(57)【要約】      （修正有）【課題】片頭痛の病態生理学の根底にある標的に対して新しい作用機序を有する片頭痛に特異的な予防療法に有益な、ＣＧＲＰ／ＣＧＲＰ受容体とＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１受容体の両方の経路に拮抗する二重の機能を有する治療用分子の提供。【解決手段】ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む、ヒトＣＧＲＰ受容体とヒトＰＡＣ１受容体の両方に結合することができる二重特異性抗原結合タンパク質、前記タンパク質をコードする単離核酸、前記単離核酸を含む発現ベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、前記宿主細胞を培養する工程を含む前記タンパク質の調製方法、前記タンパク質を含む医薬組成物、及び、前記タンパク質を用いてＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療を必要とする患者において治療を行う方法。【選択図】図１
2020074790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１５日出願の米国仮特許出願第６２／０５０，７３７号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願は、電子的に提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含み、この配列表の全体が参照により本明細書に援用される。コンピュータ読み取り可能な形式の当該配列表の複製は、２０１５年９月８日に作成され、名称はＡ−１９２２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、大きさは１，０９１キロバイトである。
【０００３】
本発明は、バイオ医薬品の分野に関する。特に、本発明は、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体及びヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドＩ型（ＰＡＣ１）受容体に特異的に結合することができる二重特異性抗原結合タンパク質、当該二重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに当該二重特異性抗原結合タンパク質の作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
片頭痛は、重症度の頭痛の反復発作及び悪心、嘔吐、光過敏、音過敏または動作過敏を含み得る随伴的特徴によって特徴付けられる、複雑で一般的な神経学的状態である。一部の患者において、頭痛には、感覚的な警告兆候または症状（すなわち、前兆）が先行するか、または伴う。頭痛の痛みは、重症である場合もあり、ある特定の患者では片側性であることもある。片頭痛の発作は、日常生活に支障をきたすものであり、欠勤日数及び効率低下により、毎年数十億ドルもの損失が生じている（Ｍｏｄｉ  ａｎｄ  Ｌｏｗｄｅｒ，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，Ｖｏｌ．７３：７２−７８，２００６）。
【０００５】
片頭痛は、世界的に極めて一般的な疾患であり、欧州人口の約１５％及び米国人口の１２％が片頭痛の発作に苦しんでいる（Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３−３４９，２００７）。更に、片頭痛は、うつ病及び血管障害などの多数の精神医学的及び医学的共存症に関連していることがわかっている（Ｂｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，Ｖｏｌ．８１：４２８−４３２，２０１０；Ｂｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１８６４−１８７１，２００９）。
【０００６】
片頭痛は、主に鎮痛薬及びトリプタンと呼ばれる種類の薬物で即時的に治療されるのが一般的である（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６００：５８７−５９８，１９９０；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ，Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．３１：１４９−１６３  １９８６）。選択的セロトニン５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄアゴニストであるトリプタンは、急性片頭痛に効果的な薬物であり、概して良好な忍容性を示すが、心臓血管疾患がある場合には冠状動脈の血管収縮をもたらす場合があるため、禁忌である。加えて、多くの片頭痛患者は、トリプタンに対して有利に応答しない。５３の試験のメタアナリシスにおいて、片頭痛を有する人では全体の最大３分の１が、片頭痛発作全体では４０％がトリプタンに応答しなかった（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３５８：１６６８−１６７５，２００１）。
【０００７】
片頭痛の予防は、医学的必要性が満たされていない大きな分野である。片頭痛患者人口の約４０％が予防療法の恩恵を受け得ると思われる（Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３−３４９，２００７）。しかしながら、何らかの予防療法を受けているのは患者のわずか約１２％である。これは、一部には、利用可能な予防療法に伴う、限られた有効性、ならびに重大な忍容性及び安全問題に起因している。電位依存性ナトリウムチャネルを遮断し、ある特定のグルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ−カイニン酸）を遮断する抗痙攣薬であるトピラマートは、米国で片頭痛予防に最も多く使用されている薬剤である。トピラマートは、無作為化プラセボ対照試験を通じて、反復性片頭痛と慢性片頭痛の両方の患者において有効性を示した唯一の片頭痛予防薬である（Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２７：８１４−８２３，２００７；Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４７：１７０−１８０，２００７）。しかしながら、患者のほぼ５０％がトピラマートに応答せず、忍容性が低い。トピラマート治療に付随する共通の有害事象には、感覚異常、拒食症及び認知的有害事象が挙げられ、これには、精神運動の低下、傾眠、言語障害ならびに記憶及び集中に関する障害が含まれる（Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，Ｖｏｌ．２９１：９６５−９７３，２００４；Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．９：１７５−１８５  ２００８；Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６１：４９０−４９５，２００４）。非盲検可変用量試験において、患者の２０％が有害作用を理由にトピラマートの使用を辞めた（Ｎｅｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４９：１４５４−１４６５，２００９）。したがって、片頭痛患者には、より有効的かつ／または忍容性のある治療選択肢に対する喫緊の医学的必要性がある。
【０００８】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、カルシトニンペプチドファミリーに属し、これらには、カルシトニン、アミリン及びアドレノメデュリンも含まれる。ＣＧＲＰは、中枢と末梢の両方の神経系にて発現する３７アミノ酸ペプチドであり、片頭痛の痛みの開始及び進行における重要な媒介物質であることが示唆されている。血管拡張物質として作用する能力に加えて、ＣＧＲＰはまた、三叉神経節及び三叉神経脊髄路核尾側亜核において神経伝達物質としても作用し、シナプス伝達及び疼痛反応を促進する（Ｄｕｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．５：７３１−７３５，２００４；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．７２４：２３８−２４５，１９９６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．９２：１１４８０−１１４８４，１９９５；Ｐｏｙｎｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．５６：２３−５１，１９９２）。
【０００９】
ＣＧＲＰ受容体は、Ｇタンパク質共役型カルシトニン様受容体（ＣＬＲ）及び１回膜貫通型ドメインタンパク質受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ１）から構成される複合体である。ＣＧＲＰ受容体複合体は、脳血管、脳幹の三叉神経頸髄複合体及び三叉神経節を含む、片頭痛に関係する部位に位置している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２７：２６９３−２７０３，２００７；Ｓｔｏｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１４２：１１７１−１１８１，２００４；Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，Ｖｏｌ．２２：６２０−６２９，２００２）。いくつかの方面からの証拠では、ＣＧＲＰが強力な血管拡張物質及び痛覚調節物質であり、片頭痛の病態生理学と関連することが示されている。（１）片頭痛の病態生理学への関与が示唆される、三叉神経系でＣＧＲＰが発現されている；（２）片頭痛患者の発作中にＣＧＲＰレベルが上昇する（Ｂｅｌｌａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４６：２４−３３，２００６；Ａｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ，Ｖｏｌ．８６：１３３−１３８，２０００；Ｇａｌｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．１５：３８４−３９０，１９９５；Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．２８：１８３−１８７，１９９０；Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．２３：１９３−１９６，１９８８）；（３）トリプタンなどの急性片頭痛治療により、治療後、ＣＧＲＰレベルが正常に戻る（Ｊｕｈａｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２５：１７９−１８３，２００５）；（４）ＣＧＲＰの注入は、片頭痛患者において、片頭痛の発現を誘発する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１４３：１０７４−１０７５，２００４；Ｌａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２２：５４−６１，２００２）；及び（５）ＣＧＲＰアンタゴニストは、急性片頭痛の逆転に有効であることが示されている（Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３：９７０−９７７，２００９；Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  １４ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００９；ＬＢＯＲ３；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３７２：２１１５−２１２３，２００８ａ；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：１３０４−１３１２，２００８ｂ）。更に、小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニスト及び抗体ＣＧＲＰリガンドアンタゴニストは、反復性片頭痛予防において、臨床上の有効性を示した（Ｄｏｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３：１１００−１１０７，２０１４ａ；Ｄｏｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３：８８５−８９２  ２０１４ｂ；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８３：９５８−９６６，２０１４）。以上を総合すると、これらのデータは、片頭痛の病因におけるＣＧＲＰ神���ペプチド及びその受容体の役割を示唆するものである。
【００１０】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、ＶＩＰ／セクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属する。ＰＡＣＡＰ２７の配列は、ＰＡＣＡＰ３８の２７個のＮ末端アミノ酸に対応し、血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）と６８％の同一性を有する（Ｐａｎｔａｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２２１４６−２２１５１，１９９６；Ｐｉｓｅｇｎａ  ａｎｄ  Ｗａｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６３４５−４９，１９９３；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｃａｎｅｓ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．，Ｖｏｌ．２：１７５−１９１，１９９２）。ヒト体内でのＰＡＣＡＰペプチドの主な形態は、ＰＡＣＡＰ３８であり、ＰＡＣＡＰ３８及びＰＡＣＡＰ２７の薬理学が互いに異なることは示されていない。３つのＰＡＣＡＰ受容体が報告されており、１つの受容体は高い親和性でＰＡＣＡＰと結合し、ＶＩＰに対する親和性は極めて低い（ＰＡＣ１受容体）。他の２つの受容体は、ＰＡＣＡＰとＶＩＰとを等しく認識する（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体）（Ｖａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．６１：２８３−３５７，２００９）。ＰＡＣＡＰは、３つの全ての受容体に類似の力価で結合することができ、したがって、特に選択的でない。一方、ＶＩＰは、ＰＡＣ１と比較して、著しく高い親和性でＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２に結合する。内因性アゴニストであるＰＡＣＡＰ及びＶＩＰに加えて、スナバエから最初に単離された６５アミノ酸ペプチドであるマキサジランは、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２と比較して、ＰＡＣ１に極めて選択的である。
【００１１】
片頭痛様頭痛を誘発するための負荷薬としてＰＡＣＡＰを用いたヒト実験片頭痛モデルは、片頭痛予防の治療候補としてのＰＡＣ１受容体拮抗作用の役割を裏付けている。ＰＡＣＡＰ３８の注入により、健常者における頭痛及び片頭痛患者における片頭痛様頭痛が引き起こされる（Ｓｃｈｙｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３２：１６−２５，２００９）。加えて、同じモデルにおいて、ＶＩＰは、片頭痛患者に片頭痛様頭痛を引き起こさない（Ｒａｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２８：２２６−２３６，２００８）。ＶＩＰがＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２の２つの受容体に非常に高い親和性を有することから、ＶＩＰ注入による片頭痛様頭痛の誘発がないことは、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体ではなく、ＰＡＣ１受容体が片頭痛に関与することを示唆している。これらのデータは、選択的ＰＡＣ１アンタゴニストが片頭痛を治療する可能性を有することを示唆している。
当該技術分野において、片頭痛の病態生理学の根底にある標的に対して新しい作用機序を有する片頭痛に特異的な予防療法を開発する必要性がある。特に、ＣＧＲＰ／ＣＧＲＰ受容体とＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１受容体の両方の経路に拮抗する二重の機能を有する治療用分子が特に有益であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｄｉ  ａｎｄ  Ｌｏｗｄｅｒ，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，Ｖｏｌ．７３：７２−７８，２００６
【非特許文献２】Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３−３４９，２００７
【非特許文献３】Ｂｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，Ｖｏｌ．８１：４２８−４３２，２０１０
【非特許文献４】Ｂｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１８６４−１８７１，２００９
【非特許文献５】Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６００：５８７−５９８，１９９０
【非特許文献６】Ｈｏｕｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ，Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．３１：１４９−１６３  １９８６
【非特許文献７】Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３５８：１６６８−１６７５，２００１
【非特許文献８】Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２７：８１４−８２３，２００７
【非特許文献９】Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４７：１７０−１８０，２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一部には、ヒトＣＧＲＰ受容体とヒトＰＡＣ１受容体の両方を遮断することができる二重特異性抗原結合タンパク質の設計及び作製に基づく。かかる二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインのそれぞれは、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖に由来する可変領域を含む。結合ドメインは、抗ＣＧＲＰ受容体及び抗ＰＡＣ１受容体の各抗体から調製することができる。
【００１４】
ある特定の実施形態において、結合ドメインの１つはＦａｂ断片であり、もう１つの結合ドメインは一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。他の実施形態において、両方の結合ドメインはＦａｂ断片である。二重特異性抗原結合タンパク質はまた、免疫グロブリン定常領域またはＦｃ領域を含み得、いくつかの実施形態において、当該領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１またはＩｇＧ２に由来する。ある特定の実施形態において、定常領域は、二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／またはエフェクター機能を減ずる１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、各標的に対して一価である。このような実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、一方の抗原結合ドメインまたはアームがＣＧＲＰ受容体に結合し、もう一方の抗原結合ドメインまたはアームがＰＡＣ１受容体に結合する、抗体であってよい。他の実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、各標的に対して二価である。このような実施形態において、抗原結合タンパク質が、二量体化したときに、ＣＧＲＰ受容体に結合する２つの抗原結合ドメインと、ＰＡＣ１受容体に結合する２つの抗原結合ドメインとを含むように、一方の結合ドメインが免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端に位置し、もう一方の結合ドメインがＦｃ領域のカルボキシル末端に位置する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体抗体などの抗体である。ヘテロ二量体抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の抗体に由来する第１の軽鎖及び第１の重鎖と、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の抗体に由来する第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み得る。ある特定の実施形態において、第１及び第２の重鎖は、ヘテロ二量体形成を促進するために、定常領域（例えば、ＣＨ３ドメイン）に１つ以上の電荷対変異を含む。関連する実施形態において、第１の軽鎖及び第１の重鎖（または第２の軽鎖及び第２の重鎖）は、正しい軽鎖−重鎖対合を助長するために、１つ以上の電荷対変異を含む。いくつかのこのような実施形態において、第１の重鎖は、アミノ酸置換を含み、第１の軽鎖と第１の重鎖とが互いに引き付け合うように、第１の軽鎖中に導入されるアミノ酸（例えば、リジン）と反対の電荷を有する荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸）が導入される。第２の軽鎖に導入される荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸）は、好ましくは、第２の軽鎖が第２の重鎖に引き付けられ、更に第１の重鎖とは反発するように、第１の重鎖に導入されるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と同じ電荷を有し、第２の重鎖に導入されるアミノ酸（例えば、リジン）と反対の電荷を有する。
【００１７】
本発明のある特定の実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的（例えば、ＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体）に対する抗体と、第２の標的（例えば、ＰＡＣ１受容体またはＣＧＲＰ受容体）に対する抗体に由来するｓｃＦｖとからなる。このＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットにおいて、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖及び重鎖と、（ｉｉ）第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含むｓｃＦｖとを含み、当該ｓｃＦｖは、そのアミノ末端にて、任意にペプチドリンカーを介して、重鎖のカルボキシル末端に融合して改変重鎖を形成し、第１または第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ領域と、ペプチドリンカーと、ＶＬ領域とを含む。他の実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ領域と、ペプチドリンカーと、ＶＨ領域とを含む。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的（例えば、ＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体）に対する抗体と、第２の標的（例えば、ＰＡＣ１受容体またはＣＧＲＰ受容体）に対する抗体に由来するＦａｂ断片とからなる。このＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットにおいて、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖と、（ｉｉ）第１の抗体に由来する重鎖であって、そのカルボキシル末端にて、任意にペプチドリンカーを介して、第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインまたはＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドに融合して改変重鎖を形成する、重鎖と、（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインまたはＶＬ−ＣＬドメインを含む第２のポリペプチドとを含み、第１または第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する。特定の実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＬドメイン（すなわち、軽鎖）を含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＨ１ドメイン（すなわち、Ｆｄ断片）を含む。他の特定の実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＨ１ドメイン（すなわち、Ｆｄ断片）を含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＬドメイン（すなわち、軽鎖）を含む。ＣＬ及びＣＨ１ドメインは、いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で入れ替えてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＬドメインを含む。他の実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＬドメインを含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質またはその構成要素のいずれかをコードする１つ以上の核酸、及び当該核酸を含むベクターを含む。また、二重特異性抗原結合タンパク質のいずれかを発現するＣＨＯ細胞などの組み換え宿主細胞も本発明に包含される。
【００２０】
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、頭痛、片頭痛及び慢性疼痛などのＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態を治療するための医薬組成物または薬剤の製造において使用することができる。したがって、本発明はまた、二重特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、頭痛の治療または予防を必要とする患者におけるその方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を当該患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、頭痛は片頭痛である。片頭痛は、反復性片頭痛または慢性片頭痛であり得る。他の実施形態において、頭痛は、群発頭痛である。特定の実施形態において、方法は、これらの状態のための予防的治療を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、慢性疼痛の治療を必要とする患者におけるその方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を当該患者に投与することを含む。本発明の方法に従って治療がなされる慢性疼痛症候群には、変形性関節症または関節リウマチに関係する疼痛などの関節痛を挙げることができる。
【００２３】
本明細書にて開示される方法のいずれかにおける、または本明細書にて開示される方法のいずれかに従う投与のための薬剤を調製することにおける、二重特異性抗原結合タンパク質の使用が特に企図される。例えば、本発明は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療または予防を必要とする患者におけるその方法にて使用するための二重特異性抗原結合タンパク質を含む。当該状態には、頭痛（例えば、片頭痛または群発頭痛）及び慢性疼痛を挙げることができる。
【００２４】
本発明はまた、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療または予防を必要とする患者におけるその薬剤の調製における二重特異性抗原結合タンパク質の使用も含む。当該状態には、頭痛（例えば、片頭痛または群発頭痛）及び慢性疼痛を挙げることができる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２）
前記第１の結合ドメインが第１の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ１）を含み、前記第２の結合ドメインが第２の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ２）を含む、項目１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３）
前記第１の結合ドメイン及び／または前記第２の結合ドメインがヒト化またはヒト免疫グロブリン可変領域を含む、項目２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４）
ＶＬ１が（ｉ）配列番号１０９〜１１９から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号１４、１７、１８及び１２０〜１２６から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号１２７〜１３５から選択されるＣＤＲＬ３とを含む、項目２または３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５）
ＶＨ１が（ｉ）配列番号１５９〜１６６から選択されるＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号１６７〜１７８から選択されるＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号１７９〜１８９から選択されるＣＤＲＨ３とを含む、項目２〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目６）
ＶＬ１がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み、ＶＨ１がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、かつ、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６７及び１７９の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６８及び１７９の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８０の配列を有するか、
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８１の配列を有するか、
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７０及び１８２の配列を有するか、または
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７１及び１８２の配列を有する、
項目２〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目７）
ＶＬ１が、配列番号１３６〜１５８から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目８）
ＶＨ１が、配列番号１９０〜２１０から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目９）
（ａ）ＶＬ１が配列番号１３６の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９０の配列を含むか、
（ｂ）ＶＬ１が配列番号１３８の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９２の配列を含むか、
（ｃ）ＶＬ１が配列番号１４０の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９４の配列を含むか、
（ｄ）ＶＬ１が配列番号１４０の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９６の配列を含むか、
（ｅ）ＶＬ１が配列番号１４２の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９４の配列を含むか、
（ｆ）ＶＬ１が配列番号１４２の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９６の配列を含むか、
（ｇ）ＶＬ１が配列番号１４４の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９４の配列を含むか、
（ｈ）ＶＬ１が配列番号１４６の配列を含み、ＶＨ１が配列番号１９８の配列を含むか、または
（ｉ）ＶＬ１が配列番号１４６の配列を含み、ＶＨ１が配列番号２００の配列を含む、項目２〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１０）
ＶＬ２が（ｉ）配列番号１〜１３から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号１４〜１９から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号２０〜２７から選択されるＣＤＲＬ３とを含む、項目２〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１１）
ＶＨ２が（ｉ）配列番号５５〜６５から選択されるＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号６６〜７３から選択されるＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号７４〜８２から選択されるＣＤＲＨ３とを含む、項目２〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１２）
ＶＬ２がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み、ＶＨ２がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、かつ、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１、１４及び２０の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号５５、６６及び７４の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、または
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４、１６及び２２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有する、
項目２〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１３）
ＶＬ２が、配列番号２８〜５４から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。（項目１４）
ＶＨ２が、配列番号８３〜１０８から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１５）
（ａ）ＶＬ２が配列番号２８の配列を含み、ＶＨ２が配列番号８３の配列を含むか、
（ｂ）ＶＬ２が配列番号３０の配列を含み、ＶＨ２が配列番号８３の配列を含むか、
（ｃ）ＶＬ２が配列番号３１の配列を含み、ＶＨ２が配列番号８５の配列を含むか、
（ｄ）ＶＬ２が配列番号３３の配列を含み、ＶＨ２が配列番号８７の配列を含むか、
（ｅ）ＶＬ２が配列番号３５の配列を含み、ＶＨ２が配列番号８９の配列を含むか、または
（ｆ）ＶＬ２が配列番号３７の配列を含み、ＶＨ２が配列番号９１の配列を含む、
項目２〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１６）
前記第１の結合ドメイン及び／または前記第２の結合ドメインが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはナノボディを含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１７）
前記結合タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する定常領域を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１８）
前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、項目１７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１９）
前記定常領域が、１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記１つ以上の置換を含まない前記結合タンパク質と比較して、グリコシル化及び／またはエフェクター機能が低減される、項目１７または１８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２０）
前記置換のうちの少なくとも１つがＮ２９７Ｇである、項目１９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２１）
前記結合タンパク質が抗体である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２２）
前記抗体が、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の抗体に由来する第１の軽鎖（ＬＣ１）及び第１の重鎖（ＨＣ１）と、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の抗体に由来する第２の軽鎖（ＬＣ２）及び第２の重鎖（ＨＣ２）とを含む、項目２１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２３）
ＬＣ１が、配列番号２７１〜２８２から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２４）
ＨＣ１が、配列番号２９５〜３１６から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２２または２３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２５）
（ａ）ＬＣ１が配列番号２７１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号２９５の配列を含むか、
（ｂ）ＬＣ１が配列番号２７２の配列を含み、ＨＣ１が配列番号２９６の配列を含むか、
（ｃ）ＬＣ１が配列番号２７１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号２９７の配列を含むか、
（ｄ）ＬＣ１が配列番号２７１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号２９８の配列を含むか、
（ｅ）ＬＣ１が配列番号２７３の配列を含み、ＨＣ１が配列番号２９９の配列を含むか、
（ｆ）ＬＣ１が配列番号２７４の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３００の配列を含むか、
（ｇ）ＬＣ１が配列番号２７３の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０１の配列を含むか、
（ｈ）ＬＣ１が配列番号２７３の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０２の配列を含むか、
（ｉ）ＬＣ１が配列番号２７５の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０３の配列を含むか、
（ｊ）ＬＣ１が配列番号２７６の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０４の配列を含むか、
（ｋ）ＬＣ１が配列番号２７５の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０５の配列を含むか、
（ｌ）ＬＣ１が配列番号２７５の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０６の配列を含むか、
（ｍ）ＬＣ１が配列番号２７５の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０７の配列を含むか、
（ｎ）ＬＣ１が配列番号２７６の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０８の配列を含むか、
（ｏ）ＬＣ１が配列番号２７５の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０９の配列を含むか、
（ｐ）ＬＣ１が配列番号２７７の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０３の配列を含むか、
（ｑ）ＬＣ１が配列番号２７８の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０４の配列を含むか、
（ｒ）ＬＣ１が配列番号２７７の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０５の配列を含むか、
（ｓ）ＬＣ１が配列番号２７９の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０３の配列を含むか、
（ｔ）ＬＣ１が配列番号２８０の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０４の配列を含むか、
（ｕ）ＬＣ１が配列番号２７９の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０５の配列を含むか、
（ｖ）ＬＣ１が配列番号２７７の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０７の配列を含むか、
（ｗ）ＬＣ１が配列番号２７８の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０８の配列を含むか、
（ｘ）ＬＣ１が配列番号２７７の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３０９の配列を含むか、
（ｙ）ＬＣ１が配列番号２８１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１０の配列を含むか、
（ｚ）ＬＣ１が配列番号２８２の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１１の配列を含むか、
（ａａ）ＬＣ１が配列番号２８１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１２の配列を含むか、
（ａｂ）ＬＣ１が配列番号２８１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１３の配列を含むか、
（ａｃ）ＬＣ１が配列番号２８１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１４の配列を含むか、
（ａｄ）ＬＣ１が配列番号２８２の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１５の配列を含むか、または
（ａｅ）ＬＣ１が配列番号２８１の配列を含み、ＨＣ１が配列番号３１６の配列を含む、
項目２２〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２６）
ＬＣ２が、配列番号２１１〜２２１から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２２〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２７）
ＨＣ２が、配列番号２３３〜２５１から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、項目２２〜２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２８）
（ａ）ＬＣ２が配列番号２１１の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３３の配列を含むか、
（ｂ）ＬＣ２が配列番号２１２の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３４の配列を含むか、
（ｃ）ＬＣ２が配列番号２１１の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３５の配列を含むか、
（ｄ）ＬＣ２が配列番号２１１の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３６の配列を含むか、
（ｅ）ＬＣ２が配列番号２１３の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３３の配列を含むか、
（ｆ）ＬＣ２が配列番号２１３の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３５の配列を含むか、
（ｇ）ＬＣ２が配列番号２１４の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３７の配列を含むか、
（ｈ）ＬＣ２が配列番号２１５の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３８の配列を含むか、
（ｉ）ＬＣ２が配列番号２１４の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２３９の配列を含むか、
（ｊ）ＬＣ２が配列番号２１４の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４０の配列を含むか、
（ｋ）ＬＣ２が配列番号２１６の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４１の配列を含むか、
（ｌ）ＬＣ２が配列番号２１７の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４２の配列を含むか、
（ｍ）ＬＣ２が配列番号２１６の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４３の配列を含むか、
（ｎ）ＬＣ２が配列番号２１６の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４４の配列を含むか、
（ｏ）ＬＣ２が配列番号２１８の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４５の配列を含むか、
（ｐ）ＬＣ２が配列番号２１９の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４６の配列を含むか、
（ｑ）ＬＣ２が配列番号２１８の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４７の配列を含むか、
（ｒ）ＬＣ２が配列番号２１８の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４８の配列を含むか、
（ｓ）ＬＣ２が配列番号２２０の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２４９の配列を含むか、
（ｔ）ＬＣ２が配列番号２２１の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２５０の配列を含むか、または
（ｕ）ＬＣ２が配列番号２２０の配列を含み、ＨＣ２が配列番号２５１の配列を含む、項目２２〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２９）
ＨＣ１またはＨＣ２が、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸に置き換えるための少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目２２〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３０）
前記置換が、位置３７０、３９２及び／または４０９のリジンを負に荷電したアミノ酸に置き換えるものである、項目２９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３１）
ＨＣ１またはＨＣ２が、負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸に置き換えるための少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目２２〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３２）
前記置換が、位置３５６及び／または３９９のアスパラギン酸を正に荷電したアミノ酸に置き換えるものである、項目３１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３３）
前記置換が、位置３５６及び／または３５７のグルタミン酸を正に荷電したアミノ酸に置き換えるものである、項目３１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３４）
ＨＣ１が、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＬＣ１が、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＨＣ１に導入された前記荷電アミノ酸が、ＬＣ１に導入された前記アミノ酸と反対の電荷を有する、項目２２〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３５）
ＨＣ１中の前記アミノ酸置換が位置４４及び／または１８３にあり、ＬＣ１中の前記アミノ酸置換が位置１００及び／または１７６にある、項目３４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３６）
ＨＣ１中の前記アミノ酸置換がＧ４４Ｅ及び／またはＳ１８３Ｅであり、ＬＣ１中の前記アミノ酸置換がＧ１００Ｋ及び／またはＳ１７６Ｋである、項目３５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３７）
ＨＣ２が、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＬＣ２が、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＨＣ２に導入された前記荷電アミノ酸が、ＬＣ２に導入された前記アミノ酸と反対の電荷を有する、項目２２〜３６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３８）
ＨＣ２中の前記アミノ酸置換が位置４４及び／または１８３にあり、ＬＣ２中の前記アミノ酸置換が位置１００及び／または１７６にある、項目３７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目３９）
ＨＣ２中の前記アミノ酸置換がＧ４４Ｋ及び／またはＳ１８３Ｋであり、ＬＣ１中の前記アミノ酸置換がＧ１００Ｅ及び／またはＳ１７６Ｅである、項目３８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４０）
前記抗体が、表８に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、またはｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される、項目２１〜３９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４１）
前記抗体が、表８に記載される、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７０２、またはｉＰＳ：３２７２７０と称する抗体から選択される、項目４０に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４２）
前記結合タンパク質が、
（ｉ）第１の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ１）を含む、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、
（ｉｉ）第２の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ２）を含む、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインと、
（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域とを含み、前記結合ドメインの一方が、前記Ｆｃ領域のアミノ末端に配置されており、もう一方の結合ドメインが前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に配置されている、
項目１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４３）
前記カルボキシル末端結合ドメインがｓｃＦｖであり、そのアミノ末端にて、ペプチドリンカーを介して、前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に融合した、項目４２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４４）
前記可変領域が、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの向きで、前記ｓｃＦｖ中に配置された、項目４３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４５）
前記ペプチドリンカーが配列番号３６８の配列を含む、項目４３または４４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４６）
前記カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂであり、ペプチドリンカーを介して、前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に融合した、項目４２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４７）
前記Ｆａｂが、前記ＦａｂのＶＬ領域のアミノ末端を介して、前記Ｆｃ領域に融合した、項目４６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４８）
前記Ｆａｂが、前記ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介して、前記Ｆｃ領域に融合した、項目４６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目４９）
前記ペプチドリンカーが配列番号３６８の配列を含む、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５０）
前記アミノ末端結合ドメインがＦａｂであり、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、前記Ｆｃ領域のアミノ末端に融合した、項目４２〜４９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５１）
前記アミノ末端Ｆａｂが、前記ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介して、前記Ｆｃ領域に融合した、項目５０に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５２）
前記アミノ末端結合ドメインがヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、前記カルボキシル末端結合ドメインがヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、項目４２〜４９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５３）
前記アミノ末端結合ドメインがヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、前記カルボキシル末端結合ドメインがヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する、項目４２〜４９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目５４）
（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖及び重鎖と、
（ｉｉ）第２の抗体に由来する軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）及び重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）を含むｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖは、そのアミノ末端にて、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のカルボキシル末端に融合して改変重鎖を形成しており、
前記第１の抗体または前記第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、
二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目５５）
前記可変領域が、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの向きで、前記ｓｃＦｖ中に配置された、項目５４に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目５６）
前記第１の抗体がヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、前記第２の抗体がヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、項目５４または５５に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目５７）
（ａ）前記改変重鎖が配列番号４１１〜４１６から選択される配列を含み、前記軽鎖が配列番号３９３の配列を含むか、
（ｂ）前記改変重鎖が配列番号４１７〜４２１から選択される配列を含み、前記軽鎖が配列番号３９４の配列を含むか、または
（ｃ）前記改変重鎖が配列番号４２２〜４２５から選択される配列を含み、前記軽鎖が配列番号３９５の配列を含む、
項目５６に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目５８）
前記結合タンパク質が、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７３１、ｉＰＳ：３８６７２５、ｉＰＳ：３８６７１７、ｉＰＳ：３８６７１５、ｉＰＳ：３８６７０７、ｉＰＳ：３８６７０５、ｉＰＳ：３８６７２３、ｉＰＳ：３８６７１９、ｉＰＳ：３８６７１３、ｉＰＳ：３８６７０９、ｉＰＳ：３８６７２７、ｉＰＳ：３８６７２１、ｉＰＳ：３８６７１１、ｉＰＳ：３８６７３３、またはｉＰＳ：３８６７２９と称する結合タンパク質から選択される、項目５７に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目５９）
前記第１の抗体がヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、前記第２の抗体がヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する、項目５４または５５に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６０）
前記改変重鎖が配列番号３９６〜４１０から選択される配列を含み、前記軽鎖が配列番号３９２の配列を含む、項目５９に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６１）
前記結合タンパク質が、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７３８、ｉＰＳ：３８６７６４、ｉＰＳ：３８６７６２、ｉＰＳ：３８６７６０、ｉＰＳ：３８６７５８、ｉＰＳ：３８６７５６、ｉＰＳ：３８６７５４、ｉＰＳ：３８６７５２、ｉＰＳ：３８６７５０、ｉＰＳ：３８６７４８、ｉＰＳ：３８６７４６、ｉＰＳ：３８６７４４、ｉＰＳ：３８６７４２、ｉＰＳ：３８６７４０、またはｉＰＳ：３８６７３６と称する結合タンパク質から選択される、項目６０に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６２）
（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖と、
（ｉｉ）前記第１の抗体に由来する重鎖であって、そのカルボキシル末端にて、ペプチドリンカーを介して、第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインまたはＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドに融合して改変重鎖を形成している、重鎖と、
（ｉｉｉ）前記第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインまたはＶＬ−ＣＬドメインを含む第２のポリペプチドとを含み、
前記第１の抗体または前記第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、
二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６３）
前記第１のポリペプチドが前記第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインを含み、前記第２のポリペプチドが前記第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む、項目６２に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６４）
前記第１のポリペプチドが前記第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含み、前記第２のポリペプチドが前記第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインを含む、項目６２に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６５）
前記第１の抗体がヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、前記第２の抗体がヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、項目６２〜６４のいずれか一項に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６６）
前記軽鎖が配列番号２７５または配列番号４２７の配列を含み、前記改変重鎖が配列番号４４０〜４５１から選択される配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号４６０〜４６３から選択される配列を含む、項目６５に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６７）
前記結合タンパク質が、表１０に記載される、ｉＰＳ：３９２５２４、ｉＰＳ：３９２５２５、ｉＰＳ：３９２５２６、ｉＰＳ：３９２５２７、ｉＰＳ：３９２５３２、ｉＰＳ：３９２５３３、ｉＰＳ：３９２５３４、またはｉＰＳ：３９２５３５と称する結合タンパク質から選択される、項目６６に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６８）
前記第１の抗体がヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、前記第２の抗体がヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する、項目６２〜６４のいずれか一項に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目６９）
前記軽鎖が配列番号２１４または配列番号４２６の配列を含み、前記改変重鎖が配列番号４２８〜４３９から選択される配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号４５２〜４５９から選択される配列を含む、項目６８に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目７０）
前記結合タンパク質が、表１０に記載される、ｉＰＳ：３９２５１３、ｉＰＳ：３９２５１４、ｉＰＳ：３９２４７５、ｉＰＳ：３９２５１９、ｉＰＳ：３９２５１５、ｉＰＳ：３９２５１６、ｉＰＳ：３９２５２１、ｉＰＳ：３９２５２０、ｉＰＳ：３９２５１７、ｉＰＳ：３９２５１８、ｉＰＳ：３９２５２２、またはｉＰＳ：３９２５２３と称する結合タンパク質から選択される、項目６９に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。（項目７１）
前記第１の抗体及び／または前記第２の抗体がヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２抗体である、項目５４〜７０のいずれか一項に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目７２）
前記第１の抗体が、前記重鎖中にＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体である、項目７１に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目７３）
前記第１の抗体が、前記重鎖中に変異Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃを有するヒトＩｇＧ１抗体である、項目７１または７２に記載の二重特異性多価抗原結合タンパク質。
（項目７４）
項目１〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質をコードする１つ以上の単離核酸。
（項目７５）
項目７４に記載の１つ以上の単離核酸を含む、発現ベクター。
（項目７６）
項目７５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目７７）
項目７６に記載の宿主細胞を前記抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、前記培養物から前記抗原結合タンパク質を回収することとを含む、二重特異性抗原結合タンパク質を調製するための方法。
（項目７８）
項目１〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
（項目７９）
ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療を必要とする患者において治療を行う方法であって、項目１〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
（項目８０）
前記状態が頭痛である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記頭痛が群発頭痛である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記頭痛が片頭痛である、項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記片頭痛が反復性片頭痛である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記片頭痛が慢性片頭痛である、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記状態が慢性疼痛である、項目７９に記載の方法。
（項目８６）
前記治療が予防的治療を含む、項目７９〜８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療を必要とする患者において治療を行うための薬剤の調製における項目１〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の使用。
（項目８８）
前記状態が頭痛である、項目８７に記載の使用。
（項目８９）
前記頭痛が群発頭痛である、項目８８に記載の使用。
（項目９０）
前記頭痛が片頭痛である、項目８８に記載の使用。
（項目９１）
前記片頭痛が反復性片頭痛である、項目９０に記載の使用。
（項目９２）
前記片頭痛が慢性片頭痛である、項目９０に記載の使用。
（項目９３）
前記状態が慢性疼痛である、項目８７に記載の使用。
（項目９４）
前記治療が予防的治療を含む、項目８７〜９３のいずれか一項に記載の使用。
（項目９５）
ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療を必要とする患者において治療を行う方法にて使用するための項目１〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目９６）
前記状態が頭痛である、項目９５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目９７）
前記頭痛が群発頭痛である、項目９６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目９８）
前記頭痛が片頭痛である、項目９６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目９９）
前記片頭痛が反復性片頭痛である、項目９８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。（項目１００）
前記片頭痛が慢性片頭痛である、項目９８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１０１）
前記状態が慢性疼痛である、項目９５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目１０２）
前記治療が予防的治療を含む、項目９５〜１０１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】抗ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体二重特異性抗体を作製するために使用される、３つの二重特異性ヘテロ免疫グロブリンフォーマットの模式図を示す。Ｋａｂａｔ−ＥＵ番号付けスキームを使用して、それぞれの鎖中にある電荷対変異の位置を表す。このＩｇＧ様二重特異性抗体フォーマットは、２つの異なる軽鎖と、２つの異なる重鎖とを含む、ヘテロ四量体である。ＨＣ１及びＬＣ１は、一方のＦａｂ結合アームの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指し、ＨＣ２及びＬＣ２は、第２のＦａｂ結合アームの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。例えば、模式図中、ＨＣ１及びＬＣ１は、抗ＣＧＲＰ受容体結合アームに該当し、ＨＣ２及びＬＣ２は、抗ＰＡＣ１結合アームに該当する。しかしながら、２つの結合アームは、ＨＣ１及びＬＣ１が抗ＰＡＣ１の結合アームに該当し、ＨＣ２及びＬＣ２が抗ＣＧＲＰ受容体の結合アームに該当するように、入れ替わってもよい。
【図２】抗ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体二重特異性抗原結合タンパク質を作製するために使用される、ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットの模式図を示す。このフォーマットにおいて、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、第２の抗体に由来する可変ドメインがグリシン−セリンリンカーによって互いに連結されており、このｓｄＦｖが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合して、改変重鎖を形成する。ｓｃＦｖ内の可変ドメインをＶＨ−ＶＬの配置で示しているが、可変ドメインは、ＶＬ−ＶＨの配置で構成することもできる。完全な分子は、第１の抗体に由来する２つの改変重鎖と、２つの軽鎖とを含む、ホモ四量体である。
【図３】抗ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体二重特異性抗原結合タンパク質を作製するために使用される、ＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットの模式図を示す。このフォーマットにおいて、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））が、ペプチドリンカーを介して、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合して、改変重鎖を形成する。完全な分子は、２つの改変重鎖と、第１の抗体に由来する２つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、Ｆｄ鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））を含有する２つのポリペプチド鎖とを含む、ホモ六量体である。正しい重鎖−軽鎖対を促進するために、第１の抗体（Ｆａｂ１）または第２の抗体（Ｆａｂ２）のＦａｂ領域に電荷対変異（丸で示す）を導入することができる。模式図には、第２の抗体の軽鎖が第１の抗体の重鎖の融合パートナーとして示されているが、第２の抗体のＦｄ領域（ＶＨ−ＣＨ１）を第２の抗体の軽鎖とともに重鎖のカルボキシル末端に融合させ、Ｆｃ領域のカルボキシル末端でＦａｂドメインが形成されるようにしてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ヒトＣＧＲＰ受容体とヒトＰＡＣ１受容体の両方に特異的に結合する二重特異性抗原結合タンパク質に関する。ＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体の両方のシグナル伝達は、大脳血管状態の制御との関与が示唆されていることから、本発明の二重特異性結合タンパク質は、両シグナル伝達カスケードを同時に調節して、群発頭痛及び片頭痛などの頭蓋血管の調節異常に関連する状態を改善する手段を提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「抗原結合タンパク質」という用語は、１つ以上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質は、抗体及びその機能性断片を含み得る。「機能性抗体断片」は、完全長重鎖及び／または軽鎖中に存在するアミノ酸のうちの少なくともいくつかを欠くが、依然として抗原に特異的に結合できる、抗体の一部である。機能性抗体断片には、限定するものではないが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン；ＶＨＨ断片、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６４：２８５３−５７，２００４参照）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられ、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはラクダなどの任意の哺乳動物源から得ることができる。機能性抗体断片は、標的抗原の結合に関してインタクトな抗体と競合することができ、当該断片は、インタクトな抗体の改変（例えば、酵素的または化学的切断）により作製することができ、あるいは組み換えＤＮＡ技術またはペプチド合成を使用して新たに合成することができる。
【００２８】
抗原結合タンパク質はまた、１つのポリペプチド鎖中または複数のポリペプチド鎖中に組み込まれた１つ以上の機能性抗体断片を含むタンパク質を包含することができる。例えば、抗原結合タンパク質には、ダイアボディ（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４−６４４８，１９９３参照）；細胞内抗体；ドメイン抗体（１つのＶＬもしくはＶＨドメインまたはペプチドリンカーによって接続された２つ以上のＶＨドメイン；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４−５４６，１９８９参照）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５−１０６，２００４及びＰｏｗｅｒｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３−１３５，２００１参照）；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ；Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５−２３，２００４参照）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に結合した１つ以上のペプチド、ＷＯ００／２４７８２参照）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７−１０６２，１９９５）；小モジュール免疫薬（米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号参照）；及び免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＩｇＧ−Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＶＨ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ＶＨ及びＦａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の抗原結合タンパク質は、「二重特異性」であり、２つの異なる抗原であるヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合することができることを意味する。本明細書で使用するとき、抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下における他の無関係のタンパク質に対する親和性と比較して、標的抗原に対して極めて高い結合親和性を有し、その結果、当該抗原を認識することができるとき、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原と特異的に結合する抗原結合タンパク質は、≦１×１０−６Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。抗原結合タンパク質は、ＫＤが≦１×１０−８Ｍである場合、「高い親和性」で抗原に特異的に結合する。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−７ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−７ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。更に別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−８ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−８ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。ある特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−９ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。他の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−９ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。特定の一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−１０ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。別の特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−１０ＭのＫＤで、ヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に結合する。
【００３０】
親和性は、様々な技術を用いて決定され、その一例は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。種々の実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）に基づくアッセイ）によって決定される。この方法を用いると、会合速度定数（ｋａ、単位Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度定数（ｋｄ、単位ｓ−１）を測定することができる。次いで、この速度論的定数の比（ｋｄ／ｋａ）から平衡解離定数（ＫＤ、単位Ｍ）を算出することができる。いくつかの実施形態において、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２−６０，２００８に記載されているＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎアッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いると、平衡解離定数（ＫＤ、単位Ｍ）及び会合速度定数（ｋａ、単位Ｍ−１ｓ−１）を測定することができる。解離速度定数（ｋｄ、単位ｓ−１）は、これらの値（ＫＤ×ｋａ）から算出することができる。他の実施形態において、親和性は、平衡／溶液法によって決定される。ある特定の実施形態において、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される。ＷＯ２０１０／０７５２３８及びＷＯ２０１４／１４４６３２（両文献の全体が参照により本明細書に援用される）は、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体に対する結合タンパク質の親和性を決定するための好適な親和性アッセイについて記載している。本発明のある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２−６０，２００８に記載されている方法を用いて実施したＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎアッセイにより測定したとき、２０ｎＭ（２．０×１０−８Ｍ）以下のＫＤ、１０ｎＭ（１．０×１０−８Ｍ）以下のＫＤ、１ｎＭ（１．０×１０−９Ｍ）以下のＫＤ、５００ｐＭ（５．０×１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、２００ｐＭ（２．０×１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１５０ｐＭ（１．５０×１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１２５ｐＭ（１．２５×１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１０５ｐＭ（１．０５×１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、５０ｐＭ（５．０×１０−１１Ｍ）以下のＫＤ、または２０ｐＭ（２．０×１０−１１Ｍ）以下のＫＤで、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ）によって発現されるヒトＣＧＲＰ受容体及び／またはヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ｋｄ（解離速度定数）として測定されるヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体に対する結合活性が約１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０ｓ−１以下であり（値が小さいほど結合活性が高いことを示す）、及び／あるいはＫＤ（平衡解離定数）として測定されるヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１に対する結合親和性が約１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ以下である（値が小さいほど結合親和性が高いこ���を示す）などの望ましい特徴を呈する。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、多価である。結合タンパク質の価数は、結合タンパク質中の個々の抗原結合ドメインの数を示す。例えば、本発明の抗原結合タンパク質に関して、「一価」、「二価」及び「四価」という用語は、それぞれ１つ、２つ及び４つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を指す。したがって、多価抗原結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、二価である。したがって、このような二重特異性二価抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ受容体に結合する１つの抗原結合ドメイン及びヒトＰＡＣ１受容体に結合する１つの抗原結合ドメインの２つの抗原結合ドメインを含有する。他の実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、多価である。例えば、ある特定の実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、四価であり、ヒトＣＧＲＰ受容体に結合する２つの抗原結合ドメイン及びヒトＰＡＣ１受容体に結合する２つの抗原結合ドメインの４つの抗原結合ドメインを含む。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「結合ドメイン」と区別なく用いられる、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原と相互に作用し、かつ抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の領域を指す。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体の天然リガンドに由来し得る。例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する結合ドメインは、ヒトα−ＣＧＲＰに由来し得、Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２５６：Ｅ３３１−Ｅ３３５，１９８９及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．３１９：７４９−７５７，２００６に記載されているＣＧＲＰ８−３７アンタゴニストペプチド及びそのバリアントなどのペプチドアンタゴニストを含む。同様に、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する結合ドメインは、ＰＡＣＡＰ３８またはＰＡＣＡＰ２７に由来し得、Ｂｏｕｒｇａｕｌｔ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５２：３３０８−３３１６，２００９及び米国特許第６，０１７，５３３号に記載されているものなどのペプチドアンタゴニストを含み得る。
【００３３】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のある特定の実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその機能性断片に由来し得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインは、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。本明細書で使用するとき、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列中の相補性決定領域（「最小認識単位」または「超可変領域」とも言う）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）とがある。本明細書で使用する「ＣＤＲ領域」という用語は、１つの可変領域中に存在する３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲまたは３つの重鎖ＣＤＲ）の一群を指す。２つの鎖の各鎖中のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質上の特定のエピトープまたはドメイン（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体）と特異的に結合する構造を形成する。天然の軽鎖及び重鎖可変領域はいずれも、Ｎ末端からＣ末端に向かって、通常、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の要素の順序に従う。これらの各ドメイン中においてアミノ酸が占める位置を、アミノ酸に割り当てるために、番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ
ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３に定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを使用して特定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、抗ＣＧＲＰ受容体抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の６つ全てのＣＤＲを含み、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、抗ＰＡＣ１受容体抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の６つ全てのＣＤＲを含む。
【００３４】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態において、結合ドメイン（抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメイン、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインまたは両方）には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはナノボディが含まれる。一実施形態において、結合ドメインは両方ともＦａｂ断片である。別の実施形態において、１つの結合ドメインはＦａｂ断片であり、もう１つの結合ドメインはｓｃＦｖである。
【００３５】
抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、免疫グロブリン定常領域を含有する残りの「Ｆｃ」断片とが生成される。Ｆａｂ断片は、可変ドメインの全てと、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。したがって、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））と、１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、もう一方の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆｃ断片は、炭水化物を提示し、抗体のクラスを互いに区別する多くの抗体エフェクター機能（補体及び細胞受容体の結合など）を担う。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖構成要素を示す。
【００３６】
「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。
【００３７】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域で重鎖間がジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ’断片を含む、二価断片である。
【００３８】
「Ｆｖ」断片は、抗体に由来する完全な抗原認識結合部位を含有する最小断片である。この断片は、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）との二量体から構成され、非共有結合的にしっかりと会合している。この構成にて、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。単一の軽鎖または重鎖可変領域（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖ断片の半分）は、ＶＨとＶＬの両方を含む結合部位全体よりも親和性が低くなるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００３９】
「一本鎖可変抗体断片」または「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ及びＶＬ領域を含み、これらの領域が単一のポリペプチド鎖中に存在し、かつＶＨ領域とＶＬ領域との間に、Ｆｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするペプチドリンカーを任意に含む（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３−４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９−５８８３，１９８８参照）。
【００４０】
「ナノボディ」は、重鎖抗体の重鎖可変領域である。このような可変ドメインは、当該重鎖抗体の最も小さな完全な機能性抗原結合断片であり、分子量はわずか１５ｋＤａである。Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
６４：２８５３−５７，２００４を参照されたい。軽鎖を持っていない機能性重鎖抗体は、ある種の動物、例えば、テンジクザメ、オオセならびにラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマなどのＣａｍｅｌｉｄａｅにて天然に生じる。これらの動物において、抗原結合部位は、単一のドメインのＶＨＨドメインにまで縮小されている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能性抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」とも呼ばれる）。ラクダ化ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインを欠く、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３定常領域と再結合することが報告されている。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を有すること（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４１：３６２８−３６，２００２）が見出されている。ラクダ化重鎖を有する抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号及び同第２００５／００３７４２１号に記載されている。代替的な足場は、サメＶ−ＮＡＲ足場に更に緊密に一致するヒト可変様ドメインから作製することができ、長い貫通ループ構造のためのフレームワークを提供し得る。
【００４１】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、結合ドメインは、所望の抗原に特異的に結合する抗体または抗体断片の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来するＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来するＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
【００４２】
本明細書中、「可変ドメイン」と区別なく用いられる、「可変領域」（軽鎖（ＶＬ）の可変領域、重鎖（ＶＨ）の可変領域）とは、抗体の抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のそれぞれの鎖中の領域を指す。上述したように、可変軽鎖及び重鎖の領域は、同じ全体構造を有し、各領域は、配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を有し、これらの領域が３つのＣＤＲにより連結されている。フレームワーク領域はβシート構造を取り、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって、その三次元構造を保持し、もう一方の鎖のＣＤＲとともに、抗原結合部位を形成する。
【００４３】
ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）これらの抗原に対する既知の抗体から得てもよいし、あるいはｂ）抗原タンパク質もしくはその断片を使用するデノボ免疫法によって、またはファージディスプレイもしくは他の慣用的方法によって得られる新しい抗体もしくは抗体断片から得てもよい。二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの由来となる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であってよい。ある特定の実施形態において、結合ドメインの由来となる抗体は、モノクローナル抗体である。これらの実施形態及び他の実施形態において、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型のものであってよい。
【００４４】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」（または「ｍＡｂ」）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在する可能性が想定される自然に発生する変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、異なるエピトープを標的にする種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、極めて特異的であり、単一の抗原部位またはエピトープを標的にする。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、免疫付与スケジュール終了後のトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、作製することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成することによって、不死化することができる。ハイブリドーマ形成融合手順にて使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、融合効率が高く、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の成長のみを助ける特定の選択培地中では成長できない酵素欠損性である。マウス融合にて使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌが挙げられ、ラット融合にて使用される細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【００４５】
いくつかの場合において、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体免疫原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させることによりハイブリドーマ細胞を形成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、ＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体と結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定することによって作製される。
【００４６】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーなどの当該技術分野において知られている任意の技術を使用して精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂは、ＣＧＲＰ受容体もしくはＰＡＣ１受容体を発現する細胞と結合する能力、ＣＧＲＰリガンドもしくはＰＡＣＡＰリガンドのそれぞれの受容体への結合を遮断もしくは阻害する能力、または受容体のいずれかを機能的に遮断する能力などの特定の性質を備えるｍＡｂを特定するために、例えば、ｃＡＭＰアッセイ、例えば、本明細書に記載するものなどを使用して、更にスクリーニングすることができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体及び抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、それぞれＰＡＣ１受容体及びＣＧＲＰ受容体に対するヒト化抗体に由来し得る。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）が、ヒト免疫グロブリンに由来する、対応する領域を含むように改変された抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、初めに非ヒト動物において作られたモノクローナル抗体から作製することができる。このモノクローナル抗体中のある特定のアミノ酸残基、典型的には抗体の非抗原認識部分のアミノ酸残基を、対応するアイソタイプのヒト抗体中の対応する残基と相同になるように、改変する。ヒト化は、例えば、各種方法を用いて、齧歯類の可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することによって実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３−２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４−１５３６，１９８８参照）。別の種において産生された抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列に由来するＦＲを整列させ、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。
【００４８】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの由来となり得る、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体に対する新規作製抗体は、完全ヒト抗体であってよい。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞の免疫グロブリン配列に由来するか、または当該配列を示す、可変及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の作製を行うために提供される１つの具体的手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子を不活性化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することは、マウス（任意の所望の抗原で免疫化することができる動物）で完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させる１つの手段である。完全ヒト抗体を使用することで、マウスまたはマウス由来ｍＡｂを治療薬としてヒトに投与することにより時として引き起こされることがある、免疫原性及びアレルギー性応答を最低限にすることができる。
【００４９】
完全ヒト抗体は、ヒト抗体のレパートリーを内因性免疫グロブリンの産生がない状態で産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって作製することができる。本目的のための抗原は、典型的には、６つ以上の連続するアミノ酸を有し、ハプテンなどの担体に任意に結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例において、トランスジェニック動物は、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無力化し、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大きな断片をマウスゲノム中に挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全な相補体に満たない部分的に改変された動物を異種交配させて、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。これらのトランスジェニック動物は、免疫原を投与すると、免疫原に関して免疫特異性でありながら、可変領域を含めて、マウスではなくヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法の更なる詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関する更なる方法については、米国特許第５，５４５，８０７号、同第６，７１３，６１０号、同第６，６７３，９８６号、同第６，１６２，９６３号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５４５，８０７号、同第６，３００，１２９号、同第６，２５５，４５８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号及び同第５，５４５，８０６号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３０４９８、ＷＯ９８／２４８９３ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１及びＥＰ５４６０７３Ａ１に記載されている。
【００５０】
本明細書にて「ＨｕＭａｂ」マウスとも呼ぶ上記のトランスジェニックマウスは、内因性μ鎖及びκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的変異とともに、再構成されていないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、これらのマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下及び免疫付与への応答を示し、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，上掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ
ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ
ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に記載されている。上述の参考文献は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。更に、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号及び同第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開ＷＯ９３／１２２７、ＷＯ９２／２２６４６及びＷＯ９２／０３９１８も参照されたい。これらの全ての開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。これらのトランスジェニックマウスにてヒト抗体を産生するために利用される技術は、ＷＯ９８／２４８９３、及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６にも記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。例えば、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を使用して、更なる完全ヒト抗ＣＧＲＰ受容体及び抗ＰＡＣ１受容体抗体を生成することができる。
【００５１】
ヒト由来抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して作製することもできる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、及びＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、当該文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。ファージ技術によって作製される抗体は、通常、抗原結合断片、例えば、ＦｖまたはＦａｂ断片として細菌中で作製されるため、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の２つの手法のうちの１つにより導入することができる。当該断片を、所望により、哺乳動物細胞中にて発現させるための完全抗体、またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を含む二重特異性抗体断片のいずれかへと操作することができる。典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲによって個別にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーでランダムに組み合わせ、次いで、これを特定の抗原に対する結合に関して選択することができる。抗体断片をファージ表面上に発現させ、抗原結合によるＦｖまたはＦａｂ（したがって、抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の選択を、パニングと呼ばれる数回の抗原結合及び再増幅の手順により行う。抗原に特異的な抗体断片を濃縮し、最終的に単離する。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイド選択」と呼ばれる齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにも使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）参照）。この場合、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーとの組み合わせで提示することができ、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択することができる。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を助ける鋳型を提供する。その後、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により、ヒトＦａｂのみが得られる。
【００５２】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する結合ドメインを含む。ヒトＰＡＣ１受容体（本明細書にて、「ヒトＰＡＣ１」、「ｈＰＡＣ１」及び「ｈＰＡＣ１受容体」とも言う）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースにおいてＰ４１５８６（ＰＡＣＲ＿ＨＵＭＡＮ）として示される４６８個のアミノ酸タンパク質であり、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１遺伝子によってコードされている。ＰＡＣＡＰ−２７及びＰＡＣＡＰ−３８が主要なＰＡＣ１の内因性アゴニストである。ヒトＰＡＣ１受容体のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＡＧＶＶＨＶＳＬＡ  ＡＬＬＬＬＰＭＡＰＡ  ＭＨＳＤＣＩＦＫＫＥ  ＱＡＭＣＬＥＫＩＱＲ  ＡＮＥＬＭＧＦＮＤＳ
ＳＰＧＣＰＧＭＷＤＮ  ＩＴＣＷＫＰＡＨＶＧ  ＥＭＶＬＶＳＣＰＥＬ  ＦＲＩＦＮＰＤＱＶＷ  ＥＴＥＴＩＧＥＳＤＦ
ＧＤＳＮＳＬＤＬＳＤ  ＭＧＶＶＳＲＮＣＴＥ  ＤＧＷＳＥＰＦＰＨＹ  ＦＤＡＣＧＦＤＥＹＥ  ＳＥＴＧＤＱＤＹＹＹ
ＬＳＶＫＡＬＹＴＶＧ  ＹＳＴＳＬＶＴＬＴＴ  ＡＭＶＩＬＣＲＦＲＫ  ＬＨＣＴＲＮＦＩＨＭ  ＮＬＦＶＳＦＭＬＲＡ
ＩＳＶＦＩＫＤＷＩＬ  ＹＡＥＱＤＳＮＨＣＦ  ＩＳＴＶＥＣＫＡＶＭ  ＶＦＦＨＹＣＶＶＳＮ  ＹＦＷＬＦＩＥＧＬＹ
ＬＦＴＬＬＶＥＴＦＦ  ＰＥＲＲＹＦＹＷＹＴ  ＩＩＧＷＧＴＰＴＶＣ  ＶＴＶＷＡＴＬＲＬＹ  ＦＤＤＴＧＣＷＤＭＮ
ＤＳＴＡＬＷＷＶＩＫ  ＧＰＶＶＧＳＩＭＶＮ  ＦＶＬＦＩＧＩＩＶＩ  ＬＶＱＫＬＱＳＰＤＭ  ＧＧＮＥＳＳＩＹＬＲ
ＬＡＲＳＴＬＬＬＩＰ  ＬＦＧＩＨＹＴＶＦＡ  ＦＳＰＥＮＶＳＫＲＥ  ＲＬＶＦＥＬＧＬＧＳ  ＦＱＧＦＶＶＡＶＬＹ
ＣＦＬＮＧＥＶＱＡＥ  ＩＫＲＫＷＲＳＷＫＶ  ＮＲＹＦＡＶＤＦＫＨ  ＲＨＰＳＬＡＳＳＧＶ  ＮＧＧＴＱＬＳＩＬＳＫＳＳＳＱＩＲＭＳＧ  ＬＰＡＤＮＬＡＴ（配列番号３３９）
【００５３】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１結合ドメインは、抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片に由来するＶＨ領域及び／もしくはＶＬ領域またはＣＤＲ領域を含む。好ましくは、抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、受容体のＰＡＣＡＰ−３８及び／またはＰＡＣＡＰ−２７に対する結合を妨害または低減する。いくつかの実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＰＡＣ１受容体の細胞外領域に特異的に結合する。特定の一実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片は、ＰＡＣ１受容体のアミノ末端細胞外ドメイン（すなわち、配列番号３３９のアミノ酸２１〜１５５）に特異的に結合する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１結合ドメインの由来となる抗ＰＡＣ１抗体またはその機能性断片は、ヒトＶＰＡＣ１及びヒトＶＰＡＣ２受容体と比較して、ヒトＰＡＣ１受容体を選択的に阻害する。抗体またはその機能性断片は、特定の受容体の阻害アッセイにおける当該抗体のＩＣ５０が、別の「参照」受容体、例えば、ｈＶＰＡＣ１またはｈＶＰＡＣ２受容体の阻害アッセイにおけるＩＣ５０よりも少なくとも１／５０であるとき、他の受容体と比較して、その特定の受容体を「選択的に阻害する」。「ＩＣ５０」は、生物学的または生化学的機能の５０％阻害を達成するのに必要な用量／濃度である。放射性リガンドの場合、ＩＣ５０は、放射性リガンドの特異的結合の５０％を置き換える競合リガンドの濃度である。任意の特定の物質またはアンタゴニストのＩＣ５０は、特定の機能的アッセイにて、用量反応曲線を作成し、異なる濃度の薬物またはアンタゴニストのアゴニスト活性を後退させる効果を調べることによって、特定することができる。所与のアンタゴニストまたは薬物に関するＩＣ５０値は、アゴニストの生物学的応答の最大値の半数を阻害するのに必要な濃度を特定することによって、算出することができる。したがって、任意の抗ＰＡＣ１抗体またはその機能性断片に関するＩＣ５０値は、実施例に記載のｃＡＭＰアッセイなどの任意の機能的アッセイにて、ヒトＰＡＣ１受容体を活性化する際のＰＡＣＡＰリガンド（ＰＡＣＡＰ−２７またはＰＡＣＡＰ−３８）の生物学的応答の最大値の半数を阻害するのに必要な抗体または断片の濃度を特定することによって、算出することができる。特定の受容体を選択的に阻害する抗体またはその機能性断片は、当該受容体に対して、中和抗体または中和断片であると理解される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１結合ドメインの由来となる抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＰＡＣ１受容体の中和抗体または断片である。
【００５５】
任意の抗ＰＡＣ１受容体抗体またはその機能性断片の可変領域またはＣＤＲ領域を使用して、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のいずれかの抗ＰＡＣ１結合ドメインを構築することができる。例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１結合ドメインは、その全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１４／１４４６３２に記載されている抗ヒトＰＡＣ１受容体抗体のいずれかに由来するＶＨ及び／もしくはＶＬ領域または１つ以上のＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態において、抗ＰＡＣ１結合ドメインの由来となる抗ＰＡＣ１抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体の結合に関して、ＷＯ２０１４／１４４６３２に記載されているヒト抗ＰＡＣ１抗体のうちの１つ以上、または以下に記載する抗ＰＡＣ１抗体のうちの１つ以上と競合する。「競合」という用語は、他の抗体または結合断片の標的（例えば、ヒトＰＡＣ１受容体またはヒトＣＧＲＰ受容体）への結合に干渉する、抗体または他の抗原結合タンパク質の能力を指す。抗体または結合断片が、別の抗体または結合断片の標的（例えば、ヒトＰＡＣ１受容体またはヒトＣＧＲＰ受容体）への結合に干渉する程度、したがって、競合すると言うことができるかどうかは、競合的結合アッセイを使用して特定することができる。多数の種類の競合的結合アッセイを使用することができ、例えば、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）直接法または間接法、固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）直接法または間接法、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３参照）；固相ビオチン−アビジンＥＩＡ直接法（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９参照）；固相直接標識法、固相直接標識サンドイッチ法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５参照）；固相ビオチン−アビジンＥＩＡ直接法（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）が挙げられる。典型的には、競合的結合アッセイは、固相表面に結合した精製抗原または抗原担持細胞、非標識の試験抗体または他の抗原結合タンパク質、及び標識した参照抗体または他の抗原結合タンパク質の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗体または他の抗原結合タンパク質の存在下で固相表面または細胞に結合した標識量を求めることによって、測定される。通常、試験抗体または他の抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗体または他の抗原結合タンパク質（すなわち、競合抗体及び競合抗原結合タンパク質）には、参照抗体または参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗体及び抗原結合タンパク質が挙げられ��。通常、競合抗体または他の抗原結合タンパク質が過剰に存在するとき、標的抗原に対する参照抗体または他の抗原結合タンパク質の特異的結合は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害される。場合によっては、参照抗体または他の抗原結合タンパク質の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。いくつかの実施形態において、競合抗体またはその結合断片は、参照抗体のヒトＰＡＣ１受容体結合を、約４０％〜１００％、例えば約６０％〜約１００％、具体的には約７０％〜１００％、より具体的には約８０％〜１００％低減させる。
【００５６】
競合的結合を検出するのに特に好適な定量的アッセイは、表面プラズモン共鳴法を使用して相互作用の程度を測定するＢｉａｃｏｒｅ装置を使用するものである。例示的なＢｉａｃｏｒｅ系競合的結合アッセイは、参照抗体をセンサーチップに固定化することを伴う。次いで、標的抗原をセンサーチップと接触させると、標的抗原がセンサーチップ上で固定化された参照抗体によって捕捉される。次いで、この捕捉された標的抗原に対して試験抗体が注入される。注入された試験抗体が、固定化された抗体によって認識されたエピトープとは異なるエピトープを認識する場合、次いで、第２の結合イベントが観察されるため、この試験抗体は、参照抗体と標的抗原への結合に関して競合しないと考えられる。別の好適な定量的競合的結合アッセイは、ヒトＰＡＣ１受容体への結合に関して、抗体間の競合を測定する、ＦＡＣＳに基づく手法を使用するものである。
【００５７】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインの由来または構築元となる、例示的なヒト抗ＰＡＣ１受容体抗体の軽鎖及び重鎖可変領域ならびに関連するＣＤＲについて、それぞれ以下の表１Ａ及び１Ｂに記載する。
【表１Ａ−００１】
2020074790.tif 000003
【表１Ａ−００２】
2020074790.tif 000004
【表１Ａ−００３】
2020074790.tif 000005
【表１Ａ−００４】
2020074790.tif 000006
【表１Ｂ−００１】
2020074790.tif 000007
【表１Ｂ−００２】
2020074790.tif 000008
【表１Ｂ−００３】
2020074790.tif 000009
【表１Ｂ−００４】
2020074790.tif 000010
【００５８】
二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ａ（軽鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＬ）及び表１Ｂ（重鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＨ）に示すＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、（ｉ）配列番号１〜１３から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号１４〜１９から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号２０〜２７から選択されるＣＤＲＬ３、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちのＣＤＲＬであって、１つ以上、例えば、１、２、３、４つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の欠失または挿入を含有するＣＤＲＬから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、（ｉ）配列番号５５〜６５から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号６６〜７３から選択されるＣＤＲＨ２、ならびに（ｉｉｉ）配列番号７４〜８２から選択されるＣＤＲＨ３、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨであって、１つ以上、例えば、１、２、３、４つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の欠失または挿入を含有するＣＤＲＨから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
【００５９】
ある特定の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ａ及び１Ｂに列挙するＣＤＲの１、２、３、４、５、または６つのバリアント型を含み得、その各々は、表１Ａ及び１Ｂに列挙するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ａ及び１Ｂに列挙するＣＤＲのうちの１、２、３、４、５または６つを含み、その各々は、これらの表に列挙するＣＤＲとアミノ酸が１、２、３、４または５つ以下異なる。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、１４及び２０の配列を有するか、（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２、１５及び２１の配列を有するか、（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１５及び２１の配列を有するか、（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４、１６及び２２の配列を有するか、（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、１５及び２１の配列を有するか、（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号６、１７及び２３の配列を有するか、（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、１８及び２４の配列を有するか、（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号８、１７及び２５の配列を有するか、（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号９、１６及び２２の配列を有するか、（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０、１９及び２６の配列を有するか、（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１、１６及び２７の配列を有するか、（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、１６及び２２の配列を有するか、または（ｍ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、１６及び２７の配列を有する。
【００６１】
他の特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５５、６６及び７４の配列を有するか、（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有するか、（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５８、６９及び７７の配列を有するか、（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５９、６９及び７８の配列を有するか、（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６０、７０及び７９の配列を有するか、（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６１、７１及び８０の配列を有するか、（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６２、７２及び８１の配列を有するか、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６３、７３及び８２の配列を有するか、（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６４、６８及び７６の配列を有するか、または（ｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６５、６８及び７６の配列を有する。
【００６２】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、１４及び２０の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５５、６６及び７４の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４、１６及び２２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有するか、
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５８、６９及び７７の配列を有するか、
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５９、６９及び７８の配列を有するか、
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号６、１７及び２３の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６０、７０及び７９の配列を有するか、
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、１８及び２４の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６１、７１及び８０の配列を有するか、
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号８、１７及び２５の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６２、７２及び８１の配列を有するか、
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号９、１６及び２２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有するか、
（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０、１９及び２６の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６３、７３及び８２の配列を有するか、
（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１、１６及び２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６４、６８及び７６の配列を有するか、
（ｍ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、１６及び２２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有するか、または
（ｎ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、１６及び２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号６５、６８及び７６の配列を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、１４及び２０の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５５、６６及び７４の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１５及び２１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５６、６７及び７５の配列を有するか、または
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４、１６及び２２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７、６８及び７６の配列を有する。
【００６４】
本発明の抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ａに示すＬＶ−０１、ＬＶ−０２、ＬＶ−０３、ＬＶ−０４、ＬＶ−０５、ＬＶ−０６、ＬＶ−０７、ＬＶ−０８、ＬＶ−０９、ＬＶ−１０、ＬＶ−１１、ＬＶ−１２、ＬＶ−１３、ＬＶ−１４、ＬＶ−１５、ＬＶ−１６、ＬＶ−１７、ＬＶ−１８、ＬＶ−１９、ＬＶ−２０、ＬＶ−２１、ＬＶ−２２、ＬＶ−２３、ＬＶ−２４、ＬＶ−２５、ＬＶ−２６及びＬＶ−２７からなる群から選択される軽鎖可変領域、及び／または表１Ｂに示すＨＶ−０１、ＨＶ−０２、ＨＶ−０３、ＨＶ−０４、ＨＶ−０５、ＨＶ−０６、ＨＶ−０７、ＨＶ−０８、ＨＶ−０９、ＨＶ−１０、ＨＶ−１１、ＨＶ−１２、ＨＶ−１３、ＨＶ−１４、ＨＶ−１５、ＨＶ−１６、ＨＶ−１７、ＨＶ−１８、ＨＶ−１９、ＨＶ−２０、ＨＶ−２１、ＨＶ−２２、ＨＶ−２３、ＨＶ−２４、ＨＶ−２５及びＨＶ−２６からなる群から選択される重鎖可変領域、ならびにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の機能性断片、誘導体、変異タンパク質及びバリアントを含み得る。
【００６５】
表１Ａに列挙する軽鎖可変領域のそれぞれを、表１Ｂに示す重鎖可変領域のうちのいずれかと組み合わせて、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質への組み込みに適した抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインを形成することができる。このような組み合わせの例には、ＬＶ−０１とＨＶ−０１、ＬＶ−０２とＨＶ−０２、ＬＶ−０３とＨＶ−０１、ＬＶ−０４とＨＶ−０３、ＬＶ−０５とＨＶ−０４、ＬＶ−０６とＨＶ−０５、ＬＶ−０７とＨＶ−０６、ＬＶ−０８とＨＶ−０７、ＬＶ−０９とＨＶ−０８、ＬＶ−１０とＨＶ−０９、ＬＶ−１１とＨＶ−１０、ＬＶ−１２とＨＶ−１１、ＬＶ−１３とＨＶ−１３、ＬＶ−１３とＨＶ−０３、ＬＶ−１３とＨＶ−１４、ＬＶ−１４とＨＶ−１２、ＬＶ−１５とＨＶ−１３、ＬＶ−１５とＨＶ−０３、ＬＶ−１５とＨＶ−１２、ＬＶ−１６とＨＶ−０３、ＬＶ−１６とＨＶ−１５、ＬＶ−１６とＨＶ−１６、ＬＶ−１６とＨＶ−１７、ＬＶ−１７とＨＶ−１８、ＬＶ−１８とＨＶ−１８、ＬＶ−１９とＨＶ−１９、ＬＶ−２０とＨＶ−２０、ＬＶ−２１とＨＶ−２１、ＬＶ−２２とＨＶ−２２、ＬＶ−２３とＨＶ−２３、ＬＶ−２４とＨＶ−２４、ＬＶ−２５とＨＶ−２５、ＬＶ−２６とＨＶ−２３及びＬＶ−２７とＨＶ−２６が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、（ａ）ＬＶ−０１（配列番号２８）及びＨＶ−０１（配列番号８３）、（ｂ）ＬＶ−０３（配列番号３０）及びＨＶ−０１（配列番号８３）、（ｃ）ＬＶ−０４（配列番号３１）及びＨＶ−０３（配列番号８５）、（ｄ）ＬＶ−０６（配列番号３３）及びＨＶ−０５（配列番号８７）、（ｅ）ＬＶ−０８（配列番号３５）及びＨＶ−０７（配列番号８９）、または（ｆ）ＬＶ−１０（配列番号３７）及びＨＶ−０９（配列番号９１）を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ａ中の軽鎖可変領域、すなわち、ＬＶ−０１、ＬＶ−０２、ＬＶ−０３、ＬＶ−０４、ＬＶ−０５、ＬＶ−０６、ＬＶ−０７、ＬＶ−０８、ＬＶ−０９、ＬＶ−１０、ＬＶ−１１、ＬＶ−１２、ＬＶ−１３、ＬＶ−１４、ＬＶ−１５、ＬＶ−１６、ＬＶ−１７、ＬＶ−１８、ＬＶ−１９、ＬＶ−２０、ＬＶ−２１、ＬＶ−２２、ＬＶ−２３、ＬＶ−２４、ＬＶ−２５、ＬＶ−２６及びＬＶ−２７から選択されるＶＬの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なる連続アミノ酸の配列を含む、軽鎖可変領域を含み、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、この欠失、挿入及び／または置換により、前述の可変ドメイン配列に対して１５個以下のアミノ酸変化がもたらされる。いくつかの抗ＰＡＣ１結合ドメイン中の軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５４のアミノ酸配列（すなわち、表１Ａ中の軽鎖可変領域）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００６７】
これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体結合ドメインは、表１Ｂ中の重鎖可変領域、すなわち、ＨＶ−０１、ＨＶ−０２、ＨＶ−０３、ＨＶ−０４、ＨＶ−０５、ＨＶ−０６、ＨＶ−０７、ＨＶ−０８、ＨＶ−０９、ＨＶ−１０、ＨＶ−１１、ＨＶ−１２、ＨＶ−１３、ＨＶ−１４、ＨＶ−１５、ＨＶ−１６、ＨＶ−１７、ＨＶ−１８、ＨＶ−１９、ＨＶ−２０、ＨＶ−２１、ＨＶ−２２、ＨＶ−２３、ＨＶ−２４、ＨＶ−２５及びＨＶ−２６から選択されるＶＨの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なる連続アミノ酸の配列を含む、重鎖可変領域を含み、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、この欠失、挿入及び／または置換により、前述の可変ドメイン配列に対して１５個以下のアミノ酸変化がもたらされる。いくつかの抗ＰＡＣ１受容体結合ドメイン中の重鎖可変領域は、配列番号８３〜１０８のアミノ酸配列（すなわち、表１Ｂ中の重鎖可変領域）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００６８】
本明細書で使用する「同一性」という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、本明細書で使用するとき、比較する分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間で同一である残基のパーセントを意味し、比較対象とする分子の最小の大きさに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメント中のギャップ（存在する場合）を特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）で処理する必要がある。整列させた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ
Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが挙げられる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般に用いられる標準的な方法により決定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの配列を、それぞれの残基が最適に一致するように配列させる（一方もしくは両方の配列の全長、または一方もしくは両方の配列の所定の部分のいずれかに沿って）。プログラムは、デフォルト開始ペナルティ及びデフォルトギャップペナルティを提供し、またＰＡＭ２５０（標準的なスコア行列；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）参照）などのスコア行列をコンピュータプログラムとともに使用することができる。次いで、例えば、同一性パーセントは、同一のマッチ総数に１００を掛けた後、一致したスパン内の長いほうの配列の長さと、２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップ数との合計で除することによって算出することができる。同一性パーセントの計算において、比較する配列は、配列間の最大一致を与えるように整列される。
【００６９】
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、パッケージにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを求めたい２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドが最適に一致するように整列される（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角成分の３倍として計算され、ここで、「平均対角成分」は、使用する比較行列の対角成分の平均であり、「対角成分」は、特定の比較行列によってそれぞれの完全なアミノ酸の一致に割り当てられたスコアまたは数値である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０）ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列がアルゴリズムとともに使用される。ある特定の実施形態において、標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列については、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）もまたアルゴリズムにより使用される。
【００７０】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメーターは、次のものである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２、上掲）のＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２（ただし、末端ギャップに対するペナルティはなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【００７１】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのある特定のアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみの一致しか得られないことがあり、この整列された小さな領域は、２つの全長配列の間に有意な関係が存在しない場合でも、極めて高い配列同一性を有し得る。したがって、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸に及ぶアラインメントを得ようとする場合には、選択するアラインメント法（ＧＡＰプログラム）を調節することができる。
【００７２】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する結合ドメインを含む。ヒトＣＧＲＰ受容体（本明細書において、「ＣＧＲＰＲ」、「ＣＧＲＰ  Ｒ」、「ｈＣＧＲＰＲ」及び「ｈｕＣＧＲＰＲ」とも呼ぶ）は、ヒトカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１７４７３．１）と、ヒト受容体活性調節タンパク質１（ＲＡＭＰ１）ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ００１０１４）とを含むヘテロ二量体である。完全長ヒトＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１ポリペプチド、ならびに両ポリペプチドに由来する細胞外ドメインのアミノ酸配列を以下の表２に記載する。
【表２】
2020074790.tif 000011
【００７３】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片に由来するＶＨ領域及び／もしくはＶＬ領域またはＣＤＲ領域を含む。好ましくは、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、当該受容体のＣＧＲＰに対する結合を妨害または低減する。ある特定の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ１の両方のポリペプチド中の残基もしくは残基の配列、または領域に特異的に結合する。一実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ１の両方のポリペプチド中のアミノ酸から形成されるエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用するとき、「エピトープ」とは、抗体またはその機能性断片が特異的に結合することができる任意の決定基を指す。エピトープは、連続していても、連続していなくてもよい（例えば、（ｉ）単鎖ポリペプチドにおいて、当該ポリペプチド配列中で互いに連続していないが、分子という概念内では、抗体または機能性断片が結合するアミノ酸残基、または（ｉｉ）例えば、２つ以上の個別の要素を含む多量体タンパク質において、当該個別の要素のうちの２つ以上に存在するが、多量体タンパク質という概念内では、抗体または機能性断片が結合するアミノ酸残基）。いくつかの実施形態において、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ１の両方のポリペプチド中のアミノ酸から形成されるエピトープは、アスパラギン酸残基といくつかのグルタミン酸残基の後のアミノ末端のペプチドを切断するＡｓｐＮプロテアーゼに対する１つ以上の切断部位を含む。
【００７４】
ある特定の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインの由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、配列番号３４２のアミノ酸配列を含むヒトＣＲＬＲポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する。代替的にまたは追加的に、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、配列番号３４３のアミノ酸配列を含むヒトＲＡＭＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体または結合断片は、配列番号３４４（ＤＳＩＱＬＧＶＴＲＮＫＩＭＴＡＱＹ；配列番号３４２のアミノ酸８〜２４に該当）、配列番号３４５（ＤＶＡＡＧＴＥＳＭＱＬＣＰ；配列番号３４２のアミノ酸５５〜６７に該当）、配列番号３４６（ＤＧＮＷＦＲＨＰＡＳＮＲＴＷＴＮＹＴＱＣＮＶＮＴＨ；配列番号３４２のアミノ酸８６〜１１０に該当）、配列番号３４７（ＥＣＹＱＫＩＭＱ；配列番号３４２のアミノ酸２５〜３２に該当）または配列番号３４８（ＤＧＷＬＣＷＮ；配列番号３４２のアミノ酸４８〜５４に該当）から選択される少なくとも１つの配列を含むヒトＣＲＬＲポリペプチド中のエピトープに特異的に結合する。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、任意にその本来の三次元構造で、配列番号３４２のヒトＣＲＬＲポリペプチドのサブ領域中のエピトープ（このエピトープは配列番号３４４〜３４８を含む）と結合する。代替的にまたは追加的に、抗ＣＧＲＰ受容体抗体または機能性断片は、配列番号３４９（ＲＥＬＡＤＣＴＷＨＭＡＥ；配列番号３４３のアミノ酸４１〜５２に該当）、配列番号３５０（ＤＷＧＲＴＩＲＳＹＲＥＬＡ；配列番号３４３のアミノ酸３２〜４４に該当）、配列番号３５１（ＥＬＣＬＴＱＦＱＶ；配列番号３４３のアミノ酸１２〜２０に該当）または配列番号３５２（ＤＣＴＷＨＭＡ；配列番号３４３のアミノ酸４５〜５１に該当）から選択されるヒトＲＡＭＰ１ポリペプチド中の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、任意にその本来の三次元構造で、配列番号３４３のヒトＲＡＭＰ１ポリペプチドのサブ領域中のエピトープ（このエピトープは配列番号３４９〜３５２を含む）に結合する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインの由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトアドレノメデュリン１（ＡＭ１）、ヒトアドレノメデュリン２（ＡＭ２）またはヒトアミリン受容体（例えば、ヒトＡＭＹ１受容体）と比較して、ヒトＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する。ヒトＡＭ１受容体は、ヒトＣＲＬＲポリペプチド及びＲＡＭＰ２ポリペプチドから構成され、一方、ヒトＡＭ２受容体は、ヒトＣＲＬＲポリペプチド及びＲＡＭＰ３ポリペプチドから構成される。したがって、ＣＲＬＲとのみ結合する（ＲＡＭＰ１に結合しない）抗体または他の結合タンパク質は、ＣＲＬＲポリペプチドがＡＭ１及びＡＭ２受容体の構成要素でもあることから、ＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害するとは考えられない。ヒトアミリン（ＡＭＹ）受容体は、ヒトカルシトニン受容体（ＣＴ）ポリペプチド及びＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２またはＲＡＭＰ３のサブユニットのうちの１つから構成される。具体的には、ヒトＡＭＹ１受容体は、ＣＴポリペプチド及びＲＡＭＰ１ポリペプチドから構成され、ヒトＡＭＹ２受容体は、ＣＴポリペプチド及びＲＡＭＰ２ポリペプチドから構成され、ヒトＡＭＹ３受容体は、ＣＴポリペプチド及びＲＡＭＰ３ポリペプチドから構成される。したがって、ＲＡＭＰ１とのみ結合する（ＣＲＬＲに結合しない）抗体または他の結合タンパク質は、ＲＡＭＰ１ポリペプチドがヒトＡＭＹ１受容体の構成要素でもあることから、ＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害するとは考えられない。上述したとおり、参照受容体（例えば、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはＡＭＹ１受容体）と比較して、特定の受容体（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体）を選択的に阻害する任意の抗体またはその機能性断片の能力は、標的受容体及び参照受容体に関する阻害アッセイにて、その抗体または機能性断片のＩＣ５０値を特定することによって評価することができる。任意の抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片に関するＩＣ５０値は、実施例に記載のｃＡＭＰアッセイなどの任意の機能的アッセイにて、ヒトＣＧＲＰ受容体を活性化する際のＣＧＲＰリガンドの生物学的応答の最大値の半数を阻害するのに必要な抗体または断片の濃度を特定することによって、算出することができる。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインの由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片は、ヒトＣＧＲＰ受容体の中和抗体または断片である。
【００７６】
任意の抗ＣＧＲＰ受容体抗体またはその機能性断片の可変領域またはＣＤＲ領域を使用して、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のいずれかの抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインを構築することができる。例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１０／０７５２３８に記載されている抗ヒトＣＧＲＰ受容体抗体のいずれかに由来するＶＨ及び／もしくはＶＬ領域または１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインの由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体の結合に関して、ＷＯ２０１０／０７５２３８に記載されているヒト抗ＣＧＲＰ受容体抗体のうちの１つ以上、または以下に記載する抗ＣＧＲＰ受容体抗体のうちの１つ以上と競合する。いくつかの実施形態において、競合抗体またはその結合断片は、参照抗体のヒトＣＧＲＰ受容体結合を、約４０％〜１００％、例えば約６０％及び約１００％、具体的には約７０％〜１００％、より具体的には約８０％〜１００％低減させる。競合的結合を検出するのに特に好適な定量的アッセイは、表面プラズモン共鳴法を使用して相互作用の程度を測定するＢｉａｃｏｒｅ装置を使用するものである。別の好適な定量的競合的結合アッセイは、ヒトＣＧＲＰ受容体への結合に関して、抗体間の競合を測定する、ＦＡＣＳに基づく手法を使用するものである。
【００７７】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインの由来または構築元となる、例示的なヒト抗ＣＧＲＰ受容体抗体の軽鎖及び重鎖可変領域ならびに関連するＣＤＲについて、それぞれ以下の表３Ａ及び３Ｂに記載する。
【表３Ａ−００１】
2020074790.tif 000012
【表３Ａ−００２】
2020074790.tif 000013
【表３Ａ−００３】
2020074790.tif 000014
【表３Ａ−００４】
2020074790.tif 000015
【表３Ｂ−００１】
2020074790.tif 000016
【表３Ｂ−００２】
2020074790.tif 000017
【表３Ｂ−００３】
2020074790.tif 000018
【表３Ｂ−００４】
2020074790.tif 000019
【００７８】
二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ａ（軽鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＬ）及び表３Ｂ（重鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＨ）に示すＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、（ｉ）配列番号１０９〜１１９から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号１４、１７、１８、１２０〜１２６から選択されるＣＤＲＬ２、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１２７〜１３５から選択されるＣＤＲＬ３、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬであって、１つ以上、例えば、１、２、３、４つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の欠失または挿入を含有するＣＤＲＬから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５９〜１６６から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１６７〜１７８から選択されるＣＤＲＨ２、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１７９〜１８９から選択されるＣＤＲＨ３、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨであって、１つ以上、例えば、１、２、３、４つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の欠失または挿入を含有するＣＤＲＨから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
【００７９】
ある特定の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ａ及び３Ｂに列挙するＣＤＲの１、２、３、４、５、または６つのバリアント型を含み得、その各々は、表３Ａ及び３Ｂに列挙するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ａ及び３Ｂに列挙するＣＤＲのうちの１、２、３、４、５または６つを含み、その各々は、これらの表に列挙するＣＤＲとアミノ酸が１、２、３、４または５つ以下異なる。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有するか、（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有するか、（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有するか、（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０９、１２２及び１２７の配列を有するか、（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１２、１４及び１３０の配列を有するか、（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１３、１２３及び１３１の配列を有するか、（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１４、１２４及び１３２の配列を有するか、（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１５、１８及び１３３の配列を有するか、（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１６、１２４及び１３２の配列を有するか、（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１７、１２５及び１３４の配列を有するか、（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１８、１２４及び１３２の配列を有するか、または（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１９、１２６及び１３５の配列を有する。
【００８１】
他の特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１５９、１６７及び１７９の配列を有するか、（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１５９、１６８及び１７９の配列を有するか、（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８０の配列を有するか、（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８１の配列を有するか、（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７０及び１８２の配列を有するか、（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７１及び１８２の配列を有するか、（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１５９、１７２及び１７９の配列を有するか、（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６２、１７３及び１８３の配列を有するか、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６３、１７４及び１８４の配列を有するか、（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７５及び１８５の配列を有するか、（ｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６４、１７６及び１８６の配列を有するか、（ｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６５、１７７及び１８７の配列を有するか、（ｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６６、１７８及び１８８の配列を有するか、または（ｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８９の配列を有する。
【００８２】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６７及び１７９の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６８及び１７９の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８０の配列を有するか、
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８１の配列を有するか、
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７０及び１８２の配列を有するか、
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７１及び１８２の配列を有するか、
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０９、１２２及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１５９、１７２及び１７９の配列を有するか、
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１２、１４及び１３０の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６２、１７３及び１８３の配列を有するか、
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１３、１２３及び１３１の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６３、１７４及び１８４の配列を有するか、
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１４、１２４及び１３２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７５及び１８５の配列を有するか、
（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１５、１８及び１３３の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６４、１７６及び１８６の配列を有するか、
（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１６、１２４及び１３２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７５及び１８５の配列を有するか、
（ｍ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１７、１２５及び１３４の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６５、１７７及び１８７の配列を有するか、
（ｎ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１８、１２４及び１３２の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６１、１７５及び１８５の配列を有するか、
（ｏ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１９、１２６及び１３５の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６６、１７８及び１８８の配列を有するか、または
（ｐ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８９の配列を有する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６７及び１７９の配列を有するか、
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０９、１２０及び１２７の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１５９、１６８及び１７９の配列を有するか、
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８０の配列を有するか、
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１０、１２１及び１２８の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６０、１６９及び１８１の配列を有するか、
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７０及び１８２の配列を有するか、または
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１１１、１７及び１２９の配列を有し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号１６１、１７１及び１８２の配列を有する。
【００８４】
本発明の抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ａに示すＬＶ−１０１、ＬＶ−１０２、ＬＶ−１０３、ＬＶ−１０４、ＬＶ−１０５、ＬＶ−１０６、ＬＶ−１０７、ＬＶ−１０８、ＬＶ−１０９、ＬＶ−１１０、ＬＶ−１１１、ＬＶ−１１２、ＬＶ−１１３、ＬＶ−１１４、ＬＶ−１１５、ＬＶ−１１６、ＬＶ−１１７、ＬＶ−１１８、ＬＶ−１１９、ＬＶ−１２０、ＬＶ−１２１、ＬＶ−１２２及びＬＶ−１２３からなる群から選択される軽鎖可変領域、及び／または表３Ｂに示すＨＶ−１０１、ＨＶ−１０２、ＨＶ−１０３、ＨＶ−１０４、ＨＶ−１０５、ＨＶ−１０６、ＨＶ−１０７、ＨＶ−１０８、ＨＶ−１０９、ＨＶ−１１０、ＨＶ−１１１、ＨＶ−１１２、ＨＶ−１１３、ＨＶ−１１４、ＨＶ−１１５、ＨＶ−１１６、ＨＶ−１１７、ＨＶ−１１８、ＨＶ−１１９、ＨＶ−１２０及びＨＶ−１２１からなる群から選択される重鎖可変領域、ならびにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の機能性断片、誘導体、変異タンパク質及びバリアントを含み得る。
【００８５】
表３Ａに列挙する軽鎖可変領域のそれぞれを、表３Ｂに示す重鎖可変領域のうちのいずれかと組み合わせて、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質への組み込みに適した抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインを形成することができる。このような組み合わせの例には、ＬＶ−１０１とＨＶ−１０１、ＬＶ−１０２とＨＶ−１０２、ＬＶ−１０３とＨＶ−１０３、ＬＶ−１０４とＨＶ−１０４、ＬＶ−１０５とＨＶ−１０５、ＬＶ−１０６とＨＶ−１０６、ＬＶ−１０５とＨＶ−１０７、ＬＶ−１０６とＨＶ−１０８、ＬＶ−１０７とＨＶ−１０５、ＬＶ−１０８とＨＶ−１０６、ＬＶ−１０９とＨＶ−１０５、ＬＶ−１１０とＨＶ−１０６、ＬＶ−１０７とＨＶ−１０７、ＬＶ−１０８とＨＶ−１０８、ＬＶ−１１１とＨＶ−１０９、ＬＶ−１１２とＨＶ−１１０、ＬＶ−１１１とＨＶ−１１１、ＬＶ−１１２とＨＶ−１１２、ＬＶ−１１３とＨＶ−１０５、ＬＶ−１１４とＨＶ−１１３、ＬＶ−１１５とＨＶ−１１４、ＬＶ−１１６とＨＶ−１１５、ＬＶ−１１７とＨＶ−１１６、ＬＶ−１１８とＨＶ−１１７、ＬＶ−１１９とＨＶ−１１６、ＬＶ−１２０とＨＶ−１０５、ＬＶ−１２１とＨＶ−１１８、ＬＶ−１２２とＨＶ−１１６、ＬＶ−１２３とＨＶ−１１９、ＬＶ−１０１とＨＶ−１２０及びＬＶ−１０７とＨＶ−１２１が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、（ａ）ＬＶ−１０１（配列番号１３６）及びＨＶ−１０１（配列番号１９０）、（ｂ）ＬＶ−１０３（配列番号１３８）及びＨＶ−１０３（配列番号１９２）、（ｃ）ＬＶ−１０５（配列番号１４０）及びＨＶ−１０５（配列番号１９４）、（ｄ）ＬＶ−１０５（配列番号１４０）及びＨＶ−１０７（配列番号１９６）、（ｅ）ＬＶ−１０７（配列番号１４２）及びＨＶ−１０５（配列番号１９４）、（ｆ）ＬＶ−１０９（配列番号１４４）及びＨＶ−１０５（配列番号１９４）、（ｇ）ＬＶ−１０７（配列番号１４２）及びＨＶ−１０７（配列番号１９６）、（ｈ）ＬＶ−１１１（配列番号１４６）及びＨＶ−１０９（配列番号１９８）、または（ｉ）ＬＶ−１１１（配列番号１４６）及びＨＶ−１１１（配列番号２００）を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ａ中の軽鎖可変領域、すなわち、ＬＶ−１０１、ＬＶ−１０２、ＬＶ−１０３、ＬＶ−１０４、ＬＶ−１０５、ＬＶ−１０６、ＬＶ−１０７、ＬＶ−１０８、ＬＶ−１０９、ＬＶ−１１０、ＬＶ−１１１、ＬＶ−１１２、ＬＶ−１１３、ＬＶ−１１４、ＬＶ−１１５、ＬＶ−１１６、ＬＶ−１１７、ＬＶ−１１８、ＬＶ−１１９、ＬＶ−１２０、ＬＶ−１２１、ＬＶ−１２２及びＬＶ−１２３から選択されるＶＬの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なる連続アミノ酸の配列を含む、軽鎖可変領域を含み、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、この欠失、挿入及び／または置換により、前述の可変ドメイン配列に対して１５個以下のアミノ酸変化がもたらされる。いくつかの抗ＣＧＲＰ結合ドメイン中の軽鎖可変領域は、配列番号１３６〜１５８のアミノ酸配列（すなわち、表３Ａ中の軽鎖可変領域）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００８７】
これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、表３Ｂ中の重鎖可変領域、すなわち、ＨＶ−１０１、ＨＶ−１０２、ＨＶ−１０３、ＨＶ−１０４、ＨＶ−１０５、ＨＶ−１０６、ＨＶ−１０７、ＨＶ−１０８、ＨＶ−１０９、ＨＶ−１１０、ＨＶ−１１１、ＨＶ−１１２、ＨＶ−１１３、ＨＶ−１１４、ＨＶ−１１５、ＨＶ−１１６、ＨＶ−１１７、ＨＶ−１１８、ＨＶ−１１９、ＨＶ−１２０及びＨＶ−１２１から選択されるＶＨの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なる連続アミノ酸の配列を含む、重鎖可変領域を含み、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、この欠失、挿入及び／または置換により、前述の可変ドメイン配列に対して１５個以下のアミノ酸変化がもたらされる。いくつかの抗ＣＧＲＰ受容体結合ドメイン中の重鎖可変領域は、配列番号１９０〜２１０のアミノ酸配列（すなわち、表３Ｂ中の重鎖可変領域）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００８８】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、抗体である。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）と、２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０〜７０ｋＤａ）とを含む、四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、１つの免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とを含む、ポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）であり得る。「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、１つの免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意に免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含む、ポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）に分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥの抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧクラス及びＩｇＡクラスの抗体は、サブクラス、すなわち、それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有するのに対し、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプ（サブタイプを含む）に由来し得る。抗体の各鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間（すなわち、軽鎖と重鎖との間）及び抗体重鎖のヒンジ領域の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結される。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体抗体（本明細書中、「ヘテロ免疫グロブリン」または「ヘテロＩｇ」と区別なく用いられる）であり、２つの異なる軽鎖と、２つの異なる重鎖とを含む抗体を指す。例えば、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する軽鎖及び重鎖と、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する軽鎖及び重鎖とを含む。図１を参照されたい。
【００９０】
ヘテロ二量体抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含み得る。本明細書で使用する「定常領域」という用語は、抗体の可変領域以外の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。上述したとおり、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１  ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、κ型またはλ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ型またはλ型軽鎖定常領域であり得、全部で５つの抗体アイソタイプが存在する。ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の配列の例を以下の表に示す。
【表４】
2020074790.tif 000020
【００９１】
ヘテロ二量体抗体の重鎖定常領域は、例えば、α型、δ型、ε型、γ型またはμ型重鎖定常領域、例えば、ヒトα型、δ型、ε型、γ型またはμ型重鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。一実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２重鎖定常領域の配列の例を表５に示す。
【表５】
2020074790.tif 000021
【００９２】
表１Ａ、１Ｂ、３Ａ及び３Ｂに開示する可変領域のそれぞれを、上記の軽鎖及び重鎖定常領域にそれぞれ結合させて、完全抗体軽鎖及び重鎖を形成することができる。更に、このようにして作製された重鎖及び軽鎖ポリペプチドのそれぞれを組み合わせて、完全二重特異性抗体構造、例えば、ヘテロ二量体抗体を形成することができる。本明細書に記載される重鎖及び軽鎖可変領域はまた、上に列挙した例示的な配列とは異なる配列を有する他の定常ドメインに結合させてもよいことを理解されたい。
【００９３】
抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する軽鎖及び重鎖と、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する軽鎖及び重鎖との二重特異性ヘテロ二量体抗体への組み立てを容易にするために、各抗体に由来する軽鎖及び／または重鎖を操作して、誤った対合分子の形成を減ずることができる。例えば、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進させる１つのアプローチは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」法であり、これは、２つの異なる抗体重鎖のＣＨ３ドメインに接触界面にて変異を導入することを伴う。具体的には、一方の重鎖中の１つ以上の嵩高いアミノ酸を、短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えて「ホール」を生成し、一方、他方の重鎖には長い側鎖を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を導入して「ノブ」を生成する。改変重鎖が共発現したとき、ホモ二量体（ホール−ホールまたはノブ−ノブ）と比較して、ヘテロ二量体（ノブ−ホール）がより大きなパーセンテージで形成される。「ノブ・イントゥ・ホール」法は、ＷＯ９６／０２７０１１；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９：６１７−６２１，１９９６；及びＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８に詳細に記述されており、これら全ての全体が参照により本明細書に援用される。
【００９４】
ホモ二量体形成を排除してヘテロ二量体形成を促進させるための別のアプローチは、静電的ステアリング機構の利用を伴うものである（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７−１９６４６，２０１０参照。その全体が参照により本明細書に援用される）。このアプローチは、静電引力を生じる反対の電荷を介して２つの異なる重鎖が会合するように、各重鎖のＣＨ３ドメインに荷電性残基を導入するか、またはこれを利用することを伴う。同一の重鎖のホモ二量体化は、その同一の重鎖が同じ電荷を有し、それゆえ、反発するため不利である。これと同じ静電的ステアリング法を使用して、正しい軽鎖−重鎖対中に結合界面にて反対の電荷を有する残基を導入することによって、軽鎖と同種でない重鎖との誤った対合を防ぐことができる。ヘテロ二量体及び正しい軽鎖／重鎖対合を促進するための静電的ステアリング法及び好適な電荷対変異については、ＷＯ２００９０８９００４及びＷＯ２０１４０８１９５５に記載されており、この両文献の全体が参照により本明細書に援用される。
【００９５】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質が、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の抗体に由来する第１の軽鎖（ＬＣ１）及び第１の重鎖（ＨＣ１）と、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の抗体に由来する第２の軽鎖（ＬＣ２）及び第２の重鎖（ＨＣ２）とを含むヘテロ二量体抗体である実施形態において、ＨＣ１またはＨＣ２は、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸に置き換えるための１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、一実施形態において、ＨＣ１のＣＨ３ドメインまたはＨＣ２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン中の対応する位置（複数可）で、野生型ヒトＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニン）が、１つ以上の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、３７０、３９２及び４０９（ＥＵ番号付けシステム）から選択される１つ以上の位置のアミノ酸（例えば、リジン）が、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）に置換される。特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖または軽鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載のＫａｂａｔ−ＥＵ番号付けに従う。アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、本明細書にて、特定の位置のアミノ酸残基に関する１文字略号の後に、対象とする元の配列を基準としたアミノ酸位置の数値と、次いで置換アミノ酸残基に関する１文字略号を続けることで典型的に示される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、対象とする元の配列を基準として、アミノ酸位置３０でのトレオニン残基のアスパラギン酸残基による置換を示す。別の例として、「Ｓ２１８Ｇ」は、対象とする元のアミノ酸配列を基準として、アミノ酸位置２１８でのセリン残基のグリシン残基による置換を示す。
【００９６】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体のＨＣ１またはＨＣ２は、負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸に置き換えるための１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、一実施形態において、ＨＣ１のＣＨ３ドメインまたはＨＣ２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン中の対応する位置（複数可）で、野生型ヒトＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸が１つ以上の正に荷電したアミノ酸に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、３５６、３５７及び３９９（ＥＵ番号付けシステム）から選択されるＣＨ３ドメインの１つ以上の位置のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）が、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニン）に置換される。
【００９７】
特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、位置３９２及び４０９に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ置換）を含む第１の重鎖と、位置３５６及び３９９に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ置換）を含む第２の重鎖とを含む。他の特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、位置３９２、４０９及び３７０に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＫ３７０Ｄ置換）を含む第１の重鎖と、位置３５６、３９９及び３５７に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ置換）を含む第２の重鎖とを含む。関連する実施形態において、第１の重鎖は、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来し、第２の重鎖は、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する。他の関連する実施形態において、第１の重鎖は、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来し、第２の重鎖は、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する。
【００９８】
特定の重鎖とその同種の軽鎖との会合を助長するために、重鎖及び軽鎖の両方に相補的アミノ酸置換が含まれ得る。本明細書で使用するとき、「相補的アミノ酸置換」とは、他方の鎖中の負に荷電したアミノ酸置換と対合する、一方の鎖中の正に荷電したアミノ酸への置換を指す。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、重鎖に導入された荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されたアミノ酸と反対の電荷を有する。ある特定の実施形態において、ＬＣ１／ＨＣ１の結合界面には、１つ以上の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジンまたはアルギニン）が第１の軽鎖（ＬＣ１）中に導入され得、１つ以上の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）が対になる重鎖（ＨＣ１）中に導入され得、一方、ＬＣ２／ＨＣ２の結合界面には、１つ以上の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）が第２の軽鎖（ＬＣ２）中に導入され得、１つ以上の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジンまたはアルギニン）が対になる重鎖（ＨＣ２）中に導入され得る。静電相互作用により、界面では反対の電荷を持つ残基（極性）が引き付けられるので、ＬＣ１はＨＣ１と対合し、ＬＣ２はＨＣ２と対合するように導かれる。界面（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）にて同じ電荷を持つ残基（極性）を有する重鎖／軽鎖対は反発し、それにより、望ましくないＨＣ／ＬＣ対合が抑制される。
【００９９】
これらの実施形態及び他の実施形態において、重鎖のＣＨ１ドメインまたは軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸が１つ以上の負に荷電したアミノ酸に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。あるいは、重鎖のＣＨ１ドメインまたは軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸が１つ以上の正に荷電したアミノ酸に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の重鎖のＣＨ１ドメイン中のＦ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置の１つ以上のアミノ酸が荷電アミノ酸に置き換えられる。ある特定の実施形態において、負または正に荷電したアミノ酸での置換に好ましい残基は、Ｓ１８３（ＥＵ番号付けシステム）である。いくつかの実施形態において、Ｓ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換される。代替的な実施形態において、Ｓ１８３は、負に荷電したアミノ酸で置換される。例えば、一実施形態において、第１の重鎖のＳ１８３が負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｅ）で置換され、第２の重鎖のＳ１８３が正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｋ）で置換される。
【０１００】
軽鎖がκ軽鎖である実施形態において、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の軽鎖のＣＬドメイン中のＦ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（κ軽鎖のＥＵ及びＫａｂａｔ番号付け）の１つ以上のアミノ酸が荷電アミノ酸に置き換えられる。軽鎖がλ軽鎖である実施形態において、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の軽鎖のＣＬドメイン中のＴ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（λ鎖のＫａｂａｔ番号付け）の１つ以上のアミノ酸が荷電アミノ酸に置き換えられる。いくつかの実施形態において、負または正に荷電したアミノ酸での置換に好ましい残基は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ及びＫａｂａｔ番号付けシステム）である。ある特定の実施形態において、ＣＬドメインのＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸に置き換えられる。代替的な実施形態において、ＣＬドメインのＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸に置き換えられる。一実施形態において、第１の軽鎖のＳ１７６が正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｋ）で置換され、第２の軽鎖のＳ１７６が負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｅ）で置換される。
【０１０１】
ＣＨ１及びＣＬドメイン中の相補的アミノ酸置換に加えて、またはその代替として、ヘテロ二量体抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために、１つ以上の相補的アミノ酸置換を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体の重鎖のＶＨ領域または軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸が１つ以上の負に荷電したアミノ酸に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。あるいは、重鎖のＶＨ領域または軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸が１つ以上の正に荷電したアミノ酸に置き換えられるような形で、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
ＶＨ領域中のＶ領域の界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域の組み立てを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔ位置１、３、３５、３７、３９、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５９、８９、９１及び９３が挙げられる。ＶＨ領域中のこれらの界面残基のうちの１つ以上を荷電（正または負に荷電した）アミノ酸で置換することができる。ある特定の実施形態において、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態において、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態において、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ３９Ｅ）に置換され、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ３９Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置４４のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態において、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置４４のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態において、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置４４のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ４４Ｅ）に置換され、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ位置４４のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ４４Ｋ）に置換される。
【０１０３】
ＶＬ領域中のＶ領域の界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域の組み立てを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔ位置３２、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８５、８７、８９、９０、９１及び１００が挙げられる。ＶＬ領域中の１つ以上の界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同種の重鎖のＶＨ領域に導入される電荷と反対の電荷を有するアミノ酸で置換することができる。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ位置１００のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態において、第１及び／または第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ位置１００のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態において、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ位置１００のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ１００Ｋ）に置換され、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ位置１００のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇ１００Ｅ）に置換される。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖と、第１の軽鎖及び第２の軽鎖とを含み、第１の重鎖は、位置４４（Ｋａｂａｔ）、１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）及び４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置４４（Ｋａｂａｔ）、１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）及び３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１の及び第２の軽鎖は、位置１００（Ｋａｂａｔ）及び１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換は、当該位置に荷電アミノ酸を導入するものである。関連する実施形態において、第１の重鎖の位置４４（Ｋａｂａｔ）のグリシンは、グルタミン酸に置換され、第２の重鎖の位置４４（Ｋａｂａｔ）のグリシンは、リジンに置換され、第１の軽鎖の位置１００（Ｋａｂａｔ）のグリシンは、リジンに置換され、第２の軽鎖の位置１００（Ｋａｂａｔ）のグリシンは、グルタミン酸に置換され、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンに置換され、及び／または第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンに置換される。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖と、第１の軽鎖及び第２の軽鎖とを含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）及び４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）及び３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換は、当該位置に荷電アミノ酸を導入するものである。関連する実施形態において、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンに置換され、及び／または第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンに置換される。
【０１０６】
更に他の実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖と、第１の軽鎖及び第２の軽鎖とを含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）、４０９（ＥＵ）及び３７０（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）、３９９（ＥＵ）及び３５７（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換は、当該位置に荷電アミノ酸を導入するものである。関連する実施形態において、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸に置換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第１の重鎖の位置３７０（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸に置換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンに置換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンに置換され、第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンに置換され、及び／または第２の重鎖の位置３５７（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンに置換される。
【０１０７】
本明細書に記載の定常ドメイン、抗ＰＡＣ１受容体可変領域及び抗ＣＧＲＰ受容体可変領域のいずれかは、ヘテロ二量体抗体の正しい組み立てを容易にするために、上述した電荷対変異のうちの１つ以上を含有するように改変することができる。本発明のヘテロ二量体抗体にて使用するのに適した１つ以上の電荷対変異を含有する、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する例示的な完全長軽鎖配列及び完全長重鎖配列をそれぞれ表６Ａ及び表６Ｂに示す。
【表６Ａ−００１】
2020074790.tif 000022
【表６Ａ−００２】
2020074790.tif 000023
【表６Ａ−００３】
2020074790.tif 000024
【表６Ａ−００４】
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【表６Ａ−００５】
2020074790.tif 000026
【表６Ａ−００６】
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【表６Ｂ−００１】
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【表６Ｂ−００２】
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【表６Ｂ−００３】
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【表６Ｂ−００４】
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【表６Ｂ−００５】
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【表６Ｂ−００６】
2020074790.tif 000033
【表６Ｂ−００７】
2020074790.tif 000034
【表６Ｂ−００８】
2020074790.tif 000035
【表６Ｂ−００９】
2020074790.tif 000036
【表６Ｂ−０１０】
2020074790.tif 000037
【表６Ｂ−０１１】
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【表６Ｂ−０１２】
2020074790.tif 000039
【表６Ｂ−０１３】
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【表６Ｂ−０１４】
2020074790.tif 000041
【表６Ｂ−０１５】
2020074790.tif 000042
【表６Ｂ−０１６】
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【表６Ｂ−０１７】
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【表６Ｂ−０１８】
2020074790.tif 000045
【表６Ｂ−０１９】
2020074790.tif 000046
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体は、表６Ａの抗ＰＡＣ１受容体軽鎖と、表６Ｂの抗ＰＡＣ１受容体重鎖とを含む。ヘテロ二量体抗体に組み込むことができる、抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖と重鎖の例示的な対には、ＬＣ−０１（配列番号２１１）とＨＣ−０１（配列番号２３３）、ＬＣ−０２（配列番号２１２）とＨＣ−０２（配列番号２３４）、ＬＣ−０１（配列番号２１１）とＨＣ−０３（配列番号２３５）、ＬＣ−０１（配列番号２１１）とＨＣ−０４（配列番号２３６）、ＬＣ−０３（配列番号２１３）とＨＣ−０１（配列番号２３３）、ＬＣ−０３（配列番号２１３）とＨＣ−０３（配列番号２３５）、ＬＣ−０４（配列番号２１４）とＨＣ−０５（配列番号２３７）、ＬＣ−０５（配列番号２１５）とＨＣ−０６（配列番号２３８）、ＬＣ−０４（配列番号２１４）とＨＣ−０７（配列番号２３９）、ＬＣ−０４（配列番号２１４）とＨＣ−０８（配列番号２４０）、ＬＣ−０６（配列番号２１６）とＨＣ−０９（配列番号２４１）、ＬＣ−０７（配列番号２１７）とＨＣ−１０（配列番号２４２）、ＬＣ−０６（配列番号２１６）とＨＣ−１１（配列番号２４３）、ＬＣ−０６（配列番号２１６）とＨＣ−１２（配列番号２４４）、ＬＣ−０８（配列番号２１８）とＨＣ−１３（配列番号２４５）、ＬＣ−０９（配列番号２１９）とＨＣ−１４（配列番号２４６）、ＬＣ−０８（配列番号２１８）とＨＣ−１５（配列番号２４７）、ＬＣ−０８（配列番号２１８）とＨＣ−１６（配列番号２４８）、ＬＣ−１０（配列番号２２０）とＨＣ−１７（配列番号２４９）、ＬＣ−１１（配列番号２２１）とＨＣ−１８（配列番号２５０）及びＬＣ−１０（配列番号２２０）とＨＣ−１９（配列番号２５１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
本発明のヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖及び／または重鎖は、表６Ａ中の軽鎖または表６Ｂ中の重鎖の配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上異なる連続アミノ酸の配列を含み得、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換である。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖は、配列番号２１１〜２２１のアミノ酸配列（すなわち、表６Ａ中の抗ＰＡＣ１受容体軽鎖）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＰＡＣ１受容体の重鎖は、配列番号２３３〜２５１のアミノ酸配列（すなわち、表６Ｂ中の抗ＰＡＣ１受容体重鎖）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１１０】
本発明のヘテロ二量体抗体にて使用するのに適した１つ以上の電荷対変異を含有する、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する例示的な完全長軽鎖配列及び完全長重鎖配列をそれぞれ表７Ａ及び表７Ｂに示す。
【表７Ａ−００１】
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【表７Ａ−００２】
2020074790.tif 000048
【表７Ａ−００３】
2020074790.tif 000049
【表７Ａ−００４】
2020074790.tif 000050
【表７Ａ−００５】
2020074790.tif 000051
【表７Ａ−００６】
2020074790.tif 000052
【表７Ｂ−００１】
2020074790.tif 000053
【表７Ｂ−００２】
2020074790.tif 000054
【表７Ｂ−００３】
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【表７Ｂ−００４】
2020074790.tif 000056
【表７Ｂ−００５】
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【表７Ｂ−００６】
2020074790.tif 000058
【表７Ｂ−００７】
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【表７Ｂ−００８】
2020074790.tif 000060
【表７Ｂ−００９】
2020074790.tif 000061
【表７Ｂ−０１０】
2020074790.tif 000062
【表７Ｂ−０１１】
2020074790.tif 000063
【表７Ｂ−０１２】
2020074790.tif 000064
【表７Ｂ−０１３】
2020074790.tif 000065
【表７Ｂ−０１４】
2020074790.tif 000066
【表７Ｂ−０１５】
2020074790.tif 000067
【表７Ｂ−０１６】
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【表７Ｂ−０１７】
2020074790.tif 000069
【表７Ｂ−０１８】
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【表７Ｂ−０１９】
2020074790.tif 000071
【表７Ｂ−０２０】
2020074790.tif 000072
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体は、表７Ａの抗ＣＧＲＰ受容体軽鎖と、表７Ｂの抗ＣＧＲＰ受容体重鎖とを含む。ヘテロ二量体抗体に組み込むことができる、抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖と重鎖の例示的な対には、ＬＣ−１０１（配列番号２７１）とＨＣ−１０１（配列番号２９５）、ＬＣ−１０２（配列番号２７２）とＨＣ−１０２（配列番号２９６）、ＬＣ−１０１（配列番号２７１）とＨＣ−１０３（配列番号２９７）、ＬＣ−１０１（配列番号２７１）とＨＣ−１０４（配列番号２９８）、ＬＣ−１０３（配列番号２７３）とＨＣ−１０５（配列番号２９９）、ＬＣ−１０４（配列番号２７４）とＨＣ−１０６（配列番号３００）、ＬＣ−１０３（配列番号２７３）とＨＣ−１０７（配列番号３０１）、ＬＣ−１０３（配列番号２７３）とＨＣ−１０８（配列番号３０２）、ＬＣ−１０５（配列番号２７５）とＨＣ−１０９（配列番号３０３）、ＬＣ−１０６（配列番号２７６）とＨＣ−１１０（配列番号３０４）、ＬＣ−１０５（配列番号２７５）とＨＣ−１１１（配列番号３０５）、ＬＣ−１０５（配列番号２７５）とＨＣ−１１２（配列番号３０６）、ＬＣ−１０５（配列番号２７５）とＨＣ−１１３（配列番号３０７）、ＬＣ−１０６（配列番号２７６）とＨＣ−１１４（配列番号３０８）、ＬＣ−１０５（配列番号２７５）とＨＣ−１１５（配列番号３０９）、ＬＣ−１０７（配列番号２７７）とＨＣ−１０９（配列番号３０３）、ＬＣ−１０８（配列番号２７８）とＨＣ−１１０（配列番号３０４）、ＬＣ−１０７（配列番号２７７）とＨＣ−１１１（配列番号３０５）、ＬＣ−１０９（配列番号２７９）とＨＣ−１０９（配列番号３０３）、ＬＣ−１１０（配列番号２８０）とＨＣ−１１０（配列番号３０４）、ＬＣ−１０９（配列番号２７９）とＨＣ−１１１（配列番号３０５）、ＬＣ−１０７（配列番号２７７）とＨＣ−１１３（配列番号３０７）、ＬＣ−１０８（配列番号２７８）とＨＣ−１１４（配列番号３０８）、ＬＣ−１０７（配列番号２７７）とＨＣ−１１５（配列番号３０９）、ＬＣ−１１１（配列番号２８１）とＨＣ−１１６（配列番号３１０）、ＬＣ−１１２（配列番号２８２）とＨＣ−１１７（配列番号３１１）、ＬＣ−１１１（配列番号２８１）とＨＣ−１１８（配列番号３１２）、ＬＣ−１１１（配列番号２８１）とＨＣ−１１９（配列番号３１３）、ＬＣ−１１１（配列番号２８１）とＨＣ−１２０（配列番号３１４）、ＬＣ−１１２（配列番号２８２）とＨＣ−１２１（配列番号３１５）及びＬＣ−１１１（配列番号２８１）とＨＣ−１２２（配列番号３１６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明のヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖及び／または重鎖は、表７Ａ中の軽鎖または表７Ｂ中の重鎖の配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上異なる連続アミノ酸の配列を含み得、ここで、かかる配列それぞれの相違は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換である。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖は、配列番号２７１〜２８２のアミノ酸配列（すなわち、表７Ａ中の抗ＣＧＲＰ受容体軽鎖）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体に組み込まれる抗ＣＧＲＰ受容体の重鎖は、配列番号２９５〜３１６のアミノ酸配列（すなわち、表７Ｂ中の抗ＣＧＲＰ受容体重鎖）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１１３】
表６Ａ及び６Ｂに列挙する抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖及び重鎖のいずれかを、表７Ａ及び７Ｂに列挙する抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖及び重鎖のいずれかと組み合わせて、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することができる。本発明の例示的な二重特異性ヘテロ二量体抗体の構造的特徴（例えば、抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖及び重鎖ならびに抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖及び重鎖の構成要素）については、以下の表８に記載する。これらの抗体は、重鎖と軽鎖の正しい対合及び抗ＰＡＣ１受容体重鎖と抗ＣＧＲＰ受容体重鎖との間のヘテロ二量体化を促進するために、本明細書に記載の１つ以上の電荷対変異を含有する。「Ａ」の表示を有する抗体は、図１に示す「ｖ１」静電的ステアリング手法を含み、「Ｂ」の表示を有する抗体は、図１に示す「ｖ３」静電的ステアリング手法を含む。「Ｃ」または「Ｄ」の表示を有する抗体は、図１に示す「ｖ４」静電的ステアリング手法を含み、「Ｃ」抗体はＩｇＧ１定常ドメインを有し、「Ｄ」抗体はＩｇＧ２定常ドメインを有する。表８中の可変軽鎖及び重鎖の名称（例えば、ＬＶ−０１、ＬＶ−０２、ＬＶ−１０１、ＬＶ−１０２、ＨＶ−０１、ＨＶ−０２、ＨＶ−１０１、ＨＶ−１０２など）は、表１Ａ、１Ｂ、３Ａ及び３Ｂ中のアミノ酸配列、ならびに表１１及び１２中のヌクレオチド配列によって定義される。表８中の軽鎖及び重鎖の名称（例えば、ＬＣ−０１、ＬＣ−０２、ＬＣ−１０１、ＬＣ−１０２、ＨＣ−０１、ＨＣ−０２、ＨＣ−１０１、ＨＣ−１０２など）は、表６Ａ、６Ｂ、７Ａ及び７Ｂ中のアミノ酸及びヌクレオチド配列によって定義される。したがって、表８中の例示的なヘテロ二量体抗体の４つの鎖のそれぞれに関する完全な配列情報は、これらの表を相互参照することによって得ることができる。例示として、ヘテロ二量体抗体ｉＰＳ：３２６４１７は、配列番号２１１（ＬＣ−０１）のアミノ酸配列を含む抗ＰＡＣ１受容体軽鎖、配列番号２３３（ＨＣ−０１）のアミノ酸配列を含む抗ＰＡＣ１受容体重鎖、配列番号２８１（ＬＣ−１１１）のアミノ酸配列を含む抗ＣＧＲＰ受容体軽鎖、及び配列番号３１０（ＨＣ−１１６）のアミノ酸配列を含む抗ＣＧＲＰ受容体重鎖を含む。
【表８−００１】
2020074790.tif 000073
【表８−００２】
2020074790.tif 000074
【表８−００３】
2020074790.tif 000075
【表８−００４】
2020074790.tif 000076
【表８−００５】
2020074790.tif 000077
【表８−００６】
2020074790.tif 000078
【表８−００７】
2020074790.tif 000079
【表８−００８】
2020074790.tif 000080
【０１１４】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、表８に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、またはｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択されるヘテロ二量体抗体である。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、表８に記載される、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７６８８、またはｉＰＳ：３２７７１４と称する抗体から選択される抗体である。他の実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、表８に記載される、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７０２、またはｉＰＳ：３２７２７０と称する抗体から選択される抗体である。特定の実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、表８に記載される、ｉＰＳ：３２７６８９またはｉＰＳ：３２７７４２と称する抗体である。
【０１１５】
本発明のヘテロ二量体抗体はまた、本明細書に記載の重鎖（複数可）及び／または軽鎖（複数可）を含む抗体であって、表６Ａ、６Ｂ、７Ａ及び７Ｂに記載する重鎖及び軽鎖のうちのいずれかに関して、例えば、抗体が発現される宿主細胞の種類から生じる翻訳後修飾に起因して、１、２、３、４または５つのアミノ酸残基がＮ末端もしくはＣ末端または両端から欠損している抗体を包含する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体重鎖からＣ末端リジンを切断することが多い。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、（ｉ）ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｉｉ）ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する第２の結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域とを含み、結合ドメインの一方はＦｃ領域のアミノ末端に位置し、もう一方の結合ドメインはＦｃ領域のカルボキシル末端に位置する。いくつかのこのような実施形態において、第１及び第２の結合ドメインのそれぞれは、免疫グロブリン可変領域を含む。例えば、ある特定の実施形態において、第１の結合ドメインは、抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含み、第２の結合ドメインは、抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む。
【０１１７】
本明細書で使用するとき、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指し、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成することができる。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメインであるＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意にＣＨ４ドメインを含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃ領域である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２免疫グロブリンに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び食作用などのエフェクター機能を保持し得る。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、本明細書にて更に詳述するように、エフェクター機能を低減または排除するように改変することができる。
【０１１８】
本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端結合ドメイン）は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって連結された重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。可変領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの向きで、ｓｃＦｖ中に配置することができる。例えば、一実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ領域と、ペプチドリンカーと、ＶＬ領域とを含む。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ領域と、ペプチドリンカーと、ＶＨ領域とを含む。ｓｃＦｖのＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＶＨ領域とＶＬ領域の間のジスルフィド結合形成を可能にする、１つ以上のシステイン置換を含み得る。このようなシステインクランプは、抗原結合構造において２つの可変ドメインを安定させる。一実施形態において、ＶＨ領域の位置４４（Ｋａｂａｔ番号付け）及びＶＬ領域の位置１００（Ｋａｂａｔ番号付け）がそれぞれシステイン残基で置換される。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、そのアミノ末端にて、ペプチドリンカーを介して、Ｆｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、または別の方法で連結される。したがって、一実施形態において、ｓｃＦｖは、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＨ領域、第２のペプチドリンカー及びＶＬ領域を含むように、Ｆｃ領域に融合される。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＬ領域、第２のペプチドリンカー及びＶＨ領域を含むように、Ｆｃ領域に融合される。「融合タンパク質」は、２つ以上の親タンパク質または親ポリペプチドに由来するポリペプチド構成要素を含むタンパク質である。典型的には、融合タンパク質は、融合遺伝子から発現され、その融合遺伝子中において、１つのタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、別個のタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列にインフレームで付加され、任意にリンカーにより分離されている。これにより、融合遺伝子は、組み換え宿主細胞によって発現され、１つの融合タンパク質が産生され得る。
【０１２０】
「ペプチドリンカー」は、１つのポリペプチドと別のポリペプチドを共有結合的に接続する、約２〜約５０個のアミノ酸のオリゴペプチドを指す。ペプチドリンカーを使用して、ｓｃＦｖ中のＶＨドメインとＶＬドメインとを連結することができる。ペプチドリンカーはまた、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片または他の機能性抗体断片をＦｃ領域のアミノ末端またはカルボキシル末端に連結するために使用して、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を作製することができる。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長である。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長である。他の実施形態において、ペプチドリンカーは、約８アミノ酸長〜約３０アミノ酸長である。更に他の実施形態において、ペプチドリンカーは、約１０アミノ酸長〜約２０アミノ酸長である。
【０１２１】
好ましくは、必ずしも必須ではないが、ペプチドリンカーは、２０種の標準アミノ酸から選択されるアミノ酸、特に、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及び／またはセリンを含む。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン及びアラニンなどの大部分が立体障害のないアミノ酸で構成される。したがって、いくつかの実施形態において好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン及びポリアラニンまたはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。いくつかの例示的なペプチドリンカーには、ポリ（Ｇｌｙ）２〜８、得に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号３６２）、（Ｇｌｙ）５（配列番号３６３）及び（Ｇｌｙ）７（配列番号３６４）、ならびにポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号３６５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２〜４及びポリ（Ａｌａ）２〜８が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎ（式中、ｘ＝３または４、及びｎ＝２、３、４、５または６）である。このようなペプチドリンカーには、「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；すなわち「Ｇ４Ｓ」；配列番号３６６）、「Ｌ９」（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；すなわち「Ｇ３ＳＧ４Ｓ」；配列番号３６７）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；すなわち「（Ｇ４Ｓ）２」；配列番号３６８）、「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；すなわち「（Ｇ４Ｓ）３」；配列番号３６９）、及び「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；すなわち「（Ｇ４Ｓ）５」；配列番号３７０）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ中でＶＨ領域とＶＬ領域を接続するペプチドリンカーは、Ｌ１５、すなわち（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３６９）である。これらの実施形態及び他の実施形態において、カルボキシル末端結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）をＦｃ領域のＣ末端に接続するペプチドリンカーは、Ｌ９、すなわちＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３６７）またはＬ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３６８）である。
【０１２２】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質に使用することができるペプチドリンカーの他の具体例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号３７１）、（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号３７２）、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３７３）、（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号３７４）、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３７５）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号３７６）、ＧＧＥＧＧＧ（配列番号３７７）、ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号３７８）、ＧＥＥＥＧ（配列番号３７９）、ＧＥＥＥ（配列番号３８０）、ＧＧＤＧＧＧ（配列番号３８１）、ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号３８２）、ＧＤＤＤＧ（配列番号３８３）、ＧＤＤＤ（配列番号３８４）、ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号３８５）、ＷＥＷＥＷ（配列番号３８６）、ＦＥＦＥＦ（配列番号３８７）、ＥＥＥＷＷＷ（配列番号３８８）、ＥＥＥＦＦＦ（配列番号３８９）、ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号３９０）、及びＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号３９１）が挙げられる。
【０１２３】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のある特定の実施形態において、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）は、本明細書に記載のペプチドリンカーまたは免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合したＦａｂ断片である。「免疫グロブリンヒンジ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結するアミノ酸配列を指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般に、約Ｇｌｕ２１６または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までのアミノ酸配列として定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列に合わせることができ、当業者によって決定され得る。いくつかの実施形態において、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に接続される。他の実施形態において、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に接続される。好ましくは、アミノ末端の結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ断片）は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を通して、Ｆｃ領域に融合される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体）に特異的に結合する第１の抗体を含み、第２の標的（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体）に特異的に結合する第２の抗体に由来する可変ドメインを含むｓｃＦｖが、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合される。本明細書において、このフォーマットを「ＩｇＧ−ｓｃＦｖ」フォーマットと呼び、このタイプの分子の一実施形態を図２に図式的に示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖及び重鎖と、（ｉｉ）第２の抗体に由来するＶＬ及びＶＨ領域を含むｓｃＦｖとを含み、当該ｓｃＦｖは、そのアミノ末端にて、ペプチドリンカーを介して、重鎖のカルボキシル末端に融合して改変重鎖を形成し、第１または第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、二重特異性多価抗原結合タンパク質を包含する。この二重特異性抗原結合タンパク質は、二量体化した場合、２つの軽鎖と、２つの改変重鎖とを含むホモ四量体となる。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、「改変重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖、特にヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２重鎖と、機能性抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）またはその部分（例えば、免疫グロブリンの軽鎖またはＦｄ断片）とを含み、当該断片またはその部分が、そのＮ末端にて、任意にペプチドリンカーを介して、重鎖のＣ末端に融合している、融合タンパク質を指す。
【０１２６】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットにおいて、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、第１の抗体（すなわち、「ＩｇＧ」）であってもよいし、第２の抗体（すなわち、ｓｃＦｖの由来となるもの）であってもよい。同様に、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、第１の抗体（すなわち、「ＩｇＧ」）であってもよいし、第２の抗体（すなわち、ｓｃＦｖの由来となるもの）であってもよい。表１Ａ及び１Ｂに記載する抗ＰＡＣ１受容体抗体可変領域のいずれかを、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素またはｓｃＦｖ構成要素のいずれかに組み込むことができる。表３Ａ及び３Ｂに記載する抗ＣＧＲＰ受容体抗体可変領域のいずれかを、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素またはｓｃＦｖ構成要素のいずれかに組み込むことができる。
【０１２７】
ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットにおける、本発明の例示的な抗原結合タンパク質の軽鎖及び改変重鎖に関するアミノ酸配列について、以下の表９にまとめる。表の前半に列挙する分子は、抗ＰＡＣ１受容体ＩｇＧ構成要素及び抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖを含み、一方、表の後半に列挙する分子は、抗ＣＧＲＰ受容体ＩｇＧ構成要素及び抗ＰＡＣ１受容体ｓｃＦｖを含む。
【表９−００１】
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【表９−００２】
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【表９−００３】
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【表９−００４】
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【表９−００５】
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【表９−００６】
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【表９−００７】
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【表９−００８】
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【表９−００９】
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【表９−０１０】
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【表９−０１１】
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【表９−０１２】
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【表９−０１３】
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【０１２８】
ある特定の実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質の第１の抗体（すなわち、ＩｇＧ構成要素）は抗ＰＡＣ１受容体抗体であり、第２の抗体（すなわち、ｓｃＦｖの由来となるもの）は抗ＣＧＲＰ受容体抗体である。このような実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、表１Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表１Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含む。例えば、一実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＰＡＣ１受容体抗体は、ＬＶ−０４（配列番号３１）ＶＬ領域と、ＨＶ−０３（配列番号８５）ＶＨ領域とを含む。
【０１２９】
ｓｃＦｖ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、表３Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表３Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含み得る。一実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−１０７（配列番号１４２）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。更に別の実施態様において、抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−１０９（配列番号１４４）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。更に別の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−１０７（配列番号１４２）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。
【０１３０】
二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来し、ｓｃＦｖ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の改変重鎖は、配列番号３９６〜４１０から選択される配列を含む。関連する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の軽鎖は、配列番号３９２の配列を含む。ある特定の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７３８、ｉＰＳ：３８６７６４、ｉＰＳ：３８６７６２、ｉＰＳ：３８６７６０、ｉＰＳ：３８６７５８、ｉＰＳ：３８６７５６、ｉＰＳ：３８６７５４、ｉＰＳ：３８６７５２、ｉＰＳ：３８６７５０、ｉＰＳ：３８６７４８、ｉＰＳ：３８６７４６、ｉＰＳ：３８６７４４、ｉＰＳ：３８６７４２、ｉＰＳ：３８６７４０、またはｉＰＳ：３８６７３６と称する抗原結合タンパク質である。他の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７３８、ｉＰＳ：３８６７５４、ｉＰＳ：３８６７５０、ｉＰＳ：３８６７４８、ｉＰＳ：３８６７４６、ｉＰＳ：３８６７４４、ｉＰＳ：３８６７４０、またはｉＰＳ：３８６７３６と称する抗原結合タンパク質である。更に他の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７４４、ｉＰＳ：３８６７４６、またはｉＰＳ：３８６７４８と称する抗原結合タンパク質である。
【０１３１】
本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質の第１の抗体（すなわち、ＩｇＧ構成要素）は抗ＣＧＲＰ受容体抗体であり、第２の抗体（すなわち、ｓｃＦｖの由来となるもの）は抗ＰＡＣ１受容体抗体である。このような実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、表３Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表３Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含む。例えば、一実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０７（配列番号１４２）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。更に別の実施態様において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０９（配列番号１４４）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。更に別の実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０７（配列番号１４２）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。
【０１３２】
ｓｃＦｖ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、表１Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表１Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含み得る。一実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体ｓｃＦｖは、ＬＶ−０４（配列番号３１）ＶＬ領域と、ＨＶ−０３（配列番号８５）ＶＨ領域とを含む。
【０１３３】
二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来し、ｓｃＦｖ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の改変重鎖は、配列番号４１１〜４２５から選択される配列を含む。関連する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の軽鎖は、配列番号３９３〜３９５から選択される配列を含む。一実施形態において、改変重鎖は、配列番号４１１〜４１６から選択される配列を含み、軽鎖は、配列番号３９３の配列を含む。別の実施形態において、改変重鎖は、配列番号４１７〜４２１から選択される配列を含み、軽鎖は、配列番号３９４の配列を含む。更に別の実施形態において、改変重鎖は、配列番号４２２〜４２５から選択される配列を含み、軽鎖は、配列番号３９５の配列を含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７３１、ｉＰＳ：３８６７２５、ｉＰＳ：３８６７１７、ｉＰＳ：３８６７１５、ｉＰＳ：３８６７０７、ｉＰＳ：３８６７０５、ｉＰＳ：３８６７２３、ｉＰＳ：３８６７１９、ｉＰＳ：３８６７１３、ｉＰＳ：３８６７０９、ｉＰＳ：３８６７２７、ｉＰＳ：３８６７２１、ｉＰＳ：３８６７１１、ｉＰＳ：３８６７３３、またはｉＰＳ：３８６７２９と称する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表９に記載される、ｉＰＳ：３８６７２１、ｉＰＳ：３８６７２３、またはｉＰＳ：３８６７３３と称する抗原結合タンパク質である。
【０１３５】
本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端結合ドメイン）は、Ｆａｂ断片である。このような実施形態において、Ｆａｂは、Ｆａｂ断片のＶＬ領域またはＶＨ領域のアミノ末端を通し、ペプチドリンカーを介して、Ｆｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、または別の方法で連結される。したがって、一実施形態において、Ｆａｂは、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むように、ＦａｂのＶＬ領域のアミノ末端を通してＦｃ領域に融合される。別の実施形態において、Ｆａｂは、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含むように、ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を通してＦｃ領域に融合される。
【０１３６】
Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂに接続するペプチドリンカーは、本明細書に記載のペプチドリンカーのいずれであってもよい。特定の実施形態において、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に接続するペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長である。他の実施形態において、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に接続するペプチドリンカーは、少なくとも８アミノ酸長である。Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に接続するのに特に好適なペプチドリンカーは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎ（式中、ｘ＝３または４、及びｎ＝２、３、４、５または６）などのグリシン−セリンリンカーである。一実施形態において、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に連結するペプチドリンカーは、Ｌ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３６８）である。別の実施形態において、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に連結するペプチドリンカーは、Ｌ９、すなわちＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３６７）である。
【０１３７】
カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂ断片である、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）も同様にＦａｂ断片である。アミノ末端Ｆａｂ断片は、本明細書に記載のペプチドリンカーまたは免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合させることが可能である。いくつかの実施形態において、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に接続される。他の実施形態において、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に接続される。好ましくは、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を通して、Ｆｃ領域に融合される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体）に特異的に結合する第１の抗体を含み、第２の標的（例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体またはヒトＰＡＣ１受容体）に特異的に結合する第２の抗体に由来するＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖（ＶＬ−ＣＬ））が、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合される。このような実施形態における二重特異性抗原結合タンパク質はまた、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、Ｆｄ鎖（ＶＨ−ＣＨ１））を含有するポリペプチド鎖を含む。本明細書において、このフォーマットを「ＩｇＧ−Ｆａｂ」フォーマットと呼び、このタイプの分子の一実施形態を図３に図式的に示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖と、（ｉｉ）第１の抗体に由来する重鎖であって、そのカルボキシル末端にて、ペプチドリンカーを介して、第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインまたはＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドに融合して改変重鎖を形成する、重鎖と、（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインまたはＶＬ−ＣＬドメインを含む第２のポリペプチドとを含み、第１または第２の抗体は、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合し、もう一方の抗体は、ヒトＰＡＣ１受容体に特異的に結合する、二重特異性多価抗原結合タンパク質を包含する。この二重特異性抗原結合タンパク質は、二量体化した場合、２つの改変重鎖と、第１の抗体に由来する２つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（Ｆｄ断片または軽鎖のいずれか）を含有する２つのポリペプチド鎖とを含む、ホモ六量体となる。一実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＬドメインを含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む。別の実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬ及びＣＬドメインを含む。
【０１３９】
第１の抗体（Ｆａｂ１）または第２の抗体（Ｆａｂ２）のＦａｂ領域に、本明細書に記載の電荷対変異または相補的アミノ酸置換を導入して、正しい重鎖−軽鎖の対合を促進することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｆａｂ１中のＶＬドメインのＫａｂａｔ位置３８のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置き換えられ、Ｆａｂ１中のＶＨドメインのＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）に置き換えられる。他の実施形態において、Ｆａｂ１中のＶＬドメインのＫａｂａｔ位置３８のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）に置き換えられ、Ｆａｂ１中のＶＨドメインのＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置き換えられる。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ２中のＶＬドメインのＫａｂａｔ位置３８のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置き換えられ、Ｆａｂ２中のＶＨドメインのＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）に置き換えられる。他の実施形態において、Ｆａｂ２中のＶＬドメインのＫａｂａｔ位置３８のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）に置き換えられ、Ｆａｂ２中のＶＨドメインのＫａｂａｔ位置３９のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置き換えられる。
【０１４０】
第２の抗体に由来するＶＨ−ＣＨ１領域（すなわち、Ｆｄ断片）が第１の抗体に由来する重鎖に融合している実施形態において、第１の抗体に由来する重鎖は、Ｓ１８３Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第１の抗体に由来する軽鎖は、Ｓ１７６Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体に由来する軽鎖は、Ｓ１７６Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体に由来するＦｄ領域（第１の抗体に由来する重鎖のＣ末端に融合する）は、Ｓ１８３Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含む。他の実施形態において、第１の抗体に由来する重鎖は、Ｇ４４Ｅ変異（Ｋａｂａｔ）及びＳ１８３Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第１の抗体に由来する軽鎖は、Ｇ１００Ｋ変異（Ｋａｂａｔ）及びＳ１７６Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体に由来する軽鎖は、Ｇ１００Ｅ変異（Ｋａｂａｔ）及びＳ１７６Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体に由来するＦｄ領域（第１の抗体に由来する重鎖のＣ末端に融合する）は、Ｇ４４Ｋ変異（Ｋａｂａｔ）及びＳ１８３Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含む。前述の例における電荷は、正しい重鎖／軽鎖対が反対の電荷を持つように、対応する軽鎖または重鎖上の電荷も同じく逆にするのであれば、逆にすることができる。
【０１４１】
追加的または代替的に、カルボキシル末端Ｆａｂ結合ドメイン中のＣＨ１ドメインとＣＬドメインを入れ替えることによって、正しい重鎖−軽鎖対合を助長することができる。例として、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み得、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み得る。別の実施形態において、重鎖のカルボキシル末端に融合する第１のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み得、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み得る。
【０１４２】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットにおいて、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、第１の抗体（すなわち、「ＩｇＧ」）であってもよいし、第２の抗体（すなわち、Ｃ末端Ｆａｂの由来となるもの）であってもよい。同様に、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、第１の抗体（すなわち、「ＩｇＧ」）であってもよいし、第２の抗体（すなわち、Ｃ末端Ｆａｂの由来となるもの）であってもよい。表１Ａ及び１Ｂに記載する抗ＰＡＣ１受容体抗体可変領域のいずれかを、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素またはＣ末端Ｆａｂ構成要素のいずれかに組み込むことができる。表３Ａ及び３Ｂに記載する抗ＣＧＲＰ受容体抗体可変領域のいずれかを、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素またはＣ末端Ｆａｂ構成要素のいずれかに組み込むことができる。
【０１４３】
ＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットにおける、本発明の例示的な抗原結合タンパク質の軽鎖、改変重鎖及び第２のポリペプチドに関するアミノ酸配列について、以下の表１０にまとめる。表の前半に列挙する分子は、抗ＰＡＣ１受容体ＩｇＧ構成要素及び抗ＣＧＲＰ受容体Ｃ末端Ｆａｂ断片を含み、一方、表の後半に列挙する分子は、抗ＣＧＲＰ受容体ＩｇＧ構成要素及び抗ＰＡＣ１受容体Ｃ末端Ｆａｂ断片を含む。
【表１０−００１】
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【表１０−００２】
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【表１０−００３】
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【表１０−００４】
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【表１０−００５】
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【表１０−００６】
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【表１０−００７】
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【表１０−００８】
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【表１０−００９】
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【表１０−０１０】
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【表１０−０１１】
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【表１０−０１２】
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【表１０−０１３】
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【表１０−０１４】
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【０１４４】
ある特定の実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質の第１の抗体（すなわち、ＩｇＧ構成要素）は抗ＰＡＣ１受容体抗体であり、第２の抗体（すなわち、カルボキシル末端Ｆａｂの由来となるもの）は抗ＣＧＲＰ受容体抗体である。このような実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、表１Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表１Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含む。例えば、一実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＰＡＣ１受容体抗体は、ＬＶ−０４（配列番号３１）ＶＬ領域と、ＨＶ−０３（配列番号８５）ＶＨ領域とを含む。
【０１４５】
カルボキシル末端Ｆａｂ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、表３Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表３Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含み得る。一実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体Ｆａｂは、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体Ｆａｂは、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。
【０１４６】
二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来し、カルボキシル末端Ｆａｂ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の改変重鎖は、配列番号４２８〜４３９から選択される配列を含む。関連する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の軽鎖は、配列番号２１４または配列番号４２６の配列を含み、第２のポリペプチド（カルボキシル末端Ｆａｂ断片の残り半分を含有する）は、配列番号４５２〜４５９から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、軽鎖と、改変重鎖と、第２のポリペプチドとを含み、
（ａ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４２８の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５２の配列を含むか、
（ｂ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４２９の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５３の配列を含むか、
（ｃ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３０の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５４の配列を含むか、
（ｄ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３１の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５５の配列を含むか、
（ｅ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３２の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５６の配列を含むか、
（ｆ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３３の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５７の配列を含むか、
（ｇ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３４の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５８の配列を含むか、
（ｈ）軽鎖は配列番号２１４の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３５の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５９の配列を含むか、
（ｉ）軽鎖は配列番号４２６の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３６の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５６の配列を含むか、
（ｊ）軽鎖は配列番号４２６の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３７の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５７の配列を含むか、
（ｋ）軽鎖は配列番号４２６の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３８の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５９の配列を含むか、または
（ｌ）軽鎖は配列番号４２６の配列を含み、改変重鎖は配列番号４３９の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４５８の配列を含む。ある特定の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表１０に記載される、ｉＰＳ：３９２５１３、ｉＰＳ：３９２５１４、ｉＰＳ：３９２４７５、ｉＰＳ：３９２５１９、ｉＰＳ：３９２５１５、ｉＰＳ：３９２５１６、ｉＰＳ：３９２５２１、ｉＰＳ：３９２５２０、ｉＰＳ：３９２５１７、ｉＰＳ：３９２５１８、ｉＰＳ：３９２５２２、またはｉＰＳ：３９２５２３と称する抗原結合タンパク質である。
【０１４７】
本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質の第１の抗体（すなわち、ＩｇＧ構成要素）は抗ＣＧＲＰ受容体抗体であり、第２の抗体（すなわち、カルボキシル末端Ｆａｂの由来となるもの）は抗ＰＡＣ１受容体抗体である。このような実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、表３Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表３Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含む。例えば、一実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０５（配列番号１９４）ＶＨ領域とを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ構成要素の由来となる抗ＣＧＲＰ受容体抗体は、ＬＶ−１０５（配列番号１４０）ＶＬ領域と、ＨＶ−１０７（配列番号１９６）ＶＨ領域とを含む。カルボキシル末端Ｆａｂ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体は、表１Ａに記載されるもののいずれかに由来するＶＬ領域と、表１Ｂに記載されるもののいずれかに由来するＶＨ領域とを含み得る。一実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体Ｆａｂは、ＬＶ−０４（配列番号３１）ＶＬ領域と、ＨＶ−０３（配列番号８５）ＶＨ領域とを含む。
【０１４８】
二重特異性抗原結合タンパク質のＩｇＧ構成要素が抗ＣＧＲＰ受容体抗体に由来し、カルボキシル末端Ｆａｂ構成要素が抗ＰＡＣ１受容体抗体に由来する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の改変重鎖は、配列番号４４０〜４５１から選択される配列を含む。関連する実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質の軽鎖は、配列番号２７５または配列番号４２７の配列を含み、第２のポリペプチド（カルボキシル末端Ｆａｂ断片の残り半分を含有する）は、配列番号４６０〜４６３から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、軽鎖と、改変重鎖と、第２のポリペプチドとを含み、
（ａ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４０の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６０の配列を含むか、
（ｂ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４１の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６１の配列を含むか、
（ｃ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４２の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６０の配列を含むか、
（ｄ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４３の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６１の配列を含むか、
（ｅ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４４の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６２の配列を含むか、
（ｆ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４５の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６３の配列を含むか、
（ｇ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４６の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６２の配列を含むか、
（ｈ）軽鎖は配列番号２７５の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４７の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６３の配列を含むか、
（ｉ）軽鎖は配列番号４２７の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４８の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６２の配列を含むか、
（ｊ）軽鎖は配列番号４２７の配列を含み、改変重鎖は配列番号４４９の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６３の配列を含むか、
（ｋ）軽鎖は配列番号４２７の配列を含み、改変重鎖は配列番号４５０の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６２の配列を含むか、または
（ｌ）軽鎖は配列番号４２７の配列を含み、改変重鎖は配列番号４５１の配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号４６３の配列を含む。ある特定の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表１０に記載される、ｉＰＳ：３９２５２４、ｉＰＳ：３９２５２５、ｉＰＳ：３９２５２６、ｉＰＳ：３９２５２７、ｉＰＳ：３９２５２８、ｉＰＳ：３９２５２９、ｉＰＳ：３９２５３２、ｉＰＳ：３９２５３３、ｉＰＳ：３９２５３０、ｉＰＳ：３９２５３１、ｉＰＳ：３９２５３４、またはｉＰＳ：３９２５３５と称する抗原結合タンパク質である。他の実施形態において、二重特異性多価抗原結合タンパク質は、表１０に記載される、ｉＰＳ：３９２５２４、ｉＰＳ：３９２５２５、ｉＰＳ：３９２５２６、ｉＰＳ：３９２５２７、ｉＰＳ：３９２５３２、ｉＰＳ：３９２５３３、ｉＰＳ：３９２５３４、またはｉＰＳ：３９２５３５と称する抗原結合タンパク質である。
【０１４９】
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域またはＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／またはエフェクター機能に影響を与える１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的と結合したときに、免疫系と連絡を取ることである。これは、一般に、「エフェクター機能」と呼ばれる。連絡により、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）がもたらされる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、Ｆｃ領域が免疫系の細胞表面上のＦｃ受容体に結合することにより媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃが補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑに結合することにより媒介される。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、定常領域中に、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性及び／またはクリアランスもしくは半減期を含む、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を高める、１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を高めることができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）には、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌまたは前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
他の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を減ずるために、定常領域に１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を減ずることができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）には、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓまたは前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に関与し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベルまたは種類に影響を与える１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへのＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの糖のうちの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも用いられ得る。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加させる。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、当該タンパク質が上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって簡便に達成することができる（Ｎ−結合型グリコシル化部位に関して）。この変更はまた、出発配列に１つ以上のセリン残基もしくはトレオニン残基を付加するか、またはこれらの残基で置換することによって行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位に関して）。簡単には、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを事前に選択した塩基で変異させることによって、改変される。
【０１５３】
本発明はまた、エフェクター活性に変化をもたらす炭水化物構造が改変された二重特異性抗原結合タンパク質分子の作製を包含し、これには、ＡＤＣＣ活性の改善を呈するフコシル化が存在しないか、またはフコシル化が低減された抗原結合タンパク質が含まれる。フコシル化を低減または排除するための各種方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子がＦｃγＲＩＩＩ受容体に結合することによって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基にあるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、この受容体に高い親和性で結合し、天然フコシル化抗体よりも効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を誘発する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされたＣＨＯ細胞で非フコシル化抗体を組み換え産生すると、ＡＤＣＣ活性が１００倍増大した抗体が得られる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４−２２，２００４参照）。類似の効果は、フコシル化経路中のα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素または他の酵素の活性を低下させることにより、例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理により、細胞株を操作して当該酵素（複数可）をノックアウトするか、または選択的グリコシル化阻害物質とともに培養することによって達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３−２３，１９８９参照）。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、フコシル化レベルのより低い抗体を自然産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−７３，２００３参照）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞での組み換え的抗体産生による、二分岐炭水化物のレベル増加もまた、ＡＤＣＣ活性を増大させることがわかっている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０，１９９９参照）。
【０１５４】
他の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除去することによって、低減または排除することができる。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除または変更するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を低減または排除することができる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、またはＮ２９７Ｇなどの位置Ｎ２９７（ＥＵ番号付け）に変異を含む。特定の一実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を改善するために、分子のＦｃ領域を更に操作してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、二量体状態でのジスルフィド結合形成を促進するために、Ｆｃ領域中の１つ以上のアミノ酸をシステインで置換する。したがって、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３またはＩ３３２（ＥＵ番号付け）に該当する残基をシステインで置換することができる。好ましくは、特定の残基ペアがシステインで置換され、これにより、当該ペアがジスルフィド結合を互いに優先的に形成し、ジスルフィド結合の不規則性が限定または防止される。好ましいペアには、Ａ２８７ＣとＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣとＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣとＶ３０２Ｃ及びＶ３２３ＣとＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態において、Ｆｃ領域はまた、Ｎ２９７Ｇ変異を含み得る。
【０１５５】
血清半減期が延長するように本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を修飾することも望ましい場合があり、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを組み込むか、もしくは付加することによるか（例えば、適切な領域の変異によるか、またはエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで、このペプチドタグを、例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成により、抗原結合タンパク質のいずれかの末端または中央に融合させることによる；例えば、ＷＯ９６／３２４７８参照）、またはＰＥＧもしくは多糖類ポリマーを含む他の水溶性ポリマーなどの分子を付加することによる。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つまたは２つのループに由来する任意の１つ以上のアミノ酸残基が、抗原結合タンパク質の類似の位置に移された領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃ領域の１つまたは２つのループに由来する３つ以上の残基が移される。更により好ましくは、エピトープは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインから得て、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域、または２つ以上の当該領域に移される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得て、抗原結合タンパク質のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、またはその両方に移される。Ｆｃバリアント及びそのサルベージ受容体との相互作用の記載に関しては、国際出願ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８を参照されたい。
【０１５６】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質及びその構成要素をコードする１つ以上の単離核酸を含む。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡならびに対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びこれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子及びその断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、優先的にヒト供給源に由来するが、本発明は、ヒト以外の種に由来するものも同様に含む。
【０１５７】
目的とする免疫グロブリンもしくはその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）またはポリペプチド由来の関連するアミノ酸配列は、タンパク質直接シークエンシングによって決定することができ、好適なヌクレオチドコード配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計することができる。あるいは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの由来となるモノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、当該抗体を産生する細胞から単離し、配列決定することができる。
【０１５８】
本明細書にて「単離ポリヌクレオチド」と区別なく用いられる「単離核酸」とは、天然源から単離された核酸である場合、核酸を単離した生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的にまたは化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子またはオリゴヌクレオチドなどの場合、こうした方法から得られる核酸は単離核酸であると解釈される。単離核酸分子とは、分離した断片の形態であるか、またはより大きな核酸構築物の構成要素である核酸分子を指す。好ましい一実施形態において、核酸は、内因性汚染物質を実質的に含まない。核酸分子は、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているものなど）により、その成分であるヌクレオチド配列を同定、操作及び回収を可能にする量または濃度で、かつ実質的に純粋な形態に、少なくとも１回は単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来しているのが好ましい。こうした配列は、好ましくは、真核細胞遺伝子に通常存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンで中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、オープンリーディングフレームの５’または３’側に存在してよく、この場合、これらの配列はコード領域の操作または発現を妨げることはない。特に指示がない限り、本明細書で考察される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への生成方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の５’末端までの５’側に存在するＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の３’末端までの３’側に存在するＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【０１５９】
本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下、より好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本的なパラメーター及び好適な条件を案出するための指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）に記載されており、当業者であれば、例えば、ＤＮＡの長さ及び／または塩基組成に基づいて、容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば約５０％ホルムアミドを含有するもの、約４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用）、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での約６０℃の洗浄条件の使用を伴う。一般に、高度にストリンジェントな条件は、上記のハイブリダイゼーション条件であるが、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄するものとして定義される。ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液のＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に代えて、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用することができ、ハイブリダイゼーション終了後に洗浄を１５分間実施する。この洗浄温度及び洗浄塩濃度は、当業者に知られているとおり、また以下に更に記載するとおり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９参照）、ハイブリダイゼーション反応及び二本鎖の安定性を制御する基本原理を適用することによって、所望の程度のストリンジェンシーを達成するように必要に応じて調節することができることを理解されたい。核酸を未知配列の標的核酸にハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズ核酸の長さであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性を持つ１つまたは複数の領域を同定することによって、決定することができる。５０塩基対未満の長さであることが予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くする必要があり、ここで、Ｔｍは、次の等式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））。好ましくは、このようなハイブリダイズ核酸のそれぞれは、少なくとも１５ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１８ヌクレオチド、もしくは少なくとも２０ヌクレオチド、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド、もしくは少なくとも３０ヌクレオチド、もしくは少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは、少なくとも５０ヌクレオチド）である長さ、または当該核酸がハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは、少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、及び最も好ましくは、少なくとも８０％）を有し、当該核酸がハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％（より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、及び最も好ましくは、少なくとも９９．５％）の配列同一性を有し、ここで、配列同一性は、上で詳述したように、重複部分及び同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように整列させた、ハイブリダイズ核酸の配列を比較することによって決定される。
【０１６０】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質のバリアントは、カセット変異導入もしくはＰＣＲ変異導入または当該技術分野においてよく知られた他の技術を使用して、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドに部位特異的変異導入を行ってバリアントをコードするＤＮＡを作製し、その後、本明細書にて概略するように細胞培養で組み換えＤＮＡを発現させることによって作製することができる。一方、確立された技術を使用したインビトロ合成では、最大約１００〜１５０残基を有するバリアントＣＤＲを含む抗原結合タンパク質を調製することができる。バリアントは、典型的に、天然に生じる類似体と定性的に同じ生物活性、例えば、抗原に対する結合を呈する。このようなバリアントは、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列中に、例えば、残基の欠失及び／または挿入及び／または置換を含む。最終的な構築物が所望の特徴を持つことを条件として、最終的な構築物に到達するように、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせがなされる。アミノ酸の変化はまた、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを変えることができ、例えば、グリコシル化部位の数または位置が変化する。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質のバリアントは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を改変するように作製することができる。他の実施形態において、本明細書にて論じる目的では、エピトープ結合に直接関与しない残基、またはエピトープ結合に全く関与しない残基の改変が望ましい。ＣＤＲ領域及び／またはフレームワーク領域のいずれかの領域中の変異導入が企図される。当業者は、共分散分析法を使用して、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列に有用な改変を設計することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４１：４７５−４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１−４８，２００４；Ｈｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（５）：３８１−８６，２００３；Ａｕｒｏｒａら、米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号；Ｇｌａｓｅｒら、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号；Ｕｒｅｃｈら、ＷＯ２００８／１１０３４８Ａ１；Ｂｏｒｒａｓら、ＷＯ２００９／００００９９Ａ２を参照されたい。共分散分析により決定されたこのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態、薬力及び／または製造性の各特徴を改善することができる。
【０１６１】
表１１は、抗ＰＡＣ１受容体抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列を示し、表１２は、抗ＣＧＲＰ受容体抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列を示す。抗ＰＡＣ１受容体及び抗ＣＧＲＰ受容体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを使用して、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体及び抗ＣＧＲＰ受容体のそれぞれの結合ドメインを構築することができる。
【表１１−００１】
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【表１１−００２】
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【表１１−００３】
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【表１１−００４】
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【表１１−００５】
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【表１１−００６】
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【表１１−００７】
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【表１１−００８】
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【表１１−００９】
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【表１２−００１】
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【表１２−００２】
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【表１２−００３】
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【表１２−００４】
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【表１２−００５】
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【表１２−００６】
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【表１２−００７】
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【表１２−００８】
2020074790.tif 000124
【０１６２】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＡＣ１受容体の結合ドメインをコードする単離核酸は、表１１に列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖可変領域をコードする単離核酸は、配列番号４６４〜４９０から選択される配列を含む。関連する実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体の重鎖可変領域をコードする単離核酸は、配列番号４９１〜５１６から選択される配列を含む。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＣＧＲＰ受容体の結合ドメインをコードする単離核酸は、表１２に列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖可変領域をコードする単離核酸は、配列番号５１７〜５３９から選択される配列を含む。関連する実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体の重鎖可変領域をコードする単離核酸は、配列番号５４０〜５６０から選択される配列を含む。
【０１６３】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質がヘテロ二量体抗体である実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体の軽鎖をコードする単離核酸は、表６Ａに列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体の抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖をコードする単離核酸は、配列番号２２２〜２３２から選択される配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体抗体の重鎖をコードする単離核酸は、表６Ｂに列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体の抗ＰＡＣ１受容体の重鎖をコードする単離核酸は、配列番号２５２〜２７０から選択される配列を含む。
【０１６４】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質がヘテロ二量体抗体である他の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体の軽鎖をコードする単離核酸は、表７Ａに列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体の抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖をコードする単離核酸は、配列番号２８３〜２９４から選択される配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、抗ＣＧＲＰ受容体抗体の重鎖をコードする単離核酸は、表７Ｂに列挙するヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のヘテロ二量体抗体の抗ＣＧＲＰ受容体の重鎖をコードする単離核酸は、配列番号３１７〜３３８から選択される配列を含む。
【０１６５】
ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットにおける、本発明の例示的な二重特異性抗原結合タンパク質の軽鎖及び改変重鎖（例えば、重鎖及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質）をコードする核酸配列を表１３に列挙する。このような実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の軽鎖をコードする単離核酸は、表１３に列挙する軽鎖ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の軽鎖をコードする単離核酸は、配列番号５６１〜５６４から選択される配列を含む。関連する実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の改変重鎖をコードする単離核酸は、表１３に列挙する改変重鎖ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の改変重鎖をコードする単離核酸は、配列番号５６５〜５９４から選択される配列を含む。
【表１３−００１】
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【表１３−００２】
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【表１３−００３】
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【表１３−００４】
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【表１３−００５】
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【表１３−００６】
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【表１３−００７】
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【表１３−００８】
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【表１３−００９】
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【表１３−０１０】
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【表１３−０１１】
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【表１３−０１２】
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【表１３−０１３】
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【表１３−０１４】
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【表１３−０１５】
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【表１３−０１６】
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【表１３−０１７】
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【表１３−０１８】
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【表１３−０１９】
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【表１３−０２０】
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【表１３−０２１】
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【表１３−０２２】
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【表１３−０２３】
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【表１３−０２４】
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【表１３−０２５】
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【表１３−０２６】
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【表１３−０２７】
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【表１３−０２８】
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【表１３−０２９】
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【表１３−０３０】
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【表１３−０３１】
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【表１３−０３２】
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【０１６６】
ＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットにおける、本発明の例示的な二重特異性抗原結合タンパク質の３つの構成要素（例えば、軽鎖、改変重鎖及びカルボキシル末端Ｆａｂドメインの残り半分を含む第２のポリペプチド）をコードする核酸配列を表１４に列挙する。このような実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする単離核酸は、表１４に列挙する軽鎖ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする単離核酸は、配列番２２５、２８７、５９５及び５９６から選択される配列を含む。関連する実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の改変重鎖をコードする単離核酸は、表１４に列挙する改変重鎖ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の改変重鎖をコードする単離核酸は、配列番号５９７〜６２０から選択される配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態において、カルボキシル末端Ｆａｂドメインの残り半分（例えば、Ｆｄ断片または第２の軽鎖）を含む、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の第２のポリペプチドをコードする単離核酸は、表１４に列挙する第２のポリペプチドヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の第２のポリペプチドをコードする単離核酸は、配列番号６２１〜６３２から選択される配列を含む。
【表１４−００１】
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【表１４−００２】
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【表１４−００３】
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【表１４−００４】
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【表１４−００５】
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【表１４−００６】
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【表１４−００７】
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【表１４−００８】
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【表１４−００９】
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【表１４−０１０】
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【表１４−０１１】
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【表１４−０１２】
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【表１４−０１３】
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【表１４−０１４】
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【表１４−０１５】
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【表１４−０１６】
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【表１４−０１７】
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【表１４−０１８】
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【表１４−０１９】
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【表１４−０２０】
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【表１４−０２１】
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【表１４−０２２】
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【表１４−０２３】
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【表１４−０２４】
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【表１４−０２５】
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【表１４−０２６】
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【表１４−０２７】
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【表１４−０２８】
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【表１４−０２９】
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【表１４−０３０】
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【表１４−０３１】
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【表１４−０３２】
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【表１４−０３３】
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【０１６７】
表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ及び１１〜１４に記載する核酸配列は単なる例示である。当業者であれば理解するように、遺伝コードの縮重に起因して、極めて多数の核酸を作製することができ、これらの全ては、本発明のＣＤＲ（ならびに本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖及び軽鎖または他の構成要素）をコードする。したがって、個々のアミノ酸配列が特定されれば、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えずに、１つ以上のコドン配列を単に変更することにより、任意の数の異なる核酸を作製することができる。
【０１６８】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のうちの１つ以上の構成要素（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、改変重鎖及びＦｄ断片）をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを包含する。「ベクター」という用語は、タンパク質のコード情報を宿主細胞に運搬するために使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を指す。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、所望のコード配列と、機能的に連結されるコード配列の特定の宿主細胞中における発現に必要とされる適切な核酸制御配列とを含有する組み換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、機能的に連結されるコード領域の転写、翻訳に影響するか、またはこれらを制御する配列、及びイントロンが存在する場合にはＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位及び任意に他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーならびに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。また、所望する場合、目的のポリペプチドの細胞からの単離をより容易にするために、発現されるポリペプチドが組み換え宿主細胞によって分泌され得るように、分泌シグナルペプチド配列を任意に発現ベクターによりコードしてもよく、目的のコード配列に機能的に連結され得る。例えば、いくつかの実施形態において、シグナルペプチド配列は、表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９及び１０に列挙するポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に付加／融合され得る。ある特定の実施形態において、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号６３３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９及び１０中のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。他の実施形態において、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号６３４）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９及び１０中のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。更に他の実施形態において、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号６３５）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９及び１０中のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。本明細書に記載のポリペプチド配列のアミノ末端に融合することができる他の好適なシグナルペプチド配列には、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号６３６）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号６３７）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号６３８）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号６３９）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号６４０）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号６４１）が挙げられる。他のシグナルペプチドについては、当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞での発現を助長または最適化するために、表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９及び１０に列挙するポリペプチド鎖のいずれかに融合することができる。
【０１６９】
典型的には、本発明の二重特異性抗原タンパク質を産生するために宿主細胞にて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列と、二重特異性抗原結合タンパク質の構成要素をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列とを含む。このような配列は、総称的に「フランキング配列」と呼ばれ、ある特定の実施形態において、次のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカー要素のうちの１つ以上を典型的に含む。これらの配列のそれぞれについては、以下に論じる。
【０１７０】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち、ポリペプチドをコードする配列の５’末端または３’末端に位置する、オリゴヌクレオチド分子を含んでよく、このオリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、または別の「タグ」分子をコードし、これらについては、市販の抗体がある。このタグは、典型的に、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、宿主細胞からの当該ポリペプチドのアフィニティー精製または検出のための手段として機能することができる。アフィニティー精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。その後、必要に応じて、特定の切断用ペプチダーゼを用いるなどの各種手段により、精製したポリペプチドからタグを取り除くことができる。
【０１７１】
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または系統由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源からのフランキング配列の組み合わせ）でも、合成でも、天然でもよい。したがって、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が、宿主細胞機構内で機能でき、かつ当該機構により活性化され得るのであれば、いずれの原核生物もしくは真核生物、いずれの脊椎動物もしくは無脊椎動物またはいずれの植物であってもよい。
【０１７２】
本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野においてよく知られた複数の方法のいずれかにより得ることができる。典型的には、本明細書にて有用なフランキング配列は、マッピング及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって事前に同定しておき、これにより、適切な組織源から適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて単離することができる。場合により、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られていることもある。この場合、核酸合成またはクローニングに関する慣用的方法を用いて、フランキング配列を合成してもよい。
【０１７３】
知られているフランキング配列が全配列であっても、その一部であっても、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ならびに／または同種もしくは別種由来のオリゴヌクレオチド及び／もしくはフランキング配列断片などの好適なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が知られていない場合は、例えば、コード配列または更には別の１つもしくは複数の遺伝子を含み得るより大きなＤＮＡ片から、フランキング配列を含むＤＮＡ断片を単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生成し、次いで、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）または当業者に知られた他の方法を使用して単離することによって、達成することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１７４】
複製起点は、典型的には、市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞中におけるベクターの増幅を助けるものである。最適なベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲーションしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性菌に好適であり、種々のウイルス性起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞でのクローニングベクターに有用である。通常、哺乳動物の発現ベクターには、複製起点成分は必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含むという理由でのみ用いられることが多い）。
【０１７５】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させる働きがある。一般に、原核細胞の転写終結配列は、Ｇ−Ｃに富んだ断片であり、後にポリ−Ｔ配列が続く。当該配列はライブラリーから簡単にクローニングでき、またベクターの一部としても市販されているが、核酸合成に関して知られている方法を用いて容易に合成することもできる。
【０１７６】
選択マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、原核生物の宿主細胞の場合、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地もしくは限定培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。具体的な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核生物及び真核生物のいずれの宿主細胞の選択にも用いることもできる。
【０１７７】
他の選択可能遺伝子を用いて、発現させる遺伝子を増幅させてもよい。増幅とは、増殖または細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組み換え細胞の継代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。ベクター中に存在する選択可能遺伝子に基づいて形質転換体のみが生存するように一意的に適合させた選択圧下に哺乳動物細胞の形質転換体を置く。選択圧を加えるには、培地中の選択剤の濃度を連続的に高め、これにより、選択可能遺伝子と、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の１つ以上の構成要素などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅がもたらされる条件下で、形質転換細胞を培養する。その結果、多量のポリペプチドが、増幅したＤＮＡから合成される。
【０１７８】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）を特徴とする。この要素は、典型的に、プロモーターの３’側及び発現させるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。ある特定の実施形態において、１つ以上のコード領域を内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に機能的に連結させてよく、これにより、単一ＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能になる。
【０１７９】
真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれるような場合には、種々のプレ配列またはプロ配列を操作して、グリコシル化または収率を改善することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更してもよいし、グリコシル化に作用し得るプロ配列を加えてもよい。最終的なタンパク質産生物は、完全に除去され得なかった、発現に伴う１つ以上の付加アミノ酸を（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に有し得る。例えば、最終的なタンパク質産生物は、アミノ末端に結合したペプチダーゼ切断部位に認められる１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位を用いて、成熟ポリペプチド中の当該領域を酵素で切断すれば、わずかに短縮した型の所望のポリペプチドが生じ得る。
【０１８０】
本発明の発現及びクローニングベクターは、典型的に、宿主生物により認識され、かつポリペプチドをコードする分子に機能的に連結されたプロモーターを含む。本明細書で使用する「機能的に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を導くことが可能な核酸分子が生じるような２つ以上の核酸配列の結合を指す。例えば、タンパク質コード配列に「機能的に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と一致する条件下で達成されるように、ベクターにライゲートされる。より具体的には、プロモーター及び／またはエンハンサー配列は、シス作用転写制御エレメントの任意の組み合わせを含め、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に機能的に連結されている。
【０１８１】
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’側）（通常、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの２つのクラスの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無または温度変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、そのプロモーターの制御下でＤＮＡから高レベルの転写を開始する。一方、構成的プロモーターは、当該プロモーターに機能的に連結された遺伝子を均一に転写する。すなわち、遺伝子発現に対する制御はほとんどないか、または全くない。候補となる種々の宿主細胞によって認識されるプロモーターは、多数知られている。好適なプロモーターは、元となるＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖、軽鎖、改変重鎖または他の構成要素をコードするＤＮＡに機能的に連結される。
【０１８２】
酵母宿主との使用に好適なプロモーターもまた当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと一緒に有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞との使用に好適なプロモーターは、よく知られており、限定するものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターなどが挙げられる。
【０１８３】
対象となり得る更なるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ならびにβ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ
ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に用いられてきた、次の動物転写制御領域も対象である。膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞及びマスト細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌ．１  ：２６８−２７６）；肝臓中で活発なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）；肝臓中で活発なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ
ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内の乏突起神経膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１８４】
エンハンサー配列は、高等真核細胞による二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、軽鎖、重鎖、改変重鎖、Ｆｄ断片）の構成要素をコードするＤＮＡの転写を増加させるために、ベクターに挿入することができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐの長さであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、配向及び位置に比較的依存せず、転写ユニットの５’側と３’側の両方の位置で確認されている。哺乳動物の遺伝子から入手できる複数のエンハンサー配列（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）が知られている。しかしながら、典型的に、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において知られている、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが真核生物プロモーターの活性化を増強する例示的な要素である。エンハンサーは、コード配列の５’側または３’側のいずれかでベクター中に配置され得るが、典型的にはプロモーターの５’側の位置に置かれる。抗体の細胞外分泌を促進するために、適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体を産生させる宿主細胞の種類に依存し、天然シグナル配列を異種シグナル配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドの例については、上述したとおりである。哺乳動物宿主細胞で機能する他のシグナルペプチドには、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されているインターロイキン−２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、欧州特許第０４６０８４６号に記載されているＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【０１８５】
提供される発現ベクターは、市販されているベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。このようなベクターは、所望のフランキング配列を全て含む場合もあれば、含まない場合もある。本明細書に記載のフランキング配列のうちの１つ以上がベクター中に既存していない場合、そのフランキング配列を個別に得て、ベクターにライゲーションしてもよい。フランキング配列のそれぞれを得るのに用いられる方法は、当業者によく知られている。発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされた融合タンパク質を含むタンパク質が産生される。
【０１８６】
ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の異なる構成要素をコードする核酸は、同じ発現ベクター中に挿入してもよい。例えば、抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖をコードする核酸を、抗ＰＡＣ１受容体の重鎖をコードする核酸と同じベクターにクローニングすることができる。このような実施形態において、２つの核酸は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられ、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写物から発現されるように、１つのプロモーターの制御下に置かれ得る。あるいは、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下であってもよい。いくつかの実施形態において、抗ＰＡＣ１受容体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸を１つの発現ベクターにクローニングし、抗ＣＧＲＰ受容体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸を第２の発現ベクターにクローニングする。
【０１８７】
同様に、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質の場合、軽鎖をコードする核酸を、改変重鎖（重鎖及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質）をコードする核酸と同じ発現ベクターにクローニングすることができ、２つの核酸は、１つのプロモーター下でＩＲＥＳによって隔てられているか、あるいは２つの核酸は、２つの別個のプロモーターの制御下にある。ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質の場合、３つの構成要素のそれぞれをコードする核酸を同じ発現ベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸及び第２のポリペプチド（Ｃ末端Ｆａｂドメインの残り半分を含む）をコードする核酸を１つの発現ベクターにクローニングし、改変重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの一方を含む融合タンパク質）をコードする核酸を第２の発現ベクターにクローニングする。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の全ての構成要素は、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１つ以上の構成要素が別個の発現ベクターにクローニングされる場合であっても、１つの細胞が二重特異性抗原結合タンパク質の全ての構成要素を産生するように、宿主細胞に両方の発現ベクターをコトランスフェクトする。
【０１８８】
ベクターを構築し、本明細書に記載する二重特異性抗原結合タンパク質の構成要素をコードする１つ以上の核酸分子を１つのベクターまたは複数のベクターの適切な部位（複数可）に挿入した後、完成したベクター（複数可）を、増幅及び／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞に挿入することができる。したがって、本発明は、二重特異性抗原結合タンパク質の構成要素をコードする１つ以上の発現ベクターを含む、単離した宿主細胞を包含する。本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換された細胞、または形質転換が可能な細胞であって、これにより目的の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語は、親細胞の子孫を含み、目的の遺伝子が存在する限り、その子孫が元の親細胞と形態学的または遺伝子構成的に同一であるかどうかは問わない。本発明の単離核酸、好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に機能的に連結された単離核酸を含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」である。
【０１８９】
選択した宿主細胞への抗原結合タンパク質のための発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションまたは他の既知の技術などを含む、よく知られた方法によって達成することができる。選択する方法は、使用される宿主細胞の種類に応じてある程度決まる。これらの方法及び他の好適な方法は、当事者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、上掲）に記載されている。
【０１９０】
宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、抗原結合タンパク質を合成する。その後、当該タンパク質を培養培地から回収してもよいし（宿主細胞が培地中に分泌する場合）、当該タンパク質を産生する宿主細胞から直接回収してもよい（分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）及び生物活性分子への折り畳み容易性などの様々な要因に左右される。
【０１９１】
例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母菌または高等真核細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、組み換えポリペプチドに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的にパン酵母菌は、下等真核生物の宿主微生物のうちで最も一般的に使用されている。しかしながら、多数の他の属、種及び系統、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主なども一般に利用可能であり、本明細書にて有用である。
【０１９２】
グリコシル化抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアントと、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。このような細胞のトランスフェクション用の各種ウイルス系は、一般に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアント及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株がある。
【０１９３】
脊椎動物の宿主細胞も好適な宿主であり、当該細胞からの抗原結合タンパク質の組み換え産生は、慣用的手順となっている。発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、限定するものではないが、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できる不死化細胞株が挙げられ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞またはＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞及び多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、かつＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体結合特性を有する二重特異性抗原結合タンパク質を恒常的に産生するかの決定を通じて選択することができる。別の実施形態では、その細胞自身の抗体を産生しないが、異種抗体を産生し分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択することができる。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を発現させるためには、いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞が好ましい宿主細胞である。
【０１９４】
宿主細胞は、二重特異性抗原結合タンパク質の産生のための上述の核酸またはベクターを用いて形質転換するか、またはトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養培地中で培養する。加えて、選択マーカーによって分離された多数の転写単位のコピーを含む新しいベクター及びトランスフェクト細胞株が抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を、１つ以上の発現ベクターによってコードされた二重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下にて、培養培地中で培養することと、培養培地から二重特異性抗原結合タンパク質を回収することとを含む、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を調製するための方法を提供する。
【０１９５】
本発明の抗原結合タンパク質の産生に使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再発行第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれかには、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）剤など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を必要に応じて添加してよい。当業者に知られているであろう任意の他の必要な添加物も適切な濃度で含めてよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前から使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
【０１９６】
宿主細胞を培養すると、二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞内、細胞膜周辺腔に産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解断片のいずれかである粒子状デブリを、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオンもしくはアニオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、目的の抗原（複数可）もしくはプロテインＡもしくはプロテインＧを親和性リガンドとして使用する親和性クロマトグラフィーを用いることにより、精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖をベースにするポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）。プロテインＧは、マウスの全てのアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの物理的に安定したマトリックスでは、アガロースの使用により達成できる場合よりも、流速を速くし、かつ処理時間を短くすることができる。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製の他の技術、例えば、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿法なども、回収する個々の二重特異性抗原結合タンパク質に応じて可能である。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の１つまたは複数を、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、溶解剤、乳化剤、防腐剤及び／またはアジュバントとともに含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、液体、凍結及び凍結乾燥の組成物が挙げられるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される」とは、使用される用量及び濃度でヒトレシピエントにとって非毒性であり、及び／またはヒトに投与したときにアレルギー反応もしくは有害反応をもたらさない分子、化合物及び組成物を指す。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘性、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透を改変、維持または保持するための製剤化材料を含んでもよい。このような実施形態において、好適な製剤化材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖、二糖及び他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色剤、矯味剤及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩生成対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）、安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張性向上剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または薬剤アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。治療用途の分子を製剤化するための方法及び好適な物質は、薬学分野にて知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、標準的な薬学的担体、例えば、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などを含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、穏やかな化学修飾などを受けたアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性を向上させるための他のタンパク質を含んでもよい。
【０１９９】
製剤中の二重特異性抗原結合タンパク質の例示的な濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１８０ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であってよい。抗原結合タンパク質の水性製剤は、例えば、約４．５〜約６．５または約４．８〜約５．５の範囲、あるいは約５．０のｐＨのｐＨ緩衝液で調製することができる。この範囲内のｐＨに適した緩衝液の例には、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸及び他の有機酸の緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。
【０２００】
抗原結合タンパク質を安定化することもできる等張化剤が製剤中に含まれてもよい。例示的な等張化剤には、マンニトール、スクロースまたはトレハロースなどのポリオールが挙げられる。好ましくは、水性製剤は等張であるが、高張溶液または低張溶液が好適な場合もある。製剤中のポリオールの例示的な濃度は、約１％〜約１５％ｗ／ｖの範囲であってよい。
【０２０１】
製剤化した抗原結合タンパク質の凝集の低減及び／または製剤中における微粒子形成の最小限化及び／または吸着の低減のために、界面活性剤を抗原結合タンパク質製剤に加えてもよい。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％〜約０．５％、または約０．００５％〜約０．２％、あるいは約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲であってよい。
【０２０２】
一実施形態において、製剤は、上述の各剤（すなわち、抗原結合タンパク質、緩衝剤、ポリオール及び界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及び塩化ベンゼトニウムなどの１つ以上の防腐剤を実質的に含まない。別の実施形態において、防腐剤は、例えば、約０．１％〜約２％、あるいは、約０．５％〜約１％の範囲の濃度で、製剤中に含まれ得る。製剤の所望の特徴に悪影響を与えないのであれば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されているものなどの１つ以上の他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を製剤中に含めてもよい。
【０２０３】
二重特異性抗原結合タンパク質の治療用製剤は、所望の純度を持つ二重特異性抗原結合タンパク質を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これらには、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、マルトースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩生成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２０４】
一実施形態において、特許請求される発明に好適な製剤は、リン酸、酢酸またはＴＲＩＳ緩衝液などの等張緩衝液を、等張化し、安定化させるポリオール、ソルビトール、スクロースまたは塩化ナトリウムなどの等張化剤との組み合わせで含む。このような等張化剤の例は、５％ソルビトールまたはスクロースである。加えて、製剤は、例えば、凝集の防止または安定性の改善のために、界面活性剤を０．０１％〜０．０２％ｗｔ／ｖｏｌで任意に含み得る。製剤のｐＨは、４．５〜６．５または４．５〜５．５の範囲であり得る。抗原結合タンパク質の医薬製剤に関する他の例示的な記載は、ＵＳ２００３／０１１３３１６及び米国特許第６，１７１，５８６号に認めることができ、その各々の全体が参照により本明細書に援用される。
【０２０５】
本明細書の製剤はまた、治療すべき特定の適応症に必要であれば、２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、免疫抑制剤を更に備えることが望ましい場合もある。このような分子は、適切には、意図した目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２０６】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、またはマクロエマルション中に閉じ込めてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２０７】
抗原結合タンパク質の懸濁液及び結晶形態も企図される。懸濁液及び結晶形態を作製するための方法は、当業者に知られている。
【０２０８】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌である必要がある。本発明の組成物は、従来のよく知られた滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、濾過滅菌膜を通す濾過によって容易に行うことができる。得られた溶液は、使用のためにパッケージするか、または無菌条件下で濾過し、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥した製剤は、投与前に滅菌溶液と混合される。
【０２０９】
凍結乾燥プロセスは、多くの場合、長期間にわたる保存のために、特にポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定である場合に、ポリペプチドを安定化するために採用される。凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、一次乾燥及び二次乾燥の３つの工程から構成される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｎｕｍｂｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  ４８−５９，１９８４参照）。凍結工程において、溶液は、十分に凍結するまで冷却される。この段階で、溶液中の大部分の水が氷を形成する。この氷を一次乾燥段階で昇華させる。これは、真空を使用して、チャンバー圧を氷の蒸気圧未満に減圧することによって行う。最後に、二次乾燥段階において、チャンバー圧の減圧及び棚温度の昇温下で、吸着または結合した水を除去する。このプロセスにより凍結乾燥ケークとして知られる物質が得られる。その後、このケークを使用前に再構成することができる。
【０２１０】
凍結乾燥物質の標準的な再構成法は、ある体積の純水（典型的に凍結乾燥中に除去された体積と等量）を再度加えることであるが、非経口投与用薬剤の調製には抗菌剤の希釈液が使用されることもある（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８：１３１１−１３５４，１９９２参照）。
【０２１１】
賦形剤は、場合によって、凍結乾燥製品の安定剤として作用することが指摘されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ７４：２２５−２３９，１９９１参照）。例えば、既知の賦形剤には、ポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）、糖（グルコース及びスクロースを含む）及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。
【０２１２】
加えて、ポリオール及び糖も、ポリペプチドを凍結及び乾燥に起因する損傷から保護するために、また保存期間中の乾燥状態の安定性を高めるために使用されることが多い。一般に、糖、特に二糖は、凍結乾燥プロセス及び保存期間の両方に有効である。単糖及び二糖ならびにＰＶＰなどのポリマーを含む、他の種類の分子もまた、凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。
【０２１３】
注射用の場合、医薬製剤及び／または薬剤は、上記のような適切な溶液で再構成するのに好適な粉末であってよい。これらの例には、凍結乾燥、回転乾燥もしくは噴霧乾燥させた粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射用の場合、製剤は、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤及びこれらの組み合わせを任意に含み得る。
【０２１４】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例には、二重特異性抗原結合タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びリュープロリド酢酸塩からなる注入可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日を超えて分子を放出することができるのに対し、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。封入されたポリペプチドが体内に長期間残存する場合、３７℃の水分に曝される結果として変性または凝集することがあり、これにより、生物活性を失い、免疫原性が変化する可能性がある。関係する機序に応じて、安定化のための合理的な手法を考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが明らかであれば、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を調整し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を作ることによって安定化することができる。
【０２１５】
本発明の製剤は、短時間作用型、速放型、長時間作用型または本明細書に記載する徐放型に設計することができる。したがって、医薬製剤は、放出制御型または遅効型に製剤化することもできる。
【０２１６】
具体的用量は、疾患の状態、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事、投薬間隔、投与経路、排泄速度ならびに薬物の組み合わせに応じて調節することができる。有効量を含有する上記の剤形はいずれも、慣用的実験の範囲内であり、したがって、十分に本発明の範囲内である。
【０２１７】
二重特異性抗原結合タンパク質は、任意の好適な手段によって投与され、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内、また、局所治療が望ましい場合には、病巣内投与が含まれる。非経口注入は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与を含む。加えて、二重特異性抗原結合タンパク質は、特に抗原結合タンパク質の用量を減らしていくパルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短期間であるか、または長期間であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは、静脈内または皮下注射によりなされる。他の投与方法、例えば、局部、特に、経皮、経粘膜、経直腸、経口、または局所投与、例えば、所望の部位に近接して配置されたカテーテルを介するものが企図される。最も好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、生理溶液中、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、毎日から毎週、毎月までの範囲の頻度（例えば、毎日、隔日、２日置きに、または週２、３、４、５もしくは６回）にて、好ましくは、０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、週１回、２週に１回または月１回の頻度にて静脈投与される。
【０２１８】
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療または改善を必要とする患者においてそれを行うために有用である。本明細書で使用するとき、「治療すること」または「治療」という用語は、疾患の発症防止または疾患の病状変更を意図して実施される介入処置である。したがって、治療とは、治療的処置及び予防的または防止的措置の両方を指す。治療を必要とする人には、疾患もしくは状態の診断をすでに受けているか、または罹患している人、更には疾患もしくは状態を予防すべき人が挙げられる。「治療」には、任意の客観的または主観的パラメーターを含む、損傷、病状または状態の改善の奏功を示す任意の兆候が含まれ、例えば、症状を緩和、寛解、軽減すること、または損傷、病状もしくは状態を患者にとって耐え得るものにすること、変性もしくは消耗の速度を遅くすること、変性の最終点の衰弱性を低減すること、または患者の身体的もしくは精神的健康の改善が挙げられる。症状の治療または改善は、身体検査、患者の自己申告、神経精神学的検査及び／または精神学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメーターに基づくことができる。
【０２１９】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する状態の治療または予防を必要とする患者におけるその方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を当該患者に投与することを含む。「患者」という用語は、ヒト患者を含む。「有効量」は、一般に、症状の重症度及び／もしくは頻度を低減し、症状及び／もしくは根本的な原因を取り除き、症状及び／もしくは根本的な原因の発生を予防し、ならびに／または特定の状態（例えば、慢性疼痛、頭痛または片頭痛）から生じるか、もしくはそれらに関連する損傷を改善もしくは修復するのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、治療上有効な量または予防上有効な量である。「治療上有効な量」は、疾患状態（例えば、頭痛、片頭痛または慢性疼痛）もしくは症状（複数可）、特に、疾患状態に関連する状態もしくは症状（複数可）を改善するか、または別の方法で疾患状態もしくは疾患に関連する任意の他の望ましくない症状の進行をいかなる方法であれ予防し、阻害し、遅延させ、もしくは逆転させるのに十分な量である（すなわち、「治療有効性」をもたらす）。「予防上有効な量」は、対象に投与したとき、意図した予防的効果、例えば、状態（例えば、頭痛または片頭痛）の発症（または再発）の防止もしくは遅延、または状態（例えば、頭痛、片頭痛または頭痛症状）の発症（または再発）の可能性の低減を有する医薬組成物の量である。完全な治療的または予防的効果は、必ずしも１回の投薬で生じるものではなく、一連の投薬後にのみ生じ得る。したがって、治療上または予防上有効な量は、１回以上の投与で投与され得る。
【０２２０】
ある特定の実施形態において、本発明は、頭痛、特に、片頭痛の治療または改善を必要とする患者におけるその方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を当該患者に投与することを含む。片頭痛は、約４〜約７２時間持続する再発性頭痛であり、片側性、拍動性及び／もしくは中等度〜重度の疼痛ならびに／または身体活動により増悪する疼痛を特徴とする。片頭痛は、多くの場合、悪心、嘔吐及び／または光（光過敏）、音（音過敏）もしくは匂いに対する過敏を伴う。一部の患者において、片頭痛の発現には前兆が先行する。前兆は、典型的に、頭痛が近く生じることの表れとなる視覚障害、感覚障害、言語障害または運動障害である。本明細書に記載の方法は、ヒト患者における前兆のある片頭痛及び前兆のない片頭痛の１つ以上の症状を予防し、治療し、または改善する。
【０２２１】
ＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体のそれぞれ対応するリガンドによる活性化は、血管拡張、特に硬膜血管系の血管拡張を誘発する。両受容体のシグナル伝達カスケードは、片頭痛の病態生理学との関係が示唆されており、異なるが関連する機序を介した片頭痛の誘発の一因であると考えられる。三叉神経血管系の活性化の結果として放出されるＣＧＲＰは、頭蓋血管の血管拡張を誘発するだけでなく、感覚神経の活性化に続く炎症の形態である神経原性炎症を惹起する一因でもある。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｂｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．５３（８）：１２３０−４４，２０１３を参照されたい。ＣＧＲＰはまた、疼痛シグナルを脳幹から視床へ伝達する神経伝達物質としても作用する。ＣＧＲＰは感覚系を介して作用するが、ＰＡＣ１受容体及びそのＰＡＣＡＰリガンドは自律神経系の副交感神経系を介して働く。カニクイザルでの免疫組織化学研究では、硬膜血管系も刺激する蝶形骨口蓋神経節（ＳＰＧ；翼口蓋神経節としても知られる）を通る副交感神経経路にＰＡＣＡＰ及びＰＡＣ１局在が認められた（データ不図示）。副交感神経経路は、独立しており、硬膜血管系の状態を同じく制御する感覚経路と並行している。ＰＡＣ１受容体アゴニストＰＡＣＡＰを注入すると、片頭痛患者にて片頭痛様頭痛が生じることから、ＰＡＣ１を遮断することが片頭痛の治療に有効である可能性が示唆されている（Ｓｃｈｙｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３２：１６−２５，２００９）。本発明を立証するために実施した更なる実験では、選択的ＰＡＣ１抗体が、電気的に刺激した三叉神経頸髄複合体（ＴＣＣ）（片頭痛の臨床的有効性との相関が報告されている電気生理学モデル）の活性化を遮断することが示された（データ不図示）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、片頭痛頭痛の治療（例えば、片頭痛の頻度、持続時間または重症度の低減）において、抗ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストまたは抗ＰＡＣ１受容体アンタゴニストのいずれかを単独で用いて得られる治療効果と比較して、相加効果または相乗効果を有する。理論に束縛されるものではないが、ＣＧＲＰ受容体とＰＡＣ１受容体の両方を本発明の二重特異性抗原結合タンパク質で阻害すると、片頭痛の治療において、どちらかの標的のみの拮抗よりも大きな有効性が得られると考えられる。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法に従って治療される患者は、反復性片頭痛を有するか、反復性片頭痛に罹患しているか、または反復性片頭痛と診断されている。反復性片頭痛は、片頭痛の経歴（例えば、生涯に少なくとも５回の片頭痛発作）を持つ患者が月１４日以下の片頭痛の頭痛日を有するとき、診断される。「片頭痛の頭痛日」は、患者が３０分を超えて持続する前兆のあるまたは前兆のない「片頭痛」の発現、継続または再発を経験する間のあらゆる暦日を含む。「片頭痛」は、悪心もしくは嘔吐もしくは光もしくは音に対する過敏を伴う頭痛、及び／または次の疼痛の特徴：片側性疼痛、拍動性疼痛、中等度〜重度の疼痛強度もしくは身体活動により増悪する疼痛のうちの少なくとも２つを特徴とする頭痛である。ある特定の実施形態において、反復性片頭痛を有するか、反復性片頭痛に罹患しているか、または反復性片頭痛と診断された患者は、月平均で少なくとも４日かつ１５日未満の片頭痛の頭痛日を有する。関連する実施形態において、反復性片頭痛を有するか、反復性片頭痛に罹患しているか、または反復性片頭痛と診断された患者は、平均で月１５日未満の頭痛日を有する。本明細書で使用するとき、「頭痛日」とは、患者が、本明細書に定義の片頭痛または３０分を超えて継続するか、もしくは急性頭痛治療を要する任意の頭痛を経験するあらゆる暦日である。
【０２２３】
ある特定の実施形態において、本発明の方法に従って治療される患者は、慢性片頭痛を有するか、慢性片頭痛に罹患しているか、または慢性片頭痛と診断されている。慢性片頭痛は、片頭痛患者（すなわち、生涯に少なくとも５回の片頭痛発作を有する患者）が月１５日以上の頭痛日を有し、かつその頭痛日のうち少なくとも８日が片頭痛の頭痛日であるとき、診断される。いくつかの実施形態において、慢性片頭痛を有するか、慢性片頭痛に罹患しているか、または慢性片頭痛と診断された患者は、平均で月１５日以上の片頭痛の頭痛日を有する。本明細書に記載の方法のある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の投与は、患者の反復性片頭痛の慢性片頭痛への進行を防止し、軽減し、遅延させる。
【０２２４】
他の実施形態において、本発明は、群発頭痛の治療または改善を必要とする患者におけるその方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を当該患者に投与することを含む。群発頭痛は、最も顕著な特徴として、いずれかの側頭部、典型的には眼周辺における重度の再発性頭痛を伴う状態である（Ｎｅｓｂｉｔｔ
ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ，Ｖｏｌ．３４４：ｅ２４０７，２０１２参照）。一部の医師及び科学者は、群発頭痛から生ずる疼痛を、出産、火傷または骨折よりもひどい、ヒトが耐え得る最も激しい疼痛であると説明している。群発頭痛は周期的に生じることが多く、疼痛の活性期の間には自然寛解が挟まれる。群発頭痛は、多くの場合、疼痛のある頭部側に限定されることが多い、流涙、鼻閉、眼瞼下垂、縮瞳、顔面の紅潮、発汗及び眼周辺の発汗などの頭部自律神経症状を伴う。群発頭痛の平均発症年齢は、約３０〜５０歳である。罹患は男性に多く、男性の女性に対する比は約２．５：１〜約３．５：１である。蝶形骨口蓋神経節（ＳＰＧ）の刺激が群発頭痛の治療に使用されている。低レベル（ただし、高周波数で生理学的に遮断する）の電気的刺激をＳＰＧに与える神経刺激装置が群発頭痛の急性消耗性疼痛を緩和する際に有効であることが最近の臨床試験にて示されている（Ｓｃｈｏｅｎｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３３（１０）：８１６−３０，２０１３参照）。当該証拠に照らして、またＰＡＣＡＰがＳＰＧにおける主要な神経伝達物質の１つであることから、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質でのＰＡＣ１受容体シグナル伝達の阻害は、ヒトにおける群発頭痛の治療に有効性を有することが期待される。
【０２２５】
本発明の方法に従って治療され得るＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体シグナル伝達に関連する他の状態には、関節痛（例えば、変形性関節症及び関節リウマチ）などの慢性疼痛症候群、神経原性炎症、緊張型頭痛、片麻痺性片頭痛、網膜片頭痛及び更年期障害に関係するものなどの血管運動神経障害（例えば、ホットフラッシュ、顔面の紅潮、発汗及び寝汗）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、状態は、慢性疼痛である。ＣＧＲＰは、片頭痛以外の慢性疼痛症候群に関与し得る。齧歯類において、髄腔内送達したＣＧＲＰは重度の疼痛を誘発し、多数の疼痛モデルにてＣＧＲＰレベルが亢進する。加えて、ＣＧＲＰアンタゴニストは、齧歯類における急性膵炎の痛覚を部分的に遮断する（Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３９：１９７−２０１，２００６参照）。本明細書に記載の方法のいずれにおいて、治療は予防的治療を含み得る。予防的治療は、患者の症状（例えば、片頭痛または群発頭痛）の頻度、重症度及び／または長さを低減するために、状態または発作の発現の前（例えば、片頭痛発作または群発頭痛エピソードの発現の前）に採用されるように設計された治療を指す。
【０２２６】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、生体試料中のＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体の検出、ならびにＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体を発現する細胞または組織の特定に有用である。例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、診断アッセイ、例えば、組織または細胞に発現したＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体を検出及び／または定量化する結合アッセイに使用することができる。加えて、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ受容体がそのリガンドＣＧＲＰと複合体を形成するのを阻害するために使用することができ、これにより、細胞または組織中におけるＣＧＲＰ受容体の生物活性が調節される。加えて、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＰＡＣ１受容体がそのリガンドＰＡＣＡＰと複合体を形成するのを阻害するために使用することができ、これにより、細胞または組織中におけるＰＡＣ１受容体の生物活性が調節される。調節することができる活性の例には、血管拡張の阻害及び／または神経原性炎症の低減が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に関連する疾患及び／または状態を検出、診断または観察するための診断目的に使用することができる。また、当業者に知られている従来の免疫組織学法を用いて、試料中のＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体の存在を検出するための方法も提供する（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ  １５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ
ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６）。いずれかの受容体（ＣＧＲＰ受容体またはＰＡＣ１受容体）の検出は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【０２２８】
本明細書にて提供される診断用途は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体の発現、ならびにそのリガンドのいずれかの受容体への結合を検出するための抗原結合タンパク質の使用を含む。受容体の存在の検出に有用な方法の例には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。
【０２２９】
診断用途の場合、抗原結合タンパク質は、典型的に、検出可能な標識基で標識される。好適な標識基には、放射性同位体もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合される。タンパク質を標識するための各種方法は、当該技術分野において知られており、用いることができる。
【０２３０】
別の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体を発現する１つの細胞または複数の細胞を特定するために使用することができる。具体的な実施形態において、抗原結合タンパク質は、標識基で標識され、標識された抗原結合タンパク質のＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体への結合を検出する。更なる具体的な実施形態において、抗原結合タンパク質のＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体への結合は、インビボで検出される。更なる具体的な実施形態において、二重特異性抗原結合タンパク質は、当該技術分野において知られている技術を使用して、単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい。
【０２３１】
別の態様は、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体への結合に関して、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と競合する試験分子の存在を検出することを提供する。このような１つのアッセイの例には、試験分子の存在下または非存在下で、ある量のＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体を含有する溶液中の遊離抗原結合タンパク質の量を検出することを伴う。遊離抗原結合タンパク質（すなわち、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体に結合していない抗原結合タンパク質）の量の増加は、試験分子が、ＣＧＲＰ受容体及び／またはＰＡＣ１受容体の結合に関して、二重特異性抗原結合タンパク質と競合できることを示す。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、標識基で標識される。あるいは、試験分子が標識され、抗原結合タンパク質の存在下及び非存在下で、遊離試験分子の量を観察する。
【０２３２】
以下は、本発明の更なる実施形態であり、これらは例示目的であり、いかなる形でも限定を意図するものではない。
【０２３３】
実施形態１：ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３４】
実施形態２：前記抗原結合タンパク質が抗体または抗体断片である、実施形態１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３５】
実施形態３：前記抗原結合タンパク質が、本明細書に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、及びｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される抗体中に認められる４つの可変ドメインを全て含む、抗体または抗体断片である、実施形態１〜２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３６】
実施形態４：前記抗原結合タンパク質が、本明細書に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、及びｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される抗体（ａ）、または（ａ）に由来し、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン重鎖を含み、前記軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端、もしくはその両方から１、２、３、４または５つのアミノ酸残基が欠けている（ｂ）抗体である、実施形態１〜３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３７】
実施形態５：前記抗原結合タンパク質が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、マキシボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キレート組み換え抗体、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質及びラクダ化抗体から選択される抗体断片である、実施形態１〜４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３８】
実施形態６：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンアイソタイプの定常領域を含む、実施形態１〜５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２３９】
実施形態７：本明細書に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、及びｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される抗体の１２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て含む、実施形態１〜６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２４０】
実施形態８：（ａ）本明細書に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、及びｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される抗体の、ＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する６つの全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）と、
（ｂ）本明細書に記載される、ｉＰＳ：３２６４１７、ｉＰＳ：３２６６２６、ｉＰＳ：３２６６２８、ｉＰＳ：３２６６３１、ｉＰＳ：３２６６３４、ｉＰＳ：３２７８７０、ｉＰＳ：３２７８７１、ｉＰＳ：３２６６４５、ｉＰＳ：３２６６４８、ｉＰＳ：３２６６５１、ｉＰＳ：３２６６５４、ｉＰＳ：３２８０００、ｉＰＳ：３２８００１、ｉＰＳ：３２６６６１、ｉＰＳ：３２６６６３、ｉＰＳ：３２６６６６、ｉＰＳ：３２６６６９、ｉＰＳ：３２７０１７、ｉＰＳ：３２７０１８、ｉＰＳ：３２７０１９、ｉＰＳ：３２７０２３、ｉＰＳ：３２７０２４、ｉＰＳ：３２７０２５、ｉＰＳ：３２７０２６、ｉＰＳ：３２７０９１、ｉＰＳ：３２７０９２、ｉＰＳ：３２７０９３、ｉＰＳ：３２７０９４、ｉＰＳ：３２６４１４、ｉＰＳ：３２７１０２、ｉＰＳ：３２７１０３、ｉＰＳ：３２７１０４、ｉＰＳ：３２７１０５、ｉＰＳ：３２７１０６、ｉＰＳ：３２７１０７、ｉＰＳ：３２７１０８、ｉＰＳ：３２７１０９、ｉＰＳ：３２７１１０、ｉＰＳ：３２７１１１、ｉＰＳ：３２７１１２、ｉＰＳ：３２７２６７、ｉＰＳ：３２７２６８、ｉＰＳ：３２７２６９、ｉＰＳ：３２７２７０、ｉＰＳ：３２７２７２、ｉＰＳ：３２７２７３、ｉＰＳ：３２７２７４、ｉＰＳ：３２７２７５、ｉＰＳ：３２７２７６、ｉＰＳ：３２７２７７、ｉＰＳ：３２７２７８、ｉＰＳ：３２７２７９、ｉＰＳ：３２７２８０、ｉＰＳ：３２７２８１、ｉＰＳ：３２７２８２、ｉＰＳ：３２７２８３、ｉＰＳ：３２７２８４、ｉＰＳ：３２７２８５、ｉＰＳ：３２７２８６、ｉＰＳ：３２７２８７、ｉＰＳ：３２７２８８、ｉＰＳ：３２７２８９、ｉＰＳ：３２７２９０、ｉＰＳ：３２７２９１、ｉＰＳ：３２７６７７、ｉＰＳ：３２７６７８、ｉＰＳ：３２７６７９、ｉＰＳ：３２７６８０、ｉＰＳ：３２７６８１、ｉＰＳ：３２７６８２、ｉＰＳ：３２７６８３、ｉＰＳ：３２７６８４、ｉＰＳ：３２７６８５、ｉＰＳ：３２７６８６、ｉＰＳ：３２７６８７、ｉＰＳ：３２７６８８、ｉＰＳ：３２７６８９、ｉＰＳ：３２７６９０、ｉＰＳ：３２７６９１、ｉＰＳ：３２７６９３、ｉＰＳ：３２７６９４、ｉＰＳ：３２７６９６、ｉＰＳ：３２７６９７、ｉＰＳ：３２７６９８、ｉＰＳ：３２７６９９、ｉＰＳ：３２７７００、ｉＰＳ：３２７７０１、ｉＰＳ：３２７７０２、ｉＰＳ：３２７７０３、ｉＰＳ：３２７７０４、ｉＰＳ：３２７７０５、ｉＰＳ：３２７７０６、ｉＰＳ：３２７７０７、ｉＰＳ：３２７７０８、ｉＰＳ：３２７７０９、ｉＰＳ：３２７７１０、ｉＰＳ：３２７７１１、ｉＰＳ：３２７７１２、ｉＰＳ：３２７７１３、ｉＰＳ：３２７７１４、ｉＰＳ：３２７７１７、ｉＰＳ：３２７７１８、ｉＰＳ：３２７７１９、ｉＰＳ：３２７７２１、ｉＰＳ：３２７７２２、ｉＰＳ：３２７７２４、ｉＰＳ：３２７７２５、ｉＰＳ：３２７７２６、ｉＰＳ：３２７７２７、ｉＰＳ：３２７７２８、ｉＰＳ：３２７７２９、ｉＰＳ：３２７７３０、ｉＰＳ：３２７７３１、ｉＰＳ：３２７７３２、ｉＰＳ：３２７７３３、ｉＰＳ：３２７７３４、ｉＰＳ：３２７７３５、ｉＰＳ：３２７７３６、ｉＰＳ：３２７７３７、ｉＰＳ：３２７７３８、ｉＰＳ：３２７７３９、ｉＰＳ：３２７７４０、ｉＰＳ：３２７７４１、ｉＰＳ：３２７７４２、ｉＰＳ：３２７８７２、ｉＰＳ：３２７８７４、ｉＰＳ：３２７８７５、ｉＰＳ：３２７８７６、ｉＰＳ：３２７８７７、ｉＰＳ：３２７８７８、ｉＰＳ：３２７８７９、ｉＰＳ：３２７８８０、ｉＰＳ：３２７８８１、ｉＰＳ：３２７８８２、ｉＰＳ：３２７８８３、ｉＰＳ：３２７８８４、ｉＰＳ：３２７８８５、ｉＰＳ：３２７８８６、ｉＰＳ：３２７８８７、ｉＰＳ：３２７８８８、ｉＰＳ：３２７８８９、ｉＰＳ：３２７８９０、ｉＰＳ：３２７８９１、ｉＰＳ：３２７８９２、ｉＰＳ：３２７８９３、ｉＰＳ：３２７８９４、ｉＰＳ：３２７８９５、ｉＰＳ：３２７８９６、ｉＰＳ：３２７８９７、ｉＰＳ：３２８０３１、ｉＰＳ：３２８０３３、ｉＰＳ：３２８０３４、ｉＰＳ：３２８０３５、ｉＰＳ：３２８０３６、ｉＰＳ：３２８０３７、ｉＰＳ：３２８０３８、ｉＰＳ：３２８０３９、ｉＰＳ：３２８０４０、ｉＰＳ：３２８０４１、ｉＰＳ：３２８０４２、ｉＰＳ：３２８０４３、ｉＰＳ：３２８０４４、ｉＰＳ：３２８０４５、ｉＰＳ：３２８０４６、ｉＰＳ：３２８０４７、ｉＰＳ：３２８０４８、ｉＰＳ：３２８０４９、ｉＰＳ：３２８０５０、及びｉＰＳ：３２８０５１と称する抗体から選択される種々の抗体に由来するＰＡＣ１と特異的に結合する６つの全てのＣＤＲとを含む、実施形態１〜６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２４１】
実施形態９：前記抗原結合タンパク質の前記ＣＤＲのうちの１つ以上が保存的アミノ酸置換を含有する、実施形態７〜８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２４２】
実施形態１０：エフェクター機能を低減または排除する改変を含む、実施形態１〜９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【０２４３】
実施形態１１：実施形態１〜１０に記載のいずれかの抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
【０２４４】
実施形態１２：実施形態１〜１０に記載のいずれかの二重特異性抗原結合タンパク質を発現する、組み換え宿主細胞。
【０２４５】
実施形態１３：前記細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態１２に記載の組み換え宿主細胞。
【０２４６】
実施形態１４：実施形態１〜１０のいずれかに記載の二重特異性抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、患者におけるＣＧＲＰ受容体もしくはＰＡＣ１またはその両方に関連する状態を治療するための方法。
【０２４７】
実施形態１５：前記状態が頭痛である、実施形態１４に記載の方法。
【０２４８】
実施形態１６：前記状態が群発頭痛である、実施形態１５に記載の方法。
【０２４９】
実施形態１７：前記状態が片頭痛である、実施形態１５に記載の方法。
【０２５０】
実施形態１８：前記片頭痛が反復性片頭痛である、実施形態１７に記載の方法。
【０２５１】
実施形態１９：前記片頭痛が慢性片頭痛である、実施形態１７に記載の方法。
【０２５２】
実施形態２０：前記状態が慢性疼痛である、実施形態１４に記載の方法。
【０２５３】
実施形態２１：予防的治療を含む、実施形態１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【０２５４】
以下の実施例は、実施した実験及び得られた結果を含め、例示のみを目的に提供するものであり、添付する特許請求の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０２５５】
実施例１．安定性、生物物理学的性質及び発現を改善し、化学的ホットスポットを取り除くためのＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体抗体の操作
出発抗体
抗ＣＧＲＰ受容体抗体の生成及びスクリーニング。その全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１０／０７５２３８（ヒトＣＧＲＰ受容体結合タンパク質）の実施例１〜３に記載されているとおりに、モノクローナル抗ヒトＣＧＲＰ受容体抗体を生成し、配列決定した。簡潔に述べれば、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションのために、ヒトＣＲＬＲ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１７４７３）及びＲＡＭＰ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１０１４）を哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｚｅｏ及びｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にそれぞれクローニングした。ＡＭ−１  ＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために、ｈＣＲＬＲ  ｃＤＮＡ及びｈＲＡＭＰ１  ｃＤＮＡをｐＤＳＲα２４ベクター（Ｋｉｍ、Ｈ．Ｙ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．（２００７）１２：４８−４９）にもクローニングした（米国特許第６，２１０，９２４号）。ＣＧＲＰＲを発現する安定したトランスフェクタントを特定した。
【０２５６】
精製した可溶性ＣＧＲＰ受容体タンパク質及びＣＧＲＰ受容体を安定して発現するＡＭ−１  ＣＨＯ細胞から調製した精製ＣＧＲＰ受容体膜を、それぞれ１０μｇ／マウス及び１５０μｇ／マウスの用量で用いて、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）動物を免疫した。その後の追加免疫は、１０μｇ／マウスの可溶性ＣＧＲＰ受容体または７５μｇの精製ＣＧＲＰ受容体膜の用量で投与した。また、ＣＧＲＰ受容体発現細胞を３．４×１０６個のＣＧＲＰ受容体トランスフェクト細胞／マウスの用量で用いて、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）動物を免疫し、その後の追加免疫を１．７×１０６個のＣＧＲＰ受容体トランスフェクト細胞／マウスとした。使用した注入部位は、皮下、尾根部及び腹腔内の組み合わせであった。免役付与は、米国特許第７，０６４，２４４号に開示されている方法に従って実施した（その開示は参照により本明細書に援用される）。アジュバントＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｔ２６８４）、Ａｌｕｍ（Ｅ．Ｍ．Ｓｅｒｇｅｎｔ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，カタログ番号１４５２−２５０）は、製造者の説明書に従って調製し、アジュバント乳剤：抗原溶液を１：１の比で混合した。第１の注入から４〜６週後に血清を採取し、組み換えＣＧＲＰ受容体発現２９３ＥＢＮＡ細胞のＦＡＣｓ染色により特異的抗体力価を測定した。マウスは、完全長ＣＧＲＰ受容体を発現する細胞からの細胞もしくは膜または可溶性ＣＧＲＰ受容体細胞外ドメインのいずれかを１１〜１７回の範囲の免役付与で用いて、約１〜３ヶ月半かけて免疫した。血清力価の最も高いマウスを特定し、ハイブリドーマ形成のために準備した。免疫化は、多数、典型的には１０匹のマウス群にて実施した。ハイブリドーマを形成するために、膝窩及び鼠経リンパ節ならびに脾臓組織を各群から典型的にプールした。ＣＧＲＰ受容体特異的モノクローナル抗体について、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によりハイブリドーマ上清をスクリーニングした。上清は、ＡＭ−１  ＣＨＯ  ｈｕＣＧＲＰ受容体細胞またはヒトＣＧＲＰ受容体でトランスフェクトした組み換えＨＥＫ２９３細胞のいずれかに対してスクリーニングし、親ＨＥＫ２９３細胞に対してカウンタースクリーニングした。標準的なＲＴ−ＰＣＲ法をＷＯ２０１０／０７５２３８（ヒトＣＧＲＰ受容体結合タンパク質）の実施例２〜３に記載のとおりに使用して、抗ＣＧＲＰ受容体抗体をスクリーニングした。
【０２５７】
抗ＰＡＣ１受容体抗体の生成及びスクリーニング。その全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１４／１４４６３２（ヒトＰＡＣ１抗体）に記載されているとおりに、モノクローナル抗ヒトＰＡＣ１受容体抗体を生成し、配列決定した。簡潔に述べれば、標準的方法、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１７２８９５号に詳述されている方法などを使用して、ＰＡＣ１細胞外ドメインタンパク質（Ｔ細胞エピトープタグでタグ付けされたＤＮＡ）、完全長ヒトＰＡＣ１を発現するＬ１．２細胞または他のヒトＰＡＣ１抗原でＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）動物を免疫することにより、抗体を作製した。ハイブリドーマ上清は、ＰＡＣ１受容体に対する結合に関して、また機能的アンタゴニスト活性に関して、ＰＡＣＡＰ（例えば、ＰＡＣＡＰ−２７またはＰＡＣＡＰ−３８）または選択的外因性ペプチドリガンド（マキサジラン）のいずれかによるＰＡＣ１の活性化によるｃＡＭＰの生成を遮断する能力を検出するアッセイにてスクリーニングし、次いで、関係する受容体ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２に対してカウンタースクリーニングした。所望の機能及び選択性を有する上清を、標準的な方法を使用して、配列決定し、クローニングし、組み換え的に発現させ、精製し、機能及び選択性に関して再度試験した。選択したヒトＰＡＣ１受容体抗体をインビトロＰＡＣ１媒介ｃＡＭＰアッセイにてスクリーニングして、内因力価を決定した。アッセイには、ヒトＰＡＣ１（ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ、ＰＡＣ１を内因的に発現するヒト神経芽細胞腫細胞株）、カニクイザルＰＡＣ１、ラットＰＡＣ１、ヒトＶＰＡＣ１及びヒトＶＰＡＣ２を発現する細胞株を使用した。スクリーニングには、ＬＡＮＣＥ  ｃＡＭＰアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いた。アッセイは、９６ウェル白プレート中で総量６０μＬにて実施した。簡潔に述べれば、アッセイ当日に凍結細胞を３７℃で解凍し、この細胞をアッセイ緩衝液で１回洗浄し、Ａｌｅｘａ標識した抗ｃＡＭＰ抗体と混合した１０，０００個の細胞を含有する１２μＬの細胞懸濁液を９６ハーフエリア白プレートに加えた。１２μＬのＰＡＣ１抗体の添加後、混合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで、１２μＬのＰＡＣ１アゴニストＰＡＣＡＰ−３８（最終濃度１ｎＭ）を加え、室温で１５分間更にインキュベートした。アゴニスト刺激の後、２４μＬの検出混合物を加え、室温で６０分間インキュベートし、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で６６５ｎＭの放射波長で読み取った。データをＰｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）またはＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）によって処理し、解析した。
【０２５８】
生物物理学的性質を改善するための操作
上述のとおりに生成し、スクリーニングしたモノクローナル抗体のうち、抗ＣＧＲＰ受容体抗体及び抗ヒトＰＡＣ１受容体抗体のサブセットを二重特異性抗体の生成及び生物物理学的性質を改善するための操作のために特定した。
【０２５９】
ＰＡＣ１抗体の操作中に、最適化のための２つの抗体を選択した。これらの抗体は、配列多様性、安定性及び発現を改善するための新規ＣＤＲグラフト試行から得られた。しかしながら、他のＰＡＣ１受容体抗体及び全てのＣＧＲＰ受容体抗体は、最適化操作プロセスを経なかった。ただし、これらの抗体は、化学的ホットスポット及び共分散違反の可能性について分析した。共分散違反を修正すると、抗体の熱安定性、発現及び生物物理学的性質が改善されることが多数のプロジェクトで示されている。例えば、ＷＯ２０１２／１２５４９５を参照されたい。選択した抗ＣＧＲＰ受容体及び抗ＰＡＣ１受容体抗体の共分散分析をＷＯ２０１２／１２５４９５に記載の方法に従って実施した。
【０２６０】
実施例２．ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体ヘテロ免疫グロブリンの生成
２つの異なる抗体の共発現による二重特異性抗体の生成は、夾雑物を生じる。発現された組み合わせの総数のうち、正しく対合した軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む好ましい二重特異性ヘテロ四量体分子は、少数のみである。夾雑物は、主に２つの異なる理由に起因して生じる。第１の理由は、抗体のＦｃ領域で合わさる重鎖がホモ二量体化し得ることで、従来の単一特異性抗体になるか、またはヘテロ二量体化し得ることで、二重特異性抗体になることである。第２の理由は、軽鎖が無差別的であり、重鎖のいずれとも対合することができるため、活性及び所望の標的への結合を保持し得ない誤った対合の軽鎖−重鎖Ｆａｂ組み立てになることである。したがって、二重特異性操作は、２段階プロセスとなる。第１の目標は、重鎖のホモ二量体化を防ぎ、ヘテロ二量体化を促すことである。これは、例えば、ノブ・イントゥ・ホールまたは電荷対変異手法を使用して、抗体のＦｃ領域の操作により達成することができる。第２の目標は、軽鎖がその同種の重鎖とのみ特異的に会合するように、軽鎖−重鎖界面を操作することである。
【０２６１】
「ヘテロ−Ｉｇ」プラットフォーム技術（例えば、ＷＯ２００９０８９００４及びＷＯ２０１４０８１９５５参照；両文献の全体が参照により本明細書に援用される）は、上述した２つの問題を克服するために、静電的ステアリング機構を利用するものである。具体的には、重鎖ヘテロ二量体化及び軽鎖−重鎖会合に至るように荷電残基を導入または利用する。Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中の電荷対変異（ＣＰＭ）は、静電引力を生じる反対の電荷により、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を導き（例えば、ＷＯ２００９０８９００４及び米国特許第８，５９２，５６２号参照）、２つの同じ重鎖の組み合わせは同じ電荷を有するため反発する。正しい重鎖−軽鎖対合は、ＣＨ１／ＣＬ結合界面（図１「ｖ１」＆「ｖ４」参照）またはＶＨ／ＶＬとＣＨ１／ＣＬ結合界面（図１「ｖ３」参照）の間のＣＰＭによって助長される。正しい重鎖−軽鎖の組み合わせは、反対の電荷を有するため、互いに引き付け合うが、誤った重鎖−軽鎖の組み合わせは、同じ電荷を有するため、反発する。その結果、正しく組み立てられたヘテロＩｇは、２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を含む好ましいヘテロ四量体の組み立てを導く、３つ（「ｖ１」）または４つのＣＰＭ（「ｖ３」及び「ｖ４」）を有し、これにより、ヘテロ四量体が発現系によって生成される大部分の要素となる。
【０２６２】
ＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体標的は細胞表面上に発現しているので、いずれかの標的の拮抗によりインビボで血小板が減少するリスクがある。そのため、二重特異性ヘテロＩｇ分子の生成に、エフェクター機能のないＩｇＧ１足場（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３４３２５２号参照；その全体が参照により本明細書に援用される）をフレームワークとして選択した。エフェクター機能のない足場には、ＣＨ２ドメインのグリコシル化をノックアウトするためのＮ２９７Ｇ変異、及びグリコシル化の不在下における安定性を改善するためにＣＨ２ドメインに導入された操作ジスルフィド結合を含むＩｇＧ１バリアントが挙げられる。Ｎ２９７Ｇ変異に起因するＣＨ２ドメインのグリコシル化の欠如は、Ｆｃγ受容体に対する結合の著しい減少をもたらし、血小板減少の問題に対処する一助になる。例えば、ＷＯ２０１４／１４４６３２の実施例５を参照されたい。
【０２６３】
６つの抗ＰＡＣ１受容体抗体（本明細書に記載の抗体０１〜０６）及び共分散違反を修正した９つの抗ＣＧＲＰ受容体操作抗体（本明細書に記載の抗体５０〜５８）を活用し、ハイスループットクローニング、発現及び精製を用いて、１６９個の別個の二重特異性ヘテロＩｇ分子を生成した。二重特異性ヘテロＩｇ分子のそれぞれは、ＩｇＧ１エフェクター機能のない足場またはＩｇＧ２足場を用いる図１に示す３つのフォーマットのうちの１つを有した。１６９個の二重特異性ヘテロ免疫グロブリンのそれぞれの配列は、表８に記載されている。
【０２６４】
実施例３．二重特異性ヘテロ免疫グロブリン分子の機能活性
以下に詳述するインビトロｃＡＭＰアッセイを使用して、実施例２に記載のとおりに生成した二重特異性ヘテロＩｇ分子を、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体のリガンド誘発活性化を阻害する能力について試験した。
【０２６５】
ＣＧＲＰ受容体活性アッセイ。アッセイには、ＡＴＣＣから入手したヒト神経芽細胞腫由来細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１０；「ＨＴＢ−１０細胞」）（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ；Ｓｐｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ８：４１０）を使用した。ＨＴＢ−１０細胞は、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ１を発現し、ヒトＣＧＲＰ受容体を形成する（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９３：３３３−３３９）。
【０２６６】
ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した。アッセイは、９６ウェル白プレート中で総量４０μＬにて実施した。簡潔に述べれば、アッセイ当日に凍結ＨＴＢ−１０細胞を３７℃で解凍し、アッセイ緩衝液で１回洗浄した。１０００個の細胞を含有する１０μＬの細胞懸濁液を９６ハーフエリア白プレートに加えた。５μＬの二重特異性ヘテロＩｇＧ（１点または１０点用量反応曲線：最終濃度範囲１μＭ〜０．５ｆＭ）を加えた後、混合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで、５μＬのＣＧＲＰ受容体アゴニストのヒトα−ＣＧＲＰ（３ｎＭ最終濃度）を加え、室温で１５分間更にインキュベートした。ヒトα−ＣＧＲＰ刺激の後、２０μＬの検出混合物を加え、室温で４５分間インキュベートし、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で６６５ｎｍの放射波長で読み取った。データをＰｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）によって処理し、解析した。
【０２６７】
ＰＡＣ１受容体活性アッセイ。アッセイには、ＡＴＣＣから入手したヒト神経芽細胞腫由来細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６６；「ＣＲＬ−２２６６細胞」）（ＳＨ−ＳＨ５Ｙ；Ｂｉｅｄｌｅｒ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３８：３７５１−３７５７，１９７８）を使用した。ＣＲＬ−２２６６細胞は、ヒトＰＡＣ１受容体を発現する（Ｍｏｎａｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０４（１）：７４−８８，２００８）。
【０２６８】
ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した。アッセイは、９６ウェル白プレート中で総量４０μＬにて実施した。簡潔に述べれば、アッセイ当日に凍結ＣＲＬ−２２６６細胞を３７℃で解凍し、アッセイ緩衝液で１回洗浄した。２０００個の細胞を含有する１０μＬの細胞懸濁液を９６ハーフエリア白プレートに加えた。５μＬの二重特異性ヘテロＩｇＧ（１点または１０点用量反応曲線：濃度範囲１μＭ〜０．５ｆＭを加えた後、混合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで、５μＬのＰＡＣ１受容体アゴニストヒトＰＡＣＡＰ３８（最終濃度１０ｐＭ）を加え、混合物を室温で１５分間更にインキュベートした。ヒトＰＡＣＡＰ３８刺激の後、２０μＬの検出混合物を加え、室温で４５分間インキュベートし、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で６６５ｎｍの放射波長で読み取った。データをＰｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）によって処理し、解析した。
【０２６９】
１６９個の二重特異性ヘテロＩｇＧのそれぞれに関するＣＧＲＰ受容体及びＰＡＣ１受容体活性の阻害パーセンテージを以下の表１５に示す。ＩＣ５０値は、１０点用量反応曲線に基づいて、二重特異性ヘテロＩｇＧのサブセットに関して算出した。これらのＩＣ５０値を以下の表１６に示す。
【表１５−００１】
2020074790.tif 000190
【表１５−００２】
2020074790.tif 000191
【表１５−００３】
2020074790.tif 000192
【表１６】
2020074790.tif 000193
【０２７０】
実施例４．ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質の合成及び活性
実施例１に記載の抗ＣＧＲＰ受容体及び抗ＰＡＣ１受容体抗体のサブセットを使用して、ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットを有する二重特異性抗原結合タンパク質を設計した。このフォーマットにおいて、第１の抗体に由来する重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ペプチドリンカーを介して、第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合され、改変重鎖を形成する（図２参照）。第２の抗体に由来する軽鎖は、改変重鎖とともに発現される。完全な分子の組み立ては、二量体化した免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端側に位置する第１の標的に対する２つの抗原結合ドメインと、二量体化したＦｃ領域のカルボキシル末端側に位置する第２の標的に対する２つの抗原結合ドメインとを有する四価の結合タンパク質をもたらす。
【０２７１】
ＣＧＲＰＲ／ＰＡＣ１  ＩｇＧ−ｓｃＦｖは、２つの抗原結合ドメインを含有し、一方はＣＧＲＰ受容体に対し、他方はＰＡＣ１受容体に対する。ＣＧＲＰＲ−ＰＡＣ１  ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子をコードするＤＮＡ分子は、Ｃ末端が抗ＰＡＣ１受容体（または抗ＣＧＲＰ受容体）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合したシステインクランプ含有または非含有の抗ＣＧＲＰＲ（または抗ＰＡＣ１受容体）抗体重鎖（ＨＣ）と、抗ＣＧＲＰ受容体（または抗ＰＡＣ１受容体）抗体軽鎖（ＬＣ）とをコードする断片を含有する。安定性を改善することができるシステインクランプを導入するために、ＶＨ領域中の位置４４（Ｋａｂａｔ番号付け）及びＶＬ領域中の位置１００（Ｋａｂａｔ番号付け）をシステインに変えた。ＤＮＡ分子をｇＢｌｏｃｋｓ合成により生成し、ｐＴＴ５．１ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターを使用してトランスフェクトし、ヒト２９３−６Ｅ細胞中でＣＧＲＰＲ／ＰＡＣ１二重特異性分子を発現させた。３０個の異なるＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性分子を生成した。各分子の完全配列は、表９に記載されている。
【０２７２】
実施例３に記載のインビトロｃＡＭＰアッセイを使用して、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子を、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体のリガンド誘発活性化を阻害する能力について試験した。各標的受容体に対する分子のそれぞれのＩＣ５０値を以下の表１７に示す。
【表１７】
2020074790.tif 000194
【０２７３】
試験した全ての二重特異性ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子は、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体の両方に対する阻害活性を呈した。興味深いことに、より強力なＰＡＣ１受容体の阻害物質であった分子（例えば、ｉＰＳ：３８６７３６、ｉＰＳ：３８６７３８、ｉＰＳ：３８６７４０、ｉＰＳ：３８６７４２、ｉＰＳ：３８６７４４、ｉＰＳ：３８６７４６、ｉＰＳ：３８６７４８、ｉＰＳ：３８６７５０、ｉＰＳ：３８６７５２、ｉＰＳ：３８６７５４、ｉＰＳ：３８６７５６、ｉＰＳ：３８６７５８、ｉＰＳ：３８６７６０、ｉＰＳ：３８６７６２、及びｉＰＳ：３８６７６４）は、ＰＡＣ１受容体結合ドメインがＦｃ領域のアミノ末端に位置したものであった。通常、このフォーマットにおいて、ＣＧＲＰ受容体結合ドメインは、阻害効力に実質的に影響を与えることなく、Ｆｃ領域のいずれの側にも位置することが可能であった。
【０２７４】
実施例５．ＣＧＲＰ受容体／ＰＡＣ１受容体ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質の合成及び活性
３つ目のフォーマットを使用して、実施例１に記載の抗ＣＧＲＰ受容体及び抗ＰＡＣ１受容体抗体のサブセットで更なる二重特異性抗原結合タンパク質を調製した。このＩｇＧ−Ｆａｂフォーマットのいくつかの実施形態において、第１の抗体に由来するＶＬ−ＣＬドメインまたはＶＨ−ＣＨ１ドメインのいずれかを含むポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合して、改変重鎖を形成する（図３参照）。第１の抗体に由来するＦａｂ断片の残りのドメイン（すなわち、ＶＨ−ＣＨ１ドメインまたはＶＬ−ＣＬドメイン）を含む第２のポリペプチドは、第２の抗体の軽鎖及び改変重鎖と共発現して、完全な分子を形成する。ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットと同様に、完全な分子の組み立ては、二量体化した免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端側に位置する第１の標的に対する２つの抗原結合ドメインと、二量体化したＦｃ領域のカルボキシル末端側に位置する第２の標的に対する２つの抗原結合ドメインとを有する四価の結合タンパク質をもたらす。
【０２７５】
ＣＧＲＰＲ／ＰＡＣ１  ＩｇＧ−Ｆａｂは、２つの抗原結合ドメインから構成され、一方はＣＧＲＰ受容体に対し、他方はＰＡＣ１受容体に対する。ＣＧＲＰＲ−ＰＡＣ１  ＩｇＧ−Ｆａｂ分子をコードするＤＮＡ分子は、抗ＣＧＲＰ受容体（または抗ＰＡＣ１受容体）抗体軽鎖と、Ｃ末端が（ｉ）抗ＰＡＣ１受容体（もしくは抗ＣＧＲＰ受容体）抗体軽鎖または（ｉｉ）抗ＰＡＣ１受容体（もしくは抗ＣＧＲＰ受容体）Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）に融合した抗ＣＧＲＰ受容体（または抗ＰＡＣ１受容体）抗体重鎖と、カルボキシ末端結合ドメインを完全にするためのＦａｂ断片の残り半分（例えば、（ｉ）抗ＰＡＣ１受容体（もしくは抗ＣＧＲＰ受容体）Ｆｄまたは（ｉｉ）抗ＰＡＣ１受容体（もしくは抗ＣＧＲＰ受容体）抗体軽鎖を含む第３のポリペプチドとをコードする断片を含有する。ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子は、各Ｆａｂ領域（図３に示すＦａｂ１及びＦａｂ２）のＣＨ１及びＣＬドメインに導入された電荷対変異を含有する。電荷対は、抗ＣＧＲＰＲ軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対及び抗ＰＡＣ１軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対の優先的組み立てを可能にするように設計される。生成したＩｇＧ−Ｆａｂ分子のサブセットに関して、軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対の正しい対合を促進するための更なる手法として、第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端領域に融合するポリペプチドが第１の抗体に由来するＶＬ及びＣＨ１領域を含み、第２のポリペプチドが第１の抗体に由来するＶＨ及びＣＬ領域を含むように、カルボキシル末端Ｆａｂ（すなわち、Ｆａｂ２）のＣＬ領域とＣＨ１領域を入れ替えた。表１０のｉＰＳ：３９２５１３、ｉＰＳ：３９２５１４、ｉＰＳ：３９２４７５、ｉＰＳ：３９２５１９、ｉＰＳ：３９２５２４、ｉＰＳ：３９２５２５、ｉＰＳ：３９２５２６、及びｉＰＳ：３９２５２７と称する分子を参照されたい。ＤＮＡ分子をｇＢｌｏｃｋｓ合成により生成し、ｐＴＴ５．１ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターを使用してトランスフェクトし、ヒト２９３  ６Ｅ細胞中でＣＧＲＰＲ／ＰＡＣ１二重特異性分子を発現させた。２４個の異なるＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子を生成した。各分子の完全配列は、表１０に記載されている。
【０２７６】
実施例３に記載のインビトロｃＡＭＰアッセイを使用して、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子を、ヒトＣＧＲＰ受容体及びヒトＰＡＣ１受容体のリガンド誘発活性化を阻害する能力について試験した。各標的受容体に対する分子のそれぞれのＩＣ５０値を以下の表１８に示す。
【表１８】
2020074790.tif 000195
【０２７７】
試験した二重特異性ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の４つを除く全てが両方の受容体に対する阻害活性を示した。
【０２７８】
本明細書にて論じ、引用する全ての公開物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。開示される発明は、記載される特定の方法論、プロトコール及び材料が変更可能であるためこれらに限定されないことが理解される。本明細書にて使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的にしており、添付する特許請求の範囲を限定するものではないことも理解される。
【０２７９】
当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の等価物を数多く認識しまたは確認できるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2020074790.tif 000196
【図２】
2020074790.tif 000197
【図３】
2020074790.tif 000198
【配列表】
2020074790000001.app
【外国語明細書】
2020074790000001.pdf