(57)【要約】【課題】  複数の卵巣組織断片を移植する際に、卵巣組織断片の集塊を防ぎ血管新生を促進させ、生着率を向上させること。【解決手段】  卵巣組織を細切することにより形成された複数の卵巣組織断片を哺乳動物に移植する際に、ゲル濃度１％程度のコラーゲンゲルを用い、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入する注入工程と、その後、複数の前記卵巣組織断片を前記コラーゲンゲル内に挿入する移植工程と、によって卵巣組織断片を移植する。このとき、複数の卵巣組織断片の夫々を予めコラーゲンゲルで被包するようにしても良い。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣組織を細切することにより形成された複数の卵巣組織断片を哺乳動物に移植する方法であって、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入する注入工程と、その後、複数の前記卵巣組織断片を前記コラーゲンゲル内に挿入する移植工程と、を含むことを特徴とする卵巣組織の移植方法。
【請求項２】
卵巣組織を細切することにより形成された複数の卵巣組織断片を哺乳動物に移植する方法であって、複数の前記卵巣組織断片を夫々コラーゲンゲルで被包する被包工程と、その後、該被包した卵巣組織断片を移植する移植工程とを含むことを特徴とする卵巣組織の移植方法。
【請求項３】
前記移植工程は、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入し、その後に前記被包工程で被包した複数の前記卵巣組織断片を当該コラーゲンゲル内に挿入することを特徴とする請求項２に記載の卵巣組織の移植方法。
【請求項４】
前記被包工程は、複数の前記卵巣組織断片の夫々を被包したコラーゲンゲルがゲル化してきた後に、複数の被包された前記卵巣組織断片の全体をさらにコラーゲンゲルで被包することを特徴とする請求項２に記載の卵巣組織の移植方法。
【請求項５】
前記移植工程の後、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを5,000〜10,000IUの範囲で投与する工程を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の移植方法。
【請求項６】
前記コラーゲンゲルは全体として5,000〜10,000IUのヒト絨毛性ゴナドトロピンが含入されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の移植方法。
【請求項７】
哺乳動物の卵巣内の卵胞を活性化させる卵胞活性化方法であって、
（１）哺乳動物から卵巣を摘出する工程と、
（２）摘出した前記卵巣を複数の卵巣組織断片に細切する工程と、
（３）前記卵巣組織断片の卵胞を培養する工程と、
（４）移植予定部位にコラーゲンゲルを注入する工程と、
（５）培養した複数の前記卵巣組織断片を前記コラーゲンゲル内に挿入する工程と、
を含むことを特徴とする卵胞活性化方法。
【請求項８】
哺乳動物の卵巣内の卵胞を活性化させる卵胞活性化方法であって、
（１）哺乳動物から卵巣を摘出する工程と、
（２）摘出した前記卵巣を複数の卵巣組織断片に細切する工程と、
（３）前記卵巣組織断片の卵胞を培養する工程と、
（４）培養した複数の前記卵巣組織断片の夫々をコラーゲンゲルで被包する工程と、
（５）被包した複数の前記卵巣組織断片を患者へ移植する工程と、
を含むことを特徴とする卵胞活性化方法。
【請求項９】
前記工程（５）は、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入し、その後に前記工程（４）で被包した卵巣組織断片を当該コラーゲンゲル内に挿入することを特徴とする請求項８に記載の卵胞活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣組織の移植方法および卵胞活性化方法に係り、特に複数の卵巣組織断片を移植する際に集塊形成を防止し血管新生を促進させることのできる卵巣組織の移植方法および卵胞活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者は一旦閉経した患者の卵巣内に残存している原始卵胞を人為的に活性化させ、卵胞の発育を再生させることで、閉経した患者が自らの卵子で妊娠することを可能とする卵胞活性化療法を開発した。本法では、腹腔鏡下に卵巣摘出し、細切したのち体外培養を行い、再度腹腔鏡下に卵管漿膜下に卵巣組織断片を移植する。その後、移植した卵巣組織で卵胞が発育し、採卵後に体外受精胚移植による不妊治療を行なうという方法である。（例えば、特許文献１、非特許文献１を参照）。
【０００３】
しかしながら、その治療効果については改善の余地があり、特に移植卵巣の生着を改善する必要があった。
【０００４】
従来、卵巣移植は卵胞活性化療法以外に、がん・生殖医療でも実施されてきた。すなわち、卵子毒性を示す化学療法や放射線療法などを実施する前に凍結保存した卵巣を、原疾患が寛解した後に移植を行なうというものである。この場合の卵巣は閉経した患者の卵巣とは異なり、卵巣内には多数の正常卵胞が存在するはずであり、卵巣移植後の卵胞発育、その後の体外受精胚移植の治療成績は良好であることが期待されたが、実際は正常卵胞の数から期待されるほど十分な成績は得られず、その一因として生着率が悪いことが考えられていた。
【０００５】
より具体的には、これまで卵巣移植は、卵管漿膜下、後腹膜、残存卵巣などに、卵巣組織断片を静置または縫合して縫い付けるなどの方法により、腹腔内の組織に物理的に接着させる方法が採られてきた。また卵胞活性化療法においては、原始卵胞の活性化を行なった卵巣組織断片を、腹腔鏡下に卵管漿膜下および卵巣内へ自家移植を行なっている。この際、限局した場所に複数の卵巣組織断片を移植するため、複数の卵巣組織断片が集塊を形成する。
【０００６】
図１１〜図１３に従来方法による卵巣組織断片移植の実施例を示す。
図１１，図１２はマウス卵巣を１〜５個独立に互いに離して移植した場合と、互いに密着するようにまとめてホストマウスの卵巣を腎皮膜下に移植した場合の実施例である。この結果、卵巣を互いに密着するように移植した場合は、独立に互いに離して移植した場合に比べて顕著な卵巣重量の低下と排卵数の低下、さらに成熟卵子数の低下、変性卵子数の増加が認められた。その変化は、限られた空間により互いに密着するように移植した卵巣の数に依存して現れた。
【０００７】
また、図１３に示すように、腎皮膜下移植後の卵巣を用いて血管新生に関与するマーカー遺伝子の発現変化を調べたところ、虚血状態により誘導されるHif1，VEGFの発現が増加し、血管網を構成する内皮細胞のマーカーであるCD31の発現が減少したことから虚血により血管網の形成が低下していることが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０４３５６８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kazuhiro Kawamura et al.「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)」, October 22, 2013, no. 43, vol.110, pp.17474-17479
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
卵巣組織断片の生着には血管新生の促進が必要不可欠であり、上記実施例に示すように従来の方法では移植卵巣組織の血管新生を促進することは困難である。移植卵巣組織が集塊となってしまえば、集塊の中心部分の血管新生は阻害され、生着率の低下を招くことになる。
【００１１】
本発明はかかる従来の事情に対処してなされたものであり、複数の卵巣組織断片を移植する際に、卵巣組織断片の集塊を防ぎ血管新生を促進させ、生着率を向上させることのできる卵巣組織の移植方法および卵胞活性化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本開示に係わる卵巣組織の移植方法は、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入する注入工程と、その後、複数の前記卵巣組織断片を前記コラーゲンゲル内に挿入する移植工程と、を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、別の開示による卵巣組織の移植方法は、卵巣組織を細切することにより形成された複数の卵巣組織断片を哺乳動物に移植する方法であって、まず複数の前記卵巣組織断片を夫々コラーゲンゲルで被包する被包工程を実行し、その後、該被包した複数の卵巣組織断片を移植する工程、または、移植予定部位にコラーゲンゲルを注入した後に該被包した複数の卵巣組織断片を当該コラーゲンに挿入する工程を実行して、卵巣組織断片同士が接着しないようにする。
【００１４】
本開示に係わる卵胞活性化方法は、マウスやヒトを含む哺乳動物の卵巣内の卵胞を活性化させる卵胞活性化方法であって、
（１）哺乳動物から卵巣を摘出する工程と、
（２）摘出した前記卵巣を複数の卵巣組織断片に細切する工程と、
（３）前記卵巣組織断片の卵胞を培養する工程と、
（４）移植予定部位にコラーゲンゲルを注入する工程と、
（５）培養された複数の前記卵巣組織断片を前記コラーゲンゲル内に挿入する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、別の開示による卵胞活性化方法は、マウスやヒトを含む哺乳動物の卵巣内の卵胞を活性化させる卵胞活性化方法であって、
（１）哺乳動物から卵巣を摘出する工程と、
（２）摘出した前記卵巣を複数の卵巣組織断片に細切する工程と、
（３）前記卵巣組織断片の卵胞を培養する工程と、
（４）培養した複数の前記卵巣組織断片の夫々をコラーゲンゲルで被包する工程と、
（５）被包した複数の前記卵巣組織断片を患者へ移植する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１６】
ここで、卵巣組織移植のコラーゲンゲルは、ヒト由来コラーゲン、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲンを含む。
【００１７】
コラーゲンゲルは、Nippiゲルの場合は、ウシ真皮由来タイプＩ（ペプシン処理）０．５〜１ｍｇ／ｍｌ、またアテロコラーゲンゲル（ウシ真皮由来）の場合は、リン酸緩衝溶液１〜２％（容量比）程度が好ましい。溶媒は、細胞培養液を用いることができるがこれに限られるものではない。また容量は３０〜５０μｌが好ましく、コラーゲンゲルの液体を注入後体温でゲル化させる。
【００１８】
移植方法としては、まず、各卵巣組織断片（概略１〜２ｍｍ四方）をコラーゲンゲルで包む。そして当該コラーゲンゲルがある程度ゲル化した時点で、複数の卵巣組織断片（例えばヒトの場合は３０個程度）全体をコラーゲンゲルで包み込み、全体がゲル化した時点で移植作業を行なう。これにより、個々の卵巣組織断片間の距離がコラーゲンゲルの皮膜により保たれた状態で複数の卵巣組織断片を効率よく移植することが可能になる。なお、移植前に全ての卵巣組織断片をコラーゲンゲルで包み込むことに代えて、患者の卵巣定着場所（例えば卵管漿膜下、残存卵巣）にまずコラーゲンゲルを注入しておき、その後個々の卵巣組織断片を当該注入したコラーゲンゲル内に挿入するようにしても良い。全卵巣組織断片を挿入後、挿入部を少ししごいて馴染ませることにより、各卵巣組織断片間の距離が十分に保たれる。
【００１９】
また、上述した条件のコラーゲンゲルを使用することにより、卵巣組織断片の移植時には卵巣組織断片が互いに密着することなく移植でき、さらに血管新生が最もアクティブになる時期である、移植後の数日間はコラーゲンゲルが完全には体内に吸収されないので、それまでの間卵巣組織断片の密着を抑制して血管新生を促進させることができる。
【００２０】
また、卵巣組織断片の移植と共にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を投与するのが好ましい。一回の投与量は5,000〜10,000ＩＵの範囲とし、移植後2-3日目に所定回数（例えば１回）投与する。
【００２１】
投与方法としては、hCGは卵巣または子宮内膜に作用するため、注射により全身の循環血液を介して卵巣または子宮内膜に届かせる方法があるが、これに限られず、hCGを上記コラーゲンに含ませて、卵巣や子宮内膜あるいはこの近傍に投与することもより高い効果が期待できる。勿論、hCG含有のコラーゲンの使用と注射によるhCGの投与とを併用することも可能である。
【発明の効果】
【００２２】
以上の如く、本発明によれば、複数の卵巣組織断片を移植する際に、コラーゲンゲルで被包して各卵巣組織断片が互いに密着し合わないように移植することにより、卵巣組織断片の集塊を防ぎ血管新生を促進させ、生着率を向上させることができる。また、hCG投与との相乗効果によりさらに生着率を高めることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施例１の効果の説明図であり、コラーゲンゲルの被包の有無による排卵重量および排卵数を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例１の効果の説明図であり、コラーゲンゲルの被包の有無によるＣＤ３１遺伝子発現量を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１の効果の説明図であり、コラーゲンゲルの被包の有無による２次卵胞以上の各卵胞ステージにおける卵胞数の割合（of total > secondary follicles）を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例２の効果の説明図であり、コラーゲンゲルの被包の有無による卵巣重量および排卵数を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２の効果の説明図であり、コラーゲンゲルの被包の有無による２次卵胞以上の各卵胞ステージにおける卵胞数の割合（of total > secondary follicles）示すグラフである。
【図６】本発明の実施例３の効果の説明図であり、卵巣腎皮膜下へのhCG投与の有無による卵巣重量および排卵数を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３の効果の説明図であり、卵巣腎皮膜下へのhCG投与の有無による２次卵胞以上の各卵胞ステージにおける卵胞数の割合（of total > secondary follicles）を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例４の効果の説明図であり、子宮における各性周期でのLHR遺伝子発現量を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例４の効果の説明図であり、子宮における各性周期でのVEGF遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例５の効果の説明図であり、子宮でのhCG投与の有無による卵巣重量および排卵数を示すグラフである。
【図１１】比較例による、卵巣を離して移植した場合と、まとめて移植した場合の卵巣重量を示すグラフである。
【図１２】比較例による、卵巣を離して移植した場合と、まとめて移植した場合の排卵数を示すグラフである。
【図１３】比較例による、卵巣を離して移植した場合と、まとめて移植した場合の血管新生因子の遺伝子発現変化を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例５による、卵巣をまとめて移植した場合のコラーゲンゲルの被包またはhCG投与の有無、およびコラーゲンゲルの被包とhCG投与の併用時の卵巣重量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に本発明に係る卵巣組織の移植方法および卵胞活性化方法の実施の形態を説明する。発明者は、移植卵巣組織の生着率が悪い原因として、移植された卵巣組織断片が互いに密着し合い、血管新生を妨げていると考え、動物試験を用いてその仮説を検証した。
【００２５】
マウス卵巣を５つまとめて腎皮膜下に移植したグループと、５つをそれぞれ離して腎皮膜下に移植したグループにおいて移植２週間後における卵巣重量、卵巣１個あたりの排卵数を比較した。
【００２６】
また、それぞれのグループにおいて血管新生マーカーであるHif1，VEGF，CD31の移植卵巣における発現量を測定した。
【００２７】
これらの研究成果から、移植卵巣が互いに密着するようまとめて卵巣移植を行なうと、卵巣重量が顕著に低下し、排卵数が減少することが明らかとなった。また、血管新生因子の遺伝子発現変化から、高密度の移植が卵巣の虚血をもたらし、代償性にVEGFの増加が起こるが、その効果は不十分で血管新生は著名に減少することが示唆された。
【００２８】
従って、移植卵巣の生着率を改善するためには、移植された卵巣組織断片が互いに密着し合わないように、移植する際にコラーゲンゲルで被包し、互いが密着しないように移植し、卵巣重量、血管新生因子の発現変化、排卵数、各卵胞ステージの卵胞数を測定し、ゲル併用卵巣移植が有用か否かを評価した。
【００２９】
VEGFは血管新生を誘導する重要な因子であるが、上記の実験結果から、誘導されるVEGFの産生量では、実際に血管を新生するには不十分であると考えられる。
【００３０】
そこで、血管新生を誘導するためには、VEGFの直接投与が有効と考えられるが、VEGFは半減期が短く頻回の投与が必要であること、ヒトに直接投与可能な薬剤としてのVEGFが存在しないことが問題である。
【００３１】
不妊治療の際の排卵誘発時に使用されるヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）は、半減期が長く、卵巣顆粒膜細胞に作用して長期にVEGFの発現を促進することが知られており、その結果卵巣過剰刺激症候群を引き起こす場合がある。
【００３２】
そこで、卵巣組織移植前にhCGを投与することで、内因性のVEGFを増加させ、虚血による血管新生障害を改善できるかどうかを検証した。この際に、疾患によっては、卵巣内にはほとんど顆粒膜細胞が存在しないものも多いため、卵巣以外のVEGF産生部位として子宮内膜を発案し、その効果を評価した。
【００３３】
（実施例１）図１〜図３
本実施例では、移植された卵巣組織断片が互いに密着し合わないように、移植する際にコラーゲンゲルで被包した上で、互いに密着しないようにして移植し、その効果について評価した。
【００３４】
本実施例で使用したコラーゲンゲルの条件は以下の通りである。
品名：コラーゲンゲル
成分：ウシ真皮由来タイプＩ（酸処理）DMEMに溶解
ゲル濃度（最終）：１％
ゲル形成量（移植時に入れる量）：３０〜５０μl
上記のコラーゲンゲルをマウスの腎皮膜下に針付シリンジで注入した後に卵巣を当該部に挿入することで、卵巣がゲル化したコラーゲンゲルに被包された状態を作り出した。
【００３５】
移植２週間後の卵巣重量と排卵数を測定したところ、卵巣重量はゲルなしのコントロールと比較して１．５倍、排卵数は３倍に回復した（図１）。
【００３６】
さらに卵巣のCD31の遺伝子発現を調べたところ、発現量はゲル併用移植卵巣において有意に増加したことから、血管網形成が回復していることが示された（図２）。
【００３７】
また移植卵巣における二次卵胞期以降の各発育段階の卵胞を測定したところ、後期二次卵胞（Late Sec）、胞状卵胞（Antral）、排卵前卵胞（PO）の卵胞数は、ほぼコントロール（間隔を離して移植したもの）と同数まで増加しており、卵胞発育が改善したことが示された（図３）。
【００３８】
（実施例２）図４，図５
ヒト体内への注入が許可されているアテロコラーゲンゲルを用いて、その他は実施例１と同一条件で実験を行なった。その結果、アテロコラーゲンゲルを用いた場合も実施例１と同様に移植卵巣の生着が向上することが示された（図４，図５）。
品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント
成分：１％アテロコラーゲン（ウシ真皮由来）のリン酸緩衝溶液
ゲル濃度（最終）：１％
ゲル形成量（移植時に入れる量）：３０〜５０μl
【００３９】
以上のごとく、実施例１、実施例２では卵巣移植について良好の結果が得られた。しかしながら、コラーゲンゲルとして、Corning高濃度（HC）マトリゲルマトリックスグロースファクターリデュースト（Corning，Matrigelは米国Corning社の登録商標）、成分：ラミニン６１％，コラーゲンＩＶ３０％，エンタクチン７％を用いて行なった実験は、ゲル形成時の硬度が緩すぎて移植部位への挿入ができなかった。
【００４０】
また、コラーゲンゲルの代わりに、アガロースゲル、成分：アガロースを用いて、ゲル濃度０．１％，０．５％，１．０％，１．５％についてそれぞれ実験を行なったが、ゲル形成時の濃度が０．１％，０．５％ではゲル硬度が緩すぎて移植部位への挿入ができず、濃度が１．０％，１．５％ではゲル硬度が固すぎて挿入後に移植片を被包しなかった。
【００４１】
（実施例３）図６，図７
次に、移植卵巣の血管新生に対するhCGの効果を検証した。マウス卵巣を１個または５個互いに密着するように５個まとめてホストマウスの卵巣腎皮膜下に移植した。また、５個互いに密着するように移植したマウスに卵巣移植後１時間の時点で５IUのhCGを投与した。
移植２週間後における卵巣重量、卵巣１個あたりの排卵数は、hCG投与群において有意に増加した（図６）。
【００４２】
また、卵巣移植後にhCG投与したマウスから移植卵巣を採取し、二次卵胞期以降の各発育段階の卵胞数を測定したところ、後期二次卵胞（Late Sec）、胞状卵胞（Antral）、排卵前卵胞（PO）は増加しており、卵胞発育が改善したことが示された（図７）。
【００４３】
（実施例４）図８，図９
さらに、全ての患者に有用となる方法の開発を目指して、子宮内膜におけるhCGによるVEGFの発現誘導を試みた。マウス子宮もhCG受容体（LHR）を発現しており、その各性周期における発現量は、発情前期および発情期で高く、発情期後期から減少し、発情間期ではほとんど発現が認められなかった（図８）。またhCGによる子宮のVEGF発現誘導は、LHRの発現量と相関し、発情前期および発情期で高値を示した（図９）。
【００４４】
（実施例５）図１０
子宮でのhCGによるVEGF発現誘導の移植卵巣の生着への効果を調べるため、発情期に卵巣を摘出したホストマウスに対して、卵巣を１個または５個互いに密着するよう移植し、移植後にhCGを投与した。その結果、移植２週間後における卵巣重量、卵巣１個当たりの成熟卵子数は、hCG投与群において有意に増加した（図１０）。さらにゲルとhCG投与併用するとそれぞれ単独使用群と比較して卵巣重量は増加した（図１４）。
【００４５】
上記の各実施例では、まず卵巣定着場所（移植予定部位）にコラーゲンゲルを注入し、その後、複数の卵巣組織断片（概略１〜２mm四方）を当該注入したコラーゲンゲル内に挿入するようにした。これにより、各卵巣組織断片は、注入したコラーゲンゲル内に分散し、各卵巣組織断片は互いに密着することなく移植することが可能となった。好ましくは、コラーゲンゲルがある程度固まって、卵巣組織断片がほぼ動かなくなるまで、コラーゲンゲルを押し広げたり、挿入部を少ししごいて馴染ませるようにするのが良い。
【００４６】
なお、まず各卵巣組織断片をコラーゲンゲルで被包してゲル化させておき、その後、卵巣定着場所にコラーゲンゲルを注入した後に前記被包した個々の卵巣組織断片を当該注入したコラーゲンゲル内に挿入するようにしても良い。これにより、被包された各卵巣組織断片は、注入したコラーゲンゲル内で一定の距離を保つので、効率的に卵巣組織断片の密着を防ぎ移植作業の省力化を図ることができる。
【００４７】
ちなみに、予めコラーゲンゲルで被包した個々の卵巣組織断片の全体をコラーゲンゲルで包み込み、全体がゲル化した時点で当該コラーゲンゲルで被われた複数の卵巣組織断片を一度あるいは数回に分けて移植するようにしても同様な効果が期待できる。しかしながら、コラーゲンゲルを予め卵巣定着場所に注入した後、当該コラーゲンゲル注入のための切開創を通して個々の卵巣組織断片を当該コラーゲンゲル内に挿入する方が、切開創の大きさを変えないようにできるので好ましい。
【００４８】
以上、本実施の形態によれば、卵巣移植の際の移植卵巣のコラーゲンゲルによる被包およびhCG投与は、移植卵巣における血管新生を改善し、卵巣の生着を向上させることができる。
【００４９】
卵胞活性化方法に関する詳細な考察については、上記特許文献１および非特許文献１を参照し、この開示内容はその全てが参照として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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