(57)【要約】【課題】糖尿病性腎症を処置又は予防する方法を提供する。【解決手段】糖尿病性腎症に罹患している対象の糖尿病性腎症を処置する方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を前記対象に投与する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を含む、糖尿病性腎症に罹患している対象の糖尿病性腎症を処置するための医薬組成物であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する前記化合物が、VEGF-Bに結合又は特異的に結合しVEGF-Bシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質であり、前記抗体可変領域が、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号3のアミノ酸25〜34に示す配列を含むCDR1をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR1、
(b)配列番号3のアミノ酸49〜65に示す配列を含むCDR2をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号3のアミノ酸98〜108に示す配列を含むCDR3をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR3、並びに
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号4のアミノ酸23〜33に示す配列を含むCDR1をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR1、
(b)配列番号4のアミノ酸49〜55に示す配列を含むCDR2をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号4のアミノ酸88〜96に示す配列を含むCDR3をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR3
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を含む、糖尿病と微量アルブミン尿症又は顕性アルブミン尿症とに罹患している対象の糖尿病性腎症を予防するための医薬組成物であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する前記化合物が、VEGF-Bに結合又は特異的に結合しVEGF-Bシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質であり、前記抗体可変領域が、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号3のアミノ酸25〜34に示す配列を含むCDR1をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR1、
(b)配列番号3のアミノ酸49〜65に示す配列を含むCDR2をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号3のアミノ酸98〜108に示す配列を含むCDR3をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR3、並びに
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号4のアミノ酸23〜33に示す配列を含むCDR1をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR1、
(b)配列番号4のアミノ酸49〜55に示す配列を含むCDR2をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号4のアミノ酸88〜96に示す配列を含むCDR3をコードする核酸によりコードされる配列を含むCDR3
を含む、医薬組成物。
【請求項３】
(i)配列番号3のアミノ酸25〜34に示す配列を含むCDR1、配列番号3のアミノ酸49〜65に示す配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸98〜108に示す配列を含むCDR3を含むVHと、配列番号4のアミノ酸23〜33に示す配列を含むCDR1、配列番号4のアミノ酸49〜55に示す配列を含むCDR2、及び配列番号4のアミノ酸88〜96に示す配列を含むCDR3を含むVLとを含むタンパク質、並びに
(ii)(i)のタンパク質のバリアントであって、コードされたC末端リジン残基を欠損しているバリアント、脱アミド化バリアント、グリコシル化バリアント、タンパク質のN末端にピログルタミン酸塩を含むバリアント、N末端残基を欠いているバリアント、及び/又は分泌シグナルの全て若しくは一部を含むバリアントの1つ以上である、バリアント
を含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物を、下記の効果:
・  高血圧を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体硬化症及び/若しくは尿細管硬化症を軽減させる、若しくは予防する、
・  メサンギウムの細胞外基質沈着及び/若しくは糸球体基底膜の異常肥厚を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のメサンギウム増殖を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体血管の再構成を軽減させる、若しくは予防する、
・  腎臓の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のコラーゲン沈着及び/若しくは硝子様細動脈硬化を軽減させる、若しくは予防する、並びに/又は
・  顕性アルブミン尿症を軽減させる若しくは予防する
のうちの1つ以上を得るのに有効な量で含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が、Fvを含むタンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記タンパク質が、
(i)単鎖Fv断片(scFv)、
(ii)二量体scFv(ジscFv)、
(iii)ダイアボディ、
(iv)トリアボディ、
(v)テトラボディ、
(vi)Fab、
(vii)F(ab')2、
(viii)Fv、又は
(ix)抗体の定常領域、Fc若しくは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/若しくはCH3に連結されている(i)から(viii)のうちの1つ
から成る群から選択される、請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記化合物が抗体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、抗体2H10(配列番号3に示す配列を含む重鎖可変領域(VH)と配列番号4に示す配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む)のVEGF-Bへの結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含むタンパク質である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
(i)のタンパク質が、抗体2H10のヒト化型の可変領域を含むか、又は前記化合物がヒト化型の抗体2H10である、請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
(i)のタンパク質が、配列番号5に示す配列を含むVHと配列番号6に示す配列を含むVLとを含む抗体である、請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記腎症を処置若しくは予防するための、又は糖尿病を処置若しくは予防するか若しくは糖尿病の進行を遅延させるための更なる化合物と組み合わせて使用される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、2013年11月28日に出願された、表題「Method of treating nephropathy」のオーストラリア特許出願第2013904595号からの優先権を主張する。この出願の内容全体が参照により援用される。
【０００２】
配列表
本出願を電子形式の配列表と共に出願する。これにより、この配列表の内容全体が参照によって援用される。
【０００３】
分野
本出願は、腎症を処置する又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
腎症
腎症とは腎臓への損傷を特徴とする障害の一クラスであり、この腎症には腎炎(炎症性腎疾患)及びネフローゼ(非炎症性腎疾患)が包含される。腎症の原因として、慢性疾患[全身性エリテマトーデス、糖尿病及び高血圧症(高血圧)等]、糸球体におけるIgA抗体の沈着、鎮痛剤の投与、キサンチンオキシダーゼ欠乏、化学療法剤の毒性、並びに鉛又はその塩への長期曝露が挙げられる。
【０００５】
糖尿病を伴う腎症(即ち「糖尿病性腎症」)は、米国及びいくつかのその他の先進国における末期腎疾患の最も一般的な原因である。例えば、糖尿病性腎症は今日の米国における末期腎疾患の35%近くを占め、毎年患者1人当たり約$50,000〜$65,000の費用がかかる。この費用は、米国の全患者だと、毎年$20億を超えている。1型糖尿病患者の約40%及び2型糖尿病患者の5〜15%は、最終的には末期腎疾患を発症する。
【０００６】
糖尿病性腎症の病態生理学的機序は完全には理解されていない。最も初期の明白な異常として、腎内高血圧、過剰ろ過(糸球体ろ過率の上昇)及び微量アルブミン尿症が挙げられる。臨床的には、初期の腎症を特定するのに最も重要なスクリーニングツールは微量アルブミン尿症の検出である。糖尿病性腎症の発症の危険因子として、高血糖、高血圧、腎症の陽性家族歴及び喫煙が挙げられる。糖尿病性腎症は糖尿病における高血圧及び高血糖の結果であると一般に考えられており、多くの研究者は、高血糖をこの疾患の発症への重要な寄与因子であると考えている。
【０００７】
これまでの医学的介入は、糖尿病性腎症の進行及び末期腎疾患の発症を処置又は予防するのに十分効果的ではない。このため、現在の処置は下記のように、この疾患の合併症を改善することに主眼を置いている:1)血圧の制御{ACE阻害剤又はアンジオテンシン受容体遮断剤(ARB)}、2)血糖値の制御、及び3)リポタンパク質ダイエット、運動又はその他のライフスタイルの改変。しかしながら、現在の処置は腎機能の進行性の低下に対する影響が限定されており、患者は今でも、透析又は腎移植のいずれかである腎代替療法まで進行する。
【０００８】
その他の処置戦略は、治療標的としての1種又は複数種の増殖因子に重点を置いており、この増殖因子は、腎症モデルにおいて上方制御されていると確認されることが多い。例えば、TGFβの阻害を目的とする治療が、単独又はACE阻害剤との併用のいずれかで試験されている。血管内皮増殖因子A(VEGF-A)及び血管形成に関与するその他の因子も、腎症の処置における標的として研究されている。
【０００９】
VEGF及び腎症
VEGFファミリの増殖因子は、3種の受容体チロシンキナーゼ(VEGFR-1、VEGFR-2及びVEGFR-3)並びにセマフォリン受容体(ニューロピリン1及びニューロピリン2)に別々に結合することができる5種のリガンド{VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及び胎盤増殖因子(PIGF)}を包含する。VEGFファミリの増殖因子は、正常な及び病的な血管形成及びリンパ管形成に関与する。VEGF-AはVEGFR-1、VEGFR-2、NP-1及びNP-2に結合し、VEGF-BはVEGFR-1及びNP-1に結合する。VEGF-C及びVEGF-Dはリンパ管形成に主に関与し、VEGFR-2、VEGFR-3及びNP-2に結合する。
【００１０】
VEGF-Aは最もよく研究されたVEGFファミリのメンバーであり、腎臓及び腎症に関連したVEGF-Aの役割及びVEGF-Aの阻害の研究からは複雑な結果が得られており、結果として腎臓への有害な影響が生じることが多い。これらの研究の内のいくつかは、可溶性VEGF受容体1(sFlt-1としても知られている)の投与を含んでおり、この可溶性VEGF受容体1は、VEGF-Aのアンタゴニストとして機能することができるがVEGF-B及びPlGFのアンタゴニストとしても機能することができ、タンパク尿症及び高血圧の原因となっている(Nakagawa他、Diabetes、58、1471〜8頁、2009)。Kosugi他(Am J Physiol Renal Physiol 298: F609〜F616、2010)は、sFlt-1処置は糖尿病性腎症において有益である可能性が低く、糖尿病性腎疾患を処置するための代替アプローチが必要であると結論付けた。db/dbマウスにおけるVEGFR-1のアンタゴニストを含む最近の研究(Yang他、PLOS ONE、9(4)、e94540、2014)により、VEGFR-1の阻害により糖尿病性腎症が悪化すると結論付けられ、VEGFR-1の活性化により2型糖尿病性腎症において治療方法が提供され得ることが実質的に示唆された。上記で論じたように、VEGF-Bは、VEGFR-1を介してシグナル伝達するリガンドの一つであり、sFlt-1又はVEGFR-1のアンタゴニストを含むこれらの研究では、非特異的な形ではあるがVEGF-Bシグナル伝達が遮断されていたのであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2006/012688
【特許文献２】PCT/US2007/008231
【特許文献３】US6300064
【特許文献４】US5885793
【特許文献５】US6204023
【特許文献６】US6291158
【特許文献７】US6248516
【特許文献８】US7270969
【特許文献９】US5516637
【特許文献１０】US6423538
【特許文献１１】US5225539
【特許文献１２】US6054297
【特許文献１３】US7566771
【特許文献１４】US5585089
【特許文献１５】US7732578
【特許文献１６】US5565332
【特許文献１７】US6300064
【特許文献１８】WO2007/019620
【特許文献１９】US6113898
【特許文献２０】US6331415
【特許文献２１】US5807715
【特許文献２２】US4816567
【特許文献２３】US4816397
【特許文献２４】WO2000/34317
【特許文献２５】WO2004/108158
【特許文献２６】US5844094
【特許文献２７】US2008152586
【特許文献２８】US5260203
【特許文献２９】US5837821
【特許文献３０】US5731168
【特許文献３１】US4676980
【特許文献３２】EP19930302894
【特許文献３３】US7217797
【特許文献３４】US7217798
【特許文献３５】US20090041770
【特許文献３６】US2005037000
【特許文献３７】WO2010/080538
【特許文献３８】WO94/04678
【特許文献３９】WO97/49805
【特許文献４０】WO2005/118629
【特許文献４１】WO1999/045110
【特許文献４２】WO2011/107595
【特許文献４３】US20080139791
【特許文献４４】WO2005/056764
【特許文献４５】US7250297B1
【特許文献４６】US20070224633
【特許文献４７】EP1641818
【特許文献４８】WO2002088171
【特許文献４９】US20040132028
【特許文献５０】US5530101
【特許文献５１】WO2003/105754
【特許文献５２】WO99/32619
【特許文献５３】WO99/53050
【特許文献５４】WO99/49029
【特許文献５５】WO01/34815
【特許文献５６】米国特許第5,496,807号
【特許文献５７】米国特許第7,030,146号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nakagawa他、Diabetes、58、1471〜8頁、2009
【非特許文献２】Kosugi他、Am J Physiol Renal Physiol 298: F609〜F616、2010
【非特許文献３】Yang他、PLOS ONE、9(4)、e94540、2014
【非特許文献４】J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)
【非特許文献５】J. Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
【非特許文献６】T.A. Brown (編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻及び第2巻、IRL Press (1991)
【非特許文献７】D.M. Glover及びB.D. Hames (編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press (1995及び1996)
【非特許文献８】F.M. Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂を含む)
【非特許文献９】Ed Harlow及びDavid Lane (編) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、(1988)
【非特許文献１０】J.E. Coligan他(編) Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons (現在までの全ての改訂を含む)
【非特許文献１１】Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda, Md.、1987及び1991
【非特許文献１２】Bork他、J Mol. Biol. 242、309〜320、1994
【非特許文献１３】Chothia及びLesk J. Mol Biol. 196:901〜917、1987
【非特許文献１４】Chothia他、Nature 342、877〜883、1989
【非特許文献１５】Al-Lazikani他、J Mol Biol 273、927〜948、1997
【非特許文献１６】Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂を含む)
【非特許文献１７】Lefranc他、Devel. And Compar. Immunol.、27: 55〜77、2003
【非特許文献１８】Honnegher及びPlukthun J. Mol. Biol.、309: 657〜670、2001
【非特許文献１９】Levey、Am J Kidney Dis. 22(1):207〜214、1993
【非特許文献２０】Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988
【非特許文献２１】Lonberg他、Nature 368 (1994): 856〜859
【非特許文献２２】Kohler及びMilstein、Nature 256、495〜497、1975
【非特許文献２３】Largaespada他、Curr. Top. Microbiol. Immunol、166、91〜96. 1990
【非特許文献２４】Sambrook及びRussell編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001
【非特許文献２５】Protein purification: principles and practice、第3版、Springer Verlag、1994
【非特許文献２６】Jones他、J Immunol Methods. 354:85〜90、2010
【非特許文献２７】Jostock他、J Immunol Methods、289:65〜80、2004
【非特許文献２８】Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience、ISBN 047 150338、1987
【非特許文献２９】Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、第3版、2001
【非特許文献３０】Shalaby他、J. Exp. Med.、175: 217〜225、1992
【非特許文献３１】Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、1987及び/又は1991
【非特許文献３２】Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、2001
【非特許文献３３】Edelman他、Proc. Natl. Acad. USA、63、78〜85、1969
【非特許文献３４】Novotny他、Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650、1991
【非特許文献３５】Hartmann及びEndres(編)、Manual of Antisense Methodology、Kluwer(1999)
【非特許文献３６】Rees及びAlcolado Diabet. Med. 22、359〜370、2005
【非特許文献３７】Kimmel他、Acta Diabetologica、29、142〜148、1992
【非特許文献３８】Remington's Pharmaceutical Science、第16版、Mack編、1980
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明を行うにあたって、本発明者らは、腎症におけるVEGFシグナル伝達に関して、当該技術分野における知識に挑むことから出発し、高脂肪給餌マウス等の一般に認められている腎症のマウスモデル並びに1型糖尿病及び2型糖尿病を伴う腎症等の糖尿病性腎症のモデルにおけるVEGF-Bのシグナル伝達の阻害の効果を研究した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、VEGF-Bの発現を妨げることにより(例えば、VEGF-Bの発現が減少しているか若しくは妨げられている遺伝子改変マウスを使用することにより)、又はVEGF-Bのアンタゴニスト(例えばアンタゴニスト抗体)を投与することにより、この増殖因子の効果を研究した。本発明者らは、驚いたことに、VEGF-Bシグナル伝達の阻害は腎症の様々な動物モデルにおいて有益な効果を有することを発見した。例えば、本発明者らは糖尿病性腎症等の腎症の発症を予防することができ、使用した処置レジメンに応じて糖尿病性腎症等の腎症を処置する(例えば進行を遅延させる)ことができた。
【００１５】
本発明者らは、VEGF-Bシグナル伝達の拮抗作用が、少なくとも糸球体のメサンギウム増殖、糸球体硬化症及び尿細管硬化症、メサンギウム細胞外基質沈着、糸球体基底膜の異常肥厚、及び例えば腎臓糸球体における、腎臓の脂質蓄積、有足細胞の喪失、高血圧、糸球体血管の再構成を減少させ又は予防し、糖尿病対象において有足細胞構造を保持することを発見した。場合によっては(例えば本明細書に記載した実験では)、糖尿病対象での血中グルコース濃度への穏やかな効果にもかかわらず腎臓で変化が起こり、このことは、VEGF-Bの阻害により、血糖コントロールに加えた又は血糖コントロール以外の経路を介して、腎症における治療的/予防的有用性がもたらされることを示す。
【００１６】
本発明者らの発見により、VEGF-Bシグナル伝達を阻害することによって対象の腎症を処置する又は予防する方法の基礎が提供される。例えば、本開示は、対象の腎症を処置する又は予防する方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
一例では、腎症は腎炎、即ち炎症性腎疾患である。例えば、腎症はIgA腎症である、又は薬剤(例えば鎮痛薬若しくは化学療法剤)の使用、キサンチンオキシダーゼ欠乏症、多発性嚢胞腎疾患により起こる、又は慢性疾患、例えば炎症性疾患若しくは自己免疫疾患若しくは糖尿病により起こる。
【００１８】
例えば、腎症は糸球体腎炎及び/又は糸球体硬化症である。例えば、糸球体腎炎及び/又は糸球体硬化症は増殖性の糸球体腎炎及び/又は糸球体硬化症である。
【００１９】
一例では、腎症又は腎炎は別の疾患を伴う、又は別の疾患により起こる。例えば、腎症は、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群)、血管炎{例えば、ウェゲナー肉芽腫症(Wegener granulomatosus)若しくは顕微鏡的多発血管炎(microspcopic polyangitis)}又は糖尿病により起こる。
【００２０】
一例では、腎症又は腎炎は前糖尿病を伴う、又は前糖尿病により起こる。
【００２１】
一例では、腎症又は腎炎は1型糖尿病を伴う、又は1型糖尿病により起こる。
【００２２】
一例では、腎症又は腎炎は2型糖尿病を伴う、又は2型糖尿病により起こる。
【００２３】
例えば、本開示は、糖尿病に罹患している対象の糖尿病性腎症を処置する又は予防する方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
本明細書において例示するように、本発明者らは、糖尿病性腎症に罹患している対象へのVEGF-Bシグナル伝達の阻害剤の投与は、この疾患の処置において効果的であることを明らかにした。従って、本開示は、糖尿病性腎症を処置する方法であって、VEGF-Bシグナル伝達の阻害剤を糖尿病性腎症に罹患している対象に投与する工程を含む方法を更に提供する。
【００２５】
一例では、対象は腎症を発症するリスクがある、又は腎症(例えば糖尿病性腎症)を発症している。例えば、対象は微量アルブミン尿症又は顕性アルブミン尿症(macroalbuminuria)に罹患している。別の例では、対象は高血圧に罹患している。
【００２６】
一例では、本開示は、腎症(例えば糖尿病性腎症)の発症を予防する又は遅延させる方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を、微量アルブミン尿症又は顕性アルブミン尿症に罹患している対象(例えば、糖尿病と微量アルブミン尿症又は顕性アルブミン尿症とに罹患している対象)に投与する工程を含む方法を提供する。一例では、対象は微量アルブミン尿症に罹患している。
【００２７】
一例では、本開示は、腎症(例えば糖尿病性腎症)の発症を予防する又は遅延させる方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を、高血圧に罹患している対象(例えば、糖尿病と高血圧とに罹患している対象)に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２８】
一例では、この化合物を、下記の効果:
・  高血圧を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体硬化症及び/若しくは尿細管硬化症を軽減させる、若しくは予防する、
・  メサンギウムの細胞外基質沈着及び/若しくは糸球体基底膜の異常肥厚を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のメサンギウム増殖を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体血管の再構成を軽減させる、若しくは予防する、
・  腎臓の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のコラーゲン沈着及び/若しくは硝子様細動脈硬化(arteriolar hyaliosis)を軽減させる、若しくは予防する、
並びに/又は
・  顕性アルブミン尿症を軽減させる若しくは予防する
のうちの1つ又は複数を得るのに効果的な量で投与する。
【００２９】
一例では、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物は、VEGF-Bシグナル伝達を特異的に阻害する。このことは、本開示の方法が多様なVEGFタンパク質のシグナル伝達の阻害を包含しないことを意味しておらず、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物(又はこの一部)がVEGF-Bに対して特異的であり、例えばVEGFタンパク質の一般的な阻害剤ではないことのみを意味する。この用語はまた、例えば二重特異性抗体又はこの結合ドメインを含むタンパク質も除外せず、この抗体又はタンパク質は、1個の(又は複数個の)結合ドメインによりVEGF-Bシグナル伝達を特異的に阻害することができ、別の結合ドメインにより別のタンパク質のシグナル伝達を特異的に阻害することができる。
【００３０】
一例では、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物はVEGF-Bに結合する。例えば、この化合物は、VEGF-Bに結合して又は特異的に結合してVEGF-Bシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質である。
【００３１】
一例では、この化合物は抗体模倣物である。例えば、この化合物は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含むタンパク質、例えばIgNAR、ラクダ抗体又はT細胞受容体である。
【００３２】
一例では、この化合物は、(例えば、VEGF-Bに結合する重鎖可変領域のみ若しくは軽鎖可変領域のみを含む)ドメイン抗体、又は重鎖のみの抗体(例えばラクダ抗体若しくはIgNAR)、又はこれらの可変領域である。
【００３３】
一例では、この化合物は、Fvを含むタンパク質である。例えば、このタンパク質は、
(i)単鎖Fv断片(scFv)、
(ii)二量体scFv(ジscFv)若しくは
(iv)ダイアボディ、
(v)トリアボディ、
(vi)テトラボディ、
(vii)Fab、
(viii)F(ab')2、
(ix)Fv、又は
(x)抗体の定常領域、Fc若しくは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/若しくはCH3に連結されている(i)から(ix)のうちの1つ
から成る群から選択される。
【００３４】
別の例では、この化合物は抗体である。例示的な抗体は、完全長抗体及び/又は裸の(naked)抗体である。
【００３５】
一例では、この化合物は、組換え型である、キメラである、CDR移植されている、ヒト化されている、シンヒト化されている(synhumanized)、霊長類化されている、脱免疫化されている又はヒトであるタンパク質である。
【００３６】
一例では、この化合物は、抗体2H10のVEGF-Bへの結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含むタンパク質である。一例では、このタンパク質は、配列番号3に記載した配列を含む重鎖可変領域(VH)と配列番号4に記載した配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む。
【００３７】
一例では、この化合物は、抗体2H10のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、このタンパク質は、抗体2H10のVH及び/又はVLの相補性決定領域(CDR)を含む可変領域を含む。例えば、このタンパク質は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号3のアミノ酸25〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号3のアミノ酸49〜65に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号3のアミノ酸98〜108に記載した配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号4のアミノ酸23〜33に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号4のアミノ酸49〜55に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号4のアミノ酸88〜96に記載した配列を含むCDR3
を含む。
【００３８】
一例では、この化合物は、VH及びVLを含むタンパク質であり、このVH及びVLは抗体2H10のヒト化可変領域である。例えば、このタンパク質は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号3のアミノ酸25〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号3のアミノ酸49〜65に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号3のアミノ酸98〜108に記載した配列を含むCDR3、
並びに
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号4のアミノ酸23〜33に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号4のアミノ酸49〜55に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号4のアミノ酸88〜96に記載した配列を含むCDR3
を含む。
【００３９】
一例では、上述した段落のいずれかでの可変領域又はVHは、配列番号5に記載した配列を含む。
【００４０】
一例では、上述した段落のいずれかでの可変領域又はVLは、配列番号6に記載した配列を含む。
【００４１】
一例では、この化合物は抗体である。
【００４２】
一例では、この化合物は、配列番号5に記載した配列を含むVHと配列番号6に記載した配列を含むVLとを含む抗体である。
【００４３】
一例では、このタンパク質又は抗体は、上述したタンパク質又は抗体のうちのいずれかをコードする核酸によりコードされた、任意の形態のタンパク質又は抗体である。
【００４４】
一例では、このタンパク質又は抗体は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号11を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号12を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号13を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号14を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号15を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号16を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
【００４５】
[1]一例では、このタンパク質又は抗体は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号23を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号24を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号25を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号26を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号27を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号28を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
【００４６】
一例では、このタンパク質又は抗体は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号35を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号36を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号37を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号38を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号39を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号40を含む核酸によりコードされた配列若しくは配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
【００４７】
一例では、この化合物は組成物中に存在する。例えば、この組成物は、本明細書に記載したような抗体可変領域若しくはVH若しくはVLを含むタンパク質又は抗体を含む。一例では、この組成物は、このタンパク質又は抗体の1種又は複数種のバリアントを更に含む。例えば、この組成物は、コードされたC末端リジン残基を欠損しているバリアント、脱アミド化バリアント、及び/又はグリコシル化バリアント、及び/又は例えばタンパク質のN末端でピログルタミン酸塩を含むバリアント、及び/又は抗体若しくはV領域においてN末端残基、例えばN末端グルタミンを欠いているバリアント、及び/又は分泌シグナルの全て若しくは一部を含むバリアントを含む。その結果、コードされたアスパラギン残基の脱アミド化バリアントは、生成されたイソアスパラギン酸アイソフォーム及びアスパラギン酸アイソフォーム、又は隣接したアミノ酸残基を含むスクシンアミドとさえもなり得る。その結果、コードされたグルタミン残基の脱アミド化バリアントはグルタミン酸となり得る。特定のアミノ酸配列に言及した場合には、そのような配列及びバリアントの異種混合物を含む組成物が含まれることを意図する。
【００４８】
一例では、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物は、VEGF-Bの発現を阻害する、又は妨げる。例えば、この化合物は、アンチセンス、siRNA、RNAi、リボザイム及びDNAザイムの群から選択される。
【００４９】
一例では、VEGF-Bは哺乳動物VEGF-Bであり、例えばヒトVEGF-Bである。
【００５０】
一例では、対象は哺乳動物であり、例えばヒト等の霊長類である。
【００５１】
本明細書に記載した処置方法は、更なる化合物を投与して腎症を処置する又は予防する工程を更に含むことができる。
【００５２】
本明細書に記載した糖尿病性腎症の処置方法は、更なる化合物を投与して糖尿病を処置する又は予防する(又は糖尿病の進行を遅延させる)工程を更に含むことができる。例示的な化合物を本明細書に記載する。
【００５３】
本開示はまた、腎症の処置又は予防で使用する、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物も提供する。
【００５４】
本開示はまた、腎症の処置用の又は予防用の医薬品の製造での、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物の使用も提供する。
【００５５】
本開示はまた、腎症の処置又は予防での使用説明書と共にパッケージ化された、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を含むキットも提供する。
【００５６】
例示的な腎症及び化合物が本明細書に記載されており、変更すべきところは変更して、前の3つの段落に記載した開示の例に適用されると解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図1Aは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスに関して(n=5/群、左側のグラフ)、並びに痩せた野生型(wt)マウス及び痩せたVegfb-/-マウスに関して(n=4〜6/群、右側のグラフ)、ELISAにより測定した尿中アルブミン/クレアチニン比(ACR)を示す2個のグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図1Bは、db/dbマウス及びdb/db//Vegfb+/-マウス(n=5/群)における尾カフ血圧(示したように、収縮期血圧及び拡張期血圧)を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図２】図2Aは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片において尿細管基底膜(BM)の肥厚として測定した尿細管区画での異常の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。痩せた28週齢の野生型マウスと比較して##P<0.01。図2Bは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片においてメサンギウム増殖として測定した糸球体硬化症の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図2Cは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片において1フレーム当たりのアポトーシス糸球体として測定した(n=4/群)糸球体アポトーシスの定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図３】図3Aは、(示したように)痩せたwt動物、db/db動物、db/db//Vegfb+/-動物及びdb/db//Vegfb-/-動物からの腎臓切片の透過電子顕微鏡(TEM)分析を使用して測定した糸球体基底膜の厚さの定量化を示すグラフである。n=3〜4/群。値は平均±標準誤差である。痩せたdb+対照と比較して###P<0.001及びdb/db対照と比較して**P<0.01。図3Bは、(示したように)痩せたwt動物、db/db動物、db/db//Vegfb+/-動物及びdb/db//Vegfb-/-動物からの腎臓切片の透過電子顕微鏡(TEM)分析を使用して測定したスリットの数の定量化を示すグラフである。n=3〜4/群。値は平均±標準誤差である。痩せたdb+対照と比較して###P<0.001及びdb/db対照と比較して**P<0.01。
【図４】図4Aは、db/db動物、db/db//Vegfb+/-動物及びdb/db//Vegfb-/-動物からの腎臓切片のオイルレッドO(ORO)分析の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05。図4Bは、(示したように)糸球体及び尿細管区画におけるオイルレッドO(ORO)染色の定量化を示すグラフである。db/db動物、db/db//Vegfb+/-動物、db/db//Vegfb-/-動物及び野生型動物。値は平均±標準誤差である。痩せた対照と比較して#P<0.05及び###P<0.001。db/db対照と比較して***P<0.001。
【図５】図5Aは、db/db、db/db//Vegfb+/-及びdb/db//Vegfb-/-からの糸球体でのシナプトポジン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図5Bは、db/db、db/db//Vegfb+/-及びdb/db//Vegfb-/-からの糸球体でのpecam染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図６】図6Aは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片における糸球体でのコラーゲンIV染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図6Bは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片における糸球体でのα-SMA染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図6Cは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓切片における細動脈の厚さを示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照と比較して*P<0.05。
【図７】図7は、痩せた野生型マウス、db/db//BKS 6週マウス及びdb/db//BKS 21週マウスの糸球体及び尿細管区画の両方でのORO染色の定量化の結果を示すグラフである。n=5〜7。値は平均±標準誤差である。#P<0.05及び##P<0.01、糸球体と比較した尿細管。*P<0.05、糸球体db/db//BKS 21週と比較した糸球体db/db//BKS 6週。
【図８】図8は、db/db//BKSマウスにおける進行性のDNでは糸球体の脂質蓄積が有足細胞の喪失と相関することを示す2個のグラフである。左側のグラフはアディポフィリン染色の定量化を示し、右側のグラフはシナプトポジン染色の定量化を示す。n=3〜5/群。値は平均±標準誤差である。#P<0.05、##P<0.01、痩せたdb+対照との比較。*P<0.05、糸球体db/db//BKS 21週と比較したdb/db//BKS 6週。
【図９】図9は、(示したように)痩せたdb+並びに6週齢の、12週齢の及び21週齢のdb/db//BKSにおけるVegfb、Vegfr1、Fatp4及びFatp3の腎臓での相対的なmRNA発現を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。*P<0.05、**P<0.01、痩せた対照動物との比較。Vegfb、血管内皮増殖因子B;Vegfr1、血管内皮増殖因子受容体1;Fatp3、脂肪酸トランスポーター3;Fatp4、脂肪酸トランスポーター4。
【図１０】図10Aは、高脂肪食(HFD)給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物における尿中アルブミン/クレアチニン比の分析を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001。HFDを給餌したwtと比較して*P<0.05、**P<0.01。図10Bは、HFD給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物における尿中アルブミンの分析を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001。HFDを給餌したwtと比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図１１】図11Aは、HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスにおける糸球体のメサンギウム増殖の定量化を示すグラフである。HFDを給餌したWTマウス、Vegfb+/-マウス、Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物の分析。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。スケールバー50mm。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。HFDを給餌したwtと比較して**P<0.01。図11Bは、HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスにおける糸球体面積の定量化を示すグラフである。HFDを給餌したWTマウス、Vegfb+/-マウス、Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物の分析。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。スケールバー50mm。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。HFDを給餌したwtと比較して**P<0.01。
【図１２】図12は、HFD給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片のORO染色の定量化を示すグラフである。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。痩せたコントール動物と比較して##P<0.01。HFDを給餌したwtと比較して*P<0.05。
【図１３】図13は、HFD給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片の糸球体でのアディポフィリン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05。HFDを給餌したwtと比較して*P<0.05。
【図１４】図14Aは、HFD給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片でのコラーゲンIV染色の定量化を示すグラフである。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、##P<0.01。HFDを給餌したwtと比較して*P<0.05、**P<0.01。図14Bは、HFD給餌WTマウス、HFD給餌Vegfb+/-マウス、HFD給餌Vegfb-/-マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片での細動脈の厚さの定量化を示すグラフである。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、##P<0.01。HFDを給餌したWTと比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図１５】図15は、8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体(「C」と名付ける)で処置したdb/db//BKSマウスの分析を示すグラフである。図15Aは、未処置の動物における食後の血中グルコース濃度を示す。矢印は、予防的試験又は治療的試験の開始時でのグルコース濃度を示す。図15Bは、未処置のdb/db//BKS動物でのACRを示す。矢印は、予防的試験又は治療的試験の開始時でのACRを示す。図15C及び図15Dは、雄(図15C、n=5/群)の及び雌(図15D、n=5〜6/群)のマウスに関して別々に示したdb/db//BKSでの予防的抗VEGF-B処置からの食後の血中グルコース濃度を示す。図15E及び図15Fは、雄(図15E、n=5/群)の及び雌(図15F、n=5〜6/群)のマウスに関して別々に示したdb/db//BKSでの治療的抗VEGF-B処置からの食後の血中グルコース濃度を示す。抗VEGF-B(2H10)処置の投与期間を各グラフ中に示す。
【図１６】図16Aは、(示したように)8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片におけるメサンギウム増殖により測定した糸球体硬化症の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照処置したdb/db//BKSマウスと比較して*P<0.05、**P<0.01。図16Bは、予防的に(示したように)8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体サイズにより測定した尿細管硬化症の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照処置したdb/db//BKSマウスと比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図１７】図17Aは、予防的に抗VEGF-B(2H10)若しくは対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス又はdb+対照マウスからの腎臓切片における糸球体のポドシン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。##P<0.01、痩せたdb+対照との比較。処置したdb/db対照と比較して**P<0.01、***P<0.001。n=3〜7/群。図17Bは、予防的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のpecam染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図１８】図18Aは、予防的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のアディポフィリン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。#P<0.05、痩せたdb+対照との比較。(n=3〜7/群)。図18Bは、予防的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のシナプトポジン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。(n=3〜5/群)。
【図１９】図19は、予防的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のコラーゲンIV染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。(n=3〜5/群)。
【図２０】図20は、予防的に2H10を使用したVEGF-Bの薬理学的阻害により糖尿病db/db//BKSマウスでの血漿中脂質プロファイルが改善されることを示す一連のグラフである。抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス(n=8/群)及び痩せたdb/+動物(n=3)の分析。グラフは、HDL-c及びLDL-cの血漿中濃度(図20A)と、非エステル化FA(NEFA)の血漿中濃度(図20B)と、ケトンの血漿中濃度(図20C)とを示す。#/*P<0.05、##/**P<0.01、痩せたdb+との比較又は処置したdb/db対照との比較。値は平均±標準誤差である。
【図２１】図21Aは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で予防的に処置した痩せたdb+マウス及びdb/db//BKSマウスからの腎臓切片におけるGBMの厚さの定量化を示すグラフである。n=3〜4/群。値は平均±標準誤差である。痩せたdb+対照と比較して##P<0.01及び処置したdb/db対照と比較して**P<0.01。図21Bは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で予防的に処置した痩せたdb+マウス及びdb/db//BKSマウスからの腎臓切片におけるスリットの数の定量化を示すグラフである。n=3〜4/群。値は平均±標準誤差である。痩せたdb+対照と比較して##P<0.01及び処置したdb/db対照と比較して**P<0.01。
【図２２】図22は、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス及び痩せたdb/+動物からの腎臓切片における糸球体及び尿細管区画の両方でのオイルレッドO染色の定量化を示すグラフである。n=3〜7/群。値は平均±標準誤差である。###P<0.001、痩せたdb+対照との比較。処置したdb/db対照と比較して**P<0.01。
【図２３】図23Aは、治療的に(示したように)8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置した雌のdb/db//BKSマウスからの腎臓切片においてメサンギウム増殖により測定した糸球体硬化症の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***p<0.001。図23は、治療的に(示したように)8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置した雄のdb/db//BKSマウスからの腎臓切片においてメサンギウム増殖により測定した糸球体硬化症の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。
【図２４】図24は、治療的に(示したように)8週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片におけるオイルレッドO染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01、***p<0.001。
【図２５】図25Aは、治療的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のpecam染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。図25Bは、治療的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のシナプトポジン染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。(n=4〜5/群)。
【図２６】図26Aは、治療的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のコラーゲンIV染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05。図26Bは、治療的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体のα-SMA染色の定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。(n=4〜5/群)。図26Cは、治療的に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したdb/db//BKSマウスからの腎臓切片における糸球体の細動脈の厚さの定量化を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。(n=4〜5/群)。
【図２７】図27Aは、8週にわたり抗VEGF-B(2H10)若しくは対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス又は痩せた動物(n=3〜7/群)においてELISAにより測定した尿中ACRを示すグラフである。値は平均±標準誤差である。開始点及び終了点はそれぞれ、処置期間の前後のACRを示す。対照処置した動物と比較して*P<0.05、**P<0.01。図27Bは、8週にわたり抗VEGF-B(2H10)若しくは対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス又は痩せた動物(n=3〜7/群)においてクレアチニンクリアランスとして測定した糸球体ろ過率を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照処置した動物と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図27Cは、8週にわたり抗VEGF-B(2H10)若しくは対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス又は痩せた動物(n=3〜7/群)における尾カフ血圧(収縮期血圧及び拡張期血圧)を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照処置した動物と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図27Dは、8週にわたり抗VEGF-B(2H10)若しくは対照抗体で処置したdb/db//BKSマウス又は痩せた動物(n=4/群)における体重(左側のグラフ)、腎臓の質量(中央のグラフ)及び腎臓の質量に対する体重の比率(右側のグラフ)を示す一連の3個のグラフである。値は平均±標準誤差である。db/db対照処置した動物と比較して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図２８】図28は、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス、及び痩せた対照動物における血中グルコース濃度を示すグラフである。処置期間の終了時での食後の血中グルコース濃度。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して##P<0.01。
【図２９】図29Aは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せた対照動物(n=5〜10/群)における尿中アルブミン濃度を示すグラフである。ACR、アルブミン/クレアチニン比、値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。処置したHFD給餌対照と比較して***P<0.001。図29Bは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置した、HFD給餌マウス、及び痩せた対照動物(n=5〜10/群)においてELISAにより測定した尿中アルブミン/クレアチニン比を示すグラフである。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。処置したHFD給餌対照と比較して***P<0.001。
【図３０】図30Aは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せたwt動物(n=5〜10/群)におけるトリグリセリドの血漿中濃度を示すグラフである。#P<0.05、##P<0.01、痩せた対照動物との比較。値は平均±標準誤差である。*P<0.05、処置したHFD給餌対照との比較。図30Bは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せた対照動物(n=5〜10/群)における非エステル化FA(NEFA)の血漿中濃度を示すグラフである。#P<0.05、##P<0.01、痩せた対照動物との比較。値は平均±標準誤差である。*P<0.05、処置したHFD給餌対照との比較。図30Cは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せたwt動物(n=5〜10/群)におけるケトンの血漿中濃度を示すグラフである。#P<0.05、##P<0.01、痩せた対照動物との比較。値は平均±標準誤差である。*P<0.05、処置したHFD給餌対照との比較。
【図３１】図31Aは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せたwt動物における糸球体のメサンギウム増殖の定量化を示すグラフである。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。処置したHFD給餌対照と比較して***P<0.001。図31Bは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せたwt動物における糸球体面積の定量化を示すグラフである。n=5〜10/群。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して#P<0.05、###P<0.001。処置したHFD給餌対照と比較して***P<0.001。
【図３２】図32は、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片の糸球体のオイルレッドO染色の定量化を示すグラフである。痩せた対照と比較して##P<0.01及びHFD対照処置した動物と比較して**P<0.01。
【図３３】図33Aは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片のコラーゲンIV染色の定量化を示すグラフである。痩せた対照動物と比較して#P<0.05。処置したHFD給餌対照と比較して*P<0.05。図33Bは、抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で治療的に処置したHFD給餌マウス及び痩せた対照動物からの腎臓切片における細動脈の厚さの定量化を示すグラフである。痩せた対照動物と比較して#P<0.05。処置したHFD給餌対照と比較して*P<0.05。
【図３４】図34Aは、ストレプトゾトシン(STZ)注入前後の血中グルコース濃度を示すグラフである。痩せた対照動物にはSTZを注入しなかった。STZ注入後、高血糖症(hyperglyceamia)(12mMを超える血中グルコース濃度)が認められた動物に抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体を投与した。(n=3〜7/群)。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して##P<0.01、###P<0.001。STZ、ストレプトゾトシン。図34Bは、STZで処置したマウス(痩せた対照動物を除く)、及び抗VEGF-B抗体(2H10)又は対照抗体で処置したマウス、及び痩せた対照動物の血中グルコース濃度を示すグラフである。痩せた対照動物にはSTZを注入しなかった。(n=3〜7/群)。値は平均±標準誤差である。痩せた対照動物と比較して##P<0.01、###P<0.001。STZ、ストレプトゾトシン。
【図３５】図35Aは、STZ投与前の、並びにSTZ投与及び1週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体の投与後のマウスにおけるアルブミン/クレアチニン比(ACR)を示すグラフである。痩せた対照動物及びdb/db動物にはSTZを注入しなかった。尿中アルブミン/クレアチニン比をELISAにより測定した(n=3〜6/群)。ACR、アルブミン/クレアチニン比。値は平均±標準誤差である。STZ前の動物と比較して##P<0.01。STZ対照処置した動物と比較して*P<0.05。STZ、ストレプトゾトシン。図35Bは、STZ投与前の、並びにSTZ投与及び1週にわたり抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体の投与後のマウスにおけるアルブミン濃度を示すグラフである。痩せた対照動物にはSTZを注入しなかった。尿中アルブミン濃度をELISAにより測定した(n=3〜6/群)。値は平均±標準誤差である。STZ前の動物と比較して##P<0.01。STZ対照処置動物と比較して*P<0.05。STZ、ストレプトゾトシン。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
配列表の説明
配列番号1は、21個のアミノ酸のN末端シグナル配列を含むヒトVEGF-B186アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号2は、21個のアミノ酸のN末端シグナル配列を含むヒトVEGF-B167アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号3は、抗体2H10のVHからのアミノ酸配列である。
配列番号4は、抗体2H10のVLからのアミノ酸配列である。
配列番号5は、ヒト化型の抗体2H10のVHからのアミノ酸配列である。
配列番号6は、ヒト化型の抗体2H10のVLのアミノ酸配列である。
配列番号7は、抗体4E12のVHからのアミノ酸配列である。
配列番号8は、抗体4E12のVLのアミノ酸配列である。
配列番号9は、抗体2F5のVHからのアミノ酸配列である。
配列番号10は、抗体2F5のVLのアミノ酸配列である。
配列番号11は、抗体2H10のVL CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号12は、抗体2H10のVL CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号13は、抗体2H10のVL CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号14は、抗体2H10のVH CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号15は、抗体2H10のVH CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号16は、抗体2H10のVH CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号17は、抗体2H10のVL CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号18は、抗体2H10のVL CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号19は、抗体2H10のVL CDR3からのアミノ酸配列である。
配列番号20は、抗体2H10のVH CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号21は、抗体2H10のVH CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号22は、抗体2H10のVH CDR3からのアミノ酸配列である。
配列番号23は、抗体2F5のVL CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号24は、抗体2F5のVL CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号25は、抗体2F5のVL CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号26は、抗体2F5のVH CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号27は、抗体2F5のVH CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号28は、抗体2F5のVH CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号29は、抗体2F5のVL CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号30は、抗体2F5のVL CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号31は、抗体2F5のVL CDR3からのアミノ酸配列である。
配列番号32は、抗体2F5のVH CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号33は、抗体2F5のVH CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号34は、抗体2F5のVH CDR3からのアミノ酸配列である。
配列番号35は、抗体4E12のVL CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号36は、抗体4E12のVL CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号37は、抗体4E12のVL CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号38は、抗体4E12のVH CDR1からのヌクレオチド配列である。
配列番号39は、抗体4E12のVH CDR2からのヌクレオチド配列である。
配列番号40は、抗体4E12のVH CDR3からのヌクレオチド配列である。
配列番号41は、抗体4E12のVL CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号42は、抗体4E12のVL CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号43は、抗体4E12のVL CDR3からのアミノ酸配列である。
配列番号44は、抗体4E12のVH CDR1からのアミノ酸配列である。
配列番号45は、抗体4E12のVH CDR2からのアミノ酸配列である。
配列番号46は、抗体4E12のVH CDR3からのアミノ酸配列である。
【００５９】
通則
本明細書全体を通して、別途具体的に述べていない限り又は文脈による別途の要求がない限り、単一の工程、物質からなる組成物、諸工程、又は物質からなる諸組成物への言及は、これらの工程、物質からなる組成物、諸工程の群又は物質からなる諸組成物の群の1つ及び複数(即ち1つ又は複数)を包含するように解釈されるものとする。
【００６０】
当業者は、本開示が、具体的に記載されているもの以外の変形及び変更を容易に受けることを認識するだろう。本開示はそのような変形及び変更の全てを含むことを理解しなければならない。本開示はまた、本明細書で言及した又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全てを、個々に又はまとめて含み、前記工程又は特徴の任意の及び全ての組み合わせ又は任意の2種以上も含む。
【００６１】
本開示は、本明細書に記載した具体例によって範囲が限定されるべきではなく、この具体例は例示のみを目的とするように意図されている。機能的に等価の製品、組成物及び方法は、明瞭に本開示の範囲内である。
【００６２】
本明細書での本開示のあらゆる例は、別途具体的に述べていない限り、変更すべきところは変更して本開示のあらゆるその他の例に適用されると解釈されるものとする。
【００６３】
腎症の処置又は予防に関する本開示のあらゆる例は、変更すべきところは変更して、腎症に罹患している対象の先天性免疫応答(例えば、消化器系における先天性免疫応答及び/若しくは全身性の先天性免疫応答)の阻害又は予防に適用されると解釈されるものとする。
【００６４】
別途具体的に定義しない限り、本明細書で使用する全ての専門用語及び科学用語は、(例えば、細胞培養での、分子遺伝学での、免疫学での、免疫組織化学での、タンパク質化学での、及び生化学での)当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有するように解釈されるものとする。
【００６５】
別途指示しない限り、本開示で利用する組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技法は標準的な手順であり、当業者に公知である。そのような技法は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻及び第2巻、IRL Press (1991)、D.M. Glover及びB.D. Hames (編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press (1995及び1996)、並びにF.M. Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂を含む)、Ed Harlow及びDavid Lane (編) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、(1988)、並びにJ.E. Coligan他(編) Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons(現在までの全ての改訂を含む)等の出典における文献全体を通して記載されている、及び説明されている。
【００６６】
本明細書における可変領域及びこの一部、免疫グロブリン、抗体及びこの断片に関する説明及び定義を、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda, Md.、1987及び1991、Bork他、J Mol. Biol. 242、309〜320、1994、Chothia及びLesk J. Mol Biol. 196:901〜917、1987、Chothia他、Nature 342、877〜883、1989並びに/又はAl-Lazikani他、J Mol Biol 273、927〜948、1997における考察により更に明らかにすることができる。
【００６７】
本明細書におけるタンパク質又は抗体のあらゆる考察は、製造中に及び/又は貯蔵中に生じたタンパク質又は抗体のあらゆるバリアントを含むと理解されたい。例えば、製造中に又は貯蔵中に、抗体は、(例えばアスパラギン残基若しくはグルタミン残基で)脱アミド化され得る、及び/又はグリコシル化が変更され得る、及び/又はグルタミン残基がピログルタミンに変換され得る、及び/又はN末端残基若しくはC末端残基が除去され得る、若しくは「切断され」得る、及び/又はシグナル配列の一部若しくは全てが不完全にプロセシングされ、結果として抗体の末端で残存し得る。特定のアミノ酸配列を含む組成物は、所定の若しくはコードされた配列の異種混合物、及び/又はこの所定の若しくはコードされた配列のバリアントであってよいと理解される。
【００６８】
用語「及び(and)/又は(or)」、例えば「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味するように理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味に明確な支持を与えるように解釈されるものとする。
【００６９】
本明細書全体を通して、単語「含む(comprise)」又は変化形、例えば「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」は、述べた要素、完全体(integer)若しくは工程、又は要素、完全体若しくは工程の群の包含を意味するが、あらゆるその他の要素、完全体若しくは工程、又は要素、完全体若しくは工程の群の排除を意味しないと理解されたい。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「に由来する」は、必ずしも特定の供給源に直接由来しなくても、指定した完全体をこの特定の供給源から得ることができることを示すと解釈されるものとする。
【００７１】
選択的定義
VEGF-Bは2種の主要なアイソフォームで存在することが知られており、VEGF-B186及びVEGF-B167と称される。命名のみを目的として限定を目的とせず、ヒトVEGF-B186の例示的配列が、NCBI参照配列:NP_003368.1に、NCBIタンパク質受託番号NP_003368、P49765及びAAL79001に、並びに配列番号1に示されている。本開示との関連では、VEGF-B186の配列は、(例えば配列番号1のアミノ酸1〜21に示されているような)21個のアミノ酸のN末端シグナル配列を欠くことができる。命名のみを目的として限定を目的とせず、ヒトVEGF-B167の例示的配列が、NCBI参照配列:NP_001230662.1に、NCBIタンパク質受託番号AAL79000及びAAB06274に、並びに配列番号2に示されている。本開示との関連では、VEGF-B167の配列は、(例えば配列番号2のアミノ酸1〜21に示されているような)21個のアミノ酸のN末端シグナル配列を欠くことができる。VEGF-Bの追加の配列を、本明細書及び/若しくは公開されているデータベースに記載されている配列を使用して決定することができる、並びに/又は{例えば、Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂を含む)若しくはSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されているような}標準的な技法を使用して決定することができる。ヒトVEGF-Bへの言及をhVEGF-Bと省略することができる。一例では、本明細書でのVEGF-Bへの言及はVEGF-B167アイソフォームへの言及である。
【００７２】
本明細書でのVEGF-Bへの言及はまた、WO2006/012688に記載されているようなVEGF-B10-108ペプチドも包含する。
【００７３】
用語「腎症」は、腎臓の損傷又は疾患を意味すると理解されるものとする。この用語は、腎線維症及び/又は糸球体疾患(例えば、糸球体硬化症、糸球体腎炎)及び/又は慢性腎機能不全をもたらし得る並びに末期の腎疾患及び/又は腎不全を引き起こし得る腎臓での全ての臨床病理変化を包含する。例示的な腎症として、高血圧性腎症、糖尿病性腎症及びその他の種類の腎症、例えば鎮痛薬性腎症、免疫介在性糸球体症(例えば、IgA腎症又はベルガー病、ループス腎炎)、虚血性腎症、HIV関連腎症、膜性腎症、糸球体腎症、糸球体硬化症、造影剤誘発性腎症、中毒性腎症、鎮痛剤誘発性の腎毒性、シスプラチン腎症、移植腎症、並びにその他の形態の糸球体の異常又は損傷、即ち糸球体の毛細血管の損傷(尿細管線維症)が挙げられる。いくつかの例では、用語「腎症(nephropathy)」又は「腎症(nephropathies)」は、対象の尿中にアルブミン等のタンパク質が存在する(即ちタンパク尿)及び/又は腎機能不全が存在する障害又は疾患を特に意味する。腎症は、尿中でのアルブミンの存在(微量アルブミン尿症若しくは顕性アルブミン尿症)、血中尿素窒素濃度の増加(例えば20mg/dLを超える濃度)、並びに/又は血清中クレアチニン濃度の増加(例えば雄の場合1.3mg/dLを超える濃度及び雌の場合1.1mg/dLを超える濃度)に基づいて診断されることが多い。
【００７４】
用語「線維症」は、線維組織の異常なプロセシング又は類線維腫又は線維性変性を意味する。線維症は様々な損傷又は疾患に起因し得る。線維症は典型的には、例えばコラーゲン及びフィブロネクチンの過剰産生及び沈着の増加等の、細胞外基質成分の異常な産生、蓄積又は沈着を伴う。本明細書で使用する場合、用語「腎線維症(kidney fibrosis)」又は「腎線維症(renal fibrosis)」又は「腎臓の線維症」は、腎機能の低下又は機能的障害に至る、細胞外基質成分、特にコラーゲンの過剰産生及び異常沈着を伴う疾患又は障害を意味する。
【００７５】
用語「腎炎」は腎臓の炎症を意味すると理解されたい。本開示との関連では、腎炎は、腎臓の炎症を特徴とする腎症の一部を包含する。この炎症は、糸球体、尿細管、又は糸球体及び尿細管を囲む間質組織に影響を及ぼす可能性がある。一般に、腎炎は、糸球体腎炎(即ち、糸球体の炎症)又は間質性腎炎(即ち、尿細管同士の間の間質腔の炎症)のいずれかである。
【００７６】
用語「糸球体腎炎」はあるクラスの腎疾患を包含し、このクラスの腎疾患を増殖性疾患及び非増殖性疾患のサブクラスに分類することができる。示した名称の通り、「増殖性」疾患は、糸球体中の細胞の数が有意に増加する糸球体腎炎の形態を含み、「非増殖性」疾患は、そのような細胞の数の増加が存在しない糸球体腎炎の形態を含む。例示的な増殖性疾患として、IgA腎症、感染後糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎及び急速進行性糸球体腎炎が挙げられる。例示的な非増殖性疾患として、微小変化型疾患、単状糸球体硬化症、菲薄基底膜疾患(think basement membrane disease)及び膜性糸球体腎炎が挙げられる。
【００７７】
「糖尿病性腎症」は、タンパク尿症、高血圧、浮腫及び腎機能不全を特徴とする、臨床的に明確に定義されている病理である。糖尿病性腎症の特徴的な態様として、糸球体硬化症、血管構造の変化、及び尿細管間質性疾患が挙げられる。糖尿病性腎症の最初の臨床的証拠は、尿中でのアルブミン尿症の存在、例えば微量アルブミン尿症又は顕性アルブミン尿症の存在であることが多い。糖尿病性腎症は典型的には下記を特徴とする:1)糸球体硬化症、2)主に小さい細動脈での血管構造の変化、及び3)尿細管間質性疾患。糖尿病性腎症の最も特徴的な態様は、メサンギウムの増殖により検出可能な及び基底膜の肥大により検出可能な糸球体損傷であり、この糸球体損傷は糸球体全体のびまん性瘢痕化(diffuse cicatrisation)のように見えることが多い。糖尿病性腎症の最初の臨床的証拠は、アルブミン尿症又はタンパク尿症の存在である。
【００７８】
「微量アルブミン尿症」は、24時間の採尿当たり30〜300mgのアルブミン及び/又は単一サンプル中における30〜300mg/Lのアルブミンの存在を意味する。一般に、上述したものの両方が2から3ヶ月の期間にわたり3個のサンプルのうちの少なくも2個で測定されるべきである。微量アルブミン尿症を、雌の場合は≧3.5mg/mmol若しくは雄の場合は≧2.5mg/mmolのアルブミン対クレアチニンの比(ACR)、又は1mgのクレアチニン当たり30〜300μgのアルブミンにより定義することもできる。例えば市販の(例えば指示薬としてブロモフェノールブルーを含む)尿試験紙を使用してアルブミン濃度を評価することができる。
【００７９】
用語「顕性アルブミン尿症」は、微量アルブミン尿症での観測よりも高いアルブミンの量(又は高いACR)の存在を意味する。
【００８０】
用語「タンパク質尿症」は、尿中の全タンパク質の量が約≧30mg/dLであること、又は45mg/mmolを超えるタンパク質/クレアチニン比を意味する。
【００８１】
「高血圧」は、収縮期圧が140mmHg以上である及び/又は拡張期圧が90mmHg以上である対象(例えばヒト対象)を意味する。本明細書に記載した方法又は使用のいくつかの例では、対象は前高血圧であり、例えば収縮期圧が約120〜139mmHg以上である及び/又は拡張期圧が80〜89mmHg以上である前高血圧である。
【００８２】
用語「組換え体」は、人工的な遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるものとする。従って、抗体可変領域を含む組換えタンパク質との関連では、この用語は、B細胞成熟中に生じる天然の組換えの産物である、対象の身体内で天然に生じる抗体を包含しない。しかしながら、そのような抗体が単離される場合、抗体可変領域を含む単離タンパク質であると考えなければならない。同様に、このタンパク質をコードする核酸が単離されて組換え手段により発現される場合、結果として生じるタンパク質は、抗体可変領域を含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質はまた、人工的な組換え手段により発現されたタンパク質が、例えばこのタンパク質が発現される細胞、組織又は対象内である場合には、このタンパク質も包含する。
【００８３】
用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、即ちペプチド結合で連結されている一連の連続したアミノ酸又は互いに共有的に若しくは非共有的に連結されている一連のポリペプチド鎖(即ちポリペプチド複合体)を含むと解釈されるものとする。例えば、この一連のポリペプチド鎖を適切な化学結合又はジスルフィド結合を使用して共有的に連結させることができる。非共有結合の例として、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用が挙げられる。
【００８４】
用語「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」はペプチド結合により連結されている一連の連続したアミノ酸を意味すると上述の段落から理解することができる。
【００８５】
「抗体」は複数のポリペプチド鎖で構成されている可変領域を含むタンパク質であり、例えば、軽鎖可変領域(VL)を含むポリペプチド及び重鎖可変領域(VH)を含むポリペプチドであると一般に考えられていることは、当業者であれば認識しているはずである。抗体は一般に定常ドメインも含み、そのいくつかが配置されると定常領域となり得る。定常領域は、重鎖の場合には定常断片又は結晶性断片(Fc)を含む。VH及びVLは相互作用し、1種又は数種の密接に関連する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むFvを形成する。一般に、哺乳動物からの軽鎖はκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかであり、哺乳動物からの重鎖はα、δ、ε、γ又はμである。抗体は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであり得る。用語「抗体」はまた、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、シンヒト化抗体及びキメラ抗体も包含する。
【００８６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」又は「全抗体」は、抗体の抗原結合断片とは対照的に、実質的にインタクトな形態での抗体を意味するために互換的に使用される。具体的には、全抗体として、Fc領域を含む重鎖及び軽鎖を有する抗体が挙げられる。定常ドメインは、野生型配列の定常ドメイン(例えばヒト野生型配列の定常ドメイン)又はこのアミノ酸配列バリアントであってよい。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「可変領域」は、本明細書で定義したような抗体の軽鎖及び/又は重鎖における、抗原に特異的に結合することができる部分を意味しており、この「可変領域」として、相補性決定領域(CDR)(即ちCDRl、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列が挙げられる。例示的な可変領域は、3種のCDRと共に3種又は4種のFR(例えば、FR1、FR2、FR3及び任意選択でFR4)を含む。IgNARに由来するタンパク質の場合、このタンパク質はCDR2を欠いている場合がある。VHは重鎖の可変領域を意味する。VLは軽鎖の可変領域を意味する。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「相補性決定領域」(同義語CDR、即ちCDR1、CDR2及びCDR3)は、存在が抗原結合に不可欠な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、CDR1、CDR2及びCDR3と同定された3種のCDR領域を典型的には有する。本開示の実施では、CDR及びFRに割り当てられるアミノ酸の位置を、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda, Md.、1987及び1991又はその他のナンバリングシステム、例えばChothia及びLesk J. Mol Biol. 196: 901〜917、1987、Chothia他、Nature 342、877〜883、1989及び/若しくはAl-Lazikani他、J Mol Biol 273: 927〜948、1997の標準的なナンバリングシステム、Lefranc他、Devel. And Compar. Immunol.、27: 55〜77、2003のIMGTナンバリングシステム、又はHonnegher及びPlukthun J. Mol. Biol.、309: 657〜670、2001のAHOナンバリングシステムに従って定義することができる。
【００８９】
「フレームワーク領域](FR)は、CDR残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「Fv」は、複数のポリペプチドで構成されるか又は単一のポリペプチドで構成されるかにかかわらず、VL及びVHが会合して抗原結合部位を有する複合体を形成する、即ち抗原に特異的に結合することができるあらゆるタンパク質を意味すると解釈されるものとする。抗原結合部位を形成するVH及びVLは、単一のポリペプチド鎖中にあることができる、又は異なるポリペプチド鎖中にあることができる。更に、本開示のFv(及び本開示のあらゆるタンパク質)は、同一の抗原に結合してもよいし結合しなくてもよい複数の抗原結合部位を有することができる。この用語は、抗体に直接由来する断片、並びに組換え手段を使用して作製された、そのような断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。いくつかの例では、VHは重鎖定常ドメイン(CH)1に連結されていない、及び/又はVLは軽鎖定常ドメイン(CL)に連結されていない。ポリペプチド又はタンパク質を含む例示的なFvとして、Fab断片、Fab'断片、F(ab')断片、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはより高次な複合体、又は定常領域若しくはこれらのドメイン、例えばCH2ドメイン若しくはCH3ドメインに連結されている上述の内いずれか、例えばミニボディが挙げられる。「Fab断片」は抗体の一価の抗原結合断片から成り、酵素パパインによる全抗体の消化によってインタクトな軽鎖と重鎖のある部分とから成る断片を得ることにより製造され得る、又は組換え手段を使用して製造され得る。全抗体をペプシンで処理した後に還元してインタクトな軽鎖と重鎖のVH及び単一の定常ドメインを含む部分とから成る分子を得ることにより、抗体の「Fab'断片」を得ることができる。この方法で処理した1個の抗体当たり2個のFab'断片が得られる。Fab'断片を組換え手段により製造することもできる。抗体の「F(ab')2断片」は、2個のジスルフィド結合により一緒に保持される2個のFab断片の二量体から成り、全抗体分子を酵素ペプシンで処理し、その後に還元することなく得られる。「Fab2」断片は、例えばロイシンジッパー又はCH3ドメインを使用して連結されている2個のFab断片を含む組換え断片である。「単鎖Fv」又は「scFv」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が適切で柔軟な
ポリペプチドリンカーにより共有的に連結されている抗体の可変領域断片(Fv)を含む組換え分子である。
【００９１】
本明細書で使用する場合、タンパク質又はこの抗原結合部位と抗原との相互作用に関する用語「結合する」は、この相互作用が抗原上の特定の構造(例えば抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識してこのタンパク質構造に結合する。抗体がエピトープ「A」に結合する場合、標識された「A」及びこのタンパク質を含む反応において、エピトープ「A」を含む分子(又は遊離した未標識の「A」)の存在により、抗体に結合する標識された「A」の量は低減される。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する(specifically bind)」又は「特異的に結合する(bind specifically)」は、本開示のタンパク質が、代替の抗原又は細胞の場合と比べて頻繁に、急速に、長い持続時間で及び/又は高い親和性で、特定の抗原又はこの抗原を発現する細胞と反応する又は/会合することを意味すると解釈されるものとする。例えば、タンパク質は、その他の増殖因子(例えばVEGF-A)、又は多反応性の天然抗体により(即ち、ヒトで天然に見出される様々な抗原に結合することが知られている、天然に存在する抗体により)一般に認識される抗原の場合と比べて著しく大きい親和性(例えば、20倍若しくは40倍若しくは60倍若しくは80倍から100倍若しくは150倍若しくは200倍)でVEGF-Bに結合する。一般に、しかし必ずしもそうではないが、結合への言及は特定の結合を意味しており、各用語はその他の用語に対して明確な支持を与えると理解されるものとする。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「中和する」は、タンパク質がVEGF-R1を介して細胞中でVEGF-Bシグナル伝達を阻止することができる、低減させることができる又は防ぐことができること意味すると解釈されるものとする。中和を測定する方法は当分野で既知である、及び/又は本明細書に記載されている。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「VEGF-Bシグナル伝達を特異的に阻害する」は、化合物がVEGF-Bシグナル伝達を阻害するが1種又は複数種のその他のVEGFタンパク質、例えばVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及び/又はPIGFによるシグナル伝達を有意には又は検出可能な程度には阻害しないことを意味すると理解される。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「有意には阻害しない」は、本明細書に記載した化合物の存在下でのVEGF-B以外のVEGFタンパク質によるシグナル伝達(例えば、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及び/又はPIGFによるシグナル伝達)の阻害の程度が、(例えばアイソタイプ対照抗体の存在下で行うことができる対照アッセイでの)本明細書に記載した化合物の非存在下の場合と比べて統計的に有意に低くないことを意味すると理解されるものとする。
【００９６】
本明細書で使用する場合、用語「検出可能な程度には阻害しない」は、本明細書に記載したような化合物が、(例えばアイソタイプの対照抗体の存在下で行うことができる対照アッセイでの)本明細書に記載した化合物の非存在下で検出したシグナル伝達の程度の10%以下又は8%以下又は6%以下又は5%以下又は4%以下又は3%以下又は2%以下又は1%以下で、VEGF-B以外のVEGFタンパク質によるシグナル伝達(例えば、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及び/又はPIGFによるシグナル伝達)を阻害することを意味すると理解されるものとする。
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「予防すること」、「予防する」又は「予防」は、本開示の化合物を投与し、それにより病気の少なくとも1種の症状の発症を止める又は妨げることを含む。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」、「処置する」又は「処置」は、本明細書に記載のタンパク質を投与し、それにより特定の疾患又は病気の少なくとも1種の症状を軽減させる若しくは取り除くこと、又は疾患若しくは病気の進行を遅延させることを含む。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトを含むあらゆる動物、例えば哺乳動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象としてヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、対象はヒトである。
【０１００】
腎症の処置
本明細書の開示は、例えば、対象の腎症を処置する又は予防する方法であって、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１０１】
一例では、この対象は糖尿病に罹患している。例えば、糖尿病に罹患している対象は、臨床的に認められている糖尿病のマーカー、例えば
・  7nmol/L以上の又は126mg/dl以上の空腹時血漿中グルコース、
・  糖尿病の症状を伴う11.1nmol/L以上の又は200mg/dl以上の(1日のうちの任意の時間で取得した)随時血漿中グルコース、
・  2時間のインターバルで測定した11.1nmol/L以上の又は200mg/dl以上の経口グルコース負荷試験(OGTT)値、このOGTTは2時間又は3時間の期間にわたり与えられる、
を有する。
【０１０２】
一例では、対象は1型糖尿病に罹患している。
【０１０３】
一例では、対象は2型糖尿病に罹患している。
【０１０４】
一例では、対象は糖尿病性腎症に罹患している。例えば、対象は、1型糖尿病を伴う腎症に罹患している。例えば、対象は、2型糖尿病を伴う腎症に罹患している。
【０１０５】
一例では、対象は糖尿病性腎症を発症するリスクがある。例えば、対象は、1型糖尿病を伴う腎症を発症するリスクがある。例えば、対象は、2型糖尿病を伴う腎症を発症するリスクがある。
【０１０６】
一例では、対象は微量アルブミン尿症に罹患している。この例に従って、本開示に係る処置は、微量アルブミン尿症を(例えば、24時間の採尿当たり約30mg未満のアルブミンまで及び/若しくは単一サンプル中における30mg/Lのアルブミンまで、並びに/又は雌の場合は3.5mg/mmol未満の若しくは雄の場合は2.5mg/mmol未満のACRまで、又は1mgのクレアチン当たり約30μg未満のアルブミンまで)軽減させることができる。
【０１０７】
別の例では、本開示に係る処置により、微量アルブミン尿症から顕性アルブミン尿症への進行が予防される、又は遅延される。
【０１０８】
一例では、対象は、例えばクレアチニンクレアランス比の低下(例えば90mL/分/1.73m2未満)により判定されるように、糸球体のろ過率の低下に罹患している。一例では、本開示の方法により糸球体のろ過率が高められる。
【０１０９】
更なる例では、対象は高血圧又は前高血圧に罹患している。一例では、本開示の方法は、対象の収縮期血圧及び/又は拡張期血圧を少なくとも1mmHg、2mmHg、3mmHg、4mmHg、5mmHg、6mmHg、7mmHg、8mmHg、9mmHg、10mmHg又はより多く低下させるのに効果的である。
【０１１０】
一例では、本開示の任意の例に従って本明細書に記載の方法を実施することにより、臨床反応が増大する、及び/又は疾患の進行が遅延される。
【０１１１】
「臨床反応」は疾患の症状の改善を意味する。ある程度の期間内で、例えば処置の開始から又は初回投与から約8週内で又は約8週で臨床反応を達成することができる。一定期間にわたり、例えば>24週又は≧48週にわたり、臨床反応を持続させることもできる。
【０１１２】
腎機能及び腎機能障害のパラメータの定量的評価は当分野で公知であり、例えばLevey(Am J Kidney Dis. 22(1):207〜214、1993)中に見出され得る。腎機能/腎機能障害の測定用のアッセイの例は、血清中クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス比、システインCクリアランス比、24時間尿中クレアチニンクリアランス、24時間尿中タンパク質分泌、糸球体ろ過率(GFR)、尿中アルブミンクレアチニン比(ACR)、アルブミン排泄率(AER)及び腎生検である。
【０１１３】
VEGF-Bシグナル伝達阻害剤
抗体可変領域を含むタンパク質
例示的なVEGF-Bシグナル伝達阻害剤は例えば抗体可変領域を含み、VEGF-Bに結合してVEGF-Bシグナル伝達を中和する抗体又は抗体断片である。
【０１１４】
一例では、この抗体可変領域はVEGF-Bに特異的に結合する。
【０１１５】
好適な抗体及びこの可変領域を含むタンパク質は当分野で既知である。
【０１１６】
例えば、抗VEGF-B抗体及びこの断片はWO2006/012688に記載されている。
【０１１７】
一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、VEGF-B又はこの抗原結合断片への2H10の結合を競合的に阻害する抗体である。一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、抗体2H10、又はこのキメラ型、CDR移植型若しくはヒト化型又はこの抗原結合断片である。これについては、抗体2H10は、配列番号3に記載した配列を含むVHと配列番号4に記載した配列を含むVLとを含む。この抗体の例示的なキメラ型及びヒト化型はWO2006/012688に記載されている。
【０１１８】
一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、配列番号5に記載した配列を含むVHと配列番号6に記載した配列を含むVLとを含む。
【０１１９】
一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、VEGF-B又はこの抗原結合断片への4E12の結合を競合的に阻害する抗体である。一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、抗体4E12、又はこのキメラ型、CDR移植型若しくはヒト化型又はこの抗原結合断片である。ただし、抗体4E12は、配列番号7に記載した配列を含むVHと配列番号8に記載した配列を含むVLとを含む。
【０１２０】
一例では、この化合物は、抗体4E12のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、このタンパク質は、抗体4E12のVH及び/又はVLの相補性決定領域(CDR)を含む可変領域を含む。例えば、このタンパク質は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号7のアミノ酸25〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号7のアミノ酸49〜65に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号7のアミノ酸98〜105に記載した配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号8のアミノ酸24〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号8のアミノ酸50〜56に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号8のアミノ酸89〜97に記載した配列を含むCDR3
を含む。
【０１２１】
一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、VEGF-B又はこの抗原結合断片への2F5の結合を競合的に阻害する抗体である。一例では、この抗VEGF-B抗体又はこの断片は、抗体2F5、又はこのキメラ型、CDR移植型若しくはヒト化型又はこの抗原結合断片である。ただし、抗体2F5は、配列番号9に記載した配列を含むVHと配列番号10に記載した配列を含むVLとを含む。
【０１２２】
一例では、この化合物は、抗体2F5のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、このタンパク質は、抗体2F5のVH及び/又はVLの相補性決定領域(CDR)を含む可変領域を含む。例えば、このタンパク質は、
(i)下記を含むVH:
(a)配列番号9のアミノ酸25〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号9のアミノ酸49〜65に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号9のアミノ酸98〜107に記載した配列を含むCDR3、
並びに/又は
(ii)下記を含むVL:
(a)配列番号10のアミノ酸24〜34に記載した配列を含むCDR1、
(b)配列番号10のアミノ酸50〜56に記載した配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号10のアミノ酸89〜96に記載した配列を含むCDR3
を含む。
【０１２３】
別の例では、抗体又はこの可変領域を含むタンパク質を、標準的な方法、例えば当分野で既知である又は本明細書で簡潔に記載した標準的な方法を使用して製造する。
【０１２４】
免疫化をベースとする方法
抗体を生成するために、任意の好適な又は所望のアジュバント及び/又は薬学的に許容される担体と任意選択で配合されているVEGF-B又はこの断片若しくは一部を有するエピトープ又はこれらの改変形態又はこれらをコードする核酸(免疫原)を、注入用組成物の形態で対象(例えば非ヒト動物対象、例えばマウス、ラット、ニワトリ等)に投与する。例示的な非ヒト動物は、ネズミ科の動物(例えばラット又はマウス)等の哺乳動物である。注入は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内又はその他の既知の経路であってよい。任意選択で免疫原を何度も投与する。抗体を調製するための手段及び抗体の特徴を明らかにするための手段は当分野で既知である(例えばAntibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい)。マウス中で抗VEGF-B抗体を産生する方法はWO2006/012688に記載されている。
【０１２５】
免疫化後の様々な時点で免疫化動物の血液をサンプリングすることにより、ポリクローナル抗体の製造をモニタリングすることができる。所望の抗体力価を達成することが必要な場合には、別のブースター注入を施すことができる。適切な力価が達成されるまで、追加免疫及び力価測定の工程を繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られると、免疫化動物から採血し、血清を単離して貯蔵する、及び/又は動物をモノクローナル抗体(mAb)の生成に使用する。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、本開示で考慮される例示的な抗体である。一般に、モノクローナル抗体の製造は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で対象(例えば齧歯動物、例えばマウス又はラット)を免疫原で免疫化する工程を含む。いくつかの例では、(例えばPCT/US2007/008231及び/又はLonberg他、Nature 368 (1994): 856〜859に記載されているように)ヒト抗体を発現してネズミ抗体タンパク質を発現しないように遺伝子操作されているマウスを免疫化して抗体を製造する。免疫化後、抗体を産生する体細胞(例えばBリンパ球)を、不死化細胞、例えば不死化骨髄腫細胞と融合させる。そのような融合細胞(ハイブリドーマ)を製造する様々な方法が当分野で既知であり、例えばKohler及びMilstein、Nature 256、495〜497、1975に記載されている。次いで、ハイブリドーマ細胞を抗体産生に十分な条件下で培養する。
【０１２７】
本開示は、抗体を製造するその他の方法、例えば、(例えばLargaespada他、Curr. Top. Microbiol. Immunol、166、91〜96. 1990に記載されている)ABL-MYC技法を考慮する。
【０１２８】
ライブラリをベースとする方法
本開示はまた、抗体又はこの抗原結合ドメインを含む(例えばこの可変領域を含む)タンパク質のライブラリをスクリーニングして、VEGF-B結合抗体又はこの可変領域を含むタンパク質を同定することも包含する。
【０１２９】
本開示で考慮されるライブラリの例として、(未負荷対象からの)naiveライブラリ、(抗原で免疫化した対象からの)免疫化ライブラリ又は合成ライブラリが挙げられる。抗体又はこの領域(例えば可変領域)をコードする核酸を、(例えば、Sambrook及びRussell編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001に開示されているような)従来技法によりクローニングし、この核酸を使用して、当分野で既知の方法を使用してタンパク質をコードする、及び提示する。タンパク質のライブラリを製造するその他の技法は、例えばUS6300064(例えばMorphosys AGのHuCALライブラリ)、US5885793、US6204023、US6291158又はUS6248516に記載されている。
【０１３０】
本開示に係るタンパク質は、可溶性の分泌タンパク質であってよい、又は細胞の表面上の融合タンパク質又は粒子(例えば、ファージ若しくはその他のウイルス、リボソーム若しくは胞子)として提示され得る。当分野では、様々な提示ライブラリフォーマットが既知である。例えば、このライブラリは、インビトロ提示ライブラリ{例えば、例えばUS7270969に記載されているような、リボソーム提示ライブラリ、共有結合提示ライブラリ(covalent display library)又はmRNA提示ライブラリ}である。更に別の例では、この提示ライブラリは、例えばUS6300064、US5885793、US6204023、US6291158又はUS6248516に記載されているような、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質がファージ上で発現されるファージ提示ライブラリである。当分野ではその他のファージ提示法が既知であり、本開示で考慮される。同様に、例えばUS5516637に記載されているような細菌提示ライブラリ、例えばUS6423538に記載されているような酵母提示ライブラリ、又は哺乳動物提示ライブラリ等の細胞提示の方法が本開示で考慮される。
【０１３１】
提示ライブラリをスクリーニングする方法が当分野で既知である。一例では、例えばScopes(In: Protein purification: principles and practice、第3版、Springer Verlag、1994)に記載されているような親和性精製を使用して、本開示の提示ライブラリをスクリーニングする。親和性精製の方法は典型的には、ライブラリにより提示される抗原結合ドメインを含むタンパク質と標的抗原(例えばVEGF-B)とを接触させる工程、続いて洗浄する工程、抗原に結合している、残留するこれらのドメインを溶出させる工程を含む。
【０１３２】
スクリーニングにより同定された任意の可変領域又はscFvは、必要に応じて完全抗体へと容易に改変される。可変領域又はscFvを完全抗体へと改変する又は再構成する例示的な方法は、例えばJones他、J Immunol Methods. 354:85〜90、2010又はJostock他、J Immunol Methods、289:65〜80、2004に記載されている。或いは又は加えて、例えば、Ausubel他(In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience、ISBN 047 150338、1987)及び/又はSambrook他(In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、第3版、2001)に記載されているように、標準的なクローニング方法を使用する。
【０１３３】
脱免疫化タンパク質、キメラタンパク質、ヒト化タンパク質、シンヒト化タンパク質、霊長類化タンパク質及びヒトタンパク質
本開示のタンパク質はヒト化タンパク質であってよい。
【０１３４】
用語「ヒト化タンパク質」はヒト様可変領域を含むタンパク質を意味すると理解すべきであり、このヒト様可変領域として、ヒト抗体からのFR上に移植された又はこのFR中に挿入された非ヒト種(例えば、マウス若しくはラット若しくは非ヒト霊長類)からの抗体(このタイプの抗体は「CDR移植抗体」とも称される)からのCDRが挙げられる。ヒト化タンパク質として、ヒトタンパク質の1個又は複数個の残基が1個又は複数個のアミノ酸置換により改変されている及び/又はヒトタンパク質の1個又は複数個のFR残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられているタンパク質も挙げられる。ヒト化タンパク質はまた、ヒト抗体又は非ヒト抗体のいずれにも見出されない残基を含むこともできる。このタンパク質の任意の更なる領域(例えばFc領域)は一般にヒトである。当分野で既知の方法、例えばUS5225539、US6054297、US7566771又はUS5585089の方法を使用して、ヒト化を実施することができる。用語「ヒト化タンパク質」はまた、例えばUS7732578に記載されているようなスーパーヒト化タンパク質も包含する。
【０１３５】
本開示のタンパク質はヒトタンパク質であってよい。用語「ヒトタンパク質」は本明細書で使用する場合、ヒトで、例えばヒト生殖細胞系で若しくは体細胞中で見出される、可変抗体領域及び任意選択で定常抗体領域を有するタンパク質、又はそのような領域を使用して製造したライブラリからのタンパク質を意味する。「ヒト」抗体は、ヒト配列でコードされていないアミノ酸残基、例えばインビトロでのランダム変異又は部位指定変異により導入される変異(特に、タンパク質の少数の残基における、例えばタンパク質の1個、2個、3個、4個又は5個の残基における保存的な置換又は変異を伴う変異)を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は必ずしもヒトの免疫反応の結果として生成される必要はなく、むしろ、これらのヒト抗体を、組換え手段(例えば、ファージ提示ライブラリのスクリーニング)を使用して、及び/又はヒト抗体の定常領域及び/又は可変領域をコードする核酸を含む遺伝子導入動物(例えばマウス)により、及び/又は(例えばUS5565332に記載されているような)誘導選択を使用して生成することができる。この用語は、そのような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒトタンパク質は、ヒト抗体からのFR又はヒトFRのコンセンサス配列からの配列を含むFRを含むタンパク質であって、例えばUS6300064及び/又はUS6248516に記載されているような1個又は複数個のCDRがランダム又はセミランダムであるタンパク質を含むとみなすこともできる。
【０１３６】
本開示のタンパク質はシンヒト化タンパク質であってよい。用語「シンヒト化タンパク質」は、WO2007/019620に記載されている方法により調製されたタンパク質を意味する。シンヒト化タンパク質は、抗体の可変領域であって、新世界霊長類の抗体可変領域からのFRと非新世界霊長類の抗体可変領域からのCDRとを含む可変領域を含む。例えば、シンヒト化タンパク質は、新世界霊長類の抗体可変領域からのFRとマウス又はラットの抗体からのCDRとを含む、抗体の可変領域を含む。
【０１３７】
本開示のタンパク質は霊長類化タンパク質であってよい。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)の免疫化後に生成された抗体からの可変領域を含む。任意選択で、非ヒト霊長類抗体の可変領域をヒト定常領域に連結させて霊長類化抗体を製造する。霊長類化抗体を製造する例示的な方法はUS6113898に記載されている。
【０１３８】
一例では、本開示のタンパク質はキメラタンパク質である。用語「キメラタンパク質」は、抗原結合ドメインが特定の種(例えば、マウス若しくはラット等のネズミ)に由来する又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属するが、タンパク質の残部が別の種(例えばヒト若しくは非ヒト霊長類等)に由来するタンパク質に由来する又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属するタンパク質を意味する。一例では、キメラタンパク質は、非ヒト抗体(例えばネズミ抗体)からのVH及び/又はVLを含むキメラ抗体であり、この抗体の残部領域はヒト抗体に由来する。そのようなキメラ抗体の製造は当分野で既知であり、(例えばUS6331415、US5807715、US4816567及びUS4816397に記載されているような)標準的な手段により達成され得る。
【０１３９】
本開示はまた、例えばWO2000/34317及びWO2004/108158に記載されているような脱免疫化タンパク質も考慮する。脱免疫化した抗体及びタンパク質は1種又は複数種のエピトープ、例えばB細胞エピトープ又はT細胞エピトープが除去されており(即ち変異しており)、それにより、この抗体又はタンパク質に対する免疫反応を対象が上昇させるであろう可能性を低下させる。
【０１４０】
抗体可変領域を含むその他のタンパク質
本開示はまた、抗体の可変領域又は抗原結合ドメインを含むその他のタンパク質、例えば
(i)抗体のVH又はVLの全て又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である単一ドメイン抗体(例えばUS6248516を参照されたい)、
(ii)例えばUS5844094及び/又はUS2008152586に記載されているようなダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、
(iii)例えばUS5260203に記載されているようなscFv、
(iv)例えばUS5837821に記載されているようなミニボディ、
(v)US5731168に記載されているような「鍵及び鍵穴(key and hole)」二重特異性タンパク質、
(vi)例えばUS4676980に記載されているようなヘテロ結合タンパク質、
(vii)例えばUS4676980に記載されているような化学架橋剤を使用して製造したヘテロ結合タンパク質、
(viii)例えばShalaby他、J. Exp. Med.、175: 217〜225、1992に記載されているようなFab'-SH断片、又は
(ix)(例えばEP19930302894に記載されているような)Fab3
も考慮する。
【０１４１】
定常ドメインの融合
本開示は、抗体の可変領域と定常領域又はFc又はそのドメイン、例えばCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインとを含むタンパク質を包含する。好適な定常領域及び/又は定常ドメインは当業者に明らかであるだろう、及び/又はそのようなポリペプチドの配列は公的に利用可能なデータベースから容易に入手可能である。Kabat他は、いくつかの好適な定常領域/定常ドメインの説明も行っている。
【０１４２】
この定常領域及び/又は定常ドメインは、生物学的活性、例えば二量化、例えばFcRn(新生児のFc受容体)への結合による血清の半減期の延長、抗原依存性細胞傷害(ADCC)、相補体依存性細胞傷害(CDC)、抗原依存性細胞貪食(ADCP)の付与に有用である。
【０１４３】
本開示はまた、例えばUS7217797、US7217798又はUS20090041770(半減期が増加している)又はUS2005037000(増加したADCC)に記載されているような変異定常領域又は変異定常ドメインを含むタンパク質も考慮する。
【０１４４】
安定化したタンパク質
本開示の中和タンパク質は、IgG4定常領域又は安定化したIgG4定常領域を含むことができる。用語「安定化したIgG4定常領域」は、Fabアーム交換若しくはFabアーム交換を受ける傾向又は半抗体の形成若しくは半抗体を形成する傾向を低減するように改変されているIgG4定常領域を意味すると理解することができる。「Fabアーム交換」は、IgG4重鎖及び結合した軽鎖(半分子)が別のIgG4分子からの重鎖-軽鎖対と交換される、ヒトIgG4のタンパク質改変の一種を意味する。そのため、IgG4分子は、(結果として二重特異性分子を生じる)2種の別々の抗原を認識する2種の別々のFabアームを獲得することができる。Fabアーム交換はインビボで自然に起こり、精製した血液細胞又は還元グルタチオン等の還元剤によりインビトロで誘発され得る。「半抗体」は、IgG4抗体が解離して単一の重鎖及び単一の軽鎖をそれぞれ含む2種の分子が形成される場合に生じる。
【０１４５】
一例では、安定化したIgG4定常領域は、Kabatのシステムに従ったヒンジ領域の241位でプロリンを含む(Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、1987及び/又は1991)。この位置は、EUナンバリングシステムに従ったヒンジ領域の228位に相当する(Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、2001及びEdelman他、Proc. Natl. Acad. USA、63、78〜85、1969)。ヒトIgG4では、この残基は一般にセリンである。セリンのプロリンへの置換後に、IgG4ヒンジ領域は配列CPPCを含む。これに関して、当業者は、この「ヒンジ領域」が、抗体の2本のFabアーム上で可動性を付与するFc領域及びFab領域を連結する抗体の重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であることを認識しているだろう。このヒンジ領域は、重鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それは一般に、Kabatのナンバリングシステムに従って、ヒトIgG1のGlu226からPro243までの伸長として定義される。その他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のジスルフィド(S-S)結合を形成する最初の及び最後のシステイン残基が同じ位置にくるようにすることにより、IgG1配列とアライメントされ得る(例えばWO2010/080538を参照されたい)。
【０１４６】
追加のタンパク質に基づくVEGF-Bシグナル伝達阻害剤
VEGF-Bとその受容体との、シグナルを生ずる相互作用(productive interaction)を妨げることができるその他のタンパク質として、変異体VEGF-Bタンパク質が挙げられる。
【０１４７】
一例では、この阻害剤は、VEGF-Bに結合する(及び例えばVEGF-Aには実質的に結合しない)VEGF-R1の1種又は複数種のドメインを含む可溶性タンパク質である。一例では、この可溶性タンパク質は、IgG1抗体等の抗体の定常領域を更に含む。例えば、この可溶性タンパク質は、Fc領域と、任意選択でIgG1抗体等の抗体のヒンジ領域とを更に含む。
【０１４８】
一例では、このタンパク質阻害剤は抗体模倣物であり、例えば、抗体に類似する形で標的タンパク質に結合する可変領域を含むタンパク質骨格である。下記に例示的な抗体模倣物を説明する。
【０１４９】
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の化合物の一例は、T細胞受容体等の免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質又は重鎖免疫グロブリン(例えば、IgNAR、ラクダ抗体)である。
【０１５０】
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、この重鎖免疫グロブリンが重鎖を含むが軽鎖を含まないという点で、多くのその他の形態の免疫グロブリン(例えば抗体)とは構造的に異なる。従って、これらの免疫グロブリンは「重鎖のみの抗体」とも称される。重鎖免疫グロブリンは例えばラクダ類及び軟骨魚類で見出される(IgNARとも呼ばれる)。
【０１５１】
自然に生じる重鎖免疫グロブリン中に存在する可変領域は一般に、この可変領域を、従来の4本鎖抗体中に存在する重鎖可変領域(「VHドメイン」と称される)及び従来の4本鎖抗体中に存在する軽鎖可変領域(「VLドメイン」と称される)と区別するために、ラクダIgでは「VHHドメイン」と称され、IgNARではV-NARと称される。
【０１５２】
重鎖免疫グロブリンは、その対応する抗原に高い親和性で及び高い特異性で結合するのに軽鎖の存在を必要としない。このことは、発現が容易であり、一般に安定していて可溶性である単一ドメイン結合断片を、重鎖免疫グロブリンから派生させ得ることを意味する。
【０１５３】
ラクダ類に由来する重鎖免疫グロブリン及びこの可変領域の概要、並びにこれらの製造及び/又は単離及び/又は使用の方法は、特に下記の参考文献WO94/04678、WO97/49805及びWO97/49805に見出される。
【０１５４】
軟骨魚類に由来する重鎖免疫グロブリン及びこの可変領域の概要、並びにこれらの製造及び/又は単離及び/又は使用の方法は、特にWO2005/118629中に見出される。
【０１５５】
V様タンパク質
本開示の化合物の一例はT細胞受容体である。T細胞受容体は、組み合わさって抗体のFvモジュールに類似する構造になる2種のVドメインを有する。Novotny他、Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650、1991には、どのようにしてT細胞受容体の2種のVドメイン(アルファ及びベータと命名する)を融合させ、単鎖ポリペプチドとして発現させることができるかが記載されており、更に、表面残基を変更して、抗体scFvと類似する疎水性を直接低減する方法が記載されている。単鎖T細胞受容体、又は2種のV-アルファドメイン及びV-ベータドメインを含む多量体T細胞受容体の製造が記載されているその他の刊行物として、WO1999/045110又はWO2011/107595が挙げられる。
【０１５６】
抗原結合ドメインを含むその他の非抗体タンパク質として、V様ドメインを有するタンパク質が挙げられ、このタンパク質は一般に単量体である。そのようなV様ドメインを含むタンパク質の例として、CTLA-4、CD28及びICOSが挙げられる。WO1999/045110には、そのようなV様ドメインを含むタンパク質が更に開示されている。
【０１５７】
アドネクチン
一例では、本開示の化合物はアドネクチンである。アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を付与するように変更されているヒトフィブロネクチンの第10フィブロネクチンIII型(10Fn3)ドメインをベースとする。例えば、10Fn3ドメインのβ-サンドウィッチの一端での3個のループを、アドネクチンが抗原を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細に関してUS20080139791又はWO2005/056764を参照されたい。
【０１５８】
アンチカリン
更なる例では、本開示の化合物はアンチカリンである。アンチカリンはリポカリンに由来し、リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さい疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリである。リポカリンは、ある抗原に結合するように操作され得る円錐構造の開口端で複数のループを有する硬いβシート二次構造を有する。このように操作されたリポカリンは、アンチカリンとして知られている。アンチカリンの更なる説明に関してUS7250297B1又はUS20070224633を参照されたい。
【０１５９】
アフィボディ
更なる例では、本開示の化合物はアフィボディである。アフィボディは、抗原に結合するように操作され得る黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAのZドメイン(抗原結合ドメイン)に由来する骨格である。このZドメインは、約58個のアミノ酸の3本のヘリックスの束から成る。ライブラリは、表面残基のランダム化により生成されている。更なる詳細に関してEP1641818を参照されたい。
【０１６０】
アビマー
更なる例では、本開示の化合物はアビマーである。アビマーは、Aドメイン骨格ファミリに由来する多ドメインタンパク質である。約35個のアミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造を採用する。多様性は、Aドメインのファミリにより示される天然変異のシャッフルにより生じる。更なる詳細に関してWO2002088171を参照されたい。
【０１６１】
DARPin
更なる例では、本開示の化合物は、設計されたアンキリン反復タンパク質(Designed Ankyrin Repeat Protein)(DARPin)である。DARPinは、細胞骨格への完全な膜タンパク質の結合を媒介するタンパク質のファミリであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、2個のαヘリクス及びβターンから成る33残基のモチーフである。DARPinを、各反復の第1のαヘリクス及びβターン中の残基のランダム化により、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。DARPinの結合界面を、モジュールの数を増加させること(親和性成熟の方法)により増加させることができる。更なる詳細に関してUS20040132028を参照されたい。
【０１６２】
タンパク質の製造方法
組換え発現
組換えタンパク質の場合、このタンパク質をコードする核酸を発現ベクター中にクローニングすることができ、次いで、この発現ベクターを、宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、若しくは別の方法では抗体を産生しない骨髄腫細胞に遺伝子導入する。本開示のタンパク質の発現に使用する例示的な細胞は、CHO細胞、骨髄腫細胞又はHEK細胞である。これらの目的を達成するための分子クローニング技法は当分野で既知であり、例えばAusubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までの全ての改訂を含む)又はSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。多種多様なクローニング方法及びインビトロでの増幅方法が組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体の製造方法も当分野で既知である。US4816567又はUS5530101を参照されたい。
【０１６３】
単離後、この核酸を、更なるクローニング(DNAの増幅)用の又は無細胞系での若しくは細胞中での発現用の発現構築物又は発現ベクター中に、プロモーターに動作可能に連結される形で挿入する。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」はその最も広い文脈で解釈されるものとし、例えば発生による及び/又は外部からの刺激に反応して又は組織特異的な形で核酸の発現を変更する更なる制御エレメント(例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー)を有する又は有さない、TATAボックス又は開始エレメント等のゲノム遺伝子の転写制御配列(正確な転写開始に必要である)を含む。本文脈では、用語「プロモーター」はまた、動作可能に連結されている核酸の発現をもたらす、活性化する又は増強する組換え核酸、合成核酸、融合核酸又は誘導体を説明するためにも使用される。例示的なプロモーターは、1種又は複数種の特異的な制御エレメントの追加のコピーを含み、前記核酸の発現を更に増強することができる、並びに/又は前記核酸の空間的発現及び/若しくは時間的発現を変更することができる。
【０１６５】
本明細書で使用する場合、用語「動作可能に連結されている」は、核酸の発現がプロモーターにより制御されるように、核酸に対してプロモーターを位置付けることを意味する。
【０１６６】
細胞中での発現用の多くのベクターが利用可能である。ベクター成分として一般に、下記のうちの1つ又は複数が挙げられるがこれらに限定されない:シグナル配列、(例えば、本明細書に記載した情報に由来する)抗体をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。当業者は、抗体の発現に好適な配列を認識することができる。例示的なシグナル配列として、原核生物分泌シグナル(例えば、pelB、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp若しくは耐熱性エンテロトキシンII)、酵母分泌シグナル(例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー若しくは酸ホスファターゼリーダー)又は哺乳動物分泌シグナル(例えば、単純ヘルペスgDシグナル)が挙げられる。
【０１６７】
哺乳動物細胞中で活性である例示的なプロモーターとして、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV-IE)、ヒト伸長因子1-αプロモーター(EF1)、核内低分子RNAプロモーター(U1a及びU1b)、α-ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス40プロモーター(SV40)、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、アデノウイルス主要後期プロモーター、β-アクチンプロモーター、CMVエンハンサー/β-アクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター又はこれらの活性断片を含むハイブリッド制御エレメントが挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651)、ヒト胎児腎臓株(293細胞又は懸濁溶液培養物中での増殖用にサブクローニングされた293細胞)、仔ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10)又はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である。
【０１６８】
例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びS.ポンベ(S. pombe)を含む群から選択される酵母細胞等の酵母細胞中での発現に好適な典型的プロモーターとして、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター又はTEF1プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６９】
単離した核酸又はこの核酸を含む発現構築物を発現用の細胞に導入する手段は当業者に既知である。所与の細胞用に使用する技法は、既知の成功している技法に基づく。組換えDNAを細胞中に導入する手段として、マイクロインジェクション、DEAE-デキストランにより媒介される遺伝子導入、リポソームにより媒介される、例えばリポフェクタミン(Gibco社、米国、メリーランド州)及び/又はセルフェクチン(Gibco社、米国、メリーランド州)の使用により媒介される遺伝子導入、PEGにより媒介されるDNA取り込み、電気穿孔、及び例えば、特にDNA被覆タングステン又は金粒子(Agracetus社、米国、ウィスコンシン州)の使用によるマイクロ粒子衝撃が挙げられる。
【０１７０】
抗体の製造に使用する宿主細胞を、使用する細胞型に応じて様々な培地中で培養することができる。市販の培地、例えばHam's Fl0(Sigma社)、Minimal Essential Medium{(MEM)、Sigma社}、RPMl-1640(Sigma社)及びDulbecco's Modified Eagle's Medium{(DMEM)、Sigma社}が哺乳動物細胞の培養に適している。本明細書で論じたその他の細胞型を培養するための培地は当分野で既知である。
【０１７１】
タンパク質の精製
製造/発現後、本開示のタンパク質を、当分野で既知の方法を使用して精製する。そのような精製により、本開示のタンパク質は非特異的タンパク質、酸、脂質、炭水化物等を実質的に含まない。一例では、このタンパク質は、調製物中におけるタンパク質の約90%超(例えば95%、98%又は99%)が本開示のタンパク質である調製物として得られる。
【０１７２】
ペプチド精製の標準的方法を利用して本開示の単離タンパク質を得る。この標準的方法として、様々な高圧(又は高性能)液体クロマトグラフィー(HPLC)及び非HPLCポリペプチド単離プロトコル、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、相分離法、電気泳動分離、沈殿法、塩溶/塩析法、免疫クロマトグラフィー及び/又はその他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
一例では、親和性精製は、標識を含む融合タンパク質の単離に有用である。親和性クロマトグラフィーを使用してタンパク質を単離する方法は当分野で既知であり、例えばScopes(In: Protein purification: principles and practice、第3版、Springer Verlag、1994)に記載されている。例えば、標識(ポリヒスチジンタグの場合、標識は例えばニッケル-NTAであってよい)に結合する抗体又は化合物を固体支持体上に固定する。次いで、しばらくの間、結合が生じるのに十分な条件下で、この固定した抗体又は化合物に、タンパク質を含むサンプルを接触させる。洗浄して未結合の又は非特異的に結合したタンパク質を全て除去した後、タンパク質を溶出させる。
【０１７４】
抗体のFc領域を含むタンパク質の場合、プロテインA若しくはプロテインG又はこれらの改変型を親和性精製に使用することができる。プロテインAは、ヒトγ1、ヒトγ2又はヒトγ4の重鎖Fc領域を含む精製タンパク質の単離に有用である。プロテインGは、全てのマウスFcアイソタイプ及びヒトγ3に推奨される。
【０１７５】
核酸をベースとするVEGF-Bシグナル伝達阻害剤
本開示の一例では、本開示の任意の例に従って本明細書に記載したような治療法及び/又は予防法は、VEGF-Bの発現を低下させる工程を含む。例えば、そのような方法は、核酸の転写及び/又は翻訳を低減させる化合物を投与する工程を含む。一例では、この化合物は核酸であり、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、PNA、干渉RNA、siRNA、マイクロRNAである。
【０１７６】
アンチセンス核酸
用語「アンチセンス核酸」は、本開示の任意の例において本明細書に記載したようなポリペプチドをコードする特定のmRNA分子の少なくとも一部に対して相補的であり、mRNA翻訳等の転写後事象を妨げることができるDNA若しくはRNA又はこれらの誘導体(例えばLNA若しくはPNA)又はこれらの組み合わせを意味すると解釈されるものとする。アンチセンス法の使用は当分野で既知である{例えばHartmann及びEndres(編)、Manual of Antisense Methodology、Kluwer(1999)を参照されたい}。
【０１７７】
本開示のアンチセンス核酸は、生理学的条件下で標的核酸にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、構造遺伝子若しくはコード領域に対応する配列又は遺伝子の発現若しくはスプライシングの制御をもたらす配列に対応する配列を含む。例えば、アンチセンス核酸は、VEGF-B若しくは5'-非翻訳領域(UTR)若しくは3'-UTR又はこれらの組み合わせをコードする核酸の標的としたコード領域に対応することができる。このアンチセンス核酸はイントロン配列に対して部分的に相補的であってよい。イントロン配列は転写中に又は転写後に切り出され得るので、このアンチセンス核酸は例えば標的遺伝子のエクソン配列だけに対して相補的になることがある。アンチセンス配列の長さは、VEGF-Bをコードする核酸の少なくとも19個の連続ヌクレオチドであるべきであり、例えば少なくとも50個のヌクレオチド、例えば少なくとも100個の、200個の、500個の又は1000個のヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写物全体に相補的な完全長配列を使用することができる。この長さは100〜2000個のヌクレオチドであってよい。標的とする転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は少なくとも90%であるべきであり、例えば95〜100%であるべきである。
【０１７８】
VEGF-Bに対する例示的なアンチセンス核酸は、例えばWO2003/105754に記載されている。
【０１７９】
触媒的核酸
用語「触媒的核酸」は、別々の基質を特異的に認識し、この基質の化学改変を触媒するDNA分子若しくはDNA含有分子(当分野では「デオキシリボザイム」若しくは「DNAザイム]としても知られている)又はRNA若しくはRNA含有分子(「リボザイム」又は「RNAザイム」としても知られている)を意味する。触媒的核酸中の核酸塩基は、塩基A、C、G、T(及びRNAの場合はU)であることがある。
【０１８０】
典型的には、触媒的核酸は、標的核酸の特異的認識用のアンチセンス配列と核酸切断酵素活性(本明細書において「触媒的ドメイン」とも称される)とを含む。本開示で有用であるリボザイムの種類は、ハンマーヘッド型リボザイム及びヘアピン型リボザイムである。
【０１８１】
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するのに有用である。理論により制限されるものではないが、この技法は、目的の遺伝子のmRNA(本場合はVEGF-BをコードするmRNA)又はこの一部と本質的には同一である配列を含むdsRNA分子の存在に依存する。好都合なことに、このdsRNAは、組換えベクター宿主細胞中の単一のプロモーターから製造することができる。ここでは、センス配列及びアンチセンス配列に、無関係な配列が隣接しており、この無関係な配列がループ構造を形成する形でセンス配列及びアンチセンス配列がハイブリダイズしてdsRNA分子を形成することが可能となる。本開示に適したdsRNA分子の設計及び製造は十分に当業者の能力内であり、特にWO99/32619、WO99/53050、WO99/49029及びWO01/34815を考慮すれば十分に当業者の能力内である。
【０１８２】
ハイブリダイズするセンス配列及びアンチセンス配列の長さはそれぞれ、少なくとも30個又は50個のヌクレオチド等の少なくとも19個の連続ヌクレオチドであるべきであり、例えば、少なくとも100個の、200個の、500個の又は1000個のヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写産物全体に相当する完全長配列を使用することができる。この長さは100〜2000個のヌクレオチドであってよい。標的とする転写物に対するセンス配列及びアンチセンス配列の同一性の程度は少なくとも85%であるべきであり、例えば95〜100%等の少なくとも90%であるべきである。
【０１８３】
例示的な低分子干渉RNA(「siRNA」)分子は、標的mRNAの約19〜21個の連続ヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、siRNA配列はジヌクレオチドAAで始まり、約30〜70%(例えば、40〜60%等の30〜60%、例えば約45%〜55%)のGC含有量を含み、例えば標準的なBLAST検索によって決定した場合に、siRNA配列を導入する哺乳動物のゲノムにおいて標的以外のいかなるヌクレオチド配列に対しても高い割合の同一性を有さない。VEGF-Bの発現を低減させる例示的なsiRNAは、Santa Cruz Biotechnology社又はNovus Biologicals社から市販されている。
【０１８４】
VEGF-Bの発現を低減させる短ヘアピンRNA(shRNA)も当分野で既知であり、Santa Cruz Biotechnology社から市販されている。
【０１８５】
スクリーニングアッセイ
VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を、例えば下記に記載するような当分野で既知の技法を使用して同定することができる。同様に、本明細書に記載した方法での使用に適したVEGF-Bシグナル伝達阻害剤の量を、例えば下記に記載するような当分野で既知の技法を使用して決定することができる、又は推定することができる。
【０１８６】
中和アッセイ
VEGF-Bに結合してシグナル伝達を阻害する化合物の場合、中和アッセイを使用することができる。
【０１８７】
一例では、中和アッセイは、検出可能な程度に標識した可溶性VEGF-R1の存在下若しくは非存在下でVEGF-Bと化合物とを接触させる工程、又はVEGF-R1を発現する細胞若しくは可溶性VEGF-R1の存在下若しくは非存在下で、検出可能な程度に標識したVEGF-Bと化合物とを接触させる工程を含む。次いで、VEGF-R1へのVEGF-Bの結合の程度を評価する。化合物の非存在下と比較して化合物の存在下でのVEGF-Bの結合の程度の低下は、この化合物がVEGF-BのVEGF-R1への結合を阻害し、結果としてVEGF-Bシグナル伝達を阻害することを示す。
【０１８８】
別の中和アッセイがWO2006/012688に記載されており、このアッセイは、固体支持体上に固定した第2のIg様ドメインを含むVEGF-R1の断片を、化合物と共にプレインキュベートしておいた亜飽和濃度(subsaturating concentration)の組換えVEGF-Bと接触させる工程を含む。洗浄して未結合のタンパク質を除去した後、固定したタンパク質を抗VEGF-B抗体と接触させ、結合した抗体(固定したVEGF-Bを示す)の量を測定する。抗体の結合の程度を、化合物の非存在下での程度と比較して低下させる化合物が、VEGF-Bシグナル伝達の阻害剤であると考えられる。
【０１８９】
別の例では、増殖がVEGF-Bシグナル伝達に依存している細胞、例えば、WO2006/012688に記載されているようにヒトエリスロポエチン受容体の細胞内ドメイン及びVEGF-R1の細胞外ドメインが組み込まれているキメラ受容体を発現するように改変されているBaF3細胞を使用して、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を同定する。細胞を、VEGF-Bの存在下において、化合物の存在下又は非存在下で培養する。次いで、標準的な方法を使用して、例えばコロニー形成アッセイ、チミジン取り込み又は細胞増殖の別の好適なマーカーの取り込み(例えば、MTS色素減少アッセイ(MTS dye reduction assay)}を使用して、細胞増殖を評価する。VEGF-Bの存在下で増殖の程度を低下させる化合物をVEGF-Bシグナル伝達の阻害剤とみなす。
【０１９０】
標準的な方法を使用して、化合物をそのVEGF-Bに結合する能力に関して評価することもできる。タンパク質への結合を評価する方法は、例えばScopes(In: Protein purification: principles and practice、第3版、Springer Verlag, 1994)に記載されているように当分野で既知である。そのような方法は一般に、化合物を標識する工程、及びこの化合物と固定したVEGF-Bとを接触させる工程を含む。洗浄して非特異的に結合した化合物を除去した後、標識の量、結果として結合した化合物の量を検出する。当然のことながら、化合物を固定し、VEGF-Bを標識してもよい。パニング型(Panning-type)アッセイも使用することができる。或いは又は加えて、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することができる。
【０１９１】
発現アッセイ
VEGF-Bの発現を低減させる又は妨げる化合物を、細胞とこの化合物とを接触させ、VEGF-Bの発現の程度を測定することにより同定する。核酸レベルで遺伝子発現を測定するのに適した方法は当分野で既知であり、この方法として、例えば定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)又はマイクロアレイアッセイが挙げられる。タンパク質レベルで発現を測定するのに適した方法も当分野で既知であり、この方法として、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、蛍光結合免疫吸着アッセイ(FLISA)、免疫蛍光又はウェスタンブロッティングが挙げられる。
【０１９２】
インビボアッセイ
本明細書に記載した化合物を、動物モデルにおける活性に関して試験することができる。II型糖尿病及び肥満の動物のモデルの例として、Ob/Obマウス(肥満の単一遺伝子モデル、レプチン欠乏)、db/dbマウス(肥満の単一遺伝子モデル、レプチン耐性)、Zucker(fa/fa)ラット(肥満の単一遺伝子モデル、レプチン耐性)、Goto-Kakizakiラット、KKマウス、NSYマウス、OLETFラット、イスラエルサンドラット(Israeli sand rat)、脂肪を給餌したストレプトゾトシン処置ラット、CBA/Caマウス、糖尿病Torriラット、ニュージーランド肥満マウスが挙げられる(Rees及びAlcolado Diabet. Med. 22、359〜370、2005を参照されたい)。
【０１９３】
自然発生2型糖尿病性腎症の既知の動物モデルとして、自然発生的な高血圧/NIH-肥満(SHR/N-cp)ラット(肥満、2型糖尿病及び腎症のモデル)、痩せたSHR/N-cpラット及びWistar-Kyoto/NIH-肥満(WKY/N-cp)ラットが挙げられる。これらの両方のモデルにより、糖尿病性腎症の病因における高血圧及び肥満の役割の評価が可能となる:SHR/N-cpラットは異常なグルコース耐性高血圧を有し、ヒト糖尿病性腎症を暗示する腎疾患を発症するの対して、WKY/N-cpラットも肥満であり、高脂血症を有するものの、このグルコース制御はSHR/N-cpラットの場合と比べて低い。更なるモデルはLA/N-cpラット(肥満の遺伝子も保有し、高脂血症を示す)である(Kimmel他、Acta Diabetologica、29、142〜148、1992を参照されたい)。本明細書で例示するように、db/dbマウスはまた、糖尿病性腎症の効果的なモデルでもある。
【０１９４】
医薬組成物及び処置の方法
VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物(別名、活性成分)は、予防的処置又は治療的処置のための非経口投与、局所(topical)投与、経口投与若しくは局所(local)投与、エアロゾル投与又は経皮投与に有用である。一例では、この化合物を非経口で投与し、例えば皮下に又は静脈内に投与する。
【０１９５】
投与する化合物の製剤は、選択した投与経路及び剤形(例えば、溶液、エマルション、カプセル)に従って異なることができる。投与する化合物を含む適切な医薬組成物を、生理学的に許容される担体中で調製することができる。溶液又はエマルションの場合、好適な担体として、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体等の水溶液又はアルコール/水溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口用賦形剤として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油を挙げることができる。種々の適切な水性担体が当業者に既知であり、この水性担体として、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール類(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)、デキストロース溶液及びグリシンが挙げられる。静脈注射用賦形剤として、様々な添加剤、防腐剤、又は液体、栄養剤若しくは電解質補充剤を挙げることができる(一般に、Remington's Pharmaceutical Science、第16版、Mack編、1980を参照されたい)。この組成物は、生理学的条件に近づけることが必要な場合に、薬学的に許容される補助剤、例えばpH調整剤及び緩衝剤並びに毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを任意選択で含むことができる。当分野で既知の凍結乾燥及び再構成の技法に従って、この化合物を保存用に凍結乾燥して使用前に適切な担体中で再構成することができる。
【０１９６】
選択した媒体中での活性成分の最適濃度は、当業者に既知の手順に従って経験的に決定することができ、所望される最終的な医薬製剤によって決まる。
【０１９７】
本開示の化合物を投与するための投与量範囲は、所望される効果を得るのに十分な大きさである。例えば、組成物は、治療的に又は予防的に有効な量の化合物を含む。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、用語「有効な量」は、対象においてVEGF-Bのシグナル伝達を阻害する/低減させる/妨げるのに十分な量の化合物を意味すると解釈されるものとする。当業者は、そのような量は、例えば化合物及び/若しくは特定の対象、並びに/又は処置する腎症の種類及び/若しくは重症度に応じて変動し得ることを認識しているだろう。従って、この用語が、本開示を特定の量、例えば化合物の質量又は数に限定すると解釈すべきではない。
【０１９９】
本明細書で使用する場合、用語「治療的に有効な量」は、腎症の1種又は複数種の症状を軽減させる又は阻害するのに十分な化合物の量を意味すると解釈されるものとする。
【０２００】
本明細書で使用する場合、用語「予防的に有効な量」は、腎症の1種又は複数種の検出可能な症状の発症を予防する又は阻害する又は遅延させるのに十分な化合物の量を意味すると解釈されるものとする。
【０２０１】
一例では、この化合物を、下記の効果:
・  高血圧を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体硬化症及び/若しくは尿細管硬化症を軽減させる、若しくは予防する、
・  メサンギウムの細胞外基質沈着及び/若しくは糸球体基底膜の異常肥厚を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のメサンギウム増殖を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体血管の再構成を軽減させる、若しくは予防する、
・  腎臓の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体の脂質蓄積を軽減させる、若しくは予防する、
・  糸球体のコラーゲン沈着及び/若しくは硝子様細動脈硬化(arteriolar hyaliosis)を軽減させる、若しくは予防する、
並びに/又は
・  顕性アルブミン尿症を軽減させる若しくは予防する
のうちの1つ又は複数を得るのに効果的な量で投与する。
【０２０２】
投与量は、有害な副作用、例えば過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投与量は患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度によって異なり得、当業者により決定され得る。任意の合併症の場合には、個々の医師により投与量を調整することができる。
【０２０３】
投与量は、1日から数日にわたり1日当たり1回又は複数回の用量投与で、約0.1mg/kgから約300mg/kgで変動することができ、例えば約0.2mg/kgから約200mg/kg、例えば約0.5mg/kgから約20mg/kgで変動することができる。
【０２０４】
いくつかの例では、化合物を、後続(維持用量)と比べて高い初回(又は負荷)用量で投与する。例えば、化合物を約1mg/kgから約30mg/kgの間の初回用量で投与する。次いで、化合物を約0.0001mg/kgから約1mg/kgの維持用量で投与する。維持用量を7〜35日毎に、例えば14日毎に、21日毎に又は28日毎に投与することができる。
【０２０５】
いくつかの例では、化合物を、後続の用量での使用と比べて低い用量で最初に投与する用量段階的増加レジメンを使用する。この投与量レジメンは、対象が最初に有害事象を患った場合に有用である。
【０２０６】
処置に十分に反応していない対象の場合、1週間に複数回の用量を投与することができる。或いは又は加えて、投与する用量を増加させることができる。
【０２０７】
複数回の曝露又は一連の用量を投与することにより、例えば化合物の少なくとも約2回の曝露、例えば約2から60回の曝露、より具体的には約2から40回の曝露、最も具体的には約2から20回の曝露により、対象を化合物で再処置することができる。
【０２０８】
一例では、疾患の徴候又は症状が再発する場合に、例えば微量アルブミン尿症が進行する場合に、あらゆる再処置を行うことができる。
【０２０９】
別の例では、規定の間隔であらゆる再処置を行うことができる。例えば、後続の曝露を様々な間隔で、例えば約24〜28週又は48〜56週又はより長期で投与することができる。例えば、そのような曝露を、それぞれ約24〜26週又は約38〜42週又は約50〜54週の間隔で投与する。
【０２１０】
本開示の方法は、本開示に係る少なくとも1種の化合物の、腎障害又は合併症、腎症(例えば糖尿病性腎症)、糖尿病、脂質異常症、高血圧及び/又は肥満の予防又は処置に治療的に有効な別の薬剤の投与との同時投与も含むことができる。
【０２１１】
一例では、本開示の化合物を、糖尿病の予防用に又は処置用に現在使用されている又は開発中である少なくとも1種の追加の既知の化合物と組み合わせて使用する。そのような既知の化合物の例として、通常の抗糖尿病薬、例えばスルホニルウレア類{例えば、グリカジド(glicazid)、グリピジド}、メトホルミン、グリタゾン類(例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン)、食事グルコース放出薬(prandial glucose releasing agent)(例えば、レパグリニド、ナテグリニド)、アカルボース並びにインスリン(例えば、ヒト起源の、ウシ起源の又はブタ起源のインスリン等のインスリンの全ての天然に存在する型、合成型及び改変型、;例えばイソフェン又は亜鉛中に懸濁されているインスリン、並びに誘導体、例えばインスリングルリジン、インスリンリスプロ、インスリンリスプロプロタミン、インスリングラルギン、インスリンデテミル又はインスリンアスパルト)が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１２】
一例では、本開示の化合物を、腎症又は関連する障害又は合併症等の腎障害の予防用に又は処置用に現在使用されている又は開発中である少なくとも1種の追加の既知の化合物と組み合わせて使用する。そのような既知の化合物の例として下記が挙げられるがこれらに限定されない:ACE阻害剤[例えば、カプトプリル{Capoten(商標)}、エナラプリル{Innovace(商標)}、ホシノプリル{Staril(商標)}、リジノプリル{Zestril(商標)}、ペリンドプリル{Coversyl(商標)}、キナプリル{Accupro(商標)}、トランダナロプリル{Gopten(商標)}、ロテンシン、モエキシプリル、ラミプリル];RAS遮断剤;アンジオテンシン受容体遮断剤(ARB)(例えば、オルメサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン等);タンパク質キナーゼC(PKC)阻害剤(例えばルボキシスタウリン);AGE依存性経路の阻害剤{例えば、アミノグアニジン、ALT-946、ピロドキサミン(ピロドドリン)、OPB-9295、アラゲブリウム};抗炎症薬(例えば、シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、マイコフェノレートモフェチル、ミゾリビン、ペントキシフィリン)、GAG{例えばスロデキシド(米国特許第5,496,807号)};ピリドキサミン(米国特許第7,030,146号);エンドセリン拮抗薬(例えばSPP 301)、COX-2阻害剤、PPAR-ガンマ拮抗薬、及びアミホスチン(シスプラチン腎症に使用する)、カプトプリル(糖尿病性腎症に使用する)、シクロホスファミド(突発性膜腎症に使用する)、チオ硫酸ナトリウム(シスプラチン腎症に使用する)のようなその他の化合物。
【０２１３】
更に、本開示の方法は、糖尿病及び/又は腎症に直接的に又は間接的に関連する別の疾患の処置用の少なくとも1種のその他の治療薬の同時投与も含むことができ、この別の疾患として、脂質異常症、高血圧、肥満、神経症及び/又は網膜症等が挙げられるがこれらに限定さない。本発明に係る化合物と同時投与することができる薬剤の追加の例は、副腎皮質ステロイド;免疫抑制剤;抗生物質;降圧薬及び利尿薬(ACE-阻害剤等);脂質低下薬、例えば胆汁捕捉樹脂(bile sequestrant resin)、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、特にコレステロール及びトリグリセリドを低減するために使用される薬剤及び医薬品[例えば、フィブラート{例えばGemfibrozil(商標)}及びHMG-CoA阻害剤、例えばLovastatin(商標)、Atorvastatin(商標)、Fluvastatin(商標)、Lescol(商標)、Lipitor(商標)、Mevacor(商標)、Pravachol(商標)、Pravastatin(商標)、Simvastatin(商標)、Zocor(商標)、Cerivastatin(商標)等];脂質の腸内吸収を阻害する化合物{例えばエゼチミンデ(ezetiminde)};ニコチン酸;及びビタミンDである。
【０２１４】
上記から明らかになるように、本開示は、対象の同時治療的処置の方法であって、有効な量の第1の化合物及び第2の化合物を、必要とする対象に投与する工程を含み、前記薬剤が本開示の化合物(即ちVEGF-Bシグナル伝達の阻害剤)であり、第2の薬剤が腎症、糖尿病性腎症、糖尿病、高血圧、高脂血症又は肥満の予防用又は処置用である、方法を提供する。
【０２１５】
本明細書で使用する場合、語句「同時治療的処置」における用語「同時」は、第2の薬剤の存在下で第1の薬剤を投与することを含む。同時治療的処置方法として、第1の、第2の、第3の又は更なる薬剤を同時に投与する方法が挙げられる。同時治療的処置方法として、第1の又は更なる薬剤を第2の又は更なる薬剤の存在下で投与する方法であって、第2の又は更なる薬剤を例えば予め投与しておくことができる方法も挙げられる。同時治療的処置方法を異なる主体により段階的に実行することができる。例えば、1人の主体が対象に第1の薬剤を投与することができ、別の主体が対象に第2の薬剤を投与することができ、この投与工程を同時に又はほぼ同時に又は離れた時間で実行することができ、但し、第1の薬剤(及び/又は更なる薬剤)が第2の薬剤(及び/又は更なる薬剤)の存在下における後の投与である。主体及び対象は同一の実体(例えばヒト)であってよい。
【０２１６】
一例では、本開示は、対象の腎症を処置する又は予防する方法であって、本開示の少なくとも1種の化合物を含む第1の医薬組成物と、1種又は複数種の追加の化合物を含む第2の医薬組成物とを対象に投与する工程を含む方法も提供する。
【０２１７】
一例では、本開示の方法は、腎症(例えば糖尿病性腎症)に罹患しており、別の(例えば糖尿病の)処置を受けている対象にVEGF-Bシグナル伝達の阻害剤を投与する工程を含む。
【０２１８】
キット
本開示の別の例は、上記に記載したような腎症の処置に有用な化合物を含むキットを提供する。
【０２１９】
一例では、このキットは、(a)任意選択で薬学的に許容される担体中の又は希釈剤中の、本明細書に記載したようなVEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物を含む容器と、(b)対象の腎症を処置するための使用説明書を含む添付文書とを含む。
【０２２０】
本開示のこの例によれば、添付文書は容器上である、又は容器に付随されている。好適な容器として、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器を、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックで形成することができる。容器には、腎症の処置に効果的である組成物が保持されており、又は入っており、この容器は無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、この容器は、静脈注射用溶液バッグであってよい、又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい)。この組成物中の少なくとも1種の活性剤は、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物である。ラベル又は添付文書は、用量並びに供給する化合物及びあらゆるその他の薬剤のインターバルに関する具体的な指示により、組成物を、処置に適格な対象、例えば腎症を有する又は腎症にかかりやすい対象の処置に使用することを示す。このキットは、薬学的に許容される希釈緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及び/又はデキストロース溶液を含む追加の容器を更に含むことができる。このキットは、商業上の観点及びユーザーの観点から望ましいその他の物質、例えばその他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを更に含むことができる。
【０２２１】
このキットは、第2の薬剤を含む容器を任意選択で更に含み、ここで、VEGF-Bシグナル伝達を阻害する化合物は第1の薬剤である。このキットは、有効な量で第2の薬剤により対象を処置するための添付文書上の使用説明書を更に含む。第2の薬剤は、上記に記載したもののうちのいずれであってもよい。
【０２２２】
本開示は下記の非限定的な実施例を含む。
【実施例１】
【０２２３】
VEGF-Bを欠損しているマウスは糖尿病性腎症の発症に対して耐性がある
VEGF-Bを欠損している糖尿病マウスは、腎機能が改善されおり、且つ高血圧が軽減されている
(糖尿病及び糖尿病性腎症のモデルとして)C57BKS/Leprdb(db/db//BKS)マウスをJackson Laboratory社から入手し、C57BL/6-Vegfb-/-マウスと一緒に飼育した。db/db//Vegfb-/-マウスをヘテロ接合型db/+//Vegfb+/-マウスと互いに交尾させることにより繁殖させ、db/db、db/db//Vegfb+/-及びdb/db//Vegfb-/-を作成した。この研究では42週齢の雌のdb/db、db/db//Vegfb+/-及びdb/db//Vegfb-/-を使用した。1種の動物/遺伝子型を収容しているケージを撮影することにより、尿の生成を測定した。尿試験紙による分析によって糖尿及びタンパク尿を測定するために、マウスを1時間にわたり飢餓させ、次いで尿を採取し、グルコース濃度及びタンパク質濃度を、製造業者(Uristix、Siemens社)に従って試薬紙を使用し直接測定した。ACRの検出用に、20μlから200μl体積の尿を各マウスから採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット{Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア(Philadelphia)}を使用して尿中クレアチニンを測定した。収縮期血圧及び拡張期血圧を、CODAセットアップ(Kent Scientific社)を使用する尾カフ(tail-cuff)法により測定した。全ての動物を2週にわたり血圧測定装置に慣れさせた。全ての動物に、最低でも3日にわたり1日当たり20回の測定の記録を1〜2サイクル受けさせた。
【０２２４】
この分析から、糖尿病db/db BKSマウスでのVegfbの欠失により腎生理機能が改善され、高血圧が軽減されることが分かった。例えば、db/db//Vegfb-/-動物は、db/db動物及びdb/db//Vegfb+/-動物と比べて尿の生成が少なかった。db/db//Vegfb-/-動物はまた、db/db動物及びdb/db//Vegfb+/-動物と比べて尿中のグルコース及びタンパク質も少なかった。
【０２２５】
図1Aは、db/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウス(n=5/群、左側のグラフ)並びに痩せた野生型マウス及び痩せたVegfb-/-マウス(n=4〜6/群、右側のグラフ)に関してELISAにより測定した尿中アルブミン/クレアチニン比を示す。これらのデータから、db/db//Vegfb-/-動物はdb/db//Vegfb+/-動物と比較して尿中アルブミン/クレアチニン比が改善されていることが分かる。同様の効果は、痩せた野生型動物と比較してVegfbを欠損している痩せた動物でも観測された。
【０２２６】
図1Bは、db/dbマウス及びdb/db//Vegfb+/-マウス(n=5/群)における尾カフ血圧(収縮期血圧及び拡張期血圧)を示す。これらのデータから、db/db//Vegfb-/-動物は、db/db動物と比較して収縮期血圧及び拡張期(diasystolic)血圧が低下していることが明らかである。
【０２２７】
これらのデータから、VEGF-Bの発現が低減している糖尿病db/dbマウス及び痩せたマウスは、尿中アルブミンの濃度及び尿中アルブミン/クレアチニン比の低下により判定されるように、より良好なろ過能力を伴う、改善された腎機能を有することが分かる。VEGF-Bの発現の低減により、db/db動物において収縮期血圧及び拡張期血圧の両方も低下した。
【０２２８】
db/db BKSマウスでは、Vegfb欠失により糸球体及び尿細管の硬化症が軽減される
42週齢の雌のdb/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスを屠殺して腎臓を単離し、固定し、包埋し、切断して切片を作り、過ヨウ素酸-シッフ(PAS)で染色し、製造業者(Sigma社)の指示に従って糸球体のメサンギウム増殖及び尿細管硬化症を評価した。各切片内においてPAS染色した、1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体又は尿細管を、20倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により撮影した。i)糸球体のPAS染色(ピクセル2/μm2)に関して、ii)1フレーム当たりのアポトーシス糸球体の数に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。糸球体は、強いPAS染色及び25μm未満の直径の場合にアポトーシスとした。i)尿細管基底膜の厚さ(μm2)に関してAxio Vision Runウィザードプログラムを使用して尿細管を定量化した。
【０２２９】
図2Aに示すように、db/dbマウスは尿細管硬化症を発症したが、この異常はdb/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスでは観測されなかった。更に、db/dbマウスは糸球体硬化症を発症したが、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスは発症しなかった(図2B)。db/dbマウスでのこれらの変化に伴って、糸球体のアポトーシスの程度が、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスと比較して増加した(図2C)。
【０２３０】
これらのデータから、db/db動物と比較してVEGF-Bの発現が低減している糖尿病db/db動物からの腎臓では、糸球体及び尿細管の硬化症が軽減されることが分かる。
【０２３１】
Vegfb欠損db/db BKSマウスでは、メサンギウムの細胞外基質沈着及び糸球体基底膜(GBM)の異常肥厚が軽減される
標準的な手順に従って、透過電子顕微鏡(TEM)分析に、42週齢の雌のdb/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎生検を使用した。簡潔に述べると、組織を固定緩衝溶液(fixation solution buffer)(2%グルタルアルデヒド、0.5%パラホルムアルデヒド、0.1Mカコジル酸塩、0.1Mスクロース、3mM CaCl2)で固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液pH7.4で洗浄した後、室温で1時間にわたりカコジル酸緩衝液中の2%OsO4で染色した。サンプルを脱水し、室温で1時間にわたり無水エタノール中の2%酢酸ウラニルでまとめて染色した。次いで、サンプルをEpon 812/アセトン系に通して処理し、純粋なEpon 812中に60℃で包埋した。Leica EM UC6 ultratomeで70nm厚の薄片に切り、ホルムバールで被覆された銅スロットグリッド上に載置した。2%水性酢酸塩pH 3.5並びにVenable及びCogglesallのクエン酸鉛で後染色を行った。グリッドをFEI TECNAI電子顕微鏡で分析した。
【０２３２】
高倍率TEM分析により、糖尿病性腎症を伴う腎臓異常、例えばメサンギウム増殖及びGBMの肥厚が、db/dbマウスと比較してVEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは減少することが分かった(図3A)。GBMの肥厚は糖尿病性腎症での一般的な特徴である。図3Bは、VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスではスリット構造が保持されることを示す。VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは有足細胞構造が保持されることも見出された。
【０２３３】
db/db BKSマウスでは、Vegfbの欠失により腎臓の脂質蓄積が軽減される
42週齢の雌のdb/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス、db/db//Vegfb-/-マウス及び痩せた野生型マウスからの腎臓を使用して、オイルレッドO(ORO)分析を実施した。簡潔に述べると、腎臓を切開してドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をOROワーキング溶液{2.5gオイルレッドO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ後、この低温切片を載置した。染色した切片を、20倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により調べ、1個の切片当たり最低10フレームを保存した。脂質滴の定量化のために、各フレーム中の赤色ピクセルの量を、全ORO染色に関してAxio Vision Runウィザードプログラムを使用して定量化した(ピクセル、オングストローム単位)。
【０２３４】
VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは、腎臓の脂質滴の蓄積及び構造が改善されている(図4A)。特に、Vegfb欠損db/dbマウスからの腎臓切片では、脂質滴がより少なく、より小さい。図4Bは、db/dbマウスでのVEGF-B発現の低減により、糸球体中での脂質蓄積が低下し、生じた脂質滴がより少なく、より小さいことを示す。
【０２３５】
Vegfbを欠損しているdb/db BKSマウスでは糸球体の再構成が予防される
42週齢の雌のdb/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスからの腎臓で糸球体の形態を評価した。簡潔に述べると、動物を屠殺して腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、その後、シナプトポジン及び/又はpecam(血小板内皮細胞接着分子)を免疫染色した。Antigen retrieval solution Ph6(Dako社)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)、ヤギ抗pecam(Abcam社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でシナプトポジン及びpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)シナプトポジン染色(ピクセル2/μm2)及び糸球体のii)pecam染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２３６】
図5A及び図5Bは、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスの糸球体におけるシナプトポジン及びpecamの発現の増加を示す。染色した糸球体のこれらのデータ及び分析は、Vegfb欠損db/dbマウスでは糸球体全体の形態が改善されることを示す。VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは、有足細胞(podcoyte)及び内皮細胞の発現及び構造、即ちろ過プロセスに不可欠な細胞型が保持される。
【０２３７】
Vegfb欠損db/db BKSマウスでは、糸球体のコラーゲン沈着及び硝子様細動脈硬化が軽減される
42週齢の雌のdb/dbマウス、db/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-マウスからの腎臓で糸球体のコラーゲン沈着及び硝子様細動脈硬化を評価した。簡潔に述べると、動物を屠殺して腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、その後、コラーゲンIV、pecam及び/又はα-SMAを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗コラーゲンIV(abcam社)、ヤギ抗pecam(abcam社)又はα-SMA(Sigma社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でコラーゲンIV、pecam又はα-SMAを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)コラーゲンIV染色(ピクセル2/μm2)、糸球体のii)α-SMA染色(ピクセル2/μm2)、iii)糸球体の細動脈の厚さ(μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２３８】
図6は、コラーゲンIV(図6A)及びα-SMA(図6B)の値が、db/dbマウスと比較してdb/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスにおいて減少したことを示す。更に、細動脈の厚さは、db/dbマウスと比較してdb/db//Vegfb+/-マウス及びdb/db//Vegfb-/-マウスにおいて減少した(図6C)。これらのデータは、VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは病理学的な糸球体内コラーゲン沈着{糸球体の細胞外基質(ECM)沈着としても知られている}及び硝子様細動脈硬化が軽減されることを示す。これらのデータから、VEGF-Bの発現が低減しているdb/dbマウスでは、糖尿病性腎症の一般的な組織学的病変、例えば糸球体のECM沈着及び硝子様細動脈硬化が軽減されることが分かる。
【０２３９】
db/db//BKSマウスでは、糖尿病性腎症の進行中に脂質が腎臓の糸球体に優先的に蓄積する
痩せたdb+マウス、6週齢のdb/dbマウス及び21週齢のdb/db//BKSマウスをオイルレッドO(ORO)分析に使用した。腎臓を切開してドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をオイルレッドOワーキング溶液{2.5gオイルレッドO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ後、この低温切片を載置した。染色した切片を、20倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により調べ、1個の切片当たり最低10フレームを保存した。脂質滴の定量化のために、各フレーム中の赤色ピクセルの量を、全ORO染色に関してAxio Vision Runウィザードプログラムを使用して定量化した(ピクセル、オングストローム単位)。
【０２４０】
図7は、db/db//BKSマウスでは顕性アルブミン尿症の発症に伴い、脂質が糸球体に優先的に蓄積することを示す。
【０２４１】
db/db//BKSマウスにおける糖尿病性腎症の進行においては、糸球体の脂質蓄積が有足細胞の喪失と相関する
痩せたdb+マウス、6週齢のdb/dbマウス及び21週齢のdb/db//BKSマウスを分析に使用した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、その後、シナプトポジン及び/又はpecamを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution pH6(Dako社)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるモルモット抗アディポフィリン(Fitzgerald社)及びウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でアディポフィリン及びシナプトポジンを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)アディポフィリン染色(ピクセル2/μm2)及びii)シナプトポジン染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２４２】
図8は、糖尿病性腎症の発症中に脂質が糸球体に蓄積し、同時に有足細胞の数が減少することを示す。
【０２４３】
Vegfbシグナル伝達経路は糖尿病性腎症の進行中に上方制御される
痩せたdb+マウス並びに6週齢の、12週齢の及び21週齢のdb/db//BKSマウスを切開し、ドライアイス上で急速凍結させた。製造業者の指示に従ってRNeasy Miniキット(Qiagen社)を使用し、腎臓から全RNAを抽出して精製した。iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad社)を使用し、0.5〜1μgの全RNAから第一鎖の(first strand)cDNAを合成した。製造業者の指示に従ってRotor-Gene Q(Qiagen社)リアルタイムPCRサーマルサイクラ―でKAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2x)Universal(KAPA Biosystems社)を使用し、リアルタイム定量的PCR(Real-Time quantitive PCR)を実施した。発現レベルをL19及びβ-2ミクログロブリンの発現に対して正規化した。
【０２４４】
図9に示すように、糖尿病性腎症では、VEGF-Bの下流標的であるVegfb、Fatp3及びFatp4、並びに主要なVEGF-B受容体であるVegfr1の腎臓での発現が上方制御される。これらのデータは、腎臓でのVEGF-Bシグナル伝達経路は糖尿病性腎症の処置に適した標的であることを示す。
【０２４５】
高脂肪を給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスでは腎機能が改善される
雄の野生型マウス、Vegf+/-マウス及びVegfb-/-マウスに、5週齢で開始して、30週にわたり60%高脂肪食(HFD)(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型対照動物も含めた。ACRの検出のために、各マウスから20μlから200μl体積の尿を採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット(Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)を使用して尿中クレアチニンを測定した。
【０２４６】
図10は、VEGF-Bの発現が低減したHFD給餌マウスでは、HFDにより媒介される尿中タンパク質の漏出が軽減されたことを示す。そのため、アルブミン排泄(図10B)及びACR(図10A)の両方により判定されるように、腎臓のろ過能力が改善された。
【０２４７】
HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスでは、糸球体のメサンギウム増殖及び肥厚が軽減される
5週齢で開始して、雄の野生型マウス、Vegf+/-マウス及びVegfb-/-マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた対照動物も含めた。動物をイソフルオラン(isofluorane)麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、製造業者に従ってPAS(Sigma社)で染色した。各切片内でPAS染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のPAS染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２４８】
図11は、VEGF-Bの発現が低減しているHFD給餌マウスでは、HFDにより誘導される腎糸球体のメサンギウム増殖(図11A)及び肥厚(図11B)が予防されることを示す。
【０２４９】
HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスでは、糸球体の脂質蓄積が軽減される
雄の野生型マウス、Vegf+/-マウス及びVegfb-/-マウスに、5週齢で開始して、30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型対照動物も含めた。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、ドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をオイルレッドOワーキング溶液{2.5gオイルレッドO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ。その後、切片をヘマトキシリン溶液に3秒間浸し、水道水下ですすいだ後、この切片を載置した。染色した切片を明視野顕微鏡により調べた。各切片内でORO及びヘマトキシリン染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のORO染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２５０】
図12及び染色した腎臓切片の分析は、HFDによる腎臓の脂質蓄積が主に糸球体で増加することを示す。しかしながら、この異所性脂質蓄積は、VEGF-Bの発現が低減しているHFD給餌マウスでは軽減される。脂質滴は数及びサイズの両方が減少した。
【０２５１】
HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスでは、糸球体の脂質蓄積が軽減され、有足細胞の完全性(integrity)が保持される
5週齢で開始して、雄の野生型マウス、Vegf+/-マウス及びVegfb-/-マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型対照動物を更に含めた。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、その後、シナプトポジン及び/又はpecamを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるモルモット抗アディポフィリン(Fitzgerald社)及びウサギ抗ポドシン(Sigma社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でアディポフィリン及びシナプトポジンを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)アディポフィリン染色(ピクセル2/μm2)及びii)ポドシン染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２５２】
図13及び染色した切片の分析は、VEGF-Bの発現が低減しているマウスでは、HFDにより引き起こされる異所性の腎臓脂質蓄積が軽減されることを示す。同時に、有足細胞の構造的完全性及び数が増加する。
【０２５３】
HFDを給餌したVegf-b+/-マウス及びVegf-b-/-マウスでは、糸球体のECM沈着及び硝子様細動脈硬化が軽減される
5週齢で開始して、雄の野生型マウス、Vegf+/-マウス及びVegfb-/-マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型対照動物も含めた。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、その後、コラーゲンIV、pecam及び/又はα-SMAを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗コラーゲンIV(abcam社)、ヤギ抗pecam(abcam社)又はα-SMA(sigma社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でコラーゲンIV、pecam又はα-SMAを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)コラーゲンIV染色(ピクセル2/μm2)及びii)糸球体の細動脈の厚さ(μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２５４】
図14及び染色した切片の分析は、VEGF-Bの発現が低減しているHFD給餌マウスでは、糖尿病性腎症での重要な組織学的病変、例えば糸球体のECM蓄積(図14A)及び硝子様細動脈硬化(図14B)の増加が軽減されることを示す。
【実施例２】
【０２５５】
抗VEGF-B抗体の中和により、糖尿病性腎症の進行が処置される、又は予防される
糖尿病db/db//BKSマウスでは、抗体により媒介されるVEGF-Bの阻害が血中グルコース濃度に穏やかに影響を及ぼす
C57BKS/Leprdb(db/db/BKS)マウスをJackson Laboratory社から購入し、400μgの2H10(中和的な抗VEGF-B抗体)又はアイソタイプが一致する対照抗体のいずれかを週に2回腹腔内注入し{6週齢(予防的試験)又は12週齢(治療的試験)で開始した}、8週にわたり継続した。予防的試験では、ACR及び血中グルコースの開始値はそれぞれ、クレアチニン1mg当たり<50μgアルブミン及び<15mMであった。治療的試験では、ACR及び血中グルコースの開始値はそれぞれ、クレアチニン1mg当たり>150μgアルブミン及び>15mMであった。マウスの食後の血中グルコース濃度を、隔週で2時間にわたる絶食後にモニタリングした。Bayer Contour Glucoseメーターを使用して、尾静脈からの採血でグルコース測定を実施した。ACRを検出するために、各マウスから20μlから200μl体積の尿を採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット(Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)を使用して尿中クレアチニンを測定した。
【０２５６】
図15A及び図15C〜図15Fは、抗体2H10で治療的に又は予防的に処置したdb/db/BKSマウスの血中グルコース濃度を示す。示したように、{本明細書で使用した糖尿病の侵襲的モデル(aggressive model)のように}本明細書に記載した実験では、糖尿病が進行した後での抗体の投与により血中グルコース濃度が実質的には減少しなかった。
【０２５７】
図15Bは、抗体2H10で治療的に又は予防的に処置したdb/db/BKSマウスでのACRレベルを示す。
【０２５８】
これらのデータから、db/db//BKSマウスは6週齢で微量アルブミン尿症を発症し、12週で顕性アルブミン尿症が認められることが分かる。これらの試験でのdb/db//BKSマウスへの予防的又は治療的のいずれの抗VEGF-B抗体の投与によっても、血中グルコース濃度は、検出可能な程には低下しなかった。
【０２５９】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により糸球体及び尿細管の硬化症が軽減される
上記に記載したように8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6〜8週齢のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、製造業者の指示に従ってPAS(Sigma社)で染色した。各切片内でPAS染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のPAS染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２６０】
図16A及び図16Bに示すように、2H10で処置したマウスは糸球体硬化症及び尿細管硬化症の程度の低下を示す。これらのデータから、血中グルコース濃度の検出不能な差違にもかかわらず、db/db//BKSマウスでの抗VEGF-B処置により糸球体硬化症及び尿細管硬化症の両方が軽減されることが明らかである。
【０２６１】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により血管の再構成が予防される
上記に記載したように8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6〜8週齢のdb/db/BKS又は歳及び性別が一致する痩せたdb/+動物から腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、pecam又はポドシンを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるヤギ抗pecam(abcam社)及びウサギ抗ポドシン(sigma社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)pecam(ピクセル2/μm2)及びii)ポドシン染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２６２】
図17Aに示すように、2H10で処置したマウスではポドシン染色の程度が保持された。2H10で処置したマウスではpecam染色の程度が増加した(図17B)。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗VEGF-B処置db/db//BKSマウスでは糸球体中の血管の形態が改善され、VEGF-Bの阻害により血管の密度及び構造が保持されることを示す。これらのデータはまた、VEGF-Bの阻害により血管の密度及び構造が保持されることも示す。そのため、抗VEGF-B抗体で処置したdb/db//BKSマウスでは、糸球体のろ過障壁を構成する細胞型、即ち有足細胞及び内皮細胞の構造及び完全性の両方が保持される。
【０２６３】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により有足細胞の構造が保持される
上記に記載したように8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6〜8週齢のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、シナプトポジン(synaptodin)及び/又はpecamを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)アディポフィリン染色(ピクセル2/μm2)及びii)シナプトポジン染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２６４】
図18Aに示すように、2H10で処置したマウスではアディポフィリン染色の程度が減少した。図18Bは、2H10で処置したマウスではシナプトポジン染色が増加したことを示す。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗VEGF-B抗体で処置したdb/db//BKSマウスでは、糸球体のろ過障壁を構成する細胞型、即ち有足細胞及び内皮細胞の構造及び完全性が保持されることを示す。これらのデータはまた、抗VEGF-B抗体による処置によって異所性の糸球体脂質蓄積が大幅に軽減され、有足細胞の発現及び形態が保持されることも示す。
【０２６５】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により糸球体のコラーゲン蓄積(細胞外基質沈着)が軽減される
上記に記載したように8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6週齢のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、糸球体のコラーゲンIVを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のコラーゲンIV染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２６６】
図19に示すように、2H10で処置したマウスでは糸球体のコラーゲンIV染色の程度が増加した。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗体により媒介されるVEGF-Bの阻害により、糖尿病性腎症での組織学的特徴であるdb/db//BKSマウスでの糸球体内の病理学的コラーゲン蓄積(細胞外基質蓄積)が軽減されることを示す。
【０２６７】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により血漿中脂質プロファイルが改善される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で予め処置した6〜8週齢の雌のdb/db/BKSマウス並びに歳及び性別が一致する痩せたdb/+から、心穿刺により血液を採取した。血液を10分にわたり14000rpm、4℃で遠心分離し、その後、血漿を分離して-80℃にてアリコートで凍結させた。市販のキットを使用して、NEFA{Wako Chemicals社、ドイツ、ノイス(Neuss)}、ベータ-ヒドロキシ酪酸塩{Stanbio Laboratories社、米国、テキサス州、ベルネ(Boerne)}並びにHDL-c及びLDL-c{BioVision社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー(Mountain View)}を酵素的に定量した。
【０２６８】
図20に示すように、2H10の投与により、db/db/BKSマウスは、2型糖尿病の重要な特徴であるケトンの濃度の上昇から保護される。抗VEGF-B処置により、「優れた」コレステロール運搬体として公知でもある血漿中HDL-c濃度を増加させた。2H10によるVEGF-Bシグナル伝達の低下は、血漿中LDL-c濃度又はNEFAに影響を及ぼさなかった。
【０２６９】
(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により、GBMの肥厚及び有足細胞の異常が予防される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6〜8週齢の雌のdb/db/BKSから腎臓を採取し、透過電子顕微鏡(TEM)分析に使用した。標準的な手順に従って、TEM用の腎生検の調製を実施した。組織を固定緩衝溶液(2%グルタルアルデヒド、0.5%パラホルムアルデヒド、0.1Mカコジル酸塩、0.1Mスクロース、3mM CaCl2)で固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液pH7.4で洗浄した後、室温で1時間にわたりカコジル酸緩衝液中の2%OsO4で染色した。サンプルを脱水し、室温で1時間にわたり無水エタノール中の2%酢酸ウラニルでまとめて染色した。次いで、サンプルをEpon 812/アセトン系に通して処理し、純粋なEpon 812中に60℃で包埋した。Leica EM UC6 ultratomeで70nm厚の薄片に切り、ホルムバールで被覆された銅スロットグリッド上に載置した。2%水性酢酸塩pH 3.5並びにVenable及びCogglesallのクエン酸鉛で後染色を行った。グリッドをFEI TECNAI電子顕微鏡で分析した。
【０２７０】
高倍率TEM分析により、db/dbマウスでの最初の病変であるGBMの肥厚が、2H10で処置した場合に軽減されることが分かった(図21A)。更に、db/db//BKSマウスでの抗VEGF-B処置により、スリット構造の数として測定した有足細胞の形態が保持される(図21B)。
【０２７１】
db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)予防的抗VEGF-B処置により糸球体の脂質蓄積が軽減される
8週にわたり2H10若しくはアイソタイプが一致する対照抗体で処置した6〜8週齢のdb/db/BKSマウス又は痩せたdb/+マウスから、血液及び腎臓を採取した。腎臓を切開し、ドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をオイルレッドOワーキング溶液{2.5gオイルレッドO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ。その後、切片をヘマトキシリン溶液に3秒間浸し、水道水下ですすいだ後、この切片を載置した。染色した切片を明視野顕微鏡により調べた。各切片内でORO及びヘマトキシリン染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のORO染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２７２】
痩せた非糖尿病動物と比較して、糖尿病動物の糸球体において脂質蓄積の明確な増加を検出した(図22)。db/db//BKSでのVEGF-Bの阻害により、この異所性の糸球体脂質蓄積が大幅に減少した。脂質滴は数及びサイズの両方が減少した。この分析は、液滴が内皮細胞及び有足細胞に主に蓄積することを示した。
【０２７３】
重度の糖尿病db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により糸球体及び尿細管の硬化症が軽減される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した12週齢の雄の及び雌のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、製造業者の指示に従ってPAS(Sigma社)で染色した。各切片内でPAS染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のPAS染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２７４】
図23A及び図23Bに示す並びに染色した切片の分析からの結果は、db/db//BKSマウスでのVEGF-Bの治療的阻害により糸球体及び尿細管の硬化症が軽減されることを示す。この効果は雌の動物でのみ検出されるが、なぜならば、おそらくこの疾患は雄のdb/db//BKSマウスではより侵襲的であるからである(よく見られる効果)。
【０２７５】
重度の糖尿病db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により腎臓の脂質蓄積が軽減される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した12週齢の雄の及び雌のdb/db/BKSから腎臓を採取し、ドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をOROワーキング溶液{2.5gORO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ後、この低温切片を載置した。染色した切片を、20倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により調べ、1個の切片当たり最低10フレームを保存した。脂質滴の定量化のために、各フレーム中の赤色ピクセルの量を、全ORO染色に関してAxio Vision Runウィザードプログラムを使用して定量化した(ピクセル、オングストローム単位)。
【０２７６】
図24に示すように、抗体処置した雌のdb/db//BKSマウスではORO染色の量が減少した。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗VEGF-B抗体で処置した雌のdb/db//BKSマウスでは脂質滴の数及びサイズの両方が減少したことを示す。雄のdb/db//BKSマウスでは抗VEGF-B抗体処置による腎臓の脂質蓄積の軽減は無かったが、おそらく雄の動物でのこの疾患のより侵襲的な発症の結果である。
【０２７７】
重度の糖尿病db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により糸球体の再構成が予防される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した12週齢の雌のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、シナプトポジン(synaptodin)又はpecamを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のシナプトポジン又はpecam染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２７８】
図25A及び図25Bは、抗VEGF抗体で治療的に処置したマウスの糸球体におけるpecamのレベル及びシナプトポジンレベルの増加を示す。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗VEGF-B抗体で処置したdb/db//BKSでは糸球体の形態が改善されることを示す。処置したdb/db//BKSマウスでは、有足細胞及び内皮細胞の発現及び構造、即ち糸球体のろ過プロセスに不可欠な細胞型が保持される。そのため、これらのデータは、抗VEGF抗体による治療的処置により、db/db//BKSマウスにおいて血管及び有足細胞の喪失も予防されることを示す。
【０２７９】
重度の糖尿病db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により糸球体のコラーゲン蓄積及び硝子様細動脈硬化が軽減される
8週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した12週齢の雌のdb/db/BKSから腎臓を採取し、48時間にわたり4%PFAで固定し、包埋して3μm切片を調製し、コラーゲンIV、pecam及び/又はα-SMAを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗シナプトポジン(Santa Cruz社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でpecamを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のコラーゲンIV、pecam及び/又はα-SMA染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２８０】
図26A〜図26Cは、2H10で処置したdb/db/BKSマウスではコラーゲンIV、α-SMA及び細動脈の厚さのレベルが低下したことを示す。染色した切片のこれらのデータ及び分析は、抗VEGF-B抗体で処置したdb/db//BKSマウスでは病理学的な糸球体内コラーゲン沈着(細胞外基質沈着)及び硝子様細動脈硬化が軽減されることを示す。
【０２８１】
微量アルブミン尿症が認められる糖尿病db/db//BKSマウスでは、(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により顕性アルブミン尿症の発症が予防される
db/db/BKSマウスに、400μgの2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体のいずれかを週に2回腹腔内注入し(6〜8週齢で開始した)、8週にわたり継続した。ACRを検出するために、各マウスから20μlから200μl体積の尿を採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット(Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)を使用して尿中クレアチニンを測定した。収縮期血圧及び拡張期血圧を、CODAセットアップ(Kent Scientific社)を使用する尾カフ法により測定した。全ての動物を2週にわたり血圧測定装置に慣れさせた。動物に、最低でも3日にわたり1日当たり20回の測定の記録を1〜2サイクル受けさせた。マウスの腎機能試験のために、個々のマウスを代謝ケージに収容した。24時間での体重及び尿量を2日連続してモニタリングした。後半24時間の尿サンプルを使用して尿中クレアチニンを測定した。代謝ケージでの収容後、動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去し、血漿中クレアチニンの測定に使用した。腎臓を切開し、マイクロスケールで秤量した。クレアチニンクリアランスを(尿[Cr]×尿量)/(血漿[Cr]×24時間)で算出した。
【０２８２】
図27Aは、2H10によるdb/db/BKSマウスの処置により微量アルブミン尿症の顕性アルブミン尿症への進行が予防され、特に、処置したマウスでは、この試験の間にACRが有意に変化しなかったことを示す。図27Bは、2H10で処置したdb/db/BKSマウスでは糸球体のろ過率(クレアチニンクリアランスとして測定した)も低下したことを示す。図27Cは、VEGF-Bの阻害により高血圧の発症が予防されたことを示す。図27Dは、VEGF-Bの発現の低減は体重又は腎臓の質量に影響を及ぼさなかったことを示す。これらのデータは、抗VEGF-B抗体で処置したdb/dbマウスは、尿中アルブミンの濃度、尿中アルブミン/クレアチニン比及びクレアチニンクリアランスの低下により判定されるように、より良好なろ過能力を伴う、改善された腎機能を有することを示す。
【０２８３】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置の血中グルコース濃度への影響は軽度である
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。試験の終了時に、2時間の絶食後にマウスの食後のBG濃度を記録した。Bayer Contour Glucoseメーターを使用して、尾静脈からの採血でグルコース測定を実施した。
【０２８４】
図28は、HFDにより血中グルコース濃度が増加するが、抗VEGF-Bで処置しても高血糖症の発症は予防されないことを示す。
【０２８５】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により、血中グルコース濃度を低下させることなく腎機能が改善される
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型の対照動物も含めた。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。試験の終了時に、アルブミン及びACRの検出用に20μlから200μl体積の尿を各マウスから採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット(Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)を使用して尿中クレアチニンを測定した。
【０２８６】
HFD給餌マウスでの抗VEGF-B処置により血中グルコース濃度は低下しなかったが、この処置は糖尿病性腎臓の生理機能に有意に影響を及ぼした(図29)。アルブミン排泄(図29A)、ACR(図29B)及びGFRの低下により判定されるように、腎臓のろ過能力が改善された。HFD給餌マウスでの抗VEGF-B処置は、対照処置マウスと比較して体重又は腎臓の質量に影響を及ぼさなかった。
【０２８７】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により、血漿中脂質プロファイルが改善される
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型の対照動物を更に含めた。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を取り出した。血液を10分にわたり14000rpm、4℃で遠心分離し、その後、血漿を分離して-80℃にてアリコートで凍結させた。市販のキットを使用して、NEFA(Wako Chemicals社、ドイツ、ノイス)、ベータ-ヒドロキシ酪酸塩(Stanbio Laboratories社、米国、テキサス州、ベルネ)及びトリグリセリド(Sigma-Aldrich社)を酵素的に定量した。
【０２８８】
図30は、HFD給餌マウスでの2H10の投与は、T2Dに関連する脂質種の濃度の上昇を防ぐことを示す。例えば、抗VEGF-B抗体処置により、トリグリセリド(図30A)、NEFA(図30B)及びケトン(図30C)の血漿中濃度が低下した。
【０２８９】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により、糸球体のメサンギウム増殖及び硬化症が予防される
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型の対照動物も含めた。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで後固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、製造業者に従ってPAS(Sigma社)で染色した。各切片内でPAS染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にて明視野顕微鏡(Axio Vision顕微鏡、Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のPAS染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２９０】
図31に示すデータ及び染色した切片の分析から、HFD給餌マウスでの2H10の投与は糸球体のメサンギウム増殖(図31A)及び糸球体の肥大(図31B)を防いだことが分かる。
【０２９１】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により、糸球体の脂質蓄積が予防される
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型の対照動物も含めた。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開してドライアイス上で急速凍結させ、直接クライオスタットのモールド上でTissue-Tek(登録商標)(Sakura社)に包埋した。低温切片(12μm)をオイルレッドOワーキング溶液{2.5gオイルレッドO(Sigma-Aldrich社)、400mlの99%イソプロパノールに溶解され、H2Oで6:10に更に希釈され、22μmフィルター(Corning社)を通してろ過されたもの}に5〜15分間浸し、水道水流下で10分間すすいだ。その後、切片をヘマトキシリン溶液に3秒間浸し、水道水下ですすいだ後、この切片を載置した。染色した切片を明視野顕微鏡により調べた。各切片内でORO及びヘマトキシリン染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のORO染色(ピクセル2/μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２９２】
図32に示すデータ及び染色した切片の分析から、HFD給餌マウスでの2H10の投与は異所性の腎臓脂質蓄積を防ぐことが分かる。脂質滴は数及びサイズの両方が減少している。
【０２９３】
HFD給餌マウスでの(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置により、糸球体の脂質蓄積が予防され、有足細胞の完全性が保持される
5週齢で開始して、マウスに30週にわたりHFDを目的として60%HFD(Research Diets社、米国)を給餌した。この研究には、痩せた野生型の対照動物も含めた。11週で抗体処置を開始し、20週にわたり2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体でマウスを処置した。動物をイソフルオラン麻酔薬で屠殺し、心穿刺により全血液を除去した。腎臓を切開し、48時間にわたり4%PFAで後固定し、続いて標準的な手順を使用してパラフィン包埋用に加工した。包埋後に3μm切片を調製し、その後、コラーゲンIV、pecam及び/又はα-SMAを免疫染色した。簡潔に述べると、Antigen retrieval solution Ph6(Dako社、#S2367)を使用して3μm切片上で抗原回復を実施し、10分にわたり98℃で加熱した。切片を、一次抗体であるウサギ抗コラーゲンIV(abcam社)、ヤギ抗pecam(Abcam社)又はα-SMA(Sigma社)と共に12時間にわたり4℃でインキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体(Invitrogen社、Alexa fluor)をアプライし、切片を室温で1時間にわたり更にインキュベートした後、切片を顕微鏡用に調製した。各切片内でコラーゲンIV、pecam又はα-SMAを染色した1匹の動物当たり少なくとも10個の糸球体を、40倍の倍率にてAxio Vision顕微鏡(Carl Zeiss社)により撮影した。糸球体のi)コラーゲンIV染色(ピクセル2/μm2)及びii)糸球体の細動脈の厚さ(μm2)に関して、Axio Vision Runウィザードプログラムを使用して糸球体を定量化した。
【０２９４】
図33に示すデータ及び染色した切片の分析から、HFD給餌マウスでの2H10の投与は、組織学的な糖尿病性腎症関連病変、例えば糸球体のECM蓄積(図33A)及び硝子様細動脈硬化(図33B)の増加を防ぐことが分かる。
【０２９５】
STZを注入した動物での(2H10を使用する)治療的抗VEGF-B処置は血中グルコース濃度に影響を及ぼさない
I型糖尿病の誘発のために、ストレプトゾトシン(streptozotozin)(STZ)モデルを採用した。Charles River社からの雄のBl/6マウスで実験を実施した。STZの注入前に4時間にわたりマウスを飢餓させ、1日目、2日目、3日目、4日目及び5日目に50mMクエン酸ナトリウム(pH4.5)中の又はクエン酸ナトリウム緩衝液中の体重1kg当たり50mgのストレプトゾトシン(Sigma-Aldrich社)を腹腔内投与した。STZ投与の前及び1週間後にマウスのBG濃度を記録した。血中グルコース濃度が12mmol/lを超える動物を高血糖とみなした。動物を2つの群にランダムに分け、週に2回、2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した。抗VEGF-B(2H10)又は対照抗体で処置したマウス及び痩せた対照動物の食後のBG濃度を、隔週で2時間の絶食後に記録した。Bayer Contour Glucoseメーターを使用して、尾静脈からの採血でグルコース測定を実施した。
【０２９６】
図34Aに示すように、雄のマウスでのSTZ注入により高血糖症が誘発される。しかしながら、STZ注入後の抗VEGF-B処置は血中グルコース濃度に大きく影響を及ぼさない(図34B)。
【０２９７】
STZを注入した動物での2H10を使用する治療的抗VEGF-B処置により腎機能が改善される
I型糖尿病の誘発のために、ストレプトゾトシン(streptozotozin)(STZ)モデルを採用した。Scanbur社からの雄のBl/6マウスで実験を実施した。STZの注入前に4時間にわたりマウスを飢餓させ、1〜5日目に50mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中の体重1kg当たり50mgのSTZ(Sigma-Aldrich社)を腹腔内投与した。STZ投与の前及び1週間後にマウスのBG濃度を記録した。グルコース濃度が12mmol/lを超える動物を高血糖とみなした。動物を2つの群にランダムに分け、上記のように週に2回、2H10又はアイソタイプが一致する対照抗体で処置した。アルブミン及びACRの検出用に、試験の終了時(これは進行中の実験であり、1週の処置についてのみ報告する)に20μlから200μl体積の尿を各マウスから採取した。Albuwell Mキットを使用して尿中アルブミンを検出し、Creatinine CompanionネズミELISAキット(Exocell社、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)を使用して尿中クレアチニンを測定した。
【０２９８】
STZ注入後に抗VEGF-B抗体2H10を投与したマウスでは、血中グルコース濃度への影響が軽度であったにもかかわらず、糖尿病マウスの腎機能は、抗体処置により有意に改善された。アルブミン排泄(図35A)及びACR(図35B)の低下により評価されるように、腎臓のろ過能力が改善された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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