(57)【要約】【課題】被験体のＲＮＡを高精度に解析する方法の提供。【解決手段】被験体から採取したＲＮＡ含有皮膚表上脂質を０℃以下で保存することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後にマルチプレックスＰＣＲにより増幅し、得られた反応産物を精製することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取したＲＮＡ含有皮膚表上脂質を０℃以下で保存することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。
【請求項２】
被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにかけること、および
該ＰＣＲの反応産物を精製すること、
を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。
【請求項３】
前記マルチプレックスＰＣＲにおけるアニーリングおよび伸長反応の温度が６２℃±１℃である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写での伸長反応が４２℃±１℃で６０分間以上行われる、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡが、該被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを分離することにより調製される、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記被験体の皮膚表上脂質が、０℃以下で保存されていたものである、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の皮膚、皮膚以外の部位、または全身の状態の解析方法。
【請求項８】
前記解析が赤味、敏感肌またはアトピー性皮膚炎を有するまたは有さない皮膚の検出であるか、あるいは皮脂量または皮膚水分量が多いまたは少ない皮膚の検出である、請求項７記載の解析方法。
【請求項９】
前記解析が皮膚状態の予測である、請求項７記載の解析方法。
【請求項１０】
前記皮膚状態の予測が、皮膚物性の予測、皮膚の目視または触診評価の予測、または皮脂組成の予測である、請求項９記載の解析方法。
【請求項１１】
前記解析が皮膚の累積紫外線曝露時間の予測である、請求項７記載の解析方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体に対する皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤または注射剤の効果または効能の評価方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の血中成分濃度の解析方法。
【請求項１４】
前記血中成分がホルモン、インスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰ、またはＬＤＬ−コレステロールである、請求項１３記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法、および該核酸を用いた被験体の皮膚の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の分子（核酸、タンパク質、代謝物等）の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。なかでも、核酸分子を用いた解析は、網羅的な解析方法が確立されていることから一度の解析で豊富な情報を得られること、および一塩基多形やＲＮＡ機能などに関する多くの研究報告に基づいて解析結果の機能的な紐付けが容易であることといった利点を有する。
【０００３】
生体の様々な組織の中でも、皮膚は、外界と接していることから、侵襲性低く生体試料を採取できる組織として注目されている。皮膚からの非侵襲的な核酸の採取および解析法として、湿らせたコットンスワブ（綿球）で皮膚表面を拭うことによりヒト皮膚サンプルを採取し、ＲＮＡプロファイリングを行なうことが報告されている（非特許文献１）。特許文献１には、皮膚表上脂質から被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡ等の核酸を分離し、生体の解析用の試料として用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報第２０１８／００８３１９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Forensic Sci Int Genet，2012, 6(5):565-577
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法、および該核酸を用いた被験体の皮膚の解析方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、被験体から採取したＲＮＡ含有皮膚表上脂質を０℃以下で保存することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法を提供する。
また本発明は、被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにかけること、および
該ＰＣＲの反応産物を精製すること、
を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法を提供する。
さらに本発明は、前記方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の皮膚、皮膚以外の部位、または全身の状態の解析方法を提供する。
さらに本発明は、前記方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体に対する皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤または注射剤の効果または効能の評価方法を提供する。
さらに本発明は、前記方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の血中成分濃度の解析方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、被験体の皮膚表上脂質に含まれる皮膚細胞に由来する核酸試料を安定的に保存することができる。したがって、本発明は、核酸試料を用いた解析（例えば、遺伝子解析、診断等）の精度を向上させる。さらに、本発明の方法で調製された皮膚細胞由来の核酸試料に含まれる特定マーカー遺伝子由来の成分の濃度は、血中に存在する各種成分の濃度に相関するため、該核酸試料を用いることで非侵襲的な血中成分濃度測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＳＳＬ中ＲＮＡの安定性に対する保存温度の影響。１８Ｓ：１８ＳリボソーマルＲＮＡ、２８Ｓ：２８ＳリボソーマルＲＮＡ。
【図２】ＳＳＬ由来ＲＮＡにおけるアトピー性皮膚炎関連マーカーの発現。
【図３】機械学習モデルに基づくＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量からの血中テストステロン濃度の予測値。縦軸は予測値、横軸は実測値を表す。
【図４】機械学習モデルに基づくＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量からの血中の各種成分の濃度の予測結果。
【図５】洗顔料の使用により発現が上昇する２２種のＲＮＡ群の発現量（０ｄａｙ）に基づいた被験者の群分け。
【図６】洗顔料の使用による角層水分量の変化。
【図７】アンケート結果に基づく洗顔料使用後の保湿効果を実感した者の割合。
【図８】皮脂分泌量の高い群、低い群におけるＢＳＧおよびＨＣＡＲ２の発現。
【図９】水分量の高い群、低い群におけるＡＳＰＲＶ１およびＰＡＤＩ３の発現。
【図１０】皮膚の赤みの高い群、低い群におけるＳＯＣＳ３、ＪＵＮＢおよびＩＬ−１Ｂの発現。
【図１１】機械学習モデルに基づくＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量からの皮膚状態の予測値。縦軸は予測値、横軸は実測値を表す。
【図１２】機械学習モデルに基づくＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量からの血中コルチゾール濃度の予測値。縦軸は予測値、横軸は実測値を表す。
【図１３】機械学習モデルに基づくＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量からの累積紫外線曝露時間の予測値。縦軸は予測値、横軸は被験者からのアンケートに基づいた算出値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１１】
本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｙｍｂｏｌに従う。一方で遺伝子オントロジー（ＧＯ）に関しては、Ｓｔｒｉｎｇ（[string-db.org/]）に記載のあるＰａｔｈｗａｙ  ＩＤ．に従う。
【００１２】
ＲＮＡは分解されやすい性質を有するため、特殊な処理を施されている場合以外は、−８０℃という特別な低温条件下で保存されるのが通常である。分解によりＲＮＡの量が減少した試料を用いた場合、解析の精度は低下する。ＲＮＡを逆転写反応によりｃＤＮＡに変換して保存する場合でも、元のＲＮＡが不安定な状態にある場合には充分な量のｃＤＮＡを得られないため、やはり解析の精度は低下する。
【００１３】
本発明者は、以前に、皮膚表上に存在する脂質（皮膚表上脂質）に被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれており、これを用いて生体の解析が可能であることを見出し、特許出願した（特許文献１）。今回、さらに本発明者は、当該皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡが一般的な低温条件で保存可能であること、さらに従来の−８０℃という特別な低温条件でなくても安定的に保存可能であることを見出した。さらに本発明者は、当該皮膚表上脂質から分離したＲＮＡを、所定の条件での逆転写反応およびＰＣＲにかけ、次いで精製することによって、ＲＮＡ含有量が少ない皮膚表上脂質からでも解析に充分な量の核酸試料を獲得できることを見出した。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法を提供する。一実施形態において、本発明による被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法は、被験体から採取したＲＮＡ含有皮膚表上脂質を０℃以下で保存することを含む。別の一実施形態において、本発明による被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法は、被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにかけること、および該ＰＣＲの反応産物を精製することを含む。
【００１５】
本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。
【００１６】
本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺およびその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
【００１７】
本発明の方法により調製される被験体の皮膚細胞に由来する核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなど特に限定されないが、好ましくはＲＮＡ、または該ＲＮＡから調製されたＤＮＡである。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）など）、ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などが挙げられる。ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであり、多くは１０００ｎｔ以上の長さを有する。ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｌｉｎｃＲＮＡは、タンパク質をコードしないｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（ｎｃ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ｎｃＲＮＡのうち、長さ１９−３０ｎｔ程度の小さなＲＮＡである。ｌｉｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡ同様にｐｏｌｙ−Ａをもつ長いｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡであり、２００ｎｔ以上の長さを有する（非特許文献１）。より好ましくは、本発明の方法において調製されるＲＮＡは、２００ｎｔ以上の長さを有するＲＮＡである。さらに好ましくは、本発明の方法において調製されるＲＮＡは、ｍＲＮＡおよびｌｉｎｃＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種である。本発明の方法において調製されるＤＮＡの例としては、前述したＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡからの反応産物（例えばＰＣＲ産物、クローンＤＮＡ等）などが挙げられる。
【００１８】
本発明の方法における被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。好ましくは、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするかまたは希望するヒトまたは非ヒト哺乳動物である。また好ましくは、該被験体は、皮膚における遺伝子発現解析、または核酸を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の状態の解析を必要とするかまたは希望するヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
【００１９】
被験体から採取されたＳＳＬは、該被験体の皮膚細胞で発現したＲＮＡを含み、好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺、および真皮のいずれかで発現したＲＮＡを含み、より好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、および汗腺のいずれかで発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。したがって、本発明の方法により調製される被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡは、好ましくは被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺および真皮から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包および汗腺から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡである。
【００２０】
一実施形態において、本発明の方法は、被験体のＳＳＬを採取することをさらに含んでいてもよい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、アトピー、ニキビ、乾燥、炎症（赤み）、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられるが、特に限定されない。また、ＳＳＬが採取される皮膚の部位は、好ましくは、手のひら、背部、足の裏、または指の皮膚を含まない。
【００２１】
被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収または除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、または皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材またはＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、当該採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは０℃以下の低温条件で保存される。当該採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは、ＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに所定の低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよいが、好ましくは−２０±２０℃〜−８０±２０℃、より好ましくは−２０±１０℃〜−８０±１０℃、さらに好ましくは−２０±２０℃〜−４０±２０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃〜−４０±１０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃、さらに好ましくは−２０±５℃である。この温度条件は、従来一般的なＲＮＡの保存条件（例えば−８０℃）と比べてかなりマイルドな条件である。したがって、本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬを好ましい低温条件で保存するには、超低温冷凍庫や専用の保存容器などの特別な機器を使用する必要がなく、通常の冷凍庫や冷蔵庫の冷凍室を使用することができる。また本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
【００２３】
採取した当該ＲＮＡ含有ＳＳＬからのＲＮＡの分離には、生体試料からのＲＮＡの抽出または精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、またはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）などのカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出などを用いることができる。
【００２４】
本発明の別の一実施形態において、当該ＲＮＡ含有ＳＳＬから分離されたＲＮＡ（ＳＳＬ由来ＲＮＡ）は、ＲＮＡの形態のまま各種解析に使用され得る。好ましい実施形態において、該ＳＳＬ由来ＲＮＡは、ＤＮＡに変換される。好ましくは、該ＳＳＬ由来ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをＰＣＲにかけ、得られた反応産物を精製する。該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存および解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。また該ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲは、マルチプレックスＰＣＲである。これは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
【００２５】
ＲＮＡの逆転写には、一般的な逆転写酵素または逆転写試薬キットを使用することが出来る。好適には、正確性および効率性の高い逆転写酵素または逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素または逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などが好ましく用いられる。
【００２６】
当該逆転写およびＰＣＲの反応条件を調整することで、ＰＣＲ反応産物の収率がより向上し、ひいてはそれを用いた解析の精度がより向上する。好適には、該逆転写での伸長反応において、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０〜１００分間に調整する。また好適には、該ＰＣＲにおけるアニーリングおよび伸長反応の温度は、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリングおよび伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリングおよび伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４〜１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５〜９９℃で１０〜６０秒間である。上記のような温度および時間での逆転写およびＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
【００２７】
当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ等のＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰとＤＮＡ溶液を混合すると、ＤＮＡは磁性ビーズの表面にコーティングされたカルボキシル基に吸着され、マグネットを用いて磁性ビーズのみを回収することでＤＮＡが精製される。またＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ溶液とＤＮＡ溶液の混合比を変化させると磁性ビーズに吸着するＤＮＡの分子サイズが変化する。この原理を利用することで、捕捉したい特定の分子サイズのＤＮＡを磁性ビーズ上に回収し、それ以外の分子サイズのＤＮＡや不純物を精製することが可能である。
【００２８】
精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングやフラグメント解析のために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去およびアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、各種解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ  ＲＴ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、およびＩｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  ＨｉＦｉ  Ｍｉｘ、およびＩｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｒｅ  Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
【００２９】
当該逆転写およびＰＣＲにかけるＳＳＬ由来ＲＮＡは、生体から採取した直後のＲＮＡ含有ＳＳＬに由来するＲＮＡ、または生体から採取した後室温もしくは冷蔵保存されていたＲＮＡ含有ＳＳＬに由来するＲＮＡでもよいが、生体から採取した後、０℃以下で保存されていたＲＮＡ含有ＳＳＬに由来するＲＮＡが好ましい。該０℃以下の保存は、−８０℃での保存でもよいが、好ましくは−２０±１０℃、より好ましくは−２０±５℃での保存である。該ＳＳＬ由来ＲＮＡは、ＳＳＬから分離された後、直ちに上記逆転写やＰＣＲに使用されてもよいが、使用まで通常の方法で保存されてもよい。
【００３０】
本発明の方法によりＳＳＬ由来ＲＮＡから調製された被験体の皮膚細胞に由来する核酸は、核酸を用いる各種の解析または診断に使用することができる。したがって、本発明はまた、上記本発明による核酸の調製方法により調製した核酸を解析することを含む、核酸の解析方法を提供する。上述した本発明による核酸の調製方法により調製した核酸である。本発明により調製された核酸を用いて行うことができる解析や診断の例としては、以下が挙げられる：
（i）被験体の皮膚に関する遺伝子発現解析およびその他の遺伝子情報の解析、ならびにそれらの解析に基づく被験体の皮膚に関する機能解析、など；
（ii）被験体の皮膚の疾患または状態の解析、例えば、皮膚の健康状態（例えば、皮脂分泌、水分量、赤味、アトピー性皮膚炎、敏感肌などの皮膚状態）の評価、皮膚の状態の現状予測もしくは将来予測、皮膚の累積紫外線曝露時間などの過去の履歴の予測、皮膚疾患の診断もしくは予後診断、皮膚ガンの診断もしくは予後診断、皮膚の微細変化の評価、など；
（iii）前述した被験体の皮膚の疾患または状態の解析を利用した、皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤、注射剤などの効果または効能の評価；
（iv）被験体の皮膚以外の部位または全身の状態の解析、例えば、全身的な健康状態の評価もしくは将来予測、および神経疾患、心血管疾患、代謝性疾患、ガン等の各種疾患の診断もしくは予後診断、など；
（v）被験体の血中成分濃度の解析。
【００３１】
本発明により調製された核酸を用いた解析や診断のより詳細な例を以下に示す。
遺伝子発現解析
特許文献１に開示されているとおり、ＳＳＬは、被験体由来のｍＲＮＡ等の高分子量ＲＮＡを豊富に含む。ＳＳＬは、被験体から非侵襲的に採取することができるｍＲＮＡの供給源であり、遺伝子発現解析用の生体試料として有用である。さらに、ＳＳＬ中のｍＲＮＡは、皮脂腺、毛包および表皮の遺伝子発現プロファイルを反映している（特許文献１の実施例１〜４を参照）。したがって、本発明により調製された核酸は、皮膚、特に皮脂腺、毛包および表皮の遺伝子発現解析用の生体試料として好適である。
【００３２】
皮膚の解析
本発明により調製された核酸を試料として、被験体の皮膚を解析することができる。該皮膚の解析の例としては、前述した遺伝子発現解析、皮膚状態の解析などが挙げられる。該皮膚状態の解析の例としては、所定の疾患または状態を有するまたは有さない皮膚の検出が挙げられる。所定の疾患または状態の例としては、皮脂量の不足もしくは過多、皮膚水分量の不足もしくは過多、赤味、アトピー性皮膚炎、敏感肌などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明により調製された核酸から被験体の皮膚における皮脂量、皮膚水分量、赤味、アトピー性皮膚炎、敏感肌などの所定の疾患または状態のマーカー遺伝子の発現レベルを解析することにより、該被験体の皮膚が該所定の疾患または状態を有するか否かを決定することができる。好適には、被験体について取得した所定の疾患または状態のマーカー遺伝子の発現レベルを、該所定の疾患または状態を有する群（陽性対照）または有さない群（陰性対照）のＳＳＬから本発明の方法により調製した核酸における該マーカー遺伝子の発現レベルと比較することで、該被験体の皮膚が該所定の疾患または状態を有するか否かを決定することができる。マーカー遺伝子には公知の皮膚状態関連マーカー遺伝子を使用することができる。
【００３３】
皮膚の解析の別の例としては、皮膚状態の予測が挙げられ、該皮膚状態の例としては、皮膚物性の予測、皮膚の目視または触診評価の予測、皮脂組成の予測などが挙げられる。該皮膚物性の例としては、角層水分量、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）、皮脂量、メラニン量、紅斑量などが挙げられる。該皮膚の目視または触診評価の例としては、通常は専門判定員が目視または触診により評価する皮膚の状態が挙げられる。該目視評価のより具体的な例としては、「きれいさ」、「透明感」、「明るさ」、「つや」、「しみ」、「クマ目立ち」、「黄色み」、「全体赤み」、「頬きめじわ」、「口角たるみ」、「鱗屑」、「ニキビ」、「頬の毛穴目立ち」、「鼻の毛穴目立ち」などの有無または程度の評価が挙げられ、触診評価の例としては「ざらつき感」、「しっとり感」などの有無または程度の評価が挙げられる。該皮脂組成の例としては、皮脂を構成する遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、ワックスエステル（ＷＥ）、コレステロールエステル（ＣｈＥ）、スクワレン（ＳＱ）、スクワレンエポキシド（ＳＱｅｐｏ）、酸化スクワレン（ＳＱＯＯＨ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）などの成分の量が挙げられる。
【００３４】
後述の実施例に示すとおり、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析から得られるＲＮＡ発現プロファイルと、それに紐付く各種皮膚状態の測定値や評価値に関するデータを相関解析することで、各種皮膚状態と関連性が高い遺伝子を選択し、予測モデルの構築に使用することができる。皮膚状態の予測に使用する具体的な関連遺伝子としては、表８に示す遺伝子が挙げられる。
【００３５】
予測モデルの構築に使用する関連性の高い遺伝子の発現データとして多数の遺伝子データをする場合は、必要に応じて、主成分分析によってデータを圧縮してから予測モデルの構築を行っても良い。
【００３６】
予測モデルの構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、線形回帰モデル（Linear model）、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（Random Forest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（SVM (rbf)）などのアルゴリズムが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が最も小さいモデルを、最適モデルとして選択することができる。
【００３７】
皮膚の解析の別の例としては、皮膚の累積紫外線曝露時間の予測が挙げられる。一般的に累積紫外線曝露時間は、生活習慣や屋外レジャー活動に関するアンケート調査に基づいて紫外線曝露時間を予測して算出される。後述の実施例に示す通り、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析から得られるＲＮＡ発現プロファイルと、それに紐付く累積紫外線曝露時間の算出データを相関解析することで、累積紫外線曝露時間と関連性が高い遺伝子を選択し、予測モデルを構築することができる。モデル構築の手順は上述と同様である。
【００３８】
あるいは、該所定の疾患または状態を有する群（陽性対照）または有さない群（陰性対照）のＳＳＬから調製した核酸の発現レベルを分析し、両群間で有意な発現レベルの変動が認められた遺伝子を皮膚状態関連マーカー遺伝子として使用することができる。具体的には、アトピー性皮膚炎についてのマーカー遺伝子としては、後述する試験例６において健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者において有意に発現が低下した１９１１個の遺伝子群（表７−１〜７−２４の（Ａ））から選ばれる１つ以上の遺伝子、ならびにアトピー性皮膚炎との強い関連性が認められたｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）であるＧＯ：００５０９１１に含まれるｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＯＲ）のうち、健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者において発現が低下した３７０種のＯＲ遺伝子群（表７−１〜７−１１の（Ｂ））、ならびに皮膚炎の重症度に応じて発現が低下した３６８種のＯＲ遺伝子群（表７−１〜７−１１の（Ｃ））および２８４種のＯＲ遺伝子群（表７−１〜７−１１の（Ｄ））から選ばれる１つ以上の遺伝子、が挙げられる。敏感肌についてのマーカー遺伝子としては、後述する試験例７において敏感肌の自覚症状がない群と比較して自覚症状がある群において有意に発現が低下した６９３個の遺伝子群（表７−１〜７−２０の（Ｅ））から選ばれる１つ以上の遺伝子、ならびに敏感肌との強い関連性が認められたｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）であるＧＯ：００５０９１１に含まれるｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＯＲ）のうち、敏感肌の自覚症状がない群と比較して自覚症状がある群において発現が低下した３４４種のＯＲ遺伝子群（表７−１〜７−１０の（Ｆ））から選ばれる１つ以上の遺伝子、が挙げられる。赤味についてのマーカー遺伝子としては、後述する試験例８において肌の赤みが強い群と弱い群との間で有意に発現が変動していた７０３個の遺伝子群（表７−１〜７−２０の（Ｇ））から選ばれる１つ以上の遺伝子が挙げられる。皮膚水分量についてのマーカー遺伝子としては、後述する試験例８において角層水分量の多い群と少ない群との間で有意に発現が変動していた５５３個の遺伝子群（表７−１〜７−１６の（Ｈ））から選ばれる１つ以上の遺伝子が挙げられる。皮脂量についてのマーカー遺伝子としては、後述する試験例８において皮脂量の多い群と少ない群との間で有意に発現が変動していた５９４個の遺伝子群（表７−１〜７−１７の（Ｉ））から選ばれる１つ以上の遺伝子が挙げられる。
【００３９】
さらに、前述した被験体における皮膚の疾患または状態の解析に基づいて、該被験体に対する所与の皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤、注射剤などの効果または効能を評価することができる。例えば、被験体の皮膚における前述した皮膚の疾患または状態についてのマーカー遺伝子の発現を調べることによって、該スキンケア製品の使用が被験体の皮膚に与える効果または効能を評価することができる。当該評価に用いられる皮膚の疾患または状態についてのマーカーの例としては、ＢＮＩＰ３、ＣＡＬＭＬ３、ＧＡＬ、ＨＳＰＡ５、ＪＵＮＢ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ６Ａ、ＯＶＯＬ１、ＰＰＩＦ、ＰＲＤＭ１、ＲＢＭ３、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ４Ｘ、ＳＥＰＴ９、ＳＯＡＴ１、ＳＰＮＳ２、ＵＢＢ、ＶＣＰ、ＷＩＰＩ２、およびＹＰＥＬ３から選ばれる１つ以上の遺伝子が挙げられる。
【００４０】
血中の各種成分濃度の解析
本発明により調製された核酸を試料として、被験体の血中に存在する各種成分の濃度を解析することができる。後述の実施例に示すとおり、ＳＳＬ由来ＲＮＡ中の関連マーカー遺伝子由来のＲＮＡ発現量と血中の各種成分の濃度データとに基づいて構築された機械学習モデルを用いて、被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡ中の関連マーカー遺伝子由来のＲＮＡ発現量から、該被験体の血中成分濃度を予測することができた。したがって、ＳＳＬ由来ＲＮＡ中の関連マーカー遺伝子由来のＲＮＡ発現量に基づいて、血中の各種成分の濃度を定量することができる。機械学習モデルは、前述した皮膚状態の予測モデルの構築の手順に準じて構築することができる。本発明により解析される血中に存在する各種成分の例としては、ホルモン、インスリン、中性脂質、γ−ＧＴＰ、ＬＤＬ−コレステロール等が挙げられる。該血中ホルモンの例としては、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン等のアンドロゲン、エストロン、エストラジオール等のエストロゲン、プロゲステロン、コルチゾールなどが挙げられる。このうち、テストステロン、コルチゾールが好ましい。血中の各種成分の濃度の定量に用いられるＳＳＬ由来ＲＮＡ中の関連マーカー遺伝子由来のＲＮＡは、その発現量が該血中成分濃度と相対的に高い相関を示すものから選択することができる。好ましくは、集団についてＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量と目的の成分の血中濃度を測定し、各ＲＮＡの発現量と該血中成分の濃度との相関を調べ、相対的に高い相関を示すＲＮＡを選択すればよい。
例えば、血中のテストステロン、インスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰ、ＬＤＬ−コレステロールそれぞれの濃度定量に用いるＳＳＬ由来ＲＮＡ中の関連マーカー遺伝子由来のＲＮＡの例としては、以下に示すヒト遺伝子に由来するＲＮＡ群から選ばれる少なくとも１つ、好ましくは全てが用いられる：
（テストステロン）ＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２、およびＣＣＤＣ９０Ｂ；
（インスリン）ＥＡＰＰ、ＳＤＥ２、ＬＹＡＲ、ＺＮＦ４９３、ＰＳＭＢ１０、ＦＡＭ７１Ａ、ＧＰＡＮＫ１、ＦＧＤ４、ＭＲＰＬ４３、およびＣＭＰＫ１；
（中性脂肪）ＣＣＤＣ９、Ｃ６ｏｒｆ１０６、ＣＥＲＫ、ＨＳＤ３Ｂ２、ＳＵＮ２、ＦＮＤＣ４、ＧＲＡＭＤ１Ｃ、ＤＧＡＴ２、ＡＬＰＬ、ＨＯＭＥＲ３、ＭＴＨＦＳ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＲＢＭ３、ＥＸＯＣ８、およびＡＲＨＧＥＦ３７；
（γ−ＧＴＰ）ＴＭＥＭ３８Ａ、ＢＴＮ３Ａ２、ＮＡＰ１Ｌ２、ＡＢＣＡ２、ＡＬＰＬ、ＳＥＣＴＭ１、Ｃ１７ｏｒｆ６２、ＧＮＢ２、Ｒ３ＨＤＭ４、ＬＲＧ１、ＳＢＮＯ２、ＣＤ１４、ＭＬＬＴ１、ＮＩＮＪ２、およびＬＩＭＤ２；
（ＬＤＬ−コレステロール）ＴＨＴＰＡ、ＬＯＣ１００５０６０２３、ＺＮＦ７００、ＴＡＢ３、ＰＬＥＫＨＡ１、ＺＮＦ８４５、ＦＸＣ１、ＣＵＬ４Ａ、ＮＤＵＦＶ１、およびＡＭＺ２。
【００４１】
ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた血中成分濃度定量の好ましい手順を、血中テストステロン濃度定量を例に以下に説明する：まず、ヒト集団から得たＳＳＬ由来ＲＮＡに含まれ、血中テストステロン濃度と高い相関を有する上記１０種の遺伝子（ＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２およびＣＣＤＣ９０Ｂ）のＲＮＡの発現量データを説明変数とし、該集団から得た血中テストステロン濃度データを目的変数とした機械学習により、該ＲＮＡの発現量から血中テストステロン濃度を予測するための最適な予測モデルを構築する。一方、血中テストステロン濃度を調べたいヒト被験体からＳＳＬ由来ＲＮＡを採取する。構築されたモデルに基づいて、該被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡ中の上記１０種の遺伝子のＲＮＡの発現量データから、該被験体の血中テストステロン濃度の予測値を算出することができる。
【００４２】
病理学的診断
最近の報告によれば、ガン細胞で発現が変化するＲＮＡ群の中の約６３％がタンパク質をコードするｍＲＮＡである（Cancer Res. 2016, 76, 216-226）。したがって、ｍＲＮＡの発現状態を測定することにより、ガン等の疾患による細胞の生理状態の変化をより忠実に捉えることができ、より正確な身体状態の診断が可能になると考えられる。ＳＳＬは、ｍＲＮＡを豊富に含んでおり、さらにガンとの関連性が報告されているＳＯＤ２のｍＲＮＡを含む（Physiol Genomics, 2003, 16, 29-37；Cancer Res, 2001, 61, 6082-6088）。したがって、ＳＳＬは、皮膚ガン等のガンの診断もしくは予後診断用の生体試料として有用である。
【００４３】
近年、肥満、アルツハイマー、乳がん、心疾患等の皮膚以外の組織での疾患を有する患者において皮膚中の分子の発現が変動すること、したがって“皮膚は体内の健康状態の窓（window to body's health）”ということができることが報告されている（Eur J Pharm Sci. 2013, 50, 546-556）。したがって、ＳＳＬ中のｍＲＮＡの発現状態を測定することで、被験体の皮膚以外の部位における生理状態、または全身的な生理状態を解析できる可能性がある。
【００４４】
ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ解析
近年、細胞の遺伝子発現におけるｍｉＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ等のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（ｎｃ）ＲＮＡの関与が着目され、盛んに研究が進められている。また従来、尿や血清中のｍｉＲＮＡを用いた非侵襲もしくは低侵襲的なガン等の診断方法が開発されている（例えば、Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 10513-10518；Urol Oncol, 2010, 28, 655-661）。ＳＳＬから調製されるｍｉＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ等のｎｃＲＮＡを、上記研究や診断のための試料に用いることができる。
【００４５】
核酸マーカーのスクリーニングまたは検出
ＳＳＬから調製した核酸を試料として、疾患もしくは状態の核酸マーカーのスクリーニングや検出を行うことができる。本明細書において、疾患もしくは状態の核酸マーカーとは、その発現が、所与の疾患もしくは状態の判定またはそのリスク判定のための指標となる核酸をいう。好ましくは、核酸マーカーはＲＮＡマーカーであり、該ＲＮＡは、好ましくはｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｌｉｎｃＲＮＡである。該核酸マーカーがターゲットとする疾患もしくは状態としては、例えば、各種皮膚疾患（アトピー性皮膚炎など）、皮膚の健康状態（敏感肌、光老化、炎症（赤み）、乾燥、水分もしくは油分量、肌のハリ、くすみなど）；ならびに、上記「病理学的診断」の項で述べた、皮膚ガン等のガン、および肥満、アルツハイマー、乳がん、心疾患等の皮膚以外の組織での疾患が挙げられるが、これらに限定されない。核酸の発現の解析は、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、マイクロアレイ、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ発現解析等の公知の手段に従って行うことができる。
【００４６】
一例は、疾患もしくは状態の核酸マーカーの選択方法である。該方法では、所定の疾患もしくは状態またはそのリスクを有する集団を被験体として、本発明の核酸の調製方法に従って、被験体の皮膚細胞に由来する核酸を調製する。該集団から調製された核酸について、その発現（発現レベル等）を、対照の発現と比較する。該対照としては、該所定の疾患もしくは状態またはそのリスクを有さない集団、およびそれに基づく統計学的データなどが挙げられる。対照と比べて異なる発現を示す核酸を、該所定の疾患もしくは状態のマーカーまたはその候補として選択することができる。そのようにして選択された核酸マーカーまたはその候補の例として、表７−１〜７−２４に記載のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００４７】
別の一例は、疾患もしくは状態の核酸マーカーの検出方法、または該マーカー検出に基づく疾患もしくは状態、またはそのリスクの判定方法である。該方法では、所定の疾患もしくは状態、またはそのリスクの判定を所望または必要とする被験体から、本発明の核酸の調製方法に従って、被験体の皮膚細胞に由来する核酸を調製する。次いで、調製された核酸から所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーを検出する。該核酸マーカーの有無や発現量に基づいて、被験体の該疾患もしくは状態、またはそのリスクを判定する。
【００４８】
本発明により調製された核酸の解析は、核酸の解析に用いられる通常の方法、例えばＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシング、クロマトグラフィー、などにより実施することができるが、本発明による核酸の解析手法はこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００５０】
〔１〕被験体から採取したＲＮＡ含有皮膚表上脂質を０℃以下で保存することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。
〔２〕前記保存の温度が、好ましくは−２０±２０℃〜−８０±２０℃、より好ましくは−２０±１０℃〜−８０±１０℃、さらに好ましくは−２０±２０℃〜−４０±２０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃〜−４０±１０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃、さらに好ましくは−２０±５℃である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記保存の期間が、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００５１】
〔４〕被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにかけること、および
該ＰＣＲの反応産物を精製すること、
を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。
〔５〕前記マルチプレックスＰＣＲにおけるアニーリングおよび伸長反応の温度が、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である、〔４〕記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記逆転写での伸長反応が以下の条件で行われる、〔４〕又は〔５〕記載の方法：
４２℃±１℃で６０分間以上；
４２℃±１℃で８０〜１００分間；
４２℃±０．５℃で６０分間以上；
４２℃±０．５℃で８０〜１００分間；
４２℃±０．２５℃で６０分間以上；又は
４２℃±０．２５℃で８０〜１００分間。
〔７〕好ましくは、前記ＰＣＲの反応産物の精製が、サイズ分離による精製である、〔４〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡが、該被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを分離することにより調製される、〔４〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記被験体の皮膚表上脂質が、好ましくは０℃以下、より好ましくは−２０±２０℃〜−８０±２０℃、より好ましくは−２０±１０℃〜−８０±１０℃、さらに好ましくは−２０±２０℃〜−４０±２０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃〜−４０±１０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃、さらに好ましくは−２０±５℃で保存されていたものである、〔４〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記被験体の皮膚表上脂質が、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下保存されていたものである、〔９〕記載の方法。
【００５２】
〔１１〕〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の皮膚、皮膚以外の部位、または全身の状態の解析方法。
〔１２〕前記解析が
好ましくは、皮膚の疾患または状態の解析であり、
より好ましくは、
赤味、敏感肌またはアトピー性皮膚炎を有するまたは有さない皮膚の検出であるか、    皮脂量または皮膚水分量が多いまたは少ない皮膚の検出であるか、
皮膚状態の予測、例えば皮膚物性の予測、皮膚の目視もしくは触診評価の予測、または皮脂組成の予測であるか、
皮膚の累積紫外線曝露時間の予測である、
〔１１〕記載の解析方法。
〔１３〕好ましくは、
前記解析がアトピー性皮膚炎を有するまたは有さない皮膚の検出であり、前記核酸が表７−１〜７−１１の（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が軽症または中等症のアトピー性皮膚炎を有するかまたはアトピー性皮膚炎を有さない皮膚の検出であり、前記核酸が表７−１〜７−１１の（Ｃ）および（Ｄ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、敏感肌を有するまたは有さない皮膚の検出であり、前記核酸が、表７−１〜７−２０の（Ｅ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、敏感肌を有するまたは有さない皮膚の検出であり、前記核酸が、表７−１〜７−１０の（Ｆ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、赤みを有するまたは有さない皮膚の検出であり、前記核酸が、表７−１〜７−２０の（Ｇ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、水分量が多いまたは少ない皮膚の検出であり、前記核酸が、表７−１〜７−１６の（Ｈ）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、皮脂量が多いまたは少ない皮膚の検出であり、前記核酸が、表７−１〜７−１７の（Ｉ）の記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記解析が、皮膚物性の予測、皮膚の目視もしくは触診評価の予測、または皮脂組成の予測であり、前記核酸が、表８に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てである、
〔１１〕記載の方法。
〔１４〕〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体に対する皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤または注射剤の効果または効能の評価方法。
〔１５〕前記被験体に対する皮膚外用剤、皮内投与剤、貼付剤、経口剤または注射剤の効果または効能が、好ましくは、スキンケア製品による被験体の皮膚状態の改善効果であり、前記核酸が、好ましくはＢＮＩＰ３、ＣＡＬＭＬ３、ＧＡＬ、ＨＳＰＡ５、ＪＵＮＢ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ６Ａ、ＯＶＯＬ１、ＰＰＩＦ、ＰＲＤＭ１、ＲＢＭ３、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ４Ｘ、ＳＥＰＴ９、ＳＯＡＴ１、ＳＰＮＳ２、ＵＢＢ、ＶＣＰ、ＷＩＰＩ２、およびＹＰＥＬ３から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは全てである、〔１４〕記載の方法。
〔１６〕〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、被験体の血中成分濃度の解析方法。
〔１７〕好ましくは、前記血中成分がホルモン、インスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰ、またはＬ−コレステロールである、〔１６〕記載の解析方法。
〔１８〕前記ホルモンが、
好ましくはテストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、エストロン、エストラジオール、プロゲステロン、またはコルチゾールであり、
より好ましくはテストステロンまたはコルチゾールである、
〔１７〕記載の解析方法。
〔１９〕前記血中成分が好ましくはテストステロンであり、前記核酸が、好ましくはＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２、およびＣＣＤＣ９０Ｂからなる１０遺伝子に由来する１０種のＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは該１０種のＲＮＡである、〔１６〕記載の解析方法。
〔２０〕前記血中成分が好ましくはインスリンであり、前記核酸が、好ましくはＥＡＰＰ、ＳＤＥ２、ＬＹＡＲ、ＺＮＦ４９３、ＰＳＭＢ１０、ＦＡＭ７１Ａ、ＧＰＡＮＫ１、ＦＧＤ４、ＭＲＰＬ４３、およびＣＭＰＫ１からなる１０遺伝子に由来する１０種のＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは該１０種のＲＮＡである、〔１６〕記載の解析方法。
〔２１〕前記血中成分が好ましくは中性脂肪であり、前記核酸が、好ましくはＣＣＤＣ９、Ｃ６ｏｒｆ１０６、ＣＥＲＫ、ＨＳＤ３Ｂ２、ＳＵＮ２、ＦＮＤＣ４、ＧＲＡＭＤ１Ｃ、ＤＧＡＴ２、ＡＬＰＬ、ＨＯＭＥＲ３、ＭＴＨＦＳ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＲＢＭ３、ＥＸＯＣ８、およびＡＲＨＧＥＦ３７からなる１５遺伝子に由来する１５種のＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは該１５種のＲＮＡである、〔１６〕記載の解析方法。
〔２２〕前記血中成分が好ましくはγ−ＧＴＰであり、前記核酸が、好ましくはＴＭＥＭ３８Ａ、ＢＴＮ３Ａ２、ＮＡＰ１Ｌ２、ＡＢＣＡ２、ＡＬＰＬ、ＳＥＣＴＭ１、Ｃ１７ｏｒｆ６２、ＧＮＢ２、Ｒ３ＨＤＭ４、ＬＲＧ１、ＳＢＮＯ２、ＣＤ１４、ＭＬＬＴ１、ＮＩＮＪ２、およびＬＩＭＤ２からなる１５遺伝子に由来する１５種のＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは該１５種のＲＮＡである、〔１６〕記載の解析方法。
〔２３〕前記血中成分が好ましくはＬＤＬ−コレステロールであり、前記核酸が、好ましくはＴＨＴＰＡ、ＬＯＣ１００５０６０２３、ＺＮＦ７００、ＴＡＢ３、ＰＬＥＫＨＡ１、ＺＮＦ８４５、ＦＸＣ１、ＣＵＬ４Ａ、ＮＤＵＦＶ１、およびＡＭＺ２からなる１０遺伝子に由来する１０種のＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは該１０種のＲＮＡである、〔１６〕記載の解析方法。
【００５３】
〔２４〕被験体の血中成分の濃度の解析方法であって、
〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法により調製した被験体の核酸から、血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子に由来するＲＮＡの発現量を取得すること、
該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子に由来するＲＮＡの発現量に基づいて、機械学習モデルにより、該被験体の血中成分の濃度を解析すること、
を含み、
該機械学習モデルが、ヒト集団から得た皮膚表上脂質由来ＲＮＡに含まれる該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子に由来するＲＮＡの発現量データを説明変数とし、該ヒト集団から得た該血中成分の濃度データを目的変数として構築された機械学習モデルである、
方法。
〔２５〕好ましくは、前記血中成分がホルモン、インスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰ、またはＬＤＬ−コレステロールであり、
該ホルモンが、好ましくはテストステロンまたはコルチゾールである、
〔２４〕記載の方法。
〔２６〕前記血中成分が、好ましくはテストステロンであり、前記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２、およびＣＣＤＣ９０Ｂから選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記血中成分が好ましくはインスリンであり、前記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＥＡＰＰ、ＳＤＥ２、ＬＹＡＲ、ＺＮＦ４９３、ＰＳＭＢ１０、ＦＡＭ７１Ａ、ＧＰＡＮＫ１、ＦＧＤ４、ＭＲＰＬ４３、およびＣＭＰＫ１から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記血中成分が好ましくは中性脂肪であり、前記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＣＣＤＣ９、Ｃ６ｏｒｆ１０６、ＣＥＲＫ、ＨＳＤ３Ｂ２、ＳＵＮ２、ＦＮＤＣ４、ＧＲＡＭＤ１Ｃ、ＤＧＡＴ２、ＡＬＰＬ、ＨＯＭＥＲ３、ＭＴＨＦＳ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＲＢＭ３、ＥＸＯＣ８、およびＡＲＨＧＥＦ３７から選ばれる少なくとも１種１種、より好ましくは全てであるか、
前記血中成分が好ましくはγ−ＧＴＰであり、前記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＴＭＥＭ３８Ａ、ＢＴＮ３Ａ２、ＮＡＰ１Ｌ２、ＡＢＣＡ２、ＡＬＰＬ、ＳＥＣＴＭ１、Ｃ１７ｏｒｆ６２、ＧＮＢ２、Ｒ３ＨＤＭ４、ＬＲＧ１、ＳＢＮＯ２、ＣＤ１４、ＭＬＬＴ１、ＮＩＮＪ２、およびＬＩＭＤ２から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
前記血中成分が好ましくはＬＤＬ−コレステロールであり、前記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＴＨＴＰＡ、ＬＯＣ１００５０６０２３、ＺＮＦ７００、ＴＡＢ３、ＰＬＥＫＨＡ１、ＺＮＦ８４５、ＦＸＣ１、ＣＵＬ４Ａ、ＮＤＵＦＶ１、およびＡＭＺ２から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てである、
〔２５〕記載の方法。
〔２７〕血中成分の濃度を解析するための機械学習モデルを構築するためのデータベースであって、
ヒト集団から得た皮膚表上脂質由来ＲＮＡに含まれる、血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子に由来するＲＮＡの発現量データ、および
該ヒト集団から得た該血中成分の濃度データ、
を含み、
該血中成分が、好ましくはテストステロンであり、該記血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２、およびＣＣＤＣ９０Ｂから選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
該血中成分が好ましくはインスリンであり、該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＥＡＰＰ、ＳＤＥ２、ＬＹＡＲ、ＺＮＦ４９３、ＰＳＭＢ１０、ＦＡＭ７１Ａ、ＧＰＡＮＫ１、ＦＧＤ４、ＭＲＰＬ４３、およびＣＭＰＫ１から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
該血中成分が好ましくは中性脂肪であり、該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＣＣＤＣ９、Ｃ６ｏｒｆ１０６、ＣＥＲＫ、ＨＳＤ３Ｂ２、ＳＵＮ２、ＦＮＤＣ４、ＧＲＡＭＤ１Ｃ、ＤＧＡＴ２、ＡＬＰＬ、ＨＯＭＥＲ３、ＭＴＨＦＳ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＲＢＭ３、ＥＸＯＣ８、およびＡＲＨＧＥＦ３７から選ばれる少なくとも１種１種、より好ましくは全てであるか、
該血中成分が好ましくはγ−ＧＴＰであり、該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＴＭＥＭ３８Ａ、ＢＴＮ３Ａ２、ＮＡＰ１Ｌ２、ＡＢＣＡ２、ＡＬＰＬ、ＳＥＣＴＭ１、Ｃ１７ｏｒｆ６２、ＧＮＢ２、Ｒ３ＨＤＭ４、ＬＲＧ１、ＳＢＮＯ２、ＣＤ１４、ＭＬＬＴ１、ＮＩＮＪ２、およびＬＩＭＤ２から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てであるか、
該血中成分が好ましくはＬＤＬ−コレステロールであり、該血中成分濃度と高い相関を有する遺伝子が、好ましくはＴＨＴＰＡ、ＬＯＣ１００５０６０２３、ＺＮＦ７００、ＴＡＢ３、ＰＬＥＫＨＡ１、ＺＮＦ８４５、ＦＸＣ１、ＣＵＬ４Ａ、ＮＤＵＦＶ１、およびＡＭＺ２から選ばれる少なくとも１種、より好ましくは全てである、
データベース。
〔２８〕〔２４〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の解析方法を行うためのプログラム。
〔２９〕〔２４〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の解析方法を行うための装置。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
試験例１  ＳＳＬ中のＲＮＡの安定性に対する保存温度の影響
１）ＳＳＬ中におけるＲＮＡの安定性
健常者の全顔よりあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムをガラスバイアルに移し、４℃で数時間放置した後、該フィルムに含まれるＳＳＬ中ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ精製では、該あぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、３０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。調製したライブラリーをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて測定したが、ライブラリーに由来するピークは検出されなかった。ピークが検出できなかった原因は、被験者の皮脂の回収量が少なかったこと、および回収後精製前に４℃で放置したことにより分解が進み、精製されたＲＮＡが少量であったことにあると考えられた。
【００５６】
２）保存温度の影響
ＳＳＬ中ヒトＲＮＡに対する保存温度の影響を調べるため、１）で皮脂を採取したあぶら取りフィルムにさらにヒト表皮細胞由来ＲＮＡ溶液を、ＲＮＡとして４０ｎｇ分塗布した後、（i）室温（ＲＴ）、（ii）４℃、（iii）−２０℃、または（iv）−８０℃で４日間保存した。なおヒト表皮細胞由来ＲＮＡ溶液としては、凍結ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社）から抽出したＲＮＡを５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液に溶解したものを使用した。保存後のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＲＮＡ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）により測定した。
【００５７】
測定の結果を図１に示す。ＲＴまたは４℃で保存したＳＳＬ中ＲＮＡでは、ヒト由来ＲＮＡ（２８Ｓおよび１８ＳリボソーマルＲＮＡ）のピークが著しく低下しており、他のＲＮＡのピークもほぼ検出されなかった。一方、−２０℃または−８０℃で保存したＳＳＬ中ＲＮＡでは、２８Ｓおよび１８ＳリボソーマルＲＮＡのピークが検出されたことから、ＲＮＡが安定に保存されていたことが示された。さらに、−８０℃保存と比べて−２０℃保存で２８Ｓと１８ＳリボソーマルＲＮＡのピーク面積がより大きかったことから、ＳＳＬ中ＲＮＡの保存温度には、従来一般的なＲＮＡの保存温度である−８０℃よりも、−２０℃がより適していると推定された。
【００５８】
試験例２  マルチプレックスＰＣＲによるＳＳＬ由来ＲＮＡからの核酸調製
１）逆転写反応条件の最適化
皮脂量の少ない健常者の全顔よりあぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて皮脂を回収し、該あぶら取りフィルムから、試験例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて実施した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。逆転写の伸長温度と時間の条件は（i）４０℃、６０分、（ii）４０℃、９０分、（iii）４２℃、６０分、または（iv）４２℃、９０分とした（温度精度±０．２５℃）。得られたｃＤＮＡを用いて、試験例１と同様の条件でマルチプレックスＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した。得られた精製物の溶液中のＰＣＲ産物の濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）で定量した。結果を表１に示す。４２℃、９０分で逆転写を行ったときに最も多くのＰＣＲ産物が得られた。
【００５９】
【表１】
2020074769.tif 000002
【００６０】
２）ＰＣＲ条件の最適化
皮脂量の少ない健常者の全顔よりあぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて皮脂を回収し、該あぶら取りフィルムから試験例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、１）と同様の手順で、ただしＰＣＲにおけるアニーリングおよび伸長での温度を変えて、ｃＤＮＡ合成およびマルチプレックスＰＣＲを行った。逆転写の条件は４２℃、９０分間とした。アニーリングおよび伸長の温度は、（i）６０℃、（ii）６２℃、（iii）６３℃、（iv）６４℃とした（温度精度±０．２５℃）。得られたＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて定量した。結果を表２に示す。アニーリングおよび伸長の温度が６２℃のときに最も多くのＰＣＲ産物が得られた。
【００６１】
【表２】
2020074769.tif 000003
【００６２】
３）ＰＣＲ産物の精製
皮脂量の少ない健常者の全顔よりあぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて皮脂を回収し、該あぶら取りフィルムから試験例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて１）と同様の手順で、ｃＤＮＡ合成およびマルチプレックスＰＣＲを行った。逆転写の条件は４２℃、３０分間とした。アニーリングおよび伸長の温度は６０℃とした（温度精度±０．２５℃）。得られたＰＣＲ産物を２つに分け、一方はＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製し、もう一方は精製を行わなかった。各サンプル溶液と、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔに付属している５×ＶＩＬＯ  ＲＴ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、およびＩｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ＨｉＦｉ  Ｍｉｘ、およびＩｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｒｅ  Ｐａｎｅｌを混合してバッファー組成を再構成し、各キット付属のプロトコルに従い、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。得られたライブラリーの濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて定量した。結果を表３に示す。精製を行わなかったサンプルではライブラリーが検出されなかった。
【００６３】
【表３】
2020074769.tif 000004
【００６４】
上記１）および２）の結果から、ＳＳＬ中ＲＮＡから核酸サンプルを調製する場合、逆転写反応の最適条件はおおよそ４２℃、９０分間であり、マルチプレックスＰＣＲのアニーリングおよび伸長温度の最適条件はおおよそ６２℃であった。これらの条件下でマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲを実施することで、ＳＳＬ中ＲＮＡからの核酸サンプルの収量を増加させることができると考えられた。また３）の結果からは、ＰＣＲ後に精製工程を追加することで核酸サンプルの収量が増加し、ＲＮＡ量が少ないＳＳＬからも核酸サンプル調製が可能になることが示された。さらに、試験例１で示したように被験体から採取したＳＳＬ中ＲＮＡを核酸サンプル調製に用いるまで−２０℃保存することで、ＲＮＡの変性を抑制し、核酸サンプルの収量をより増加させることができると考えられた。
なお、上記の逆転写反応時に使用した逆転写酵素はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、プライマーはＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓであり、ＰＣＲ実施時に使用した酵素は、ＡｍｐｌｉＳｅｑ  ＨｉＦｉ  Ｍｉｘ  Ｐｌｕｓ、プライマーは、ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣＯＲＥである。
【００６５】
試験例３  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いたアトピー性皮膚炎の検出
ＳＳＬ採取
健常者（２０〜３９歳男性、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）２０名、およびアトピー性皮膚炎患者（ＡＤ）（２０〜３９歳男性、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）１１名を被験者とした。健常者は、予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことを確認されており、ＡＤは、予め皮膚科医によりアトピー性皮膚炎の診断を受けていた。全顔の写真撮影を行った後に、あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで−８０℃で、約１ヶ月間保存した。なお、本試験例を含む以下の試験例では、被験体から採取したＳＳＬはＲＮＡ抽出に使用するまで一般的な保存条件である−８０℃で保存したが、試験例１で示したようにＳＳＬ中ＲＮＡをより安定的保存できる条件（−２０℃）で保存すれば、ＲＮＡ発現解析データがより安定的に得られるため、同様以上の解析結果が得られると考えられる。
【００６６】
ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
保存したあぶら取りフィルムから、試験例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを、４２℃、９０分間の条件で逆転写を行い、マルチプレックスＰＣＲは６２℃のアニーリングおよび伸長温度で実施した。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、試験例２、３）と同様の手順で、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ  ５４０  Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ  Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
【００６７】
ＲＮＡ発現解析
シーケンシングで発現が確認されたＳＳＬ由来ＲＮＡ種について、健常者とＡＤでその発現量を比較した。比較対象のＲＮＡ種には、１９種の免疫応答関連ＲＮＡおよび１７種の角化関連ＲＮＡを用いた。これらのＲＮＡ種は、文献（J Allergy Clin Immunol, 2011, 127:954-964）にて、ＡＤの皮膚組織の罹患部と非罹患部との間で健常者に対する発現量の割合が異なることが報告されている。
【００６８】
結果を図２に示す。図中の数値は、各ＲＮＡについての、本試験例で測定された健常者に対するＡＤでの発現量の割合、ならびに上記文献で測定された健常者に対するＡＤの罹患部、非罹患部での発現量の割合を表す。図中、ＡＤで発現が上昇していたＲＮＡは薄い灰色、逆に減少していたＲＮＡは濃い灰色で示した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行った。ＳＳＬ由来ＲＮＡ中の免疫応答関連ＲＮＡの多くは、上記文献での報告と同様に健常者と比べてＡＤで発現量が上昇していた。一方で、ＳＳＬ由来ＲＮＡ中の角化関連ＲＮＡの多くは、上記文献での報告と同様に健常者と比べてＡＤで発現量が減少していた。本結果より、ＳＳＬ由来ＲＮＡに、炎症状態の亢進やバリア機能の減少等を反映するアトピー性皮膚炎関連マーカーが含まれていること、それらのＳＳＬ由来ＲＮＡ中のマーカーの発現に基づいてアトピー性皮膚炎患者を判定することができることが示された。
【００６９】
試験例４  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた血中成分濃度の予測
被験者
予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことが確認された健常男性（２０〜５９歳、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）３８名を被験者とした。
【００７０】
血液採取および血中成分の濃度定量
各被験者の腕より真空採血管を用いて血液３ｍＬを採取し、血清を分離して−８０℃で保存した。保存した血清から、Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｙｍａｎ社）を用いて、添付のプロトコルに従い血清テストステロン濃度を定量した。血清中のインスリン、中性脂質、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロールの濃度については、外部検査機関（株式会社ＬＳＩメディエンス）に定量を委託した。
【００７１】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
全顔の写真撮影を行った後に、あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、−８０℃で約１ヶ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中のＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００７２】
ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた血中テストステロン濃度の予測
上記で測定した被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ：ＲＰＭ値）を無作為に３３名分と５名分に分割した。該３３名についてのＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量（ＲＰＭ値）と血清テストステロン濃度を用いて、機械学習による血清テストステロン濃度の予測モデルを構築した。はじめに、ＲＰＭ値を基に血清テストステロン濃度との相関性が最も高い１０種のＲＮＡ（ＳＣＡＲＮＡ１６、ＰＲＳＳ２７、ＲＤＢＰ、ＰＳＭＢ１０、ＳＢＮＯ１、ＥＭＣ３、ＭＡＲ９、Ｃ２０ｏｒｆ１１２、Ｃ１４ｏｒｆ２、およびＣＣＤＣ９０Ｂ由来のＲＮＡ）を選抜した。
学習データとして該３３名分の前述選抜した１０種のＲＮＡについてのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（ＲＰＭ値）を説明変数とし、該３３名の血清テストステロン濃度を目的変数として用いて、Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（株式会社ＮＴＴ数理システム）により、最適な予測モデルの構築、選抜を実施した。
選抜された予測モデルを用いて、残り５名のＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量から血中テストステロン濃度の予測値を算出した。その結果、図３に示すとおり、算出した予測値は、血清テストステロン濃度の実測値と高い相関性を有していた（相関係数＝０．９３）。このことから、ＳＳＬ由来ＲＮＡが血中テストステロン濃度を予測するのに重要な情報を有していることが明らかとなった。
【００７３】
ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた血中インスリン、中性脂質、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度の予測
上記で測定した被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（ＲＰＭ値）を無作為に３１名分と７名分に分割した。該３１名についてのＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量（ＲＰＭ値）と血清中のインスリン、中性脂質、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度を用いて、機械学習による血清中のインスリン、中性脂肪、γ―ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度の予測モデルをそれぞれ構築した。はじめに、ＲＰＭ値を基に１）インスリン、２）中性脂肪、３）γ−ＧＴＰ、４）ＬＤＬ−コレステロールそれぞれの血清中濃度との相関性が最も高いＲＮＡとして以下に示す分子に由来するＲＮＡを選抜した。
１）インスリン：ＥＡＰＰ、ＳＤＥ２、ＬＹＡＲ、ＺＮＦ４９３、ＰＳＭＢ１０、ＦＡＭ７１Ａ、ＧＰＡＮＫ１、ＦＧＤ４、ＭＲＰＬ４３、およびＣＭＰＫ１
２）中性脂肪：ＣＣＤＣ９、Ｃ６ｏｒｆ１０６、ＣＥＲＫ、ＨＳＤ３Ｂ２、ＳＵＮ２、ＦＮＤＣ４、ＧＲＡＭＤ１Ｃ、ＤＧＡＴ２、ＡＬＰＬ、ＨＯＭＥＲ３、ＭＴＨＦＳ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＲＢＭ３、ＥＸＯＣ８、およびＡＲＨＧＥＦ３７
３）γ−ＧＴＰ：ＴＭＥＭ３８Ａ、ＢＴＮ３Ａ２、ＮＡＰ１Ｌ２、ＡＢＣＡ２、ＡＬＰＬ、ＳＥＣＴＭ１、Ｃ１７ｏｒｆ６２、ＧＮＢ２、Ｒ３ＨＤＭ４、ＬＲＧ１、ＳＢＮＯ２、ＣＤ１４、ＭＬＬＴ１、ＮＩＮＪ２、およびＬＩＭＤ２
４）ＬＤＬ−コレステロール：ＴＨＴＰＡ、ＬＯＣ１００５０６０２３、ＺＮＦ７００、ＴＡＢ３、ＰＬＥＫＨＡ１、ＺＮＦ８４５、ＦＸＣ１、ＣＵＬ４Ａ、ＮＤＵＦＶ１、およびＡＭＺ２
学習データとして該３１名分の前述選抜したＲＮＡそれぞれについてのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（ＲＰＭ値）を説明変数とし、該３１名の血中のインスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰまたはＬＤＬ−コレステロール濃度を目的変数として用いて、Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（株式会社ＮＴＴ数理システム）により、最適な予測モデルの構築、選抜を実施した。
選抜された予測モデルを用いて、残り７名のＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量から血中のインスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度予測値をそれぞれ算出した。その結果、図４に示すとおり、算出した予測値は、血清中のインスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度それぞれの実測値と正の相関性を有していた。このことから、ＳＳＬ由来ＲＮＡは、血中のインスリン、中性脂肪、γ−ＧＴＰおよびＬＤＬ−コレステロール濃度を予測するのに有用な指標であることが明らかとなった。
【００７４】
試験例５  皮膚外用剤（洗顔料）の評価
（１）洗顔料の皮膚への効果予測に使用するＲＮＡ種の同定
被験者およびＳＳＬ採取
健常男性（２０〜３９歳）９名を被験者とした。被験品として、角栓を分解して落とす効果を有する洗顔料（ビオレおうちｄｅエステ、花王株式会社）を用いた。被験者は、被験品を適量（約１ｇ）使用して、１日２回（朝、夜）、１週間に渡って全顔の洗顔を行った。被験品洗顔料の使用開始前（０日）、および使用開始２日後において、あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて被験者の全顔からＳＳＬを採取した。
【００７５】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
上記で採取したＳＳＬを含むあぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、−８０℃で約１ヶ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中ＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００７６】
データ解析
上記で測定した洗浄料使用開始前、および使用開始２日後のＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量（ＲＰＭ値）を基に、０日と比較して使用開始２日後でＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔでｐ値が０．０５以下かつＲＰＭ値が２倍以上に上昇するＲＮＡとして、ＢＮＩＰ３、ＣＡＬＭＬ３、ＧＡＬ、ＨＳＰＡ５、ＪＵＮＢ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ６Ａ、ＯＶＯＬ１、ＰＰＩＦ、ＰＲＤＭ１、ＲＢＭ３、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ４Ｘ、ＳＥＰＴ９、ＳＯＡＴ１、ＳＰＮＳ２、ＵＢＢ、ＶＣＰ、ＷＩＰＩ２、およびＹＰＥＬ３の２２種の分子に由来するＲＮＡを同定した（表４）。これらの分子の中には、ＢＮＩＰ３、ＯＶＯＬ１、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１７といった皮膚の終末角化に関連する分子や、ＪＵＮＢ、ＰＲＤＭ１等といった抗炎症作用に関連する分子が含まれていた。これらの分子は、本洗浄料を使用することで発現量が上昇したことから、皮膚の状態の改善を示すマーカーである可能性が示唆された。
【００７７】
【表４】
2020074769.tif 000005
【００７８】
（２）洗顔料の効果予測
被験者、および皮膚状態データとＳＳＬ採取
健常男性（２０〜４８歳）１８名を被験者とした。被験品として、角栓を分解して落とす効果を有する洗顔料（ビオレおうちｄｅエステ、花王株式会社）を用いた。上記「（１）洗顔料の皮膚への効果予測に使用するＲＮＡ種の同定」と同様に、被験者は、被験品を適量（約１ｇ）使用して、１日２回（朝、夜）、１週間に渡って全顔の洗顔を行った。被験品洗顔料の使用開始前（０日）および使用開始１週間後に、下記の通り、被験者へのＳＳＬの採取および皮膚状態の測定を実施した。
i）あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて、全顔からＳＳＬを採取。
ii）洗顔を実施した後に、恒温室（２０±５℃、４０％ＲＨ）で１５分間の馴化を実施。
iii）頬部の拡大画像を撮影した後に、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）を用いて、左側頬部における角層水分量を１ヶ所計測。
iv）肌状態に関するアンケートを実施。
【００７９】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
上記で採取したＳＳＬを含むあぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、−８０℃で約１ヶ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中ＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００８０】
データ解析
上記「（１）洗顔料の皮膚への効果予測に使用するＲＮＡ種の同定」で選抜した２２種のＲＮＡ群についての０日でのＲＰＭ値（表４）を用いて、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（トミーデジタルバイオロジー）ソフトウェアの自己組織化マップ（Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  Ｍａｐ）により該２２種のＲＮＡの発現が全体的に高い傾向にある群（高値群）と低い傾向にある群（低値群）の２群に群分けを行った（図５）。
【００８１】
Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｉｏｒｉｏらにより、疾患等により発現が低下したＲＮＡ群の発現を上昇させる効果を有する薬剤等を作用させる疾患改善方法として、“Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ”が報告されている（Drug Discov Today, 2013, 18(7-8):350-357）。この方法に基づけば、該低値群は、本被験品の使用により、高値群と比較して該２２種のＲＮＡ群がより顕著に上昇し、皮膚状態が改善することが予測された。実際に、被験品使用１週間後の角層水分量の変化量（使用１週間後の値−０日の値）を比較した結果を図６に示す。角層水分量については、本試験の使用開始０日の試験日と比較して、使用開始１週間後試験日では気温が大きく低下した影響で、角層水分量の変化量がマイナスの値となり角層水分量が減少する傾向が見られた。しかし、高値群の角層水分量の減少幅と比較して、低値群はその減少幅が小さく、水分量の減少が抑えられている傾向が示された。さらに使用実感についてのアンケート調査においても、低値群は、高値群と比較して肌の保湿状態が改善したと実感する人の割合が多く認められた（図７）。
これらの結果より、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析技術を用いることで、皮膚外用剤の効果を商品の使用開始前に予測することが可能になることが示唆された。例えば、ある皮膚外用剤の効果を享受しやすい者に特徴的に発現するまたは発現しないＳＳＬ由来ＲＮＡ（例えば本実施例で見出した２２種のＲＮＡ）を予め同定し、次いで被験者における該ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量を調べることで、該被験者が該皮膚外用剤を使用したときに効果が得られるか否かを予測することができる。
【００８２】
試験例６  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた新規アトピー性皮膚炎マーカー分子の検出
被験者
健常者（２０〜４９歳男性、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）５５名、および軽症アトピー性皮膚炎患者（２０〜３９歳男性、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）１５名、中等症アトピー性皮膚炎患者（２０〜３９歳男性、ＢＭＩ １８．５以上２５．０未満）２５名を被験者とした。健常者は、予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことを確認されており、アトピー性皮膚炎患者は、予め皮膚科医によりアトピー性皮膚炎の診断を受けていた。
【００８３】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで約１ヶ月間−８０℃で保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中のＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００８４】
データ解析
ＳＳＬ由来ＲＮＡ情報（ＲＰＭ値）に基づき、底２の対数値に変換したＲＰＭ値をデータ解析に供した。健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者で、底２の対数値に変換したＲＰＭ値が２倍以上低下し、かつＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔでｐ値が０．０５以下となった１９１１個の遺伝子群を抽出した（表７−１〜７−２４の（Ａ））。次いでＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値を使用し、ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）の水準を５％として、既報文献（Nature Protoc, 2009, 4:44-57; Nucleic Acids Res, 2009, 37:1-13）に従って、遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によるｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）の探索を行った。その結果、アトピー性皮膚炎患者において発現低下した遺伝子群と関連した１９個のＢＰが得られたが、その中でもＧＯ：００５０９１１（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍｅｌｌ）が最も関連性が強いことが示された（表５）。ＧＯ：００５０９１１を構成するＲＮＡには、約４００種のｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＯＲ）が含まれており、健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者においては３７０種のＯＲの発現が統計学的に有意に減少しており、これらの発現低下がＧＯの有意性に寄与していた。このことから、ＳＳＬ由来ＲＮＡ情報中に含まれるこれら３７０種のＯＲの発現量は、健常者とアトピー性皮膚炎患者を区別する有用なマーカーとなる可能性が示唆された。さらに、ＯＲのＲＮＡ発現について健常者と軽症アトピー性皮膚炎患者、および軽症アトピー性皮膚炎患者と中等症アトピー性皮膚炎患者をそれぞれ比較した結果、３６８種のＯＲが健常者に対して軽症アトピー性皮膚炎患者において低下し、さらに２８４種のＯＲは軽症アトピー性皮膚炎患者に対して中等症アトピー性皮膚炎患者において低下していた（表７−１〜７−１１の（Ｂ）〜（Ｄ））。これらの結果より、ＳＳＬ中の表７−１〜７−１１の（Ｂ）〜（Ｄ）に示すＯＲの発現量は、アトピー性皮膚炎の症状が悪化するに従い低下することが明らかとなり、これらのＯＲの発現量を指標とすることでアトピー性皮膚炎の重症度を把握できる可能性が示唆された。
【００８５】
【表５】
2020074769.tif 000006
【００８６】
試験例７  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた新規敏感肌マーカー分子の検出
被験者
予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことが確認された健常女性（２０〜５９歳、ＢＭＩ １８．５以上 ２５．０未満）４２名を、被験者の候補者とした。これらの候補者に対して、敏感肌の自覚の有無についてのアンケート（「気になる」、「あまり気にならない」、「気にならない」、「まったく気にならない」の４つから１つを選択）を実施し、「気にならない」または「まったく気にならない」を選択した１０名を敏感肌の自覚症状がない群に、「気になる」を選択した１３名を敏感肌の自覚症状がある群に分け、被験者とした。
【００８７】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで約１ヶ月間−８０℃で保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中のＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００８８】
データ解析
ＳＳＬ由来ＲＮＡ情報（ＲＰＭ値）に基づき、底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）をデータ解析に供した。敏感肌の自覚症状がない群と比較して敏感肌の自覚症状がある群で、Ｌｏｇ2ＲＰＭ値が２倍以上低下し、かつＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔでｐ値が０．０５以下となった６９３個の遺伝子群を抽出した（表７−１〜７−２０の（Ｅ））。次いでＬｏｇ2ＲＰＭ値を使用し、ＦＤＲの水準を５％として、上記既報文献に従って遺伝子オントロジーエンリッチメント解析によるＢＰの探索を行った。その結果、敏感肌の自覚症状がある群において発現低下した遺伝子群と関連した４個のＢＰが得られ、ＧＯ：００５０９１１が最も関連性が強いことが示された（表６）。ＧＯ：００５０９１１に含まれる約４００種のＯＲのうち、敏感肌の自覚症状がない人と比較して、敏感肌の自覚症状がある人は３４４種（表７−１〜７−１０の（Ｆ））のＯＲの発現が統計学的に有意に減少しており、これらの発現低下がＧＯの有意性に寄与していた。このことから、ＳＳＬ由来ＲＮＡ情報中に含まれるこれらＯＲの発現量は、敏感肌の自覚症状を検出する有用なマーカーとなる可能性が示唆された。
【００８９】
【表６】
2020074769.tif 000007
【００９０】
試験例８  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた皮脂分泌、水分量、赤み関連マーカー分子の検出
被験者
予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことが確認された健常男性（２０〜５９歳、ＢＭＩ １８．５以上 ２５．０未満）３８名を被験者とした。
【００９１】
皮膚物性の測定
全顔の写真撮影を行った後に、各被験者の額より洗顔前のカジュアル皮脂量を、Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）を用いて測定した。その後、洗顔を実施し、環境可変室で馴化（温度２０℃（±２℃）、湿度５０％（±５％））を１５分間実施した。馴化終了後、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）を用いて頬部の水分量を測定した。
【００９２】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
上記の皮膚物性の測定のカジュアル皮脂量測定後に、あぶら取りフィルム（３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、−８０℃で約１ヶ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中のＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【００９３】
データ解析
１）皮脂分泌関連分子
Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒを用いて測定した額のカジュアル皮脂量の値が１００未満の人を低値群、１５０以上の人を高値群として群分けを実施した。試験例７と同様の手順で低値群と高値群の２群間でのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（ＲＰＭ値）の比較を実施したところ、５９４種のＲＮＡが統計学的に有意に発現変動することが示された（表７−１〜７−１７の（Ｉ））。その中でも、図８に示すように、皮脂分泌高値群は低値群と比較してＢａｓｉｇｉｎ（ＢＳＧ）の発現量が統計学的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）に上昇することが明らかとなった。ＢＳＧノックアウトマウスでは皮脂腺と生物学的、構造学的に類似するマイボーム腺において、脂質の蓄積が減少し萎縮する表現型を示す事が報告されている（Cell Death and Disease, 2015, 6:e1726）。さらに皮脂分泌高値群は低値群と比較して、統計学的に有意にＨｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｓｈｉｄ  ｒｅｓｅｐｔｏｒ  ２（ＨＣＡＲ２）の発現量が減少することが明らかとなった。またＨＣＡＲ２は、マクロファージにおいて脂質の蓄積を抑制する効果を有することが報告されている（J Lipid Res, 2014, 2501-2508）。これらの知見より、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡは、皮脂の分泌量を反映する有用な指標であることが示唆された。
【００９４】
２）水分量関連分子
コルネオメータの測定結果に基づき、角層水分量が高い上位１５名（高値群）と低い下位１５名（低値群）を選抜した。試験例７と同様の手順でこれら高値群と低値群の２群間でＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（ＲＰＭ値）の比較を実施したところ、５５３種のＲＮＡが統計学的に有意に発現変動することが示された（表７−１〜７−１６の（Ｈ））。天然保湿因子は、皮膚の保湿力を保つうえで重要な役割を示す事が報告されている（Dermatol Ther, 17 Suppl, 2004, 1:43-48）。天然保湿因子の生成に関連する因子の発現について検証を行ったところ、図９に示すように、高値群と比較して低値群においてＡｓｐａｒｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｌｉｋｅ  １（ＡＳＰＲＶ１）やＰｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ３（ＰＡＤＩ３）等の発現量が統計学的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）に減少することが明らかとなった。ＡＳＰＲＶ１を欠損したマウスでは、実際に角層水分量が減少する事が報告されている（EMBO Mol Med, 2011, 3:320-333）。一方でＰＡＤＩ３も、天然保湿因子の生成に重要な役割を果たしていることが報告されている（J Invest Dermatol, 2005, 124:384-393）。これらの知見より、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡは、皮膚の水分量を反映する有用な指標であることが示唆された。
【００９５】
３）赤み関連分子
顔画像を目視評価した結果に基づき、肌の赤みが強い人８人（高値群）と弱い人６人（低値群）を選抜した。試験例７と同様の手順でこれら高値群と低値群の２群間でＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（ＲＰＭ値）の比較を実施したところ、７０３種のＲＮＡが統計学的に有意に発現変動することが示された（表７−１〜７−２０の（Ｇ））。その中でも、図１０に示すように、赤み高値群は低値群と比較して、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｈｉｇｎａｌｉｎｇ  ３（ＳＯＣＳ３）、およびＪｕｎＢ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＪＵＮＢ）の発現量が統計学的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）に減少することが明らかとなった。ＪＵＮＢ、およびＳＯＣＳ３のノックアウトマウスでは皮膚に炎症が惹起されることが報告されている（Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:20423-20428、PLoS One, 2012, 7:e40343）。さらに統計学に有意な差は確認されなかったものの、皮膚において炎症を惹起することが知られているＩＬ−１Ｂが、赤み高値群で低値群と比較して上昇傾向にあることが明らかとなった。これらの知見より、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡは、皮膚の赤みを反映する有用な指標であることが示唆された。
【００９６】
【表７−１】
2020074769.tif 000008
【００９７】
【表７−２】
2020074769.tif 000009
【００９８】
【表７−３】
2020074769.tif 000010
【００９９】
【表７−４】
2020074769.tif 000011
【０１００】
【表７−５】
2020074769.tif 000012
【０１０１】
【表７−６】
2020074769.tif 000013
【０１０２】
【表７−７】
2020074769.tif 000014
【０１０３】
【表７−８】
2020074769.tif 000015
【０１０４】
【表７−９】
2020074769.tif 000016
【０１０５】
【表７−１０】
2020074769.tif 000017
【０１０６】
【表７−１１】
2020074769.tif 000018
【０１０７】
【表７−１２】
2020074769.tif 000019
【０１０８】
【表７−１３】
2020074769.tif 000020
【０１０９】
【表７−１４】
2020074769.tif 000021
【０１１０】
【表７−１５】
2020074769.tif 000022
【０１１１】
【表７−１６】
2020074769.tif 000023
【０１１２】
【表７−１７】
2020074769.tif 000024
【０１１３】
【表７−１８】
2020074769.tif 000025
【０１１４】
【表７−１９】
2020074769.tif 000026
【０１１５】
【表７−２０】
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【０１１６】
【表７−２１】
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【０１１７】
【表７−２２】
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【０１１８】
【表７−２３】
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【０１１９】
【表７−２４】
2020074769.tif 000031
【０１２０】
試験例９  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた皮膚状態の予測
被験者
顔、手指、上腕の皮膚にトラブルが無い健常女性（３０代）３９名を被験者とした。
【０１２１】
皮脂の採取
洗顔前の各被験者の全顔よりあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、３Ｍ社）を用いて皮脂を採取し、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析用のサンプルとして−８０℃で約１カ月間保存した。
【０１２２】
皮膚の目視評価・触診評価
皮脂採取後、被験者は市販の洗顔料を用いて洗顔し、環境可変室（温度２０℃±１℃、湿度４０％±５％）で１０分間順化した。この順化の間に、被験者の顔の皮膚の状態について目視評価と触診評価を行った。
・目視評価項目：「きれいさ」、「透明感」、「明るさ」、「黄色味」、「全体赤味」、「しみ」、「鱗屑」、「つや」、「頬きめじわ」、「クマ目立ち」、「口角たるみ」、「ニキビ」、「毛穴目立ち（頬）」、「毛穴目立ち（鼻）」
・触診評価：「ざらつき感」、「しっとり感」
各評価項目に関し、評価基準（３：とてもある、２：ある、１：ややある、０：なし）に基づいて３名の専門評価者がスコアをつけ、３名の評価者の平均値を評価値とした。
【０１２３】
皮膚物性の測定
順化終了後の被験者から、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）及びＳｋｉｃｏｎ（株式会社ヤヨイ）を用いて角層水分量を、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）を用いて経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を、Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ（ＭＰＡ５８０、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツ）を用いて皮脂量を、ＣＭ２６０００ｄ（コニカミノルタジャパン）を用いてメラニン量と紅斑量を測定した。なお、皮脂量を額部で測定した以外は、全て頬部で測定した。
【０１２４】
皮脂組成分析
洗顔から１時間以上経過後の被験者から、仰臥位にて、クロロホルム／メタノール＝１／１により脱脂処理したシガレットペーパー（１．７ｃｍ×１．７ｃｍ、ＲＩＺＬＡ社：リズラ・ブルー・ダブル）２枚を重ならないように額の正中付近に並べ、１０秒間軽く押し当て皮脂を採取した。皮脂を採取したシガレットペーパーは、スクリュー管内に入れて即時メタノールを添加し、分析時まで−８０℃にて冷凍保管した。
【０１２５】
該スクリュー管から窒素気流下にて溶媒を留去し、次いで該スクリュー管内へ、クロロホルム／メタノール＝１／１を１ｍＬ添加した。該スクリュー管内の溶媒へシガレットペーパーが十分に浸っていることを確認した上で、５分間の超音波処理による脂質抽出を行い、皮脂溶液を得た。微量バイアル内に１００μｍｏｌ／ＬのＤｉｒｅｃｔ−ＭＳ／ＭＳ測定用の脂質内部標準混合溶液２０μＬを乾固させ、そこへ上記手順にて調製した皮脂溶液１００μＬを添加し、溶解及び混合することで、内部標準入り皮脂試料溶液を調製した。調製した試料溶液から、Ｄｉｒｅｃｔ−ＭＳ／ＭＳにて被験者毎に、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、ワックスエステル（ＷＥ）、コレステロールエステル（ＣｈＥ）、スクワレン（ＳＱ）、スクワレンエポキシド（ＳＱｅｐｏ）、酸化スクワレン（ＳＱＯＯＨ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の量を測定し、内部標準に基づいて絶対量を算出した。
【０１２６】
＜Ｄｉｒｅｃｔ−ＭＳ／ＭＳ測定条件＞
文献（特許６４８２２１５号）に記載の方法に従って、下記の条件にて測定を行った。
装置：ＬＣ／Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ、質量分析計／６４６０  トリプル四重極（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム含有クロロホルム／メタノール＝１／１
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
検出条件：イオン化法＝ＥＳＩ、乾燥ガス温度＝３００℃、乾燥ガス流量＝５Ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー圧力＝４５ｐｓｉ、シースガス温度＝２５０℃、シースガス流量＝１１Ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー電圧＝０Ｖ、キャピラリー電圧＝３５００Ｖ
（質量分析装置の検出モード）
ＦＦＡ：Ｓｃａｎ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）
ＷＥ：構成脂肪酸由来のプロダクトイオンから分子を検出するＰｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｉｏｎ  Ｓｃａｎ
ＣｈＥ：コレステロール骨格由来のプロダクトイオンから分子を検出するＰｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｉｏｎ  Ｓｃａｎ
ＳＱ、ＳＱｅｐｏ、ＳＱＯＯＨ：ＭＲＭ
ＤＡＧ：脱離した水酸基から分子を検出するＮｅｕｔｒａｌ  Ｌｏｓｓ  Ｓｃａｎ
ＴＡＧ：中性分子として脱離した脂肪酸から分子を検出するＮｅｕｔｒａｌ  Ｌｏｓｓ  Ｓｃａｎ
【０１２７】
ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製、およびシーケンス解析
保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中ＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【０１２８】
機械学習モデルの構築
・使用データ
上記で測定した被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、リードカウントが１０未満のデータについては欠損値として扱い、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、欠損値についてはＳｉｎｇｕｌａｒ  Ｖａｌｕｅ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＳＶＤ）ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎにて補填した。但し、全被験者の８０％以上で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみを以下の解析に使用した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を用いた。また、各予測対象項目（上述した皮膚の目視及び触診評価、皮膚物性測定、皮脂組成分析からのデータ、表８）における評価値、測定値は各対象データセット内における偏差値に変換し、その値をターゲット値とした。
【０１２９】
・データセット分割
被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、８０％に当たる３１名分のＲＮＡプロファイルデータを肌状態予測モデルの訓練データとし、残り２０％に当たる８名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。訓練データとテストデータの分割には、年齢の分布が均一になるような分割方法（分割１）と予測対象項目のターゲット値が均一になるような分割方法（分割２）を検討した。
【０１３０】
・特徴量遺伝子の選択
訓練データにおいて予測対象項目のターゲット値とＬｏｇ2ＲＰＭ値のスピアマンの相関係数（ｒｈｏ）の絶対値を算出し、表８に示す上位１０遺伝子（または５遺伝子）を各予測対象項目の特徴量遺伝子として選択した。
【０１３１】
・モデル構築
モデル構築は統計解析環境Ｒのｃａｒｅｔパッケージを使用して行った。
・・訓練データのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を説明変数とし、予測対象項目それぞれのターゲット値を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。
・・予測対象項目毎に、線形回帰モデル（Linear model）、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（Random Forest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（SVM (rbf)）の６種のアルゴリズムを用いて、１０倍交差検証を行って予測モデルを学習させた。
・・各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を入力して、各予測項目のターゲット予測値を計算した。
・・予測項目毎に予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を計算し、その値が最も小さいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
【０１３２】
【表８】
2020074769.tif 000032
【０１３３】
（結果）
表９に各予測対象項目についての最小のＲＭＳＥを与えたデータ分割方法、使用アルゴリズム、ＲＭＳＥを示す。また、最適な予測モデルにおけるターゲット値の予測値と実測値をプロットした散布図を図１１に示す。尚、図中のＲは予測値と実測値とのピアソンの相関解析における相関係数を示す。全ての予測対象項目において正の相関係数が得られ、ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータを用いて、皮膚状態の予測が可能であることが示された。
【０１３４】
【表９】
2020074769.tif 000033
【０１３５】
試験例１０  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた血中コルチゾール濃度の予測
被験者
顔、手指、上腕の皮膚にトラブルが無い健常女性（２０〜５０代）１２８名を被験者とした。
【０１３６】
皮脂の採取とＳＳＬ−ＲＮＡのシーケンシング
洗顔前の各被験者の全顔よりあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、３Ｍ社）を用いて皮脂を採取し、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析用のサンプルとして−８０℃で約１カ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中ＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【０１３７】
血中コルチゾール濃度の測定
各被験者の腕より真空採血管を用いて血液１５ｍＬを採取し、血清を分離して−８０℃で保存した。保存した血清中のコルチゾール濃度を、外部検査機関（株式会社ＬＳＩメディエンス）に委託して、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）にて定量した。
【０１３８】
機械学習モデルの構築
・使用データ
試験例９と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）のリードカウントが１０未満のデータについては欠損値とし、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、ＳＶＤ  ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎにて欠損値を補填した。機械学習モデルの構築には、全被験者の８０％以上で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみを解析に使用し、発現量データとしてＬｏｇ2ＲＰＭ値を用いた。
【０１３９】
・データセット分割
被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットから、８０％に当たる１０２名分のＲＮＡプロファイルデータをランダムに抽出し、血中コルチゾール濃度予測モデルの訓練データとした。残り２０％に当たる２６名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。
【０１４０】
・特徴量遺伝子の選択
訓練データにおいて血中コルチゾール濃度とピアソンの相関係数が大きい１０００遺伝子を抽出した。
【０１４１】
・使用アルゴリズム（ハイパーパラメータ候補値）
サポートベクターマシン（Support vector machine）（C: [0.1, 1, 10], kernel: [‘linear’, ‘rbf’, ‘poly’]）
ランダムフォレスト（Random forest）（max_depth: [1, 2, 3], max_features: [1, 2], n_estimators: [10, 100]）
多層パーセプトロン（Multilayer perceptron）（solver: [‘lbfgs’, ‘adam’], alpha: [0.1, 1, 10]）
【０１４２】
・モデル構築
モデル構築はＰｙｔｈｏｎの機械学習ライブラリーｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎを使用して行った。
・・訓練データのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を説明変数とし、血中コルチゾール濃度を目的変数として、１０倍交差検証を行って予測モデルを学習させた。
・・交差検証内で、特徴量遺伝子として抽出した１０００遺伝子の発現量データを主成分分析により第１から第１０主成分へ圧縮した後に、各アルゴリズムとハイパーパラメータ候補値についてグリッドサーチを実施しながらモデル学習させた。
・・学習後の各モデルにテストデータのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を入力して予測値を計算し、実測値との差のＲＭＳＥが最も小さかったモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
【０１４３】
（結果）
最小のＲＭＳＥが得られたランダムフォレスト（max_depth=2, max_features=2, n_estimator=100）を使用した予測モデルにテストデータのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を入力して得られた血中コルチゾール濃度の予測値を、実測値に対してプロットした散布図を図１２に示す。なお、図中に予測値と実測値とのピアソンの相関解析における相関係数（Ｒ）とＲＭＳＥ値を示す。図中に示したように、正の相関係数が得られ、ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータを用いて、血中コルチゾール濃度の予測が可能であることが示された。
【０１４４】
試験例１１  ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた累積紫外線曝露時間の予測
被験者
顔、手指、上腕の皮膚にトラブルが無い健常女性（２０〜５０代）１３０名を被験者とした。
【０１４５】
皮脂の採取とＳＳＬ−ＲＮＡのシーケンシング
洗顔前の各被験者の全顔よりあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、３Ｍ社）を用いて皮脂を採取し、ＳＳＬ由来ＲＮＡ解析用のサンプルとして−８０℃で約１カ月間保存した。保存したあぶら取りフィルムから、試験例３と同様の手順でＳＳＬ中ＲＮＡを抽出、ライブラリー調製を行い、シーケンシングによりＲＮＡ種を同定し、それらの発現量を測定した。
【０１４６】
累積紫外線曝露時間の算出
被験者が、一定の年齢範囲において太陽光に曝露されていた標準的な時間を、生活習慣や屋外レジャー活動に関するアンケート調査に基づいて予測し、実年齢を考慮して累積紫外線曝露時間（hour）を計算した。なお、アンケートの質問項目は米国がんセンター公開の光曝露歴に関する質問票をもとに作成した（Arch. Dermatol. 144, 217-22 (2008)）。
【０１４７】
機械学習モデルの構築
試験例９と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）のリードカウントが１０未満のデータについては欠損値とし、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、SVD imputationにて欠損値を補填した。機械学習モデルの構築には、全被験者の８０％以上で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみを解析に使用し、発現量データとしてＬｏｇ2ＲＰＭを用いた。
【０１４８】
・データセット分割  
被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットから、８０％に当たる１０４名分のＲＮＡプロファイルデータをランダムに抽出し、累積紫外線曝露時間予測モデルの訓練データとした。残り２０％に当たる２６名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。
【０１４９】
・特徴量遺伝子の選択
訓練データにおいて累積紫外線曝露時間とピアソンの相関係数が大きい１０００遺伝子を抽出した。これら１０００遺伝子に加え、被験者の年齢を特徴量に加えた。
【０１５０】
・使用アルゴリズム（ハイパーパラメータ候補値）
試験例１０と同じアルゴリズムを用いた。
【０１５１】
・モデル構築
試験例１０と同様に１０倍交差検証を行い、実測値との差のＲＭＳＥが最も小さかったモデルを最適な予測モデルとして選抜した。但し、特徴量として上で選択した１０００遺伝子に加え、被験者の年齢を使用した。
【０１５２】
（結果）
最小のＲＭＳＥが得られたサポートベクターマシン（C=10, kernel=‘linear’）を使用した予測モデルにテストデータのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量（Ｌｏｇ2ＲＰＭ値）を入力して得られた累積紫外線曝露時間の予測値を、アンケートに基づいた算出値に対してプロットした散布図を図１３に示す。なお、図中に予測値と算出値とのピアソンの相関解析における相関係数（Ｒ）とＲＭＳＥ値を示す。図中に示したように、正の相関係数が得られ、ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータを用いることで、アンケートによらずとも累積紫外線曝露時間の予測が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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