(57)【要約】      （修正有）【課題】新規のhENaCαβγ活性化剤、それを含有する疾患等の治療剤、塩味増強剤の提供。【解決手段】下記式で表される3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩を有効成分とするhENaCαβγの活性化剤。2020050654.tif 000015【選択図】図２
2020050654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-
3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミド
と同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩を有効成分とするhENaC αβγ活性化剤。
【化１】
2020050654.tif 000014
【請求項２】
前記化合物が食品、天然抽出物由来の成分である請求項１に記載のhENaC αβγ活性化剤。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれかに記載のhENaC αβγ活性化剤を含有する疾患等の治療剤。
【請求項４】
請求項１又は２のいずれかに記載のhENaC αβγ活性化剤を含有する塩味増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮性Na+チャンネルhENaC αβγの活性化剤、及び、これを含有する疾患等の治療剤並びに塩味増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮性ナトリウムチャンネル（epithelial sodium channel ENaC）は、ENaC / degenerinファミリーに属する非電位依存性のNaイオンチャネルである（非特許文献１）。
【０００３】
ENaCを構成する各々のサブユニットは二回膜貫通領域を持ち、αβγもしくはδβγの三量体で機能する。ENaCαβγは、主に胃、腎臓、結腸に発現し、ENaCδβγは、主に大脳皮質や小脳、海馬などの神経組織や精巣で発現する（非特許文献2-4）。また、舌ではENaC αβγが、鼓索神経が投射する前方部に発現し、低濃度の塩味受容（＜150 mM NaCl）に関与する（非特許文献5）。また塩味増強効果及び、塩味阻害効果を示す根拠の１つとしてhumanENaC(hENaC) αβγを活性化または、阻害する現象が広く用いられている（先行特許文献1-5）。
【０００４】
医薬分野では、hENaC αβγの遺伝的変異による疾患として、高Na+血症や腎疾患、リルド症候群等が挙げられる。これらの治療としてhENaCαβγの阻害剤であるアミロライドなどの使用が挙げられる(非特許文献6、7)
【０００５】
一方で偽性アルドステロン症1型や新生児呼吸窮迫症候群の治療には、hENaC αβγを活性化させる活性化剤が考えられる。化合物S3969は、hENaC αβγ活性化剤（アクチベーター）として知られており、上記の疾患の治療薬として期待されている(非特許文献6)。
【０００６】
しかしながら、S3969を除いてhENaCαβγを活性化させる小分子の報告例はない。
【０００７】
S3969の構造からインドール環がhENaCを活性化させる１つの部分構造であると考えられているが、インドール環を除くhENaC活性化能を持つ部分構造に関する報告例はない。
【０００８】
そこで、hENaC αβγを活性化させる小分子や部分構造を探索、開発することで、hENaC αβγ活性化剤（アクチベーター）が、hENaC αβγが関連する遺伝的疾患を緩和するばかりでなく、口腔内の塩味受容を修飾し、呈味性を大きく向上させることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2017-217005
【特許文献２】特許第5674984号
【特許文献３】特開2016-161281
【特許文献４】特表2009-539377
【特許文献５】特表2008-529987
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Canessa, C. M., Horisberger, J. D., & Rossier, B. C. (1993). Epithelial sodium channel related to proteins involved in neurodegeneration. Nature, 361(6411), 467.
【非特許文献２】Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., et al. (1995). Molecular cloning and functional expression of a novel amiloride-sensitive Na+ channel. Journal of Biological Chemistry, 270(46), 27411-27414.
【非特許文献３】Yamamura, H., Ugawa, S., Ueda, T., et al. (2004). Protons activate the δ-subunit of the epithelial Na+ channel in humans. Journal of Biological Chemistry, 279(13), 12529-12534.
【非特許文献４】Staruschenko, A., Adams, E., Booth, R. E., et al. (2005). Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophysical journal, 88(6), 3966-3975.
【非特許文献５】Chandrashekar, J., Kuhn, C., Oka, Y., et al. (2010). The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature, 464(7286), 297.
【非特許文献６】Baker, E., Jeunemaitre, X., Portal, A. J., et al. (1998). Abnormalities of nasal potential difference measurement in Liddle's syndrome. The Journal of clinical investigation, 102(1), 10-14.
【非特許文献７】Lu, M., Echeverri, F., Kalabat, D., Laita, B., Dahan, D. S., Smith, R. D., ... & Hwang, N. (2008). Small molecule activator of the human epithelial sodium channel. Journal of Biological Chemistry, 283(18), 11981-11994.
【非特許文献８】Swamidass SJ, Baldi P.(2007) Mathematical correction for fingerprint similarity measures to improve chemical retrieval J. Chem. Inf. Model., 2007, 47 (3), pp 952-964
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、優れたhENaC αβγの活性化作用を有する化合物を見出すことを課題とした。また、当該化合物を含有し、医薬分野での疾患等の治療剤、また食品分野での塩味増強剤を提供する事を課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、鋭意研究の結果、3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩にhENaCを活性化させる作用があることを見出した。
すなわち、本願第一の発明は、
“下記式（１）で表される3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩を有効成分とするhENaC αβγの活性化剤
【００１３】
【化１】
2020050654.tif 000003
。”である。
【００１４】
さらに、前記化合物が食品、天然抽出物由来の成分であることが好ましい。
すなわち、本願第二の発明は、
“前記化合物が食品、天然抽出物由来の成分である請求項１に記載のhENaC αβγ活性化剤。”、である。
【００１５】
次に、本願の化合物又はその塩は、疾患等の治療薬としても利用できる。
すなわち、本願第三の発明は、
“請求項１又は２のいずれかに記載のhENaC αβγ活性化剤を含有する疾患等の治療剤。”
である。
【００１６】
次に、本願の化合物又はその塩は、塩味増強剤としても利用できる。
すなわち、本願第四の発明は、
“請求項１又は２のいずれかに記載のhENaC αβγ活性化剤を含有する塩味増強剤。”、である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、hENaC αβγの活性化剤が提供される。また、本発明の3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩を有効成分とする活性化剤を含有することで、hENaC αβγが原因と考えられる遺伝子疾患の治療剤が提供される。さらに、塩味受容体でもあるhENaC αβγ活性化による塩味増強剤が提供される。
【００１８】
また3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミド及び3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似した構造がhENaC αβγを活性化するという構造情報は、研究開発のツールとして有用であり、医薬、食品産業及び健康科学のさらなる発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１における膜電位感受性色素を用いた3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドのhENaC αβγ活性化効果の濃度応答曲線を示す。
【図２】実施例１及び実施例２の方法を示した模式図である。
【図３】実施例２の結果であり、膜電位感受性色素を用いた3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミド及びこれに類似構造を示す化合物（３種）によるhENaC αβγ活性を示す。
【図４】実施例２の結果であり、膜電位感受性色素を用いた3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似構造を示す化合物（３種）によるhENaC αβγ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．hENaC αβγの活性化剤  
本発明にいう、hENaC αβγとは、ヒトの遺伝子human ENaCα（あるいはSCNN1a）, human ENaCβ（あるいはSCNN1b）human ENaCγ（あるいはSCNN1g）にコードされ生体膜上で、αβγの三量体を形成し、上皮性ナトリウムチャネルの性質を示す膜タンパク質のことをいう。
また、その活性化剤とは、hENaC αβγで構成される三量体膜タンパク質の孔の開口構造に影響を与え、hENaCを介して流入する主にナトリウムイオンの流入効率を上げる性質をもつ化合物をいう。
【００２１】
２．本発明のhENaC αβγ活性化能を有する化合物
本発明においては、3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一若しくは類似構造を有する化合物又はその塩、を対象とする。
本3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドは、以下の構造を有する。
【００２２】
【化２】
2020050654.tif 000004
当該化合物は、ベンゾチオフェノン環を有することを特徴とする。本発明者は、多くの化合物のスクリーニングの結果、本化合物にhENaC αβγの活性化能を有することを見出した。
さらに、当該化合物に類似する構造を有する化合物を検索し、複数のhENaC αβγの活性化能を有する化合物を見出した。さらに、本発明はこれらの化合物の塩も意図する。
【００２３】
３．類似構造を有する化合物
本発明にいう“3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似構造を有する化合物とは、ChemBioFinder Ultra 12.0 (CambridgeSoft製)による類似検索で60%以上の類似度を示すものを指すものとする。
60%以上の類似度を持つ化合物のサンプリングに関して、化学構造情報のデータベース管理ソフトであるChemBioFinder Ultra 12.0 を用いることができる。検索対象とする化合物ライブラリーは、大学、種々の研究機関等が所有する化合物ライブラリーを用いることができる。
【００２４】
3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの類似化合物の定義方法を下記に示す。即ち、3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの構造情報をChemBioFinder Ultra 12.0を用いて数値化された記述子に変換し、類似度を計算することができる。ChemBioFinder では、Unity 2D Fingerprint、Similog key、MaCCS keyのといった代表的な構造キー特徴を組み合わせ、改変した独自の構造キーを用いて化合物の構造情報を記述子への変換が行う事が可能である。
化合物の構造情報を類似性評価尺度については、可換性を持つTanimoto類似性判定法を用いた（非特許文献８）。Tanimoto類似判定法は、Tanimoto係数を用いてQ（クエリ）、T（ターゲット）が以下の数式：
【００２５】
【数１】
2020050654.tif 000005
を満たすものを60%以上の類似度と定義できる。ここで示さるQ（クエリ）、T（ターゲット）は、それぞれ3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似構造を持つ化合物の記述子を示す。
【００２６】
３．食品、天然抽出物由来の成分
本発明のhENaC αβγの活性化能を有する化合物（3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと同一又は類似構造を持つ化合物）は、食品、天然物由来成分として得ることができる。
【００２７】
４．疾患等の治療剤
本発明のhENaC αβγの活性化剤は、疾患等の治療剤として利用することができる。具体的には、腎臓におけるナトリウムイオンの再吸収が損なわれてしまう疾病である偽性低アルドステロン症I型、肺では、細胞内ナトリウムイオンを増加させることによる肺水腫、新生児呼吸症候群等の疾患に利用することができる（非特許文献７）。
【００２８】
５．塩味増強剤
本発明のhENaC αβγの活性化剤は塩味増強剤として利用できる。すなわち、塩味増強剤とは、食塩の塩味を強く感じさせる作用を発揮することをいう。当該塩味増強剤は、飲食品等に幅広く利用することができる。
本発明の塩味増強剤は、上記化合物のみの形態で提供されるものであっても、固形組成
物または液体組成物の形態により提供されるものであってもよい。組成物として提供され
る場合は、塩味増強作用を妨げない範囲において、必要に応じて、賦形剤、色素、香料等
の飲食品の製造に使用可能な添加剤を含有してもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【００３０】
［実施例１］培養細胞を用いた3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドによるhENaC αβγ活性の結果。
3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドによるhENaC αβγの活性化能を見るために、hENaC αβγを発現するHEK293T細胞を用いたセルベースアッセイ法で濃度依存曲線を作成した（図１）。
【００３１】
＜方法＞
プラスミド及び発現タンパク質
実験手法は、特開2017-217005に準じて行った。即ちヒトhumanENaC αβγ（hENaC αβγ）をHEK293T細胞に発現させるために、EF1αプロモーターを持つプラスミドベクター pEAK10（EdgeBiosystem社）を用いた。pEAK10 のマルチクローニングサイト間にhENaC α、hENaC β、hENaC γのcDNA領域を挿入した発現コンストラクトをα：β：γ＝1：1：1の割合でミックスし、1 μg/35mm dishの比率で遺伝子導入を行った。 hENaC αβγの各遺伝子配列を示すaccession numberと挿入した制限酵素サイトを表1に示す。遺伝子導入試薬にはLipofectamine LTX Reagent with PLUS＆ Reagent（Thermo Fisher社）を用いた。
【００３２】
遺伝子導入した細胞を96ウェルプレート(black wall, CellBIND surface; CORNING)に播き、24から72時間CO2インキュベータ内(37℃, 5％ CO2)、10μMアミロライド（SIGMA）と10 ％FBS(GIBCO)を含むDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地 SIGMA)で培養した。
【００３３】
FlexStation 3を用いたセルベースアッセイ
FlexStation 3(Molecular Devices)は分注機能付きのプレートリーダーである。これを用いて膜電位感受性色素を負荷した細胞にリガンド溶液を投与し、その蛍光強度の経時的変化を測定した。96ウェルプレートに播種した細胞の培養液は、測定前にアッセイバッファー液で洗浄し、置換した。アッセイバッファー液の組成は、130 mM NaCl、10 mM Dグルコース、10 mM HEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2であり、NaOHを用いてpH 7.4に調整した。
【００３４】
アッセイは27 ℃で行い、530 nmで励起した時のMembrane potential assay kit blue(R8042 Molecular Devices社)の蛍光(560 nm)を2秒に1度測定した。測定開始から20秒後に2倍の濃度に洗浄と同じバッファーで調製したリガンド溶液を細胞に投与し、120秒間にわたり経時的な蛍光強度変化を測定した。Membrane potential assay kit blue に2.5mM プロベネシドを添加することでより測定結果が安定させることができた。
【００３５】
測定結果の模式図と活性化能の評価方法を図２に示す。 FlexStation 3によって得られた蛍光の経時的変化から、リガンド溶液投与後、100秒時点でのリガンド添加効果による蛍光強度の値と100秒時点でのビークル（リガンドを調整したアッセイバッファー液）の蛍光強度の差分から delta relative fluorescence units(ΔRFU)値を算出してこれを細胞の応答値と定義した。
【００３６】
リガンド溶液の濃度は、終濃度が10nM、50nM、100nM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、75μM、100μM、300μM、500μM、1mMの12点（各n=6）を測定した。
【００３７】
【表１】
2020050654.tif 000006
【００３８】
─結果─
図２における“sample”に示すように、3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドには、各種濃度を添加後、100秒時点で3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの添加効果による蛍光強度の値と100秒時点でのビークル（リガンドを調整したアッセイバッファー液）との蛍光強度の差分である delta relative fluorescence units(ΔRFU)値が濃度依存的に大きな値を得られたことから、hENaC αβγ に活性化能が有ることが示された。
また3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドのEC50は、95.0±21.0 μMであり、最大効果濃度（Emax）は、ΔRFU値で928±67.8であった。
【００３９】
図１に3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの濃度応答曲線を示す。
【００４０】
[実施例２]   膜電位感受性色素を用いた3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似する構造をもつ化合物によるhENaC αβγ活性
【００４１】
＜方法＞
3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似構造をもつとする化合物は、ChemBioFinder Ultra 12.0 (CambridgeSoft製)による類似検索で60%以上の類似度を示すものを指す。
【００４２】
60%以上の類似度を持つ化合物のサンプリングに関して、化学構造情報のデータベース管理ソフトであるChemBioFinder Ultra 12.0 を用いた。検索対象とした化合物ライブラリーは、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリーを用いた。3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの類似化合物の定義方法を下記に示す。即ち、3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドの構造情報をChemBioFinder Ultra 12.0を用いて数値化された記述子に変換し、類似度を計算した。ChemBioFinder では、Unity 2D Fingerprint、Similog key、MaCCS keyのといった代表的な構造キー特徴を組み合わせ、改変した独自の構造キーを用いて化合物の構造情報を記述子への変換が行う事が可能である。
【００４３】
化合物の構造情報を類似性評価尺度については、可換性を持つTanimoto類似性判定法を用いた（非特許文献８）。Tanimoto類似判定法は、Tanimoto係数を用いてQ（クエリ）、T（ターゲット）が以下の数式：
【００４４】
【数２】
2020050654.tif 000007
を満たすものを60%以上の類似度と定義した。ここで示さるQ（クエリ）、T（ターゲット）は、それぞれ3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドと3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドに類似構造を持つ化合物の記述子を示す。
【００４５】
このようにして選択した化合物を以下に示す。
(((1,1-ジオキシベンゾ[ベータ]チオフェン-2-イル)メトキシ)カルボニル)-Ｌ-アスパラギン、
【００４６】
【化３】
2020050654.tif 000008
【００４７】
1-(4-(3-((ベンゾ[ベータ]チオフェン-2-イルメチル)(メチル)アミノ)-2-エチルベンゾ[1,2-アルファ]ピリジン-6-カルボニル)ピペラジン-1-イル)エタン-1-オン
【００４８】
【化４】
2020050654.tif 000009
【００４９】
N-(2-(ターシャリーブチルアミノ)-2-オキシオエチル)-3-クロロ-N-エチルベンゾ[ベータ]チオフェン-2-カルボキシアミド
【００５０】
【化５】
2020050654.tif 000010
【００５１】
N-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキシエチル)-N-エチル-4-フルオロベンゾ[ベータ]チオフェン-2-カルボキシアミド
【００５２】
【化６】
2020050654.tif 000011
【００５３】
2-ベンジル-N-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキシエチル)-N-エチルベンザミド
【００５４】
【化７】
2020050654.tif 000012
【００５５】
1-(4-クロロフェニル)-N-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキシオエチル)-N-エチルシクロブタン-1-カルボキシアミド
【００５６】
【化８】
2020050654.tif 000013
プラスミド及び発現タンパク質
実験方法及び材料は、
【００５７】
から[００２３]に記載した方法と同様の方法及び材料を用いた。
【００５８】
＜評価方法＞
前述のFlexStation 3によって得られた蛍光の経時的変化から、リガンド溶液投与後後、100秒時点での蛍光強度の値と計測開始時点での値の差分を算出してこれを細胞の応答値と定義した。また必要な場合は、対照として計測した1μMのS3969の細胞の応答値を1としたときの相対応答値として、すべての細胞の応答値を換算した。評価スコア0.18以上を活性ありとした。評価方法の模式図を図２に示す。尚、本評価方法は、特開2017-217005と同様に記載されているものと同様の方法である。
【００５９】
─結果─
図３及び図４に示す3-クロロ-Ｎ-(2-((1,1-ジオキシドテトラハイドロチオフェン-3-イル)アミノ)-2-オキソエチル)-Ｎ-エチルベンゾ[β]チオフェン-2-カルボキシアミドとその類似構造を持つ6化合物には、hENaCαβγに対して活性化能が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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