(57)【要約】【課題】本発明は、新規の二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合ポリペプチド、さらに具体的には、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することが可能な新規の二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性免疫グロブリン単一可変ドメイン構築物を提供する。本発明は、そのようなポリペプチドの特定の配列、その産生方法、およびがんなどの疾患の処置方法を含む、そのようなポリペプチドを使用する方法にも関する。【解決手段】特定の配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むことにより定義される第１の免疫グロブリン単一可変ドメインと、特定の配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むことにより定義される第２の免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に特異的に結合するポリペプチドにより、上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のＣＤＲ配列：
（ｉ）：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
（ｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
（ｉｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
を含むことにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群から選択される第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン
ならびに
以下のＣＤＲ配列：
（ｉｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
（ｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を含むことにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）の群から選択される第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含む、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項２】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
を含み、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
を含む、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
を含み、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を含む、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
を含み、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を含む、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨドメイン、好ましくはヒト化ＶＨＨドメインである、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下の配列：
（ｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVAAIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号１９）、
（ｉｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２０）、
（ｉｉｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２１）
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群から選択され、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが以下の配列：
（ｉｖ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２２）、
（ｖ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２３）
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）からなる群から選択される、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有し、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、
請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する、
請求項１または請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有し、
前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する、
請求項１または請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記第１および前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインがリンカーペプチドにより共有結合的に連結されており、前記リンカーペプチドが第３の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでいても、またはからなっていてもよい、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが半減期延長部分をさらに含み、前記半減期延長部分が前記ポリペプチドに共有結合的に連結されており、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合免疫グロブリンドメインなどのアルブミン結合部分、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメインなどのトランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、およびヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択されていてもよい、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記半減期延長部分がアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくは、配列番号２４により定義されるＡｌｂ１１ドメインである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７を含むまたはからなるポリペプチドの群から選択されるポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載されるポリペプチドをコードする、好ましくは単離された形態の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、
請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップと、
前記ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）活性成分として、請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチド、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含み、ならびに（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含んでもよい医薬組成物。
【請求項２０】
ヒトまたは動物における疾患、障害または状態の処置、予防または軽減のための方法で医薬として使用するための、請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
がん、好ましくは、乳がん、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肉腫、卵巣がんもしくは肝細胞癌の処置において使用するための、または特発性肺疾患の処置において使用するための、または異常なＷｎｔシグナル伝達により引き起こされる網膜症の処置において使用するための、請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の処置において使用するための、請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２３】
化学療法剤、血管新生を阻害する治療活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、またはホルモン療法剤と組み合わせて使用するための、請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチドと組み合わせて使用するための化学療法剤、血管新生を阻害する治療活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、およびホルモン療法剤からなる群から選択される治療剤。
【請求項２５】
それを必要とする患者におけるがんまたは特発性肺疾患または網膜症の処置方法であって、請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１９に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与するステップを含む処置方法。
【請求項２６】
ＬＲＰ５ならびにＬＲＰ６に特異的に結合することができ（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性）Ｗｎｔ１駆動標的遺伝子転写を阻害する第１の免疫グロブリン結合タンパク質、および
ＬＲＰ５ならびにＬＲＰ６に特異的に結合することができ（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性）Ｗｎｔ３ａ駆動標的遺伝子転写を阻害する第２の免疫グロブリン結合タンパク質
を含むポリペプチド。
【請求項２７】
前記第１と前記第２の免疫グロブリン結合タンパク質が免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
樹状細胞においてＷｎｔ１駆動およびＷｎｔ３ａ駆動標的遺伝子転写を阻害することにより腫瘍微小環境を改変するための、請求項１から１３、２６または２７のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項２９】
がんの処置において使用するための、請求項１から１３、２６または２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３０】
抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、および抗ＴＩＭ３抗体からなる群から選択される免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、またはがんワクチンと組み合わせてがんの処置において使用するための、請求項１から１３、２６または２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の低密度リポタンパク質受容体様タンパク質５（ＬＲＰ５）および低密度リポタンパク質受容体様タンパク質６（ＬＲＰ６）結合ポリペプチドに関する。本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸に、そのようなポリペプチドを調製するための方法に、そのようなポリペプチドを発現するまたは発現することができる宿主細胞に、そのようなポリペプチドを含む組成物に、および特にがん疾患の分野での治療目的でのそのようなポリペプチドまたはそのような組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体へのおよび共受容体ＬＲＰ５（受託番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｏ７５１９７／ＬＲＰ５＿ＨＵＭＡＮ）またはその密接に関係する相同体ＬＲＰ６（受託番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｏ７５５８１／ＬＲＰ６＿ＨＵＭＡＮ）への細胞外Ｗｎｔリガンドの結合が必要である。哺乳動物細胞には１９のＷｎｔタンパク質および１０のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体が存在する。Ｗｎｔリガンドが存在しなければ、細胞質ベータカテニンは、スキャフォールドタンパク質アキシンおよびＡＰＣならびにキナーゼＧＳＫ３ベータおよびＣＫ１ａからなるタンパク質複合体によりリン酸化される。ユビキチンリガーゼベータＴｒｃＰによるそれに続く認識によってベータカテニンはユビキチン媒介性の分解を受ける。Ｗｎｔリガンドが存在すると、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ５またはＬＲＰ６にＷｎｔが結合して、細胞質エフェクタータンパク質Ｄｖｌが動員されてＬＲＰ５またはＬＲＰ６細胞質テイルがリン酸化され、それによりアキシンに対するドッキング部位が提供される。ＬＲＰ５またはＬＲＰ６によりアキシンが隔離されると、アキシン−ＡＰＣ−ＧＳＫ３ベータ複合体が不活性化され、したがって、細胞内ベータカテニンが安定化して蓄積される。このゆえに、ベータカテニンの細胞質レベルが上昇し、ベータカテニンは核に移動して、転写因子のＴ細胞因子（ＴＣＦ）／リンパ系エンハンサー結合因子（ＬＥＦ）ファミリーのメンバーと複合体化する。次に、基礎転写機構およびｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）結合タンパク質（ＣＢＰ）またはその相同体ｐ３００を含む転写活性化補助因子が動員されて、アキシン２、サイクリンＤ１およびｃ−Ｍｙｃを含む種々の標的遺伝子が発現される。
【０００３】
追加のレベルのリガンド依存性Ｗｎｔ経路調節は、Ｅ３リガーゼＲＮＦ４３、およびその密接に関係する相同体ＺＮＲＦ３により、ならびに分泌型Ｒ−スポンジンタンパク質により媒介される（de Lau et al. “The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module: regulator of Wnt signal strength”. Genes Dev.2014; 28(4):305-16）。ＲＮＦ４３は、細胞表面でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５またはＬＲＰ６受容体複合体のユビキチン化を媒介して、この複合体を分解させ、それによってリガンド依存性Ｗｎｔ経路活性を阻害する。ＲＮＦ４３の活性はＲ−スポンジンファミリーメンバー（Ｒ−スポンジン１〜４リガンド）により相殺される。Ｒ−スポンジンリガンドが存在する場合、それは細胞表面からＲＮＦ４３を取り除いて、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５またはＬＲＰ６複合体を蓄積させ、Ｗｎｔリガンドの存在下でＷｎｔシグナル伝達を増強する。
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６はリガンド依存性Ｗｎｔシグナル伝達活性化のゲートキーパーとして機能し、したがって、１９のＷｎｔリガンドおよび１０のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のすべてにより媒介されＲ−スポンジンリガンドにより増強される経路の完全な遮断を達成するための標的と見なしうる。特に、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ１クラスとＷｎｔ３ａクラスに分けることが可能であり、それぞれがシグナル伝達のためにＬＲＰ５およびＬＲＰ６の異なるエピトープ／領域に結合する。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の外部ドメインは、ＥＧＦ様ドメインに連結されているベータプロペラの４つの反復単位、続いて３つのＬＤＬＲタイプＡ反復を含む。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の組み合わされた構造的および機能的分析により、Ｗｎｔ１（Ｗｎｔ１クラスリガンド）はベータプロペラ１および２を含有する断片に結合し、Ｗｎｔ３ａはＬＲＰ６のベータプロペラ３および４を含有する断片に結合すると示唆されている。現在までのところ、ベータプロペラ１〜４領域を含有するＬＲＰ６外部ドメインの低解像度写真のみが報告されている（Ahn et al. “Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”.Dev Cell.2011; 21(5):862-73）。しかし、これらの低解像度復元（４０Å）が不確実でありＷｎｔリガンドと複合体化したＬＲＰ６外部ドメインの構造データがないために、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａリガンド結合に関与する正確なエピトープを確定することができないでいる。
【０００４】
Ｗｎｔシグナル伝達の過剰活性化は種々のタイプのがんの発病に関与している。一部のがんタイプでは、下流シグナル伝達分子における頻繁な突然変異が構成的に活性化されたＷｎｔ経路の一因となっている（例えば、結腸直腸がんにおけるＡＰＣ突然変異；肝細胞癌におけるベータカテニン活性化突然変異）。これとは対照的に、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓腺癌では、ならびに結腸直腸がん（ＣＲＣ）のサブセットおよび子宮内膜がんでは、Ｗｎｔシグナル伝達活性化は、ベータカテニン細胞内蓄積により検出した場合、リガンド依存性機構により（すなわち、自己分泌／パラ分泌Ｗｎｔ活性化により）駆動される。ＮＳＣＬＣ、ＴＮＢＣおよび膵臓腺癌では、リガンド依存性Ｗｎｔ活性化は、Ｗｎｔリガンドならびに／もしくはＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体の増加した発現、またはＬＲＰ５およびＬＲＰ６ネガティブレギュレーターＤＫＫ１のサイレンシングを含む、複数の機構によって媒介される（TNBC: Liu et al. “LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy”. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107 (11):5136-41; Khramtsov et al. “Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome”. Am J Pathol.2010; 176(6): 2911-20; NSCLC: Nakashima et al. “Wnt1 overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients”. Oncol Rep.2008; 19(1):203-9; Pancreatic cancer: Zhang et al. “Canonical wnt signaling is required for pancreatic carcinogenesis”. Cancer Res.2013; 73(15):4909-22）。特に、公表されているデータによれば、健康な組織（例えば、乳腺および肺上皮）では、ベータカテニンは細胞膜のみに局在していることが明らかにされてきた。これとは対照的に、ＴＮＢＣ、ＮＳＣＬＣおよび膵臓腺癌原発臨床試料の大多数が、異常なＷｎｔシグナル伝達に起因するベータカテニン細胞内蓄積（すなわち、細胞質／核において；Ｗｎｔシグナル伝達活性化のバイオマーカー）を示した。最近の刊行物によれば、ＣＲＣおよび子宮内膜がんのサブセットにおいて、リガンド依存性Ｗｎｔシグナル伝達活性化は突然変異した／不活性化したＲＮＦ４３により（Giannakis et al.“RNF43 is frequently mutated in colorectal and endometrial cancers”. Nat Genet.2014; 46(12):1264-6）、またはＲ−スポンジン融合転写物（構成的に活性な強力プロモーターにより駆動されるＲ−スポンジン２またはＲ−スポンジン３タンパク質をコードする；Seshagiri et al. “Recurrent R-spondin fusions in colon cancer”. Nature 2012; 488(7413):660-4）を活性化することにより媒介されることが明らかにされてきた。不活性化ＲＮＦ４３突然変異およびＲ−スポンジン融合転写物は両方とも、細胞表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄの量を増加することによりリガンド依存性Ｗｎｔシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大させることが明らかにされてきた。腫瘍中でのリガンド依存性Ｗｎｔの活性化は、腫瘍増殖および化学療法または免疫療法に対する抵抗性を駆動することが明らかにされ、前臨床モデルでの再発に関連付けられている。
【０００５】
いくつかのＬＲＰ５またはＬＲＰ６結合分子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節することができ、当技術分野で公知である：
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）はＬＲＰ５およびＬＲＰ６阻害剤である。ＤＫＫ１は両方のＷｎｔ共受容体、ＬＲＰ５および６と会合し、膜貫通タンパク質ＫｒｅｍｅｎはＷｎｔシグナル伝達を阻害して急速なＬＲＰ５およびＬＲＰ６内部移行をもたらす。ＤＫＫ１はＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ媒介性シグナル伝達の両方を阻害することが明らかにされている。構造モデル研究により、単一ＤＫＫ１分子はＬＲＰ６外部ドメインの伸長領域（ベータプロペラ１〜３）に協同的に結合することが明らかにされる。構造分析によれば、ＤＫＫ１はＬＲＰ６と協同的に結合相互作用し、ベータプロペラ３領域への最初の結合によりＬＲＰ６外部ドメインの立体構造変化を経てベータプロペラ１および２への相互作用／結合が促進されることが示唆されている。しかし、言及したように、ＤＫＫ１に結合している完全ＬＲＰ６外部ドメインの構造再構築の解像度が低いせいで、ＬＲＰ６へのＤＫＫ１結合に関与するベータプロペラ１、２および３ドメイン内の確定したエピトープは解明されていない。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＫＫ１処置は消化管において重篤な毒性を引き起こすことが明らかにされた。特に、成獣マウスでＤＫＫ１を、アデノウイルスの媒介により発現させると、小腸および結腸での増殖を著しく阻害し、進行性の構造変性、深刻な体重減少ならびに大腸炎および全身感染症による死亡を伴うことが明らかにされた。特に、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は腸の増殖性上皮細胞において発現され腸上皮の増殖に必要とされ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６を阻害するとこのおよび他の正常組織に有毒である可能性があることが示唆されている（Zhong et al.“Lrp5 and Lrp6 play compensatory roles in mouse intestinal development”. J Cell Biochem.2012; 113(1):31-8）。このために、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６を阻害する、またはＷｎｔ（Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ）シグナル伝達経路全般を阻害する薬剤を治療目的に使用可能かどうか、例えば、抗がん薬として開発することが可能かどうかは疑わしい。
【０００７】
国際公開第２００９／０５６６３４号は、Ｗｎｔ１シグナル伝達経路とまたはＷｎｔ３／３ａシグナル伝達経路と相互作用することがあるＬＲＰ６結合分子に言及しており、この分子はアンタゴニスト的にもアゴニスト的にもなることがあり、変形性関節炎、多発性嚢胞腎疾患、またはがんなどの「Ｗｎｔシグナル伝達関係障害」の診断目的でまたはこれを処置するために使用することができる。そのアミノ酸配列により定義されるそのような結合分子の特定の例は本文書には提供されていない。
国際公開第２０１１／１３８３９１号および国際公開第２０１１／１３８３９２号は多価ＬＲＰ６結合抗体を開示している。国際公開第２０１１／１３８３９１号は、１つのＷｎｔシグナル伝達経路（Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３）をもう一方の経路（ぞれぞれＷｎｔ３またはＷｎｔ１）を増強することなく遮断している抗体の権利を主張している。国際公開第２０１１／１３８３９２号は、とりわけ、ＬＲＰ６受容体のクラスター化によりＷｎｔシグナル伝達を増強する抗体または抗体断片を提供している。
【０００８】
国際公開第２０１１／１３８３９１号は、所望の効果を達成するためには、ＬＲＰ６結合分子を完全長ＩｇＧ抗体のフォーマットにする必要があると説明している。第２の結合特異性を有する一本鎖Ｆｖ部分に連結されている第１の結合特異性を有するＩｇＧ分子を含むＬＲＰ６二重パラトピック分子の例が提供される。一部のフォーマットは著しく減少した熱安定性（５０〜５２℃のＴｍ）を有すると記載されている。Ｆｃ部分は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能をＩｇＧ分子に与えることができる。
国際公開第２０１３／０６７３５５号は、国際公開第２０１１／１３８３９１号に開示されているＩｇＧ分子由来の半減期延長された二重パラトピックＬＲＰ６結合ｓｃＦｖ免疫グロブリン構築物を開示している。
国際公開第２０１１／１１９６６１号は、ＬＲＰ６に結合し、第１のＷｎｔアイソフォームにより、特に、Ｗｎｔ３またはＷｎｔ３ａにより誘導されるシグナル伝達を阻害するが、第２のＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を増強する抗体を開示しており、この第２のＷｎｔアイソフォームはＷｎｔ１、２、２ｂ、４、６、７ａ、７ｂ、８ａ、９ａ、９ｂ、１０ａまたは１０ｂアイソフォームのこともある。ＬＲＰ６のＥ１〜Ｅ２領域にならびにＬＲＰ６のＥ３〜Ｅ４領域に結合する二重特異性分子が開示されている。ノブインホール技法を使用して二重特異性抗体は作成された。
【０００９】
ＬＲＰ６抗体の結合に関与している結合エピトープ（ＬＲＰ６外部ドメイン／ベータプロペラ領域内の限定されたアミノ酸残基）の同定は、国際公開第２００９／０５６６３４号でも国際公開第２０１１／１３８３９１号または国際公開第２０１３／０６７３５５号でも提供されておらず、国際公開第２０１１／１１９６６１号で部分的に提供されているだけである。特に、ＬＲＰ６結合抗体は、直接Ｗｎｔと競合するまたは三元受容体複合体（Ｗｎｔ−ＬＲＰ６−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）の形成を阻害することを含む、ＬＲＰ６の異なる領域への結合による別の機構を介してＷｎｔシグナル伝達を阻害することが可能であり、他の抗体は、おそらく受容体クラスター化によりシグナル伝達を増強する（Ahn et al. “Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”.Dev Cell.2011; 21(5):862-73）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、当技術分野で記載される結合分子で、現在までいずれかの疾患を処置する医薬としての使用を保健機関から認可を受けたものは１つもない。具体的には、そのような使用には、そのような分子が他の標的に結合、これを活性化、もしくこれを阻害する、またはこれに結合、これを活性化、もしくこれを阻害（例えば、他のシグナル伝達経路の望ましくない活性化もしくは阻害、または標的アイソフォームに関して活性化もしくは阻害の欠如をもたらしてしまう）しないように非常に特異的な結合特性、正確な特異性が必要であり、二重または多特異性剤の場合には、２つまたはそれよりも多い結合特異性の間の正確な均衡、適切な薬理動態および動的特性、許容できる毒性プロファイル、ならびに当然のことながらｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が必要である。
上記に鑑みて、数種類のがん疾患および腫瘍の効率的な処置を可能にする新規の治療剤の必要性がある。したがって、ＮＳＣＬＣおよびＴＮＢＣを含むいくつかのがん疾患の処置において使用することが可能であるそのような薬理活性剤を提供することが本発明の目的である。
特に、当技術分野で現在使用されているおよび／または公知の薬剤、組成物および／または方法と比べてある特定の利点を与えるそのような薬理活性剤、組成物および／または処置の方法を提供することが本発明の目的である。これらの利点は、特に当技術分野で既知の候補薬物と比べた場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性、改良された治療的および薬理的特性、より少ない副作用、および改善された調製の容易さまたは減少した製品コストなどの他の有利な特性を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、本発明はＬＲＰ５またはＬＲＰ６に特異的に結合するポリペプチドを提供し、そのような本発明のポリペプチドは、以下のＣＤＲ配列：
（ｉ）：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
（ｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
（ｉｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
を有することにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群から選択される第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）
ならびに以下のＣＤＲ配列：
（ｉｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
（ｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を有することにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）の群から選択される第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｂ）
を含む。
【００１２】
そのような免疫グロブリン単一可変ドメインに関して用語「第１の」および「第２の」は、（これらのドメインは少なくとも異なるＣＤＲ配列を含むので）専らこれらのドメインが２つの異なるドメインであることを示すことを意図されている。したがって、これらの用語は、そのようなポリペプチド鎖内でのドメインの正確な順序または配列を指すとは理解されないものとする。
【００１３】
本発明のポリペプチドは、
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１（Ａｌｂ１１）：ＳＦＧＭＳ（＝配列番号１６）
ＣＤＲ２（Ａｌｂ１１）：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１７）
ＣＤＲ３（Ａｌｂ１１）：ＧＧＳＬＳＲ（＝配列番号１８）
を含む、Ａｌｂ１１ドメインなどの、特にアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインなどの、第３の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでいてもよい。
【００１４】
さらに具体的な実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、ＶＨＨドメイン、好ましくはヒト化ＶＨＨドメインである免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
さらに具体的な実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、以下の配列：
（ｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVAAIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号１９）
（ｉｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２０）
（ｉｉｉ）：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２１）
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群から選択される第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）
ならびに以下の配列：
（ｉｖ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２２）、および
（ｖ）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
（＝配列番号２３）
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）からなる群から選択される第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｂ）
を含む。
【００１５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは半減期延長部分をさらに含み、前記半減期延長部分は前記ポリペプチドに共有結合的に連結されており、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合免疫グロブリンドメインなどのアルブミン結合部分、好ましくは、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、さらに好ましくは、Ａｌｂ１１ドメイン、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメインなどのトランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、およびヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択してもよい。
特に好ましいのは、上で概説した２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）および（ｂ）に加えて、以下の配列：
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTI
GGSLSRSSQGTLVTVSS
（＝配列番号２４）
を有するＡｌｂ１１ドメインを含むポリペプチドである。
【００１６】
さらなる実施形態によれば、本発明は、以下の３つのポリペプチド鎖：
Ｆ１３５００５７５、配列番号２５の配列を有する、
Ｆ１３５００５７１、配列番号２６の配列を有する、および
Ｆ１３５００７２０、配列番号２７の配列を有する、
のいずれかを含むまたはからなるポリペプチドを特に含む。
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドの産生に使用される核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および製造方法に関する。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、それぞれの発現ベクターを構築するために単離された形態で使用することが可能であり、次にベクターは本発明のポリペプチドの生物製剤生産のために使用される宿主細胞にトランスフェクトすることができる。そのような製造方法は典型的に、当技術分野で公知の方法に従って、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収して、
これを精製するステップを含む。
【００１７】
本発明のポリペプチドに関与するさらなる態様、実施形態、使用および方法は、本発明の以下の詳細な説明からおよび添付の特許請求の範囲から明らかになる。
本発明は、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、およびＮＳＣＬＣなどのいくつかのがんタイプの副作用がもっと少ないもっと効率的な処置を可能にする新規の分子を提供する。本発明のポリペプチドは、腫瘍縮小を誘導して病理学的完全奏功（ｐＣＲ）をもたらすことができる点で、がん患者の処置において驚くべき治療効果（すなわち、有効性）を提供する。これは次に、特に、例えば、乳がんでなどの高度なアンメットメディカルニーズ適応症で、無憎悪生存および全生存を著しく改善すると予想される。したがって、本発明のポリペプチドは、いくつかのがんタイプ、特に、脱調節されたＷｎｔシグナル伝達経路およびベータカテニン蓄積を示すがんタイプの処置での新規の治療選択肢を提供する。
【００１８】
さらに、本発明のポリペプチドは製造が容易であり、高い安定性および低い抗原性を有し、注射および注入に加えて、投与経路に関して種々の選択肢を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａシグナル伝達に拮抗する二重パラトピックポリペプチドの概略図を示す図である。これらは、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の異なるエピトープに結合する２つのドメイン（Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ遮断剤）、ならびに半減期延長のための１つのドメイン（ヒト血清アルブミン結合剤）の３つのドメインからなる。
【図２】ラマの免疫性付与に由来するＬＲＰ６結合ＶＨＨの代表的な数に関して、結合ＦＡＣＳとＥＬＩＳＡアッセイの間の相関性の欠如を示す図である。ＶＨＨの「１」番のパネルは、ＦＡＣＳ結合アッセイ（ｙ軸にＭＣＦ値を報告する）によって検出される、細胞膜上にＬＲＰ６を発現する細胞への高親和性を特徴とする。ＶＨＨの「２」番のパネルは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（ｘ軸にＯＤ４０５値を報告する）によって検出される、組換えヒトＬＲＰ６の外部ドメイン（ｒｈＬＲＰ６−Ｆｃ）への高親和性を特徴とする。
【図３Ａ】非標的化結合剤（ＨＥＫ２９３細胞に発現していない細菌タンパク質に結合するＶＨＨ構築物）からなる陰性対照と比較した、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の、ヒトＬＲＰ５（図３Ａ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株への結合を示す図である。
【図３Ｂ】非標的化結合剤（ＨＥＫ２９３細胞に発現していない細菌タンパク質に結合するＶＨＨ構築物）からなる陰性対照と比較した、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の、ヒトＬＲＰ６（図３Ｂ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株への結合を示す図である。
【図４Ａ】ＦＡＣＳベースのＤＫＫ１競合アッセイによって検出された、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物のヒトＬＲＰ５（図４Ａ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株両方への結合に対するＤＫＫ１の完全な競合を示す図である。
【図４Ｂ】ＦＡＣＳベースのＤＫＫ１競合アッセイによって検出された、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物のヒトＬＲＰ６（図４Ｂ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株両方への結合に対するＤＫＫ１の完全な競合を示す図である。
【図５Ａ】３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図５Ａ）の、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の完全な阻害、ならびにＷｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイにおける他のＬＲＰ６結合分子との比較（図５Ｂ：Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９およびＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ６４７５ｓｃｆｖ；図５Ｃ：８０２Ｔ）を示す図である。
【図５Ｂ】３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図５Ａ）の、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の完全な阻害、ならびにＷｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイにおける他のＬＲＰ６結合分子との比較（図５Ｂ：Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９およびＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ６４７５ｓｃｆｖ；図５Ｃ：８０２Ｔ）を示す図である。
【図５Ｃ】３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図５Ａ）の、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の完全な阻害、ならびにＷｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイにおける他のＬＲＰ６結合分子との比較（図５Ｂ：Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９およびＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ６４７５ｓｃｆｖ；図５Ｃ：８０２Ｔ）を示す図である。
【図６Ａ】相対的なＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の阻害（図６Ａ）によって検出されるがん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害、ならびにＦ０１３５００５７１および未処置（対照）細胞（図６Ｂの左手側／右手側の図表）と比較して、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（最終濃度１ｍＭ）での処置後、および８０２Ｔでの処置による、生存細胞の割合（％）の減少によって検出される細胞増殖（図６Ｂ）を示す図である；用量反応曲線は、１つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６構築物（図６Ｃ）および８０２Ｔ（図６Ｄ）での処置を示す。
【図６Ｂ】相対的なＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の阻害（図６Ａ）によって検出されるがん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害、ならびにＦ０１３５００５７１および未処置（対照）細胞（図６Ｂの左手側／右手側の図表）と比較して、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（最終濃度１ｍＭ）での処置後、および８０２Ｔでの処置による、生存細胞の割合（％）の減少によって検出される細胞増殖（図６Ｂ）を示す図である；用量反応曲線は、１つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６構築物（図６Ｃ）および８０２Ｔ（図６Ｄ）での処置を示す。
【図６Ｃ】相対的なＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の阻害（図６Ａ）によって検出されるがん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害、ならびにＦ０１３５００５７１および未処置（対照）細胞（図６Ｂの左手側／右手側の図表）と比較して、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（最終濃度１ｍＭ）での処置後、および８０２Ｔでの処置による、生存細胞の割合（％）の減少によって検出される細胞増殖（図６Ｂ）を示す図である；用量反応曲線は、１つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６構築物（図６Ｃ）および８０２Ｔ（図６Ｄ）での処置を示す。
【図６Ｄ】相対的なＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の阻害（図６Ａ）によって検出されるがん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害、ならびにＦ０１３５００５７１および未処置（対照）細胞（図６Ｂの左手側／右手側の図表）と比較して、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（最終濃度１ｍＭ）での処置後、および８０２Ｔでの処置による、生存細胞の割合（％）の減少によって検出される細胞増殖（図６Ｂ）を示す図である；用量反応曲線は、１つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６構築物（図６Ｃ）および８０２Ｔ（図６Ｄ）での処置を示す。
【図７Ａ】Ｗｎｔ駆動腫瘍モデル（ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植片モデル）における、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図７ＡはＦ０１３５００５７１および図７ＢはＦ０１３５００７２０）、およびＫｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９（図７Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。
【図７Ｂ】Ｗｎｔ駆動腫瘍モデル（ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植片モデル）における、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図７ＡはＦ０１３５００５７１および図７ＢはＦ０１３５００７２０）、およびＫｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９（図７Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。
【図７Ｃ】Ｗｎｔ駆動腫瘍モデル（ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植片モデル）における、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（図７ＡはＦ０１３５００５７１および図７ＢはＦ０１３５００７２０）、およびＫｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９（図７Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。
【図８Ａ】対照群と比較した、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の低下によって検出される、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物、Ｆ０１３５００５７１およびＦ０１３５００７２０で処置した腫瘍におけるＷｎｔ経路の阻害を示す図である。
【図８Ｂ】対照群と比較した、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の低下によって検出される、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物、Ｆ０１３５００５７１およびＦ０１３５００７２０で処置した腫瘍におけるＷｎｔ経路の阻害を示す図である。
【図９Ａ】半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物での処置時に、樹状細胞による炎症性サイトカインＴＮＦアルファの放出におけるＷｎｔ３ａ駆動シグナル伝達阻害の効果（図９Ａ）、およびインターフェロンガンマ放出によって測定されるＴ細胞活性化における効果（図９Ｂ）を示す図である。各記号は、単独の樹状細胞（ＤＣ）ドナーを表す。示したデータは、未処置対照のＴＮＦアルファレベルに正規化され（図９Ａ）、各記号はＤＣおよびＴ細胞の単独のドナー対を表す（パネルＢ）。
【図９Ｂ】半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物での処置時に、樹状細胞による炎症性サイトカインＴＮＦアルファの放出におけるＷｎｔ３ａ駆動シグナル伝達阻害の効果（図９Ａ）、およびインターフェロンガンマ放出によって測定されるＴ細胞活性化における効果（図９Ｂ）を示す図である。各記号は、単独の樹状細胞（ＤＣ）ドナーを表す。示したデータは、未処置対照のＴＮＦアルファレベルに正規化され（図９Ａ）、各記号はＤＣおよびＴ細胞の単独のドナー対を表す（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明の上記ならびに他の態様および実施形態は本明細書のさらなる説明から明らかになる：
ａ）別の方法で示されるまたは定義されなければ、使用される用語はすべて当技術分野でのその通常の意味を有し、このことは当業者に明らかになる。例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)などの標準的ハンドブック、ならびに本明細書で引用される一般的背景技術を参照する。さらに、別の方法で示されなければ、特に詳細に記載されていない方法、ステップ、技法および操作はすべて、当業者には明らかになるように、実施することが可能でありそれ自体公知の様式で実施されてきた。例えば、再び、標準的ハンドブックを、上で言及された一般的背景技術を、およびそこに引用されるさらなる参考文献を参照する。
【００２１】
ｂ）別の方法で示されなければ、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書で使用されるのが重鎖抗体を指すためであれ従来の４本鎖抗体を指すためであれ、フルサイズ抗体、その個々の鎖の両方、ならびに、その部分、ドメインまたは断片（それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたは断片を含むがこれらに限定されない）すべてを含む一般用語として使用される。さらに、本明細書で使用される用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」のような用語で）は、文脈がさらに限定された解釈を必要としていなければ、一般に、関連するアミノ酸配列ならびにそのアミノ酸配列をコードしている核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
ｃ）本明細書で使用される用語「ドメイン」（ポリペプチドまたはタンパク質の）とは、タンパク質の残りとは独立して、その三次構造を保持する能力を有するフォールディングされたタンパク質構造のことである。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能特性の原因であり、多くの場合、タンパク質の残りのおよび／またはドメインの機能を失わずに付加する、取り除くまたは他のタンパク質に移すことができる。
【００２２】
ｄ）本明細書で使用される用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖（例えば、従来の４本鎖抗体のまたは重鎖抗体の鎖など）の球状領域、または本質的にそのような球状領域からなるポリペプチドのことである。免疫グロブリンドメインは抗体分子に特徴的である免疫グロブリンフォールドを保持していて、このフォールドは２本のベータシートに配置された約７本の逆平行ベータストランドの２層サンドイッチからなり、保存されたジスルフィド結合により安定化されていてもよいことを特徴とする。
ｅ）本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインであり、これら領域は当技術分野ではおよび以下では、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれ、これらのフレームワーク領域は３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」により分断されており、これらの領域は当技術分野ではおよび以下では、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの全体構造または配列は以下の通り：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４に示すことが可能である。抗原結合部位を有することにより抗原に対する特異性を抗体に与えるのは免疫グロブリン可変ドメインである。
【００２３】
ｆ）本明細書で使用される用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、追加の可変免疫グロブリンドメインと対合せずに抗原のエピトープ特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインのことである。本発明の意味での免疫グロブリン単一可変ドメインの１例は、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨおよびＶＬ（ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）などの「ドメイン抗体」である。免疫グロブリン単一可変ドメインのもう１つの重要な例は、下文で定義されるように、ラクダ科由来の「ＶＨＨドメイン」（または単に「ＶＨＨ」）である。
上の定義に鑑みて、従来の４本鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子などの；当技術分野では公知である）のまたはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片、もしくはそのような従来の４本鎖抗体に由来するダイアボディ（すべて当技術分野では公知である）の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとは見なされない。なぜならば、これらの場合、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は通常は、１つ（単一）の免疫グロブリンドメインによっては起こらず、軽および重鎖可変ドメインなどの一対の（会合している）免疫グロブリンドメインにより、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに共同で結合する、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対により起こると考えられるからである。
【００２４】
ｆ１）「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られているが、最初は「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」の；Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインと言われてきた。用語「ＶＨＨドメイン」が選ばれてきたのは、これらの可変ドメインを従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶHドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ばれる）とおよび従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶLドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するためである。ＶＨＨドメインは追加の抗原結合ドメインなしでエピトープに特異的に結合することが可能である（従来の４本鎖抗体中のＶＨまたはＶＬとは対照的に、これらの場合、エピトープはＶＬドメインとＶＨドメインが一緒になって認識する）。ＶＨＨドメインは単一の免疫グロブリンドメインにより形成される小さく頑強で効率的な抗原認識ユニットである。
【００２５】
本発明の文脈では、用語ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨ抗体、ならびに「ナノボディ（登録商標）」および「ナノボディ（登録商標）ドメイン」（「ナノボディ」はＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．社；Ｇｈｅｎｔ；Ｂｅｌｇｉｕｍの商標である）は互換的に使用され、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の構造を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とせずにエピトープに特異的に結合する）を表し、例えば、国際公開第２００９／１０９６３５号、図１に定義されるいわゆる「ホールマーク残基」によりＶＨドメインとは区別することもできる。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基はＫａｂａｔらにより与えられたＶHドメインについての一般的番号付け（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91）に従って番号が付けられており、ラクダ科由来のＶＨＨドメインに適用した場合、例えば、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)の図２に示されている。この番号付けに従えば、
−ＦＲ１は１〜３０位のアミノ酸残基を含み、
−ＣＤＲ１は３１〜３５位のアミノ酸残基を含み、
−ＦＲ２は３６〜４９位のアミノ酸を含み、
−ＣＤＲ２は５０〜６５位のアミノ酸残基を含み、
−ＦＲ３は６６〜９４位のアミノ酸残基を含み、
−ＣＤＲ３は９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、および
−ＦＲ４は１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。
しかし、ＶHドメインについて及びＶＨＨドメインについて当技術分野では周知のように、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸残基の総数は変動することがあり、Ｋａｂａｔ番号付けにより示されるアミノ酸残基の総数とは一致しないことがある（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けに従った１つまたは複数の位置が実際の配列内で占有されていないことがある、または実際の配列がＫａｂａｔ番号付けにより許される数よりも多くのアミノ酸残基を含有することがある）ことに留意すべきである。これは、一般にはＫａｂａｔに従った番号付けは実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けと一致することも一致しないこともあることを意味する。
【００２６】
ＶHドメインのアミノ酸残基を番号付けするための別の方法が当技術分野では公知であり、この方法はＶＨＨドメインにも類似する様式で適用することが可能である。しかし、本明細書、特許請求の範囲および図では、別の方法で示されていなければ、上記のように、Ｋａｂａｔに従ってＶＨＨドメインに適用される番号付けに従う。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は通常は１１０〜１２０の範囲、多くの場合１１２と１１５の間である。しかし、より小くより長い配列のほうが本明細書に記載される目的にも適していることがあることに留意すべきである。
【００２７】
ＶＨＨドメインおよびＶＨＨドメインを含有するポリペプチドのさらなる構造的特徴および機能特性は以下のようにまとめることが可能である：
ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインが存在しなくても、およびこれと相互作用しなくても抗原と機能的に結合するように本来「設計」されている）は、単一の比較的小さな機能的抗原結合構造ユニット、ドメインまたはポリペプチドとして機能することが可能である。これによりＶＨＨドメインは従来の４本鎖抗体のＶＨおよびＶＬドメインと区別される。従来の４本鎖抗体のＶＨおよびＶＬドメインはそれだけでは一般に単一の抗原結合タンパク質または免疫グロブリン単一可変ドメインとして実用化に適してはおらず、機能的な抗原結合ユニットを提供するためには何らかの形態で組み合わせる必要がある（例えば、Ｆａｂ断片などの従来の抗体断片で；ｓｃＦｖで、これはＶＬドメインに共有結合的に連結されているＶＨドメインからなる）。
【００２８】
これらの独特な特性のせいで、ＶＨＨドメインの使用は、単独でももっと大きなポリペプチドの一部としてでも、従来のＶＨおよびＶＬドメイン、ｓｃＦｖまたは従来の抗体断片（Ｆａｂ−またはＦ（ａｂ’）２断片など）の使用よりも有意な利点をいくつか提供する：
−抗原に高親和性でおよび高選択性で結合するためには単一のドメインのみが必要であり、そのために２つの別々のドメインが存在する必要も、これら２つのドメインが正しい空間立体構造および立体配置で（すなわち、ｓｃＦｖの場合のように、特別に設計されたリンカーの使用を通じて）存在していることを確かめる必要もない；
−ＶＨＨドメインは単一遺伝子から発現させることが可能であり、翻訳後フォールディングまたは修飾を必要としない；
−ＶＨＨドメインは容易に、工学的に操作して多価および多重特異性フォーマットにすることが可能である（本明細書でさらに考察される）；
−ＶＨＨドメインは高度に可溶性であり凝集する傾向がない（Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)により記載されているマウス由来抗原結合ドメインの場合と同様に）；−ＶＨＨドメインは熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性剤または状態に対して高度に安定しており、したがって、冷凍装置を使用せずに、調製し、保存しまたは輸送することができ、経費削減、時間節約および環境保全をかなえる；
−ＶＨＨドメインは、生産に必要な規模でも、調製するのが容易であり比較的安価である。例えば、ＶＨＨドメインおよびＶＨＨドメインを含有するポリペプチドは微生物発酵を使用して産生することが可能であり（例えば、下でさらに説明される）、例えば、従来の抗体断片の場合のように、哺乳動物発現系の使用を必要としない；
−ＶＨＨドメインは、従来の４本鎖抗体およびその抗原結合断片と比べて比較的小さく（おおよそ１５ｋＤａ、または従来のＩｇＧの１０分の１）、したがって、そのような従来の４本鎖抗体およびその抗原結合断片よりも
−−組織への高度な（より高度な）浸透を示し
−−より高用量で投与することが可能である；
−ＶＨＨドメインはいわゆる空洞結合特性を示すことが可能であり（従来のＶＨドメインと比べて、とりわけその伸張されたＣＤＲループのせいで）、したがって、従来の４本鎖抗体およびその抗原結合断片では到達できない標的およびエピトープにも接近することが可能である。
【００２９】
特定の抗原またはエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は、以前、例えば、国際公開第２００６／０４０１５３号および国際公開第２００６／１２２７８６号に記載されている。そこにも詳細に説明されているように、ラクダ科由来のＶＨＨドメインは、最初のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基をヒト由来の従来の４本鎖抗体由来のＶＨドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数で置き換えることにより「ヒト化」することが可能である。ヒト化ＶＨＨドメインは１つまたは複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することが可能であり、さらに具体的な実施形態では、ＤＰ−２９、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、またはその部分に由来するヒトフレームワーク領域配列を含有することが可能であり、ＪＨ５などのＪＨ配列と組み合わせてもよい。
【００３０】
ｆ２）「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、および「ｄＡｂ」（用語「Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」および「ｄＡｂ」はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅグループ会社により商標として使用されている）としても知られるが、例えば、Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J.et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); および国際公開第２００３／００２６０９号に記載されてきた。ドメイン抗体は非ラクダ科哺乳動物、特にヒト４本鎖抗体のＶＨまたはＶＬドメインに本質的に一致する。単一抗原結合ドメインとして、すなわち、それぞれＶＬまたはＶＨドメインと対合することなくエピトープに結合するためには、例えば、ヒト単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することにより、そのような抗原結合特性の特定の選択が必要である。ドメイン抗体は、ＶＨＨ同様に、おおよそ１３〜おおよそ１６ｋＤａの分子量を有し、完全ヒト配列に由来する場合は、例えば、ヒトでの治療的使用のためにヒト化する必要がない。ＶＨＨドメインの場合と同様に、ドメイン抗体も原核生物発現系でよく発現され、全体的製造費用が著しく減少する。
【００３１】
ドメイン抗体、ならびに、ＶＨＨドメインは、１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列に１つまたは複数の変更を導入することにより親和性成熟にかけることが可能であり、この変更によりそれぞれの親分子と比べた場合、そのそれぞれの抗原に対して得られた免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性が改善される。本発明の親和性成熟免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、例えば、Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, or Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol.155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J.Immunol.154(7):3310-9; and Hawkins et al., 1992, J. MoI.Biol.226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996により記載される通りに、当技術分野で公知の方法により調製することができる。
【００３２】
ｆ３）さらに、上記のＣＤＲのうちの１つまたは複数を、ヒトスキャフォールドまたは非免疫グロブリンスキャフォールドを含むがこれらに限定されない他の「スキャフォールド」上に「移植する」ことが可能であることも当業者に明らかになる。適切なスキャフォールドおよびそのようなＣＤＲ移植のための技法は当技術分野では公知である。
ｇ）用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、互換的に使用することが可能であり、従来の抗体または本発明のポリペプチドなどの抗原結合分子により、さらに詳細には、前記分子の抗原結合部位により認識される、ポリペプチドなどの巨大分子の一部のことである。エピトープは免疫グロブリンに対する最小結合部位を定義し、したがって、免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
抗原結合分子（従来の抗体または本発明のポリペプチドなどの）のうちエピトープを認識する部分はパラトープと呼ばれる。
【００３３】
ｈ）本明細書で使用される用語「二重パラトピック」（抗原）結合分子または「二重パラトピック」ポリペプチドとは、本明細書で定義される第１の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、これら２つの可変ドメインは１つの抗原の２つの異なるエピトープに結合することができ、そのエピトープは通常では、例えば、従来の抗体または１つの免疫グロブリン単一可変ドメインなどの１つの単一特異性免疫グロブリンが同時に結合することはない、ポリペプチドを意味するものとする。本発明に従った二重パラトピックポリペプチドは異なるエピトープ特異性を有する可変ドメインで構成されており、同じエピトープに結合する互いに相補的な可変ドメインを含有しない。したがって、本発明に従った二重パラトピックポリペプチドはＬＲＰ５またはＬＲＰ６への結合を巡って互いに競合しない。
ｉ）ある特定のエピトープ、抗原もしくはタンパク質（またはその少なくとも１つの部分、断片もしくはエピトープ）に「結合する」もしくは「特異的に結合する」ことができる、「親和性を有する」および／または「特異性を有する」ポリペプチド（免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、本発明のポリペプチド、または一般的には抗原結合分子もしくはその断片）は、前記エピトープ、抗原もしくはタンパク質に「対する」もしくは「向けられる」と言われるまたはそのようなエピトープ、抗原もしくはタンパク質に関する「結合」分子である。
【００３４】
ｋ）一般的に、用語「特異性」とは、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、または本発明のポリペプチドなどの）が結合することが可能な異なるタイプの抗原またはエピトープの数のことである。抗原結合タンパク質の特異性はその親和性および／または結合活性に基づいて決定することが可能である。親和性は、抗原と抗原結合タンパク質の解離についての平衡定数（ＫD）により表されるが、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位の間の結合強度を表す尺度であり：ＫDの値が小さくなるに従ってエピトープと抗原結合分子の間の結合強度は強くなる（代わりに、親和性は１／ＫDのことである親和性定数（ＫA）として表すことも可能である）。当業者には明らかになるように（例えば、本明細書でのさらなる開示に基づいて）、親和性は目的の特定の抗原に応じて、それ自体公知である様式で決定することが可能である。結合活性は、抗原結合分子（免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、または本発明のポリペプチドなどの）と関連する抗原の間の結合の強さの尺度である。結合活性は、エピトープと抗原結合分子上のその抗原結合部位の間の親和性と抗原結合分子上に存在する関連する結合部位の数の両方に関係する。
【００３５】
典型的には、抗原結合タンパク質（本発明のポリペプチドなどの）は、１０Ｅ−５〜１０Ｅ−１４モル／リットル（Ｍ）もしくはそれ未満、好ましくは、１０Ｅ−７〜１０Ｅ−１４モル／リットル（Ｍ）もしくはそれ未満、さらに好ましくは、１０Ｅ−８〜１０Ｅ−１４モル／リットル、さらに好ましくは、１０Ｅ−１１〜１０Ｅ−１３の解離定数（ＫD）で（例えば、Ｋｉｎｅｘａアッセイで測定した場合；当技術分野では公知）、および／または少なくとも１０Ｅ７  ＭＥ−１、好ましくは、少なくとも１０Ｅ８  ＭＥ−１、さらに好ましくは、少なくとも１０Ｅ１１  ＭＥ−１などの少なくとも１０Ｅ９  ＭＥ−１の会合定数（ＫA）で結合する。１０Ｅ−４Ｍよりも大きな任意のＫD値は一般に非特異的結合を示していると見なされる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは、２００ｎＭ未満、さらに好ましくは、５００ｐＭ未満などの１０ｎＭ未満のＫDで所望の抗原に結合する。抗原またはエピトープへの抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ、スキャチャード解析ならびに／または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ、ならびに当技術分野でそれ自体公知であるその異なるバリアントを含む、それ自体公知である任意の適切な様式で決定することが可能である。
【００３６】
ｌ）ＬＲＰ５にならびにＬＲＰ６に結合することができる結合分子と関連した用語「交差反応性の」（「ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性の」）は、そのような結合分子がＬＲＰ５分子に含まれるエピトープに特異的に結合することが可能であり、代わりにＬＲＰ６分子に含まれるエピトープにも特異的に結合することが可能であることを意味するように意図されている。通常、そのような交差反応性は、そのような結合分子が結合している異なるタンパク質のエピトープが類似する構造および／または配列を有する、例えば、保存されたエピトープを表す、例えば、同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質（例えば、ＬＲＰタンパク質ファミリーに属しているＬＲＰ５とＬＲＰ６）により共有されている場合に生じることがある。
【００３７】
ｍ）アミノ酸残基は、当技術分野で一般に知られており取り決められているように、標準３文字または１文字アミノ酸コードに従って示される。２つのアミノ酸配列を比較した場合、用語「アミノ酸差異」とは、第２の配列と比べて、基準配列の位置での表示された番号のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換のことである。置換の場合、そのような置換は好ましくは保存的アミノ酸置換であり、これはアミノ酸残基が、類似する化学構造でありポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に全く影響を及ぼさない別のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。そのような保存的アミノ酸置換は当技術分野では、例えば、国際公開第９８／４９１８５号から周知であり、保存的アミノ酸置換は好ましくは、以下の群（ｉ）〜（ｖ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ｉ）小型の脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｉｉ）極性、負電荷残基およびその（非電荷）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｉｉｉ）極性、正電荷残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｉｖ）大型の脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｌｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐである。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである：
ＡｌａからＧｌｙへまたはＳｅｒへ；
ＡｒｇからＬｙｓへ；
ＡｓｎからＧｌｎへまたはＨｉｓへ；
ＡｓｐからＧｌｕへ；
ＣｙｓからＳｅｒへ；
ＧｌｎからＡｓｎへ；
ＧｌｕからＡｓｐへ；
ＧｌｙからＡｌａへまたはＰｒｏへ；
ＨｉｓからＡｓｎへまたはＧｌｎへ；
ＩｌｅからＬｅｕへまたはＶａｌへ；
ＬｅｕからＩｌｅへまたはＶａｌへ；
ＬｙｓからＡｒｇへ、ＧｌｎへまたはＧｌｕへ；
ＭｅｔからＬｅｕへ、ＴｙｒへまたはＩｌｅへ；
ＰｈｅからＭｅｔへ、ＬｅｕへまたはＴｙｒへ；
ＳｅｒからＴｈｒへ；
ＴｈｒからＳｅｒへ；
ＴｒｐからＴｙｒへ；
ＴｙｒからＴｒｐへまたはＰｈｅへ；
ＶａｌからＩｌｅへまたはＬｅｕへ。
【００３８】
ｎ）核酸またはポリペプチド分子は、例えば、その天然の生物学的供給源および／またはその核酸もしくはポリペプチド分子が得られた反応培地もしくは培養培地と比べた場合、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子などのその核酸もしくはポリペプチド分子が前記供給源もしくは培地では通常会合している少なくとも１つの他の成分または少なくとも１つの汚染物質、不純物もしくは微量成分から分離されている場合、「本質的に単離された（形態）」であると見なされる。特に、核酸またはポリペプチド分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに詳細には少なくとも１００倍、および１０００倍まで、またはそれよりも多く精製されている場合は「本質的に単離されている」と見なされる。「本質的に単離された形態」である核酸またはポリペプチド分子は、好ましくは、適切なクロマトグラフィー技法などの、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切な技法を使用して決定された場合、本質的に均一である。
ｏ）例えば、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン配列間の「配列同一性」はこれら２つの配列間で同一であるアミノ酸の百分率を示している。配列同一性は、国際公開第２００８／０２００７９号の４９および５０頁の段落ｆ）に記載されている通りに計算するまたは決定することができる。「配列類似性」は、同一であるまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の百分率を示している。
【００３９】
標的特異性
本発明のポリペプチドは、それがこれらの分子（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子）の両方に含まれるエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む点で、ＬＲＰ５ならびにＬＲＰ６に対して特異性を有する。
本発明の分子は、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６のヒト形態に、ならびに、好ましくは、創薬に適している他の種の対応物、すなわち、カニクイザルおよびマウスＬＲＰ５およびＬＲＰ６にも結合するものとする。
【００４０】
本発明のポリペプチド
その最も広い意味で、本発明はがん疾患の処置のための新規の薬理活性剤を提供する。本発明に従った薬剤は、新規のクラスの結合分子、すなわち、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピックポリペプチドに属し、この二重パラトピックポリペプチドは異なるエピトープにおいてＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する２つまたはそれよりも多い免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。用語「交差反応性の」および「二重パラトピック」は上に説明されているので、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック分子は、ＬＲＰ５タンパク質に含まれる２つの異なるエピトープにおいてＬＲＰ５に結合することができ、ＬＲＰ６タンパク質に含まれる対応する２つのエピトープにおいてＬＲＰ６に結合することもできる分子と定義することが可能である。
【００４１】
さらに具体的には、本発明のポリペプチドは：
−Ｗｎｔ１駆動標的遺伝子転写が阻害されるように、Ｗｎｔ１シグナル伝達経路の阻害をもたらすエピトープを介して／様式で、ＬＲＰ５にならびにＬＲＰ６に特異的に結合することができる（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性の）第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および
−Ｗｎｔ３ａ駆動標的遺伝子転写が阻害されるように、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達経路の阻害をもたらすエピトープを介して／様式で、ＬＲＰ５にならびにＬＲＰ６に特異的に結合することができる（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性の）第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含む。そのようなポリペプチドに存在する２つの免疫グロブリン単一可変ドメインであって、２つのドメインが異なるエピトープ（関係するＷｎｔ１／Ｗｎｔ３ａシグナル伝達）に結合している免疫グロブリン単一可変ドメインのせいで、これらの分子は二重パラトピック結合分子である。この二重パラトピック結合様式は図１に模式的に示されている。
【００４２】
この文脈では、本発明のポリペプチドは、図１に示されるようにそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合ドメインの両方を介して１つの単一ＬＲＰ５またはＬＲＰ６分子に結合することが可能である（分子内結合様式）と想定されていることに留意すべきである。しかし、他の結合様式も同様に生じることがある。
最後に、本発明のポリペプチドは、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６への結合を巡って、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の天然のリガンドでありＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａシグナル伝達を妨害するＤＫＫ１と競合し、それによってＷｎｔ１ならびにＷｎｔ３ａシグナル伝達経路を阻害することができると想定されている。しかし、この説も本発明の範囲を限定もすると理解されるべきではない。
【００４３】
さらに具体的には、本発明に従ったポリペプチドはＬＲＰ５またはＬＲＰ６に特異的に結合し、そのようなポリペプチドは、以下のＣＤＲ配列：
（ｉ）：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
［＝Ｗｎｔ１−３３３Ｅ０６ｍｏｄドメインのＣＤＲ］
（ｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
［＝Ｗｎｔ１−３３３Ｇ０６ドメインのＣＤＲ］
（ｉｉｉ）：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
［＝Ｗｎｔ１−３３２Ｄ０３６ｍｏｄドメインのＣＤＲ］
を有することにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群から選択される第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）
ならびに以下のＣＤＲ配列：
（ｉｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
［＝Ｗｎｔ３ａ−０９３Ａ０１ドメインのＣＤＲ］
（ｖ）：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
［＝Ｗｎｔ３ａ−３６７Ｂ１０ドメインのＣＤＲ］
を有することにより定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）の群から選択される第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｂ）
を含む。
【００４４】
そのような免疫グロブリン単一可変ドメインに関連する用語「第１の」および「第２の」の使用は、これらのドメインが、異なるＣＤＲ配列を含むことになり、異なるエピトープに結合することになるので、異なるドメインであることを示すことのみが意図されている。しかし、これらの用語は、そのようなポリペプチド鎖内のドメインの正確な順番または配列を指すと理解されるものとしない。言い換えると、上記の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）および（ｂ）は、本発明のそのようなポリペプチド内で（ａ）−（ｂ）の順でまたは（ｂ）−（ａ）の順で配置されてもよい。
用語「ＬＲＰ５またはＬＲＰ６分子に特異的に結合する」は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）および（ｂ）がＬＲＰ５およびＬＲＰ６との関連では交差反応性であることを意味すると意図されている。当然のことながら、そのような分子の結合特性はその（ＣＤＲ）配列により決定されるので、上でおよび特許請求の範囲で述べられる特色「ＬＲＰ５またはＬＲＰ６分子に特異的に結合する」は本発明の有用性を説明することだけを意図されており、本発明の範囲を限定するためではない。
【００４５】
免疫グロブリン単一可変ドメインは典型的には、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる。１つのポリペプチド、またはポリペプチド鎖内に位置するためには、前記第１のおよび前記第２の免疫グロブリン単一可変ドメインは直接的にまたはリンカーペプチドにより共有結合的に連結される必要がある。
したがって、本発明の分子の全体構造は以下の：
ＦＲ（ａ）１−ＣＤＲ（ａ）１−ＦＲ（ａ）２−ＣＤＲ（ａ）２−ＦＲ（ａ）３−ＣＤＲ（ａ）３−ＦＲ（ａ）４−［リンカーペプチド］−ＦＲ（ｂ）１−ＣＤＲ（ｂ）１−ＦＲ（ｂ）２−ＣＤＲ（ｂ）２−ＦＲ（ｂ）３−ＣＤＲ（ｂ）３−ＦＲ（ｂ）４
のように描くことも可能であり、
ＦＲ（ａ）は第１の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域を表し、
ＦＲ（ｂ）は第２の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域を表し、
ＣＤＲ（ａ）は第１の免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲを表し、
ＣＤＲ（ｂ）は第２の免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲを表し、
［リンカーペプチド］は存在していてもよいリンカーペプチドを表し、
ＣＤＲは上述の配列を有している。
【００４６】
その上、（ａ）と（ｂ）は交換することが可能であると理解されているものとする、すなわち、
ＦＲ（ｂ）１−ＣＤＲ（ｂ）１−ＦＲ（ｂ）２−ＣＤＲ（ｂ）２−ＦＲ（ｂ）３−ＣＤＲ（ｂ）３−ＦＲ（ｂ）４−［リンカーペプチド］−ＦＲ（ａ）１−ＣＤＲ（ａ）１−ＦＲ（ａ）２−ＣＤＲ（ａ）２−ＦＲ（ａ）３−ＣＤＲ（ａ）３−ＦＲ（ａ）４
の全体構造を有する分子も本発明には包含されているものとする。
リンカーペプチドは、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）１：ＳＦＧＭＳ（＝配列番号１６）
ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１７）
ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）３：ＧＧＳＬＳＲ（＝配列番号１８）
を含むＡｌｂ１１ドメインなどの、例えば、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインなどの、第３のドメインを含むまたはからなっていてもよい。
【００４７】
これにより、以下の全体構造：
ＦＲ（ａ）１−ＣＤＲ（ａ）１−ＦＲ（ａ）２−ＣＤＲ（ａ）２−ＦＲ（ａ）３−ＣＤＲ（ａ）３−ＦＲ（ａ）４−［リンカーペプチド］−ＦＲ（Ａｌｂ１１）１−ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）１−ＦＲ（Ａｌｂ１１）２−ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）２−ＦＲ（Ａｌｂ１１）３−ＣＤＲ（Ａｌｂ１１）３−ＦＲ（Ａｌｂ１１）４−［リンカーペプチド］−ＦＲ（ｂ）１−ＣＤＲ（ｂ）１−ＦＲ（ｂ）２−ＣＤＲ（ｂ）２−ＦＲ（ｂ）３−ＣＤＲ（ｂ）３−ＦＲ（ｂ）４
を有する本発明のポリペプチドの群が生じる。
【００４８】
その上、３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）、（ｂ）、およびＡｌｂ１１の順番は固定されておらず、上記のドメインが順番：
（ｂ）−Ａｌｂ１１−（ａ）
で配置されているポリペプチドも同様に包含されているものとする。さらに、ポリペプチドのＮ−またはＣ−終端末端にＡｌｂ１１ドメインを有するポリペプチド（例えば、Ａｌｂ１１−（ａ）−（ｂ）、Ａｌｂ１１−（ｂ）−（ａ）、（ａ）−（ｂ）−Ａｌｂ１１、または（ｂ）−（ａ）−Ａｌｂ１１）も本明細書には包含されているものとする。
【００４９】
３つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは以下の通りに定義される免疫グロブリン単一可変ドメインを含む：
第１の好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含むポリペプチド。
第２の好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含むポリペプチド。
第３の好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含むポリペプチド。
【００５０】
当然のことながら、上述のバリアント、すなわち、リンカーペプチドおよび／またはさらなるドメインを含んでいる、特に、Ａｌｂ１１ドメイン、異なる順番の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでいてもよい、はこれら３つの好ましい実施形態にも同様に当てはまるものとする。
【００５１】
特に好ましい実施形態では、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインは２つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合免疫グロブリン単一可変ドメインの間に位置している。したがって、３つの特に好ましい実施形態は以下の通りに想定することが可能である：
第１の特に好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＴＹＴＶＧ（＝配列番号１）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＲＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号２）
ＣＤＲ３：ＤＴＲＴＶＡＬＬＱＹＲＹＤＹ（＝配列番号３）
を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ（＝配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＧＧＳＬＳＲ（＝配列番号１８）
を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１０）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１１）
ＣＤＲ３：ＳＰＩＰＹＧＳＬＬＲＲＲＮＮＹＤＹ（＝配列番号１２）
を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン
をこの順に、または上記ドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
第２の特に好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号４）
ＣＤＲ２：ＡＩＲＲＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＲＶＲＳＳＴＲＹＮＴＧＴＷＷＷＥＹ（＝配列番号６）
を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ（＝配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＧＧＳＬＳＲ（＝配列番号１８）
を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン
をこの順に、または上記ドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
第３の特に好ましい実施形態：以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＲＹＴＭＧ（＝配列番号７）
ＣＤＲ２：ＡＩＶＲＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号８）
ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＧＥＮＹＩＬＬＹＳＳＧＲＹＥＹ（＝配列番号９）
を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ（＝配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＧＧＳＬＳＲ（＝配列番号１８）
を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
および以下のＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＧ（＝配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＡＩＳＷＲＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（＝配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＤＰＲＧＹＧＶＡＹＶＳＡＹＹＥＹ（＝配列番号１５）
を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン
をこの順に、または上記ドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
【００５２】
上記のＣＤＲ配列は表ＩＡ、ＩＢ、およびＩＣにまとめられている：
【表１】
2020178701.tif 000002
【００５３】
【表２】
2020178701.tif 000003
【００５４】
【表３】
2020178701.tif 000004
【００５５】
上述のＣＤＲ配列に加えて、本発明のポリペプチドに含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは免疫グロブリンフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。これらの配列は好ましくはヒトにおいて免疫原性ではなく、したがって好ましくはヒトまたはヒト化ＦＲ配列である。適切なヒトまたはヒト化ＦＲ配列は当技術分野では公知である。特に好ましいＦＲ配列は下に示される実施形態から取得することが可能であり、下では、完全な免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそれによってＣＤＲ配列ならびにＦＲ配列を開示している。
【００５６】
さらに具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＶＨＨドメイン、好ましくはヒト化ＶＨＨドメインである免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
さらに具体的な実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、以下の配列：
（ｉ）
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVA
AIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
［＝Ｗｎｔ１−３３３Ｅ０６ｍｏｄドメイン；＝配列番号１９］
（ｉｉ）
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
ARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
［＝Ｗｎｔ１−３３３Ｇ０６ドメイン；＝配列番号２０］、および
（ｉｉｉ）
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVA
AIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
［＝Ｗｎｔ１−３３３Ｄ０３ｍｏｄドメイン；＝配列番号２１］
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ａ）、
ならびに、以下の配列：
（ｉｖ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
SPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
［＝Ｗｎｔ３ａ−０９３Ａ０１ドメイン；＝配列番号２２］および
（ｖ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
［＝Ｗｎｔ３ａ−３６７Ｂ１０ドメイン；＝配列番号２３］
を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）からなる群から選択される第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｂ）
を含む。
【００５７】
好ましい実施形態は、
−配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン；または
−配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン；または
−配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する第１の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン
を含むポリペプチドである。
【００５８】
したがって、上記実施形態は
ｉｓｖｄ（ａ）−［リンカーペプチド］−ｉｓｖｄ（ｂ）
として模式的に表すことが可能であり、
「ｉｓｖｄ」はそれぞれの免疫グロブリン単一可変ドメインを表し、他の点では
特に、任意のリンカーペプチドおよび／またはさらなるドメイン、特に、Ａｌｂ１１ドメインの存在に関して、ならびに免疫グロブリン単一可変ドメインの異なり順番に関して、同じ定義およびバリアントが上述の通りに当てはまるものとする。
【００５９】
本発明の特定の実施形態によれば、上記のペプチドは半減期延長部分をさらに含んでいてもよく、前記半減期延長部分は前記ポリペプチドに共有結合的に連結されており、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合免疫グロブリンドメインなどのアルブミン結合部分、好ましくは、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、さらに好ましくは、Ａｌｂ１１ドメイン、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメインなどのトランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミン、および（ヒト）血清アルブミンの断片からなる群から選択してもよい。
上記Ａｌｂ１１免疫グロブリン単一可変ドメインの配列は以下の通りである：
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTI
GGSLSRSSQGTLVTVSS
（＝Ａｌｂ１１ドメイン；＝配列番号２４）
【００６０】
ヒト血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのさらなる例は当技術分野では公知であり、例えば、国際公開第２００６／１２２７８７号および国際公開第２００８／０２８９７７号にさらに詳細に記載されている。ヒト血清アルブミンに結合する他のポリペプチドは、例えば、国際公開第２００８／０６８２８０号、国際公開第２００９／１２７６９１号、および国際公開第２０１１／０９５５４５号に記載されている。
したがって、本発明の３つの好ましい特定の実施形態は以下の通りである：
第１の好ましい特定の実施形態：
−配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメインを
この順に、または上記３つのドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
第２の好ましい特定の実施形態：
−配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメインを
この順に、または上記３つのドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
第３の好ましい特定の実施形態：
−配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する第１の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；
−配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する第２の（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合）免疫グロブリン単一可変ドメインを
この順に、または上記３つのドメインが交換されている順に含むポリペプチド。
【００６１】
さらに具体的な好ましい実施形態では、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインは２つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合免疫グロブリン単一可変ドメイン間に位置している。
上記の免疫グロブリン単一可変ドメインの配列は表ＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＣにまとめられている。
【００６２】
【表４】
2020178701.tif 000005
【００６３】
【表５】
2020178701.tif 000006
【００６４】
【表６】
2020178701.tif 000007
【００６５】
上述のように、本発明のポリペプチドに存在する（少なくとも２つの）免疫グロブリン単一可変ドメインはリンカーを使用せずに直接的に、またはリンカーを介して互いに連結することが可能である。リンカーは好ましくはリンカーペプチドであり、本発明に従えば、その標的エピトープのそれぞれへの少なくとも２つの異なる免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を可能にするように選択されることになる。
適切なリンカーはとりわけエピトープ、特に、免疫グロブリン単一可変ドメインを結合させる標的分子上のエピトープ間の距離に依存することになる。これは本明細書の開示に基づけば当業者には明らかになるが、それはある限定された程度の決まりきった実験の後でもよい。
したがって、適切なリンカーは、例えば、９またはそれよりも多いアミノ酸、好ましくは、約２０〜４０アミノ酸などの少なくとも１７アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含むことができる。リンカー配列は天然に存在する配列でも天然には存在しない配列でもよい。治療目的で使用される場合には、リンカーは好ましくは、本発明のポリペプチドが投与される対象では非免疫原性である。
【００６６】
１つの有用なグループのリンカー配列は、国際公開第１９９６／３４１０３号および国際公開第１９９４／０４６７８号に記載されている重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどのポリアラニンリンカー配列である。
リンカー配列のさらに好ましい例は、例えば、（ｇｌｙ4ｓｅｒ）3、（ｇｌｙ4ｓｅｒ）5、（ｇｌｙ4ｓｅｒ）7、（ｇｌｙ3ｓｅｒ）3、（ｇｌｙ3ｓｅｒ）5、（ｇｌｙ3ｓｅｒ）7、（ｇｌｙ3ｓｅｒ2）3、（ｇｌｙ3ｓｅｒ2）5、および（ｇｌｙ3ｓｅｒ2）7を含む、（ｇｌｙxｓｅｒy）zリンカーなどの異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。
ポリペプチドリンカーに代わって、またはこれに加えて、本発明のポリペプチドに存在する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを別のポリペプチドなどの別の部分を介して互いに連結させることができ、この別の部分は、好ましいしかし非限定的実施形態では、すでに上に記載されているさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。そのような部分は本質的に不活性でもよく、またはポリペプチドの所望の特性を改善するなどの生物学的効果を有していてもよく、またはポリペプチドに１つまたは複数の追加の所望の特性を与えてもよい。すでに上で述べられたように、Ａｌｂ１１ドメインなどの（ヒト）血清アルブミン結合ドメインなどの好ましい追加のポリペプチドドメインは、ポリペプチドの半減期を増加することになる。
【００６７】
したがって、さらなる実施形態によれば、本発明は、正確なアミノ酸配列は下の表ＩＩＩから取得することが可能である、以下の配列のいずれかを含むポリペプチドを特に含む：
配列番号２５（＝ポリペプチドＦ０１３５００５７５の配列）
配列番号２６（＝ポリペプチドＦ０１３５００５７１の配列）、および
配列番号２７（＝ポリペプチドＦ０１３５００７２０の配列）。
さらに特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは以下の分子の群から選択される：
ポリペプチドＦ０１３５００５７５、配列番号２５の配列を有する、
ポリペプチドＦ０１３５００５７１、配列番号２６の配列を有する、
ポリペプチドＦ０１３５００７２０、配列番号２７の配列を有する。
【００６８】
【表７】
2020178701.tif 000008
【００６９】
以前説明されたように、別の方法で示されなければ、本発明のポリペプチドは、さらなる部分および／または追加のポリペプチドドメインを、そのような追加の部分またはドメインによりＬＲＰ５／ＬＲＰ６へのその結合が妨げられない限り、含んでもよい。
本発明のポリペプチドは、グリコシル残基などの改変物または改変されたアミノ酸側鎖をさらに含有することが可能であり、そのような分子の半減期および他の特性を増加するためにペグ化してもよい。二重パラトピック免疫グロブリン単一可変ドメイン構築物をペグ化するのに有用な技法および試薬は、例えば、国際公開第２０１１／１０７５０７号から取得してもよい。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、ある特定の発現系（特定のベクターまたは宿主細胞などの）を使用することにより発現されるように、または封入体としてもしくは可溶性形態で発現されるように、または培地もしくは細胞膜周辺腔に分泌されるように、または細胞内に含有されるように、またはさらに均一な産物を産生するように分子を最適化するために、改変されたＮ終端配列、例えば、Ｎ終端アミノ酸のうちの１つもしくは複数の欠失、または、例えば、第１のＮ終端アミノ酸の交換（例えば、グルタミンからアラニンへ）を有していてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば、そのようなポリペプチドの安定性をさらに増強するまたは免疫原性を減少するために、例えば、国際公開第２０１２／１７５７４１号、国際公開第２０１１／０７５８６１号、または国際公開第２０１３／０２４０５９号で説明されているように、追加のアラニンなどの改変されたＣ終端配列（上の表ＩＩＩに示される３つの実施形態について示されている）、および／またはＣ終端部分でもしくはフレームワーク領域のいずれか内の他の限定された位置でさらなるアミノ酸交換を有していてもよい。
【００７１】
さらに、本発明のポリペプチドの半減期は、アルブミンドメインを付加することにより、すなわち、ポリペプチドをアルブミン融合タンパク質に変換することにより増強してもよい。有用なアルブミン部分、およびその部分を結合分子に付加する方法の例は、例えば、国際公開第２００１／０７９２７１号および国際公開第２００３／０５９９３４号に提供されている。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、下の実施例７．１に記載されるＦＡＣＳ結合アッセイで測定され、１０-6モル／リットルもしくはそれ未満の、さらに好ましくは１０-9モル／リットルもしくはそれ未満の範囲の、さらに好ましくは１０-10から１０-13モル／リットルの範囲の結合（ＥＣ50）値を有しており、
または、下の実施例７．３で述べられている、Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイで測定され、１０-9モル／リットルもしくはそれ未満の、好ましくは、５×１０-10モル／リットルから１０-12モル／リットルまでの範囲のＩＣ50値を有している。
【００７２】
本発明のポリペプチドは、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、およびＮＳＣＬＣなどのいくつかのがんタイプのさらに効率的な処置を可能にする。本発明のポリペプチドは、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴（すなわち、Ｗｎｔ経路阻害のより高い効率、例えば、下の実施例７および８参照）、ならびに有意なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害特性を有し、例えば、下の実施例９および１０に示されるように、当技術分野で記載される他のＬＲＰ６結合分子と比べてより高いｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらす。
特に、Ｗｎｔ駆動腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで示されるように、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性半減期延長二重パラトピックヒト化ＶＨＨ構築物はＷｎｔシグナル伝達および腫瘍増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することができ、実質的な腫瘍縮小さえ提供し（すなわち、１００％を超える腫瘍増殖阻害）、これは同じ実験設定下で、当技術分野で公知のＬＲＰ６結合剤を用いては達成できなかった。腫瘍縮小（すなわち、腫瘍退縮）は当然のことながらがん患者の処置のための所望の治療効果（すなわち、有効性）である。さらに、病理学的完全奏功（ｐＣＲ）をもたらす腫瘍退縮は、無憎悪生存および全生存の著しい改善を示す、認知された臨床的エンドポイントである。
同じｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、有意な体重変化は観察されず（＜１０％）、胃腸病理組織学的分析の結果は本発明の上記ポリペプチドのいかなる毒性効果も示さなかった。これは、上で考察されたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＫＫ１発現研究（すなわち、腸粘膜潰瘍および体重減少をもたらす）を考慮すると特に驚くべきことである。
【００７３】
したがって、本発明のポリペプチドは実際にがん疾患の処置のための、および特に（トリプルネガティブ）乳がんなどの高度なアンメットメディカルニーズ適応症においてさえも使用するための新規の治療選択肢を提供している。
驚くべきことに、本発明者らは、従来の経路を介して、すなわち、ＬＲＰ６（例えば、国際公開第２００９／０５６６３４号での「Ｗｎｔシグナル伝達媒介性疾患」の処置のための標的として言及されている）などの１つの所与の標的に対して高い特異性／選択性を有する阻害剤または結合分子を開発しようとして、この解決策に到達したのではない。それとは対照的に、本発明者らは、２つの関連するタンパク質、ＬＲＰ６とＬＲＰ５を同時に標的とする分子を開発し、それによって、先行技術では期待できなかった上記の著しく改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ効果を達成した。
この優位性の根底にある分子機構は完全に明らかになってはいない。しかし、特定の理論に縛られたくはないが、そのような交差反応性分子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の高度に複雑なシグナル伝達カスケードに対して追加の、それによるより強力な効果をもたらすことができると推測することができる。
【００７４】
上記の有利な効果は、下の実施例においておよびその中に含まれる比較データを通じてさらに説明されることになる。
さらに、本発明のポリペプチドは製造するのが容易であり、可溶性が高く、これは本発明のポリペプチドが従来の抗体と比べてより高い濃度で貯蔵しおよび／または投与することができることを意味する。本発明のポリペプチドは室温で安定しており、極端なｐＨでさえ長期の安定性を有するので、冷凍装置を使用せずに、調製し、貯蔵しおよび／または輸送することができ、輸送費削減、時間節約および環境保全をかなえる。上記のせいでおよびその低い免疫原性のせいで、本発明のポリペプチドは、注射および注入以外の投与経路に関して、ならびに投与レジメンおよび特定のデバイスの使用に関して種々の選択肢をさらに提供する。
核酸、ベクター、宿主細胞
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子および発現ベクターに、ならびに本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞に関する。これらの核酸、ベクター、および宿主細胞は本発明のポリペプチドを製造するのに有用であり、さらなる態様およびその実施形態は、本発明のポリペプチドを製造する方法の概要に関連して下でさらに説明されることになる。
【００７５】
治療的使用
本発明のポリペプチドは、その生物学的特性のせいで、がんおよび特発性肺線維症（ＩＰＥ）などの過剰なまたは異常な細胞増殖を特徴とする疾患を処置するのに適している。
例えば、以下のがん、腫瘍、および他の増殖性疾患は、それに限定されることなく、本発明に従ったポリペプチドで処置することができる：
頭頸部のがん；例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）などの肺のがん；例えば、神経原性腫瘍および間充織腫瘍などの縦隔の新生物；例えば、食道、胃（胃がん）、膵臓、肝臓および胆管（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む）、ならびに小腸および大腸（例えば、結腸直腸がんを含む）のがんなどの消化（ＧＩ）管のがん；前立腺のがん；精巣のがん；例えば、卵巣のがんなどの婦人科がん；例えば、乳癌、ホルモン受容体陽性乳がん、Ｈｅｒ２陽性乳がん、およびトリプルネガティブ乳がんなどの乳房のがん；内分泌系のがん；例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫などの軟部組織のがん；例えば、骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、骨軟骨腫、骨芽細胞腫、および軟骨芽細胞腫などの骨の肉腫；中皮腫；例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、メルケル細胞癌、およびメラノーマなどの皮膚のがん；例えば、星状細胞腫、神経膠芽腫、グリオーマ神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの中枢神経系および脳の新生物；例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、慢性Ｔ細胞リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性／骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞腫、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などのリンパ腫および白血病；ならびに未知の原発部位のがん。
【００７６】
身体でのその特定の位置／起源を特徴とする上記のあらゆるがん、腫瘍、新生物、などは、原発腫瘍とそれに由来する転移性腫瘍の両方を含むことが意図されている。
さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、異常な細胞増殖が異常な（活性化された）Ｗｎｔシグナル伝達により引き起こされるまたはこれを伴う疾患、特に、がん疾患の処置に有用である。
したがって、本発明のポリペプチドは固形腫瘍の処置に、さらに具体的には、肺がん、肝臓がん、結腸がん、脳がん、甲状腺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんの処置に、さらに具体的には非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）の処置に特に有用である。特に、本発明のポリペプチドは、無憎悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）を延ばすために、局所進行性または転移性ＴＮＢＣを有する患者、転移性ＮＳＣＬＣまたは局所進行性もしくは転移性ＣＲＣを有する患者を処置するのに単剤としてまたは組み合わせて使用してもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、病理学的完全奏功（ｐＣＲ；ネオアジュバンド全身療法の完了に続く完全切除胸検体およびすべての採取された所属リンパ節の病理組織学的評価により残遺浸潤がんおよび上皮内がんが存在しないことと定義されている）を達成するために乳がん患者のためのネオアジュバンド処置として使用してもよい。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、第一選択、第二選択、または任意のさらなる選択処置という状況での治療レジメンで使用してもよい。
本発明のポリペプチドは、上記疾患の予防、短期または長期処置のために使用してもよく、これを放射線療法および／または手術と組み合わせてもよい。
同様に、本発明のポリペプチドは、特発性肺線維症（ＩＰＥ）などの、Ｗｎｔシグナル伝達経路を伴う異常な細胞増殖により引き起こされる他の疾患の処置に特に有用である（Konigshoff et al. “Functional Wnt signaling is increased in idiopathic pulmonary fibrosis”. PLoS One 2008;3(5):e2142; Lam et al. “Wnt coreceptor Lrp5 is a driver of idiopathic pulmonary fibrosis”. Am J Respir Crit Care Med.2014;190(2):185-95）。
【００７８】
さらに、本発明のポリペプチドは、網膜内層細胞での異常なＷｎｔ活性化に起因する網膜症の処置、とりわけ、糖尿病性網膜症の処置に特に有用であり、この異常なＷｎｔ活性化は異常な新しい網膜血管形成の増加を引き起こし、糖尿病性網膜症の発症および進行をもたらす（Chen, Y., et al. “Activation of the Wnt pathway plays a pathogenic role in diabetic retinopathy in humans and animal models” The Am J Pathol.2009; 175(6):2676-85., Gao et al. “Elevated LRP6 levels correlate with vascular endoth
elial growth factor in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy” Mol Vis.2015;21:665-72）。
最後に、Ｗｎｔ１／Ｗｎｔ３ａシグナル伝達経路を阻害すれば樹状細胞（ＤＣ）および樹状細胞機能にも効果を及ぼすことが可能であることは明らかにできたので、本発明のポリペプチドは、免疫疾患および感染症の処置に、ならびにすでに上で述べた種々のがん疾患での腫瘍微小環境に影響を及ぼすのにも有用である可能性がある。腫瘍は抗腫瘍免疫を積極的に抑制し、ＤＣはがん免疫回避機構で重要な役割を果たしている。特に、腫瘍微小環境でのＷｎｔリガンドが免疫細胞内のパラ分泌シグナル伝達を開始し、宿主抗腫瘍免疫を調節することも可能であることが研究により明らかになった（Hong et al. “beta-catenin promotes regulatory T-cell responses in tumors by inducing vitamin A metabolism in dendritic cells”. Cancer Res.2015;75(4):656-65）。
【００７９】
当然のことながら、上記は、それを必要とする患者に治療有効用量を投与することにより上記疾患を処置する種々の方法での本発明のポリペプチドの使用、ならびにそのような疾患の処置のための医薬ならびにそのような本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の製造ならびにそのような本発明のポリペプチドおよび同類の物を含む医薬の調製および／または製造のためのこれらポリペプチドの使用も含む。
【００８０】
他の活性物質との組合せ
本発明のポリペプチドは、単独でまたは例えば、細胞分裂阻害もしくは細胞傷害性物質、細胞増殖阻害剤、抗血管新生物質、ステロイド、免疫調節剤／チェックポイント阻害剤、および同類の物などの、最先端のもしくは標準治療化合物などの他の薬理活性物質と組み合わせて使用してもよい。
【００８１】
本発明に従った化合物と組み合わせて投与してもよい細胞分裂阻害および／または細胞傷害性物質は、ホルモン、ホルモン類似体および抗ホルモン薬、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヒト上皮増殖因子（ＨＥＲ、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの増殖因子）の阻害剤、阻害剤は、例えば、（抗）増殖因子抗体、（抗）増殖因子受容体抗体、ならびに、例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブおよびトラスツズマブなどのチロシンキナーゼ阻害剤である；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセドなどの葉酸代謝拮抗剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビンおよびゲムシタビンなどのピリミジン類似体、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビンおよびペントスタチンなどのプリンおよびアデノシン類似体、シタラビン（ａｒａＣ）、フルダラビン）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン）；白金誘導体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、例えば、カルムスチンおよびロムスチンなどのニトロソ尿素、チオテパ）；有糸分裂阻害剤（例えば、例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；ならびにパクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン）；血管新生阻害剤、チューブリン阻害剤；ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、例えば、エトポシドおよびリン酸エトポシドなどのエピポドフィロトキシン、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン）、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ−Ｒａｆ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、Ｃ−Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、デュアルｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（ボラセルチブなどの）、ＣＤＫの阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、ＴＲＡＩＬＲ２アゴニスト、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢ受容体阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲン受容体阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射性医薬品、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫治療���（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、およびイピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどのＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン）、伝統的な腫瘍ワクチンなどのがんワクチン（細胞ベースワクチン、例えば、前立腺がんの処置のためのシプロイセルＴ）、個別化ネオ抗原ワクチン、および腫瘍溶解性ウイルス、ならびに、アミフォスチン、アナグレリド、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔ）、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｎ）、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミソール、メスナ、ミトタン、パミドロネートおよびポルフィマーなどの種々の化学療法剤を含むがそれらに限定されない。
【００８２】
特に好ましいのは、
（ｉ）乳がん患者での化学療法組合せ（ネオアジュバンド設定でのドキソルビシン／シクロホスファミド組合せおよび／またはカペシタビン／ドセタキセル組合せ；第一および後期選択処置のためのタキサン／白金レジメンを含む）とのまたはそれなしでの抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブおよび他の抗血管新生物質）；
（ｉｉ）肺がん患者での化学療法組合せ（第一選択処置でのゲムシタビン／シスプラチン；第二選択処置でのドセタキセルまたはペメトレキセドを含む、白金ベース細胞傷害併用療法）とのまたはそれなしでのＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣに対するＥＧＦＲ  ＴＫｌまたはＡＬＫ転位置ＮＳＣＬＣに対するクリゾチニブ；
（ｉｉｉ）例えば、ＣＲＣ患者の処置のための、化学療法組合せ（イリノテカンを含む）、抗ＶＥＧＦ抗体組合せ（ベバシズマブおよび他の抗血管新生物質）またはレゴラフェニブ組合せとのまたはそれなしでの抗ＥＧＦＲ抗体（ＫＲＡＳ野生型腫瘍におけるセツキシマブおよびパニツムマブ）；
（ｉｖ）例えば、乳がん、肺がんおよびＣＲＣ患者の処置のための、ペンブロリズマブおよびニボルマブなどの抗ＰＤ−１剤、抗ＰＤ−Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ４剤、抗ＢＴＬＡ剤、抗ＬＡＧ３剤、ならびに抗ＰＤＬ１抗体などの抗ＴＩＭ３剤、等を含む、免疫療法剤；
（ｖ）例えば、乳がんまたはＣＲＣ患者の処置のための、白金ベース抗悪性腫瘍剤などの、またはフォリン酸、５’−フルオロウラシル、およびオキサリプラチンを含むＦＯＬＦＯＸ化学療法レジメンと組み合わせた、またはフォリン酸、５’−フルオロウラシル、オキサリプラチン、およびイリノテカンを含む、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ化学療法レジメンと組み合わせた、化学療法剤
からなる群から選択される薬物と組み合わせた本発明のポリペプチドの使用を含む処置方法である。
【００８３】
２つまたはそれよりも多い物質または成分が併用処置レジメンの一部として使用されることになる場合、これらの物質または成分は、本質的に同じ時間に（すなわち、同時に）または異なる時間に（例えば、逐次に、連続して、交互に、引き続いて、または他のいかなる種類の交互レジメンに従ってでも）、同じ投与経路を介してまたは異なる投与経路を介して投与することが可能である。
【００８４】
物質または成分が同じ投与経路を介して同時に投与されることになる場合、これらの物質または成分は、異なる医薬製剤もしくは組成物としてまたは組み合わされた医薬製剤もしくは組成物の一部として投与してもよい。その上、２つまたはそれよりも多い活性物質または成分が併用処置レジメンの一部として使用されることになる場合、物質または成分のそれぞれは同じ量で、および化合物または成分が単独で使用される場合に使用されるのと同じレジメンに従って投与してもよく、そのような併用は相乗効果をもたらすこともあればもたらさないこともある。しかし、２つまたはそれよりも多い活性物質または成分の併用が相乗効果をもたらす場合、所望の治療作用をまだ達成しつつ、投与される物質または成分のうちの１つ、それよりも多いまたは全ての量を減らせる可能性もある。これは、例えば、まだ所望の薬理学的または治療効果を得つつ、その通常の量で使用される場合の物質または成分のうちの１つまたは複数の使用に付随する不必要ないずれかの副作用を回避する、制限するまたは減少させるのに有用な場合がある。
当然のことながら、上記は、上記の組合せパートナーとの併用のための調製および本発明のポリペプチドの調製方法を含む。本発明のポリペプチドとの併用のための調製および上記組合せパートナーの調製方法も含まれる。したがって、本発明はこれによって、例えば、本発明のポリペプチドと組み合わせての投与のための、さらに具体的には、本発明のポリペプチドを用いた併用療法レジメンでの投与のための、ペンブロリズマブまたはニボルマブなどの、抗ＰＤ１抗体などの免疫調節剤／チェックポイント阻害剤の使用方法、または使用のための調製方法を提供する。
【００８５】
さらに、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドおよび上記の疾患および障害の処置のために使用される他の薬物からなる群から選択される１つまたは複数の他の成分および下記のデバイスを含むキットも包含する。
医薬組成物、投与方法、投与量
疾患の上記処置方法は前記疾患の処置のための医薬の調製を含むことは当業者に明らかになる。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む、上文で言及された疾患の処置のための医薬組成物にさらに関する。
本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドを含む組成物は、使用される特定の医薬製剤または組成物に応じて、それを必要とする患者にいかなる適切な様式でも投与することが可能である。したがって、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドを含む組成物は、例えば、有効量または用量で、静脈内に（ｉ．ｖ．）、皮下に（ｓ．ｃ．）、筋肉内に（ｉ．ｍ．）、腹腔内に（ｉ．ｐ．）、経皮的に、経口的に、舌下に（例えば、舌下に置かれ粘膜を通じて吸収され舌下の毛細管網目構造に入る舌下錠、スプレーまたはドロップの形態で）、経鼻的に（鼻腔内に）（例えば、スプレー式点鼻薬の形態でおよび／または噴霧剤として）、局所的に、坐薬により、吸入により、または他のいかなる適切な様式でも投与することが可能である。
【００８６】
本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドを含む組成物は、処置されるまたは軽減される疾患、障害または状態を処置するおよび／または軽減するのに適している処置レジメンに従って投与される。臨床医は一般に、処置されるまたは軽減される疾患、障害または状態、疾患の重症度、その症状の重症度、使用される特定の本発明のポリペプチド、使用される特定の投与経路および医薬製剤または組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態などの要因、ならびに臨床医に周知である類似の要因に応じて、適切な処置レジメンを決定することができる。一般には、処置レジメンは、治療有効量または用量での、１つまたは複数の本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドを含む１つまたは複数の組成物の投与を含むことになる。
【００８７】
一般に、本明細書で言及される疾患、障害および状態の処置および／または軽減のためにならびに処置される特定の疾患、障害または状態、使用される特定の本発明のポリペプチドの効力、使用される特定の投与経路および特定の医薬製剤または組成物に応じて、本発明のポリペプチドは、体重１キログラムおよび用量あたり０．００５〜２０．０ｍｇ、好ましくは０．０５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／用量、さらに好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ／用量の量で、連続して（例えば、注入により）またはさらに好ましくは単一用量（例えば、週２回、毎週、または毎月投与などの；下参照）として一般に投与されるが、特に、前述のパラメータに応じて著しく変動することがある。したがって、いくつかの場合には、上に与えられた最少用量未満を使用するので十分なこともあれば、他の場合には、上限を超えなければならないこともある。大量を投与する場合は、その量を１日にわたり分散されるいくつかのより少用量に分割するのが賢明であることもある。
特定の本発明のポリペプチドならびにその特定の薬物動態および他の特性に応じて、特定の本発明のポリペプチドは毎日、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとにまたは６日ごとに、毎週、毎月、などで投与されてもよい。投薬レジメンは長期、毎週処置を含むこともできる。「長期」とは、少なくとも２週間、好ましくは、数か月または数年の期間のことである。
【００８８】
本発明のポリペプチドのおよび本発明のポリペプチドを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患に応じて、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイおよび／もしくはそれ自体公知である動物モデル、またはその任意の組合せを使用して試験することが可能である。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明らかであり、例えば、下の実施例において使用されるアッセイおよび動物モデルを含む。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、これらのアッセイまたはモデルのうちの少なくとも１つにおいて、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏモデルのうちの１つまたは複数において、当技術分野で公知の従来の抗体（上のセクションの〔背景技術〕に記載されるＬＲＰ６結合剤などの）よりも優れた特徴を有している。
【００８９】
処方
製薬使用のため、本発明のポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１つの本発明のポリペプチド、（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および／または安定化剤を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のさらなる薬理活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい医薬調製物として処方することができる。「薬学的に許容される」とは、個体に投与された場合、それぞれの材料がいかなる生物学的または他の点で望ましくない効果も示さず、その材料を含有している医薬組成物のその他の成分（例えば、薬学的に活性な成分などの）のいずれとも有毒な様式で相互作用しないことを意味する。具体的な例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)などの標準的ハンドブックに見出すことが可能である。例えば、本発明のポリペプチドは、従来の抗体および抗体断片ならびに他の薬学的に活性なタンパク質についてそれ自体公知であるいかなる様式でも処方し投与することができる。したがって、さらなる実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドならびに少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバンドおよび／または安定化剤に関し、１つまたは複数のさらなる薬理活性な物質に関してもよい。
【００９０】
静脈内、筋肉内、皮下注射または静脈注入などの非経口投与のための医薬調製物は、例えば、活性成分を含み、注入または注射に適しているのがさらなる溶解または希釈ステップの後でもよい無菌溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、または粉末でもよい。例えば、そのような調製物に適した担体または希釈剤は、限定せずに、無菌水および薬学的に許容される水性緩衝液および生理リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス液などの溶液；水油；グリセロール；エタノール；プロピレングリコールなどのグリコール、ならびに鉱物油、動物油、および植物油、例えば、ピーナッツオイル、ダイズ油、ならびにその適切な混合物を含む。
本発明のポリペプチドの溶液は、抗菌剤および抗真菌剤、例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール、エチレンジアミン四酢酸（のアルカリ金属塩）、および同類の物などの微生物の増殖を妨げる保存剤を含有していてもよい。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。乳化剤および／または分散剤を使用してもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、または界面活性剤の使用により維持することが可能である。吸収を遅らせる他の薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを添加してもよい。溶液は注入バイアル、アンプル、輸液ビン、および同類の物に充填することができる。
あらゆる場合に、最終剤形は製造および保存の条件下で無菌、液体および安定でなければならない。無菌注射液は、必要に応じて上に列挙された種々のその他の成分と一緒に活性化合物を必要な量で適切な溶媒に取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥および冷凍乾燥技法であり、これらの技法は活性成分プラス既に無菌濾過された溶液中に存在する任意の追加の所望成分の粉末を産する。
【００９１】
通常、水溶液または懸濁液が好まれることになる。一般には、本発明のポリペプチドなどの治療タンパク質の適切な処方は、タンパク質を適切な濃度（０．００１〜４００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．００５〜２００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜２００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１．０ｍｇ／ｍｌ（静脈内投与）または１００ｍｇ／ｍｌ（皮下投与）などの１．０〜１００ｍｇ／ｍｌなどの）で含む溶液などの緩衝タンパク質溶液、ならびに
−リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４
−他のリン酸緩衝液、ｐＨ６．２〜８．２
−酢酸緩衝液、ｐＨ３．２〜７．５、好ましくはｐＨ４．８〜５．５
−ヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０
−コハク酸緩衝液、ｐＨ３．２〜６．６、および
−クエン酸緩衝液、ｐＨ２．１〜６．２
などの水性緩衝液であり、ならびに、溶液の等張性を提供するために、塩（例えば、ＮａＣｌ）および／または糖（例えば、サクロースおよびトレハロースなどの）および／または他の多価アルコール（例えば、マンニトールおよびグリセロールなどの）でもよい。
【００９２】
好ましい緩衝タンパク質溶液は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５に溶解された本発明のポリペプチド約０．０５ｍｇ／ｍｌを含む溶液であり、２２０ｍＭのトレハロースを添加することにより等張性に調整されている。さらに、洗浄剤、例えば、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０などの他の薬剤がそのような溶液に含まれていてもよい。皮下適用のための処方は、１００ｍｇ／ｍｌまでまたは１００ｍｇ／ｍｌよりも上でもなどの著しく高濃度の本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。しかし、上に与えられる成分およびその量は１つの好ましい選択肢を表しているだけであることは当業者には明らかである。代替物およびその異形は当業者には直ちに明らかになる、または上記開示から始めて容易に思いつくことが可能である。
その上、従来の抗体または抗体断片と比べて、本発明のポリペプチドの使用の１つの大きな利点は、本発明のポリペプチドが非経口投与以外の経路を介して容易に投与することも可能であり、そのような投与のために容易に処方することが可能なことである。例えば、国際公開第２００４／０４１８６７号に記載されているように、そのようなポリペプチドは、経口、鼻腔内、肺内および経皮投与用に処方してもよい。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドは、注射器、インジェクターペン、マイクロポンプ、または他のデバイスなどの、ポリペプチドの投与に有用であるデバイスと組み合わせて使用してもよい。
【００９３】
製造および精製の方法
本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
−本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明のポリペプチドをコードする核酸（以下「本発明の核酸」）を含む宿主細胞を培養するステップと、
−培養物から宿主細胞により発現されたポリペプチドを回収するまたは単離するステップと、
−本発明のポリペプチドをさらに精製するおよび／または改変するおよび／または処方してもよいステップを
一般に含む方法をさらに提供する。
本発明の核酸は、例えば、コード配列ならびに調節配列を含み、天然のもしくは人工のイントロンを含んでもよいＤＮＡ分子が可能であり、またはｃＤＮＡ分子が可能である。本発明の核酸は、その元々のコドンを有していてもよいし、または目的の宿主細胞または宿主生物での発現に特に適応させた最適化コドン使用を有していてもよい。本発明の１つの実施形態によれば、本発明の核酸は、上で定義されるように、本質的に単離された形態である。
【００９４】
本発明の核酸は、例えば、プラスミド、コスミドまたはＹＡＣなどのベクターの形態である、その中に存在しているおよび／またはその一部であってもよく、このベクターも再び、本質的に単離された形態であってよい。ベクターは本質的に発現ベクター、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系で）ポリペプチドの発現を提供できるベクターであってよい。そのような発現ベクターは一般に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および同類の物などの１つまたは複数の適切な調節エレメントに作動可能に連結されている少なくとも１つの本発明の核酸を含む。本発明のポリペプチドを発現するのに有用であるまたは必要である、そのような調節エレメントならびに組込み因子、選択マーカー、シグナルまたはリーダー配列、レポーター遺伝子、および同類の物などの他のエレメントの具体例は、例えば、国際公開第２００６／０４０１５３号の１３１〜１３３頁に開示されている。
【００９５】
本発明の核酸は、本明細書に与えられる本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいてそれ自体公知の様式で（例えば、自動ＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術により）調製するまたは得ることが可能である。
別の実施形態によれば、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するもしくは発現することができる；および／または本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主または宿主細胞に関する。特に好ましい実施形態によれば、前記宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
工業規模での生産では、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドおよびこれを含有するタンパク質治療薬の（工業）生産のための好ましい異種宿主は、大規模発現、生産および発酵に、特に大規模（生物）医薬品発現、生産および発酵に適している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株を含む。
【００９６】
上述の細胞で産生される本発明のポリペプチドは、細胞内で（例えば、細胞質ゾルで、周辺質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ）でまたは封入体で）産生されることが可能であり、次に宿主細胞から単離されることが可能であり、さらに精製されてもよく、または本発明のポリペプチドは、細胞外で（宿主細胞が培養されている培地に分泌される）産生され、次に培養培地から単離されることが可能であり、さらに精製されてもよい。
適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導方法、培養条件、および同類の物などのポリペプチドの組換え産生に使用されるさらなる方法および試薬は当技術分野では公知である。同様に、本発明のポリペプチドの製造方法で有用であるタンパク質単離および精製技法は当業者には周知である。
大腸菌および酵母などの都合の良い組換え宿主生物での発酵を通じた本発明のポリペプチドの産生は、通常高価な哺乳動物細胞培養設備を必要とする従来の抗体と比べると、費用効果がある。さらに、発現の達成可能レベルは高く、本発明のポリペプチドの収率は１〜１０ｇ／ｌ（大腸菌）ならびに最大１０ｇ／ｌ（酵母）およびそれよりも高い範囲である。
【実施例】
【００９７】
（例１）
液性免疫応答の誘導のため、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６によるラマの免疫性付与
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合ＶＨＨドメインの同定のために、ラマの免疫性付与のためのいくつかの手順を考え実行する必要がある：ラマは、まずＬＲＰ６およびＬＲＰ５タンパク質（ヒトおよびマウス）の組換え細胞外ドメインにより免疫化した。しかしながら、上述のＬＲＰ５組換えタンパク質の機能的特性解析により、Ｗｎｔ１クラス結合エピトープのみが正しくフォールドされたことが明らかになった。対照的に、ＬＲＰ５−Ｗｎｔ３ａクラス結合ドメインの正しいフォールディングの兆候はなかった。したがって、免疫性付与のための好適な抗原を開発するため、さらなる研究が必要である。次善策として、ヒトＬＲＰ５またはヒトＬＲＰ６を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞によってラマを免疫化した。しかしながら、一過的なトランスフェクションによりまたは安定的なトランスフェクションにより、また異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯおよびＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を使用しても、ヒトＬＲＰ５の非常に低い発現のみが達成された。したがって、ＬＲＰ５の十分な発現を達成するために、さらなる研究が必要であった。いくつかの成功しなかった試行錯誤の後、最後には、これは、細胞外でのＬＲＰ５の発現の増加を企図したシャペロンであるＭｅｓＤＣ−２によるＨＥＫ２９３細胞の安定的なコトランスフェクションを含む手順の開発によって達成できた。それでも、すなわちＬＲＰ５を安定的にトランスフェクトした細胞株の生成中にＭｅｓＤＣ−２を共発現しても、タンパク質発現の不安定性が繰り返し観察された。このことは、ＬＲＰ５の発現が免疫性付与および選択の間に失われ得るという問題を生じた。このさらなる問題を解決するため、ＬＲＰ５を発現する細胞の継代を可能な限り制限し、さらなる細胞のソーティングを実施してＬＲＰ５を発現する細胞を増やした。
【００９８】
ラマは、さらに、反対側の脇腹にｈＭｅｓＤＣ−２シャペロン有りおよび無しで、ＬＲＰ５コードＤＮＡおよびＬＲＰ６コードＤＮＡにより免疫化した。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨドメインを同定する機会を増やす目的により、交差反応性免疫応答を増強する試みにおいて、数匹のラマにさらなる追加免疫を行った。
免疫血液（ＰＢＬ）試料を一定間隔で採取し、血清応答を測定し、全ＲＮＡを単離したＰＢＬから調整した。組換えタンパク質による免疫性付与時のＬＲＰ５への低い血清応答に対して、ＬＲＰ６への中程度の血清応答が観察された。中程度のＬＲＰ５免疫応答は、ＤＮＡによって免疫化したラマで観察された。対照的に、非常に低い免疫応答が細胞免疫性付与に関して観察された。さらに、合成ライブラリーも探索された。それでも、最終的に、例２において概説したように、次のステップを進めるための十分に多様なレパートリーが得られた。
【００９９】
（例２）
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６結合一価ＶＨＨドメイン（ＶＨＨ）の単離
ライブラリー構築：
免疫組織の回収後すぐに全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡの完全性および濃度を確認した。これらのＲＮＡ調製物からｃＤＮＡ試料を作製した。ＶＨＨをコードするヌクレオチド配列を、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡ試料から増幅した。試料中のＩｇＧ２およびＩｇＧ３  ｃＤＮＡから特異的に増幅した７００ｂｐのアンプリコンを、アガロースゲルから単離し、続いてネステッドＰＣＲ反応の鋳型として使用した。続いてＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩによって切断し、ファージミドベクターｐＡＸ５０の相当する制限酵素部位にライゲートした。ライゲーション混合物は大腸菌（Escherichia coli）ＴＧ−１にエレクトロポレーションした。得られた形質転換体のプールにより、遺伝的に多様なファージディスプレイライブラリーを構築した。
ｐＡＸ５０は、ｐＵＣ１１９由来の発現ベクターであり、下流のＶＨＨドメインクローニング部位とインフレームに、アンピシリンの耐性遺伝子およびｌａｃプロモーター、続いてｐＩＩＩタンパク質シグナルペプチドのコード配列を含有する。ＶＨＨドメインコード配列とインフレームに、ベクターは、Ｃ末端ＭｙｃおよびヘキサヒスチジンタグおよびｃｏｌｉファージｐＩＩＩタンパク質をコードする。ヘルパーファージによる大腸菌ＴＧ−１へのライブラリークローンの感染後、ｐＡＸ５０の存在により、ｐＩＩＩタンパク質との融合タンパク質として個々のＶＨＨドメインを提示する、これらのクローンからのファージ粒子の産生が可能になる。
【０１００】
選択：
選択のため、ＶＨＨドメインのファージミドライブラリーを構築および使用した。種間（ラマのＬＲＰ５およびＬＲＰ６とヒトのＬＲＰ５およびＬＲＰ６の間）の非常に高い種の相同性を考慮すると、ラマで生じた免疫応答が十分に多様なＶＨＨドメインを生じるかどうかは不確かであった。したがって、選択の間、免疫ライブラリーと平行して２つの合成ライブラリーを使用した。
以下のように、選択の間、異なる戦略を使用した：
−  ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨドメインを同定する機会を増強するため、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６由来の手段を交替で用いる、例えば、ＬＲＰ５によって免疫化したラマ由来のライブラリーにおけるＬＲＰ６由来タンパク質による選択、または合成ライブラリーにおける選択の間にＬＲＰ５およびＬＲＰ６両方のタンパク質の使用。
−  ヒト／マウスのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨドメインの選択のため、もとの種を交替で用いる（有効性の評価を可能にするそのようなＬＲＰ５およびＬＲＰ６アンタゴニストのマウス交差反応性、すなわち腫瘍増殖阻害、および同じ前臨床モデル（すなわち、異種移植片腫瘍−マウスモデル）において、治療濃度域のアセスメントに必要な安全性プロファイル）。
−  それらの自然な構造のエピトープを維持するために、組換えタンパク質による「溶液中の」選択：さらなる障害として、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の組換えタンパク質は、ＥＬＩＳＡの結合プレートに直接コートした場合、それらの正しいフォールディングを失うことが見出された。したがって、組換えタンパク質はビオチン化され、機能性アッセイにおいて正しいフォールディングの確認後、「溶液中の」選択に使用した。
−  受容体の自然な構造を持つように、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６を過剰発現する細胞を使用する選択：これは、驚くべきことに、組換えタンパク質の機能性データがＷｎｔ３ａ結合エピトープの正しいフォールディングの欠如を示したため、特にＬＲＰ５のＷｎｔ３ａ−クラス結合ドメインへの結合剤の選択を改善するために必要とされ、重要な策であることが判明した。
【０１０１】
（例３）
一価ＶＨＨのスクリーニング
選択後、クローンを９６深ウェルプレート（１ｍＬ容積）で増殖し、ＶＨＨ発現をＩＰＴＧの添加によって誘導した。単一クローンの周辺質の抽出物を、例えばＷＯ２０１１／１０７５０７に報告されているように標準的な方法に従って調整し、ヒトＬＲＰ６およびＬＲＰ５への結合をスクリーニングした。まず、ＦＡＣＳベースの結合アッセイと比較した場合、感受性を示し、強固で、ハイスループットなアッセイである、組換えＬＲＰ５およびＬＲＰ６を使用する結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて周辺質の抽出物をスクリーニングした。精製後、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて同定されたＶＨＨは、結合ＦＡＣＳアッセイを使用してさらに特性解析され、精製したＶＨＨの、それらの自然な構造でのＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体への結合を確認した。
【０１０２】
通常、ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳ結合アッセイの間の良好な相関性が期待される。しかしながら、本事例では、パネル「２」の結合剤に関して図２に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイにおける最も良いＬＲＰ５およびＬＲＰ６結合ＶＨＨ（すなわち組換えＬＲＰ５またはＬＲＰ６の外部ドメインに高親和性）は、ＦＡＣＳ結合アッセイにおいてヒトＬＲＰ５およびヒトＬＲＰ６への結合を示さないまたは非常に弱い結合を示した。異なるコーティング緩衝液（ｄＰＢＳ対重炭酸塩緩衝液）およびＥＬＩＳＡ装置中の遮断液（Ｍａｒｖｅｌ対ＢＳＡ）の使用によっても、観察された矛盾を解決しなかった。代わりに、ＥＬＩＳＡにおいて非常に弱い結合剤は、パネル「１」の結合剤に関して図２に示すように、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６発現細胞を使用する結合ＦＡＣＳアッセイにおいてＬＲＰ５およびＬＲＰ６への高親和性を示すことが見出された。したがって、これらのさらなるデータおよび実験により、２つの受容体の自然な構造を認識する高親和性結合剤の選択が可能になった。さらに、これらの高親和性結合剤が、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６タンパク質において、構造依存的なエピトープを認識し、線状エピトープは認識しないことの確認がこれにより得られた。したがって、これらのさらなる非日常的なデータおよび実験により、その自然な構造で細胞膜上に発現するＬＲＰ５およびＬＲＰ６に対して高親和性を有するはずである、治療上関連のあるＬＲＰ５およびＬＲＰ６結合剤の選択を可能にした。
【０１０３】
したがって、（ｉ）ロースループットのＦＡＣＳ結合アッセイ、（ｉｉ）あまり強固ではないアッセイ設定、および（ｉｉｉ）ＬＲＰ５を過剰発現する細胞の継代時に組換えタンパク質発現の喪失により遭遇する上記の困難にもかかわらず、これらのアッセイは高親和性ＶＨＨ結合剤のさらなる選択および特性解析のために続けて使用した。簡単に述べると、細胞は、プレート撹拌機上で、４℃で１．５時間、精製したＶＨＨ希釈物（１μＭから最終濃度１ｐＭまでの１：５段階希釈）とインキュベートした。１×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋０．０５％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ緩衝液により、細胞を５回洗浄後、それらをＶＨＨのフレームワーク領域に結合する、したがって試験した全てのＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６結合剤に結合する、マウスポリクローナル抗体と４℃で３０分から最高１時間までインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液により細胞を３回洗浄後、細胞は標識した二次抗体（抗マウス−ＰＥ）と４℃で３０分から最高１時間までインキュベートし、続いて、ＦＡＣＳ緩衝液による３回の洗浄ステップを行った。蛍光はＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ）を使用して測定した。
【０１０４】
結合ＦＡＣＳデータおよび配列解析に基づき、免疫ライブラリーおよび合成起源から、全部で１００個のＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨファミリー／クラスターが同定された。それらの代表的な例を以下にさらに示し、それらの配列によって定義した。ＶＨＨは大腸菌において発現され、精製された。大腸菌における発現が不十分であると分かった場合には、ＶＨＨはピキア・パトリス（Pichia pastoris）において産生した。ＶＨＨの発現および精製の簡単な説明を以下にさらに報告する。
大腸菌におけるＶＨＨの遺伝的発現
コード配列をｐＡＸ１００発現ベクターにクローニングし、ｃ−Ｍｙｃヘキサ−ヒスチジン−タグタンパク質として大腸菌において発現させた。対象のＶＨＨ構築物を含有する大腸菌ＴＧ−１細胞を、振盪フラスコ内でカナマイシンを補充したＴＢ培地中で増殖させ（３７℃、２５０ｒｐｍ）、発現のため１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して誘導した。細胞培養物をスピン後、周辺質の抽出物は、ペレットを凍結融解し、ｄＰＢＳ中に再懸濁することによって調整した。
【０１０５】
ピキア（Ｐ）・パトリスにおけるＶＨＨの遺伝的発現
コード配列をｐＡＸ１５９発現ベクターにクローニングし、ｃ−Ｍｙｃヘキサ−ヒスチジン−タグタンパク質としてＰ．パトリスにおいて発現させた。対象のＶＨＨ構築物を含有するＰ．パトリスＸ−３３細胞を、ＢＧＣＭ（緩衝化グリセロール複合培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた（３０℃、２５０ｒｐｍ）。３日目に、培地をＢＭＣＭ（緩衝化メタノール複合培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変え、培養物をさらに増殖させ、０．５ｖｏｌ％のメタノール（１００％）の添加により定期的に誘導した。細胞培養物をスピン後、上澄み液（分泌されたＶＨＨを含有する）を回収した。
ＶＨＨ精製：
ヘキサ−ヒスチジン−タグＶＨＨは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ  １００ｕｌ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  ６  ＦＦ、Ａｔｏｌｌ）によってＴｅｃａｎ  ＥＶＯ１５０上で精製し、２５０ｍＭイミダゾールによってカラムから溶出し、続いてｄＰＢＳで脱塩した。ＶＨＨの純度および完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または抗Ｍｙｃおよび抗ＶＨＨ検出を使用するウェスタンブロットによって確かめた。
【０１０６】
（例４）
精製した一価ＶＨＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性解析
ＶＨＨスクリーニング後、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６を発現する細胞に高親和性の精製したＶＨＨは、以下に記載したようにいくつかの機能性アッセイおよび生物物理学的アッセイを使用して特性解析した。
４．１  ＬＲＰ５およびＬＲＰ６結合能および交差反応性：ＦＡＣＳベースのＤＫＫ１競合アッセイ
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性一価ＶＨＨの特性解析中、結合ＦＡＣＳアッセイにおいて得られたデータは、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイにおいて観察された効力といつも相関するわけではないことが観察され、ほとんどの場合、いくつかのＶＨＨの急速オフ速度によるようである。したがって、選択性および結合能測定ならびにＬＲＰ５とＬＲＰ６結合の間の比較がより信頼できることが分かっている、このさらなるアッセイが確立される必要がある（すなわち、ＤＫＫ１競合ＦＡＣＳ）。その目的は、同じ濃度で両受容体の封鎖を達成するために、同様の効力でＬＲＰ５およびＬＲＰ６に結合する機能性ＶＨＨを選択することである。したがって、同定したＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ機能性ＶＨＨは、以下のようにＤＫＫ−１競合ＦＡＣＳにおいて特性解析した：
【０１０７】
ＦＡＣＳベースのＤＫＫ１競合アッセイのため、ヒトＬＲＰ５またはヒトＬＲＰ６を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した。ヒト組換えＤＫＫ１（ｒｈＤＫＫ１−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ  ５４３９−ＤＫ／ＣＦ）は、一定の最終濃度１ｎＭで細胞に添加した。細胞は、プレート撹拌機上で、４℃で１．５時間、ｒｈＤＫＫ１ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６結合剤希釈物（精製したＶＨＨの１：５段階希釈）とインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液により細胞を３回洗浄後、細胞はビオチン化ヤギ抗ヒトＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ  ＢＡＦ１０９６）と、プレート撹拌機上で、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液により細胞を３回洗浄後、細胞はストレプトアビジンＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ  ５５４０６１）と、暗所のプレート撹拌機上で、４℃で３０分から１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、蛍光をＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ）を使用して測定し、ＭＣＦ値を報告した。
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合、ならびにヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関して、ヒトＤＫＫ１と競合すると考えられる。対照的に、ＬＲＰ５特異的ＶＨＨは、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関してヒトＤＫＫ１と競合するが、ヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関しては、結合能がないまたは非常に弱い（＞２００ｎＭ）（同じことが、逆に、ＬＲＰ６特異的ＶＨＨに当てはまる）。この実験の結果として、本ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合、ならびにヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関して、ヒトＤＫＫ１と競合することが示され得る（すなわち、結合剤の濃度の増加によるＭＣＦ値の減少。ＤＫＫ１結合の完全な阻害は、試験した最高濃度での≦６０  ＭＣＦ値に相当する）。
【０１０８】
４．２  種間交差反応性：マウスとカニクイザル（cynomolgus monkey）
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨの選択されたパネルが、マウスおよびカニクイザル起源のＬＲＰ５およびＬＲＰ６に結合できるかどうか調べるため、ＤＫＫ１競合ＦＡＣＳを以下のように実施した：
ＶＨＨの段階希釈物を、１および０．３ｎＭ  ｈＤＫＫ１の存在下でマウスＬＲＰ５、カニクイザルＬＲＰ５、マウスＬＲＰ６、またはカニクイザルＬＲＰ６を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞とインキュベートした（それぞれマウスおよびカニクイザルのＥＣ５０値を下回る濃度）。細胞へのＤＫＫ１の結合は、上記のように二次検出としてストレプトアビジン−ＰＥを有するビオチン化抗ＤＫＫ１抗体を使用して検出した。結果として、そのような交差反応性が実証された。
【０１０９】
４．３  エピトープビニング
最も強力なＷｎｔ１シグナル伝達遮断ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨに関してビニング実験を実施し、異なるエピトープビンを同定した。特に、ＦＡＣＳベースのアッセイを使用して、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体結合に関して他のビオチン化ＶＨＨ（参照ＶＨＨと呼ぶ）との競合能力について、個々のＶＨＨを分析した。個々のＶＨＨの段階希釈物を、２００ｐＭまたは５００ｐＭのビオチン化参照ＶＨＨ（ＥＣ５０値を下回る濃度）と共に、ヒトＬＲＰ５またはＬＲＰ６を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞上でインキュベートした。ビオチン化参照ＶＨＨの細胞への結合は、ストレプトアビジン−ＰＥを使用して検出した。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６への結合に関して参照ＶＨＨと競合するＶＨＨは、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙを使用して測定した蛍光の減少を示した。
これらの実験の結果として、Ｗｎｔ１遮断剤は３つのビンに分類できた。Ｗｎｔ３ａ遮断剤に関して、ＶＨＨの低い親和性によりエピトープビニング実験を実施できなかった。
【０１１０】
４．４  Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイ
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨのＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を、機能性Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａアッセイにおいて試験した。これに関しても、確立された手順は使用できないが、Ｗｎｔ１／Ｗｎｔ３ａ−ＬＲＰ５／ＬＲＰ６遮断アッセイなど、生化学機能性アッセイを確立するためにいくつかの試みが必要であった。組換えＬＲＰ５およびＬＲＰ６タンパク質が遭遇する困難（例１参照）に加えて、機能性組換えＷｎｔ１リガンド（市販のものを含む）は入手できない。Ｗｎｔタンパク質は、多くの保存システインを含有し、不飽和モノ脂肪酸（パルミトレイン酸）によって改変され、保存セリンに結合する。これらの翻訳後修飾は効率的なシグナル伝達およびＷｎｔ分泌に必要である。構造分析により、パルミトレイン酸脂質を含有するドメインの１つがＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体への結合に必要であり、細胞表面でのＷｎｔリガンドのＬＲＰ５およびＬＲＰ６との相互作用を可能にする構造変化をもたらすことが示された。したがって、そのような翻訳後修飾が、このタンパク質を含む機能性研究に必要であるが、同時にそのような脂質ベースの翻訳後修飾はこれらのタンパク質の発現および精製（低可溶性）を非常に困難にすることが分かった。したがって、このことが生化学アッセイの大きなハードルとなることが分かった。
【０１１１】
したがって、精製したＶＨＨの特性解析のために細胞ベースの機能性アッセイを開発した：Ｗｎｔベータラクタマーゼレポーター遺伝子アッセイ。特に、Ｗｎｔ１経路阻害のため、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ  ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｋ１６７７）をヒトＷｎｔ１によりトランスフェクトし、ヒトＷｎｔ１を安定的に過剰発現するクローンを選択した。Ｗｎｔ３ａ経路の阻害を試験するため、ヒトＷｎｔ３ａを安定的に過剰発現するＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ  ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞を生成した。ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞株は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に安定的に組み込まれるＷｎｔ誘導性ＬＥＦ／ＴＣＦプロモーターの制御下のベータラクタマーゼレポーター遺伝子を含有する。したがって、これらの細胞におけるＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａの発現は、恒常的な発現、したがってベータラクタマーゼの酵素活性をもたらす。したがって、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性機能性ＶＨＨによる処置は、ベータラクタマーゼの酵素活性の阻害をもたらすＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の阻害をもたらすと考えられる。
【０１１２】
アッセイのため、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａを過剰発現する１Ｅ０６／ｍｌの細胞を３８４ウェルの組織培養プレートに播種し、３７℃で終夜インキュベートした。後日、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ溶液の様々な段階希釈物を調整し、最終濃度１０ｎＭでＬｉＣｌの存在下で細胞に添加した。陽性対照として、ＤＫＫ１を、最終濃度２００ｎＭで細胞に添加した。ＤＫＫ１処置はＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の完全な阻害、したがって、ベータラクタマーゼの酵素活性の阻害をもたらした。細胞は３７℃で終夜インキュベートした。後日、ベータラクタマーゼの酵素活性を製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｋ１０８５）に従って測定した。蛍光発光に関して、４６０ｎｍおよび５３０ｎｍでの値は標準的な蛍光プレートリーダーを使用して得られ、４６０／５３０ｎｍ発光比を示した処置に関してプロットした。陽性対照に対して有効性を算出した（ＤＫＫ１；最終濃度２００ｎＭ）
完全な有効性、および５０ｎＭより優れた効力がある、全部で１２個のＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性Ｗｎｔ１遮断剤が選択された。主に効力が低い１４個の交差反応性Ｗｎｔ３ａ遮断剤が同定された。１つのＷｎｔ３ａ遮断剤のみが、良好な効力を示した（５ｎＭ以下）。
【０１１３】
４．５  Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａリン酸化アッセイ
Ｗｎｔ１遮断剤に関する各ビンからの、最も効力があり有効なリード、ならびに最も効力があり有効なＷｎｔ３ａ遮断剤を、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ依存性ＬＲＰ５およびＬＲＰ６リン酸化アッセイにおいて続けて試験した。Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａのいずれかをコードする発現ベクターとコトランスフェクトした、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ  ＬＥＦ／ＴＣＦ  ２９３Ｆ細胞（ｃａｔ  Ｋ１６７７）を、リン酸化アッセイに使用した。Ｗｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ＬＲＰ５またはＬＲＰ６複合体形成は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６リン酸化、続いて下流のシグナル伝達をもたらすため、リン酸化の定量はそのようなシグナル伝達の測定に使用され得る。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６特異的な読出しを得るため、細胞を溶解し、ＬＲＰ６またはＬＲＰ５選択的抗体（２つの受容体の細胞内ドメインに対する）によって免疫沈降を実施した。ウェスタンブロットにおいて、ＬＲＰ６およびＬＲＰ５リン酸化タンパク質の両方を検出する抗リン酸−ＬＲＰ６（Ｓｅｒ１４９０）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、リン酸化ＬＲＰ６またはＬＲＰ５を検出した。各ビンから少なくとも１つの代表的なＶＨＨを含有する精製したＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ遮断ＶＨＨの選択したパネルを、最終濃度１０から１００ｎＭで試験した。特に、細胞溶解ならびにＬＲＰ５およびＬＲＰ６免疫沈降の前に、細胞を、遮断ＶＨＨの存在下で終夜インキュベートした。遮断ＬＲＰ５およびＬＲＰ６リン酸化におけるＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ遮断ＶＨＨの効果は、陽性対照に対するウェスタンブロットのバンドの定量によって算出した（ＤＫＫ１、最終濃度１μＭ）。
【０１１４】
４．６  生物物理学的特徴
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、例３に報告したように、大腸菌およびピキア・パトリスにおける発現および精製に関してさらに特性解析した。特に、一価のリードパネルＶＨＨの発現率は、それらが０．１ｍｇ／Ｌを超えた場合に許容可能であると考えられた。選択したＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、大腸菌において０．１から８．２ｍｇ／Ｌの範囲で、ならびにピキア・パトリスはより高い濃度で（＞１ｍｇ／Ｌ）発現を示した。発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。
一価ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨの熱安定性は、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して蛍光ベースの熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）により測定した。ＶＨＨを、Ｓｙｐｒｏオレンジの存在下、異なるｐＨ値でインキュベートし、温度勾配を適用した。熱誘導性のアンフォールディング時に、タンパク質の疎水性パッチが暴露されＳｙｐｒｏオレンジと結合し、蛍光強度の増加をもたらした（Ｅｘ／Ｅｍ＝４６５／５８０ｎｍ）。蛍光強度曲線の一次導関数の屈曲点は、融解温度（Ｔｍ）の指標として役立つ。全てのＶＨＨに関して、ＴｍはｐＨの増加と共に上昇し、ｐＨ６で横ばいになり、ＶＨＨは典型的なＴｍパターンを示す。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性Ｗｎｔ１遮断剤ＶＨＨおよびＷｎｔ３ａ遮断剤ＶＨＨに関して、ｐＨ７で平均８２℃が得られた。
【０１１５】
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６  ＶＨＨの凝集および多量体化の発生可能性は、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって調べた。このため、０．５ｍｇ／ｍＬの精製したＶＨＨ試料８μｇを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳＥＣ−３カラム上のＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００装置を介して注入した。Ｌ−アルギニン緩衝液（１０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  Ａｒｇ−ＨＣｌ、ｐＨ６．０）を移動相として使用し、流速１ｍＬ／分を適用した。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６  ＶＨＨはいずれも、ＳＥＣ分析の間主な凝集事象を示さなかった：プロファイルにより、ほとんどの試料は９５％より多くが単量体であることが示された。
【０１１６】
（例５）
半減期延長二重パラトピック構築物の生成および特性解析
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ  ＶＨＨを、図１に図示したように、構成要素として使用して二重パラトピック構築物を生成した。ＶＨＨを結合する血清アルブミンへの遺伝的融合を、半減期延長方法として使用した。３つの構成要素（Ｗｎｔ１遮断剤、Ｗｎｔ３ａ遮断剤、およびアルブミン結合剤）を、可動性リンカーを介して連結した。例３に記載のように、ＶＨＨをピキア・パトリスにおいて産生し、精製した。生じた構築物、すなわち二重パラトピックの、半減期延長ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物を、例えばＷＯ２０１２／１３１０７８に報告したように標準的な手順に従って、Ｃ末端ｃＭｙｃ−ヘキサ−ヒスチジンタグＶＨＨ構築物の形態で、ピキア・パトリス発現ベクターｐＡＸ１５９にクローニングした。異なる方向の構成要素および異なるリンカー、特にＧＳ−リンカーを探索した。ＬＲＰ６における潜在的なＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ結合部位間の広範囲の表面積（すなわち、ベータプロペラドメイン１および２はベータプロペラドメイン３に近接していない）を反映するモデルデータに基づき、比較的長いＧＳリンカーを選択した。Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイにおける効力の最良の結果は、ヒト血清アルブミン／ＨＳＡ結合ＶＨＨを中央に置くことによって得られた。３５個のＧＳリンカーを使用し、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ  ＶＨＨ遮断剤を好ましい順番で配置した。
【０１１７】
最適なＶＨＨ結合剤および結合剤の組合せの選択のため、ライブラリーを生成し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ＶＨＨをＬＲＰ５／ＬＲＰ６  Ｗｎｔ１−Ｗｎｔ３ａ遮断剤間に置いた。特に、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａアッセイ（レポーターアッセイおよびリン酸化アッセイ）において高い効力および有効性を持つ高親和性結合剤のパネルを、ライブラリーに使用し、図１に図示したように設計した半減期延長二重パラトピック構築物を生成した。ピキア・パトリスでの発現（例３に報告したように）に続いて精製後、半減期延長二重パラトピック構築物を３つの希釈（１／１００、１／１０００、１／７０００）で、３０μＭ  ＨＳＡの存在下で、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイ（例４に記載）において続けてスクリーニングし、有効性および相対的な効力を評価した。一般に、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイにおけるデータ間の良好な相関が観察され、多くのフォーマットに関して高い有効性が測定された。全部で１１個の半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５およびＬＲＰ６構築物をさらなる特性解析のために選択し、レポーターアッセイと多様なＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ遮断剤の両方における有効性を考慮に入れた。このさらなる特性解析アッセイは、以下に記載する。
【０１１８】
Ｗｎｔ１／Ｗｎｔ３ａレポーターアッセイ：
Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイを最終濃度の３０μＭ  ＨＳＡの存在下で例４．４に記載のように実施した。精製した二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６構築物を、２．５μＭから始めて１２段階の希釈で試験した。ほとんどの構築物が、１．７ｎＭから０．１６ｎＭの間の範囲の高い効力を示し、以下の表ＩＶに示すように、両方のレポーターアッセイにおいて完全な有効性を示した。ここに記載のＶＨＨドメインを阻害する個々のＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａの配列を、以下の表Ｖに提供する。
【０１１９】
【表８】
2020178701.tif 000009
【０１２０】
【表９】
2020178701.tif 000010
2020178701.tif 000011
2020178701.tif 000012
2020178701.tif 000013
2020178701.tif 000014
【０１２１】
（例６）
ＶＨＨおよびＶＨＨ構築物の配列最適化
配列最適化は、親配列を変異させ、ヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖系列コンセンサス配列への同一性を上昇させるプロセスである。例えば、フレームワーク領域（いわゆる、ホールマーク残基は除く）の特異的なアミノ酸をそれらのヒトの対応物と交換し、途中、タンパク質構造、活性および安定性は保存されるべきである。
【０１２２】
これらの変異は以下のように分類され得る：
１．標準：これらの位置の配列最適化は、ＶＨＨの安定性または活性または親和性を劇的に変えるとは考えられず、したがってそれらは全てを一度に変更し、基本的なバリアントを産生する。
２．ユニーク：これらの位置の配列最適化がＶＨＨの安定性または活性または親和性に影響するかは分かっておらず、したがってそれらは、基本的なバリアントに加えて個々の基準で調ベる。
ホールマーク残基はＶＨＨの安定性、活性、および親和性に重要であることが公知であり、したがって変異されない。
さらに、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に感受性であるという実験的な証拠があるＣＤＲに存在するアミノ酸は、ＰＴＭ部位が不活性化されるが、タンパク質構造、活性、および安定性は無傷なままである方法で変更される。抗体およびＶＨＨに関して記載した最も一般的な翻訳後修飾を、以下の表ＶＩに列挙する。翻訳後修飾へのＶＨＨの感受性は、加速ストレス研究によって分析し、メチオニン酸化を分析するためのＨ2Ｏ2処置、高温、高ｐＨ、および長期保存を含むいくつかの標準的な条件を適用し、アスパラギン脱アミノ化およびアスパラギン酸異性化を試験する。酸化、脱アミノ化、および異性化の割合は、標準的な手順に従って測定し、参照試料と比較した（ＶＨＨは−２０℃で保存）。逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）および質量分析（ＭＳ）を使用するペプチドマッピングにおいて完全タンパク質分析を実施し、感受性の可能性がある残基を同定した。ストレス試験後にＶＨＨにおいて観察された翻訳後修飾の場合、相当するアミノ酸を変異した。
【０１２３】
【表１０】
2020178701.tif 000015
結果として、先に記載の構築物にいくつかの突然変異が導入され、特に、上記の表ＩＩＩに示した３つの構築物をもたらし、以下の例にさらに記載のように、それらはさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ特性解析のために選択された。
【０１２４】
（例７）
３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性解析；他のＬＲＰ６結合分子との比較
ＶＨＨ配列の最適化後、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物を組換えにより発現および精製し、以下に記載のように、いくつかの機能性アッセイおよび生物物理学的アッセイを使用して特性解析した。
【０１２５】
７．１  ＦＡＣＳ結合アッセイ
ヒトＬＲＰ５およびＬＲＰ６への結合は、図３Ａおよび図３Ｂに報告したように、ＦＡＣＳ分析によって細胞上で測定した。特に、ヒトＬＲＰ５への結合はヒトＬＲＰ５を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞上で試験した。ヒトＬＲＰ６への結合に関しては、ヒトＬＲＰ６を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した。細胞は、プレート撹拌機上で、４℃で１．５時間、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６結合剤希釈物（図３Ａおよび図３Ｂに示した最終濃度に相当する結合剤の１：５段階希釈）とインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．ｎｏ．１４１１９０−０９４）＋１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｆ７５２４）＋０．０５％アジ化ナトリウム）により５回洗浄後、細胞はＶＨＨのフレームワーク領域に結合するマウスポリクローナル抗体と４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄後、細胞は標識化二次抗体（抗マウスＰＥ（１１５−１１６−０７１））と４℃で１時間インキュベートし、続いて、ＦＡＣＳ緩衝液による３回の洗浄ステップを行った。蛍光は、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ）を使用して測定した。ヒトＬＲＰ５およびＬＲＰ６への結合は、試験した最高濃度において≧６００ＭＣＦ値に相当する。陰性対照は、非標的化結合剤（ＨＥＫ２９３細胞に発現しない細菌タンパク質に結合するＶＨＨ構築物）からなる。それぞれ図３Ａおよび図３Ｂに示すように、ヒトＬＲＰ５およびＬＲＰ６への結合は、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の試験した最高濃度でそれぞれ≧６００ＭＣＦおよび≧１６００ＭＣＦ値に相当する。これらのデータは、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子が細胞アッセイシステムにおいてそれらの自然な構造でヒトＬＲＰ５およびヒトＬＲＰ６両方に結合することを明らかにする。ｈＬＲＰ５およびｈＬＲＰ６への結合のＥＣ５０値を以下の表ＶＩＩに報告する。
【０１２６】
【表１１】
2020178701.tif 000016
７．２  ＦＡＣＳ−ＤＫＫ１競合アッセイ
３つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の効力および有効性を、例４．１に記載したようにＦＡＣＳベースのＤＫＫ１競合アッセイを使用してさらに分析した。ヒトＬＲＰ５またはヒトＬＲＰ６を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の段階希釈物とインキュベートした（図４Ａおよび図４Ｂに示した最終濃度に相当する１：５段階希釈）。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示すように、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関して、ならびにヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関して、ヒトＤＫＫ１と競合した。ＤＫＫ１結合の完全な阻害は、試験した最高濃度（≧１０ｎＭ）で達成され、ＭＣＦ値≦６０に相当した。対照的に、ＬＲＰ５特異的ＶＨＨは、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関してはヒトＤＫＫ１と競合するが、ヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関しては、全くないまたは非常に低い効力（＞２００ｎＭ）である（同じことが、逆に、ＬＲＰ６特異的ＶＨＨに当てはまる）。この実験の結果として、本ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨは、ヒトＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞ならびにヒトＬＲＰ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合に関して、ヒトＤＫＫ１と競合する（すなわち、結合剤の濃度の増加によるＭＣＦ値の減少。ＤＫＫ１結合の完全な阻害は、試験した最高濃度での≦６０ＭＣＦ値に相当する）。３つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物のｈＬＲＰ５およびｈＬＲＰ６への結合に関するＤＫＫ１競合のＩＣ５０値を以下の表ＶＩＩＩに報告する。これらのデータは、３つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物のヒトＬＲＰ５およびヒトＬＲＰ６への結合を明確にし、２つの受容体間で非常に似た親和性を示した（ＤＫＫ１競合アッセイにおいてＩＣ50効力値によって本明細書で定義した）。さらにデータは、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子が、それらの自然な構造でヒトＬＲＰ５ならびにヒトＬＲＰ６に結合しているという考えを補強する。
【０１２７】
【表１２】
2020178701.tif 000017
【０１２８】
７．３  Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイ
フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子の効力および有効性を、Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイを使用して分析し、同じアッセイにおいてＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ遮断剤両方の機能性試験を可能にした。Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイは、手順に以下の変更を加えた例４．４に記載のアッセイに基づく。３８４ウェルの組織培養プレートに播種したＷｎｔ１を過剰発現する１Ｅ０６個／ｍｌの細胞を、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＷｎｔ３ａ（ｒｅｃ．ｈｕｍａｎ  Ｗｎｔ３ａ：Ｒ＆Ｄ  ＃５０３６−ＷＮ／ＣＦ）により処置し、次いで細胞を３７℃で終夜インキュベートした。後日、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６二重パラトピック交差反応性ＶＨＨの様々な段階希釈溶液を調整し、最終濃度１０ｎＭのＬｉＣｌの存在下で細胞に添加した。陽性対照として、ＤＫＫ１を最終濃度２００ｎＭで細胞に添加した。ＤＫＫ１処置は、Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合した経路の完全な阻害、したがってベータラクタマーゼの酵素活性の完全な阻害をもたらした。細胞は３７℃で終夜インキュベートした。後日、ベータラクタマーゼの酵素活性を製造業者の指示に従って測定した。例４．４に報告したように、蛍光放出に関して、４６０ｎｍおよび５３０ｎｍでの値を標準的な蛍光プレートリーダーを使用して得て、４６０／５３０ｎｍ放出比を示した処置についてプロットした。図５Ａに「ベースライン」として報告した蛍光の比［４６０／５３０ｎｍ］の値は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路の完全な阻害に相当し、陽性対照による処置によって決定された（ＤＫＫ１；最終濃度２００ｎＭ）。「Ｗｎｔ１」として報告した蛍光［４６０／５３５ｎｍ］の比の値は、Ｗｎｔ１経路のみの活性化に相当し、Ｗｎｔ１過剰発現細胞から決定された（すなわち組換えヒトＷｎｔ３ａによる処置無し）。「Ｗｎｔ１＋Ｗｎｔ３ａ」として報告した蛍光の比［４６０／５３５ｎｍ］の値はＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路を複合した活性化に相当し、組換えヒトＷｎｔ３ａによるＷｎｔ１過剰発現細胞の処置によって決定した。図５Ａに示すように、完全な阻害（すなわち、ベースラインに相当する蛍光の比［４６０／５３５ｎｍ］）は、３つのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子による処置によって達成される。さらに、ＩＣ５０値によって以下の表ＩＸに示すように高い効力も報告された。
【０１２９】
【表１３】
2020178701.tif 000018
次に、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子の効力および有効性を、ＷＯ２０１１／１３８３９１およびＷＯ２０１１／１１９６６１に報告された先に開示のＬＲＰ６結合分子と比較した。
【０１３０】
ＷＯ２０１１／１３８３９１では、ＬＲＰ６に結合し、プロペラ１（例えば、Ｗｎｔ１）およびプロペラ３（例えば、Ｗｎｔ３）リガンド相互作用の両方を阻害する多価抗体が開示された。これらの多価ＬＲＰ６結合抗体は、第一の受容体結合ドメインとしてＩｇＧ抗体および第二の受容体結合ドメインとしてｓｃＦｖ断片からなる二重パラトピックＬＲＰ６結合分子であり、ＩｇＧ抗体とｓｃＦｖ断片はリンカーによって連結されている。ＷＯ２０１１／１３８３９１では、全てのＬＲＰ６結合分子がＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイにおいてほぼ同じ効力を持つことが報告されている（ＷＯ２０１１／１３８３９１の図１８）。したがって、それらの多価ＬＲＰ６結合分子のいずれかが、比較実験のために選択され得る。したがって、第一の比較化合物として「９０１」構築物を使用することが決定された（ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖと呼ばれる；ＷＯ２０１１／１３８３９１の図２７にも示された）。
【０１３１】
この「９０１」構築物の誘導体がＷＯ２０１３／０６７３５５に示される。特に、８０１Ｔおよび８０２Ｔと名付けられた化合物が開示され（明細書のｐ．１３２の開示を参照）、両方とも２つのＬＲＰ６結合ｓｃＦｖドメインと半減期延長部分を持つ。８０１Ｔおよび８０２Ｔは同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力および生物物理学的な特性を持つようであるため、それらのうち１つのみ−変異体８０２Ｔ−を以下に記載の実験に含めた。
ＷＯ２０１１／１１９６６１では、ＬＲＰ６に結合し、複数のＷｎｔアイソフォームによるシグナル伝達を阻害する二重特異性抗体が開示された。これらの二重特異性抗ＬＲＰ６抗体はＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合し、Ｗｎｔアイソフォーム、中でもＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａによって誘導されたシグナル伝達を阻害する。Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ工学（Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ”．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；２７０（１）：２６−３５）を使用して、これらの二重特異性抗ＬＲＰ６抗体を構築した。ＷＯ２０１１／１１９６６１の例１１は、ＹＷ２１１．３１．６２およびＹＷ２１０．０９重鎖ヘテロダイマーを持つＩｇＧハイブリッドを開示する。したがって、比較のため、ＹＷ２１１．３１．６２およびＹＷ２１０．０９重鎖ヘテロダイマーを持つ２つの二重特異性ＩｇＧハイブリッド抗体を、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ工学技術により、すなわち、ＹＷ２１０．０９の重鎖のＣＨ３にＫｎｏｂ、ＹＷ２１１．３１．６２の重鎖のＣＨ３にｈｏｌｅ、またはその逆を作製するように工学的に操作したアミノ酸変化により生成し、それぞれＫｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９およびＫｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１１．３１．６２と本明細書において呼ぶ。これら２つの構築物は、例４．４に従ってＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーターアッセイにおいて特性解析した。予想した通り、ＹＷ２１１．３１．６２およびＹＷ２１０．０９重鎖ヘテロダイマーを持つ２つの二重特異性ＩｇＧハイブリッドは、以下の表Ｘに報告するように、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａアッセイにおいて類似の効力を示した。したがって、以下にさらに示した比較例のため、Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９を第二の比較化合物として選択した。
【０１３２】
【表１４】
2020178701.tif 000019
【０１３３】
半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の効力および有効性は、Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａを複合したレポーターアッセイを使用して、ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ二重パラトピックＬＲＰ６結合分子、Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９二重特異性抗ＬＲＰ６分子、および８０２Ｔ二重特異性抗ＬＲＰ６分子と比較した。図５Ｂに示すように、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子Ｆ０１３５００５７１と同様に、Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９（ＹＷ２１１．３１．６２およびＹＷ２１０．０９重鎖ヘテロダイマーを持つ二重特異性ＩｇＧハイブリッド抗体）による処置により、完全な阻害（すなわち、図５Ｂのベースラインに相当する蛍光の比［４６０／５３５ｎｍ］）が達成された。しかしながら、以下の表ＸＩに報告したように、Ｆ０１３５００５７１はより高い効力を示した。代わりに、ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖおよび８０２Ｔ二重パラトピックＬＲＰ６結合分子は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ阻害の完全な欠如を示した（すなわち蛍光の比［４６０／５３５ｎｍ］が、それぞれ図５Ｂおよび図５Ｃのベースラインよりも著しく高い）。これらのデータは、ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖと８０２Ｔ二重パラトピックＬＲＰ６結合分子の両方が、Ｆ０１３５００５７１と比較した場合、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ経路阻害において著しく有効性が低いことを示す。したがって、Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９は、以下にさらに記載したようにｉｎ  ｖｉｖｏ実験のための比較化合物として選択された（例９；ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性）。
【０１３４】
【表１５】
2020178701.tif 000020
【０１３５】
（例８）
がん細胞株のＷｎｔシグナル伝達および生存率における３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の効果
活性なＷｎｔシグナル伝達を阻害する半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の能力は、先に記載されたように、活性なＷｎｔシグナル伝達を有するがん細胞株を使用してさらに特性解析した（Ｂａｆｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４；６（５）：４９７−５０６；ＤｅＡｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｗｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８ＣＲＤ−ｈＦｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（１１）：５３７１−９）；Ａｋｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｗｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ”．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００９；２８（２１）：２１６３−７２）。簡単に述べると、活性なＷｎｔシグナル伝達を有するがん細胞株、ＰＡ−１およびＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｓを１２ウェルプレートに播種し、最終濃度１μＭのＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物により２日間処置した。Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力は、内在性のＷｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現の阻害によって検出した。標準的なＲＮＡ技術を使用してｑＰＣＲ発現解析を実施した：ＲＮＡ単離は、ＱＩＡＧＥＮによって提供された手順に従って、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して実施した；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用するｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７５４０５０）およびＡｘｉｎ２  ＴａｑＭａｎプライマー／プローブ（Ｈｓ００６１０３４４＿ｍ１  ＡＸＩＮ２  ＦＡＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および真核生物の１８ｓ内在性対照ＶＩＣ−ＭＧＢ（４３１９４１３Ｅ−１３０７０６１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙを使用するｑＰＣＲを実施した。
【０１３６】
図６Ａに示したように、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物によって処置したＰＡ−ＴＵ８９８８ＳおよびＰＡ−１がん細胞の両方は、未処置（対照）細胞と比較した場合、Ａｘｉｎ２の相対的なｍＲＮＡレベル（すなわち、内在性対照に対して正規化）の著しい減少を示した。これらのデータは、活性なＷｎｔシグナル伝達を有するがん細胞株におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の能力を実証した。さらに、細胞の生存率に対するＷｎｔシグナル伝達遮断の効果を、それらの増殖が活性なＷｎｔシグナル伝達依存的であることが先に報告された（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＦ４３  ｃｏｎｆｅｒ  Ｗｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ”．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０（３１）：１２６４９−５４）ＰＡ−ＴＵ８９８８ＳおよびＹＡＰＣがん細胞株において調べた。細胞生存率は、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物（最終濃度１μＭ）または比較化合物８０２Ｔ（最終濃度１μＭ）による処置の１０日後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．＃ＤＡＬ１１００）を実施することによって測定した。図６Ｂに示すように、３つの半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物によって処置したＰＡ−ＴＵ８９８８Ｓがん細胞は、未処置（対照）細胞と比較した場合、生存細胞の割合が著しく減少した（≧７５％減少）。８０２Ｔによる処置時、細胞生存率における影響は検出されなかった（図６Ｂ、右手側の図表）。これらのデータは、活性なＷｎｔシグナル伝達に依存するがん細胞の細胞増殖を阻害する、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物の能力を実証し、また８０２Ｔと比較した場合、これらの構築物の優れた効果も示す。
【０１３７】
さらに、細胞生存率の用量依存性は、上記のように８０２Ｔと比較して、ＰＡ−ＴＵ８９８８Ｓ（図６Ｃ）およびＹＡＰＣ（図６Ｄ）がん細胞株においてＦ０１３５００５７１に関して評価した。細胞生存率の用量依存的な減少は、Ｆ０１３５００５７１での処置時に検出された。対照的に、ＰＡ−ＴＵ８９８８ＳおよびＹＡＰＣがん細胞株の両方における比較化合物８０２Ｔによる処置時には、細胞生存率への効果は見られなかった。これらのデータは、８０２Ｔと比較した場合、半減期延長二重パラトピックＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性ＶＨＨ構築物が優れた効果を有することを示す。
【０１３８】
（例９）
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック半減期延長ＶＨＨ構築物／結合分子を、Ｗｎｔ駆動腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでさらに特性解析した。実験は、これらの結合分子がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害するか測定するために行った。比較化合物Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９の有効性もまた、同じＷｎｔ駆動腫瘍モデルを使用して測定した。マウス乳がんウイルスＬＴＲエンハンサー（ＭＭＴＶプロモーター）を使用するＷｎｔリガンドのトランスジェニック発現は、マウスにおいて広範な乳管過形成、続いて６カ月齢までにトランスジェニック（ＴＧ）マウスにおいて乳腺腺癌をもたらす。これらの乳房腫瘍は、グルココルチコイド誘導性のＷｎｔリガンドの過剰発現によって駆動され、細胞内ベータカテニン局在によって評価されるように、上皮および間葉マーカーの発現（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ表現型）ならびに活性なＷｎｔシグナル伝達を含む、ＴＮＢＣ腫瘍と類似の特性を有する。特に、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１トランスジェニックマウス由来の乳房腫瘍はＷｎｔ１依存的である。実際に、ヒトＦｃドメインに融合したＦｒｉｚｚｌｅｄ８システインリッチドメイン（ＣＲＤ）（Ｆ８ＣＲＤｈＦｃ）を含む可溶性Ｗｎｔ受容体を使用するＷｎｔ活性の遮断は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を阻害することが報告された（ＤｅＡｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｗｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８ＣＲＤ−ｈＦｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（１１）：５３７１−９）。したがって、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスから単離した腫瘍は、有効性実験の開始前、２から５回の継代の間にヌードマウスに腫瘍断片として皮下に継代した。移植後１４日から２１日の間、腫瘍が平均容積およそ１５０から２５０ｍｍ3に達した場合、マウスは群あたり７匹の群に無作為に分け、化合物をｉ．ｖ．投与した。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック半減期延長ＶＨＨ構築物を、Ｆ０１３５００５７１については図７Ａに、Ｆ０１３５００７２０については図７Ｂに示した用量で週２回マウスにｉ．ｖ．投与した。比較化合物Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９も週２回ｉ．ｖ．投与したが、上記に説明したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験においてこの化合物で得られたデータにより、より高用量、すなわち３０および４５ｍｇ／ｋｇ（図７Ｃ）で投与した。有効性実験の間、腫瘍容積および体重をモニターし、中間の腫瘍容積を図７Ａから図７Ｃに報告する。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は有効性実験の終了時に測定した。特に、ＴＧＩは、対照群（図７Ａおよび図７Ｂに示した実験においてはヒスチジン緩衝液−２０ｍＭヒスチジン  ｐＨ６．５緩衝液−、または図７Ｃに示した実験においてはクエン酸緩衝液によってマウスを処置）と比較して各処置群について測定した。さらに、有効性実験の終了時に胃腸（ＧＩ）の病理組織学的分析（十二指腸から直腸までの胃腸管の断片のＨ＆Ｅ染色による）を実施し、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６アンタゴニストの潜在毒性を評価した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験の終了時のＧＩ病理組織��的分析の結果、著しい体重の減少（有効性実験の開始時と比較して体重の減少が＞１８％）により屠殺する必要があるマウスの数に相当する死亡率、および腫瘍退縮の数（処置の開始時に測定した腫瘍容積よりも小さい実験終了時の腫瘍容積）を、実験に関する表ＸＩＩＡ、ＸＩＩＢ、およびＸＩＩＣにおいて各処置群について報告し、データはそれぞれ図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃにも示した。
【０１３９】
【表１６】
2020178701.tif 000021
【０１４０】
【表１７】
2020178701.tif 000022
【０１４１】
【表１８】
2020178701.tif 000023
【０１４２】
図７Ａから図７Ｃおよび上記の表ＸＩＩＡから表ＸＩＩＣから分かるように、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性半減期延長二重パラトピックＶＨＨ構築物（２×／週のスケジュールで、４ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇのＦ０１３５００５７１および１ｍｇ／ｋｇのＦ０１３５００７２０）による処置は、著しい体重の変化（＜１０％）がなく、ＧＩ病理組織学的分析後に何も所見が報告されずに、実際に腫瘍退縮（すなわち、腫瘍の縮小；有効性実験の開始時の腫瘍容積と比較して有効性実験の終了時の腫瘍容積の減少に相当する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）＞１００％）をもたらした。重要なことに、それに対して、３×／週のスケジュールでの９０ｍｇ／ｋｇに相当する、マウスにおいて投与可能な最大ｉ．ｖ．用量／スケジュールでさえも、ＬＲＰ６特異的結合剤Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９による処置時には腫瘍退縮が観察できなかった。
上記に説明した実験において観察されたように、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性における差をさらに調べるため、比較化合物のより高用量でさえもマウスにより頻繁に投与（３回／週）できるようにさらなる実験を設定した。要するに、そのようなより高い暴露を達成するため、比較化合物は、以下の表ＸＩＩＤに示したようにｉ．ｐ．投与された。
【０１４３】
【表１９】
2020178701.tif 000024
【０１４４】
表ＸＩＩＤに示したデータから分かるように、この設定においても、ＴＧＩに関して著しく強い効果は得られなかった。言い換えると、これらの実験、データおよび結果は、Ｋｎｏｂ  ＨＣ  ＹＷ２１０．０９と比較した場合に、半減期延長二重パラトピックＶＨＨ構築物のより高い有効性、ならびに本発明のポリペプチドの腫瘍増殖を減らすだけでなく、腫瘍縮小も誘導する先例のない能力をはっきりと示す。もちろん、がん患者の処置のため、腫瘍縮小（すなわち、腫瘍退縮）は望ましい治療効果（すなわち有効性）である。実際に、臨床試験において、病理学的完全奏功（ｐＣＲ）をもたらす腫瘍退縮を誘導する処置は、乳がんなど、高いアンメットメディカルニーズ適応症の無憎悪生存および全生存の著しい改善を積極的に導く。
上記の比較例は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック半減期延長ＶＨＨ構築物が、親和性またはＫD値など、その結合特性において優れているだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ設定においても非常に有利であり優れた特性を有することも示す。
【０１４５】
次に、化合物ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖが同様の有利な効果を提供し得るかどうか調べた。このため、以下のようにマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ忍容性試験を実施した：ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ化合物を週２回（２ｑｗ）、３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した；ＷＯ２０１１／１３８３９１において図２２に記載したように、異種移植片腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が検出された同じ用量／レジメン。ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖによる最初の処置は１日目に実施し、６日目からマウスの著しい体重の減少が検出された。１０日目に、ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ化合物によって処置した何匹かのマウスは、著しい体重の減少（＞１０％）を示した。１１日目に、マウスを屠殺し、胃腸管（ＧＩ）病理組織学的分析により、マウスの大腸および盲腸にびらんを伴う炎症が明らかになった。これらのデータは、ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖが有効な用量／レジメンで忍容ではないことを示す。したがって、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック半減期延長ＶＨＨ構築物は、治療濃度域に関して優れている；すなわちそれらは、著しい体重の変化なく（＜１０％）腫瘍退縮を誘導し、ＧＩ病理組織学的分析後に何の所見も報告されなかった。
【０１４６】
（例１０）
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｗｎｔ経路阻害
Ｗｎｔシグナル伝達におけるＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性二重パラトピック半減期延長ＶＨＨ構築物／結合分子の効果をさらに特性解析するため、例９に記載するように、有効性実験の終了時に腫瘍を単離した。特に、化合物または対照処置の最後の注入の１６時間後に腫瘍を単離した。Ｗｎｔシグナル伝達阻害は、例８に記載したように分析し、腫瘍におけるＡｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現の低下によって測定した。対照群に対するＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の倍数変化を、Ｆ０１３５００５７１によるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に関しては図８Ａに、Ｆ０１３５００７２０によるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に関しては図８Ｂに報告する。各処置群に関するＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡ低下の定量は、以下の表ＸＩＩＩＡおよびＸＩＩＩＢに報告する。
【０１４７】
【表２０】
2020178701.tif 000025
【表２１】
2020178701.tif 000026
【０１４８】
図８Ａおよび図８Ｂならびに表ＸＩＩＩＡおよび表ＸＩＩＩＢから分かるように、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の著しい低下および用量依存的な減少（特に、Ｆ０１３５００５７１による処置に関して）が、対照群と比較してＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子によって処置した腫瘍において観察された。これらの結果は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子が、実際に腫瘍細胞においてＷｎｔシグナル伝達を抑制することによって腫瘍増殖を阻害できることを示す。
【０１４９】
（例１１）
工業生産プロセス
１１．１  発酵：上記の表ＩＩＩおよび表Ｖに記載のいずれかのポリペプチドは、誘導性プロモーターの制御下で、Ｗ３１１０、ＴＧ１、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＭＭ２９４のような異なる大腸菌株の細胞質で発現され得る。このプロモーターは、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、Ｔ７、ｔｒｐ、Ｔ５、ａｒａＢから選択され得る。培養培地は、好ましくはＷｉｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（Ｗｉｌｍｓ，Ｂ．，Ｈａｕｃｋ，Ａ．，Ｒｅｕｓｓ，Ｍ．，Ｓｙｌｄａｔｋ，Ｃ．，Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．，Ｓｉｅｍａｎｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．：Ｈｉｇｈ−Ｃｅｌｌ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｎ−Ｃａｒｂａｍｏｙｌａｓｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｈａＢＡＤ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７３：９５−１０３（２００１））、ＤｅＬｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（ＤｅＬｉｓａ，Ｍ．Ｐ．，Ｌｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｒａｏ，Ｇ．，Ｗｅｉｇａｎｄ，Ｗ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｗ．Ｅ．：Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ＧＦＰ−ｏｐｅｒｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６５：５４−６４．（１９９９））に従って完全に定義される、または等価物である。しかしながら、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンのようなアミノ酸、または大豆ペプトンもしくは酵母エキスなどの複合培地成分による培地の補充が有益であり得る。発酵のプロセスはフェドバッチモードで実施される。条件：温度３０〜４０℃、ｐＨ６〜７．５、溶存酸素は２０％以上に保つ。最初の炭素源の消費後、培養物は上述の供給培地（または等価物）によって供給される。発酵槽内の乾燥細胞重量が４０から９０ｇ／Ｌに達した場合、使用したプロモーターシステムに対応する適切な誘導物質によって培養が誘導される（例えば、ＩＰＴＧ、ラクトース、アラビノース）。誘導は、パルス完全誘導としてまたは長時間にわたりそれぞれの誘導物質を発酵槽に供給することによる部分誘導としてのいずれかで実施され得る。産生相は少なくとも４時間続く。細胞は、ボウル型遠心分離機、筒状ボウル型遠心分離機、またはディスク型遠心分離機において遠心分離によって回収され、培養上澄み液は廃棄した。
【０１５０】
１１．２  精製：大腸菌細胞塊を６から８倍量の溶解緩衝液（リン酸またはＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７〜８．５）に再懸濁した。細胞溶解は、好ましくは高圧ホモジナイズし、続いてボウル型、筒状ボウル型、またはディスク型遠心分離機での遠心分離によって細胞片を除去することにより実施した。標的タンパク質を含有する上澄み液は、０．２２〜１０μｍフィルターを使用して濾過してもよく、ｐＨ７〜８．５で陽イオン交換クロマトグラフィーによって分離してもよい（例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭｅｇａＣａｐ（登録商標）ＩＩ  ＳＰ−５５０ＥＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ−６５０Ｍ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦまたはＳ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））。溶出は、ｐＨ７〜８．５で線形に増加するＮａＣｌ勾配によって実施した。標的タンパク質を含有する画分を集め、続いて遊離システイン残基によって仲介される二量体化または凝集を防ぐため、５〜１０ｍＭ  ＤＴＴとインキュベートした。０．８〜１Ｍ  硫酸アンモニウムまたは２〜３Ｍ  ＮａＣｌのさらなる添加後、溶液は、ｐＨ７〜８．５での親水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０（Ｓ，Ｍ，Ｃ）、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０（Ｓ，Ｍ，Ｃ））によって分離した。溶出は、５ｍＭ  ＤＴＴの存在下で、線形に減少する硫酸アンモニウムまたはＮａＣｌ勾配によってｐＨ７〜８．５で行った。純度が最少で９０％の標的タンパク質を含有する画分を集め、５ｍＭ  ＤＴＴの存在下で透析濾過により脱塩し、続いておよそ５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。続く再フォールディングは、タンパク質溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ  ８．５により１：５〜１：２０に希釈し、最終タンパク質濃度を０．２５〜１ｍｇ／ｍｌにすることによって実施した。再フォールディング溶液は、室温で１２〜３６時間撹拌下でインキュベートし、次いでｐＨ７〜８．５での陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０（Ｓ、Ｍ、Ｃ））によって分離した。溶出は、ｐＨ７〜８．５で線形に増加するＮａＣｌ勾配によって実施した。単量体の標的タンパク質を含有する画分を集め、透析濾過により２５ｍＭ  Ｎａ−リン酸、２２０ｍＭ  エンドトキシンフリーのトレハロース、ｐＨ７．５に製剤化した。溶液は濾過によって滅菌し、２から８℃で保存した。
【０１５１】
（例１２）
ｓ．ｃ．投与用の医薬製剤
本発明の上記の二重パラトピックポリペプチド構築物のいずれかは、以下の組成を有する皮下適用のための医薬製剤の製造のために選択され得る。
原薬：１００ｍｇ／ｍｌ（１から３ｎｍｏｌ／ｍｌ）
酢酸緩衝液：２５ｍＭ
トレハロース：２２０ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ−２０：０．０２％
原薬は、上記の組成を有する溶液内で製剤化され、滅菌し、２から８℃で保存した。
【０１５２】
（例１３）
ヒトにおける医薬用途
上記の例１１．２で調整した溶液は、２週間ごとから４週間ごとに静脈注入（用量１００から２００ｍｇ）によって、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤に感受性のがんを患っているヒトなど、それを必要とする患者に適用する。
【０１５３】
（例１４）
ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイにおける樹状細胞による炎症性サイトカイン放出へのＷｎｔ３ａシグナル伝達阻害の効果
ＰＢＭＣは、インフォームフォコンセントを行った健常なドナーから得た。ヒト単核球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を以下のように生成した：ＰＢＭＣは、５０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を補充したＸ−ＶＩＶＯ培地中で培養した。培養２４時間後、上澄み液を注意深く除去し、同じＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬー４を補充したＸ−ＶＩＶＯ培地中で置き換えた。４日目に、上澄み液を注意深く除去し、ＬＰＳのみの存在下、もしくはヒトＷｎｔ３ａまたはヒトＷｎｔ３ａおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子との組合せの存在下でＸ−ＶＩＶＯ培地によって置き換えた。後日、上澄み液を回収し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−アルファの分析にかけた。先に報告されたように（Ｏｄｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９０（１２）：６１２６−３４）、および図９Ａに示すように、Ｗｎｔ３ａは分化した樹状細胞（ＤＣ）による炎症性サイトカイン分泌（すなわち、ＴＮＦ−アルファ放出）を直接阻害する。ＤＣからのＴＮＦ−アルファ放出のＷｎｔ３ａ駆動抑制は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子の添加によって回復した。
【０１５４】
これらのデータは、フォーマットした、二重パラトピックの、および配列最適化結合分子が、Ｗｎｔ３ａ処置した樹状細胞によるＴＮＦアルファ分泌を回復することができ、それにより樹状細胞においてＷｎｔ阻害効果を抑制することを示す。
腫瘍微小環境内の樹状細胞においてＷｎｔ経路を遮断することは、腫瘍媒介性の免疫抑制の破壊および抗腫瘍免疫の増大に対する可能な治療アプローチを示していると考えることは重要である。
Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）に対するＤＣの効果を調べるため、先に記載したように（Ｏｄｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９０（１２）：６１２６−３４）、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子有りまたは無しでＷｎｔ３ａによって前処置したＤＣをＴ細胞と共培養し、ＰＢＭＣから単離した。ＤＣ／Ｔ細胞の共培養３日後、上澄み液を回収し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによりＩＦＮガンマの分析にかけた。
【０１５５】
ＩＦＮガンマ分泌は、Ｔ細胞活性化のマーカーである。図９Ｂに示すように、Ｗｎｔ３ａ媒介性ＤＣ阻害は、Ｔ細胞によるＩＦＮガンマ分泌の減少をもたらし（Ｔ細胞機能の阻害）、それはＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子での処置によって完全に回復される。
要約すると、これらのデータは、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子が樹状細胞においてＷｎｔ阻害効果を抑制し、Ｔ細胞機能の回復をもたらすことを示している。
Ｔ細胞の継続的な活性化／刺激は最終分化を誘導し、枯渇したＴ細胞表現型、Ｔ細胞機能の進歩的な喪失をもたらすことが知られている。したがって、Ｔ細胞におけるＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子の効果は、ＤＣの活性化によって媒介され、Ｔ細胞枯渇によって制限され得ることが考えられる。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６交差反応性結合分子の投与とＴ細胞枯渇を遮断する免疫チェックポイント阻害剤の投与を組み合わせる組合せ処置は、したがって、Ｔ細胞機能を活性化および維持するのに役立ち、それにより腫瘍微小環境が変化し、本発明の分子の治療効果をサポートすると考えられる。
【図１】
2020178701.tif 000027
【図２】
2020178701.tif 000028
【図３Ａ】
2020178701.tif 000029
【図３Ｂ】
2020178701.tif 000030
【図４Ａ】
2020178701.tif 000031
【図４Ｂ】
2020178701.tif 000032
【図５Ａ】
2020178701.tif 000033
【図５Ｂ】
2020178701.tif 000034
【図５Ｃ】
2020178701.tif 000035
【図６Ａ】
2020178701.tif 000036
【図６Ｂ】
2020178701.tif 000037
【図６Ｃ】
2020178701.tif 000038
【図６Ｄ】
2020178701.tif 000039
【図７Ａ】
2020178701.tif 000040
【図７Ｂ】
2020178701.tif 000041
【図７Ｃ】
2020178701.tif 000042
【図８Ａ】
2020178701.tif 000043
【図８Ｂ】
2020178701.tif 000044
【図９Ａ】
2020178701.tif 000045
【図９Ｂ】
2020178701.tif 000046
【配列表】
2020178701000001.app
【外国語明細書】
2020178701000001.pdf