(57)【要約】【課題】乳酸菌、それを含む組成物、およびアレルギー性喘息を改善するためのその使用に関する。【解決手段】本発明は、ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２、それを含む組成物、および喘息の改善、特にアレルギー性喘息を改善するための気道抵抗の低下、血清中の非特異的および特異的ＩｇＥレベルの低下、気管支収縮の緩和および肝組織間質液中のＧＳＨレダクターゼレベルの増加のためのその使用を提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸耐性、胆汁耐性および／または熱耐性であるビフィドバクテリウム  ラクティスであって、ミリリットルあたりのコロニー形成単位は、ｐＨ３．２から２．０の培地では約５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ、０．３％胆汁酸塩と混合した液体培地では約５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌ、および／または所望の温度で約０〜１５分間加熱された液体培地では５ｘ１０７から５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌである、ビフィドバクテリウム  ラクティス。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウム  ラクティスはＧＫＫ２であり、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＭＣＣ番号１５２０５）、請求項1に記載のビフィドバクテリウム  ラクティス。
【請求項３】
中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（番号１５２０５）ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を含むアレルギー性喘息改善用組成物。
【請求項４】
中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（番号１５２０５）ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２の活性物質を含む、アレルギー性喘息を改善するための組成物。
【請求項５】
前記活性物質が以下の方法、すなわち、
（ａ）固体培地に乳酸菌をストリーキングして単一コロニーを取得し、
（ｂ）ステップ（ａ）で培養した乳酸菌の単一コロニーを液体培養用の液体培地に接種すること
により調製される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記方法は、
（ｃ）ステップ（ｂ）で培養された液体培養物を遠心分離して、細菌ペレットを取得するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記細菌ペレットを凍結乾燥するステップと、をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ステップ（ｂ）は、３０〜５０℃で、０〜１ｖｖｍの窒素または二酸化炭素中で実行され、１０〜１００ｒｐｍで回転され、および／または１６〜２４時間インキュベートされる、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ステップ（ｄ）での前記凍結乾燥の温度は−１９６〜−４０℃である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される添加剤を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤の形態をとる、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
アレルギー性喘息改善のための請求項３〜１１のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
【請求項１３】
アレルギー性喘息を改善するために前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与された対象は、前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与されなかった対象よりも低い気道抵抗を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アレルギー性喘息を改善するために前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与された対象は、前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与されなかった対象よりも低いレベルの血清中の非特異的ＩｇＥ抗体を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アレルギー性喘息を改善するために前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与された対象は、前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与されなかった対象よりも低いレベルの血清中の特異的ＩｇＥ抗体を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
アレルギー性喘息を改善するために前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与された対象は、前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与されなかった対象よりも低い気管支収縮を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
アレルギー性喘息を改善するために前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与された対象は、前記ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を投与されなかった対象よりも高いレベルの肝組織間質液中のＧＳＨレダクターゼを示す、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、それを含む組成物、およびアレルギー性喘息を改善するためのその使用に関する。より具体的には、本発明は、ビフィドバクテリウム  ラクティスを含む組成物、細菌の製造方法、および被験者に投与した際に、気道抵抗を低下させ、血清中の非特異的および特異的ＩｇＥレベルを低下させ、気管支収縮を緩和し、ＧＳＨレダクターゼレベルを上昇させ、肝組織間質液中のＧＳＨレダクターゼレベルを増加させ、それによりアレルギー性喘息を改善するためのこの細菌の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー反応
アレルギー反応は、通常無害な物質に対する過敏性免疫反応である。そのような反応はさらに、急性または慢性炎症などの有害な症状、またはより深刻な場合には臓器機能障害を引き起こす可能性がある。一般的なアレルギー疾患には、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、麻疹、アトピー性皮膚炎が含まれる。
【０００３】
アレルギー性喘息
アレルギー性喘息は気道の疾患であり、その有病率は世界的な環境の悪化とともに上昇し続けている。アレルギー性喘息の最も一般的な兆候には、呼吸困難、咳、胸の圧迫感、喘鳴が含まれる。このような病気は、より深刻な場合には致命的であり得る。さまざまな手段で人体に入ると、環境アレルゲンは最初に感作のプロセスを経る。つまり、アレルゲンは人体に接触するとすぐに抗原特異的な細胞に結合する。次に、抗原特異的細胞はアレルゲンをＴリンパ球に提示する。Ｔリンパ球はＴｈ２細胞に分化し、さまざまな炎症性サイトカインを放出する。同時に、Ｂリンパ球はアレルゲンによって活性化され、ＩｇＥ抗体（免疫グロブリンＥ）を産生する。ＩｇＥ抗体は血流を介して組織に入り、マスト細胞の表面に結合するため、個人はアレルギー反応を起こしやすくなる。人体が再び同じアレルゲンにさらされると、アレルゲンはマスト細胞表面にあるＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞が活性化されてヒスタミン、ロイコトリエン（ＬＴ）、インターロイキン（ＩＬ）などの炎症性サイトカインを放出し、直接または間接的に気道の炎症反応を引き起こす。これらの反応が起こると、気道が膨らみ、周囲の平滑筋が収縮し、気道が狭くなる。気道が粘液腺から分泌された蓄積粘液で満たされると、急激な気道収縮とそれに続く喘息が発生する。
【０００４】
グルタチオン
グルタチオン（ＧＳＨ）は、グルタミン酸、システイン、およびγ−アミド結合およびチオール部分を有するグリシンから構成されるトリペプチドである。ＧＳＨはほとんどすべての細胞株に存在し、正常な免疫機能の維持に役立つ。ＧＳＨレダクターゼは、ＧＳＳＧをＧＳＨに還元し、それによって免疫系を強化するために体内のＧＳＨのレベルを増加させることができる。
【０００５】
ビフィドバクテリウム
ビフィドバクテリウムは、グラム陽性、非運動性、桿状、およびしばしば分岐した嫌気性細菌の属である。それらは、人間や動物の胃腸管、膣、口に遍在する。１８９９年、健康な乳児の糞から最初に分離され、後に、特定のビフィドバクテリウム株が食品、医薬品、飼料に添加されるプロバイオティクスとして使用できることが発見された。
【０００６】
研究は、特定の乳酸菌株がＩＦＮ−γの発現を増加させ、アレルギー関連ＩＬ−４、ＩＬ−５および特定のＩｇＥの発現レベルを低下させ、それによりＴｈ２免疫応答を下方制御し、アレルギー応答を軽減し得ることを示唆した。他の研究では、乳酸菌を４ヶ月連続で摂取すると、アレルギーの素因を持つ人々のＩＦＮ−γ分泌が増加し、アレルギー症状が改善することが示唆された。近年、プロバイオティクスの早期摂取が、母乳で育てられた乳児のアトピー性皮膚炎の症状の緩和及び発生の低減をもたらし、さらにアレルギー性喘息の発生を減らす可能性があることを示す臨床研究がある。さらに、学者はアシドフィルス菌を使用して二重盲検試験を実施し、アシドフィルス菌がダニや花粉に関連するアレルギー性喘息の症状の緩和に役立つことを発見した。しかし、上記の細菌はどれも気道過収縮を緩和することができない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、酸耐性、胆汁耐性および／または熱耐性であるビフィドバクテリウム  ラクティスを提供する。ミリリットルあたりのコロニー形成単位は、ｐＨ３．２から２．０の培地では約５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ、０．３％胆汁酸塩と混合した液体培地では約５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌ、および／または所望の温度で０〜１５分間加熱された液体培地では５ｘ１０７から５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌである。
【０００８】
好ましくは、株はビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２であり、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（ＣｈｉｎａＧｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＭＣＣ番号１５２０５）。
【０００９】
本発明は、ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２を含むアレルギー性喘息改善用組成物を提供する。この菌株は、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（ＣＧＭＣＣ番号１５２０５）。
【００１０】
本発明はまた、ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２の活性物質を含む、アレルギー性喘息を改善するための組成物を提供する。ＧＫＫ２は、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（ＣＧＭＣＣ番号１５２０５）。
【００１１】
好ましくは、活性物質は以下の方法により調製される。
（ａ）ビフィズス菌株を寒天プレートにストリーキングして、単一コロニーを生成し、
（ｂ）ステップ（ａ）で培養した乳酸菌の単一コロニーを液体培養用の液体培地に接種する。
【００１２】
好ましくは、この方法はさらに、
（ｃ）ステップ（ｂ）で培養された液体培養物を遠心分離して、細菌ペレットを取得するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた細菌ペレットを凍結乾燥するステップとを含む。
【００１３】
好ましくは、ステップ（ｂ）は、３０〜５０℃で、０〜１ｖｖｍの窒素または二酸化炭素中で実行され、１０〜１００ｒｐｍで回転し、および／または１６〜２４時間インキュベートする。
【００１４】
好ましくは、ステップ（ｄ）での凍結乾燥の温度は−１９６〜−４０℃である。
好ましくは、組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される添加剤を含む。
【００１５】
好ましくは、組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である。
好ましくは、組成物は、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤の形態をとる。
【００１６】
本発明のＧＫＫ２株は、アレルギー性喘息を改善することが示され証明されている。
好ましくは、アレルギー性喘息を改善する方法に関して、ＧＫＫ２株を投与された対象は、ＧＫＫ２株を投与されなかった対象よりも低い気道抵抗を示す。
【００１７】
好ましくは、アレルギー性喘息を改善する方法に関して、ＧＫＫ２株を投与された対象は、ＧＫＫ２株を投与されなかった対象よりも低いレベルの血清中の非特異的ＩｇＥ抗体を示す。
【００１８】
好ましくは、アレルギー性喘息を改善する方法に関して、ＧＫＫ２株を投与された対象は、ＧＫＫ２株を投与されなかった対象よりも低いレベルの血清中の特異的ＩｇＥ抗体を示す。
【００１９】
好ましくは、アレルギー性喘息を改善する方法に関して、ＧＫＫ２株を投与された対象は、ＧＫＫ２株を投与されなかった対象よりも低い気管支収縮を示す。
好ましくは、アレルギー性喘息を改善する方法に関して、ＧＫＫ２株を投与された対象は、ＧＫＫ２株を投与されなかった対象よりも高いレベルの肝組織間質液中のＧＳＨレダクターゼを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】酸耐性試験後のコロニーの数を示す。
【図２】胆汁酸塩耐性試験後のコロニーの数を示す。
【図３】熱耐性試験後のコロニーの数を示す。
【図４】実験手順を示す。
【図５】気道抵抗試験の結果を示す。
【図６】血清中の非特異的ＩｇＥ抗体のレベルを示す。
【図７】血清中の特異的ＩｇＥ抗体のレベルを示す。
【図８】気道組織切片を示す。
【図９】ＧＳＨレダクターゼのレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
乳酸菌の供給源
本発明で使用される乳酸菌は、ビフィドバクテリウム属のビフィドバクテリウム  ラクティスである。好ましい実施形態では、乳酸菌は、生後３ヶ月で健康な母乳で育てられた男性の乳児から収集された糞便サンプルから単離され、乳児は、腸の機能やサンプルの微生物叢に影響を与える可能性のあるプロバイオティクスサプリメントを含め、生まれてから薬や健康食品を摂取したことがない。これらのサンプルは黄色の正常などろどろした外観をしており、母乳で育てられた乳児の便の特徴と一致している。取得後、サンプルはすぐにアネロパック（登録商標）を含む嫌気性ジャーに保存され、サンプル中の嫌気性細菌が生きたままになる。その後、サンプルはすぐに実験室に運ばれ、細菌種の分離とスクリーニングが行われる。好ましい実施形態では、この細菌種は、２０１８年２月１２日に台湾の財団法人食品工業発展研究所（Ｔａｉｗａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の生物資源収集研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＢＣＲＣ−９１０８２６）に寄託され、および中国普通微生物菌種保蔵管理センター（Ｎｏ．１５２０５）に寄託された。
【００２２】
ＧＫＫ２のスクリーニングおよび培養
サンプルを含む嫌気性ジャーは、嫌気性環境を備えた嫌気性ワークステーションを使用して開けられる。２グラムのサンプルを滅菌サンプルスプーンで収集し、２００ｍｌの滅菌生理食塩水で均質化する。均質化されたサンプルを１：１０４〜１０７に希釈する。混釈平板（Ｐｏｕｒ  ｐｌａｔｅ）法を用いて、希釈液をＴＯＳ−ＭＵＰ培地に移す。サンプルからのビフィドバクテリウム  ラクティスのスクリーニングと分離は、より選択的でエンテロバクターの干渉がないことが証明されているため従来のＢＩＭ−２５培地の代わりにＴＯＳ−ＭＵＰ培地を使用して行われる。ビフィドバクテリウム  ラクティスのスクリーニング率は１００％にもなる。
【００２３】
混釈平板法を使用して培養した後、プレートを嫌気性ジャー内に配置する。アネロパックを開いて酸素を吸収し、ジャーを密閉する。次に、ジャーを嫌気性ワークステーションから遠ざけ、３７±０．５℃のインキュベーターで４４〜４８時間インキュベートする。
【００２４】
インキュベーション後、嫌気性ジャーを嫌気性ワークステーションに移動して、単一系統の選択および保存のために開ける。保管のために各サンプルから１００を超える単一コロニーが選択され、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイを使用して検査される。具体的には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、末梢血単核細胞、一次脾臓細胞、およびマスト細胞を使用して行われる。さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＩＳＤ２寿命遺伝子も調べられる。複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、スクリーニングおよび選択される菌株は、免疫システムを高め、体内および皮膚のアレルギー反応を緩和するのに役立つ可能性の高い乳酸菌である。選択後、これらの新規プロバイオティクス株はさらに、乳製品または果物と野菜ジュースの発酵に使用でき、直接食べることができるプロバイオティクス粉末に製造できるため、さまざまな異常な生理学的反応が改善される。
【００２５】
表現型分析
番号Ｉの乳酸菌（ＧＫＫ２）と他の種とを、酸耐性試験、胆汁耐性試験および熱耐性試験を使用して比較し、それらの間の表現型の違いを研究する。
【００２６】
耐酸性試験
ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ  １７３９４（台湾の財団法人食品工業発展研究所の生物資源収集研究センターから購入）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２１９に寄託されている）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｎｏ．ＤＳＭ  １５９５４に寄託）およびＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２２０に寄託されている）を含む５種の株が本実験に使用された。ＨＣｌを最初のＭＲＳ液体培地に加えることにより、そのｐＨレベルは約６．５から３．２、２．４および２．０に調整する。菌株を異なるｐＨ値の培地に接種し、３７℃で３時間インキュベートする。次に、形成されたコロニーをカウントする。
【００２７】
結果を図１に示す。初期ｐＨ（約６．５）で、ＧＫＫ２および他の４種のコロニーの数はすべて５×１０９ｃｆｕ／ｍｌに達した。ｐＨ３．２では、ＧＫＫ２と他の４種の間に有意差を示すことなく、すべての種のコロニー数がわずかに減少した。ｐＨレベルが２．４および２．０に低下すると、ＢＣＲＣ１７３９４、ＢＢ−１２およびＢｉ０７のコロニー数は６乗台および７乗台に減少し、８乗台に維持されたＧＫＫ２のコロニーよりも大幅に低くなった（ｐ＜０．０５）。そのため、酸性環境では、ＧＫＫ２のコロニー数は他の種のコロニー数よりも大幅に多くなる。これらの結果は、ＧＫＫ２が他の種よりも耐酸性であり、したがって胃を通過する際の胃酸に対する耐性が高いことを示唆している。
【００２８】
胆汁耐性試験
ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ  １７３９４（台湾の財団法人食品工業発展研究所の生物資源収集研究センターから購入）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２１９に寄託されている）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｎｏ．ＤＳＭ  １５９５４に寄託）およびＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２２０に寄託されている）を含む５種の株が本実験に使用された。菌株を０．３％胆汁酸塩を含むＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で３０分間インキュベートする。次に、形成されたコロニーがカウントされる。結果を図２に示す。ＧＫＫ２および他の４種のコロニーの数はすべて、最初のＭＲＳ液体培養培地で５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌに達した。一方、ＢＣＲＣ  １７３９４、Ｂｉ０４、Ｂｉ０７のコロニー数は、０．３％胆汁酸塩を含むＭＲＳのＧＫＫ２のコロニー数よりも有意に低い（ｐ＜０．０５）が、ＢＢ−１２とＧＫＫ２コロニー数との統計的有意差はない。そのため、胆汁酸塩のある環境では、ＧＫＫ２のコロニー数は他の種のコロニー数よりも大幅に多くなる。これらの結果は、ＧＫＫ２は他の種よりも胆汁耐性が高いため、胃腸管を通過する際の胆汁塩に対する耐性が高いことを示唆している。
【００２９】
熱耐性試験
ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ  １７３９４（台湾の財団法人食品工業発展研究所の生物資源収集研究センターから購入）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２１９に寄託されている）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｎｏ．ＤＳＭ  １５９５４に寄託）およびＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  Ｂｉ０７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＳＤ  ５２２０に寄託されている）を含む５種の株が本実験に使用された。菌株をＭＲＳ液体培地に接種し、７０℃で５、１０および１５分間加熱する。次に、形成されたコロニーがカウントされる。
【００３０】
結果を図３に示す。ＧＫＫ２および他の４種のコロニーの数はすべて、加熱される前（０分）に５×１０９ｃｆｕ／ｍｌに達した。一方、ＢＣＲＣ１７３９４、Ｂｉ０４、Ｂｉ０７のコロニー数は、７０℃で５分間加熱した後のＧＫＫ２のコロニー数よりもかなり少なくなる（ｐ＜０．０５）。一方、ＢＢ−１２とＧＫＫ２のコロニー数の間には統計的に有意な差はない。他の４種の数は、７０℃で１５分間加熱した後のＧＫＫ２の数よりもかなり少なくなっている（ｐ＜０．０５）。そのため、高温環境では、ＧＫＫ２のコロニー数は他の種のコロニー数よりも大幅に多くなる。これらの結果は、ＧＫＫ２が他の種よりも耐熱性があることを示唆している。乳酸菌は通常、耐熱性ではないため、生き続けるために低温で保存する必要がある。これらの結果は、ＧＫＫ２が耐熱性であり、周囲温度で保存できることをさらに示唆している。このような機能は、ＧＫＫ２が製品に存在すると有用であることを示唆している。
【００３１】
細菌培養
上記のビフィドバクテリウム  ラクティスからコロニーを拾い、次いで固体培地にストリークする。好ましい実施形態では、固体培地はＭＲＳ寒天である。完全に成長したら、ビフィドバクテリウム  ラクティスの単一コロニーを液体培養用の液体培地を含むフラスコに接種する。好ましい実施形態では、ビフィドバクテリウム  ラクティスは、液体培地で３５〜５０℃、０〜１ｖｖｍの窒素または二酸化炭素中で培養され、１０〜１００ｒｐｍで回転される。好ましい実施形態では、細菌は１６から２４時間、より好ましくは１８時間培養される。好ましい実施形態では、液体培地はＭＲＳ液体培地である。好ましい実施形態では、液体培地の成分を以下の表１に示す。
【００３２】
【表１】
2020074751.tif 000003
凍結乾燥粉末の調製
乳酸菌種が液体培養で完全に成長したら、液体培地を遠心分離して細菌ペレットを得る。好ましい実施形態では、液体培地は１０００から１５０００ｒｐｍで遠心分離される。得られた細菌ペレットを保護剤（６−３０％脱脂粉乳）と混合し、低温で保存するために凍結乾燥する。好ましい実施形態では、温度は−１９６から−４０℃に設定される。好ましい実施形態では、混合物は１６〜７２時間凍結乾燥される。好ましい実施形態では、凍結乾燥混合物は、−３０〜０℃で保存される。乳酸菌の凍結乾燥粉末は、以下の細胞実験の原料として、すなわち本願が請求する乳酸菌活性物質の実施形態の一つとして使用するために保存される。本願によって特許請求される乳酸菌活性物質の実施形態はまた、上記の液体媒体およびペレットを含む。
【００３３】
実験動物および実験デザイン
この実験で使用した動物は、国立実験動物センターから購入した５週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス２４匹であった。マウスは、中国医科大学の実験動物サービスセンターのマウス用の実験室にある個々の換気ケージシステムに保管された。動物施設の温度は２２±２℃、相対湿度は４０−６０％に保たれた。ライトサイクルは自動タイマーによって制御され、０７：００から１９：００に暗い期間が設定され、１９：００から０７：００に明るい期間が設定された。動物は、この実験で被験体として使用される前に、２週間の適応期間とともに、食物および無菌の逆浸透水への自由なアクセスが許可された。
【００３４】
動物実験で使用されるアレルギーの動物モデルは、感作を使用して確立することができる。この実験では、抗原としてアレルゲンを使用し、アジュバントとして水酸化アルミニウムを使用した。動物を感作するために、アレルゲンを皮下投与した。血液サンプルから分離された血清中の抗原特異的抗体のレベルを測定することによりアレルギーモデルが正常に確立されたことを確認するために、アレルゲンの注入の１週間前および１週間後に血液が採取された。必要に応じて感作を３〜４回行い、血清中の抗原特異的抗体のレベルがその後の検査に必要なアレルギーモデルの基準を満たすのに十分であるようにした。スプレーを使用して気道アレルゲンに対する感作も確立され、これにより動物はアレルゲンを気道に吸い込んで気道に接触させるようにする。
【００３５】
卵白アルブミン（ＯＶＡ）を使用したマウスにおけるアレルギーおよび喘息の刺激は、ＯＶＡ（５００μｇ／ｍｌ）および不完全フロイントアジュバント（ＯＶＡ：ＩＦＡ＝１：１）からなる均一に混合されたエマルジョンに基づいて達成され、すぐに使用する前に、エマルジョンは滅菌膜フィルターを使用してろ過された。上記のアレルゲンは、実験の３０、４０、５０日目にマウスの各グループに皮下投与され、そして、２％ＯＶＡアレルゲンの１０分間吸入がアレルギー性喘息を誘発できるように、４５日目と５５日目に各グループにスプレーで投与された。
【００３６】
この実験で使用した５週齢の雄のＢａｌｂ／ｃマウス２４匹を、通常の生理食塩水を与えた対照群、ＯＶＡで感作した感作群、およびＯＶＡで感作した２つの試験群に分けた。ＯＶＡで感作されたグループは、それぞれ高用量と低用量のＧＫＫ２を与えられた２つの試験群に分けられた。１グループが６匹のマウスから成る合計４つのグループが用意された。ＧＫＫ２は経管栄養によりマウスに与えられ、用量は、実験動物の表面積と人間の表面積の比に基づいて計算される用量等価換算係数１２．３を使用して、ヒトからマウスに換算された。マウスの体重を週に１回測定した。各グループの平均体重が得られた後、マウスの１日投与量を計算できる。これは次の式を使用して、成人のための製造業者のサンプルの１日投与量に基づいている（体重６０ｋｇの人の場合、１日あたり２０ｍｇおよび１００ｍｇであり、１人あたり１日あたりそれぞれ１００億および３００億コロニーに相当）
マウスの毎日の摂食量（ｇ）＝
｛成人の用量／６０ｋｇ（成人の体重）｝×マウスの体重（ｋｇ）×１２．３（ヒトからマウスへの用量減少係数）
試験群に与えられるＧＫＫ２用量は、上記の方程式を使用して計算され、表２に示された。
【００３７】
【表２】
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マウスに給餌されるサンプルは、０．９％生理食塩水中に上記用量のＧＫＫ２を添加することにより作製された。ステンレス鋼の栄養チューブは、通常７５％のアルコールに浸漬し、使用前に取り出して０．９％の生理食塩水で洗浄した。ニードルを１ｍｌの滅菌プラスチックシリンジに挿入して、栄養チューブとして使用した。マウスのグループには、それぞれ０．２ｍｌの生理食塩水（対照群）またはさまざまな濃度のＧＫＫ２溶液を経管栄養した。各グループには、上記のサンプルを６０日間連続で毎日経管栄養した。図４は、この実験の一般的な手順を示している。
【００３８】
６２日目に、採血すべき血液試料および血清のためにすべてのマウスを屠殺した。具体的には、肝門脈から１ｍｌのシリンジを使用して血液サンプルを収集した。マウスから全血サンプルの半分を収集し、白血球の分類とカウントのために抗凝固剤を含む試験管に入れた。他の半分の全血サンプルを収集し、抗凝固剤を含まない試験管に入れ、周囲温度で１時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を血清と名付けた。血清は、血清およびアレルゲン誘導性の特異的抗体に存在する免疫グロブリンを後で分析するために、−８０℃で保存した。
【００３９】
気道抵抗試験
屠殺の１日前に、全身プレチスモグラフィ（ＷＢＰ、Ｂｕｘｃｏ）を使用して、マウスの非侵襲性気道抵抗を測定した。このＷＢＰは、呼吸パターンの動的な研究を可能にし、専用ソフトウェアを使用して、ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐａｕｓｅ（Ｐｅｎｈ）と呼ばれる単位のない変数で気管支収縮指数を計算する。一般的に、Ｐｅｎｈが高いほど気道抵抗が大きいことを示す。この実験では、最初にマウスを動物用チャンバー内に置き、Ｐｅｎｈ値のベースラインを３分間測定した。次に、噴霧した０．９％ＮａＣｌに３分間さらし、その後、Ｐｅｎｈ値をさらに３分間測定した。次に、ＰｅｎｈＭｃｈを測定する前に、非特異的気管支収縮剤である噴霧されたメタコリン（６．２５ｍｇ／ｍｌ）にさらに３分間さらした。より高いレベルのメタコリン（１２．５ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、および５０ｍｇ／ｍｌ）を使用して、上記の手順を繰り返した。この実験の結果は、Ｐｅｎｈ率で表された。データ分析は、メタコリンの各レベルで得られたＰｅｎｈＭｃｈ値を、各被験体に与えられた生理食塩水のＰｅｎｈＮａＣｌ値で除算することにより行った。
【００４０】
血清中のＩｇＥレベルの分析
血清中のＩｇＥ抗体レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定された。さまざまな抗マウスモノクローナル抗体をコーティングバッファー（ｐＨ９．６）と適切な量で個別に混合した。得られた混合物をヌンク免疫９６ウェルプレート（登録商標）にコーティングし、１時間インキュベートした。結合していないモノクローナル抗体は洗浄バッファーで除去し、ブロッキングバッファー（２００μｌ／ウェル）をウェルに加えて、残留オープン結合部位をブロックした。プレートを室温で３０分間インキュベートした後、洗浄バッファーで洗浄した。１００μｌのマウス血清または既知の濃度のＩｇＥ標準液をプレートに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。ＨＲＰに結合した抗ＩｇＥ二次抗体を適切なレベル（１００μｌ／ウェル）で添加した。室温で３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。次に、１００μｌのＴＭＢ基質を加えてＨＲＰと反応させた。１５分間の発色後、１００μｌの２ＮＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度に対してプロットされたＩｇＥ標準の標準曲線に基づいて、血清中の抗体の濃度は、回帰式を使用した補間によって推定された。
【００４１】
血清中のアレルゲン誘導性特異的ＩｇＥのレベルの分析
血清中のアレルゲン誘導性特異的ＩｇＥ抗体のレベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定された。さまざまな抗マウスモノクローナル抗体をコーティングバッファー（ｐＨ９．６）と適切な量で個別に混合し、１００μｌ／ｍｌＯＶＡ抗原を加えた。得られた混合物をヌンク免疫９６ウェルプレートにコーティングし、１時間インキュベートした。結合していないモノクローナル抗体は洗浄バッファーで除去し、ブロッキングバッファー（２００μｌ／ウェル）をウェルに加えて、残留オープン結合部位をブロックした。プレートを室温で３０分間インキュベートした後、洗浄バッファーで洗浄した。１００μｌのマウス血清または既知の濃度のＩｇＥ標準液をプレートに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。ＨＲＰに結合した抗ＩｇＥ二次抗体を適切なレベル（１００μｌ／ウェル）で添加した。室温で３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。次に、１００μｌのＴＭＢ基質を加えてＨＲＰと反応させた。１５分間の発色後、１００μｌの２ＮＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度に対してプロットされたＩｇＥ標準の標準曲線に基づいて、血清中のアレルゲン誘導性の特異的抗体の濃度は、回帰式を使用した補間によって推定された。
【００４２】
組織切片
気道組織をパラフィンに包埋し、切片にした。次に、ヘマトキシリンおよびエオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を使用して切片を染色し、顕微鏡で観察した。
【００４３】
ＧＳＨレダクターゼレベルの分析
固定量のマウス肝臓をＨＥＰＥＳ緩衝液に入れた。実験の前に、サンプルをＧＳＨレダクターゼで後の分析のために−８０°Ｃで保存する必要がある。その濃度の分析は、市販のＥＬＩＳＡを使用して行った。
【００４４】
生物統計学的分析
この実験から得られた結果は、平均±ＳＤとして表され、ＳＰＳＳ  １２．０ソフトウェアを使用して分析された。グループのペア間の違いは、ダンカンの複数範囲テストを使用して測定された。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意な差を示す。結果はＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０を使用してプロットされた。
【００４５】
結果
気道抵抗試験について、各群の結果を表３に示し、統計分析を図５に示す。
【００４６】
【表３】
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上記の結果は、噴霧された気管支収縮剤メタコリンの濃度が増加するにつれて、腹腔内または吸入によりＯＶＡが投与された感作群の気道抵抗が有意に増加し、最終的には対照群よりも著しく高くなることを示した。そのため、ＯＶＡ感作マウスモデルの確立に成功したことが証明された。さらに、噴霧された気管支収縮剤メタコリンの濃度が増加しても、ＧＫＫ２が投与された試験群の気道抵抗は感作群ほど増加しなかった。このような結果は、ＧＫＫ２投与がＯＶＡアレルゲンによって誘発される気道抵抗の低下に役立つ可能性があることを示唆している。言い換えれば、喘息による気道抵抗が減少する可能性がある。さらに、ＧＫＫ２のレベルを上げた場合、試験群は気道抵抗のわずかな増加を示した。このような結果は、アレルギー性喘息に対するＧＫＫ２の治療効果が濃度に依存することを示唆している。
【００４７】
血清中の非特異的ＩｇＥ抗体の濃度について、結果を表４に示し、統計分析を図６に示す。
【００４８】
【表４】
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感作マウス（感作群）では、血清中の非特異的ＩｇＥ抗体の濃度は、対照群のそれらと比較した場合に有意に増加した。ＧＫＫ２を経管栄養した感作マウス（高用量および低用量の試験群）では、血清中の非特異的ＩｇＥ抗体の濃度は、感作群と比較して有意に低下し（ｐ＜０．０５）、最終的には対照群と類似した。このような結果は、ＧＫＫ２の投与が血清中の非特異的ＩｇＥ抗体のレベルを低下させ、それによりアレルギー反応を改善する可能性があることを示唆している。
【００４９】
血清中の特定のＩｇＥ抗体の濃度について、結果を表５に示し、統計分析を図７に示す。
【００５０】
【表５】
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感作マウス（感作群）では、血清中の特異的ＩｇＥ抗体の濃度は、対照群のそれらと比較した場合に有意に増加した。ＧＫＫ２を経管栄養した感作マウス（高用量および低用量の試験群）では、血清中の特定のＩｇＥ抗体の濃度は、感作群と比較して有意に低下し（ｐ＜０．０５）、最終的には対照群のそれと類似した。このような結果は、ＧＫＫ２の投与が血清中の特定のＩｇＥ抗体のレベルを低下させ、それによりアレルギー反応を改善する可能性があることを示唆している。
【００５１】
組織切片に関して、結果を図８に示す。感作マウス（感作群）では、対照群の気道径と比較して気道径が著しく減少した。ＧＫＫ２を経管栄養した感作マウス（高用量および低用量の試験群）では、気管支収縮は感作群と比較した場合にあまり明らかではなく、対照群と比較した場合に有意な差は見られなかった。このような結果は、ＧＫＫ２の投与が気管支収縮の緩和と喘息の発生率の低下に役立つ可能性を示唆している。
【００５２】
ＧＳＨレダクターゼの濃度について、結果を表６に示し、統計分析を図９に示す。
【００５３】
【表６】
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感作マウス（喘息群）では、ＧＳＨレダクターゼのレベルが著しく低下した。ＧＫＫ２を経管栄養した感作マウスでは、喘息群と比較して、ＧＳＨレダクターゼのレベルが大幅に増加した（ｐ＜０．０５）。このような結果は、ＧＫＫ２の投与が免疫系の強化を助け、個人のアレルギー反応に対する感受性を低下させ、それにより喘息の発生率を低下させる治療効果を示すことを示唆している。
【００５４】
要約すると、上記の試験結果から、ＧＫＫ２がアレルギー性喘息によって引き起こされる気管支収縮の緩和、血清中のアレルギー誘発性の非特異的および特異的ＩｇＥ抗体のレベルの低下、および体内のＧＳＨレダクターゼ濃度の増加に有用であることが証明できる。したがって、ビフィドバクテリウム  ラクティス  ＧＫＫ２はアレルギー性喘息の改善に役立つ。
【００５５】
本発明は、ＧＫＫ２を含む組成物を提供し、アレルギー反応の緩和を助けることができる。
組成物は、添加剤をさらに含む。好ましい実施形態では、組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味料、またはそれらの組み合わせであり得る。賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、スクロースまたはそれらの組み合わせから選択することができる。ベンジルアルコールやパラベンなどの防腐剤は、医薬組成物の貯蔵寿命を延ばすことができる。希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセロールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。充填剤は、ラクトース、高分子量ポリエチレングリコールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。甘味料は、アセスルファムＫ、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、ネオテームまたはそれらの組み合わせから選択することができる。上記の添加物に加えて、乳酸菌活性物質の薬学的効果が影響を受けない限り、実際の必要性に応じて他のものを選択してもよい。
【００５６】
組成物は、製薬産業における様々な製品に開発することができる。好ましい実施形態では、組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である。
組成物は、対象のニーズを満たすために様々な形態をとることができる。好ましい実施形態では、組成物は、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤形態であり得る。
【００５７】
本発明の組成物は、動物またはヒトに投与することができる。乳酸菌活性物質の効果が影響を受けない限り、任意の剤形にし、剤形に応じて動物またはヒトに適切な経路を介して投与することができる。
【００５８】
組成物の調製
本発明のＧＫＫ２が食事に使用される場合、以下に記載される組成物１に関する実施形態は例示的であるものとする。
【００５９】
組成物１：ＧＫＫ２の凍結乾燥粉末を乳酸菌活性物質（２０重量％）として使用し、防腐剤として使用するベンジルアルコール（８重量％）および希釈剤として使用するグリセロール（７ｗｔ％）と混合した。得られた混合物を純水（６５ｗｔ％）に溶解し、将来の使用のために４℃で保存した。「重量％」という表記は、組成物の総重量に対する各成分の重量の割合を指す。
【００６０】
本発明のＧＫＫ２が医療用途である場合、以下に記載される組成物２に関する実施形態は例示的であるものとする。
組成物２：ＧＫＫ２の凍結乾燥粉末を乳酸菌活性物質（２０重量％）として使用し、防腐剤として使用するベンジルアルコール（８重量％）、希釈剤として使用するグリセロール（７ｗｔ％）、および希釈剤として使用されるスクロース（１０ｗｔ％）と混合した。得られた混合物を純水（５５ｗｔ％）に溶解し、将来の使用のために４℃で保存した。「重量％」という表記は、組成物の総重量に対する各成分の重量の割合を指す。
【００６１】
乳酸菌Ｉの寄託番号（ＧＫＫ２）：ＣＧＭＣＣ番号１５２０５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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