(57)【要約】【課題】試料中に含まれるコンドロイチン硫酸を二糖にまで分解する方法を提供すること。【解決手段】試料中に含まれるコンドロイチン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，５０分〜１８０分間，６０℃〜９０℃の温度で加熱して二糖にまで分解するものである，方法。特に，該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，方法。【選択図】図２
2020029456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸を，下記の式（ＩＶ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化４】
2020029456.tif 000038
該コンドロイチン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，５０分〜１８０分間，６０℃〜９０℃の温度で加熱して分解するものである，方法。
【請求項２】
該コンドロイチン硫酸の分解における該加熱が，７０分〜１１０分間，６５℃〜７５℃の温度で行われるものである，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該患者が，体内に存在するコンドロイチン硫酸を減少させる治療を受けたものである，請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ，該コンドロイチン硫酸を下記の式（ＩＶ）で示される二糖に，及び
【化４】
2020029456.tif 000039
該ヘパラン硫酸を下記の式（ＸＩＶ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化１４】
2020029456.tif 000040
該ヘパラン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，８０分〜１８０分間，６５℃〜８５℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該コンドロイチン硫酸を，請求項１又は２に記載の方法で分解するものである，方法。
【請求項１０】
該ヘパラン硫酸の分解における該加熱が，１１０分〜１３０分間，７８℃〜８２℃の温度で行われるものである，請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸を，それぞれ，該コンドロイチン硫酸を下記の式（ＩＶ）で示される二糖に，
【化４】
2020029456.tif 000041
該ヘパラン硫酸を下記の式（ＸＩＶ）で示される二糖に，及び
【化１４】
2020029456.tif 000042
該デルマタン硫酸を下記の式（ＸＩＩ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化１２】
2020029456.tif 000043
該デルマタン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，２０分〜１００分間，６０℃〜８０℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該コンドロイチン硫酸及び該ヘパラン硫酸を，請求項９又は１０に記載の方法で分解するものである，方法。
【請求項１２】
該デルマタン硫酸の分解における該加熱が，３０分〜８０分間，６３℃〜６７℃の温度で行われるものである，請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項９乃至１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項９乃至１２の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者である，請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該患者が，体内に存在するコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものを減少させる治療を受けたものである，請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定する方法であって，
請求項１乃至８の何れかに記載の方法で得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
【請求項２０】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定する方法であって，
請求項９乃至１０の何れかに記載の方法により，コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
【請求項２１】
試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって，
請求項１０乃至１８の何れかに記載の方法により，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を分解して得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸又は／及びヘパラン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸又は／及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
【請求項２５】
該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項２２乃至２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
該試料が，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患であって，該体内に蓄積した物質を減少させる治療を受けた患者から，該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり，該試料中に含まれる該体内に蓄積した物質の量を，請求項１９乃至２１の何れかに記載の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて，該治療の効果を確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，コンドロイチン硫酸を二糖にまで分解する方法に関し，更には，該二糖を液体クロマトグラフィー−質量分析法により分析することにより，コンドロイチン硫酸の量を測定する方法に関する。また，本発明は，コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸，若しくはこれらに加えてデルマタン硫酸を二糖にまで分解する方法に関し，更には，該二糖を液体クロマトグラフィー−質量分析法により分析することにより，コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸，若しくはこれらに加えてデルマタン硫酸の量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は，アミノ酸を含む一群の酸性多糖である。ＧＡＧは，アミノ糖（グルコサミン，ガラクトサミン）とウロン酸（グルクロン酸等）又はガラクトースからなる二糖が，繰返し結合した長鎖構造を有している。ＧＡＧを構成する糖が硫酸化されているものもある。ＧＡＧとしては，ヒアルロン酸，コンドロイチン４−硫酸，コンドロイチン６−硫酸，へパリン，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸，ケラタン硫酸がある。
【０００３】
それぞれの種類のＧＡＧには，これらを特異的に分解する酵素が存在する。例えば，β-グルクロニダーゼは，グリコシド結合を加水分解する酵素で，主にコンドロイチン４−硫酸内の-GlcA-GalNAc-構造を認識して，そのβ-グリコシド結合を加水分解する活性を有する酵素である。この酵素の活性が遺伝的に一部又は全て失われるとスライ症候群（ムコ多糖症VII型）を発症する。スライ症候群の患者では，コンドロイチン４−硫酸等が体内に蓄積し，身体変形，精神遅滞等の諸症状が引き起こされる。
【０００４】
その他，ＧＡＧを分解する酵素の遺伝的欠損を原因とする疾患であって，体内にコンドロイチン４−硫酸等が蓄積するものとして，モルキオ症候群等が知られている。
【０００５】
ＧＡＧを分解する酵素の欠損により引き起こされる疾患は，ムコ多糖症と総称される。ムコ多糖症の患者の組織内には，ＧＡＧが異常に蓄積される。例えば，スライ症候群の患者では，コンドロイチン４−硫酸を含むＧＡＧが体内に蓄積することになる。従って，ムコ多糖症を適応症とする薬剤の効果は，例えば，組織内に存在するＧＡＧの量の変化を測定することによって定量的に求めることができる。また，組織内に存在するＧＡＧの量を測定することによって，ムコ多糖症の患者を同定することができる。
【０００６】
ＧＡＧの分析法としては，試料中に含まれるＧＡＧを還元的アミノ化反応により分解して蛍光ラベル化二糖類を得て，これを液体クロマトグラフィーで分析する方法が知られている（特許文献１）。また，試料中に含まれるＧＡＧをメタノリシス処理により二糖類にまで分解し，これを液体クロマトグラフィーに直結させた質量分析計を用いて分析する方法が知られている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１０８０５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Auray-Blais C. et al., Mol Genet Metab. 102． 49-56 (2011)
【非特許文献２】Auray-Blais C. et al., Clin Chim Acta. 413. 771-8 (2012)
【非特許文献３】Zang H. et al., Clin Chem. 57. 1005-12 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は，コンドロイチン硫酸を，これを構成する二糖類にまで分解する方法，及びコンドロイチン硫酸を分解して得られた二糖類を，液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析及び測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，ＧＡＧを構成するコンドロイチン硫酸（特にコンドロイチン４−硫酸）を，塩酸メタノール存在下に分解することにより，二糖類にまで効率よく分解することができること，及び，分解して得られた二糖類を液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析することにより，コンドロイチン硫酸を感度良く測定することができることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
【００１１】
１．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸を，下記の式（ＩＶ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化４】
2020029456.tif 000003
該コンドロイチン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，５０分〜１８０分間，６０℃〜９０℃の温度で加熱して分解するものである，方法。
２．該コンドロイチン硫酸の分解における該加熱が，７０分〜１１０分間，６５℃〜７５℃の温度で行われるものである，上記１に記載の方法。
３．該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記１又は２に記載の方法。
４．該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記１又は２に記載の方法。
５．該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，上記４に記載の方法。
６．該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，上記４に記載の方法。
７．該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記６に記載の方法。
８．該患者が，体内に存在するコンドロイチン硫酸を減少させる治療を受けたものである，上記６又は７に記載の方法。
９．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ，該コンドロイチン硫酸を下記の式（ＩＶ）で示される二糖に，及び
【化４】
2020029456.tif 000004
該ヘパラン硫酸を下記の式（ＸＩＶ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化１４】
2020029456.tif 000005
該ヘパラン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，８０分〜１８０分間，６５℃〜８５℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該コンドロイチン硫酸を，上記１又は２に記載の方法で分解するものである，方法。
１０．該ヘパラン硫酸の分解における該加熱が，１１０分〜１３０分間，７８℃〜８２℃の温度で行われるものである，上記９に記載の方法。
１１．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸を，それぞれ，該コンドロイチン硫酸を下記の式（ＩＶ）で示される二糖に，
【化４】
2020029456.tif 000006
該ヘパラン硫酸を下記の式（ＸＩＶ）で示される二糖に，及び
【化１４】
2020029456.tif 000007
該デルマタン硫酸を下記の式（ＸＩＩ）で示される二糖にまで分解する方法であって，
【化１２】
2020029456.tif 000008
該デルマタン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，２０分〜１００分間，６０℃〜８０℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該コンドロイチン硫酸及び該ヘパラン硫酸を，上記９又は１０に記載の方法で分解するものである，方法。
１２．該デルマタン硫酸の分解における該加熱が，３０分〜８０分間，６３℃〜６７℃の温度で行われるものである，上記１１に記載の方法。
１３．該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記９乃至１２の何れかに記載の方法。
１４．該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記９乃至１２の何れかに記載の方法。
１５．該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，上記１４に記載の方法。
１６．該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者である，上記１４に記載の方法。
１７．該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記１６に記載の方法。
１８．該患者が，体内に存在するコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸，及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものを減少させる治療を受けたものである，上記１６又は１７に記載の方法。
１９．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定する方法であって，
上記１乃至８の何れかに記載の方法で得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
２０．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定する方法であって，
上記９乃至１０の何れかに記載の方法により，コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
２１．試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって，
上記１０乃至１８の何れかに記載の方法により，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を分解して得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
２２．上記１９に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
２３．上記２０に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸又は／及びヘパラン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸又は／及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
２４．上記２１に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
２５．該疾患が，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記２２乃至２４の何れかに記載の方法。
２６．該試料が，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか１つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患であって，該体内に蓄積した物質を減少させる治療を受けた患者から，該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり，該試料中に含まれる該体内に蓄積した物質の量を，上記１９乃至２１の何れかに記載の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて，該治療の効果を確認する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば，例えば，哺乳動物から採取された試料（血清，脳脊髄液等）中に含まれるコンドロイチン硫酸を単独で，又はヘパラン硫酸とともに，若しくはこれらに加えてデルマタン硫酸とともに，感度良く測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンドロイチン硫酸を250 ng/mL含有する検量線作成用溶液を，メタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラム。縦軸はカウント毎秒（ｃｐｓ），横軸は溶出時間（分）を示す。
【図２】コンドロイチン硫酸の検量線を示す図。縦軸は面積比（CS検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積），横軸はコンドロイチン硫酸の濃度（ng/mL）を示す。
【図３】デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表４に示す条件Ａでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラム。縦軸はカウント毎秒（ｃｐｓ），横軸は溶出時間（分）を示す。
【図４】デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表４に示す条件Ｂでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラム。縦軸はカウント毎秒（ｃｐｓ），横軸は溶出時間（分）を示す。
【図５】マウスの血清中に含まれるデルマタン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のデルマタン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はIDSヘミ接合体マウスの血清中のデルマタン硫酸の濃度をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差（n=3）を示す。(A)は75分間，65℃，(B)は2時間，80℃，(C)は18時間，65℃でメタノリシス処理をしたものを測定した結果を，それぞれ示す。
【図６】マウスの血清中に含まれるヘパラン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のヘパラン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はIDSヘミ接合体マウスの血清中のヘパラン硫酸の濃度の結果をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差（n=3）を示す。(A)は75分間，65℃，(B)は2時間，80℃，(C)は18時間，65℃でメタノリシス処理をしたものを測定した結果を，それぞれ示す。
【図７】rhIDSを投与したマウスの血清中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウス，網掛け棒はrhIDS投与のIDSヘミ接合体マウスの結果をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差，二重♯印はｔ検定でｐ＜０．０１（野生型マウスとrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとの比較），二重星印はｔ検定でｐ＜０．０１（rhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとの比較）を示す。(A)はヘパラン硫酸の濃度の測定結果，(B)はデルマタン硫酸の濃度の測定結果を，それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において「コンドロイチン硫酸」というときは，一般に，Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）がβ1,3結合した二糖の繰返し構造を含むものが硫酸基で修飾されたものをいう。ＧｌｃＡと４位に硫酸基が結合したＧａｌＮＡｃの二糖の繰返し構造を含むものがコンドロイチン４−硫酸である。ＧｌｃＡと６位に硫酸基が結合したＧａｌＮＡｃの二糖の繰返し構造を含むものはコンドロイチン６−硫酸という。その他，コンドロイチン硫酸には，コンドロイチン硫酸Ｄ，コンドロイチン硫酸Ｅ，コンドロイチン硫酸Ｋ等の分子種がある。コンドロイチン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖は，例えば，下記の一般式（I）で示される。
【００１５】
【化１】
2020029456.tif 000009
【００１６】
〔式（I）中，Ｒ１はNH2 ，NHCOCH3 ，NHSO3H，又はその塩；Ｒ２はOH，OSO3H又はその塩，Ｒ３はOH，OSO3H又はその塩；Ｒ4はCOOH又はその塩；Ｒ5はCH2OH，CH2OSO3H，又はその塩；Ｒ6はOH，OSO3H，又はその塩である。但し，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ3,Ｒ４及びＲ５の何れか１つは硫酸基を含む。
特に，式（I）中，Ｒ１はNHCOCH3又はその塩；Ｒ２はOH；Ｒ３はOH；Ｒ４はCOOH又はその塩；Ｒ５はCH2OH；Ｒ6はOSO3H，又はその塩であるものは，コンドロイチン４−硫酸という。
また，式（I）中，Ｒ１はNHCOCH3又はその塩；Ｒ２はOH；Ｒ３はOH；Ｒ４はCOOH又はその塩；Ｒ５はCH2OSO3H，又はその塩；Ｒ6はOHであるものは，コンドロイチン６−硫酸という。
また，式（I）中，Ｒ１はNHCOCH3又はその塩；Ｒ２はOSO3H又はその塩；Ｒ３はOH；Ｒ４はCOOH又はその塩；Ｒ５はCH2OSO3H，又はその塩；Ｒ6はOHであるものは，コンドロイチン硫酸Ｄという。
また，式（I）中，Ｒ１はNHCOCH3又はその塩；Ｒ２はOH；Ｒ３はOH；Ｒ４はCOOH又はその塩；Ｒ5はCH2OSO3H，又はその塩；Ｒ6はOSO3H，又はその塩であるものは，コンドロイチン硫酸Ｅという。
また，式（I）中，Ｒ１はNHCOCH3又はその塩；Ｒ２はOH；Ｒ３はOSO3H又はその塩；Ｒ４はCOOH又はその塩；Ｒ５はCH2OH；Ｒ6はOSO3H，又はその塩であるものは，コンドロイチン硫酸Ｋという。〕
【００１７】
塩酸メタノール中でコンドロイチン硫酸を，カルボキシル基がメチル化されたＤ−グルクロン酸と，１位の水酸基がメチル化されたＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ1,3結合した二糖にまで分解する反応を，メタノリシス（メタノール分解）という。ＧｌｃＡと４位に硫酸基が結合したＧａｌＮＡｃの二糖の繰返し構造のコンドロイチン４−硫酸を例にして，このメタノリシスの反応式を下記の式（II）に示す。
【００１８】
【化２】
2020029456.tif 000010
【００１９】
〔式（II）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００２０】
また，ＧｌｃＡと６位に硫酸基が結合したＧａｌＮＡｃの二糖の繰返し構造のコンドロイチン６−硫酸を例にして，このメタノリシスの反応式を下記の式（III）に示す。
【００２１】
【化３】
2020029456.tif 000011
【００２２】
〔式（III）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００２３】
メタノリシスにより生じる二糖は，式（II）及び式（III）で示されるように，コンドロイチン４−硫酸とコンドロイチン６−硫酸で同一であり，下記の式（IV）で示される。
【００２４】
【化４】
2020029456.tif 000012
【００２５】
コンドロイチン硫酸のメタノール分解反応（メタノリシス）は，コンドロイチン硫酸を含有する試料を，2, 2-ジメトキシプロパンを含有する塩酸メタノール中で加熱して行われる。ここで，塩酸メタノールとは塩化水素を含むメタノールのことをいう。塩酸メタノールに含まれる塩化水素の濃度は，好ましくは０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであり，より好ましくは１〜４ｍｏｌ／Ｌであり，更に好ましくは２．５〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり，例えば３ｍｏｌ／Ｌである。またここで，塩酸メタノールに対する2, 2-ジメトキシプロパンの比率に，特に限定はないが，例えば０．５〜１．５：１０（ｖ／ｖ）であり，特に１：１０（ｖ／ｖ）である。また，このときのメタノール分解反応時の加熱条件は，好ましくは，６０℃〜９０℃の温度で５０分〜１８０分間であり，より好ましくは，６５℃〜７５℃の温度で７０分〜１１０分間であり，更に好ましくは，６７℃〜７３℃の温度で８０分〜１００分間又は８５〜９５分であり，例えば，７０℃の温度で９０分間である。
【００２６】
本発明の方法により，試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定することができる。コンドロイチン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のメタノール分解反応の条件で加熱される。この反応により試料中に含まれるコンドロイチン硫酸が二糖にまで分解される。
【００２７】
メタノール分解反応（メタノリシス）によりコンドロイチン硫酸を分解させて得られた二糖は，液体クロマトグラフィーに付される。そして，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に供される。
【００２８】
このとき用いられる液体クロマトグラフィーは，上記化学式（IV）で示される二糖を，カラムに一旦吸着させた後に溶出させることにより，他の物質から分離できるものである限り特に限定はない。
【００２９】
例えば，イオン性相互作用，疎水性相互作用，親水性相互作用等により二糖を吸着させることのできる担体を充填したカラムを用いる高速液体カラムクロマトグラフィーは，本発明の方法において，好適に用いることができる。
【００３０】
上記化学反応式（II）及び（III）で例示されるコンドロイチン硫酸のメタノール分解反応で生じる式（IV）で示される二糖は，極性が高い。従って，これらを一旦吸着させた後に溶出させることのできる担体としては，親水性相互作用により二糖を保持することができるものが特に好ましい。つまり，親水性相互作用により二糖を保持することのできる担体を用いた高速液体クロマトグラフィーが，メタノール分解反応で得られた二糖を分離する方法として好適である。このような高速液体クロマトグラフィーとして，下記の実施例４において使用されている，親水性相互作用液体クロマトグラフィーが挙げられる。
【００３１】
液体クロマトグラフィーの流出口からの流路は，質量分析装置に連結されており，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に送り込まれる。
【００３２】
このとき用いることのできる質量分析装置に特に限定はない。例えば，質量分析装置は，分析対象の分子をイオン化するためのイオン源として，光イオン化法（ＡＰＰＩ），電子イオン化法（ＥＩ），化学イオン法，電気脱離法，高速原子衝撃法（ＦＡＢ），マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ），及びエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む，何れのイオン化法を採用したものであってもよい。また，質量分析装置は，イオン化された分子を分離するための分析部が，磁場偏向型，四重極型，イオントラップ型，及びタンデム四重極型を含む，何れの型のものであってもよい。
【００３３】
陽イオンモードで作動させるエレクトロスプレーイオン化法（ESI）で運用されるイオン源と，タンデム四重極型の分析部とを有する質量分析装置は，本発明の方法において好適に用いることができる。タンデム四重極型質量分析装置は，マスフィルターとして機能する四重極（Ｑ１），衝突（コリジョン）セルとして機能する四重極（Ｑ２），及びマスフィルターとして機能する四重極（Ｑ３）を直列に配置した質量分析装置である。四重極（Ｑ１）において，イオン化により生じた複数のイオンから，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，目的のプレカーサーイオンが分離される。次いで，コリジョンセル（Ｑ２）でプレカーサーイオンを不活性ガス等（例えばアルゴン）と衝突させてプロダクトイオン（フラグメントイオン）を生成させる。次いで，四重極（Ｑ３）において，得られたプロダクトイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，選択的に検出する。
【００３４】
以下にタンデム四重極型質量分析装置により，上記の式（II）で示されるコンドロイチン４−硫酸又は上記の式（III）で示されるコンドロイチン６−硫酸のメタノール分解により得られる式（IV）で示される二糖から，プレカーサーイオン及びプロダクトイオンを生成させる方法の具体例を例示する。まず，当該二糖をイオン化することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が４２６のプレカーサーイオンが得られる。このプレカーサーイオンは，下記の式（V）で示される。
【００３５】
【化５】
2020029456.tif 000013
【００３６】
上記の式（V）で示されるプレカーサーイオンを分離し，コリジョンセル（Ｑ２）で開裂させることにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンが得られる。プレカーサーイオンを開裂させてプロダクトイオンを得る反応は概略式（VI）で示される。
【００３７】
【化６】
2020029456.tif 000014
【００３８】
上記の液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを用いた方法により，試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定することができる。既知量のコンドロイチン硫酸をメタノール分解し，これをタンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンに対応するクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を算出する。そして，コンドロイチン硫酸の量と検出ピークの面積との相関を示す検量線を作成する。また，コンドロイチン硫酸の含量が未知の試料を，同様にして，メタノール分解し，タンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，プロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。得られた値を検量線に内挿することにより，試料中に含まれるコンドロイチン硫酸を測定することができる。
【００３９】
本発明において，分析対象となる試料に，特に限定はないが，例えば，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料，又はこれらに由来するものが挙げられる。
【００４０】
試料が細胞である場合，その細胞の由来する生物種に特に限定はない。生物種は，原核生物であっても真核生物であってもよく，例えば，細菌，酵母，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００４１】
試料が体液，組織又は器官である場合，これらの由来する生物種に特に限定はない。生物種としては，例えば，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物が挙げられるが，特に哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００４２】
試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた体液，血液，血清，血漿，骨髄液，脳脊髄液，尿，又はこれらに由来するものである。ここで，体液とは，血液，骨髄液，脳脊髄液，唾液，涙，汗，精液，滑液，尿を含む，哺乳動物に由来する液性の成分全般のことをいう。血清又は血漿は，遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００４３】
また，試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた細胞，組織，器官，又はこれらに由来するものである。ここで，細胞の種類に特に限定はないが，細胞としては，例えば，間葉系幹細胞，神経細胞，神経芽細胞，筋芽細胞，グリア細胞，シュワン細胞，心筋細胞，骨格筋細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，骨芽細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，上皮細胞，内皮細胞，角膜上皮細胞，角膜内皮細胞，網膜細胞，肝細胞，メサンギウム細胞，間葉細胞，血球細胞，造血細胞，樹状細胞，間質細胞，が挙げられる。また，組織についても特に限定はなく，組織としては，例えば，上皮組織，結合組織，筋組織，神経組織，線維性結合組織，軟骨組織，骨組織，が挙げられる。また，器官についても特に限定はなく，器官としては，例えば，胃，小腸，大腸，肝臓，膵臓，腎臓，脾臓，心臓，肺，下垂体，精巣，卵巣，小脳，大脳，間脳，中脳，延髄，脳下垂体が挙げられる。
【００４４】
コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患が知られている。かかる疾患として，例えば，マロトー・ラミー症候群，モルキオ症候群Ａ型，モルキオ症候群Ｂ型，スライ症候群が挙げられる。このような疾患においては，体内に異常に蓄積したコンドロイチン硫酸を減少させることにより，症状を軽減させる治療法が試みられている。コンドロイチン硫酸を分解する酵素を体内に投与する酵素補充療法は，そのような治療法の一例である。
【００４５】
コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者は，血液中に含まれるコンドロイチン硫酸の濃度を測定し，得られた測定値に基づいてスクリーニングすることができる。測定値が正常ヒトより異常に高値である場合，被験者は当該疾患の患者であると判断できる。本発明の方法は，かかる判断を行う目的で実施することができる。
【００４６】
コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者を治療した際の，その治療の効果は，治療の前及び治療の後で患者の体内に蓄積したコンドロイチン硫酸を測定し，治療後のこれらの減少量を測定することにより，確認することができる。その減少量が大きい程，治療効果が高いと判断できる。本発明の方法は，かかる治療効果の確認を行う目的で実施することができる。例えば，患者の血液中に含まれるコンドロイチン硫酸の濃度が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上減少した場合に，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，治療効果があったと判断できる。
【００４７】
また，コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者の治療を目的とした薬剤のスクリーニングは，実験動物に被験薬を投与し，被験薬の投与前後で，実験動物の体内に蓄積したコンドロイチン硫酸を測定し，投与後のこれらの減少量を測定することにより行うことができる。これらの減少量が大きい程，被験薬の治療効果は高いと判断できる。例えば，患者の血液中に含まれるコンドロイチン硫酸の濃度が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，被験薬の治療効果は高いと判断できる。
【００４８】
マロトー・ラミー症候群は，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ（ＡＳＢ）活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。ＡＳＢの欠損又は欠失により，患者の体内にはコンドロイチン硫酸が蓄積する。従って，マロトー・ラミー症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。マロトー・ラミー症候群の治療薬としては，ＡＳＢ，ＡＳＢの類似物，ＡＳＢと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ＡＳＢと抗体の結合体としては，例えば，ＡＳＢと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００４９】
また，モルキオ症候群Ａ型はＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ活性を，モルキオ症候群Ｂ型はβ−ガラクトシダーゼを遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。この酵素の欠損又は欠失により，患者の体内にはコンドロイチン硫酸が蓄積する。従って，モルキオ症候群Ａ型及びＢ型の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。モルキオ症候群Ａ型の治療薬としては，Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ，その類似物，この酵素と抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。この酵素と抗体の結合体としては，例えば，この酵素と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。モルキオ症候群Ｂ型の治療薬としては，β−ガラクトシダーゼ，その類似物，この酵素と抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。この酵素と抗体の結合体としては，例えば，この酵素と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００５０】
また，スライ症候群は，β−グルクロニダーゼを遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。β−グルクロニダーゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはコンドロイチン硫酸が蓄積する。従って，スライ症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。スライ症候群の治療薬としては，β−グルクロニダーゼ，その類似物，β−グルクロニダーゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。β−グルクロニダーゼと抗体の結合体としては，例えば，β−グルクロニダーゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００５１】
本発明の方法は，食品，及び飼料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定する方法としても用いることができる。例えば，ヒト又はヒト以外の動物が摂取する食品又は飼料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を予め測定することにより，コンドロイチン硫酸の摂取量をコントロールすることもできる。上記疾患の患者が，コンドロイチン硫酸の摂取量を制限すべき状態であるとき，本発明の方法で予めコンドロイチン硫酸の量を測定した食品を摂取することにより，コンドロイチン硫酸の摂取量を適切にコントロールできる。
【００５２】
本発明において「デルマタン硫酸」というときは，一般に，ウロン酸とアミノ糖がα1,3結合した二糖の繰返し構造を含むものをいう。ウロン酸としてはL-イズロン酸，L-イズロン酸-2-硫酸，アミノ糖としてはN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸が挙げられるが，これらに限定されるものではない。デルマタン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖は，例えば，下記の一般式（VII）で示される。
【００５３】
【化７】
2020029456.tif 000015
【００５４】
〔式（VII）中，Ｒ１はNH2 ，NHCOCH3 ，NHSO3H，又はその塩；Ｒ２はOH，OSO3H又はその塩，Ｒ３はCOOH又はその塩；Ｒ４はCH2OH，CH2OSO3H，又はその塩；Ｒ５はOH，OSO3H，又はその塩である。但し，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ４及びＲ５の何れか１つは硫酸基を含む。〕
【００５５】
下記の式（VIII）に示されるものは，デルマタン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖の，より具体的な一例であり，ウロン酸がL-イズロン酸であり，アミノ糖がN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸であるものである。
【００５６】
【化８】
2020029456.tif 000016
【００５７】
本発明において「ヘパラン硫酸」というときは，一般に，ウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖の繰返し構造を含むものをいう。ウロン酸としてはL-イズロン酸，L-イズロン酸-2-硫酸，アミノ糖としてはD-グルコサミン，N-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ヘパラン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖は，例えば，下記の一般式（IX）で示される。
【００５８】
【化９】
2020029456.tif 000017
【００５９】
〔式（IX）中，Ｒ１はNH2 ，NHCOCH3 ，NHSO3H，又はその塩；Ｒ２はOH，OSO3H又はその塩；Ｒ３はCOOH又はその塩；Ｒ４はCH2OH，CH2OSO3H，又はその塩である。但し，Ｒ１，Ｒ２，及びＲ４の何れか１つは硫酸基を含む。〕
【００６０】
下記の式（X）に示されるものは，ヘパラン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖の，より具体的な一例であり，ウロン酸がL-イズロン酸-2-硫酸であり，アミノ糖がN-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸であるものである。
【００６１】
【化１０】
2020029456.tif 000018
【００６２】
塩酸メタノール中でデルマタン硫酸を，カルボキシル基がメチル化されたウロン酸と，１位の水酸基がメチル化されたアミノ糖がα1,3結合した二糖にまで分解する反応を，メタノリシス（メタノール分解）という。ヘパラン硫酸をカルボキシル基がメチル化されたウロン酸と，１位の水酸基がメチル化されたアミノ糖がα1,4結合した二糖にまで分解する反応についても同様である。
【００６３】
ウロン酸がL-イズロン酸であり，アミノ糖がN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸であるデルマタン硫酸のメタノリシスの反応式を下記の式（XI）に例示する。
【００６４】
【化１１】
2020029456.tif 000019
【００６５】
〔式（XI）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００６６】
上記デルマタン硫酸のメタノリシスにより生じる二糖は，下記の式（XII）で示される。
【００６７】
【化１２】
2020029456.tif 000020
【００６８】
ウロン酸がL-イズロン酸-2-硫酸であり，アミノ糖がN-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸であるヘパラン硫酸のメタノリシスの反応式を下記の式（XIII）に例示する。
【００６９】
【化１３】
2020029456.tif 000021
【００７０】
〔式（XIII）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００７１】
上記ヘパラン硫酸のメタノリシスにより生じる二糖は，下記の式（XIV）で示される。
【００７２】
【化１４】
2020029456.tif 000022
【００７３】
デルマタン硫酸のメタノール分解反応（メタノリシス）は，デルマタン硫酸を含有する試料を，2, 2-ジメトキシプロパンを含有する塩酸メタノール中で加熱して行われる。ここで，塩酸メタノールとは塩化水素を含むメタノールのことをいう。塩酸メタノールに含まれる塩化水素の濃度は，好ましくは０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであり，より好ましくは１〜４ｍｏｌ／Ｌであり，更に好ましくは２．５〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり，例えば３ｍｏｌ／Ｌである。またここで，塩酸メタノールに対する2, 2-ジメトキシプロパンの比率に，特に限定はないが，例えば０．５〜１．５：１０であり，特に１：１０である。また，このときのメタノール分解反応時の加熱条件は，好ましくは，６０℃〜８０℃の温度で２０分〜１００分間であり，より好ましくは，６０℃〜７０℃の温度で２０分〜９０分間であり，更に好ましくは，６３℃〜６７℃の温度で３０分〜８０分間又は６０〜８０分であり，例えば，６５℃の温度で７５分間である。
【００７４】
ヘパラン硫酸のメタノール分解反応（メタノリシス）は，ヘパラン硫酸を含有する試料を，2, 2-ジメトキシプロパンを含有する塩酸メタノール中で加熱して行われる。ここで，塩酸メタノールに含まれる塩化水素の濃度は，好ましくは０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであり，より好ましくは１〜４ｍｏｌ／Ｌであり，更に好ましくは２．５〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり，例えば３ｍｏｌ／Ｌである。またここで，塩酸メタノールに対する2, 2-ジメトキシプロパンの比率に，特に限定はないが，例えば０．５〜１．５：１０であり，特に１：１０である。また，このときのメタノール分解反応時の加熱条件は，好ましくは，６５℃〜８５℃の温度で８０分〜１８０分間であり，より好ましくは，７５℃〜８５℃の温度で９０分〜１８０分間であり，更に好ましくは，７８℃〜８２℃の温度で１１０分〜１３０分間であり，例えば，８０℃の温度で１２０分間である。
【００７５】
本発明の方法により，試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸の量を測定することができる。このとき，測定対象の試料は分割され，その一つはデルマタン硫酸を測定するための試料として用いられ，他の一つはヘパラン硫酸を測定するための試料として用いられる。デルマタン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のデルマタン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。この反応により試料中に含まれるデルマタン硫酸が二糖にまで分解される。また，ヘパラン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のヘパラン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。この反応により試料中に含まれるヘパラン硫酸が二糖にまで分解される。メタノール分解反応の条件が同一の場合には，メタノール分解反応後に測定対象の試料を分割してもよい。またこのとき，デルマタン硫酸又はヘパラン硫酸のいずれか一方についてのみメタノール分解反応を行い，これらの何れか一方のみを測定することもできる。
【００７６】
メタノール分解反応（メタノリシス）によりデルマタン硫酸及び／又はヘパラン硫酸を分解させて得られた二糖は，液体クロマトグラフィーに付される。そして，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に供される。
【００７７】
このとき用いられる液体クロマトグラフィーは，上記化学式（XII）及び（XIV）で示される二糖を，カラムに一旦吸着させた後に溶出させることにより，他の物質から分離できるものである限り特に限定はない。
【００７８】
例えば，イオン性相互作用，疎水性相互作用，親水性相互作用等により二糖を吸着させることのできる担体を充填したカラムを用いる高速液体カラムクロマトグラフィーは，本発明の方法において，好適に用いることができる。
【００７９】
上記化学反応式（XI）及び（XIII）で例示されるメタノール分解反応で生じる二糖は，極性が高い。従って，これらを一旦吸着させた後に溶出させることのできる担体としては，親水性相互作用により二糖を保持することができるものが特に好ましい。つまり，親水性相互作用により二糖を保持することのできる担体を用いた高速液体クロマトグラフィーが，メタノール分解反応で得られた二糖を分離する方法として好適である。このような高速液体クロマトグラフィーとして，下記の実施例４において使用されている，親水性相互作用液体クロマトグラフィーが挙げられる。
【００８０】
液体クロマトグラフィーの流出口からの流路は，質量分析装置に連結されており，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に送り込まれる。
【００８１】
このとき用いることのできる質量分析装置に特に限定はない。例えば，質量分析装置は，分析対象の分子をイオン化するためのイオン源として，光イオン化法（ＡＰＰＩ），電子イオン化法（ＥＩ），化学イオン法，電気脱離法，高速原子衝撃法（ＦＡＢ），マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ），及びエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む，何れのイオン化法を採用したものであってもよい。また，質量分析装置は，イオン化された分子を分離するための分析部が，磁場偏向型，四重極型，イオントラップ型，及びタンデム四重極型を含む，何れの型のものであってもよい。
【００８２】
陽イオンモードで作動させるエレクトロスプレーイオン化法（ESI）で運用されるイオン源と，タンデム四重極型の分析部とを有する質量分析装置は，本発明の方法において好適に用いることができる。タンデム四重極型質量分析装置は，マスフィルターとして機能する四重極（Ｑ１），衝突（コリジョン）セルとして機能する四重極（Ｑ２），及びマスフィルターとして機能する四重極（Ｑ３）を直列に配置した質量分析装置である。四重極（Ｑ１）において，イオン化により生じた複数のイオンから，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，目的のプレカーサーイオンが分離される。次いで，コリジョンセル（Ｑ２）でプレカーサーイオンを不活性ガス等（例えばアルゴン）と衝突させてプロダクトイオン（フラグメントイオン）を生成させる。次いで，四重極（Ｑ３）において，得られたプロダクトイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，選択的に検出する。
【００８３】
以下にタンデム四重極型質量分析装置により，上記の式（XI）で示されるデルマタン硫酸のメタノール分解により得られる二糖から，プレカーサーイオン及びプロダクトイオンを生成させる方法の具体例を例示する。まず，当該二糖をイオン化することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が４２６のプレカーサーイオンが得られる。このプレカーサーイオンは，下記の（XV）で示される。
【００８４】
【化１５】
2020029456.tif 000023
【００８５】
上記の式（XV）で示されるプレカーサーイオンを分離し，コリジョンセル（Ｑ２）で開裂させることにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンが得られる。プレカーサーイオンを開裂させてプロダクトイオンを得る反応は概略式（XVI）で示される。
【００８６】
【化１６】
2020029456.tif 000024
【００８７】
以下にタンデム四重極型質量分析装置により，上記の式（XIII）で示されるヘパラン硫酸のメタノール分解により得られる二糖から，プレカーサーイオン及びプロダクトイオンを生成させる方法の具体例を例示する。まず，当該二糖をイオン化することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が３８４のプレカーサーイオンが得られる。このプレカーサーイオンは，下記の式（XVII）で示される。
【００８８】
【化１７】
2020029456.tif 000025
【００８９】
上記の式（XVII）で示されるプレカーサーイオンを分離し，コリジョンセル（Ｑ２）で開裂させることにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が１６２のプロダクトイオンが得られる。プレカーサーイオンを開裂させてプロダクトイオンを得る反応は概略式（XVIII）で示される。
【００９０】
【化１８】
2020029456.tif 000026
【００９１】
上記の液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを用いた方法により，試料中に含まれるデルマタン硫酸の量を測定することができる。既知量のデルマタン硫酸をメタノール分解し，これをタンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンに対応するクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を算出する。そして，デルマタン硫酸の量と検出ピークの面積との相関を示す検量線を作成する。また，デルマタン硫酸の含量が未知の試料を，同様にして，メタノール分解し，タンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，プロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。得られた値を検量線に内挿することにより，試料中に含まれるデルマタン硫酸を測定することができる。
【００９２】
同様にして試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定することもできる。既知量のヘパラン硫酸をメタノール分解し，これをタンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が１６２のプロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。そして，ヘパラン硫酸の量と検出ピークの面積との相関を示す検量線を作成する。また，ヘパラン硫酸の含量が未知の試料を，同様にして，メタノール分解し，タンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，プロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。得られた値を検量線に内挿することにより，試料中に含まれるヘパラン硫酸を測定することができる。
【００９３】
上記のコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法を組み合わせることにより，試料中に含まれるこれらの量を測定することもできる。この場合，測定対象の試料は分割され，その一つはコンドロイチン硫酸を測定するための試料として用い，他の一つはヘパラン硫酸を測定するための試料として用いる。コンドロイチン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のコンドロイチン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。また，ヘパラン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のヘパラン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。メタノール分解反応の条件が同一の場合は，メタノール分解反応後に測定対象の試料を分割してもよい。コンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸のメタノール分解物を，それぞれ液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得て，この溶出液を，順次質量分析装置で分析することにより，試料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定することができる。
【００９４】
上記のコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法を組み合わせることにより，試料中に含まれるこれらの量を測定することもできる。この場合，測定対象の試料は分割され，その一つはコンドロイチン硫酸を測定するための試料として用い，その一つはデルマタン硫酸を測定するための試料として用い，他の一つはヘパラン硫酸を測定するための試料として用いる。コンドロイチン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のコンドロイチン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。デルマタン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のデルマタン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。また，ヘパラン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のヘパラン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。メタノール分解反応の条件が同一の場合は，メタノール分解反応後に測定対象の試料を分割してもよい。コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，及びヘパラン硫酸のメタノール分解物を，それぞれ液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得て，この溶出液を，順次質量分析装置で分析することにより，試料中に含まれるコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，及びヘパラン硫酸の量を測定することができる。
【００９５】
本発明において，分析対象となる試料に，特に限定はないが，例えば，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料，又はこれらに由来するものが挙げられる。
【００９６】
試料が細胞である場合，その細胞の由来する生物種に特に限定はない。生物種は，原核生物であっても真核生物であってもよく，例えば，細菌，酵母，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００９７】
試料が体液，組織又は器官である場合，これらの由来する生物種に特に限定はない。生物種としては，例えば，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物が挙げられるが，特に哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００９８】
試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた体液，血液，血清，血漿，骨髄液，脳脊髄液，尿，又はこれらに由来するものである。ここで，体液とは，血液，骨髄液，脳脊髄液，唾液，涙，汗，精液，滑液，尿を含む，哺乳動物に由来する液性の成分全般のことをいう。血清又は血漿は，遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００９９】
また，試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた細胞，組織，器官，又はこれらに由来するものである。ここで，細胞の種類に特に限定はないが，細胞としては，例えば，間葉系幹細胞，神経細胞，神経芽細胞，筋芽細胞，グリア細胞，シュワン細胞，心筋細胞，骨格筋細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，骨芽細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，上皮細胞，内皮細胞，角膜上皮細胞，角膜内皮細胞，網膜細胞，肝細胞，メサンギウム細胞，間葉細胞，血球細胞，造血細胞，樹状細胞，間質細胞，が挙げられる。また，組織についても特に限定はなく，組織としては，例えば，上皮組織，結合組織，筋組織，神経組織，線維性結合組織，軟骨組織，脳下垂体骨組織，が挙げられる。また，器官についても特に限定はなく，器官としては，例えば，胃，小腸，大腸，肝臓，膵臓，腎臓，脾臓，心臓，肺，下垂体，精巣，卵巣，小脳，大脳，間脳，中脳，延髄，が挙げられる。
【０１００】
コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患が知られている。かかる疾患として，例えば，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群（Ａ〜Ｄ型），モルキオ症候群（Ａ及びＢ型），マロトー・ラミー症候群，スライ症候群等が挙げられる。このような疾患においては，体内に異常に蓄積したこれら物質の何れか一つ又は複数のものを減少させることにより，症状を軽減させる治療法が試みられている。コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものを分解する酵素を体内に投与する酵素補充療法は，そのような治療法の一例である。
【０１０１】
コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者は，体内に蓄積したこれらの物質の何れか一つ又は複数のものの量を測定し，得られた測定値に基づいてスクリーニングすることができる。測定値が正常ヒトより異常に高値である場合，被験者は当該疾患の患者であると判断できる。本発明の方法は，かかる判断を行う目的で実施することができる。
【０１０２】
コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者を治療した際の，その治療の効果は，治療前及び治療の後で患者の体内に蓄積したこれら物質の量を測定し，治療後のこれらの減少量を測定することにより，確認することができる。これらの減少量が大きい程，治療効果が高いと判断できる。本発明の方法は，かかる治療効果の確認を行う目的で実施することができる。例えば，患者の体内に蓄積したコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものの量が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上減少した場合に，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，治療効果があったと判断できる。
【０１０３】
また，コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の何れか一つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者の治療を目的とした薬剤のスクリーニングは，実験動物に被験薬を投与し，被験薬の投与前後で，実験動物の体内に蓄積したこれら物質の量を測定し，投与後のこれらの減少量を測定することにより行うことができる。これらの減少量が大きい程，被験薬の治療効果は高いと判断できる。例えば，実験動物の体内に蓄積したこれら物質の量が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，被験薬の治療効果は高いと判断できる。
【０１０４】
ハンター症候群は，イズロン酸−２−スルファターゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。イズロン酸−２−スルファターゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，ハンター症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。ハンター症候群の治療薬としては，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ），ｈＩＤＳの類似物，ｈＩＤＳと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ｈＩＤＳと抗体の結合体としては，例えば，ｈＩＤＳと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【０１０５】
また，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群は，Ｌ−イズロニダーゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。Ｌ−イズロニダーゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，これらの疾患に関し，患者のスクリーニング，治療法の効果の確認，及び治療薬の薬効の評価，被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。これらの疾患の治療薬としては，Ｌ−イズロニダーゼ，Ｌ−イズロニダーゼの類似物，Ｌ−イズロニダーゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。Ｌ−イズロニダーゼと抗体の結合体としては，例えば，Ｌ−イズロニダーゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【０１０６】
また，マロトー・ラミー症候群は，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。ＡＳＢの欠損又は欠失により，患者の体内には特にデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸が蓄積する。従って，マロトー・ラミー症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。マロトー・ラミー症候群の治療薬としては，ＡＳＢ，ＡＳＢの類似物，ＡＳＢと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ＡＳＢと抗体の結合体としては，例えば，ＡＳＢと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【０１０７】
また，サンフィリッポ症候群は，Ａ型，Ｂ型，Ｃ型，及びＤ型に分類され，それぞれ，ヘパラン硫酸Ｎ−スルファターゼ活性，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性，アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランフェラーゼ活性，及びＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。これらの酵素の欠損又は欠失により，患者の体内には特にヘパラン硫酸が蓄積する。従って，サンフィリッポ症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。サンフィリッポ症候群の治療薬としては，これらの酵素，これらの酵素の類似物，これらの酵素の何れかと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。これらの酵素と抗体の結合体としては，例えば，これらの酵素と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【０１０８】
また，スライ症候群は，β−グルクロニダーゼを遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。β−グルクロニダーゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，スライ症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。スライ症候群の治療薬としては，β−グルクロニダーゼ，その類似物，β−グルクロニダーゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。β−グルクロニダーゼと抗体の結合体としては，例えば，β−グルクロニダーゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【０１０９】
本発明の方法は，食品，及び飼料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸，若しくはこれらに加えてデルマタン硫酸の量を測定する方法としても用いることができる。例えば，ヒト又はヒト以外の動物が摂取する食品又は飼料中に含まれるコンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸等の量を予め測定することにより，これらの摂取量をコントロールすることもできる。例えば，上記疾患の患者が，コンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸等の摂取量を制限すべき状態であるとき，本発明の方法で予めコンドロイチン硫酸等の量を測定した食品を摂取することにより，コンドロイチン硫酸等の摂取量を適切にコントロールできる。
【実施例】
【０１１０】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【０１１１】
〔実施例１：各種溶液の調製〕
以下の実施例１〜６はコンドロイチン硫酸の分析法に関するものである。試験に用いる（ａ）〜（ｋ）の溶液を以下の手順で調製した。
（ａ）10%炭酸アンモニウム溶液：
10 gの炭酸アンモニウムを100 mLの注射用水で溶解し，10%炭酸アンモニウム溶液とした。
（ｂ）重水素ラベル化溶媒：
氷浴下で，1.5 mLのメタノール-d4（Sigma-Aldrich社）に240 μLのアセチルクロリドを滴下し，これを重水素ラベル化溶媒とした。
（ｃ）MeCN/water：
2 mLの注射用水と18 mLのアセトニトリルを混合し，これをMeCN/waterとした。
（ｄ）移動相A：
475 mLの注射用水に，25 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液を添加して混合したものを，移動相Aとした。
（ｅ）移動相B：
930 mLのアセトニトリルに，70 mLの移動相Aを混合したものを，移動相Bとした。
（ｆ）コンドロイチン硫酸標準原液（CS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate A（Sigma-Aldrich社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をCS標準原液とした。
（ｇ）検量線作成用溶液：
990 μLの注射用水を計り取り，これにCS標準原液を10 μL添加し，コンドロイチン硫酸を50 μg/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で希釈し，コンドロイチン硫酸を5000 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で2段階希釈し，コンドロイチン硫酸を，25〜5000 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
（ｈ）デルマタン硫酸標準原液（DS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B（Sigma-Aldrich社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
（ｉ）デルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）：
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（deuteriomethanolysis）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し，冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）とした。
（ｊ）内標準溶液：
4 mLのメタノールに，4 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した。この溶液を内標準溶液とした。本溶液は用時調製とした。
（ｋ）細胞抽出溶液
9 μLのポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテルに2961 μLの生理食塩液及び30 μLのプロテアーゼ阻害剤を添加し，細胞抽出溶液とした。
【０１１２】
〔実施例２：細胞サンプル溶液の調製〕
培養細胞をPBSで洗浄した後，細胞抽出溶液を添加して細胞を1.5 mLチューブに回収した。氷上で90分間静置した後，遠心（12000 rpm，4℃，10分間）して上清を回収した。この細胞抽出液に注射用水を添加してタンパク質濃度を100 μg/mLに調整し，これを細胞サンプル溶液とした。
【０１１３】
〔実施例３：メタノリシス反応〕
上記実施例１で調製した検量線作成用溶液を，それぞれ20 μL計り取り，個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また，ブランクとして，注射用水をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した（N=1）。乾固物に，20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3 Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，恒温水槽を用いて70℃，90分間でメタノリシス反応を行った。反応後，氷冷した後に200 μLの10%炭酸アンモニウム溶液を添加し，反応を停止させた。50 μLの内標準溶液を添加した後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に250 μLの注射用水を添加して溶解後，固相カートリッジ（OASIS HLB (1 cc, 30 mg)）を用いて精製した。溶媒を窒素気流下で留去した。200 μLのMeCN/waterを添加して溶解し，上清をバイアルに採取した。
【０１１４】
また，実施例２で調製した細胞サンプル溶液を20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取し，試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に，20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，恒温水槽を用いて70℃，90分間でメタノリシス反応を行った。反応後，氷冷した後に200 μLの10%炭酸アンモニウム溶液を添加し，反応を停止させた。50 μLの内標準溶液を添加した後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に250 μLの注射用水を添加して溶解後，固相カートリッジ（OASIS HLB (1 cc, 30 mg)）を用いて精製した。溶媒を窒素気流下で留去した。200 μLのMeCN/waterを添加して溶解し，上清をバイアルに採取した。
【０１１５】
〔実施例４：LC/MS/MS分析〕
LC/MS/MS分析は，親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置（MS/MS装置）として，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）を用い，これにHPLC装置として，Nexera X2（島津製作所）をセットした。また，LCカラムとして，Acquity UPLCTM BEH Amide 1.7 μm (2.1 Ｘ 150 mm，Waters社)を用いた。移動相として，実施例１で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また，カラム温度は60℃に設定した。
【０１１６】
6% (v/v)の移動相Aと94% (v/v)の移動相Bからなる混合液でカラムを平衡化した後，5 μLの試料を注入し，表１に示す移動相のグラジエント条件で，クロマトグラフィーを実施した。なお，移動相の流量は0.4 mL/分とした。
【０１１７】
【表１】
2020029456.tif 000027
【０１１８】
MS/MS装置のイオン源パラメーターを，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）の使用説明書に従って，表２に示すように設定した。
【０１１９】
【表２】
2020029456.tif 000028
【０１２０】
検量線作成用溶液の測定により，各検量線作成用溶液に含まれていたコンドロイチン硫酸に由来するプロダクトイオンのクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を求めた。また，DS内部標準溶液に由来するプロダクトイオンの検出ピークの面積を求めた。検量線作成用溶液はN=1で測定を行った。
【０１２１】
ここで検出されるプロダクトイオンは，上記反応式（VI）で得られるイオンである。なお，DS内部標準溶液に含まれるデルマタン硫酸は重水素ラベルされている。従って，これらに由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，432と，非ラベルのものと比較して大きな値をとる。非ラベルのコンドロイチン硫酸に由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，426である。従って，これらプレカーサーイオンは，四重極（Ｑ１）において，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，分離されるので，個別に検出可能となる。表３にプレカーサーイオンとプロダクトイオンの（ｍ／ｚ）をまとめて示す。
【０１２２】
コンドロイチン硫酸を250 ng/mLの濃度で含有する検量線作成用溶液をメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラムを図１に示す。図１は，液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるイオン量を，コンドロイチン硫酸のプレカーサーイオンに対応するｍ／ｚ＝426で順次検出したものである。図中，黒塗りしたピークがコンドロイチン硫酸のプレカーサーイオンに対応する。
【０１２３】
【表３】
2020029456.tif 000029
【０１２４】
各検量線作成用溶液に含まれていたコンドロイチン硫酸に由来する検出ピークの面積（CS検出ピーク面積）に対する，DS内部標準溶液に由来する検出ピーク（DS-IS検出ピーク面積）の面積比（CS検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積）を求めた。この値を縦軸にとり，各検量線作成用溶液のコンドロイチン硫酸の濃度を横軸にとり，二次計画法を用いて回帰式を算出し検量線を作成した。
【０１２５】
〔実施例５：検量線の検討〕
検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線は， 25.0〜5000 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した（図２）。相関係数(r)は0.9998であった。
【０１２６】
〔実施例６：培養細胞抽出液中に含まれるコンドロイチン硫酸の測定結果〕
実施例２で調製した培養細胞の抽出液である細胞サンプル溶液を，実施例３に記載の方法でメタノリシス反応させた後，実施例４に記載の方法で分析し，コンドロイチン硫酸に由来する検出ピークの面積（細胞サンプル溶液検出ピーク面積）を求めることができる。更に，この面積とDS-IS検出ピーク面積の比（細胞サンプル溶液検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積）を求め，これを実施例４で得られた検量線に内挿することにより，細胞サンプル溶液中に含まれるコンドロイチン硫酸を定量することができる。
【０１２７】
以上の結果から，培養細胞の抽出液中に含まれるコンドロイチン硫酸のメタノリシスの条件としては加熱温度：７０℃，加熱時間：９０分間が好適であるといえる。
【０１２８】
〔実施例７：各種溶液の調製〕
以下の実施例７〜１４はヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の分析法に関するものである。試験に用いる（ｌ）〜（ｗ）の溶液を以下の手順で調製した。
（ｌ）MeCN/water：
0.5 mLの注射用水と4.5 mLのアセトニトリルを混合し，これをMeCN/waterとした。本溶液は用時調製とした。
（ｍ）重水素ラベル化溶媒：
氷浴下で，1.5 mLのメタノール-d4（Sigma-Aldrich社）に240 μLのアセチルクロリドを滴下し，これを重水素ラベル化溶媒とした。本溶液は用時調製とした。
（ｎ）PBS/クエン酸溶液：
クエン酸を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸溶液を作製した。更に，クエン酸三ナトリウム二水和物を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸ナトリウム溶液を作製した。クエン酸溶液にクエン酸ナトリウム溶液を滴下してpH 3.0に調整した。この溶液を10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）とした。また，18 mLの10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）に2 mLのPBSを加えた溶液をPBS/クエン酸溶液とした。
（ｏ）移動相A：
247.5 mLの純水に，2.5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と400 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)を添加して混合したものを，移動相Aとした。本溶液は用時調製とした。
（ｐ）移動相B：
45 mLの純水に，5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と，450 mLのアセトニトリルと，800 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)とを混合したものを，移動相Bとした。本溶液は用時調製とした。
（ｑ）ヘパラン硫酸標準原液（HS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにHeparan sulfate（Iduron社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をHS標準原液とした。
（ｒ）デルマタン硫酸標準原液（DS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa（Sigma-Aldrich社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
（ｓ）デルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）：
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（deuteriomethanolysis）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し，冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）とした。
（ｔ）ヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）：
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのHS標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（deuteriomethanolysis）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し，冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）とした。
（ｕ）サンプル溶解用溶液：
5 mLのMeCN/waterに，1 μLのHS内部標準溶液及び1 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した後，超音波処理を30分間行った。この溶液をサンプル溶解用溶液とした。本溶液は用時調製とした。
（ｖ）検量線作成用溶液：
480 μLのPBS/クエン酸溶液を計り取り，これにHS標準原液とDS標準原液をそれぞれ10 μLずつ添加し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ100 μg/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で希釈し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ2500 ng/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で2段階希釈し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ25〜2500 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
（ｗ）組織抽出溶液
1 mLのポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテルに生理食塩液を添加し，全量を500 mLとした。この溶液を組織抽出溶液とした。
【０１２９】
〔実施例８：血液サンプルの調製〕
野生型マウス（C57BL/6N）及びIDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス（IDSヘミ接合体マウス，C57BL/6N）から血液を採取した。採取した血液をチューブに移して室温で30分間以上静置した後，遠心（2000 g，20分間）して血清を回収した。8 μLの血清に8 μLのPBSと144 μLの10mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）を加えて撹拌した。これを20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これを血液サンプル溶液とした。
【０１３０】
〔実施例９：メタノリシス反応〕
上記実施例７で調製した検量線作成用溶液を，それぞれ20 μL計り取り，個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また，ブランクとして，PBS/クエン酸溶液をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した（N=1）。乾固物に，20 μL の2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表４に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【０１３１】
また，デルマタン硫酸標準原液とヘパラン硫酸標準原液とをPBS/クエン酸溶液で希釈し，デルマタン硫酸標準原液及びヘパラン硫酸標準原液とをいずれも25.0 ng/mL，50.0 ng/mL，500 ng/mL，及び2000 ng/mLの濃度で含有する4種類の品質管理試料（QC試料）を調製し，それぞれ，QC-LL，QC-L，QC-M，及びQC-Hとした。これらをそれぞれ20 μL計り取り，個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した（N=1）。乾固物に，20 μL の2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表４に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【０１３２】
また，実施例８で調製した血液サンプル溶液を20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した（N=1）。乾固物に，20 μL の2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表４に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【０１３３】
【表４】
2020029456.tif 000030
【０１３４】
〔実施例１０：LC/MS/MS分析〕
LC/MS/MS分析は，親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置（MS/MS装置）として，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）を用い，これにHPLC装置として，Nexera X2（島津製作所）をセットした。また，LCカラムとして，Acquity UPLCTM BEH Amid 1.7 μm (2.1 Ｘ 50 mm，Waters社)を用いた。移動相として，実施例７で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また，カラム温度は50℃に設定した。
【０１３５】
6% (v/v)の移動相Aと94% (v/v)の移動相Bからなる混合液でカラムを平衡化した後，10μLの試料を注入し，表５に示す移動相のグラジエント条件で，クロマトグラフィーを実施した。なお，移動相の流量は0.4 mL/分とした。
【０１３６】
【表５】
2020029456.tif 000031
【０１３７】
MS/MS装置のイオン源パラメーターを，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）の使用説明書に従って，表６に示すように設定した。
【０１３８】
【表６】
2020029456.tif 000032
【０１３９】
検量線作成用溶液及びQC試料の測定により，各検量線作成用溶液に含まれていたデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸に由来するプロダクトイオンのクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を求めた。また，DS内部標準溶液，及びHS内部標準溶液に由来するプロダクトイオンの検出ピークの面積を求めた。検量線作成用溶液はN=1，QC試料（QC-LL，QC-L，QC-M，及びQC-H）はN=3で測定を行った。
【０１４０】
ここで検出されるプロダクトイオンは，デルマタン硫酸については上記反応式（XVI）で得られるイオン，ヘパラン硫酸については上記反応式（XVIII）で得られるイオンである。なお，DS内部標準溶液及びHS内部標準溶液に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸は重水素ラベルされている。従って，これらに由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，それぞれ432及び390と，非ラベルのものと比較して大きな値をとる。非ラベルのデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸に由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，それぞれ426及び384である。従って，これらプレカーサーイオンは，四重極（Ｑ１）において，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，分離されるので，個別に検出可能となる。表７にプレカーサーイオンとプロダクトイオンの（ｍ／ｚ）をまとめて示す。
【０１４１】
デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表４に示す条件Ａでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラムを図３に示す。図３は，液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるイオン量を，デルマタン硫酸のプレカーサーイオンに対応するｍ／ｚ＝426で順次検出したものである。図中，黒塗りしたピークがデルマタン硫酸のプレカーサーイオンに対応する。
【０１４２】
また，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表４に示す条件Ｂでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラムを図４に示す。図４は，液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるイオン量を，ヘパラン硫酸のプレカーサーイオンに対応するｍ／ｚ＝384で順次検出したものである。図中，黒塗りしたピークがヘパラン硫酸のプレカーサーイオンに対応する。
【０１４３】
【表７】
2020029456.tif 000033
【０１４４】
各検量線作成用溶液に含まれていたデルマタン硫酸に由来する検出ピークの面積（DS検出ピーク面積）に対する，DS内部標準溶液に由来する検出ピーク（DS-IS検出ピーク面積）の面積比（DS検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積）を求めた。この値を縦軸にとり，各検量線作成用溶液のデルマタン硫酸の濃度を横軸にとり，二次計画法を用いて回帰式を算出し検量線を作成した。
【０１４５】
また，各検量線作成用溶液に含まれていたヘパラン硫酸に由来する検出ピークの面積（HS検出ピーク面積）に対する，HS内部標準溶液に由来する検出ピーク（HS-IS検出ピーク面積）の面積比（HS検出ピーク面積／HS-IS検出ピーク面積）を求めた。この値を縦軸にとり，各検量線作成用溶液のヘパラン硫酸の濃度を横軸にとり，二次計画法を用いて回帰式を算出し検量線を作成した。
【０１４６】
また，QC試料の測定値に基づき下記の計算式により精度（％）と真度（％）を求めた。
精度（％）＝測定値の標準偏差／測定値の平均値×１００
真度（％）＝測定値の平均値／理論濃度×１００
なお，真度（％）の計算式中の理論濃度とは，QC試料に添加されたデルマタン硫酸又はヘパラン硫酸の濃度のことをいう。
【０１４７】
〔実施例１１：条件Ａで得られた検量線の検討〕
上記表４に示す条件Ａでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線（条件Ａの検量線）は，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても，25.0〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した（データは示さない）。相関係数(r)は，デルマタン硫酸については0.9995，ヘパラン硫酸については0.9938であった。
【０１４８】
次いで，精度及び真度についてみる。表８及び表９に各QC試料における精度及び真度を示す。これらの値は，条件Ａが，25.0〜2500 ng/mLの濃度範囲のデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の濃度を測定するためのメタノリシスの条件として，好適であることを示す。但し，25.0 ng/mLの濃度でのヘパラン硫酸の測定値は，真度及び精度ともに大きく低下した（表８）。一方，デルマタン硫酸では，25.0 ng/mLの濃度の測定値の真度及び精度は大きくは低下しなかった（表９）。
【０１４９】
【表８】
2020029456.tif 000034
【０１５０】
【表９】
2020029456.tif 000035
【０１５１】
〔実施例１２：条件Ａ，Ｂ及びＣで得られた検量線の比較〕
条件Ａ，Ｂ及びＣでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線はいずれも，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても，25〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した（データは示さない）。それぞれの条件における検量線の相関係数(r)を表１０に示す。
【０１５２】
【表１０】
2020029456.tif 000036
【０１５３】
しかし，実施例１１で，条件Ａでは，25.0 ng/mLの濃度でのヘパラン硫酸の測定値の真度及び精度が，ともに低下した。従って，25.0 ng/mLの濃度のヘパラン硫酸をより正確に測定するための条件を検討することとした。そこで，条件Ａ，Ｂ及びＣにおける，QC試料（QC-LL）のヘパラン硫酸の測定値の真度及び精度を比較した。なお，QC試料（QC-LL）は，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とをそれぞれ25.0 ng/mLの濃度で含むものである。その結果を表１１に示す。ヘパラン硫酸では，条件Ｂで測定した場合に，真度及び精度がともに高い測定値が得られた。ヘパラン硫酸では，条件Ｃで測定した場合でも，真度及び精度がともに高い測定値が得られたが，条件Ｃは熱処理に長時間を要するという欠点がある。従って，ヘパラン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ｂが好ましいと結論付けられた。なお，実施例１１で示されたのと同様に，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａで真度及び精度がともに低下した。
【０１５４】
デルマタン硫酸についても，条件Ａ，Ｂ及びＣにおける測定値の真度及び精度を比較した。その結果を表１１に示す。デルマタン硫酸では，条件Ａと比較して，条件Ｂ及びＣで真度及び精度がともに低下した。
【０１５５】
これらの結果は，デルマタン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ａが好ましく，ヘパラン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ｂが好ましいことを示すものである。
【０１５６】
【表１１】
2020029456.tif 000037
【０１５７】
〔実施例１３：条件Ａ，Ｂ及びＣでの血清中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定結果の比較〕
生体由来の試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法として，条件Ａ，Ｂ及びＣの何れのメタノリシス反応が好適であるかを，実施例９に記載した野生型マウス及びIDSヘミ接合体マウスの血液から調製した血液サンプル溶液のメタノリシス反応物を用いて調べた。各メタノリシス反応物を実施例１０に記載の方法で分析し，デルマタン硫酸に由来する検出ピークの面積（血液サンプル溶液DS検出ピーク面積）を求めた。更に，この面積とDS-IS検出ピーク面積の比（血液サンプル溶液DS検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積）を求め，これを実施例１０で得られた対応するメタノリシス反応条件の検量線に内挿することにより，血液サンプル溶液中に含まれるデルマタン硫酸を定量した。また，各メタノリシス反応物を実施例１０に記載の方法で分析し，ヘパラン硫酸に由来する検出ピークの面積（血液サンプル溶液HS検出ピーク面積）を求め，更に，この面積とHS-IS検出ピーク面積の比（血液サンプル溶液HS検出ピーク面積／HS-IS検出ピーク面積）を求めた。これを実施例１０で得られた対応するメタノリシス反応条件の検量線に内挿することにより，血液サンプル溶液中に含まれるヘパラン硫酸を定量した。IDSは，デルマタン硫酸，ヘパラン硫酸を含むＧＡＧを分解する活性を有する酵素である。従って，IDSヘミ接合体マウスの血中のＧＡＧの濃度は，野生型マウスと比較して高いことが知られている。
【０１５８】
野生型マウス及び，IDSヘミ接合体マウスから採取した血清中の，条件Ａ，Ｂ及びＣでのデルマタン硫酸の測定結果を図５に，ヘパラン硫酸の測定結果を図６に示す。
【０１５９】
デルマタン硫酸の測定値は，条件Ａでは，野生型マウスと比較してIDSヘミ接合体マウスで高値を示した（図５）。この結果は，IDSヘミ接合体マウスの遺伝子型を反映している。一方，条件Ｂ及びＣのデルマタン硫酸の測定値は，野生型マウスとIDSヘミ接合体マウスでほぼ同等であり，且つ，条件Ａの測定結果と比較して極めて高い値を示した（図５）。これらの結果は，条件Ｂ及びＣでは，血清中に含まれるデルマタン硫酸以外の成分に由来するプロダクトイオンが生じたためと考えられる。すなわち，条件Ｂ及びＣでは，血清中のデルマタン硫酸は測定が困難である。
【０１６０】
一方，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａ〜Ｃの何れにおいても，野生型マウスと比較してIDSヘミ接合体マウスで高値を示しており，IDSヘミ接合体マウスの遺伝子型を反映した測定結果となった（図６）。しかし，表１１で示される結果から，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａで測定した値よりも，条件Ｂで測定した値の精度が高いといえる。従って，図６で示される条件Ａ〜Ｃの測定結果においても，条件Ａでの測定値よりも条件Ｂでの測定値のほうが真度及び精度がともに高いといえる。
【０１６１】
以上の結果から，血清中に含まれるデルマタン硫酸のメタノリシスの条件としては条件Ａ（加熱温度：６５℃，加熱時間：７５分間）が好ましく，ヘパラン硫酸のメタノリシスの条件としては条件Ｂ（加熱温度：８０℃，加熱時間：2時間）が好適であると結論できる。
【０１６２】
〔実施例１４：IDSを投与したマウス血液中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定〕
医療用に市販されている遺伝子組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（rhIDS）を生理食塩液で希釈し，0.1 mg/mLのrhIDS溶液を調製した。このrhIDS溶液を，IDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス（IDSヘミ接合体マウス，C57BL/6N）に，0.5 mg/kg体重の用量で，7日毎に計4回，静脈内投与した。最後に投与した日から７日後に，マウスを放血により安楽死させた。このとき血液をチューブに採取して，室温で30分間以上静置した後，遠心（2000 g, 20分間）して血清を回収した。同様にして，ｒｈＩＤＳ非投与のＩＤＳヘミ接合体マウス（rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウス）及び野生型マウスからも，血清を回収した。
【０１６３】
各マウスから回収した血清について，２本のホウケイ酸ねじ口試験管に，それぞれ2 μLの血清，8 μLのPBS，及び18 μLの10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）とを加えて撹拌した。これを血液サンプル溶液とした。血液サンプル溶液について，実施例９に記載の条件Ｂ（加熱温度80℃，加熱時間２時間）及び条件Ａ（加熱温度65℃，加熱時間75分）でメタノリシス反応を行った。次いで，メタノリシス反応後の血液サンプル溶液について，実施例１０に記載のLC/MS/MS分析を行い，血液サンプル溶液中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを定量した。ここで，デルマタン硫酸の定量は条件Ａでメタノリシス反応させたサンプル，ヘパラン硫酸の定量は条件Ｂでメタノリシス反応させたサンプルを用いて行った。測定は，野生型，IDS投与ヘミ接合体マウス，IDS非投与ヘミ接合体マウスともに３〜４匹のマウスを用いて実施した。
【０１６４】
血液サンプル溶液中のヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量結果を，それぞれ図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量値は，いずれも野生型マウスと比較してrhIDS非投与IDSヘミ接合体マウスで高値を示した。また，rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウスと比較して，rhIDS投与IDSヘミ接合体マウスでは，ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量値がいずれも低下した。これらの結果は，血液サンプル溶液を，ヘパラン硫酸を定量するためのメタノリシスの条件として条件Ｂ（加熱温度：80℃，加熱時間：2時間），及びデルマタン硫酸を定量するためのメタノリシスの条件として条件Ａ（加熱温度：65℃，加熱時間：75分間），で処理することにより，血液中に含まれるヘパラン硫酸とデルマタン硫酸とを定量することができることを示す。更には，得られた定量値より，IDS又はIDS活性を有する物質を用いた酵素補充療法の効果を，定量的に検証することができることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明によれば，試料中に含まれる微量のコンドロイチン硫酸の濃度を正確に測定できるので，例えば，体内にコンドロイチン硫酸が蓄積するスライ症候群，モルキオ症候群を含むライソソーム病患者のスクリーニングに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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