(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性を示す抗体を提供することである。【解決手段】  デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性があることを特徴とする抗体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性があることを特徴とする抗体。
【請求項２】
配列番号３に記載のＨ鎖配列が含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号３に記載のＨ鎖配列と、配列番号４に記載のＬ鎖配列とが含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号３に記載のＨ鎖配列と、配列番号５に記載のＬ鎖配列とが含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）は主に副腎皮質から分泌されるステロイドホルモンの一種として知られている。そしてこのホルモンは、副腎皮質に疾患があると異常な血中濃度を示すことが分かっている。そのためＤＨＥＡ―Ｓは、各種副腎皮質疾患の診断マーカーとして利用されている。
【０００３】
ＤＨＥＡ−Ｓの血中濃度測定では通常、抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を用いた競合法が利用されている。この方法ではまず、固相化された抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体をアルカリホスファターゼなどの酵素で標識されたＤＨＥＡ−Ｓ（以下、標識ＤＨＥＡ−Ｓ）と検体との混合物に加え反応させる。そして、その後これを洗浄し、固相に結合している標識ＤＨＥＡ−Ｓから出るシグナルを測定する。検体中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度が低い時には多くの標識ＤＨＥＡ−Ｓが固相に結合して強いシグナルが出る。しかし、血中ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が高くなると固相に結合する標識ＤＨＥＡ−Ｓが減り、弱いシグナルとなる。このシグナル変化の割合を調べることにより、血中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度を求めることができる（図１）。
【０００４】
以上のようなＤＨＥＡ−Ｓ測定系を構築するためには、抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体が必要となる。しかし現在までに報告されている抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体は抗原との反応性が低く、高感度な測定系を構築する上で大きな課題となっていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性を示す抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る抗体は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性があることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列が含まれる。
【０００８】
また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる。
【０００９】
また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる。
【００１０】
また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる。
【００１１】
また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高感度なＤＨＥＡ−Ｓ測定系を構築できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】競合法によるＤＨＥＡ−Ｓ測定の原理図である。
【図２】Ｈ鎖変異体１の検量線を示した図である。
【図３】Ｌ鎖変異体１の検量線を示した図である。
【図４】Ｈ鎖変異体１とＬ鎖変異体１を掛け合わせた変異体の検量線を示した図である。
【図５】Ｈ鎖変異体１とＬ鎖変異体２を掛け合わせた変異体の検量線を示した図である。
【図６】各変異体の抗原検出感度の比較を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の抗体は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）との高い反応性があることを特徴とする。以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１５】
本発明の抗体としては、例えば、配列番号３に記載のＨ鎖配列が含まれる抗体、配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体が挙げられる。
【００１６】
本発明の抗体は、ＤＨＥＡ−Ｓとの反応性があれば特にその由来が限定されるものではなく、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ウサギ、魚類などに由来する抗体を利用することができ、ＤＨＥＡ−Ｓとの反応性があれば特にその由来が限定されるものではなく、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ウサギ、魚類などに由来する抗体を利用することができる。
【００１７】
さらに、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、２重特異性抗体のいずれであってもよく、これらの抗体の混合物であってもよく、融合タンパク質の形態をとっていても構わない。
【００１８】
本発明の抗体と融合される化合物に関しては特にその種類が限定されるわけではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、アビジン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホーセラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼなどのタンパク質分子、ＨｉｓタグやＦｌａｇタグやｃＭｙｃタグなどのペプチドタグを融合させることも可能である。
【００１９】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００２０】
本実施例に使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。
炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）
１２ｍＭ      炭酸ナトリウム
３８ｍＭ      炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ  ７．４）
１ｍＭ        トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
７．５ｍＭ    塩化ナトリウム
０．０５％    ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
１％          スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
０．１％      スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ          ジエタノールアミン
０．５ｍＭ    塩化マグネシウム
１０ｍＭ      ４−メチルウンベリフェリルリン酸
【００２１】
（１）抗原溶液の調製
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）を１００ｍｇ量り取り、１０ｍｌの５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にリンカーが導入されているＤＨＥＡ−Ｓを１４ｍｇ量り取り、２００μｌのジメチルホルムアミドヘ溶かした。その後、このＤＨＥＡ−Ｓ溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そして、この反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のＤＨＥＡ−Ｓを除去した。透析後は透析チューブの中からＤＨＥＡ−Ｓで標識されたＢＳＡを回収し、免疫用の抗原として利用した。
【００２２】
（２）実験動物への免疫
免疫動物としてマウス（雌、ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢）を用意した。次に、１ｍｇ／ｍｌの抗原溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そして、この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後、この溶液を用意してあるマウスの腹腔へ１００μｌずつ注入し、免疫した。
初回の免疫を行った１週間後、フロイントインコンプリートアジュバンドで上述の乳化混合溶液を作成し、マウスの腹腔へ１００μｌずつ注入して再度免疫した。そして２回目の免疫以降はこの免疫作業を１週間おきに３か月間繰り返し行った。
【００２３】
（３）細胞融合
３か月間の免疫後、免疫したマウスから脾臓を摘出した。そして、ここからＢ細胞を単離し、ミエローマ細胞と混ぜて電気融合法により細胞融合させ、融合細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ−ＲＤＦ＋１０％ウシ血清＋５％ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、１．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう細胞密度を調整した。その後、この細胞懸濁液を３８４プレートへまき、３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。
【００２４】
（４）スクリーニング
融合細胞の培養後、培養上清中に分泌された抗体と抗原との反応性をＥＬＩＳＡ法によって下記の通り調べた。
（Ａ）抗マウス抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）標識ＤＨＥＡ−Ｓを含むインキュベーション緩衝液を５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｇ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４６５ｎｍ）、抗原と反応性のある抗体が含まれるウェルを調べた。
【００２５】
（５）クローニング
スクリーニングにより、抗原と強く反応する抗体が含まれるウェルを同定した。このウェルから細胞を回収し、細胞培養用培地（Ｅ−ＲＤＦ＋１０％ウシ血清）に懸濁して３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。その後、細胞の生育が確認できたら下記の通り限界希釈を行い、細胞を単クローン化した。
（Ａ）回収した細胞を、６．４ｍｌの細胞培養用培地へ懸濁した。
（Ｂ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｃ）残された３．２ｍｌの細胞懸濁液に新たな細胞培養用培地を等量加え、よく懸濁した。
（Ｄ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｅ）ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となるまで上記の希釈・分注操作を繰り返した。
（Ｆ）細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２の環境下におき、培養した。
（Ｇ）培養上清中に分泌された抗体と抗原との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、ＥＬＩＳＡの条件は、スクリーニングの際に行ったＥＬＩＳＡと全く同じ条件を用いた。
（Ｈ）抗原と強く反応する抗体が含まれるウェルの中から特に、ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となっているものだけを選抜した。そして、これらのウェルを顕微鏡で観察し、細胞が単クローン化されていることを確認した。その後、このウェルから細胞を回収した。
【００２６】
（６）遺伝子配列の取得
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、回収した細胞からｍＲＮＡを精製した。その後、このｍＲＮＡをテンプレートとし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡをテンプレートとし、抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子をＰＣＲ法でそれぞれ増幅させた。なお、この時行ったＰＣＲでは、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（ＰＲＯＧＥＮ社）をプライマーとして用いた。その後、このＰＣＲ産物の遺伝子配列を解析し、ＤＨＥＡ−Ｓと反応性のある抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の全長配列を決定した。この時、Ｈ鎖配列は配列番号１、Ｌ鎖配列は配列番号２の通りであることが確認された。
【００２７】
（７）変異体の作成及び性能評価
配列番号１に記載のＨ鎖と配列番号２に記載のＬ鎖とを含む野生型抗体をベースとして変異体を複数デザインし、各変異体の発現ベクターを作成した。そして、このベクターをＣＯＳ細胞へ導入し、各変異体を一過性発現させた。各変異体を含むこの培養上清を用いてそれぞれその性能を以下の通り評価した。
初めに、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）で標識されたＤＨＥＡ−Ｓ（以下、ＣＪ）を抗マウスＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加えて混ぜた。次に、ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１〜６）を用意し、ここにそれぞれ一定量加えた。更に変異体が含まれる溶液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてＤＨＥＡ−Ｓが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２〜６）を加えた時のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。ＤＨＥＡ−Ｓ濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。そして（Ｂ／Ｂ０）×１００＝５０％となる時のキャリブレーター濃度（Ｃ５０）を指標とし、各変異体の抗原検出感度を定量的に評価した（この値が小さいほど、抗原検出感度が高いことを意味している）。なお、この一連の操作は東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行った。以上の方法で各変異体の抗原検出感度を評価したところ、野生型抗体よりも抗原検出感度が高くなっている変異体を見つけることができた（図２−図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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