(57)【要約】      （修正有）【課題】ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるための方法の提供。【解決手段】ドーパミン作動性前駆細胞移植におけるｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用を提供し、前記使用は、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにＢＰを使用し、ドーパミン作動性前駆細胞移植において、ＢＰとＢＰ処理したドーパミン作動性前駆細胞を組み合わせて使用することを含む。この使用は、特に、パーキンソン病に対するドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにＢＰを使用することに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を移植する前に有効成分を含むドーパミン作動性前駆細胞培地でドーパミン作動性前駆細胞を培養することを含み、前記有効成分がｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩であるドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高める方法。
【請求項２】
前記培地中の前記有効成分の量が、前記培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の範囲にある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パーキンソン病に対するドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにある請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（１）塩基性培地及び神経誘導因子を含む条件培地、ならびに
（２）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含む組み合わせ。
【請求項５】
前記神経誘導因子が、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、及びパルモルファミンの少なくとも１つであり、前記線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）及び線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）の少なくとも１つであり、トランスフォーミング増殖因子阻害剤がＳＢ−４３１５４２であり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤がＢＩＯである請求項４に記載の組み合わせ。
【請求項６】
前記神経誘導因子が線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）及びパルモルファミンの少なくとも１つである請求項４又は５に記載の組み合わせ。
【請求項７】
ドーパミン作動性前駆細胞と併用して投与し、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含み、前記ドーパミン作動性前駆細胞がｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理される細胞移植のための医薬組成物。
【請求項８】
ドーパミン作動性前駆細胞の処理が、前記培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の量で、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地において行われる請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
パーキンソン病を治療するためにある請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口投与、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態である請求項７から９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ドーパミン作動性前駆細胞が、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態である請求項７から１０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、台湾知的財産局に２０１８年８月２３日に出願した台湾特許出願第１０７１２９５１３号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、細胞移植、特にドーパミン作動性前駆細胞移植におけるｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用に関する。その使用は、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにＢＰを使用し、ドーパミン作動性前駆細胞移植において、ＢＰとＢＰ処理したドーパミン作動性前駆細胞の組み合わせを使用することを含む。この使用は、特に、パーキンソン病に対するドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにＢＰを使用することに関する。
背景技術
【０００３】
好発する中枢神経系の変性疾患であるパーキンソン病は、ドーパミン作動性神経の変性及び／又は死によるドーパミンの分泌の減少に主に起因する。パーキンソン病患者は徐々に運動制御能力を失い、体を動かすことが困難になる。現在、パーキンソン病治療において臨床使用されている薬剤（例えばＬ−ドーパ）は、患者の体内のドーパミン量を増加させることによって患者の病態を制御する。しかしながら、疾患の進行に伴って患者のドーパミン作動性神経の死が特定のレベルに達すると、Ｌ−ドーパ又はより浸潤性の刺激治療薬によって提供されうる治療効果はやや限定的になる。
【０００４】
したがって、製薬業界及び研究所は、パーキンソン病を効果的に治療する薬又は方法の開発に専心している。近年、ドーパミン作動性前駆細胞移植がパーキンソン病の治療に新しい機会をもたらしている。用語「ドーパミン作動性前駆細胞移植」は、ドーパミン作動性前駆細胞を患者の脳に移植し、そのため、移植したドーパミン作動性前駆細胞がドーパミン作動性神経に分化し、それにより患者のドーパミン作動性神経の数が増加し、神経突起伸長を促進する。しかしながら、研究者は、患者の脳にニューロスフェアとして移植したドーパミン作動性前駆細胞がドーパミン作動性神経に分化することができるものの、多くのドーパミン作動性神経がニューロスフェアに凝集し、ニューロスフェアから移動することができないことを発見した。そのため、新しい神経ネットワークを確立することができず、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果が限定的なままである。
【０００５】
上記の課題の観点から、本発明の発明者は、ドーパミン作動性前駆細胞のドーパミン作動性神経への分化の進行において、ＢＰを細胞の培養環境に加えることでドーパミン作動性神経の移動を誘導し、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促し、神経接続の確立を助け、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めることを発見した。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、細胞を移植する前に有効成分を含むドーパミン作動性前駆細胞培地にドーパミン作動性前駆細胞を培養し、有効成分がＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩であるドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高める方法を提供することである。好ましくは、培地中の有効成分の量は、培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の範囲にある。例えば、前述の方法は、パーキンソン病に対するドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めることができる。
【０００７】
本発明の別の目的は、（１）塩基性培地及び神経誘導因子を含む条件培地、ならびに（２）ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含む組み合わせを提供することである。前述の組み合わせにおいて、神経誘導因子は、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、及びパルモルファミンの少なくとも１つであり、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）及び線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）の少なくとも１つであり、トランスフォーミング増殖因子阻害剤はＳＢ−４３１５４２であり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤はＢＩＯである。好ましくは、神経誘導因子は、ＦＧＦ−８ｂ及びパルモルファミンの少なくとも１つである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、医薬組成物の製造に有効成分の使用を提供することであり、有効成分はＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩であり、医薬組成物は、細胞移植において、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞と組み合わせて投与される。ドーパミン作動性前駆細胞の処理は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地で行われる。好ましくは、培地中のＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩の量は、培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の範囲にある。好ましくは、医薬組成物は、経口投与、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態で提供する。好ましくは、ドーパミン作動性前駆細胞は、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態で提供する。例えば、前述の医薬組成物は、パーキンソン病を治療するために、細胞移植においてＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞と組み合わせて投与される。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、細胞移植のための医薬組成物を提供することであり、医薬組成物はＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含み、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞と組み合わせて投与される。ドーパミン作動性前駆細胞の処理は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地で行われる。好ましくは、培地中のＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩の量は、培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の範囲にある。好ましくは、医薬組成物は、経口投与、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態で提供する。好ましくは、ドーパミン作動性前駆細胞は、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態で提供する。例えば、医薬組成物は、パーキンソン病を治療するための細胞移植に使用される。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、細胞移植の方法を提供することであり、方法は、有効量のドーパミン作動性前駆細胞及び有効量の有効成分を、必要とする対象に別々に又は同時に投与することを含み、ドーパミン作動性前駆細胞は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理され、有効成分は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩である。好ましくは、ドーパミン作動性前駆細胞の処理は、培地のｍＬあたり、０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の量で、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地において行われる。好ましくは、有効成分は、経口投与、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射の少なくとも１つによって対象に投与される。好ましくは、ドーパミン作動性前駆細胞は、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、及び皮下注射の少なくとも１つによって対象に投与される。例えば、前述の方法は、パーキンソン病を治療するためにある。
【００１１】
本発明において実施される詳細な技術及びいくつかの特定の実施形態は、当業者が請求の発明の特徴を充分に理解するように、以下のパラグラフに述べる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本出願は、色で描いた少なくとも１つの図を含む。カラー図（複数可）を有する本出願のコピーは、要求に応じて必要な手数料で特許商標局が提供する。
【００１３】
【図１】細胞表面のコリン（Ｃｏｒｉｎ）の発現を検出するためにＩｎｆｌｕｘセルソーターを使用した結果を示す。
【００１４】
【図２】ＪｕＬＩ（商標）Ｂｒ細胞イメージアナライザーで撮像した画像を示し、画像は、ＢＰ処理をしていないドーパミン作動性前駆細胞の分化のプロセスを示す。
【００１５】
【図３】各群のドーパミン作動性前駆細胞を倒立顕微鏡で撮像した画像を示し、対照群の細胞をＢＰのない条件培地で６日間培養し、「ＢＰ（５）」群、「ＢＰ（１０）」群、「ＢＰ（２０）」群、「ＢＰ（５０）」群、及び「ＢＰ（１００）」群は、それぞれ、５、１０、２０、５０及び１００μＭの濃度のＢＰを含む条件培地で６日間培養した。
【００１６】
【図４】各群のドーパミン作動性前駆細胞を蛍光顕微鏡で撮像した画像を示し、対照群の細胞をＢＰのない条件培地で１０日間培養し、「ＢＰ（５）」群、「ＢＰ（１０）」群、「ＢＰ（２０）」群、「ＢＰ（５０）」群、及び「ＢＰ（１００）」群は、それぞれ、５、１０、２０、５０及び１００μＭの濃度のＢＰを含む条件培地で１０日間培養し、緑色の蛍光はドーパミン作動性前駆細胞、赤色の蛍光はドーパミン作動性神経、青色の蛍光は神経核を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下は、本発明の実施形態のいくつかを詳細に記述する。しかしながら、本発明は、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な実施形態を実施することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるべきではない。さらに、本明細書において他に断りがない限り、本発明の明細書（特に請求項）において記載する語句「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等は、単数形と複数形の両方を含むことを意図している。用語「前処理」又は「前処理する」は、本明細書で使用するとき、細胞移植を行う前に、移植に使用する細胞をｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で処理することを指す。用語「対象」は、本明細書において、ヒト及び非ヒト動物を含む哺乳動物を指す。
【００１８】
本明細書で使用する数値範囲（例えば５〜１００）は、その範囲の有理数の全て、及びその範囲の有理数から成る範囲を含むものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書で使用する数値範囲は、列挙した値の下限値と上限値の間の数値の可能な全ての組み合わせを含むべきである。
【００１９】
フレーズ「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用するとき、「官能性酸基（複数可）を含む前述の化合物」及び「有機又は無機塩基」から形成される「薬学的に許容される塩基付加塩」、ならびに「官能性塩基（複数可）を含む前述の化合物」及び「有機又は無機酸」から形成される「薬学的に許容される酸付加塩」を含む。
【００２０】
無機塩基で形成する「薬学的に許容される塩基付加塩」の例として、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩）、遷移金属塩（例えば、第二鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩及びアルミニウム塩）及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
有機塩基で形成する「薬学的に許容される塩基付加塩」の例として、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ν，Ν−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェンアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂及びその類似体等で形成される塩を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
無機塩で形成する「薬学的に許容される酸付加塩」の例として、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ハイパークロリック  アシッド等で形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
有機酸で形成する「薬学的に許容される酸付加塩」の例として、スルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エチルスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸）、カルボキシル酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸及びコハク酸）、アニオン性アミノ酸（例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、ヒドロキシ酸（例えば、クエン酸、乳酸、酒石酸、グリコール酸及びリンゴ酸）、脂肪酸（例えば、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、オレイン酸及びステアリン酸）、ジヒドロキシナフトエ酸、レシノリック  アシッド等で形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）」は本明細書で使用するとき、ＢＰの薬学的に許容される塩を有効成分として使用する場合、薬学的に許容される塩によって提供することができるＢＰの量を指す。
【００２５】
前述のように、パーキンソン病は、ドーパミン作動性神経の変性及び／又は死によるドーパミン分泌の減少に主に起因する。パーキンソン病患者は徐々に運動制御能力を失う。ドーパミン作動性前駆細胞移植がパーキンソン病の治療に新しい機会をもたらしている。現在、細胞移植に使用するドーパミン作動性前駆細胞が、多くが誘導性胚性幹細胞から分化する。例えば、線維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８ｂ）、トランスフォーミング増殖因子阻害剤（例えばＳＢ−４３１５４２）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤（例えばＢＩＯ）、及びパルモルファミン等の神経誘導因子が付加された塩基性培地に胚性幹細胞を培養することで、胚性幹細胞のドーパミン作動性前駆細胞への分化を誘導することができる。
【００２６】
しかしながら、ドーパミン作動性前駆細胞を患者の脳に移植すると、ドーパミン作動性前駆細胞はドーパミン作動性神経に分化することができるが、多くのドーパミン作動性神経はニューロスフェアに凝集したままであり、ニューロスフェアから移動することができない。そのため、新しい神経ネットワークが確立することができず、治療効果が限定的である。このことについて『霊長類のパーキンソン病モデルにおけるヒトｉＰＳ細胞由来ドーパミン作動性神経機能、Ｎａｔｕｒｅ  ５４８、５９２−５９６（２０１７）』及び『Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｇｒａｆｔ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈＥＳＣ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０、１３５−１４８、（２０１７）』に記述があり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００２７】
本発明の発明者は、ドーパミン作動性前駆細胞のドーパミン作動性神経への分化のプロセスにおいて、ＢＰを培養環境に加えることでドーパミン作動性神経の移動を誘導し、ニューロスフェアからドーパミン作動性神経が移動することを促し、神経接続の確立を助けることを発見した。そのため、ＢＰをドーパミン作動性前駆細胞移植で使用して、ドーパミン作動性前駆細胞がドーパミン作動性神経に分化した後に、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促し、神経接続の確立を助けることができ、それにより、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高める。
【００２８】
本発明は、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるＢＰの効果及びその用途に関する。本発明は、特に、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果の向上におけるＢＰの効果がパーキンソン病に与える効果に関する。その用途は、ドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高める方法及び組み合わせを提供することを含む。方法は、細胞を移植する前に、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地でドーパミン作動性前駆細胞を培養することを含み、組み合わせは、（１）塩基性培地及び神経誘導因子を含む条件培地、ならびに（２）ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含む。
【００２９】
本発明に係るドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高める方法において、「ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地でドーパミン作動性前駆細胞を培養することによってドーパミン作動性前駆細胞を前処理する」というフレーズは、処理を行うときに、ドーパミン作動性前駆細胞を培地に置くことを意味する。さらに、本発明に係る方法で使用するドーパミン作動性前駆細胞培地は、塩基性培地及び神経誘導因子を含み、塩基性培地は、ドーパミン作動性前駆細胞の増殖のために栄養及び条件（例えばｐＨ値）を提供することができる必須成分を含む。概して、塩基性培地の例として、Ｎ２栄養補助剤を外添するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）及びＮ２栄養補助剤を外添する神経基本培地が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｎ２栄養補助剤を外添するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、塩基性培地として使用して、ドーパミン作動性前駆細胞の処理を行うことができる。
【００３０】
本発明に係る方法において、ドーパミン作動性前駆細胞を処理するための培地で使用するＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩の量は、通常、培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）、好ましくは培地のｍＬあたり２μｇ（ＢＰとして）〜１５μｇ（ＢＰとして）、より好ましくは培地のｍＬあたり３μｇ（ＢＰとして）〜１２μｇ（ＢＰとして）である。例えば、添付の例によって示すように、培地のｍＬあたり０．９μｇ（ＢＰとして）〜１９μｇ（ＢＰとして）の量（すなわち、ＢＰの量は５μＭ〜１００μＭである）で、ドーパミン作動性神経の移動を効果的に誘導し、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促進することができる。
【００３１】
本発明に従って提供する組み合わせは、（１）塩基性培地及び神経誘導因子を含む条件培地、ならびに（２）ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含む。組み合わせにおいて、塩基性培地の適用する種類及びＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩の使用量は、前述と全て一致している。
【００３２】
塩基性培地の他に、本発明に従って提供する組み合わせの成分（１）（すなわち条件培地）は、さらに、幹細胞を、ドーパミン作動性前駆細胞、例えば線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、パルモルファミン又はその組み合わせに分化することを誘導することを助けることができる神経誘導因子を含むが、これらに限定されない。好ましくは、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）及び線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８ｂ）の少なくとも１つであり、トランスフォーミング増殖因子阻害剤はＳＢ−４３１５４２であり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤はＢＩＯである。より好ましくは、神経誘導因子は、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）及びパルモルファミンの少なくとも１つである。
【００３３】
本発明に従って提供する組み合わせは、キット又は組成物であってもよい。組み合わせがキットの場合、成分（１）（すなわち条件培地）及び成分（２）（すなわちＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩）は、通常、独立してパッケージにされ、異なる容器（例えば、プラスチック袋、プラスチックボトル、ガラス製ボトル、アンプル）に保管し、別々に又はセットで輸送し、販売することができる。任意に、成分（１）の小成分を独立してパッケージ及び保管してもよい。キットはさらに説明手順書を含み、細胞を培養し、処理し、使用するために、現場で成分を混合するための手順及びプログラムをユーザーに提供する。
【００３４】
例えば、成分（１）及び成分（２）の小成分が独立してパッケージにし、保管し、輸送し、又は別々に販売する場合、神経誘導因子（複数可）（例えばＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８ｂ、ＳＢ−４３１５４２及びＢＩＯ）ならびにＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩は、−２０℃未満の温度の暗環境で保管し、塩基性培地は−２０℃の環境で保管してもよい。また、本発明に係るキットの成分をセットで輸送し、販売する場合、神経誘導因子（複数可）ならびにＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩は、−２０℃の内部温度の容器に保管し、塩基性培地は−２０℃の内部温度の容器に保管してもよい。容器が望ましい断熱機能を提供して、成分をセットで輸送し、販売するときに、成分の保管温度が互いに影響しあうことがないようにできれば、容器の形状及び大きさに特に制限はない。
【００３５】
本発明に係るキットを使用するとき、各成分を混合する順序に特に制限はない。例えば、条件培地の小成分が独立してパッケージになっている場合、条件培地を最初に配合し、その後、条件培地をＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩と混合する。また、塩基性培地をＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩と混合して、混合物を提供することもでき、その後、混合物を他の小成分と混合する。あるいは、条件培地の全ての小成分ならびにＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を、同時に混合してもよい。さらに、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を条件培地又は塩基性培地と直接混合してもよく、又はＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を溶媒に溶解して、ＢＰ溶液を提供し、その後、ＢＰ溶液を条件培地又は塩基性培地と混合する。ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を溶解することができる溶媒の例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール及び植物油が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明に従って提供する組み合わせが組成物である場合、成分（１）及び成分（２）は通常、混合し、容器（例えば、プラスチック袋、プラスチックボトル、ガラス製ボトル、アンプル）に一緒に保管する。
【００３７】
本発明において、ドーパミン作動性前駆細胞移植において前述の組み合わせを使用することによって、ドーパミン作動性神経の移動を誘導し、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促し、神経接続の確立を助けることができ、それによりドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果が向上する。例えば、ドーパミン作動性前駆細胞移植において本発明の組み合わせを使用する場合、幹細胞を、塩基性培地及び神経誘導因子（複数可）（例えば、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８ｂ、ＳＢ−４３１５４２、ＢＩＯ及びパルモルファミン）を含む条件培地で培養し、幹細胞のドーパミン作動性前駆細胞への分化を誘導し、その後、前述の培地を塩基性培地ならびにＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含む別の条件培地に置き換えて、ドーパミン作動性前駆細胞を８〜１２日間、連続して培養し、最後に、提供したドーパミン作動性前駆細胞を必要とする対象に移植する。
【００３８】
本発明に係る医薬組成物の製造において、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を使用するとき、医薬組成物は、細胞移植において、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞と組み合わせて投与する。ドーパミン作動性前駆細胞の処理は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を、培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）、好ましくは培地のｍＬあたり２μｇ（ＢＰとして）〜１５μｇ（ＢＰとして）、より好ましくは培地のｍＬあたり３μｇ（ＢＰとして）〜１２μｇ（ＢＰとして）の量で含むドーパミン作動性前駆細胞培地で行う。
【００３９】
望まれる目的（複数可）に応じて、本発明の医薬組成物は、特に制限がなく適した形態で提供することができる。例えば、医薬組成物は、限定されないが、例えば、経口又は非経口経路（例えば、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、及び皮下注射）で必要とする対象に投与することができる。形状及び目的（複数可）に応じて、適した担体を選択し、使用して医薬組成物を提供することができ、担体の例として、賦形剤、希釈剤、補助剤、安定剤、吸収抑制剤、崩壊剤、ヒドロトロープ剤、乳化剤、抗酸化剤、接着剤、結合剤、粘着付与剤、分散剤、懸濁剤、潤滑剤、吸湿剤等が挙げられる。
【００４０】
経口投与の形態として、医薬組成物は、有効成分（すなわちＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩）の望まれる効果に悪影響を及ぼさない薬学的に許容される担体を含むことができる。適した担体の例として、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール又はその類似体、セルロース、スターチ、糖ベントナイト、及びその組み合わせ挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物は、経口投与に適した形態、例えば、錠剤（例えば糖衣錠）、丸剤、カプセル、粒剤、散剤、流エキス、溶液、シロップ、懸濁液、チンキ等の適した方法で提供することができる。
【００４１】
皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射に適した注入液又は点滴の形態として、医薬組成物は、一又は複数の成分（複数可）、例えば、等張液、塩緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝液又はクエン酸緩衝生理食塩水）、ヒドロトロープ剤、乳化剤、５％の糖液、及びその他の担体を含んで、静脈内注入液、乳化静脈内注入液、注射用粉末、注射用懸濁液、又は注射用粉末懸濁液としての医薬組成物を提供する。あるいは、医薬組成物は前注射固体として調製することができる。前注射固体は、他の溶液もしくは懸濁液に可溶な形態、又は乳化可能な形態で提供することができる。望ましい注射は、他の溶液又は懸濁液に前注射固体を溶解し、又は必要とする対象に投与する前に乳化することによって提供する。
【００４２】
任意に、本発明に従って提供する医薬組成物は、適切な量の付加物、例えば、香味料、トナー、又は医薬組成物の嗜好性及び視覚性を高めるための着色剤、及び／又は緩衝液、保存剤、防腐剤、抗菌薬、又は医薬組成物の安定性及び保存性を改善するための抗真菌薬をさらに含むことができる。任意に、医薬組成物は、他の有効成分が本発明の有効成分（すなわちＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩）の望ましい効果に悪影響を及ぼさない限り、一又は複数の有効成分をさらに含むことができ、又は一もしくは複数の有効成分を含む医薬品と組み合わせて使用して、医薬組成物の効果をさらに向上させ、又は提供する調製物の適用柔軟性及び適合性を増加させることができる。
【００４３】
本発明に係る使用において、本発明に従って提供する医薬組成物の他に、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞は、必要とする対象に投与するべきであり、ドーパミン作動性前駆細胞と医薬組成物は、同時に又は別々に投与することができる。望まれる目的（複数可）に応じて、前処理したドーパミン作動性前駆細胞は、特に制限することなく、適した投与経路で投与することができる。例えば、前処理したドーパミン作動性前駆細胞は、注射又は細胞注入に適した形態で提供することができ、限定されないが、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射によって対象に投与することができる。一又は複数の薬学的に許容される担体（例えば、通常の生理食塩水）を使用して、注射又は細胞注入に適した形態で前処理したドーパミン作動性前駆細胞を提供することができる。
【００４４】
対象の必要性、年齢、体重及び健康状態に応じて、医薬組成物及びＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞は、様々な投与回数、例えば、１日１回、１日複数回、２、３日に１回等で別々に投与することができる。さらに、本発明に従って提供する医薬組成物の有効成分（すなわち、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩）の濃度は、実際の適用の必要条件に応じて調整することができる。例えば、医薬組成物を１日２回、対象に経口投与し、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理したドーパミン作動性前駆細胞を２週間に１回脳内注入によって対象に投与して、パーキンソン病を治療し、及び／又は発症を遅延させる場合、医薬組成物は、毎回、３０ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重〜２０００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重、好ましくは毎回、５０ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重〜１０００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重、より好ましくは毎回１００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重〜５００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ体重を投与する。単位「ｍｇ／ｋｇ体重」は、対象のｋｇ体重あたり必要な量を指す。さらに、ドーパミン作動性前駆細胞は、通常、１×１０５細胞〜５×１０６細胞、好ましくは１×１０６細胞〜２×１０６細胞の量で投与する。
【００４５】
本発明は、また、細胞移植の方法に関し、方法は、有効量のドーパミン作動性前駆細胞及び有効量の有効成分を、必要とする対象に別々に又は同時に投与することを含み、ドーパミン作動性前駆細胞は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理され、有効成分は、ＢＰ及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩である。用語「必要とする対象」は、ドーパミン作動性神経変性、ドーパミン作動性神経死、及び／又はドーパミンの不十分な分泌をり患している対象を指す。本発明の細胞移植の方法において、ドーパミン作動性前駆細胞の処理、ならびに前処理したドーパミン作動性前駆細胞及び有効成分の投与タイプは、前述と全て一致している。
【００４６】
本発明は、以下の特定の例でさらに詳細に説明する。しかし、以下の例は、本発明を説明するために提供するに過ぎなく、そのため本発明の範囲を限定しない。本発明の範囲は、添付の請求項に示す。
【実施例】
【００４７】
実施例
【００４８】
［調製の実施例］
【００４９】
Ａ．条件培地の調製
【００５０】
Ａ−１．ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ダルベッコ変法イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２、Ｇｉｂｃｏ社から購入、製造番号：１１３２００３３）にＮ２栄養補助剤（Ｇｉｂｃｏ社から購入、製造番号：１７５０２０４８）を外添し、塩基性培地として使用し、さらにＢＩＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入、製造番号：Ｂ１６８６）、ＳＢ−４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入、製造番号：Ｓ４３１７）、ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社から購入、製造番号：１００−１８Ｂ）、パルモルファミン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入、製造番号：１０００９６３４）、及びＦＧＦ−８ｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社から購入、製造番号：４２３−Ｆ８）を含む神経誘導因子を、それぞれ最終濃度がＢＩＯを０．５μＭ、ＳＢ−４３１５４２を１０μＭ、ＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬ、パルモルファミンを１μＭ及びＦＧＦ−８ｂを５０ｎｇ／ｍＬになるように加え、条件培地を得た。
【００５１】
Ａ−２．［調製実施例Ａ−１］に従って別の条件培地を得たが、塩基性培地のみに加えた神経誘導因子は、パルモルファミン及びＦＧＦ−８ｂを含み、最終濃度はそれぞれ、パルモルファミンが１μＭ、ＦＧＦ−８ｂが５０ｎｇ／ｍＬであった。
【００５２】
Ｂ．ドーパミン作動性前駆細胞の調製
【００５３】
Ｂ−１．胚性幹細胞の前培養
【００５４】
胚性幹細胞（Ｌｅｅ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｗａｎから提供）を２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ社から購入、製造番号：１０８２８０２８）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に２日間培養し、懸濁した球状の細胞になった。
【００５５】
Ｂ−２．胚性幹細胞の分化
【００５６】
［調製実施例Ｂ−１］によって得た懸濁した球状の胚性幹細胞を［調製実施例Ａ−１］によって得た条件培地に２日間培養した。その後、培地を取り除き、細胞を［調製実施例Ａ−２］によって得た条件培地に６日間連続して培養し、細胞液体を得た。
【００５７】
コリンは腹側中脳の特定の表面タンパク質であることが知られている。そのため、コリン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社から購入、製造番号：ＭＡＢ２２０９）を前に得た細胞液体に加え、１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。その後、蛍光を有する二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入、製造番号：Ａ２１２０８）を加え、１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。最後に細胞をＰＢＳに懸濁した。前述の細胞懸濁液の蛍光は、Ｉｎｆｌｕｘセルソーター（ＢＤ社から購入）によって検出し（図１に示すようにコリンを発現している細胞は３９．６％であった）、蛍光シグナルを有する細胞（腹側中脳のドーパミン作動性前駆細胞）をソートした。
【００５８】
Ｃ．ドーパミン作動性前駆細胞の処理
【００５９】
［調製実施例Ｂ−２］によって得たドーパミン作動性前駆細胞を［調製実施例Ａ−２］によって得た条件培地に３７℃で５％のＣＯ２下で２４時間培養した。その後、細胞を６つの群に分け、独立して以下の処理に供した。
（１）対照群：細胞を［調製実施例Ａ−２］によって得た条件培地（すなわち、ＢＰのない培地）に１０日間連続して培養した。
（２）「ＢＰ（５）」群、「ＢＰ（１０）」群、「ＢＰ（２０）」群、「ＢＰ（５０）」群、及び「ＢＰ（１００）」群：対照群の条件に従って細胞を培養したが、条件培地にＢＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入、製造番号：Ｗ３３３３０１）をそれぞれ５、１０、２０、５０及び１００μＭの最終濃度でさらに加えた。
【００６０】
実施例１：ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）のドーパミン作動性前駆細胞の分化能力に与える影響
【００６１】
ドーパミン作動性前駆細胞のドーパミン作動性神経への分化に対するＢＰの影響を理解するために、［調製実施例Ｃ］によって得た対照群の細胞の分化プロセスをＪｕＬＩ（商標）Ｂｒ細胞イメージアナライザー（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ社から購入）で連続して撮像し（結果を図２に示す）、［調製実施例Ｃ］によって得た各群の細胞形態を、６日間連続して細胞を培養しているときに、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社から購入）で記録した（結果を図３に示す）。
【００６２】
図２に示すように、対照群の細胞（すなわちＢＰで処理していないドーパミン作動性前駆細胞）を５日間連続して培養し、神経分化の現象を観察することができ、細胞を１０日間培養したときは、細胞は軸索パターンのドーパミン作動性神経に分化した。図３に示すように、対照群、「ＢＰ（５）」群、「ＢＰ（１０）」群、「ＢＰ（２０）」群、「ＢＰ（５０）」群、及び「ＢＰ（１００）」群の全てで神経線維の形成を観察することができる。これらの結果は、ＢＰの処理がドーパミン作動性前駆細胞の通常の神経分化に影響しないことを示している。
【００６３】
実施例２：ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）のドーパミン作動性神経の移動の促進に対する影響
【００６４】
ＢＰのドーパミン作動性神経に対する影響を理解するために、［調製実施例Ｃ］によって得た各群の細胞を１０日間連続して培養したとき、細胞を固定し、Ｓｏｘ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社から購入、製造番号：ＳＣ−１７３１８）、ＴＨ（チロシン水酸化酵素；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入、製造番号：ＭＡＢ１５２）及びＤＡＰＩ（ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、製造番号：Ｄ１３０６）を含む抗体を蛍光染色に供し、それぞれ（Ｓｏｘ−１はドーパミン作動性前駆細胞に発現し、ＴＨはドーパミン作動性神経に発現し、ＤＡＰＩは核特異的染料である）。その後、ドーパミン作動性前駆細胞（緑蛍光）、ドーパミン作動性神経（赤蛍光）、核（青蛍光）を直立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社から購入）によって観察した。結果を図４に示す。
【００６５】
図４に示すように、対照群に比べて、ニューロスフェアから移動するドーパミン作動性神経の現象が、「ＢＰ（５）」群、「ＢＰ（１０）」群、「ＢＰ（２０）」群、「ＢＰ（５０）」群、及び「ＢＰ（１００）」群で観察することができ、「ＢＰ（５０）」群における現象が最も顕著であった。これらの結果は、ＢＰが確かに、ドーパミン作動性神経の移動を誘導することができ、そのため、ＢＰをドーパミン作動性前駆細胞移植で使用して、ドーパミン作動性神経がドーパミン作動性前駆細胞から分化した後に、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促し、神経接続の確立を助けることができ、それによりドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めることを示している。
【図１】
2020029449.tif 000003
【図２】
2020029449.tif 000004
【図３】
2020029449.tif 000005
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月14日(2020.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を移植する前に有効成分を含むドーパミン作動性前駆細胞培地でドーパミン作動性前駆細胞を培養することを含み、前記有効成分がｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩である、ドーパミン作動性神経のニューロスフェアからの移動を促す方法。
【請求項２】
前記培地中の前記有効成分の量が、前記培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の範囲にある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パーキンソン病に対するドーパミン作動性前駆細胞移植の治療効果を高めるためにある請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（１）塩基性培地及び神経誘導因子を含む条件培地、ならびに
（２）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩
を含む組み合わせであって、その組み合わせはキット又は組成物である。
【請求項５】
前記神経誘導因子が、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、及びパルモルファミンの少なくとも１つであり、前記線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）及び線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）の少なくとも１つであり、トランスフォーミング増殖因子阻害剤がＳＢ−４３１５４２であり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤がＢＩＯである請求項４に記載の組み合わせ。
【請求項６】
前記神経誘導因子が線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ−８ｂ）及びパルモルファミンの少なくとも１つである請求項４又は５に記載の組み合わせ。
【請求項７】
ドーパミン作動性前駆細胞と併用して投与し、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含み、前記ドーパミン作動性前駆細胞がｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩で前処理される細胞移植のための医薬組成物。
【請求項８】
ドーパミン作動性前駆細胞の処理が、前記培地のｍＬあたり０．５μｇ（ＢＰとして）〜２０μｇ（ＢＰとして）の量で、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び／又はＢＰの薬学的に許容される塩を含むドーパミン作動性前駆細胞培地において行われる請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
パーキンソン病を治療するためにある請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口投与、経鼻投与、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態である請求項７から９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ドーパミン作動性前駆細胞が、皮質脊髄注入、くも膜下腔内注射、脳内注入、静脈注射、腹膜注入、又は皮下注射のための形態である請求項７から１０の何れか一項に記載の医薬組成物。