(57)【要約】      （修正有）【課題】移植前の膵島組織などに代表される組織や細胞の機能性や状態をリアルタイムでモニタリング可能な手法の提供。【解決手段】細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能な培養システムであって、細胞又は組織を格納し培養するチャンバー部、チャンバー部に培養液を供給する送液手段、チャンバー部から排出される培養液を回収する溶液回収手段、および、チャンバー部の下流側に、排出される培養液中の特定成分を検出し細胞又は組織の状態を観測する手段を備え；チャンバー部が、送液手段から供給される培養液をチャンバー部内に注入する上部領域の開口部、チャンバー部から培養液を排出する下部領域の開口部、および、それらの開口部の間の領域に、細胞又は組織を保持しつつ培養液が通過可能な空孔を有する足場部材を備える、培養システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能な培養システムであって、
前記細胞又は組織を格納し、培養するためのチャンバー部と、
前記チャンバー部に培養液を供給するための送液手段と、
前記チャンバー部から排出される培養液を回収するための溶液回収手段と、
前記チャンバー部の下流側に、前記チャンバー部から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより前記細胞又は組織の状態を観測するための観測手段とを備え、
前記チャンバー部が、
前記チャンバー部の上部領域に、前記送液手段から供給される前記培養液をチャンバー部内に注入するための注入開口部と、
前記チャンバー部の下部領域に、前記チャンバー部から前記培養液を排出するための排出開口部と、
前記注入開口部と前記排出開口部との間の領域に、前記細胞又は組織を保持しつつ、前記培養液が通過可能な空孔を有する足場部材とを備えること
を特徴とする、培養システム。
【請求項２】
前記チャンバー部内の前記培養液の灌流方向が、前記チャンバー部の上部領域から下部領域への流れ方向であり、これにより、前記培養液が前記足場部材に保持されている前記細胞又は組織を上下方向に透過する流れとなる、請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
前記チャンバーが、上部が開放された容器形態のチャンバー本体と、前記チャンバー本体の上部を覆う蓋部、及び前記チャンバー本体に収容されるセルストレーナーからなり、
前記チャンバー本体が前記排出開口部を有し、前記蓋部が前記注入開口部を有し、及び、前記セルストレーナーが前記足場部材を有する、
請求項１又は２に記載の培養システム。
【請求項４】
前記足場部材が、３０〜９０μｍのポアサイズの空孔を有する、請求項１〜３のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項５】
前記観測手段が、前記溶液回収手段において回収された培養液を測定するものである、請求項１〜４のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項６】
前記観測手段が、前記排出開口部と前記溶液回収手段とを連結する連結管と一体化している、請求項１〜４のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項７】
前記観測手段が、前記チャンバー部から排出される培養液中に含まれるグルコース濃度又はインスリン濃度を測定するものである、請求項１〜６のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項８】
前記観測手段が、前記培養液中の特定成分の存在を蛍光応答として検出するものである、請求項１〜７のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項９】
前記溶液回収手段において回収された培養液を、前記送液手段に再び循環させる手段を更に備える、請求項１〜８のいずれか１に記載の培養システム。
【請求項１０】
細胞又は組織の培養方法であって、
（ａ）培養液が通過可能な空孔を有する足場部材上に前記細胞又は組織を保持し、培養容器中で前記細胞又は組織を連続的に灌流培養する工程、及び
（ｂ）前記培養容器から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測する工程を含む、培養方法。
【請求項１１】
前記灌流培養における前記培養液の流れが、前記培養液が前記足場部材に保持されている前記細胞又は組織を上下方向に透過する流れである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）が、前記培養液中の特定成分の存在を蛍光応答として検出することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において前記培養容器から排出される培養液を回収し、再び培養容器中に供給する工程を更に備える、請求項１０〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
前記特定成分が、グルコース又はインスリンである、請求項１０〜１３のいずれか１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織が膵島組織であり、前記特定成分がインスリンである、請求項１０〜１４のいずれか１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）により、工程（ａ）で培養されている膵島組織が膵島移植に適切なインスリン分泌機能を有していることを評価することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）を行う際に、灌流する培養液におけるグルコース濃度を高濃度に変化させ、培養されている膵島組織に負荷を加えることを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜９に記載の培養システムを用いる、細胞又は組織の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織を連続的に灌流培養しながら、培養物の状態をリアルタイムで観測可能な培養システム及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血糖値の上昇をもたらす代謝障害であり、有効な予防・治療方法の確立が切望されている。血糖を下げるホルモンであるインスリンは膵臓の膵島（ランゲルハンス島）内に存在するβ細胞から分泌され血糖値を正常に保つ役割を有するが、糖尿病患者ではインスリンの作用不足により高血糖値を呈する。糖尿病は１型と２型に大別され、１型糖尿病は、免疫細胞により膵島のβ細胞が死滅することでインスリンの分泌不全となる自己免疫疾患であり、一方、２型糖尿病は、インスリン分泌の低下／感受性の低下を伴うものであり、運動不足などの環境因子による生活習慣病の一種である。
【０００３】
従来、１型糖尿病に対する治療は、インスリンの投与が主であったが、患者の負担が重い等の課題があるため、新たな治療法として膵島移植が注目されている（非特許文献１等）。膵島移植は、膵臓そのものの移植と比較して、患者の安全性、簡便性および最小限の侵襲性などの利点を有する革新的な治療法といえる。一般に、膵島移植の前には、品質管理のため、膵島の純度、形態、無菌性、生存率および効力等の評価が行われる。しかしながら、現在、移植前の膵島品質を評価するために用いられている、静的グルコース培養や生存率アッセイのような標準的な評価法では、細胞機能に関する情報をほとんど提供せず、細胞形態、代謝およびシグナル伝達レベル等の欠陥について評価することは困難であった。
【０００４】
また、かかる膵島の例に限らず、一般に、器官などの三次元組織培養においても、培養系の環境を制御するだけでなく、細胞代謝の動態を明らかにするという観点で、三次元組織培養中の状態をリアルタイムでモニタリング可能な技術は非常に有用である。しかしながら、培養の組織等を連続的にモニター可能な技術に関する報告はほとんどなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００、 ３４３（４）、２３０-２３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、移植前の膵島組織などに代表される組織や細胞の機能性や状態をリアルタイムでモニタリング可能な手法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能な系を新規に見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能な培養システムであって、前記細胞又は組織を格納し、培養するためのチャンバー部と、前記チャンバー部に培養液を供給するための送液手段と、前記チャンバー部から排出される培養液を回収するための溶液回収手段と、前記チャンバー部の下流側に、前記チャンバー部から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより前記細胞又は組織の状態を観測するための観測手段とを備え；前記チャンバー部が、前記チャンバー部の上部領域に、前記送液手段から供給される前記培養液をチャンバー部内に注入するための注入開口部と、前記チャンバー部の下部領域に、前記チャンバー部から前記培養液を排出するための排出開口部と、前記注入開口部と前記排出開口部との間の領域に、前記細胞又は組織を保持しつつ、前記培養液が通過可能な空孔を有する足場部材とを備えることを特徴とする、培養システム；
＜２＞前記チャンバー部内の前記培養液の灌流方向が、前記チャンバー部の上部領域から下部領域への流れ方向であり、これにより、前記培養液が前記足場部材に保持されている前記細胞又は組織を上下方向に透過する流れとなる、上記＜１＞に記載の培養システム；
＜３＞前記チャンバーが、上部が開放された容器形態のチャンバー本体と、前記チャンバー本体の上部を覆う蓋部、及び前記チャンバー本体に収容されるセルストレーナーからなり、前記チャンバー本体が前記排出開口部を有し、前記蓋部が前記注入開口部を有し、及び、前記セルストレーナーが前記足場部材を有する、上記＜１＞又は＜２＞に記載の培養システム；
＜４＞前記足場部材が、３０〜９０μｍのポアサイズの空孔を有する、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の培養システム；
＜５＞前記観測手段が、前記溶液回収手段において回収された培養液を測定するものである、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の培養システム；
＜６＞前記観測手段が、前記排出開口部と前記溶液回収手段とを連結する連結管と一体化している、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の培養システム；
＜７＞前記観測手段が、前記チャンバー部から排出される培養液中に含まれるグルコース濃度又はインスリン濃度を測定するものである、上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の培養システム；
＜８＞前記観測手段が、前記培養液中の特定成分の存在を蛍光応答として検出するものである、上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の培養システム；及び
＜９＞前記溶液回収手段において回収された培養液を、前記送液手段に再び循環させる手段を更に備える、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の培養システム
を提供するものである。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
＜１０＞細胞又は組織の培養方法であって、（ａ）培養液が通過可能な空孔を有する足場部材上に前記細胞又は組織を保持し、培養容器中で前記細胞又は組織を連続的に灌流培養する工程、及び（ｂ）前記培養容器から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測する工程を含む、培養方法；
＜１１＞前記灌流培養における前記培養液の流れが、前記培養液が前記足場部材に保持されている前記細胞又は組織を上下方向に透過する流れである、上記＜１０＞に記載の方法；
＜１２＞前記工程（ｂ）が、前記培養液中の特定成分の存在を蛍光応答として検出することを含む、上記＜１０＞又は＜１１＞に記載の方法；
＜１３＞工程（ａ）において前記培養容器から排出される培養液を回収し、再び培養容器中に供給する工程を更に備える、上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の方法；
＜１４＞前記特定成分が、グルコース又はインスリンである、上記＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法；
＜１５＞前記組織が膵島組織であり、前記特定成分がインスリンである、上記＜１０＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の方法；
＜１６＞工程（ｂ）により、工程（ａ）で培養されている膵島組織が膵島移植に適切なインスリン分泌機能を有していることを評価することを含む、上記＜１５＞に記載の方法；
＜１７＞工程（ｂ）を行う際に、灌流する培養液におけるグルコース濃度を高濃度に変化させ、培養されている膵島組織に負荷を加えることを含む、上記＜１５＞又は＜１６＞に記載の方法；及び
＜１８＞上記＜１＞〜＜９＞に記載の培養システムを用いる、細胞又は組織の培養方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測することができる。これにより、膵島移植に用いられる膵島組織の機能（インスリン分泌の動態）を正確かつ簡便に、リアルタイムで機能評価を行うことができる。
【００１１】
また、本発明は、膵島組織に限らず、肝細胞や内皮細胞のような様々なタイプの細胞やオルガノイドなどをはじめとする三次元組織の培養及び機能解析に広く適用することができる。本発明の培養システムに蛍光ベースのグルコースセンサーを備えることで、細胞代謝の動態をリアルタイムでモニタリングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施態様に係る培養システムの全体を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の別の好ましい実施態様に係る培養システムの全体を示す模式図である。
【図３】図３は、実施例で用いた本発明の培養システムの構成を示す画像である。
【図４】図４は、実施例で用いたチャンバーの形状を示す画像である。
【図５】図５は、膵島の灌流培養後のインスリン分泌量の変化を示すグラフである。
【図６】図６は、培養前及び培養４日後の膵島（β細胞）を示すイメージ画像である。
【図７】図７は、ＨｅｐＧ２細胞の灌流培養におけるグルコース濃度変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１４】
１．培養システム
本発明の培養システムは、細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能であることを特徴とするものである。図１に、本発明の好ましい実施態様に係る培養システムの全体を示す模式図を示す。
【００１５】
図１に示すように、本実施態様に係る培養システムは、中央部に細胞又は組織を格納し、培養するためのチャンバー部２を備え、その上流側にチャンバー部２に培養液を供給するための送液手段１が設けられ、チャンバー部２の下流側にチャンバー部から排出される培養液を回収するための溶液回収手段３が設けられているという全体構造を有するものである。送液手段１から供給された培養液は、チャンバー部２の上方から流入して下方へと流れ、その過程で、培養のためにチャンバー部２の内部に保持された細胞又は組織を通過することになる。培養液は、チャンバー部２の下部から流出し、そこからさらに溶液回収手段３において回収される。典型的には、チャンバー部２を出て溶液回収手段３に至る任意の位置に観測手段４が設けられる。当該観測手段４では、チャンバー部２から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより、灌流培養中の細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測することができる。
【００１６】
＜送液手段＞
送液手段１は、チャンバー部２へ培養液を注入するための手段であり、例えば、当該技術分野において汎用されるシリンジポンプ等の送液装置を用いることができる。送液手段１は、典型的には、後述のようにチャンバー部２の上方に設けられた注入開口部と連結され、当該注入開口部からチャンバー部２の内部に培養液が送られることができる。送液手段１とチャンバー部２は直接接続されてもよいし、任意のチューブ状部材を介して接続されてもよい。かかる接続用チューブ状部材としては、高分子材料、ゴム、金属等の任意の材料を用いることができ、その長さや径サイズも所望に応じて適宜選択することができる。また、後述のように、培養液中のグルコース濃度等を時間依存的に変更する必要がある場合には、例えば、異なるグルコース濃度の培養液を格納した複数のシリンジポンプ等の収納部を備え、これらを適宜切り替えることが可能な機能を有する送液手段を用いることもできる。
【００１７】
＜チャンバー部＞
チャンバー部２は、図１に示すように、その上部領域に、送液手段１から供給される培養液をチャンバー部２の内部に注入するための注入開口部２１を、また、チャンバー部の下部領域に、チャンバー部２から培養液を排出するための排出開口部２２をそれぞれ有する。さらに、チャンバー部２には、注入開口部２１と排出開口部２２との間の領域に、細胞又は組織を保持しつつ、培養液が通過可能な空孔を有する足場部材２３が設けられている。
【００１８】
チャンバー部２が、かかる構造を有することにより、チャンバー部内の前記培養液の灌流方向がチャンバー部の上部領域（すなわち、注入開口部２１）から下部領域（すなわち、排出開口部２２）への流れ方向となる。これにより、培養液が足場部材２３に保持されている細胞又は組織を上下方向（縦方向）に透過する灌流流れとなる。これにより、従来の横方向の灌流による培養と比べて、より三次元培養に好ましい環境下で、細胞や組織を培養することが可能となる。ここで、三次元培養とは、平面的に単層で細胞を増殖させるものとは異なり、細胞同士を接着させながら増殖させ、立体的な細胞塊又はスフェロイドを形成させるものである。
【００１９】
注入開口部２１は、送液手段１の先端又は接続用チューブ状部材が連結可能であれば、任意の形状やサイズであることができる。典型的には、円形上の孔であることができ、チャンバー部２の上方壁（後述の蓋部３１）を上下方向に貫通して延在する管状の形状であることもできる。注入開口部２１の位置は、好ましくは、チャンバー部２の上方壁の中央付近であるが、上述のようにチャンバー部２内の灌流流れが上下方向となり得る限り、その位置は特に限定されない。
【００２０】
排出開口部２２は、チャンバー部２内の培養液を排出することができるものであれば、任意の形状やサイズであることができるが、典型的には円形上の孔である。当該排出される培養液を回収する溶液回収手段３に至る連結管３４と連結可能なように、排出開口部２２は管状部分を含むこともできる。また、排出開口部２２は、典型的には、チャンバー部２の底部に設けられるが、培養液を排出することができる限り、チャンバー部２の側部に設けることもできる。
培養により好ましい成長を示さなかった細胞や組織が、足場部材２３の空孔を透過し下方に離脱した場合に、かかる不良な細胞や組織を培養液と共に回収することができる等の観点から、排出開口部２２は、チャンバー部２の底部の中央付近に位置することが好ましい。この場合、チャンバー部２の底部は、図１に示されるように漏斗状のテーパー形状を有することが好ましい。
【００２１】
足場部材２３は、培養される細胞又は組織をその上面に保持するとともに、培養液が通過可能な空孔を有するものであり、これにより上下方向の灌流流れを形成することができる。足場部材２３の空孔は、培養の対象となる細胞や組織の大きさによって適宜調整することができるが、例えば、３０〜９０μｍのポアサイズであることができる。特に、膵島移植に用いられる好ましい膵島組織の大きさが１００〜２００μｍであることから、後述のように本発明の培養システムを用いて膵島組織を培養する場合には、かかるサイズの膵島組織が足場部材２３上に保持されるように、好ましくは３０〜９０μｍ、より好ましくは４０〜７０μｍのポアサイズであることが好ましい。
【００２２】
足場部材２３は、任意の多孔質材料であることができるが、典型的には、高分子材料又は金属よりなるメッシュ構造を有する部材であることができる。高分子材料は、ナイロンやポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）であることができ、生体親和性の高分子材料であることもできる。また、場合により、足場部材の上面に、細胞や組織が保持され易くするために、ゲルや生体材料を設けることもできる。足場部材２３は、典型的には、チャンバー部２の高さ方向で中央付近から下部領域付近の間に設けることができる。
【００２３】
好ましい態様において、チャンバー部２は、図１に示すように、上部が開放された容器形態のチャンバー本体３２と、チャンバー本体３２の上部を覆う蓋部３１と、及びチャンバー本体３２に収容されるセルストレーナー３３の３つの部材から構成される。この場合、チャンバー本体３２の下部領域又は底部に排出開口部２２が設けられ、蓋部３１に注入開口部２１が設けられる。また、セルストレーナー３３は、好ましくは、その底部に足場部材を有している。セルストレーナー３３は、チャンバー本体３２と同様に上部が開放された容器形態であって、チャンバー本体３２より小さい寸法を有しており、チャンバー本体３２内に収容可能な部材である。
【００２４】
チャンバー部２を構成するこれらの部材は、内部に培養液を保持し灌流できるものであれば、高分子材料、金属、ガラス等、又はこれらの組み合わせの任意の材料であることができる。典型的には、チャンバー本体３２と蓋部３１は、３Ｄプリンタ等の光造形技術を用いることができる。３Ｄプリンタ等の光造形技術を用いる観点からは、光硬化性樹脂を用いることが好適であり、そのような光硬化性樹脂の非限定的な例として、エポキシアクリレート、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレートなどの紫外線硬化性樹脂を挙げることができる。また、成形等によりチャンバー部２を作製することができ、その場合に用いられる高分子材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ナイロンなどを用いることができる。使用される高分子材料は一種類でも構わないし、複数種を組み合わせて用いることも可能である。
【００２５】
セルストレーナー３３も、同様に高分子材料や金属、又はこれらの組み合わせであることができ、足場部材についても上述のとおりである。なお、かかる足場部材を有するセルストレーナーは、様々な空孔サイズ（メッシュサイズ）を有するものが市販されているため、培養対象とする細胞や組織に併せて適切なものを入手することができる。したがって、本発明の培養システムの好ましい態様では、チャンバー部２を上記３つの部材で構成し、チャンバー本体３２にセルストレーナー３３を収容する構造とすることで、培養対象とする種々の細胞や組織に応じて所望の空孔サイズ（メッシュサイズ）を有するセルストレーナー３３をその都度交換するだけで、チャンバー本体３２と蓋部３１を維持したまま広範な使用目的に対応することができるという利点を提供するものである。
【００２６】
＜溶液回収手段＞
溶液回収手段３は、チャンバー部２の排出開口部２２から排出される培養液を回収するためのものである。かかる回収手段としては、例えば、当該技術分野において公知のフラクションコレクターを用いることができ、１フラクション当たりの容量は適宜選択することができる。後述のように、溶液回収手段３に回収された培養液を観測手段４により測定する場合には、かかる測定に適切なサンプル量となるように１フラクション当たりの容量を設定することができる。
【００２７】
好ましい態様において、排出開口部２２から流出する培養液を溶液回収手段３に導くために、排出開口部２２と溶液回収手段３とを連結する連結管を設けることもできる。かかる連結管は、高分子材料、ゴム、金属等の任意の材料によりなるチューブ状部材であることができ、その長さや径サイズも所望に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
また、場合によっては、溶液回収手段３において回収した培養液を、送液手段１に送る手段をさらに設けて、培養液を循環させる構造を採用してもよい。例えば、一定期間、灌流培養を行った後に、ある時点で観測手段４による測定を行いような場合において、灌流培養の期間中は培養液を循環させる仕様で運転することができる。これにより、使用する培養液の消費量を抑制することができる。
【００２９】
＜観測手段＞
観測手段４は、チャンバー部２から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより細胞又は組織の状態を観測するためのものであり、チャンバー部２の下流側の位置に設けられる。これにより、連続的に灌流培養を行いながら、培養中の細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測を行うという本発明の目的を達成することができる。
【００３０】
一態様において、観測手段４は、溶液回収手段３において回収された培養液を測定するものであることができ、この場合、観測手段４は、溶液回収手段３と隣接し或いは一体化した位置に設置される。上述のように、溶液回収手段３がフラクションコレクターである場合には、観測手段４は、当該フラクションごとに特定成分を検出し、その濃度等を測定するものであることが好ましい。後述のように、特定成分として培養物から分泌されるインスリンを検出対象とする場合には、かかる態様が好適である。
【００３１】
別の態様では、観測手段４が、排出開口部２２と溶液回収手段３とを連結する連結管３４と一体化していることもできる。この場合、連結管３４を通過する培養液をリアルタイムで測定することにより、培養液中の特定成分をリアルタイムでモニタリングすることが可能となる。後述のように、特定成分として培養物によって消費されるグルコースを検出対象とする場合には、かかる態様が好適である。
【００３２】
ここで、観測手段４による観測の対象とする特定成分の例としては、グルコースやインスリンを挙げることができる。すなわち、観測手段４は、チャンバー部２から排出される培養液中に含まれるグルコース濃度又はインスリン濃度を測定するものであることができる。ただし、これら以外の特定成分の検出可能な観測手段４を用いることで、他の成分の含有量等を評価することも可能である。
【００３３】
観測手段４において特定成分を検出手段としては、蛍光応答を用いることができる。例えば、インスリン濃度を検出する場合には、インスリンと結合して蛍光応答を示す抗体物質を利用したＥＬＩＳＡ法を典型的に用いることができる。そのような抗体物質は当該技術分野において公知である。
【００３４】
また、グルコース濃度を検出する場合には、例えば、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素を利用したグルコースセンサーを用いることができる。そのようなグルコースセンサーとしては、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素を含有するハイドロゲルを用い、当該ハイドロゲル中を通過する溶液に含まれるグルコースの存在を蛍光応答として検出し得るデバイスを好適に用いることができる。
【００３５】
本発明の培養システムの好ましい例として、観測手段４としてのグルコースセンサーを、排出開口部２２と溶液回収手段３とを連結する連結管３４と一体化させて設けた態様を図２に示す。かかる態様では、チャンバー部２の底部の排出開口部２２から流出する培養液が、蛍光色素を含有するハイドロゲルを通過する際に、光源（ＬＥＤ）によって励起光を照射し、蛍光発光を検出器（ＰＤ）により検出する。これを無線データ転送システム（ｗｉｒｅｌｅｓｓ  ｍｏｄｕｌｅ）によって外部に送信することができる。また、グルコースセンサーの外周は、黒色材料によって斜光されている。かかる態様によれば、チャンバー２に供給された培養液中のグルコース濃度（初期濃度）と、グルコースセンサーにより測定されるグルコース濃度の差分により、培養物によって消費されるグルコース量を連続的にモニタリングすることができる。なお、蛍光応答の検出は、当該技術分野において公知の装置やシステム等を用いることができる。
【００３６】
２．培養及び評価方法
別の態様において、本発明は、細胞又は組織を連続的に灌流培養しながら、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測可能であることを特徴とする細胞又は組織の培養方法にも関する。
【００３７】
より詳細には、本発明の細胞又は組織の培養方法は、
（ａ）培養液が通過可能な空孔を有する足場部材上に前記細胞又は組織を保持し、培養容器中で前記細胞又は組織を連続的に灌流培養する工程、及び
（ｂ）前記培養容器から排出される培養液中に含まれる特定成分を検出することにより、培養中の前記細胞又は組織の状態をリアルタイムで観測する工程
を含むことを特徴とするものである。本発明の培養方法は、典型的には、これまでに説明した培養システムを用いて行うことが好ましい。
【００３８】
本発明の培養方法では、工程（ａ）の灌流培養における培養液の流れが、培養液が前記足場部材に保持されている前記細胞又は組織を上下方向（縦方向）に透過する流れであることが好ましい。この点は、上記チャンバー部２について説明したとおりである。また、工程（ａ）において前記培養容器から排出される培養液を回収し、再び培養容器中に供給する工程を更に備えることも可能である。これは、チャンバー部２から流出した培養液を回収して、再循環させる態様に相当する。
【００３９】
また、工程（ｂ）は、培養液中の特定成分の存在を蛍光応答として検出することを含むことが好ましい。この点は、観測手段４について説明したとおりである。工程（ｂ）で検出の対象とされる特定成分としては、グルコース又はインスリンであることができる。ただし、上述のように、ただし、これら以外の特定成分の検出可能な観測手段を用いることで、他の成分の含有量等を評価することも可能である。
【００４０】
好ましい態様では、培養される組織が膵島組織であり、特定成分がインスリンである。この場合、工程（ｂ）では、工程（ａ）で培養されている膵島組織が膵島移植に適切なインスリン分泌機能を有していることが評価される。当該態様は、膵島移植に用いられる膵島組織を灌流培養しながら、移植に適切な組織か否かをインスリン分泌機能によって評価する場合に好適である。例えば、培養中の膵島組織が、所望のインスリン分泌機能を示さなかった場合には、膵島移植には十分ではないとして廃棄することができる。また、上述のように、一定の空孔(メッシュ)サイズの足場部材を有するチャンバー部を用いて灌流培養することにより、灌流培養中に望ましい成長を示さなかった組織は、培養液とともに排出され、所望の大きさ以上の膵島組織のみを選別的に培養することができる。
【００４１】
工程（ｂ）においてインスリン分泌機能を評価する場合には、灌流する培養液におけるグルコース濃度を高濃度に変化させ、培養されている膵島組織に負荷を加えることが好ましい。かかる負荷を加えることにより、培養されている膵島組織からのインスリンの分泌を促し、その機能を評価することができる。かかる負荷は、好ましくは、培養液におけるグルコース濃度を２〜１０倍の高濃度に変化させ、これを１０〜６０分間継続することができる。
【００４２】
また、膵島組織の培養においては、灌流培養は１〜４日の期間行われることが好ましい。灌流時の流速は、好ましくは、０．０１〜５ｍｌ／分であり、より好ましくは、２ｍｌ／分程度である。
【００４３】
特定成分がグルコースである場合には、図２に例示したように、グルコースセンサーを用いて、培養物によって消費されるグルコース量を連続的にモニタリングすることができる。これにより、三次元組織培養における培養系の環境を制御するだけでなく、細胞代謝の動態を解明するために有用なツールとなり得る。例えば、肝細胞や内皮細胞、腫瘍細胞等の動態の解析に用いることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
１．膵島組織の灌流培養及びインスリン分泌機能の評価
図１に示す態様の培養システムを用いて、膵島組織の灌流培養及びインスリン分泌機能の評価を行った。実際に用いた培養システムの構成を図３に示す。また、３Ｄプリンタにより作製したチャンバーを図４に示す。セルストレーナー（ポアサイズ：４０μｍ）は市販のものを用いた。
【００４６】
まず、脱イオン水と２ｍＭのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて、培養液の流速を最適化した。２ｍｌ／分の流速の場合にチャンバー内の大部分が置換され、ほぼリアルタイムでチャンバーから流出した培養液をモニターできることから、流速として２ｍｌ／分を用いた。
【００４７】
次に、ヒト膵島を灌流培養し、高純度の膵臓細胞とし、外分泌膵臓細胞を除去した。ヘマトキシリンエオシン（ＨＥ）および免疫蛍光染色により、ヒト膵島のインスリン陽性細胞が、４日間の灌流培養後に高い核発現を維持することを確認した。
【００４８】
ラットの膵島を用いて灌流培養を行い、併せてインスリン分泌機能の評価を行った。グルコース濃度を３．３ｍＭと２２ｍＭとした２種類培養液を用いて段階的に負荷を加え、フラクションコレクターを用いて培養液を収集し、ＥＬＩＳＡによりインスリン分泌量を蛍光応答から測定した。得られた結果を図５に示す。
【００４９】
図５に結果から、ラット膵島は、２種類の濃度のグルコース溶液で動的に灌流培養され、４日間の培養までそれらの動的インスリン分泌を維持し得ることが分かった。一方、培養期間が７日間に至ると膵島のインスリン分泌機能が低下することが分かった。これらの結果は、灌流培養によるグルコース濃度の段階的変化に応答して、膵島のインスリン放出プロフィールが得られることを示している。
【００５０】
培養前及び培養４日後の膵島（β細胞）の状態を比較した顕微鏡イメージを図６に示す。培養４日後には、好ましい大きさを有する膵島が得られることを確認した。
【００５１】
２．ＨｅｐＧ２細胞の灌流培養及び連続的グルコースモニタリング
図２に示す態様の培養システムを用いて、ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞の灌流培養及びグルコースの連続モニタリングを行った。セルストレーナー（ポアサイズ：４０μｍ）は市販のものを用いた。
【００５２】
グルコースセンサーには、グルコース応答性蛍光色素として、以下の構造を有するアリールボロン酸化アントラセン誘導体（製品名「G55」：株式会社ナード社製）を用いた。この色素では、グルコース分子がジボロン酸部位に結合すると、アントラセンから蛍光発光の強度が向上する。かかる蛍光挙動を用いてグルコース濃度を定量することができる。
【化１】
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【００５３】
ＨｅｐＧ２細胞を含んだハイドロゲルマイクロファイバーを灌流培養した。培養液のグルコース濃度を１００ｍｌ／ｄＬから４５０ｍｌ／ｄＬに変化させ、グルコースの濃度をモニターした。その結果を図７に示す。その結果、グルコースの濃度の連続的リアルタイムモニターが可能であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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