(57)【要約】【課題】安全で高い活性を有し、副作用のリスクが低く長期投与が可能なアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及びそれらを含む抗アルツハイマー組成物を提供する。【解決手段】本発明のアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物は、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物、好ましくは果皮及び果実の一方又は双方の抽出物又は該抽出物より分離される１又は複数の化合物を有効成分として含み、アルツハイマー型認知症の症状に関連するアミロイドβ凝集を阻害する活性及びアミロイドβの生成に関与する酵素であるＢＡＣＥ１を阻害する活性を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とするアミロイドβ凝集阻害剤組成物。
【請求項２】
前記有効成分として、前記ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の抽出物又は該抽出物より分離される１又は複数の化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載のアミロイドβ凝集阻害剤組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、前記ヒシ科に属する植物の果皮熱水抽出物又はエタノール抽出物であることを特徴とする請求項２に記載のアミロイドβ凝集阻害剤組成物。
【請求項４】
ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とするＢＡＣＥ１阻害剤組成物。
【請求項５】
前記有効成分として、前記ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の抽出物又は該抽出物より分離される１又は複数の化合物を含むことを特徴とする請求項４に記載のＢＡＣＥ１阻害剤組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、前記ヒシ科に属する植物の果皮熱水抽出物又はエタノール抽出物であることを特徴とする請求項５に記載のＢＡＣＥ１阻害剤組成物。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載のアミロイドβ凝集阻害剤組成物及び請求項４から６のいずれか１項に記載のＢＡＣＥ１阻害剤組成物の一方又は双方を含有する抗アルツハイマー組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全で高い活性を有する新規なアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及びそれらを含む抗アルツハイマー組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、加齢に伴う脳機能障害であり、その有病率及び罹患率は、加齢に伴い著しく増大する。世界的な高齢化の進行に伴い、認知症の罹患者は増大傾向にあり、全世界の認知症罹患者数は、２０２０年には４０００万人、２０４０年には８０００万人に達するという推計もなされている。
【０００３】
認知症の主なものとして、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）、脳血管性認知症、レビー小体型認知症があるが、最も頻度が高いのはアルツハイマー病で、認知症全体の４０〜６０％を占める。最近の疫学研究によると、脳血管性認知症の有病率や罹患率は治療法や予防法などの進歩に伴い年々減少する傾向にあるが、アルツハイマー型認知症の罹患者は確実に増加しているとも言われている（非特許文献１参照）。
【０００４】
上述のとおり、アルツハイマー型認知症は、高齢化の進行する現在社会において深刻な社会問題の一つとなっており、その治療や予防を目的とした医薬品やサプリメント等の開発が急務となっている。アルツハイマー型認知症の要因として、脳内におけるアミロイドβ（アミロイドβタンパク質：Ａβ）の蓄積及び脳内に蓄積したアミロイドβの神経毒性に起因する神経細胞死が考えられている。現在、アルツハイマー型認知症の症状の軽減のための治療として、脳の機能低下に対する対症療法としてのコリンエステラーゼ阻害剤又はグルタミン酸ＮＭＤＡ受容体拮抗薬の投与、脳の神経細胞の細胞死を抑制する効果を有する薬剤として、ペリンドブリル等の投与が行われている。しかし、ペリンドブリルには血圧降下作用の存在が知られており、却って症状を悪化させる懸念がある。
【０００５】
アミロイドβは、「アミロイドβ生成」と「アミロイドβ凝集」の２つの段階を経て脳内に蓄積すると考えられている。したがって、これらの段階の一方又は双方を阻害する活性を有する化合物は、アルツハイマー型認知症の予防又は治療に有効であることが期待される。アミロイドβ凝集を阻害する活性を有する組成物として、例えば、シソ抽出物を有効成分として含むものが提案されている（特許文献１参照）。また、アミロイドβ生成に関与するタンパク質プロセシング酵素の１つであるγセクレターゼを阻害する活性を有する組成物として、ヒシュカ等に由来する植物エキスを有効成分として含むγセクレターゼ阻害組成物が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１２４８６５号公報
【特許文献２】特開２０１３−５３０７６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nakamura  S,  Shigeta  M,  Iwamoto  M,  Tsuno  N,  Niina  R,  Homma  A,  Kawamuro  Y.  Prevalence  and  predominance of Alzheimer type dementia in rural Japan. Psychogeriatrics. 3 (2003):97-103.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高い安全性を有し、副作用のリスクが低く、長期投与が可能で高い効果を有する抗アルツハイマー剤が今なお求められている。
【０００９】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安全で高い活性を有し、副作用のリスクが低く長期投与が可能なアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及びそれらを含む抗アルツハイマー組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とするアミロイドβ凝集阻害剤組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１１】
本発明の第２の態様は、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とするＢＡＣＥ１阻害剤組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１２】
本発明の第１の態様に係るアミロイドβ凝集阻害剤組成物及び本発明の第２の態様に係るＢＡＣＥ１阻害剤組成物において、前記有効成分として、果皮及び果実の一方又は双方の抽出物又は該抽出物より分離される１又は複数の化合物を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の第１の態様に係るアミロイドβ凝集阻害剤組成物及び本発明の第２の態様に係るＢＡＣＥ１阻害剤組成物において、前記抽出物が、前記ヒシ科に属する植物の果皮熱水抽出物又はエタノール抽出物であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に係るアミロイドβ凝集阻害剤組成物又は本発明の第２の態様に係るＢＡＣＥ１阻害剤組成物の一方又は双方を含有する抗アルツハイマー組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物の有効成分は、食経験のあるヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物であるため、高い安全性を有する。更に、今回新たに見出されたように高いアミロイドβ凝集阻害活性及びＢＡＣＥ１阻害活性を有する。このように、本発明によると、安全で高い活性を有し、副作用のリスクが低く長期投与が可能なアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及びそれらを含む抗アルツハイマー組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒシ果皮抽出物のアミロイドβ凝集阻害活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】ヒシ果皮抽出物のＢＡＣＥ１阻害活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の第１の実施の形態に係るアミロイドβ凝集阻害剤組成物（以下、「アミロイドβ凝集阻害剤組成物」と略称する場合がある。）は、ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含んでいる。
【００１８】
有効成分であるヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物としては、例えば、経口投与用の組成物の場合には、果皮や果実の粉砕物又は微粉化したものを含んでいてもよいが、注射剤等として用いられる組成物等の製造の場合には、果実の搾汁や、果実及び果皮の一方又は双方の抽出物が好ましく用いられる。
【００１９】
ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物は、好ましくは、果皮及び果実の一方又は双方の抽出物又は該抽出物より分離される１又は複数の化合物である。以下、果皮及び果実の一方又は双方の抽出物の調製方法について詳述する。
【００２０】
ヒシ科植物の果実及び果皮は、生の実又は生の実から採取したもの、採取後乾燥したもの、乾燥した実又は乾燥した実から採取したもののいずれであってもよい。抽出効率を向上させるために、溶媒抽出の前に任意の方法を用いて破砕又は粉砕等の前処理を行ってもよい。
【００２１】
抽出に用いられるヒシ科植物は特に制限されないが、具体例としては、ヒシ（Trapa  japonica）、オニビシ（Trapa  natans  L.  ver.  japonica）、ヒメビシ（Trapa  incisa）及びトウビシ（Trapa  bispinosa  Roxb.）が挙げられる。
【００２２】
抽出に用いる溶媒としては、水、水溶液、水と混和する任意の１種以上の溶媒と水とを任意の割合で混合した混合溶媒（水性溶媒）を用いることができるが、好ましい抽出溶媒は、水、メタノール、エタノール及びこれらの任意の２以上を任意の割合で混合した水性溶媒であり、特に好ましい抽出溶媒は、水、食品添加物として認められている有機溶媒であるエタノール、エタノールと水とを任意の割合で混合した水性溶媒である。抽出溶媒の温度は、室温を超え抽出溶媒の沸点以下の任意の温度であってよいが、抽出効率、被抽出物の耐熱性及び揮発性等を考慮して決定されることが好ましい。
【００２３】
抽出溶媒として水及び水性溶媒を用いる場合には、抽出効率を向上させるために、必要に応じて、酸、塩基、塩等を適宜含んでいてもよい。抽出に用いる水の温度及びｐＨについては特に制限はないが、ｐＨについては、生体への使用を考慮して中性付近、より具体的にはｐＨ４〜９であることが好ましく、６〜８であることがより好ましい。必要に応じて、抽出効率を向上させるために、加熱した抽出溶媒を用いてもよい。
【００２４】
熱水抽出は任意の公知の方法により行うことができ、例えば、ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方を溶媒中で所定時間混合後、ろ過、遠心分離、デカンテーション等により固形分と分離する方法、ソックスレー抽出法等の連続抽出法等の方法を用いることができる。
【００２５】
ヒシ科植物の果皮の溶媒抽出物から、１又は複数の化合物を分離する前に、高分子量成分や不溶分等を除去するために、透析、限外ろ過、ろ過、カラムクロマトグラフィー等による前処理を行ってもよい。
【００２６】
ろ過により不溶分等を除去する場合には、必要に応じて、不純物を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に抽出液の状態で用いる場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
【００２７】
必要に応じて上述のような前処理を行った熱水抽出物の分離は、カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー等の任意の公知の方法を用いて行うことができ、アルツハイマー型認知症に関連する諸症状の改善に関連すると思われる、後述する各種活性の高い画分を分画することにより行うことができる。
【００２８】
アルツハイマー型認知症に関連する諸症状の改善に関連すると思われる活性の一例として、アミロイドβの生成を阻害する活性が挙げられる。アルツハイマー型認知症は、脳内にアミロイドβからなるアミロイド線維が沈着して生成した老人斑が広範に認められる神経変性疾患であり、アミロイドβの蓄積がアルツハイマー型認知症の発症の引き金であるというアミロイドβ仮説が提唱されている。アミロイドβは、アミノ酸残基数約７００の一回膜貫通型前駆体タンパク質（アミロイド前駆体タンパク質：ＡＰＰ）が２種類のタンパク質プロセシング酵素により切断されることにより産生される。アミロイドβは、ＡＰＰの細胞外領域から膜貫通領域にかけて存在しており、βセクレターゼによりアミロイドβのＮ末部分が、次いでγセクレターゼによりＣ末部分が切断させる。
【００２９】
ＢＡＣＥ１（β site amyloid cleaving enzyme）は、βセクレターゼを有する膜結合型のアスパラギン酸プロテアーゼであり、１９９９年にクローニングされて以来、阻害剤に関する多くの研究がなされている。一方、γセクレターゼは複数のサブユニットからなる複合タンパク質であるが、未だ正体は不明であり、ＡＰＰ以外にも、細胞の発生や分化に関与するいくつかの膜貫通型タンパク質も基質とすることが知られている。γセクレターゼの触媒中心であるプレセニリン（ＰＳ）をノックアウトしたマウスは胎生致死であることが知られており、γセクレターゼの阻害剤には危険な副作用が存在する可能性が懸念されている。
【００３０】
アミロイド線維の脳内への沈着には、アミロイドβの凝集が深く関与している。アミロイドβは、単量体として存在する場合には無害であるが、分子間会合してβシート構造を形成することにより凝集し、線維状の凝集体を形成する。アミロイドβのコンホメーション変化の原因は必ずしも明らかではないが、アミロイドβの凝集を阻害する活性を有する化合物は、アルツハイマー型認知症の有効な治療薬となる可能性を有している。
【００３１】
ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物、特にヒシ科植物の果皮の熱水抽出物及びエタノール抽出物は、高いアミロイドβの凝集を阻害する活性及び高いＢＡＣＥ１阻害活性を有しており、アミロイドβ凝集阻害剤、ＢＡＣＥ１阻害剤、ひいては抗アルツハイマー剤の有効成分として有効である。
【００３２】
担体等と混合することにより、ヒシ科植物の果皮の熱水抽出物及びエタノール抽出物等のヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を、アミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物等の医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒト或いは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／日である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、或いは上記範囲を超えて必要な場合もある。
【００３３】
経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製でき、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、アミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物と、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。
【００３４】
アミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物を含む食品としては、アミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物を食品に配合したもの、或いは、カプセル、錠剤等、食品又はサプリメントに通常用いられる任意の形態をとることができる。配合される食品の種類に特に制限はなく、例えば、コーヒー、果汁、清涼飲料水、ビール、牛乳、味噌汁、スープ、紅茶、茶、栄養剤、シロップ、マーガリン、ジャム等の液状（流動状）食品、米飯、パン、じゃがいも製品、もち、飴、チョコレート、ふりかけ、ハム、ソーセージ、キャンディーなどの固形形状食品等の主食、副食、菓子類ならびに調味料に配合することも可能である。用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形してもよい。また、必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と適宜混合してもよい。
【００３５】
本発明は、ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方に含まれる１又は複数の化合物を有効成分として含むアミロイドβ凝集阻害剤組成物、ＢＡＣＥ１阻害剤組成物及び抗アルツハイマー組成物を投与することにより、ヒトのアルツハイマー型認知症の諸症状を改善する方法を提供するものでもある。
【実施例】
【００３６】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ヒシ果皮抽出物の調製
（１）ヒシ科植物の熱水抽出物（以下、「ヒシ果皮抽出物」と略称する。）の調製
収穫後のトウビシ（Trapa  bispinosa）の果実を乾燥させ、乾燥果皮を回収した。フードプロセッサーを使用して乾燥果皮を粉末化し、熱水抽出（９０℃の熱水を使用）し、固形分をろ過後、得られた抽出液を凍結乾燥し、固体状のヒシ果皮熱水抽出物を得た。
【００３７】
ヒシエキスは、最終的に得られるヒシ果皮抽出物のポリフェノール含量が２５重量％以上となるよう予め定めた所定の濃縮率で抽出液を濃縮した。濃縮液６７重量％に対し３３重量％のデキストリンを添加し、スプレードライヤーで噴霧乾燥することにより調製した。
【００３８】
（２）ヒシ果皮エタノール抽出物の調製
上記（１）と同様の手順で得たトウビシの乾燥果皮粉末１重量部に対し１６重量部の５０％エタノールを使用してエタノール抽出を行った。固形分をろ過後、ロータリーエバポレーターを用いて抽出液からエタノールを減圧留去し、固体状のヒシ果皮エタノール抽出物を得た。
【００３９】
実施例２：アミロイドβ凝集阻害活性の評価
アミロイドβ凝集阻害活性の評価には、in  vitro評価法であるチオフラビンＴ法を用いた。測定は、Ｏｋｕｄａらの方法（Journal  of  Alzheimer’s  Disease  59,  313-328,  2017）に準拠して行った。具体的な手順は下記のとおりである。Ａβ１−４２（ペプチド研究所製）を、濃度が０．２ｍＭとなるように０．１％アンモニア水に溶解した後、ＰＢＳでアミロイドβ濃度が２０μＭになるよう希釈した。アミロイドβ凝集阻害剤組成物及び対照（ヒシ果皮熱水抽出物、ヒシ果皮エタノール抽出物、ヒシエキス、シソ葉抽出物、タイム、クルクミン）は、濃度が最終濃度の１００倍になるようにＤＭＳＯ若しくは蒸留水に溶解した後、ＰＢＳで５０倍希釈した。このようにして調製したアミロイドβ溶液と測定試料溶液を、９６ウェルブラックプレート（ハーフウェル）に２５μＬずつ添加して、ピペッティング攪拌した。プレートシールでウェルを密封して、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ：８．５）で６μＭに調整したチオフラビンＴ（富士フイルム和光純薬製）を５０μＬ加え、ピペッティング後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起波長：４４０ｎｍ、測定波長：４８６ｎｍ）。陽性対照として、アミロイドβ凝集阻害剤として知られるクルクミン、タイム、シソ葉抽出物を使用した。アミロイドβ（Ａβ）凝集阻害率（％）は、下式を用いて求めた。
【００４０】
Ａβ凝集阻害率（％）＝［（Ｉ０−Ｂ０）−（Ｉ−Ｂ）］／（Ｉ０−Ｂ０）×１００
【００４１】
式中、Ｉ０は阻害剤非存在下における蛍光強度、Ｂ０は阻害剤非存在下におけるバックグラウンド、Ｉは阻害剤存在下における蛍光強度、Ｂは阻害剤存在下におけるバックグラウンドである。阻害剤の濃度と阻害剤の関係から、阻害率が５０％になるときの阻害剤濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００４２】
結果を図１に示す。ヒシ果皮エタノール抽出物、ヒシ果皮熱水抽出物、ヒシエキスは、高いアミロイドβ凝集活性を有することが知られているタイム、シソ葉抽出物と同程度又はより高い活性を示すことが確認された。
【００４３】
実施例３：ＢＡＣＥ１阻害活性の評価
ＢＡＣＥ１阻害活性の評価は、インビトロジェン社製ＢＡＣＥ１  ＦＲＥＴアッセイキットを用いて行った。阻害剤（ヒシ果皮熱水抽出物、ヒシ果皮エタノール抽出物、ヒシエキス）は最終濃度の３０倍濃度となるようにＤＭＳＯ若しくは蒸留水に溶解し、キットに付属のバッファーで１０倍希釈したものを使用した。測定方法は、９６ウェルブラックハーフプレートに測定試料溶液（コントロールは１０％ＤＭＳＯ若しくは１０％蒸留水）および基質溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加し、混和した。次いで、ＢＡＣＥ１酵素溶液（ブランクはバッファー）を１０μＬ添加して混和後、恒温槽内（２８℃）で２時間静置した。次いで、反応停止液１０μＬを添加して混和後、プレートリーダーで蛍光強度（励起波長：５４５ｎｍ、測定波長：５８５ｎｍ）を測定した。ＢＡＣＥ１阻害率の算出は下式を用いて行った。
【００４４】
ＢＡＣＥ１阻害率（％）＝［（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ）］／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【００４５】
式中、Ｃは阻害剤非存在下における蛍光強度、ＣＢは阻害剤非存在下におけるバックグラウンド（コントロールバックグラウンド）、Ｓは阻害剤存在下における蛍光強度、ＳＢは阻害剤存在下におけるバックグラウンド（サンプルバックグラウンド）である。阻害剤の濃度と阻害剤の関係から、阻害率が５０％になるときの阻害剤濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００４６】
結果を図２に示す。トウビシ果皮エタノール抽出物は、アミロイドβ凝集阻害に加え、数十μｇ／ｍＬ程度のＢＡＣＥ１阻害活性を示すことが確認された。
【図１】
2020083815.tif 000003
【図２】
2020083815.tif 000004