(57)【要約】【課題】生体由来の揮発性有機化合物の新規な検出方法を提供することを課題とする。【解決手段】昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、生体由来の揮発性有機化合物の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
生体由来の揮発性有機化合物の検出方法。
【請求項２】
前記試料は、呼気、尿、汗、唾液及び血液から選択される1種又は2種以上である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記嗅覚受容体タンパク質は、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53及びBmOR1から選択さ
れる1種又は2種以上である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記生体由来の揮発性有機化合物は、(S)-2-ヒドロキシプロパン酸、ヘプチルヒドロペルオキシド、2,3-ジヒドロキシプロパナール、塩化ノナノイル、ドデカナール、(Z)-2-ノネナール、4,5-ジメチル-3(2H)-イソキサゾロン、(Z)-2-デセナール、トリクロロ酸3-ト
リデシルエステル、レボグルコサン、4-（ジメチルアミノ）-3-メチル-2-ブタノン、4-メチル-1-ブテン-1-イルペンタン酸エステル、ジエチルフタル酸、1-クロロ-8-ヘプタデセ
ン、ペンタデカン酸、1,2-ベンゼンジカルボン酸ブチルデシルエステル、ノナナール、1-ブタノール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、２−エチル-1-ヘキサノール、2-ペンタノン、テトラヒドロフラン、2-メチルピラジン及び(E)-2-ノネナールから選択される1種又は2種以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記昆虫細胞は、ガ由来の細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記昆虫細胞は、Sf21、Sf9、High Five及びTni由来細胞から選択される、請求項１〜
５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記昆虫細胞は、細胞内イオン濃度の変化に基づいて蛍光を発する蛍光タンパク質を発現しており、
前記信号は、嗅覚受容体タンパク質と生体由来の揮発性有機化合物との結合による細胞内イオン濃度の変化に基づいて、前記蛍光タンパク質が発する蛍光である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
異なる種類の生体由来の揮発性有機化合物と結合する昆虫の嗅覚受容体タンパク質をそれぞれ発現する複数の昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて複数の昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
複数の異なる揮発性有機化合物を検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の検出方法により検出された生体由来の揮発性有機化合物の量を、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較し、生体由来の揮発性有機化合物の量を指標として疾患を判定する工程を含む、
疾患の検査方法。
【請求項１０】
被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定し、
被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する、
請求項９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記疾患は、がん、感染症及び糖尿病から選択される、請求項９又は１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記がんは、膀胱がん、肺がん及び乳がんから選択される、請求項１１に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の揮発性有機化合物の検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病と揮発性有機化合物（Volatile Organic Compounds：VOC）は古くから研究がなさ
れており、肺がん、乳がん等で呼気、尿、血液等で特徴的なVOCが確認されている。特に
、膀胱がんでは、高知大学のグループによる尿のメタボローム解析から、膀胱がん患者に特徴的なVOCが尿中から検出されると報告されている（特許文献１）。
【０００３】
他方、昆虫は、触角で機能発現する嗅覚受容体によって、環境中に存在するさまざまなVOCを高感度かつ選択的に検出する。これまでに、本発明者らは、昆虫の嗅覚受容体を発
現させた昆虫由来の培養細胞Sf21細胞を匂い検出素子として開発する技術を確立してきた（特許文献２及び３）。本技術に従い作出した細胞系統は、蛍光強度変化量として匂い物質を高感度かつ選択的に検出する匂い検出素子として利用できる。対象臭を検出する嗅覚受容体を発現させることで、受容体の応答特性に従った匂い検出素子が作出できる一方、これまでに膀胱がん等の対象臭に対する嗅覚受容体が特定されていない。
【０００４】
また、疾患の診断分野、予防・早期発見のためのヘルスケア分野では、簡便且つ、感度、特異性が高く、非侵襲的な検査技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2013-122383号公報
【特許文献２】特開2013-27376号公報
【特許文献３】特開2018-113957号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体由来の揮発性有機化合物の新規な検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、膀胱がん患者の尿のメタボローム解析に関する知見（特許文献１）による、膀胱がん患者に特徴的な揮発性有機化合物12種を1次ターゲットとし、該VOCを検出する昆虫の嗅覚受容体を特定し、センサ細胞を作出した。また、同センサ細胞が、膀胱がん患者に特有なVOCを検出できることを知見した。そして、同センサ細胞を、各種疾患等に特
有なVOCを検出する方法に利用できることを知見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下に関する。
【０００８】
［１］
昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
生体由来の揮発性有機化合物の検出方法。
［２］
前記試料は、呼気、尿、汗、唾液及び血液から選択される1種又は2種以上である、［１］に記載の検出方法。
［３］
前記嗅覚受容体タンパク質は、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53及びBmOR1から選択さ
れる1種又は2種以上である、［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］
前記生体由来の揮発性有機化合物は、(S)-2-ヒドロキシプロパン酸、ヘプチルヒドロペルオキシド、2,3-ジヒドロキシプロパナール、塩化ノナノイル、ドデカナール、(Z)-2-ノネナール、4,5-ジメチル-3(2H)-イソキサゾロン、(Z)-2-デセナール、トリクロロ酸3-ト
リデシルエステル、レボグルコサン、4-（ジメチルアミノ）-3-メチル-2-ブタノン、4-メチル-1-ブテン-1-イルペンタン酸エステル、ジエチルフタル酸、1-クロロ-8-ヘプタデセ
ン、ペンタデカン酸、1,2-ベンゼンジカルボン酸ブチルデシルエステル、ノナナール、1-ブタノール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、２−エチル-1-ヘキサノール、2-ペンタノン、テトラヒドロフラン、2-メチルピラジン及び(E)-2-ノネナールから選択される1種又は2種以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
【０００９】
［５］
前記昆虫細胞は、ガ由来の細胞である、［１］〜［４］のいずれかに記載の検出方法。［６］
前記昆虫細胞は、Sf21、Sf9、High Five及びTni由来細胞から選択される、［１］〜［
５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］
前記昆虫細胞は、細胞内イオン濃度の変化に基づいて蛍光を発する蛍光タンパク質を発現しており、
前記信号は、嗅覚受容体タンパク質と生体由来の揮発性有機化合物との結合による細胞内イオン濃度の変化に基づいて、前記蛍光タンパク質が発する蛍光である、
［１］〜［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］
異なる種類の生体由来の揮発性有機化合物と結合する昆虫の嗅覚受容体タンパク質をそれぞれ発現する複数の昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて複数の昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、
複数の異なる揮発性有機化合物を検出する、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。
【００１０】
［９］
［１］〜［８］のいずれかに記載の検出方法により検出された生体由来の揮発性有機化合物の量を、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較し、生体由来の揮発性有機化合物の量を指標として疾患を判定する工程を含む、
疾患の検査方法。
［１０］
被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定し、
被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する、
［９］に記載の検査方法。
［１１］
前記疾患は、がん、感染症及び糖尿病から選択される、［９］又は［１０］に記載の検査方法。
［１２］
前記がんは、膀胱がん、肺がん及び乳がんから選択される、［１１］に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生体由来の揮発性有機化合物の検出方法が提供される。また、本発明の検出方法により検出された、疾患に特有な生体由来の揮発性有機化合物の量を指標とした、疾患の検査方法が提供される。
生体由来の揮発性有機化合物は濃度が低く、特にがん由来のVOCはpptレベルであり、従来の小型センサでは検出が難しかった。本発明では、より高感度の、昆虫嗅覚受容体を用いたバイオセンサを用いているため、簡便且つ、感度、特異性が高く、非侵襲的な検査技術として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ドデカナールに対するBmOR1細胞系統の蛍光強度の継時変化を示す図である。微細バブルで溶解したドデカナール、及びDMSOで溶解したボンビコールに対する蛍光変化率の継時変化を表す。Cont.1では気体のドデカナールの溶解に使用した純水を、Cont.2ではボンビコールの溶解に使用したDMSOを、それぞれ刺激に対するコントロールとして使用した。
【図２】図２は、嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞の対象臭に対する蛍光応答を示す図である。AgOR12-Or83bを導入したセンサ細胞（A）とAgOR16-Or83bを導入したセンサ細胞（B）の蛍光応答を示す。上図は蛍光変化率の継時変化、下図は各刺激後の蛍光変化率のピーク時の蛍光イメージを表す。コントロール（Cont.）は0.1%DMSOで、(Z)-2-nonenal、(E)-2-nonenal、nonanalは100μMに調製し、点線の時間に刺激した。蛍光変化率(%)は疑似カラーで示す。スケールバーは100μmを表す。それぞれの細胞は、(Z)-2-nonenalに強く応答することがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について説明する。
＜生体由来の揮発性有機化合物の検出方法＞
本発明の一態様は、昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現している昆虫細胞に、被検体から採取された試料を接触させ、嗅覚受容体タンパク質と試料に含まれる生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて昆虫細胞が発する信号を検出する工程を含む、生体由来の揮発性有機化合物の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ということがある）に関する。
【００１４】
本発明の検出方法では、疾患等に特有の対象臭である生体由来の揮発性有機化合物に結合する昆虫の嗅覚受容体タンパク質（以下、単に「嗅覚受容体」と言うことがある）を発現している細胞（以下、単に「嗅覚受容体発現細胞」と言うことがある）をセンサ細胞として用いることで、簡便且つ高感度な生体由来の揮発性有機化合物の検出を可能としたものである。
【００１５】
（生体由来の揮発性有機化合物）
本発明の検出方法が対象とする生体由来の揮発性有機化合物としては、同生体由来の揮発性有機化合物と結合する昆虫の嗅覚受容体が存在するものであれば限定されない。ここで揮発性有機化合物としては、常温で蒸発しやすい性質を有する有機化合物であって、沸点範囲が<0℃〜100℃の高揮発性有機化合物、沸点範囲が50℃〜260℃の揮発性有機化合物、及び沸点範囲が240℃〜400℃の準揮発性有機化合物を含む。好ましくは、沸点範囲が50℃〜260℃の揮発性有機化合物である。揮発性有機化合物の分子量は、特に限定されない
が、例えば10〜400程度の分子量を有するものであってよい。本発明の検出方法が対象と
する生体由来の揮発性有機化合物としては、例えば、膀胱がんの対象臭である(S)-2-ヒド
ロキシプロパン酸、ヘプチルヒドロペルオキシド、2,3-ジヒドロキシプロパナール、塩化ノナノイル、ドデカナール、(Z)-2-ノネナール、4, 5-ジメチル-3(2H)-イソキサゾロン、(Z)-2-デセナール、トリクロロ酸3-トリデシルエステル、レボグルコサン、4-（ジメチルアミノ）-3-メチル-2-ブタノン、4-メチル-1-ブテン-1-イルペンタン酸エステル、ジエチルフタル酸、1-クロロ-8-ヘプタデセン、ペンタデカン酸、1,2-ベンゼンジカルボン酸ブ
チルデシルエステル；肺がんの対象臭であるノナナール、1-ブタノール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、２−エチル-1-ヘキサノール、2-ペンタノン、テトラヒドロフラン、2-メチルピラジン；(E)-2-ノネナール等が挙げられる。
【００１６】
（昆虫細胞）
昆虫細胞は、昆虫の嗅覚受容体が機能可能に発現するものであれば、限定されず用いることができる。例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)等のガ由来の細胞であってもよい。ヨトウガ由来の細胞の例としては、Sf21及びSf9が挙げられる。Sf21細胞は、卵巣細胞由来である。Sf21細胞は、無限分裂し、導
入した遺伝子を永続的に発現する安定発現系統を樹立することが可能である。また、Sf21細胞は、18℃から40℃の広い温度範囲で生存可能であり、培養液のpHを調整するための二酸化炭素も不要である。Sf21細胞は、本来、嗅覚受容体を有しないが、嗅覚受容体の遺伝子を導入することにより、嗅覚受容体を発現させることが可能である。Sf9細胞は、Sf21
のクローンである。イラクサギンウワバ由来の細胞の例としては、High Five及びTniが挙げられる。Tni由来細胞は、卵巣細胞由来である。
【００１７】
あるいは、昆虫細胞は、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。ショウジョウバエ由来の細胞の例としては、Drosophila S2細胞が挙げられる。
【００１８】
（嗅覚受容体）
嗅覚受容体は、Gタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャンネル型受容
体であってもよい。イオンチャネル型受容体は、匂い分子（生体由来の揮発性有機化合物等）であるリガンドと相互作用する部位と、イオンが流入する部位と、を有する。昆虫細胞のイオンチャンネル型受容体がリガンドと結合すると、昆虫細胞内にナトリウムイオンやカルシウムイオン等の陽イオンが流入する。昆虫細胞において、イオンの流入は、リガンドの結合から数10ミリ秒程度で生じ得る。流入するイオンの量は多く、1個のリガンド
の結合に対し、細胞内に流入するイオンの量は107個ともいわれている。
【００１９】
一般に、特定の種類の嗅覚受容体は、特定の匂い分子に対する特異性を有する。昆虫細胞において、1種類の匂い分子に対応する1種類の嗅覚受容体のみを発現させてもよいし、複数種類の匂い分子に対応する複数種類の嗅覚受容体を発現させてもよい。また、発現させる嗅覚受容体の量を調整して、匂いセンサとしての検出感度を調整してもよい。
【００２０】
嗅覚受容体（Olfactory receptor: OR）の例としては、カイコガの性フェロモンであるボンビコール(Bombykol)の受容体であり、膀胱がんの対象臭であるドデカナールの受容体であるBmOR1、カイコガの性フェロモンであるボンビカール(Bombykal)の受容体であるBmOR3、ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)の受容体であって、膀胱がんの対象臭であ
る(Z)-2-ノネナールの受容体であるAgOr12、AgOr16、AgOR50、AgOR53、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭である1-オクテン-3-オールの受容体であるOr13a、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭であるジェオスミンの受容体であるOr56a、キイロショ
ウジョウバエの一般臭受容体であるOr85b、及びコナガの性フェロモン受容体であるPxOR1等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
遺伝子工学的に嗅覚受容体を昆虫細胞に発現させる場合は、例えば、嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクト
させる。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚器官からmRNAを抽出し、cDNAを合成して単離することができる。単離されたcDNAから、PCRプライマーを用いて、
嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部をPCR法にて増幅することが可能である。
【００２２】
嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖cDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してcDNAライブラリーを作製することによっても取得することができる。cDNAは、制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたcDNAを制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクター
に連結する方法によって、ベクターに組込むことができる。
【００２３】
昆虫培養細胞発現用ベクターには、好ましくは、嗅覚受容体タンパク質と複合体を形成して細胞内にイオンを流入させるとされているOrcoファミリー受容体（Olfactory receptor co-receptor）[例えばOr83bファミリータンパク質をコードする遺伝子（アクセッション番号：AY567998）]が組み込まれる。
【００２４】
（信号の検出）
嗅覚受容体と生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて、昆虫細胞が発する信号は、限定されないが、嗅覚受容体と生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づく細胞内イオン濃度の変化等に基づく膜電位、蛍光強度等の変化として検出され得る。昆虫細胞が発する信号の検出は、電位測定器、光センサ等により検出することができる。
【００２５】
昆虫細胞において、嗅覚受容体とともに蛍光タンパク質が発現されていてもよい。例えば昆虫細胞において、イオンチャンネル型嗅覚受容体に生体由来の揮発性有機化合物が結合すると、昆虫細胞内にカルシウムイオン等のイオンが流れる。したがって、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現させる遺伝子を昆虫細胞に導入することにより、蛍光強度の変化から、昆虫細胞が生体由来の揮発性有機化合物を検出しているか否かを確認することが可能となる。蛍光タンパク質の例としては、限定されないが、GCaMP3、GCaMP6s及びエクオリン等が挙げられる。
【００２６】
蛍光タンパク質は細胞内で光を発することから、検出される蛍光強度は蛍光タンパク質の発現量に依存することになる。そのため、その発現量を高くするために、蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、嗅覚受容体タンパク質をコードする遺伝子やOr83bタンパク質
ファミリーをコードする遺伝子とは別のベクターに組み込むことが好ましい。
【００２７】
なお、嗅覚受容体発現細胞に蛍光タンパク質を共発現させずに、当該細胞に、カルシウムイオン依存性蛍光色素を添加してもよい。カルシウムイオン依存性蛍光色素を共存させることにより、当該受容体が対象となる生体由来の揮発性有機化合物と結合すると細胞内のカルシウムイオン濃度が変化し、蛍光を発する。かかる蛍光色素としては、例えば、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等を用いることができる。
【００２８】
嗅覚受容体発現細胞は、容器等に保持され培養した状態で、本発明の方法に使用することができる。細胞は接着又は付着細胞が好ましい。培養液は、嗅覚受容体発現細胞を培養可能な、炭素源、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む通常の培地であればよく、培養条件も二酸化炭素の存在を必要としない。培養液のpHは、嗅覚受容体発現細胞が生育し得る範囲のpHであればよく、pH 6.0〜7.4程度に調整するのが好適である。培養温度
は、嗅覚受容体発現細胞が生育し得る温度であればよく、通常25〜30℃程度に調整するのが好ましい。
【００２９】
嗅覚受容体発現細胞を保持する容器の数は1個であってよいが、容器の数は特に制限さ
れず、複数個であってもよい。
【００３０】
複数個の容器を有する態様として、細胞を格納するための複数の容器（マイクロウェル）を有するマイクロウェルアレイとすることもできる。
このような複数個の容器を有する態様では、各容器に、対象となる異なる種類の生体由来の揮発性有機化合物と結合する嗅覚受容体をそれぞれ発現している細胞を保持することができる。このような態様では、対象となる生体由来の揮発性有機化合物を接触させた時の、容器ごとに異なる蛍光強度を示すその応答パターンを確認することにより、同生体由来の揮発性有機化合物を検出することができる。また、このような態様の系を用いれば、同一のアレイ上で複数の種類の生体由来の揮発性有機化合物を同時に検出することができる。
【００３１】
嗅覚受容体と生体由来の揮発性有機化合物との結合に基づいて、昆虫細胞が発する信号が、蛍光等の光強度の変化として光センサによって検出される場合、センサは、例えば、細胞の裏面側に配置され、２次元アレイ状に光電変換素子が配置されたセンサと、センサ上に容器の像を結合する結像光学系とを有する。細胞とセンサとの間にバンドパスフィルタをさらに備えてもよい。フィルタは、細胞が発する蛍光が持つ波長の光を透過し、その他の波長の光を透過しないものが好ましい。なお、センサは、細胞の表面側に配置してもよい。
【００３２】
センサが有する光電変換素子は、例えば、CCD型イメージセンサ又はCOMS型イメージセ
ンサとすることができる。センサは、例えば、撮影領域が300万画素以上の解像度を持ち
、細胞1つ当たりの蛍光を撮影素子の4画素以上で捕らえることができる機能を持つものであることが好ましい。そして、センサは、容器の像が特定の領域に写った蛍光画像を生成する。容器内に含まれる細胞が発光すると、細胞の像が写っている画素の輝度が増加する。
【００３３】
センサにより生成した蛍光画像を判定器に渡してもよい。
判定器は、プロセッサ、半導体メモリ及び周辺回路を有し、センサから出力された蛍光画像に基づいて対象となる生体由来の揮発性有機化合物を検出する。判定器は、センサから出力された蛍光画像において、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる生体由来の揮発性有機化合物が接触する前の、その容器が写っている領域の平均輝度値と、化合物が接触した後の、その領域の平均輝度値とを比較し、後者の平均輝度値が、例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上増加している場合に、その容器において対象となる化合物を検出できたと判定する。
【００３４】
別の実施態様では、判定器は、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる生体由来の揮発性有機化合物が接触する前の輝度値よりも、化合物が接触した後の輝度値が、所定の輝度閾値以上（例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上）高くなった画素数が、その容器に対応する領域に含まれる画素数の所定の割合以上、例えば1/1000〜1/100以上検出された場合に、その容器において対象となる化合物が検出され
たと判定してよい。
【００３５】
容器の数が1個の場合には、センサは、フォトダイオード又はフォトマルを用いてもよ
い。一方、容器の数が複数の場合には、センサは、容器ごとにフォトダイオードと集光光学系とを有してもよい。これらの場合には、センサは1つの容器について細胞が発する光
の蛍光強度に対応した強度を有する1つの信号を出力する。この場合、判定器は、各容器
に対応するフォトダイオード又はフォトマルから出力された信号強度が、生体由来の揮発性有機化合物が接触する前よりも接触した後に5%以上、好ましくは10%以上、より好まし
くは20%以上増加していれば、化合物が検出されたと判定してよい。
【００３６】
本発明の検出方法においては、判定器を有さず、センサからの信号をそのまま出力してもよい。
【００３７】
（試料）
本発明の検査方法に用いられる試料は、生体由来の揮発性有機化合物を含む可能性がある、被検体から採取された試料であれば特に限定されず、採取した呼気、尿、汗、唾液及び血液等であり得る。採取の簡便性、取扱いの容易性等の観点から特に好ましい試料は、尿である。
試料の調製方法は、嗅覚受容体発現細胞において生体由来の揮発性有機化合物を検出できる試料を調製できる方法であればどのような調製方法でもよい。
例えば、採取した呼気、尿、汗、唾液及び血液等をそのまま用いることができる。又は、例えば、試料を適当な溶媒に溶解、希釈することで試料を調製することができる。
【００３８】
（被検体）
本発明の検出方法の対象となる被検体は、ヒトを含む哺乳類が挙げられる。例えば、ヒト以外の哺乳類として、限定されないがマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ウマ、ウシ等を対象とする。
また、被検体としては、がん等の疾患の疑いがない対象、疾患が疑われる対象、すでに何らかの疾患を患っている対象、がん組織の外科的切除後等の疾患の治療後の対象等のいずれであってもよい。
【００３９】
本発明の検出方法は、対象となる生体由来の揮発性有機化合物をpptレベルの高感度で
かつ高い識別能で検出でき、また、本発明の検出方法に使用するセンサ細胞は長期間にわたり使用可能であり、しかも携帯性を有する。さらに、センサ細胞は、6ケ月間以上凍結
保存することもできる。また、センサ細胞は、洗浄することによって再利用可能である。したがって、本発明の検出方法は、医療機関・健診での検査や個人向けの検査等のためのさまざまな場面での利用が期待される。例えば、医療機関・健診での検査であれば、がんや感染症等の検査時間の短縮、コスト削減、非侵襲的且つ高感度の検査方法への移行、感染症等の原因菌の迅速特定等、個人向け検査であれば、がんや感染症等の疾患や、ストレス、口臭・体臭、生活習慣病等の簡便且つ非侵襲的な検査、健康モニタリング、病気の早期発見・重症化予防等への応用が期待される。
【００４０】
＜疾患の検査方法＞
本発明の別の一態様は、本発明の検出方法により検出された生体由来の揮発性有機化合物の量を、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較し、生体由来の揮発性有機化合物の量を指標として疾患を判定する工程を含む、疾患の検査方法（以下、「本発明の検査方法」ということがある）に関する。
【００４１】
いくつかの疾患では、患者は疾患に特有な対象臭として、生体由来の揮発性有機化合物を発することが知られており、疾患マーカーとして使用できる可能性が示唆されている。すなわち、被検体が、疾患の症状を有する又は疾患状態の変化を示す場合には、被検体から採取された試料における疾患に特有の生体由来の揮発性有機化合物の濃度等の量に変動が生じる。
【００４２】
変動は、例えば、疾患に特有の生体由来の揮発性有機化合物の濃度上昇、濃度減少、消失、出現等の1種又は2種以上を含む概念である。
この変動は、被検体から採取された試料の1種又は2種以上の生体由来の揮発性有機化合物の量と、対照（健常者、疾患に罹患する以前の対象、疾患の治療前の対象等）の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量とを比較することにより、容易に確認することができる。
【００４３】
例えば、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量を、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較し、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して多い場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定する。
限定されないが、例えば、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量に対し、例えば1.2倍以上、好まし
くは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは5倍以上、よりさらに好まし
くは10倍以上の場合に、疾患を有する又は疾患を有する可能性が高いと判定する。
【００４４】
また、例えば、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量を、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較し、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量と比較して同等又は少ない場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能性が高いと判定する。
限定されないが、例えば、被検体から採取された試料の生体由来の揮発性有機化合物の量が、対照の試料の生体由来の揮発性有機化合物の量に対し、例えば0.1倍以下、好まし
くは0.2倍以下、より好ましくは0.5倍以下、さらに好ましくは0.8倍以下、よりさらに好
ましくは1倍以下の場合に、疾患を有さない、疾患が治療された又は疾患を有さない可能
性が高いと判定する。
【００４５】
一般的には、健常者又は患者由来の試料中の生体由来の揮発性有機化合物の量又は発現パターンを対照とすることにより容易に変動を確認することができる。なお、予め、健常者又は患者由来の試料中の生体由来の揮発性有機化合物の量又は発現パターンの測定結果を標準結果とし用意しておき、その標準結果と比較して有意差の有無を判定してもよい。このような態様も本発明の方法に包含される。
なお、試料の生体由来の揮発性有機化合物の量は、生体由来の揮発性有機化合物の量と相関する値（例えば、蛍光強度の測定値等）により比較してもよい。
【００４６】
2種以上の生体由来の揮発性有機化合物の量を指標として用いる場合、2種以上の生体由来の揮発性有機化合物の量の合計量として判定してもよいし、各生体由来の揮発性有機化合物の量（いずれかの化合物に重みづけをすることを含む）に基づいて総合して判定してもよい。
また、2種以上の生体由来の揮発性有機化合物の量を指標として疾患を判定する場合は
、対照の試料の揮発性有機化合物の発生パターンとの一致に基づいて、疾患の種類等を判定することができる。
【００４７】
すなわち、被検体から採取された試料の1種又は2種以上の生体由来の揮発性有機化合物の量の変動結果から、疾患の判定（疾患の有無）、疾患の種類（がんの種類又は部位、感染症の原因菌）、疾患の程度（治療効果、疾患の予後の診断等）を診断する目的で使用することが可能である。
【００４８】
（疾患）
本発明の検査方法の対象とする疾患は、疾患に特有の生体由来の揮発性有機化合物を有し、同揮発性有機化合物が昆虫嗅覚受容体により検出可能であれば、特に限定されず、膀胱がん、肺がん及び乳がん等のがん、感染症、糖尿病等の生活習慣病から選択される1種
又は2種以上であってよい。対象とする疾患として好ましくは、膀胱がんである。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定される
ものではない。
【００５０】
＜実施例１＞
(カイコガの行動、触角電位図による対象臭検出嗅覚受容体の特定)
膀胱がん患者に特徴的な対象臭の一つとして、ドデカナールが報告されている（特許文献１）。ドデカナールは炭素数12の直鎖アルデヒドであり、ある種のガ類の性フェロモン成分として利用される化合物である（Pherobase -Database of Pheromones and Semiochemicals；http://www.pherobase.com/）。カイコガ（Bombyx mori）も同様に性フェロモンによる雌雄間交信を行っており、性フェロモン成分の一つであるボンビコール（E,Z,-10,12-hexadecadienol）を触角で検出すると、配偶行動が解発されることが報告されている(Butenandtet al., 1959)。ドデカナールは、性フェロモン成分として利用されていること、またボンビコールと比較的化学構造が類似していることから、カイコガはドデカナールに応答を示す可能性がある。そこで、本項目では、カイコガ成虫で機能する嗅覚受容体がドデカナールに応答するかどうかを調査するため、カイコガ成虫を用いて、行動レベル及び触角レベルでドデカナールに対する応答性を取得・評価した。
【００５１】
まず、カイコガの配偶行動を指標にドデカナールに対する応答性を調査した。ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide; DMSO）単独、及びDMSOに溶解したドデカナール（100mM）を用いて、各試料20μLを濾紙に滴下し、それぞれ別のパスツールピペットにセット
した。濾紙から各成分をパスツールピペット内に十分に揮発させた後、オスカイコガ成虫の触角へ刺激した結果、DMSO単独では配偶行動を示さなかった。一方、DMSOに溶解したドデカナールには、羽ばたき、探索行動、そして腹曲げ行動といった一連の配偶行動を示した。これらの結果から、ドデカナールは、カイコガの配偶行動を解発することが分かった。
【００５２】
次に、ドデカナールでの配偶行動の解発が触角で機能発現する嗅覚受容体によるものかどうかを調査するため、触角電図（electroantennogram; EAG）によりドデカナールに対
するオスカイコガの触角応答を取得した。カイコガの触角には、性フェロモン受容体であるBmOR1が機能発現しており、その活性化によって配偶行動が引き起こされることが明ら
かにされている(Sakurai et al., 2004)。DMSO単独、及びDMSOに溶解したドデカナールで刺激した結果、DMSO単独では触角電位が変化しない一方、ドデカナールに対して約1.5mV
の明確な触角電位の変化を示すことが分かった。この応答は、ヘキサンで希釈した1μgのボンビコールと同程度の電位変化量であった。以上の結果から、ドデカナールはカイコガオスの触角で受容されており、その応答により配偶行動が解発される、すなわちBmOR1が
ドデカナールを検出していることが示唆された。
【００５３】
(カイコガフェロモン受容体を発現させたセンサ細胞による対象臭の検出)
オスカイコガの行動試験、及び触角電位の応答測定の研究（前項）から、オスカイコガの触角で機能発現する性フェロモン受容体（BmOR1）はドデカナールを受容する可能性が
示唆された。これまでに本発明者らは、BmOR1を、共受容体BmOrco及びカルシウム感受性
蛍光タンパク質（GCaMP6s）とともにSf21細胞で共発現させることにより、性フェロモン
成分であるボンビコールを蛍光強度変化量として検出する細胞系統（以下、BmOR1細胞系
統と呼ぶ）を作出してきた(Mitsuno et al., 2015, Termtanasombat et al., 2016)。そ
こで、本項目では、ドデカナールに対するBmOR1細胞系統をセンサ細胞として、その蛍光
応答を取得することにより、ドデカナールの受容体としてBmOR1の利用可能性を検証した
。
【００５４】
まず、DMSO単独、及びDMSOに溶解したドデカナール（30μM）で刺激した結果、BmOR1細胞系統はDMSO単独には蛍光応答を示さなかったが、ドデカナールに対してはわずかに蛍光応答を示した。しかし、その蛍光変化率は数％程度であり、また調製した刺激液中で結晶
の析出が確認されたことから、難水溶性有機化合物であるドデカナールの溶液中への溶解率は低く、計算した濃度の刺激液が調製できていない可能性が示唆された。
【００５５】
そこで、すでに本発明者らにより確立した、微細バブルによる気体の難水溶性有機化合物の液中への溶解技術を活用し、気体のドデカナールを純水に効率的に溶解することでドデカナール溶解サンプルを調製し、細胞応答試験に供した。溶解したドデカナールをアッセイバッファー（140 mM NaCl、5.6 mM KCl、4.5 mM CaCl2、11.26 mM MgCl2、11.32mM MgSO4、9.4 mM D-glucose、5 mM HEPES、pH 7.2）で希釈し蛍光応答を測定した。その結果、BmOR1細胞系統は12.4μMのドデカナールに対して約20％の蛍光強度変化を示し、ポジティブコントロールとして刺激した100μMのボンビコールに対しても約50％の蛍光強度変化を示した（図１）。前項に加えて、これらの結果は、BmOR1細胞系統がドデカナールに蛍
光応答を示す可能性を示しており、BmOR1が膀胱がんの一つの対象臭を検出する嗅覚受容
体として利用できることが示唆された。
【００５６】
＜実施例２＞
（嗅覚受容体を導入したセンサ細胞の対象臭検出性能の評価）
膀胱がん患者に特徴的な対象臭は、ドデカナールのほかに、(Z)-2-ノネナールが含まれる（特許文献１）。2-ノネナールは、膀胱がんの対象臭であることに加えて、加齢臭の成分として同定された物質である（Haze et al., 2001）。しかし、ドデカナールと同様、(Z)-2-ノネナールに対する嗅覚受容体は現在までに同定されていないことから、当該嗅覚
受容体を検出素子として利用するためには、対象となる嗅覚受容体を選定・単離し、細胞発現系にて受容体の機能を同定する必要がある。そのような状況の中、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）では、嗅覚受容体の応答特性がDoOR；Database of Odorant Responses（http://neuro.uni-konstanz.de/DoOR/default.html）と呼ばれるデータベースで集約されており、特定の対象臭を選択することで、応答を示す嗅覚受容体を検索することができる（Munch et al., 2016）。また、ハマダラカ（Anopheles gambiae）
では、嗅覚受容体の網羅的な応答特性解析が行われており、論文ベースでそれら嗅覚受容体の応答特性が利用できる（Carey et al., 2010、Wang et al., 2010）。そこで、本項
目では、(Z)-2-ノネナールと化学構造が類似した化合物に応答する嗅覚受容体を選抜し、Sf21細胞を用いた細胞発現系で、嗅覚受容体の応答特性を評価することにより、(Z)-2-ノネナールに対する嗅覚受容体の同定を目指した。
【００５７】
DoORによると、キイロショウジョウバエの嗅覚受容体のうち、Or74aは(Z)-2-ノネナー
ルの類似物質である1-ノネナールに、Or19aは(Z)-2-ノネン-1-オールに応答することが報告されている（Munch et al., 2016）。そこで、まずこれらの嗅覚受容体をSf21細胞で発現させて、(Z)-2-ノネナールに対する蛍光応答を取得した。すなわち、これらの嗅覚受容体をコードする遺伝子を合成し、実施例１のBmOR1細胞系統において、BmOR1に換えて発現させることでOr74a発現細胞、Or19a発現細胞を作出し、蛍光応答を測定した。その結果、Or74a発現細胞、Or19a発現細胞は(Z)-2-ノネナールに対してほとんど応答を示さなかった。
【００５８】
次に、ハマダラカの嗅覚受容体の応答特性をもとに、嗅覚受容体の選定を行った。ハマダラカの嗅覚受容体のうち、AgOR12、AgOR16、AgOR50、AgOR53の4種類の嗅覚受容体が(Z)-2-ノネナールの類似化合物であるノナナールに強く応答することが報告されている（Wang et al., 2010）。そこで、これら嗅覚受容体を対象に嗅覚受容体をコードする遺伝子合成を行い、実施例１のBmOR1細胞系統において、BmOR1に換えてSf21細胞による発現系に適用することで、センサ細胞として、これら嗅覚受容体を発現する細胞を作出し、(Z)-2-ノネナールに対する蛍光応答を測定した。その結果、4種類の嗅覚受容体のうち、AgOR12、AgOR16をキイロショウジョウバエのOrco（ここではOr83bと呼ぶ）及びGCaMP6sとともに共
発現させたSf21細胞は、(Z)-2-ノネナールに蛍光応答を示し、それぞれ約6%、約10%の蛍
光強度変化を示した（図２のA、B）。また、嗅覚受容体の選択性を評価するために、(Z)-2-ノネナールに加えて、化学構造の類似する2種類の匂い物質（(E)-2-ノネナール、ノナ
ナール）で刺激した。その結果、各受容体はノナナールにほとんど応答を示さない一方、(Z)-2-ノネナール、及び(E)-2-ノネナールには蛍光応答を示し、(Z)-2-ノネナールに対して強く蛍光応答を示すことが分かった（図２のA、B）。以上の結果から、AgOR12及びAgOR16は、膀胱がんの対象臭の一つである(Z)-2-ノネナールを検出する嗅覚受容体として利用できる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、がん等の疾患の検査等の診断・ヘルスケア分野等に適用できる。
【図１】
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【図２】
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