(57)【要約】【課題】  標的核酸の配列数や種類に応じたプライマー設計を必要とせずに、融解曲線を用いて標的核酸の高感度な検出を可能とする核酸検出方法を提供する。【解決手段】  試料に含まれる標的核酸を検出する核酸検出方法であって、（１）前記標的核酸と実質的に相補的な塩基配列を有し、かつ、前記標的核酸とは異なる塩基配列である計測用部位を有する増幅用核酸を、前記試料に添加する第１工程、（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、（３）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的核酸を検出する第３工程を有することを特徴とする核酸検出方法。【選択図】  図１
2020178681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
（１）計測用部位Ａを含む増幅用核酸Ａ、計測用部位Ｂを含む増幅用核酸Ｂ、切断用核酸、プライマーＡ、及びプライマーＢを、前記試料に添加する第１工程、
（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位Ｂを鋳型として前記計測用部位Ａを伸長して得られる計測用核酸を増幅する第２工程、
（３）前記第２工程で得られる前記計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的核酸を検出する第３工程、を有し、
前記増幅用核酸Ａが、その３’端側に前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、
前記増幅用部位Ｂが、その３’端側に酵素反応ブロック部位を有し、
前記計測用部位Ａ及び前記計測用部位Ｂが、前記標的核酸とは塩基配列が異なり、かつ、それらの３’端側に互いに相補的な塩基配列を有し、
前記切断用核酸の３’端側が、前記標的核酸のうち前記認識部位Ａが結合する領域よりも３’端側の領域と実質的に相補的な塩基配列を有し、
前記プライマーＡ及び前記プライマーＢが、それぞれ前記計測用部位Ａ及び前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一な塩基配列を有することを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
前記計測用部位Ａが、その５’端側から順に、前記プライマーＡと実質的に同一な塩基配列Ａ１、及び前記計測用部位Ｂと相補的な塩基配列Ａ２を有し、
前記計測用部位Ｂが、その５’端側から順に、前記プライマーＢと実質的に同一な塩基配列Ｂ１、及び前記計測用部位Ａと相補的な塩基配列Ｂ２を有する請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ａ２、並びに前記塩基配列Ｂ１及び前記塩基配列Ｂ２において重複する塩基の数が、５塩基以下である請求項１又は２に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ａ２、並びに前記塩基配列Ｂ１及び前記塩基配列Ｂ２において重複する塩基の数が、１塩基以下である請求項３に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ａ２、並びに前記塩基配列Ｂ１及び前記塩基配列Ｂ２において重複する塩基がない請求項３に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記計測用部位Ａの塩基の数が、４０塩基以下であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
前記計測用部位Ａの塩基の数が、３６塩基以下であることを特徴とする請求項６に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
前記酵素が、５’−Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を有する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
試料に含まれる標的核酸を検出するための試薬キットであって、
前記試薬キットが、増幅用核酸Ａ、増幅用核酸Ｂ、切断用核酸、プライマーＡ、プライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、
前記増幅用核酸Ａが、前記標的核酸とは塩基配列が異なる計測用部位Ａを有し、かつ、その３’端側に前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、
前記増幅用核酸Ｂが、前記標的核酸とは塩基配列が異なる計測用部位Ｂを有し、かつ、その３’端側に酵素反応ブロック部位を有し、
前記計測用部位Ａの３’端側と前記計測用部位Ｂの３’端側が、互いに相補的な塩基配列を有し、
前記切断用核酸の３’端側が、前記標的核酸のうち前記認識部位Ａが結合する領域よりも３’端側の領域と実質的に相補的な塩基配列を有し、
前記プライマーＡ及び前記プライマーＢが、前記計測用部位Ａ及び前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一の塩基配列を有することを特徴とする試薬キット。
【請求項１０】
試料に含まれる標的核酸を検出するための試薬キットであって、
前記試薬キットが、増幅用核酸Ａ、増幅用核酸Ｂ、プライマーＡ、プライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、
前記増幅用核酸Ａが、前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、かつ、前記標的核酸とは異なる配列である計測用部位Ａを３’端側に有し、
前記増幅用核酸Ｂが、前記標的核酸を認識する認識部位Ｂを有し、かつ、前記標的核酸とは異なる塩基配列である計測用部位Ｂを３’端側に有し、
前記計測用部位Ａ及び前記計測用部位Ｂの３’端側が、互いに実質的に相補的な塩基配列を有し、
前記プライマーＡ及び前記プライマーＢがそれぞれ、前記計測用部位Ａの５’端側及び前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一な塩基配列であることを特徴とする試薬キット。
【請求項１１】
試料に含まれる標的核酸を検出するための試薬キットであって、
前記試薬キットが、増幅用核酸Ａ、増幅用核酸Ｂ、ライゲーション用核酸、プライマーＡ、プライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、
前記増幅用核酸Ａが、前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、かつ、前記標的核酸とは異なる塩基配列である計測用部位Ａを５’端側に有し、５’末端がリン酸化されていて、
前記増幅用核酸Ｂが、前記標的核酸を認識する認識部位Ｂを有し、かつ、前記標的核酸とは異なる塩基配列である計測用部位Ｂを３’端側に有し、
前記ライゲーション用核酸が、前記計測用部位Ａの５’端側と実質的に相補的な塩基配列、及び前記計測用部位Ｂの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有し、
前記プライマーＡが、前記計測用部位Ａの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有し、
前記プライマーＢが、前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一な塩基配列を有することを特徴とする試薬キット。
【請求項１２】
前記酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項９に記載の試薬キット。
【請求項１３】
前記酵素が、ＤＮＡリガーゼ及び耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１０に記載の試薬キット。
【請求項１４】
前記試薬キットが、融解曲線を測定するための色素を含む請求項９乃至１２のいずれか１項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法、及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に存在する目的の核酸（標的核酸）を高感度に検出する方法の１つとして、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を代表とする遺伝子増幅反応を用いるものが挙げられる。ＤＮＡマイクロアレイや次世代ＤＮＡシークエンシングなどの他の核酸検出方法と比べて、ＰＣＲは、網羅性に劣るものの、低コストであり、かつ、簡便性及び定量性に優れるため、広く用いられている。
【０００３】
ＰＣＲにより核酸を検出するためには、標的核酸が増幅したことを確認する必要がある。一般に、標的核酸の増幅を、蛍光強度の変化で確認することが多い。例えば、ＰＣＲにより増幅した標的核酸と特異的に結合でき、かつ、蛍光物質を有するプローブを用いるプローブ法（Ｔａｑ  Ｍａｎプローブ法など）がある。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光物質がＰＣＲにより増幅した標的核酸に取り込まれることを利用するインターカレータ法などもある。
【０００４】
なかでも、インターカレータ法は、すべての２本鎖ＤＮＡを検出できるため、標的核酸ごとに対応するプローブを準備する必要がなく、低コストで用いることができる。しかし、プライマーダイマーのような、非特異的な増幅産物にも蛍光物質が結合してしまうため、非特異的な増幅産物が蛍光強度に影響を与える場合がある。そこで、標的核酸の増幅産物の生成を、融解曲線を測定することで、確認する方法がある（特許文献１参照）。ここで、融解曲線とは、２本鎖の核酸の量に対する、２本鎖の核酸が解離して得られる１本鎖の核酸の量の割合の、温度依存性を示すものである。
【０００５】
さらに、標的核酸の融解曲線を測定するのではなく、標的核酸の存在により生じる別の核酸の融解曲線を測定することで、標的核酸を検出する方法がある。具体的には、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯが切断されて断片を放出し、その断片がＣＴＯにハイブリッド形成して得られた伸長２本鎖の存在を検出することで、ターゲット核酸配列を検出する方法がある（特許文献２参照）。ここで、ＰＴＯとは、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの略であり、ＣＴＯとは、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの略である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１２−５０２６３４号公報
【特許文献２】特開２０１７−０７０２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの検討の結果、標的核酸の増幅産物が４０塩基対以上の長さであると、増幅産物の融解曲線のピークの位置を正確に予測することが難しく、目的の増幅産物の生成を確認できないことがわかった。また、試料中に検出したい標的核酸が複数種ある場合、複数種の増幅産物に対応する複数の融解曲線が測定されることとなる。融解曲線が複数あると、各融解曲線を分離することが難しく、目的の増幅産物の生成を確認できない場合がある。長い増幅産物の融解曲線を予め測定したり、複数の融解曲線を分離したりするためには、標的核酸の配列数や種類に応じて、ＰＣＲに用いるプライマーの配列を試行錯誤しながら設計する必要があり、手間がかかる。
【０００８】
また、特許文献２に記載の方法では、ターゲット核酸配列の検出感度を向上させるために、ＰＴＯとハイブリッド形成するターゲット核酸配列を増幅させる必要がある。しかし、増幅させたターゲット核酸配列の存在により、伸長２本鎖の融解曲線を取得しにくい場合があり、ターゲット核酸配列の検出感度のさらなる向上が求められる。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、標的核酸の配列数や種類に応じたプライマー設計を必要とせずに、融解曲線を用いて標的核酸の高感度な検出を可能とする核酸検出方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、標的核酸の配列数や種類に応じたプライマー設計を必要とせずに、融解曲線を用いて標的核酸の高感度な検出を可能とする試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様による核酸検出方法は、試料に含まれる標的核酸を検出する核酸検出方法であって、（１）前記標的核酸と実質的に相補的な塩基配列を有し、かつ、前記標的核酸とは異なる塩基配列である計測用部位を有する増幅用核酸を、前記試料に添加する第１工程、（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、並びに（３）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的核酸を検出する第３工程を有する。
【００１１】
本発明の一態様による試薬キットは、試料に含まれる標的核酸を検出するための試薬キットであって、前記試薬キットが、増幅用核酸Ａ、増幅用核酸Ｂ、切断用核酸、プライマーＡ、プライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、前記増幅用核酸Ａが、前記標的核酸とは塩基配列が異なる計測用部位Ａを有し、かつ、その３’端側に前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、前記増幅用核酸Ｂが、酵素反応ブロック部位を３’端側に有し、かつ、前記標的核酸とは塩基配列が異なる計測用部位Ｂを有し、前記計測用部位Ａの３’端側と前記計測用部位Ｂの３’端側が、互いに相補的な塩基配列を有し、前記切断用核酸の３’端側が、前記標的核酸のうち前記認識部位Ａが結合する領域よりも３’端側の領域と実質的に相補的な塩基配列を有し、前記プライマーＡ及び前記プライマーＢが、前記計測用部位Ａ及び前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一の塩基配列を有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、標的核酸の配列数や種類に応じたプライマー設計を必要とせずに、融解曲線を用いて標的核酸の高感度な検出を可能とする核酸検出方法、及び試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る核酸検出方法の一例を示す図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る核酸検出方法の一例を示す図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【図７】本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図８】本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【図９】図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が増幅用核酸Ａを切断する反応に関して、計測用部位Ａの塩基数と切断用核酸が認識する標的核酸の配列の位置が切断反応に与える影響を検討した実験結果である。
【図１０】図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する計測用部位Ａの塩基数の影響を検討した実験結果である。
【図１１】図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する計測用部位Ａの塩基配列の影響と、切断用核酸が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する増幅用核酸Ａの切断箇所の配列の影響を検討した実験結果である。
【図１２】図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序が機能することを確認する検討を行った実験結果である。
【図１３】図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序が機能することを確認する検討を行った実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。本発明において、試料とは、尿や血液などの、生体から採取する検体であってもよいし、精製や濃縮、検体中の検出対象物の化学修飾や断片化など、検出のための前処理を行った検体であってもよい。また、標的核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などであり、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００１５】
さらに、本発明において、「実質的に同一な塩基配列」、「実質的に相補的な塩基配列」とは、２つの核酸が十分に２本鎖を形成しうる塩基配列のことを指す。塩基配列Ｘと「実質的に同一な塩基配列」の例として、塩基配列Ｘと完全同一な塩基配列、塩基配列Ｘと７５％以上の同一性を有する塩基配列、塩基配列Ｘにおいて、１〜１５個の塩基が欠失、置換、又は付加されている塩基配列が挙げられる。また、塩基配列Ｘと「実質的に相補的な塩基配列」の例として、塩基配列Ｘと完全相補的な塩基配列Ｙ、塩基配列Ｙと７５％以上の同一性を有する塩基配列、塩基配列Ｙにおいて、１〜１５個の塩基が欠失、置換、又は付加されている塩基配列が挙げられる。
【００１６】
本発明のいずれの実施形態においても、標的核酸そのものではなく、計測用部位を有する計測用核酸を増幅させることで、標的核酸を検出することができる。そのため、標的核酸の配列数や種類に応じたプライマーの設計を必要とせずに融解曲線を用いた核酸の検出が可能となる。
【００１７】
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態に係る核酸検出方法の一例を示す図である。核酸検出方法は、試料１０２から標的核酸１０１を検出する方法であり、以下の工程を少なくとも有する。
（１）標的核酸１０１と実質的に相補的な塩基配列を有し、かつ、標的核酸１０１とは異なる塩基配列である計測用部位１０３を有する増幅用核酸１０４を、試料に添加する第１工程
（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を、第１工程で得られる試料に添加し、計測用部位１０３を有する計測用核酸１０５を増幅する第２工程
（３）第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、測定した融解曲線に基づいて標的核酸１０１を検出する第３工程
【００１８】
試料に標的核酸が存在すると、標的核酸と実質的に相補的な配列を有する増幅用核酸が標的核酸と結合する。増幅用核酸の標的核酸への結合により、増幅用核酸を鋳型として、酵素、及び、ＮＴＰ又はｄＮＴＰの存在下で、計測用部位を有する計測用核酸が増幅する（図１（ｂ））。このような核酸検出方法を用いることで、標的核酸が存在すると、標的核酸そのものではなく、計測用部位を有する計測用核酸を増幅させることができる。そのため、標的核酸の配列数が多かったり、標的核酸の種類を変更したりする場合でも、増幅用核酸の一部の塩基配列を、標的核酸の塩基配列と実質的に相補的な塩基配列になるように変更すればよく、計測用核酸の塩基配列を変更する必要はない。さらに、複数種の標的核酸を増幅させる場合は、複数種の標的核酸の融解曲線を予め測定しておく必要があるが、計測用核酸を増幅させる場合は、計測用核酸の融解曲線を測定しておけばよい。このように、本発明の核酸検出方法は、手間がかからない。
【００１９】
融解曲線とは、２本鎖の核酸の量に対する、２本鎖の核酸が解離して得られる１本鎖の核酸の量の割合の、温度依存性を示すものである。例えば、２本鎖の核酸を含む溶液の温度を上昇させる際の、物理的信号の強度（蛍光強度など）の変化を測定することで得られる。蛍光強度を測定する色素としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎなどのインターカレータ色素が用いられる。インターカレータ色素とは、核酸に結合して、核酸の２重らせん構造に入り込む分子の１種である。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎと比べて、ＥｖａＧｒｅｅｎは、蛍光強度が大きく、色素の再分布も起こりにくい。そのため、蛍光強度を測定する色素として、ＥｖａＧｒｅｅｎを用いることが好ましい。
【００２０】
第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、測定した融解曲線に基づき、試料中に増幅した計測用核酸が存在することが分かれば、試料中に標的核酸が存在していることを示している。一方、試料中に増幅した計測用核酸が存在しない（図１（ａ））ことが分かれば、試料中に標的核酸が存在しないことを示している。
【００２１】
本実施形態において、第３工程は、第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線とを比較することで、標的核酸を検出することができる。また、第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線との相関係数を算出し、相関係数に基づいて標的核酸を検出してもよいし、融解曲線の融解温度に基づいて標的核酸を検出してもよい。また、これらの方法を複数用いて標的核酸を検出してもよい。ここで、相関係数とは、２つの融解曲線の類似性を定量化した指標である。例えば、上記２つの融解曲線のデータをそれぞれベクトルとし、ベクトルのすべての要素の平均値が０、ベクトルの大きさが１となるように正規化した後、その２つのベクトルの内積を相関係数とすることができる。
【００２２】
試料中に検出したい標的核酸が複数種ある場合は、複数種の標的核酸に対応する複数種の増幅用核酸を用いればよい。図２は、本発明の第１の実施形態に係る核酸検出方法の一例を示す図である。図２は、検出したい標的核酸を、標的核酸２０１及び２０２の２種としているが、３種以上であってもよい。標的核酸２０１の検出には、標的核酸２０１と実質的に相補的な塩基配列を有し、かつ、計測用部位２０４を有する増幅用核酸２０６を用いることができる（図２）。標的核酸２０２の検出には、標的核酸２０２と実質的に相補的な塩基配列を有し、かつ、計測用部位２０５を有する増幅用核酸２０７を用いることができる（図２）。
【００２３】
予め測定されている計測用核酸の融解曲線との比較により、計測用部位２０４を有する計測用核酸２０８の融解曲線が得られたことが分かれば、試料中に標的核酸２０１が存在していることを示している（図２（ｂ））。また、計測用部位２０５を有する計測用核酸２０９の融解曲線が得られたことが分かれば、試料中に標的核酸２０２が存在していることを示している（図２（ｃ））。一方、試料中に増幅した計測用核酸２０８及び計測用核酸２０９が存在しない（図２（ａ））ことが分かれば、試料中に標的核酸が存在しないことを示している。
【００２４】
＜第２の実施形態＞
本発明の第２の実施形態に係る核酸検出方法は、試料から標的核酸を検出する方法であり、以下の工程を少なくとも有する。
（１）計測用部位Ａを含む増幅用核酸Ａ、計測用部位Ｂを含む増幅用核酸Ｂ、切断用核酸、プライマーＡ、及びプライマーＢを、試料に添加する第１工程
（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、第１工程で得られる試料に添加し、計測用部位Ｂを鋳型として計測用部位Ａを伸長して得られる計測用核酸（図４中で増幅する核酸を計測用核酸４０８とする）を増幅する第２工程
（３）第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、融解曲線に基づいて標的核酸を検出する第３工程
【００２５】
ここで、増幅用核酸Ａは、その３’端側に前記標的核酸を認識する認識部位Ａを有し、増幅用部位Ｂは、その３’端側に酵素反応ブロック部位を有する。計測用部位Ａ及び計測用部位Ｂは、標的核酸とは塩基配列が異なり、かつ、それらの３’端側に互いに相補的な塩基配列を有する。切断用核酸の３’端側は、標的核酸のうち認識部位Ａが結合する領域よりも３’端側の領域と実質的に相補的な塩基配列を有する。プライマーＡ及びプライマーＢは、それぞれ計測用部位Ａ及び計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一な塩基配列を有する。
【００２６】
第２の実施形態において、標的核酸を検出するために、プライマーとして、増幅用核酸に含まれる計測用部位の５’端側と実質的に同一な配列を有するものを用いることが重要である。その理由は、以下の通りである。
【００２７】
標的核酸が存在すると、増幅用核酸Ａの有する認識部位Ａが標的核酸を認識することで、増幅用核酸Ａが切断されて計測用部位Ａが生じる。この計測用部位Ａの３’端側と、計測用部位Ｂの３’端側が相補的に結合することで、計測用部位Ａの３’端側から塩基の伸長が起こり、計測用核酸が生じる。この計測用核酸の３’端側は、プライマーＢと実質的に相補的な塩基配列を有するため、プライマーＢと相補的に結合して、プライマーＢの３’端側から塩基の伸長が起こり、さらなる計測用核酸が生じる。これにより、計測用核酸が増幅する。
【００２８】
一方、標的核酸が存在しないと、そもそも増幅用核酸Ａの切断が起こらないため、計測用核酸が生じない。そして、プライマーが増幅用核酸に含まれる計測用部位の５’端側と相補的に結合できないため、プライマーからの塩基の伸長が起こらず、核酸が増幅することはない。
【００２９】
このように、第２の実施形態に係る核酸検出方法においては、計測用部位の５’端側と相補的な塩基配列を有する核酸が存在しないことで、標的核酸の有無による計測用核酸の増幅の有無を確認することが可能となる。
【００３０】
図３は、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料から標的核酸３０１を検出するための試薬キットである。試薬キットは、増幅用核酸Ａ３０２、増幅用核酸Ｂ３０３、切断用核酸３０４、プライマーＡ３０５、プライマーＢ３０６、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。増幅用核酸Ａは、標的核酸３０１とは塩基配列が異なる計測用部位Ａ３０７を有し、かつ、その３’端側に標的核酸を認識する認識部位Ａ３０９を有する。増幅用核酸Ｂは、酵素反応ブロック部位３１０を３’端側に有し、かつ、標的核酸３０１とは塩基配列が異なる計測用部位Ｂ３０８を有する。計測用部位Ａの３’端側３１１と計測用部位Ｂの３’端側３１２は、互いに相補的な塩基配列を有する。切断用核酸３０４の３’端側は、標的核酸のうち認識部位Ａ３０９が結合する領域よりも３’端側の領域と実質的に相補的な塩基配列を有する。また、プライマーＡ及びＢは、計測用部位Ａ及びＢの５’端側３１３，３１４と実質的に同一の塩基配列を有する。
【００３１】
酵素としては、増幅用核酸としてＤＮＡを用いる場合は、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、増幅用核酸としてＲＮＡを用いる場合は、逆転写酵素を用いることが好ましい。
【００３２】
複数種の標的核酸を検出するためには、複数種の試薬キット含む試薬セットを用いることが好ましい。標的核酸と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的核酸に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的核酸の種類に応じて、異なる。
【００３３】
図４は、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。まず、増幅用核酸Ａ４０２の有する認識部位Ａが標的核酸４０１を認識して、標的核酸に結合する。さらに、切断用核酸４０３は、増幅用核酸Ａ４０２の有する認識部位Ａが認識する標的核酸４０１の領域よりも３’端側の領域に結合する。試薬キットに含まれる酵素４０４、及びヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、切断用核酸４０３の３’末端から核酸の伸張反応が起こる。酵素としては、５’−Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を有するものを用いることが好ましい。これにより、増幅用核酸Ａ４０２に含まれる計測用部位Ａ４０５の３’末端で核酸が切断される。そして、試料キットに含まれる増幅用核酸Ｂ４０６の有する計測用部位Ｂ４０７の３’端側と、切断されて得られる計測用部位Ａの３’端側の塩基配列とが相補的に結合することで、計測用部位Ａの３’末端から核酸の伸張反応が起こる。一方で、増幅用核酸Ｂ４０６は、酵素反応ブロック部位を３’端側に有するため、増幅用核酸Ｂ４０６の核酸の伸長反応は起こらない。酵素反応ブロック部位としては、何らかの化学的修飾（例えば、３’末端のリン酸化）や、標的核酸を含む核酸と結合しないランダム配列、ポリｄＡ配列、ポリｄＴ配列、ポリｄＧ配列、及びポリｄＣ配列などの塩基配列が挙げられる。
【００３４】
さらに、試料キットに含まれるプライマーＡ、プライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、計測用部位Ａ及び計測用部位Ｂを有する計測用核酸４０８が増幅される（図４（ａ））。得られた計測用核酸４０８の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的核酸を検出できる。酵素としては、増幅用核酸としてＤＮＡを用いる場合は、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、増幅用核酸としてＲＮＡを用いる場合は、逆転写酵素を用いることが好ましい。
【００３５】
標的核酸が存在しない場合は、図４（ｂ）に示すように、増幅用核酸Ａ４０２から計測用部位Ａ４０２が切断されず、計測用部位Ａ４０２には標的核酸を認識する認識部位Ａが結合したままである。そのため、計測用部位Ａ４０２と計測用部位Ｂ４０６が結合しても伸張反応が起こらず、計測用部位Ａ及び計測用部位Ｂを有する計測用核酸の増幅が起こらない。
【００３６】
試薬キットは、融解曲線を測定するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【００３７】
計測用部位Ａは、その５’端側から順に、プライマーＡと実質的に同一な塩基配列Ａ１、及び計測用部位Ｂと相補的な塩基配列Ａ２を有することが好ましい。また、計測用部位Ｂは、その５’端側から順に、プライマーＢと実質的に同一な塩基配列Ｂ１、及び計測用部位Ａと相補的な塩基配列Ｂ２を有することが好ましい。
【００３８】
すなわち、計測用部位Ａ及びＢにおいて、プライマーＡ及びＢと実質的に同一な塩基配列（３１３、３１４）は、計測用部位Ａ及びＢの３’端側の互いに相補的な塩基配列（３１１、３１２）よりも、５’端側に位置することが好ましい（図３参照）。各計測用部位において、プライマーＡ及びＢと実質的に同一な塩基配列（３１３、３１４）と計測用部位Ａ及びＢの３’端側の互いに相補的な塩基配列（３１１、３１２）の間に塩基が含まれていてもよい。また、プライマーＡ及びＢと実質的に同一な塩基配列（３１３、３１４）と計測用部位Ａ及びＢの３’端側の互いに相補的な塩基配列（３１１、３１２）が重複していてもよい。しかし、計測用部位Ｂを鋳型としたプライマーＡの伸長反応、又は計測用部位Ａを鋳型としたプライマーＢの伸長反応が進まないことが好まし。伸長反応の進みやすさの観点から、重複する塩基の数は、５塩基以下であることが好ましく、１塩基以下であることがさらに好ましく、重複する塩基がないことがさらに好ましい。
【００３９】
また、計測用部位Ａ４０５の塩基の数は、酵素４０４による増幅用核酸Ａ４０２の切断が起こりにくくなるため、４０塩基以下であることが好ましく、３６塩基以下であることがさらに好ましい。
【００４０】
なお、増幅用核酸Ａの計測用部位Ａの塩基配列は、本発明の第２の実施形態における酵素切断の活性には影響しない。また、増幅用核酸Ａの認識部位Ａの配列、及び酵素切断配列に関しても、酵素切断の活性には影響しない。
【００４１】
増幅用核酸Ａが標的核酸を認識する認識部位Ａと標的核酸のＴｍ値、増幅用核酸Ａと増幅用核酸Ｂの相補的な配列のＴｍ値は、４０〜８０℃程度が好ましく、ＰＣＲ反応時の温度を各Ｔｍ値に応じて調節することが好ましい。
【００４２】
＜第３の実施形態＞
図５は、本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料から標的核酸５０１を検出するための試薬キットである。試薬キットは、増幅用核酸Ａ５０２、増幅用核酸Ｂ５０３、プライマーＡ５０４、プライマーＢ５０５、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。増幅用核酸Ａ５０２は、標的核酸５０１を認識する認識部位Ａ５０６を有し、かつ、標的核酸５０１とは異なる塩基配列である計測用部位Ａ５０８を３’端側に有する。増幅用核酸Ｂ５０３は、標的核酸５０１を認識する認識部位Ｂ５０７を有し、かつ、標的核酸５０１とは異なる塩基配列である計測用部位Ｂ５０９を３’端側に有する。計測用部位Ａ及び計測用部位Ｂの３’端側５１０、５１１の塩基配列は、互いに実質的に相補的である。プライマーＡ５０４及びプライマーＢ５０５はそれぞれ、計測用部位Ａの５’端側５１２及び計測用部位Ｂの５’端側５１３と実質的に同一な塩基配列である。酵素としては、増幅用核酸としてＤＮＡを用いる場合は、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、増幅用核酸としてＲＮＡを用いる場合は、逆転写酵素を用いることが好ましい。
【００４３】
複数種の標的核酸を検出するためには、複数種の試薬キット含む試薬セットを用いることが好ましい。標的核酸と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的核酸に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的核酸の種類に応じて、異なる。
【００４４】
図６は、本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。まず、増幅用核酸Ａ６０２と増幅用核酸Ｂ６０３はそれぞれ、標的核酸６０１を認識する部位を有するため、２種の増幅用核酸が標的核酸に互いに近接して結合する。さらに、増幅用核酸Ａ６０２の有する計測用部位Ａ６０４の３’端側と、増幅用核酸Ｂ６０３の有する計測用部位Ｂ６０５の３’端側が互いに相補的な塩基配列を有することで、その相補的な塩基配列の部分で、安定して２本鎖を形成できる。
【００４５】
そして、試薬キットに含まれる酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、２種の計測用部位の３’末端から核酸の伸長反応が起こる。次いで、試薬キットに含まれる２種の計測用部位の末端と実質的に同一な塩基配列を有する２種のプライマー、酵素、及びヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、２種の計測用部位を有する計測用核酸がＰＣＲにより増幅する。得られた計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的核酸を検出できる。
【００４６】
試料中に標的核酸が存在しない場合は、２種の増幅用核酸が互いに近接しにくいので、２種の計測用核酸の３’端側の塩基配列の部分で、２本鎖を形成しにくい。そのため、２種の計測用核酸の３’末端から核酸の伸長反応が起こらない。これにより、２種の計測用部位を有する計測用核酸が増幅しない。
【００４７】
試薬キットは、融解曲線を測定するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【００４８】
＜第４の実施形態＞
図７は、本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料に含まれる標的核酸７０１を検出するための試薬キットである。試薬キットは、増幅用核酸Ａ７０２、増幅用核酸Ｂ７０３、ライゲーション用核酸７０４、プライマーＡ７０５、プライマーＢ７０６、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。増幅用核酸Ａ７０２は、標的核酸７０１を認識する認識部位Ａ７０７を有し、かつ、標的核酸７０１とは異なる塩基配列である計測用部位Ａ７０９を５’端側に有し、５’末端がリン酸化７１０されている。増幅用核酸Ｂは、標的核酸７０１を認識する認識部位Ｂ７０８を有し、かつ、標的核酸７０１とは異なる塩基配列である計測用部位Ｂ７１１を３’端側に有する。ライゲーション用核酸７０４は、計測用部位Ａの５’端側７１２と実質的に相補的な塩基配列７１３、及び計測用部位Ｂの３’端側７１４と実質的に相補的な塩基配列７１５を有する。プライマーＡは、計測用部位Ａの３’端側７１６と実質的に相補的な塩基配列を有し、プライマーＢは、計測用部位Ｂの５’端側７１７と実質的に同一な塩基配列を有する。
【００４９】
図７（ａ）のように標的核酸７０１における増幅用核酸Ａの結合部位が、増幅用核酸Ｂの結合部位より３’端側にあってもよいし、図７（ｂ）のように標的核酸７０１における増幅用核酸Ａの結合部位が、増幅用核酸Ｂの結合部位より５’端側にあってもよい。
【００５０】
酵素としては、第２の実施形態及び第３の実施形態で挙げたもののほかに、ライゲーション反応を促進させる酵素であるＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ  Ｃｏｌｉ．ＤＮＡリガーゼなどを用いることができる。
【００５１】
複数種の標的核酸を検出するためには、複数種の試薬キット含む試薬セットを用いることが好ましい。標的核酸と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的核酸に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的核酸の種類に応じて、異なる。
【００５２】
図８は、本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。まず、増幅用核酸Ａ８０２と増幅用核酸Ｂ８０３はそれぞれ、標的核酸８０１を認識する部位を有するため、２種の増幅用核酸が標的核酸に互いに近接して結合する。さらに、増幅用核酸Ａの有する計測用部位Ａ８０５、及び増幅用核酸Ｂの有する計測用部位Ｂ８０６と、実質的に相補的な塩基配列を有するライゲーション用核酸８０４が存在する。これにより、ライゲーション用核酸と２種の増幅用核酸とで安定な３者複合体が形成される。試料キットに含まれる酵素により、ライゲーション反応が生じることで、計測用部位ＡとＢが連結される。さらに、試薬キットに含まれる２種のプライマー、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、２種の計測用部位Ａ及びＢを有する計測用核酸がＰＣＲにより増幅する。得られた計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的核酸を検出できる。
【００５３】
試料中に標的核酸が存在しない場合は、２種の増幅用核酸が互いに近接しにくいので、ライゲーション用核酸と２種の増幅用核酸との３者複合体が形成しにくい。そのため、２種の計測用部位を有する計測用核酸が増幅しない。
【００５４】
試薬キットは、融解曲線を測定するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【実施例】
【００５５】
＜実施例１：計測用部位Ａの塩基数と切断用核酸の位置の検討＞
図４に示す本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が伸長する際に酵素が増幅用核酸Ａを切断する反応に関して、計測用部位Ａの塩基数と切断用核酸が認識する標的核酸の配列の位置が切断反応に与える影響を調べた。
【００５６】
増幅用核酸Ａが酵素により切断されたことを確認するために、増幅用核酸Ａの５’末端、若しくは３’末端に蛍光色素を修飾し、電気泳動を行うことにより、蛍光色素で修飾された増幅用核酸Ａの分子量の変化を蛍光イメージングで評価した。増幅用核酸Ａとして、塩基配列８の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾し、３’末端をＣ３スペーサで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８−Ｃ３ｓｐａｃｅｒ）、塩基配列８の３’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾した増幅用核酸（増幅用核酸Ａ８‐ＦＡＭ）、塩基配列８の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８）、塩基配列１の５’末端をＦＡＭで修飾し、３’末端をＣ３スペーサで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ１−Ｃ３ｓｐａｃｅｒ）を用いた。３’末端のＣ３スペーサ修飾の有無で、酵素による増幅用核酸Ａの切断反応の効率が大きく変わることを考慮して、Ｃ３スペーサ修飾の有無での検討を行った。また、切断用核酸が結合する標的核酸の部位と増幅用核酸Ａが結合する標的核酸の部位の距離により、酵素による増幅用核酸Ａの切断反応の効率が大きく変わる。そのことを考慮して、切断用核酸が結合する標的核酸の部位と増幅用核酸Ａが結合する標的核酸の部位の距離が異なる条件での検討を行った。切断用核酸としては、増幅用核酸Ａが結合する標的核酸の部位からの距離が異なる切断用核酸１（塩基配列９）、切断用核酸２（塩基配列２９）を用いた。増幅用核酸Ａ、切断用核酸、標的核酸を、それぞれ、終濃度１μＭ、２μＭ、０．５μＭで混合し、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲプレミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｍ０４９６Ｌ）を１倍量になるように混合し、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ）を用いて、９５℃で３０秒間熱した後に、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間を３０サイクル繰り返した。その後、変性電気泳動ゲルＮｏｖｅｘ（ＴＭ）  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ，１５％，１０  ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で電気泳動を行った。また、マーカーとして、増幅用核酸Ａ８の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾し、３’末端をＣ３スペーサで修飾したＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８−Ｃ３スペーサと、増幅用核酸Ａ１とＡ８の切断後の計測用部位Ａ側の核酸（配列番号２６、２７）の各々の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾したＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ１、Ａ８、増幅用核酸Ａ８の切断後の認識部位（配列番号２８）の３’末端側をＦＡＭで修飾した切断後増幅用核酸Ａ８−ＦＡＭを用いた。電気泳動後、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光イメージングを行い、切断用核酸による増幅用核酸Ａの切断による分子量の変化をゲル中の蛍光バンドの変化から評価した。その結果を図９に示す。図９において、レーン２に示すマーカー（ＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ８）と同じ位置に、レーン３に示す標的核酸が存在した時のＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８―Ｃ３ｓｐａｃｅｒと切断用核酸２との反応後のサンプルで蛍光のバンドが確認できた。また、レーン４に示す標的核酸が存在しない時では、その蛍光バンド��確認できないことより、計測用部位Ａが１４塩基の場合は切断反応が起こることを確認した。同様に、レーン６とレーン７、８を比較することで、ＦＡＭ修飾の位置が３’末端側でも、切断反応が起こっていること、レーン２とレーン９、１０を比較することで、増幅用核酸Ａの３’末端にＣ３ｓｐａｃｅｒが無くても、切断反応が起こっていることを確認した。一方、レーン１７に示すマーカー（ＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ１）と同じ位置に、レーン１８、１９で示すサンプルでは蛍光バンドが確認できないことより、計測用部位Ａが４６塩基の場合は切断が起こっていないことを確認した。また、レーン１１と１３とも、レーン１６に示すマーカー（ＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ８）と同じ位置に蛍光バンドが確認できることより、切断用核酸の標的核酸を認識する位置が、増幅用核酸Ａの標的核酸を認識する位置からの距離が５塩基でも、３１塩基でも切断が起こることを確認した。
【００５７】
＜実施例２：計測用部位Ａの塩基数の検討＞
図４に示す、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が伸長する際に酵素が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する計測用部位Ａの塩基数の影響について、詳細に検討した。
【００５８】
計測用部位Ａの塩基数の異なる塩基配列１〜８の増幅用核酸の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ１〜Ａ８）と、塩基配列９の切断用核酸、塩基配列１０の標的核酸を、それぞれ、終濃度１μＭ、２μＭ、０．５μＭで混合し、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲプレミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｍ０４９６Ｌ）を１倍量になるように混合し、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ）を用いて、９５℃で３０秒間熱した後に、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間を３０サイクル繰り返した。その後、変性電気泳動ゲルＮｏｖｅｘ（ＴＭ）  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ，１５％，１０  ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で電気泳動を行った。また、マーカーとして、増幅用核酸Ａ１とＡ８の５’末端に蛍光色素ＦＡＭで修飾したＦＡＭ−増幅用核酸Ａ１、Ａ８、増幅用核酸Ａ１とＡ８の切断後の計測用部位Ａ側の核酸（配列番号２６、２７）の５’末端に蛍光色素ＦＡＭで修飾したＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ１、Ａ８を用いた。電気泳動後、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光イメージングを行い、切断用核酸による増幅用核酸Ａの切断による分子量の変化をゲル中の蛍光バンドの変化から評価した。ゲルの蛍光イメージングの蛍光写真を図１０に示す。レーン２に示すマーカー（ＦＡＭ−切断後増幅用核酸）と同じ位置に、レーン３に示す標的核酸が存在した時のＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８の反応後のサンプルにおいても蛍光バンドが確認でき、レーン４に示す標的核酸が存在しない時では、その蛍光バンドが確認できないことにより、計測用部位Ａの塩基数が１４塩基の場合に切断反応が起こっていることが確認できる。同様に、レーン２よりは分子量が大きいが、レーン１の切断前のＦＡＭ−増幅用核酸Ａ８の蛍光バンドよりは、分子量の小さい位置に、レーン５、７、９、１３、１５において、蛍光バンドが確認でき、その蛍光バンドは、標的核酸が存在しない時のサンプル（レーン６、８、１０、１４、１６）では確認できなかった。また、レーン１７、１９では、レーン１２に示すマーカーＦＡＭ−切断後増幅用核酸Ａ１の蛍光バンド付近に、蛍光バンドが確認できなかった。以上より、計測用部位Ａの塩基数が４１（レーン１７に相当）以上だと、酵素による増幅用核酸Ａの切断がほとんど起こらないことを確認した。
【００５９】
＜実施例３：計測用部位Ａの配列依存性の検討＞
図４に示す、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が伸長する際に酵素が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する計測用部位Ａの塩基配列の影響を検討した。
【００６０】
計測用部位Ａの塩基数は同じで配列が異なる塩基配列５、１１〜１４の増幅用核酸の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ５、Ａ１１〜１４）と、塩基配列９の切断用核酸、塩基配列１０の標的核酸を、それぞれ、終濃度１μＭ、２μＭ、０．５μＭで混合し、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲプレミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｍ０４９６Ｌ）を１倍量になるように混合し、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ）を用いて、９５℃で３０秒間熱した後に、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間を３０サイクル繰り返した。その後、変性電気泳動ゲルＮｏｖｅｘ（ＴＭ）  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ，１５％，１０  ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で電気泳動を行った。その後、ＩＶＩＳ  ＬｕｍｉｎａＬＴ  ＳｅｒｉｅｓＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光イメージングを行い、切断用核酸による増幅用核酸Ａの切断による分子量の変化をゲル中の蛍光バンドの変化から評価した。ゲルの蛍光イメージングの蛍光写真を図１１のレーン１〜１０に示す。標的核酸が存在しない場合（レーン２、４、６、８、１０）と比較して、標的核酸が存在する場合（レーン１、３、５、７、９）では、低分子量の位置に蛍光バンドが確認できた。これにより、計測用部位Ａの配列に依らずに切断が起こることを確認した。
【００６１】
＜実施例４：増幅用核酸Ａの切断箇所の配列依存性の検討＞
図４に示す、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序のうち、切断用核酸が伸長する際に酵素が増幅用核酸Ａを切断する活性に対する増幅用核酸Ａの切断箇所の配列の影響を検討した。
【００６２】
切断箇所の配列の異なる塩基配列５、１５〜１８の５’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾した増幅用核酸（ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ５、Ａ１５〜Ａ１８）と、塩基配列９の切断用核酸、塩基配列１０の標的核酸を、それぞれ、終濃度１μＭ、２μＭ、０．５μＭで混合し、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲプレミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｍ０４９６Ｌ）を１倍量になるように混合し、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ）を用いて、９５℃で３０秒間熱した後に、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間を３０サイクル繰り返した。その後、変性電気泳動ゲルＮｏｖｅｘ（ＴＭ）  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ，１５％，１０  ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で電気泳動を行った。その後、ＩＶＩＳ  ＬｕｍｉｎａＬＴ  ＳｅｒｉｅｓＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光イメージングを行い、切断用核酸による増幅用核酸Ａの切断による分子量の変化をゲル中の蛍光バンドの変化から評価した。ゲルの蛍光イメージングの蛍光写真を図１１に示す。実験の結果、ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ５、１５、１６、１８（レーン１１、１３、１５、１９）では切断が確認できたが、ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ１７（レーン１７）ではほとんど切断が見られなかった。原因として、ＦＡＭ−増幅用核酸Ａ１７では、標的核酸を認識する認識部位Ａに相当する塩基配列のＴｍ値が他の配列と比べて５〜１０℃程度低く、標的核酸へのアニールが不十分であったと考えられる。他のレーン（レーン１１、１３、１５、１９）で見られているＦＡＭ−増幅用核酸Ａそのものの蛍光バンド以外の、標的核酸を鋳型として増幅用核酸の３’側が伸長することで生じた、やや分子量が増加した蛍光バンドが、レーン１７では見られなかった。このことからも、標的核酸へのアニールが不十分であったと考えられ、これはＰＣＲ時の温度設定により改善可能であると考えられる。
【００６３】
＜実施例５：本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序が機能することの検討＞
図４に示す、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序が機能することを確認する検討を行った。
【００６４】
実施例１での検討で、計測用部位Ａの切断が確認できた配列のうち、塩基配列３、４、５のＦＡＭ修飾していない増幅用核酸（増幅用核酸Ａ３、Ａ４、Ａ５）と、各々の増幅用核酸Ａに対応する塩基配列１９、２０、２１の増幅用核酸Ｂ（増幅用核酸Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１）を用いた。また、増幅用核酸Ａ３、Ｂ１９に対応するプライマーＡ１（塩基配列２２）、プライマーＢ１（塩基配列２３）、増幅用核酸Ａ４、Ｂ２０に対応するプライマーＡ２（塩基配列２４）、プライマーＢ１（塩基配列２３）、増幅用核酸Ａ５、Ｂ２１に対応するプライマーＡ３（塩基配列２５）、プライマーＢ１（塩基配列２３）をそれぞれ用いた。前記の増幅用核酸Ａ、Ｂをそれぞれ終濃度５ｎＭ、前記の２組ずつのプライマーをそれぞれ終濃度５００ｎＭ、塩基配列９の切断用核酸を終濃度５ｎＭ、塩基配列１０の標的核酸を終濃度１ｎＭ、インターカレータ蛍光色素のＥｖａＧｒｅｅｎ（ＢＴＩ  Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．）を終濃度１Ｘになるように、内部標準蛍光色素ＡＴＴＯ５３２（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ）を終濃度５０ｎＭ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲプレミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｍ０４９６Ｌ）を１倍量になるように混合し、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ）を用いて、９５℃で３０秒間熱した後に、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間を０〜４０サイクルの条件で繰り返した。その後、ＰＣＲ後の溶液を１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（ナカライテスク、１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＳｏｌｕｔｉｏｎをＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１０倍希釈）で２０倍希釈して、蛍光マクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＭＸ、ＢｉｏＴｅｋ）で蛍光強度を測定し、ＥｖａＧｒｅｅｎ／ＡＴＴＯ５３２の蛍光強度比を算出した。その結果、標的核酸のない時と比較して、ある時の方が蛍光強度比が高く、標的核酸の有無を検出できることを確認した（図１２）。次に、増幅用核酸Ａ４、Ｂ２０の組み合わせの条件に関して、標的核酸の終濃度を０〜１０ｎＭに変化させた時の蛍光強度比も評価した。その結果、標的核酸濃度に応じて、蛍光強度比が増加しており、標的核酸の定量的な検出ができる可能性があることを確認した（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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