(57)【要約】【課題】所望の培養性能を得る。【解決手段】細胞培養装置１は、培養対象である細胞を含む培地を収容すると共に、第１軸線に沿って伸びる槽本体１３と、槽本体１３に培地を送り込むポンプ１０と、槽本体１３の底部に設けられると共にポンプ１０が接続されて、ポンプ１０から送り込まれた培地Ｍを槽本体１３の内部に導くと共に槽本体１３の内部における培地Ｍの流れの方向を制御する培地受入部１４と、を備え、培地受入部１４は、軸線Ａ１３に対して平行な軸線Ａ１６を有する貫通穴１６を含む。貫通穴１６の内径は、槽本体１３の底部の外径よりも小さい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養対象である細胞を含む培地を収容すると共に、第１軸線に沿って伸びる槽本体と、
前記槽本体に前記培地を送り込むポンプと、
前記槽本体の底部に設けられると共に前記ポンプが接続されて、前記ポンプから送り込まれた前記培地を前記槽本体の内部に導くと共に前記槽本体の内部における前記培地の流れの方向を制御する培地受入部と、を備え、
前記培地受入部は、前記第１軸線に対して平行な第２軸線を有する貫通穴を含み、
前記貫通穴の内径は、前記槽本体の底部の外径よりも小さい、細胞培養装置。
【請求項２】
前記貫通穴の前記第２軸線から前記第１軸線までの長さは、前記貫通穴の前記第２軸線から前記槽本体の底部の外周縁までの長さよりも短い、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記第１軸線は、前記槽本体の中心軸線であり、
前記培地受入部は、複数の前記貫通穴を含み、
複数の前記貫通穴は、前記第１軸線のまわりに等間隔に配置されている、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記ポンプの動作を制御する制御部をさらに備え、
前記制御部は、前記槽本体への前記培地の送り込みと、前記槽本体への前記培地の送り込みの停止と、を繰り返すように、前記ポンプを制御する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１、２は、細胞培養装置を開示する。具体的には、特許文献１、２は、いわゆるプラグフローを用いて培養槽内の細胞塊の分布を制御する技術を開示する。これらの細胞培養装置では、培地が上方に向かう旋回流となって、移動する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−８６７９１号公報
【特許文献２】特開２０１５−１４２５５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
培地の流れとして旋回流を用いる細胞培養装置では、所望の培養性能が得られないことがあり得る。例えば、細胞塊の大きさが意図する大きさよりも大きくなりすぎることがある。また、時間の経過に伴って増殖する細胞数が意図する数よりも少なくなることもある。
【０００５】
そこで、本発明は、所望の培養性能が得られる細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一形態は、培養対象である細胞を含む培地を収容すると共に、第１軸線に沿って伸びる槽本体と、槽本体に培地を送り込むポンプと、槽本体の底部に設けられると共にポンプが接続されて、ポンプから送り込まれた培地を槽本体の内部に導くと共に槽本体の内部における培地の流れの方向を制御する培地受入部と、を備え、培地受入部は、第１軸線に対して平行な第２軸線を有する貫通穴を含み、貫通穴の内径は、槽本体の底部の外径よりも小さい。
【０００７】
槽本体の底部には、培地受入部が設けられている。この培地受入部が含む貫通穴は、槽本体の第１軸線に対して平行な第２軸線に沿って延びる。その結果、ポンプから送り込まれた培地は、培地受入部の貫通穴を通ると、第１軸線の方向に沿って槽本体の内部に排出される。つまり、培地受入部は、上昇成分を有する流れを生じさせるのであり、旋回成分を有する流れは生じさせない。その結果、培地は、槽本体の内部を上昇した後に、液面付近において槽本体の壁面に向かって流れ、その後、壁面に沿って下降する。そして、培地は、再び槽本体の内部を上昇する。つまり、槽本体の内部において、培地は、上昇と下降とを含む対流を生じる。その結果、培地に含まれる細胞及び細胞塊も培地の流れに応じて、槽本体の中央付近における上昇と壁面付近における下降とを繰り返す。従って、細胞及び細胞塊の滞留の発生が抑制されるので、滞留に起因する細胞又は細胞塊の過剰な融合などを抑制することが可能になる。従って、細胞培養装置は、所望の培養性能を得ることができる。
【０００８】
一形態において、貫通穴の第２軸線から第１軸線までの長さは、貫通穴の第２軸線から槽本体の底部の外周縁までの長さよりも短くてもよい。この構成によれば、槽本体の第１軸線の付近に培地の上昇流を発生させることができる。
【０００９】
一形態において、第１軸線は、槽本体の中心軸線であり、培地受入部は、複数の貫通穴を含み、複数の貫通穴は、第１軸線のまわりに等間隔に配置されてもよい。この構成によれば、所望の上昇流を複数の貫通穴から排出される培地の流れによって形成する。その結果、細胞及び細胞塊に与えるストレスを低減することができる。
【００１０】
一形態に係る細胞培養装置は、ポンプの動作を制御する制御部をさらに備え、制御部は、槽本体への培地の送り込みと、槽本体への培地の送り込みの停止と、を繰り返すように、ポンプを制御してもよい。この構成によれば、槽本体の内部における培地、細胞及び細胞塊の滞留をさらに好適に抑制できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、所望の培養性能が得られる細胞培養装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。
【図２】図２は、培地受入部を拡大して示す斜視図である。
【図３】図３の（ａ）部は、比較例に係る細胞培養装置の作用を説明するための図であり、図３の（ｂ）部は、実施形態に係る細胞培養装置の作用を説明するための図である。
【図４】図４は、変形例に係る培地受入部を示す図である。
【図５】図５は、実験例１の結果を示す模式図である。
【図６】図６は、比較例１の結果を示す模式図である。
【図７】図７は、実験例２及び比較例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態を詳細に説明する。図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１４】
動物細胞を培養する手法として、シャーレ等を用いた静置培養と、培養槽内において細胞を培地に浮遊させて培養する浮遊培養とがある。浮遊培養は、細胞の大量培養に適する。本実施形態に係る細胞培養装置は、浮遊培養のための装置である。
【００１５】
図１に示すように、気密構造を有する細胞培養装置１は、細胞培養槽２と、曝気ユニット３と、廃液ユニット４と、を有する。細胞培養槽２は、培地流出管６及び培地導入管７によって曝気ユニット３と接続されている。培地導入管７には、ポンプ１０が設けられている。ポンプ１０は、曝気ユニット３から細胞培養槽２に向けて培地Ｍを送り込む。ポンプ１０には、コントローラ１０ａ（制御部）が接続されており、コントローラ１０ａから提供される制御信号に基づいて、ポンプ１０が動作する。具体的には、コントローラ１０ａは、曝気ユニット３から細胞培養槽２に向けて培地Ｍを送り込む動作と、培地Ｍを送り込む動作と停止させる動作と、を相互に切り替える。このように、送り込みと送り込みの停止とを繰り返す動作によれば、間欠的な灌流を得ることが可能である。その結果、細胞培養槽２の内部における培地Ｍ、細胞及び細胞塊Ｃの滞留を抑制できる。また、曝気ユニット３は、培地排出管８によって廃液ユニット４と接続されている。
【００１６】
細胞培養槽２は、培養対象である細胞を培養する容器である。細胞培養槽２は、培地Ｍを収容する。培地Ｍは、細胞或いは細胞が付着した担体を含む。担体は、マイクロキャリアとも称される微小な粒体である。担体は、細胞の付着基盤である。そして細胞は、担体の表面において増殖する。細胞培養槽２の上部には、気密構造の蓋９が設けられる。細胞培養槽２の上縁には開口が形成され、当該開口は蓋９によって気密に閉鎖される。蓋９は、培地流出管６によって、曝気ユニット３に接続されている。培地流出管６の一端は、蓋９の底面における最も下方の位置に連結される。培地流出管６の他端は、曝気ユニット３に連結されている。
【００１７】
細胞培養槽２のさらに詳細な説明は、後述する。
【００１８】
曝気ユニット３は、細胞培養槽２に供給するための培地Ｍを貯溜する。また、曝気ユニット３は、培地排出管８を介して余剰の培地Ｍを廃液ユニット４に排出する。曝気ユニット３には、さらに、エアフィルタ２２が設けられたガス供給管１１及び培地供給管１２が接続されている。これらの管から供給されるガスによって、曝気ユニット３は、培地Ｍのガス濃度を調整する。曝気ユニット３には、培地供給管１２の他端が接続される。
【００１９】
廃液ユニット４は、曝気ユニット３から排出された培地Ｍを貯溜する。廃液ユニット４には、培地排出管８の一端が接続される。培地排出管８の一端の位置は、廃液ユニット４に貯溜されている培地Ｍの液面より上方である。
【００２０】
細胞培養槽２は、主要な構成要素として、槽本体１３と、培地受入部１４と、を有する。
【００２１】
槽本体１３は、培地Ｍを収容する培養領域を形成する。槽本体１３の水平断面は、上方に向かって次第に拡大する。例えば、槽本体１３の形状は、略逆円錐状である。また、槽本体１３は、筒状である。さらに、槽本体１３は、上端側に設けられた上端開口１３ａと、下端側に設けられた下端開口１３ｂと、を含む。
【００２２】
培地受入部１４は、下端開口１３ｂを閉鎖する円盤状の部材である。図２に示すように、培地受入部１４は、底板１５と、複数の貫通穴１６を含むノズルユニットである。これらの貫通穴１６の軸線Ａ１６（第２軸線）は、槽本体１３の軸線Ａ１３（第１軸線）に対して平行である。換言すると、貫通穴１６は、軸線Ａ１３に沿って延びている。さらに、貫通穴１６は、軸線Ａ１３を囲むように配置されている。具体的には、複数の貫通穴１６は、軸線Ａ１３を中心とする仮想円ＰＣ上において等間隔に配置されている。例えば、貫通穴１６の数は４個であるので、貫通穴１６同士の間隔は、９０度である。
【００２３】
また、貫通穴１６は、軸線Ａ１３の近傍に配置されている。この近傍とは、例えば、軸線Ａ１３から貫通穴１６の軸線Ａ１６の距離（つまり、仮想円ＰＣの半径）が軸線Ａ１６から底板１５の外周縁１５ａまでの距離よりも短いものとして定義してよい。貫通穴１６の内径は、細孔である。例えば、貫通穴１６の内径は、底板１５の外径よりも小さい。さらに、複数の貫通穴１６の内径は、仮想円ＰＣの直径よりも小さい。
【００２４】
培地受入部１４には、培地導入管７が接続されている。具体的には、培地導入管７の端部には、チューブ１７の一方の端部が差し込まれている。そして、チューブ１７の多方の端部は、貫通穴１６に差し込まれている。
【００２５】
以下、槽本体１３の内部における培地Ｍの流れについて比較例と対比しつ説明する。
【００２６】
図３の（ａ）部は、比較例に係る細胞培養槽１００における培地Ｍの流れを示す。細胞培養槽１００は、培地受入部１０１を有する。培地受入部１０１は、軸線Ａ１００に対して直交する方向から培地Ｍを受け入れる（矢印Ｔ１参照）。このような構成によれば、培地Ｍが細胞培養槽１００の下部から上部へ向かう流れと共に、軸線Ａ１００のまわりに培地Ｍが旋回する流れ（矢印Ｔ２参照）も生じる。このような構成によって、旋回上昇流を利用して細胞塊Ｃ１００を浮遊させる手法によれば、細胞塊Ｃ１００同士が融合しやすくなる。旋回流によって培地Ｍよりも比重の高い細胞塊Ｃ１００が旋回流に起因する遠心力によって槽本体の壁面に局在し、局所的に細胞塊Ｃ１００の存在密度が上昇するので、融合を促進しやすくなるためである。
【００２７】
より詳細には、旋回流によって、培地Ｍに浮遊する細胞塊Ｃ１００も軸線Ａ１００の周りに公転する。この公転によれば、細胞塊Ｃ１００に遠心力Ｆが作用するので、細胞塊Ｃ１００は、細胞培養槽１００の壁面１００ａに向けて移動する。その結果、細胞培養槽１００の半径方向に沿って、細胞塊Ｃ１００の分布に偏りが生じる。具体的には、細胞培養槽１００の壁面１００ａに近づくほど、細胞塊Ｃ１００の存在密度が高くなる。つまり、細胞塊Ｃ１００は、細胞培養槽１００の壁面１００ａに偏在する。
【００２８】
壁面１００ａの近傍では、培地Ｍの上昇流成分が作用している。一方、細胞塊Ｃ１００は、その大きさに応じた沈降速度を有する。そうすると、培地Ｍの上昇速度と細胞塊Ｃ１００の沈降速度とが釣り合ってしまうと、細胞塊Ｃ１００は、その位置において浮遊し続けることになる。その結果、細胞培養槽１００の壁面近傍では、細胞塊Ｃ１００の存在密度が高まる要因（遠心力）がある一方で、存在密度を低くする要因が存在しないために、細胞塊Ｃ１００の存在密度が高まり続け、ある存在密度で飽和する可能性がある。細胞塊Ｃ１００の存在密度が高くなると、細胞塊Ｃ１００同士の融合が促進されやすくなるので、細胞塊Ｃ１００の大きさが目標としている大きさよりも大きくなりすぎる場合が生じ得る。さらに、細胞の増殖も抑制される（死滅する細胞が多くなり，みかけの増殖速度が低下する）ので、所望数の細胞が得られなくなることもあり得る。
【００２９】
図３の（ｂ）部は、細胞培養槽２における培地Ｍの流れを示す。細胞培養槽２は、底部に設けられた培地受入部１４の複数の貫通穴１６（図２参照）から培地Ｍを受け入れる。この貫通穴１６は、軸線Ａ１３に沿って延びている。その結果、貫通穴１６から排出される培地Ｍの流れる方向は、軸線Ａ１３に沿う。そうすると、培地Ｍの流れは、軸線Ａ１３に交差する成分を実質的に含まないので、培地Ｍは、槽本体１３の軸線Ａ１３に沿って下方から上方に向かって流れる。換言すると、培地Ｍの流れは、旋回成分を実質的に含まない。培地Ｍは、槽本体１３の底部から上部まで移動する（矢印Ｓ１参照）。次に、培地Ｍは、槽本体１３の軸線Ａ１３の側から槽本体１３の壁面１３ｃに向かって移動する（矢印Ｓ２参照）。この培地Ｍの流れを外向きの流れと呼ぶ。そして、壁面１３ｃに達した培地Ｍは、壁面１３ｃに沿って下方に移動する（矢印Ｓ３参照）。槽本体１３の上方では、上昇流（矢印Ｓ１）が生じている領域と、下降流（矢印Ｓ３）が生じている領域とが十分に離れているので、上昇流と下降流とが存在し得る。一方、槽本体１３の形状は、逆円錐状である。従って、槽本体１３の下方では、上方と比べて、上昇流が生じている領域と下降流が生じている領域とが近くなる。その結果、上昇流が生じている領域と下降流が生じている領域との距離が所定距離よりも小さくなると、上昇流が支配的となる。従って、当該位置（領域Ｓ４参照）において、培地Ｍの流れは、再び上昇流に転ずる。
【００３０】
細胞培養槽２の内部では、培地Ｍの循環流が生じている。換言すると、細胞培養槽２の内部にでは、培地Ｍがよどみにくい状態となっている。その結果、培地Ｍに含まれる細胞及び細胞塊Ｃの存在密度が遍在することが抑制される。つまり、細胞培養槽２における細胞及び細胞塊Ｃの存在密度を均一に近づけることができる。
【００３１】
このような細胞塊Ｃの分布によれば、過剰な細胞塊Ｃ同士の融合が抑制されるので、細胞塊Ｃの大きさを所望の大きさに制御することができる。そして、細胞塊Ｃの大きさを制御することにより、細胞の増殖の低下が抑制されるので、細胞の増殖を好適に行うことができる。つまり、死滅する細胞が少なくなるので見かけの細胞の増殖数を増加させることができる。
【００３２】
要するに、この槽本体１３の底部には、培地受入部１４が設けられている。この培地受入部１４が含む貫通穴１６は、槽本体１３の軸線Ａ１３に対して平行な軸線Ａ１６に沿って延びる。その結果、ポンプ１０から送り込まれた培地Ｍは、培地受入部１４の貫通穴１６を通ると、軸線Ａ１３の方向に沿って槽本体１３の内部に排出される。つまり、培地受入部１４は、上昇成分を有する流れを生じさせるのであり、旋回成分を有する流れは生じさせない。その結果、培地Ｍは、槽本体１３の内部を上昇した後に、培養槽上部付近において槽本体１３の壁面１３ｃに向かって流れ、その後、壁面１３ｃに沿って下降する。そして、培地Ｍは、再び槽本体１３の内部を上昇する。つまり、槽本体１３の内部において、培地Ｍは、上昇と下降とを含む対流を生じる。その結果、培地Ｍに含まれる細胞及び細胞塊Ｃも培地Ｍの流れに応じて、槽本体１３の中央付近における上昇と壁面１３ｃの近傍における下降とを繰り返す。従って、細胞塊Ｃの滞留の発生が抑制されるので、滞留に起因する細胞の過剰な融合などを抑制することが可能になる。従って、細胞培養装置１は、所望の培養性能を得ることができる。
【００３３】
また、貫通穴１６の軸線Ａ１６から軸線Ａ１３までの長さは、貫通穴１６の軸線Ａ１６から槽本体１３の底部の外周縁までの長さよりも短い。この構成によれば、槽本体１３の軸線Ａ１３の付近に培地Ｍの上昇流を発生させることができる。
【００３４】
また、細胞培養槽２において、軸線Ａ１３は、槽本体１３の中心軸線であり、培地受入部１４は、複数の貫通穴１６を含む。複数の貫通穴１６は、軸線Ａ１３のまわりに等間隔に配置される。この構成によれば、所望の上昇流を複数の貫通穴１６から排出される培地Ｍの流れによって形成する。貫通穴１６を単数から複数にすることにより、流速を分散することができ、ストレスを低減することができる。また貫通穴１６を軸線Ａ１３のまわりに等間隔に配置することにより、偏りのない流れを形成することができる。その結果、細胞及び細胞塊Ｃに与えるストレスを低減し、かつ融合を抑制することができる。
【００３５】
本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限られない。
【００３６】
例えば、培地受入部は、上記のような貫通穴１６の配置に限定されない。貫通穴１６の数及び配置は、外向きの対流を生じさせることが可能なものであればよい。例えば、培地受入部１４Ａ（図４の（ａ）部参照）は、２個の貫通穴１６を有するものであってもよい。培地受入部１４Ｂ（図４の（ｂ）部参照）は、３個の貫通穴１６を有するものであってもよい。培地受入部１４Ｃ（図４の（ｃ）部参照）は、６個の貫通穴１６を有するものであってもよい。また、培地受入部１４Ｄ（図４の（ｄ）部参照）は、１個の貫通穴１６を有するものであってもよい。貫通穴１６が１個の場合には、貫通穴１６の軸線Ａ１６は、槽本体１３の軸線Ａ１３と重複していてもよい。
【００３７】
また、貫通穴１６は、軸線Ａ１３からずれた位置に配置されると共に、軸線Ａ１３に対して非対称とされてもよい。このような配置であっても、培地Ｍの上昇と下降とを含む対流を生じさせることが可能である。
【００３８】
＜実験例１、２、比較例１、２＞
細胞培養装置１の効果を確認する実験を行った。実験例１及び比較例１では、細胞塊の大きさの相違について確認した。実験例２及び比較例２では、培養された細胞の数について確認した。実験例１、２と比較例１、２との違いは、旋回流の有無であり、そのほかの条件は共通とした。そして、実験例１に用いた細胞培養装置１は、培地Ｍが上昇流のみを含むものとし、旋回流は実質的含まないものとした。比較例１の実験に用いた細胞培養装置は、培地Ｍが上昇流と旋回流を含むものとした。なお、主な条件は以下のとおりである。
細胞の種類：ヒトｉＰＳ細胞。
培地の種類：ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社製）。
単位時間当たりの流量：１００ｍＬ／ｍｉｎ以下。
処理時間：１２０時間。
【００３９】
図５は、比較例１の結果を示す模式図である。図５は、上記処理時間後の培地Ｍに含まれる細胞塊Ｃ１００を撮影対象とした画像であって、当該画像に含まれる細胞塊Ｃ１００のエッジを抽出したものである。図５に示すように、培地Ｍが旋回流を含む場合、細胞塊Ｃ１００の大きさは、５００マイクロメートル程度であった。
【００４０】
図６は、実験例１の結果を示す模式図である。図６も図５と同様に、細胞塊Ｃのエッジを抽出したものである。図５に示すように、培地Ｍが旋回流を含まない場合、細胞塊Ｃの大きさは、２００マイクロメートル程度であった。
【００４１】
従って、培地Ｍに旋回流を生じさせない細胞培養装置１によれば、細胞塊Ｃの意図しない融合が抑制できることがわかった。
【００４２】
また、図７のグラフは、実験例２及び比較例２の結果を示す。横軸は、培養日数を示す。縦軸は、細胞数の相対値を示す。つまり、縦軸は、実験開始時の細胞数を１とした場合の各日数における細胞数の相対値である。さらに、グラフＧ７ａは、実験例２の結果を示す。グラフＧ７ｂは、比較例２の結果を示す。グラフＧ７ａ、Ｇ７ｂが示すように、実験例２に係る細胞培養装置は、比較例２に係る細胞培養装置に比べて、培養日数が５日であるとき細胞数がおよそ３倍となることがわかった。つまり、細胞塊の過剰な融合が抑制された結果、細胞の数を好適に増加させ得ることがわかった。
【符号の説明】
【００４３】
１  細胞培養装置
２  細胞培養槽
３  曝気ユニット
４  廃液ユニット
６  培地流出管
７  培地導入管
８  培地排出管
９  蓋
１０  ポンプ
１０ａ  コントローラ（制御部）
１１  ガス供給管
１２  培地供給管
１３  槽本体
１３ａ  上端開口
１３ｂ  下端開口
１３ｃ  壁面
１４，１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ  培地受入部
１５  底板
１５ａ  外周縁
１６  貫通穴
１７  チューブ
１００  細胞培養槽
１０１  培地受入部
１００ａ  壁面
Ａ１３  軸線（第１軸線）
Ａ１６  軸線（第２軸線）
Ｃ  細胞塊
Ｆ  遠心力
Ｍ  培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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