(57)【要約】【課題】シワタケの植物成長調整活性物質を同定し、植物成長調整剤として利用する。【解決手段】式（Ｉ）または（II）2020029406.tif 000006で表されるセスキテルペン化合物。これらの化合物は、特に、植物の主根の伸長を促進する活性を有し、植物成長促進剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）または（II）：
【化１】
2020029406.tif 000005
で表されるセスキテルペン化合物。
【請求項２】
請求項１の化合物を有効成分とする、植物成長調節剤。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物を１００〜１０００ppmの濃度で使用する、植物成長促進剤。
【請求項４】
式（II）の化合物を１０〜３００ppmの濃度で使用する、植物成長促進剤。
【請求項５】
請求項１の化合物を植物体に投与することを特徴とする、植物成長の調節方法。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物を１００〜１０００ppmの濃度で使用する、植物成長の促進方法。
【請求項７】
式（II）の化合物を１０〜３００ppmの濃度で使用する、植物成長の促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シワタケが産生するセスキテルペン化合物およびそれを含有する植物成長調整剤、並びに該化合物を用いることを特徴とする植物成長の調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
きのことは、担子菌門あるいは子嚢菌門に属する菌類で、肉眼で観察できる大きさの子実体を形成するものを指す。きのこには、国内だけでも４０００から５０００の野生種が存在し、そのうち同定されているものは２０００種くらいといわれている。きのこ類は他の生物との相互作用を有する場合が多く、多様な生理活性物質を有するものが少なくないが、その機能性成分の研究対象は極めて限られている。
シワタケは、白色腐朽菌と呼ばれるきのこの一種であり、木材の白腐されを起こす微生物である。食用には適さないが、その培養濾液抽出物には種々の生理活性化合物が含まれることが知られていて、そのひとつであるメルリジアール（Merulidial）は、強い抗菌活性や変異原性、細胞毒性活性を有することが報告されている（非特許文献１〜３）。また、アフラトキシン生合成阻害活性を有することも見出された（非特許文献４）。しかしながら、本願のような植物成長促進および／または阻害作用は全く知られていない。
なお、シワタケから単離されたセスキテルペン類としてはメルラクトンが報告されている（非特許文献５）が、メルラクトンの植物成長に与える影響は極めて弱い。
【０００３】
一方、農業分野において、植物の成長を促進し、または制御することは生産性向上のために重要な技術である。現在では植物の成長促進および／または抑制を目的とした様々な種類の植物成長調整剤が実用化され、植物成長調整剤は作物の収量や生産物の品質向上に貢献している。
具体的には、オーキシンの着果促進作用、果実肥大作用を利用した着果促進剤、果実肥大促進剤が知られており、また、オーキシンのエチレン発生促進作用を活用した果樹の摘果剤、果実着色促進剤として、4-クロロフェノキシ酢酸、ジクロルプロップ、エチクロゼートなどが実用化されている。しかしながら、こういった植物成長調整剤も、その数が少なく、効果も十分でなく、更に好ましくない作用を有する場合が多かった。
最近では、安全性指向の考え方から、特に、天然物由来の植物成長調整剤が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】H. Anke, O. Sterner, W. Steglich. Structure-activity relatonships of unsaturated dialdehydes 3. Mutagenic, antimicrobial, cytotoxic, and phytotoxic activities of merulidial derivarives. J. Antibiotic. 42, 738-744 (1989)
【非特許文献２】M. G. Bruno, B. Steffan, W. Steglih W: Antibiotics from basidiomycetes. Part 23. Merulidial, an isolactarane derivative from Merulius tremellosus. Terahedron, 42, 3579-3586 (1986)
【非特許文献３】W. Quack, T. Anke, O. Oberwinkler, M. G. Giannetti, W. Steglich: Antibiotics from basidiomycetes. Part 5. Merulidial, an isolactarane derivative from Merulius tremellosus. Antibiotics, 31. 737-741 (1978)
【非特許文献４】井上瑞季、遠藤直樹、早乙女梢、前川二太郎、中桐昭、上野琴巳、石原亨、担子菌類からのアフラトキシン生合成阻害活性物質の探索、日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部2017年度合同大阪大会、講演要旨集p.101
【非特許文献５】Sterner O, Anke T, Sheldrick W, Steglich W (1990) New sterpurane and isolactarane sesquiterpenes from the fungus Merulius tremellosus. Tetrahedron, 46 (7) 2389-2400
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、シワタケから植物成長調整、特に成長促進活性化合物を単離して同定し、農薬として利用することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、シワタケの成長促進活性化合物が下式（Ｉ）または(II)で表される化合物：
【化１】
2020029406.tif 000002
であることを見出し、さらにこれら化合物の植物成長促進活性を確認して本発明を完成した。
【０００７】
本願が提供する発明は次の通りである。
（１）式（Ｉ）または（II）で表される化合物。
（２）上記化合物を有効成分として含有し、必要な添加剤や担体を含む植物成長調整剤。
（３）植物成長促進剤である、（２）の植物成長調整剤。
（４）上記化合物を使用することを特徴とする、植物成長の調整方法。
（５）植物成長の促進方法である、（４）の植物成長の調整方法。
【発明の効果】
【０００８】
本願発明によれば、シワタケの産生する植物成長調整活性化合物が同定された。これら化合物（Ｉ）または（II）は、天然物由来であるためヒトや動物に対して安全性が高く、また環境に及ぼす影響も少ないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、シワタケ抽出物が主根の伸張、側根の伸張および側根数に与える影響を示す。バーは標準偏差を、アスタリスクは統計的な有意差（＊P<0.05、＊＊P<0.01、クラスカル−ウォリス検定）をそれぞれ示す。
【図２】図２は、シリカゲルドライカラムクロマトグラフィーによって得られた画分が主根の伸張、側根の伸張および側根数に与える影響を示す。図中のバーおよびアスタリスクは図１と同様である。
【図３】図３は、シワタケ培養濾液抽出物のカラムによる精製スキームを示す。
【図４】図４は、シリカゲルウェットカラムクロマトグラフィーによって得られた画分が主根の伸張、側根の伸張および側根数に与える影響を示す。図中のバーおよびアスタリスクは図１と同様である。
【図５】図５は、化合物１の精製スキームを示す。
【図６】図６は、化合物２の精製スキームを示す。
【図７】図７は、化合物１と化合物２が主根の伸張、側根の伸張および側根数に与える影響を示す。図中のバーおよびアスタリスクは図１と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願発明の植物成長調整剤は、式（Ｉ）および／または（II）：
【化２】
2020029406.tif 000003
で表される化合物を有効成分として含有する。
式（Ｉ）および／または（II）の化合物は後述する実施例に従ってシワタケを培養しその培養濾液から抽出してもよいし、化学合成してもよい。
本発明において用いられる「植物成長調整」という用語は、植物の成長促進および阻害の両方を含み、例えば、植物の矮化（伸長抑制）、開花時期の調節、直立葉の誘導（及びそれに伴う光合成効率の向上、バイオマス増加作用）、花粉成長抑制、花の鮮度保持、植物の抗ストレス剤（熱、乾燥、寒さなど）、生殖制御による雑草防除、植物の老化抑制、根の肥大化、着果促進、果実肥大促進、落果防止、果皮着色促進などを含めて、最も広義に解釈する必要がある。例えば、発根促進剤、植物成長促進剤、根系発達促進剤などは、本発明の植物成長調整剤の典型的な例であるが、本発明の植物成長調整剤はこれらに限定されることはない。
【００１１】
本発明の植物成長調整剤は、上記化合物の水溶液をそのまま植物成長調整剤として用いることができるが、水和剤、乳剤、粒剤、粉剤、界面活性剤など、通常の植物成長調整剤で用いられる担体を用いて製剤化してもよい。例えば、固体担体としては鉱物質粉末（カオリン、ベントナイト、クレー、モンモリロナイト、タルク、ケイソウ土、雲母、バーミキュライト、セッコウ、炭酸カルシウム、リン石灰など）、植物質粉末（大豆粉、小麦粉、木粉、タバコ粉、デンプン、結晶セルロースなど）、高分子化合物（石油樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリビニル酢酸樹脂、ポリ塩化ビニル、ケトン樹脂など）、更に、アルミナ、ワックス類などを使用することができる。また、液体担体としては、例えば、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、ベンジルアルコールなど）、芳香族炭化水素類（トルエン、ベンゼン、キシレンなど）、塩素化炭化水素類（クロロホルム、四塩化炭素、モノクロルベンゼンなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、酸アミド類（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなど）、エーテルアルコール類（エチレングリコールエチルエーテルなど）、又は水などを使用することができる。
【００１２】
乳化、分散、拡散などの目的で使用される界面活性剤としては、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両イオン性のいずれも使用することができる。本発明において使用することができる界面活性剤の例を挙げると、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、オキシエチレンポリマー、オキシプロピレンポリマー、ポリオキシエチレンアルキルリン酸エステル、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル、第四級アンモニウム塩、オキシアルキルアミン、レシチン、サポニン等である。また、必要に応じてゼラチン、カゼイン、アルギン酸ソーダ、デンプン、寒天、ポリビニルアルコールなどを補助剤として用いることができる。
【００１３】
本発明の植物成長調整剤は、製剤の形状も制限はなく、粉剤、顆粒剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤、乳剤及びペースト剤等のあらゆる製剤形態に成形することができる。その他の成分を常法に従い、混合、撹拌、噴霧乾燥等することにより製造することができる。
植物に適用する場合、土壌処理剤、茎葉処理剤、播種前の種子処理剤、移植前植物の処理剤及び移植時の植物に対する処理剤等として使用することができる。また、水耕栽培においては水耕液に混合して使用してもよく、組織培養では培地中に懸濁又は溶解させて用いてもよい。
【００１４】
本発明の植物成長調整剤の使用濃度は、化合物１の場合、好ましくは１０〜２０００ｐｐｍ、より好ましくは５０〜２０００ｐｐｍ、特に好ましくは１００〜１０００ｐｐｍの範囲とする。また、化合物２の場合、好ましくは１〜５００ｐｐｍ、より好ましくは１０〜３００ｐｐｍの範囲とする。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００１５】
１．シワタケ抽出物の植物成長調節活性
（１）シワタケの液体培養
保存菌株からＰＤＡ培地（ポテト・デキストロース寒天培地）に植菌し、生育させたシワタケ（Phlebia tremellosa TUFC11737）を用いて大量培養を行った。麦芽液体培地５Lを５００mL容三角フラスコに２００mLずつ分注し、オートクレーブで滅菌した。ＰＤＡ培地から麦芽液体培地にシワタケを植菌し、２５℃で５２日間培養した。
濾過により、培養濾液と菌糸体に分離してから、下記の方法に従って、それぞれの植物成長調節活性を測定した。
（２）植物成長調節活性試験
２４穴プレートに濾紙を敷き、試料をメタノールに溶解して濾紙に添加し、風乾によりメタノールを完全に除去してから蒸留水３００μLを加えた。レタス種子を１穴あたり４粒播種し、２８℃、明期１６時間、暗期８時間のサイクル人工気象機内でインキュベートした。６日後、植物体の画像をスキャナーで取り込み、主根の伸張、側根の伸張、側根数について画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
シワタケ抽出物に関して、培養濾液と菌糸体の各抽出物の測定結果を図１に示す。実験は８個体で行い、平均値を示した。
（３）シワタケ培養濾液抽出物の分画と植物成長調節活性
シワタケの培養物を吸引濾過し、濾液を約三分の一量の酢酸エチルで３回分配抽出を行った。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥し、エバポレーターで減圧濃縮した。その後、デシケータで完全に乾燥し抽出物を得た（946.4mg）。
次いで、シリカゲルのドライカラムクロマトグラフィー（Daisogel IR-60-63/210、ダイソー株式会社、大阪、85.0 g）により分画した。溶出にはアセトン−ヘキサン混合溶媒を用い、アセトン濃度０％%から６０％まで、１０％ずつ段階的に増加させた後、１００％アセトン、続いて、メタノールで溶出した。１つのフラクションあたり650 mLの溶媒を使用した。その結果、九つの画分、即ち、アセトン濃度に関して０％画分（36.6 mg）、１０％画分（32.3 mg）、２０％画分（325.0 mg）、３０％画分（136.1 mg）、４０％画分（68.3 mg）、５０％画分（23.9 mg）、６０％画分（32.9 mg）、１００％画分（28.8 mg）およびメタノール画分（27.5 mg）を得た。これら九つの画分につき、上記の植物成長調節活性試験を実施した。結果を図２に示す。
上記植物試験の結果、２０％画分（325.0 mg）が高い活性を示した。この画分（288.5 mg）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Daisogel、28.5 g）によりさらに分画した。溶出には酢酸エチル−ヘキサンの混合溶媒を用い、酢酸エチル濃度を２０％から６０％まで、１０％ずつ段階的に増加させた後、酢酸エチル１００％、次いでメタノールで溶出した。１つのフラクションあたり285 mLの溶媒を使用した。その結果、七つの画分、即ち、酢酸エチル濃度に関して２０％画分（3.6 mg）、３０％画分（7.3 mg）、４０％画分（22.0 mg）、５０％画分（17.8 mg）、６０％画分（60.8 mg）、１００％画分（72.6 mg）およびメタノール画分（37.8 mg）を得た。ここまでの精製スキームを図３に、得られた七つの画分についての植物成長調節活性試験結果を図４に示す。
【００１６】
２．活性化合物の単離と構造決定
（１）化合物１の単離
上記の酢酸エチル６０％画分（60.8 mg）を、ＴＬＣ〔ＳｉＯ２ガラスプレート Silica gel 60 F254、Merck社、展開溶媒：酢酸エチル−ヘキサン（４：１）〕によって６つのフラクション、60%-1、60%-2、60%-3、60%-4、60%-5、60%-6 に分けた。それぞれの Rf 値は 0.0−0.07（60%-1）、0.07−0.16（60%-2）、0.16−0.29（60%-3）、0.29−0.37（60%-4）、0.37−0.46（60%-5）、0.46−1.0（60%-6）であった。
植物成長調節活性試験の結果、活性のあった60%-5画分から分取ＨＰＬＣを用いて主要な化合物を精製した。この化合物の保持時間は、4.01 分であった。分取ＨＰＬＣの条件を表５に示す。この活性化合物を化合物１とした。化合物１の精製スキームを図５に、マススペクトルデータを下記に示す。
化合物１の収量：5.9 mg．ポジティブESI MS m/z: 247.2[M+H]+、高分解能ESI MS m/z: 247.1324[M+H]+（calc.for Ｃ１５Ｈ１９Ｏ３: 247.1334）、GC-MS m/z: 246.10(35.16), 189.10(39.66), 115.05(41.55), 131.10(43.88), 105.10(44.14), 157.10(45.80), 143.10(50.53), 91.05(55.19), 145.10(57.03), 159.15(90.51), 43.05(100.00).
（２）化合物２の単離
前記の酢酸エチル５０％画分（17.8 mg）をTLC〔ＳｉＯ２ガラスプレート Silica gel 60 F254、Merck社、展開溶媒：酢酸エチル−ヘキサン（４：１）〕によって６つのフラクション、50%-1、50%-2、50%-3、50%-4、50%-5、50%-6 を得た。それぞれの Rf 値は 0.0−0.11（50%-1）、0.11−0.18（50%-2）、0.18−0.33（50%-3）、0.33−0.40（50%-4）、0.40−0.51（50%-5）、0.51−1.0（50%-6）であった。
植物成長調節活性試験の結果、活性のあった50%-5画分から分取ＨＰＬＣを用いて活性化合物を精製した。この化合物の保持時間は 4.7 分であった。分取ＨＰＬＣの条件を表 5 に示す。この活性化合物を化合物２とした。化合物２の精製スキームを図６に、マススペクトルデータを下記に示す。
化合物２の収量：9.7 mg. ポジティブESI MS m/z: 247[M+H]+、高分解能ESI MS m/z: 246.1326[M+H]+（calc.for Ｃ１５Ｈ１９Ｏ３: 247.1334）、GC-MS m/z: 246.10 (48.44), 07.10(49.67), 203.10(51.22), 159.10(54.36), 131.10(54.46), 79.05(58.27), 119.10(60.30), 173.15(71.56), 41.50(72.83), 77.05(73.83), 217.10(74.84), 105.10(76.41), 43.05(89.84), 91.05(100.00).
【００１７】
（３）構造決定
ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳの分析結果から、化合物１は分子量２４６の化合物と推定された。また、高分解能ＭＳから、分子式がＣ１５Ｈ１８Ｏ３、不飽和度７の化合物であることが分かった。この分子式は、シワタケから単離されているメルラクトン（前記非特許文献５参照）から水素原子が２つ失われたものと一致する。そのため、化合物１は、メルラクトンと類似した構造をしていると推察した。
実際、メルラクトンと化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較すると、メルラクトンの、H-2、H-5、H-8〜H-10、H-12〜H-15とこれらに対応するシグナルのケミカルシフトは類似していた。また、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでも、メルラクトンのC-2〜C-15のシグナルのケミカルシフトは、これらと対応するシグナルと近い値を示した。
一方、H-1のプロトンは１つしか観察されず、ケミカルシフトはδH 4.09であった。さらに、C-1のケミカルシフト（δC 80.5）からもC-1に酸素が結合していると推定された。加えて、H-H COSY、H-H NOESYおよびHMBC各スペクトルの観察を併せて考慮し、メルラクトンの8位に結合している酸素が1位の炭素と結合し、架橋を形成していると考えて、化合物１の構造を式（Ｉ）のとおり決定した。また、同様の考察から、化合物２の構造を式（II）のとおり決定した。
化合物１および化合物２の1H-および13C−NMRスペクトルは次表の通りであった。
【表１】
2020029406.tif 000004
【実施例２】
【００１８】
化合物１および２の植物成長調節活性
同定した化合物１および２を用いて植物成長調節活性試験を行った。その結果を図７に示す。
化合物１は主根の伸長に対して100 ppm、300 ppmで促進活性を示した。また3000 ppmでは阻害活性を示した。側根の伸長・分岐に対しては、300 ppmで顕著に促進し、1000 ppmでやや促進する傾向を示した。
一方、化合物２は主根の伸長に対して 10 および30 ppmで促進傾向を示したが、300 ppm以上では阻害傾向を示した。側根の伸長・分岐に対しては、100 ppmより低い濃度では促進傾向を示し、1000 ppm以上では顕著に阻害活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、農薬の分野において利用可能である。詳細には、本発明の化合物は、植物生理に影響を及ぼし、作物の品質および／または収量を向上させる植物成長促進剤として好適に使用することができる。
【図１】
2020029406.tif 000007
【図２】
2020029406.tif 000008
【図３】
2020029406.tif 000009
【図４】
2020029406.tif 000010
【図５】
2020029406.tif 000011
【図６】
2020029406.tif 000012
【図７】
2020029406.tif 000013