(57)【要約】      （修正有）【課題】安全で安定した、有効な、且つ費用対効果の高いインフルエンザワクチンの提供。【解決手段】異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクター。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入される。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入される。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス5型(PIV5)ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、前記異種ヌクレオチド配列が前記PIV5ゲノムの融合(F)遺伝子とスモール疎水性タンパク質(SH)遺伝子との間に挿入される、前記ウイルス発現ベクター。
【請求項２】
前記PIV5ゲノムが1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１記載のウイルス発現ベクター。
【請求項３】
前記突然変異が、V/P遺伝子の突然変異、V及びPタンパク質の共通N末端の突然変異、V及びPタンパク質の共通N末端の残基26、32、33、50、102及び/又は157の突然変異、Vタンパク質のC末端が欠損した突然変異、Fタンパク質の突然変異、リンタンパク質(P)の突然変異、ラージRNAポリメラーゼ(L)タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２記載のウイルス発現ベクター。
【請求項４】
前記突然変異が、PIV5VΔCを含む、請求項２記載のウイルス発現ベクター。
【請求項５】
前記異種ポリペプチドがインフルエンザポリペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター。
【請求項６】
前記異種インフルエンザポリペプチドが、インフルエンザヘマグルチニン(HA)、インフルエンザノイラミニダーゼ(NA)、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質(NP)、M1、M2、PA、PB1、PB2、PB1-F2、NS1又はNS2ポリペプチドを含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項７】
前記インフルエンザが、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、又はC型インフルエンザウイルスを含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスH5N1、H3N2、又はH1N1株を含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項９】
前記異種ポリペプチドが、A型インフルエンザウイルスH1〜H18亜型株由来のヘマグルチニン(HA)を含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１０】
前記異種ポリペプチドが、A型インフルエンザウイルスH5N1、H3N2、又はH1N1株由来のヘマグルチニン(HA)を含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１１】
前記異種ポリペプチドが、インフルエンザA型N1〜N10亜型由来のインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)を含む、請求項５記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１２】
前記NP、M1、M2、PA、PB1、PB2、PB1-F2、NS1又はNS2がA型インフルエンザウイルスH1〜H17株由来であり、且つ前記NAがA型インフルエンザウイルスN1〜N10株由来である、請求項６記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリインフルエンザ、イヌインフルエンザ、トリメタニューモウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトカリシウイルス、動物カリシウイルス(veterinary calcivirus)、ヒトノロウイルス、動物ノロウイルス、牛疫ウイルス、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及び/又はヒト若しくは動物における新興インフルエンザウイルスに由来する、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドが細菌又は寄生体に由来する、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１５】
前記異種ポリペプチドが狂犬病ウイルス糖タンパク質(G)を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１６】
異種ポリペプチドを発現する2つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター又はウイルス粒子の組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
細胞において異種ポリペプチドを発現する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１９のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物とin vitroで接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
非ヒト対象において異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記免疫応答が、体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
対象におけるウイルス感染症に対するワクチンの製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物の使用。
【請求項２４】
対象において異種ポリペプチドを発現するための、請求項１〜１９のいずれか１項記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物。
【請求項２５】
前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔内に、筋肉内に、局所的に、経口的に、又は卵内に投与される、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の方法又は使用。
【請求項２６】
前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔内に、筋肉内に、局所的に、経口的に、又は卵内に投与される、請求項２４記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラインフルエンザウイルス５型ベースのワクチンに関する。
【０００２】
継続出願データ
本願は、２０１２年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／５９０，０７０号明細書、２０１２年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／５９０，０５６号明細書、及び２０１２年８月１６日に出願された同第６１／６８３，８１０号明細書の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０００３】
政府資金提供
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の提供による補助金交付番号第Ｒ０１ＡＩ０７０８４７号及び第Ｒ５６ＡＩ０８１８１６号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
不活化インフルエンザワクチンは１９４０年代から利用されており、一致するインフルエンザウイルス株に対して６０〜８０％の有効性であるが、抗原ドリフト変異体に対しては有効性が低く、異なる亜型に対しては無効である。従って、新しい株又は亜型の感染を防ぐには、毎年ワクチンを接種する必要がある。現在の季節性インフルエンザワクチンは、２つのＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）及び１つ又は２つのＢ型インフルエンザウイルスからなる。さらに、ワクチン接種率及び生産が、世界的に常に問題となっている。現在認可されているインフルエンザウイルスワクチンは鶏卵で生産されるため、何百万個もの卵を利用する必要があるとともに、ワクチン株を同定してからワクチンが利用可能になるまでにかなりの時間を要する。加えて、このワクチン接種戦略は、予想外の株、集団発生、又は世界的流行に対して防御を提供しない。インフルエンザウイルス感染を予防し、制御するための、新規のワクチン接種戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターを含み、ここで異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒｏａｍｉｎｉｄａｓｅ）（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間には挿入されない。
【０００６】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入される。
【０００７】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入される。
【０００８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入される。
【０００９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子と基質タンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入される。
【００１０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入される。
【００１１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入される。
【００１２】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入される。
【００１３】
一部の実施形態では、ＰＩＶ５のＦ又はＨＮ遺伝子の一部が、異種ヌクレオチド配列で置換されている。
【００１４】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列を置換する。
【００１５】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入される。
【００１６】
一部の実施形態では、ＰＩＶ５ゲノムは１つ以上の突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、突然変異には、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、突然変異には、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、ＰＩＶ５ゲノムは１つ以上の突然変異をさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリインフルエンザ、イヌインフルエンザ、トリメタニューモウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトカリシウイルス、動物カリシウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、ヒトノロウイルス、動物ノロウイルス、牛疫ウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及び／又はヒト若しくは動物における新興インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、細菌又は寄生体に由来する。
【００１８】
本発明は、異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターを含み、ここで異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入され、且つＰＩＶ５ゲノムは１つ以上の突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、突然変異には、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、突然変異には、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００１９】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリインフルエンザ、イヌインフルエンザ、トリメタニューモウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトカリシウイルス、動物カリシウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、ヒトノロウイルス、動物ノロウイルス、牛疫ウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及び／又はヒト若しくは動物における新興インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、細菌又は寄生体に由来する。
【００２０】
本発明は、異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターを含み、ここで異種ポリペプチドはインフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を含む。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入される。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列の直ちに下流に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子と基質タンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；ここでＰＩＶ５のＦ又はＨＮ遺伝子の一部が、異種ヌクレオチド配列で置換されており；ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列を置換し；ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入される。一部の実施形態では、ＰＩＶ５ゲノムは１つ以上の突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、突然変異には、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、突然変異には、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００２１】
本明細書に記載されるウイルス発現ベクターの一部の実施形態において、異種ポリペプチドには、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＢ１−Ｆ２、ＮＳ１又はＮＳ２が含まれる。一部の実施形態では、ここでインフルエンザには、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＣ型インフルエンザウイルスが含まれる。
【００２２】
一部の実施形態では、ここで異種ポリペプチドには、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１８亜型株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）が含まれる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドには、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ１Ｎ１株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）が含まれる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドには、インフルエンザＡ型Ｎ１〜Ｎ１０亜型由来のインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）が含まれる。一部の実施形態では、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＢ１−Ｆ２、ＮＳ１又はＮＳ２がＡ型インフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１７株由来であり、且つＮＡがＡ型インフルエンザウイルスＮ１〜Ｎ１０株由来である。
【００２３】
本発明は、異種ポリペプチドを発現する２つ以上の異種ヌクレオチド配列を有する本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクターを含む。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子を含む。
【００２５】
本発明は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター又はウイルス粒子の組成物を含む。
【００２６】
本発明は、細胞において異種ポリペプチドを発現する方法を含み、この方法は、細胞を、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と接触させるか又はそれに感染させる工程を含む。
【００２７】
本発明は、対象において異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態では、免疫応答には、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が含まれる。
【００２８】
本発明は、対象において異種ポリペプチドを発現する方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与する工程を含む。
【００２９】
本発明は、対象をワクチン接種する方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与する工程を含む。
【００３０】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物は、鼻腔内に、筋肉内に、局所的に、経口的に、又は卵内に投与される。
【００３１】
用語「及び／又は」は、列挙される要素の１つ若しくは全て又は列挙される要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００３２】
語句「好ましい」及び「好ましくは」は、ある状況下で特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下で他の実施形態が好ましいこともまたある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することは意図されない。
【００３３】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及びその変化形は、これらの用語が説明及び特許請求の範囲に出現する場合に、限定する意味を有しない。
【００３４】
特記されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は同義的に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。
【００３５】
また、本明細書において、端点による数値範囲の記載は、当該の範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５を含む等）。
【００３６】
個別的な工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、それらの工程は、任意の実行可能な順序で行われ得る。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。
【００３７】
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される構成成分の分量、分子量などを表現する数値は全て、いずれの場合にも用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。従って、特にそうでない旨が指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは概数であり、本発明により達成しようとする所望の特性に応じて異なり得る。最低限でも、また均等論を特許請求の範囲に限定しようとするものではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁の数を踏まえて、且つ通常の丸め方を適用することにより解釈されなければならない。
【００３８】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、しかしなお、具体例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、数値は全て、本質的に、それぞれの試験計測値に存在する標準偏差によって必然的にもたらされる範囲を含んでいる。
【００３９】
本発明の上記の要約は、本発明の開示されるそれぞれの実施形態又はあらゆる実施態様を記載することを意図したものではない。以下に続くより詳細な説明は、例示的な実施形態を示す。本願全体を通じたいくつかの部分で、例を列挙して指針を提供しており、それらの例は、様々な組み合わせで用いることができる。それぞれの場合に、記載される列挙は代表例をまとめたものとして供され、排他的な列挙として解釈されてはならない。
【００４０】
全体を通じ、見出しは全て、読者の便宜のためであり、指定する旨がない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いられてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＰＩＶ５ゲノム構造を示す。ＰＩＶ５ゲノムは７つの既知の転写単位を含み、８つの既知のウイルスｍＲＮＡを転写する。Ｖ及びＰ  ｍＲＮＡは、いずれも、疑似鋳型転写と呼ばれるＲＮＡ編集プロセスにより同じＶ／Ｐ遺伝子から生じる。Ｖ  ｍＲＮＡはＶ／Ｐ遺伝子から忠実に転写されるが、Ｐ  ｍＲＮＡは、Ｖ  ｍＲＮＡ転写中、ＲＮＡポリメラーゼスタッタリングに起因して特定の部位に２つの鋳型なしＧ残基が挿入されることによって生じる。リーダー及びトレーラー配列は、ウイルスＲＮＡの合成及び転写開始に重要である。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、リーダー配列においてのみ転写が開始され、そのリーダー配列に最も近い遺伝子が最も多く転写される。
【図２Ａ】ＰＩＶ５−Ｈ５が致死性Ｈ５Ｎ１の攻撃を防御したことを示す。図２ＡはＺＬ４８の概略図であり、ＺＬ４８は、ＨＮとＬとの間に挿入されたＨ５を有する（ＰＩＶ５−Ｈ５ＨＬとしても知られる）。
【図２Ｂ】ＰＩＶ５−Ｈ５が致死性Ｈ５Ｎ１の攻撃を防御したことを示す。図２Ｂは、Ｈ５Ｎ１攻撃後の体重減少を示す。マウス（ｎ＝１０／群）に、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６及び不活化インフルエンザＡ／ＶＮ／０３／０４株（ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１）を接種した。ＺＬ４６は、ＳＨとＨＮとの遺伝子間にＨ５挿入を有する。接種後２１日目、マウスを致死量のＨ５Ｎ１に感染させた。マウスの体重を記録し、体重減少を図示した。
【図２Ｃ】ＰＩＶ５−Ｈ５が致死性Ｈ５Ｎ１の攻撃を防御したことを示す。図２Ｃは生存率を示す。
【図２Ｄ】ＰＩＶ５−Ｈ５が致死性Ｈ５Ｎ１の攻撃を防御したことを示す。図２Ｄは、攻撃後の肺におけるウイルス力価を示す。Ｈ５Ｎ１による攻撃後４日目、感染したマウスの肺を採取し、肺におけるＨ５Ｎ１の力価を決定した。
【図３Ａ】ＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）が致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を防御したことを示す。図３Ａは、Ｈ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１のＮＡを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図３Ｂ】ＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）が致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を防御したことを示す。図３Ｂは、Ｈ５Ｎ１攻撃後の体重減少を示す。マウス（ｎ＝１０／群）に、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）並びにＨ５Ｎ１のＨＡ及びＮＡを発現する組換えインフルエンザウイルス（ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８）を接種した。接種後２１日目、マウスを致死量のＨ５Ｎ１に感染させた。マウスの体重を記録し、体重減少を図示した。
【図３Ｃ】ＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）が致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を防御したことを示す。図３Ｃは生存率を示す。
【図４Ａ】ＰＩＶ５−ＮＰ（Ｈ５Ｎ１）が致死性インフルエンザウイルス攻撃を防御したことを示す。図４Ａは、Ｈ５Ｎ１のＮＰを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｐ−Ｓ３０８Ｇは、Ｐタンパク質の残基Ｓ３０８に突然変異を有する。ＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰは、ＳＨタンパク質の欠失を有する。
【図４Ｂ】ＰＩＶ５−ＮＰ（Ｈ５Ｎ１）が致死性インフルエンザウイルス攻撃を防御したことを示す。図４Ｂは、致死性Ｈ１Ｎ１攻撃後の体重減少を示す。マウス（ｎ＝１０／群）に、１０５ｐｆｕのＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−ＮＰ（Ｈ５Ｎ１）、又はインフルエンザウイルスＸ３１株を接種した。接種後２１日目、マウスを致死量のＨ１Ｎ１（１００  ＴＣＩＤ５０）に感染させた。マウスの体重を記録し、体重減少を図示した。
【図４Ｃ】ＰＩＶ５−ＮＰ（Ｈ５Ｎ１）が致死性インフルエンザウイルス攻撃を防御したことを示す。図４Ｃは生存率を示す。
【図５】ＰＩＶ５−Ｈ５ＨＬ及びＰＩＶ５−Ｈ５ＬＮの概略図を提供する。Ｈ５をＨＮとＬとの間に挿入するとＰＩＶ５−Ｈ５ＨＬを得ることができ、又はリーダー配列とＮＰとの間に挿入するとＰＩＶ５−Ｈ５ＬＮを得ることができる。Ｈ５挿入のより詳細な図が示される。遺伝子開始（ＧＳ）、遺伝子間領域（Ｉ）及び遺伝子終了（ＧＥ）配列（これらはウイルスｍＲＮＡ合成の開始及び終結に重要である）が示される。
【図６Ａ】Ｈ５Ｎ１  ＰＩＶ５Ｈ５のＨＡの発現レベルが免疫に影響を及ぼしたことを示す。図６Ａは、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。Ｈ５挿入部位が示される。
【図６Ｂ】Ｈ５Ｎ１  ＰＩＶ５Ｈ５のＨＡの発現レベルが免疫に影響を及ぼしたことを示す。図６Ｂは、ワクチン接種マウスのＥＬＩＳＡ抗体力価を示す。マウスに１０００ｐｆｕのウイルス（これは図２で用いた用量の１／１，０００である）を接種した。接種後２１日目、マウスを出血させ、ＥＬＩＳＡを用いて抗インフルエンザウイルスの力価を計測した。
【図６Ｃ】Ｈ５Ｎ１  ＰＩＶ５Ｈ５のＨＡの発現レベルが免疫に影響を及ぼしたことを示す。図６Ｃは、ワクチン接種マウスの中和抗体力価を示す。中和抗体力価アッセイでは、図６Ｂの試料を使用した。
【図７Ａ】ＮＰを発現する突然変異体ＰＩＶ５がより優れた防御を有したことを示す。図７Ａは、致死性Ｈ１Ｎ１攻撃後の体重減少を示す。マウス（ｎ＝１０／群）に、１０５ｐｆｕのＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−ＮＰ、ＰＩＶ５−ＮＰ（Ｓ３０８Ｇ）、ＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰ又はインフルエンザウイルスＸ３１株を接種した。ＰＢＳ、生理食塩緩衝液を対照として含めた。接種後２１日目、マウスを致死量のＨ１Ｎ１（１０００  ＴＣＩＤ５０）（図４の１０倍の用量）に感染させた。マウスの体重を記録し、体重減少を図示した。
【図７Ｂ】ＮＰを発現する突然変異体ＰＩＶ５がより優れた防御を有したことを示す。図７Ｂは生存率を示す。ＰＩＶ５−ＮＰ（デルタＳＨ）は、ＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰと同じである。
【図８Ａ】Ｈ５を発現する突然変異体ＰＩＶ５が抗体力価に対して影響を与えたことを示す。図８Ａは、Ｈ５を発現するＰＩＶ５突然変異体の概略図を示す。ＺＬ４８はＰＩＶ５−Ｈ５であり、ＺＬ１２８はＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５であり、ＺＬ１２７はＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５であり、及びＺＬ１５４はＰＩＶ５ＶΔＣΔＳＨ−Ｈ５である。
【図８Ｂ】Ｈ５を発現する突然変異体ＰＩＶ５が抗体力価に対して影響を与えたことを示す。図８Ｂは、Ｈ５を発現する突然変異体ＰＩＶ５によって免疫が生じたことを示す。マウス（ｎ＝１０／群）に、１０００ｐｆｕのＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５、ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５又はＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５（クローン１及び３）を接種した。接種後２１日目、マウスを出血させ、抗Ｈ５  ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで計測した。
【図９】ＰＩＶ５タンパク質に代えて目的のワクチン標的のウイルスタンパク質を発現するキメラＰＩＶ５である、改良ＰＩＶ５ベクターの生成に関する概略図を示す。
【図１０Ａ】ＰＩＶ５ベースのＨＩＶワクチン候補を示す。図１０Ａは、ＨＩＶのＥｎｖ又はＧａｇを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図１０Ｂ】ＰＩＶ５ベースのＨＩＶワクチン候補を示す。図１０Ｂは、ＰＩＶ５−Ｅｎｖ感染細胞におけるＥｎｖの発現を示す。ＨｅＬａ細胞をＰＩＶ５−Ｅｎｖに感染させた。細胞ライセートをウエスタンブロットにおいて使用した。
【図１０Ｃ】ＰＩＶ５ベースのＨＩＶワクチン候補を示す。図１０Ｃは、ＰＩＶ５−Ｇａｇ感染細胞におけるＧａｇの発現を示す。ＨｅＬａ細胞をＰＩＶ５−Ｇａｇに感染させた。細胞ライセートをウエスタンブロットにおいて使用した。
【図１１Ａ】ＰＩＶ５曝露のないイヌにおける抗ＰＩＶ５抗体の力価を示す。８匹のＰＩＶ５未感作イヌを、８×１０７ＰＦＵのＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３ウイルスの１用量で鼻腔内経路により免疫した。イヌは２群に分けた：ＰＩＶ５感染イヌ及びｒＰＩＶ５−Ｈ３感染イヌ。感染後０日目及び２１日目に、ＥＬＩＳＡ（図１１Ａ）及びウイルス中和抗体（ｎＡｂ）アッセイ（図１１Ｂ）用の血液試料を採取した。灰色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が、このアッセイの検出限界である１０未満であることを示している。黒色の柱は、ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１１Ｂ】ＰＩＶ５曝露のないイヌにおける抗ＰＩＶ５抗体の力価を示す。８匹のＰＩＶ５未感作イヌを、８×１０７ＰＦＵのＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３ウイルスの１用量で鼻腔内経路により免疫した。イヌは２群に分けた：ＰＩＶ５感染イヌ及びｒＰＩＶ５−Ｈ３感染イヌ。感染後０日目及び２１日目に、ＥＬＩＳＡ（図１１Ａ）及びウイルス中和抗体（ｎＡｂ）アッセイ（図１１Ｂ）用の血液試料を採取した。灰色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が、このアッセイの検出限界である１０未満であることを示している。黒色の柱は、ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１２Ａ】ＰＩＶ５曝露のないイヌにおけるＰＩＶ５の複製を示す。感染後３日目及び５日目にイヌの鼻スワブを採取し、０．５ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭが入ったバイアルに入れた。図１２Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスの検出を示す。スワブ試料はＢＨＫ２１細胞に対するプラークアッセイにより調べた。アッセイでは、段階希釈した各スワブ試料（１：１００〜１：１０２）につき２つのレプリケートを使用した。
【図１２Ｂ】ＰＩＶ５曝露のないイヌにおけるＰＩＶ５の複製を示す。感染後３日目及び５日目にイヌの鼻スワブを採取し、０．５ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭが入ったバイアルに入れた。図１２Ｂは、プラークアッセイによるウイルスの検出を示す。スワブ試料はＢＨＫ２１細胞に対するプラークアッセイにより調べた。アッセイでは、段階希釈した各スワブ試料（１：１００〜１：１０２）につき２つのレプリケートを使用した。
【図１３】ｒＰＩＶ５−Ｈ３を接種したＰＩＶ５未感作イヌにおける免疫応答を示す。感染後０日目及び２１日目にイヌ血液試料を採取した。９６ウェル丸底プレートにおいて、４ＨＡＵのＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２、Ｈ３Ｎ２亜型）を段階希釈したイヌ血清と混合した。赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）力価を、血球凝集を完全に抑制する最大希釈抗血清の逆数としてスコア化した。このグラフは、イヌ毎のデュプリケートウェルの平均値を示す。ＨＡＩ力価の検出限界（１０）が示される。
【図１４Ａ】ＰＩＶ５ワクチン接種イヌにおける抗ＰＩＶ５抗体の力価を示す。生ＰＩＶ５をワクチン接種しておいた８匹のイヌを、鼻腔内経路により１ｍＬのＰＢＳ中８×１０７ＰＦＵのｒＰＩＶ５−Ｈ３ウイルスの１用量で免疫した。イヌは２群に分けた：２匹のイヌにはＰＢＳを投与した；残りの６匹のイヌにはｒＰＩＶ５−Ｈ３を投与した。感染後０日目及び２１日目に、ＥＬＩＳＡ（図１４Ａ）用及びウイルス中和抗体アッセイ（図１４Ｂ）用の血液試料を採取した。データは、デュプリケートウェルの平均値として提供した。中和抗体アッセイにおいて、白色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１４Ｂ】ＰＩＶ５ワクチン接種イヌにおける抗ＰＩＶ５抗体の力価を示す。生ＰＩＶ５をワクチン接種しておいた８匹のイヌを、鼻腔内経路により１ｍＬのＰＢＳ中８×１０７ＰＦＵのｒＰＩＶ５−Ｈ３ウイルスの１用量で免疫した。イヌは２群に分けた：２匹のイヌにはＰＢＳを投与した；残りの６匹のイヌにはｒＰＩＶ５−Ｈ３を投与した。感染後０日目及び２１日目に、ＥＬＩＳＡ（図１４Ａ）用及びウイルス中和抗体アッセイ（図１４Ｂ）用の血液試料を採取した。データは、デュプリケートウェルの平均値として提供した。中和抗体アッセイにおいて、白色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１５Ａ】先行ＰＩＶ５ワクチン接種を有するイヌにおけるＰＩＶ５の複製を示す。イヌの鼻スワブを３及び５ｄｐｉで採取した。ウイルスの検出は図１２と同じように実施した。図１５ＡはＲＴ−ＰＣＲの結果である。
【図１５Ｂ】先行ＰＩＶ５ワクチン接種を有するイヌにおけるＰＩＶ５の複製を示す。イヌの鼻スワブを３及び５ｄｐｉで採取した。ウイルスの検出は図１２と同じように実施した。図１５Ｂはプラークアッセイの結果である。
【図１６】ｒＰＩＶ５−Ｈ３を接種したＰＩＶ５ワクチン接種イヌにおける免疫応答を示す。イヌ血液試料を０及び２１ｄｐｉで採取した。図１３と同じ手法を用いて抗ＰＩＶ５及び抗ＨＡＩ力価を決定した。
【図１７Ａ】ヒトにおけるＰＩＶ５抗体を示す。１８〜５０歳の健常人から４５例のヒト血清試料を得た。図１７Ａは、抗ＰＩＶ５及び抗ＭｕＶ抗体値の比較である。精製ＰＩＶ５又は精製ＭｕＶで被覆したプレートにおいて、段階希釈した血清でＥＬＩＳＡを実施した。各ヒト血清試料について３２０倍希釈で、ＰＩＶ５又はムンプスウイルス特異的ＥＬＩＳＡ  ＯＤ４５０値を示した。白色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が検出限界の１０未満であることを示している。黒色の柱は、ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１７Ｂ】ヒトにおけるＰＩＶ５抗体を示す。１８〜５０歳の健常人から４５例のヒト血清試料を得た。図１７Ｂは、ヒト血清中におけるＰＩＶ５に対する中和抗体の力価を示す。抗体力価のデータはデュプリケートウェルの平均値であり、ヒト試料毎に提供した。白色の柱は、ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価が検出限界の１０未満であることを示している。黒色の柱は、ｎＡｂ力価が１０以上であることを示している。
【図１８Ａ】Ｈ５を発現する組換えＰＩＶ５の情報を提供する。図１８Ａは、Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の概略図である。多塩基アミノ酸残基を含む切断部位が欠失され、配列が示される。ＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧは配列番号１であり、ＮＳＰＱＧＬＦＧは配列番号２である）。
【図１８Ｂ】Ｈ５を発現する組換えＰＩＶ５の情報を提供する。図１８Ｂは、Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５ストックの力価を示す。プラーク精製ウイルスをＭＤＢＫ細胞において成長させ、ＢＨＫ細胞で力価測定した。
【図１９Ａ】ＰＩＶ５ゲノムのＨＮとＬとの間にＨ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の作成及び分析を示す。図１９Ａは、免疫ブロット法を用いたＨ５Ｎ１  ＨＡ発現の確認である。ＭＤＢＫ細胞をＺＬ４８に感染させ、２４ｈｐｉで溶解した。このライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、抗Ｈ５Ｎ１  ＨＡでイムノブロットした。
【図１９Ｂ】ＰＩＶ５ゲノムのＨＮとＬとの間にＨ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の作成及び分析を示す。図１９Ｂは、免疫蛍光法（ＩＦ）を用いたＨ５Ｎ１  ＨＡ発現の確認である。ＭＤＢＫ細胞をＺＬ４８に感染させ、抗Ｈ５Ｎ１  ＨＡで染色した。ＩＦに用いた抗体はパネルの左側に示した。
【図１９Ｃ】ＰＩＶ５ゲノムのＨＮとＬとの間にＨ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の作成及び分析を示す。図１９Ｃは、ｒＰＩＶ５−Ｈ５の成長率を示す。ＭＤＢＫ細胞をＭＯＩ０．１でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。２４時間毎に培地を採取した。プラークアッセイを用いて培地中のウイルスの力価を決定した。
【図２０Ａ】ｒＰＩＶ５−Ｈ５を接種したマウスにおける免疫応答を示す。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。図２０Ａは抗ＨＡのＥＬＩＳＡ力価を示す。マウスを１０６ｐｆｕのＺＬ４８又はＰＩＶ５に感染させた。２１ｄｐｉでマウスを出血させた。ＥＬＩＳＡを用いて抗ＨＡの力価を決定した。
【図２０Ｂ】ｒＰＩＶ５−Ｈ５を接種したマウスにおける免疫応答を示す。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。図２０Ｂは、抗ＨＡ力価のブーストを示す。図２０Ａのマウスを２８ｄｐｉでブーストし、３５ｄｐｉで出血させた。ＥＬＩＳＡを用いて抗ＨＡの力価を計測した。
【図２０Ｃ】ｒＰＩＶ５−Ｈ５を接種したマウスにおける免疫応答を示す。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。図２０Ｃは中和力価を示す。ＰＩＶ５又はＺＬ４８をワクチン接種したマウスの血清中におけるＨ５Ｎ１に対するｎＡｂの力価を、「材料及び方法」に記載されるとおり決定した。
【図２０Ｄ】ｒＰＩＶ５−Ｈ５を接種したマウスにおける免疫応答を示す。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。図２０Ｄは細胞媒介性応答を示す。ＥＬＩＳｐｏｔ分析により決定するときのワクチン接種後１２日目の縦隔リンパ節におけるＩＦＮ−γ産生リンパ球（ｎ＝３マウス／群のプール）。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１Ａ】マウスにおけるｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を示す。マウスに、１０６ｐｆｕ／マウスの用量でＰＢＳ、ＰＩＶ５又はＺＬ４８（ｎ＝１０／群）を接種した。２１ｄｐｉで、マウスを１，０００  ＴＣＩＤ５０の用量のｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）で攻撃した。攻撃後４日目に肺を採取した。マウスの肺におけるｒｇＰＲ８Ｈ５Ｎ１の力価を、プラークアッセイを用いて決定した。
【図２１Ｂ】マウスにおけるｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を示す。マウスに、１０６ｐｆｕ／マウスの用量でＰＢＳ、ＰＩＶ５又はＺＬ４８（ｎ＝１０／群）を接種した。２１ｄｐｉで、マウスを１，０００  ＴＣＩＤ５０の用量のｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）で攻撃した。攻撃後４日目に肺を採取した。マウスの肺におけるｒｇＰＲ８Ｈ５Ｎ１の力価を、プラークアッセイを用いて決定した。
【図２２Ａ】マウスにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を示す。マウスに、１０６ｐｆｕ／マウスの用量でＰＢＳ、ＰＩＶ５又はＺＬ４８（ｎ＝１５／群）を接種した。２１ｄｐｉで、１０  ＬＤ５０の用量のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１によりマウスを攻撃した。図２２Ａは、Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの体重を示す。体重は攻撃後毎日、１５日間にわたりモニタした。体重は、元の（攻撃当日の）体重に対する割合の平均としてグラフ化する。
【図２２Ｂ】マウスにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を示す。マウスに、１０６ｐｆｕ／マウスの用量でＰＢＳ、ＰＩＶ５又はＺＬ４８（ｎ＝１５／群）を接種した。２１ｄｐｉで、１０  ＬＤ５０の用量のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１によりマウスを攻撃した。図２２Ｂは生存率を示す。
【図２２Ｃ】マウスにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を示す。マウスに、１０６ｐｆｕ／マウスの用量でＰＢＳ、ＰＩＶ５又はＺＬ４８（ｎ＝１５／群）を接種した。２１ｄｐｉで、１０  ＬＤ５０の用量のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１によりマウスを攻撃した。図２２Ｃは、Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの肺力価を示す。マウス（Ｎ＝５）は、Ｈ５Ｎ１攻撃後４日目に犠牲にした。ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いて力価を決定した。
【図２３Ａ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の分析である。図２３Ａは、Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５を感染させた細胞におけるＨ５Ｎ１  ＨＡ発現の分析である。細胞をＭＯＩ１でＺＬ４６、ＺＬ４７及びＺＬ４８並びにＰＩＶ５に感染させた。感染細胞におけるＨ５Ｎ１  ＨＡの発現レベルを、「材料及び方法」に記載されるとおりフローサイトメトリーを用いて決定した。感染細胞からの培地を２４時間毎に採取し、プラークアッセイに用いてウイルスの力価を決定した。
【図２３Ｂ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の分析である。図２３Ｂは、組織培養細胞における組換えウイルスの成長率を示す。細胞をＭＯＩ０．１でウイルスに感染させた。感染細胞からの培地を２４時間毎に採取し、プラークアッセイに用いてウイルスの力価を決定した。
【図２４】組換えウイルスのインビボ成長を示す。マウス（ｎ＝５）を鼻腔内経路により１０６ｐｆｕの用量でウイルスに感染させた。４ｄｐｉで肺を採取し、プラークアッセイに用いてウイルスの力価を決定した。
【図２５Ａ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する有効性を示す。マウスを鼻腔内経路により１０３、１０４、又は１０５ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。２４ｄｐｉで、マウスを１０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１により攻撃した。マウスの体重を毎日モニタした。図２５Ａは、１０  ＬＤ５０のＡ／ベトナム／１２０３／０４で攻撃したマウスのログ・ランク生存分析である。１０３ｐｆｕ（図２５Ｂ）、１０４ｐｆｕ（図２５Ｃ）、又は１０５ｐｆｕ（図２５Ｄ）をワクチン接種し、且つ１０  ＬＤ５０のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの相対体重。ｒｇＶＮ−ＰＲ８をワクチン接種したマウスには、２０００ｐｆｕのウイルスを投与した。
【図２５Ｂ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する有効性を示す。マウスを鼻腔内経路により１０３、１０４、又は１０５ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。２４ｄｐｉで、マウスを１０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１により攻撃した。マウスの体重を毎日モニタした。図２５Ａは、１０  ＬＤ５０のＡ／ベトナム／１２０３／０４で攻撃したマウスのログ・ランク生存分析である。１０３ｐｆｕ（図２５Ｂ）、１０４ｐｆｕ（図２５Ｃ）、又は１０５ｐｆｕ（図２５Ｄ）をワクチン接種し、且つ１０  ＬＤ５０のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの相対体重。ｒｇＶＮ−ＰＲ８をワクチン接種したマウスには、２０００ｐｆｕのウイルスを投与した。
【図２５Ｃ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する有効性を示す。マウスを鼻腔内経路により１０３、１０４、又は１０５ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。２４ｄｐｉで、マウスを１０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１により攻撃した。マウスの体重を毎日モニタした。図２５Ａは、１０  ＬＤ５０のＡ／ベトナム／１２０３／０４で攻撃したマウスのログ・ランク生存分析である。１０３ｐｆｕ（図２５Ｂ）、１０４ｐｆｕ（図２５Ｃ）、又は１０５ｐｆｕ（図２５Ｄ）をワクチン接種し、且つ１０  ＬＤ５０のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの相対体重。ｒｇＶＮ−ＰＲ８をワクチン接種したマウスには、２０００ｐｆｕのウイルスを投与した。
【図２５Ｄ】Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する有効性を示す。マウスを鼻腔内経路により１０３、１０４、又は１０５ｐｆｕの用量でＰＩＶ５又はＺＬ４８に感染させた。２４ｄｐｉで、マウスを１０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１により攻撃した。マウスの体重を毎日モニタした。図２５Ａは、１０  ＬＤ５０のＡ／ベトナム／１２０３／０４で攻撃したマウスのログ・ランク生存分析である。１０３ｐｆｕ（図２５Ｂ）、１０４ｐｆｕ（図２５Ｃ）、又は１０５ｐｆｕ（図２５Ｄ）をワクチン接種し、且つ１０  ＬＤ５０のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１で攻撃したマウスの相対体重。ｒｇＶＮ−ＰＲ８をワクチン接種したマウスには、２０００ｐｆｕのウイルスを投与した。
【図２６Ａ】ＲＶ−Ｇタンパク質を発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ）の作成を示す。図２６ＡはｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの概略図である。ＮＰ、核タンパク質；Ｐ、リンタンパク質；Ｖ、Ｖタンパク質；Ｍ、基質タンパク質；ＳＨ、スモール疎水性タンパク質；Ｆ、融合タンパク質；ＨＮ、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質；Ｌ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。リーダー及びトレーラー配列は、ＰＩＶ５  ＲＮＡ複製にとって重要である。
【図２６Ｂ】ＲＶ−Ｇタンパク質を発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ）の作成を示す。図２６Ｂは、ＩＦＡを用いたＲＶ−Ｇ発現の検出を示す。マウス抗ＲＶ−Ｇ抗体を使用した間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によってｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染ＭＤＢＫ細胞でＲＶ−Ｇ発現を同定し、一方でＰＩＶ５感染細胞を陰性対照として使用した。
【図２６Ｃ】ＲＶ−Ｇタンパク質を発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ）の作成を示す。図２６Ｃは、ＷＢを用いたＲＶ−Ｇ発現の検出を示す。マウス抗ＲＶ−Ｇ抗体を使用したウエスタンブロッティング（ＷＢ）によってｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染ＭＤＢＫ細胞でＲＶ−Ｇ発現を調べ、ＰＩＶ５感染細胞を陰性対照とした。
【図２７Ａ】細胞におけるＰＩＶ５とｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇとの成長動態の比較である。図２７Ａは、マルチサイクル成長アッセイである。ＭＯＩ０．０１でＭＤＢＫ細胞においてＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇのマルチサイクル成長曲線を実施した。細胞培養物からの上清のアリコートを２４時間毎に感染後１２０時間まで採取した。上清のウイルス力価を、ＢＨＫ２１細胞におけるプラークアッセイにより決定した。値は、２つの独立した実験の結果の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図２７Ｂ】細胞におけるＰＩＶ５とｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇとの成長動態の比較である。図２７Ｂは、シングルサイクル成長アッセイである。ＭＯＩ５でＭＤＢＫ細胞においてＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇのシングルサイクル成長曲線を実施した。細胞培養物からの上清のアリコートを１２時間毎に感染後６０時間まで採取した。上清のウイルス力価を、ＢＨＫ２１細胞におけるプラークアッセイにより決定した。値は、２つの独立した実験の結果の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図２８】ｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧビリオンにおけるＲＶ−Ｇの取り込みを示す。１０％から８０％（ｗｔ／ｖｏｌ）へのショ糖勾配によってウイルス粒子を精製した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いることによりウイルスタンパク質を分析し、ＲＶ−Ｇに対するマウス抗体によるウエスタンブロット分析に供した。ＲＶ−Ｇタンパク質の位置を示す。
【図２９Ａ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇのプライム−ブースト免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）を１０倍希釈のｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０３ＰＦＵ〜１０６ＰＦＵ）により鼻腔内免疫した。対照マウスには１０６ＰＦＵのＰＩＶ５又はＰＢＳを接種した。プライムワクチン接種後３週間目、動物を同量のワクチンでブーストした。ブーストの１週間後、全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図２９ＡはＶＮＡ試験である。攻撃前に血清試料を採取し、迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）による狂犬病ウイルスに対するＶＮＡ力価の計測に使用した。簡潔に言えば、血清中のＶＮＡ力価を既知の標準（既知の濃度の国際単位（ＩＵ）毎ミリメートル溶液を含む）と比較した。１０６ＰＦＵと１０５ＰＦＵ、１０５ＰＦＵと１０４ＰＦＵの接種間のＶＮＡ力価は統計的に有意である（Ｐ値はそれぞれ０．０００１及び０．０００４である、これらはスチューデントのｔ検定を用いて計算される）；１０４ＰＦＵと１０３ＰＦＵとの間のＶＮＡ力価は統計的に差がない（Ｐ値は０．０６である）。
【図２９Ｂ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇのプライム−ブースト免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）を１０倍希釈のｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０３ＰＦＵ〜１０６ＰＦＵ）により鼻腔内免疫した。対照マウスには１０６ＰＦＵのＰＩＶ５又はＰＢＳを接種した。プライムワクチン接種後３週間目、動物を同量のワクチンでブーストした。ブーストの１週間後、全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図２９Ｂは生存率を示す。感染動物は狂犬病の臨床徴候について毎日、２２日間観察し、生存率をプロットした。
【図３０Ａ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの１用量免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）に１０倍希釈のｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０５ＰＦＵ〜１０７ＰＦＵ）を鼻腔内免疫し、又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０６ＰＦＵ〜１０８ＰＦＵ）を筋肉内ワクチン接種した。対照マウスに１０６ＰＦＵのＰＩＶ５を接種した。３週間後、各群の全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３０ＡはＶＮＡ試験である。攻撃前に血清試料を採取し、ＲＦＦＩＴによる狂犬病ウイルスに対するＶＮＡ力価の計測に使用した。ＩＮ  １０７と１０６ＰＦＵ、ＩＭ  １０７と１０６ＰＦＵとの間のＶＮＡ力価は統計的に有意である（Ｐ値はそれぞれ０．０１８及び０．００８である）。ＩＮ  １０６と１０５ＰＦＵ、ＩＭ  １０７と１０８ＰＦＵとの間のＶＮＡ力価は統計的に差がない（Ｐ値はそれぞれ０．１１及び０．４０２である）。
【図３０Ｂ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの１用量免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）に１０倍希釈のｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０５ＰＦＵ〜１０７ＰＦＵ）を鼻腔内免疫し、又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス（１０６ＰＦＵ〜１０８ＰＦＵ）を筋肉内ワクチン接種した。対照マウスに１０６ＰＦＵのＰＩＶ５を接種した。３週間後、各群の全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３０Ｂは生存率を示す。感染動物は狂犬病の臨床徴候について毎日、２２日間観察した。
【図３１Ａ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの経口免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）に１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの１用量を鼻腔内免疫し、又はＩＭ若しくは経口経路で１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルスをワクチン接種した。陽性対照として、マウスのある群をＩＭ経路により１×１０７ＦＦＵの狂犬病ワクチンＬＢＮＳＥ株で免疫した。対照マウスには１０６ＰＦＵのＰＩＶ５又はＰＢＳを接種した。３週間後、各群の全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３１ＡはＶＮＡ試験である。攻撃前に血清試料を採取し、ＲＦＦＩＴによる狂犬病ウイルスに対するＶＮＡ力価の計測に使用した。ＩＮ（１０６ＰＦＵ）とＩＭ（１０８ＰＦＵ）との間のＶＮＡ力価は統計的に差がない（スチューデントのｔ検定を用いて計算したＰ値は０．６６である）。経口とＩＮ又はＩＭとの間のＶＮＡ力価は統計的に有意である（Ｐ値はそれぞれ０．０３及び０．００３である）。
【図３１Ｂ】マウスにおける狂犬病攻撃に対するｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの経口免疫の有効性を示す。マウスの群（ｎ＝１０、各群）に１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの１用量を鼻腔内免疫し、又はＩＭ若しくは経口経路で１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルスをワクチン接種した。陽性対照として、マウスのある群をＩＭ経路により１×１０７ＦＦＵの狂犬病ワクチンＬＢＮＳＥ株で免疫した。対照マウスには１０６ＰＦＵのＰＩＶ５又はＰＢＳを接種した。３週間後、各群の全てのマウスをＩ．Ｃ．経路により５０  ＬＤ５０のＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３１Ｂは生存率を示す。感染動物は狂犬病の臨床徴候について毎日、２２日間観察した。
【図３２】卵内経路によりＰＩＶ５−Ｈ５を接種したニワトリの抗インフルエンザ抗体力価を示す。１００μｌのＰＩＶ５−Ｈ５を用いて１８日齢のＳＰＦ胚に卵内ワクチン接種した（力価は各群の下に示す）。孵化後（ａｈ）１４日目及び２８日目にニワトリを出血させた。血球凝集抑制（ｈｅｍａｇｇｌｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（ＨＩ）力価をＯＩＥ勧告に従い決定した。ｙ軸はＨＩ力価（ｌｏｇ２）である。１２羽のニワトリ（対照については１０羽のニワトリ）の平均力価及び該当する標準偏差が柱に示される。それぞれの同居させた非ワクチン接種接触ニワトリのＨＩ力価が、該当する柱の上にある。
【図３３】は、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の概略図を示す。ＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４８）は、ＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間にＨ５挿入を有する。ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５はＳＨ遺伝子が欠損している。ＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５は、Ｖタンパク質の保存されたＣ末端が欠損している。このウイルスの２つの異なる分離株が得られており、試験されることになる。ＳＨ欠失と保存されたＣ末端の欠失とを組み合わせてＰＩＶ５ＶΔＣΔＳＨ−Ｈ５が作製されている。ＳＨ又はＶΔＣの欠失により、マウスの減弱が引き起こされる。
【図３４Ａ】ＰＩＶ５−Ｈ５がＨＡをビリオンに取り込み、感染中にＨ５を発現することを示す。図３４ＡはＺＬ４８及びＺＬ４８のゲノムを示す概略図であり、Ｈ５ＨＡ遺伝子挿入の位置を示している。
【図３４Ｂ】ＰＩＶ５−Ｈ５がＨＡをビリオンに取り込み、感染中にＨ５を発現することを示す。図３４Ｂでは、ＭＤＢＫ細胞を、ＰＩＶ５、ＺＬ４８、又はＺＬ４６（ＭＯＩ＝０．１）に７２時間感染させ、上清（ｓｕｐｅｒｎａｔｅｎｔ）を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離してクマシーブルー染色により画像化した精製上清を比較した。
【図３４Ｃ】ＰＩＶ５−Ｈ５がＨＡをビリオンに取り込み、感染中にＨ５を発現することを示す。図３４Ｃでは、ＭＤＢＫ細胞を、ＰＩＶ５、ＺＬ４８、又はＺＬ４６（ＭＯＩ＝５）に感染させ、２４時間後に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦに移し、ＰＩＶ５のＶ／Ｐタンパク質に特異的なモノクローナル抗体及びＨＡを検出するためｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８に感染させたマウス由来の高度免疫血清でブロットした。サイズはｋＤａ単位である。
【図３４Ｄ】ＰＩＶ５−Ｈ５がＨＡをビリオンに取り込み、感染中にＨ５を発現することを示す。図３４Ｄでは、Ｖｅｒｏ細胞をＰＩＶ５又はＺＬ４６に感染させるか、又はモック感染させた。ｐ．ｉ．２４時間で、細胞を固定し、抗Ｈ５及び抗Ｖ／Ｐモノクローナル抗体で染色した。免疫蛍光顕微鏡写真を倍率２０倍で撮影した（バー、２００μｍ）。
【図３５Ａ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）  ＩＭで免疫した。免疫後７日目、１４日目及び２１日目にマウスを出血させた。血清は分析用にプールした。図３５Ａでは、ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）特異的ＥＬＩＳＡを用いて血清試料中のＨＡ（Ｈ５）特異的抗体力価を計測した。点線は検出限界を表す。
【図３５Ｂ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）  ＩＭで免疫した。免疫後７日目、１４日目及び２１日目にマウスを出血させた。血清は分析用にプールした。図３５Ｂは、免疫後血清中のｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８中和抗体力価を示す。マウスをＰＩＶ５、ＺＬ４６、又は致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８でＩＮ又はＩＭ免疫し、感染後１４日目又は２１日目に鼻洗浄（図３５Ｃ）及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）（図３５Ｄ）を実施した。ＨＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる分析用に試料をプールした。
【図３５Ｃ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）  ＩＭで免疫した。免疫後７日目、１４日目及び２１日目にマウスを出血させた。血清は分析用にプールした。図３５Ｂは、免疫後血清中のｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８中和抗体力価を示す。マウスをＰＩＶ５、ＺＬ４６、又は致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８でＩＮ又はＩＭ免疫し、感染後１４日目又は２１日目に鼻洗浄（図３５Ｃ）及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）（図３５Ｄ）を実施した。ＨＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる分析用に試料をプールした。
【図３５Ｄ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）  ＩＭで免疫した。免疫後７日目、１４日目及び２１日目にマウスを出血させた。血清は分析用にプールした。図３５Ｂは、免疫後血清中のｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８中和抗体力価を示す。マウスをＰＩＶ５、ＺＬ４６、又は致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８でＩＮ又はＩＭ免疫し、感染後１４日目又は２１日目に鼻洗浄（図３５Ｃ）及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）（図３５Ｄ）を実施した。ＨＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる分析用に試料をプールした。
【図３５Ｅ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）  ＩＭで免疫した。免疫後７日目、１４日目及び２１日目にマウスを出血させた。血清は分析用にプールした。図３５Ｅは、ＥＬＩＳｐｏｔ分析により決定するときのワクチン接種後１２日目の縦隔リンパ節におけるＩＦＮ−γ産生リンパ球（ｎ＝３マウス／群のプール）を示す。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図３６Ａ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＰＡＩ攻撃を防御することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）、不活化ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ｉＺＬ４６）  ＩＭ、致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＮ、又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＭでＩＮ又はＩＭ免疫した。ｐ．ｉ．２８日でマウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＶＮ／１２０３／０４によりＩＮ攻撃した。図３６Ａでは、マウスの体重をモニタし、その攻撃前の体重に対する割合の平均値±ＳＥＭとして提示した（ｎ＝８）。
【図３６Ｂ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＰＡＩ攻撃を防御することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）、不活化ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ｉＺＬ４６）  ＩＭ、致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＮ、又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＭでＩＮ又はＩＭ免疫した。ｐ．ｉ．２８日でマウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＶＮ／１２０３／０４によりＩＮ攻撃した。図３６Ｂは、攻撃後生き残ったマウスの割合を示す。
【図３６Ｃ】生ＰＩＶ５−Ｈ５による免疫化がＨＰＡＩ攻撃を防御することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）、不活化ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ｉＺＬ４６）  ＩＭ、致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＮ、又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＭでＩＮ又はＩＭ免疫した。ｐ．ｉ．２８日でマウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＶＮ／１２０３／０４によりＩＮ攻撃した。図３６Ｃは、攻撃後３日目にＭＤＣＫ細胞に対するＴＣＩＤ５０により計測したときの肺における攻撃ウイルス力価を示す（ｎ＝５／群）。データは、平均対数変換ＴＣＩＤ５０／ｍｌ肺ホモジネート±ＳＥＭとして提示する。検出限界は１００  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【図３７Ａ】ＰＩＶ５−Ｈ５によるブーストがＨＡ特異的抗体反応を増強することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４  ＩＭ（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）で免疫した。免疫後７日目、１４日目、及び２１日目にマウスを出血させた。免疫後２８日目、マウスを前回と同じくブーストし、ブースト後７日目及び１４日目に血清を採取した。血清は分析用にプールした。図３７Ａでは、ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを用いて血清試料中のＨＡ（Ｈ５）特異的抗体力価を計測した。点線は検出限界を表す。
【図３７Ｂ】ＰＩＶ５−Ｈ５によるブーストがＨＡ特異的抗体反応を増強することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４  ＩＭ（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）で免疫した。免疫後７日目、１４日目、及び２１日目にマウスを出血させた。免疫後２８日目、マウスを前回と同じくブーストし、ブースト後７日目及び１４日目に血清を採取した。血清は分析用にプールした。図３７Ｂは、免疫後血清中のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８中和抗体力価を示す。マウスをｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８で攻撃し、攻撃後３日目に、ＭＤＣＫ細胞に対するＴＣＩＤ５０により計測したときの肺におけるウイルス力価を計測した（ｎ＝５／群）。データは、平均対数変換ＴＣＩＤ５０／ｍｌ肺ホモジネート±ＳＥＭとして提示する。検出限界は１００  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【図３７Ｃ】ＰＩＶ５−Ｈ５によるブーストがＨＡ特異的抗体反応を増強することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、ＰＩＶ５  ＩＮ、ＺＬ４６  ＩＮ若しくはＩＭ、不活化ＺＬ４６  ＩＭ（ｉＺＬ４６）、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４  ＩＭ（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）で免疫した。免疫後７日目、１４日目、及び２１日目にマウスを出血させた。免疫後２８日目、マウスを前回と同じくブーストし、ブースト後７日目及び１４日目に血清を採取した。血清は分析用にプールした。図３７Ｃでは、マウスをｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８で攻撃し、攻撃後３日目に、ＴＣＩＤ５０により肺におけるウイルス力価を計測した（ｎ＝５／群）。
【図３８】ＰＩＶ５−ＮＰウイルスの概略図であり、ＰＩＶ５ゲノムは、３’−ＮＰ−Ｖ／Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＳＨ−ＨＮ−Ｌ−５’の順番で７つの遺伝子を含み、ゲノムの端部にリーダー及びトレーラー領域が位置する。ＰＩＶ５ゲノムの指示される遺伝子接合部にＨ５Ｎ１−ＮＰ遺伝子を挿入した。
【図３９Ａ】ＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌのインビトロ及びインビボ成長を示す。図３９Ａは、組織培養細胞におけるＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの多段階成長曲線を示す。ＭＤＢＫ細胞を、ＭＯＩ０．１でＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌに感染させ、２４時間毎に培地を採取した。ＢＨＫ細胞に対するプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【図３９Ｂ】ＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌのインビトロ及びインビボ成長を示す。図３９Ｂでは、マウスに１０５ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌを鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後３日目にマウスを安楽死させて肺ウイルス力価を決定した。
【図４０】ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌによって誘導されたマウスにおけるＮＰ抗体値を示す。マウスに１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１を鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、血液試料を採取し、血清を調製した。精製Ｈ５Ｎ１−ＮＰを使用して、製造者の指示（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）に従いＥＬＩＳＡを実施した。
【図４１】ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌによって誘導されたマウスにおけるＴ細胞応答を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は０．１  ＬＤ５０のＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝５／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを犠牲にし、脾臓を採取した。脾細胞を、Ｆｌｕ−ＮＰ、陰性対照としてのエボラＧＰ  Ｐ２、又は陽性対照としてのＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激した。結果は、１０６脾細胞当たりの平均サイトカイン分泌細胞数として提示する。
【図４２Ａ】Ｈ１Ｎ１攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した。体重減少（図４２Ａ）及び生存率（図４２Ｂ）を攻撃後１４日間、毎日モニタした。体重減少は、元の（攻撃当日の）体重に対する割合の平均として提示する。
【図４２Ｂ】Ｈ１Ｎ１攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した。体重減少（図４２Ａ）及び生存率（図４２Ｂ）を攻撃後１４日間、毎日モニタした。体重減少は、元の（攻撃当日の）体重に対する割合の平均として提示する。
【図４２Ｃ】Ｈ１Ｎ１攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した。図４２Ｃは、Ｈ１Ｎ１で攻撃したマウスの肺力価を示す。攻撃後３日目にマウス（ｎ＝５）を犠牲にした。ＭＤＣＫ細胞を使用したＴＣＩＤ５０アッセイを用いて力価を決定した。
【図４３Ａ】Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌをワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。体重減少（図４３Ａ）及び生存率（図４３Ｂ）をインフルエンザウイルス攻撃後１６日間モニタした。
【図４３Ｂ】Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌをワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。体重減少（図４３Ａ）及び生存率（図４３Ｂ）をインフルエンザウイルス攻撃後１６日間モニタした。
【図４４Ａ】ＮＰを発現する組換えＰＩＶ５の分析を示す。図４４Ａは、ＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰウイルスの多段階成長曲線を示す。ＭＤＢＫ細胞をＭＯＩ０．１でＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルスに感染させ、２４時間毎に培地を採取した。ＢＨＫ細胞を使用したプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【図４４Ｂ】ＮＰを発現する組換えＰＩＶ５の分析を示す。図４４Ｂは、ＰＩＶ５−ＮＰウイルス感染細胞におけるＨ５Ｎ１−ＮＰ発現レベルを示す。ＭＤＢＫ細胞をＭＯＩ５でＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルスに感染させた。Ｈ５  ＮＰとＰＩＶ５−ＶＰとのＭＦＩ比をフローサイトメトリーにより調べた。
【図４４Ｃ】ＮＰを発現する組換えＰＩＶ５の分析を示す。図４４Ｃは、ＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰウイルスのインビボ成長を示す。マウスに、１０５ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルスを鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後３日目にマウスを安楽死させて肺ウイルス力価を決定した。
【図４５】ＰＩＶ５−ＮＰウイルスがＴ細胞応答をプライミングすることを示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルス、又は０．１  ＬＤ５０のＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝５／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを犠牲にし、脾臓を採取した。脾細胞を、Ｆｌｕ−ＮＰ、エボラＧＰ  Ｐ２、又はＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激した。結果は、１０６脾細胞当たりの平均サイトカイン分泌細胞数として提示する。
【図４６Ａ】Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰウイルスの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルス、又は２０００ｐｆｕのｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを２０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。体重減少（図４６Ａ）及び生存率（図４６Ｂ）をインフルエンザウイルス攻撃後１４日間モニタした。体重減少を、元の（攻撃当日の）体重に対する割合の平均としてグラフ化する。
【図４６Ｂ】Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰウイルスの防御を示す。マウスに、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰウイルス、又は２０００ｐｆｕのｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した（ｎ＝１０／群）。ワクチン接種後２１日目、マウスを２０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。体重減少（図４６Ａ）及び生存率（図４６Ｂ）をインフルエンザウイルス攻撃後１４日間モニタした。体重減少を、元の（攻撃当日の）体重に対する割合の平均としてグラフ化する。
【図４７Ａ】Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の概略図を示す。図４７Ａにおいて、ＰＩＶ５ゲノム内の既定の挿入部位は、ＨＮとＬとの遺伝子間の接合部である。ＨＮとＬとの遺伝子間以外への挿入については、組換えウイルスの後ろに遺伝子接合部が加えられる。例えば、ＳＨとＨＮとの遺伝子間へのＨ５の挿入は、ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＳＨ−ＨＮである。挿入された遺伝子には、転写に必要なＰＩＶ５由来の遺伝子開始、遺伝子終了及び接合部配列が隣接した。
【図４７Ｂ】Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の概略図を示す。図４７Ｂでは、ＰＩＶ５ゲノム内の既定の挿入部位は、ＳＨとＨＮとの遺伝子間の接合部である。ワクチンに対するＰ−Ｓ３０８突然変異の効果を試験する際には、ウイルス遺伝子発現に対する影響が最小限となるように、遺伝子はＨＮとＬとの遺伝子間の接合部に挿入される。
【図４８】生じさせようとする狂犬病ウイルス抗原を発現する組換えＰＩＶ５の概略図を示す。ＰＩＶ５ゲノム内の初期試験用の既定の挿入部位は、ＨＮとＬとの遺伝子間の接合部であるが、さらなる挿入部位もまた利用し得る。
【図４９Ａ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ａは、ＲＳＶ抗原Ｆ及びＧを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｂ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｂは、ニパウイルス抗原Ｆ及びＧを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｃ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｃは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原８５Ａ、８５Ｂ及びＥＳＡＴ６を発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｄ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｄは、ＰＲＲＳＶ抗原を発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｅ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｅは、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）抗原を発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｆ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｆは、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）抗原Ｔｓを発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｇ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｇは、ノロウイルス抗原を発現するＰＩＶ５の概略図を示す。
【図４９Ｈ】様々なＯＰＩＶ５抗原コンストラクトの概略図を示す。図４９Ｈは、ＨＩＶ抗原Ｅｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１４０又はｇｐ１２０及びＧａｇ）を発現するＰＩＶ５概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）は、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２型及び４型、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスなど、多くの重要なヒト及び動物病原体を含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）のメンバーである。ＰＩＶ５は、以前はシミアンウイルス５型（ＳＶ５）として知られていた。ＰＩＶ５は多くの動物及びヒトに感染するウイルスであるが、ヒトにおいて知られる症状又は疾患のなかで、ＰＩＶ５と関連付けられているものはない。多くのパラミクソウイルスと異なり、ＰＩＶ５はほとんど細胞変性効果なしに正常細胞に感染する。マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるため、ＰＩＶ５のゲノムは極めて安定している。ＰＩＶ５はそのライフサイクルにＤＮＡ相を有さず、且つ細胞質においてのみ複製するため、ＰＩＶ５は宿主ゲノムに組み込まれることができない。従って、ＰＩＶ５をベクターとして使用すると、宿主細胞ＤＮＡの遺伝子修飾によって意図しない帰結となる可能性が回避される。ＰＩＶ５は、ＷＨＯ及びＦＤＡによってワクチン製造に承認されているＶｅｒｏ細胞を含め、細胞において高力価に成長することができる。従って、ＰＩＶ５はワクチンベクターとして多くの利点を呈する。
【００４３】
本発明はＰＩＶ５コンストラクトを提供し、改良ワクチンベクターとしての使用を含めた、ウイルス発現ベクターとしてのＰＩＶ５の有効性を向上させるＰＩＶ５のゲノム内の突然変異を同定する。本発明のワクチンベクターは、種々の野生型株、突然変異株、又は組換え（ｒＰＩＶ５）株のいずれをベースとしてもよい。野生型株としては、限定はされないが、ＰＩＶ５株Ｗ３Ａ、ＷＲ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＶＲ−２８８（商標））、イヌパラインフルエンザウイルス株７８−２３８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５７３）（Ｅｖｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ；１７７：１１３２−１１３４；及びＥｖｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ；６８：１６５−１７２）、イヌパラインフルエンザウイルス株Ｄ００８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３９９）（Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ；１２６：１４０−１４５）、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、種子伝染性潜伏ウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔ１及びＳＥＲが挙げられる。例えば、Ｃｈａｔｚｉａｎｄｒｅｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ；８５（Ｐｔ  １０）：３００７−１６；Ｃｈｏｐｐｉｎ，１９６４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：２３：２２４−２３３；及びＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；２７：２１８−２２３を参照のこと。加えて、市販のケンネルコフワクチン、例えば、ＢＩ、ＦＤ、Ｍｅｒｃｋ、及びＭｅｒｉａｌワクチンなどに使用されているＰＩＶ５株を用いてもよい。
【００４４】
ＰＩＶ５ワクチンベクターは、限定はされないが、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７（２）：２４９−６０，１９９７）にさらに詳細に記載される逆遺伝学系を含めた種々の方法のいずれかを用いて構築され得る。図１はＰＩＶ５ゲノム構造を示す。ＰＩＶ５は８つのウイルスタンパク質をコードする。ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）及びラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質は、ウイルスＲＮＡゲノムの転写及び複製に重要である。Ｖタンパク質は、ウイルス病原性並びにウイルスＲＮＡ合成において重要な役割を果たす。糖タンパク質である融合（Ｆ）タンパク質は、細胞−細胞間及びウイルス−細胞間の両方の融合をｐＨ非依存的に媒介し、細胞へのウイルス侵入に必須である。Ｆタンパク質の構造は決定されており、効率的な融合にとって決定的なアミノ酸残基が同定されている。別のウイルス糖タンパク質であるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）もまた、ウイルス侵入及び宿主細胞からの放出に関与する。基質（Ｍ）タンパク質は、ウイルス集合及び出芽において重要な役割を果たす。疎水性（ＳＨ）タンパク質は４４残基の疎水性内在性膜タンパク質であり、膜においてそのＮ末端が細胞質に向いている。パラミクソウイルスの分子生物学のレビューに関しては、例えば、Ｗｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；２８３：６１−１１９；及びＬａｍｂ  ＆  Ｐａｒｋｓ，（２００６）．Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（パラミクソウイルス科：ウイルスとその複製）。所収Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｎ，ｐｐ．１４４９−１４９６．編者Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ  ＆  Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと。本発明のＰＩＶ５ウイルスワクチンはまた、これらの８つのタンパク質の１つ以上に突然変異、改変、又は欠失も有し得る。
【００４５】
ＰＩＶ５はヒトに感染し得るが（Ｈｓｉｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；９４：６７−７３）、知られている病気のなかで、それと関連付けられているものはない。ＰＩＶ５はマウス及びハムスターに感染するが、それらの動物に症状を引き起こすことはない。ＰＩＶ５は、細胞で成長させて、最大１×１０８ｐｆｕ／ｍｌの力価で培地に放出させることができ、安全な遺伝子送達ベクター及び可能な費用対効果の高いウイルス量産方法としてのその潜在力が示唆される。現在までのエビデンスは全て、ＰＩＶ５がシミアンウイルスではないことを示している。１９７０年代には、ＰＩＶ５が、多発性硬化症（ＭＳ）、亜急性硬化性全脳炎（ｓｕｂａｃｕｔｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｐａｎｅｎｃｅｐａｌｉｔｉｓ）（ＳＳＰＥ）、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、天疱瘡、アテローム性動脈硬化症、パジェット病、肝炎及びかぜを含む数多くの病気に関連しているのではないかという全く事実無根の憶測があったが、ＰＩＶ５がヒトにおいて疾患を引き起こすという説得力のある証拠はない。その後の研究により、これらの疾患のいずれについても、ＰＩＶ５は病原因子から除外されている。このウイルスは、２００９年にパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）と改名された。
【００４６】
ネガティブ非分節型一本鎖ＲＮＡウイルス（ＮＮＳＶ）であるＰＩＶ５は、そのライフサイクルにＤＮＡ相を有さず、従って組換え又は挿入による宿主細胞ＤＮＡの遺伝子修飾が意図しない帰結となる可能性が回避されるため、ワクチン開発に適したウイルスベクター候補である。ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスと比較して、ＰＩＶ５のゲノム構造は安定している。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する組換えＰＩＶ５が作成されており、ＧＦＰ遺伝子は１０世代超にわたり維持された。ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは組み換わり、多くの場合に挿入された外来遺伝子がすぐに欠失するため、従ってワクチンベクターとして、ＰＩＶ５はポジティブ鎖ＲＮＡウイルスより好適である。また、ＰＩＶ５は、一次ヒト細胞並びに樹立ヒト細胞株を含めた広範囲の細胞型に感染する。ＰＩＶ５抗原がＨＰＩＶ２及びムンプスウイルスに対する抗体と交差反応する可能性を考えると、ＰＩＶ５をワクチンベクターとして使用することは懸念され得る。しかしながら、マウスにおいてはＰＩＶ５に対する中和抗体はＰＩＶ５感染を阻止しないため（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４（１１）：５４０３−１１）、ヒトにおけるＰＩＶ５に対する交差反応性抗体がＰＩＶ５感染を阻止する可能性は低い。実施例２は、ＰＩＶ５ベースのベクターが、循環抗ＰＩＶ５抗体力価を有するイヌを含め、イヌにおいて有効となり得ることの、初めての実証である。
【００４７】
異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムの様々な位置のいずれに挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入されてもよい。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間の位置には挿入されない。
【００４８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間以外の位置に挿入される。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入されてもよい。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流には挿入されない。
【００４９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列の直ちに下流に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子と基質タンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入されてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入されてもよい。
【００５０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間には挿入されない。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入され、且つＰＩＶ５ゲノムが１つ以上の突然変異をさらに含み得る。
【００５１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はインフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）をコードし、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入される。
【００５２】
本発明は、本明細書と共に含まれる任意の図及び実施例に示されるとおりの位置に異種ヌクレオチド配列が挿入されたＰＩＶ５ワクチンコンストラクトを含む。
【００５３】
異種ヌクレオチド配列を挿入することにより、ＰＩＶ５ゲノム内のＰＩＶ５遺伝子の全て又は一部を置換してもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列が、ＰＩＶ５ゲノムのＦ、ＨＮ、又はＳＨ遺伝子を置換してもよい。一部の実施形態では、例えば、インフルエンザＨＡ又はＮＡをコードする異種ヌクレオチド配列が、ＰＩＶ５遺伝子を置換してもよい。一部の実施形態では、ＨＡ又はＮＡインフルエンザ遺伝子がＰＩＶ５  Ｆ又はＨＮ遺伝子の一部を置換してもよい。
【００５４】
異種ヌクレオチド配列をＰＩＶ５遺伝子内に挿入することで、キメラポリペプチドの発現がもたらされ得る。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入されてもよい。
【００５５】
ＰＩＶ５は、細胞を多くの細胞型でほとんど細胞変性効果（ＣＰＥ）なしに生産的に感染させることができる。細胞型によっては、ＰＩＶ５感染により合胞体の形成、すなわち多くの細胞が一体となる融合が引き起こされ、細胞死に至る。突然変異には、合胞体形成を促進する１つ以上の突然変異が含まれ得る（例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２７０：１７−３０を参照のこと）。
【００５６】
ＰＩＶ５感染はアポトーシスを誘導しない（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７５：４０６８−４０７９。しかしながら、ＳＨが欠損した組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５  ΔＳＨ）は、Ｌ９２９細胞において腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−γ媒介性外因性アポトーシス経路を経るアポトーシスを誘導する（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７５：４０６８−４０７９；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２５０：３０−４０；及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７７：３３７１−３３８３）。
【００５７】
ＰＩＶ５のＶタンパク質は、ウイルスにより誘導されたアポトーシスの遮断において決定的な役割を果たす。Ｖタンパク質の保存されたシステインリッチのＣ末端が欠損した組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５Ｖ  ΔＣ）は、様々な細胞において、おそらくは小胞体（ＥＲ）ストレスにより惹起される内因性アポトーシス経路を経るアポトーシスを誘導する（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７８：５０６８−５０７８）。Ｖ／Ｐ遺伝子産物のＮ末端に突然変異を有する突然変異体組換えＰＩＶ５、例えばｒＰＩＶ５−ＣＰＩ−もまた、アポトーシスを誘導する（Ｗａｎｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，２００２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７６：１０１０９−１０１２１）。突然変異には、限定はされないが、ｒＰＩＶ５  ΔＳＨ、ｒＰＩＶ５−ＣＰＩ−、ｒＰＩＶ５ＶΔＣ、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００５８】
突然変異には、限定はされないが、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、及び／又は合胞体形成を増強する突然変異が含まれる。
【００５９】
突然変異としては、限定はされないが、ｒＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ−ＣＰＩ−、ｒＰＩＶ５−ＣＰＩ−、ｒＰＩＶ５−ＣＰＩ＋、ｒＰＩＶ５Ｖ  ΔＣ、ｒＰＩＶ−Ｒｅｖ、ｒＰＩＶ５−ＲＬ、ｒＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ１５７Ａ、ｒＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ａ、ｒＰＩＶ５−Ｌ−Ａ１９８１Ｄ及びｒＰＩＶ５−Ｆ−Ｓ４４３Ｐ、ｒＰＩＶ５−ＭＤＡ７、ｒＰＩＶ５  ΔＳＨ−ＣＰＩ−、ｒＰＩＶ５  ΔＳＨ−Ｒｅｖ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００６０】
本発明のＰＩＶ５ワクチンは、本明細書と共に含まれる図及び実施例に記載されるコンストラクトの任意の１つ以上を含めた、本明細書に記載される突然変異の任意の１つ以上を含む組換えＰＩＶ５コンストラクトを含む。
【００６１】
本発明のＰＩＶ５ウイルス発現ベクターは、異種ヌクレオチド配列を含む。かかる異種ヌクレオチド配列は、例えば、異種ＤＮＡ、異種ＲＮＡ、及び／又は異種ポリペプチドをコードし得る。一部の態様において、異種ヌクレオチド配列は異種ポリペプチド、又はその断片をコードし得る。かかるポリペプチドは抗原性で、ワクチンとしての有用性を有し得る。かかる抗原性ポリペプチドは、ヒト及び／又は動物を罹患させる多種多様な病原体及び疾患のいずれに由来してもよい。一部の態様において、異種ポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリメタニューモウイルス、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ブタインフルエンザ、ヒトカリシウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、動物カリシウイルス、ヒトノロウイルス、動物ノロウイルス、牛疫ウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、又はヒト及び動物における新興インフルエンザウイルスに由来してもよい。一部の態様において、異種ポリペプチドは細菌又は寄生体に由来してもよい。一部の態様において、異種ポリペプチドは癌抗原であってもよい。
【００６２】
一部の態様において、異種ポリペプチドは、限定はされないが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＣ型インフルエンザを含むインフルエンザウイルス由来である。インフルエンザは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）におけるネガティブセンスの分節性ＲＮＡウイルスである。これは、主要な抗原表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づき亜型に分類される。これまでに１７種の異なるＨＡ亜型及び９種の異なるＮＡ亜型があり、全てがトリ起源の分節を含む。インフルエンザは再集合能力を有し、従って遺伝子分節の交換により、集団が免疫的に未感作である新しいインフルエンザウイルスを作り出す。異種ポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＳ１又はＮＳ２であってもよい。ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＳ１、又はＮＳ２は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ１Ｎ１株由来であってもよい。
【００６３】
ＨＡは、例えば、Ａ型インフルエンザＨ１亜型、Ａ型インフルエンザＨ２亜型、Ａ型インフルエンザＨ３亜型、Ａ型インフルエンザＨ４亜型、Ａ型インフルエンザＨ５亜型、Ａ型インフルエンザＨ６亜型、Ａ型インフルエンザＨ７亜型、Ａ型インフルエンザＨ８亜型、Ａ型インフルエンザＨ９亜型、Ａ型インフルエンザＨ１０亜型、Ａ型インフルエンザＨ１１亜型、Ａ型インフルエンザＨ１２亜型、Ａ型インフルエンザＨ１３亜型、Ａ型インフルエンザＨ１４亜型、Ａ型インフルエンザＨ１５亜型、又はＡ型インフルエンザＨ１６亜型由来であってもよい。ＨＡは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ１Ｎ１株由来であってもよい。一部の態様において、ＨＡポリペプチドは、切断を防止する突然変異を含み得る。
【００６４】
ＮＡは、例えば、Ａ型インフルエンザのＡ型インフルエンザＮ１亜型、Ａ型インフルエンザＮ２亜型、Ａ型インフルエンザＮ３亜型、Ａ型インフルエンザＮ４亜型、Ａ型インフルエンザＮ５亜型、Ａ型インフルエンザＮ６亜型、Ａ型インフルエンザＮ７亜型、Ａ型インフルエンザＮ８亜型、又はＡ型インフルエンザＮ９亜型由来であってもよい。ＮＡは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ１Ｎ１株由来であってもよい。
【００６５】
異種ポリペプチドとしては、本明細書と共に含まれる図及び実施例に記載される任意のものが含まれる。
【００６６】
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）感染は、ヒトを含む温血動物において、曝露後治療しない場合に初期の急性脳炎及び後期の致死により特徴付けられる狂犬病を引き起こす（Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ；４：１０２１−１０３８）。未治療の狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）感染は死亡に至る。ＲＡＢＶ感染症の予防には、ワクチン及び曝露後治療が有効となっている。しかしながら、費用が原因となって、発展途上国では狂犬病ワクチン接種及び治療はあまり用いられていない。狂犬病が原因で毎年５万５千人が死亡している。野良犬、野生食肉類及びコウモリは、野外ＲＡＢＶの自然界の保菌動物であり、これらの狂犬病キャリアはヒト及び家畜にとって公衆衛生上のリスクである。ヒト狂犬病の発生原因は、大半が、動物のワクチン接種が限られている発展途上国、特に農村地域で野良犬に噛まれることである。有効な且つ費用対効果の高い狂犬病ワクチンが必要とされている。一部の態様において、異種ポリペプチドは１つ以上の狂犬病ポリペプチドである。
【００６７】
本明細書に記載されるとおりのＰＩＶ５ウイルス発現ベクターは、ワクチンベクターの有効性の増強を実証し得る。
【００６８】
ＰＩＶ５ウイルス発現ベクターは、限定はされないが、本明細書に記載される任意のものを含め、１つ以上の突然変異を含み得る。一部の態様において、２つ以上（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれ以上）の突然変異の組み合わせが有利であり得るとともに、活性の増強を実証し得る。
【００６９】
以前、ＰＩＶ５を生ワクチンベクターとして使用することの実行可能性を試験するため、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子が、ＰＩＶ５ゲノムに追加の遺伝子としてヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージ（Ｌ）ポリメラーゼ遺伝子との間に挿入された。ＵｄｏｒｎのＨＡ遺伝子を含む組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｈ３）が回収され、それがインビトロ及びインビボの両方で野生型ＰＩＶ５と同様に複製された。ｒＰＩＶ５−Ｈ３感染細胞により発現されたＨＡタンパク質がビリオンに組み込まれ、ＨＡ遺伝子の追加によってはマウスにおけるウイルスの病原性は増加しなかった。生ワクチンとしてのｒＰＩＶ５−Ｈ３の有効性が調査されており、単一用量接種でＡ型インフルエンザウイルス感染に対して広域の相当な免疫が提供される（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２（１）：１３９−５０）。従って、一部の態様において、本発明はＴｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２（１）：１３９−５０のＰＩＶ５ウイルスコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、ｒＰＩＶ５−ＨＡを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、ＰＩＶ５ゲノムに追加の遺伝子としてヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージ（Ｌ）ポリメラーゼ遺伝子との間に挿入されたＡ型インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、ＰＩＶ５ゲノムに追加の遺伝子としてヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージ（Ｌ）ポリメラーゼ遺伝子との間に挿入されたＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、ＰＩＶ５ゲノムに追加の遺伝子としてヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージ（Ｌ）ポリメラーゼ遺伝子との間に挿入されたＡ型インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部の態様において、本発明は、ＰＩＶ５ゲノムに追加の遺伝子としてヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージ（Ｌ）ポリメラーゼ遺伝子との間に挿入されたポリペプチドを発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。例えば、一部���態様において、本発明は、この段落に記載されるＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトの１つ以上の作製又は使用方法を含まない。
【００７０】
さらに、一部の態様において、本発明は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。一部の態様において、本発明は、検出可能なマーカーを発現するＰＩＶ５ウイルスベクターコンストラクトを含まない。
【００７１】
これまでに、インフルエンザウイルスのＨＡを発現するＰＩＶ５が免疫を提供することは実証されているが、本発明は、意外にも、ＰＩＶ５ベースのウイルスベクターがインフルエンザＮＡ及びＮＰタンパク質を発現して防御レベルの免疫の発生をもたらすことを実証する。ＨＡは極めて免疫原性が高く、多くのベクターが抗ＨＡ免疫を生じさせる能力を有する。しかしながら、所与の発現ベクターがＨＡに対する発現及び免疫をもたらすことが分かったからといって、同じベクターが他のタンパク質、例えばインフルエンザウイルスのＮＡ又はＮＰなどに対する発現及び免疫応答の発生に有用であると見なすことはできない。これは、アデノウイルスウイルス（ＡｄＶ）及びニューカッスル病（ＮＤＶ）の両方のベクターでの研究によって示される。両ベクターとも免疫を生じさせるためＨＡを発現することができるが、ＮＡ又はＮＰの発現に使用される場合、免疫を生じない。本明細書に記載されるとおりのＰＩＶ５ウイルスベクターが防御免疫の発生をもたらしたことは、新しく、予想外である。
【００７２】
一部の態様において、本発明のウイルス発現ベクターは多価であり、２種以上の供給源、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、又はそれ以上の供給源由来の異種ポリペプチドを発現する。
【００７３】
また、本発明には、本明細書に記載されるとおりの異種ポリペプチドを発現する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むＰＩＶ５ゲノムを含むビリオン及び感染性ウイルス粒子も含まれる。
【００７４】
また、本発明には、本明細書に記載されるとおりの、ウイルスコンストラクト又はビリオンの１つ以上を含む組成物も含まれる。かかる組成物は薬学的に許容可能な担体を含み得る。使用に際して薬学的に許容可能な担体とは、ヒト又は他の脊椎動物への投与に好適な１つ以上の適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を指す。かかる担体はパイロジェンフリーであってもよい。本発明はまた、本明細書に記載されるウイルスベクター及び組成物の作製及び使用方法も含む。
【００７５】
本開示の組成物は、選択された投与経路に適した種々の形態の医薬製剤に製剤化されてもよい。当業者は、投与方法及び投薬量単位に応じて組成物が異なり得ることを理解するであろう。
【００７６】
この発明の薬剤は、限定はされないが、静脈内、局所、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内送達を含め、種々の方法で投与することができる。一部の態様において、本発明の薬剤は、制御放出又は持続放出用に製剤化されてもよい。
【００７７】
本明細書に含まれる例に示されるとおり、ＰＩＶ５−Ｈ５による筋肉内又は鼻腔内免疫はＨＡ特異的免疫応答を誘導する。鼻腔内免疫の一つの利点は、粘膜免疫応答を誘導する潜在力である。概して気道又は腸上皮細胞で複製するインフルエンザウイルスとは異なり、ＰＩＶ５はより広い細胞向性の潜在力を有する。この特徴により、ＰＩＶ５は、生筋肉内ワクチンとしての使用に魅力的な候補となっている。ＰＩＶ５−Ｈ５による筋肉内免疫は、鼻腔内免疫と比較してロバストなＨＡ特異的及び中和血清抗体反応を誘導する。さらに、その筋肉内免疫は、このワクチンを他の注射ワクチンと組み合わせるとともに、農業適用に魅力的であり得る注射ワクチン製剤とも組み合わせる機会を提供する。
【００７８】
また、本発明には、限定はされないが、本明細書に記載される任意のものを含めた、ＰＩＶ５ウイルス発現ベクターの作製及び使用方法も含まれる。
【００７９】
例えば、本発明は、細胞を本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と接触させるか、又はそれに感染させることにより、細胞において異種ポリペプチドを発現させる方法を含む。
【００８０】
例えば、本発明は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することにより、対象において異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を含む。免疫応答には、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が含まれ得る。この免疫応答は、自然及び／又は適応免疫応答を増強し得る。
【００８１】
例えば、本発明は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することにより、対象において異種ポリペプチドを発現させる方法を含む。
【００８２】
例えば、本発明は、本明細書に記載されるとおりのウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することにより、対象をワクチン接種する方法を含む。
【００８３】
本発明の方法では、種々の投与方法のいずれが用いられてもよい。例えば、投与は、静脈内、局所、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、卵内、母性由来などであってもよい。一部の態様では、投与は、粘膜表面に対する投与である。ワクチンは、ワクチンを飲用水中に入れることによるか、又は動物の環境に噴霧することによるなど、大量投与技法により投与されてもよい。注射により投与される場合、免疫原性組成物又はワクチンは非経口的に投与されてもよい。非経口投与には、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、又は腹腔内注射による投与が含まれる。
【００８４】
本開示の薬剤は一度に投与されてもよく、又は時間間隔をおいて投与するいくつかの複数回用量に分割されてもよい。例えば、本発明の薬剤は、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８回、又はそれ以上、繰り返し投与されてもよく、又は持続注入により投与されてもよい。正確な投薬量及び治療期間は、治療される疾患に応じて変わり、既知の試験プロトコルを用いて実験的に決定しても、又はインビボ若しくはインビトロ試験データから推定することにより決定してもよいことが理解される。濃度及び投薬量の値もまた、緩和しようとする病態の重症度に伴い異なり得ることは注記されるべきである。さらに、任意の特定の対象について、時間の経過とともに、個別的な必要性及び組成物の投与者又はその投与の監督者の専門的な判断に従い具体的な投薬レジメンを調整しなければならないこと、並びに、本明細書に示されるいずれの濃度範囲も例示に過ぎず、特許請求される組成物及び方法の範囲又は実施を限定するよう意図するものではないことが理解されるべきである。
【００８５】
一部の治療実施形態において、薬剤の「有効量」は、少なくとも１つの病理学的パラメータの低下をもたらす量である。従って、例えば、本開示の一部の態様において有効量とは、その薬剤で治療されない個体で予想されるパラメータの低下と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の低下を実現するのに有効な量である。
【００８６】
一部の態様では、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２２８９８号明細書「ＰＩＶ５  ａｓ  ａｎ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ（腫瘍退縮剤としてのＰＩＶ５）」、発明者Ｂｉａｏ  Ｈｅ、２０１３年１月２４日出願（本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるＰＩＶ５ベースのコンストラクト及び方法のいずれかを、本発明において用いてもよい。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、例えば哺乳類を含めた、生物を表す。哺乳類としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、及び他の非ヒト脊椎動物が挙げられる。対象は、「個体」、「患者」、又は「宿主」であってもよい。非ヒト脊椎動物としては、家畜動物（限定はされないが、ウシ、ウマ、ヤギ、及びブタなど）、家庭内ペット又は伴侶動物、限定はされないが、イヌ又はネコなど、及び実験動物が挙げられる。非ヒト対象としてはまた、非ヒト霊長類並びにげっ歯類、限定はされないが、ラット又はマウスなども挙げられる。非ヒト対象としてはまた、限定なしに、家禽、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、及びウサギも挙げられる。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明のＰＩＶ５ワクチンは家禽に投与されてもよく、本発明に係るワクチンはニワトリにおいて有効に用いられ得るが、他の家禽、例えば、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、及びパートリッジなどの接種が成功し得る。ニワトリとしては、限定はされないが、雌鳥、雄鶏、ブロイラー鶏、ロースター鶏、ブリーダー鶏、ブリーダー雌鳥の子孫、及び産卵鶏が挙げられる。本発明のワクチンは、家禽に孵化前又は孵化後に投与されてもよい。家禽は種々の年齢でワクチンを投与され得る。例えば、ブロイラー鶏は、１日齢で、卵内に、又は２〜３週齢で卵内ワクチン接種し得る。産卵ストック又は繁殖ストックは、例えば約６〜１２週齢でワクチン接種し、約１６〜２０週齢でブーストし得る。かかる産卵ストック又は繁殖ストックは、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、又は約１２週齢でワクチン接種し得る。かかる産卵ストック又は繁殖ストックは、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０週齢でブーストし得る。かかるＰＩＶ５ワクチンにより、ワクチンは、家禽に対して感染性の病原体に由来する１つ以上の免疫原を発現し得る。かかる免疫原は、例えば、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、ポックスウイルス、又はレオウイルスに由来してもよい。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「インビトロ」は細胞培養物中であり、及び「インビボ」は対象の体内である。本明細書で使用されるとき、「単離された」は、その天然の環境（例えば、それが天然に存在する場合には、天然の環境）から取り出されたか、組換え技術を用いて産生されたか、又は化学的若しくは酵素的に合成された材料、従ってその天然の状態から「人の手により」改変されている材料を指す。
【００９０】
用語「及び／又は」は、列挙される要素の１つ若しくは全て又は列挙される要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００９１】
語句「好ましい」及び「好ましくは」は、ある状況下で特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下で他の実施形態が好ましいこともまたある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することは意図されない。
【００９２】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及びその変化形は、これらの用語が説明及び特許請求の範囲に出現する場合に、限定する意味を有しない。
【００９３】
特記されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は同義的に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。
【００９４】
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される構成成分の分量、分子量などを表現する数値は全て、いずれの場合にも用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。従って、特にそうでない旨が指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは概数であり、本発明により達成しようとする所望の特性に応じて異なり得る。最低限でも、また均等論を特許請求の範囲に限定しようとするものではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁の数を踏まえて、且つ通常の丸め方を適用することにより解釈されなければならない。
【００９５】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、しかしなお、具体例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、数値は全て、本質的に、それぞれの試験計測値に存在する標準偏差によって必然的にもたらされる範囲を含んでいる。
【００９６】
個別的な工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、それらの工程は、任意の実行可能な順序で行われ得る。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。
【００９７】
説明は、例示的な実施形態を示す。本願全体を通じたいくつかの部分で、例を列挙して指針を提供しており、それらの例は、様々な組み合わせで用いることができる。それぞれの場合に、記載される列挙は代表例をまとめたものとして供され、排他的な列挙として解釈されてはならない。
【００９８】
見出しは全て、読者の便宜のためであり、指定する旨がない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いられてはならない。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間には挿入されない、ウイルス発現ベクター。
（２）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（３）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（４）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（５）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子と基質タンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（６）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（７）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（８）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（９）ＰＩＶ５のＦ又はＨＮ遺伝子の一部が、前記異種ヌクレオチド配列で置換されている、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（１０）前記異種ヌクレオチド配列がＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列を置換する、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（１１）前記異種ヌクレオチド配列が、ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入される、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（１２）前記ＰＩＶ５ゲノムが１つ以上の突然変異をさらに含む、（１）に記載のウイルス発現ベクター。
（１３）突然変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせを含む、（１４）に記載のウイルス発現ベクター。
（１４）前記突然変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせを含む、（１４）に記載のウイルス発現ベクター。
（１５）前記ＰＩＶ５ゲノムが１つ以上の突然変異をさらに含む、（２）〜（１２）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター。
（１６）突然変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせを含む、（１５）に記載のウイルス発現ベクター。
（１７）前記突然変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせを含む、（１６）に記載のウイルス発現ベクター。
（１８）異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入され、且つ前記ＰＩＶ５ゲノムが１つ以上の突然変異をさらに含む、ウイルス発現ベクター。
（１９）突然変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせを含む、（１８）に記載のウイルス発現ベクター。
（２０）前記突然変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせを含む、（１８）に記載のウイルス発現ベクター。
（２１）異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、前記異種ポリペプチドがインフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を含む、ウイルス発現ベクター。
（２２）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入される、（２１）に記載のウイルス発現ベクター。
（２３）前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子とラージＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりリーダーの近くに挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列の直ちに下流に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのスモール疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子と基質タンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；ここでＰＩＶ５のＦ又はＨＮ遺伝子の一部が、前記異種ヌクレオチド配列で置換されており；ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列を置換し；ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入される、（２１）に記載のウイルス発現ベクター。
（２４）前記ＰＩＶ５ゲノムが１つ以上の突然変異をさらに含む、（２１）〜（２３）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター。
（２５）突然変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の突然変異、Ｖ及びＰタンパク質の共通Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の突然変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠損した突然変異、スモール疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠損した突然変異、融合（Ｆ）タンパク質の突然変異、リンタンパク質（Ｐ）の突然変異、ラージＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の突然変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む突然変異、アポトーシスを誘導する突然変異、又はそれらの組み合わせを含む、（２４）に記載のウイルス発現ベクター。
（２６）前記突然変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組み合わせを含む、（２４）に記載のウイルス発現ベクター。
（２７）前記異種ポリペプチドが、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＢ１−Ｆ２、ＮＳ１又はＮＳ２を含む、（１）又は（１８）に記載のウイルス発現ベクター。
（２８）前記インフルエンザが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＣ型インフルエンザウイルスを含む、（２７）に記載のウイルス発現ベクター。
（２９）前記異種ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１８亜型株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、（２７）に記載のウイルス発現ベクター。
（３０）前記異種ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ１Ｎ１株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、（２７）に記載のウイルス発現ベクター。
（３１）前記異種ポリペプチドが、インフルエンザＡ型Ｎ１〜Ｎ１０亜型由来のインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、（２７）に記載のウイルス発現ベクター。
（３２）前記ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＢ１−Ｆ２、ＮＳ１又はＮＳ２がＡ型インフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１７株由来であり、且つ前記ＮＡがＡ型インフルエンザウイルスＮ１〜Ｎ１０株由来である、（２７）に記載のウイルス発現ベクター。（３３）前記異種ポリペプチドが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリインフルエンザ、イヌインフルエンザ、トリメタニューモウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトカリシウイルス、動物カリシウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、ヒトノロウイルス、動物ノロウイルス、牛疫ウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及び／又はヒト若しくは動物における新興インフルエンザウイルスに由来する、（１）又は（１８）に記載のウイルス発現ベクター。
（３４）前記異種ポリペプチドが細菌又は寄生体に由来する、（１）又は（１８）に記載のウイルス発現ベクター。
（３５）異種ポリペプチドを発現する２つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、（１）、（１８）、又は（２１）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター。
（３６）（１）〜（３５）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子。
（３７）（１）〜（３６）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター又はウイルス粒子の組成物。
（３８）アジュバントをさらに含む、（３７）に記載の組成物。
（３９）細胞において異種ポリペプチドを発現する方法であって、前記細胞を、（１）〜（３８）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と接触させる工程を含む方法。
（４０）対象において異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、（１）〜（３９）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
（４１）前記免疫応答が、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む、（４０）に記載の方法。
（４２）対象において異種ポリペプチドを発現する方法であって、（１）〜（３８）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
（４３）対象をワクチン接種する方法であって、（１）〜（３８）のいずれか一に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
（４４）前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔内に、筋肉内に、局所的に、経口的に、又は卵内に投与される、（４０）〜（４３）のいずれか一に記載の方法。
【００９９】
以下の例に本発明を説明する。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に示されるとおりの本発明の範囲及び趣旨に従い広義に解釈されなければならないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１００】
［実施例１］
ワクチンベクターとしてのパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ５）
インフルエンザウイルスのＨＡを発現するＰＩＶ５が、致死性高病原性鳥インフルエンザＨ５Ｎ１（ＨＰＡＩ）であって最も病原性の強いインフルエンザウイルス株であるＨ５Ｎ１による攻撃を防御することができるかどうかを試験するため、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５（ＰＩＶ５−Ｈ５）を作成し、動物におけるこのウイルスの有効性を試験した。図２Ａ〜図２Ｄに示されるとおり、ＰＩＶ５−Ｈ５の単一用量接種が致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を防御したことから、ＰＩＶ５がワクチン開発向けに優れたベクターであることが示される。
【０１０１】
インフルエンザウイルスのＮＡは、潜在的にワクチン開発に役立つ標的である。しかしながら、ＮＡを抗原として発現させる試みは成功していない。ＮＡを発現するニューカッスル病（ＮＤＶ）の場合、組換えウイルスはいかなる防御も提供しなかった（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８４（５）：２４０８−２０）。ＰＩＶ５がより優れたワクチンベクターであるかどうかを試験するため、Ｈ５Ｎ１のＮＡを発現する組換えＰＩＶ５であるｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）及び汎発性Ｈ１Ｎ１のＮＡを発現する組換えＰＩＶ５であるｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）を作成した。図３Ａ〜図３Ｃに示されるとおり、ＮＡを発現する組換えＰＩＶ５は致死性ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対して殺菌免疫を提供する。興味深いことに、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）までもが、Ｈ５Ｎ１攻撃に対して部分免疫を提供した。ＮＡを発現するウイルスベクターベースのワクチンがＨ５Ｎ１攻撃に対する免疫を提供したのは、これが初めてである。このＰＩＶ５ベースのベクターは、インフルエンザウイルス攻撃に対する免疫の提供に関して、今のところ他のどのウイルスベクターと比べても最良である。
【０１０２】
万能インフルエンザウイルスに向けて。インフルエンザウイルスのＮＰタンパク質は、あらゆるインフルエンザウイルス株間で極めて良く保存されており、広域防御性のインフルエンザウイルスワクチンの開発に優れた標的であると考えられる。しかしながら、ＮＰベースのワクチンを開発する試みは成功していない。ＮＰを発現するワクシニアウイルス（ＶＶ）はインフルエンザウイルス攻撃を防御しない（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６８（６）：３５０５−１１）。ＰＩＶ５がＮＰの発現に良好なベクターとなり得るかどうかを調べるため、Ｈ５Ｎ１のＮＰ遺伝子を発現する組換えＰＩＶ５（ＰＩＶ５−ＮＰ）を作成した。信じ難いことに、ＰＩＶ５−ＮＰはＨ１Ｎ１並びにＨ５Ｎ１の攻撃に対して防御を提供したことから、ＰＩＶ５ベースのＮＰワクチンが異型のインフルエンザウイルス攻撃を防御し得ることが示される（図４Ａ〜図４Ｃ）。ＮＰに基づく細胞性免疫応答（Ｔ細胞に基づく免疫応答）が防御性である一方、体液性免疫応答（抗体に基づく免疫応答）はＨＡ媒介性免疫に十分であることが知られている（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｉａｌｅ，１９９７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；１８６（１２）：２０６３−８；Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ；１７（１８）：２２６５−７４；及びＫｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；１０３（４３）：１５９８７−９１）。ＰＩＶ５ベースのワクチンがおそらく細胞性免疫応答を介して防御を提供したことは、新規であり、予想外である。さらに、ＰＩＶ５によってＮＰを発現させることにより防御が得られたため、ＰＩＶ５及びＮＰをベースとする万能インフルエンザウイルスワクチンを作成できる可能性がある。
【０１０３】
リーダー配列近傍に外来遺伝子（ｆｏｒｇｅｉｎ  ｇｅｎｅ）を挿入することによるワクチンの有効性の向上。ＰＩＶ５などのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは３’末端リーダー配列から転写を開始し、ウイルス遺伝子の翻訳レベルはリーダー配列までのその距離の影響を受ける。例えば、ＰＩＶ５のうちリーダー配列の最も近くにあるＮＰ遺伝子は最も豊富に転写され、一方、リーダー配列から最も離れた位置にあるＬ遺伝子は、転写が最小である（図５）。外来遺伝子は、そこがウイルス複製を破壊する潜在力が最小の接合部であるという理由で、事実上のプロモーター配列であるリーダー配列から最も遠位の遺伝子接合部であるＨＮ遺伝子とＬ遺伝子との間に挿入されている（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２（１）：１３９−５０；及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ；５４（５）：１１２６−３９。ワクチン候補は、抗原の発現レベルを増加させることにより増強され得る。Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡ遺伝子（Ｈ５）などの抗原の発現レベルを増加させるため、リーダー配列の直ちに下流及びＮＰ遺伝子の上流にＨ５遺伝子を挿入した（ＰＩＶ５−Ｈ５ＬＮ）（図５）。残念ながら、ＲＳＶなどの他のパラミクソウイルスと異なり、リーダー配列とＮＰ遺伝子との間に外来遺伝子を挿入すると、生存ウイルスを得られなかった。ＰＩＶ５−Ｈ５ＨＬ（ＺＬ４８としても知られる）が作成されている。この組換えウイルスは致死性高病原性鳥インフルエンザＨ５Ｎ１（ＨＰＡＩ）攻撃を防御した（図２を参照）。他の遺伝子接合部が試されており、Ｖ／ＰとＭとの間の接合部、及びＳＨとＨＮとの間の接合部が、外来遺伝子の挿入に好適であると決定された。外来遺伝子の発現レベルは、Ｈ５遺伝子がリーダー配列に近いほど高くなる。最も重要なことには、リーダー配列に近いＨ５を有する組換えＰＩＶ５ほど、望ましい抗原に対する免疫の発生がより良好であった（図６Ａ〜図６Ｃ）。
【０１０４】
ワクチンベクターとしての突然変異体ＰＩＶ５ウイルス。アポトーシスは、抗原提示において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞は、樹状細胞などのプロフェッショナルＡＰＣに対する抗原の供給源である。ウイルス感染により活性化されたアポトーシス経路もまた抗原提示において役割を果たし得るとともに、異なるアポトーシス経路は抗原提示に異なる形で影響を及ぼし得ると考えられる。野生型ＰＩＶ５感染は細胞死を誘導しない。しかしながら、スモール疎水性（ＳＨ）遺伝子が欠損している（ＰＩＶ５ΔＳＨ）又はＶタンパク質の保存領域が欠損している（ＰＩＶ５ＶΔＣ）突然変異体ＰＩＶ５ウイルスは、感染細胞において種々のアポトーシス経路を介してアポトーシスを誘導することが示されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７８（１０）：５０６８−７８；及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７７（６）：３３７１−８３）。また、ＰＩＶ５のＶ／Ｐ遺伝子における突然変異がアポトーシス並びにサイトカイン発現を誘導することも報告されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ；５（７）：ｅ１０００５２５）。アポトーシス並びにサイトカインを誘導する突然変異体ＰＩＶ５ウイルスは、野生型ＰＩＶ５と比べて、Ｈ５Ｎ１タンパク質などの外来抗原を提示するのにより良好なベクターであるものと思われる。Ｈ５Ｎ１のＨ５及びＮＰなどの外来抗原を発現する突然変異体組換えＰＩＶ５が作成されており、それらの突然変異の中には、より優れた防御をもたらしたものもあった一方、一部の抗原に対してそれほど防御をもたらさなかった突然変異もあった。ｒＰＩＶ５−ＮＰ、ｒＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰ及びｒＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ−ＮＰ（Ｐタンパク質の残基Ｓ３０８におけるＧへの点突然変異を含む）の中では、ｒＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ｇ−ＮＰが最も良好な防御を有した（図７Ａ及び図７Ｂ）。ｒＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰは、致死性インフルエンザウイルス攻撃後の生存率がｒＰＩＶ５−ＮＰと同じであったが、ｒＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰの方が体重減少がやや多く、ｒＰＩＶ５−ＮＰ免疫化マウスと比べて一層病気のように見えた。従ってＰＩＶ５からＳＨ遺伝子を欠失させても、ＮＰに対する免疫は増強されなかったように思われ、いくらか有害でさえあり得る。興味深いことに、ｒＰＩＶ５−Ｈ５、ｒＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５及びｒＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５−１及びｒＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５−３では、ＳＨの欠失は免疫原性に影響を与えておらず、Ｖ／Ｐ遺伝子における突然変異が免疫原性に悪影響を及ぼしたものと見られた（図８Ａ及び図８Ｂ）。ＮＰ媒介性免疫には細胞性免疫が必要であり、且つＨＡ媒介性免疫では多くの場合に体液性免疫が有効であるため、ＳＨの欠失は細胞性免疫に悪影響を及ぼし、Ｖ／Ｐ遺伝子突然変異は体液性免疫に影響を与え得るものと思われる。
【０１０５】
ワクチンとしてのキメラＰＩＶ５。ＰＩＶ５ベースのワクチンにおいてＰＩＶ５により生じる免疫が妨げとなることを低減するため、ＰＩＶ５を標的とする宿主免疫を低減することが望ましい。ＰＩＶ５タンパク質を、目的とするワクチン標的のタンパク質に置換する。例えば、ＰＩＶ５のＦ及びＨＮをインフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡに置換する（図９）。これにより、ワクチン標的の抗原を発現してＰＩＶ５タンパク質により生じる免疫の効果を最小限に抑える生存可能なキメラＰＩＶ５を作成する。
【０１０６】
開発中のさらなるワクチン候補。この例に示されるとおり、ＰＩＶ５は、多くの病原体（ウイルス性並びに細菌性）にとって優れたワクチンベクターである。限定はされないがヒトワクチン、例えば、ＰＩＶ５−ＨＩＶ、ＰＩＶ５−ＰＩＶ２（パラインフルエンザウイルス２型）、ＰＩＶ５−ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＰＩＶ５−ニパウイルス（ヒト及びブタ用）、及びＰＩＶ５−エボラウイルスなど、並びに動物ワクチン、例えば、ＰＩＶ５−狂犬病ウイルス（動物用）、ＰＩＶ５−ＰＣＶ（ブタサーコウイルス）、ＰＩＶ５−ＰＲＲＳＶ（ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）、及びＰＩＶ５−ブタインフルエンザウイルスなどを含めた、さらなるワクチン候補が開発中である。例えば、図１０Ａ〜図１０Ｃに示されるとおり、ＰＩＶ５ベースのＨＩＶワクチン候補が作成され、組織培養細胞において試験されている。
【０１０７】
［実施例２］
パラインフルエンザウイルス５型に対する免疫が先在する宿主におけるパラインフルエンザウイルス５型ベースのワクチンの評価
ベクターとしてのＰＩＶ５の使用に関する重要な論点は、ＰＩＶ５に対する先行曝露がＰＩＶ５ベースのワクチンの使用を妨げるかどうかである。この例では、Ａ型インフルエンザウイルス３亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｈ３）の免疫原性を、ＰＩＶ５に対して免疫したイヌにおいて調べた。ＰＩＶ５に対する中和抗体を含むイヌにｒＰＩＶ５−Ｈ３をワクチン接種すると、Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫が生じたことが見出され、ＰＩＶ５ベースのワクチンが先行曝露を有するイヌにおいて免疫原性であることを示している。さらに、ヒト集団におけるＰＩＶ５の曝露を調べた。４５例中１３例のヒト血清試料（約２９％）で、ＰＩＶ５に対する中和抗体（ｎＡｂ）が検出されている。ヒトにおけるｎＡｂ力価はワクチン接種イヌより低かったことから、ヒトにおけるｎＡｂのためにＰＩＶ５がヒトにおいて有効なベクターとなれない可能性は低いことが示唆される。
【０１０８】
ＰＩＶ５はイヌにおいてケンネルコフに関与し得ると考えられている（Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ；１２６：１４０−１４５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ；９４：１４７−１６５；Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｖｅｔ  Ｒｅｃ；９８：３０１−３０２；ＭｃＣａｎｄｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｖｅｔ  Ｒｅｃ；１０２：２９３−３０１；及びＡｚｅｔａｋａ  ａｎｄ  Ｋｏｎｉｓｈｉ，１９８８，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｊｕｉｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ；５０：８５１−８５８）。イヌがＰＩＶ５に感染してもケンネルコフは引き起こされなかったが（Ｃｈｌａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ；４２：２６６−２７０；及びＫｏｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ；４２：１６９４−１６９８）、それでも３０年間にわたり、弱毒生ＰＩＶ５を含むケンネルコフワクチンがイヌに対して使用されてきた。イヌは鼻腔内ワクチン接種を受け、ワクチン接種の間、多くの場合にイヌはくしゃみをするため、獣医診療従事者及び飼い主も同様に曝露される。生ＰＩＶ５を含むケンネルコフワクチンが広く利用されていることから、ＰＩＶ５はヒトにおいて安全なワクチンであり得ることが示唆される。３亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｈ３）を発現する組換えＰＩＶ５の単一用量接種が、マウスにおいてインフルエンザウイルス攻撃を防御し（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２：１３９−１５０、及びＨ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の１，０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）もの低量での単一用量ワクチン接種が、マウスにおいて高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１による致死的攻撃を防御した（実施例３及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３５４−６２を参照）。
【０１０９】
ＰＩＶ５をベクターとして使用することに関する一つの重大な問題は、ＰＩＶ５に対する先行曝露がＰＩＶ５ベースのワクチンの使用を妨げるかどうかである。この例では、ＰＩＶ５に対して免疫したイヌにおいて、インフルエンザウイルスのＨＡを発現する組換えＰＩＶ５（ＰＩＶ５−ＨＡ）の有効性を調べた。さらに、この例では、ヒトにおけるＰＩＶ５の曝露を調べた。
【０１１０】
材料及び方法
ウイルス及び細胞。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＭＤＢＫ、ＢＨＫ２１及びＶｅｒｏ細胞を成長させた。Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２、Ｈ３Ｎ２亜型）ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を含むｒＰＩＶ５−Ｈ３ウイルスを、以前記載されるとおり構築した（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２：１３９−１５０）。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを使用してＰＩＶ５ウイルスをＭＤＢＫ細胞で４〜５日間成長させ、以前報告されたとおりウイルス力価をＢＨＫ２１細胞に対するプラークアッセイにより調べた（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。簡潔に言えば、６ウェルプレートにあるＢＨＫ２１細胞を、段階希釈ウイルス（１：１０１〜１：１０７）に感染させた。２時間（ｈ）後、接種混合物を取り出し、２％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１％低融点アガロースを含有する４ｍｌ  ＤＭＥＭに交換した。感染後４〜６日目（ｄｐｉ）にプラークを計数した。力価計算には、各時間点につき２つのレプリケートを用意した。ムンプスウイルスのＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ（ＪＬ）ワクチン株をＶｅｒｏ細胞で成長させ、４〜７ｄｐｉで回収した。以前記載されたとおり、Ｖｅｒｏ細胞においてプラークアッセイによりウイルス力価を計測した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４１７：１２６−１３６）。インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２ウイルスを卵内で成長させた（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ，１９９３，Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ（インフルエンザウイルス及びパラミクソウイルスの分子生物学）．所収：Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ａ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＲＭ編．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．３５−７３）。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡアッセイ用のＰＩＶ５及びムンプスウイルスを精製するため、清澄化した上清中のウイルスを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ超遠心機タイプＦ４０Ｌ−８×１００ロータにおいて３７，０００ｒｐｍで１時間ペレット化した。次にペレットをＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス［ｐＨ７．４］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、１０％〜８０％のショ糖勾配に負荷し、ＴＨ−６４１ロータにおいて１時間、３７，０００ｒｐｍで遠心した。ウイルスバンドを採取し、Ｆ４０Ｌ−８×１００ロータにおいて１時間、３７，０００ｒｐｍでペレット化した。精製したウイルスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【０１１２】
動物の使用に関する倫理的声明。本研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）の勧告を厳守して行われた。プロトコルはジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の動物実験倫理委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の承認を受けた（許可番号：Ａ２０１１  １２−０１２−Ｙ１−Ａ３）。苦痛を最小限に抑えるためあらゆる努力を行った。本研究に使用されたイヌは、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）（第８版）に従い飼育及び管理された。
【０１１３】
ＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３によるイヌの感染。本研究に使用した専用繁殖犬は、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（４８２  Ｆｒｅｎｃｈｓ  Ｓｔｏｒｅ  Ｒｏａｄ，Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ，ＶＡ）から購入した。最初の実験では、合計８匹の３ヶ月齢ＰＩＶ５ワクチン未感作ビーグルを２群に分け、４匹のイヌに、各々、ＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３を鼻腔内（ＩＮ）感染させた。イヌは、ワクチン接種のため、並びに必要に応じて血液採取及び鼻スワブのため、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの用量の筋肉内アセプロマジン（ＰｒｏｍＡｃｅ，Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）により鎮静させたが、麻酔はかけなかった。感染後０日目（出血前）及び２１日目に血液試料を採取した。血液試料から血清を分離し、−２０℃で保存した。感染後３日目及び５日目（ｄｐｉ）に鼻スワブを採取した。第２の実験では、８匹の５ヶ月齢ＰＩＶ５ワクチン接種ビーグルをＰＢＳ対照群（ｎ＝２）とｒＰＩＶ５−Ｈ３群（ｎ＝６）とに分け、鼻腔内経路により免疫した。免疫後０日目及び２１日目にイヌを出血させた。３及び５ｄｐｉで鼻スワブを採取した。各ＩＮ免疫は、１ｍＬのＰＢＳ又は８×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）を含むｒＰＩＶ５−Ｈ３の投与を伴った。
【０１１４】
ＲＴ−ＰＣＲを使用してウイルスを検出する。イヌから鼻スワブを得るため、鼻咽頭に抵抗が感じられるまで、ポリエステル先端付き可撓性アルミニウムシャフトアプリケータ（Ｐｕｒｉｔａｎ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を鼻孔に挿入し、次に１８０度回転させて引き抜いた。スワブアプリケータを取り外し、吸収性スワブを、０．５ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭが入ったバイアルに入れた。バイアルを−７０℃で保存した。検体をボルテックスし、製造者の指示に従いＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ抽出ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、１４０μＬ容量を全ＲＮＡ抽出に使用した。以前記載されるとおりＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：８３７６−８３８５）。簡潔に言えば、３０μＬ総容量中１１μＬの精製ＲＮＡ鋳型を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２０μＬ反応容量で増幅することにより、ウイルスｃＤＮＡを作成した。ＲＴにはランダムプライマーを使用した一方、ＰＣＲにはゲノムＲＮＡのＰＩＶ５  Ｐ／Ｖ及びＭ遺伝子にアニーリングする遺伝子特異的プライマーＰ／Ｖ−Ｆ１及びＭ−Ｒ１を使用した。Ｐ／Ｖ−Ｆ１プライマーは５’−ＣＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）であり、Ｍ−Ｒ１プライマーは５’−ＧＧＴＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧ）（配列番号４）であった。ＲＴからの２０μＬ総容量中５μＬのｃＤＮＡを５０μＬ反応容量におけるＰＣＲに使用した。ウイルスゲノムの相対レベルを既知の力価のＰＩＶ５ウイルスのウイルスゲノムレベルと比較した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＰＩＶ５又はムンプスウイルス特異的抗体力価を決定した。１００μｌ／ウェルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中精製全ＰＩＶ５ウイルスタンパク質１００ｎｇで一晩コーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、初めに洗浄溶液（ＫＰＬ）中０．５％ＢＳＡ及び０．５％脱脂粉乳で１時間ブロックし、次に、ＫＰＬ洗浄溶液で３回洗浄した。イヌ又はヒト由来の血清の段階希釈液をブロッキング緩衝液に調製し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１：２，０００希釈の二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）又はヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共に１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  １成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）で発色させた。等量の１Ｎ  ＨＣｌを添加することにより発色を停止させ、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取った。ＥＬＩＳＡエンドポイント力価は、デュプリケートウェルの平均ＯＤ値が血清についての平均ＯＤ値＋２標準偏差（ＳＤ）の２倍を上回った最大の血清希釈度として定義された。
【０１１６】
ＰＩＶ５に対する中和抗体（ｎＡｂ）力価を決定する。ウイルス中和アッセイにより、血清試料中のＰＩＶ５中和抗体力価を計測した。５０μｌの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに血清を段階希釈した。希釈した血清に２００  ＴＣＩＤ５０のＰＩＶ５ウイルスを加え、３７℃で２時間インキュベートした。９０〜１００％コンフルエントなＭＤＢＫ細胞が入った９６ウェルマイクロタイタープレートに血清及びウイルスを加え、３７℃で３日間インキュベートした。個々のウェルを間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により調べた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中３．７％ホルムアルデヒドで１０分間細胞を固定し、次に、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１％ＦＢＳにより室温で３０分間透過処理した。固定した細胞を一次抗体（１：４００希釈のマウス抗ＰＩＶ５  ＮＰ抗体）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス（１：４００希釈；ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用した。中和抗体力価は、２００  ＴＣＩＤ５０のＰＩＶ５ウイルスを完全に中和する最大の血清希釈度とした。
【０１１７】
ＨＡＩアッセイ。動物インフルエンザ診断及びサーベイランスに関するＷＨＯマニュアル（ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）（ＷＨＯ（２００２）Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に従い赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイを実施した。簡潔に言えば、ニワトリ赤血球（ｃＲＢＣ）を洗浄し、ＰＢＳ中０．５％の終濃度となるように再懸濁した。Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２、Ｈ３Ｎ２亜型）を、ＰＢＳ中２５μｌ当たり４血球凝集単位（ＨＡＵ）となるように調整した。９６ウェル丸底プレートにおいて、２５μｌの個々のＲＤＥ処理した血清試料を２倍方式で段階希釈した。血清の段階希釈液の調製後、２５μｌ（４ＨＡＵ）の希釈ウイルスを加えた。プレートを穏やかに混合し、室温で１時間インキュベートした。次に、各ウェルに５０ｕｌの０．５％ｃＲＢＣを加え、穏やかに混合し、室温で３０〜４５分間インキュベートした。プレートを４５度の角度に傾けることにより、血球凝集をスコア化した。ＨＡＩ力価は、血球凝集を完全に抑制した最後の希釈抗血清の逆数である。
【０１１８】
ヒト血清試料。４５人の無作為のボランティアからヒト血液試料を採取した。参加者は健常な非妊娠の１８〜５０歳で、体重が１１０ポンド超であった。ボランティアはインフォームドコンセント用紙に署名した。ボランティアは匿名であった。個人情報は収集されなかった。ヒト対象プロトコルは、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ：ＵＧＡ）治験審査委員会の承認を受けた。静脈穿刺により抗凝固薬なしに１０ｍＬチューブに１０ｍＬの静脈血を採血した。凝固後、血液試料を４００ｇで５分間遠心した。無細胞上清を０．２２μｍ細孔径フィルタ装置でろ過し、血清として使用した。血清試料は−８０℃で保存した。
【０１１９】
統計的分析。この研究では、ピアソン相関法を用いて、ＰＩＶ５及びＪＬに対する抗体の相関分析を実施した。１：３２０におけるＯＤ４５０の読取りが血清希釈の線形範囲にあったため、これらの読取りを選択した。統計パッケージＲ（Ｔｅａｍ  ＲＤＣ（２００３）統計的計算のためのＲプロジェクト（Ｔｈｅ  Ｒ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のｃｏｒ．ｔｅｓｔ関数を使用して分析を行った。ｐ値が０．０５未満のとき、統計的に有意な差であると見なした。結果は、ピアソンのｒが０．０６に等しく（ｐ値＝０．６９４１）、ＰＩＶ５とＪＬとの間に有意な相関関係がないことを示している。
【０１２０】
結果
ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−Ｈ３による「未感作」イヌの感染。本明細書に含まれるさらなる例は、マウスにおいてインフルエンザウイルスに対する免疫を生じさせるのにｒＰＩＶ５−Ｈ３が有効であることを示しているが、同じウイルスがイヌにおいて免疫を生じさせるのに有効となり得るかどうかは明らかでない。従って、イヌに鼻腔内経路によってｒＰＩＶ５−Ｈ３を接種し、イヌにおけるウイルスの複製を決定し、ウイルスに対する免疫応答を測定した。イヌは通常、幼齢（早ければ３週齢）で生ＰＩＶ５を含むワクチンのワクチン接種を受ける。動物供給業者の手配により、生ＰＩＶ５のワクチン接種を受けていない８匹の１２週齢イヌを入手した。これらのイヌのＰＩＶ５抗体の力価を、ＥＬＩＳＡ及び中和アッセイを用いて測定した。ＥＬＩＳＡでは、全てのイヌがＰＩＶ５に陽性であった（図１１Ａ）。しかしながら、中和抗体（ｎＡｂ）力価は検出不能であった（図１１Ｂ）。イヌ（ｎ＝４）を鼻腔内（ＩＮ）経路でＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３に感染させた。感染後３日目及び５日目、感染したイヌから鼻スワブを採取し、ウイルスの存在についてアッセイした。プラークアッセイを用いてスワブを分析したところ、ウイルスは検出されなかった（図１２）が、感染後３日目（ｄｐｉ）に８匹中７匹のイヌでＲＴ−ＰＣＲ産物が検出され、５ｄｐｉに８匹中５匹のイヌで極めて弱いＲＴ−ＰＣＲシグナルが検出されたことから、感染後３日目の感染イヌの鼻孔においてＰＩＶ５の複製は限られていたこと、及び感染後５日目には感染が除去されていたことが示唆される。感染後２１日目にイヌを出血させた。全てのイヌにおいて抗ＰＩＶ５力価の増加が検出されたことから、イヌが感染したことが示唆される。ＨＡＩアッセイを用いた抗ＨＡ力価の計測から、全てのｒＰＩＶ５−Ｈ３接種イヌが血清転換し、感染後３週間目に平均４２．５（２０〜８０の範囲）のＨＡＩ力価を有したことが示された（図１３）。ＰＩＶ５を接種したイヌにおいてＨＡＩは検出されなかった。
【０１２１】
ＰＩＶ５に曝露したイヌのＰＩＶ５−ＨＡによる感染。ＰＩＶ５に先行曝露したイヌを、なお組換えＰＩＶ５ベースのワクチンでワクチン接種することができるかどうかを調べるため、ＰＩＶ５に対して複数回ワクチン接種され、抗ＰＩＶ５中和抗体を有したイヌを入手した（図１４）。イヌをＩＮ経路によりｒＰＩＶ５−Ｈ３に感染させた。３及び５ｄｐｉでプラークアッセイを用いて、感染したイヌの鼻孔にウイルスは検出されなかった。３ｄｐｉでＲＴ−ＰＣＲを用いて、８匹中１匹のイヌが試験で陽性と出た（図１５）。次に、感染後３週間目にイヌを出血させた。ｒＰＩＶ５−Ｈ３でワクチン接種されたイヌは、４０〜８０の範囲（平均７７、４０が１匹及び８０が５匹）のＨＡＩ力価を有した（図１６）ことから、ｒＰＩＶ５−Ｈ３ワクチン接種がインフルエンザウイルスに対する免疫を生じさせたことが示される（ＨＡＩ力価の４倍の増加又は４０のＨＡＩ力価を、インフルエンザウイルス感染に対して防御性であると見なす）。ＰＩＶ５に対するｎＡｂ力価もまたｒＰＩＶ５−Ｈ３感染イヌにおいて増加したことから、イヌがｒＰＩＶ５−Ｈ３に感染したことが確認された。
【０１２２】
ヒトにおけるＰＩＶ５への曝露。以前報告されたとおり、抗ＰＩＶ５抗体はヒトにおいて検出されている（Ｇｏｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ；６５：１２９５−１３０３；及びＧｏｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ；３２７：２４４−２４７）。ヒトにおける抗ＰＩＶ５が近縁のパラミクソウイルスに対する抗体からの交差反応性に起因するのかどうかを決定するため、ヒト血清中のＰＩＶ５及びムンプスウイルスの抗体力価を調べた。ムンプスウイルス（ＭｕＶ）はＰＩＶ５と同じゲノム構造を有し、最も近縁である。ヒトにおけるムンプスウイルス曝露は、米国ではワクチン接種及び自然感染によってほぼ１００パーセントであるため、米国の１８〜５０歳から採取した本発明者らの試料の全てにおいて、抗ムンプスウイルス抗体が検出されると予想された。予想どおり、４５例の試料全てがムンプスウイルスについて陽性であった（図１７Ａ）。興味深いことに、全ての血清がＰＩＶ５抗原についても同様にＥＬＩＳＡで陽性であった（図１７Ａ）。ヒト血清におけるＰＩＶ５抗原に対する反応性が抗ムンプスウイルスからの交差反応性によってもたらされたなら、抗ＰＩＶ５の力価は抗ムンプスウイルスの力価と相関しなければならない。しかしながら、統計的分析により、血清中の抗ＭｕＶの力価と血清中の抗ＰＩＶ５の力価との間に相関がないことが示されたため、ＰＩＶ５に対するヒト血清の反応性がムンプスウイルスからの交差反応性に起因するのではないことが示唆される。さらに、ＰＩＶ５に対するｎＡｂの力価をヒト血清で調べたところ、４５例中１３例の試料で抗ＰＩＶ５  ｎＡｂが検出された（約２９％）（図１７Ｂ）。
【０１２３】
考察
ＰＩＶ５が発見されて以来、ヒトにおける多くの疾患がＰＩＶ５と関連付けられたが、それらは全て、最終的に誤りであることが分かった。なぜＰＩＶ５がこれらの疾患と結び付けられてきたのかについては、振り返ってみると、いくつかの考えられる説明がある。一つは、ヒト研究においてウイルス単離に用いられた条件に基づき、すなわち研究室はサル細胞系を使用したが、サル細胞系はＰＩＶ５に持続感染している可能性があり、且つこれらの細胞は検出可能な細胞変性効果を示さないことが多い（Ｈｓｉｕｎｇ，１９７２，Ｐｒｏｇ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ；１４：２４１−２７４；及びＣｈａｔｚｉａｎｄｒｅｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ；８５：３００７−３０１６）。別の可能性は、ＰＩＶ５と近縁で、且つヒト集団でほぼ１００パーセント曝露を有するムンプスウイルスなどの遍在性パラミクソウイルスとのＰＩＶ５の抗原交差反応性である（Ｒａｎｄａｌｌ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，１９８８，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ；６９（Ｐｔ  ８）２０５１−２０６０；Ｔｓｕｒｕｄｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１７１：３８−４８；及びＫｏｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ；１１６：２７７−２８３）。この例では、ヒト集団におけるＰＩＶ５の曝露を調べ、ヒト血清中に抗ＰＩＶ５抗体が認められた。興味深いことに、抗ムンプスウイルスと抗ＰＩＶ５との間に力価の相関は見出されなかったことから、ＰＩＶ５陽性ヒトは、少なくともその一部について、ＰＩＶ５に曝露されていた可能性があることが示唆される。ヒト血清試料の約２９％がＰＩＶ５に対する中和抗体を有した。その一部は、ムンプスウイルスに対してロバストな抗体を有しなかった（図１７）ことから、少なくとも一部のヒトはムンプスウイルスとは別にＰＩＶ５に曝露されていたことが示唆される。イヌとヒトとの間の密接な接触は、ヒトがイヌからのＰＩＶ５に曝露されることに寄与する要因となり得るものと思われる。イヌは鼻腔内ワクチン接種を受け、多くの場合にワクチン接種の間にくしゃみをするため、獣医診療従事者及び飼い主も同様に曝露される。加えて、３ｄｐｉでＲＴ−ＰＣＲを用いて、未感作イヌでＰＩＶ５が検出されたことから、ワクチン接種イヌがワクチン接種後にウイルスを排出し、ヒトのそのウイルスへの曝露がもたらされ得る可能性があることが示唆される。これは、生ＰＩＶ５を含むケンネルコフワクチンの利用が普及していること、及び米国の人口の約４０％が犬の飼い主であることと整合する。
【０１２４】
米国人口において高率でＰＩＶ５抗体が検出され、臨床疾患が引き起こされていない点は、ＰＩＶ５がヒト集団において安全であることを示唆しており、有望である。しかしながら、米国人口の大きい割合がＰＩＶ５に曝露されている可能性があるため、ＰＩＶ５がヒトのワクチン開発に有効なベクターであるかどうか、疑問が生じる。ベクターの先行曝露というまさに同じ問題が、ワクチン開発に向けたアデノウイルスベースのベクターの使用に大きな障害をもたらしている。この例では、ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５が、ＰＩＶ５に対する先在する免疫を有するイヌにおいて免疫原性であったことが見出されており、ＰＩＶ５ベースのワクチンベクターが先在する免疫に打ち勝ち得ることが示される。これらの結果は、マウスではＰＩＶ５に対する中和抗体がＰＩＶ５感染を予防しないというこれまでの報告と整合した（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４：５４０３−５４１１）。イヌがＰＩＶ５感染を除去する能力については、依然として不確かである。マウスでは、細胞媒介性免疫応答がＰＩＶ５感染の除去において決定的な役割を果たすと考えられる（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４：５４０３−５４１１）。ＰＩＶ５はイヌにおいて複製が自己抑制的であるため、細胞媒介性免疫が感染の除去において同様に決定的な役割を果たすものと思われる。細胞媒介性免疫が反応して有効となるまでには時間がかかるため、この時間が、ＰＩＶ５ベースの生ワクチンが複製してロバストな免疫応答が生じる機会を提供する。これは、ＰＩＶ５が一次細胞を含めたあらゆる種類の細胞に感染するという観察結果と整合する（Ａｒｉｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８０：３４１６−３４２７；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２：１３９−１５０；及びＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４２１：６７−７７）。
【０１２５】
ワクチン接種イヌにおけるＰＩＶ５に対するｎＡｂ力価は「未感作」イヌより高く、３００もの高さであった（図１４Ｂ）。ＰＩＶ５に対するｎＡｂを有する全てのイヌが、ｒＰＩＶ５−Ｈ３の単一用量をＩＮ接種した後血清転換し、且つ抗Ｈ３抗体の力価はＰＩＶ５に対するｎＡｂ力価と相関を有しなかったことから、イヌにおけるＰＩＶ５ベースのワクチンに対する免疫応答の決定において、ＰＩＶ５のｎＡｂが予測的な値を有しなかったことがさらに確認された。ヒトにおけるＰＩＶ５に対するｎＡｂの最大の力価は６０であり、イヌにおけるＰＩＶ５に対するｎＡｂの力価より低い。従って、ヒトにおけるＰＩＶ５に対する中和抗体は、ＰＩＶ５ベースのワクチン候補による防御免疫の発生を妨げないものと思われる。
【０１２６】
イヌＡ型インフルエンザウイルスＨ３亜型の集団発生が、イヌ集団において発生したことがある（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３１０：４８２−４８５；Ｄａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１４：４６１−４６４；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｖｏｌ；１０：１２８６−１２８８）。ｒＰＩＶ５−Ｈ３がイヌを血清転換させ、防御性と見なされる免疫を生じたという事実は、Ｈ３を発現する組換えＰＩＶ５がイヌインフルエンザウイルスに対する有効なワクチンとなり得ることを示唆している。さらに、これらの結果は、ＰＩＶ５が、イヌ、他の動物及びヒト用のワクチン開発に向けた、他の抗原を発現させるための新規ベクターとなり得ることを示唆している。
【０１２７】
さらに、ブタをＰＩＶ５に感染させている。感染後５日目（ｄｐｉ）の鼻スワブ（ｎａｓａｌ  ｓｗａｐ）においてＰＩＶ５が検出されたが、３５ｄｐｉで内臓器官又は組織にＰＩＶ５は検出されなかったことから、ＰＩＶ５がブタにおける持続感染を確立しなかったことが示唆される。
【０１２８】
この例は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ａ  Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ５−Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｈｏｓｔ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅ−Ｅｘｉｓｔｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ５（パラインフルエンザウイルス５型に対する免疫が先在する宿主におけるパラインフルエンザウイルス５型ベースのワクチンの評価）」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；２０１２；７（１１）：ｅ５０１４４，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０１４４，Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  ２０として発表されており、これは参照により全体として本明細書に援用される。
【０１２９】
［実施例３］
Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えパラインフルエンザウイルス５型は、マウスを致死性高病原性鳥インフルエンザＨ５Ｎ１攻撃から防御した
安全且つ有効なワクチンは、ヒト集団における大規模な高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩ）Ｈ５Ｎ１の集団発生を防ぐ最良の方法である。現在ＦＤＡに認可されているＨ５Ｎ１ワクチンには、重大な制限がある。より有効なＨ５Ｎ１ワクチンが緊急に必要とされている。本明細書に示されるとおり、Ｈ５Ｎ１亜型由来のＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子を発現する生の組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｈ５）の単一用量が、マウスにおいて致死量のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１感染に対する殺菌免疫を提供した。さらに、ＰＩＶ５ゲノム内の種々の位置にＨ５Ｎ１  ＨＡを挿入することによる、ＰＩＶ５ベースのワクチンの有効性に対する効果を調べたところ、ＰＩＶ５の事実上のプロモーターであるリーダー配列と、第１のウイルス遺伝子ＮＰとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入が、生存ウイルスをもたらさなかったことが示された。ＮＰと次の遺伝子Ｖ／Ｐとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入は、成長を欠くウイルスをもたらした。ＳＨ遺伝子とＨＮ遺伝子との間の接合部へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入では、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する最良の免疫が得られた：マウスにおいて致死性ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃を防御するのに、１０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）もの低い用量で十分であった。従って、Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５は、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１ワクチンとしての大きい潜在力を有する。この例では、ＨＡ導入遺伝子をリーダー配列に近い部位に順次挿入して組換えＰＩＶ５ウイルスの有効性を試験した。さらに、ＰＩＶ５を使用してＨ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルスのＨＡを発現させ、致死性ＨＰＡＩ攻撃の確立されたマウスモデルにおいて、それらのワクチン候補としての有効性を試験した。
【０１３０】
材料及び方法
細胞。ＢＳＲ  Ｔ７細胞の単層培養は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％リン酸トリプトースブロス（ＴＰＢ）及び４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ中に維持した。Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＢＨＫ細胞の単層培養は、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に維持した。全ての細胞は３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ウイルス感染細胞は、２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で成長させた。ＰＩＶ５のプラークアッセイはＢＨＫ細胞を使用して実施し、インフルエンザウイルスのプラークアッセイはＭＤＣＫ細胞を使用して実施した。
【０１３１】
インフルエンザウイルス。使用したＡ型インフルエンザウイルスには、ＶＮＨ５Ｎ１−ＰＲ８／ＣＤＣ−ＲＧ（Ｈ５Ｎ１；Ｒｕｂｅｎ  Ｄｏｎｉｓ博士，ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡから供与されたｒｇＶＮ−ＰＲ８）及びＡ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１；Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｂｂｙ，セント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ），Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮから供与された）が含まれる。Ａ／ＶＮ−ＰＲ８は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で４８〜７２時間増殖させた。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活化Ａ／ベトナム／１２０３／０４は、セント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のＲｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｂｂｙから供与された。Ａ／ベトナム／１２０３／０４は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で２４時間増殖させた。ウイルスは全て、アリコートに分け、−８０℃で保存した。生の高病原性鳥インフルエンザウイルスを使用した実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによる審査及び承認を受け、ＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従いバイオセーフティレベル３、高度な封じ込め下で行われた。
【０１３２】
マウス。全ての試験に雌性６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用した。ＢＳＬ２ウイルスによるマウスの免疫化及び試験は、高度ＢＳＬ２施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。マウスＨＰＡＩ感染は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによって承認されている指針及びＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従い、高度ＢＳＬ３施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。全ての動物試験は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内動物管理・使用委員会によって審査及び承認されたプロトコルに基づき行われた。
【０１３３】
組換えプラスミドの構築。ＺＬ４８（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＨＮ／Ｌ）プラスミドを作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノム及びＨＮとＬとの遺伝子間に追加のＥＧＦＰ遺伝子挿入を含むプラスミドＢＨ３１１におけるＧＦＰのコード配列を、Ｈ５Ｎ１のＨＡ遺伝子に置換した。ＺＬ４６（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＳＨ／ＨＮ）、ＺＬ２０９（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＮＰ／ＶＰ）、ＺＬ２１５（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−Ｌｅ／ＮＰ）プラスミドを作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノムを含むプラスミドＢＨ２７６をベクターとして使用した。ＺＬ４７（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＶＰ／Ｍ）プラスミドを作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノムを含むプラスミドｐＳＶ５−Ｍ−ＮＳをベクターとして使用した。切断部位なしにＨ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子を含むプラスミドを、適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアを使用したＰＣＲ増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。
【０１３４】
組換えＰＩＶ５のレスキュー及び配列。以前記載したとおり感染性組換えＰＩＶ５のレスキューを実施した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。簡潔に言えば、ＨＮとＬとの遺伝子間にＨＡ遺伝子挿入を有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードするｐＺＬ４８、ＳＨとＨＮとの遺伝子間にＨＡ遺伝子挿入を有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードするｐＺＬ４６、Ｖ／ＰとＭとの遺伝子間にＨＡ遺伝子挿入を有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードするｐＺＬ４７、ＮＰとＶ／Ｐとの遺伝子間にＨＡ遺伝子挿入を有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードするｐＺＬ２０９、又はリーダーとＮＰ遺伝子との間にＨＡ遺伝子挿入を有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードするｐＺＬ２１５のプラスミドと、ＮＰ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする３つのヘルパープラスミドｐＰＩＶ５−ＮＰ、ｐＰＩＶ５−Ｐ、及びｐＰＩＶ５−Ｌとを、Ｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む６ｃｍプレートにおいて９５％コンフルエンシーでＢＳＲ  Ｔ７細胞に同時形質転換した。使用したプラスミドの量は以下のとおりであった：５μｇ  ｐＺＬ４８／ＺＬ４６／ＺＬ４７／ＺＬ２０９／ＺＬ２１５、１μｇ  ｐＰＩＶ５−Ｎ、０．３μｇ  ｐＰＩＶ５−Ｐ、及び１．５μｇ  ｐＰＩＶ５−Ｌ。３時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を、１０％ＦＢＳ及び１０％ＴＰＢ含有ＤＭＥＭに交換した。３７℃で７２時間インキュベートした後、培地を回収し、低速遠心（３，０００ｒｐｍ、１０分）により細胞デブリをペレット化した。プラークアッセイを用いて組換えウイルスのシングルクローンを得た。ＺＬ４８、ＺＬ４６、ＺＬ４７、及びＺＬ２０９ウイルスのプラーク精製シングルクローンの完全長ゲノムを、以前記載されるとおり配列決定した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ；５：ｅ１０００５２５；及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：８３７６−８３８５）。ＺＬ４８、ＺＬ４６、ＺＬ４７及びＺＬ２０９ウイルス感染Ｖｅｒｏ細胞の培地からの全ＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。ランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡを調製し、次に適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアを使用したＰＣＲ反応でｃＤＮＡのアリコートを増幅した。
【０１３５】
組換えＰＩＶ５のインビトロ及びインビボ成長。６ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞を、ＭＯＩ０．１でＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６又はＺＬ４７に感染させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳ中に維持した。０、２４、４８、７２、９６及び１２０ｈｐｉで培地を採取した。ＢＨＫ細胞に対するプラークアッセイによりウイルスの力価を決定した。
【０１３６】
マウスにおいてウイルスの成長を比較するため、６週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００ｌ容量中１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６又はＺＬ４７に鼻腔内感染させた。感染後４日目にマウスを安楽死させ、肺を採取してウイルス力価を決定した。
【０１３７】
タンパク質発現の検出。ＭＯＩ５でＰＩＶ５及びＺＬ４８に感染させた６ウェルプレートのＭＤＢＫ細胞に対して免疫ブロット法を実施した。２４ｈｐｉで、細胞を全細胞抽出緩衝液（ＷＣＥＢ）（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８］、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１０％グリセロール）で溶解させた。ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、抗Ｈ５Ｎ１  ＨＡ及び抗ＰＩＶ５抗体でイムノブロットした。
【０１３８】
ＭＯＩ０．１でＰＩＶ５及びＺＬ４８を感染させた２４ウェルプレートのＭＤＢＫ細胞においてＨ５Ｎ１  ＨＡ発現の免疫蛍光法を実施した。２ｄｐｉで細胞をＰＢＳで洗浄し、次に０．５％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ−サポニン溶液において透過処理し、１：２００希釈のポリクローナル抗ＰＩＶ５−ＶＰ又は抗Ｈ５Ｎ１  ＨＡで３０分間インキュベートした後、細胞にＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体を添加した。細胞を３０分間インキュベートし、Ｎｉｋｏｎ  ＦＸＡ蛍光顕微鏡を使用して調べ、撮影した。
【０１３９】
ＭＯＩ１でモック感染又はＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６又はＺＬ４７感染させた６ウェルプレートのＭＤＢＫ細胞を使用して、ウイルス感染細胞におけるＨ５Ｎ１  ＨＡの発現レベルを比較した。２４ｈｐｉで細胞を採取し、０．５％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｙｈｙｄｅ）で１時間固定した。固定した細胞を遠心によりペレット化し、次に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭ（５０：５０）を含有する５００μｌの溶液中に再懸濁した。細胞を７０％エタノールにおいて一晩透過処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次にマウス抗Ｈ５Ｎ１  ＨＡ抗体と共にＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１：２００）中４℃で１時間インキュベートした。フィコエリトリン（１：２００）で標識した抗マウス抗体により４℃で１時間、暗所で細胞を染色し、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡで１回洗浄した。フローサイトメーターを使用して蛍光強度を計測した。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いてＨＡ（Ｈ５Ｎ１  ＨＡ）特異的血清抗体力価を計測した。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２  ＨＢ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍｌ組換えＨ５Ｎ１  ＨＡタンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次にプレートをＫＰＬ洗浄溶液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）で洗浄し、５％脱脂粉乳及び０．５％ＢＳＡを含有する２００μｌのＫＰＬ洗浄溶液（ブロッキング緩衝液）により室温で１時間、ウェルをブロッキングした。血清試料の段階希釈液を（ブロッキング緩衝液中に）作製し、コーティングしたプレートに移して１時間インキュベートした。結合した血清抗体を検出するため、各ウェルに１００μｌのブロッキング緩衝液中１：１０００希釈アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。１００μｌ  ｐＮＰＰホスファターゼ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）を添加することによりプレートを発色させ、室温で反応により発色させた。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳプレートリーダーにおいて光学濃度（ＯＤ）を４０５ｎｍで計測した。ＩｇＧ力価は、平均ＯＤを上回って未感作血清の平均値＋２標準偏差より高いＯＤを有する最小の血清希釈度と定めた。
【０１４１】
ＰＩＶ５によるマウスの感染。ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−Ｈ５によるワクチン接種のため、５０μｌ  ＰＢＳ中の１０６ＰＦＵ  ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−ＺＬ４６、又はｒＰＩＶ５−ＺＬ４８を、ｔｅｒｔ−アミルアルコール中の２，２，２−トリブロモエタノール（アベルチン；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）によって麻酔下にあるマウスに鼻腔内投与した。致死量以下のｒｇＶＮ−ＰＲ８感染のため、５０μｌ  ＰＢＳ中の２０００ＰＦＵウイルスをＰＩＶ５ワクチン接種について記載されるとおり投与した。ＢＰＬ不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４ワクチン接種用に、次に５０μｌ  ＰＢＳ中２５６血球凝集単位（ＨＡＵ）／ｍｌを尾側大腿筋の各々に注入した。免疫後２１日目に血液を採取した。ブーストする場合、プライム後２８日目にこのプロセスを繰り返した。マウスは毎日モニタし、一部の実験については、隔日で体重を記録した。
【０１４２】
中和抗体力価の計測。ＥＬＩＳＡエンドポイントによるマイクロ中和アッセイにより、血清中のインフルエンザ中和抗体力価を計測した。１％ＢＳＡ、抗生物質／抗真菌薬、及び１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫトリプシンを含有するＤＭＥＭに熱不活化血清を段階希釈した。次に希釈した血清を１０００  ＴＣＩＤ５０  ｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８又はｒｇ  Ａ／Ａｎｈｕｉ−ＰＲ８と３７℃で２時間インキュベートした。次にＭＤＣＫ細胞を添加し、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベーション終了時、ウェルを氷冷メタノール及びアセトン（それぞれ８０：２０）で固定し、上記に記載したとおりＥＬＩＳＡを実施した。中和力価は、バックグラウンドＯＤを２倍上回るＯＤ読取りにより決定するものとして、１０００  ＴＣＩＤ５０  ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８又はｒｇＡ／Ａｎｈｕｉ−ＰＲ８を中和することが可能な最小の血清希釈度であると定めた。
【０１４３】
細胞性応答。記載されるとおり、不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４に対するリンパ球におけるＴ細胞応答を検出するエリスポットを実施した（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１３：４２６−４３５）。５０μｌ完全腫瘍培地（ＣＴＭ）中の不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ウェルあたり１０ＨＡＵ当量）及び関連性のないペプチドとしてエボラＧＰ  Ｐ２  ＥＹＬＦＥＶＤＮＬ（１μｇ／ｍｌ）、及びＰＭＡ／イオノマイシン（２５ｎｇ／ｍｌ；それぞれ１．２５ｎｇ／ｍｌ）で細胞を再刺激した。ＡＩＤ  ＶｉｒｕＳｐｏｔリーダー（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用してスポットを計数した。
【０１４４】
Ａ型インフルエンザウイルスによるマウスの感染。初めにＢＡＬＢ／ｃマウスを、野生型ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−ＺＬ４６、ｒＰＩＶ５−ＺＬ４８  ＩＮ、又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４  ＩＭで上記に記載したとおりワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、血清分析のため尾静脈からマウスを出血させた。ワクチン接種後２４日目、マウスを麻酔し、５０μｌ  ＰＢＳに希釈した１０  ＬＤ５０  Ａ／ベトナム／１２０３／０４を鼻腔内接種した。次に、罹患率及び死亡率についてマウスを毎日モニタし、隔日で体重を計測した。攻撃後３日目、マウス群を安楽死させ、それらの肺を１．０ｍｌ  ＰＢＳ中に採取し、ホモジナイズした。次にホモジネートを遠心により清澄化した。次に、記載されるとおり清澄化したホモジネートにおいてＴＣＩＤ５０アッセイを用いてウイルス力価を決定した（Ｓｏｂｏｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；６：ｅ２１９３７）。
【０１４５】
結果
Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｈ５）をインビトロで作成及び分析する。Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５が致死的攻撃ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１からマウスを防御することができるかどうかを試験するため、多塩基切断部位のないＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１のＨＡ遺伝子（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｋａｗａｏｋａ，１９９４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６８：２１３０−３１２８；及びＳｕｇｕｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８６：２７０６−２７１４）を、ＰＩＶ５の完全長ｃＤＮＡゲノムを含むプラスミド（ＺＬ４８）のＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間の接合部に挿入した（図１８Ａ）。このプラスミドを、以前記載されたとおりＮＰ、Ｐ及びＬをコードするプラスミドと共にＢＳＲ  Ｔ７細胞にトランスフェクトすることにより、感染性ウイルスＺＬ４８（ｒＰＩＶ５−Ｈ５）を回収した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：８３７６−８３８５）。回収したウイルスをプラーク精製し、Ｖｅｒｏ細胞で成長させた。プラーク精製ウイルスの完全長ゲノムを、直接ＲＴ−ＰＣＲ配列決定法を用いて配列決定した。ウイルスの大量ストックをＭＤＢＫ細胞で成長させた。ウイルスの力価は１０８ｐｆｕ／ｍｌであった（図１８Ｂ）。ＺＬ４８感染細胞からのＨ５Ｎ１  ＨＡの発現を、免疫ブロット法（図１９Ａ）及び免疫蛍光法（図１９Ｂ）を用いて確認した。ＺＬ４８は、低ＭＯＩ成長曲線に示されるとおり（図１９Ｃ）、野生型ＰＩＶ５と同程度に成長した。
【０１４６】
マウスにおけるｒＰＩＶ５−Ｈ５の免疫原性。ＺＬ４８がインビボでＨＡ特異的免疫を生じさせ得るかどうかを決定するため、マウスに単一用量の１０６ｐｆｕのＺＬ４８又は野生型ＰＩＶ５を鼻腔内感染させ、Ｈ５Ｎ１逆遺伝学ワクチンコンストラクト（ｒｇＶＮ−ＰＲ８）を感染させるか、又は不活化Ｈ５Ｎ１ウイルス（ｉＡ  ＶＮ）で免疫したマウスと免疫応答を比較した。接種／免疫後２１日目にマウスを出血させた。抗ＨＡ  ＩｇＧの血清値を、ＥＬＩＳＡを用いて決定した（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。ＺＬ４８の感染により、不活化Ｈ５Ｎ１ビリオン及びＰＲ８由来の内在遺伝子とＨ５Ｎ１由来のＨＡ及びＮＡとを含む組換えＨ５Ｎ１と同等の安定したレベルのＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａが生じた。ＺＬ４８感染マウスの血清の中和抗体（ｎＡｂ）力価は低かった（図２０Ｃ）。しかしながら、２１ｄｐｉでブーストすると、防御性であると見なされるレベルまで血清ｎＡｂレベルが増強された。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて細胞性応答を調べた。ＺＬ４８感染マウスは細胞性応答を生じた（図２０Ｄ）。Ｔｈ１（ＩＦＮγ産生Ｔ細胞）の応答は、逆遺伝学Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染させたマウスと比較して限られていたが、これらのマウスは、インフルエンザＨＡのみを有したＺＬ４８と比較して、内在する非構造タンパク質細胞に含まれた免疫優性抗原（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；１５７：５５５５−５５６２）を含め、インフルエンザウイルス全体に対する応答を有し、且つリンパ球が全ウイルスにより再刺激された。
【０１４７】
マウスにおける組換えＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性。コスト及び比較的低いｎＡｂ力価の理由から、初めに、ホモタイプなウイルス攻撃に対するＺＬ４８の有効性を、マウスにおいて、ＰＲ８由来の全ての内在遺伝子とＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１由来のＨＡ及びＮＡとを含む（ＨＡ内の多塩基切断部位が除去された）組換えインフルエンザウイルスｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）を使用して調べた。このウイルスは、マウスにおける野生型ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１と比べてマウスにおいて病原性が低く、ＢＳＬ２生物学的封じ込め下で使用することができる。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕのＺＬ４８又は野生型ＰＩＶ５の単一用量で免疫した。別の群のマウスには陽性対照として不活化Ｈ５Ｎ１ウイルス（ｉＡ  ＶＮ）を投与した。免疫後２１日目にマウスを１，０００  ＴＣＩＤ５０  ｒｇＡ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）で攻撃した。ｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）はマウスにおいて死亡を引き起こさないため、マウスの肺における攻撃ウイルスの力価を用いてＺＬ４８免疫化の有効性を調べた。攻撃後４日目のＺＬ４８免疫化マウスの肺にｒｇＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）ウイルスは検出されなかった（図２１Ａ及び図２１Ｂ）ことから、ＺＬ４８がＨ５Ｎ１感染の予防に有効であったことが示唆される。
【０１４８】
マウスにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するｒＰＩＶ５−Ｈ５の有効性。ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１に対するＺＬ４８の有効性を、マウスにおいて、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４株で調べた（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７９：２１９１−２１９８）。マウスを鼻腔内経路により１０６ｐｆｕのＺＬ４８の単一用量で免疫した。免疫後２１日目にマウスをＨ５Ｎ１で攻撃した。ＰＩＶ５免疫マウスは実質的に体重が減少し、その９０パーセントは攻撃後１０日目までに死亡し、攻撃後１４日目には全てが死亡した（図２２５Ｂ）。対照的に、ＺＬ４８で免疫した全てのマウスが攻撃を生き残り、実験期間中、体重減少は観測されなかった（図２２Ａ）。さらに、ＺＬ４８免疫マウスの肺に攻撃ウイルスは検出されなかった（図２２Ｃ）ことから、ＺＬ４８がマウスにおいてＨ５Ｎ１感染の予防に有効であることが示される。
【０１４９】
ＰＩＶ５ゲノム内の種々の位置にＨ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｈ５）を作成し、それらをインビトロ及びインビボで分析する。ＰＩＶ５の唯一の事実上のプロモーターであるリーダー配列との距離は、遺伝子発現レベルに逆に作用する。ＺＬ４８においてＨ５Ｎ１  ＨＡが挿入されたところであるＨＮとＬとの遺伝子間の遺伝子接合部は、ＰＩＶ５においてリーダー配列から最も離れている（図１８Ａ）。Ｈ５Ｎ１  ＨＡをＨＮ−Ｌ遺伝子接合部からリーダー配列の近くに動かすと、Ｈ５Ｎ１  ＨＡタンパク質の遺伝子発現レベルのレベルが増加し得る。Ｈ５Ｎ１  ＨＡの発現レベルが増加すればワクチンの有効性が高まるであろうという論拠から、Ｈ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子をリーダー配列とＮＰ遺伝子との間に挿入した。リーダー配列とＮＰ遺伝子との間に挿入を有するプラスミドが作成されたが、残念ながらこのプラスミドは生存可能な感染性ウイルスを生じることができなかった（図１８）ことから、この挿入がウイルスのライフサイクルにとって有害であることが示唆される。次にＨ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子を、次の遺伝子接合部であるＮＰとＶ／Ｐとの遺伝子接合部に挿入した（ＺＬ２０９）。プラスミドＺＬ２０９からは組換えウイルスが回収されたが、ウイルスは組織培養細胞で十分に成長しなかった。加えて、このウイルスは他の部位に突然変異を含んだ（例えば、図１８Ｂを参照）。Ｈ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子をＶ／ＰとＭとの遺伝子接合部である次の遺伝子接合部（ＺＬ４７、図１８）並びにＳＨとＨＮとの接合部（ＺＬ４６、図１８）に挿入した。ＺＬ４６及びＺＬ４８は野生型ＰＩＶ５と同程度まで成長した一方、ＺＬ４７は力価がやや低下した（図２３Ａ）。Ｈ５Ｎ１  ＨＡの発現レベルはＺＬ４６感染細胞で最も高かった一方、ＺＬ４７感染細胞では、Ｈ５Ｎ１  ＨＡのレベルはＺＬ４８感染細胞と同程度であった（図２３Ｂ）。感染マウスの肺のウイルス力価を測定することにより、マウスにおけるこれらのウイルスの複製能力を比較した。感染後４日目、ＰＩＶ５及びＺＬ４６の力価は同程度であった（図２４）。ＺＬ４８及びＺＬ４７感染マウスの肺における力価は、ＰＩＶ５又はＺＬ４６感染マウスより低かった。平均では、ＺＬ４７が最も低かった（図２４）（しかしながら、ＺＬ４７とＺＬ４８との差は統計的に有意ではなかった）。
【０１５０】
マウスにおいてＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するＨ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５Ｈ５の有効性を決定する。Ｈ５Ｎ１  ＨＡを発現する全ての組換えＰＩＶ５ワクチンが、単一の高接種用量（１０６ｐｆｕ）の後、マウスにおいてＨ５Ｎ１攻撃に対する完全な防御を提供したため、用量反応試験を実施して、ＰＩＶ５ゲノム内におけるＨ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子の位置によってワクチンの有効性が変わるかどうかを決定した。マウスを鼻腔内経路により、１０３、１０４又は１０５ｐｆｕの用量のＺＬ４６、４７及び４８に感染させた。２１ｄｐｉでマウスを出血させ、血清を分析した。
【０１５１】
１０４ｐｆｕ以上のＺＬ４６、ＺＬ４７又はＺＬ４８を接種した全てのマウスが、致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を生き残った。しかしながら、低用量の免疫化では異なる結果が明らかとなった。１０００（１０３）ｐｆｕのＺＬ４６は、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１による致死的攻撃に対して１００％マウスを防御したが、ＺＬ４８は免疫動物の７０％を防御し、ＺＬ４７は僅か３０％のマウスしか防御しなかった（図２５８Ａ）ことから、ＳＨとＨＮとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡ遺伝子の挿入が防御免疫応答の最も強力なプライミングを可能にしたことが示唆される。体重減少を調べると、同様の傾向が認められた。１０３接種では、ＺＬ４７で免疫されたマウスが最大の体重減少であった一方、ＺＬ４６は最小の体重減少であった（図２５Ｂ）。１０４接種では、ＺＬ４８及びＺＬ４６は同程度に体重減少を防いだ一方、ＺＬ４７免疫化マウスはなおその開始時の体重の１０〜１５％を失った（図２５Ｃ）。１０５以上の免疫化用量では、全てのマウスで同程度にＨＰＡＩ感染に起因する体重減少が防がれた（図２５Ｄ）。
【０１５２】
考察
この例では、マウスにおける最も病原性の強いインフルエンザウイルス、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１による攻撃に対して、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５を試験した。この組換えワクチンは、極めて低い用量であっても、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対するマウスの防御において有効であったことから、ＰＩＶ５がＨ５Ｎ１ワクチンの開発に実行可能なベクターであることが示される。現在、Ｈ５Ｎ１に対して唯一ＦＤＡが承認しているワクチンには、特にそれが２回投与しなければならず、且つ中程度の有効性を実現するのに、従来のインフルエンザワクチンと比較して実質的により高濃度のワクチンが必要であるとおり、重大な制限がある。Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡ及びＮＡを利用する従来のワクチンは免疫原性が不十分となっており、且つ安全性及び生産に問題を抱えている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；４：４９９−５０９にレビューされている）。ＺＬ４６などのＰＩＶ５ベースのＨ５Ｎ１ワクチンは単一の低い用量（１０３ＰＦＵ／マウス）で防御免疫を生じさせることができる一方、このワクチンは組織培養細胞で、特定の無菌卵なしに１０８ＰＦＵ／ｍｌまで成長することができて、ワクチンの生産が従事者に健康上のリスクをもたらすことがないため、ＰＩＶ５ベースのＨ５Ｎ１ワクチンは、現行のＦＤＡ承認Ｈ５Ｎ１ワクチンと比べて利点を有する。さらに、ＰＩＶ５ベースのＨ５Ｎ１ワクチンの費用対効果の高い性質により、それをニワトリなどのＨ５Ｎ１の保菌動物に対して使用することが可能である。
【０１５３】
ＰＩＶ５などのパラミクソウイルスは、リーダー配列においてのみ転写を開始する。従って、リーダー配列までの距離がウイルス遺伝子のレベルと反比例する。ＨＮとＬとの遺伝子間の遺伝子接合部は、ＰＩＶ５においてリーダー配列から最も離れている。これは、多くの場合に、外来遺伝子を挿入することの任意の潜在的有害作用を回避するため、外来遺伝子の挿入に使用されている（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０；及びＴｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２：１３９−１５０）（図１８）。Ｈ５Ｎ１  ＨＡをＨＮ−Ｌ遺伝子接合部からリーダー配列の近くに動かすと、遺伝子発現レベルが増加するはずである。リーダー配列とＮＰ遺伝子との間への外来遺伝子の挿入が生存ウイルスをもたらさなかったことは興味深く、この挿入がウイルスのライフサイクルに有害であって、リーダーとＮＰ遺伝子との間の領域がＰＩＶ５複製に決定的であることを示唆している。ＮＰとＶ／Ｐとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入は生存ウイルスを生じたが、ウイルスがその成長を欠いたとともに、回収されたウイルスの他の領域に突然変異が生じたことから、この領域も同様にウイルス複製に重要であることが示唆される。以前、ＮＰ発現とＶ／Ｐ遺伝子発現との比がミニゲノム系において最適なウイルス複製に決定的であることが報告されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３３８：２７０−２８０）。ＮＰとＶ／Ｐとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入によりＮＰとＶ／Ｐとの比が崩れ、ウイルス複製の不良をもたらしたものと思われる。この結果は、ＶＳＶにおけるＮとＰとの間へのＧＦＰの挿入と同様である。ＺＬ４６、ＺＬ４７及びＺＬ４８は全て、マウスにおいてＨ５Ｎ１攻撃に対する完全な防御を、マウス当たり１０４ｐｆｕもの低い単一接種用量の後に提供したが、Ｖ／ＰとＭとの間へのＨ５Ｎ１  ＨＡの挿入がＺＬ４８（ＨＮとＬとの間への挿入）又はＺＬ４６（ＳＨとＨＮとの間への挿入）ほど優れた防御を提供しなかったことは意外である。Ｖ／ＰとＭとの間への挿入がインビトロ（図２３）及びインビボ（図２４）で組換えウイルスの複製に悪影響を及ぼし、ワクチン候補の有効性が弱まった可能性がある。続く例では、有効なワクチン接種に生の組換えＰＩＶ５が必要であることが示される。これらの結果は、インビボでのウイルスの適応度及びＰＩＶ５ゲノム内での挿入部位が、ワクチン候補の有効性に対して強い影響を有することを示している。
【０１５４】
インフルエンザウイルスに対する中和抗体は、防御免疫を証明するものである。しかしながら、Ｈ５Ｎ１のＨ５Ｎ１  ＨＡを発現する組換えＰＩＶ５による低用量の接種では、低レベルのｎＡｂがかろうじて検出されたに過ぎないが、マウスは完全に防御された。この結果から、生ワクチンからの細胞媒介性免疫応答が、高病原性インフルエンザウイルス攻撃に対する防御に寄与し得ることが示唆される。これは、インフルエンザのＮＰタンパク質をワクチン抗原として利用する試験によって裏付けられる（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｖａｃｃｉｎｅ；２３：５４０４−５４１０）。マウスにおいてＺＬ４８のブーストが免疫を増強したことは興味深く、プライム接種がＰＩＶ５ベースのワクチンの再免疫又は感染を妨げなかったことが示唆される。これは、マウスにおいてＰＩＶ５に対する中和抗体がＰＩＶ５感染を予防しないという報告と整合する（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４：５４０３−５４１１）。人はＰＩＶ５に曝露されているが、ＰＩＶ５はヒト疾患と関連せず、ＰＩＶ５はヒトにおける使用に安全であり得ることが示唆される。
【０１５５】
この例は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ５  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈ５Ｎ１  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈ５Ｎ１  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニンを発現する組換えパラインフルエンザウイルス５型は、致死性高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１攻撃に対してマウスを防御した）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２０１３  Ｊａｎ；８７（１）：３５４−６２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３２１−１２．Ｅｐｕｂ  ２０１２年１０月１７日として発表されており、これは全体として参照により本明細書に援用される。
【０１５６】
［実施例４］
狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現する組換えパラインフルエンザウイルス５型ベースの狂犬病ワクチン
有効で且つ費用対効果の高い狂犬病ワクチンが必要とされている。この例では、ＰＩＶ５ベクター化狂犬病ワクチンをマウスにおいて試験した。ＲＡＢＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードする組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ）を鼻腔内（ＩＮ）、筋肉内（ＩＭ）及び経口接種によりマウスに投与した。ワクチン接種マウスを５０致死的脳内狂犬病攻撃用量（ＬＤ５０）のＣＶＳ−２４で攻撃した。ＩＮ経路により投与したとき、単一用量の１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇが１００％防御に十分であった。ＩＭ経路により１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの単一用量でワクチン接種したマウスは、極めてロバストな防御を提供した（９０％〜１００％）。興味深いことに、１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの単一用量を経口ワクチン接種したマウスは５０％生存率を示したが、これは弱毒化狂犬病ワクチンｒＬＢＮＳＥ株接種マウスの６０％生存率に匹敵する。これは、ベクターとしてのＰＩＶ５に基づく動物において経口的に有効な狂犬病ワクチン候補の初めての報告であり、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇが新世代の組換え狂犬病ワクチンの優れた候補であり、ＰＩＶ５が有望な経口ワクチン用ベクターであることを示している。
【０１５７】
人獣共通感染疾患の一つとして、狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）感染症は、ヒトを含む温血動物において、曝露後治療しない場合に初期の急性脳炎及び後期の致死により特徴付けられる狂犬病を引き起こす（Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ；４：１０２１−１０３８）。未治療の狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）感染症は死亡に至る。ＲＡＢＶ感染症の予防には、ワクチン及び曝露後治療が有効となっている。しかしながら、費用が原因となって、発展途上国では狂犬病ワクチン接種及び治療はあまり用いられていない。狂犬病が原因で毎年約５万５千人が死亡していると報告されており、それらの症例のほとんどは発展途上国で起きている（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，２０００，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；４：２２２−２２８を参照）。野良犬、野生食肉類及びコウモリは、野外ＲＡＢＶの自然界の保菌動物であり、これらの狂犬病キャリアはヒト及び家畜にとって公衆衛生上のリスクである。ヒト狂犬病の発生原因は、大半が、動物のワクチン接種が限られている発展途上国、特に農村地域で野良犬に噛まれることである。
【０１５８】
ワクチン接種がＲＡＢＶ感染に対する曝露前治療の最も有効な方法であり、ヒト及び保菌動物の両方において使用されてきた。曝露後治療については、不活化細胞培養ワクチンの複数回の接種及び免疫グロブリン注射が合わせて利用され、狂犬病の発症が予防される。しかしながら、狂犬病ワクチン免疫及び免疫グロブリン治療は、発展途上国の農村地域又は遠隔地の家族にとって比較的高価である（Ｋｎｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ；８３：３６０−３６８）。野良犬のワクチン接種も同様に、狂犬病感染を予防する潜在的に費用対効果の高い戦略である。従って、有効で且つ費用対効果の高いワクチンが必要とされている。野良犬のワクチン接種には、経口免疫などの無針のワクチン接種が理想的となる。
【０１５９】
現在、死菌狂犬病ワクチンがニワトリ胚細胞、ＢＨＫ、又はＶｅｒｏ細胞から調製され、筋肉内（ＩＭ）注射によりヒトでの使用及び愛玩動物用に利用可能である（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ；１０：１５９７−１６０８）。曝露前狂犬病ワクチンは、通常、不活化ワクチンの３回の連続注射によって投与されている。家畜及び野生動物における狂犬病予防のため、弱毒生狂犬病ワクチン（ＳＡＤベース及びＥＲＡベースの修飾生狂犬病ワクチン）及びＲＡＢＶ  Ｇを発現するワクシニアウイルスをベースとする組換え狂犬病ワクチン（Ｖ−ＲＧ）が開発されている（Ｋｉｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ；３１２：４；Ｍｅｓｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；１８７：２６；及びＷｉｋｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；８１：７１９４−７１９８）。これらのワクチンは多くの種で良好な防御免疫応答を生じたという事実にも関わらず、イヌ及びスカンクでは不十分な防御免疫が認められた（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ；２３５：６９１−６９５；Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３４５：５；及びＴｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ；５１：３６３−３６６）。弱毒生ＲＡＢＶの使用はまた、ＲＮＡゲノム突然変異に起因する病原性の表現型への復帰突然変異、ワクチンの過剰投与により引き起こされる残留病原性又は標的種の変化に関する安全性上の懸念も引き起こす。ワクチンとしてのワクシニアウイルスは、ヒトにおいて有害な局所的及び全身性の反応を引き起こすことが報告されており、及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎａ  ｖｉｒｕｓ）ベクター化狂犬病ワクチン（Ｖ−ＲＧ）も、ヒトにおいて同様に反応を引き起こしたことが報告された（ＣＤＣ、２００９、ＭＭＷＲ  ５８：４；及びＲｕｐｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｊ  Ｗｉｌｄｌ  Ｄｉｓ；２６：９９−１０２）。その後、ＲＶ  Ｇを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）が、広く使われているＶ−ＲＧワクチンに代用されるより安全性の高いワクチンとして開発されているが、組換えＭＶＡの経口免疫は、先行曝露を有するイヌ及びアライグマにおいて既往免疫応答を誘発できなかった（Ｗｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ；２７：７１９８−７２０１）。従って、動物用並びにヒト用の有効で安全な狂犬病ワクチンの開発が必要とされている。野生動物のワクチン接種には、経口投与することのできる狂犬病ワクチンが必要とされる。
【０１６０】
ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のリッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）のメンバーであるＲＡＢＶは、エンベロープを持つＲＮＡウイルスであり、弾丸型構造の一本鎖ネガティブセンスゲノムを有する。ＲＮＡゲノムは、以下の順序で５つの構造遺伝子をコードする：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、基質タンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及びウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）（９）。Ｎ、Ｐ、Ｌタンパク質がウイルスＲＮＡゲノムと組み合わさってリボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｌｅｏｐｏｒｔｅｉｎ）（ＲＮＰ）を形成する。ＲＡＢＶ  Ｇは、ウイルス中和抗体の主要な抗原である（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ；１６：７５４−７５９）。
【０１６１】
パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）は、約１５キロベースのサイズのゲノムを有する非分節性マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、パラミクソウイルス科に属する。ＰＩＶ５は、大きい細胞変性効果（ＣＰＥ）なしに広域の細胞系に感染し、これにより、ＰＩＶ５が連続細胞系で成長して高力価を達成することが裏付けられ、経済的な量産手段が提供される。ＰＩＶ５のヒト疾患との関連性、ウイルスゲノムが宿主ＤＮＡに組み込まれるリスクがないこと、及びポジティブセンスＲＮＡウイルスと比べたマイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムの安定性は、ＰＩＶ５が良好なワクチンベクター及びタンパク質発現ツールであることを示唆している。生ＰＩＶ５を含むケンネルコフワクチンは、動物又はヒトに対する安全上の懸念を生じることなく長年イヌにおいて使用されているため、ＲＡＢＶ  Ｇを発現するＰＩＶ５はイヌ用の有効なワクチンとなり得るとともに、既存のイヌワクチン接種プログラムに容易に組み込むことができる。この例では、新規狂犬病ワクチンとしてのＲＡＢＶ  Ｇを発現するＰＩＶ５を実証する。
【０１６２】
材料及び方法
細胞。ＢＨＫ２１、ＢＨＫ２１細胞に由来するクローン細胞系であるＢＳＲ−Ｔ７細胞及びＢＳＲ細胞（Ｓａｒｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ；１２１：１４４−１５１）は、１０％リン酸トリプトースブロス、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に維持した。ＭＤＢＫ細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで成長させた。マウス神経芽細胞腫（ＮＡ）細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地に維持した。ＢＳＲ−Ｔ７細胞の培地にはＧ４１８を添加し、４００μｇ／ｍｌの終濃度とした。ウイルス感染のため、単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次にＤＭＥＭ＋１％ウシ血清アルブミン中のウイルスを接種した。次に単層をＰＢＳで洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２において２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭでインキュベートした。
【０１６３】
ウイルス。野生型ＰＩＶ５については以前記載した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ＰＩＶ５を濃縮するため、ウイルスを含む上清を２０％ショ糖に負荷し、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ超遠心機タイプＦ４０Ｌ−８×１００ロータにおいて３７，０００ｒｐｍで１時間、ペレット化した。次にペレットを１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、−７０℃で保存した。哺乳マウス脳適応ＣＶＳ−２４狂犬病ウイルス株（ここでＣＶＳは、攻撃ウイルス標準である）を、哺乳マウスにおいて増殖させた。狂犬病ワクチンＬＢＮＳＥ株は、以前報告されたＬ１６株に由来したもので（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：１６３４−１６４４）、ＢＳＲ細胞で成長させた。攻撃ウイルス標準１１（ＣＶＳ−１１）は、ＮＡ細胞において増殖させた。ＲＶ−Ｎタンパク質に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗体を、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から購入した。
【０１６４】
ウイルス感染性クローンの構築。ＰＩＶ５感染性クローンプラスミドｐＢＨ３１１は、ＰＩＶ５ゲノムのＨＮとＬとの遺伝子間に追加の遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含み、ＧＦＰを発現する（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。
【０１６５】
ＲＡＢＶ  ＥＲＡ株由来のＧ遺伝子を含むプラスミドから完全長ＲＡＢＶ  Ｇ遺伝子（１，５７５ヌクレオチド）をＰＣＲ増幅した。プライマー配列は以下のとおりである：
ＲＶ−Ｇ１、５’ＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣ（配列番号５）；及びＲＶ−Ｇ２、５’ＡＡＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣ  ＣＡＣＴＣ（配列番号６）。ＰＩＶ５感染性クローンベクターにＰＣＲ断片を挿入して、追加の遺伝子としてＨＮとＬとの間にＲＡＢＶ  Ｇを含むプラスミド、ｐＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを作成した。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇゲノムの長さは、６の倍数として維持した。
【０１６６】
ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルスのレスキュー。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルスをレスキューするため、プラスミドｐＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ（３μｇ）を、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＰＩＶ５−Ｌ（１．５μｇ）、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＩＶ５−ＮＰ（１μｇ）、及びｐＣＡＧＧＳ−ＰＩＶ５−Ｐ（２００ｎｇ）と共にＢＳＲＴ−７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４日目、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを含む上清を採取し、ＢＨＫ２１細胞においてプラーク精製した。プラーク（感染後４〜７日目［ｄｐｉ］に発色）を選択し、ＭＤＢＫ細胞でさらに増幅した。ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡミニキットを使用して上清からＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーで逆転写（ＲＴ）を実施した。ＨＮ  ３’末端又はＬ  ５’末端に結合する特異的プライマーを使用して、逆転写産物をさらにＰＣＲ増幅した。プライマー配列は以下のとおりである：３１１−１０６９９−Ｆ１、５’ＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＴＧＡＣ（配列番号７）；及び３１１−１１７６４−Ｒ１、５’ＡＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧ（配列番号８）。ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０１６７】
成長曲線及びプラークアッセイ。６ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞を、ＭＯＩ０．０１でＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇに感染させた。感染後０、１、２、３、４、及び５日目に上清を採取した。高ＭＯＩ感染のため、６ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞をＭＯＩ５でＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇに感染させ、感染後０、１２、２４、３６、４８、及び６０時間目に上清を採取した。６ウェルプレート中のＢＨＫ２１細胞を、段階希釈のウイルスストックに感染させた（１：１０〜１：１０６）。２時間後、接種混合物を除去し、２％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１％低融点アガロースを含有する５ｍｌ  ＤＭＥＭに交換した。感染後５〜６日目にプラークを計数した。各時間点につき２つのレプリケートを使用した。
【０１６８】
間接免疫蛍光アッセイ。ＲＡＢＶ  Ｇの発現を検出するため、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染ＭＤＢＫ細胞を間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により調べた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３９８：８７−９７）。簡潔に言えば、ＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で１０分間細胞を固定し、次にＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１％ＦＢＳにより室温で３０分間透過処理した。固定した細胞を、３７℃で一次抗体（１：２００希釈のマウス抗ＲＡＢＶ−Ｇ抗体；Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）と共に１時間インキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２００希釈；ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用した。
【０１６９】
ウエスタンブロッティング。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染ＭＤＢＫ細胞を、全細胞抽出緩衝液（ＷＣＥＢ）（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８］、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１０％グリセロール）（Ｔｉｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８２：９１２３−９１３３）で溶解した。４０００ｒｐｍで１５分間遠心することによりライセートを清澄化し、上清を同量の２×ＳＤＳ負荷緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、２００ｍＭジチオスレイトール［ＤＴＴ］、及び０．１％ブロモフェノールブルー）と混合し、９５℃で５分間加熱し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク質をフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。膜をマウス抗ＲＡＢＶ−Ｇ抗体（１：２０００希釈）又はマウス抗ＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ抗体（１：２０００希釈、ＰＩＶ５ウイルス感染対照に使用）（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：１０２６１−１０２６８）と共にインキュベートし、続いて１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートし、Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４４０を使用して走査した。
【０１７０】
ウイルスの精製。ＲＡＢＶ  Ｇが組換えＰＩＶ５粒子に組み込まれるかどうかを決定するため、清澄化した上清中のウイルスを２０％ショ糖に負荷し、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ超遠心機タイプＦ４０Ｌ−８×１００ロータにおいて３７，０００ｒｐｍで１時間ペレット化した。次にペレットをＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス［ｐＨ７．４］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、１０％〜８０％ショ糖勾配に負荷してＴＨ−６４１ロータにおいて３７，０００ｒｐｍで１時間遠心した。ウイルスバンドを採取し、Ｆ４０Ｌ−８×１００ロータにおいて３７，０００ｒｐｍで１時間ペレット化した。精製したウイルスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。精製したウイルス粒子からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング解析に供した。
【０１７１】
動物試験。動物試験では６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。全ての動物実験は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内動物管理・使用委員会によって承認されたプロトコルに従い実施した。マウス免疫は、鼻腔内（ＩＮ）、筋肉内（ＩＭ）、又は経口経路により実施する。鼻腔内免疫は、６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを初めにアベルチン（１８０〜２５０ｕｌ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、次に１００μｌのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ又はＰＩＶ５を種々の用量で滴下して鼻腔内接種した。ＰＢＳ処置マウスを対照として供した。３週間後、２用量応答実験では、初回接種と同じ用量でマウスをブーストした。マウスはまた、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ粒子を経口投与するか、又は１００μｌ  ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを種々の用量で後肢の大腿筋に筋肉内注射することによっても免疫した。狂犬病ワクチン対照として、ある群のマウスを１×１０７ＦＦＵの狂犬病ワクチンＬＢＮＳＥ株でＩＭ経路により免疫した。血清学的評価のため、マウスを尾から出血させた後、攻撃した。
【０１７２】
マウス攻撃は、１用量実験では免疫後３週間目に実施し、又は２用量実験ではブースト後１週目に実施した。マウスをＩ．Ｃ．経路により、５０脳内（Ｉ．Ｃ．）５０％致死量（ＬＤ５０）のＣＶＳ−２４株に感染させた。感染動物は狂犬病ウイルス感染の症状について毎日、２２日間観察した。
【０１７３】
狂犬病中和抗体測定。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）の標準検査である迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）を用いてウイルス中和抗体（ＶＮＡ）を測定するため、種々の群の各マウスから血液を採取した。簡潔に言えば、Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に血清の段階５倍希釈液５０μｌを調製した。ＣＶＳ−１１の５０ＦＦＤ５０（５０％蛍光フォーカス用量）を各チャンバーに加え、３７℃で９０分間インキュベートした。各チャンバーにＮＡ細胞（１０５細胞）を加え、スライドを３７℃で２０時間インキュベートした。次に細胞を氷冷８０％アセトンで固定し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＲＶ  Ｎ抗体により３７℃で１時間染色した。各チャンバーの２０フィールドを蛍光顕微鏡下に観察し、リード−ミュンヒ（Ｒｅｅｄ−Ｍｅｕｎｃｈ）の式に従い５０％エンドポイント力価を計算した。それらの値を、既知の濃度（国際単位、ＩＵ／ｍｌ）のＶＮＡを含有する基準血清（国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ），Ｈｅｒｔｓ，英国から入手した）と比較した。
【０１７４】
結果
ＲＡＢＶ  Ｇを発現する組換えＰＩＶ５の作成及び分析。ＰＩＶ５ベクターを使用した組換え狂犬病ワクチンを、以下のとおり構築した。狂犬病ＥＡＲ株の糖タンパク質遺伝子（ＲＶ−Ｇ）をＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間に挿入した（図２６Ａ）。ＰＩＶ５ゲノムにおけるＲＶ−Ｇ遺伝子には、ＮＰ遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との接合部領域の遺伝子開始（ＧＳ）、遺伝子間配列（Ｉ）及び遺伝子終了（ＧＥ）配列が隣接し、これは高度な転写を生じた（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ウイルスを回収し、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ分析及び配列決定によってゲノムを確認した。
【０１７５】
間接免疫染色アッセイ（ＩＦＡ）によってｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染細胞におけるＲＶ−Ｇタンパク質の発現を検出した。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを感染させた細胞を、ＲＡＢＶ  Ｇに対するマウスモノクローナル抗体により染色し、一方、ＰＩＶ５感染細胞は染色しなかった（図２６Ｂ）。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ感染細胞におけるＲＡＢＶ  Ｇ発現を、ＲＶ−Ｇに対するマウスモノクローナル抗体によるウエスタンブロット分析によってさらに確認した（図２６Ｃ）。組換えＲＡＢＶ  Ｇ（約６５ｋＤａ）のサイズは、天然のＲＡＢＶのサイズであるものと予想される（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ；１４：６６２−６７２）。
【０１７６】
ＲＡＢＶ  Ｇ遺伝子の挿入がウイルス複製に及ぼす効果を決定するため、ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルスの多段階及び一段階成長曲線を決定した。多段階成長曲線アッセイでは、ＭＤＢＫ細胞を細胞当たり０．０１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の（感染多重度、ＭＯＩ０．０１）ｒＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇに感染させ、２４時間毎に１２０時間まで上清を採取した。一段階成長曲線アッセイでは、ＭＤＢＫ細胞をＭＯＩ５でｒＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇに感染させ、上清を１２時間毎に６０時間まで採取した。ＢＨＫ２１細胞においてプラークアッセイによりウイルスを定量化した。図２７Ａ及び図２７Ｂに示されるとおり、両方のウイルスとも同様の初期成長動態を有したが、多段階成長における２４時間から９６時間の間及び一段階成長における１２時間から４８時間の間のｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの成長率は、野生型ＰＩＶ５と比べてやや低かった。両方のウイルスが、多段階成長では感染後約１２０時間（ｐ．ｉ．）で、及び一段階成長では６０時間ｐ．ｉ．で、同程度の最大力価に達した。この結果から、ＲＡＢＶ  Ｇ遺伝子を追加的な発現単位としてＰＩＶ５ゲノムに挿入しても、ＰＩＶ５ウイルスのインビトロ成長に重大な影響は及ばなかったことが示された。
【０１７７】
ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇウイルス粒子へのＲＡＢＶ  Ｇ組み込みの同定。ＲＡＢＶ  Ｇはエンベロープタンパク質であるため、ＰＩＶ５粒子へのその取り込みを調べた。ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧをＭＤＢＫ細胞において成長させて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによりポリペプチドを分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの精製ビリオンが、Ｌ、ＨＮ、ＮＰ、Ｆ、Ｐ及びＭを含む主要なＰＩＶ５構造タンパク質へと分離された（図２８）。ＲＡＢＶ  Ｇ特異抗体による精製ウイルスのウエスタンブロット分析により、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧビリオンにＲＡＢＶ  Ｇバンドの存在が検出された一方、ＰＩＶ５ビリオンにはＲＡＢＶ  Ｇバンドは認められなかった（図２８）。この結果から、ＲＡＢＶ  Ｇが組換えＰＩＶ５粒子に組み込まれることが示された。
【０１７８】
マウスにおける鼻腔内接種によるｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの有効性。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇがマウスモデルにおいてロバストな狂犬病攻撃に対して十分な防御免疫を誘発できることを決定するため、２用量免疫化レジメンを実施した。生ＰＩＶ５を含む現行のワクチンはイヌにＩＮ経路で投与されるため、初めにＩＮワクチン接種を用いてｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの有効性を試験した。４群のマウスに、１０３、１０４、１０５又は１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧをＩＮワクチン接種した。対照群にはＩＮ経路によってＰＢＳを投与した。プライムワクチン接種の３週間後、全てのマウスを初回接種と同量でブーストした。一週間後、血清を採取し、狂犬病ＶＮＡアッセイに使用した。その後、マウスをＩ．Ｃ．経路により５０ＬＤ５０の狂犬病ＣＶＳ−２４株で攻撃した。ＷＨＯの指針に従いＲＡＢＶ中和抗体（ｎＡｂ）の力価を決定した。図２９Ａ及び図２９Ｂに示されるとおり、生存率及びＲＡＢＶ  ｎＡｂレベルのいずれも、用量依存的反応を示した。１０３、１０４、１０５又は１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇでワクチン接種した群の平均ＶＮＡ力価及び生存率（ＶＮＡ／生存率）は、０．５３ＩＵ／３０％、１．５２国際単位（ＩＵ）／７７．８％、７．９４ＩＵ／１００％、６２．９６ＩＵ／１００％であり、ＰＢＳ治療群の０ＩＵ／０と対照的であった。０．５ＩＵが、防御抗体の最小レベルと考えられる。各群における０．５ＩＵ以上の個別マウスの割合は生存率と強く相関し、例えば１０３ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの群では、１０匹中３匹のマウス（３０％）が最小防御抗体値より高く、生存率は３０％であった。ＰＢＳ群のマウスは全て、ＲＡＢＶによる攻撃後９日以内に死亡した。この結果から、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇは２用量免疫化スケジュールでマウスにおいて狂犬病攻撃に対する防御免疫応答を誘発可能であることが示された。１００％防御のためのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの最小有効２用量は、１０５ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇである。
【０１７９】
２用量レジメン試験の結果から、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの狂犬病攻撃に対する免疫原性潜在力が実証されたが、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇがマウスにおいて１用量ワクチン接種で有効となり得るかどうかをさらに調べた。３つのマウス群に、１０５、１０６又は１０７ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧをＩＮワクチン接種した。対照群にはＩＮ経路によって１０７ＰＦＵのＰＩＶ５を投与した。免疫の３週間後、マウスをＩ．Ｃ．経路により５０ＬＤ５０の狂犬病ＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３０Ａ及び図３０Ｂに示されるとおり、１０５、１０６又は１０７ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧでＩＮ免疫したマウス群は、平均ＶＮＡ力価の用量依存的な増加を示し、生存率は７７．８％、１００％、及び１００％であった。従って、ＩＮワクチン接種による１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの単一用量が、狂犬病ウイルス攻撃に対する１００％防御のための最小用量であった。
【０１８０】
マウスにおける筋肉内接種によるｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの有効性。状況によっては、ＩＭワクチン接種が好ましいこともある。従って、ＩＭ免疫の有効性を調べた。ＩＮ接種と同時に、３つのマウス群に、ＩＭ経路によって１０６、１０７又は１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを注入した。免疫の３週間後、マウスをＩ．Ｃ．経路により５０ＬＤ５０の狂犬病ＣＶＳ−２４株で攻撃した。図３０Ａ及び図３０Ｂに示されるとおり、ＩＭによって１０６、１０７又は１０８ＰＦＵでワクチン接種した群は平均ＶＮＡ力価の用量依存的な増加を示し、それぞれ６０％、７０％及び９０％の生存率を示した。
【０１８１】
マウスにおける経口接種によるｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの有効性。経口経路による有効なワクチン接種は、野生動物のワクチン接種の成功にとって決定的である。経口免疫によるワクチン候補の有効性を決定するため、３つのマウスの群に、ＩＮ経路による１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ、ＩＭ経路による１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇ、又は経口経路による１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇをワクチン接種した。２つの陰性対照群は、ＩＮ経路によって１０６ＰＦＵのＰＩＶ５又はＰＢＳの接種を受けた。加えて、対照マウス群に、弱毒化狂犬病ワクチンであるｒＬＢＮＳＥ株１０７ＦＦＵを、ＩＭ経路によってワクチン接種した。ワクチン接種の３週間後にＲＶ  ＶＮＡアッセイ用の血清を採取し、Ｉ．Ｃ．経路によって５０ＬＤ５０の狂犬病ＣＶＳ−２４株でマウスを攻撃した。図３１Ｂに示されるとおり、ＩＮ経路によって１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを投与したマウス、及びＩＭ経路によって１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇを投与したマウスの全てが、攻撃を生き残った。経口経路により１０８ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇをワクチン接種したマウスは５０％の生存率であった一方、ｒＬＢＮＳＥ株ワクチン接種マウスの６０％が生き残った。ＰＩＶ５群又はＰＢＳ群のいずれのマウスも、攻撃後９日以内に全て死亡した。最も高い平均ＶＮＡレベルは、ＩＮ経路による１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの群で見出された（図３１Ａ）。全体として、平均ＶＮＡレベルは、予想どおり生存率と正の相関を有した。
【０１８２】
考察
過去１０年の間、弱毒生ＲＡＢＶ又はＲＡＢＶ  Ｇを発現する組換えウイルス（Ｖ−ＲＧなど）をベースとする数多くの組換え狂犬病ワクチン候補が、現行の狂犬病ワクチンに代わる可能性を有するものとして開発されてきた（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：８２４１−８２５２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３５６：１４７−１５４；Ｔｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）；１３１：４６７−４７６；Ｗｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ；２５：４２１３−４２２２；Ｗｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ；２７：７１９８−７２０１；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ；１４：６６２−６７２）。それらのワクチン候補の一部は、ＩＭによる投与時に防御免疫を生じたが、これらの候補による経口免疫の有効性に関するデータは欠けている。報告されている中で、狂犬病Ｇ遺伝子を有するイヌアデノウイルスによる経口免疫は、マウスにおいて狂犬病感染に対する防御を付与しなかった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３５６：１４７−１５４）。Ｖ−ＲＧに代わるより安全なものとして、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子を発現する組換えＭＶＡワクチンが作成されてマウスで試験され、その結果から、１０９ＰＦＵもの高い用量を末梢経路によりワクチン接種したマウスにおいてのみ、防御が認められたことが示された（Ｗｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ；２７：７１９８−７２０１）。
【０１８３】
この例は、ＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間にＲＡＢＶのＧ遺伝子を挿入すると、経口免疫並びにＩＮ及びＩＭ免疫により有効な有効ワクチンが提供されることを実証する。これは、パラミクソウイルスをワクチンベクターとして使用した狂犬病ウイルスワクチンについてのマウスにおける経口免疫有効性を初めて実証したものであり、経口送達が不可欠なワクチンの開発にＰＩＶ５をベクターとして使用し得ることが示される。
【０１８４】
３つの免疫化経路をマウスにおいて試験した。そのうち、ＩＮ接種で最良の免疫応答及び防御が得られ、ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇが狂犬病に対する防御免疫応答を誘発できることを実証した。米国では、長年多くの飼い犬でケンネルコフワクチン接種などのＩＮ免疫が使用されている。ＰＩＶ５−ＲＶ−ＧがＩＮ免疫により有効であったことから、それを既存のイヌワクチン接種プログラムに組み込み可能であることが示唆される。免疫化のＩＭ経路は、用量が高いほど有効であった。精製ＰＩＶ５−ＲＶ−ＧビリオンでＧが検出されたため、ＩＭ免疫化においては、ＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの用量が高いほどより多くのＧタンパク質が注入されたものと思われる。しかしながら、前出の例に示されるとおり、ＩＭによって投与された不活化ＰＩＶ５ベースのワクチンは部分免疫しか提供しないため、ＩＭ経路によるＰＩＶ５ベースのワクチンの免疫を高度に有効とするには、実にウイルスが生きている必要がある（実施例７及びＭｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３６３−７１を参照）。単一用量接種はマウスにおいて致死性狂犬病ウイルス攻撃に対し免疫を提供したが、ブーストがｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇの有効性をさらに増強した：ＩＮ経路の接種で１０５ＰＦＵの単一用量により７７％防御が得られたのに対し、１０５ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇによるプライム−ブーストは１００％防御を提供した。平均ＶＮＡ力価は１用量の１０５ＰＦＵにおける２．７６ＩＵから２用量ワクチン接種における７．９４ＩＵに増加した。最も顕著なことには、ＩＮ接種で１用量から２用量の１０６ＰＦＵのｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇによることで、ＶＮＡがマウスにおいて４．７３ＩＵから６２．９６ＩＵに増加した。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇをワクチン接種したマウスにおいて既往免疫応答が誘発されたことから、ＰＩＶ５に対する先行曝露がＰＩＶ５ベクター化抗原に対するロバストな免疫応答を妨げなかったことが示唆される。ｒＰＩＶ５−ＲＶ−Ｇワクチンを使用する際の懸念の一つは、先在する抗ＰＩＶ５免疫がＰＩＶ５ベクター化ワクチンの有効性に悪影響を及ぼすかどうかである。
【０１８５】
生ワクチンによるブーストからのロバストな免疫応答は、ウイルスベクターに対する先在する免疫がＰＩＶ５ベースのワクチンの有効性に影響を及ぼさなかったことを示唆している。さらに、実施例２に示されるとおり、ＰＩＶ５に対する中和抗体を有するイヌが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡを発現するＰＩＶ５による免疫後にインフルエンザウイルスに対して防御免疫応答を生じたことから、先行曝露を有するイヌにおいてＰＩＶ５ベースのワクチンが有効であることが示される（実施例２及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ；７（１１）：ｅ５０１４４を参照）。新生仔イヌにおける狂犬病ワクチン、特に弱毒生狂犬病ワクチンの使用は、母性抗狂犬病抗体が６ヶ月もの間持続し得るため、制限されている。ＰＩＶ５ベースの狂犬病ワクチンは、新生仔イヌを有効にワクチン接種する代替的な方法を提供する。
【０１８６】
ｒＰＩＶ５−ＲＶ−ＧについてはＩＮ免疫が最良の防御を提供したが、野良犬又は野生動物のワクチン接種には経口免疫が最良の手法であろう。経口ワクチンは、その使用の簡便さ、集団予防接種運動との適合性、及び接触が困難な種に接触できるなど、従来のワクチンと比べて利点を有する（Ｆａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｚｏｏｎｏｓｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ；５６：２６２−２６９）。本研究におけるマウスの半分が、１用量ワクチン接種で防御された。これは現行の生狂犬病ワクチンに匹敵する。経口ワクチン接種の防御機構については、ほとんど解明されていない。経口ワクチン接種したマウスの末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒｉａｌ  ｂｌｏｏｄ）由来の血清のＶＮＡ力価は、全身免疫応答を示した。経口接種によるＶＮＡ力価の範囲は０．１ＩＵ〜３．８ＩＵであり、平均力価は１．５ＩＵであった。ＰＩＶ５は経口経路によって抗原を粘膜細胞に送達することができ、それによりＰＩＶ５ベクター化抗原に対する全身性反応を含む特異的免疫応答が生じたものと思われた。プライム−ブーストレジメンを用いることにより、経口接種の防御有効性をさらに増加させることが可能である。加えて、ＰＩＶ５ベクターを修飾すると、ＰＩＶ５ベクター化狂犬病ワクチンの有効性が増加し得る。前出の例に示されるとおり、ＰＩＶ５内における外来遺伝子（ｆｏｒｅｇｉｎ  ｇｅｎｅ）の挿入部位が、ＰＩＶ５ベースのワクチンの免疫原性に影響を及ぼす（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３５４−６２も参照のこと）。例えば、Ｈ５Ｎ１のＨＡをＰＩＶ５内でＳＨとＨＮとの間に挿入すると、マウスにおいて、Ｈ５Ｎ１のＨＡがＰＩＶ５内でＨＮとＬとの間に挿入されたワクチンと比べ、Ｈ５Ｎ１攻撃に対してより良好な免疫を生じるワクチン候補となる。ＰＩＶ５ベースのワクチンの有効性は、ＰＩＶ５ゲノム内の異なる位置にＧ遺伝子を挿入することにより、経口免疫に関してさらに改善することができる。加えて、さらなる狂犬病ウイルス抗原の発現がＰＩＶ５ベースのワクチンの効力を増強し得る。以前、狂犬病ＲＮＰが防御性であり得ることが報告されている。例えば、ＰＩＶ５を使用して狂犬病Ｎ、Ｐ又はＬタンパク質のうちの一つをＧタンパク質と共に発現させると、免疫防御有効性が増強され得る。
【０１８７】
この例に示されるとおり、ＰＩＶ５ベースの狂犬病ワクチンは狂犬病ウイルス感染からの致死的攻撃を防御するロバストな免疫応答を生じており、イヌにおける狂犬病感染を制御するための狂犬病用ワクチンとしてのＰＩＶ５の潜在力、並びにイヌ及び他の動物並びにヒトにおける他の感染症向けのベクターとしてのその潜在力を実証している。
【０１８８】
この例は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｂｉｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（新規糖タンパク質を発現する組換えパラインフルエンザウイルス５型ベースの狂犬病ワクチン）」  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；２０１２  Ｄｅｃ  ２６  ［印刷版に先行する電子版］，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２８８６−１２としても発表されており、これは全体として参照により本明細書に援用される。
【０１８９】
［実施例５］
卵内ワクチン接種用のＰＩＶ５ベースのワクチンの免疫原性
この例は、潜在的な卵内接種用ワクチンとしてのＰＩＶ５ベースのワクチンの有効性を実証する。表１に示すとおり、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現するＰＩＶ５（ＰＩＶ５−Ｈ５、ＺＬ４６としても知られる；ここでＨ５はＰＩＶ５ゲノム内のＳＨとＨＮとの遺伝子間に挿入された）の卵内注射は、孵化率に影響を及ぼさなかった。
【表１】
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【０１９０】
次に、孵化後１４日目及び２８日目のニワトリにおいて抗インフルエンザウイルス抗体力価を調べた。１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）もの低さの用量で、ロバストな抗インフルエンザウイルス免疫を生じさせることができた（図３２）。簡潔に言えば、卵内経路によりＰＩＶ５−Ｈ５を接種したニワトリの抗インフルエンザ抗体力価を測定した。１８日齢ＳＰＦ胚に、１００μｌのＰＩＶ５−Ｈ５を使用して卵内ワクチン接種した（力価は図３２において各群の下に示す）。ワクチン接種は、Ｉｎｏｖｏｊｅｃｔオートマット（Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、旧Ｅｍｂｒｅｘ）を使用して実施した。孵化後、ニワトリは陽圧下のＨｏｒｓｆａｌｌ−Ｂａｕｅｒ装置に保管した。ワクチン接種したニワトリがウイルスを排出するかどうかを調べるため、対照群の３匹の未感作孵化メイトを各ウイルス接種群に加えた。孵化（ａｈ）後１４日目及び２８日目にニワトリを出血させた。血球凝集抑制（ｈｅｍａｇｇｌｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（ＨＩ）力価をＯＩＥ勧告に従い決定した。
【０１９１】
未感作の同居させたニワトリにおいても抗インフルエンザ抗体が検出されたことから、ＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）の排出が示唆される。生ワクチンの排出は、群れ免疫を生じさせるには潜在的に有益であるが、規制上の懸念について難題を提起し得る。従って、他のＰＩＶ５ベースのＨ５ワクチンを卵内で試験して、排出なしにロバストな免疫を生じるＰＩＶ５ベースのワクチンを同定する。
【０１９２】
弱毒化された、且つＨ５を発現するいくつかのＰＩＶ５コンストラクトが作成されており、上記に記載したとおり試験し得る。これには、限定はされないが、本明細書に含まれ且つ図３３に示される例に記載されるとおりのコンストラクトが含まれる。図３３は、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５の概略図を示す。ＰＩＶ５はネガティブセンスＲＮＡゲノムを含むパラミクソウイルスである。これは、８つの既知のウイルスタンパク質をコードする。リーダー及びトレーラー配列は、ウイルスのＲＮＡ複製及び転写にとって重要である。ＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）の結果は、表１及び図３２に示される。ＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４８）は、ＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間にＨ５挿入を有する。ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５はＳＨ遺伝子が欠損している。ＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５は、Ｖタンパク質の保存されたＣ末端が欠損している。ＳＨ欠失及び保存されたＣ末端の欠失を組み合わせてＰＩＶ５ＶΔＣΔＳＨ−Ｈ５が作製されている。ＳＨ又はＶΔＣの欠失は、マウスにおいて減弱を生じさせる。
【０１９３】
前出のとおり、１８日齢の胚に、種々の用量（１０，０００、１，０００、１００及び１０ＰＦＵ／卵）のウイルスを卵内接種する。希釈当たり５４個の卵を使用する。ＰＢＳ接種を対照として使用する。ウイルス接種卵及びＰＢＳ接種卵の孵化率を比較する。孵化後、各群から１０匹のニワトリを選び、陰性対照の５匹のニワトリ（ＰＢＳ接種したもの）と混ぜる。ウイルスが排出されるのはどこか、気道からか、それとも消化管からかを分析するため、排泄腔及び口腔咽頭スワブを採取し、細胞を使用してウイルスを単離することによるか及び／又はｑＲＴ−ＰＣＲによりウイルスの存在を決定する。孵化後２日目（ｄ）、５ｄ、７ｄ、１４ｄの各ニワトリのスワブを採取し、ウイルスについて調べる。孵化後１４日目及び２８日目、ニワトリを出血させ、ＨＩ試験を用いて抗ＨＡ力価を決定する。
【０１９４】
［実施例６］
動物の健康のためのワクチン
ＰＩＶ５イヌインフルエンザワクチン開発。イヌインフルエンザに対するＰＩＶ５−Ｈ３ベクター化ワクチンを開発するため、以下を行う：
イヌインフルエンザのＨ３遺伝子のＤＮＡ配列を決定する；
発現制御エレメントを選択する；
ＲＧプラスミド系の所望の挿入部位にＨＡ遺伝子を合成及びクローニングする；
ＨＡ遺伝子及び発現制御エレメントの配列を確認する；
適切な細胞系において組換えウイルスをトランスフェクト及びレスキューする；
組換えウイルスからのＨＡタンパク質の発現を確認する；
組換えウイルスストックを調製及び保存する；
組換えウイルスをプラーク精製する；
プラーク精製ウイルスの５、１０及び１５継代目に、Ｈ３タンパク質発現並びにプロモーター及びターミネーター配列を含めたＤＮＡ配列のインビトロ安定性を確認する；
少なくとも２つの動物試験を行うのに十分なＰ１０〜１２のウイルスストックを調製する；及び
イヌにおいてＰＯＣ動物試験を実施する。
【０１９５】
ＰＩＶ５犬ジステンパーワクチン開発。イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）に対するＰＩＶ５−Ｆ＋Ｈベクター化ワクチンを開発するため、以下を行う：
ＣＤＶのＦ及びＨ遺伝子のＤＮＡ配列を決定する；
発現制御エレメントを選択する；
ＲＧプラスミド系の所望の挿入部位にＦ及びＨ遺伝子をクローニングする；
Ｆ及びＨ遺伝子及び発現制御エレメントの配列を確認する；
適切な細胞系において組換えウイルスをトランスフェクト及びレスキューする；
組換えウイルスからのＦ及びＨタンパク質の発現を確認する；
組換えウイルスストックを調製及び保存する；
組換えウイルスをプラーク精製する；
プラーク精製ウイルスの５、１０及び１５継代目に、Ｆ及びＨタンパク質発現並びにプロモーター及びターミネーター配列を含めたＤＮＡ配列のインビトロ安定性を確認する；  少なくとも２つの動物試験を行うのに十分なＰ１０〜１２のウイルスストックを調製する；及び
イヌにおいてＰＯＣ動物試験を実施する。
【０１９６】
Ｆ＋Ｈの両方の遺伝子を単一のワクチンベクターに組み込むことができない場合、ＰＩＶ５−Ｆ及びＰＩＶ５−Ｈベクター化ワクチンを個別に合成する。
【０１９７】
ＰＩＶ５−ＦｅＬＶワクチン開発計画。ＦｅＬＶに対するＰＩＶ５−ｇｐ７０ベクター化ワクチンを開発するため、以下を行う：
ＦｅＬｖ  ｇｐ７０のＤＮＡ配列を決定する；
発現制御エレメントを選択する；
ＲＧプラスミド系の所望の挿入部位にｇｐ７０遺伝子を合成及びクローニングする；
ｇｐ７０遺伝子及び発現制御エレメントの配列を確認する；
適切な細胞系において組換えウイルスをトランスフェクト及びレスキューする；
組換えウイルスからのｇｐ７０タンパク質の発現を確認する；
組換えウイルスストックを調製及び保存する；
組換えウイルスをプラーク精製する；
プラーク精製ウイルスの５、１０及び１５継代目に、ｇｐ７０タンパク質発現並びにプロモーター及びターミネーター配列を含めたＤＮＡ配列のインビトロ安定性を確認する；  少なくとも２つの動物試験を行うのに十分なＰ１０〜１２のウイルスストックを調製する；及び
ネコにおいてＰＯＣ動物試験を実施する。
【０１９８】
ＰＩＶ５ネコカリシウイルスワクチン開発計画。ネコカリシウイルスに対するＰＩＶ５カリシウイルスカプシドベクター化ワクチンを開発するため、以下を行う：
ネコカリシウイルスのカプシド遺伝子のＤＮＡ配列を決定する；
発現制御エレメントを選択する；
ＲＧプラスミド系の所望の挿入部位にカプシド遺伝子を合成及びクローニングする；
カプシド遺伝子及び発現制御エレメントの配列を確認する；
適切な細胞系において組換えウイルスをトランスフェクト及びレスキューする；
組換えウイルスからのカプシドタンパク質の発現を確認する；
組換えウイルスストックを調製及び保存する；
組換えウイルスをプラーク精製する；
プラーク精製ウイルスの５、１０、及び１５継代目に、カプシドタンパク質発現並びにプロモーター及びターミネーター配列を含めたＤＮＡ配列のインビトロ安定性を確認する；
少なくとも２つの動物試験を行うのに十分なＰ１０〜１２のウイルスストックを調製する；及び
ネコにおいてＰＯＣ動物試験を実施する。
【０１９９】
［実施例７］
インフルエンザヘマグルチニンをコードする組換えＰＩＶ５ワクチンは、鼻腔内又は筋肉内送達時、Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス感染を防御する
インフルエンザウイルス感染を予防する新しいワクチン接種手法が必要とされている。Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルスなどの新興ウイルスは、世界的流行の脅威をもたらすのみならず、ワクチン開発及び生産にも難題を提起する。パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）はワクチン開発に魅力的なベクターである。この例では、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩウイルス由来のＨＡをコードするＰＩＶ５−Ｈ５の有効性を種々のワクチンスキームで試験した。生ＰＩＶ５−Ｈ５による単回の筋肉内又は鼻腔内免疫は、ロバストな中和血清抗体反応を速やかに誘発し、ＨＰＡＩ攻撃を防御したが、鼻腔内免疫によりプライムされた粘膜ＩｇＡ応答は、肺におけるウイルス複製をより有効に制御した。ＰＩＶ５−Ｈ５ワクチンはＨ５  ＨＡをビリオンに組み込み、不活化フォーマットのワクチンの有効性を試験した。不活化ＰＩＶ５−Ｈ５は中和血清抗体反応をプライムし、Ｈ５Ｎ１ウイルス複製を制御したが、他のＨ５抗原ワクチンと同様に、防御免疫応答をプライムするのにブースター免疫が必要であった。まとめると、これらの結果は、ＰＩＶ５−ＨＡワクチン及び詳細にはＨ５特異的ワクチンが、複数のフォーマットで、且つ複数の投与経路により利用され得ることを示唆している。これは、専ら鼻腔内投与であることに基づき起こり得る禁忌を回避し、単一のワクチンベクターを使用しながらも、より広い適用機会を提供し得る。
【０２００】
実施例３に示されるとおり、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡを発現するＰＩＶ５ワクチンは、マウスにおいて生鼻腔内ワクチンとして送達されるとき、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）攻撃の防御に有効である。鼻腔内（ＩＮ）免疫化は魅力的ながら、欠点がある。免疫が低下した集団において生の鼻腔内ウイルスをワクチンとして使用することに関しては、禁忌となる可能性がある。注射ワクチンはこの課題を回避し、農業適用において集団予防接種の機会を提供し得る。この例は、代替的な経路により送達されるｒＰＩＶ５−Ｈ５ワクチンの有効性を比較し、ｒＰＩＶ５−Ｈ５が鼻腔内投与時のみならず、筋肉内投与時にも同様にＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対して防御的であることを示す。さらに、不活化ＰＩＶ５−Ｈ５ワクチンはＨ５Ｎ１感染に対する防御に有効であったが、これにはブースター免疫が必要である。
【０２０１】
材料及び方法
インフルエンザウイルス。用いられるＡ型インフルエンザウイルスには、ＶＮＨ５Ｎ１−ＰＲ８／ＣＤＣ−ＲＧ（Ｈ５Ｎ１；ｒｇＶＮ−ＰＲ８；Ｒｕｂｅｎ  Ｄｏｎｉｓ博士，ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡから供与された）及びＡ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１；Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｂｂｙ，セント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ），Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮから供与された））が含まれる。Ａ／ＶＮ−ＰＲ８は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で４８〜７２時間増殖させた。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活化Ａ／ベトナム／１２０３／０４は、セント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のＲｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｂｂｙから供与された。Ａ／ベトナム／１２０３／０４は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で２４時間増殖させた。ウイルスは全て、アリコートに分け、−８０℃で保存した。生の高病原性鳥インフルエンザウイルスを使用した実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによる審査及び承認を受け、ＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従いバイオセーフティレベル３、高度な封じ込め下で行われた。
【０２０２】
マウス。全ての試験に雌性６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用した。ＢＳＬ２ウイルスによるマウスの免疫化及び試験は、高度ＢＳＬ２施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。マウスＨＰＡＩ感染は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによって承認されている指針及びＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従い、高度ＢＳＬ３施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。全ての動物試験は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の動物管理・使用委員会によって承認されている指針に基づき行われた。
【０２０３】
細胞。メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞は、５％ＦＢＳ、５％Ｌ−グルタミン、及び抗生物質／抗真菌薬溶液（１０，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０，０００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２５ｕｇ／ｍｌアムホテリシンＢ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を含有するＤＭＥＭで培養した。Ｖｅｒｏ細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生物質／抗真菌薬を含有する最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。５％ＦＢＳ、５％Ｌ−グルタミン、及び抗生物質／抗真菌薬溶液（１０，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０，０００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２５ｕｇ／ｍｌアムホテリシンＢ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を含有するＤＭＥＭで培養したメイディンダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）。全ての細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２０４】
組換えウイルスの構築。ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）を、前出の例に記載されるとおり作成した。簡潔に言えば、ＨＡ遺伝子を含む組換えＰＩＶ５プラスミド、ＺＬ４６（ｒＰＩＶ５−Ｈ５−ＳＨ／ＨＮ）を作成した。ＺＬ４６プラスミドを作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノムを含むプラスミドＢＨ２７６をベクターとして使用した。ＳＨとＨＮとの遺伝子間の遺伝子終了（ＧＥ）、遺伝子間領域及び遺伝子開始（ＧＳ）配列をプライマーに加えてＨＡ遺伝子転写を停止させ、ＨＮ遺伝子転写を開始させた。次にＨＡ遺伝子を増幅した。次にウイルスをレスキューし、前述のとおり配列決定した。
【０２０５】
ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５ウイルスストックを２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにおいて５〜７日間、それらの血球吸着力価がプラトーに達するまでＭＤＢＫ細胞で成長させた（＜ｐ２０）。培地を採取し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機（５８１０  Ｒ）において３０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより清澄化した。清澄化した上清にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して全溶液を１％ＢＳＡにした。次にウイルスストックをアリコートに分け、ドライアイスで急速凍結し、−８０℃で保存した。次にＶＥＲＯ細胞に対するプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【０２０６】
ウイルス定量化。ＶＥＲＯ細胞に対するプラークアッセイによりＰＩＶ５力価を決定した。ＶＥＲＯ細胞を、１％ＢＳＡ及び抗生物質／抗真菌薬を含むＤＭＥＭ中に作製したウイルス試料の段階希釈液と共にインキュベートした。次にウイルス試料を取り出し、１：１の低融点アガロースと２％ＦＢＳ及び抗生物質／抗真菌薬を含有するＤＭＥＭとでオーバーレイし、３７℃で５〜６日間インキュベートした。プラークを検出するため、次に単層を１０％緩衝ホルマリンで固定し、免疫染色した。２％ＦＢＳ、０．１％ナトリウムアジド、及び０．５％サポニンを含む１×ＰＢＳ（透過処理緩衝液）で細胞を透過処理した。ＰＩＶ５のＶ及びＰタンパク質の共通領域（Ｖ／Ｐ）に特異的な１：１０００希釈の抗体を使用して１時間、ＰＩＶ５を検出した。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３０分間インキュベートした。プラークを可視化するため、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（製造者の指示に従い調製した）を添加した（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ）。次にプレートを洗浄し、乾燥させてプラークを計数した。以前記載されているとおりのＴＣＩＤ５０アッセイによるか（Ｓｏｂｏｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ；６：ｅ２１９３７）、或いはＭＤＣＫ細胞に対するプラークアッセイにより、インフルエンザ力価を決定した。ＭＤＣＫ細胞を、１ｍｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＭＥＭ中に作製したウイルス試料の段階希釈液と共に３７℃で２時間インキュベートした。次に希釈ウイルス試料を取り出し、１ｍｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシンを含む１．２％微結晶性セルロースＡｖｉｃｅｌを単層にオーバーレイした。プレートを７２時間インキュベートし、オーバーレイをＰＢＳで穏やかに洗い落し、冷メタノール／アセトン（４０：６０％）で固定し、風乾し、クリスタルバイオレットで対比染色して、プラークを可視化した。
【０２０７】
ＰＩＶ５ビリオンの精製及びクーマシー染色。Ｔ−１５０フラスコ中のＭＤＢＫ細胞を、ＭＯＩ０．１でＰＩＶ５、ＺＬ４８、又はＺＬ４６に感染させた。３ｄｐｉで培地を採取し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞デブリを除去した。清澄化した培地をＮＴＥ緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の２０％ショ糖にオーバーレイした。試料を４０，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間遠心した。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１．３ｍｌのＮＴＥ緩衝液中８０％ショ糖と混合した。１．８ｍｌ  ＮＴＥ緩衝液中５０％ショ糖を添加し、次に０．６ｍｌ  ＮＴＥ緩衝液中１０％ショ糖を添加することにより、勾配ショ糖溶液を得た。次に勾配ショ糖溶液を、４５，０００ｒｐｍ、４℃で３時間遠心した。５０％と１０％ショ糖の間の界面にあるビリオンによって形成された白色のバンドを採取し、４０，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間遠心することによりペレット化した。ペレットを０．５ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁した。ＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６又はＺＬ４７のビリオンを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、クマシーブルーで染色した。
【０２０８】
ウエスタンブロット。Ｖｅｒｏ細胞を５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩのＰＩＶ５又はＺＬ４６に感染させ、又はモック感染させた。感染後２４時間で、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを使用して、細胞を溶解した。分離及びウエスタンブロッティングを記載されるとおり実施した（Ｇａｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ；２２：１８９−１９８）。ｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８感染マウス由来の高度免疫血清を一次抗体として使用してＨＡを検出し、Ｖ／Ｐ特異的モノクローナル抗体を使用してＶ／Ｐを検出した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＷｅｓｔｅｒｎＣ（ＢｉｏＲａｄ）を標準として使用した。
【０２０９】
免疫蛍光法。Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートで成長させ、５ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＰＩＶ５又はＺＬ４６に感染させ、又はモック感染させた。感染後２４時間目、細胞を５％緩衝ホルマリンにより室温で１０分間固定した。次に細胞を透過処理緩衝液で透過処理し、次に１：１０００希釈（１μｇ／ｍｌ）の抗ＨＡ（Ｈ５）Ａ／ＶＮ／１２０３／０４モノクローナル抗体（ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）と共に１時間インキュベートした。１：２５０希釈のＰＥヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を４５分間加えてＨＡを検出した。ＰＩＶ５を検出するため、次にＶ／Ｐ特異抗体（１：１０００希釈した）を添加し、１時間インキュベートした。ＰＩＶ５を可視化するため、１：５００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３０分間インキュベートした後、洗浄した。各ウェルに０．５ｍＬ  ＰＢＳを添加し、ＡＭＳ  ＥＶＯＳ  ｆｌ蛍光顕微鏡を使用して蛍光を調べた。細胞は各工程の間にＰＢＳで十分に洗浄した。
【０２１０】
動的光散乱（ＤＬＳ）。ＤＬＳを記載されるとおり実施した（Ｄｒｉｓｋｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｉｐｐ，２０１１，Ａｎａｌｙｓｔ；１３６：３０８３−３０９０）。抗ＨＡ（Ｈ５）Ａ／ＶＮ／１２０３／０４  ｍＡｂ（ＢＥＩ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を使用した。製造者の指示に従いＮＡｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、血清からＩｇＧを精製した。次に、精製したＩｇＧを、ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造者の指示に従い使用して脱塩した。次に、脱塩したＩｇＧを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造者の指示に従い使用して、最終容量が約２ｍＬになるまで濃縮した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造者の指示に従い使用して、タンパク質を定量化した。ＰＩＶ５、ＺＬ４６、ＺＬ４８、ｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８、ウイルス培養上清、尿膜腔液、及びＰＢＳをアッセイした。
【０２１１】
免疫化。ＰＩＶ５及びｒＰＩＶ５−Ｈ５によるワクチン接種については、５０μｌ  ＰＢＳ中の１０６ＰＦＵ  ＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−ＺＬ４６を、ｔｅｒｔ−アミルアルコール中の２，２，２−トリブロモエタノール（アベルチン；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）による麻酔下のマウスに鼻腔内投与した。致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８感染については、５０μｌ  ＰＢＳ中の２，０００ＰＦＵウイルスを、ＰＩＶ５ワクチン接種について記載されるとおり投与した。ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８筋肉内ワクチン接種については、２，０００ＰＦＵ  ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８を５０μｌ  ＰＢＳ中において尾側大腿筋に投与した。不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４免疫については、ＢＰＬ不活化ウイルスを２５６血球凝集単位（ＨＡＵ）／ｍｌで５０μｌ  ＰＢＳに再懸濁し、これを尾側大腿筋の各々に注入した（１００μｌ、合計２５ＨＡＵ）。免疫後２１日目に血液を採取した。ワクチン接種後１４日目又は２１日目に、それぞれ０．５又は１ｍｌ  ＰＢＳを使用して鼻洗浄及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いてＨＡ（Ｈ５）特異的血清抗体力価を測定した。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２  ＨＢ９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍｌ組換えＨ５タンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次にプレートをＫＰＬ洗浄溶液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）で洗浄し、５％脱脂粉乳及び０．５％ＢＳＡを含有する２００μｌのＫＰＬ洗浄溶液（ブロッキング緩衝液）により室温で１時間、ウェルをブロッキングした。血清試料の段階希釈液を（ブロッキング緩衝液中に）作製し、コーティングしたプレートに移して１時間インキュベートした。結合した血清抗体を検出するため、各ウェルに１００μｌのブロッキング緩衝液中１：１０００希釈アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。１００μｌ  ｐＮＰＰホスファターゼ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）を添加することによりプレートを発色させ、室温で反応により発色させた。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳプレートリーダーにおいて光学濃度（ＯＤ）を４０５ｎｍで計測した。ＩｇＧ力価は、未感作血清の平均ＯＤ＋２標準偏差より高いＯＤを有する最小の血清希釈度と決定した。
【０２１３】
マイクロ中和アッセイ。ＥＬＩＳＡエンドポイントによるマイクロ中和アッセイにより、血清中のインフルエンザ中和抗体力価を計測した。１％ＢＳＡ、抗生物質／抗真菌薬、及び１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫトリプシンを含有するＤＭＥＭに熱不活化血清を段階希釈した。次に希釈した血清を、１０００  ＴＣＩＤ５０のｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８と３７℃で２時間インキュベートした。次にＭＤＣＫ細胞を添加し、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベーション終了時、ウェルを氷冷メタノール及びアセトン（それぞれ８０：２０）で固定し、上記に記載したとおりＥＬＩＳＡを実施した。中和力価は、バックグラウンドＯＤを２倍上回るＯＤ読取りにより決定するものとして、１，０００  ＴＣＩＤ５０のｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８を中和することが可能な最小の血清希釈度であると定めた。
【０２１４】
リンパ球採取及びＥｌｉｓｐｏｔ。ＰＩＶ５、ＺＬ４６、又はｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８によるワクチン接種の１２日後、マウスから縦隔リンパ節（ＭＬＮ）を採取し、プールして、ホモジナイズした。ゲイ平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して室温で５分間、リンパ球から赤血球を枯渇させ、デブリを除去した。次に、Ｚ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子カウント及びサイズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞を計数した。記載されるとおり、不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４に対するリンパ球におけるＴ細胞応答を検出するＥＬＩＳｐｏｔを実施した（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１３：４２６−４３５）。５０μｌ完全腫瘍培地（ＣＴＭ）中の不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ウェルあたり１０ＨＡＵ当量）、関連性のないペプチドとしてエボラＧＰ  Ｐ２  ＥＹＬＦＥＶＤＮＬ（１μｇ／ｍｌ）、及びコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）で細胞を再刺激した。ＡＩＤ  ＶｉｒｕＳｐｏｔリーダー（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用してスポットを計数した。
【０２１５】
ウイルス攻撃実験。初めにＢＡＬＢ／ｃマウスを記載されるとおりワクチン接種し、次に指示されるとおり出血させた。最後の出血の少なくとも３日後、マウスを麻酔し、５０μｌ  ＰＢＳに希釈した１０  ＬＤ５０  Ａ／ベトナム／１２０３／０４又は２０，０００ＰＦＵのｒｇ  Ａ／ＶＮ−ＰＲ８を鼻腔内接種した。次に、罹患率及び死亡率についてマウスを毎日モニタし、隔日で体重を計測した。攻撃後３日目、マウス群を安楽死させ、それらの肺を１．０ｍｌ  ＰＢＳ中に採取し、ホモジナイズした。次にホモジネートを遠心により清澄化した。次に、記載されるとおり清澄化したホモジネートにおいてＴＣＩＤ５０アッセイを用いてウイルス力価を決定した（Ｓｏｂｏｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ；６：ｅ２１９３７）。
【０２１６】
統計的分析。生存の統計的有意差はログ・ランク分析により決定した。肺ウイルス力価の差はＡＮＯＶＡと、続いてダネットの多重比較検定により決定した。Ｐ≦０．０５を有意と見なした。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。
【０２１７】
結果
ｒＰＩＶ５−Ｈ５ビリオンにおけるＨＡの発現及び取り込み。組換えＰＩＶ５ウイルスの正常な発現及びパッケージングを試験するため、ＭＤＢＫ細胞を、ＰＩＶ５、ＺＬ４８、ＺＬ４６に感染させ、又はモック感染させた。ＺＬ４８は、ＨＮとＬとの間に挿入されたＨ５遺伝子を有するもので（実施例３）、既発表のウイルスと比較可能な対照として含めた。上清を採取し、ショ糖で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシー染色してタンパク質バンドを可視化した。ＰＩＶ５  ＨＮ、ＮＰ、Ｆ、Ｍ及びＭタンパク質に該当するサイズのタンパク質バンドを全ての試料に容易に見ることができ、一方、インフルエンザＨＡに該当するサイズのバンドはＺＬ４８及びＺＬ４６試料に見ることができたが、ＰＩＶ５には見られなかった（図３４Ｂ）。これらのバンドのアイデンティティをウエスタンブロットにより確認した。
【０２１８】
Ｈ５  ＨＡがビリオンに取り込まれたことを確認するため、動的光散乱（ＤＬＳ）及び金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）標識を利用して、ｒＰＩＶ５と、対するＺＬ４６のビリオン表面上のＨＡを検出した。ＰＩＶ５、ＺＬ４６、及びｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８の清澄化したウイルス培養上清をＡｕＮＰ標識抗ＨＡ（Ｈ５）抗体と共にインキュベートし、次に、ＡｕＮＰプローブの凝集を以前記載されるとおり計測した（Ｄｒｉｓｋｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｉｐｐ，２０１１，Ａｎａｌｙｓｔ；１３６：３０８３−３０９０）。ＡｕＮＰ凝集の程度は、特定のＨＡを含むウイルスの存在と相関し、ウイルスが増加するほど凝集及びＺシフトが増加する。ＺＬ４６について８ｎｍの平均流体力学的径（ｚ平均）の増加が、ＰＩＶ５と比較して観察された（それぞれ９０．４１±１．３１６対８２．０８±０．６０５ｎｍ）ことから、ウイルスを導入するとＡｕＮＰプローブの抗原特異的な凝集があったことが示され、ＨＡがビリオンの表面に存在することが示唆される。ＰＩＶ５で観察された平均直径は、培養上清又は尿膜腔液単独（それぞれ７７．０６±０．６０９及び８１．２５±１．２８７ｎｍ）とほぼ同じサイズであった。陽性対照のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８ウイルスは、平均直径が１１３．６７±１．４７５ｎｍであった。
【０２１９】
ＰＩＶ５−Ｈ５感染中に天然のＨＡが発現されていたことを確認するため、Ｖｅｒｏ細胞を、ＰＩＶ５、ＺＬ４６に感染させるか（ＭＯＩ＝５）、又はモック感染させ、２４時間後、溶解してウエスタンブロットにより分析した。ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１）ウイルスに対して生じたポリクローナル抗血清で検出すると、ＺＬ４６細胞ライセート中においてインフルエンザＨＡ０単量体のサイズである７５ｋＤタンパク質が可視化されたが、ＰＩＶ５又はモックライセート中では可視化されなかった（図３４Ｃ）。ＰＩＶ５  Ｖ／Ｐ特異的ｍＡｂで検出された４６ｋＤａバンドは、全ての感染ライセートに存在する。Ｈ５  ＨＡが感染細胞の表面上で発現することを確認するため、免疫蛍光染色を実施した。ＰＩＶ５、ＺＬ４６に感染させるか（ＭＯＩ＝５）又はモック感染させたＶｅｒｏ細胞を、抗ＨＡ（Ｈ５）ｍＡｂ又はＰＩＶ５のＶ／Ｐタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（抗Ｖ／Ｐ）で染色した。ＺＬ４６及びＰＩＶ５感染細胞の両方でＶ／Ｐのロバストな同等の発現が検出された一方、Ｈ５はＺＬ４６感染細胞においてのみ検出され、ＨＡがｒＰＩＶ５−Ｈ５に感染した細胞で発現していることが確認された（図３４Ｄ）。
【０２２０】
ＰＩＶ５−Ｈ５による筋肉内又は鼻腔内免疫はＨＡ特異的免疫応答を誘導する。Ｈ３ウイルスのＨＡ又はＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１由来のＨ５を発現する組換えＰＩＶ５コンストラクトによる鼻腔内免疫は、マウスにおいてインフルエンザウイルス攻撃に対して防御性であることが示された（実施例３及びＴｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２：１３９−１５０）。しかしながら、ワクチン接種に広く用いられている免疫化経路である筋肉内免疫は、試験されていない。さらに、Ｈ５  ＨＡがｒＰＩＶ５−Ｈ５ビリオンで検出されたため、現行の不活化インフルエンザワクチンと同様に、不活化ワクチンが防御免疫応答を誘導し得る可能性があった。ｒＰＩＶ５−Ｈ５が筋肉内（ＩＭ）投与時に免疫原性であるかどうかを決定するため、マウスにｒＰＩＶ５−Ｈ５を生ウイルス（ＺＬ４６）でＩＮ、及び生又は不活化（ｉＺＬ４６）ウイルスでＩＭによりワクチン接種した。最後のマウス群には陽性対照として不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）を投与し、全ての群を、ＰＩＶ５を鼻腔内（ＩＮ）投与したマウスと比較した。７日目、１４日目、及び２１日目にマウスを出血させ、それらの血清をＨＡ特異的ＩｇＧ及びＨ５Ｎ１インフルエンザ中和抗体について評価した。ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）を鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌｌｙ）又は筋肉内にワクチン接種したマウスは、それぞれ、早くも免疫後７日目又は１４日目に高レベルのＩｇＧを生じ（図３５Ａ）、力価は、不活化全インフルエンザウイルス（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）で免疫したマウスに匹敵した。同様に、ＺＬ４６  ＩＭ又はＩＮ免疫はロバストな中和血清抗体をプライムし（図３５Ｂ）、しかしながら不活化インフルエンザウイルス力価の方が免疫後２１日目まで高かった。対照的に、不活化ＺＬ４６（ｉＺＬ４６）  ＩＭでワクチン接種したマウスが生成したＩｇＧ及び中和抗体は限られていたことから、強力な体液性応答をプライムするにはＨＡ抗原の量が不十分であるか、免疫の誘導にＰＩＶ５複製が必要とされ得ることが示唆された。予想どおり、ＰＩＶ５ワクチン接種マウスは、検出可能なＨＡ特異的ＩｇＧ抗体又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８中和抗体を生成しなかった（図３５Ａ及び図３５Ｂ）。
【０２２１】
鼻腔内免疫の一つの利点は、粘膜免疫応答を誘導する潜在力である。ｒＰＩＶ５−Ｈ５をＩＮによりワクチン接種されるのと、それに対してＩＭによりワクチン接種されるのとでのマウスにおけるＩｇＡ応答の違いを評価するため、マウスに、ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）をＩＭ若しくはＩＮワクチン接種するか、又は致死量以下のｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８を接種し、免疫後１４日目又は２１日目に鼻洗浄及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。ｒＰＩＶ５−Ｈ５をＩＭワクチン接種したマウスでは、鼻洗浄液又はＢＡＬ液においてＩｇＡは検出不能であった。対照的に、ｒＰＩＶ５−Ｈ５の鼻腔内投与は免疫化マウスの鼻道及び肺の両方にロバストなＩｇＡ応答を誘導した（それぞれ図３５Ｃ及び図３５Ｄ）。ＩｇＡレベルは１４日目にｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８感染マウスに匹敵したが、しかしながらインフルエンザ接種マウスにおける粘膜ＩｇＡ応答は、おそらくは排除されるまでのウイルス複製時間がｒＰＩＶ５と比較したときより長いことに起因して、１４日目の後も上昇し続けた。
【０２２２】
投与経路によるＴ細胞プライミングの違いを評価するため、ｒＰＩＶ５−Ｈ５又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８をＩＭ又はＩＮワクチン接種したマウスの群を、感染後１２日目に安楽死させ、インフルエンザ特異的ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞についてリンパ節リンパ球をアッセイした。ｒＰＩＶ５−Ｈ５又はインフルエンザウイルスによる鼻腔内ワクチン接種は、流入領域リンパ節においてロバストなインフルエンザ特異的Ｔ細胞応答をプライムしたが、ＩＭ免疫化マウスと比較して非特異的な応答の増加もまた有した（図３５Ｅ）。ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）によるＩＭワクチン接種は、おそらくはインフルエンザウイルスと比較して筋組織におけるＰＩＶ５の複製が向上したことに起因して、Ａ／ＶＮ／１２０３／０４特異的Ｔ細胞応答をｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８のＩＭ投与より有効にプライムした。Ｔ細胞はインフルエンザウイルス感染に対する防御において役割を果たし得るため、これは、ＰＩＶ５によるＩＭワクチン接種にとって有利であり得る。
【０２２３】
この粘膜応答がインフルエンザウイルス感染に対する防御に必須であるかどうか、すなわちｒＰＩＶ５−Ｈ５によるＩＭ免疫が攻撃を防御し得るかどうかを決定するため、マウスに、ＩＮ又はＩＭ送達したＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５−Ｈ５、又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８をワクチン接種した。またマウスのある群に、不活化ＰＩＶ５−Ｈ５  ＩＭ（ｉＺＬ４６）をワクチン接種し、検出された弱いＩｇＧ応答（図３５Ａ）が防御性であったかどうかを決定した。免疫後２８日目、マウスを１０  ＬＤ５０のＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１  Ａ／ＶＮ／１２０３／０４で攻撃した。これまでの結果及び観察された抗体力価と一致して、ｒＰＩＶ５−Ｈ５  ＩＮワクチン接種マウスでは、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に関連する体重減少及び死亡が防がれた（図３６Ａ及び図３６Ｂ）。ＺＬ４６  ＩＭワクチン接種マウスでもＨ５Ｎ１攻撃が防御されたが、しかしながら感染後期に限定的な死亡及び体重減少があったことから、完全防御には粘膜抗体反応が重要であることが示唆される。攻撃３日後のマウスの一部でウイルス力価を評価した。ＺＬ４６又はｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＮで免疫したマウスにおいてＨ５Ｎ１ウイルスは検出不能であった。対照的に、ＺＬ４６  ＩＭで免疫したマウスでは、ＰＩＶ５  ＩＭ免疫マウスと比較してウイルス力価が低下しなかったが、ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８  ＩＭ免疫マウスはまたウイルスが検出不能であった（図３６Ｃ）。これもまた、ｒＰＩＶ５−Ｈ５  ＩＮ免疫によりプライムされた粘膜ＩｇＡが完全防御に重要であることを示唆している。或いは、ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８免疫によるような、複数のインフルエンザ抗原に対する免疫応答のプライミングが、ＩｇＡ応答の必要性を解消し得る。不活化ｒＰＩＶ５−Ｈ５（ｉＺＬ４６）をワクチン接種したマウスにおいて防御は観察されなかったことから、生ウイルス、及びおそらくは複製が、防御免疫の誘発に必要であることが確認された。従って、いずれの投与経路とも防御性であるが（体重減少及び生存率により計測したとき）、ＩＮ免疫に伴う粘膜ＩｇＡ応答の誘導及び／又はＩＦＮ−γ  Ｔ細胞数の増加は、感染及び肺におけるウイルス複製を制限するものである。
【０２２４】
ブーストはＰＩＶ５−Ｈ５免疫に伴うＨＡ特異的免疫応答を増強する。不活化ＰＩＶ５−ＨＡによる単回のＩＭ免疫は、限られたＨＡ特異的血清ＩｇＧを誘導したが（図３４Ａ）、中和抗体は誘導せず（図３４Ｂ）、感染からの防御を提供しなかった（図３６）。他のＨ５ワクチン抗原でも同様の結果が認められており（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７３：５９０３−５９１１）、従ってブーストが免疫応答を防御レベルまで増加させ得るかどうかを試験するため、ＺＬ４６プライムしたマウスを毎週出血させ、プライミング後２８日目にブーストし、７日後及び１４日後に血清を採取した。生ＺＬ４６  ＩＮ又はＩＭで免疫したマウスを、不活化ＺＬ４６（ｉＺＬ４６）又は不活化Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４）によるＩＭ免疫マウスと比較した。
【０２２５】
またしても、生ＺＬ４６はプライミング後２１日目までにロバストなＩｇＧ応答及び中和抗体反応を誘導し、ｉＺＬ４６からはより控えめなＩｇＧ応答で、中和抗体反応はなかった。しかしながら、ブースト１週間後、３つ全てのＺＬ４６免疫方法（生ＩＮ、生ＩＭ、及び不活化ＩＭ）で、ロバストなＨＡ特異的ＩｇＧ応答及びＨ５中和血清抗体反応があった（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。ブースト６週間後、マウスをｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８ウイルスで攻撃し、３日後、安楽死させて肺ウイルス力価を評価した。顕著なことに、全てのワクチン接種マウス（ＺＬ４６  ＩＮ又はＩＭ、ｉＺＬ４６  ＩＭ、ｉＡ／ＶＮ／１２０３／０４  ＩＭ）で、ＰＩＶ５免疫対照マウスと比較して肺ウイルス力価が有意に低下した一方（図３７Ｃ；Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡと、続くダネットの多重比較検定）、ＨＡワクチン接種群のいずれにも、互いに比べて有意な差はなかった。ＺＬ４６によるＩＮ免疫が引き続き最良の防御を提供した一方（３／５マウスのウイルス力価が検出不能であった一方、他のＺＬ４６免疫マウスの全てが、いずれも攻撃後３日目に検出可能なウイルスを有した）、生又は不活化ＰＩＶ５−ＨＡによるＩＭ免疫は防御性中和血清抗体反応の誘導に有効で、全不活化野生型インフルエンザウイルスに匹敵した。
【０２２６】
ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する不活化ワクチンは、概して哺乳類において免疫原性が不十分であり、高い抗原用量、複数回の免疫、及びアジュバントが場合によって必要となる（Ｌｉｐａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１９４：１０４０−１０４３；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７３：５９０３−５９１１；Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ；１９：１７３２−１７３７；及びＴｕｍｐｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７５：５１４１−５１５０）。生及び不活化ＨＰＡＩワクチンのいずれも、生産中のワクチン収率の低下、困難なシード株作成、及び安全上の懸念を含め、生産に課題がある（Ｓｔｅｅｌ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ；２５：２８５−２９８）。本発明では、新規組換えパラミクソウイルスワクチンベクターである、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス由来のＨＡを発現するＰＩＶ５を開発しており、これはＨＰＡＩウイルス感染に対する防御免疫を誘発する（図３４〜図３６及び実施例３を参照）。ここでは、種々の免疫方法を利用し、且つ生及び不活化ワクチンを比較して、このワクチンの有効性を評価する。
【０２２７】
生ＰＩＶ５−Ｈ５による鼻腔内免疫は、ＨＡ導入遺伝子に特異的なロバストな血清及び粘膜抗体反応を誘導する。無毒性のＰＩＶ５−Ｈ５ワクチンによる単回免疫によって誘導されたＨＡ特異的反応は、ｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８インフルエンザウイルスによる致死量以下の感染によって誘導された反応に匹敵し、ここでインフルエンザ免疫マウスは病気の臨床徴候を有し、最大１５％が失われた（図３５）。従って、ＰＩＶ５は、弱毒生インフルエンザワクチンにより引き起こされる再集合の懸念がなく、鼻腔内免疫に魅力的な方法を提供する。
【０２２８】
受容体及びプロテアーゼの要求から概して気道又は腸上皮細胞で複製するインフルエンザウイルスと異なり（Ｒｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ；１５２：Ｓ１６−１９）、ＰＩＶ５は、より広い細胞向性を持つ可能性がある。この特徴により、ＰＩＶ５は、生筋肉内ワクチンとしての使用に魅力的な候補となっている。一方で、これはまた、ＰＩＶ５ワクチンが他の組織に播種し得る可能性も提示するが、先行研究では、鼻腔内ＰＩＶ５感染後他の組織において病変のエビデンスは認められなかった（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１３：４２６−４３５）ことから、ｒＰＩＶ５ベクターによる筋肉内免疫が同様に安全であり得ることが示唆される。
【０２２９】
ＰＩＶ５−Ｈ５による筋肉内免疫は、ＰＩＶ５−Ｈ５による鼻腔内免疫又は全不活化Ｈ５Ｎ１ウイルスによる筋肉内免疫に匹敵するロバストなＨＡ特異的中和血清抗体反応を誘導する（図３５）。生ＰＩＶ５−Ｈ５による筋肉内免疫は、ロバストなＨＡ特異的Ｔ細胞応答も同様にプライミングするという付加的な利点を有する。ＰＩＶ５−Ｈ５筋肉内免疫は粘膜抗体反応が存在しないと不完全となるが、これは実に、喘息又は他の鼻腔内免疫に対する禁忌を有する個体に潜在的により適切な免疫化経路を提供する。さらにこれは、このワクチンを他の注射ワクチン、並びに農業適用に魅力的であり得る注射ワクチン製剤と組み合わせる機会を提供する。
【０２３０】
粘膜抗体は、同種免疫及び異種亜型免疫の両方からの防御と関連付けられてきた。この例では、生ｒＰＩＶ５−Ｈ５ワクチンの筋肉内投与が粘膜ＩｇＡ応答を誘導できなかったが、致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を防御したことが見出された（図３５及び図３６）。同じワクチンによる粘膜（鼻腔内）免疫は、匹敵するウイルス中和血清抗体力価をプライムしたが、また、ウイルス特異的肺及び鼻ＩｇＡも誘導した（図３５）。これらのマウスはまた、致死性Ｈ５Ｎ１感染に関連する死亡からも防御されたが、また、感染後３日目の肺においてウイルスも検出不能であった。対照的に、検出可能なＩｇＡを有しないマウス（筋肉内免疫群）は、対照動物と同様のウイルス力価を有した。従って、筋肉内免疫は鼻腔内免疫と比べて、特に慢性呼吸器疾患を有する個体についていくらかの利点を有し得るものの、鼻腔内免疫が最も有効な投与経路であるものと思われる。
【０２３１】
不活化ｒＰＩＶ５−Ｈ５は、筋肉内に１回送達したとき有効でなかった。インフルエンザ感染に対する防御抗体反応を有効にプライムするには、ビリオンに組み込まれたＨＡの量が不十分である可能性がある；しかしながら全ウイルス不活化インフルエンザワクチンは、単回免疫後にウイルス中和血清抗体反応を誘発できていない（Ｌｉｐａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１９４：１０４０−１０４３；及びＬｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７３：５９０３−５９１１）。ここで、不活化同種全ウイルスは、おそらく高い抗原用量（２５ＨＡＵ）に起因して、中和抗体を誘発しなかった；さらに、全ウイルスは、複数のインフルエンザ抗原に対する応答をプライミングするという利点を有し、これは攻撃からの防御に寄与し得る。或いは、インフルエンザウイルスは、応答をより有効にプライムする（すなわちアジュバントとして働く）他の抗原又はＰＡＭＰを含んでもよく、ＰＩＶ５ウイルスにはこれらの刺激分子が欠損している。これは、全ビリオンワクチンで認められる反応原性に反映される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ；６９：４０４−４０８）。いずれの場合にも、複製能を有するｒＰＩＶ５−Ｈ５はこの欠損を克服し、Ｔ細胞及び中和抗体反応の両方をプライミングし、それにより同種ＨＰＡＩ攻撃を防御した。さらに、不活化ＰＩＶ５−Ｈ５ワクチン（ｉＺＬ４６）によるブーストがインフルエンザ中和抗体反応のプライミングに成功し、それにより攻撃後のＨ５Ｎ１ウイルス力価が、生ＰＩＶ５−Ｈ５及び不活化Ｈ５Ｎ１ワクチンに匹敵するほど低下した（図３７）。ＰＩＶ５ワクチンはワクチンに承認された細胞系（例えばＶｅｒｏ細胞）で容易に成長させることができるため、ＰＩＶ５−ＨＡは、従来のＨＡ特異的不活化汎発性インフルエンザワクチンを、インフルエンザワクチンシード株の同定及び開発に付随する難題なしに迅速、安全に生産するための手段を提供し得る。アジュバントを含む不活化ＰＩＶ５−ＨＡワクチンの製剤は、他のＨ５ＨＡベースのワクチンと同様、単回免疫による中和抗体力価のプライミングを可能にし得る（Ｓｔｅｅｌ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ；２５：２８５−２９８）。
【０２３２】
ｒＰＩＶ５−ＨＡの鼻腔内投与はマウスにおいて安全であることが示されているが、生の複製ウイルスベクター化ワクチンの呼吸送達は、喘息患者又は免疫低下患者にとって懸念となり得る。生ワクチン又は不活化ワクチンの筋肉内投与という選択肢は、ワクチンプラットフォームの改良のない、鼻腔内免疫に代わる魅力的な方法を提供し得る。これは、弱毒生インフルエンザウイルスワクチン又は分割された不活化野生型ウイルスワクチンのいずれかがそれぞれ鼻腔内又は筋肉内に送達される現行の代替方法と対照的である。さらに、生又は不活化ＰＩＶ５−ＨＡワクチンによる筋肉内免疫は、既存の生の又は抗原ベースの（不活化）ワクチンとの共製剤化を可能にし得るため、特に集団予防接種運動における潜在的有用性が向上し得る。最後に、投与及び製剤化について複数の選択肢を利用できれば、農業におけるワクチン接種プログラムに有用であり、ここでは多様な適用に対して普遍的な生産プラットフォームがより安全でより費用対効果の高い選択肢を提供し、ワクチン接種を改善し得る。従って、ＰＩＶ５−ＨＡワクチンは、新興又は汎発性インフルエンザウイルス及び特にＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩウイルスを防御するためのワクチン生産用汎用ワクチンプラットフォームである。
【０２３３】
［実施例８］
Ｈ５Ｎ１由来のＮＰを発現する組換えパラインフルエンザウイルス５型の単一用量ワクチン接種は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する広域免疫を提供する
インフルエンザウイルスは、既往のインフルエンザウイルス感染及び／又はワクチン接種にも関わらず、多くの場合に抗原ドリフト及びシフトによって宿主免疫を回避する。最適な防御には、循環ウイルス株に適合するワクチンが必要である。広域の交差防御免疫を提供する万能インフルエンザワクチンの開発は、大きな利点となり得る。Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの全ての株にわたり高度に保存されており、万能インフルエンザウイルスワクチン開発の抗原として探究されている。この例では、高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルスであるＨ５Ｎ１（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）由来のＮＰをＨＮとＬとの間に含む組換えパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）（ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ）を作成し、その有効性を試験した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌは、マウスにおいて体液性応答及びＴ細胞応答を誘導した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの単回接種により、致死性異種亜型Ｈ１Ｎ１攻撃に対する完全な防御、及び致死性Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対する５０％防御が提供された。有効性を向上させるため、ＰＩＶ５ゲノム内の種々の位置にＮＰを挿入した。ＦとＳＨとの間（ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ）又はＳＨとＨＮとの間（ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ）にＮＰを含む組換えＰＩＶ５は、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌと比べてＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対してより優れた防御を提供した。これらの結果は、Ｈ５Ｎ１由来のＮＰを発現するＰＩＶ５が万能インフルエンザウイルスワクチンとして利用される潜在力を有することを示している。
【０２３４】
インフルエンザウイルスは、分節性ゲノムを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスは世界的流行に関連し、その２つの主要な表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって分類される。タンパク質相同性が約３０％異なる１７個のＨＡ亜型及び９個のＮＡ亜型があり、これを用いてＡ型インフルエンザウイルスが亜型（例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１等）に分類される。表面糖タンパク質の抗体結合部位における点突然変異により、ウイルスは抗体媒介性免疫を回避してヒト及び動物に再感染することが可能である（抗原ドリフト）。異なるＡ型インフルエンザウイルス亜型が同じ宿主に感染すると、遺伝子分節の交換が起こり、ウイルスゲノムの固有の組み合わせを有する新しいウイルスがもたらされることがあり（抗原シフト）、こうして世界的流行が生じ得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、毎年著しく高い罹患率及び死亡率をもたらす。現在ヒトにおいて循環している株（すなわちＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、及びＨ３Ｎ２）により世界人口の最大１５％が感染し、米国では平均３万６千人の死亡及び２２万６千人の入院が引き起こされ（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＭＭＷＲ  Ｒｅｃｏｍｍ  Ｒｅｐ；５４：１−４０）、世界でも何百万人もの死亡が引き起こされている（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ，２００３，Ｗｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｃ；７８：７７−８０）。汎発性インフルエンザの散発的な集団発生は、過去１世紀にわたり著しく高い死亡率をもたらしており、最も注目すべきは１９１８年のスペイン風邪であり、世界で５千万人の死亡が引き起こされている（Ｌｉｐａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７８：８９５１−８９５９にレビューされている）。別の潜在的に世界的流行となり得るインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１も兆しが見えている。この鳥インフルエンザウイルスは東南アジアに最も顕著に出現し、何百万羽の鳥の廃棄をもたらしており、２００３年以降６０８件のヒト症例が報告され、そのうち３５９件は致死的であった。
【０２３５】
ワクチンが異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスに対して広域の防御を提供することができれば、理想的である。保存されているインフルエンザウイルスタンパク質を標的とするワクチン候補が、有望な万能インフルエンザウイルスワクチンとして探究されている。Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）は、ウイルスゲノムをカプシドで包み込むものであり、全てのインフルエンザウイルス間において９０パーセント超のアミノ酸残基相同性で十分に保存されており、万能インフルエンザウイルスワクチン開発の一構成要素として同定されている。ＮＰを含むアデノウイルスは、同種並びに異種亜型インフルエンザウイルス攻撃に対して防御を提供することが示されている（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；５：ｅ１３１６２）。さらに、インフルエンザウイルスのＮＰ及びＭ１を含む組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導し、且つヒトにおいて第１相及び第２ａ相試験で症状の重症度及びウイルスシェディングを低下させたことから、ＮＰを潜在的な広域防御性インフルエンザウイルスワクチンの開発に利用し得ることが示唆される。インフルエンザ抗原ＮＰを発現する組換えＤＮＡワクチンが動物モデルにおいて試験されており、防御抗体及びＴ細胞応答を誘導することが示されている；しかしながら、ＤＮＡの反復投与を必要とする点が、急速に蔓延するインフルエンザウイルスの世界的流行に対してＤＮＡベースのワクチンを使用する際の障害となり得る。
【０２３６】
本明細書により含まれる例に示されるとおり、ＰＩＶ５ベクター化ワクチンは動物において有効である。実施例３に示されるとおり、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨＡを発現するＰＩＶ５を１０３ｐｆｕもの低量で単一用量鼻腔内（ＩＮ）接種することで、マウスにおいて致死性Ｈ５Ｎ１攻撃が防御された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２も参照のこと）。また、実施例２に示されるとおり、ＰＩＶ５ベースのワクチンは、ＰＩＶ５に曝露されたイヌにおいて防御免疫を誘導することが示されている。免疫のレベルは、先行するＰＩＶ５曝露があるイヌ及びそれがないイヌにおいて同等であったことから、先在する抗ＰＩＶ５免疫がＰＩＶ５ベースのワクチンの免疫原性に悪影響を及ぼさないことが示される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；７：ｅ５０１４４も参照のこと）。
【０２３７】
この例では、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）由来のＮＰ遺伝子を含む組換えＰＩＶ５を作成し、マウスにおいて致死性同種並びに異種亜型インフルエンザウイルス攻撃を防御するその有効性を試験した。
【０２３８】
材料及び方法
細胞。ＭＤＢＫ、ＭＤＣＫ及びＶｅｒｏ細胞の単層培養は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に維持した。ＢＨＫ及びＢＳＲ−Ｔ７細胞は、１０％ＦＢＳ、１０％リン酸トリプトースブロス（ＴＰＢ）を含有するＤＭＥＭ中に維持した。ＢＳＲ−Ｔ７細胞にはＧ４１８を添加した。全ての細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ウイルス感染細胞は、還元型ＦＢＳ（２％）を含有する培地で培養した。以前記載されるとおりＢＨＫ細胞を使用してＰＩＶ５ウイルスのプラークアッセイを実施した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。以前記載されるとおりＭＤＣＫ細胞を使用してインフルエンザウイルスのＴＣＩＤ５０アッセイを実施した（Ｓｏｂｏｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；６：ｅ２１９３７）。
【０２３９】
インフルエンザウイルス。Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）、Ｘ−３１（Ｈ３Ｎ２；Ａ／愛知／２／６８  Ｘ  ＰＲ８リアソータント）（Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１４１：３６２−３６５）、及びｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８（Ｈ５Ｎ１；Ｒｕｂｅｎ  Ｄｏｎｉｓ博士，ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡから供与された）は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で４８〜７２時間増殖させた。高病原性Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１；Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｂｂｙ，セント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ），Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮから供与された）は、孵化鶏卵の尿膜腔において３７℃で２４時間増殖させた。ウイルスは全て、アリコートに分け、−８０℃で保存した。生の高病原性Ａ／ベトナム／１２０３／２００４を使用した実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによる審査及び承認を受け、ＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従い、高度なバイオセーフティレベル３（ＢＳＬ３＋）の封じ込め下で行われた。
【０２４０】
マウス。全ての試験に６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用した。全ての鼻腔内ワクチン接種及びインフルエンザウイルス攻撃の前に、アベルチン（２，２，２−トリブロモエタノール）を腹腔内投与してマウスを麻酔した。ＢＳＬ２ウイルスによるマウスの免疫化及び試験は、高度ＢＳＬ２施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。マウスＨＰＡＩ感染は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内バイオセーフティプログラムによって承認されている指針及びＣＤＣによって承認されている指定生物剤の使用に関する指針に従い、高度ＢＳＬ３施設においてＨＥＰＡフィルタ付きアイソレーターで実施した。全ての動物試験は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内動物管理・使用委員会によって承認されている指針に基づき行われた。
【０２４１】
組換えプラスミドの構築。ＰＩＶ５ゲノムのＨＮとＬとの遺伝子間にＮＰ挿入を含むプラスミド（ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ）を作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノムと、ＨＮとＬとの遺伝子間に追加のＧＦＰ遺伝子とを含むプラスミドＢＨ３１１を使用した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）由来のＮＰのＯＲＦ。ＭとＦとの間（ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ）、ＦとＳＨとの間（ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ）、又はＳＨとＨＮとの間（ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ）にＮＰ挿入を含むプラスミドを作成するため、ＰＩＶ５の完全長ゲノムを含むプラスミドＢＨ２７６を使用した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ＮＰ遺伝子を得るため、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作成した。ＮＰ特異的プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅し、ＮＰ遺伝子を生成した。ｐＥＴ−１５ｂベクターを使用して、Ｈｉｓタグ標識Ｈ５Ｎ１−ＮＰタンパク質をコードする発現プラスミドｐＥＴ−１５ｂ−ＮＰを構築した。
【０２４２】
ウイルスレスキュー及び配列決定。指示される遺伝子接合部にＮＰ遺伝子挿入を有する完全長ＰＩＶ５ゲノムをコードするプラスミドＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ、並びにＮＰ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする３つのヘルパープラスミドｐＰＩＶ５−ＮＰ、ｐＰＩＶ５−Ｐ、及びｐＰＩＶ５−Ｌを、Ｊｅｔｐｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含む６ｃｍプレートにおいて９５％コンフルエンシーでＢＳＲ−Ｔ７細胞にコトランスフェクトした。使用したプラスミドの量は以下のとおりであった：５μｇ完全長ＰＩＶ５−ＮＰプラスミド、１μｇ  ｐＰＩＶ５−ＮＰ、０．３μｇ  ｐＰＩＶ５−Ｐ、及び１．５μｇ  ｐＰＩＶ５−Ｌ。３７℃で７２時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞デブリを低速遠心（３，０００ｒｐｍ、１０分）によりペレット化した。プラークアッセイを用いて組換えウイルスのシングルクローンを得た。
【０２４３】
プラーク精製ＰＩＶ５−ＮＰウイルスの完全長ゲノムを配列決定した。ウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ＰＩＶ５−ＮＰウイルス感染Ｖｅｒｏ細胞の培地から全ＲＮＡを精製した。以前記載されるとおりランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡを調製し、次に適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアを使用したＰＣＲ反応でｃＤＮＡのアリコートを増幅した（実施例３及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２）。ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０２４４】
ウイルスタンパク質発現の検出。免疫蛍光法（ＩＦ）及び免疫沈降（ＩＰ）アッセイを用いてウイルスタンパク質の発現を検出した。ＩＦアッセイでは、２４ウェルプレートにおいてＭＤＢＫ細胞をモック感染させるか、又はＰＩＶ５若しくはＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬにＭＯＩ０．１で感染させた。２ｄｐｉで細胞をＰＢＳで洗浄し、次に０．５％ホルムアルデヒドに固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ−サポニン溶液において透過処理し、次にモノクローナル抗ＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ又は抗Ｈ５Ｎ１−ＮＰ抗体と共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。細胞を３０分間インキュベートし、洗浄し、蛍光顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｇｒｏｕｐ）を使用して調べ、撮影した。
【０２４５】
ＩＰでは、６ウェルプレートにおいてＭＤＢＫ細胞をモック感染させるか、又はＰＩＶ５若しくはＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬにＭＯＩ５で感染させた。２２ｈｐｉで細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ  Ｐｒｏｍｉｘ（１００μＣｉ／ｍｌ）によって２時間標識した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、モノクローナル抗ＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ又は抗Ｈ５Ｎ１−ＮＰ抗体を使用してアリコートを免疫沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｓｔｏｒｍ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用してオートラジオグラフィーにより調べた。
【０２４６】
モック感染させるか、又はＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、若しくはＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬにＭＯＩ５で感染させた６ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞を使用して、ウイルス感染細胞におけるＨ５−ＮＰの発現レベルを比較した。２ｄｐｉで細胞を採取し、０．５％ホルムアルデヒドで１時間固定した。固定した細胞をＦＢＳ−ＤＭＥＭ（５０：５０）に再懸濁し、次に７０％エタノール中で一晩透過処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１：２００）中のマウス抗Ｈ５Ｎ１  ＮＰ抗体又は抗ＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。フィコエリトリンで標識した抗マウス抗体により暗所において４℃で１時間、細胞を染色し、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡで１回洗浄した。フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）を使用して蛍光強度を計測した。
【０２４７】
ウイルスのインビトロ及びインビボ成長。６ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞を、ＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬにＭＯＩ０．１で感染させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳ中に維持した。０、２４、４８、７２、９６及び１２０ｈｐｉで培地を採取した。ＢＨＫ細胞に関するプラークアッセイによりウイルスの力価を決定した。
【０２４８】
マウスにおけるウイルスの成長を比較するため、６週齢野生型ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、５０μｌ容量中１０５ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌを鼻腔内ワクチン接種した。感染後３日目にマウスを安楽死させ、肺を採取してウイルス力価を決定した。
【０２４９】
ＥＬＩＳＡ。精製インフルエンザＮＰタンパク質を生成するため、ｐＥＴ  １５ｂ−ＮＰプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換した。Ｎｉ荷電樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して組換え６Ｘ  Ｈｉｓ−ＮＰタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色により調べた。免疫血清の生成のため、マウスに１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１を鼻腔内ワクチン接種し、ワクチン接種後２１日目に血液試料を採取した。２μｇ／ｍｌの精製ＮＰタンパク質を、４℃で一晩９６ウェルプレートにコーティングした。製造者の指示（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）に従いＥＬＩＳＡを実施した。コーティングしたプレートにＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ及びＸ３１接種マウスの血清試料の段階希釈液を添加した。ＡＰ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、プレートを発色させた。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳプレートリーダーにおいて４０５ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を計測した。
【０２５０】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。ワクチン接種マウスの脾臓におけるＣＴＬ応答を検出するため、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は０．１  ＬＤ５０のＰＲ８を使用して、マウスを鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、マウスを犠牲にし、脾臓を採取した。脾臓をホモジナイズし、ＨＢＳＳ培地で洗浄した。ゲイ溶液を添加して赤血球を除去した。完全腫瘍培地（ＣＴＭ）中の脾細胞を、７０％エタノールで調製して抗マウスＩＦＮ−γ  ｍＡｂ  ＡＮ１８（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）でコーティングした９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ  ＭＡＩＰＳＷＵ１０）に加えた。細胞をモック再刺激するか、又はＦｌｕ−ＮＰ  １４７−１５５ペプチド（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ）（配列番号９）、無関係のペプチドとしてのエボラＧＰ  Ｐ２（ＥＹＬＦＥＶＤＮＬ）（配列番号１０）、又はＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。脾細胞を取り出し、プレートを洗浄してビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ  ｍＡｂ  Ｒ４−６Ａ２（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）と共にインキュベートし、室温で１時間インキュベートした。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）溶液を使用してプレートを発色させた。ＡＩＤ  ＶｉｒｕＳｐｏｔリーダー（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用してスポットを計数した。結果は、１０６脾細胞当たりのモック刺激の平均の数を減じた平均サイトカイン分泌細胞数として提示する。
【０２５１】
Ａ型インフルエンザウイルスによるマウスの感染。Ｈ１Ｎ１−マウスを単一用量のＰＢＳ、１０６ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又は１０５ｐｆｕのＸ３１で鼻腔内免疫した。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した。攻撃後３日目、マウスの群を安楽死させ、肺を採取してホモジナイズした。ＴＣＩＤ５０アッセイを用いて、清澄化したホモジネートにおけるウイルス力価を決定した。
【０２５２】
Ｈ５Ｎ１−マウスを、ＰＢＳ、１０７ｐｆｕのＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、又は２０００ｐｆｕのｒｇＡ／ＶＮ−ＰＲ８の単回鼻腔内投与で免疫した。ワクチン接種後２１日目、マウスを、指示されるとおり１０又は２０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。攻撃後、体重減少及び生存についてマウスを毎日モニタした。マウスを感染の臨床徴候に基づきスコア化した（立毛、亀背位、呼吸困難：各１点、２５％未満の体重減少：１点、２５〜３５％の体重減少：２点、３５％超の体重減少：３点、神経学的症状：３点）。動物は、３点に達したところで人道的に安楽死させた。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４が関与する攻撃は、ＡＢＳＬ３＋の封じ込め下で行われた。全ての動物試験は、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の機関内動物管理・使用委員会によって承認されている指針に基づき行われた。
【０２５３】
結果
ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの作成及び分析。Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ由来のＮＰを発現する組換えＰＩＶ５が、マウスにおいて種々の亜型のインフルエンザウイルス攻撃に対し防御を提供し得るかどうかを試験するため、ＰＩＶ５のｃＤＮＡのＨＮとＬとの遺伝子間にＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ  ＮＰ遺伝子を挿入した（図３８）。以前記載されるとおり、ＮＰ遺伝子がＨＮとＬとの遺伝子間に挿入されたＰＩＶ５ゲノムを含むプラスミドを、ＰＩＶ５  ＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子をコードする３つのヘルパープラスミドと共にＢＳＲ−Ｔ７細胞にトランスフェクトして、感染性ウイルスを回収した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８５：８３７６−８３８５）。感染性ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌウイルスをプラーク精製し、実施例３に記載されるとおりＲＴ−ＰＣＲ配列決定を用いてＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの完全長ゲノム配列を決定した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２  ２１も参照のこと）。ゲノム配列の正確なｃＤＮＡに一致する一つのプラーク精製クローンを、以降の全ての実験に使用した。
【０２５４】
ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ感染細胞からのＮＰの発現は、免疫蛍光法及び免疫沈降アッセイを用いて確認した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ感染細胞においてはＨ５Ｎ１−ＮＰタンパク質が検出されたが、モック感染又はＰＩＶ５感染細胞では検出されなかった。ＮＰ発現がＰＩＶ５ウイルスタンパク質発現レベルに影響したかどうかを試験するため、ＰＩＶ５−Ｖ／Ｐ抗体を使用してＰＩＶ５ウイルスタンパク質を免疫沈降させた。ＰＩＶ５ウイルスとＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌウイルスとの間でＰＩＶ５ウイルスタンパク質発現レベルに差は認められなかった。
【０２５５】
組織培養細胞におけるＰＩＶ５とＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌとの成長を比較するため、ＭＤＢＫ細胞を使用して多段階成長曲線を実施した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬはＰＩＶ５と比べて成長がやや遅かった（図３９Ａ）。インビボでのＰＩＶ５及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの成長を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０５ｐｆｕのＰＩＶ５又はＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌを鼻腔内ワクチン接種した。感染後３日目に、ワクチン接種マウスの肺におけるウイルスの力価を決定した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌワクチン接種マウスの肺における力価は、ＰＩＶ５ワクチン接種マウスより低かった；しかしながら、これらの２つの群間に有意な差はなかった（図３９Ｂ）。
【０２５６】
マウスにおけるＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ接種に対する免疫応答。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬがインビボでＮＰ特異抗体を生じさせ得るかどうかを調べるため、マウスにＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又はＸ３１を鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、血液試料を採取し、血清を調製した。細菌から精製したＨｉｓタグ標識ＮＰタンパク質を使用して９６ウェルプレートをコーティングした。プレートに段階希釈血清試料を加えた。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌワクチン接種は、生のインフルエンザウイルス感染による誘導に匹敵するロバストな抗ＮＰ血清ＩｇＧ力価を誘導した（図４０）。
【０２５７】
ＰＩＶ５−ＮＰが細胞性免疫応答を誘導することができるかどうかを調べるため、マウスにＰＢＳ、ＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又はＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、マウスを安楽死させ、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ−ワクチン接種マウスは、ＰＲ８ワクチン接種マウスと比較して同程度のＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導した（図４１）。
【０２５８】
マウスにおける異種亜型Ｈ１Ｎ１攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの有効性を決定する。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌが異種亜型Ｈ１Ｎ１攻撃に対する交差防御を提供し得るかどうかを調べるため、マウスを単一用量のＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌで鼻腔内免疫した。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した。ＰＢＳ免疫化及びＰＩＶ５免疫化マウスは体重が減少し、全てのマウスが攻撃後１０日目までに死亡した。対照的に、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌで免疫した全てのマウスが、実験期間中に有意な体重減少を示さず、全てのマウスが攻撃を生き残った（図４２Ａ及び図４２Ｂ）。これはＸ３１プライム陽性対照群に匹敵した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ免疫マウスの肺では、攻撃後３日目にインフルエンザウイルスが検出され（図４２Ｃ）、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ群のウイルス力価はＰＢＳ群より低かったが、これらの２つの群間に統計的に有意な差はなかった。
【０２５９】
マウスにおけるＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの有効性を決定する。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌが同種Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対する防御を提供し得るかどうかを調べるため、マウスを単一用量のＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌで鼻腔内免疫した。ワクチン接種後２１日目、マウスを１０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。ＰＢＳ免疫化及びＰＩＶ５免疫化マウスは全て体重が減少し、感染して死亡した。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌをワクチン接種したマウスは、５０％の攻撃後生存率を呈し、生き残ったマウスにおける体重減少は、その元の体重の２０％未満であった（図４３Ａ及び４３Ｂ）。
【０２６０】
ＰＩＶ５ゲノム内の種々の位置でＨ５Ｎ１  ＮＰを発現するＰＩＶ５の作成及び分析。実施例３に示されるとおり、ＰＩＶ５ゲノム内の挿入部位は、挿入された抗原の免疫原性に影響を及ぼした（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２  ２１も参照のこと）。ＰＩＶ５ゲノム内の異なる位置へのＮＰの挿入がワクチンの有効性の向上をもたらすかどうかを調べるため、ＮＰをＰＩＶ５ゲノム内の種々の遺伝子接合部間に挿入した。リーダー配列とＮＰ遺伝子との間へのＮＰ挿入は、生存可能な感染性ウイルスをもたらさなかった。ＰＩＶ５ゲノム内でＭ遺伝子の上流に外来遺伝子を挿入すると、インビトロ及びインビボでのウイルス成長が影響を受けたため（実施例３及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２）、ＰＩＶ５ゲノム内でＭ遺伝子の下流の接合部領域にＮＰを挿入した。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆ、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌの成長は互いに同程度で、ＰＩＶ５と比較して力価の低下を伴った（図４４Ａ）。ＮＰのＰＩＶ５  Ｖ／Ｐに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比をフローサイトメトリーによって調べ、Ｈ５Ｎ１−ＮＰタンパク質発現レベルを決定した。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨが最大の比を生じ、一方、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮとＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌとは同程度の比を生じた。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆが最小の比をもたらした。これらの結果は、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨが最大のＮＰ発現レベルを誘導することを示唆している（図４４Ｂ）。これらのウイルスがマウスにおいて複製する能力もまた比較した。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌでワクチン接種したマウスにおける肺ウイルス力価は、ＰＩＶ５のみをワクチン接種したマウスと比べてやや低かったが、ワクチン接種後３日目に有意な差はなかった（図４４Ｃ）。
【０２６１】
ＰＩＶ５−ＮＰウイルス感染に対する細胞性応答。ＮＰの発現レベルが予想されるように免疫応答に影響を及ぼすかどうかを決定するため、マウスにＰＢＳ、ＰＩＶ５、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ又はＰＲ８を鼻腔内ワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目、マウスを安楽死させ、ＩＦＮ−ａｎＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。ＰＩＶ５−ＮＰワクチン接種マウスは、ＰＩＶ５ワクチン接種マウスと比べてより高度なＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導した。ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨワクチン接種マウスは、他のＰＩＶ５−ＮＰウイルス及びＰＲ８ワクチン接種マウスと比較して、最も高度なＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じた（図４５）が、ＰＩＶ５ウイルスとＰＩＶ５−ＮＰウイルスとの間の差、又はＰＩＶ５−ＮＰウイルスとＰＲ８との間の差は、統計的に有意ではなかった。
【０２６２】
マウスにおけるＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対するＰＩＶ５−ＮＰウイルスの有効性を決定する。ＰＩＶ５−ＮＰ−／ＳＨ及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ免疫がＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対してより優れた防御を提供し得るかどうかを調べるため、マウスを単一用量のＰＩＶ５−ＮＰウイルスで鼻腔内免疫した。ワクチン接種後２１日目、マウスを２０  ＬＤ５０  Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩで攻撃した。このより高い攻撃用量を使用することにより、種々のワクチン候補間にあり得るあらゆる差を最大化した。ＰＢＳ免疫化及びＰＩＶ５免疫化マウスは全て、体重が減少し、攻撃後１０日目までに感染して死亡した。対照的に、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌでワクチン接種したマウスの２０％、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮでワクチン接種したマウスの３０％、及びＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨでワクチン接種したマウスの６７％が攻撃を生き残ったことから、ＰＩＶ５内のＦとＳＨとの間へのＮＰの挿入が最良の防御を提供したことが示される（図４６Ａ及び図４６Ｂ）。
【０２６３】
考察
この例は、単一のＮＰ遺伝子を発現する生ウイルスベクターベースのワクチンが、マウスにおけるロバストな攻撃モデル（２０ＬＤ５０攻撃）において、致死性Ｈ１Ｎ１攻撃に対し完全な防御性を有し、且つ高致死率のＨ５Ｎ１攻撃に対し実質的な防御（６７％）を提供したことの初めての報告であり、ＮＰベースのワクチンについてＰＩＶ５がＡｄＶ及びＶＶと比べてより有効なウイルスベクターであることを示している。
【０２６４】
一般に、ＮＰにより生じるＡ型インフルエンザウイルスに対する防御免疫は細胞媒介性で、ＮＰに対する抗体はＮＰ媒介性防御に必須でないと考えられている。しかしながら、最近の報告では、抗ＮＰ抗体が防御免疫において役割を果たし得ることが示されている。抗ＮＰ抗体が決定的なものでないことと一致して、抗ＮＰ血清力価と体重減少との間に相関は認められなかった。しかしながら、この相関の欠如によって、防御免疫応答における抗体の寄与が排除されるわけではない。この例では、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで実証するとき、ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／ＬがロバストなＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じた。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌ免疫マウスは、致死量以下のＨ１Ｎ１感染と同程度のＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導した（図４０Ｂ）。細胞媒介性免疫がインフルエンザウイルス感染を除去しないという観察と一致して、ＰＢＳ及び免疫化マウスの肺における攻撃インフルエンザウイルスの力価は同程度であった（図４１Ｃ）。ＮＰを発現する種々の組換えＰＩＶ５で免疫したマウスの群のなかでは、最も多くＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を有したＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨ免疫化マウスが、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃後の生存率が最も高かった（６７％）。
【０２６５】
ゲノムの３’末端に単一の事実上のプロモーター、すなわちリーダー配列を含むモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅ）には、転写極性が認められる。ウイルス遺伝子はゲノムの３’末端に近いほど、５’末端の方にあるものと比べてより豊富に転写される。実施例３では、ＰＩＶ５のＳＨとＨＮとの間にＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩ由来のＨＡを挿入すると（ＺＬ４６、ＰＩＶ５−Ｈ５−ＳＨ／ＨＮ）、ＰＩＶ５のＮＰとＶ／Ｐ、Ｖ／ＰとＭ、又はＨＮとＬ（ＺＬ４８、ＰＩＶ５−Ｈ５−ＨＮ／Ｌ）の接合部における挿入と比べて、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩ攻撃に対してより優れた防御がもたらされており、これはおそらく、ＰＩＶ５−Ｈ５−ＳＨ／ＨＮがウイルス成長に悪影響を及ぼすことなしに最も高度なＨＡ発現を生じたためと思われる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４−３６２  ２１も参照のこと）。このＰＩＶ５ベースのＮＰワクチンの有効性を向上させるため、ＰＩＶ５のＮＰ遺伝子の上流、ＭとＦとの遺伝子間、ＦとＳＨとの遺伝子間、及びＳＨとＨＮとの遺伝子間にＮＰ遺伝子を挿入した。実施例３に報告されるとおり、ＰＩＶ５のＮＰ遺伝子の上流への挿入は生存可能な組換えＰＩＶ５をもたらさなかったことから、ＰＩＶ５のＮＰ遺伝子の上流への外来遺伝子の挿入が致死的であることが示唆される。興味深いことに、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨウイルス感染細胞が最も高度なＮＰ発現を生じた。３’末端リーダー配列の最も近くに挿入されたＮＰを含んで、最も高いＮＰ発現レベルを有するはずのＰＩＶ５−ＮＰ−Ｍ／Ｆが、最も低いＮＰ発現レベルを有した（図４３Ｂ）。
【０２６６】
ＭとＦとの間の接合部は、ＰＩＶ５ゲノム内のあらゆる接合部のなかで最も長く、ＭからＦへの読み過し転写がＰＩＶ５の接合部領域のなかで最も高い（Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７５：２２１３−２２２３）。同様に、Ｍ−Ｆ接合部の破壊は、挿入された遺伝子の発現に悪影響を及ぼした。ＰＩＶ５−ＮＰ−ＳＨ／ＨＮ及びＰＩＶ５−ＮＰ−ＨＮ／Ｌワクチン接種マウスは、ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）と同程度のＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導し、ＰＩＶ５−ＮＰ−Ｆ／ＳＨワクチン接種マウスは、やや高度なＴ細胞応答を誘導したが、差は統計的に有意ではなかった（図４４）。興味深いことに、ＰＩＶ５−ＮＰウイルス感染細胞で生じたＮＰ発現レベルは、ＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答レベルと相関したことから、外来遺伝子の発現レベルが増加すると、外来遺伝子により生じる細胞性免疫応答がより高度になり得ることが示唆される。
【０２６７】
これらのワクチン候補の有効性は、接種用量を増加させることにより、及び／又はプライム−ブーストレジメン用いることにより向上し得る。ＰＩＶ５−ＮＰを他のインフルエンザウイルス抗原、例えばＭ２と組み合わせてその有効性をさらに増強することで、ＰＩＶ５−ＮＰ単独より有効なインフルエンザウイルスワクチンがもたらされる。
【０２６８】
［実施例９］
パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ベースのＨ５Ｎ１ワクチン
この例では、引き続きＰＩＶ５をベクターとして使用してＨ５Ｎ１に対するワクチンを開発し、万能インフルエンザウイルスワクチン用のベクターとしてのＰＩＶ５の使用を探究する。この例は、Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の、フェレットにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する有効性を試験することを含む。Ｈ５Ｎ１抗原ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２を発現する組換えＰＩＶ５（まとめてＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１と称される）が作成されている。一部のＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１の単一用量接種は、マウスにおいて致死性ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対する完全な防御を提供した（死亡なし、罹患なし及び肺における攻撃ウイルスの検出なし、本発明者らはこれを殺菌免疫と定義する）。これらのワクチン候補の有効性を、限定はされないがフェレット動物モデルを含めた、さらなる動物モデルで試験する。フェレットは、インフルエンザウイルス感染に最良の小動物モデルである。フェレットとヒトとの間には肺の生理及び形態に著しい類似性がある。フェレットは、インフルエンザウイルスへの感染に高度の感受性を示す。ワクチン候補をフェレットでＨ５Ｎ１攻撃に対して試験する。この例では、マウス並びにフェレットにおいてＰＩＶ５ベースのワクチン候補により生じる免疫の機構をさらに研究する。この例は、Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の、Ｈ５Ｎ１に対する有効性の改良、及び万能インフルエンザウイルスワクチンの開発を含む。ベクターは、より優れた有効性を実現し、且つ潜在的な安全性リスクを低下させるように、さらに修飾される。ｒＰＩＶ５−ＮＰは、Ｈ５Ｎ１攻撃に対する防御のみならず、Ｈ１Ｎ１攻撃に対する防御もまた提供する。興味深いことに、Ｈ１Ｎ１のＮＡを発現する組換えＰＩＶ５は、致死性Ｈ１Ｎ１攻撃を完全に防御したのみならず、致死性Ｈ５Ｎ１及びＨ３Ｎ２攻撃も部分的に防御した。ワクチン候補は、Ｈ５Ｎ１に対する有効性が高まるだけでなく、異種亜型インフルエンザウイルス攻撃に対するより優れた防御も提供することで万能ワクチンへとつながるように、さらに修飾される。
【０２６９】
ＰＩＶ５は、ヒト用の新規ワクチンベクター、Ｈ５Ｎ１に対する新規ウイルスベクターであり、万能インフルエンザウイルスワクチン用のベクターとなる潜在力を有する。インフルエンザウイルスに対するＰＩＶ５をベースとするＮＡベースのワクチンは、新規である。ベクターのアポトーシス誘導能を操作することにより免疫応答を増強する新規戦略を開発する。ＩＦＮシグナル伝達経路を調節することにより免疫応答を増強する新規戦略を開発する。
【０２７０】
この例には３つの目標がある。目標１は、Ｈ５Ｎ１に対するワクチンとしての、Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５（ＰＩＶ５−Ｈ５）を試験することである。Ｈ５Ｎ１のＨＡを発現する組換えＰＩＶ５が、マウスにおいて最も致死率の高いインフルエンザウイルスである致死的攻撃ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１からマウスを防御することができるかどうかを試験するため、ＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間の接合部に切断部位のないＨ５Ｎ１のＨ５（これがＨＡタンパク質の機能を不活化した）を含むＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４８ウイルス）が作成されている。このウイルス、並びに野生型ウイルスもまた、成長した。１０６ｐｆｕのＺＬ４８の単一用量で免疫した全てのマウスが攻撃を生き残り、体重減少はなかった。免疫化マウスの肺においてＨ５Ｎ１は検出されなかった。抗体移入実験から、抗Ｈ５抗体が防御を媒介したことが確認された。単一用量のＰＩＶ５−Ｈ５接種は致死性Ｈ５Ｎ１攻撃からマウスを完全に防御したが、２回目の用量が、中和抗体力価をさらにブーストした。先在するベクター免疫が生ウイルスによるブーストを妨げなかったことは、抗ＰＩＶ５抗体がＰＩＶ５感染を妨げないという報告と一致する（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４（１１）：５４０３−１１）。実施例３及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３５４−６２（５９）を参照のこと。
【０２７１】
Ｈ５の発現レベルが増加すると、ワクチン候補としての組換えウイルスの有効性が向上するものと思われる。ＰＩＶ５の唯一の事実上のプロモーターであるリーダー配列までの距離が、遺伝子発現レベルに逆に作用する。ＨＮとＬとの遺伝子間の遺伝子接合部は、ＰＩＶ５においてリーダー配列から最も離れている。目的の遺伝子をＨＮ−Ｌ遺伝子接合部からリーダー配列の近くに動かすと、遺伝子発現レベルが増加し得る。Ｈ５Ｎ１のＨＡ遺伝子がＰＩＶ５ゲノム内の種々の位置に挿入されている（図４７；実施例３；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３５４−６２）。全てのコンストラクトが単一の高用量接種（１０６ｐｆｕ）の後にマウスにおいてＨ５Ｎ１攻撃に対する完全な防御を提供したため、用量反応試験を実施した（１０３、１０４、及び１０５ｐｆｕ）。１０４ｐｆｕ以上のＺＬ４６、ＺＬ４７又はＺＬ４８を接種した全てのマウスが致死性Ｈ５Ｎ１攻撃を生き残った（実施例３；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８７（１）：３５４−６２）。１０３ｐｆｕのＺＬ４６はＨ５Ｎ１致死的攻撃からマウスを１００％防御した。
【０２７２】
１０３ｐｆｕの用量でＺＬ４８は７０％のマウスを防御したが、ＺＬ４７は僅か３０％のマウスを防御したに過ぎなかった。通常のヒトインフルエンザウイルス免疫は、ほとんどがＩＭで行われ、且つ弱毒生インフルエンザウイルスワクチンはＩＮで接種されるため、ＩＭ及びＩＮ免疫の有効性を比較した。ＩＭ及びＩＮは双方とも機能したが、ＩＮではＩＭより優れた防御が提供された。興味深いことに、不活化ＰＩＶ５−Ｈ５はＩＭ又はＩＮで防御しなかったことから、ＩＭ接種であっても、ＰＩＶ５の複製がその有効性に必須であることが示唆される。ＰＩＶ５は、呼吸器感染病原体である。ＩＮ経路によりＰＩＶ５−Ｈ５を免疫したマウスの気管支肺胞洗浄液及び鼻洗浄液に抗ＨＡ  ＩｇＡが検出されたことから、ＰＩＶ５ベースのワクチンが気道においてロバストな粘膜免疫を生じ得ることが示唆される。実施例７及びＭｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌを参照。
【０２７３】
ワクチン用の抗原としてＰＩＶ５を使用して発現させた他のＨ５Ｎ１タンパク質の潜在力を試験する。Ｈ５Ｎ１タンパク質ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２及びＮＰを発現する組換えＰＩＶ５が作成され（図４７Ａ）、ワクチン候補としてのそれらの有効性がＨ５Ｎ１に対して試験されている。Ｈ１Ｎ１のＨ１又はＮ１を発現するＰＩＶ５もまた作成して試験した。これらの全てのコンストラクトについて、ＰＩＶ５ゲノム複製に対する潜在的な有害効果を回避する出発点として、ＨＮ及びＬ接合部に遺伝子を挿入した。ｒＰＩＶ５−Ｍ２を除き、全てのウイルスが組織培養細胞で良好に成長した。
【０２７４】
Ｈ５Ｎ１のＮＡ遺伝子を含むＺＬ１１６（図４７Ａ）によるマウスの接種は、マウスを致死性Ｈ５Ｎ１攻撃から完全に防御した。さらに、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）免疫マウスの肺においてＨ５Ｎ１は検出されなかった。これは、Ｈ５Ｎ１に対する殺菌免疫（死亡なし、罹患なし及び肺における攻撃ウイルスの検出なし）がウイルスベクターベースのＮＡワクチンを使用して初めて観察された、面白い結果である。Ｈ５Ｎ１媒介性防御のＮ１が特異的で、Ｈ５Ｎ１のＮＡのみに限られているかどうかを調べるため、ＺＬ１０８（Ｈ１Ｎ１由来のＮ１を発現するＰＩＶ５）を試験した。ＮＡにより生じた免疫が防御性であり得ることを確認して、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）はマウスを致死性Ｈ１Ｎ１攻撃から完全に防御した。興味深いことに、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）は致死性Ｈ１Ｎ１攻撃に対する完全な防御を提供した；ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）もまた致死性Ｈ５Ｎ１攻撃に対して部分的な防御（６０％）を提供した。ＮＡベースの防御が広域であり得るかどうかをさらに調べるため、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）及びｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）を致死性Ｈ３Ｎ２攻撃に対して試験した。意外にも、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）はＨ３Ｎ２攻撃を部分的に（４０％）防御したが、一方、ｒＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）は全く防御しなかった。
【０２７５】
Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰは十分に保存されている。ＮＰにより生じる免疫は細胞媒介性であると考えられる。最近では、ＮＰが万能インフルエンザウイルスワクチン開発の一構成要素として使用されている（Ｓｏｂｏｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；６（７）：ｅ２１９３７）。Ｈ５Ｎ１のＮＰを発現するＰＩＶ５を作成し、Ｈ５Ｎ１由来の異なる亜型であるＨ１Ｎ１ウイルス（ＰＲ８株）による致死的攻撃に対してその有効性を試験した。ＰＩＶ５−ＮＰによるマウスの単一用量接種は、致死性ＰＲ８株攻撃に対して１００パーセントの防御を提供した。しかしながら、いくらかの体重減少（５〜１０％）があった。抗ＮＰが決定的でないことと一致して、抗ＮＰ力価と体重減少との間に相関は観察されなかった。また、ＮＰ媒介性免疫がインフルエンザウイルス感染を予防しないという既報告と一致して、免疫マウスの肺にＰＲ８ウイルスは検出されなかった。対照的に、ＮＰを発現するＶＶは同じウイルスの攻撃に対していかなる防御も提供せず、ＮＰを含むアデノウイルスは致死性Ｈ１Ｎ１攻撃に対して８０％の防御を提供するが、マウスは体重が約３０％減少した。これらのＰＩＶ５コンストラクトがＡｄＶベース及びＶＶベースのＮＰワクチンより良好に機能したことは、ＡｄＶ又はＶＶ（ＭＶＡ）と比べてＰＩＶ５が、インフルエンザウイルスに対するより優れたワクチンベクターであることを実証している。
【０２７６】
次にＰＩＶ５−ＮＰを致死性Ｈ５Ｎ１攻撃に対して試験し、死亡及びいくらかの体重減少（１０〜２０％）からの部分的防御が認められた。Ｈ５Ｎ１に対する防御は５０％に過ぎなかったが、これは、ウイルスベクター化ＮＰワクチン候補による単一用量ワクチン接種について報告されているなかで最良である。これは、免疫用量を増加させ、ＰＩＶ５ゲノム内のＮＰ挿入部位を変更し、ＰＩＶ５ベクターを修飾し、且つこれを本明細書に記載される他のインフルエンザウイルス抗原と組み合わせることにより、改善され得る。
【０２７７】
Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質は保存されている。ＨＮとＬとの間にＨ５Ｎ１のＭ１を発現する組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５−Ｍ１）の有効性を決定した（図４７Ａ）。興味深いことに、ｒＰＩＶ５−Ｍ１は、マウスにおいて致死性ＰＲ８に対して部分的防御（７０％）を提供した。防御が理想に満たないのは、Ｍ１遺伝子の遺伝子開始配列における予想外の突然変異に起因する可能性が最も高い。より優れた有効性のＭ１を発現する組換えＰＩＶ５を作成する。
【０２７８】
Ｈ５を発現するＰＩＶ５突然変異体を作成した（図４７Ａ）。組換えウイルスのルーチン分析の一環として、ウイルスのゲノム全体をプラーク精製し、配列決定する。ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５（ＺＬ１２８）は正確な入力配列を有するが、ＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５ウイルスのゲノムには突然変異がある。以前、インターフェロン欠損細胞系であるＶｅｒｏ細胞にｒＰＩＶ５ＶΔＣが移された後、Ｖタンパク質の発現を回復した突然変異並びに他の部位における突然変異を有するウイルスが出現した。これは、Ｃ末端の欠失の作られ方及びウイルス複製におけるＶタンパク質の重要性に起因するものと思われる。Ｖ及びＰ  ｍＲＮＡは両方とも同じＶ／Ｐ遺伝子から転写されるため、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体の不可欠な部分であるＰタンパク質のＮ末端も同様に欠失させることなしには、ＶのためにＰＩＶ５ゲノムからコード配列全体を欠失させることはできなかった。代わりに、両方のｍＲＮＡの転写にとって決定的に重要なＶ／Ｐ遺伝子の領域内に複数の点突然変異を導入することにより、Ｖ／Ｐ遺伝子にＰ  ｍＲＮＡのみを作らせ、Ｖ  ｍＲＮＡを作らせないようにした。多数のｒＰＩＶ５ＶΔＣ−Ｈ５クローンを配列決定しており、それらは全て、異なる位置に突然変異を含む。Ｖタンパク質のＣ末端の発現を無効にする意図した突然変異を除いては異なる突然変異を有する回収したウイルスのうち２つのクローンを選び、試験した。理論的解釈は、全ての突然変異体が同じ効果を有し、且つ共通の特徴がＶの保存されたＣ末端の欠損であるならば、ＶのＣ末端の欠損が表現型を決定する因子であり得るというものである。ウイルスにより生じる免疫を生じさせ、マウスにおける致死性Ｈ５Ｎ１攻撃に対する組換えウイルスの有効性を試験した。ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５は、ＰＩＶ５−Ｈ５と比べてより優れた抗体反応及び細胞媒介性応答を生じていた。調べたＰＩＶ５ＶΔΔＣ−Ｈ５の２つのクローンのうちの一方は、一方がより優れた抗体を生じ、他方がＨ５に対するより優れた細胞媒介性応答を生じていた。全ての突然変異体ＰＩＶ５が野生型ＰＩＶ５と比べてＨ５Ｎ１攻撃に対してより優れた防御を提供した。ｒＰＩＶ５ＶΔＣΔＳＨ−Ｈ５、ｒＰＩＶ５ＶΔＣ−ＮＰ及びｒＰＩＶ５ΔＳＨ−ＮＰ突然変異体を作成しており（図４７Ａ）、試験中である。
【０２７９】
ＰＩＶ５に対する先行曝露を有するイヌのｒＰＩＶ５−Ｈ３による免疫。ＰＩＶ５に対する先在する免疫がワクチンベクターとしてのＰＩＶ５の使用に悪影響を及ぼすかどうかを調べるため、次に、ＰＩＶ５未感作イヌ及びＰＩＶ５に対して複数回ワクチン接種したイヌを試験した。ＰＩＶ５未感作イヌにおける中和抗ＰＩＶ５の欠如が確認され、ＰＩＶ５ワクチン接種イヌにおけるＰＩＶ５に対する中和抗体（ｎＡｂ）力価は、３００もの高さであった（実施例２及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；７（１１）：ｅ５０１４４を参照）。イヌにＰＢＳ、ＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ３をＩＮ経路によりワクチン接種した。ｒＰＩＶ５−Ｈ３をワクチン接種したＰＩＶ５未感作イヌは、２０〜８０の範囲（平均４２）のＨＡＩ力価を有した。ｒＰＩＶ５−Ｈ３をワクチン接種したＰＩＶ５陽性イヌは、４０〜８０の範囲（平均７７）のＨＡＩ力価を有した（２群のＨＡＩの差は、統計的に有意ではなかった）ことから、ｒＰＩＶ５−Ｈ３ワクチン接種がインフルエンザウイルスに対する免疫を生じたことが示され（ＨＡＩ力価の４倍増加又は４０のＨＡＩ力価を、インフルエンザウイルス感染に対して防御性と見なす）、先在する抗ＰＩＶ５  ｎＡｂ力価がイヌにおいてＰＩＶ５ベースのワクチンの有効性に影響を与えなかったことが示唆される。これらの結果は、ＰＩＶ５に対するｎＡｂがマウスにおいてＰＩＶ５感染を妨げないという既報告と一致する（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；６４（１１）：５４０３−１１）。イヌがＰＩＶ５感染を除去する能力については、依然として不確かである。ＰＩＶ５はイヌにおいて複製が自己抑制的であるため、細胞媒介性免疫が感染の除去においても同様に決定的な役割を果たすものと思われる。細胞媒介性免疫が応答して有効となるまでには時間がかかるため、この時間差が、ＰＩＶ５ベースの生ワクチンが細胞において複製してロバストな免疫応答が生じる機会を提供する。
【０２８０】
目標１は、Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の、フェレットにおけるＨ５Ｎ１攻撃に対する有効性を試験することである。マウスにおいてＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１攻撃に対して有効なＰＩＶ５ベースのＨ５Ｎ１ワクチン候補が得られている。フェレットはインフルエンザウイルス感染に最良の小動物モデルであるため、フェレットを含めたさらなる動物モデルで有効性を試験する。図４７に列挙する１３個を含め、多くのワクチン候補がマウスで試験されている。これらをフェレットにおいて試験する。主要な目的はＨ５Ｎ１ワクチンの開発であるため、Ｈ５に対する抗体がワクチン候補の有効性の評価に広く受け入れられているパラメータであることから、初めにＰＩＶ５−Ｈ５を試験する。ＰＩＶ５−Ｈ５については、あらゆる野生型ＰＩＶ５−Ｈ５のなかでＺＬ４６が最も有効であるため、初めにＺＬ４６を試験する。第二に、ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５（ＺＬ１２８）を試験し、これは突然変異体ＰＩＶ５−Ｈ５のなかで最良であり、安定もしている。ｒＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５によるＴＮＦ−αの活性化が適応免疫応答に影響を及ぼすかどうかを決定することで、新規ワクチンの設計に有益な情報が得られる。第三に、フェレットにおけるウイルスベクター化ＮＡワクチンの成功は報告されていないため、ＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ５Ｎ１）（ＺＬ１１６）を試験する。ＮＡが有効な抗原であり得るかどうか、及びＮＡを発現するＰＩＶ５がフェレットにおいてインフルエンザウイルスに有効であり得るかどうかを決定するために、この研究は重要である。第四に、ＮＰベースのワクチンの免疫は細胞性免疫応答によって媒介されると考えられるため、フェレットにおいてＰＩＶ５−ＮＰ（ＺＬ１１２）を試験する。これは、ＮＰを発現するＰＩＶ５がフェレットにおいて有効であり得るかどうかを試験するのみならず、ＰＩＶ５ベースのワクチンがフェレットにおいてロバストな細胞性免疫応答を生じさせ得るかどうかの決定でもある。
【０２８１】
ＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１の安全性、安定性及び免疫原性の調査。４セットのワクチン候補を試験する：ＰＩＶ５−Ｈ５、ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５、ＰＩＶ５−Ｎ１及びＰＩＶ５−ＮＰ。各セットに陰性対照としてＰＢＳ及びＰＩＶ５を含める。陽性対照として不活化Ｈ５Ｎ１を使用する。ＰＩＶ５ΔＳＨ−Ｈ５（ＺＬ１２８）ワクチンについては、ＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４８）もまた比較のため含め、これは、そのいずれもがＰＩＶ５ゲノム内の同じ位置にＨ５挿入を含むためである。６匹の群のフェレットに、麻酔下で０．５ｍｌ容量中１０６ＰＦＵの組換えＰＩＶ５親ウイルス（ＰＩＶ５）又はＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１、又はＰＢＳを接種する。免疫原性に関する陽性対照として、感染のフェレットモデルにおいてＨＡ特異的抗体反応を誘発し、且つ致死的攻撃を防御することが示されている１５ｕｇの不活化Ｈ５Ｎ１により、３匹のフェレットを筋肉内（ＩＭ）免疫する。臨床症状（発熱、嗜眠、及び体重減少）に関して動物を１４日間モニタする。接種後２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１４日目及び２１日目、鼻洗浄液を採取し、プラークアッセイを用いてそのウイルス力価を決定する。鼻洗浄液はまた、ＨＡ特異的ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡを用いて、粘膜抗体反応についてもアッセイする。０日目、８日目、１４日目、及び２１日目に血清及び全血も採取して、ＣＢＣ、臨床化学、血清抗体反応及び／又は細胞媒介性免疫応答を計測する。接種後４日目（ＰＩＶ５シェディングのピーク）、３匹のフェレットを人道的に安楽死させ、肉眼的病理学及び顕微鏡的病理変化について剖検する。また、肺及び鼻甲介を採取し、ウイルス力価を決定する。リンパ球（免疫応答）分析のため、さらなる組織を採取する。Ｈ＆Ｅ染色を用いて病理変化を調べる。残りのフェレットは、免疫後２１日目にＨ５Ｎ１で攻撃する。
【０２８２】
安定性試験のため、鼻洗浄液を使用して直接ＲＴ−ＰＣＲ配列決定用のウイルスＲＮＡを得るか、及び／又は鼻洗浄液中に直接ＲＴ−ＰＣＲ配列決定には不十分なウイルスしかない場合、Ｖｅｒｏ細胞で培養した後、ＲＴ−ＰＣＲ配列決定に使用する。病理検査のため、肉眼的病理学の後、安楽死させた動物から組織を取り出し、グリッド上に置き、１ｃｍ断片を選択し（臓器全体に相当する）、１０％緩衝ホルマリンに固定する。プラークアッセイによるウイルス力価の分析用にさらなる断片を採取する。固定した組織をパラフィン包埋し、３ミクロンの薄片に切り、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡法によって調べ、病理学者が盲検的にスコア化する。Ｈ＆Ｅ結果により示唆される場合、組織をウイルス特異的又はリンパ球特異的（例えばＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞）ｍＡｂで免疫染色し、ウイルス抗原発現及び／又はリンパ球浸潤のレベルをスコア化する。
【０２８３】
局所免疫。免疫応答の誘導部位により免疫応答の性質が変わり、防御有効性に著しい影響が及び得る。粘膜免疫は、一致型の攻撃及び異種亜型の攻撃の両方を防御するインフルエンザ特異的粘膜ＩｇＡ及びＩｇＧ応答を誘導することが示されている。鼻腔内ＰＩＶ５免疫は、インフルエンザ攻撃に対する防御を媒介する局所的インフルエンザ特異的Ｔ細胞及び免疫グロブリン応答を誘導する潜在力を有する。鼻洗浄液及び肺の分析により（安楽死当日）、局所的（すなわち肺）ＰＩＶ５特異的及びインフルエンザ特異的免疫応答を評価する。遠心によって浸潤性リンパ球集合を採取し、粘膜ＩｇについてＢＡＬ洗浄液を分析する。
【０２８４】
細胞媒介性免疫（Ｔ細胞）分析  ワクチン接種により誘導されたＴ細胞応答及び攻撃後のＴ細胞応答の変化を、抗原特異的ＩＦＮ産生によって計測する。具体的には、末梢血、ＢＡＬ、脾臓及び／又は流入領域リンパ節由来のリンパ球を、不活化Ｈ５Ｎ１、逆遺伝学的６：２のＰＲ８：Ａ／ＶＮ／１２０３／０４、組換えＨＡ（ＮＡ又はＮＰ）、又はＨ５Ｎ１  ＨＡ（又はＮＡ、ＮＰ）ペプチドプールで再刺激することにより、インフルエンザ特異的Ｔ細胞応答についてアッセイする。細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＡ、及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＩＦＮ−γ応答を決定する。インフルエンザウイルス感染後に、様々なＨＡ特異的ペプチドエピトープが同定されている。フェレットについてＡ／ベトナム／１２０３／０４  ＨＡにおける特異的なエピトープは同定されていないが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスにはＨＡペプチドライブラリが利用可能であり、必要に応じて、反応性に関して免疫細胞集団をスクリーニングしてペプチドエピトープを同定することができる。
【０２８５】
体液性免疫（抗体）分析  血清、鼻洗浄液、及びＢＡＬ洗浄液中のＨＡ（ＮＡ又はＮＰ）特異的体液性免疫応答を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより、同種（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）又は異種（Ａ／Ｕｄｏｒｎ）ウイルス又は組換えＨＡ（ＮＡ又はＮＰ）をプレート結合抗原として使用して計測する。ＩｇＡ及びＩｇＧの双方とも、フェレットクラス特異抗体を使用して評価する。ＨＡ特異的抗体力価もまた、ウイルスマイクロ中和アッセイ又はＨＡＩにより計測する。同種Ａ／ＶＮ／１２０３／０４（クレード１）ＨＡに対して反応性を示す試料は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（クレード２．３．４）との交差クレード反応性について評価する。全ての血清及びＢＡＬ洗浄液試料を、対応する免疫前試料又は対照免疫試料と比較する。
【０２８６】
Ｈ５Ｎ１攻撃に対するＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１の有効性の調査。攻撃実験は、ＢＳＬ３ＡＧ＋  封じ込め下で実施する。上記のとおり免疫したフェレットに、１０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１をＩＮ接種する。活動、体重減少、及び体温を含む臨床症状、並びに生存について、フェレットを１４日間モニタする。感染後２日目、４日目、６日目、及び８日目に鼻洗浄液を採取し、ＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス力価をアッセイする。１４日目、生存している動物を出血させ、インフルエンザ特異的血清抗体をアッセイする。
【０２８７】
フェレットを野生型ＰＩＶ５又はｒＰＩＶ５−Ｈ５（ＺＬ４６）に感染させ、ＥＬＩＳＡ及びウイルス中和アッセイを用いてＨ５に対する抗体力価を計測した。このワクチン候補は、防御性であると見なされる抗Ｈ５抗体力価を生じさせるのに有効であった（図４７Ｂ）。マウスにおけるＰＩＶ５−Ｈ５、ＰＩＶ５−Ｎ１及びＰＩＶ５−ＮＰでの結果、及びフェレットにおけるＰＩＶ５−Ｈ５のこの実験から、ＰＩＶ５−Ｈ５及びＰＩＶ５−Ｎ１が免疫原性で、致死性Ｈ５Ｎ１攻撃からフェレットを防御するのに有効であり得ることが予想される。Ｈ５Ｎ１  Ａｎｈｕｉ（クレード２ウイルス）に対するＰＩＶ５−Ｈ５（Ｈ５Ｎ１、ＶＮ）で免疫したマウス由来の血清のロバストな交差反応性が観察されており、ＰＩＶ５−Ｈ５（ＶＮ、クレード１）がクレード２ウイルスからの攻撃に対して防御性であることが示唆される。
【０２８８】
初回接種は１０６ＰＦＵ（図４７Ｂ）のワクチン候補から開始する。これが完全防御（症状なし、死亡なし及び検出可能なウイルスなし）に不十分な場合、フェレット当たり最大１０８ＰＦＵまで用量を増加させる。単一用量が完全防御に不十分な場合、プライム−ブーストレジメンを用いて免疫を増強する。全てのインフルエンザウイルス関連試薬が容易に入手可能であり、Ｔ細胞分析用に精製ＮＰ及びＭ１が生成されている。
【０２８９】
フェレットにおけるこの研究のため、抗フェレット抗体などの、有効な免疫アッセイに必要な試薬を、ＢＥＩ及び他の商業的供給元から入手し、交差反応性抗体を使用することができる。さらに、フェレットタンパク質に対するモノクローナル抗体を作成する。この目的のため、フェレットの抗ＣＤ４のハイブリドーマが２つ、及びフェレットの抗ＩＦＮ−βのハイブリドーマが３つ、開発されている。
【０２９０】
目標２は、Ｈ５Ｎ１抗原を発現する組換えＰＩＶ５の、Ｈ５Ｎ１並びに異種亜型インフルエンザウイルス攻撃に対する有効性を向上させることによる、ＰＩＶ５ベースのＨ５Ｎ１ワクチンのさらなる改良並びに一般的な有望な万能インフルエンザウイルスワクチンを含む。
【０２９１】
ＩＦＮ発現を誘導し、且つＩＦＮシグナル伝達を遮断する突然変異を組み込む。ＩＦＮ発現などの自然免疫応答の活性化が適応免疫応答を増強することが分かっている。ウイルスベクターにとって、これは両刃の剣である。ウイルスベクターがロバストなＩＦＮ発現を誘導する場合、次にはＩＦＮのこの誘導がベクターの複製を阻害し、ベクターの有効性が低下する。ウイルスベクターがＩＦＮ産生の誘導を可能にしながらも、なおＩＦＮシグナル伝達を遮断してその効率的な複製を可能にするその能力を維持していることが、理想的である。Ｉ型インターフェロンなどのサイトカインの発現の誘発能を有するＰＩＶ５タンパク質内の残基が同定されている（Ｓｕｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ；５（７）：ｅ１０００５２５）。ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ１５７の残基は、宿主キナーゼＰＬＫ１に対する結合部位であり、ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ３０８の残基は、ＰＬＫ１のリン酸化部位である。Ｓ１５７又はＳ３０８をアミノ酸残基Ａに突然変異させると、ウイルスはインターフェロン−βの発現を増加させる。最も重要なことに、ウイルスは、ＩＦＮシグナル伝達を遮断するＶタンパク質をなお発現する。従って、これは、それ自体の複製に悪影響を及ぼすことなしにＩＦＮ発現を誘導することのできるウイルスベクターである。Ｈ５又はＮＰを発現する組換えＰＩＶ５を作成し（図４７Ｂ）、マウス及びフェレットにおけるＨ５Ｎ１攻撃に対する免疫原性及び有効性を決定する。ＨＡを使用して、抗体反応に対するＰ−Ｓ３０８Ａの効果を試験し、ＮＰを使用して、細胞媒介性応答に対するＰ−Ｓ３０８Ａの効果を試験する。
【０２９２】
ＰＩＶ５−ＮＰとＰＩＶ５−ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２及び／又はＨＡｓｔｅｍとによる混合免疫の、万能ワクチンとしての有効性を試験する。ｒＰＩＶ５−ＮＰはＨ１Ｎ１並びにＨ５Ｎ１を防御し、且つＰＩＶ５−Ｎ１（Ｈ１Ｎ１）はＨ１Ｎ１攻撃のみならず、Ｈ３Ｎ２も防御したため、ＮＰ並びに他のインフルエンザウイルス抗原を発現するＰＩＶ５は、万能インフルエンザウイルスワクチンの優れた候補となり得ることが予想される。第一に、２つのワクチンの組み合わせが防御において相乗作用を提供し得るかどうかを試験する。それらが相乗作用を提供する場合には、それらを組み合わせて単一のウイルスベクターとする。ＮＰは広域の防御を提供することが知られているため、ＮＰを、他方と混合するベースとして使用する。ＰＩＶ５−ＮＰをＰＩＶ５−ＮＡ、ＰＩＶ５−Ｍ２及び／又はＰＩＶ５−Ｍ１並びにＰＩＶ５−ＨＡｓｔｅｍ（ＨＡのステム領域）と共にマウスで試験し、次にフェレットで試験する。
【０２９３】
Ｍ２は、インフルエンザウイルスタンパク質の間で比較的保存されている。Ｍ２は広域の抗インフルエンザウイルス免疫を生じ得ることが示されている。しかしながら、本研究では、ＰＩＶ５から完全長の機能性Ｍ２が発現したとき、いかなる防御も検出されなかった。このようにＭ２免疫応答を誘発できなかったことは、ＰＩＶ５−Ｍ２感染細胞におけるＭ２の毒性であるものと思われる。Ｍ２はイオンチャネルであり、この機能に決定的な残基が同定されている。Ｈ３７及びＷ４１はイオンチャネル活性に決定的であることが知られている。これらの残基を突然変異させると、Ｍ２の構造に影響が及ぶことなくイオンチャネル活性が消失する（Ｍ２は、単一の膜貫通ドメインを有するホモ四量体である）。Ｍ２のイオンチャネル活性を不能にすることにより、急激過ぎる感染細胞の死滅なしに高度なＭ２を発現するＰＩＶ５が生成され得る。また、Ｍ２のエピトープは分かっており、それらはＭ２の外部ドメインにあるため、ＰＩＶ５のＳＨとＭ２との間でハイブリッドタンパク質が生成され得る。ＰＩＶ５のＳＨは４４アミノ酸残基長の膜貫通タンパク質であり、７アミノ酸残基の外部ドメインを有する。Ｍ２の外部ドメインをＳＨの外部ドメインに付加し得る（ＳＨ−Ｍ２）。最近になって、ＨＡのステム領域であるＨＡの保存領域を認識する抗体が、インフルエンザウイルスのあらゆる亜型の感染予防に有効であることが報告されている。ＰＩＶ５由来のＨＡのステム領域を発現させ（図４７Ｂ）、マウスにおけるその免疫原性を調べる。ＰＩＶ５−Ｍ１コンストラクトは、致死性ＰＲ８攻撃に対して既に７０％の防御を提供した。このウイルスは、正確な遺伝子開始配列を使用することにより、及びＳＨとＨＮとの間にＭ１を挿入することにより、さらに改良され得る。
【０２９４】
２つ以上のインフルエンザウイルス抗原を発現するＰＩＶ５を作成する。単純化するため、及び不必要な規制上の負担を回避するため、単一のウイルスから複数の抗原を発現することが、異なる抗原を発現するＰＩＶ５の混合物を使用することと比較して望ましいともいえる。ＮＰの発現を、同じＰＩＶ５からのＮＡ、ＨＡｓｔｅｍ、Ｍ１及び／又はＭ２の発現と組み合わせる（図４７Ｂ）。
【０２９５】
複数のインフルエンザウイルス抗原を発現するＰＩＶ５の万能ワクチンとしての有効性を試験する。ＮＡ、ＮＰ、Ｍ２  ｍｕｔ及び／又はＭ１を発現するＰＩＶ５を作成した後、それらの有効性を、初めにマウスにおいて、初めにＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１からの攻撃に対して試験する。マウスにおいて有効であれば、それらをフェレットで試験する。
【０２９６】
目標３は、ＰＩＶ５ベクターに基づく免疫に関する理解を高めるための研究を含む。ＰＩＶ５ベースのワクチン候補により生じる免疫の機構を、マウス並びにフェレットにおいてさらに試験する。従来のインフルエンザウイルスワクチンでは、一般に、ＨＡに対する中和抗体が、防御免疫を証明するものと考えられる。しかしながら、生ワクチンによる免疫では、体液性及び細胞性の両方の免疫応答が生じる可能性が高くなる。これらの例では、ＮＡ及びＮＰを発現するＰＩＶ５が、これまでに観察されたことのないレベルの防御を提供したことが示されている。組換えＰＩＶ５ウイルスによる改変された抗原の提示が免疫応答を変えた可能性もあり得る。アポトーシス経路は抗原提示に影響を及ぼすと考えられる。ＰＩＶ５ΔＳＨ及びＰＩＶ５ＶΔＣにより誘導されるアポトーシスをもたらす経路は同定されており、且つ異なるため、これらのウイルスは、同じ抗原を発現するが異なるアポトーシス経路を活性化するウイルスによる抗原提示を調べるまたとない機会を提供する。１つのアポトーシス経路が抗体反応を選択的に増強し得ると同時に、他方がＴ細胞応答に影響を及ぼし得る可能性がある。アポトーシスがどのようにウイルス感染に対する免疫応答に影響を及ぼすかを理解することは、より優れたＨ５Ｎ１ワクチンの設計に役立つばかりでなく、ワクチン設計及び免疫応答に関する一般的知識もまた提供し得る。ＰＩＶ５−Ｐ−Ｓ３０８Ａベースのワクチンにより、ウイルスベクターの複製に対するＩＦＮの効果を懸念することなしに、ＩＦＮの誘導が適応免疫応答に与える効果を調べることが可能となる。ｒＰＩＶ５−Ｈ５、ｒＰＩＶ５−ＮＡ及びｒＰＩＶ５−ＮＰにより提供される防御の免疫機構については、この目標のなかで取り組む。
【０２９７】
ＰＩＶ５により誘導される防御の機構は、３つの方法によって調べる。抗体が防御に十分であるかどうかを決定するため、未感作、ＰＩＶ５、ＰＩＶ５−Ｈ５Ｎ１（全てＰＩＶ５が基準、突然変異を含む又は含まない、Ｈ５Ｎ１抗原を発現する）、又はＨ５Ｎ１免疫マウスからの血清を未感作マウスに受身移入させる。被移入マウスをＨ５Ｎ１インフルエンザで攻撃する。攻撃後様々な日数でウイルス力価分析のため一部の動物を犠牲にし、他のマウスは罹患率及び死亡率についてモニタする。抗体が防御に必須であるかどうかを決定するため、抗体産生が欠損しているＭＴマウスを免疫に使用する。免疫マウスが致死的攻撃を生き残った場合、それは、抗体が必要ではなく、細胞媒介性免疫応答で十分に防御されることを示している。細胞性免疫応答の役割を評価するため、上記のとおりマウスを免疫し、ｍＡｂ枯渇により免疫動物から個別のＴ細胞サブセット（ＣＤ４、ＣＤ８又は両方）を急性的に枯渇させる。枯渇させた後、マウスをＨ５Ｎ１インフルエンザで攻撃し、上記のとおり防御を評価する。急性枯渇試験は時に不確定なデータ（ｄａｔｅ）を生じることがある；例えばＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇は防御を無効にしないが、ＣＤ９０枯渇を加えると、防御が完全に失われる。この普通でない結果については、ＣＤ４及びＣＤ８特異的ｍＡｂによる不完全な枯渇又は防御におけるＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の役割を含め、可能性のある説明がいくつかある。加えて、急性枯渇はプライムされたＴ細胞を除去するのみならず、未感作Ｔ細胞も除去し、防御に寄与する攻撃に対する一次応答の寄与を全て消失させる。受身血清移入と同様に、未感作動物へのプライムされたＴ細胞の養子移入は、防御免疫応答における個々の細胞集団の役割を直接特徴付けることができる。急性枯渇に代わるものとして、クラスＩ欠損マウスを使用してＣＤ８＋（ＣＴＬ）活性の寄与を評価して、野生型及びβ２ｍ欠損マウスを免疫し、防御有効性を評価し得る。クラスＩＩ（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）欠損マウスは別の代替的手法であるが、有効なＣＴＬ及び血清抗体反応の誘導に関してさらなる課題を有する。
【０２９８】
［実施例１０］
改良狂犬病ワクチン
狂犬病は、世界各地で依然として重大な公衆衛生上の脅威であり、毎年７万人を超える死亡者を生じている。ヒト狂犬病の予防には、愛玩動物及び保菌野生生物の免疫化、リスクを有する人の曝露前免疫化、及び狂犬病の動物に噛まれた人の曝露後治療が含まれる。細胞培養物から調製された不活化狂犬病ウイルス（ＲＶ）ワクチンは、安全且つ有効であるものの、欠点を有する。第一に、これらのワクチンは高価であり、従って発展途上国のワクチンを必要とするほとんどの人には手が届かない。さらに、防御免疫応答を生じさせるには、不活化ワクチンによる頻回の免疫化が必要である。加えて、これらの不活化ワクチンは常にアジュバントを含むが、アジュバントは副作用を引き起こし得る。従って、より安全で、より安価な、且つより有効なＲＶワクチンが必要とされている。
【０２９９】
この例には３つの目標がある。１、イヌにおいてｒＰＩＶ５−Ｇの有効性を試験すること。イヌにおいて、異なるワクチン接種経路（鼻腔内、経口及び筋肉内）を使用してｒＰＩＶ５−Ｇの有効性を調べ、ｒＰＩＶ５−Ｇの用量反応を決定する。２、Ｇを発現する組換えＰＩＶ５の有効性を向上させること。ＰＩＶ５ゲノム内における抗原の挿入部位が、動物におけるワクチン候補の免疫原性に影響を及ぼした。先行研究では、狂犬病ウイルスのＧ遺伝子がＨＮとＬとの遺伝子間に挿入されている。ＧをＰＩＶ５ゲノム内の他の位置に挿入し、それらの有効性をマウス及びイヌで試験する。ＰＩＶ５に対する修飾は、抗原に対する免疫応答を増強させる。例えば、ＳＨ遺伝子を欠失させると、野生型ＰＩＶ５と比較して外来遺伝子に対する免疫が増加した。ＰＩＶ５のゲノムを修飾して、Ｇタンパク質に対する最大免疫を得る。そして、３、他の狂犬病ウイルスタンパク質の免疫を試験すること。狂犬病攻撃に対して防御免疫を生じさせるのにＧは十分であるが、狂犬病ウイルスタンパク質Ｎもまた、防御免疫を生じさせることが知られている。Ｎを発現する組換えＰＩＶ５を構築して試験する。加えて、本発明者らは、ウイルス粒子の決定的な成分であるＭを組み込んでＰＩＶ５ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作成し、狂犬病ワクチンとしてのそれらの有効性を試験する。
【０３００】
この例は、複数の経路で送達することのできる新規の安全で有効な狂犬病ワクチンにつながるのみならず、イヌ及び場合により野生動物用のワクチンの新規開発戦略も提供する。本研究から得られる知識により、ＨＩＶ及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの他の疾患向けのＰＩＶ５ベースのワクチンの設計が導かれる。
【０３０１】
イヌにおけるｒＰＩＶ５−Ｇの有効性を試験する。異なるワクチン接種経路（鼻腔内、経口及び筋肉内）を使用してイヌにおけるｒＰＩＶ５−Ｇの有効性を調べ、ｒＰＩＶ５−Ｇの用量反応を決定する。イヌにおけるｒＰＩＶ５−Ｇの安全性、安定性及び免疫原性の調査  ＰＩＶ５はケンネルコフワクチンに含まれているため、ＰＩＶ５の安全性は本質的にイヌにおいて試験されている。安全性及び免疫原性を可能な限り高い用量で様々な免疫化経路によりさらに試験する。８匹の群のイヌに、ＩＭ、経口又はＩＮ経路によって１０８ｐｆｕの組換えＰＩＶ５親ウイルス（ＰＩＶ５）又はＰＩＶ５−Ｇを接種する。対照として、ｒＬＢＳＮＥ（本質的にＳＡＧ−２、市販の狂犬病ワクチン）をＩＭによって含める。臨床症状（発熱、嗜眠、及び体重減少）に関して動物を１４日間モニタする。接種後２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１４日目及び２１日目、鼻洗浄液を採取し、プラークアッセイを用いてそのウイルス力価を決定する。また、０日目、７日目、１４日目、及び２１日目に血清及び全血も採取し、ＣＢＣ、及び臨床化学を計測する。接種後４日目（ＰＩＶ５シェディングのピーク）、イヌ（各群から４匹）を人道的に安楽死させ、肉眼的病理学及び顕微鏡的病理変化について剖検する。また、肺及び鼻甲介を採取し、ウイルス力価を決定する。病理検査のため、肉眼的病理学の後、安楽死させた動物から組織を取り出し、グリッド上に置き、１ｃｍ断片を選択し（臓器全体に相当する）、１０％緩衝ホルマリンに固定する。プラークアッセイによるウイルス力価の分析用にさらなる断片を採取する。固定した組織をパラフィン包埋し、３ミクロンの薄片に切り、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡法によって調べ、盲検的にスコア化する。Ｈ＆Ｅ結果により示唆される場合、組織をウイルス特異的又はリンパ球特異的（例えばＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞）ｍＡｂで免疫染色し、ウイルス抗原発現及び／又はリンパ球浸潤のレベルをスコア化する。
【０３０２】
鼻洗浄液はまた、Ｇ特異的ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡを使用して、粘膜抗体反応についてもアッセイする。また、０日目、７日目、１４日目、及び２１日目に血清及び全血も採取し、抗体反応及び／又は細胞媒介性免疫応答を計測する。残りのイヌ（各群４匹）は免疫後２１日目に狂犬病で攻撃する。
【０３０３】
局所免疫。免疫応答の誘導部位により免疫応答の性質が変わり、防御有効性に著しい影響が及び得る。粘膜免疫は、一致型の攻撃及び異種亜型の攻撃の両方を防御するインフルエンザ特異的粘膜ＩｇＡ及びＩｇＧ応答を誘導することが示されている。鼻腔内ＰＩＶ５免疫は、狂犬病攻撃に対する防御を媒介する局所的な狂犬病特異的Ｔ細胞及び免疫グロブリン応答を誘導する潜在力を有する。鼻洗浄液及び肺の分析により（安楽死当日）、局所的（すなわち肺）ＰＩＶ５特異的及び狂犬病特異的免疫応答を評価する。遠心によって浸潤性リンパ球集合を採取し、粘膜ＩｇについてＢＡＬ洗浄液を分析する。
【０３０４】
細胞媒介性免疫（Ｔ細胞）分析  ワクチン接種により誘導されたＴ細胞応答及び攻撃後のＴ細胞応答の変化を、抗原特異的ＩＦＮ産生によって計測する。具体的には、末梢血、ＢＡＬ、脾臓及び／又は流入領域リンパ節由来のリンパ球を、不活化狂犬病ウイルスで再刺激することにより、狂犬病特異的Ｔ細胞応答についてアッセイする。細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＡ、及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＩＦＮ−γ応答を決定する。
【０３０５】
体液性免疫（抗体）分析  血清、鼻洗浄液、及びＢＡＬ洗浄液中における狂犬病特異的体液性免疫応答を、プレート結合抗原としての精製狂犬病ウイルスを使用する標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって計測する。ＩｇＡ及びＩｇＧの両方を、イヌアイソタイプ特異抗体を使用して評価する。Ｇ特異的抗体力価もまた、ウイルスマイクロ中和アッセイによって計測する。全ての血清及びＢＡＬ洗浄液試料を、対応する免疫前試料又は偽免疫試料と比較する。
【０３０６】
細胞培養物及びイヌの両方で組換えＰＩＶ５−Ｇの安定性を試験する。細胞培養物では、ウイルスをＶｅｒｏ細胞において少なくとも２０代にわたり連続継代する。継代毎にウイルスを回収し、−８０Ｃで保存する。イヌでは、ウイルスを経口経路によって１０代にわたり連続継代する。隔日で６日間にわたり口腔からウイルスを単離する。回収又は単離したウイルスは、挿入したＧ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに使用して、導入遺伝子がなお組換えウイルスのゲノムにあることを確かめる。鼻洗浄液中に、生ウイルスを単離するのに不十分なウイルスしかない場合、鼻洗浄液を使用して、直接ＲＴ−ＰＣＲ配列決定用のウイルスＲＮＡを得る。
【０３０７】
狂犬病攻撃に対するＰＩＶ５−Ｇの有効性の調査。攻撃実験は、ＢＳＬ３ＡＧ＋  封じ込め下で実施する。上記のとおり免疫したイヌに、メキシコ犬から単離した５００マウス脳内ＬＤ５０（ＭＩＣＬＤ５０）の街上狂犬病ウイルスをＩＣ接種する。活動、体重減少、及び体温（植込み型マイクロチップを使用）を含めた臨床症状、並びに生存について、イヌを４５日間モニタする。１４日目、生存している動物を出血させ、狂犬病特異的血清抗体をアッセイする。攻撃後４５日目、本発明者らはイヌを犠牲にし、イヌから組織を採取する。本発明者らは、ルーチンの病理検査に加え、イヌの脳に狂犬病ウイルスが存在するかどうかを決定する。
【０３０８】
イヌにおいて狂犬病ウイルスを単回注射すると、１４日以内に死亡した。従って、費用節約のため、イヌを攻撃後４５日間観察する。このワクチン候補は、マウスにおいて、市販の狂犬病ワクチン（弱毒生）であるＳＡＧ−２より優れていたため、このワクチンがイヌにおいても実にＳＡＧ−２より優れていることが予想される。ＩＮ及びＩＭ接種は、マウスにおいて極めてロバストな狂犬病攻撃に対し１００パーセントの防御を提供したため、イヌのＩＮ及びＩＭ接種は優れた防御をもたらすことが予想される。しかしながら、経口接種については、防御は、ＳＡＧ−２よりは優れているにしても、理想未満（５０％未満）となり得る可能性がある。その場合、特定の目標２及び目標３から、より新しい候補を試験する。
【０３０９】
Ｇを発現する組換えＰＩＶ５の有効性を向上させる。ＰＩＶ５ゲノム内における抗原の挿入部位は、動物におけるワクチン候補の免疫原性に影響を及ぼした。ＨＮとＬとの接合部に外来遺伝子の挿入を有する野生型ＰＩＶ５ゲノムを含む基本モデルが十分に機能したことは、有望である。狂犬病ウイルスのＧ遺伝子は、ＨＮとＬとの遺伝子間に挿入されている。ｒＰＩＶ５−Ｇは単一用量の１０６ｐｆｕ接種で１００パーセント防御したが、ＩＭで１００パーセント防御するには１０８ｐｆｕが必要で、１０８ｐｆｕ経口接種は５０％のマウスを防御したに過ぎなかった（実施例４を参照）。ＩＮ及びＩＭ送達の有効性が高まると、有効なワクチン接種に必要なウイルスの量が低下し、従ってＩＮ及びＩＭワクチン接種の費用が低下し得る。経口接種の有効性が高まると、野生動物におけるワクチン候補の適用が促進され得る。ＧをＰＩＶ５ゲノム内の他の位置に挿入し、それらの有効性をマウス及びイヌで試験する。ＰＩＶ５に対する修飾は、抗原に対する免疫応答を増強させることができ、ＰＩＶ５のゲノムを修飾して、Ｇタンパク質に対する最大免疫を得る。
【０３１０】
ＳＨとＨＮとの間にＧを発現させる。ＳＨとＨＮとの間へのＨＡの挿入が、Ｈ５Ｎ１に対して最良の免疫をもたらすことが分かっている。同じ位置にＧを発現する組換えＰＩＶ５を作成し（図４８）（ｒＰＩＶ５−Ｇ−ＳＨ／ＨＮ）、マウス及びイヌにおいてその有効性を試験する。ＳＨが欠失したＰＩＶ５におけるＧの発現  ＳＨを欠失させると、外来遺伝子に対する免疫が増加することが分かっている。ＳＨをＧで置換し、これによりＳＨを欠失させるとともにＨＮの上流にＧ遺伝子を置き（図４８）、組織培養細胞でウイルスを分析し、マウスにおけるその免疫原性を調べ、マウス及びイヌにおけるその有効性を試験する。
【０３１１】
ＩＦＮ発現を誘導し、且つＩＦＮシグナル伝達を遮断する突然変異を組み込む。ＩＦＮ発現などの自然免疫応答の活性化は、適応免疫応答を増強させることが分かっている。弱毒生ウイルスにとって、これは両刃の剣である。多くの生ウイルスがロバストなＩＦＮ発現を誘導することができるが、次にはＩＦＮのこの誘導が、生ウイルスの複製を阻害する。ＰＩＶ５ＶΔＣの場合、ウイルスは、ＩＦＮ産生並びにＩＦＮシグナル伝達を阻害するＶが欠損しているため、より高度なＩＦＮ及びＩＬ−６発現を誘導する。ＩＦＮ産生の誘導を可能にしながらも、なおＩＦＮシグナル伝達を遮断してその効率的な複製を可能にするその能力を維持するウイルスが、理想的である。ウイルス遺伝子発現を増強し、且つＩ型インターフェロンなどのサイトカインの発現を誘導する能力を有するＰＩＶ５タンパク質内の残基が同定されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏｓ  Ｐａｔｈｏｇ；５（７）：ｅ１０００５２５）。ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ１５７の残基は、宿主キナーゼＰＬＫ１に対する結合部位であり、ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ３０８の残基は、ＰＬＫ１のリン酸化部位である。Ｓ１５７又はＳ３０８をアミノ酸残基Ａに突然変異させると、ウイルスはウイルス遺伝子の発現並びにインターフェロン発現の誘導を増加させる。最も重要なことに、ウイルスは、ＩＦＮシグナル伝達を遮断するＶタンパク質をなお発現する。Ｇ又はＮを発現する組換えＰＩＶ５を作成し（図４８）、マウス及びイヌにおいて狂犬病攻撃に対するそれらの免疫原性及び有効性を調べる。Ｇを使用して、抗体反応に対するＰ−Ｓ３０８Ａの効果を試験し、Ｎを使用して、細胞媒介性応答に対するＰ−Ｓ３０８Ａの効果を試験する。狂犬病ウイルス抗原に対するより強力な免疫応答を誘発するのにＰ−Ｓ３０８Ａが有効である場合、Ｐ−Ｓ３０８Ａ及びΔＳＨの突然変異を組み合わせる。これらの組換えウイルスを、安全性及び免疫原性について上記に記載したとおりマウス及びイヌで試験する。
【０３１２】
これらのワクチン候補の有効性を、初めにマウスで試験する。次に、ｒＰＩＶ５−Ｇより優れた防御を提供するものをイヌで試験する。マウスにおいてｒＰＩＶ５−Ｇより優れていると見なすには、候補は、ＩＮ及びＩＭによってｒＰＩＶ５−Ｇより低用量で１００パーセントの防御率を有し、及び／又は経口接種によって５０パーセントより高い防御率を有する。
【０３１３】
他の狂犬病ウイルスタンパク質の免疫を試験する。狂犬病攻撃に対して防御免疫を生じさせるのにＧは十分であるが、狂犬病ウイルスＮタンパク質もまた、防御免疫を生じさせることが知られている。ＰＩＶ５ベースの狂犬病ワクチン候補の有効性をさらに向上させるため、Ｎ及びＭなどのさらなる狂犬病ウイルスタンパク質を発現する組換えＰＩＶ５を構築して試験する（図４８）。Ｍは、ウイルス集合及び出芽に重要であることが知られている。Ｇ、Ｎ及びＭが全て同時に発現することができる場合、ｒＰＩＶ５−Ｇ−Ｎ−Ｍ感染細胞において狂犬病ウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作成する。
【０３１４】
Ｎを発現する組換えＰＩＶ５を作成及び試験する。狂犬病のＮは免疫原性であり、免疫が防御性であり得ることが分かっている。ＨＮとＬとの間の接合部はリーダー配列から最も離れており、従って、ＰＩＶ５複製に対する有害効果を有する可能性が最小であるため、初めに、ＮをＰＩＶ５のＨＮとＬとの間に挿入する。次にＮを、ＺＬ４６のように、ＳＨとＨＮとの間の接合部に移す（図４８）。これらのワクチン候補の有効性をマウスにおいて初めに単独で、並びにｒＰＩＶ５−Ｇとの組み合わせで試験する。ｒＰＩＶ５−ＮとｒＰＩＶ５−Ｇとの組み合わせがｒＰＩＶ５−Ｇ単独と比べて任意の防御を提供する場合、それをイヌで試験する。
【０３１５】
Ｍを発現する組換えＰＩＶ５を作成及び試験する。ＮＡ及びＮＰを発現するウイルスベクターはインフルエンザウイルスワクチンの開発に成功しておらず、ＮＡ及びＮＰはウイルスベクターベースのワクチン手法に理想的な抗原ではないという仮説が導かれる。しかしながら、ＮＡ及びＮＰは、ＰＩＶ５から発現するとき、能力がある抗原である。従って、ＰＩＶ５を使用して、これまで良好な抗原であるとは知られていなかった抗原に対する免疫を発生させることができる。狂犬病に対する免疫へのＭの効果は試験されていない。抗原としてのＭの潜在力を、ＰＩＶ５ベースのワクチンにおいて試験する。Ｎと同様に、ＭをＨＮとＬとの間に挿入し、次にＳＨとＨＮとの間にＭを発現する別の組換えＰＩＶ５（図４８）。これらのワクチン候補の有効性をマウスにおいて初めに単独で、並びにｒＰＩＶ５−Ｇとの組み合わせで試験する。ｒＰＩＶ５−ＭとｒＰＩＶ５−Ｇとの組み合わせがｒＰＩＶ５−Ｇ単独より優れた防御を提供する場合、それをイヌで試験する。ｒＰＩＶ５−Ｇ、ｒＰＩＶ５−Ｎ及びｒＰＩＶ５−Ｍの組み合わせの有効性をマウスで試験し、次にイヌで試験する。Ｇ及びＮ、及び／又はＭを発現する組換えＰＩＶ５を作成及び試験する。Ｇ及びＮを発現する組換えＰＩＶ５を作成する（図４８）。ｓＰＩＶ５−Ｍが狂犬病攻撃に対する免疫を提供する場合、Ｍを挿入する（図４８）。
【０３１６】
［実施例１１］
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対するワクチンとしてのＰＩＶ５
結核（ＴＢ）の病原因子である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）は、毎年約１４０万人が死亡し、世界人口の３分の１が感染している細胞内細菌性病原体である。１世紀以上にわたる研究及び臨床使用の結果から、生ワクチンがＭｔｂによるエアロゾル感染に対して最良の防御を提供することが示されている。今日使用されているなかで最も広く投与されているワクチンはＢＣＧであり、ＢＣＧは、反芻動物において結核を引き起こす近縁種、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の弱毒生変異体である。ＢＣＧワクチンは、世界のほとんどの国で出生時に皮下投与されるが、防御は一定せず、青年期までに減弱する。免疫抑制者に対するＢＣＧ投与は播種し、重篤な生命を脅かす感染をもたらし得る。この固有の安全性リスクは、Ｍｔｂ抗原及び／又は宿主細胞内部での生存率が高い細菌を浸透させる因子を発現するように修飾された第二世代ＢＣＧワクチンにも依然として残る。加えて、ＢＣＧワクチン接種に対する免疫応答は、世界で最も広く用いられているＴＢ検査であるツベルクリン皮膚検査と交差反応するため、結果が信頼できないものとなる。このような理由で、米国及びカナダの公衆衛生局はＢＣＧワクチンの使用を推奨していない。従って、安全でより有効なＴＢワクチンが必要とされている。この例では、パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）をベースとする新規ＴＢワクチンを開発する。
【０３１７】
Ｍｔｂに対するワクチンとしてＰＩＶ５を試験する。ＰＩＶ５は呼吸器ウイルスであるため、非経口経路によって導入されるワクシニアウイルスなどの他のウイルスベクターと比べ、Ｍｔｂ（呼吸器病原体）に対して優れた局所的免疫を提供し得る。これはまた、細菌性抗原を発現させるためにＰＩＶ５を使用する初めての例でもある。
【０３１８】
この例は、以下の目標を含む。１、Ｍｔｂ抗原８５Ａ（ｒＰＩＶ５ＰＩＶ５−８５Ａ）及び８５Ｂ（ｒＰＩＶ５ＰＩＶ５−８５Ｂ）を発現する組換えＰＩＶ５を作成及び分析する。ＰＩＶ５は、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスである。そのゲノムを直接操作することは不可能である。従って、逆遺伝学系を開発し、ここではそのＲＮＡゲノム全体のｃＤＮＡをクローニングすることにより、ＲＮＡゲノムが操作を受け易いようにした。この系は、インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を含めた、様々な外来遺伝子を発現する感染性ＰＩＶ５の作成に使用されている。この目標では、Ｍｔｂ抗原を発現する組換えウイルスを作成し、マウスモデルで調べたこれらの組換えウイルスの安全性プロファイルを確認する。２、組換えウイルスの免疫原性及び有効性をインビボで評価する。ワクチン接種マウスにおいて組換えウイルスの免疫原性を調べる。マウスにおいてロバストな免疫応答を生じさせるウイルスの防御有効性を、Ｍｔｂエアロゾル攻撃によって評価する。マウスエアロゾル感染モデルは、後続のモルモット及び／又は非ヒト霊長類での試験に先行して新規ワクチンの効力、安全性、免疫応答性及び有効性を決定するための第一選択の試験モデルとして認められている。
【０３１９】
約１世紀前に開発された、弱毒化した種類のウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）であるＢＣＧワクチンは、結核（ＴＢ）に対する新生児のワクチン接種に日常的に使用されている。これは、ほとんどの国において比較的安全で容易に利用可能なものとして、世界中の公衆衛生当局により認められている。ＢＣＧによる免疫化は、乳児及び低年齢小児において最も有益であるように見え、重篤な播種型のＴＢの発生を抑える。しかしながら、対照試験では、成人においてより有病率の高い肺型の疾患に対して、ＢＣＧが提供する防御レベルは一定しないことが立証されている。さらに、ＢＣＧワクチン接種は、世界で最もＴＢに見舞われている地域において有効性が最小であるものと見られ、世界的なＴＢの蔓延に対して確かな影響を及ぼしていない。世界的なＴＢの推定新規症例数及び一人当たりの発生率は、毎年上昇し続けている。米国でのＴＢ発生率はもはや上昇していないが、この疾患は、免疫抑制者集団及び多くの都市において、特に移民の間で、依然として重大な問題である。米国では、他の国と同様に、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）の多剤耐性株の蔓延が、現行のＴＢを制御しようとする取り組みの有効性を脅かしている。ＴＢの世界的蔓延を制御下に置くための一番の期待は、新規の有効なＴＢワクチンの開発である。この差し迫った必要性のため、世界的に研究努力が進められており、多数の候補ワクチンが調査されている。いくつかの候補ワクチン（抗原８５Ｂを過剰発現する組換えＢＣＧ（Ａｇ８５Ｂ）、Ａｇ８５Ａを過剰発現する改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ−８５Ａ）、アジュバントと組み合わされた、２つの他の抗原を含む融合ペプチド（名称７２ｆ）、Ａｇ８５Ｂ及びＥＳＡＴ−６を含む別のアジュバント含有融合タンパク質、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のリステリオリシンＯを発現する組換えＢＣＧを含む）は、第Ｉ相又は第ＩＩ相臨床試験中である。３つの一般的な形態のワクチン：弱毒生、死菌又は「サブユニット」、及びＤＮＡワクチンの中では、生ワクチンが、それが免疫抑制者を含めたあらゆる被接種者にとって確実に安全である限り、ＴＢに対して最も強力で、最も耐久性のある防御を提供すると考えられる。
【０３２０】
抗原８５複合体（Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂ）の分泌タンパク質成分は、様々なＴＢワクチン送達系について最もよく試験されているＭｔｂ抗原の一部である。これらのタンパク質は、体液性及び細胞媒介性（ＣＤ４及びＣＤ８）免疫応答の両方を含むヒト及び動物における自然感染の過程でＭｔｂ菌に感染することにより、及び動物モデルにおいて感染前ワクチンとして投与される場合に発現する。これらの抗原を発現する様々なワクチンコンストラクトが、マウス、モルモット、及びサルにおいて、非経口及びエアロゾル経路により投与したとき防御レベルをもたらすことが示されている。一つの特定のワクチン候補である、Ａｇ８５Ａを発現する生の組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）（ＭＶＡ．８５Ａ）は、小型脊椎動物モデルにおいてＢＣＧワクチン接種後に投与したとき、有意な防御を示している。これは、ヒトにおけるワクチン及び天然にプライムされる応答を増強し、現在、第２相臨床評価が進行中である。これらの研究から、肺の免疫化が、ワクチン送達媒体を貪食することにより肺において抗原提示細胞（主に肺胞マクロファージ）を標的化するため場所及び能力を利用することが実証された。同様に、この例のワクチンコンストラクトを、Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂを発現するそれらの能力について調べ、エアロゾル接種によって試験動物に投与する。
【０３２１】
実験計画
Ａｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂを発現するＰＩＶ５（ＰＩＶ５−８５Ａ又は８５Ｂ）を作成及び分析する。Ｍｔｂ  Ａｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂを発現する組換えＰＩＶ５（ＰＩＶ５−８５Ａ及びＰＩＶ５−８５Ｂ）を作成し、インビトロ及びインビボでのウイルス成長特性及び安全性を分析する。
【０３２２】
インビトロで、Ａｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂを発現する組換えＰＩＶ５を作成し、それらのウイルスを分析する。ＰＩＶ５のＨＮとＬとの遺伝子間にインフルエンザウイルス由来のＨ５遺伝子を挿入すると（ＰＩＶ５−Ｈ５）、マウスにおいて致死性Ｈ５Ｎ１攻撃に対する殺菌免疫が提供された（実施例３）。Ｍｔｂ  Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂを発現する組換えＰＩＶ５を作成するため、商業的な供給業者（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いてヒト細胞に最適化したコドン使用頻度で遺伝子を合成する。次にＭｔｂ遺伝子を、ＰＩＶ５のウイルスｍＲＮＡ合成にとって重要な遺伝子終了（ＧＥ）、遺伝子間領域（Ｉ）及び遺伝子開始（ＧＳ）と組み合わせる。これらの配列をＨＮとＬとの遺伝子間に挿入する。ＰＩＶ５−８５Ａ及びＰＩＶ５−８５Ｂを回収し、確認して、分析する。組換えウイルスのゲノム全体を配列決定し、入力ｃＤＮＡ配列と一致することを確認する。感染細胞におけるウイルスの成長動態、ウイルスタンパク質の発現レベル並びにＡｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂの発現レベル、並びに培養上清中での分泌レベルを調べる。
【０３２３】
ＰＩＶ５−８５Ａ又は８５Ｂの安全性を調べる。ワクチン候補ウイルスの高力価ストックをＶｅｒｏ細胞で成長させ、アリコートに分け、全てのインビボ研究で使用するため−８０℃で保存する。希釈後のウイルス力価をプラークアッセイによって確認してから保存し、ＰＩＶ５のＨＮは細胞表面上のシアル酸残基に結合するため、免疫時には、ＰＩＶ５を多くの細胞型に感染させる。ＰＩＶ５−８５Ａ又は８５Ｂが、ＰＩＶ５を超えて拡張したトロピズムを有するかどうかを調べるため、ヌードマウスにおけるＰＩＶ５−８５Ａ又は８５Ｂの分布をＰＩＶ５と比較する。ヌードマウスに、２００μｌ  ＰＢＳ中１０７ＰＦＵのＰＩＶ５−８５Ａ、８５Ｂ、ＰＩＶ５対照ウイルス又はＰＢＳ単独を尾静脈から注入する。マウスの体重を初めの７日間は毎日、次に３日毎に２週間モニタする。接種後０日目、３日目、７日目及び１４日目に各群から４匹のマウスを犠牲にする。脳、肺、肝臓、脾臓、心臓及び腎臓の半分を採取し、固定して、前出のとおりＨ＆Ｅ染色及び病理学的スコア化のため処理する。臓器の半分は、ＰＩＶ５抗体による免疫組織化学染色用に処理する。
【０３２４】
加えて、野生型マウスに、１０６ＰＦＵ  ＰＩＶ５親ウイルス（ＰＩＶ５）、ＰＩＶ５−８５Ａ又は８５Ｂ、又はＰＢＳを鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種する。免疫動物を臨床症状の任意の徴候（すなわち体重減少、立毛等）についてモニタする。加えて、肺ウイルス力価及び肺病理を調べ、様々な組換えウイルスが宿主を感染させるその能力を維持し、且つ肺病理を引き起こさないことを確認する。病理検査のため、肺を気管から１０％緩衝ホルマリンで灌流し、固定するためホルマリン中に置く。肺葉をパラフィン包埋し、５ミクロンに薄切りし、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、光学顕微鏡法によって調べる。各試料について、４つの主要な肺の変化（細気管支周囲浸潤；血管周囲浸潤；実質浸潤；胸膜下浸潤）を、治療群に関する知識なしに以下に従い、すなわち０＝変化なし及び３＝重大な変化として０〜３で主観的にスコア化し、総スコアを求める。Ｈ＆Ｅ結果が重大な炎症を示す場合、組織をウイルス特異的又はリンパ球特異的（例えばＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞）ｍＡｂで免疫染色し、ウイルス抗原発現及び／又はリンパ球浸潤レベルをスコア化する。
【０３２５】
インビボでの組換えウイルスの免疫原性及び有効性を評価する。この攻撃試験は、肺及び脾臓におけるＭｔｂ菌の対数ＣＦＵについてワクチン接種群をワクチン非接種（対照）群と比較して、一元配置分散分析により決定するように設計される。比較の陽性対照としてＢＣＧを使用する。有効なワクチンは、攻撃後４及び８週間目の肺及び脾臓におけるＭｔｂ菌のＣＦＵ数が減少する。
【０３２６】
ＰＩＶ５−８５Ａ又はＰＩＶ５−８５Ｂの免疫原性を調べる。ＰＩＶ５−８５Ａ又はＰＩＶ５−８５Ｂ免疫化マウスにおいて、様々なエンドポイントを使用してＰＩＶ５特異的及びＭｔｂ  Ａｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂ特異的免疫応答を計測する。対照として、マウスを１０６ＰＦＵのＰＩＶ５ワクチン株で鼻腔内免疫するか、或いは１０５  ＣＦＵのウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧデンマーク株（デンマーク国立血清学研究所（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ），Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ；ＳＳＩ）で皮下免疫する。ＳＳＩから、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧデンマーク株の凍結アリコートを入手する。これらのアリコート中のＢＣＧデンマークは、出荷前に正確な国際規格に成長させてアリコートに分けられ、生存率が決定されている。必要な数のアリコートを解凍した後、直ちにワクチン接種する。免疫後の様々な時間点で、ＰＩＶ５及びＡｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂに対する局所的及び全身性免疫を計測する。粘膜免疫は、Ｍｔｂ特異的粘膜ＩｇＡ及びＩｇＧ応答を誘導することが示されている。従って、鼻腔内ＰＩＶ５免疫は、Ｍｔｂ攻撃に対する防御を媒介する局所的Ｍｔｂ特異的Ｔ細胞及び免疫グロブリン応答を誘導する潜在力を有する。免疫後又は攻撃後の時間点で採取したＢＡＬ試料を分析することにより、局所的（すなわち肺）ＰＩＶ５特異的及びＭｔｂ特異的免疫応答を評価する。浸潤性リンパ球集団を遠心により採取し、粘膜免疫グロブリンについてＢＡＬ洗浄液を分析する。血清抗体及び脾臓又は縦隔リンパ節（ＭＬＮ）リンパ球集団を分析することにより、全身性応答を評価する。
【０３２７】
細胞媒介性免疫（Ｔ細胞）分析。ワクチン接種により誘導されたＴ細胞応答及び攻撃後のＴ細胞応答の変化を、抗原特異的ＩＦＮ産生によって計測する。具体的には、ＢＡＬ、脾臓及び／又は流入領域リンパ節からのリンパ球を、ＰＩＶ５、Ｍｔｂ  Ａｇ８５Ａ又はＡｇ８５Ｂタンパク質又はＰＰＤで再刺激することにより、ＰＩＶ５特異的又はＭｔｂ特異的Ｔ細胞応答についてアッセイする。細胞内サイトカイン染色及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＩＦＮ−γ応答を決定する。他の研究者は、実験的ＭＶＡ８５Ａワクチン（現在、第ＩＩ相臨床試験中）で免疫したマウスによるＩＦＮγ産生ＥＬＩＳＰＯＴを、ワクチン効力試験として利用できることを実証した（ＮＩＨ／ＦＤＡ  ＴＢ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）。
【０３２８】
体液性免疫（抗体）分析。抗体は、Ｍｔｂ免疫において決定的な役割を果たすことは知られていないが、それでもなお、ＰＩＶ５−８５Ａ及びＰＩＶ５−８５Ｂによるワクチン接種後の体液性免疫を調べる。ＰＩＶ５は、Ｍｔｂに対する新規ワクチンベクターである。ＰＩＶ５−８５Ａ及びＰＩＶ５−８５Ｂによって異なる及び／又は追加的な防御機構が用いられ得る可能性がある。体液性免疫試験のため、マウスから適合する正常な血清試料を採取し、１週間後、尾静脈の切り込みから免疫する。血清及びＢＡＬ洗浄液中の抗ＰＩＶ５抗体を、ＰＩＶ５特異的ＥＬＩＳＡにより計測する。同様に、Ｍｔｂ  Ａｇ８５Ａ−又はＡｇ８５Ｂ特異的体液性免疫応答を、プレート結合抗原として組換えＡｇ８５Ａ又は８５Ｂを使用して標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより計測する。ＥＬＩＳＡアッセイでは、適切な二次抗体を使用して、抗体のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）も決定する。全ての血清及びＢＡＬ洗浄液試料を、対応する免疫前試料と比較する。
【０３２９】
マウス攻撃モデルにおけるＰＩＶ５−８５Ａ／ＰＩＶ５−８５Ｂの有効性を調べる。鼻腔内ＰＩＶ５−８５Ａ及びＰＩＶ５−８５Ｂ、皮下ＢＣＧワクチン接種及びワクチン非接種マウス（２０匹の群）を５０〜１００ＣＦＵのＭｔｂで攻撃し、動物を最長８週間モニタする。病原性のあるＭｔｂエルドマン株は２００５年にＦＤＡによってバンクに登録されたもので、研究者に利用可能である。必要な数のアリコートを解凍した後、直ちに攻撃する。Ｍａｄｉｓｏｎエアロゾルチャンバーを使用して、全てのマウスをＭｔｂエルドマンに曝露させる。感染前、Ｍｔｂの単細胞培養物を、適切な感染用量が送達されるように予め設定された曝露サイクルでエアロゾルチャンバーネブライザージャーに入れる。計時された曝露期間後、感染チャンバーを清浄なろ過空気でパージし、マウス群を各自のケージに戻す。各感染サイクルの間、エアロゾル化したＭｔｂ菌を運ぶ空気流を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が入った全ガラスインピンジャーにサンプリングし、各群に送達された実感染用量（ＣＦＵ）を計算する。各インピンジャーからの１００μｌのＰＢＳ（無希釈、ＰＢＳ中１０分の１希釈、１００分の１希釈及び１０００分の１希釈）を７Ｈ１１−ＯＡＤＣ寒天プレートに４つのレプリケートで接種し、３７℃で最長６週間インキュベートする。加えて、Ｍａｄｉｓｏｎエアロゾルチャンバーを攻撃に利用する毎に、攻撃翌日に５匹のワクチン非接種マウスを犠牲にし、Ｍｔｂの実曝露用量が肺において５０〜１００ＣＦＵであることを確認する。各群につき最長８週間、動物の生存曲線を決定し、攻撃後４週間目及び８週間目に組織病理／細菌負荷を評価する。全てのマウスは、ワクチン接種経路に関わらず、最初の１週間は毎日倦怠についてモニタする；体温もまた、感染の最初の１週間にわたり計測する。全てのマウスを毎週計量し、食欲不振又は体重に影響を及ぼし得る他の有害な反応を検出する。皮下ＢＣＧ注射マウスは、初めに毎日、次に毎週、その注射部位を目視で調べる。上気道ワクチン反応原性をモニタするためのスコア化システムを使用して、各鼻腔内ワクチン接種マウスの定量的スコアを求める。スコア化システムの要素は、以下である：外鼻孔の目に見える炎症（０〜３）、ない、やや漿液性、著しく漿液性、やや粘液膿性、又は著しく粘液膿性として特徴付けられる鼻汁（０〜４）、及びマウスの鼻詰まりを反映する指標として有効とされている呼吸数（０〜３）。攻撃後４週間目、各実験群から１０匹のマウス（群の半数）を犠牲にし、残りの半数は攻撃後８週間目に犠牲にする。安楽死後、肺、肝臓、脾臓、及び鼻組織を含む組織を採取し、異なる実験に割り当てる。規定のスコア化システムを使用して、獣医学病理学者が肉眼的及び顕微鏡的組織病理検査を行う。臨床所見及び病理検査に関して先述したスコア化システムもまた用いて、定量的計測値を得る。これらの計測値の各々を、群間の有意差についてスチューデントｔ検定により比較する。
【０３３０】
［実施例１２］
さらなるＰＩＶ５抗原コンストラクト
図４９Ａ〜図４９Ｈに示す以下のさらなるＰＩＶ５抗原コンストラクトが作製されている。これには、ＲＳＶ抗原Ｆ及びＧを発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ａ）、ニパウイルス抗原Ｆ及びＧを発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｂ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原８５Ａ、８５Ｂ及びＥＳＡＴ６を発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｃ）、ＰＲＲＳＶ抗原を発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｄ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）抗原を発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｅ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．Ｃｒｕｚｉ）抗原Ｔｓを発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｆ）、ノロウイルス抗原を発現するＰＩＶ５コンストラクト（図４９Ｇ）、及びＨＩＶ抗原Ｅｎｖを発現するＰＩＶ５コンストラクト（ｇｐ１６０、ｇｐ１４０又はｇｐ１２０及びＧａｇ）（図４９Ｈ）が含まれる。
【０３３１】
［実施例１３］
さらなるＰＩＶ５ベクター
この例では、全て市販のケンネルコフワクチンを入手し、それらのＰＩＶ５株を配列決定した。以下の市販のケンネルコフワクチンから分離したＰＩＶ５株を配列決定した：ＢＩ、ＦＤ、Ｍｅｒｃｋ及びＭｅｒｉａｌワクチン。また、ＡＴＣＣに寄託された２つのＰＩＶ５分離株、すなわちイヌパラインフルエンザウイルス株７８−２３８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５７３）（Ｅｖｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ；１７７：１１３２−１１３４；及びＥｖｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ；６８：１６５−１７２）及びイヌパラインフルエンザウイルス株Ｄ００８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３９９）（Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ；１２６：１４０−１４５）も配列決定した。表２においてヌクレオチド配列を比較する。これは、市販の実験室株（ＷＲ株）及びケンネルコフワクチン株及び野生型分離株（ＡＴＣＣから入手した２つの株によって代表される）の間の初めての配列比較である。
【表２】
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【０３３２】
現行のケンネルコフワクチン由来のＰＩＶ５株及びＡＴＴＣ寄託株に基づき、ＰＩＶ５コンストラクトを作成して試験する。興味深いことに、ワクチン株の一つ（Ｍｅｒｉａｌ）は、野生型分離株の一つ（Ｄ００８）とほぼ同じであり（９９．９％ゲノム配列同一性）、人は飼い犬のワクチン接種を介して野生型ＰＩＶ５に曝露されている可能性が高いことが示唆される。それでもなお、安全性に関する潜在的な懸念を軽減するため、ケンネルコフワクチン株ベースの組換えＰＩＶ５コンストラクトを作成する。Ｍｅｒｃｋワクチン株は本発明者らのＰＩＶ５株と最も異なり（９８．９％同一性）、且つイヌにおいて広く使用されているため、初めに、Ｍｅｒｃｋワクチン株をワクチンコンストラクトのベースとして使用する。Ｍｅｒｃｋ株の逆遺伝学系を作成し、ゲノムにＨ５又はＮＰを挿入する。ＰＩＶ５−Ｈ５とＭｅｒｃｋ−Ｈ５及びＰＩＶ５−ＮＰとＭｅｒｃｋ−ＮＰとの免疫原性を、マウス及びフェレットにおいて比較する。以後の研究では、表２に掲載される株のいずれか及び本明細書に記載されるワクチン抗原コンストラクトのいずれかを利用する。
【０３３３】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物の完全な開示、並びに電子的に利用可能な資料（例えば、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列提出物、並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢのアミノ酸配列提出物、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑのアノテートされたコード領域からの翻訳を含む）は、参照によって援用される。本願の開示と参照により本明細書に援用される任意の文献の開示との間に何らか矛盾がある場合、本願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明及び例は、理解を明確にするために提供されているに過ぎない。そこから不必要な限定が理解されてはならない。当業者に明らかな変形例が、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれるため、本発明は、図示及び説明される正確な詳細に限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図４９Ｅ】
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【図４９Ｆ】
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【図４９Ｇ】
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【図４９Ｈ】
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【配列表】
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