(57)【要約】【課題】  血液試料中に多量に含まれる夾雑細胞を選択的に除去することで、前記試料中に含まれる目的細胞を高倍率に濃縮する方法を提供すること。【解決手段】  （１）血液試料に溶血剤を添加し、当該試料中に含まれる赤血球を溶血させる工程と、（２）（１）の工程後の溶液を遠心分離し、得られた上清を除去する工程と、（３）（２）の工程で得た細胞を含む溶液に（ｉ）置換溶液、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加する工程と、（４）夾雑細胞と結合した前記担体を除去する工程と、を含む、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する方法であって、前記（３）の置換溶液が塩化ナトリウムを含む緩衝液であり、血液試料中に含まれる目的細胞の回収率が５０％以上であり、かつ血液試料中に含まれる目的細胞の回収率［％］を同試料中に含まれる夾雑細胞の残存率［％］で除して得られる濃縮倍率が８倍以上である、前記方法により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）血液試料に溶血剤を添加し、当該試料中に含まれる赤血球を溶血させる工程と、
（２）（１）の工程後の溶液を遠心分離し、得られた上清を除去する工程と、
（３）（２）の工程で得た細胞を含む溶液に（ｉ）置換溶液、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加する工程と、
（４）夾雑細胞と結合した前記担体を除去する工程と、
を含む、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する方法であって、
前記（３）の置換溶液が塩化ナトリウムを含む緩衝液であり、血液試料中に含まれる目的細胞の回収率が５０％以上であり、かつ血液試料中に含まれる目的細胞の回収率［％］を同試料中に含まれる夾雑細胞の残存率［％］で除して得られる濃縮倍率が８倍以上である、前記方法。
【請求項２】
（２）に記載の上清の除去工程が、得られた上清のうち５５％以上９９％以下の量を除去する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
夾雑細胞が白血球であり、夾雑細胞と結合可能な担体が白血球表面抗原に対する抗体を結合した担体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
白血球表面抗原に対する抗体が抗ＣＤ４５抗体および抗ＣＤ１５抗体を少なくとも含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
担体が磁性粒子である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法。
（Ｉ）血液試料に保存剤を添加して保存処理する工程、
（ＩＩ）請求項１から５のいずれかに記載の方法で、（Ｉ）の工程後の試料から目的細胞を濃縮する工程、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）の工程後の試料から目的細胞を検出する工程
【請求項７】
請求項６に記載の方法で目的細胞を検出後、前記目的細胞および／または夾雑細胞を採取する、血液試料中に含まれる細胞の採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する方法に関する。特に本発明は、血液試料中に多量に含まれる夾雑細胞を選択的に除去することで、当該試料中に微量しか含まれない目的細胞を高効率に濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、これら分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
しかしながら、がん患者より得られる血液試料中に含まれるＣＴＣ数は、赤血球や白血球などの血球細胞と比較して非常に少なく、前記血球細胞を除去する前処理が必須である。また血液試料中に含まれるＣＴＣ数は非常に少ないことから、ＣＴＣを高感度で検出するには、前記前処理によるＣＴＣの取りこぼしを極力少なくする必要がある。
【０００４】
ＣＴＣ検出を目的とした血液試料の前処理方法として、特許文献１では、ＣＴＣ表面に発現が見られる上皮系マーカーに対して免疫磁気的に細胞を濃縮する方法が開示されている。しかしながら、ＣＴＣの中には前記上皮系マーカーを発現していないものもあり、当該ＣＴＣはこの方法では回収できずに取りこぼすおそれがあることが課題であった。特許文献１に開示の方法の他にも、血球細胞との大きさの違い（血球細胞より大きい）に基づくフィルターによる濾過や、血球細胞との比重の違い（血球細胞より比重が小さい）に基づく比重差分離による濃縮が知られているが、ＣＴＣの中には血球細胞と同等以下の径や血球細胞と同等以上の比重を有したものもあるため、それらのＣＴＣは前処理により取りこぼすおそれがあった。
【０００５】
前処理によるＣＴＣの取りこぼしを極力抑えた、ＣＴＣの検出方法として、特許文献２では、溶血剤を用いて血液試料中に含まれる赤血球を溶血し除去した後、残りのすべての細胞を解析してＣＴＣを検出する方法が開示されている。しかしながら、前記溶血処理後の溶液には白血球などの夾雑細胞が大量に含まれており、検出時間が膨大に掛かる課題があった。また偽陽性が発生するおそれもあった。
【０００６】
血液試料中に含まれるＣＴＣ以外の夾雑細胞を除去する方法として、非特許文献１では溶血剤により血液試料中に含まれる赤血球を破砕（溶血）した後、夾雑細胞である白血球に特異的に結合可能な抗体である抗ＣＤ４５抗体を修飾した磁性粒子を用いて白血球を除去する方法が開示されている。非特許文献１に開示の方法は、ＣＴＣをほとんど取りこぼすことなく白血球を除去できるが、その除去率は約８０％（すなわち約２０％は残存）であり、濃縮倍率（血液試料中に含まれる目的細胞（ＣＴＣ）の回収率［％］÷血液試料中に含まれる夾雑細胞（白血球）の回収率［％］）を計算すると５倍程度に留まっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５３３４８７号公報
【特許文献２】特表２０１３−５０８７２９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｌｌｅｒｇｉ，Ｇａｌａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，４１１−４１９（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
血液試料中に微量に含まれる目的細胞を高効率に検出するには、目的細胞を従来技術よりも高倍率に濃縮する前処理が必要である。そこで本発明の課題は、血液試料中に多量に含まれる夾雑細胞を選択的に除去することで、前記試料中に含まれる目的細胞を高倍率に濃縮する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち本発明の第一の態様は、
（１）血液試料に溶血剤を添加し、当該試料中に含まれる赤血球を溶血させる工程と、
（２）（１）の工程後の溶液を遠心分離し、得られた上清を除去する工程と、
（３）（２）の工程で得た細胞を含む溶液に（ｉ）置換溶液、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加する工程と、
（４）夾雑細胞と結合した前記担体を除去する工程と、
を含む、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する方法であって、
前記（３）の置換溶液が塩化ナトリウムを含む緩衝液であり、血液試料中に含まれる目的細胞の回収率が５０％以上であり、かつ血液試料中に含まれる目的細胞の回収率［％］を同試料中に含まれる夾雑細胞の残存率［％］で除して得られる濃縮倍率が８倍以上である、前記方法。
【００１２】
また本発明の第二の態様は、（２）に記載の上清の除去工程が、得られた上清のうち５５％以上９９％以下の量を除去する工程である、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１３】
また本発明の第三の態様は、夾雑細胞が白血球であり、夾雑細胞と結合可能な担体が白血球表面抗原に対する抗体を結合した担体である、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１４】
また本発明の第四の態様は、白血球表面抗原に対する抗体が抗ＣＤ４５抗体および抗ＣＤ１５抗体を少なくとも含む、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１５】
また本発明の第五の態様は、担体が磁性粒子である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１６】
さらに本発明の第六の態様は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法である。
（Ｉ）血液試料に保存剤を添加して保存処理する工程、
（ＩＩ）前記第一から第五の態様のいずれかに記載の方法で、（Ｉ）の工程後の試料から目的細胞を濃縮する工程、
（ＩＩＩ）（ＩＩ）の工程後の試料から目的細胞を検出する工程
また本発明の第七の態様は、前記第六の態様に記載の方法で目的細胞を検出後、前記目的細胞および／または夾雑細胞を採取する、血液試料中に含まれる細胞の採取方法である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明における血液試料は、後述する目的細胞ならびに赤血球や白血球などの血液成分を少なくとも含む試料であればよく、具体的には、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの血液由来成分を含み得る試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前述した試料または組織懸濁液より分離して得られる、試料または組織由来の細胞を含む画分、などがあげられる。このうち試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００１９】
本発明の方法で濃縮する目的細胞は、前述した血液試料中に含まれる細胞であれば特に限定はないが、本発明の本質を考慮すると、血液試料中に含まれる夾雑細胞数に対して極めて少ない数しか前記試料中に存在しない細胞を目的細胞とすると好ましい。前記好ましい態様の一例として、血液試料中に含まれる夾雑細胞数に対して１０％以下、３％以下、１％以下、０．３％以下、または０．１％以下の数、前記試料中に存在する細胞があげられる。夾雑細胞が好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球などの白血球である場合における、目的細胞の一例として、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、各種幹細胞、Ｂ細胞があげられる。また目的細胞が特定の特徴を有した白血球であり、夾雑細胞が前記特徴を有さない白血球であってもよい。
【００２０】
本発明の方法で用いる溶血剤は、赤血球の破砕（溶血）を可能とする物質を少なくとも含んでいればよく、一例として、赤血球への取り込み能が高いアンモニウム化合物や、細胞膜を溶解可能な界面活性剤、生理的浸透圧よりも低張な溶液があげられる。特に赤血球以外の細胞への損傷が少なく選択的に赤血球を破砕可能なアンモニウム化合物を用いた溶血が好ましい。溶血剤に含ませるアンモニウム化合物の一例として塩化アンモニウムがあげられる。
【００２１】
本発明の方法は、血液試料に溶血剤を添加し当該試料中に含まれる赤血球を溶血させる工程、前記溶血工程後の溶液を遠心分離し得られた上清を除去する工程、置換溶液および血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加する工程、および夾雑細胞と結合した前記担体を除去する工程により、血液試料中に含まれる目的細胞を回収率５０％以上かつ濃縮倍率８倍以上で濃縮する方法である。なお本明細書において濃縮倍率とは、血液試料中に含まれる目的細胞の回収率［％］を同試料中に含まれる夾雑細胞の残存率［％］で除して得られる値である。目的細胞の回収率は高ければ好ましい。具体的には、６０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらにより好ましく、最も好ましくは９２％以上である。また濃縮倍率に影響する夾雑細胞の残存率は低いほど好ましく、１２％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、８％以下がさらに好ましく、５％以下がさらにより好ましい。
【００２２】
本発明の方法の好ましい態様では、前記溶血剤の添加により赤血球を溶血させた後の溶液を遠心分離して得られる上清のうち、５５％以上９９％以下の量を除去する。溶血剤を含む上清の持ち込み量をゼロまたはほぼゼロにする（すなわち９９％超の上清を除去する）と、前記溶血剤による、夾雑細胞と結合可能な担体（後述）と前記夾雑細胞との結合阻害が低減し、前記夾雑細胞の除去を効率的に行なえる一方、前記遠心分離により得られた目的細胞を含むペレットの近傍にある上清も除去するため、当該目的細胞が同時に除去されるおそれがある。また上清一部除去、置換溶液添加、遠心分離、上清一部除去の操作を複数回行ない、上清の持ち込み量をゼロまたはほぼゼロにする方法を採用しても、当該複数回の操作により目的細胞が除去されるおそれがある。本発明の方法の好ましい態様では、赤血球を溶血させた後の溶液を遠心分離して得られる上清の除去を、当該上清の持ち込みによる夾雑細胞と結合可能な担体（後述）と前記夾雑細胞との結合阻害がほぼ生じず、かつ血液試料中に含まれる目的細胞が除去されるおそれがないまたはほぼない量を除去する。前記溶血剤の添加により赤血球を溶血させた後の溶液を遠心分離して得られる上清のうち、液面上部から６０％以上９８％以下の量を除去するとさらに好ましく、６５％以上９７％以下の量を除去するとさらにより好ましい。また、前記赤血球溶血後の溶液の遠心分離条件として、目的細胞が遠心により損傷を受けることのない遠心強度以下にすることが好ましく、溶血剤に目的細胞が浸っている時間を短時間にすることで目的細胞の損傷を抑制できる点から遠心強度は高く、遠心時間は短い方が好ましい。遠心強度としては２００×ｇ以上２０００×ｇ以下が好ましく、５００×ｇ以上１０００×ｇ以下がさらに好ましい。遠心時間としては１分以上３０分以下が好ましく、３分以上１０分以下がさらに好ましい。
【００２３】
本発明の方法では、前述した上清の除去後、置換溶液および血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加し、夾雑細胞を前記担体と結合させることで除去し、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する。本発明の方法で用いる置換溶液を、生理的浸透圧および／または生理的ｐＨに調整された緩衝液にすると、細胞への損傷が少なくなる点で好ましい。なお前記置換溶液の比重は、目的細胞の比重より置換溶液の比重が高いと目的細胞の回収が困難となるため、目的細胞の比重より低い比重としたほうがよい。
【００２４】
本発明の方法で用いる置換溶液は、塩化ナトリウムを少なくとも含む緩衝液である。塩化ナトリウムを含んだ緩衝液で置換することで、夾雑細胞と当該細胞と結合可能な担体との結合効率（すなわち前記担体による夾雑細胞の除去効率）が向上する。塩化ナトリウムの濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．０％（ｗ／ｖ）以下がより好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）以上１．０％（ｗ／ｖ）以下が特により好ましい。置換溶液の好ましい態様の一例としてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム濃度：０．８％（ｗ／ｖ））があげられる。
【００２５】
本発明の方法で用いる置換溶液に、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含ませると、血液試料中に含まれる目的細胞を効率的に回収できる点で好ましい。親水性高分子は電荷を持たない親水性高分子であればよく、一例としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマー、多糖類、ポリペプチドがあげられる。タンパク質は水溶性を有していればよく、一例として血清由来タンパク質や血漿由来タンパク質などの血液由来タンパク質やカゼインなどの乳由来タンパク質があげられ、さらに具体的な例として当業者が通常用いる血清由来タンパク質である、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）があげられる。親水性高分子を結合したタンパク質は、前述した親水性高分子とタンパク質とが一定の割合で結合したタンパク質であり、例えば、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を付与した親水性高分子とタンパク質とを一定のモル比で反応させることで得られる。なお親水性高分子とタンパク質との反応比は、タンパク質に対し親水性高分子を０．０１以上のモル比で反応させればよく、０．５以上のモル比で反応させればより好ましく、２以上のモル比で反応させると最も好ましい。一例として、血液由来タンパク質または乳タンパク質に対し親水性高分子を２以上のモル比で反応させると、血液由来タンパク質に対しては親水性高分子が実測モル比１以上で結合し、乳由来タンパク質に対しては親水性高分子が実測モル比０．２以上で結合する（特開２０１６−１０６６２２号公報参照）。
【００２６】
本発明の方法で用いる夾雑細胞と結合可能な担体は、夾雑細胞が特異的に有するタンパク質、脂質、糖質、核酸などと特異的に結合可能な物質を結合した担体である。前記物質の一例として、夾雑細胞が特異的に有するタンパク質に対する抗体や、夾雑細胞が特異的に有する糖鎖と特異的に結合可能なレクチンや、夾雑細胞が特異的に有するタンパク質や核酸と結合可能なアプタマーがあげられる。中でも、夾雑細胞が特異的に有するタンパク質に対する抗体を前記物質として用いると好ましい。前記物質と担体との修飾方法に特に限定はなく、共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、配位結合などがあげられる。
【００２７】
夾雑細胞が白血球である場合、夾雑細胞が特異的に有するタンパク質の例として、白血球表面抗原である、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６９およびＣＤ１２４があげられ、これら表面抗原に対する抗体を結合した担体を夾雑細胞と結合可能な担体として用いると好ましい。さらに、前記表面抗体を複数種類組み合わせると、担体に対する夾雑細胞（白血球）の結合率が向上し、当該担体を除去することによる、目的細胞（ＣＴＣなど）の夾雑細胞（白血球）に対する濃縮倍率が向上するため好ましい。複数種類組み合わせる態様の好ましい一例として、
多くの白血球の表面に存在する抗原であるＣＤ４５に対する抗体（抗ＣＤ４５抗体）と、ＣＤ１５に対する抗体（抗ＣＤ１５）との組み合わせや、
抗ＣＤ４５抗体と、抗ＣＤ１５抗体と、ＣＤ５０に対する抗体（抗ＣＤ５０抗体）との組み合わせ、があげられる。
なお組み合わせる方法として、複数種類の表面抗体を同一の担体に結合することで組み合わせてもよいし、表面抗体を結合した抗体を複数種類用意しそれらを混合することで組み合わせてもよい。
【００２８】
夾雑細胞と結合可能な物質を結合させる担体は、親水性または疎水性の水不溶性物質からなる担体が好ましい。具体的にはアガロース系、デキストラン系、キトサン系、セルロース系等の多糖類、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコール系、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリル系、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ４−フッ化エチレン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系、ポリアミド系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン系、ポリビニルホルマール系、ポリアリレート系、ポリエーテルスルホン系等の有機合成高分子、ガラス系、チタン系、活性炭系、アルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト等の各種セラミックス系、酸化鉄、金等の金属系の無機物など、本技術分野で通常用いられる公知の担体であれば、特別の限定なく使用可能である。前記担体の形態も特に限定はなく、粒子状、繊維状、中空糸上、膜状、平板状等、公知の形状の担体が利用できるが、中でも取扱いが簡便な点、目的細胞に物理的な損傷を与えにくい点、担体の損傷が生じにくい点、均一な担体の粒子を得やすい点などから、粒子状のものが好ましく、特に球形（真球のみならずほぼ球状を含む）の担体が好ましい。
【００２９】
本発明の方法では、前述した担体と夾雑細胞とを結合させた後、前記担体を除去することで、夾雑細胞が担体とともに除去され、夾雑細胞に対する目的細胞の純度（濃縮倍率）が向上する。担体を除去するには、担体と目的細胞との物理学的または化学的性質の差に基づき行なえばよい。一例として、比重差、沈降速度差、粒子径差、誘電率差に基づく除去があげられる。なお担体を磁性粒子とすると、外部磁場の印加により、夾雑細胞を結合した担体と目的細胞とを、簡便、短時間かつ高精度に分離できるため、本発明の方法における担体除去方法として好ましい方法といえる。
【００３０】
本発明の方法では、血液試料として、保存剤を添加して保存処理した血液試料を用いてもよい。臨床現場では血液試料の採取から本発明の方法による目的細胞の濃縮を実施するまでに長い時間を要することがある。その場合、溶液中に含まれる細胞が劣化し、当該細胞の形状崩壊ならびにそれに伴う当該細胞内の核酸およびタンパク質の放出が生じるおそれがある。そのような現象が生じると、血液試料中に含まれる目的細胞の検出率や採取率の低下や、採取した目的細胞中に含まれる核酸やタンパク質の解析能力の低下につながるおそれがある。そこで目的細胞を安定化させるための保存剤を、目的細胞を含む血液試料に含ませることで、当該目的細胞由来の核酸やタンパク質が不溶化および／または不活性化し、当該目的細胞が安定化するため、目的細胞の劣化を長時間抑制することができる。
【００３１】
前述した目的で血液試料に添加する保存剤としては、アルデヒド類、酸類、脱水剤・有機溶媒類、金属塩類といった、当業者が細胞固定化剤として通常用いる物質の中から適宜選択すればよいが、中でも、タンパク質の高次構造を変化させたり、ポリペプチド鎖を保持することによってさらなる変性を防いだり、タンパク質構造を安定化するとともに、細胞原形質をゲル化させて酵素活性を抑えることで、細胞を安定化させる効果を持つアルデヒド類を用いると好ましい。さらにアルデヒド類の中でも、細胞の形体を保持させることが可能なホルムアルデヒドドナー化合物を用いると良い。ホルムアルデヒドドナー化合物は、それ自体は直接細胞に作用しないが、加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出し、細胞を安定化させることが可能な化合物のことをいう。ホルムアルデヒドドナー化合物の具体例として、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、メテンアミン、パラホルムアルデヒドがあげられる。中でもイミダゾリジニル尿素は、ホルムアルデヒドを緩慢に放出できる点で最も好ましい保存剤の一つといえる。
【００３２】
血液試料に添加する保存剤の量は、当該保存剤が有する、血液試料中に含まれる目的細胞の固定化強度や固定化速度を考慮して適宜決定すればよい。例えば、保存剤としてホルムアルデヒドドナー化合物であるイミダゾリジニル尿素を用いる場合は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．２５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．３％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。
【００３３】
血液試料を保存処理する際、保存剤に加え抗血小板剤をさらに添加してもよい。抗血小板剤は血小板の凝集を抑制する物質のことをいい、血小板ＡＤＰ受容体を遮断し、血小板セロトニン２受容体を遮断し、血小板シクロオキシゲナーゼを阻害し、または血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を遮断することにより、血小板機能に直接の影響を与えて、血小板の凝集を阻害する物質が挙げられる。血小板ＡＤＰ受容体を遮断し、血小板セロトニン２受容体を遮断し、血小板シクロオキシゲナーゼを阻害する阻害剤は、主に血小板膜表面の受容体を阻害、または受容体からのシグナル経路の阻害剤として働き、血小板凝集に関わる血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の発現に寄与している血小板内のカルシウムイオン濃度の上昇を抑制するために適用される。一方、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤は、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子や、フィブリノーゲンなどを介した、血小板間の血小板膜表面に発現した血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体同士の結合による凝集を抑制する働きを有する。中でも、様々な経路で血小板内のカルシウム濃度が上昇することから、血小板凝集に直接作用する血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤を抗血小板剤として用いるとよい。血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤の一例として、チロフィバン（ｔｉｒｏｆｉｂａｎ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）があげられる。これらは、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。抗血小板剤として、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤であるチロフィバンを用いる場合は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として２．４μｇ／ｍＬ以上となるよう添加すればよく、終濃度として２４μｇ／ｍＬ以上となるよう添加するとより好ましい。
【００３４】
血液試料を保存処理する際、保存剤に加え抗凝固剤をさらに添加してもよい。抗凝固剤の一例として、血液凝固の要因となるカルシウムイオンを配位することで前記血液凝固を抑制するキレート剤や、血液凝固の要因となるトロンビン活性を抑制する抗トロンビン剤があげられる。中でもキレート剤が好ましく、その具体例として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＣＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス−２−アミノエチルエーテル四酢酸）、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）があげられる。これらは、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
血液試料を保存処理する際、保存剤に加えポリエチレングリコールをさらに添加してもよい。ポリエチレングリコールの添加量は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間であってよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。またポリエチレングリコールの分子量としては、平均分子量として６００以上であればよく、１０００から１００万の間とすると好ましく、１０００から１０万の間とするとさらに好ましい。
【００３６】
本発明の方法により目的細胞を濃縮した試料から、スライドに塗布したり、顕微鏡や光学検出器などで観察したり、フローサイトメトリーを用いたりすることで当該目的細胞を検出できる。なお顕微鏡や光学検出器などで観察して目的細胞を検出する場合、前記細胞を含む懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察するとよい。保持部の例として、前記細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。また細胞を保持部に保持させる際、誘電泳動力を用いると、保持部に細胞を効率的に保持できる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００３７】
以下、本発明の方法を利用した、血液試料中に含まれる目的細胞の検出および採取方法の一例として、血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出および採取する方法を用いて詳細に説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
【００３８】
（１）がんの疑いのある患者から血液試料を採取する。なお血液試料を採取する際、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤に代表される抗凝固剤を添加すると好ましい。
【００３９】
（２）（１）で採取した血液試料（または希釈した血液試料）に、ＣＴＣを安定化させるための保存剤であるホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤、ポリエチレングリコールを添加する。なお、（１）で抗凝固剤を添加せずに血液試料を採取した場合は抗凝固剤も添加する。前記添加の際、前記保存剤を構成する全ての物質を一度に添加してもよく、各成分を含む溶液をそれぞれ添加してもよい。さらに（１）で抗凝固剤が添加される状態で血液試料を採取し、本工程でホルムアルデヒドドナー化合物および抗血小板剤を含む溶液を血液試料に添加する場合、血液試料中に含まれる抗凝固剤の濃度を維持するために、本工程で抗凝固剤を追加してもよい。血液試料への保存剤の添加量は、血液試料１ｍＬあたり０．０１ｍＬから１０ｍＬの間であればよく、０．０４ｍＬから２ｍＬの間であればより好ましい。保存剤であるホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加した血液試料は、室温で少なくとも５日間は安定に保存が可能である。
【００４０】
（３）保存剤を添加した血液試料（保存処理した血液試料）に含まれる赤血球を、塩化アンモニウムを用いて破砕する（溶血させる）。塩化アンモニウムによる赤血球の破砕（溶血）は、赤血球と他の細胞とのイオン取り込み能の違いを利用した破砕（溶血）方法であり、他の細胞への損傷を抑えながら赤血球を破砕できるため、好ましい赤血球破砕方法である。
【００４１】
（４）赤血球破砕（溶血）処理後、遠心分離することで血液試料中に含まれるＣＴＣをペレット状にした後、溶血剤（塩化アンモニウム）を含む上清を除去する。その際、得られた上清のうち５５％以上９９％以下の量を除去する。なお６０％以上９８％以下の量の上清を除去すると好ましく、６５％以上９７％以下の量の上清を除去するとより好ましい。
【００４２】
（５）塩化ナトリウムを少なくとも含む置換溶液を添加し、ＣＴＣを含むペレットを懸濁させる。塩化ナトリウムを少なくとも含む置換溶液としては、生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）が例示できるが、生理的ｐＨの維持が容易なＰＢＳを用いるとよい。なお前記置換溶液に、親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ）を含ませると、ＣＴＣの回収効率が向上するため好ましい。親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液における当該タンパク質の終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）の間であれば好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましい。また前記タンパク質を置換溶液に添加することで、細胞に対する白血球と結合可能な結合部位を修飾した担体との非特異吸着を抑制することも可能となる。
【００４３】
（６）（５）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。本操作は懸濁液内の細胞の懸濁濃度を向上させ、夾雑細胞である白血球と、白血球と結合可能な担体との反応性を高めることを目的に行なう操作である。
【００４４】
（７）夾雑細胞と結合可能な担体として、抗ＣＤ４５抗体を結合した磁性粒子を添加する。磁性粒子との反応時間や反応温度は、使用した抗体の特性に応じて適時変更すればよい。
【００４５】
（８）前記磁性粒子と白血球とを結合させた後、添加した前記磁性粒子を磁石を用いて取り除き、上清を回収する。なお上清は、適時好ましい溶液に置換してもよい。例えば、回収した細胞を誘電泳動を用いて細胞を操作する場合、マンニトールなど糖を含む溶液を用いて置換するとよい。
【００４６】
（９）（８）で得られたＣＴＣを含む細胞懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持装置（例えば、図１および２に示す装置）に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察することで血液試料中に含まれるＣＴＣを検出する。ＣＴＣの検出は、例えば、明視野像によるＣＴＣと夾雑細胞（例えば、白血球などの血液成分）との大きさや形状の違いに基づき検出してもよく、サイトケラチンやＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などＣＴＣで発現するタンパク質に対する標識抗体および／または夾雑細胞で発現するタンパク質（夾雑細胞が白血球の場合はＣＤ４５など）に対する標識抗体で細胞を染色し当該染色結果に基づき検出してもよい。
【００４７】
（９）（８）で検出したＣＴＣを採取手段で採取する。採取手段の一例として、ノズルによる吸引吐出により採取する手段があげられ、具体例として特開２０１６−１４２６１６号に開示の装置があげられる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明は、血液試料に溶血剤を添加し当該試料中に含まれる赤血球を溶血させる工程と、前記溶血工程後の溶液を遠心分離し得られた上清を除去する工程と、塩化ナトリウムを少なくとも含む置換溶液および血液試料中に含まれる夾雑細胞と結合可能な担体を添加する工程と、夾雑細胞と結合した前記担体を除去する工程とを含む、血液試料中に含まれる目的細胞を濃縮する方法によって、血液試料中に含まれる目的細胞の回収率が５０％以上であり、かつ血液試料中に含まれる目的細胞の回収率［％］を同試料中に含まれる夾雑細胞の残存率［％］で除して得られる濃縮倍率が８倍以上であることを特徴としている。
【００４９】
本発明により、血液試料中に含まれる目的細胞数が夾雑細胞数に対して非常に少ない場合であっても、血液試料中に含まれる夾雑細胞を選択的に除去し、目的細胞を濃縮できる。したがって血液試料中に含まれる目的細胞を検出する際に、検出対象となる細胞の総数を減らすことができ、検出時間の短縮にも繋がる。また本発明の方法は、目的細胞以外の夾雑細胞数を減らせるため、夾雑細胞を目的細胞として誤検出する頻度を大幅に減らせる。
【００５０】
一例として、本発明を血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出に適用する場合、本発明の方法により高効率にＣＴＣを濃縮できるため、血液試料の採取量を少なくすることができ、患者への負担が低減できる。また、がんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、精度高くがんを診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の一例を示す図である。
【図２】図１に示す装置の正面図である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００５３】
参考例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を２５℃近傍で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
【００５４】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血した。
【００５５】
（３）血液３ｍＬに、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で４５ｍＬまでメスアップ後、５分間放置して溶血し、９００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離した。当該操作により赤血球が破壊される。
【００５６】
（４）遠心後の上清を４４ｍＬ除去した後、血球細胞のペレットを再懸濁することで得られた細胞懸濁液を溶血剤血球懸濁液とした。
【００５７】
（５）（３）の遠心後の上清を４３ｍＬ除去した後、血球細胞のペレットを含む残液２ｍＬの細胞懸濁液に対して、（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で４０ｍＬまでメスアップした。前記ＰＢＳを置換溶液とする。
【００５８】
（６）前記懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を３８ｍＬ除去し、再度置換溶液で４０ｍＬまでメスアップし、前記懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離した。遠心後の上清を３９ｍＬ除去した後、血球細胞のペレットを再懸濁することで得られた細胞懸濁液を置換溶液血球懸濁液とした。
【００５９】
（７）溶血剤血球懸濁液と置換溶液血球懸濁液とを以下の任意の割合で混合し、２００μＬの血球懸濁液を得た。
（ａ）溶血剤血球懸濁液：置換溶液血球懸濁液＝０：１（溶血剤残存率０．３％）
（ｂ）溶血剤血球懸濁液：置換溶液血球懸濁液＝１：９（溶血剤残存率１０％）
（ｃ）溶血剤血球懸濁液：置換溶液血球懸濁液＝１：２（溶血剤残存率３３％）
（ｄ）溶血剤血球懸濁液：置換溶液血球懸濁液＝１：１（溶血剤残存率５０％）
（ｅ）溶血剤血球懸濁液：置換溶液血球懸濁液＝１：０（溶血剤残存率１００％）
（８）抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）２０μＬと抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ１５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）２０μＬとを混合した液から、磁石を用いて液を除去し磁性粒子を濃縮後、前記溶血剤と前記置換溶液とを以下の任意の割合で混合した溶液１００μＬに懸濁した。
（ａ）溶血剤：置換溶液＝０：１（溶血剤残存率０．３％）
（ｂ）溶血剤：置換溶液＝１：９（溶血剤残存率１０％）
（ｃ）溶血剤：置換溶液＝１：２（溶血剤残存率３３％）
（ｄ）溶血剤：置換溶液＝１：１（溶血剤残存率５０％）
（ｅ）溶血剤：置換溶液＝１：０（溶血剤残存率１００％）
（９）（７）および（８）で得られた溶液を、それぞれ同一の溶血剤残存率の値を持つ溶液同士を混合した後、室温で５分間回転撹拌し、磁石を用いて磁性粒子に結合した白血球を除去した。
【００６０】
（１０）（９）で白血球を除去した血球懸濁液に含まれる残存の白血球数を計測し、（７）で調整した血球懸濁液に含まれる計測した白血球数で除することで、白血球残存率を算出した。
【００６１】
白血球残存率の結果を表１に示す。磁性粒子を反応させる溶液において、比較例１の溶血剤残存率が高い場合（溶血剤残存率１００％：白血球残存率３３．３％、溶血剤残存率５０％：白血球残存率１７．３％）と比較して、実施例１における当該残存率が低い場合（溶血剤残存率３３％：白血球残存率９．３％、溶血剤残存率１０％：白血球残存率３．５％、溶血剤残存率０．３％：白血球残存率１．９％）では白血球残存率が低下することがわかる。白血球残存率が低いということは、白血球と磁性粒子との反応性が高いことを意味しており、溶血剤により白血球と磁性粒子に結合している抗体との反応性が低下、もしくは置換溶液に含まれる塩化ナトリウムの濃度に依存して前記抗体との反応性が向上したと考えられる。
【００６２】
【表１】
2020074694.tif 000002
【００６３】
実施例１
（１）イミダゾリジニル尿素（保存剤）２．３ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２．３ｇ、チロフィバン（抗血小板剤）１．２ｍｇおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（抗凝固剤）３０ｍｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【００６４】
（２）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素であるＣＦＳＥ（５−  ｏｒ  ６−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ３’，６’−ｄｉａｃｅｔａｔｅ、同仁化学研究所社製）およびＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ社製）で標識した。蛍光標識されたＰＣ９細胞を目的とするがん細胞とした。
【００６５】
（３）インフォームドコンセントを得た健常人からＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、（１）で調製した溶液０．４５ｍＬおよび（２）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、希釈血液試料を調製した。
【００６６】
（４）希釈血液試料を２５℃で１０分間放置後、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で４５ｍＬまでメスアップし、５分間放置することで溶血させた。
【００６７】
（５）溶血後の溶液を９００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離し、遠心後の上清を下記に示す量除去した。
（ａ）除去量１５ｍＬ（残液量３０ｍＬ）
（ｂ）除去量３０ｍＬ（残液量１５ｍＬ）
（ｃ）除去量３５ｍＬ（残液量１０ｍＬ）
（ｄ）除去量４０ｍＬ（残液量５ｍＬ）
（ｅ）除去量４４ｍＬ（残液量１ｍＬ）
（ｆ）除去量４４．９ｍＬ（残液量０．１ｍＬ）
（６）上清残液でペレットを懸濁後、前記（ａ）以外の条件では、ポリエチレングリコールを結合したウシ血清アルブミン（ＰＥＧ−ＢＳＡ）（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）として０．１％（ｗ／ｖ））および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３０ｍＬまでメスアップした。なお前記ＰＥＧ−ＢＳＡは、一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ＢＳＡ（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比が２となるよう、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を２５℃近傍で３時間撹拌し、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行ない、調製した。また各条件における、本操作後の上清の残存率を下記に示す。
（ａ）上清残存率１００％（上清除去率０％）
（ｂ）上清残存率５０％（上清除去率５０％）
（ｃ）上清残存率３３．３％（上清除去率６６．７％）
（ｄ）上清残存率１６．７％（上清除去率８３．３％）
（ｅ）上清残存率３．３％（上清除去率９６．７％）
（ｆ）上清残存率０．３％（上清除去率９９．７％）
（７）懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、残液量１．５ｍＬとなるよう上清を除去した。
【００６８】
（８）上清残液でペレットを懸濁後、あらかじめＰＢＳに置換した抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬを添加し、室温で５分間回転撹拌後、磁石を用いて当該磁性粒子に結合した白血球を除去した。
【００６９】
（９）白血球を除去した血球懸濁液に含まれる、がん細胞数および白血球数を計測した。計測したがん細胞数を（３）で添加したがん細胞数で除することでがん細胞回収率［％］を算出し、計測した白血球数を（３）で採取した血液中に含まれる白血球数で除することで白血球残存率［％］を算出した。さらに、がん細胞回収率［％］を白血球残存率［％］で除することで白血球に対するがん細胞の濃縮倍率を算出した。
【００７０】
結果を表２に示す。上清除去率が多いほど白血球の残存率は低下した。具体的には上清除去率が５０％を超える（例えば、前記（ｃ）から（ｆ）の条件）と、白血球の残存率は１０％以下になった。一方、がん細胞回収率は上清除去率にかかわらず９０％以上を維持していた。このことから、前記（ｃ）から（ｆ）の条件では、前記（９）で算出した濃縮倍率が８倍以上となり、血液試料中に含まれるがん細胞を高倍率に濃縮できることがわかる。なお上清残存率が極端に低い条件（例えば、前記（ｆ）の条件）では、濃縮倍率は向上したものの、細胞ペレット近傍に存在するがん細胞が吸引されたことで、がん細胞の回収率が若干低下したことから、上清除去率は５５％以上９９％以下（例えば、前記（ｃ）から（ｅ）の条件）が好ましいといえる。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
実施例２
（１）実施例１（５）における上清残液量を１０ｍＬ（すなわち上清除去率６６．７％）とし、実施例１（８）で添加する磁性粒子懸濁液として下記（ａ）または（ｂ）に示す方法で得られた懸濁液を用いた他は、実施例１（３）から（８）に記載と同様な方法で白血球を除去した。
（ａ）抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬと抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ１５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬとを混合した液から磁石を用いて上清を除去し磁性粒子を濃縮後、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し得られた液
（ｂ）抗ＣＤ５０抗体溶液（マウス抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）１６μＬと抗マウス抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬとを混合することで作製した抗ＣＤ５０抗体修飾磁性粒子懸濁液ならびに前記（ａ）で用いた抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子懸濁液１００μＬおよび抗ＣＤ１５抗体修飾磁性粒子懸濁液１００μＬとを混合した液から磁石を用いて上清を除去し磁性粒子を濃縮後、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し得られた液
（２）（１）で白血球を除去したがん細胞を含む懸濁液を、実施例１（６）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２８０ｍＭキシリトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
【００７３】
（３）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、再度、血球細胞を含むペレットを、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭスクロースを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血小板を含む血液成分を除去し、血球細胞を濃縮するための操作である。
【００７４】
（４）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去した血球細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞保持装置１００に導入し、信号発生器５０から電極基板３１・３２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を３分間印加することで前記装置が有する保持部６０に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞保持装置１００は、直径３０μｍの貫通孔１２ａを複数有した絶縁体１２と直径３０μｍの貫通孔１１ａを複数有した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と電極基板３１とを上から絶縁体１２−遮光部材１１−電極基板３１の順に密着して設け、さらに絶縁体１２の上面に試料の導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する厚さ１ｍｍのスペーサー２０を、スペーサー２０の上面に電極基板３２を、それぞれ密着して設けてなる装置である。なお貫通孔１１ａ／１２ａおよび電極基板３１により、直径３０μｍ、深さ３０μｍからなる細胞７０を保持可能な保持部６０が形成されている。
【００７５】
（５）保持部６０に保持されたがん細胞数および白血球数を計測し、実施例１（９）に記載と同様な方法で、がん細胞回収率、白血球除去率、および白血球に対するがん細胞の濃縮倍率を算出した。
【００７６】
結果を表３に示す。白血球と結合可能な担体として、抗ＣＤ４５抗体を結合した磁性粒子に加え抗ＣＤ１５抗体を結合した磁性粒子も用いることで白血球残存率は低下した（抗ＣＤ４５抗体を結合した磁性粒子のみ：８．１％、抗ＣＤ４５抗体を結合した磁性粒子＋抗ＣＤ１５抗体を結合した磁性粒子：７．６％）。さらに抗ＣＤ５０抗体を結合した磁性粒子も用いると白血球残存率はさらに低下し（３．２％）、濃縮倍率は大幅に向上した（２７．８倍）。この結果から、白血球と結合可能な担体として、抗ＣＤ４５抗体を結合した担体に加え抗ＣＤ１５抗体を結合した担体を用いると高効率に白血球を除去できる点で好ましく、抗ＣＤ５０抗体を結合した担体も用いるとさらに好ましいことがわかる。
【００７７】
【表３】
2020074694.tif 000004
【００７８】
実施例３
（１）実施例１（５）における上清残液量を５ｍＬ（すなわち上清除去率８３．３％）とし、実施例１（６）における置換溶液をＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））およびＰＢＳを含む溶液を用いた他は、実施例１（３）から（８）に記載と同様な方法で白血球を除去した。
【００７９】
（２）（１）で白血球を除去したがん細胞を含む懸濁液を用いて、実施例２（２）から（５）に記載と同様な方法でがん細胞回収率、白血球除去率、および白血球に対するがん細胞の濃縮倍率を算出した。
【００８０】
比較例１
置換溶液として、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２８０ｍＭキシリトールを含む溶液を用いた他は、実施例５と同様な方法でがん細胞回収率、白血球除去率、および白血球に対するがん細胞の濃縮倍率を算出した。
【００８１】
実施例３および比較例１の結果をまとめて表４に示す。置換溶液として塩化ナトリウムを含む溶液（ＢＳＡ溶液）を用いることで、塩化ナトリウムを含まない溶液（キシリトール溶液）を用いた場合（比較例１、がん細胞回収率：３６．４％、白血球残存率：３５．３％、濃縮倍率：１．０倍）と比較して、白血球残存率は低下（４．５％）し、がん細胞回収率（９２．３％）および濃縮倍率（２０．５倍）は向上した（実施例３）。このことから、夾雑細胞と当該細胞と結合可能な担体とを結合させる際、塩化ナトリウムの存在は夾雑細胞と前記担体との結合の選択性に大きく寄与していることがわかる。
【００８２】
【表４】
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【符号の説明】
【００８３】
１００：細胞保持装置
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
【図１】
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【図２】
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