(57)【要約】【課題】早期がんの有無についても精度よく判定できる、がんの診断用バイオマーカーを提供すること。【解決手段】被験者から採取された血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片における特定のシトシンのメチル化レベルが、がんに罹患していない対照者におけるメチル化レベルよりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと判定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするがんの判定方法。
（ａ）被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定する工程であって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンである、前記工程；
（ｂ）工程（ａ）で測定したメチル化レベルを、がんに罹患していない対照者における前記メチル化レベルと比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定したメチル化レベルが、対照者におけるメチル化レベルよりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程；
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とするがんの判定方法。
（Ａ）被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合とを測定する工程であって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンである、前記工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で測定したメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合を、それぞれ、がんに罹患していない対照者における前記メチル化レベル及び前記ＤＮＡ断片の割合と比較する工程；
（Ｃ）工程（Ａ）で測定したメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合の少なくともいずれか一方が、それぞれ、対照者におけるメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合よりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程；
【請求項３】
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片をさらに含み、
工程（ａ）及び（Ａ）において、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンのメチル化レベルをさらに測定する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
がんが、胃癌又は膵臓癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
胃癌が、ステージＩの胃癌であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、がんの判定用キットであって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンであることを特徴とする
前記キット。
【請求項８】
血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と、
血清試料又は血漿試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と
を含む、がんの判定用キットであって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンであることを特徴とする
前記キット。
【請求項９】
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片をさらに含み、
フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンのメチル化レベルをさらに測定するためのものである
ことを特徴とする請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
がんが、胃癌又は膵臓癌であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
胃癌が、ステージＩの胃癌であることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＴＥＲＴ遺伝子由来の二本鎖ＤＮＡが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん発症の有無を判定する方法や、がん発症の有無を判定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省が毎年行っている「人口動態統計」によれば、がんは、日本人の死因の１位を占めており、２位が心疾患、３位が肺炎である。平成２５年度統計結果では、がんによる死亡者数は年間３６万人を超え、ほぼ３人に１人ががんで死亡していることになる。近年のがん死亡率を臓器別で見ると、男女で多少差はあるものの、大腸癌（結腸癌及び直腸癌）、肺癌、肝臓癌、胃癌の順で高い傾向にある。
【０００３】
がん治療において、早期発見が極めて重要であり、これまでに多くのがん検査手法が開発されてきた。例えば、便潜血検査は、大腸癌で広く用いられているが、検出感度が低く、早期発見が難しいという問題があった。また、内視鏡検査は、大腸癌や胃癌で広く用いられているが、内視鏡検査に対する被検者の抵抗感が高いという問題があった。
【０００４】
近年、がんと、血清試料又は血漿試料中の二本鎖ＤＮＡ断片との関連性に着目した、がんの判定方法が報告されている。例えば、血清試料中の、反復配列（ＬＩＮＥ１）を含む二本鎖ＤＮＡ断片のサイズパターンを指標にして、がんを判定する方法が報告されている（特許文献１）。また、血清試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるメチル化レベルを指標として、胃癌を判定する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、かかる文献においては、胃癌患者の症例数が４例と少なく、信ぴょう性が低い可能性があり、また、早期がんを診断できるかどうかは不明である。また、非特許文献２には、ステージＩの初期胃癌患者から採取された血清試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片は、メチル化されていることが報告されている。しかしながら、メチル化されている患者の割合は約１９％（４／２１）と低く、検出感度に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１２−５２１７７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tan, S.H. et al, Oncol Rep. 2007, 18(5):1225-1230Oncol Rep.
【非特許文献２】Lu, X.X. et al, Cancer. 2012, 118(22):5507-5517Oncol Rep.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、早期がんの有無についても精度よく判定できる、がんの診断用バイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、がん患者由来の血清試料中に含まれるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片のシトシン・グアニン（ＣＧ）部位におけるシトシンのメチル化レベルを測定した。ところが、当該ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片には、ＤＮＡ多型が存在するものが多いため、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片全体に共通するＣＧ部位の特定から行う必要があった。また、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片全体に共通するＣＧ部位を特定できたとしても、がんとは無関係のメチル化シトシンが多数見つかり、がん特異的なメチル化シトシンの同定は困難を極めた。請求項１等に定義する３種類のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片についても、ＤＮＡ多型が多数存在し、同定は困難と思われたが、試行錯誤の末、請求項１等に定義する特定のシトシンのメチル化が、ステージＩの初期胃癌の発症と関連していることを見出した。さらに、がん患者由来の血清試料中に含まれるヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ遺伝子、以下、単に「ＴＥＲＴ遺伝子」という）由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定したところ、上記メチル化レベルと、当該割合との組合せを指標とすることにより、それぞれを単独で指標とした場合と比べ、ステージＩの初期胃癌の有無をより精度よく判定できることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするがんの判定方法。
（ａ）被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定する工程であって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンである、前記工程；
（ｂ）工程（ａ）で測定したメチル化レベルを、がんに罹患していない対照者における前記メチル化レベルと比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定したメチル化レベルが、対照者におけるメチル化レベルよりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程；
〔２〕以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とするがんの判定方法。
（Ａ）被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合とを測定する工程であって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンである、前記工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で測定したメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合を、それぞれ、がんに罹患していない対照者における前記メチル化レベル及び前記ＤＮＡ断片の割合と比較する工程；
（Ｃ）工程（Ａ）で測定したメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合の少なくともいずれか一方が、それぞれ、対照者におけるメチル化レベル及び二本鎖ＤＮＡ断片の割合よりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程；
〔３〕ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片をさらに含み、
工程（ａ）及び（Ａ）において、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンのメチル化レベルをさらに測定する
ことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕がんが、胃癌又は膵臓癌であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕胃癌が、ステージＩの胃癌であることを特徴とする上記〔４〕に記載の方法。
〔６〕ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする上記〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、がんの判定用キットであって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンであることを特徴とする
前記キット。
〔８〕血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と、
血清試料又は血漿試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と
を含む、がんの判定用キットであって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を含み、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンであることを特徴とする
前記キット。
〔９〕ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片をさらに含み、
フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシンのメチル化レベルをさらに測定するためのものである
ことを特徴とする上記〔７〕又は〔８〕に記載のキット。
〔１０〕がんが、胃癌又は膵臓癌であることを特徴とする上記〔７〕〜〔９〕に記載のキット。
〔１１〕胃癌が、ステージＩの胃癌であることを特徴とする上記〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕ＴＥＲＴ遺伝子由来の二本鎖ＤＮＡが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載のキット。
【００１０】
また本発明の実施の他の形態として、
被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化レベルを測定する工程であって、
前記ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片（以下、「ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１」ということがある）を含み、かつ、任意で、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片（以下、「ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２」ということがある）、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片（以下、「ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３」ということがある）をさらに含み（以下、これらを総称して、「ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３」ということがある）、
前記シトシンが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン（以下、「本件シトシン１」ということがある）、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン（以下、「本件シトシン２」ということがある）、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の５４番目のシトシン（以下、「本件シトシン３」ということがある）である（以下、これらシトシンを総称して「本件シトシン１〜３」ということがある）、前記工程を含む、がんの判定方法；や、
被験者から採取された血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合とを測定する工程（Ａ）であって、任意で、前記血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化レベルをさらに測定する、前記工程（Ａ）を含む、がんの判定方法；や、
上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む、がんを判定（診断）するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、がんを判定（診断）するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（ａ）〜（ｃ）を含み、さらに、工程（ｃ）において、がんに罹患している可能性が高いと評価（診断）された被験者に対して、がんを治療する処置（例えば、放射線治療、抗がん剤治療等）を施す工程（ｐ）を任意で含む、がんの診断方法；や、
上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含み、さらに、工程（Ｃ）において、がんに罹患している可能性が高いと評価（診断）された被験者に対して、がんを治療する処置（例えば、放射線治療、抗がん剤治療等）を施す工程（ｐ）を任意で含む、がんの診断方法；や、
がんの判定（診断）方法における使用のための、
血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物であって、任意で、前記血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化レベルをさらに測定するための、前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物；や、
がんの判定（診断）方法における使用のための、
血清試料又は血漿試料中の１若しくは２種以上のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と、血清試料又は血漿試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物との組合せであって、前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物が、任意で、前記血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化レベルをさらに測定するためのものである、前記組合せ；や、
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化を含む、がんの判定用バイオマーカーであって、任意で、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化をさらに含み、がんに罹患している者から採取された血清試料又は血漿試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベルが、がんに罹患していない対照者における本件シトシン１〜３のメチル化レベルと比べ、高い、前記バイオマーカー；や、
がんの判定（診断）方法におけるバイオマーカーとして使用するためのＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化であって、任意で、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化を組み合わせて使用し、がんに罹患している者から採取された血清試料又は血漿試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベルが、がんに罹患していない対照者における本件シトシン１〜３のメチル化レベルと比べ、高い、前記本件シトシン１のメチル化；や、
がんの判定（診断）方法におけるバイオマーカーとして使用するためのＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化と、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片との組合せであって、任意で、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化を組み合わせて使用し、がんに罹患している者から採取された血清試料又は血漿試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベル及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合の少なくともいずれか一方が、それぞれ、がんに罹患していない対照者における本件シトシン１〜３のメチル化レベル及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合と比べ、高い、前記組合せ；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、がん、特にステージＩの初期胃癌の発症の有無についても精度よく判定することができるため、がん発症後初期段階で適切な治療を受けることができ、がんの早期発見及び早期治療に資する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、胃癌群及び健常群の血清試料中に含まれるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における、メチル化された本件シトシン１〜３の割合を測定した結果を示す図である。縦軸は、血清４０μＬあたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数を示す。図中の白丸（○）は、各被験者を示す。図中の「＊＊」は統計学的に有意差（ｐ＝０．００１９）があることを示す。図１Ｂは、図１Ａで得られた結果を基に作成したＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を示す図である。
【図２】図２Ａは、胃癌群及び健常群の血清試料中に含まれるＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定した結果を示す図である。縦軸は、血清４０μＬあたりの、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の数を示す。図中の白丸（○）は、各被験者を示す。図中の「＊＊」は統計学的に有意差（ｐ＝０．００５６）があることを示す。図２Ｂは、図２Ａで得られた結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示す図である。
【図３】図３Ａは、膵臓癌群及び健常群の血清試料中に含まれるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における、メチル化された本件シトシン１〜３の割合を測定した結果を示す図である。縦軸は、血清４０μＬあたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数を示す。図中の白丸（○）は、各被験者を示す。図３Ｂは、図３Ａで得られた結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のがんの判定方法としては、
被験者から採取された血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のメチル化レベルと、任意で、前記血清試料又は血漿試料中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２〜３における本件シトシン２〜３のメチル化レベル（以下、これらを総称して「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」ということがある）とを測定し、必要に応じて定量する工程（ａ）；「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」を、がんに罹患していない対照者における前記メチル化レベル（以下、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」ということがある）と比較する工程（ｂ）；及び「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程（ｃ）；の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法（以下、「本件判定方法１」ということがある）；や、
「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」と、被験者から採取された血清試料又は血漿試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合（以下、「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」ということがある）とを測定し、必要に応じて定量する工程（Ａ）；「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」及び「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」を、それぞれ、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」及びがんに罹患していない対照者における前記ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合（以下、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」ということがある）と比較する工程（Ｂ）；並びに「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」及び「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」のいずれか一方又は両方が、それぞれ、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」及び「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」よりも高いとき、前記被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価する工程（Ｃ）；の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む方法（以下、「本件判定方法２」ということがある）；
であれば特に制限されない（本件判定方法１と本件判定方法２を総称して、以下「本件判定方法」ということがある）。本件判定方法は、医師によるがんの有無の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
【００１４】
また、本発明のがんの判定用キットとしては、
「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」を測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー（以下、「プライマーセット」ということがある）、並びに／又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、がんの判定（診断）に用いるためのキット（以下、「本件キット１」ということがある）；や、
「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」を測定するためのプライマーセット、及び／又はプローブ、若しくはそれらの標識物と、
「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」を測定するためのプライマーセット、及び／又はプローブ、若しくはそれらの標識物とを含む、がんの判定（診断）に用いるためのキット（以下、「本件キット２」ということがある）；
であれば特に制限されない（本件キット１と本件キット２を総称して、以下「本件キット」ということがある）。本件キットは、がんを判定するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種の判定キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、がんを判定するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
【００１５】
大部分の被験者においては、後述する本実施例で示されているとおり、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３のうち、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１のみが血液試料中に含まれている。このため、本発明において、測定対象のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片におけるシトシンとしては、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１における本件シトシン１のみでもよいが、判定精度をより高めるために、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２における本件シトシン２、及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３における本件シトシン３をさらに含むことが好ましい。
【００１６】
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルや、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を指標として、被験者が、がんに罹患しているか否かを判定できることから、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化や、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片は、がんの判定用バイオマーカーとなり得る。
【００１７】
本発明において、がんとしては、例えば、大腸癌（結腸癌又は直腸癌）；胃癌；肝臓癌；脳腫瘍；肺癌（腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌）；食道癌；十二指腸癌；小腸癌；皮膚癌；乳癌；前立腺癌；膀胱癌；膣癌；子宮頸部癌；子宮体癌；腎臓癌；膵臓癌；脾臓癌；気管癌；気管支癌；頭頚部癌；胆嚢癌；胆管癌；精巣癌；卵巣癌；骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、神経組織、血管組織、又は造血組織における癌（具体的には、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫；肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫；胚細胞腫瘍；リンパ腫；白血病）；等を挙げることができ、これらの中でも、本実施例でその効果が実証されているため、胃癌や膵臓癌が好ましく、ステージＩの胃癌がより好ましい。
【００１８】
上記血清試料又は血漿試料は、換言すると、血液細胞（例えば、赤血球、白血球、血小板）を除去した血液試料ということができる。
【００１９】
上記被験者としては、ヒトである限り特に制限されず、例えば、がんに罹患しているか否か不明な被験者を挙げることができる。かかる被験者には、過去にがんに罹患したことがあり、その後がんは完治したものの、被検時にがんに罹患しているか否か不明な被験者も含まれる。
【００２０】
本発明において、「シトシンのメチル化」とは、シトシン塩基５位の炭素がメチル化された状態を意味する。
【００２１】
本発明において、測定対象のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞外に存在する断片化した二本鎖ＤＮＡであり、細胞内（細胞核）のゲノムＤＮＡ上に存在するＲＵＮＸ３遺伝子及びＴＥＲＴ遺伝子とは異なる。ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の長さは、ゲノムＤＮＡがヌクレオソーム単位で断片化することを考慮すると、例えば、約１４０〜１７０塩基長の範囲内、及び／又はその倍数の塩基長、例えば、２倍の場合、２８０〜３４０塩基長であり、３倍の場合、４２０〜５１０塩基長である。
【００２２】
上記ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片としては、血液中に含まれる、断片化したＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡであればよく、具体的には、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含むＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片を挙げることができる。血液中に含まれるＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列については、血清試料又は血漿試料から定法に従ってＤＮＡを単離・精製し、次世代シーケンサー（例えば、イルミナ［Illumina］社製のMiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq及びHiSeq Xシリーズ；ロシュ社製のRoche 454 GS FLXシーケンサー）を用いて決定することができる。
【００２３】
本明細書において、「ＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」としては、メチル化された本件シトシン１〜３のメチル化の程度を示す値であればよく、例えば、ＲＵＮＸ３断片１つあたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数（割合）や、血清試料又は血漿試料の体積あたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数（濃度）を挙げることができる。また、本明細書において、「ＴＥＲＴ断片の割合」は、具体的には、血清試料又は血漿試料の体積あたりのＴＥＲＴ断片の数（濃度）である。これら「ＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」及び「ＴＥＲＴ断片の割合」は、絶対値であっても、相対値であってもよい。
【００２４】
上記工程（ａ）及び（Ａ）において、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３におけるシトシンのメチル化レベルを測定する方法としては、本件シトシン１〜３のメチル化レベルを検出・定量し得る方法である限り特に制限されず、ハイブリダイゼーション法（例えば、ＭＢＤ２［methyl-CpG-binding domain protein 2］や抗ＭＢＤ２抗体等を用いたクロマチン免疫沈降法［ＣｈＩＰ］などによりメチル化ＤＮＡを濃縮し、ＤＮＡマイクロアレイ解析する方法）；メチル化感受性制限酵素を用いて解析する方法；亜硫酸水素塩（バイサルファイト）処理を利用したバイサルファイト法；を例示することができる。
【００２５】
上記メチル化感受性制限酵素を用いて解析する方法は、制限酵素の認識配列中のシトシンがメチル化されることで、ＤＮＡを切断できなくなる現象を利用したものである。ここで使用するメチル化感受性制限酵素は、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３中の本件シトシン１〜３を含む前後のヌクレオチド配列が、「ＣＣｐＧＧ」（ここで、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｃｐ」は、メチル化され得る本件シトシン１〜３を示し、「Ｇ」はグアニンを示す。）であることを考慮すると、通常、かかる配列を標的とするＨｐａＩＩである。なお、ＨｐａＩＩの比較対照として、「ＣＣＧＧ」を標的とするメチル化非感受性制限酵素ＭｓｐＩを用いてもよい。ＨｐａＩＩによる反応（処理）時間は、適宜選択することができ、例えば１〜４８時間の範囲内であり、好ましくは５〜２４時間、より好ましくは１２〜２０時間である。また、ＨｐａＩＩによる反応（処理）温度は、適宜選択することができ、例えば３０〜３９℃の範囲内であり、好ましくは３５〜３８℃の範囲内である。メチル化感受性制限酵素による処理後、本件シトシン１〜３部位の切断効率、すなわち、本件シトシン１〜３のメチル化レベルは、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法；サザンハイブリダイゼーション；リアルタイムＰＣＲ（polymerase chain reaction）、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）等のＰＣＲ；などの方法で解析することができる。
【００２６】
上記ｄｄＰＣＲ法は、サンプル中のターゲットＤＮＡ量を絶対定量する方法である。この方法では、サンプル中のターゲットＤＮＡを約２万個の小液滴（ドロップレット）に分画し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。ターゲットＤＮＡが入っている小液滴は光り、入っていない小液滴は変化しない。光っている小液滴と光っていない小液滴の数をカウントすることでサンプル中の測定対象遺伝子の濃度を絶対的な数値として出すことができるという原理である。データは、小液滴（ドロップレット）のターゲットＤＮＡのアリ／ナシで判断することから、それがデジタル信号の１／０と同じなので「デジタルＰＣＲ」という。後述する本実施例において、メチル化された本件シトシン１〜３の数、及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の数は、ドロップレットリーダーによって、上記２万個の小液滴（ドロップレット）を一つずつ蛍光量測定し、蛍光を発するドロップレットの数をカウントすることにより定量することができ、測定前の血清体積を基に、血清中に含まれるメチル化された本件シトシン１〜３の割合（濃度）や、血清中に含まれるＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合（濃度）を算出することができる。
【００２７】
上記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、インターカレーター法、５’−ヌクレアーゼ法、サイクリングプローブ法を挙げることができる。
【００２８】
本件判定方法において、本件シトシン１〜３のメチル化を測定する場合、本件シトシン１〜３のメチル化のそれぞれを個別に測定するプライマーセット、プローブ、又はそれらの標識物を用いてもよいが、本件シトシン１〜３のメチル化すべてを共通して測定できるプライマーセット、プローブ、又はそれらの標識物を用いて測定することが好ましく、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー；配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー、又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるリバースプライマー；配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプローブ、又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるプローブ；及びこれらの標識物を好適に例示することができる。
【００２９】
本発明において、比較する両者（被験者及び対照者間におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル；被験者及び対照者間におけるＴＥＲＴ断片の割合；がん患者及び対照者間におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル；又は、がん患者及び対照者間におけるＴＥＲＴ断片の割合）は、互いに対応するものである。対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベルやＴＥＲＴ断片の割合は、本件判定方法を実施する際、対照者から採取された血清試料又は血漿試料を基に、その都度測定した値であってもよいが、予め測定した値であってもよい。また、比較する両者は、実質的に同じ方法により調製された血清試料又は血漿試料や、実質的に同じ測定方法により得られたものが好ましい。
【００３０】
上記工程（ｃ）及び工程（Ｃ）において、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高いか否かを評価（判定）するために、任意の閾値（カットオフ値）を適宜設定することができ、かかる閾値としては、例えば、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」の平均値、前記平均値±標準偏差（ＳＤ）、前記平均値±２ＳＤ、前記平均値±３ＳＤ、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」の中央値、前記中央値±ＳＤ、前記中央値±２ＳＤ、前記中央値±３ＳＤ等を挙げることができる。また、閾値は、感度（がんに罹患している被験者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（がんに罹患していない対照者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」のデータと、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
【００３１】
上記工程（Ｃ）において、「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」が、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」よりも高いか否かを評価（判定）するために、任意の閾値（カットオフ値）を適宜設定することができ、かかる閾値としては、例えば、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」の平均値、前記平均値±標準偏差（ＳＤ）、前記平均値±２ＳＤ、前記平均値±３ＳＤ、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」の中央値、前記中央値±ＳＤ、前記中央値±２ＳＤ、前記中央値±３ＳＤ等を挙げることができる。また、閾値は、感度（がんに罹患している被験者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（がんに罹患していない対照者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」のデータと、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ曲線を用いて算出することもできる。
【００３２】
上記工程（ｃ）において、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高いとき、被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価（判定）し、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高くない（低い）とき、被験者は、がんに罹患している可能性が低いと評価（判定）する。
【００３３】
上記工程（Ｃ）において、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高いか、又は、「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」が、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」よりも高いか、あるいはその両方であるとき、被験者は、がんに罹患している可能性が高いと評価（判定）し、「被験者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」が、「対照者におけるＲＵＮＸ３断片のメチル化レベル」よりも高くなく（低く）、かつ、「被験者におけるＴＥＲＴ断片の割合」が、「対照者におけるＴＥＲＴ断片の割合」よりも高くない（低い）とき、被験者は、がんに罹患している可能性が低いと評価（判定）する。
【００３４】
本件キットにおいて、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、鋳型ＤＮＡであるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３のうち、少なくとも本件シトシン１〜３を含む一部又は全部を、特異的に増幅するものであればよく、具体的には、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１番目のヌクレオチドを上流とし、末尾のヌクレオチドを下流とした場合、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の上流側で、その一部又は全部がアニール（ハイブリダイズ）するフォワードプライマーや、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の下流側で、その一部又は全部がアニールするリバースプライマーを挙げることができる。これらフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２、及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３の３断片を特異的に増幅するものが好ましく、具体的には、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーや、配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー、又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
【００３５】
本件キットにおいて、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、鋳型ＤＮＡであるＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の一部又は全部を、特異的に増幅するものであればよく、具体的には、配列番号４に示されるヌクレオチド配列において、１番目のヌクレオチドを上流とし、末尾のヌクレオチドを下流とした場合、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の上流側で、その一部又は全部がアニール（ハイブリダイズ）するフォワードプライマーや、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の下流側で、その一部又は全部がアニールするリバースプライマーを挙げることができる。これらフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、より具体的には、配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、又は配列番号８に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーや、配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー、又は配列番号９に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
【００３６】
本件キットにおいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さは、例えば、１０〜４０塩基長であり、好ましくは１２〜３５塩基長であり、より好ましくは１４〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。
【００３７】
本件キットにおいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＰＣＲで用いるポリメラーゼがプライマーの３’末端で複合体を形成し、ＤＮＡ鎖を伸長することを考慮すると、かかるプライマーの３’末端のヌクレオチドは、鋳型ＤＮＡであるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３やＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片とアニールするように設計することが好ましく、さらに、プライマーの３’末端でのポリメラーゼ／プライマー複合体の安定性を高めるために、Ｇ又はＣとなるように設計することがより好ましい。
【００３８】
本件キットにおいて、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３におけるシトシンのメチル化レベルを測定するためのプローブとしては、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３に直接アニール（ハイブリダイズ）し、本件シトシン１〜３のメチル化レベルを測定する場合（例えば、ハイブリダイゼーション法）、鋳型ＤＮＡであるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３のうち、少なくとも本件シトシンを含む一部又は全部に、特異的にアニール（ハイブリダイズ）するものであればよく、また、メチル化の指標となる、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３から得られた二次産物（例えば、ＰＣＲ産物）にアニール（ハイブリダイズ）し、本件シトシン１〜３のメチル化レベルを測定する場合（例えば、メチル化感受性制限酵素を用いて解析する方法、バイサルファイト処理を利用したバイサルファイト法）、前記二次産物の一部又は全部に、特異的にアニール（ハイブリダイズ）するものであればよく、具体的には、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部又は全部にアニール（ハイブリダイズ）するプローブや、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の一部又は全部にアニール（ハイブリダイズ）するプローブや、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の一部又は全部にアニール（ハイブリダイズ）するプローブを挙げることができる。かかるプローブとしては、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２、及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３の３断片に、特異的にアニールするものが好ましく、具体的には、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプローブ、又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるプローブを挙げることができる。
【００３９】
本件キットにおいて、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定するためのプローブとしては、鋳型ＤＮＡであるＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の一部又は全部に、特異的にアニール（ハイブリダイズ）するものであればよく、具体的には、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の一部又は全部にアニール（ハイブリダイズ）するプローブを挙げることができる。かかるプローブとしては、より具体的には、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなるプローブ、又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなるプローブを挙げることができる。
【００４０】
本発明において、「１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜５個の範囲内、好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。
【００４１】
本件キットにおいて、フォワードプライマーの標識物、リバースプライマーの標識物、及びプローブの標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素；フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質；３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体；ビオチン、アビジン、又は化学発光物質；レポーター蛍光物質とクエンチャー蛍光物質又は構造との組合せ（例えば、５−ＦＡＭ［5-Carboxyfluorescein］と５−ＴＡＭＲＡ［5-Carboxytetramethylrhodamine］との組合せ、ＶＩＣとＭＧＢ［Minor Groove Binder］との組合せ）を挙げることができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
１．胃癌患者由来血清試料を用いた本件判定方法
１−１  材料と方法
［血清試料］
胃癌群における胃癌患者２３名（男性１８名、女性５名；平均年齢７２歳［４４〜９１歳］）と、健常群における健常者１８名（男性１０名、女性８名；平均年齢５２歳［４１〜６０歳］）の計４１名の被験者から、定法に従って血清試料を調製した。血清試料は、２０１６年１１月２５日〜２０１７年１２月２０日の間、上部消化管内視鏡検査の前に、山口大学医学部附属病院、セントヒル病院、又は阿知須共立病院で予め採取し、ＤＮＡの抽出を行うまで−８０℃で保存した。癌細胞が血液中にコンタミネーションすることを避けるために、生検が行われた場合、生検の３週間後以降に血液の採取を行った。対照である健常者は、いかなる癌の病歴もなく、上部消化管内視鏡検査により、胃腺腫及び癌を有さないと判定された者である。胃癌患者は、胃癌以外のがんの病歴がない、内視鏡的切除でステージＩの初期胃癌と診断された患者である。胃癌患者２３名のうち、高分化度（Well）の胃癌患者は２２名であり、中分化度（Moderate）胃癌患者は１名であった。また、胃癌患者の平均腫瘍サイズは１３ｍｍ（７〜４４ｍｍ）であった。なお、胃癌のステージは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）にしたがって分類した（文献「Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C, editors. TNM Classification of Malignant Tumours, 7th ed. Oxford: Wiley-Blackwell; 2009.」参照）。また、上記被験者は全員日本人であった。本研究の目的、上部消化管内視鏡検査の複雑性及びリスクを対面の面談で口頭及び同意書で明確にした。上記健常者は、自発的に参加し、上部消化管内視鏡検査のリスクを理解した者に限定され、インフォームドコンセントの書類に署名した。研究プロトコールは、山口大学大学院医学研究科、セントヒル病院、及び阿知須共立病院の施設内倫理委員会で承認され、インフォームドコンセントを上記被験者から入手した。
【００４４】
［被験者由来血清試料中のＤＮＡの調製］
−８０℃で保存した上記被験者由来血清試料を解凍し、各血清試料０．４ｍＬから、MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I（Roche社製）を用い、製品添付のプロトコールに従って、５０μＬの溶出緩衝液中にＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの濃度は、Qubit２．０フルオロメーター（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて定量した。なお、非メチル化ＤＮＡのコントロールとして末梢血白血球由来のＤＮＡを使用し、また、高メチル化ＤＮＡのコントロールとしてEpiScope メチル化ＨＣＴ１１６ｇＤＮＡ（Takara Bio社製）を使用した。
【００４５】
［ＣＯＲＤ（Combined Restriction Digital PCR）アッセイ］
被験者由来血清試料中の二本鎖ＤＮＡ断片のメチル化を検出するために、２ステップからなるＣＯＲＤアッセイ（文献「Suehiro Y, Zhang Y, Hashimoto S, Takami T, Higaki S, Shindo Y, et al. Highly sensitive faecal DNA testing of TWIST1 methylation in combination with faecal immunochemical test for haemoglobin is a promising marker for detection of colorectal neoplasia. Ann Clin Biochem. 2017:4563217691064.」参照）を行った。具体的には、まず第１ステップにおいて、抽出したＤＮＡを含む溶出緩衝液１０μＬ（８０μＬの血清に相当）に、１μＬのGeneAmp 10 x PCR Buffer II、及び１μＬの２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、並びに、２種類のメチル化感受性制限酵素（１０ユニットのＨｈａＩ［認識部位：ＧＣＧＣ］、及び１０ユニットのＨｐａＩＩ［認識部位：ＣＣＧＧ］）、及び２０ユニットのエキソヌクレアーゼI（ＥｘｏＩ）（全て、Thermo Fisher Scientific 社製）を添加し、３７℃で１６時間、ＤＮＡ分解処理を行った。なお、ここでＥｘｏＩは、血清試料中に含まれる１本鎖ＤＮＡを分解するために用いた。次に、第２のステップにおいては、さらに別の種類のメチル化感受性制限酵素（１０ユニットのＢｓｔＵＩ［認識部位：ＣＧＣＧ］［New England Biolabs 社製］）を添加し、６０℃で１６時間、追加のＤＮＡ分解処理を行った。制限酵素処理後、サンプルを９８℃で１０分間加熱処理した。
【００４６】
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２、及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３や、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片（表１参照）を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）法（文献「High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-10.」）により増幅・定量した。具体的には、制限酵素処理後のＤＮＡサンプル８μＬ（４０μＬの血清に相当）と、１×ddPCR Supermix for Probes（BioRad社製）、並びにプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）０．２５μｍｏｌ／Ｌ及び０．１２５μｍｏｌ／Ｌのプローブ（表２参照）を用い、Automated Droplet Generator（BioRad社製）によりドロップレットを生成し、QX100 droplet Digital PCRシステム（BioRad社製）を用いてＰＣＲを行い、データ解析は、QuantaSoft software（BioRad社製）を用いて行った。
【００４７】
【表１】
2020014415.tif 000002
【００４８】
【表２】
2020014415.tif 000003
【００４９】
［統計処理］
胃癌群と健常群の間の統計学的有意差は、Mann-Whitney U test、chi-square test、Fisher’s test及び線形回帰分析を使用して算出した。なお、Ｐ値が０．０５未満のとき、統計的に有意差があると評価した。統計分析は、GraphPad InStat Ver. 3及びGraphPad Prism Ver. 6 statistical software（GraphPad Software社製)を用いて行った。
【００５０】
１−２  結果
［血清試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベル］
ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２には、それぞれメチル化感受性制限酵素であるＨｐａＩＩの認識部位（ＣＣＧＧ）が１カ所あるため、かかる部位のシトシン（表１中の四角で囲った本件シトシン１〜３）がメチル化されると、ＨｐａＩＩによる切断が阻害されるため、両断片はｄｄＰＣＲ法により増幅・検出される。一方、本件シトシン１〜３がメチル化されないと、両断片はＨｐａＩＩにより切断されるため、両断片はｄｄＰＣＲ法により増幅・検出されない。
【００５１】
まず、１０００ゲノムプロジェクト（世界の２６の集団からの２５００人以上のゲノムデータであり、全てが、全ゲノム塩基配列解読、高深度エキソーム塩基配列解読、高密度マイクロアレイによる遺伝子型判定法を使って解析されている。この情報はインターネットで公開されている）におけるＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２の存在比を調査したところ、それぞれ９９．４２％〜１００％及び０〜０．５８％であった（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/?gts=rs532454563）。
次に、両断片及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルを解析した。その結果、図１Ａに示すとおり、胃癌群における、メチル化された本件シトシン１〜３の割合（血清４０μあたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数）の中央値は、６．０（０〜２６）であり、健常群の中央値（１．８［０〜９．８］）と比べ、有意に増加した。この結果は、胃癌患者の血清試料中に存在するＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルは、健常者と比べ、高いことを示している。
【００５２】
また、図１Ａの結果を基に、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．７４８８と高い値を示した。また、胃癌群と健常群とを区別するためのカットオフ値として、５．９を設定したところ、胃癌に罹患する者の感度（胃癌群における検査陽性者の割合）及び特異度（健常群における検査陰性者の割合）は、それぞれ５２．２％（１２／２３）及び９４．４％（１７／１８）であった。
【００５３】
この結果は、血液細胞を除いた血液試料（血清試料又は血漿試料）中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルを測定し、適切なカットオフ値を設定すると、本件シトシン１〜３のメチル化レベルを指標として、胃癌（特に早期胃癌）を判定できることを示している。
【００５４】
［血清試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合］
ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片には、上記３種類のメチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ、ＨｐａＩＩ、及びＢｓｔＵＩ）のいずれの認識部位も存在しないため、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片は、血清試料中のその割合に依存して、ｄｄＰＣＲ法により増幅・検出される。
【００５５】
血清試料中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を解析したところ、図２Ａに示すとおり、胃癌群における、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合（血清４０μあたりの、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の数）の中央値は、９２２（３４８〜２５２０）であり、健常群の中央値（２８２［１２２〜１２６０］）と比べ、有意に増加した。この結果は、胃癌患者の血清試料中に存在するＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合は、健常者と比べ、高いことを示している。
【００５６】
また、図２Ａの結果を基に、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．８４９０と高い値を示した。また、胃癌群と健常群とを区別するためのカットオフ値として、１２７１を設定したところ、胃癌に罹患する者の感度（胃癌群における検査陽性者の割合）及び特異度（健常群における検査陰性者の割合）は、それぞれ３４．８％（８／２３）及び１００％（１８／１８）であった。
【００５７】
この結果は、血液細胞を除いた血液試料（血清試料又は血漿試料）中のＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を指標として、胃癌（特に早期胃癌）を判定できることを示している。
【００５８】
［血清試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合の組合せ］
次に、血清試料中の本件シトシン１〜３のメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合とを組み合わせた場合に、胃癌群と健常群とを精度よく判定できるかどうかを検証した。それぞれのカットオフ値は、前述と同じものを使用し、胃癌群において、少なくとも、本件シトシン１〜３のメチル化及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合のいずれかが陽性の被験者を検査陽性者とし、健常群において、本件シトシン１〜３のメチル化及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合の両方が陰性の被験者を検査陰性者として評価したところ、胃癌に罹患する者の感度及び特異度は、それぞれ６０．１％（１４／２３）及び９４．４％（１７／１８）であった。
【００５９】
この結果は、血液細胞を除いた血液試料（血清試料又は血漿試料）中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルと、ＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合とを測定し、それぞれ適切なカットオフ値を設定すると、本件シトシン１〜３のメチル化レベル及びＴＥＲＴ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の割合を指標として、それぞれ単独を指標とした場合と比べて、胃癌（特に早期胃癌）をより精度よく判定できることを示している。
【実施例２】
【００６０】
２．膵臓癌患者由来血清試料を用いた本件判定方法
２−１  材料と方法
［血清試料］
膵臓癌群における膵臓癌患者２６名（男性１１名、女性１５名；平均年齢７０歳［４６〜８５歳］）と、健常群における健常者３０名（男性１５名、女性１５名；平均年齢４９歳［３９〜６０歳］）の計５６名の被験者から、定法に従って血清試料を調製した。血清試料は、２０１６年１１月２５日〜２０１７年１２月２０日の間、上部消化管内視鏡検査や手術などの侵襲的検査の前に、山口大学医学部附属病院、セントヒル病院、又は阿知須共立病院で予め採取し、ＤＮＡの抽出を行うまで−８０℃で保存した。癌細胞が血液中にコンタミネーションすることを避けるために、生検が行われた症例は除外した。対照である健常者は、いかなる癌の病歴もなく、上部消化管内視鏡検査により、胃腺腫及び癌を有さないと判定された者である。膵臓癌患者は、膵臓癌以外のがんの病歴がない、画像診断や手術所見などでステージ１〜４の膵臓癌と診断された患者である。膵臓癌患者２６名のうち、高分化度（Well）の膵臓癌患者は２名であり、中分化度（Moderate）膵臓癌患者は１５名であり、低分化（Poor）膵臓癌患者は１名であり、その他の組織型あるいは組織型不明の膵臓癌患者は８名であった。なお、膵臓癌のステージは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）にしたがって分類した（文献「Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C, editors. TNM Classification of Malignant Tumours, 7th ed. Oxford: Wiley-Blackwell; 2009.」参照）。また、上記被験者は全員日本人であった。本研究の目的、上部消化管内視鏡検査の複雑性及びリスクを対面の面談で口頭及び同意書で明確にした。上記健常者は、自発的に参加し、上部消化管内視鏡検査のリスクを理解した者に限定され、インフォームドコンセントの書類に署名した。研究プロトコールは、山口大学大学院医学研究科、セントヒル病院、及び阿知須共立病院の施設内倫理委員会で承認され、インフォームドコンセントを上記被験者から入手した。
【００６１】
被験者由来血清試料中のＤＮＡは、上記実施例１の［被験者由来血清試料中のＤＮＡの調製］の項目に記載の方法に従って調製し、ＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１及びＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片２における本件シトシン２のメチル化レベルは、上記実施例１の［ＣＯＲＤ（Combined Restriction Digital PCR）アッセイ］の項目に記載の方法に従って解析した。
【００６２】
２−２  結果
図３Ａに示すとおり、膵臓癌群における、メチル化された本件シトシン１〜３の割合（血清４０μあたりの、メチル化された本件シトシン１〜３の数）の中央値は、４．０（０．０〜２６．０）であり、健常群の中央値（２．１［０．０〜９．８］）と比べ、増加した。この結果は、膵臓癌患者の血清試料中に存在するＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルは、健常者と比べ、高いことを示している。
【００６３】
また、図３Ａの結果を基に、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．６４１０と高い値を示した。また、膵臓癌群と健常群とを区別するためのカットオフ値として、５．９を設定したところ、膵臓癌に罹患する者の感度（膵臓癌群における検査陽性者の割合）及び特異度（健常群における検査陰性者の割合）は、それぞれ３４．６％（９／２６）及び９３．３％（２８／３０）であった。
【００６４】
この結果は、血液細胞を除いた血液試料（血清試料又は血漿試料）中のＲＵＮＸ３遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片１〜３における本件シトシン１〜３のメチル化レベルを測定し、適切なカットオフ値を設定すると、本件シトシン１〜３のメチル化レベルを指標として、膵臓癌を判定できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、がんの早期発見及び早期治療に資するものである。
【図１】
2020014415.tif 000004
【図２】
2020014415.tif 000005
【図３】
2020014415.tif 000006
【配列表】
2020014415000001.app