(57)【要約】      （修正有）【課題】カテプシンＥ（ＣＥ）の生物学的活性を促進するペプチドであって、従来のペプチドよりも高い活性化機能を有するペプチド、及びこのペプチドを用いた試料中のＣＥ活性及びＣＥ量の測定方法の提供。【解決手段】式１：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９（式１中、Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、Ａ又はＶ、Ｘ３はＰ又はＴ、Ｘ４はＣ、Ｈ又はＹ、Ｘ５はＩ、Ａ、Ｅ又はＶ、Ｘ７はＦ又はＬ、Ｘ８はＫ又はＭ、Ｘ１３はＶ又はＭ、Ｘ１９はＬ、Ｔ、Ｑ又はＰ、Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、Ｅ又はＰ、Ｘ２１はＳ、Ｔ又はＡ、Ｘ２２はＡ又はＲ、Ｘ２４はＳ又はＨ、Ｘ２６はＳ又はＨ、Ｘ２９はＷ又はＳである）（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、ただしＸ８がＭであり且つＸ２９がＳであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９
（式１中、Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３はＰまたはＴであり、
Ｘ４はＣ、ＨまたはＹであり、
Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶであり、
Ｘ７はＦまたはＬであり、
Ｘ８はＫまたはＭであり、
Ｘ１３はＶまたはＭであり、
Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰであり、
Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰであり、
Ｘ２１はＳ、ＴまたはＡであり、
Ｘ２２はＡまたはＲであり、
Ｘ２４はＳまたはＨであり、
Ｘ２６はＳまたはＨであり、
Ｘ２９はＷまたはＳである）（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、但しＸ８がＭであり且つＸ２９がＳであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。
【請求項２】
前記式１のＸ８がＫである（配列番号２）、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記式１のＸ８がＭであり、Ｘ２９がＷである（配列番号３）、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記式１中、
Ｘ１はＧまたはＬであり、
Ｘ３はＰであり、
Ｘ４はＣまたはＨであり、
Ｘ５はＩまたはＡであり、
Ｘ７はＦであり、
Ｘ１９はＬであり、
Ｘ２０はＬ、Ｓ、ＱまたはＥであり、
Ｘ２１はＳまたはＴであり、
Ｘ２２はＡである（配列番号４〜６）、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
カテプシンＥの元の酵素活性を１００％とすると、三次ライブラリーで得られたペプチド（ＣＥＡＰ３）よりも、カテプシンＥの酵素活性をさらに約２０％以上、上昇させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
カテプシンＥへの結合に対する解離定数（ＫＤ）は１ｎＭ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドを含む、がんを治療するための医薬。
【請求項８】
試料中のカテプシンＥの酵素活性測定方法であって、
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、
（ｂ）固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥと、標識されたカテプシンＥ基質を接触させる工程、および
（Ｃ）カテプシンＥによるカテプシンＥ基質の切断を検出してカテプシンＥ酵素活性を求める工程
を含み、前記ペプチドアプタマーが請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドである、方法。
【請求項９】
試料中に含まれるカテプシンＥ量の測定方法であって、
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、および
（ｂ）カテプシンＥが結合したペプチドアプタマーを検出し、試料中のカテプシンＥ量を求める工程
を含み、前記ペプチドアプタマーが請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドである、方法。
【請求項１０】
カーボンナノチューブ電界効果型トランジスタ法を用いて実施される請求項９に記載の方法であって、
前記工程（ａ）において、固相化されたペプチドアプタマーは、電極に設置されたカーボンナノチューブに固相化されたペプチドアプタマーであり、そして
前記工程（ｂ）は、前記ペプチドアプタマーとカテプシンＥの結合前後において、前記電極に生じる標準電極に対する電位差を測定することを含む工程である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドとその使用に関する。より具体的には、酵素活性に影響を与えるペプチド、該ペプチドを含む医薬、および該ペプチドを利用した酵素の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテプシンＥ（以下、ＣＥと略記することがある）は細胞内アスパラギン酸プロテアーゼであり、免疫系細胞、消化系上皮細胞および皮膚組織など特定の細胞で主に発現する（非特許文献１）。本酵素は正常皮膚では角化細胞（ケラチノサイト）および毛包の内毛根鞘の領域に存在し、また免疫系細胞のマクロファージなどの抗原提示細胞では主としてエンドソームなどの細胞内小器官に存在する（特許文献１）。
【０００３】
カテプシンＥ活性の低下により、悪性腫瘍や免疫アレルギー疾患などが生じることが報告されている。川久保らは、カテプシンＥはマウス乳腺におけるシグナル伝達、発生、分化および増殖に関連するタンパク質の発現を調節すること、カテプシンＥの欠損はマウス乳腺組織において前がん状態を誘発すること (非特許文献２)、さらには血清カテプシンＥ活性が患者の好ましい予後結果と有意に相関していること(非特許文献３)を報告している。この研究は、カテプシンＥ発現の抑制が乳房発がんリスクを高め、乳がんの予後不良に結びつくことを示している。加えて、カテプシンＥ欠損マウスは無菌環境下で飼育しても全く異常を示さないが、通常環境下に移すとアトピー性皮膚炎様症状（ＡＤ）を示すことが報告されており、カテプシンＥの発現の減少は、ＡＤを有するヒトおよびＡＤマウスモデルＮＣ／Ｎｇａの両方の赤血球においても観察されている（非特許文献４）。一方、臨床的意義は議論の余地があるものの、特定のヒトがんのバイオマーカーとしてのカテプシンＥの有用性を示唆する報告がある（非特許文献５〜９)。しかし、この相反する報告は、異なるタイプのがん細胞における非機能的カテプシンＥの発現レベルの差異から生じていると考えられる(非特許文献３)。
【０００４】
カテプシンＥは、強力な抗がん作用を有するプロテアーゼである。マウス実験ではカテプシンＥの発現レベルが腫瘍抑制の程度と正に相関することがわかっており、カテプシンＥは複数の経路を介して強力な腫瘍増殖と転移を抑制すると考えられている（非特許文献１０）。第１にインビトロでカテプシンＥががん細胞表面からアポトーシス誘導分子ＴＲＡＩＬを特異的に切断遊離し、がん細胞表面のデス受容体に結合することによってがん細胞特異的アポトーシスが誘導されることが明らかになっている（非特許文献１０)。さらにはカテプシンＥが、腫瘍関連血管新生の抑制に関与していることや、腫瘍周辺部におけるマクロファージの浸潤増加と活性化亢進を誘導することが報告されている（非特許文献１０)。また、カテプシンＥは、ヒト前立腺がん細胞の増殖停止とアポトーシスを誘導することも報告されている（非特許文献１１）。最近の研究では、カテプシンＥ発現の血清レベルと臨床病理学的パラメータとの間の相関分析により、タンパク質レベルではなく活性レベルが乳がんステージおよび進行と負に関連しているとの報告がある（非特許文献３）。
【０００５】
したがって、カテプシンＥの発現/活性を増加させる薬剤が、がん治療に役立つことが期待されている。特に、ペプチド創薬の標的としてカテプシンＥは非常に興味深い。創薬で現在主流となっている抗体医薬の問題点として、抗体の分子量が大きいことや合成コストが高いことなどが挙げられる。一方、ペプチドは、抗体の100分の１ほどのサイズであり低コストで合成できること、分子改変や化学修飾が容易であるためドラッグデリバリーシステムへの応用や分子ミミック化によって標的分子の生理活性の調節が可能であるといったメリットがある。
【０００６】
カテプシンＥに特異的に結合し、その活性について阻害作用を有するペプチドが報告されている（特許文献２）。このペプチドはin-vitro-virus（ＩＶＶ）法を使用した、分子淘汰操作により作成された。
一方、酵素に特異的に結合するペプチド（ペプチドアプタマー）の開発において、酵素活性阻害作用を有するものに比較し、酵素活性化作用を有するペプチドの開発は困難である。カテプシンＥ活性化ペプチドは、高速化された試験管内分子進化法である発達ライブラリー法を用いてライブラリーを進化させ、ＳＦリンク法（非特許文献１２）を使用して酵素活性機能について淘汰することにより開発されている（非特許文献１３および１４）。ビヤニらは、一次ライブラリーおよび二次ライブラリーとして、中性環境下でカテプシンＥを活性化する８から１６アミノ酸残基長のペプチドの開発を報告した（非特許文献１３）。小松らは、８アミノ酸残基長の２つのペプチドをリンカーで連結した三次ライブラリーの作成を報告している（非特許文献１４）。
【０００７】
さらには、カテプシンＥについて腫瘍マーカーとしての利用が提案されている。被検試料中のカテプシンＥの量を測定し、測定結果と乳がんの可能性または乳がんの予後とを関連付けることにより乳がんを検出する方法が報告されている（特許文献３）。カテプシンＥの測定が、カテプシンＥの基質、カテプシンＥに対する抗体、またはカテプシンＥに対して特異的に親和性を有するペプチド性化合物（アプタマー）を用いて行われてもよいと報告されている（特許文献３）。カテプシンＥに特異的に結合するペプチドを用いてカテプシンＥの量を測定する方法が報告されている（特許文献４及び非特許文献１５）。さらには、カテプシンＥタンパク質あるいはカテプシンＥタンパク質の発現促進作用（インターフェロンγまたはリポ多糖）を有する物質を含む、老化現象を改善、防止または遅延させるための医薬組成物が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−１０５６８６
【特許文献２】特開２００７−３３２０８５
【特許文献３】特開２０１１−１３７６８５
【特許文献４】特開２０１１−１１５１４６
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yamamoto K, Kawakubo T, Yasukochi A, Tsukuba T, Emerging roles of cathepsin E in host defense mechanisms, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Volume 1824, Issue 1, 2012, Pages 105-112.
【非特許文献２】Kawakubo T. et al. (2008) Gene expression profiling of mammary glands of cathepsin E-deficient mice compared with wild-type littermates. Biochimie, 90, 396-404.
【非特許文献３】Kawakubo T, Yasukochi A, Toyama T, et al. Repression of cathepsin E expression increases the risk of mammary carcinogenesis and links to poor prognosis in breast cancer. Carcinogenesis. 2014 Mar;35(3):714-26.
【非特許文献４】Tsukuba T, Okamoto K, Okamoto Y et al. Association of cathepsin E deficiency with development of atopic dermatitis. J Biochem. 2003 Dec;134(6):893-902.
【非特許文献５】Ullmann,R. et al. (2004) Protein expression profiles in adenocarcinomas and squamous cell carcinomas of the lung generated using tissue microarrays. J. Pathol., 203, 798-807.
【非特許文献６】Blaveri,E. et al. (2005) Bladder cancer outcome and subtype classification by gene expression. Clin. Cancer Res., 11, 4044-4055.
【非特許文献７】Mota,F. et al. (1997) Cathepsin E expression by normal and premalignant cervical epithelium. Am. J. Pathol., 150, 1223-1229.
【非特許文献８】Caruso,M. et al. (2009) Over-expression of cathepsin E and trefoil factor 1 in sessile serrated adenomas of the colorectum identified by gene expression analysis. Virchows Arch., 454, 291-302.
【非特許文献９】Uno,K. et al. (2000) Clinical significance of cathepsin E in pancreatic juice in the diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol., 15, 1333-1338.
【非特許文献１０】Kawakubo, T, Yasukochi, A, Nakamura S, and Yamamoto, K. Cathepsin E as a potent anticancer protease. J. Oral Biosci.53(2):128-136, 2011。
【非特許文献１１】Kawakubo T, Okamoto K, Iwata JI, et al. Cathepsin E prevents tumor growth and metastasis by catalyzing the proteolytic release of soluble TRAIL from tumor cell surface. Cancer Research. 2007;67(22):10869-10878.
【非特許文献１２】Naimuddin M, Kitamura K, Kinoshita Y, et al. Selection-by-function: efficient enrichment of cathepsin E inhibitors from a DNA library. Journal of Molecular Recognition. 2007;20(1):58-68.
【非特許文献１３】Biyani M, Futakami M, Kitamura K, et al. In vitro selection of cathepsin E-activity-enhancing peptide aptamers at neutral pH. International Journal of Peptides.International Journal of Peptides Volume 2011 (2011), Article ID 834525, 10 pages
【非特許文献１４】Komatsu M, et al., "Peptide-Modulated Activity Enhancement of Acidic Protease Cathepsin E at Neutral pH," International Journal of Peptides, vol. 2012, Article ID 316432, 7 pages, 2012.
【非特許文献１５】Tung et al.,"1 Peptide aptamer-modified single walled carbon nanotube-based transistors for high-performance biosensors  Scientific Reports 7:17881 DOI:10.1038 (2017).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
カテプシンＥの活性を促進するペプチドであって、従来のペプチドよりも高い活性化機能を有するペプチド、および／または従来のペプチドよりもカテプシンＥに対し高い結合親和性を有するペプチドを提供することを課題とする。加えて、上記ペプチドを用いたカテプシンＥの酵素活性測定方法およびカテプシンＥ量の測定方法の提供を課題とする。さらには、該カテプシンＥの活性を促進するペプチドを含むがん治療用医薬の提供を課題する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、三次ライブラリーを基礎として、それを独自のアプローチによりさらに進化させて、三次ライブラリーに属する最高の活性化力を有するカテプシンＥ活性化ペプチドよりも一段と高い活性化機能を有するペプチドを見出した。また、このペプチドを含むがん治療用医薬を見出した。
【００１２】
上記三次ライブラリーに属するペプチドアプタマーは、検出感度が解離定数で数十ｎＭである。一定の強度を持つとはいえ、生物試料中（例えば血液中）のカテプシンＥの濃度（数ｎＭ以下）を測定するには精度的に十分ではなかった。今回取得したペプチドアプタマーは十分な精度で、血液中の低濃度カテプシンＥを検出することが期待される。
【００１３】
本発明は以下の通りである。
[1] 式１：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９
（式１中、Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３はＰまたはＴであり、
Ｘ４はＣ、ＨまたはＹであり、
Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶであり、
Ｘ７はＦまたはＬであり、
Ｘ８はＫまたはＭであり、
Ｘ１３はＶまたはＭであり、
Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰであり、
Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰであり、
Ｘ２１はＳ、ＴまたはＡであり、
Ｘ２２はＡまたはＲであり、
Ｘ２４はＳまたはＨであり、
Ｘ２６はＳまたはＨであり、
Ｘ２９はＷまたはＳである）（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、但しＸ８がＭであり且つＸ２９がＳであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。
[2] 上記式１のＸ８がＫである（配列番号２）、[1]に記載のペプチド。
[3] 上記式１のＸ８がＭであり、Ｘ２９がＷである（配列番号３）、[1]に記載のペプチド。
[4] 上記式１中、
Ｘ１はＧまたはＬであり、
Ｘ３はＰであり、
Ｘ４はＣまたはＨであり、
Ｘ５はＩまたはＡであり、
Ｘ７はＦであり、
Ｘ１９はＬであり、
Ｘ２０はＬ、Ｓ、ＱまたはＥであり、
Ｘ２１はＳまたはＴであり、
Ｘ２２はＡである（配列番号４〜６）、
[1]〜[3]のいずれか一に記載のペプチド。
[5] カテプシンＥの元の酵素活性を１００％とすると、三次ライブラリーで得られたペプチド（ＣＥＡＰ３）よりも、カテプシンＥの酵素活性をさらに約２０％以上、上昇させる、[1]〜[5]のいずれか一に記載のペプチド。
[6] カテプシンＥへの結合に対する解離定数（ＫＤ）は１ｎＭ以下である、[1]〜[5]のいずれか一に記載のペプチド。
[7] [1]〜[6]のいずれか一に記載のペプチドを含む、がんを治療するための医薬。
[8] 試料中のカテプシンＥの酵素活性測定方法であって、
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、
（ｂ）固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥと、標識されたカテプシンＥ基質を接触させる工程、および
（Ｃ）カテプシンＥによるカテプシンＥ基質の切断を検出してカテプシンＥ酵素活性を求める工程
を含み、上記ペプチドアプタマーが[1]〜[6]のいずれか一に記載のペプチドである、方法。
[9] 試料中に含まれるカテプシンＥ量の測定方法であって、
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、および
（ｂ）カテプシンＥが結合したペプチドアプタマーを検出し、試料中のカテプシンＥ量を求める工程
を含み、上記ペプチドアプタマーが[1]〜[6]のいずれか一に記載のペプチドである、方法。
[10] カーボンナノチューブ電界効果型トランジスタ法を用いて実施される[9]に記載の方法であって、
上記工程（ａ）において、固相化されたペプチドアプタマーは、電極に設置されたカーボンナノチューブに固相化されたペプチドアプタマーであり、そして
上記工程（ｂ）は、上記ペプチドアプタマーとカテプシンＥの結合前後において、上記電極に生じる標準電極に対する電位差を測定することを含む工程である、方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のペプチドは従来のペプチドと比較してカテプシンＥに対する結合親和性が高い。したがって、本発明のペプチドは、ペプチドアプタマーとして利用して試料中の低濃度カテプシンＥを検出することができる。本発明のペプチドは従来のペプチドと比較して、カテプシンＥに対する結合親和性が高くかつカテプシンＥ活性を促進する作用がより高い。したがって、本発明のペプチドは、ペプチドアプタマーとして利用して、試料中のカテプシンＥの酵素活性を高い感度により測定することができる。本発明のペプチドは従来のペプチドと比較してカテプシンＥ活性を促進する作用がより高い。したがって、本発明のペプチドは、がん細胞にアポトーシスを誘導する働きをより増強することができ、がん治療への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】点置換体四次ライブラリー用のコンストラクト(P109)（配列番号４５）。Variable領域（３８２から４６８番目の塩基）の１コドンにつき元のアミノ酸を除く19種類のアミノ酸に変異が加わるように設計されており、理論上19×19＝361種類の変異体が含まれたライブラリー。
【図２】Selection-by-Function導入型ｃＤＮＡディスプレイを用いたin vitro Selectionの概要図。
【図３】点置換体四次ライブラリー淘汰産物のゲル電気泳動図。レーン１：１００ｂｐラダー、レーン２：カテプシンＥに対して結合のないもの、レーン３：Selection bufferによる洗浄１、レーン４：Selection bufferによる洗浄２、レーン５：Selection bufferによる洗浄３、レーン６：カテプシンＥ酵素反応産物、レーン７：wash bufferによる洗浄、レーン８：溶出物（各５２４ｂｐのバンド）。
【図４】点置換体四次ライブラリー淘汰産物のアミノ酸配列。リンカー領域は影をつけて示した。アミノ酸点置換を□（囲み文字）で示す。アミノ酸配列の横の数字は、得られたコピー数である。
【図５】点置換体ペプチドのカテプシンＥ活性促進度合。縦軸の標記は活性促進度合であり、ＣＥの活性としては、この数値に１００％を加えたものである。エラーバーは標準偏差（実験３回）を示す。
【図６】加算的点置換体四次ライブラリーのゲル電気泳動結果。レーン１：１００ｂｐラダー、レーン２：参照バンド（５４５ｂｐ）、レーン３：加算的点置換体ライブラリー（５２４ｂｐ）。レーン３は、後に転写、ライゲーション、翻訳、淘汰を行う際に必要な配列を含めた５２４ｂｐのバンドを表している。
【図７】加算的点置換体四次ライブラリーのダイレクトシークエンス法による塩基配列波形。
【図８】淘汰前後での加算的点置換体四次ライブラリーの塩基配列波形。淘汰前後のダイレクトシークエンス法による塩基配列波形を上下に並べて示す。
【図９】加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物のアミノ酸配列。太字＋下線で示した残基は、表３のオリゴマーで導入され、作製された変異体ライブラリーを用いて淘汰された結果、変異が確認された部位を示す。下線のみを記した残基はライブラリー構築時における断片ごとのハイブリダイゼーションからの伸長反応の際のエラーによるものであると考えられる変異を含む部位を示す。アミノ酸配列の横の数字は、得られたコピー数である。
【図１０】加算的点置換体ペプチドのカテプシンＥ活性促進度合。活性評価は、加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物１３種類と、点置換体ライブラリー淘汰の際にカテプシンＥに対する活性を調べていないＭ８Ｋ変異体ペプチドを含む。縦軸の標記は活性促進度合であり、ＣＥの活性としては、この数値に１００％を加えたものである。エラーバーは標準偏差（実験３回）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１７】
（定義）
本明細書中の「カテプシンＥ」は、カテプシンＥタンパク質を意味し、本明細書ではＣａｔＥあるいはＣＥと記載することがある。
本明細書中の「ペプチドアプタマー」は、特定の分子と特異的に結合するペプチドを指す。本明細書中で使用する場合、「ペプチドアプタマー」という言葉は、特定の分子がもつ生物学的活性を抑制するか促進するかを問わず、または特定の分子がもつ生物学的活性に影響を及ぼすか及ぼさないかを問わず、特定の分子に特異的に結合するペプチドを意味する。本明細書において、「ペプチドアプタマー」を単にアプタマーと記載する場合がある。
【００１８】
本明細書中の「カテプシンＥ活性化ペプチド（ＣＥＡＰ）」とは、直接的または間接的に、実質的に完全にまたは部分的に、カテプシンＥの生物学的活性を誘導、促進、または増強することが可能である任意のペプチドを含む。通常、カテプシンＥは酸性ｐＨで機能するが、本明細書では中性ｐＨで機能するカテプシンＥの第２の活性に対して、それに有効な基質を用いて淘汰（スクリーニング）しており、本発明のペプチドは中性ｐＨ環境下でカテプシンＥを活性化する。
【００１９】
本明細書中の「ＣＥＡＰ３」は三次ライブラリー淘汰産物であり、アミノ酸配列「GCPCIDFMVEVQVEVAEALLTALSLSPGS」（配列番号７）を有する。ペプチド非存在下でのカテプシンＥの活性を１００％とすると、ＣＥＡＰ３の存在下でカテプシンＥの活性は１５０％である。なお、非特許文献１４では、ペプチド非存在下と比較して、ペプチド存在下で、カテプシンＥの活性を１７５％や１８６％にすることができるペプチドが得られている。
【００２０】
本明細書中の式１、２または３の「Ｘ１」「Ｘ３」「Ｘ４」「Ｘ５」「Ｘ７」「Ｘ８」「Ｘ１３」「Ｘ１９」「Ｘ２０」「Ｘ２１」「Ｘ２２」「Ｘ２４」「Ｘ２６」「Ｘ２９」は、任意のアミノ酸残基を示し、Ｘに付された番号は便宜上、式１に記載のアミノ酸配列のＮ末端側からの位置を示す。なお、例えば、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基は式１ではＸ２とは記載せずＣ（ｃｙｓ）と記載している。本発明のペプチドはＮ末端側に任意のアミノ酸残基が付加されてもよいので、その場合はＸ１が１番目のアミノ酸残基とはならない。
【００２１】
用語「ペプチド」は、一般に、ペプチド（アミド）結合によって結合したアミノ酸の連続する比較的短い配列を指す。典型的には、必ずしもそうではないが、ペプチドは、約２から約５０個のアミノ酸、約４から４０個のアミノ酸、または約１０から３０個のアミノ酸の長さを有する。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、一般に、ペプチドの長い形態を指すが、「ポリペプチド」と「ペプチド」は、本明細書の幾つかの文脈では互換的に使用することができる。
用語「アミノ酸」および「残基」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２３】
ペプチドまたはポリペプチドの「領域」は、典型的には、２以上のアミノ酸の連続配列である。少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の連続するアミノ酸からなる。
【００２４】
本明細書中「ライブラリー」とは、構造が異なる分子の群を意味する。本発明のライブラリーは、ｍＲＮＡディスプレイライブラリーやｃＤＮＡディスプレイライブラリー等を含む。ライブラリー中から特定の性質を有する分子を選択する工程を、本明細書では特に分子の機能活性により選択しているので「淘汰」という。本明細書において「淘汰」と「選択」は互換的に使用される。
【００２５】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、前述のように、三次ライブラリーの淘汰産物を基礎として、それを独自のアプローチによりさらに進化させて、三次ライブラリーの淘汰産物（ＣＥＡＰ３を含む）よりも一段と高い活性化機能を有するペプチド群を見出したことを基礎とする。さらなる進化の手法は、第１段階が、配列中に点置換を導入することによる四次ライブラリー（第１段階）の作成であり、第２段階は、そのライブラリーを淘汰して得られた優位変異体（元より活性の高い変異体）の配列情報から、活性を向上させると考えられる点置換を選び、それらを任意の組合せで複数含む変異体（複数点置換変異体）の分子ライブラリー(加算的点置換体ライブラリー)、すなわち、四次ライブラリー(第２段階)を作製し、その四次ライブラリーの淘汰による、カテプシンＥに対する高活性化機能を有するペプチド群の選択である。これら２つの段階において、ペプチドアプタマーが高活性化機能を有するために適したアミノ酸配列に関する知見を得て、下記式１の本発明のペプチドに到達した。
【００２６】
第１段階の点置換体による四次ライブラリーの作成においては、図４に示すアミノ酸配列および図５に示すカテプシンＥ活性促進度合から、ＣＥＡＰ３よりも一段と高い活性化機能を有するペプチドとして点置換Ｌ２０ＥおよびＴ２１Ｓを有するペプチドを見出した。さらにこれらの結果は、２つのアプタマー領域において、アミノ酸置換が入っても、活性が大きく低下しない部位とアミノ酸の種類を明らかにしている。
【００２７】
さらに、第２段階の加算的点置換体四次ライブラリーの淘汰においては、図９に示すアミノ酸配列および図１０に示すカテプシンＥ活性促進度合から、カテプシンＥに対する高活性化機能を有するペプチド群として、点置換Ｍ８Ｋおよび／またはＳ２９Ｗを有するペプチド群を見出した。さらにこれらの結果は、２つのアプタマー領域において、アミノ酸置換が入ってもペプチドが有する生物学的活性が大きく低下しない位置とそのアミノ酸の種類、および活性が低下する傾向がある位置とそのアミノ酸の種類を明らかにしている。
【００２８】
これら２段階の実験結果から、カテプシンＥ活性促進を格段に向上させるのは、Ｍ８ＫおよびＳ２９Ｗの一方または両方であり、第１段階において見出されたＬ２０ＥおよびＴ２１Ｓは、カテプシンＥ活性促進の格段の向上には寄与していないことが分かるとともに、しかしこれら置換前後のいずれのアミノ酸であっても、Ｍ８ＫおよびＳ２９Ｗの一方または両方が含まれるペプチドにおいてはカテプシンＥ活性促進の格段の向上が得られることが分かる。
【００２９】
同様にこれらの２つの実験結果に基づいて、本発明では、以下の式１を定めた。
式１：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９
（Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３はＰまたはＴであり、
Ｘ４はＣ、ＨまたはＹであり、
Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶであり、
Ｘ７はＦまたはＬであり、
Ｘ８はＫまたはＭであり、
Ｘ１３はＶまたはＭであり、
Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰであり、
Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰであり、
Ｘ２１はＳ、ＴまたはＡであり、
Ｘ２２はＡまたはＲであり、
Ｘ２４はＳまたはＨであり、
Ｘ２６はＳまたはＨであり、
Ｘ２９はＷまたはＳである）（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、ただしＸ８がＭであり且つＸ２９がＳであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。
【００３０】
本発明の好ましい第一実施態様では、式１におけるＸ８はＫである。
２段階の実験結果において示すＸ８がＫであるペプチドは、いずれもＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を示し、特に、ＭＰ０４、０２、１３、０１、０３、１０、０９、１１は、有意差を持ってＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を示す（図１０参照）。また、ＭＰ０７およびＭＰ０６も、ＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有するが有意差を持つものではない。前者の結果から、ＭＰ０４、０２、１３、０１、０３、１０、０９、１１が有するＸ８以外のアミノ酸置換は、Ｘ８がＫであることによって得られるカテプシンＥ活性促進効果を妨げるものではなく、これらの置換を有するペプチドは、ＭＰ０４、ＭＰ０３とほぼ同等のカテプシンＥ活性促進効果を奏する。ＭＰ０７およびＭＰ０６が有するアミノ酸置換は、ＭＰ０３と比べてカテプシンＥ活性促進効果をやや低下させるが、ＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を示す。ＭＰ０７およびＭＰ０６は、いずれもＸ２９が（Ｗではなく）Ｓであり、ＭＰ０２の結果との対比からは、ＭＰ０７およびＭＰ０６においてＸ２９がＷであるペプチドは、ＭＰ０７およびＭＰ０６よりはさらに高いカテプシンＥ活性促進効果であって、有意差を持ってＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を示すであろうことが推察される。
【００３１】
本発明の好ましい第二の実施態様では、式１におけるＸ２９はＷである。
ＭＰ１２および０５の結果から、Ｘ８がＫではなくＭであるペプチドについては、Ｘ２９がＳではなくＷであっても、大幅なカテプシンＥ活性促進効果は得られないが、ＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有する（図１０参照）。ただし、有意差を持つものではない。Ｘ８がＫであり、且つＸ２９がＷであるペプチドが、より高いカテプシンＥ活性促進効果を有するという観点から好ましい。
【００３２】
Ｘ８およびＸ２９以外のアミノ酸で、置換可能であることが実験的に確認されたアミノ酸は、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２４、Ｘ２６である。
Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶである。Ｘ１がＧまたはＬであるペプチドは、第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ１がＮ、ＡまたはＶであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことは明らかであり、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３とほぼ同様のカテプシンＥ活性促進効果を奏する蓋然性が高いことが予想される。ここで、ＭＰ０２は点置換Ｍ８Ｋ、Ｖ１３ＭおよびＳ２９Ｗを有するが他の置換を含まないペプチドであり、ＭＰ０３は点置換Ｍ８ＫおよびＶ１３Ｍを有するが他の置換を含まないペプチドである。ＭＰ０２およびＭＰ０３は高いカテプシンＥ活性促進効果を示す（図１０）。
【００３３】
Ｘ３はＰまたはＴである。Ｘ３がＰであるペプチドは、第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ３がＴであるペプチドとしては、ＭＰ０８（Ｘ８＝Ｍ（Ｋではない）、Ｘ２９＝Ｓ（Ｗではない））のみの結果であるが、大幅なカテプシンＥ活性促進効果の低下は見られないことから、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００３４】
Ｘ４はＣ、ＨまたはＹである。Ｘ４がＣまたはＨであるペプチドは、第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ４がＹであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことは明らかであり、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３とほぼ同様のカテプシンＥ活性促進効果を示す蓋然性が高いことが予想される。
【００３５】
Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶである。Ｘ５がＩ、Ａ、ＥまたはＶであるペプチドは、第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ５がＡであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことも示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００３６】
Ｘ７はＦまたはＬである。Ｘ７がＦであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ７がＬであるペプチドとしては、ＭＰ０８（Ｘ８＝Ｍ（Ｋではない）、Ｘ２９＝Ｓ（Ｗではない））のみの結果であるが、大幅なカテプシンＥ活性促進効果の低下は見られないことから、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００３７】
Ｘ１３はＶまたはＭである。Ｘ１３がＶまたはＭであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ１３がＭであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことも示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏する。
【００３８】
Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰである。Ｘ１９がＬ、ＴまたはＱであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ１９がＰであるペプチドは第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことが示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００３９】
Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰである。Ｘ２０がＬ、ＳまたはＱであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ２０がＥまたはＰであるペプチドは第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことが示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００４０】
Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＡである。Ｘ２１がＳまたはＴであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ２１がＳであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことも示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。Ｘ２１がＡであるペプチドとしては、ＭＰ０８（Ｘ８＝Ｍ（Ｋではない）、Ｘ２９＝Ｓ（Ｗではない）のみの結果であるが、大幅なカテプシンＥ活性促進効果の低下は見られないことから、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００４１】
Ｘ２２はＡまたはＲである。Ｘ２２がＡであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ２２がＲであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させないことも示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００４２】
Ｘ２４はＳまたはＨである。Ｘ２４がＳまたはＨであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。
【００４３】
Ｘ２６はＳまたはＨである。Ｘ２６がＳであるペプチドは第２段階の結果からＣＥＡＰ３より高いカテプシンＥ活性促進効果を有することが明らかである。Ｘ２６がＨであるペプチドは、第１段階の結果からペプチドが有するカテプシンＥ活性促進効果を実質的に低下させることがないことも示されており、Ｘ８がＫであり、Ｘ２９がＳまたはＷであるペプチドにおいて、ＭＰ０２およびＭＰ０３に近いカテプシンＥ活性促進効果を奏するものと予想される。
【００４４】
本発明の好ましいペプチドは、上記式１中のＸ８がＫである場合にはＸ２９がＷまたはＳであり、且つＸ８がＭである場合にはＸ２９がＷであるアミノ酸配列を有する。本発明の別の好ましいペプチドは、上記式１中のＸ２９がＷである場合にはＸ８がＫまたはＭであり、且つ上記式１のＸ２９がＳである場合にはＸ８がＫであるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
本発明のペプチドは、好ましい実施態様において、式１中、Ｘ１がＧまたはＬであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＣまたはＨであり、Ｘ５がＩまたはＡであり、Ｘ７がＦであり、Ｘ８がＭまたはＫであり、Ｘ１３がＶまたはＭであり、Ｘ１９がＬであり、Ｘ２０がＬ、Ｓ、ＱまたはＥであり、Ｘ２１がＳまたはＴであり、Ｘ２２がＡであり、Ｘ２４がＳまたはＨであり、Ｘ２６がＳまたはＨであり、Ｘ２９がＷまたはＳであるアミノ酸配列を有し、但しＸ８がＭであり且つＸ２９がＳであるアミノ酸配列を除くペプチドである。
【００４６】
本発明のペプチドは、好ましい実施態様において、式１中、Ｘ１がＧまたはＬであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＣまたはＨであり、Ｘ５がＩまたはＡであり、Ｘ７がＦであり、Ｘ８がＫであり、Ｘ１３がＶまたはＭであり、Ｘ１９がＬであり、Ｘ２０がＬ、Ｓ、ＱまたはＥであり、Ｘ２１がＳまたはＴであり、Ｘ２２がＡであり、Ｘ２４がＳまたはＨであり、Ｘ２６がＳまたはＨであり、Ｘ２９がＷまたはＳであるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４７】
本発明のペプチドは、好ましい実施態様において、式１中、Ｘ１がＧまたはＬであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＣまたはＨであり、Ｘ５がＩまたはＡであり、Ｘ７がＦであり、Ｘ８がＫであり、Ｘ１３がＶまたはＭであり、Ｘ１９がＬであり、Ｘ２０がＬ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ２１がＳまたはＴであり、Ｘ２２がＡであり、Ｘ２４がＳまたはＨであり、Ｘ２６がＳであり、Ｘ２９がＷまたはＳであるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４８】
本発明のペプチドは、好ましい実施態様において、式１中、Ｘ１がＧであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＣであり、Ｘ５がＩまたはＡであり、Ｘ７がＦであり、Ｘ８がＫであり、Ｘ１３がＶまたはＭであり、Ｘ１９がＬであり、Ｘ２０がＬであり、Ｘ２１がＳまたはＴであり、Ｘ２２がＡであり、Ｘ２４がＳまたはＨであり、Ｘ２６がＳであり、Ｘ２９がＷであるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４９】
本発明のペプチドは、上記式１のアミノ酸配列を有し、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸残基からなる。
【００５０】
本発明のペプチドは、上記式１のアミノ酸配列のＮ末端側にＮ個（ここでＮは、１以上２１以下の整数）のアミノ酸をさらに含み、そして／または、Ｃ末端側にＭ個（ここでＭは、１以上２１以下の整数）のアミノ酸をさらに含むことができる。
【００５１】
本発明のペプチドは、第１のアプタマー領域として、式２：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８（式２中、Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶであり、Ｘ３はＰまたはＴであり、Ｘ４はＣ、ＨまたはＹであり、Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶであり、Ｘ７はＦまたはＬであり、またはＸ８はＫまたはＭである）（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。すなわち、第１のアプタマー領域は、少なくとも８アミノ酸残基の長さであり、以下の表の各位置（Ｘ１からＸ８）に記載したアミノ酸種類の組み合わせで構成されたアミノ酸配列の全てを含む。
【００５２】
【表１】
2020029403.tif 000003
【００５３】
本発明のペプチドの第１のアプタマー領域の例としては、ＧＣＰＣＩＤＦＫ（配列番号９）、ＧＣＰＣＡＤＦＫ（配列番号１０）、ＧＣＰＨＩＤＦＫ（配列番号１１）、ＬＣＰＣＩＤＦＫ（配列番号１２）、ＧＣＰＣＡＤＦＭ（配列番号１３）、ＧＣＰＣＥＤＦＭ（配列番号１４）、ＧＣＰＣＶＤＦＫ（配列番号１５）、ＧＣＴＣＩＤＬＭ（配列番号１６）、ＧＣＰＣＩＤＦＭ（配列番号１７）、ＮＣＰＣＩＤＦＭ（配列番号１８）、ＡＣＰＣＩＤＦＭ（配列番号１９）、ＧＣＰＣＡＤＦＭ（配列番号２０）、ＧＣＰＹＩＤＦＭ（配列番号２１）およびＶＣＰＣＩＤＦＭ（配列番号２２）などがある。
【００５４】
本発明のペプチドは、第２のアプタマー領域として、式３：Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９（式３中、Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰであり、Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰであり、Ｘ２１はＳ、ＴまたはＡであり、Ｘ２２はＡまたはＲであり、Ｘ２４はＳまたはＨであり、Ｘ２６はＳまたはＨであり、Ｘ２９はＷまたはＳである）（配列番号２３）のアミノ酸配列を含む。すなわち、第２のアプタマー領域は、少なくとも１１アミノ酸残基の長さであり、以下の表の各位置（Ｘ１９からＸ２９）に記載したアミノ酸種類の組み合わせで構成されたアミノ酸配列の全てを含む。
【００５５】
【表２】
2020029403.tif 000004
【００５６】
本発明のペプチドの第２のアプタマー領域の例としては、ＬＬＳＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号２４）、ＬＬＴＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号２５）、ＬＬＴＡＬＨＬＳＰＧＷ（配列番号２６）、ＬＬＴＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号２７）、ＬＬＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号２８）、ＬＳＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号２９）、ＬＬＴＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号３０）、ＬＱＴＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号３１）、ＴＬＴＡＬＳＬＳＰＧＷ（配列番号３２）、ＱＬＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３３）、ＬＬＡＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３４）、ＬＬＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３５）、ＬＬＳＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３６）、ＬＥＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３７）、ＰＬＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３８）、ＬＰＴＡＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号３９）、ＬＬＴＲＬＳＬＳＰＧＳ（配列番号４０）およびＬＬＴＡＬＳＬＨＰＧＳ（配列番号４１）などがある。
【００５７】
上記式１のアミノ酸配列中のＶ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ（Ｘ１３はＶまたはＭである）（配列番号４２）はリンカー領域である。リンカー領域は、標的分子（タンパク質）に独立に結合する２つのペプチド（アプタマー領域）を連結するために必要な一定のスペーサーである。リンカーを構成するアミノ酸は、三次ライブラリーではグリシンを主な構成とする（Gly-Gly-Gly-Ser）×２〜３を使用した（非特許文献１４）。三次ライブラリーの淘汰では、グリシンを主な構成とするリンカーのフレームシフトにより得られたＶ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａをリンカーとして使用したペプチドが選択されたペプチドとして残ったので、本発明の四次ライブラリー用のコンストラクトはリンカー配列：Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ（配列番号４３）を使用して設計した。本発明のペプチドのリンカー領域は、Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａであるか、またはＶ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｍ-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ（配列番号４４）である。本発明のペプチドは、第１のアプタマー領域と第２のアプタマー領域が上記リンカーにより連結されている。第１のアプタマー領域とリンカー領域と第２のアプタマー領域の組み合わせは、図９に示した１３の組み合わせに限定されない。当然であるが、本発明のペプチドは、式１：Ｘ１-Ｃ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｄ-Ｘ７-Ｘ８-Ｖ-Ｅ-Ｖ-Ｑ-Ｘ１３-Ｅ-Ｖ-Ａ-Ｅ-Ａ-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｘ２２-Ｌ-Ｘ２４-Ｌ-Ｘ２６-Ｐ-Ｇ-Ｘ２９（式１中、Ｘ１はＧ、Ｌ、Ｎ、ＡまたはＶであり、Ｘ３はＰまたはＴであり、Ｘ４はＣ、ＨまたはＹであり、Ｘ５はＩ、Ａ、ＥまたはＶであり、Ｘ７はＦまたはＬであり、Ｘ８はＫまたはＭであり、Ｘ１３はＶまたはＭであり、Ｘ１９はＬ、Ｔ、ＱまたはＰであり、Ｘ２０はＬ、Ｓ、Ｑ、ＥまたはＰであり、Ｘ２１はＳ、ＴまたはＡであり、Ｘ２２はＡまたはＲであり、Ｘ２４はＳまたはＨであり、Ｘ２６はＳまたはＨであり、Ｘ２９はＷまたはＳである）（配列番号１）のアミノ酸配列に包含される第１のアプタマー領域とリンカー領域と第２のアプタマー領域のあらゆる組み合わせを含む。ある実施態様では、本発明のペプチドはＮ末端からＣ末端の方向に順に第１のアプタマー領域、リンカー領域および第２のアプタマー領域を含む。別の実施態様では、本発明のペプチドはＮ末端からＣ末端の方向に順に第２のアプタマー領域、リンカー領域および第１のアプタマー領域を含む。
【００５８】
本発明に用いられ、そして本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドおよび小分子は、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて製造することができる。
【００５９】
本発明のペプチドは、担体にコンジュゲートされてもよい。担体は、生分解性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、炭水化物、セルロース、キチン、およびリグニン、またはポリペプチド担体（Ｆｃおよび血清アルブミンなど））である。担体にコンジュゲートされた本発明のペプチドは、担体にコンジュゲートされていないものと比較して、半減期および/または生物学的利用率が向上する。
【００６０】
（四次ライブラリー淘汰産物）
本発明のペプチドは、カテプシンＥの酵素活性を促進する機能を有する、カテプシンＥを活性化する分子（カテプシンＥ活性化ペプチド（ＣＥＡＰ））である。
本発明のペプチドは、ペプチド非存在下と比較して、ペプチド存在下のカテプシンＥの活性を少なくとも約１４０から２２０％、約１７０から２２０％、あるいは約１９０から２２０％にすることができるものであり、特に「２００％以上」という値（すなわち、カテプシンＥの活性を２倍以上にすることができること）は、本発明のペプチドの、がん治療のための医薬用途に大きな期待を与える。また、カテプシンＥの活性を特異的かつ高感度に検出する方法にもつながる。血清カテプシンＥ活性と乳がん患者の予後の研究では、好ましい予後結果を有する患者のカテプシンＥ活性は、好ましくない予後結果を有する患者に比較して、約２倍高いことがわかっている（非特許文献３、Fig.1(E)等）。したがって、乳がん患者のカテプシンＥ活性を少なくとも２００％に活性化できる分子（例えば、ペプチド）は、予後予測が悪い患者の治療に有用であることが期待される。本発明のペプチドは、ペプチド非存在下の活性と比較して、カテプシンＥの活性を１４０％以上、１５０％以上、１７０％以上、１７２％以上、１７３％以上、１７５％以上、１８０％以上、１８５％以上、１８８％以上、１９０％以上、１９５％以上、２００％以上、２０５％以上、２０８％以上、２１０％以上、２１５％以上、２１８％以上、あるいは２２０％以上にすることができる。本発明のペプチドは、ペプチド非存在下の活性と比較して、カテプシンＥの活性を約１４０から２２０％、約１５０から２２０％、約１７０から２２０％、約１７２から２２０％、約１７３から２２０％、約１７５から２２０％、約１８０から２２０％、約１８５から２２０％、約１８８から２２０％、約１９０から２２０％、約１９５から２２０％、約２００から２２０％、約２０５から２２０％、約２０８から２２０％、約２１０から２２０％、あるいは約２１５から２２０％、にすることができる。
【００６１】
本発明のペプチドは、カテプシンＥの元の酵素活性を１００％とすると、三次ライブラリーで得られたペプチド（ＣＥＡＰ３）よりも、カテプシンＥの活性をさらに少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５８％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６８、あるいは少なくとも約７０％上昇させることができる。
【００６２】
本発明のペプチドは、カテプシンＥに対し１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合することができる。本発明のペプチドは、１ｎＭ以下、すなわちｐＭオーダーの解離定数を有するため、試料中の低濃度カテプシンＥを検出することが期待される  本発明のペプチドは、カテプシンＥの異なる部分にそれぞれ結合する第１のアプタマー領域と第２のアプタマー領域を有するため、カテプシンＥに対する特異性が高い。
【００６３】
（医薬）
本発明のペプチドは、該ペプチドを含む医薬として提供される。ある実施態様では、本発明の医薬は個体における疾患または障害を治療するためのものである。ある実施態様では疾患または障害の症状は、自己免疫疾患である。別の実施態様では、本発明の医薬はがんの治療のためのものである。
【００６４】
本発明が治療対象とするがんは任意の種類のがんである。好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、とりわけカテプシンＥが関与すると考えられるＴＲＡＩＬリガンドの遊離とそれに伴うＴＲＡＩＬ受容体への結合およびそれに続くアポトーシス反応によるがん細胞死が期待されるがんに有効と考えられる。本発明のペプチドは、カテプシンＥの接近が容易な遊離がん細胞（血液系や浮遊性のがん細胞）には特に有効と考えられる。本発明のペプチドは、固形がん細胞であっても、その表層細胞を順次細胞死する形で、縮小消滅させることが期待される。本発明のペプチドは、治療方法に使用することができる。また、本発明のペプチドは医薬の製造または調製方法に使用することができる。
本発明の治療対象の個体または患者は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００６５】
本発明は、有効成分としてカテプシン活性化ペプチドを含む、がんを治療するための医薬を提供する。カテプシンＥ酵素活性を促進するために、本発明の医薬の有効量が患者に投与される。本発明の医薬は、有効成分であるペプチドに加えて、医薬として許容される担体を含んでもよい。
【００６６】
別の態様において、本発明の医薬は、２種類以上のカテプシンＥ活性化ペプチド（ＣＥＡＰ）を含む。第１のＣＥＡＰと第２のＣＥＡＰは、カテプシンＥの同じ部位に結合するものであってもよく、または異なる部位に結合するものであってもよい。
【００６７】
本発明の医薬は、任意の適切な手段によって、経口投与、肺内投与、鼻腔内投与、病巣内投与、局所投与、または眼内投与されてもよい。本発明の医薬は非経口注入により投与されてもよく、非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、または腹腔内への注入、または皮下注射などが含まれる。投薬レジュメは、投与が短期間かまたは長期であるかによって適切に計画される。本発明の医薬は治療目的に最適な剤形で処方され、医療従事者の知識に基づいて治療に最適且つ臨床的に妥当な投与経路、投与方法、投与量および投与スケジュールが決定される。
【００６８】
（カテプシンＥの酵素活性測定方法）
本発明のペプチドはペプチドアプタマーとして、以下の（ａ）から（ｃ）を含む、試料中のカテプシンＥの酵素活性測定方法に使用することができる。
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、
（ｂ）固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥと、標識されたカテプシンＥ基質を接触させる工程、および
（Ｃ）カテプシンＥによるカテプシンＥ基質の切断を検出してカテプシンＥ酵素活性を求める工程。
本発明のペプチドは、カテプシンＥを捕捉しても、それとの結合はいわゆるアロステリック結合であり、酵素の活性を妨げず、むしろ活性を向上させる機能がある。このため、カテプシンＥ酵素活性の測定感度が上昇する。
【００６９】
乳がん患者の予後と相関しているのは、カテプシンＥの物質的総量ではなく、カテプシンＥの活性である（非特許文献３）。可能性としては、これに限定されないが、乳がん患者のカテプシンＥは一部失活しているか、そもそも発現量が減っているかの両方があり、前者はカテプシンＥの物質量と活性量の両者を測定することで判断できる。従来技術では、高感度に活性を測定するのが難しく、腕のいいエキスパートしかできなかったという事情がある。本発明のペプチドは、１ｎＭ以下、すなわちｐＭオーダーの解離定数でカテプシンＥに結合してかつカテプシンＥの酵素活性を向上させるため、カテプシンＥ活性の測定に用いた場合、測定感度が、従来のペプチドを用いた場合と比較して格段に上昇する。
【００７０】
カテプシンＥの酵素活性測定方法工程（ａ）
本発明のカテプシンＥの酵素活性測定方法では、ペプチドアプタマーは、プレート、プレートのウェル、アレイ、ビーズ、チューブ、チップなどの固相に固相化される。ペプチドアプタマーは、固相に、ペプチドやＰＥＧなどのリンカーを介して固相化されてもよいし、直接的に固相化されてもよい。
【００７１】
本発明の測定方法に用いられる試料は、ＣＥを含有する試料であれば、特に制限はなく、通常は生物由来検体であり、例えば哺乳動物の血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液、細胞（がん細胞、良性腫瘍細胞、悪性腫瘍細胞）およびそれらの細胞溶解液、または組織（がん組織、良性腫瘍組織、悪性腫瘍組織）およびそれらの組織溶解液であることができる。
【００７２】
固相化されたペプチドアプタマーと試料との混合は、例えばペプチドアプタマーが固相化された固相を含む容器に、上記試料を含む緩衝液を注入することにより実施してもよいし、上記試料と緩衝液を含む容器にペプチドアプタマーが固相化されたビーズ等を投入することにより実施してもよい。この混合により、試料中のＣＥは、固相化ペプチドアプタマーに結合する。これにより固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る。ペプチドアプタマーと試料との混合は、試料がカテプシンＥを含む場合にはペプチドアプタマーとカテプシンＥが結合できる条件を適宜選択して行われる。すなわち、仮に測定試料にカテプシンＥ濃度が過剰に存在し、結合可能なペプチド濃度を超えるような場合は、試料を緩衝液で希釈して用いることができる。固相化ペプチドアプタマーに非特異的に弱く結合している夾雑物を除去するため、上記固相や固相を含む容器（例えばプレートのウェルやチューブ）を、試料を含む緩衝液の除去後に、蒸留水等で洗浄することが好ましい。
【００７３】
カテプシンＥの酵素活性測定方法の工程（ｂ）
固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥと、標識されたカテプシンＥ基質を接触させる。標識は、例えば、発色物質、蛍光発生物質、化学発光物質、酵素などを利用するものであってもよい。固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥと、標識されたカテプシンＥ基質との接触は、ｐＨを中性に調整した溶液中で実施される。本発明のペプチドは、中性ｐＨ環境下でカテプシンＥを活性化するためである。
【００７４】
カテプシンＥの酵素活性測定方法の工程（ｃ）
カテプシンＥによるカテプシンＥ基質の切断を検出してカテプシンＥ酵素活性を求める。カテプシンＥによるカテプシンＥ基質の切断は、標識物質の化学的変化をモニターすることにより検出される。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができ、発色物質の場合には分光光度計により検出することができる。
試料中のカテプシンＥの酵素活性の測定方法について、以下に具体例を記載する。但し、この例に限定される意図ではない。
【００７５】
＜ペプチドアプタマーの固相化＞
本発明のペプチド（ペプチドアプタマー）をカップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌのペプチド溶液をペプチドコーティングプレート（TaKaRa）のアレイに注ぎ、直ちに、１０μｌのReaction solution（TaKaRa）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶液をプレートのウェルから移動させ、ペプチドコーティングウェルを２００μｌの蒸留水で３回洗浄する。次に、ブロッキング溶液（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３））２００μｌを各ウェルに添加し、容器内に存在する非特異的結合物質を失活させるために室温で１時間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去した後、ウェルを２００μｌの蒸留水で３回洗浄する。
【００７６】
＜ペプチドアプタマーによるカテプシンＥの捕捉＞
カテプシンＥプロテアーゼ含有組織抽出物または血清を緩衝液（５００ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）でｐＨ７．４に調整する。１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってできた沈殿を除去し、上清を回収する。３０μｌの上清を各認識ペプチド固定化ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートし、溶液を除去する。プレート上に残っている溶液を２００μｌの蒸留水で２回洗浄する。
【００７７】
＜Enzyme on peptideでの測定＞
ペプチド上に捕捉されたカテプシンＥの量を蛍光発生基質を用いたアッセイにより測定する。蛍光発生基質で標識されたカテプシンＥ基質（Nma-Gly-Gly-Arg-Arg-Ser-Gly-Thr-Cys-Gly（Dnp）-D-Arg-NH2：配列番号１０１）、５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ４．５）を各ウェルに添加し、次いで４０℃で１０分間インキュベートする。
蛍光プレートリーダーＦｌｕＰＯＬＯ（TaKaRa）を用いて、インキュベーション中に基質切断によって生成された蛍光強度の増加を、励起波長３６０ｎｍ/蛍光波長４３０ｎｍで測定する。
【００７８】
（カテプシンＥ量の測定方法）
本発明のペプチドは、ペプチドアプタマーとして、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、試料中に含まれるカテプシンＥ量を測定する方法に使用される。
（ａ）固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る工程、および
（ｂ）カテプシンＥが結合したペプチドアプタマーを検出し、試料中のカテプシンＥ量を求める工程。
【００７９】
カテプシンＥ量の測定方法の工程（ａ）
本発明のカテプシンＥ量の測定方法では、ペプチドアプタマーは、プレート、プレートのウェル、アレイ、ビーズ、チューブ、チップ、バイオセンサチップなどの固相に固相化される。また、固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、カーボンなど挙げられる。
【００８０】
本発明の測定方法に用いられる試料は、ＣＥを含有する試料であれば、特に制限はなく、通常は生物由来検体であり、例えば哺乳動物の血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液、細胞（がん細胞、良性腫瘍細胞、悪性腫瘍細胞）およびそれらの細胞溶解液、または組織（がん組織、良性腫瘍組織、悪性腫瘍組織）およびそれらの組織溶解液であることができる。
【００８１】
固相化されたペプチドアプタマーと試料との混合は、緩衝液中で上記試料と固相化されたペプチドアプタマーを混合することにより実施してもよく、例えば、当該固相を含む容器に上記試料と緩衝液を加えることにより実施してもよい。この混合により、試料中のＣＥは、固相化ペプチドアプタマーに結合する。これにより、ペプチドアプタマーに結合したカテプシンＥを得る。ペプチドアプタマーと試料との混合は、試料がカテプシンＥを含む場合にはペプチドアプタマーとカテプシンＥが結合できる条件を適宜選択して行われる。
【００８２】
カテプシンＥ量の測定方法の工程（ｂ）
カテプシンＥが結合したペプチドアプタマーの検出は、例えば適当な標識を予めペプチドアプタマーに結合させておき、この標識から得られるシグナルを測定することができる。ここで使用可能な標識としては、例えば、化学発光物質を基質とするような、HRP(Horse Radish Peroxidase)、ALP(Alkaline Phosphatase)などの他、蛍光標識などの公知の物質を使用することができる。
【００８３】
本発明のペプチドアプタマーの、第１のアプタマー領域と第２のアプタマー領域はカテプシンＥタンパク質の同じ部位に結合するか、あるいは異なる部位に結合する。本発明の好ましい実施態様では、本発明のペプチドアプタマーの、第１のアプタマー領域と第２のアプタマー領域はカテプシンＥタンパク質の異なる部位に結合し、ペプチドアプタマーのカテプシンＥに対する結合力が相加的にまたは相乗的に増大する。本発明のペプチドアプタマーは、カテプシンＥの異なる部分にそれぞれ結合する第１のアプタマー領域と第２のアプタマー領域を有するため、カテプシンＥに対する特異性が高く、試料中に含まれるカテプシンＥ量を精度よく測定することができる。
本発明のペプチドアプタマーは、１ｎＭ以下、ｐＭオーダーの解離定数（ＫＤ）でカテプシンＥに結合するため、カテプシンＥ量の測定精度が、従来のペプチドと比較して上昇する。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明のカテプシンＥ量測定方法は、単層カーボンナノチューブ電界効果型トランジスタ法（ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴ）を用いて実施することができる。ここで、カテプシンＥ量の測定方法の工程（ａ）の固相化されたペプチドアプタマーは、電極に設置されたカーボンナノチューブに固相化されたペプチドアプタマーであってもよく、そして工程（ｂ）は、上記ペプチドアプタマーとカテプシンＥの結合前後において、上記電極に生じる標準電極に対する電位差を測定することを含む工程としてもよい。
【００８５】
ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴ法を用いたカテプシンＥ量の測定方法では、ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴを製造し、本発明のペプチドをペプチドアプタマーとしてＳＷＣＮＴチャネルのカーボンナノチューブにリンカーを介して固相化して、カテプシンＥ検出用ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴセンサーを用意する。固相化のための、ペプチドアプタマーとリンカーの濃度およびインキュベーション条件は、当該分野の公知技術に基づいて、体系的に調整し決定することができる。ペプチドアプタマーを修飾したセンサーは０．０００５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に入れ、さまざまな濃度（例えば、０．１〜１０ｎｇ/ｍＬ）のカテプシンＥで計測をすることができる。ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴ法を用いたカテプシンＥ量の測定方法については、非特許文献１５を参考にして実施することができる。
【００８６】
（ライブラリーについて）
本発明のペプチドは、高速化された試験管内分子進化法である発達ライブラリー法を使用したカテプシン活性化ペプチド開発の最終段階に位置付けられた四次ライブラリーから開発された。試験管内進化法はランダムな配列をもつ集団をはじめとし、分子集団であるライブラリーから目的の機能をもつ分子群を淘汰する集団選択と、個々のクローンごとに淘汰するクローン選択のプロセスを経てライブラリーを高い活性を持つ集団へと絞りこんでいく。淘汰が進むにつれて弱い活性、低い親和性の分子は取り除かれ、ライブラリーの多様性は減少する。すなわち構成する分子群の種類は減っていくが、高い活性をもつ分子が残る。ここからさらに高い活性を示す分子群を選び出すために、人工的に変異を加えることで次段階のライブラリーを構成する。発達ライブラリー法の中では、ライブラリーの進化のためにＹ連結ブロックシャフリング（ＹＬＢＳ）法を用いる段階がある。この方法では、Ｎ種（たとえば、１０種）のブロックを原料としてわずか４回連結するだけでＮ16（たとえば、出発時に１０種の要素から始めると、１０16）の分子多様性が実現する。集団での淘汰、および個々のクローンでの淘汰を行った後に得られたペプチド分子から、４つのアミノ酸ブロックを選び出し連結して二次ライブラリーを得て、続いて淘汰を行う。この結果得られた二次ライブラリー淘汰産物はすでに機能単位（モジュール）とみなすことができる（Kitamura K et al. Journal of Molecular Biology. 2009;387(5):1186-1198、非特許文献１３）。この機能単位とスペーサ配列を組み合わせることで三次ライブラリー（ペアペプチドライブラリー）が作製された（非特許文献１４）。本明細書ではこの三次ライブラリーの淘汰産物に対してさらにアミノ酸配列に点置換を加えて得られる点置換体四次ライブラリーを作製する（図１）。点置換体四次ライブラリーを淘汰した後に、さらに、それらの点置換体四次ライブラリー淘汰産物にＤＮＡシャフリング（Stemmer WP.Nature.1994, Aug4;370 (6488): 389-91）を導入する。
【００８７】
（cDNAディスプレイ法）
ペプチドを創製するために、まず表現型であるペプチド部分と遺伝型部分であるＤＮＡを対応付ける必要がある。本研究室で開発されたｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、四次ライブラリーから目的のペプチド・タンパクを得る手順を図２に示す。
ペプチドをコードする四次ライブラリーのＤＮＡをＰＣＲすることで増幅し、転写することによってｍＲＮＡをつくり、表現型と遺伝型の対応をつける小分子ピューロマイシンリンカーと連結する。そして、翻訳を行うことによってピューロマイシンにペプチドを連結させる。その後、ｍＲＮＡを安定化させるために逆転写を行う。続いてピューロマイシンに連結しているペプチド鎖の精製過程を経ることによってｃＤＮＡディスプレイを作製する。最後にターゲットに対して淘汰を行うことによって、より機能（結合能）の高いペプチドが得られる（非特許文献１２、Tsuji-Ueno S, et al. Protein and Peptide Letters. 2011;18(6):642-650）。この連結体にはＳＦリンク（Naimuddin et al. J. MOL, Recog. 2007）が導入されており、機能（例えば、酵素活性制御）により淘汰できる。
【００８８】
実験方法について以下に説明する。
実験方法１：ｃＤＮＡディスプレイの作製
図１に記載の点置換体四次ライブラリーのコンストラクトのＤＮＡを増幅したＰＣＲ産物と転写反応試薬を以下のとおり混合する。
PCR産物                                1 pmol
25 mM r(A,T,U,G)TP mix (Promega)       3μl
5×T7 Trans Buffer (Promega)           2μl
RNase-free water (Promega)             up to 9μl
T7 Enz mix (Promega)                   1μl
【００８９】
ＰＣＲ産物を含む溶液を３７℃で３時間インキュベートし、更にＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（１Ｕ／μｌ、Promega）を１μｌを加えて３７℃で１５分間インキュベートする。ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡ精製を行い、最終溶液量を１４μｌにした。分光光度計Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００を用いてｍＲＮＡ産物を定量する。
上記得られたｍＲＮA産物とライゲーション試薬を以下のとおり混合する。
mRNA産物                                            20 pmol
SBP (streptavidin puromycin) linker (20pmol/μl)    22 pmol
10×T4 ligase buffer (TaKaRa)                       2.5μl
RNase-free water                                    up to 20μl
【００９０】
次に、ｍＲＮＡを含む溶液について、ライゲーション反応を、９０℃：２ｍｉｎ→７０℃：２ｍｉｎ→２５℃：３ｓｅｃ→４℃：Ｈｏｌｄの手順で行う。Ｔ４  ＲＮＫ（１０Ｕ／μｌ；TaKaRa）１μｌおよびＴ４ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  （３０Ｕ／μｌ；TaKaRa）１μｌを加えた後、２５℃で１時間２０分インキュベートする。ＲＮＡ精製を行い、最終溶液量を２７μｌにする。電気泳動でライゲーション産物を確認する（Gel組成：Polyacrylamide gel (6%T,5%C) containing 8M Urea、1×TBE；泳動条件100V、55℃、5×TBE, 8min）。
ライゲーション産物と翻訳用試薬を以下のとおり混合する。０．２ｍｌのチューブで２本分作製する。
ライゲーション産物 (2.2pmol/μl)   4μl
20×Master Mix-Me                  1.25μl
20×Master Mix-Leu                 1.25μl
Reticulocyte lysate                34μl
RNase-free water                   up to 50μl
【００９１】
ライゲーション産物を含む溶液を翻訳のため、３０℃で２０分間インキュベートした後、３ＭのＫＣｌを２０μｌ、１ＭのＭｇＣｌ2を６μｌを加え、３７℃で１時間２０分間インキュベートする。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによりｍＲＮＡディスプレイ産物を確認する（Gel組成：Polyacrylamide gel(4→6%T 5%C) containing 8 M Urea、0.1 SDS；泳動条件：電流10 mA、２時間、泳動用緩衝液25mM Tris、192mM Glycine、0.1% SDS)。ｍＲＮＡディスプレイ産物をＳＡ−ビーズ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1)を使用して精製する。
ｍＲＮＡディスプレイ産物が結合したＳＡ−ビーズと逆転写用試薬を以下のとおり混合する。
mRNAディスプレイ産物が結合したビーズ           全量
5×ReverTraAce buffer (TOYOBO)                 8μl
2.5 mM dNTP mix                                16μl
RNase-free water                               up to 15μl
ReverTraAce Enzyme  (TOYOBO)                   1μl
【００９２】
ビーズを含む溶液を４２℃で２０分混和しながらインキュベートした後、上澄みを除去する。１００μｌの5 mM imidazole in PBS500で２回洗浄する。０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｔ１（１０００Ｕ／μｌ）を３９．５μｌのビーズを含む5 mM imidazole in PBS500に加える。３７℃で２０分間インキュベートし、上澄みを回収する。さらに、ピューロマイシンに連結しているペプチド鎖を精製し(His Mag sepharose Ni-ビーズ、バイオスピンカラム、Xa)、ｃＤＮＡディスプレイを得る。
【００９３】
実験方法２：In vitro selection法
得られたｃＤＮＡディスプレイについて、selection-by-function 法を使用してカテプシンＥ活性化ペプチドを選択する。カテプシンＥを固定化したＮＨＳ−ビーズ (NHS Mag Sepharose, GE Healthcare)を用意する。ｃＤＮＡディスプレイを、カテプシンＥ固定化ＮＨＳ−ビーズを含むSelection buffer (50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, pH 7.4)中で、２５℃で１０分間インキュベートする。非結合ＤＮＡ分子をSelection bufferにより３回洗浄除去する。カテプシンＥ固定化ＮＨＳ−ビーズに結合したＤＮＡ分子をカテプシンＥ蛋白分解反応に適した温度（３７℃）でインキュベートする。Wash buffer（50 mM Tris-HCl, 1.0 mM NaCl pH 7.4）により洗浄し、elution buffer (25% NH3)で６５℃、１０分間溶出させる。ビーズから溶出したＤＮＡ分子は大部分がカテプシンＥの増強されたタンパク質分解反応によって生成されると想定できるので、次の評価工程のために回収する。この手順を、カテプシンＥ蛋白分解反応のための反応時間を短くして、３回繰り返す（1min、20sec、10sec）。最終産物をクローニングおよび配列決定に供して、点置換体四次ライブラリー淘汰産物であるカテプシンＥ活性化ペプチドを同定した。
【００９４】
実験方法３：カテプシンＥ活性化ペプチドの評価
選択されたペプチドによるカテプシンＥ活性についての促進活性を決定するために、ペプチドをin vitro翻訳または化学合成により合成した。２０ｎＭカテプシンＥと選択されたペプチドをSelection buffer (50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH7.4)中、２５℃で１０分間前もってインキュベートする。次に蛍光基質（MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2：配列番号１０２）を５μＭ加え、３７℃で１時間反応させる。蛍光測定器を用いて蛍光強度を４４０ｎｍ（励起３４０ｎｍ）で観察する。カテプシンＥは通常、酸性ｐＨで機能するが、中性ｐＨ（７．４）で感受性の蛍光発生基質は、S.B.P. Athauda and K. Takahashi (Protein and Peptide Letters,vol.9, no.1, pp.15-22,2002) らの文献をもとに設計された。
【００９５】
カテプシンＥの活性（％）は以下の計算式から導いた。
2020029403.tif 000005
Ｓｆは選択されたペプチドの存在下でのカテプシンＥ反応の蛍光強度、Ｃｆは選択されたペプチドの不在下でのカテプシンＥ反応の蛍光強度、Ｂｆは蛍光基質のみを含む溶液のバックグラウンド蛍光である。ペプチド不在化でカテプシンＥの活性は１００％となる。なお、図５および１０のグラフは、縦軸の標記は活性促進度合であり、カテプシンＥの活性としては、この数値に１００％を加えたものである。
【００９６】
実験方法４：加算的点置換体四次ライブラリーの設計と構築
オリゴマーを用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーションと伸長反応を行うことにより新たなライブラリーを作製する。ハイブリダイゼーション試薬を以下のとおり混合する。
10×Ex taq Buffer                2.5μl
2.5 mM dNTP mixture              2μl
Hybridization oligomer           各100 pmol
Template DNA                     500 ng
D.D.W                            up to 25μl
Ex Taq (5 U/μl)(TaKaRa)         0.125μl
各ハイブリダイゼーションステップにおいて、同じチューブのままで多段階反応させる。
以下のサイクルで反応を行う:95℃ =2min → 25℃(35℃) =5min → 40℃ =10min → 72℃ =5min。但し、ハイブリダイゼーション温度は各オリゴマーのTmに対して変更する。
【００９７】
上記サイクルを６回行い、断片をつなぎ合わせる。最終産物を通常のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅させることにより、加算的点置換体四次ライブラリーを得る。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
【実施例】
【００９８】
実施例１：機能淘汰型ｃＤＮＡディスプレイ
以前得られた三次ライブラリーの淘汰産物（非特許文献１４）に対してさらにアミノ酸配列に点置換を加えて得られる点置換体四次ライブラリーを図１のコンストラクトから作製した。
通常のｃＤＮＡディスプレイ法に対して、Selection-by-Function法を導入して行うin vitro selection（図２の左挿入図参照）においては、いわゆるｃＤＮＡディスプレイ部分は、ｃＤＮＡ部分（情報）＋リンカー＋ペプチド（機能）からなるが、このペプチド部分の先頭にカテプシンＥの基質配列が仕組まれている。そのために、カテプシンＥにペプチドが結合したときに、結合様式（阻害／中立／活性化）によっては、カテプシンＥを活性化する場合があり、そのとき、「馬の鼻先にニンジンを垂らした状態」になり、基質部分が切断されることになる。その場合は、ペプチドの機能領域はカテプシンＥに結合したままであるが、ＤＮＡ部分は基質部分のペプチドの開裂によりフリーになり溶液中に出てくる。逆に、ペプチドがカテプシンＥを阻害するときには切断が起こらず、ｃＤＮＡディスプレイ全体はカテプシンＥに結合し溶液中にはＤＮＡはでてこない。この原理を利用して、切断されたＤＮＡ断片をアクリルアミドゲル電気泳動で確認した実験を図３に示す。この一連のin vitro selection法で選択されたｃＤＮＡディスプレイ（レーン６）は、洗浄後に選択工程を経ていないｃＤＮＡディスプレイ（レーン５）と比較して濃いバンド（５２４ｂｐ）を示した。
【００９９】
実施例２：点置換体四次ライブラリー淘汰産物の配列決定
次に点置換体四次ライブラリーの淘汰産物の配列を決定した。合計６２クローン、４２種類の配列を決定した。結果を図４に示す。特に２１番目のアミノ酸ＴｈｒがＳｅｒに変異した配列が１０コピー、２０番目のＬｅｕがＧｌｕに変異した配列が３コピー得られた。リンカー配列にもアミノ酸置換があったが本来点置換を加えた箇所ではないためＰＣＲ由来による非意図的有利変異であると考えられる。
【０１００】
実施例３：カテプシンＥに対する点置換体ペプチドの機能評価
淘汰産物である４２種類のクローン配列の内、同一の配列が得られた７クローン、ランダムに選んだ６クローン、変異を加えていない三次ライブラリー淘汰産物（ＣＥＡＰ３）の計１４クローンについて無細胞翻訳を行い、実験方法３に従って、ペプチドによるカテプシンＥの機能促進能を検証した。結果を図５に示す。
特に取得クローンの内コピー数が多かった変異Ｔ２１ＳまたはＬ２０Ｅを有するペプチドが三次ライブラリー淘汰産物（ＣＥＡＰ３）に比べてそれぞれ約３５％、３８％の上昇がみられた。一方、変異Ｃ４Ｙ、Ｇ１Ｖ、またはＡ２２Ｒを有するペプチドにおいては、ＣＥＡＰ３と比較してわずかに低い活性促進能を示した。また、変異Ｖ１３Ｍを有するペプチドにおいては１０％ほどの減少度が確認された。また、出現頻度の高かった２１番目のセリンは元のトレオニン（Ｔ）と同じ親水性、２０番目のグルタミン酸は酸性を示す極性電荷側鎖アミノ酸であり、親水性アミノ酸がカテプシンＥの活性促進に関与していることが示唆される。
【０１０１】
実施例４：加算的点置換体四次ライブラリーの作製
次に、実施例３の結果に基づいて、複数の点置換を組み合わせた加算的点置換体四次ライブラリーを作製した。
表３に示したオリゴマー（配列番号４６から７４）を用いて、実験方法４に記載したＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび伸長反応を行うことにより新たなライブラリーを作製した。仮にすべての点置換候補が導入された場合には、アミノ酸配列：NCPYADFKVEVQMEVAEAPESALHLSPGW(配列番号１０３)が作成される。
【０１０２】
【表３】
2020029403.tif 000006
【０１０３】
加算的点置換体四次ライブラリーを電気泳動で確認した（図６、レーン３）。また、伸長反応によるライブラリー全体が正確に構築されていることをダイレクトシークエンスにより確認した（図７）。次の淘汰工程に必要な配列が構築できたことを確認した。その他の点置換においては、最低でも５０％の割合で変異が加わった配列が得られた。Ｇ１Ｎ、Ｃ４Ｙ、Ｉ５Ａの点置換においては、変異が加わっていない配列が優勢であった。
【０１０４】
実施例５：加算的点置換体四次ライブラリーの淘汰と評価
実施例４で作成した加算的点置換体四次ライブラリーについて、実験方法１から３に従って、ｃＤＮＡディスプレイを作製し、カテプシンＥと反応させることにより選択された加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物を得た。この淘汰産物をダイレクトシークエンス法で分析した。得られた塩基配列波形を図８に示す。
淘汰前後のＤＮＡ塩基配列の波形より、Ｍ８Ｋの変異においては、２番目の塩基が淘汰前ではほとんど同程度の強度を示していたが、Ｍｅｔを示すＡＴＧのコドンからＬｙｓを示すＡＡＧのコドンが強い強度を示していた。同様にＳ２９Ｗでは淘汰前はＳｅｒを示すＴＣＧとＴｒｐを示すＴＧＧのコドンが同程度の強度であったが、淘汰後はＴｒｐに対応するコドンがより強い強度を示した。また、点置換体四次ライブラリー淘汰産物の中でもっとも高い活性を示したＬ２０Ｅ、Ｔ２１Ｓについても淘汰によってｗｉｌｄ  ｔｙｐｅに近い配列に収束した。これらの結果は、Ｍ８Ｋ、Ｓ２９Ｗの変異をもつペプチドがカテプシンＥの活性をより促進する作用を持つことを示唆する。
【０１０５】
実施例６：加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物の配列決定
加算的点置換体四次ライブラリーに対して２ラウンドの淘汰を行って得られた淘汰産物のアミノ酸配列を図９に示す。興味深いことには、元の点置換体４次ライブラリー淘汰産物中で、一番高い活性促進能を持つＴ２１ＳとＬ２０Ｅの加算的点置換体は選択されなかった。このことは単純な推論では及ばない配列空間形状の複雑性、すなわち、タンパク質の立体構造の形状やその機能に関して、個々のアミノ酸の寄与だけではなく、それらの相互関係が重要であるということを示している。
変異体として、Ｍ８Ｋ、Ｖ１３Ｍ、Ｓ２９Ｗの変異が多く見られ、これらの２点、３点の加算的点置換体配列も得られた。また、点置換体四次ライブラリーの淘汰産物の中で最も活性の高かった２クローンの中のＴ２１Ｓの変異が加わった加算的点置換体配列も得られた。
【０１０６】
実施例７：加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物の評価活性
２ラウンドの淘汰を行って得られた実験方法３に従ってカテプシンＥに対する活性評価を行った。淘汰によって得られた１３種類の配列と点置換体ライブラリー淘汰の際にカテプシンＥに対する活性を調べていないＭ８Ｋ変異体ペプチドの計１４種類について活性評価を行った結果を図１０に示す。
特にＭ８Ｋの変異とＳ２９Ｗの変異を持つ配列を含む加算的点置換体ペプチドは、カテプシンＥを高く活性化した。点置換ペプチドの活性評価で得られた活性促進度に対して、非線形で正に相関した加算活性度が得られ、タンパク質科学的に合理的な結果となった（一般に単純加算にはならない）。このことで、加算的点置換体ライブラリーの有効性を実証できた。
カテプシンＥ活性の促進作用が最も高かった加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物は、カテプシンＥの活性を２１８％に増大した。発達ライブラリー法第３段階の成果であるＣＥＡＰ３との比較では、６８％の上昇がみられた（ＭＰ０４）。
【０１０７】
実施例８：解離定数による特徴づけ
実施例７で得られた加算的点置換体四次ライブラリー淘汰産物であるペプチドＭＰ０４とカテプシンＥの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）により決定した。カテプシンEを、アミンカップリングキット（GE Healthcare、UK）を用いたアミンカップリング法によりBiacoreセンサーチップＮＴＡ（GE Healthcare、UK）に固定化した。解離定数を決定するために、５つの異なる濃度（２００μＭ、４０μＭ、８μＭ、１．６μＭ及び０．３２μＭ）のペプチドＭＰ０４を相互作用に使用した。ペプチドＭＰ04はあまり溶解性が高くないため、１０％ＤＭＳＯを実験で使用し、高い濃度のペプチド濃度で実験を行った。解離定数は、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１において、反応モデルは１：１結合を用いて算出した。結果を以下の表に示す。
【表４】
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ペプチドＭＰ０４（配列番号９１）の解離定数（ＫＤ）は３．１３ｐＭと算出された。従来の三次ライブラリーでは、１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカテプシンＥに結合するペプチドは開発されていない。本発明のペプチドは、１ｎＭ以下の解離定数でカテプシンＥに結合するため、生物試料中（例えば血液中）に低濃度で含まれるカテプシンＥ（数ｎＭ以下）を十分な精度で測定することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１〜４１：カテプシンＥ活性化ペプチド
配列番号４２〜４４：リンカー配列
配列番号４５：コンストラクト
配列番号４６〜７４：表３に記載のオリゴマー
配列番号７５〜８７：図４に記載のペプチド
配列番号８８〜１００：図９に記載のペプチド
配列番号１０１及び１０２：カテプシンＥ基質
配列番号１０３及び１０４：変異ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月20日(2018.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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