(57)【要約】      （修正有）【課題】炎症に由来する２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化等の予防、改善又は治療に有効な抗炎症剤の提供。【解決手段】６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン等のグルタミナーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミナーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２】
グルタミナーゼ阻害剤がＤＯＮ又はＣＢ−８３９である請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
炎症に由来する疾患の予防、改善又は治療に用いられる請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
前記疾患が、２型糖尿病、高血糖、インスリン抵抗性、高血圧、アテローム性動脈硬化、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、脂質異常症、関節炎、アルツハイマー、炎症性大腸炎、喘息及び心疾患から選ばれる少なくとも１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
血糖値上昇、血圧上昇、血中中性脂肪上昇、動脈硬化、関節炎、慢性膝関節痛若しくは認知症の抑制、予防又は改善作用、脂質代謝の改善作用、並びに記憶学習機能及び認知機能の少なくとも一方の増強又は改善作用から選ばれる少なくとも１の作用を有する請求項１又は２記載の抗炎症剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗炎症剤を含有する飲食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗炎症剤を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症を抑制する効果に優れる抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、生体組織に何らかの有害な刺激を起こす物質（起炎物質）が作用したときに生体が示す、局所的な一過性の反応であり、生体防御反応の一種である。しかしながら、炎症は生体組織に対してもダメージを与え、慢性化して慢性炎症となると過剰な炎症反応がかえって有害となる。
【０００３】
慢性炎症は、生活習慣病や癌を含む加齢関連疾患等の基盤病態となる（非特許文献１及び２）。また、慢性炎症は、時間の経過により患部組織の障害や構造変化（変形）を伴い、患部組織が有する本来の機能に障害をきたすものであり、血糖値上昇、血圧上昇、関節炎、神経変性を伴う認知症等の原因となり得る。
【０００４】
従来の抗炎症剤として、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、天然由来成分を用いた抗炎症剤等が実用化されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】真鍋  一郎著、慢性炎症と加齢関連疾患、日本老年医学会雑誌、５４巻２号、２０１７年４月、１０５〜１１３頁
【非特許文献２】Ｍａｙａ  Ｅ．Ｋｏｔａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ，Ｃｅｌｌ，１６０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２６，２０１５，８１６−８２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の抗炎症剤には、長期間の使用による副作用発現のリスクが高い、単独での抗炎症作用が弱く多量の投与を要する、他の抗炎症剤との併用を要する等の欠点がある。そのため、優れた抗炎症作用を発揮する抗炎症剤の開発が望まれている。
【０００７】
したがって、本発明は、炎症作用の予防、改善又は治療に有効な抗炎症剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、グルタミナーゼ阻害剤が抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、以下の通りである。
１．グルタミナーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
２．グルタミナーゼ阻害剤がＤＯＮ又はＣＢ−８３９である前記１に記載の抗炎症剤。
３．炎症に由来する疾患の予防、改善又は治療に用いられる前記１又は２に記載の抗炎症剤。
４．前記疾患が、２型糖尿病、高血糖、インスリン抵抗性、高血圧、アテローム性動脈硬化、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、脂質異常症、関節炎、アルツハイマー、炎症性大腸炎、喘息及び心疾患から選ばれる少なくとも１である、前記１〜３のいずれか１に記載の抗炎症剤。
５．血糖値上昇、血圧上昇、血中中性脂肪上昇、動脈硬化、関節炎、慢性膝関節痛若しくは認知症の抑制、予防又は改善作用、脂質代謝の改善作用、並びに記憶学習機能及び認知機能の少なくとも一方の増強又は改善作用から選ばれる少なくとも１の作用を有する前記１又は２記載の抗炎症剤。
６．前記１〜５のいずれか１に記載の抗炎症剤を含有する飲食品。
７．前記１〜５のいずれか１に記載の抗炎症剤を含有する医薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗炎症剤は、優れた抗炎症作用を発揮し得ることから、炎症に由来する疾患又は症状の予防、改善又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、通常食（以下、ＮＤとも略す。）を摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＮＤ＋ＣＢ）についてのマウスの代表的な画像及び体重のグラフを示す。また、図１Ｂは、高脂肪食（以下、ＨＦＤとも略す。）を摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）についてのマウスの代表的な画像及び体重のグラフを示す。コントロール群との比較において、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±Ｓ．Ｄを示す。
【図２】図２Ａは、ＮＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＮＤ＋ＣＢ）における、体重に対する食物摂取量と体重に対する水分摂取量の比率を示す。図２Ｂは、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）における、体重に対する食物摂取量と体重に対する水分摂取量の比率を示す。データは平均±Ｓ．Ｄを示す。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）における、各組織の画像及び体重に対する各組織の質量比を示す。図３Ａは内臓脂肪組織（ｅＷＡＴ）、図３Ｂは皮下脂肪組織（ｉＷＡＴ）、図３Ｃは褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、図３Ｄは肝臓の結果を示す。ＨＦＤ＋ＣＶとの比較において、＊ｐ＜０．０５。データは平均±Ｓ．Ｄを示す。
【図４】図４Ａは、ＮＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＤＯＮ投与群（ＮＤ＋ＤＯＮ）におけるマウスの体重を示す。図４Ｂは、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＤＯＮ投与群（ＨＦＤ＋ＤＯＮ）におけるマウスの体重を示す。ＨＦＤ＋ＣＶとの比較において、＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±Ｓ．Ｄを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｅは、ＨＦＤを摂取させた場合のコントロール群（ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＣＢ）における各ｍＲＮＡ発現量と内部標準に用いた１８Ｓ遺伝子発現の比をＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す。図５ＡはＴＮＦ−α／１８Ｓ、図５ＢはＭＣＰ−１／１８Ｓ、図５ＣはＦ４／８０／１８Ｓ、図５ＤはＣＤ１１ｃ／１８Ｓ、図５ＥはＣＤ２０６／１８Ｓの結果である。ＣＶとの比較において、＊ｐ＜０．０５。データは平均±Ｓ．Ｄを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書中において、「抗炎症」とは、炎症を予防すること、及び炎症を改善することのいずれも包含する概念である。
【００１３】
本発明は、その一態様において、グルタミナーゼ阻害剤を含有する、抗炎症剤に関する。グルタミナーゼ阻害剤は、グルタミンからグルタミン酸を生成する酵素であるグルタミナーゼを阻害する化合物であればよい。阻害態様は特に限定されない。
【００１４】
グルタミナーゼ阻害剤としては、特に限定されず、公知のグルタミナーゼ阻害剤が挙げられる。例えば、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン［（Ｓ）−２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸又はその塩（ＤＯＮ）］、ＣＢ−８３９ビス−２−（５−フェニルアセトアミド−１，３，４−チアジアゾール−２−イル）エチルスルフィド（ＢＰＴＥＳ）、エブセレン（Ｅｂｓｅｌｅｎ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ９６８、ＧｌｕｔａＤＯＮ（登録商標）（ＰＥＧ−ＰＧＡ＋ＤＯＮ）（Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ＡＧ社製）、ＧｌｕｔａＣｈｅｍｏ（ＰＥＧ−ＰＧＡ＋理想的候補）（Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ＡＧ社製）が挙げられる。グルタミナーゼ阻害剤は１種単独であってもよいし、２種以上の組み合わせであってもよい。
【００１５】
グルタミナーゼ阻害剤は、ＴＮＦαの発現抑制作用、脂肪炎症抑制作用、マクロファージ（例えば、マクロファージ−１、マクロファージ−２）抑制作用などの作用を有することから、抗炎症剤［例えば、食品組成物、医薬、健康増進剤、栄養補助剤（例えば、サプリメントなど）、食品添加剤など］の有効成分として、利用することができる。グルタミナーゼ阻害剤は、これをそのまま、又は慣用の成分とともに抗炎症剤となして、非ヒト動物及びヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）できる。
【００１６】
本発明に係る抗炎症剤は、炎症に由来する疾患の予防、改善又は治療に利用できる。炎症に由来する疾患としては、例えば、２型糖尿病、高血糖、インスリン抵抗性、高血圧、アテローム性動脈硬化、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、脂質異常症、関節炎、アルツハイマー、炎症性大腸炎、喘息及び心疾患などが挙げられる。
【００１７】
また、本発明に係る抗炎症剤の作用としては、例えば、血糖値上昇、血圧上昇、血中中性脂肪上昇、動脈硬化、関節炎、慢性膝関節痛及び認知症（例えば、脳内異物又は脳内老廃物の蓄積を伴う認知症）から選ばれる少なくとも１の抑制、予防又は改善作用、脂質代謝の改善作用、並びに記憶学習機能及び認知機能の少なくとも一方の増強又は改善作用が挙げられる。
【００１８】
前記脂質代謝の改善作用としては、例えば、血中中性脂肪値の低下作用、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロール値の低下作用、全ＬＤＬに占めるｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールの割合の低下作用が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗炎症剤の適用形態については、特に制限されないが、例えば、経口、経皮、経腸、経粘膜、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内等の任意の適用形態で使用できる。本発明の抗炎症剤は、任意の適用形態で使用して抗炎症作用を発揮できるので、飲食品、医薬、飼料、ペットフード等の各種製品に適用することができる。本発明の抗炎症剤は、サプリメント等としてそのまま摂取（投与）してもよいし、飲食品等の組成物に抗炎症作用を付与するための添加剤として使用してもよい。
【００２０】
また、本発明の抗炎症剤の剤型は、固形状、半固形状、液状等のいずれであってもよく、当該製品の種類や用途に応じて適宜設定される。本発明の抗炎症剤には、その形態等に応じて、本発明の効果を損なわない範囲内で、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の添加剤を含有してもよい。
【００２１】
また、本発明の抗炎症剤は、その形態や用途等に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、他の抗炎症成分を配合してもよい。このような抗炎症成分としては、例えば、ビタミンＣ、スクワラン、ナイアシン、ナイアシンアミド、長鎖ヒアルロン酸、プラセンタエキス、ソルビトール、キチン、キトサン、各種植物抽出物等が挙げられる。これらの配合量については、本発明の効果を損なわない限り限定されない。
【００２２】
本発明の抗炎症剤を飲食品として用いる場合、グルタミナーゼ阻害剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調整して、前記所望の効果を奏する飲食品として提供される。
【００２３】
このような飲食品としては、一般の飲食品の他、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメントを包含し、疾病リスク低減表示を付した食品などの保健機能食品（例えば、特定保険用食品、栄養機能性食品及び機能性表示食品等）、病者用食品が挙げられる。
【００２４】
これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはドリンク類、スープ類、非アルコール飲料、アルコール飲料、ゼリー状飲料及び機能性飲料等の液状食品；ゼリー及びヨーグルト等の半固形状食品；みそ及び発酵飲料等の発酵食品；クッキー及びケーキ等の洋菓子類、饅頭及び羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓並びに氷菓等の各種菓子類；食用油、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリンなどの油分を含む製品；飯類、餅類、麺類、パン類及びパスタ類等の炭水化物含有食品；ハム及びソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；カレー、あんかけ及び中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ及びインスタントみそ汁等のインスタント食品；電子レンジ対応食品；卵を用いた加工品、及び魚介類又は畜肉の加工品；調味料；等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。これらの飲食品は、前述する用途に供することが出来る。また、前記病者用食品は、炎症症状及び炎症性疾患の予防、改善又は治療が必要とされる患者用として、あるいは慢性炎症が基盤病態となっている疾患の予防、改善又は治療が必要とされる患者用として提供される。
【００２５】
本発明の抗炎症剤を飲食品に使用する場合、飲食品に対するグルタミナーゼ阻害剤の配合量については、飲食品の形態等に応じて異なるが、当業者であれば使用するグルタミナーゼ阻害剤に応じて、既知情報や動物試験等に基づいて効果を予測しつつ、適切に設定することができる。そのようにして設定することのできるグルタミナーゼ阻害剤の配合量としては、好ましくは０．００００１〜１００質量％、より好ましくは０．０００１〜１００質量％、更に好ましくは０．００１〜１００質量％、特に好ましくは０．０１〜１００質量％となる範囲が挙げられる。
【００２６】
更に、本発明の抗炎症剤を飲食品に使用する場合、本発明の抗炎症剤を単独で、又は他の成分と組み合わせて、抗炎症用の食品用添加剤として提供することもできる。本発明の抗炎症剤を食品用添加剤として使用する場合、当該食品用添加剤中のグルタミナーゼ阻害剤の含有量、飲食品に対する当該食品用添加剤の添加量等は、添加対象となる飲食品中でグルタミナーゼ阻害剤が前述する含有量を充足できるように適宜設定すればよい。
【００２７】
また、本発明の抗炎症剤を医薬に使用する場合、本発明の抗炎症剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調整して、前記所望の効果を奏する医薬として提供される。
【００２８】
このような医薬の形態としては、特に制限されないが、具体的には、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤等の経口投与製剤；液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、吸入剤、坐剤等の経皮又は経粘膜投与製剤；注射剤等が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗炎症剤を医薬に使用する場合、医薬に対するグルタミナーゼ阻害剤の配合割合は、医薬の形態等に応じて異なるが、例えば、経口投与製剤又は注射剤の場合であれば、好ましくは０．００００１〜１００質量％、より好ましくは０．０００１〜１００質量％、更に好ましくは０．００１〜１００質量％、特に好ましくは０．０１〜１００質量％となる範囲が挙げられる。
【００３０】
本発明の抗炎症剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）は、有効量であれば特に制限されず、通常、有効成分のグルタミナーゼ阻害剤の質量として、一般に一日あたり好ましくは１０ｍｇ〜３０ｇ、より好ましくは５０ｍｇ〜１０ｇ、さらに好ましくは２００ｍｇ〜５ｇである。上記適用量は１日１回以上（例えば、１日１〜３回）に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］階層クラスタリング解析及びＫＥＧＧパスウェイ解析
野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボサービス社製）について、通常食（以下、ＮＤとも略す。）を摂取させた普通餌群（２０匹）及び脂肪含有量が６０ｋｃａｌ％である高脂肪食（以下、ＨＦＤとも略す。）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社製、Ｄ１２４９２）を摂取させた高脂肪食群（２０匹）を調製した。０、３、６及び１０日目にマウス（肥満や耐糖能異常は未発症）各５匹の脂肪組織に関して、網羅的な発現変動遺伝子を抽出し、マイクロアレイを用いて階層クラスタリング解析を行った。その結果、初期段階（３日目）で普通餌群と高脂肪食群を振り分け可能なＧｒｏｕｐ１２を検出した。
【００３３】
Ｇｒｏｕｐ１２には８３個のＫＥＧＧパスウェイがヒットした。ヒットした８３個のＫＥＧＧパスウェイに関して、ＰｕｂＭｅｄにて「ｏｂｅｓｔｙ（肥満）」、「ｄｉａｂｅｔｅｓ（糖尿病）」で検索した結果、「グルタミナーゼ」のパスウェイが含まれていた。「グルタミナーゼ」のパスウェイについては、肥満及び糖尿病の領域での報告がなく、グルミナーゼと肥満との関連は初めて見出されたものであった。
【００３４】
［実施例２］動物実験を用いたＣＢ−８３９投与による効果の解析
動物実験により、ＣＢ−８３９の投与による効果を解析した。５週齢雄性野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（三協ラボサービス社製）を１２時間の明暗サイクルを一定にして制御された温度で維持した。マウスには食物と水を自由に摂取させた。
【００３５】
食物として、ＮＤ又はＨＦＤを用いた。食物としてＨＦＤを摂取させたマウス（以下、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウスとも略す。）は、５週齢から開始して、ＨＦＤに自由にアクセスさせた。
【００３６】
ＣＢ−８３９（２００ｍｇ／ｋｇ）（Ａｒｃｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）又は対照ビヒクルを週に２回経口投与した後の体重及び食物及び水の摂取量を測定した。対照ビヒクルは、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩（ｐＨ２）中の２５％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ；富士フィルム和光純薬社製）からなるものとした。ＣＢ−８３９は、対照として２０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の溶液として処方した［Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００３，  ５２（８）：  １９５８−１９６６．］。実験は、国立大学法人富山大学の動物実験委員会による承認後、動物倫理を念頭に置いて行った。
【００３７】
図１Ａに、食物としてＮＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＮＤ＋ＣＢ）についてのマウスの代表的な画像及び体重のグラフを示す。また、図１Ｂは、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）についてのマウスの代表的な画像及び体重のグラフを示す。
【００３８】
図１Ａに示すように、ＮＤを摂取させた場合、コントロール群とＣＢ−８３９投与群との間に体重の差異は観察されなかった。また、図１Ｂに示すように、ＨＦＤの摂取によって誘発された体重の増加は、ＣＢ−８３９によって有意に減少した。この結果から、ＣＢ−８３９の投与により、高脂肪食を摂取したマウスの体重増加が減弱することがわかった。
【００３９】
図２Ａに、食物としてＮＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＮＤ＋ＣＢ）における、体重に対する食物摂取量と体重に対する水分摂取量の比率を示す。図２Ｂは、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）における、体重に対する食物摂取量と体重に対する水分摂取量の比率を示す。
【００４０】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ＣＢ−８３９投与群は、コントロール群と比較して体重に対する食物摂取量と体重に対する水分摂取量に有意差は見られなかった。
【００４１】
食物としてＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＨＦＤ＋ＣＢ）における、各組織の画像及び体重に対する各組織の質量比を図３Ａ〜Ｄに示す。
【００４２】
図３Ａ、Ｂ及びＤに示すように、ＨＦＤを摂取させたマウスでは、ＣＢ−８３９投与群では対照群よりも体重に対するｅＷＡＴ、ｉＷＡＴの比が有意に低かった。
【００４３】
また、図３Ａ〜Ｃに示すようにＣＢ−８３９投与群では対照群と比較して、ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ＢＡＴにおける肥大の抑制が観察された。さらに、図３Ｄに示すように、ＣＢ−８３９投与群ではコントロール群と比較して、肝臓がより透明な赤色状態であった。
【００４４】
［実施例３］動物実験を用いたＤＯＮ投与による効果の解析
動物実験により６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）の投与による効果を解析した。４週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボサービス社製）を１２時間の明暗サイクルを一定にして制御された温度で維持した。マウスには食物と水を自由に摂取させた。
【００４５】
肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、４週齢から開始して、ＨＦＤに自由にアクセスさせた。
【００４６】
ＤＯＮ（シグマ社製）又はＰＢＳからなる対照ビヒクルの腹腔内注射後、体重及び食物及び水の摂取を測定した。ＤＯＮは２．５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の溶液として処方した。全ての群の用量は０．５ｍｇ／マウスとした。これらの実験は、国立大学法人富山大学の動物実験委員会の承認を経て動物倫理を念頭に置いて行った。
【００４７】
図４Ａに、ＮＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＮＤ＋ＣＶ）及びＤＯＮ投与群（ＮＤ＋ＤＯＮ）におけるマウスの体重を示す。また、図４Ｂに、ＨＦＤを摂取させた場合の、コントロール群（ＨＦＤ＋ＣＶ）及びＤＯＮ投与群（ＨＦＤ＋ＤＯＮ）におけるマウスの体重を示す。
【００４８】
図４Ａに示すように、食物としてＮＤを摂取させた場合において、ＤＯＮ投与群の体重は、コントロール群と比較して有意に低かった。また、図４Ｂに示すように、食物としてＨＦＤを摂取させた場合において、ＤＯＮ投与群の体重は、コントロール群と比較して有意に低かった。
【００４９】
［実施例４］リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＢ−８３９の免疫学的効果を調べた。ＴＲＩＳｕｒｅ（日本ジェネティクス社製）を用いて、凍結ｅＷＡＴからｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。組織（１００ｍｇ）を３００μＬのＴＲＩＳｕｒｅでホモジナイズした。ＴＲＩＳｕｒｅ（６００μＬ）とクロロホルム（２００μＬ）を加え、十分に混合した。
【００５０】
室温にて３分間インキュベートした後、混合物を４℃にて１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後、ＲＮＡは水相に存在し、ＤＮＡ及びタンパク質は間期及びフェノール相に存在した。水相を新鮮なマイクロチューブに移し、５００μＬのイソプロパノールと混合し、１２０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離した。
【００５１】
上清を除去し、７５％エタノールを添加してＲＮＡペレットを洗浄した。ペレットを再び７５００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離した。上清を除去し、ＲＮＡペレットを室温（約１５分間）で乾燥させた。ＲＮＡペレットを２０μＬのＲＮＡｓｅフリー水に溶解した。
【００５２】
抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で確認し、ＲＮａｓｅフリー水で２５０ｎｇ／μＬに希釈した。ｃＤＮＡ合成は、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬キットを用いて行った。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＭＸ３０００Ｐ及びＭＸ３００５Ｐ（アジレント・テクノロジー社製）で行った。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの配列を表１に示す。変性工程の後、９５℃にて１０秒間の４０〜５０サイクルのＰＣＲ増幅及び６２℃にて２０秒間のアニーリング、次いで７２℃における伸長反応を１５秒間とした。Ｍｘ  ｐｒｏソフトウェアバージョン４．１０を使用して結果を分析した。
【００５４】
【表１】
2020029412.tif 000002
【００５５】
図５Ａ〜Ｅは、ＨＦＤを摂取させた場合のコントロール群（ＣＶ）及びＣＢ−８３９投与群（ＣＢ）における各ｍＲＮＡ発現量と内部標準に用いた１８Ｓ遺伝子発現の比をＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す。図５ＡはＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）、図５ＢはＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、図５ＣはＦ４／８０、図５ＤはＣＤ１１ｃ、図５ＥはＣＤ２０６に対する１８Ｓの比の結果である。ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を用いて、コントロール群とＣＢ−８３９投与群とについて結果を比較した。データは、平均±Ｓ．Ｅとして示す。差はｐ＜０．０５である場合に、統計的に有意とした。
【００５６】
図５Ａ〜Ｅに示すように、ｅＷＡＴにおける、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ１／１８ｓ、Ｆ４／８０／１８ｓ、ＣＤ１１ｃ／１８ｓ、ＣＤ２０６／１８ｓについてのｍＲＮＡの発現比はそれぞれＣＢ−８３９投与群とコントロール群とで有意に異なっていた。  
【００５７】
図５Ａに示すようにＴＮＦ−αの発現比はＣＢ−３８９投与群ではコントロール群よりも有意に低く、ＣＢ−３８９の摂取により炎症が阻害されたことが示唆された。
【００５８】
また、図５Ｂに示すようにＭＣＰ１／１８ｓの発現比はＣＢ―３８９投与群ではコントロール群よりも有意に低く、ＣＢ−８３９の摂取により脂肪炎症が抑制されたことが示唆された。
【００５９】
さらに、図５Ｃ〜Ｅに示すように、Ｆ４／８０／１８ｓ、ＣＤ１１ｃ／１８ｓ及びＣＤ２０６／１８ｓ発現比はＣＢ―３８９投与群ではコントロール群よりも有意に低く、ＣＢ−８３９の摂取によりマクロファージ、マクロファージ−１及びマクロファージ−２の発現がそれぞれ減少したことが示唆された。
【００６０】
従って、これらの結果から、ＣＢ−８３９は、脂肪組織における炎症を阻害し得ることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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