(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、正電荷を有する官能基を大量に導入した粒子に機能性物質を固定化させても、当該粒子を高効率で保持できる方法を提供することである。【解決手段】    保持部を有した粒子保持手段に目的粒子を含んでなる懸濁液を導入する工程と、誘電泳動力を利用して前記目的粒子を前記保持部に保持させる工程と、を含んでなる粒子の保持方法であって、前記目的粒子のゼータ電位が−１０ｍＶ以下であることを特徴とする、前記保持方法を提供する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
保持部を有した粒子保持手段に目的粒子を含んでなる懸濁液を導入する工程と、
誘電泳動力を利用して前記目的粒子を前記保持部に保持させる工程と、
を含んでなる粒子の保持方法であって、
前記目的粒子のゼータ電位が−１０ｍＶ以下であることを特徴とする、前記保持方法。
【請求項２】
正電荷を有する官能基が導入された粒子に、機能性物質を前記官能基を介して固定化させた後、正電荷を低減する物質を作用させることで製造された、
前記目的粒子を用いることを特徴とする請求項１に記載の保持方法。
【請求項３】
正電荷を低減する物質が、当該正電荷と静電相互作用可能な物質である、請求項２に記載の保持方法。
【請求項４】
機能性物質が蛍光色素である、請求項２または３に記載の保持方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法で保持部に保持された目的粒子を検出手段で検出する工程と、
前記検出手段による検出結果に基づき、前記保持部への粒子保持および／または前記検出手段による粒子検出が正常に行なわれているかを判断する工程と、
を含んでなる、粒子保持手段および／または検出手段の検査方法。
【請求項６】
検出手段による粒子検出が、保持部に保持された目的粒子の数および／または目的粒子由来の光の輝度分布に基づく検出である、請求項５に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性物質を固定化した粒子の保持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、粒子を基板上に個別に規則正しく配列させることで、各粒子の性質や構造を個々に解析したり観察したりする技術が提案され、創薬、治療、検査、分析など様々な分野での応用が期待されている。
【０００３】
例えば、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。具体例として特許文献１には、細胞を含む懸濁液を導入し、上部電極と、当該細胞を保持可能な保持部（貫通孔）を多数形成した絶縁体層を有する下部電極との間に交流電圧を印加することで、両電極間内の空間に誘電泳動力を発生させ、細胞を前記保持部へと高効率（具体的には導入した細胞の８０％以上）に短時間で保持する方法を開示している。
【０００４】
特許文献１に開示の方法のように、誘電泳動力で粒子を保持部に保持させて検出する場合、精度良い粒子検出を行なうためには、誘電泳動力により当該粒子が保持部に正常に保持されているか、および／または保持部に保持された当該粒子を正常に検出しているか、を適宜判断する必要がある。そして、正常に保持されていない、および／または正常に検出していないと判断した場合は、正常な保持および／または検出が行なえるよう、校正する必要がある。一例として、特許文献２では、輝度の異なる２種類の蛍光色素固定化粒子を校正用粒子（前記判断に用いる粒子）として用い、当該粒子を誘電泳動力により保持部に保持させた後、保持部における当該粒子の検出率に基づき、誘電泳動力による保持部への粒子保持および保持された粒子の検出が正常に行なわれているかを判断している。
【０００５】
特許文献２で判断に用いる蛍光色素固定化粒子は、官能基を導入した粒子に、蛍光色素を前記官能基を介して固定化させて製造する。従って、高輝度の蛍光色素固定化粒子を製造するには、蛍光色素を固定化させる粒子に官能基を多量に導入する必要がある。しかしながら、当該官能基がアミノ基などの正電荷を有する官能基である場合、固定化後の粒子には未反応の官能基が大量に残存するため正電荷を帯び、誘電泳動力による保持部への保持率が低下する課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１７４５９６号公報
【特許文献２】特開２０１８−１４６５７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、正電荷を有する官能基を大量に導入した粒子に機能性物質を固定化させても、当該粒子を高効率で保持できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、正電荷が十分に低減された粒子を用いることで本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明の一態様においては、
保持部を有した粒子保持手段に目的粒子を含んでなる懸濁液を導入する工程と、
誘電泳動力を利用して前記目的粒子を前記保持部に保持させる工程と、
を含んでなる粒子の保持方法であって、
前記目的粒子のゼータ電位が−１０ｍＶ以下であることを特徴とする。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
粒子保持手段は、導入した懸濁液中の目的粒子を保持可能な保持部を有した構造体のことをいう。保持部の例としては、目的粒子を保持可能な凹部または貫通孔や、目的粒子を固定可能な材料で被覆した平面または凸部が挙げられるが、細胞保持の確実性の点から凹部または貫通孔が好ましい。凹部を保持部とした場合、一端が目的粒子の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有しており他端が底部を形成している態様とし、貫通孔を保持部とした場合、一端が目的粒子の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有し他端が当該開口部よりも狭い開口部とするか、両端が目的粒子の一部を保持可能な大きさの開口部である態様とする。なお、保持部の大きさ（径）を溶液中に含まれる目的粒子を一つだけ保持可能な大きさとすると、目的粒子の解析などが容易に行なえる点で好ましい。
【００１２】
保持部を有する粒子保持手段の一態様として、図１から３に示す粒子保持装置が挙げられる。図１から３に示す粒子保持装置１００は、
貫通孔１１１を有した平板状の絶縁膜１１０と、
貫通孔１２１を有した平板状の遮光膜１２０と、
導入口１３１、排出口１３２および貫通部１３３を有した平板状のスペーサ１３０と、
遮光部材１２０の下面およびスペーサ１３０の上面と密着するよう設けた電極１４１・１４２と、
電極１４１・１４２同士を接続する導線１５０と、
電極１４１・１４２に信号を印加する交流電源１６０と、
を備えている。
【００１３】
絶縁膜１１０が有する貫通口１１１と遮光膜１２０が有する貫通孔１２１とは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう絶縁膜１１０および遮光膜１２０を備えている。貫通孔１１１、貫通孔１２１および遮光部材１１１の下部に密着して設けた電極１４１により、粒子保持装置１００内に粒子を保持可能な保持部１７０が構成され、導入口１３１から目的粒子２００を含む懸濁液を導入すると貫通部１３３を通じて保持部１７０へ目的粒子２００が導入される。
【００１４】
遮光膜１２０は、絶縁膜１１０自体の自家蛍光に起因するバックグラウンドノイズや隣接する保持部１７０からの漏れ光に起因するクロストークノイズなどの光ノイズを低減させる効果があり、検出部３００による保持部１７０に保持された目的粒子２００の検出を当該目的粒子由来の光を用いて行なう際、各保持部１７０に保持された目的粒子２００由来の光のみを高感度かつ高精度に検出できる。電極１４２はスペーサ１３０上面に密着して備えており、導入口１３１から導入した、目的粒子を含む試料の飛散や蒸発を防止している。
【００１５】
なお、保持部１７０に保持した目的粒子の回収を容易にするため、電極１４２はスペーサ１３０から取り外し可能な構造となっている。なお、電極１４１・１４２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部１７０に保持された目的粒子２００を、検出部３００（顕微鏡や光学検出器など）を用いて容易に検出できるため、好ましい。
【００１６】
前述した粒子保持装置１００のうち、電極については、図１に示すように絶縁膜１１０、遮光膜１２０およびスペーサ１３０を上下方向に挟むよう備えてもよいし、図２に示すように遮光膜１２０の下面のみに＋極１４１ａおよび−極１４１ｂを設けた櫛形電極の態様で電極１４１を備えてもよい。
【００１７】
目的粒子２００は誘電泳動力を利用することで、高効率で保持部１７０に保持させることができる。本明細書において「高効率で保持部に保持させる」とは、保持部１７０に保持された粒子数および貫通部１３３内に導入されているものの保持部１７０に保持されていない粒子数を計測し、保持部１７０に保持された粒子数を貫通部１３３内全体の粒子数で除した値である保持率が８０％以上であることを意味する。誘電泳動力４００を目的粒子２００に作用させるには、保持部１７０を含めた粒子保持装置１００内の空間を試料で満たした状態で、保持部１７０の部分に電気力線が集中するよう、交流電源１６０を用いて電極１４１・１４２へ所定の波形を有する交流電圧を印加すればよい（図３）。なお、保持部１７０を複数設ける場合は、アレイ状に均等に設けると、電極間に印加した電圧によって生じる電界が各保持部１７０にほぼ均等に生じ、各保持部１７０に対して同じように目的粒子２００を誘導し保持できるため好ましい。
【００１８】
交流電源１６０を用いて電極１４１・１４２へ印加する交流電圧の大きさは、保持部１７０に目的粒子２００を移動／保持可能な誘電泳動力４００を発生させるのに十分な電圧であればよい。具体的には、ピーク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１００Ｈｚから１０ＭＨｚ程度の正弦波、矩形波、三角波、台形波などの波形の交流電圧が例示できる。特に矩形波は、正弦波、三角波、台形波などの他の波形と比較し、瞬時に設定したピーク電圧に到達するため、粒子を保持部へ速やかに移動できる点で好ましい。
【００１９】
なお、図１から３に示す粒子保持装置１００に備える交流電源１６０は、直流成分を有しない交流電圧を発生する電源が好ましい。直流成分を有する交流電圧とは、例えば周波数デューティ比が５０％でない電圧、オフセットを有する電圧、周期が極端に長い（例えば周期が１秒以上の）電圧をいう。直流成分を有する交流電圧を電極へ印加すると、直流成分により発生した静電気力（電気泳動力）により粒子が特定の方向に偏った力を受けて移動し、誘電泳動力による粒子保持が困難になるからである。
【００２０】
図１から３に示す粒子保持装置１００では、粒子の比重が当該粒子を懸濁させる溶媒の比重より大きく、粒子が下方向に沈降する場合を想定し、保持部を形成する絶縁膜１１０および遮光膜１２０を下面に備えていた態様となっているが、本発明における粒子保持手段は前記態様に限定されるものではなく、粒子の比重が当該粒子を懸濁させる溶媒の比重より小さく、粒子が上方向に浮上する場合は、保持部を形成する絶縁膜１１０および遮光膜１２０を上面に備えた態様としてもよい。
【００２１】
本発明における目的粒子とは、ゼータ電位が−１０ｍＶ以下であれば特に制限はないが、正電荷を有する官能基が導入された粒子に、機能性物質を前記官能基を介して固定化させた後、正電荷を低減する物質を作用させることで好適に製造することが可能である。
【００２２】
粒子とは溶媒中に単独または凝集状態で分散する不溶性粒子のことをいう。具体的には、細胞、ウイルス、オルガネラ、小胞、核、ミトコンドリア、リポソームなどの生体物質からなる粒子、ビーズ、粉砕用ボール、液晶用スペーサ、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤などの無機化合物（セラミックス系、ガラス系、チタン系など）や、有機化合物（多糖類、有機合成高分子など）からなる粒子が挙げられる。中でも無機化合物や有機化合物からなる粒子が好ましい。粒子の形状は特に限定はなく、球状、多面体状、繊維状、中空糸状、膜状、平板状など、公知の形状を用いることができる。中でも物理的な損傷が生じにくい点、均一な粒子径の粒子を得やすい点などから球状または多面体状が好ましい。粒子は公知の方法を用いて製造してもよいし、市販の粒子をそのまま、または修飾して用いてもよい。前記市販の粒子の一例として、クロマトグラフィーの分野で通常用いられる公知の担体が挙げられる。前記担体は粒子径や細孔径の大きさが均一である点、表面改質が可能である点、容易に入手できる点、から好ましい粒子の一態様といえる。
【００２３】
正電荷を有する官能基とは、溶媒中で正に荷電する官能基のことをいう。一例として、グアニジノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、第４級アンモニウム基、イミノ基が挙げられる。また、正電荷を有する官能基が導入された粒子は、前記官能基がすでに固定化された市販の粒子（例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０（東ソー製）といった、アミノ基活性型クロマトグラフィー用担体）をそのまま用いても良いし、未修飾の粒子に前記官能基を固定化させることで得ても良い。正電荷を有する官能基がアミノ基であり、未修飾の粒子がメタクリレートポリマー粒子の場合、未修飾の粒子に前記官能基を固定化する方法の一例として、メタクリレートポリマー粒子が有する水酸基にエポキシ基を有する化合物（例えばエピクロロヒドリン、ジエポキシ化合物、またはポリエポキシ化合物など）を反応させて前記粒子にエポキシ基を導入後、前記エポキシ基に対してアミノ基を有する化合物（例えばアンモニア、メチルアミン、エチルアミン、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、３，３’−ジアミノジプロピルアミン、ジエチレントリアミン、フェニレンジアミン、ポリアリルアミン、またはポリエチレンイミンなど）を反応させる方法が挙げられる。
【００２４】
機能性物質とは、粒子に導入された官能基を介して当該粒子表面に固定化可能かつ当該粒子に機能を付与する物質であり、用途に応じて適宜選択することができる。代表的な機能性物質として、酵素、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸などの生体分子、分析などの際に検出指標となり得る蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子、ｐＨ感受性色素分子などの化合物が挙げられ、中でも蛍光特性を有する色素（蛍光色素）が好ましい。なお、粒子に固定化させる機能性物質は１種類のみでもよく、１個の粒子に２種類以上の機能性物質を固定化させてもよい。
【００２５】
正電荷を有する官能基を介して機能性物質を粒子に固定化する方法は、共有結合、イオン結合、疎水結合、物理的吸着、抗原−抗体結合やアビジン−ビオチン結合などの生化学的特異結合、架橋法、包括法、複合法といった公知の方法を用いることができるが、中でも共有結合による固定化が好ましい。正電荷を有する官能基がアミノ基である場合の、共有結合による正電荷を有する官能基を介した固定化の一例として、活性エステルによるアミド化が挙げられる。具体的には、活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、４−ジメチルアミノピリジン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ヒドロキシアザベンゾトリアゾールなど）が結合した機能性物質（ＡＴＴＯ−ＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）など）をアミノ基を導入した粒子と反応させることで当該粒子に固定化できる。
【００２６】
正電荷を低減する物質とは、正電荷を中和する物質のことを意味する。一例として、電荷を有さない官能基を有する物質や、正電荷と静電相互作用可能な物質（つまり、負電荷を有する物質）が挙げられる。
【００２７】
電荷を有さない官能基の一例としては、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。電荷を有さない官能基による、粒子に残存する正電荷の低減は、例えば、粒子に残存する正電荷を有する官能基と置き換えることで低減できる。具体例として、アセチル化剤（無水酢酸、塩化アセチル、酢酸メチル、Ｎ−メチルアセトアミドなど）を用いて、粒子に残存する正電荷を有する官能基をアセチル基に置換することで、正電荷を低減できる。
【００２８】
負電荷を有する物質の一例としては、タンパク質やペプチド、アミノ酸、核酸、陰イオン性ポリマーが挙げられる。このうち陰イオン性ポリマーは、負電荷を有する官能基を主鎖または側鎖に有する高分子を意味し、一例として、スルホン酸、硫酸、カルボン酸などの負電荷を帯びることが可能な官能基を有するポリスチレンスルホン酸、ポリビニル硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ポリアネトールスルホン酸、これらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、これらの共重合体が挙げられる。負電荷を有する物質による、粒子に残存する正電荷の低減は、例えば、正電荷が残存している粒子の表面に吸着させることで低減できる。具体例として、陰イオン性ポリマー溶液（ポリスチレンスルホン酸ナトリウム溶液など）に、正電荷を有する官能基が残存する粒子を浸漬し、粒子表面に陰イオン性ポリマーを吸着させることで、正電荷を低減できる。負電荷を有する物質を粒子表面に吸着させる方法は、粒子のゼータ電位を大きく低下させられるためより好ましい。
【００２９】
目的粒子のゼータ電位の測定方法の一例として、超音波振動電位法や電気泳動動的光散乱法（レーザードップラー法）が挙げられる。目的粒子のゼータ電位は−１０ｍＶ以下であり、−１５ｍＶ以下がより好ましく、−３０ｍＶ以下がさらに好ましく、−５０ｍＶ以下が特に好ましい。なお、本発明における粒子のゼータ電位の値は、粒子の超純水分散液（粒子濃度：２×１０６個／ｍＬ）のゼータ電位を、ゼータ電位測定装置（大塚電子製ＥＬＳＺ）を用いて測定した値を用いることとする。
【００３０】
本発明の保持方法で保持部へと保持した目的粒子の検出は、明視野像、蛍光画像、化学発光画像といった光学的特徴に基づき検出する場合は光学検出器や光学顕微鏡などの光学測定器、弾性や粘性といった特徴に基づき検出する場合は超音波顕微鏡などの超音波測定器、放射化学的特徴に基づき検出する場合はシンチレーション検出器などの放射線検出器、熱応答性や熱物性に基づき検出する場合は前記熱応答性や熱物性を検出可能な装置、磁気に基づき検出する場合は磁気検出器を用いて検出すればよい。
【００３１】
粒子保持手段および検出手段として、図３に示す粒子保持装置１００および検出部３００をそれぞれ用いた場合、アミノ基を導入した粒子に蛍光色素を当該アミノ基を介して導入後、陰イオン性ポリマーを吸着させることで前記粒子に残存する正電荷を低減させた粒子（目的粒子２００）について例えば以下に示す方法で検出できる。
（ｉ）目的粒子２００を粒子保持装置１００に導入し、交流電源１６０から電極１４１・１４２へ交流電圧を印加することにより誘電泳動力４００を発生させ、保持部１７０に保持させる。
（ｉｉ）保持部１７０に保持された目的粒子２００を、検出部３００（例えば蛍光顕微鏡）を用いて光学的に検出を行なう。
【００３２】
なお、前記（ｉｉ）の光学的検出は、粒子に固定化されている蛍光色素に対応した励起光を保持部１７０に保持された目的粒子２００に照射し、当該照射により得られる当該蛍光色素に由来する蛍光５００の強度に基づき行なえばよい。
【００３３】
前述した方法で目的粒子を検出した結果に基づき、粒子保持手段および／または検出手段を検査できる。さらに当該検査結果に基づき、粒子保持手段および／または検出手段の校正や誤差補正も行なえる。本発明において「検査」とは、粒子保持手段を構成する交流電源や電極、ならびに検出手段を構成する光源、光学系、撮像部などの機器類の再現性、性能ならびに動作などの状態を確認することを意味する。また、本明細書において「誤差」とは、粒子保持手段および検出部を構成する機器類の経年劣化や汚れの蓄積や、装置設置環境の違いなどにより、測定結果に生じる誤差のことを意味する。
【００３４】
検査方法の一例として、検出部３００にて検出された、目的粒子２００の蛍光強度（輝度）に基づき、導入粒子数と検出粒子数の差異や、検出した粒子の輝度分布にズレがあるかどうか確認することにより、粒子保持装置１００を検査する方法が挙げられる。本明細書において「輝度」とは、検出部３００において対象物を光学的に検出し、ＣＭＯＳカメラやＣＣＤカメラなどの撮像手段で撮影し取得した画像の明るさのことを意味し、撮像手段として８ビットカメラを用いる場合は、０から２５５の２５６階調で表わされる（最も暗いときの輝度は０、最も明るいときの輝度は２５５となる）。
【００３５】
前記導入粒子数と検出粒子数の差異を確認する方法の一例として、粒子保持装置１００に導入した目的粒子２００の個数と、検出部３００で光学的に検出した目的粒子２００の個数とを比較する方法が挙げられる。前記光学的な検出を、当該蛍光色素に由来する蛍光５００の強度に基づき行なう場合、特定の個数の目的粒子２００を前記（ｉ）の方法で保持させ、（ｉｉ）の方法において当該蛍光色素由来の蛍光５００を検出部３００により検出し、蛍光画像を撮影する。撮影した蛍光画像を解析し、蛍光の輝点数および前記各輝点の輝度を計測する。設定した閾値以上の輝度の輝点数（値Ｎ）を検出粒子数として算出し、導入粒子数との差異から検出が正常に行なわれているか、判断する。なお、値Ｎを取得する際の閾値は、蛍光色素固定化粒子２００が有する蛍光色素量などにより適宜設定すればよい。
【００３６】
前記輝度分布のズレを確認する方法の一例として、特定輝度範囲における輝点数の割合や輝度代表値のズレを確認する方法が挙げられる。本明細書において「代表値」とは、導入した目的粒子２００の輝度を代表する値であればよく、例えば、輝度の平均値、中央値、最頻値が挙げられる。
【００３７】
輝度分布のズレの確認を、特定輝度範囲における輝点数の割合で行なう場合、前述した方法で蛍光の輝点数および前記各輝点の輝度を計測した後、（式１）により値Ｄ１［％］を算出し、検出が正常に行なわれているか、判断する。なお、値Ｄ１［％］を算出する際の特定輝度範囲は、目的粒子２００が有する蛍光色素量などにより適宜設定すればよい。
（式１）
値Ｄ１［％］＝（特定輝度範囲における輝点数）÷（全輝点数）×１００
輝度分布のズレの確認を、輝度代表値のズレで行なう場合、前述した方法で蛍光の輝点数および前記各輝点の輝度を計測した後、輝度代表値（値Ｄ２）を算出し、検出が正常に行なわれているか、判断する。
【００３８】
例えば、交流電源１６０に故障などが生じた場合、交流電圧が印加されず目的粒子２００が保持部１７０へ保持されないため、値Ｎは減少する。また、検出手段を構成する光学系のどこかに異常がある場合、取得画像における蛍光色素固定化粒子２００の輝度が低下するため、値Ｄ１［％］および／または値Ｄ２の数値が変化する。なお、使用する目的粒子２００は蛍光色素を多く固定化した高輝度の粒子と、蛍光色素を少なく固定化した低輝度の粒子の二種類を使用し、輝度が高く検出しやすい高輝度の粒子で値Ｎを算出し、光学系の劣化が判断しやすい低輝度の粒子で値Ｄ１［％］または値Ｄ２を算出してもよい。値Ｎおよび値Ｄ１［％］または値Ｄ２に対しそれぞれ任意で閾値を設定することで、粒子保持手段および／または検出部が正常に機能しているか判断できる。値Ｎおよび値Ｄ１［％］または値Ｄ２が共に合格基準内となった場合は、粒子保持手段および検出部が正常であることを示している。少なくともいずれか１つが合格基準外（不合格）となった場合は、測定時において粒子保持手段および／または検出部に異常があることを示しており、粒子保持手段の交流電源や光学系の設定値（例えばカメラのシャッター速度やゲインなどの数値）の変更、機器類の清掃や整備および消耗品（光源の照明など）交換、故障（コードの断線など）または劣化した機器類の修理などのメンテナンスにより、機器類の状態を正常に戻す必要がある。そしてこれらメンテナンスにより、前記粒子保持手段および検出部による粒子検出が正常に行なえるよう、機器類の状態が維持される。
【００３９】
例えば、あらかじめ繰り返し測定により輝度代表値を規定した目的粒子２００（規定した輝度代表値を値Ｓとする）を検出部３００にて検出して値Ｄ２を算出し、値Ｄ２と値Ｓから求めたパラメーター（値Ｓ／値Ｄ２）をもとに光学系の設定値（例えばカメラのシャッター速度やゲインなどの数値）を変更することにより、誤差補正を行なえる。具体的には、検出部３００において励起光を発生させるための光源が劣化した場合、励起光光量低下により取得した蛍光検出画像の輝度が低下し、測定結果に誤差が生じると同時に、値Ｄ２が減少する。ここで、パラメーター（値Ｓ／値Ｄ２）をカメラのゲイン値にかけ合わせ、補正したゲイン値を用いて再度測定を行なうことにより、正常時と同等の蛍光検出画像を取得でき、誤差補正が可能となる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、誘電泳動力により粒子を粒子保持手段に設けた保持部へ高効率に保持できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明で利用可能な、粒子保持手段を構成する粒子を保持可能な基板の一例を示す図である。
【図２】本発明で利用可能な、粒子保持手段を構成する粒子を保持可能な基板の別の態様を示す図である。
【図３】図１に示す基板を備えた粒子保持手段および検出部の一態様を示す図である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  蛍光色素固定化粒子の作製
（１）粒子表面へのエポキシ基の導入
（１−１）多孔性メタクリレートポリマー粒子（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ、平均粒子径１０μｍ、平均細孔径１００ｎｍ、東ソー製、溶媒：水）をガラスフィルターで吸引ろ過（サクションドライ）した。
（１−２）サクションドライ後の粒子１０ｇを１００ｍＬのポリテトラフルオロエチレン（以下ＰＴＦＥ）製広口ボトルに秤量し、ジメチルスルホキシド（関東化学製、以下ＤＭＳＯ）１０ｇ、エピクロロヒドリン（東京化成工業製）９ｇ、５Ｍ水酸化ナトリウム（関東化学製）２３ｇ、超純水２３ｇを添加し、シェーカーで撹拌しながら３５℃にて３時間反応させた。
（１−３）反応終了後、粒子をガラスフィルターで吸引ろ過し、ろ液がｐＨ６から８程度となるまで超純水で洗浄することにより、エポキシ基を導入した粒子を得た。
（２）粒子表面へのアミノ基の導入
（２−１）（１）で得たエポキシ基を導入した粒子を全量ガラスフィルターで吸引ろ過（サクションドライ）し、１００ｍＬのＰＴＦＥ製広口ボトルに移した。
（２−２）無水エチレンジアミン（東京化成工業製）０．６７ｍＬと超純水１９．３３ｍＬを混合して得た０．５Ｍエチレンジアミン水溶液２０ｍＬを添加し、シェーカーで撹拌しながら５０℃にて３時間反応させた。
（２−３）反応終了後、粒子をガラスフィルターで吸引ろ過し、ろ液がｐＨ６から８程度となるまで超純水で洗浄することにより、アミノ基を導入した粒子を得た。
（３）アミノ基導入粒子表面への蛍光色素の固定化
（３−１）（２）で得たアミノ基を導入した粒子をガラスフィルターで吸引ろ過しながらＤＭＳＯで洗浄し、粒子孔内を十分ＤＭＳＯで置換した後、アミノ基を導入した粒子が１０ｗｔ％となるようＤＭＳＯに懸濁させた。
（３−２）蛍光色素として、アミノ基と反応可能な蛍光色素ＡＴＴＯ−５６５−ＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用し、２００μＭとなるようＤＭＳＯに溶解した。
（３−３）（３−１）で得たアミノ基を導入した粒子懸濁液７．９２ｍＬと（３−２）で得られた蛍光色素溶液０．０８ｍＬとを５０ｍＬのコニカルチューブに入れ、シェーカーで撹拌しながら３５℃にて４時間反応させた。
（３−４）反応終了後、粒子をガラスフィルターで吸引ろ過しながら超純水で洗浄し、粒子孔内を十分超純水で置換することにより、蛍光色素を固定化した粒子を得た。
（４）蛍光強度の測定
（３）で得た蛍光色素固定化粒子を２×１０５個／ｍＬの濃度となるよう超純水に懸濁後、フローサイトメーターＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  １１（Ｍｅｒｃｋ製）に導入し、蛍光強度を測定した。結果、蛍光色素固定化粒子が高い蛍光強度を示しており、当該粒子表面上に蛍光色素が固定化していることを確認した。
【００４４】
実施例２  蛍光色素固定化粒子に残存するアミノ基のアセチル化
（１）実施例１で得た蛍光色素固定化粒子をガラスフィルターで吸引ろ過しながらＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（富士フイルム和光純薬製、以下ＤＭＦ）で洗浄することで粒子孔内を十分ＤＭＦで置換後、蛍光色素固定化粒子１００ｍｇを５０ｍＬコニカルチューブに秤量した。
（２）無水酢酸（富士フイルム和光純薬製）０．９４５ｍＬとＤＭＦ４．０５５ｍＬを混合して得た２ｍＭ無水酢酸／ＤＭＦ溶液５ｍＬを添加し、シェーカーで撹拌しながら５０℃にて２時間反応させることで、粒子に残存するアミノ基をアセチル化した。
（３）反応終了後、粒子をガラスフィルターで吸引ろ過しながらＤＭＦ、超純水の順で洗浄することで、粒子孔内を十分超純水で置換し、残存アミノ基をアセチル化した蛍光色素固定化粒子を得た。
【００４５】
実施例３  蛍光色素固定化粒子への陰イオン性ポリマー吸着（ＰＳＳ処理）
（１）実施例１で得た蛍光色素固定化粒子をガラスフィルターで吸引ろ過（サクションドライ）後、１．５ｍＬのマイクロチューブ４本に２．５ｍｇずつ粒子を秤量した。
（２）陰イオン性ポリマーとしてポリスチレンスルホン酸ナトリウム（以下、ＰＳＳ）を使用し、１ｗｔ％ＰＳＳ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を、マイクロチューブに１ｍＬずつ添加し、シェーカーで撹拌しながら室温にて１時間処理した。
（３）処理終了後、遠心分離機を用いて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。マイクロチューブに超純水１ｍＬを添加し粒子を分散させた後、再度遠心分離を行ない、上清を除去した（洗浄操作）。当該洗浄操作を３回繰り返し行なった後、超純水１ｍＬに懸濁し、ＰＳＳ処理蛍光色素固定化粒子を得た。
【００４６】
実施例４  アセチル化蛍光色素固定化粒子の保持率、蛍光強度およびゼータ電位測定
（１）試料の調製
実施例２で得たアセチル化蛍光色素固定化粒子を２×１０５個／ｍＬの濃度となるよう超純水に懸濁し、これを本実施例で用いる目的粒子を含む試料とした。
（２）保持部への保持
（１）で得た試料を図１および図３に示す粒子保持装置１００に導入し、交流電源１６０から電極１４１・１４２へ交流電圧（電圧：２０Ｖｐｐ、周波数：１ｋＨｚ、波形：矩形波）を３分間印加することで粒子保持装置１００が有する保持部１７０に粒子を保持させた。なお、粒子保持装置１００には、直径φ３０μｍ、深さ４０μｍの保持部１７０を約３０万個設けている。
（３）保持率の算出
顕微鏡（検出部３００）を用いて目視により、保持部１７０に保持された粒子数、および貫通部１３３内に導入されているものの保持部１７０には保持されていない粒子数を計測し、保持部１７０に保持された粒子数を貫通部１３３内に存在する全ての粒子数で除することで、保持部１７０へのアセチル化蛍光色素固定化粒子の保持率を算出した。
（４）蛍光強度の測定
（１）で得た試料をフローサイトメーターＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ１１（Ｍｅｒｃｋ製）に導入し、蛍光強度を測定した。
（５）ゼータ電位の測定
実施例２で得たアセチル化蛍光色素固定化粒子を２×１０６個／ｍＬの濃度となるよう超純水に懸濁後、ゼータ電位測定装置（大塚電子製ＥＬＳＺ）に導入し、ゼータ電位を測定した。
【００４７】
実施例５  ＰＳＳ処理蛍光色素固定化粒子の保持率、蛍光強度およびゼータ電位測定
目的粒子として実施例３で得たＰＳＳ処理蛍光色素固定化粒子を用いた他は、実施例４と同様な方法で保持率、蛍光強度およびゼータ電位を測定した。
【００４８】
比較例１
目的粒子として実施例１で得た蛍光色素固定化粒子を用いた他は、実施例４と同様な方法で保持率、蛍光強度およびゼータ電位を測定した。
【００４９】
比較例２
目的粒子として実施例１、２、３で得た粒子をそれぞれ用い、実施例４（２）において交流電圧を印加しなかった他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で保持率を測定した。
【００５０】
実施例４、５および比較例１、２で測定した保持率および蛍光強度の結果をまとめて表１に示す。なお表１において「×」は保持率８０％未満を、「○」は保持率１００％を、それぞれ示す。
【００５１】
【表１】
2020091218.tif 000003
【符号の説明】
【００５２】
１００：粒子保持装置
１１０：絶縁膜
１２０：遮光膜
１１１・１２１：貫通孔
１３０：スペーサ
１３１：導入口
１３２：排出口
１３３：貫通部
１４１・１４２：電極
１４１ａ：＋極
１４１ｂ：−極
１５０：導線
１６０：交流電源
１７０：保持部      
２００：目的粒子
３００：検出部
４００：誘電泳動力
５００：蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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