示している。
【０４５７】
実施例１９．ＣＤ８＋樹状細胞の寛容原性機能の阻害
ＣＤ８＋樹状細胞（ＤＣ）に対するＴＧＦ−βの寛容原性機能を阻害する抗ＴＧＦβ抗体の能力を評価するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を開発した。ＭＬＲは、外部抗原を系に添加することなくＤＣ抗原の提示を試験するために使用される古典的な実験である。正常Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓を微小断片に切断し、１０％ＲＰＭＩおよび１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型中、３７℃で１時間振盪インキュベータ内でインキュベートした。さらに５分間ＥＤＴＡを添加した後、ナイロンメッシュを通して溶液を濾過した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ビオチニル化抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色し、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ビオチン精製キットを使用して、正の選択を行った。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ＣＤ８抗体で染色した。ＣＤ８＋およびＣＤ８−集団を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）細胞分類機で分類した。ＣＤ８＋  ＤＣを、抗ＴＧＦβ抗体または対照抗体とともに２４時間培養し、ＣＤ８−  ＤＣに１：１０比で混合した。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｔ細胞陰性選択キットを使用して、正常Ｂ６脾臓からＴ細胞を精製し、ＣＦＳＥで標識化した。次いで、９６ウェル丸底プレート内で、混合ＤＣをＢ６  Ｔ細胞とともに５日間共培養した。ＣＤ８＋  ＤＣの免疫阻害機能を、Ｔ細胞増殖により評価した。ＣＤ８＋  ＤＣが、抗原を提示するＣＤ８−  ＤＣの能力を阻害する場合、Ｂ６  Ｔ細胞の増殖はより少ない。抗ＴＧＦβ抗体が自己分泌ＴＧＦβをブロックし、ＣＤ８＋  ＤＣ寛容原性機能を減衰させる場合、Ｂ６  Ｔ細胞の増殖はより多い。
【０４５８】
図１６に示されるように、ＢＭ−１処置群においては、抗ＫＬＨ対照群と比較して、Ｔ細胞増殖の変化はほとんど観察されなかった。対照的に、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は両方とも、対照抗ＫＬＨ処置群と比較して、Ｔ細胞増殖を有意に増加させ、Ｔ細胞増殖に対するＸＰＡ．４２．６８１の効果は、基準抗体ＢＭ−１と比較して有意であった。これらのデータは、ＴＧＦ−βをブロックすることにより、免役原性ＤＣに対するＣＤ８＋  ＤＣの寛容原性作用を低減することができることを示しており、これは、免役原性ＤＣによる向上した抗原提示を提供し得る。
【０４５９】
実施例２０．ＣＴＬ機能の向上
腫瘍条件下でのＣＴＬの活性化を模倣し、ＣＴＬ機能が抗ＴＧＦβ抗体により向上され得るかどうかを決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を開発した。パーフォリンおよびグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の染色によって、ＣＤ２５の発現および機能によりＣＴＬ活性化を評価した（Ｍａｓｓａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８：３６９−３８０，２００５）。Ｔ細胞陰性選択（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、正常Ｂａｌｂ／ｃ脾臓からＴ細胞を精製した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によるＴ細胞活性化／発現キットを用いて、ＭＡＣビーズを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングした。９６ウェル丸底プレート内で、抗ＴＧＦβ抗体および対照抗体とともに、Ｔ細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８コーティングＭＡＣビーズを、２０μｌの４Ｔ１培養物上清の存在下で、２×１０ｅ６／ｍＬの濃度で１：１比で４８時間共培養した。細胞表面上のＣＤ２５発現によりＣＴＬ活性化を評価し、ＦｏｘＰ３染色プロトコルを使用した細胞内染色により決定される、ＧｚｍＢ（図１７Ａ）およびパーフォリン（図１７Ｂ）の発現により機能を評価した。
【０４６０】
公開データと一致して、抗体処置群および対照群との間でＣＤ２５発現における変化は観察されなかった。ＢＭ−１処置ＣＴＬは、ＧｚｍＢおよびパーフォリン発現の両方で最小の変化を示した。しかしながら、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１抗体は両方とも、対照抗ＫＬＨ処置と比較して、ＣＴＬにおけるＧｚｍＢ発現を有意に増加させた（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＸＰＡ．４２．０８９処置ＣＴＬにおけるＧｚｍＢ発現の増加は、コンパレータＢＭ−１（Ｐ＜０．０５）よりも有意に大きかった。パーフォリン発現において、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１処置ＣＴＬは両方とも、対照抗ＫＬＨ処置ＣＴＬ（Ｐ＜０．０５）と比較して有意により多くのパーフォリンを産生した。さらに、ＸＰＡ．４２．６８１は、有意にＢＭ−１コンパレータよりもＣＴＬにおけるパーフォリン発現を改善した（Ｐ＜０．０５）。したがって、ＸＰＡ．４２．０８９およびＸＰＡ．４２．６８１は両方とも、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、腫瘍細胞から分泌されたＴＧＦ−βにより抑制されたＧｚｍＢおよびパーフォリンの両方の発現を修復することができ、したがって、腫瘍細胞により産生されたＴＧＦβを中和することによりＣＴＬ機能を促進するためのメカニズムを提供する。
【０４６１】
実施例２１．ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ機能の阻害
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増加および機能に対する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の効果、ならびにＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ活性を阻害する本開示の抗ＴＧＦβ抗体の能力を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養系を開発した。
【０４６２】
ＭＤＳＣは、腫瘍に対する免役反応を抑制し、腫瘍浸潤および転移を促進するとともに、免役反応を下方調節することが知られているＴｒｅｇの増加および機能を促進することが知られている。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部乳腺に、５０μｌの１×ＰＢＳ中の７×１０３４Ｔ１腫瘍細胞を接種する。２１日目に脾臓を採取し、ビオチン標識化ＣＤ１１ｂ抗体およびビオチン陽性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＭＤＳＣを精製する。同時に、正常ＢＡＬＢ／ｃ脾臓を採取し、Ｔ細胞陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＴ細胞を精製する。細胞を、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ２５−ＰＥで染色する。二重陽性細胞をＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）細胞分類機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分類する。Ｔｒｅｇ集団をＣＦＳＥ標識化し、抗ＴＧＦβまたは対照抗体の存在下で、４Ｔ１腫瘍注入マウスからのＭＤＳＣとともに１：１比で５日間共培養する。Ｔｒｅｇの増加をＣＦＳＥ分割により測定する。Ｔｒｅｇ機能に対するＭＤＳＣの効果を評価するために、４Ｔ１注入ＢａｌＢ／ｃマウスから採取されたＭＤＳＣをＣＦＳＥ標識化し、抗ＴＧＦβまたは対照抗体の存在下で、Ｔｒｅｇとともに５日間共培養する。Ｔｒｅｇを、共培養物からＣＦＳＥ陰性集団として分類する。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＴ細胞をＣＦＳＥ標識化し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズで２×１０６細胞／ｍｌで播種する。分類したＴｒｅｇを、培養系に添加する。Ｔ細胞のＣＦＳＥ分割の数を分析することにより、Ｔｒｅｇの阻害機能を測定する。
【０４６３】
実施例２２．マウスモデルにおけるＴＧＦβ抗体による線維症の阻害
本開示の抗体を、さらに、線維症の動物モデルにおいて、線維症（例えば、肺線維症、腎臓線維症）を阻害する能力について評価する。
【０４６４】
腎臓線維症
腎臓線維症モデルを使用して、抗ＴＧＦβ抗体を評価した（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４：３７７−３８８；２００３）。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ、３０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照としてのオリーブ油を、低塩食（ＬＳＤ、５０〜１００ｐｐｍ  ＮａＣｌ）の６〜７週齢雄ＩＣＲマウスに１日１回４週間皮下注射し、腎臓線維症疾患を発症させた。対照マウスは通常食で維持され、ＣｓＡを与えられなかった。ＣｓＡ処置を開始する１日前に、抗ＴＧＦβ抗体ＸＰＡ．４２．０８９またはＩｇＧ対照抗体の腹腔内投薬（２．５ｍｇ／ｋｇ、ＴＩＷ）を開始した。動物を安楽死させ、組織学および腎機能評価項目を評価するために、血清、尿および腎臓を採取した。
【０４６５】
標準的技法を用いて、ホルマリン固定およびパラフィン包埋腎臓切片（５μｍ）をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭａｓｓｏｎトリクロムで染色することにより、組織病理学検査を行った。ＣｓＡ誘導病理学的変化の評価は、一般的に認められているコード化された切片の半定量的スコア化（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｆ３８３−Ｆ３９０，１９９９）、ならびに、例えば、腎臓切片当たりの疾患領域のパーセンテージを数えることによるスコア化を含む、管損傷、間質浸潤、細動脈の肥大、尿細管間質性膨張、および線維症のいずれかまたは全てに基づく評価を含み得る。正常対照、ＣｓＡ注入およびＸＰＡ．４２．０８９抗体処置マウスからの矢状腎臓切片を、Ｍａｓｓｏｎのトリクロム染色で染色した。ＣｓＡ注入マウスの尿細管間質において、ＣｓＡにより誘導された線維症の発達が観察されたが、対照動物においては観察されなかった。さらに、ＣｓＡ処置マウスにおいて、いくつかの尿細管の内腔径の増加が観察された。ＸＰＡ．４２．０８９抗体による処置は、尿細管間質において観察されたＣｓＡ誘導線維症の量を低減し、尿細管直径を低減した。
【０４６６】
また、腎機能は、腎機能障害の血清クレアチニン、血中尿素窒素、および尿バイオマーカーのいずれかまたは全てにより評価することができる。
【０４６７】
血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、腎機能障害の指標である。本試験において、ＢＵＮは、餌またはＬＳＤを与えた対照マウスと比較して、ＣｓＡに暴露されたマウスにおいて有意に増加した（図１８）。ＸＰＡ．４２．０８９による処置は、ＩｇＧ対照抗体と比較して、血清ＢＵＮを有意に低減した。
【０４６８】
タンパク尿症、すなわち尿中のアルブミン蓄積の増加は、罹患腎臓における糸球体機能障害の特徴である。本試験において、尿中アルブミンは、餌またはＬＳＤを与えた対照マウスに比べ、ＣｓＡマウスにおいてほぼ４倍増加した（図１９）。ＸＰＡ．４２．０８９による処置は、ＩｇＧ対照抗体処置マウスと比較して、タンパク尿症の有意な改善をもたらした。
【０４６９】
腎臓におけるＥＣＭ堆積および線維症の程度を反映する尿中ＩＶ型コラーゲンのレベルは、餌またはＬＳＤを与えた対照マウスに比べ、ＣｓＡマウスにおいて有意に増加した（図２０）。ＸＰＡ．４２．０８９による処置は、ＩｇＧ対照抗体と比較して、尿中ＩＶ型コラーゲンを適度に減少させた。
【０４７０】
腎臓組織に対して定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、線維症に関与する遺伝子の発現を測定した。ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、全ＲＮＡを腎臓（皮質および髄質）から分離した。ランダムプライマーおよびＭＵＬＴＩＳＣＲＩＢＥ（商標）ＲＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ  ４８０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、２μｌのｃＤＮＡに対し定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。値は、シクロフィリンに正規化し、比較ＣＴ法を用いて計算した。ＴＧＦ−β１は、線維芽細胞分化およびＩＩＩ型コラーゲンを含むＥＣＭタンパク質の堆積の有効な指標である。ＴＧＦ−β１発現は、対照マウスと比較すると、ＣｓＡ処置動物においてほぼ２倍高かった（図２１Ａ）。ＸＰＡ．４２．０８９による処置は、ＩｇＧ対照抗体と比較して、腎臓内のＴＧＦ−β１の発現レベルを有意に低減した。ＩＩＩ型コラーゲンの発現においても同様の効果が観察され、ＣｓＡ処置マウスにおいて穏やかな上昇が観察された（図２１Ｂ）。ＸＰＡ．４２．０８９による処置は、ＩｇＧ対照抗体処置マウスと比較して、ＩＩＩ型コラーゲン発現レベルの低下をもたらした。
【０４７１】
肺線維症
本質的にＷｉｌｓｏｎら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：５３５−５５２；２０１０）により説明されるように、肺線維症モデルを使用することができる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、−１、３および５日目に、抗体（例えば、群当たりｎ＝１０、５００μｇ）あり、またはなしで、生理食塩水中０．１５Ｕ硫酸ブレオマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を気管内注入する。肺組織学、肺コラーゲン含量（例えば、コラーゲン堆積）、および炎症性浸潤の分析のために、７日目に動物を致死させる。肺組織学では、パラフィン包埋肺組織の５μｍ切片を、Ｍａｓｓｏｎのトリクロムで染色する。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）コラーゲンおよび肺におけるコラーゲン堆積として測定される肺損傷は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイを用いて定量化される。炎症性浸潤は、フローサイトメトリーによりＢＡＬにおいて測定される。
【０４７２】
実施例２３．ＴＧＦβ媒介眼科的疾患の処置
本開示の抗ＴＧＦ−β抗体は、例えば目における線維症疾患（例えば線維増殖性状態に関連した疾患）を含む、多くの眼科的（例えば目）疾患および状態の治療に使用され得る。
【０４７３】
網膜色素上皮細胞におけるＴＧＦβ１の中和
上皮表現型の維持は、組織の恒常性に重要である。網膜においては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の脱分化は、網膜機能不全および線維症をもたらし、ＴＧＦβは、多くのメカニズムにより網膜脱分化に寄与し、そのメカニズムのいくつかはＳＭＡＤ２経路の活性化に依存する。ｐＳＭＡＤ２アッセイを使用して、ＲＰＥ細胞におけるＴＧＦβ反応の活性化を相殺する能力について、本開示の抗体を評価した。
【０４７４】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ  ＃１９４９８７）を、網膜色素上皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ＃００１９５４０９）中に維持した。細胞をトリプシンで剥離し、トリプシンを中和し（トリプシン中和溶液、Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−５００２）、細胞をペレット化し、１ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁させ、６ウェル皿内に１００，０００〜２００，０００細胞／ウェルで播種した。翌日、細胞を洗浄し、ＲＰＥ基本培地（Ｌｏｎｚａ＃００１９５４０６）を添加して、細胞をＧ０／Ｇ１期で停止させた。翌日、１０μｇ／ｍＬの抗ＴＧＦβ抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、およびＸＰＡ．４２．６８１、基準抗体ＢＭ−１およびＢＭ−２、または対照抗ＫＬＨ−Ｇ２抗体ありまたはなしで５分間プレインキュベートされた１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１００−２１）で、細胞を処理した。３７℃で３０分後、新鮮な状態で添加された１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）中で、細胞を溶解した。４℃で５分間振盪した後、細胞を擦り落とし、９６ディープウェルプレート内に分注して２０分間氷上で溶解させた。溶解物を、４℃で５分間３Ｋで沈降させた。溶解物を希釈し、製造者の推奨に従い、ホスホ−ＳＭＡＤ２（細胞シグナル伝達＃７３４８）および全ＳＭＡＤ２（細胞シグナル伝達＃７２４４）検出に供した。
【０４７５】
図２２に示されるように、ＴＧＦβ１処置は、ＲＰＥ細胞中のｐＳＭＡＤ２の確実な増加をもたらし、これは、抗体ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８およびＸＰＡ．４２．６８１、ならびに基準抗体のそれぞれにより有意に中和された。これらのデータは、ＸＰＡ．４２．０８９、０６８および６８１がＲＰＥ細胞中のＴＧＦβ媒介シグナル伝達を相殺することを示唆し、抗体が網膜機能不全の処置に有用となり得ることを示している。
【０４７６】
増殖性硝子体網膜症
増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）は、網膜剥離手術の失敗の最も一般的な原因である。ＰＶＲは、網膜の上および下の硝子体腔内の線維性血管膜の形成を特徴とし、その後の網膜剥離をもたらす。様々な因子がＰＶＲの進行に寄与し、ＴＧＦβは中心的役割を果たすと考えられている。ＴＧＦβは、ＰＶＲ患者の硝子体内に豊富に含まれ、ＴＧＦβの特徴的機能、例えば上皮間葉移行（ＥＭＴ）の誘導、細胞外基質産生の刺激、細胞膜の収縮、および炎症の誘導が、全てＰＶＲの進行におけるマイナス要因である。
【０４７７】
本開示の抗体の効果を評価するために、実験的ＰＶＲをウサギモデルにおいて誘導する（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１２１４−１２２０；Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２，９：１２１４−１２２０）。イソフルランまたはケタミンおよびキシラジンの筋肉内注射により成体有色ウサギを麻酔する。１滴の１０％塩酸フェニレフリン、１％トロピカミド、および１％硫酸アトロピンで瞳孔を散大させる。各ウサギの一方の目の硝子体腔内に、毛様体扁平部を通して、０．１ｍｌ  ＢＳＳ溶液中の５．０×１０ｅ５ウサギ結膜線維芽細胞を注入する。経扁平部硝子体切除術は、ＰＶＲモデルを誘導する。その直後に、ＢＳＳ、抗ＴＧＦβ抗体（例えば、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１、５ｍｇ）または対照抗体（例えば、抗ＫＬＨ−Ｇ２）の１回の硝子体内注入を１０匹の動物の群に施し、随意に毎週繰り返す。注入された全ての目を１、３、５、７、１０、１４および２８日目に検眼鏡検査し、Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９３：５６５−５７２，１９８２により説明される臨床基準を使用して、ＰＶＲを６段階に分類する。
【０４７８】
角膜へのアルカリ熱傷
角膜へのアルカリ熱傷の形態での眼球外傷は、深刻な臨床上の問題であり、重度および永久的な視力障害をもたらし得る。角膜細胞、すなわち角膜実質細胞および上皮細胞の活性化、ならびに単球／マクロファージ等の炎症細胞の流入は、角膜におけるアルカリ組織損傷後の傷害の病因に関与し、持続性の上皮欠陥をもたらし得る。さらに、これらの細胞により分泌されるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、ゼラチナーゼ）による基底膜の破壊は、病原性の潰瘍化および間質の穿孔に寄与する。角膜縁幹細胞の損失後の角膜表面の結膜化は、混濁および角膜実質の新血管形成とともに、全て後の治癒段階において患者の視覚を低下させる。ＴＧＦ−βを含む多くの成長因子およびサイトカインが、アルカリ熱傷後に角膜に生じる組織破壊および後の瘢痕に関与すると考えられている。
【０４７９】
本開示の抗体の効果を評価するために、マウスアルカリ熱傷モデルを使用する（Ｓａｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００５，１６６：１４０５−１８）。簡潔に述べると、３μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右目に適用し（ｎ＝７２）、全身および局所麻酔の両方において眼表面アルカリ熱傷を生成する。抗ＴＧＦ−β抗体（例えば、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１）または対照抗体（例えば、抗ＫＬＨ−Ｇ２）を、アルカリ暴露から２時間後ならびに５、１０および１５日目に投与する（ｎ＝２４／群）。角膜のフルオレセイン染色を使用して、表面欠陥（例えば損傷上皮）を可視化する。角膜フルオレセイン検査後、ブロモデオキシウリジンで標識化してから２時間後に眼球を摘出し、３、５、１０、および２０日目に、パラフィンまたは低温切片のいずれかにおける組織学的検査用に処理する。
【０４８０】
水晶体線維症
損傷後、水晶体上皮細胞は、損傷した水晶体における線維性組織の形成に寄与するＥＭＴを呈する。水晶体摘出および人口眼内レンズの移植後のヒト水晶体嚢においても、同様の現象が観察される。そのようなＥＭＴ関連線維症反応は、残された前水晶体嚢の混濁および収縮、ならびに後嚢の混濁をもたらし得るため、臨床的に好ましくない。目の房水は、豊富なＴＧＦ−βを含有し、水晶体上皮細胞での損傷関連ＥＭＴにおけるＴＧＦ−βの役割が示唆されている。
【０４８１】
本開示の抗体の効果を評価するために、マウスモデルにおいて実験的角膜線維症を誘導する（Ｓａｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４，１６４：６５１−６６３）。成体マウス（４から６週齢）を、ペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔する。散瞳薬および麻酔薬としてのオキシブプロカイン点眼液の局所適用後に、２６ゲージ皮下注射針の刃の部分を用いて、右目における角膜切開を通して中央前嚢に小切開を行う。その直後、抗ＴＧＦβ抗体（例えば、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１）または対照抗体（例えば、抗ＫＬＨ−Ｇ２）（ｎ＝２４／群）を、試験期間中週２回、目に投与する。左目は非損傷対照として役立つ。損傷の深さは、約３００μｍ、または針の刃の部分の長さの約４分の１であり、これは、嚢破断部周囲の線維性組織の形成をもたらす。オフロキサシン軟膏の注入後、動物を６時間から８週間治癒させる。増殖細胞を、ブロモデオキシウリジンの腹腔内注射により標識化し、続いて２時間後に動物を致死させ、分析のためにそれぞれの目を摘出する。
【０４８２】
術後緑内障手術
緑内障手術の長期転帰の主要な決定因子は、創傷治癒反応である。結膜および強膜切開部位のレベルの過度の術後瘢痕は、低い術後眼圧制御に関連する。そのような手術における抗増殖剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）の使用はまた、広範な細胞死およびアポトーシスを引き起こし、角膜びらんおよび嚢胞性無血管性小疱をもたらし得る。
【０４８３】
緑内障手術に関連したこれらの状態に対する本開示の抗体の効果を評価するために、ウサギモデルを使用する（Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００３，４４：３３９４−３４０１）。全身麻酔（ケタミンおよびキシラジン）下のニュージーランドホワイトウサギ（１２および１４週齢）に対し、緑内障濾過手術を行う。部分厚８−０シルク角膜牽引縫合糸を１２時方向に設置し、上結膜への露出を得た。円蓋部基底結膜弁を上げ、角膜輪部後方１５ｍｍの距離まで結膜下腔の鈍的切開を行う。ＭＶＲブレードを使用して、部分厚強膜トンネルを形成し、角膜輪部後方４ｍｍから開始して、刃がちょうど前部角膜実質内に見えるまで継続する。次いで、２２ゲージ／２５ｍｍ静脈内カニューレを、カニューレ針が透明な角膜内に見えるまで強膜トンネルに通過させる。カニューレの針を前眼房に進入させ、カニューレを瞳孔中央領域に前進させ、針を引き抜く。最後に、挿入点から１ｍｍ突出するように強膜端部でカニューレを調整して傾斜させ、１０−０ナイロン縫合糸を使用して、管を強膜表面に固定する。結節縫合および針上の中央マットレス型１０−０ナイロン縫合で結膜切開部を閉じ、水密性の閉鎖部を形成した。手術の最後に、硫酸アトロピン１％およびリン酸ベタメタゾンナトリウム０．１％、硫酸ネオマイシン０．５％軟膏を１滴注入する。次いで、抗ＴＧＦβ抗体（例えば、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．６８１）または対照抗体（例えば、抗ＫＬＨ−Ｇ２）（例えば、５ｍｇ／ｍＬ；１６／群）の結膜下注射（１００μＬ）  の術後コースを受けさせるために、動物を無作為に配分する。結膜下注射を、手術（０日目）から２、３、４、７、９、１１、および１４日目に、３０ゲージ針を使用して、局所麻酔下（プロキシメタカイン塩酸塩０．５％点眼液、眼当たり１滴）で与える。抗体を、上直筋の鼻側縁の角膜輪部後方５ｍｍに注射する。手術部位から１８０°に５−ＦＵを投与する。
【０４８４】
両目における眼圧の測定を、０．５％プロキシメタカインＨＣｌ点眼液の局所注入後に、携帯型眼圧計で行う。結膜外観および排液領域を観察する。全ての動物は、手術から所定時間後に盲検的に観察者により検査される。０日目から４日目まで毎日、およびその後一定期間、少なくとも週２回、両目の評価（対側の未処理の目を対照として使用）を行う。ノギスを用いて、長さ、幅および高さを含む小疱の特徴を測定し、眼圧を記録する。結膜領域を四分円に分割し、外観をスコア化（０、無血管；＋１、正常血管分布；＋２、充血；および＋３、非常に充血）することにより、排液小疱血管分布特性を類別する。両方の前眼房活性（０、静穏；１、細胞；２、フィブリン；および３、前房蓄膿）および前眼房深度（深い（＋２）、浅い（＋１）または平坦（０）として記録される）を特定するために、細隙灯検査を行う。左目へのリグノカインフルオレセインの局所注入後に角膜上皮症の期間の評価を行い、罹患角膜の面積に従い類別する（０、なし；１、＜５％；２、＜５０％；３、＜７５％；４、＜９０％；５、１００％まで）。小疱の生存率を、主要な有効性評価項目として記録する。小疱の不全を、深い前眼房の存在下での平坦な血管新生化および瘢痕化小疱の外観として定義する。四分円毎の小疱の面積および高さ、前眼房の深さおよび活性、ならびに結膜血管分布を全て分析する。また、いくつかの動物からの組織を、組織学的検査（例えば、結膜下コラーゲン堆積）用に処理する。
【０４８５】
本明細書に開示される抗ＴＧＦβ抗体は、目における線維症の発症中のＴＧＦβ活性を阻害し、それにより線維性堆積を減少させ、目の線維症に関連した症状を改善すると期待される。
【０４８６】
上記の例示的な実施例に記載のように、本開示における数々の修正および変形が生じることが、当業者に予測される。結果として、添付の特許請求の範囲に見られるような限定のみが、本開示に適用されるべきである。
【０４８７】
（表１）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月6日(2019.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願の明細書に記載される発明。