(57)【要約】      （修正有）【課題】概日リズムにおいて重要な反応を担うメラノプシンを標的とした機能性核酸分子の提供。【解決手段】（ａ）特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、メラノプシンに結合するポリヌクレオチドを含み、メラノプシンに特異的に結合する核酸分子、並びに核酸分子とメラノプシンとを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンを検出することを特徴とするメラノプシンの検出方法、及びメラノプシンの検出に用いられる検査キット。【選択図】図３
2020178615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、
メラノプシンに特異的に結合することを特徴とする核酸分子。
（ａ）配列番号１〜３２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、メラノプシンに結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
概日リズムの位相を変化させる機能を有する請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
眼球のメラノプシン発現網膜神経節細胞に作用し、当該細胞からＳＣＮを刺激することにより、概日リズムの位相を変化させる請求項１又は２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の前記核酸分子とメラノプシンとを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンを検出することを特徴とするメラノプシンの検出方法。
【請求項５】
前記接触工程は、前記核酸分子が固定化された担体を用いて、前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させるものであることを特徴とする請求項４に記載のメラノプシンの検出方法。
【請求項６】
前記核酸分子は標識物質で標識されており、前記接触工程において、標識された前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させるものであることを特徴とする請求項４又は５のいずれか一項に記載のメラノプシンの検出方法。
【請求項７】
メラノプシンの検出に用いられる検査キットであって、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の核酸分子が固定化された担体を備えており、その担体をメラノプシンに接触させることで、前記核酸分子をメラノプシンに結合させることを特徴とするメラノプシン検出キット。
【請求項８】
メラノプシンの検出に用いられる検出試薬であって、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の核酸分子が標識物質で標識された標識核酸分子を含んでおり、前記標識核酸分子をメラノプシンに接触させることで、前記標識核酸分子をメラノプシンに結合させることを特徴とするメラノプシン検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目の中にある網膜にあるメラノプシンに作用し、メラノプシンを介して概日リズムを制御する核酸分子に関する。以下、メラノプシンアプタマーともいう。
【背景技術】
【０００２】
概日リズムは一般的に体内時計ともいわれ、睡眠リズム、ホルモンの分泌等を制御している。概日リズムの中枢時計は視交叉上核にあり、24時間/1日に同調するためには光が最も重要な因子である。
【０００３】
近年、パソコンや携帯電話などの機器使用の広がり、それに伴いVisual Dsiplay Terminals（VDT）作業が大幅に増加している。VDTにはLEDが用いられることが多く、作業者は大量のブルーライトを受容している。夜間も昼間と同等の光環境下にさらされ、概日リズムは撹乱され、これに伴う疾病（睡眠障害、肥満、高血圧、高血糖、癌、うつ、エイジング等）の増加が深刻化している。このような状況を背景に、ブルーライトと概日リズムの関連性や概日リズムが関与する生理現象の研究が精力的に行われている。
【０００４】
概日リズムの撹乱による疾病、特に睡眠障害（睡眠相前進症候群、睡眠相後退症候群など）を治療するためには青色光受容体であるメラノプシンに作用し、概日リズムの位相をずらすことが考えられる。つまりメラノプシンの光受容活性を制御することによって、概日リズムをコントロールし、外界周期とうまく同調させることができれば睡眠障害を防ぐ一法になる可能がある。非特許文献には、メラノプシンの機能を薬理学的に制御することを目的に、化学物質のスクリーニングを行い、メラノプシンに特異的に作用する化合物を見出したことが記載されているが実用化されてはいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kenneth A Jonesら、9、630-635（2013）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
メラノプシンを検出するに当たって、抗メラノプシン抗体を作製することが考えられる。例えば、メラノプシンを発現している細胞において、抗メラノプシン抗体で該細胞を染色することが行われている（科学研究費助成事業  研究成果報告書  課題番号23247011）。しかしながら、抗体の場合、タンパク質であることに起因し、抗原性を有する可能性が極めて高く、また温度、ｐH等により安定性を欠くなどの欠点がある。
【０００７】
また、睡眠障害を治療するためには、直接、全身の概日リズムを統御する視交叉上核（ＳＣＮ）を刺激し、概日リズムの位相を修正することが考えられる。しかしながら、ＳＣＮは視床下部の前方、視交叉の背側に位置するため、外部から直接刺激することはできない。このことから、眼球のメラノプシン発現網膜神経節細胞からＳＣＮを刺激することにより、位相のずれを調節することが最も有効だと考えられるが、その方法は開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
タンパク質である抗メラノプシン抗体は、抗原性を有する可能性が極めて高く、また温度、ｐH等により安定性を欠くなどの欠点を有している。これらの欠点を克服するために発明者らは、抗原性が少ない核酸分子に着目し、温度、ｐＨ等に対し安定なＤＮＡからなるメラノプシンアプタマーを提供することを目的に発明をなした。
【０００９】
該アプタマーは、下記（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、
メラノプシンに特異的に結合することを特徴とする核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜３２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、メラノプシンに結合するポリヌクレオチド
【００１０】
該アプタマーは、概日リズムの位相を変化させる機能を有する請求項１に記載の核酸分子である。
【００１１】
該アプタマーは、眼球のメラノプシン発現網膜神経節細胞に作用し、当該細胞からＳＣＮを刺激することにより、概日リズムの位相を変化させる請求項１又は２のいずれか一項に記載の核酸分子である。
【００１２】
請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の前記核酸分子とメラノプシンとを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンを検出することを特徴とするメラノプシンの検出方法である。
【００１３】
前記接触工程は、前記核酸分子が固定化された担体を用いて、前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させるものであることを特徴とする請求項４に記載のメラノプシンの検出方法である。
【００１４】
前記核酸分子は標識物質で標識されており、前記接触工程において、標識された前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させるものであることを特徴とする請求項４又は５のいずれか一項に記載のメラノプシンの検出方法である。
【００１５】
メラノプシンの検出に用いられる検査キットであって、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の核酸分子が固定化された担体を備えており、その担体をメラノプシンに接触させることで、前記核酸分子をメラノプシンに結合させることを特徴とするメラノプシン検出キットである。
【００１６】
メラノプシンの検出に用いられる検出試薬であって、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の核酸分子が標識物質で標識された標識核酸分子を含んでおり、前記標識核酸分子をメラノプシンに接触させることで、前記標識核酸分子をメラノプシンに結合させることを特徴とするメラノプシン検出キットである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の核酸分子によれば、メラノプシンに特異的に結合するという効果を奏する。本核酸分子は、ＤＮＡであることから、大量合成が容易であり、さらに化学修飾が容易という効果を奏する。また、ｐＨ等の変化に対しても生体内で安定であり、分子量が小さいことから、免疫原性が低く、抗メラノプシン抗体よりも抗原性が少ないという効果を奏する。
【００１８】
前記核酸分子は、眼球のメラノプシン発現網膜神経節細胞に作用し、当該細胞からＳＣＮを刺激することにより、概日リズムの位相を変化させるという効果を奏する。
【００１９】
本核酸分子はメラノプシンと特異的に結合することから、本核酸分子とメラノプシンを接触させる接触工程を含み、その接触工程において本核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンの検出を可能にするという効果を奏する。
【００２０】
前記接触工程は、前記核酸分子が固定化された担体を用いて、前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンの検出を可能にするという効果を奏する。
【００２１】
前記核酸分子は標識物質で標識されており、前記接触工程において、標識された前記核酸分子とメラノプシンを接触させ、前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンを特異的に検出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Cell-SELEX法の概要
【図２】メラノプシンアプタマーのメラノプシン発現細胞への吸着
【図３】メラノプシンアプタマーによる位相のずれ
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一本鎖ＤＮＡメラノプシンアプタマーは、塩基配列によって多様の高次構造を形成し、標的タンパク質に特異的に結合する。
【００２４】
請求項５に記載のメラノプシンの検出方法は、核酸分子とメラノプシンとを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子とメラノプシンとを結合させることにより、メラノプシンを検出するものである。
【００２５】
前記核酸分子において、前記（ａ）、（ｂ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【００２６】
前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。なお、後者の場合、リボヌクレオチド残基の数は、「１もしくは数個」に制限されるものではなく、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００２７】
前記核酸分子は、１もしくは数個の修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。なお、修飾化ヌクレオチド残基の含有数は「１もしくは数個」に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドであれば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００２８】
前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化デオキシリボヌクレオチド残基及び修飾化リボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、デオキシリボース残基又はリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位及び／又は４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、又は、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位及び／又は４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００２９】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）及びウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基及び改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔ又はｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）又はウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔ及びｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００３０】
前記核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００３１】
前記核酸分子は、例えば、前記（ａ）、（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、前記核酸分子は、前記（ａ）、（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。その数は特に制限されるものではなく、例えば、２以上であり、好ましくは２〜２０であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは、２又は３である。かかる２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、これら複数のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれが直接的に連結してもよい。
【００３２】
加えて上述のポリヌクレオチドが２つ以上含まれる場合は、例えば、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。また、かかる複数のポリヌクレオチドは、例えば、リンカー又は付加配列等のいずれかまたは双方を有してもよい。
【００３３】
前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００３４】
前記リンカー数は、前記核酸分子に含まれる複数のポリヌクレオチド数によるが、特に制限されない。さらに前記リンカーの塩基数も、特に制限されない。例えば、前記リンカーの塩基数は、１〜２００塩基であり、好ましくは１〜２０塩基であり、より好ましくは１〜１０塩基であり、さらに好ましくは１〜５塩基である。
【００３５】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、配列番号１〜３２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３６】
a3（配列番号１）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGAATCACTGGGCCCATGACCCCATGCAATACAAGAAGACTCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
b4（配列番号２）
AAAAGGGGAATTCGGATCCCGACCCGAAGGAGCGGTGGATAACCCCACCAAGATACGTCCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
c1（配列番号３）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGAAGAGGGTGATCGTAATAACGCGTAAAACGAGACTATCTCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
c2（配列番号４）
AAAAGGGGAATTCGGATCCTTCACCGATACGGCTCCCTTGGCCAGACAGGAAAAAATAACTGCAGAAGCTTCCGAAAA
d2（配列番号５）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGCACGGCGCGGTAGGCATGTCACTACCAGAAACTAGGCCCCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
d4（配列番号６）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGAACTACCCTACAAACCAAACAAGGCGCACGATCGATATACTGCAGAAGCTTCCGAAAA
e1（配列番号７）
AAAAGGGGAATTCGGATCCCCGCACACGTGGAGCCAAGTCGAGTTTAATTCCCTATCGCCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
e3（配列番号８）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGCCCCGGAGTGCGGCCTGAAAACCACCATCTATAAGCCAACTGCAGAAGCTTCCGAAAA
g1（配列番号９）
AAAAGGGGAATTCGGATCCCCGATGTAGAAATCCAACACCGCAGTAGAGCATTGCCGACCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
g2（配列番号１０）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGAATTCCAGCACAGACCACCCTTGTCGAACCCAGCAACTCGCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
h4（配列番号１１）
AAAAGGGGAATTCGGATCCGGCCGTCACGCCCCGGCTGCGAAGCCATCAAGCCTCCATACTGCAGAAGCTTCCGAAAA
i4（配列番号１２）
AAAAGGGGAATTCGGATCCAGGATAATGAACCTTCGCCAGACCTACCCTAACAAGTCCCACTGCAGAAGCTTCCGAAAA
j1（配列番号１３）
AAAAGGGGAATTCGGATCCCCCGATTGGACAACTCAAACCATCATCCGAACCAGTACGTCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
j3（配列番号１４）
AAAAGGGGAATTCGGATCCCCCAAATCCATGAAAGGGGGAAACACAATCTTACGCCGCGCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
k3（配列番号１５）
AAAAGGGGAATTCGGATCCAGCGTACGCCCAGGCCGGANTGGGACCGCAAACCCATTCGCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
alpha1（配列番号１６）
AAAAGGGGAATTCGGATCCAGAATGACCTAACTTCTCGCCCAGGCGTGCACAATCCATCCTGCAGAAGCTTCCGAAAA
a3-0（配列番号１７）
GAATCACTGGGCCCATGACCCCATGCAATACAAGAAGACT
b4-0（配列番号１８）
CGACCCGAAGGAGCGGTGGATAACCCCACCAAGATACGTC
c1-0（配列番号１９）
GAAGAGGGTGATCGTAATAACGCGTAAAACGAGACTATCT
c2-0（配列番号２０）
TTCACCGATACGGCTCCCTTGGCCAGACAGGAAAAAATAA
d2-0（配列番号２１）
GCACGGCGCGGTAGGCATGTCACTACCAGAAACTAGGCCC
d4（配列番号２２）
GAACTACCCTACAAACCAAACAAGGCGCACGATCGATATA
e1-0（配列番号２３）
CCGCACACGTGGAGCCAAGTCGAGTTTAATTCCCTATCGC
e3-0（配列番号２４）
GCCCCGGAGTGCGGCCTGAAAACCACCATCTATAAGCCAA
g1-0（配列番号２５）
CCGATGTAGAAATCCAACACCGCAGTAGAGCATTGCCGAC
g2-0（配列番号２６）
GAATTCCAGCACAGACCACCCTTGTCGAACCCAGCAACTCG
h4-0（配列番号２７）
GGCCGTCACGCCCCGGCTGCGAAGCCATCAAGCCTCCATA
i4-0（配列番号２８）
AGGATAATGAACCTTCGCCAGACCTACCCTAACAAGTCCCA
j1-0（配列番号２９）
CCCGATTGGACAACTCAAACCATCATCCGAACCAGTACGT
j3-0（配列番号３０）
CCCAAATCCATGAAAGGGGGAAACACAATCTTACGCCGCG
k3-0（配列番号３１）
AGCGTACGCCCAGGCCGGANTGGGACCGCAAACCCATTCG
alpha1-0（配列番号３２）
AGAATGACCTAACTTCTCGCCCAGGCGTGCACAATCCATC
【００３７】
前記（ｂ）において、「同一性」を有する塩基配列とは、メラノプシンに結合する能力を消失しない範囲で改変された塩基配列をいう。例えば、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるものである。
【００３８】
さらに、「同一性」を有する塩基配列とは、例えば、前記（a）のいずれかの塩基配列において、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、非常に好ましくは１００％の塩基配列が同一である塩基配列をいう。この同一性は、例えば、解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス社製）等を用いて算出できる。
【００３９】
なお、配列番号１７〜３２のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１６のポリヌクレオチドの配列からフォワードプライマー（AAAAGGGGAATTCGGATCC）とリバースプライマー（CTGCAGAAGCTTCCGAAAA）の配列を除いたポリヌクレオチドである。
【００４０】
前記核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造及びループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造及び／又はバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００４１】
前記核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記(a）、（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記(a）、（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。前記核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記(a）、（ｂ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造及びループ構造を形成していることが好ましい。
【００４２】
前記核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００４３】
前記核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ蛍光色素（以下、ＦＡＭ）、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、前記核酸分子に結合していればよく、結合箇所の制限はない。結合箇所は、好ましくは、５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していればよく、より好ましくは５’末端に結合している。
【００４４】
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
【００４５】
前記核酸分子及びそれを修飾した核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
【００４６】
前記検出方法は、前述のように、メラノプシンの検出方法であって、試料と前記核酸分子とを接触させ、前記試料中のメラノプシンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のメラノプシンを検出する検出工程を含むことを特徴とする。前記検出方法は、前記核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程及び条件等は、特に制限されない。
【００４７】
本発明によれば、前記核酸分子が、メラノプシンに特異的に結合することから、例えば、メラノプシンと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のメラノプシンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のメラノプシンの有無又はメラノプシンの量を分析可能であることから、定性又は定量も可能である。
【００４８】
前記核酸分子は、眼球のメラノプシン発現網膜神経節細胞に作用し、当該細胞からＳＣＮを刺激することにより、概日リズムの位相を変化させることが可能となる。
【００４９】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中メラノプシンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、メラノプシンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のメラノプシンの有無又は量を分析する工程を含む。
【００５０】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜４０℃であり、好ましくは１８〜３７℃であり、より好ましくは３５〜３７℃接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００５１】
前記接触工程において、前記核酸分子は、未固定の遊離した核酸分子でもよい。その場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させることができる。前記核酸分子が、例えば、前記標識物質を有していれば、メラノプシンと結合した前記核酸分子を介して、メラノプシンの検出を可能とする極めて有用なツールとなる。
【００５２】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよい。なお、前記核酸分子は、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。
【００５３】
前記核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用する場合、前記核酸分子の５’末端及び３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００５４】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のメラノプシンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のメラノプシンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のメラノプシンの量を分析（定量）できる。
【００５５】
メラノプシンと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、表面プラズモン共鳴分析法、蛍光偏光法等があげられる。
【００５６】
［検出試薬］
前記接触工程において、前記核酸分子が未固定の遊離した核酸分子である場合、容器等の中で混合することで、前記試料と接触させることができる。前記核酸分子が、前記標識物質を有している場合、メラノプシンに結合した前記標識物質に基づき、前記標識物質量を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、吸光度計等を用い観測、測定することでメラノプシンを検出できる。本検出試薬は、前記核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記標識物質は、前記核酸分子に結合していればよく、結合箇所の制限はない。結合箇所は、好ましくは、５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していればよく、より好ましくは５’末端に結合している。
【００５７】
［検出キット］
また、メラノプシンの検出するために、前記核酸分子を用いた検出手段をキット化してもよい。検出キットは、前記核酸分子を含むことを特徴とする。前記検出キットは、前記核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
【実施例】
【００５８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００５９】
試験管内進化（以下、Cell-SELEX）法により、メラノプシンを識別できる核酸分子（以下、メラノプシンアプタマーともいう）の選別を行った。Cell-SELEX法に用いる1本鎖ＤＮＡ(ssＤＮＡ)ライブラリーの調整及びメラノプシン発現細胞は以下の方法で調整した。
【００６０】
［ssＤＮＡライブラリーの調製とアプタマーの増幅］
Cell-SELEX法においてssＤＮＡライブラリーの調製およびCell-SELEX法により得られたアプタマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により増幅した。
【００６１】
ssＤＮＡライブラリー（5’-AAAAGGGGAATTCGGATCC-N40-CTGCAGAAGCTTCCGAAAA-3’）を10 pmolを調製(北海道システムサイエンス)し、定法に従い、非対称PCR法にて増幅した。N40は、ランダムに配置された40塩基配列を示す。
【００６２】
［メラノプシン発現細胞の調製］
細胞培養容器（以下、ディッシュ）にまいた副腎髄質由来の褐色細胞腫PC12細胞に、メラノプシン遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ（以下、メラノプシンプラスミド）をリポフェクション法により細胞に導入した。なお、メラノプシンプラスミドを導入した細胞は、強制的にメラノプシンを発現する。
【００６３】
本発明で用いたリポフェクション法について、以下に示す。無血清培地OPTI-MEM I(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、メラノプシンプラスミドを添加した。また、無血清培地OPTI-MEM Iに、リポフェクト試薬Lipofectamine2000 (Invitrogen社製品)を加え、常温で5分間静置した。それぞれの溶液を混合し20分間室温で静置してメラノプシンプラスミドを含むリポソームを調製しリポソーム液とした。直径35 mmのディッシュに2.5×105細胞になるようにPC12細胞をまき、ほぼ24時間培養した細胞にリポソーム液を加え、37℃、5%ＣＯ２、湿度95%の条件下で6時間インキュベートし、メラノプシンプラスミドを有し、メラノプシンを強制発現するPC12細胞（ポジティブ細胞）を調製した。6時間後に新しい培地と交換し、インキュベートを開始してから24時間経過後から実験に使用した。また、メラノプシン遺伝子をリポフェクションしていないメラノプシン非発現PC12細胞（以下、ネガティブPC12細胞）を準備した。
【００６４】
［Cell-SELEX法］
上記で調製したメラノプシンを強制発現させたPC12細胞とネガティブPC12細胞を用い、Cell-SELEX）法によりメラノプシン特異的アプタマーを取得した。ネガティブPC12細胞は、Cell-SELEX法において、非特異的結合を排除するために用いた。
【００６５】
培養したネガティブPC12細胞をピペッティング操作に底面がらはがし、遠心分離(2000rpm、3分)で回収する。上清を捨てた後に、3mlのリン酸緩衝生理食塩水（以下、PBS）に懸濁し、新しい60mmディッシュに移した。1015〜17分子のssＤＮＡライブラリーを95℃で5分間処理し、冷却後、60mmディッシュ内のネガティブPC12細胞に加え、振とうしながら1時間インキュベートした。その後、60mmディッシュ内の溶液と細胞を回収し、遠心分離(2000rpm、3分)行い、上清（以下、ネガティブ上清）を分離し、次のCell-SELEX法の工程に供した。
【００６６】
次に、ポジティブ細胞を培養し、ピペッティングによりディッシュ底面から細胞をはがした細胞と培養液を遠心分離(2000rpm、3分)して、培養液を除去した。残った細胞ペレットを3mlのPBSに懸濁して新しいディッシュに移した。
【００６７】
ネガティブ上清を95℃で5分間処理した後、ポジティブ細胞ディッシュに加え、浸透機で揺らしながら1時間インキュベートした。次に、そのディッシュから細胞とPBSを回収し、遠心分離して上清を除去した。残った細胞ペレットに対し、細胞濃度が1×105細胞/mlとなるようにPBSを加えて懸濁した。
【００６８】
懸濁した細胞には、特異的に細胞表面にあるメラノプシンに結合したアプタマーが付着していることから、細胞を含んだまま上記記載のPCR法でメラノプシンに結合したアプタマーの増幅を行った。なお、PCRの工程中で、細胞は消失した。得られたアプタマーの濃度は12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、PAGE）で確認した。図１のCell-SELEX法を8回繰り返し、メラノプシンに特異性のあるアプタマーを得た（表１）。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
得られたメラノプシンに特異性のあるアプタマーは、TAクローニングキット（タカラバイオ社製）の実験手順に従い、Tベクターに挿入した。
【００７１】
Tベクターを定法に従い大腸菌に導入し、大腸菌を培養することにより、メラノプシンアプタマーを含むTベクターを調製した。なお該Tベクターの回収・精製しには、NucleoSpin（マッハライ・ナーゲル社登録商標） Plasmid QuickPure(タカラバイオ社製)を用いた。
【００７２】
[メラノプシン特異的アプタマーのフルオレセインイソチオシアネート標識]
Tベクターに組み込まれたメラノプシン特異的アプタマーを鋳型とし、フルオレセインイソチオシアネート（以下、FITC）を標識したフォワードプライマーを用いた非対称PCR法を行い、FITC標識されたメラノプシン特異的アプタマーを得た。
【００７３】
[メラノプシン特異的アプタマーとメラノプシンとの結合検証]
単離したメラノプシンアプタマー候補のメラノプシン発現細胞に対する結合親和力を評価するために、FACSを用いて、メラノプシン発現細胞に結合した蛍光標識メラノプシンアプタマー量を定量した。本研究では、蛍光物質フルオレセイン（FITC）で標識したアプタマーをメラノプシンを発現させたPC12細胞に吸着させ、その結合量を定量することで、Cell-SELEX法を用いたメラノプシン特異的なアプタマーのセレクションが適当に行われたかを検証した。
使用するPC12細胞はあらかじめ60mm ディッシュに5×105細胞/ディッシュで継代しておき、48時間後にメラノプシンプラスミドをトランスフェクション法により導入し、メラノプシンを発現させた。導入してから48時間後にFITC標識アプタマーを終濃度20μｇ/mlになるようメラノプシン発現PC12細胞に添加し、ディッシュを振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。その後、2000rpmで3分間遠心することで細胞を回収し、PBS(-)5mlで洗浄し、再び遠心で細胞を回収した。最後にPBS1mlに細胞を懸濁し、FACSに供した。FITCの励起波長(488nm)でFITCを励起し、メラノプシンを発現している細胞に結合したFITC標識メラノプシンアプタマー量を定量した。
【００７４】
図２は、横軸にFITC量、縦軸は細胞数を表している。対照は、メラノプシン非発現細胞かつFITCで標識したアプタマー添加なしのもので、図２上のようになった。図２下は、メラノプシン発現「なし」、または「あり」の場合を示している。例えばメラノプシンアプタマーa3を吸着させた場合、発現「なし」の場合は、図２上と同様なグラフとなるが、「あり」の場合は、a3が発現したメラノプシンに吸着するため、FITC量が増加し、グラフの右側に点がシフトした。本法により、本発明のアプタマーの吸着度を測定した。
【００７５】
図２に示すように、対照である1cyを吸着させた場合は、メラノプシン発現の有無に関係なく１％以下の結合であったが、メラノプシンアプタマーa3の場合は、非発現細胞に対する結合量（８．９８％）に対し、メラノプシン発現細胞に対する結合量は、約2倍も１６．１８％であった。
【００７６】
[Per2リズム位相シフトアッセイ］
単離したメラノプシンアプタマーが、膜蛋白メラノプシンに作用し、細胞の概日リズムの位相を変化させる機能を有することを検証する実験を行った。
【００７７】
時計遺伝子Per2の24時間周期の転写リズムをコメツキムシルシフェラーゼによる生物発光現象を利用してリアルタイム計測できるPer2-dSLG細胞株を用いた。本細胞株は、Per2のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ酵素をコードした遺伝子dSLGを連結したマウス繊維芽NIH3T3細胞株である。
【００７８】
Per2-dSLG細胞を35mmディッシュに1.5×105cell/ディッシュの細胞密度で細胞をまき、高グルコースDMEM培地で37℃、ＣＯ2濃度5%にて培養した。培養48時間後に、メラノプシンプラスミド（2.5μg/ディッシュ）をリポフェクション法によりPer2-dSLG細胞に導入し、メラノプシンを一過的に細胞表面に強制発現させた。
【００７９】
すべてのPer2-dSLG細胞内のルシフェラーゼ転写リズムを同調させるために、Per2上流のプロモーター遺伝子を活性化するcAMP誘導剤であるフォルスコリンを、メラノプシンを導入してから24時間後に、終濃度10μMになるように培地に添加しPer2-dSLG細胞を37℃で、30分間インキュベートした。フォルスコリン処理後、PBSで細胞を洗浄し、フォルスコリンを含まない新しい培地と共に終濃度0.1mMになるようにホタルルシフェリンポタシウム塩の基質を培地に加えた。
【００８０】
ディッシュの全細胞の発光測定は、光電子増倍管（以下、PMT）を搭載したルミノメーター(Kronos,ATTO)で測定した。ルミノメーターにセットし、37℃、5%ＣＯ２の条件で細胞を培養しながら3分ごとに10秒間の露光時間で、PMTにて、発光値をリアルタイム計測で、1週間ほど連続計測した。
【００８１】
測定開始から3日目の、発光振動をコサインカーブでフィッティングしたときに、1周期を24としたときの22のタイミングで、メラノプシンアプタマー候補を10μg/ディッシュで添加し、その直後に青色LEDライト(エーモン工業社製)を用いて30分間光刺激を行い、メラノプシンを光により活性化した（図３）。
【００８２】
光刺激後、4日目までルミノメーターによるディッシュの発光リズム測定を継続し、光刺激後2つ目と3つ目のリズムのピークから位相を算出し、各メラノプシンアプタマーで処理した細胞の発光(Per2-SLG)リズム位相比較を行った（図３）。
【００８３】
このようなリズム位相比較を行った結果、例えばメラノプシンアプタマーa3、c1、h4がリズム位相を前進させ、30分間光刺激を行わない場合は、メラノプシンアプタマーa3、i4がリズム位相を前進させ、メラノプシンアプタマーc1、c2、h4が位相を後退させる効果があることが分かった。他のメラノプシンアプタマーでも同様な効果があった。
【００８４】
以上、実施形態及び実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態及び実施例に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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