(57)【要約】      （修正有）【課題】グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）のリン酸化抑制によってβカテニン減少状態が継続することによるストレス性疾患、などのストレス状態を予防、改善または治療することができる組成物を提供する。【解決手段】グレリンおよび／またはグレリン誘導物質を含む、ストレス状態の予防用、改善用または治療用組成物、とくにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の脱リン酸化抑制用である前記組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グレリンおよび／またはグレリン誘導物質を含む、ストレス状態の予防用、改善用または治療用組成物。
【請求項２】
グレリンが、活性型グレリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ストレス状態が、グレリン関連ストレス性疾患である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
グレリン誘導物質が、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の脱リン酸化抑制用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
食品組成物または医薬組成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス性疾患の予防、改善または治療に用いることができる食品組成物または医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内ではストレスに対処する防御反応として、主に２つの生体システムが働く。一つは視床下部−交感神経−副腎髄質系とよばれる、副腎髄質や交感神経終末からアドレナリン、ノルアドレナリンが分泌され、行動学的には攻撃または闘争・逃走反応を制御する。もう一方は神経内分泌系の活性化である。視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ系）により制御され、副腎皮質からグルココルチコイドが分泌され、行動学的には行動意欲の減退といった受動的ストレス反応が現れる。長期的あるいは過剰なストレスは、ＨＰＡ系の過活動を引き起こし、うつ病、双極性障害など、様々なストレス性疾患を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
生体内の糖代謝酵素の一つに、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）がある。ＧＳＫ３βはストレスによる影響を受けやすい分子であり、マウスに継続的な水泳を施すとＧＳＫ３βのｍＲＮＡ量の上昇やリン酸化の減少が見られ、うつ病との関連が指摘されている（非特許文献２）。また、ＧＳＫ３βが、うつ病などの精神疾患やアルツハイマー病などの神経疾患と関連することが示唆されている（非特許文献３）。さらに、ＧＳＫ３βのキナーゼ活性によって、βカテニンの分解（destruction）が起きるとされている（非特許文献４）。
【０００４】
また、不安神経症や不安障害を治療するために、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）などの中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）を用いること（特許文献１）や、うつ病またはうつ状態の予防または治療のために、炭素数８〜１０の中鎖脂肪酸と炭素数１２〜２４の長鎖脂肪酸とをトリグリセリドの形態で含有する組成物を用いること（特許文献２）が提案されている。
一方、グレリン分泌促進剤として、「タンパク質としてタンパク質加水分解物及び発酵乳タンパク質；脂質として中鎖脂肪酸；並びに糖質を含有する、グレリン分泌促進剤」（特許文献３）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１８−５１１５５８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０８０９８２号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１９９１９２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】吾郷由希夫、他、うつ病と副腎皮質ステロイドホルモン受容体、日薬理誌、134巻、page 304-308、2009年
【非特許文献２】Strekalova T, et al: Individual Differences in Behavioural Despair Predict Brain GSK-3beta Expression in Mice: The Power of a Modified Swim Test. Neural Plast. 5098591, 2016
【非特許文献３】Beurel E, et al: Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): regulation, actions, and diseases. Pharmacol Ther. Vol. 148, page 114-31, 2015
【非特許文献４】van Kappel EC, et al: “Molecular regulation and pharmacological targeting of the β-catenin destruction complex.”, Br J Pharmacol. vol. 174, page 4575-4588, 2017
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＧＳＫ３βのリン酸化抑制によってβカテニン減少状態の継続することによるストレス性疾患などのストレス状態を予防、改善または治療することができる組成物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、グレリンが、リン酸化されたＧＳＫ３β（非活性型）の脱リン酸化を抑制することによって、βカテニンを分解する作用を有するリン酸化されていないＧＳＫ３β（活性型）の生成を防ぐことができることを見出した。βカテニン減少状態の継続がうつ病やアルツハイマー病などのストレス性疾患の要因と考えられることから、活性型ＧＳＫ３βの生成を防ぐことによってβカテニン量を上昇させ、ストレス性疾患の予防、改善または治療ができることを見出し、さらに検討を進め、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明は、以下に関する。
［１］  グレリンおよび／またはグレリン誘導物質を含む、ストレス状態の予防用、改善用または治療用組成物。
［２］  グレリンが、活性型グレリンである、前記［１］に記載の組成物。
［３］  ストレス状態が、グレリン関連ストレス性疾患である、前記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］  グレリン誘導物質が、中鎖脂肪酸トリグリセリドである、前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５］  グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の脱リン酸化抑制用である、前記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の組成物。
［６］  食品組成物または医薬組成物である、前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のグレリンおよび／またはグレリン誘導物質を含む組成物は、ストレス状態の予防、改善または治療に用いることができる。
とくに本発明の組成物を摂食または投与することによって、ストレス状態の対象において、活性型グレリンが、ＧＳＫ３βの脱リン酸化を抑制することにより、βカテニンの減少状態が解消され、グレリン関連ストレス性疾患などのストレス状態を予防、改善または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ラット副腎由来細胞株ＰＣ１２細胞から分化した神経様細胞にグルココルチコイドアゴニスト（ＤＥＸ）を投与した場合の、リン酸化ＧＳＫ３βの脱リン酸化ＧＳＫ３βに対する割合を示したグラフである。図中、危険率５％未満を＊で、危険率１％未満を＊＊で示した。
【図２】図２は、ＤＥＸ存在培養下（１μＭ）のラット副腎由来細胞株ＰＣ１２細胞から分化した神経様細胞に活性型グレリンを投与した場合の、リン酸化ＧＳＫ３βの脱リン酸化ＧＳＫ３βに対する割合を示したグラフである。図中、危険率５％未満を＊で、危険率１％未満を＊＊で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下では、本発明を詳細に説明するが、本発明は、個々の態様には限定されない。
本発明は、一態様において、グレリンおよび／またはグレリン誘導物質を含む、ストレス状態の予防用、改善用または治療用組成物に関する。
【００１３】
本発明においてグレリンは、活性型グレリン（アシルグレリン）および不活性型グレリン（デスアシルグレリン）のいずれも用いることができるが、活性型グレリンを用いることが好ましい。
グレリン誘導物質とは、グレリンの産生や分泌を誘導することができる物質であれば、とくに限定されない。グレリン誘導物質としては、例えば、中鎖脂肪酸や中鎖脂肪酸含有油脂などが挙げられる。また、「タンパク質としてタンパク質加水分解物及び発酵乳タンパク質；脂質として中鎖脂肪酸；並びに糖質を含有する、グレリン分泌促進剤」（特許文献３）などの公知のグレリン誘導物質も用いることができる。
【００１４】
本明細書において中鎖脂肪酸とは、炭素数６〜１４の中鎖脂肪酸を示し、より具体的には、カプロン酸（炭素数６）、ヘプチル酸（炭素数７）、カプリル酸（炭素数８）、ペラルゴン酸（炭素数９）、カプリン酸（炭素数１０）、ラウリン酸（炭素数１２）、ミリスチン酸（炭素数１４）などが挙げられる。また、中鎖脂肪酸含有油脂とは、典型的には、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ：Medium-chain triglyceride）を示す。
【００１５】
中鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸含有油脂は、ココナッツ、パームフルーツ等の植物体や、牛乳等の乳製品に存在するため、これらから抽出（粗抽出を含む）あるいは精製または粗精製した中鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸含有油脂を本発明に使用することができる。あるいは、化学合成法による産物や市販品を中鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸含有油脂の一部または全部として使用してもよい。
【００１６】
本発明に係る組成物によって、予防、改善または治療の対象となるストレス状態は、とくに限定されないが、典型的には、ＧＳＫ３βのリン酸化抑制に伴うβカテニン減少状態の継続によって生じるストレス状態が挙げられる。ストレス状態の改善や治療は、例えば、血液、唾液、毛髪、爪などの試料中のコルチゾール、ストレスと関連のある血液マーカーなどを指標として確認することができる。
【００１７】
グレリン関連ストレス性疾患とは、ＧＳＫ３βのリン酸化抑制に伴うβカテニン減少状態の継続によって発症、重篤化リスクが高まると考えられる疾患である。かかる疾患としては、例えば、うつ病、双極性障害、アルツハイマー病、癌、統合失調症、炎症性肺疾患などが挙げられる。なお、本発明の予防、改善または治療の対象となるストレス性疾患は、全てのストレス性疾患であるとは限らない。すなわち、うつ病を例に挙げると、全てのうつ病が対象となるのではなく、ＧＳＫ３βのリン酸化抑制に伴うβカテニン減少状態の継続によって発症するうつ病が対象である。本発明の予防、改善または治療の対象となるストレス性疾患であるか否かについては、例えば、ＧＳＫ３βのリン酸化の程度、βカテニンの減少の程度などを指標として、適宜決定することができる。
【００１８】
本発明に係る組成物は、一態様において、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の脱リン酸化抑制用である。本発明に係る組成物は、ストレス状態の予防、改善または治療を目的としない、ＧＳＫ３βの脱リン酸化の抑制のためにも用いることができる。
【００１９】
本発明に係る組成物は、一態様において、食品組成物または医薬組成物である。
本発明に係る組成物に含まれるグレリンまたはグレリン誘導物質の量は、ＧＳＫ３βの脱リン酸化を抑制できる量であれば、特に限定されない。例えば、血中グレリン濃度が、０．０１ｎＭ〜１ｎＭとなる量であることが好ましい。したがって、食品組成物や経口投与用医薬組成物に含まれるグレリンやグレリン誘導物質の量は、摂取後の血中グレリン濃度などを指標として、摂取計画に従い決定することができる。
【００２０】
医薬組成物の場合、剤形に応じてグレリンおよび／またはグレリン誘導物質の含有量を変更することができる。
以下では、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これにより限定されない。
【００２１】
［実施例］
本発明の組成物が、ストレス状態を予防、改善または治療できることについて、下記の実験１および２によって確認した。
実験１および実験２において用いた材料および方法は次のとおりである。
＜ＰＣ１２細胞の培養＞
ＰＣ１２細胞（RIKEN BRC）は、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。実験に使用したＰＣ１２細胞は、２４ｗｅｌｌ中に８×１０４〜１．２×１０５／ｗｅｌｌの初期密度で１０％ウシ胎児血清および５％ウマ血清（Thermo Fisher Scientific）を含む培地（ＤＭＥＭ、Nacalai）にて培養した。
【００２２】
＜試料の調製＞
上記のとおりＰＣ１２細胞を培養し、１日後、培地を１００μｇ／ｍｌのＮＧＦ（Alomone labs）および１％ウマ血清に置き換え、これにデキサメタゾン（ＤＥＸ）（Sigma Aldrich）、グレリン（Acylated Ghrelin、Peptide Institute）を加え、４８時間培養した後、２ｘ sample buffer（１００ｍＭ Tris-Cl ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ Bromophenol Blue、１０％ ２−メルカプトエタノール）にて抽出し、５分間煮沸して試料とした。
【００２３】
＜ウエスタンブロット＞
得られた試料は電気泳動後、ウエスタンブロットにてメンブレン（Immobilon、Merck Millipore）に固定し、ＧＳＫ−３βまたはＰｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）抗体（Cell Signaling）にて４℃、一晩反応させた後、ＨＲＰ標識二次抗体（SeraCare Life Sciences）中で１時間反応させた。発色反応にはECL Prime（GE Healthcare）を用い、ChemiDoc Touch（Bio-Rad）にてイメージ化した。タンパク質の定量化にはImage Jを用いた。数値化したデータはダネット法にて検定し、コントロール（Control）と比較した。検定の結果は、危険率５％未満をもって有意とした。
【００２４】
実験１：グルココルチコイドアゴニスト（ＤＥＸ）投与によるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）リン酸化への影響
ラット副腎由来細胞株ＰＣ１２細胞を神経成長因子（ＮＧＦ）存在下で培養し、神経様細胞に分化させた。そこに、ストレスによって分泌されるストレスホルモンであるグルココルチコイド（ＧＣ）のアゴニストであるＤＥＸを投与したところ（０．０１〜１μＭ、４８時間）、ＧＳＫ３βのリン酸化が２０〜３５％程度減少することが示された（図１）。なお、ＤＥＸ非投与群をコントロールとした。
【００２５】
以上より、ストレスホルモンのアゴニストであるＤＥＸがＰＣ１２細胞のＧＳＫ３βのリン酸化を抑制することが示された。２０〜３５％程度の減少であっても、このようなＧＳＫ３βへのマイナスの影響が長期間繰り返されれば、様々な神経疾患を引き起こす要因となり得ることは十分に推測できる。すなわち、神経細胞へのストレスの影響は、ＧＣを介したＧＳＫ３βのリン酸化によってもたらされることが示唆された。
【００２６】
実験２：ＤＥＸ存在培養下（１μＭ）でグレリンがＧＳＫ３βのリン酸化に与える影響
実験１同様のＤＥＸ投与下でグレリンがＧＳＫ３βのリン酸化にどのような効果をもたらすかを解析した。グレリンはアシル化されたもの（活性型グレリン）を使用し、グレリンの投与濃度は血中グレリン濃度を参考とし、０．０１〜１ｎＭとした。
１μＭのＤＥＸ存在下でグレリンを０．０１、０．１ｎＭ添加すると、ＧＳＫ３βのリン酸化をおよそ２０％程度上昇させることが明らかとなった（図２）。なお、グレリン非投与群をコントロールとした。
【００２７】
以上より、ストレスホルモンによるＧＳＫ３βリン酸化抑制効果は、グレリンの投与によって回復させうることが示唆された。とくにグレリン濃度０．０１ｎＭは、血中濃度としても十分ありうる濃度であり、通常の生理条件下でのグレリン上昇でもＧＳＫ３βのリン酸化を減少させる効果が期待できることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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