(57)【要約】【課題】体細胞の再プログラミングの提供。【解決手段】本開示は、１つまたは複数の体細胞（例えば、部分的に分化した体細胞または完全分化／最終分化した体細胞）をより低い分化状態（例えば、多能性状態または多分化能状態）に再プログラミングする方法に関する。さらなる実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞、かかる細胞の使用、および体細胞の再プログラミングに有用な薬剤の同定方法に関する。本発明は、選択マーカーの発現が、マーカーが連結する内因性多能性遺伝子の発現と実質的に適合するような様式で１つまたは複数の内因性多能性遺伝子が選択マーカーに作動可能に連結する操作された体細胞を提供する。【選択図】図１
2020014479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞を多能性細胞へ再プログラミングする方法であって、該方法は、
（ａ）該Ｂ細胞を、外因的に導入されたＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ、およびＣ／ＥＢＰαと接触させる工程、ならびに
（ｂ）該細胞を、細胞増殖に適切な条件下で該細胞の再プログラミングを開始するのに十分な期間維持する工程
を含み、ここで、該再プログラミングされた細胞が、（ｉ）内因性Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｉｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｉｉｉ）内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーを含まない、方法。
【請求項２】
外因性Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ、およびＣ／ＥＢＰαポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、前記Ｂ細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外因性Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ、およびＣ／ＥＢＰαポリヌクレオチドが、前記細胞に導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外因的に導入されたポリヌクレオチドが、ｃ−Ｍｙｃをコードしない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記外因的に導入されたポリヌクレオチドが、トランスフェクションによって導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記外因的に導入されたポリヌクレオチドが、ウイルス感染によって導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記外因的に導入されたポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを機能的に不活化する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞における部位特異的リコンビナーゼを導入することまたは前記細胞における部位特異的リコンビナーゼを発現させることによって前記外因的に導入されたポリヌクレオチドの少なくとも一部を切り出す工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）が、５−アザ−シチジン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、およびバルプロ酸からなる群から選択される再プログラミング薬で前記細胞を維持する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記再プログラミング薬で培養された前記細胞の少なくとも５０％が、ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記再プログラミング薬で培養された前記細胞が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩの発現を少なくとも５０％減少させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞が、最終分化Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法から得られた単離されたヒト多能性細胞の精製調製物。
【請求項１４】
前記細胞が、遺伝的に改変されていない、請求項１３に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１５】
前記細胞が、少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１３に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１６】
前記細胞が、細胞療法を必要とする個体に対して自源性または異質遺伝子性である、請求項１３に記載の細胞の精製調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／０３６，０６５号、２００７年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９５９，３４１号、および２００７年４月７日に出願された米国仮特許出願第６０／９２２，１２１号の利益を主張する。これらの出願の明細書は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本願は、全体または一部において、国立衛生研究所からの補助金第５−ＲＯ１−ＨＤＯ４５０２２号、同第５−Ｒ３７−ＣＡ０８４１９８号および同第５−ＲＯ１−ＣＡ０８７８６９号により支援された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
胚発生および細胞分化は一方向性の経路と考えられている。これは、細胞が細胞運命の決定中に発生能を段階的に喪失するからである。以下の多能性幹細胞の２つのカテゴリーが現在公知である：胚性幹細胞および胚性生殖細胞。胚性幹細胞は、胚に直接由来する多能性幹細胞である。胚性生殖細胞は、中絶胎児の胎児組織に直接由来する多能性幹細胞である。簡潔にするために、胚性幹細胞および胚性生殖細胞を、本明細書中で集合的に「ＥＳ」細胞という。
【０００４】
哺乳動物種における体細胞核移植（ＳＣＮＴ）実験の成功により、分化した成体細胞の後成的状態は固定していないが、卵母細胞の細胞質中に存在する因子による再プログラミングには依然として柔軟であることが証明された（Ｂｙｒｎｅら，２００７；Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，２００８；Ｗａｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，２００１）。しかし、ヒト体細胞をクローン化する試みに関連する非効率および倫理上の懸念が、卵母細胞を用いずに核再プログラミングするための代替法の研究分野に拍車をかけている（Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，２００８）。実際、体細胞の胚性癌細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞への融合により、体細胞ゲノムが後成的にリセットされるが、これには４Ｎ多能性細胞の生成が含まれ、かかる細胞の潜在的治療用途は限られている（Ｃｏｗａｎら，２００５；Ｔａｄａら，２００１）。
【０００５】
それにもかかわらず、ＥＳ細胞との融合による体細胞の再プログラミングにより、ＥＳ細胞が、卵母細胞の細胞質と同様に、核再プログラミングを誘導することができる因子を含むことが示唆された。重要な功績はＹａｍａｎａｋａ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓによって達成され、彼らは４つの転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの形質導入による線維芽細胞の誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞への直接再プログラミングに成功した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。最初に得られたｉＰＳ細胞は正常でなかったが、いくつかのグループが胚由来のＥＳ細胞と後成的および発生的に識別不可能なｉＰＳ細胞の生成によって直接再プログラミング技術を何度か進歩させた（Ｍａｈｅｒａｌｉ，２００７；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら，２００７；Ｏｋｉｔａら，２００７；Ｗｅｒｎｉｇら，２００７）。さらに、ｃ−Ｍｙｃのトランスジェニック発現は再プログラミングに重要でないことが見出されたが、再プログラミング効率を加速および増強させた（Ｎａｋａｇａｗａら，２００８；Ｗｅｒｎｉｇら，２００８）。最後に、ヒトｉＰＳ細胞を定義された因子の体細胞への形質導入によって生成することができることも示されている（Ｐａｒｋら，２００８；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｙｕら，２００７）。
【０００６】
今まで行われた研究にもかかわらず、定義した因子を使用して最終的に分化した細胞を多能性に再プログラミングすることができるかどうか、または、体性幹細胞などの少ししか分化していない細胞が多能性への核再プログラミングを受けることができるのかどうかについては依然として知られていない。さらに、ドナー細胞の進行性分化がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再プログラミング効率に影響を及ぼすかどうかは不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、選択マーカーの発現が、マーカーが連結する内因性多能性遺伝子の発現と実質的に適合するような様式で１つまたは複数の内因性多能性遺伝子が選択マーカーに作動可能に連結する操作された体細胞を提供する。本発明はまた、これらの操作された体細胞を含むトランスジェニックマウスを提供する。
【０００８】
本発明はまた、体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする方法を提供する。一定の方法では、本発明の操作された体細胞を、薬剤で処理する。次いで、選択マーカーを発現する細胞を選択し、多能性について評価する。薬剤での処理は、クロマチン構造を変化させる薬剤との細胞の接触であり得るか、少なくとも１つの多能性遺伝子との細胞のトランスフェクションであり得るか、その両方であり得る。
【０００９】
本発明は、さらに、体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法を提供する。一定の方法では、上記の操作された体細胞を、候補薬と接触させる。次いで、選択マーカーを発現する細胞を選択し、多能性の特徴について評価する。多能性の特徴の少なくともサブセットの存在は、薬剤が体細胞を低分化状態に再プログラミングすることができることを示す。次いで、本発明によって同定された薬剤を使用して、体細胞の薬剤との接触によって体細胞を再プログラミングすることができる。
【００１０】
本発明はまた、体細胞中の少なくとも１つの内因性多能性遺伝子を発現させる遺伝子を同定する方法を提供する。一定の方法では、操作された体細胞を、ＥＳ細胞などの多能性細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトする。次いで、適切な選択マーカーを発現する細胞を選択し、適切な内因性多能性遺伝子の発現を試験する。内因性多能性遺伝子の発現は、細胞中でのその発現によって内因性多能性遺伝子が直接または間接的に発現するタンパク質をｃＤＮＡがコードすることを示す。
【００１１】
本発明は、遺伝的に改変されていない体細胞から再プログラミングされた体細胞を誘導する方法を提供する。本発明は、遺伝子選択を使用しないか、いくつかの実施形態では、化学的選択を使用しないで再プログラミングされた体細胞を誘導する方法を提供する。再プログラミングされた体細胞は、例えば、再プログラミング薬の非操作体細胞への導入および／または非操作体細胞中でのかかる薬剤の発現ならびに細胞内に外因性遺伝子材料が存在する必要がない種々の方法のうちのいずれかによる再プログラミングされた細胞の選択によって本発明の非操作体細胞に由来する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本方法は、再プログラミングされない体細胞集団から再プログラミングされた体細胞を同定するための形態学的基準を使用する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＳ様状態に再プログラミングされないか部分的にのみ再プログラミングされた細胞集団からＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定するための形態学的基準を使用する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくともいくつかの再プログラミングされた体細胞を含む細胞集団から少なくともいくつかの再プログラミングされない体細胞を排除するための補体媒介溶解を使用する。
【００１４】
本発明は、さらに、かかる治療を必要とする個体の容態を治療する方法を提供する。一定の実施形態では、体細胞を個体から得て、細胞が所望の細胞型に発生するのに適切な条件下において本発明の方法によって再プログラミングする。次いで、所望の細胞型の再プログラミングされた細胞を回収し、個体に導入して容態を処置する。一定のさらなる実施形態では、個体から得た体細胞は、１つまたは複数の遺伝子に変異を含む。これらの例では、一定の実施形態では、個体から得た体細胞を、最初に、１つまたは複数の正常な遺伝子を細胞に戻し、その結果得られた細胞が正常な内因性遺伝子を保有するように処置し、次いで、個体に導入するように本方法を修正する。
【００１５】
一定のさらなる実施形態では、個体から得た体細胞を、その個体からの除去後に１つまたは複数の遺伝子が発現するように操作する。細胞を、遺伝子または遺伝子を含む発現かセットの細胞への導入によって操作することができる。遺伝子またはその一部を、部位特異的リコンビナーゼ部位に隣接させることができる。
【００１６】
遺伝子は、再プログラミングされた細胞の同定、選択、および／または生成に有用な遺伝子であり得る。一定の実施形態では、遺伝子は、細胞内のＤＮＡメチル化を減少させる発現産物をコードする。例えば、遺伝子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ、または３ｂ（Ｄｎｍｔ１、３ａ、３ｂ）の発現を干渉するＲＮＡをコードすることができる。ＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはミクロＲＮＡ前駆体であり得る。一定の実施形態では、ＲＮＡは、細胞内でプロセシングされてＤｎｍｔ１、３ａ、または３ｂの発現を阻害する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が得られる前駆体である。一定の実施形態では、遺伝子は、正の選択および負の選択に使用可能なマーカーをコードする。
【００１７】
一定の実施形態では、遺伝子は、再プログラミングされた状態の開始および／または維持に寄与する遺伝子である。一定の実施形態では、遺伝子は、その発現産物が再プログラミングされた状態の開始に寄与する（一定の実施形態では、再プログラミングされた状態の維持に必要である）が、再プログラミングされた状態の維持に重要でない遺伝子である。これらの例では、一定の実施形態では、本方法は、再プログラミング後に操作された細胞を処置して遺伝子発現を減少または排除する工程を含む。再プログラミングされた細胞が再プログラミング後にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分化する方法では、遺伝子発現を減少または排除する処置を、再プログラミングした細胞が分化する前または後に行うことができる。処置は、例えば、細胞中のリコンビナーゼの導入または発現によって導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含み得る。一定の実施形態では、遺伝子は、その発現産物が再プログラミングされた状態の維持に寄与する（一定の実施形態では、再プログラミングされた状態の維持に必要である）が、一旦再プログラミングされた細胞が所望の細胞型に分化すると重要でない遺伝子である。これらの実施形態では、本方法は、操作された再プログラミングされた細胞をその分化後に処置して遺伝子発現を減少または排除する工程を含むことができる。
【００１８】
一定の他の実施形態では、本発明の方法を使用して、機能器官を必要とする個体を処置することができる。本方法では、機能器官を必要とする個体から体細胞を得て、本発明の方法によって再プログラミングして再プログラミングされた体細胞を産生する。次いで、かかる再プログラミングされた体細胞を、再プログラミングされた体細胞の所望の器官への発生に適切な条件下で培養し、次いで、個体に導入する。本方法は、以下の容態のいずれか１つの治療に有用である：神経学的容態、内分泌容態、構造的容態、骨の容態、血管の容態、泌尿器の容態、消化管の容態、外皮の容態、血液の容態、自己免疫性の容態、炎症容態、または筋肉の容態。
【００１９】
本発明はまた、クローン化した動物を産生する方法を提供する。本方法では、所望の特徴を有する動物から体細胞を得て、本発明の方法を使用して再プログラミングし、１つまたは複数の再プログラミングされた多能性体細胞（「ＲＰＳＣ」）を産生する。次いで、ＲＰＳＣをレシピエント胚に挿入し、得られた胚を培養して、レシピエント雌への移植に適切なサイズの胚を産生し、次いで、レシピエント雌に移入して妊娠した雌を得る。妊娠した雌を、胚を出産予定日まで保有するのに適切な条件下で維持してキメラ動物の子孫を産生し、次いで、野生型動物と交配してクローン化した動物を得る。
【００２０】
一定の実施形態では、あるいは、ＲＰＳＣを、さらなるクローニングに使用するために凍結保存することができる。一定の他の実施形態では、標的変異などの遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を、レシピエント胚への挿入前にＲＰＳＣに導入することができる。
【００２１】
本発明はまた、クローン化したトリを産生する方法を提供する。本方法では、所望の特徴を有するトリから体細胞を単離し、本発明の方法を使用して再プログラミングして、１つまたは複数の再プログラミングされた多能性体細胞（「ＲＰＳＣ」）を産生する。次いで、ＲＰＳＣを胚に発生できない卵に挿入し、次いで、得られた卵をインキュベートしてＲＰＳＣの遺伝子型を有するトリ子孫を産生し、それにより、クローン化したトリを産生する。
【００２２】
上記の全ての実施形態を本発明の全ての異なる態様に適用可能であると認識される。必要に応じて任意の上記実施形態を１つまたは複数の他のかかる実施形態と自由に組み合わせることができることも意図する。
【００２３】
本明細書中に記載のように、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ）のトランスジェニック発現および誘導発現を使用して、マウスＢリンパ球を再プログラミングした。これらの因子は、Ｂ細胞受容体が部分的な再構成を受けた非最終分化Ｂ細胞を多能性状態に変換するのに十分であった。成熟Ｂ細胞の再プログラミングには、骨髄転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）（Ｂ細胞同一性を維持する転写状態を妨害する能力について公知）のさらなる異所性発現が必要であった。複数のｉＰＳ株は、非完全分化および完全分化した成熟Ｂリンパ球の両方にクローン的に由来し、このｉＰＳ株は、成体キメラを生じ、四倍体胚盤胞に注射した場合に後期胚を生じ、生殖系列に寄与した。本明細書中に記載の作業により、最終分化した成体細胞の多能性への直接核再プログラミングについての決定的証拠が得られる。
【００２４】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、分化した体細胞を細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬と接触させる工程、細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの再プログラミング薬の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始に十分な期間維持する工程、および少なくとも１つの再プログラミング薬を機能的に不活化する工程を含む、方法に関する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程を含む、方法に関する。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって、分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別または識別する工程を含む、方法に関する。１つの実施形態では、１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との区別または識別は、１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞の選択または富化および／または１つまたは複数の多能性のマーカーを示さない細胞の淘汰を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、分化した体細胞は、部分的に分化している。本発明の他の実施形態では、分化した体細胞は完全に分化している。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態では、分化した体細胞は造血分化系の細胞であり、いくつかの実施形態では、分化した体細胞は末梢血から得る。本発明の１つの実施形態では、分化した体細胞は免疫系細胞である。１つの実施形態では、分化した体細胞はマクロファージである。１つの実施形態では、分化した体細胞はリンパ球系細胞である。本発明の他の実施形態では、分化した体細胞は、Ｂ細胞（未熟（例えば、プロＢ細胞またはプレＢ細胞）または成熟（例えば、非ナイーブ）Ｂ細胞など）である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子はポリヌクレオチドである。他の実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子はポリペプチドである。１つの実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択される。本発明の特定の実施形態では、分化した体細胞は、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ−４、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む。
【００３０】
本発明の１つの実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択され、分化した体細胞は、分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子は、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される。本発明の１つの実施形態では、分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子は、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ベクター（例えば、誘導ベクターまたは条件的に発現されるベクター）を使用して導入する。１つの態様では、少なくとも１つの外因的に導入した因子を、メチル化媒介サイレンシングに供さないベクターを使用して導入する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）を使用して導入する。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持するか、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、内因性多能性遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびその組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、内因性多能性遺伝子を、選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子または発光マーカーなど）と同時発現する。特定の実施形態では、分化した体細胞は、少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、分化した体細胞は、Ｏｃｔ４遺伝子座、Ｎａｎｏｇ遺伝子座、またはＯｃｔ４遺伝子座、およびＮａｎｏｇ遺伝子座の両方に選択遺伝子を含む。一定の実施形態では、少なくとも１つの外因的に導入した因子を誘導ベクターを使用して導入し、少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程は、細胞が維持される条件をベクターの誘導発現に不適切にすることを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態では、多能性のマーカーは、多能性遺伝子の発現、その発現が多能性遺伝子の発現の直接または間接的な結果である遺伝子の発現、アルカリホスファターゼの発現、ＳＳＥＡ１の発現、ＳＳＥＡ３の発現、ＳＳＥＡ４の発現、ＴＲＡＦ−６０の発現、Ｎａｎｏｇの発現、Ｏｃｔ４の発現、Ｆｘｂ１５の発現、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態学、出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、２つの活性なＸ染色体の存在、ＤＮＡメチル化に対する耐性、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００３５】
本発明はまた、本発明の方法よる再プログラミングされた分化した体細胞に由来する単離多能性細胞に関する。特に、本発明は、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団に関する。
【００３６】
本発明は、さらに、（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、（ｂ）細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞を示さない細胞と区別する工程を含む方法によって産生された単離多能性細胞に関する。
【００３７】
本発明はまた、（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、（ｂ）細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団に関する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、体細胞から多能性細胞を産生する方法であって、（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、（ｂ）１つまたは複数の細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始または少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、（ｅ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、（ｆ）キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、（ｇ）１つまたは複数の体細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始または少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との間で区別する工程を含む、方法に関する。特定の実施形態では、本方法により、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団が得られる。
【００３９】
本発明はまた、（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、（ｂ）１つまたは複数の細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始または少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、（ｅ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、（ｆ）キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、（ｇ）１つまたは複数の体細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された単離多能性細胞に関する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、本方法により、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の多能性細胞を含む精製体細胞集団が得られる。特定の実施形態では、多能性細胞は遺伝的に同種である。
【００４１】
本発明はまた、（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、（ｂ）１つまたは複数の細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始または少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、（ｅ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、（ｆ）キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、（ｇ）１つまたは複数の体細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングの開始または少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団に関する。
【００４２】
本発明はまた、分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、（ｂ）細胞を、細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程を含む、方法を含む。本方法の１つの実施形態では、誘導ベクターをメチル化誘導サイレンシングに供さない。
【００４３】
本発明はまた、（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、（ｂ）細胞を、細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した免疫細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製免疫細胞集団に関する。
【００４４】
本発明はまた、再プログラミング薬を同定する方法であって、（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、外因的に導入した各因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入し、その発現を異なるインデューサーによって誘導される調節エレメントによって調節する、準備する工程、（ｂ）１つまたは複数の細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングまたは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、（ｅ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、（ｆ）キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、（ｇ）１つまたは複数の体細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で維持する工程であって、少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性のみでは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に不十分である、維持する工程、（ｈ）（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触させる工程、および（ｉ）１つまたは複数の多能性を示す１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触した細胞を同定する工程であって、（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の多能性のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング薬を再プログラミング薬と同定する、同定する工程を含む方法に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性であるかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性を示す場合、前記候補再プログラミング薬は再プログラミング薬として同定される、決定する工程を含む、方法。
（項目２）  ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を維持する工程および前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が生存するかどうかを決定する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）  ゲノムＤＮＡのメチル化を減少させるように細胞を処理する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を阻害する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記細胞をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する薬剤と接触させる工程を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）  前記細胞中の干渉ＲＮＡの発現を逆に誘導する工程であって、前記干渉ＲＮＡがＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、誘導する工程を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）  前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩである、項目４に記載の方法。
（項目８）  前記細胞のゲノムＤＮＡ中のメチル化ＣｐＧ配列の平均数を少なくとも１０％減少させるように前記細胞を処理する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）  前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）  前記細胞中のＤＮＭＴ１メチルトランスフェラーゼ活性の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）  ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を適切な期間維持する工程であって、前記期間後の生細胞の存在数が、薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多いことは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、維持する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）  前記期間が５日間と３０日間との間である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）  前記期間後の生細胞の存在が細胞を薬剤と接触させなかった場合の少なくとも２倍であることは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、項目１２に記載の方法。
（項目１５）  前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合、前記細胞の少なくとも８０％は２０日後に増殖を停止するか死滅すると予想される、項目１に記載の方法。
（項目１６）  前記細胞がヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１７）  前記細胞が有糸分裂終了していない、項目１に記載の方法。
（項目１８）  体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を項目１に記載の方法にしたがって同定された再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性の増加以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかかどうかを決定し、前記特徴を示す場合、候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
（項目１９）  さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力；（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日（ｔｅｒｍ）まで生存するキメラの形成に関与する能力からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）  前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を準備する工程であって、前記体細胞の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＤＮＡ脱メチル化耐性である細胞を選択し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
（項目２２）  工程（ｂ）で選択された細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  前記体細胞が外因的に導入した多能性遺伝子を発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）  前記方法が細胞を再プログラミング薬と接触させる工程を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）  細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）  前記体細胞が内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにターゲティングしたＲＮＡｉ薬を可逆的に発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２７）  選択された体細胞中のＲＮＡｉ薬の発現を阻害し、それにより、選択された体細胞のゲノムＤＮＡがメチル化されるようになる工程をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）  ２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２９）  ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目３０）  前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）  ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ脱メチル化に感受性である体細胞を準備する工程、
（ｂ）体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処置に前記細胞を供する工程、
（ｃ）細胞を処置してゲノムＤＮＡのメチル化を減少させる工程、
（ｄ）培養物中の細胞を一定期間維持する工程、および
（ｅ）前記期間後に生存する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増大する細胞を同定する工程
を含む、方法。
（項目３２）  工程（ｅ）で同定された前記細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、項目３１に記載の方法。
（項目３３）  工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）  工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が細胞を遺伝子でトランスフェクトすることを含み、前記遺伝子が任意選択的に多能性遺伝子である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）  前記処置が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子で前記細胞をトランスフェクトする工程を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３６）  細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３７）  ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３８）  前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）  ２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目４０）  ＥＳ様状態に再プログラミングした体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、前記細胞集団の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされており、前記細胞が、選択マーカーの発現が内因性多能性遺伝子の発現に実質的に適合するような様式で、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含む、準備する工程、および
（ｂ）選択マーカーを発現する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する工程
を含む、方法。
（項目４１）  前記内因性多能性遺伝子がＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）  ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態学的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４３）  工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４４）  単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）少なくとも１つの遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有し、（ｄ）外因的に導入した多能性遺伝子または内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーを発現しない、精製調製物。
（項目４５）  少なくとも５０％の細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性をである、項目４４に記載の細胞の精製調製物。
（項目４６）  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩ発現が少なくとも５０％減少する条件下で前記細胞が生存する、項目４４に記載の細胞の精製調製物。
（項目４７）  前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、項目４４に記載の精製調製物。
（項目４８）  再プログラミングされた体細胞を生成する方法であって、
（ａ）体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞は、前記細胞が（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性であり、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化する、ＥＳ様状態に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
（項目４９）  前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）  工程（ｂ）が、前記細胞中への部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞中の部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５１）  体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性である、準備する工程、
（ｂ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｃ）培養物中で前記細胞を維持する工程、
（ｄ）前記培養物中で前記候補薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する、決定する工程
を含む、方法。
（項目５２）  前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）選択マーカーを発現しない細胞を選択し、それにより、選択マーカー遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択した体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性なままである場合に予想されるよりも多数の細胞が選択マーカーを発現するかどうかを決定し、それにより、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｅ）候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合、前記候補薬を再プログラミング薬と同定する工程
を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）  前記方法が、細胞を候補再プログラミング薬と接触させた後に選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性Ｘ染色体が再活性化された細胞を選択する工程を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）  前記選択マーカーが正の選択および負の選択に適切である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）  工程（ｂ）が選択マーカーの機能的形態を発現する細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含み、工程（ｄ）が選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５６）  前記遺伝子が、Ｘ染色体上に存在する内因性遺伝子である、項目５２に記載の方法。
（項目５７）  前記遺伝子がヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする、項目５２に記載の方法。
（項目５８）  前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠くＸ染色体が前記遺伝子を不活化する操作された遺伝子の変化を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５９）  前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が、その発現を選択することができる第１の選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子およびその発現を選択することができる第２の選択マーカー遺伝子の機能的形態を含み、前記Ｘ染色体の他方が各前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠く、準備する工程、
（ｂ）前記第１の選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞を選択し、それにより、機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）前記第２の選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性なＸ染色体を再活性化した細胞を選択する工程、
（ｅ）前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が不活性なＸ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｆ）前記候補再プログラミング薬が細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する工程
を含む、項目５１に記載の方法。
（項目６０）  体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに適切な再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を項目５１に記載の方法にしたがって同定した再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかどうかを決定して、前記特徴を示す場合、前記候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
（項目６１）  さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する細胞の能力からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、その一方が不活性である、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）不活性なＸ染色体が活性になった細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
（項目６３）  前記方法が、前記細胞を評価して前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）  工程（ｂ）が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）  工程（ｂ）が、前記細胞を多能性遺伝子でトランスフェクトする工程を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６６）  前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、項目６２に記載の方法。
（項目６７）  前記選択マーカー遺伝子が内因性遺伝子である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）  前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６９）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記細胞の不活性なＸ染色体が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記活性なＸ染色体が前記マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になり、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目７０）  前記選択マーカー遺伝子が、前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）  前記選択マーカー遺伝子がＨＰＲＴをコードする、項目６９に記載の方法。
（項目７２）  前記活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の非機能的対立遺伝子を含み、前記非機能的対立遺伝子が前記対立遺伝子を不活化する変異または操作された変化を有する、項目６９に記載の方法。
（項目７３）（ｉ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｉｉ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む細胞を選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｉｖ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になった細胞を選択する工程
を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７４）  前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記方法が、
（ａ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、第１のＸ染色体が転写的に不活性である細胞集団を得る工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、
（ｃ）前記第１のＸ染色体上の選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、前記第２のＸ染色体が転写的に活性である細胞を選択する工程
を含む、項目６２に記載の方法。
（項目７５）  前記選択マーカー遺伝子が前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）  工程（ｃ）が部位特異的リコンビナーゼを使用して選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７７）  体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量を決定する工程であって、コントロールと比較した場合、ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量の増加が、候補薬が再プログラミング薬であることを示す、決定する工程
を含む、方法。
（項目７８）  ＥＳ様状態に再プログラミングした可能性が増加する体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）細胞の化学的選択に有用な遺伝子改変を含まない体細胞を準備する工程であって、前記細胞の少なくともいくつかが、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程
を含む、方法。
（項目７９）  前記体細胞が遺伝的に改変されていない、項目７８に記載の方法。
（項目８０）  準備した前記体細胞が、前記細胞の化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、項目７８に記載の方法。
（項目８１）  準備した前記体細胞が、前記細胞の遺伝的または化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、項目７８に記載の方法。
（項目８２）  前記体細胞が、少なくとも１つの外因的に導入した再プログラミング薬を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８３）  前記外因的に導入した再プログラミング薬が、タンパク質形質導入または前記タンパク質をコードする構築物の一過性トランスフェクションによって導入されたタンパク質である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）  工程（ａ）の体細胞が、１つまたは複数の外因的に導入した多能性遺伝子またはかかる遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８５）  前記体細胞がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの非内因性タンパク質を含むか発現する、項目７８に記載の方法。
（項目８６）  工程（ａ）の体細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８７）  工程（ａ）の少なくともいくつかの細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、項目７８に記載の方法。
（項目８８）  選択された前記細胞が、以下の特徴：（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現、（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現、および（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力の少なくとも３つを示す、項目７８に記載の方法。
（項目８９）  前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＴＲＡＦ−６０からなる群から選択される、項目８８に記載の方法。
（項目９０）  同定された前記細胞を１つまたは複数の選択工程に供して、ＥＳ様細胞をＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞から分離する工程をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目９１）  前記１つまたは複数の選択工程が、
（ａ）ＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞を溶解するのに十分な補体成分の存在下での細胞の補体媒介溶解に耐性を示す細胞を選択する工程、
（ｂ）体細胞ではなくＥＳ細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現に基づいた細胞選別工程、
（ｃ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性である細胞を選択する工程、
（ｄ）２つの活性なＸ染色体を有する細胞を選択する工程、および
（ｅ）前記コロニーを継代またはサブクローニングする工程、および前記コロニーの細胞の子孫からＥＳ様形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程から選択される、項目９０に記載の方法。
（項目９２）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程
を含む、方法。
（項目９３）  前記細胞のコロニー由来の細胞または少なくともいくつかの細胞を、かかる形態を欠く集団中の他の細胞と区別する工程をさらに含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）  工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９５）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の再プログラミング薬を細胞に導入する工程であって、前記再プログラミング薬が前記細胞の少なくともいくつかをＥＳ様状態に再プログラミングするのに十分である、導入する工程、
（ｂ）前記細胞を、ＥＳ様細胞を含むコロニーが発生するのに適切な期間培養物中で維持する工程、および
（ｃ）化学的選択または遺伝的選択を使用せずにＥＳ様細胞の少なくとも１つのかかるコロニーを同定する工程
を含む方法。
（項目９６）  工程（ａ）が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を細胞に導入することを含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）  ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、
（ｂ）（ｉ）細胞溶解に十分な補体成分および（ｉｉ）ＥＳ様状態に再プログラミングしない体細胞の細胞表面に存在するが、ＥＳ細胞によって存在しないか有意でないレベルで発現するマーカーに特異的に結合する補体結合抗体の存在下にて培養物中で前記細胞を維持する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）を生存する細胞を単離する工程
を含む、方法。
（項目９８）  前記マーカーがＭＨＣクラスＩ抗原である、項目９７に記載の方法。
（項目９９）  前記有意でないレベルが、体細胞の型と同型の生物由来の線維芽細胞によって発現される平均レベルの１０倍より小さい、項目９７に記載の方法。
（項目１００）  単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、精製調製物。
（項目１０１）  前記細胞が遺伝的に改変されていない、項目１００に記載の細胞の精製調製物。
（項目１０２）  前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、項目１００に記載の細胞の精製調製物。
（項目１０３）  再プログラミングされた体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）前記細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子またはタンパク質を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞が、（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示し、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化するＥＳ様状態に前記細胞が再プログラミングされている、準備する工程、
（ｂ）遺伝的選択または化学的選択を使用せずにＥＳ様細胞を単離する工程、および
（ｃ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
（項目１０４）  前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子またはこれらのタンパク質を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）  工程（ｂ）が、前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）  再プログラミングされた細胞を誘導する方法であって、（ｉ）遺伝的に改変されていない細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に部分的または完全に再プログラミングされている、準備する工程、（ｉｉ）補体媒介溶解を使用して部分的または完全に再プログラミングされた細胞を富化して、少なくともいくつかの非再プログラミング細胞を排除する工程、および（ｉｉｉ）形態的基準を使用して、再プログラミングされた細胞またはかかる細胞を含むコロニーを同定する工程を含む、方法。
（項目１０７）  体細胞が、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、ＥＳ様状態に再プログラミングされた単離体細胞。
（項目１０８）  前記細胞が遺伝的に改変されない、項目１０７に記載の単離体細胞。
（項目１０９）  少なくとも９０％の細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされており、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、精製体細胞集団。
（項目１１０）  前記細胞が遺伝的に改変されていない、項目３２に記載の精製体細胞集団。
（項目１１１）  準備した前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）、霊長類、またはヒトから得る、項目７８に記載の方法。
（項目１１２）  前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット、霊長類、またはヒトから得る、項目１０９に記載の精製体細胞集団。
（項目１１３）  分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞を前記細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの再プログラミング薬の活性に適切な条件下で前記細胞の再プログラミングの開始に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの再プログラミング薬を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
（項目１１４）  分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
（項目１１５）  多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む、方法。
（項目１１６）  前記分化した体細胞が部分的に分化している、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１１７）  前記分化した体細胞が完全に分化している、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１１８）  前記分化した体細胞が造血性系列細胞である、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１１９）  前記分化した体細胞を末梢血から得る、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１２０）  前記分化した体細胞が免疫系細胞である、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１２１）  前記分化した体細胞がマクロファージである、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１２２）  前記分化した体細胞がリンパ球系細胞である、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１２３）  前記分化した体細胞がＢ細胞である、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１２４）  前記部分的に分化した細胞が未熟Ｂ細胞である、項目１１６に記載の方法。
（項目１２５）  前記未熟Ｂ細胞がプレＢ細胞またはプロＢ細胞である、項目１１６に記載の方法。
（項目１２６）  前記完全に分化した細胞が成熟Ｂ細胞である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２７）  前記完全に分化した細胞が非ナイーブ成熟Ｂ細胞である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２８）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１２９）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１３０）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１３１）  前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ−４を含む、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１３２）  前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１３３）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択され、前記分化した体細胞が、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１３４）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３６）  前記分化した体細胞が外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２  およびＫｌｆ−４を含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１３７）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、項目１３６に記載の方法。
（項目１３９）  前記分化した体細胞が、外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１４０）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、項目１３９に記載の方法。
（項目１４２）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１４３）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１３６に記載の方法。
（項目１４４）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１３９に記載の方法。
（項目１４５）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、項目１３３に記載の方法。
（項目１４６）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、項目１３６に記載の方法。
（項目１４７）  前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、項目１３９に記載の方法。
（項目１４８）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１４９）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、誘導ベクターまたは条件的に発現されるベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５０）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、メチル化媒介サイレンシングに供さないベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５１）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ウイルスベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５２）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レトロウイルスベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５３）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レンチウイルスベクターを使用して導入する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５４）  前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、項目１１８に記載の方法。
（項目１５５）  前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、項目１２３に記載の方法。
（項目１５６）  前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、項目１１８に記載の方法。
（項目１５７）  前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、項目１２３に記載の方法。
（項目１５８）  前記内因性多能性遺伝子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１５９）  前記内因性多能性遺伝子が、選択マーカーと同時発現する、項目１１４または項目１１５に記載の方法。
（項目１６０）  前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子または発光マーカーである、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）  前記分化した体細胞が、前記少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１６２）  前記分化した体細胞が、Ｏｃｔ４遺伝子座中、Ｎａｎｏｇ遺伝子座中、またはＯｃｔ４遺伝子座中およびＮａｎｏｇ遺伝子座中の両方に選択遺伝子を含む、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１６３）  前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を誘導ベクターを使用して導入し、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程が、前記細胞が維持される条件を前記ベクターの誘導発現に不適切にすることを含む、項目１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
（項目１６４）  前記少なくとも１つの多能性のマーカーが、多能性遺伝子の発現、その発現が多能性遺伝子の発現の直接または間接的な結果である遺伝子の発現、アルカリホスファターゼの発現、ＳＳＥＡ１の発現、ＳＳＥＡ３の発現、ＳＳＥＡ４の発現、ＴＲＡＦ−６０の発現、Ｎａｎｏｇの発現、Ｏｃｔ４の発現、Ｆｘｂ１５の発現、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態、出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、２つの活性なＸ染色体の存在、ＤＮＡメチル化に対する耐性、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１１５に記載の方法。
（項目１６５）  再プログラミングされた分化した体細胞に由来する単離多能性細胞。
（項目１６６）  再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。  
（項目１６７）  （ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞を示さない細胞と区別する工程
を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
（項目１６８）（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
（項目１６９）  体細胞から多能性細胞を産生する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との間で区別する工程
を含む、方法。
（項目１７０）（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
（項目１７１）  （ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
（項目１７２）  分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む、方法。
（項目１７３）  前記誘導ベクターがメチル化誘導サイレンシングに供されない、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した免疫細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製免疫細胞集団。
（項目１７５）  再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した各因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入し、その発現を異なるインデューサーによって誘導される調節エレメントによって調節する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で前記細胞を再プログラミングするか少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で維持する工程であって、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性のみでは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に不十分である、維持する工程、
（ｈ）（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｉ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す前記１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触した細胞を同定する工程であって、（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の多能性のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング薬を再プログラミング薬と同定する、同定する工程
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、誘導性Ｏｃｔ４対立遺伝子の略図である。第１の組込みベクターである誘導性Ｏｃｔ４組込みベクターは、テトラサイクリン−誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｐ）によって駆動するＯｃｔ４遺伝子を含む。Ｔｅｔ−Ｏｐ−Ｏｃｔ４カセットは、５’でスプライスアクセプターダブルポリＡシグナル（ＳＡ−ｄｐＡ）と隣接し、３’でＳＶ４０ポリＡテール（ＳＶ４０−ｐＡ）と隣接している。第２の組込みベクターであるテトラサイクリンアクチベーター組込みベクターは、野生型アクチベーターよりもドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導に応答するテトラサイクリンアクチベーターの変異形態（Ｍ２−ｒｔＴＡ）を含む（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１４）：７９６３  ２０００））。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ選択ｉＰＳ細胞の生成を示す。図２Ａに示すように、ＩＲＥＳ−ＧｆｐＮｅｏ融合カセットを、Ｏｃｔ４エクソン５のＢｃｌＩ部位顆粒に挿入する。正確にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、５’外側プローブ（５’ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ）を使用したＮｃｏＩ消化ＤＮＡのサザン分析によってスクリーニングした。Ｎａｎｏｇ遺伝子を、Ｍｉｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ  １１３（５）：６３１（２００３）に記載のようにターゲティングした。図２Ｂは、感染およびｎｅｏ選択の４週間後のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇｎｅｏ  ＭＥＦのＡＰ陽性コロニーおよび強いＳＳＥＡ１陽性コロニーの総数（左のスケール）および比率（右のスケール）を示す。
【図３】図３は、マウスＢ細胞分化系におけるＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃのトランスジェニック誘導発現、特に、Ｂ細胞分化系由来の再プログラミング細胞のために本研究で使用したストラテジーを示す略図を示す。
【図４】図４は、再プログラミング効率を測定するための実験の略図を示す。３×１０６個のＣＤ１９＋成体Ｂ細胞にＣ／ＥＢＰα−ＮｅｏＲ構築物をコードするレトロウイルスを感染させ、２４時間後、ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋成熟成体Ｂ細胞を分類し、ＯＰ９間質細胞株を予めプレートした９６ウェルプレート中に単一細胞としてプレートした。実験を通して、細胞を馴化培地＋Ｄｏｘ＋ＬＩＦ中で成長させた。６日目に、培養ウェルをピューロマイシンおよびネオマイシン選択に５日間供し、それにより、Ｃ／ＥＢＰαを感染させたトランスジェニックＢ細胞のみを成長させた。２０日目に、薬物耐性細胞を含むウェルを、ＦＡＣＳ分析によってＮａｎｏｇ−ＧＦＰ発現についてスクリーニングした。その後、陽性とスコアリングされたウェルを、ＥＳ培地中のＭＥＦ上で継代し、ｉＰＳ細胞株中で成長させた。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
体細胞核の別の細胞型への後成性のリワイヤリング（ｒｅｗｉｒｉｎｇ）の概念に関連する核再プログラミングを、異なるアプローチによって行うことができる。最近確立された体細胞を多能性に再プログラミングするためのストラテジーは、体細胞中の定義した転写因子の直接異所性発現を含む（Ｏｋｉｔａら，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ
Ｙａｍａｎａｋａ，２００６；Ｗｅｒｎｉｇら，２００７）。この因子発現の強制は、培養物中で比較的長期間にわたって起こる一連の確率的事象を開始するようであり、この事象により、最終的に、安定な多能性状態を獲得したほんのわずかな細胞が生成される（Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，２００８）。形質導入された因子は、再プログラミング過程の初期に必要であり（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，２００８）、その間に、この因子は内因性多能性遺伝子と相互作用し（Ｂｏｙｅｒら，２００５；Ｌｏｈら，２００６）、後成的変化を段階的に誘導し、その後に内細胞塊由来ＥＳ細胞の後成的状態と識別不可能な安定な後成的状態を維持することができる。この過程の間に、ｄｅ  ｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼであるＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂも活性化するようになり、同様に、ウイルス形質導入因子をメチル化およびサイレンシングする。外因性因子のサイレンシングは、ｉＰＳ細胞のその後の分化に不可欠である（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｗｅｒｎｉｇら，２００７；Ｓｔａｄｆｅｌｄら，２００８）。
【００４７】
Ｂ細胞分化系に沿った細胞の発生では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座中での連続的な固有の遺伝子ＤＮＡ再構成は、Ｂ細胞成熟の異なる連続した段階に遺伝的に印をつける（Ｊｕｎｇら，２００６）。プロＢ発生期の細胞は、免疫グロブリン再構成（Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、およびＪ（連結）遺伝子セグメントのアセンブリに関与する過程）を開始する。重鎖遺伝子座（ＩｇＨ）のアセンブリは、軽鎖遺伝子座（ＩｇＬ）のアセンブリに先行する（Ｊｕｎｇら，２００６）。さらに、ＩｇＨ遺伝子座の再構成は連続的であり、ＤＨとＪＨとの連結は、ＶＨセグメントとＤＨＪＨセグメントとの再構成前の両対立遺伝子上で起こる（Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕら，１９９７）。ＶＨ−ＤＨＪＨ可変遺伝子領域の産生的アセンブリは、次の段階への分化を直接シグナル伝達し、ここで、ＩｇＬ鎖は、一般にＩｇλの再構成に先行してＩｇκ再構成とアセンブリする（Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕら，１９９７）。産生的ＩｇＬ鎖の生成により、最終的に機能的な軽鎖および重鎖タンパク質が会合して、これらが共に細胞表面上にＢ細胞受容体を形成する。得られたＢ細胞は周囲に移動することができ、ここで同族抗原と遭遇した際に適切な免疫学的機能を発揮することができる（Ｓｃｈｌｉｓｓｅｌ，２００３）。
【００４８】
本明細書中に記載の作業では、異なる連続的に獲得された遺伝子「フィンガープリント」を保有するこの高秩序発生経路由来の細胞を使用した。フィンガープリントにより、各モノクローナルｉＰＳ株を生成することができるドナーＢ細胞核の発生段階を正確に遡及的に評価することができるであろう。特に、本明細書中に記載のように、ｉＰＳ細胞を、再プログラミング因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４での形質導入によってプロＢ細胞およびプレＢ細胞から生成し、Ｃ／ＥＢＰα（十分に特徴づけられた骨髄転写因子）のさらなる過剰発現によって成熟Ｂ細胞から生成した。この作業により、再プログラミングされた細胞がドナー非最終分化Ｂ細胞および成熟した最終分化したＢ細胞に特徴的な遺伝子再構成を有し、成体キメラマウスを生成して生殖系列に寄与することが示される。これらの結果は、再プログラミング因子の特定の組み合わせによって最終分化した細胞のゲノムを多能性状態にリセットすることができることを示す。
【００４９】
本明細書中に記載の作業により、成体マウスから得た最終分化した成熟Ｂ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＳ様細胞に直接再プログラミングすることができるという決定的な証拠が得られる。最終的に首尾よく再プログラミングされたドナーＢ細胞集団は、以下の後成的変化および遺伝子変化に関与する複雑な分化経路を完了した：造血性Ｂ細胞分化系およびその後のＢ細胞分化系への最初の関与；産生的な重鎖および軽鎖の再構成の獲得；成体マウスにおける末梢リンパ系器官を再配置するための骨髄からの脱出、および、得られた細胞株の１つで認められるように、抗原刺激に応答したＢ細胞受容体遺伝子の可変領域中の体細胞超変異の獲得。したがって、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰα転写因子の強い異所性発現により、完全分化したリンパ球系細胞の多能性への再プログラミングを、３０個の細胞中で約１個の細胞という比較的高頻度で誘導した。
【００５０】
重要なことには、本明細書中に記載の結果は、Ｂ細胞分化系におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子の類似の誘導レベル下で、非最終分化Ｂ細胞および最終分化したＢ細胞がこれらの因子と異なって応答することを証明する。完全分化した成熟Ｂリンパ球の多能性への強い再プログラミングは、Ｃ／ＥＢＰα転写因子（通常、顆粒球の細胞運命決定で役割を果たす）を最初に過剰発現した場合に達成された（Ｒａｍｊｉ  ａｎｄ  Ｆｏｋａ，２００２）。Ｔｈｏｍａｓ  Ｇｒａｆ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｘｉｅら，２００４）は、Ｃ／ＥＢＰαの過剰発現は、Ｐａｘ５機能の阻害によるＢ細胞後期特異的マーカー（例えば、ＣＤ１９）の下方制御および初期Ｂ細胞レギュレーター（ＥＢＦｌおよびＥ２Ａ転写因子）の消滅の促進によってＢ細胞をマクロファージ様細胞に変換することを示した。さらに、Ｃ／ＥＢＰαは、骨髄性転写ネットワーク成分の上方制御を誘導した（Ｌａｉｏｓａら，２００６；Ｘｉｅら，２００４）。これらの所見は、再プログラミング機構の理解に関連し、マウス成熟Ｂリンパ球の再プログラミング過程の誘導におけるＣ／ＥＢＰαの極めて重要な役割が示唆される。これにより、以下の多数の相互に非排他的な可能性が示唆される。
【００５１】
１）Ｃ／ＥＢＰαは、成熟Ｂ細胞の同一性を維持するＢ細胞転写ネットワークの重要なレギュレーターを交差拮抗する（ｃｒｏｓｓ−ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）ことができる。これはＢ細胞のより低い分化状態への脱分化を容易にし、それにより、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子誘導性再プログラミングを行うことができる。この説明は、神経幹細胞および角化細胞の幹細胞は同一分化系から得た他のより分化した細胞よりも効率的に再プログラミングされたので、ドナー細胞の分化状態が核移植による再プログラミング効率に影響を及ぼすことが知られているという所見と一致する（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら，２００６；Ｌｉら，２００７）。成熟Ｂ細胞中でのＰａｘ５の条件付き欠失によっていくつかの成熟Ｂ細胞マーカーが脱分化および喪失したので（Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ａ）、Ｐａｘ５の欠失もまたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃによる多能性への再プログラミングに対して成熟Ｂ細胞を感作するかもしれない。
【００５２】
２）Ｃ／ＥＢＰαは、成熟Ｂ細胞を異なる後成的状態を有するマクロファージ様細胞（Ｘｉｅら，２００４）に変換することができる。この異なる後成的状態がおそらくＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、および／またはｃ−Ｍｙｃの標的遺伝子への近づきやすさを増強することが可能であり、それにより、多能性状態を支配する内因性自己調節ループの有効な誘導を容易にするであろう（Ｂｏｙｅｒら，２００５；Ｌｏｈら，２００６）。
【００５３】
３）Ｃ／ＥＢＰα媒介過剰発現は、成熟Ｂ細胞を懸濁液中での成長状態からＯＰ９細胞の存在下で接着細胞になるまで移行することができ、この発現はその再プログラミングにおいて律速事象であり得る。
【００５４】
４）最後に、実施例で使用した組み合わせ以外の因子の組み合わせにより、異なる培養条件下で成熟Ｂリンパ球を再プログラミングすることができる。
【００５５】
出願人は、体細胞（例えば、部分的または完全に分化した体細胞）を再プログラミングして多能性細胞または多分化能細胞を生成する新規の方法を発明した。本発明の方法は先行技術の方法（体細胞核移植が含まれるが、これらに限定されない）を含むことを意図しないことに留意すべきである。すなわち、体細胞の核の卵母細胞のインタクトな細胞質との接触（すなわち、除核卵母細胞への体細胞の核の導入）による体細胞の再プログラミングは本発明の範囲内に含まれない。本発明のいくつかの実施形態が、通常含まれる細胞質から単離された体細胞の核を再プログラミングし、任意選択的にその後に同一または異なる細胞型の除核細胞に核を導入する方法を含む一方で、これらの実施形態は、再プログラミング薬が除核卵母細胞である方法を含まない。出願人は、単独または他の因子および／または条件と組み合わせて体細胞を再プログラミングする薬剤を同定する新規の方法も発明した。
【００５６】
本発明の一定の方法は、ＥＳ細胞（例えば、背景に記載の従来の方法を使用して生成したＥＳ細胞）と体細胞との間で相違する特徴を使用する。これらの特徴により、ＥＳ細胞を再プログラミングされていない体細胞と識別し、一定の方法において再プログラミングされた細胞（誘導多能性細胞）を同定するための根拠として使用する。
【００５７】
１つのかかる特徴は、体細胞と比較してＥＳ細胞がゲノムＤＮＡの脱メチル化を生き残る能力の増大である。体細胞を再プログラミングすることができる任意の種々の方法で処理し、この細胞をＤＮＡ脱メチル化を行う手順に供する。本発明の一定の実施形態では、この手順を生き抜くことができる体細胞を、この手順を生き抜くことができない細胞と比較して再プログラミングされているか再プログラミングされる可能性が増加すると同定する。本発明の一定の実施形態では、少なくとも一部の細胞がＤＮＡ脱メチル化に耐性を示すようになった（すなわち、ＤＮＡメチル化条件下で生き抜くことができる）候補再プログラミング薬（例えば、処置または因子）を、体細胞の再プログラミングに有用な薬剤と同定する。
【００５８】
ＥＳ細胞を体細胞と識別するＥＳ細胞の別の特徴は、ＥＳ細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を含むのに対して、体細胞中の１つのＸ染色体は、通常、大部分または完全に転写的に不活性であることである（Ａｖｎｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：５９−６７，２００１；Ｅｇｇａｎ，Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（５４９６）：１５７８−８１，２０００を参照のこと）。本発明の１つの実施形態によれば、体細胞を、再プログラミングすることができる任意の種々の方法で処理する。処理は、例えば、候補再プログラミング薬（例えば、処理または因子）との細胞の接触であり得る。本発明の一定の実施形態では、両Ｘ染色体が転写的に活性である細胞を一方のみのＸ染色体が転写的に活性である細胞と比較して再プログラミングされるか再プログラミングされる可能性が増加すると同定する。本発明の一定の実施形態では、２つの転写活性Ｘ染色体を有する少なくとも一部の細胞が得られた候補再プログラミング薬（例えば、処理または因子）を、体細胞の再プログラミングに有用な処理と同定する。いくつかの実施形態では、本方法の１つの工程はたった１つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞の選択を含み、本方法のその後の工程は、その不活性なＸ染色体が活性化された細胞の選択を含む。
【００５９】
一定の他の方法は、出願人によってデザインされた操作体細胞を活用する。この操作際細胞は、典型的に多能性に関連する内因性遺伝子（「多能性遺伝子」）を、内因性多能性遺伝子の発現が実質的に選択マーカーの発現に適合する様式で選択マーカーに作動可能に連結するように操作されている。多能性遺伝子は一般に多能性細胞のみで発現して体細胞で発現しないので、内因性多能性遺伝子の発現は、首尾の良い再プログラミングを示す。内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーを有することにより、稀にしか起こり得ない潜在的に再プログラミングされた体細胞を選択するための強力な機構が得られる。得られた細胞を、他の多能性の特徴について代替的または付加的に評価して、体細胞が多能性に首尾よく再プログラミングされたかどうかを確認することができる。
【００６０】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、１つまたは複数の体細胞（例えば、部分的に分化したか、完全／最終的に分化した体細胞）をより低い分化状態（例えば、多能性状態または多分化能状態）に再プログラミングする方法に関する。一般に、本方法は、体細胞または単離体細胞核を、細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬と接触させる工程、細胞を、細胞の増殖および再プログラミング薬の活性に適切な条件下で内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および再プログラミング薬を機能的に不活化する（例えば、再プログラミング薬を不活化または除去する）工程を含む。さらなる実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞およびこの細胞の使用に関する。
【００６１】
本発明の方法の使用による多能性または多分化能細胞の生成は、少なくとも２つの利点を有する。第１に、本発明の方法により、患者に特異的な細胞である自己多能性細胞を生成することが可能である。細胞療法における自己細胞の使用により、免疫学的拒絶の影響を受ける可能性がより高い非自己細胞の使用を超える大きな利点が得られる。対照的に、自己細胞は、有意な免疫学的応答を誘発する可能性がより低い。第２に、本発明の方法により、胚、卵母細胞、および／または核移植テクノロジーを使用しないで多能性細胞を生成することが可能である。
専門用語
本明細書中で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明確に反対に示されない限り、複数形が含まれると理解すべきである。反対に示されないか、文脈から明らかでない限り、群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求項または説明は、１つか、１つを超えるか、全ての群のメンバーが所与の生成物または過程に存在するか、生成物または過程中で使用されるか、そうでなければ生成物または過程に関連することを満たすと見なされる。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の一定の実施形態または本発明の態様は、かかる要素、特徴などからなるか本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、あらゆる場合に、本明細書中に具体的に正確に引用して記載されていない。特定の排除を明細書中で引用するかどうかと無関係に、本発明の任意の実施形態（例えば、先行技術内に見出される任意の実施形態）を特許請求の範囲から明確に排除することができるとも理解すべきである。例えば、任意の薬剤を候補再プログラミング薬組から排除することができ、任意の遺伝子を多能性遺伝子組から排除することができる。
【００６２】
範囲が与えられた場合、本発明は終点が含まれる実施形態、両方の終点が排除された実施形態、および一方の終点が含まれ、且つ他方の終点が排除された実施形態を含む。他で示さない限り、両方の終点が含まれると見なすべきであろう。さらに、他で示さないか、そうでなければ文脈から明らかでなく、且つ当業者に理解されない限り、範囲として示される値は、本発明の異なる実施形態中に示した範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲（文脈上明らかに示されない限り、範囲の下限の単位の１／１０まで）と見なすことができると理解すべきである。一連の数値を本明細書中に示す場合、本発明は、一連の値中の任意の２つの値によって定義される任意の中間の値または範囲に同様に関連する実施形態を含み、最低値を最小とし、最高値を最大とすることができるとも理解される。本明細書中で使用する場合、数値には、百分率として示した値が含まれる。数値の前に「約」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」を示す本発明の任意の実施形態について、本発明には、正確な値を引用した実施形態が含まれる。数値の前に「約」または「およそ」を示さない本発明の任意の実施形態について、本発明には、値の前に「約」または「およそ」を示す実施形態が含まれる。他で示されていないか、そうでなければ文脈から明らかでない場合、「およそ」または「約」には、一般に、いずれかの方向に（数値より大または小）数値の１％またはいくつかの実施形態では５％の範囲内に含まれる数値が含まれる（かかる数値が可能な数値の１００％を許されないほど超える場合を除く）。
【００６３】
さらに、他で示さないか、矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本発明が、列挙した１つまたは複数の請求項由来の１つまたは複数の制限、要素、節、記述用語などが、同一の基本請求項に依存した別の請求項（または、関連する場合、任意の他の請求項）に導入される全ての変形形態、組み合わせ、および置換物（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むと理解すべきである。要素がリスト（例えば、マーカッシュグループまたは類似の形式）として存在する場合、要素の各下位集団も開示され、任意の要素を群から除去することができると理解すべきである。
【００６４】
一定の請求項が便宜上従属形態で存在するが、任意の従属請求項を、独立請求項およびかかる請求項が従属する任意の他の請求項の制限を含むように独立形式に書き換えることができ、かかる書き換えた請求項は、独立形式で書き換えられる前の従属請求項（補正または非補正のいずれか）の全てに関して等価であると見なされるべきである。明確に逆に示されない限り、１つを超える行為を含む特許請求の範囲に記載の任意の方法中で、方法の行為の順序は必ずしも方法の行為が引用される順序に制限されないが、本発明は順序がこのようにして制限される実施形態を含むとも理解されるべきである。上記の全ての実施形態を本発明の全ての異なる態様に適用可能であることを意図する。必要に応じて任意の上記実施形態を１つまたは複数の他のかかる実施形態と自由に組み合わせることができることも意図される。
体細胞
本発明の体細胞は、初代細胞（非不死化細胞）（動物から新たに単離された細胞など）であり得るか、細胞株（不死化細胞）に由来し得る。細胞を、被験体からの単離後に細胞培養物中で維持することができる。一定の実施形態では、細胞を、本発明の方法で使用する前に、１回または１回を超えて（例えば、２〜５回、５〜１０回、１０〜２０回、２０〜５０、５０〜１００回、またはそれ以上）継代する。いくつかの実施形態では、細胞は、本発明の方法で使用する前に、わずか１回、２回、５回、１０回、２０回、または５０回継代されるであろう。細胞を、凍結、融解などを行うことができる。本発明の一定の実施形態では、体細胞を、雌から得る。使用される体細胞は、未変性体細胞または操作した体細胞（すなわち、遺伝的に変化した体細胞）であり得る。
【００６５】
本発明の体細胞は、典型的には、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、霊長類細胞、またはマウス細胞など）である。体細胞を、周知の方法によって得ることができ、生きた体細胞を含む任意の器官または組織（例えば、血液、骨髄、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道、他の泌尿器など）から得ることができる。本発明で有用な哺乳動物体細胞には、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛嚢細胞、角化細胞、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、および他の筋細胞などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、用語「体細胞」には、成体幹細胞も含まれる。成体幹細胞は、特定組織の全ての細胞型を生じることができる細胞である。成体幹細胞の例には、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞が含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、細胞を、所望の細胞型中で唯一または主に発現することが公知の内因性マーカーの発現に基づいて選択する。例えば、ビメンチンは線維芽細胞マーカーである。他の有用なマーカーには、種々のケラチン、細胞接着分子（カドヘリンなど）、フィブロネクチン、ＣＤ分子などが含まれる。体細胞集団の平均的な細胞周期は、１８時間と９６時間との間（例えば、２４〜４８時間、４８〜７２時間など）であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超える細胞は、２４、４８、７２、または９６時間などの所定の期間内に分裂すると予想されるであろう。
【００６７】
本発明の方法を使用して、１つまたは複数の体細胞（例えば、体細胞のコロニーまたは集団）を再プログラミングすることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞集団は、少なくとも９０％の細胞が目的の表現型または特徴を示すという点で実質的に均一である。いくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９、９９．９５％、またはそれを超える細胞が目的の表現型または特徴を示す。本発明の一定の実施形態では、体細胞は分裂する能力を有する（すなわち、体細胞は有糸分裂後ではない）。細胞は、例えば、当該分野で公知の標準的な培養条件下にて培養物中で維持した場合に１８〜７２時間（例えば、２４〜４８時間）の平均細胞周期（すなわち、細胞が１つの細胞分裂周期を完了するために必要な期間）を有し得る。
【００６８】
本発明の分化した体細胞は、部分的または完全に分化している。分化は、低特殊化細胞がより特殊化された細胞型になる過程である。細胞分化は、細胞のサイズ、形状、極性、代謝活性、遺伝子発現、および／またはシグナル反応性の変化を含未み得る。例えば、造血幹細胞は、分化して、全ての血液細胞型（骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系分化系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）が含まれる）を生じる。分化経路に沿った進行中に、細胞の最終的な運命はより固定するようになる。本明細書中に記載の作業によって示されるように、部分的に分化した体細胞（例えば、プレＢ細胞およびプロＢ細胞などの未熟Ｂ細胞）および完全に分化した体細胞（例えば、成熟Ｂ細胞、非ナイーブ成熟Ｂ細胞）の両方を本明細書中に記載のように再プログラミングして、多分化能細胞または多能性細胞（「誘導多能性細胞」としても公知）を産生することができる。
再プログラミングおよび多能性細胞
細胞の分化状態は連続する範囲であり、この範囲の一方の終点が最終分化状態であり、他方の終点が脱分化状態（多能性状態）である。本明細書中で使用する場合、再プログラミングは、体細胞の分化状態を変化させるか逆行する過程をいい、分化状態は部分分化または最終分化のいずれかであり得る。再プログラミングには、体細胞の分化状態の完全な逆行および部分的逆行が含まれる。言い換えれば、本明細書中で使用する場合、用語「再プログラミング」は、低分化状態に向かう範囲に沿った細胞の分化状態の任意の移動を含む。例えば、再プログラミングには、多分化能細胞の多能性細胞への逆行および最終的に分化した細胞の多分化能細胞または多能性細胞のいずれかへの逆行が含まれる。１つの実施形態では、体細胞の再プログラミングは、体細胞を多能性状態まで逆戻させる。別の実施形態では、体細胞の再プログラミングは、体細胞を多分化能状態まで逆戻りさせる。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「低分化状態」は、相対的用語であり、完全な脱分化状態および部分的な分化状態が含まれる。
【００６９】
多能性細胞は、長期間（例えば、１年超）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂する能力を有し、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）に由来する細胞に分化する固有の能力を有する細胞である。多能性細胞は、特定の組織に固有の明らかに異なる形態学的表現型、細胞学的表現型、または機能的表現型を有する全範囲の娘細胞に分化する可能性を有する。対照的に、多能性細胞の子孫は、その分裂可能性が段階的に制限され、細胞によってはたった１つの運命しか持たない。多分化能細胞は、３つ全ての胚葉由来のいくつかであるが全てではない細胞に分化することができる細胞である。したがって、多分化能細胞は、部分的に分化した細胞である。成体幹細胞はまた、多分化能であるか部分的に分化した細胞である。公知の成体幹細胞には、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞が含まれる。
再プログラミング薬での体細胞の処理
本明細書中に記載のように、１つまたは複数の（例えば、集団またはコロニー）体細胞（例えば、分化した体細胞）を、細胞の再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬または因子で処理するか接触させる。用語「接触する」、「接触」、「処理する」、「処理」などを、本明細書中で交換可能に使用し、細胞を任意の種類の過程または条件に供することまたは細胞に対して任意の種類の手順を実施することを含む。処理は、非限定的な例として、公知の再プログラミング薬または候補再プログラミング薬（例えば、細胞のクロマチン構造を変化させる薬剤、ＤＮＡメチル化を減少させる薬剤、ヒストンアセチル化を減少させる薬剤）との細胞の接触、再プログラミング薬をコードするポリヌクレオチドでの細胞のトランスフェクション、および／またはかかる細胞が典型的に維持される標準的な培養条件と異なる条件下での細胞の培養であり得る。例えば、温度またはｐＨを変化させることができる。複数の公知の再プログラミング薬または候補再プログラミング薬を、共に／同時にまたは連続的に使用することができる。別の実施形態では、本発明の方法は、さらに、薬剤または因子での細胞の処理工程の反復を含む。処理の繰り返しで使用される薬剤は、第１の処理で使用される薬剤と同一でも異なっていても良い。本発明の再プログラミング薬は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子などであり得る。
【００７０】
細胞を、再プログラミング因子または再プログラミング薬と種々の期間接触させることができる。いくつかの実施形態では、細胞を、薬剤と１時間と３０日間の間薬剤と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を、薬剤と細胞の再プログラミングまたは内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間接触させる。例えば、期間は、１日間、５日間、７日間、１０日間、１２日間、１４日間、または２０日間であり得る。再プログラミング薬を除去または不活化し、その後に多能性細胞を富化するために選択を実施するか、多能性の特徴について細胞を評価することができる。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、体細胞を再プログラミング薬または再プログラミング因子と接触させた後、体細胞を、細胞の増殖および再プログラミング薬または再プログラミング因子の活性に適切な条件下で細胞の再プログラミングまたは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する。細胞を再プログラミングが起こっている間の種々の期間培養物中で維持し、その後に再プログラミングされた細胞を選択または富化することができる。したがって、一定の方法では、再プログラミング薬または再プログラミング因子と接触した体細胞を、培養物中で３日間を超えて維持し、その後に再プログラミングされた細胞を同定または選択する。いくつかの方法では、この細胞を、培養物中で少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１日間またはそれ以上の期間（例えば、３〜５週間）維持し、その後に再プログラミングされた細胞を同定または選択する。
【００７２】
さらに、本発明の特定の実施形態では、１つまたは複数の再プログラミング薬と接触させた体細胞を、記載の方法にしたがって、細胞の増殖に適切な条件下で維持する。特定の細胞型の維持および増殖に適切な条件は、当業者に明らかであろう。特殊化された培養培地を商業的供給源から得ることができるか、増殖の増強に必要であるか望ましい因子を標準的な培養培地に添加することができる。さらなる因子または薬剤を培養培地に添加して、例えば、細胞中の誘導エレメントの発現を誘導するか特定の薬剤に感受性を示す細胞の成長を阻害することもできる。
【００７３】
非限定的な例として、ＤＮＡメチル化インヒビターおよびヒストン脱アセチル化インヒビターは、本発明の方法で使用することができる２つの薬剤クラスである。例示的薬剤には、５−アザ−シチジン、ＴＳＡ、およびバルプロ酸が含まれる。本明細書中に記載のように、ＤＮＡメチル化インヒビターはまた、ＤＮＡメチル化インヒビターが再プログラミングに寄与するかどうかと無関係に、再プログラミングされた細胞を同定するのに有用である。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、再プログラミング薬はＤＮＡメチル化インヒビターではない。例えば、再プログラミング薬は、ＤＮＡメチル化に検出可能な影響を及ぼさないか、ＤＮＡメチル化を１％未満減少させる。いくつかの実施形態では、再プログラミング薬は、ＤＮＡメチル化を５％未満減少させ、そして／またはＤＮＭＴ１、３ａ、および／または３ｂ活性を１％未満または５％未満阻害する。
【００７４】
本発明の一定の実施形態では、再プログラミング薬または再プログラミング因子を、細胞に外因的に導入する。「外因的に導入する」を、（典型的には、人の手を含む過程によって）細胞または細胞の外側由来の細胞の先祖に導入され、そして／または本来はこの細胞型で見出されないか、異なる配列、文脈、および／または異なる量で見出されるポリヌクレオチド（または他の物質（小分子またはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない））をいうために当該分野でのその意味と共に一貫して使用する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、再プログラミング薬を、ウイルス形質導入（例えば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入）を使用して細胞に導入する。特定の実施形態では、使用ベクターを、メチル化誘導サイレンシングに供さない。いくつかの実施形態では、ベクターは非複製ベクターであり、いくつかの実施形態では、ベクターは非組込みベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、細胞ゲノムから切り出すことができる（例えば、切り出し後の細胞ゲノムがベクターの組み込み前に細胞のゲノムに実質的に類似するか同一であるように切り出すことができる）組み込みベクターである。いくつかの実施形態では、再プログラミング薬を、タンパク質自体または細胞を再プログラミングするための他の再プログラミング薬との組み合わせのいずれかで有効なタンパク質をコードする核酸構築物のタンパク質導入または一過性トランスフェクションを使用して細胞に導入する。任意選択的に、細胞を電場に供し、そして／または再プログラミング薬の取り込みを増加させるための細胞透過性を増強する薬剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、およびｃ−Ｍｙｃの少なくとも１つを、かかる方法を使用して体細胞に外因的に導入することができる。１つの実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４を細胞に導入する一方で、別の実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを細胞に導入する。別の実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を細胞に導入する。
【００７６】
細胞の多能性状態に影響を及ぼし、したがって候補再プログラミング薬である遺伝子には、多能性遺伝子、クロマチンリモデリングに関与する遺伝子、および多能性の維持に重要な遺伝子（ＬＩＦ、ＢＭＰ、およびＰＤ０９８０５９など）が含まれる（Ｃｅｌｌ，１１５：２８１−２９２（２００３）；Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ
Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２００３  Ａｕｇ  ２９；３５８（１４３６）：１３９７−４０２）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、成体ヒト細胞の再プログラミングのためのレンチウイルス系を使用してＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を使用した（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８５４：１２２４−１２２５（１１／２３／２００７））。細胞が多能性であることに無関係に影響を及ぼし得る他の遺伝子には、一定の癌遺伝子（ｃ−ｍｙｃなど）が含まれる。他の遺伝子には、テロメラーゼ（例えば、テロメラーゼの触媒サブユニットをコードする遺伝子）が含まれる。さらに他の遺伝子には、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＦｏｘＤ３、Ｓｔａｔ３、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５が含まれる。目的の他の遺伝子には、多分化能または多能性に関連しており、そして／または多分化能細胞または多能性細胞中で天然に発現するミクロＲＮＡ前駆体をコードする遺伝子が含まれる。任意選択的に、細胞が分化し、そして／または成体体細胞中で発現しない場合、遺伝子は下方制御される。目的の他のポリヌクレオチドには、多分化能細胞または多能性細胞中で天然に発現する内因性ミクロＲＮＡの標的である遺伝子にターゲティングしたｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ薬をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００７７】
さらに、体細胞中でさらなる因子を過剰発現するか外因的に発現して、再プログラミングを容易にすることができる。例えば、細胞のより低い分化状態への誘導を補助する因子を、細胞中に発現することができる。本明細書中に記載のように、Ｃ／ＥＢＰαは、成熟Ｂ細胞の再プログラミングを補助することが示されている。Ｃ／ＥＢＰαファミリーの他のメンバー（Ｃ／ＥＢＰαのヒトホモログ）は、同様に有用であり得る。
【００７８】
本発明の実施形態を通して、他で示されないか、文脈から示唆されない限り、コードされたポリペプチドを、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの外因性導入の代わりまたはこれに加えて細胞に外因的に導入することができると理解されるであろう。さらに、本明細書中の「遺伝子」に対する言及は、他で示されないか、文脈から示唆されない限り、遺伝子の内因性調節エレメントを含むか含んでおらず、イントロン配列エレメントを含むか含んでいない遺伝子のコード配列を含むことを意図すると理解されるであろう。
【００７９】
外因的に導入したポリヌクレオチドを、いくつかの方法で発現することができる。１つの実施形態では、外因的に導入したポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの内因性染色体遺伝子座と異なる染色体遺伝子座から発現することができる。かかる染色体遺伝子座は、開いたクロマチン構造を有する遺伝子座であり得、体細胞に不必要な遺伝子を含む。言い換えれば、望ましい染色体遺伝子座は、その破壊によって細胞が死滅しない遺伝子を含む。例示的な染色体遺伝子座には、例えば、マウスＲＯＳＡ  ２６遺伝子座およびＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａｌ）遺伝子座が含まれる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら，１９９７を参照のこと）。外因的に導入したポリヌクレオチドを、必要に応じてその発現を調節することができるように誘導性プロモーターから発現することができる。
【００８０】
別の実施形態では、外因的に導入したポリヌクレオチドを、個別またはｃＤＮＡ発現ライブラリーの一部として細胞に一過性にトランスフェクトすることができる。１つの実施形態では、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、多能性細胞（胚性幹細胞、卵母細胞、卵割球、内細胞塊細胞、胚性生殖細胞、胚様体（胚）細胞、桑実胚由来細胞、奇形腫（奇形癌腫）細胞、および胚発生過程の後期由来の多分化能の部分的に分化した胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない）から調製することができる。候補再プログラミング薬を、かかるライブラリーから同定することができる。
【００８１】
ｃＤＮＡライブラリーを、従来の技術によって調製する。簡潔に述べれば、ｍＲＮＡを目的の生物から単離する。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼを、テンプレートとしてｍＲＮＡを使用した第１の鎖合成のために使用する。第２の鎖合成を、ｃＤＮＡ産物が得られるＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼを使用して行う。ｃＤＮＡのクローニングを容易にする従来のプロセシング後、ｃＤＮＡが少なくとも１つの調節配列と作動可能に連結されるように、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入する。ｃＤＮＡライブラリーと共に使用するための発現ベクターの選択は、特定のベクターに制限されない。マウス細胞での使用に適切な任意の発現ベクターが適切である。１つの実施形態では、ｃＤＮＡ発現構築物からの発現を駆動するプロモーターは誘導性プロモーターである。用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントが含まれる。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動可能に連結された場合にＤＮＡ配列の発現を調節する広範な種々の発現調節配列のいずれかをこれらのベクター中で使用して、ｃＤＮＡを発現することができる。かかる有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、λファージの主なオペレーターおよびプロモーター、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにその種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターのデザインが形質転換すべき宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の型などの要因に依存し得ると理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮すべきである。
【００８２】
外因的に導入したポリヌクレオチドを、誘導性プロモーターから発現することができる。本明細書中で使用する場合、用語「誘導性プロモーター」は、インデューサー（化学的因子および／または生物学的因子など）の非存在下で、発現を指示しないか、作動可能に連結された遺伝子（ｃＤＮＡが含まれる）の低レベルの発現を指示し、インデューサーに応答して、発現を指示する能力が増強されるプロモーターをいう。例示的な誘導性プロモーターには、例えば、重金属（ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１），１６７−２２０；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら．Ｎａｔｕｒｅ（１９８２），２９６，３９−４２）、熱ショック、ホルモン（Ｌｅｅら．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ（１９８８），８５，１２０４−１２０８；（１９８１），２９４，２２８−２３２；Ｋｌｏｃｋら．Ｎａｔｕｒｅ（１９８７），３２９，７３４−７３６；Ｉｓｒａｅｌ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９），１７，２５８９−２６０４）に応答するプロモーター、化学的因子（グルコース、ラクトース、ガラクトース、または抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ））など）に応答するプロモーターが含まれる。
【００８３】
テトラサイクリン誘導性プロモーターは、抗生物質に応答する誘導性プロモーターの例である。Ｇｏｓｓｅｎら，２００３を参照のこと。テトラサイクリン誘導性プロモーターは、１つまたは複数のテトラサイクリンオペレーターに作動可能に連結されたミニマルプロモーターを含む。テトラサイクリンまたはそのアナログの１つの存在により、転写アクチベーターがテトラサイクリンオペレーター配列に結合し、それにより、ミニマルプロモーターを活性化し、それゆえに、会合したｃＤＮＡが転写される。テトラサイクリンアナログには、テトラサイクリンと構造相同性を示し、且つテトラサイクリン誘導性プロモーターを活性化することができる任意の化合物が含まれる。例示的なテトラサイクリンアナログには、例えば、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、およびアンヒドロテトラサイクリンが含まれる。テトラサイクリン抑制プロモーターも使用する。
【００８４】
上記方法を使用して、体細胞中で本明細書中に記載の任意の外因的に導入したポリヌクレオチドを発現することができる。例えば、上記方法を使用して、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをターゲティングしたＲＮＡｉ薬をコードするポリヌクレオチドを発現することができるか、上記方法を使用して、部位特異的リコンビナーゼを発現することができる。
【００８５】
出願人は、外因的に導入した因子が多能性表現型の維持に不必要であり得ることを発見した。例えば、外因的に導入したポリヌクレオチドであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の発現は、多能性表現型の維持に不必要である。したがって、本発明は、再プログラミング後に再プログラミングされた体細胞を改変して、細胞のＥＳ様表現型を保持しながら１つまたは複数の導入した因子（例えば、ポリヌクレオチド）を非機能性にすることができるという認識を含む。
【００８６】
本発明の一定の実施形態では、導入したポリヌクレオチドを非機能的にすることにより、細胞への癌遺伝子の導入に関連する潜在的な懸念材料を軽減する。したがって、本発明は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを体細胞に導入する工程であって、１つまたは複数のポリヌクレオチドが少なくとも一部の細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする、導入する工程、ＥＳ様状態に再プログラミングされた細胞を同定する工程、および１つまたは複数の導入したポリヌクレオチドを機能的に不活化する工程を含む。細胞を、導入したポリヌクレオチドの不活化前に適切な期間培養物中で維持することができる。１つの実施形態では、細胞が多能性のマーカーまたは特徴を示し始めるか、内因性多能性遺伝子（例えば、Ｏｃｔ−４および／またはＮａｎｏｇ）を発現し始めるか、内因性多能性遺伝子の下流標的を発現し始めるのに十分な期間を選択することができる。一定の実施形態では、外因的に導入したポリヌクレオチドを誘導調節エレメントによって調節し、このエレメントのインデューサーの除去によって機能的に不活化する。
【００８７】
機能的不活化は、導入したポリヌクレオチドの除去または切り出しを含むことも意図する。一定の実施形態では、１つまたは複数の導入したポリヌクレオチドの少なくとも一部を、部位特異的リコンビナーゼ部位に隣接させる。導入したポリヌクレオチドを、細胞中でのリコンビナーゼの発現または細胞へのリコンビナーゼの導入によって機能的に不活化することができる。得られた再プログラミングされた体細胞は、任意の外因的に導入したコード配列および／または調節エレメントを欠き得る。細胞は、組換え後に残存する１つまたは複数の部位を含むことを除き、非操作体細胞と同一であり得る。
多能性マーカー
１つまたは複数の再プログラミング薬で処理した体細胞を、培養物中で細胞の再プログラミングの開始に十分な期間維持する。処置細胞集団を、種々の方法で分析して、再プログラミングの有無を同定することができる。すなわち、処理細胞集団を、さらに処理または分析して、再プログラミング過程を開始した細胞を選択または富化するか、再プログラミング過程を開始し始めなかった細胞を淘汰するか減少させることができる。処理した体細胞集団を評価して、再プログラミングされた（例えば、多能性）細胞の１つまたは複数のマーカーまたは特徴を示さない細胞を同定することができる。例えば、細胞集団を評価して、再プログラミングの表現型マーカー、機能的マーカー、または遺伝子マーカー（１つまたは複数の多能性遺伝子の発現および多能性遺伝子の発現の結果としてその発現が直接または間接的に活性化される１つまたは複数の遺伝子の発現が含まれる）を同定することができる。非限定的な例として、細胞集団を評価して、アルカリホスファターゼの発現、ＳＳＥＡ１の発現、ＳＳＥＡ３の発現、ＳＳＥＡ４の発現、ＴＲＡＦ−６０の発現、Ｎａｎｏｇの発現、Ｏｃｔ４の発現、Ｆｘｂ１５の発現、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態学、出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、２つの活性なＸ染色体の存在、ＤＮＡメチル化に対する耐性、およびその組み合わせを評価することができる。細胞集団を評価して、再プログラミングの任意のマーカーの非存在を同定し、再プログラミングを受けなかった細胞を同定することもできる。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「多能性遺伝子」は、多能性に関連する遺伝子をいう。多能性遺伝子の発現は、典型的には、多能性細胞（例えば、多能性幹細胞）に制限され、多能性細胞の機能的同一性に不可欠である。多能性遺伝子によってコードされるタンパク質は卵母細胞における母性因子として存在することができ、この遺伝子を、例えば、着床前期の少なくとも一部を通じて、および／または成体の生殖細胞前駆体中の少なくともいくつかの胚細胞によって発現することができると認識されるであろう。
【００８９】
いくつかの実施形態では、多能性遺伝子は、哺乳動物のＥＳ細胞中でのその平均発現レベルがその型の成体哺乳動物（例えば、マウス、ヒト、家畜）の体内に存在する体細胞型中の細胞発現レベルあたりのその平均の少なくとも５、１０、２０、５０、または１００倍である遺伝子である。いくつかの実施形態では、多能性遺伝子は、ＥＳ細胞中での平均発現レベルが、成体哺乳動物（例えば、マウス、ヒト、家畜）の体内に存在する最終的に分化した細胞型中のその平均発現レベルの少なくとも５、１０、２０、５０、または１００倍である遺伝子である。いくつかの実施形態では、多能性遺伝子は、従来の方法を使用して誘導したＥＳ細胞の生存能または多能性状態を維持するのに不可欠な遺伝子である。したがって、遺伝子がノックアウトまたは阻害（すなわち、排除または減少）されている場合、ＥＳ細胞は死滅するか、いくつかの実施形態では、分化する。いくつかの実施形態では、多能性遺伝子は、ＥＳ細胞中でのその発現の阻害（例えば、ＲＮＡ転写物および／または遺伝子よってコードされるタンパク質の平均定常状態レベルの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超える減少）により、生存可能であるがもはや多能性ではない細胞が得られるという点で特徴づけられる。いくつかの実施形態では、多能性遺伝子を、細胞が最終的に分化した細胞に分化する場合にＥＳ細胞中でのその発現が減少する（それにより、例えば、ＲＮＡ転写物および／または遺伝子よってコードされるタンパク質の平均定常状態レベルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えた減少）という点で特徴づけられる。
【００９０】
転写因子Ｏｃｔ−４（Ｐｏｕ５ｆ１、Ｏｃｔ−３、Ｏｃｔ３／４とも呼ばれる）は、多能性遺伝子の一例である。Ｏｃｔ−４は、ＥＳ細胞の未分化表現型の確立および維持に必要であることが示されており、胚形成および細胞分化における初期事象の決定で役割を果たす（Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：３７９−３９１；Ｎｉｗａら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４：３７２−３７６）。Ｏｃｔ−４は、幹細胞が特殊化細胞に分化するにつれて下方制御される。
【００９１】
Ｎａｎｏｇは、多能性遺伝子の別の例である。Ｎａｎｏｇは、未分化ＥＳ細胞の増殖を指示する多様なホメオドメインタンパク質である。Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡは、多能性マウスおよびヒト細胞株中に存在し、分化した細胞に不在である。着床前胚では、Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞が誘導され得る創始細胞に制限される。内因性Ｎａｎｏｇは、Ｓｔａｔ３のサイトカイン刺激に並行して作用し、ＥＳ細胞の自己複製を駆動する。導入遺伝子構築物由来のＮａｎｏｇ発現の増加は、ＥＳ細胞のクローン増殖、Ｓｔａｔ３の迂回、およびＯｃｔ４レベルの維持に十分である（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１３：６４３−６５５；Ｍｉｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ．２００３，１１３（５）：６３１−４２を参照のこと）。他の例示的な多能性遺伝子には、Ｓｏｘ２およびＳｔｅｌｌａが含まれる（Ｉｍａｍｕｒａら，ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６，６：３４，Ｂｏｒｔｖｉｎら．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３，１３０（８）：１６７３−８０；Ｓａｉｔｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ．２００２，４１８（６８９５）：２９３−３００）。
【００９２】
本発明の一定の実施形態では、内因性多能性遺伝子を、選択マーカーと同時発現させる。例えば、内因性多能性遺伝子を、選択マーカーおよび内因性多能性遺伝子が同時発現するような様式で選択マーカーをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に連結させることができる。本明細書中で使用する場合、「同時発現」は、選択マーカーの発現が内因性多能性遺伝子の発現と実質的に適合することを意味することを意図する。１つの実施形態では、本発明の分化した体細胞は、第１の選択マーカーの発現が第１の内因性多能性遺伝子の発現と実質的に適合するような様式で第１の選択マーカーをコードするＤＮＡに連結された第１の内因性多能性遺伝子を含む。分化した体細胞を、各選択マーカーとそれぞれ連結された多数の内因性多能性遺伝子を含むように操作することもできる。したがって、別の実施形態では、本発明の分化した体細胞は、それぞれ異なる選択マーカーをコードするＤＮＡに連結する２つの内因性多能性遺伝子を含む。さらなる実施形態では、本発明の分化した体細胞は、それぞれ異なる選択マーカーをコードするＤＮＡに連結する３つの内因性多能性遺伝子を含む。分化した体細胞を、誘導性プロモーター下で導入遺伝子として発現する１つまたは複数の多能性遺伝子を有するようにさらに操作することができる。
【００９３】
１つの実施形態では、本方法で使用される体細胞は、第１の選択マーカーに連結されたたった１つの内因性多能性遺伝子を含み、選択工程を実施して、第１の選択マーカーの発現について選択する。別の実施形態では、本方法で使用される体細胞は、それぞれが異なる選択マーカーに連結された多数の内因性多能性遺伝子を含み、選択工程を実施して、選択マーカーの少なくともサブセットを選択する。例えば、選択工程を行って、種々の内因性多能性遺伝子に連結された全ての選択マーカーを選択することができる。
【００９４】
１つの実施形態では、本方法で使用される体細胞は、内因性多能性遺伝子および誘導性プロモーター下で導入遺伝子として発現するさらなる多能性遺伝子に連結された選択マーカーを含む。これらの細胞について、再プログラミング方法は、多能性導入遺伝子の発現を誘導する工程を含み、選択マーカーの発現について選択することができる。本方法は、さらに、体クロマチン構造を変化させる薬剤と細胞を接触させる工程を含むことができる。
【００９５】
本発明の目的のために、内因性多能性遺伝子および選択マーカーの発現レベルが同一である必要がなく、類似する必要さえない。内因性多能性遺伝子が活性化された細胞が再プログラミングされた細胞に選択可能な表現型を付与するのに十分なレベルで選択マーカーも発現することのみが必要である。例えば、選択マーカーが致死的薬物に耐性を付与するマーカー（「薬物耐性マーカー」）である場合、内因性多能性遺伝子が活性化される細胞が再プログラミングした細胞に致死的薬物耐性を付与するのに十分なレベルで薬物耐性マーカーも発現する方法で細胞を操作する。したがって、再プログラミングした細胞が生存および増殖するのに対して、再プログラミングしない細胞は死滅するであろう。
【００９６】
本発明の一定の実施形態では、選択マーカーを、内因性多能性遺伝子からの転写を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結する。選択マーカーをコードするＤＮＡを、所望の内因性多能性遺伝子をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）の末端から下流（ＯＲＦの最後のヌクレオチドとポリアデニル化部位の最初のヌクレオチドとの間のどこか）に挿入することができる。配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、選択マーカーをコードするＤＮＡの前に配置することができる。あるいは、選択マーカーをコードするＤＮＡを、所望の内因性多能性遺伝子のＯＲＦ内のどこか（プロモーターの下流）に終止シグナルと共に挿入することができる。配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、選択マーカーをコードするＤＮＡの前に配置することができる。さらなる実施形態では、選択マーカーをコードするＤＮＡを、多能性遺伝子発現の結果としてその発現が直接または間接的に活性化される遺伝子内のどこかに挿入することができる。いくつかの実施形態では、選択マーカーをコードするＤＮＡを、イントロン中に挿入する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡが挿入された内因性多能性遺伝子は、機能的多能性遺伝子産物を発現する一方で、他の実施形態では発現しない。選択マーカーを、内因性多能性遺伝子一方のみの対立遺伝子または両方の対立遺伝子に挿入することができる。一定の他の実施形態では、内因性多能性遺伝子の発現を活性化するのに適切な条件も外因性ポリヌクレオチドの発現を活性化するように、外因性ポリヌクレオチド（内因性多能性遺伝子由来の転写を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーが含まれる）を、細胞ゲノム中の内因性多能性遺伝子の遺伝子座の外側の位置に挿入する。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、選択マーカーは、発現した場合にレシピエント細胞に選択可能な表現型（抗生物質耐性、細胞毒性薬耐性、原栄養性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、または表面タンパク質の発現など）を付与するマーカーである。その発現を容易に検出することができる他のタンパク質（蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質または基質に作用して有色物質、蛍光物質、もしくは発光物質を産生する酵素も選択マーカーとして使用される。内因性多能性遺伝子に連結する選択マーカーの存在により、内因性多能性遺伝子が発現する再プログラミングした細胞を同定および選択することも可能になる。種々の選択マーカー遺伝子を使用することができる（ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、およびｈｉｓＤ遺伝子など）。他のマーカーには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色、サファイア、黄色、赤色、橙色、およびシアンの蛍光タンパク質、ならびにこれらのいずれかのバリアントが含まれる。ルシフェラーゼ（例えば、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼ）などの発光タンパク質も使用される。酵素レポーター（β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）に基づいた系も使用される。いくつかの実施形態では、マーカーは分泌酵素である。当業者に明らかであるように、本明細書中で使用する場合、用語「選択マーカー」は、遺伝子または遺伝子の発現産物（例えば、コードされたタンパク質）をいうことができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、選択マーカーを発現しないか、有意に低いレベルで選択マーカーを発現する細胞と比較して、選択マーカーを発現する細胞に増殖および／または生存上の利点を付与する。かかる増殖および／または生存上の利点は、典型的には、細胞を一定の条件下（すなわち、「選択的条件下」）で維持した場合に起こる。有効な選択を確実にするために、細胞集団を、マーカーを発現しない細胞が増殖せず、そして／または生存せず、集団から排除されるか、その数が集団の非常に小さな画分に減少するような条件および十分な期間で維持することができる。マーカーを発現しない細胞の大部分または細胞を完全に排除するための選択条件下での細胞集団の維持によって増殖および／または生存上の利点を付与するマーカーを発現する細胞の選択過程を、本明細書中で「正の選択」といい、このマーカーを、「正の選択に有用」であるという。正の選択に有用なマーカーは、内因性多能性遺伝子を選択マーカーに連結する本発明の実施形態で特に興味深い。
【００９９】
負の選択および負の選択に有用なマーカーもまた、本明細書中に記載の一定の方法で興味深い。かかるマーカーの発現により、マーカーを発現しないか有意に低いレベルでマーカーを発現する細胞と比較して、マーカーを発現する細胞に増殖および／または生存上の利点が付与される（または、別の方法を考慮した場合、マーカーを発現しない細胞は、マーカーを発現する細胞と比較して増殖および／または生存上の利点を有する）。したがって、選択条件下で十分な期間維持した場合、マーカーを発現する細胞を、細胞集団からその大部分または完全に排除することができる。
【０１００】
本明細書中の一定の目的のマーカーは、使用した特定の選択条件に依存して、正の選択および負の選択に有用である。したがって、一定の条件下では、マーカーを発現する細胞は、マーカーを発現しない細胞と比較して増殖および／または生存上の利点を有する一方で、他の条件下では、マーカーを発現する細胞は、マーカーを発現しない細胞と比較して増殖および／または生存上の欠点を有する。本発明での使用に適切なかかるマーカーの２つの例は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）（プリン型化合物を合成および／または相互交換する一定の反応を触媒する酵素）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）（ピリミジン型化合物を合成および／または相互交換する一定の反応を触媒する）である。典型的な培養条件下で、哺乳動物細胞中でのＤＮＡ合成は、グルタミンおよびアスパラギン酸塩をプリン型（例えば、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ）およびピリミジン型（例えば、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）ヌクレオチドを合成する一連の反応の初期基質として使用する主要な（ｄｅ  ｎｏｖｏ）経路を介して進行する。ｄｅ  ｎｏｖｏ経路が遮断される場合、哺乳動物細胞は必要なヌクレオチドを合成するために別の経路を利用しなければならない。プリンサルベージ経路は、ヒポキサンチンのＩＭＰへの変換（ＨＰＲＴによって触媒される反応）を含む。第２の経路は、チミジンをｄＴＭＰに変換する（ＴＫによって触媒される反応）。したがって、ＨＰＲＴ発現を欠く細胞（例えば、ＨＰＲＴ遺伝子の機能的コピーを欠く細胞）またはＴＫ発現を欠く細胞（例えば、ＴＫ遺伝子の機能的コピーを欠く細胞）は、標準的な培養培地で成長することができるが、アミノプテリン、ヒポキサンチン、およびチミジンを含むＨＡＴ培地中で死滅する。ＨＰＲＴ内因性発現を欠く細胞では、ＨＰＲＴを、その発現をＨＡＴ培地中で選択することができる選択マーカーとして使用することができる。同様に、内因性ＴＫ発現を欠く細胞中で、ＴＫを、その発現をＨＡＴ培地中で選択することができる選択マーカーとして使用することができる。
【０１０１】
ＨＰＲＴまたはＴＫを発現する細胞を選択する能力に加えて、機能的ＨＰＲＴおよび／またはＴＫの発現を欠く細胞（例えば、これらの酵素の一方または両方を発現しない細胞）を選択することも可能である。ＨＰＲＴは、一定の他の非毒性化合物（種々のプリンアナログ（８−アザグアニン（８−ＡＺ）および６−チオグアニン（６−ＴＧ）など）が含まれる）を細胞傷害性化合物に変換する。ＴＫは、一定のピリミジンアナログ（５−ブロモデオキシウリジンおよびトリフルオロ−メチル−チミジンなど）を細胞傷害性化合物に変換する。細胞傷害性化合物は、例えば、核酸合成に関与する酵素の阻害および／またはＤＮＡに組み込まれるようになること、ミスマッチおよび変異の誘導によって細胞に悪影響を及ぼし得る。したがって、８−ＡＺ、６−ＴＧなどを含む培養培地中で、ＨＰＲＴを発現する細胞は、ＨＰＲＴを発現しないか、核酸合成を完全に支持するのに不十分なより低いレベルでＨＰＲＴを発現する細胞と比較して成長に不利である。したがって、ＨＰＲＴ活性を欠く細胞を選択するためにこれらの選択条件を使用することが可能得ある。同様に、ブロモデオキシウリジンまたはトリフルオロ−メチル−チミジンを含む培地中で、ＴＫを発現する細胞は、ＴＫ発現を欠くか、より低いレベルまたは不十分なレベルのＴＫを発現する細胞と比較して成長に不利である。したがって、ＴＫ活性を欠く細胞を選択するためにこれらの選択条件を使用することが可能である。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の再プログラミング薬または再プログラミング因子で処理し、適切な期間維持した分化した体細胞の集団をアッセイして、多能性のマーカーを示す細胞を同定する。
【０１０３】
本明細書中に記載のように、本発明で使用する分化した体細胞は、かかる操作した体細胞を含むトランスジェニックマウスから得ることができる分化した体細胞であり得る。かかるトランスジェニックマウスを、当該分野で公知の標準的な技術を使用して産生することができる。例えば、Ｂｒｏｎｓｏｎらは、選択された染色体部位への導入遺伝子の単一コピーの挿入技術を記載している。Ｂｒｏｎｓｏｎら，１９９６を参照のこと。簡潔に述べれば、所望の組み込み構築物（例えば、多能性遺伝子に連結された選択マーカーを含む構築物）を含むベクターを、当該分野で公知の標準的な技術によってＥＳ細胞に導入する。得られたＥＳ細胞を、所望の組み込み事象（選択マーカーが多能性遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込まれ、多能性遺伝子プロモーターの調節下にあるようにノックインベクターが所望の内因性多機能性遺伝子に組み込まれる事象）についてスクリーニングする。次いで、所望のＥＳ細胞を使用して、全ての細胞型が正確な組み込み事象を含むトランスジェニックマウスを産生する。所望の細胞型を、トランスジェニックマウスから選択的に得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができる。１つの実施形態では、それぞれ異なる組み込み構築物を保有する２つ以上のトランスジェニックマウスを作製することができる。次いで、これらのマウスを交配させて、複数の所望の組み込み構築物を保有するマウスを生成することができる。例えば、選択マーカーに連結された内因性多能性遺伝子を保有するように第１のトランスジェニックマウス型を作製することができる一方で、誘導性プロモーター下で導入遺伝子として発現される多能性遺伝子を保有するように第２のトランスジェニックマウス型を作製することができる。次いで、これらの２つのマウス型を交配させて、内因性多能性遺伝子および誘導性プロモーター下で導入遺伝子として発現されるさらなる多能性遺伝子に連結された両方の選択マーカーを有するトランスジェニックマウスを生成することができる。これら２つの多能性遺伝子は同一であっても同一でなくても良い。以下の多数の変動が意図される：マーカーに連結された内因性多能性遺伝子の同一性、導入遺伝子として発現される多能性遺伝子の同一性、選択マーカーに連結された内因性多能性遺伝子の数、および導入遺伝子として発現される多能性遺伝子の数。本発明は、これらの変動の全ての可能な組み合わせを含む。他の実施形態では、一方のマウスは選択マーカーに連結された内因性多能性遺伝子を保有し、一方のマウスは以下にさらに考察されたＤＮＭＴ遺伝子にターゲティングされたＲＮＡｉ薬をコードするＤＮＡを保有する（それにより、ＤＮＭＴ遺伝子の発現を阻害することができる）。
【０１０４】
あるいは、本発明の操作された分化した体細胞を、体細胞への所望の構築物の直接導入によって産生することができる。ＤＮＡ構築物を、当該分野で公知の任意の標準的な技術（ウイルストランスフェクション（例えば、アデノウイルス系を使用）またはリポソーム媒介トランスフェクションなど）によって細胞に導入することができる。標的化組み込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を使用して体細胞を生成するための当該分野で公知の任意の手段を使用して、本発明の体細胞（例えば、選択マーカーが内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された細胞または内因性遺伝子が条件プロモーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）または部位特異的リコンビナーゼ部位の遺伝子内または遺伝子付近への導入によって条件的にされた細胞）を産生することができる。
【０１０５】
哺乳動物細胞では、相同組換えは、非相同組換えと比較してはるかに低い頻度で起こる。非相同組換え事象を超える相同組換え事象の選択を容易にするために、少なくとも２つの以下の富化方法が開発されている：正の選択−負の選択（ＰＮＳ）法および「プロモーターレス（ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ）」選択法（Ｓｅｄｉｖｙ  ａｎｄ  Ｄｕｔｒｉａｕｘ，１９９９）。簡潔に述べれば、ＰＮＳ（第１の方法）は、遺伝子用語で負の選択である。この負の選択は、ターゲティングベクターに隣接して存在する負に選択可能な遺伝子の使用に依存することによって不正確な（非相同性）遺伝子座での組換えを淘汰する。他方では、第２の方法である「プロモーターレス」選択は、遺伝子用語で正の選択である。この正の選択は、その発現によって相同性標的部位での組換えが条件的にされる正に選択可能な遺伝子の使用に依存することによって正確な（相同性）遺伝子座での組換えを選択する。Ｓｅｄｉｖｙ  ａｎｄ  Ｄｕｔｒｉａｕｘの開示は本明細書中で援用される。
【０１０６】
本明細書中に記載のように、少なくとも１つの再プログラミング薬と接触された分化した体細胞を評価して、多分化能または多能性に再プログラミングされた細胞を再プログラミングされなかった細胞と識別する。１つまたは複数の多能性の特徴を証明するか、多能性の１つまたは複数のマーカーを示す細胞をそうでない細胞と識別することによってこれを行うことができる。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、用語「多能性の特徴」は、多能性に関連する多数の特徴（例えば、全細胞型に分化する能力および多能性細胞に明らかな発現パターン（多能性遺伝子の発現、他のＥＳ細胞マーカーの発現が含まれる）、ならびに、大域的レベルでの「幹細胞シグニチャー」または「ステムネス（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」として公知の異なる発現プロフィールが含まれる）をいう。
【０１０８】
したがって、多能性の特徴について再プログラミングされた体細胞を評価するために、異なる成長の特徴およびＥＳ細胞様形態学についてかかる細胞を分析することができる。細胞を免疫低下ＳＣＩＤマウスに皮下注射して、奇形腫を誘導することができる（標準的なＥＳ細胞アッセイ）。ＥＳ様細胞を胚様体に分化することができる（別のＥＳに特異的な特徴）。さらに、特定の細胞型への分化を駆動することが公知の一定の成長因子の添加によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＳ様細胞を分化することができる。テロメラーゼ活性の誘導によって示される自己複製能力は、モニタリングすることができる別の多能性の特徴である。胚盤胞への再プログラミングされた体細胞の導入および細胞が全ての細胞型を生じることができるかどうかの決定によって再プログラミングされた体細胞の機能アッセイを行うことができる。Ｈｏｇａｎら，２００３を参照のこと。再プログラミングされた細胞がいくつかの細胞型を形成することができる場合、これらは多分化能を示す。再プログラミングされた細胞が身体の全ての細胞型（生殖細胞が含まれる）を形成することができる場合、これらは多能性を示す。
【０１０９】
再プログラミングされた体細胞中の各多能性遺伝子発現を試験して、その多能性の特徴を評価することもできる。さらに、他のＥＳ細胞マーカーの発現を評価することができる。段階特異的胎児１５抗原である−１、−３、および−４（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４）は、初期胚発生で特異的に発現する糖タンパク質であり、ＥＳ細胞のマーカーである（Ｓｏｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：５５６５−５５６９；Ｋａｎｎａｇｉら，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２：２３５５−２３６１）。酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の増加は、未分化胚性幹細胞に関連する別のマーカーである（Ｗｏｂｕｓら，１９８４，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  １５２：２１２−２１９；Ｐｅａｓｅら，１９９０，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４１：３２２−３５２）。他の幹細胞／前駆細胞マーカーには、中間体神経フィラメントであるネスチン（Ｌｅｎｄａｈｌら，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６０：５８５−５９５；Ｄａｈ−Ｉｓｔｒａｎｄら，１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０３：５８９−５９７）、膜糖タンパク質であるプロミニン／ＡＣ１３３（Ｗｅｉｇｍａｎｎら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ９４：１２４２５−１２４３０；Ｃｏｒｂｅｉｌら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１：２６２５−２２６２６）、転写因子Ｔｃｆ−４（Ｋｏｒｉｎｅｋら，１９９８，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３７９−３８３；Ｌｅｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４．１  ５６６−１  ５７２）、および転写因子であるＣｄｘ１（Ｄｕｐｒｅｙら，１９８８，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：１６４７−１６５４；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａ’ｎら，１９９８，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
６４：１１−１８）が含まれる。さらなるＥＳ細胞マーカーは、Ｇｉｎｉｓ，Ｉ．ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２６９：３６９−３８０，２００４に記載されている。例えば、ＲＥＸ−１、ＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＴＲＦ−１、ＴＲＦ−２、コネキシン４３、コネキシン４５、ＦＧＦＲ−４、ＡＢＣＧ−２、およびＧｌｕｔ−１を使用する。
【０１１０】
再プログラミングされた体細胞の発現プロファイリング分析をさらに行ってその多能性の特徴を評価することができる。多能性細胞（胚性幹細胞など）および多分化能細胞（成体幹細胞など）は、大域的遺伝子発現プロフィールの異なるパターンを有することが知られている。この異なるパターンを、「幹細胞分子シグニチャー」または「ステムネス」という。例えば、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：５９７−６００（２００２）；Ｉｖａｎｏｖａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：６０１−６０４を参照のこと。分子ＤＮＡの後成的状態を評価することができる。大域的ＤＮＡ脱メチル化に対する細胞の耐性を評価することができる。細胞の発生能力を評価することができる。いくつかの実施形態では、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞を含む奇形腫を形成することができ、そして／または（マウス胚盤胞への注射後に）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力を有する細胞を多能性と見なす。
操作した体細胞およびかかる細胞を含むトランスジェニックマウス
本発明は、さらに、ＤＮＡメチル化を調節することができる操作された体細胞を提供する。「ＤＮＡメチル化」を、当該分野でのその使用と一致して、メチル基のシトシンへの結合による真核生物ＤＮＡの改変をいうために本明細書中で使用される。当該分野で公知のように、ＤＮＡのシトシンメチル化は後成的遺伝子調節およびゲノム完全性の維持で重要な役割を果たす。哺乳動物細胞は、ＤＮＡ中に存在するシトシンへのメチル基の輸送を担ういくつかの異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを有する（Ｇｏｌｌ，Ｇ，ａｎｄ
Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７４：４８１−５１４，２００５）。少なくとも３つの遺伝子が、哺乳動物細胞中でのゲノムメチル化の確立および維持に関与する（すなわち、ｄｅ  ｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼであるＤＮＭＴ３ａおよびＤＮＭＴ３ｂならびにヘミメチル化ＤＮＡをメチル化するだけでなく、非メチル化ＤＮＡをメチル化する能力も示す維持酵素ＤＮＭＴ１をコードする遺伝子）。マウスの変異分析により、これら３つの遺伝子が不可欠であり、Ｄｎｍｔ１−ヌル胚中では原腸形成の直後に死亡し、機能的Ｄｎｍｔ３ａ遺伝子またはＤｎｍｔ３ｂ遺伝子を欠く胚の場合ではより後の時点で死亡することが証明されている（Ｌｉ，１９９２；Ｏｋａｎｏら，Ｃｅｌｌ，９９（３）：２４７−５７，１９９９）。多数の遺伝子の異常な調節がこれらの胚で認められた。データは、哺乳動物発生中の多数の細胞型で起こり、適切な細胞分化に必要である可能性が高い転写サイレンシングのためのＤＮＡメチル化要件と一致する。
【０１１１】
本発明は、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）遺伝子（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはＤｎｍｔ３ｂなど）の発現を調節することができ、そして／または非操作体細胞と比較して内因性Ｄｎｍｔ遺伝子の発現が変化する細胞を提供する。一定の実施形態では、体細胞は、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）遺伝子（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはＤｎｍｔ３ｂなど）の発現を干渉するＲＮＡをコードする外因的に導入した遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を干渉する。「ＲＮＡｉ」を、当該分野でのその意味と一致して、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がｄｓＲＮＡの一方の鎖と相補的な対応するｍＲＮＡの配列特異的分解または翻訳抑制を誘発する現象をいうために本明細書中で使用する。ｄｓＲＮＡ鎖とｍＲＮＡ鎖との間の相補性は１００％である必要はないが、遺伝子発現の阻害（「サイレンシング」または「ノックダウン」ともいう）を媒介するのに十分であることのみ必要であると認識されるであろう。例えば、相補度は、鎖が、（ｉ）ＲＮＡ誘導サイレンシング誘導体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体中でｍＲＮＡ切断をガイドすることができるか、（ｉｉ）ｍＲＮＡの翻訳を抑制することができるような程度である。一定の実施形態では、ＲＮＡの二本鎖部分は、約３０ヌクレオチド長未満、例えば、１７ヌクレオチド長と２９ヌクレオチド長との間である。哺乳動物細胞では、適切な二本鎖核酸を細胞に導入することまたは細胞中で核酸を発現させ、その後に細胞内でプロセシングして細胞内でｄｓＲＮＡを得ることによってＲＮＡｉを行うことができる。
【０１１２】
本発明の目的のために、任意選択的に細胞内プロセシングした後の遺伝子発現の配列特異的阻害を誘発することができる少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡを、「ＲＮＡｉ薬」という。ＲＮＡｉを媒介することができる例示的核酸は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびミクロＲＮＡ前駆体である。これらの用語は周知であり、当該分野でのその意味と一致して本明細書中で使用される。ｓｉＲＮＡは、典型的には、相互にハイブリッド形成して二重鎖を形成する２つの個別の核酸鎖を含む。ｓｉＲＮＡを、例えば、標準的な核酸合成技術を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。ｓｉＲＮＡは、広範な種々の改変ヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）を含むことができ、化学的または生物学的に改変された塩基、改変骨格などを含むことができる。当該分野でＲＮＡｉに有用であると認識されている任意の改変を使用することができる。いくつかの改変により、安定性、細胞取り込み、力価などが増加する。一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の二重鎖および１〜５ヌクレオチド長の１つまたは２つの３’オーバーハングを含み、これらはデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。ｓｈＲＮＡは、支配的な非自己相補領域によって分離された２つの相補部分を含む１つの核酸鎖を含む。相補部分はハイブリッド形成して二重鎖構造を形成し、非自己相補領域はループを形成し、このループが二重鎖の一方の鎖の３’末端および他方の鎖の５’末端に連結する。ｓｈＲＮＡは細胞内プロセシングされてｓｉＲＮＡを生成する。
【０１１３】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、（哺乳動物系では）約２１〜２５ヌクレオチドの小さな非コード一本鎖ＲＮＡであり、配列特異的様式で遺伝子発現を阻害する。ミクロＲＮＡは、相補性が不完全な１つまたは複数の領域をしばしば含む二重鎖を含む短いヘアピン（約７０ヌクレオチド長）から構成される特徴的な二次構造を有する前駆体から細胞内に生成される。天然に存在するｍｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡと部分的にのみ相補的であり、典型的には、翻訳抑制を介して作用する。本明細書中で使用する場合、用語「ｓｈＲＮＡ」は、内因性ミクロＲＮＡ前駆体に対してモデリングされたＲＮＡｉ薬を含む。いくつかの実施形態では、ステム−ループ構造のステム部分をコードするか完全なステム−ループをコードする配列を、例えば、内因性ミクロＲＮＡまたは最小の（約７０ヌクレオチド）ミクロＲＮＡヘアピンをコードする配列の代わりに内因性ミクロＲＮＡ一次構築物の少なくとも一部を含む核酸に挿入することができる。
【０１１４】
当業者は、遺伝子発現を阻害するための適切なＲＮＡｉ薬を同定することができるであろう。かかるＲＮＡｉ薬を、遺伝子およびコードされたｍＲＮＡ「にターゲティングされている」という。ＲＮＡｉ薬は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはそのコードされたタンパク質の平均定常状態レベルを、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えて減少させるのに十分に発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ薬は、１７〜２９ヌクレオチド長（例えば、１９〜２３ヌクレオチド長（ｍＲＮＡと１００％相補的である）または１、２、３、４、もしくは５個までのヌクレオチドまたは約１０〜３０％ヌクレオチドまで（最大数の相補塩基対を達成するためにｍＲＮＡとアラインメントした場合にワトソン−クリック塩基対に関与しない）の配列を含むことができる。ＲＮＡｉ薬は、１７〜２９ヌクレオチド長（全てのヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対に関与するか約１０〜３０％のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対に関与しない）の二重鎖を含むことができる。当業者は、配列の特徴がかかるｓｉＲＮＡをデザインすることができるよりすぐれたｓｉＲＮＡの機能性およびアルゴリズムにしばしば関連することを承知している（例えば、Ｊａｇｌａ，Ｂ．ら，ＲＮＡ，１１（６）：８６４−７２，２００５）。本発明の方法は、かかる特徴を有するｓｉＲＮＡを使用することができるにもかかわらず、有用な配列の範囲はこれらの規則を満たす範囲に制限される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ薬のいずれかまたは両方の鎖の配列を、非標的遺伝子のサイレンシングを回避するように選択する。例えば、鎖は、標的ｍＲＮＡ以外の任意のｍＲＮＡと７０％、８０％、または９０％未満で相補であり得る。いくつかの実施形態では、複数の異なる配列を使用する。以下の表は、ＤＮＭＴ１、３ａ、および３ｂをコードするヒト遺伝子およびマウス遺伝子ならびにこれらの遺伝子のサイレンシングのための例示的ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の遺伝子ＩＤを列挙している。ＨＰＲＴについての類似の情報も含まれる。当業者は、公的に利用可能なデータベース中に任意の目的の遺伝子についての遺伝子ＩＤ、受入番号、および配列情報を容易に見出すことができる。当業者は、これらの遺伝子または他の遺伝子をサイレンシングするようにｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを容易にデザインすることができる。いずれかの末端または両方の末端でのさらなるヌクレオチドの組み込みによって配列を変化および／または伸長することができると認識されるであろう。さらに、複数のイソ型が存在する場合、目的の所与の細胞型または生物中で発現する全てのイソ型に存在する領域に対してターゲティングするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをデザインすることができる。
【０１１５】
【化１】
2020014479.tif 000003
【０１１６】
【化２】
2020014479.tif 000004
体細胞中でＲＮＡｉ薬を発現するために、当該分野で公知のように、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されたＲＮＡｉ薬をコードする配列を含む核酸構築物を細胞に導入することができる。本発明の目的のために、目的のＲＮＡまたはポリペプチドをコードする配列を含む核酸構築物（この配列は、目的の細胞中での転写を指示するプロモーターなどの発現調節エレメントに作動可能に連結される）を、「発現カセット」という。プロモーターは、哺乳動物細胞中で機能的なＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩプロモーターであり得る。一定の実施形態では、プロモーターは、体細胞に導入された場合に機能的であるプロモーターである。一定の実施形態では、ＲＮＡｉ薬の発現は条件的である。いくつかの実施形態では、調節可能な（例えば、誘導性または抑制性）プロモーターの調節下でＲＮＡｉ薬をコードする配列の配置によって発現を調節する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現の調節は、部位特異的リコンビナーゼに依存する。遺伝子の調節された可逆的発現を達成するための部位特異的リコンビナーゼおよびその使用方法は、当該分野で公知である。かかるリコンビナーゼは、特異的核酸配列を認識し、これらの部位の間に存在する配列への挿入または配列の切り出しを媒介するタンパク質である。リコンビナーゼ系には、特に、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系およびＦｌｐ−Ｆｒｔ系が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ薬のコード配列の少なくとも一部は、リコンビナーゼ部位の間に存在する。細胞中のリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の発現または細胞へのその外因的導入により、部位間に存在するコード配列の一部が切り出され、遺伝子発現が恒久的にオフになる。いくつかの実施形態では、細胞中での遺伝子発現は、プロモーターエレメントと転写開始部位との間またはプロモーターエレメントの異なる部分との間（例えば、ＴＡＴＡボックスとプロモーターエレメントの第２の部分との間）に存在する「ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ）」配列の存在に起因して妨害される。ストッパー配列はリコンビナーゼ部位に隣接し、この部位は、プロモーターと転写開始部位との間またはプロモーターエレメントの異なる部分の間にも存在する。細胞へのリコンビナーゼの発現または導入によってストッパー配列が切り出され、それにより、プロモーターが転写開始部位と作動可能に会合するか機能的プロモーターを再構成し、それにより、転写が進行する。いくつかの実施形態では、細胞は、リコンビナーゼ発現が誘導性発現調節エレメント（誘導性プロモーターなど）の調節下にある発現カセットを含む。リコンビナーゼ発現を、例えば、小分子（例えば、テトラサイクリンまたはそのアナログ、エストロゲンまたは糖質コルチコイドなどのホモログ、金属など）などの適切な誘導薬を細胞または生物に投与することまたはリコンビナーゼをコードする発現ベクターを細胞または生物に導入することによって誘導する。例えば、米国特許第６，９９５，０１１号およびＶｅｎｔｕｒａら（リファレンスセット２のリファレンス１３）を参照のこと。１つの実施形態では、プロモーターはＵ６プロモーターであり、Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ配列を、近位配列エレメント（ＰＳＥ）とＴＡＴＡボックスとの間またはＴＡＴＡボックスと転写開始部位との間に挿入する。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）中のＴＡＴＡボックスを、Ｃｒｅ媒介組換えを受ける能力を保持し、且つ機能性ＴＡＴＡボックスを含む二機能性ｌｏｘ部位（ＴＡＴＡｌｏｘ）と置換してこれを使用し、その結果、組換え後のＰＳＥ、ＴＡＴＡ、および転写開始部位の間隔が変化しない（Ｖｅｎｔｕｒａら，２００４）
いくつかの実施形態では、本発明は、機能的であるが、第１のリコンビナーゼを発現するか細胞に導入することによって非機能性にすることができるＤｎｍｔ遺伝子の第１のコピーおよび非機能性であるが、第２のリコンビナーゼを発現するか細胞に導入することによって機能性にすることができるＤｎｍｔ遺伝子の第２のコピーを含む細胞を提供する。遺伝子またはその不可欠な部分の第１のコピーを、例えば、第１のリコンビナーゼが存在する場合に遺伝子またはその一部が切り出されて遺伝子が非機能性になるように第１のリコンビナーゼ部位に隣接する。遺伝子の第２のコピーは、例えば、第２のリコンビナーゼ部位の間に存在するストッパー配列を含むことができる。ストッパー配列は、機能的ＤＮＭＴタンパク質の合成を妨害する。例えば、ストッパーは、プロモーターと転写開始部位との間に存在して転写を妨害することができるか、ＤＮＭＴタンパク質に挿入してこのタンパク質を非機能性にすることができる。第２のリコンビナーゼが存在する場合、ストッパー配列が切り出されて機能的ＤＮＭＴが産生される。いくつかの実施形態では、検出可能に転写されないか、転写される場合、転写レベルが少なくとも１／１００に減少する場合、遺伝子は「非機能性」と見なされる。いくつかの実施形態では、「非機能性」遺伝子は、その触媒ドメインの少なくとも９０％および／またはその局在化ドメインの少なくとも９０％を欠くＤＮＭＴタンパク質をコードする。当業者は、非機能的Ｄｎｍｔ１、３ａ、および／または３ｂ遺伝子を生成することができるであろう。遺伝子を試験して、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの使用または遺伝子がＤｎｍｔ１、３ａ、または３ｂノックアウトの致死性をレスキューすることができるかどうかの決定によって遺伝子が機能的タンパク質をコードするかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態では、「非機能的遺伝子」は、当該分野で公知の標準的なアッセイを使用した適切な基質（例えば、ＤＮＭＴ１の場合はヘミメチル化ＤＮＡ）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそのＤＮＡメチル化活性が少なくとも９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて減少するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、非機能的遺伝子は、目的の体細胞（初代哺乳動物線維芽細胞など）中のＤＮＭＴタンパク質の唯一の供給源として存在する場合に標準的な培養条件で１０日間細胞を生存させることができるタンパク質をコードしない遺伝子である。ＤＮＡメチル化を、以下のように細胞中で調節することができる。第１に、第１のリコンビナーゼの導入または発現によってＤＮＡメチル化を阻害し、それにより、機能的ＤＮＭＴ１の発現が排除される。細胞を培養物中に維持する。機能的ＤＮＭＴ１の非存在下で、ＤＮＡ脱メチル化が長期間起こり（自発的または活性な脱メチル化の結果として）、細胞分裂後にヘミメチル化ＤＮＡは再メチル化されない。ＤＮＡメチル化を修復することが望ましい場合、第２のリコンビナーゼを細胞に導入するか発現させてストッパー配列を除去し、機能的ＤＮＭＴ１を産生させる。いくつかの実施形態では、このアプローチを適用して、ＤＮＭＴ１、３ａ、３ｂ、またはその任意の組み合わせの発現を条件的にする。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼを一過性に発現させる。例えば、リコンビナーゼが、約１〜２日後、２〜７日後、１〜２週間後などに検出不可能になる。一過性トランスフェクションまたは調節可能なプロモーターからの発現によって一過性発現を行うことができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼを外部供給源に導入する。任意選択的に、リコンビナーゼは、これらの実施形態では、ポリペプチドの細胞取り込みを増強するアミノ酸配列（「タンパク質形質導入ドメイン」ともいう）を含む。かかる取り込み増強アミノ酸配列は、例えば、ＨＩＶ−Ｉ  ＴＡＴタンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＤＮＡ結合ドメインＶＰ２２、およびショウジョウバエアンテナペディア（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子などで見出される。例えば、高塩基性アミノ酸（ＬｙｓおよびＡｒｇ）を含有する合成ペプチドも使用される。さらなる有用な配列については、米国特許出願公開第２００６０１４８１０４号を参照のこと。いくつかの実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されたリコンビナーゼをコードする配列を含む発現かセットを含むベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター））での細胞の感染によってリコンビナーゼ発現を行う。ベクターは、リコンビナーゼを一過性発現させるか（例えば、細胞ゲノムに安定に組み込まれない）、安定に遺伝するエピソームが得られるベクターであり得る。本発明の一定の実施形態では、操作された体細胞は機能的ｐ５３経路を含む（ｐ５３経路の説明についてはＨａｒｒｉｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：２８９９−２９０８，２００５）。かかる細胞は、機能的ｐ５３遺伝子を含み、体細胞中のｐ５３依存性アポトーシスを誘導することが当該分野で公知のＤＮＡ損傷、低酸素症，および／または種々の化学療法薬（例えば、微小管インヒビター）に対する曝露などの種々のストレスに応答してｐ５３依存性細胞周期の停止および／または細胞死が起こりうる。いくつかの実施形態では、ｐ５３依存性経路によってアポトーシスが起こる。いくつかの実施形態では、ｐ５３依存性経路によって細胞老化が起こる。当業者は、例えば、ｐ５３依存性細胞周期の停止または死滅を誘導することが公知の条件への細胞の曝露および機能的ｐ５３依存性経路の存在と一致する様式で細胞が応答するかどうかの決定によって細胞が機能的ｐ５３経路を有するかどうかを決定することができるであろう。一般に、哺乳動物被験体から得た非癌性体細胞は、機能的ｐ５３経路を保有すると予想される。
【０１２０】
本発明の一定の実施形態では、体細胞はＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す。本明細書中で使用する場合、細胞がＤＮＡメチル化減少条件下で生存または増殖する能力の減少を示す場合、細胞はＤＮＡ脱メチル化に「感受性を示す」。ＤＮＡメチル化は、種々の異なる体細胞型（特に、増殖している体細胞）の生存に必要である。例えば、Ｄｎｍｔ１遺伝子は、Ｃｒｅ媒介組換えによって増殖線維芽細胞中で非機能的にされ、Ｃｒｅが発現される構築物の導入から３〜５日後に細胞は漸増的ＤＮＡ脱メチル化を示し、構築物の導入から５日後と６日後との間で死滅する（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｇｒｕｓｂｙら）。ＤＮＡ脱メチル化は、種々の体細胞型の増殖によって共有される性質であり、Ｄｎｍｔ１、３ａ、および３ｂが不可欠な遺伝子であるという事実と一致する。対照的に、ＥＳ細胞は、分化するように誘導されない限り、機能的ＤＮＭＴ１の非存在下で生存および増殖することができる。
【０１２１】
一定の実施形態では、本発明の細胞集団は、平均して、細胞のゲノムＤＮＡ中のメチル化シトシン数が、「標準的条件」下で示されるレベルと比較して少なくとも５％減少するという点で特徴づけられる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ中のメチル化シトシン数が、平均して、標準的条件下で示されるレベルと比較して５％と１０％との間、１０％と２５％との間、２５％と５０％との間、５０％と７５％との間、７５％と９５％との間、または９５％と１００％との間で減少するような条件に細胞集団を供する。本発明の一定の実施形態では、少なくとも１０、２０、５０、または１００個の遺伝子および／または遺伝子エレメント（ＩＡＰ、Ｌ１、ＬＩＮＥ、またはＳＩＮＥエレメントなど）または内因性レトロウイルスエレメントの平均メチル化量（すなわち、平均メチル化シトシン数）は、脱メチル化条件に供さなかった他の同一の細胞集団と比較して細胞集団中で減少する。一定の実施形態では、細胞集団中のＤｎｍｔ  ｍＲＮＡ（例えば、Ｄｎｍｔ１  ｍＲＮＡ）の平均発現レベルは、その通常レベルの５０％未満である。いくつかの実施形態では、細胞集団中のＤＮＭＴタンパク質（例えば、ＤＮＭＴ１タンパク質）の平均発現レベルは、その通常レベルの５０％未満である。
【０１２２】
体細胞（初代線維芽細胞など）の増殖において細胞周期の停止または細胞死が起こるレベルにＤＮＡメチル化が減少する場合に細胞が生存または増殖することができる場合、細胞は「ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示す」という。本発明の一定の実施形態では、「増殖細胞」は、適切な培養条件下に維持した場合に９６時間以内に分裂すると予想される細胞である。一定の実施形態では、増殖細胞は、適切な培養条件下に維持した場合に７２時間以内に分裂すると予想されるであろう。いくつかの実施形態では、細胞は、４８時間以内または２４時間以内に分裂すると予想されるであろう。言い換えれば、細胞（およびその子孫）を適切な条件下で培養物中に維持した場合、細胞総数は２４、４８、７２、または９６時間以内に２倍になるであろう。「適切な培養条件」は、目的の体細胞型の生存および増殖に適切な当該分野で公知の標準的な培養条件をいう。例えば、Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊ．（ｅｄ．）Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ｆｒｅｓｈｅｙ，Ｉ．ら，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ
Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２００５を参照のこと。
【０１２３】
（ａ）内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性の阻害の阻害または内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるＤＮＡメチル化の阻害（例えば、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を阻害するかＤＮＡメチル化を阻害する薬剤との細胞の接触）、（ｂ）細胞中でのＤＮＭＴによる内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を阻害するかＤＮＡメチル化を阻害する薬剤の発現、（ｃ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ以外の内因性タンパク質（このタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによってシトシンへのメチル基の輸送のための基質を供給する生化学経路の任意の工程に必要である）の発現または活性の阻害；（ｄ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ以外の内因性タンパク質（このタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによってシトシンへのメチル基の輸送のための基質を供給する生化学経路の任意の工程に必要である）の発現または活性を阻害する薬剤の細胞中の発現、および／または（ｅ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるシトシンへのメチル基の輸送のための基質の合成に必要な栄養が枯渇している条件下（しかし、別の方法で細胞生存を補助するのに十分な栄養素の存在下）での細胞の培養によってＤＮＡメチル化を減少させることができる。（ｂ）または（ｄ）に記載の細胞中の薬剤を、かかる発現を誘導または抑制解除する薬剤と細胞を接触させるかそうでなければかかる発現を生じさせる（例えば、リコンビナーゼ媒介機構による）ことによって発現させることができる。ＤＮＡ脱メチル化を減少させるための任意の上記方法（または当該分野で公知の任意の他の方法）で処理した細胞は、「ＤＮＡ脱メチル化条件」に供したといわれる。例えば、ＤＮＭＴ発現を阻害するＲＮＡｉ薬の発現を誘導する薬剤と接触したか、ＤＮＭＴ遺伝子を不活化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビターまたはリコンビナーゼと接触した細胞を、ＤＮＡ脱メチル化条件に供した。
【０１２４】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＭＴ、３ａ，および／または３ｂであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１のみの発現および／または活性を阻害する。他の実施形態では、ＤＮＭＴ１およびＤＮＭＴ３ａまたは３ｂのいずれかの発現および／または活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１、３ａ、および３ｂの発現および／または活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ以外の内因性タンパク質は、細胞中のＤＮＡメチルトランスフェラーゼによってシトシンへのメチル基の輸送のための基質を供給する生化学経路の任意の工程に必要な内因性の輸送体または酵素である。いくつかの実施形態では、条件の組み合わせを使用する。例えば、少なくとも１つのＤＮＭＴを阻害し、ＤＮＡメチル化に必要な栄養素の少なくともいくつかを欠く条件で細胞を培養する。別の実施形態では、ＤＮＡメチル化（５’アザ−シチジンなど）を阻害する小分子と細胞を接触させ、ＤＮＭＴ１、３ａ、または３ｂの発現を阻害するＲＮＡｉ薬を細胞中で発現させる。一定の実施形態では、ＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す細胞は、ＤＮＡメチル化が減少する場合および／またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性が阻害される場合に細胞周期の停止または細胞死を生じ、ＤＮＡ脱メチル化が起こる。
【０１２５】
種々のＤＮＡメチル化インヒビターは当該分野で公知であり、本発明で使用される。例えば、Ｌｙｋｏ，Ｆ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．，ＪＮＣＩ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９７（２０）：１４９８−１５０６，２００５を参照のこと。ＤＮＡメチル化のインヒビターには、ヌクレオシドＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター（５−アザシチジン、５−ａｚａデオキシシチジン、およびゼブラリンなど）、非ヌクレオシドインヒビター（ポリフェノール（−）−エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）および小分子ＲＧ１０８（２−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸）など）、ＷＯ２００５０８５１９６に記載の化合物およびフタルアミド、スクシンイミド、およびＷＯ２００７００７０５４に記載の関連化合物が含まれる。３つのさらなる化合物クラスを以下に示す：（１）４−アミノ安息香酸誘導体（抗不整脈薬プロカインアミドおよび局所麻酔薬プロカインなど）；（２）プサムマプリン（ヒストンデアセチラーゼも阻害する）（Ｐｉｎａ，Ｉ．Ｃ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．，６８（１０）：３８６６−７３，２００３）、および（３）オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＧ９８など）が含まれる）。ＤＮＡメチル化インヒビターは、種々の異なる機構によって作用することができる。ヌクレオシドインヒビターは、ＤＮＡに組み込まれる前に細胞経路によって代謝される。組み込み後、これらのインヒビターはＤＮＭＴ酵素の自殺基質（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として機能する。非ヌクレオシドインヒビターであるプロカイン、エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、およびＲＧ１０８は、ＤＮＭＴ標的配列（すなわち、プロカイン）のマスキングまたは酵素（すなわち、ＥＧＣＧおよびＲＧ１０８）の活性部位の遮断によってＤＮＡメチルトランスフェラーゼを阻害すると提案されている。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化インヒビターの組み合わせを使用する。いくつかの実施形態では、細胞に及ぼす毒作用を最少にするために濃縮物を選択する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに組み込む薬剤（または代謝産物をＤＮＡに組み込む薬剤）を使用しない。本発明の一定の実施形態では、細胞ゲノムＤＮＡ中のメチル化シトシン数が「標準的条件下」（特定の目的の細胞型のために当該分野で公知であり、且つ日常的に使用される哺乳動物被験体の体内の条件または適切な細胞培養条件を意味する）で存在するレベルと比較して少なくとも５％減少する場合、細胞中のＤＮＡメチル化は「減少した」と見なされ、細胞のＤＮＡは少なくとも部分的に「脱メチル化した」と見なされる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ中のメチル化シトシン数は、標準的条件下（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのインヒビターの投与または発現の誘導の前）で存在するレベルと比較して、５％と１０％との間、１０％と２５％との間、２５％と５０％との間、５０％と７５％との間、７５％と９５％との間、または９５％と１００％との間で���少する。本発明の一定の実施形態では、細胞ゲノムＤＮＡ中のメチル化ＣｐＧ配列数が「標準的条件下」（特定の目的の細胞型のために当該分野で公知であり、且つ日常的に使用される哺乳動物被験体の体内の条件または適切な細胞培養条件を意味する）で存在するレベルと比較して少なくとも５％減少する場合、細胞中のＤＮＡメチル化は「減少した」と見なされ、細胞のＤＮＡは少なくとも部分的に「脱メチル化した」と見なされる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ中のメチル化ＣｐＧ配列数は、標準的条件下（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのインヒビターの投与または発現の誘導の前）で存在するレベルと比較して、５％と１０％との間、１０％と２５％との間、２５％と５０％との間、５０％と７５％との間、７５％と９５％との間、または９５％と１００％との間で減少する。一定の実施形態では、細胞を大域的ＤＮＡ脱メチル化に供する。「大域的ＤＮＡ脱メチル化」は、１つまたはいくつかの特異的遺伝子座とは対照的にゲノム中の多数の位置で起こるＤＮＡ脱メチル化をいう。本発明の一定の実施形態では、大域的ＤＮＡ脱メチル化により、少なくとも１０、２０、５０、または１００個の遺伝子および／または遺伝子エレメント（ＩＡＰ、Ｌ１、ＬＩＮＥ、またはＳＩＮＥエレメントなど）または内因性レトロウイルスエレメントのメチル化（すなわち、メチル化シトシン数）が減少する。当業者は、細胞のＤＮＡが脱メチル化されたかどうかを定量的に決定し、そして／または脱メチル化範囲を決定することが容易にできるであろう。例えば、当業者は、一定の制限酵素および／またはＤＮＡ切断薬がメチル化ＤＮＡのみを認識するという事実を使用することができる。一定の実施形態では、亜硫酸水素塩配列決定を使用する。１つの実施形態では、ＤＮＡ反復エレメントの亜硫酸水素塩処理およびその後のＰＣＲ増幅を使用する（Ｙａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（３）：ｅ３８，２００４）。一定の実施形態では、ＨＰＬＣまたは最近接分析（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、５−メチルシトシンを定量する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、脱メチル化条件へ細胞を供してから３０日以下の日数以内（例えば、１５日以下の日数以内、１０日以内、５日以内など）で起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、脱メチル化条件へ細胞を供してから５〜６日以内に起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、非脱メチル化条件下で１０細胞周期を完了するために細胞に必要とされる期間の１０倍以内（例えば、脱メチル化条件へ細胞を供した後の５〜１０細胞周期倍（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｔｉｍｅｓ）または２〜５細胞周期倍）で起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、細胞中でＤｎｍｔ遺伝子にターゲティングしたＲＮＡｉ薬の発現誘導から３０日以下の日数以内（例えば、１５日以下の日数以内、１０日以内、５日以内など）で起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、細胞中でＤｎｍｔ遺伝子にターゲティングしたＲＮＡｉ薬の発現誘導から５〜６日以内に起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、Ｄｎｍｔ遺伝子が正常に発現する条件下で１０細胞周期を完了するために細胞に必要とされる期間の１０倍以内（例えば、細胞中でＤｎｍｔ遺伝子にターゲティングしたＲＮＡｉ薬の発現誘導後の５〜１０細胞周期倍または２〜５細胞周期倍）で起こる。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、３０日以下の日数後に起こり、その間に、Ｄｎｍｔ  ｍＲＮＡ（例えば、Ｄｎｍｔ１  ｍＲＮＡ）の平均発現レベルがその正常レベルの５０％未満である（例えば、１５日以下の日数後、１０日以下の日数後、または５日以下の日数後）。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、３０日以下の日数後に起こり、その間に、ＤＮＭＴタンパク質（例えば、ＤＮＭＴ１タンパク質）の平均発現レベルがその正常レベルの５０％未満である（例えば、１５日以下の日数以内、１０日後、５日後など）。いくつかの実施形態では、細胞サイクルの停止または死滅は、３０日以下の日数後に起こり、その間に、ＤＮＭＴタンパク質（例えば、ＤＮＭＴ１タンパク質）の平均メチルトランスフェラーゼ活性レベルがその正常レベルの５０％未満である（例えば、１５日以下の日数後、１０日以下の日数後、または５日以下の日数後）。
【０１２７】
本発明の方法をしばしば体細胞集団を使用して実施されると認識されるであろう。少なくとも９０％の細胞がＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す場合、体細胞集団はＤＮＡ脱メチル化に感受性を示すといわれる。いくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９、９９．９５％、またはそれを超える細胞がＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す。したがって、細胞を脱メチル化条件に供する場合、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、またはそれを超える細胞は、選択された期間以内に（例えば、３０日以内、１５日以内、１０日以内など）細胞周期の停止または死滅を受ける。細胞集団は単一の型の細胞集団であってよく、実質的に他の細胞型を含まなくてよい。本明細書中で使用する場合、「実質的に含まない」を、全細胞集団中で少なくとも純度約８０％、好ましくは純度８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える所望の細胞集団をいう。いくつかの実施形態では、所望の細胞型のみの一定期間の成長を支持する培地中で培養し、それにより、他の細胞型を実質的に含まない細胞集団が得られる。
【０１２８】
本発明の一定の実施形態では、再プログラミングされた体細胞を、ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示す細胞の選択を含む方法によって同定する。本発明は、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、（ａ）体細胞を準備する工程であって、体細胞の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および（ｂ）ＤＮＡ脱メチル化耐性を示す細胞を選択し、それにより、再プログラミングされる（例えば、ＥＳ様状態に再プログラミングされる）可能性が増加する細胞を同定する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法を使用して同定した少なくともいくつかの細胞を、ＥＳ様状態に再プログラミングした。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかの細胞を、１つまたは複数のさらなる処理に供した場合、ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示さない細胞よりも多能性状態への再プログラミングに感受性を示すように、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングした。
【０１２９】
本方法は、多数のまたはほとんどの体細胞型がＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す（すなわち、これらがそのゲノムＤＮＡの十分なメチル化を維持する能力を用いずに長期間生存や増殖することができない）という事実を使用する。対照的に、ＥＳ細胞はＤＮＡ脱メチル化に耐性を示し、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの非存在下で生存することができる。いくつかの実施形態では、体細胞集団を、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のその細胞型の非再プログラミング体細胞が条件に供してから３０日以内に増殖を停止するか死滅すると予想される条件に供する。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％のその型の非再プログラミング体細胞が、条件に供してから２０日以内に増殖を停止させるか死滅すると予想されるであろう。いくつかの実施形態では、体細胞集団を、少なくとも９５％のその細胞型の非再プログラミング体細胞が条件に供してから１５日後以内に増殖を停止させるか死滅すると予想される条件に供する。別の実施形態では、体細胞集団を、少なくとも９９％のその細胞型の非再プログラミング体細胞が条件に供してから１０日後以内に増殖を停止させるか死滅すると予想される条件に供する。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は増殖細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は線維芽細胞である。一定の実施形態では、体細胞は、外因的に導入した再プログラミング因子を発現する。一定の実施形態では、細胞は、再プログラミング薬と接触されている。いくつかの実施形態では、細胞を、ＤＮＡが脱メチル化される条件に供する。一定の実施形態では、体細胞は、内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにターゲティングされたＲＮＡｉ薬を可逆的に発現する。一定の実施形態では、本方法は、さらに、細胞を選択した後に選択された体細胞中のＲＮＡｉ薬の発現を阻害し（すなわち、減少または排除し）、それにより、選択された体細胞のゲノムＤＮＡがメチル化されるようになる工程を含む。したがって、細胞を培養物中に維持し、そして／またはその子孫を分化するように誘導するにつれてＤＮＡメチル化が起こり得る。
【０１３０】
本発明は、さらに、多能性状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、ＤＮＡ脱メチル化に感受性を示す体細胞を準備する工程、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の因子と細胞を接触させる工程、細胞を処置してゲノムＤＮＡのメチル化を減少させる工程、培養物中の細胞を一定期間維持する工程、および期間後に生存する細胞を同定し、それにより、多能性状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増大した細胞を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法を使用して同定した少なくともいくつかの細胞を、ＥＳ様状態に再プログラミングした。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかの細胞を、１つまたは複数のさらなる処理に供した場合、ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示さない細胞よりも多能性状態への再プログラミングに感受性を示すように、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングした。本発明の一定の実施形態では、次いで、細胞をかかるさらなる処理に供する。当業者は、体細胞集団を試験して、脱メチル化条件に供した場合に集団中の所望の細胞画分が生存しないように、必要な条件および期間を決定することができるであろう。
【０１３１】
例えば、Ｄｎｍｔ１遺伝子にターゲティングしたＲＮＡｉ薬の発現の誘導後に細胞を培養し、異なる時点で生存細胞を計数して、ＤＮＡメチル化減少の結果として少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞が死滅するのに必要な期間（「Ｘ」時間または日間）を決定することができる。本発明の方法を実施する場合、細胞を再プログラミングすることができる薬剤で処理され、且つＸ時間またはＸ日間生存する細胞は潜在的に再プログラミングされている。全ての生存細胞を再プログラミングすることができるわけではないと認識されるであろう。例えば、いくつかの細胞は、非再プログラミング細胞の死滅に十分なレベルでＲＮＡｉ薬を発現できない。細胞を１つまたは複数のさらなる選択または試験に供して、細胞が再プログラミングされるかどうかを決定するか、潜在的に再プログラミングされる細胞から再プログラミングされる細胞を選択することができる。例えば、時間Ｘ後に生存する細胞を、２つの転写活性Ｘ染色体（雌由来の細胞の場合）を有する細胞のスクリーニングまたは選択に供し、そして／またはＥＳ細胞などに特徴的な１つまたは複数のマーカーを発現する細胞をスクリーニングまたは選択することができる。
【０１３２】
本発明は、さらに、多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を同定する方法であって、細胞集団を準備する工程であって、細胞集団の少なくともいくつかが多能性状態に再プログラミングされており、細胞が、選択マーカーの発現が内因性多能性遺伝子の発現に実質的に適合するような様式で、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、準備する工程、およびそれにより、（選択マーカーを発現しない細胞と比較して）多能性状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、内因性多能性遺伝子はＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇである。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態学的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程を含む。当該分野で公知の形態学的基準を使用して、かかる細胞またはコロニーを選択することができる。
【０１３３】
本発明のさらなる実施形態では、再プログラミングされた体細胞を、２つの転写活性Ｘ染色体を含む細胞の選択によって同定する。１つの実施形態では、本発明は、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、その一方が不活性である、準備する工程、細胞を体細胞を再プログラミングする１つまたは複数の処理に供する工程、および不活性なＸ染色体が活性になった細胞を同定し、それにより、再プログラミングされる（例えば、ＥＳ様状態に再プログラミングされる）可能性が増加した細胞を同定する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法を使用して同定した少なくともいくつかの細胞を、ＥＳ様状態に再プログラミングした。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかの細胞を、１つまたは複数のさらなる処理に供した場合、２つの転写活性Ｘ染色体を持たない細胞よりも多能性状態への再プログラミングに感受性を示すように、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングした。本発明の一定の実施形態では、次いで、細胞をかかるさらなる処理に供する。
【０１３４】
一定の実施形態では、体細胞は２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の一方は選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、他方のＸ染色体は選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない。一定の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である。一定の実施形態では、体細胞は２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の両方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む。
【０１３５】
一定の実施形態では、体細胞は２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の両方が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、方法は、（ａ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、第１のＸ染色体が転写的に不活性である細胞集団を得る工程、（ｂ）細胞を、体細胞を再プログラミングする１つまたは複数の処理に供する工程、（ｃ）第１のＸ染色体上の選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程、および（ｄ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、第２のＸ染色体が転写的に活性である細胞を選択する工程を含む。一定の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子（例えば、Ｈｐｒｔ遺伝子）である。
【０１３６】
本発明は、さらに、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、（ａ）選択マーカーの機能的対立遺伝子を欠く活性なＸ染色体および選択マーカーの機能的対立遺伝子を含む不活性なＸ染色体を含む体細胞を準備する工程、（ｂ）体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に細胞を供する工程、および（ｃ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になった細胞を選択する工程を含む、方法を提供する。かかる細胞は、不活性なＸ染色体が転写的に活性にならなかった細胞と比較してＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する。
【０１３７】
本発明は、さらに、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、他方のＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、（ｂ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む細胞を選択する工程、（ｃ）体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に細胞を供する工程、および（ｄ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になった細胞を選択する工程を含む方法を提供する。かかる細胞は、不活性なＸ染色体が転写的に活性にならなかった細胞と比較してＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する。
【０１３８】
選択マーカーの機能的対立遺伝子を欠く第１のＸ染色体を有する体細胞を、種々の方法で調製することができる。例えば、相同組換えを使用して、対立遺伝子の全てまたは一部を欠失することができる。対立遺伝子が首尾よく不活化された細胞を、従来の方法を使用して選択することができる。あるいは、細胞を遺伝子操作できないが、その代わりに遺伝子を不活化する変異を保有することができる。細胞を変異原またはＵＶ照射などの条件に曝露してかかる変異を有する細胞集団を増加させることができたか、変異を選択圧下で自発的に生じさせることができる。１つの実施形態では、選択マーカーは、Ｈｐｒｔなどの正の選択および負の選択に使用可能なものである。かかる実施形態では、一方のＸ染色体が遺伝子の機能的対立遺伝子を欠く細胞を、マーカーを発現する細胞を淘汰する条件下で選択する。例えば、Ｈｐｒｔの場合、細胞を、チオグアニンを含む培地中での培養によって選択することができる。体細胞を再プログラミングすることができる処理に細胞を供した後、マーカーを発現する細胞を、例えば、ＨＡＴ培地中での培養によって選択する。かかる細胞は、不活性なＸ染色体を再活性化し、それにより、再プログラミングされた可能性が増加するであろう。本方法を使用して同定された少なくともいくつかの細胞は、再プログラミングされた体細胞である。
【０１３９】
本発明の一定の方法は、多分化能細胞または多能性細胞によって発現されるマーカーを発現する細胞を選択する工程を含む。マーカーを、かかる細胞中で特異的に発現させることができる。潜在的に再プログラミングされた細胞を、この細胞に結合する検出可能な標識を有する抗体の存在下で培養し、フローサイトメトリー（例えば、蛍光標示式細胞分取）を使用して、マーカー（再プログラミング状態を示す）を発現する細胞をマーカーを発現しない細胞から分離することができる。他の実施形態では、親和性ベースの分離方法を使用して、再プログラミングされた細胞を再プログラミングされない細胞から分離する。１つの実施形態では、再プログラミングされた体細胞を、この細胞に結合するＥＳ細胞表面マーカーに特異的に結合する結合剤を有する固体または半固体の支持体と細胞との細胞の接触によって選択する。支持体は、結合剤を結合することができる表面を有する。表面は、例えば、プラスチック（ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデンクロリド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド）、ガラス、金属（例えば、シリコン）、アガロースなどを含むことができる。有用な支持体には、アガロースまたはアガロースベースのマトリックス（例えば、アガロースまたはセファロースのビーズ）、磁性物質の少なくとも一部からなる粒子、スチレンまたはラテックスなどのポリマーを含む粒子、組織培養用の容器またはプレート、管（例えば、微量遠心管）、膜などが含まれる。いくつかの実施形態では、支持体は、磁性ビーズなどの粒子の集団である。かかる粒子は、しばしば、最長の軸直径（ａｘｉａｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）が１００ミクロン未満（例えば、１ミクロンと１０ミクロンとの間）であり、しばしばほぼ球体である。細胞分離のための磁性ビーズおよびその使用方法は当該分野で公知であり、多数の供給元から市販されている。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）は、磁性物質が至るところに分散しており、薄いポリマーシェルを有する超常磁性ポリマービーズである。従来の方法を使用して、この表面に結合剤を共有結合または非共有結合させることができる。結合剤は、ＥＳ細胞表面マーカーに特異的に結合する天然に存在するか人工のペプチドまたはポリペプチド、小分子、核酸（例えば、アプタマー）であり得る。１つの実施形態では、結合剤は、抗体または抗体フラグメントである。別の実施形態では、結合剤は受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、細胞を、この細胞に結合する結合剤を有する磁性ビーズの存在下にて液体培地中でインキュベートする。磁力を使用して、培地からビーズを回収する。例えば、ビーズを容器の側面に結合させて培地を除去することができる。標準的な方法（結合剤との競合またはビーズ表面上に存在する分子に結合するが細胞に結合しない親和性試薬とのビーズの接触など）を使用して、細胞をビーズから回収するか、ビーズを細胞から取り出す。
【０１４０】
あるいはまたはさらに、潜在的に再プログラミングされた細胞が由来し、従来の方法を使用して生成したＥＳ細胞中で発現されない体細胞に特徴的なマーカーを発現しない細胞を選択することができる。例えば、体細胞に特徴的であり、且つ多能性細胞上に見出されないマーカーに結合する第１の結合剤（例えば、抗体）の存在下で細胞をインキュベートすることができる。結合剤を標識する場合、フローサイトメトリーを使用して、細胞に結合した抗体を持たない細胞を単離することができる。別の実施形態では、第１の結合剤に結合する第２の結合剤を使用して、第２の結合剤に結合した第１の結合剤を有する細胞を取り出す。別の実施形態では、第１の結合剤を架橋し、これを沈殿させて、体細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を取り出す。他の細胞分離方法は、多能性細胞と体細胞との間に存在し得る平均の細胞サイズまたは密度の相違を利用することができる。例えば、一定の細胞のみが通過可能な孔を有する材料によって細胞を濾過することができる。
【０１４１】
本発明の方法を任意の順序で組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、第１のＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択し、次いで、細胞をさらなる多能性の特徴（第２のＥＳ細胞マーカーの発現、ＤＮＡメチル化に対する耐性、２つの転写活性Ｘ染色体を有することなど）について評価する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化に耐性を示し、そして／または２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択し、それにより、再プログラミングされた細胞が富化された細胞集団を得る。次いで、細胞を、第１のＥＳ細胞マーカーを発現する細胞の選択を含むさらなる富化工程に供する。任意選択的に、次いで、細胞を試験して、細胞が第２のＥＳ細胞マーカーを発現するかどうかを決定する。多数のマーカーを使用して、ＥＳ様細胞を富化し、そして／またはその発現を評価することができる。
【０１４２】
したがって、本発明により、当業者は、多能性の再プログラミングされた体細胞の精製調製物を調製することが可能である。体細胞を再プログラミングして、多能性の特徴のいずれかの一揃えを得ることができ、したがって、体細胞は多能性を示す。あるいは、体細胞を再プログラミングして、多能性の特徴のサブセットのみを得ることができる。代替法では、体細胞を再プログラミングして多分化能にすることができる。
【０１４３】
本明細書は、細胞がかかる目的のために使用可能な遺伝子改変を有し、そして／またはかかる遺伝子改変に基づいた化学的選択または遺伝的選択を使用する、再プログラミングされた細胞を同定および／または選択するための多数の方法を提供する。しかし、本明細書中で使用する場合、ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を、かかる化学的選択または遺伝的選択を使用せずに同定することができる。したがって、本発明は、遺伝子改変されない体細胞から再プログラミングされた体細胞を誘導する方法をさらに提供し、本発明の方法を使用して誘導した再プログラミングされた体細胞をさらに提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されない体細胞を、種々の種から得ることができる。例えば、適切な細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびウシなど）、ペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｓ）（例えば、イヌおよびネコなど）、霊長類、およびヒトから得ることができ、これらを使用してＥＳ様多能性細胞または多分化能細胞を誘導することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞集団由来の再プログラミングされた体細胞を含むコロニーを同定するための形態学的基準を使用する。コロニーを、１回または複数回サブクローン化および／または継代し、一定の実施形態では、それにより、ＥＳ様細胞が富化された細胞集団を得る。富化集団は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える（例えば、１００％）ＥＳ様細胞を含むことができる。本発明は、ＥＳ様状態に安定且つ遺伝的に再プログラミングされた体細胞の細胞株を提供する。
【０１４４】
「遺伝的選択」は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入し、導入された遺伝子材料によって所望の細胞（例えば、１つまたは複数の所望の特徴を有する細胞）を他の細胞と識別することが可能である方法を含む。例えば、蛍光タンパク質などの検出可能なマーカーをコードするＤＮＡに連結された内因性多能性遺伝子により、遺伝的選択が可能であろう。「化学的選択」は、望ましくない細胞に対して負の選択圧を発揮し（例えば、望ましくない細胞を死滅させるかその増殖を減速させる）、そして／または所望の細胞のみが生存および／または増殖可能である化学物質に細胞を曝露する工程を含む方法を含む。例えば、ｎｅｏなどの薬物耐性マーカーをコードするＤＮＡに連結された内因性多能性遺伝子により、薬物耐性マーカーを発現しない細胞を死滅させる化学物質（例えば、Ｇ４１８）の存在下での細胞の培養によって化学的選択が可能である。導入された遺伝子材料を使用するので、かかる選択も遺伝的選択と見なされるであろう。いくつかの実施形態では、化学的選択方法を使用するが、本方法は、細胞中で天然に見出されない遺伝子材料の存在に依存しない。例えば、化学的選択は、天然に存在する細胞産物（例えば、細胞表面マーカー）を対象とすることができる。いくつかの実施形態では、化学的選択は、抗生物質を使用しない。
【０１４５】
本発明は、再プログラミングすべき細胞の遺伝子改変を必要とせずに体細胞から再プログラミングされた体細胞を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、再プログラミングされた体細胞は、人工的にこの細胞（またはこの細胞の先祖）のゲノムに導入された外因性遺伝子材料を含まない。いくつかの実施形態では、再プログラミングされた体細胞は、人工的にこの細胞に一過性に導入されたかこの細胞（またはこの細胞の先祖）のゲノムに安定に導入された遺伝子材料を含まない。いくつかの実施形態では、細胞を、再プログラミングに寄与するタンパク質をコードする構築物で一過性にトランスフェクトし、この構築物は薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーをコードする。選択圧を、細胞が再プログラミングされるようになるのに十分な期間維持する。その後、細胞の少なくとも一部が再プログラミングするようになり、そして／または内因性多能性遺伝子（Ｏｃｔ４など）が活性化するのに十分な期間の後、第２の選択を適用して、構築物を喪失した細胞を選択する。いくつかの実施形態では、再プログラミングされた体細胞は、そのゲノム中に外因的に導入した遺伝子材料を含むが、かかる遺伝子材料を、（ｉ）再プログラミング過程を誘導し、そして／または（ｉｉ）かかる細胞中の遺伝的欠損を修正するか、治療目的のためにかかる細胞の所望のタンパク質の合成を可能にするために導入し、いずれかの場合、再プログラミングされた細胞を選択するために使用しない。再プログラミングを誘導するために行われる遺伝子改変は、その目的が再プログラミングした細胞を選択することであり、且つそれ自体が再プログラミングに寄与しない遺伝子改変と異なると認識されるであろう。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本方法は、再プログラミングされていない体細胞集団から再プログラミングされた体細胞を同定するための形態学的基準を使用する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＳ様状態に再プログラミングされていないか部分的にのみ再プログラミングされた細胞集団からＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定するための形態学的基準を使用する。「形態学的基準」を、細胞またはコロニーのサイズ、形状、構造、組成、および／または物理的形態の任意の視覚的に検出可能な態様をいうために広義で使用する。形態学ベースの同定は、細胞による特定の選択マーカー（例えば、蛍光タンパク質）の視覚的に検出可能な発現に基づいた同定と異なる。形態学的基準には、例えば、非再プログラミング細胞と比較した再プログラミング細胞のコロニーの形状、コロニー境界の鋭さ（ＥＳ様細胞コロニーに特徴的な鋭い境界）、コロニー中の細胞密度（ＥＳ様細胞コロニーに特徴的な高密度）、および／または小さなサイズおよび異なる形状などが含まれる。本発明は、コロニー（またはコロニー由来の細胞）を同定し、任意選択的に、単離する工程を含み、このコロニーは、これらの形態（ｆｉｇｕｒｅ）で示される１つまたは複数のかかる特徴を示す。
【０１４７】
再プログラミングされた体細胞を、第１の細胞培養皿で成長したコロニーおよび第２の培養皿に移したコロニーまたはその一部として同定し、それにより、再プログラミングされた体細胞を単離することができる。本明細書中で使用する場合、「組織培養皿」は、生きている細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができる任意の容器、プレート、レセプタクル、コンテナなどをいう。組織培養皿の底の少なくとも一部を、細胞が配置される基質（例えば、ゼラチンなどのタンパク質またはその混合物、マトリゲル、フィブロネクチン、または他の細胞接着分子、コラーゲン、タンパク質ベースまたは非タンパク質ベースのヒドロゲルなど）でコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、皿は支持細胞（任意選択的に、照射済）を含み、この支持細胞で皿の底の少なくとも一部をコーティングすることができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくともいくつかの再プログラミングされた体細胞を含む細胞集団から少なくともいくつかの再プログラミングされない体細胞を排除するための補体媒介溶解を使用する。１つの実施形態では、体細胞集団を、多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞）によって検出可能に発現されないが（またはかかる細胞によってはるかに低く（例えば、有意でないレベルで）発現されるが）、非再プログラミング体細胞（例えば、非再プログラミング線維芽細胞）によって発現される細胞表面マーカーに結合する補体結合抗体（例えば、ＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体）と接触させる。かかるより低いレベルは、例えば、本発明の種々の実施形態において非再プログラミング細胞で見出される平均発現レベルの２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満、または大部分の細胞の補体媒介溶解を支持するのに十分でないレベルなどであり得る。細胞を、抗体が結合する細胞の溶解を媒介するのに十分な補体成分（「補体」）でさらにコーティングする。１つの実施形態では、細胞を、血清（例えば、補体を含むマウス血清またはヒト血清）でコーティングする。１つの実施形態では、細胞を、組換え補体成分（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、およびＣ６−Ｃ９などの古典経路を媒介するのに十分な補体成分）でコーティングする。補体および抗体の存在下で生存する細胞を、再プログラミングされる可能性が増加すると同定する。本方法を使用して、再プログラミングされた細胞を富化または選択する。１つの実施形態では、細胞表面マーカーはＭＨＣクラスＩ抗原（「ＭＨＣ」）である。例えば、実施例９に示すように、ＥＳ様状態（ｉＰＳ細胞）に再プログラミングされたマウス細胞はＭＨＣをオフにする。再プログラミングする因子との形質導入後に無作為に選別し、Ｏｃｔ４活性化について分類した細胞はＭＨＣ陰性である。さらに、前記因子で形質導入した細胞集団中のＭＨＣ陰性細胞は、再プログラミングされる可能性がより高い。感染細胞を、ＭＨＣ陰性について分類した（高ＭＨＣ集団よりはるかに多数のコロニー）。補体媒介枯渇（非再プログラミング細胞の死滅）により、ＳＳＥＡ１陽性細胞が富化する。補体媒介選択により、再プログラミングを示す形態学的特徴を示すはるかに多数のコロニーが得られる。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態では、２つ以上の方法（いずれも遺伝的選択または化学的選択を使用しない）を使用する。例えば、本発明は、（ｉ）非遺伝子改変細胞集団を準備する工程であって、その細胞の少なくともいくつかがＥＳ様状態に部分的または完全に再プログラミングされている、準備する工程、（ｉｉ）補体媒介溶解を使用して部分的または完全に再プログラミングされた細胞を富化し、少なくともいくつかの非再プログラミング細胞を排除する工程、および（ｉｉｉ）形態学的基準を使用してかかる細胞を含む再プログラミングされた細胞またはコロニーを同定する工程を含む、再プログラミングされた細胞を誘導する方法を提供する。
【０１５０】
再プログラミングされた体細胞の生成、選択、または単離に関する本発明の任意の方法は、細胞療法を必要とするドナーから体細胞を得る工程または体細胞集団を得る工程を含むことができる。再プログラミングされた体細胞を、得られた細胞または得られた細胞の子孫である細胞から生成、選択、または同定する。任意選択的に、細胞を、培養物中で拡大し、その後にドナーと遺伝的に適合する再プログラミングされた体細胞を生成、選択、または同定する。
体細胞を再プログラミングする薬剤のスクリーニング方法
本発明はまた、体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法および同定された薬剤を提供する。１つの実施形態では、本方法は、操作または選択された本発明の体細胞を候補薬と接触させる工程、適切な選択マーカーを発現する細胞を選択する工程を含む。適切な選択マーカーを発現する細胞の存在は、薬剤が体細胞を再プログラミングすることを示す。かかる薬剤を、本出願の目的のための「再プログラミング薬」または「細胞を再プログラミングする薬剤」という。本発明のいくつかの実施形態では、再プログラミング薬は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、またはＮａｎｏｇではない。
【０１５１】
さらなる実施形態では、本方法は、操作された本発明の体細胞を候補薬と接触させる工程、適切な選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、およびこのようにして選択された細胞を多能性の特徴について評価する工程を含む。一揃えの多能性の特徴の存在は、薬剤が体細胞を多能性となるように再プログラミングすることを示す。
【０１５２】
さらなる実施形態では、本発明は、体細胞をより低い分化状態にプログラミングする薬剤を同定する方法であって、（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性を示す、接触させる工程、および（ｂ）薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性を示すかどうかを決定する工程であって、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性を示す場合、候補再プログラミング薬は再プログラミング薬として同定される、決定する工程を含む方法を提供する。一定の実施形態では、本方法は、ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を維持する工程および薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が生存するかどうかを決定する工程を含む。本発明の一定の実施形態では、細胞は増殖細胞である（すなわち、細胞は有糸分裂後ではない）。
【０１５３】
さらなる実施形態では、本発明は、体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性を示す、接触させる工程、および（ｂ）ＤＮＡメチル化減少に耐性を示す細胞量を決定する工程であって、コントロールと比較したＤＮＡメチル化減少に耐性を示す細胞量の増加が、候補薬が再プログラミング薬であることを示す、決定する工程を含む方法を提供する。コントロールは、候補薬で処理していないか、公知の効果（例えば、正の効果または負の効果など）を有する候補で処理したアパラレルサンプル（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓａｍｐｌｅ）であり得る。あるいは、コントロールは、特定のアッセイのために予め決定した値であり得る。
【０１５４】
例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現の阻害および／またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するか、そうでなければＤＮＡメチル化を誘導する経路における任意の工程を阻害する薬剤との細胞の接触によってゲノムＤＮＡのメチル化を減少させるように細胞を処理することができる。適切な方法および薬剤を上に記載する。１つの実施形態では、ＤＮＡメチル化を細胞中での干渉ＲＮＡ発現の可逆的誘導によって減少させ、この干渉ＲＮＡはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１など）の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、細胞中でのＤｎｍｔ（例えば、Ｄｎｍｔ１）ｍＲＮＡの発現を、平均して、少なくとも５０％、少なくとも９０％、またはそれを超えて減少させる。いくつかの実施形態では、細胞中でのＤＮＭＴタンパク質（例えば、ＤＮＭＴ１タンパク質）の発現を、平均して、少なくとも５０％、少なくとも９０％、またはそれを超えて減少させる。本方法の実施に有用な操作された体細胞を上に記載する。
【０１５５】
細胞を、候補再プログラミング薬と接触させた後であるが、ＤＮＡ脱メチル化が起こる条件に細胞を供する前に培養物中で一定期間維持することができる。例えば、細胞をＤＮＡ脱メチル化条件に供する前に、候補再プログラミング薬の存在下で、１時間と１２時間との間、１２時間と２４時間との間、２４時間と４８時間との間、４８時間と７２との間などの期間細胞を維持することができる。あるいは、ＤＮＡ脱メチル化条件に課した後に（ＤＮＡ脱メチル化条件に課してから１、２、５、または１０日後まで）、細胞を薬剤と接触させることができる。候補再プログラミング薬は、細胞をＤＮＡ脱メチル化が起こる条件に供する間に存在することができるが、その必要はない。細胞を、ＤＮＡメチル化減少条件下（例えば、１つまたは複数の内因性ＤＮＭＴタンパク質の発現が減少する条件下）にて培養物中で維持することができる。細胞が再プログラミングされない場合に予想されるよりも多数の細胞がかかる条件を生存および／または増殖することができる場合、薬剤を体細胞を再プログラミングする薬剤と同定する。細胞を、ＤＮＡメチル化減少条件下にて例えば、少なくとも５日間、１０日間まで、１５日間まで、３０日間までなどの期間培地中で維持することができる。いくつかの実施形態では、細胞が薬剤に接触していなかった場合よりも細胞が候補薬と接触した場合に上記期間後に少なくとも２、５、または１０倍の細胞が生存することができる場合、薬剤を、細胞を再プログラミングする薬剤と同定する。
【０１５６】
生細胞の存在を、細胞生存を評価するための当該分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。例えば、細胞が色素を排除する能力、細胞が酵素反応を行う能力、ＭＴＴアッセイ、標識基質の組み込みの測定、または顕微鏡下での目視観察は、生細胞が存在するかどうかを決定し、生細胞を定量するために使用することができる方法の例である。いくつかの実施形態では、生存細胞は蛍光シグナルまたは発光シグナルを産生する。いくつかの実施形態では、アッセイは、細胞がアポトーシスを受けるかどうかの決定を含む。例えば、カスパーゼなどのアポトーシスを誘導するか関与する遺伝子の発現を評価することができるか、ＤＮＡ断片化を試験するアッセイを使用することができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、細胞がｐ５３依存性アポトーシスおよび／または細胞周期の停止を受けることができるように細胞がｐ５３経路を有するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示すが依然としてｐ５３依存性アポトーシスを受け得る細胞を選択する。したがって、一定の実施形態では、候補薬は、ｐ５３またはｐ５３依存性アポトーシスを受けるために細胞に必要とされる遺伝子を阻害する薬剤ではない。
【０１５８】
本発明は、さらに、体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性である、準備する工程、（ｂ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、（ｃ）培養物中で細胞を維持する工程、（ｄ）培養物中で候補薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程であって、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に候補薬を再プログラミング薬として同定する、決定する工程を含む、方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、他方のＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、（ｂ）選択マーカーを発現しない細胞を選択し、それにより、選択マーカー遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、（ｃ）工程（ｂ）で選択した体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、（ｄ）選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性なままである場合に予想されるよりも多数の細胞が選択マーカーを発現するかどうかを決定し、それにより、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および（ｅ）候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合、候補薬を再プログラミング薬と同定する工程を含む。１つの実施形態では、上記方法は、細胞を候補再プログラミング薬と接触させた後に選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性Ｘ染色体が再活性化された細胞を選択する工程を含む。本発明の一定の実施形態では、選択マーカーは、正の選択および負の選択に適切である。一定の実施形態では、本方法は、選択マーカーの機能的形態を発現する細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持する工程および候補再プログラミング薬での細胞の処理後に選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持する工程を含む。一定の実施形態では、遺伝子はＸ染色体上に存在する内因性遺伝子であり、例えば、遺伝子はヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする。一定の実施形態では、遺伝子の機能的対立遺伝子を欠くＸ染色体が遺伝子を不活化する操作された遺伝子の改変を含む。一定の実施形態では、本方法は、（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、Ｘ染色体の一方が、その発現を淘汰することができる第１の選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子およびその発現を選択することができる第２の選択マーカー遺伝子の機能的形態を含み、Ｘ染色体の他方が各遺伝子の機能的対立遺伝子を欠く、準備する工程、（ｂ）第１の選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞を選択し、それにより、機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、（ｃ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、（ｄ）第２の選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性なＸ染色体を再活性化した細胞を選択する工程、（ｅ）候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が不活性なＸ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および（ｆ）候補再プログラミング薬が細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に候補薬を再プログラミング薬として同定する工程を含む。
【０１５９】
本発明で使用した候補薬は、多数の化学クラスを含むが、典型的には、候補薬は、有機分子（有機小化合物（例えば、分子量が１５００ダルトン以下であり、複数の炭素−炭素結合を有する化合物）が含まれる）である。候補薬はまた、生体分子（ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸、およびその誘導体、構造アナログ、または組み合わせが含まれる）で見出される。
【０１６０】
候補薬は、天然に生じる候補薬、組換え候補薬、または研究室でデザインされた候補薬であり得る。候補薬を、微生物、動物、または植物から単離することができるか、組換えによって産生することができるか、当該分野で公知の化学的方法によって合成することができる。いくつかの実施形態では、候補薬を、本発明の方法を使用して、合成化合物または天然化合物のライブラリーから単離する。例えば、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および定方向の合成のための多数の手段（無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる）を利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを利用可能であるか容易に産生される。さらに、天然または合成によって産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的手段、物理的手段、および生化学的手段によって容易に修飾し、これを使用して、組み合わせライブラリーを産生することができる。公知の薬理学的因子（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）を、定方向または無作為の化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化が含まれる）に供して、構造アナログを生成することができる。
【０１６１】
多数の市販の化合物ライブラリー（例えば、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  ＤＩＶＥＲＳｅｔが含まれる）が存在する。ライブラリーは、学術的調査機関からも利用可能である（ＮＣＩ開発治療プログラム（ＮＣＩ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｐｒｏｇｒａｍ）のＤｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｔなど）。
【０１６２】
上記のスクリーニング方法は、細胞に対して行ったアッセイに基づく。これらの細胞ベースのアッセイを、高処理スクリーニング（ＨＴＳ）形式で行うことができ、この形式は当該分野で説明されている。例えば、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌらは、翻訳後修飾を含む小型化哺乳動物細胞ベースのアッセイにおける小分子の高処理スクリーニングを記載していた（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌら，１９９９）。同様に、Ｑｉａｎらは、抗癌薬の高処理スクリーニングのための白血病細胞ベースのアッセイを記載していた（Ｑｉａｎら，２００１）。両リファレンスは、その全体が本明細書中で援用される。
【０１６３】
再プログラミング薬は、多数の異なるカテゴリーのうちのいずれか１つに属することができる。例えば、再プログラミング薬はクロマチンリモデリング薬であり得る。クロマチンリモデリング薬は、クロマチンリモデリングに関与するタンパク質またはより開いた構造にクロマチンが変化することが公知の薬剤（ＤＮＡメチル化インヒビターまたはヒストン脱アセチル化インヒビターなど）であり得る。例示的化合物には、５−アザ−シチジン、ＴＳＡ、およびバルプロ酸が含まれる。別の例のために、かかる薬剤は多能性タンパク質（例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、およびＳｔｅｌｌａが含まれる）であり得る。かかる薬剤はまた、少なくともいくつかの文脈で多能性に不可欠な遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＬＩＦ、およびＳｔａｔ３が含まれる）であり得る。Ｓｍｉｔｈら．１９８８，Ｗｉｌｌｉａｍら，１９８８，Ｉｈｌｅ，１９９６，Ａｖｉｌｉｏｎら，２００３，およびＨａｎｎａら，２００２を参照のこと。候補再プログラミング薬が、典型的には、標準的な培養培地中に存在しないか、存在する場合はより低量で存在する薬剤であると認識されるであろう。
【０１６４】
有用な再プログラミング薬または他の再プログラミング処理形態が全ての体細胞型を再プログラミングできる必要がなく、所与の細胞型の全ての体細胞を再プログラミングできる必要もないとも認識されるであろう。処理によって非処理手段と比較して再プログラミングされた細胞が富化された集団が得られる（すなわち、出発集団よりも再プログラミングされた細胞の比率がより高い）場合、この処理は本発明で有用である。例えば、制限されないが、０．０００００１％と１００％との間の処理細胞を再プログラミングする再プログラミング処理が有用である。また、再プログラミングされた細胞が富化された体細胞集団が得られる方法は、細胞の実質的画分が再プログラミングされない場合でさえ有用である。かかる集団中の細胞は、本方法に供さなかった他の等価な細胞集団と比較して細胞が再プログラミングされる可能性が増加する。制限されないが、例として、少なくとも５％の細胞が再プログラミングされる細胞集団が得られるスクリーニングまたは選択が有用である。制限されないが、再プログラミングされた細胞が２、５、１０、５０、１００倍またはそれを超えて富化された（すなわち、集団中の再プログラミングされた細胞の画分が出発集団中の存在数の２、５、１０、５０、または１００倍である）集団が得られる方法が有用である。複数の選択および／またはスクリーニング手順を使用して、再プログラミングされた細胞が次第に富化される細胞集団を得ることができる。
【０１６５】
本発明の１つの実施形態では、候補再プログラミング薬のスクリーニングで用いる誘導多能性細胞を、１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、外因的に導入した各因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入し、その発現を異なるインデューサーによって誘導される調節エレメントによって調節する（すなわち、外因的に導入した各因子が個別に誘導可能である）、準備する工程、（ｂ）１つまたは複数の細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で細胞を再プログラミングするか少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、（ｃ）少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、（ｅ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、（ｆ）１つまたは複数の体細胞（例えば、分化した体細胞）をキメラ胚から得る工程、（ｇ）１つまたは複数の体細胞を、細胞の増殖および少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との間で区別する工程を含む方法によって調製する。好ましい実施形態では、外因的に導入した因子は組み合わせでの再プログラミングに十分であるが、組み合わせ未満を発現する場合に不十分である。外因的に導入した因子のサブコンビネーションを誘導的に発現することができ、候補再プログラミング薬（例えば、薬剤のライブラリー）を、失われた因子の代わりをする能力についてスクリーニングすることができる。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施形態では、再プログラミング薬を、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする遺伝子および／またはタンパク質自体から選択する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ、３つ、または全ての遺伝子を、体細胞に導入する。本発明の１つの態様は、別の再プログラミング薬を同定する方法を含む。例えば、３つの薬剤を細胞に導入し、それにより、かかる細胞を再プログラミングに対して感受性にすることができる。次いで、細胞を本発明のスクリーニング法で使用して、細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする第４の薬剤または薬剤の組み合わせを同定する。１つの実施形態では、本方法を使用して、ｃ−ｍｙｃの代わりの薬剤を同定する。１つの実施形態では、本方法を使用して、Ｋｌｆ４の代わりの薬剤を同定する。１つの実施形態では、本方法を使用して、Ｓｏｘ２の代わりの薬剤を同定する。１つの実施形態では、本方法を使用して、Ｏｃｔ−４の代わりの薬剤を同定する。いくつかの実施形態では、本方法をヒト細胞を使用して実施し、関連因子のヒトアナログを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、選択マーカーに連結された内因性多能性遺伝子を含む本発明の操作された細胞である。
遺伝子の同定方法
本発明は、体細胞中で内因性多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子を同定する方法を提供する。本方法は、本発明の体細胞をＥＳ細胞または卵母細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトする工程、第１の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、および第１の選択マーカーを発現するトランスフェクトした細胞中の第１の内因性多能性遺伝子の発現を評価する工程を含む。第１の内因性多能性遺伝子の発現は、ｃＤＮＡが体細胞中の内因性多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子をコードすることを示す。
【０１６７】
本方法は、体細胞中で少なくとも２つの内因性多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子の同定に適用可能である。本方法で使用される体細胞は、さらに、第２の選択マーカーに連結された第２の内因性多能性遺伝子を含む。本方法を、両方の選択マーカーを発現するトランスフェクトした細胞を選択し、そのうちで第１および第２の内因性多能性遺伝子の発現が評価されるように修正する。第１および第２の内因性多能性遺伝子の両方の発現は、ｃＤＮＡが体細胞中で少なくとも２つの多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子をコードすることを示す。
【０１６８】
本方法は、さらに、体細胞中で少なくとも３つの内因性多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子の同定に適用可能である。本方法で使用される体細胞は、さらに、第３の選択マーカーに連結された第３の内因性多能性遺伝子を含む。本方法を、３つ全ての選択マーカーを発現するトランスフェクトした細胞を選択し、そのうちで３つ全ての内因性多能性遺伝子の発現が評価されるように修正する。３つ全ての内因性多能性遺伝子の発現は、ｃＤＮＡが体細胞中で少なくとも３つの多能性遺伝子の発現を活性化する遺伝子をコードすることを示す。
【０１６９】
本発明の実施には、他で示さない限り、マウス遺伝学、発生生物学、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用するであろう。これらの技術は当業者の範囲内である。かかる技術は、論文に記載されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｄａｓｓｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈａｒｆｏｒｄ，ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｂｙ  Ｈｏｇａｎら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９３；およびＧｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２０００を参照のこと。
再プログラミングされた体細胞およびその使用
したがって、本発明は、以下：（ｉ）遺伝子改変を欠く体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングし、かかる再プログラミングされた細胞を再プログラミングしないか部分的にのみＥＳ様状態に再プログラミングされる細胞集団から選択する能力；および（ｉｉ）再プログラミング薬の必要な安定且つ進行中の発現または曝露よりもむしろ再プログラミング薬の一過性の存在によって安定な再プログラミングを行うことができるという認識を含む再プログラミングされた体細胞の治療的使用を容易にする多数の有意な利点を提供する。第１の利点により、特に、選択のための遺伝子改変を必要とせずにドナー特異的体細胞からＥＳ様細胞の効率的に誘導することが可能である。第２の利点により、特に、（例えば、再プログラミングに寄与するタンパク質をコードする核酸構築物の）一過性トランスフェクション、タンパク質形質導入、およびゲノムの改変や体細胞への安定に遺伝可能な遺伝因子の導入を必要としない細胞への薬剤の他の導入方法などの方法を使用して再プログラミング可能である。まとめると、これらの利点は、遺伝子改変を使用することなく体細胞を再プログラミングすることによってドナー特異的ＥＳ様細胞が得られる可能性を開く。
【０１７０】
本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞（ＲＳＣ）（再プログラミングされた多能性体細胞（ＲＰＳＣ）が含まれる）を提供する。所望の細胞型の細胞の生成に有用なこれらの方法を広範に適用する。一例として、これらの方法は、家畜管理（経済的または健康上の目的のための動物の正確な遺伝子操作が含まれる）で適用される。別の例として、これらの方法を、容態の治療または防止において医学的に適用する。
【０１７１】
したがって、本発明は、哺乳動物の容態を治療または防止する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法を、個体から体細胞を得ることから開始し、このようにして得た体細胞を本発明の方法によって再プログラミングしてＲＰＳＣを得る。次いで、ＲＰＳＣを、所望の細胞型の細胞のＲＰＳＣの発生に適切な条件下で培養する。発生した所望の細胞型の細胞を回収し、個体に導入して容態を治療する。別の実施形態では、本方法を個体から体細胞を得ることから開始し、このようにして得た体細胞を本発明の方法によって再プログラミングする。次いで、ＲＰＳＣを、所望の生物中へのＲＰＳＣの発生に適切な条件下で培養し、これを回収し、個体に導入して容態を治療する。容態は、細胞または器官の機能が異常であり、そして／または正常レベル未満に低下している任意の容態であり得る。したがって、本発明は、細胞療法を必要とするドナーから体細胞を得る工程、細胞を再プログラミング薬に供する工程（細胞を再プログラミング薬と接触させる工程など）、本発明の方法にしたがって再プログラミングされた体細胞を選択する工程を含む。細胞療法を必要とするドナーは、任意の容態を罹患し得、ドナーへの細胞の投与によって容態または容態の１つまたは複数の症状を緩和することができ、そして／またはドナーへの細胞の投与によって容態の進行を遅延させることができる。
【０１７２】
本発明の一定の実施形態におけるＲＰＳＣはＥＳ様細胞である。したがって、ＥＳ細胞を分化するための公知の方法にしたがって分化を誘導して所望の細胞型を得ることができる。例えば、ＲＰＳＣを、かかる細胞を分化培地中にて細胞分化が起こる条件下で培養することによって、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経系細胞（例えば、ニューロン）などに分化するように誘導することができる。適切な培養条件である胚性幹細胞を分化させる培地および方法は当該分野で公知である。
【０１７３】
例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：７５３０−３７（１９９５）は、レチノイン酸を欠く懸濁培養培地中で幹細胞の凝集体を最初に培養し、その後にレチノイン酸を含む同一培地中で培養すること含む誘導手順に幹細胞を供し、その後に細胞に付着する基質に細胞凝集体を移行することによる胚細胞株からの造血幹細胞の産生を教示している。
【０１７４】
さらに、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６：５４３−５２（１９９４）は、種々の分化した細胞型（特に、造血細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞が含まれる）を産生するための胚性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法を開示する多数の文献を参照した総説である。
【０１７５】
さらに、Ｂａｉｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８：３４２−３５７（１９９５）は、ニューロン特性を保有する神経細胞を産生するための胚性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を教示する。これらのリファレンスは、胚様細胞または幹細胞様細胞から分化した細胞を得るための報告された方法の例である。これらのリファレンスおよび胚性幹細胞の分化方法に関するリファレンス中の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１７６】
したがって、公知の方法および培養培地を使用して、当業者は、本発明の胚様細胞または幹細胞様細胞を培養して、所望の分化した細胞型（例えば、死刑細胞、筋細胞、造血細胞など）を得ることができる。さらに、誘導性のＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘｌの使用は、特定の分化系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生の増強に有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、リンパ系および神経の発生中に起こる多数であるが全てではないアポトーシス細胞死の型を妨害する。どのようにしてＢｃｌ−２発現を使用してドナー細胞のトランスフェクション後に関連細胞の分化系のアポトーシスを阻害することができるのかについての徹底した考察は、米国特許第５，６４６，００８号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
【０１７７】
本ＲＰＳＣを使用して、任意の所望の分化した細胞型を得ることができる。かかる分化したヒト細胞の治療上の用途は他に例がない。例えば、ヒト造血幹細胞を、骨髄移植を必要とする医学的治療で使用することができる。かかる手順を使用して、多数の疾患（例えば、卵巣癌および白血病などの末期癌ならびにＡＩＤＳなどの免疫系を危険にさらす疾患）を治療する。例えば、癌またはＡＩＤＳ患者の成体体細胞（例えば、上皮細胞またはリンパ球）の除核卵母細胞（例えば、ウシ卵母細胞）との融合、上記の胚様細胞または幹細胞様細胞を得ること、および造血幹細胞が得られるまで分化を好む条件下でかかる細胞を培養することによって造血幹細胞を得ることができる。かかる造血細胞を、疾患（癌およびＡＩＤＳが含まれる）の治療で使用することができる。
【０１７８】
本発明の方法を使用して、神経疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、またはＡＬＳ、リソソーム蓄積症、多発性硬化症、または脊髄損傷など）を治療、防止、または安定化することもできる。例えば、体細胞を治療を必要とする個体から得て、多能性が得られるように再プログラミングし、培養して神経外胚葉細胞を誘導し、これを使用して、罹患または損傷した組織を正常な機能と置換するか補助することができる。
【０１７９】
内分泌容態の治療または防止のために、成長因子、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、ステロイド、セロトニン、エピネフリン、またはノルエピネフリンなどのホルモンを産生するＲＰＳＣを哺乳動物に投与することができる。さらに、再プログラミングした上皮細胞を投与して、体腔または器官の内膜（肺、腸、外分泌腺、または尿生殖路など）の損傷を修復することができる。ＲＰＳＣを哺乳動物に投与して、器官（膀胱、脳、食道、ファロピウス管、心臓、腸管、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮など）中の細胞の損傷または欠損を治療することができることも意図される。
【０１８０】
本発明は、移植に適切な同質遺伝子的または同一遺伝子的ヒト細胞を本質的に無制限に供給する可能性を有する。かかる供給により、現在の移植法に関連する深刻な問題（すなわち、宿主対移植片拒絶または移植片対宿主拒絶のために起こり得る移植組織の拒絶）が未然に防げるであろう。従来は、シクロスポリンなどの抗拒絶薬の投与によって拒絶を防止または減少させる。しかし、かかる薬物は深刻な副作用（例えば、免疫抑制、発癌性）を有し、非常に高価である。本発明は、抗拒絶薬（シクロスポリン、イムラン（ｉｍｕｌａｎ）、ＦＫ−５０６、糖質コルチコイド、およびラパマイシン、ならびにその誘導体など）の必要性を排除するか少なくとも大幅に削減することができる。
【０１８１】
ＲＰＳＣをマトリックスと組み合わせてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで組織または器官を形成し、これを使用して、レシピエント哺乳動物中の組織または器官を修復または置換することもできる。例えば、ＲＰＳＣをマトリックスの存在下にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して泌尿生殖器系の組織または器官（膀胱、陰核、海綿体、腎臓、精巣、尿管、尿道弁（ｕｒｅｔａｌ  ｖａｌｖｅ）、または尿道など）を生成し、次いで、哺乳動物に移植することができる（Ａｔａｌａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｕｒｏｌ．９（６）：５１７−５２６，１９９９）。別の移植適用では、適切なマトリックスの存在下での再プログラミングされた細胞の培養によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成血管を形成し、次いで、心血管容態または循環容態の治療または防止のために哺乳動物に血管を移植する。ドナー軟骨または骨組織の生成のために、軟骨細胞または骨細胞などのＲＰＳＣを、軟骨または骨を形成させる条件下にてマトリックスの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、次いで、ドナー組織を含むマトリックスを哺乳動物に投与する。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの所望の組織の形成のために、細胞とマトリックスとの混合物を哺乳動物に投与することができる。好ましくは、細胞をマトリックス表面に付着させるか、マトリックスによってカプセル化する。ドナー組織または器官の形成のために使用することができるマトリックスの例には、コラーゲンマトリックス、炭素繊維、ポリビニルアルコールスポンジ、アシルアセトアミドスポンジ、フィブリン−トロンビンゲル、ヒアルロン酸ベースのポリマー、およびポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリグリコール酸を含む合成ポリマーマトリックス、またはその組み合わせが含まれる（例えば、米国特許第４，８４６，８３５号；同第４，６４２，１２０号；同第５，７８６，２１７号；および同第５，０４１，１３８号を参照のこと）。
【０１８２】
本発明にしたがって産生したＲＰＳＣを使用して、遺伝子操作されたかトランスジェニックの分化した細胞を産生することができる。本質的に、所望の遺伝子の導入、本発明にしたがって産生されたＲＰＳＣの内因性遺伝子の全部または一部の除去、およびかかる細胞を所望の細胞型に分化することによってこれを行うことができる。かかる改変の実施に好ましい方法は相同組換えによる方法である。これは、かかる技術を使用して、幹細胞様細胞ゲノム中の特定の部位の遺伝子を挿入、欠失、または改変することができるからである。
【０１８３】
この方法論を使用して、欠損遺伝子（例えば、欠損免疫系遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子）を置換するか、治療的に有利なタンパク質（成長因子、リンホカイン、サイトカイン、酵素など）を発現する遺伝子を導入することができる。例えば、脳由来成長因子をコードする遺伝子を、ヒト胚様細胞または幹細胞様細胞に導入し、この細胞を神経細胞に分化し、この細胞をパーキンソン病患者に移植してかかる疾患中の神経細胞の喪失を遅延させることができる。これらの方法を使用して救済することができる変異の例には、嚢胞性線維症遺伝子の変異；デュニガン病（Ｄｕｎｎｉｎｇａｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）に関連する変異（ラミンＡ遺伝子中のＲ４８２Ｗ変異、Ｒ４８２Ｑ変異、およびＲ５８４Ｈ変異など）；およびエメリー・ドライフス（Ｅｍｅｒｙ  Ｄｅｙｆｕｓｓ）筋ジストロフィの常染色体優性形態に関連する変異（ラミンＡ遺伝子中のＲ２４９Ｑ変異、Ｒ４５３Ｗ変異、およびＱ６ＳＴＯＰ変異など）が含まれる。Ｑ６ＳＴＯＰ変異では、Ｇｌｎ６のコドンが終止コドンに変異する。
【０１８４】
以前は、ＢＤＮＦでトランスフェクトした細胞型は初代細胞から不死化細胞株（神経または非神経（筋芽細胞および線維芽細胞）由来細胞のいずれか）まで様々であった。例えば、星状膠細胞をレトロウイルスベクターを使用してＢＤＮＦ遺伝子でトランスフェクトし、細胞をパーキンソン病のラットモデルに移植した（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９１：２５−３６，（１９９５））。このｅｘ  ｖｉｖｏ療法により、導入から３２日後にラットにおけるパーキンソン病様症状が４５％まで軽減した。また、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子を星状膠細胞中に配置し、類似の結果を得た（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１３９：３９−５３（１９９６）およびそのリファレンス）。
【０１８５】
しかし、かかるｅｘ  ｖｉｖｏ系には問題がある。特に、現在使用されているレトロウイルスベクターはｉｎ  ｖｉｖｏで下方制御し、導入遺伝子は一過性にしか発現しない（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２（１９９３）の総説）。また、かかる研究は、初代細胞（星状膠細胞）を使用したが、これは寿命が有限であり、且つゆっくり複製される。かかる性質はトランスフェクション率に悪影響を及ぼし、安定にトランスフェクトした細胞の選択を妨げる。さらに、相同組換え技術で使用するために遺伝子ターゲティングした初代細胞の巨大集団を増殖させることはほとんど不可能である。
【０１８６】
対照的に、ＥＳ様細胞である本発明のＲＰＳＣの使用によって、レトロウイルス系に関連する困難を排除しなければならない。所望の遺伝子／変異をＥＳ細胞に導入するための公知の方法を使用して、ＲＰＳＣを遺伝子操作し、得られた操作された細胞を所望の細胞型（例えば、造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞など）に分化することができる。ＲＰＳＣに導入することができる遺伝子には、例えば、上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア由来神経栄養性成長因子、インスリン様成長因子（ＩおよびＩＩ）、神経栄養因子、ニューロトロフィン−４／５、毛様体神経栄養因子、ＡＦＴ−１、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（αおよびβ）など）、治療酵素、コラーゲン、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子などが含まれる。
【０１８７】
さらに、必要に応じて、患者から治療細胞を排除するための現在当該分野で公知の負の選択系の１つを使用することも可能である。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子でトランスフェクトしたドナー細胞により、ＴＫ遺伝子を含む胚性（例えば、ＥＳ細胞様）細胞集団が得られるであろう。これらの細胞の分化により、ＴＫ遺伝子も発現する目的の治療細胞が単離されるであろう。かかる細胞を、ガンシクロビル投与の際に患者からいつでも選択的に排除することができる。かかる負の選択系は、米国特許第５，６９８，４４６号に記載されており、本米国特許は本明細書中で参考として援用される。他の実施形態では、その発現が誘導性プロモーターの調節下にある有毒産物をコードする遺伝子を含むように細胞を操作する。インデューサーの投与により、有毒産物が産生され、それにより細胞が死滅する。したがって、任意の本発明の体細胞は、任意選択的に発現カセットに含まれる自殺遺伝子を含むことができ、これをゲノムに組み込むことができる。自殺遺伝子は、その発現が細胞に致命的である遺伝子である。例には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシンなどをコードする遺伝子が含まれる。自殺遺伝子は、特異的誘導薬または刺激の非存在下にて通常の環境下で発現を指示しない発現調節エレメントの調節下にあり得る。しかし、例えば、（ｉ）適切な誘導薬の細胞または生物への投与によるか、（ｉｉ）特定の遺伝子（例えば、癌遺伝子、細胞分裂周期に関与する遺伝子、または脱分化または分化の喪失を示す遺伝子）が細胞中で発現する場合、または（ｉｉｉ）分化を示す細胞周期調節遺伝子などの遺伝子の発現が喪失する場合、適切な条件下で発現を誘導することができる。例えば、米国特許第６，７６１，８８４号を参照のこと。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換え事象後にのみ遺伝子が発現する。かかる事象により、コード配列を発現調節エレメント（プロモーターなど）と作動可能に結合することができる。リコンビナーゼは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにターゲティングされたＲＮＡｉ薬の発現を誘導するために使用されたものと異なるリコンビナーゼであり得る。細胞（またはその祖先）を被験体に投与した後に被験体の身体から細胞（またはその子孫）を排除することを望む場合、自殺遺伝子の発現を誘導することができる。例えば、再プログラミングされた体細胞が腫瘍を生じる場合、自殺遺伝子発現の誘導によって腫瘍を排除することができる。いくつかの実施形態では、脱分化または適切な細胞周期調節の喪失の際に細胞は自動的に排除されるので、腫瘍形成は阻害される。
【０１８８】
治療または防止することができる疾患、障害、または容態の例には、神経、内分泌、構造、骨格、血管、泌尿器、消化管、外皮、血液、免疫、自己免疫、炎症、内分泌、腎臓、膀胱、心血管、癌、循環器、消化管、造血系、および筋肉の疾患、障害、または容態が含まれる。さらに、再プログラミングされた細胞を、組織または器官の修復または置換などのための再建のために使用することができる。
【０１８９】
本発明の治療方法に関して、哺乳動物へのＲＰＳＣの投与は、特定の投与様式、投薬量、または投与頻度に制限されることを意図しない。本発明は、全ての投与様式（筋肉内、静脈内、関節内、病巣内、皮下、または疾患を防止または治療するのに適切な用量を得るのに十分な任意の他の経路が含まれる）を意図する。ＲＰＳＣを、単回用量または複数回用量で哺乳動物に投与することができる。複数回投与する場合、用量を、例えば、１週間、１ヶ月間、１年間、または１０年間の間隔をあけることができる。１つまたは複数の成長因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、または他の細胞を細胞の投与前、投与中、または投与後に投与して、特定の細胞型にさらに偏らせることもできる。
【０１９０】
本発明のＲＰＳＣを、特に初期発生調節に関与する遺伝子の研究のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化モデルとして使用することができる。ＲＰＳＣを使用した分化した細胞の組織および器官を、薬物研究で使用することができる。
【０１９１】
さらに、本発明にしたがって産生したＲＰＳＣを、動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、ウシ、ブタ）に、例えば、腎被膜下または筋肉内に導入し、これを使用して前記位置に奇形腫を生成することができる。この奇形腫を使用して、異なる組織型を誘導することができる。また、Ｘ種（Ｘ−ｓｐｅｃｉｅｓ）核移植によって生成された内細胞塊を、生分解性生体適合性ポリマーマトリックスと共に導入して、三次元組織を形成することができる。組織の形成後、ポリマーは、理想的にはドナー組織（例えば、心臓、膵臓、神経、肺、肝臓）から離れた直後から分解する。いくつかの例では、血管形成を促進する成長因子およびタンパク質を含むことが有利であり得る。あるいは、適切な培養培地および条件、成長因子、および生分解性ポリマーマトリックスを使用して、組織形成を完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
体細胞再プログラミング法の適用および動物中のＲＰＳＣ
本明細書中に開示の再プログラミング法を使用して、種々の動物種についてのＲＰＳＣを産生することができる。産生されたＲＰＳＣは、所望の動物を生成するのに有用であり得る。動物には、例えば、鳥類および哺乳動物ならびに絶滅危惧種である任意の動物が含まれる。例示的な鳥類には、家禽類（例えば、ウズラ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、およびホロホロチョウ）および猛禽類（例えば、タカ、ハヤブサ、ミサゴ、コンドルなど）、絶滅危惧種の鳥類（例えば、オウム、カリフォルニアコンドルなど）、ダチョウなどの他の鳥類が含まれる。例示的な哺乳動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、および霊長類が含まれる。これらのうちで好ましいメンバーには、家畜（例えば、ウシ、バッファロー、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、モルモット、ヒツジ、およびヤギが含まれる）が含まれる。
【０１９２】
本発明の再プログラミング法によって産生されたＲＰＳＣにより、他の手段によってＥＳ細胞が利用可能でない動物を初めて遺伝子操作することができる。ＲＰＳＣはＥＳ様細胞であり、したがって、遺伝子操作に適している。今まで、ＥＳ細胞は広範な種々の動物で利用できなかった。結果として、これらの動物について、ターゲティングされた変異を有する遺伝子改変動物を作製することは現在不可能である。ＥＳ細胞様ＲＰＳＣを操作して、所望のターゲティングされた遺伝子改変を導入することができる。次いで、得られた操作されたＲＰＳＣを使用し、マウスにおけるＥＳ細胞について記載の方法を使用して、その生殖系列中に所望の遺伝子改変を有するクローン化された動物を生成することができる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓに付与された米国特許第５，４８７，９９２号、同第５，６２７，０５９号、同第５，６３１，１５３号、および同第６，２０４，０６１号を参照のこと。動物における遺伝子操作は、種々の動物、特に家畜に広く適用される可能性がある。
【０１９３】
本発明の体細胞再プログラミング法は、少なくとも２つの至適化された家畜の出産方法を提供する。第１に、体細胞再プログラミングを使用して、家畜に最良の利用可能な表現型を捕捉させることができる。至適化した家畜を出産するために使用される現在のテクノロジーは、選択的交配および好ましい種畜からの拡大に基づく。よりすぐれた特徴（例えば、肉含有量、産卵（家禽類の場合）、飼料転換効率が含まれる）に基づいて選択した動物を使用して、多数の動物を交配し、ヒトへの食料供給で使用する。この伝統的な過程は、非常に非効率であるという特徴がある。各動物で認められる表現型は、しばしば、その動物の子孫で一部しか伝達されない。したがって、伝統的な交配スキームは、全ての子孫動物が最高の表現型を捕捉するには非効率である。対照的に、本発明の再プログラミング法は、所望の特徴を有する動物の体細胞からＲＰＳＣを生成することによって同一の目的を達成するための制御された効率的方法を提供する。生成されたＲＰＳＣを直ちに使用して、ＲＰＳＣ由来のクローン化動物を生成することができる。公知のＥＳ細胞からのマウスの生成方法を、この目的のために使用することができる。あるいは、生成されたＲＰＳＣを低温保存し、飼育者の必要に応じて解凍することができる。
【０１９４】
第２の方法では、所望の特徴を有する動物由来の体細胞を再プログラミングしてＲＰＳＣを産生する。ＲＰＳＣをさらに遺伝子操作して所望の遺伝子改変を導入し、その後にレシピエント胚に配置して所望の子孫を産生する。
【０１９５】
再プログラミング法を使用して、絶滅危惧種を救済することもできる。体細胞再プログラミングにより、絶滅危惧動物の体細胞からＲＰＳＣを効率的に生成する方法が得られる。得られたＲＰＳＣを直ちに使用して、絶滅危惧動物数を拡大することができる。あるいは、ＲＰＳＣを低温保存し、絶滅危惧種の絶滅に対する保護措置としての絶滅危惧種のためのＲＰＳＣストックを生成することができる。
【０１９６】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明されるであろう。本明細書中に引用した全ての特許、特許出願、およびリファレントは、その全体が本明細書中で参考として援用される。さらに、２００３年１１月２６日出願の米国特許仮出願第６０／５２５，６１２号、２００３年１２月１５日出願の米国特許仮出願第６０／５３０，０４２号、２００７年４月７日出願の米国特許仮出願第６０／９２２，１２１号、および２００４年１１月２４日出願の米国特許出願第１０／９９７，１４６号の教示は、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１９７】
（実施例１）
方法
細胞培養、ＭＥＦ単離、およびウイルス感染
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を、１５％ウシ胎児血清、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および非必須アミノ酸を含むＤＭＥ中の照射ＭＥＦ上で培養した。０．２％ゼラチン上で２回継代するために全細胞から支持細胞を枯渇させ、その後にＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質を単離した。トランスジェニックＭＥＦを単離し、Ｏｃｔ４−ＩＲＥＳ−ＧｆｐＮｅｏまたはＮａｎｏｇ−ｎｅｏ構築物（Ｍｉｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ  １１３（５）：６３１（２００３））のいずれかで予めターゲティングしたＯｃｔ４誘導性ＫＨ２  ＥＳ細胞（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら，Ｃｅｌｌ  １２１（３）：４６５（２００５））の胚盤胞注射後に、２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）中でＥ１３．５キメラ胚から選択した。３〜４継代目の２×１０５個のＭＥＦに、パッケージングプラスミドｐＣＬ−Ｅｃｏと共にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ＭｙｃのｃＤＮＡを含むＭｏｌｏｎｅｙベースのレトロウイルスベクターｐＬＩＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｕｇｅｎｅ，Ｒｏｃｈｅ）のトランスフェクションによって生成したプールしたウイルス上清を一晩感染させた（Ｎａｖｉａｕｘら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０（８）：５７０１（１９９６））。
サザンブロット、メチル化、およびクロマチン分析  ＤＮＡメチル化レベルを評価するために、ゲノムＤＮＡをＨｐａＩＩで消化し、マイナーサテライト反復（ｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｒｅｐｅａｔ）（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８４（１９８４））のプローブとしてのｐＭＲ１５０またはＩＡＰ−プローブ（Ｗａｌｓｈら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（２）：１１６（１９９８））を用いてハイブリッド形成した。Ｑｉａｇｅｎ  ＥｐｉＴｅｃｔキットを使用して亜硫酸水素処理を行った。Ｏｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態について、亜硫酸水素配列決定分析を以前に記載のように行った（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（９）：２００７（２００６））。各サンプルの１０〜２０クローンを、両方向に配列決定した。刷り込み遺伝子について、ＣＯＢＲＡアッセイを行った。ＰＣＲプライマーおよび条件は、以前に記載のとおりであった（Ｌｕｃｉｆｅｒｏら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９（４）：５３０（２００２））。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢｓｔＵＩまたはＨｐｙＣＨ４  ＩＶで消化し、２％アガロースゲルで分離した。２価ドメインの状態を、以前に記載のクロマチン免疫沈降およびその後の定量的ＰＣＲによって決定した（Ｂｏｙｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ
４４１：３４９（２００６））。
発現分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した５０ｎｇの総ＲＮＡを逆転写し、ＱｕａｎｔＴｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して７０００  ＡＢＩ検出システムにて定量した。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光分析を記載のように行った（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら，Ｃｅｌｌ  １２１（３）：４６５（２００５）；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４（２２）：５２５８（２００４））。一次抗体は、Ｏｃｔ４（モノクローナルマウス、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（ポリクローナルウサギ、Ｂｅｔｈｙｌ）、アクチン（モノクローナルマウス、Ａｂｃａｍ）、ＳＳＥＡ１（モノクローナルマウス、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）を含んでいた。適切に標識された二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。２μｇの総ＲＮＡ由来のマイクロアレイ標的を合成し、Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して標識し、Ａｇｉｌｅｎｔホールマウスゲノムオリゴアレイ（Ｇ４１２２Ｆ）にハイブリッド形成させた。アレイをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５Ｂスキャナでスキャンし、シグナル強度をＡｇｉｌｅｎｔ  ＦＥソフトウェアで計算した。データセットを、以前に記載のようにＲスクリプトを使用して正規化し、クラスタリングした（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（４）：９３３（２００６））。マイクロアレイデータセットを、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベースに提出した。
結果
核移植実験によって証明したところ、Ｏｃｔ４誘導性線維芽細胞は非誘導性線維芽細胞よりも再プログラミングに高い感受性を示す
Ａ．誘導性Ｏｃｔ４導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスの生成
誘導性Ｏｃｔ４対立遺伝子を、以下のように構築した。第１に、２つの組込みベクターを構築する。第１の組込みベクター（誘導性Ｏｃｔ４組込みベクター）は、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｐ）によって駆動するＯｃｔ４遺伝子を含む。Ｔｅｔ−Ｏｐ−Ｏｃｔ４カセットを、その５’末端でスプライスアクセプターダブルポリＡシグナル（ＳＡ−ｄｐＡ）に隣接させ、３’末端でＳＶ４０ポリＡテール（ＳＶ４０−ｐＡ）に隣接させる。第２の組込みベクター（テトラサイクリンアクチベーター組込みベクター）は、野生型アクチベーターよりもドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導に対する応答性が高いテトラサイクリンアクチベーターの変異形態（Ｍ２−ｒｔＴＡ）を含む（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１４）：７９６３（２０００））。
【０１９８】
以下の２つの組込みベクターを、Ｖ６．５  ＥＳ細胞に導入する。図１に示すように、誘導性Ｏｃｔ４組込みベクターおよびテトラサイクリンアクチベーター組込みベクターを、部位特異的組み込みを使用してコラーゲン遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座にそれぞれ導入する。得られたＥＳ細胞を使用して、四倍体胚補完によってＯｃｔ４誘導性マウスを作製する。
Ｂ．誘導性Ｏｃｔ４導入遺伝子の発現
Ｏｃｔ４誘導性マウスの尾生検由来の線維芽細胞を培養した。培養線維芽細胞画分をドキシサイクリンで３日間誘導し（２マイクログラム／ｍｌ）、Ｏｃｔ４発現をＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析およびＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によって検出した。ドキシサイクリンで処理した線維芽細胞におけるＯｃｔ４発現レベルは、ＥＳ細胞中のＯｃｔ４発現レベルに匹敵し、ドキシサイクリンで処理していない線維芽細胞で検出不可能である。発現の結果は、誘導性Ｏｃｔ４導入遺伝子が計画どおりに発現することを示す。
Ｃ．核移植実験
核移植を、誘導性Ｏｃｔ４導入遺伝子を保有するマウスの尾生検由来の線維芽細胞に対して行った。核移植の２４時間前にＤｏｘ誘導を行った。次いで、以前に記載のように、クローン化した胚を活性化し、胚盤胞期まで培養してＥＳ細胞を誘導した（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１０３５（２００２））。平均して、胚盤胞形成およびＥＳ細胞誘導（前核形成した卵の画分として測定）は、非誘導性線維芽細胞よりＯｃｔ４誘導性線維芽細胞の方が効率的である。この結果は、線維芽細胞などの体細胞中で誘導されたＯｃｔ４発現がこれらの細胞を再プログラミングに対してより高感受性にすることを証明する。
ストリンジェントな基準によるＥＳ様細胞の選択
ＥＳ細胞における相同組換えを使用して、内因性Ｏｃｔ４遺伝子座（Ｏｃｔ４−ｎｅｏ）またはＮａｎｏｇ遺伝子座（Ｎａｎｏｇ−ｎｅｏ）のいずれかに挿入されたネオマイシン耐性マーカーを保有するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を生成した（図２Ａ）。これらの培養物はＧ４１８に感受性を示し、Ｏｃｔ４遺伝子座およびＮａｎｏｇ遺伝子座が予想どおり体細胞中でサイレンシングされたことを示す。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を発現するレトロウイルスベクターでの感染の５日後、細胞を継代し、Ｇ４１８を培養物に添加して薬物耐性細胞を選択した。Ｎａｎｏｇ−ｎｅｏ培地およびＯｃｔ４−ｎｅｏ培地の両方で耐性コロニーが出現したが、効率が非常に異なった。Ｎａｎｏｇ−ｎｅｏ培養物中の薬物耐性コロニー数は、Ｏｃｔ４−ｎｅｏ培養物の３５倍であった（図２Ｂ）。コロニーをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＳＳＥＡ１について染色した場合、Ｏｃｔ４−ｎｅｏコロニーの有意により高い画分が陽性であり、ＥＳ細胞様形態を示した。これにより、Ｎａｎｏｇ遺伝子座はより容易に活性化されたが、Ｏｃｔ４−ｎｅｏ培養物中の薬物耐性コロニーのより高い画分が多能性状態に再プログラミングされたことが示唆される。この概念と一致して、１２個の無作為に選別したＯｃｔ４−ｎｅｏコロニーのうち、１０個が増殖し続けてＥＳ様表現型を維持し、これらのうちの３つが強いＡＰ活性およびＳＳＥＡ１発現を示した。対照的に、９個全ての継続的に増殖するＮａｎｏｇ−ｎｅｏコロニーは、平坦または小さな丸形の外観を有し、稀なＥＳ細胞に類似するコロニーはＳＳＥＡ１抗体で一部のみが標識された。しかし、ＥＳ細胞に特徴的であることが当該分野で公知の基準に基づいた両選択ストラテジー由来の慎重な形態学的コロニー選択後、ＥＳ様コロニー（「誘導多能性細胞」のためのｉＰＳ細胞として指定）を増殖することができ、このコロニーは同種のＮａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１、およびＡＰ発現を示し、ゼラチンコーティングした皿にクローン密度（ｃｌｏｎａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）で播種した場合に未分化コロニーを形成した。
ｉＰＳ細胞中での遺伝子発現およびＤＮＡメチル化の特徴づけ
再プログラミングされた細胞を分子レベルで特徴づけるために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＥＳ細胞および線維芽細胞特異的遺伝子の発現を測定した。Ｏｃｔ４−ｎｅｏ選択されたｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と類似のレベルで内因性ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４を発現したのに対して、ＭＥＦはいずれの遺伝子も発現しなかった。内因性Ｓｏｘ２転写物をウイルスＳｏｘ２転写物と識別するための特異的プライマーの使用により、Ｓｏｘ２転写物の大部分が内因性遺伝子座に由来することが示された。対照的に、ＨｏｘＡ９およびＺｆｐｍ２はＭＥＦ中で高度に発現されたが、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞では非常に低レベルで発現された。ウェスタン分析により、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞中で類似レベルのＮａｎｏｇタンパク質およびＯｃｔ４タンパク質が示された。最後に、マイクロアレイテクノロジーを使用して、大域レベルでの遺伝子発現パターンを比較した。野生型ＭＥＦまたはドナーＭＥＦと対照的に、ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と共にクラスタリングされた。
【０１９９】
Ｏｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーターのＤＮＡメチル化レベルを調査するために、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、およびＭＥＦから単離したＤＮＡを使用して亜硫酸水素塩配列決定およびＣＯＢＲＡ分析を行った。両遺伝子座は、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞中で脱メチル化され、ＭＥＦ中で完全にメチル化された。ゲノム刷り込みの維持が損なわれるかどうかを評価するために、４つの刷り込まれた遺伝子であるＨ１９、Ｐｅｇｌ、Ｐｅｇ３、およびＳｎｒｐｎのメチル化状態を評価した。非メチル化遺伝子座およびメチル化遺伝子座に対応するバンドを、ＭＥＦ、ｉＰＳ細胞、および尾端線維芽細胞中の各遺伝子について検出した。対照的に、全ての刷り込みを消去したＥＧ細胞（Ｌａｂｏｓｋｙら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０（１１）：３１９７（１９９４））を非メチル化した。本発明者らの結果は、Ｏｃｔ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の後成的状態が転写的に抑制された（体細胞）状態から活性な（胚性）状態に再プログラミングされ、体細胞刷り込みパターンがｉＰＳ細胞で維持されたことを示す。
【０２００】
最近、ＥＳ細胞中のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の下流標的遺伝子を、ゲノム大域分析（ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって定義した（Ｂｏｙｅｒら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８（４）：４３１（２００６））。これらの標的には、多数の重要な発生レギュレーターが含まれ、その比率はまたＰｃＧ複合体であるＰＲＣ１およびＰＲＣ２によって制限および抑制される（Ｌｅｅら，Ｃｅｌｌ  １２５（２）：３０１（２００６）；Ｂｏｙｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０９１）：３４９（２００６））。特に、多数のこれらの非発現標的遺伝子でのクロマチンはＥＳ細胞中で２価の高次構造を採用し、この高次構造は、「活性」ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４）メチル化マークおよび「抑制性」ヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）メチル化マークの両方を保有する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｃｅｌｌ  １２５（２）：３１５（２００６）；Ａｚｕａｒａら，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８（５）：５３２（２００６））。分化した細胞では、これらの遺伝子は、その発現状態に応じて、代わりにＨ３Ｋ４メチル化マークまたはＨ３Ｋ２７メチル化マークのいずれかを保有する傾向がある。
【０２０１】
本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびリアルタイムＰＣＲを使用して、多能性ＥＳ細胞中で２価であると報告された遺伝子組についてＨ３Ｋ４メチル化およびＨ３Ｋ２７メチル化を定量した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｃｅｌｌ  １２５（２）：３１５（２００６））。ＭＥＦでは、発現した遺伝子Ｚｆｐｍ２およびＨｏｘＡ９は強いＨ３Ｋ４メチル化を保有するがＨ３Ｋ２７メチル化は弱いか保有しないのに対して、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１、Ｌｂｘ１ｈ、Ｐａｘ５、およびＥｖｘ１はＨ３Ｋ２７メチル化を支配的に保有する。しかし、Ｏｃｔ４−ｎｅｏ  ｉＰＳ細胞を分析する場合、本発明者らは、これらの各遺伝子に正常なＥＳ細胞におけるような両ヒストン修飾を有する２価の高次構造を見出した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｃｅｌｌ  １２５（２）：３１５（２００６））。Ｏｃｔ４−ｎｅｏ線維芽細胞およびＮａｎｏｇ−ｎｅｏ線維芽細胞から選択された、いくつかのｉＰＳクローンにおいて同一の結果を得た。
ｉＰＳ細胞は大域脱メチル化（Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）に耐性を示す
体細胞がメチルトランスフェラーゼの喪失の際に迅速なアポトーシスを受けるので、ゲノム脱メチル化耐性はＥＳ細胞の固有の性質である。本発明者らは、ｉＰＳ細胞がＤｎｍｔ１阻害後に大域的脱メチル化に耐性を示し、Ｄｎｍｔ１活性の修復後に大域的メチル化パターンを再確立することができるかどうかを調査した。この目的を達成するために、本発明者らは、Ｄｎｍｔ１ターゲティングｓｈＲＮＡおよびＧＦＰレポーター遺伝子を含む条件的レンチウイルスベクターを使用した（Ｖｅｎｔｕｒａら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（２８）：１０３８０（２００４））。感染ｉＰＳ細胞を低密度でプレートし、ＧＦＰ陽性コロニーを選別し、拡大した。ＨｐａＩＩ消化ゲノムＤＮＡを使用したサザン分析は、非感染ｉＰＳ細胞またはＭＥＦと対照的に、感染ｉＰＳ細胞の大域的脱メチル化がＤｎｍｔ１−／−ＥＳに類似し、これは通常のメチル化レベルを示すことを示した。
【０２０２】
形態学的に、ＧＦＰ陽性細胞は親株または非感染姉妹サブクローンと識別不可能であり、ｉＰＳ細胞が大域的ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示すことを示した。第２の工程では、ＥＳ細胞について以前に報告されたように、Ｄｎｍｔ１  ｓｈＲＮＡをＣｒｅ媒介性組換えによって切り出し、通常のＤＮＡメチル化レベルを修復した（Ｈｏｌｍら，Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ  ８（４）：２７５（２００５））。これらの所見は、ｉＰＳ細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ  メチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａ／ｂの機能的再活性化を示す（Ｏｋａｎｏら，Ｃｅｌｌ  ９９：２４７（１９９９））。予想通り、刷り込まれた遺伝子ＳｎｒｐｎおよびＰｅｇ３は非メチル化され、再メチル化に耐性を示した。
レトロウイルスベクターは、ｉＰＳ細胞中でのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化によってサイレンシングされる
サザン分析は、Ｏｃｔ４−ｎｅｏ  ｉＰＳクローン１８がＯｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の４〜６コピーおよびＳｏｘ２レトロウイルスベクターのたった１つのコピーを保有することを示した。これら４つの因子が構成性に発現されるレトロウイルスＬＴＲの調節下にあったので、以前の研究ではなぜｉＰＳ細胞を分化するように誘導することができるのか不明確であった（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ
１２６（４）：６６３（２００６））。この問題に取り組むために、本発明者らは、４つのウイルスがコード因子の転写物に特異的なプライマーをデザインし、感染２日後にｑＲＴ−ＰＣＲによってＭＥＦ、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞由来の胚様体（ＥＢ）、ならびに脱メチル化ｉＰＳ細胞および再メチル化ｉＰＳ細胞中の発現レベルを比較した。非感染細胞および感染細胞から構成される不均一な集団を示すにもかかわらず、ｉＰＳ細胞中のウイルス依存性のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４  ＲＮＡレベルは感染ＭＥＦ中の１／５であり、ＭＥＦの再プログラミングの際のｄｅ  ｎｏｖｏメチル化によるウイルスＬＴＲのサイレンシングが示唆される。この考察は、ｉＰＳ細胞中の総Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４  ＲＮＡレベルは野生型（ｗｔ）ＥＳ細胞中のレベルと類似し、ｉＰＳ細胞中のＳｏｘ２転写物の大部分は、排他的でない場合、内因性遺伝子から転写されるという事実と一致する。ＥＢへの分化の際、ウイルス転写物および内因性転写物の両方が下方制御した。重要には、ウイルスＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびＫｌｆ４転写物はＤｎｍｔ１ノックダウンｉＰＳ細胞中で約２倍に上方制御され、Ｄｎｍｔ１活性の修復後に再度下方制御された。対照的に、ｉＰＳ細胞中のｃ−Ｍｙｃの転写物レベルは感染ＭＥＦ中の約１／２０であり、脱メチル化の分化の際に変化しなかった。本発明者らの結果により、レトロウイルスベクターが線維芽細胞の再プログラミングの際にｄｅ  ｎｏｖｏメチル化によるサイレンシングに供されることが示唆される。
ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と類似の発生能を有する
本発明者らは、奇形腫およびキメラの形成によるｉＰＳ細胞の発生能を決定した。ＳＣＩＤマウスへのｉＰＳ細胞の皮下注射の３週間後に形成された腫瘍の組織学的分析により、３つ全ての胚葉を示す種々の細胞型に細胞が分化したことが明らかとなった。重要には、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇは、未分化と思われる細胞のみで発現するが、ｗｔＥＳ細胞の注射に起因する奇形腫にあるような分化した細胞でサイレンシングした。ｉＰＳ細胞の発生能をより厳格に評価するために、ＧＦＰ標識サブクローンを、二倍体（２Ｎ）または四倍体（４Ｎ）の胚盤胞に注入した。得られる胚が注入したドナー細胞のみから構成されるので（「全ＥＳ胚」）、４Ｎ胚盤胞への細胞の注入は発生能についての最も厳密な試験である。Ｏｃｔ４−ｎｅｏＭＥＦおよびＮａｎｏｇ−ｎｅｏＭＥＦ由来のｉＰＳ細胞は、「全ｉＰＳ胚」を生成することができる。２Ｎ胚盤胞へのｉＰＳ細胞の注入により、高貢献（ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）出生前キメラおよび生存可能な出生後キメラが効率よく生成された。これらの所見は、ｉＰＳ細胞が胚の全分化系に寄与することができ、したがって、ＥＳ細胞と類似の発生能を有することを示す。
【０２０３】
実施例１に示す結果により、４つの転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４が体細胞ゲノムの胚状態への後成的再プログラミングを誘導することができるがその効率が低いということが確認される。これら４つの因子は、体細胞中でＦｂｘ１５遺伝子を発現する能力に基づいて最初に同定された。Ｆｂｘ１５はマウスＥＳ細胞および初期胚中で特異的に発現するが、多能性およびマウス発生の維持に重要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６（４）６６３（２００６））。そのＦｂｘ１５発現に基づいて選択された細胞と対照的に、内因性Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ４−ｎｅｏ）遺伝子座またはＮａｎｏｇ（Ｎａｎｏｇ−ｎｅｏ）遺伝子座を再活性化した線維芽細胞は独立して支持細胞を成長させ、発現した正常なＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２のＲＮＡおよびタンパク質レベルは多数の基準によってＥＳ細胞後成的に同一であり、生存可能なキメラを生成することができた。４因子の形質導入により、Ｏｃｔ４−ｎｅｏ線維芽細胞の３５倍のＮａｎｏｇ−ｎｅｏ由来の薬物耐性細胞が生成されたが、Ｏｃｔ４選択細胞のより高い画分は、評価した多能性ＥＳ細胞の全ての特徴を示した。
【０２０４】
上記のデータにより、ｉＰＳ細胞の多能性状態はウイルス形質導入因子によって誘導されるが、内因性多能性因子（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２が含まれる）の活性によって大部分が維持されることが示唆され、これは、ＭＥＦで高度に発現するにもかかわらず、ウイルス調節転写物のほとんどがｉＰＳ細胞中でサイレンシングされるからである。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の全レベルは、ｉＰＳおよびｗｔＥＳ細胞中で類似していた。多能性状態が内因性多能性遺伝子によって維持されるという考察は、Ｏｃｔ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子がＥＳにあるようにｉＰＳ中で低メチル化するようになり、発生レギュレーターの２価ヒストン改変が再確立されたという事実と一致する。重要には、ｉＰＳ細胞は、Ｄｎｍｔ１の不活化によって誘導される大域的脱メチル化に耐性を示し、これはＥＳ細胞に類似し、体細胞と対照的であった。低メチル化ＥＳ細胞中でのＤｎｍｔ１の再発現によって大域的に再メチル化し、これは、ｉＰＳ細胞もｄｅ  ｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａ／ｂを再活性化することを示した。全てのこれらの所見は、ｉＰＳ細胞が後成的状態を得、これが通常のＥＳ細胞と類似するという結論と一致する。
【０２０５】
４因子の発現は、体細胞の多能性状態への再プログラミングを誘導するロバストな方法であることが証明された。本発明の１つの目的は、潜在的に有害な遺伝子材料の遺伝子導入を行わずに細胞を再プログラミングする小分子を同定するための新規の方法を提供することである。
（実施例２）
方法
細胞培養、ＭＥＦ単離、およびウイルス感染
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を、１５％ウシ胎児血清、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール、および非必須アミノ酸を含むＤＭＥ中の照射ＭＥＦ上で培養した。０．２％ゼラチン上で２回継代するために全細胞から支持細胞を枯渇させ、その後にＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質を単離した。３〜４継代目の２×１０５個のＭＥＦに、パッケージングプラスミドｐＣＬ−Ｅｃｏと共にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ＭｙｃのｃＤＮＡを含むＭｏｌｏｎｅｙベースのレトロウイルスベクターｐＬＩＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｕｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅ）のトランスフェクションによって生成したプールしたウイルス上清を一晩感染させた（Ｎａｖｉａｕｘら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５７０１（１９９６））。
【０２０６】
胚盤胞注入
二倍体または四倍体の胚盤胞（ＨＣＧ注入の９４〜９８時間後）を、鉱物油下で１５％ＦＣＳを含む１滴のＤＭＥＭ中に入れた。内径１２〜１５ｍｍのフラットチップ微量注入ピペットを、ＥＳ細胞注入に使用した。数を制御したＥＳ細胞を胚盤胞腔に注入した。注入後、胚盤胞をＫＳＯＭ培地に戻し、レシピエント雌に導入するまで３７℃においた。
レシピエント雌および帝王切開
１０〜１５個の注入した胚盤胞を、交尾後２．５日目の偽妊娠Ｂ６Ｄ２Ｆ１雌の各子宮角に導入した。満期ＥＳまたはキメラ子を回収するために、レシピエント母を交尾後１９．５日目に屠殺した。生存している子を、授乳中のＢＡＬＢ／ｃ母に育てさせた。
ウイルス組み込み
ゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで一晩消化し、その後に電気泳動し、トランスファーした。ブロットを、各放射性標識ｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。
免疫組織化学
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中にて室温で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中の５％ＦＢＳで１５分間ブロッキングした。Ｓｏｘ２（モノクローナルマウス、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｏｃｔ４（モノクローナルマウス、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｃ−ｍｙｃ（ポリクローナルウサギ、Ｕｐｓｔａｔｅ）、Ｎａｎｏｇ（ポリクローナルウサギ、Ｂエチル）、およびＳＳＥＡ１（モノクローナルマウス、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）に対する一次との１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入したフルオロフォア標識された適切な二次抗体とインキュベートした。試料をＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡で分析し、Ｚｅｉｓｓ
Ａｘｉｏｃａｍカメラで画像を取得した。
結果
遺伝子選択や化学的選択を使用しない体細胞の再プログラミング
上記のように、体細胞の多能性ＥＳ細胞様状態へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再プログラミングを、マウス線維芽細胞へのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、およびＫｌｆ４のレトロウイルス形質導入によって行った。これらの実験では、稀な「誘導性多能性幹」（ｉＰＳ）細胞を、内因性のＯｃｔ４遺伝子座またはＮａｎｏｇ遺伝子座に挿入したネオマイシン耐性遺伝子の活性化についての厳格な選択によって単離した。培養体細胞由来の多能性細胞の直接単離は、治療上有利である可能性があるが、かかる方法を非マウス（例えば、ヒト）系に変換するために、上記のｉＰＳ単離プロトコールで使用されるトランスジェニックドナーの要件に対する代替法を開発することが望ましいであろう。ここに、本発明者らは、再プログラミングした多能性細胞を形態学的基準のみに基づいて遺伝子非改変ドナー体細胞から単離することができることを初めて証明した。したがって、例えば、遺伝子非改変ドナー体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）、霊長類、またはヒトから得て、再プログラミングした多能性細胞をこれらのドナー細胞から誘導することができる。
【０２０７】
胚性幹（ＥＳ）細胞を使用した体細胞核移植および細胞融合は、体細胞核を多能性状態に再プログラミングするための十分に確立されたアプローチであった。培養体細胞からの多能性ＥＳ様細胞の直接ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離は、最近、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃ（以下、「因子」と呼ぶ））の遺伝子改変された線維芽細胞への形質導入によって行われていた。稀な再プログラミングされた誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞の選択は、Ｆｂｘ１５遺伝子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３（２００６））またはＯｃｔ４遺伝子もしくはＮａｎｏｇ遺伝子の再活性化に基づいており、これらの遺伝子の全ては、相同組換えまたはＮａｎｏｇプロモーターを含む導入遺伝子によって各内因性遺伝子座に挿入された薬物耐性マーカーを保有していた。Ｆｂｘ１５活性化に基づいたｉＰＳ細胞単離によって多能性である細胞が得られた一方で、この細胞は分子レベルでＥＳ細胞と異なり、生きたキメラを生成できなかった。これらの実験では、ウイルス形質導入の３日後に選択を開始した。対照的に、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ活性化についての選択により、通常のＥＳ細胞と後成的および生物学的に識別可能な多能性ｉＰＳ細胞が産生された。しかし、多能性への再プログラミングは、因子導入後から２〜４週間にわたるＥＳ細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇの連続的活性化を含むゆっくりした段階的な過程であった。したがって、Ｇ４１８を因子形質導入の３日後にＯｃｔ４−ｎｅｏ線維芽細胞またはＮａｎｏｇ−ｎｅｏ線維芽細胞の培養物に添加した場合、薬物耐性コロニーは形成されなかったのに対して、１週間の薬物の添加によっていくつかの薬物耐性を示す再プログラミングしたコロニーが生成され、２週間の添加によって有意により多数の薬物耐性を示す再プログラミングしたコロニーが生成された。因子形質導入後の薬物選択器官と薬物耐性ｉＰＳ細胞数との間の逆の関係は、再プログラミング過程が体細胞の後成的状態を多能性細胞の後成的状態に変換する複数の確率的事象を含むという概念と一致する。
【０２０８】
本実施例では、本発明者らは、多能性ｉＰＳ細胞が通常の遺伝子非改変ドナー細胞に由来し得ることを示す。最初の実験で、本発明者らはＯｃｔ４遺伝子座に挿入したＧＦＰマーカーを使用して再プログラミング過程をモニタリングした。Ｏｃｔ４遺伝子座中にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットを保有するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、上記のレトロウイルス媒介性遺伝子導入によって４つの因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、およびＫｌｆ４で形質導入した。感染３日後、線維芽細胞は、非感染コントロール細胞より形態学に多様になり、成長が増加した遺伝子座が出現した。６日目に、小さな密集した縁の鋭いコロニーは、類似のＥＳ細胞コロニーを発生させた。その後数日間にわたってこれらのコロニーはＥＳ細胞様成長に類似するいくつかの領域を有する巨大且つより不均一な細胞凝集体に成長し続けた一方で、より小さく密集したコロニーが出現し続けた。
【０２０９】
その形態学のみに基づいて、これらの巨大コロニーのうちの８個を１１日目に選別し、１０個のさらなるコロニーを１６日目に選別した。蛍光顕微鏡下で試験した場合、ＧＦＰ発現は１１日目に検出不可能であり、１６日目に選別した１０個のコロニーのうちのたった１個が弱いＧＦＰ発現を示した。１１日目に選別した８個のコロニーのうちの１個および１６日目に選別した１０個のコロニーのうちの４個が均一なＥＳ様細胞株を生じた。完全に再プログラミングされたｉＰＳ細胞について予想されるように、５つ全ての株が１〜３継代以内にＯｃｔ４−ＥＧＦＰ発現を開始し（表１）、均一なＡＰ活性ならびにＳＳＥＡ１およびＮａｎｏｇ発現を示した。
【０２１０】
形態学的基準に基づいて最初に選別した残りのコロニーのうちの１０個は、いくつかのＥＳ様コロニーが点在した線維芽細胞様細胞を主に含む不均一な培養物を生じた（表１）。本発明者らは、これらの不均一な培養物がさらなる継代の際にさらなるｉＰＳ細胞株が得られるかどうかを調査した。これのために、本発明者らは、最初の伸長由来の５つの各混合培養物および２〜３継代以内の首尾よく確立した５つのさらなるｉＰＳ細胞株から３つのＥＳ様コロニーを選別した（表１および２）。認められた不均一性が部分的に不完全な再プログラミングまたは再プログラミングされなかった線維芽細胞の夾雑の結果であったかどうかを試験するために、本発明者は、クローン番号５および不均一なサブクローン番号５．２由来のＧＦＰ陽性細胞および陰性細胞をＦＡＣＳ分取し、サザンブロット分析を使用してプロウイルス組み込みパターンを比較した。結果は、２つの細胞集団が同一の親細胞に由来することを示し、これは、さらなる後成的事象要件を示した。二次ｉＰＳ株を生成しなかった選別したサブクローンから、３つのサブクローン（６．１、６．２、および６．３；表１および２を参照のこと）は形態の変化（小さな細胞、密集して成長したコロニー）を示したが、複数回の継代にわたってＯｃｔ４−ＧＦＰ陰性のままであり、ＡＰ、ＳＳＥＡ１、またはＮａｎｏｇについて染色されず、これらの細胞が多能性でないことが示唆された。ＥＳマーカー陰性細胞の出現は稀であり、これらの細胞はＥＳ細胞または真のｉＰＳ細胞とわずかに異なる形態（コロニー境界の形状など）を示した。細胞を４つ全てのレトロウイルスに感染させたので、４つの因子は正しいレベルで発現されず、多能性細胞よりもむしろ形質転換細胞が得られた可能性がある。例えば、高いｃ−ｍｙｃ／Ｋｌｆ４発現および不十分なＯｃｔ４／Ｓｏｘ２発現によって非ｉＰＳ細胞が急速に成長することができ、これは、再プログラミング過程におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ２の役割がｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４形質転換表現型の抑制であり得るという概念と一致する（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １：３９−４９（２００７））。
【０２１１】
試験した全てのｉＰＳ細胞株は、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ＥＳ細胞に匹敵するＧＦＰ高度を示した。これは、Ｏｃｔ４タンパク質レベルが異なるｉＰＳ細胞株で類似するという本発明者らの以前の所見と一致した（Ｗｅｒｎｉｇ，２００７）。形態学的基準によって単離されたｉＰＳ細胞が長期間にわたって表現型的に安定し続けるかどうかを分析するために、複数回の継代後にＧＦＰ蛍光をモニタリングした。これらの結果は、ｉＰＳ細胞は、少なくとも９継代目までは不変且つロバストなＯｃｔ４−ＧＦＰ発現を示したことを示す。これらのデータは、安定なｉＰＳ株を薬物選択に依存することなく効率的に誘導することができることを明確に証明している。
【０２１２】
本発明者らは、ウイルス感染したインプット細胞（ｉｎｐｕｔ  ｃｅｌｌ）画分およびＥＳ細胞様コロニー数を使用して、再プログラミング効率を評価した。典型的な実験では、約１００，０００個の細胞をウイルスに曝露した。基準としてＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−ｍｙｃの選択を使用して、本発明者らは、約１０．２％の細胞が４つ全てのウイルスに感染し、１１５個のＥＳ細胞様コロニーが生成されると評価した。選別コロニー数からのｉＰＳ細胞の誘導効率は４４％であった。したがって、全再プログラミング効率は約０．５％と推定された。
【０２１３】
最後に、本発明者らは、奇形腫形成ならびに二倍体（２Ｎ）および四倍体（４Ｎ）胚盤胞への注入による非選択ｉＰＳ細胞の発生能を評価した（表３）（Ｅｇｇａｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４（２００１））。ＳＣＩＤマウスへの皮下注入から３週間後、株８．１および１４は腫瘍を発症し、この腫瘍は、組織学的分析によって決定された３つの全胚様由来の組織型を含んでいた。２Ｎ胚盤胞への注入後、本発明者らは、色調の強い毛色のキメリズムを有する、生きている出生後動物を生成した。重要には、４Ｎ胚盤胞に注入した場合（発生能についての最も厳格な試験である）、生きているＥ１４．５胚を回収することができた（表４）。これらのデータは、薬物耐性についての選択よりもむしろ形態学的基準に基づいたｉＰＳ細胞のスクリーニングによってＥＳ細胞と類似の生物学的効力を示す多能性ｉＰＳ細胞を生成することができることを証明している。
遺伝子非改変ドナー細胞からのｉＰＳ細胞の誘導
上記実験では、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマーカーを使用して、再プログラミング過程をモニタリングしたが、再プログラミングされたｉＰＳ細胞をスクリーニングしなかった。ｉＰＳ細胞を遺伝子非改変ドナー細胞から誘導することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスおよび１２９ＳｖＪａｅ／Ｃ５７Ｂ１６（Ｆ１）マウスから野生型ＭＥＦを作製し、１２９ＳｖＪａｅ／Ｃ５７Ｂ１６（Ｆ１）マウスおよびＣ５７Ｂ１６／ＤＢＡ（Ｆ１）２〜３月齢マウスから成体尾端線維芽細胞を生成した。上記のように、細胞に４つの因子をコードするレトロウイルスを感染させ、巨大コロニーを１６日目以降に選別した。以前の実験などの場合、ＥＳ様コロニーは、初代コロニーの選別後の１継代以内に視覚可能になった。継代の継続の際またはサブクローニングにより、ＥＳ細胞の形態学および成長特性を有する同種細胞株が容易に確立された。
【０２１４】
再プログラミングされた細胞がドナー線維芽細胞を成長させると仮定して、形態学的基準にしたがったコロニーの選別のかわりに全プレートを継代することによってｉＰＳ細胞を生成することを試みた。ＥＳ細胞コロニーに完全に類似する多数の小コロニーが感染細胞集団の最初の継代の数日後以内に認められ、６個の選別コロニーのうちの５個が安定なｉＰＳ株に成長した（表３）。直接選別または全プレートの継代およびその後の各コロニーの選別のいずれかを使用した２〜３継代後、各バックグラウンドから１つまたは複数のｉＰＳ株を確立させた（表３）。全ての遺伝子非改変ｉＰＳ株は、ＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇを発現した。さらに、本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃおよび１２９／Ｂ６  ＭＥＦ由来ｉＰＳ株からキメラ胚を生成し、遺伝子非改変線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞が多能性であることが証明した（表４）。しかし、継代によって因子が細胞集団に形質導入され、簡潔な単離プロトコールである一方で、各ｉＰＳ細胞株が同一の再プログラミングした親細胞に由来したかもしれないということを排除できないということに留意すべきである。
【０２１５】
本発明者らの結果により、線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再プログラミングが非トランスジェニックドナー細胞中で十分に検出される頻度で起こり、選択圧を使用せずに安定にＯｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現することが示唆される。したがって、４因子誘導再プログラミングを野生型細胞に適用することができる。いかなる理論にも拘束されないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の異所性発現によって複数の感染細胞で段階的な再プログラミング過程が開始され、最終的に、数週間にわたって多能性が誘導されるようである。内因性Ｏｃｔ４遺伝子座の再活性化をモニタリングするためにＯｃｔ４
ＧＦＰ  ＭＥＦを使用して、本発明者らは、１コロニー以外の全コロニーで選別時にＧＦＰ陰性であり（表２を参照のこと）、数回の継代後にのみＧＦＰ陽性になることを見出した。これにより、再プログラミングがＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇなどのＥＳ細胞マーカーの連続的活性化を含むゆっくりとした過程であり、Ｏｃｔ４活性化がこの過程における最後の後成的事象の１つを示すことが示唆される。また、これらの所見は、再プログラミングしたコロニーの数が、Ｏｃｔ４活性化についての薬物選択をウイルス形質導入後初期に適用した場合に少数であるが、薬物選択を後期に開始した場合に有意に増加したという以前の所見と一致する。最後に、因子形質導入によって誘導されたゆっくりとした再プログラミング過程は、なぜ最初のｉＰＳ単離プロトコールで使用した感染から３日後の早期のＦｂｘ１５活性化についての薬物選択によって不完全な後に成的再プログラミングを受けた細胞のみが得られたのかを説明することができる。本発明者らの結果は、後期Ｆｂｘ１５活性化の選択によってＯｃｔ４活性化について選択したか形態学的基準に基づいて単離したｉＰＳ細胞に類似するｉＰＳ細胞が生成されることが予想される。
（実施例３）
方法
細胞培養およびウイルス感染
ＥＳ細胞および確立されたｉＰＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール、および非必須アミノ酸を含むＤＭＥ中の照射ＭＥＦ上で培養した。誘導性レンチウイルスでの感染によって一次ｉＰＳ株を誘導するために使用したＭＥＦを、ＲＯＳＡ２６−Ｍ２ｒｔＴＡマウス（Ｂｅａｒｄら，２００６）とＮａｎｏｇ−ＧＦＰマウス（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）との間のＦ１交配から１３．５ｄｐｃで回収した。マウスＣ／ＥＢＰαｃＤＮＡを、ｐＬｉｂ、ＭＳＣＶ−Ｎｅｏ、およびｐＭｉｇレトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩクローニング部位にクローン化した。ＥＳ多能性遺伝子をコードするｐＭＸｓベクターは以前に記載されていた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。レンチウイルスの調製およびならびにＴｅｔＯ／ＣＭＶ  プロモーターによって駆動されるＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＳｏｘ２  ｃＤＮＡをコードするドキシサイクリン誘導性レンチウイルスでの感染は以前に記載されていた（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，２００８）。レトロウイルスストックをＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用したＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞の一過性トランスフェクションによって調製し、４８時間後に上清を回収した。感染のために、精製Ｂ細胞サブセットを、１５％  ＦＣＳならびにＩＬ−４、ＩＬ−７、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ４０（０．１μｇ／ｍｌ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＤｏｘ（４μｇ／ｍｌ）を含むＩＭＤＭ中に再懸濁した。次いで、２ｍｌアリコートをレトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）（Ｔａｋａｒａ）でプレコーティングした２４ウェルプレート上にプレートし、その後にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）（８μｇ／ｍｌ）を添加した２ｍｌのレトロウイルス上清をプレートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後に１ｍｌのウイルス上清を、上記のサイトカイン馴化培地中に再懸濁したＢ細胞と置換した。プレートを９００ＲＰＭで９０分間遠心分離し、５％ＣＯ２中にて３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、感染細胞を、新鮮なサイトカインおよびＤｏｘ補足培地中でＯＰ９骨髄間質細胞株（ＡＴＣＣ）に導入した。Ｄｏｘで１４日後、コロニーを選別し、ＥＳ培地（造血性サイトカインまたはＤｏｘを含まない）および任意の残存ＯＰ９細胞を排除するためのピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）の存在下のＭＥＦ支持細胞上で培養した。
Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成分析
以前に記載のように、ＩｇＨ、Ｉｇκ、およびＩｇλ再構成を、縮重プライマー組を使用したＰＣＲによって増幅した（Ｃｈａｎｇら，１９９２；Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ａ；Ｓｃｈｌｉｓｓｅｌら，１９９１）（表２）。Ｖ−ＤＪ再構成を特徴づけるために、ＰＣＲフラグメントをＴＯＰＯベクター中でクローン化し、同一ＰＣＲフラグメントに対応する少なくとも５個のクローンを配列決定した。得られた配列を、ＤＮＡＰＬＯＴ検索エンジン（ｗｗｗ．ｄｎａｐｌｏｔ．ｄｅで見出される）で分析した。Ｉｇｈ遺伝子座でのＶ−ＤＪおよびＤ−Ｊ再構成を、ＥｃｏＲＩで消化した表示のｉＰＳ株のゲノムＤＮＡに対する３’ＪＨ４プローブ（プラスミドＪＨ４．３の１．６−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント）を使用したサザンブロットによって検出した（Ａｌｔら，１９８１）。Ｉｇｋ遺伝子座でのＶＫ−ＪＫ再構成を、３’Ｊκ５プローブ（プラスミドｐＢＳ−ＪκＭＡＲの１−ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント）を使用したＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって決定した（Ｌｅｗｉｓら，１９８２）。
ＤＮＡメチル化およびヒストンマーク分析
Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態について、亜硫酸水素塩配列決定分析を以前に記載のように行った（Ｗｅｒｎｉｇら，２００７）。全部で１０〜２０個の各サンプルのクローンを、両方向で配列決定した。以前に記載のように、Ｈ３Ｋ４およびＨ３Ｋ２７の２価ドメインの状態を、クロマチン免疫沈降およびその後の定量的ＰＣＲ分析によって決定した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００６）。
胚盤胞注入および奇形腫形成
二倍体または四倍体の胚盤胞（ＨＣＧ注入の９４〜９８時間後）を、鉱物油下で１５％ＦＣＳを含む１滴のＤＭＥＭに入れた。内径１２〜１５ｍｍのフラットチップ微量注入ピペットを、ｉＰＳ細胞注入に使用した（Ｐｉｅｚｏマイクロマニピュレーター３４を使用）。数を制御した細胞を胚盤胞腔に注入した。注入後、胚盤胞をＫＳＯＭ培地に戻し、レシピエント雌に導入するまで３７℃においた。１０〜１５個の注入した胚盤胞を、交尾後２．５日目の偽妊娠Ｂ６Ｄ２Ｆ１雌の各子宮角に導入した。満期の子を回収するために、レシピエント母を交尾後１９．５日目に屠殺した。生存している子を、授乳中のＢＡＬＢ／ｃ母に育てさせた。奇形腫生成のために、２×１０６個の細胞をレシピエントＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注入し、最初の注入開始から３〜６週間後に腫瘍を採取して切片にした。
免疫蛍光染色
細胞を４％パラホルムアルデヒド中にて２５℃で２０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１５分間ブロッキングした。Ｎａｎｏｇ（ポリクローナルウサギ、Ｂｅｔｈｙｌ）およびＳＳＥＡ１（モノクローナルマウス、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）に対する一次抗体との０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む１％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ中で１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入したフルオロフォア標識された適切な二次抗体とインキュベートした。試料をＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡で分析し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍカメラで画像を取得した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
骨髄Ｂ細胞をＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３を補足したＯＰ９細胞を含む培地にて成長させた一方で、脾臓Ｂ細胞をＩＬ−４、抗ＣＤ４０、およびＬＰＳを使用して成長させた。ＯＰ９細胞を、ゼラチンコーティングプレート上でのプレプレーティングによって枯渇させ、その後に細胞をｍＲＮＡ調製のために回収した。ピューロマイシンを線維芽細胞（２μｇ／ｍｌ）およびＢ細胞（０．３μｇ／ｍｌ）培養物に添加して、非トランスジェニック細胞を排除した。Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡを単離した。３マイクログラムの総ＲＮＡをＤＮアーゼＩで処理し、ＤＮＡ  Ｆｒｅｅ  ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡの潜在的な夾雑物を除去した。１マイクログラムのＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡを、Ｆｉｒｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写し、最後に１００μｌの水に懸濁した。定量的ＰＣＲ分析を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）における１／５０の逆転写反応を使用して三連で行った。増幅のために使用したプライマーは以下であった：ｃ−Ｍｙｃ：順方向、５’−ＡＣＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１）および逆方向、５’−ＴＣＣＡＣＡＴＡＧＣＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＣ−  ３’（配列番号２）；Ｋｌｆ４：順方向、５’−ＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧ−３’（配列番号３）および逆方向、５’−ＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＣＡ−３’（配列番号４）；Ｓｏｘ２：順方向、５’−ＣＡＴＴＡＡＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣ−３’（配列番号５）および逆方向、５’−ＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＣＡ−３’（配列番号６）；Ｏｃｔ４：順方向、５’−ＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣ−３’（配列番号７）および逆方向、５’−ＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＣＡ−３’（配列番号８）。ＲＴ反応へのｃＤＮＡの等価なローディングを確実にするために、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、以下のプライマーを使用して増幅した：順方向、５’−ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号９）および逆方向、５’−ＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号１０）。線形範囲の増幅からデータを抽出した。示したｑＲＴ−ＰＣＲデータの全てのグラムは、並行してＤＮアーゼ処理し、逆転写し、増幅してこれらの手順に固有の変動を回避したＲＮＡのサンプルを示す。ＥＳ細胞の遺伝子発現分析を、以前に公開されたプライマーを使用したＰＣＲによって行った（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。
フローサイトメトリー分析および細胞分取
以下の蛍光抱合した抗体（ＰＥ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、またはＡＰＣ標識）を、ＦＡＣＳ分析および細胞分取のために使用した：抗ＳＳＥＡ１（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗Ｉｇκ、抗Ｉｇλｌ、２、３、抗ＣＤ１９、抗Ｂ２２０、抗ｃ−Ｋｉｔ；抗ＣＤ２５、抗ｓＩｇＭ、抗ｓＩｇＤ（全てＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）。細胞分取を、ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用によって行い、９７％超の細胞分取純度を一貫して達成した。脾臓およびリンパ節由来の成熟ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞の単離のために、分取前の分化系マーカー抗体（ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ１、ｃ−Ｋｉｔ、Ｍａｃ１、およびＴｅｒ１１９）での染色後のＭＡＣＳ分取によって細胞からＬｉｎ＋非Ｂ細胞を枯渇させた。
結果
Ｂ細胞分化系における再プログラミング因子の誘導性発現
最初に、本明細書中に記載の研究により、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ転写因子（マウスおよびヒト線維芽細胞培養物（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら，２００７；Ｏｋｉｔａら，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６；Ｗｅｒｎｉｇら，２００７）およびマウス肝臓および胃由来細胞培養物（Ａｏｉら，２００８）を再プログラミングするのに十分であることが示されている）がＢ細胞分化系細胞を再プログラミングできるかどうかを探求した。マウスリンパ球のウイルス感染力が比較的低いので、本発明者らは、Ｂ細胞中で４つの再プログラミング因子の誘導性導入遺伝子発現が可能な系を確立した。
【０２１６】
この目的を達成するために、本発明者らは、最近、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４転写因子をコードするドキシサイクリン誘導性（Ｄｏｘ）レンチウイルスベクターがマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をＤｏｘ離脱後にその多能性を維持する安定なｉＰＳ細胞に再プログラミングすることができることを示した（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）。胚盤胞に注入した場合、これらの細胞は、同一のプロウイルスコピーを保有する体細胞のクローン集団を含む出生後キメラを作製し、「初代」ｉＰＳ細胞を生成できた（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）。本発明者らは、これらのキメラ由来のＢ細胞は、適切な培養条件下でＤｏｘに曝露した場合、初代ｉＰＳ細胞を誘導したプロウイルスコピーを活性化することができ、したがって、再プログラミングおよび「二次」ｉＰＳ細胞の生成を容易にすることができると理由づけた（図３）。
【０２１７】
構成性に発現されるＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される逆テトラサイクリントランスアクチベーター（Ｒ２６−Ｍ２ｒｔＴＡ）および内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子座へのＧＦＰのノックイン（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ）を含むＭＥＦに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４遺伝子をコードするＤｏｘ誘導性レンチウイルスベクターを感染させた（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）。Ｄｏｘ処理の１２日後に出現する巨大な巨視的コロニーを選別し、Ｄｏｘを使用せずに増殖させてＮａｎｏｇ−ＧＦＰ＋ｉＰＳ株を確立し、多能性マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ１抗原、およびＯｃｔ４を発現させた。ＭＥＦ駆動初代ｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入して、胚性キメラおよび成体キメラを生成した。プロＢ（Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋）およびプレＢ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２５＋）（Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ａ）を骨髄から単離し、成熟ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞を８週齢の成体キメラマウスの脾臓から精製し、造血性サイトカインおよびＤｏｘを補足した培地中で７日間成長させた。機能的ピューロマイシン耐性遺伝子を、  Ｍ２ｒｔＴＡのターゲティングストラテジーの一部としてＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入し（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）、ピューロマイシン選択（０．３μｇ／ｍｌ）によって宿主駆動非トランスジェニックＢ細胞を排除した。
【０２１８】
キメラ由来のドナーＢ細胞がＤｏｘの存在下で高発現レベルの４因子を誘導したので、ＭＥＦ−ｉＰＳ−番号１細胞株由来のキメラをさらなる研究のために選択した。ＭＥＦ−ｉＰＳ番号１株由来の成体尾端線維芽細胞は、Ｄｏｘの添加後にＮａｎｏｇ−ＧＦＰ＋ｉＰＳ株を生成するが、Ｄｏｘ添加後の４因子の発現レベルは同一キメラ由来のＢ細胞で認められる発現レベルより低かった。
非最終分化Ｂ細胞の再プログラミング
培養５日以内に細胞が死滅したので、ＬＩＦおよびＤｏｘを補足した照射支持細胞を含むＥＳ培地で培養した骨髄由来Ｂ細胞および脾臓Ｂ細胞を再プログラミングする最初の試みは失敗した。本発明者らは、サイトカイン添加がＢ細胞の最初の増幅に必要であり、この増殖により、４因子の発現によって後成的再プログラミングを開始するのに必要な十分な細胞数が確保されると理由づけた。したがって、本発明者らは、未成熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞の成長ならびにＥＳ細胞の成長を支持する培養条件を至適化し、Ｂ細胞からｉＰＳ細胞への再プログラミング過程中の生存能を確保した。
【０２１９】
ＥＳ細胞成長に必要なＬＩＦ、Ｂ細胞発生を支持するＩＬ−７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ−３Ｌ（Ｍｉｌｎｅら，２００４）、成熟Ｂ細胞の増殖に重要なＩＬ−４、抗ＣＤ４０、およびＬＰＳ（Ｈａｙａｓｈｉら，２００５）を補足したＯＰ９骨髄間質細胞を含む培地中で細胞を成長させた。最初の実験では、本発明者らは、Ｄｏｘ処置の１４日後に８週齢の成体キメラ骨髄由来の分取されたプレＢ細胞およびプロＢ細胞の培養物中でＡＰ陽性コロニーを検出した。Ｄｏｘ誘導の３日後に小さくて平らなコロニーが出現し、その後にロバストに拡大した。Ｄｏｘ誘導の約１１日後、粒状の巨大コロニー内に埋め込まれた滑らかなＥＳ様小コロニーが認められ、１４日目にＮａｎｏｇ−ＧＦＰ＋となった。コロニーを、Ｄｏｘ誘導の１４日後に３つの独立した実験から選別し、Ｄｏｘを含まないＥＳ培地中のＭＥＦ支持細胞上で成長させた。３継代以内に、選別したコロニーの９０％超が均一なＥＳ様Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞に成長した。以後、これらの細胞株を、ｉＢ−ｉＰＳ細胞（「未熟な」非完全分化Ｂ細胞（プレＢ細胞およびプロＢ細胞が含まれる）由来のｉＰＳ細胞）という。
【０２２０】
確立したｉＢ−ｉＰＳ細胞株から回収したゲノムＤＮＡを、重鎖および軽鎖再構成についてのＰＣＲによって分析した。本発明者らは、重鎖遺伝子座の３つの主なＶセグメントファミリー（ＶＨＱ５２、ＶＨ７１８３−ＤＪ、ＶＨＧａｍ３．８）を含む再構成、ＤＨ−ＪＨ重鎖再構成、ならびにＩｇκおよびＩｇλ軽鎖再構成の大部分を認識する以前に記載の縮重プライマーを使用した（Ｃｈａｎｇら，１９９２；Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ａ）（表２）。Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋Ｐｒｏ−Ｂ細胞分集団から再プログラミングされた代表的な細胞株は、プロＢ細胞の発生段階でのドナーＢ細胞サブセットにおける再構成が予想されるように、いくつかのｉＰＳ株がＤＨ−ＪＨ再構成（株番号１、２、７、９）を保有した一方で、他はいかなるＩｇＨ再構成（株番号３、４、６）の証拠も示さないことを示した。成体骨髄由来Ｂ２２０＋ＣＤ２５＋プレＢ細胞から確立された細胞株は、少なくとも１つのＶＨ−ＤＪＨ再構成およびさらなるＤＨ−ＪＨ再構成またはＶＨ−ＤＪＨ再構成（株番号５、８）を保有し、ＩｇＨ遺伝子座の両遺伝子再構成はかかるＢ細胞集団で典型的に認められた（Ｊｕｎｇら，２００６）。ｉＢ−ｉＰＳ中のＩｇＨ再構成を、サザンブロット分析によって検証した。
【０２２１】
その後の分析のために、本発明者らは、ＩｇＨ再構成の遺伝的証拠を含む細胞に注目した。これは、この細胞株のみを明らかにＢ細胞分化系にかかわる細胞まで追跡することができるからである。全てのｉＢ−ｉＰＳ細胞株はＥＳマーカーであるＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＯｃｔ４に陽性染色し、試験した全ての細胞株（番号５、７、８、９）は、免疫不全マウスに注射した場合に分化した奇形腫を生成した。さらに、本発明者らは、いくつかのｉＢ−ｉＰＳ細胞株から成体キメラを得た（表１）。ｉＢ−ｉＰＳ番号８細胞株由来キメラ由来の尾ＤＮＡの代表的なサザンブロットは、ドナーｉＢ−ｉＰＳ細胞株と同一の重鎖再構成パターンを示した。したがって、キメラが各ｉＢ−ｉＰＳ細胞株に由来するが、汚染ＥＳまたはＭＥＦ由来ｉＰＳ細胞に由来しないことが確認された。得られた全マウスのアグーチ毛色によって証明されるように、ｉＢ−ｉＰＳ株番号９由来のキメラの１００％の生殖系列が伝達された。予想通り、サザンブロット分析により、いくつかのマウスのドナーｉＢ−ｉＰＳ株中に見出された再構成ＩｇＨ対立遺伝子の分離が確認された。これらの結果は、ＤＨ−ＪＨまたはＶＨ−ＤＪＨ再構成を保有するＢ細胞分化系にかかわるが完全に分化されない細胞を、４つの転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの誘導によって多能性ＥＳ様状態に再プログラミングすることができることを証明している。
最終分化したＢ細胞の再プログラミング
本発明者らは、５つの独立した実験において成熟脾臓ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋細胞または骨髄由来ＩｇＫ＋細胞からいかなる再プログラミングされたＡＰ＋コロニーも生成できなかった。ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋成熟トランスジェニックＢ細胞を本発明者らの培養条件で６週間まで維持し、Ｂ細胞マーカーを発現し続けることができることを考慮すると、これは不可解である。トランスジェニックＢ細胞がｃ−Ｍｙｃ（Ｂ細胞成長を促進することが公知であり、Ｂ細胞形質転換における重要な作用因子（ｐｌａｙｅｒ）である）の誘導によってＤｏｘを含む馴化培地中で比較的長期間増殖できるようであった（Ｚｈｕら，２００５）。したがって、本発明者らは、さらなる多能性因子が成熟Ｂ細胞の再プログラミングを達成する必要があるという仮説を試験した。成体ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋脾臓Ｂ細胞を、線維芽細胞再プログラミングについてスクリーニングするために最初に生成された２０の異なる多能性因子をコードするレトロウイルスと組み合わせて感染させた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。それにもかかわらず、これらの実験では繰り返し負の結果が得られた。
【０２２２】
別のアプローチとして、本発明者らは、その成熟Ｂ細胞同一性の変化によってＤｏｘ依存性４因子誘導に対して応答するようにＢ細胞を「感作する」ことを目的とした。骨髄転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）の過剰発現が、Ｐａｘ５（成熟Ｂ細胞発生および免疫学的機能の主なレギュレーターである転写因子）（Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ｂ）の機能の破壊によってＢ細胞をマクロファージ様細胞（Ｘｉｅら、２００４）に再プログラミングすることができることが示されている。これらの実験では、Ｃ／ＥＢＰα形質導入Ｂ細胞は、骨髄サイトカインの存在下にて骨髄間質細胞で成長し、機能的マクロファージに分化した（Ｘｉｅら，２００４）。したがって、本発明者らは、Ｃ／ＥＢＰαでの形質導入が成熟Ｂ細胞の再プログラミングを容易にするかどうかを試験した。
【０２２３】
１０週齢キメラ由来の成体脾臓Ｂ細胞を、Ｃ／ＥＢＰαおよび／またはＩＬ７−Ｒαサブユニットをコードするレトロウイルスで形質導入し、Ｄｏｘの存在下にてＯＰ９細胞で培養して、４つの因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを誘導した。ＡＰ陽性コロニーは、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαおよびＩＬ７−Ｒαで形質導入した細胞中で培養１４日後に出現したが、ＩＬ７−Ｒαのみで形質導入した細胞中には出現しなかった。ＯＰ９での成長３日後に、接着性の小コロニーが形成され、このコロニーはより密度が高い粒状コロニーに成長し続けた。Ｄｏｘ誘導性プレＢ細胞およびプロＢ細胞培養物に類似して、巨大で密集した粒状コロニー内に小さな円形のＥＳ様コロニーが出現し、およそ１４日目にＮａｎｏｇ−ＧＦＰ＋増殖巣（ｆｏｃｕｓ）が容易に検出された。
【０２２４】
ＭＥＦ支持細胞やゼラチンコーティングプレート上で細胞を培養した場合にｉＰＳ細胞が検出されなかったので、ＯＰ９骨髄間質細胞上のプレーティングはｉＰＳ細胞の回収に重要であった。１４日目に単離したコロニーを造血性サイトカインやＤｏｘを含まないＭＥＦ支持細胞上で継代し、３継代以内に全ての株がＥＳ様形態をとり、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰマーカーに陽性を示した。
【０２２５】
本発明者らは、ＦＡＣＳ分析を行ってＣ／ＥＢＰαレトロウイルスを感染させたＤｏｘ誘導性骨髄Ｂ２２０＋Ｂ細胞集団および成熟脾臓ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞におけるＳＳＥＡ１およびＮａｎｏｇ多能性マーカーの活性化速度を測定した。このアッセイは、ＳＳＥＡ１＋細胞がＤｏｘ添加の７日目に最初に検出され、１１日目に豊富になったという類似の再プログラミング速度を示した。Ｎａｎｏｇ発現は、多能性マーカーの連続的出現と類似して、ＭＥＦの再プログラミング中の１５日目に検出された（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら，２００８）。本発明者らの結果により、Ｃ／ＥＢＰαでの形質導入がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の発現に応答するように成熟Ｂ細胞を感作し、多能性マーカーを再発現することができることが示唆される。
【０２２６】
本発明者らは、Ｄｏｘ添加およびＣ／ＥＢＰα形質導入の１４日後に成体脾臓およびリンパ節由来のＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞を含む独立した組織培養ウェルから選別した１２０個の独立したｉＰＳ株を確立し、徹底的な特徴づけのために９細胞株を無作為に選択した（株１〜６は成体脾臓から得、７〜９はリンパ節から得た）。以後、本発明者らは、これらの細胞株を「Ｂ−ｉＰＳ」細胞（成熟「Ｂ」細胞由来のｉＰＳ細胞）という。
【０２２７】
次に、本発明者らは、Ｂ−ｉＰＳ細胞株のマーカー発現、ＤＮＡメチル化、およびヒストンマークを特徴づけた。免疫蛍光染色は、全てのＢ−ｉＰＳ細胞株がＥＳ細胞マーカーであるＡＰ、ＳＳＥＡ１抗原、Ｏｃｔ４タンパク質を一様に発現し、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰに陽性であることを示した。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析は、Ｂ−ｉＰＳおよびＥＳ細胞が類似のレベルのＮａｎｏｇ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、およびＧＤＦ３遺伝子を発現するが、初代Ｂ細胞は発現しなかったことを示した。亜硫酸水素塩配列決定を行って、ｉＢ−ｉＰＳ細胞株およびＢ−ｉＰＳ細胞株のＯｃｔ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定した。予想通り、線維芽細胞およびＢ細胞コントロールサンプルは、両プロモーターで広域のメチル化を示したのに対して、Ｂ−ｉＰＳ株およびｉＢ−ｉＰＳ株はＥＳ細胞と類似のこれらの領域の広範な脱メチル化を示した。
【０２２８】
細胞のクロマチン状態を評価するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびリアルタイムＰＣＲを行って、ＥＳ細胞中で２価である（活性または抑制性メチル化マークの両方を保有する）ことが公知の選択された遺伝子組上の「活性な」ヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）および「抑制性」ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）メチル化マークを定量した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００６）。細胞分化として、かかる遺伝子は「１価」になり、その発現に応じてＨ３Ｋ４ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３マーカーのいずれかを保有することができる。Ｂ細胞転写因子遺伝子であるＰａｘ５のプロモーター領域は、ドナー成熟Ｂ細胞中のＨ３Ｋ４ｍｅ３メチル化の強い富化を示したのに対して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化はサイレント遺伝子Ｚｆｐｍ２およびＩｒｘ２で優位であった。逆に、Ｂ−ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞では、全てのこれらの遺伝子は両ヒストン改変が等しく豊富であり、これは、これらの２価のドメインが再プログラミング中に再確立されたという概念と一致する。
【０２２９】
まとめると、本発明者らの結果は、Ｂ−ｉＰＳ細胞のクロマチン配置が最終分化した成体成熟Ｂ細胞に典型的な配置からＥＳ細胞に特徴的な配置に変換したことを示す（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００６）。
Ｂ−ｉＰＳ細胞中の免疫グロブリン遺伝子座の再プログラミングによってドナー細胞の成熟Ｂ細胞同一性を確認する
Ｂ−ｉＰＳ細胞中のＩｇ遺伝子座のゲノム再構成を特徴づけるために、ゼラチン上で成長させたＭＥＦ枯渇ｉＰＳ細胞株由来のゲノムＤＮＡを、サザンブロッティング、ＰＣＲ、および各ＰＣＲフラグメントの配列決定を含む相補性アプローチによってＩｇＨ、Ｉｇκ、およびＩｇλ再構成について分析した（Ａｌｔら，１９８１；Ｃｈａｎｇら，１９９２；Ｃｏｂａｌｅｄａら，２００７ａ；Ｌｅｗｉｓら，１９８２；Ｓｃｈｌｉｓｓｅｌら，１９９１）（表６）。全ての細胞株は、以下の２つの重鎖再構成を含んでいた。一方が増殖性のインフレームＶ−ＤＪ再構成であったのに対して、他方は凍結したＤ−Ｊ再構成または非増殖性Ｖ−ＤＪ再構成のいずれかであった。これらの結果は、末梢の成体成熟Ｂ細胞が２つの再構成された重鎖遺伝子座を有するという十分に確立された所見と一致する（Ｊｕｎｇら，２００６）。
【０２３０】
成熟Ｂ細胞について予想されるように、軽鎖遺伝子座は１つの増殖性のインフレームＩｇκまたはＩｇλ軽鎖再構成を有していた（Ｊｕｎｇら，２００６）。マウス中の９５％のＩｇλ＋Ｂ細胞が非増殖性Ｉｇκ再構成を保有することが公知であるにもかかわらず、Ｂ−ｉＰＳ細胞株番号９は、生殖系列配置中に保持された再構成された増殖性のＩｇλ鎖およびκ遺伝子座を有する小さなＢ細胞分集団に由来した（Ｎａｄｅｌら，１９９０；Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｆｅｒら，２００３）。最後に、Ｂ−ｉＰＳ細胞株番号４由来の重鎖および軽鎖再構成から得た配列により、この細胞株が得られたドナーＢ細胞核が体細胞超変異（ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原と遭遇した後に生じ、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡ全体に存在する「ホットスポット」にて高い比率での体細胞変異の獲得を含む過程）を受けたという決定的な証拠が得られた（Ｔｅｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ，２００７）。この有向超変異により、特異的な外来抗原を認識して結合する能力が増大した免疫グロブリン受容体を発現するＢ細胞が選択される。この細胞株中の増殖性再構成の可変領域中のほとんどの非サイレント変異の存在量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで既に抗原に遭遇していた非ナイーブＢ細胞も直接再プログラミングの影響を受けることを示す。
【０２３１】
Ｂ−ｉＰＳ番号４細胞株は、細胞分取過程中のＩｇＭ＋ＩｇＤ−細胞の汚染から生じた可能性が高い。何故なら、再プログラミングのためにＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞を選択し、この選択によってナイーブ成熟Ｂ細胞のみが抗原に遭遇する細胞として生成されと予想され、体細胞超変異がＩｇＤ抗原を下方制御するからである（Ｍａｔｔｈｉａｓ  ａｎｄ  Ｒｏｌｉｎｋ，２００５）。最後に、Ｃ／ＥＢＰαウイルス導入遺伝子は、分析した全てのＢ−ｉＰＳ細胞株由来のゲノムＤＮＡ中で検出された。上記のゲノム分析により、ｉＰＳ細胞株は最終分化した成体成熟Ｂ細胞に由来し、このＢ細胞は、その骨髄での変異が完了し、予想される機能的重鎖および軽鎖の再構成を保有し、末梢リンパ器官に存在しているという明確な証拠が得られる。
Ｂ−ｉＰＳ細胞の発生能
発生能についての最初の試験として、本発明者らは、８つのＢ−ｉＰＳ細胞株を免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの背側の側腹部に皮下注入した。注入６週間後、全注入マウスに巨視的奇形腫が認められた。組織学的試験により、奇形腫が３つの全胚葉を示す細胞型（腸様上皮組織（内胚葉）、横紋筋（中胚葉）、軟骨（中胚葉）、神経組織（外胚葉）、およびケラチン含有上皮組織（外胚葉）が含まれる）を含むことが示された。その発生能をより厳格に評価するために、各Ｂ−ｉＰＳ細胞株を二倍体（２Ｎ）胚盤胞に注入して、試験した４つ全てのＢ−ｉＰＳ細胞株から生きた高貢献キメラを生成した（表５）。Ｂ−ｉＰＳ番号４および番号１由来のキメラから単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、ドナー注入したＢ−ｉＰＳ細胞株中で見出されるものと同一の再構成されたＩｇκ遺伝子座に対応するゲノムフラグメントの存在が明らかとなった。重要には、胚盤胞注入前にＢ−ｉＰＳ株番号１の形質導入のために使用された構成性に発現したレンチウイルス導入遺伝子ＥＧＦＰベクターを保有する子孫の誘導によって明らかであるように、Ｂ−ｉＰＳ株番号１は、生殖系列に貢献した。
【０２３２】
得られた胚が注入したドナー胚のみに由来するので、４Ｎ宿主胚盤胞中の多能性細胞の注入を含む四倍体胚補完によるマウスの生成は、発生能についてのもっとも厳密な試験である（Ｅｇｇａｎら，２００１）。試験した両Ｂ−ｉＰＳ株（番号４および番号９）は、４Ｎ胚盤胞への注入後に妊娠中期および妊娠後期の「全Ｂ−ｉＰＳ胚」を生成することができた。遺伝子再構成の際に失われるＢ細胞受容体重鎖遺伝子座由来の２Ｋｂ生殖系列領域の検出のための高感度ＰＣＲ分析（Ｃｈａｎｇら，１９９２）は、ドナー核中のレパートリーから予想されるように、四倍体胚補完によって誘導されたＢ−ｉＰＳ番号４細胞株胚由来のゲノムＤＮＡが胚帯（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｂａｎｄ）を喪失してＤ−Ｊ再構成のみを保有していたことを示す。この結論は、Ｂ−ｉＰＳ番号４から得たＥ１４．５四量体胚由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって確認された。この分析により、生殖系列対立遺伝子についてのいかなる証拠もなく、２つの再構成したＩｇＫ遺伝子座対立遺伝子が証明された。これは、同一の２つの再構成されたＩｇＫ遺伝子座および宿主胚盤胞由来細胞に由来する胚帯を生成した２Ｎキメラから得たＤＮＡと対照的である。
【０２３３】
本発明者らは、次に、再プログラミングされた成熟Ｂ細胞が、その再構成されたＩｇＨ遺伝子座およびＩｇＬ遺伝子座によって課された制限の結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏでモノクローナルＢ細胞を生成する能力を試験した（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，２００２；Ｉｎｏｕｅら，２００５；Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｆｅｒら，２００３）。キメラマウス中のＢ−ｉＰＳ由来細胞の単離を容易にするために、Ｂ−ｉＰＳ株番号４および９を、胚盤胞注入の前のレンチウイルスベクター媒介形質導入によってＧＦＰマーカーで標識した。末梢血から精製されたＣＤ１９＋細胞上で発現したＩｇκおよびＩｇλ軽鎖タンパク質の表面発現を、ＦＡＣＳ染色によって評価した。Ｂ−ｉＰＳ番号４由来キメラ中の全てのＧＦＰ＋Ｂ細胞は、Ｉｇκを発現するがＩｇλタンパク質を発現せず、これは、この細胞株における機能的Ｉｇκ軽鎖再構成を示した遺伝子分析と一致する。対照的に、Ｂ−ｉＰＳ番号９細胞株由来Ｂ細胞は、機能的Ｉｇλ軽鎖再構成のみを保有していた。
【０２３４】
最後に、本発明者らは、２つのＢ−ｉＰＳ細胞株を確立した。この細胞株は、本発明者らの研究に記載した同一の培養条件で成長したＯｃｔ−４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαでの遺伝子非改変成熟Ｂ細胞の直接的感染によって生成され、成体キメラを生成することができた。まとめると、本発明者らの結果により、機能的な軽鎖および重鎖再構成を含む成熟Ｂ細胞ドナー核が多能性に再プログラミングされた明確な分子的および機能的証拠が得られる。細胞株は、増殖性の重鎖および軽鎖再構成を保有し、多能性マーカーを発現し、生きたキメラを生成し、生殖系列に貢献した。
成熟成体Ｂ細胞の多能性への再プログラミング効率
成熟成体Ｂ細胞の多能性への再プログラミング効率を評価するために、成体キメラの脾臓から単離したＣＤ１９＋Ｂ細胞の巨大な出発プール（３×１０６）に、ネオマイシン耐性遺伝子を保有するＣ／ＥＢＰαコードレトロウイルスを感染させた。２４時間後、ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞を、単一細胞として９６ウェルプレート中のＤｏｘおよびＬＩＦが存在するサイトカイン馴化培地中のＯＰ９間質細胞上にプレートした。プレーティング５日後、ピューロマイシンおよびネオマイシンを培養培地に添加して、Ｃ／ＥＢＰαにも感染したトランスジェニックＢ細胞を選択した（図４）。２０日目に、細胞成長を示したウェルをＮａｎｏｇ−ＧＦＰ＋細胞の検出のためのＦＡＣＳによってスクリーニングした。陽性にスコアリングされたウェルを拡大し、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ  ｉＰＳ細胞が３日以内に出現した。得られたＢ−ｉＰＳ株のＰＣＲ分析により、２つの独立した実験から得た全ての細胞株が異なるＢ細胞受容体再構成を有するＣ／ＥＢＰα感染成熟Ｂ細胞に由来することが確認された。これらのデータに基づいて、本発明者らは、得られたＧＦＰ＋ウェル数（出力）をＣ／ＥＢＰα感染トランスジェニックＢ細胞含有ウェル数（ピューロマイシンおよびネオマイシン二重耐性ウェル＝入力）で割ることによって再プログラミング効率を計算することができた。この計算により、成熟Ｂ細胞の直接的再プログラミングの相対効率は２７〜３４細胞中で約１個であることが示唆された。本発明者らは、比較的高い再プログラミング効率はレトロウイルスベクター感染およびランダムプロウイルス組み込みに依存しなかった５つの異所性発現因子のうちの４つの強いＤｏｘ媒介誘導によると考えている。
【０２３５】
【表１】
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【０２３６】
【表２】
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【０２３７】
【表３】
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【０２３８】
【表４】
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【０２３９】
【表５】
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【０２４０】
【表６】
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リファレンス
以下のリファレンスを本明細書中で引用し、その教示は、全ての目的のために参考として援用される。
【０２４１】
【化３】
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【０２４２】
【化４】
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【０２４３】
【化５】
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【０２４４】
【化６】
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【０２４５】
【化７】
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【０２４６】
【化８】
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【０２４７】
【化９】
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【０２４８】
【化１０】
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【０２４９】
【化１１】
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【０２５０】
【化１２】
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【０２５１】
【化１３】
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【０２５２】
【化１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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