(57)【要約】【課題】本発明は、クッシング病の治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】クッシング病治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ８（ＵＳＰ８）タンパク質とＳｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３（ＳＨ３）ドメインタンパク質とを接触させる工程（ａ）と、工程（ａ）の後に、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定する工程（ｂ）と、を含み、前記被験物質の存在下における前記複合体の形成量が、前記被験物質の非存在下における前記複合体の形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、クッシング病治療剤であることを示す、スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クッシング病治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ８（ＵＳＰ８）タンパク質とＳｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３（ＳＨ３）ドメインタンパク質とを接触させる工程（ａ）と、
工程（ａ）の後に、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定する工程（ｂ）と、を含み、
前記被験物質の存在下における前記複合体の形成量が、前記被験物質の非存在下における前記複合体の形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、クッシング病治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＳＨ３ドメインタンパク質がｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＳＴＡＭ１）タンパク質又はｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２（ＳＴＡＭ２）である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＵＳＰ８タンパク質又はＵＳＰ８タンパク質をコードする核酸と、ＳＨ３ドメインタンパク質又はＳＨ３ドメインタンパク質をコードする核酸とを含む、クッシング病治療剤のスクリーニング用キット。
【請求項４】
ＵＳＰタンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質との結合を阻害する結合阻害物質。
【請求項５】
ＵＳＰ８タンパク質のＳＨ３ドメイン結合モチーフに結合する特異的結合物質である、請求項４に記載の結合阻害物質。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の結合阻害物質からなるクッシング病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クッシング病治療剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、クッシング病治療剤のスクリーニング方法、スクリーニング用キット、結合阻害物質、クッシング病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クッシング病は、脳下垂体腫瘍から副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が過剰に分泌され、それに応じて副腎皮質から糖質コルチコイドが過剰に分泌されて起こる疾患である。クッシング病を発症すると、免疫力低下、高血圧、糖尿病などの合併症のリスクが上昇する。
【０００３】
クッシング病を発症した患者は、治療をしないと５年生存率が５０％まで低下する。クッシング病は、厚生労働省の指定難病の一つとされている。クッシング病の国内推定患者数は約５００人であり、希少疾患である。
【０００４】
クッシング病におけるＡＣＴＨ過剰分泌の原因メカニズムはこれまで不明で、特異的な治療薬は開発されていない。現在は、高度な医療技術を要する腫瘍切除が主な治療法となっている。
【０００５】
発明者らは、クッシング病の下垂体腫瘍のゲノム解析を行い、最も高頻度に変異が見られる遺伝子としてｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ８（ＵＳＰ８）を見出した（例えば、非特許文献１を参照）。ＵＳＰ８の遺伝子変異は主にクッシング病の下垂体腫瘍で報告されており、他の腫瘍のゲノム解析ではほとんど見出されていない。
【０００６】
ユビキチン化はタンパク質の翻訳後修飾の一種であり、標的タンパク質のリジン残基またはＮ末端のアミノ基に、ユビキチンと呼ばれる７６アミノ酸のタンパク質のＣ末端が共有結合する反応である。
【０００７】
逆に、ユビキチンを取り外す酵素を脱ユビキチン化酵素と呼ぶ。脱ユビキチン化酵素はヒトには約１００種類存在することが知られており、ＵＳＰ８はその一つである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Reincke M et al., Mutations in the deubiquitinase gene USP8 cause Cushing's disease., Nat Genet., 47(1):31-38, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、クッシング病の発症機構は不明であった。また、クッシング病の治療剤は知られていない。そこで、本発明は、クッシング病の治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］クッシング病治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ＵＳＰ８タンパク質とＳｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３（ＳＨ３）ドメインタンパク質とを接触させる工程（ａ）と、工程（ａ）の後に、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定する工程（ｂ）と、を含み、前記被験物質の存在下における前記複合体の形成量が、前記被験物質の非存在下における前記複合体の形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、クッシング病治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［２］前記ＳＨ３ドメインタンパク質がｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＳＴＡＭ１）タンパク質又はｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２（ＳＴＡＭ２）である、［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］ＵＳＰ８タンパク質又はＵＳＰ８タンパク質をコードする核酸と、ＳＨ３ドメインタンパク質又はＳＨ３ドメインタンパク質をコードする核酸とを含む、クッシング病治療剤のスクリーニング用キット。
［４］ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質との結合を阻害する結合阻害物質。
［５］ＵＳＰ８タンパク質のＳＨ３ドメイン結合モチーフに結合する特異的結合物質である、［４］に記載の結合阻害物質。
［６］［４］又は［５］に記載の結合阻害物質からなるクッシング病治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、クッシング病の治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１が結合することを示す模式図である。
【図２】野生型又は変異型のＵＳＰ８と、ＳＴＡＭ１の結合を、免疫沈降とイムノブロットにより解析した結果である。
【図３】変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１の結合における、ＳＢＭの役割を解析した結果である。
【図４】変異型ＵＳＰ８によるＶ１ｂＲの存在量の制御を解析した結果である。
【図５】（ａ）は、健常者における、野生型ＵＳＰ８、１４−３−３タンパク質、Ｖ１ｂＲの関係を示す模式図である。（ｂ）は、クッシング病患者における、変異型ＵＳｐ８、ＳＴＡＭ１、Ｖ１ｂＲの関係を示す模式図である。
【図６】（ａ）は、ＧＳＴを融合させたＳＨ３ドメインの発現を確認した結果である。（ｂ）は、変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１の結合がＧＳＴ−ＳＨ３により阻害されることを示す結果である。（ｃ）ＳＴＡＭ１が発現したことを示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図１（ａ）は、野生型ＵＳＰ８と１４−３−３タンパク質が結合することを示す模式図である。図１（ａ）中、１，２，３はそれぞれＳＨ３ドメイン結合モチーフ（ＳＨ３−ｄｏｍａｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ，ＳＢＭ）を示し、４は１４−３−３結合モチーフを示し、５は脱ユビキチン化酵素活性ドメインを示す。
【００１４】
図１（ａ）に示すように、野生型ＵＳＰ８タンパク質は、１４−３−３結合モチーフと、３個のＳＢＭ（ＳＢＭ１〜３）を有している。以下、ＵＳＰ８タンパク質が有する３個のＳＢＭをＮ末端から順に、ＳＢＭ１、ＳＢＭ２、ＳＢＭ３とよぶ。
【００１５】
野生型ＵＳＰ８タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。野生型ＵＳＰ８タンパク質は、１４−３−３結合モチーフを介して、１４−３−３タンパク質と結合する。１４−３−３結合モチーフは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、７１５〜７２０番目のアミノ酸配列からなる。配列番号２は、１４−３−３結合モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
図１（ａ）に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、ＳＢＭ１は、４０５〜４１３番目のアミノ酸配列からなり、ＳＢＭ２は４４０〜４４８番目のアミノ酸配列からなり、ＳＢＭ３は７３８〜７４６番目のアミノ酸配列からなる。ＳＢＭ３は、１４−３−３結合モチーフ４の近傍に位置する。
【００１７】
配列番号３はＳＢＭ１のアミノ酸配列を示し、配列番号４はＳＢＭ２のアミノ酸配列を示し、配列番号５はＳＢＭ３のアミノ酸配列を示す。
【００１８】
クッシング病患者の腫瘍において見出される変異は、１４−３−３結合モチーフに存在することが多い。クッシング病患者のＵＳＰ８タンパク質に見出される変異としては、例えば、７２０番目のアミノ酸がプロリンからアルギニンに置換する変異（以下、Ｐ７２０Ｒという）、７１８番目のセリンがプロリンに置換する変異（以下、Ｓ７１８Ｐという）、７１８番目のセリンが欠失する変異（以下、ΔＳ７１８という）等が知られている。
【００１９】
図１（ｂ）は、変異型ＵＳＰ８タンパク質とｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＳＴＡＭ１）タンパク質が結合することを示す模式図である。１〜３、５は図１（ａ）において上述したものと同様である。６はＳｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３（ＳＨ３）ドメインであり、７はユビキチン結合領域であり、８は変異した１４−３−３結合モチーフである。
【００２０】
発明者らは、野生型のＵＳＰ８は１４−３−３結合タンパク質と結合するが、クッシング病患者の変異型ＵＳＰ８は、変異した１４−３−３結合モチーフを有し、１４−３−３結合タンパク質が結合しないことを明らかにした。
【００２１】
図１（ｂ）に示すように、発明者らは、変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合モチーフの近傍にあるＳＢＭ３を介して、ＳＨ３ドメインを有するＳＴＡＭ１と結合することを見出した。ＳＴＡＭ１はユビキチン結合領域７を有している。
【００２２】
本明細書において、変異を有さない正常なＵＳＰ８タンパク質を野生型ＵＳＰ８タンパク質という場合がある。また、クッシング病患者において見出される変異を有するＵＳＰ８タンパク質を変異型ＵＳＰ８タンパク質という場合がある。また、本明細書において、ＵＳＰ８タンパク質をＵＳＰ８、ＳＴＡＭ１タンパク質をＳＴＡＭ１という場合がある。
【００２３】
［スクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、クッシング病治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質とを接触させる工程（ａ）と、工程（ａ）の後に、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定する工程（ｂ）と、を含み、前記被験物質の存在下における前記複合体の形成量が、前記被験物質の非存在下における前記複合体の形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、クッシング病治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００２４】
上述のように、クッシング病患者の腫瘍のゲノムは、その約半数が、ＵＳＰ８タンパク質をコードする遺伝子内に変異を有している。これらの変異によって、１４−３−３タンパク質結合モチーフ内のアミノ酸は、置換するか欠失することが知られている。
【００２５】
ＳＨ３ドメインとは、プロリンを多く含む、タンパク質の相互作用に関わるドメインである。本明細書において、ＳＨ３ドメインタンパク質とは、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質のことを指す。
【００２６】
実施例において後述するように、クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８タンパク質は、１４−３−３タンパク質結合モチーフ内の変異により、１４−３−３タンパク質との結合能が低下する。その結果、変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３タンパク質結合モチーフ近傍に位置するＳＢＭ３を介して、ＳＨ３ドメインを有するＳＴＡＭ１タンパク質との結合能が亢進する。
【００２７】
本実施形態において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等に由来する物質が挙げられる。
【００２８】
本実施形態において、変異型ＵＳＰ８タンパク質は、クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８タンパク質であってもよい。上述の変異型ＵＳＰ８タンパク質としては、例えば、Ｐ７２０Ｒ、Ｓ７１８Ｐ又はΔＳ７１８を有する変異型ＵＳＰ８タンパク質であってもよいが、これに限定されない。
【００２９】
（第１実施形態）
第１実施形態のスクリーニング方法によれば、別々に調製したＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を用いて、工程（ａ）を試験管内で行うことができる。
【００３０】
上述したように、試験管内には１４−３−３タンパク質が存在しないため、被験物質の非存在下で、野生型及び変異型のＵＳＰ８タンパク質は、ＳＨ３ドメインタンパク質と複合体を形成することができる。本実施形態において用いられるＵＳＰタンパク質は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。
【００３１】
第１実施形態のスクリーニング方法では、まず、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を別々に調製する。これらを用いて、被験物質の存在下で、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質とを接触させる工程（ａ）を行う。続いて、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定する工程（ｂ）を行う。
【００３２】
工程（ｂ）において、複合体の形成量は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、ＦＲＥＴ法（蛍光共鳴移動法）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等により測定することができるが、これに限定されない。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ法により、例えば、次のように複合体の形成量を測定することができる。まず、ＵＳＰ８タンパク質を吸着させた固相を用意する。続いて、被験物質の存在下で、この固相に対し、ＳＨ３ドメインタンパク質、又はタグを付加したＳＨ３ドメインタンパク質を接触させる。
【００３４】
続いて、酵素標識された、ＳＨ３ドメインタンパク質を認識する抗体、又はタグを認識する抗体を添加する。さらに、酵素の適当な基質を加えて、酵素と基質の反応による発色や発光の強度を測定し、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定することができる。
【００３５】
測定する発色や発光の強度を増強し、測定の感度を向上させるために、ＳＨ３ドメインタンパク質を認識する一次抗体、又はタグを認識する一次抗体と、酵素で標識された二次抗体を用いてもよい。
【００３６】
また、固相に吸着させるタンパク質は、ＳＨ３ドメインタンパク質であってもよい。この固相に対し、ＵＳＰ８タンパク質又はタグを付加したＵＳＰ８タンパク質を接触させた後、酵素標識された、ＵＳＰ８タンパク質を認識する抗体又はタグを認識する抗体を用いて、複合体の形成量を測定してもよい。
【００３７】
ＦＲＥＴ法により、例えば、次のように複合体の形成量を測定することができる。ＵＳＰ８タンパク質及びＳＨ３ドメインタンパク質に異なるタグを付加する。各々のタグは、ドナー蛍光団又はアクセプター蛍光団のいずれかで標識されている。被験物質の存在下で、タグが付加された、ＵＳＰ８タンパク質及びＳＨ３ドメインタンパク質を溶液内で混合する。
【００３８】
溶液に励起光を照射し、アクセプター蛍光団から発せられた蛍光の強度を測定する。ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質が複合体を形成している場合、励起光による光エネルギーは、ドナー蛍光団からアクセプター蛍光団へ移動し、蛍光が発せられる。蛍光強度を測定することにより、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質の複合体の形成量を測定することができる。
【００３９】
免疫沈降法により、例えば、次のように複合体の形成量を測定することができる。まず、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を、別々に調製する。ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質はタグが付加されていてもよい。
【００４０】
被験物質の存在下で、調製したＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を接触させ、ＵＳＰ８タンパク質を認識する抗体により免疫沈降を行う。続いて、イムノブロット法等により、ＳＨ３ドメインタンパク質を認識する抗体を用いて、得られた免疫沈降物に含まれるＳＨ３ドメインタンパク質の量を測定し、複合体の形成量を測定してもよい。
【００４１】
あるいは、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を接触させ、ＳＨ３ドメインタンパク質を認識する抗体により免疫沈降を行う。続いて、イムノブロット法等により、ＵＳＰ８タンパク質を認識する抗体を用いて、得られた免疫沈降物に含まれるＵＳＰ８タンパク質の量を測定し、複合体の形成量を測定してもよい。
【００４２】
表面プラズモン共鳴法により、例えば、次のように複合体の形成量を測定することができる。まず、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を、別々に調製し、ＵＳＰ８タンパク質を基板上に固定する。
【００４３】
被験物質の存在下で、基板上にＳＨ３ドメインタンパク質を含む溶液を流し、基板上の質量変化を測定し、複合体の形成量を測定してもよい。
【００４４】
あるいは、ＳＨ３ドメインタンパク質を基板上に固定し、ＵＳＰ８タンパク質を含む溶液を流す。続いて、基板上の質量変化を測定し、複合体の形成量を測定してもよい。
【００４５】
工程（ｂ）により複合体の形成量を測定した結果、被験物質の存在下における複合体の形成量が、被験物質の非存在下における複合体の形成量より有意に減少していた場合、被験物質はクッシング病治療剤であるということができる。
【００４６】
（第２実施形態）
第２実施形態のスクリーニング方法によれば、大腸菌等の原核生物を宿主として、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させることにより、工程（ａ）を宿主内で行うことができる。
【００４７】
大腸菌を宿主として用いる場合、大腸菌内には１４−３−３結合タンパク質が存在しないため、被験物質の非存在下で、野生型又は変異型のＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質は複合体を形成することができる。
【００４８】
被験物質の存在下で大腸菌を培養し、大腸菌内で野生型又は変異型のＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させ、複合体を形成させて、工程（ａ）を行う。
【００４９】
本実施形態における工程（ｂ）では、第１実施形態において上述した、ＦＲＥＴ法、免疫沈降法等を用いることができる。工程（ｂ）により複合体の形成量を測定した結果、被験物質の存在下における複合体の形成量が、被験物質の非存在下における複合体の形成量より有意に減少していた場合、被験物質はクッシング病治療剤であるということができる。
【００５０】
（第３実施形態）
第３実施形態のスクリーニング方法によれば、真核生物を宿主として、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させることにより、工程（ａ）を真核生物の宿主内で行うことができる。宿主細胞としては、例えば、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を用いることができるが、これに限定されない。
【００５１】
真核生物の細胞内には１４−３−３結合タンパク質が存在するため、真核生物の細胞内では、野生型ＵＳＰ８タンパク質はＳＨ３ドメインタンパク質と複合体を形成することができないが、変異型ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質は複合体を形成することができる。
【００５２】
被験物質の存在下で宿主を培養し、宿主内で変異型ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させ、複合体を形成させて、工程（ａ）を行う。本実施形態における工程（ｂ）では、第１実施形態において上述した、ＦＲＥＴ法、免疫沈降法等を用いることができる。
【００５３】
工程（ｂ）により複合体の形成量を測定した結果、被験物質の存在下における複合体の形成量が、被験物質の非存在下における複合体の形成量より有意に減少していた場合、被験物質はクッシング病治療剤であるということができる。
【００５４】
（第４実施形態）
第４実施形態のスクリーニング方法によれば、無細胞翻訳系でＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させることにより、工程（ａ）を行うことができる。無細胞翻訳系としては、特に限定されず、例えば、ウサギ網状赤血球を用いた翻訳系、コムギ胚芽を用いた翻訳系、昆虫細胞を用いた翻訳系、大腸菌を用いた再構成翻訳系等が挙げられる。
【００５５】
無細胞翻訳系に１４−３−３タンパク質が含まれない場合、共発現させるＵＳＰ８タンパク質は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。無細胞翻訳系に１４−３−３タンパク質が含まれる場合、変異型のＵＳＰ８タンパク質を共発現させる。
【００５６】
被験物質の存在下で、無細胞翻訳系を用いてＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を共発現させることにより、工程（ａ）を行う。本実施形態における工程（ｂ）では、第１実施形態において上述した、ＦＲＥＴ法、免疫沈降法等を用いることができる。
【００５７】
工程（ｂ）により複合体の形成量を測定した結果、被験物質の存在下における複合体の形成量が、被験物質の非存在下における複合体の形成量より有意に減少していた場合、被験物質はクッシング病治療剤であるということができる。
【００５８】
実施例において後述するように、ＳＴＡＭ１タンパク質はＳＨ３ドメインを有し、変異型のＵＳＰ８タンパク質と複合体を形成する。上述のＳＨ３ドメインタンパク質は、ＳＴＡＭ１であってもよい。
【００５９】
ＳＴＡＭ１タンパク質のオルソログであるｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２（ＳＴＡＭ２）とＳＴＡＭ１は、いずれも、Ｖｐｓ２７／Ｈｒｓ／ＳＴＡＭドメイン、ユビキチン結合ドメイン、ＳＨ３ドメインを有する。また、ＳＴＡＭ２はＳＴＡＭ１と５３％のアミノ酸配列の同一性を示す。
【００６０】
したがって、ＳＴＡＭ２タンパク質は、ＳＴＡＭ１タンパク質と同様に、変異型ＵＳＰ８タンパク質と複合体を形成すると考えられる。上述のＳＨ３ドメインタンパク質は、ＳＴＡＭ２であってもよい。
【００６１】
［キット］
１実施形態において、本発明は、ＵＳＰ８タンパク質又はＵＳＰ８タンパク質をコードする核酸と、ＳＨ３ドメインタンパク質又はＳＨ３ドメインタンパク質をコードする核酸とを含む、クッシング病治療剤のスクリーニング用キットを提供する。
【００６２】
例えば、本実施形態のキットに付属した、ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を接触させて複合体を形成させ、上述した方法により複合体の形成量を測定し、クッシング病治療剤のスクリーニングを行うことができる。ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質はペプチドタグが付加されたものであってもよい。
【００６３】
あるいは、本実施形態のキットに付属した、ＵＳＰ８タンパク質をコードする核酸とＳＨ３ドメインタンパク質をコードする核酸を用いて、大腸菌等の宿主内で発現させることができる。
【００６４】
ＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を発現させる発現ベクターとしては、プロモーターの下流に、ＵＳＰ８タンパク質又はＳＨ３ドメインタンパク質をコードする遺伝子断片が挿入されたものであってもよい。
【００６５】
あるいは、発現ベクターは、ＵＳＰ８タンパク質又はＳＨ３ドメインタンパク質のＮ末端又はＣ末端にペプチドタグが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子断片が挿入されたものであってもよい。
【００６６】
発現させたＵＳＰ８タンパク質とＳＨ３ドメインタンパク質を接触させて複合体を形成させ、上述した方法により、複合体の形成量を測定し、クッシング病治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【００６７】
［結合阻害物質］
１実施形態において、本発明は、ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質との結合を阻害する結合阻害物質を提供する。本実施形態の結合阻害物質は、例えば、上述したスクリーニング方法により得ることができる。
【００６８】
実施例において後述するように、変異型ＵＳＰ８タンパク質はＳＨ３ドメイン結合モチーフを介して、ＳＴＡＭ１タンパク質のＳＨ３ドメインと結合する。そして、実施例において後述するように、ＧＳＴタグを付加したＳＨ３ドメインは、ＵＳＰ８タンパク質のＳＨ３ドメイン結合モチーフに結合して、変異型ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質の結合を阻害する。
【００６９】
すなわち、ＳＨ３ドメイン結合モチーフに結合する特異的結合物質は、ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質の結合を阻害する結合阻害物質であるということができる。
【００７０】
特異的結合物質としては、天然化合物、合成化合物、既存薬、代謝物等の低分子化合物、抗体、抗体断片、又はアプタマー等が挙げられる。
【００７１】
実施例において後述するように、変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３タンパク質が結合できず、その結果、ＳＴＡＭ１と結合する。ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１は、バソプレシン受容体を脱ユビキチン化して安定化させて、細胞内のバソプレシン受容体の存在量を上昇させる。その結果、クッシング病を引き起こすと考えられる。
【００７２】
ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質の結合を阻害する結合阻害物質は、ＵＳＰ８タンパク質とＳＴＡＭ１タンパク質の複合体の形成を阻害することができる。このため、上述の結合阻害物質は、クッシング病治療剤として利用することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
以下、Ｐ７２０Ｒ、Ｓ７１８Ｐ又はΔＳ７１８を有する変異型ＵＳＰ８タンパク質を、それぞれ、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）、ＵＳＰ８（Ｓ７１８Ｐ）、ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）という。
【００７５】
［実験例１］
クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１をＨＥＫ２９３細胞に発現させ、変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１との結合における１４−３−３結合モチーフの役割を、免疫沈降実験により解析した。
【００７６】
上述したように、クッシング病の患者において、ＵＳＰ８の１４−３−３結合モチーフのアミノ酸配列は高頻度で変異している。これらの変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１との結合能を解析した。１４−３−３結合モチーフに変異を有する変異型ＵＳＰ８としては、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）、ＵＳＰ８（Ｓ７１８Ｐ）、ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）を用いた。
【００７７】
結合能の解析においては、タグを付加した解析対象の各タンパク質をＨＥＫ２９３細胞に発現させ、免疫沈降により解析した。タグとしては、ｍｙｃとＦＬＡＧを用いた。結果を図２に示す。図２は、変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１を免疫沈降させ、イムノブロットにより解析した結果を示す。
【００７８】
図２中、ＷＴは野生型ＵＳＰ８を示し、Ｐ７２０Ｒ、Ｓ７１８Ｐ、ΔＳ７１８は変異型ＵＳＰ８を示す。また、ＩＰは免疫沈降に用いた抗体が認識するペプチドタグを示し、ＩＢはイムノブロットにおいて用いた抗体が認識するペプチド又はタンパク質を示す。
【００７９】
その結果、レーン２、４〜６に示されるように、正常な野生型ＵＳＰ８に比較して、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）、ＵＳＰ８（Ｓ７１８Ｐ）、ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）は、ＳＴＡＭ１との結合能が亢進していることが明らかになった。
【００８０】
また、ＧＦＰ−Ｄｉｆｏｐｅｉｎの細胞への発現によって、野生型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１との結合能は亢進することが明らかになった。ここで、ＧＦＰ−Ｄｉｆｏｐｅｉｎは、１４−３−３結合モチーフと１４−３−３タンパク質との結合を阻害するタンパク質である。ＤｉｆｏｐｅｉｎのＣＡＳ番号は３９６８３４−５８−５である。
【００８１】
この結果から、野生型ＵＳＰ８は、１４−３−３タンパク質との結合が阻害されることによって、ＳＴＡＭ１との結合能が亢進することが示唆された。
【００８２】
［実験例２］
変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１をＨＥＫ２９３細胞に発現させ、変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１との結合おけるＳＨ３ドメイン結合モチーフ（ＳＢＭ）の役割を、免疫沈降実験により解析した。
【００８３】
ＳＢＭ３の近傍には１４−３−３結合モチーフが存在する。また、ＳＴＡＭ１はＳＨ３ドメインを有している。
【００８４】
ここで、発明者らは、クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合タンパク質と結合しにくくなり、その結果、ＳＢＭ３を介してＳＴＡＭ１と結合するという仮説を立てた。発明者らは、この仮説を次に示すように検証した。
【００８５】
ここで、ＳＢＭはＳＨ３ドメインと結合するが、ＳＢＭドメインのコンセンサス配列中に点変異を導入することにより、ＳＢＭとＳＨ３ドメインの結合能は低下することが知られている。変異型ＳＢＭ１の配列は配列番号６に示され、変異型ＳＢＭ２の配列は配列番号７に示され、変異型ＳＢＭ３の配列は配列番号８に示される。
【００８６】
変異型ＵＳＰ８として、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）を解析に用いた。また、野生型ＵＳＰ８又はＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）に、ＳＢＭ１と２、ＳＢＭ２と３、ＳＢＭ１と３、又はＳＢＭ１〜３に上述の変異を導入したタンパク質についても解析を行った。ここで、例えば、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）のＳＢＭ１と２に変異を有するタンパク質を、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ１，２）と表記する。
【００８７】
まず、ｍｙｃタグを付加した変異型ＵＳＰ８と、ＦＬＡＧタグを付加したＳＴＡＭ１をＨＥＫ２９３細胞に発現させて、これらの結合能を解析した。抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降し、抗ＳＴＡＭ１抗体を用いてイムノブロット解析を行った。
【００８８】
結果を図３に示す。図３は、ＳＢＭに変異を有するＵＳＰ８とＳＴＡＭ１との結合を、免疫沈降とイムノブロットにより解析した結果である。
【００８９】
図３中、ＩＰは免疫沈降に用いた抗体が認識するペプチドタグを示し、ＩＢはイムノブロットにおいて用いた抗体が認識するペプチド又はタンパク質を示す。
【００９０】
ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）のＳＢＭ３が変異した、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ１，３）、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ２，３）、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ１〜３）は、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）と比較して、ＳＴＡＭ１との結合能が顕著に低下していた。
【００９１】
対して、ＳＢＭ３が変異していないＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ１，２）は、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）と比較して、ＳＴＡＭ１との結合能が同等であった。
【００９２】
これらの結果から、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）とＳＴＡＭ１との結合において、ＳＢＭ３が重要であることが明らかになった。すなわち、ＳＴＡＭ１のＳＨ３ドメインは、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）のＳＢＭ３を介して結合することが示唆された。
【００９３】
［実験例３］
クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８のターゲットの候補である、バソプレシン受容体（Ｖ１ｂＲ）について解析した。変異型ＵＳＰとＶ１ｂＲをＨＥＫ２９３細胞に共発現させて、Ｖ１ｂＲの存在量の変化を解析した。
【００９４】
結果を図４に示す。図４は、変異型ＵＳＰとＶ１ｂＲをＨＥＫ２９３細胞に発現させて、Ｖ１ｂＲの存在量をイムノブロットにより解析した結果である。
【００９５】
図４中、ＳＢＭ３ｍｕｔは、ＳＢＭ３に変異を有するＵＳＰ８を示す。変異させたＳＢＭ３のアミノ酸配列は配列番号８に示される。また、図４中、ＩＢはイムノブロットにおいて用いた抗体が認識するペプチド又はタンパク質を示す。
【００９６】
その結果、レーン１と３に示されるように、野生型ＵＳＰ８とＶ１ｂＲを共発現させた場合と比較して、クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）とＶ１ｂＲを共発現させた場合においては、Ｖ１ｂＲの存在量が上昇することが明らかになった。
【００９７】
この結果は、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）によりＶ１ｂＲの脱ユビキチン化が進行し、プロテアソーム依存的なＶ１ｂＲの分解が抑制されて、Ｖ１ｂＲの存在量が上昇することを示唆している。
【００９８】
さらに、レーン３と４に示されるように、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）とＶ１ｂＲを共発現させた場合と比較して、ＳＢＭ３が変異したＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ，ＳＢＭ３）とＶ１ｂＲを共発現させた場合、Ｖ１ｂＲの存在量は低下することが明らかになった。
【００９９】
この結果は、ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）によるＶ１ｂＲ存在量の上昇には、ＳＢＭ３が必要であることを示している。ここで、ＳＴＡＭ１はユビキチンに結合することが知られている。ＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）によるＶ１ｂＲの脱ユビキチン化には、ＳＴＡＭ１がＳＢＭ３を介してＵＳＰ８（Ｐ７２０Ｒ）と結合することが必要であることが示唆された。
【０１００】
以上の結果を小括すると、次に示すようなメカニズムにより、クッシング病が発症すると考えられる。図５（ａ）に示すように、野生型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合モチーフを介して１４−３−３タンパク質と結合する。このとき、野生型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合モチーフの近傍にあるＳＢＭ３を介して、ＳＴＡＭ１と結合することができない。
【０１０１】
図５（ｂ）に示すように、変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合モチーフに変異を有し、１４−３−３タンパク質と結合しない。このとき、変異型ＵＳＰ８は、１４−３−３結合モチーフの近傍にあるＳＢＭ３を介して、ＳＴＡＭ１と結合する。ユビキチン結合領域を有するＳＴＡＭ１と、脱ユビキチン化酵素活性ドメインを有する変異型ＵＳＰ８の複合体は、Ｖ１ｂＲの脱ユビキチン化を促進させる。その結果、Ｖ１ｂＲのプロテアソーム依存的な分解が抑制され、Ｖ１ｂＲの存在量は上昇する。Ｖ１ｂＲを介したシグナル伝達が亢進すると、副腎皮質刺激ホルモンの分泌が亢進し、クッシング病が発症する。
【０１０２】
［実験例４］
クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８に対し、ＳＨ３ドメインを有するペプチドを添加し、ＳＴＡＭ１とＵＳＰ８の複合体の形成に与える影響について解析した。
【０１０３】
まず、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）と、配列番号９に示されるＳＴＡＭ１のＳＨ３ドメインを有するペプチドと、ＧＳＴタグを融合させたタンパク質（ＧＳＴ−ＳＨ３）を大腸菌に発現させた。配列番号９に示されるアミノ酸配列のうち、ＳＴＡＭ１のＳＨ３ドメインのアミノ酸配列は配列番号１０に示される。
【０１０４】
引き続いて、大腸菌の破砕液をグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させ、吸着物を還元型グルタチオンにより溶出し精製した。結果を図６（ａ）に示す。
【０１０５】
図６（ａ）は、ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＳＨ３をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＣＢＢ染色した結果である。その結果、ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＳＨ３は十分に精製されていることが確認された。
【０１０６】
次に、ＨＥＫ２９３細胞にｍｙｃタグを付加した、ＵＳＰ８又はクッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）と、ＦＬＡＧタグを付加したＳＴＡＭ１を共発現させた。
【０１０７】
続いて、ＨＥＫ２９３細胞を破砕して得た細胞抽出液を、抗ＦＬＡＧ抗体結合ビーズと４℃で２時間反応させ免疫沈降を行った。その後、ビーズを洗浄し、ＦＬＡＧペプチドを用いてＦＬＡＧ−ＳＴＡＭ１およびそれに結合するタンパク質を溶出した。この免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロットを行った。
【０１０８】
図６（ｂ）は、免疫沈降物をイムノブロットにより解析した結果である。その結果、レーン１と２に示されるように、変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）は野生型ＵＳＰ８に比べてＳＴＡＭ１の結合量が亢進していることが確認された。また、レーン３と４に示されるように、変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）にＧＳＴ−ＳＨ３を添加すると、変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）に結合するＳＴＡＭ１が減少することが明らかになった。
【０１０９】
図６（ｃ）は、細胞抽出液に含まれるＳＴＡＭ１をイムノブロットにより解析した結果である。その結果、野生型ＵＳＰ８と変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）は同程度発現していることが確認された。
【０１１０】
これらの結果から、ＳＨ３ドメインは変異型ＵＳＰ８（ΔＳ７１８）とＳＴＡＭ１の相互作用を阻害すること示された。すなわち、ＵＳＰ８のＳＢＭに結合する物質は、クッシング病患者において見出される変異型ＵＳＰ８とＳＴＡＭ１の複合体の形成を阻害することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明によれば、クッシング病の治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【符号の説明】
【０１１２】
１…ＳＢＭ１、２…ＳＢＭ２、３…ＳＢＭ３、４…１４−３−３結合モチーフ、
５…脱ユビキチン化酵素活性ドメイン、６…ＳＨ３ドメイン、７…ユビキチン結合領域、
８…変異した１４−３−３結合モチーフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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