(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト補体成分Ｃ６に結合する単離されたモノクローナル抗体ならびに関連する抗体系組成物および分子の提供。また、該抗体を使用するための治療的方法の提供。【解決手段】ヒトＣ６に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、以下の特性：（ａ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、（ｂ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−８Ｍ以下のＫＤを有すること、（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、および（ｄ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、のうちの少なくとも３つを呈する、抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣ６に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、以下の特性：
（ａ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−８Ｍ以下のＫＤを有すること、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、および
（ｄ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、のうちの少なくとも３つを呈する、抗体。
【請求項２】
配列番号５２の残基８３５〜８５４の全てまたは一部を含有するヒトＣ６の領域に結合する、単離された抗体。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むエピトープに結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むエピトープに結合し、前記エピトープが不連続である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ヒトＣ６への結合について、配列番号５に示される重鎖可変領域および配列番号１０に示される軽鎖可変領域を含む抗体と交差競合する、単離された抗体。
【請求項６】
ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
それぞれ配列番号６、７、および８に示される重鎖ＣＤＲ１、２、および３配列を含み、それぞれ配列番号１１、１２、および１３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２、および３配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体である、請求項７に記載の単離された抗体。
【請求項９】
ヒトＣ６に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号８に示される重鎖ＣＤＲ３と配列番号１３に示される軽鎖ＣＤＲ３とを含む、抗体。
【請求項１０】
配列番号７に示される重鎖ＣＤＲ２と配列番号１２に示される軽鎖ＣＤＲ２とを更に含む、請求項９に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
配列番号６に示される重鎖ＣＤＲ１と配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ１とを更に含む、請求項１０に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
（ａ）配列番号３０の重鎖可変領域と配列番号３１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｂ）配列番号３２の重鎖可変領域と配列番号３３の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｃ）配列番号３４の重鎖可変領域と配列番号３５の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｄ）配列番号３６の重鎖可変領域と配列番号３７の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｅ）配列番号３８の重鎖可変領域と配列番号３９の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｆ）配列番号４０の重鎖可変領域と配列番号４１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｇ）配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域とを含む抗体、および
（ｈ）配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４５の軽鎖可変領域とを含む抗体、からなる群から選択される、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣ６に結合する単離された抗体。
【請求項１４】
（ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記軽鎖可変領域が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
（ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記軽鎖可変領域が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
（ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記軽鎖可変領域が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項において特許請求される、ヒトＣ６に結合する抗体の軽鎖、重鎖、または軽鎖と重鎖との両方の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターによって形質転換された細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体と、担体と、を含む、組成物。
【請求項２０】
対象において膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成または活性を阻害する方法であって、前記対象に、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を、前記対象においてＭＡＣ形成または活性を阻害するのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項２１】
対象において補体系の望まれない活性によって媒介される障害の症状を治療、防止、または低減する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
対象において神経の再生を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
対象において損傷または変性した神経の回復を促進する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
対象において神経の変性を低減または遅延させる方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象が、前記神経の物理的傷害を患っている、請求項２２、２３、または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記物理的傷害が、外傷性傷害、外科的傷害、または非外傷性傷害である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記傷害が、末梢神経系（ＰＮＳ）に対するものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記傷害が、中枢神経系（ＣＮＳ）に対するものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、傷害部位にまたはその付近に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、免疫媒介性炎症性障害または進行性神経変性障害を患っている、請求項２２、２３、または２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害が後天性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が遺伝性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が慢性脱髄性神経障害である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記障害が神経変性障害である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０９４，６４９号に対する優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
補体系は、有機体からの病原体のクリアランスにおいて抗体および食細胞を支援または「補完」するように機能する自然免疫系の一部である。この系が活性化されると、触媒的な一連の反応および相互作用が生じ、これが、破壊のための活性化細胞、有機体、または粒子の標的化をもたらす。補体系は、調節されたカスケード系において共に作用して病原体（例えば、細菌）の細胞外形を攻撃する、３０個を超える血漿および膜タンパク質のセットを含む。補体系は、膜侵襲経路として知られる共通の終末非酵素的経路で合流する、古典的経路および代替経路という２つの明確に異なる酵素的活性化カスケードを含む。
【０００３】
古典的経路として知られる第１の酵素的に活性化されたカスケードは、いくつかの成分Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ５（経路中の順番で列挙）を含む。補体系の古典的経路の始動は、免疫活性因子および非免疫活性因子の両方による第１の補体成分（Ｃ１）の結合および活性化に続いて起こる。Ｃ１は、成分Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓのカルシウム依存性複合体を含み、Ｃ１ｑ成分の結合を介して活性化される。Ｃ１ｑは、６つの同一サブユニットを含有し、各サブユニットは、３つの鎖（Ａ鎖、Ｂ鎖、およびＣ鎖）を含む。各鎖は、コラーゲン様の尾部に接続する球状頭部領域を有する。抗原−抗体複合体によるＣ１ｑの結合および活性化は、Ｃ１ｑ頭部群領域を介して起こる。タンパク質、脂質、および核酸を含む多数の非抗体Ｃ１ｑ活性剤は、コラーゲン様の茎領域にある固有の部位を介してＣ１ｑに結合し、それを活性化する。Ｃ１ｑｒｓ複合体はその後、補体成分Ｃ４およびＣ２の活性化を触媒し、Ｃ３転換酵素として機能するＣ４ｂ２ａ複合体を形成する。
【０００４】
代替経路として知られる第２の酵素的に活性化されたカスケードは、補体系活性化および増幅のための急速な抗体依存性経路である。代替経路は、いくつかの成分Ｃ３、Ｂ因子、およびＤ因子（経路中の順番で列挙）を含む。代替経路の活性化は、Ｃ３のタンパク質分解性に切断された形態であるＣ３ｂが細菌などの活性化表面媒介物に結合されるときに起こる。Ｂ因子はその後、Ｃ３ｂに結合され、Ｄ因子によって切断されて、活性酵素Ｂａを生む。次に酵素Ｂａは、より多くのＣ３を切断してより多くのＣ３ｂを生成し、活性化表面上にＣ３ｂ−Ｂａ複合体の広範な沈着をもたらす。
【０００５】
このように、古典的補体経路と代替的補体経路との両方が、Ｃ３因子をＣ３ａとＣ３ｂとに分割するＣ３転換酵素を産生する。この時点で、両Ｃ３転換酵素は更に、集合してＣ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂおよびＣ３ｂ３ｂＢｂ）となる。これらの複合体は、続いて補体成分Ｃ５を切断し、Ｃ５ａポリペプチド（９ｋＤａ）およびＣ５ｂポリペプチド（１７０ｋＤａ）という２つの成分にする。Ｃ５ａポリペプチドは、元来は白血球と関連付けられ、現在は肝細胞および神経細胞を含む様々な組織上で発現されることが知られている７回膜貫通Ｇタンパク質タンパク質共役受容体に結合する。Ｃ５ａ分子は、ヒト補体系の主要な走化性成分であり、白血球走化性、平滑筋収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球−内皮接着、サイトカインおよび脂質メディエータ放出、ならびにオキシダント形成を含む様々な生体応答を誘発し得る。
【０００６】
より大きいＣ５ｂ断片は、補体カスケードのより後の成分Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９に順に結合して、Ｃ５ｂ−９膜侵襲複合体（「ＭＡＣ」）を形成する。この親油性のＣ５ｂ−９ＭＡＣは、赤血球を直接的に溶解させ得、より高い量では、白血球の溶解を起こし、筋、上皮細胞、および内皮細胞などの組織に有害である。溶解量を下回る量では、Ｃ５ｂ−９  ＭＡＣは、接着分子の上方調節、細胞内カルシウム増加、およびサイトカイン放出を刺激し得る。加えて、溶解濃度を下回る濃度では、Ｃ５ｂ−９  ＭＡＣは、細胞溶解を引き起こさずに内皮細胞などの細胞および血小板を刺激し得る。Ｃ５ａの非溶解効果およびＣ５ｂ−９  ＭＡＣは、同等かつ互換的である。
【０００７】
補体系は健康維持に重要な役割を有するが、疾患を引き起こすかそれに寄与する可能性を有する。例えば、研究により、補体カスケードの阻害または補体成分の枯渇が、中枢神経系の神経変性疾患において、または実験的脳傷害において損傷を低減させることが示されている（例えば、Ｆｅａｓｂｙ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４１９：９７−１０３、Ｖｒｉｅｓｅｎｄｏｒｐ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５８：１５７−１６５、Ｊｕｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２００：１６７−１７０、Ｄａｉｌｅｙ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：６７１３−６７２２、Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：１４０７−１４１７、Ｌｅｉｎｈａｓｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＢＭＳ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：７：５５を参照）。具体的には、Ｃ６を欠乏しているために膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成することができないラットは、脱髄または軸索損傷のいずれも呈さず、マッチしたＣ６充足ラットと比較したときに多発性硬化症についての抗体媒介性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における有意に低減した臨床スコアを呈する（Ｍｅａｄ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：４５８−４６５）。しかしながら、単核細胞浸潤のレベルは、Ｃ６充足マウスに見られるレベルと同等であった。Ｍｅａｄら（２００２）は、脱髄および軸索損傷が、抗体の存在下で起こり、Ｃ６の欠乏によって阻害することができるＭＡＣ沈着を含む補体カスケード全体の活性化を必要とすると結論付けた。
【０００８】
したがって、Ｃ６を阻害するための試薬が必要であり、様々な治療目的に望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成がインビトロおよびインビボの両方で阻害されるようにＣ６の機能活性を効果的に阻害する能力、ならびに非常に低いＫＤ（例えば、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ以下）、および非常に長い半減期（例えば、４０時間以上）を含む、治療目的に望ましい機能特性を有する抗Ｃ６抗体を提供する。３８個の抗ヒトＣ６抗体のパネルを、精製したヒトＣ６  タンパク質によるラットの免疫付与によって生成した。これら３８個のうち２個が、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成の阻害を示した。これらの所望の機能特性を有する１個の特定のラット抗ヒトＣ６を成長させ（本明細書では７Ｅ５と称する）、ヒト化ｍＡｂである８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２を含む、７Ｅ５のＣＤＲを保持するヒト化抗体のパネルを調製した。これら８個のヒト化ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域、ならびにヒト化ｍＡｂ  ７Ｃ０２の重鎖可変領域およびヒト化ｍＡｂ  ７Ｇ０８の軽鎖可変領域は、８１個全ての可能性のある「ミックスアンドマッチ」コンビネーションにおいて発現され、８１個全ての対が、Ｃ６機能活性を効果的に阻害することが示された。更に、７Ｅ５のエピトープをヒトＣ６内でマッピングした。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、ヒトＣ６に結合する単離された抗体に関連し、本抗体は、以下の特性：
（ａ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−８Ｍ以下のＫＤを有すること、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、および
（ｄ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、のうちの少なくとも３つを呈する。
【００１１】
上記の特定のうちの少なくとも３つの任意の組み合わせが包含される。一実施形態では、本抗体は、特性（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を呈する。別の実施形態では、本抗体は、特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を呈する。他の実施形態では、本抗体は、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−９Ｍ以下または５×１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、配列番号５２の残基８３５〜８５４の全てまたは一部を含有するヒトＣ６の領域に結合する単離された抗体（即ち、本抗体は残基８３５〜８５４内の１つ以上の残基に結合する）に関連する。別の実施形態では、本抗体は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むエピトープに結合する（即ち、本抗体は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３内の１つ以上のアミノ酸残基に結合する）。ある特定の実施形態では、エピトープは、抗体によって認識される不連続エピトープの一部である。例えば、一実施形態では、本抗体は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むエピトープに結合し、このエピトープは不連続である。
【００１３】
更に別の実施形態では、本発明は、ヒトＣ６への結合について、配列番号５に示される重鎖可変領域および配列番号１０に示される軽鎖可変領域（即ち、ｍＡｂ  ７Ｅ５の重鎖および軽鎖可変領域）を含む抗体と交差競合する抗体を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、ヒトＣ６への結合について、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２からなる群から選択されるｍＡｂと交差競合する抗体を提供する。
【００１４】
様々な実施形態において、本発明の抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。
【００１５】
様々な実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ配列番号６、７、および８に示される重鎖ＣＤＲ１、２、および３配列を含み、それぞれ配列番号１１、１２、および１３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２、および３配列を含む。例えば、本抗体は、前述のＣＤＲを含むヒト化抗体であり得る。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ヒトＣ６に結合する単離された抗体を提供し、本抗体は、配列番号８に示される重鎖ＣＤＲ３と配列番号１３に示される軽鎖ＣＤＲ３とを含む。本抗体は、配列番号７に示される重鎖ＣＤＲ２と配列番号１２に示される軽鎖ＣＤＲ２とを更に含み得る。本抗体は、配列番号６に示される重鎖ＣＤＲ１と配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ１とを更に含み得る。前述のＣＤＲを含む抗体の代表例としては、
（ａ）配列番号３０の重鎖可変領域と配列番号３１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｂ）配列番号３２の重鎖可変領域と配列番号３３の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｃ）配列番号３４の重鎖可変領域と配列番号３５の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｄ）配列番号３６の重鎖可変領域と配列番号３７の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｅ）配列番号３８の重鎖可変領域と配列番号３９の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｆ）配列番号４０の重鎖可変領域と配列番号４１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｇ）配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域とを含む抗体、および
（ｈ）配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４５の軽鎖可変領域とを含む抗体、が挙げられる。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣ６に結合する単離された抗体を提供する。
【００１８】
他の実施形態では、この重鎖および軽鎖可変領域は、前述のアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。別の実施形態では、単離された抗体は、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。
【００１９】
本発明の抗体の軽鎖、重鎖、または軽鎖と重鎖との両方の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびかかる発現ベクターによって形質転換された宿主細胞、ならびに形質転換された宿主細胞を使用する抗体の組み換えによる発現方法も、本発明に包含される。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ断片として発現される。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域を持つものなどのＩｇＧ４アイソタイプ抗体などの全長抗体として発現される。
【００２０】
本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物などの、本発明の抗体を含む組成物も包含される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体を使用する方法に関連する。一実施形態では、本発明は、対象において膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成または活性を阻害する方法を提供し、本方法は、対象に、本発明の抗体を、対象においてＭＡＣ形成または活性を阻害するのに有効な量で投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象において補体系の望まれない活性によって媒介される障害の症状を治療、防止、または低減する方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、対象において神経を再生する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。更に別の実施形態では、本発明は、対象において損傷または変性した神経の回復を促進する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。更に別の実施形態では、本発明は、対象において神経の変性を低減または遅延させる方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【００２３】
一実施形態では、対象は、外傷性傷害（例えば、事故による）、外科的傷害、または非外傷性傷害（例えば、神経圧迫）などの神経の物理的傷害を患っている。一実施形態では、傷害は、末梢神経系（ＰＮＳ）に対するものである。別の実施形態では、傷害は、中枢神経系（ＣＮＳ）に対するものである。一実施形態では、抗体は、傷害部位にまたはその付近に投与される。
【００２４】
別の実施形態では、対象は、免疫媒介性炎症性障害または進行性神経変性障害を患っている。一実施形態では、障害は後天性である。別の実施形態では、障害は遺伝性である。一実施形態では、障害は、多発性硬化症（ＭＳ）などの慢性脱髄性神経障害である。別の実施形態では、障害は、重症筋無力症または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性障害である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】ヒトＣ６で免疫付与した２匹の異なるラット由来の３８のハイブリドーマからの上清を使用する溶血アッセイの結果を示す棒グラフであり、これは、上清１１（７Ｅ５  ｍＡｂを産生する）が最も強い阻害効果を有することを示す。
【図１Ｂ】ヒトＣ６で免疫付与した２匹の異なるラット由来の３８のハイブリドーマからの上清を使用するマンナン活性化補体ＥＬＩＳＡの結果を示す棒グラフであり、これは、上清１１（７Ｅ５  ｍＡｂを産生する）が最も強い阻害効果を有することを示す。
【図２】ヒトＣ６への組み換えラット７Ｅ５の結合についてのビアコア動態を示すグラフである。
【図３Ａ】２７Ｂ１  ｍＡｂと７Ｅ５  ｍＡｂとの間のエピトープ交差遮断実験についての結果を示すグラフであり、７Ｅ５が２７Ｂ１とは異なるエピトープを占有することを示す。
【図３Ｂ】２７Ｂ１  ｍＡｂと７Ｅ５  ｍＡｂとの間のエピトープ交差遮断実験についての結果を示すグラフであり、７Ｅ５が２７Ｂ１とは異なるエピトープを占有することを示す。
【図３Ｃ】２７Ｂ１  ｍＡｂと７Ｅ５  ｍＡｂとの間のエピトープ交差遮断実験についての結果を示すグラフであり、７Ｅ５が２７Ｂ１とは異なるエピトープを占有することを示す。
【図３Ｄ】２７Ｂ１  ｍＡｂと７Ｅ５  ｍＡｂとの間のエピトープ交差遮断実験についての結果を示すグラフであり、７Ｅ５が２７Ｂ１とは異なるエピトープを占有することを示す。
【図４Ａ】ペプチド４１８の場所を示す、ヒトＣ６部分アミノ酸配列（配列番号５０）およびラットＣ６部分アミノ酸配列（配列番号５１）の整列である。
【図４Ｂ】ペプチド４１８の場所を示す、ヒトＣ６タンパク質の模式図である。
【図５】溶血アッセイによって測定して、７Ｅ５がヒトＣ６を補充したＣ６欠乏ラットにおいてインビボでＣ６を遮断することを示す棒グラフである。ラットは指示量のヒトＣ６および抗体７Ｅ５を受けた。補体活性をＹ軸上にプロットし、Ｏ．Ｄ．１．０は感作赤血球の最大溶解を示し、Ｏ．Ｄ．０は溶解の不在を示す。
【図６Ａ】ラット抗Ｃ５  ７Ｅ５  ｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）とヒトＶＨ３＿１生殖細胞系列（配列番号４８）との整列であり、差異を示す。ヒト化を目的とするアミノ酸交換を整列の下に示す。
【図６Ｂ】ラット抗Ｃ５  ７Ｅ５  ｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）とヒトＶｋ２＿５生殖細胞系列（配列番号４９）との整列であり、差異を示す。ヒト化を目的とするアミノ酸交換を整列の下に示す。
【図７Ａ】９個のヒト化７Ｅ５変異型ＶＨ鎖および９個のヒト化７Ｅ５変異型ＶＬ鎖（それぞれ図７Ａおよび７Ｂに示す）の８１個全ての可能性のある組み合わせの阻害活性を示す、溶血アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】９個のヒト化７Ｅ５変異型ＶＨ鎖および９個のヒト化７Ｅ５変異型ＶＬ鎖（それぞれ図７Ａおよび７Ｂに示す）の８１個全ての可能性のある組み合わせの阻害活性を示す、ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図８Ａ】７Ｅ５重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）と、ヒト化７Ｅ５変異型７Ｃ０２（配列番号４６）、７Ｅ１１（配列番号４２）、７Ｅ１２（配列番号３２）、７Ｆ０２（配列番号４４）、７Ｆ０６（配列番号３８）、７Ｆ１１（配列番号４０）、７Ｇ０９（配列番号３４）、８Ｆ０７（配列番号３６）、および８Ｇ０９（配列番号３０）の重鎖アミノ酸配列との整列である。保存されたＣＤＲ１、２、および３領域を示す。
【図８Ｂ】７Ｅ５軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）と、ヒト化７Ｅ５変異型７Ｅ１１（配列番号４３）、７Ｅ１２（配列番号３３）、７Ｆ０２（配列番号４５）、７Ｆ０６（配列番号３９）、７Ｆ１１（配列番号４１）、７Ｇ０８（配列番号４７）、７Ｇ０９（配列番号３５）、８Ｆ０７（配列番号３７）、および８Ｇ０９（配列番号３１）の軽鎖アミノ酸配列との整列である。保存されたＣＤＲ１、２、および３領域を示す。
【図９】野生型７Ｅ５ラットＦ’Ａｂの親和性と比較した、ヒトＣ６についての８のヒト化Ｆ’Ａｂの親和性（Ｂｉａｃｏｒｅ）を示す。
【図１０】インビボの神経挫滅実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、有益な機能特性を呈する抗Ｃ６抗体を提供する。これらの機能特性には、例えば、（ａ）溶血アッセイにおける０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０、（ｂ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合の５×１０−１０Ｍ以下のＫＤ、（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合の４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期、および／または（ｄ）カニクイザルＣ６との交差反応が含まれる。他の実施形態では、本抗体は、特定の重鎖および軽鎖可変領域および／またはＣＤＲ配列を含む。例えば、８１個全ての可能性のある鎖の「ミックスアンドマッチ」コンビネーションにおいて有効なＣ６阻害活性を呈する９個のヒト化重鎖および９個のヒト化軽鎖可変領域が提供される。更に他の実施形態では、抗Ｃ６抗体は、７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、または７Ｆ０２などの本明細書に開示の特定の抗Ｃ６抗体と同じエピトープに結合するか、またはＣ６への結合についてそれと競合する。
【００２７】
本発明がより容易に理解され得るように、まずある特定の用語を定義する。追加の定義は、発明を実施するための形態にわたって示す。
【００２８】
用語「Ｃ６」（「Ｃ６補体」または「Ｃ６補体成分」とも称する）は、Ｃ５ｂ、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９成分と結合してＣ５ｂ−Ｃ９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する補体カスケードの成分を指す。用語「Ｃ６」は、自然に発現されるＣ６の任意の変異型またはアイソフォームを含む。本発明の抗体は、ヒトＣＤ６に特異的であってもよく、他の種とのいずれの交差反応性も呈しない場合がある。あるいは、本発明の抗体は、カニクイザルなどのヒト以外の種からのＣ６と交差反応してもよい。あるいは、本発明の抗体は、カニクイザルなどの霊長類からのＣ６と交差反応するが、マウスまたはラットＣ６などの非霊長類Ｃ６とは交差反応しない場合がある。Ｃ６、またはその任意の変異型およびアイソフォームは、それらを自然に発現する細胞または組織から単離するか、または当該技術分野で周知の技法を使用して組み換えによって生産してもよい。Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）（受諾番号ＮＰ＿００１１０８６０．３）は、以下の通りヒトＣ６のアミノ酸を報告している（配列番号５２）。
【化１】
2020178711.tif 000002
【００２９】
「抗体」という用語は、本明細書で言及する場合、全抗体および任意の抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、１つの好ましい実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。ＶＨおよびＶＬは各々、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３０】
抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ヒトＣ６）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。かかる「断片」は、例えば、約８〜約１５００アミノ酸長、好適には約８〜約７４５アミノ酸長、好適には約８〜約３００、例えば、約８〜約２００アミノ酸、または約１０〜約５０、若しくは１００アミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域ＣＤＲ、または（ｖｉｉ）任意選択で合成リンカーによって接合されてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。更に、ＶＬおよびＶＨのＦｖ断片の２つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、これらを、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって、組み換え法を使用して接合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、これについては、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。かかる一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来的な技法を使用して得られ、断片は、完全抗体と同じ様式で可用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法によって、または完全免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって生産され得る。
【００３１】
「二重特異性」または「二官能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００３２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および任意選択の定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００３３】
「組み換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組み換え手段によって調製、発現、作出、または単離される全てのキメラ、ヒト化、およびヒト抗体を含み、これは、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマについてトランスジェニックであるかまたは染色体導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、（ｃ）組み換えのコンビナトリアルヒトまたはヒト化抗体ライブラリから単離した抗体、ならびに（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体などである。
【００３４】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列配列からのフレームワーク領域および非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ）からのＣＤＲを有する抗体を指し、例えば、ヒトフレームワーク領域および／またはＣＤＲが結合を最適化するために特定の部位指向性の突然変異生成を受けた抗体を含む。ヒト化抗Ｃ６抗体の調製の例示的な説明は、実施例８に記載する。
【００３５】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロの無作為な若しくは部位特異的な突然変異生成によって、またはインビボの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６を参照されたい）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列における抗体がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（即ち、ヒト化抗体）を含まない。
【００３６】
「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ヒトＣ６に特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＣ６以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、エピトープに特異的に結合する単離された抗体は、異なる種からの他のＣ６タンパク質への交差反応性を有し得る。しかし、抗体は、常にヒトＣ６に結合することが好ましい。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態では、異なるＣ６特異性を有する「単離された」抗体の組み合わせは、明確に定義された組成で組み合わせられる。
【００３７】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原の部位を指す。エピトープは、タンパク質の３次の折り畳みによって並列された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への露出の際に保持されるが、３次の折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を固有の空間的配座で含む。どのエピトープが所与の抗体によって結合されるのかを決定するための方法（即ち、エピトープマッピング）は、当該技術分野で周知であり、例えば、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイを含み、これにおいては、Ｃ６からの重複または連続ペプチドを所与の抗Ｃ６抗体との反応性について試験する。エピトープの空間的配座を決定する方法には、当該技術分野における技法および本明細書に記載の技法、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照）。
【００３８】
「不連続エピトープ」という用語は、不連続アミノ酸で構成されるエピトープを指す。例えば、このエピトープは、配座的に折り畳まれるときに、抗体が各領域内で１つ以上の残基に結合するように（近接して）まとめられるヒトＣ６の複数の領域からの残基を含んでもよい。
【００３９】
「エピトープマッピング」という用語は、抗体−抗原認識のための分子決定基の特定の過程を指す。
【００４０】
２つ以上の抗体に関する「同じエピトープに結合する」という用語は、抗体が抗原への結合について競合し、アミノ酸の同じ重複または包括する連続または不連続セグメントに結合することを意味する。当業者であれば、「同じエピトープに結合する」という語句が、必ずしも抗体が全く同じアミノ酸に結合することを意味するものではないことを理解する。抗体が結合する正確なアミノ酸は異なり得る。例えば、第１の抗体は、第２の抗体によって結合されるアミノ酸のセグメントによって完全に包括されるアミノ酸のセグメントに結合し得る。別の例では、第１の抗体は、その第２の抗体によって結合されるその１つ以上のセグメントと大きく重複するアミノ酸の１つ以上のセグメントに結合する。本明細書の目的では、かかる抗体は、「同じエピトープに結合する」と見なされる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗体結合を指す。典型的には、本抗体は、組み換えヒトＣ６を分析物として、本抗体をリガンドとして使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００計器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合、約１０−７Ｍ未満、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、若しくは１０−１０Ｍ未満、または更にそれ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性を少なくとも２倍上回る親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００４２】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図される。典型的には、本発明の抗体は、組み換えヒトＣ６を分析物として、本抗体をリガンドとして使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００計器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合、解離平衡定数（ＫＤ）が約１０−８Ｍ以下、若しくは１０−９Ｍ以下、若しくは１０−１０Ｍ以下、または更にそれ以下でＣ６に結合する。
【００４３】
「ｋｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を指すことが意図される。
【００４４】
「ｋａ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体の抗原との会合についての会合速度定数を指すことが意図される。
【００４５】
「ＩＣ５０」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の生体応答を半分に阻害するために、インビトロアッセイにおいてもインビボアッセイにおいても必要とされる、抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。つまり、これは、抗体またはその抗原結合部分の半抑制（ｈａｌｆ  ｍｉｎｉｍａｌ）（５０％）阻害濃度（ＩＣ）である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ｉｓｏｔｙｐｅ」アイソタイプは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を指す。一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。別の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。別の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。別の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）アイソタイプ（即ち、アミノ酸位置２２８にて野生型セリン残基のプロリン置換を有するＩｇＧ４アイソタイプ）である。
【００４７】
「固定化Ｃ６に結合する」という用語は、本発明のヒト抗体が、Ｃ６、例えば、細胞の表面に発現されるかまたは固体支持体に付着するＣ６に結合する能力を指す。
【００４８】
「交差反応する」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の抗体が異なる種からのＣ６に結合する能力を指す。例えば、ヒトＣ６に結合する本発明の抗体はまた、カニクイザルなどのＣ６の別の種に結合してもよい。本明細書で使用される場合、交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）において精製された抗原との特異的反応を検出すること、あるいはＣ６を生理学的に発現している細胞への結合、またはそれとの機能的な相互作用によって測定される。交差反応性を決定するための方法としては、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００  ＳＰＲ計器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による本明細書に記載の標準的な結合アッセイ、またはフローサイトメトリー技法が挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合される炭水化物単位のパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が、異種抗体のグリコシル化パターンを、導入遺伝子のＣＨ遺伝子が由来した種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種における該グリコシル化パターンにより類似していると認識し得る場合に、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンに実質的に類似していることを特徴とし得る。
【００５０】
「天然に存在する」という用語は、物体に適用され、本明細書で使用される場合、物体が天然に見出され得ることを指す。例えば、天然にある源から単離され得、かつ研究所で人間によって意図的に修飾されていない、有機物（ウィルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００５１】
「再配列された」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖセグメントが、Ｄ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して、それぞれ完全ＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードする配座で位置付けられる、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の構成を指す。再配列された免疫グロブリン遺伝子は、生殖細胞系列ＤＮＡとの比較によって特定することができ、再配列された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体相同性要素を有することになる。
【００５２】
「再配列されていない」または「殖細胞系列構成」という用語は、Ｖセグメントに関して本明細書で使用される場合、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない構成を指す。
【００５３】
「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００５４】
「単離された核酸分子」という用語は、Ｃ６に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して本明細書で使用される場合、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、Ｃ６以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列がヒトゲノムＤＮＡにおいて核酸の両側部に位置し得る、核酸分子を指すことが意図される。例えば、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、および２８は、それぞれ、抗Ｃ６モノクローナル抗体８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２の重鎖（ＶＨ）可変領域をコードするヌクレオチド配列に対応する。配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、および２９は、それぞれ、抗Ｃ６モノクローナル抗体８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２の軽鎖（ＶＨ）可変領域をコードするヌクレオチド配列に対応する。
【００５５】
本発明はまた、配列番号４〜４７に示される配列の「保存的配列修飾」、即ち、ヌクレオチド配列によってコードされるかまたはアミノ酸配列を含有する抗体の抗原への結合を廃さないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾を包含する。かかる保存的配列修飾には、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失が含まれる。例えば、修飾は、部位指向性突然変異およびＰＣＲ媒介性突然変異などの当該技術分野で既知の標準的な技法によって、配列番号４〜４７に導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で代置するものが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このため、ヒト抗Ｃ６抗体中の予測非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で代置することが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）、およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照）。
【００５６】
あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異などによって抗Ｃ６抗体コード化配列の全てまたは一部にかけて無作為に導入することができ、結果として得られる修飾された抗Ｃ６抗体を結合活性についてスクリーニングし得る。
【００５７】
核酸について、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸またはその指定の配列が、最適に整列し比較されるときに、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、およびより好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％において、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って同一であることを示す。あるいは、実質的な相同性は、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の補体にハイブリダイズするときに存在する。
【００５８】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、その配列が共有する同一の位置の数の関数である（即ち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例に記載するように、数学アルゴリズムを使用して獲得することができる。
【００５９】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００６０】
本発明の核酸およびタンパク質配列を更に「クエリ配列」として使用して、例えば関連する配列を特定するために、公的なデータベースに検索を行うことができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語調＝１２）を用いて行って、本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語調＝３）を用いて行って、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのある整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００６１】
本発明の核酸またはタンパク質は、全細胞において、細胞溶解物において、または部分的に精製されているか若しくは実質的に純粋な形態において存在してもよい。核酸またはタンパク質は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野で周知の他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製されるときに、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。
【００６２】
ｃＤＮＡ、ゲノム、またはその混合物のいずれかに由来するが、多くの場合天然配列（修飾された制限部位などを除く）中にある本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準的な技法に従って突然変異され得る。コード化配列に対して、これらの突然変異は、所望のようにアミノ酸配列に影響し得る。具体的には、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ、および本明細書に記載の他のかかる配列と実質的に相同であるかまたはそれらに由来するＤＮＡ配列が企図される（ここでは、「由来する」は、ある配列が別の配列と同一であるかまたはそれから修飾されることを示す）。
【００６３】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的な関係に置かれるときに「動作可能に連結」される。例えば、ポロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合にコード化配列に動作可能に連結される。転写調節配列に関して、動作可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が隣接し、また２つのタンパク質コード化領域を接合する必要がある場合には、隣接し、かつリーディングフレーム中にあることを意味する。スイッチ配列については、動作可能に連結することは、その配列がスイッチ組み換えに影響可能であることを示す。
【００６４】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここでは、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され得、その結果、宿主ゲノムと併せて複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが動作可能に結合する遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、「組み換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と本明細書では称される。一般に、組み換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態にある場合が多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであるため、互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などのかかる他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。
【００６５】
「組み換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、組み換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫も指すことが意図されることを理解されたい。ある特定の修飾が突然変異または環境の影響のいずれかに起因して後継世代で生じ得るため、係る子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用される場合「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、２つ以上の分子の会合を指す。結合は、共有的または非共有的であり得る。結合はまた、遺伝的であり得る（即ち、組み換えによって融合されたもの）であり得る。かかる結合は、化学的共役および組み換えタンパク質生産などの当該技術分野で認識されている多種多様な技法を使用して達成することができる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「遮断する」（例えば、抗Ｃ６抗体によるＭＡＣの形成の阻害／遮断を指して）という用語は、互換的に使用され、部分および完全阻害／遮断の両方を包含する。Ｃ６の阻害／遮断は、好ましくは、Ｃ６が遮断または阻害されないときに起こる活性の通常のレベルを低減させるかまたはその種類を改変する。阻害および遮断はまた、抗Ｃ６抗体と接触していないＣ６と比較して、抗Ｃ６抗体と接触しているときのＣ６の結合または活性における測定可能ないずれの減少も含むことが意図され、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、Ｃ６の結合または活性を阻害する。一実施形態では、本抗Ｃ６抗体は、少なくとも約７０％、Ｃ６の結合または活性を阻害する。別の実施形態では、本抗Ｃ６抗体は、少なくとも８０％、Ｃ６の結合または活性を阻害する。
【００６８】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の治療または予防手段を指す。「治療」の方法は、かかる治療、本発明の抗体を必要とする対象、例えば、かかる治療を必要とする対象への投与を用いる。
【００６９】
「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」または「有効薬量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓａｇｅ）」という用語は、所望の効果を達成するかまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患を既に患っている患者において疾患およびその合併症を治癒させるかまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、治療する障害の重症度、および患者自身の免疫系の全般的状態に依ることになる。
【００７０】
「患者」という用語は、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本発明の方法および組成物は、免疫障害を有する対象を治療するために使用することができる。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００７２】
本発明の様々な態様を以下の小節で更に詳述する。
【００７３】
Ｉ．Ｃ６に対する抗体の生産
本発明は、Ｃ６、例えば、ヒトＣ６に結合する抗体、例えばヒト化抗体を包含する。Ｃ６に結合する例示的なモノクローナル抗体には、７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２が含まれ、これらの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号５、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、および４４に示され、これらの軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５に示される。これらの抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、および３は、それぞれ、配列番号６、７、および８に示され、一方でこれらの抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３は、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３に示される。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって説明されている標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法などの様々な既知の技法を使用して生産することができる。体細胞ハイブリダイゼーション処置が好ましいが、原理上は、モノクローナル抗体を生産するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリを使用するファージディスプレイ技法、および実施例６に記載のものなどのヒト化技法を用いることもできる。
【００７５】
したがって、一実施形態では、ハイブリドーマ法が、ヒトＣ６に結合する抗体を生産するために使用される。この方法では、ラット、マウス、または他の適切な宿主動物を好適な抗原で免疫付与して、免疫付与に使用される抗原に特異的に結合することになる抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を引き出す。実施例１に記載の通り、抗ヒトＣ６抗体の生育に特に好適な宿主動物は、ヒトＣ６による免疫付与が完全に「異質」であると見なされるように、Ｃ６を欠損しているラット（Ｃ６−／−ラット）である。免疫付与した宿主動物からの上清を、実施例１で詳述する溶血アッセイまたはＭＡＣ  ＥＬＩＳＡなどの抗Ｃ６活性を検出するための好適なアッセイにおいて試験して、Ｃ６阻害活性を有する抗体を発現している宿主動物を特定することができる。
【００７６】
その後、選択された宿主動物からのリンパ球を、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。例示的な融合パートナーはＹ３−Ａｇ１．２．３細胞であるが、ＳＰ２／０−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）などの当該技術分野で既知の他の骨髄腫細胞も好適である。ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、抗原に向けられたモノクローナル抗体の産生について、溶血アッセイおよび／またはＭＡＣ  ＥＬＩＳＡなどを用いてアッセイする。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させ得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水、または血清から、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、または親和性クロマトグラフィーなどの従来的な免疫グロブリン精製手順によって分離することができる。抗Ｃ６抗体を分泌するハイブリドーマの調製の例示的かつ非限定的な例は、実施例１で詳述する。
【００７７】
ラットまたはマウス抗体などの非ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用してヒト化することができる。例えば、実施例６で詳述するように、ラット抗ヒトＣ６  ｍＡｂは、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２２０５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：３５−４２に記載されている手法を使用してヒト化することができる。この手法は、非ヒトおよびヒト抗体が類似して構築されたＣＤＲを有する場合、ヒトフレームワークは親和性を良好に保持しながら非ヒトＣＤＲも支持することになるという原理に基づく。このため、この方法において、ヒトフレームワーク配列は、ヒト化される抗体のＣＤＲに対するヒトＣＤＲの構造的類似性（同じＣｈｏｔｈｉａ正準構造）に基づいて、ヒト生殖細胞系列遺伝子のセットから選択される。偏位したＦＲ残基を含むＦａｂ変異型配列のファージディスプレイライブラリを生成する。親和性主導による選択の後、個々のクローンを結合および解離速度についてスクリーニングし、配列ヒト同一性および相同性を決定する。当該技術分野で定着しているＣＤＲ移植およびヒト化のための他の手法および方法も、本発明のヒト化抗Ｃ６抗体を生成するために使用することができる。
【００７８】
別の実施形態では、ヒトＣ６に結合する抗体および抗体部分は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、およびＨｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，３４４−３４８；Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、および同第６，５９３，０８１号に記載されている技法を使用して生成される抗体ファージライブラリから単離することができる。加えて、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに極めて大規模なファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボの組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を使用してもよい。
【００７９】
一実施形態では、ヒトＣ６に結合する抗体は、前出のＨｏｅｔらによって説明されているファージディスプレイ技法を使用して生産される。この技法は、ヒトドナーから単離した免疫グロブリン配列の固有の組み合わせを有し、重鎖ＣＤＲ中に合成による多様性を有するヒトＦａｂライブラリが生成されることを伴う。その後、ライブラリをヒトＣ６に結合するＦａｂについてスクリーニングする。
【００８０】
一実施形態では、Ｃ６に向けられた抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保持するトランスジェニックまたは染色体導入マウスを使用して生成される。一実施形態では、本発明は、本明細書では「ＨｕＭＡｂマウス」と称されるトランスジェニックマウスを用い、これは、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的突然変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９）。したがって、これらのマウスは、マウスＩｇＭまたはκの減少した発現を呈し、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（前出のＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６中で論評されている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載されている。更に、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５��８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９；Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号；１９９８年６月１１日公開国際公開第ＷＯ  ９８／２４８８４号；１９９４年１１月１０日公開の同第ＷＯ  ９４／２５５８５号；１９９３年６月２４日公開の同第ＷＯ  ９３／１２２７号；１９９２年１２月２３日公開の同第ＷＯ  ９２／２２６４５号；１９９２年３月１９日公開の同第ＷＯ  ９２／０３９１８号を参照されたい。
【００８１】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスなどの、導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウスを使用して生育することができる。当該技術分野では「ＫＭマウス」と称されるかかるマウスは、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公開第ＷＯ  ０２／４３４７８号で詳述されている。
【００８２】
また更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現している代替的なトランスジェニック動物系が当該技術分野で利用可能であり、本発明の抗Ｃ６抗体を生育するために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替的なトランスジェニック系を使用することができ、かかるマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載されている。
【００８３】
更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現している代替的な染色体導入動物系が当該技術分野で利用可能であり、本発明の抗Ｃ６抗体を生育するために使用することができる。例えば、当該技術分野では「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスを使用することができ、かかるマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載されている。更に、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保持するウシが当該技術分野で説明されており（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明の抗Ｃ６抗体を生育するために使用することができる。
【００８４】
ヒト抗体を育てるための当該技術分野で説明されている追加のマウス系を本発明の抗Ｃ６抗体の生育に適用することもでき、かかるマウス系としては、（ｉ）キメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）がマウス中で生育されるように、内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同的組み換えによって、内因性マウス定常領域に動作可能に連結したヒト重鎖および軽鎖可変領域で代置され、その後続いて、標準的な組み換えＤＮＡ技法を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ならびに（ｉｉ）マウスが、単一の再配列されたヒト共通軽鎖可変領域ではなく、再配列されていないヒト重鎖可変領域を含有する、ＭｅＭｏ（登録商標）マウス（Ｍｅｒｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。かかるマウス、および抗体を生育するためのその使用は、例えば、ＷＯ  ２００９／１５７７７、ＵＳ  ２０１０／００６９６１４、ＷＯ  ２０１１／０７２２０４、ＷＯ  ２０１１／０９７６０３、ＷＯ  ２０１１／１６３３１１、ＷＯ  ２０１１／１６３３１４、ＷＯ  ２０１２／１４８８７３、ＵＳ  ２０１２／００７０８６１、およびＵＳ  ２０１２／００７３００４に記載されている。
【００８５】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫付与時にヒト抗体の応答が生成され得るように中でヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。かかるマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号および第５，６９８，７６７号に記載されている。
【００８６】
Ｃ６に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体はまた、例えば、当該技術分野で周知のように組み換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生させることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。抗Ｃ６抗体の組み換え発現のための例示的な実施形態は、実施例５（これにおいては、ｐＭＱＲ  発現ベクターをＨＥＫ−２９３宿主細胞中で使用する）、実施例６（大腸菌宿主細胞中でｐＣＢ４発現ベクターを使用するＦａｂ発現）、および実施例７（ＣＨＯ細胞発現）において更に説明する。
【００８７】
更に、一実施形態では、目的の遺伝子（複数可）、例えば、抗体遺伝子は、ＷＯ  ８７／０４４６２、ＷＯ  ８９／０１０３６、およびＥＰ  ３３８  ８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系、または当該技術分野で周知の他の発現系によって使用されるものなどの真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターへとライゲーションされ得る。クローン化した抗体遺伝子を持つ精製されたプラスミドは、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞などの真核宿主細胞、または代替的に植物由来の細胞、菌類、または酵母細胞のような他の真核細胞中に導入され得る。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミン、または他のものなどの当該技術分野で説明されている方法であり得る。これらの抗体遺伝子を宿主細胞中に導入した後で、抗体を発現している細胞を特定し、選択することができる。これらの細胞は、続いてその発現レベルについて増幅させ、規模を増大させて抗体を産生することができるトランスフェクトーマを表す。組み換え抗体は、これらの培養上清および／または細胞から単離および精製することができる。
【００８８】
あるいは、これらのクローン化抗体遺伝子は、大腸菌などの他の発現系において若しくは完全な有機体において発現させるか、または合成によって発現させ得る。
【００８９】
交差競合および同じエピトープに結合する抗体
実施例３で詳述するように、７Ｅ５抗体が結合するエピトープを、配列番号５２のアミノ酸８３５〜８５４（ヒトＣ６）に対応するヒトＣ６の領域内の残基に、アラニンへの系統的変異導入法によってマッピングした。配列番号１、２、および３に示される特定のペプチドも、７Ｅ５が結合するエピトープの一部を形成する残基を含有することが示された。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号５２の残基８３５〜８５４の全てまたは一部を含むヒトＣ６のエピトープに結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、エピトープが不連続である、配列番号５２の残基８３５〜８５４の全てまたは一部を含むヒトＣ６のエピトープに結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、および３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むヒトＣ６のエピトープに結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、エピトープが不連続である、配列番号１、２、および３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むヒトＣ６のエピトープに結合する抗体を提供する。更に別の実施形態では、本発明は、ヒトＣ６への結合について、配列番号５に示される重鎖可変領域および配列番号１０に示される軽鎖可変領域（７Ｅ５のＶＨおよびＶＬ配列）を含む抗体と交差競合する抗体を提供する。更に他の実施形態では、本発明の抗体は、Ｃ６への結合について、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、または７Ｆ０２などの本明細書に記載の他の抗Ｃ６抗体と交差競合する。
【００９０】
かかる競合的抗体は、標準的なＣ６結合アッセイにおいて、ｍＡｂｓ  ７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、７Ｆ０２のうちの１つ以上のＣ６への結合を競合的に阻害するその能力に基づいて特定することができる。Ｃ６への結合についての交差競合を検査するための例示的なアッセイは、実施例３で詳述するエピトープサンドイッチＥＬＩＳＡである。更に、同じエピトープを認識するかまたは結合について競合する抗体は、他の慣習的な技法を使用して特定することができる。かかる技法としては、例えば、ある抗体が、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示す免疫アッセイ、即ち、競合的結合アッセイが挙げられる。競合的結合は、試験下の免疫グロブリンが参照抗体のＣ６などの共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される。多数の種類の競合的結合アッセイが既知であり、これには、例えば、固相直接または間接放射免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２（１９８３）参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）参照）、固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８））、Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６（１９９０））、および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０））が挙げられる。典型的には、かかるアッセイは、標識されていない免疫グロブリンおよび標識されている参照免疫グロブリンのいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、これは、参照抗体の共通抗原への特異的結合を、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、またはそれ以上阻害することになる。
【００９１】
したがって、本明細書に記載の特定の抗体によって認識されるエピトープの全てまたは一部を含むＣ６上のエピトープ（例えば、同じか若しくは重複している領域、または領域間にある領域若しくは領域間をまたぐ領域）に結合する抗体も、本発明に包含される。
【００９２】
一実施形態では、Ｃ６への結合について競合し、かつ／またはヒトＣ６上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒト化抗体である。かかるヒト化モノクローナル抗体は、例えば、実施例６に記載のように調製し単離することができる。
【００９３】
抗体が結合するエピトープを決定するための他の技法としては、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析などのエピトープマッピング法が挙げられる。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾に起因する結合の損失がエピトープ成分の指標と見なされることが多い、抗原断片または抗原の突然変異した変型への抗体の結合を監視する。加えて、エピトープマッピングのためのコンピュータによるコンビナトリアル方法も使用し得る。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリから特定の短ペプチドを親和性単離する能力に依存する。ペプチドはこうして、ペプチドライブラリをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリーダーと見なされる。エピトープマッピングのために、配座的不連続エピトープをマッピングすることが示されているコンピュータによるアルゴリズムが開発されている。
【００９４】
本明細書に記載の所望の特性を有する単一の原型的な抗Ｃ６  ｍＡｂを単離した後は、当該技術分野で既知の方法を使用することによって、類似した特性を有する、例えば、同じエピトープを有する他のｍＡｂｓを生成することは簡単である。例えば、マウスまたはラットを本明細書に記載のようにＣ６で免疫付与し、ハイブリドーマを生産し、結果として得られるｍＡｂを、Ｃ６への結合について原型ｍＡｂと競合する能力についてスクリーニングし得る。ラットまたはマウスを、原型的なｍＡｂが結合するエピトープを含有するＣ６のより小さい断片によって免疫付与することもできる。エピトープは、例えば、Ｃ６にわたる一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることによって位置を特定し得る。あるいは、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９，１９９４の方法を使用して、原型ｍＡｂと同じエピトープ、故にそれに類似した特性を有するｍＡｂの選択を誘導してもよい。ファージディスプレイを使用して、まず、原型抗体の重鎖を（好ましくはヒト）軽鎖のレパートリーと対形成させてＣ６に結合するｍＡｂを選択し、次に、新たな軽鎖を（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーと対形成させて原型ｍＡｂと同じエピトープを有する（好ましくはヒト）Ｃ６を結合するｍＡｂを選択する。あるいは、原型ｍＡｂの変異型を、本抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異生成によって得てもよい。
【００９５】
エピトープマッピング、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているエピトープマッピングを行って、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定することができる。また、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５によって説明されている「アラニン系統的変異導入法」またはヒトＣ６中のアミノ酸残基の点突然変異の何らかの他の形態を使用して、本発明の抗Ｃ６抗体のための機能的エピトープを決定してもよい。しかしながら、突然変異研究は、Ｃ６の全体的な３次元構造に不可欠であるが、抗体−抗原接触に直接的に関与しないアミノ酸残基も明らかにし得るため、この方法を使用して決定した機能的エピトープを確認するために他の方法が必要となり得る。
【００９６】
特定の抗体によって結合されるエピトープも、ヒトＣ６の断片を含むペプチドへの抗体の結合を評定することによって決定し得る。Ｃ６の配列を含む一連の重複ペプチドを合成し、例えば、直接的ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ（ペプチドを、抗体がマイクロタイタープレートのウェルに結合したＣ６に結合することを防止するその能力について評定するもの）において、またはチップ上で結合についてスクリーニングしてもよい。かかるペプチドスクリーニング方法は、一部の不連続の機能的エピトープ、即ち、Ｃ６ポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を伴う機能的エピトープを検出することができない場合がある。
【００９７】
本発明の抗体によって結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリング、ならびに遊離している場合、および目的の抗体と複合体中で結合している場合の、Ｃ６中の不安定アミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含む核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などの構造的方法によって決定してもよい（Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１１３３５−１１３４７、Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，６８８４−６８９１）。
【００９８】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、当該技術分野で既知の方法のいずれか（例えば、Ｇｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：３３９−３５０、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３）を使用して獲得してもよく、これらの方法には、マイクロバッチ（例えば、Ｃｈａｙｅｎ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１２６９−１２７４）、懸滴蒸気拡散（例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００−６３０３）、播種および透析が含まれる。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、濃度が約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の１０００〜２０，０００（ＰＥＧ、約１０００〜約２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量）、好ましくは約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは約６０００Ｄａのポリエチレングリコールを含有する沈殿剤溶液において最良に達成され得る。タンパク質安定剤、例えば、グリセロールを約０．５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことも望ましい場合がある。好ましくは約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度の好適な塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化リチウム、またはクエン酸ナトリウムも、沈殿剤溶液中で望ましいことがある。沈殿剤を、約３．０〜約５．０、好ましくは約４．０のｐＨに中和することが好ましい。沈殿剤溶液中で有用な特定の緩衝液は様々であり、当該技術分野で周知である（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄ．，（１９９４）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。有用な緩衝液の例としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、および酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃、および２６℃を含む幅広い範囲の温度で成長させ得る。
【００９９】
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技法を使用して研究してもよく、コンピュータソフトウェア、例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１４  ＆  １１５，Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照）、およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９３）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ４９：３７−６０、Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６Ａ：３６１−４２３，Ｃａｒｔｅｒ  ＆  Ｓｗｅｅｔ，ｅｄｓ．、Ｒｏｖｅｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５６：１３１３−１３２３）（開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して精緻化してもよい。
【０１００】
完全抗体を発現させるための部分的抗体配列の使用
ある特定の実施形態では、本発明の抗Ｃ６抗体は、配列番号８に示される重鎖ＣＤＲ３と配列番号１３に示される軽鎖ＣＤＲ３とを含む。本抗体は、配列番号７に示される重鎖ＣＤＲ２と配列番号１２に示される軽鎖ＣＤＲ２とを更に含み得る。本抗体は、配列番号６に示される重鎖ＣＤＲ１と配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ１とをまた更に含み得る。前述のＣＤＲを利用する本発明の例示的な抗体としては、
（ａ）配列番号３０の重鎖可変領域と配列番号３１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｂ）配列番号３２の重鎖可変領域と配列番号３３の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｃ）配列番号３４の重鎖可変領域と配列番号３５の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｄ）配列番号３６の重鎖可変領域と配列番号３７の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｅ）配列番号３８の重鎖可変領域と配列番号３９の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｆ）配列番号４０の重鎖可変領域と配列番号４１の軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｇ）配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域とを含む抗体、および
（ｈ）配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４５の軽鎖可変領域とを含む抗体が挙げられる。
【０１０１】
抗体は、６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を主に通して標的抗原と相互作用する。この理由により、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に貢献するため、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組み換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植した特定の天然に存在するからのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、およびＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照）。かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系列配列は、それらが、Ｂ細胞突然変異の間にＶ（Ｄ）Ｊ接合によって形成される完全に組み立てられた可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系列配列は、可変領域にわたって均一に個々で高親和性二次レパートリー抗体の配列とも異なることになる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域のアミノ末端部分において比較的頻度が低い。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分において比較的頻度が低い。更に、多くの体細胞突然変異は、抗体の結合特性を大幅に改変しない。この理由により、元の抗体のものに類似した結合特性を有する完全な組み換え抗体を再度作出するために、特定の抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５５３５を参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的重鎖および軽鎖配列が、典型的にはこの目的に十分である。部分的配列を使用して、どの生殖細胞系列可変および接合遺伝子セグメントが組み換え抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、生殖細胞系列配列を使用して、可変領域の欠損している部分を埋める。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質突然変の間に切断され、最終抗体の特性に寄与しない。欠損している配列を加えるために、クローニングしたｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは、可変領域全体を、短く重複したオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅によって組み合わせて、完全に合成の可変領域クローンを作出し得る。このプロセスは、特定の制限部位の排除若しくは組み入れ、または特定のコドンの最適化などのある特定の利点を有する。
【０１０２】
ハイブリドーマからの重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を使用して、合成オリゴヌクレオチドの重複しているセットを設計し、天然配列と同一のアミノ酸コード化能力を有する合成Ｖ配列を作出する。合成の重鎖およびカッパ鎖配列は、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を促進するために一続きの反復ヌクレオチド塩基が妨害されること、最適な翻訳開始部位がＫｏｚａｋのルールに従って組み込まれること（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）、ならびにＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流で操作されること、という３つの点で天然配列とは異なり得る。
【０１０３】
重鎖および軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコード化および対応する非コード化鎖配列は、対応する非コード化オリゴヌクレオチドのほぼ中点、３０〜５０ヌクレオチドに分けられる。このため、各鎖について、オリゴヌクレオチドは、１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複した二本鎖セットに組み立てることができる。その後、プールを鋳型として使用して、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生産する。典型的には、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットは２つのプールに分けられ、これを別個に増幅して２つの重複したＰＣＲ産物を生成する。次に、これらの重複した産物をＰＣＲ増幅によって組み合わせて、完全な可変領域を形成する。また、重鎖または軽鎖定常領域（カッパ軽鎖のＢｂｓＩ部位、またはガンマ重鎖の場合にはＡｇｅＩ部位を含む）の重複断片をＰＣＲ増幅に含めて、発現ベクター構築物に容易にクローニングできる断片を生成することが望ましい場合がある。
【０１０４】
その後、再構築した重鎖および軽鎖可変領域を、クローニングしたプロモーター、リーダー配列、翻訳開始、リーダー配列、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化、および転写終了の配列と組み合わせて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物を単一のベクターに組み込み、宿主細胞に同時トランスフェクト、連続トランスフェクト、または個別トランスフェクトし、これを後に両方の鎖を発現している宿主細胞を形成するために融合させ得る。
【０１０５】
発現ベクターの構築に使用するためのプラスミドを、ＰＣＲ増幅したＶ重鎖およびＶカッパ軽鎖ｃＤＮＡ配列を重鎖および軽鎖ミニ遺伝子の再構築に使用し得るように構築した。これらのプラスミドを使用して、完全ヒトＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κ抗体を発現させることができる。本発明の完全ヒト抗体およびキメラ抗体はまた、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体を含む。類似のプラスミドを、他の重鎖アイソタイプのため、またはラムダ軽鎖を含む抗体の発現のために構築し得る。
【０１０６】
このように、本発明の別の態様では、本発明の抗Ｃ６抗体の構造的特徴を使用して、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する構造的に関連した抗Ｃ６抗体を作出する。これらの機能的特性は、例えば、
（ａ）７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、または７Ｆ０２などの本発明の抗Ｃ６抗体と同じエピトープに結合すること、
（ｂ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−８Ｍ以下（あるいは５×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、または５×１０−１０Ｍ以下）のＫＤを有すること、
（ｄ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、または
（ｅ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、などである。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲ領域は、既知のフレームワーク領域およびＣＤＲと組み換えによって組み合わせて、追加の組み換え操作された本発明の抗Ｃ６抗体を作出することができる。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じ抗体配列または異なる抗体配列に由来し得る。抗体配列は、天然に発生する抗体の配列であり得るか、またはいくつかの抗体のコンセンサス配列であり得る。ＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈらのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３（１９９１）、ＫｏｌｂｉｎｇｅｒらのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９７１（１９９３）、およびＣａｒｔｅｒらのＷＯ  ９２／２２６５３を参照されたい。
【０１０８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、抗Ｃ６抗体を調製するための方法を提供し、本方法は、（１）重鎖ＣＤＲの少なくとも１つが配列番号６、７、および８に示されるＣＤＲのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖フレームワーク領域および重鎖ＣＤＲと、（２）軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが配列番号１１、１２、および１３に示されるＣＤＲのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖フレームワーク領域および軽鎖ＣＤＲとを含む抗体を調製することを含み、本抗体はＣ６に結合する能力を保持する。Ｃ６に結合する抗体の能力は、実施例に示すものなどの標準的な結合および／または機能アッセイを使用して決定することができる。好ましくは、抗体は、（ａ）〜（ｅ）として上で列挙した機能特性のうちの少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または５つ全てを呈する。本明細書に開示のかかる抗体の例としては、７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２抗体が挙げられる（実施例６に記載の通り）。
【０１０９】
抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗体の抗原に対する結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことは当該技術分野で周知である（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．，１４９：１６０５−１６１２（１９９２）、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３１８−５３２９（１９９４）、Ｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１９３：４００−４１９（１９９５）、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）、Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２９６：８３３−８４９（２０００）、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５（１９９８）、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２１６１−２１６２（１９９４）、Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：７３９−７４９（１９９６）を参照）。したがって、上に示した通りに調製した本発明の組み換え抗体は、好ましくは、それぞれ配列番号８および１３に示される７Ｅ５抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む。本明細書に開示のかかる抗体の例としては、７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２抗体が挙げられる（実施例６に記載の通り）。
【０１１０】
更に、別の実施形態では、本発明は、（１）重鎖フレームワーク領域、重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、および重鎖ＣＤＲ３領域（重鎖ＣＤＲ３領域が配列番号８の配列を含む）、ならびに（２）軽鎖フレームワーク領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域、および軽鎖ＣＤＲ３領域（軽鎖ＣＤＲ３領域が配列番号１３の配列を含む）を含む抗Ｃ６抗体を更に提供し、本抗体はＣ６に結合する。本抗体は、それぞれ配列番号７および１２に示される７Ｅ５抗体の重鎖ＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ２を更に含み得る。本抗体は、それぞれ配列番号６および１１に示される７Ｅ５抗体の重鎖ＣＤＲ１および／または軽鎖ＣＤＲ１を更に含んでもよい。本明細書に開示のかかる抗体の例としては、７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２抗体が挙げられる（実施例６に記載の通り）。
【０１１１】
修飾された配列を有する抗体の生成
別の実施形態では、本発明の抗Ｃ６抗体の可変領域配列またはその一部を修飾して、結合（即ち、非修飾抗体と同じエピトープへの）を保持し、故に機能的に同等である、構造的に関連した抗Ｃ６抗体を作出する。抗原結合を除去することなく改変することができる残基を特定するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０（７）：７７９−８３（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，  ｔｈｅｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｆｉｘｅｄ  ＣＤＲ３  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｎｇｅｓ）、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（９）：８９９−９０３（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｔｏ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３（８）：２６２８−３１（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｃａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１２）：５６４７−５４（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を参照）。
【０１１２】
したがって、本発明の一態様では、上記の操作した抗体のＣＤＲ１、２、および／または３領域は、本明細書に開示の配列番号６〜７および１１〜１３（７Ｅ５  ＣＤＲ）に示されるまさにそのアミノ酸配列（複数可）を含み得る。しかしながら、本発明の他の態様では、本抗体は、７Ｅ５のまさにそのＣＤＲ配列からの誘導体を含むが、依然としてＣ６に効果的に結合する能力を保持する。かかる配列修飾は、１つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換、例えば、上記のような保存的配列修飾を含んでもよい。配列修飾はまた、７Ｅ５抗体の特定のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列についての上記のコンセンサス配列に基づいてもよい。
【０１１３】
したがって、別の実施形態では、操作した抗体は、７Ｅ５抗体の１つ以上のＣＤＲ（配列番号６〜８および１１〜１３に示される）と、例えば、９０％、９５％、９８％、または９９．５％同一である１つ以上のＣＤＲで構成され得る。上で引用した値の中間の範囲、例えば、上の配列のうちの１つ以上に対して、９０〜９５％、９５〜９８％、または９８〜１００％同一の同一性であるＣＤＲも、本発明に包含されることが意図される。
【０１１４】
更に別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（または９０〜９５％、９５％〜９８％、９８％〜１００％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（または９０〜９５％、９５％〜９８％、９８％〜１００％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣ６に結合する単離された抗体を提供する。
【０１１５】
更に別の実施形態では、単離された抗体は、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。
実施例７は、「ミックスアンドマッチ」実験を詳述し、この実験では、これらの重鎖および軽鎖可変領域の各々を、互いに８１個全ての可能性のある組み合わせで対にし、Ｃ６活性の阻害における８１個全ての組み合わせの機能活性を実証した。
【０１１６】
更に、別の実施形態では、ＣＤＲの１つ以上の残基を、結合を修飾するように改変して、理想的な結合定数が達成されるように、より好適な結合の会合速度、より好適な結合の解離速度、またはその両方を達成してもよい。この戦略を使用して、例えば、１０１０Ｍ−１以上の超高結合親和性を有する抗体を達成することができる。当該技術分野で周知であり、本明細書に記載する親和性成熟技法を使用して、ＣＤＲ領域（複数可）を改変した後、結果として得られる結合分子を、結合の所望の変化についてスクリーニングし得る。このため、ＣＤＲ（複数可）の改変時に、最良の組み合わせの結合および低い免疫原性に最適化された抗体が達成されるように、結合親和性の変化および免疫原性を監視し採点する。
【０１１７】
このように、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内の可変領域修飾について、部位指向性突然変異生成またはＰＣＲ媒介性突然変異生成を行って、突然変異（複数可）を導入し、抗体結合に与える影響、または他の目的の機能特性を、本明細書に記載し実施例で提供するように、インビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（本明細書で考察する通り）を導入することが好ましい。突然変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失であり得るが、置換が好ましい。更に、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個、または５個以下の残基を改変する。
【０１１８】
このように、別の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、または配列番号６と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列、または配列番号８と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ３領域、（ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１１と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１１と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、および（ｆ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２と比較して、１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ３領域、を含む、単離された抗Ｃ６モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１９】
更に別の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに（ｂ）配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域、を含む、単離された抗Ｃ６モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２０】
ＣＤＲ内の修飾に加えて、またはその代わりに、修飾は、これらの修飾が抗体の結合親和性を排除しない限り、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のうちの１つ以上の中で行われ得る。例えば、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域における１つ以上の非生殖細胞系列アミノ酸残基は、生殖細胞系列アミノ酸残基、即ち、抗体が顕著な配列同一性を有する、重鎖または軽鎖可変領域についてのヒト生殖細胞系列配列における対応するアミノ酸残基で置換される。例えば、抗体鎖は、それが共に顕著な配列同一性を共有する生殖細胞系列抗体鎖と整列され得、抗体フレームワーク配列と生殖細胞系列鎖フレームワークとの間で一致しないアミノ酸残基は、生殖細胞系列配列からの対応する残基で置換され得る。アミノ酸が抗体可変フレームワーク領域と同等のヒト生殖細胞系列配列可変フレームワーク領域との間で異なる場合、抗体フレームワークアミノ酸は、通常、アミノ酸が以下のカテゴリーのうちの１つに入ることが合理的に予測される場合には、同等のヒト生殖細胞系列配列アミノ酸によって置換されるはずである：
（１）．抗原に直接的に非共有結合するアミノ酸残基、
（２）．ＣＤＲ領域に隣接するアミノ酸残基、
（３）．別のやり方でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、コンピュータモデリングによって決定してＣＤＲ領域の約３〜６Å内にある）アミノ酸残基、または
（４）．ＶＬ−ＶＨ相互作用に関与するアミノ酸残基。
【０１２１】
「抗原に直接的に非共有結合する」残基には、確立されている化学力に従って、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによって、抗原上のアミノ酸と直接的に相互作用する可能性が良好であるフレームワーク領域における位置にあるアミノ酸が含まれる。このように、一実施形態では、本発明の抗体のフレームワーク領域におけるアミノ酸残基は、抗原に直接的に非共有結合する対応する生殖細胞系列アミノ酸残基で置換される。
【０１２２】
「ＣＤＲ領域に隣接する」残基には、抗体の一次配列におけるＣＤＲのうちの１つ以上に直接隣接する位置にある、例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ、またはＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））に直接隣接する位置にある、アミノ酸が含まれる。したがって、一実施形態では、本発明の抗体のフレームワーク領域内にあるアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域に隣接する対応する生殖細胞系列アミノ酸残基で置換される。
【０１２３】
「別のやり方でＣＤＲ領域と相互作用する」残基には、二次構造分析によって、ＣＤＲ領域に影響するのに十分な空間定位にあることが決定されるものが含まれる。かかるアミノ酸は、一般に、ＣＤＲ中のなんらかの原子の約３オングストローム単位（Å）内に側鎖原子を有することになり、上に列挙したものなどの確立されている化学力に従って、ＣＤＲ原子と相互作用し得る原子を含有する必要がある。したがって、一実施形態では、本発明の抗体のフレームワーク領域内にあるアミノ酸残基は、別のやり方でＣＤＲ領域と相互作用する対応する生殖細胞系列アミノ酸残基で置換される。
【０１２４】
フレームワーク中のいくつの位置でのアミノ酸は、多くの抗体においてＣＤＲ構造に重要であることが知られている（例えば、ＣＤＲと相互作用することができる）ことが知られている（全て参照により本明細書に組み込まれる、前出のＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、前出のＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５（１９９０））。これらの著者は、いくつかの既知の抗体の構造の分析によって、ＣＤＲ配座に重要な保存されたフレームワーク残基を特定した。分析された抗体は、ＣＤＲの配座に基づいて、限られた数の構造または「正準」クラスに分類された。正準クラスのメンバー内の保存されたフレームワーク残基を「正準」残基と称する。正準残基には、軽鎖の残基２、２５、２９、３０、３３、４８、６４、７１、９０、９４、および９５、ならびに重鎖の残基２４、２６、２９、３４、５４、５５、７１、および９４が含まれる。追加の残基（例えば、ＣＤＲ構造決定残基）は、Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｔｏｎ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００の方法に従って特定することができる。注目すべきことに、軽鎖の２、４８、６４、および７１位のアミノ酸、ならびに重鎖の２６〜３０、７１、および９４位（Ｋａｂａｔに従う付番）は、多くの抗体においてＣＤＲと相互作用することができると知られている。軽鎖における３５位、ならびに重鎖における９３および１０３位のアミノ酸もまた、ＣＤＲと相互作用する可能性が高い。ＣＤＲの配座に影響し得る追加の残基は、Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７の方法に従って特定することができる。かかる残基は、「バーニヤ」残基と呼ばれ、ＣＤＲの密接な基礎となっている（即ち、その下に「プラットホーム」を形成している）フレームワーク領域における残基である。
【０１２５】
「ＶＬ−ＶＨ相互作用に関与する」残基または「パッキング残基」には、例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４５９２−６６（１９８５）または前出のＣｈｏｔｈｉａらによって定義されている、ＶＬとＶＨとの間の界面にある残基を含む。
【０１２６】
特定のアミノ酸が上述のカテゴリーのうちの１つ以上に中に入るかどうかについては、多少曖昧であることがある。かかる場合には、代替的な変異型抗体が生産され、このうち１つは特定の置換を有し、もう１つは有しない。このように生産された代替的な変異型抗体は、所望の活性のための本明細書に記載のアッセイのうちのいずれか、および選択された好ましい抗体において試験することができる。
【０１２７】
フレームワーク領域内の置換のための追加の候補は、その位置のアミノ酸には異常または「希少」であるアミノ酸である。これらのアミノ酸は、ヒト生殖細胞系列配列の同等の位置、またはより典型的な抗体の同等の位置からのアミノ酸で置換され得る。例えば、抗体のフレームワーク領域におけるアミノ酸がその位置には希少であり、かつ生殖細胞系列配列における対応するアミノ酸が免疫グロブリン配列においてその位置に一般的である場合、または抗体におけるアミノ酸がその位置には希少であり、かつ生殖細胞系列配列における対応するアミノ酸も、他の配列と比較して希少である場合に、置換が望ましくてもよい。異常アミノ酸を、偶然にも抗体に典型的である生殖細胞系列配列からのアミノ酸で代置することによって、抗体の免疫原性をより低くし得ることが企図される。
【０１２８】
「希少」という用語は、本明細書で使用される場合、配列の代表試料中、配列の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、更により好ましくは約３％未満、更により好ましくは約２％未満、および更により好ましくは約１％未満においてその位置で生じるアミノ酸を示し、「一般」という用語は、本明細書で使用される場合、代表試料中、配列の約２５％超であるが、通常は約５０％超において生じるアミノ酸を示す。例えば、全ての軽鎖および重鎖可変領域配列は、それぞれ、互いに特に相同であり、ある特定の重要な位置で同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」にグループ分けされる（前出のＫａｂａｔら）。抗体配列におけるアミノ酸が配列間で「希少」であるか「一般」であるかを決定するときには、その抗体配列と同じサブグループにおける配列のみを考慮することが好ましい場合が多い。
【０１２９】
一般に、抗体のフレームワーク領域は、通常は実質的に同一であり、更に通常は、それらが由来するヒト生殖細胞系列配列のフレームワーク領域と同一である。言うまでもなく、フレームワーク領域におけるアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和性にほとんどまたは全く寄与しない。このため、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、結果として得られる免疫グロブリンの特異性または親和性の感知できる変化なく許容され得る。よって、一実施形態では、可変抗体のフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列可変フレームワーク領域配列またはかかる配列のコンセンサスとの少なくとも８５％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、抗体の可変フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列可変フレームワーク領域配列またはかかる配列のコンセンサスとの少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。
【０１３０】
フレームワーク修飾を行って、例えば、ＵＳ２００３／０１５３０４３においてＣａｒｒらによって記載されているように、抗体の免疫原性を低減するか、またはその中に存在するＴ細胞エピトープを低減若しくは除去することもできる。
【０１３１】
本発明の操作した抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾を行ったものが含まれる。典型的には、かかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つの手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に逆突然変異させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって特定することができる。
【０１３２】
フレームワーク修飾の別の種類は、フレームワーク領域内、または更には１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の可能性のある免疫原性を低減させることを伴う。この手法は、「脱免疫化」とも称され、米国特許公開第２００３０１５３０４３号で更に詳述されている。
【０１３３】
単純なＣ６への結合に加えて、抗体は、その本発明の抗体の他の機能特性の保持について選択されてもよく、これらの機能特性とは、例えば、
（ａ）７Ｅ５、８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、または７Ｆ０２などの本発明の抗Ｃ６抗体と同じエピトープに結合すること、
（ｂ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に５×１０−１０Ｍ以下のＫＤを有すること、
（ｄ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、または
（ｅ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、などである。
【０１３４】
追加の抗体修飾
本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を含有し得る。かかるグリコシル化部位は、改変された抗原結合に起因する抗体の増加した免疫原性または抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２、Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４、Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９、Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ、Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７、Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフにて生じることが知られている。一部の場合には、可変領域グリコシル化を含有しない抗Ｃ６抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることのいずれかによって達成することができる。
【０１３５】
例えば、一実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、可変領域を改変して、可変領域に存在する１つ以上のグリコシル化部位を除去する。より具体的には、グリコシル化を生じやすい部位を除去することが本抗体の配列において望ましい。これは、特にＮ残基および／またはＳ若しくはＴ残基の置換によって、親可変領域で生じる１つ以上のＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）配列（Ｘは任意のアミノ酸残基である）の発生を改変することによって達成することができる。一実施形態では、Ｔ９５をＫ９５に突然変異させる。別の実施形態では、Ｎ４７をＲ４７に突然変異させる。
【０１３６】
例えば、非グリコシル化（即ち、グリコシル化を欠く）抗体を作製し得る。グリコシル化を改変して、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増加させることができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによって獲得することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を排除する、１つ以上のアミノ酸置換を行い得る。かかる非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を増加させ得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【０１３７】
加えてまたはあるいは、本抗体は、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの改変された種類のグリコシル化を有し得る。かかる改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって獲得することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野で説明されており、本発明の組み換え抗体を発現することにより改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株において発現された抗体がその炭水化物上でフコースを欠くようにする。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株を、２つの代置ベクターを使用するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化した断絶によって作出した（米国特許公開第  ２００４０１１０７０４号、およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照）。別の例として、ＥＰ  １，１７６，１９５は、細胞株中で発現される抗体が、α−１，６結合関連酵素を低減させるかまたは排除することによって低フコシル化を呈するように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に断絶したＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を説明している。ＥＰ  １，１７６，１９５はまた、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するための低い酵素活性を有するか、または酵素活性を有しない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）を説明している。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力が低減し、同様にその宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異型ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞を説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。修飾グリコシル化プロファイルを有する抗体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０６／０８９２３１号に記載されているように鶏卵中で産生させることもできる。あるいは、修飾グリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属などの植物細胞中で産生させることができる。植物系における抗体の産生方法は、２００６年８月１１日出願のＡｌｓｔｏｎ  ＆  Ｂｉｒｄ  ＬＬＰ弁理士整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されている。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作され、その結果、操作された細胞株中で発現される抗体が抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を呈するようになる細胞株を記載している（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照）。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断することができ、例えば、フコシダーゼα−Ｌ−フコシダーゼは、フコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【０１３８】
本発明の抗体の可変領域を改変して、１つ以上のグリコシル化部位を排除し、かつ／または抗体の物理的安定性を改善することができる。例えば、一実施形態では、抗体の物理的安定性は、セリンを可変領域の２２８位にてプロリン残基で置換することによって改善される（即ち、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む可変領域を有する）。Ｓ２２８Ｐ改変は、抗体構造を鎖内ジスルフィド結合の形成に対して顕著に安定させる。一実施形態では、本発明の全長抗体は、Ｓ２２８Ｐ改変を有するＩｇＧ４アイソタイプ（ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ）である。
【０１３９】
別の実施形態では、可変領域を改変して、可変領域に存在する１つ以上のグリコシル化部位を排除する。より具体的には、グリコシル化を生じやすい部位を除去することが本抗体の配列において望ましい。上記のように、これは、特にＮ残基および／またはＳ若しくはＴ残基の置換によって、親可変領域で生じる１つ以上のＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）配列（Ｘは任意のアミノ酸残基である）の発生を改変することによって達成することができる。一実施形態では、Ｔ９５をＫ９５に突然変異させる。別の実施形態では、Ｎ４７をＲ４７に突然変異させる。
【０１４０】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われた修飾に加えて、またはその代わりに、本発明の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性などの抗体の１つ以上の機能特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作することができる。本抗体はまた、ここでも抗体の１つ以上の機能特性を改変するために、そのグリコシル化を改変するように化学修飾（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させ得る）または修飾することができる。これらの実施形態の各々は、以下で更に詳述する。Ｆｃ領域における残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を保有することで、インビボの抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）は不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。インビトロおよび／またはインビボの細胞毒性アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃｇＲ結合を欠く（このため、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にし得る。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃｇＲＩＩＩのみを発現し、一方で探求は、ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩ、およびＦｃｇＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７−４９２の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３（１９８６）７０５９−７０６３、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２（１９８５）１４９９−１５０２を参照）、米国特許第５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１−１３６１を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ．ＴＭ．フローサイトメトリー用非放射性細胞毒性アッセイ（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６．ＲＴＭ．非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．を参照）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたは加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいて評定してもよい。またＣ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９およびＷＯ  ２００５／１００４０２中のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２（１９９６）１６３−１７１、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１（２００３）１０４５−１０５２、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３���２００４）２７３８−２７４３）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２００６）１７５９−１７６９を参照）。
【０１４２】
特定の実施形態では、本抗体は、抗体の物理的安定性を改善するように突然変異される可変領域を含む。一実施形態では、本抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域における２２８位に対応する位置でのセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ、ＥＵインデックス）を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。この突然変異は、ヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を排することが報告されている（前出のＡｎｇａｌら；２４１位はＫａｂａｔ付番システムに基づく）。例えば、様々な実施形態では、本発明の抗Ｃ６抗体は、前出のＡｎｇａｌらに記載の２４１位に対応する位置でのセリンがプロリンに突然変異した、ヒトＩｇＧ４定常領域に結合した本明細書に記載の抗体のいずれかの重鎖可変領域を含み得る。このように、ヒトＩｇＧ４定常領域に結合した重鎖可変領域について、この突然変異は、ＥＵインデックスによるＳ２２８Ｐ突然変異に対応する。
【０１４３】
別の実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変される、例えば、増加または減少するように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号で更に説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するように、または抗体の安定性を増加または減少させるように改変される。
【０１４４】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異される。より具体的には、１つ以上のアミノ酸突然変異は、抗体が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対する障害のあるスタフィロコッシル（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号で更に説明されている。
【０１４５】
別の実施形態では、本抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。様々な手法が可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの突然変異のうちの１つ以上を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、本抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取したサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変し得、これは、米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載の通りである。更に別の手法においては、本抗体は、２つの突然変異、４３４位のセリンでの１つと、３１１位のイソロイシン、３１１位のバリン、４３６位のイソロイシン、および４３６位のバリンからなる群から選択される第２の突然変異とを導入することによって、その生物学的半減期を増加させるように修飾する。この手法は、米国特許公開第２０１２／６１２８６６３号で説明されている。
【０１４６】
更に他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で代置して、抗体のエフェクター機能（複数可）を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で代置し、その結果、抗体が、エフェクターリガンドへの改変された親和性を有するが、親抗体への抗原結合能力を保持するようにし得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この手法は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号で更に詳述されている。
【０１４７】
別の実施形態では、アミノ酸残基３２９、３３１、および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で代置し、その結果、抗体が、改変されたＣ１ｑ結合および／または低減した若しくは無効となった補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有するようにし得る。この手法は、米国特許第６，１９４，５５１号で更に詳述されている。
【０１４８】
別の実施形態では、アミノ酸２３１位および２３９位内の１つ以上のアミノ酸残基を改変して、それにより抗体が補体を結合させる能力を改変する。この手法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／２９３５１号で更に説明されている。
【０１４９】
更に別の実施形態では、Ｆｃ領域を修飾して、抗体が抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増加させ、かつ／または１つ以上のアミノ酸を、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、若しくは４３９位にて修飾することによって抗体のＦｃγ受容体への親和性を増加させる。この手法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／４２０７２号で更に説明されている。更に、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、結合が改善した変異型が説明されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、および３３９位での特異的突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。加えて、以下の組み合わせの突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１５０】
更に別の実施形態では、Ｆｃ領域を修飾して、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を低減し、かつ／またはＰｒｏ３２９位でのアミノ酸置換、ならびに好ましくはＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、およびＰ３３１Ｓから選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を導入することによって、抗体のＦｃγ受容体への親和性を低減する。この手法は、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号で説明されている。
【０１５１】
低減したエフェクター機能が低減した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を伴うものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異を含む、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７位のうちの２つ以上での置換を伴うＦｃ突然変異が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１）。
【０１５２】
ＦｃＲｓへの結合が改善または衰退したある特定の抗体変異型が説明されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ  ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４を参照）。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、抗体変異型は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位での置換（残基のＥＵ付番）を伴うＦｃ領域を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ  ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４に記載されているように、改変された（即ち、改善したかまたは衰退した）Ｃ１ｑ結合、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。
【０１５５】
母体ＩｇＧの胎児への移送に貢献する、半減期が増加し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善した抗体は（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７（１９７６）５８７−５９３、およびＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４（１９９４）２４２９−２４３４）は、ＵＳ  ２００５／００１４９３４に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する、中に１つ以上の置換を伴うＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異型には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を伴うものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異型の他の例については、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８８）７３８−７４０、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ  ９４／２９３５１号も参照されたい。
【０１５６】
加えて、本抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、典型的には、本抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ群が抗体または抗体断片に結合した状態となる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似した反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化によって実行する。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態の任意のもの、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ若しくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することが意図される。ある特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野で既知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照されたい。
【０１５７】
Ｃ６に対するモノクローナル抗体の特性評価
本発明のモノクローナル抗体は、様々な既知の技法を使用して、Ｃ６への結合および／またはＣ６の機能的阻害について特性評価することができる。典型的には、抗体のその標的抗原への結合は、まずＥＬＩＳＡによって特性評価する。端的には、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中の精製したＣ６でコーティングした後、ＰＢＳ中で希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの無関係のタンパク質で遮断し得る。Ｃ６で免疫付与したマウスからの血漿の希釈物を各ウェルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した後、アルカリホスファターゼと複合体化させたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬と共に、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ＡＢＴＳ基質を用いて現像し、４０５のＯＤにて分析した。好ましくは、最も高い結合および／または機能的阻害活性を呈する抗体の最も高い力価を発現するマウスを融合に使用する。
【０１５８】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、故にＣ６免疫原性との陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングすることができる。次に、Ｃ６と好ましくは高い親和性で結合するハイブリドーマをサブクローニングし、更に特性評価し得る。次に、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡにより）各ハイブリドーマから１つのクローンを、細胞バンクを作製するため、および抗体精製のために選択し得る。
【０１５９】
加えてまたはあるいは、抗体がＣ６活性を阻害または遮断する能力を決定した機能アッセイを、目的の抗体のスクリーニングおよび選択に使用し得る。好適なインビトロ機能アッセイには、実施例１で詳述するように、溶血アッセイおよびＭＡＣ  ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。インビボで機能活性を決定するための好適なアッセイは、実施例４で詳述する。
【０１６０】
抗Ｃ６抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、ローラーボトル、２リットルのスピナーフラスコまたは他の培養系において成長させ得る。上清を濾過し濃縮した後、タンパク質Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた親和性クロマトグラフィーを行い、タンパク質を精製し得る。ＰＢＳへの緩衝液交換後、濃度を、１．４３の吸光係数を使用するＯＤ２８０によって、または好ましくは比濁分析によって決定し得る。ＩｇＧは、ゲル電気泳動によって、または抗原特異的方法によって確認し得る。
【０１６１】
選択された抗Ｃ６モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、各抗体を、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してビオチン化し得る。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジンで標識したプローブを用いて検出し得る。精製した抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、当該技術分野で認識されている技法を使用して行い得る。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを４℃で一晩１０μｇ／ｍｌの抗Ｉｇでコーティングし得る。５％のＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、２時間周囲温度で１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体または精製したアイソタイプ対照と反応させる。次に、ウェルを他のアイソタイプ特異的複合体化プローブのいずれかと反応させ得る。プレートを現像し、上記のように分析する。
【０１６２】
様々な抗Ｃ６抗体の結合親和性、交差反応性、および結合動態を分析するための方法としては、当該技術分野で既知の標準的なアッセイ、例えば、本明細書の実施例２に記載するＢｉａｃｏｒｅ（商標）２０００  ＳＰＲ計器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析が挙げられる。
【０１６３】
好ましくは、本発明の抗体は、ＫＤが５×１０−８Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが２×１０−８Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが５×１０−９Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが４×１０−９Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが３×１０−９Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが２×１０−９Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが１×１０−９Ｍ以下でＣ６に結合し、ＫＤが５×１０−１０Ｍ以下でＣ６に結合し、またはＫＤが２．５×１０−１０Ｍ以下でＣ６に結合する。
【０１６４】
好ましくは、本発明の抗体は、少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４０時間、または少なくとも４５時間のＴ１／２（表面プラズモン共鳴によって決定した場合）を有する。
【０１６５】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、その様々な物理的特性によって特性評価して、その異なるクラスを検出および／または区別することができる。
【０１６６】
好ましい実施形態では、本開示の抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じ、ポリペプチド鎖にキンクを導入しその安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の作出をもたらし得る。
【０１６７】
各抗体は、一般に６〜９．５のｐＨ範囲に入る固有の等電点（ｐＩ）を有することになる。ＩｇＧ１抗体についてのｐＩは、典型的には、７〜９．５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体についてｐＩは、６〜８のｐＨ範囲に入る。ｐＩが正常範囲を外れている抗体は、インビボ条件下で何らかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ると推測される。このため、正常範囲に入るｐＩ値を含む抗Ｃ６抗体を有することが好ましい。これは、ｐＩが正常範囲内である抗体を選択するか、または荷電表面残基を突然変異させることによって達成することができる。
【０１６８】
好ましい実施形態では、急速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定することができる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ＤＥ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２）。
【０１６９】
別の好ましい実施形態では、抗体は、望ましくない免疫応答および／または改変された若しくは好ましくない薬物動態特性の誘発に繋がり得る凝集が最小限である抗体を選択する。一般的に、凝集が２５％以下、好ましくは２０％以下、更により好ましくは１５％以下、更により好ましくは１０％以下、および更により好ましくは５％以下の抗体が許容可能である。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および光散乱を含む、いくつかの技法によって測定することができる。
【０１７０】
各抗体は、特有の融解温度を有することになり、より高い融解温度は、インビボでのより優れた全体的安定性を示す（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  ＭＣ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１）。一般的に、ＴＭ１（初期アンフォールディングの温度）は、６０℃超、好ましくは６５℃超、更により好ましくは７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２）または円偏光二色性（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９）を使用して測定することができる。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の抗体は、高い融解温度を有する。一実施形態では、抗体は、少なくとも６５℃、より好ましくは少なくとも６６℃、更により好ましくは少なくとも６７℃、および更により好ましくは少なくとも６８℃の融点を有する。好ましくは、本発明の抗体は、６７℃〜７２℃、より好ましくは６８℃〜７２℃、または６９℃〜７２℃、または７０℃〜７２℃、または６９℃〜７１．４３℃の範囲の融点を有する。
【０１７２】
ＩＩ．免疫毒素、免疫抱合体、および抗体誘導体
別の実施形態では、本発明の抗体は、細胞毒素、薬物、または放射性同位体などの治療部分に連結される。細胞毒素に抱合されるとき、これらの抗体抱合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害な（例えば、殺滅する）任意の薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗物質薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（元ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（元アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、放射性同位体、例えば、放射性ヨウ素に抱合させて、細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。
【０１７３】
本発明の抗体抱合体は、所与の生体応答を修飾するために使用することができ、薬物部分は、伝統的な化学治療薬に限定されるものと解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。かかるタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、若しくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素若しくはその活性断片；腫瘍壊死因子若しくはインターフェロン−γなどのタンパク質；または例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、若しくは他の成長因子などの生体応答修飾物質が含まれ得る。
【０１７４】
かかる治療部分を抗体に抱合させるための技法は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１７５】
抗体および細胞毒素の抱合体は、様々な二官能性タンパク質結合剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩、イミノチオラン、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなどのイミドエステルの二官能性誘導体、スベリン酸ジスクシンイミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビス−アジド化合物、トルエン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製し得る。Ｃ１４標識化１−イソチオシアノベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への抱合に好適なキレート剤である。
【０１７６】
免疫毒素の毒素成分は、例えば、化学療法剤、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素若しくはその断片などの毒素、または小分子毒素、または２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅなどの放射性アイソトープであり得る。
【０１７７】
かかる免疫抱合体の生成に有用な化学療法剤としては、ＤＭ−１およびＤＭ−４を含むメイタンシノイド、オーリスタチン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソイド、例えば、パクリタキセル、およびドセタキセル、タキソテール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォサミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロラムブシル、メルファラン、ならびに他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。タモキシフェンおよびオナプリストンなどの、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤も含まれる。使用することができる毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、サポリン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｎｅ）が挙げられる。小分子毒素としては、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、パリトキシン、およびＣＣ１０６５が挙げられる。
【０１７８】
抗体を抱合させて免疫毒素を形成し得る追加の治療薬としては、代謝拮抗物質薬、アルキル化剤、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、および抗有糸分裂剤が挙げられる。抱合体において、抗体および治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、またはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーによって抱合される。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号１５）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。複合体は、米国特許第７，０８７，６００号、同第６，９８９，４５２号、および同第７，１２９，２６１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０２／０９６９１０号、同第ＷＯ  ０７／０３８６５８号、同第ＷＯ  ０７／０５１０８１号、同第ＷＯ  ０７／０５９４０４号、同第ＷＯ  ０８／０８３３１２号、および同第ＷＯ  ０８／１０３６９３号、米国特許公開第２００６００２４３１７号、同第２００６０００４０８１号、および同第２００６０２４７２９５号に記載されているように調製することができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
本発明の抗体はまた、試料試験およびインビボの撮像を含む診断目的に使用することもでき、この目的のために、抗体（またはその結合断片）を適切な検出可能な薬剤に抱合させて、免疫抱合体を形成し得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身撮像については放射性同位体を含む検出可能な標識、試料試験については、放射性同位体、酵素、蛍光標識、および他の好適な抗体タグである。
【０１８０】
Ｃ６検出には、検出可能な標識は、インビトロ診断の分野で現在使用されている様々な型のうちのいずれかであることができ、これには、コロイド金などの金属ゾルを含む微粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３Ｓ、若しくはＮ４型のペプチドキレート剤によって提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などのアイソトープ、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団、ならびに所与の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識、およびポリメラーゼ連鎖反応などによる増幅後に明らかとなるポリヌクレオチドタグが含まれる。好適な酵素標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。例えば、標識は、１，２ジオキセタン基質、例えば、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、二ナトリウム３−（４−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ｛３．３．１．１  ３，７｝デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）、ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）または当業者に周知の他の発光基質、例えば、テルビウム（ＩＩＩ）およびユウロピウム（ＩＩＩ）などの好適なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって検出される酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択した標識によって決定される。標識またはその反応産物の外観は、標識が微粒子であり適切なレベルで蓄積する場合には裸眼を使用するか、分光光度計、照度計、蛍光光度計、および同様のものなどの計器を全て標準的な慣行に従って使用して、獲得し得る。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体を更に修飾して、当該技術分野で既知であり、容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含有させてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分枝または非分枝であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、１つ超のポリマーが結合する場合には、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善させる抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で療法において使用されることになるかなどを含むがこれらに限定されない考慮すべき事柄に基づいて決定し得る。
【０１８２】
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質性部分との複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２００５）１１６００−１１６０５）。放射線は、いずれの波長であってもよく、通常の細胞を害さず、非タンパク質性部分を抗体−非タンパク質性部分の近位にある細胞が殺滅される温度に加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０１８３】
実質的に（またはほぼ）非免疫原性である連結をもたらす複合体化が特に好適である。したがって、ペプチド−（即ち、アミド−）、スルフィド−、（立体障害）、ジスルフィド−、ヒドラゾン−、またはエーテル連結が特に好適である。これらの連結は、ほぼ非免疫原性であり、血清中で適度な安定性を示す（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（２００９）２３５−２４４、ＷＯ  ２００９／０５９２７８、ＷＯ  ９５／１７８８６を参照）。
【０１８４】
部分および抗体の生化学的性質に応じて、異なる複合体化戦略が利用可能である。この部分が天然に存在するかまたは５０〜５００個のアミノ酸の組み換えである場合、当業者であれば容易に理解できるタンパク質複合体の合成についての化学を説明しているテキスト中の標準的な手順がある（例えば，Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，Ｄ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４７（２００８）１００３０−１００７４を参照）。一実施形態では、抗体または部分内のシステイン残基とのマレイミド部分の反応を使用する。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片を使用する場合に特に好適な結合化学である。あるいは、一実施形態では、抗体または部分のＣ末端部への結合を行う。例えばＦａｂ断片のタンパク質のＣ末端修飾は、例えば、説明されているように行い得る（Ｓｕｎｂｕｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７（２００９）３３６１−３３７１）。
【０１８５】
一般に、部位特異的反応および共有結合は、天然アミノ酸を、存在する他の官能基の反応性と直交である反応性を有するアミノ酸に形質転換することに基づく。例えば、希少配列構成内の特異的システインをアルデヒド中で酵素的に転換させ得る（Ｆｒｅｓｅ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｄｉｅｒｋｓ，Ｔ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．１０（２００９）４２５−４２７を参照）。ある特定の酵素の所与の配列構成にある天然アミノ酸との特異的酵素反応性を利用して所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である（例えば、Ｔａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（２００４）１１９−１２６、Ｇａｕｔｉｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５（２００８）１２８−１３６；およびＣ−−Ｎ結合のプロテアーゼ触媒形成がＢｏｒｄｕｓａ，Ｆ．，Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）３８９−４０３によって使用されている）。
【０１８６】
部位特異的反応および共有結合も、適切な修飾試薬を用いて末端アミノ酸の選択的反応によって達成することができる。
【０１８７】
Ｎ末端システインのベンゾニトリルとの反応性（Ｒｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８（２００９）９６５８−９６６２）を使用して、部位特異的共有結合を達成し得る。
【０１８８】
天然の化学的ライゲーションも、Ｃ末端システイン残基に依存し得る（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｖｏｇｅｌ；Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９），２２（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），６５−９６）。
【０１８９】
ＥＰ  １  ０７４  ５６３は、負に荷電したアミノ酸の範囲内のシステインの、正に荷電したアミノ酸の範囲に位置するシステインとのより速い反応に基づく複合体化方法を説明している。
【０１９０】
この部分はまた、合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合、直交化学反応性を有するアミノ酸をかかる合成中に組み込み得る（例えば、ｄｅ  Ｇｒａａｆ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０（２００９）１２８１−１２９５を参照）。多種多様な直交官能基が問題となり、合成ペプチドに導入され得るため、かかるペプチドのリンカーへの複合体化は、標準的な化学である。
【０１９１】
単標識されたポリペプチドを得るために、１：１の化学量論の複合体を、他の複合体化副生物からクロマトグラフィーによって分離し得る。この手順は、染料で標識した結合対メンバーおよび荷電したリンカーを使用することによって促進することができる。この種の標識され高度に負に荷電した結合対メンバーを使用することによって、電荷および分子量の差異を分離に使用できるため、単一複合体化ポリペプチドは、非標識ポリペプチド、および１つ超のリンカーを担持するポリペプチドから容易に分離される。蛍光染料は、複合体を標識した一価結合剤のような非結合成分から精製するのに有用であり得る。
【０１９２】
一実施形態では、エフェクター部分は、結合部分、標識化部分、および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
【０１９３】
ＩＩＩ．組成物
別の実施形態では、本発明は、組成物、例えば、担体（例えば、薬学的に許容される担体）と共に製剤化した１つの本発明のモノクローナル抗体またはその組み合わせを含有する組成物を提供する。本発明の抗体を含む二重特異性分子を含有する組成物も提供される。一実施形態では、本組成物は、複数（例えば、２つ以上）の本発明の単離された抗体の組み合わせを含む。好ましくは、本組成物の抗体の各々は、明確に異なる事前に選択されたＣ６のエピトープに結合する。
【０１９４】
本発明の薬学的組成物は、併用療法において、即ち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、抗炎症薬、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、免疫抑制剤、および化学療法薬などの少なくとも１つ以上の追加の治療薬を伴う本発明の組成物を含み得る。本発明の薬学的組成物は、放射線療法と組み合わせて投与することもできる。他の抗体との同時投与も本発明に包含される。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「担体」および「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適である。投与経路に応じて、活性化化合物、即ち、抗体、二重特異性および多特異性分子は、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の自然条件から化合物を保護するために物質でコーティングしてもよい。
【０１９６】
本発明の抗体および構築物と共に使用し得るアジュバントの例としては、完全および不完全フロイトアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）；水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン誘導体化多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、−７、−１２、および他の同様の因子などのサイトカイン；３Ｄ−ＭＰＬ；ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ならびにモノホスホリルリピドＡ、例えば、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが挙げられる。
【０１９７】
ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ、例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号、および同第４，９１２，０９４号を参照されたい）。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）が周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ  ９９／３３４８８、および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列も、例えば、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって説明されている。
【０１９８】
更なる代替的なアジュバントとしては、例えば、ＱＳ２１およびＱＳ７、エスチン、ジギトニン、またはカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）若しくはキヌア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）サポニンを含む、Ｑｕｉｌ  Ａなどのサポニン若しくはその誘導体（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）；ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）；ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能なＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４）；Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）；ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸塩（ＡＧＰ）；ＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１に記載されているものなどのポリオキシエチレンエーテルアジュバント；イミキモド［Ｓ−２６３０８、Ｒ−８３７］（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１８２０−１８２６，２００１、およびレシキモド［Ｓ−２８４６３，  Ｒ−８４８］（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０４：６４−７４，２０００などの合成イミダゾキノリン；ツカレソール（ｔｕｃａｒｅｓｏｌ）（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：７１−７５，１９９５）などの抗原提示細胞およびＴ細胞表面に恒常的に発現するカルボニルおよびアミンのシッフ塩基；例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＴＧＦ−アルファ、およびＴＧＦ−ベータなどの炎症誘発性サイトカイン、インターフェロンガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１などのＴｈ１誘導因子、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３などのＴｈ２誘導因子、ならびにＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０Ｌなどの他のケモカインおよび共刺激遺伝子を含む、タンパク質またはペプチドのいずれかとしてのサイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子；ＣＴＬＡ−４およびＬ−セレクチンなどのリガンドを標的とする免疫刺激剤、Ｆａｓなどのアポトーシス刺激性タンパク質およびペプチド；バクスフェクチン（ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３７７８−３７８６，２００１）スクアレン、アルファ−トコフェロール、ポリソルベート８０、ＤＯＰＣ、およびコレステロールなどの合成脂質系アジュバント；内毒素［ＬＰＳ］（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２３−３０，２０００）；合成マイコバクテリアリポタンパク質、マイコバクテリアタンパク質ｐ１９ペプチドグリカン、テイコ酸、およびリピドＡなどのＴｏｌｌ受容体にＴｈ１誘導性サイトカインを産生させるリガンド；ならびにＣＴ（コレラ毒素、サブユニットＡおよびＢ）およびＬＴ（大腸菌からの易熱性腸毒素、サブユニットＡおよびＢ）、熱ショックタンパク質ファミリー（ＨＳＰ）、およびＬＬＯ（リステリオリシンＯ；ＷＯ  ０１／７２３２９）が挙げられる。これらおよび様々な更なるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストは、例えば、Ｋａｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｙ  ２００７，Ｖｏｌ  １３，Ｎｏ  ５に記載されている。
【０１９９】
「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いずれの望まれない毒性効果も与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。かかる塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、塩化水素、窒素、リン、硫黄、臭化水素、ヨウ化水素、亜リン、および同様のものなどの非毒性無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸、および同様のものなどの非毒性有機酸が含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および同様のものなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン、および同様のものなどの非毒性有機アミンが含まれる。
【０２００】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の様々な方法によって投与され得る。当業者には理解されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なることになる。活性成分は、化合物を急速な放出から保護する担体、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤と共に調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性のポリマーを使用することもできる。かかる製剤の調製のための多くの方法が特許取得され、当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０２０１】
本発明の化合物をある特定の投与経路によって投与するためには、その不活性化を防止するための物質によって化合物をコーティングするか、またはこの物質を同時投与することが必要となる場合がある。例えば、本化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤中で対象に投与してもよい。許容される希釈剤としては、生理食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦエマルション、および従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２０２】
担体としては、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合性でない限り、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。追加の活性化合物も本組成物に組み込むことができる。
【０２０３】
治療用化合物は、典型的には、製造および保管条件下で無菌および安定である必要がある。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化し得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には求められる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持し得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましくなる。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって引き起こすことができる。
【０２０４】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、上で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込んだ後、無菌精密濾過を行うことによって調製し得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上で列挙したものからの求められる他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射溶液用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末、それに加えてその事前に無菌濾過した溶液からの任意の更なる所望の成分を生む、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【０２０５】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整する。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかに分割した用量を、時間をかけて投与してもよく、あるいは用量を、治療状況の危急によって示される通りに比例的に低減するかまたは増加させてもよい。例えば、本発明の抗体は、皮下若しくは筋肉内注射によって週に１回若しくは２回、または皮下若しくは筋肉内注射によって月に１回または２回、投与してもよい。
【０２０６】
親組成物は、投与の簡便性及製剤均一性のために投与単位で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位は、治療される対象への単位剤形として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、求められる薬学的担体と併せて所望の治療効果を生むように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位の明細は、活性化合物の固有の特性、および達成するべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個人における過敏症の治療のためのかかる活性化合物を調合する技法に内在する限界に決定付けられるか、またはそれに直接的に依存する。
【０２０７】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン、塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、および同様のものなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、レシチン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール、および同様のものなどの油溶性抗酸化剤、ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、および同様のものなどの金属キレート剤が挙げられる。
【０２０８】
本治療組成物に対して、本発明の製剤には、静脈内、腹腔内、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、経膣、および／または非経口投与に好適なものが含まれる。製剤は、単位剤形において簡便に提示され得、調剤学の分野で既知の任意の方法によって調製され得る。担体材料と組み合わせて単一の剤形を生産し得る活性成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて個異なることになる。担体材料と組み合わせて単一の剤形を生産し得る活性成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物の量となる。一般に、１００パーセント中、この量は、活性成分の約０．００１パーセント〜約９０パーセント、好ましくは約０．００５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約０．０１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０２０９】
経膣投与に好適な本発明の製剤には、当該技術分野で適切であることが知られている担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡剤も含まれる。本発明の組成物の局所または経皮投与用剤形には、粉末剤、噴霧剤、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ、および吸入剤が挙げられる。本活性化合物は、薬学的に許容される担体、および必要な場合がある任意の保存剤、緩衝剤、または推進剤と無菌条件下で混合し得る。
【０２１０】
「非経口投与」および「非経口で投与される」という語句は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および内部胸骨注射および注入を非限定的に含む。
【０２１１】
本発明の薬学的組成物中で用いてもよい好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同様のものなど）およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適当な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用によって、分散剤の場合には求められる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持し得る。
【０２１２】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の防止を、前出の無菌処理と、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール、および同様のものを含めることとの両方によって確実にし得る。糖、塩化ナトリウム、および同様のものなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。加えて、注射用の医薬品形態の持続的吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって引き起こしてもよい。
【０２１３】
本発明の化合物をヒトおよび動物に医薬品として投与するとき、これらは、単独で、または例えば、０．００１〜９０％（より好ましくは０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％など）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として付与し得る。
【０２１４】
選択する投与経路に関わらず、好適な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に既知の従来的な方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０２１５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者にとって毒となることなく、特定の患者、組成物、および投与様式のために所望される治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように、変化させ得る。選択された用量レベルは様々な薬物動態因子に依存することになり、これらの因子には、用いられる本発明の特定の組成物、またはそれらエステル、塩、若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および／または治療される患者の物質、年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、および既往歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む。当該技術分野の医師または獣医師であれば、有効量の必要とされる薬学的組成物を容易に決定し処方することができる。例えば、医師および獣医師は、薬学的組成物中で用いられる本発明の化合物の投薬を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に増加させ得る。一般に、好適な本発明の組成物の日用量は、治療効果を生むのに有効な最低用量である化合物の量となる。かかる有効用量は、一般に、上記の因子に依存することになる。静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与が好ましく、好ましくは標的の部位の近くに投与する。所望の場合、有効日用量の治療組成物は、１日を通して適切な間隔を空けて別個に投与される２、３、４、５、６、またはそれ以上の副用量として、任意選択で単位剤形で、投与してもよい。本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、本化合物を薬学的製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【０２１６】
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、無針皮下注射器、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６に開示されている器具によって投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、医薬品を制御された速度で分注するための移植型マイクロ注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；薬剤を、皮膚を通して投与するための治療器具を開示している米国特許第４，４８６，１９４号；医薬品を正確な注入速度で送達するための医薬品注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；継続的な薬物送達のための変流量移植型注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のかかるインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に既知である。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、適当なインビボでの分布を確実にするように製剤化し得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの親水性が高い化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢをわたることを確実にするために（所望の場合）、これらを例えばリポソーム中で製剤化し得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含むことにより、標的化した薬物送達を強化し得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。例となる標的化部分としては、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）（これらの異なる種が本発明の製剤および発明の分子の成分を含んでもよい）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられ、併せてＫ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ、Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ、Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照されたい。本発明の一実施形態では、本発明の治療化合物はリポソーム中で製剤化され、より好ましい実施形態では、このリポソームは標的化部分を含む。本組成物は、容易な注射器使用性が存在する程度に流動性である必要がある。これは製造および保管条件下で安定である必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０２１８】
本組成物は、無菌であり、本組成物を注射器によって送達できる程度に流動性である必要がある。水に加えて、担体は、等張性緩衝生理食塩溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物であり得る。適当な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には求められる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持し得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩またはゼラチンを組成物中に含めることによって引き起こすことができる。
【０２１９】
上記のように活性化合物が好適に保護されている場合、本化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体を用いて経口投与してもよい。
【０２２０】
ＩＶ．本発明の使用および方法
本発明の抗Ｃ６抗体は、Ｃ６を必要とする膜侵襲複合体の形成が阻害されるように、Ｃ６をインビトロおよびインビボの両方で機能的に阻害することができる。したがって、別の態様では、本発明は、対象において膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成または活性を阻害する方法に関し、本方法は、対象に、本発明の抗体を、対象においてＭＡＣ形成または活性を阻害するのに有効な量で投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象において補体系の望まれない活性によって媒介される障害の症状を治療、防止、または低減する方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。かかる障害の例は、以下で更に記載する。
【０２２１】
米国特許第８，７０３，１３６号に詳述するように（その内容全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）、補体系の阻害によって軸索の再生が強化され得ることが認められている。このため、補体系の阻害、特にＭＡＣ形成の阻害のための抗Ｃ６抗体の使用は、例えば、中枢または末梢神経系の傷害または疾患による影響を受けた哺乳動物において、軸索再生が求められる状態の治療に使用することができる。本発明に従って治療され得る軸索再生を必要とする状態には、末梢または中枢神経系の物理的傷害および神経変性障害が含まれる。
【０２２２】
一実施形態では、本発明の抗体は、軸索再生を促進する。本明細書で使用される場合、「軸索再生を促進する」または「神経再生を促進する」という用語は、軸索または神経変性を低減または防止することとは区別される。軸索または神経再生の促進（または助長）は、本明細書では、軸索または神経の再生が、治療されていない対象と比較して治療される対象において改善することを意味すると理解される。軸索の改善した再生は、好ましくは、治療されていない対象と比較して治療される対象において（軸索若しくは神経傷害の後、または治療開始の後）より早い時点で生じる再生である。軸索または神経の改善した再生はまた、治療されていない対象と比較して治療される対象においてより高速におよび／またはより大きい程度に生じる再生を含む。本発明に従う抗体は、このため、感覚機能または運動機能の増大を生むことが好ましい。
【０２２３】
したがって、一実施形態では、本発明は、対象において神経を再生する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象において損傷または変性した神経の回復を促進する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。更に別の実施形態では、本発明は、対象において神経の変性を低減または遅延させる方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【０２２４】
対象は、末梢神経系（ＰＮＳ）または中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害などの神経の物理的傷害、例えば、物理的傷害からの神経外傷を患い得る（以下で更に考察する）。物理的傷害は、例えば、外傷性傷害（例えば、事故）、外科的傷害、または非外傷性傷害（神経圧迫など）に由来し得る。一実施形態では、抗体は、傷害部位にまたはその付近に投与される。あるいは、対象は、後天性および／若しくは先天性であり得る免疫媒介性炎症性障害および／若しくは進行性神経変性障害、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）などの慢性脱髄性神経障害、または重症筋無力症若しくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの他の神経変性障害といった疾患を患っていてもよい（以下で更に考察する）。
【０２２５】
軸索再生の改善は、好ましくは、ヒト対象において比較的容易に実施される機能試験によって決定され、例えば、感覚機能または運動機能の回復が、当該技術分野で利用可能な標準試験において決定されることが好ましい（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ．４０：２１９−２２４、Ｊｅｒｏｓｃｈ−Ｈｅｒｏｌｄ（２００５）Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ．３０：２５２−２６４を参照されたい）。好適な試験は、好ましくは、定量的で標準化されたものであり、より好ましくは、その精神測定学的特性を評価および定量したものである。かかる試験としては、例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｔｅｓｔ（ＷＥＳＴ）またはＳｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ｔｅｓｔ（ＳＷＭＴ）、および触知認識のための形状感触識別（ＳＴＩ）試験が挙げられる。改善した軸索再生は、Ｈａｒｅ，Ｇ．Ｍ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８９：２５１−２５８およびＤｅ  Ｋｏｎｉｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．７４：２３７−２４６によって説明されているように、感覚機能または運動機能の回復についての機能試験によって、試験動物において実験的に決定し得る。抗体は、例えば、上で示した試験において決定し得るように、感覚機能または運動機能の増大を生むことが好ましい。
【０２２６】
実施例８は、本発明の抗Ｃ６抗体が感覚機能に与える影響を試験するために使用することができる動物モデルを詳述する。この神経挫滅モデル（坐骨神経の挫滅）を使用して、抗ヒトＣ６モノクローナル抗体がヒトＣ６を補充したＣ６ノックアウトラット（ＰＶＣ）における感覚機能の回復に与える影響を試験する。神経挫滅は、末梢神経傷害のモデルである。ＷＯ  ２０１０／００５３１０（ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０４１８）、およびｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：２９５−３０２を参照されたい。
【０２２７】
改善した軸索再生はまた、組織学的検査によって試験動物において実験的に決定してもよく、例えば、改善した再ミエリン化を、治療されていない動物および治療された動物における軸索周辺のミエリン鞘の測定値を比較することによって決定してもよく、ここでは、より厚いミエリン鞘が改善した再ミエリン化を示す。より効率的な軸索再生は、治療されていない動物におけるより小さい軸索の群と比較した場合の、治療された動物における直径が大きい単一の軸索芽の生産として決定し得る。
【０２２８】
抗体の適切な用量は、上記の感覚機能または運動機能の改善によって見られ得るような軸索再生を助長するのに有効な量である。「有効量」、「治療量」、または「有効用量」とは、所望の薬理効果または治療効果を引き出し、それにより傷害または障害の有効な治療をもたらすのに十分な量を意味する。
【０２２９】
神経傷害を最低限に抑えるためおよび／または軸索再生をできるだけ早く促進するために、本発明の方法では、抗体は、神経傷害の発生の直後に、即ち、神経傷害の発生後、２４、１２、６、３、２、または１時間以内、より好ましくは４５、３０、２０、または１０分以内に投与することが好ましい。本発明の一実施形態では、本抗体は、神経傷害を最低限に抑えるように、および／または神経の外科的傷害の直後に軸索再生を促進するように、神経傷害の危険を伴う手術（以下参照）の前に（例えば、予防措置として）投与してもよい。
【０２３０】
軸索再生を必要とする様々な状態を本発明の抗体によって治療し得る。これらの状態には、ＰＮＳの傷害およびＣＮＳの傷害が含まれる。これらの状態には、物理的傷害の結果としてのおよび疾患に起因する神経外傷が含まれる。かかる疾患には、免疫媒介性炎症性障害若しくは傷害、ならびに／または後天性および／若しくは先天性であり得る進行性神経変性障害が含まれる。
【０２３１】
ＰＮＳおよびＣＮＳの物理的傷害は、外科的傷害を含む外傷性傷害、または非外傷性傷害であってもよい。本発明の方法および／または医薬品を用いて治療され得る外傷性ＰＮＳおよびＣＮＳ傷害としては、脊髄損傷、および衝突、自動車事故、銃創、骨折、脱臼、裂傷、または何らかの他の形態の穿通性外傷からの外傷を含む末梢神経への外傷性創傷が挙げられる。外傷を通して傷害を受けた治療され得る末梢神経には、指神経、正中神経、尺骨神経、橈骨神経、顔面神経、脊髄副神経、および腕神経叢神経が含まれる。
【０２３２】
外科的ＰＮＳ傷害は、本明細書では、外科手術中に神経を除去または切断することが臨床的に必要となる場合に生じる末梢神経への傷害と理解される。これは、毎年何千もの外科手術において発生する。本発明の方法および／または医薬品によって治療され得る外科的傷害を受けた末梢神経の一例としては、例えば、勃起機能および膀胱制御を支援する海綿体神経が挙げられ、これらの神経は、前立腺腫瘍およびその周辺組織の外科的除去中に損傷を受けることが多い。本発明に従って治療され得る外科的傷害を受けた末梢神経の別の例は、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）後の横隔神経である。
【０２３３】
本発明の抗体によって治療され得る非外傷性物理的ＰＮＳ傷害には、絞扼性神経障害としても知られる末梢神経の圧迫および／または接着が含まれる。最も一般的な絞扼性神経障害は、手根管症候群である。
【０２３４】
加えて、免疫媒介性炎症性障害または傷害が本発明の抗体によって治療され得る。これらには、自己免疫基盤を有し、乏突起膠細胞またはミエリンに直接引き起こされた損傷の結果として神経脱髄をもたらすと考えられる中枢および末梢神経系の脱髄性疾患が含まれる。かかる脱髄性疾患としては、例えば、ギランバレー症候群（ＧＢＳ；炎症性脱髄性多発性神経障害、急性特発性多発性神経根炎、急性特発性多発性神経炎、フレンチポリオ（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｏｌｉｏ）、およびランドリーの上行性麻痺とも称される）が挙げられる。好ましくは、ＧＢＳにおける急性期の後の軸索再生を助長するために本発明の抗体を適用する。同様に、ＧＢＳの慢性的なものと見なされる慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）が本発明の抗体によって治療され得る。多発性硬化症（ＭＳ）は、本発明の抗体によって治療され得る別の脱髄性疾患である。
【０２３５】
本発明の抗体によって治療され得る遺伝要素を伴う更なる神経変性ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ障害としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ときにルー・ゲーリック病と呼ばれる）、シャルコー−マリー−トゥース病（遺伝性運動感覚ニューロパチー、ＨＭＳＮ）、およびハンチントン病（ＨＤ）が挙げられる。
【０２３６】
本発明を以下の実施例によって更に例解するが、これは更に限定的であると理解されるべきでない。本出願全体で引用する配列リスト、図面、および全ての参照文献、特許、公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０２３７】
実施例１：ラット抗ヒトＣ６モノクローナル抗体の生成
ラット抗ヒトＣ６モノクローナル抗体を、ＰＶＧ  Ｃ６  −／−株の５匹のラットをヒトＣ６タンパク質で免疫付与することによって生成した。当分野での現時点での理解によると、正常な齧歯動物における機能的なＣ６抗体の生成は極めて困難であるため、Ｃ６欠乏ラットを選択した。Ｃ６に対する免疫付与は、ヒトと齧歯動物との間のＣ６タンパク質の相同性の程度が高いことに起因して、野生型動物においては効率的でないと推測されている。Ｃ６欠乏動物における抗体応答は、これらの動物が循環中に機能的なＣ６タンパク質を有さず、それ故にＣ６を完全に「異質」であるとみなす傾向にあるため、より強固である。ヒトＣ６を、セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−０７１７−０１）とカップリングした２３Ｄ１マウスモノクローナル抗体２３Ｄ１（Ｌ．Ｃｌａｙｔｏｎ（２００５）Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに詳述されている）を使用して親和性クロマトグラフィーを用いてヒト全血清から精製した。
【０２３８】
抗原および免疫付与：免疫付与の１週間前に、免疫付与前ブリードを、１００μｌの血液を尾静脈から採集することによってラットに行った。免疫付与の１日目に、ラットに、注射１回あたり２５０μｌの体積で完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）中１００μｇのＣ６抗原を４つの部位に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ブースター注射を、１４日目および２１日目に再び４つのｓ．ｃ．部位にて注射１回あたり２５０μｌの体積で不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中５０μｇのＣ６抗原を用いて行った。試験ブリードを、インビトロ試験のために尾静脈から１００μｌの血液を採集することによって３６日目に行った。これらの試験ブリードを、Ｃ６  ＥＬＩＳＡ、Ｃ６ウェスタンブロット、および溶血アッセイ（以下で更に説明する）において分析すると、これらは、５匹全てのラットがヒトＣ６に対して陽性の免疫応答を有し、５匹全てのラットが溶血アッセイにおいて溶液を遮断した抗体を有し、５匹全てのラットがウェスタンブロット（変性条件）上で精製されたＣ６を認識した抗体を有したことを示した。融合前ブースターを、２５０μｌのＰＢＳ中１００μｇの抗原の腹腔内注射によって６２日目に行った。最後に、融合前ブースターを、２５０μｌのＰＢＳ中１００μｇの抗原の静脈内注射（尾静脈）によって６４日目に行った。２匹のラットの脾臓を６６日目に採取し（他の３匹のラットは予備として残した）、単離した脾細胞をハイブリドーマの調製に使用した。
【０２３９】
ハイブリドーマ調製：ハイブリドーマを、Ｌｕｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２９：２４３−２５０に本質的に記載されているように標準的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性融合を使用する、ヒトＣ６で免疫付与したラットからの脾細胞のＹ３−Ａｇ１．２．３  融合パートナー細胞との融合によって調製した。上清を採取し、ヒトＣ６抗原でコーティングした９６ウェルプレートを使用するＥＬＩＳＡによる抗ヒトＣ６抗体についての初期スクリーニングに使用した。陽性クローンを選択し、サブクローニングした。３８個の陽性クローンを更なる分析のために選択した。
【０２４０】
溶血アッセイ：これらの３８個の上清および対照上清を、ヒト血清を補体源として使用して、１：５０の希釈にて溶血アッセイにおいて更に試験した。このアッセイでは、補体活性化抗原でコーティングした赤血球を血清の存在下でインキュベートする。血清は補体系の成分を含有し、この成分は、コーティングされた赤血球と出会うときに古典的経路を通して活性化される。膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が終末補体系の一部として形成され、ＭＡＣは赤血球の溶解を始動する。赤血球溶解は、ＯＤを上清において４０５または４１５ｎｍで測定することによって定量することができ、ＭＡＣの活性の直接的測定である。補体阻害剤は、それらが有効であれば赤血球溶解を定量的様式で防止することになるため、この系において試験することができる。
【０２４１】
アッセイを行うために、ＣＦＴ緩衝液（Ｖｉｒｉｏｎ／Ｓｅｒｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｗｕｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｍａｎｙ）と共に、使用の準備ができている溶液系を商業的に入手した（Ｖｉｒｉｏｎ／Ｓｅｒｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｗｕｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｍａｎｙ）。ＣＦＴ緩衝液を製造業者の指示に従って調製した。溶結系を低温室でローラーバンク上に配置して、赤血球を完全に混合した。ＣＦＴ血清カクテルを調製するために、１００μｌのヒト血清を５ｍｌのＣＦＴ緩衝液に添加した。５０μｌの体積の試験阻害剤の希釈物を、丸底９６ウェルプレートに添加し、５０μｌのＣＦＴ血清カクテルを各ウェルに添加し、ピペッティングしながら慎重に混合し、プレートを３０分間３７℃でインキュベートした。陽性対照はＥＤＴＡであった。陰性対照は、無血清またはＣ６欠乏血清であった。インキュベーション後、プレートを５分間２０００ｒｐｍで遠沈させ（Ｈｅｔｔｉｃｈ卓上遠心分離）、８０μｌの上清を、４０５または４１５ｎｍでの測定のために平底プレートに移した。移したあと１０分以内にＯＤを測定した。
【０２４２】
試験上清を溶血アッセイにおいて希釈物に添加して、それらが赤血球溶解を防止するかどうかを決定した。例となる結果を図１Ａに示し、これは、上清のある特定のものが他のものよりの強力な阻害活性を呈したことを示す。具体的には、上清＃６〜１２が他の上清よりも強力な阻害を呈し、上清＃１１および＃１２が最も強力な阻害を示した。上清（１：５０の希釈）も、ラット血清を補体源として使用して溶血アッセイにおいて試験すると、阻害効果は観察されず、抗体の阻害活性がヒトＣ６に特異的であったことを示した。
【０２４３】
ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡアッセイ：第２のアッセイを使用して、上清がＭＡＣ形成を遮断することができたかどうかを決定した。このアッセイでは、プレート中のＥＬＩＳＡウェルを、血清の存在下で、それぞれレクチンまたは補体の古典的経路のいずれかの誘発物としてマンナンまたはＩｇＧのいずれかでコーティングする。血清は、それらがコーティングされたプレートに曝露されるときにいずれかの経路を通して活性化される補体系の成分を含有する。膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が終末補体系の一部として形成され、ＭＡＣはＥＬＩＳＡプレート上に堆積することになる。プレート上のＭＡＣの堆積は、ＨＲＰ複合体化抗体によって検出し、色素源および基質の存在下での酵素反応によって視覚化することができる。この反応により、４５０または６５５ｎｍのＯＤの測定によって定量することができる色が生産される。ＯＤは、ＭＡＣ形成量の直接的測定である。補体阻害剤は、それらが有効であればプレート上のＭＡＣの堆積を防止または阻害することになるため、この系において試験することができる。
【０２４４】
ハイブリドーマ上清を試験するために使用する第２のアッセイでは、マンナン活性化補体ＥＬＩＳＡアッセイを行った。端的には、ＥＬＩＳＡプレートをマンナンでコーティングし、希釈したハイブリドーマ上清およびヒト血清を加えた。マンナンでコーティングしたプレート上で複合体を形成する補体成分は、抗体を使用して検出することができる。このアッセイに限っては、Ｃ９をＭＡＣ形成の指標として検出した。上清の非存在下と比較して上清の存在下でより少ないＣ９が検出される場合、これはＭＡＣ阻害を示す。使用した陽性対照はＥＤＴＡであった（反応がカルシウム依存性であるため）。
【０２４５】
アッセイを行うために、コーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１５ｍＭのＮａＮ３、ｐＨ９．６）、遮断緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ／ＨＡＳ、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４５ｍＭのＮａＣｌ、１５ｎＭのＮａＮ３、ｐＨ７．４）、洗浄緩衝液（１×ＴＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭのＣａＣｌ２）、および希釈緩衝液（４ｍＭのバルビタール、１４５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０）を調製した。平底高結合９６ウェルプレートのウェルを、１０μｇ／ｍｌのマンナン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７５０４）を含有する１００μｌのコーティング緩衝液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、室温で１時間、２００μｌの遮断緩衝液で遮断した。希釈緩衝液中のヒト血清（１：１００）を、丸底プレートにおいて上清（１：５０）を用いて希釈し、ウェルあたり５０μｌを丸底高結合プレートに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。抗Ｃ５ｂ−９ｎｅｏ（クローンａＥ１１、ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｍ０７７７）を希釈緩衝液中１：１００で希釈し、ウェルあたり５０μｌを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ０４４７）を希釈緩衝液中１：２０００で希釈し、ウェルあたり５０μｌを加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。現像のため、５０μｌのＴＭＢ色素源（ＴＭＢ：Ｓｉｇｍａ  Ｔ２８８５、ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌのＴＭＢの調製済み原液）および１０μｌの３％  Ｈ２Ｏ２を、５ｍｌのＮａＡｃ緩衝液（１リットルのＨ２Ｏ中、８．２ｇｍの酢酸ナトリウム、２１ｇｍのクエン酸一水和物）に加え、９６ウェルプレートに分配した。反応を２５μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４によって停止させ、ＯＤを４５０ｎｍ／６５５ｎｍにて分光光度計を用いて測定した。
【０２４６】
このアッセイの例となる結果を図１Ｂに示し、これは、＃１１および＃１７という２個の上清が他の３６個の上清よりも顕著に良好な阻害能力を有し、上清＃１１は、分析したクローン全ての中で最も優れた阻害能力を有したことを示す。
【０２４７】
上清＃１１が溶血アッセイとＭＡＣ  ＥＬＩＳＡアッセイとの両方において最も強力な阻害を呈したため、このハイブリドーマを更なる特性評価のために選択した。このハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体は、本明細書では７Ｅ５と称する。
【０２４８】
実施例２：７Ｅ５モノクローナル抗体の特性評価
この実施例では、ラット抗ヒトＣ６モノクローナル抗体７Ｅ５の結合および機能的特性評価を更に検査するために追加の実験を行った。
【０２４９】
交差活性：ウェスタンブロットを、ヒト血清およびカニクイザル（Ｃｙｎｏ）からの血清を使用して行った。ヒトおよびＣｙｎｏ血清をＰＡＧＥ（１０％ゲル）および標準的なウェスタンブロットに使用した。抗体を１：５００の希釈で、１時間ブロット上でインキュベートした。ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉ）暗箱撮像システムにおいて、抗ラット西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯ、１：１０００）およびＬｕｍｉｌｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出を行った。結果は、７Ｅ５がヒトＣ６とカニクイザルＣ６との両方を認識することができることを示した。
【０２５０】
結合動態：Ｃ６への７Ｅ５結合の動態を調査するために、研究用グレードのＣＭ５センサチップを装備したＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）における表面プラズモン共鳴測定を使用した。リガンド（Ｃ６、１１３ｋＤａ）を、アミン結合化学を使用して固定化した。フローセル２の表面を、５μｌ／分の流量で０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と０．４ＭのＥＤＣ（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド）との１：１の混合物を用いて７分間活性化した。ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中１０μｇ／ｍｌの濃度のリガンドを、９５５ＲＵの密度で固定化した。ｐＨ８．０の１Ｍのエタノールアミンの７分の注射によって表面を遮断した。
【０２５１】
フローセル１を、先の実験からの抗体を用いて固定化し（αｖＷＷＦ、９８７ＲＵ）、参照表面とした。
【０２５２】
動態的結合データを収集するために、ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０中の分析物（抗Ｃ６−抗体、１５０ｋＤａ）を、３０μｌ／分の流量および２５℃の温度で２つのフローセルにかけて注射した。注射した濃度は抗体によって異なる。データを１Ｈｚの速度で収集した。複合体を９０秒および３００秒間それぞれ会合および解離させた。表面を、０．１ＭのＨＣｌの１０秒の注射によって再生した。各試料および緩衝液ブランクの二重注射（順序は無作為）を２つの表面上に流した。
【０２５３】
データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェア中で利用可能なグローバルデータ分析オプションを使用して単純な１：１のインタラクションモデルに適合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ動態の結果を図２に示す。代表的な実験からの結果を以下の表１〜４で要約する。
【表１】
2020178711.tif 000003
【表２】
2020178711.tif 000004
【表３】
2020178711.tif 000005
【表４】
2020178711.tif 000006
【０２５４】
７Ｅ５のＫＤは、２．５×１０−１０Ｍとして計算する。高い親和性は、高い抗体−抗原複合体半減期（４５時間）によって主に引き起こされる。このため、７Ｅ５結合は極めて安定であり、７Ｅ５−Ｃ６複合体の半減期は４０時間超であると予測される。
【０２５５】
抗原−抗体複合体がＦｃガンマ受容体による結合および細胞取り込み後にエンドソームおよびリソソーム中で放出され得るかどうかを決定するために、７Ｅ５−Ｃ６複合体の感受性を低いｐＨで試験した。リソソームではｐＨは約４．８であるため、複合体安定性は最大ｐＨ＝４で試験した。このＢＩＡＣＯＲＥ実験では、チップ上の７Ｅ５−Ｃ６複合体を漸減するｐＨの緩衝液で洗浄した。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）をｐＨ７．４、７．０、および６．５に使用した。１０ｍＭの酢酸ナトリウムをｐＨ６．０、５．５、５．０、４．５、および４．０に使用した。複合体の安定性は低いｐＨには感受性でないことが観察された。
【０２５６】
事前インキュベーションが溶血アッセイに与える影響：ＢＩＡＣＯＲＥ実験によって、７Ｅ５のＣ６からの緩慢な放出が７Ｅ５のＫＤの主な決定因子であることが明らかになったため、赤血球を加える前の７Ｅ５の補体原（ヒト血清）との事前インキュベーションにより、溶血アッセイにおける阻害効果が増加したかどうかを調査した。７Ｅ５を、室温（２０℃）にて３０、９０、または１８０分間、ヒト血清と共にインキュベートした後、赤血球を添加し、反応を３７℃で開始した。結果は、事前インキュベーション時間を最大３時間に増加させることが溶血の阻害の更なる強化に繋がらなかったことを示した。このことは、この反応における７Ｅ５によるＣ６結合の動態が、Ｃ６が効果的に複合体化され数分以内に完全に中和されるものであることを意味する。
【０２５７】
実施例３：７Ｅ５モノクローナル抗体のエピトープマッピング
ペプチドアレイを使用して、ヒトＣ６における７Ｅ５のエピトープを決定した。Ｃ６タンパク質配列からの連続し重複した１６ｍｅｒのペプチド（１６個のアミノ酸長であり、１４個のアミノ酸が重複しているペプチド）を合成し、膜上のグリッドパターン中に並べた。次に、膜を７Ｅ５抗体と共にインキュベートして、どのペプチドが抗体によって認識されたかを検出した。７Ｅ５によって認識された主なペプチド配列はＧＳＣＱＤＧＲＱＬＥＷＧＬＥＲＴ（ペプチド４１８）（配列番号１）であった。
【０２５８】
続いて、選択したペプチドに対するアラニンスキャン（アラニンを使用して１つ１つアミノ酸を代置するもの）を行って、エピトープの正確な特定を助けた。この研究では、ペプチド４１８の修飾に加えて、４個のアミノ酸が４１８に対してシフトしたペプチドであるペプチド４２０（ＤＧＲＱＬＥＷＧＬＥＲＴＲＬＳＳ）（配列番号２）、およびそのアラニン修飾のうちのいくつかが７Ｅ５の結合を示した。このため、７Ｅ５の主要エピトープの一部を形成するアミノ酸が、ペプチド４１８と４２０とを組み合わせたこのペプチド配列ＧＳＣＱＤＧＲＱＬＥＷＧＬＥＲＴＲＬＳＳ（配列番号３）内にあることが予測されると結論付けた。
【０２５９】
図４Ａは、ヒト（配列番号５０）およびラットＣ６（配列番号５１）におけるペプチド４１８および周辺エリアの配列を示す。図４Ｂで概略的に例解するように、ペプチド４１８は、Ｃ６の第１のＦＩＭドメインの端部に部分的に位置する。
【０２６０】
他の抗体が７Ｅ５抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ交差遮断実験を実施し、ここでは、Ｃ６抗原をチップに結合させた後、単一の抗Ｃ６抗体のみ（対照として）か、または第１の抗Ｃ６抗体（抗体１）、続いて第２の抗Ｃ６抗体（抗体２）かのいずれかであった分析物（複数化）を流して、交差遮断を決定した。マウスｍＡｂ  ２７Ｂ１がラットｍＡｂ  ７Ｅ５と同じエピトープに結合するかどうかを決定するための交差遮断実験の結果を図３Ａ〜Ｄに示し、図３Ａは、抗体１としての２７Ｂ１および抗体２としての７Ｅ５の結果を示し、図３Ｂは、抗体１としての７Ｅ５および抗体２としての２７Ｂ１の結果を示し、図３Ｃは、２７Ｂ１のみの結果を示し、図３Ｄは、７Ｅ５のみの結果を示す。
【０２６１】
実施例４：７Ｅ５モノクローナル抗体のインビボの効能
７Ｅ５が生きている動物においてＣ６を遮断することができるかどうかを試験するために、ヒトＣ６を補充したＣ６欠乏ＰＧＲラットを使用した。この手法を使用した理由は、７Ｅ５がヒトＣ６に特異的であり、ラットＣ６を阻害することができないためであった。Ｃ６欠乏マウスでは、ヒトＣ６を注射することで完全な補体系機能およびＭＡＣ活性を回復することができ、７Ｅ５の効果をラットＣ６によって引き起こされる交絡効果なく測定することができる。
【０２６２】
まず、この手法を、ヒトＣ６を注射した２匹のラットにおける溶結活性を決定することによって試験した。Ｃ６の注射後にいくつかの血液試料を採取することにより、ラットにおけるヒトＣ６は約４８時間であると予測した。２匹のＣ６欠乏ラットに４ｍｇ／ｋｇのヒトＣ６をＩＶ注射した。血液試料をＣ６の注射後１０分、２４時間、および４８時間で採取した。全血液試料の凝固後、凝固物を遠沈させること（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心分離中で室温にて１０分間１３，０００ｒｐｍ）によって血清を単離した。血清を実施例１に記載の溶結アッセイで使用してＭＡＣ活性を決定した。野生型ＰＶＧラットおよび処置していないＣ６欠乏ラットからの血清を、最大および最小溶結活性についての参照として使用した。溶血アッセイを使用して、ラットにおけるヒトＣ６の半減期は約４８時間であると予測した。
【０２６３】
パイロット実験では、１匹の雌のＣ６欠乏ＰＶＧラット（体重２２０グラム）に１２ｍｇの高用量の７Ｅ５を腹腔内注射し、２ｍｇのヒトＣ６を補充した（静脈内注射）。ヒトＣ６を、Ｃ６抗体でコーティングしたカラムによる親和性精製を使用してヒト血清から単離した。Ｃ６を、７Ｅ５ボーラス注射の２４時間前に１ｍｇ、５分後に１ｍｇ投薬した。対照ラット（７Ｅ５で処理したラットと同じ体重）はＣ６注射のみを受けた。溶血アッセイ用の血液を７Ｅ５の注射から６０分後に採取した。結果を図５に示す。結果は、溶血活性が７Ｅ５投薬から６０分後に７Ｅ５によって遮断されたことを示したため、７Ｅ５がインビボでＭＡＣ形成を遮断し得ることを証明した。
【０２６４】
後続の実験では、２つの雌のＣ６欠乏ラット（ＰＶＧ種）に１ｍｇのＣ６を注射した。血液試料をＣ６注射前およびＣ６注射後（ＩＶ、１ｍｇ）に採取して、正常な溶血活性および補充溶血活性を規定した。Ｃ６注射から１０分後、７Ｅ５を８ｍｇのＩＰまたは２ｍｇのＩＶいずれかで投薬した。７Ｅ５投薬から６０分後、血液試料を採取して、７Ｅ５が溶血活性に与える影響を評定した。両方の投薬戦略が血中のＭＡＣ活性を遮断した。次に、別の１ｍｇのＣ６を同じラットにＩＶ注射した。新たなＣ６補充から１５分後の血液サンプリングは、溶血活性の小幅の増加しか示さず、これは、溶血活性が自由に循環する７Ｅ５によって両方のラットにおいて依然として阻害されたことを示す。
【０２６５】
これらの上記の実験は、７Ｅ５が生きている動物においてＣ６を遮断できることを示す。
【０２６６】
実施例５：７Ｅ５モノクローナル抗体の配列決定および組み換え発現
７Ｅ５  ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、標準的な手段によって決定した。
【０２６７】
ＶＨ領域のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【化２】
2020178711.tif 000007
【０２６８】
ＶＨ領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【化３】
2020178711.tif 000008
【０２６９】
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＣＤＲ１：ＤＹＹＭＡ（配列番号６）
ＣＤＲ２：ＴＩＮＹＤＧＳＳＴＹＹＲＥＳＶＫＧ（配列番号７）
ＣＤＲ３：ＰＳＴＥＡＬＦＡＹ（配列番号８）
【０２７０】
ＶＬ領域のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【化４】
2020178711.tif 000009
【０２７１】
ＶＬ領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【化５】
2020178711.tif 000010
【０２７２】
ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＣＤＲ１：  ＲＳＳＱＳＬＬＮＤＶＧＮＴＹＬＹ（配列番号１１）
ＣＤＲ２：ＬＶＳＤＬＧＳ（配列番号１２）
ＣＤＲ３：ＭＱＡＳＨＡＰＹＴ（配列番号１３）
【０２７３】
クローニングのための適切な制限部位の導入および産生細胞株（Ｈｅｋ−２９３細胞）における発現のためのコード化配列の最適化の後、発現カセットを調製した。７Ｅ５の合成重鎖および軽鎖可変ドメインをｐＭＱＲ真核細胞発現ベクターセット（ｐＭＱＲ−ｈＩｇＧ１およびｐＭＱＲ−ｈＩｇＫ）をクローニングしたことで、ヒト−ラットキメラ組み換え抗体を生成した。結果として得られたクローンの配列分析により、両方の配列が適正にクローニングされたことが示された。両方の７Ｅ５可変ドメイン宿すｐＭＱＲ真核細胞発現ベクターをＨｅｋ−２９３細胞へと形質転換し、これらの細胞に組み立て抗体を産生させた。産生後、捕捉ＥＬＩＳＡを使用することでｈＩｇＧ１／ｈＩｇＫ抗体が廃上清中で検出された。トランスフェクション上清は、０．０１９ｍｇ／ｍｌで組み換え７Ｅ５を含有することが示された。
【０２７４】
実施例６：７Ｅ５モノクローナル抗体のヒト化
部位指向性突然変異の周期に基づく抗体ヒト化方法の代わりとして、ラット７Ｅ５  ｍＡｂを、Ｈｗａｎｇおよび同僚（Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００５．  ３６：３５−４２）によって説明されているように、ヒト抗体およびマウス抗体間のＣＤＲ相同性に基づくヒト化手法を使用してヒト化した。この方法は、非ヒトおよびヒト抗体が類似して構築されたＣＤＲを有する場合、ヒトフレームワークは親和性を良好に保持しながら非ヒトＣＤＲも支持することになるという原理に基づく。この方法において、ヒトフレームワーク配列は、ヒト化される抗体のＣＤＲに対するヒトＣＤＲの構造的類似性（同じＣｈｏｔｈｉａ正準構造）に基づいて、ヒト生殖細胞系列遺伝子のセットから選択される。偏位したＦＲ残基を含むＦａｂ変異型配列のファージディスプレイライブラリを生成する。親和性主導による選択の後、個々のクローンを結合および解離速度についてスクリーニングし、配列ヒト同一性および相同性を決定する。
【０２７５】
この作業に適用されるヒト化７Ｅ５ラット抗体に対するプロセスは、以下のステップで構成される。
１−ヒト化ライブラリの設計：最も近いヒト生殖細胞系列の特定、およびこれらのヒト生殖細胞系列に由来するラットＶＨおよびＶＫ  ＦＲ残基の特定。
２−７Ｅ５遺伝子ライブラリの組み立て（重複オリゴヌクレオチドを使用して、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖コード化遺伝子をＰＣＲを介して合成によって生成する）。
３−ヒト定常重（ＣＨ１）および定常軽（Ｃκ）鎖を含有するファージミド（ｐＣＢ１３−ＣＫ１／３）へのこれらの遺伝子ライブラリのクローニング（ライブラリ構築）。
４−ファージディスプレイおよび親和性選択を使用する機能的Ｆａｂの選択。
５−解離速度（Ｂｉａｃｏｒｅ）のスクリーニングおよび配列決定。
６−ｈＣ６への結合を喪失せずに最も高いヒト同一性および相同性を持つＦａｂの選択。
７−更なる親和性測定および機能アッセイにおいて使用するための８個のヒト化リーダーの生産および精製。
【０２７６】
ヒト化ライブライの設計：ラット７Ｅ５抗体の可変ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに公的なデータベースおよびツールを使用して、７Ｅ５が、ＩＧＨＶ５Ｓ４５＊０１、ＩＧＨＤ１−６＊０１、ＩＧＨＪ３＊０１、およびＩＧＫＶ２Ｓ２７＊０１、ＩＧＫＪ２−３＊０１を生殖細胞系列セグメントとして使用することを確認した。また、７Ｅ５のＣＤＲ  Ｈ１およびＣＤＲ  Ｈ２についての正準の折り畳みの組み合わせは１−３であり、７Ｅ５のＣＤＲ  Ｌ１およびＣＤＲ  Ｌ２については４−１であると結論付けた。
【０２７７】
７Ｅ５  ＶＨ配列と、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２についての同一の正準の折り畳みの組み合わせ１−３を持つヒト生殖細胞系列との比較により、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３ファミリーメンバー１が最も近いマッチであることが明らかになった。最も近いヒトＪＨ生殖細胞系列はＩＧＨＪ４である。これらの生殖細胞系列セグメントに対する整列を図６Ａに示す。７Ｅ５重鎖アミノ酸配列も配列番号５に示す。ヒト生殖細胞系列ＶＨ３＿１アミノ酸配列も配列番号４８に示す。ＦＲおよびＣＤＲを示し、これにより、ヒト生殖細胞系列から逸脱したＦＲ残基の特定を可能となる。
【０２７８】
同様の分析を使用して、７Ｅ５  Ｖκ配列について、最も近いヒト生殖細胞系列がヒトＶＫ２ファミリーメンバー５であることを決定した。最も近いヒトＪＨ生殖細胞系列はＩＧＫＪ２およびＩＧＫＪ５である。これらの生殖細胞系列セグメントに対する整列を図６Ｂに示す。７Ｅ５軽鎖アミノ酸配列も配列番号１０に示す。ヒト生殖細胞系列ＶＫ２＿５アミノ酸配列も配列番号４９に示す。ＦＲおよびＣＤＲを示し、これにより、ヒト生殖細胞系列から逸脱したＦＲ残基の特定を可能となる。
【０２７９】
図６Ａおよび６Ｂに示すように、７Ｅ５  ＶＨ配列について１３個の位置、７Ｅ５  Ｖκについては１６個の位置がそれぞれ存在し、これについて、ヒト残基、また変化が抗原結合に有害である場合に備えてラット残基もヒト化ライブラリに組み込んだ。突然変異のための位置の数および位置あたりの変異型の数を考慮に入れると、導入した多様性を網羅するためのライブラリサイズは、ヒト化ＶＨおよびＶκライブラリについてそれぞれ８．２×１０３および９．８×１０４である。
【０２８０】
ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂライブラリ構築：最終ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂファージディスプレイライブラリの構築のため、最初に２つの異なるサブライブラリを構築した。
１−ヒト化７Ｅ５  ＶＨ遺伝子をＷＴ  ７Ｅ５Ｖκと共にクローニングして、ヒト定常ドメインＣＨ１およびＣκをコードする遺伝子を含有するｐＣＢ１３−ＣＫ３にした、ＶＨヒト化Ｆａｂサブライブラリ。
２−ヒト化７Ｅ５  Ｖκ遺伝子をＷＴ  ７Ｅ５ＶＨと共にクローニングして、ヒト定常ドメインＣＨ１およびＣκをコードする遺伝子を含有するファージミドベクターｓｐＣＢ１３−ＣＫ１およびｐＣＢ１３−ＣＫ３にした、ＶＬヒト化Ｆａｂサブライブラリ。
【０２８１】
使用した２つの異なるファージミドのクローニング戦略および配列に起因して、ｐＣＢ１３−ＣＫ１から生産したクローンの軽鎖Ｖドメインの１０４位〜１０７位にある残基は、ＬＥＩＫ（ヒト化７Ｅ５配列）に対応し、一方でｐＣＢ１３−ＣＫ３において生産したクローンのＶドメイン軽鎖は、同じ位置のアミノ酸ＬＥＬＫ（７Ｅ５  ＷＴ  Ｖκ配列）において現れる。
【０２８２】
２つの結果として得られるサブライブラリをヒトＣ６に対して掬い取り、結合クローンを回収して重鎖および軽鎖の両方をヒト化した最終Ｆａｂライブラリ構築に進んだ。
【０２８３】
合成遺伝子組み立て：異なるヒト化重鎖および軽鎖サブライブラリを構築するために、ヒト化７Ｅ５  ＶＨおよびＶκ遺伝子を遺伝子組み立てによって生成した（Ｃｈｅｒｒｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０：８２０−２、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３）。
【０２８４】
ヒト化７Ｅ５  ＶＨおよびＶκサブライブラリ構築：７Ｅ５  ＶＨ  Ｆａｂサブライブラリの構築のため、遺伝子組み立てによって生成した約４００ｂｐの合成ＶＨ遺伝子、および７Ｅ５  Ｖκ  ＷＴを体系化するＤＮＡ断片を（ヒト定常重鎖およびカッパ軽鎖をコードする遺伝子を含有する）ファージミドｐＣＢ１３−ＣＫ３にクローニングした。
【０２８５】
７Ｅ５  Ｖκ  Ｆａｂサブライブラリの構築のため、遺伝子組み立てによって生成した約４００ｂｐの合成Ｖκ遺伝子、および７Ｅ５  ＶＨ  ＷＴを体系化するＤＮＡ断片を、それぞれＡｐａＬＩ／  ＸｈｏＩ部位およびＮｃｏＩ／ＮｈｅＩによって、（ヒト定常重鎖およびカッパ軽鎖をコードする遺伝子を含有する）ファージミドｐＣＢ１３−ＣＫ１およびｐＣＢ１３−ＣＫ３の等モル混合物にクローニングした。
【０２８６】
クローニングプロセスから生じた新たなベクターをエレクトロポレーションによって大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。ライブラリのサイズを、ＬＢＡカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）、グルコース２％上のＴＧ１形質転換細胞の５μｌのスポットから計算し、ＦａｂインサートのパーセンテージをコロニーＰＣＲによって決定した。サブライブラリのサイズおよびインサートパーセンテージを表５で以下に要約する。
【表５】
2020178711.tif 000011
【０２８７】
サブライブラリもライブラリあたり４８個のクローンのＤＮＡ配列分析によってＱＣした。アミノ酸配列を、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して抽出した。有効なＶＨおよびＶκ配列ならびに位置あたりのＷＴまたは突然変異残基の頻度の分析により、約５０／５０（Ｖκ遺伝子における１０３位については３３／３３／３３）のＷＴ／突然変異の割合でのサブライブラリの設計および構築に成功し、ＦＲ突然変異の平均数が設計通りに得られたことが明らかになった。
【０２８８】
ヒト化７Ｅ５  ＶＨおよびＶκ  サブライブラリのパニング選択：ファージを２つのサブライブラリから調製し、コーティングしたヒトＣ６に対する１周目の選択に使用した。この周の選択の目的は、サブライブラリを非結合Ｆａｂから一掃し、それによりストリンジェント条件が適用されないようにすることであった。
【０２８９】
パニング選択のため、５および０μｇ／ｍｌのヒトＣ６を、低脂肪粉乳（ＰＢＳ中４％Ｍａｒｖｅｌｌ）によって９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）中でコーティングし、遮断した。サブライブラリファージとの２時間のインキュベーションおよび続く洗浄後、トリプシン溶出（１０ｍｇ／ｍｌ）を室温で行った。１６ｍＭのプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することによってプロテアーゼ活性を即座に中和した。
【０２９０】
全てのファージ生産物を対数的に成長させた大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、５μｌの感染細菌を生産物の分析および濃縮決定のために寒天プレート（ＬＢＡＧｌｕｃ２％Ｃａｒｂ１００μｇ／ｍｌ）上にプレーティングした。濃縮は、ヒトＣ６から溶出したファージの数対無タンパク質条件から溶出したものの割合として計算した。ヒト化７Ｅ５  ＶκとＶＨ  Ｆａｂサブライブラリとの両方について、バックグラウンド（ＰＢＳ）と比較して極めて良好な濃縮が観察された。
【０２９１】
最終ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂファージディスプレイライブラリの構築：７Ｅ５  ＶＨ  Ｆａｂサブライブラリから選択したクローンから回収したヒト化重鎖（ＶＨＣＨ）を７Ｅ５  Ｖκ  Ｆａｂサブライブラリから選択した回収したヒト化軽鎖（ＶκＣκ）と組み合わせることによって、最終ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂライブラリを構築した。結果として得られるライブラリのサイズを、ＬＢＡカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）、グルコース２％上のＴＧ１形質転換細胞の５μｌのスポットから計算し、ＦａｂインサートのパーセンテージをコロニーＰＣＲによって決定した。
【０２９２】
ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂライブラリの選択：ラットＷＴ  ７Ｅ５  抗体と比較して親和性が失われていないか、または更には親和性が改善したヒト化変異型を選択するために、ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂライブラリを用いた溶液内ファージディスプレイ選択を、ビオチン化ｈＣ６抗原を使用して行った。ヒトＣ６をビオチン化し、抗ヒトＣ６抗体７Ｅ５を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、およびＥＬＩＳＡによってＱＣし、ニュートラアビジンでコーティングしたプレート上に捕捉したビオチン化Ｃ６を検出した。親和性主導型選択を、３周連続して、抗原濃度を周から周にかけて減少させて行い、同様にファージ投入も１周目から２週目にかけて減少させた。選択の２週目および３週目において、ニュートラアビジンで捕捉したヒトＣ６とインキュベートしたファージも、２時間または一晩過剰な非ビオチン化Ｃ６の存在下でインキュベートして（解離速度選択）、何度かの洗浄後に高解離速度で結合するクローンを取り除いた。対照として、同時に同様の選択を行い、ここでは、ファージを、非ビオチン化ｈＣ６の代わりにニュートラアビジンで捕捉したヒトＣ６およびＰＢＳとインキュベートした（解離速度選択なし）。
【０２９３】
全てのファージ生産物を対数的に成長させた大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、５μｌの感染細菌を生産物の分析および濃縮決定のために寒天プレート（ＬＢＡＧｌｕｃ２％Ｃａｒｂ１００μｇ／ｍｌ）上にプレーティングした。濃縮は、ヒトＣ６から溶出したファージの数対無タンパク質条件から溶出したものの割合として計算した。背景（ＰＢＳ）と比較して極めて良好な濃縮が得られた。
【０２９４】
ヒト化７Ｅ５  Ｆａｂライブラリから選択したクローンの結合スクリーニング：２周目および３周目の解離速度選択後に得られた溶出ファージプールに感染させた大腸菌ＴＧ１の個々のコロニーを、−８０℃の２０％のグリセロール中で保管した１００μｌの２ＴＹＧｌｕｃｏｓｅ２％カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含有する  ２つの９６ウェルプレート（マスタープレート）中で８時間３７℃にて成長させ、後の配列決定およびペリプラスム抽出物生産に使用した。全部で２つのマスタープレート（ＭＰ）を、２周目の選択および３周目の選択からのクローンを用いて生成した。これらのＭＰから、可溶性モノクローナルＦａｂを含有する細菌抽出物（ペリプラスム抽出物）を生産した。モノクローナル細菌の小規模培養を、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによって０．８のＯＤ６００にて誘導した。その後、Ｆａｂを含有するペリプラスム抽出物（Ｐ．Ｅ．）を、ＰＢＳ中での細菌ペレットの凍結融解、および細胞残屑を除去するための続く遠心分離によって調製した。
【０２９５】
選択したクローンの標的結合能を決定するために、１：５希釈のＰ．Ｅ．を、ニュートラアビジンでコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に捕捉した１０ｎＭのビオチン化ｈＣ６への結合について試験した。ラット７Ｅ５  ＷＴ  Ｆａｂから調製したＰ．Ｅ．  を陽性対照として使用した。ブランクのＰ．Ｅ．（ＭＰ中の植菌していないウェルから調製）を陰性対照として使用した。Ｐ．Ｅ．の標的への結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に複合体化した抗ｃ−ｍｙｃマウス抗体によって検出した。両方のＭＰについて４０％の結合ヒット率を得、陽性クローンの結合シグナル（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ値）は、親ラット７Ｅ５  Ｆａｂで得られたシグナルに相当した。
【０２９６】
ヒトＣ６に結合する選択されたクローンの解離速度スクリーニングならびにヒト同一性および相同性の分析：陽性結合クローンについて、ｈＣ６の解離速度を、ＳＰＲ法を使用して決定し、同時に重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡの配列決定を行った。
【０２９７】
解離速度を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。この目的のため、ｐＨ４．５のアセテート緩衝液中５０μｇ／ｍｌのｈＣ６を、約２０００ＲＵにＣＭ５センサチップ上で固定した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１０００−１２）。再生条件を試験し、２×１０μｌの１０ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌを試料注射間の再生に使用した。上記のように調製した３０μｌのＰ．Ｅ．を１２０μｌのＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で希釈し、この６０μｌから３０μｌ／分の流入で注射した。解離を４００秒間測定し、解離速度を、１：１のラングミュア解離適合モデルを適用することによって決定した。
【０２９８】
同時に、ヒト同一性および相同性を分析するために、ｈＣ６への特異的結合を示したクローンの可変重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡの配列決定を行った。アミノ酸配列を、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して抽出した。ＶκおよびＶＨ配列を参照配列（７Ｅ５  ＷＴ）に対して個々に整列させた。全ての配列を分析し、Ａｂｌｉｇｎｅｒソフトウェアを使用して、ヒト同一性（最も近く一致する生殖細胞系列に見出されるフレームワーク領域の部分）およびヒト相同性（最も近く一致する生殖細胞系列または同じサブクラスの他の生殖細胞系列に見出されるフレームワーク残基の部分）のパーセンテージを決定した。
【０２９９】
ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅデータ間の全体的に良好な相関、ならびに８８〜９９％で変動する良好なヒト同一性および相同性パーセント値が観察された。
【０３００】
良好な結合、解離速度、ならびにヒト同一性および相同性データを有した８個のクローンのリーダーパネルを選択し、これらを８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２と称する。８個のヒト化クローンのリーダーパネルの重鎖および軽鎖の可変ドメインの完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に示す。
８Ｇ０９  ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
８Ｇ０９  ＶＨ
【化６】
2020178711.tif 000012
８Ｇ０９  Ｖκ
【化７】
2020178711.tif 000013
７Ｅ１２  ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｅ１２  ＶＨ
【化８】
2020178711.tif 000014
７Ｅ１２  Ｖκ
【化９】
2020178711.tif 000015
７Ｇ０９  ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｇ０９  ＶＨ
【化１０】
2020178711.tif 000016
７Ｇ０９  Ｖκ
【化１１】
2020178711.tif 000017
８Ｆ０７ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
８Ｆ０７  ＶＨ
【化１２】
2020178711.tif 000018
８Ｆ０７  Ｖκ
【化１３】
2020178711.tif 000019
７Ｆ０６ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｆ０６  ＶＨ
【化１４】
2020178711.tif 000020
７Ｆ０６  Ｖκ
【化１５】
2020178711.tif 000021
７Ｆ１１ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｆ１１  ＶＨ
【化１６】
2020178711.tif 000022
７Ｆ１１  Ｖκ
【化１７】
2020178711.tif 000023
７Ｅ１１ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｅ１１  ＶＨ
【化１８】
2020178711.tif 000024
７Ｅ１１  Ｖκ
【化１９】
2020178711.tif 000025
７Ｆ０２ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列：
７Ｆ０２  ＶＨ
【化２０】
2020178711.tif 000026
７Ｆ０２  Ｖκ
【化２１】
2020178711.tif 000027
８Ｇ０９ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
８Ｇ０９  ＶＨ
【化２２】
2020178711.tif 000028
８Ｇ０９  Ｖκ
【化２３】
2020178711.tif 000029
７Ｅ１２ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｅ１２  ＶＨ
【化２４】
2020178711.tif 000030
７Ｅ１２  Ｖκ
【化２５】
2020178711.tif 000031
７Ｇ０９ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｇ０９  ＶＨ
【化２６】
2020178711.tif 000032
７Ｇ０９  Ｖκ
【化２７】
2020178711.tif 000033
８Ｆ０７ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
８Ｆ０７  ＶＨ
【化２８】
2020178711.tif 000034
８Ｆ０７  Ｖκ
【化２９】
2020178711.tif 000035
７Ｆ０６ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｆ０６  ＶＨ
【化３０】
2020178711.tif 000036
７Ｆ０６  Ｖκ
【化３１】
2020178711.tif 000037
７Ｆ１１ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｆ１１  ＶＨ
【化３２】
2020178711.tif 000038
７Ｆ１１  Ｖκ
【化３３】
2020178711.tif 000039
７Ｅ１１ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｅ１１  ＶＨ
【化３４】
2020178711.tif 000040
７Ｅ１１  Ｖκ
【化３５】
2020178711.tif 000041
７Ｆ０２ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列：
７Ｆ０２  ＶＨ
【化３６】
2020178711.tif 000042
７Ｆ０２  Ｖκ
【化３７】
2020178711.tif 000043
【０３０１】
ラット７Ｅ５重鎖可変領域のアミノ酸配列の、ヒト化７Ｅ５変異型８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２の重鎖可変領域のアミノ酸配列への整列を、ＣＤＲ１、２、および３を指し示して図８Ａに示す。ラット７Ｅ５軽鎖可変領域のアミノ酸配列の、ヒト化７Ｅ５変異型８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列への整列を、ＣＤＲ１、２、および３を指し示して図８Ｂに示す。ラット７Ｅ５抗体の８個のヒト化変異型についての重鎖ＣＤＲ１、２、および３配列は、ラット７Ｅ５  ｍＡｂのものと同じである（そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６、７、および８に示される）。同様に、ラット７Ｅ５抗体の８個のヒト化変異型についての重鎖ＣＤＲ１、２、および３配列は、ラット７Ｅ５  ｍＡｂのものと同じである（そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１１、１２、および１３に示される）。
【０３０２】
Ｆａｂ発現、精製、およびＱＣ：更なるアッセイ（即ち、事前感作した赤血球の補体媒介性溶解アッセイ、親和性決定、融解温度および凝集挙動アッセイ）において７Ｅ５ヒト化変異型の一部を特性評価するために、可溶性Ｆａｂを上記の８個のクローンのリーダーパネルから生産および精製した。８個全てのヒト化クローンのＦａｂ遺伝子および７Ｅ５  ＷＴ対照をＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化によってクローニングしてｐＣＢ４発現ベクター（ｐＣＢ１３に酷似しているが、遺伝子３体系化配列を持たない）にし、熱ショックによってＴＧ１大腸菌株に形質転換した。配列を、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して確認した。
【０３０３】
ｐＣＢ４クローン化７Ｅ５ヒト化変異型および７Ｅ５  ＷＴからの可溶性Ｆａｂを含有するＰ．Ｅ．の生産を、０．１％のグルコースおよびカルベニシリンを１００μｇ／ｍｌで補充した８００ｍｌの２ｘＹＴ中で行った。１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧとの０．５〜０．８のＯＤ６００でのインキュベーション後、培養物を少なくとも２０時間２４℃にてインキュベートした。可溶性ＦａｂをＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂によって精製した。
【０３０４】
５００ｎｇの結果として得られる精製産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行したとき、Ｆａｂ特異性バンドとは別のいくつかの更なるバンド（それぞれ非還元条件下および還元条件下で５０ＫＤａおよび約２５ＫＤａ）が観察された。これらの試料を更に精製するために、ヒトＣＨ１ドメインに特異的に結合するＶＨＨを含有するＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の樹脂（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ  ＩｇＧ−ＣＨ１、カタログ番号１９４３２０００５）を製造業者の指示に従って使用した。結果として得られる精製されたタンパク質の濃度を、微用量分光光度計を使用し、ε＝１．５３のモル吸光係数を仮定してＯＤ２８０ｎｍを測定することによって見積もった。精製した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、高レベルの純度を示した。精製したＦａｂの機能性をＥＬＩＳＡにおいて確認し、このＥＬＩＳＡでは、これらのＦａｂの連続希釈物の、ニュートラアビジンをコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに捕捉した１０ｎＭのビオチン化ｈＣ６への結合を検査した。８個全ての精製したＦａｂが、ｈＣ６への有効な結合を呈した。
【０３０５】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析：７Ｅ５のヒト化が結果として得られるヒト化抗体の結合特異性または活性を改変したかどうかを決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性分析を、（親）野生型ラット７Ｅ５  ｍａｂおよびマウス２７Ｂ１  ｍＡｂと比較して、８個の選択されたヒト化Ｆａｂ（７Ｅ１２、７Ｅ１１、７Ｆ２、７Ｆ６、７Ｆ１１、７Ｇ９、８Ｆ７、および８Ｆ９）に対して行った。結果を図９に示す。結果は、７Ｅ５のヒト化が抗体の特異性または活性を改変しなかったことを示す。
【０３０６】
実施例７：ヒト化抗Ｃ６抗体の「ミックスアンドマッチ」特性評価
この実施例では、選択されたヒト化  抗Ｃ６抗体からのヒト化ＶＨ鎖およびヒト化ＶＬ鎖のパネルを、様々な組み合わせで哺乳動物細胞において全長抗体として発現させ、その機能活性について評価した。
【０３０７】
使用したヒト化ＶＨ鎖は、実施例６に記載した８個のＶＨ鎖（８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２）、ならびにそのアミノ酸配列が配列番号４６に示される９番目の７Ｃ０２であった。これら９個の鎖の整列を図８Ａに示す。
【０３０８】
使用したヒト化ＶＬ鎖は、実施例６に記載した８個のＶＨ鎖（８Ｇ０９、７Ｅ１２、７Ｇ０９、８Ｆ０７、７Ｆ０６、７Ｆ１１、７Ｅ１１、および７Ｆ０２）、ならびにそのアミノ酸配列が配列番号４７に示される９番目の７Ｇ０８であった。これら９個の鎖の整列を図８Ｂに示す。
【０３０９】
重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列を発現ベクターへとクローニングして、安定させたＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域を有する全長鎖をコードする配列を作出した。９個の重鎖および９軽鎖を、ＣＨＯ宿主細胞において全ての可能な組み合わせで対として共発現させた。このようにして、９個の重鎖および９個の軽鎖の８１個全ての可能な「ミックスアンドマッチ」コンビネーションを評価した。８１個の対を溶結アッセイおよびＭＡＣ  ＥＬＩＳＡにおいて各々試験した。各々のアッセイには、ＣＨＯ上清からの４μｇのヒト化７Ｅ５  ｍＡｂを使用した。溶結アッセイの結果を図７Ａに示す。ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡの結果を図７Ｂに示す。これらの結果は、９個のＶＨ鎖および９個のＶＬ鎖の８１個全ての可能な「ミックスアンドマッチ」コンビネーションが、両方のアッセイにおいて強力な阻害活性を呈したことを示す。
【０３１０】
実施例８：Ｃ６抗体が神経再生に与える影響を試験するための動物モデル
神経挫滅モデル（坐骨神経の挫滅）を使用して、ラット７Ｅ５またはヒト化７Ｅ５などの抗ヒトＣ６モノクローナル抗体がヒトＣ６を補充したＣ６ノックアウトラット（ＰＶＣ）における感覚機能の回復に与える影響を試験する。神経挫滅は、末梢神経傷害のモデルである。ＷＯ  ２０１０／００５３１０（ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０４１８）、およびｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：２９５−３０２を参照されたい。
【０３１１】
治療のため、Ｃ６−／−ラット（ＰＶＧ、６〜８週）にヒトＣ６または対照（ＰＢＳ）のいずれかを補充した。Ｃ６をＰＢＳ中４ｍｇ／ｋｇの用量で、挫滅傷害前１日前（−１日目）、および０〜６日目には１日１回、Ｃ６?／?ラットに静脈内投与した。Ｃ６補充ラットおよび対照群を挫滅の１０分前に開始して抗ヒトＣ６  ｍＡｂで処置した（０日目）（腹膜内注射で４ｍｇ／ラット）。ＰＶＧラットを神経挫滅の５分前に抗ヒトＣ６  ｍＡｂ（４ｍｇ／ラット  ＩＰ）で再度処置した。抗ヒトＣ６  ｍＡｂの後続の用量を１〜６日目に与えた（４ｍｇ／ラット  ＩＰ）。対照動物は、同じ挫滅を受けたが、抗体による処置はなかった。動物のサブセットを挫滅後７２時間で屠殺し、神経の組織構造を研究した。７２時間を選択し、これは、この時にワーラー変性がＷＴ動物において最大であり、この時点が治療効果を評定するために極めて有益であるためである。
【０３１２】
神経挫滅を以下のように行った。全ての手術手順を、深いイソフルラン麻酔（２．５体積％のイソフルラン、１Ｌ／分０２および１Ｌ／分Ｎ２０）下で無菌で行った。左大腿部の毛を剃り、坐骨神経を大腿上部の切開によって露出させた。神経を、平滑で湾曲した鉗子（７番）を使用して坐骨切痕のレベルにて１０秒間３回で挫滅させて、神経の挫滅エリアの完全に半透明の外観をもたらした。右脚を内部対照として使用した。次に、筋および皮膚を縫合によって閉じた。
【０３１３】
組み換え抗ヒトＣ６  ｍＡｂ  ７Ｅ５（１２ｍｇ／ｋｇ）による処置のための実験セットアップを表６で以下に示す。
【表６】
2020178711.tif 000044
【０３１４】
傷害後３日に、全ての動物に、ｐＨ７．６のピペラジン−Ｎ−Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液中４％のパラホルムアルデヒドを心臓内灌流した。左および右坐骨神経を各動物から除去し、挫滅部位から遠位の５ｍｍ長のセグメント１つを収集した。各セグメントを慣習的に加工して、免疫組織化学のためのパラフィンワックスにした。
【０３１５】
７ミクロン厚のパラフィン切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライド（Ｋｎｉｔｔｅｌ  Ｇｌａｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せた。切片を脱パラフィン化および再水和した。エピトープを、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の熱誘導性抗原回復によって露出させた。抗体の非特異的結合を、室温で２０分間、ＰＢＳ中１０％の正常なヤギ血清（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して遮断した。一次抗体をＮｏｒｍａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ，Ｄｕｉｖｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で希釈し、室温で１時間インキュベートした。１％ウシ血清アルブミン中で１：２００に希釈したＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのヤギ抗ウサギフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合体化ＩｇＧまたはヒツジ抗マウスＣｙ３複合体化のいずれかにおいて、切片をインキュベートすることによって検出を行った。インキュベート時、スライドを４，６−ジアミノジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって封入した。画像を、蛍光顕微鏡（Ｖａｎｏｘ，ＡＨＢＴ３、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に取り付けたデジタルカメラ（ＤＰ１２、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって捉えた。
【０３１６】
結果を図１０に示す。細胞を、ＭＡＣの検出のために抗Ｃ９により、軸索の検出のために抗ｐａｎ−ニューロフィラメント（ＳＭＩ３１２）によって、ミエリンの検出のために抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）により、および食細胞（マクロファージ）の検出のために抗リソソーム膜（ＣＤ６８）により染色した。パネルＡは、傷害のない坐骨神経の結果を示し、これは、ＭＡＣの不在、強力な軸索染色、環状のミエリン染色、および活性化されたマクロファージがないことを示している。パネルＢは、傷害後の結果を示し、ここでは、正常な補体活性を有するラットは、ＭＡＣ堆積、軸索およびミエリンの喪失、ならびにマクロファージの流入を示した。パネルＣは、Ｃ６再構成ラットを抗Ｃ６で処置した後の結果を示し、これは、抗体が、ＭＡＣ形成を完全に遮断し、軸索およびミエリン破壊を阻害し、マクロファージ流入を阻害することを示している。パネルＤは、再構成されていないＣ６−／−ラットの結果を示し、ＭＡＣ堆積の不在および急激な神経変性を示している。
【０３１７】
このように、神経挫滅実験の結果は、７Ｅ５抗Ｃ６抗体によるインビボの処置が、ＭＡＣ形成を遮断し、軸索およびミエリン破壊を阻害し、マクロファージ流入を低減することに成功したことを示し、それにより末梢神経傷害の動物モデルにおけるインビボの抗体の有効性を示す。
【０３１８】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識することになるか、あるいは単に日常的な実験を使用してそれを特定することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【表７−１】
2020178711.tif 000045
【表７−２】
2020178711.tif 000046
【図１Ａ】
2020178711.tif 000047
【図１Ｂ】
2020178711.tif 000048
【図２】
2020178711.tif 000049
【図３】
2020178711.tif 000050
【図４Ａ】
2020178711.tif 000051
【図４Ｂ】
2020178711.tif 000052
【図５】
2020178711.tif 000053
【図６Ａ】
2020178711.tif 000054
【図６Ｂ】
2020178711.tif 000055
【図７】
2020178711.tif 000056
【図８Ａ】
2020178711.tif 000057
【図８Ｂ】
2020178711.tif 000058
【図９】
2020178711.tif 000059
【図１０】
2020178711.tif 000060
【配列表】
2020178711000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月7日(2020.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣ６に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、以下の特性：
（ａ）溶血アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有すること、
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に１×１０−８Ｍ以下のＫＤを有すること、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって決定した場合に４０時間以上の抗体−Ｃ６結合半減期を有すること、および
（ｄ）カニクイザルＣ６と交差反応すること、のうちの少なくとも３つを呈する、抗体。