(57)【要約】【課題】より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たな脂肪性肝疾患診断法を提供することを課題とする。  体液試料中のオクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定し、基準値と比較することにより、前記課題を解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した前記長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
を含む、前記対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項２】
前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、請求項１に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項３】
前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、請求項１又は２に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項４】
肝臓における線維化の進行度を判断する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項５】
アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項６】
前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、請求項５に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項７】
対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。
【請求項８】
対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記体液試料が、血液、血清又は血漿であり、前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌である、請求項８に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。
【請求項１０】
脂肪性肝疾患を診断するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。
【請求項１１】
前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、請求項１０に記載のバイオマーカー。
【請求項１２】
前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、請求項１０又は１１に記載のバイオマーカー。
【請求項１３】
肝臓における線維化の進行度を判断する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
【請求項１４】
脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットであって、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定する試薬を含む診断薬キット。
【請求項１５】
脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定すること
測定した長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
を含む、前記対象における肝線維化の進行度の判定方法。
【請求項１６】
前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、請求項１５に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法。
【請求項１７】
アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法。
【請求項１８】
前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、請求項１７に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法。
【請求項１９】
脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における肝線維化の進行度の判定方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における、肝線維化の進行度を判定するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法に関する。また、本発明は、脂肪性肝疾患のバイオマーカー及び診断薬キットに関する。また、本発明は、対象の肝線維化の進行度の判定方法、及び対象の肝線維化の進行度を判定するためのバイオマーカーにも関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）はアルコールを原因としない脂肪肝の総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と、病態がほとんど進行しない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨは、近年日本国内及び外国において急激に注目を集めている脂肪性肝疾患である。日本国内においては、約１０００万人がＮＡＦＬＤに、そして約１００万〜２００万人がＮＡＳＨに罹患していると推定される。なお、本明細書においては、用語「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、及びＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含むものとする。
【０００３】
ＮＡＳＨの確定診断には、肝組織の生検が必須とされている。肝組織の生検により、脂肪量、炎症の程度、及び／又は線維化の進行程度を把握し、ＮＡＳＨを診断することが可能となる。しかしながら、肝組織の生検は、肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取することを含むものであり、患者及び医療従事者に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを伴うものである。したがって、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない、ＮＡＳＨを初めとする脂肪性肝疾患の新たな診断法の開発が望まれている。
【０００４】
アシルカルニチンは、生体内において脂肪酸がミトコンドリア内膜へ運搬される場合に、脂肪酸とカルニチンが結合して生成される化合物である。より詳細には、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩ）の作用によりアシルＣｏＡとカルニチンからアシルカルニチンが生成される。またアシルカルニチンはミトコンドリア内膜に入った後に、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩＩ）によって再びカルニチンとアシルＣｏＡに分かれ、アシルＣｏＡがβ酸化を受けエネルギー産生に利用される。これらの代謝経路の異常により組織中・血液中アシルカルニチン濃度が変動し、血液及び尿などの生体試料中のアシルカルニチン分析は、新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニングにおいて分析項目とされている。
【０００５】
非特許文献１は、肝細胞癌組織と非癌組織との間でメタボローム解析を行ったところオレオイルカルニチンとパルミトイルカルニチンが、肝細胞癌組織において、非癌組織と比較して多く検出されたことを開示する。非特許文献２は、肝細胞癌に罹患する患者では、健常対象と比較して、血清中のアシルカルニチンレベルが高かったことを開示している。しかしながら、これらの報告において用いられた肝細胞癌組織は、脂肪性肝疾患由来のものではない。より具体的には、これらの報告において用いられた肝細胞癌組織は、ＮＡＳＨが進行して癌化したものではなく、したがって、脂肪性肝疾患とアシルカルニチンレベルとの関連性は依然として不明である。加えて、肝細胞癌が他の組織の代謝機構を変化させることにより、アシルカルニチンが肝臓とは異なる他の組織からも放出される可能性も否定できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｄｈｕ  Ａ  ｅｔ ａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１３  Ｍａｙ；１４４（５）：１０６６−１０７５
【非特許文献２】Ｙａｌｉｇａｒ Ｊ  ｅｔ ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ ６  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２０２９９（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない脂肪性肝疾患の新たな診断法を提供することである。本発明の他の目的は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における、患者及び医療従事者に負担をかけない新たな肝線維化の進行度の判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、体液試料、例えば血清中の特定の長鎖アシルカルニチン量を測定し、基準値と比較することで、患者及び医療従事者に負担をかけず簡易的に脂肪性肝疾患の早期診断が可能であること及び肝線維化の進行度の判定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した前記長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
を含む、前記対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜２＞  前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜３＞  前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、＜１＞又は＜２＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜４＞  肝臓における線維化の進行度を判断する、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜５＞  アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
をさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜６＞  前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、＜５＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜７＞対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、
＜８＞  対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、
＜９＞  前記体液試料が、血液、血清又は血漿であり、前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌である、＜８＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜１０＞  脂肪性肝疾患を診断するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー、
＜１１＞  前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１０＞に記載のバイオマーカー、
＜１２＞  前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、＜１０＞又は＜１１＞に記載のバイオマーカー、
＜１３＞  肝臓における線維化の進行度を判断する、＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載のバイオマーカー、
＜１４＞脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットであって、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定する試薬を含む診断薬キット、
＜１５＞  脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定すること
測定した長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
を含む、前記対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１６＞  前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１５＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１７＞  アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
をさらに含む、＜１５＞又は＜１６＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１８＞  前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、＜１７＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１９＞脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における肝線維化の進行度の判定方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、並びに
＜２０＞  脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における、肝線維化の進行度を判定するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に脂肪性肝疾患の診断を行うことができる。本発明によれば、対象の脂肪性肝疾患が、脂肪性肝疾患由来の肝細胞癌に進行する前に、脂肪性肝疾患、例えば、ＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、対象における肝線維化の進行度の判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化学発癌剤Ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ（ＤＥＮ）投与後に高脂肪食を与えたマウスの肝細胞癌組織（ＨＦＤ−ＨＣＣ）と通常食を与えたＤＥＮ注入マウスの非腫瘍組織（ＮＤ−ＮＴ）における、様々な長鎖アシルカルニチンの量の比較を示す図である。
【図２】通常食を与えたＤＥＮ投与マウスの非腫瘍組織（ＮＤ−ＮＴ）、通常食を与えたＤＥＮ投与マウスの肝細胞癌組織（ＮＤ−ＨＣＣ）、高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスの非腫瘍組織（ＨＦＤ−ＮＴ）、及び高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスの肝細胞癌組織（ＨＦＤ−ＨＣＣ）の各々における、様々な長鎖アシルカルニチンの量を示す図である。
【図３】生体内におけるアシルカルニチンの代謝経路を示す模式図である。
【図４】通常食を与えたＤＥＮ投与マウスの非腫瘍組織（ＮＤ−ＮＴ）、通常食を与えたＤＥＮ投与マウスの肝細胞癌組織（ＮＤ−ＨＣＣ）、高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスの非腫瘍組織（ＨＦＤ−ＮＴ）、及び高脂肪食を与えたＤＥＮ注入マウスの肝細胞癌組織（ＨＦＤ−ＨＣＣ）の各々における、リアルタイムＰＣＲを用いて調査したＡＣＳＬ４、ＣＰＴ１Ａ、ＣＡＣＴ、及びＣＰＴ２の発現量を示す図である。
【図５】肝細胞癌組織において、長鎖アシルカルニチンの蓄積が起こるメカニズムを示す模式図である。
【図６】種々の線維化の進行度のＮＡＦＬＤ患者血清における長鎖アシルカルニチン量の分析結果を示す図である。
【図７】種々の線維化の進行度のＮＡＦＬＤ患者血清における短鎖アシルカルニチン量の分析結果を示す図である。
【図８】肝細胞癌を有するＮＡＳＨ患者（ＨＣＣ（＋））と肝細胞癌を有しないＮＡＳＨ患者（ＨＣＣ（−））において、長鎖アシルカルニチン量を分析した結果を示す図である。
【図９】種々の線維化の進行度のＮＡＦＬＤ患者血清における、式ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１―ＡＣ５：０の線維化の進行度のマーカーとしての有効性を分析した結果を示す図である。
【図１０】肝細胞癌を有するＮＡＳＨ患者（ＨＣＣ（＋））と肝細胞癌を有しないＮＡＳＨ患者（ＨＣＣ（−））において、式（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０の肝細胞癌関連因子としての有効性を分析した結果を示す図である。
【図１１】ＮＡＦＬＤ患者血清における、長鎖アシルカルニチン量と血清炎症性サイトカインとの関連性の分析結果を示す図である。
【図１２】ＮＡＦＬＤ患者血清における、長鎖アシルカルニチン量と血清発癌リスクマーカーとの関連性の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法
（対象からの体液試料）
本発明において分析可能な体液試料としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。本発明において分析可能な体液試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液であり、さらに好ましくは血液、血清又は血漿であり、さらに好ましくは脂肪性肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨ）に罹患している疑いのある対象の血液、血清又は血漿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。
【００１２】
（アシルカルニチン）
本発明において、アシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ３）３Ｎ+ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ１）ＣＨ２ＣＯＯ- 
（式１中、Ｒ１は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
【００１３】
アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３−ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書中においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。本明細書においては脂肪酸が結合していない遊離カルニチンについては、アシルカルニチンに含めないものとする。
【００１４】
飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表１に記載のものが挙げられる。アシルカルニチンは、脂肪酸代謝異常等の先天性代謝異常スクリーニングにおいても評価項目として使用されている。先天性代謝異常スクリーニングなど臨床での評価項目に使用される主なアシルカルニチンを表２に示す。
【００１５】
【表１】
2020064055.tif 000002
【００１６】
【表２】
2020064055.tif 000003
【００１７】
（長鎖アシルカルニチン）
本明細書において「長鎖アシルカルニチン」とは、脂肪酸残基（アシル基）の炭素数が１２〜３０個であるアシルカルニチンを意味する。本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法においては、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチン（以下、６種の長鎖アシルカルニチンと称することがある）のいずれか１つ以上の量を測定する。より好ましくは、測定される長鎖アシルカルニチンは、テトラデセノイルカルニチン及びオクタデセノイルカルニチンから選択される１つ以上であり、最も好ましくはオクタデセノイルカルニチンである。
【００１８】
細胞内の長鎖脂肪酸は、アシルＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）合成酵素（ＡＣＳＬ）ファミリーによってアシルＣｏＡにエステル化される。次に、このアシルＣｏＡが、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）によってカルニチンに結合することによりアシルカルニチンに変換される。カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ（ＣＡＣＴ）を介してミトコンドリア内膜に入った後、アシルカルニチンはカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）によって再びカルニチンとアシルＣｏＡに再変換され、アシルＣｏＡがβ酸化を受けエネルギー産生に利用される。（図３参照）。
【００１９】
本発明者らは、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織をサンプリングして、上記経路に関連する遺伝子発現量の変化を調査したところ、ＡＣＳＬファミリーの１つであるＡＣＳＬ４及びＣＰＴ１Ａの発現量が増加し、そしてＣＰＴ２の発現量が減少していることを発見した。これらの発現量の変化によって、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織では、ＣＰＴ２による長鎖アシルカルニチンのアシルＣｏＡへの再変換が機能しなくなる。したがって、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織では、長鎖アシルカルニチンの蓄積が生じると考えられる（図５参照）。
【００２０】
（長鎖アシルカルニチンの量の測定方法）
長鎖アシルカルニチンの量は、例えばキャピラリー電気泳動−質量分析計、及び液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等により測定することができる。これらの方法を組み合わせて使用することもできる。本明細書において「液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計」又は「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により分離した分析対象成分を専用のインターフェースを介してイオン化し、生成するイオンを質量分析計（ＭＳ）で分離して特定の質量を有するイオンを解離及び／又はフラグメント化させ、それらのイオンを質量分析計で検出する装置を意味する。
【００２１】
（基準値）
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法は、６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれか１つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較することを含む。本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が、健常人群の前記長鎖アシルカルニチンの量よりも高いことを指標として脂肪性肝疾患の検出およびリスクの予測を行うことができる。具体的には、例えば、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性が高いと判定することができる。
【００２２】
数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量の範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチンの量が、健常な対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性が高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性が高い。
【００２３】
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。
【００２４】
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、６種の長鎖アシルカルニチンのうちの特定の１つの長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較してもよく、２つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を各々の長鎖アシルカルニチンの基準値と比較してもよい。
【００２５】
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンの量を測定すること、及び前記中短鎖アシルカルニチン量を基準値と比較することをさらに含むことが好ましい。前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンであることがより好ましい。なお、以下、アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンを、単に中短鎖アシルカルニチンと呼ぶことがある。
【００２６】
具体的には、本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、対象におけるいずれかの中短鎖アシルカルニチンの量が、健常人群の前記中短鎖アシルカルニチンの量よりも低いことを指標として、より精密に脂肪性肝疾患の検出およびリスクの予測を行うことができる。具体的には、例えば、対象におけるいずれかの中短鎖アシルカルニチンの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以下となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性がより高いと判定することができる。
【００２７】
数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中のいずれかの中短鎖アシルカルニチンの範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチンが、健常な対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性がより高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性がより高い。
【００２８】
以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと、計算した前記指標スコアを基準値と比較することとにより、脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測をより精密に行うこともできる。
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
【００２９】
以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと、計算した前記指標スコアを基準値と比較することとにより、脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測をより精密に行うこともできる。
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
上記式を用いる場合、脂肪性肝疾患は、好ましくはＮＡＳＨが進行した肝細胞癌である。
【００３０】
（脂肪性肝疾患）
本明細書において「脂肪性肝疾患」とは、肝細胞の線維化及び／又は脂肪沈着によって引き起こされる肝疾患を意味する。脂肪性肝疾患は、好ましくはＮＡＦＬＤである。ＮＡＦＬＤには、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、及びＮＡＳＨが進行した肝細胞癌が含まれる。脂肪性肝疾患は、より好ましくはＮＡＳＨである。なお、本明細書においては、用語「ＮＡＦＬＤ」及び「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含むことができるが、含まないことが好ましい。
【００３１】
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、ＮＡＳＨが、肝細胞癌に進行する前にＮＡＳＨを検出する又はリスクを予測することができる。したがって、脂肪性肝疾患が、肝細胞癌を有しないＮＡＳＨであることが、早期診断の観点からより好ましい。
また、後述の実施例において示すように、長鎖アシルカルニチンの量と肝線維化とは有意な正の相関を有する。したがって、検出感度の観点からは、脂肪性肝疾患は、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、又はＮＡＳＨが進行した肝細胞癌であることが好ましく、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌であることが最も好ましい。
【００３２】
（脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法）
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法は、脂肪性肝疾患の進行度をモニタリングすることができる。この場合、特定の時点での対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象におけるこの長鎖アシルカルニチンの量を測定し、以前の測定値と比較してこの長鎖アシルカルニチンの量が多ければ、脂肪性肝疾患が進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較してこの長鎖アシルカルニチンの量が同じ程度であるか又は少なければ、脂肪性肝疾患が進行していないと判断することができる。前述のように、６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量に加えて、アシル基の炭素数がＣ２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量（好ましくは、イソ吉草酸カルニチンの量）を、特定の時点及び一定期間経過後にさらに測定することもできる。
【００３３】
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法を行った後、必要に応じて、他の脂肪性肝疾患（例えばＮＡＳＨ）の検出方法の患者への実施、及び／又は脂肪性肝疾患（例えばＮＡＳＨ）の治療薬の患者への投与を実施してもよい。
【００３４】
［２］脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカー
本明細書において、バイオマーカーとは、所定の疾患に関連するペプチド、タンパク質、核酸、脂質又はその他の低分子化合物であり、その生体中の濃度の増減が当該疾患の存在又は進行度に反映するものである。本発明の脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカーでは、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が、健常人群の前記長鎖アシルカルニチンの量よりも高いことを指標として脂肪性肝疾患を診断することができる。具体的には、例えば、対象におけるいずれかの長鎖アシルカルニチンの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性が高いと判定することができる。
【００３５】
本発明の脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカーでは、数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中の６種のうちのいずれかの長鎖アシルカルニチン量の範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチンが、健常な対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性が高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性が高い。
【００３６】
［３］診断薬キット
本発明の脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットは、６種の長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定するための試薬を含む。前記試薬は、特定の１つの長鎖アシルカルニチンの量を測定するための試薬を含んでいてもよく、２つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を測定するための試薬を含んでいてもよい。本発明の脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットは、好ましくは、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて６種の長鎖アシルカルニチンのうちの１つ以上の量を測定するための試薬を含む。
【００３７】
［４］対象の肝線維化の進行度の判定方法
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法では、対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンのいずれかの量に応じて、肝臓における線維化の進行度を判定することができる。本明細書において「肝線維化」とは、慢性的な肝臓の炎症により、コラーゲン線維などの線維性成分及び／又は細胞外基質を含む結合組織が肝臓に大量に増加し、組織が硬化することを意味する。本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うことができる。また、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに既に罹患している対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うこともできる。長鎖アシルカルニチンの測定方法や体液試料については、前述のとおりである。
【００３８】
（基準値）
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、測定した長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較することを含む。本発明の本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法では、数値の範囲を基準値とすることが好ましい。対象の肝線維化の進行度を判定する際には、予め、種々の肝線維化段階の対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンうちのいずれかの量の範囲を計測しておき、この長鎖アシルカルニチンの量が、特定の肝線維化段階の体液試料中の長鎖アシルカルニチンの範囲に入る場合は、対象はその特定の肝線維化段階である可能性が高い。
肝線維化段階の分類は、例えば、Ｆ０：線維化なし、Ｆ１：小葉中心部の線維化、Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化、Ｆ３：線維性架橋形成、Ｆ４：肝硬変、ＨＣＣ：肝細胞がんの区別に従うことができる。本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、対象の肝臓が上記Ｆ０〜Ｆ４のどの段階にあるかを判定することができる。ただ、上記Ｆ０〜Ｆ４の分類には限定されず、異なる分類を使用してもよい。
【００３９】
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。
【００４０】
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、対象の肝線維化の進行度をモニタリングすることができる。この場合、特定の時点での対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンうちのいずれかの量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象のこの長鎖アシルカルニチンを測定し、以前の測定値と比較して量が多ければ、肝線維化が進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較して量が同じ程度であるか又は少なければ、肝線維化が進行していないと判断することができる。
【００４１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
〔実施例１〕ＨＦＤ−ＨＣＣとＮＤ−ＮＴにおける様々な長鎖アシルカルニチンの量の比較
肥満に関連した肝細胞癌に特徴的な代謝の変化を調べるために、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた８ヶ月齢のジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）投与マウスから得られた非腫瘍組織（ＮＴ）及び肝細胞癌組織（ＨＣＣ）に関して、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した非標的メタボロミクスプロファイリングを行った。高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスは、肥満に関連した肝細胞癌モデルマウスとして、広く認知されている。
【００４３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを日本クレア株式会社から購入した。ジエチルニトロサミン（Ｓｉｇｍａ株式会社）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、出生後１４日目にマウスに腹腔内注射した（２５ｍｇ／ｋｇ）。マウスが６週齢になると、高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ）又は通常食（ＮＤ）の投与を開始した。８ヶ月齢となるまで、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）の投与を続け、通常食又は高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスを得た。その後、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）の各々を投与したマウス肝臓から非腫瘍組織（ＮＴ）及び肝細胞癌組織（ＨＣＣ）をサンプリングし、ＮＤ−ＮＴ（通常食・非腫瘍組織）、ＮＤ−ＨＣＣ（通常食・腫瘍組織）、ＨＦＤ−ＮＴ（高脂肪食・非腫瘍組織）、及びＨＦＤ−ＨＣＣ（高脂肪食・腫瘍組織）として、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した非標的メタボロミクスプロファイリングを以下の手順で行った。
【００４４】
（代謝産物の抽出）
代謝産物の抽出と代謝産物の分析を、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＨＭＴ；鶴岡市）において行った。簡潔には、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析のために、凍結組織約５０ｍｇを内部標準（Ｈ３３０４−１００２；ＨＭＴ）を含有する５０％アセトニトリル／ミリＱ水１，５００μＬ中に０℃で沈降させた。組織を組織ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ１００Ｒ；富士デジタルバイオロジー社）を用いて１，５００ｒｐｍで１２０秒間３回ホモジナイズした。ホモジネートを２，３００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。続いて、上部水層８００μＬをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ５−ｋＤａカットオフフィルター（ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ−ＰＬＨＣＣ；ＨＭＴ）を用いて遠心分離し、高分子を除去した（９，１００ｘｇ、４℃、１２０分）。濾液を遠心分離して濃縮し、ＨＭＴでのＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析のために、ミリＱ水５０μＬに再懸濁した。
【００４５】
液体クロマトグラフィーＴＯＦＭＳ（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ）分析のために、凍結組織約５０ｍｇを、内部標準溶液（Ｈ３３０４−１００２；ＨＭＴ）を含有する１％ギ酸／アセトニトリル５００μＬ中に０℃で沈降させた。組織を上記のようにホモジナイズし、ミリＱ水１６７μＬの添加後、混合物を再びホモジナイズし、ホモジネートを遠心分離した（２，３００ｘｇ、４℃、５分間）。次に、上清に１％ギ酸／アセトニトリル５００μＬとミリＱ水１６７μＬを混合し、混合溶液を３−ｋＤａカットオフフィルター（ＮＡＮＯＣＥＰ ３Ｋ ＯＭＥＧＡ；ＰＡＬＬ社）を通してろ過し、高分子を除去した。ハイブリッドＳＰＥリン脂質カートリッジ（５５２６１−Ｕ; Ｓｕｐｅｌｃｏ社）を使用してさらにろ過し、リン脂質を除去した。濾液を乾燥させ、ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析のために、イソプロパノール／ミリＱ水１００μＬに再懸濁した。
【００４６】
（代謝産物の分析）
メタボローム分析を、Ｏｏｇａら  Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ ２０１１；７：１２１７〜１２２３頁及びＳｕｇｉｍｏｔｏら  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ２０１０；６：７８−９５頁に記載の方法に基づいて、イオンおよび非イオン代謝産物に関して、それぞれ、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ及びＬＣ−ＴＯＦＭＳを用いて、ＨＭＴのＤｕａｌＳｃａｎパッケージを用いて行った。簡潔には、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＴＯＦＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ＨＰＬＣポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１６０３Ａ ＣＥ−ＭＳアダプターキット、及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ１６０７Ａ ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ ＣＥシステムを使用してＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析を行った。このシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２２０１Ａ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＢ．０３．０１ ｆｏｒ ＣＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって制御されており、溶融シリカキャピラリー（５０μｍ i.d.×８０ｃｍ全長）により、電解液としての市販の電気泳動バッファー（カチオン及びアニオン分析に関して、それぞれＨ３３０１−１００１及びＨ３３０２−１０２１；ＨＭＴ）に接続していた。分光光度計を５０〜１，０００ｍ／ｚで走査した。ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＴＯＦＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＲＲＬＣシステムＳＬ）を用いて行った。このシステムをＯＤＳカラム（２ｘ５０ ｍｍ、２μｍ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ２２０１Ａ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＢ．０３．０１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって制御した。
【００４７】
ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（慶應義塾大学、鶴岡市）を使用してピークを抽出し、ｍ／ｚ、ピーク面積、泳動時間（ＭＴ）を含むピーク情報を得た。既知のメタボライトのアイソトポマー、アダクトイオン、その他のプロダクトイオンに対応するシグナルピークは除外し、残りのピークは、ＴＯＦＭＳを使用して決定されたＭＴおよびＲＴとそれらのｍ／ｚ値とに基づいて、ＨＭＴ代謝産物データベースによりアノテートした。次に、アノテートしたピークの領域を、内部標準レベルおよびサンプル量に基づいて正規化して、各代謝産物の相対レベルを得た。それぞれの標準化合物を用いた１点較正に基づいて、１１０種類の主要代謝産物を絶対的に定量した。階層的クラスター分析と主成分分析（ＰＣＡ）を、それぞれＨＭＴ独自のソフトウェアであるＰｅａｋＳｔａｔとＳａｍｐｌｅＳｔａｔを使用して行った。検出された代謝産物を、ＶＡＮＴＥＤソフトウェアを用いて代謝経路マップ上に表示した。
【００４８】
４種の組織において種々の長鎖アシルカルニチンの量を分析した。結果を図１及び２に示す。図１において、ＡＣ（２０：１）の「２０」はアシル基の炭素数を示し、「１」は不飽和結合の数を示す。図１において、数字「９．８」及び円の大きさは、ＮＤ−ＮＴにおけるＡＣ（２０：１）を１とした場合の、ＨＦＤ−ＨＣＣにおけるＡＣ（２０：１）の相対的な量を示す。
ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＮＤ−ＮＴと比較して、様々な種類の長鎖アシルカルニチン（ＡＣ）の量が増加していることが分かった（図１）。
【００４９】
図２において、データは、ＮＤ−ＮＴ組織における平均量に対する相対的な量として表示されている。＊は、ＮＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、†は、ＮＤ−ＨＣＣ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、‡は、ＨＦＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示す。
ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＮＴの各々よりも、長鎖アシルカルニチン量が多い傾向があった。特にＡＣ１２：１、ＡＣ１６：０、及びＡＣ１８：１の３種は、ＨＦＤ−ＨＣＣ組織において他の３種の組織の全てに対して、有意に多い量が確認できた。
【００５０】
〔実施例２〕肥満に関連したＨＣＣにおけるアシルカルニチン代謝関連遺伝子の発現の検証
実施例１において得た、通常食又は高脂肪食を与えたＤＥＮ注入マウスを実験に用いた。ＮＤ−ＮＴ、ＮＤ−ＨＣＣ、ＨＦＤ−ＮＴ、及びＨＦＤ−ＨＣＣの各々の組織において、アシルカルニチン代謝に関連するＡＣＳＬ４、ＣＰＴ１Ａ、ＣＡＣＴ、及びＣＰＴ２の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて調査した。結果を図４に示す。
【００５１】
図４において、データは、ＮＤ−ＮＴ組織における遺伝子発現量に対する相対的な量として表示されている。＊は、ＮＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、†は、ＮＤ−ＨＣＣ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、‡は、ＨＦＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示す。ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＨＣＣ組織において、ＣＰＴ１Ａ及びＡＣＳＬ４の強い発現が検出された。一方で、ＣＰＴ２は、ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＨＣＣ組織において発現量が低下しており、特にＨＦＤ−ＨＣＣ組織における発現量低下は、ＮＤ−ＮＴ、ＮＤ−ＨＣＣ、及びＨＦＤ−ＮＴの全てに対して有意差があった。ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＣＡＣＴに関してもＮＤ−ＮＴに対して有意に発現量が低下していた。この結果は、肝細胞癌組織において、脂肪酸の長鎖アシルカルニチンへの変換がＨＦＤ−ＨＣＣ組織において増加している一方で、長鎖アシルカルニチンのアシルＣｏＡへの再変換が抑制されていることを示している。すなわち、この結果は、肝細胞癌組織において、長鎖アシルカルニチン種が蓄積する理由を説明している（図５参照）。なお、ＣＰＴ１Ａ及びＣＰＴ２に関しては、ウエスタンブロット分析を用いて各々の組織における発現量を確認する試験を行ったが、同様の傾向が見られた。
【００５２】
〔実施例３〕ヒト血清サンプルを用いた検証
ＮＡＦＬＤ患者保存血清２４１検体を用いて、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）（積水メディカル社製）を用いて様々なアシルカルニチンの濃度を測定し、ＮＡＦＬＤの病態との関連性を検討した。また、血清中アシルカルニチン濃度と血清中炎症性サイトカイン濃度又は血清中発癌リスクマーカー濃度との関連性を検討した。
【００５３】
１．患者血清サンプル
ＮＡＦＬＤ患者血清を線維化の程度に応じて、以下のようにＦ０〜４及び肝細胞癌に分類した。
Ｆ０：線維化なし
Ｆ１：小葉中心部の線維化
Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化
Ｆ３：線維性架橋形成
Ｆ４：肝硬変
ＨＣＣ：肝細胞癌
２４１検体の内訳は、線維化レベルＦ０が３８検体、Ｆ１が７４検体、Ｆ２が６３検体、Ｆ４が２５検体、肝細胞癌が２３検体である。
【００５４】
２．血清中の長鎖アシルカルニチン量の測定
採取した血清サンプルを、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）を用いて測定した。ＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）には、重水素で同位体標識した、カルニチン（Ｃ０）、アセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＨ）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、及びステアロイルカルニチン（Ｃ１８）が内部標準として含まれている。測定対象物質であるそれぞれのアシルカルニチン又は遊離カルニチンのピーク面積と内部標準物質とのピーク面積の比を算出することにより、血清サンプル中に存在する測定対象物質の量及び濃度を求めることができる。
【００５５】
ヒト血清検体１０μＬにＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）に添付の内部標準原液１０μＬを添加した。エタノール２００μＬをさらに添加して１０秒間撹拌した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）を実施し、上清をガラス製試験管に移した。窒素気流下（４０℃）で濃縮乾固した。ギ酸／アセトニトリル（０．０５：１０）１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。アセトニトリル１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、３分）を実施し、上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでアシルカルニチン量の測定を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は以下のとおりである。
【００５６】
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）および４０００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）
＜ＬＣ条件＞
ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ａｍｉｄｅ (２．１×２５０ｍｍ, ３μｍ, ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ  Ａ：２００ ｍｍｏｌ/Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ  Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：
【００５７】
【表３】
2020064055.tif 000004
【００５８】
【表４】
2020064055.tif 000005
【００５９】
なお、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値と重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を算出し、Ｃ１６ＯＨピーク面積値と内部標準Ｃ１６ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ピーク面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１ＯＨ面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ＯＨ面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。
【００６０】
ＡＣ１４：１（テトラデセノイルカルニチン）及びＡＣ１８：１（オクタデセノイルカルニチン）の測定結果を図６に示す。ＡＣ１４：１及びＡＣ１８：１は、肝線維化と有意な正の相関を示した。（ＡＣ１４：１はトレンド検定のｐ値が０．００８７であり、ＡＣ１８：１はトレンド検定のｐ値が０．０１１１である）。したがって、生体中のこれらの長鎖アシルカルニチン濃度を測定することにより、脂肪性肝疾患を検出でき、そして脂肪性肝疾患における線維化の進行度を判定できることが分かった。また長鎖アシルカルニチンと短鎖アシルカルニチンを組み合わせた計算式ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０は、肝線維化とより強い正の相関を示した（ｐ値０．０００７２１）（図９）。
【００６１】
ＡＣ５：０（イソ吉草酸カルニチン）の測定結果を図７に示す。イソ吉草酸カルニチンではトレンド検定のｐ値が０．００２４９となり、肝線維化と有意な負の相関を示した。したがって、生体中のこれらの短鎖アシルカルニチン濃度を測定することにより脂肪性肝疾患を検出でき、そして脂肪性肝疾患における線維化の進行度を判定できることが分かった。
【００６２】
ＨＣＣを有しないＮＡＦＬＤ患者（Ｆ０〜４の合計）、及びＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者におけるＡＣ１８：１の測定結果を図８に示す。ＡＣ１８：１は、ＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において、有意に高い値を示した。したがって、生体中のＡＣ１８：１の量を測定することにより、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を検出できることが分かった。
【００６３】
ＨＣＣを有しないＮＡＦＬＤ患者（Ｆ０〜４の合計）、及びＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において、式（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）の計算値を比較した結果を図１０に示す。
前記式（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０の計算値は、ＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において高い値を示した。したがって、前記式の計算値を計算することにより、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を検出できることが分かった。
【００６４】
ＡＣ１８：１と血清炎症性サイトカイン濃度との関連性を示す図を図１１に示す。ＡＣ１８：１と血清発癌リスクマーカー濃度との関連性を示す図を図１２に示す。ＡＣ１８：１は、血清炎症性サイトカイン濃度及び血清発癌リスクマーカー濃度の各々と正の相関を示した。したがって、ＡＣ１８：１は、脂肪性肝疾患に関連した炎症及び発癌のマーカーとして使用できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に脂肪性肝疾患の診断を行うことができる。本発明によれば、対象が肝細胞癌に進行する前に、ＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、対象における肝線維化の進行度の判定を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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