(57)【要約】【課題】本発明の課題は、金ナノ粒子の表面から、ハロゲン化第四級アンモニウムを除去することである。【解決手段】ハロゲン化第四級アンモニウムの金ナノ粒子表面への結合力要因となっている金又は銀のハロゲン化物を溶解させるための特定の添加物を用いる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金ナノ粒子の懸濁液であって、当該金ナノ粒子の表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量が低減されていることを特徴とする、金ナノ粒子の懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面上の第四級アンモニウムカチオン並びに／又は金及び／若しくは銀のハロゲン化物の量が低減された金ナノ粒子の懸濁液、その製造方法並びに金ナノ粒子の表面から第四級アンモニウムカチオン並びに／又は金及び／若しくは銀のハロゲン化物を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金ナノ粒子は、核酸又は薬物などの機能性分子を生体内に導入し、その機能を発現させるためのキャリヤー等としての医療分野への応用が提案されている。金ナノ粒子（特にナノロッドやナノキューブ、ナノプレートなどの異方性形状を有する金ナノ粒子）の製造には、通常、ハロゲン化第四級アンモニウム（第四級アンモニウムカチオンとハロゲン化物イオンからなる化合物）が用いられ、得られる金ナノ粒子の表面にはハロゲン化第四級アンモニウムが結合している。しかしながら、ハロゲン化第四級アンモニウムは、細胞毒性を有する。この毒性はハロゲン化第四級アンモニウムの第四級アンモニウムカチオンによる脂質膜中のリン脂質とコレステロールの可溶化、およびタンパク質の変性に起因している。そのため、金ナノ粒子を医療用途に用いるためには、金ナノ粒子表面に結合しているハロゲン化第四級アンモニウムを除去又は低減する必要がある。
【０００３】
特許文献１には、金ナノロッド溶液中のセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ：ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）（ハロゲン化第四級アンモニウムの１つ）を、水と混合しない極性有機溶媒に抽出することにより、金ナノロッドの合成段階で使用されるＣＴＡＢを金ナノロッド溶液から取り除く方法が開示されている（段落００２３）。しかしながら、特許文献１に開示される方法では、金ナノロッドの表面に結合しているＣＴＡＢまでも除去することはできない。
【０００４】
非特許文献１には、Ｃ10アルキルスペーサーを担持するポリエチレングリコールリガンドで金ナノロッドを被覆して、高い化学安定性、コロイド安定性及び高いポリエチレングリコールグラフト密度を有するポリエチレングリコール化金ナノロッドを得る技術が開示されている（Abstract）。しかしながら、非特許文献１には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によると、ポリエチレングリコール化金ナノロッドにはＣＴＡＢが存在していることが示唆されることが開示されている（Estimating the PEGMUA coverage）。
【０００５】
金ナノ粒子の製造には、金ナノ粒子の合成収率向上のために、硝酸銀が用いられる場合がある。この場合には、ＣＴＡＢの臭化物イオンは、硝酸銀由来の銀イオンと反応して銀の臭化物を形成し、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオンは、銀の臭化物を介して金ナノ粒子表面に結合していることが、非特許文献２に報告されている（pp1257右欄）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２５５５８２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】F. Schulz, et al., Nanoscale (2016), Vol. 8, pp. 7296-7308
【非特許文献２】Samuel E. Lohse, et al., Chem. Mater(2013), Vol. 25, pp1250-1261
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、金ナノ粒子の表面から、ハロゲン化第四級アンモニウムを除去することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、ハロゲン化第四級アンモニウムの金ナノ粒子表面への結合力要因となっている金及び／又は銀のハロゲン化物を溶解させるための添加物を用いることにより解決できることが見出された。本発明は、以下の〔１〕〜〔１６〕に関するものである。
【００１０】
〔１〕金ナノ粒子の懸濁液であって、当該金ナノ粒子の表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量が低減されていることを特徴とする、金ナノ粒子の懸濁液。
〔２〕金ナノ粒子の懸濁液であって、当該金ナノ粒子の表面上に（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を実質的に有さないことを特徴とする、金ナノ粒子の懸濁液。
〔３〕飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて３．４ ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、１００ｍＶ以下である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔４〕飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて３．４ｍＪ／ｃｍ2を超え１９ ｍＪ／ｃｍ2以下のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、１００ｍＶ以下である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔５〕飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて１９ｍＪ／ｃｍ2を超え３９ ｍＪ／ｃｍ2以下のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、１０００ｍＶより低い、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔６〕飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて１９ｍＪ／ｃｍ2を超え３９ ｍＪ／ｃｍ2以下のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、１００ｍＶ以下である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔７〕前記金ナノ粒子が、球状、多面体状、立方体状、双錐状、棒状又は板状の形状を有する、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔８〕前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオンが、Ｎ+（Ｒ）4（各Ｒは、それぞれ独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖アルキル基から選択される）で表される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔９〕前記（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物が、金及び／又は銀の臭化物又は塩化物である、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液。
〔１０〕前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液の乾燥物。
〔１１〕前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液の製造方法であって、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を表面上に有する金ナノ粒子を含む懸濁液に、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドを添加して、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程を含むことを特徴とする、金ナノ粒子の懸濁液の製造方法。
〔１２〕前記金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物が、チオシアン酸、チオ硫酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸及びこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つである、前記〔１１〕に記載の金ナノ粒子の懸濁液の製造方法。
〔１３〕前記金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物が、チオシアン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム又はクエン酸である、前記〔１２〕に記載の金ナノ粒子の懸濁液の製造方法。
〔１４〕前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程の前に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、及び／又はチオール基を有する化合物を前記金ナノ粒子の表面に付着させる工程を更に含む、前記〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の金ナノ粒子の懸濁液の製造方法。
〔１５〕前記チオール基を有する化合物が、チオール化２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン又はチオール化ポリエチレングリコールである、前記〔１４〕に記載の金ナノ粒子の懸濁液の製造方法。
〔１６〕（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を金ナノ粒子の表面から除去する方法であって、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を表面上に有する金ナノ粒子を含む懸濁液に、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドを添加して、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、金ナノ粒子の表面からハロゲン化第四級アンモニウムが除去され、金ナノ粒子の医療分野への応用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＴＡＢの金ナノ粒子表面への結合態様を示す。
【図２】金ナノロッド懸濁液Ａの２０倍希釈液の吸収スペクトルを示す。
【図３】金ナノロッド懸濁液Ａの透過走査電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）像を示す。
【図４】金ナノロッド懸濁液Ｅ（比較例４）のＴＯＦ−ＭＳスペクトル（ポジティブイオンモード）を示す。
【図５】金ナノロッド懸濁液Ｇ（実施例２）のＴＯＦ−ＭＳスペクトル（ポジティブイオンモード）を示す。
【図６】金ナノロッド懸濁液Ｃ（比較例２）のＴＯＦ−ＭＳスペクトル（ネガティブイオンモード）を示す。
【図７】金ナノロッド懸濁液Ｇ（実施例２）のＴＯＦ−ＭＳスペクトル（ネガティブイオンモード）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、ハロゲン化第四級アンモニウムの金ナノ粒子表面への結合態様を検討した。その結果、例えば金ナノ粒子の製造にヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）及び硝酸銀を使用した場合には、図１に示すように、臭化物イオンは、金ナノ粒子表面で、銀イオンだけでなく金イオンとも反応して金の臭化物及び銀の臭化物を形成し、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオンは、金の臭化物及び銀の臭化物を介して金ナノ粒子表面に結合していることを見出した。
【００１４】
金ナノ粒子表面のハロゲン化第四級アンモニウムを除去するためには、金及び／又は銀のハロゲン化物を介して金ナノ粒子表面に結合している（Ａ）第四級アンモニウムカチオン、及びハロゲン化第四級アンモニウムの金ナノ粒子表面への結合力要因となっている（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の除去が必要である。しかし、金ナノ粒子表面に吸着している金及び／又は銀のハロゲン化物は水へほとんど溶解しないので、除去が困難である。本発明者らは、金及び／又は銀のハロゲン化物を溶解させるための特定の添加物を用いることにより、金ナノ粒子の表面から（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を除去することができることを見出した。
【００１５】
本発明は、表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量が低減されている金ナノ粒子の懸濁液に関する。
【００１６】
金ナノ粒子とは、金から製造されたナノ粒子をいい、形状には特に限定はない。例えば、本発明の金ナノ粒子は、球状、多面体状、立方体状（ナノキューブ）、双錐状、棒状（ナノロッド）又は板状（ナノプレート）の形状を有し、金ナノロッド、金ナノキューブ、金ナノプレートであることが好ましい。
【００１７】
「ナノ粒子」とは、ナノメートル（ｎｍ）オーダーの大きさを持つ粒子のことで、例えば１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、好ましくは５ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の大きさの粒子である。粒子の大きさとは、粒子の最大長さを指す。金ナノ粒子の大きさは、例えば、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察、走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）観察、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行って計測してもよく、最大長さに関しては動的光散乱式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）で測定してもよい。ＳＥＭ観察写真、ＳＴＥＭ観察写真、及びＴＥＭ観察写真から金ナノ粒子の最大長さを計測する場合、任意の金ナノ粒子１００個について、各粒子の最大長さを計測した計１００点のデータの内、上位と下位の値１０％（１０個）を除いた８０点の平均値を用いてもよい。
【００１８】
本発明の金ナノ粒子は、局在表面プラズモン共鳴（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＬＳＰＲ）由来の光吸収特性を有する。金ナノ粒子の光吸収波長はその大きさや形状、アスペクト比（棒状粒子の場合、長軸と短軸の比、板状粒子の場合、平面最大長と厚さの比）、周囲の誘電率などで変化する。可視光領域に最大吸収波長を有する金ナノ粒子の懸濁液は様々な色調を呈する。例えば、金ナノロッドの場合、アスペクト比（長軸／短軸）が、１より大きく３以下であると、水分散液中において最大吸収波長を約５３０ｎｍ〜約６７０ｎｍの範囲で調節することができる。このような最大吸収波長を有する金ナノロッドの水懸濁液は赤色、マゼンタ、紫色、紺色、青色、シアン、薄水色の色調を呈する。また、金ナノプレートの場合、厚さが１０ｎｍで平均アスペクト比が、１より大きく１０以下であると、水懸濁液中における表面プラズモン共鳴による光吸収ピーク（最大吸収波長）を５５０ｎｍ以上〜７４０ｎｍの波長領域に調節することができる。このような最大吸収波長を有する金ナノプレートの水懸濁液は赤色、マゼンタ、紫色、紺色、青色、シアン、又は、薄水色の色調を呈する。上記、金ナノロッド及び金ナノプレートはアスペクト比を大きくすることで最大吸収波長の長波長シフトが可能なため、「生体の窓」と呼ばれる生体を透過する波長領域である６５０ｎｍ〜１０００ｎｍに最大吸収波長を調整することが可能である。本発明の金ナノ粒子は光熱変換能を有するため、薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）における薬剤担体として使用することで、光照射による熱の発生により薬剤を放出するシステムに使用可能である。また、光エネルギーを吸収した金ナノ粒子が熱を放出し、その熱による体積膨張で音響波が発生する「光音響効果」を利用した、光音響イメージング（フォトアコースティックイメージング：ＰＡＩ）における光熱変換素子として使用することも可能である。さらに、プラズモン支援光熱療法（例えば、がんの温熱療法：Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）の光熱変換素子として本発明の金ナノ粒子を使用することも可能である。
【００１９】
第四級アンモニウムカチオンは、式Ｎ+（Ｒ）4で表すことができる。各Ｒは、例えば、それぞれ独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖アルキル基から選択される。前記第四級アンモニウムカチオンの４種のＲの組み合わせは、例えば、炭素数１〜９（好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜３）の直鎖又は分枝鎖アルキル基（Ｒa）と炭素数１０〜２０（好ましくは１２〜１８、さらに好ましくは１４〜１７）の直鎖又は分枝鎖アルキル基（Ｒb）との組み合わせであってもよく、好ましくは２種のＲaと２種のＲbとの組み合わせ、さらに好ましくは３種のＲaと１種のＲbとの組み合わせである。このような第四級アンモニウムカチオンは、例えば、デシルトリメチルアンモニウムカチオン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン、又は、ヘプタデシルトリメチルアンモニウムカチオンであってもよい。第四級アンモニウムカチオンと共に前記ハロゲン化第四級アンモニウムを構成する対イオンとしては、このカチオンの対イオンとして通常採用されているものを特に制限なく用いることができ、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン又はヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンを採用してもよい。
【００２０】
ハロゲン化第四級アンモニウムを構成する前記ハロゲン化物イオンは、金ナノ粒子と反応して、金ナノ粒子表面に金のハロゲン化物を形成する。また、前記対イオンは、硝酸銀由来の銀イオンと反応して、金ナノ粒子表面に銀のハロゲン化物を形成する。
金又は銀のハロゲン化物としては、例えば、金又は銀の塩化物、臭化物又はヨウ化物等が挙げられる。
【００２１】
本発明の金ナノ粒子は、表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量が低減されており、ある態様では、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を実質的に有さない。「実質的に有さない」とは、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量が、金ナノ粒子がハロゲン化第四級アンモニウムに由来する細胞毒性を実質的に示さない量であるか、又は、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物が検出限界以下の量であることを意味する。
【００２２】
金ナノ粒子表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量は、例えば、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて第四級アンモニウムカチオンや金及び／又は銀のハロゲン化物を検出することにより測定することができる。具体的には、消光度に基づいて濃度を調整した金ナノ粒子懸濁液を試料プレートに滴下したものを測定試料とする。ところで、平行光線が物体中を透過するときの該物体の光吸収の強さを吸光度というが（狭義の吸光度）、その実測にあたっては、該物体の表面での反射又は散乱などによる光の損失も考慮する必要がある（広義の吸光度）。光の吸収、反射及び散乱などのあらゆる要因による光の損失の強度を意味する広義の吸光度を、本明細書では特に消光度という。
【００２３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いてポジティブイオンモードで表面支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＳＡＬＤＩ−ＭＳ）測定を行うことにより、金ナノ粒子表面上の第四級アンモニウムカチオンを検出することができ、ネガティブイオンモードでＳＡＬＤＩ−ＭＳ測定を行うことにより、金及び／又は銀のハロゲン化物を検出することができる。例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド由来のヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン（ＣＴＡ+）はｍ／ｚ ２８４付近、銀の臭化物（ＡｇＢｒ2-）はｍ／ｚ ２６７付近、金の臭化物（ＡｕＢｒ2-）はｍ／ｚ ３５６付近にピークが検出される。ラスタースキャン方式で試料中の複数箇所を測定後、平均化して得られるマススペクトルの検出ピークの高さ（検出強度）を評価する。検出ピークが低いと、第四級アンモニウムカチオン量や、金及び／又は銀のハロゲン化物量が少ないことを示していると言える。また、第四級アンモニウムカチオンは金及び／又は銀のハロゲン化物を介して金ナノ粒子表面に結合しているため、（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出ピークが低いと、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の両方の量が少ないことを示していると言える。
【００２４】
また、金ナノ粒子表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の量は、ハロゲン化第四級アンモニウムを検出することにより測定することもできる。すなわち、第四級アンモニウムカチオンは、金及び／又は銀のハロゲン化物を介して金ナノ粒子表面に結合しているため、検出されるハロゲン化第四級アンモニウムの量が、金ナノ粒子上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金又は銀のハロゲン化物の指標となる。検出されるハロゲン化第四級アンモニウムの量（検出強度）が低くなれば、金ナノ粒子表面上の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の両方の量が低減されていると言える。
【００２５】
本発明の金ナノ粒子は、例えば、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて３．４ ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定した場合、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、好ましくは１００ｍＶ以下、より好ましくは７５ｍＶ以下、更に好ましくは５０ｍＶ以下である。３．４ ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定した場合の（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が１００ｍＶ以下であれば、金ナノ粒子のハロゲン化第四級アンモニウムに由来する細胞毒性が十分に低いと言える。あるいは、３．４ｍＪ／ｃｍ2を超え１９ ｍＪ／ｃｍ2以下のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、好ましくは１００ｍＶ以下、より好ましくは７５ｍＶ以下、更に好ましくは５０ｍＶ以下であってもよく、１９ｍＪ／ｃｍ2を超え３９ ｍＪ／ｃｍ2以下のレーザー光強度で測定した場合、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の検出強度が、例えば１０００ｍＶより低く、好ましくは１００ｍＶ以下、より好ましくは７５ｍＶ以下、更に好ましくは５０ｍＶ以下であってもよい。一般的にレーザー光強度を高くすると検出強度も高くなるが、偽陽性が生じやすいので、３．４ ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定するのが好ましい。
【００２６】
本発明の金ナノ粒子の懸濁液の分散媒体としては、例えば、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサノール、エチレングリコール等のアルコール類、キシレンやトルエン等の芳香族炭化水素、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、酢酸エチルや酢酸ブチル等のエステル類、エチレングリコールモノブチルエーテル等のエーテル等、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、あるいはこれらの混合物が代表的なものとして挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明はまた、金ナノ粒子の懸濁液の乾燥物に関する。金ナノ粒子の乾燥物は、例えば懸濁液の溶媒を減圧下で濃縮、乾燥することで得られる。乾燥物に乾燥前の懸濁液量と同量の溶媒を加えることで乾燥前の懸濁液に戻すことが可能である。
【００２８】
本発明の金ナノ粒子の懸濁液は、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を表面上に有する金ナノ粒子を含む懸濁液に、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドを添加して、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程を含む方法により製造することができる。
【００２９】
原料となる（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を表面上に有する金ナノ粒子は公知であり、市場において容易に入手することができるか、又は調製可能である。市販品としては、Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ（シグマアルドリッチ社）等が挙げられる。また、例えば、特許第４５１２８７６号に記載の方法により金ナノロッドを調製することができる。
【００３０】
上記原料となる金ナノ粒子の懸濁液の分散媒体としては、本発明の金ナノ粒子の懸濁液に用いる分散媒体と同様のものを用いることができる。
【００３１】
上記原料となる金ナノ粒子の懸濁液に金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物を添加することにより、金ナノ粒子表面の金及び／又は銀のハロゲン化物を溶解させ、除去することができる。前記化合物としては、例えば、チオシアン酸、チオ硫酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸及びこれらの塩等が挙げられる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。チオシアン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸が好ましい。これらの化合物は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物に代えて、ジメチルスルホキシドを懸濁液に添加してもよい。あるいは、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物とジメチルスルホキシドとを組み合わせて用いてもよい。ジメチルスルホキシドは、金及び／又は銀のハロゲン化物の溶解度を高めることができる。
【００３３】
懸濁液への金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドの添加方法には、特に制限はない。例えば、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物を水溶液として添加してもよく、ジメチルスルホキシド溶液として添加してもよい。また、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドを懸濁液に直接添加してもよく、懸濁液を遠心分離後、上清を除去し、前記化合物の溶液及び／又はジメチルスルホキシドを添加してもよい。
【００３４】
本発明の製造方法は、任意に、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程の前に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及び／又はチオール基を有する化合物を前記金ナノ粒子の表面に付着させる工程を含んでもよい。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及び／又はチオール基を有する化合物を金ナノ粒子の表面に付着させておくと、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を除去した後の金ナノ粒子の凝集を抑制することができ、また、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の金ナノ粒子への再結合を防止することができる。
【００３５】
金ナノ粒子を医薬用途に用いるためには、チオール基を有する化合物は、生体適合性を有することが好ましい。生体適合性を有するチオール基を有する化合物としては、例えば、チオール化２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：ＭＰＣ−ＳＨ）、チオール化ポリエチレングリコール（Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ−ＳＨ）、アルカンチオールグルタチオン、カプトプリル、システイン等が挙げられる。好ましくは、チオール化２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン又はチオール化ポリエチレングリコールである。
【００３６】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及び／又はチオール基を有する化合物を金ナノ粒子の表面に付着させる方法には特に制限はない。例えば、金ナノ粒子の懸濁液にチオール基を有する化合物を直接添加してもよく、あるいは、金ナノ粒子の懸濁液を遠心分離後、上清を除去し、チオール基を有する化合物の水溶液に再分散させてもよい。
【００３７】
本発明はまた、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を金ナノ粒子の表面から除去する方法に関する。前記方法は、（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物を表面上に有する金ナノ粒子を含む懸濁液に、金及び／又は銀のハロゲン化物とキレートを形成する化合物及び／又はジメチルスルホキシドを添加して、前記（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の少なくとも一部を前記金ナノ粒子表面から除去する工程を含む。
【００３８】
本発明の金ナノ粒子は、細胞毒性が高い第四級アンモニウムカチオンを含まないため、薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）における薬剤担体、光音響イメージング（フォトアコースティックイメージング：ＰＡＩ）における光熱変換素子、プラズモン支援光熱療法の光熱変換素子、光線力学的治療法(ＰＤＴ)の光増感剤、プラズモン吸収の変化を利用した診断試薬等の生物医学、診断分野に好適に用いることができる。
【００３９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
１．金ナノロッド懸濁液の合成（金ナノロッド懸濁液Ａの作製）
濃度０.５０Ｍのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）水溶液５ｍＬに濃度２４ｍＭの塩化金酸水溶液０．５ｍＬ、アセトン０．１ｍＬ、１０ｍＭの硝酸銀水溶液０．５ｍＬを加えて反応溶液とした。この反応溶液に４０ｍＭのアスコルビン酸（ＡＳ）水溶液を０．５ｍＬ添加して化学還元を行った。ＡＳ水溶液を添加した直後に反応溶液はオレンジ色から透明な溶液に変化した。透明になった溶液を容量１０ｍＬのビーカーに入れ、ＵＶ照射器(高圧水銀ランプ)の紫外線を合成溶液に５分間照射した。光照射後、そのまま静置して１時間後に保存容器に移した。得られた懸濁液１ｇを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を除去、水１ｇで再分散し、金ナノロッド懸濁液Ａを作製した。金ナノロッド懸濁液Ａの金濃度は１．８ｍＭであった。
【００４１】
金ナノロッド懸濁液Ａを水で２０倍に希釈し、吸収スペクトル測定試料溶液とした。この希釈した金ナノロッド懸濁液Ａの金濃度は０．０９ｍＭであった。この溶液の吸収スペクトルを図２に示す。吸収スペクトルの測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。図２の吸収スペクトルにおいて、最大吸収波長は９０４ｎｍ、最大吸収波長における消光度は１．２８である。
【００４２】
金ナノロッド懸濁液Ａの透過走査電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）像を図３に示す。図３に示される金ナノロッド懸濁液Ａ中の金ナノ粒子の寸法は、平均で長軸４５ｎｍ、短軸９ｎｍであった。
【００４３】
２．金ナノロッド懸濁液の表面処理
２−１．チオール基末端ポリエチレングリコール処理（金ナノロッド懸濁液Ｂの作製）
金ナノロッド懸濁液Ａ １ｇへ濃度０．０５％の末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＳＨ（分子量：２０，００００、ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）の水溶液を０．０１ｇ添加し、室温下で１２時間静置した。得られた懸濁液を１０，０００ｒｐｍで３時間遠心分離後、上清を除去し、超純水１ｇで再分散した。得られた懸濁液を再度遠心分離後、上清を除去し、純水１ｇで再分散し、金ナノロッド懸濁液Ｂを作製した。
【００４４】
２−２．ポリスチレンスルホン酸ナトリウム処理（金ナノロッド懸濁液Ｄの作製）
金ナノロッド懸濁液Ａ １ｇを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を除去し、超純水１ｇで再分散した。得られた金ナノロッド懸濁液Ｃを１０，０００ｒｐｍで再度１０分間遠心分離後、上清を除去、０．５％のＰｏｌｙ（ｓｏｄｉｕｍ−ｐ−ｓｔｙｒｅｎｓｌｕｆｏｎａｔｅ）（ＰＳＳＳ）１ｇで再分散した。得られた懸濁液を１５，０００ｒｐｍで再度１０分間遠心分離後、上清を除去、０．５％のＰｏｌｙ（ｓｏｄｉｕｍ−ｐ−ｓｔｙｒｅｎｓｌｕｆｏｎａｔｅ）（ＰＳＳＳ）１ｇで再分散した。上記の遠心分離とＰＳＳＳ再分散操作を合計３回実施し、金ナノロッド懸濁液Ｄを作製した。
【００４５】
２−３．チオール化２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ−ＳＨ）処理（金ナノロッド懸濁液Ｅの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｄ １ｇを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＭ  ＭＰＣ−ＳＨ水溶液１ｇで再分散した。上記の遠心分離とＭＰＣ−ＳＨ水溶液での再分散操作を合計２回実施し、金ナノロッド懸濁液Ｅを作製した。
【００４６】
３．（Ａ）第四級アンモニウムカチオン及び／又は（Ｂ）金及び／又は銀のハロゲン化物の除去・低減
３−１．チオ硫酸ナトリウム水溶液を使用したヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン（ＣＴＡ+）、臭化金および臭化銀除去、低減法
３−１−１．実施例１：金ナノロッド懸濁液Ｂ中のＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減（金ナノロッド懸濁液Ｆの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｂ  １ｇを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム水溶液１ｇで再分散した。再分散後、直ちに上記条件で遠心分離後、上清を除去し、純水１ｇで再分散した。得られた懸濁液を上記条件で遠心分離後、上澄みを０．９５ｇ除去し、金ナノロッド懸濁液Ｆを作製した。
【００４７】
３−１−２．実施例２：金ナノロッド懸濁液Ｅ中のＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減（金ナノロッド懸濁液Ｇの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｅ  １ｇを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム水溶液１ｇで再分散した。再分散後、直ちに上記条件で遠心分離後、上清を除去、純水１ｇで再分散し、金ナノロッド懸濁液Ｇを作製した。
【００４８】
３−２．実施例３：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用したＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減法（金ナノロッド懸濁液Ｈの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｂ  １ｇを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、上清を除去し、ＤＭＳＯ１ｇで再分散した。再分散後、直ちに上記条件で遠心分離後、上清を除去し、純水１ｇで再分散した。得られた懸濁液を上記条件で遠心分離後、上澄みを０．９５ｇ除去し、金ナノロッド懸濁液Ｈを作製した。
【００４９】
３−３．実施例４：クエン酸三ナトリウム水溶液を使用したＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減法（金ナノロッド懸濁液Ｉの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｂ  １ｇを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＭ クエン酸三ナトリウム水溶液１ｇで再分散した。再分散後、直ちに上記条件で遠心分離後、上清を除去し、純水１ｇで再分散した。得られた懸濁液を上記条件で遠心分離後、上澄みを０．９５ｇ除去し、金ナノロッド懸濁液Ｉを作製した。
【００５０】
３−４．クエン酸のＤＭＳＯ溶液を使用したＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減法３−４−１．実施例５：クエン酸濃度が２ｍＭのＤＭＳＯ溶液を使用した懸濁液Ｂ中のＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減（金ナノロッド懸濁液Ｊの作製）
金ナノロッド懸濁液Ｂ  １ｇを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、上清を除去し、クエン酸濃度が２ｍＭのＤＭＳＯ溶液１ｇで再分散した。再分散後、直ちに上記条件で遠心分離後、上清を除去し、純水１ｇで再分散した。上記の遠心分離と純水での再分散操作を合計２回実施した。得られた懸濁液を上記条件で遠心分離後、上澄みを０．９５ｇ除去し、金ナノロッド懸濁液Ｊを作製した。
【００５１】
３−４−２．実施例６：クエン酸濃度が１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液を使用した懸濁液Ｂ中のＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減（金ナノロッド懸濁液Ｋの作製）
実施例５のクエン酸濃度を１０ｍＭとして、同様に実施し、金ナノロッド懸濁液Ｋを作製した。
【００５２】
３−４−３．実施例７：クエン酸濃度が１００ｍＭのＤＭＳＯ溶液を使用した懸濁液Ｂ中のＣＴＡ+、臭化金および臭化銀除去、低減（金ナノロッド懸濁液Ｌの作製）
実施例５のクエン酸濃度を１００ｍＭとして、同様に実施し、金ナノロッド懸濁液Ｌを作製した。
【００５３】
４．比較例
４−１．比較例１：金ナノロッド合成（金ナノロッド懸濁液Ａの作製）
金ナノロッドの合成液である懸濁液Ａを比較例１とした。
【００５４】
４−２．比較例２：金ナノロッド懸濁液Ａの超純水洗浄（金ナノロッド懸濁液Ｃの作製）  ２−２で作製した金ナノロッド懸濁液Ａ １ｇを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を除去、超純水１ｇで再分散して作製した懸濁液Ｃを比較例２とした。
【００５５】
４−３．比較例３：金ナノロッド懸濁液Ａのチオール基末端ポリエチレングリコール処理（金ナノロッド懸濁液Ｂの作製）
２−１で作製した金ナノロッド懸濁液Ｂを比較例３とした。
【００５６】
４−４．比較例４：金ナノロッド懸濁液Ｄのチオール基末端２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ−ＳＨ）処理（金ナノロッド懸濁液Ｅの作製）
２−３で作製した金ナノロッド懸濁液Ｅを比較例４とした。
【００５７】
４−５．比較例５：金ナノロッド懸濁液Ａのホスファチジルコリン修飾（金ナノロッド懸濁液Ｍの作製）
金ナノロッド懸濁液Ａ １ｇに濃度１０ｍＭのＬ-α-ホスファチジルコリン（ナカライテスク株式会社製）が溶解したクロロホルム溶液０．５ｍＬを注入、振とうして均一にした後、二層に分離するまで静置した。上澄み液を取り出し、濃度１０ｍＭのホスファチジルコリンが溶解したクロロホルム溶液０．５ｍＬへ注入した。この操作を二回繰り返した。得られた金ナノロッド懸濁液を６，２００ｒｐｍ（２０００×ｇ）、１０分で遠心分離し、上澄み液を除去後、超純水６０μＬで再分散し、金ナノロッド懸濁液Ｍを作製した。
金ナノロッド懸濁液Ｍを比較例５とした。
【００５８】
作製した懸濁液を以下の表１にまとめた。
【表１】
2020050960.tif 000003
【００５９】
５．ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン（ＣＴＡ+）、臭化金および臭化銀の測定
５−１．試料調製
実施例、比較例で調製した各種金ナノロッド懸濁液の吸収特性を紫外可視近赤外分光光度計で測定し、最大吸収波長における消光度が０．２になるように濃度を調整した。濃度調整した金ナノロッド懸濁液１ｍＬをサンプルチューブに移し、懸濁液中の金ナノロッドを遠心分離によってサンプルチューブ下部に落とした。金ナノロッドを除去しないように上澄み液を９８０μＬ除去し、懸濁液を２０μＬに濃縮した。
【００６０】
５−２．表面支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＳＡＬＤＩ−ＭＳ）用測定プレートの調製
キャリブレーション試料にはα−シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）とアンジオテンシンＩＩを用いた。測定試料には、上述の２０μＬに濃縮した懸濁液の内から５μＬを試料プレート上に滴下したものを用いた。
【００６１】
５−３．ＳＡＬＤＩ−ＭＳ測定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて、試料プレート上に滴下した金ナノロッド試料中をラスタースキャン方式で複数箇所測定した。得られたデータを平均化し、マススペクトルを得た。
【００６２】
装置：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計 (ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｉｎｃ.)
モード：ポジティブイオンモード
（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン測定時に設定）
ネガティブイオンモード
（臭化金および臭化銀測定時に設定）
スキャンモード：Ｒａｓｔｅｒ ｓｃａｎ
Ｗｉｄｔｈ：１０００ｕｍ
Ｈｅｉｇｈｔ：１０００ｕｍ
Ｓｐａｃｉｎｇ：１００ｕｍ
Ｐｏｉｎｔｓ：１２１
レーザーパワー（ＬＰ）：任意
例）ＬＰ  ５：レーザー光強度３．４ｍＪ／ｃｍ2
ＬＰ２５：レーザー光強度１９ｍＪ／ｃｍ2
ＬＰ５０：レーザー光強度３９ｍＪ／ｃｍ2
Ｐｒｏｆｉｌｅ：１２１
Ｓｈｏｔｓ：５
Ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｆｏｒ：１０００
Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ：１０−２０００
【００６３】
５−４．ＳＡＬＤＩ‐ＭＳ測定結果
５−４−１．ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン（ＣＴＡ+）測定結果
ＳＡＬＤＩ‐ＭＳ測定により得られた各懸濁液のヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン（ｍ／ｚ ２８４）由来のピーク強度を表２に示す。
【００６４】
【表２】
2020050960.tif 000004
【００６５】
比較例１〜５で作製した金ナノロッド懸濁液を、３．４ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定した場合、強い強度でＣＴＡ+のピークが検出され、金ナノロッド上にＣＴＡ+が存在していることが確認された。特に、比較例１及び２で作製した金ナノロッド懸濁液については、検出強度はＭＡＬＤＩ装置の最大ピーク検出強度（２０００ｍＶ）以上となり、正確なピーク強度の算出はできなかった。一例として、図４に、比較例４の懸濁液Ｅの測定スペクトルを示す。懸濁液ＥにおけるＣＴＡ+の検出強度は１２００ｍＶであった。一方、実施例１〜７で作製した金ナノロッド懸濁液を、３．４ｍＪ／ｃｍ2のレーザー光強度で測定した場合、ＣＴＡ+のピークはまったく検出されなかった（１ｍＶ以下）。一例として、図５に、実施例２の懸濁液Ｇの測定スペクトルを示す。これらの結果より、実施例では、金ナノロッドの表面上のＣＴＡ+が低減されており、当該金ナノロッドの表面上には、ＣＴＡ+が実質的に存在していないことがわかった。実施例の金ナノロッドは、細胞毒性を有さないことが期待できる。更に、実施例３〜７の金ナノロッド懸濁液については、３９ｍＪ／ｃｍ2という比較的強いレーザー光で測定しても、ＣＴＡ+のピークが１０００ｍＶを下回っており、ジメチルスルホキシド処理及び／又はクエン酸溶液処理によれば、極めて高い効率でＣＴＡ+を除去できることがわかった。
【００６６】
５−４−２．臭化金（ＡｕＢｒ2-）および臭化銀（ＡｇＢｒ2-）測定結果
比較例２の懸濁液Ｃをレーザー光強度３．４ｍＪ／ｃｍ2で測定した場合、臭化金（ＡｕＢｒ2-：ｍ／ｚ ３５６．７）および臭化銀（ＡｇＢｒ2-：ｍ／ｚ ２６６．７）の検出強度はいずれも１５００ｍＶ／ｃｍ2であった（図６）。一方、実施例２の懸濁液Ｇをレーザー光強度３．４ｍＪ／ｃｍ2で測定した場合、臭化金（ＡｕＢｒ2-：ｍ／ｚ ３５６付近）および臭化銀（ＡｇＢｒ2-：ｍ／ｚ ２６７付近）のピークは検出できず（１ｍＶ以下）、レーザー光強度を２３ｍＪ／ｃｍ2まで上げて測定しても、臭化金および臭化銀は検出されなかった（図７）。これらの結果より、本発明の懸濁液Ｇにおいては、金ナノロッドの表面上の臭化金及び臭化銀が低減されており、当該金ナノロッドの表面上には、臭化金及び臭化銀が実質的に存在していないことがわかった。
【００６７】
６．細胞毒性試験
６−１．試料調製
６−１−１．金ナノロッド懸濁液Ｋの濃度調整
株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で吸収スペクトルを測定した場合に、１００倍希釈液の最大吸収波長における消光度が０．４９５になるように、金ナノロッド懸濁液Ｋを超純水で希釈して、金濃度を調整した。金濃度が０．０９ｍＭ（１７．７ｐｐｍ）である金ナノロッド懸濁液Ａの消光度の測定値が１．２８であったことから、１００倍希釈前の金ナノロッド懸濁液Ｋの金濃度は、６８８ｐｐｍと算出される。
【００６８】
６−１−２．金ナノロッド懸濁液Ｋ含有培地懸濁液の調製
濃度５％のＮｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＢＣＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（５％  ＮＢＣＳ／ＤＭＥＭ培地）で金濃度６８８ｐｐｍの金ナノロッド懸濁液Ｋを希釈し、金濃度６９ｐｐｍ、３４ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、８．６ｐｐｍ、４．３ｐｐｍ、２．２ｐｐｍ、１．１ｐｐｍ又は０．５４ｐｐｍの金ナノロッド懸濁液Ｋ含有培地懸濁液を調製した。
【００６９】
６−１−３．陽性対照群の調製
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を５％  ＮＢＣＳ／ＤＭＥＭ培地で溶解し、ＳＬＳ濃度２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ又は１．６μｇ／ｍＬの陽性対照群を調製した。
【００７０】
６−２．ニュートラルレッド法による細胞毒性試験
マウス全胎児由来のＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１（ＢＡＬＢ／３Ｔ３）細胞（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク製）を９６ウェルプレートに１ウェルあたり３×１０3細胞／１００μＬ、ブランクには１０％ ＮＢＣＳ／ＤＭＥＭ培地を１ウェルあたり１００μＬ添加した。陽性対照試験用と金ナノロッド試験用の２プレートを作製し、ＣＯ2インキュベータ中（３７℃、５％ ＣＯ2）で２４時間培養した。
【００７１】
播種翌日、各ウェルから培地を除去し、各濃度の金ナノロッド懸濁液Ｋ含有培地懸濁液１００μＬ、陽性対照群１００μＬ、陰性対照群として５％  ＮＢＣＳ／ＤＭＥＭ培地１００μＬ、ブランク用に５％  ＮＢＣＳ／ＤＭＥＭ培地１００μＬを所定の位置に添加した（１プレート当たり、金ナノロッド懸濁液Ｋ含有培地懸濁液又は陽性対照群は各濃度についてｎ＝６、陰性対照群はｎ＝１２、ブランクはｎ＝１２で実施）。４８時間後、試験液を除き、各ウェルを温めたりん酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（−）２５０μＬで洗浄した。１ウェルあたり２５０μＬのニュートラルレッド（ＮＲ）溶液を添加し、更に３時間培養して生細胞にＮＲを取り込ませた。ＮＲ取り込み終了後、ＮＲ溶液を除き、温めたＰＢＳ（−）２５０μＬで洗浄した。抽出液を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温下でプレートを２０分間振盪し、ウェル内の色を均一にしてから、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０）を使用して５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７２】
６−３．評価
＜細胞生存率の算出＞
ブランクの吸光度の平均値をバックグラウンドとし、金ナノロッド懸濁液Ｋ含有培地懸濁液及び陽性対照群の各試験試料における吸光度（測定値からバックグラウンドの値を差し引いた値）について各濃度での平均値（ｎ＝６）を求め、それの陰性対照群の吸光度（測定値からバックグラウンドの値を差し引いた値）の平均値（ｎ＝１２）に対する割合を、細胞生存率（％）として算出した。
細胞生存率（％）＝（試験試料吸光度540÷陰性対照吸光度540）×１００
試験試料吸光度540：（試験試料の吸光度−バックグラウンドの値）の平均値
（ｎ＝６）
陰性対照吸光度540：（陰性対照の吸光度−バックグラウンドの値）の平均値
（ｎ＝１２）
ただし、細胞生存率がマイナスの値を示した場合は、細胞生存率を０とした。
【００７３】
６−４．試験結果
６−４−１．陽性対照試験結果
陽性対照試験結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
2020050960.tif 000005
※４．陰性対照群
【００７５】
６−４−２．金ナノロッド懸濁液Ｋ試験結果
金ナノロッド懸濁液Ｋ試験結果を表４に示す。
【００７６】
【表４】
2020050960.tif 000006
※５.陰性対照群
【００７７】
ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を用いるニュートラルレッド法による細胞毒性試験において、金ナノロッド懸濁液Ｋには細胞毒性はないことが示された。このように、本発明の金ナノ粒子は、第四級アンモニウムが除去されたことによって、細胞毒性が十分に低くなり、生体への適用など医療分野への応用が可能になったと言える。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の金ナノ粒子は、細胞毒性が高い第四級アンモニウムカチオンを含まないため、薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）における薬剤担体、光音響イメージング（フォトアコースティックイメージング：ＰＡＩ）及び、プラズモン支援光熱療法（例えば、がんの温熱療法：Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）の光熱変換素子として有用である。
【図１】
2020050960.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020050960.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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