(57)【要約】      （修正有）【課題】注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができる評価方法、及びＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価するためのデータを取得する方法を提供する。【解決手段】評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を指標として、注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する評価工程を含む、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を指標として、注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する評価工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法。
【請求項２】
前記評価方法が、評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記評価工程が、前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量と、基準値とを比較する処理を含み、
前記基準値が、健常個体由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値及びＡＤＨＤ患者由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値の少なくともいずれかであり、
前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量が、前記健常個体由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値より少ない場合、及び前記ＡＤＨＤ患者由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値と同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象が、ＡＤＨＤに罹患している又は発症する可能性を有すると評価する工程である請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１種以上のサイトカインである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記評価工程が、前記サイトカインの量のデータに基づいてＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式に前記サイトカインの量のデータを代入することを含み、前記評価式には、前記サイトカインの量のデータが代入される少なくとも１つの変数が含まれている請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記評価対象由来の試料が、唾液である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価するためのデータを取得する方法。
【請求項９】
前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１種以上のサイトカインである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記評価対象由来の試料が、唾液である請求項８から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦである請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価対象が注意欠如・多動症（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ−Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法、及び評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価するためのデータを取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
注意欠如・多動症（注意欠如・多動症障害ともいう。以下、「ＡＤＨＤ」と称することもある。）は、衝動性、過活動性又は不注意などの症状を特徴とし、小児期及びその後の人生において有意な障害を引き起こし得る神経発達障害である。過活動性はＡＤＨＤを有する小児によく見られるが、成人期には消失する傾向があるものの、ＡＤＨＤを有する小児の過半数は生涯にわたって、ある程度の不注意症状を有し続ける。
【０００３】
ＡＤＨＤは遺伝的要因が７６％とされるが、分離が洗練されておらず家庭という環境要因が含まれてしまっているため、遺伝的要因をもって容易に診断することはできない。
【０００４】
ＡＤＨＤは、７歳以前（ＤＳＭ−Ｖを用いるなら１２歳以前）から発症し、少なくとも６か月以上継続しており、通常生活に支障があるときに診断されている。診断は、一般的に多くの精神障害と同様に問診等で行われる。診断を補助するための評価尺度としてＤＳＭ−Ｖがある。なお、ＤＳＭ−Ｖでは、ＭＲＩや血液検査等の生物学的データは診断項目としていない。そのため、誤診も多く、客観的な指標が必要とされている。
【０００５】
これまでに、問診以外の方法として、ディスプレイを用いて評価する方法（例えば、特許文献１参照）、一塩基多型をマーカーとして利用する方法（例えば、特許文献２参照）、Ｐｍｃｈ遺伝子をマーカーとして利用する方法（例えば、特許文献３参照）、抹消皮膚温度を測定し、ＡＤＨＤを示す値を測定する方法（例えば、特許文献４参照）など、様々な方法が提案されている。
しかしながら、臨床実施が可能な技術は未だ提供されていないという問題がある。
【０００６】
また、現在までのところ、ＡＤＨＤの根治法はなく、行動療法と薬物療法との組合せにより症状を管理することが行われている。薬物療法では、中枢神経刺激薬の投薬が広く使用されている。
しかしながら、薬物療法には有害作用の危険も伴うため、不要な投与は避け必要最低限の使用にとどめることが理想的である。
そのため、不要な投薬の回避という点からも、ＡＤＨＤに罹患しているか否かを正確に診断することは非常に重要である。
【０００７】
したがって、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができる新たな技術の速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１８−５０３４１０号公報
【特許文献２】特開２０１３−６６４５４号公報
【特許文献３】特開２０１０−４８４８号公報
【特許文献４】特開２００３−３３３５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができる評価方法、及びＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価するためのデータを取得する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＡＤＨＤの患者由来の試料中の特定のサイトカインの量が、健常者由来の試料中の前記サイトカインの量と比べて有意に異なることを知見した。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を指標として、注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する評価工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法である。
＜２＞  評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価するためのデータを取得する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができる評価方法、及びＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価するためのデータを取得する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１で採取した健常者群及びＡＤＨＤ患者群の唾液中において、有意差があったサイトカインの濃度平均値を示すグラフである。なお、実線は健常者群から採取した唾液に含まれるサイトカイン濃度を、破線はＡＤＨＤ患者群から採取した唾液に含まれるサイトカイン濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（ＡＤＨＤの評価方法）
本発明の評価対象が注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法（以下、「ＡＤＨＤの評価方法」と称することがある。）は、評価工程を少なくとも含み、必要に応じて更に、測定工程等のその他の工程を含む。
【００１５】
ＡＤＨＤは、衝動性、過活動性又は不注意などの症状を特徴とし、小児期及びその後の人生において有意な障害を引き起こし得る神経発達障害である。
【００１６】
＜評価工程＞
前記ＡＤＨＤの評価方法における評価工程は、評価対象由来の試料におけるサイトカインの量（以下、「濃度」と称することもある。）を指標として、前記評価対象が、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する工程である。
本発明において、前記ＡＤＨＤに罹患しているか否かには、ＡＤＨＤの症状の程度も含まれる。
【００１７】
前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量は、後述する測定工程で測定されたものであってもよいし、別途測定されたものであってもよい。
前記サイトカインの量のデータの単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、モル濃度、重量濃度、これらの濃度に任意の定数を加減乗除することで得られるものなどが挙げられる。
【００１８】
−評価対象−
前記評価対象としては、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かの評価が求められる対象であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記評価対象の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒトであってもよいし、ヒト以外の動物であってもよい。
前記評価対象の性別としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、男であってもよいし、女であってもよい。
前記評価対象の年齢としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記評価対象がヒトの場合、成人前であってもよいし、成人後であってもよいが、２０歳以下が好ましく、１５歳以下がより好ましく、５歳以上１５歳以下が特に好ましい。
【００１９】
−評価対象由来の試料−
前記評価対象由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭ぬぐい液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、母乳などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、血液、唾液が好ましく、非侵襲的に得ることができる点で、唾液がより好ましい。
【００２０】
前記試料の調製方法（以下、「採取方法」と称することもある。）としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
例えば、前記試料が血液の場合は、例えば、通常のシリンジを用いて採血する方法などが挙げられる。
また、前記試料が、唾液の場合は、例えば、唾液を直接採取する方法、サリベットや市販の採取用器具を用いる方法などが挙げられる。
【００２１】
前記評価対象由来の試料の採取時期（以下、「採取時間帯」と称することもある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する評価工程において比較する対象から試料を採取した時期と同程度の時期とすることが好ましい。特に、前記試料が唾液の場合には、唾液中に含まれるサイトカインの量の日内変動が大きいことがあるため、一日のうち一定の時間帯に行うことが好ましい。
【００２２】
前記評価対象由来の試料は、必要に応じて、希釈などの処理が施されてもよい。
【００２３】
−サイトカイン−
前記サイトカインとは、細胞シグナリングにおいて重要な役割を果たす、比較的小型のタンパク質（およそ５〜２０ｋＤａ）の総称である。
前記評価工程に用いるサイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インターロイキン；リンフォカイン；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）等のケモカイン；インターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）等の造血因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等の細胞増殖因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、リンフォトキシン（ＴＮＦ−β）等の細胞障害因子；レプチン、ＴＮＦ−α等のアディポカイン；神経成長因子（ＮＧＦ）等の神経栄養因子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
前記サイトカインの中でも、より評価の精度を高めることができる点で、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２  ｐ７０（ＩＬ−１２  ｐ７０）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群から選択される１種以上が好ましく、前記群から選択される２種以上がより好ましく、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦの２種が特に好ましい。
【００２５】
−評価−
前記評価の方法としては、評価対象が、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
前記評価の方法としては、例えば、前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量と、基準値とを比較する処理を含む方法が挙げられる。
【００２７】
前記基準値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（Ｉ）健常個体由来の試料におけるサイトカインの量（以下、「正常値」と称することがある。）に基づく値、（ＩＩ）ＡＤＨＤ患者由来の試料におけるサイトカインの量（以下、「疾患値」と称することがある。）に基づく値などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＡＤＨＤ患者は、典型的なＡＤＨＤ患者であってもよいし、軽度、中度、又は重度のＡＤＨＤ患者であってもよい。
【００２８】
前記（Ｉ）正常値に基づく値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スクリーニング検査のように、疾患群を見逃さないことを最優先とする場合には、特異度よりも感度を優先し、前記正常値を参考に、閾値（以下、「カットオフ値」と称することがある。）を前記正常値又は前記正常値に近い値に設定するなどが挙げられる。
【００２９】
前記（ＩＩ）疾患値に基づく値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＨＤの症状の程度を評価する場合には、前記疾患値を参考に、閾値を前記疾患値又は前記疾患値に近い値に設定するなどが挙げられる。
【００３０】
前記処理では、前記基準値が（Ｉ）正常値に基づく値の場合には、前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量が、前記正常値に基づく値より少ない場合に、評価対象が、ＡＤＨＤに罹患している又はＡＤＨＤを発症する可能性を有すると評価することができる。
前記健常個体は、前記評価対象と同一種類の個体であって、年齢が近しい個体が好ましい。
【００３１】
また、前記基準値が（ＩＩ）疾患値に基づく値の場合には、前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量が、前記疾患値に基づく値と同量以下の場合に、評価対象が、ＡＤＨＤに罹患している又はＡＤＨＤを発症する可能性を有すると評価することができる。
前記ＡＤＨＤ患者は、前記評価対象と同一種類の個体であって、年齢が近しい患者が好ましい。
【００３２】
前記基準値は、前記ＡＤＨＤの評価方法を実施する際に併せて測定した試料におけるサイトカインの量に基づいて設定したものを用いてもよいし、既に測定された試料におけるサイトカインの量に基づいて設定したものを用いてもよい。
【００３３】
また、前記評価の方法としては、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式を用いる方法も挙げられる。
【００３４】
例えば、前記サイトカインの濃度のデータに基づいて、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式に前記サイトカインの濃度のデータを代入して、前記評価対象が、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法が挙げられる。ここで、前記評価式には、前記サイトカインの濃度値が代入される変数が含まれている。前記変数の数としては、少なくとも１つであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より評価の精度を高めることができる点で、少なくとも２つが好ましい。即ち、２種以上のサイトカインの量のデータに基づいてＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式に、前記２種以上のサイトカインの量のデータを代入することを含み、前記評価式には、前記２種以上のサイトカインの量のデータが代入される少なくとも２つの変数が含まれていることが好ましい。
前記サイトカインは、上記−サイトカイン−の項目に記載したものと同様である。
【００３５】
前記評価式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロジスティック回帰式、分数式、線形判別式、重回帰式、サポートベクターマシンで作成された式、マハラノビス距離法で作成された式、正準判別分析で作成された式、決定木で作成された式などが挙げられる。これにより、ＡＤＨＤの状態を知る上で参考となり得る情報の更なる信頼性向上を実現することができる。
【００３６】
また、評価式として採用する式とは、一般に多変量解析で用いられる式の形式を意味するものであり、例えば、分数式、重回帰式、多重ロジスティック回帰式、線形判別関数、マハラノビス距離、正準判別関数、サポートベクターマシン、決定木、異なる形式の式の和で示されるような式などが挙げられる。ここで、重回帰式、多重ロジスティック回帰式、正準判別関数においては各変数に係数及び定数項が付加されるが、この係数及び定数項は、好ましくは実数であれば構わず、より好ましくは、データから前記の各種分類を行うために得られた係数及び定数項の９９％信頼区間の範囲に属する値であれば構わず、さらに好ましくは、データから前記の各種分類を行うために得られた係数及び定数項の９５％信頼区間の範囲に属する値であれば構わない。また、各係数の値及びその信頼区間は、それを実数倍したものでもよく、定数項の値及びその信頼区間は、それに任意の実定数を加減乗除したものでもよい。ロジスティック回帰、線形判別、重回帰分析などの表示式を評価式として用いる場合、表示式の線形変換（定数の加算、定数倍）及び単調増加（減少）の変換（例えばｌｏｇｉｔ変換など）は評価性能を変えるものではなく変換前と同等であるので、この表示式には、これらの変換が行われた後のものも含まれる。
【００３７】
例えば、２種のサイトカインの濃度データを用いて評価する場合、（サイトカインＡの濃度）＋（サイトカインＢの濃度）という式が挙げられる。これによれば、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かの評価を具体的な数値として定量化することができる。また、前もって、様々なサイトカインとＡＤＨＤ患者との相関を調べて得られた結果に基づき、サイトカインの種類ごとに重みづけを行ってもよい。さらには、（評価対象の各サイトカインの濃度データの値）／（健常者の各サイトカインの濃度データの平均値）を用いて（あるいは、その値に一定の重みづけをして）加算した値によって評価を行ってもよい。また、年齢、性別、人種、ＡＤＨＤ遺伝的背景の有無などによって、サイトカイン濃度の値を補正してもよい。これらの補正の程度や補正の有無は、サイトカインの種類によって変更してもよい。以上のようにして得られた評価の値を一般的な人の値（例えば日本人の平均値）と比較をして、その倍率によってＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価してもよい。
【００３８】
前記濃度のデータを変数として用いるサイトカインの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より評価の精度を高めることができる点で、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される２種以上が好ましく、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦの２種がより好ましい。
また、前記サイトカインを抽出するにあたり、例えば、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ；受信者動作特性曲線）のＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ）などを用いることができる。なお、本発明においては、例えば、変数減少法によってＡＵＣが最大となるサイトカインの組合せを求めることができる。
【００３９】
＜その他の工程＞
前記ＡＤＨＤの評価方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、測定工程、試料調製工程などが挙げられる。
【００４０】
＜＜測定工程＞＞
前記ＡＤＨＤの評価方法における測定工程は、前記評価対象由来の試料における前記サイトカインの量を測定する工程である。
【００４１】
−測定−
前記試料における前記サイトカインの量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、タンパク質の量を測定する方法、ｍＲＮＡの量を測定する方法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
なお、前記サイトカインのアミノ酸配列や塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。
【００４２】
前記サイトカインのタンパク質の量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記サイトカインを特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的手法により測定する方法などが挙げられる。
【００４３】
前記免疫学的手法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７０：  ４１９−４３９  （１９８０））、ドットブロット法、免疫核酸アッセイ法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが挙げられる。
【００４４】
前記ＥＬＩＳＡ法の具体例としては、マイクロプレートに標的サイトカインを固相化し、標識した当該サイトカインを認識する抗体を作用させる直接法、抗サイトカイン抗体を認識する標識二次抗体を用いる間接法、抗サイトカイン抗体を固相化し、さらに標識した抗サイトカイン抗体を用いるサンドイッチ法、抗サイトカイン抗体を固相化し、目的タンパク質および濃度があらかじめ分かっている酵素標識抗原を、同一マイクロプレート内で同時に反応させる競合法などが挙げられる。
【００４５】
前記ｍＲＮＡの量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法などが挙げられる。
【００４６】
前記試料における前記サイトカインの量は、市販されているサイトカイン量の測定キットを使用して測定することもできる。
【００４７】
＜＜試料調製工程＞＞
前記ＡＤＨＤの評価方法における試料調製工程は、前記評価対象由来の試料を調製する工程であり、前記試料の種類に応じて、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４８】
本発明のＡＤＨＤの評価方法は、問診等の他の手段による評価と組み合わせて行うこともできる。
【００４９】
本発明のＡＤＨＤの評価方法によれば、評価対象由来の試料における前記サイトカインの量を指標とすることで、前記評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができる。
【００５０】
したがって、本発明は、前記評価工程を少なくとも含み、必要に応じて更に前記その他の工程を含む、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か若しくは発症する可能性を有するか否かを診断する方法、又は評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か若しくは発症する可能性を有するか否かの診断を補助する方法にも関する。
また、本発明は、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か若しくは発症する可能性を有するか否かを評価、診断、又は診断補助するためのバイオマーカーであって、サイトカインからなるバイオマーカーにも関する。
【００５１】
（ＡＤＨＤの評価用データ取得方法）
本発明の評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価するためのデータを取得する方法（以下、「ＡＤＨＤの評価用データ取得方法」と称することがある。）は、測定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００５２】
＜測定工程＞
前記ＡＤＨＤの評価用データ取得方法における測定工程は、評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程であり、上記した本発明のＡＤＨＤの評価方法のその他の工程における測定工程と同様にして行うことができる。
【００５３】
＜その他の工程＞
前記ＡＤＨＤの評価用データ取得方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試料調製工程などが挙げられる。
【００５４】
＜＜試料調製工程＞＞
前記ＡＤＨＤの評価用データ取得方法における試料調製工程は、前記評価対象由来の試料を調製する工程であり、上記した本発明のＡＤＨＤの評価方法のその他の工程における試料調製工程と同様にして行うことができる。
【００５５】
本発明のＡＤＨＤの評価用データ取得方法は、前記サイトカイン以外の物質の量の測定と組み合わせて行ってもよい。
【００５６】
本発明のＡＤＨＤの評価用データ取得方法によれば、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価するために有用なデータを収集することができる。
【００５７】
（ＡＤＨＤの評価、診断、又は診断補助用キット）
上記したように、本発明のＡＤＨＤの評価方法によれば、評価対象由来の試料における前記サイトカインの量を指標とすることで、前記評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価することができるので、本発明は、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かの評価、診断、又は診断補助用キット（以下、「ＡＤＨＤの評価、診断、又は診断補助用キット」と称することがある。）にも関する。
【００５８】
前記ＡＤＨＤの評価、診断、又は診断補助用キットは、サイトカイン検出手段を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の構成を含む。
【００５９】
＜サイトカイン検出手段＞
前記サイトカイン検出手段としては、前記試料における目的のサイトカイン、好ましくはＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１種以上のサイトカインを検出することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記サイトカインを免疫学的に検出するために、前記サイトカインに対する抗体を固定した検出器具が含まれることが好ましい。
【００６０】
前記サイトカインに対する抗体を固定する対象としては、固体又は不溶性材料である担体であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる担体などが挙げられる。
【００６１】
前記担体の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどが挙げられる。前記薄膜やプレート等の平坦な担体は、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
【００６２】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、特に制限はなく、公知の診断用キットなどに含まれる構成を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫学的測定法に用いる試薬、キットの取扱説明書などが挙げられる。
【００６３】
前記ＡＤＨＤの評価、診断、又は診断補助用キットによれば、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを高い精度で評価、診断、又は診断補助することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６５】
（実施例１）
被検者として、ＡＤＨＤ患者２０名（患者群）、及び健常者２０名（健常者群）の２群を用いた。患者群を健常者群より先に収集し、それと人数、性別比、及び平均年齢が一致する健常者を後で収集した。
唾液検体の採取は、ＡＤＨＤ患者は起床後と、同日の日中の２回、健常者は日中に１回行った。採取した唾液に含まれるサイトカイン（２７種）を分析した。
【００６６】
表１に被検者背景を示した。
【表１】
2020091242.tif 000002
【００６７】
検体収集機関、分析装置、サイトカイン分析キット、分析を行ったサイトカインの種類、及び検査方法の詳細を以下に示す。
・  検体収集機関  ：  信州大学医学部附属病院
・  分析装置  ：  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株））
・  サイトカイン分析キット  ：
Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２７−Ｐｌｅｘ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株））
・  分析を行ったサイトカインの種類  ：
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＦＧＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ
・  検査方法  ：
（１）唾液からの測定サンプルの採取方法
１）採取カップ（日本メディカル：型番ＭＳ−５０）を２つ用意し、ＩＤを記入する（２つの採取カップのＩＤは同一とする）。
２）採取カップに採取量  １５０μＬのラインを入れる。
３）２つのカップに必要量（およそ１５０μＬ）の唾液を入れ、採取後２時間以内に−８０℃で凍結保存する。
【００６８】
以上のようにして採取したサンプルについて、上記した分析装置及びサイトカイン分析キットを用いて２７種類のサイトカインの濃度を測定した。
【００６９】
更に、得られた分析結果について、統計分析ソフト（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、日本アイ・ビー・エム（株））を使用してＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔを行った。
なお、サイトカインの測定濃度値が検出限界より低い場合、ＬＯＤ値（Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ブランクの濃度に、ブランク間で観測される濃度揺らぎを加えた濃度のことで、ブランクから求められる測定下限値を意味し、算出式はブランクの値＋２×ブランクのＳＤ値）が算出可能な場合に限り、ＬＯＤ／２値を測定値として代用した。適用条件としては、ＬＯＤ／２値が、サンプル濃度、ＬＬＯＱ（標準液の低濃度域）の測定下限値よりも低値である場合のみ適用とした。また、ＬＯＤ／２値よりＬＬＯＱ値が低値であった場合は、ＬＬＯＱ／２値を測定値として用いた。
ＬＯＤ値は、８個のスタンダード濃度の実測値から求めたスタンダードカーブ回帰式の係数を用いて算出した。ただし、ＬＯＤ／２値がスタンダードの最も薄い濃度値（Ｓ８）よりも高い場合は、Ｓ８濃度値／２を測定値として代用した。
【００７０】
＜解析１＞
患者群において、１回目（起床後）に採取した唾液中のサイトカインの濃度、及び２回目（日中）に採取した唾液中のサイトカインの濃度と、健常群において採取した唾液中のサイトカインの濃度とを比較した。なお、患者群のうち、１名からは２回目（日中）の唾液の採取ができなかったため、患者群における２回目（日中）に採取したサンプルは１９検体とした。
【００７１】
−解析結果１−
患者群の１回目（起床後）に採取した唾液中のサイトカインの濃度は、データが取得できなかったＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ以外では、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、及びＶＥＧＦ以外のサイトカインにおいて、健常群において採取した唾液中のサイトカインの濃度を上回る濃度で検出された。
一方、患者群の２回目（日中）に採取した唾液中のサイトカインの濃度は、起床後に採取した唾液中のサイトカインの濃度と比べて濃度値が低下し、健常者群の平均値に近づく傾向が認められた。
そのため、以下の解析においては、患者群では、２回目（日中）に採取した唾液検体を用いることとした。
【００７２】
＜解析２＞
患者群の２回目（日中）に採取した唾液中のサイトカインの濃度と、健常者群の唾液中のサイトカインの濃度について、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｔｅｓｔによる統計分析を行った。その結果を表２に示す。
なお、分析した２７種類のサイトカイン中、データ損失があった１１種類のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＦＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ）については、解析から除外した。
【００７３】
−解析結果２−
解析２の結果、患者と健常者の唾液中のサイトカインの濃度に関し、いくつかのサイトカインには両者間で有意差が認められた（表２）。
なお、すべてのサイトカインの種類について、性別及び年齢における有意差の有無についても分析を行ったが、性別及び年齢における有意差は認められなかった。
これらの結果から、患者から採取した唾液に含まれるサイトカインのうち、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦについては、性別及び年齢に関係なく、健常者から採取した唾液に含まれるそれらのサイトカインの濃度より有意に低いことが示された。なお、有意差があったサイトカインの唾液に含まれる濃度平均値を示すグラフを図１に示した（実線：健常者群、破線：ＡＤＨＤ患者群）。
【表２】
2020091242.tif 000003
【００７４】
＜解析３＞
解析２の結果、患者群と健常群との間で有意差が認められた８種類のサイトカインについて、更に、ステップワイズ法を用いたロジスティック回帰分析によるモデル化、及びＲＯＣ解析による判定能の検証を行った。
【００７５】
−解析結果３−
解析３の結果、８種類のサイトカインの中で、ＩＬ−１ｒａとＶＥＧＦとの組合せが、ＲＯＣ解析によるＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）が０．９１４（感度：０．７２２、特異度：１．０００）と最も１に近づいた。なお、他のサイトカインの組み合わせから算出されるＡＵＣは、該ＩＬ−１ｒａとＶＥＧＦとの組み合わせから算出されるＡＵＣよりも低かった。
なお、ＩＬ−１βのＡＵＣは０．７５３、ＩＬ−１ｒａのＡＵＣは０．７０８、ＩＬ−７のＡＵＣは０．７１７、ＩＬ−８のＡＵＣは０．８２１、ＩＬ−１２  ｐ７０のＡＵＣは０．７４６、Ｇ−ＣＳＦのＡＵＣは０．７６４、ＩＦＮ−γのＡＵＣは０．７５６、ＶＥＧＦのＡＵＣは０．８０８であった。
【００７６】
以上の結果から、唾液中のサイトカインの濃度について、ＡＤＨＤ患者では、健常者に比べ濃度が低下するサイトカイン（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦ）があることが分かった。
更に、ＩＬ−１ｒａとＶＥＧＦとの組合せは、特に患者群と健常者群との間における差異が大きいことが示された。
このため、評価対象由来の試料に含まれるサイトカインの量を指標とすることで、ＡＤＨＤに罹患しているか否か又は罹患する可能性を有するか否かを評価できることが分かった。
【００７７】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を指標として、注意欠如・多動症（ＡＤＨＤ）に罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する評価工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価する方法である。
＜２＞  前記評価方法が、評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程を更に含む、前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  前記評価工程が、前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量と、基準値とを比較する処理を含み、
前記基準値が、健常個体由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値及びＡＤＨＤ患者由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値の少なくともいずれかであり、
前記評価対象由来の試料におけるサイトカインの量が、前記健常個体由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値より少ない場合、及び前記ＡＤＨＤ患者由来の試料におけるサイトカインの量に基づく値と同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象が、ＡＤＨＤに罹患している又は発症する可能性を有すると評価する工程である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞  前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１種以上のサイトカインである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞  前記評価工程が、前記サイトカインの量のデータに基づいてＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式に前記サイトカインの量のデータを代入することを含み、前記評価式には、前記サイトカインの量のデータが代入される少なくとも１つの変数が含まれている前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞  前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される２種以上のサイトカインであり、
前記評価工程が、前記２種以上のサイトカインの量のデータに基づいてＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価することが可能な評価式に前記２種以上のサイトカインの量のデータを代入することを含み、前記評価式には、前記２種以上のサイトカインの量のデータが代入される少なくとも２つの変数が含まれている前記＜５＞に記載の方法である。
＜７＞  前記評価対象由来の試料が、唾液である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞  前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞  評価対象由来の試料におけるサイトカインの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、評価対象がＡＤＨＤに罹患しているか否か又は発症する可能性を有するか否かを評価するためのデータを取得する方法である。
＜１０＞  前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２  ｐ７０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１種以上のサイトカインである前記＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞  前記評価対象由来の試料が、唾液である前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞  前記サイトカインが、ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦである前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
【図１】
2020091242.tif 000004