(57)【要約】      （修正有）【課題】高度に免疫原性であるｒＭｕＶJL2（組換え流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ２系）で構成される流行性耳下腺炎に対する新規ワクチンの提供。【解決手段】特定のポリヌクレオチド配列を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株の単離された全長ゲノムであって、ここで、ＪＬ２株が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＲＣ−５細胞から選択される宿主細胞において増殖する、前記単離された全長ゲノム。該全長ゲノムを含む流行性耳下腺炎ウイルスワクチン。係るワクチンは、安全であり、費用対効果が高く、非常に有効かつ安定であり、生産性の点で一貫している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８を有するポリヌクレオチド配列を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株の単離された全長ゲノムであって、ここで、ＪＬ２株が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＲＣ−５細胞から選択される宿主細胞において増殖する、前記単離された全長ゲノム。
【請求項２】
宿主細胞が、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含み、ここで、ベクターが、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＣＡ又はｐＳＣ６から選択される、請求項１に記載の単離された全長ゲノム。
【請求項３】
請求項１に記載の流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株の全長ゲノムを含む流行性耳下腺炎ウイルスワクチン。
【請求項４】
適切な医薬としての賦形剤とともに、請求項１に記載の流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株の全長ゲノムを含有する免疫原性組成物。
【請求項５】
医薬としての賦形剤が、緩衝剤、安定化剤、等張剤、界面活性剤、アジュバント、凍結保護剤又はそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
（ａ）緩衝液が、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液、及びそれらの混合物から選択され；
（ｂ）安定化剤が、アミノ酸、糖、ポリオール、又はそれらの組み合わせから選択され；
（ｃ）等張剤が、糖、塩、又はそれらの組み合わせから選択され；
（ｄ）界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又はそれらの組み合わせから選択され；
（ｅ）アジュバントが、アルミニウム、モノホスホリル脂質類似体、サイトカイン誘導物質、スクアレン系アジュバント、親油性アジュバント、又はそれらの組合せから選択され；そして
（ｆ）凍結防止剤が糖である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
アミノ酸、糖、ポリオール、若しくはそれらの組み合わせから選択される安定化剤、緩衝剤、または塩を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
緩衝液が、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液、及びそれらの混合物から選択され；
アミノ酸が、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、システイン／シスチン、及びそれらの適切な組み合わせから選択され；
糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、及びそれらの適切な混合物から選択され、好ましくはトレハロース又はラフィノースから選択され；
ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの適切な組み合わせから選択され；そして
塩が、ＮａＣｌ又はＫＣｌから選択される、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
以下の要素：
ａ．請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含む転写ベクター；
ｂ．ＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、及びそれらの組み合わせから選択されるトランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクター；
ｃ．請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の適切な転写のためのＲＮＡポリメラーゼ
を含むレスキュー組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え流行性耳下腺炎ウイルスを生成する方法であって、
ａ．流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株のゲノム配列断片を化学合成するステップ：
ｂ．得られた各遺伝子断片およびそれらの組み合わせを、それを増幅するための中間ベクターにクローニングするステップ；
ｃ．ステップｂから得られた各遺伝子断片を単一の転写ベクターに連結することによりｐＭｕＶJL2ベクターを得るために、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株の全長ＤＮＡゲノムのクローンを構築するステップ；
ｄ．ｐＭｕＶJL2と、トランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクターとを宿主細胞に同時トランスフェクトするステップであって、ここで、トランス作用性タンパク質が、ＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスのマイナス鎖をレスキューするためのＲＮＡポリメラーゼから選択される上記ステップ；
ｅ．場合により、レスキューされた流行性耳下腺炎ウイルスをその拡大のために宿主細胞中で継代するステップ
を含む上記方法。
【請求項１１】
ＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質をコードする遺伝子が、それぞれ配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１に示される、請求項９に記載のレスキュー組成物。
【請求項１２】
ＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に示される、請求項９に記載のレスキュー組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡポリメラーゼをコードするベクターが、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生する方法。
【請求項１４】
転写ベクター又は中間ベクターが、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＣＡ、又はｐＳＣ６から選択され；
宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びＭＲＣ−５細胞から選択される、請求項１０に記載の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に免疫原性のｒＭｕＶJL2（組換え流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ２系）で構成される流行性耳下腺炎に対する新規なワクチンを提供する。さらに、上記免疫原性組成物を開発する方法は、本発明に記載されている。本発明によるワクチンは、安全で、費用対効果が高く、非常に有効で安定し、生産性の点で一貫している。
【背景技術】
【０００２】
流行性耳下腺炎は、急性のウイルス性疾患であり、典型的には幼児に影響を及ぼし、睾丸炎、卵巣炎、膵炎および髄膜炎などの合併症を引き起こすことがある耳下腺（単数又は複数）の発熱および腫脹を特徴とする。しかしながら、感染した個体の約半数が古典的な病気を発症する。流行性耳下腺炎ウイルス（ＭｕＶ）は、ヒトにのみ感染するパラミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、およびルブラウイルス属の一員である［Ｈｖｉｉｄら、２００８］。  ＭｕＶは、１５，３８４ヌクレオチドからなる一本鎖のマイナスセンスＲＮＡゲノムを有する。ゲノムは、２つの表面糖タンパク質；融合（Ｆ）及び赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、４つのコアタンパク質；核タンパク質（ＮＰ）、ホスホ（Ｐ）、マトリックス（Ｍ）およびラージタンパク質（Ｌ）、および膜関連小疎水性（ＳＨ）タンパク質をコードする。
【０００３】
歴史的に、流行性耳下腺炎は、小児期の疾患と考えられていたが、過去２０年間にわたり、流行性耳下腺炎の予防接種が日常的に行われている国の高齢の子供や成人に影響を与えた。ワクチン接種率が高いにもかかわらず、流行性耳下腺炎の再発は、米国、英国、カナダ、モルドバ共和国、オランダなどいくつかの国で報告されている［Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ、２００８；Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆら、２０１０；ＣＤＣ、２０１０；Ｗｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１０；Ｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１０］。インドでは、流行性耳下腺炎の疫学、その発生率、抗体有病率などのデータが入手可能である。ＫｅｒａｌａとＭａｈａｒａｓｈｔｒａの州からいくつかの流行性耳下腺炎の流行が報告されている［Ｇｅｅｔａ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ、２００４；Ｊｏｈｎ、２００４；Ｇｈａｔａｇｅ  ａｎｄ  Ｋａｋａｄｅ、２００７］。流行性耳下腺炎ワクチンは、１２カ月またはそれ以降の麻疹ワクチンおよび風疹ワクチンと一緒に小児に与えられる。生きた弱毒化流行性耳下腺炎ウイルスの２つの菌株が、英国においてワクチンで使用され、すなわち、卵羊膜における継代による野生型の日本分離株に由来するウラベ株、及び野生型の米国分離株の組織培養継代に由来するＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株である。生きた弱毒化ウイルス株に基づくもの以外のワクチンは、流行性耳下腺炎には利用できない。
【０００４】
Ｊｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ（ＪＬ）流行性耳下腺炎ウイルス（ＭｕＶ）ワクチンには、ヌクレオチド配列において顕著に異なるＭｕＶＪＬ５とＭｕＶＪＬ２の２種類のコンポーネント菌株が含まれる（Ａｍｅｘｉｓ  ｅｔ  ａｌ、２００２）。
【０００５】
ＭｕＶＪＬワクチンは、非ヒト宿主細胞におけるウイルスの継代によって生きた弱毒化ワクチンに変換された単一の臨床分離株（Ａｆｚａｌら、１９９３）に由来することが報告されている。ＭｕＶＪＬ５とＭｕＶＪＬ２の完全なヌクレオチド配列が報告されており（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０００；Ａｍｅｘｉｓ  ｅｔ  ａｌ、２００２）、ＭｕＶＪＬ５とＭｕＶＪＬ２の間に８７個のアミノ酸変化をもたらす４１４個のヌクレオチド変化を示す。この変化レベルは、ＭｕＶの遺伝子型間の差異と同じレベルにある。ＭｕＶＪＬ５とＭｕＶＪＬ２の間には生物学的な違いがある。例えば、ＭｕＶＪＬ２は、ＭｕＶＪＬ５よりも発育した卵でよりよく増殖する（Ａｍｅｘｉｓら、２００２）。ＭｕＶＪＬ５とＭｕＶＪＬ２の両方は、ラットの神経毒性試験において非神経毒性である（Ｒｕｂｉｎら、１９９９，２０００，２００３）。
【０００６】
ＭｕＶの増殖は、宿主細胞依存性と同様に菌株依存性であることが知られている［Ａｆｚａｌら、１９９０］。また、Ｖｅｒｏ細胞培養と特異的に相互作用するＭｕＶ株の強力な固有の特徴は、非常に異なる形態の細胞変性効果（ＣＰＥ）をもたらすことも報告されている。細胞のウイルス感染の間、ウイルスの複製サイクルは、通常細胞死で終わる細胞内での多数の生化学的および形態学的変化を伴う。これらの形態学的変化は、ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）と呼ばれる。ＣＰＥは、いくつかの形態、例えば、合胞体形成、細胞球形化、方向転換、腫脹または収縮、表面からの剥離、全細胞溶解などを取ることがある。ＣＰＥの形態は、ウイルスと、ウイルスが増殖する細胞の両方に依存する［Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（２０１０）１８８７−１８９２］。
【０００７】
Ａｍｅｘｉｓら、２００２には、ＭＡＰＲＥＣ（様々なＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ調製物中のＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎの亜種の比を決定するための分子的方法）データがクローニング実験からの結果を確認したこと、Ｖｅｒｏ細胞上のＭｅｒＬ  ＭＶＬの最初の継代によって、  ＪＬ２の割合が２０％から２％に減少し、その後の継代において検出できず、一方、胚鶏卵（ＥＣＥ）におけるＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株の継代は、ＪＬ２の急速な蓄積（９０％以上）とＪＬ１の喪失をもたらし、これは、ＪＬ２がＥＣＥにおいて強い選択優位性を有することを示唆することが言及されている。
【０００８】
さらに、この著者は、クローニングとＭＡＰＲＥＣによって検出されたＶｅｒｏおよびＣＥＦ細胞におけるウイルス継代中のＪＬ２の急速な消失は、ＪＬ２がＶｅｒｏおよびＣＥＦ細胞培養ではほとんど複製しないこと、またはＪＬ１がヘルパーとして存在する必要があることを示唆していると結論付けている。
【０００９】
上記の開示から、宿主細胞としてＶｅｒｏ細胞またはＣＥＦを接近させることによるＪＬ２株のレスキューモデルの開発は、ワクチンのさらなる開発にとっては困難であることが十分に理解される。細胞変性効果、宿主細胞、ウイルス株、ウイルス株と宿主細胞の組み合わせなどのいくつかの因子は、Ｊｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ流行性耳下腺炎ウイルスに対する免疫原性組成物の開発の場合に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【００１０】
本発明において、本発明者らは、ワクチン接種の目的で適切な安定剤と共にさらに製剤化することができるＪＬ２株ベースの免疫原性組成物を開発した。本発明によるこのような免疫原性組成物は、より高い免疫原性を有し、外来性タンパク質および他の薬剤を含まず、最終的には流行性耳下腺炎に対するワクチンの開発のための良好な候補である。さらに、このようなワクチンは、おそらく、その菌株のより高い遺伝的均質性のために、従来のワクチンよりも安定である。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｖｅｒｏ細胞を宿主細胞として使用することにより上記の安定な免疫原性組成物を開発することができる。Ｖｅｒｏ細胞は、ＪＬ２株の開発のための良好な候補ではないことが知られているが、驚くべきことに、本発明の発明者ら、Ｖｅｒｏ細胞またはＭＲＣ−５細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を用いて、流行性耳下腺炎ウイルスに対する新規な免疫原性組成物を開発した。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチンを生成するために使用され得る安定なＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ２（本明細書において、以下、ＪＬ２とする）株を提供する。
【００１３】
好ましい態様において、単離されたＪＬ２株の全長ゲノムを含むベクターが記載される。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、ＪＬ２株が異なる宿主細胞中で増殖するＪＬ２株のレスキュープロセスを提供する。ここで、宿主細胞は、品質および生産性の点で安定で一貫した適切な哺乳動物細胞であり得る。
【００１５】
好ましい態様において、本発明は、組換え流行性耳下腺炎ウイルスＪＬ２株のためのレスキュー組成物を提供する。
【００１６】
第３の態様において、本発明は、哺乳動物細胞において高収率で増殖するＪＬ２株を提供する。このような哺乳動物細胞は、Ｖｅｌｌ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞または他のものであり得る。
【００１７】
これらの態様の１つでは、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスを防御する新規な免疫原性組成物を提供する。
【００１８】
さらなる局面において、本発明による免疫原性組成物は、Ｊｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株に由来する遺伝的に均一な流行性耳下腺炎ウイルスを含む。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスに対して防御する上記免疫原性組成物を含む安定なワクチンを提供する。
【００２０】
このようなワクチンは、麻疹、風疹および／または水痘ワクチン成分と組み合わせて、混合ワクチンを作製することができる。
【００２１】
第６の態様において、本発明は、上記免疫原性組成物の開発方法を提供する。
【００２２】
本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスを防御することができるＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ２株由来の安定した免疫原性組成物を提供する。このような免疫原性組成物は、逆遺伝学的方法を用いて誘導される。
【００２３】
このような免疫原性組成物は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する安定なワクチンを開発するために、様々な哺乳動物細胞を宿主として使用して作製される。
【００２４】
さらに、本発明は、上記高度に免疫原性で安定な組成物の開発方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、アガロースゲル上で分離された流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株の化学的に合成された断片を示す。流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化ＪＬ２株のゲノムの全長をカバーする６つの断片がある。ここでは、１＋２、３＋４および５＋６断片の組み合わせが示される。これは、制限消化後に断片が適切に得られたことを示す。
【図２】図２は、ｐＭｕＶJL2の制限地図を示す。
【図３】図３は、Ｐ０継代後のＶｅｒｏ細胞における合胞体形成を示す。
【図４】図４は、ａ）感染のないＭＲＣ５細胞（対照）、ｂ）ｒＭｕＶJL2ＦＬに感染したＭＲＣ５細胞を示す。
【図５】図５は、クリスタルバイオレットによって着色されたＵＶ光下でのＴＣＡ染色によって固定されたＶｅｒｏ細胞を示し、この場合、ＡおよびＢがｒＭｕＶJL2合胞体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
配列の概要
配列１は、制限部位ＮｏｔＩおよびＲｓｒＩＩを用いた制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片１は、全長ＤＮＡゲノムの１〜３５７６ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号１）。
【００２７】
配列２は、制限部位ＲｓｒＩＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片２は、全長ＤＮＡゲノムの３５７６〜６２５８ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号２）。
【００２８】
配列３は、制限部位ＡｖｒＩＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片３は、全長ＤＮＡゲノムの６２５８〜８４３８ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号３）。
【００２９】
配列４は、制限部位ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを用いた制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片４は、全長ＤＮＡゲノムの８４３８〜１０４９８ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号４）。
【００３０】
配列５は、制限部位ＫｐｎＩおよびＸｍａＩを用いた制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片５は、全長ＤＮＡゲノムの１０４９８〜１３９５０ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号５）。
【００３１】
配列６は、制限部位ＸｍａＩおよびＮａｒＩを用いて制限消化によって得られた第１の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片６は、全長ＤＮＡゲノムの１３９５０〜１５４４０ヌクレオチド位の位置を有する（配列番号６）。
【００３２】
配列７は、ベクターｐＭｕＶJL2の完全なヌクレオチド配列である（配列番号７）。
【００３３】
配列８は、救済された組換え流行性耳下腺炎ウイルスｒＭｕＶJL2ＦＬの完全なヌクレオチド配列である（配列番号８）。
【００３４】
配列９は、流行性耳下腺炎ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をコードするヌクレオチド配列である（配列番号９）。
【００３５】
配列１０は、流行性耳下腺炎ウイルスのリンタンパク質（Ｐ）をコードするヌクレオチド配列である（配列番号１０）。
【００３６】
配列１１は、流行性耳下腺炎ウイルスの大きな（Ｌ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列である（配列番号１１）。
【００３７】
配列１２は、流行性耳下腺炎ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）のアミノ酸配列である（配列番号１２）。
【００３８】
配列１３は、流行性耳下腺炎ウイルスのリンタンパク質（Ｐ）のアミノ酸配列である（配列番号１３）。
【００３９】
配列１４は、流行性耳下腺炎ウイルスの大きなタンパク質（Ｌ）のアミノ酸配列である（配列番号１４）。
【００４０】
配列１５は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするｐＳＣ６−Ｔ７のヌクレオチド配列である（配列番号１５）。
【００４１】
発明の詳細な説明
実施形態の１つにおいて、本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチンを製造するために使用され得る安定なＪＬ２株に基づく免疫原性組成物を提供する。単離されたＪＬ２株は、遺伝的に均質であり、高度に免疫原性である。本明細書に開示された単離されたＪＬ２株は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する抗体産生に関して安全かつ効率的である。
【００４２】
さらなる実施形態では、本発明は、ＪＬ２株の逆転写されたｍ−ＲＮＡから発生したＪＬ２株の全長ゲノムを提供する。全長のＪＬ２ゲノムは、流行性耳下腺炎ウイルスの全ゲノム長（１５，３８４ｂｐ）をカバーするために、６つの異なる断片で化学的に合成された。このように化学的に合成されたゲノム断片は、適切なプラスミドベクター（中間ベクター）を用いて増幅することができる。全長ゲノムは、制限消化法を用いて、ここに示される６つ以下の断片または６つ以上の断片で合成することができる。
【００４３】
この実施形態の１つでは、本発明は、ＪＬ２ゲノムの化学的に合成された断片を適切なベクターにクローニングする方法を提供する。流行性耳下腺炎ウイルスの遺伝子およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をトランス作用性ウイルスタンパク質ＮＰ（核タンパク質）、Ｐ（リンタンパク質）およびＬ（ラージタンパク質）をヘルパープラスミドにクローニングする。
【００４４】
トランス作用性ウイルスタンパク質は、ウイルスのキャプシド形成、転写および翻訳に本質的に必要とされるウイルスタンパク質として定義することができる。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明のトランス作用性ウイルスタンパク質は、配列番号９〜１１に記載されるヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
より好ましい実施形態では、本発明によるトランス作用性ウイルスタンパク質は、配列番号１２〜１４に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
さらなる実施形態では、本発明によるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ含有ベクターは、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
さらに別の実施形態において、本発明によれば、ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１９、ｐＣＡ、ｐＳＣ６および他のものから選択することができる。これらのベクターは市販されており、当業者に公知である。
【００４９】
第２の実施形態では、単離されたＪＬ２株の全長ゲノムを含むベクターが記載される。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明は、最終転写ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）を使用して、ＪＬ２ゲノムの化学的に合成された断片を段階的にクローニングすることにより、ＪＬ２（ｐＭｕＶJL2）の全長ゲノムを含むプラスミドを構築する方法を提供する。
【００５１】
転写ベクターは、発現に調節的役割を果たす遺伝子エレメント（単数又は複数）、例えば、プロモーター、流行性耳下腺炎ＲＮＡに転写される構造遺伝子またはコード配列、および適切な転写開始および終止エレメントの組み立てを含む作動可能に連結された転写単位を含む。  本発明の全てのクローニング手順は、基本的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）によって記載されている通りである。
【００５２】
第３の実施形態では、本発明は、ＪＬ２株が適切な宿主細胞内で増殖するＪＬ２株の救済のプロセスを提供する。ここで、宿主細胞は、品質および生産性に関して安定で一貫性のある適切な哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞であり得る。孵化鶏卵（ＥＣＥ）におけるＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株の継代は、ＪＬ２の急速な蓄積（９０％以上）およびＪＬ１の喪失をもたらし、ＪＬ２がＥＣＥにおいて強い選択優位性を有することを示唆していることは既に知られている。しかし、ＥＣＥ細胞は、一貫性がなく、再現性のない初代細胞である。したがって、このような初代細胞を用いて所望の力価のＪＬ２染色を維持することは困難になる。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞を専ら使用する免疫原性組成物の製造を提供する。このような哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および他の類似の二次または三次細胞系、および大腸菌などの非哺乳動物細胞から選択することができる。産生レベルにおいて安定で十分な免疫原性である免疫原性組成物は、当該技術分野において利用可能ではない。したがって、流行性耳下腺炎ウイルスに対するワクチン調製に使用することができるこのような宿主を用いた免疫原性組成物は、市販されていない。本発明は、現在の要求を満たすことが期待される。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明は、全長流行性耳下腺炎ＪＬ２ゲノムを含むプラスミド（ｐＭｕＶJL2）、およびトランス作用性ウイルスタンパク質ＮＰ、Ｐ、Ｌをコードする遺伝子を含むヘルパープラスミド、及びＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを使用する、適切な哺乳動物の宿主細胞のトランスフェクションを提供する。トランスフェクトされた細胞をインキュベートして、合胞体形成を可能にする。
【００５５】
より好ましい態様では、本発明によれば、ｐ ＮJL2として示される核タンパク質（ＮＰ）、ｐ ＰJL2として示されるリンタンパク質（Ｐ）、ｐ ＬJL2として示されるラージタンパク質（Ｌ）をコードするヘルパープラスミド、およびｐＳＣ６−Ｔ７（配列番号１５）として示されるＴ７ポリメラーゼをコードするプラスミドが使用される。
【００５６】
ｐＭｕＶJL2とともに宿主細胞を同時トランスフェクトするために使用されるトランス作用性ウイルスタンパク質およびＴ７ポリメラーゼを発現するプラスミドは、ヘルパープラスミドとして定義することができる。これらは、ウイルスのキャプシド形成、転写および翻訳に必須である。
【００５７】
合胞体は、感染細胞と、ウイルスタンパク質の発現によって媒介される隣接細胞との融合から生じる多核拡大細胞として定義することができる。
【００５８】
これらの合胞体は、ウイルス増殖（継代Ｐ０）に関して、異なる哺乳動物宿主細胞に感染させるために使用される。ウイルスの子孫は、Ｐ０継代後に救済される（ｒＭｕＶJL2ＦＬ）。継代は、宿主細胞上で救済されたウイルスの継代培養として定義することができる。最初の継代後、新鮮な哺乳動物細胞は、継代（Ｐ１およびＰ２）のために継代Ｐ０に感染される。最後の継代後、救済されたウイルスは、ウイルスストック（マスターシード）として保存される。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、以下の要素を含むレスキュー組成物を提供する：
ａ．ＪＬ２株の全長ゲノムを含む転写ベクター。
ｂ．ＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質およびそれらの組み合わせから選択されるトランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクター。
ｃ．ＪＬ２株の完全長ゲノムの適切な転写のためのＲＮＡポリメラーゼ。
【００６０】
ここで、本発明によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
【００６１】
さらに別の実施形態では、本発明において、救済されたウイルスは、当該技術分野で公知の配列決定法、より好ましくはプライマーウォーキング配列決定法により特徴付けられる。
【００６２】
第４の実施形態では、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスに対するワクチンの開発に使用することができる単離されたＪＬ２株を含む、新規の安定であり高度に免疫原性の組成物を提供する。
【００６３】
このような免疫原性組成物は、遺伝的に均質なＪＬ２株を含む。本発明による安定な免疫原性組成物は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する従来のワクチンの一部であるＭｕＶＪＬ５成分株を含まない。したがって、本発明は、ＪＬ２株およびＪＬ５株の組み合わせを使用して従来保護されている流行性耳下腺炎ウイルス抗原に対して防御することができる、安定で純粋であり、高度に免疫原性の組成物を提供する。
【００６４】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞およびＭＲＣ−５細胞から選択される。上述したように、従来のＪＬ２株は、初代ニワトリ胚由来細胞において良好に増殖することが知られている。孵化卵細胞を使用することの欠点は、残りの卵由来タンパク質および他の未知の外来物質（他のウイルスを含む）のリスクに置く。このような残留卵由来タンパク質は、ワクチン接種された個体において望ましくないアレルギー反応を引き起こす原因となり得る。さらに、未知の他のウイルスの存在は、ワクチンのさらなるリスクを誘発する可能性がある。本発明者らは、流行性耳下腺炎ウイルスに対する安定なワクチンの開発に用いることができるＶｅｒｏ細胞およびＭＲＣ−５細胞を用いて、安定した、均質で純粋な単離されたＪＬ２株およびそれを含む組成物を開発した。
【００６５】
第５の実施形態では、本発明は、遺伝的に均質であり、熱安定性のＪＬ２株を含む安定なワクチンを提供する。
【００６６】
さらなる実施形態では、本ワクチンは、本発明のＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎワクチンとともに、麻疹、風疹、水痘および他の生ウイルスワクチン株を含む組み合わせワクチンを提供する。
【００６７】
第６の実施形態において、本発明は、従来の逆遺伝学的方法論を用いて上記免疫原性組成物を開発する方法を提供する。それは、流行性耳下腺炎ウイルスのＪＬ２株の全長ゲノムを開発するためのクローニング法を含む。このようなＪＬ２株の完全長ゲノムは、単離されたＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎ株の元のｍ−ＲＮＡから逆転写される。安定した合胞体形成は、本発明の逆転写されたＪＬ２株から得られる細胞変性効果として起こる。本発明の単離されたＪＬ２株から得られたそのような合胞体は、遺伝的に均質であり、高度に免疫原性である。そのような免疫原性ワクチン株は、異なる哺乳動物細胞系を用いて、産生細胞培養で増殖させることができる。本発明者らは、古典的なＪｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎワクチンに使用されるＣＥＦ初代細胞と比較して、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの細胞基質が、より低い生産コストで複数の継代においてより良好な細胞増殖を示すことを見出した。
【００６８】
上述の哺乳動物細胞株を用いて得られた免疫原性組成物は、ＪＬ２染色の所望の力価を生成する品質および感受性に関して一貫しているが、ＣＥＦ初代細胞の場合には再現性がない。
【００６９】
さらに、本発明による免疫原性組成物は、任意の初代細胞の場合ではない適切な安定な二次細胞株を使用することによって、細胞基質からの新規の外来物質の汚染のリスクを回避するのに役立つ。本明細書に記載の免疫原性組成物が商業的に実行可能であることを意味する。
【００７０】
適切なベクターを使用して適切な宿主細胞をトランスフェクションすることを含むクローニングストラテジーを含む、本発明による上記免疫原性組成物を開発する方法が提供される。
【００７１】
この実施形態の１つでは、本発明は、以下の工程を含む、組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生するための方法を提供する：
ａ．流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたＪＬ２のゲノム配列断片の化学合成；
ｂ．増幅用の中間ベクターへの得られた各遺伝子断片のクローニング；
ｃ．単一ベクターへの各遺伝子断片の連結を介して、ｐＭｕＶＪＬ２ベクターを得るために、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたＪＬ２株の完全長ＤＮＡゲノムのクローンの構築。
ｄ．流行性耳下腺炎ウイルスレスキューのマイナス鎖に対して、トランス作用性タンパク質がＮＰタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質から選択される、トランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクターとｐＭｕＶＪＬ２の宿主細胞の同時トランスフェクション；
ｅ．場合により、救済された流行性耳下腺炎ウイルスをその拡大のために宿主細胞に継代すること。
【００７２】
さらなる実施形態では、本発明は、適切な医薬として許容される担体または賦形剤を伴う免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００７３】
実施形態の１つでは、本発明は、適切な緩衝剤、安定化剤、等張剤、界面活性剤および凍結保護剤を伴う免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
実施形態の１つでは、緩衝液は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液などから選択することができ、好ましくはリン酸緩衝液である。
【００７５】
実施形態の１つでは、安定化剤は、アミノ酸、糖、ポリオールおよびそれらの組み合わせから選択することができる。
【００７６】
実施形態の１つでは、アミノ酸は、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、システイン／シスチンおよびそれらの適切な組み合わせから選択することができる。
【００７７】
本発明において、糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ラフィノースおよびそれらの適切な混合物から選択することができ、好ましくはトレハロースまたはソルビトールまたはマンニトールである。
【００７８】
さらに、ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な組み合わせから選択することができ、好ましくはソルビトールである。
【００７９】
実施形態の１つでは、適切な張性剤は、上記医薬組成物のための糖、塩およびそれらの組み合わせから選択することができる。
【００８０】
実施形態の１つでは、適切な塩は、等張剤、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどから選択することができる。
【００８１】
本発明において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。
【００８２】
さらに、凍結防止剤は、糖などから選択することができる。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明は、適切なアジュバントと共に組換えＪＬ２（ｒＭｕＶＪＬ２ＦＬ）を含む免疫原性組成物を提供する。
【００８４】
アジュバントは、ワクチンへの身体の免疫応答を増加させるためにワクチンに添加される物質として定義することができる。
【００８５】
本発明によるアジュバントは、アルミニウムの塩、モノホスホリルリピド（Ｍｏｎｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ）類似体、例えば、ＧＬＡ（グルコピラノシル脂質アジュバント）、モナチド、サイトカイン誘導物質、およびスクアレン系アジュバント、親油性アジュバントなどから選択することができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｊｅｒｙｌ  Ｌｙｎｎに対する本発明の免疫原性組成物を含有するワクチンを提供する。これらのワクチンは、従来の経路および用量で投与することができる。
【００８７】
本発明において使用される分析方法
１．ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡを逆転写することによって相補的ＤＮＡを合成および増幅するために使用される方法である。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素およびプライマーを用いて、所望のＲＮＡ配列をアニールおよび伸長させる。ＲＮＡが存在する場合、逆転写酵素およびプライマーはＲＮＡ配列にアニーリングし、ＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）を転写する。次いで、この鎖をプライマーおよびＴａｑポリメラーゼで複製し、標準ＰＣＲプロトコールに従う。このプロトコールは、一本鎖ＤＮＡを少ない時間量で何百万回もコピーして、相当量のＤＮＡを生成する。次いで、ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ鎖）をアガロースゲル電気泳動で分離する。
【００８８】
２．アガロースゲル電気泳動：アガロースゲル電気泳動は、アガロースのマトリックス中のＤＮＡまたはタンパク質の混合集団を分離するための生化学、分子生物学、遺伝学および臨床化学において用いられるゲル電気泳動の方法である。
【００８９】
３．プライマーウォーキング配列決定法：プライマーウォーキングは、大きなＤＮＡ断片を配列決定するための最適な配列決定方法である。単一の配列において長すぎて配列決定されない断片は、チェーン・ターミネーション法を用いて読み取られる。この方法は、長い配列をいくつかの連続する短い配列に分割することによって機能する。用語「プライマーウォーキング」とは、主な目的がゲノムを配列することである場合に使用される。
【００９０】
４．多重配列分析：多重配列分析は、生物学的配列の分析に用いられ、分析のために整列された配列間の類似および相違の領域を決定するための方法である。
【実施例】
【００９１】
以下の非限定的な例は、適切な哺乳類細胞へのゲノムおよび構造的プラスミドの同時トランスフェクションからのＪＬ２の救済を記載する。さらに、限界希釈法を用いた純粋で遺伝的に均質なＪＬ２株の単離を本明細書において以下に記載する。異なる宿主細胞を有する他の免疫原性組成物を調製することができ、このような免疫原性組成物は当業者の範囲内であり、本発明の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【００９２】
実施例１：流行性耳下腺炎ウイルスを弱毒化したＪＬ２株の完全長ＤＮＡゲノムのクローンの構築
流行性耳下腺炎ＪＬ２の全長ｃＤＮＡの作製
６つのゲノム配列断片を流行性耳下腺炎ウイルスの全ゲノム長（１５，３８４ｂｐ）をカバーするように化学合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。続いて、各ゲノム断片およびベクターを特異的制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）で切断し、中間ベクターにクローニングした。各断片は、図１に示すようにアガロースゲル上でそれらを分離することによって確認した。制限消化後に得られた断片を以下に記載する。
断片１：１〜３５７６位  ＮｏｔＩ−ＲｓｒＩＩ（配列番号１）；
断片２：３５７６〜６２５８位  ＲｓｒＩＩ−ＡｖｒＩＩ（配列番号２）；
断片３：６２５８〜８４３８位  ＡｖｒＩＩ−ＸｈｏＩ（配列番号３）；
断片４：８４３８〜１０４９８位  ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ（配列番号４）；
断片５：１０４９８〜１３９５０位  ＫｐｎＩ−ＸｍａＩ（配列番号５）；
断片６：１３９５０〜１５４４０位  ＸｍａＩ−ＮａｒＩ（配列番号６）
【００９３】
本実施例において言及される制限部位は、当業者に周知である。当業者は、その要求に従って代替の制限部位を使用することができる。
【００９４】
得られた断片の転写ベクターへのクローニングおよび断片の連結
化学的に合成され、制限エンドヌクレアーゼで処理された断片は、最終ベクターとして改変されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）を用いて、段階的なクローニング法によりプラスミドに組み込まれた。相補的な凝集末端を介して断片を互いに進行的に連結することにより、最終的なｐＭｕＶJL2プラスミドが得られた。ｐＭｕＶJL2プラスミドのベクターマップが図２に示されている。プラスミドｐＭｕＶJL2は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する。適切なベクターにクローニングすることにより、流行性耳下腺炎ウイルスの構造タンパク質の遺伝子を含むヘルパープラスミド、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製した。ここで、ｐＳＣ６ベクターは、トランス作用性タンパク質およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングに使用されている。本出願に記載のクローニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）に記載されているように行った。
【００９５】
実施例２：弱毒化された流行性耳下腺炎Ｊｅｒｙｌ−Ｌｙｎｎ  ２ウイルスのレスキュー
市販のＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヘルパープラスミドｐ ＮJL2、ｐ ＰJL2、ｐ ＬJL2およびｐＳＣ６−Ｔ７と一緒にｐＭｕＶJL2によりトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、３５ｍｍウェルに播種され、トランスフェクションしたとき、５０〜７０％のコンフルエンスに達した。コンフルエントは、培養皿またはフラスコ中の接着細胞の数の推定値として一般に使用される用語であり、細胞単層によって覆われる表面の割合を指す。トランスフェクションの４時間前に、培地を１０％ＦＣＳを含む３ｍｌのＤＭＥＭと置換した。全ての組換えプラスミドは、ＱＩＡＧＥＮプラスミド調製キットに従って調製された。ＤＮＡのＣａ2+リン酸塩共沈殿のためのキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【００９６】
細胞は、以下の最終濃度でプラスミドと同時トランスフェクトされた。
ｐ ＮJL2        ０．５μｇ、
ｐ ＰJL2        ０．１μｇ、
ｐ ＬJL2        ０．５μｇ、
ｐＳＣ６−Ｔ７   １．０μｇ、
ｐＭｕＶJL2      ５．０μｇ
【００９７】
Ｈ2Ｏで希釈した上記のプラスミドを２Ｍ  ＣａＣｌ2を含むエッペンドルフチューブに添加し、混合物を振とう条件下でＨＥＰＥＳ緩衝液を含む別のエッペンドルフチューブに添加し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。共沈殿物を培養液に滴下し、３７℃、５％ＣＯ2で約１８時間トランスフェクションを行った。続いて、トランスフェクション培地を、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ  ３．０ｍｌと置換した。Ｔ７ポリメラーゼの一過性発現は、Ｔ７促進遺伝子の効率的なタンパク質発現を可能にし、最終的に流行性耳下腺炎救済のマイナス鎖に導いた。トランスフェクトされた細胞を合胞体形成まで約１５日間モニターした。単一のプラークからの合胞体形成が図３に示されている。ウイルスの継代０（Ｐ０）を確立するために、ＷＨＯが承認したＶｅｒｏ細胞に感染するために単一の合胞体が拾われた。
【００９８】
救済された組換え弱毒化ウイルスは、ｒＭｕＶJL2ＦＬと命名される。ｒＭｕＶJL2ＦＬのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載される。
【００９９】
救済された流行性耳下腺炎ウイルスの解析的配列決定
トランスフェクションの約１５日後、最初の合胞体が出現するとすぐに、単一クローンを顕微鏡下で吸引し、続いて特徴付けに使用した。特徴付けは、救済されたｒＭｕＶJL2ＦＬウイルスゲノムの配列決定によって行った。ｒＭｕＶJL2ＦＬ感染したＶｅｒｏ細胞からのウイルスＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットに従って調製した。２．０μｌの抽出されたウイルスＲＮＡから出発して、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットの指示に従って、逆転写および増幅を順次行った。
【０１００】
重複するＰＣＲ断片を増幅するために、全長ゲノム配列（１５，３８４ｂｐ）をカバーする３４のプライマー対が設計されている。精製されたＰＣＲは、プライマーウォーキング配列決定手順に従って配列決定されている。
【０１０１】
バリュー・リード配列は、ｒＭｕＶJL2ＦＬウイルスゲノム全体をカバーして組み立てられている。元のプラスミドｐＭｕＶJL2の配列に対して、救済されたｒＭｕＶJL2ＦＬのＬ遺伝子において６点突然変異が検出され、多重配列分析によって確認された。
【０１０２】
【表１】
2020074792.tif 000002
【０１０３】
実施例３：救済された流行性耳下腺炎ＪＬ２ウイルスの拡大
救済されたｒＭｕＶJL2ＦＬウイルスのＰ０継代は、ＷＨＯ承認のベロ細胞で増殖した。Ｖｅｒｏ細胞は、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で単層として維持され、コンフルエンスが７０〜８０％に達したとき、救済されたｒＭｕＶJL2ＦＬウイルスのＰ０継代により、全体積が５．０ｍＬのＯＰＴＩＭＥＭ中で５．０〜１．０ｍＬの救済されたウイルスを用いて感染された。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。インキュベーション後、接種材料をＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳで置換した。感染した細胞は２日後に分裂し、５−ｄｐｉ後に９０〜１００％の合胞体形成が観察された。回収した無細胞画分（ＣＦ）の１×１０4ｐｆｕ／ｍＬと回収された細胞関連画分（ＣＡ）の１×１０6ｐｆｕ／ｍＬの間に力価を達するように、無細胞（ＣＦ）および細胞関連（ＣＡ）画分を回収し、ラボスケールのウイルスストックを得た。
【０１０４】
実施例４：救済された流行性耳下腺炎ＪＬ２ウイルスのマスター細胞バンクの調製および単一ウイルス回収物の生産
Ｐ０継代から救出された流行性耳下腺炎ウイルスは、十分なマスターシードを得るために、Ｖｅｒｏ細胞の継代２（Ｐ２）までさらに継代された。
【０１０５】
Ｖｅｒｏ細胞における各継代後に得られた力価を以下に示す：
Ｐ０継代：１×１０3ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＦ、無細胞画分）〜１×１０4ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＡ、細胞関連画分）の間の力価。
Ｐ１継代：１×１０4ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＦ、無細胞画分）〜５×１０4ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＡ、細胞関連画分）の間の力価。
Ｐ２継代：１×１０4ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＦ、無細胞画分）〜１×１０6ｐｆｕ／ｍＬ（ＣＡ、細胞関連画分）の間の力価。
【０１０６】
このようなマスターシードは、−１５０℃〜−１９６℃の間の温度で貯蔵される。このマスターシードは、ヒト用の市販のワクチンを調製するためのワーキングシードを生産するために使用される。マスターシードから得られたワーキングシードは、Ｖｅｒｏ細胞における単一のウイルス回収物の生産に使用される。マスターシードから得られたワーキングシードは、ＭＲＣ５細胞における単一のウイルス回収物の生産に使用することができる。ＭＲＣ５細胞における単一のウイルス回収物の産生はまた本明細書において以下に例示する。
【０１０７】
ＭＲＣ５細胞における単一のウイルス回収物の生産
細胞の増殖
培地を除去し、細胞をＭＥＭ  ＥＢＳ培地で洗浄し、１ｍｌ／Ｔ７５ｃｍ２および１０ｍｌ／ＲＢ  ８５０ｃｍ２でＴｒｙｐＬＥ溶液を添加（トリプシン置換）し、３５±２℃でインキュベートした。新鮮な培地での分離後に細胞を再懸濁し、新しい培養フラスコおよびローラーボトルに播種した。完全にコンフルエントなＴ７５フラスコを、バッチサイズに応じて、次の継代でそれぞれＴ７５、Ｔ７５およびＲＢ８５０ローラーボトルの１：４〜１：１６の比で分割した。細胞を１週間に１回、および十分なコンフルエンスを達成した後に分割した。その後、ウイルス接種に細胞を用いた。
【０１０８】
単一のウイルス回収物生産
単一のウイルス回収−流行性耳下腺炎は、ＭＲＣ−５細胞にワーキングウイルス種子を感染させ、ウイルス吸着のために３３±２℃で６０〜１２０分間インキュベートすることにより産生させた。吸着後、各感染ローラーボトルに２５０〜３００ｍＬのＣｒｅｅｋ最小培地（ＣＭＭ）を補充し、３３±２℃、０．５ｒｐｍでローラー装置中で４０〜７０時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、すべてのローラーボトルを単層の透明性および分離について観察した。単層をプレーンＭＥＭ培地で洗浄し、１００〜２００ｍＬのプレーンＭＥＭ培地で補充した。ボトルをローラー装置中で３３±２℃、０．５ｒｐｍで５〜１３日間再びインキュベートした。インキュベーションの終わりに、全てのローラーボトルを細胞病理学的効果の明瞭さと存在について観察し、単一の容器内の全てのローラーボトルから回収した。ヒト血清アルブミンを、回収したウイルス採取のための安定化剤として使用した。その後、単一の回収物として個々の予め滅菌されたＰＥＴＧボトルに分配した。こうして得られたバルクを浄化し、流行性耳下腺炎ワクチンを製造するのに必要な濃度に希釈した。感染のないＭＲＣ５細胞（対照）およびｒＭｕＶJL2ＦＬに感染したＭＲＣ５細胞をそれぞれ図４に（ａ）および（ｂ）として示す。
【０１０９】
流行性耳下腺炎ワクチン（ＪＬ）製造物を効力について試験し、細胞培養法により試験した１０4.12／ｍｌ〜１０4.57／ｍｌのＣＣＩＤ50（培養細胞の５０％に感染する細胞培養感染用量）の範囲にあることが判明した。
【０１１０】
実施例５：プラークアッセイおよびインサイチュ免疫蛍光法による流行性耳下腺炎ＪＬ２株の同定および定量
プラークアッセイによるウイルス滴定
ウイルス調製物の連続１０倍希釈をＯＰＴＩＭＥＭを用いて最終容量０．５ｍｌになるまで実施した。各希釈物を３５ｍｍのＶｅｒｏ細胞培養物に添加した。ウイルス吸着の１時間後、接種物を除去し、感染細胞に５％ＦＣＳおよび１％低融点アガロース（ＬＭＰアガロース）を含む２．０ｍｌのＤＭＥＭを重層した。３７℃および５％ＣＯ2での５日間のインキュベーション後、培養物を１ｍｌの１０％ＴＣＡで１時間固定し、次いでＵＶ架橋を３０分間行った。アガロースオーバーレイを除去した後、細胞単層を４％エタノールに溶解したクリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、プラークを倒立顕微鏡下で計数した。顕微鏡画像は図５に与えられる。
【０１１１】
インサイチュ免疫蛍光
マスターシードの様々な１０倍希釈物を、２％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＭＥＭ（最小必須培地）培地中のマスターシードウイルスから調製した。続いて、Ｖｅｒｏ細胞懸濁液を０．１５〜０．２０百万／ｍＬの濃度範囲で調製した。この細胞懸濁液を９６ウェルプレートにウイルス希釈上に注ぎ、５％ＣＯ2で３７℃に保った。プレートを同じ条件下で１０日間インキュベートした。１０日後、プレートからの細胞上清を捨て、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。プレート中の細胞をアセトンメタノール固定緩衝液で固定した。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）とコンジュゲートした抗流行性耳下腺炎ＩｇＧ抗体を１：５０の希釈倍率で添加した。ウイルス力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｋａｒｂｅｒ式を用いて蛍光顕微鏡下で染色細胞を計数することによって決定した。
【０１１２】
Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｋａｒｂｅｒ式：
【数１】
2020074792.tif 000003
【０１１３】
ｘ０＝（全てのウェルが陽性である最低希釈のｌｏｇ１０）、ｄ＝希釈ステップのｌｏｇ１０、この場合は１、ｎｉ＝複製数、この場合は６、ｒｉ＝陽性ウェルの数。
【０１１４】
実施例６：免疫原性組成物の形成
流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収の必要量を計算し、１０００ＣＣＩＤ50の標的力価を得た。同様に原材料（安定剤）の必要量を計算して、最終製品の組成に従って所望のバッチサイズのワクチンを製剤化した。計算量あたりの安定剤１７６（ゼラチンソルビトールと他のアミノ酸の組合せ混合物）およびＭ１９９（希釈剤）を滅菌容器に移し、流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収のその計算された量まで添加され、混合された。
【０１１５】
最終製剤は以下に記載の通りである。
【０１１６】
【表２】
2020074792.tif 000004
【０１１７】
最終製剤を０．５ｍｌ／バイアルに充填し、バイアルを半分にし、標準サイクルで凍結乾燥させた。ここで、急速凍結は−６０℃、一次乾燥は−４０℃で、二次乾燥は３７℃で行った。１分未満で再構成され、水分試験は１．６％〜２％に下がるラウンドインタクトなケーキが見出された。
【０１１８】
製造された流行性耳下腺炎ワクチン（ＪＬ）ワクチンは、効力について試験され、細胞培養法により試験した１０3／用量〜１０3.57／ｍｌのＣＣＩＤ50の範囲にあることが判明した。
【０１１９】
本発明の免疫原性組成物は、標準的な免疫アッセイ法により救済された流行性耳下腺炎ウイルスの免疫原性の測定について試験される。このような免疫アッセイ法の例は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）および流行性耳下腺炎ウイルス中和抗体の測定に使用される他の標準的方法である。このようなアッセイは、非霊長類または霊長類における救済されたウイルスの免疫原性を決定するために使用され得る。このような研究は、上記ワクチンの最適用量および投与計画を決定するために有用であり得る。救済された流行性耳下腺炎ウイルスを有する本発明の免疫原性組成物は、さらなるワクチン調製に適していることが見出される。本発明による救助された流行性耳下腺炎ウイルスを製造するためのプロセスは、任意の他のウイルス性または非ウイルス性病原体由来の任意の要素の使用を伴わない。このようにして、救済された流行性耳下腺炎ウイルスは安定で均質であり、したがって、流行性耳下腺炎以外の病原性粒子を欠いている。よって、本発明による救済された流行性耳下腺炎ウイルスは、ワクチン開発に適した候補である。
【図１】
2020074792.tif 000005
【図２】
2020074792.tif 000006
【図３】
2020074792.tif 000007
【図４】
2020074792.tif 000008
【図５】
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【配列表】
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