(57)【要約】【課題】非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法の提供。【解決手段】被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度を測定することを含む、FGF18タンパク質濃度を指標として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度を測定することを含む、FGF18タンパク質濃度を指標として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法。
【請求項２】
生体試料が血液、血清又は血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度よりも高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度があらかじめ定めたカットオフ値より高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
被験体から採取した血清中のFGF18タンパク質濃度があらかじめ定めたカットオフ値である270〜290 pg/mL以上である場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度及びTNFSF13Bタンパク質濃度を測定することを含む、FGF18タンパク質濃度及びTNFSF13Bタンパク質濃度を指標として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法。
【請求項７】
生体試料が血液、血清又は血漿である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者の生体試料中のFGF18タンパク質濃度よりも高く、かつ被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質の濃度よりも高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度及び被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度があらかじめ定めたそれぞれのカットオフ値より高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法に用いる検査試薬であって、抗FGF18タンパク質抗体を含む検査試薬。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか１項に記載のアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法に用いる検査試薬であって、抗FGF18タンパク質抗体及び抗TNFSF13Bタンパク質抗体を含む検査試薬。
【請求項１２】
FGF18タンパク質である、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出するためのバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD：nonalcoholic fatty liver disease）は、近年増加している肝疾患である。NAFLDは肝臓に脂肪が蓄積しただけの単純脂肪肝（NAFL：nonalcoholic fatty liver又はSS)と、肝細胞死と炎症を伴う進行性の非アルコール性脂肪性肝炎（NASH：nonalcoholic steato-hepatitis)に大別される。
【０００３】
健康な肝臓に脂肪が蓄積すると非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）になり、さらに憎悪が進むと過酸化脂質ストレス、炎症、肝細死が進行し、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に進行する。NAFLD患者のうち80〜90％は脂肪肝のままで、病気は進行せず、この状態を単純脂肪肝（NAFL)と呼ぶ。残りの10〜20％の患者は徐々に悪化して非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)になる。NASHは、線維化により肝硬変に進行したり、さらには肝がんを発症することもある。
【０００４】
単純脂肪肝（NAFL)と非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を鑑別診断するためには肝生検が必要であるが、侵襲性が高く感染のおそれもあるため、より侵襲性の低く精度の高い診断方法が求められていた。
【０００５】
サイトケラチン18断片（CK18 fragment)及びFGF21(Fibroblast growth factor 21)を非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)のバイオマーカーとして用い得ることが報告されている（非特許文献１〜４を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shen et al., J. Hepatol. 56:1363-70, 2012
【非特許文献２】Yilmaz and Eren, Clin. Chim. Acta, 414:154-157, 2012
【非特許文献３】Yang et al., PLoS ONE, 10(6):e0131664, 2015
【非特許文献４】He et al., Biomed. Res. Int. 2017:9729107, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)と単純脂肪肝（NAFL)とを、より高精度で鑑別して検出し得るバイオマーカーの探索について鋭意検討を行った。
【０００９】
その結果、NAFLDにおいては血清中のFGF18タンパク質濃度が増加し、特にNASHにおいて高値を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。被験体の血清のFGF18タンパク質濃度を定量することにより、NAFLDと診断された患者を低侵襲的かつ高精度に非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)と単純脂肪肝（NAFL)とに鑑別して検出することができる。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度を測定することを含む、FGF18タンパク質濃度を指標として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法。
[２]  生体試料が血液、血清又は血漿である、[１]の方法。
[３]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度よりも高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、[１]又は[２]の方法。
[４]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度があらかじめ定めたカットオフ値より高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５]  被験体から採取した血清中のFGF18タンパク質濃度があらかじめ定めたカットオフ値である270〜290 pg/mL以上である場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度及びTNFSF13Bタンパク質濃度を測定することを含む、FGF18タンパク質濃度及びTNFSF13Bタンパク質濃度を指標として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法。
[７]  生体試料が血液、血清又は血漿である、[６]の方法。
[８]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者の生体試料中のFGF18タンパク質濃度よりも高く、かつ被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質の濃度よりも高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、[６]又は[７]の方法。
[９]  被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度及び被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度があらかじめ定めたそれぞれのカットオフ値より高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断する、[６]〜[８]のいずれかの方法。
[１０]  [１]〜[５]のいずれかのアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法に用いる検査試薬であって、抗FGF18タンパク質抗体を含む検査試薬。
[１１]  [６]〜[９]のいずれかのアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出する方法に用いる検査試薬であって、抗FGF18タンパク質抗体及び抗TNFSF13Bタンパク質抗体を含む検査試薬。
[１２]  FGF18タンパク質である、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出するためのバイオマーカー。
【発明の効果】
【００１１】
生体試料中のFGF18タンパク質をバイオマーカーとして用いることにより、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD）患者において、高精度でアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出することができる。
【００１２】
さらに、生体試料中のFGF18タンパク質及びTNFSF13Bタンパク質をバイオマーカーとして併用することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD）患者において、より高精度でアルコール性脂肪性肝炎（NASH)を単純脂肪肝（NAFL)と鑑別して検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】健常者、単純脂肪肝患者及びNASH患者における血清中のFGF18タンパク質、CK18fragment、FGF21タンパク質及びTNFSF13Bタンパク質濃度を示す図である。
【図２】FGF18タンパク質、CK18fragment、FGF21タンパク質及びTNFSF13Bタンパク質をNASH検出のためのバイオマーカーとして用いたときのROC曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、被験体から採取した生体試料中のFGF18（Fibroblast growth factor 18)タンパク質レベルを指標に非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を検出する方法である。また、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）と単純脂肪肝（NAFL）を鑑別する方法を含む。さらに、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出する方法である。ここで、鑑別とは疾患を検出するにあたり、検査の結果から可能性のある複数の疾患を比較しながら、特定することをいう。すなわち、本発明の方法においては、生体試料中のFGF18タンパク質をマーカーとして用いる。さらに、本発明は生体試料中のFGF18タンパク質レベルを指標に、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を検出するための、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）と単純脂肪肝（NAFL）を鑑別するための、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出するための補助的データを取得する方法でもある。
【００１６】
なお、FGF21が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）のバイオマーカーとして用い得ることが報告されているが、FGF18とFGF21は同じFGFファミリーに属するが機能的にも構造的にも異なる分子である。
【００１７】
本発明において、被験体は、検査により非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された被験体、又は健常人である。超音波検査やCT検査等の画像検査で脂肪肝の所見があり、他の肝臓疾患を有しない場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断される。
【００１８】
生体試料は、血液（全血）、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、漿液、間質液、血管外液、脳脊髄液、滑液、強膜液等が含まれるが、この中でも血液、血清又は血漿が好ましく、特に血清が好ましい。
【００１９】
FGF18タンパク質の測定方法は限定されないが、好ましくは抗FGF18抗体を用いた免疫学的測定方法により測定すればよい。免疫学的測定方法として、RIA（radio immunoassay）、EIA（enzyme immunoassay）、FIA（fluoro immunoassay）、CLIA（chemiluminescent immunoassay）、CLEIA（chemiluminescent enzyme immunoassay）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法等が挙げられる。
【００２０】
この中でも、EIA(Enzyme Immunoassay)法の１種であるELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法、イムノクロマト法、抗体を固相化したラテックス粒子を用いたラテックス凝集法（LA)等が好ましい。
【００２１】
ELISA法では、FGF18タンパク質に対する抗体を固相化したマイクロタイタープレートに抗原（FGF18タンパク質）を含む検体を添加し抗原・抗体反応を行わせ、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素で酵素標識したFGF18タンパク質に対する抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して生体試料中のFGF18タンパク質濃度を測定する。蛍光標識したFGF18タンパク質に対する抗体を用いてもよい。
【００２２】
イムノクロマト法は、FGF18タンパク質に対する抗体が固相化されたメンブレンを含むイムノクロマトデバイスを用い、メンブレンに対してFGF18タンパク質を含む溶液を水平方向に展開させて行う方法である。メンブレン上には、体液を含む試料を添加する部位（試料添加部位）、抗FGF18タンパク質抗体を結合させた金コロイド、ラテックス粒子等の不溶性担体粒子が固相化された部位が存在する。試料添加部位に体液を含む試料を添加すると、該試料がメンブレン上を展開し、生体試料中にFGF18タンパク質が存在する場合、該FGF18タンパク質がメンブレン上に固相化された抗FGF18タンパク質抗体を結合させた不溶性担体粒子と結合し、複合体を形成し、さらに、該複合体がメンブレン上に固相化された抗FGF18タンパク質抗体に結合し、抗FGF18タンパク質抗体が固相化された部分に不溶性担体粒子が集積凝集しシグナルを発する。該シグナルを目視又は測定機器により測定すればよい。不溶性担体の代わりに抗体を酵素や蛍光物質で標識してもよい。
【００２３】
ラテックス凝集法は、FGF18タンパク質に対する抗体をラテックス粒子に固相化し、抗原（FGF18タンパク質）を含む検体と混合する。抗原が存在する場合、抗原抗体反応によりラテックス粒子が凝集し、この凝集を目視により観察するか、あるいは自動分析装置により濁度を測定することにより抗原を定量することができる。
【００２４】
免疫学的測定方法において、抗原抗体反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、1分〜18時間、より好ましくは5分〜1時間、さらに好ましくは10分〜1時間程度である。
【００２５】
免疫学的測定方法において用いられる抗FGF18タンパク質抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。さらに、モノクローナル抗体のFab、F(ab')、F(ab')2等の結合活性断片を用いることもできる。
【００２６】
本発明においては、健常人又は非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）患者のうち単純脂肪肝（NAFL）と診断された患者から採取した生体試料を陰性対照として、同時に測定してもよい。健常人及び単純脂肪肝（NAFL）患者を非NASH患者ということもある。
【００２７】
この場合、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患している場合、被験体の生体試料中のFGF18タンパク質濃度が健常人又は単純脂肪肝（NAFL）患者に比べて上昇するので、被験体における生体試料中のFGF18タンパク質濃度が健常人又は単純脂肪肝（NAFL）患者よりも高い場合、被験体は非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。例えば、被験体の生体試料中のFGF18タンパク質濃度が健常人又は単純脂肪肝（NAFL）患者の生体試料中の濃度の1.2倍以上、好ましくは1.3倍以上、さらに好ましくは1.5倍以上の場合に被験体は非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。
【００２８】
また、あらかじめ健常人又は単純脂肪肝（NAFL）患者の生体試料中のFGF18タンパク質を測定しておき、該測定値に基づいてFGF18タンパク質の濃度測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としカットオフ値以上か、又はカットオフ値を超えた場合に、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。
【００２９】
カットオフ値は、例えば、ROC（receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線）解析により設定することができる。ROC曲線は、各カットオフ値での感度（sensitivity)及び特異性(specificity)を算出し、横軸を特異性とし、縦軸を感度とした座標上にプロットして作成する。また、ROC解析により本発明の方法による判定精度（感度及び特異性）を決定することができる。ROC解析は、試料として非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）患者から採取した生体試料と健常人又は単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料についてFGF18タンパク質濃度を測定し、FGF18タンパク質濃度について、各カットオフ値での感度（sensitivity)及び特異性(specificity)を算出し、横軸を特異性とし、縦軸を感度とした座標上にプロットして行う。本発明の方法の測定結果についてROC解析により判定精度を解析した場合の、曲線下面積（AUC：area under the curve）は0.8以上と高く、感度は70％以上、好ましくは75％以上であり、特異性は70％以上、好ましくは75％以上である。本発明の方法により、非常に高い精度で非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができ、あるいは非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を検出することができる。
【００３０】
ROC曲線を用いてカットオフ値を決定する場合、カットオフ値は感度と特異度のバランスから決定すればよく、例えば、ROC曲線の図の左上隅からの距離が最少となる点の値をカットオフ値としてもよく、曲線下面積（AUC)=0.500となる斜点線から最も離れた点の値をカットオフ値としてもよい（Youden's index）。
【００３１】
例えば、血清中のFGF18タンパク質濃度のカットオフ値として、200〜300 pg/mL、好ましくは250〜300 pg/mL。さらに好ましくは260〜290 pg/mL、特に好ましくは270〜290 pg/mLと設定することができる。このカットオフ値は一例であり、この値には限定されない。このカットオフ値は、好ましくはELISA法で測定したときの値である。
【００３２】
本発明は、被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質レベル及びTNFSF13B（Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B)タンパク質レベルを指標に非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を検出する方法も包含する。該方法は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）と単純脂肪肝（NAFL）を鑑別する方法を含み、さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出する方法を含む。さらに、該方法は生体試料中のFGF18タンパク質レベル及びTNFSF13Bタンパク質レベルを指標に、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)を検出するための、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）と単純脂肪肝（NAFL）を鑑別するための、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者において、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出するための補助的データを取得する方法も含む。
【００３３】
該方法は、FGF18タンパク質とTNFSF13Bタンパク質をマーカーとして併用して、検出する方法でもある。
【００３４】
TNFSF13Bは、BAFF（B-cell activating factor)とも呼ばれる32 kDaの膜貫通グリコプロテインである。TNFSF13Bを非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）のマーカーとして用い得ることは報告されている（Miyake et al., Hepatol. Int. 7; 539-547, 2013)。
【００３５】
TNFSF13Bタンパク質についても上記の方法でカットオフ値を定めることができる。
【００３６】
被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者の生体試料中のFGF18タンパク質濃度よりも高く、かつ被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度が単純脂肪肝（NAFL）患者から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質の濃度よりも高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。また、被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質濃度及び被験体から採取した生体試料中のTNFSF13Bタンパク質濃度があらかじめ定めたそれぞれのカットオフ値より高い場合に、被験体が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。
【００３７】
FGF18タンパク質とTNFSF13Bタンパク質を併用する場合、被験体から採取した生体試料中のFGF18タンパク質とTNFSF13Bタンパク質の両方が健常人よりも高い場合、あるいは両方がカットオフ値を超えている場合に、それぞれのマーカーを単独で用いる場合よりも高精度で、該被験体は非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出することができる。
【００３８】
本発明は、抗FGF18タンパク質抗体あるいは抗FGF18タンパク質抗体と抗TNFSF13Bタンパク質抗体を含む、キット又は検査試薬であって非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に罹患していると判断し、単純脂肪肝（NAFL）と鑑別して検出するためのキット又は検査試薬を包含する。該キット又は検査試薬は、緩衝液、ELISA用プレート、イムノクロマト用デバイス、凝集法用ラテックス、取扱説明書等を含む。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４０】
血清FGF18濃度の測定はELISA Kit for Fibroblast Growth Factor 18 (FGF18) (Cloud-Clone社、Catalog Number:SEC907Hu)を用い、添付文書記載の方法に従い行った。比較対照として、血清CK18fragment（サイトケラチン18断片）濃度の測定はM30 Apoptosense CK18 kit (PEIVIVA社（現在はVLVbio社）Catalog number 10011)を、血清FGF21濃度の測定はHuman FGF21 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems社、 Catalog number DF2100)を、血清TNFSF13B濃度の測定はHuman BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit (R&D Systems社、Catalog number DBLYS0B)を用い、それぞれ添付文書記載の方法に従い行った。
【００４１】
（1）材料
血清試料として、東邦大学医療センター大森病院消化器センター内科において肝生検により確定診断された単純脂肪肝(SS)9例とNASH4例、及び健常人ボランティア7例を用いた。
【００４２】
（2）方法
FGF18 kitについては、血清100 μLを希釈せずに用いた。M30 Apoptosense CK18 kit、FGF21 Quantikine ELISA Kit、及びBAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kitについては、添付文書記載の方法に従い、それぞれ血清25 μL（CK18 fragment)及び50 μL（FGF21及びTNFSF13B)を添付の希釈溶液で希釈して用いた。測定にはMolecular Device社製SPECTRAMAX 340PCを用い、450 nmと570 nmの吸光度を測定した。測定結果をもとにGraphPad社製Prism 7.0ソフトウェアを用いて棒グラフ及び受信者操作特性曲線(ROC曲線: Receiver Operating Characteristic Curve)を作成した。統計的解析はStudentのt検定により行った。*; p<0.05、**; p<0.01、***; p<0.001、ns; not significantを示す。
【００４３】
（3）結果
３種類の血清バイオマーカーに対して、それぞれ測定値の棒グラフを作成し、統計的な解析を行った。図１に示す通り、血清中FGF18濃度は、健常者で平均値±標準誤差(pg/mL)=102.34±22.7、単純脂肪肝患者で232.5±26.7、NASH患者で327.3±33.9であった。一方血清CK18fragment濃度は健常者で平均値±標準誤差(U)=48.316±5.5、単純脂肪肝患者で316.2±63.7、NASH患者で506.3±266.8であり、血清FGF21濃度は健常者で平均値±標準誤差(pg/mL)=111.6±49.9、単純脂肪肝患者で288.5±73.1、NASH患者で388.3±75.6であった。いずれの血清バイオマーカーも健常者に比べて単純脂肪肝患者とNASH患者は統計的に有意な高値を示したことから、健常者と脂肪性肝疾患の判別マーカーとしては有用であった。単純脂肪肝患者とNASH患者の比較では、いずれの血清バイオマーカーもNASH患者が高値を示す傾向にあった。血清中TNFSF13B濃度は、健常者で平均値±標準誤差(pg/mL)=626.4±30.0、単純脂肪肝患者で547.5±36.2、NASH患者で835.5±113.6であり、健常者及び単純脂肪肝患者に比べてNASH患者で統計的に有意な高値を示した。
【００４４】
FGF18のp値は0.0648であり、一方CK18fragmentでは0.3481、FGF21では0.4309であった。FGF18のp値が最も小さかったことから、3種類の血清バイオマーカーの中ではFGF18が最も優れていることがわかった。TNFSF13Bのp値は0.0087であった。
【００４５】
次に単純脂肪肝とNASHの鑑別能を比較するため、３種類の血清バイオマーカーについてROC曲線を作成した。図２に示す通り、血清FGF18濃度のROC曲線下面積(AUC: Area Under the Curve)は0.8333であった。一方CK18fragmentでは0.5556であり、FGF21では0.6944であった。FGF18のAUCが最も大きいことから、３種類の血清バイオマーカーの中ではFGF18が最も優れていた。TNFSF13BのROC曲線下面積は0.9167であった。本実施例では、図２中の矢印で示す通り血清FGF18濃度のカットオフ値を277.9 pg/mLに設定することで、感度(sensitivity)75%、特異度(specificity)77.8%の精度で両者を鑑別診断できると考えられた。
【００４６】
また、FGF18タンパク質とTNFSF18Bタンパク質をバイオマーカーとして併用することにより、高精度で両者を鑑別診断できることが予測される。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
FGF18タンパク質を非アルコール性脂肪性肝炎（NASH)の新しいバイオマーカーとして用いることができる。
【図１】
2020106382.tif 000002
【図２】
2020106382.tif 000003