(57)【要約】      （修正有）【課題】がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導し、分化した通常細胞に対して化学療法等を行うことにより癌を治療する方法の提供。【解決手段】がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、有効成分としてＥＲＯ１−α（小胞体酸化酵素）阻害物質を含む、前記分化誘導剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、有効成分としてＥＲＯ１−α阻害物質を含む、前記分化誘導剤。
【請求項２】
ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、請求項１に記載の分化誘導剤。
【請求項３】
がん幹細胞が、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞である、請求項１または２に記載の分化誘導剤。
【請求項４】
分化誘導が、がん幹細胞におけるＣＤ４４ｖ９またはＫＬＦ４の発現の低下により確認される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化誘導剤。
【請求項５】
がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、医薬組成物。
【請求項６】
がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための医薬の製造のための、ＥＲＯ１−α阻害物質の使用。
【請求項７】
がん幹細胞をＥＲＯ１−α阻害物質で処置することを含む、インビトロにおいて、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法。
【請求項８】
対象において、ＥＲＯ１−α阻害物質により、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法。
【請求項９】
対象に有効量のＥＲＯ１−α阻害物質を投与することを含む、対象におけるがん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための方法。
【請求項１０】
ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、がん用化学療法剤の増強剤。
【請求項１１】
ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、請求項１０に記載の増強剤。
【請求項１２】
増強が、薬物排出タンパク質の発現抑制によるものである、請求項１０または１１に記載の増強剤。
【請求項１３】
薬物排出タンパク質が、ＡＢＣトランスポーターである、請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１４】
化学療法剤が、細胞膜透過性の抗がん剤である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項１５】
請求項１０に記載の増強剤、および化学療法剤を含むキット。
【請求項１６】
がん用化学療法剤と併用して投与するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
化学療法剤が、細胞膜透過性の抗がん剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＥＲＯ１−α阻害物質が腫瘍内投与され、化学療法剤が静脈投与される請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することによってがんを治療するための医薬の製造のためのＥＲＯ１−α阻害物質の使用。
【請求項２１】
化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、インビトロにおいて、がん幹細胞を処置する方法。
【請求項２２】
化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、対象において、がん幹細胞を処置する方法。
【請求項２３】
化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、対象において、がんを治療および／または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための医薬およびその方法、がん用化学療法剤を増強するための医薬およびその方法、ならびに、がん用化学療法剤と併用して投与するための医薬およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん幹細胞は、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞である。これまでの研究により、がん幹細胞は通常がん細胞と比較して化学療法剤抵抗性が高いことが知られており、がん幹細胞が死滅せずに対象内に潜伏していることが、転移・再発の原因の１つであると考えられている（非特許文献１および２）。そのため、がん幹細胞を標的とする治療法の開発が望まれているが、未だ有望な治療法は開発されていない。
【０００３】
ここで、小胞体酸化酵素（ＥＲＯ１−α；endoplasmic reticulum oxidoreductin 1−α）は、小胞体内に存在するジスルフィド結合形成酵素である。ＥＲＯ１−αは、小胞体内において、ジスルフィド結合の掛け替えを行うタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；Protein disulfide-isomerase）の還元型を再酸化する役割を担っており、増殖因子を含む様々な分泌タンパク質の産生に必須である。これまでに、ＥＲＯ１−αとがんとの関係については、いくつかの知見があり、例えば、ＥＲＯ１−αが、がんの環境を特徴付ける低酸素ストレスにより発現誘導されること（非特許文献３）、およびＥＲＯ１−αのタンパク質発現を抑制することにより腫瘍形性能が抑えられること（特許文献１）などが知られている。しかしながら、ＥＲＯ１−αとがんとの関係について十分に解明されているとは言えず、ましてやＥＲＯ１−αとがん幹細胞との関係性については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−２３２４４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ebben et al., Expert Opin Ther Targets. 2010, June; 14(6): 621-632
【非特許文献２】Clarke et al., Cancer Res 2006; 66: (19), October 1, 2006
【非特許文献３】May et al., Oncogene (2005) 24, 1011-1020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がん幹細胞は、化学療法剤抵抗性が高く、従来の化学療法では治療することが困難であるところ、本発明者らは、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導することにより、既知の化学療法等により治療を行うことができるという着想を得た。この着想を実現すべく、本発明は、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導し、分化した通常細胞に対して化学療法等を行うことにより癌を治療することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、ＥＲＯ１−αを阻害することにより、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導することができ、さらに各種がん用化学療法剤の効果を増強させることができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、有効成分としてＥＲＯ１−α阻害物質を含む、前記分化誘導剤。
［２］ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、［１］に記載の分化誘導剤。
［３］がん幹細胞が、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞である、［１］または［２］に記載の分化誘導剤。
［４］分化誘導が、がん幹細胞におけるＣＤ４４ｖ９またはＫＬＦ４の発現の低下により確認される、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の分化誘導剤。
［５］がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、医薬組成物。
［６］がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための医薬の製造のための、ＥＲＯ１−α阻害物質の使用。
【０００９】
［７］がん幹細胞をＥＲＯ１−α阻害物質で処置することを含む、インビトロにおいて、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法。
［８］対象において、ＥＲＯ１−α阻害物質により、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法。
［９］対象に有効量のＥＲＯ１−α阻害物質を投与することを含む、対象におけるがん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための方法。
［１０］ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、がん用化学療法剤の増強剤。
［１１］ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、［１０］に記載の増強剤。
［１２］増強が、薬物排出タンパク質の発現抑制によるものである、［１０］または［１１］に記載の増強剤。
【００１０】
［１３］薬物排出タンパク質が、ＡＢＣトランスポーターである、［１２］に記載の増強剤。
［１４］化学療法剤が、細胞膜透過性の抗がん剤である、［１０］〜［１３］のいずれか一つに記載の増強剤。
［１５］［１０］に記載の増強剤、および化学療法剤を含むキット。
［１６］がん用化学療法剤と併用して投与するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む医薬組成物。
［１７］ＥＲＯ１−α阻害物質が、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］化学療法剤が、細胞膜透過性の抗がん剤である、［１６］に記載の医薬組成物。
【００１１】
［１９］ＥＲＯ１−α阻害物質が腫瘍内投与され、化学療法剤が静脈投与される［１６］に記載の医薬組成物。
［２０］化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することによってがんを治療するための医薬の製造のためのＥＲＯ１−α阻害物質の使用。
［２１］化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、インビトロにおいて、がん幹細胞を処置する方法。
［２２］化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、対象において、がん幹細胞を処置する方法。
［２３］化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とを併用して投与することを含む、対象において、がんを治療および／または予防する方法。
【発明の効果】
【００１２】
ＥＲＯ１−αを阻害することにより、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導することができる。さらに各種がん用化学療法剤の治療効果を増強させることができる。がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導することにより、死滅せずに潜伏するがん幹細胞の数を減らすことができるので、がんの転移・再発の予防も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０におけるサイドポピュレーション（ＳＰ）解析の結果である。
【図２】図２（Ａ）は、図１に示すＳＰ解析において、サイドポピュレーション（ＳＰ：Side Population）に分類されたクローンＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｈ、ならびにメインポピュレーション（ＭＰ：main population）に分類されたクローンＭＰ−Ｄにおける、リアルタイムＰＣＲによるＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比を示すグラフである。図２（Ｂ）は、クローンＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＨおよびＭＰ−ＤにおけるＡＢＣＧ２、ＥＲＯ１−α、ＰＤＩおよびβ−ａｃｔｉｎについてのウェスタンブロッティング像である。
【図３】図３は、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０における、ＥＲＯ１−αについてのウェスタンブロッティング像である。
【図４】図４（Ａ）は、ＥＲＯ１−αをノックダウンしたヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０における、ＣＤ４４ｖ９を標識して行ったフローサイトメトリーの結果である。太線はノックダウンした細胞を表し、細線は対照を表す。図４（Ｂ）は、ＥＲＯ１−αをノックダウンした細胞における、リアルタイムＰＣＲによるＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比を示すグラフである。図４（Ｃ）は、ＥＲＯ１−αをノックダウンした細胞における、リアルタイムＰＣＲによるＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比を示すグラフである。
【００１４】
【図５】図５は、ＥＲＯ１−αをノックアウトしたヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０における、ＳＰ解析の結果である。
【図６】図６は、ＥＲＯ１−αをノックダウンしたヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０における、リアルタイムＰＣＲによる、ＰＯＵ５Ｆ１（図６Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図６Ｂ）、ｃ−Ｍｙｃ（図６Ｃ）、ＫＬＦ４（図６Ｄ）のβ−ａｃｔｉｎに対する発現比を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるｓｈＲＮＡによるＥＲＯ１−α遺伝子抑制の影響を示す。図７（Ａ）は、ＥＲＯ１−αに対するｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（クローンｓｈ２−５）おける、ＥＲＯ１−αについてのウェスタンブロッティング像である。図７（Ｂ）は、フローサイトメトリーの結果である。太線は抗ＣＤ４４抗体または抗ＣＤ４４ｖ９抗体で標識した対照細胞を表し、細線は抗ＣＤ４４抗体または抗ＣＤ４４ｖ９抗体で標識したノックダウン細胞を表し、破線はアイソタイプ対照抗体で標識した対照細胞を表し、点線はアイソタイプ対照抗体で標識したノックダウン細胞を表す。図７（Ｃ）は、リアルタイムＰＣＲによる、ＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比を示すグラフである。図７（Ｄ）は、リアルタイムＰＣＲによる、ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比を示すグラフである。図７（Ｅ）は、リアルタイムＰＣＲによる、ＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎの発現比を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０におけるＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤ＥＮ４６０による影響を示す。図８（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲによる、ＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比を示すグラフである。図８（Ｂ）は、リアルタイムＰＣＲによる、ＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎの発現比を示すグラフである。
【００１５】
【図９】図９は、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるｓｈＲＮＡによるＥＲＯ１−α遺伝子抑制の影響を示す。図９（Ａ）は、ＥＲＯ１−αに対するｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（クローンｓｈ２−２）おける、ＥＲＯ１−αについてのウェスタンブロッティング像である。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーの結果である。太線は抗ＡＢＣＧ２抗体で標識したノックダウン細胞を表し、細線は抗ＡＢＣＧ２抗体で標識した対照細胞を表し、破線はアイソタイプ対照抗体で標識した対照細胞を表し、点線はアイソタイプ対照抗体で標識したノックダウン細胞を表す。
【図１０】ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０の腫瘍における５−ＦＵとｓｉＲＮＡの併用投与の結果である。
【図１１】ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍におけるパクリタキセルとｓｉＲＮＡの併用投与の結果である。
【図１２】ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍におけるゲムシタビンとｓｉＲＮＡの併用投与の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、有効成分としてＥＲＯ１−α阻害物質を用いる、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための医薬およびその方法、がん用化学療法剤を増強するための医薬およびその方法、ならびに、がん用化学療法剤と併用して投与するための医薬およびその方法に関する。
【００１７】
本発明において、「がん細胞（cancer cell）」は、悪性腫瘍細胞を指し、ここで悪性腫瘍とは、癌（carcinoma）や肉腫（sarcoma）、白血病などの血液悪性腫瘍も含めた広義な意味で悪性腫瘍を指しており、「がん幹細胞」および「通常がん細胞」が含まれる。
【００１８】
本発明において標的とするがんとしては、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。本発明において、がんは、好ましくは大腸癌、乳癌、または膵臓癌であり、より好ましくは大腸癌、または乳癌である。
【００１９】
がん細胞は、「がん幹細胞」と「通常がん細胞」とに大別することができる。本発明において、「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞を指し、「通常がん細胞」とは、がん細胞のうちがん幹細胞から分化した細胞を指す。がん細胞が、がん幹細胞であるか否かは、例えば、がん幹細胞に特徴的な細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４ｖ９やＣＤ１３３などを発現していること、ＫＬＦ４などの幹細胞性の維持に重要な遺伝子を発現していること、Hoechst 33342色素排出能を指標としたサイドポピュレーション（ＳＰ）解析によりＳＰに分類されることなどによって判別される。
【００２０】
本発明において、がん幹細胞から通常がん細胞への分化誘導は、例えば、ＣＤ４４ｖ９のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現が低下すること、ＣＤ１３３のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現が低下すること、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現が低下すること、ＳＰ解析においてメインポピュレーション（ＭＰ）に分類されたことなどによって確認することができる。
ここで、ＣＤ４４ｖ９は、細胞表面マーカーＣＤ４４のバリアントであり、がん幹細胞において高頻度で発現していることから、がん幹細胞のマーカーとして一般に用いられている。ＣＤ１３３は、造血幹細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞およびグリア幹細胞で発現することが報告されている細胞表面マーカーであり、がん幹細胞マーカーとしても報告されている。
また、ＫＬＦ４は、体細胞の初期化に用いられる遺伝子の１つであり、ＫＬＦ４の発現は、幹細胞性の維持に必須であると考えられている。
【００２１】
ＥＲＯ１−αは、小胞体内に存在するジスルフィド結合形成酵素である。ＥＲＯ１−α遺伝子の塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である。
【００２２】
本発明において、「ＥＲＯ１−α阻害物質」とは、ＥＲＯ１−αのｍＲＮＡの発現を阻害する物質、ＥＲＯ１−αのタンパク質発現を阻害する物質、および発現したＥＲＯ１−αの活性を阻害する物質を含む。例えば、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ＥＲＯ１−αに対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、これらを発現するベクターもしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質の活性阻害剤が挙げられる。
【００２３】
ＥＲＯ１−αに対する干渉核酸としては、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））などが挙げられる。
ＥＲＯ１−α遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、当業者は、干渉核酸を設計することができる。
【００２４】
本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＥＲＯ１−α遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に実質的に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは、２１〜２３ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ、を有し、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。
本発明において、「相補的」とは、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。
また、本発明において、「実質的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、他の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成する場合のみならず、核酸配列の全ての残基のうち、例えば、７０％、８０％、および９０％の残基が、他の核酸配列の残基と水素結合を形成する場合も含む。
したがって、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＥＲＯ１−α遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に１００％相補的なヌクレオチドから数塩基変更されているヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡを有していてもよい。
また、本発明において、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。また、本発明において、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡであってもよい。
【００２５】
本発明において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、例えば、センス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせを含むｓｉＲＮＡであってもよく、例えば、以下の配列などであってもよい。以下の配列において、大文字はＲＮＡを表し、小文字は、ＤＮＡを表す。
ＥＲＯ１−Ａ  ｓｉＲＮＡ：
5'-ACCAGACAAGAAAUAGUAUCAUUat-3'（センス鎖、配列番号１）
5'-AAUGAUACUAUUUCUUGUCUGGUat-3'（アンチセンス鎖、配列番号２）；
ＥＲＯ１−Ｂ  ｓｉＲＮＡ：
5'-GGUAUAACAUGUU- GAAAUGUCACat-3'（センス鎖、配列番号３）
5'-GUGACAUUUCAA- CAUGUUAUACCat-3'（アンチセンス鎖、配列番号４）;
ＥＲＯ１−Ｃ  ｓｉＲＮＡ：
5'-AGCUGAAUAUGUAGAUUUGCUUCtt-3'（センス鎖、配列番号５）
5'-GAAGCAAAUCUACAUAUUCAGCUtt-3'（アンチセンス鎖、配列番号６）
上記ｓｉＲＮＡは、OriGene（Rockville, MD, USA）から購入することができる。
【００２６】
また、本発明において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ｓｈＲＮＡであってもよく、例えば、以下の配列を含むプラスミドを用いてもよい。
ＥＲＯ１  ｓｈＲＮＡ：
5'-AGAGCATTCTACAGACTTATATCTGGCCT-3'（配列番号７）
上記ｓｈＲＮＡは、OriGene（Rockville, MD, USA）から購入することができる。
【００２７】
ＥＲＯ１−α阻害物質の阻害物質の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３ｐ．ｆ．ｕ．、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１ｐ．ｆ．ｕ．、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０ｐ．ｆ．ｕ．で用いることができる。
【００２８】
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
【００２９】
本発明において、「化学療法剤」とは、がん用化学療法に有用な化学物質を指し、特に限定されない。
本発明の化学療法剤としては、細胞透過性抗がん剤などの、がん治療に用いられる化学療法剤が好ましく、細胞透過性抗がん剤としては、限定されずに、殺細胞作用や増殖阻害作用などの細胞障害作用を有する化学療法剤、例えば、アルキル化剤（例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチンなど）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、クラドリビン、クロファラビン、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、など）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシンなど）、アルカロイド、ホルモン療法剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾールなど）、白金錯体（例えば、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンなど）、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、エトポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イリノテカン、ＳＮ−３８、ノギテカン、ソブゾキサンなど）、微小管作用薬（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、エリブリン、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなど）、ＣＤＫ阻害剤（フラボピリドールなど）、および、チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ルカパリブなど）などが挙げられる。
【００３０】
本発明の化学療法剤は、より好ましくは、ＡＢＣＧ２の基質となる細胞透過性抗がん剤であり、例えば、Westover et al., J Exp Clin Cancer Res. 2015; 34: 159や、Mo et al., Int J Biochem Mol Biol. 2012; 3(1): 1-27などに記載されているものであってもよく、例えば、限定されずに、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、クラドリビン、クロファラビン、６−メルカプトプリン、ミトキサントロン、エトポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イリノテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ルカパリブなどが挙げられる。
【００３１】
本発明は、一側面において、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、有効成分としてＥＲＯ１−α阻害物質を含む、前記分化誘導剤に関する。
本発明の一態様において、がん幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４４ｖ９を発現する細胞である。
本発明の一態様において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ＥＲＯ１−αに対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、これらを発現するベクターもしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−α活性阻害剤である。
【００３２】
本発明はまた、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、医薬組成物に関する。
本発明はまた、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための医薬の製造のための、ＥＲＯ１−α阻害物質の使用に関する。
本発明はまた、インビトロにおいて、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法であって、がん幹細胞をＥＲＯ１−α阻害物質で処置することを含む、前記方法に関する。
【００３３】
本発明はまた、対象において、分化誘導剤により、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導する方法に関する。
本発明の一態様において、分化誘導剤は、有効成分としてＥＲＯ１−α阻害物質を含む。
本発明の一態様において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ＥＲＯ１−αに対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、これらを発現するベクターもしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−α活性阻害剤である。
本発明はまた、対象におけるがん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導して、がんを治療および／または予防するための方法であって、対象に有効量のＥＲＯ１−α阻害物質を投与することを含む、前記方法に関する。
【００３４】
本発明は、別の側面において、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、がん用化学療法剤の増強剤に関する。
本発明において、「化学療法剤の増強」とは、抗がん剤などの化学療法剤を、同じ濃度で投与した場合において、がん細胞または対象におけるその化学療法剤の効果が増強されることを指す。
特定の理論に拘束されることは望まないが、ＥＲＯ１−αの発現を抑制することにより、がん幹細胞が通常がん細胞に分化誘導され、がん幹細胞において高発現していた薬物排出タンパク質の発現が抑制され、その結果、化学療法剤の薬物排出能が低下することにより、化学療法剤が細胞内に留まりやすくなり、化学療法剤の効果が増強されるものと考えられる。
【００３５】
本発明の一態様において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である。
【００３６】
本発明の一態様において、増強は、薬物排出タンパク質の発現抑制によるものである。
薬物排出タンパク質としては、例えば、ＡＢＣトランスポーター（ATP-binding cassette transporters）（ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２など）、多剤排出トランスポーター（multi-drug resistance(MDR)transporter）などが挙げられる。
本発明の一態様において、薬物排出タンパク質は、ＡＢＣトランスポーターである。
本発明の一態様において、化学療法剤は、細胞膜透過性の抗がん剤である。
本発明において、細胞膜透過性の抗がん剤は、好ましくは、ＡＢＣＧ２の基質となる細胞透過性抗がん剤であり、例えば、限定されずに、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、クラドリビン、クロファラビン、６−メルカプトプリン、ミトキサントロン、エトポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イリノテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、またはルカパリブなどである。
【００３７】
本発明はまた、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む、がん用化学療法剤の増強剤、および化学療法剤を含むキットに関する。
【００３８】
本発明は、さらに別の側面において、がん用化学療法剤と併用して投与するための、ＥＲＯ１−α阻害物質を含む医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明において、「化学療法剤と併用して投与する」とは、本発明の医薬組成物を化学療法剤と組み合わせて投与することを意味する。本発明の医薬組成物と化学療法剤を同時に投与してもよく、または逐次的に投与してもよい。本発明の医薬組成物と化学療法剤はまた、単一の組成物に含めてもよく、複数の組成物に別々に含ませ、それらを別々に用いてもよい。
【００４０】
本発明において、本発明の医薬組成物と化学療法剤は、投与する経路が同じでも異なっていてもよい。例えば、本発明の医薬組成物が、独立して、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等から選択される経路により投与され、化学療法剤が、独立して、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等から選択される経路により投与されてもよい。具体的には、例えば、本発明の医薬組成物が腫瘍内投与されかつ化学療法剤が静脈投与される態様、本発明の医薬組成物と化学療法剤の両方が静脈投与される態様、本発明の医薬組成物が腫瘍内投与されかつ化学療法剤が経口投与される態様、本発明の医薬組成物と化学療法剤の両方が経口投与される態様、および本発明の医薬組成物と化学療法剤の両方が腫瘍内投与される態様等が挙げられる。
本発明の一態様において、ＥＲＯ１−α阻害物質が腫瘍内投与され、化学療法剤が静脈投与される。
【００４１】
本発明の一態様において、ＥＲＯ１−α阻害物質は、ＥＲＯ１−α遺伝子に対する干渉核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、もしくはこれらを発現するベクター、もしくはこれらを発現するように形質転換された細胞、またはＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤である。
本発明の一態様において、化学療法剤が、細胞膜透過性の抗がん剤である。
【００４２】
本発明はまた、がんを治療するための医薬の製造のためのＥＲＯ１−α阻害物質の使用であって、前記医薬が、化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とが併用して投与される医薬である、前記使用に関する。
【００４３】
本発明はまた、インビトロにおいて、がん幹細胞を処置する方法であって、前記処置が、化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とが併用して投与される処置である、前記方法に関する。
【００４４】
本発明はまた、対象において、がん幹細胞を処置する方法であって、前記処置が、化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とが併用して投与される処置である、前記方法に関する。
【００４５】
本発明はまた、対象において、がんを治療および／または予防する方法であって、前記治療が、化学療法剤とＥＲＯ１−α阻害物質とが併用して投与される治療である、対象に有効量のＥＲＯ１−α阻害物質を投与することを含む、前記方法に関する。
【００４６】
本発明の医薬
本発明において、対象とは、処置の必要な対象であり、任意の生物であればよく、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯動物、ウシ、ラクダ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコなどが挙げられ、より好ましくはヒトである。
本明細書において「処置」とは、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００４７】
本発明の種々の態様において、本発明の処置、治療または予防における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、疾患の進行を遅延もしくは停止、または疾患の発症もしくは再発を予防する量である。また、例えば、がん幹細胞を通常細胞に分化誘導することや、化学療法剤を増強することなどを指標として、適宜、量を決定することもできる。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【００４８】
本明細書に記載される本発明の方法において投与する有効成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【００４９】
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
【００５０】
本発明の医薬は、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。
【００５１】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり得る。
【００５２】
本発明の医薬は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。
【００５３】
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって適宜決定することができる。例えば、毎日、数日毎（すなわち、２日、３日、４日、５日、６日、７日毎など）、数週間毎（すなわち、２、３、４週間毎など）の投与であってもよい。また、投与は、１回または複数回（すなわち、２、３、４、５回など）投与してもよい。したがって、例えば、１日複数回（すなわち１日、２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６日毎など）に１回、週に複数回（すなわち、週に１または２回など）、１週間毎に１回、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）に１回であってもよい。
【００５４】
本発明においては、投与を、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１４週間、少なくとも１６週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間または少なくとも１２ヶ月間続けてもよい。
【００５５】
本発明の方法においては、本発明の医薬を、がんを処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することもできる。例えば、本発明の方法は、放射線治療などの物理療法や外科手術などの外科的治療などと併用することができる。対象を外科的治療で治療する場合には、本発明の術前化学療法及び術後化学療法の何れか一方又は双方において適用することができる。
【００５６】
本発明のキット
本発明は、本発明の医薬に含まれ得る有効成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される医薬の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の医薬の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５７】
本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。
【００５８】
実験方法
細胞および薬剤
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０およびヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＡＴＣＣ（Manassas, VA, USA）から購入した。ＳＷ４８０細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Invitrogen Life Technologies）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）中で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
ヒトＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）には、OriGene（Rockville, MD, USA）から購入した以下の配列：
ＥＲＯ１−Ａ  ｓｉＲＮＡ；
5'-ACCAGACAAGAAAUAGUAUCAUUat-3'（センス鎖、配列番号１）
5'-AAUGAUACUAUUUCUUGUCUGGUat-3'（アンチセンス鎖、配列番号２）
または対照スクランブルｓｉＲＮＡを用いた。図３〜６および１０〜１２には、上記配列を使用して得られた結果を示しているが、以下の配列：
ＥＲＯ１−Ｂ  ｓｉＲＮＡ：
5'-GGUAUAACAUGUU- GAAAUGUCACat-3'（センス鎖、配列番号３）
5'-GUGACAUUUCAA- CAUGUUAUACCat-3'（アンチセンス鎖、配列番号４）;
ＥＲＯ１−Ｃ  ｓｉＲＮＡ：
5'-AGCUGAAUAUGUAGAUUUGCUUCtt-3'（センス鎖、配列番号５）
5'-GAAGCAAAUCUACAUAUUCAGCUtt-3'（アンチセンス鎖、配列番号６）
を用いても同様の結果が得られる。上記の配列において、大文字はＲＮＡを表し、小文字は、ＤＮＡを表す。
トランスフェクトは、RNAiMAX（Life Technologies）を用いて行い、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞を培養した。
ヒトＥＲＯ１−αに対するｓｈＲＮＡには、OriGene（Rockville, MD, USA）から購入した以下の配列：
ＥＲＯ１  ｓｈＲＮＡ：
5'-AGAGCATTCTACAGACTTATATCTGGCCT-3'（配列番号７）
または対照スクランブル配列を含むプラスミドを用いた。トランスフェクトは、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用いて行い、ピューロマイシン（Sigma-Aldrich）選択（４μｇ／ｍｌ）下で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞を安定に増殖させた。
【００５９】
ヒトＥＲＯ１−αをノックアウトした細胞は、以下のように作成した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集のためのオールインワンベクターであるpCG SapIベクター（ｇＲＮＡ配列挿入のためのクローニング部位およびＣａｓ９配列が含まれる）に、ＥＲＯ１−αエクソン１に特異的に設計されたｇＲＮＡ配列（5'-GCTCAGCTCGGGCCACGGAGAGG-3'（配列番号８））を挿入した。このように構築したベクターとｐｃＤＮＡ３．１（＋）をLipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を用いてヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０にトランスフェクトし、Ｇ４１８薬剤（８００μｇ／ｍＬ）選択下で培養した。単一細胞クローンを選択し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイにより標的対立遺伝子のインデル（挿入／欠失）を確認した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、標的遺伝子座近傍に結合するように設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物をpGEM Teasy（Promega）にサブクローニングした。得られたクローンを3100 Genetic Analyzer（ABI）により配列解析し、各対立遺伝子の標的配列中のインデルの存在を確認した。ＥＲＯ１−αがタンパク質レベルで発現していないことを選択したクローンにおいてウェスタンブロッティングにより確認した。対照細胞クローン（Ｍｏｃｋ）は、空のベクターをトランスフェクトすることによって作製した。細胞株の確立のために、ノックアウトしたクローンにｐＣＭＶ６−ＥＲＯ１α（OriGene）をトランスフェクトし、単一コロニーの選択のために細胞を０．８μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する培地で培養した。
ＥＲＯ１−αのタンパク質活性阻害剤ＥＮ４６０は、MERCK（Darmstadt, Germany）から購入した。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、パクリタキセル、ゲムシタビンはWako（Tokyo, Japan）から購入した。
【００６０】
ＳＰ解析
ＳＰ解析は、いくつかの改変を伴って、Inoda et al., The American journal of pathology. 2011;178(4):1805-13. Epub 2011/03/26. pmid:21435460; PubMed Central PMCID: PMC3078439、Takaya et al., PLoS One. 2016 Jul 14;11(7):e0158903. doi: 10.1371/journal.pone.0158903. eCollection 2016、およびNishizawa et al., Cancer Res. 2012 Jun 1;72(11):2844-54. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3062. Epub 2012 May 2などに記載されているように行った。細胞を、ＡＢＣトランスポーター阻害剤であるベラパミル（Sigma-Aldrich）７５μＭの存在下または非存在下で、終濃度２．５μｇ／ｍｌのHoechst 33342 色素（Lonza, Walkersville, MD, USA）で染色した。細胞を連続振とうしながら３７℃で９０分間インキュベートした。FACS Aria II（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用い、３５７ｎｍで励起し、その蛍光を二重波長（青色、４０２〜４４６ｎｍ；赤色、６５０〜６７０ｎｍ）で測定した。
【００６１】
フローサイトメトリー
ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４およびＡＢＣＧ２に対する反応性の抗体（適切なアイソタイプ対照を含む）を用いて、細胞を標識した。標識された対照細胞およびノックダウンした細胞を、FACS Caliburフローサイトメーター（BD Biosciences）およびFlowJo（Tree Star Inc.）によって分析した。抗体は、全てFunakoshi（Tokyo, Japan）から購入した。
【００６２】
ウェスタンブロット分析
培養した細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Tris-HCl［ｐＨ７．５］、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０）中で氷上でインキュベートすることによって溶解し、４℃において２１８８０ｇで３０分間遠心分離して細胞を分離した。遊離チオールのブロックのために、細胞をＰＢＳ中の１０ｍＭメチルメタンチオスルホナート（Pierce, Rockford, IL, USA）で５分間前処理した。核除去後の上清を非還元または還元ＳＤＳサンプル緩衝液中で９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P；Millipore, Billerica, MA, USA)に電気泳動的に転写した。膜をブロッキング緩衝液（ＰＢＳまたはＢＳＡ中５％脱脂粉乳）で３０分間室温でインキュベートし、その後、抗ＥＲＯ１−α  ｍＡｂ（Abnova, Taipei, Taiwan）、抗ＰＤＩポリクローナル抗体（Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA）、抗ＡＢＣＧ２抗体（Cell Signaling Technologies, Danvers, Massachusetts, USA）、またはマウス抗β−ａｃｔｉｎ ｍＡｂ  ＡＣ−１５（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄後、膜をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（KPL, Gaitherburg, MD, USA）と３時間反応させた。その後、製造元のプロトコールに従って、ＥＣＬ検出システム（Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, USA）またはＩＭＭＯＢＩＬＯＮ検出システム（Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, USA）を用いてシグナルを視覚化した。
【００６３】
リアルタイムＰＣＲ分析
ISOGEN試薬（Nippon Gene, Tokyo, Japan）およびRNeasy Miniキット（QIAGEN, Valencia, CA）を製造元の指示に従って用いて、細胞から単離した。ｃＤＮＡ混合物を製造元のプロトコールに従って、Superscript IIIおよびoligo(dT)プライマー（Life Technologies）を用いて全逆転写により計１μｇの全ＲＮＡから合成した。正常大腸組織ｃＤＮＡおよび正常乳腺組織ｃＤＮＡの鋳型には、ヒト多組織ｃＤＮＡパネルＩおよびＩＩ（TAKARA BIO INC., Otsu, JAPAN）の正常大腸組織ｃＤＮＡおよび正常乳腺組織ｃＤＮＡをそれぞれ用いた。
その後、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦまたは４およびβ−ａｃｔｉｎに対して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）を実施した。各種プライマーは、Thermo Fisher Scientific（Tokyo, Japan）から購入した。各試料の発現値をβ−ａｃｔｉｎに対して正規化し、所定の遺伝子の発現レベルは、複数回の反応の平均（±ＳＥＭ）したものにより表した。ＰＣＲは、StepOneReal-TimeＰＣＲシステム（Life Technologies）により、９５℃で１０分、９５℃で１５秒および６０℃で１分のサイクルを４５サイクル行い、その後、融解曲線解析を行った。データ解析にはΔΔＣｔ法を用いた。
【００６４】
マウスおよび異種移植片移植
４〜６週齢の雌性非肥満糖尿病／重度複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスをSankyo Laboratory Co. Ltd.（Tsukuba, Japan）から購入し、研究は札幌医科大学の動物実験倫理委員会（Sapporo, Japan）の承認を得て行った。
ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞については、５×１０６個のＳＷ４８０細胞をＰＢＳとマトリゲル（BD Biosciences）との混合物に懸濁し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの左背部に注入した。対照群については、移植後７日目から生理食塩水１０μｌを週に２回投与した。ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与した。５−ＦＵ投与群については移植後７日目から、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）、合計４回、腹腔内に投与した。ｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵ併用投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与し、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）、合計４回腹腔内に投与した。
【００６５】
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞については、１×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＰＢＳとマトリゲル（BD Biosciences）との混合物に懸濁し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右第３乳腺に注入した。対照群については、移植後７日目からエタノール１０μｌを週に２回投与した。ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを、移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与した。パクリタキセルまたはゲムシタビン投与群については移植後７日目から、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）またはゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。ｓｉＲＮＡおよびパクリタキセルまたはゲムシタビン併用投与群については、ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与し、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）またはゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。
腫瘍の長さおよび幅は、キャリパーで測定した。
【００６６】
統計分析
２つの不対サンプルの分析にスチューデントのｔ検定を用いた。ＥＲＯ１−αの発現とＫＬＦ４の発現との間の相関性、およびＫＬＦ４の発現とＣＤ４４ｖ９の発現との間の相関性を、スピアマンの順位相関係数を用いて評価した。全ての分析は、STATMATE version 3.19（ATMS Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いて行った。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした。全ての統計的検定を両側検定で行った。
【００６７】
例１：ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０におけるサイドポピュレーション（ＳＰ）解析
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０においてＳＰ解析を行った。結果を図１に示す。近年、多くの幹細胞がＡＢＣＧ２ポンプの発現により、Hoechst 33342というDNA蛍光色素に対して高い排出能を持つことが報告されており、これらの細胞はサイドポピュレーション（ＳＰ）細胞と呼ばれている。ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０において、Hoechst 33342色素排出能を有するＳＰ細胞、すなわちがん幹細胞が存在していることが分かる。
【００６８】
例２：ＳＰ細胞におけるＣＤ４４ｖ９およびＡＢＣＧ２の発現
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０においてＳＰに分類されたクローンＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｈ、ならびにメインポピュレーション（ＭＰ）に分類されたクローンＭＰ−Ｄにおいて、リアルタイムＰＣＲにより、がん幹細胞の指標であるＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比を測定した。結果を図２（Ａ）に示す。ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比は、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｈにおいて高く、ＭＰ−Ｄにおいては低かった。このことからもＳＰ細胞は、がん幹細胞であるものと考えられる。
また、ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０においてＳＰに分類されたクローンＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｈ、ならびにＭＰに分類されたクローンＭＰ−Ｄにおいて、ＥＲＯ１−α、ＡＢＣＧ２、ＰＤＩ、およびβ−ａｃｔｉｎ（対照）について、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図２（Ｂ）に示す。ＳＰ−ＢおよびＳＰ−ＨのＡＢＣＧ２およびＥＲＯ１−αの発現量は、ＭＰ−Ｄと比較して高く、がん幹細胞において、ＥＲＯ１−αおよびＡＢＣＧ２が高発現していることが確認された。
【００６９】
例３：ＥＲＯ１−α抑制剤によるＥＲＯ１−αタンパク質発現への影響
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０に、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ＥＲＯ１−αおよびβ−ａｃｔｉｎ（対照）について、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図４に示す。ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、ＥＲＯ１−α発現の低下が見られた。したがって、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてＥＲＯ１−α発現がノックダウンされたことが確認された。
【００７０】
例４：ＥＲＯ１−α抑制剤によるＣＤ４４ｖ９への影響
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０を、例３で用いたＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡによりノックダウンし、がん幹細胞マーカーであるＣＤ４４ｖ９の発現について調べた。
ＣＤ４４ｖ９を標識して行ったフローサイトメトリーの結果を図４（Ａ）に示す。太線がノックダウンした細胞を表し、細線が対照を表す。ノックダウンし細胞は、対照と比較して、ＣＤ４４ｖ９の発現が低下していた。
加えて、リアルタイムＰＣＲにより、ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比およびＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比を測定した。結果を図４（Ｂ）と（Ｃ）に示す。ノックダウンした細胞は、対照と比較して、ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４の発現比およびＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比が低下していた。
以上より、ＥＲＯ１−αの発現を抑制することが、がん幹細胞が通常がん細胞に分化しているものと理解することができる。
【００７１】
例５：ＥＲＯ１−α抑制剤によるＳＰ解析
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０を、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡでノックアウトし、ＳＰ解析を行った。結果を図５に示す。ｍｏｃｋ対照においてＳＰに分類される細胞の割合が９．７５％であるのに対し、ノックダウンした細胞においては、ＳＰに分類される細胞の割合は０．２７％であった。ＥＲＯ１−αをノックアウトすることにより、ＳＰに分類される細胞の割合は大きく低下したことからも、ＥＲＯ１−αの発現の抑制が、がん幹細胞が通常がん細胞に分化しているものと理解することができる。
【００７２】
例６：ＥＲＯ１−α抑制剤による各種遺伝子への影響
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０を、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡでノックダウンし、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４の発現についてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図６に示す。ノックダウンした細胞は、対照と比較して、幹細胞性の維持に重要な遺伝子である山中因子の一つであるＫＬＦ４の発現が著しく低下していた。ＥＲＯ１−αの発現の抑制により、ＫＬＦ４発現の低下が生じることは、ＥＲＯ１−αの発現の抑制が、がん幹細胞を通常がん細胞に分化誘導していることを示すものである。
【００７３】
例７：ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＥＲＯ１−α抑制剤のＣＤ４４ｖ９およびＫＬＦ４への影響
まず、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、ＥＲＯ１−αに対するｓｈＲＮＡをトランスフェクトし、クローンｓｈ２−５を得た。ＥＲＯ１−αおよびβ−ａｃｔｉｎについて、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図７（Ａ）に示す。クローンｓｈ２−５において、ＥＲＯ１−α発現の低下が見られた。したがって、ｓｈＲＮＡをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてＥＲＯ１−αがノックダウンされたことが確認された。
次に、ＣＤ４４またはＣＤ４４ｖ９を標識してフローサイトメトリーを行った。結果を図７（Ｂ）に示す。細線は抗ＣＤ４４抗体または抗ＣＤ４４ｖ９抗体で標識した対照細胞を表し、太線は抗ＣＤ４４抗体または抗ＣＤ４４ｖ９抗体で標識したノックダウン細胞を表す。ノックダウンした細胞は、対照細胞と比較して、ＣＤ４４ｖ９の発現が低下していた。
さらに、リアルタイムＰＣＲにより、ＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比、ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４比の発現比、およびＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎの発現比を測定した。結果を図７（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）にそれぞれ示す。ノックダウンした細胞のＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎ発現比、ＣＤ４４ｖ９／ＣＤ４４発現比、およびＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎ発現比は、いずれも対照より低いものであった。すなわち、ＥＲＯ１−αの発現の抑制により、がん幹細胞マーカーであるＣＤ４４ｖ９の発現、および幹細胞性の維持に重要な役割を果たしているＫＬＦ４の発現低下が低下していた。
これらの結果はヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０で見られたのと同様の傾向であり、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においても、ＥＲＯ１−αの発現の抑制が、がん幹細胞が通常がん細胞に分化誘導していることを示すものである。
【００７４】
例８：ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０におけるＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤（ＥＮ４６０）の影響
ヒト大腸がん細胞ＳＷ４８０において、ＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤であるＥＮ４６０により処理し、リアルタイムＰＣＲにより、ＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比およびＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎの発現比を測定した。結果を図８（Ａ）と（Ｂ）に示す。ＣＤ４４ｖ９／β−ａｃｔｉｎの発現比およびＫＬＦ４／β−ａｃｔｉｎの発現比は、ＥＮ４６０の濃度依存的に、低下した。ＥＲＯ１−αタンパク質活性阻害剤による処理によっても、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをトランスフェクトした場合と同様に、がん幹細胞は通常がん細胞に分化誘導されることが示された。
【００７５】
例９：ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＥＲＯ１−α抑制剤によるＥＲＯ１−αおよびＡＢＣＧ２タンパク質発現への影響
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、ＥＲＯ１−αに対するｓｈＲＮＡをトランスフェクトし、クローンｓｈ２−２を得た。ＥＲＯ１−αおよびβ−ａｃｔｉｎについて、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図９（Ａ）に示す。クローンｓｈ２−２において、ＥＲＯ１−α発現の低下が見られた。ｓｈＲＮＡをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてＥＲＯ１−αがノックダウンされたされたことが確認された。
次に、ＡＢＣＧ２を標識してフローサイトメトリーを行った。結果を図７（Ｂ）に示す。細線は抗ＡＢＣＧ２抗体で標識した対照細胞を表し、太線は抗ＡＢＣＧ２抗体で標識したノックダウン細胞を表す。ノックダウンした細胞は、対照細胞と比較して、ＡＢＣＧ２の発現が低下していた。
【００７６】
例１０：ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０における、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡと抗がん剤５−ＦＵとの併用効果
４〜６週齢の雌性非肥満糖尿病／重度複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの左背部に５×１０６個のヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０を左背部に注入した。対照群については、移植後７日目から生理食塩水１０μｌを週に２回投与した。ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与した。５−ＦＵ投与群については移植後７日目から、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）、合計４回、腹腔内に投与した。ｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵ併用投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与し、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）、合計４回腹腔内に投与した。腫瘍の長さおよび幅は、キャリパーで測定した。
結果を図１０に示す。ｓｉＲＮＡおよび５−ＦＵ併用投与群は、対照群、５−ＦＵ投与群、およびｓｉＲＮＡ投与群と比較して、腫瘍体積は著しく減少した。
【００７７】
例１１：ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡと抗がん剤パクリタキセルとの併用効果
４〜６週齢の雌性非肥満糖尿病／重度複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右第３乳腺に１×１０６個のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入した。対照群については、移植後７日目からエタノール１０μｌを週に２回投与した。ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを、移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与した。パクリタキセル投与群については移植後７日目から、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。ｓｉＲＮＡおよびパクリタキセル投与併用群については、ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与し、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。腫瘍の長さおよび幅は、キャリパーで測定した。
結果を図１１に示す。ｓｉＲＮＡおよびパクリタキセル併用投与群は、対照群、パクリタキセル投与群、およびｓｉＲＮＡ投与群と比較して、腫瘍体積は著しく減少した。
【００７８】
例１２：ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、ＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡと抗がん剤ゲムシタビンとの併用効果
４〜６週齢の雌性非肥満糖尿病／重度複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右第３乳腺に１×１０６個のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入した。対照群については、移植後７日目からエタノール１０μｌを週に２回投与した。ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを、移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与した。ゲムシタビン投与群については移植後７日目から、ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。ｓｉＲＮＡおよびゲムシタビン併用投与群については、ｓｉＲＮＡ投与群については、５０μＬのLipotrust（Hokkaido System Science, Sapporo, Japan）にＥＲＯ１−αに対するｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を混合したものを移植後７日目から週に２回（７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、２８日目）、合計７回腫瘍内に投与し、ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）を週に１回（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）静脈内に投与した。腫瘍の長さおよび幅は、キャリパーで測定した。
結果を図１２に示す。ｓｉＲＮＡおよびゲムシタビン併用投与群は、対照群、ゲムシタビン投与群、およびｓｉＲＮＡ投与群と比較して、腫瘍体積は著しく減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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