(57)【要約】【課題】多部分シグナル伝達タンパク質およびその使用の提供。【解決手段】本開示は、細胞シグナルの誘発および下流の応答を、空間的にも時間的にも制御するように化学的に誘導された、融合タンパク質複合体を有する細胞免疫を、疾患を処置するために使用するための組成物および方法に関する。一局面において、非天然細胞が提供され、この細胞は、（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と、（ｂ）結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、前記第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第２の核酸分子とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然Ｔ細胞であって、以下：
（ａ）ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢまたはＯＸ４０共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記ＦＲＢ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と、
（ｂ）単鎖抗体もしくはその抗原結合性断片、ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）多量体化ドメイン、および第２の膜貫通ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、発現すると前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第２の核酸分子と
を含み、ここで
第１の架橋因子が前記非天然Ｔ細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子は、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
非天然Ｔ細胞。
【請求項２】
非天然Ｔ細胞であって、以下：
（ａ）ＦＫＢＰ多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢまたはＯＸ４０共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と、
（ｂ）単鎖抗体もしくはその抗原結合性断片、ＦＲＢ多量体化ドメインおよび第２の膜貫通ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、発現すると前記ＦＲＢ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第２の核酸分子と
を含み、ここで
第１の架橋因子が前記非天然Ｔ細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子は、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
非天然Ｔ細胞。
【請求項３】
前記ＦＲＢ多量体化ドメインが、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドを含み、前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項４】
前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項５】
前記第１または第２の膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項６】
前記共刺激ドメインが、４−１ＢＢ共刺激ドメインである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項７】
前記単鎖抗体またはその抗原結合性断片が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項８】
前記単鎖抗体またはその抗原結合性断片が、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される抗原標的に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項９】
前記第１の融合タンパク質が、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζアクチュエータードメインを含み、前記第２の融合タンパク質は、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なｓｃＦｖ、およびＣＤ４膜貫通ドメインを含み；前記非天然Ｔ細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する前記第１の架橋因子が、ラパマイシンまたはラパログのＡＰ２１９６７である、請求項１に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項１０】
前記第１の融合タンパク質が、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζアクチュエータードメインを含み、前記第２の融合タンパク質は、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含み；前記非天然Ｔ細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する前記第１の架橋因子が、ラパマイシンまたはラパログのＡＰ２１９６７である、請求項２に記載の非天然Ｔ細胞。
【請求項１１】
融合ポリペプチドであって、以下：
（ａ）ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢまたはＯＸ４０共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質であって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記ＦＲＢ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の融合タンパク質と、
（ｂ）自己切断型ポリペプチドと、
（ｃ）単鎖抗体もしくはその抗原結合性断片、ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）多量体化ドメイン、および第２の膜貫通ドメインを含む第２の融合タンパク質であって、発現すると前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第２の融合タンパク質と
を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１２】
融合ポリペプチドであって、以下：
（ａ）ＦＫＢＰ多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢまたはＯＸ４０共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質であって、発現すると前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の融合タンパク質と、
（ｂ）自己切断型ポリペプチドと、
（ｃ）単鎖抗体もしくはその抗原結合性断片、ＦＲＢ多量体化ドメインおよび第２の膜貫通ドメインを含む第２の融合タンパク質であって、発現すると前記ＦＲＢ多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第２の融合タンパク質と
を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＦＲＢ多量体化ドメインが、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドを含み、前記ＦＫＢＰ多量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、請求項１１または１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記第１または第２の膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記共刺激ドメインが、４−１ＢＢ共刺激ドメインである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記単鎖抗体またはその抗原結合性断片が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂからなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記単鎖抗体またはその抗原結合性断片が、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される抗原標的に結合する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記自己切断型ポリペプチドがウイルス２Ａペプチドである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記自己切断型ポリペプチドが、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチドおよびカルジオウイルス２Ａペプチドからなる群から選択されるウイルス２Ａペプチドである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記自己切断型ポリペプチドが、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群より選択されるウイルス２Ａペプチドである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記第１の融合タンパク質が、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメインポリペプチド、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζアクチュエータードメインを含み、
前記自己切断型ポリペプチドがウイルス２Ａペプチドであり、
前記第２の融合タンパク質は、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、およびＣＤ４膜貫通ドメインを含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記第１の融合タンパク質が、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメインポリペプチド、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζアクチュエータードメインを含み、
前記自己切断型ポリペプチドがウイルス２Ａペプチドであり、
前記第２の融合タンパク質が、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメインポリペプチド、およびＣＤ４膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質、または請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター。
【請求項２５】
レンチウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年１月３１日に出願された米国仮出願第６１／９３４，０９２号および２０１３年７月２９日に出願された米国仮出願第６１／８５９，６９７号（これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表についての言明
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキストフォーマットで提供され、本明細書における参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０３６＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、４３３ＫＢであり、２０１４年７月２３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。
【０００３】
本開示は、免疫療法において多成分タンパク質を使用するための組成物および方法に関し、より詳細には、化学的に誘導される多量体化を使用して、養子免疫療法における、細胞シグナルの誘発および下流の応答の空間的な制御および時間的な制御をモジュレートするためのキメラ抗原受容体タンパク質を作り出すことに関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞療法は、生物学的作用のための複合シグナルを送達するための強力な枠組みとして出現しつつある。低分子かつ生物学的な薬物組成物とは対照的に、細胞は、それらの多種多様な感知応答プログラム、ならびにますます明確とされつつある遺伝子制御機構のために、固有の治療的役割を果たす潜在的可能性を有する。このような治療的価値を達成するために、細胞は、局所的な生理学的環境と関連する化学的情報および／または生物学的情報を感知および統合するための機構を備える必要がある。
【０００５】
操作された感知−応答機構の、最も臨床的に先進的な例は、養子細胞免疫療法における使用のための遺伝子操作されたＴ細胞内のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である（Ｊｕｎｅら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０巻：６１１頁、２０１２年；Ｒｅｓｔｉｆｏら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：２６９頁、２０１２年を参照されたい）。抗原の結合は、ＣＡＲの細胞内セグメント上のシグナル伝達ドメインを刺激し、これにより炎症機構および細胞傷害機構の抑制を解除するシグナルを伝達する。ＣＡＲベースの養子細胞免疫療法は、従来の標準治療処置に対して不応性の腫瘍を伴うがん患者を処置するのに使用されている（Ｇｒｕｐｐら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６８巻：１５０９頁、２０１３年；Ｋａｌｏｓら、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、３巻：９５〜７３頁、２０１１年を参照されたい）。
【０００６】
Ｔ細胞の活性化の標的化および誘発に加えて、有効な養子細胞免疫療法はまた、Ｔ細胞の増殖および存続のほか、Ｔ細胞シグナル伝達の強度および質もモジュレートすることが好ましい。しかし、現行のＣＡＲに媒介されるＴ細胞応答は、Ｔ細胞の活性化および増殖の潜在的可能性を十分には実現していない。ＣＡＲ機能の改善は、共刺激性シグナル伝達ドメインを、ＣＡＲ構造に組み入れることにより達成されている（例えば、Ｋｏｗｏｌｉｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６６巻：１０９９５頁、２００６年；Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１７巻：１４５３頁、２００９年；Ｐｕｌｅら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１２巻：９３３頁、２００５年；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６巻：３３６０頁、２００９年を参照されたい）が、臨床結果は様々である（例えば、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：４８１７頁、２０１１年；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：３９４０頁、２０１２年；ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、１０巻：２６７頁、２０１３年を参照されたい）。他の研究者らは、ＣＡＲに加えて、共刺激性リガンド（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１３巻：１４４０頁、２００７年を参照されたい）、共刺激性受容体（例えば、Ｄｕｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３巻：３３頁、２０１１年；Ｗｉｌｋｉｅら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２巻：１０５９頁、２０１２年を参照されたい）、およびサイトカイン（例えば、Ｈｓｕら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７５巻：７２２６頁、２００５年；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉら、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：２７９３頁、２００７年を参照されたい）の共発現も含めた。
【０００７】
ＣＡＲの使用に関する懸念は、２つの形態で生じる毒性であって、１つは、正常組織の標的化された破壊であり、第２は、サイトカイン放出関連の有害事象（例えば、サイトカインストーム）である形態で生じる毒性である。例えば、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲに付随して観察される損傷は、Ｂ細胞形成不全である（Ｋａｌｏｓら、２０１１年；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：２７０９頁、２０１２年）。このようなオフターゲット効果は、特に、標的抗原が、心臓または肺など、他の組織上で見出される場合に、極めて危険となる。多数の活性化Ｔ細胞と関連するサイトカインストームは、致死性でありうる（Ｋａｌｏｓら、２０１１年；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２０１２年）。薬物投与量を低減することにより、毒性を制御しうる、従来の薬物処置と異なり、Ｔ細胞の増殖は、現行のＣＡＲ技術では制御することができず、したがって、Ｔ細胞の閾値レベルに到達すれば、免疫性病態が結果としてもたらされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｕｎｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２年）３０巻：６１１頁
【非特許文献２】Ｒｅｓｔｉｆｏら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２年）１２巻：２６９頁
【非特許文献３】Ｇｒｕｐｐら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０１３年）３６８巻：１５０９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＡＲに媒介されるＴ細胞応答と関連する限界を踏まえると、当技術分野では、免疫細胞シグナルの誘発および増殖のモジュレーションが制御可能な免疫療法に有用な、代替的な組成物および方法が必要とされている。本開示は、このような必要を満たし、他の関連する利点もさらに提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、薬理学的作用物質により制御される（それらの活性化および不活化の両方において）シグナル伝達系を有する、非天然細胞組成物について記載する。本明細書では、薬理学的に制御される、多数の多部分シグナル伝達系が想定される。
【００１１】
多様な実施形態では、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第２の核酸分子とを含み、第１の架橋因子が非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、非天然細胞が提供される。
【００１２】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとは、同じであるかまたは異なる。
【００１３】
追加の実施形態では、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する。
【００１４】
さらなる実施形態では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である。
【００１５】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００１７】
一実施形態では、架橋因子は、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス（ｎｏｖｏｌｉｍｕｓ）、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス（ｕｍｉｒｏｌｉｍｕｓ）、またはゾタロリムスである。
【００１８】
さらなる実施形態では、第１の核酸分子は、第３の多量体化ドメインをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする。
【００１９】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、Ｔｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子のための結合性ドメインである。
【００２０】
特定の実施形態では、第２の架橋因子が少なくとも２つの第１の融合タンパク質の会合を促進し、架橋因子は、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される。
【００２１】
特定の実施形態では、タンパク質複合体は、少なくとも２つの第１の融合タンパク質を含むホモ複合体である。
【００２２】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲまたはＧｙｒＢのうちの少なくとも１つの多量体化ドメインを有する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド複合体の結合性ドメインは、標的細胞表面に位置する標的に特異的に結合する。
【００２４】
さらなる実施形態では、タンパク質複合体は、１種または複数の第１の融合タンパク質および１種または複数の第２の融合タンパク質を含むヘテロ複合体である。
【００２５】
さらなる実施形態では、タンパク質ヘテロ複合体の結合性ドメインは、標的細胞表面に位置する標的に特異的に結合する。
【００２６】
特定の実施形態では、疎水性ドメインは、膜貫通ドメインである。
【００２７】
別の特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである。
【００２８】
一実施形態では、アクチュエータードメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、１種または複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００３１】
特定の実施形態では、第１の核酸分子は、異なるアクチュエータードメイン、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする。
【００３２】
さらなる実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００３３】
特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含む。
【００３４】
一実施形態では、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むタンパク質、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せである。
【００３５】
さらなる実施形態では、リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せである。
【００３６】
さらなる実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００３７】
特定の実施形態では、非天然細胞は、共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せを過剰発現させる。
【００３８】
一実施形態では、第２の融合タンパク質が、発現すると非天然細胞から分泌されるように、第２の核酸分子は、分泌シグナルをさらにコードし、任意選択で、アンカードメインをさらにコードする。
【００３９】
ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである。
【００４０】
さらなる実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。
【００４１】
特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、多量体化ドメインのアミノ末端側にある。
【００４２】
一実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある。
【００４３】
さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子は、結合性ドメインと第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む。
【００４４】
特定の実施形態では、細胞は、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第３の融合タンパク質をコードする第３の核酸分子であって、第３の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第３の核酸分子をさらに含む。
【００４５】
関連する特定の実施形態では、結合性ドメインを含む融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインを有する。
【００４６】
さらなる実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインは、１つの標的または最大で４つの異なる標的に特異的である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、結合性ドメインは、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である。
【００４８】
特定の実施形態では、がんは、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である。
【００４９】
さらなる実施形態では、血液悪性疾患と関連する抗原標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である。
【００５０】
一実施形態では、結合性ドメインは、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する。
【００５１】
ある特定の実施形態では、第１の架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【００５２】
一実施形態では、第２の架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【００５３】
さらなる実施形態では、コードされた第１の融合タンパク質は、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのアクチュエータードメインを含み；コードされた第２の融合タンパク質は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する第１の架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【００５４】
特定の実施形態では、第１の融合タンパク質は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、第２の融合タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
多様な実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組換え細胞を投与するステップであって、第１の核酸分子が、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードし、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化し、第２の核酸分子が、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、ステップと；架橋因子を投与するステップであって、架橋因子が組換え細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み、ポリペプチド複合体の結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置する方法が提供される。
【００５６】
多様な実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子を含む非天然細胞を投与するステップであって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、ステップと；結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質を投与するステップと；架橋因子を投与するステップであって、架橋因子が組換え細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み、ポリペプチド複合体の結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置する、方法。
【００５７】
さらなる実施形態では、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとは、同じであるかまたは異なる。
【００５８】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する。
【００５９】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である。
【００６０】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００６１】
一実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００６２】
ある特定の実施形態では、架橋因子は、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである。
【００６３】
別のある特定の実施形態では、第１の核酸分子は、第３の多量体化ドメインをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする。
【００６４】
特定の実施形態では、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、Ｔｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子のための結合性ドメインである。
【００６５】
一実施形態では、少なくとも２つの第１の融合タンパク質の会合を第２の架橋因子が促進し、架橋因子は、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される。
【００６６】
さらなる実施形態では、タンパク質複合体は、少なくとも２つの第１の融合タンパク質を含むホモ複合体である。
【００６７】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲまたはＧｙｒＢのうちの少なくとも１つの多量体化ドメインを有する。
【００６８】
特定の実施形態では、ポリペプチド複合体の結合性ドメインは、標的過剰増殖性疾患細胞表面に位置する標的に特異的に結合する。
【００６９】
さらなる実施形態では、タンパク質複合体は、１種または複数の第１の融合タンパク質および１種または複数の第２の融合タンパク質を含むヘテロ複合体である。
【００７０】
さらなる実施形態では、タンパク質ヘテロ複合体の結合性ドメインは、標的過剰増殖性疾患細胞表面に位置する標的に特異的に結合する。
【００７１】
さらなる一実施形態では、疎水性ドメインは、膜貫通ドメインである。
【００７２】
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである。
【００７３】
別の特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む。
【００７４】
さらに別の特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【００７５】
なおさらに別の特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００７６】
ある特定の実施形態では、第１の核酸分子は、異なるアクチュエータードメイン、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする。
【００７７】
さらなる実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００７８】
さらなる実施形態では、アクチュエータードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含む。
【００７９】
特定の一実施形態では、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、１種または複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むタンパク質、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せである。
【００８０】
特定の実施形態では、リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せである。
【００８１】
一実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００８２】
別の実施形態では、細胞質シグナル伝達タンパク質は、ＣＤ３ζと４−１ＢＢとの組合せ、またはＣＤ３ζとＯＸ４０との組合せである。
【００８３】
さらに別の実施形態では、非天然細胞は、共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる。
【００８４】
ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである。
【００８５】
ある特定の一実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。
【００８６】
特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、多量体化ドメインのアミノ末端側にある。
【００８７】
さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある。
【００８８】
特定の実施形態では、第２の融合タンパク質は、結合性ドメインと第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをさらに含む。
【００８９】
さらなる実施形態では、細胞は、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第３の融合タンパク質をコードする第３の核酸分子であって、第３の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第３の核酸分子をさらに含む。
【００９０】
ある特定の実施形態では、結合性ドメインを含む融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインを有する。
【００９１】
一実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインは、１つの標的または最大で４つの異なる標的に特異的である。
【００９２】
特定の実施形態では、結合性ドメインは、がんと関連する抗原である標的に特異的である。
【００９３】
さらなる実施形態では、がんは、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である。
【００９４】
さらなる実施形態では、血液悪性疾患と関連する抗原標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である。
【００９５】
一実施形態では、結合性ドメインは、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する。
【００９６】
特定の実施形態では、第１の架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【００９７】
特定の実施形態では、第２の架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【００９８】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのアクチュエータードメインを含み；第２の融合タンパク質は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する第１の架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【００９９】
一実施形態では、第１の融合タンパク質は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、第２の融合タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１００】
特定の実施形態では、方法は、Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤を投与するステップをさらに含む。
【０１０１】
さらなる実施形態では、薬剤は、Ｔ細胞リガンドをアンタゴナイズまたは遮断する。
【０１０２】
特定の実施形態では、薬剤は、Ｔ細胞受容体をアンタゴナイズまたは遮断する。
【０１０３】
さらなる実施形態では、Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤は、抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合性断片、あるいはＰＤ−１を標的とする、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである。
【０１０４】
特定の実施形態では、方法は、サイトカインアゴニストを投与するステップをさらに含む。
【０１０５】
多様な実施形態では、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む、第１の融合タンパク質と；細胞外結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む、第２の融合タンパク質と；架橋因子とを含み、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、架橋因子とが会合してポリペプチドヘテロ複合体を形成し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、融合ポリペプチドヘテロ複合体が提供される。
【０１０６】
一実施形態では、結合性ドメインは、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである。
【０１０７】
さらなる実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。
【０１０８】
一実施形態では、結合性ドメインは、多量体化ドメインのアミノ末端側にある。
【０１０９】
特定の実施形態では、結合性ドメインは、多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある。
【０１１０】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１１２】
さらなる実施形態では、疎水性ドメインは、膜貫通ドメインである。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、アクチュエータードメインは、リンパ球受容体鎖を含む。
【０１１４】
一実施形態では、架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【０１１５】
さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質は、アンカードメインをさらに含む。
【０１１６】
特定の実施形態では、アンカードメインは、膜貫通ドメインである。
【０１１７】
さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質は、閾値下シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、アンカードメインは、ＧＰＩシグナル配列である。
【０１１９】
一実施形態では、ＧＰＩシグナル配列を変化させており、第２の融合タンパク質は、ＧＰＩ分子をさらに含む。
【０１２０】
さらなる実施形態では、結合性ドメインは、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、がんは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７の抗原標的を有する血液悪性疾患である。
【０１２２】
多様な実施形態では、本明細書で想定される融合タンパク質のうちの任意の１種または複数をコードする核酸分子が提供される。
【０１２３】
さらなる実施形態では、核酸分子は、ゲノム遺伝子座と相同な５’側ポリヌクレオチド配列と３’側ポリヌクレオチド配列との間に配置されている。
【０１２４】
多様な実施形態では、本明細書で想定される核酸を含有する、発現ベクターが提供される。
【０１２５】
特定の実施形態では、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を、ポリシストロニックのメッセージまたは２Ａペプチドで隔てられた単一のタンパク質としてコードする。
【０１２６】
特定の実施形態では、ポリシストロニックのメッセージは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【０１２７】
多様な実施形態では、Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメインおよび第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、第１の融合タンパク質が細胞から分泌される、第１の核酸分子と、標的細胞表面に位置する標的に結合する結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、第２の融合タンパク質が細胞から分泌される、第２の核酸分子とを含み、架橋因子がポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、非天然細胞が提供される。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとは、同じであるかまたは異なる。
【０１２９】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する。
【０１３０】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である。
【０１３１】
さらなる実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１３３】
一実施形態では、架橋因子は、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである。
【０１３４】
特定の実施形態では、非天然細胞は、共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、第１の融合タンパク質の結合性ドメイン、および第２の融合タンパク質の結合性ドメインの各々は、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドからなる群より独立に選択される。
【０１３６】
さらなる実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。
【０１３７】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質の結合性ドメインは、第１の多量体化ドメインのアミノ末端側にある。
【０１３８】
一実施形態では、第１の融合タンパク質の結合性ドメインは、第１の多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある。
【０１３９】
さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、第２の多量体化ドメインのアミノ末端側にある。
【０１４０】
特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、第２の多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある。
【０１４１】
一実施形態では、第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子は、結合性ドメインと第１の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む。
【０１４２】
特定の実施形態では、第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子は、結合性ドメインと第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む。
【０１４３】
特定の実施形態では、第２の核酸分子の結合性ドメインは、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、がんは、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、血液悪性疾患と関連する抗原標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である。
【０１４６】
一実施形態では、第２の核酸分子の結合性ドメインは、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する。
【０１４７】
さらなる実施形態では、架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である。
【０１４８】
特定の実施形態では、第１の核酸は、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードし；第２の核酸は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし；ポリペプチド複合体の形成を促進する架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【０１４９】
さらなる実施形態では、第１の核酸は、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードし；第２の核酸は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし；ポリペプチド複合体の形成を促進する架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【０１５０】
多様な実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、本明細書で想定される非天然細胞を投与するステップと、架橋因子を投与するステップであって、架橋因子がポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み；第２の融合ポリペプチドの結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患を処置する方法が提供される。
【０１５１】
多様な実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメインおよび第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質；ならびに過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に結合する結合性ドメイン、および第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質を投与するステップと；架橋因子を投与するステップであって、架橋因子がポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み、これにより過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置する方法が提供される。
【０１５２】
多様な実施形態では、Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメインおよび第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質と；標的細胞の細胞表面標的に結合する結合性ドメインを含む第２の融合タンパク質と；架橋因子とを含み、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、架橋因子とが会合してポリペプチドヘテロ複合体を形成し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、融合ポリペプチドヘテロ複合体が提供される。
【０１５３】
特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとは、同じであるかまたは異なる。
【０１５４】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である。
【０１５６】
さらなる実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインは、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、第２の多量体化ドメインは、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、架橋因子は、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである。
【０１５９】
一実施形態では、第１の融合タンパク質の結合性ドメイン、および第２の融合タンパク質の結合性ドメインの各々は、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドからなる群より独立に選択される。
【０１６０】
さらなる実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。
【０１６１】
さらなる実施形態では、第２の融合ポリペプチドの結合性ドメインは、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含み；第２の融合タンパク質は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【０１６３】
特定の実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含み；第２の融合タンパク質は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。
【０１６４】
多様な実施形態では、本明細書で想定される融合タンパク質のうちの任意の１種または複数をコードする核酸分子が提供される。
【０１６５】
特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム遺伝子座と相同な５’側ポリヌクレオチド配列と３’側ポリヌクレオチド配列との間に配置されている。
【０１６６】
多様な実施形態では、本明細書で想定される核酸を含有する発現ベクターが提供される。
【０１６７】
一実施形態では、発現ベクターは、ポリシストロニックのメッセージまたは２Ａペプチドで隔てられた単一のタンパク質としてコードされた第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を含む。
【０１６８】
別の実施形態では、ポリシストロニックのメッセージは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非天然細胞であって、以下：
（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と、
（ｂ）結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、前記第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第２の核酸分子と
を含み、ここで
第１の架橋因子は、前記非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子は、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
非天然細胞。
（項目２）
前記第１の多量体化ドメインと前記第２の多量体化ドメインとが、同じであるかまたは異なる、項目１に記載の非天然細胞。
（項目３）
前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する、項目１または項目２に記載の非天然細胞。
（項目４）
前記第１の多量体化ドメインおよび前記第２の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目５）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目６）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目７）
前記架橋因子が、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、項目５または６に記載の非天然細胞。
（項目８）
前記第１の核酸分子が、第３の多量体化ドメインをさらに含む第１の融合タンパク質をコードする、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目９）
前記第１の融合タンパク質の前記第３の多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、Ｔｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子のための結合性ドメインである、項目８に記載の非天然細胞。
（項目１０）
第２の架橋因子が少なくとも２つの第１の融合タンパク質の会合を促進し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記第３の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１１）
タンパク質複合体が、少なくとも２つの第１の融合タンパク質を含むホモ複合体である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２）
前記第１の融合タンパク質が、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲまたはＧｙｒＢのうちの少なくとも１つの多量体化ドメインを有する、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３）
前記ポリペプチド複合体の前記結合性ドメインが、標的細胞表面に位置する標的に特異的に結合する、項目１から１２のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１４）
前記タンパク質複合体が、１種または複数の第１の融合タンパク質および１種または複数の第２の融合タンパク質を含むヘテロ複合体である、項目１３に記載の非天然細胞。
（項目１５）
前記タンパク質ヘテロ複合体の前記結合性ドメインが、標的細胞表面に位置する標的に特異的に結合する、項目１４に記載の非天然細胞。
（項目１６）
前記疎水性ドメインが、膜貫通ドメインである、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１７）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１８）
前記アクチュエータードメインが、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１９）
前記アクチュエータードメインが、１種または複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２０）
前記アクチュエータードメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せを含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２１）
前記第１の核酸分子が、異なるアクチュエータードメイン、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む前記第１の融合タンパク質をコードする、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２２）
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目１８に記載の非天然細胞。
（項目２３）
前記アクチュエータードメインが、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２４）
前記細胞質シグナル伝達タンパク質が、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むタンパク質、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せである、項目２３に記載の非天然細胞。
（項目２５）
前記リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せである、項目２４に記載の非天然細胞。
（項目２６）
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目２４に記載の非天然細胞。
（項目２７）
共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２８）
前記第２の融合タンパク質が、発現すると前記非天然細胞から分泌されるように、前記第２の核酸分子が、分泌シグナルをさらにコードし、任意選択で、アンカードメインをさらにコードする、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目２９）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３０）
前記単鎖抗体の可変領域が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである、項目２９に記載の非天然細胞。
（項目３１）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのアミノ末端側にある、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３２）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３３）
前記第２の融合タンパク質をコードする前記第２の核酸分子が、前記結合性ドメインと前記第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３４）
前記細胞が、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第３の融合タンパク質をコードする第３の核酸分子をさらに含み、前記第３の融合タンパク質は、発現すると細胞外に局在化する、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３５）
結合性ドメインを含む前記融合タンパク質が、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインを有する、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３６）
１つ、２つ、３つ、または４つの前記結合性ドメインが、１つの標的または最大で４つの異なる標的に特異的である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３７）
前記結合性ドメインが、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目３８）
前記がんが、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である、項目３７に記載の非天然細胞。
（項目３９）
前記血液悪性疾患と関連する抗原標的が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である、項目３８に記載の非天然細胞。
（項目４０）
前記結合性ドメインが、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目４１）
前記第１の架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目４２）
前記第２の架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、項目１０に記載の非天然細胞。
（項目４３）
コードされた前記第１の融合タンパク質が、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのアクチュエータードメインを含み；コードされた前記第２の融合タンパク質が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；前記非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する前記第１の架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、前記項目のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目４４）
前記第１の融合タンパク質が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の融合タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、項目４３に記載の非天然細胞。
（項目４５）
過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組換え細胞を投与するステップであって、前記第１の核酸分子が、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードし、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化し、そして前記第２の核酸分子が、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし、前記第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、ステップと；
（ｂ）架橋因子を投与するステップであって、前記架橋因子が前記組換え細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップと
を含み、
前記ポリペプチド複合体の前記結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより前記過剰増殖性疾患、前記炎症性疾患、前記自己免疫疾患、または前記移植片対宿主病を処置する、方法。
（項目４６）
過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子を含む非天然細胞を投与するステップであって、前記第１の融合タンパク質が発現すると、前記第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、ステップと；
（ｂ）結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質を投与するステップと；
（ｃ）架橋因子を投与するステップであって、前記架橋因子が前記組換え細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップと
を含み、
前記ポリペプチド複合体の前記結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより前記過剰増殖性疾患、前記炎症性疾患、前記自己免疫疾患、または前記移植片対宿主病を処置する、方法。
（項目４７）
前記第１の多量体化ドメインと前記第２の多量体化ドメインとが、同じであるかまたは異なる、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する、項目４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記第１の多量体化ドメインおよび前記第２の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である、項目４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む、項目４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む、項目４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記架橋因子が、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５３）
前記第１の核酸分子が、第３の多量体化ドメインをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする、項目４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の融合タンパク質の前記第３の多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、Ｔｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子のための結合性ドメインである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
少なくとも２つの第１の融合タンパク質の会合を第２の架橋因子が促進し、前記架橋因子は、前記第１の融合タンパク質の前記第３の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、項目４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
タンパク質複合体が、少なくとも２つの第１の融合タンパク質を含むホモ複合体である、項目４５から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記第１の融合タンパク質が、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲまたはＧｙｒＢのうちの少なくとも１つの多量体化ドメインを有する、項目４５から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ポリペプチド複合体の前記結合性ドメインが、標的過剰増殖性疾患細胞表面に位置する標的に特異的に結合する、項目４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記タンパク質複合体が、１種または複数の第１の融合タンパク質および１種または複数の第２の融合タンパク質を含むヘテロ複合体である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記タンパク質ヘテロ複合体の前記結合性ドメインが、標的過剰増殖性疾患細胞表面に位置する標的に特異的に結合する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記疎水性ドメインが、膜貫通ドメインである、項目４５から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、またはＣＤ２８膜貫通ドメインである、項目４５から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記アクチュエータードメインが、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む、項目４５から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記アクチュエータードメインが、複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、項目４５から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記アクチュエータードメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せを含む、項目４５から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の核酸分子が、異なるアクチュエータードメイン、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、前記第１の融合タンパク質をコードする、項目４５から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記アクチュエータードメインが、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含む、項目４５から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記細胞質シグナル伝達タンパク質が、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、１種または複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むタンパク質、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、もしくはＣＤ７９Ｂ、またはこれらの任意の組合せである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記細胞質シグナル伝達タンパク質が、ＣＤ３ζと４−１ＢＢとの組合せ、またはＣＤ３ζとＯＸ４０との組合せである、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記非天然細胞が、共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる、項目４５から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである、項目４５から７３のいずれか一項に記載の方法。（項目７５）
前記単鎖抗体の可変領域が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのアミノ末端側にある、項目４５から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある、項目４５から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記第２の融合タンパク質が、前記結合性ドメインと前記第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをさらに含む、項目４５から７７のいずれか一項に記載の方法。（項目７９）
前記細胞が、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第３の融合タンパク質をコードする第３の核酸分子を含み、前記第３の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、項目４５から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
結合性ドメインを含む前記融合タンパク質が、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインを有する、項目４５から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
１つ、２つ、３つ、または４つの前記結合性ドメインが、１つの標的または最大で４つの異なる標的に特異的である、項目４５から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記結合性ドメインが、がんと関連する抗原である標的に特異的である、項目４５から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記がんが、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記血液悪性疾患と関連する抗原標的が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記結合性ドメインが、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する、項目４５から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記第１の架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、項目４５から８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記第２の架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、項目５５に記載の方法。
（項目８８）
前記第１の融合タンパク質が、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのアクチュエータードメインを含み；前記第２の融合タンパク質が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；前記非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する前記第１の架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、項目４５から８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記第１の融合タンパク質が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の融合タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤を投与するステップをさらに含む、項目４５から８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記薬剤が、Ｔ細胞リガンドをアンタゴナイズまたは遮断する、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記薬剤が、Ｔ細胞受容体をアンタゴナイズまたは遮断する、項目９０に記載の方法。（項目９３）
Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する前記薬剤が、抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合性断片、あるいはＰＤ−１を標的とする、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである、項目９０から９２のいずれか一項に記載の方法。（項目９４）
サイトカインアゴニストを投与するステップをさらに含む、項目４５から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
以下：
（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質と；
（ｂ）細胞外結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質と；
（ｃ）架橋因子と
を含む、融合ポリペプチドヘテロ複合体であって、ここで、
前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質と、前記架橋因子とが会合してポリペプチドヘテロ複合体を形成し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目９６）
前記結合性ドメインが、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである、項目９５に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目９７）
前記単鎖抗体の可変領域が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである、項目９６に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目９８）
前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのアミノ末端側にある、項目９５から９７のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目９９）
前記結合性ドメインが、前記多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある、項目９５から９７のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１００）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む、項目９５から９９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０１）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む、項目９５から９９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０２）
前記疎水性ドメインが、膜貫通ドメインである、項目９５から１０１のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０３）
前記アクチュエータードメインが、リンパ球受容体鎖を含む、項目９５から１０２のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０４）
前記架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、項目９５から１０３のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０５）
前記第２の融合タンパク質が、アンカードメインをさらに含む、項目９５から１０４のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０６）
前記アンカードメインが、膜貫通ドメインである、項目１０５に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０７）
前記第２の融合タンパク質が、閾値下シグナル伝達ドメインをさらに含む、項目１０５または１０６に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０８）
前記アンカードメインが、ＧＰＩシグナル配列である、項目１０５に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１０９）
前記ＧＰＩシグナル配列を変化させており、前記第２の融合タンパク質が、ＧＰＩ分子をさらに含む、項目１０５に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１１０）
前記結合性ドメインが、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である、項目９５から１０９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１１１）
前記がんが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７の抗原標的を有する血液悪性疾患である、項目１１０に記載のポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１１２）
項目１から４４または９５から１０９のいずれか一項に記載の融合タンパク質のうちの任意の１種または複数をコードする核酸分子。
（項目１１３）
ゲノム遺伝子座と相同な５’側ポリヌクレオチド配列と３’側ポリヌクレオチド配列との間に配置された、項目１１２に記載の核酸分子。
（項目１１４）
項目１１２または項目１１３に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目１１５）
前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質を、ポリシストロニックのメッセージまたは２Ａペプチドで隔てられた単一のタンパク質としてコードする、項目１１４に記載の発現ベクター。
（項目１１６）
前記ポリシストロニックのメッセージが、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、項目１１５に記載の発現ベクター。
（項目１１７）
非天然細胞であって、以下：
（ａ）Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメインおよび第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、前記第１の融合タンパク質が前記細胞から分泌される、第１の核酸分子と、
（ｂ）標的細胞表面に位置する標的に結合する結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、前記第２の融合タンパク質が前記細胞から分泌される、第２の核酸分子と
を含み、ここで
架橋因子がポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
非天然細胞。
（項目１１８）
前記第１の多量体化ドメインと前記第２の多量体化ドメインとが、同じであるかまたは異なる、項目１１７に記載の非天然細胞。
（項目１１９）
前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する、項目１１７または項目１１８に記載の非天然細胞。
（項目１２０）
前記第１の多量体化ドメインおよび前記第２の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２１）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む、項目１１７から１２０のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２２）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む、項目１１７から１２０のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２３）
前記架橋因子が、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、項目１２１または項目１２２に記載の非天然細胞。
（項目１２４）
共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる、項目１１７から１２３のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２５）
前記第１の融合タンパク質の前記結合性ドメイン、および前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインの各々が、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドからなる群より独立に選択される、項目１１７から１２４のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２６）
前記単鎖抗体の可変領域が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである、項目１２５に記載の非天然細胞。
（項目１２７）
前記第１の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記第１の多量体化ドメインのアミノ末端側にある、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２８）
前記第１の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記第１の多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１２９）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記第２の多量体化ドメインのアミノ末端側にある、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３０）
前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインが、前記第２の多量体化ドメインのカルボキシ末端側にある、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３１）
前記第１の融合タンパク質をコードする前記第１の核酸分子が、前記結合性ドメインと前記第１の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む、項目１１７から１３０のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３２）
前記第２の融合タンパク質をコードする前記第２の核酸分子が、前記結合性ドメインと前記第２の多量体化ドメインとの間に配置されたリンカーをコードする配列をさらに含む、項目１１７から１３０のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３３）
前記第２の核酸分子の前記結合性ドメインが、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である、項目１１７から１３２のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３４）
前記がんが、充実性悪性疾患または血液悪性疾患である、項目１３３に記載の非天然細胞。
（項目１３５）
前記血液悪性疾患と関連する抗原標的が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、またはＣＤ３７である、項目１３４に記載の非天然細胞。
（項目１３６）
前記第２の核酸分子の前記結合性ドメインが、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する、項目１１７から１３２のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３７）
前記架橋因子が、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体である、項目１１７から１３６のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３８）
前記第１の核酸が、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードし；前記第２の核酸が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし；ポリペプチド複合体の形成を促進する前記架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、項目１１７から１３７のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１３９）
前記第１の核酸が、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードし；前記第２の核酸が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし；ポリペプチド複合体の形成を促進する前記架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、項目１１７から１３７のいずれか一項に記載の非天然細胞。
（項目１４０）
過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、項目１１７から１３９のいずれか一項に記載の非天然細胞を投与するステップと、架橋因子を投与するステップであって、前記架橋因子がポリペプチド複合体の形成を促進し、前記架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み；前記第２の融合ポリペプチドの結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより前記過剰増殖性疾患を処置する、方法。
（項目１４１）
過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメイン、および第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質；ならびに過剰増殖性疾患細胞、炎症性疾患細胞、自己免疫疾患細胞、または移植片対宿主病細胞の細胞表面標的に結合する結合性ドメイン、および第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質を投与するステップと；
（ｂ）ポリペプチド複合体の形成を促進する架橋因子を投与するステップであって、前記架橋因子は、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み、
これにより前記過剰増殖性疾患、前記炎症性疾患、前記自己免疫疾患、または前記移植片対宿主病を処置する、方法。
（項目１４２）
融合ポリペプチドヘテロ複合体であって、以下：
（ａ）Ｔ細胞の受容体に結合する結合性ドメインおよび第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質と；
（ｂ）標的細胞の細胞表面標的に結合する結合性ドメインを含む第２の融合タンパク質と；
（ｃ）架橋因子と
を含み、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質と前記架橋因子とが会合してポリペプチドヘテロ複合体を形成し、前記架橋因子が、前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、
融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４３）
前記第１の多量体化ドメインと前記第２の多量体化ドメインとが、同じであるかまたは異なる、項目１４２に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４４）
前記第１の融合タンパク質の前記多量体化ドメインおよび前記第２の融合タンパク質の前記多量体化ドメインが、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子と会合する、項目１４２または項目１４３に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４５）
前記第１の多量体化ドメインおよび前記第２の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体から選択される対である、項目１４２から１４４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４６）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含む、項目１４２から１４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４７）
前記第１の多量体化ドメインが、第１のＦＲＢポリペプチドまたはその変異体を含み、前記第２の多量体化ドメインが、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはその変異体を含む、項目１４２から１４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４８）
前記架橋因子が、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、項目１４６または項目１４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１４９）
前記第１の融合タンパク質の前記結合性ドメイン、および前記第２の融合タンパク質の前記結合性ドメインの各々が、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドからなる群より独立に選択される、項目１４２から１４８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１５０）
前記単鎖抗体の可変領域が、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである、項目１４９に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１５１）
前記第２の融合ポリペプチドの前記結合性ドメインが、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合する、項目１４２から１５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１５２）
前記第１の融合タンパク質が、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含み；前記第２の融合タンパク質が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；前記架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、項目１４１から１５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１５３）
前記第１の融合タンパク質が、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインを含み；前記第２の融合タンパク質が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み；前記架橋因子が、ラパログのＡＰ２１９６７である、項目１４１から１５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドヘテロ複合体。
（項目１５４）
項目１１７から１５３のいずれか一項に記載の融合タンパク質のうちの任意の１種または複数をコードする核酸分子。
（項目１５５）
ゲノム遺伝子座と相同な５’側ポリヌクレオチド配列と３’側ポリヌクレオチド配列との間に配置された、項目１５４に記載の核酸分子。
（項目１５６）
項目１５４または項目１５５に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目１５７）
第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を、ポリシストロニックのメッセージまたは２Ａペプチドで隔てられた単一のタンパク質としてコードする、項目１５６に記載の発現ベクター。
（項目１５８）
前記ポリシストロニックのメッセージが、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、項目１５７に記載の発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｈ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｉ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｊ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｋ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｌ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図１Ｍ】図１Ａ〜１Ｍは、本開示の、多様な種類の多部分シグナル伝達複合体についての概略を示す図である。
【図２】図２は、本開示の、特定の多部分シグナル伝達複合体による、特異的な細胞の殺滅およびサイトカインの分泌を検出するアッセイについての概略を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞の細胞傷害特性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞の細胞傷害特性を示す図である。
【図４】図４は、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞についての、サイトカイン分泌プロファイルを示す図である。
【図５−１】図５は、架橋成分に対して異なる特異性を有する、独立の多量体化ドメインの使用により、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞の、方向付けられた細胞傷害活性が可能となることを示す図である。加えて、この図は、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞は、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を、別個の細胞内で個別に発現させる場合であってもなお、細胞傷害性でありうることを示す。
【図５−２】図５は、架橋成分に対して異なる特異性を有する、独立の多量体化ドメインの使用により、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞の、方向付けられた細胞傷害活性が可能となることを示す図である。加えて、この図は、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を発現させるヒトＴ細胞は、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を、別個の細胞内で個別に発現させる場合であってもなお、細胞傷害性でありうることを示す。
【図６】図６は、架橋因子が、ＤＡＲＩＣ系において、臨床的に関連する濃度で機能しうることを示す図である。
【図７−１】図７は、ＤＡＲＩＣ結合性成分が、細胞から放出されるか、または細胞表面に係留され、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分となおも機能的に会合して、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を形成しうることを示す図である。
【図７−２】図７は、ＤＡＲＩＣ結合性成分が、細胞から放出されるか、または細胞表面に係留され、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分となおも機能的に会合して、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を形成しうることを示す図である。
【図８】図８は、ＤＡＲＩＣ結合性成分が、ＧＰＩアンカーを介して、細胞表面に係留され、架橋因子の存在下で、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分となおも機能的に会合して、本開示の、多部分シグナル伝達複合体を形成しうることを示す図である。
【図９】図９は、さらなるモデル抗原である、ＣＤ１２３を標的化するＤＡＲＩＣ系であって、骨髄性がんを根絶するのに使用することもでき、骨髄移植の前の馴化レジメンにおいて、骨髄細胞を除去するのに使用することもできる、ＤＡＲＩＣ系を示す図である。
【図１０】図１０は、ＦＲＢ多量体化ドメインおよびＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを、ＤＡＲＩＣ結合性成分またはＤＡＲＩＣシグナル伝達成分に付加し、架橋因子の存在下で、機能的な多部分シグナル伝達複合体をなおも形成しうることを示す図である。
【図１１】図１１は、ＤＡＲＩＣ結合性成分とＤＡＲＩＣシグナル伝達成分とのカップリングを、多量体化ドメインのうちの１つだけに結合する一価薬物である、抗架橋因子の添加により不活化し、これにより細胞の活性化を遮断しうることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
一実施形態では、養子免疫療法などの免疫療法に対する生物学的応答のモジュレーティングにおける使用のための、多成分融合タンパク質が提供される。背景として述べると、細胞表面受容体によるシグナル伝達は、細胞外情報を、細胞内応答に変換するものであり、リガンド認識および膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）シグナル伝達の両方のための機構を必要とする。細胞表面受容体は、細胞外結合性ドメインの使用を介して、リガンドを認識し、リガンドに結合すると、細胞内シグナル伝達ドメインと接続された膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを介して、細胞膜を越えてシグナルを伝達する。これらは、結合とシグナル伝達とが直接関連する単一鎖単位として、またはリガンドの細胞表面への結合が、シグナル伝達ドメインの、他のタンパク質との細胞内相互作用であって、細胞シグナル伝達を媒介する細胞内相互作用を可能とする、複数鎖の接触を介して生じる。
【０１７１】
本明細書で想定される組成物および方法の利点は、このようなシグナル伝達結合およびシグナル伝達活性に対する、空間的な制御および時間的な制御の両方をもたらすことである。一実施形態では、本開示は、結合性成分およびシグナル伝達成分であって、各々が、別個の融合タンパク質として発現するが、細胞表面の２つの機能的な成分（本明細書では、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と称する）の再カップリングのための細胞外多量体化機構（架橋因子）であり、時間的制御をもたらす細胞外多量体化機構（架橋因子）を含有する成分を提示する。結合性成分は、分泌されるか、表面で発現するか、または組換え形態で送達されるので、いかなる細胞シグナル伝達機構とも基本的にカップリングすることなく、細胞外環境内に存在する。目的の細胞により発現させる、膜貫通シグナル伝達融合タンパク質は、膜貫通ドメインを介して、ＦＲＢタンパク質またはＦＫＢＰ１２タンパク質（いずれも、結合性成分上には存在しない）などの、細胞外多量体化ドメインに融合させた、１種または複数の細胞内シグナル伝達（アクチュエーター）ドメインを含む。ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２カップリング薬（例えば、ラパマイシンまたはそのラパログ）が適用されるときに限り、結合性成分とシグナル伝達成分とは、シグナル伝達を誘発することが可能な複合体を形成する。
【０１７２】
特定の実施形態では、構築を解除された、薬物調節型の、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、別個の融合タンパク質として発現するＢｉＴＥが提供される。図１Ｌを参照されたい。ＢｉＴＥは、Ｔ細胞受容体に結合する結合剤、および第１の多量体化ドメインを含む、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と；標的細胞の抗原に結合する結合剤、およびＦＲＢタンパク質またはＦＫＢＰ１２タンパク質（いずれも、結合性成分上には存在しない）などの、第２の多量体化ドメインを含む、ＤＡＲＩＣ結合性成分とを含む。ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２カップリング薬（例えば、ラパマイシンまたはそのラパログ）が適用されるときに限り、ＢｉＴＥ成分は、シグナル伝達を誘発することが可能な複合体を形成する。
【０１７３】
しかし、シグナル伝達のための機構を刺激するのは、本明細書で記載される多量体化機構を介して達成される時間的制御に限られる。化学的に誘導される多量体化は、シグナル伝達の強化された受容体を再構成するが、細胞内シグナル伝達成分を凝集させないため、下流におけるシグナル伝達は活性化させない。したがって、結合性成分上の結合性ドメインにより認識される標的の存在または非存在に基づき、空間的制御が達成される。結合性成分の融合タンパク質は、細胞の外部に分泌される（または外部から適用される）ので、標的（例えば、細胞表面抗原）および架橋因子の両方が存在する場合に限り、細胞が活性化するように、標的が存在する場所だけに蓄積される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子を含む組換え細胞を、過剰増殖性疾患（例えば、がん）、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を有する被験体に投与する。このような融合タンパク質をＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と称する場合があるが、これは、１種または複数の膜貫通タンパク質として発現しうる。ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分は、ホモ二価架橋因子の存在下で、ホモ二量体化を促進する、多量体化ドメインを含む、１つを超える多量体化ドメインを含有しうる。このような実施形態（図１ｃを参照されたい）では、架橋因子の投与により、細胞外標的への結合の非存在下で、あるレベルの基礎的なシグナル伝達が促進される（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分（この文脈では、薬物と同様に機能する）による活性化の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞増殖を駆動する方途として）である。Ｔ細胞では、低レベルの活性化であれば、増殖が促進されるが、より高次の多量体化（標的細胞の高密度の抗原、およびＤＡＲＩＣ成分の、架橋成分とのヘテロ二量体化により生じる）であれば、細胞傷害応答の活性化がもたらされることが公知である。
【０１７５】
さらなる実施形態では、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を発現させる、組換え（非天然）細胞（例えば、Ｔ細胞）を受容する被験体に、結合性ドメインおよび多量体化ドメイン（ＤＡＲＩＣ結合性成分）を含む融合タンパク質と、架橋因子（例えば、ラパマイシンまたはそのラパログ）とを、同時的または逐次的に、さらに投与して、非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進することができ、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメイン（それぞれ、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分およびＤＡＲＩＣ結合性成分）と会合し、これらの間に配置される。ある特定の実施形態では、核酸分子は、分泌シグナル、結合性ドメイン、および多量体化ドメインを含む融合タンパク質をさらにコードし、ここで、融合タンパク質（ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、発現すると非天然細胞から分泌される。一部の実施形態では、核酸分子は、分泌シグナル、結合性ドメイン、および多量体化ドメインを含む融合タンパク質をさらにコードし、ここで、発現する融合タンパク質（ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、分泌され、非天然細胞の細胞表面に、係留またはアンカリングされる（図１Ｉ〜Ｋを参照されたい）。ＤＡＲＩＣ結合性成分は、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と会合する前に、またはこれと会合した後で、架橋因子を介して、標的細胞（例えば、がん細胞、自己免疫細胞）に特異的に結合し、ここで、２つのＤＡＲＩＣ成分および架橋因子による三部分会合は、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置する細胞応答を誘発する。例えば、少なくとも１つのＤＡＲＩＣ結合性成分および細胞表面標的が存在すれば、多量体化に起因する、標的の密度に比例して増大するシグナルがもたらされる。
【０１７６】
さらなる実施形態では、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分は、薬物調節型二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）表面に既存の活性化受容体を活用することにより創出することができる。この場合、標的細胞に結合する結合性成分、およびＴ細胞の受容体（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）に結合するシグナル伝達成分の、両方のＤＡＲＩＣ成分が分泌される。一実施形態では、非天然細胞は、両方の成分を分泌する。別の実施形態では、１種または複数の非天然細胞は、成分のうちの１種または複数を分泌する。
【０１７７】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用される、ある特定の用語の定義を提示することが、その理解の一助となりうる。さらなる定義は、本開示を通して示される。
【０１７８】
本記載では、そうでないことが示されない限りにおいて、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数の範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、適切な場合は、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解される。また、そうでないことが示されない限りにおいて、ポリマーのサブユニット、サイズ、または厚さなど、任意の物理的特徴に関して、本明細書で列挙される任意の数の範囲も、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で使用される「約」という用語は、（１）表示の範囲、値、もしくは構造に対する±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±１０％、±１５％、または±２０％；（２）値を決定するのに用いられる方法についての、固有のばらつきもしくは誤差を含む値；または（３）そうでないことが示されない限りにおいて、多連の実験の間に存在するばらつきを含む値を意味する。本明細書で使用される「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、列挙された構成要素のうちの「１または複数」を指すことを理解されたい。代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物または列挙された構成要素のうちの１つ、両方、またはこれらの任意の組合せを意味するものと理解されたい。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義に使用され、これらの用語およびそれらの変形は、非限定的と解釈されることを意図する。
【０１７９】
本明細書で使用される、タンパク質またはポリペプチドは、複数のドメインの外部の部分（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のアミノ酸、または２つのドメインの間のアミノ酸）の、タンパク質またはポリペプチドの長さへの寄与が、組合せで、最大２０％（例えば、最大１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％）であり、多様なドメインのうちの１種または複数の活性（例えば、結合性ドメインの標的結合親和性、多量体化ドメインの、複合体の形成を容易とする能力、およびアクチュエータードメインの、機能的なシグナルを、細胞に伝達する能力）には実質的に影響を及ぼさない（すなわち、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％を超えないなど、５０％を超えて活性を変化させない）場合に、数個のドメイン（例えば、結合性ドメイン、リンカーまたはスペーサー、疎水性ドメイン、多量体化ドメイン、アクチュエータードメイン）「から本質的になる」。ある特定の実施形態では、タンパク質（例えば、単鎖ポリペプチド）は、標的、リンカー、および多量体化ドメインに特異的に結合する、結合性ドメインから本質的になり、ここで、タンパク質は、タンパク質のアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端に、または２つの異なるドメインの間に（例えば、結合性ドメインと多量体化ドメインとの間に、多量体化ドメインとリンカーとの間に）、接合部アミノ酸を含みうる。
【０１８０】
本明細書で使用される「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、１種または複数の親タンパク質または親ポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含み、宿主細胞内では天然に存在しないタンパク質を指す。融合タンパク質は、２つまたはこれを超える天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在しない様式で併せて連結されたアミノ酸配列を含有する。例えば、融合タンパク質は、細胞内で通常は見出されない様式で連結された同じタンパク質に由来する、２つまたはこれを超える部分を有する場合もあり、融合タンパク質は、細胞内で通常は見出されない様式で連結された、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える異なるタンパク質に由来する部分を有する場合もある。融合タンパク質は、１つのタンパク質またはその部分をコードするヌクレオチド配列が、１種もしくは複数の異なるタンパク質またはその部分をコードする核酸分子とインフレームで付加され、そして任意選択で、リンカー、スペーサー、または接合部アミノ酸をコードするヌクレオチドにより隔てられた核酸分子でコードされうる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞に導入し、発現させる。
【０１８１】
本明細書で使用される「宿主」という用語は、外因性の核酸分子により、目的のポリペプチド（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分）を産生するように遺伝子改変されうる、細胞（例えば、Ｔ細胞）または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、任意選択で、融合タンパク質の生合成と関連するかまたは関連しない、所望の特性（例えば、ＴＣＲの欠失、変化、または切断；共刺激性因子の発現の増大）を付与する、他の遺伝子改変を既に保有する場合もあり、これらを含むように改変される場合もある。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、もしくはこれらの両方を、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼであるＬＨＥ）でノックアウトしたヒトＴ細胞である。
【０１８２】
本明細書で使用される「組換え」または「非天然」とは、少なくとも１カ所の、操作された遺伝子変化を有するか、もしくは異種核酸分子の導入により改変されている、生物、微生物、細胞、核酸分子、もしくはベクターを指すか、または内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現を制御しうるように変化させた細胞を指す。組換えはまた、非天然細胞に由来するか、または１カ所もしくは複数カ所のこのような改変を有する非天然細胞の後代である細胞も指す。遺伝子変化は、例えば、タンパク質をコードする発現可能な核酸分子、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝子物質の他の機能的な変化を導入する改変を含む。例えば、組換え細胞は、遺伝子、または天然（野生型）細胞内では、同一または相同な形態で見出されない、他の核酸分子（例えば、融合タンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸分子）を発現させる場合もあり、過剰発現させるか、過少発現させるか、最小限に発現させるか、または全く発現させないなど、内因性遺伝子の発現パターンの変化をもたらす場合もある。
【０１８３】
当技術分野では、外因性核酸または異種核酸を、細胞内で発現させるための組換え法が周知である。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）において記載されていることが見出されうる。発現させる、例示的な外因性タンパク質または外因性酵素は、ｓｃＦｖ、ＣＤ３ζ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、サイトカイン、またはこれらの任意の組合せを含む。融合タンパク質をコードする核酸分子に対する遺伝子改変は、組換え細胞または非天然細胞に、その天然に存在する状態から変化させた、生化学的能力または代謝能を付与しうる。
【０１８４】
本明細書で使用される「内因性」または「天然」という用語は、通常宿主細胞内に存在する、遺伝子、タンパク質、化合物、または活性を指す。「相同な」または「相同体」という用語は、外因性（非天然）供給源に由来する分子または活性であって、宿主細胞、宿主種、または宿主株において見出されるか、またはこれらに由来する分子または活性と同じであるかまたは類似の分子または活性を指す。
【０１８５】
本明細書で使用される「異種」核酸分子、「異種」構築物、または「異種」配列とは、それを発現させる細胞に対して天然ではない核酸分子もしくは核酸分子配列の部分、宿主細胞に対して天然である、核酸分子もしくは核酸分子の部分であって、変化させるかもしくは変異させた核酸分子もしくは核酸分子の部分、または類似の条件下で、天然の発現レベルと比較して発現を変化させた核酸分子を指す。例えば、異種制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を使用して、遺伝子または核酸分子の発現を、天然で、または培養物中で、通常発現する、遺伝子または核酸分子とは異なる様式で調節することができる。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞遺伝子と相同でありうるが、発現レベルを変化させる場合もあり、異なる配列を有する場合もあり、これらの両方の場合もある。他の実施形態では、異種核酸分子または外因性核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性ではなく（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子であり）、代わりに、形質転換（例えば、トランスフェクション、電気穿孔）により宿主細胞に導入することができるが、ここで、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれる場合もあり、１世代を超える世代にわたり、一過性に（例えば、ｍＲＮＡ）、または安定的に、染色体外遺伝子物質として存在する（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド、または他の自己複製型ベクター）場合もある。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、１つを超える異種核酸分子または外因性核酸分子は、宿主細胞に、別個の核酸分子として導入することもでき、ポリシストロニックの核酸分子として導入することもでき、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として導入することもでき、これらの任意の組合せとして導入することもでき、やはり、１つを超える異種核酸または外因性核酸として考えることができる。２つまたはこれを超える外因性核酸分子を、宿主細胞に導入する場合、２つまたはこれを超える外因性核酸分子は、単一の核酸分子（例えば、単一のベクター上の）として導入することもでき、別個のベクター上で導入することもでき、単一または複数のｍＲＮＡ分子として導入することもでき、単一の部位または複数の部位において、宿主染色体に組み込むこともでき、これらの実施形態の各々は、やはり、２つまたはこれを超える外因性核酸分子であると考えられることが理解される。したがって、言及される、異種核酸分子または異種タンパク質の活性の数とは、コード核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指すものであり、宿主細胞に導入された別個の核酸分子の数を指すものではない。
【０１８７】
例えば、細胞は、２つまたはこれを超える異種核酸分子または外因性核酸分子であって、同じ場合もあり、異なる場合もあり、本明細書で開示される、１種または複数の融合タンパク質をコードする異種核酸分子または外因性核酸分子を発現させるように改変することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子、および第２の融合タンパク質をコードする別個の第２の核酸分子を含有するか、または宿主細胞は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードする単一のポリシストロニックの核酸分子、または第１の融合タンパク質、自己切断型アミノ酸配列、および第２の融合タンパク質をコードする単一の核酸分子を含有する。
【０１８８】
当業者には、適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドが公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻、６９９〜７２２頁；Ｓｃｙｍｃｚａｋら（２００４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５巻、５８９〜５９４頁を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビモウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビモウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（コメツングロ球状ウイルス（ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス（ｐａｒｓｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼによる切断部位を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、その高度な切断厳密性のために、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧおよびＥＮＬＹＦＱＳ（配列中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）が好ましい（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧとの間、またはＱとＳとの間に生じる）。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａ部位、２Ａ配列、もしくは２Ａドメインまたは２Ａ様部位、２Ａ様配列、もしくは２Ａ様ドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８２巻：１０２７〜１０４１頁）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０１９０】
一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群より選択される。
【０１９１】
本明細書で使用される「ポリペプチド複合体」または「タンパク質複合体」は、標的に特異的な結合性ドメインを有する、少なくとも１つの鎖と、アクチュエータードメインを有する１つの鎖とを含む、少なくとも２つの異なる単鎖ポリペプチドにより形成された、二量体、三量体、またはより高次の多量体を指す。この用語は、４つの単鎖ポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成された抗体を含まない。「二量体」とは、互いと会合した２つのサブユニットを含有する生物学的実体を指し、「ポリペプチド複合体」とは、少なくとも２つのタンパク質サブユニットと、架橋因子とを含む生物学的実体であって、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および他の相互作用（例えば、静電相互作用、塩架橋、水素結合、および疎水性相互作用）を含む、分子間力の１種または複数の形態を介して互いと会合し、適切な条件下で（例えば、生理学的条件下で、組換えタンパク質を発現させ、精製し、かつ／もしくは保存するのに適する水溶液中で、または非変性型電気泳動および／もしくは非還元型電気泳動のための条件下で）安定な生物学的実体を指す。
【０１９２】
「単鎖ポリペプチド」とは、単一の、直鎖状で、連続的な、共有結合的に連結されたアミノ酸の配置である。「単鎖ポリペプチド」は、鎖間ジスルフィド結合などを介して、非直鎖状の様式で併せて連結される、２つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖が、ジスルフィド結合を介して、重鎖と連結される、免疫グロブリン分子の半分）を含まない。ある特定の実施形態では、単鎖ポリペプチドは、１種または複数の鎖間ジスルフィド結合を有するかまたは形成しうる。ある特定の他の実施形態では、２つまたはこれを超える単鎖ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、複合体が、融合タンパク質またはキメラタンパク質など、少なくとも１つの非天然タンパク質からなり、天然の抗体ではないという条件で、潜在的に活性の複合体をもたらすように、鎖間ジスルフィド結合を介して会合しうる。
【０１９３】
本明細書で使用される「多量体化ドメイン」とは、別の異なるポリペプチド分子と、直接または架橋分子を介して、優先的に相互作用するかまたは会合する、ポリペプチド分子を指し、ここで、異なる多量体化ドメインの相互作用は、多量体化（すなわち、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ多量体、ヘテロ多量体でありうる、二量体、三量体、または多部分複合体の形成）に実質的に寄与するか、またはこれを効率的に促進する。本開示の代表的な多量体化ドメインは、本明細書で提示される通り、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、カルシニューリン、シクロフィリン、細菌性ＤＨＦＲ、ＰＹＬ１、ＡＢＩ１、ＧＩＢ１、ＧＡＩ、またはこれらの変異体を含む。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド複合体は、（ｉ）第１の多量体化ドメインを有する、第１の融合タンパク質と、（ｉｉ）第１の多量体化ドメインと同じではない、第２の多量体化ドメインを有する、第２の融合タンパク質とを含み、ここで、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、架橋因子の存在下で、ポリペプチド複合体の形成に実質的に寄与するか、またはこれを効率的に促進する。第１の多量体化ドメイン、第２の多量体化ドメイン、または架橋因子の非存在下で、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質との間の会合の、統計学的に有意な低減が見られるなら、第１の多量体化ドメインと、第２の多量体化ドメインとの間の相互作用は、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質との多量体化に実質的に寄与するか、またはこれを効率的に促進する。ある特定の実施形態では、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質とを、共発現させる場合、第１の単鎖ポリペプチドおよび第２の単鎖ポリペプチドのうちの、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも約８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、および少なくとも約９０％〜約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、架橋因子の存在下で、互いと多量体を形成する。
【０１９５】
本明細書で使用される「疎水性ドメイン」とは、細胞膜内で、熱力学的に安定な三次元構造を有する、アミノ酸配列を指す。疎水性ドメインの構造は、アルファへリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータへリックス、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ある特定の実施形態では、疎水性ドメインは、内在性膜タンパク質（例えば、受容体、表面抗原分類（ＣＤ：ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分子、酵素、輸送体、細胞接着分子など）に由来する膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインである。
【０１９６】
本明細書で使用される「アンカードメイン」とは、本開示の融合タンパク質の、細胞表面への係留、アンカリング、またはこれとの会合を促進する、アミノ酸配列、または他の分子を指す。例示的なアンカードメインは、細胞膜内で安定な構造を伴うアミノ酸配列、または糖脂質（グリコシルホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩとしてもまた公知である）の付加を促進するアミノ酸配列などを含む。背景として述べると、ＧＰＩ分子は、カルボキシ末端のＧＰＩシグナル配列の切断（例えば、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１３巻：７２１頁、２０００年を参照されたい）、および既に合成されたＧＰＩアンカー分子の、新たに形成されたカルボキシ末端のアミノ酸への同時的な移動（例示的なＧＰＩアンカーであって、参照によりその全体が組み込まれるＧＰＩアンカーについては、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２０７１１を参照されたい）を結果としてもたらす、アミノ基転移反応により、翻訳後において、タンパク質標的に付着される。ある特定の実施形態では、アンカードメインは、疎水性ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン）、またはＧＰＩシグナル配列である。一部の実施形態では、アンカードメインを伴う、本開示の、融合タンパク質をコードする核酸分子は、ＧＰＩ分子をさらに含む、融合タンパク質を結果としてもたらす。
【０１９７】
本明細書で使用される「アクチュエータードメイン」は、適切なシグナルを受け取ると、直接的または間接的に、細胞内の生物学的応答または生理学的応答を促進する。ある特定の実施形態では、アクチュエータードメインとは、標的分子に結合されるか、またはこれに結合すると、シグナルを受け取る、タンパク質またはタンパク質複合体の一部であり、結合により、アクチュエータードメインからのシグナルが誘発される。アクチュエータードメインは、それが、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）などのシグナル伝達ドメインまたはシグナル伝達モチーフを含有する場合に、細胞応答を直接促進しうる。他の実施形態では、アクチュエータードメインは、細胞応答を直接促進する、１種または複数の他のタンパク質と会合することにより、細胞応答を間接的に促進する。例示的なアクチュエータードメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０１９８】
特定の実施形態では、「膜貫通ドメイン」とは、シグナル伝達成分の部分であって、細胞外多量体化ドメインと、１種または複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを融合させ、シグナル伝達成分を、Ｔ細胞の細胞膜にアンカリングする部分を指す。ある特定の実施形態では、「膜貫通ドメイン」とは、結合性成分の部分であって、細胞外多量体化ドメインに融合し、結合性成分を、Ｔ細胞の細胞膜にアンカリングする部分を指す。膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来する場合もあり、合成の供給源に由来する場合もあり、半合成の供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に由来する場合もある。例示的な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１に由来しうる（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）。多様な実施形態では、結合性成分および／またはシグナル伝達成分の膜貫通ドメインを、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーであって、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間の長さであり、任意選択で、シグナル伝達成分の膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する、リンカーに融合させる。
【０１９９】
本明細書で使用される「結合性ドメイン」（また、「結合性領域」、「結合性作用因子」、または「結合性部分」とも称する）とは、標的（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０）を特異的に認識し、これらに結合する能力を保有する、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを指す。結合性ドメインは、任意の、天然に存在するか、合成であるか、半合成であるか、または組み換えにより生成された結合性パートナーであって、目的の生物学的分子または別の標的に対する結合性パートナーを含む。例示的な結合性ドメインは、単鎖抗体の可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、受容体のエクトドメイン（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）、またはリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン、または細胞表面関連のリガンド）を含む。特定の実施形態では、結合性ドメインは、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディー）を含むがこれらに限定されない、抗体またはその抗原結合性断片を含む。特定の標的に特異的に結合する、本開示の結合性ドメインを同定することための様々なアッセイであって、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ解析を含むアッセイが公知である。
【０２００】
結合性ドメインおよびその融合タンパク質は、それが、被験試料中に存在する他の成分に有意に結合せずに、１０５Ｍ−１と等しいかまたはこれを超えるＫａ（すなわち、単位を１／Ｍとする、特定の結合性相互作用の平衡会合定数）の親和性で標的に結合するなら、標的「に特異的に結合する」。結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」の結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）および「低親和性」の結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）と分類することができる。「高親和性」の結合性ドメインとは、Ｋａを、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１とする結合性ドメインを指す。「低親和性」の結合性ドメインとは、Ｋａを、最大で１０７Ｍ−１、最大で１０６Ｍ−１、最大で１０５Ｍ−１とする結合性ドメインを指す。代替的に、親和性は、単位をＭとする、特定の結合性相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することもできる。本開示に従う、結合性ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、従来の技法を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物を参照されたい）。
【０２０１】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、ＣＤ３と共に、Ｔ細胞の表面に見出される分子であって、一般に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）分子に結合した抗原の認識の一因となる分子である。大半のＴ細胞では、ＴＣＲは、高度に可変性のα鎖とβ鎖との、ジスルフィド連結されたヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞では、可変性のγ鎖およびδ鎖から構成される、代替的な受容体が発現する。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質テールを保有する（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５版）、Ｓａｕｎｄｅｒｓ編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００３年；Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１４８、１４９、および１７２頁、１９９９年を参照されたい）。本開示で使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む、１つまたは多様な動物種に由来しうる。
【０２０２】
当技術分野では、「ＣＤ３」は、６つの鎖の多重タンパク質複合体として公知である（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ、２００３年；Ｊａｎｅｗａｙら、１７２および１７８頁、１９９９年を参照されたい）。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの関連性が高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞受容体鎖と会合することを可能とする特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の細胞内テールの各々が、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして公知の、単一の保存されたモチーフを含有するのに対し、各ＣＤ３ζ鎖は、３つの保存されたモチーフを有する。ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能のために重要であると考えられている。本開示で使用されるＣＤ３は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む、１つまたは多様な動物種に由来しうる。
【０２０３】
本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体」とは、ＣＤ３の、ＴＣＲとの会合により形成された複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖からなる場合がある。代替的に、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖からなる場合もある。
【０２０４】
本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体の成分」とは、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはＣＤ３ζ）、または２つまたはこれを超えるＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖により形成された複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβとの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδとの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δとの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εとの複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖によるＴＣＲ部分複合体（ｓｕｂ−ＴＣＲ  ｃｏｍｐｌｅｘ））を指す。
【０２０５】
本明細書において、異なる形で明示的に定義されない限りにおいて、抗体技術の技術分野の当業者により理解される用語の各々には、当技術分野で獲得されている意味を与える。抗体は、可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することが公知である。免疫グロブリンの構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）において総説されている。
【０２０６】
例えば、「ＶＬ」および「ＶＨ」という用語は、抗体の軽鎖および重鎖のそれぞれに由来する、可変結合性領域を指す。可変結合性領域は、個別の、十分に規定された部分領域であって、「相補性決定領域」（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の部分領域から構成される。「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体の軽鎖に由来する定常領域を指す。「ＣＨ」という用語は、抗体のアイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分けられる、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指す。「Ｆａｂ」（抗原結合性断片）とは、抗体の部分であって、抗原に結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して、軽鎖に連結された重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む部分である。
【０２０７】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域定常ドメイン部分」または「Ｆｃ領域部分」とは、抗体に由来するＦｃ断片（「結晶化可能な断片」領域すなわちＦｃ領域）の重鎖定常領域セグメントであって、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはこれらの任意の組合せなど、１種または複数の定常ドメインを含みうるセグメントを指す。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、もしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびにこれらの任意の組合せ、またはＩｇＭ抗体もしくはＩｇＥ抗体のＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、ならびにこれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３構造またはＣＨ３ＣＨ４構造は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭなど、同じ抗体アイソタイプに由来する。背景として述べると、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞性食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）、および補体結合、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）への結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の延長、プロテインＡ結合、および、なおおそらくは、胎盤通過など、免疫グロブリンのエフェクター機能の一因となる（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁（１９８９年）を参照されたい）。
【０２０８】
「リンカー」または「スペーサー」とは、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続し、結果として得られるポリペプチドが、標的分子に対する特異的結合親和性を保持するか、またはシグナル伝達活性（例えば、アクチュエータードメイン活性）を保持するように、２つの部分結合性（例えば、多量体化）ドメインの相互作用と適合性のスペーサー機能をもたらしうる、アミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、約２〜約３５アミノ酸、例えば、または約４〜約２０アミノ酸、または約８〜約１５アミノ酸、または約１５〜約２５アミノ酸から構成される。他の実施形態では、スペーサーは、抗体のＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなど、特定の構造を有しうる。一実施形態では、スペーサーは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０２０９】
「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」とは、結合性ドメインと隣接する多量体化ドメインとの間、または疎水性領域と隣接する多量体化ドメインとの間、または２つのモチーフ、領域、もしくはドメインを連結する、ペプチドリンカーもしくはペプチドスペーサーと、隣接するアクチュエータードメインとの間など、ポリペプチドの、２つの隣接するモチーフ、領域、またはドメインの間の、１個または複数の（例えば、約２〜１０個の）アミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物デザインからもたらされる場合がある（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築時における、制限酵素部位の使用からもたらされるアミノ酸残基）。
【０２１０】
「変化させたドメイン」または「変化させたタンパク質」とは、野生型のモチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、野生型ヒトＦＫＢＰ１２、野生型ヒトＦＲＰ、野生型ヒトＩＴＡＭ、野生型ヒトＣＤ３ζ、野生型ヒトＴＣＲ）に対する配列同一性を、少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）とする、モチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。例えば、「変化させたＦＫＢＰ」とは、野生型ＦＫＢＰ（例えば、ヒトＦＫＢＰ）に対する配列同一性を、少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）とするＦＫＢＰを指す。同様に、「変化させたＣＤ３ζ」とは、野生型ＣＤ３ζ（例えば、ヒトＣＤ３ζ）に対する配列同一性を、少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）とするＣＤ３ζを指す。
【０２１１】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、オリゴヌクレオチド、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳により作り出される断片、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、またはエクソヌクレアーゼ作用のうちのいずれかにより作り出される断片のうちのいずれかを指す。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲにより生成される。核酸は、天然に存在するヌクレオチドである単量体（デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドなど）、天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−光学異性形態）、またはこれらの両方の組合せからなる場合がある。修飾ヌクレオチドは、糖部分またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分の修飾または置き換えを有しうる。核酸の単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような連結の類似物により連結することができる。ホスホジエステル連結の類似物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、モルホリノなどを含む。「核酸分子」という用語はまた、ポリアミド骨格に付着させた、天然に存在する核酸塩基または改変された核酸塩基を含む、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）も含む。核酸分子は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。
【０２１２】
本明細書で使用される「変異」とは、核酸分子またはポリペプチド分子の配列の、基準核酸分子もしくは野生型核酸分子または基準ポリペプチド分子もしくは野生型ポリペプチド分子のそれぞれと比較した変化を指す。変異は、配列の、複数の異なる種類の変化であって、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む変化を結果としてもたらしうる。他の実施形態では、変異は、１種または複数のヌクレオチドまたは残基の置換である。
【０２１３】
「構築物」という用語は、組換え核酸を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌性ベクター、ウイルスベクター）内に存在する場合もあり、ゲノムに組み込まれる場合もある。「ベクター」とは、別の核酸を運ぶことが可能な核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または直鎖状もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子で有り得、これらは染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸を含みうる。例示的なベクターは、自律複製が可能なベクター（エピソームベクター）、および／またはそれらが連結された核酸の発現が可能なベクター（発現ベクター）である。
【０２１４】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）を含む、二本鎖ＤＮＡウイルス、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、およびカナリア痘ウイルス）を含む。他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、哺乳動物Ｄ型レトロウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年）。
【０２１５】
本明細書で使用される「レンチウイルスベクター」とは、それらの比較的大きなパッケージング容量、低減された免疫原性、および高効率で、広範にわたる、異なる細胞型を安定的に形質導入するそれらの能力のために、遺伝子送達に極めて有望な、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、３つまたはこれを超えるプラスミド（パッケージングプラスミド、エンベローププラスミド、および導入プラスミド）の、産生細胞への一過性のトランスフェクションに従い作り出される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターも、ウイルス表面の糖タンパク質の、細胞表面の受容体との相互作用を介して標的細胞に入る。侵入すると、ウイルスＲＮＡは、逆転写を経るが、これは、ウイルス逆転写酵素複合体に媒介される。逆転写の産物は、二本鎖直鎖状のウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡ内のウイルスの組込みのための基質である。
【０２１６】
本明細書で使用される「組込み型レンチウイルスベクター（すなわちＬＶ）」とは、標的細胞のゲノムに組み込むことができるベクターの例などのベクターを意味する。
【０２１７】
「非組込み型レンチウイルスベクター」（すなわちＮＩＬＶ：ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）とは、効率的な遺伝子送達ベクターであって、ウイルスインテグラーゼの作用を介して、標的細胞のゲノムに組み込まないベクターを意味する。一実施形態では、ＮＩＬＶとは、そのインテグラーゼ活性を特異的に減少させるように変異させたインテグラーゼタンパク質を有する、レンチウイルスを指す。インテグラーゼ活性を低減するのに適する、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子内の例示的な変異は、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３ＡおよびＫ２６４Ｈを含むがこれらに限定されない。
【０２１８】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の核酸配列の機能が、他方の核酸配列の影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の関係を指す。例えば、プロモーターは、それが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）とき、コード配列と作動可能に連結されている。「連結されていない」は、関連の遺伝子エレメントが、互いと緊密に関係しておらず、一方の機能が、他方に影響を及ぼさないことを意味する。
【０２１９】
本明細書で使用される「発現ベクター」とは、適切な宿主内の核酸分子の発現をもたらすことが可能な、適切な制御配列に作動可能に連結された核酸分子を含有する、ＤＮＡ構築物を指す。このような制御配列は、転写をもたらすプロモーター、このような転写を制御する、任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合性部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミドの場合もあり、ファージ粒子の場合もあり、ウイルスの場合もあり、単なる潜在的なゲノムインサートの場合もある。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、複製され、宿主ゲノムと独立に機能する可能性もあり、場合によって、ゲノム自体に組み込まれる可能性もある。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」、および「ベクター」は、互換的に使用されることが多い。
【０２２０】
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸配列に基づき産生される過程を指す。過程は、転写および翻訳の両方を含む。
【０２２１】
核酸配列を細胞に挿入する文脈における「導入された」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸配列の、真核細胞または原核細胞への組込みに対する言及を含み、ここで、核酸配列は、細胞のゲノムに組み込まれる（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）場合もあるか、自律性レプリコンに変換される場合もあるか、または一過性に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）場合もある。
【０２２２】
本明細書で使用される「配列同一性」とは、配列を整列し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入し、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない後における、１つの配列内の、別の基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一なアミノ酸残基の百分率を指す。配列同一性の百分率値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁により規定される通り、パラメータを、デフォルト値に設定した、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアによりもたらされる。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、変化させた免疫グロブリンは、野生型免疫グロブリンドメインの保存的アミノ酸置換だけを含有する。ある特定の他の実施形態では、変化させた免疫グロブリンドメインは、野生型免疫グロブリンドメインの非保存的アミノ酸置換だけを含有する。さらに他の実施形態では、変化させた免疫グロブリンドメインは、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含有する。
【０２２４】
当技術分野では、「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として認識されている。当技術分野では、例示的な保存的置換が周知である（例えば、１９９７年３月１３日に公開された、ＷＯ９７／０９４３３、１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ｉｎｃ．  ＮＹ、ＮＹ（１９７５年）、７１〜７７頁；Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ（１９９０年）、８頁を参照されたい）。ある特定の実施形態では、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。
【０２２５】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、酵素を伴うかまたは伴わない、化学的手段または生物学的手段による、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成による、ペプチドの１種または複数のアミノ酸残基の修飾を指す。一般に、「誘導体」は、親ポリペプチドが、「誘導体」を作り出す出発材料ではありうるが、「類似体」を作り出す出発材料として必ずしも使用されるわけではないという点で、「類似体」と異なる。誘導体は、親ポリペプチドの、異なる化学的特性、生物学的特性、または物理的特性を有しうる。例えば、誘導体は、親ポリペプチドと比較して、より親水性の場合もあり、反応性を変化させている（例えば、ＣＤＲが、標的に対するその親和性を変化させるアミノ酸変化を有するか、またはＦＫＢＰが、ラパマイシンまたはそのラパログに対するその親和性を変化させるアミノ酸変化を有する）場合もある。
【０２２６】
「受容体」とは、細胞の細胞膜内または細胞質内に存在するタンパク質であって、シグナル分子（すなわち、リガンド、例えば、ホルモン、神経伝達物質、毒素、サイトカイン）が結合または付着しうるタンパク質である。単一の分子の、受容体への結合は、受容体のコンフォメーション変化を結果としてもたらす可能性があり、これにより細胞応答が誘発されうる。しかし、一部のリガンドは、いかなる応答も誘導せずに、受容体を遮断する（例えば、アンタゴニスト）に過ぎない。一部の受容体タンパク質は、末梢の膜タンパク質であり、多くのホルモンおよび神経伝達物質の受容体は、細胞膜のリン脂質二重層内に埋め込まれた膜貫通タンパク質であり、受容体の別の主要なクラスは、ステロイドに対する細胞内タンパク質、および細胞内分泌ペプチドホルモン受容体などの細胞内タンパク質である。
【０２２７】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、それが天然に存在する供給源から除去された物質を指す。物質は、単離するために精製する必要はない。例えば、宿主細胞内で産生されるタンパク質は、それが、細胞から取り出されるか、または放出されるとき、単離されると考えられる。本開示の目的では、粗細胞溶解物画分中に含有されるタンパク質は、「単離された」とみなされる。さらに、「単離核酸分子」とは、個別の断片の形態にあるポリヌクレオチド分子、またはより大型の核酸構築物の成分としてのポリヌクレオチド分子であって、その供給源である細胞であって、それが通常は存在する染色体を含む細胞から、少なくとも一度は分離されたポリヌクレオチド分子を指す。例えば、組換えポリペプチド、組換えペプチド、またはこれらの変異体をコードするＤＮＡ分子であって、細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＤＮＡ分子は、単離核酸分子である。単離核酸分子の別の例は、適切な宿主細胞内の複製が可能なベクターにクローニングされうる、バクテリオファージのプロモーター（例えば、Ｔ５またはＴ７）、または核酸の発現制御配列である。単離核酸分子のなおも別の例は、化学合成された核酸分子またはＰＣＲにより合成された核酸分子である。
【０２２８】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、それに随伴することが典型的である夾雑物および他の材料を少なくとも部分的に含まないようにされた物質を指す。物質は、多様な程度まで精製することができる。物質は、物質の調製物または組成物が、約１％未満の夾雑物を含有する場合に、「実質的に純粋」である。物質は、物質の調製物または組成物が、約５％未満の夾雑物を含有する場合に、「本質的に純粋」である。物質は、物質の調製物または組成物が、約２％未満の夾雑物を含有する場合に、「純粋」である。「均一性まで精製された」物質では、夾雑物は、従来の解析法では検出することができない。
【０２２９】
「処置」、「処置すること」、または「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」とは、治療的処置または予防的／防止的処置を指す。処置を施される個体における疾患の少なくとも１つの症状を改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）か、または処置が、個体における進行性疾患の増悪を遅延させうるか、もしくはさらなる関連の疾患の発症を防止しうるなら、処置は、治療的である。
【０２３０】
特異的結合分子または特異的化合物の「治療有効量（または治療有効用量）」または「有効量（または有効用量）」とは、処置される疾患の１種または複数の症状の、統計学的に有意な様式での改善を結果としてもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与された個別の有効成分に言及する場合、治療有効用量とは、その成分単独を指す。組合せに言及する場合、治療有効用量とは、組み合わせられた有効成分の量であって、逐次的に投与されたのであれ、同時的に投与されたのであれ、治療効果を結果としてもたらす量を指す。
【０２３１】
「薬学的に許容される」という用語は、当技術分野で周知の経路を使用して投与される場合に、アレルギー性有害反応または他の重篤な有害反応をもたらさない、分子的実体および組成物を指す。
【０２３２】
「必要とする被験体」とは、本明細書で提示される、非天然細胞、ポリペプチド複合体、またはこれらの組成物による処置または改善に適する、疾患、障害、または状態の危険性があるか、またはこれらを患う被験体を指す。ある特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【０２３３】
さらなる定義は、本開示を通して提示される。
【０２３４】
ある特定の態様では、本開示は、（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子であって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の核酸分子と；（ｂ）結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞から分泌されるかまたは細胞表面にアンカリングされて、細胞外に局在化する、第２の核酸分子とを含み；第１の架橋因子が非天然細胞の表面のポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、非天然細胞を対象とする。ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）をさらに含み、ここで、細胞外に局在化した第２の融合タンパク質は、非天然細胞の表面に係留またはアンカリングされている。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８などに由来する膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインにより、非天然細胞の表面にアンカリングされている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＰＩ分子により、非天然細胞の表面にアンカリングされている。
【０２３５】
さらなる実施形態では、第１の融合タンパク質は、それ自体の疎水性ドメインおよびアクチュエータードメインを含むのではなく、代わりに、Ｔ細胞の表面に発現する膜貫通タンパク質であって、疎水性ドメインおよびアクチュエータードメインを含む膜貫通タンパク質（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３など）に結合する、結合性ドメインを含む。
【０２３６】
さらなる態様では、本開示は、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする異種核酸分子であって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、異種核酸分子を含む第１の非天然細胞；ならびに結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の異種核酸分子であって、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に放出される、第２の異種核酸分子を含む第２の非天然細胞であって、第１の架橋因子が第１の非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、第１の非天然細胞ならびに第２の非天然細胞を対象とする。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、第１の多量体化ドメインと、第２の多量体化ドメインとは、同じであるかまたは異なる。例示的な架橋因子であって、多量体化ドメインと会合し、本開示の融合タンパク質に対して有用な架橋因子は、ラパマイシン（シロリムス）またはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ：ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ：ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＦＫＢＰ））もしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０２３８】
例示的なラパマイシン類似体（ラパログ）は、米国特許第６，６４９，５９５号において開示されている、ラパマイシン類似体（ラパログ）であって、参照により本明細書に組み込まれるラパログ構造を含む。ある特定の実施形態では、架橋因子は、免疫抑制効果が、ラパマイシンと比較して実質的に低減されたラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」とは、臨床で測定されるか、またはヒト免疫抑制活性についての、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサロゲート（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサロゲートにおいて測定される免疫抑制効果が、当モル量のラパマイシンについて観察または予測される免疫抑制効果の、少なくとも０．１〜０．００５倍未満であるラパログを指す。代替的に、「実質的に低減された免疫抑制効果」とは、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＥＣ５０値が、同じアッセイにおいて、ラパマイシンについて観察されるＥＣ５０値の、少なくとも１０〜２５０倍であるラパログを指す。他の例示的なラパログは、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスを含む。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と会合する。例えば、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインとは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログとの三部分複合体を形成することが可能なポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒトおよび他の種に由来する、ｍＴＯＲタンパク質（文献ではまた、ＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称する）；Ｔｏｒ１およびＴｏｒ２を含む酵母タンパク質；ならびにＣａｎｄｉｄａ属のＦＲＡＰ相同体を含む、多数の天然に存在するタンパク質内に存在する。当技術分野では、これらのタンパク質のヌクレオチド配列、クローニング、および他の側面に関する情報が既に公知である。例えば、ヒトｍＴＯＲのタンパク質配列の受託番号は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４０７５．１（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：７５６頁、１９９４年）である。
【０２４０】
本開示の融合タンパク質における使用のためのＦＲＢドメインは一般に、少なくとも約８５〜約１００のアミノ酸残基を含有する。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質における使用のためのＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づき、９３アミノ酸の配列であるＩｌｅ−２０２１〜Ｌｙｓ−２１１３、およびＴ２０９８Ｌの変異を含む。本開示の融合タンパク質における使用のためのＦＲＢドメインは、本開示の、ラパマイシンまたはそのラパログに結合させたＦＫＢＰタンパク質による複合体への結合が可能である。ある特定の実施形態では、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）ヒトｍＴＯＲの、少なくとも表示の９３アミノ酸の領域、もしくは相同なタンパク質の対応する領域に及ぶ、天然に存在するペプチド配列；（ｂ）天然に存在するペプチドのうちの、最大で約１０アミノ酸、または約１〜約５アミノ酸、または約１〜約３アミノ酸、または、一部の実施形態では、ただ１つのアミノ酸を、欠失させるか、挿入するか、もしくは置換した、天然に存在するＦＲＢの変異体；または（ｃ）天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズすることが可能な核酸分子によりコードされるペプチド、もしくは遺伝子コードの縮重を別として、天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列によりコードされるペプチドを含む。
【０２４１】
ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合性タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなどのマクロライドに対する、細胞質ゾル受容体であり、種系列を越えて高度に保存されている。本開示の目的では、ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログへの結合が可能であり、ＦＲＢ含有タンパク質またはＦＲＢを含有する融合タンパク質との三部分複合体をさらに形成することも可能な、タンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合性ドメイン」とも称する。当技術分野では、多様なＦＫＢＰ分子種の、ヌクレオチド配列、クローニング、および他の側面に関する情報が公知である（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３４６巻：６７１頁、１９９０年（ヒトＦＫＢＰ１２）；Ｋａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、３１４巻：３６１頁、１９９６年を参照されたい）。当技術分野ではまた、他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における、相同なＦＫＢＰタンパク質も公知であり、本明細書で開示される融合タンパク質内で使用することができる。本発明における使用のためのＦＫＢＰドメインのサイズは、どのＦＫＢＰタンパク質を用いるのかに応じて変化する。本開示の融合タンパク質のＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢ含有タンパク質との三部分複合体に関与すること（このような結合を検出するための、直接的または間接的な任意の手段により決定されうる）が可能である。
【０２４２】
本発明のＦＫＢＰ融合タンパク質のＦＫＢＰドメインのペプチド配列は、（ａ）ヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５８４７６．１）もしくはこれに由来するペプチド配列に由来することが好ましい、天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、別のヒトＦＫＢＰに由来する天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、マウスＦＫＢＰもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰに由来する天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、または一部の他の動物のＦＫＢＰ、酵母ＦＫＢＰ、もしくは真菌ＦＫＢＰに由来する天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列；（ｂ）天然に存在するペプチドのうちの、最大で約１０アミノ酸、または約１〜約５アミノ酸、または約１〜約３アミノ酸、または、一部の実施形態では、ただ１つのアミノ酸を、欠失させるか、挿入するか、または置換した、天然に存在するＦＫＢＰ配列の変異体；あるいは（ｃ）天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズすることが可能な核酸分子によりコードされるペプチド配列、または遺伝子コードの縮重を別として、天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列によりコードされるペプチド配列を含む。
【０２４３】
他の多量体化ドメイン対は、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはこれらの変異体を含む。
【０２４４】
さらに他の実施形態では、抗架橋因子は、少なくとも２つの第１の融合タンパク質の、架橋因子との会合を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６は、ラパマイシンを追い出し（ｔｉｔｒａｔｅ  ｏｕｔ）、したがって、結合する多量体化ドメインが１つだけであるので、シグナル伝達を停止させる、抗架橋因子として使用されうる。ある特定の実施形態では、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制剤である抗架橋因子を使用して、本開示の融合タンパク質の機能を遮断するかまたは最小化し、同時に、臨床的状況における、望ましくない炎症応答または病理学的炎症応答を阻害または遮断することができる。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、第１の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分）は、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはこれらの変異体を含む第１の多量体化ドメインを有し、第２の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、第１のＦＲＢポリペプチドまたはこれらの変異体を含む第２の多量体化ドメインを有する。他の実施形態では、第１の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分）は、第１のＦＲＢポリペプチドまたはこれらの変異体を含む第１の多量体化ドメインを有し、第２の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、第１のＦＫＢＰポリペプチドまたはこれらの変異体を含む第２の多量体化ドメインを有する。これらの実施形態のうちのいずれかでは、第２の融合タンパク質は、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）をさらに含み、任意選択で、閾値下シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２の融合タンパク質は、ＧＰＩシグナル配列が除去されているか、またはＧＰＩシグナル配列をＧＰＩ分子に付着させるように変化させた、ＧＰＩ分子を含有する。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、第１の核酸分子は、第１の多量体化ドメイン、第３の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードし、ここで第１の多量体化ドメインおよび第３の多量体化ドメインは、第１の融合タンパク質が、細胞内で発現すると細胞外に局在化する。ある特定の実施形態では、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインは、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、Ｔｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組合せから選択される架橋因子のための結合性ドメインである。
【０２４７】
なおさらなる実施形態では、第２の架橋因子が少なくとも２つの第１の融合タンパク質の会合を促進し、架橋因子は、第１の融合タンパク質の第３の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される。ある特定の実施形態では、形成されるタンパク質複合体は、少なくとも２つの第１の融合タンパク質を含むホモ複合体であり、ここで、多量体化ドメインは、ＤＨＦＲ（架橋分子はメトトレキサートである）、またはＧｙｒＢ（架橋分子はクーママイシンである）、またはＦＫＢＰ（架橋分子はＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である）でありうる。ある特定の他の実施形態では、タンパク質複合体は、１種または複数の第１の融合タンパク質および１種または複数の第２の融合タンパク質を含むヘテロ複合体である。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、疎水性ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８などに由来する膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、膜貫通ドメインまたはＧＰＩシグナル配列などのアンカードメインを含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、ＧＰＩシグナル配列が除去されているか、またはＧＰＩシグナル配列をＧＰＩ分子に付着させるように変化させた、ＧＰＩ分子を含有する。
【０２４９】
さらなる実施形態では、アクチュエータードメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含むか、または１種または複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、アクチュエータードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分であって、細胞質シグナル伝達タンパク質が、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むタンパク質、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せである、細胞質部分を含む。例示的なアクチュエータードメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、ＯＸ４０、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。なおさらなる実施形態では、第１の核酸分子は、１種もしくは複数の異なるアクチュエータードメイン、共刺激ドメイン、接着因子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第１の融合タンパク質をコードする。本明細書で使用される「共刺激性シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激因子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。例示的な共刺激ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＡＴ、Ｚａｐ７０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＳＬＡＭＦ１、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｌｐ７６、ＴＲＩＭ、およびＯＸ４０に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含むがこれらに限定されない。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、非天然細胞は、共刺激因子、免疫調節因子、共刺激因子に対するアゴニスト、免疫調節因子に対するアゴニスト、またはこれらの任意の組合せをさらに過剰発現させる。関連の実施形態では、共因子であるＩＬ−１２を過剰発現させるか、または細胞に供給する。
【０２５１】
本発明で有用な融合タンパク質の結合性ドメインは、当技術分野で公知であるかもしくは本明細書で記載される結合性ドメイン、または当技術分野で公知の様々な方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号および同第６，２９１，１５８号を参照されたい）により作り出される結合性ドメインを含む。例えば、融合タンパク質の結合性ドメインは、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片についてのＦａｂファージライブラリー（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：３４４頁、２００５年を参照されたい）をスクリーニングすることにより同定することができる。加えて、標的抗原を、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂ  ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＴＣ  ｍｏｕｓｅ（商標）、ＫＭ−ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ラマ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において免疫原として使用することなど、ハイブリドーマ開発のための従来の戦略を使用して、目的の標的特異的な結合性ドメインを有する、抗標的抗体を開発することができる。
【０２５２】
さらなる結合性ドメインの供給源は、ヒト、齧歯動物、鳥類、およびヒツジを含む、多様な種に由来する標的特異的抗体可変ドメイン（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または可溶性ＶＨドメインまたはドメイン抗体としてフォーマットされうる）を含む。結合性ドメインのさらなる供給源は、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、またはラマに由来する）（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４１４巻：５２１頁、１９９７年；Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８４巻：３２７３頁、２００９年；およびＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、１９９３年；およびＮｇｕｙｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁、１９９８年）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９５巻：１１８０４頁、１９９８年）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁、２００２年）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１０５巻：２０４０頁、２００８年；およびＡｌｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：３１９頁、２００８年）など、他の種に由来する抗体の可変ドメインを含む。これらの抗体は、重鎖可変領域だけを使用して、抗原結合性領域を形成しうる、すなわち、これらの機能的な抗体は、重鎖だけのホモ二量体（「重鎖抗体」と称する）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６４巻：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１２巻：５８０頁、２００６年；およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８３巻：３６３９頁、２００８年）であると考えられる。
【０２５３】
標的特異的な結合性ドメインの他の代替的な供給源は、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓとしてもまた公知である；Ｂｉｎｚら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４８９頁、２００３年；およびＢｉｎｚら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：５７５頁、２００４年）、フィブロネクチン結合性ドメイン（アドネクチンまたはモノボディーとしてもまた公知である；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３２６巻：１４７５頁、２００３年；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．、１８巻：４３５頁、２００５年；およびＨａｃｋｅｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１２３８頁、２００８年）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９２巻：６４０４頁、１９９５年；Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１巻：７１頁、２００２年；およびＨｕａｎｇら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１３巻：７５５頁、２００５年）、テトラトリコペプチドリピートドメイン（Ｍａｉｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１１巻：４９７頁、２００３年；およびＣｏｒｔａｊａｒｅｎａら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、３巻：１６１頁、２００８年）、ロイシンリッチリピートドメイン（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４７１頁、２００３年）、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７５巻：２６７７頁、２００８年）、リポカリンドメイン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０９５１６４号；Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９６巻：１８９８頁、１９９９年；およびＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１０６巻：８１９８頁、２００９年を参照されたい）、アルマジロリピートタンパク質（ＡｒｍＲＰ；Ｖａｒａｄａｍｓｅｔｔｙら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４２４巻：６８頁、２０１２年）、ダイアボディー（Ｍａｎｚｋｅら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、８２巻：７００頁、１９９９年）、レペボディー（ｒｅｐｅｂｏｄｙ）（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９巻：３２９９頁、２０１２年）、ミニボディー（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻：３０５５頁、１９９６年）、シクロチド（Ｃｒａｉｋら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９４巻：１３２７頁、１９９９年）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７２巻：６１７９頁、２００５年；Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８９巻：７５３頁、１９９２年；およびＳａｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１���０巻：７７７９頁、２００３年）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；同第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）、その他（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．、８巻：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６８巻：４２６９頁、２００１年；およびＢｉｎｚら（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：１２５７頁、２００５年）など、代替的な非抗体足場のループ領域内の、操作された多様なアミノ酸をコードする配列を含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、単鎖抗体の可変領域、受容体のエクトドメイン、またはリガンドである。さらなる実施形態では、単鎖抗体の可変領域は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂである。なおさらなる実施形態では、第２の融合タンパク質の結合性ドメインは、多量体化ドメインのアミノ末端側またはカルボキシ末端側にある。
【０２５５】
ある特定のさらなる態様では、非天然細胞は、結合性ドメインおよび多量体化ドメインを含み、任意選択で、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）、または閾値下シグナル伝達ドメインを伴うアンカードメインを含む、融合体をコードする核酸分子であって、結合性ドメインが、標的細胞表面に位置する標的に特異的に結合する、核酸分子を含む。さらなる実施形態では、結合性ドメインは、がん（例えば、充実性悪性疾患、血液悪性疾患）、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病と関連する抗原である標的に特異的である。例示的な標的抗原は、α−葉酸受容体、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒ−α２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１を含むがこれらに限定されない。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、このような結合性融合タンパク質（ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分および架橋因子との三部分複合体を形成して、ポリペプチド複合体を形成する。このような複合体のための、例示的な架橋因子は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、ＡＢＡもしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、またはＴｍｐ−ＳＬＦもしくはその誘導体を含む。
【０２５７】
他の実施形態では、本開示は、（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の異種核酸分子であって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、第１の異種核酸分子と；（ｂ）結合性ドメイン、第２の多量体化ドメイン、およびアンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩ分子）を含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子であって、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞表面に局在化する、第２の核酸分子とを含む非天然細胞であって、第１の架橋因子が非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、非天然細胞を対象とする。ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質は、細胞内に局在化した、閾値下シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２５８】
本明細書で使用される「閾値下シグナル伝達ドメイン」は、１種または複数の他の閾値下シグナル伝達ドメインの存在下では、十分に頑健なシグナル伝達カスケードを誘導することも活性化させることもできないが、アクチュエータードメインの存在下では、シグナル伝達カスケードを誘導するかもしくは活性化させるか、またはシグナルを定性的に調整することが可能である。例えば、細胞表面に係留された第２の融合タンパク質であって、細胞表面に係留された別の第２の融合タンパク質と会合する融合タンパク質は、シグナル伝達を誘導しないか、シグナル伝達を最小限にしか活性化しない。例示的な閾値下シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ８１、ＣＤ１３７、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＬＩＧＨＴ、ＳＬＡＭ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１などの共刺激ドメインを含む。
【０２５９】
特定の実施形態では、コードされた第１の融合タンパク質は、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのアクチュエータードメインを含み；コードされた第２の融合タンパク質は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖの結合性ドメイン、およびＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインを含み、任意選択で、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）、または閾値下シグナル伝達ドメインを伴うアンカードメインを含み；非天然細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進する第１の架橋因子は、ラパログのＡＰ２１９６７である。例示的な、第１の融合タンパク質は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、例示的な、第２の融合タンパク質は、配列番号１または５６に示されるアミノ酸配列を有する。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、ＤＡＲＩＣ結合性成分は、複数の結合性ドメインを有しうる。例えば、非天然細胞は、第３の融合タンパク質をコードする第３の核酸分子であって、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメイン、任意選択で、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）、または閾値下シグナル伝達ドメインを伴うアンカードメインを含み、第３の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、第３の核酸分子をさらに含む。関連の実施形態では、結合性ドメインを含む融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインを有し、ここで、１つ、２つ、３つ、または４つの結合性ドメインは、１つの標的または最大で４つの異なる標的に特異的である。
【０２６１】
前述の実施形態のうちのいずれかでは、第２の（結合性）融合タンパク質をコードする第２の核酸分子は、結合性ドメインと第２の多量体化ドメインとの間に配置された、リンカー、スペーサー、または接合部アミノ酸をコードする配列をさらに含みうる。ある特定の実施形態では、第２の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）をコードする第２の核酸分子は、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）をさらに含み、任意選択で、閾値下シグナル伝達ドメインをさらに含む。さらなる実施形態では、第２の融合タンパク質（例えば、ＤＡＲＩＣ結合性成分）は、ＧＰＩシグナル配列が除去されているか、またはＧＰＩシグナル配列をＧＰＩ分子に付着させるように変化させた、ＧＰＩ分子を含有する。
【０２６２】
過剰な受容体介在性シグナル伝達と関連する、例示的な疾患または障害は、がん（例えば、充実性悪性疾患および血液悪性疾患）、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態または炎症性疾患もしくは炎症性状態、細菌感染から生じる敗血症、およびウイルス感染を含む。
【０２６３】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性化を方向付けるための方法であって、腫瘍特異的抗原、またはＴ細胞の活性化が所望される部位または細胞における、選択された他の抗原である、細胞表面標的などの標的に特異的に結合する、有効量のＤＡＲＩＣ結合性成分またはその医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法を提示する。
【０２６４】
医薬技術分野ではまた、治療的使用のための、薬学的に許容される担体も周知であり、例えば、それらの各々が、関連する部分において、参照により本明細書に組み込まれる、ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、６２版、Ｏｒａｄｅｌｌ、ＮＪ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．、２００８年；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００５年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年；およびＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、１４版、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ：  Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、２００６年において記載されている。例示的な、薬学的に許容される担体は、生理学的ｐＨにおける、滅菌食塩液およびリン酸緩衝食塩液を含む。医薬組成物中には、保存剤、安定化剤、色素なども施すことができる。加えてまた、抗酸化剤および懸濁剤も使用することができる。
【０２６５】
医薬組成物はまた、緩衝剤などの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、デキストリン）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、および他の安定化剤および賦形剤も含有しうる。中性の緩衝食塩液または非特異的血清アルブミンと混合した食塩液は、例示的な希釈剤である。
【０２６６】
別の態様では、本開示は、悪性疾患（例えば、充実性悪性疾患または血液悪性疾患）の成長、転移、または転移性成長を阻害するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書で提示されるポリペプチド複合体をコードする有効量の細胞、またはこれらの組成物を投与するステップを含む方法を提示する。
【０２６７】
充実性悪性疾患および血液悪性疾患を含む、多種多様ながんが、本明細書で開示される組成物および方法に適する。処置されうる種類のがんは、乳房、前立腺、膵臓、結腸、および直腸の腺がん；肺の気管支原性癌の全ての形態（有棘細胞癌、腺がん、小細胞肺がん、および非小細胞肺がんを含む）；骨髄性がん；黒色腫；肝がん；神経芽細胞腫；乳頭種；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；および癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアス癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、有棘細胞癌、および移行上皮癌）を含む。処置されうるさらなる種類のがんは、組織球性障害（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ
ｄｉｓｏｒｄｅｒ）；白血病；悪性組織球増殖症（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ）；ホジキン病；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；腎細胞癌；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；栄養膜腫瘍（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）を含む。
【０２６８】
さらにまた、以下の種類のがん：腺腫；胆管腫；真珠腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝がん；汗腺腫；膵島細胞腫；レイディッヒ細胞腫；乳頭種；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫（ｌｅｉｍｙｏｍａ）；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節細胞腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；および多形性神経膠芽腫も、処置に適すると想定されている。処置されうる種類のがんはまた、被角血管腫；好酸球増加症随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管周囲細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫症；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢胞肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；および子宮頚部異形成も含む。
【０２６９】
同様に本明細書で開示される組成物および方法に適する、さらなる例示的ながんは、Ｂ細胞リンパ腫（多様な形態のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または中枢神経系リンパ腫など）を含む、Ｂ細胞がん、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、および慢性骨髄芽球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）など）、および骨髄腫（多発性骨髄腫など）である。さらなるＢ細胞がんは、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、孤発性骨形質細胞腫、骨外形質細胞腫（ｅｘｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／バーキット白血病、悪性の可能性をもつＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性障害を含む。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、充実性悪性疾患の成長または充実性悪性疾患もしくは血液悪性疾患の転移もしくは転移性成長を阻害するのに有用なポリペプチド複合体をコードする細胞は、腫瘍抗原またはがん抗原およびがん細胞の第２の標的抗原に特異的に結合するものを含む。
【０２７１】
別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、自己免疫障害、もしくは自己免疫状態、または炎症性疾患、炎症性障害、もしくは炎症性状態を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書で提示されるポリペプチド複合体をコードする有効量の細胞、またはこれらの組成物を投与するステップを含む方法を提示する。
【０２７２】
融合タンパク質ならびにそれらの組成物および単位用量形態により処置されうる、例示的な自己免疫疾患、自己免疫障害、もしくは自己免疫状態、または炎症性疾患、炎症性障害、もしくは炎症性状は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、皮膚筋炎、多発性筋炎、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、神経精神ループス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、喘息、乾癬性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としてもまた公知である）、自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、血管炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、子宮内膜症、汗腺膿瘍、間質性膀胱炎、斑状強皮症、強皮症、ナルコレプシー、神経性筋強直、白斑、および自己免疫性内耳疾患を含む。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法は、（ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組換え細胞を投与するステップであって、第１の核酸分子が、第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードし、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化し、第２の核酸分子が、結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードし、第２の融合タンパク質が、発現すると細胞外に局在化する、ステップと；（ｃ）架橋因子を投与するステップであって、架橋因子が組換え細胞の表面でポリペプチド複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み；ポリペプチド複合体の結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患を処置する。
【０２７４】
特定の実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法は、（ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む１種または複数の組換え細胞を投与するステップであって、第１の核酸分子が、Ｔ細胞で発現される受容体に結合する結合剤および第１の多量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質をコードし；第２の核酸分子が、過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に結合する結合剤および第２の多量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードする、ステップと；（ｃ）架橋因子を投与するステップであって、架橋因子がポリペプチド複合体、例えば、ＢｉＴＥの形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み；第１の融合タンパク質の結合剤がＴ細胞の受容体に結合し、第２の融合タンパク質の結合剤が過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患を処置する。
【０２７５】
他の実施形態では、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または移植片対宿主病を処置するための方法は、（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子を含む非天然細胞を投与するステップであって、第１の融合タンパク質が発現すると、第１の多量体化ドメインが細胞外に局在化する、ステップと；（ｂ）結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含み、任意選択で、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン、ＧＰＩシグナル配列）、または閾値下シグナル伝達ドメインを伴うアンカードメインを含む第２の融合タンパク質を投与するステップと；（ｃ）架橋因子を投与するステップであって、架橋因子が組換え細胞表面のポリペプチドヘテロ複合体の形成を促進し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、ステップとを含み；ポリペプチドヘテロ複合体の結合性ドメインが、過剰増殖性疾患細胞の細胞表面標的に特異的に結合して免疫調節応答を促進し、これにより過剰増殖性疾患を処置する。
【０２７６】
本開示の処置方法では、前述の非天然細胞、融合タンパク質、架橋因子、および他のアクセサリー分子のうちのいずれも使用することができる。ある特定の実施形態では、方法は、Ｔ細胞リガンドまたはＴ細胞受容体をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤など、Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤を投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性化の阻害剤をアンタゴナイズまたは遮断する薬剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体、またはこれらの抗原結合性断片、あるいはＰＤ−１を標的とする、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、方法は、サイトカインアゴニストを投与するステップをさらに含む。
【０２７７】
本開示の細胞、融合タンパク質、架橋因子、他のアクセサリー分子、またはこれらの組成物は、経口投与することもでき、局所投与することもでき、経皮投与することもでき、非経口投与することもでき、吸入スプレーにより投与することもでき、膣に投与することもでき、直腸に投与することもでき、頭蓋内注射により投与することもでき、これらの任意の組合せにより投与することもできる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質、架橋因子、またはこれらの組成物を、非経口投与する。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下注射、静脈内注射法、筋内注射法、槽内注射法、または注入法を含む。血管内注射、静脈内注射、動脈内注射、皮内注射、筋内注射、乳房内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、眼球後注射、肺内注射、および／または特定の部位における手術による植込みによる投与もまた想定されている。ある特定の実施形態では、融合タンパク質、架橋因子、またはこれらの組成物は、静脈内注射などの注射により投与する。
【０２７８】
また、架橋因子を伴う組換え細胞、融合タンパク質および架橋因子またはこれらの組成物を伴う組換え細胞の、第２の薬剤と組み合わせた投与も想定される。第２の薬剤は、がん、炎症、自己免疫、および感染など、特定の疾患状態または障害のための標準的処置として当技術分野で許容された薬剤でありうる。想定される、例示的な第２の薬剤は、架橋因子を伴う組換え細胞、融合タンパク質および架橋因子またはこれらの組成物を伴う組換え細胞であって、主要な（ｐｒｉｍａｒｙ）タンパク質複合体が結合する標的とは異なる標的に結合する組換え細胞、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、免疫グロブリン由来の融合タンパク質、化学療法剤、電離放射線、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、抗感染剤、もしくは他の活性剤および補助剤、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０２７９】
本明細書で提示される、架橋因子を伴う組換え細胞、融合タンパク質および架橋因子またはこれらの組成物を伴う組換え細胞と組み合わせて有用な第２の薬剤は、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、クルクミン、ファルネシルチオサリチル酸）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、代謝拮抗剤（例えば、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル）、ポリクローナル抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン）、モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ）、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプトまたはベラタセプト）でありうる。
【０２８０】
充実性悪性疾患の成長を阻害するのに有用であるか、充実性悪性疾患の転移もしくは転移性成長を阻害するのに有用であるか、または血液悪性疾患を処置もしくは改善するのに有用である第２の薬剤は、化学療法剤、電離放射線、および他の抗がん薬を含む。さらなる治療剤として想定される化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロランブシル）；二官能性化学療法剤（例えば、ベンダムスチン）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））；エチレンイミンおよびメチル−メラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ：ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（チオテパ）、およびヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；およびトリアジン（例えば、ダカルバジン（ｄａｃａｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ））；代謝拮抗剤、例えば、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート、およびペメトレキセド（多重標的化葉酸代謝拮抗剤））；ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、および２，２’−ジフルオロデオキシシチジンなど）；およびプリン類似体（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；カンプトテシン（ＣＰＴ）、トポテカン、およびイリノテカンなどのＩ型トポイソメラーゼ阻害剤；天然生成物、例えば、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、およびブレオマイシンなどの抗腫瘍抗生物質；５−ブロモデオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏｄｅｏｚｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ヨードデオキシウリジン、およびブロモデオキシシチジンなどの放射線増感剤；シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンなどの白金配位錯体；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；ならびにＮ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンなどのメチルヒドラジン誘導体を含む。
【０２８１】
自己免疫疾患の処置のための、本開示により想定されるさらなる治療剤は、免疫抑制剤と呼ばれ、処置される個体の免疫系を抑制または遮蔽するように作用する。免疫抑制剤は、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ：ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ）、鎮痛剤、グルココルチコイド、関節炎の処置のための、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ：ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ
ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇ）、または生物学的応答修飾剤を含む。また、ＤＭＡＲＤについての記載中の組成物も、関節リウマチを除く、他の多くの自己免疫疾患の処置に有用である。
【０２８２】
例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤（ＶｉｏｘｘまたはＣｅｌｅｂｒｅｘなど）、およびシアリレートを含む。例示的な鎮痛剤は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドール、または塩酸プロポキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）を含む。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンを含む。例示的な生物学的応答修飾剤は、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）を指向する分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、およびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、および接着分子阻害剤を含む。生物学的応答修飾剤は、モノクローナル抗体のほか、分子の組換え形態も含む。例示的なＤＭＡＲＤは、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋内）、およびミノサイクリンを含む。
【０２８３】
なおさらなる態様では、本開示は、（ａ）第１の多量体化ドメイン、疎水性ドメイン、およびアクチュエータードメインを含む、第１の融合タンパク質と；（ｂ）細胞外結合性ドメインおよび第２の多量体化ドメインを含む、第２の融合タンパク質と；（ｃ）架橋因子とを含み、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、架橋因子とが会合してポリペプチドヘテロ複合体を形成し、架橋因子が、第１の融合タンパク質の多量体化ドメインおよび第２の融合タンパク質の多量体化ドメインと会合し、これらの間に配置される、融合ポリペプチドヘテロ複合体を提示する。これらの実施形態では、前述の融合タンパク質成分および架橋因子のうちのいずれも使用することができる。
【０２８４】
他の態様では、本開示は、前述の融合タンパク質のうちの任意の１種または複数をコードする核酸分子を提示する。このような核酸分子は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を、ポリシストロニックのメッセージまたは２Ａペプチドで隔てられた単一のタンパク質としてコードする発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、ポリシストロニックのメッセージは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【０２８５】
ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の例示的な例を、配列番号１〜７５および下記の表１に提示する。
【０２８６】
【表１−１】
2020178690.tif 000002
【０２８７】
【表１−２】
2020178690.tif 000003
【０２８８】
【表１−３】
2020178690.tif 000004
【０２８９】
【表１−４】
2020178690.tif 000005
【０２９０】
【表１−５】
2020178690.tif 000006
【０２９１】
【表１−６】
2020178690.tif 000007
【０２９２】
【表１−７】
2020178690.tif 000008
【０２９３】
【表１−８】
2020178690.tif 000009
【０２９４】
【表１−９】
2020178690.tif 000010
【０２９５】
【表１−１０】
2020178690.tif 000011
【０２９６】
【表１−１１】
2020178690.tif 000012
【０２９７】
【表１−１２】
2020178690.tif 000013
【０２９８】
【表１−１３】
2020178690.tif 000014
【０２９９】
【表１−１４】
2020178690.tif 000015
【０３００】
【表１−１５】
2020178690.tif 000016
【０３０１】
【表１−１６】
2020178690.tif 000017
【０３０２】
【表１−１７】
2020178690.tif 000018
【０３０３】
【表１−１８】
2020178690.tif 000019
【０３０４】
【表１−１９】
2020178690.tif 000020
【０３０５】
【表１−２０】
2020178690.tif 000021
【実施例】
【０３０６】
（実施例１）
ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の構築
ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の各々を、Ｔ７プロモーター、ｈＳｃｎ分泌シグナルまたはｈＣＤ８分泌シグナルのそれぞれと、下流の直鎖化部位とを含有するプラスミドベクターに、別個にクローニングした。次いで、直鎖化されたプラスミドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に続く、３’−ポリアデニル化ステップおよび５’−キャッピングステップのための鋳型として使用して、初代ヒトＴ細胞に電気穿孔される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された成熟ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｍＲＮＡ）を創出した。ヒトＴ細胞は、常磁性ビーズを使用する陰性選択により、ＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと共に、４８時間にわたり増殖させてから、電気穿孔にかけた。蛍光タンパク質をコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡを使用する、対照の電気穿孔を、並行して実施して、トランスフェクション効率を確認するか、または２Ａタンパク質を連結した蛍光タンパク質を、ＤＡＲＩＣ成分のｍＲＮＡ分子種に直接組み込んだ。
【０３０７】
結合性成分（ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、および多量体化ドメインである、ＦＫＢＰ１２（「ＤｍｒＡ」）、ＦＫＢＰ１２  Ｆ３６Ｖ（「ＤｍｒＢ」）、ＦＲＢ（２０２１〜２１１３）Ｔ２０９８Ｌ（「ＤｍｒＣ」））をコードする例示的なＩＶＴ−ｍＲＮＡを、配列番号２、５、および８（ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、および多量体化ドメインである、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２  Ｆ３６Ｖ、またはＦＲＢ（２０２１〜２１１３）Ｔ２０９８Ｌのそれぞれ）に提示する。シグナル伝達成分をコードする例示的なＩＶＴ−ｍＲＮＡを、配列番号１６、２０、および２４（多量体化ドメインである、ＦＲＢ（２０２１〜２１１３）Ｔ２０９８Ｌ、ＦＫＢＰ１２  Ｆ３６Ｖ、またはＦＫＢＰ１２のそれぞれ、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζ）に提示する。
【０３０８】
多量体化は、ラパマイシンもしくはそのラパログ、またはジベレリンもしくはその誘導体などの架橋因子により促進する。ラパマイシンおよびその誘導体（例えば、Ｃ−１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシンとしてもまた公知であり、ＩＣ５０＝１０ｎＭとする、化学修飾された非免疫抑制性ラパマイシン類似体である、ＡＰ２１９６７）は、ＦＫＢＰ１２と、ＦＲＢ含有融合タンパク質とのヘテロ二量体化を誘導しうる。ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７は、ラパマイシンのＦＫＢＰ１２相互作用性成分に基づくホモ二価薬物であって、本明細書で記載されるホモ二量体化状況において使用されうるホモ二価薬物である。
【０３０９】
（実施例２）
ＤＡＲＩＣ成分をコードするＴ細胞の細胞傷害
２つのＤＡＲＩＣ成分を発現させる組換えＴ細胞を、ＣＤ１９抗原またはＣＤ２０抗原を発現させるように改変された、Ｋ５６２標的細胞（ヒト骨髄性白血病細胞系）と共にインキュベートして、標的細胞の溶解について検討した。略述すると、Ｔ細胞を、Ｋ５６２−ＣＤ１９標的細胞系と、Ｋ５６２−ＣＤ２０標的細胞系との５０：５０混合物と共に、３：１または１０：１のＴ細胞対標的細胞比で、共インキュベートした。被験試料には、最終濃度を５００ｎＭとするヘテロ二価ラパログであるＡＰ２１９６７を添加した。標的細胞系の各々の相対百分率を、ＣＤ１９抗原およびＣＤ２０抗原についてのフローサイトメトリー染色によりモニタリングして、細胞の溶解を評価した（図３を参照されたい）。
【０３１０】
初代ヒトＴ細胞についての４例の試料は、（ｉ）広範に検証された単一鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＣＤ１９−ＣＡＲ、配列番号１４、陽性対照）；（ｉｉ）ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分だけ（ＤＳＣ、配列番号１６、陰性対照）；（ｉｉｉ）ＤＡＲＩＣ結合性成分だけ（ＤＢＣ−ＣＤ１９、配列番号２、陰性対照）；および（ｉｖ）ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の両方（ＤＳＣ、配列番号１６に加えたＤＢＣ−ＣＤ１９、配列番号２）をコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡを伴う電気穿孔により調製した。標的細胞系の各々の相対百分率を、ＣＤ１９抗原およびＣＤ２０抗原についてのフローサイトメトリー染色によりモニタリングした（図３Ａ）。
【０３１１】
比細胞傷害パーセントを、各条件について、投入されたＫ５６２−ＣＤ１９：Ｋ５６２−ＣＤ２０比と比べた百分率の変化として計算した。検証されたＣＤ１９−ＣＡＲ（配列番号１４）を発現させるＴ細胞は、実質的な細胞傷害を示し、特に、Ｔ細胞対標的細胞比を１０：１とするときに、生細胞ゲートにおける、ＣＤ２０細胞と対比したＣＤ１９細胞の比の非対称を示した。ＤＡＲＩＣ結合性成分を単独で発現させるＴ細胞、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を単独で発現させるＴ細胞、または両方のＤＡＲＩＣ成分を発現させるが、ヘテロ二価ラパログであるＡＰ２１９６７の添加を伴わないＴ細胞は、有意な細胞傷害作用を示さなかった。ＡＰ２１９６７の存在下では、両方のＤＡＲＩＣ成分を発現させるＴ細胞との共インキュベーションの際に、実質的な特異的細胞傷害およびＫ５６２−ＣＤ１９標的細胞の喪失が観察された（図３Ｂ）。
【０３１２】
これらの結果は、ＤＡＲＩＣ機構が、抗原特異的標的細胞の溶解を再構成しうることを示す。さらに、ＤＡＲＩＣデザインは、Ｔ細胞による抗原特異的な細胞傷害作用の薬理学的制御を可能とする。
【０３１３】
（実施例３）
ＤＡＲＩＣ成分をコードするＴ細胞の、サイトカイン分泌プロファイル
２つのＤＡＲＩＣ成分を発現させる組換えＴ細胞を、ＣＤ１９抗原またはＣＤ２０抗原を発現させるように改変された、Ｋ５６２標的細胞（ヒト骨髄性白血病細胞系）と共にインキュベートして、サイトカインの発現を調べた。略述すると、ＩＶＴ−ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＴ細胞を、１：１のＴ細胞対標的比を使用して、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞系またはＫ５６２−ＣＤ２０細胞系と共に、５００ｎＭのＡＰ２１９６７の添加を伴うかまたはを伴わずに、共インキュベートした。サイトカイン産生を解析するために、上清を単離した（図４を参照されたい）。
【０３１４】
初代ヒトＴ細胞についての２例の試料を単離し、増殖させ、次いで、（ｉ）検証された単一鎖ＣＡＲ（ＣＤ１９−ＣＡＲ、配列番号１３、陽性対照）；または（ｉｉ）ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の両方（ＤＳＣ、配列番号１６に加えたＤＢＣ−ＣＤ１９、配列番号２）をコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡを伴う電気穿孔により調製した。増殖させ、電気穿孔されたＴ細胞を十分に洗浄して、残留サイトカインを成長培地から除去した後で、Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１９抗原（左パネル）またはＣＤ２０抗原（右パネル）を発現させるＫ５６２細胞系と共に、１：１のＴ細胞対標的細胞比で、ＡＰ２１９６７ラパログの存在下または非存在下において共インキュベートした。次いで、上清を回収し、サイトカイン捕捉抗体で標識されたビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２キット）を使用して、分析物の濃度についてアッセイした。組換えタンパク質の標準物質との比較により、ビーズアレイにより包含される６つのサイトカインの各々の絶対濃度の計算を可能とした。
【０３１５】
ＣＤ１９を発現させるＫ５６２標的細胞と共に共インキュベートしたところ、陽性対照であるＣＤ１９−ＣＡＲを発現させるＴ細胞が、実質的な量のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）およびインターロイキン２（ＩＬ−２：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）を産生したことは、細胞傷害についてのかつての知見と符合する。ＤＡＲＩＣ成分を発現させるＴ細胞は、架橋因子であるＡＰ２１９６７の非存在下では、有意なサイトカイン産生を示さなかったが、ＡＰ２１９６７の存在下では、ＩＦＮγおよびＩＬ−２を、単鎖ＣＤ１９−ＣＡＲ陽性対照と同等であるかまたはこれを上回るレベルで産生した。
【０３１６】
（実施例４）
ＤＡＲＩＣ成分のレンチウイルスによる送達
初代ヒトＴ細胞を単離し、活性化させ、次いで、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分（配列番号４４および４７）をコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した。次いで、形質導入されたＴ細胞を、ＣＤ１９（Ｋ５６２−ＣＤ１９）を発現させるＫ５６２標的細胞またはＣＤ２０（Ｋ５６２−ＣＤ２０）を発現させるＫ５６２標的細胞の約５０：５０混合物と共に共インキュベートして、抗原特異的細胞傷害作用について評価した。Ｔ細胞対Ｋ５６２細胞の全体比は、全ての試料中で５：１とした。対照試料には、架橋因子を添加しなかったのに対し、被験試料には、ラパマイシン（１０ｎＭ）またはＡＰ２１９６７（１００ｎＭ）を、分泌された抗原結合性成分およびシグナル伝達成分のための架橋因子として適用した（例えば、図１Ｂを参照されたい）。ＤＡＲＩＣ抗原結合性成分は、ＣＤ１９抗原結合性ｓｃＦｖドメインおよびＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを含み、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質に連結された。ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分上では、架橋成分に対する異なる特異性を有する、２つの独立の多量体化ドメイン：ラパマイシンに対して応答性であるＦＲＢ、ならびにラパマイシンおよびＡＰ２１９６７の両方に対して応答性であるＦＲＢ（２０２１〜２１１３）Ｔ２０９８Ｌ変異体であって、各々が青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ：ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に連結された多量体化ドメインについて調べた。
【０３１７】
レンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞についてのフローサイトメトリー解析により、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質およびＢＦＰタンパク質の両方の同時の発現が裏付けられたことから、両方のＤＡＲＩＣ成分が、同じ細胞内で発現していたことが示される（各処理については、図５の第１列を参照されたい）。Ｋ５６２細胞についてのフローサイトメトリー解析は、変異体のＦＲＢ（２０２１〜２１１３）Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメインを発現させる試料中の、ＣＤ１９を発現させるＫ５６２細胞の、ラパマイシン依存性消失およびＡＰ２１９６７依存性消失を実証したのに対し、架橋因子の非添加は、細胞の生存に対して効果を及ぼさないことを実証した（各処理については、図５の第２列の上段の行を参照されたい）。しかし、ラパマイシンだけが、ＦＲＢ二量体化ドメインを発現するＴ細胞により、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞の消失を活性化させることが可能であったのに対し、ＡＰ２１９６７、または架橋因子を添加しないことは、細胞の生存に対して効果を及ぼさなかった（各処理については、図５の第２列の第２行を参照されたい）。これらのデータは、ＤＡＲＩＣ多部分成分系により達成されうる、細胞傷害活性の特異性を示す。
【０３１８】
加えて、一方の集団が、ＤＡＲＩＣ抗原結合性成分を発現させており、他の集団が、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を発現させている、２つの顕著に異なるＴ細胞集団を混合した。この混合細胞集団は、ＣＤ１９を発現させるＫ５６２細胞およびＣＤ２０を発現させるＫ５６２細胞と共に共培養されると、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞に対するラパマイシン依存性細胞傷害応答を示したが、架橋因子の非存在は、標的細胞の生存に対して効果を及ぼさなかった（図５の下段の行を参照されたい）。これらのデータは、一方のＴ細胞集団によって発現されたＤＡＲＩＣ抗原結合性成分が、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分を発現させる、異なるＴ細胞集団とトランスで作用し、標的細胞を攻撃することを示す。
【０３１９】
ＣＤ１９を標的化するＤＡＲＩＣ結合性成分が、ＦＲＢに基づくＤｍｒＣドメインを含み、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分が、ＦＫＢＰ１２に基づくＤｍｒＡドメインを含む（配列番号１２、３１）ように、多量体化ドメインをスワッピングすることにより、ＤＡＲＩＣ系の柔軟性を検証した。初代ヒトＴ細胞を、「スワッピングされた」ＤＡＲＩＣ成分を発現させるように生成し、次いで、Ｋ５６２−ＣＤ１９標的細胞とＣ５６２−ＣＤ２０標的細胞との５０：５０混合物と共に、表示濃度のラパマイシンの非存在下または存在下で共インキュベートした（図１０）。架橋因子を含有する被験試料中では、抗原特異的細胞傷害が観察されたが、ラパマイシンを欠く対照試料では観察されなかった。これらのデータは、ＤＡＲＩＣ系の構築が、柔軟であり、様々な多量体化ドメインの方向付けに適することを裏付ける。
【０３２０】
（実施例５）
亜治療（ｓｕｂ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）レベルまでの架橋因子の滴定
広範にわたる架橋因子（ラパマイシンおよびエベロリムス）濃度について調べて、ＤＡＲＩＣ系が、臨床的に関連する濃度で機能しうるのかどうかについて決定した。実施例４における通り、初代ヒトＴ細胞を単離し、活性化させ、次いで、ＤＡＲＩＣ結合性成分（配列番号１、４、７）およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分（配列番号１５、１９、２３）を発現させるレンチウイルスベクターにより形質導入した。次いで、ＤＡＲＩＣを発現させるＴ細胞を、Ｋ５６２−ＣＤ１９標的細胞とＫ５６２−ＣＤ２０標的細胞との５０：５０混合物と共に共インキュベートして、抗原特異的細胞傷害作用について評価した。Ｔ細胞対Ｋ５６２細胞の全体比は、全ての試料中で５：１とした。
【０３２１】
表示濃度のラパマイシンおよびエベロリムスを、共培養物試料に添加し、次いで、細胞傷害応答を、フローサイトメトリーにより評価した（図６）。細胞傷害応答は、ナノモル濃度未満の薬物濃度であって、これらの薬物を、診療所において患者に投与する場合に現在達成される、ラパマイシンおよびエベロリムスの定常状態濃度をはるかに下回る薬物濃度まで維持された。
【０３２２】
（実施例６）
係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分の使用
一連のさらなるＤＡＲＩＣ分子であって、抗原結合性成分が、細胞外空間に放出されるのではなくＴ細胞表面に維持されるＤＡＲＩＣ分子について調べた（例えば、図１Ｉを参照されたい）。複数のタンパク質領域および膜貫通ドメイン（配列番号５０、５３、５６、５９）であって、各々が、ＤＡＲＩＣ結合性成分およびＤＡＲＩＣシグナル伝達成分の多量体化を支配するスペーシングパラメータまたは立体パラメータを変化させたタンパク質領域および膜貫通ドメインを使用して、結合性ドメインをＴ細胞表面にアンカリングした。前出の実施例における通り、レンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞、およびＫ５６２−ＣＤ１９標的細胞とＫ５６２−ＣＤ２０標的細胞との５０：５０混合物を使用する、抗原特異的細胞傷害応答を使用して、係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分について評価した。Ｔ細胞対Ｋ５６２細胞の全体比は、全ての試料中で５：１とし、被験試料中では、表示濃度の架橋因子を使用した。
【０３２３】
各デザインは、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞に対する、架橋因子応答性の、抗原特異的細胞傷害作用の特性を有した。係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分であって、ＣＤ８ヒンジドメイン／ＣＤ８膜貫通ドメインを含有するＤＡＲＩＣ結合性成分（配列番号５３）は、架橋因子の非存在下で、測定可能なレベルの活性を示した。係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分であって、ＣＤ４膜貫通ドメインとともにＩｇＧ４  ＣＨ２ＣＨ３スペーサーを含む、ＤＡＲＩＣ結合性成分（配列番号５６）は、ラパマイシン（架橋因子）を添加すると、最も強力な細胞傷害性応答をもたらしたが、ＣＤ４膜貫通ドメインだけを含む係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分（配列番号５０）は、中程度に活性であった（図７）。また、ＣＤ５２タンパク質に由来するＧＰＩシグナル配列を含むＤＡＲＩＣ結合性成分（図１Ｋの概略図を参照されたい）についても調べた。ＧＰＩによりアンカリングされたＤＡＲＩＣは、適切な架橋因子の存在下に限り、抗原特異的細胞傷害応答をもたらした（図８）。これらのデータは、ＤＡＲＩＣ結合性成分が、放出される場合もあり、細胞表面に係留される場合もあるが、なおもＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と共に機能することを裏付ける。
【０３２４】
係留されたＤＡＲＩＣ結合性成分を含む、さらなるレンチウイルス構築物であって、修飾されたＣＤ４膜貫通ドメインを含み、他の係留された膜貫通ＤＡＲＩＣ結合性成分に対して活性が改善された構築物（配列番号６４〜６９）を作り出し、同様にヒトＴ細胞内で調べた。加えて、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分およびＤＡＲＩＣ結合性成分を、２つの成分（図１１で使用される成分など）の間に配置した２Ａペプチドを含む、単一のオープンリーディングフレームに組み込み、これにより、単一のレンチウイルスベクターを使用する、単純化されたＤＡＲＩＣ送達スキームについても検証した（配列番号６６、６９、７２）。
【０３２５】
任意のＤＡＲＩＣ構成部分のデザインについて、例えば、二方向性プロモーターを含むもの（配列番号７３）などの様々なレンチウイルスベクターデザインを使用して、または代替的な導入遺伝子送達ベクター（例えば、アデノウイルスまたはＡＡＶ）および例えば、相同組換え（遺伝子特異的ヌクレアーゼを使用して、高効率に刺激されうる工程）を介する導入遺伝子の標的化された組込みを含む導入遺伝子送達スキームを使用して、類似の結果が期待される。
【０３２６】
（実施例７）
さらなるモデル抗原のＤＡＲＩＣによる標的化
ＤＡＲＩＣ系を、さらなるモデル抗原に拡張して、本明細書で想定される、薬物調節型多部分受容体を発現させる人工細胞の、広範な適用可能性を示した。ＣＤ１２３抗原を発現させるＫ５６２標的細胞系を、この抗原を、ピューロマイシン選択カセットを含むレンチウイルスベクター（配列番号７４）にサブクローニングすることにより作り出し、レンチウイルス粒子を生成し、Ｋ５６２細胞に感染させ、ピューロマイシンにより選択した。初代ヒトＴ細胞を単離し、活性化させ、次いで、ＣＤ１２３を標的化するＤＡＲＩＣ結合性成分を、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分と共にコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した（配列番号７０〜７２）。Ｋ５６２−ＣＤ１９標的細胞とＫ５６２−ＣＤ１２３標的細胞との５０：５０混合物と共に共培養された、レンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞を使用し、従来のＣＤ１２３を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を陽性対照として使用して、抗原特異的細胞傷害応答を評価した。Ｔ細胞対Ｋ５６２細胞の全体比は、全ての試料中で５：１とし、被験試料中では、表示濃度の架橋因子を使用した。陽性対照試料中、およびラパマイシンを含有するＣＤ１２３  ＤＡＲＩＣ試料中では、細胞傷害が観察された。結果は、多様な抗原を標的化するＤＡＲＩＣ系によれば、架橋因子依存性細胞傷害活性を達成しうることを裏付けた（図９）。
【０３２７】
（実施例８）
抗架橋因子を使用する、ＤＡＲＩＣの不活化
多量体化ドメインのうちの１つへの結合について競合する薬理学的薬剤の添加による、ＤＡＲＩＣ系の不活化について調べた。従来のＣＤ１９を標的化するＣＡＲを発現させる初代ヒトＴ細胞、またはＣＤ１９を標的化するＤＡＲＩＣ成分（配列番号６６）を発現させる初代ヒトＴ細胞を、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞とＫ５６２−ＣＤ２０細胞との５０：５０混合物と共に共インキュベートした。ＣＤ１９を標的化するＣＡＲ（配列番号１４）を発現させるＴ細胞については、ラパマイシンの存在下または非存在下のいずれにおいても、細胞傷害が観察された。これに対し、ＣＤ１９標的化ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞は、ナノモル濃度未満のレベルのラパマイシンの存在下で、効率的な抗原特異的細胞傷害を示したが、架橋因子の非存在下では、細胞傷害を示さなかった（図１１）。しかし、ＦＫ５０６を添加すると、ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞については、抗原特異的細胞傷害の顕著な低減が観察されるのに対し、ＣＡＲ  Ｔ細胞については、最小限の低減しか観察されなかったことから、ＦＫ５０６は、ＤＡＲＩＣ構成部分のカップリングを破壊し、抗原に駆動される細胞傷害応答を不活化したことが示される。
【０３２８】
本実施例は、架橋因子の競合的阻害剤が、ＤＡＲＩＣ抗原受容体を実質的に阻害し、したがって、投与された細胞の過剰な増殖または活性化の結果として生じうる病態を制限する、臨床的使用に適することを示す。いかなる特定の理論に束縛されることも望まずに述べると、この戦略は、Ｔ細胞増殖性応答を促進する、細胞内シクロフィリンを阻害するＦＫ５０６について当てはまる通り、阻害剤が、細胞応答に寄与する天然タンパク質を伴う、さらなる免疫抑制作用機構を有する場合に、特に、有効でありうる。
【０３２９】
（実施例９）
内因性シグナル伝達受容体を活用するＤＡＲＩＣ系
２つの分泌性ＤＡＲＩＣ成分（配列番号７５）をもたらすように、ＤＡＲＩＣ系をデザインした。ＤＡＲＩＣ結合性成分は、ＣＤ１９に結合する結合性ドメインを含み、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分は、ＣＤ３に結合する結合性ドメインと、多量体化ドメインとを含む。改変された、共培養物による細胞傷害実験を使用して、この系について調べる。２つの分泌性ＤＡＲＩＣ成分をコードするレンチウイルス粒子により形質導入されたＴ細胞に由来する上清を、Ｋ５６２−ＣＤ１９標的細胞とＫ５６２−ＣＤ２０標的細胞との５０：５０ミックスであって、形質導入されていないＴ細胞もまた含有するミックスに移す。細胞傷害を、架橋因子の存在下および非存在下で、測定する。架橋因子を施さずにおくことにより、カップリングを解除された状態に保たれた上清を含む対照試料は、何ら抗原特異的細胞傷害を示さないことが予測される。しかし、上清および架橋因子を添加した試料は、抗原特異的細胞傷害応答を誘発することが予測される。この結果は、細胞傷害応答を、薬物調節型様式で、全身において誘発する、可溶性ＤＡＲＩＣ系を発現させるように、人工細胞を作製しうることを裏付ける。
【０３３０】
上記で記載した多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができる。本明細書で言及され、かつ／または出願データシートで列挙される、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許公開の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。多様な特許、出願、および公開の概念を援用して、なおさらなる実施形態をもたらすことが必要な場合、実施形態の態様を改変することもできる。
【０３３１】
上記で詳述した記載に照らして、これらの変化および他の変化を実施形態に施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書で開示される具体的な実施形態および特許請求の範囲に限定するものとみなされるべきではなく、全ての可能な実施形態を、このような特許請求の範囲が付与される、同等物の全ての範囲と共に含むものとみなされるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１Ａ】
2020178690.tif 000022
【図１Ｂ】
2020178690.tif 000023
【図１Ｃ】
2020178690.tif 000024
【図１Ｄ】
2020178690.tif 000025
【図１Ｅ】
2020178690.tif 000026
【図１Ｆ】
2020178690.tif 000027
【図１Ｇ】
2020178690.tif 000028
【図１Ｈ】
2020178690.tif 000029
【図１Ｉ】
2020178690.tif 000030
【図１Ｊ】
2020178690.tif 000031
【図１Ｋ】
2020178690.tif 000032
【図１Ｌ】
2020178690.tif 000033
【図１Ｍ】
2020178690.tif 000034
【図２】
2020178690.tif 000035
【図３Ａ】
2020178690.tif 000036
【図３Ｂ】
2020178690.tif 000037
【図４】
2020178690.tif 000038
【図５−１】
2020178690.tif 000039
【図５−２】
2020178690.tif 000040
【図６】
2020178690.tif 000041
【図７−１】
2020178690.tif 000042
【図７−２】
2020178690.tif 000043
【図８】
2020178690.tif 000044
【図９】
2020178690.tif 000045
【図１０】
2020178690.tif 000046
【図１１】
2020178690.tif 000047
【配列表】
2020178690000001.app