(57)【要約】【課題】培地の強度を要する試験等に利用できる微生物用培地を形成できる、微生物培地用組成物を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類と、一価の金属イオンとを含む微生物培地用組成物：（ａ）ゲランガム；（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類と、一価の金属イオンとを含む微生物培地用組成物：
（ａ）ゲランガム；
（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；
（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。
【請求項２】
前記多糖類の含有量の合計が０．１重量％以上である、請求項１に記載の微生物培地用組成物。
【請求項３】
前記多糖類の少なくともいずれか１種を０．１重量％超含む、請求項１または２に記載の微生物培地用組成物。
【請求項４】
前記多糖類の含有量の合計が１．０重量％以下である、請求項１から３のいずれか１項に記載の微生物培地用組成物。
【請求項５】
さらに酵母エキス、ポリペプトンおよびスクロースを含み、前記一価の金属イオンの供給源として塩化ナトリウムを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の微生物培地用組成物。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類、および一価の金属イオンの混合物を加熱する加熱工程と、
前記加熱工程にて加熱された混合物をゲル化させるゲル化工程と、
を含む、微生物培地の製造方法：
（ａ）ゲランガム；
（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；
（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物培地用組成物および微生物培地の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物を培養するための培地として、固体培地または液体培地が用いられている。固体培地では、培地を固めるため多糖類が用いられており、なかでも寒天が多用されている。しかし寒天は、原料となる海藻の収穫量が減少することにより、需要を満たせなくなる虞があることが発表されている（非特許文献１）。そのため、多糖類として寒天の代替となる素材の開発が喫緊の課題となっている。
【０００３】
特許文献１では、コンニャクグルコマンナンを用いた培地支持体について開示されている。また、非特許文献２では、ゲランガムに二価の金属イオンを加えることにより固体培地を作製できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２７１２８１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Microbiology's most important reagent is in short supply, Ewen Callaway, Nature 528(2015) p. 171-172
【非特許文献２】GELRITE as an Agar Substitute in Bacteriological Media, Shungu et. al., Applied and Environmental Microbiology Vol.46, No.4, (1983) p. 840-845.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のような従来技術は、微生物の培養に必要な強度を備えた培地を安価に提供する観点から、改善の余地があった。特許文献１に示す培地支持体では、培養物、例えば植物の成長に合わせて柔軟に変形できることが意図されている。そのため、当該培地支持体では、培地に強度を要する単一コロニー分離のような試験等に利用することは意図されていない。また、非特許文献２に示すゲランガムを用いた培地では、２価の金属イオンが必要であるとともに、ゲランガムが比較的多量に用いられている。
【０００７】
そこで、本発明の一態様は、寒天を用いずとも、微生物の培養に必要な強度を備えた培地を安価に提供することができる、微生物培地用組成物を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の課題を解決するために、本発明の発明者が鋭意検討したところ、多糖類と、一価の金属イオンとを含む微生物培地用組成物により形成される微生物培地は、寒天を用いずとも、微生物の培養に必要な強度を備えることを見出した。すなわち、本発明は以下の態様を含む。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類と、一価の金属イオンとを含む微生物培地用組成物：
（ａ）ゲランガム；
（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；
（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。
〔２〕前記多糖類の含有量の合計が０．１重量％以上である、〔１〕に記載の微生物培地用組成物。
〔３〕前記多糖類の少なくともいずれか１種を０．１重量％超含む、〔１〕または〔２〕に記載の微生物培地用組成物。
〔４〕前記多糖類の含有量の合計が１．０重量％以下である、〔１〕から〔３〕のいずれか１つに記載の微生物培地用組成物。
〔５〕さらに酵母エキス、ポリペプトンおよびスクロースを含み、前記一価の金属イオンの供給源として塩化ナトリウムを含む、〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載の微生物培地用組成物。
〔６〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類、および一価の金属イオンの混合物を加熱する加熱工程と、前記加熱工程にて加熱された混合物をゲル化させるゲル化工程と、を含む、微生物培地の製造方法：
（ａ）ゲランガム；
（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；
（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一態様によれば、寒天を用いずとも、微生物の培養に必要な強度を備えた培地を安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験１の培養結果を示す図である。
【図２】試験２における電気泳動の結果を示す図である。
【図３】試験３で用いた多糖類の量の関係を示す図である。
【図４】試験４の培養結果を示す図である。
【図５】試験５の培養結果を示す図である。
【図６】試験６の培養結果を示す図である。
【図７】試験７の培養結果を示す図である。
【図８】試験８の培養結果を示す図である。
【図９】試験９の培養結果を示す図である。
【図１０】試験９の培養結果を示す図である。
【図１１】試験１０の培養結果を示す図である。
【図１２】試験１１の培養結果を示す図である。
【図１３】試験１１の培養結果を示す図である。
【図１４】試験１１の培養結果を示す図である。
【図１５】微生物培地の強度の試験方法の概要を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１２】
〔１．微生物培地用組成物〕
本発明の一実施形態に係る微生物培地用組成物は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類と、一価の金属イオンとを含む：
（ａ）ゲランガム；
（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン；
（ｃ）ゲランガムおよびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種。
【００１３】
微生物培地用組成物は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類と、一価の金属イオンとを含むことにより、寒天を用いずとも、微生物の培養に必要な強度を備えた培地を形成できる。また、後述のように多糖類の使用量を比較的低濃度とすることが可能であるため、培地を安価に提供することができる。
【００１４】
本明細書中、「微生物培地用組成物」とは、微生物を培養する固体培地の作製に用いられる組成物であって、当該組成物を用いて固体培地を形成した際に、内部に水を含み、水溶液に不溶な三次元構造を形成する組成物を意図する。なお、以下では、微生物培地用組成物を単に「組成物」とも称する。また、内部に水を含み、水溶液に不溶な三次元構造を有する高分子物質の膨潤体を「ハイドロゲル」とも称する。前記組成物は、内部に水を含んだ三次元構造を形成する前の液体であってもよく、あるいは、液体状に溶解する前の粉末であってもよい。例えば、前記組成物は、水（蒸留水等）に各種成分を溶解させた液体であってもよい。
【００１５】
本明細書中、「微生物」とは、細菌または菌類などであってよく、ウイルス、微細藻類、原生動物（アメーバまたはゾウリムシなど）などを含んでもよい。特に限定されないが、例えば、細菌としては大腸菌等が挙げられ、菌類としては酵母、カビ等が挙げられる。
【００１６】
本明細書中、微生物の培養に必要な強度とは、例えば、固体培地を形成した場合に、単一コロニー分離（ＳＣＩ）に用いることができる強度であってよく、swarm plate assay（ＳＰＡ）に用いることができる強度であってよい。さらに、前記多糖類の量を変更することにより、ＳＣＩに用いることができる強度と、ＳＰＡに用いることができる強度との両方の強度を示すことができる前記組成物であることがより好ましい。
【００１７】
なお、本明細書中、ＳＣＩとは、コロニーを形成した微生物を無限希釈することにより、単一のコロニーを分離することを意図する。具体的には、ループを有する白金耳を用いて微生物を固体培地上にストリークすることを繰り返し、単一のコロニーを分離する。ここで、固体培地の強度が低い場合、ループが固体培地に埋没してしまうため、ＳＣＩの実施が困難である。
【００１８】
また、本明細書中、ＳＰＡは、微生物の鞭毛等により、微生物が固体培地の上を移動できるか否かを判定する試験を意図する。固体培地の強度が低い場合、鞭毛による微生物の移動を観察することが難しい。
【００１９】
＜１−１．多糖類＞
微生物培地用組成物は、多糖類として、（ａ）ゲランガム、（ｂ）ゲランガムおよびカラギーナン、（ｃ）ゲランガム、およびカラギーナンのうちの少なくとも１種、並びにグルコマンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガムおよびペクチンのうちの少なくとも１種、のいずれかを含む。
【００２０】
ゲランガムは、２つのＤ−グルコース残基と１つのＬ−ラムノース残基と１つのＤ−グルクロン酸残基とから構成される四糖の繰り返し単位が直鎖状に連結した多糖類である。ゲランガムの市販品としては、富士フィルム和光純薬社製ゲランガムまたはイナゲルＥ−１５０（伊那食品工業株式会社製）等が挙げられる。
【００２１】
カラギーナンは、Ｄ−ガラクトースがα−１，３結合またはβ−１，４結合を交互に繰繰り返した構造をした多糖類である。カラギーナンとしては、κ−カラギーナン、ι−カラギーナン、λ−カラギーナン等が挙げられる。東京化成製κ−カラギーナン等の市販品を用いてもよい。
【００２２】
グルコマンナンは、グルコースとマンノースとがグリコシド結合した多糖類である。グルコマンナンとしては、例えばコンニャク精粉（製造元：茂木食品工業株式会社、群馬県下仁田町）、またはコンニャク粉（製造元：株式会社 荻野商店、群馬県下仁田町）等のように市販されている純度の低いグルコマンナンを用いてよい。あるいは、ビストップ（登録商標）Ｄ−２１３１（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）、プロボール Ａ（清水化学株式会社）等の精製されたコンニャク粉等の市販品を用いてもよい。
【００２３】
ガラクトマンナンは、ガラクトースとマンノースとがグリコシド結合した多糖類である。例えば、ローカストビーンガム由来、タラガム由来、またはグアガム由来のガラクトマンナンが挙げられる。またガラクトマンナンは、未精製のものであっても、精製されたものであってもよい。ガラクトマンナンとして、市販品を適宜利用してもよい。これらのガラクトマンナンの市販品としては、ユニテックフーズ社の製品が挙げられる。
【００２４】
キサンタンガムは、グルコース２分子、マンノース２分子、およびグルクロン酸の繰り返し単位からなる多糖類である。キサンタンガムとしては、例えば、株式会社マルゴーコーポレーション販売のキサンタンガム、またはカーギル社製のSATIAXANETM CX93等の市販品を用いることができる。
【００２５】
ペクチンは、植物の細胞壁または中葉に含まれる複合多糖類で、ガラクツロン酸がα-１、４結合したポリガラクツロン酸が主成分である。そして、ペクチンはガラクツロン酸のカルボキシル基がメチルエステル化されたものである。ペクチンとしては、例えば、富士フィルム和光純薬製、柑橘由来のペクチン等の市販品を用いることができる。
【００２６】
多糖類としては、ゲランガムを用いること、ゲランガムと、カラギーナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、またはキサンタンとを用いること、あるいはκ−カラギーナンと、グルコマンナンまたはガラクトマンナンとを用いることが好ましい。より好ましくはゲランガムと、カラギーナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、またはキサンタンとの組み合わせ、またはκ−カラギーナンと、グルコマンナンまたはガラクトマンナンとの組み合わせが用いられる。
【００２７】
前記組成物は、上述する多糖類の含有量が合計で０．１重量％以上であることが好ましく、０．２重量％以上であることがより好ましい。多糖類を合計で０．１重量％以上含むことにより、ＳＰＡに用いることのできる強度を備える微生物培地を形成できる。
【００２８】
また、前記組成物は、上述する多糖類の少なくともいずれか１種を、０．１重量％超含むことが好ましく、０．２重量％以上含むことがより好ましい。前記組成物が多糖類の少なくともいずれか１種を０．１重量％超含むことにより、ＳＣＩに用いることのできる強度を備えた微生物培地を形成できる。
【００２９】
例えば、前記組成物は、グルコマンナン０．１重量％以上、且つｋ−カラギーナン０．２重量％以上であるか、グルコマンナン０．２重量％以上、且つｋ−カラギーナン０．１重量％以上であることが望ましい。
【００３０】
また、前記組成物は、上述する多糖類の含有量の合計が１．０重量％以下であることが好ましく、１．０重量％未満であることがより好ましく、０．７重量％以下であることがさらに好ましく、０．５重量％以下であることが特に好ましい。前記組成物が多糖類を合計で１．０重量％以下含むことにより、多糖類の使用量を低減でき、微生物培地を作製するコストを低減できる。寒天を用いた微生物培地では、通常、１．０重量％以上の寒天が用いられる。すなわち、前記組成物は、寒天よりも少ない量の多糖類によって、寒天と同程度の強度を実現することができる。また、非特許文献２では１．０重量％のゲランガムが用いられている。前記組成物は、この非特許文献２に記載の技術よりも少ない量の多糖類によって、寒天と同程度の強度を実現することができる。
【００３１】
前記多糖類は、多糖類の他の不純物を含む純度の低い市販品であってもよいし、純度の低い市販品を独自に精製して多糖類の他の不純物を除去したものを用いてもよい。
【００３２】
多糖類の精製方法は、特に限定されず、多糖類の精製方法として公知の精製方法を用いればよい。例えば、下記に示すような、多糖類水溶液に活性炭を作用させて多糖類を精製する方法が適用され得る。
【００３３】
前記多糖類水溶液としては、特に限定されないが、例えば多糖類をエタノールに懸濁し、これを水（蒸留水等）に加えて得られる水溶液が挙げられる。多糖類水溶液における多糖類の濃度（すなわち、多糖類水溶液の濃度）は、特に限定されず、多糖類水溶液の粘度を上げ過ぎることなく、多糖類を好適に溶解させる範囲において、適宜決定される。エタノールおよび水の量は多糖類の量等に応じて適宜決定すればよい。ここで、エタノールの添加は、多糖類を容易に水に分散させることを目的としている。
【００３４】
また、撹拌しながら多糖類水溶液を作製してもよい。多糖類水溶液を手動で（すなわち、撹拌棒等を用いて）撹拌してもよく、撹拌機構を備えた装置によって撹拌してもよい。撹拌機構を備えた装置としては、マグネチックスターラー等が挙げられる。多糖類水溶液を撹拌する時間は特に限定されず、例えば、３０分〜２時間である。また、多糖類水溶液を撹拌する温度としては、例えば、５℃〜２５℃である。
【００３５】
多糖類水溶液として、多糖類水溶液から固液分離された上清を用いてもよい。固液分離は、遠心分離、ろ過、等の公知の固液分離方法を用いて行うことができる。例えば、遠心分離により固液分離を実施する場合、遠心分離の条件（時間、温度、遠心力（×ｇ）等）は、上清の量および上清に含まれる多糖類水溶液の濃度等に応じて適宜決定すればよい。
【００３６】
活性炭の原料および形態は、特に限定されない。また、活性炭の添加量は、多糖類水溶液の量および濃度等に応じて適宜決定すればよい。
【００３７】
多糖類水溶液に活性炭を加えた後、撹拌することが好ましい。撹拌を行うことで、活性炭への不純物の吸着を効率的に行うことができると考えられる。撹拌方法は特に限定されず、手動で撹拌してもよく、撹拌機構を備えた装置によって撹拌してもよい。撹拌機構を備えた装置としては、マグネチックスターラー等が挙げられる。
【００３８】
多糖類水溶液に含まれ得る不純物を除去できる限りにおいて、活性炭以外にその他の成分を多糖類水溶液に加えてもよい。その他の成分として、例えば、ＥＤＴＡ、アジ化ナトリウム等の防腐剤が挙げられる。その他の成分の量は、多糖類水溶液の容量および濃度等に合わせて適宜決定すればよい。
【００３９】
多糖類の精製方法は得られた溶液を遠心分離した後、さらに、上清を回収する工程を含んでいてもよい。遠心分離の時間、遠心分離の遠心力および遠心分離の温度等の遠心分離条件は、上清の量および上清に含まれる多糖類の濃度等に応じて適宜決定すればよい。
【００４０】
回収した上清に対して、さらに遠心分離を繰り返し行ってもよい。また、必要に応じ、ナイロンメッシュ等で上清を濾過してもよい。
【００４１】
＜１−２．一価の金属イオン＞
一価の金属イオンは、多糖類がゲル化することにより微生物培地を形成することを促進する。なお、本明細書中、「ゲル化」とは、前記組成物が、内部に水を含み、水溶液に不溶な三次元構造を形成することを意図する。特許文献１および非特許文献２に記載されているように、通常ゲランガムのゲル化には二価の金属イオンが必要である。一価の金属イオンを用いて上述の多糖類のゲル化が可能であることは本発明者が独自に見出したことである。
【００４２】
一価の金属イオンとしては、アルカリ金属、すなわち、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムまたはフランシウム等のイオンを用いることができる。入手が容易であり、微生物への悪影響が少ないという観点からは、ナトリウムイオンまたはカリウムイオンが好ましい。そして、一価の金属イオンの供給源として、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、またはハロゲン化塩等の塩が前記組成物に添加されてもよい。そのような塩として、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが用いられる。
【００４３】
一価の金属イオンの添加量は、多糖類および一価の金属イオンの種類や、それらの濃度に応じて、適宜最適な添加量が決定され得る。
【００４４】
＜１−３．その他の成分＞
微生物培地用組成物はさらに、微生物を培養するために必要な成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、炭素源、窒素源等が挙げられる。炭素源としては、炭水化物（単糖、オリゴ糖、多糖、糖アルコール等）、有機酸、アルコール類、脂質類等が挙げられる。窒素原としては、酵母エキス、ポリペプトン、ペプトン、大豆粉、コーンスティープリカー等の含窒素化合物；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩等が挙げられる。これらは一種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせてもよい。
【００４５】
前記組成物が、酵母エキス、ポリペプトンおよび塩化ナトリウムを含むＬＢ培地を含む場合、大腸菌を培養するために好適に利用できる。また、前記組成物が、酵母エキス、ポリペプトンおよびデキストロースを含むＹＰＤ培地、または酵母エキス、ポリペプトンおよびスクロースを含むＹＰＳ培地を含む場合、酵母を培養するために好適に利用できる。あるいは、前記組成物が、酵母エキス、ポリペプトン、スクロースおよび塩化ナトリウムを含むＹＰＳＳ培地を含む場合、大腸菌および酵母を培養するために好適に利用できる。特に前記組成物がＹＰＳＳ培地を含む場合、大腸菌用の培地および酵母用の培地のいずれにも用いることができるため、好ましい。
【００４６】
前記組成物は、さらに例えば、選択マーカーとして利用するために抗生物質（ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン等）を含んでいてもよい。また、前記組成物は、好酸性菌または好アルカリ菌等を培養するために、ｐＨを変化させる酸またはアルカリを含んでいてもよい。酸またはアルカリとして、例えば希硫酸、または水酸化ナトリウムなどを用いることができる。
【００４７】
他にも、微生物培地用組成物に含まれる成分として、寒天培地に用いることができる成分を制限なく用いることができる。例えば、前記組成物は、無機塩類、ビタミン等の補酵素、色素類等を含んでいてもよい。
【００４８】
〔２．微生物培地の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る微生物培地の製造方法について以下に説明する。微生物培地の製造方法は、少なくとも、加熱工程と、ゲル化工程とを含んでいればよい。これにより、寒天を用いずとも、微生物の培養に必要な強度を備えた培地を安価に提供することができる。
【００４９】
＜２−１．加熱工程＞
加熱工程は、上述の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示す多糖類、および一価の金属イオンの混合物を加熱する工程である。すなわち、加熱工程は、上述の微生物培地用組成物を加熱することにより、多糖類を溶解させる工程である。そのため、多糖類の融点以上に加熱することが好ましい。例えば、多糖類としてグルコマンナンを用いた場合では、７０℃以上に加熱することが好ましい。多糖類の融点以上に加熱することにより、多糖類が溶解するため、均一な微生物培地を形成できる。
【００５０】
＜２−２．ゲル化工程＞
ゲル化工程は、前記加熱工程にて加熱された混合物をゲル化する工程である。例えば、加熱した混合物を放置することによってゲル化させることが好ましい。これにより、ハイドロゲルとして培地を得ることができる。放置する温度は、混合物がゲル化できる温度であれば特に限定されるものではないが、例えば、２０〜５０℃であることが好ましく、室温であることがより好ましい。
【００５１】
＜２−３．その他の工程＞
前記製造方法は、成形工程を含んでいてもよい。成形工程は、ゲル化された混合物、すなわちハイドロゲルを所望の形状に成形する工程である。例えば、シャーレまたは試験管等の容器を用いて、ハイドロゲルを平板培地、高層培地、斜面培地または半斜面培地などの所望の培地の形状となるよう成形してもよい。培地の形状は、培養したい菌種および試験に応じた適宜選択される。
【００５２】
なお、成形工程は、ゲル化工程と同時に行われてもよい。例えば、加熱工程において溶解した混合物を型に流し込んだ後に放置しゲル化することによって、所望の形状の培地を得ることができる。
【００５３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例では、大腸菌として、ｐＵＣ１９を導入した大腸菌ＤＨ５αを用い、酵母としてＢＹ４７４２を用いた。
【００５５】
〔強度試験〕
規定の濃度の溶液である微生物培地用組成物を自動式高圧蒸気滅菌器（モデルMLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を６０℃程度まで冷却した。その後、当該溶液４．５ｍＬを直径３５ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Thermo Fisher社）に注ぎ、約３０分間室温に放置することにより微生物培地を作製した。
【００５６】
図１５は、微生物培地の強度の試験方法の概要を示した図である。図１５の（ａ）に示すように規定の重さの分銅を、固化した微生物培地に積載し、３０秒間静置した。分銅としては、略円筒形の分銅（(株)村上衡器製作所製）を使用した。その後に、分銅を取り除き、微生物培地が破断しているか否かを評価した。
【００５７】
図１５の（ｂ）に示すように分銅が細胞培養皿の底面に接触した場合、微生物培地が破断したと判断した。図１５の（ｃ）または（ｄ）に示すように分銅が微生物培地上に維持された場合は、微生物培地が破断していないと判断した。また、分銅による負荷に伴い微生物培地から溶液が排出された場合では、分銅を取り除いた後、スポイトなどを用いて微生物培地から排出された溶液の量を測定した。
【００５８】
なお、１ｇ以上の分銅を積載しても微生物培地が破断しなかった場合、ＳＰＡに用いることのできる強度を備えた微生物培地であると判断した。また、１００ｇ以上の分銅を積載しても微生物培地が破断しなかった場合、ＳＣＩに用いることのできる強度を備えた微生物培地であると判断した。
【００５９】
〔試験１．ｐＨが微生物培地に与える影響の評価〕
＜実施例１＞
κ−カラギーナンが０．４重量％、グルコマンナンが０．１重量％含まれるようにκ−カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Miller、粉末、Nacalai Tesque製）、蒸留水を混合することにより微生物培地組成物である溶液を作製した。なお、ＬＢ  ｂｒｏｔｈは塩化ナトリウムを含んでいる。得られた溶液のｐＨを、ｐＨメーターを用いて測定したところ、ｐＨ７．０であった。
【００６０】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【００６１】
＜実施例２＞
加熱滅菌する前の溶液に希硫酸を加えることにより、ｐＨ４．５である溶液を得たこと以外は実施例１と同様にして微生物培地を得た。
【００６２】
＜実施例３＞
加熱滅菌する前の溶液に水酸化ナトリウムを加えることにより、ｐＨ９．５である溶液を得たこと以外は実施例１と同様にして微生物培地を得た。
【００６３】
＜大腸菌の播種＞
プラスミドベクターｐＵＣ１９（GibcoBRL）を遺伝子導入したコンピテントな大腸菌ＤＨ５α株（タカラバイオ株式会社、ＤＨ５α（ｐＵＣ１９））を、ＬＢ培地にて１５時間震盪培養した。なお、当該ＬＢ培地は、前記ＬＢ  ｂｒｏｔｈを蒸留水で希釈することにより得られ、１００ｍＬ当たり酵母エキス０．５ｇ、ポリペプトン１．０ｇ、および塩化ナトリウム１．０ｇを含む。震盪培養後の菌体液に、アンピシリンを含むＬＢ培地（ＬＢ／Ａｍｐ）を加えることによる１０倍希釈を５回行った（１０倍希釈した菌体液をさらに１０倍希釈することを繰り返した）。なお、ＬＢ／Ａｍｐは、前記と同じ組成のＬＢ培地にアンピシリンを加えることによって得た。さらに、希釈された菌体液２０μＬとＬＢ／Ａｍｐ８０μＬとを混合することにより播種用菌体液を作製した。
【００６４】
当該菌体液を、Ｌ型スプレッダー（Greiner社）を用いて、もしくはInoculating loop （QuadLoop, MINIPLAST EIN SHEMER）を用いたＳＣＩによって上述の微生物培地に播種した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３７℃、２４時間、培養を行った。
【００６５】
＜結果＞
図１の（ａ）は実施例１でInoculating loopを用いた場合、（ｂ）は実施例１でＬ型スプレッダーを用いた場合、（ｃ）は実施例２、（ｄ）は実施例３の培養結果を示す図である。図１の（ａ）〜（ｄ）からわかるように、微生物培地のｐＨを変更した場合であっても、大腸菌を培養することができた。従って、前記組成物は、広範囲なｐＨにおいて性質が変化せず、好酸性菌または好アルカリ菌を含む多様な微生物の固体培養に用いることができることがわかった。また、いずれの微生物培地もＳＣＩを行うことができた。
【００６６】
〔試験２．プラスミド導入の確認〕
ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡがコンピテントな大腸菌に取り込まれ、当該大腸菌が、有効活性を持つアンピシリンを含む上述の培地（実施例１で作製した微生物培地）上で、寒天を用いた培地と同様に増殖することを確認するため、以下の試験を行った。
【００６７】
＜ＰＣＲ反応＞
反応液（全量１０μＬ）として、１０μＭ  プライマー合計で２μＬ、２×ＰＣＲ  ｍｉｘを５μＬ、大腸菌の単一コロニーをＬＢ／Ａｍｐ２０μＬに懸濁した菌体液を１μＬ、蒸留水を２μＬ用いた。なお、プライマーとしてＭ１３ｒｅｖ（配列番号１：ＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧ）１μＬ、およびＭ１３ｆｗｄ（−２０）（配列番号２：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ）１μＬを用いた。
【００６８】
ＰＣＲ装置（GeneAtlas、アステック株式会社、モデル４８０）を用いた。ＰＣＲ反応としては、以下のように行った：９５℃、１分、１回；９５℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で１５秒のサイクルを３５回；７２℃、５分、１回。
【００６９】
ＰＣＲ産物は、定法によりアガロース電気泳動法で分析した（T. Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory参照）。
【００７０】
アガロースゲル（電気泳動用ゲル）は、４％アガロース（Recenttec）を含むＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて形成した。そして、形成した電気泳動用ゲルを用いて、１００Ｖ、３５分間電気泳動し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍＬ）で染色した。染色した電気泳動用ゲルを、アガロースゲル撮影装置（ＵＶイルミネーター、Model BioDoc-It（登録商標）、Imaging sysytem, UVP社製）を用いて撮影した。
【００７１】
＜結果＞
図２は、試験２における電気泳動の結果を示す図である。図２の（ａ）および（ｂ）のレーン１および９では、ＤＮＡ分子量マーカーとして、５０ bp DNA Ladder（タカラバイオ製）を用いた。
【００７２】
図２の（ａ）のレーン２〜８は、大腸菌としてランダムに単一コロニーから採取した大腸菌を用い、ＰＣＲ法で遺伝子を増幅した後、アガロース電気泳動法を行なった結果である。
【００７３】
図２の（ｂ）のレーン１５では、２５／１００ bp Mixed DNA Ladder（BIONEER製）にＤＮＡ制限酵素処理を行った。ＤＮＡ制限酵素処理（全量１０μＬ）は、ＰＣＲ産物１μＬ、10×Fast Digest buffer（Thermo Fisher製）１μＬ、制限酵素（タカラバイオ製）１μＬ、蒸留水７μＬを、３７℃にて１時間反応させることにより行った。反応終了後、全量１０μＬから３μＬをレーン１５にてアガロース電気泳動に供した。
【００７４】
また、図２の（ｂ）のレーン１０はＰＣＲ産物であって未消化のＤＮＡ断片（１０３ｂｐ）、レーン１１はＥｃｏＲＩで処理したＤＮＡ断片（１８ｂｐおよび８５ｂｐ）、レーン１２は、ＳｃａＩで処理したＤＮＡ断片（２４ｂｐおよび７９ｂｐ）、レーン１３はＢａｍ  Ｈ１で処理したＤＮＡ断片（３５ｂｐおよび６８ｂｐ）、レーン１４はＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片（３２ｂｐおよび７１ｂｐ）の結果を示す。なお、括弧内は、それぞれの予想される切断断片の大きさを示す。
【００７５】
図２の（ｂ）に示すように、ＤＮＡ断片として予想される切断断片の大きさを有するＤＮＡ断片が得られており、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡが導入された大腸菌であることが確認できた。
【００７６】
以上より、プラスミドＤＮＡの導入からアンピシリンを含む大腸菌の微生物培地における育成までの全過程が問題なく実施されており、当該微生物培地が寒天を用いた培地の代替となることが確認できた。
【００７７】
〔試験３：微生物培地の強度の評価〕
まずκ−カラギーナン粉末（東京化成製）を０．５重量％となるように蒸留水に溶解させた。得られたκ−カラギーナン溶液１０．００ｇを１０分間遠心分離することにより、上清を回収した。回収した上清に終濃度が１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えた。そして、調製後のκ−カラギーナン溶液を冷蔵保存した。
【００７８】
また、グルコマンナン粉末（荻野商店製）を０．６重量％となるように蒸留水に溶解させた。得られたグルコマンナン溶液１０．００ｇを１０分間遠心分離することにより、上清を回収した。回収した上清に終濃度が１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えた。そして、調製後のグルコマンナン溶液を冷蔵保存した。
【００７９】
＜実施例４〜１１、比較例１、２＞
κ−カラギーナンおよびグルコマンナンが図３および後述の表１に示す濃度になるように、κ−カラギーナン溶液とグルコマンナン溶液とを使用し、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムを１重量％加え、微生物培地用組成物である溶液を得た。当該溶液を用いて作製した微生物培地の強度を評価した。また、実施例１と同様にして微生物培地を作製し、試験１と同様にＳＣＩも行った。
【００８０】
＜結果＞
組成および評価結果を、表１に示す。なお、表１の番号２〜１０は、図３の２〜１０に対応する。
【００８１】
表１において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１２０ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。１２０ｇの分銅でも破断した場合は×とした。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没した場合は×（不適）、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）とした。ＮＤはデータ無しを表す。
【００８２】
【表１】
2020178665.tif 000003
【００８３】
比較例１のように、κ−カラギーナンが０．３重量％のみの場合では、ＳＣＩが実施できなかった。また、比較例２のようにκ−カラギーナンを用いずにグルコマンナンを用いた場合は、ゲル化せず試験に用いることができなかった。
【００８４】
実施例４〜１０では、ＳＣＩを実施できるだけの強度を有していた。また、二つの成分を適正割合で混合したことによる融点の変化も観察された。そして、いずれかの多糖類を０．１重量％超含む場合、具体的にはκ−カラギーナンを０．２重量％以上かつグルコマンナンを０．１重量％以上含む場合、またはκ−カラギーナンを０．１重量％以上かつグルコマンナンを０．２重量％以上含む場合に微生物培地の強度がＳＣＩなどを実施するに好ましい強度を有することが判った。
【００８５】
〔試験４：カラギーナンの種類〕
＜実施例１１〜１３＞
κ−カラギーナンとして三晶株式会社製３Ｓ−８、３Ｓ−９、伊那食品工業製Ｉｎａｇｅｌを用い、κ−カラギーナンが０．３重量％、グルコマンナンが０．２重量％となるようにしたこと以外は、実施例１と同様の方法により微生物培地用組成物である溶液を作製した。微生物培地を作製し強度の評価を行った。また、試験１と同様にＳＣＩも実施した。
【００８６】
＜比較例３、４、参考例１、２＞
κ−カラギーナンおよびグルコマンナンの代わりに精製寒天（BactoAgar、Nacalai Tesque製）を表２に示す量で用いたこと以外は実施例１１と同様にして溶液を作製した。また、微生物培地を作製し強度の評価を行った。試験１と同様にＳＣＩも実施した。
【００８７】
＜結果＞
図４の（ａ）は比較例４、（ｂ）は参考例１、（ｃ）は参考例２、（ｄ）は実施例１１、（ｅ）は実施例１２、（ｆ）は実施例１３の培養結果を示す図である。組成および評価結果を、表２に示す。
【００８８】
表２において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１２０ｇ、１００ｇ、７０ｇ、５０ｇ、２０ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。２０ｇの分銅でも破断した場合は×とした。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没した場合は×（不適）、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）、Inoculating loopでは埋没したが、Ｌ字スプレッダーを用いてコロニーを単離できた場合は○（適）とした。ＮＤはデータ無しを表す。
【００８９】
【表２】
2020178665.tif 000004
【００９０】
実施例１１〜１３に示すように、κ−カラギーナンの種類を変更した場合であっても、微生物培地の強度に差はなかった。そして、実施例１１〜１３では、参考例１および２と同等の強度を有する微生物培地が得られた。すなわち、上述の微生物培地は、寒天を用いた微生物培地に比べ少ない量の多糖類によって、寒天より高い融点に移行し、同等の強度を実現することができるため、微生物培地を作製するためのコストを低減することができる。また、比較例３では２０ｇの分銅で微生物培地が破断した。
【００９１】
また、培養後、２４時間経過後のコロニーの大きさは実施例１１〜１３で差はない。さらに実施例１１〜１３で使用した微生物培地では、比較例４にて使用した微生物培地と同様のコロニーの大きさとなり、微生物培地の強度が高くてもコロニーの成長を抑制しないことが示された。なお、実施例１１〜１３の培地は、比較例３、４、参考例１、２の寒天培地に比べて透明性に優れていた。
【００９２】
〔試験５：カラギーナンと種々の多糖類との組み合わせの検討〕
＜実施例１４＞
κ−カラギーナンが０．３重量％、グルコマンナンが０．２重量％含まれるようにκ−カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Miller、粉末、Nacalai Tesque製）、蒸留水を混合することにより微生物培地組成物である溶液を作製した。
【００９３】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。得られた溶液に、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【００９４】
試験１と同様に得た菌体液１０μＬを上述の微生物培地に播種した。また、Inoculating loop （QuadLoop, MINIPLAST EIN SHEMER）、もしくはＬ型スプレッダー（Greiner社）を用いてＳＣＩを実施した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３７℃、２０〜２４時間、培養を行った。また、強度の評価も行った。
【００９５】
＜実施例１５＞
グルコマンナン粉末の代わりにペクチン粉末（富士フィルム和光純薬製、柑橘由来）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【００９６】
＜実施例１６＞
グルコマンナン粉末の代わりにグアガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【００９７】
＜実施例１７＞
グルコマンナン粉末の代わりにローカストビーンガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【００９８】
＜実施例１８＞
グルコマンナン粉末の代わりにタラガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【００９９】
＜実施例１９＞
グルコマンナン粉末の代わりにキサンタンガム粉末（マルゴーコーポレーション製）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１００】
＜実施例２０＞
グルコマンナン粉末の代わりにゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）を用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１０１】
＜比較例５＞
グルコマンナンを用いなかったこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１０２】
＜参考例３＞
κ−カラギーナン粉末およびグルコマンナン粉末の代わりに精製寒天（BactoAgar、Nacalai Tesque製）を、表３に示す濃度となるように用いたこと以外は実施例１４と同様にして溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１０３】
＜結果＞
図５の（ａ）は参考例３、（ｂ）は実施例１４、（ｃ）は実施例１５、（ｄ）は実施例１６、（ｅ）は実施例１７、（ｆ）は実施例１８、（ｇ）は実施例１９、（ｈ）は実施例２０の培養結果を示す図である。組成および評価結果を、表３に示す。
【０１０４】
表３において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１２０ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没した場合は×（不適）、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）、Inoculating loopでは埋没したが、Ｌ字スプレッダーを用いてコロニーを単離できた場合は○（適）とした。
【０１０５】
【表３】
2020178665.tif 000005
【０１０６】
実施例１４〜２０に示すように、κ−カラギーナンと組み合わせる多糖類の種類を変更した場合いずれにおいても、微生物培地はＳＣＩを実施するために十分な強度を有することがわかる。
【０１０７】
〔試験６：ゲランガムと種々の多糖類との組み合わせの検討〕
＜実施例２１＞
κ−カラギーナン粉末の代わりにゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）を用い、ゲランガムを０．２重量％含むこと以外は、実施例１４と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１０８】
＜実施例２２＞
ゲランガムを０．３重量％含むこと以外は、実施例２１と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１０９】
＜実施例２３＞
グルコマンナン粉末の代わりにローカストビーンガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１０】
＜実施例２４＞
グルコマンナン粉末の代わりにタラガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１１】
＜実施例２５＞
グルコマンナン粉末の代わりにグアガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１２】
＜実施例２６＞
グルコマンナン粉末の代わりにキサンタンガム粉末（マルゴーコーポレーション製）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１３】
＜実施例２７＞
グルコマンナン粉末の代わりにκ-カラギーナン粉末（東京化成製）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１４】
＜実施例２８＞
グルコマンナン粉末を添加しない以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１５】
＜実施例２９＞
グルコマンナン粉末の代わりにペクチン粉末（富士フィルム和光純薬製、柑橘由来）を用いたこと以外は実施例２２と同様の方法により溶液を作製した。また、ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１１６】
＜結果＞
図６の（ａ）は実施例２１、（ｂ）は実施例２２、（ｃ）は実施例２３、（ｄ）は実施例２４、（ｅ）は実施例２５、（ｆ）は実施例２６、（ｇ）は実施例２７、（ｈ）は実施例２８、（ｉ）は実施例２９の培養結果を示す。組成および評価結果を、表４に示す。
【０１１７】
表４において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１００ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）、Inoculating loopでは埋没したが、Ｌ字スプレッダーを用いてコロニーを単離できた場合は○（適）とした。
【０１１８】
【表４】
2020178665.tif 000006
【０１１９】
実施例２１および２２から、ゲランガムの濃度を増加させることにより強度が上昇することがわかる。また、実施例２１〜２９に示すように、ゲランガムと組み合わせる多糖類の種類を変更した場合いずれにおいても、微生物培地はＳＣＩを実施するに十分な強度を有する。そして、二価の金属イオンを用いずに一価の金属イオンを用いた場合であっても、これらの多糖類から十分な強度を有する微生物培地を作製できることがわかる。
【０１２０】
〔試験７：酵母の培養〕
＜比較例６＞
ゲランガム０．２重量％、グルコマンナン０．２重量％を含むように、ゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ＹＰＤ培地を混合することにより、微生物培地用組成物である溶液を作製した。なお、ＹＰＤ培地は１００ｍＬ当たり、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストロース２ｇを含む。
【０１２１】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１２２】
ＳＣＩによって上述の微生物培地に酵母ＢＹ４７２４を播種した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３０℃、２日間、培養を行った。強度の評価も行った。
【０１２３】
＜比較例７＞
ＹＰＤ培地の代わりにＹＰＳ培地を用いたこと以外は比較例６と同様にして溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。なお、ＹＰＳ培地は１００ｍＬ当たり、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン２ｇ、スクロース２ｇを含む。
【０１２４】
＜実施例３０＞
塩化ナトリウム１重量％を含むように塩化ナトリウムを添加したこと以外は比較例６と同様にして溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１２５】
＜実施例３１、３２＞
ＹＰＤ培地の代わりにＹＰＳＳ培地を用い、ゲランガムの濃度を表５に示すように変更したこと以外は比較例６と同様にして溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。なお、ＹＰＳＳ培地は１００ｍＬ当たり、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン２ｇ、スクロース１ｇ、塩化ナトリウム１ｇを含む。
【０１２６】
＜参考例４＞
マグネシウムイオン０．１重量％を含むように硫酸マグネシウムを添加したこと以外は比較例６と同様にして溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１２７】
＜結果＞
図７の（ａ）は実施例３０、（ｂ）は実施例３１、（ｃ）は実施例３２、（ｄ）は参考例４の培養結果を示す。組成および評価結果を、表５に示す。
【０１２８】
表５において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１２０ｇ、１００ｇ、７０ｇ、５０ｇ、２０ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没した場合は×（不適）、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）、Inoculating loopでは埋没したが、Ｌ字スプレッダーを用いてコロニーを単離できた場合は○（適）とした。
【０１２９】
【表５】
2020178665.tif 000007
【０１３０】
一価の金属イオンを添加していない比較例６および７では十分な強度の培地を得ることができなかった。一価の金属イオンを含む実施例３０〜３２では十分な強度の培地を得ることができた。デキストロースを含む実施例３０に比べて、スクロースを含む実施例３１、３２ではより強い培地を得ることができた。これはゲランガム鎖の構成糖と類似したデキストロースがゲル形成の際の多糖類鎖の相互作用を阻害しているためと推測される。また、これらの培地は二価の金属イオンを含む参考例４と同様の強度と生育環境を提供できることが分かった。
【０１３１】
なお、参考例４にてマグネシウムイオン濃度を１重量％に変更した場合、溶液を１００℃の高温で加熱しても、粉末を十分に溶解させることができず、不均一なゲルが形成された。
【０１３２】
〔試験８：酵母の培養における各種多糖類の検討〕
＜実施例３３＞
ゲランガム０．４重量％を含むように、ゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）、ＹＰＳＳ培地を混合することにより、微生物培地用組成物である溶液を作製した。なお、ＹＰＳＳ培地は１００ｍＬ当たり、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン２ｇ、スクロース１ｇ、塩化ナトリウム１ｇを含む。
【０１３３】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１３４】
ＳＣＩによって上述の微生物培地にＹＰＳＳ培地を用いて培養した酵母ＢＹ４７２４を播種した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３０℃、２日間、培養を行った。強度の評価も行った。
【０１３５】
＜実施例３４＞
ゲランガム０．４重量％、ローカストビーンガム０．２重量％含むように、ゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）、ローカストビーンガム粉末（ユニテックフーズ製）、ＹＰＳＳ培地を混合したこと以外は、実施例３３と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１３６】
＜実施例３５＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにタラガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１３７】
＜実施例３６＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにグアガム粉末（ユニテックフーズ製）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１３８】
＜実施例３７＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにキサンタンガム粉末（マルゴーコーポレーション製）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１３９】
＜実施例３８＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにκ-カラギーナン粉末（東京化成製）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１４０】
＜実施例３９＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにグルコマンナン粉末（荻野商店製）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１４１】
＜実施例４０＞
ローカストビーンガム粉末の代わりにペクチン粉末（富士フィルム和光純薬製、柑橘由来）を用いたこと以外は、実施例３４と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１４２】
＜結果＞
図８の（ａ）は実施例３３、（ｂ）は実施例３４、（ｃ）は実施例３５、（ｄ）は実施例３６、（ｅ）は実施例３７、（ｆ）は実施例３８、（ｇ）は実施例３９、（ｈ）は実施例４０の培養結果を示す。組成および評価結果を、表６に示す。
【０１４３】
表６において、強度試験の結果は、３００ｇ、２００ｇ、１５０ｇ、１００ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）とした。
【０１４４】
【表６】
2020178665.tif 000008
【０１４５】
実施例３３〜４０に示すように、ＹＰＳＳ培地を用いた場合においても、微生物培地はＳＣＩを実施するために十分な強度を有する。
【０１４６】
〔試験９：ＹＰＳＳ培地の検討〕
＜参考例５＞
寒天が１．５重量％含まれるように、精製寒天（BactoAgar、Nacalai Tesque製）、ＹＰＳＳ培地を混合することにより、微生物培地用組成物である溶液を作製した。
【０１４７】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。得られた溶液に、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１４８】
試験１と同様に得た菌体液１０μＬを上述の微生物培地に播種した。また、Inoculating loop （QuadLoop, MINIPLAST EIN SHEMER）、もしくはＬ型スプレッダー（Greiner社）を用いてＳＣＩを実施した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３７℃、２２時間、培養を行った。また、強度の評価も行った。
【０１４９】
＜参考例６＞
寒天が２．０重量％含まれるように、精製寒天（BactoAgar、Nacalai Tesque製）、ＹＰＳＳ培地を混合することにより、微生物培地用組成物である溶液を作製した。
【０１５０】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１５１】
ＳＣＩによって上述の微生物培地にＹＰＳＳ培地を用いて培養した酵母ＢＹ４７２４を播種した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３０℃、２日間、培養を行った。強度の評価も行った。
【０１５２】
＜実施例４１＞
寒天の代わりにκ-カラギーナンを０．３重量％、グルコマンナンを０．２重量％含むようにκ-カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ＹＰＳＳ培地を混合したこと以外は、参考例５と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１５３】
＜実施例４２＞
κ-カラギーナン粉末の代わりにゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）を用いたこと以外は、実施例４１と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１５４】
＜実施例４３＞
寒天の代わりにκ-カラギーナンを０．４重量％、グルコマンナンを０．２重量％含むようにκ-カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ＹＰＳＳ培地を混合したこと以外は、参考例６と同様の方法により溶液を作製した。ＳＣＩおよび強度の評価も同様に行った。
【０１５５】
＜結果＞
図９の（ａ）は参考例５、（ｂ）は実施例４１、（ｃ）は実施例４２、図１０の（ａ）は参考例６、（ｂ）は実施例４３の培養結果を示す。組成および評価結果を、表７に示す。
【０１５６】
表４において、強度試験の結果は、２００ｇ、１５０ｇ、１２０ｇ、１００ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。また、ＳＣＩは、Ｌ型スプレッダーおよびInoculating loopのいずれも埋没しなかった場合は◎（最適）、Inoculating loopでは埋没したが、Ｌ字スプレッダーを用いてコロニーを単離できた場合は○（適）とした。
【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
ＹＰＳＳ培地と各種多糖類との組み合わせは寒天の代替となり、また、従来のＬＢ培地、ＹＰＤ培地等で提供されていた生育環境と同等の環境を提供できることがわかる。
【０１５９】
〔試験１０：β−ガラクトシダーゼ活性〕
＜参考例７＞
Ｓ−Ｇａｌ／ＬＢアガーブレンド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を寒天の濃度が１．２重量％となるように蒸留水で希釈することにより、微生物培地用組成物である溶液を作製した。
【０１６０】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。得られた溶液に、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１６１】
試験１と同様に得た菌体液１０μＬを上述の微生物培地に播種した。また、Inoculating loop （QuadLoop, MINIPLAST EIN SHEMER）、もしくはＬ型スプレッダー（Greiner社）を用いてＳＣＩを実施した。インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３７℃、２０〜２４時間、培養を行った。なお、Ｓ−Ｇａｌ／ＬＢアガーブレンドは、５００ｇあたり、トリプトン５ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天６ｇ、Ｓ‐Ｇａｌ（３，４‐シクロヘキセノエスクレチンβ‐Ｄ‐ガラクトピラノシド）０．１５ｇ、クエン酸アンモニウム鉄０．２５ｇ、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）０．０１５ｇを含む。そして、Ｓ‐Ｇａｌｇは、β‐ガラクトシダーゼの活性を誘導する。
【０１６２】
＜実施例４４＞
寒天を０．４重量％含むように希釈し、さらにκ-カラギーナンを０．４重量％、グルコマンナンを０．１重量％含むようにκ-カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）を加えたこと以外は、参考例７と同様に溶液を作製し、ＳＣＩを行った。
【０１６３】
＜結果＞
図１１の（ａ）は参考例７における不溶性色素の沈殿が生成された微生物培地を示し、（ｂ）は不溶性色素の沈殿の拡大図である。図１１の（ｃ）は実施例４４における不溶性色素の沈殿が生成された微生物培地を示し、（ｄ）は不溶性色素の沈殿の拡大図である。
【０１６４】
図１１の（ａ）〜（ｄ）に示すように、実施例４４の微生物培地では、参考例７の寒天培地と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性を阻害しないことが判った。また、図１１の（ｃ）および（ｄ）に示すように、実施例４４の微生物培地は、透明性に優れ、コロニーの目視がきわめて容易となった。
【０１６５】
〔試験１１：ＳＰＡにおける利用＞
＜参考例８〜１０＞
寒天が表８に示す濃度にて含まれるように、精製寒天（BactoAgar、Nacalai Tesque製）、ＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Miller、粉末、Nacalai Tesque製）、蒸留水を混合することにより微生物培地組成物である溶液を作製した。
【０１６６】
前記溶液を自動式高圧蒸気滅菌器（モデル MLS-3020、サンヨー、ラボ・オートクレーブ）で加熱滅菌（１２１℃、１５分）した。そして当該溶液を５０℃程度まで冷却した。得られた溶液に、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた。その後、溶液を直径９０ｍｍの透明プラスチック製の細胞培養皿（Azone社）に１５〜２０ｍＬ加えることにより微生物培地を作製した。
【０１６７】
試験１と同様に得た菌体液１μＬを上述の微生物培地に播種し、インキュベータ（SOFT INCUBATOR SL1-600N, EYELA製）を用いて３７℃、１６〜２４時間、培養を行った。Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays, Nydia Morales-Sato et al., Journal of Visualized Experiments, 98, April 2015； Video article, URL: http://www.jove.com/video/52338/preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motilityに従い、swarm plate assayを行った。また、強度の評価も行った。
【０１６８】
＜実施例４５〜４８＞
寒天の代わりにκ-カラギーナンおよびグルコマンナンが表８に示す濃度にて含まれるように、κ-カラギーナン粉末（東京化成製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）を用いたこと以外は参考例８と同様に溶液を作製した。また、培養、swarm plate assay、強度の評価も行った。
【０１６９】
＜実施例４９〜５９＞
寒天の代わりに各種多糖類が表８に示す濃度にて含まれるように、ゲランガム粉末（富士フィルム和光純薬製）、グルコマンナン粉末（荻野商店製）、ローカストビーンガム粉末（ユニテックフーズ製）、タラガム粉末（ユニテックフーズ製）、グアガム粉末（ユニテックフーズ製）、キサンタンガム粉末（マルゴーコーポレーション製）κ-カラギーナン粉末（東京化成製）および／またはペクチン粉末（富士フィルム和光純薬製、柑橘由来）を用いたこと以外は参考例８と同様に溶液を作製した。また、培養、swarm plate assay、強度の評価も行った。
【０１７０】
＜結果＞
図１２の（ａ）は参考例９、（ｂ）は参考例１０、（ｃ）は実施例４５、（ｄ）は実施例４６、（ｅ）は実施例４７、（ｆ）は実施例４８の１６時間培養の結果を示す図である。図１３の（ａ）は実施例５７、（ｂ）は実施例５８、（ｃ）は実施例５９の１６時間培養の結果、（ｄ）は実施例５７、（ｅ）は実施例５８、（ｆ）は実施例５９の２４時間培養の結果を示す図である。図１４の（ａ）は実施例４９、（ｂ）は実施例５０、（ｃ）は実施例５１、（ｄ）は実施例５２、（ｅ）は実施例５３、（ｆ）は実施例５４、（ｇ）は実施例５５、（ｈ）は次指令５６の１６時間培養の結果を示す図である。組成および評価結果を、表８および９に示す。
【０１７１】
表８および９において、強度試験の結果は、３０ｇ、２０ｇ、１０ｇ、５ｇ、２ｇ、１ｇの分銅のうち、培地が破断しなかった最大の重量を記載した。１ｇの分銅でも破断した場合は×とした。また、ＳＰＡは、大腸菌の移動が観察された場合は○（適）、観察できなかった場合は×（不適）とした。ＮＤはデータ無しを表す。
【０１７２】
【表８】
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【０１７３】
【表９】
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【０１７４】
実施例４５〜５９のいずれの微生物培地であっても寒天培地と同様以上の強度を有する。また、実施例４５〜５９のいずれの微生物培地を用いて培養した大腸菌は、寒天を用いて培養した大腸菌と同様の移動性を示し、微生物培地が大腸菌の移動を阻害しないことがわかった。なお、ゲランガムと組み合わせる多糖類として、強度の観点からはグルコマンナンが好ましいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明の一態様は、微生物の培養に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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