(57)【要約】【課題】神経退行性疾患治療剤候補物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】１）成体マウス由来の神経幹細胞に、ベータアミロイド、ＭＰＴＰ（１−methyl−４−phenyl−１，２，３，６−tetrahydropyridine）、ロテノン、オキシドーパミン、グルタメート、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）及びＳ１００Ｂ（Ｓ１００ calcium−binding protein Ｂ）からなる群のうち選択された１以上の神経細胞損傷誘発物質を処理する段階と、２）前記神経細胞損傷誘発物質が処理された神経幹細胞に試験物質を投与する段階と、３）細胞形態素分析を介して、神経幹細胞の分化及び細胞死滅のいかんを確認する段階と、を含む、神経退行性疾患治療剤候補物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）成体マウス由来の神経幹細胞に、ベータアミロイド、ＭＰＴＰ（１−methyl−４−phenyl−１，２，３，６−tetrahydropyridine）、ロテノン、オキシドーパミン、グルタメート、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）及びＳ１００Ｂ（Ｓ１００ calcium−binding protein Ｂ）からなる群のうち選択された１以上の神経細胞損傷誘発物質を処理する段階と、
２）前記神経細胞損傷誘発物質が処理された神経幹細胞に試験物質を投与する段階と、
３）細胞形態素分析を介して、神経幹細胞の分化及び細胞死滅のいかんを確認する段階と、を含む、神経退行性疾患治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
神経細胞損傷誘発物質が、ベータアミロイドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベータアミロイドが、オリゴマー形態のベータアミロイドであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴマー形態のベータアミロイドが、ベータアミロイドのトリマーとテトラマーとを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ベータアミロイドが、４２個のアミノ酸からなるＡβ（１−４２）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経再生が必要な患者に、ＭＥＫ１／２抑制剤を投与することを含む、神経再生を誘導する方法、及びそのような方法に使用するためのＭＥＫ１／２抑制剤を含む組成物に関する。本発明において、ＭＥＫ１／２抑制剤は、神経幹細胞を神経細胞に分化させたり、ベータアミロイドによる細胞毒性から、神経細胞及び神経幹細胞を保護したりするか、いずれによっても神経再生を誘導する。また、本発明は、ＭＥＫ１／２抑制剤を投与することを含む、神経細胞の損失または損傷から神経細胞を保護する方法、及びそのような方法に使用するためのＭＥＫ１／２抑制剤を含む組成物に関する。さらには、本発明は、神経細胞の損失または損傷によって生じる神経退行性疾患の予防または治療が必要な患者に、前記ＭＥＫ１／２抑制剤を投与することを含む、神経細胞の損失または損傷によって生じる神経退行性疾患の予防方法または治療方法、及びそのような方法に使用するためのＭＥＫ１／２抑制剤を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病やパーキンソン病のような神経退行性疾患は、主に老人層が多くかかるが、社会の老齢化により、その患者数も幾何級数的に増えている。また、若年層でも、早期発現型神経退行性疾患が少なくなく報告されている。そのために、当該病気の進行を中断させたり、損傷された脳組織を回復させたりするためのさまざまな治療法開発に多くの関心が寄せられている。
【０００３】
これまでのところ、そのような神経退行性疾患に対する確かな原因は、究明されていないが、今まで明らかにされたところによれば、脳の特定部分（海馬（hippocampus）あるいは黒質（substantia nigra）など）に存在する神経細胞が破壊されて生じるものであり、不足した神経細胞間のネットワークが壊れ、神経退行性疾患の多様な症状が引き起こされると知られている。
【０００４】
それを治療するために多様な分野で研究がなされているが、今のところは、症状緩和と係わる薬物（メマンチン（memantine）：ＮＭＤＡ receptor antagonist、Ｌ−ＤＯＰＡ：dopamine mimic drugなど）がほとんどであり、それら以外の薬物治療も、短期的な効果に留まるか、あるいは持続的な投与による副作用が発見され、治療に適用し難く、一時的に症状を緩和させる以上の治療効果を期待し難いというような問題点がある。従って、神経退行性疾患の原因を治療することができる治療法が絶対的に必要な実情である。
【０００５】
成人の脳には、神経系細胞に分化される能力を有した神経幹細胞（ＮＳＣ：neural stem cell）と神経前駆細胞（ＮＰＣ：neural progenitor cell）とが存在する。特に、側脳室（lateral ventricle）の脳室下帯（subventricular zone）と、海馬の歯状回（dentate gyrus）との部分に神経幹細胞が存在し、この部分での神経幹細胞の分化及び増殖を介して、一生にわたって神経細胞新生（neurogenesis）がなされると知られている（非特許文献１）。
【０００６】
神経退行性疾患においては、脳神経細胞の損傷と死滅が起こるので、ＮＳＣ（neural stem cell）及びＮＰＣ（neural progenitor cell）を刺激し、損傷・死滅した神経細胞を、正常機能を行う神経細胞に交替させることが、神経退行性疾患治療の根本的治療法にもなる。そのような接近法には、患者の生体において、ＮＳＣ及びＮＰＣを分離し、それらを試験管内において刺激し、神経細胞に分化させて患者に移植する方式が含まれる（幹細胞治療剤）。しかし、ＮＳＣ及びＮＰＣを生体から得て患者に移植するには、困難さが伴い、脳に移植されたＮＳＣやＮＰＣが、脳において、短時間に機能を喪失するので、頻繁に移植を行わなければならない。その代案として、神経幹細胞を患者に移植する代わりに、患者に薬物を投与し、患者の脳中に存在するＮＳＣまたはＮＰＣを刺激し、分化を誘導することにより、神経細胞を再生させる方法が最近提案された（非特許文献２）。
【０００７】
ベータアミロイド（Ａβ）は、３６〜４３個のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ：amyloid precursor protein）という第１型内在性膜タンパク質が、ベータセクレターゼとガンマセクレターゼとによって分解されて誘導される。Ａβは、脳において、可溶性Ａβオリゴマーに凝集された後、プロトフィブリル（protofibril）を経て、不溶性Ａβフィブリルを形成し、脳内にアミロイドプラークとして蓄積される。脳内ベータアミロイドの沈着は、シナプス損傷、神経細胞損傷及び脳萎縮と関連があり、結果として、アルツハイマー病の典型的症状である、記憶力と認知機能との損傷が引き起こされる。Ａβの多くの形態のうち可溶性であるＡβオリゴマー、特に、トリマー（trimer）やテトラマー（tetramer）が神経機能障害及びシナプス損傷と最も関連性がある毒性Ａβ種と認識されている（非特許文献３;非特許文献４）。
【０００８】
従って、ベータアミロイド、特に、オリゴマー形態のＡβから神経細胞を保護することが、アルツハイマー病治療の潜在的標的と認識されている。しかし、アルツハイマー病患者は、すでに神経細胞が相当数損傷されている状態であるので、神経細胞の保護のみではなく、内因性神経幹細胞の分化を介して神経細胞を再生させることが病気の根本的治療に必要である。
【０００９】
ＭＥＫ（mitogen-activated protein kinase kinase；ＭＡＰ２ＫまたはＭＡＰＫＫとも呼ばれる）は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫの順序でつながるＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ：mitogen activated protein kinase）信号伝逹経路（以下、「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路」とする）の一員である。成長因子、ホルモン、サイトカインのようなさまざまな信号伝逹物質が細胞膜の受容器に結合し、受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase）を活性化させれば、Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅタンパク質が活性化され、その結果、細胞質内のＲａｆが細胞膜に募集される。活性化されたＲａｆは、順次にＭＥＫ、ＥＲＫをリン酸化させて活性化させ、活性化されたＥＲＫは、核内に移動し、多様な転写要素を活性化させる。該転写要素は、多様な遺伝子の促進子（promoter）に結合し、細胞の増殖、分化及び生存を統制する。該ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信号伝逹経路が腫瘍細胞で亢進されているために、構成員であるキナーゼは、癌を始めとする他の増殖性疾患において疾患進行を抑制する重要な目標と見られてきた。
【００１０】
ＭＥＫには、ＭＥＫ１からＭＥＫ７に至る７個のタンパク質が知られているが、そのうち、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とが、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の信号伝逹に係わっている。ＭＥＫ１とＭＥＫ２は、互いに異なる遺伝子によって暗号化されているが、Ｃ−末端の触媒キナーゼ領域と、ほとんどのＮ−末端調節区域とにおいて、高い類似性（８０％）を共有している。ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発癌形態は、ヒト癌において探すことができないが、ＭＥＫの持続的な活性化が細胞を変異させることが知られており、他の腫瘍遺伝子によって活性化されもする。従って、ＭＥＫ１，２の抑制も、抗癌剤開発のターゲットとして研究されてきた。しかし、ＭＥＫ１，２を始めとするＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路が、成体の神経幹細胞の増殖及び分化において、いかなる役割を行うかということは、明確ではない。
【００１１】
また、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路が、アルツハイマー患者の脳で発見されるベータアミロイドまたはタウタンパク質と関係があるという研究結果があるが、アルツハイマー病の治療のために、該信号伝逹経路を活性化させなければならないか、または抑制させなければならないか、あるいは該信号伝達経路の調節がアルツハイマー病の治療と連結されるかということが明確ではない。
【００１２】
非常に初期のアルツハイマー患者の脳において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路のタンパク質の発現が増加されており（非特許文献５; 非特許文献６）、該経路のＥＲＫ１／２とＭＥＫ１／２とがアルツハイマー脳のタウタンパク質の過リン酸化（hyperphosphorylation）と関係があり（非特許文献７）、アミロイド前具体タンパク質（ＡＰＰ）を発現するＢ１０３細胞（マウスの神経母細胞腫細胞）において、Ｒａｓの発現増加と、ＥＲＫ１／２活性化とが観察されたという報告がある（非特許文献８）。
【００１３】
一方、他の研究結果では、ＥＲＫ１／２が活性化されれば、Ａβによって誘導される細胞死滅が抑制され、Ａβの蓄積が低減されると報告された（非特許文献９;非特許文献１０;非特許文献１１）。また、ＥＲＫ１／２は、ＡＰＰからＡβを生成させる役割を行うガンマ−セクレターゼ（λ−secretase）活性を低下させ、酸化ストレス環境において、ＢＡＣＥ１（β−secretase １）の発現と活性とを低減させると報告されたりもした（非特許文献１２）。
【００１４】
従って、アルツハイマー病を始めとした神経退行性疾患の治療において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の調節、及びＭＥＫの抑制がいかなる役割を行うかということについては、互いに相反した見解が存在し、明確に明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Zhao et al., (2008) Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis, Cell 132: 645-660
【非特許文献２】Davies et al., (2015) Stemistry: The Control of Stem Cells in Situ Using Chemistry. J. Med. Chem. 58: 2863-2894
【非特許文献３】Murakami (2014) Conformation-specific antibodies to target amyloid β oligomers and their application to immunotherapy for Alzheimer’s disease, Biosci, Biotechnol, Biochem. 78 (8): 1293-1305
【非特許文献４】Jana et al., (2016) Membrane-bound tetramer and trimer Aβ oligomeric species correlate with toxicity towards cultured neurons, J Neurochem, 136(3): 594-608
【非特許文献５】Arendt et al., (1995) Increased expression and subcellular translocation of the mitogen activated protein kinase kinase and mitogen-activated protein kinase in Alzheimer's disease, Neuroscience 68(1), 5-18
【非特許文献６】Gartner et al., (1999) Elevated expression of p21ras is an early event in Alzheimer's disease and precedes neurofibrillary degeneration, Neuroscience 91 (1): 1-5
【非特許文献７】Pei et al., (2002) Up-regulation of mitogen-activated protein kinases ERK1/2 and MEK1/2 is associated with the progression of neurofibrillary degeneration in Alzheimer's disease, Brain Res Mol Brain Res, 109 (1-2): 45-55
【非特許文献８】Chaput et al., (2012) SILAC-based proteomic analysis to investigate the impact of amyloid precursor protein expression in neuronal-like B103 cells, Electrophoresis 33 (24): 3728-3737
【非特許文献９】Guerra et al., (2004) Plasma membrane oestrogen receptor mediates neuroprotection against b-amyloid toxicity through activation of Raf-1/MEK/ERK cascade in septal-derived cholinergic SN56 cells, J. Neurochem, 91: 99-109
【非特許文献１０】Watson et al., (2005) Macrophage Inflammatory Protein 2 Inhibits β-Amyloid Peptide (1-42)-Mediated Hippocampal Neuronal Apoptosis through Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase and Phosphatidylinositol 3-Kinase Signaling Pathways, Molecular Pharmacology 67 (3): 757-765
【非特許文献１１】Mills et al., (1997) Regulation of amyloid precursor protein catabolism involves the mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway, J. Neurosci, 17: 9415-9422
【非特許文献１２】Tamagno et al., (2009) JNK and ERK1/2 pathways have a dual opposite effect on the expression of BACE1, Neurobiology of Aging 30: 1563-1573
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する化合物を利用し、神経幹細胞を神経細胞に分化させ、ベータアミロイドから神経幹細胞と神経細胞とを保護することにより、神経再生を誘導する方法を提供する。また、本発明者らは、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する化合物を利用し、神経細胞の損失または損傷から神経細胞を保護する方法を提供し、神経細胞の損失または損傷によって生じる神経退行性疾患の予防方法または治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する化合物（以下、「ＭＥＫ１／２抑制剤」とする）、特に、下記［化学式１］で表示される化合物が、神経幹細胞を神経細胞に分化させることに効果的であり、特に、ベータアミロイドから神経幹細胞と神経細胞とを保護しながら、同時に神経幹細胞を神経細胞に分化誘導するということを発見した。
【００１８】
【化１】
2020074796.tif 000002
【００１９】
本発明の一側面は、前記［化学式１］で表示される化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物に関する。前記組成物は、神経幹細胞の癌細胞的成長を伴わない。
【００２０】
前記神経幹細胞の分化促進用組成物は、ベータアミロイド存在下でも、神経幹細胞から神経細胞への分化を誘導する。
【００２１】
前記神経幹細胞の分化促進用組成物による神経細胞分化促進は、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とを同時に抑制することによるものでもある。
【００２２】
前記組成物は、［化学式１］化合物の代わりに、特定のＭＥＫ１／２抑制剤を含んでもよい。該組成物は、ベータアミロイドの存在下でも、神経幹細胞の神経細胞への分化を誘導する。
【００２３】
本発明の他の側面は、前記神経幹細胞の分化促進用組成物を利用し、神経幹細胞を神経細胞に分化させる方法に係わるものである。
【００２４】
前記分化方法は、神経幹細胞に、前記神経幹細胞の分化促進用組成物を処理した後、分化完了まで、１日ないし７日間かかるものでもある。
【００２５】
また、本発明のさらに他の側面は、神経幹細胞の分化を促進させるのに使用するための、特に、ベータアミロイドの存在下で、神経幹細胞と神経細胞とを保護し、神経幹細胞を神経細胞に分化させるのに使用するための［化学式１］の化合物に係わるものである。また、本発明の他の側面は、神経幹細胞の分化を促進させるのに使用するための、特に、ベータアミロイドの存在下でも、神経幹細胞と神経細胞とを保護しながら、神経幹細胞を神経細胞に分化させるための特定のＭＥＫ１／２抑制剤に係わるものである。
【００２６】
本発明のさらに他の側面は、試験管内で、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進させるためのキットに係わるものであり、前記キットは、前記神経幹細胞の分化促進用組成物、培地、プレート、コーティング溶液または成長因子のような細胞培養に必要な添加剤などを含んでもよい。
【００２７】
本発明のさらに他の側面は、神経再生が必要な患者に、特定のＭＥＫ１／２抑制剤を投与することを含む、神経再生を誘導する方法に係わるものである。本発明において、ＭＥＫ１／２抑制剤は、神経幹細胞を神経細胞に分化させたり、ベータアミロイドによる細胞毒性から神経幹細胞及び神経細胞を保護したりするか、あるいはいずれにもよって神経再生を誘導する。最も望ましいＭＥＫ１／２抑制剤は、［化学式１］の化合物である。本発明のさらなる側面は、神経再生誘導に使用するための特定のＭＥＫ１／２抑制剤、特に、［化学式１］化合物に係わるものである。
【００２８】
本発明のさらに他の側面は、特定のＭＥＫ１／２抑制剤を投与することを含む、神経細胞の損失または損傷から神経細胞を保護する方法に係わるものである。該方法において、最も望ましいＭＥＫ１／２抑制剤は、［化学式１］の化合物である。本発明のさらなる側面は、神経細胞の損失または損傷から神経細胞を保護するのに使用するための特定のＭＥＫ１／２抑制剤、特に、［化学式１］化合物に係わるものである。
【００２９】
本発明の他の側面は、［化学式１］で表示される化合物を有効成分として含む神経退行性疾患の予防用または治療用の薬学組成物、または［化学式１］の化合物を利用し、神経退行性疾患を予防または治療する方法に係わるものである。
【００３０】
前記神経退行性疾患は、神経細胞の機能低下または機能消失により、運動調節能、認知機能、知覚機能、感覚機能、及び自律神経の機能異常が起こる疾患をいうものであり、例えば、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、老人性痴呆、前頭側頭葉痴呆、レビー小体痴呆、パーキンソン病、多系統萎縮症、皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、進行性核上麻痺、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病、ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、脊髄筋肉萎縮病、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ：progressive bulbar palsy）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ：progressive muscular atrophy）、仮性延髄麻痺（pseudobulbar palsy）、遺伝性強直性下半身麻痺（ＨＳＰ：hereditary spastic paraplegia）、小脳性運動失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、ギラン・バレー症侯群などでもある。
【００３１】
前記薬学組成物または方法は、［化学式１］化合物の代わりに、他の特定のＭＥＫ１／２抑制剤を含んだり使用したりすることができる。
【００３２】
本発明のさらなる側面は、神経退行性疾患の予防または治療に使用するための［化学式１］化合物に係わるものである。また、神経退行性疾患の予防または治療に使用するための特定のＭＥＫ１／２抑制剤に係わるものである。
【００３３】
本発明のさらなる側面は、アルツハイマー病を始めとした神経退行性疾患を模写した環境において、神経幹細胞を神経細胞に分化誘導しながら、同時に神経幹細胞または神経細胞を保護することができる物質をスクリーニングする方法に係わるものである。本発明によるスクリーニング方法は、次のような段階を含む。
【００３４】
１）成体マウス由来の神経幹細胞を、ベータアミロイド（特に、オリゴマー形態のベータアミロイド）、ＭＰＴＰ（１−methyl−４−phenyl−１，２，３，６−tetrahydropyridine）、ロテノン（rotenone）、オキシドパーミン（oxidopamine）、グルタメート（glutamate）、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）、Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００ calcium−binding protein Ｂ）のような神経細胞損傷誘発物質で処理する段階；
２）試験物質を、前記神経細胞損傷誘発物質が処理された神経幹細胞に投与する段階；及び
３）細胞形態（morphology）分析を介して、神経幹細胞の分化及び細胞死滅のいかんを確認する段階。
【発明の効果】
【００３５】
本発明による神経幹細胞の分化促進用組成物は、神経退行性疾患を病んでいる患者に適用される場合、患者脳に存在する神経幹細胞が神経細胞に分化されるように誘導する結果、新生された神経細胞が損傷または損失された神経細胞を代替し、すなわち、神経細胞新生（neurogenesis）により、神経再生（neural regenerationまたはneuro-regeneration）を誘導することにより、神経退行性疾患などを治療することができる予防用または治療用の組成物として活用が可能である。本発明において、「神経細胞新生」は、神経幹細胞から神経細胞（neuron）が生成されることをいい、神経再生は、神経細胞死滅で退行した神経系組織が神経細胞新生がなされながら、組織的に機能的に再生されることをいう。また、本発明による組成物は、ベータアミロイドオリゴマーから神経幹細胞または神経細胞を保護し、治療効果または予防効果を示すことができる。
【００３６】
また、神経退行性疾患と係わる新薬開発において、薬物効果検定または各種研究のための材料として、幅広く利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実験例１の形態分析結果であり、マウス胚芽神経幹細胞に、トラメチニブとピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６）とをそれぞれ多様な濃度で処理したとき、神経幹細胞が神経細胞に分化されるところを、位相差顕微鏡で観察した結果である。ＵＤ（undifferentiated）とＤ（differentiated）は、試験物質を処理していないものであり、それぞれ実験例１の段階１Ａで培養された未分化マウス胚芽神経幹細胞と、段階１Ｂで培養された分化された神経幹細胞との写真である。
【図２】実験例２の形態分析結果であり、下段は、マウス成体神経幹細胞にオリゴマー形態のベータアミロイド（Ａβ１−４２）１０μＭ処理した群の結果であり、上段は、ベータアミロイドを処理していない群の結果である。ＵＤ（undifferentiated）とＤ（differentiated）は、試験物質を処理していないものであり、それぞれ実験例２の段階１Ａで得た未分化マウス成体神経幹細胞と、段階１Ｂで得た分化された成体神経幹細胞の写真である。トラメチニブ（１０ｎＭ）、トラメチニブ（１００ｎＭ）、メマンチン（５μＭ）、メマンチン（１０μＭ）、ＡＳ７０３０２６（１０μＭ）は、実験例２の段階１Ａで得た未分化マウス成体神経幹細胞に、それぞれの物質をそれぞれの濃度で処理したときの結果である。
【図３】比較例１により、１４．５日になったマウス胚芽神経幹細胞にオリゴマー形態のベータアミロイド（Ａβ）１０μＭを処理した群（下段）と、処理していない群（上段）との細胞形態の比較結果である。ＵＤ（undifferentiated）とＤ（differentiated）は、それぞれ試験物質を処理していない状態の比較例１の段階１で得た未分化または分化の胚芽神経幹細胞である。トラメチニブ（１００ｎＭ）、メマンチン（１０μＭ）、ＡＳ７０３０２６（１０μＭ）は、比較例１の段階１で得た未分化マウス胚芽神経幹細胞に、それぞれの物質をそれぞれの濃度で処理したときの結果である。
【図４】実験例３の蛍光顕微鏡写真結果である。最初の並びのＵＤとＤは、それぞれ試験物質を処理していない状態の未分化または分化の胚芽神経幹細胞であり、２番目及び３番目の並びは、トラメチニブとＡＳ７０３０２６とを各濃度で処理したときの細胞写真である。青色に染色された点は、ＤＡＰＩによって染色された神経系細胞の核を示し、赤色の細長く伸びた枝を有するのは、ローダミン付着Ｔｕｊ１によって赤色蛍光を呈する神経細胞である。
【図５Ａ】実験例４−１の結果であり、多様な濃度のトラメチニブとＡＳ７０３０２６とをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、神経細胞特異的マーカーであるＴｕｊ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図５Ｂ】実験例４−１の結果であり、多様な濃度のトラメチニブとＡＳ７０３０２６とをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨの相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図６Ａ】実験例４−２の結果の一部であり、多様な濃度のトラメチニブをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨの相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図６Ｂ】実験例４−２の結果の一部であり、多様な濃度のトラメチニブをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、コリン性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴの相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図６Ｃ】実験例４−２の結果の一部であり、多様な濃度のトラメチニブをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、運動神経細胞マーカーであるＩｓｌ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図６Ｄ】実験例４−２の結果の一部であり、多様な濃度のトラメチニブをマウス胚芽神経幹細胞に処理したとき、ＧＡＢＡ性神経細胞マーカーであるＧａｄ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図７Ａ】実験例４−２の結果の一部であり、トラメチニブ（Ｔｒａ）１０ｎＭとＡＳ７０３０２６（ＡＳ）１０μＭとをマウス成体神経幹細胞に処理したとき、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図７Ｂ】実験例４−２の結果の一部であり、トラメチニブ（Ｔｒａ）１０ｎＭとＡＳ７０３０２６（ＡＳ）１０μＭとをマウス成体神経幹細胞に処理したとき、コリン性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴの相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図７Ｃ】実験例４−２の結果の一部であり、トラメチニブ（Ｔｒａ）１０ｎＭとＡＳ７０３０２６（ＡＳ）１０μＭとをマウス成体神経幹細胞に処理したとき、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨの相対的ｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図８Ａ】実験例５−１の結果であり、ＭＥＫ１、またはＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現が抑制されたマウス胚芽神経幹細胞の神経細胞への分化能を分析するために、ＲＴ−ＰＣＲを介して、ドパーミン神経細胞マーカー（ＴＨ）の発現有無を確認した結果である。
【図８Ｂ】実験例５−１の結果の一部であり、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とを利用し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、またはＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現を抑制させたマウス胚芽神経幹細胞において、Ｔｕｊ１及びＴＨの相対的ｍＲＮＡ発現量を確認し、ウェスタン・ブロッティングを介して、各タンパク質の発現有無を確認した結果である。
【図８Ｃ】実験例５−２の結果の一部であり、ＣＡＭＥＫ１、ＣＡＭＥＫ２を利用し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、またはＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現を活性化させたマウス胚芽神経幹細胞において、Ｔｕｊ１及びＴＨの相対的ｍＲＮＡ発現量を確認し、ウェスタン・ブロッティングを介して、各タンパク質の発現有無を確認した結果である。
【図９Ａ】実験例５−３の結果であり、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とを利用し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、またはＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現を抑制させたマウス成体神経幹細胞に、ベータアミロイド（Ａβ）を処理したり処理しなかったりするとき、位相差顕微鏡によって細胞形態を観察した結果である。
【図９Ｂ】実験例５−３の結果であり、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とを利用し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、またはＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現を抑制させたマウス成体神経幹細胞に、ベータアミロイド（Ａβ）を処理したり処理しなかったりするとき、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を分析した結果である。
【図１０Ａ】実験例６の結果であり、ＭＥＫ１／２抑制剤であるトラメチニブ、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ１８４３５２、レファメチニブ、ＰＤ３１８０８８、ビニメチニブ及びＡＳ７０３０２６を、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭの濃度でマウス胚芽神経幹細胞に処理した後、位相差顕微鏡で細胞の形態を観察した結果である。
【図１０Ｂ】実験例６の結果であり、ＭＥＫ１／２抑制剤であるトラメチニブ、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ１８４３５２、レファメチニブ、ＰＤ３１８０８８、ビニメチニブ及びＡＳ７０３０２６を、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭの濃度でマウス胚芽神経幹細胞に処理した後、Ｔｕｊ１の相対的ｍＲＮＡ発現量を分析した結果である。
【図１０Ｃ】実験例６の結果であり、ＰＤ０３２５９０１、ＲＯ５１２６７６６、ＢＩ８４７３２５及びＵ０１２６をマウス成体神経幹細胞に処理した後、位相差顕微鏡で細胞の形態を観察した結果である。
【図１１】実験例７の結果であり、マウス成体神経幹細胞に、ベータアミロイドを処理したり処理しなかったりし、ＭＥＫ１／２抑制剤であるトラメチニブ（０．１μＭ）、ＡＳ７０３０２６（１０μＭ）、ＡＺＤ８３３０（１μＭ）、ＰＤ３１８０８８（１μＭ）、ビニメチニブ（１０μＭ）、レファメチニブ（１μＭ）、ＰＤ０３２５９０１（１０μＭ）、ＲＯ５１２６７６６（１０μＭ）、及びＭＥＫ２に比べ、ＭＥＫ１に対して選択的な抑制剤として知られたコビメチニブ（１０μＭ）を投与した後、位相差顕微鏡で細胞形態を観察した結果である。「−」で表示した並びは、ベータアミロイドを処理していないものであり、「Ａβ１−４２」と表示した並びは、ベータアミロイドを１０μＭ処理したものである。
【図１２Ａ】実験例８の結果の一部であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの大脳体性感覚皮質（somatosensory cortex）部分の切片に対して、免疫組織化学染色方法でＮｅｕＮを染色し、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図１２Ｂ】実験例８の結果の一部であり、ビークルのみを投与したグループ対比でトラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示したグラフである。
【図１３Ａ】実験例８の結果の一部であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの大脳運動皮質部分の切片に対して、免疫組織化学染色方法でＮｅｕＮを染色し、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図１３Ｂ】実験例８の結果の一部であり、ビークルのみを投与したグループ対比で、トラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示したグラフである。
【図１４Ａ】実験例８の結果の一部であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの海馬移行部（hippocampus subiculum）部分の切片に対して免疫組織化学染色方法でＮｅｕＮを染色し、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図１４Ｂ】実験例８の結果の一部であり、ビークルのみを投与したグループ対比で、トラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示したグラフである）。
【図１５】実験例９−１の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの大脳体性感覚皮質部分切片に対して、免疫組織化学染色方法でＴｕｊ１を染色し、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。写真において、矢印（→）で表示した部分は、Ｔｕｊ１が染色された細胞を示し、矢印の頭（▼）で表示したものは、ベータアミロイド凝集によるプラークを示す。
【図１６Ａ】実験例９−２及び９−３の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの海馬の歯状回（dentate gyrus）部分の切片において、Ｎｉｓｓｌ、ＮｅｕＮ、Ｄｃｘ及びＢｒｄＵを染色し、顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、該写真において、矢印（→）で表示した部分は、Ｄｃｘが染色された細胞を示し、矢印の頭（▼）で表示したものは、ＢｒｄＵが染色された細胞を示す。
【図１６Ｂ】実験例９−３の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの海馬の歯状回（dentate gyrus）部分の切片において、ＢｒｄＵが染色された細胞の数を計数した結果である。
【図１７】実験例１０の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの海馬移行部（hippocampus subiculum）と大脳体性感覚皮質部分との切片に対して細胞死滅（apoptosis）を確認することができるＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase dＵＴＰ nick end labeling）染色を行った後、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。海馬移行部において細胞死滅が起き、緑色蛍光を呈する細胞を矢印（→）で表示した。
【図１８】実験例１１の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの小脳部分の切片をＴｕｊ１及びカルビンジンで染色し、小脳のプルキンエ細胞（Purkinje neuron）を顕微鏡で観察した結果を示す写真である。各処理群別において、２個（Ｔｕｊ１染色）または３個（カルビンジン染色）のスライドに係わる写真を添付した。
【図１９Ａ】実験例１２の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウス脳の半球（hemisphere）を利用し、ウェスタン・ブロッティングを介して、ｐＥＲＫタンパク質の発現有無を確認した結果である。
【図１９Ｂ】実験例１２の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウス脳の半球（hemisphere）を利用し、ウェスタン・ブロッティングを介して、ｐＥＲＫタンパク質の発現有無を確認し、それを定量化した結果である。
【図２０】実験例１３の結果であり、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウス脳の半球（hemisphere）を利用し、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）方法を介してＡβ４０とＡβ４２との量を測定し、Ａβ４０とＡβ４２との比率を測定した結果である。
【００３８】
前記各図面のグラフにおいて、星印（＊）は、統計的にｔ−test結果それぞれの次を意味する：＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００５。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下で、本発明のさまざまな側面、及び多様な具現例について、さらに具体的に説明する。
【００４０】
本発明において、「神経幹細胞」は、未分化状態で続けて増殖する自家更新（self-renew）能を有し、１つの幹細胞から多様な神経細胞（neuron）及び膠細胞（glia）に分化する分化の多能性（multipotency）を有する細胞を意味し、動物に由来したものである。このとき、動物とは、ヒト及び霊長類だけではなく、牛、豚、羊、馬、犬、マウス、ラット及び猫などの動物を含み、望ましくは、ヒトである。場合によっては、「神経幹細胞」は、「神経前駆細胞（neural progenitor cell）」を包括する意味としても使用される。
【００４１】
本発明において、用語「分化（differentiation）」とは、細胞が特定細胞に発達することを意味し、具体的には、細胞が分裂増殖して成長する間、構造や機能が特化される現象であり、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられたところを遂行するために、形態や機能が変わっていくことをいう。神経幹細胞の「分化」には、母細胞が互いに異なる性格を有する２つの細胞に分裂する非対称分裂（asymmetric division）が先行することになるが、分裂された細胞のうち一部は、母細胞と同一幹細胞として残っており、一部は、特定細胞に分化される。神経幹細胞の分化に、そのような非対称分裂過程が伴うという点において、「神経幹細胞の分化」は、「増殖」の意味を含む。
【００４２】
本発明において、用語「増殖（proliferation）」とは、細胞が分裂増殖する現象を意味するものであり、具体的には、細胞が分裂され、同質のものが増える現象、すなわち、同一形態の細胞が再生産されてその数が増える場合をいう。
【００４３】
本発明において、用語「保護（protection）」とは、危険や破壊など困難な外部刺激が与えられたとき、それらからいたわり守ることであり、神経細胞損傷誘発物質、特に、ベータアミロイドに対して、神経幹細胞が死滅せずに、増殖や分化をなることができるように状態を維持させ、分化された神経細胞が生き残るように守ることを意味する。特に、アルツハイマー病と係わり、本発明において、用語「保護」は、脳でのＡβ（１−４２）／Ａβ（１−４０）比率を低くし、ベータアミロイドによる損傷から、神経幹細胞及び神経細胞を保護することを含む（Majid et al., (2015) Pharmacologic treatment with histone deacetylase 6 inhibitor (ACY-738) recovers Alzheimer's disease phenotype in amyloid precursor protein/presenilin 1 (APP/PS1) mice, Alzheimers Dement, 170-181; Borchelt et al., (1996) Familial Alzheimer's disease-linked Presenilin 1 variants elevate Aβ1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo, Neuron, 17: 1005-1013）。
【００４４】
本発明において、用語「予防」とは、本発明による薬学組成物の投与によって神経退行性疾患の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記薬学組成物の投与により、神経退行性疾患の疑い、及び発病個体の症状が好転したり好ましく変更したりする全ての行為を意味する。
【００４５】
本発明の一側面は、下記［化学式１］で表示される化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物に係わるものである。
【００４６】
【化２】
2020074796.tif 000003
【００４７】
前記［化学式１］で表示される化合物の一般名は、トラメチニブであり、化学名は、Ｎ−（３−｛３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル｝フェニル）アセトアミドである。日本たばこ産業（株）が出願人であるＷＯ２００５／１２１１４２の実施例４−１の化合物として開示されている。［化学式１］の化合物は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（mitogen-activated protein kinase／extracellular regulated kinase）信号伝達経路のうちＥＲＫの上位段階（upstream）分子であるＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する。商品名ＭＥＫＩＮＩＳＴ（Ｒ）として、黒色腫及び非小細胞癌に抗癌剤として使用されている。本発明において［化学式１］の化合物は、遊離塩基、または製薬学的に許容可能な塩、または溶媒化物の形態でも使用される。該溶媒化物は、例えば、水和物、またはジメチルスルホキシド、酢酸、エタノール、ニトロメタン、クロロベンゼン、１−ペンタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール及び３−メチル−１−ブタノールなどの溶媒化物でもある。
【００４８】
特に、本発明の一側面は、ベータアミロイドから神経幹細胞と神経細胞とを保護しながら、同時に神経幹細胞を神経細胞に分化させる、前記［化学式１］の化合物を含む組成物に係わるものである。該ベータアミロイドは、脳において、アミロイドプラークとして蓄積され、シナプス損傷、神経細胞損傷及び脳萎縮と関連があり、結果として、アルツハイマー病の典型的症状である記憶力と認知機能との損傷を引き起こすと認識されている。従って、ベータアミロイドから、神経幹細胞または神経細胞を保護しながら、内因性神経幹細胞の分化を介して、神経細胞を再生させることがアルツハイマー病の根本的治療法にもなる。
ベータアミロイドのうち４２個のアミノ酸からなるＡβ（１−４２）が、Ａβ（１−４０）より凝集体を形成する傾向がさらに強く、特に、毒性が強いトリマーやテトラマーを形成する傾向が強く、アルツハイマー病の疾病状態と連関性がさらに高いと見られている。従って、Ａβ（１−４２）、特に、Ａβ（１−４２）のオリゴマー形態の存在下、神経幹細胞を保護しながら、神経幹細胞を分化させる組成物が望ましい。
【００４９】
本発明の具体的な実施例において、発明者らは、マウスの神経幹細胞を利用し、それを神経細胞に分化を誘導する組成物を確立しようとし、前記［化学式１］の化合物が非常に効果的に、マウス胚芽またはマウス成体の脳から分離した神経幹細胞を神経細胞に分化するように誘導するということを確認した。
【００５０】
該神経幹細胞は、多様な神経細胞に分化したり、希少突起膠細胞（oligodendrocyte）、星状細胞（astrocyte）、小膠細胞（microglia）などの膠細胞（glial cell）に分化することができる能力を有している。本発明の［化学式１］の化合物は、神経幹細胞を主に神経細胞に分化させ、膠細胞への分化を制限させる。従って、［化学式１］の化合物は、神経細胞の新生を効果的に誘導することにより、神経細胞損失が起きた神経退行性疾患患者の脳で損失された神経細胞が新生神経細胞で代替されるようにし、神経再生（neural regenerationまたはneuro−regeneration）を促進する医薬としても使用される。
【００５１】
また、本発明の具体的な実施例において本発明者らは、ベータアミロイドオリゴマーを処理し、アルツハイマー病の脳内環境を模写した試験管内（in vitro）実験を介して、［化学式１］の化合物が神経幹細胞または神経細胞の死滅に対して保護効果があり、神経幹細胞を、神経細胞に分化されるように誘導していることを確認した（図２）。
【００５２】
さらには、本発明の一側面は、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する特定化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物に係わるものであり。本発明において、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制する化合物を「ＭＥＫ１／２抑制剤」とも呼ぶ。本発明において、「ＭＥＫ１／２抑制剤」は、望ましくは、ｎＭレベルのＩＣ５０を示し、ＭＥＫ１に対するＩＣ５０と、ＭＥＫ２に対するＩＣ５０との差が、望ましくは、１０倍以下、さらに望ましくは、５倍以下の物質である。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２に対するＩＣ５０は、例えば、文献［Yamaguchi et al. (2011) International Journal of Oncology 39: 23-31］に記載された方法で測定することができる。本発明で使用することができるＭＥＫ１／２抑制剤は、神経幹細胞を、神経細胞に分化されるように誘導しながら、同時に、ベータアミロイドのような毒性物質から、神経幹細胞と神経細胞とを保護する物質である。例えば、本発明で使用されるＭＥＫ１／２抑制剤は、次のとおりである：トラメチニブ、ピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６）、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２、ＡＲＲＹ−４３８１６２）、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Bay ８６−９７６６）、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＲＯ５１２６７６６。
【００５３】
本発明において、望ましいＭＥＫ１／２抑制剤の化学構造、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２に対するＩＣ５０値、及びその測定法が記載されている文献は、下記表１の通りである。
【００５４】
【表１−１】
2020074796.tif 000004
【００５５】
【表１−２】
2020074796.tif 000005
【００５６】
また、本発明の一側面は、前記ＭＥＫ１／２抑制剤を含み、ベータアミロイド、特に、オリゴマー形態のＡβ（１−４２）から神経幹細胞と神経細胞とを保護しながら、同時に、神経幹細胞を神経細胞に分化させるための組成物に係わるものである。
【００５７】
ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制するＭＥＫ１／２抑制剤ではない、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２のうちいずれか１つの選択的な抑制剤である場合には、神経細胞への分化を誘導する効果が弱いので、望ましくない。例えば、コビメチニブは、ＭＥＫ２に比べ、ＭＥＫ１に対して１００倍以上の選択性を示すＭＥＫ１の選択的抑制剤であるが（ＭＥＫ１ ＩＣ５０＝０．９５ｎＭ、ＭＥＫ２ＩＣ５０＝１９９ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１７，２２：１５５１）、ＭＥＫ１／２抑制剤とは異なり、ベータアミロイド処理いかんに関係なく、１０μＭの高濃度でも、マウス成体神経幹細胞の分化を誘導することができないということを確認した（実験例７）。
【００５８】
また、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制することが、神経幹細胞の神経細胞への分化誘導、及び神経幹細胞と神経細胞との保護に関与することは、ｓｈＲＮＡ（short hairpin ＲＮＡ）を利用したＭＥＫ１及びＭＥＫ２の発現抑制実験、及びconstitutively active ＭＥＫ１（ＣＡＭＥＫ１）プラスミド、constitutively active ＭＥＫ２（ＣＡＭＥＫ２）プラスミドを利用したＭＥＫ１及びＭＥＫ２の発現活性化実験でも確認される（実験例５）。
【００５９】
しかし、ＭＥＫ１／２抑制剤といって、いずれも同一効果を示すものではない。例えば、ＭＥＫ１／２抑制剤であるＵ０１２６、ＰＤ１８４３５２及びＢＩ８４７３２５は、実験した全ての濃度において、神経幹細胞を神経細胞に分化誘導する効果が微弱であるか、細胞毒性を誘発し、本発明の神経幹細胞分化誘導用組成物としての使用に不適であった（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。従って、ＭＥＫ１／２抑制活性のある化合物が有する他の固有特性により、神経幹細胞の神経細胞への分化誘導効果、または神経幹細胞及び神経細胞の保護効果が異なりもし、本発明においては、ＭＥＫ１／２抑制剤のうち、トラメチニブ、ピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６）、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ、レファメチニブ、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＲＯ５１２６７６６が、神経幹細胞の神経細胞への分化誘導効果、及び神経幹細胞／神経細胞の保護効果があるということを確認した。
特に、［化学式１］の化合物は、本発明において使用可能なＭＥＫ１／２抑制剤のうちでも、顕著に優秀な分化能、及びベータアミロイドからの保護効果を示した。例えば、［化学式１］の化合物は、ＡＳ７０３０２６に比べ、１００倍以上さらに低濃度で顕著に優秀な分化能、及びベータアミロイドからの保護効果を示した。そのような本発明の［化学式１］の化合物の効果は、該化合物のＭＥＫ１／２抑制活性から予測されるところよりさらに顕著に優秀である。
【００６０】
本発明において、［化学式１］で表示される化合物は、神経幹細胞を神経細胞に分化を誘導する用途において、全く使用されたことがない物質であり、ＡＴＰ non−competitive bindingを介して、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのいずれに対する活性をも阻害するＭＥＫ１／２抑制剤でありながら、黒色腫及び非小細胞癌治の療剤として知られているだけであった。
【００６１】
本発明の他の側面は、［化学式１］で表示される化合物、または他の特定ＭＥＫ１／２抑制剤を利用し、神経幹細胞を神経細胞に分化させる方法に係わるものである。
【００６２】
本発明の方法において、神経幹細胞は、公知された方法により、動物の胚芽及び成体の脳から分離して使用することができ、市販される製品を購入して使用したり、一般的な培養方法によって培養して使用することができ、それは、特別に限定されるものではない。本発明の実施例においては、前記神経幹細胞として、マウス胚芽１４．５日の前頭葉から分離したもの、及び８週齢マウスの脳室下帯から分離したものを使用した。
【００６３】
前記神経幹細胞の分化以前に培養培地に接種し、３７℃で培養することができる。前記神経幹細胞を培養するための培地としては、成長因子を追加した無血清培地組成成分であるならば、制限されるものではない。前記培地は、例えば、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium／Nutrient Mixture Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（１：１）に、９０−１１０μＭプトレシン、２０−４０ｎＭセレナイト、１０−３０ｎＭプロゲステロン、１．０−２．０ｍｇ／ｍｌグルコース（ｄ−（＋）−glucose）、２０−３０μｇ／ｍｌインシュリン、０．０５−０．２ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．３−０．６ｍＭ Glutamax、５０−１５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び５０−１５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる群から選択されたいずれか１以上の成分を追加し、１０−３０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０−３０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、及びそれらの混合物からなる群から選択されたいずれか１以上の成長因子を追加したものでもある。
【００６４】
前記神経幹細胞を、例えば、Ｎ２培地［Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）、１００μＭプトレシン、３０ｎＭセレナイト、２０ｎＭプロゲステロン、１．５５ｍｇ／ｍｌグルコース（ｄ−（＋）−glucose）、２５μｇ／ｍｌインシュリン、０．１ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．５ｍＭ Glutamax、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを組成成分として含む］に、成長因子を追加して培養することにより、未分化神経幹細胞を得ることができる。
【００６５】
前記培養された神経幹細胞を神経細胞に分化することは、前記［化学式１］で表示される化合物を含む分化誘導用組成物を、前記神経幹細胞に処理し、当業者に公知の方法によって分化させることをいう。例えば、該神経幹細胞が培養された培地に、本発明の神経幹細胞の分化促進用組成物を添加し、３７℃で分化を誘導することができる。
【００６６】
前記神経幹細胞は、前記の多様な培養条件（培地の成分、前記成分の含量、培養期間など）において、分化過程を経て神経細胞に分化されるが、前記培養条件は、特別にそれらに制限されるものではないが、望ましくは、３５ないし４０℃で、神経幹細胞から神経細胞に分化を誘導することができる。もし前記培養条件が３５℃未満であるか、４０℃を超えることになれば、神経幹細胞が神経細胞に分化される以前に死滅する問題が生じる。
【００６７】
また、前記神経幹細胞は、前記［化学式１］で表示される化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物を添加する以前に、細胞濃度を十分に確保するか、あるいは神経幹細胞の増殖、分化または死滅などの細胞変化を観察するために、７日以下の培養期間内に、前記［化学式１］で表示される化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物を、前述の方法で処理することが望ましいが、前記神経幹細胞の培養期間は、細胞濃度を十分に確保するために、最短１日、最長７日以下の培養期間であることがさらに望ましい。
【００６８】
また、前記［化学式１］で表示される化合物は、１ｎＭないし２０μＭの濃度で、神経幹細胞に処理することが望ましいが、前記［化学式１］で表示される化合物が、１ｎＭ未満であるならば、神経幹細胞の分化誘導性能が低下する問題が生じ、２０μＭを超えれば、細胞毒性を示す問題が生じる。化合物を処理するとき、該神経幹細胞は、通常プレートの各ウェル（well）が約７０ないし８０％充填されるように散布（seeding）する。例えば、１２ウェルプレートの場合は、ウェル当たり１ｘ１０５個、６ウェルプレートの場合は、ウェル当たり５ｘ１０５個の細胞を散布（seeding）する。
【００６９】
さらに望ましくは、下記実施例で後述するが、前記［化学式１］で表示される化合物は、１０ｎＭないし１０μＭ、さらに望ましくは、１０ｎＭないし１００ｎＭの濃度で処理することが望ましいが、１０ｎＭ濃度未満であるならば、神経幹細胞の分化速度が遅くなり、分化誘導期間が長くなるので、非経済的である問題があり、１０μＭを超えることになれば、有効成分である前記［化学式１］で表示される化合物が過量に添加されるために、追って生体内に投与されるとき、細胞内のさまざまな信号伝達経路に影響を及ぼすＭＥＫ１とＭＥＫ２との同時抑制効果が大きくなり、所望しない反応が誘導され、一般細胞にも影響を及ぼす問題が生じる。
【００７０】
前記神経幹細胞培養液に、ＭＥＫ１／２抑制剤である前記［化学式１］で表示される化合物を含む神経幹細胞の分化促進用組成物を添加した後、分化完了まで、１日ないし７日間かかることを特徴とするが、望ましくは、約３日ないし５日が必要となる。
【００７１】
本発明者らは、本発明の［化学式１］の化合物を神経幹細胞に処理する場合、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１の発現が増大し、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨ，ＧＡＢＡ性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ）神経細胞マーカーであるＧａｄ１、運動（motor）神経細胞マーカーであるＩｓｌ１、及びコリン性（cholinergic）神経細胞マーカーであるＣｈＡＴの発現がいずれも増大することを確認した（実験例４）。それは、［化学式１］の化合物により、神経幹細胞がドパーミン神経細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞、コリン性神経細胞、運動神経細胞のような多種の神経細胞に分化が誘導されるということを意味する。従って、本発明の［化学式１］の化合物は、多様な神経細胞の損失または損傷が原因になる多様な神経退行性疾患の治療にも使用される。例えば、パーキンソン病は、主にドパーミン神経細胞の損失と関係があり、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病、ＡＬＳ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ：progressive bulbar palsy）、進行性筋萎縮症（ＰＭＰ：progressive muscular atrophy）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ：primary lateral sclerosis）、仮性延髄麻痺（pseudobulbar palsy）、遺伝性強直性下半身麻痺（ＨＳＰ：hereditary spastic paraplegia）などの運動神経細胞病（motor neuron disease）は、運動神経細胞（motor neuron）の損失と関係があり、アルツハイマー病、血管性痴呆、老人性痴呆を始めとした痴呆は、主にコリン性神経細胞の損失と関連がある。また、ハンチントン病は、主に大脳基底核（basal ganglia）の線条体（striatum）でのＧＡＢＡ性中間サイズ有棘ニューロン（medium spiny neurons）の損失と関連がある。
【００７２】
特に、［化学式１］の化合物は、アルツハイマー病の主要病理的特徴であるベータアミロイドから神経幹細胞を保護しながら、それを神経細胞に分化させるために、アルツハイマー病治療剤として非常に有用に利用される。
【００７３】
また、本発明者らは、［化学式１］の化合物がヒト痴呆遺伝子を有したアルツハイマーマウス（５ｘＦＡＤ）の海馬移行部（subiculum）と大脳皮質のlayer ５との部分で、神経細胞の数を増加させることを確認した（実験例８）。５ｘＦＡＤマウスは、ヒト家族性アルツハイマー病をもたらすと知られたＡＰＰ（amyloid precursor protein）とプレセニリン（ＰＳＥＮ１）との遺伝子突然変異を有するマウスであり、海馬移行部と大脳皮質のlayer ５とにアミロイドの沈着が多く、その部位の神経細胞が損失されているマウスである。このマウスモデルにおいて、本発明の［化学式１］の化合物が、神経細胞の数を増加させたということは、［化学式１］の化合物が、生体内で神経幹細胞を神経細胞に分化させ、神経細胞の数を増加させ、かつ／またはベータアミロイドから神経細胞を保護することを確認するのである。
【００７４】
また、［化学式１］の化合物は、５ｘＦＡＤマウス大脳皮質の多様な部位、特に、運動皮質部分（motor cortex）、体性感覚皮質部分（somatosensory cortex）において、対照群に比べ、神経細胞の数を増加させた（実験例８、図１２、図１３）。それは、［化学式１］の化合物が、前述部分の神経細胞損失によって生じる疾病、例えば、筋萎縮性側索硬化症などの運動神経細胞病の治療に使用されるということを意味する
【００７５】
また、前記５ｘＦＡＤマウスの小脳（cerebellum）において［化学式１］の化合物は、対照群と対比し、プルキンエ細胞（Purkinje neuron）のエキソンの分枝形成（arborization）を増大させたり、エキソン構造を保全させたりする（実験例１１、図１８）。それは、［化学式１］の化合物が、小脳のプルキンエ細胞の損失または損傷が原因になって生じる小脳性運動失調症（cerebellar ataxia）の治療に使用されるということを意味する。
【００７６】
［化学式１］の化合物は、神経細胞を新生させたり（neurogenesis）、神経細胞を保護したりするか、あるいはそれらいずれの効果も示し、それを介して、神経再生を誘導する効果を有する。実験例９の結果から分かるように、［化学式１］の化合物は、アルツハイマー病モデルマウス（５ｘＦＡＤ）の大脳体性感覚皮質部分において、神経細胞新生過程中にある神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１発現を増大させ、海馬歯状回（dentate gyrus）の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）において、神経細胞新生過程中に特徴的に現れるtype ２細胞形態またはtype ３細胞形態の細胞を増加させ（図１６のＮｉｓｓｌ染色及びＮｅｕＮ染色の結果）、ＤＣＸを発現する未成熟神経細胞と、ＢｒｄＵ染色がなされる分裂中である細胞との数を増加させた（図１６）。それは、トラメチニブがマウスの大脳皮質及び海馬歯状回との部分において、神経細胞新生を誘導したということを裏付ける。
【００７７】
また、［化学式１］の化合物は、５ｘＦＡＤマウスにおいて、ＴＵＮＥＬ assayで確認することができる死滅している細胞の数を減らし（実験例１０、図１７）、小脳プルキンエ細胞のエキソン分枝形成増大またはエキソン構造保全（実験例１１、図１８）、及び脳組織のＡβ（１−４２）／Ａβ（１−４０）の比率低下（実験例１３、図２０）の効果を示した。それは、［化学式１］の化合物が、神経細胞の損失または損傷が起こる環境において、神経細胞を保護し、神経細胞の状態または活性を向上させ、神経再生に貢献することができるということを示す。
【００７８】
従って、本発明のさらに他の側面は、［化学式１］の化合物を有効成分として含む神経退行性疾患の予防用または治療用の薬学組成物、または［化学式１］の化合物を利用し、神経退行性疾患を予防または治療する方法、または神経退行性疾患の予防または治療に使用するための［化学式１］の化合物に係わるものである。本発明において、［化学式１］の化合物の代わりに、神経幹細胞を、神経細胞に分化されるように誘導しながら、同時に、ベータアミロイドのような毒性物質から、神経幹細胞と神経細胞とを保護する他のＭＥＫ１／２抑制剤を使用することができるが、［化学式１］の化合物を使用することが、特に望ましい。
【００７９】
前述のように、神経退行性疾患は、神経細胞（ニューロン）の漸進的な構造的、機能的な損失によって生じる精神的機能、身体的機能の退化疾患を意味するものであり、具体的には、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、老人性痴呆、前頭側頭葉痴呆、レビー小体痴呆、パーキンソン病、多系統萎縮症、皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、進行性核上麻痺、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病、ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、脊髄筋肉萎縮病、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、仮性延髄麻痺、遺伝性強直性下半身麻痺（ＨＳＰ）、小脳性運動失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、ギラン・バレー症侯群などから選択された疾患などを含む。
【００８０】
特に、本発明による［化学式１］で表示される化合物は、既存抗癌効果を示す濃度より低濃度でも、著しい分化誘導効果及び神経細胞保護効果を示すために、抗癌剤としての用量より少ない用量で、さらに安全に投与される。［化学式１］化合物を抗癌剤として使用する場合のおすすめ用量は、２ｍｇ１日１回経口投与であり、副作用でもって用量減量が必要である場合、１．５ｍｇ１日１回、１ｍｇ１日１回まで減量する。本発明において、［化学式１］の化合物を５ｘＦＡＤマウスで実験した場合、０．１ｍｇ／ｋｇ／日の低用量でも、神経幹細胞の分化効果を示したということを確認することができた。該用量は、ヒト６０ｋｇに該当する用量に変換するとき、０．４８ｍｇ／日に該当する（Journal of Basic and Clinical Pharmacy 2016, 7(2): 27-31）。
【００８１】
一方、本明細書において、用語「有効成分として含む」とは、本発明の神経退行性疾患を抑制するのに十分な量を含むということを意味する。
【００８２】
本発明の予防用または治療用の組成物は、当業界に一般的な剤形、例えば、経口投与剤あるいは注射剤などの非経口投与形態にも製造される。
【００８３】
本発明による薬学組成物は、薬剤の製造に一般的に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよく、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形；外用剤；坐剤；パッチ剤；及び滅菌注射溶液の形態に剤形化しても使用される。
【００８４】
本発明の組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、クロスカメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカメロースナトリウム及び鉱物油を使用できる。
【００８５】
製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、本発明の薬学組成物に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁液剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤、パッチ剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（witepsol）、マクロゴ−ル、トゥイーン（tween）６１、カカオ油、ラウリンジ、グリセロールゼラチンなどが使用される。
【００８６】
本発明の組成物は、経口または非経口によって投与され、全身投与または局所投与が可能である。
【００８７】
本発明の組成物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び投与期間によって異なるが、当業者によって適切に選択される。例えば、本発明の組成物は、１日０．０００１ないし１０ｇ／ｋｇであり、望ましくは、０．００１ないし８ｍｇ／ｋｇで投与することができる。該投与は、１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。望ましくは、前記［化学式１］で表示される化合物は、１日０．１ｍｇないし１０ｍｇ、０．１ｍｇないし５ｍｇ、０．１ｍｇないし２ｍｇ、０．１ｍｇないし１ｍｇ、０．１ｍｇないし０．５ｍｇ、０．２５ｍｇないし２ｍｇ、０．２５ｍｇないし１ｍｇ、０．２５ｍｇないし０．５ｍｇ、０．５ｍｇないし２ｍｇ、０．５ｍｇないし１ｍｇの範囲内で投与することができる。例えば、［化学式１］の化合物は、１日０．１ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇの用量で投与することができる。
【００８８】
本発明の他の側面において、本発明は、アルツハイマー病を始めとした神経退行性疾患を模写した環境において、神経幹細胞を神経細胞に分化誘導しながら、同時に、神経細胞を保護することができる物質をスクリーニングする方法に係わるものである。本発明のスクリーニング方法は、ベータアミロイド、ＭＰＴＰ（１−methyl−４−phenyl−１，２，３，６−tetrahydropyridine）、ロテノン（rotenone）、オキシドパーミン（oxidopamine）、グルタメート（glutamate）、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）、Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００ calcium−binding protein Ｂ）のような神経細胞損傷誘発物質と、マウス由来神経幹細胞とを利用するものであり、次のような段階を含む。
【００８９】
１）成体マウス由来の神経幹細胞を、ベータアミロイド（特に、オリゴマー形態のベータアミロイド）、ＭＰＴＰ（１−methyl−４−phenyl−１，２，３，６−tetrahydropyridine）、ロテノン、オキシドパーミン、グルタメート、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）、Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００ calcium−binding protein Ｂ）のような神経細胞損傷誘発物質で処理する段階；
２）試験物質を、前記神経細胞損傷誘発物質が処理された神経幹細胞に投与する段階；及び
３）細胞形態（morphology）分析を介して、神経幹細胞の分化及び細胞死滅のいかんを確認する段階。
【００９０】
前記スクリーニング方法において神経幹細胞は、マウスに由来したものを使用することが望ましい。マウスのような動物の神経幹細胞を使用すれば、ヒト神経幹細胞を使用することに比べ、細胞培養が容易であり、倫理的な面においても、利点がある。また、ヒト神経幹細胞の場合、マウスとは異なり、培地を折々交替しなければならず、高価な成長因子が必要であるが、マウスの神経幹細胞を使用すれば、そのような短所を避けることができる。さらに、ヒト神経幹細胞は、細胞の増幅（expansion）及び分化に、それぞれ７日以上の時間が必要となる一方、マウスの神経幹細胞は、細胞の増幅に、３日あるいは４日ほどが必要となり、分化期間も短く、迅速にスクリーニングすることが可能である。
【００９１】
前記神経幹細胞は、マウス成体脳から分離して培養して使用することができる。マウス成体神経幹細胞は、８週齢ないし１２週齢、例えば、８週齢マウスの脳室下帯で分離したものを使用することができる。一般的には、マウスの神経幹細胞は、受精後、１２日ないし１６日になったマウス胚芽の前頭葉から分離して培養する場合が多い。マウス胚芽神経幹細胞は、マウス成体由来の神経幹細胞に比べ、幹細胞能（stemness）がさらに強く、毒性環境にさらに耐えると予想される。しかし、本発明者らがマウス胚芽神経幹細胞に、ベータアミロイドを処理したとき、試験物質の処理と関係なく、細胞がいずれも死滅し、神経細胞への分化を観察することができなかった（比較例１及び図３参照）。それとは異なり、マウス成体脳から分離した神経幹細胞は、ベータアミロイドに対して細胞が耐える能力がさらに強く、アルツハイマー病模写環境での神経幹細胞分化誘導物質スクリーニングに適するということを発見した。従って、本発明の方法においては、成体マウスの神経幹細胞を使用する。
【００９２】
マウス成体から分離した神経幹細胞を分化される以前に、培養培地に接種し、３７℃で培養することができる。前記神経幹細胞を培養するための培地としては、成長因子を含む無血清培地組成成分を使用した方がよいが、望ましくは、初めに成体マウスから神経幹細胞を分離するときには、成長因子を含むＩＰＭ培地を利用して培養し、ニューロスフェアが形成された後、単一細胞に分離して培養するときには、Ｎ２培地を使用することができる。また、前記ＩＰＭ培地は、Neurobasal mediumに１−４％ Ｂ２７ supplement、０．５−２％ Glutamax、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んでもよく、Ｎ２培地は、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium／Nutrient Mixture Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（１：１）に、９０−１１０μＭプトレシン、２０−４０ｎＭセレナイト、１０−３０ｎＭプロゲステロン、１．０−２．０ｍｇ／ｍｌグルコース（ｄ−（＋）−glucose）、２０−３０μｇ／ｍｌインシュリン、０．０５−０．２ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．３−０．６ｍＭ Glutamax、５０−１５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び５０−１５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる群から選択されたいずれか１以上の成分を追加し、１０−３０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０−３０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、及びそれらの混合物からなる群から選択されたいずれか１以上の成長因子を追加したものでもある。成長因子は、神経幹細胞を未分化状態で維持する役割を行うが、培地に成長因子を含めて神経幹細胞を培養し、分化が抑制された状態で試験物質を処理してこそ、試験物質による神経幹細胞の分化誘導効果を正確に判断することができる。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法において、ベータアミロイドは、市販されるものを使用することができ、例えば、Gibco（Waltham，ＭＡ）社から入手することができる。特に、ヒト由来のものを使用することが望ましい。ベータアミロイドは、４０個のアミノ酸からなるＡβ（１−４０）と、４２個のアミノ酸からなるＡβ（１−４２）とが最も一般的な形態であるが、そのうち、Ａβ（１−４２）がＡβ（１−４０）より凝集体を形成する傾向がさらに強く、特に、毒性が強いトリマーやテトラマーを形成する傾向が強く、アルツハイマー病の疾病状態と関連性がさらに高いと見られている（Dahlgren, et al., (2002) Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability, J. Biol. Chem, 277(35): 32046-32053; K. Murakami (2014) Conformation-specific antibodies to target amyloid β oligomers and their application to immunotherapy for Alzheimer’s disease, Biosci. Biotechnol. Biochem., 78(8): 1293-1305）。従って、本発明のスクリーニング方法には、Ａβ（１−４２）、特に、Ａβ（１−４２）のオリゴマー形態を使用することが望ましい。
【００９４】
本発明のスクリーニング方法において、オリゴマー形態のＡβは、２４個未満、望ましくは、１２個以下のＡβ単量体の凝集体、さらに望ましくは、Ａβのテトラマーとトリマーとから主になる混合物であり、Ａβのプロトフィブリルやフィブリルをほとんど含まないものである。本発明において、Ａβ（１−４２）のオリゴマー形態は、文献［Dahlgren, et al., (2002) Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability, J. Biol. Chem., 277(35): 32046-32053］に開示された方法を使用して製造することができる。具体的には、Ａβ（１−４２）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶かした後、真空下で乾燥させ、乾燥されたペプチドが５ｍＭになるように、ＤＭＳＯに再懸濁させる。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（フェノールレッドなし）を添加し、ペプチドが１００μＭの濃度になるようにした後、４℃で２４時間培養する。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法において、ＭＰＴＰは、神経毒素であるＭＰＰ＋（１−methyl−４−phenylpyridinium）に対するプロドラッグであり、ＭＰＰ＋は、脳の黒質において、ドパーミン性ニューロンを破壊することにより、パーキンソン病の症状を永久に誘発させる。ＭＰＴＰは、パーキンソン病動物モデルにおいて、パーキンソン病の症状を誘発するために使用される。
【００９６】
ロテノン（rotenone）は、細胞内ミトコンドリアcomplex Ｉの活性を阻害することにより、脳黒質ドパーミン神経細胞の退行を誘発する物質であり、パーキンソン病の病理学的特徴を誘発すると知られている。
【００９７】
オキシドパーミン（oxidopamine）は、６−ヒドロキシドパーミン（６−ＯＨＤＡ）または２，４，５−トリヒドロキシフェネチルアミン（trihydroxyphenethylamine）とも呼ばれ、脳において、ドパーミン性ニューロン及びノルアドレナリン性ニューロンを選択的に破壊させるために、研究者らが使用する神経毒性化合物である。オキシドパーミンは、ドパーミン及びノルアドレナリンの再吸収受容体（reuptake transporter）を介して、ニューロンに入ると考えられる。オキシドパーミンは、ドパーミン性ニューロンを選択的に損傷させるために、選択的ノルアドレナリン再吸収抑制剤（例えば、デシプラミン）と共に使用されたりする。
【００９８】
グルタメートは、中枢神経系において、主要興奮性神経伝達物質として作用するが、高濃度で存在するとき、神経細胞に損傷を負わせ、細胞死滅を起こすと知られている。グルタメートの神経興奮毒性（excitotoxicity）は、虚血や外傷性脳損傷のような急性ＣＮＳ損傷だけではなく、ＡＬＳ、多発性硬化症、パーキンソン病などの慢性神経退行性疾患とも係わっている。
【００９９】
ＬＰＳ（lipopolysaccharide）は、グラム陰性細菌の細胞表面を構成する物質であり、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）（Sigma，Ｓｔ．Louis，ＭＯ）から分離したものを使用することができる。ＬＰＳは、動物において強い免疫反応を起こし、神経系において、小膠細胞を活性化させて炎症反応を誘発する。非正常的に過多活性化された小膠細胞による炎症媒介物の分泌は、免疫系の恒常性を撹乱させ、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のような中枢神経系自家免疫疾患関連退行性疾患を誘発して進展させる。
【０１００】
Ｓ１００Ｂは、星状細胞によって分泌されて発現されるカルシウム結合タンパク質である。Ｓ１００Ｂは、神経細胞の発達及び維持において、神経栄養性活性（neurotrophic activity）を有し、正常脳の認知機能に影響を及ぼす。しかし、Ｓ１００Ｂレベルの非正常的上昇は、膠細胞を活性化させ、神経炎症反応を起こすので、神経細胞に有害である。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法において、ベータアミロイドのような神経細胞損傷誘発物質は、試験物質処理前に、神経幹細胞に処理する。従来、神経細胞に試験物質処理を行い、一定時間が過ぎた後、ベータアミロイドを処理し、試験物質の神経細胞保護効果を観察する方式で行われた実験例があるが（例：大韓神経科学会誌２１（２）：１７４〜１８２、２００３）、そのような方式では、ベータアミロイドがすでに脳内に存在している状態で薬物を投与されるアルツハイマー病治療状況を模写することができない。本発明でのように、神経幹細胞に、ベータアミロイドをまず処理した後、試験物質を処理してこそ、疾患治療を試みる時点でのアルツハイマー病患者の脳内環境に近く模写することができる。
【０１０２】
神経細胞損傷誘発物質の処理後、試験物質を神経幹細胞に処理し、成長因子を毎日処理しながら追加して培養する。試験物質処理後、早ければ１２時間後、遅くとも４８〜７２時間後に、試験物質が神経幹細胞分化誘導効果を示すか否かということを形態（morphology）分析でもって確認することができる。
【０１０３】
該形態分析は、位相差顕微鏡でもって、細胞形態を観察して判断する。図２上段のＵＤ（未分化）とＤ（分化）とで表示した写真から分かるように、神経幹細胞が分化された場合（Ｄ）には、分化されていない場合（ＵＤ）と顕著に区別される。分化されていない場合（ＵＤ）には、細胞本体（cell body）が広く、エキソンやデンドライトのような神経突起（neurite）の形態を確認し難く、細胞が続けて分裂しており、全体的な細胞の数が多い。一方、分化された場合（Ｄ）には、細胞の本体が小さく、丸く変わった代わりに、神経突起が細長く伸びている。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法において使用する神経幹細胞は、通常の細胞株や癌細胞株に比べ、比較的か弱い細胞であるので、試験物質の毒性に敏感に反応する。試験物質が細胞毒性を示す場合、顕微鏡で死滅された細胞を観察することができ、分化誘導効果観察時、試験物質の毒性いかんも１回に判別することができる。
【０１０５】
本発明のスクリーニング方法によれば、アルツハイマー病のような神経退行性疾患患者の脳内環境を模写した状態において、神経幹細胞の分化誘導効果を有する物質をスクリーニングすることができ、神経退行性疾患の根本的治療剤候補物質のスクリーニング方法として適する。また、別途の試験分析の必要なしに、細胞形態の観察だけで、神経幹細胞の分化いかんを判別することができて便利である。また、一般的に、成長因子が含まれていない培地で培養し、自然的な分化を誘導する場合、神経幹細胞の分化は、最短で４８時間以後になってこそ、細胞形態が変わることを観察することができるが、分化効能に非常にすぐれる物質の場合、成長因子が含まれた培地で培養を行う状態であるにもかかわらず、試験物質処理後、早ければ１２時間、遅くとも４８〜７２時間後には、分化効果を示すか否かということを確認することができて迅速であり、試験物質の毒性いかんも、分化誘導効果いかんと同時に観察することができて効率的である。
【０１０６】
また、本発明は、前述のようなスクリーニング方法を遂行することができるキットに係わるものである。本発明のスクリーニング用キットは、マウス成体由来の神経幹細胞、ベータアミロイド、ＭＰＴＰ、ロテノン、オキシドパーミン、グルタメート、ＬＰＳまたはＳ１００Ｂのような神経細胞損傷誘発物質、成長因子、培地、その他細胞培養用添加物、細胞培養用プレート（コーティングされたものであるか、あるいは別途のコーティング溶液を含む）を含んでもよい。
【０１０７】
以下、実施例を介して、本発明についてさらに詳細に説明するが、ただし、以下の実施例により、本発明の範囲及び内容が縮小されたり制限されたりして解釈されるものではない。また、以下の実施例を含んだ本発明の開示内容に基づけば、具体的実験結果が提示されていない実施態様も、当業者が容易に実施することができ、そのような変形及び修正が、特許請求の範囲に属するということは言うまでもない。
【実施例】
【０１０８】
実験例１：マウス胚芽神経幹細胞における［化学式１］化合物の神経幹細胞分化能確認
段階１：マウス胚芽神経幹細胞培養
段階１Ａ：未分化状態でのマウス胚芽神経幹細胞培養
マウス胚芽１４．５日の脳から神経幹細胞を分離し、Ｎ２培養培地に、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：human basic fibroblast growth factor）（Peprotech，Princeton，ＮＪ、ｃａｔ＃．１００−１８Ｂ）と２０ｎｇ／ｍｌヒト表皮成長因子（ＥＧＦ：human epidermal growth factor）（Peprotech、ｃａｔ＃．ＡＦ−１００−１５）とを処理し、２５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ，Pittsburgh，ＰＡ）で、４日間、懸濁液状態で培養した。２日後から、ニューロスフェア形成を観察することができた。
【０１０９】
単一細胞分離のために、前日、１５μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−オルニチン（poly−Ｌ−ornithine）（Sigma，Ｓｔ．Louis，ＭＯ、ｃａｔ＃．Ｐ２５３３）溶液を６ウェルプレートに処理し、３７℃で１日の間（overnight）コーティングした（incubation）。実験当日、ポリ−Ｌ−オルニチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回プレートを洗った（washing）。次に、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（fibronectin）（Gibco，Waltham，ＭＡ、ｃａｔ＃．３３０１６０１５）溶液を入れ、さらに３７℃で２時間コーティングした（incubation）。プレート準備が完了すれば、形成されたニューロスフェアに、ＴｒｙＰＬＥ（Gibco，Ｃａｔ＃．１２６０４０１３）を処理し、単一細胞に分離した後、細胞の数を数え、４〜５Ｘ１０５個の細胞が２００〜３００μｌの培養液（１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含むＮ２培養培地）に含まれるように準備した。細胞を散布（seeding）する直前、コーティング溶液をサクション（suction）し、プレートが乾く前に、等しく良好に散布（seeding）した。約１分間、細胞がプレートに付着するように置いておいて、細胞がある程度付着したことを観察した後、１．５ｍｌの培養培地（１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含むＮ２培養培地）をさらに追加し、３７℃インキュベータで培養した。
【０１１０】
このとき、前記Ｎ２培養培地の成分は、次の通りである。
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）（Gibco，ｃａｔ＃．１１３２００３３）、１００μＭプトレシン（Sigma，ｃａｔ＃．５１７９９）、３０ｎＭセレナイト（Sigma，ｃａｔ＃．Ｓ５２６１）、２０ｎＭプロゲステロン（Sigma，ｃａｔ＃．Ｐ０１３０）、１．５５ｍｇ／ｍｌグルコース（ｄ−（＋）−glucose）（Sigma，ｃａｔ＃．Ｇ８２７０）、２５μｇ／ｍｌインシュリン（Gibco，ｃａｔ＃．１２５８５０１４）、０．１ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン（Sigma，ｃａｔ＃．Ｔ１１４７）、０．５ｍＭ Glutamax（Gibco，ｃａｔ＃．Ａ１２８６００１）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（Gibco，ｃａｔ＃．１５１４０１２２）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Gibco，ｃａｔ＃．１５１４０１２２）
【０１１１】
段階１Ｂ：分化を抑制していない状態の神経幹細胞の培養
単一細胞に分離して散布するとき、ｂＦＧＦとＥＧＦとを処理していないことを除いては、前記１Ａと同一にマウス胚芽神経幹細胞を培養した。
【０１１２】
段階２：試験物質の処理
段階１Ａで培養されたマウス胚芽神経幹細胞に、多様な濃度の［化学式１］の化合物（以下、「トラメチニブ」ともいう）（Medchem express，Monmouth Junction，ＮＪ、ｃａｔ＃．ＨＹ−１０９９９Ａ）及びＡＳ７０３０２６（ピマセルチブ）（Selleckchem，Houston，ＴＸ、ｃａｔ＃．Ｓ１４７５）を毎日処理し、４日間培養した。
【０１１３】
段階３：形態分析
培養４日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図１に示した。
【０１１４】
図１において、ＵＤ（undifferentiated：未分化）は、試験物質を処理していない段階１Ａで得た未分化マウス胚芽神経幹細胞であり、Ｄ（differentiated：分化）は、試験物質を処理していない段階１Ｂで得た分化されたマウス胚芽神経幹細胞である。ＵＤ群の未分化神経幹細胞は、細胞本体が広く、神経突起（neurite）形態を確認し難く、細胞が続けて分裂しており、全体的な細胞数がＤ群に比べて多い。Ｄ群の分化された細胞は、細胞本体が小さくて丸く変わった代わりに、神経突起が細長く伸び、ＵＤ群細胞と形態が確実に区別される。
【０１１５】
図１に示されているように、［化学式１］の化合物（トラメニチブ）は、１０ｎＭ、２５ｎＭ及び１００ｎＭ（０．１μＭ）の低濃度で、神経幹細胞から神経細胞への分化を良好に誘導した。ＡＳ７０３０２６を処理した群は、トラメチニブを処理した群より１００倍以上高濃度である１．０μＭにおいて、神経細胞分化が観察され始めた。
【０１１６】
前記結果を総合すれば、［化学式１］の化合物が、神経幹細胞から神経細胞への分化を誘導し、特に、非常に低濃度（１０ｎＭ以上）でも、そのような効果が著しいということが分かり、それは、［化学式１］の化合物が、神経幹細胞を、神経細胞に分化されるように誘導する組成物及び分化方法に利用され、神経退行性疾患の治療に利用される可能性があることを示唆する。
【０１１７】
実験例２：マウス成体神経幹細胞における［化学式１］の化合物の神経幹細胞分化能確認（神経幹細胞を神経細胞に分化誘導しながら、同時に、神経細胞を保護することができる物質をスクリーニングする方法）
段階１：マウス成体神経幹細胞の培養
段階１Ａ：未分化状態でのマウス成体神経幹細胞の培養
８週齢マウス脳の脳室下帯部分から神経幹細胞を分離し、ＩＰＭ培養培地に、２０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と２０ｎｇ／ｍｌヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）とを処理し、２４ウェルプレートで７日間懸濁液状態で培養した。４日後から、ニューロスフェア形成を観察することができた。
【０１１８】
単一細胞に分離する２日前、１０μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−オルニチン（poly−Ｌ−ornithine）溶液を６ウェルプレートに処理し、常温で１日（overnight）コーティングした（incubation）。翌日、ポリ−Ｌ−オルニチン溶液を除去し、三次滅菌水で３回プレートを洗った（washing）。次に、０．５ｍｇ／ｍｌラミニン（Roche，Upper Bavaria，Germany、ｃａｔ＃．１１２４３２１７００１）溶液を入れ、さらに３７℃で一晩（overnight）コーティングした（incubation）。プレート準備が完了すれば、形成されたニューロスフェアに０．０２５％ trypsin−ＥＤＴＡを処理し、単一細胞に分離した後、細胞数を数え、４〜５Ｘ１０５個の細胞が２００〜３００μｌの培養液に含まれるように細胞を準備した。このとき、培養液としては、Ｎ２培地（２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含み）を使用した。細胞を散布（seeding）する直前、コーティング溶液をサクションし、プレートが乾く前に等しく良好に散布した。約１分間細胞がプレートに付着するように置いておいて、細胞がある程度付着したことを観察した後、１．５ｍｌの培養培地（２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含むＮ２培養培地）をさらに追加し、３７℃インキュベータで２４時間培養した。
【０１１９】
このとき、前記ＩＰＭ培養培地とＮ２培養培地との成分は、次の通りである。
ＩＰＭ培養培地：Neurobasal medium（Gibco，ｃａｔ＃．２１１０３０４９）、Ｂ２７ supplement（Gibco，ｃａｔ＃．Ａ３５８２８０１）、Glutamax、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
Ｎ２培養培地：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）、１００μＭプトレシン、３０ｎＭセレナイト、２０ｎＭプロゲステロン、１．５５ｍｇ／ｍｌグルコース（ｄ−（＋）―glucose）、２５μｇ／ｍｌインシュリン、０．１ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．５ｍＭ Glutamax、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。
【０１２０】
段階１Ｂ：分化を抑制しない状態の神経幹細胞の培養
単一細胞に分離して散布するとき、ｂＦＧＦとＥＧＦとを処理していないことを除いては、前記１Ａと同一にマウス成体神経幹細胞を培養した。
【０１２１】
段階２：ベータアミロイド処理
段階１で培養した神経幹細胞の培地を替え、各ウェルに、ベータアミロイド（Ａβ）（Gibco，ｃａｔ＃．０３１１２）１０μＭを処理した。比較群として使用するために、ベータアミロイドを処理していないウェルを残しておいた。
【０１２２】
ベータアミロイド（Ａβ）は、Gibco（Waltham，ＭＡ）のヒトＡβ（１−４２）を購入して使用し、ベータアミロイドオリゴマー形成のために、次のような過程を経た。まず、ベータアミロイドが１ｍｇ／ｍｌになるように、１００％ ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−hexafluoro−２−propanol）（Sigma，ｃａｔ＃．１０５２２８）に溶かした後、常温で１時間ボルテキシング（vortexing）した。その後、speed Ｖａｃ機械を利用して１０分間乾燥させ、５ｍＭになるように、ＤＭＳＯ（Sigma，ｃａｔ＃．Ｄ２６５０）を入れ、常温で１０分間弱くボルテキシングした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（フェノールレッドなし）（Gibco，ｃａｔ＃．２１０４１０２５）をさらに添加し、１００μＭになるようにした。４℃で２４時間培養した後、細胞に処理した。
【０１２３】
段階３：試験物質投与
ベータアミロイド処理直後、トラメチニブは、１０ｎＭ、１００ｎＭを添加し、メマンチン（Sigma，ｃａｔ＃．Ｍ９２９２）は、５μＭ、１０μＭを添加し、ＡＳ７０３０２６は、１０μＭをそれぞれ添加した。ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ベータアミロイド及び試験物質を毎日処理しながら４日間培養した。
【０１２４】
段階４：形態分析
培養４日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図２に示した。
【０１２５】
図２において上段は、マウス成体神経幹細胞にベータアミロイド処理していない群であり、下段は、ベータアミロイドを１０μＭ濃度で処理した群である。ＵＤ（undifferentiated）は、試験物質を処理していない段階１Ａで得た未分化成体神経幹細胞であり、Ｄ（differentiated）は、試験物質を処理していない段階１Ｂで得た分化された成体神経幹細胞である。上段のＡβ未処理群のうちＵＤ群の細胞は、細胞本体が広く、神経突起（neurite）の形態を確認し難く、細胞が続けて分裂しており、全体的な細胞数がＤ群に比べて多い。Ｄ群の細胞は、細胞本体が小さくて丸く変わった代わりに、神経突起が細長く伸び、ＵＤ群細胞と形態が確実に区別される。
【０１２６】
トラメチニブを処理した群は、ベータアミロイド処理有無と係わりなく、１０ｎＭ及び１００ｎＭの低濃度において、神経幹細胞から神経細胞への分化を良好に誘導した。ＡＳ７０３０２６を処理した群は、トラメチニブを処理した群よりはるかに高濃度である１０μＭにおいて、ベータアミロイド処理有無と関係なく、神経細胞への分化誘導効果を示した。また、２つの物質いずれも、分化誘導効果を示した濃度において、細胞毒性を示さず、アルツハイマー病治療剤の候補物質として適するということを確認した。
【０１２７】
同時に、現在アルツハイマー病症状緩和剤として使用されているメマンチンを処理したグループでは、神経幹細胞から神経細胞への分化を確認することができず、むしろ神経幹細胞の死滅が観察された。メマンチンは、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤として、グルタメート信号伝逹に関与し、アルツハイマー患者において、正常な神経信号伝逹がなされるように一助となる役割を行うが、そのような機能によっては、損傷された神経細胞の回復によるアルツハイマー病の根本的な治療を期待することができない。メマンチンが神経幹細胞の分化を誘導することができず、むしろ細胞を死滅させるという前述の実験結果は、メマンチンが痴呆の根本的治療剤になれないという事実を確認させる。
【０１２８】
比較例１：マウス胚芽神経幹細胞にベータアミロイド処理したときの効果
段階１：マウス胚芽神経幹細胞培養
実験例１：段階１Ａ及び１Ｂと同一方法で培養した。
【０１２９】
段階２：アミロイドベータ処理
実験例２：段階２と同一方法で、前述の段階１で培養されたマウス胚芽神経幹細胞に、ベータアミロイドを処理した。
【０１３０】
段階３：試験物質投与
ベータアミロイド処理直後、トラメチニブ１００ｎＭ、メマンチン１０μＭ、ＡＳ７０３０２６（ピマセルチブ）１０μＭを添加した。ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ベータアミロイド及び試験物質を毎日処理しながら４日間培養した。
【０１３１】
段階４：形態分析
培養４日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図３に示した。図３において上段は、マウス胚芽神経幹細胞にベータアミロイドを処理していない群であり、下段は、ベータアミロイドを１０μＭ濃度で処理した群である。ＵＤ（undifferentiated）は、未分化胚芽神経幹細胞であり（試験物質未処理）、Ｄ（differentiated）は、分化された胚芽神経幹細胞である（試験物質未処理）。Ａβ処理群において、試験物質処理いかんと関係なく、細胞がいずれも死滅し、試験物質の効果を確認することができなかった。
【０１３２】
実験例３：免疫細胞化学染色分析（immunocytochemistry）
実験例１において、神経幹細胞が神経細胞に分化が誘導されたか否かということを確認するために、Ｔｕｊ１及びＤＡＰＩ（４’，６−diamidino−２−phenylindole）マーカーを利用した免疫細胞化学染色分析を行った。Ｔｕｊ１（neuron−specific class ＩＩＩ beta−tubulin）は、神経細胞特異的なマーカータンパク質であり、本実験において、ローダミン（rhodamine）を付着させ、赤色蛍光が示されるように標識し、ＤＡＰＩは、細胞のＤＮＡに結合し、核を青色蛍光に標識する染料である。
【０１３３】
実験例１の方法で培養した胚芽神経幹細胞を、coverslipが込められた２４ウェルプレートに散布し、トラメチニブとＡＳ７０３０２６とを濃度別に４日間処理した。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。１０％ホルムアルデヒド（Sigma，ｃａｔ＃．ＨＴ５０１１２８）で、常温で１０分間固定させた後、さらにＰＢＳで洗浄した。０．２％ Triton Ｘ−１００（Sigma，ｃａｔ＃．９３４４３）で、常温で１５分間透過化（permeabilization）させ、ＰＢＳで洗浄した後、１０％ ＢＳＡ（Sigma，ｃａｔ＃．Ａ２１５３）＋１％ normal goat serum（Vector ｌａｂ，Burlingame，ＣＡ、ｃａｔ＃．Ｓ１０００）で、常温で１時間インキュベーションさせた。１％ ＢＳＡ＋１％ normal goat serumに、１：２００の比率で、Ｔｕｊ１抗体（Cell signaling，Danvers，ＭＡ、ｃａｔ＃４４６６）がある溶液を入れ、４℃で一晩（overnight）インキュベーションさせた。その後、該溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１％ ＢＳＡ＋１％ normal goat serumに、１：２００の比率で、二次抗体（ローダミン付着抗体）がある溶液を、常温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Sigma，ｃａｔ＃．Ｄ９５４２）で５分間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、スライドガラスにmountingさせ、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１３４】
その結果を図４に示した。図４から分かるように、ＡＳ７０３０２６で処理したグループは、１．０μＭ濃度処理したグループにおいて、赤色に標識された細長く伸びた神経細胞の神経突起（neurite）が見え始め、該濃度において、神経細胞に分化が始まっていることが分かるが、分化が非常に微々たるほどに留まっていた。また、それ以下の濃度で処理したグループ（０．１μＭ）においては、分化が全くなされていないということが分かる。
【０１３５】
一方、トラメチニブで処理したグループは、非常に低い１０ｎＭ濃度で処理したグループから、神経細胞への分化が活発に増大していることを確認した。細胞形態も、トラメチニブ１０ｎＭを処理したグループにおいて、神経突起（neurite）が伸びる神経細胞群集が増加していることを確認することができた。
【０１３６】
実験例４：相対的なｍＲＮＡ発現分析
実験例４−１：マウス胚芽神経幹細胞における［化学式１］の化合物のＴｕｊ１及びＴＨ発現分析
実験例１で分化誘導された細胞の種類を確認するために、quantitative ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を介して、神経細胞特異的マーカーであるＴｕｊ１と、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨ（tyrosine hydroxylase）とのｍＲＮＡ発現を確認した。
【０１３７】
段階１：ＲＮＡ分離
実験例１で形態分析を終えた後、各処理群の培地をいずれも除去し、ＴＲＩｚｏｌ（Ｒ）（Invitrogen，Waltham，ＭＡ）をプレートに入れた後、５分間常温でインキュベーションし、細胞が良好に壊れるようにした。ＴＲＩｚｏｌ（Ｒ）と共に細胞を集めてチューブで移し、クロロホルム（Sigma，ｃａｔ＃．３６６９１９）を入れた後、良好に混ぜて遠心分離し、上澄み液の澄んだ部分だけ新たなチューブに移した。イソプロパノール（Ducsan，GyunggiDo，Korea、ｃａｔ＃．６７−６３−０）を処理し、ＲＮＡが良好に分離されるように混ぜ、さらに遠心分離した後、上澄み液を除去し、ペレットだけ残した。７５％エタノール（Ducsan、ｃａｔ＃、６４−１７−１５）を処理し、さらに遠心分離し、上澄み液を除去した。三次滅菌水でペレットを良好に溶かし、ｍＲＮＡを得て、５５℃で１０分間インキュベーションした後、−８０℃でＲＮＡを保管した。
【０１３８】
段階２：逆転写酵素（reverse transcription）
ＲＮＡの濃度を測定し、実験各グループのＲＮＡが２μｇになるように計算し、Reverse transcription kit（Invitrogen，ｃａｔ＃．２８０２５０１３）を利用して実験した。三次滅菌水、１ｐＭ ｏｌｉｇｏ ｄＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰを入れ、６５℃で５分間インキュベーションした後、５Ｘ first−strand buffer、１０ｍＭ ＤＴＴ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素をさらに添加し、４２℃で１時間、７２℃で１５分、４℃で３０分インキュベーションした後、作られたｃＤＮＡを−２０℃で保管した。
【０１３９】
段階３：ｑＲＴ−ＰＣＲ
前述の段階で作られたｃＤＮＡ １μｌ、プライマー１ｐＭ、三次蒸溜水、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ（Ｒ）Green（Qiagen，Venlo，Netherlands、ｃａｔ＃．２０４０７４）を入れて良好に混ぜた後、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ（Qiagen）機械を利用してＰＣＲを行った。使用されたプライマー（Bioneer，Daejeon，Korea）は、下記表２の通りである。
【０１４０】
【表２】
2020074796.tif 000006
【０１４１】
その結果を図５に示した。図５Ａ、図５Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を３回行って得た各グループの相対的なｍＲＮＡ発現数値に係わる平均値である。ここで、相対的なｍＲＮＡ発現数値とは、各グループの全体ＲＮＡの量を補正（normalization）するために、一般的に発現量に大差がないＧＡＰＤＨの発現量で、各分化マーカーに該当するｍＲＮＡ発現量を除算し、その後、さらに各グループの対照群（未分化神経幹細胞）の数値に対して、試験物質処理群の数値を比較したものを意味する。
【０１４２】
図５から分かるように、トラメチニブ処理群は、１０ｎＭ、２５ｎＭ及び１００ｎＭの濃度において、神経細胞分化因子であるＴｕｊ１と、ドパーミン神経細胞のマーカーであるＴＨとの発現が高く示された。そのような結果は、トラメチニブ、が神経幹細胞から神経細胞への分化を非常に効率的に誘導し、特に、ドパーミン神経細胞への分化を良好に誘導するということを示す。また、トラメチニブは、１ｎＭの非常に低濃度でも、分化誘導効果を示した。それは、本発明による神経幹細胞を、神経細胞に分化されるように誘導する組成物及び分化方法を介して、神経退行性疾患に利用される可能性があるということを示唆する。
【０１４３】
ＡＳ７０３０２６は、１０μＭ（１０，０００ｎＭ）において、トラメチニブ２５ｎＭ処理群と同等程度の効果を示し、トラメチニブが、ＡＳ７０３０２６より４００倍以上さらに低濃度において、神経幹細胞を神経細胞に分化誘導するということを確認した。
【０１４４】
実験例４−２：マウス胚芽及び成体神経幹細胞における［化学式１］化合物のＴＨ，ＣｈＡＴ，Ｉｓｌ１及びＧａｄ１ ｍＲＮＡ発現分析
［化学式１］化合物が、ドパーミン神経細胞以外に、他種の神経細胞でも分化を誘導する否かということを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を介して、コリン性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴ（choline acetyltransferase）、運動神経細胞マーカーであるＩｓｌ１（Ｉｓｌｅｔ１）、ＧＡＢＡ性神経細胞マーカーであるＧａｄ１（glutamate decarboxylase １）のｍＲＮＡ発現を確認した。
【０１４５】
実験例１の方法で細胞を培養し、トラメチニブを１ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭないし１００ｎＭで２日間処理した後、ＲＮＡを分離し、神経細胞分化マーカーを確認した。ｍＲＮＡの発現は、前述の実験例４−１と同一方法で確認し、使用したプライマーは、以下表３の通りである。
【０１４６】
その結果を図６に示した。
【０１４７】
【表３】
2020074796.tif 000007
【０１４８】
図６から分かるように、トラメチニブの処理濃度が高くなるほど、試した全種の神経細胞マーカー、すなわち、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨ、コリン性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴ、運動神経細胞マーカーであるＩｓｌ１、ＧＡＢＡ性神経細胞マーカーであるＧａｄ１の発現が増大するということを確認した。それは、トラメチニブが、多種の神経細胞損失が原因になる神経退行性疾患の治療に使用されるということを意味する。
【０１４９】
マウス成体神経幹細胞においても、同一効果が示される否かということを確認するために、実験例２の段階１Ａのように培養したマウス成体神経幹細胞に、１０ｎＭ濃度のトラメチニブと、１０μＭ濃度のＡＳ７０３０２６とを２日間それぞれ処理した後、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１と、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨ、コリン性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴｍＲＮＡとの発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。
【０１５０】
該結果を図７に示した。成体神経幹細胞においても、胚芽神経幹細胞と同様に、トラメチニブが、Ｔｕｊ１、ＴＨ、ＣｈＡＴのいずれの発現も増大させた。特に、トラメチニブは、ＡＳ７０３０２６よりも１，０００倍低濃度においても、神経細胞への分化誘導効果がはるかに高いということを確認した。
【０１５１】
実験例５：神経幹細胞におけるＭＥＫ１，ＭＥＫ２発現調節による分化能確認
実験例５−１：マウス胚芽神経幹細胞におけるＭＥＫ１，ＭＥＫ２発現抑制
ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現程度による神経幹細胞の神経細胞への分化能を確認した。このとき、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現が調節された細胞は、下記のように製造したものを利用した。
【０１５２】
まず、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現が抑制された神経幹細胞を製造するために、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現を抑制するｓｈＲＮＡを利用した。具体的には、実験例１、段階１Ａでのように培養されたマウス胚芽神経幹細胞をプレートに良好に散布（seeding）し、２４時間培養後、前記細胞に、１μｇ／ｍｌのｓｈＲＮＡ−ＭＥＫ１（ＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＧＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ）またはｓｈＲＮＡ−ＭＥＫ２（ＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＧ）をLipofectamine（Invitrogen，ｃａｔ＃．１８３２４０１０）を使用してトレンスフェクション（transfection）し、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２、またはそれらいずれの発現も抑制された神経幹細胞を製造した。
【０１５３】
そのように作られた神経幹細胞を、４時間後、さらにＮ２培養培地に培地を替えて４日間さらに培養した後、ＲＮＡを、実験例４−１の方法で抽出した後、Reverse transcription ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、神経細胞への分化能を分析した。具体的には、ｃＤＮＡで逆転写し、ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＧ Ｂｉｏ、KyunggiDo，Korea）とプライマーとを入れた後、Ｔ１００ＴＭ Thermal Cycler（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Hercules，ＣＡ）機械を利用してＰＣＲを行った。９５℃で５分インキュベーションした後、９５℃で３０秒、５５〜６２℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして、総２５〜３５サイクルになるようにＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果は、２％アガロースゲルを利用して電気泳動した後、image analyzerであるＬＡＳ−３０００（Fujifilm，Tokyo，Japan）機械で結果を確認した。
【０１５４】
本実験例、並びに下記実験例５−２及び５−３において、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下の表４の通りである。
【０１５５】
【表４】
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【０１５６】
その結果を図８Ａに示した。図８Ａから分かるように、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とで同時に処理し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発現をいずれも抑制した神経幹細胞（ｓｈＭＥＫ１＋、ｓｈＭＥＫ２＋）の場合、ＭＥＫ２発現のみを抑制した神経幹細胞（ｓｈＭＥＫ１−、ｓｈＭＥＫ２＋）に比べ、ドパーミン神経細胞マーカー（ＴＨ）の発現が大きく増大するということを確認した。
【０１５７】
ＭＥＫ１及びＭＥＫ２それぞれの発現阻害効果、並びにＭＥＫ１及びＭＥＫ２の同時発現阻害効果をさらに１回確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタン・ブロッティングの方法で、神経幹細胞の神経細胞への分化能を確認した。前述の方法で、ＭＥＫ１、ＭＫＥ２がそれぞれ発現が抑制された神経幹細胞と、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とが同時に発現が抑制された神経幹細胞を製造した後、神経幹細胞を、４時間後、さらにＮ２培養培地に培地を替え、４日間さらに培養し、実験例４−１の方法でｑＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を、図８Ｂのグラフに示した。図８Ｂのグラフから分かるように、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現をそれぞれ阻害したときより、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発現をいずれも阻害したとき、神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１及びＴＨの発現が顕著に増大しているということを確認することができた。
【０１５８】
ｍＲＮＡだけではなく、タンパク質レベルにおいても、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発現阻害による神経細胞分化効果を示すか否かということを確認するために、ウェスタン・ブロッティングを行った。
【０１５９】
各細胞について、次のようにウェスタン・ブロッティングを行った。前述のＭＥＫ１、ＭＥＫ２の発現が抑制された神経幹細胞を４日間培養した後、培地をいずれも除去し、氷の上で、ＲＩＰＡバッファ（０．０５Ｍ Tris ＨＣｌ ｐＨ７．４（Sigma，ｃａｔ＃．Ｔ３２５３）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（Ducsan，ｃａｔ＃．７６４７−１４−５）、０．２５％デオキシコール酸（Sigma，ｃａｔ＃．Ｄ６７５０）、１％ ＮＰ−４０（ＵＳＢ，Waltham，ＭＡ、ｃａｔ＃．１９６２８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma，ｃａｔ＃．ＥＤＳ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Acros organics，Geel，Belgium、ｃａｔ＃．２１５７４００５０）、１ｍＭ sodium orthovanadate（Ｂｉｏ ｌａｂｓ，Ipswich，ＭＡ、ｃａｔ＃．Ｐ０７５８Ｌ）、１ｍＭ フッ化ナトリウム（Sigma，ｃａｔ＃．Ｓ７９２０）、protease inhibitors（Sigma，ｃａｔ＃．Ｐ８３４３０））をプレートに入れた後、scrapperで細胞を集めた。１０分間、氷でインキュベーションした後、１３，０００ｒｐｍ、４℃に遠心分離して上澄み液を集めた。タンパク質の濃度を測定した後、サンプルバッファ（０．２５Ｍ Tris−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０５％ ＳＤＳ（Amersco，Solon，ＯＨ、ｃａｔ＃．２２７）、５０％グリセロール（Ducsan，ｃａｔ＃．５６−８１−５）、０．２５Ｍ ＤＴＴ（Invitrogen，ｃａｔ＃．Ｒ０８６１）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＰＢ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Hercules，ＣＡ、ｃａｔ＃．１６１−０４０４）を添加し、１００℃で１０分煮沸した後、−２０℃に保管した。
【０１６０】
８〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥｇｅｌを作り、１０〜２０μｇタンパク質サンプルをローディングして分離した後、nitrocellulose membraneに移し、５％ スキムミルクで常温で１時間ブロッキングした。０．１％ Tween ２０（Sigma，ｃａｔ＃．Ｐ１３７９）を含むＴＢＳ（tris buffered saline）に、Ｔｕｊ１，ＴＨ（Cell signaling、ｃａｔ＃．２７９２），ＭＥＫ１／２（Santa cruz，Dallas，ＴＸ、ｃａｔ＃．ｓｃ−２９２８３８）、ＥＲＫ（Snata cruz、ｃａｔ＃．ｓｃ−１３５９００）抗体をそれぞれ準備し、常温で２時間、あるいは４℃で一晩（overnight）インキュベーションした後、horseradish peroxidaseが付いている二次抗体を、常温で１時間インキュベーションした。その後、感光装備でタンパク質発現を確認し、その結果を図８Ｂ下段の写真に示した。図８Ｂに示されているように、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とで同時に処理し、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発現をいずれも抑制した神経幹細胞の場合（ｓｈＭＥＫ１＋、ｓｈＭＥＫ２＋）、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１と、ドパーミン神経細胞のマーカー（ＴＨ）との発現が、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとで、いずれも大きく増大するということを確認した。
【０１６１】
一方、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか１つの発現のみを抑制した神経幹細胞の場合には、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも抑制した神経幹細胞より、Ｔｕｊ１やＴＨの発現量が低いということを確認することができた。
【０１６２】
実験例５−２：マウス胚芽神経幹細胞におけるＣＡＭＥＫ１，ＣＡＭＥＫ２発現誘導
ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の活性化による神経幹細胞の神経細胞への分化能を確認するために、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とが常時活性化されるように突然変異を有するconstitutively active ＭＥＫ１（ＣＡＭＥＫ１），constitutively active ＭＥＫ２（ＣＡＭＥＫ２）プラスミドを利用して実験した。具体的には、実験例１、段階１Ａでのように培養されたマウス胚芽神経幹細胞をプレートに良好に散布（seeding）し、２４時間培養後、前記細胞に、１μｇ／ｍｌのＣＡＭＥＫ１，ＣＡＭＥＫ２を、Lipofectamineを使用してトレンスフェクションし、ＣＡＭＥＫ１とＣＡＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、またはＣＡＭＥＫ１とＣＡＭＥＫ２とのいずれも発現された神経幹細胞を製造した。そのように作られた神経幹細胞を、４時間後、さらにＥＧＦとｂＦＧＦとが含まれていないＮ２培養培地に培地を替え、４日間さらに培養した後、ＲＮＡ及びタンパク質を抽出し、quantitative ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）及びウェスタン・ブロッティングを行い、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２の活性化が、神経幹細胞から神経細胞への分化能に及ぼす影響を確認し、図８Ｃに示した。
【０１６３】
図８Ｃの結果は、図８Ｂとは反対に、分化が誘導される環境において、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とが活性化されれば、分化が抑制されるということを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタン・ブロッティングを介して確認したとき、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１と、ドパーミン神経細胞マーカーであるＴＨとのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現がいずれも抑制されるということを確認し、特に、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とがいずれも活性化された場合には、二つのうちいずれか一つが活性化された場合に比べ、Ｔｕｊ１とＴＨとの発現が顕著に減少するということを確認した。
【０１６４】
実験例５−３：マウス成体神経幹細胞におけるＭＥＫ１，ＭＥＫ２発現抑制
成体幹細胞においても、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との抑制が、神経幹細胞の分化を誘導するか否かということ、ベータアミロイドがある状況においても、同一効果があるか否かということを確認するために、次のように実験を進めた。
【０１６５】
実験例２、段階１Ａでのように培養されたマウス成体神経幹細胞をプレートに良好に散布（seeding）し、２４時間培養後、前記細胞に、１μｇ／ｍｌのｓｈＲＮＡ−ＭＥＫ１（CCGGGCCATCCAACATTCTAGTGAACTCGAGTTCACTAGAATGTTGGATGGCTTTTT）またはｓｈＲＮＡ−ＭＥＫ２（CCGGCCTCCGAGAGAAGCACCAGATCTCGAGATCTGGTGCTTCTCTCGGAGGTTTTTG）をLipofectamine（Invitrogen）を使用してトレンスフェクションし、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２、またはそれらいずれもの発現が抑制された神経幹細胞を製造した。
【０１６６】
そのように作られた神経幹細胞を、４時間後、さらにＮ２培養培地に培地を替えるか、あるいはＮ２培地に、１０μＭのベータアミロイド（Ａβ）１０μＭが処理された培地に替え、２日間さらに培養した後、顕微鏡で細胞形態を観察し、実験例４の方法でＲＮＡ抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行い、神経細胞への分化能を分析した。
【０１６７】
その結果を図９に示した。
【０１６８】
図９Ａから分かるように、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とのうちいずれか一つを処理した場合より、ｓｈＭＥＫ１、ｓｈＭＥＫ２を同時に処理し、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の双方の発現を抑制した神経幹細胞の場合、分化がさらに良好に誘導されたことを確認することができた。ベータアミロイドが処理された場合、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とが阻害されていない群においては、細胞が死滅したが、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか一つ、または双方とも阻害された場合には、細胞死滅が起こらずに分化が誘導されるということを確認した。
【０１６９】
また、図９Ｂから分かるように、ｓｈＭＥＫ１とｓｈＭＥＫ２とで同時に処理し、ＭＥＫ１，ＭＥＫ２発現をいずれも抑制した神経幹細胞の場合（ｓｈＭＥＫ１＋ｓｈＭＥＫ２）、神経細胞マーカー（Ｔｕｊ１）の発現が大きく増大することを確認した。一方、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とのうちいずれか１つの発現のみを抑制した神経幹細胞の場合（ｓｈＭＥＫ１及びｓｈＭＥＫ２）には、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との発現をいずれも抑制した場合より、神経細胞マーカー（Ｔｕｊ１）の発現が少なく、神経細胞への分化効果が低いということを確認することができた。ベータアミロイドを処理した環境においては、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２のいずれか１つの発現のみを抑制した場合にも、ある程度保護効果及び分化効果があったが、ＭＥＫ１とＭＥＫ２とをいずれも阻害したグループの場合、細胞の保護と分化とが顕著にさらに良好に誘導された。
【０１７０】
それを介して、成体神経幹細胞において、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との阻害は、神経幹細胞の分化を誘導するだけではなく、ベータアミロイドに対する保護効果も有しているということが分かる。
【０１７１】
実験例６：他のＭＥＫ１／２抑制剤の神経幹細胞分化誘導効果
トラメチニブ以外の他のＭＥＫ１／２抑制剤も、神経幹細胞の分化誘導効果及び保護効果があるか否かということを認するために、マウス胚芽神経幹細胞に各化合物を処理した。具体的には、実験例１の段階１Ａでのように培養されたマウス胚芽神経幹細胞に、ＭＥＫ１／２抑制剤として知られたＡＺＤ８３３０（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ２１３４）、ＰＤ１８４３５２（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ１０２０）、レファメチニブ（Sellechchem，ｃａｔ＃．Ｓ１０８９）、ＰＤ３１８０８８（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ１５６８）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ７００７）及びＡＳ７０３０２６を、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭでそれぞれ処理して培養した。比較のために、トラメチニブも、同濃度で処理した。培養２日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図１０Ａに示した。図１０Ｂは、各グループの細胞に対して、Ｔｕｊ１ ｍＲＮＡ発現を分析した結果である。
【０１７２】
図１０Ａ及び図１０Ｂから分かるように、ＡＺＤ８３３０、レファメチニブ、ＰＤ３１８０８８、ベニミチニブ及びＡＳ７０３０２６は、各化合物が分化誘導を始める濃度だけ異なり、分化を誘導しているということを確認した。ＡＺＤ８３３０、レファメチニブ及びＰＤ３１８０８８は、１．０μＭから、ベニミチニブ及びＡＳ７０３０２６は、１０μＭから分化形態を示していた。分化マーカーであるＴｕｊ１の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認しときにも、同濃度で分化を誘導しているということを確認した。トラメチニブは、０．１μＭの低濃度においても、他の物質より顕著に優秀な神経幹細胞分化効果を示した。しかし、ＰＤ１８４３５２は、０．１μＭで微弱な分化誘導効果を示したのみ、１．０μＭ及び１０μＭにおいては、細胞がいずれも死滅した。
【０１７３】
追加して、他のＭＥＫ１／２抑制剤であるＰＤ０３２５９０１（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ１０３６）、ＲＯ５１２６７６６（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ７１７０）、ＢＩ８４７３２５（Selleckchem，ｃａｔ＃．Ｓ７８４３）及びＵ０１２６（Ａ．Ｇ．Scientific，San Diego，ＣＡ、ｃａｔ＃．Ｕ−１０２）を、実験例２の段階１Ａでのように培養したマウス成体神経幹細胞に多様な濃度で投与し、神経幹細胞の分化誘導効果があるか否かということを観察した。試験物質処理後、培養２日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図１０Ｃに示した。図１０Ｃから分かるように、ＰＤ０３２５９０１は、０．１μＭから、ＲＯ５１２６７６６は、１．０μＭから分化誘導効果を示した。特に、ＰＤ０３２５９０１は、０．１μＭから１０μＭに至るまで広い濃度範囲にわたって分化を誘導させ、優秀な効果を示すということを確認した。一方、ＢＩ８４７３２５は、０．１μＭにおいて微弱な分化誘導効果を示したのみ、１．０μＭ及び１０μＭで処理したときには、細胞がいずれも死滅した。ＢＩ８４７３２５をさらに低濃度で処理したときにも（１．０ｎＭ及び１０ｎＭ）、細胞増殖が若干抑制されたように見え、分化誘導効果は、示されなかった。Ｕ０１２６は、０．１μＭ及び１μＭにおいて、細胞増殖が抑制されたように見え、１０μＭでは、細胞毒性が示された。Ｕ０１２６は、２．５μＭでも、明らかな分化誘導効果を示さず、処理した全ての濃度において、神経幹細胞の分化誘導効果を確認することができなかった。
【０１７４】
該実験結果は、既存にＭＥＫ１／２抑制剤として知られた物質が、いずれも神経幹細胞の分化を効果的に誘導するものではないということを示す。実験例５の結果によれば、ＭＥＫ１とＭＥＫ２との抑制が神経幹細胞の分化誘導に関与することは、明らかであるが、各ＭＥＫ１／２抑制剤が有する固有の他特性が神経幹細胞の分化誘導能力に影響を及ぼし、実験例６のような結果が得られたものと考えられる。
【０１７５】
実験例７：細胞毒性因子存在下で他のＭＥＫ１／２抑制剤の神経細胞分化能
実験例２、段階１Ａでのように培養した成体神経幹細胞に、実験例２の段階２でのように、ベータアミロイド１０μＭを処理して細胞毒性環境を誘発し、ＭＥＫ１／２抑制剤であるＡＳ７０３０２６（１０μＭ）、ＡＺＤ８３３０（１μＭ）、ＰＤ３１８０８８（１μＭ）、ベニミチニブ（１０μＭ）、レファメチニブ（１μＭ）、ＰＤ０３２５９０１（１０μＭ）、ＲＯ５１２６７６６（１０μＭ）を、それぞれ実験例６で最も分化を良好に誘導した濃度で処理して培養した。比較のために、トラメチニブ０．１μＭ処理群と、ＭＥＫ２に比べ、ＭＥＫ１に対して選択的な阻害剤として知られたコビメチニブ１０μＭ処理群と、を追加し、ベータアミロイド処理を行わず、各化合物を培養した群も、追加した。培養２日目、位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、その結果を図１１に示した。
【０１７６】
図１１において、「−」と表示した並びは、マウス成体神経幹細胞に対してベータアミロイド処理を行っていない群であり、「Ａβ１−４２」と表示した並びは、ベータアミロイドを１０μＭ濃度で処理した群である。ベータアミロイド１０μＭを処理し、細胞毒性が誘発された環境において、ＡＳ７０３０２６、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ３１８０８８、ベニミチニブ、レファメチニブ、ＰＤ０３２５９０１及びＲＯ５１２６７６６は、成体神経幹細胞に、それぞれ最も分化を良好に誘導する濃度で処理したとき、細胞を保護し、分化を良好に誘導しているということを確認した。対照的に、ＭＥＫ２に比べ、ＭＥＫ１に対して選択的な阻害剤で知られたコビメチニブは、１０μＭの高濃度で処理したときでも、ベータアミロイド処理と無関係に、成体神経幹細胞の分化を誘導することができなかった。
【０１７７】
実験例８：アルツハイマー病気モデルマウスにおける神経細胞数の増加効果確認
前述の実験結果を介して、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２を同時に抑制する物質のうち特定物質が神経幹細胞から神経細胞への分化を誘導し、ベータアミロイドから神経幹細胞を保護する効果があり、特に、トラメチニブが顕著に優秀な効果を示すということを確認した。そのような効果を、神経退行性疾患モデルマウスでも確認するために、神経退行性疾患のうち最も一般的な疾患であるアルツハイマー病の症状、特に、体性感覚皮質のlayer ５及び海馬移行部（subiculum）での神経細胞の退行及び死滅を示す動物モデル（Oakley et al., (2006) Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation, J Neurosci. 26 (40): 10129-10140）である５ＸＦＡＤマウスを利用し、トラメチニブの神経再生効能及び治療効能を確認した。
【０１７８】
アルツハイマー病モデルマウスである５ＸＦＡＤ（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ）が１２ヵ月齢になったとき、トラメチニブを、０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日２８日間経口投与し、対照群には、ビークル（４％ ＤＭＳＯ＋corn oil）を同一方法で投与した（群当たり７匹）。追って、ＢｒｄＵ染色実験を行うために、前述の投与期間の最後の５日間は、追加して５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ（Sigma，ｃａｔ＃．Ｂ５００２）を毎日投与した。その後、マウスに麻酔をかけた後、ＰＢＳを利用し、perfusion方法によって犠牲にして脳を摘出した。群当たり３匹のマウスで摘出した脳のうち、半分の脳組織（hemisphere）は、ウェスタン・ブロッティングとＥＬＩＳＡとの実験のために摘出するや否や、直ちに超低温冷凍庫（deep freezer）に保管した。残りの反対側脳の半球（hemisphere）と、さらに他の残りの群当たり３匹のマウスから摘出した脳は、１０％ホルマリン溶液に入れ、４℃で１日置いておき、パラフィンが脳組織に良好に浸透するように、７０％，８０％，９５％，１００％アルコールの順序でそれぞれ１時間ずつ置いて脱水化を行い、clearingのために、キシレンに１時間ずつ３回浸しておいて、溶液状態のパラフィンに１時間ずつ２回浸した。その後、フレームに良好に固定させ、５μｍ厚に切片を作り、スライド状で常温保管した。免疫組織化学染色実験のために、スライド上の組織を、キシレン、アルコール１００％，９０％，８０％，７０％，５０％、水の順序で５分ずつ浸して再水化させた。クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ、ｐＨ６）（Sigma，Ｓ４６４１）バッファに浸した後、１２０℃で１５分間antigen retrieval過程を経た後、１０％ ＢＳＡ（bovine serum albumin）でブロッキングした後、神経細胞マーカーであるＮｅｕＮの抗体（Cell signaling、ｃａｔ＃．２４３０７）で、４℃で１日インキュベーションさせた。翌日anti-rabbit抗体（Vector ｌａｂ，ｃａｔ＃．ＰＩ−１０００）を、常温で１時間インキュベーションさせた後、ＤＡＢ染色法で染色し、脳における神経細胞分布を分析した。
【０１７９】
５ＸＦＡＤマウスの場合、大脳皮質のlayer ５と、海馬の海馬移行部（subiculum）との部分で神経細胞損傷が多く起きていることがすでに知られているので、まず第一にこの部分を確認した。
【０１８０】
図１２は、マウス大脳皮質のうち、体性感覚皮質（somatosensory cortex）部分の矢状面（sagittaｌ）切片を分析した結果である。図１２Ａから分かるように、５ＸＦＡＤマウスに、ビークル（４％ ＤＭＳＯ＋corn oil）のみを投与した対照群（左側最初の写真）は、すでに大脳皮質layer ５の神経細胞が多く損傷され、ＮｅｕＮが染色される神経細胞数が減っているが、トラメチニブを、０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇで投与した５ＸＦＡＤマウスは、ＮｅｕＮが染色される神経細胞数が顕著に増加していることを確認した。図１２Ｂは、体性感覚皮質layer ５部分の単位面積当たりＮｅｕＮが染色された細胞数（％）であるが、グループ当たり３匹のマウスにおいて、匹当たり３部分の面を分析して総９面の細胞数を計数し、ビークルのみを投与したグループ対比で、トラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示したものである。
【０１８１】
図１３は、マウス大脳皮質のうち、運動皮質（motor cortex）部分の冠状面（coronal）切片を分析した結果である。図１３Ａから分かるように、体性感覚皮質での結果と同様に、５ＸＦＡＤマウスにビークルだけ投与したグループは、運動皮質のlayer ５の神経細胞の損傷を示しているが、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスグループにおいては、神経細胞数が顕著に増加しているということをさらに１回確認した。図１３Ｂは、運動皮質layer ５部分のＮｅｕＮが染色された細胞数を計数し、単位面積当たり細胞数の比率で示したものである。グループ当たり３匹のマウスにおいて、匹当たり６部分の面を分析し、総１８面の細胞数を計数し、ビークルのみを投与したグループ対比で、トラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示した。
【０１８２】
図１４は、マウス海馬移行部（hippocampus subiculum）部分の矢状面（sagittaｌ）を分析した結果である。図１４Ａから分かるように、大脳皮質の結果と同様に、５ＸＦＡＤマウスにビークルだけ投与したグループは、海馬移行部部分において、神経細胞マーカーであるＮｅｕＮが染色された神経細胞数が顕著に少ないということを確認することができた。トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスグループにおいては、ＮｅｕＮが染色された神経細胞数が、ビークルを処理したグループに比べ、顕著に増加しているということをさらに１回確認した。図１４Ｂは、図１４Ａで点線表示された海馬移行部（hippocampus subiculum）のＮｅｕＮ染色された細胞数を計数し、単位面積当たり細胞数の比率で示したものである。グループ当たり３匹のマウスにおいて、匹当たり３部分の面を分析し、総９面の細胞数を計数し、ビークルのみを投与したグループ対比で、トラメチニブを投与したマウスでのＮｅｕＮ染色細胞数の比率を計算して表示した。前述の実験を介して、トラメチニブが５ＸＦＡＤマウスにおいて、大脳皮質layer ５部分と海馬移行部との神経細胞数を増加させる効果があることを確認することができた。
【０１８３】
実験例９：アルツハイマー病気モデルマウスで神経細胞新生効果確認
実験例８において、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの大脳皮質及び海馬移行部での神経細胞数の増加が、トラメチニブによる神経細胞新生誘導効果を介して示されたものであるか否かということを確認するために、神経幹細胞から神経細胞に分化する過程中に示される多様な細胞のマーカーを利用し、免疫組織化学染色方法で確認した。
【０１８４】
ＤＣＸ（doublecortin）は、神経前駆細胞で発現されるタンパク質であり、移動する神経細胞（migrating neurons）や分化している神経細胞において、主に発現されるので、神経細胞新生過程中にある未成熟神経細胞であるということを示し、Ｔｕｊ１（neuron−specific classＩＩＩβ tubulin）は、まさに分裂中である神経前駆細胞、または新たに生成された未成熟後分裂期神経細胞で発現されるタンパク質であり、神経細胞新生過程にある神経細胞であるということを示す。従って、ＤＣＸやＴｕｊ１の存在を免疫組織化学染色方法で確認することにより、神経幹細胞から神経細胞への分化を介して、神経細胞新生が起こったか否かということを確認することができる。ＢｒｄＵ（５−bromodeoxycytidine）は、塩基配列のうち１つのチミジン（thymidine）の類似体であるが、分裂する細胞においてＤＮＡが合成されるとき、チミジンの代わりに入り込む。従ってＢｒｄＵに対する免疫組織化学染色方法で、神経細胞新生によって分裂する細胞を確認することができる。
【０１８５】
実験例９−１：大脳体性感覚皮質部分のＴｕｊ１発現確認
実験例８の５ＸＦＡＤマウスの脳組織スライドに、Ｔｕｊ１抗体を４℃で１日インキュベーションさせ、翌日、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）−二次抗体（Invitrogen，ｃａｔ＃．ａ２１１２１）を常温で１時間インキュベーションさせ、蛍光染色法で染色した。大脳皮質のうち体性感覚皮質部分の蛍光顕微鏡写真結果を図１５に示した。図１５において、矢印（→）で表示した部分は、Ｔｕｊ１が染色された細胞を示し、矢印の頭（▼）で表示したものは、ベータアミロイド凝集によるプラークを示す。ビークル処理群とトラメチニブ処理群とのいずれにおいても、ベータアミロイドプラークが存在していたが、特に、トラメチニブ０．１ｍｇ／ｋｇを投与した群において、ビークルグループと対比し、類似程度のベータアミロイドプラークの存在にもかかわらず、Ｔｕｊ１が染色された細胞数が顕著に増加しているということを確認した。
【０１８６】
実験例９−２：海馬の歯状回（dentate gyrus）部分のＮｉｓｓｌ，ＮｅｕＮ及びＤＣＸ発現確認
マウス歯状回（dentate gyrus）の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）において、神経細胞新生過程が活性化されれば、神経幹細胞が非対称分裂が起こり、その結果として、Type ２形態の細胞が最も初期に生成される。Type ２形態の細胞は、小さい細胞体（soma）と非定型の細胞核とを有しており、短く水平方向に細胞が位置しており、ネスチンやＤｃｘを発現している。Type ３形態の細胞は、Type ２形態の細胞がさらに分化した形態の細胞をいうが、神経母細胞（neuroblast）ともいう。Type ３細胞は、神経阿膠細胞系譜（glial cell lineage）ではなく、神経細胞系譜（neuronal cell lineage）に分化される分化初期の細胞である。Type ３細胞は、マウス歯状回の顆粒細胞下帯において、果粒層側に若干移動した位置に存在し、細胞形態は、Type ２細胞と異なり、水平方向から垂直方向の形態に変わっている形態である。マウス歯状回の顆粒細胞下帯に、Type ２細胞とType ３細胞とが存在することは、神経細胞新生がなされていることを意味する。
【０１８７】
Ｎｉｓｓｌ染色は、神経細胞のＮｉｓｓｌ bodyを染色するものであり、脳において、神経細胞の分布、及び神経細胞の状態を確認することができる染色方法である。Ｎｉｓｓｌ染色のために、実験例８のマウス脳のスライド上の組織を、キシレン、アルコール１００％，９０％，８０％，７０％，５０％、水の順序で５分ずつ浸して再水化させた後、０．１％ cresyl violet（Sigma，ｃａｔ＃．Ｃ５０４２）溶液に、常温で１５分間浸し、さらにアルコール８０％，９０％，１００％、キシレンによって脱水化した。Cover slipで良好に覆った後、脳内神経細胞を観察した。
【０１８８】
ＮｅｕＮ染色は、実験例８と同一方法で行い、ＤＣＸ染色も、同一方法で行うが、ＮｅｕＮ抗体の代わりに、ＤＣＸ抗体（Santa cruz、ｃａｔ＃．ｓｃ２７１３９０）を使用して実験した。
【０１８９】
その結果を図１６Ａに示した。Ｎｉｓｓｌ染色とＮｅｕＮ染色との結果、トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの場合、歯状回（dentate gyrus）の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）部分と、顆粒細胞下帯より若干granular zoneに近い部分とにおいて、神経細胞新生過程中に特徴的に示されるType ２細胞形態またはType ３細胞形態を有する細胞が多く増加していると示された。また、ＤＣＸ染色によっても染色される未成熟神経細胞（図１６の「Ｄｃｘ」で表示した並びの写真において、矢印（→）で表示）が確認され、トラメチニブが投与されたマウス海馬の歯状回部分で神経再生が起きているということを確認した。
【０１９０】
実験例９−３：海馬の歯状回（dentate gyrus）部分のＢｒｄＵ染色
神経細胞の新生が起こるためには、神経幹細胞の非対称分裂（asymmetric division）がまず起こらなければならないが、それを確認するために、次のように実験を行った。
【０１９１】
実験例８での犠牲前５日から、５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを５日間毎日投与された５ＸＦＡＤマウスの脳組織スライドを再水化させ、１．５Ｍ ＨＣｌ（塩酸）に浸し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、０．５％ ＢＳＡ（bovine serum albumin）、０．３％ TritonＸ−１００、１０％ normal goat serumが含まれた溶液でブロッキングを行い、ＢｒｄＵ抗体（Cell signaling、ｃａｔ＃．５２９２）を、４℃で１日インキュベーションさせた。翌日、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）−二次抗体を常温で１時間インキュベーションさせ、蛍光染色法で染色した。海馬の歯状回部分の染色された組織を蛍光顕微鏡で確認した。
【０１９２】
その結果を図１６Ａの「ＢｒｄＵ」で表示した並びの写真に示した。写真において、矢印頭（▼）で表示した細胞が、ＢｒｄＵが染色された細胞である。トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスの歯状回において、ＢｒｄＵが染色される細胞数が、ビークル投与グループに比べて増加していた。図１６Ｂは、ＢｒｄＵが染色された細胞数を計数した結果であり、やはりトラメチニブ投与群において、ＢｒｄＵ染色された細胞数増加を示す。図１６Ｂは、グループ当たり３匹のマウスにおいて、匹当たり３部分の面を分析し、総９面の細胞数を計数し、その平均値をグラフで示したものである。
【０１９３】
前述の実験例結果を基に、トラメチニブが、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、神経幹細胞の分化を誘導し、神経細胞新生を誘導するということが分かる。そのような結果は、トラメチニブが、アルツハイマー病の根本的治療剤として有用に使用されるだけではなく、大脳皮質の神経細胞の損傷または消失、特に、運動皮質の損傷または消失が原因になる疾患の治療または予防に有効であろうということを示唆する。
【０１９４】
実験例１０：アルツハイマー病気モデルマウスでの神経細胞保護効果確認
５ＸＦＡＤマウスの大脳皮質及び海馬移行部において、トラメチニブが神経細胞の保護効果を有するか否かということを確認するために、細胞死滅（apoptosis）を確認することができる免疫組織化学染色方法であるＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）assayを行った。ＴＵＮＥＬ assayは、細胞死滅が起こるとき、壊れているＤＮＡの３’−ヒドロキシ末端を染色する染色法であり、組織内で死滅している細胞を目で確認することができる。
【０１９５】
実験例８の５ＸＦＡＤマウスの矢状面（sagittaｌ）脳組織スライドを再水化させ、ＴＵＮＥＬ assayｋｉｔ（Promega，Wisconsin，ＵＳＡ、ｃａｔ＃．Ｇ３２５０）を利用して染色した。具体的には、脳組織スライドを、２０μｇ／ｍｌ proteinase Ｋ溶液で１０分間permeabilizationした後、equilibrationバッファで１０分間インキュベーションし、ＴｄＴ溶液で３７℃で１時間インキュベーションすることによって染色した。その後、５ＸＦＡＤマウスにおいて、細胞死滅が著しく示されると知られた体性感覚皮質（somatosensory cortex）部分と海馬移行部（subiculum）とを顕微鏡で観察した。このとき、一般成体マウス脳組織スライドを利用し、ＴＵＮＥＬ assay実験が良好に行われたか否かということを確認した。
【０１９６】
図１７は、その結果を示す。ＴＵＮＥＬ assayの結果、一般成体マウス脳の場合は、細胞死滅が起こらず、緑色蛍光表示が示されていないが（図１７において、「normal mouse」と表示した写真）、５ＸＦＡＤマウス脳の場合、体性感覚皮質部分（図１７において、「cortex」と表示した並びの写真）と海馬移行部（図１７において、「subiculum」と表示した行義写真）とにおいて、緑色蛍光に染色された細胞が多いということを確認することができた。図１７において、海馬移行部の場合、染色された細胞は、矢印（→）で表示し、体性感覚皮質の場合、染色された細胞が多く、別途に矢印で表示していない。トラメチニブを投与した５ＸＦＡＤマウスは、体性感覚皮質部分と海馬移行部とにおいて、ＴＵＮＥＬ染色される細胞数が、ビークル投与グループより顕著に減少しているということを確認することができた。
【０１９７】
前述の実験例の結果を基に、トラメチニブが、アルツハイマー病気モデルマウスにおいて、神経細胞の死滅に対して保護する効果を有しているということが分かる。
【０１９８】
実験例１１：アルツハイマー病気モデルマウスにおける小脳プルキンエ細胞（Purkinje cell）保護効果確認
実験例８の５ＸＦＡＤマウスの脳組織スライドに、Ｔｕｊ１抗体及びカルビンジン抗体（Cell signaling，ｃａｔ＃．１３１７６）を、４℃で１日インキュベーションさせ、翌日ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）−二次抗体またはローダミン−二次抗体を、常温で１時間インキュベーションさせて蛍光染色法で染色した。小脳プルキンエ細胞層（Purkinje cell layer）部分を蛍光顕微鏡で観察した結果の写真を図１８に示した。各処理群別において、２個（Ｔｕｊ１染色）または３個（カルビンジン染色）のスライドに係わる写真を添付した。
【０１９９】
図１８から分かるように、ビークル処理群のプルキンエ細胞は、伸びていくエキソンの形態が細く、中間が切れる様相を帯びであるのに比べ、トラメチニブ投与群、特に、トラメチニブ０．１ｍｇ／ｋｇ処理群は、ビークル処理群に比べ、プルキンエ細胞エキソンの分枝形成（arborization）が増加しているか、あるいはエキソン構造が保全されていた。
【０２００】
小脳（cerebellum）は、主に感覚認知の統合、及び運動筋肉の調整、制御に重要な役割を担当する器官である知られている。小脳に存在する細胞のうち、最も目立つ細胞であるプルキンエ細胞（Purkinje cell）は、脳において大きさが最大である細胞のうち一つであり、プルキンエ細胞に伸びていくエキソンで形成された分枝（arborization）が互いにシナプスを形成し、小脳の深い核まで伸びていき、運動筋肉を調整、制御する役割を担当する。本実験例の結果は、トラメチニブが、小脳でプルキンエ細胞を保護し、エキソンの分枝形成を増大させ、小脳のプルキンエ細胞の損失または損傷が原因になって生じる小脳性運動失調症（cerebellar ataxia）などの治療に使用されるということを示す。
【０２０１】
実験例１２：アルツハイマー病気モデルマウスにおけるトラメチニブのＭＥＫ活性阻害効果確認
神経退行性疾患治療用薬物は、中枢神経系に作用する薬物であるので、血液脳障壁（blood brain barrier）を通過し、脳で作用することができる否かということが問題になる。ＭＥＫ１／２抑制剤のうち、ＡＳ７０３０２６のような物質は、マウスのＢＢＢを効果的に通過し、マウス脳においてＭＥＫを抑制する結果、phosphorylated ＥＲＫ（ｐＥＲＫ：ＥＲＫの活性化された形態）の発現を低減させると知られている（Shaw et al., (2012) Evaluation of brain pharmacokinetics as a potential differentiation factor for the MEK inhibitors, MSC2015103 and pimasertib, Abstract LB-456, American Association for Cancer Research Annual Meeting, Chicago, IL）。本実験例においては、ＭＥＫ１／２抑制剤であるトラメチニブが、５ＸＦＡＤマウスに経口投与されたとき、脳に伝達され、前述の実験例のような効果を示したか否かということを確認するために、脳組織でのｐＥＲＫ発現レベルを測定した。
【０２０２】
実験例８において、超低温冷凍庫（deep freezer）に保管中であった群当たり３匹５ＸＦＡＤマウス脳の半球（hemisphere）を液体窒素に入れ、液体窒素が込められた乳鉢できれいにすりつぶした。すりつぶした粉末を６等分し、それぞれ新たなチューブに移し、さらに超低温冷凍庫に保管した。そのうち１つのチューブを取り出し、実験例５−２の方法でウェスタン・ブロッティングを行った。ＲＩＰＡバッファを入れ、ピペットで粉末を良好に懸濁し、１０分間氷でインキュベーションした後、１３，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離して上澄み液を集めた。タンパク質の濃度を測定した後、サンプルバッファ（０．２５Ｍ Tris−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０５％ ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．２５Ｍ ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＰＢ）を添加し、１００℃で１０分煮沸した後、−２０℃で保管した。１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ gelを作り、１０μｇタンパク質サンプルをローディングして分離した後、nitrocellulose membraneに移し、５％スキムミルクで常温で１時間ブロッキングした。０．１％ Tween ２０を含むＴＢＳ（tris buffered saline）に、ｐＥＲＫ（Cell signaling、ｃａｔ＃．４３７０）抗体とＥＲＫ抗体とをそれぞれ準備し、常温で１時間インキュベーションした後、horseradish peroxidaseが付いている二次抗体を、常温で１時間インキュベーションした。その後、感光装備でタンパク質の発現を確認した（図１９Ａ）。ｐＥＲＫの発現量変化を定量するために、濃度計測（densitometry）を行い、ｐＥＲＫ及びＥＲＫの発現濃度を測定し、ｐＥＲＫの発現量をＥＲＫ発現量で正規化（normalize）した後、ビークルグループ対比で、トラメチニブ処理グループでの正規化されたｐＥＲＫ発現量を図１９Ｂに表示した。
【０２０３】
図１９に示されているように、ビークルグループと比較し、トラメチニブを０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇで投与したマウスの脳において、ｐＥＲＫタンパク質の量が顕著に減少しているということを確認した。
【０２０４】
該結果は、トラメチニブを経口投与したとき、トラメチニブが脳に移動し、ＭＥＫの活性を抑制した結果、ｐＥＲＫの量が減少したことを示し、それにより、神経細胞新生及び神経細胞保護の効果が示されたものであるということを示唆するものである。
【０２０５】
実験例１３：アルツハイマー病気モデルマウスにおけるベータアミロイド（Ａβ）の蓄積減少確認
アルツハイマー病気の最大病理学的特徴は、ベータアミロイドの蓄積であるので、トラメチニブが、ベータアミロイド蓄積を減少させる効果があるか否かということを確認した。実験例１２から得られた５ＸＦＡＤマウス脳の半球（hemisphere）の良好にすりつぶされア粉末を利用し、Ａβ（１−４０）とＡβ（１−４２）との量を、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）方法で確認した。次のように、ＥＬＩＳＡ kit（Invitrogen，ＭＡ、ｃａｔ＃．ＫＨＢ３４４２）を利用して実験を行った。まず、５Ｍ guanidine−ＨＣｌ溶液を入れ、ピペットでマウス脳の粉末を良好に懸濁し、１６，０００ｘｇ、４℃で遠心分離し、上澄み液を集めた。タンパク質の濃度を測定した後、３０〜５０μｇのタンパク質が１００μｌになるように、dilution バッファを入れて準備した。Ａβ（１−４０）抗体あるいはＡβ（１−４２）抗体を９６ウェルプレートにそれぞれ１００μｌずつ入れ、常温で２時間インキュベーションした後、溶液を除去し、４回洗浄用バッファで洗浄した。ＨＲＰが付いた二次抗体をそれぞれ１００μｌずつ入れ、常温で３０分間インキュベーションした。また、溶液を除去し、洗浄用バッファで４回洗浄した。その後、準備しておいたタンパク質を、１００μｌずつ各ウェルに入れ、暗いところで３０分間インキュベーションした後、stop溶液を１００μｌさらに添加して反応を止めた。その後、感光機械を利用し、４５０ｎｍで感光反応を測定した。吸光度数値を、基準濃度対比で換算し、測定された各タンパク質の濃度を計算した。タンパク質総量（３０〜５０μｇ）対比で、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）の量を計算し、またＡβ（１−４０）対比で、Ａβ（１−４２）の量を計算した。グループ当たり３匹での数値の平均値を求め、図２０に示した。図２０から分かるように、トラメチニブを処理したグループにおいて、ビークル処理グループより、Ａβ（１−４２）／Ａβ（１−４０）の量が小さくなるということを確認した。
【０２０６】
それは、トラメチニブが、アルツハイマー病動物モデルにおいて、ベータアミロイド量、特に、毒性が強いオリゴマーや凝集体を形成する傾向が強いＡβ（１−４２）の量を減らし、神経細胞を保護することができるということを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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