(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａ型インフルエンザウイルスの複数のグループ１及びグループ２サブタイプに対して保護する新規抗体の提供。【解決手段】Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある抗体及びその結合断片。該抗体又は結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプに対して結合し、及び／又は中和する能力がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、単離抗体又はその結合断片。
【請求項２】
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ；並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある、請求項１に記載の抗体又は結合断片。
【請求項３】
グループ１サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６及びＨ９並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７を中和する能力があるか；或いはグループ１サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ６並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７を中和する能力がある、請求項１又は２のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項４】
マイクロ中和アッセイにおいて、Ａ型インフルエンザウイルスの中和における抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの範囲内での５０％阻害濃度（ＩＣ５０μｇ／ｍｌ）として表される高い中和能力を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項５】
６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで６つのＣＤＲの前記セットが、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号４のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３、配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号２３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２、配列番号２５のＨＣＤＲ３、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、配列番号３５のＨＣＤＲ３、配列番号３８のＬＣＤＲ１、配列番号３９のＬＣＤＲ２及び配列番号４０のＬＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号４３のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２、配列番号４５のＨＣＤＲ３、配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２及び配列番号５０のＬＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号５３のＨＣＤＲ１、配列番号５４のＨＣＤＲ２、配列番号５５のＨＣＤＲ３、配列番号５８のＬＣＤＲ１、配列番号５９のＬＣＤＲ２及び配列番号６０のＬＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号６３のＨＣＤＲ１、配列番号６４のＨＣＤＲ２、配列番号６５のＨＣＤＲ３、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、配列番号７４のＨＣＤＲ２、配列番号７５のＨＣＤＲ３、配列番号７８のＬＣＤＲ１、配列番号７９のＬＣＤＲ２及び配列番号８０のＬＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号８３のＨＣＤＲ１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、配列番号８５のＨＣＤＲ３、配列番号８８のＬＣＤＲ１、配列番号８９のＬＣＤＲ２、配列番号９０のＬＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号９３のＨＣＤＲ１、配列番号９４のＨＣＤＲ２、配列番号９５のＨＣＤＲ３、配列番号９８のＬＣＤＲ１、配列番号９９のＬＣＤＲ２及び配列番号１００のＬＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号１０３のＨＣＤＲ１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、配列番号１０５のＨＣＤＲ３、配列番号１０８のＬＣＤＲ１、配列番号１０９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号１２３のＨＣＤＲ１、配列番号１２４のＨＣＤＲ２、配列番号１２５のＨＣＤＲ３、配列番号１２８のＬＣＤＲ１、配列番号１２９のＬＣＤＲ２及び配列番号１３０のＬＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１３３のＨＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣＤＲ２、配列番号１３５のＨＣＤＲ３、配列番号１３８のＬＣＤＲ１、配列番号１３９のＬＣＤＲ２及び配列番号１４０のＬＣＤＲ３；及び
（ｏ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、配列番号１４４のＨＣＤＲ２、配列番号１４５のＨＣＤＲ３、配列番号１４８のＬＣＤＲ１、配列番号１４９のＬＣＤＲ２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ３
（ｐ）１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｑ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４若しくは２５のアミノ酸置換を含む、（ａ）〜（ｐ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｒ）（ｉ）配列番号３に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は３つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は６つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号６に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換及び／若しくは１つの欠失を含むＬＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号７に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号８に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は１つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ３；
を含む、（ａ）〜（ｑ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｓ）（ｉ）Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＮ、Ｓ、又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基３５がＶ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＡがＷであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＢがＮである
ＨＣＤＲ１
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ残基５０がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５２ＡがＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＫ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＷであり、
Ｋａｂａｔ残基５７がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５８がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５９がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基６０がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基６１がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基６２がＥ、Ｖ又はｄであり、
Ｋａｂａｔ残基６３がＳ又はＦであり、
Ｋａｂａｔ残基６４がＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基６５がＫである
ＨＣＤＲ２
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔ残基９５がＳ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９６がＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９７がＨであり、
Ｋａｂａｔ残基９８がＩであり、
Ｋａｂａｔ残基９９がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基１００がＶ又はＥであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＦであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＧであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＮであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＶ又はＩであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＡであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＦ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基１０１がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１０２がＭ、Ｉ又はＶである
ＨＣＤＲ３
（ｉｖ）Ｋａｂａｔ残基２４がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２５がＴ、Ａ又は存在せず、
Ｋａｂａｔ残基２６がＳ又はＡであり、
Ｋａｂａｔ残基２７がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基２８がＳ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２９がＬであり、
Ｋａｂａｔ残基３０がＳ、Ｎ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＬ、Ｔ又はＤであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＨである
ＬＣＤＲ１
（ｖ）Ｋａｂａｔ残基５０がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＬ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＱ、Ｌ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＳである
ＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）Ｋａｂａｔ残基８９がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基９０がＱ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基９１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基９２がＲであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基９３がＴである
ＬＣＤＲ３
を含む、（ａ）〜（ｒ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項６】
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及び／又はＶＬに対して、少なくとも７５％の同一性を有するＶＨ及び／又は少なくとも７５％の同一性を有するＶＬを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項７】
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項８】
免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、及び二特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項９】
前記ＶＨがヒト生殖系列フレームワークＶＨ６−１を含み、前記ＶＬがヒト生殖系列フレームワークＶＫ１−３９を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片、及びその組み合わせ。
【請求項１０】
Ｆｃ領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１１】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４又はその断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１２】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片であって、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される１つ以上のグループ２サブタイプの中で保存されるエピトープに結合する、抗体又はその結合断片。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）に結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力があるＡ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片であって、ＨＡ２の保存されたストーク領域内に位置するエピトープに結合する、抗体又はその結合断片。
【請求項１４】
前記エピトープが、Ｈ３付番方式に従い、ＨＡ２の位置１８、１９、４２及び４５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項１２に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１５】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力があり、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体と同じエピトープに結合するか、又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合において競合する、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片。
【請求項１６】
配列番号１１２で示されるアミノ酸配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合において競合する、請求項１４に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片をコードする単離核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸又は請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片を作製するための方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を、前記抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞培養物から前記抗体又はその結合断片を単離するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片、２５ｍＭ  Ｈｉｓ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌをｐＨ６．０で含む組成物。
【請求項２４】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項２５】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬物の製造における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片の使用。
【請求項２６】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片の有効量を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、小分子抗ウイルス組成物と組み合わせて請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記小分子抗ウイルス組成物が、ノイラミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）阻害剤又はアダマンタンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記小分子抗ウイルス組成物が、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジン、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染のインビトロ診断における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスに対して広範な中和活性を有する抗体及びかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）は、毎年のインフルエンザ流行病や偶発的な世界的大流行を引き起こし、世界規模で公衆衛生に多大な脅威をもたらしている。季節性インフルエンザ感染は、毎年、特に幼児、易感染性患者及び高齢者における２００，０００〜５００，０００人の死亡に関連している。死亡率は、典型的には、パンデミックインフルエンザの大流行に伴い、季節を通じてさらに増加する。特に十分なサービスを受けていない集団においてインフルエンザ感染を予防し、治療するための強力な抗ウイルス薬を開発するという多くの満たされていない医学的需要が残っている。
【０００３】
インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）には３つの型、すなわちＡ型、Ｂ型及びＣ型が存在する。Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒト、ブタ、ニワトリ及びフェレットを含む、多種多様な鳥類及び哺乳類に感染し得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、表面糖タンパク質のヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする２つの遺伝子の抗原領域内の対立遺伝子バリエーションに基づいてサブタイプに分類され得る。ＨＡは、受容体結合性の膜融合糖タンパク質であり、ウイルスの標的細胞への付着及び侵入を媒介し、またＨＡは、保護的液性免疫応答の主要な標的である。ＨＡタンパク質は、構造が三量体をなし、単一のポリペプチド前駆体ＨＡ０の３つの同一コピーから構成され、タンパク質分解成熟時、球状頭部（ＨＡ１）及びストーク領域（ＨＡ２）を有するｐＨ依存性の準安定な中間体に切断される。膜遠位「球状頭部」は、ＨＡ１構造の大部分を構成し、ウイルス侵入におけるシアル酸結合ポケット及び主要な抗原ドメインを有する。ＨＡ２及び一部のＨＡ１残基から構築される膜近位「ストーク」構造は、融合機構を有し、後期エンドソームの低ｐＨ環境下で立体構造変化を受け、膜融合及び細胞への侵入を誘発する。Ａ型インフルエンザサブタイプ間での配列相同性の程度は、ＨＡ１内（サブタイプ間の相同性が３４％〜５９％）ではＨＡ２領域内（相同性が５１％〜８０％）と比べてより小さい。インフルエンザウイルス感染によって誘発される中和抗体は通常、ウイルス受容体結合を阻止するように可変ＨＡ１の球状頭部に標的化され、また通常、株に特異的である。まれに、ＨＡの球状頭部を標的にする広範な交差反応性モノクローナル抗体が同定されている（Ｋｒａｕｓｅ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５；Ｗｈｉｔｔｌｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＰＮＡＳ  １０８；Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９；Ｌｅｅ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＮＡＳ１０９）。それに対し、ストーク領域の構造は、比較的保存されており、ウイルス侵入におけるｐＨ誘発性融合ステップを阻止するようにＨＡストークに結合する、一握りの広域中和抗体が近年同定されている（Ｅｋｉｅｒｔ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４；Ｓｕｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６；Ｗｒａｍｍｅｒｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８；Ｅｋｉｅｒｔ  Ｄ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３；Ｃｏｒｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０；Ｔｈｒｏｓｂｙ  Ｍ  ２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３）。これらのストーク反応性の中和抗体の大部分は、Ａ型インフルエンザグループ１ウイルスに特異的であるか又はグループ２ウイルスに特異的であるかのいずれかである。直近では、グループ１及び２ウイルスの双方に対して交差反応性を示す、ストークに結合する抗体が単離された（Ｃｏｒｔｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３；Ｌｉ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＮＡＳ  １０９及びＣｙｒｉｌｌｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７；Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｒａｕｓｅ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｔｌｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＰＮＡＳ  １０８
【非特許文献３】Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＮＡＳ１０９
【非特許文献５】Ｅｋｉｅｒｔ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４
【非特許文献６】Ｓｕｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６
【非特許文献７】Ｗｒａｍｍｅｒｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８
【非特許文献８】Ｅｋｉｅｒｔ  Ｄ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３
【非特許文献９】Ｃｏｒｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０
【非特許文献１０】Ｔｈｒｏｓｂｙ  Ｍ  ２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３
【非特許文献１１】Ｃｏｒｔｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３
【非特許文献１２】Ｌｉ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＮＡＳ  １０９
【非特許文献１３】Ｃｙｒｉｌｌｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７
【非特許文献１４】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在まで、すべてのＡ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和又は阻害するか或いはＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を減弱させる、市場化された抗体は皆無である。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のグループ１及びグループ２サブタイプに対して保護する新規抗体に対する需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片を提供する。
【０００７】
好ましくは、本発明の抗体又は結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ及び少なくとも１、２、３、４、５、又は６つのＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある。さらに好ましくは、本発明の抗体又は結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつ少なくとも５つのＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つ又は２つのＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある。
【０００８】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンサブタイプは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７を含むグループ１、並びにサブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５を含むグループ２として同定された２つの主要な系統発生学的分類に分かれる。一実施形態では、本発明に記載の抗体又は結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプに対して結合し、及び／又は中和する能力がある。別の実施形態では、本発明に記載の抗体又は結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７、並びにＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５に対して結合し、及び／又は中和する能力がある。別の実施形態では、抗体又は結合断片は、グループ１サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、及びＨ９、並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７に対して結合し、及び／又は中和する能力がある。さらなる実施形態では、抗体又は結合断片は、グループ１サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ６、並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７に対して結合し、及び／又は中和する能力がある。
【０００９】
本発明は、天然に存在するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の、出発物質として個別のドナーから採取されたＩｇＧメモリーＢ細胞からの単離に基づく。本明細書に記載されるように、最適化を用いて、改善された特性を有する抗体変異体が作成された。最適化された抗体変異体は、天然に存在せず、それらは組換え技術を用いて作成される。本発明の抗体又はその断片は、ＨＡのストーク領域に結合し、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１及びグループ２のサブタイプから各々選択される２つ以上のサブタイプの感染を中和する。本発明の抗体は、抗Ａ型インフルエンザＨＡストーク結合抗体であり、Ａ型インフルエンザウイルスに対して、公表された文献に由来する抗体（国際公開第２０１３／０１１３４７Ａ１号パンフレットに記載の抗体ＦＩ６ｖ４）及び実施例５の表６に示される抗体と比べて、わずかに広範囲の又はより優れた中和活性を示した。加えて、本発明の抗体は、実施例６の図１に示されるように、ＨＡ成熟を遮断する場合に、他の１つ若しくは複数のｍＡｂよりも有効であり得る。
【００１０】
一部の実施形態では、抗体又はその結合断片は、６つのＣＤＲのセットを含み、ここで６つのＣＤＲのセットは、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号４のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３、配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号２３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２、配列番号２５のＨＣＤＲ３、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、配列番号３５のＨＣＤＲ３、配列番号３８のＬＣＤＲ１、配列番号３９のＬＣＤＲ２及び配列番号４０のＬＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号４３のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２、配列番号４５のＨＣＤＲ３、配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２及び配列番号５０のＬＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号５３のＨＣＤＲ１、配列番号５４のＨＣＤＲ２、配列番号５５のＨＣＤＲ３、配列番号５８のＬＣＤＲ１、配列番号５９のＬＣＤＲ２及び配列番号６０のＬＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号６３のＨＣＤＲ１、配列番号６４のＨＣＤＲ２、配列番号６５のＨＣＤＲ３、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、配列番号７４のＨＣＤＲ２、配列番号７５のＨＣＤＲ３、配列番号７８のＬＣＤＲ１、配列番号７９のＬＣＤＲ２及び配列番号８０のＬＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号８３のＨＣＤＲ１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、配列番号８５のＨＣＤＲ３、配列番号８８のＬＣＤＲ１、配列番号８９のＬＣＤＲ２、配列番号９０のＬＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号９３のＨＣＤＲ１、配列番号９４のＨＣＤＲ２、配列番号９５のＨＣＤＲ３、配列番号９８のＬＣＤＲ１、配列番号９９のＬＣＤＲ２及び配列番号１００のＬＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号１０３のＨＣＤＲ１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、配列番号１０５のＨＣＤＲ３、配列番号１０８のＬＣＤＲ１、配列番号１０９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号１２３のＨＣＤＲ１、配列番号１２４のＨＣＤＲ２、配列番号１２５のＨＣＤＲ３、配列番号１２８のＬＣＤＲ１、配列番号１２９のＬＣＤＲ２及び配列番号１３０のＬＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１３３のＨＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣＤＲ２、配列番号１３５のＨＣＤＲ３、配列番号１３８のＬＣＤＲ１、配列番号１３９のＬＣＤＲ２及び配列番号１４０のＬＣＤＲ３；及び
（ｏ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、配列番号１４４のＨＣＤＲ２、配列番号１４５のＨＣＤＲ３、配列番号１４８のＬＣＤＲ１、配列番号１４９のＬＣＤＲ２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ３；
（ｐ）１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｑ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４若しくは２５のアミノ酸置換を含む、（ａ）〜（ｐ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｒ）
（ｉ）配列番号３に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は３つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は６つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号６に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換及び／若しくは１つの欠失を含むＬＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号７に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号８に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は１つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ３；
を含む、（ａ）〜（ｑ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｓ）
（ｉ）
Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＮ、Ｓ、又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基３５がＶ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＡがＷであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＢがＮである
ＨＣＤＲ１
（ｉｉ）
Ｋａｂａｔ残基５０がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５２ＡがＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＫ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＷであり、
Ｋａｂａｔ残基５７がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５８がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５９がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基６０がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基６１がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基６２がＥ、Ｖ又はｄであり、
Ｋａｂａｔ残基６３がＳ又はＦであり、
Ｋａｂａｔ残基６４がＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基６５がＫである
ＨＣＤＲ２
（ｉｉｉ）
Ｋａｂａｔ残基９５がＳ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９６がＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９７がＨであり、
Ｋａｂａｔ残基９８がＩであり、
Ｋａｂａｔ残基９９がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基１００がＶ又はＥであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＦであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＧであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＮであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＶ又はＩであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＡであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＦ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基１０１がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１０２がＭ、Ｉ又はＶである
ＨＣＤＲ３
（ｉｖ）
Ｋａｂａｔ残基２４がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２５がＴ、Ａ又は存在せず、
Ｋａｂａｔ残基２６がＳ又はＡであり、
Ｋａｂａｔ残基２７がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基２８がＳ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２９がＬであり、
Ｋａｂａｔ残基３０がＳ、Ｎ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＬ、Ｔ又はＤであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＨである
ＬＣＤＲ１
（ｖ）
Ｋａｂａｔ残基５０がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＬ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＱ、Ｌ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＳである
ＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）
Ｋａｂａｔ残基８９がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基９０がＱ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基９１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基９２がＲであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基９３がＴである
ＬＣＤＲ３
を含む、（ａ）〜（ｒ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
からなる群から選択される。
【００１１】
本発明は、６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む抗体及びその結合断片を提供し、ここで６つのＣＤＲのセットは、表１１及び表１３に示される。
【００１２】
本発明の変異抗体配列は、本願中に挙げられる配列と７５％以上（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列同一性を共有し得る。一部の実施形態では、配列同一性は、参照配列（すなわち本願中に挙げられる配列）の完全長に対して計算される。一部のさらなる実施形態では、百分率同一性は、本明細書で言及されるとき、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって特定されたデフォルトパラメーター［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックス；ギャップオープンペナルティ＝Ｉ１及びギャップ延長ペナルティ＝１］を用いるＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて決定されたものである。
【００１３】
変異抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。従って、本願中で挙げられる配列の変異体もまた、本発明の範囲内に含まれる。改善された親和性及び／又は能力を有する抗体配列の変異体は、当該技術分野で公知の方法を用いて得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸置換を用いて、さらに改善された親和性を有する抗体を得ることができる。或いは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体を産生するための発現系における翻訳の効率を改善することができる。さらに、本発明の核酸配列のいずれかに対する定向進化法の適用による、抗体特異性又は中和活性について最適化された配列を含むポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００１４】
本発明は、
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及び／又はＶＬに対して、少なくとも７５％の同一性を有するＶＨ及び／又は少なくとも７５％の同一性を有するＶＬを含む、本発明に記載の抗体又はその結合断片を提供する。
【００１５】
本発明に記載の抗体又はその結合断片は、
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬを含んでもよい。
【００１６】
本発明に記載の抗体又はその結合断片は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）からなる群から選択してもよい。
【００１７】
本発明に記載の抗体又はその結合断片は、ヒト生殖系列フレームワークを含むＶＨ、好ましくはＶＨ６−１、及び／又はヒト生殖系列フレームワークを含むＶＬ、好ましくはＶＫ１−３９を含んでもよい。好ましくは、本発明に記載の抗体又はその結合断片は、ヒト生殖系列フレームワークＶＨ６−１を含むＶＨ及びヒト生殖系列フレームワークＶＫ１−３９を含むＶＬを含む。ＶＨ６フレームワークは、抗体において使用されることはまれである。
【００１８】
本発明に記載の抗体又はその結合断片は、Ｆｃ領域を含んでもよく、好ましくは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４又はその結合断片である。
【００１９】
一実施形態では、本発明の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ定常ドメインに対して１つ以上のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ定常ドメインを含む。本発明の抗体は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）アミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ定常ドメインを含んでもよく、ここでのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って付番される。
【００２０】
本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片であって、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合において上記の本発明の抗体と競合することを特徴とする、抗体又はその結合断片を提供する。従って、本発明は、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体又はその断片、又は結合において本発明の抗体と競合する抗体を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明に記載の抗体又はその断片をコードする単離核酸を提供する。好ましくは、核酸はｃＤＮＡである。本発明はまた、本発明の抗体の軽鎖及び重鎖並びにＣＤＲの一部又は全部をコードする核酸配列を含む。従って、本明細書で提供されるのは、本発明の例示的な抗体の軽鎖及び重鎖並びにＣＤＲの一部又は全部をコードする核酸配列である。本発明の例示的な抗体のＣＤＲ、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列に対する配列番号が提供される。遺伝コードの冗長性により、同一のアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異体が存在することになる。
【００２２】
本発明は、本発明に記載の単離核酸を含むベクターをさらに提供するが、好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。
【００２３】
加えて、本発明は、本発明に記載の単離核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞は、哺乳類細胞株、例えばＨＥＫ又はＣＨＯ細胞由来のものを含む。
【００２４】
さらに、本発明は、本発明の抗体又は断片を作製するための方法であって、本発明の宿主細胞を、抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
かかる方法は、さらに、抗体又はその断片を宿主細胞培養物から単離するステップと、場合により、単離抗体又は断片を組成物に配合するステップと、を含んでもよい。
【００２６】
本発明は、本発明に記載の抗体又はその断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物をさらに提供する。
【００２７】
また、本発明によって提供されるのは、本発明に記載の抗体又はその断片、約５．５〜約６．５の範囲内のｐＨ、好ましくは約６．０のｐＨでのヒスチジン及びＮａＣｌを含み；さらにより好ましくは、本発明に記載の抗体又はその断片、約５．５〜約６．５の範囲内のｐＨ、好ましくは約６．０のｐＨでの約２０〜約３０ｍＭのヒスチジン及び約０．１〜約０．２ＭのＮａＣｌを含み；最も好ましくは、約５．５〜約６．５の範囲内のｐＨ、例えば約６．０のｐＨでの２５ｍＭのＨｉｓ及び０．１５ＭのＮａＣｌを含む、組成物である。
【００２８】
さらに、本発明は、
−被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための本発明に記載の抗体又はその断片；
−被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療用の薬物の製造における本発明に記載の抗体又はその断片の使用；
−本発明に記載の抗体又はその断片の投与を含む、被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法；
−Ａ型インフルエンザウイルスの細胞内への侵入におけるｐＨ誘発性融合ステップを阻止するための本発明に記載の抗体又はその断片の使用；又は
−Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ成熟を阻害するための本発明に記載の抗体又はその断片の使用
を提供する。
【００２９】
本発明の例示的抗体は、限定はされないが、抗体３、抗体５、抗体６、抗体８、抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１３、抗体１４、及び抗体１５を含む。
【００３０】
本発明はまた、被験体におけるＡ型インフルエンザ感染のインビトロ診断における、本発明に記載の抗体又はその結合断片の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
導入
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ストークに結合し、かつ本明細書に記載されるＡ型インフルエンザウイルス感染のグループ１及びグループ２サブタイプを中和させる、ヒト型を含む抗体、並びに断片、誘導体／コンジュゲート及びそれらの組成物を提供し、ここで抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体は、本明細書中で本発明の抗体と称される。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「中和」は、抗体又はその結合断片の、感染病原体、例えばＡ型インフルエンザウイルスに結合し、かつ感染病原体の生物学的活性、例えば病原性を低減する能力を指す。中和のための最低限の要件は、抗体又はその結合断片の、感染病原体に結合する能力である。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。より特定の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストークタンパク質の少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。
【００３３】
抗体は、感染病原体、例えばＡ型インフルエンザウイルスの活性を、ウイルスの生活環の期間中の様々な時点で中和し得る。例えば、抗体は、ウイルスと１つ以上の細胞表面受容体との相互作用に干渉することにより、ウイルスの標的細胞への付着に干渉し得る。或いは、抗体は、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスによるウイルス内部移行に干渉することにより、ウイルスとその受容体との１つ以上の付着後の相互作用に干渉し得る。
【００３４】
一実施形態では、抗体又はその結合断片は、融合過程に干渉することにより、例えばウイルスとエンドソーム膜との融合に干渉することにより、Ａ型インフルエンザの活性を中和する。別の実施形態では、抗体又はその結合断片は、プロテアーゼ媒介性のＨＡ０の切断に干渉し、ひいてはウイルス成熟及びＨＡ２ウイルス融合ペプチドの形成に干渉する。例えば、一実施形態では、抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスの活性化に必要とされるプロテアーゼ媒介性ＨＡ０切断に干渉する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、免疫グロブリンとしても知られる「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望される生物学的活性を呈する抗体断片（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、及び上記のいずれかのエピトープ−結合断片を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子、を含む。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ又はｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、又はｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２又は３））であってもよい。
【００３６】
ヒト抗体は通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は１つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖に連結される一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内のジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それにいくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の１番目の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づきλ鎖又はκ鎖のいずれかに分類される。κ軽鎖の可変ドメインはまた、本明細書中でＶＫとして表され得る。
【００３７】
本発明の抗体は、完全長抗体又はインタクトな抗体、抗原結合断片を含む抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト抗体、ヒト化抗体、翻訳後修飾抗体、キメラ又は融合抗体、イムノコンジュゲート、及びそれらの機能断片を含む。抗体は、Ｆｃ領域内を修飾することで、所望されるエフェクター機能又は血清半減期を供することができる。下記のセクション内でより詳細に考察されるように、適切なＦｃ領域とともに、細胞表面上に結合されたネイキッド抗体は、例えば抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）における補体を動員することにより、又はＡ型インフルエンザウイルスＨＡストーク上の結合された抗体を認識する１つ以上のエフェクターリガンドを発現し、その後に抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）における細胞の食作用を引き起こす非特異的細胞毒性細胞を動員することにより、細胞毒性、又はいくつかの他の機構を誘発し得る。或いは、副作用又は治療合併症を最小化するようにエフェクター機能を排除又は低減することが望ましい場合、特定の他のＦｃ領域を使用してもよい。本発明の抗体のＦｃ領域は、修飾により、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増強し、ひいては血清半減期を増加させ得る。或いは、Ｆｃ領域は、ＰＥＧ又はアルブミンにコンジュゲートすることで血清半減期が増加し得、又はいくつかの他のコンジュゲーションにより所望される効果がもたらされる。
【００３８】
本抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体は、哺乳類におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を診断し、予防し、治療し、及び／又は軽減するのに有用である。
【００３９】
本発明は、本発明の抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体及び担体を含む組成物を提供する。Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防又は治療することを意図して、組成物をかかる治療を必要とする患者に投与することができる。本発明はまた、本発明の抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体及び担体を含む製剤を提供する。一実施形態では、製剤は、薬学的に許容できる担体を含む治療製剤である。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、哺乳類におけるＡ型インフルエンザ感染を予防又は治療するのに有用な方法であって、治療有効量の抗体を哺乳類に投与するステップを含む、方法を提供する。抗体治療組成物は、医師の指示に従って、短期間に（急性的に）、慢性的に、又は間欠的に投与することができる。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明はまた、少なくとも抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体を含む製品（ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）、例えば滅菌剤形及びキットを提供する。キットは、Ａ型インフルエンザウイルスのインビトロでの検出及び定量のため、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、抗体を含むように提供することができる。検出にとって有用なかかる抗体には、蛍光又は放射標識などの標識を提供してもよい。
【００４２】
用語
本発明を詳細に記載する前に、この発明が具体的な組成物又は方法ステップに限定されるものでなく、したがって変わり得ることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００４３】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、この発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００４４】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される、その一般に公知の３文字記号又は１文字記号のいすれかによって指すことができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められた１文字コードによって指すことができる。
【００４５】
抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸の付番は、別段の指示がない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に示されるＫａｂａｔ定義に従う。この付番システムを用いて、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応する、より少ないか又は追加的なアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後への単一のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体については、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列とが相同な領域での整列によって判定してもよい。フレームワーク残基の最大の整列は、Ｆｖ領域において使用されるべきである付番システムにおける「スペーサー」残基の挿入が必要である場合が多い。さらに、任意の所与のＫａｂａｔ部位番号での特定の個別の残基の同一性は、種間又は対立遺伝子の相違により、抗体鎖ごとに変化し得る。
【００４６】
抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体
特定の実施形態では、抗体は、単離及び／又は精製された抗体及び／又はパイロジェンフリーの抗体である。用語「精製された」は、本明細書で使用されるとき、その天然環境の構成成分から同定され、分離され、及び／又は回収されている他の分子、例えばポリペプチド、核酸分子を指す。従って、一実施形態では、本発明の抗体は、その天然環境の１つ以上の構成成分から分離されている精製抗体である。用語「単離抗体」は、本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体分子から実質的に遊離された抗体を指す（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストークに特異的に結合する単離抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストークの抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体から実質的に遊離している）。従って、一実施形態では、本発明の抗体は、異なる特異性を有する抗体から分離されている単離抗体である。典型的には、単離抗体は、モノクローナル抗体である。さらに、本発明の単離抗体は、１つ以上の他の細胞物質及び／又は化学物質から実質的に遊離していてもよく、本明細書中で、単離され、精製された抗体を指す。本発明の一実施形態では、「単離」モノクローナル抗体の組み合わせは、異なる特異性を有し、かつ十分に規定された組成物中で組み合わされている抗体に関する。抗体の産生方法及び精製／単離方法は、以下により詳細に記載される。
【００４７】
本発明の単離抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコードされた本明細書に開示される抗体アミノ酸配列、又は任意の単離若しくは配合された抗体を含む。
【００４８】
本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡストークタンパク質に特異的な、少なくとも１つの特定のエピトープに免疫特異的に結合する。用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、抗体に結合する能力があるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖の側鎖など、分子の化学的活性表面群（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、また通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点から区別される。
【００４９】
一実施形態では、抗体又はその結合断片は、少なくともＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６若しくはＨ１７又はすべてのＡ型インフルエンザＨＡサブタイプの中で保存されるエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体又はその結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６から選択される１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、若しくは６つのグループ２サブタイプの中で保存されるエピトープに結合する。
【００５０】
一実施形態では、抗体又はその結合断片は、少なくとも１７のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６若しくはＨ１７又はすべてのＡ型インフルエンザサブタイプに、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、又は約０．０１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、又は約０．０１μｇ／ｍｌ〜約０．１μｇ／ｍｌ、又は約５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、若しくは０．０５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する。別の実施形態では、抗体又はその結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６から選択される１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、又は６つのグループ２サブタイプに、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、又は約０．０１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、又は約０．０１μｇ／ｍｌ〜約０．１μｇ／ｍｌ、又は約５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、若しくは０．０５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する。
【００５１】
一実施形態では、抗体又はその結合断片は、線状エピトープ又は連続エピトープのいすれかのエピトープを認識する。別の実施形態では、抗体又はその結合断片は、非線状又は立体構造エピトープを認識する。一実施形態では、エピトープは、ＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内に位置する。より特定の実施形態では、抗体又は結合断片は、ＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内の立体構造エピトープに結合する。一実施形態では、エピトープは、接触残基として、ＨＡ２のストーク領域内の位置１８、１９、４２、４５（位置は、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１２，７３７−７６１（１９９０）に記載のＨ３付番システムに従って付番される）から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。より特定の実施形態では、エピトープは、接触残基として、ＨＡ２のストーク領域内の１８、１９、４２及び４５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、接触残基として、ＨＡ２のストーク領域内のアミノ酸１８、１９、４２及び４５を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、接触残基として、ＨＡ２のストーク領域内のアミノ酸１８、１９、及び４２を含む。
【００５２】
本発明の抗体又はその結合断片によって認識される１つ若しくは複数のエピトープは、多数の用途を有し得る。例えば、精製又は合成形態のエピトープは、免疫応答を高める（すなわち、ワクチンとして、又は他の用途を意図して抗体を産生するため）か、又はエピトープと免疫反応する抗体について血清をスクリーニングするために、使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片によって認識されるエピトープ、又はかかるエピトープを有する抗原は、免疫応答を高めるためのワクチンとして使用してもよい。別の実施形態では、本発明の抗体及び結合断片を使用して、ワクチンの質を、例えばワクチン中の抗原が正しい立体構造中に正確な免疫原性エピトープを含むか否かを判定することにより、監視することができる。
【００５３】
可変領域
本明細書で使用されるとき、用語「親抗体」は、本明細書で定義される、変異体又は誘導体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体を指す。親ポリペプチドは、天然抗体配列（すなわち、天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、天然に存在するもの）又は天然に存在する配列の既存のアミノ酸配列修飾（他の挿入、欠失及び／又は置換など）を有する抗体配列を含み得る。親抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、親抗体の変異体である。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換の理由で、アミノ酸配列が「親」抗体アミノ酸配列と異なる抗体を指す。
【００５４】
抗体の抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を含む。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって実行され得ることは示されている。抗体の用語「抗原結合部分」の内部に包含される結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、つまりＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、つまりヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合し、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成するような単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結され得る。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」の範囲内に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、また断片は、有用性について、インタクトな抗体の場合と同様な方法でスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断により、産生することができる。
【００５５】
本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬドメインを含む、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、精製抗体は、表１に開示されるＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも１つに対して所与のパーセント同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む。本明細書で使用されるとき、用語「パーセント（％）配列同一性」（「相同性」も含む）は、最大のパーセント配列同一性を得るため、必要に応じて、配列を整列し、ギャップを導入した後の（ここでは配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮しない）、参照配列、例えば親抗体配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率と定義される。比較のための配列の最適な整列は、手作業に加えて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，２４４４の類似性探索方法によるか、又はこれらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）を用いるコンピュータープログラムによって、生成することができる。
【００５７】
本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＨアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有するか又は１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含んでもよい。抗体は、本明細書に記載されるＶＨアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか又は１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を有してもよい。
【００５８】
本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＬアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有するか又は１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含んでもよい。抗体は、本明細書に記載されるＶＬアミノ酸配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか又は１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を有してもよい。
【００５９】
本発明の範囲内に含まれる抗体は、本明細書に記載されるように、Ａ型インフルエンザウイルスの１つ以上のグループ１サブタイプ及び１つ以上のグループ２サブタイプを中和する能力がある。
【００６０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）が抗原結合領域を含む一方で、その可変性は、抗体の可変ドメインをわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖（ＶＬ又はＶＫ）及び重鎖（ＶＨ）可変ドメインの双方で相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される区間に集中している。可変ドメインのなかでより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主としてβシート構成をとる、３つのＣＤＲで接続された４つのＦＲを含み、ＣＤＲが形成するループがこのβシート構造を接続し、ある場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一体に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照のこと）。重鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３と命名され、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と命名される。Ｋａｂａｔ付番システムは、本明細書で使用される。このように、ＣＤＲ−Ｈ１は、大体アミノ酸３１（すなわち、１番目のシステイン残基の後から約９残基目）で始まり、約５〜７のアミノ酸を含み、かつ次のチロシン残基で終結する。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端の後から１５番目の残基で始まり、約１６〜１９のアミノ酸を含み、かつ次のアルギニン又はリジン残基で終結する。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の末端の後から約３３番目のアミノ酸残基で始まり、３〜２５のアミノ酸を含み、かつ配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＣＤＲ−Ｌ１は、大体残基２４（すなわち、システイン残基の後）で始まり、約１０〜１７の残基を含み、かつ次のチロシン残基で終結する。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端の後から約１６番目の残基で始まり、約７つの残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端の後から約３３番目の残基で始まり；約７〜１１の残基を含み、かつ配列Ｆ−Ｇ−Ｘ−Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＣＤＲが抗体と抗体の間でかなり異なる（また定義によると、Ｋａｂａｔ共通配列との相同性を呈することはない）ことに留意のこと。
【００６１】
本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じ配列内のアミノ酸を含む抗Ａ型インフルエンザＨＡストーク抗体を中和することを包含する。本明細書に記載される配列と実質的に同じアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、並びに例えば、抗体１１、抗体１２、抗体１３、抗体１４若しくは抗体１５のアミノ酸配列、又は配列番号１０２、１１２、１２２、１３２、若しくは１４２で示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失及び／又は挿入を含む配列を含む。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸の、第１のアミノ酸の場合と類似した化学的特性及び／又は物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸による置換を指す。保存的置換は、以下の基、すなわち、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴの中での、１つのアミノ酸のもう１つのアミノ酸による置換を含む。
【００６２】
フレームワーク領域
重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、可変ドメインの最も高度に保存された部分である４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を含む。重鎖の４つのＦＲは、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４と命名され、軽鎖の４つのＦＲは、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４と命名される。Ｋａｂａｔ付番システムは、本明細書中で使用され、表１、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、前掲を参照のこと。このように、ＦＲ−Ｈ１は、位置１で始まり、大体アミノ酸３０で終結し、ＦＲ−Ｈ２は、大体アミノ酸３６〜４９であり、ＦＲ−Ｈ３は大体アミノ酸６６〜９４であり、ＦＲ−Ｈ４は、大体アミノ酸１０３〜１１３である。ＦＲ−Ｌ１は、アミノ酸１で始まり、大体アミノ酸２３で終結し、ＦＲ−Ｌ２は、大体アミノ酸３５〜４９であり、ＦＲ−Ｌ３は、大体アミノ酸５７〜８８であり、ＦＲ−Ｌ４は、大体アミノ酸９８〜１０７である。特定の実施形態では、フレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う置換、例えば、ＦＲ−Ｌ１における１０６Ａでの挿入を含んでもよい。天然に存在する置換に加えて、ＦＲ残基の１つ以上の改変（例えば置換）はまた、本発明の抗体に、中和能を保持するという条件で導入してもよい。特定の実施形態では、これらは、抗体のＡ型インフルエンザウイルスＨＡストークに対する結合親和性において改善又は最適化をもたらす。修飾対象のフレームワーク領域の残基の例として、抗原に非共有結合的に直接結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの立体構造と相互作用又は作用するもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）が挙げられる。
【００６３】
別の実施形態では、ＦＲは、「ジャームライニング（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」を意図して１つ以上のアミノ酸変化を含んでもよい。例えば、選択された抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、生殖系列の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列と比較され、選択されたＶＬ及び／又はＶＨ鎖の特定のフレームワーク残基が、（例えばファージライブラリを調製するのに用いられる免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異の結果として）生殖系列の立体配置と異なる場合、生殖系列の立体配置に対して、選択された抗体の改変されたフレームワーク残基を「逆突然変異する」（すなわち、選択された抗体のフレームワークアミノ酸配列を、生殖系列のフレームワークアミノ酸配列と同じであるように改変する）ことが望ましい場合がある。フレームワーク残基のかかる「逆突然変異」（又は「ジャームライニング」）は、特異的突然変異の導入（例えば、部位特異的変異誘発；ＰＣＲ媒介性の突然変異誘発など）のための標準的な分子生物学的方法によって達成することができる。
【００６４】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列
上記のアミノ酸配列に加えて、本発明はまた、アミノ酸配列に対応しかつ本発明のヒト抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。これらは、限定はされないが、上で参照したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。従って、本発明はまた、本明細書に記載される抗体のＣＤＲ及びＦＲを含むＶＨ及びＶＬフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列、並びに細胞（例えば、哺乳類細胞）でのその効率的発現のための発現ベクターを提供する。ポリヌクレオチドを使用して抗体を作製する方法は、以下により詳細に説明される。
【００６５】
本発明はまた、例えば本明細書中で定義するとおりの、ストリンジェントな又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の下で、本明細書に記載される本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。用語「ストリンジェンシー」は、本明細書で使用されるとき、プローブとフィルタに結合した核酸との間の相同性の程度を表す、ハイブリダイゼーション実験の実験条件（例えば、温度及び塩濃度）を指し、ストリンジェンシーが高まると、プローブとフィルタに結合した核酸との間のパーセント相同性が高まる。
【００６６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定はされないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのフィルタに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中約５０〜６５℃での１回以上の洗浄、高度にストリンジェントな条件、例えば６×ＳＳＣ中約４５℃でのフィルタに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、続く０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中約６５℃での１回以上の洗浄、又は当業者に公知の任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹの６．３．１〜６．３．６頁及び２．１０．３頁を参照のこと）が挙げられる。
【００６７】
実質的に同一な配列は、多形配列、すなわち、集団内の代替配列又は対立遺伝子であってもよい。対立遺伝子の差異は、１つの塩基対と同程度に小さくてもよい。実質的に同一な配列はまた、サイレント突然変異を含む配列を含む、変異誘発された配列を含んでもよい。突然変異は、１つ以上の残基の変化、１つ以上の残基の欠失、又は１つ以上のさらなる残基の挿入を含んでもよい。
【００６８】
当該技術分野で公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得て、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築してもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載のとおり）、それはつまり、抗体をコードする配列の一部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、同オリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、及びそれに続くＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【００６９】
抗体をコードするポリヌクレオチドはまた、好適な供給源由来の核酸から作成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するか、或いは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は、抗体を発現する任意の組織若しくは細胞、例えば抗体を発現するために選択されるハイブリドーマ細胞から作成されるｃＤＮＡライブラリ、又はそれから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、又は特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングし、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを同定することにより、入手してもよい。次に、ＰＣＲによって生成される増幅核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００７０】
抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技法を参照のこと）を用いて操作し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成し、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせることができる。
【００７１】
結合特性
上記のように、本発明の抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストークのタンパク質、ペプチド、サブユニット、断片、部分又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に、他のポリペプチドに関して排他的又は優先的のいずれかで、免疫特異的に結合する。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、本明細書で使用されるとき、抗体に結合する能力があるタンパク質決定基を指し、本明細書中の用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。これらのタンパク質決定基又はエピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、また通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の荷電特性を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープ（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）は、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが後者では失われないという点で区別される。用語「不連続エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの分かれた領域から形成される、タンパク質抗原上の立体構造エピトープを指す。
【００７２】
抗原と抗体の間の相互作用は、他の非共有結合的なタンパク質−タンパク質相互作用の場合と同じである。一般に、４種の結合相互作用、すなわち、（ｉ）水素結合、（ｉｉ）分散力、（ｉｉｉ）ルイス酸とルイス塩基の間の静電力、及び（ｉｖ）疎水性相互作用が、抗原と抗体の間に存在する。疎水性相互作用は、抗体−抗原相互作用における主な駆動力であり、また分子間引力ではなく非極性基による水の反発に基づくものである（Ｔａｎｆｏｒｄ，１９７８）。しかし、特定の物理的力はまた、抗原−抗体結合、例えば異なる抗体結合部位を有するエピトープ形状のフィット又は優遇（ｆｉｔ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）に寄与する。さらに、他の材料及び抗原は、抗体と交差反応し、それによって利用可能な遊離抗体と競合し得る。
【００７３】
抗原と抗体の間の結合の親和性定数及び特異性の測定は、本発明の抗体を用いての予防、治療、診断及び研究方法の有効性を判定する際に重要な要素である。「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有相互作用を合計した力を指す。特に指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹとの親和性は、一般に、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される平衡解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照のこと。親和性は、当該技術分野で公知の一般的方法、例えば本明細書に説明及び例示の方法により、測定することができる。動力学的特性化のための市販システムの例として、機器のＯＣＴＥＴ（登録商標）ファミリーが挙げられる。低親和性抗体は、一般に抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向があり、他方で、高親和性抗体は、一般に抗原により迅速に結合し、結合状態をより長く維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は、当該技術分野で公知であり、それらのいくつかは、本発明を目的として用いることができる。
【００７４】
結合親和性の決定については、実施例セクション中にさらに説明される特定の技法、及び当該技術分野で周知の方法を用いて測定することができる。１つのかかる方法は、非標識抗原の滴定系列の存在下で、（１２５Ｉ）標識抗原の最低濃度で、Ｆａｂを平衡化し、次に抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートと結合された抗原を捕獲することにより、Ｆａｂの抗原に対する溶液の結合親和性を測定する以下のアッセイに記載のとおりの、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により、解離定数「Ｋｄ」を測定することを含む（Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１）。アッセイ用の条件を確立するため、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）が、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（Ｈ９．６）中、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、その後、室温（摂氏約２３度）で、ＰＢＳ中、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間ブロッキングされる。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）内で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原が、（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９中の、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）目的のＦａｂの連続希釈物と混合される。次に、目的のＦａｂは一晩インキュベートされるが、インキュベーションは、平衡に達することを保証するため、より長い期間（例えば６５時間）継続する場合がある。その後、混合物は、室温（例えば１時間）でのインキュベーションのため、捕獲プレートに移される。次に、溶液は除去され、プレートはＰＢＳ中、０．１％ツイーン２０で８回洗浄される。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートは、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数される。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度は、競合的結合アッセイでの使用のために選択される。
【００７５】
別の例では、Ｋｄ値は、摂氏２５度で固定化抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で用いるＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いることにより、測定してもよい。つまり、カルボキシメチル化したデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）は、供給業者の使用説明書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、５μｌ／分の流速での注射前、１１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２ｕＭ）に希釈され、約１０応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質が得られる。抗原の注射後、エタノールアミンが筋肉内注射され、未反応基が遮断される。動力学測定のため、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が、約２５μｌ／分の流速で、摂氏２５度の０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳに注射される。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて算出される。
【００７６】
上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより、オン速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、次にオン速度は、分光計、例えばストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又はスターレッドキュベット（ｓｔｉｒ  ｒｅｄ  ｃｕｖｅｔｔｅ）を備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定されるように、漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の摂氏２５度での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍの帯域）の増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を用いることにより、測定することができる。本発明に従う「オン速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた、上記のようにＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いる上記と同じ表面プラズモン共鳴技術を用いて測定することができる。
【００７７】
本発明の抗体、又はその改変／変異誘導体（ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（下記に考察）の結合特性の判定に適した方法及び試薬は、当該技術分野で公知であり、及び／又は市販されている（米国特許第６，８４９，４２５号明細書；同第６，６３２，９２６号明細書；同第６，２９４，３９１号明細書；同第６，１４３，５７４号明細書）。さらに、かかる動力学分析のために設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａ１００、及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器；Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００７８】
一実施形態では、本発明の抗体（その結合断片又は変異体を含む）はまた、そのＡ型インフルエンザウイルスポリペプチドに対する結合親和性の観点から説明又は特定され得る。典型的には、高い親和性を有する抗体は、１０−７Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態では、抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド、又はその断片又は変異体に、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ又は１０−１５Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。Ａ型インフルエンザポリペプチドは、ＨＡポリペプチドを含むことができる。より特定の実施形態では、抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド、又はその断片又は変異体に、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ又は１０−１２Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザポリペプチドに、個別の列挙された値のいずれかの間の範囲内に含まれる解離定数すなわちＫｄで結合する抗体を包含する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１又は１０−３秒−１、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、又は１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１又は１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋｏｆｆ）で結合する。より特定の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、又は１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１又は１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋｏｆｆ）で結合する。本発明はまた、Ａ型インフルエンザポリペプチドに、個別の列挙された値のいずれかの間の範囲内に含まれるオフ速度（ｋｏｆｆ）で結合する抗体を包含する。
【００８０】
別の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、５×１０４Ｍ−１秒−１、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、１０７Ｍ−１秒−１、又は５×１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋｏｎ）で結合する。より特定の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、１０７Ｍ−１秒−１又は５×１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋｏｎ）で結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザポリペプチドに、個別の列挙された値のいずれかの間の範囲内に含まれるオン速度（ｋｏｎ）で結合する抗体を包含する。
【００８１】
一実施形態では、結合アッセイは、直接結合アッセイとして又は競合結合アッセイとしてのいずれかで行ってもよい。結合は、標準ＥＬＩＳＡ又は標準フローサイトメトリーアッセイを用いて検出することができる。直接結合アッセイでは、候補抗体は、その同種抗原への結合について試験される。他方、競合結合アッセイでは、候補抗体がＡ型インフルエンザウイルスＨＡストークに結合する公知の抗体又は他の化合物と競合する能力が評価される。一般に、抗体と検出可能なＡ型インフルエンザウイルスＨＡストークとの結合を可能にする任意の方法は、抗体の結合特性を検出し、測定することを意図した本発明の範囲内に包含される。当業者は、これらの周知の方法を理解することになり、この理由から、同方法は本明細書で詳細に提供されない。これらの方法はまた、１群の抗体に対して、所望される特性を提供するものについてスクリーニングするために利用される。
【００８２】
本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡストークに免疫特異的に結合し、かつＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。中和アッセイは、本明細書の実施例の項にて記載されるように、又は当該技術分野で公知の他の方法を用いて実施してもよい。用語「阻害濃度５０％」（「ＩＣ５０」として略記）は、Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和に要求される阻害剤（例えば本発明の抗体）の濃度を表す。当業者は、より低いＩＣ５０値がより強力な阻害剤に対応することを理解するであろう。
【００８３】
一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその結合断片は、マイクロ中和アッセイでのＡ型インフルエンザウイルスの中和における、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ〜約０．１μｇ／ｍｌの範囲内での５０％阻害濃度（ＩＣ５０μｇ／ｍｌ）として表される中和能力を有する。本明細書に記載されるマイクロ中和アッセイにおいて使用される抗体の最高濃度は、５０μｇ／ｍｌであった。本発明の抗体の高い能力は、抗体のより低い濃度を用いて、Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和を達成できることを意味する。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、細胞死を誘導しうる。「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を生育不能に至らしめるものである。細胞死は、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下でインビトロで測定し、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を区別することができる。従って、細胞死用のアッセイは、熱不活化血清を用いて（すなわち補体の不在下で）かつ免疫エフェクター細胞の不在下で実施してもよい。抗体が細胞死を誘導することができるか否かを判定するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１（１９９５）を参照のこと）、７ＡＡＤの取り込み又は当該技術分野で周知の方法によって評価される膜完全性の欠損は、未処理細胞と比べて評価することができる。
【００８５】
具体的な実施形態では、本発明の抗体は、アポトーシスを介して細胞死を誘導し得る。「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は（アポトーシス体と呼ばれる）膜小胞の形成によって判定されるプログラム細胞死を誘導するものである。アポトーシスに関連した細胞事象を評価するための様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座は、アネキシンの結合によって測定可能であり、ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダリングを通じて評価可能であり、またＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞での任意の増加によって評価可能である。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比べて約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、また最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導をもたらすものである。
【００８６】
別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を介して細胞死を誘導し得る。ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現は、一般に、抗体のＦｃ領域の、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞又は活性化マクロファージなどのエフェクター細胞の表面上に存在する抗体に対する受容体（以降「ＦｃγＲ」と称される）への結合を含む。様々な補体成分が結合され得る。その結合に関しては、抗体のヒンジ領域内の数個のアミノ酸残基及びＣ領域の２番目のドメイン（以降「Ｃγ２ドメイン」と称される）が重要であり（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１０９８（１９９３）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））、Ｃγ２ドメイン内の糖鎖（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））もまた重要であることが示唆されている。
【００８７】
目的の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するため、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号明細書に記載のものを用いることができる。アッセイはまた、市販のキット、例えばＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施してもよい。かかるアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、限定はされないが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫ細胞株が挙げられる。トランスジェニックＦｃ受容体（例えばＣＤ１６）及びそれに関連するシグナル伝達ポリペプチド（例えば、ＦＣεＲＩ−γ）を発現するＮＫ細胞株もまた、エフェクター細胞として役立ち得る（国際公開第２００６／０２３１４８号パンフレット）。例えば、任意の特定の抗体が補体活性化及び／又はＡＤＣＣによって溶解を媒介する能力については、アッセイ可能である。目的の細胞は、インビトロで生育され、標識され；抗体は、抗原抗体複合体によって活性化され得る免疫細胞、すなわち、ＡＤＣＣ応答に関与するエフェクター細胞と組み合わせて細胞培養物に添加される。抗体はまた、補体活性化について試験することができる。いずれの場合においても、細胞溶解は、溶解細胞からの標識の放出によって検出される。細胞溶解の程度はまた、細胞質タンパク質（例えばＬＤＨ）の上清への放出を検出することによって判定することができる。事実、抗体は、補体及び／又は免疫細胞の供給源として患者自身の血清を用いてスクリーニングすることができる。次いで、インビトロ試験においてヒトＡＤＣＣを媒介する能力がある抗体は、その特定の患者において治療的に用いることができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性はまた、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）で開示されたものなどの動物モデルで評価してもよい。さらに、抗体のＡＤＣＣ、場合により、ＣＤＣ活性のレベルを調節する（すなわち増加又は低下させる）ための技法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；米国特許第６，１９４，５５１号明細書；米国特許第７，３１７，０９１号明細書）。本発明の抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを誘発する能力があるか又はその能力を有するように修飾されている場合がある。ＡＤＣＣ機能を判定するためのアッセイは、ヒトエフェクター細胞を用いて実行し、ヒトＡＤＣＣ機能を評価することができる。かかるアッセイはまた、ネクローシス及び／又はアポトーシス機構により、細胞死を誘発し、媒介し、増強し、遮断する抗体をスクリーニングすることが意図されたものを含んでもよい。実行可能な色素を利用するアッセイ、カスパーゼを検出し、分析する方法、及びＤＮＡ切断を測定するアッセイを含むかかる方法を用いて、目的の抗体とともにインビトロで培養された細胞のアポトーシス活性を評価することができる。
【００８８】
抗体の産生
以下は、本発明において有用な抗体の産生のための例示的技術を説明する。
【００８９】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせを含めた、当該技術分野において公知の幅広い技術を用いて調製することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体又は単離抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個別の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤と対照的に、各モノクローナル抗体が抗原上の同じ決定基を標的とする。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の抗体による汚染なしに合成され得る点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。以下はモノクローナル抗体の代表的な産生方法の説明であり（この説明は限定することを意図するものではない）、例えばモノクローナル哺乳類抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン、ダイアボディ、ワクチボディ、線状抗体及び多重特異性抗体の産生に用いることができる。
【００９０】
ハイブリドーマ技法
ハイブリドーマ技術を用いた特異的抗体の産生及びスクリーニング方法は、当該技術分野においてルーチンであり、周知されている。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫して、免疫化に用いた抗原に特異的に結合し得る抗体を産生する又はその産生能を有するリンパ球を誘導する。或いは、インビトロでリンパ球を免疫してもよい。免疫後、リンパ球を単離し、次に好適な融剤又は融合パートナー、例えばポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞株と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。特定の実施形態では、選択される骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高度な抗体産生を支持し、且つ融合しなかった親細胞を選択外にする選択培地に対して感受性を有するものである。一態様において、骨髄腫細胞株はマウス骨髄腫株、例えば、ソーク研究所細胞頒布センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ），Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、並びにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２及び誘導体、例えばＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００９１】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、クローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準方法により成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、前掲）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば細胞をマウスに腹腔内注射することにより、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。
【００９２】
サブクローンにより選択されたモノクローナル抗体は、好適には、従来の抗体精製手順、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧセファロース）又はイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティータグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等によって培養培地、腹水、又は血清と分離される。例示的な精製方法を以下にさらに詳細に記載する。
【００９３】
組換えＤＮＡ技法
組換えＤＮＡ技術を用いた特異的抗体の産生及びスクリーニング方法は、当該技術分野においてルーチンであり、周知されている（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び／又は配列決定することができる。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次にその発現ベクターが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの、本来抗体タンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関するレビュー論文としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。ファージディスプレイにより作成される抗体及び抗体のヒト化について以下に記載するとおり、組換え抗体用のＤＮＡ又は遺伝物質をハイブリドーマ以外の１つ又は複数の供給源から入手して、本発明の抗体を作成することができる。
【００９４】
抗体又はその変異体の組換え発現には、概して、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。従って本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体若しくはその一部分の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖若しくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号明細書；同第５，５９１，６３９号明細書；同第５，６５８，７５９号明細書及び同第５，１２２，４６４号明細書を参照のこと）、抗体の可変ドメインが、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖全体の双方の発現用のかかるベクターにクローニングされてもよい。
【００９５】
従来技術によって発現ベクターが宿主細胞に移入されると、次にトランスフェクト細胞が従来技術によって培養され、抗体が産生される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体又はその断片、又はその重鎖又は軽鎖、又はその一部分、又は本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体を発現させる特定の実施形態では、以下に詳述するとおり、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターを、免疫グロブリン分子全体の発現用の宿主細胞で同時に発現させてもよい。
【００９６】
組換え抗体の発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において周知されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、及び数多くの他の細胞株が挙げられる。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾について特徴的で特異的な機構を有する。発現させた抗体又はその一部分の正しい修飾及びプロセシングが確実となるように、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。このため、適切な一次転写物のプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。かかる哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ヒーラー、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる機能性免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。ヒトリンパ球を不死化することにより開発されたヒト細胞株を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，オランダ）を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。
【００９７】
組換え抗体の発現用宿主として用いられ得るさらなる細胞株としては、限定はされないが、昆虫細胞（例えばＳｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）又は酵母細胞（例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書；他）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）；及びニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）が挙げられる。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の安定発現を呈する細胞株で発現させる。安定発現は、組換えタンパク質の長期高収率産生に用いることができる。例えば、抗体分子を安定発現する細胞株を作成してもよい。宿主細胞を、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と、選択可能なマーカー遺伝子とを含む適切に操作されたベクターで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、細胞を１〜２日間強化培地で成長させてもよく、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーが選択に対する耐性を付与し、プラスミドをその染色体に安定的に組み込んだ細胞の成長及びフォーカスの形成を可能にすることで、次にはそのフォーカスをクローニングし、細胞株へと拡大することができる。安定細胞株を高収率で作製する方法は当該技術分野において周知されており、概して試薬が市販されている。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の一過性発現を呈する細胞株で発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入された核酸が当該細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込まれないプロセスである。それは実際、染色体外要素、例えばエピソームとして細胞に維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされるタンパク質が産生される。
【０１００】
細胞株は、安定的にトランスフェクトされるものも、或いは一過性にトランスフェクトされるものも、モノクローナル抗体の発現及び産生をもたらす当該技術分野において公知の細胞培養培地及び条件に維持される。特定の実施形態では、哺乳類細胞培養培地は、例えばＤＭＥＭ又はＨａｍ  Ｆ１２を含む市販の培地製剤をベースとする。他の実施形態では、細胞培養培地は、細胞成長及び生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように修飾される。本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養培地」、「培養培地」、及び「培地製剤」は、多細胞生物又は組織の外部の人工インビトロ環境で細胞を維持し、成長させ、増殖させ、又は拡大するための栄養溶液を指す。細胞培養培地は、例えば、細胞の成長を促進するように配合された細胞培養成長培地、又は組換えタンパク質産生を促進するように配合された細胞培養産生培地を含め、特定の細胞培養用途に最適化され得る。用語の栄養素、成分、及び構成成分は、本明細書では、細胞培養培地を構成する構成物を指して同義的に使用される。
【０１０１】
一実施形態では、細胞株は流加法を用いて維持される。本明細書で使用されるとき、「流加法」は、初めに基礎培地でインキュベートされた後、流加細胞培養物にさらなる栄養素が供給される方法を指す。例えば、流加法は、所与の時間内に所定の補給スケジュールに従い補足培地を添加することを含み得る。従って、「流加細胞培養物」は、細胞、典型的には哺乳類細胞、及び培養培地が培養槽に最初に供給され、且つ培養終了前の定期的な細胞及び／又は産物の回収を伴い、又は伴わずさらなる培養栄養素が培養中に培養物に対して連続的に、又は不連続に徐々に補給される細胞培養物を指す。
【０１０２】
使用される細胞培養培地及びそこに含まれる栄養素は、当業者に周知されている。一実施形態では、細胞培養培地は、基礎培地と、少なくとも１つの加水分解物、例えば、大豆ベースの加水分解物、酵母ベースの加水分解物、又はこれらの２種類の加水分解物の組み合わせとを含むことで、変法基礎培地をもたらす。別の実施形態では、さらなる栄養素は、濃縮基礎培地など、基礎培地のみを含んでもよく、又は加水分解物、若しくは濃縮加水分解物のみを含んでもよい。好適な基礎培地としては、限定はされないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ  ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）又はＣＨＯ細胞用タンパク質不含ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられる。本発明において用いられ得る基礎培地の他の例としては、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅａｇｌｅ，Ｈ（１９６５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９，３６もまた参照のこと）；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８，３９６；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２，１８５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：２，９３もまた参照のこと）；ＣＭＲＬ  １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）；Ｐａｒｋｅｒ  Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９５７）Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５，３０３もまた参照のこと）が挙げられる。
【０１０３】
基礎培地は無血清、つまり培地は血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、又は当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないか、又は動物性タンパク質不含培地又は化学限定培地であってもよい。
【０１０４】
基礎培地は、様々な無機及び有機緩衝剤、１つ又は複数の界面活性剤、及び塩化ナトリウムなどの、標準的な基礎培地に見られる特定の非栄養成分を除去するため、修飾され得る。基礎細胞培地からかかる構成成分を除去することにより、残りの栄養成分の濃度を高めることができ、細胞成長及びタンパク質発現が全体的に向上し得る。加えて、取り除いた構成成分を、細胞培養条件の要件に応じて、変法基礎細胞培地を含有する細胞培養培地に加え戻してもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地は、変法基礎細胞培地と、以下の栄養素、すなわち、鉄源、組換え成長因子；緩衝剤；界面活性剤；容量オスモル濃度調節因子；エネルギー源；及び非動物性加水分解物の少なくとも１つとを含有する。加えて、変法基礎細胞培地は、場合により、アミノ酸、ビタミン、又はアミノ酸とビタミンとの両方の組み合わせを含有し得る。別の実施形態では、変法基礎培地は、グルタミン、例えば、Ｌ−グルタミン、及び／又はメトトレキサートをさらに含有する。
【０１０５】
抗体産生は、当該技術分野において公知の流加、バッチ、潅流又は連続供給バイオリアクター法を用いるバイオリアクタープロセスによって大量に行われ得る。大規模バイオリアクターは少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。このようなバイオリアクターは撹拌機インペラを使用して酸素及び栄養素を分配し得る。小規模バイオリアクターは、概して容積が約１００リットル以下の細胞培養を指し、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る。或いは、単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）が、大規模培養又は小規模培養のいずれにも用いられ得る。
【０１０６】
温度、ｐＨ、撹拌、曝気及び接種密度は、使用する宿主細胞及び発現させる組換えタンパク質に応じて異なり得る。例えば、組換えタンパク質細胞培養物は、摂氏３０〜４５℃の温度に維持され得る。培養培地のｐＨは、培養プロセスの間、ｐＨが至適レベルに保たれるように監視されてもよく、至適レベルは、ある種の宿主細胞に対して６．０〜８．０のｐＨ範囲内であり得る。かかる培養方法での撹拌には、インペラ駆動による混合が用いられ得る。インペラの回転速度は約５０〜２００ｃｍ／秒の先端速度であってよく、しかしながら培養される宿主細胞の種類に応じて、当該技術分野で公知の他のエアリフト又は他の混合／曝気システムが用いられてもよい。十分な曝気を提供することにより、ここでもやはり培養される特定の宿主細胞に応じて、培養物中約２０％〜８０％空気飽和の溶存酸素濃度が維持される。或いは、バイオリアクターにより空気又は酸素を培養培地中に直接拡散させてもよい。中空糸膜曝気装置を用いる無気泡曝気システムを含め、他の酸素供給方法が存在する。
【０１０７】
ファージディスプレイ技法
モノクローナル抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を用いて作成される抗体ファージライブラリから単離することができる。かかる方法では、抗体は、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製される組換えコンビナトリアル抗体ライブラリ、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリのスクリーニングによって単離することができる。かかるライブラリの調製及びスクリーニング方法は、当該技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリ作成用の市販のキットに加えて（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）、抗体ディスプレイライブラリの作成及びスクリーニングに特に適している方法及び試薬の例を、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書；米国特許第６，５４５，１４２号明細書；同第６，２９１，１５８号明細書；同第６，２９１，１５９号明細書；同第６，２９１，１６０号明細書；同第６，２９１，１６１号明細書；同第６，６８０，１９２号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第６，１７２，１９７号明細書；同第６，８０６，０７９号明細書；同第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第７，１９５，８６６号明細書に見出すことができる。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の産生及び単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に代わる実行可能な手法である。
【０１０８】
ファージディスプレイ方法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示される。詳細な実施形態において、かかるファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒト又はマウスのもの）から発現する抗原結合ドメインを提示することができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを抗原により、例えば標識された抗原又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉されている抗原を使用して、選択又は同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現するｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。
【０１０９】
上記の参考文献に記載されるとおり、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを用いてヒト抗体、ヒト化抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を作成し、例えば以下に詳細に記載されるとおり、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片の組換え産生技法もまた、国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されるものなどの、当該技術分野において公知の方法を用いて採用することができる。
【０１１０】
単鎖Ｆｖ及び抗体の産生に用いることのできる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２５８，４９８号明細書に記載されるものが挙げられる。従って、上記に記載される技法及び当該技術分野において公知の技法を用いて、組換え抗体を作成することができ、ここで結合ドメイン、例えばＳｃＦｖは、ファージディスプレイライブラリから単離された。
【０１１１】
抗体の精製及び単離
組換え発現又はハイブリドーマ発現による産生後、抗体分子は、当該技術分野において公知の免疫グロブリン分子を精製する任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原プロテインＡ又はプロテインＧに対する親和性によるもの、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度の差によるか、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法により精製され得る。さらに、本発明の抗体又はその断片は、精製を促進することが知られる異種ポリペプチド配列（本明細書において「タグ」と称される）に融合されてもよい。
【０１１２】
組換え技術を用いるとき、抗体は細胞内に産生されるか、細胞膜周辺腔に産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程として、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかである粒子状デブリが、例えば遠心又は限外ろ過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体の単離手順を記載している。抗体が培地中に分泌される場合、概して、初めにかかる発現系からの上清が、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮される。前述の工程のいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性汚染物の成長を防止してもよい。
【０１１３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを、単独で、或いは他の精製工程との組み合わせで用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存し、当業者は理解するであろう。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。コントロールド・ポア・グラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るより高い流量及びより短い処理時間を実現する。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が有用である。他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収する抗体に応じて利用可能である。
【０１１４】
任意の予備的精製工程の後、目的の抗体及び汚染物を含む混合物を、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用する、且つ低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。
【０１１５】
従って、特定の実施形態では、実質的に精製／単離された本発明の抗体が提供される。一実施形態では、このような単離／精製された組換え発現抗体を患者に投与してもよく、それにより予防又は治療効果が媒介され得る。予防は、疾患、障害又は感染の発生を予防するために設計され、使用される薬物適用又は治療である。治療は、特定の疾患、障害又は感染の治療と特に関係している。治療量は、特定の疾患、障害又は感染を治療するのに必要とされる量である。別の実施形態では、これらの単離／精製抗体を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス感染を診断してもよい。
【０１１６】
ヒト抗体
ヒト抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いて作成することができる。ヒト抗体は、マウス又はラット可変及び／又は定常領域を有する抗体に付随する問題の一部を回避する。かかるマウス又はラット由来のタンパク質が存在すると、抗体の急速なクリアランスが引き起こされ得るか、又は患者による抗体に対する免疫応答の発生が引き起こされ得る。
【０１１７】
ヒト抗体は、インビトロ方法によって得ることもできる。好適な例としては、限定はされないが、ファージディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ）、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ））、酵母ディスプレイなどが挙げられる。ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照のこと）を用いることにより、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体又は抗体断片を作製することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子がＭ１３又はｆｄなどの繊維状バクテリオファージの主要な或いはマイナーなコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として提示される。この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能特性に基づき選択すると、またそれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することになる。従って、ファージはＢ細胞のいくらかの特性を模倣する。ファージディスプレイは様々なフォーマットで実施することができ、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）にレビューされている。いくつかのＶ遺伝子セグメント供給源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。本質的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に従い、非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、及び抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書もまた参照のこと。
【０１１８】
上記に考察したとおり、ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により作成してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照のこと）。
【０１１９】
免疫グロブリン遺伝子は、可変領域におけるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント間の組換え、アイソタイプスイッチング、及び超突然変異を含め、免疫応答が成熟する間に様々な修飾を受ける。組換え及び体細胞超突然変異は抗体多様性及び親和性成熟を生じる基礎であるが、それらはまた配列ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）も生じ得るために、かかる免疫グロブリンの治療剤としての商業生産は困難となり、又は抗体の免疫原性リスクが増加し得る。一般に、ＣＤＲ領域における突然変異は親和性及び機能の向上に寄与するものと思われる一方、フレームワーク領域における突然変異は免疫原性リスクを増加させ得る。このリスクは、抗体の活性が悪影響を受けないことを確実にしながら、フレームワーク突然変異を生殖系列に復帰させることによって低減できる。多様化プロセスにより何らかの構造的ライアビリティが生じることもあり、又はそのような構造的ライアビリティが、重鎖及び軽鎖可変ドメインに寄与する生殖系列配列内に存在することもある。供給源にかかわらず、不安定性、凝集、産物の不均一性、又は免疫原性の増加をもたらし得る潜在的な構造的ライアビリティは除去することが所望され得る。望ましくないライアビリティの例としては、不対のシステイン（これはジスルフィド結合のスクランブリング、又は可変のスルフヒドリル付加物の形成を引き起こし得る）、Ｎ−結合型グリコシル化部位（構造及び活性の不均一性をもたらす）、並びにアミド分解（例えばＮＧ、ＮＳ）、異性化（ＤＧ）、酸化（露出したメチオニン）、及び加水分解（ＤＰ）部位が挙げられる。
【０１２０】
従って、免疫原性リスクを低減し、且つ薬学的特性を向上させるため、フレームワーク配列を生殖系列に復帰させ、ＣＤＲを生殖系列に復帰させ、及び／又は構造的ライアビリティを除去することが所望され得る。
【０１２１】
従って、一実施形態では、特定の抗体がその各々の生殖系列配列とアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列は、生殖系列配列に逆突然変異され得る。かかる修正的な突然変異は、標準的な分子生物学的技法を用いて、１つ、２つ、３つ若しくはそれより多くの位置で、又は突然変異した位置のいずれかの組み合わせにおいて発生し得る。
【０１２２】
抗体断片
特定の実施形態では、本抗体は、抗体断片又はそれらの断片を含む抗体である。抗体断片は、完全長抗体のうち、概してその抗原結合領域又は可変領域である一部分を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片が含まれる。ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書）及び一本鎖抗体分子である。
【０１２３】
伝統的には、これらの断片は、当該技術分野において公知の技法を用いたインタクトな抗体のタンパク質消化によって得られた。しかしながら、現在これらの断片は、組換え宿主細胞が直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞型で発現させて、そこから分泌させることができるため、これらの断片は大量産生が容易に可能である。一実施形態では、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的にカップリングすることにより、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を産生する他の技術が、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択される抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、抗体はＦａｂ断片でない。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する唯一の種である；従ってこれらは、インビボで使用する間の非特異的結合を低減するのに好適である。ｓｃＦｖのアミノ端又はカルボキシ端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合が生じるようにｓｃＦｖ融合タンパク質を構築してもよい。
【０１２４】
特定の実施形態では、本抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖可変（ＶＨ）又は軽鎖可変（ＶＬ）領域に対応する抗体の小さい機能的結合単位を含む抗体である。ドメイン抗体の例としては、限定はされないが、Ｄｏｍａｎｔｉｓのものが挙げられる（例えば、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット；国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット；国際公開第０４／００３０１９号パンフレット；国際公開第０３／００２６０９号パンフレット；米国特許第６，２９１，１５８号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，６９６，２４５号明細書；及び同第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと）。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態では、本抗体は、線状抗体である。線状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照のこと。
【０１２６】
他のアミノ酸配列修飾
上述のヒト抗体、ヒト化抗体及び／又はキメラ抗体に加えて、本発明はまた、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又は可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び／又はＦｃ領域における１つ以上のアミノ酸残基及び／又はポリペプチド置換、付加及び／又は欠失、及び翻訳後修飾を含む本発明の抗体のさらなる修飾体、並びにその変異体及びその断片も包含する。これらの修飾体には、抗体がある部分に共有結合している抗体コンジュゲートが含まれる。抗体との結合に好適な部分としては、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、薬物、標識、及び細胞毒素が挙げられる。このような抗体に対する変化は、Ａ型インフルエンザ感染症の治療及び／又は診断に適切であるように抗体の（生化学的な、結合上の及び／又は機能的な）特性を改変し、又は微調整するために加えられ得る。コンジュゲートを形成し、アミノ酸及び／又はポリペプチド変化並びに翻訳後修飾を加える方法は、当該技術分野において公知であり、その一部を以下に詳述する。
【０１２７】
抗体に対するアミノ酸変化は、必然的に、上記に同定される抗体配列又は親抗体配列と１００％未満の同一性の配列をもたらす。特定の実施形態では、これに関連して抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と約２５％〜約９５％の配列同一性を有し得る。従って、一実施形態では修飾抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、改変抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、改変抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４のアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、改変抗体は、抗体の可変領域の１つ以上に導入された１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失及び／又は付加）により作成される。別の実施形態では、アミノ酸改変はフレームワーク領域に導入される。フレームワーク領域残基の１つ以上を改変すると、抗原に対する抗体の結合親和性の向上がもたらされ得る。これは特に、フレームワーク領域がＣＤＲ領域と異なる種から形成され得るヒト化抗体にそのような変化が加えられるときに該当し得る。修飾するフレームワーク領域残基の例には、抗原を直接非共有結合的に結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲのコンホメーションと相互作用する／それを生じさせるもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））；及び／又はＶＬ−ＶＨ接合部に関与するもの（米国特許第５，２２５，５３９号明細書及び同第６，５４８，６４０号明細書）が含まれる。一実施形態では、約１〜約５個のフレームワーク残基が改変され得る。ときにこれは、超可変領域残基が一つも改変されていない場合であっても、前臨床試験での使用に好適な抗体変異体を得るのに十分であり得る。しかしながら、通常は、改変抗体は１つ又は複数のさらなる超可変領域改変を含み得る。
【０１２９】
改変抗体の一つの有用な作成手順は、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。この方法では、超可変領域残基の１つ以上がアラニン又はポリアラニン残基に置換されることにより、標的抗原とのアミノ酸の相互作用が改変される。次に、置換に対して機能的感受性を示すそれらの１つ又は複数の超可変領域残基が、置換部位に、又は置換部位用の追加的な又は他の突然変異を導入することによって精緻化される。従って、アミノ酸配列変異の導入部位は予め決めておかれるが、突然変異の性質それ自体を予め決めておく必要はない。このように産生されたＡｌａ突然変異体は、本明細書に記載されるとおりのその生物活性についてスクリーニングされる。
【０１３０】
特定の実施形態において置換変異体には、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することが関わる。概して、さらなる展開用に選択される得られた１つ又は複数の変異体は、それが作成される元になった親抗体と比べて生物学的特性が向上したものであり得る。かかる置換変異体を作成するための好都合な方法には、ファージディスプレイを使用した親和性成熟が関わる（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（４５）：１０８３２−１０８３７（１９９１））。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を突然変異させることにより、各部位にあらゆる可能なアミノ酸置換が作成される。このように作成された抗体突然変異体が、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価の形で提示される。次に、ファージが提示する突然変異体が、本明細書に開示されるとおりその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１３１】
抗体配列の突然変異には、置換、欠失（内部欠失を含む）、付加（融合タンパク質を生じる付加を含む）、又はアミノ酸配列内の及び／又はそれに隣接したアミノ酸残基の、但し変化が機能的に等価な抗体を生じる点で「サイレント」な変化をもたらす保存的置換が含まれ得る。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質の類似性を基準として作製されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられ；及び負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。加えて、グリシン及びプロリンは、鎖配向に影響を及ぼすことのできる残基である。非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを伴い得る。さらに、必要であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を置換又は付加として抗体配列に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、共通アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸ｓ、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般にアミノ酸類似体が挙げられる。
【０１３２】
別の実施形態では、抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、概してセリンと置換されてよく、それにより分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止し得る。逆に、１つ又は複数のシステイン結合を抗体に加えることで、その安定性を向上させてもよい（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１３３】
変異Ｆｃ領域
Ｆｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸置換及び／又は付加及び／又は欠失）は、抗体のエフェクター機能を増強又は減退させ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第６，５３８，１２４号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５３８，１２４号明細書；国際公開第０３／０７４６７９号パンフレット；国際公開第０４／０２９２０７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレット；国際公開第９９／５８５７２号パンフレット；米国特許出願公開第２００６／０１３４１０５号明細書；同第２００４／０１３２１０１号明細書；同第２００６／０００８８８３号明細書を参照）、及び抗体の薬物動態特性（例えば半減期）を改変し得る（米国特許第６，２７７，３７５号明細書及び同第７，０８３，７８４号明細書を参照）ことが知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の抗体は、改変されたＦｃ領域（本明細書では「変異Ｆｃ領域」とも称される）を含み、ここでは抗体の機能特性及び／又は薬物動態特性を変化させるため、Ｆｃ領域に１つ以上の改変が加えられている。かかる改変は、ＩｇＧに関して、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）又はＦｃγＲ結合、及び抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）の減少又は増加をもたらし得る。本発明は、エフェクター機能を増強するか又は減退させるかの微調整により所望のエフェクター機能が提供されるように変化を生じさせた変異Ｆｃ領域を有する本明細書に記載される抗体を包含する。従って、本発明の抗体は、変異Ｆｃ領域（すなわち、以下で考察するとおり改変されているＦｃ領域）を含む。変異Ｆｃ領域を含む本発明の抗体はまた、本明細書では「Ｆｃ変異抗体」とも称される。本明細書で使用されるとき、天然とは、修飾されていない親配列を指し、天然Ｆｃ領域を含む抗体は、本明細書では「天然Ｆｃ抗体」と称される。Ｆｃ変異抗体は、当業者に周知されている数多くの方法で作成することができる。非限定的な例としては、抗体コード領域を（例えばハイブリドーマから）単離し、その単離した抗体コード領域のＦｃ領域に１つ以上の所望の置換を作製することが挙げられる。或いは、抗体の抗原結合部分（例えば可変領域）を、変異Ｆｃ領域をコードするベクターにサブクローニングしてもよい。一実施形態では、変異Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較したとき同程度のエフェクター機能の誘導レベルを呈する。別の実施形態では、変異Ｆｃ領域は、天然Ｆｃと比較したときより高いエフェクター機能の誘導を呈する。変異Ｆｃ領域のいくつかの具体的な実施形態を以下に詳述する。エフェクター機能の計測方法は、当該技術分野において周知されている。
【０１３４】
抗体のエフェクター機能は、限定はされないが、アミノ酸置換、アミノ酸付加、アミノ酸欠失及びＦｃアミノ酸に対する翻訳後修飾（例えばグリコシル化）の変化を含め、Ｆｃ領域を変化させることにより修飾される。以下に記載される方法を用いることにより、本抗体のエフェクター機能、所望の特性を有する治療用抗体をもたらす、ＦｃＲに対するＦｃ領域の結合特性（例えば、親和性と特異性）の比率を微調整し得る。
【０１３５】
本明細書で使用されるとおりのＦｃ領域には、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドが含まれることが理解される。従ってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関しては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧに関しては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）、及びＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含み得る。Ｆｃ領域の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６又はＰ２３０からそのカルボキシル端を含むように定義され、ここで付番は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスに基づく。Ｆｃは、単離におけるこの領域を指してもよく、又は抗体、抗体断片、若しくはＦｃ融合タンパク質の文脈におけるこの領域を指してもよい。限定はされないが、ＥＵインデックスにより付番するときの２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位、及び３５８位を含む複数の異なるＦｃ位置で多型が観察されており、従って提示される配列と先行技術の配列との間には、僅かな違いが存在し得る。
【０１３６】
一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は天然Ｆｃ抗体と比較したとき、限定はされないが、ＦｃＲｎ、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、及びＦｃγＲＩＣを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２、アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＣを含む）；及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢを含む）を含め、１つ以上のＦｃ受容体に対して改変された結合親和性を呈する。
【０１３７】
一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて１つ以上のＦｃリガンドに対する結合が増強されている。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００〜２００倍高い又は低いＦｃリガンドに対する親和性の増加又は減少を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃリガンドに対する親和性を呈する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃリガンドに対する親和性が増加している。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃリガンドに対する親和性が低下している。
【０１３８】
具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対して増強された結合性を有する。別の具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対して増強された結合性を有する。さらに具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの双方に対して増強された結合性を有する。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対して増強された結合性を有するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比較したとき、ＦｃγＲＩＩＢ受容体との結合性の付随する増加を有しない。具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対して低下した結合性を有する。さらに具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対して低下した結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対して増強された結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べてＣ１ｑに対して改変された結合性を有する。
【０１３９】
一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００〜２００倍高い又は低いＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を呈する。
【０１４０】
一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍高い又は低いＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を呈する。
【０１４１】
一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増加又は低下したＣ１ｑに対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍高い又は低いＣ１ｑ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＣ１ｑに対する親和性を呈する。さらに別の具体的な実施形態において、Ｃｉｑに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対して増強された結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、Ｃ１ｑに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べてＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された結合性を有する。
【０１４２】
当該技術分野においてまとめて抗体エフェクター機能として知られる複数のプロセスを介して攻撃及び破壊を誘導する能力が抗体にあることは、当該技術分野において公知である。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」として知られるこれらのプロセスの一つは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保持細胞に特異的に結合させ、続いて細胞を細胞毒で死滅させることを可能にする細胞傷害性の一形態を指す。細胞の表面を指向する特異的高親和性ＩｇＧ抗体が細胞傷害性細胞を「装備」し、かかる死滅には必須である。細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞間接触が必要で、且つ相補体は関与しない。
【０１４３】
用語エフェクター機能に包含される別のプロセスは、補体依存性細胞傷害性（以下、「ＣＤＣ」と称する）であり、これは、補体系による細胞破壊の生化学的イベントを指す。補体系は、正常な血漿に認められるタンパク質の複合系であり、抗体と組み合わさって病原性細菌及び他の外来細胞を破壊する。
【０１４４】
用語エフェクター機能に包含されるさらに別のプロセスは、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）であり、これは、１つ以上のエフェクターリガンドを発現する非特異的細胞傷害性細胞が細胞上の結合した抗体を認識し、続いて細胞の食作用を生じる細胞媒介性反応を指す。
【０１４５】
Ｆｃ変異抗体は、１つ以上のＦｃγＲ媒介性エフェクター細胞機能を決定するためのインビトロ機能アッセイにより特徴付けられることが企図される。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、インビボモデル（本明細書に記載及び開示されるものなど）において、インビトロベースのアッセイの場合と同様の結合特性及びエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本発明は、インビトロベースのアッセイで所望の表現型を呈しないが、インビボで実に所望の表現型を呈するＦｃ変異抗体を除外しない。
【０１４６】
特定の実施形態では、Ｆｃ変異体を含む抗体は、天然Ｆｃ領域を含む抗体と比べて、細胞毒性又は食作用活性（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ）を増強している。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍高い細胞毒性又は食作用活性を有する。或いは、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、細胞毒性又は食作用活性を低下させている。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍低い細胞毒性又は食作用活性を有する。
【０１４７】
特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて低下したＡＤＣＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍低いＡＤＣＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低下したＡＤＣＣ活性を呈する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、検出不能なＡＤＣＣ活性を有する。具体的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性の低下及び／又は低減（ａｂｌａｔｅｍｅｎｔ）は、Ｆｃ変異抗体がＦｃリガンド及び／又は受容体に対して呈する低下した親和性に起因し得る。
【０１４８】
他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍高いＡＤＣＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％増強されたＡＤＣＣ活性を呈する。具体的な実施形態では、増強されたＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ変異抗体がＦｃリガンド及び／又は受容体に対して呈する増強された親和性に起因し得る。
【０１４９】
特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強し、かつＡＤＣＣ活性を増強している。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、増強されたＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期の双方を有する。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低下させ、かつＡＤＣＣ活性を低下させている。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、低下したＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期の双方を有する。
【０１５０】
特定の実施形態では、細胞毒性は、ＣＤＣによって媒介され、ここでＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、増強されるか又は低下したＣＤＣ活性のいずれかを有する。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の構成成分の、ある分子、例えば同種抗原と複合体を形成した抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３に記載のＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００〜２００倍高いＣＤＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％増強されたＣＤＣ活性を呈する。具体的な実施形態では、ＣＤＣ活性の増強は、Ｆｃ変異抗体がＣ１ｑに対して呈する増強された親和性に起因し得る。
【０１５２】
本発明の抗体は、抗体の主要な作用機構の一つであるＣＤＣを増強するＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のおかげで、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性を呈し得る。抗体のアイソタイプであるＩｇＧ３の一部分が、治療抗体における標準的アイソタイプであるＩｇＧ１の対応する領域内に導入される、アイソタイプキメラ（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ）と呼ばれる手法を用いて、ＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のいずれかの場合と比べてＣＤＣ活性を著しく増強し、他方でＩｇＧ１の所望される特徴、例えばＡＤＣＣ、ＰＫ特性及びプロテインＡ結合を保持する。さらに、ＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術はＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）技術と併用することができ、それにより、増強されたＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を伴うさらに優れた治療用Ｍａｂ（ＡＣＣＲＥＴＡＭＡＢ（登録商標））が創出される。
【０１５３】
本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。
【０１５４】
本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。
【０１５５】
本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性、増強されたＣＤＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。
【０１５６】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより、増加させることができる。用語「抗体半減期」は、本明細書で使用されるとき、抗体分子のその投与後の平均生存時間の尺度である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、例えば血清中（すなわち循環半減期）又は他の組織で計測するときに、既知量の免疫グロブリンの５０パーセントを患者の体内（又は他の哺乳類）又はその特定のコンパートメントから排出するのに必要な時間として表すことができる。半減期は免疫グロブリン毎又は免疫グロブリンのクラス毎に異なり得る。一般に、抗体半減期が増加すると、投与された抗体についての循環中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が増加する。
【０１５７】
半減期の増加により、患者に投与する薬物の量を低減するとともに投与頻度を低減することが可能になる。抗体の血清半減期を増加させるためには、例えば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるとおり、抗体（特に抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子の生体内血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１５８】
或いは、半減期が増加した本発明の抗体を、Ｆｃ受容体とＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると特定されたアミノ酸残基を修飾することにより作成してもよい（例えば、米国特許第６，８２１，５０５号明細書及び同第７，０８３，７８４号明細書；及び国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットを参照のこと）。加えて、本発明の抗体の半減期は、当該技術分野で広く利用されている技術によってＰＥＧ又はアルブミンとコンジュゲートすることにより増加させてもよい。一部の実施形態では、本発明のＦｃ変異領域を含む抗体は、天然Ｆｃ領域を含む抗体と比較したとき、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％又はそれ以上の半減期の増加を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ変異領域を含む抗体は、天然Ｆｃ領域を含む抗体と比較したとき、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍又はそれ以上、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜２５倍、又は１５倍〜５０倍の半減期の増加を有する。
【０１５９】
一実施形態では、本発明はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１、２２５、２２８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３０８、３１３、３１６、３１８、３２０、３２２、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４２８、４３３、４３４、４３５、４３６、４４０、及び４４３からなる群から選択される１つ以上の位置に修飾（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。場合により、Ｆｃ領域は、当業者に公知の追加的及び／又は代替的な位置に修飾を含み得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，０８３，７８４号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，２１７，７９７号明細書；同第７，２７６，５８５号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１４７３１１号明細書；同第２００４／０００２５８７号明細書；同第２００５／０２１５７６８号明細書；同第２００７／０１３５６２０号明細書；同第２００７／０２２４１８８号明細書；同第２００８／００８９８９２号明細書；国際公開第９４／２９３５１号パンフレット；及び国際公開第９９／５８５７２号パンフレットを参照のこと）。さらに、有用なアミノ酸位置及び特定の置換が、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２、及び表６〜表１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に提示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、図１２、及び図１５に提示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、図９及び図１０に提示される表、並びに国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８〜図１０、図１３及び図１４に提示される表に例示される。
【０１６０】
具体的な実施形態において、本開示はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１Ｋ、２２１Ｙ、２２５Ｅ、２２５Ｋ、２２５Ｗ、２２８Ｐ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４Ｉ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３７Ｌ、２３７Ｍ、２３７Ｐ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５０Ｅ、２５０Ｑ、２５１Ｆ、２５２Ｌ、２５２Ｙ、２５４Ｓ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｆ、２５６Ｍ、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３Ｉ、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４Ｉ、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ａ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６８Ｅ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２９６Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ａ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５Ｉ、３０８Ｆ、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３１８Ａ、３１８Ｓ、３２０Ａ、３２０Ｓ、３２２Ａ、３２２Ｓ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２６Ａ、３２６Ｄ、３２６Ｅ、３２６Ｇ、３２６Ｍ、３２６Ｖ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１Ｉ、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３３Ａ、３３３Ｄ、３３３Ｇ、３３３Ｑ、３３３Ｓ、３３３Ｖ、３３４Ａ、３３４Ｅ、３３４Ｈ、３３４Ｌ、３３４Ｍ、３３４Ｑ、３３４Ｖ、３３４Ｙ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、４３３Ｋ、４３３Ｌ、４３４Ａ、４２４Ｆ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｈ、４４０Ｙ及び４４３Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。場合により、Ｆｃ領域は、限定はされないが、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２、及び表６〜表１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に提示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、図１２、及び図１５に提示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、図９及び図１０に提示される表、並びに国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８、図９及び図１０に提示される表に例示されるものを含む当業者に公知の追加的及び／又は代替的なアミノ酸置換を含み得る。
【０１６１】
具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８、２３４、２３５及び３３１からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、及び３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの置換である。
【０１６２】
別の具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、且つＫａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８及び２３５からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾を含む。さらに別の具体的な実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３５Ｅ及び２３５Ｙからなる群から選択される。
【０１６３】
別の具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９、３３０及び３３２からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、及び３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換である。
【０１６４】
具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２、２５４、及び２５６からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換である。本発明の特に好ましい抗体では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの３つの置換２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（「ＹＴＥ」として公知）であり、米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照のこと。
【０１６５】
特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体により誘発されるエフェクター機能は、タンパク質のＦｃ領域に連結した炭水化物部分に強く依存する（Ｃｌａｕｄｉａ  Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９３：８５１−８６１）。従って、Ｆｃ領域のグリコシル化を、エフェクター機能が増加又は低下するように修飾することができる（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；同第６，９４６，２９２号明細書；同第７，０６４，１９１号明細書；同第７，２１４，７７５号明細書；同第７，３９３，６８３号明細書；同第７，４２５，４４６号明細書；同第７，５０４，２５６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；同第２００３／０００３０９７号明細書；同第２００９／００１０９２１号明細書；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス）を参照のこと）。従って、一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化によりエフェクター機能が低下する。別の実施形態では、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化によりエフェクター機能が増加する。具体的な実施形態において、Ｆｃ領域はフコシル化が低下している。別の実施形態では、Ｆｃ領域は非フコシル化型である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号明細書を参照のこと）。一態様において、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ））で作成されるとおりの、エフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加したこれらの抗体は、親細胞によって産生される抗体と比較して、１００倍超高いＡＤＣＣを有する高度に脱フコシル化した抗体を産生するように操作される（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１−９０８；Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：１５９１−７）。
【０１６６】
ＩｇＧ分子上のオリゴ糖類に対するシアル酸の付加は、その抗炎症活性を増進し、且つその細胞傷害性を改変し得る（Ｋｅｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１３：６７０−６７３；Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００７  Ｍａｒ；４４（７）：１５２４−３４）。上記に参照する研究は、シアリル化を増加させたＩｇＧ分子が抗炎症特性を有する一方、シアリル化を低減したＩｇＧ分子は免疫賦活特性が増加する（例えば、ＡＤＣＣ活性が増加する）ことを実証している。従って、抗体を、特定の治療適用に適切なシアリル化プロファイルで修飾することができる（米国特許出願公開第２００９／０００４１７９号明細書及び国際公開第２００７／００５７８６パンフレット）。
【０１６７】
一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して改変されたシアリル化プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して増加したシアリル化プロファイルを含む。別の実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して減少したシアリル化プロファイルを含む。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７−４０；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３−５６４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２６５７−２６６２；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：５３−５９；Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７−１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２：１１９８０−１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．４４：１１１−１１７；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ９：１１５−１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５４：１０１−１０４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：４９６３−４９６９；Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２６１３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４１７８−４１８４；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１９２５−１９３３；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００：１６−２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５７１−２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０：４８７−４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第５，６７７，４２５号明細書；同第６，１６５，７４５号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第５，８６９，０４６号明細書；同第６，１２１，０２２号明細書；同第５，６２４，８２１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５２８，６２４号明細書；同第６，１９４，５５１号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書；同第６，１８０，３７７号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書；及び国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに開示されるものなどの他の公知のＦｃ変異体と組み合わされてもよい。Ｆｃドメインの他の修飾及び／又は置換及び／又は付加及び／又は欠失が、当業者には容易に明らかであろう。
【０１６９】
グリコシル化
グリコシル化が抗体のエフェクター機能を改変する能力に加えて、可変領域の修飾されたグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を改変することができる。一実施形態では、本抗体の可変領域におけるグリコシル化パターンが修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、この抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性が増加するように改変することができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変して達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該の部位のグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を作製することができる。かかる非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。かかる手法は、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域に存在するグリコシル化部位（例えば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換もまた作製することができる。さらには、非グリコシル化抗体は、必須のグリコシル化機構を欠く細菌細胞において産生され得る。
【０１７０】
抗体コンジュゲート
特定の実施形態では、本発明の抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて物質とコンジュゲート又は共有結合される。一実施形態では、結合される物質は、治療剤、検出可能標識（本明細書ではレポーター分子とも称される）又は固体支持体である。抗体との結合に好適な物質としては、限定はされないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成高分子、高分子マイクロパーティクル、生体細胞、ウイルス、フルオロフォア、発色団、色素、毒素、ハプテン、酵素、抗体、抗体断片、放射性同位元素、固体マトリックス、半固体マトリックス及びそれらの組み合わせが挙げられる。別の物質を抗体にコンジュゲート又は共有結合する方法は、当該技術分野において公知である。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は固体支持体にコンジュゲートされる。抗体は、スクリーニング及び／又は精製及び／又は製造プロセスの一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。或いは本発明の抗体は、診断方法又は組成物の一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。本発明での使用に好適な固体支持体は、典型的には液相に対して実質的に不溶性である。多数の支持体が利用可能であり、当業者には周知されている。従って、固体支持体には、固体及び半固体マトリックス、例えばエーロゲル及びハイドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜被覆バイオチップを含む）、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも称される）、膜、導電性及び非導電性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）及び磁気支持体が含まれる。固体支持体のより具体的な例には、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖、例えばセファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが含まれる。
【０１７２】
一部の実施形態では、固体支持体は、限定はされないが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシド等を含めた、本発明の抗体を結合するための反応性官能基を含み得る。
【０１７３】
好適な固相支持体は、所望の最終用途及び様々な合成プロトコルの適合性を基準として選択することができる。例えば、本発明の抗体を固体支持体に結合するのにアミド結合形成が望ましい場合、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等から入手可能なＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，カナダから調達可能）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調達可能）、ポリエチレングリコールにグラフトされたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、又はＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調達可能）などの、概してペプチド合成に有用な樹脂が用いられ得る。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体及び／又はそれに関連したリガンドが検出可能である診断及び他のアッセイを目的として、標識にコンジュゲートされる。抗体にコンジュゲートされ、また本明細書に記載される本方法及び本組成物で使用される標識は、２８０ｎｍを超える波長で最大吸収を呈し、かつ抗体に共有結合的に結合されるときにそのスペクトル特性を保持する、任意の化学的部分（有機的又は無機的）である。標識としては、限定はされないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、りん光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられる。
【０１７５】
特定の実施形態では、抗体はフルオロフォアにコンジュゲートされる。このように、本発明の抗体を標識するのに用いられるフルオロフォアには、限定なしに；ピレン（米国特許第５，１３２，４３２号明細書に開示される対応する誘導体化合物のいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール又はベンズインドール、オキサゾール又はベンゾオキサゾール、チアゾール又はベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許第６，９７７，３０５号明細書及び同第６，９７４，８７３号明細書における任意の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７，２７５号明細書；米国特許第４，９８１，９７７号明細書；同第５，２６８，４８６号明細書；同第５，５６９，５８７号明細書；同第５，５６９，７６６号明細書；同第５，４８６，６１６号明細書；同第５，６２７，０２７号明細書；同第５，８０８，０４４号明細書；同第５，８７７，３１０号明細書；同第６，００２，００３号明細書；同第６，００４，５３６号明細書；同第６，００８，３７３号明細書；同第６，０４３，０２５号明細書；同第６，１２７，１３４号明細書；同第６，１３０，０９４号明細書；同第６，１３３，４４５号明細書；及び国際公開第０２／２６８９１号パンフレット、国際公開第９７／４０１０４号パンフレット、国際公開第９９／５１７０２号パンフレット、国際公開第０１／２１６２４号パンフレット；欧州特許出願公開第１  ０６５  ２５０  Ａ１号明細書における任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４，７７４，３３９号明細書；同第５，１８７，２８８号明細書；同第５，２４８，７８２号明細書；同第５，２７４，１１３号明細書；及び同第５，４３３，８９６号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号明細書；同第６，１３０，１０１号明細書；同第６，２２９，０５５号明細書；同第６，３３９，３９２号明細書；同第５，４５１，３４３号明細書；同第５，２２７，４８７号明細書；同第５，４４２，０４５号明細書；同第５，７９８，２７６号明細書；同第５，８４６，７３７号明細書；同第４，９４５，１７１；米国特許出願第０９／１２９，０１５号明細書及び同第０９／９２２，３３３号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）又はベンゾキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号明細書；同第５，４５９，２７６号明細書；同第５，５０１，９８０号明細書及び同第５，８３０，９１２号明細書に開示される対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号明細書及び同第４，８４９，３６２号明細書に開示される対応する化合物を含む）及びベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）及びこれらの誘導体が含まれる。本明細書で使用されるとき、オキサジンには、レゾルフィン（米国特許第５，２４２，８０５号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、及びこれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
【０１７６】
具体的な実施形態において、本明細書に記載される抗体にコンジュゲートされるフルオロフォアには、キサンテン（ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、ローダミン、フルオレセイン及びこれらの誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン及びボラポリアザインダセンが含まれる。他の実施形態では、かかるフルオロフォアは、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン及びスルホン化シアニンである。また、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ、ＣＹ（登録商標）Ｄｙｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、オレゴングリーン（ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ）（登録商標）、パシフィックブルー（ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ）（商標）、ＩＲＤＹＥ（登録商標）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、及びＲＯＸ（商標）の商標で販売され、且つそのように一般に知られている色素も含まれる。
【０１７７】
抗体に結合するフルオロフォアの選択が、コンジュゲート抗体の吸収及び蛍光発光特性を決定し得る。抗体及び抗体結合リガンドに用いることのできるフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定はされないが、スペクトル特性（吸収、発光及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光及び光退色速度、又はそれらの組み合わせが挙げられる。これらの物理的特性は全て、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するために用いることができ、従って多重化解析を可能にする。特定の実施形態では、フルオロフォアは４８０ｎｍより大きい波長に吸収極大を有する。他の実施形態では、フルオロフォアは、４８８ｎｍ〜５１４ｎｍ若しくはその近傍（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に特に好適）又は５４６ｎｍ近傍（水銀アークランプによる励起に特に好適）を吸収する。他の実施形態ではフルオロフォアは、組織又は全生物体適用にＮＩＲ（近赤外領域）で発光することができる。蛍光標識の他の望ましい特性としては、例えば抗体の標識が細胞又は生物体（例えば、生きている動物）で実施される場合に、細胞透過性及び低毒性を挙げることができる。
【０１７８】
特定の実施形態では、酵素が標識であり、本明細書に記載される抗体にコンジュゲートされる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅を達成することができ、アッセイ感度の増加がもたらされるため、望ましい標識である。酵素それ自体は検出可能な反応を生じないが、適切な基質を接触させると基質を分解する働きをし、それにより変換された基質が蛍光、比色又は発光シグナルを生じる。標識試薬の一つの酵素が複数の基質についての検出可能なシグナルへの変換をもたらし得るため、酵素は検出可能なシグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい計測可能な生成物、例えば比色、蛍光又は化学発光生成物が得られるように選択される。かかる基質は当該技術分野で広範に用いられており、当業者には周知されている。
【０１７９】
一実施形態では、比色基質又は蛍光発生基質及び酵素の組み合わせは、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼと、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの識別性のある色（それぞれ褐色及び赤色）を生じる基質とを使用する。検出可能な生成物を生じる他の比色オキシドレダクターゼ基質としては、限定はされないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられる。蛍光発生基質としては、限定はされないが、ホモバニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン及び還元型ベンゾチアジン、例えばＡｍｐｌｅｘ（登録商標）レッド試薬及びその変種（米国特許第４，３８４，０４２号明細書）及び還元型ジヒドロキサンテン、例えばジヒドロフルオレセイン（米国特許第６，１６２，９３１号明細書）及びジヒドロローダミン、例えばジヒドロローダミン１２３が挙げられる。チラミドであるペルオキシダーゼ基質（米国特許第５，１９６，３０６号明細書；同第５，５８３，００１号明細書及び同第５，７３１，１５８号明細書）は、酵素が作用する前に本質的に検出可能であり得るが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載される過程でペルオキシダーゼの作用によって「その場に固定」される点で、ペルオキシダーゼ基質のユニークなクラスに相当する。これらの基質は、細胞、組織又はアレイである試料中の抗原を、後に顕微鏡法、フローサイトメトリー、光学走査及び蛍光定量法によって検出するために標識するのに広範に利用されている。
【０１８０】
別の実施形態において、比色（及びある場合には蛍光発生）基質と酵素との組み合わせは、ホスファターゼ酵素、例えば酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ又はかかるホスファターゼの組換え型を、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、又はｏ−ニトロフェニルリン酸などの比色基質と組み合わせて、又は４−メチルウンベリフェリルリン酸、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号明細書）、フルオレセイン二リン酸、３−Ｏ−メチルフルオレセインリン酸、レゾルフィンリン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（ＤＤＡＯリン酸）、又はＥＬＦ  ９７、ＥＬＦ  ３９若しくは関連するリン酸（米国特許第５，３１６，９０６号明細書及び同第５，４４３，９８６号明細書）などの蛍光発生基質と組み合わせて用いる。
【０１８１】
グリコシダーゼ、特にβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−グルコシダーゼが、さらなる好適な酵素である。適切な比色基質としては、限定はされないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及び同様のインドリルガラクトシド、グルコシド、及びグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及びｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。一実施形態では、蛍光発生基質には、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びこれらの構造的変種（米国特許第５，２０８，１４８号明細書；同第５，２４２，８０５号明細書；同第５，３６２，６２８号明細書；同第５，５７６，４２４号明細書及び同第５，７７３，２３６号明細書）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号明細書）が含まれる。
【０１８２】
さらなる酵素としては、限定はされないが、コリンエステラーゼ及びペプチダーゼなどのヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼなどのオキシダーゼ、及びそれに対する好適な基質が知られるレダクターゼが挙げられる。
【０１８３】
一部のアッセイには、化学発光を生じる酵素及びその適切な基質が好ましい。それらとしては、限定はされないが、天然及び組換え形態のルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼに対する化学発光生成基質、例えば、安定ジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムエステルを含有するものが、さらに有用である。
【０１８４】
別の実施形態では、ビオチンなどのハプテンもまた標識として利用される。ビオチンは、酵素系において検出可能なシグナルをさらに増幅するよう機能することができ、且つ単離目的でアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するタグとして機能することができるため、有用である。検出目的では、アビジン−ＨＲＰなどの、ビオチンに対して親和性を有する酵素コンジュゲートが用いられる。続いてペルオキシダーゼ基質を添加すると、検出可能なシグナルが生成される。
【０１８５】
ハプテンにはまた、ホルモン、天然に存在する及び合成の薬物、汚染物、アレルゲン、作用因子分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなども含まれる。
【０１８６】
特定の実施形態では、蛍光タンパク質が標識として抗体にコンジュゲートされてもよい。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質及びこれらの誘導体が含まれる。蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識された標識試薬を作り出すのに特に有用である。このようなタンデム色素は、より大きいストークスシフトの達成を目的として蛍光タンパク質及びフルオロフォアを含み、ここでは発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらに遠くにシフトする。これは、試料中の低量の抗原を検出するのに特に有利であり、ここでは放たれる蛍光の光が最大限最適化され、換言すれば、放たれる光がほとんど乃至全く蛍光タンパク質に再吸収されない。これが機能するには、蛍光タンパク質とフルオロフォアとがエネルギー伝達対として働き、ここで蛍光タンパク質はフルオロフォアが吸収する波長で発光し、次にそのフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）が、その蛍光タンパク質のみで達成され得たより蛍光タンパク質からさらに遠い波長を発光する。特に有用な組み合わせは、米国特許第４，５２０，１１０号明細書；同第４，８５９，５８２号明細書；同第５，０５５，５５６号明細書に開示されるフィコビリタンパク質と、米国特許第５，７９８，２７６号明細書に開示されるスルホローダミンフルオロフォア、又は米国特許第６，９７７，３０５号明細書及び同第６，９７４，８７３号明細書に開示されるスルホン化シアニンフルオロフォア；又は米国特許第６，１３０，１０１号明細書に開示されるスルホン化キサンテン誘導体、及び米国特許第４，５４２，１０４号明細書に開示されるそれらの組み合わせである。或いは、フルオロフォアがエネルギー供与体として働き、且つ蛍光タンパク質がエネルギー受容体である。
【０１８７】
特定の実施形態では、標識は放射性同位体である。好適な放射性物質の例としては、限定はされないが、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ，、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ，１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕが挙げられる。
【０１８８】
治療及び使用
本発明の抗体及びその結合断片及びその変異体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防、並びに／或いはＡ型インフルエンザウイルス感染の検出、診断及び／又は予後に使用してもよい。
【０１８９】
診断の方法は、抗体又は抗体断片を試料に接触させることを含んでもよい。かかる試料は、例えば、鼻道、洞腔（ｓｉｎｕｓ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、目、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳又は皮膚から採取された組織試料であってもよい。検出、診断、及び／又は予後の方法もまた、抗原／抗体複合体の検出を含んでもよい。
【０１９０】
一実施形態では、本発明は、被験体に、本発明に記載の抗体又はその結合断片、又は抗体又はその結合断片を含む医薬組成物を有効量で投与することにより、被験体を治療する方法を提供する。一実施形態では、抗体又はその結合断片は、実質的に精製される（すなわち、その効果を制限するか又は望ましくない副作用をもたらす物質から実質的に遊離される）。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、暴露後、或いは被験体がＡ型インフルエンザウイルスに暴露されているか又はＡ型インフルエンザウイルスに感染した後、投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、暴露前、或いはＡ型インフルエンザウイルスにまだ暴露されていないか又はＡ型インフルエンザウイルスにまだ感染していない被験体に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザサブタイプに対して血清陰性である被験体に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザサブタイプに対して血清陽性である被験体に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、感染又は症状発症から１、２、３、４、５日以内に被験体に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、感染又は症状発症から１、２、３、４、５、６、若しくは７日後、及び２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０日以内に被験体に投与され得る。
【０１９１】
一実施形態では、本方法は、被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染を低下させる。別の実施形態では、本方法は、被験体において、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対して、予防し、そのリスクを低下させるか又は遅延させる。一実施形態では、被験体は、哺乳類である。より特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。一実施形態では、被験体は、限定はされないが、例えば易感染性被験体を含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対して特にリスクがあるか又は感受性が高い被験体を含む。
【０１９２】
治療は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールが可能であり、また本発明の抗体又はその結合断片は、受動免疫で使用することができる。
【０１９３】
一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、１つ以上の抗ウイルス薬と組み合わせて被験体に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、１つ以上の小分子抗ウイルス薬と組み合わせて被験体に投与される。小分子抗ウイルス薬は、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））などのノイラミニダーゼ阻害剤並びにアマンタジン及びリマンタジンなどのアダマンタンを含む。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防又は治療のための薬物として使用される組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体又はその結合断片、及び／又は、本発明の抗体又はその結合断片が被験体の治療及び／又は被験体における診断のための薬物の作製において結合する対象のエピトープを含むタンパク質の使用を提供する。
【０１９５】
本発明に記載される抗体及びその断片はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断用のキットの中で使用してもよい。さらに、本発明の抗体に結合する能力があるエピトープは、ワクチン接種手順の有効性を、保護的な抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することによって監視するためのキットの中で使用してもよい。本発明に記載される抗体、抗体断片、又はその変異体及び誘導体はまた、所望される免疫原性を伴うワクチン製造を監視するためのキットの中で使用してもよい。
【０１９６】
本発明はまた、医薬組成物を調製する方法であって、本明細書に記載される本発明に記載のモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体を、１つ以上の薬学的に許容できる担体と混合するステップを含む、方法を提供する。
【０１９７】
限定はされないが、リポソーム中のカプセル封入、微小粒子、マイクロカプセル、抗体又は抗体断片を発現する能力がある組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス、レトロウイルス又は他のベクターの一部分としての核酸の構築、電気穿孔法による送達技術（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｄｅｃ  ３１；８（１２）：ｅ８４２３４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８４２３４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１３に記載のとおり）によるネイキッドヌクレオチド酸の送達等を含む様々な送達系は、公知であり、本発明の抗体又はその結合断片を投与するのに用いてもよい。導入方法は、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む。組成物は、任意の便宜的経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等）を介した吸収により、投与してもよく、限定はされないが、小分子抗ウイルス組成物を含む他の生物活性剤とともに投与してもよい。投与は、全身性又は局所性であり得る。経肺投与はまた、例えば、吸入器又は噴霧器の使用やエアロゾル化剤（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）との配合により、用いることができる。さらに別の実施形態では、組成物は、徐放システムで送達することができる。
【０１９８】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本発明の抗体又はその結合断片、及び薬学的に許容できる担体を治療有効量で含む。用語「薬学的に許容できる」は、本明細書で使用されるとき、動物、より詳細にはヒトで使用するため、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって認可されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方において収載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を指す。かかる薬学的担体は、滅菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用に、液体担体として使用することができる。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、坐剤として、従来型の結合剤及びトリグリセリドなどの担体と配合することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準担体を含み得る。一実施形態では、医薬組成物は、患者に対する適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の抗体又はその結合断片を、適量の担体とともに、好ましくは精製形態で含有する。製剤は、投与方法に適合させるべきである。
【０１９９】
典型的には、抗体治療薬においては、患者に投与される用量は、患者の体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、単離抗体又はその結合断片。
２．Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ；並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある、上記１に記載の抗体又は結合断片。
３．グループ１サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６及びＨ９並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７を中和する能力があるか；或いはグループ１サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ６並びにグループ２サブタイプＨ３及びＨ７を中和する能力がある、上記１又は２のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
４．マイクロ中和アッセイにおいて、Ａ型インフルエンザウイルスの中和における抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの範囲内での５０％阻害濃度（ＩＣ50μｇ／ｍｌ）として表される高い中和能力を有する、上記１〜３のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
５．６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで６つのＣＤＲの前記セットが、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号４のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３、配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号２３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２、配列番号２５のＨＣＤＲ３、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、配列番号３５のＨＣＤＲ３、配列番号３８のＬＣＤＲ１、配列番号３９のＬＣＤＲ２及び配列番号４０のＬＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号４３のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２、配列番号４５のＨＣＤＲ３、配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２及び配列番号５０のＬＣＤＲ３；
（ｆ）配列番号５３のＨＣＤＲ１、配列番号５４のＨＣＤＲ２、配列番号５５のＨＣＤＲ３、配列番号５８のＬＣＤＲ１、配列番号５９のＬＣＤＲ２及び配列番号６０のＬＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号６３のＨＣＤＲ１、配列番号６４のＨＣＤＲ２、配列番号６５のＨＣＤＲ３、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、配列番号７４のＨＣＤＲ２、配列番号７５のＨＣＤＲ３、配列番号７８のＬＣＤＲ１、配列番号７９のＬＣＤＲ２及び配列番号８０のＬＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号８３のＨＣＤＲ１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、配列番号８５のＨＣＤＲ３、配列番号８８のＬＣＤＲ１、配列番号８９のＬＣＤＲ２、配列番号９０のＬＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号９３のＨＣＤＲ１、配列番号９４のＨＣＤＲ２、配列番号９５のＨＣＤＲ３、配列番号９８のＬＣＤＲ１、配列番号９９のＬＣＤＲ２及び配列番号１００のＬＣＤＲ３；
（ｋ）配列番号１０３のＨＣＤＲ１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、配列番号１０５のＨＣＤＲ３、配列番号１０８のＬＣＤＲ１、配列番号１０９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２及び配列番号１１０のＬＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号１２３のＨＣＤＲ１、配列番号１２４のＨＣＤＲ２、配列番号１２５のＨＣＤＲ３、配列番号１２８のＬＣＤＲ１、配列番号１２９のＬＣＤＲ２及び配列番号１３０のＬＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号１３３のＨＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣＤＲ２、配列番号１３５のＨＣＤＲ３、配列番号１３８のＬＣＤＲ１、配列番号１３９のＬＣＤＲ２及び配列番号１４０のＬＣＤＲ３；及び
（ｏ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、配列番号１４４のＨＣＤＲ２、配列番号１４５のＨＣＤＲ３、配列番号１４８のＬＣＤＲ１、配列番号１４９のＬＣＤＲ２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ３
（ｐ）１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｑ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４若しくは２５のアミノ酸置換を含む、（ａ）〜（ｐ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット；
（ｒ）（ｉ）配列番号３に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は３つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は６つ以下のアミノ酸残基置換を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号６に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換及び／若しくは１つの欠失を含むＬＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号７に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は５つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号８に対して同一のアミノ酸配列を有するか又は１つ以下のアミノ酸残基置換を含むＬＣＤＲ３；
を含む、（ａ）〜（ｑ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｓ）（ｉ）Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＮ、Ｓ、又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基３５がＶ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＡがＷであり、
Ｋａｂａｔ残基３５ＢがＮである
ＨＣＤＲ１
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ残基５０がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５２ＡがＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＫ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＷであり、
Ｋａｂａｔ残基５７がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５８がＮ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基５９がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基６０がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基６１がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基６２がＥ、Ｖ又はｄであり、
Ｋａｂａｔ残基６３がＳ又はＦであり、
Ｋａｂａｔ残基６４がＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基６５がＫである
ＨＣＤＲ２
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔ残基９５がＳ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９６がＧであり、
Ｋａｂａｔ残基９７がＨであり、
Ｋａｂａｔ残基９８がＩであり、
Ｋａｂａｔ残基９９がＴであり、
Ｋａｂａｔ残基１００がＶ又はＥであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＦであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＧであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＶ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＮであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＶ又はＩであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＡであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＦ又はＹであり、
Ｋａｂａｔ残基１０１がＤであり、
Ｋａｂａｔ残基１０２がＭ、Ｉ又はＶである
ＨＣＤＲ３
（ｉｖ）Ｋａｂａｔ残基２４がＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２５がＴ、Ａ又は存在せず、
Ｋａｂａｔ残基２６がＳ又はＡであり、
Ｋａｂａｔ残基２７がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基２８がＳ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基２９がＬであり、
Ｋａｂａｔ残基３０がＳ、Ｎ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基３１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＹであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＬ、Ｔ又はＤであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＨである
ＬＣＤＲ１
（ｖ）Ｋａｂａｔ残基５０がＡであり、
Ｋａｂａｔ残基５１がＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｋａｂａｔ残基５２がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＳ又はＴであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＬ又はＲであり、
Ｋａｂａｔ残基５５がＱ、Ｌ又はＧであり、
Ｋａｂａｔ残基５６がＳである
ＬＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）Ｋａｂａｔ残基８９がＱであり、
Ｋａｂａｔ残基９０がＱ又はＬであり、
Ｋａｂａｔ残基９１がＳであり、
Ｋａｂａｔ残基９２がＲであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基９３がＴである
ＬＣＤＲ３
を含む、（ａ）〜（ｒ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
からなる群から選択される、上記１〜４のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
６．
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及び／又はＶＬに対して、少なくとも７５％の同一性を有するＶＨ及び／又は少なくとも７５％の同一性を有するＶＬを含む、上記１〜５のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
７．
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７２のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、
（ｉ）配列番号８２のＶＨ及び配列番号８７のＶＬ、
（ｊ）配列番号９２のＶＨ及び配列番号９７のＶＬ、
（ｋ）配列番号１０２のＶＨ及び配列番号１０７のＶＬ、
（ｌ）配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬ、
（ｍ）配列番号１２２のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ、
（ｎ）配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３７のＶＬ、
（ｏ）配列番号１４４のＶＨ及び配列番号１４７のＶＬ、並びに
（ｐ）配列番号１５２のＶＨ及び配列番号１５７のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、上記１〜６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
８．免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、及び二特異性抗体からなる群から選択される、上記１〜７のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
９．前記ＶＨがヒト生殖系列フレームワークＶＨ６−１を含み、前記ＶＬがヒト生殖系列フレームワークＶＫ１−３９を含む、上記１〜８のいずれかに記載の抗体又はその結合断片、及びその組み合わせ。
１０．Ｆｃ領域を含む、上記１〜９のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
１１．前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４又はその断片である、上記１〜１０のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
１２．Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片であって、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される１つ以上のグループ２サブタイプの中で保存されるエピトープに結合する、抗体又はその結合断片。
１３．Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）に結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力があるＡ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片であって、ＨＡ２の保存されたストーク領域内に位置するエピトープに結合する、抗体又はその結合断片。
１４．前記エピトープが、Ｈ３付番方式に従い、ＨＡ２の位置１８、１９、４２及び４５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、上記１２に記載の抗体又はその結合断片。
１５．Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力があり、上記１〜１４のいずれかに記載の抗体と同じエピトープに結合するか、又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合において競合する、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその結合断片。
１６．配列番号１１２で示されるアミノ酸配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合において競合する、上記１４に記載の抗体又はその結合断片。
１７．上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片をコードする単離核酸。
１８．上記１７に記載の単離核酸を含むベクター。
１９．上記１７に記載の核酸又は上記１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
２０．上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片を作製するための方法であって、上記１９に記載の宿主細胞を、前記抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
２１．前記宿主細胞培養物から前記抗体又はその結合断片を単離するステップをさらに含む、上記２０に記載の方法。
２２．上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
２３．上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片、２５ｍＭ  Ｈｉｓ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌをｐＨ６．０で含む組成物。
２４．被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための、上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
２５．被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬物の製造における、上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片の使用。
２６．被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片の有効量を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
２７．被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、小分子抗ウイルス組成物と組み合わせて上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその結合断片の有効量を投与するステップを含む、方法。
２８．前記小分子抗ウイルス組成物が、ノイラミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）阻害剤又はアダマンタンである、上記２７に記載の方法。
２９．前記小分子抗ウイルス組成物が、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジン、及びそれらの組み合わせから選択される、上記２７に記載の方法。
３０．被験体におけるＡ型インフルエンザ感染のインビトロ診断における、上記１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその断片の使用。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１Ａは、抗体３及び抗体１２の、サブタイプＨ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ４、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５の表面発現ＨＡタンパク質への結合を示す。ヒストグラムは、細胞の数に対する、白色のＨＡトランスフェクト細胞又は灰色のモックトランスフェクト細胞に結合する抗体の蛍光強度を示す。図１Ｂは、抗体３、抗体１２、又はＭＰＥ８ｖ３（非関連ウイルス融合タンパク質抗体）（Ｃｏｒｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  ５０１）の存在下での、ニワトリ赤血球とＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４との低ｐＨ誘発性融合のパーセント阻害を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、トリプシンで５、１０若しくは２０分間消化後の非切断（ＨＡ０）の組換えＨ１  ＨＡのイムノブロットを示す。消化反応は、１Ｃでは、ＨＡ単独（インプット）、又はＦＩ６ｖ４（国際公開第２０１３／０１１３４７Ａ１号パンフレットで開示）、抗体３、ＦＥ１７．２３（球状頭部に特異的なｍＡｂ）（Ｃｏｒｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０）若しくは非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で前処理したＨＡ、及び１Ｄでは、ＨＡ単独（インプット）、又は抗体３、抗体１２、抗体１４、若しくは非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で前処理したＨＡを含んだ。
【図２】図２は、漸増量の抗体３、抗体１１、抗体１２、及び抗体１４の存在下での、Ａ／ＨＫ／８／６８に感染したＭＤＣＫ細胞のＮＫ細胞媒介性死滅の百分率を示す。
【図３】図３は、漸増量の抗体３、抗体１１、抗体１２、及び抗体１４、又は非関連アイソタイプ対照（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）の存在下での、Ａ／ＨＫ／８／６８ＨＡを発現するＭＤＣＫ標的細胞を貪食したマクロファージの百分率を示す。
【図４】図４は、漸増量の抗体３、抗体１１、抗体１２、及び抗体１４の存在下での、Ａ／ＰＲ／８／３４に感染したＭＤＣＫ細胞の補体依存性殺滅の百分率を示す。
【図５】図５は、異なる濃度の抗体３又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）が、マウスに致死量のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）への感染の４時間前に投与された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図６】図６は、異なる濃度の抗体３又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）が、マウスに致死量のＨ３インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）への感染の４時間前に投与された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図７】図７は、マウスが致死量のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、かつ異なる時点（感染の１日後及び２日後）に３０ｍｇ／ｋｇの抗体３又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で治療された場合での各群における生存動物の百分率を示す。
【図８】図８は、マウスが致死量のＨ３インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、かつ異なる時点（感染の３、４及び５日後）に３０ｍｇ／ｋｇの抗体３又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で治療された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図９】図９は、マウスが致死量のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、かつ感染の１日後に２ｍｇ／ｋｇの抗体３、抗体１１、抗体１２、抗体１４又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で治療された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図１０】図１０は、マウスが致死量のＨ３インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、かつ感染の２日後に３ｍｇ／ｋｇの抗体３、抗体１１、抗体１２、抗体１４又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で治療された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図１１】図１１は、マウスが致死量のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、かつ２５ｍｇ／ｋｇ、５日間のオセルタミビル、１０ｍｇ／ｋｇの抗体１２、又は１０ｍｇ／ｋｇの非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）での治療が異なる時点（感染の４時間前、１日後、又は２日後）に開始された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図１２】図１２は、マウスが致死量のＨ３インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回（ＢＩＤ）、５日間のオーラルオセルタミビル（ｏｒａｌｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）、又は単回用量１０ｍｇ／ｋｇの抗体１２、又は１０ｍｇ／ｋｇの非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）での治療が様々な時点（感染の１、２、３又は４日後）に開始された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図１３】図１３は、マウスが致死量のＨ３インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染され、感染の２日後、２．５ｍｇ／ｋｇ若しくは０．３ｍｇ／ｋｇ単回用量での抗体１２、２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビル、又は２．５ｍｇ／ｋｇ若しくは０．３ｍｇ／ｋｇでの抗体１２と２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビルとの組み合わせで治療された場合の試験の各群における生存動物の百分率を示す。
【図１４】図１４は、致死量のＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）への感染後、感染の１、２、若しくは３日後、２５ｍｇ／ｋｇ単回用量の抗体１２、２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビル、又は非関連対照抗体（Ｃｔｒｌ．ＩｇＧ）で治療した場合の試験の各群における生存フェレットの百分率を示す。
【図１５】図１５は、ＭＡＲＭ選択において用いられるＡ型インフルエンザ株のＨＡ２タンパク質のアライメントを示す。
【実施例】
【０２０１】
実施例１  メモリーＢ細胞から単離したヒトモノクローナル抗体の構築及び最適化
ＣＤ２２＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞は、高力価のヘテロサブタイプ抗体について選択したドナーの凍結保存した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から選別し、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド２００６及び支持細胞を用いて、３細胞／ウェルで不死化した。抗体を含有する培養上清を１４日後に回収し、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによってスクリーニングし、Ｈ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）及びＨ７（Ａ／ＮＬＤ／０３）ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合活性を各々判定した。４つのＢ細胞クローン（抗体１、抗体４、抗体７、及び抗体９）は、両方のＨＡに特異的に結合することが見出されたので、回収した。これらのクローンのＶＨ及びＶＬ遺伝子は、配列決定し、Ｋａｂａｔデータベースを用いてＶＨ及びＶＬ  Ｖ、Ｄ及びＪ断片対して実施した相同性分析によると、クローン的に関連性があることが見出された。注目すべきことには、抗体４のＶＨは、（抗体５においてコードされる）バリン又は（抗体６においてコードされる）グルタミン酸塩のいずれかをコードするＨＣＤＲ３における縮重ヌクレオチド部位を有することが見出された。４つの抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子は、ＩｇＧ１発現ベクターにクローニングし（クローニング及び  又はコドン最適化を促進するための少数の配列修飾により、５つの抗体；抗体３、抗体５、抗体６、抗体８及び抗体１０が得られた；以下の実施例中で使用）、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞由来の哺乳類細胞株の一過性トランスフェクションによって組換え抗体を産生した。トランスフェクト細胞からの上清を培養の７〜１０日後に回収し、ＩｇＧをプロテインＡクロマトグラフィーによって親和性精製し、ＰＢＳに透析した。抗体３は、さらに最適化して変異体を産生し、ここではフレームワーク領域内に位置する非生殖系列コード化体細胞突然変異は、生殖系列コード化アミノ酸に変化し、ＣＤＲ領域は、簡素な突然変異誘発を受けた。異なる突然変異を有する完全ＩｇＧ構築物は、上記のように発現させ、粗上清は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、Ｈ３及びＨ１  ＨＡタンパク質への結合活性が増強したクローンを選択した。ＥＬＩＳＡは、ＩｇＧを上清から捕獲し、正規化するように、０．１５μｇ／ｍｌのコーティング濃度のウサギ抗ヒトＩｇＧを用いて実施し、次に０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＨＡサブタイプＨ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０４（Ｈ１Ｎ１））又はサブタイプＨ３（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３Ｎ２））を添加し、１時間インキュベートした。結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５０００）の添加によって検出し、発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）吸光度を４５０ｎｍで読み取った。より優れた結合をもたらす有利な単一の突然変異を組み合わせ、コンビナトリアルライブラリ中にクローニングし、発現させ、上記のとおりのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。このライブラリ手法により、５つの追加的な抗体３変異体の産生がもたらされ、それらをさらに特徴づけた（抗体１１〜１５）。
【０２０２】
実施例２  抗ＨＡ中和抗体（ｎＡｂ）は異なるサブタイプのＨＡに結合する
抗ＨＡ抗体のエピトープが異なるサブタイプのＨＡの中で保存されるか否かを試験するため、ＨＡ交差反応性のＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施した。３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）は、ＰＢＳ中、０．５ｕｇ／ｍｌの組換えＨＡ（ｒＨＡ）、サブタイプＨ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１））、サブタイプＨ２（Ａ／Ｓｗｉｎｅ／ＭＯ／０６（Ｈ２Ｎ３））、サブタイプＨ３（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３Ｎ２））、サブタイプＨ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１））、サブタイプＨ６（Ａ／ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））、サブタイプＨ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７））及びサブタイプＨ９（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＨＫ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２））で、摂氏４度で一晩コーティングした。プレートは、０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄し、コーティングされていないタンパク質を除去し、その後１％（ｗ／ｖ）カゼインを含有するブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング溶液は廃棄し、ブロッキング溶液（カゼイン−ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の３倍連続希釈抗ＨＡ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、結合した抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて検出した。抗体の結合活性は、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加後に化学発光シグナルを測定するか、又は１つの基質成分（ＫＰＬ）のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とのインキュベーション、その後の反応を停止するための２Ｎ硫酸の添加後、４５０ｎｍでの色変化を測定することにより、算出した。
【０２０３】
【表１】
2020178704.tif 000003
【０２０４】
表１は、試験したすべての抗ＨＡ  ＩｇＧがサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９及びＨ７の組換えＨＡに結合したことを示す。サブタイプＨ９の組換えＨＡは、試験した抗体の最高濃度（６ｕｇ／ｍｌ）で、抗体３及び抗体１０によって認識されたが、抗体５、抗体６及び抗体８によって認識されなかった。これは、これらの大半の抗ＨＡ  ＩｇＧのエピトープが異なるサブタイプのＨＡ分子の中で保存されることを示す。
【０２０５】
【表２】
2020178704.tif 000004
【０２０６】
表２は、試験したすべての抗ＨＡ  ＩｇＧ変異体がグループ１サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６及びＨ９の組換えＨＡに類似のＥＣ５０値で結合したことを示す。すべての変異体がグループ２のＨＡタンパク質（Ｈ３及びＨ７）に結合したが、抗体１１及び抗体３は、抗体１２〜１５と比べて増加したＥＣ５０値で低下した活性を示した。
【０２０７】
これらの結合の結果を拡張し、より多様なＨＡサブタイプを含めるように、発明者らは、ＨＡトランスフェクト細胞に対するフローサイトメトリーに基づく結合を用いて、さらなる結合試験を実施した。このアッセイでは、ＨＥＫ細胞に、サブタイプＨ４  Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／５６（Ｈ４Ｎ６））、サブタイプＨ１０（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ４９（Ｈ１０Ｎ７））、サブタイプＨ１１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／５４６／７４（Ｈ１１Ｎ９））、サブタイプＨ１２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５））、サブタイプＨ１３（Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６））、サブタイプＨ１４（Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５））、サブタイプＨ１５（Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ｗｅｓｔ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ／２５７６／７９（Ｈ１５Ｎ９））、サブタイプＨ１６（Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／２／９９（Ｈ１６Ｎ３））、及びサブタイプＨ１７（Ａ／ｌｉｔｔｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ−ｓｈｏｕｌｄｅｒｅｄ  ｂａｔ／Ｇｕａｔｅｍａｌａ／１６４／２００９（Ｈ１７Ｎ１０））の完全長野生型ＨＡを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞は、トリプシンで剥離し、５μｇ／ｍｌの抗体３又は抗体１２とともに氷上で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞−表面に発現されたＨＡタンパク質に結合した抗体は、次にヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｄａｙｌｉｇｈｔ  ６４９（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色し、フローサイトメトリーによって検出した。図１Ａは、抗体がサブタイプの各々からのＨＡ発現細胞（白色）対モックトランスフェクト細胞（灰色）に結合される際の蛍光強度の変化を示す。抗体３は、両方のグループ（グループ１のＨ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、及びＨ１７並びにグループ２のＨ４、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５）から試験したＨ１２を例外とするすべてのＨＡに結合した一方で、抗体１２は、試験したすべてのＨＡに結合した。
【０２０８】
実施例３  Ｏｃｔｅｔを用いた抗体３及び抗体５  ＩｇＧ１へのＨＡの結合の動力学的特徴づけ
３８４傾斜ウェルプレート内でＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて、親和性測定を実施した。すべての試薬は、Ｏｃｔｅｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で希釈した。異なるサブタイプ、すなわちサブタイプＨ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０４（Ｈ１Ｎ１））及びサブタイプＨ３（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３Ｎ２））のＨｉｓタグ化ＨＡを、１０μｇ／ｍＬで抗Ｈｉｓセンサ上に固定化した。次に、抗ＨＡ  ｍＡｂの会合／解離を、ゼロｍＡｂ対照に加えて、１００ｎＭからの２倍希釈において監視した。
【０２０９】
会合及び解離の生データは、ゼロｍＡｂ対照において任意のドリフトについて訂正し、次に親和性をカーブフィッティングするため、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にエクスポートした。データは、５×１０−６／秒−１を超える課された限界でのグローバルな会合／解離フィッティングを用いてフィッティングした。表３に示すように、両抗体は、検出限界を下回る緩徐な解離速度で、Ｈ１に対してｐＭレベルで非常に高い親和性結合を有する。Ｈ３三量体の場合に、両抗体の類似したｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄがサブｎＭレベルで認められた。
【０２１０】
【表３】
2020178704.tif 000005
【０２１１】
実施例４  異なるサブタイプのウイルスに対する抗ＨＡ  ＩｇＧ１のインビトロ交差反応性中和活性
マイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）は、読み取りとしてノイラミニダーゼ活性（ＮＡ）を用いる前述の迅速なウイルス阻害アッセイから変更した（Ｈａｓｓａｎｔｏｕｆｉｇｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：７９０）。つまり、ＭＮＡは、抗生物質、グルタミン及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（完全ＭＥＭ培地）中で培養したＭＤＣＫ細胞に対して実施した。６０ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）のウイルスを、室温で３０分のインキュベーション後、２通りのウェルで、０．７５ｕｇ／ｍｌのトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有する完全ＭＥＭ培地中、３８４ウェルプレート内の３倍希釈抗体に添加し、２×１０４個の細胞／ウェルをプレートに添加した。摂氏３３度の５％ＣＯ２インキュベーターで約４０時間インキュベーション後、蛍光標識物質メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ΜＵ−ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、摂氏３７度で１時間インキュベートすることにより、ＮＡ活性を測定した。ＮＡ活性によって表されるウイルス複製は、次の設定、すなわち励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ；１０フラッシュ／ウェルを用いて、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  Ｅｎｖｉｓｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光を読み取ることによって定量した。中和力価（５０％阻害濃度［ＩＣ５０］）は、細胞対照ウェルと比べて、蛍光シグナルが５０％低下した最終抗体濃度として表される。表４及び表５は、抗ＨＡ抗体が、以下、すなわち、Ｈ１−ＰＲ３４（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＰＲ３４−ＯＲ（オセルタミビル耐性を与えるＮＡ２７４Ｙ（Ｎ２付番）突然変異を有するＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＦＭ４７（Ａ／Ｆｏｒｔ  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／４７（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＮＪ７６（Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−Ｋａｗ８６（Ａ／Ｋａｗａｓａｋｉ／９／８６（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＴＸ９１（ｃａＡ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１））：Ｈ１−ＢＪ９５（ｃａ  Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−Ｎｃａｌ９９（ｃａ  Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＳＤ０７（ｃａ  Ａ／ＳｏｕｔｈＤａｋｏｔａ／６／０７（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＣＡ０９（ｃａ  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ１−ＣＡ０９−ＯＲ（オセルタミビル耐性を与えるＮＡ２７４Ｙ（Ｎ２付番）突然変異を有するｃａ  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１））；Ｈ５−ＶＮ０４（ｃａ  Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１））；Ｈ５−ＨＫ０３（ｃａ  Ａ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１））；Ｈ９−ＨＫ９７（ｃａ  Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）；Ｈ２−ＪＰ５７（ｃａ  Ａ／Ｊａｐａｎ／５７（Ｈ２Ｎ２））；Ｈ２−ＭＯ０６（ｃａ  Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｓｓｏｕｒｉ／０６（Ｈ２Ｎ３））；Ｈ６−ＨＫ９７（ｃａ  Ａ／ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））；Ｈ６−ＡＢ８５（ｃａ  Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｌｂｅｒｔａ／８９／８５（Ｈ６Ｎ２））；Ｈ３−ＨＫ６８（Ａ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−Ｖｉｃ７５（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−ＬＡ８７（Ａ／Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ／７／０９（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−ＳＤ９３（Ａ／Ｓｈａｎ  ｄｏｎｇ／９／９３（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−ＷＨ９５（ｃａ  Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−Ｓｙｄ９７（ｃａ  Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−ＷＨ９５−ＯＲ（オセルタミビル耐性を与えるＮＡ２７４Ｙ（Ｎ２付番）突然変異を有するｃａ  Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−Ｐａ９９（ｃａ  Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−Ｗｙ０３（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／０３（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−ＷＩ０５（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ３−Ｐｅｒｔｈ０９（ｃａ  Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３Ｎ２））、Ｈ３−ＶＣ１１（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２））；Ｈ７−ＮＬＤ０３（ｃａ  Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７））；Ｈ７−ＢＣ０４（ｃａ  Ａ／Ｂｒｉｔ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ／ＣＮ−６／０４（Ｈ７Ｎ３−ＬＰ）；Ｈ７−ＡＮＵ１３（ｃａ  Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／１３（Ｈ７Ｎ９）といった試験した異なるサブタイプのＡ型インフルエンザウイルスを中和することを示した。
【０２１２】
【表４】
2020178704.tif 000006
【０２１３】
表４は、抗ＨＡ抗体が試験したすべてのグループ１のＡ型インフルエンザウイルスを中和させることを示す。抗体８を除くすべての抗ＨＡ抗体は、試験したすべてのＨ３のＡ型インフルエンザウイルスに対して中和活性を呈し、抗体６を除くすべての抗ＨＡ抗体は、Ｈ７−ＮＬＤ０３（ｃａ  Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７））；Ｈ７−ＢＣ０４（ｃａ  Ａ／Ｂｒｉｔ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ／ＣＮ−６／０４（Ｈ７Ｎ３−ＬＰ）に対して中和活性を呈した。
【０２１４】
【表５】
2020178704.tif 000007
【０２１５】
表５は、抗体変異体（抗体１１〜１５）が、試験したすべてのＡ型インフルエンザウイルスのグループ１及びグループ２を中和する場合に、低下したＩＣ５０値で、親抗体３より有効であることを示す。さらに、抗体はまた、オセルタミビル耐性（ＯＲ）を与えるＮＡタンパク質へと操作された突然変異を有する３つのウイルスを中和した。
【０２１６】
実施例５  ブタ由来Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する抗ＨＡ  ＩｇＧの中和活性
新たに出現したブタ由来Ｈ３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１１／２０１０及びＡ／Ｉｎｄｉａｎａ／１０／２０１１）に対する抗ＨＡ抗体３及び変異体（抗体１１〜１５）の中和活性を、実施例４に記載のとおりのマイクロ中和アッセイで測定した。抗体ＦＩ６ｖ４（国際公開第２０１３／０１１３４７Ａ１号パンフレットに記載）を対照抗体として用いた。２つの独立実験から得た表６に示されるように、抗体３及び抗体変異体（抗体１１〜１５）は、ブタ由来Ａ／Ｉｎｄｉａｎａ／１０／２０１１  Ｈ３Ｎ２ウイルスを中和する場合にＦＩ６ｖ４より有効であった。抗体３及び抗体変異体はブタ由来Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１１／２０１０  Ｈ３Ｎ２ウイルスを強力に中和し、他方でＦＩ６ｖ４は試験した抗体を最高濃度（５０ｕｇ／ｍｌ）で中和することができなかった。
【０２１７】
【表６】
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【０２１８】
実施例６  抗ＨＡ中和抗体はインフルエンザ融合及びプロテアーゼ媒介性ＨＡ０切断を阻害する
抗体媒介性の融合阻害について試験するため、低ｐＨ誘発性赤血球融合アッセイを、前述の変更したプロトコルを通じて実施した（Ｗａｎｇ  Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．６）。つまり、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４ウイルス（１０×１０６のＴＣＩＤ５０）を、ヒト赤血球（２％の最終赤血球濃度）とともに氷上で１０分間インキュベートした。希釈した抗体３、抗体１２、及び非関連抗体ＭＰＥ８ｖ３を、ウイルスとともに室温で３０分間インキュベートした。次に、赤血球をウイルス−抗体混合物に摂氏３７度で３０分間添加し、最終的に酢酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ  ｐＨ５．０）を摂氏３７度でさらに４５分間添加した。試料を４００×ｇで６分間遠心し、室温でさらに４５分間インキュベートし、次に４００×ｇで６分間再び遠心し、赤血球をペレット化した。次に、上清をＥＬＩＳＡプレートに移し、放出されたＮＡＤＰＨの量を５４０ｎｍで吸光度を測定することによって判定した（図１Ｂ）。結果は、抗体３及び抗体１２がウイルス融合を強力に阻害し、他方で、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）の融合タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体、ＭＰＥ８ｖ３（Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  ５０１）が低ｐＨ誘発性融合を阻害できないことを示した。
【０２１９】
ＨＡ成熟の抗体媒介性遮断について試験するため、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）の組換えＨＡを、抗体３、ＦＩ６ｖ４、ＦＥ１７．２３又は同位体対照抗体とともに１５：１のモル比（ｍＡｂ：ＨＡ）で４０分間インキュベートした。次に、抗体−ＨＡ混合物を、２．５ｕｇ／ｍｌのＴＰＣＫで処理したトリプシンに暴露し、摂氏３７度で５、１０及び２０分間インキュベートした。試料を、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次にＡ型インフルエンザ株のＨＡ２及びＨＡ０を認識するビオチン化ヒトｍＡｂ（ＦＯ３２）（Ｈｕｍａｂｓ）を用いるウエスタンブロット解析用のニトロセルロース膜に移した（図１Ｃ）。結果は、抗体３が、プロテアーゼ媒介性ＨＡ０切断を遮断する場合にＦＩ６ｖ４より強力であることを示した。それに対し、ＨＡ球状頭部を認識するヒトモノクローナル抗体ＦＥ１７．２３及び対照抗体は、プロテアーゼ媒介性ＨＡ０切断を阻害できなかった。別の実験において、発明者らは、上記と同じ条件を用いて、抗体１２及び抗体１４のプロテアーゼ切断阻害を抗体３に対して比較した（図１Ｄ）。結果は、抗体１２、抗体１３が、抗体３と同様のプロテアーゼ切断に対する遮断能を有することを示した。
【０２２０】
実施例７  抗ＨＡ抗体はＦｃエフェクター機能を呈する
抗体は、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などのＦｃエフェクター機能を通じて、ウイルス感染細胞を除去する能力を有する。抗ＨＡ抗体がＡＤＣＣ活性を呈したことを確認するため、発明者らは、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在下でウイルス感染細胞を殺滅するその能力を試験した。ＡＤＣＣアッセイは、２０のＭＯＩでＡ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／８／６８に感染したＭＤＣＫ細胞に対して実施した。感染細胞は、抗体の希釈系列とともにインキュベートし、次に６：１のエフェクター対標的比でヒトＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からネガティブセレクションした精製ＮＫ細胞とともにインキュベートした。感染細胞、抗体、及びＮＫ細胞の混合物を４時間インキュベートし、細胞死滅をＬＤＨ放出によって測定した（Ｒｏｃｈｅ）。図２は、４つすべての抗ＨＡストーク抗体が感染ＭＤＣＫ細胞の死滅を用量依存的に呈したことを示す。
【０２２１】
抗ＨＡ抗体の食作用を媒介する能力を測定するため、発明者らは、標的細胞として、Ａ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／８／６８由来のＨＡが安定的にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞を用いた。ヒト単球を、ＰＢＭＣから単離し、Ｍ−ＣＳＦの存在下で７日間培養し、マクロファージに分化させた。ヒトマクロファージ及びＨＡを発現する標的細胞を各々、青紫色及び緑色に蛍光標識した（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ又はＣＳＦＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。標識したエフェクター及び標的細胞を、６：１の比で、抗体の希釈系列の存在下で２時間インキュベートし、次にフローサイトメトリーによって分析した。パーセント食作用を、緑色の標的細胞でも陽性（二重陽性）である青紫色に染色したマクロファージのパーセントとして測定した。図３は、すべての抗ＨＡ抗体が同様のＡＤＣＰレベルを示し、予想どおり、非特異的対照抗体が食作用を全く示さなかったことを示す。
【０２２２】
抗ＨＡ抗体が補体と共働し、感染細胞の死滅を媒介する能力を測定するため、発明者らは、ＣＤＣアッセイを実施した。このアッセイでは、ＭＤＣＫ細胞を、２のＭＯＩでＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に感染させ、１：１８のエフェクター対標的比で、抗体の希釈系列、及びウサギ由来の補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）とともにインキュベートした。細胞死滅を、ＬＤＨ放出によって測定した（Ｒｏｃｈｅ）。図４は、すべての抗ＨＡ抗体が、補体の存在下で細胞死滅を媒介する能力を示したことを示す。
【０２２３】
実施例８  抗ＨＡ抗体の予防及び治療効果
インフルエンザウイルス感染に対するヒト中和抗体（ｎＡｂ）の保護的有効性を、６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）マウスモデルで評価した。マウスは、致死性ウイルス負荷の前又は後のいずれかに異なる用量のｎＡｂで治療した。
【０２２４】
予防活性（図５及び６）
８群のマウスに、１００μｌの容量で、０．１、０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で単回腹腔内注射（ＩＰ）として抗体３を、又は１０ｍｇ／ｋｇでヒトアイソタイプ非関連対照ＩｇＧを投与した。投与の４時間後、マウスの鼻腔内に、５０μｌの容量で、５０％マウス致死量の７倍（７ＭＬＤ５０）のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１）（Ｈ１−ＣＡ０９）又は７：１  Ａ／ＰＲ／８：Ａ／ＨＫ／８／６８ＨＡ（Ｈ３Ｎ１）（Ｈ３−ＨＫ６８）リアソータントを接種した。マウスは、ウイルス負荷の当日又は１日前に秤量し、体重減少及び生存について１４日間毎日監視した（２５％以上の体重減少を伴うマウスは安楽死させた）。抗体３は、用量依存的な様式で保護を与えた。１ｍｇ／ｋｇ以上の抗体３のＩＰ注射は、Ｈ１−ＣＡ０９（図５）及びＨ３−ＨＫ６８（図６）を負荷した動物に完全な保護をもたらした。より低い抗体用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）もまた、９０％の保護で非常に保護的であった。予想どおり、１０ｍｇ／ｋｇでのアイソタイプ対照ｍＡｂを受けたマウスは、感染の致死的負荷に対して全く生存しなかった。
【０２２５】
治療活性（図７及び８）
マウスに、３ＭＬＤ５０のＨ１−ＣＡ０９を接種し、感染から２４及び４８時間後（ｈ．ｐ．ｉ．）に抗体３（図７）又は感染から７２、９６及び１２０時間後に５ＭＬＤ５０のＨ３−ＨＫ６８（図８）を注射した。３０ｍｇ／ｋｇの抗体３によるＩＰ治療によると、感染から２４及び４８時間後では、Ｈ１−ＣＡ０９を負荷したマウスの７５〜１００％が保護され、また感染から７２及び９６時間後では、Ｈ３−ＨＫ６８を負荷したマウスの８７．５〜１００％が保護された。Ｈ１及びＨ３モデルにおける感染から０又は２４時間後での同じ用量の非関連アイソタイプ対照抗体での治療によると、マウスは致死性負荷から保護できず、生存率は各々０％又は１２．５％であった。
【０２２６】
抗体３変異体の治療活性（図９及び１０）
マウスに、３ＭＬＤ５０のＨ１−ＣＡ０９を接種し、感染から２４時間後に抗体を注射するか（図９）、又は７ＭＬＤ５０のＨ３−ＨＫ６８を接種し、感染から４８時間後に抗体を注射した（図１０）。２ｍｇ／ｋｇの抗体３及び変異体ｍＡｂ（抗体１１、抗体１２、及び抗体１４）によるＩＰ治療によると、Ｈ１−ＣＡ０９を負荷したマウスの８７．５〜１００％が保護され、また３ｍｇ／ｋｇ用量の異なるｎＡｂによるＩＰ治療によると、Ｈ３−ＨＫ６８を負荷したマウスの５０〜８７．５％が保護された。予想どおり、Ｈ１及びＨ３モデルにおける感染から２４又は４８時間後での同じ用量の非関連アイソタイプ対照抗体での治療によると、マウスは保護できず、生存率は各々０％又は１２．５％であった。
【０２２７】
実施例９  抗ＨＡ抗体及び小分子阻害剤オセルタミビルの治療効果
小分子ノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤、オセルタミビルに対する抗ＨＡ  ｎＡｂの保護的有効性、及び併用療法の効果を直接的に比較するため、発明者らは、実施例８に記載の感染のインフルエンザマウスモデルを用いた。
【０２２８】
抗ＨＡ  ｎＡｂ及びオセルタミビルの治療比較（図１１及び１２）
マウスに、３ＭＬＤ５０のＨ１−ＣＡ０９を接種し、感染の４時間前、１日後、又は２日後のいずれかに開始した、１０ｍｇ／ｋｇの抗体１２又は２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビルでの治療を行った（図１１）。感染の１日前及び１日後の抗体１２での治療によると、Ｈ１−ＣＡ０９を負荷したマウスの１００％が保護され、他方で、オセルタミビルで治療したすべての動物が感染に屈した。感染の４時間前に同じ用量の非関連アイソタイプ対照で治療したすべての動物が死滅し、生存率は０％であった。加えて、マウスに、７ＭＬＤ５０のＨ３−ＨＫ６８を接種し、次に、感染の１、２、３、又は４日後のいずれかに開始した、１０ｍｇ／ｋｇの抗体１２又は２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビルの治療を行った（図１２）。感染から１、２、又は３日後に抗体１２で治療した動物が１００％の生存率を示し、他方で、これらと同じ時点でのオセルタミビルによる治療では、わずか６０％〜２０％の生存率を示した。予想どおり、感染の１日後に同じ用量の非関連アイソタイプ対照抗体で治療したマウスは感染に屈し、生存率は１０％であった。
【０２２９】
抗ＨＡ  ｎＡｂとオセルタミビルとの治療的組み合わせ（図１３）
抗ＨＡ  ｍＡｂとオセルタミビルとの組み合わせの相加効果を評価するため、マウスに、７ＭＬＤ５０のＨ３−ＨＫ６８を接種し、感染の３日後、準最適濃度の抗体１２（２．５又は０．３ｍｇ／ｋｇ）、２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビル、又は抗体１２（２．５又は０．３ｍｇ／ｋｇ）と２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビルとの組み合わせで治療した（図１３）。抗体１２又はオセルタミビル単独のいずれかでの治療によると、動物のわずか１０〜２０％が保護され、他方で、オセルタミビルと組み合わせた２．５ｍｇ／ｋｇの抗体１２での治療によると、動物の８０％が保護され、またオセルタミビルと組み合わせた０．３ｍｇ／ｋｇの抗体１２での治療によると、動物の５０％が保護された。
【０２３０】
実施例１０  フェレットにおけるＨ５Ｎ１インフルエンザ感染に対する抗ＨＡ抗体及び小分子阻害剤の治療効果
高病原性のインフルエンザウイルス感染に対する抗ＨＡ  ｎＡｂ及びオセルタミビルの保護的有効性を、５〜６月齢のインフルエンザ血清陰性フェレット（Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆ  Ｆａｒｍｓ）において評価した。すべてのフェレットの鼻腔内に、１．０ｍＬ（約０．５ｍＬ／鼻孔）で、１ＬＤ９０のＡ／ＶＮ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）高病原性トリインフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）を負荷し、次に、感染から１、２、又は３日後に開始した、単回用量の、２５ｍｇ／ｋｇの抗体１２又は２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回、５日間のオセルタミビルのいずれかでの治療を行った。各群（ｎ＝７）に対して、パーセント生存を算出した（図１４）。感染から１、２、及び３日後に開始した抗体１２での治療を行ったフェレット、ならびに感染から１日後にオセルタミビルで治療したものは、保護され、１００％の生存率を有した。しかし、感染から２及び３日後にオセルタミビル治療が開始された時、フェレットは各々、７１％の生存率（死滅の平均日が１２）及び２９％の生存率（死滅の平均日が９）しか有しなかった。予想どおり、感染から１日後に２５ｍｇ／ｋｇの非関連アイソタイプ対照抗体で治療した動物は、生存できず、生存率は０％であった。
【０２３１】
実施例１１  モノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）の選択によるエピトープの同定
抗体耐性突然変異体を、３つのＨ３Ｎ２ウイルスから２つの異なる方法を用いて単離した。Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ａｉｃｈｉ／６８）Ｈ３Ｎ２を、高濃度の抗体１２（１２５×ＩＣ５０）とともに、ウイルスと抗体の混合物が１０×９６ウェルプレート内、３０，０００ＴＣＩＤ５０／ウェルのＭＤＣＫ細胞に吸着される前に１時間インキュベートし、抗体１２（１０×ＩＣ５０）の存在下で培養した。感染から最大３日以内に、感染細胞に対する細胞変性効果（ＣＰＥ）を呈する３つの推定上の抗体１２  ＨＫ２／６８  ＭＡＲＭを単離した。ＨＡ遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、その後、配列決定した。配列分析によると、親配列と比べて、２つの非同義置換が示された（表７）。これら２つのヌクレオチド変化は各々、ＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内のアミノ酸位置１８及び１９での、イソロイシン（Ｉ）からアルギニン（Ｒ）へ、及びアスパラギン酸（Ｄ）からチロシン（Ｙ）への単一のアミノ酸置換をコードする。或いは、連続継代したインフルエンザＨ３Ｎ２ウイルス、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（ＷＩ０５）及びｃａ  Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｐａ９９）を、２〜５×ＩＣ５０から最大で１００×ＩＣ５０まで増加する濃度の抗体１２の存在下で増殖させた。有望なエスケープ変異体を、限界希釈によりサブクローニングし、それと同種のＨＡ遺伝子に対して配列分析を行った。ＨＡ２中、位置１９でのＤからＹへ、及び位置４２でのグルタミン（Ｑ）からＲへの単一のアミノ酸変化が同定された。加えて、二重突然変異が、Ｄ１９Ｙと併せてＨＡ１中の位置１５６でのヒスチン（Ｈｉｓｔｉｎｅ）（Ｈ）からＱへのアミノ酸置換、又はＨＡ２中の残基４５でのＩからＮへのアミノ酸変化と併せて位置１９でのＤからアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸置換、或いはＱ４２Ｒと併せてＨＡ１中の位置１９６でのアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）へのアミノ酸置換の場合に認められた（表７）。同様に、Ｐａ９９を最大１００×ＩＣ５０の濃度の抗体１２の存在下で連続継代した時、単一のアミノ酸置換が、ＨＡ２残基４２（Ｑ４２Ｒ）及び４５（Ｉ４５Ｔ）で選択された（表７）。表７に示される代表的なＭＡＲＭ変異体を、マイクロ中和アッセイで用いて、抗体１２による中和に対するこれらＭＡＲＭの表現型感受性をさらに評価した。結果は、インビトロで選択された、突然変異Ｄ１９Ｙ、Ｈ１５６Ｑ／Ｄ１９Ｙ、Ｄ１９Ｎ／Ｉ４５Ｎ、Ｑ４２Ｒ又はＡ１９６Ｔ／Ｑ４２Ｒを有するＷＩ０５  ＭＡＲＭ；Ｑ４２Ｒ又はＩ４５Ｔを有するＰａ９９  ＭＡＲＭ、及び突然変異Ｄ１９Ｙ又はＩ１８Ｒを有するＡｉｃｈｉ／６８  ＭＡＲＭが、それらの親野生型株と各々比べたとき、抗体中和に対してより低い感受性を示し、ＩＣ５０計算値の増加がＰａ９９耐性クローンにおける８倍超からＷＩ０５耐性変異体における１８０倍超にかけての範囲であることを示した（表８）。これらのアミノ酸置換の抗体１２による中和への感受性に対する効果を評価するため、個別の突然変異をコードする組換えＡ／Ｈｏｎｇ  ｋｏｎｇ／１−５／６８（ｒＨＫ６８）Ｈ３変異体を作成し、マイクロ中和アッセイを用いて評価した。表９に示されるとおり、Ｈ３  ｒＨＫ６８＿Ｉ１��Ｒ及びｒＨＫ６８＿Ｄ１９Ｙ変異体は、試験した最高濃度（約２００μｇ／ｍＬ）で抗体１２に対する耐性を呈し、抗体１２による中和への感受性において、野生型ｒＨＫ６８ウイルスと比べて１３０倍を超える低下をもたらした。ｒＨＫ６８における単一のアミノ酸変化Ｑ４２Ｒは、抗体１２による中和への感受性において中程度の約８倍の低下をもたらした。しかし、選択したＭＡＲＭのＨＡタンパク質において同定されたアミノ酸置換（Ｋ１５６Ｑ、Ａ１９６Ｔ、Ｉ４５Ｎ又はＩ４５Ｔ）は、マイクロ中和アッセイにおいて、かかる置換をコードする組換えＨＫ６８ウイルスの抗体１２に対する感受性を改変しなかった。これらの結果は、抗体１２がＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内の立体構造エピトープを認識し、また位置１８、１９  ４２又は４５でのアミノ酸が重要な接触残基であることを示唆している。
【０２３２】
【表７】
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【０２３３】
【表８】
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【０２３４】
【表９】
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【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
【表１１】
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【０２３７】
【表１２】
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【０２３８】
【表１３】
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【０２３９】
Ａ型インフルエンザ  参考文献：
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【０２４０】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、単離抗体又はその結合断片であって、前記抗体又はその結合断片は配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含み、かつ前記抗体は天然抗体と比較して改変されたグリコシル化プロファイルを含む、前記単離抗体又はその結合断片。
【請求項２】
前記抗体が非グリコシル化型である、請求項１に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項３】
天然Fc領域と比較して改変されたグリコシル化プロファイルを有するFc領域を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項４】
Fc領域において存在するグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項５】
アスパラギン２９７の除去をもたらす置換を含む、請求項３に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項６】
Fc領域が非フコシル化型である、請求項３に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項７】
Fc領域が天然Fc領域と比較して増加した、又は減少したシアリル化プロファイルを含む、請求項３に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項８】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、単離抗体又はその結合断片であって、前記抗体又はその結合断片は配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含み、前記抗体又はその結合断片は治療剤、検出可能標識、又は固体支持体にコンジュゲート又は共有結合されている、前記単離抗体又はその結合断片。
【請求項９】
前記抗体又はその結合断片がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成高分子、高分子マイクロパーティクル、生体細胞、ウイルス、フルオロフォア、発色団、色素、毒素、ハプテン、酵素、抗体、抗体断片、放射性同位元素、固体マトリックス、半固体マトリックス、又はそれらの組み合わせにコンジュゲートされている、請求項８に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項１０】
配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離抗体又はその結合断片。
【請求項１１】
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、かつＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある、単離抗体又はその結合断片であって、配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２、配列番号１１５のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１１２のＶＨに対して少なくとも７５％の同一性を有するＶＨ、及び配列番号１１７のＶＬに対して少なくとも７５％の同一性を有するＶＬを含む、前記単離抗体又はその結合断片。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片をコードする単離核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸又は請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片を作製するための方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を、前記抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項１７】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片を含む組成物。
【請求項１８】
被験体におけるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬物の製造における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片の使用。