(57)【要約】【課題】癌処置の有効性における微生物叢の役割に関係し、そして、患者が癌処置の恩恵を受ける可能性が高いか判定する方法、並びに処置を必要としている患者における斯かる処置の有効性を改善するプロバイオティクスを提供すること。【解決手段】本発明は、患者が特定の細菌種の過剰出現を伴う腸微生物叢失調を有するか測定することによって、該患者が癌処置の利益を得る可能性が高いか決定する方法を提供する。本発明はまた、処置を必要としている患者において、癌処置、特に化学療法の有効性を改善するためのプロバイオティック菌株も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者に投与される抗腫瘍薬処置に対するアジュバントとしての使用のための、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌を含むプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記組成物がエンテロコッカス・ヒラエを含み、さらに、ポルフィロモナス、バーンシエラ、及びホールデマニアから成る群から選択される少なくとも１つの菌株を含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項３】
前記組成物がラクトバチルス・ジョンソニー株をさらに含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１又は２に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４】
前記エンテロココッカス・ヒラエ菌株が、番号Ｉ−４８１５として、２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された菌株である、請求項１に記載の使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項５】
前記プロバイオティクス組成物が経口投与のために処方される、請求項１に記載の使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項６】
前記プロバイオティクス組成物が、処置を必要としている患者に抗腫瘍薬処置の投与後に投与される、請求項１に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項７】
前記抗腫瘍薬処置が化学療法薬による処置である、請求項１又は請求項６に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項８】
前記抗腫瘍薬処置が、ワクチンアジュバントとしての化学療法薬を伴った抗癌ワクチンである、請求項１又は請求項６に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項９】
前記化学療法薬がシクロホスファミド（ＣＴＸ）である、請求項７又は請求項８に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１０】
前記患者が、前記プロバイオティクス組成物中に存在する種の低出現を伴う微生物叢失調を患っている、請求項１及び６〜９のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１１】
癌処置における使用のために前記個人に投与されたとき、個人の腸微生物叢のフィルミクテス／バクテロイデテス比を低下させるか、又はＳＦＢ及び／又はポルフィロモナス科を特に増加させる、及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる、化学療法薬と抗生物質組成物との組み合わせ。
【請求項１２】
前記抗生物質組成物が、バンコマイシン＋イミペナム及びネオマイシン＋セファロチンから成る群から選択される、請求項１１に記載の使用のための、請求項１１に記載の組み合わせ。
【請求項１３】
前記化学療法薬がシクロホスファミド（ＣＴＸ）である、請求項１１に記載の使用のための、請求項１１又は１２に記載の組み合わせ。
【請求項１４】
前記抗生物質組成物が、癌を患っている患者に、前記患者への化学療法薬投与前に投与される、請求項１１に記載の使用のための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
前記患者に投与される化学療法薬の抗癌効果を増強するように患者の腸微生物叢を調節するための使用のための、前記個人に投与されたときに、個人の腸微生物叢のフィルミクテス／バクテロイデテス比を低下させるか又はＳＦＢを特に増加させる、及び／又はポルフィロモナス科及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる、抗生物質組成物。
【請求項１６】
前記抗生物質組成物が、バンコマイシン＋イミペナム及びネオマイシン＋セファロチンから成る群から選択される、請求項１５に記載の使用のための、請求項１５に記載の抗生物質組成物。
【請求項１７】
前記化学療法薬がシクロホスファミド（ＣＴＸ）である、請求項１５に記載の使用のための、請求項１５又は１６に記載の抗生物質組成物。
【請求項１８】
癌患者に投与される抗腫瘍薬処置に対するアジュバントとしての使用のための、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、エンテロコッカス・フェカリス、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記組成物がエンテロコッカス・ヒラエの断片を含み、さらに、ポルフィロモナス、バーンシエラ、及びホールデマニアから成る群から選択される少なくとも１つの菌株の断片を含む、請求項１８に記載の使用のための、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記エンテロココッカス・ヒラエ菌株が、番号Ｉ−４８１５として、２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された菌株である、請求項１８に記載の使用のための、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記組成物が皮下又は筋肉内投与のために処方される、請求項１８に記載の使用のための、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロバイオティクス組成物又は請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物で生体外においてパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物。
【請求項２３】
前記ＡＰＣがまた、腫瘍抗原でも生体外においてパルスされた、請求項２２に記載の細胞組成物。
【請求項２４】
樹状細胞を含む、請求項２２又は２３に記載の細胞組成物。
【請求項２５】
癌を処置するための、抗腫瘍薬処置と組み合わせた養子細胞移植における使用のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細胞組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、節内注射、静脈内注射又は皮下注射のために処方される、請求項２５に記載の使用のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細胞組成物。
【請求項２７】
癌患者由来のＴ細胞を、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細胞組成物と、生体外において接触させる方法によって得られた免疫記憶Ｔ細胞を含む細胞組成物。
【請求項２８】
癌を処置するための、抗腫瘍薬処置と組み合わせた養子細胞移植における使用のための、請求項２７に記載の細胞組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、節内注射、静脈内注射又は皮下注射のために処方される、請求項２８に記載の使用のための、請求項２７に記載の細胞組成物。
【請求項３０】
前記抗腫瘍薬処置が化学療法を含む、請求項２５〜２８のどいずれか１項に記載の使用のための、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
【請求項３１】
前記化学療法がＣＴＸ投与を含む、請求項３０に記載の使用のための、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
【請求項３２】
前記抗腫瘍薬処置が抗腫瘍ワクチン接種をさらに含む、請求項３０又は３１に記載の使用のための、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
【請求項３３】
インビトロにおいて、化学療法に対する優れた応答者である可能性が高い患者を同定する方法であって、前記患者のＴＬＲ４、ＮＯＤ１及びＮＯＤ２の機能性を測定することを含み、ここで、前記患者が、機能的なＴＬＲ４及び／又はＮＯＤ１及び／又はＮＯＤ２を欠いている場合、該患者が化学療法に対する優れた応答者として同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌処置の分野に関する。特に、本発明は、癌処置の有効性における微生物叢の役割に関係し、そして、患者が癌処置の恩恵を受ける可能性が高いか判定する方法、並びに処置を必要としている患者における斯かる処置の有効性を改善するプロバイオティクスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来の癌処置は、患者の腫瘍性細胞を根絶するための化学療法、外科手術、ホルモン療法、及び／又は放射線処置の組み合わせを伴う。癌化学療法は、複製細胞を殺滅する薬剤であって、できれば、その殺滅が、作用物質が患者の正常細胞を殺滅するより速い薬剤の使用に基づいている。外科手術は、腫瘍バルクを削減するのに使用されるが、しかし、一旦癌が転移すると、わずかな効果しかない。放射線は局部だけで有効である。これらのアプローチのすべてが、著しい欠点、及び感染症にかかりやすくなるなどの追加リスクをもたらす。
【０００３】
癌療法への更なるアプローチは、腫瘍自体を標的とすることよりむしろ又はそれに加えて免疫系を標的とすること（「免疫療法」）である。
しかしながら、検出及び処置の進歩にもかかわらず、多くの治療プロトコールが生存率に対してわずかしか貢献しておらず、斯かる処置の費用対効果やクオリティオブライフに与える影響が問われている。最近、従来の化学療法ベース及び放射線療法ベースの癌処置の抗腫瘍効果に対する先天性及び順応性免疫系の重要な貢献が説明された（Kroemer et al., 2013; Zitvogel et al., 2008）。
【０００４】
腸の共生細菌が哺乳類の免疫を大きく構築していることは、現在十分に確立されている（Hooper et al., 201 12）。細菌生態系の不均衡を引き起こす腸微生物叢失調は、慢性炎又は局所的な免疫抑制を促進することによって結腸発癌を助長する能力がある一部の細菌の過剰に通じる（Grivennikov et al., 2012; Wu et al., 2009）。しかしながら、非消化器癌への微生物叢失調の影響は未知である。
【０００５】
抗癌化学療法剤は、抗生物質での処置を必要とする２つの合併症、粘膜炎（細菌トランスロケーションに関連している消耗性粘膜関門傷害）及び好中球減少症の原因となることが多く、そしてそれが、今度は微生物叢失調をもたらす可能性がある（Ubeda et al, 2010; van Vliet et al., 2010）。
そのため、（相乗効果でなくても）化学療法及び／又は放射線や免疫などの処置の間の建設的な相互作用に有利に働く、改善された癌処置の開発に関して切迫した需要が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これに関連して、発明者らは、シクロホスファミド（ＣＴＸ）がマウスの小腸微生物叢の組成物を変更し、グラム＋細菌のうちの選択種の二次リンパ器官への移行を引き起こすことを観察した。そこでは、これらの細菌が「病害性」Ｔヘルパー１７（ｐＴｈ１７）細胞と免疫記憶Ｔｈ１免疫応答の一部の産生を刺激する。発明者らはまた、抗生物質で処置してグラム＋細菌を殺滅した無菌マウス又は宿主が、ｐＴｈ１７細胞が養子移植されない限り、低下したｐＴｈ１７応答及びＣＴＸに対する相対化学療法抵抗性を示すことを実証した。そのうえ、微生物叢失調は、他の抗癌化学療法剤（アントラサイクリン系やオキサリプラチンなど）の活性を妨げた。これらの結果は、抗癌性免疫応答を構築する際の腸微生物叢の決定的役割を明らかにする。これらの結果、並びに腸微生物叢と抗腫瘍薬処置との相互作用に関連する他の結果は、最近のいくつかの刊行物で再検討されている（Dzutsev et al., 2014; Viaud et al., Cancer Res., 2014; Viaud et al., Cell Death Differ., 2014 and Viaud et al., Oncoimmunology, 2014）。
【０００７】
本発明は、癌患者に投与される抗腫瘍薬処置へのアジュバントとして使用できるプロバイオティクス組成物を提供し、ここで、前記プロバイオティクス組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス（Porphyromonas）、バーンシエラ（Barnesiella）、ホールデマニア（Holdemania）及びその混合物の中から選択される細菌を含む。
本発明の別の態様は、癌を患っている患者を処置するための、個人に投与すると前記個人の腸微生物叢のフィルミクテス（firmicutes）／バクテロイデテス（bacteroidetes）比を低下させる、ＳＦＢ及び／又はポルフィロモナス科（Porphyromonadaceae）を特に増大させる、及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる化学療法薬と抗生物質組成物の組み合わせの使用である。
【０００８】
本発明はまた、前記患者に投与した化学療法薬の抗癌効果を増強するように患者の腸微生物叢を調節するための先に記載したものなどの抗生物質組成物の使用に関する。
エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物、並びに癌患者に投与される抗腫瘍薬処置へのアジュバントとしてその使用もまた本発明の一部である。
本発明は更に、細胞組成物、及び化学療法薬と組み合わせた養子細胞移植におけるその利用に関係する。
【０００９】
第一の細胞組成物は、先に記載のプロバイオティクス組成物又は免疫原性組成物で生体外においてパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及び第二の細胞組成物は、癌患者由来のＴ細胞を先に規定した第一の細胞組成物と生体外で接触させるプロセスによって得られた免疫記憶Ｔ細胞を含む。
本発明はまた、化学療法に対して優れた応答者である可能性が高い患者を同定するインビトロにおける方法であって、前記患者でＴＬＲ４、ＮＯＤ１、及びＮＯＤ２の機能性を測定することを含み、ここで、前記患者が機能的なＴＬＲ４及び／又はＮＯＤ１及び／又はＮＯＤ２を欠いている場合、該患者が化学療法に対する優れた応答者として同定される方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、インビトロにおける、癌患者が抗腫瘍薬処置の恩恵を受けるかどうか決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）例えば、十二指腸又は回腸粘膜の生検検体、又は患者からの糞便サンプルから得た、前記患者からの適切な生物学的サンプルから癌処置の具体的状況の中で「好ましくない」細菌、例えば、前記患者の腸微生物叢の種パラバクテロイデス・ディスタノニス（Parabacteroides distasonis）及びフェカリバクテリウム・プラウスニッツイー（Faecalibacterium prausnitzii）、並びに属ゲミガー（Gemmiger）、アリスチペス（Alistipes）及びクロストリジウム属クラスタＩＶを含む又はそれらから成る群由来の細菌、の相対量を測定し；
（ｉｉ）腸微生物叢失調の存在又は不存在を決定すること、
を含み、ここで、「好ましくない」細菌の過剰発現を伴った腸微生物叢失調が、該患者が抗腫瘍薬処置に対する優れた応答者でないことを示す、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、インビトロにおける、癌患者に関して抗腫瘍薬処置を続けるべきか又は中止されるべきか決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記患者からの生物学的サンプル、例えば、前記抗腫瘍薬処置の開始から３〜９週間、好ましくは６〜９週間後に入手した血液サンプルなどから、少なくとも１つの片利共生種の細菌に対する、例えばＬ．ジョンソニー、Ｅ．ヒラエ、及び／又はＥ．フェカリスに対する免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析し；
（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析するそれぞれの片利共生種について、応答を以下のカテゴリ：
−免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答なし；
−Ｔｈ１０表現型の免疫記憶応答；
−Ｔｈ１表現型の免疫記憶応答、
のうちの１つに分類することを含み、ここで、Ｔｈ１表現型の免疫記憶応答が少なくとも１つの片利共生種に関して観察される場合、該抗腫瘍薬処置が続けられ、そして、斯かる応答の不存在では、該抗腫瘍薬処置が中止される、方法を提供する。
【００１２】
応答の分類は、例えば、生体外における再刺激アッセイにおいて処置前後のサイトカイン分泌を比較することによって行われる。
本発明はまた、インビトロにおける、患者に投与されたネオアジュバント抗腫瘍薬処置の生物学的効果を決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）例えば、患者由来の十二指腸又は回腸粘膜の生検検体から得られた、前記患者由来の適切な生物学的サンプルから、前記微生物叢中の、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウム属を含めた第一群由来の細菌の相対量を測定し、
（ｉｉ）同じ生物学的サンプルから、前記腸微生物叢中の、パラバクテロイデス・ディスタノニス、フェカリバクテリウム・プラウスニッツイー、ゲミガー、アリスチペス及びクロストリジウム属クラスタＩＶを含めた第二群由来の細菌の相対量を測定し；
（ｉｉｉ）第一群由来の細菌の存在量と第二群由来の細菌の存在量の間の比を計算すること、
を含み、ここで、前記比が予定された閾値を超えている場合、結果は、ネオアジュバント抗腫瘍薬処置がＴ−ｂｅｔ／Ｔｈ１局所的及び全身的免疫応答を引き起こしたことを示す方法に関係する。
【００１３】
本発明の別の目的は、Ｔ−ｂｅｔ／Ｔｈ１局所的及び全身的免疫応答を誘発するために抗悪性腫瘍薬と組み合わせて使用するための、ラクトバチルス・ジョンソニー（特に菌株ＣＮＣＭ １−４８２３）及びエンテロコッカス・ヒラエ（特に菌株ＣＮＣＭ １−４８１５）及びエンテロコッカス・フェカリスから成る群から選択されるプロバイオティクス菌株、並びにそれを含んでいる組成物である。
【００１４】
本発明はまた、癌を処置するための抗腫瘍薬処置と組み合わせて、前記癌患者において、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−２３の混合物の存在下で未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することによって癌患者から得られた細胞を養子細胞移植することにも関係する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１：シクロホスファミドは腸粘膜構造を破壊する。（Ａ〜Ｂ）．Ｃ５７ＢＬ／６未処置マウスにおけるＮａＣｌ（Ｃｏ）、ＣＴＸ又はドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）処置４８ｈ後の小腸上皮のヘマトキシリン−エオシン染色（Ａ）。示した炎症病巣の数／ｍｍ（Ｂ、左のパネル、Ａにくさび形で示した）、水腫を反映する粘膜固有層の厚さ（Ｂ、中央パネル、Ａに＃で示した）及び低下した絨毛の長さ（Ｂ、右のパネル、Ａにくさび形で示した）を、ＣＴＸ又はＤｏｘｏ処置マウス由来の５個の回腸で１００個の絨毛／回腸について評価された。
【図１Ｂ】図１：シクロホスファミドは腸粘膜構造を破壊する。（Ａ〜Ｂ）．Ｃ５７ＢＬ／６未処置マウスにおけるＮａＣｌ（Ｃｏ）、ＣＴＸ又はドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）処置４８ｈ後の小腸上皮のヘマトキシリン−エオシン染色（Ａ）。示した炎症病巣の数／ｍｍ（Ｂ、左のパネル、Ａにくさび形で示した）、水腫を反映する粘膜固有層の厚さ（Ｂ、中央パネル、Ａに＃で示した）及び低下した絨毛の長さ（Ｂ、右のパネル、Ａにくさび形で示した）を、ＣＴＸ又はＤｏｘｏ処置マウス由来の５個の回腸で１００個の絨毛／回腸について評価された。
【図１Ｃ】（Ｃ）．典型的なムチン含有杯細胞を含んでいる回腸絨毛の代表的な顕微写真を、ビヒクル及びＣＴＸ又はＤｏｘｏで処置したマウスにおいて示す（左のパネル）。杯細胞の数／絨毛を、両化学療法剤について右のパネル内で数えた。
【図１Ｄ】（Ｄ）．パネート細胞の特異染色が２つの代表的な免疫蛍光法顕微写真に示されている（Ｄ、左のパネル）。パネート細胞の定量化を、２４〜４８時間にＮａＣｌ（Ｃｏ）又はＣＴＸで処置されたマウスから採取した６個の回腸におけるリゾチーム陽性クラスタの平均面積を計測することによって実施した。
【図１Ｅ】（Ｅ）．１８時間にＣＴＸで処置されたマウスからの十二指腸及び回腸粘膜固有層細胞におけるリゾチームＭ及びＲｅｇＩＩＩγ転写レベルの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。３つの独立した実験からの連結した３〜４匹のマウス／群の正規化されたΔＣＴの平均±ＳＥＭ。
【図１Ｆ】（Ｆ）．２用量のＣＴＸ後１８時間における４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン血漿蓄積を計測するインビボにおける腸透過性アッセイ。４つの独立した実験からのすべてのデータを示すグラフであって、それぞれのドットが１匹のマウスを表す（ｎ＝１３〜１５）。データをｔ−検定で分析した。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】図２：シクロホスファミドは、粘液関連微生物叢失調及び二次リンパ器官における微生物の細菌トランスロケーションを誘発する。（Ａ〜Ｂ）．ＣＴＸ又はＤｏｘｏ後４８時間に、未処置マウスからの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）及び脾臓細胞を、好気性及び嫌気性条件下で培養し、そして、ＮａＣｌ（Ｃｏ）（ｎ＝１０〜１６）、ＣＴＸ（ｎ＝１２〜２７）又はＤｏｘｏ（ｎ＝３〜１７）（３〜４つの実験）で処置された各マウスからコロニーを数え（Ａ）、質量分析法によって同定し（Ｂ）。ＮａＣｌ対照では、細菌同定の試みがほとんど失敗し、６７％のラクトバチルス・ムリヌス（Lactobacillus murinus）を得た（未掲載）。データをｔ−検定で分析した。
【図２Ｂ】図２：シクロホスファミドは、粘液関連微生物叢失調及び二次リンパ器官における微生物の細菌トランスロケーションを誘発する。（Ａ〜Ｂ）．ＣＴＸ又はＤｏｘｏ後４８時間に、未処置マウスからの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）及び脾臓細胞を、好気性及び嫌気性条件下で培養し、そして、ＮａＣｌ（Ｃｏ）（ｎ＝１０〜１６）、ＣＴＸ（ｎ＝１２〜２７）又はＤｏｘｏ（ｎ＝３〜１７）（３〜４つの実験）で処置された各マウスからコロニーを数え（Ａ）、質量分析法によって同定し（Ｂ）。ＮａＣｌ対照では、細菌同定の試みがほとんど失敗し、６７％のラクトバチルス・ムリヌス（Lactobacillus murinus）を得た（未掲載）。データをｔ−検定で分析した。
【図２Ｃ】（Ｃ）．微生物組成（属レベル）を、未処置マウス及びＢ１６Ｆ１０腫瘍担持体の回腸及び盲腸からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４５４パイロシークエンシングによって分析した。主成分分析（ＰＣＡ）は、マウス微生物叢（各ドットは１匹のマウスを表す）の固有のクラスタが処置（ＮａＣｌ：Ｃｏ、灰色のドット；ＣＴＸ処置、黒色のドット）に依存していることを明らかにした。モンテカルロ順位検定を、これらのクラスタの有意性を評価するために適用した。
【図２Ｄ】（Ｄ）．小腸粘膜に関連している様々な細菌群の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を、ＣＴＸ若しくはＮａＣｌ（Ｃｏ）処置、未処置、又はＭＣＡ２０５癌担持マウスに対して実施した。絶対値を、全細菌、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、及びクロストリジウム属第ＩＶ群について計算し、サンプルの希釈及び重量によって標準化した。検量線を、各細菌群からの既知濃度のゲノムＤＮＡの段階希釈から、閾値サイクル（Ｃｔ）対細菌数（ＣＦＵ）をプロットすることによって作製した。点線より下の点は検出閾値未満であった。データを、線形モデル又は一般化線形モデルで分析した。＊、ｐ＜０．５、＊＊、ｐ＜０．１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【図３Ａ】図３：ＣＴＸ誘発ｐＴｈ１７エフェクター及び免疫記憶Ｔｈ１応答は腸微生物叢に依存した。（Ａ）．無菌（ＧＦ）又は従来の特定病原菌未感染（ＳＰＦ）状態（左のパネル）で育て、そして、ＡＴＢ又はバンコマイシン（Ｖａｎｃｏ）（右のパネル）で処置した又は処置していないＣＴＸ対ＮａＣｌ処置動物からの脾細胞を、４８ｈ、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ Ａｂを使用して架橋した。ＩＬ−１７をＥＬＩＳＡによって評価した。２〜９匹のマウス／群を含む２〜３の実験が示され、各ドットが１匹のマウスを表している。
【図３Ｂ】（Ｂ）．特定の粘膜細菌の数と脾臓Ｔｈ１７特徴との相関関係。各ドットは、腫瘍を担持していない（丸いドット）、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ダイヤモンド形のドット）又はＭＣＡ２０５肉腫（四角いドット）を担持している１匹のマウスを表し、白抜きのドットはＮａＣｌ処置マウスを特徴とし、そして、塗りつぶしたドットはＣＴＸ処置動物を示す。
【図３Ｃ】（Ｃ）．ＡＴＢ又は対照としての水の投薬計画下、ＮａＣｌ又はＣＴＸ処置のいずれかの７日間後に癌非担持マウスから採取した脾細胞の細胞内分析。２〜８の独立した実験における、ＩＦＮγ＋Ｔｈ１７細胞、ＲＯＲγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の中のＴ−ｂｅｔ＋細胞及びＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の中のＣＸＣＲ３＋細胞のパーセンテージの平均±ＳＥＭ、そして、各ドットが１匹のマウスを表す。
【図３Ｄ】（Ｄ）．ＡＴＢ処置後に、指示した細菌種を口腔内再構成した（orally-reconstituted）未処置マウスから、ＣＴＸ処置の７日間後に採取した総脾細胞の細胞内染色。
【図３Ｅ】（Ｅ）．ＣＴＸ又はＮａＣｌ（Ｃｏ）処置の７日間後、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２４時間、低減した量の細菌と共に添加した骨髄樹状細胞（ＢＭ−ＤＣｓ）により生体外で再び刺激した。ＥＬＩＳＡによって観察されたＩＦＮγ放出を示している。試験されたマウスの総数のうちの（ＮａＣｌベースライン閾値に基づく）応答マウスの数を示す（ｎ）。統計的比較は対応のあるｔ−検定に基づいた。データを、β回帰又は線形モデル及び修正ケンドールタウからの相関分析を用いて分析した。＊、ｐ＜０．０５、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【図４Ａ】図４：バンコマイシンは、化学療法の殺腫瘍活性に必須であるＣＴＸ誘発性ｐＴｈ１７分化を鈍化させる。（Ａ）．広域スペクトルＡＴＢでの３週間にわたる前処置後に、ＤＢＡ２マウスにＰ８１５肥満細胞腫を接種し（０日目）、６日目にＣＴＸ（矢印）で処置し、そして、腫瘍増殖を観察した。腫瘍増殖動態を図１３Ａに示し、そして、屠殺時点での無腫瘍マウスのパーセンテージを１１〜１４匹のマウス／群から成る２つの実験について示す。
【図４Ｂ】（Ｂ）．ＭＣＡ２０５肉腫を、適宜セグメント細菌（ＳＦＢ）の単独群叢を伴った特定病原菌未感染（ＳＰＦ）又は無菌（ＧＦ）マウスに０日目に接種し、ＣＴＸ（矢印）で処置し、そして、増殖動態について観察した（平均±ＳＥＭ）。２〜３の実験のうちの代表的な１つの実験（ｎ＝５〜８匹のマウス／群）がＧＦマウスについて示され、そして、２つの統合された実験（ｎ＝１４匹のマウス／群）はＳＰＦマウスについて示されていた。
【図４Ｃ】（Ｃ）．バンコマイシン又はコリスチンによる３週間のコンディショニング後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５肉腫を接種し（０日目）、１２〜１５日目にＣＴＸで処置し（矢印）、そして、腫瘍増殖を観察した。２つの独立した実験（ｎ＝１５〜２０匹のマウス／群）からの連結データがコリスチン処置について示されており、そして、１つの代表的な実験（ｎ＝６匹のマウス／群）がバンコマイシン処置について示されている。
【図４Ｄ】（Ｄ）．８週齢のＫＰ（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／ＷＴ；ｐ５３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ）マウスに、肺腺癌を引き起こすために鼻腔内滴下によってＣｒｅリコンビナーゼ（ＡｄＣｒｅ）を発現するアデノウイルスを与えた（ｄ０）。ＡｄＣｒｅ後ｄ７７にマウスのサブグループ（「Ｃｈｅｍｏ＋Ｖａｎｃｏ」）にバンコマイシンが開始された。バンコマイシン開始１週間後に、ＣＴＸベースの化学療法が、化学療法（「Ｃｈｅｍｏ」）しか受けていないマウス又は並行してバンコマイシン（「Ｃｈｅｍｏ＋Ｖａｎｃｏ」）を受けているマウスにｉ．ｐ．で適用された。マウスは、ｄ８４、ｄ９１、及びｄ９８に化学療法を受けた。対照群は未処置のままであった（「Ｃｏ」）。データは、全肺腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）の発展がｄ７３〜ｄ１００の間の非侵襲性造影によって６〜１２匹のマウス／群において評価されたことを示す。
【図４Ｅ】（Ｅ）．図３Ｃのとおり、樹立された（１５〜１７日）ＭＣＡ２０５腫瘍を担持する無処置又はバンコマイシン処置マウス由来の脾臓内のｐＴｈ１７の細胞数を、ＣＴＸ処置の７日後に測定した。各ドットは、統合された２つの実験からの１匹のマウスを表す。
【図４Ｆ】（Ｆ）．ＣＤ３＋及びＣＤ４＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を、水又はバンコマイシンで処置されたマウスにおける１８日目の樹立されたＭＣＡ２０５腫瘍（ＣＴＸの８日後）から摘出した生きたＣＤ４５＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）にゲーティングすることによって実施した。各ドットは、最大で４つの統合された実験からの１匹のマウスを表す。
【図４Ｇ】（Ｇ）．水又はバンコマイシンによって３週間前処置されたＷＴマウスにおいて樹立されたＭＣＡ２０５腫瘍をＣＴＸと一緒に注射し（矢印）、そして、腫瘍増殖を観察した。ＣＴＸ後７日目の時点で、３００万個の生体外発生したＴｈ１７又はｐＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞を静脈内に注射した。２〜１０匹のマウス／群を含む最大３つの実験を統合した。データを、ｔ−検定、線形モデル又は一般化線形モデルのいずれかで分析した。＊、ｐ＜０．５、＊＊、ｐ＜０．１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【図５Ａ】図５：ＣＴＸ後の２４又は４８ｈの微生物叢失調の欠如。（Ａ）．様々な時点（ＣＴＸ後０、２４、４８時間）における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の高性能４５４パイロシークエンシングによって評価された腸微生物叢の全体的な組成。各列は、ｔ０（ＣＴＸ注射前）、ｔ２４及びｔ４８（ＣＴＸ後２４及び４８時間）の１匹のマウスの小腸粘膜微生物叢由来のデータを表す。異なった属の代表性に関する正のグラジエント（Ｌｏｇ１０変換の色分け地図）が示されている。統計的分析：ｔ０〜ｔ２４又はｔ４８時間の間でｎｓ。
【図５Ｂ】（Ｂ〜Ｃ）．クロストリジウム属クローン４０及びＬ．ロイテリ（L.reuteri）に関するパイロシークエンシングデータの詳細な例。材料と方法に詳述されている時間外のラクトバチルス属量のｑＰＣＲ分析。
【図５Ｃ】（Ｂ〜Ｃ）．クロストリジウム属クローン４０及びＬ．ロイテリ（L.reuteri）に関するパイロシークエンシングデータの詳細な例。材料と方法に詳述されている時間外のラクトバチルス属量のｑＰＣＲ分析。
【図６】図６：ＣＴＸ処置されたマウスの回腸における細菌属の配分。ＮａＣｌ（Ｃｏ）及びＣＴＸ処置動物からの小腸内の属の相対量のＬｏｇ１０変換の色分け地図。ＣＴＸ治療法前に、動物のサブグループに腫瘍を接種した（ＴＢ＋）。微生物叢全体のうちの０．０５％超を示す細菌属だけを提示する。相対量データに対する適用されたＬｏｇ１０変換を、材料と方法の項の微生物叢で説明した。非特異的クラスタリング法を色分け地図構築のために適用した。各属のＣｏとＣＴＸの間のパーセンテージの平均デルタを、細菌属を順序づけするために計算した。ＣＴＸは、ＣＴＸ処置動物の粘液において、４つの属及び群がその中に配分するファーミキューテス（Firmicutes）門の細菌群（クロストリジウム属クラスタＸｌＶａ、ロゼブリア（Roseburia）、未分類ラクノスピラ（Lachnospiraceae）、コプロコッカス（Coprococcus）、表２）の低減を引き起こした。ＣＴＸはまた、スピロヘータ門（Spirochaetes phylum）（ｐ＝０．０１６）、特にトレポネーマ属（Treponema genus）の割合の低減にも関連していた（ＮａＣｌ群における０．０２５％対ＣＴＸ群における０％、ｐ＝０．０１６）。種のレベルでは、ある細菌は、ＣＴＸ後に過剰（ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）など）であるか、又は不足（ラクノスピラ科から及びクロストリジウム属クラスタＸｌＶａからのクロストリジウム属クローン４０や他の酪酸産生菌など）であった（図２Ｂ）。セグメント細菌Ｘ７７８１４（ＳＦＢ）は、対照と比べてＣＴＸで処置したマウスにおける一貫した濃縮を明らかにしなかった（ＣＴＸにおける７．９５％のＳＦＢ対ビヒクル対照における０．８３％、ｐ＝０．０８、表２）。ウイルコクソン検定：＊、ＴＢ−群におけるＣｏ対ＣＴＸにおいてｐ＜０．０５、‡、ＴＢ＋群におけるＣｏ対ＣＴＸにおいてｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７：小腸細菌種と相関がある十二指腸固有層におけるＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋及びＴｈ１７細胞の喪失と脾細胞のＴｈ１極性化。（Ａ）．小腸のＬＰにおける樹状細胞（ＤＣ）サブセット。ＣＴＸ注射後０日目、３日目、及び７日目の小腸及び大腸のＬＰにおける様々なＤＣサブセットのフローサイトメトリー分析及び定量化。グラフは、２つの連結された実験における７匹のマウス／時点のＤＣに関するパーセンテージの平均＋ＳＥＭを図示する。大腸ＤＣサブセットは、ＣＴＸによって影響を受けなかった（未掲載）。データをマンホイットニーｔ−検定によって分析した。（Ｂ〜Ｃ）．ＣＴＸ７日後のＴｈ１７細胞の変化。
【図７Ｂ】（Ｂ）．ＮａＣｌ対ＣＴＸで処置したマウスから採取した、十二指腸及び回腸のＬＰから分離したリンパ球のフローサイトメトリー分析。グラフは、８つの独立した実験からの連結データを図示し、そして、各ドットは１つの実験を表す。統計的比較はウイルコクソン検定に基づいた。
【図７Ｃ】（Ｃ）．左のパネル：ＮａＣｌ対ＣＴＸの処置されたマウスにおける回腸の蛍光抗体染色の顕微鏡写真の画像。γδＴＣＲ＋細胞を、抗γδ□ＴＣＲ Ａｂを使用して緑色（Alexa Fluor488）に染色し、そして、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ Ａｂを使用して青色（Alexa Fluor647）に染色した。右のパネル：陽性細胞のカウントを、３個の回腸における１００の絨毛に対して２人の別々の研究者によって実施した。
【図７Ｄ】（Ｄ）．ＣＴＸ注射後７日目における脾細胞のＴｈ１極性化。ＣＴＸ対ＮａＣｌ処置動物からの脾細胞を、ＧＦ又は従来のＳＰＦ条件（左のパネル）において培養し、そして、ＡＴＢ又はバンコマイシン（右のパネル）で処置した又は処置していないものを、４８ｈ、抗ＣＤ３±抗ＣＤ２８ Ａｂｓを使用して架橋した。ＩＦＮγのレベルを、ＥＬＩＳＡによって４８時間の上清において観察した。２〜９匹のマウス／群を含む３つの実験を示し、そして、各ドットが１匹のマウスを表す。（Ｃ）及び（Ｄ）からのデータをｔ−検定で分析した。
【図７Ｅ】（Ｅ）．図３Ｃのものと同様であるが、未処置、Ｂ１６Ｆ１０又はＭＣＡ２０５腫瘍担持細胞においてそれぞれの細菌群と図６（Ｃ）に示したＩＦＮγ□分泌プロファイルの間の相関関係を分析した。
【図７Ｆ】（Ｆ）．ＣＴＸ後７日目にて図３Ｃで数えた脾臓ｐＴｈ１７細胞のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、ｎｓ、有意ではない。
【図８Ａ】図８：ドキソルビシンは、脾臓におけるｐＴｈ１７細胞を誘発せず、腫瘍増殖を低減するために腸の片利共生を必要としない。（Ａ〜Ｂ）．ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）はＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する脾臓ＩＬ−１７を誘発しない。Ｄｏｘｏを、指示した用量（Ａ）又は２ｍＭにて５０μｌの固定用量（体重２０ｇのマウスでは３ｍｇ／ｋｇ）（Ｂ）にてマウスにｉ．ｐ．注射し、そして、脾細胞を７日後に採取して、４８時間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８架橋に応答したＩＬ−１７産生（Ａ、Ｂ）又はＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＲＯＲγｔ＋表現型を有する細胞の頻度を評価するためにフローサイトメトリーによって測定した（Ｂ）。１００ｍｇ／ｋｇの用量で使用されるシクロホスファミド（ＣＴＸ）は、正の対照として使用された。適宜、制御性Ｔ細胞を抗ＣＤ２５ Ａｂの注射（２５０ｇ、Ｄｏｘｏ投与の１又は３日前）によって枯渇させ、そして、無関係なアイソタイプ対応対照Ａｂを対照として使用した。
【図８Ｂ】図８：ドキソルビシンは、脾臓におけるｐＴｈ１７細胞を誘発せず、腫瘍増殖を低減するために腸の片利共生を必要としない。（Ａ〜Ｂ）．ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）はＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する脾臓ＩＬ−１７を誘発しない。Ｄｏｘｏを、指示した用量（Ａ）又は２ｍＭにて５０μｌの固定用量（体重２０ｇのマウスでは３ｍｇ／ｋｇ）（Ｂ）にてマウスにｉ．ｐ．注射し、そして、脾細胞を７日後に採取して、４８時間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８架橋に応答したＩＬ−１７産生（Ａ、Ｂ）又はＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＲＯＲγｔ＋表現型を有する細胞の頻度を評価するためにフローサイトメトリーによって測定した（Ｂ）。１００ｍｇ／ｋｇの用量で使用されるシクロホスファミド（ＣＴＸ）は、正の対照として使用された。適宜、制御性Ｔ細胞を抗ＣＤ２５ Ａｂの注射（２５０ｇ、Ｄｏｘｏ投与の１又は３日前）によって枯渇させ、そして、無関係なアイソタイプ対応対照Ａｂを対照として使用した。
【図８Ｃ】（Ｃ）．特定病原菌未感染（ＳＰＦ）、抗生物質（ＡＴＢ）処置、及び無菌マウスにおける樹立されたＭＣＡ２０５に対するドキソルビシンの抗癌効果。腫瘍増殖（平均粒径±ＳＥＭ）の動態を、４〜６匹の動物／群を含んでいる２〜３つの統合された実験で図示する。データを、ｔ−検定、線形モデル又は一般化線形モデルで分析した。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【図９】図９：未処置又は癌担持マウスの糞便からの細菌の喪失における広範囲ＡＴＢの有効性。糞便を、未処置のままであったか又は様々な時点において広範囲ＡＴＢで処置されたマウスから新たに採取し、好気性又は嫌気性条件のための血液寒天平板、並びにエンテロコッカス特異的増殖のためのＤＣＯ寒天平板（BioMerieux）上で平板培養した。培養４８ｈ後に、単離されたコロニーを数えた。それぞれの異なった実験のすべてのマウスを、このように観察しスコア化した。１つの代表的な観察を示す。
【図１０】図１０：ＣＴＸ誘発ｐＴｈ１７分化は、Ｎｏｄ１／２ではなく、Ｍｙｄ８８に依存する。（Ａ）．（抗ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮγ、及びＩＬ−１７ Ａｂｓを用いた細胞内及び細胞外染色を使用して）ＰＭＡ／イオノマイシンと共に４時間再刺激されたＮａＣｌ対ＣＴＸで処置したＷＴ（図３Ｃのように）及びＮｏｄ２−／−対Ｍｙｄ８８−／−マウスから採取したリンパ球のフローサイトメトリー分析。グラフは、２つの独立した実験からのＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の中のＩＦＮγ＋陽性細胞の平均パーセンテージを明らかにし、そして、各ドットは１匹のマウスを表す。（Ｂ）．Ｎｏｄ１及びＮｏｄ２は、ＣＴＸによって誘発された腫瘍増殖減退のための不必要である。５及び１２日目のＣＴＸ投与前に、ＭＣＡ２０５腫瘍をＷＴ又はＮｏｄ１−／−Ｎｏｄ２−／−マウスにおいて樹立した。腫瘍増殖動態（平均±ＳＥＭ）を５匹の動物／群で観察した。２つの独立した実験では同様の結果を得た。データを、ｔ−検定、線形モデル又は一般化線形モデルで分析した。＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【図１１】図１１：ＣＴＸ後の共生細菌に対する免疫化。（Ａ〜Ｃ）．ＣＴＸ後の近交系マウスにおけるＣＢｉｒ Ｔｇ Ｔ細胞の回復。１００万個の未処置Ｂ６．ＣＤ４５．１＋ＣＢｉｒ１ ＴＣＲ Ｔｇ ＣＤ４＋Ｔ細胞を、未感作ＣＤ４５．２ ＷＴレシピエント近交系マウスにおいてｉ．ｖ．で養子移植し、そのマウスを、１日後にＮａＣｌ又はＣＴＸで処置し、そして、脾細胞のＦＡＣＳ分析及びＣＢｉｒｌ特異的ペプチドによる生体外再刺激のために７日後に屠殺した。ＣＤ４５．１細胞のゲーティングにより、ＣＢｉｒｌ Ｔｇ Ｔ細胞の回復又は増殖のパーセンテージを分析すること（Ａ、５匹の動物についての平均±ＳＥＭ）、そして、６ｈのリンモリブデン酸／イオノマイシン活性化後の細胞内染色を使用したＩＬ−１７及びＩＦＮγ産生を分析することを可能にした。代表的なドットプロットは、Ｂにおける１匹の動物について示されている。脾細胞を、２４ｈ、ＣＢｉｒｌ特異的ペプチド又は対照の無関係なペプチドで再刺激した。市販のＥＬＩＳＡでは、上清中のＩＦＮγの濃度を観察した（Ｃ）。４〜５匹の動物／群を含んでいる３つの実験を実施した。マンホイットニーのｔ−検定：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１２】図１２：樹状細胞によって加工及び提示された移行細菌は、生体外において未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の極性化をもたらす。移行細菌を用いたＴｈ１７／Ｔｈ１細胞の生体外分化。様々な細菌によってもたらされたＢＭＤＣｓと未感作ＣＤ４＋Ｔとの間の４日間にわたるクロストーク。市販のＥＬＩＳＡによるＩＬ−１７（左）又はＩＦＮγ（右）サイトカイン濃度の観察。各ドットは三連ウェルで実施した１つの試験管内における実験を表す。１１個の実験を実施し、且つ、明らかにした。ｔ−検定：＊、ｐ＜０．５、＊＊、ｐ＜０．０１、ｎｓ、有意ではない。
【図１３】図１３：腸微生物叢は化学療法効果に影響する。（Ａ）．ＡＴＢによる細菌の喪失が、樹立された肥満細胞腫の化学感受性を低減した。６日目に、広範囲ＡＴＢで３週間前処置した又はしていないＰ８１５担持ＤＢＡ２マウスに、１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸをｉ．ｐ．に接種し、そして、腫瘍増殖を屠殺まで観察した。増殖動態は、３つのうちの代表的な実験における水対ＡＴＢで処置されたマウスにおいてそれぞれの個々のマウスについて示した。（Ｂ）．バンコマイシンは、ＭＣＡ２０５肉腫に対するＣＴＸの有効性を低減した。１０日目に、バンコマイシンで３週間前処置したか又はしていないＭＣＡ２０５担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸをｉ．ｐ．に接種し、そして、腫瘍表面積並びに腫瘍拒絶反応率を１カ月間にわたって観察した。増殖動態は、２つのうちの１つの代表的な実験における水対バンコマイシンで処置されたマウスにおいてそれぞれの個々のマウスについて示す一方で、無腫瘍マウスのパーセンテージを括弧内に示す。
【図１４】図１４：パラバクテロイデス・ディスタノニスと化学療法抵抗性。（Ａ）．パラバクテロイデス・ディスタノニスの単独群叢を伴ったことで、樹立された肉腫の化学療法抵抗性を誘導した。従来どおり飼育したマウスを、広域抗生物質（ＡＴＢ）で２週間処置し、７日間、ＭＣＡ２０５を接種し、そして、ドキソルビシンで処置した。この特定の実験では、糞便には、ＶＩＴＥＫ（登録商標）自動化システム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いてＰ．ディスタノニスと同定された１種類の単一細菌種が混入していた。腫瘍増殖動態（平均±ＳＥＭ）は、Ｐ．ディスタノニス混入に組み合わせたＡＴＢが生体内における癌の化学療法抵抗性状態を誘発したことを明らかにした（ｎ＝４〜５匹のマウス／群）（Ｂ）。従来どおり飼育されたマウスを、３〜４週間、ＡＴＢで処置し、４日間、ＭＣＡ２０５を移植し、次に、糞便を単独コロニー化したＰ．ディスタノニスを経口的に接種した。腫瘍接種後６日目には、マウスをドキソルビシンで処置した。ドキソルビシン後（平均±ＳＥＭ）、Ｐ．ディスタノニス再構成又は非再構成ＡＴＢ処置マウスの間の腫瘍増殖動態を、８〜１２匹のマウス／群で観察した。データを、線形モデル又は一般化線形モデルで分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５】図１５：ＣＴＸ誘発脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した生体外産生Ｔｈ１７及びｐＴｈ１７の転写プロファイリング。未感作Ｔ細胞を、組み換えマウスＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍｌ）（「ＰＴｈ１７」細胞の場合）又はｒＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６、（「Ｔｈ１７」細胞の場合）のいずれかの存在下、或いは不存在下（Ｔｈ０）、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ Ａｂｓに対するプレート結合抗体で刺激した。インビトロ産生ｐＴｈ１７、Ｔｈ１７細胞（Ａ）又はＮａＣｌ若しくはＣＴＸ後の生体外採取した脾臓由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）に関する転写プロフィールを示す。Ｔｈ１対Ｔｈ１７極性化を規定する転写因子及びサイトカインを検出する特異的プローブを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【図１６】図１６：バンコマイシン抵抗性微生物の微生物叢。未処置のままか又はバンコマイシンで処置した腫瘍担持体からの糞便の片利共生を、材料と方法で指定したように平板培養し、カウントし、同定して耐性コロニーの数を分析した。２つの異なった動物飼育施設において実施された２つの独立した実験（CGFL, Dijon対IGR, Villejuif）の結果を示す。
【図１７】図１７：抗生物質は、γδΤ１７腫瘍浸潤性リンパ球の化学療法で誘発された蓄積に影響する。ＩＬ−１７産生腫瘍浸潤性γγΤ細胞のフローサイトメトリー表現型決定のために、ＭＣＡ２０５肉腫を、１０日目に化学療法で処置し、そして、１８日目に採取した。生きたＣＤ４５＋白血球中のＴＣＲγδ＋ＩＬ−１７＋のパーセンテージを、バンコマイシン又は広範囲ＡＴＢで処置した各群で示す。各群は６〜２１匹のマウスを含んでいた。スチューデントｔ’検定：＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１８】図１８：ニワトリＯＶＡに対する初代細胞のＴｈ１及びＴｃ１免疫応答は、野性型未処置マウスにおける抗生物質投薬計画で影響を受けない。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、広範抗生物質（ＡＴＢ）、コリスチン（Ｃｏｌｉ）又はバンコマイシン（Ｖａｎｃｏ）を含めた様々な抗生物質の処方で８〜１０日間前処置し、糞便を培養することによって種々の時点にて観察し、ｉ．ｐ．ＣＴＸ投与の３日後に、５０μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合した１ｍｇのＯＶＡを用いて足蹠において免疫した。ワクチン後５日目に、膝窩及び鼠頸部流入領域リンパ節を採取し、そして、それぞれ１ｍｇ及び１０μｇ／ｍｌのＯＶＡタンパク質（左のパネル）又はＳＩＩＮＦＥＬペプチド（右のパネル）で再刺激した。ＩＦＮγ放出を、７２時間の時点でＥＬＩＳＡによって上清中で観察した。各ドットは１匹のマウス、且つ、インビトロ再刺激の三連ウェルの平均を表す。統計的分析を、抗原再刺激なしに対して比較する対応のないｔ検定を実施して、Ａｇ特異的エフェクター／免疫記憶応答をとらえた。＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない。
【図１９】図１９：化学療法を使用した肺の腺癌を担持するＫＰマウスの処置。８週齢ＫＰ（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇｌ２Ｄ／ＷＴ、ｐ５３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ）マウスに、肺腺癌を引き起こすように鼻腔内滴下によってＣｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｃｒｅ）を与えた（ｄ０）。マウスには、未処置のままか（≪Ｃｏ≫）又は０．２５ｍｇ／ｍｌのバンコマイシンの不存在下（≪Ｃｈｅｍｏ≫）又は存在下、化学療法（ｄ８４、ｄ９１、及びｄ９８）を与えた（≪Ｃｈｅｍｏ＋Ｖａｎｃｏ≫）（Ａｄ−ｃｒｅ後ｄ７７に開始し実験終了まで、飲料水中に混合した；抗生物質含有水を隔週で置き換えた）。Ａ．腫瘍体積を、先に記載した非侵襲性造影（コルテス−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１２）によって麻酔下のマウスにおいてｄ７３及び１００に定量化した（化学療法の「前」及び「後」に相当する）。データは２つの時点の間の全肺腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）における絶対変化を示す。注意すべきは、抗生物質がこの疾患の自然な進行に影響を全く与えないことである（未掲載）。Ｂ．ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を、それぞれの群から得られた摘出肺組織サンプルのフローサイトメトリー測定によって測定した。無腫瘍マウス群（≪腫瘍なし≫）もまた調査された。各群ｎ≧６匹のマウス；＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１（対応のない両側ｔ検定）。
【図２０Ａ】図２０：癌患者の共生細菌に対するＣＴＸ誘発Ｔｈ１及びＴｈ１０免疫応答。規定された細菌を３時間負荷し、抗生物質で中和し、次に、（ＤＣへの分化のため）ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４中で培養し、そして、様々な時点の自家血液から精製したＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞（１：２比にて）と共に３日間インキュベートした、患者の自己単球を使用した生体外再刺激アッセイ（０日目：ＣＴＸ前、１２〜４６日目：ＣＴＸ後、ＮＳＣＬＣ：非肺小細胞癌）。Ａ．ＥＬＩＳＡを使用して、サイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１０）を観察した。ＣＴＸ前後の時点の間で少なくとも２倍増のＩＦＮγ分泌を示した患者の数（Ａ、左のパネル）及びパーセンテージ（Ａ、右のパネル）。Ｂ．Ｔｈ１免疫応答を生じた３つのケースの例示；患者３は、Ｌ．ジョンソニー＋Ｅ．ヒラエに対して発揮された強いＴｈ１免疫を生じた。
【図２０Ｂ】Ｂ．Ｔｈ１免疫応答を生じた３つのケースの例示；患者３は、Ｌ．ジョンソニー＋Ｅ．ヒラエに対して発揮された強いＴｈ１免疫を生じた。
【図２０Ｃ】Ｃ．１ケースはＥ．フェカリスに対する強いＴｈ１免疫を伴った。
【図２０Ｄ】Ｄ．２つのケースは対照的にＴｈ１／ＴＨ１０特異的応答を伴った。Ｂ〜Ｄは、ＣＴＸ投与前後のそれぞれ個人の患者の２５０．０００個の免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の４０ｈ上清中のサイトカインレベルを示す。
【図２１】図２１：比較対照（化学療法なし）対新アジュバント化学療法後を比較した、１６ＳｒＲＮＡパイロシークエンシング後の全患者の回腸の単離株レベルに対する主成分分析法。
【図２２】図２２：ランダムフォレスト分析：化学療法を受けた又は受けていない、或いは結腸癌を担持している患者間の主たる特徴的な属。  ネオアジュバントのオキサリプラチンベースの化学療法による６人の患者と治療前の７人の患者からの分析。
【図２３】図２３：対照（化学療法なし）対新アジュバント化学療法後の間で有意に異なった主たる属。
【図２４】図２４：ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム、及びクロストリジウム属第ＩＶ群の配分。  化学療法で処置された又は処置されていない大腸癌患者の中の回腸。
【図２５】図２５：Ｅ．ヒラエの単独群叢を伴った後のＴＨ１及びｐＴＨ１７免疫応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、バンコマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、及びコリスチン（広範囲ＡＴＢ投薬計画）で１４日間処理し、続いて１５日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単回ｉｐ注射によって処置し、そして、２２日目の脾細胞のフローサイトメトリー分析前の１６日目に１０９個の細菌（グラフで例示される）を経口摂食させた。Ａ〜Ｃ．ｐＴＨ１７細胞のフローサイトメトリー分析。生きた脾細胞のゲートにおいてＩＦＮγとＩＬ−１７（左のパネル）又はＣＸＣＲ３とＣＣＲ６（右のパネル）を発現するか又は同時発現するＣＤ４＋Ｔ細胞。５匹のマウス／群を含んでいる３つの個々の実験からの連結データ。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２６】図２６：ＣＴＸで処置されたＭＣＡ２０５に対する抗癌プロバイオティクス活性。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、バンコマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン及びコリスチン（広範囲ＡＴＢ投薬計画）で１４日間処置し、ＭＣＡ２０５肉腫をｓｃ接種し、次に、２１日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単回ｉｐ注射で処置し、そして、２２日目に１０９個の細菌（グラフで例示される）を経口摂取させた。腫瘍増殖動態を１カ月にわたり隔週で観察した。Ａ．実験の設定。Ｂ．陽性（ＡＴＢなしＣＴＸ）及び、陰性対照（ＡＴＢありＣＴＸ）群の腫瘍増殖。Ｃ〜Ｆ．Ｅ．ヒラエ若しくはＬ．ジョンソニー又はそれらの両方（カクテル）の経口強制飼養の存在下での腫瘍増殖動態。Ｆ．５匹のマウス／群を含んでいる３つの実験から連結データ。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２７】図２７：Ｅ．ヒラエはＯＶＡ特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす。  ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、バンコマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン及びコリスチン（広範囲ＡＴＢ投薬計画）で１４日間処置し、ＭＣＡ２０５−ＯＶＡ肉腫をｓｃ接種し、次に、２１日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単回ｉｐ注射によって処置し、そして、２２日目に１０９個のＥ．ヒラエ（グラフＡで例示される）を経口摂食させた。２４日目に、１０６個のＣＤ４５．２＋ＯＴＩＩトランスジェニックＴ細胞をｉｖ移植し、そして、レシピエント（ＣＤ４５．１、Ｂ）又はドナー（ＣＤ４５．２）ＣＤ４＋Ｔリンパ球のフローサイトメトリー分析のために、８日後にマウスを屠殺した。Ｂ．脾細胞の数（左のパネル）、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの測定（中央パネル）、及びＡＴＢあり若しくはなしのＣＴＸ後の宿主におけるｐＴＨ１７。Ｃ．脾臓におけるＣＤ４５．２＋、Ｋｉ６７＋又はＣＤ４４＋発現によって調べたドナーＴ細胞の回復。Ｄ．Ｃと同様であるが、腫瘍ベッドにおいて絶対数を数えることによる。代表的な実験を、統計的分析のためのスチューデントｔ’検定を用いて示す。＊ｐ＜０．０５。
【図２８】図２８：Ｅ．ヒラエは、Ｅ７特異的抗腫瘍免疫応答を引き起こす。Ａ．実験の設定。広範囲ＡＴＢで前処置されたマウスにおける皮下ＴＣＩ接種、そして、ＳＢｘＴ−Ｅ７とＣＴＸ（＋／− Ｅ．ヒラエの単独群叢を伴う）の組み合わせを使用した腫瘍移植後７日目の治療法。Ｂ〜Ｃ．２つの実験における、代表的な腫瘍増殖動態及び完全な腫瘍根絶のパーセンテージ。Ｄ．脾臓のＤｂ−Ｅ７３９−４７四量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞の観察。２つの実験からの結果を示す。統計的分析のＡｎｏｖａ検定。＊ｐ＜０．０５。
【図２９】図２９：異なった公的ライブラリーからの一連のＥ．ヒラエ単離株のパルスフィールド電気泳動。これらのクローンの間には、配列類似性の管理された階層的なクラスタリングはなかった。クローン１３１４４−１３１４７は、異種治療法（ＣＴＬＡ４遮断、ＣＴＸ）後にマウス脾細胞からGustave Roussy動物飼育施設において単離された。今後又は先に使用した１つの単離株は、この図中で「13144 Villejuif」と記載され、番号Ｉ−４８１５として、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）で２０１３年１１月７日に寄託されたエンテロココッカス・ヒラエ（Enterocococcus hirae）菌株に相当する。
【図３０】図３０：生体内における様々なＥ．ヒラエの差別的な免疫原性。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、バンコマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン及びコリスチン（広範囲ＡＴＢ投薬計画）で１４日間処置し、１５日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単回ｉｐ注射によって処置し、そして、２２日目の脾細胞のフローサイトメトリー分析前の１６日目に１０９個の細菌（クローン７０８対クローンＣＮＣＭ Ｉ−４８１５）を経口摂食させた。正の対照は前処理ＡＴＢなしにＣＴＸで処置されたマウスによって表される。Ａ〜Ｃ．ＴＨ１、Ｔｃ１又はｐＴＨ１７細胞のフローサイトメトリー分析。生きたＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ脾細胞のゲートにおけるＩＦＮγ又はＣＸＣＲ３を発現するＣＤ４＋ＴＨ１細胞（Ａ、左と右のパネル）、ＩＦＮγを発現するＣＤ８＋Ｔｃ１（Ｂ）又はＣＸＣＲ３を発現するＣＤ４＋ｐＴＨ１７細胞（Ｃ）。５匹のマウス／群を含んでいる３つの個々の実験からの連結データ。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３１】図３１：抗微生物ペプチドの放出の促進による、ＮＯＤ受容体が妨げる細菌トランスロケーションの誘発及びｐＴＨ１７細胞の感作。Ａ．様々なマウス背景におけるＣＴＸ治療後４８時間の脾細胞における細菌コロニーのカウント。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ又はＮＯＤ１−／−ｘＮＯＤ２−／−マウスから採取した脾細胞（左のパネル）と腸間膜ＬＮ（中央パネル）を、４８時間、嫌気性条件で培養した。増殖した細菌をカウントし（コロニー数／プレート及び陽性プレートの頻度／動物（右のパネル））そして、細菌同定のために質量スペクトロメトリーによって最終的に特徴づけした。Ｂ．ｐＴＨ１７細胞のフローサイトメトリー分析。ＷＴ対ＮＯＤ１又はＮＯＤ２欠損マウスの生きたＩＬ−１７＋Ｔ脾細胞のゲートにおけるＩＦＮ□γを同時発現するＣＤ４＋Ｔ細胞。Ｃ．Ｂと同様ではあるが、グラフの上部に整列した実験設定に従ってＮＯＤ作動薬（ＭＤＰ及びＴｒｉＤＡＰ）で処置したＷＴ動物で実施した実験。Ｄ．Ｃに整列した実験設定によるマウスの糞便中のリポカリン−２のＥＬＩＳＡ観察。代表的な実験はＡ及びＤについて示されている。３匹のマウス／群を含んでいる２〜３の個々の実験からの連結データを、Ｂ〜Ｃに示す。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３２】図３２：ＬＰＳは、Ｅ．ヒラエ＋Ｌ．ジョンソニーがｐＴＨ１７細胞を惹起する能力に対して阻害的役割を担う。Ａ〜Ｃ．脾臓におけるＴＨ１（Ａ）、Ｔｃ１（Ｂ）及びｐＴＨ１７（Ｃ）細胞の惹起に関するＴＬＲ４作動薬とグラム陽性菌の比較。図２５に実験設定を記載したが、２回繰り返される５００μｇ／マウスの投薬でのＬＰＳの経口投与の有無を追加した。生きた脾細胞のゲートにおけるＩＦＮγとＩＬ−１７を同時発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析。５匹のマウス／群を含んでいる３つの個々の実験からの連結データ。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３３】図３３：様々な遺伝子欠損宿主における肉腫増殖に対するＣＴＸの相対的有効性。ＷＴ（Ａ）、ＮＯＤ１（Ｂ）、ＮＯＤ２（Ｃ、左のパネル）、ＣＡＲＤ９（Ｃ、中央パネル）、ＲＩＰ２（Ｃ、右のパネル）、ＮＯＤ１ｘＮＯＤ２（Ｄ、左のパネル及び右のパネル）欠損マウスにおいて、１００ｍｇ／ｋｇのｉｐにて７日おきにＣＴＸを投与した。各グラフは１つの代表的な増殖動態の５つの腫瘍／群の平均を示す。スチューデントｔ’検定：＊ｐ＜０．０５。
【図３４】図３４：Ｅ．ヒラエ＋Ｌ．ジョンソニーの群叢から成る抗癌性プロバイオティクス活性におけるＴＬＲ４作動薬の阻害作用。ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、バンコマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン及びコリスチン（広範囲ＡＴＢ投薬計画）で１４日間処置し、ＭＣＡ２０５−ＯＶＡ肉腫をｓｃ接種し、次に、２１日目（及び２９日目）に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単回ｉｐ注射によって処置し、そして、２２日目に５００μｇ／マウスのＬＰＳ（Ａ）又は１０９個の細菌（Ｅ．コリ（E.coli））を経口摂食させた。腫瘍増殖動態を１カ月にわたり隔週で観察した。陽性（ＡＴＢなしＣＴＸ）及び陰性（ＡＴＢありＣＴＸ）対照を示す。Ｅ．ヒラエ＋Ｌ．ジョンソニー＋／−Ｅ．コリ又はＬＰＳの経口強制飼養の存在下での腫瘍増殖動態／５匹のマウス／群の平均。代表的なグラフはＡ及びＢに示され、そして、５匹のマウス／群を含んでいる２つの実験からのＥ．コリ＋ＬＰＳの連結データはＣに示されている。スチューデントｔ’検定：＊ｐ＜０．０５。
【図３５Ａ】図３５：ＣＴＸで処置された又は処置されていないＷＴ対ＮＯＤ１ｘＮＯＤ２欠損マウスの便からの遺伝子単位複製配列の１６ｓｒＲＮＡのパイロシークエンシングの主成分分析。Ａ．ＰＣＡ．便を、未処置Ｃ５７ＢＬ／６非腫瘍担持体においてＣＴＸ接種後７日目に採取した。４〜５匹の動物／群からの糞便について配列決定した。遺伝子欠損マウスのＰＢＳ及びＣＴＸ治療法の間の有意な結果を示すｐ値を、グラフについて示す。
【図３５Ｂ】Ｂ．二重ＫＯマウスにおいてＣＴＸ治療法後に過剰発現した科の詳細。バクテロイデテス門の科構成員の大部分の分析。４つの群の間の多様性及び相違点に関する色分け地図（左のパネル）の表示は、右のパネルに示された統計的分析に示したように、ＣＴＸ治療法によるラクノスピラを犠牲にしたポルフィロモナス科の富化が強調された。
【図３５Ｃ】Ｃ．バーンシエラ、ホールデマニア、及びポルフィロモナスに関する、二重ＫＯマウスにおけるＣＴＸ治療法後のＯＴＵの詳細。
【図３６Ａ】図３６：ＣＴＸで処置された又は処置されていないＷＴ対ＮＯＤ１ｘＮＯＤ２欠損マウスからの小腸のバイオフィルムに関する遺伝子単位複製配列の１６ｓｒＲＮＡのパイロシークエンシングの主成分分析。Ａ．ＰＣＡ。回腸のバイオフィルムを、未処置Ｃ５７ＢＬ／６非腫瘍担持体におけるＣＴＸ接種後７日目に採取した。４〜５匹の動物／群からの小腸について配列決定した。遺伝子欠損マウスのＰＢＳ及びＣＴＸ治療法の間の有意な結果を示すｐ値を、グラフについて示す。Ｂ．４つの群の間の多様性及び相違点に関する色分け地図の表示は、表１に示された統計的分析に示したように、ＣＴＸ治療法によるエリシペロトリクス（Erysipelotrichaceae）を犠牲にしたクロストリジウム科（ほとんどＳＦＢ、表４）の富化が強調された。
【図３６Ｂ】Ｂ．４つの群の間の多様性及び相違点に関する色分け地図の表示は、表１に示された統計的分析に示したように、ＣＴＸ治療法によるエリシペロトリクス（Erysipelotrichaceae）を犠牲にしたクロストリジウム科（ほとんどＳＦＢ、表４）の富化が強調された。
【図３７】図３７：片利共生Ｅ．ヒラエと病原性細菌ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の組み合わせ。図２６と同じ実験設定ではあるが、Ｃ．パーフリンゲンスを同じように経口強制飼養によって導入した。腫瘍増殖動態を１カ月にわたり隔週で観察した。Ａ．２つの群Ｅ．ヒラエ対ウェルシュ菌についての腫瘍増殖。Ｂ．Ｅ．ヒラエ＋プランタルム（L.plantarum）対Ｅ．ヒラエ＋ウェルシュ菌の経口強制飼養の存在下の腫瘍増殖動態。５匹のマウス／群を含んでいる２つの実験を示す。Ａｎｏｖａ統計的分析：＊ｐ＜０．０５。
【図３８】図３８：ＣＴＸを組み合わせた抗癌ワクチンは、腸のグラム陰性菌に依存した持続的な抗癌免疫を促進する。Ａ．実験の設定。Ｃ５６ＢＬ／６マウスを、広範囲ＡＴＢ（アンピシリン、コリスチン、ストレプトマイシン）又はバンコマイシン（グラム＋細菌のみを殺滅）又はコリスチン（グラム−細菌のみを殺滅）で９日間処置し、ＣＴＸ（１００ｍｇ／ｋｇ）の単回ｉｐ注射を与え、続いて３日後にＣｐＧアジュバント中のＯＶＡタンパク質（又は見せかけのワクチン）のワクチン接種を与えた。ＡＴＢを２０日後に終了し、そして、動物は１カ月間観察下で未処置のままにした。５０日目に、すべてのマウスに、１０ｘ回のＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍ腫瘍細胞ｓｃのＭＴＤから成る致死量で再感作した。Ｂ．動物を、腫瘍増殖に基づいてスコア化した（皆無又は弱い免疫記憶Ｔ細胞応答を特徴とした）。無腫瘍マウスのパーセンテージを、５匹のマウス／群を含む２つの実験について記録した。＊Ａｎｏｖａ検定：ｐ＜０．０５。
【図３９】図３９：ＣＴＸの有効性に対するＡＴＢ投薬計画の効果。異なったＡＴＢ投薬計画（Zhang Y et al. Toxicology and Applied Pharmacology 277 (2014) 138- 145）を、腫瘍接種及び１３日おきのＣＴＸ治療法の１５日前に投与した。腫瘍増殖を、キャリパーを用いて１週間に２度観察した。プロトコールは、ファーミキューテスを低減することを報告し、最も特に、ファーミキューテス／バクテロイド比（ネオマイシン＋セファロチン又はバンコマイシン＋イミペナムの組み合わせなどの）を最終的に低下させるクロストリジウム科が（パネルＣ〜Ｄ）ＣＴＸ誘発抗癌効果を改善する場合があること、その一方で、シフロキサシン（cifloxacin）は効果的でなかった（対照的に、バクテロイデテスの顕著な抑制を引き起こした）（パネルＢ）ことを報告した。注意すべきは、ネオマイシン＋セファロチンの組み合わせがＳＦＢの代表性を増大させる場合がある一方で、ｖａｎｃｏ＋イミペナムはポルフィロモナスの代表性を増強したことである。各実験は、５匹のマウスから成る数個の群を含んでいる。＊Ａｎｏｖａ検定：ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい実施形態の詳細な説明
当該テキストでは、以下の一般的な定義が使用されている：
腸微生物叢
（以前、腸内フローラ又は微生物フローラと呼ばれた）「腸微生物叢」は、動物界（ヒト、動物、昆虫など）に属するいずれかの生物体の腸内に生きる微生物集団を示す。各個人は独特な微生物叢組成を有するが（合計４００〜５００の別個の細菌種／個人に対して、６０〜８０の細菌種がサンプル採取集団の５０％超を占める）、いつも同様の主たる生理機能を満たし、且つ、個人の健康に直接的な影響を有する：
【００１７】
・胃と小腸が消化することができない特定の食料（主に非消化性繊維）の消化に貢献する。
・いくつかのビタミン（Ｂ及びＫ）の産生に貢献する。
・他の微生物からの攻撃性から保護し、そして、腸粘膜の完全性を維持する。
・適切な免疫系の発生において重要な役割を果たす。
・健康で、様々な、そして、平衡を保った腸微生物叢は本来の腸の機能を確保するのに重要である。
【００１８】
身体の正常機能及びそれが達成する様々な機能に参加する腸微生物叢の主要な役割を考慮すると、それは今では「臓器」とみなされる。しかしながら、新生児は無菌で生まれるので、それは「獲得性」の臓器である；すなわち、腸のコロニー形成は、出産直後始まり、その後発展する。
腸微生物叢の発生は出産時に始まる。子宮内は無菌であり、新生児の消化管は母親（腟、皮膚、乳房など）、送達が行われる環境、空気などからの微生物によって急速にコロニー形成される。三日目から、腸微生物叢の組成は、乳児がどのように給養されているかに直接依存している：乳児用調製粉乳で給養された新生児と比較して、母乳で育てられた新生児の腸微生物叢は、例えば、主にビフィドバクテリアによって占められている。
【００１９】
腸微生物叢の組成は、出産から高齢まで一生を通じて発展し、それは異なった環境的影響の結果である。腸微生物叢のバランスは、加齢過程の間に影響を受ける可能性があり、そして、結果的に、高齢者は若い成人と実質的に異なった微生物叢を有する。
優位な腸微生物叢の全般的な組成は、健康な人々のほとんどで同様であり（４種類の主たる門、すなわち、ファーミキューテス、バクテロイデテス、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、及びプロテオバクテリア（Proteobacteria））、種レベルでの組成は、非常に個人化されていて、個人の遺伝的、環境、及び食事に大きく影響される。腸微生物叢の組成は、一時的又は恒久的に食物成分に順応するようになり得る。例えば、日本人の人々は、彼らの微生物叢が海洋細菌から取得した特異的酵素のおかげで海草（彼らの日常食の一部）を消化する。
【００２０】
微生物叢失調
それは変化に順応し、且つ、高いレジリエンス能力を有するが、腸微生物叢組成の不均衡はいくつかの特別な状況で生じ得る。これは「微生物叢失調」と呼ばれ、腸内における潜在的「有害」と既知の「有益な」細菌の間の不均衡、又は主たる細菌群の組成と多様性の観点から「健康な」微生物叢と見なされるものからのいずれかの偏りである。微生物叢失調は、機能性腸疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、肥満及び糖尿病などの健康問題につながり得る。それはまた、細胞傷害性の処置又は抗生物質処置などの処置との因果関係でもあり得る。
【００２１】
特定の微生物叢失調は、病原性状況に依存することに注目され得る。例えば、クローン病（慢性炎症性腸疾患）の患者は、ファーミキューテス門に属す細菌の低いパーセンテージ及び多様性を有する、ほとんどがクロストリジウム・レプツム（leptum）（クラスタＩＶ）群の微生物叢を示す（Manichanh et al., 2006; Sokol et al., 2006）。一般に、ラクノスピラ科の細菌が減少しているパーセンテージが観察される。そのうえ、これらの患者の粘液関連微生物叢は、ビフィドバクテリウム及びラクトバチルス属の細菌が枯渇しており、接着性且つ侵襲性の表現型（ＡＩＥＣ）を有するエシェリキア・コリの特定の株などの潜在的病原細菌が高いレベルに向かう（Darfeuille-Michaud et al. 2011, 2004; Joossens et al., 2011）。
【００２２】
それと反対に、肥満及び代謝異常を患っている患者は、彼らの糞便中でファーミキューテス門に属する細菌のより高い割合及び低いレベルのエシェリキア・コリを有する（Ley et al., 2005; Turnbaugh et al., 2009）。これらの患者におけるＥ．コリの高い割合は、肥満手術後に起こる体重減少及び低レベルの血清レプチンに関連している（Furet et al., 2010）。
【００２３】
しかしながら、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の患者では、腸内微生物の微生物叢失調は、バクテロイド属細菌種の富化、並びにフェカリバクテリウム及びロゼブリア属に属する種の減少に関連する（Sobhani et al., 2011; Wu et al., 2013）。具体的には、フゾバクテリウム及びカンピロバクター属が、ＣＲＣ患者の糞便と粘液の両方で一貫して増加するのがわかった。
【００２４】
癌との関連において、「有益である」又は「好ましい」細菌は、事実上、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムであり、そして、「有害である」又は「好ましくない」細菌は、事実上、種パラバクテロイデス・ディスタノニス及びフェカリバクテリウム・プラウスニッツイー、属ゲミガー、アリスチペス及びクロストリジウム・クラスターＩＶ（クロストリジウム・レプツム群）である。
【００２５】
抗腫瘍薬処置
「抗腫瘍薬処置」は、本明細書中では、外科手術以外のあらゆる癌の処置を示す。それらには、化学療法、ホルモン療法、生物療法、及び放射線療法が含まれる。
化学療法
「化学療法」は、１若しくは複数の「化学療法薬」を用いた癌処置と本明細書中に規定される。化学療法薬は、ほとんどの癌細胞の主な特性の１つである急速に分裂する細胞を殺滅するように作用する化学分子である。化学剤にはいくつかのカテゴリが存在する：
−アルキル化剤（以下でさらに規定する）；
−メベンダゾール、コルヒチンなどの紡錘体阻害剤；
【００２６】
−有糸分裂阻害剤（タキサン（パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテレ（登録商標）））及びビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）を含む）；
−細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質：アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、イダルビシン、エピルビシン及びミトキサントロン、バルルビシン）、ストレプトマイセス（例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）など；
−代謝拮抗物質（ピリミジン類似体（例えばフルオロピリミジン類似体、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクシウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、カペシタビン；プリン類似体（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、カペシタビン、クロファラビン）；葉酸類似体（例えばメトトレキサート、葉酸、ペメトレキセド、アミノプテリン、ラルチトレキセド、トリメトプリム、ピリメタミン）など；
【００２７】
−トポイソメラーゼ阻害剤（例えば：カンプトテシン：イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド）；
−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤：２’−デオキシ−５−アザシチジン（ＤＡＣ）、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、１−［β］−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシン、ジヒドロ−５−アザシチジン；
−血管破壊剤、フラボン酢酸誘導体、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）及びフラボン酢酸（ＦＡＡ）など；
【００２８】
−他の化学療法薬、アプロピタント、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、Millenium Pharmaceuticals）、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、タモキシフェン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カルボキシアミドトリアゾール、エファプロキシラール、チラパザミン、キシシトリン、チマルファシン、ビンフルニンなど。
【００２９】
アルキル化剤
「アルキル化剤」は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡを含めた多くの分子をアルキル化するそれらの能力のためそのように命名されている。それらのアルキル基を介してＤＮＡに共有するこの能力は、細胞アポトーシスを引き起こすので、それらの抗癌効果の主原因である。アルキル化剤は、細胞のサイクルから独立した薬物なので、それらの効果は通常用量依存性である。
アルキル化剤のサブタイプは、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、及び非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードとしては、メクロールエサミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、及びブスルファンが挙げられる。ニトロソ尿素としては、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチン及びストレプトゾトシンが挙げられる。テトラジンとしては、ダカルバジン、ミトゾロミド及びテモゾロミドが挙げられる。アジリジンとしては、チオテパ、マイトマイシン、及びジアジクオン（ＡＺＱ）が挙げられる。非古典的アルキル化剤としては、プロカルバジン及びヘキサメチルメラミンが挙げられる。
【００３０】
本願を通じて、プラチナベースの化学療法薬（「プラチナ類似体」とも呼ばれる）及びアルキル化剤と同様の様式で機能する「アルキル化様作用物質」は「アルキル化剤」のカテゴリに含まれる。これらの作用物質は、アルキル基を有しないが、それにもかかわらず、ＤＮＡに損害を与える。それらは、ＤＮＡ修復を妨げるようにＤＮＡを恒久的に調整する。本明細書中に規定するアルキル化剤のこのサブカテゴリの例は、プラチナ、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン及びトリプラチン四硝酸塩である。
【００３１】
生物療法
抗癌「生物療法」は、直接癌細胞を標的とするか、又は癌細胞に対して作用する体の免疫系を刺激（「免疫療法」）することによって癌を処置するために、生きた生物、生物から得られた物質、又は斯かる物質の実験室製造バージョンの使用を伴う。生物療法としては、モノクローナル抗体（癌細胞表面を標的とするもの、例えば、リツキシマブ及びアレムツズマブ；抗ＣＴＬＡ４ Ｍａｂｓ、イピリムバブなど；標的増殖因子：ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ及びトラスツズマブ；抗ＰＤ−１ Ｍａｂｓ；抗Ｔｉｎ３ Ｍａｂｓ、抗ＩＣＯＳ Ｍａｂｓを含む）、免疫抱合体（例えば、９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタン、１３１Ｉ−トシツモマブ、及びアド−トラスツズマブ・エムタンシン）、サイトカイン（ＩＦＮαなどのインターフェロン；ＩＬ−２、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＭ、ＧＭ−ＣＳＦなどのインターロイキンを含む）、処置用ワクチン（例えば、Sipuleucel-T（プロベンジ（登録商標））、細菌バチルスカルメット−ゲラン、癌殺滅ウイルス、遺伝子療法、並びに養子細胞Ｔ細胞移植が挙げられる。
【００３２】
プレバイオティクス、プロバイオティクス、及びシンバイオティクス
「プレバイオティクス」は、健康に有益であると主張された方法で消化器系における細菌の増殖及び／又は活性を刺激する非消化性食品構成要素である。通常、それらは、腸微生物叢の組成及び／又は活性の両方における特有の変化を可能にする選択的発酵構成要素である。
【００３３】
「プロバイオティクス」は、消費されたときに、健康の利益が主張される微生物である。プロバイオティクスは、ヨーグルト、ダイズヨーグルト中などの特に活性な生きた培養菌が加えられた発酵食品の一部として又は補助食品として一般的に消費される。一般に、プロバイオティクスは、腸微生物叢がそのバランス、完全性、及び多様性を保つ（又は再発見する）助けとなる。プロバイオティクスの効果は通常、系統依存性である。
【００３４】
「シンバイオティクス」は、相乗作用、したがって、シンバイオティクスの形態でプロバイオティクスとプレバイオティクスを組み合わせた栄養補助食品を指す。プレバイオティクスとプロバイオティクスを組み合わせて使用することが、シンバイオティックと説明されることが多いが、United Nations Food & Agriculture Organization（ＦＡＯ）は、正味の健康利益が相乗的である場合にだけ「シンバイオティック」という用語が使用されることを推奨している。
【００３５】
癌、処置など
本明細書中に使用される場合、「癌」とはすべてのタイプの癌を意味する。特に、癌は固形癌又は非固形癌である。癌の限定されることのない例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌及び結腸癌、肉腫、リンパ腫、メラノーマ、白血病、生殖細胞癌並びに芽細胞腫などの癌腫又は腺癌である。
本明細書中に使用される場合、「処置する」、「処置」、及び「処置すること」という用語は、癌、特に固形腫瘍の進行、重症度、及び／又は継続のいずれかの低減又は改善を指す；例えば、乳癌において、１若しくは複数の治療法の投与から生じるその１若しくは複数の症状の軽減を指す。
【００３６】
必要であるときには、他の定義が以下で指定される。
第一の態様によると、本発明は、癌患者に投与される抗腫瘍薬処置にアジュバントとして使用するための、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌を含むプロバイオティクス組成に関係する。
【００３７】
本発明のプロバイオティクス組成物の好ましい実施形態によると、前記組成物は、エンテロコッカス・ヒラエと、ポルフィロモナス、バーンシエラ、及びホールデマニアの中から選択される少なくとも１つの菌株を含む。上記組成物のためのエンテロココッカス・ヒラエの好ましい菌株は、番号Ｉ−４８１５で２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された菌株である。斯かる組成物は、番号Ｉ−４８２３で２０１３年１１月１５日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたラクトバチルス・ジョンソニー菌株ＬＪＦＳ００１Ｂなどのラクトバチルス・ジョンソニー菌株を有利にさらに含み得る。
【００３８】
上記のプロバイオティクス組成物は、有利に経口投与のために処方され、そして、栄養補助食品又は機能性食品として投与され得る。当業者は、生きた又は死滅した微生物を包含し得る、栄養補助食品（例えば、丸薬、錠剤など）として又は飲料、発酵ヨーグルトなどの機能性食品として提供され得る様々な処方を知っている。
【００３９】
好ましい実施形態によると、本発明によるプロバイオティクス組成物は、抗腫瘍薬処置の投与、例えば、前記患者へのシクロホスファミド（ＣＴＸ）などの化学療法薬の投与の後に、処置を必要としている患者に投与される。例えば、プロバイオティクス組成物は、ＣＴＸ用量と同じ日に投与されても、又は処置の数日後に投与されてもよい。機械のように規則正しいＣＴＸ投与の場合には、プロバイオティクス組成物は、毎日、それぞれのＣＴＸ摂取後に又は同時であっても投与されうる。あるいは、本発明によるプロバイオティクス組成物は、抗腫瘍薬処置の投与前に処置を必要としている患者に投与される。
いくつかの化学療法薬（特にＣＴＸ）は、抗癌ワクチンに対して効果的なアジュバントとして記述されている。本発明によるプロバイオティクス組成物の特に有用な適用は、さらに癌ワクチンの有効性を増強するための、斯かる化学療法薬と組み合わせたその利用である。
【００４０】
癌患者を処置するための方法であって、前記患者に単独で又は抗癌ワクチンと組み合わせて、化学療法薬を投与する前又はその後に、プロバイオティクス微生物組成物、例えば先に記載したものなどを投与することを含む方法もまた、本発明の一部である。
上記組成物は、抗腫瘍薬処置、例えば（単独又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた）化学療法などで処置された任意の患者に適切に投与され得るが、それらは前記プロバイオティクス組成物中に存在する種の過少出現を伴う微生物叢失調を有する患者において特に有用である。
【００４１】
本発明の別の態様は、癌を処置するために前記個人に投与したときに、個人の腸微生物叢においてフィルミクテス／バクテロイデテス比を低下させる、具体的には、ＳＦＢ及び／又はポルフィロモナス科を増強し、及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる化学療法薬と抗生物質組成物の組み合わせの使用である。特定の実施形態によると、抗生物質組成物は、バンコマイシンとイミペナムの組み合わせを含むか又はそれらから成る。別の特定の実施形態によると、抗生物質組成物は、ネオマイシンとセファロチンの組み合わせを含むか又はそれらから成る。有利なことには、先に記載したように抗生物質組成物と組み合わせて使用される化学療法薬は、シクロホスファミド（ＣＴＸ）である。
【００４２】
本明細書中に使用される場合、「組み合わせ」という用語は、２つ以上作用物質の使用を指す（例えば、バンコマイシン＋イミペナム及びＣＴＸ）。「組み合わせ」という用語の使用は、処置薬が患者に投与される順序を制限しないが、化学療法薬より先に又はそれと同時に抗生物質のカクテルを投与するのが望ましい。例えば、バンコマイシンとイミペナムは、ＣＴＸの前（例えば２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間に、２週間、３週間、４週前）、規則的に又は何度か（例えば、毎日）、好ましくは抗腫瘍薬処置を投与する前の３〜７日間、投与され得る。有利なことには、抗生物質組成物は、前記化学療法薬（ＣＴＸなど）の効果を最適化するように患者の腸微生物叢を調節するために、化学療法薬の投与前に投与される。したがって、本発明は、癌患者を処置するための方法であって、（単独又は抗癌ワクチンと組み合わせた）化学療法薬を投与する前に、フィルミクテス／バクテロイデテス比を低下させる、具体的には、前記個人に投与されたときに個人の腸微生物叢中の、ＳＦＢ及び／又はポルフィロモナス科を増強し、及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる抗生物質組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
本発明はまた、前記患者に投与される化学療法薬の抗癌効果を増強するためのアジュバント療法として、フィルミクテス／バクテロイデテス比を低下させる、具体的には、前記個人に投与されたときに、個人の腸微生物叢中のＳＦＢ及び／又はポルフィロモナス科を増強し、及び／又はクロストリジウム属第ＩＶ群を減少させる抗生物質組成物の使用に関係する。実際には、以下の実験部分で例示されるように、例えばＣＴＸなどの化学療法薬の抗癌効果を増強するために、抗生物質及び／又はプロバイオティクスの使用によって患者の腸微生物叢を調節することは、有用であり得る。バンコマイシン＋イミペナムやネオマイシン＋セファロチンなどの抗生物質組成物は、この目的に特に有用である。
本発明の別の目的は、癌患者に投与される抗腫瘍薬処置に対するアジュバントとしての使用のための、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、エンテロコッカス・フェカリス、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物である。
【００４４】
好ましい実施形態によると、免疫原性組成物は、エンテロコッカス・ヒラエの断片、より好ましくは菌株ＣＮＣＭ Ｉ−４８１５の断片を、ポルフィロモナス、バーンシエラ、及びホールデマニアから成る群から選択される少なくとも１つの菌株の断片と一緒に含む。
本発明による免疫原性組成物は、皮下又は筋肉内投与のために好ましくは処方される。それらは、有利なことには、処置に対するアジュバント効果を有する免疫応答を誘発するために、ＣＴＸなどの化学療法薬の投与の前に、同時に又は後で投与され得る。
本発明は更に、化学療法薬と組み合わせた養子細胞移植の際の細胞組成物及びその利用に関係する。患者から様々な免疫細胞型を得るための技術、及び斯かる細胞を生体外でパルス又は教育するための技術は、当業者に周知である。斯かる技術は、とりわけ、Cauxら(1996)、Sallust (1994)、Palucka (2013)、Vanlint (2014)、Arrntzen (2008)、及びLesterhuis (2008)による説明されている。本発明による第一の細胞組成物は、先に記載のとおりプロバイオティクス組成物又は免疫原性組成物を用いて生体外でパルスした、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物である。好ましい実施形態によると、細胞組成物中に存在する抗原提示細胞はまた、腫瘍抗原を用いて生体外でパルスされた。
【００４５】
本発明による細胞組成物は、養子細胞移植を抗腫瘍薬処置に組み合わせることによって、癌を処置するのに特に有用である。臨床状況によって、医師は斯かる細胞組成物をどのように投与するか決める。特に、これらの組成物は、節内注射、静脈内注射又は皮下注射によって投与されてもよい。
【００４６】
本発明の別の養子細胞移植法によると、上記ＡＰＣ組成物は、患者に教育Ｔ細胞、特に免疫記憶Ｔ細胞を再注入する前に、患者から得られたＴ細胞を生体外で「教育する」ために使用できる。したがって、上述のとおり、癌患者からのＴ細胞をＡＰＣ組成物と生体外で接触させること含むプロセスによって得られた免疫記憶Ｔ細胞を含む細胞組成物もまた、本発明の一部である。斯かるＴ細胞組成物は、有利なことには、単独で又は抗腫瘍性ワクチン接種と組み合わせて投与される、化学療法（特にＣＴＸ投与）などの抗腫瘍薬処置の効果を増強するためのアジュバントとして養子細胞移植において使用され得る。樹状細胞に関する場合、Ｔ細胞は、臨床状況によって、節内注射、静脈内注射又は皮下注射によって投与され得る。
【００４７】
本発明はまた、化学療法薬の抗癌活性を改善することができるＴ細胞を生体外で取得するための方法であって、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、及び／又はホールデマニアからの樹状細胞（ＤＣ）提示ペプチドを用いてポリクローナルＴ細胞株又は大量の自己Ｔ細胞を生体外で増加させることを含む方法に関連する。
本発明の別の態様は、化学療法に対する優れた応答者である可能性が高い患者を同定するインビトロにおける方法であって、前記患者においてＴＬＲ４、ＮＯＤ１、及びＮＯＤ２の機能性を測定することを含み、ここで、前記患者が、機能的なＴＬＲ４及び／又はＮＯＤ１／ＣＡＲＤ４（ｒｓ２００６８４７、ｒｓ２０６６８４４、ｒｓ２０６６８４５、ｒｓ２０６６８４２、ＮＤ（１）＋３２６５６、ｒｓ２０７５８２０、．．．）及び／又はＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５（ｐ．Ｒ７０２Ｗ、ｐ．Ｇ９０８Ｒ、ｐ．Ｌｅｕｌ００７ｆｓＸ１００８など）を欠いている場合、該患者が化学療法（アントラサイクリン系及びオキサプラチン、及び放射線療法以外のすべて）に対する優れた応答者と同定される。２つの同時分離一塩基変異多型（ＳＮＰ）−Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ及びＴｈｒ３９９Ｉｌｅ−は、ＴＬＲ４をコードする遺伝子内で同定された。これらのＳＮＰは、白人の個人の約１０％に存在し、いくつかの感染症で明確に関連するのがわかった。この方法の特定の実施形態において、これらのＳＮＰのうちの一方又は両方の存在又は不存在は、例えば、ＰＣＲによって又は当業者によって知られているその他の方法によって決定される。
【００４８】
別の実施形態によると、本発明は癌患者が抗腫瘍薬処置の恩恵を受けるかどうかをインビトロにおいて決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記患者からの適切な生物学的サンプルから、癌及び化学療法の具体的状況の中で「好ましくない」細菌、例えば前記患者の腸微生物叢中の種パラバクテロイデス・ディスタノニス及びフェカリバクテリウム・プラウスニッツイー、属ゲミガー、アリスチペス、及びクロストリジウム属クラスタＩＶ（群クロストリジウム・レプツム；Collinsらによってクロストリジウム属細菌の分類学説明に記載のとおり）からの細菌を含むか又はそれらから成る群からの細菌、の相対量を測定し；適宜、同じ生物学的サンプルにおいて、癌及び化学療法の具体的状況の中で「好ましい」細菌、例えば属ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムからの細菌、の相対量も決定し；例えば、ファーミキューテス／（バクテロイダレス）の比の低下が観察される場合、科ポルフィロモナス科、ＳＦＢ．．．からの細菌の存在もまた測定され；
（ｉｉ）腸微生物叢失調の存在又は不存在を決定すること、
を含み、
【００４９】
ここで、ステップ（ｉ）で挙げられた分類群からの「好ましくない」細菌の過剰発現を伴った腸微生物叢失調が、患者が抗腫瘍薬処置に対して優れた応答者にならないことを示す方法に関係する。
先の内容では、「相対量」は生物学的サンプル中の細菌の総数のパーセンテージとして特定の分類学レベル（門から種まで）の細菌数と規定される。この相対量は、例えば、これらの細菌に割り当てられている、サンプル中に存在する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のパーセンテージを計測することによって、評価できる。それは、当業者によって知られている任意の適切な技術、例えば以下の実験の項に記載の４５４パイロシークエンシング及びこれらの特定の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子マーカーの定量的ＰＣＲ、又は細菌群に特異的な任意の遺伝子の定量的ＰＣＲ、によって計測できる。
【００５０】
当該テキストにおける、「処置に対する優れた応答者」とは、「応答者」又は「感受性のある」患者、又は言い換えれば、この処置から「恩恵を受ける」患者とも呼ばれ、癌に罹患していて、且つ、この処置を受けた後に、臨床的に有意な癌の軽減を示すか又は示すであろう患者を指す。疾患の臨床データは、免疫型関連応答基準（ｉｒＲＣ）、ＷＨＯ又はＲＥＣＩＳＴ評価基準などの当該技術分野で認識されている基準に従って評価され得る。
【００５１】
特定の実施形態によると、生物学的サンプルは、患者から得られた十二指腸又は回腸粘膜の生検検体（好ましくは大きい生検検体）のバイオフィルムである。例えば、この生検検体は、膵臓、胃、胆道又は結腸癌の特定の外科手術中に得ることもできた。
任意のタイプの癌に関する別の実施形態によると、生物学的サンプルは、患者から入手された検便用便である。このサンプルは、診断の時点で又は例えば、処置の開始を決める前の任意の時点で採取されてもよかった。
【００５２】
先に規定されるような「好ましくない」菌の過剰発現を伴った腸微生物叢失調が観察されるとき、これは、患者が抗腫瘍薬処置を始める前又は前記の処置のアジュバントとして腸微生物叢のバランスをとるために処置（例えば、化学療法の前／開始時のプレバイオティクス又はプロバイオティクス投与）を必要とすることを示す。したがって、抗腫瘍薬処置を始める前の期間中（例えば、数週間）に、（プレ又はプロバイオティクスを提供する）患者の投薬計画に適合させるように決定されてもよい。
【００５３】
別の態様によると、本発明は、抗腫瘍薬処置が癌患者のために続けられるべきか又は中止されるべきかインビトロにおいて決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）抗腫瘍薬処置の開始から少なくとも３週間後、好ましくは抗腫瘍薬処置の開始から６〜９週間後（３サイクルの化学療法に相当）に得られた前記患者からの生物学的サンプルから、少なくとも１つの片利共生種の細菌（好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、４つ以上の片利共生）に対して向けられた免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析し；
【００５４】
（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が分析されるそれぞれの片利共生種について、応答を以下のカテゴリ：
−免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答なし；
−Ｔｈ１０：Ｔｒ１／Ｔｒｅｇ表現型の免疫記憶応答；
−Ｔｈ１表現型の免疫記憶応答、
のうちの１つに分類することを含み、
【００５５】
ここで、Ｔｈ１表現型の免疫記憶応答が少なくとも１つの片利共生種に関して観察される場合、該抗腫瘍薬処置が続けられ、そして、斯かる応答の不存在では、抗腫瘍薬処置が中止されるか又は適切なプロバイオティクスで補われる（以下を参照のこと）、
方法に関係する。
【００５６】
この薬力学的アッセイは、この化学療法がアジュバント免疫応答及び臨床利益を引き起こす可能性があるかどうか、化学療法の３〜９週後（化学療法の１〜３サイクル）、好ましくは化学療法の６〜９週後（２〜３サイクル）に予測するために特に有用である。
【００５７】
応答を分類するために、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ−１０の分泌が生体外再刺激アッセイで評価される。好ましい実施形態において、処置の数週間後のサイトカイン分泌特性を処置前に観察したものと比較するために、最初のアッセイは処置開始前におこなわれる。これらのアッセイは、例えば、規定した細菌を添加し、そして、自家血液から精製されたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞とインキュベートした患者の自己単球を使用して実施され得る。特に処置の前後に得られた結果と比較したときに、それがＴｈ１表現型の応答であった場合、すなわち、再刺激がＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの有意な分泌及びＩＬ−１０の低い分泌を引き起こした場合、応答が第三の（好ましい）カテゴリに分類される。一般的に、Ｔｈ１表現型の応答を有している患者にとって、（処置前と比較して）ＩＦＮγの少なくとも２倍増の分泌が処置後に観察される。第一のカテゴリ（免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答なし）は、処置後の再刺激アッセイにおける有意なサイトカイン分泌の不存在に該当するのに対し、第二のカテゴリは、処置後の再刺激アッセイにおけるＩＬ−１０分泌が処置前に観察されたものより優れている応答に該当している。
【００５８】
上記の方法の特定の実施形態によると、ラクトバチルス・ジョンソニー、エンテロコッカス・ヒラエ及びエンテロコッカス・フェカリスの中から選択される少なくとも２つの種に対する免疫記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が分析される。好ましくは、これらの２つに対する、より好ましくはこれらのすべてに対する応答が評価される。
この薬力学的方法の１つの特に有利な態様は、それが血液サンプルを使用して行われるということである。もちろん、どんな種類の癌を患っている患者のためにおこなわれ得る。
【００５９】
第三の態様によると、本発明は、インビトロにおける、患者に投与されたネオアジュバント抗腫瘍薬処置の生物学的効果を決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記患者からの適切な生物学的サンプルから、前記微生物叢中の「好ましい」細菌の相対量を測定し；
（ｉｉ）同じ生物学的サンプルから、前記腸微生物叢中の「好ましくない」細菌の相対量を測定し；
（ｉｉｉ）好ましい細菌の存在量と好ましくない細菌の存在量との間の比を計算すること、
を含み、
ここで、前記比が予定された閾値を超えている場合、結果は、ネオアジュバント抗腫瘍薬処置がＴ−ｂｅｔ／Ｔｈ１局所的及び全身的免疫応答を引き起こしたことを示す方法に関係する。
【００６０】
上記の方法を実施するために、「好ましい」細菌は、属ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムを含む又はそれらから成る群からの細菌であってもよく、そして、「好ましくない」細菌は、種パラバクテロイデス・ディスタノニス及びフェカリバクテリウム・プラウスニッツイー、並びに属ゲミガー、アリスチペス及びクロストリジウム・クラスターＩＶ（クロストリジウム・レプツム群）を含む又はそれらから成る群からの細菌であってもよい。
【００６１】
当業者は、各群（例えば、パイロシークエンシング又は定量的ＰＣＲ）からの細菌の相対量を測定するのに使用される技術に依存する、且つ、患者の各群の定義に依存する適切な閾値を決定する。実際、すべての癌患者について独特な閾値を決定することができないので、比は、患者の健康や食習慣を含めたいくつかの因子を考慮して正しく評価されなければならない。
【００６２】
上記方法を実施するために、生物学的サンプルは、好ましくは、患者から得られた十二指腸又は回腸粘膜の生検検体からの（好ましくは大きい生検検体からの）バイオフィルムである。例えば、この生検検体は、膵臓、胃、胆道又は結腸癌における特定の外科手術中に得てもよい。
重要なことには、先に記載した方法は、化学療法、生物療法、放射線療法、ホルモン療法などを含めた、先に規定される任意の抗腫瘍薬処置に対する癌患者の応答性を予測又は診断するために実施される。特に、これらの方法は、癌患者に関して、化学療法の、より特に、先に引用したものなどのアルキル化剤又は白金塩、及び／又は抗腫瘍ワクチンを用いたものの、（潜在的）利益を評価するのに特に有利に使用され得る。以下の実験データは、シクロホスファミド（実施例１、３及び４）、ドキソルビシン（少なくとも図１４を参照のこと）及びオキサリプラチン（実施例２）によって誘発された免疫応答に対する微生物叢の役割を明確に記載している。興味深いことに、実施例３〜５は、マウスにおいて得られた結果がヒトに対して推定される可能性があることを示す。実験データは、「有益な」微生物叢もまたアントラサイクリン（図８）による処置の効率に対してプラスの影響を有し、且つ、明らかに、フェカリバクテリウム・プラウスニッツイーなどの免疫調整の役割を有する細菌種が腸微生物叢中に多すぎる場合、これらの細菌は薬剤効率にマイナスの影響を与えることを示す。
【００６３】
本発明はまた、癌を処置するために、Ｔ−ｂｅｔ／Ｔｈ１局所的及び全身的免疫応答を引き起こすために抗悪性腫瘍薬と組み合わせて使用するための、ラクトバチルス・ジョンソニー、エンテロコッカス・ヒラエ、及びエンテロコッカス・フェカリスから成る群から選択されるプロバイオティクス菌株にも関連する。
本発明によるプロバイオティクスの例は、番号Ｉ−４８２３で２０１３年１１月１５日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたラクトバチルス・ジョンソニー菌株ＬＪＦＳ００１Ｂ、及び数号Ｉ−４８１５で２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたエンテロココッカス・ヒラエ菌株ＥＨＦＳ００１である。
【００６４】
好ましい実施形態によると、本発明によるプロバイオティクス菌株は経口投与のために処方される。当業者は、生きた又は死滅した微生物類を含み得る、且つ、栄養補助食品（例えば、丸薬、錠剤など）として又は飲料、発酵ヨーグルトなどの機能性食品として提供され得る様々な処方を知っている。
本発明はさらに、癌患者を処置するための、抗腫瘍薬処置と組み合わせた斯かるプロバイオティクスの使用に関連している。
【００６５】
本明細書中に使用される場合、「組み合わせ」という用語は、２つ以上の作用物質（例えば、プロバイオティック株と化学療法薬）の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、治療法が患者に投与される順序を限定しないが、抗腫瘍薬処置の前又はそれと同時にプロバイオティック株を投与するのが望ましい。例えば、プロバイオティック株は、抗腫瘍薬処置が投与される前に規則的又は何度か（例えば、毎日）、抗悪性腫瘍薬に先立って（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前に）投与され得る。
【００６６】
好ましい実施形態によると、本発明によるプロバイオティクス菌株は、化学療法薬又は生物学的免疫療法と組み合わせて、例えばアルキル化剤又は免疫療法による処置と組み合わせて使用される。
少なくとも、番号Ｉ−４８２３で２０１３年１１月１５日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたラクトバチルス・ジョンソニー菌株ＬＪＦＳ００１Ｂ（図２６Ａ）、及び／又は番号Ｉ−４８１５で２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたエンテロココッカス・ヒラエ菌株ＥＨＦＳ００１（図２６Ｂ）を含んでいる組成物もまた本発明の一部である。本発明による組成物は、栄養補助食品（例えば、丸薬、錠剤、シロップなど）の形態であっても、又は飲料、発酵ヨーグルトなどの機能性食品の形態であってもよい。プロバイオティクスはこれらの組成物中で優先的に生存している。
【００６７】
別の態様によると、本発明は、前記患者を処置するための、優先的に化学療法（例えば、アルキル化剤を用いる）又は免疫療法（例えば、抗腫瘍ワクチン、．．．）などの抗腫瘍薬処置と組み合わせて、癌患者から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞由来の「病原性」Ｔｈ１７（ｐＴｈ１７）細胞の養子細胞移植に関連する。例えば、ＣＤ４＋未感作Ｔ細胞を血液から得、次に、増幅し、そして、ｐＴｈ１７表現型（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、及び適宜ＩＬ−１ｂ＋ＩＬ−９の存在下）並びにＴＣＲ架橋（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ａｂでコートしたビーズなど）に都合がよいサイトカインの存在下、生体外で刺激した。先に記載したように、ｐＴｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞（転写因子Ｔ−ｂｅｔの核発現、ＩＦＮγの細胞質発現、及びケモカイン受容体ＣＸＣＲ３の表面露出）及びＴｈ１７細胞（ＲＯＲγｔ、ＩＬ−１７及びＣＣＲ６の発現）の顕著な特徴を共有する。細胞の表現型は、患者へのそれらの移植前に制御される。必要であれば、生体外で得られた細胞は、ｐＴｈ１７表現型を呈するものだけを保有するように選別される。
【００６８】
本発明の他の特徴はまた、本発明の枠組みの中で実施され、且つ、その範囲を制限せずに必要な実験的支援と共にそれを提供する生物学的アッセイに付け加える説明の過程でも明らかになる。
【実施例】
【００６９】
実施例１：腸微生物叢はシクロホスファミドの抗癌性免疫効果を調節する−マウス研究
材料と方法
注意：相容れない適用がない限り、当該実施例に記載のある材料と方法は、他の実施例で使用されたものでもある。
【００７０】
動物と腫瘍モデル。すべての動物実験を、フランス及びヨーロッパの法律及び規制を遵守して実施した。マウスを７〜１４週齢で使用した。ＷＴ ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＤＢＡ２／Ｊマウスを、Harlan, Charles River又はJanvierから入手し、そして、特定病原菌未感染条件（ＳＰＦ）内に保持した。Ｎｏｄ１−／−Ｎｏｄ２−／−及びＮｏｄ２−／− Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはI. Gomperts Boneca（Institut Pasteur, France）によって提供され、Ｍｙｄ８８−／− Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはB. Ryffel（CNRS, France）によって提供され、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ無菌マウスはCDTA（Orleans, France）又はInstitut Pasteurから入手し、そして、無菌のアイソレータ内で維持した。ＭＣＡ２０５、Ｂ１６Ｆ１０（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの同系）及びＰ８１５（ＤＢＡ２／Ｊマウスの同系）を、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Invitrogen）含有ＲＰＭＩ１６４０中で３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。０．５〜１×１０６個のＭＣＡ２０５、０．３×１０６個のＢ１６Ｆ１０又は０．８×１０６個のＰ８１５腫瘍細胞を右側部にｓ．ｃ．で接種した。腫瘍が３５〜６０ｍｍ２に達したときに、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の腫瘍内投与（２ｍＭ、５０μｌ）又はＣＴＸの腹腔内接種（１００ｍｇ／ｋｇ体重）によって化学療法を実施した。
【００７１】
化学療法を使用した肺腺癌担持ＫＰマウスの処置。８週齢のＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／ＷＴ；ｐ５３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘマウスに、鼻腔内滴下によってＣｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを与えた（ｄ０と規定）。Ｃｒｅリコンビナーゼシステムは、肺のいくつかの体細胞内で発癌性Ｋｒａｓ（ＫｒａｓＧ１２Ｄ）を活性化し、そして、ｐ５３を非活性化する；グレード３及び４の腺癌は〜ｄ７０で目に見えるようになる（Cortez-Retamozo et al., 2013）。マウスは、未処置のままのか、又は０．２５ｍｇ／ｍｌバンコマイシンの不存在又は存在下（ｄ７７に開始し実験終了まで飲料水中に混合して；抗生物質含有水は隔週で置き換えた）、化学療法（ｄ８４、ｄ９１、及びｄ９８）を与えた。腫瘍体積を、先に記載した断層撮影技術（Cortez-Retamozo et al., 2013）によって麻酔下のマウスで、ｄ７３及び１００に定量した（「プレ」及び「プロ」化学療法に相当）。データは、２つの時点の間の全肺腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）の絶対変化を示す。
【００７２】
試薬。シクロホスファミド（ＣＴＸ）（エンドキサン、Baxter）はInstitut Gustave Roussyによって提供された。塩酸ドキソルビシン（Ｄ１５１５）及びフルオレセインイソチオシアナートデキストラン（ＦＩＴＣデキストラン）（４６９４４、４ｋＤａ）をSigma Aldrichから入手した。ＣＤ３ε、ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３−１７３）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８α（５３−６．７）、γδＴＣＲ（ＧＬ−３）、ＩＬ−１７（ｅＢｉｏｌ７Ｂ７）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ１０）、ＲＯＲγｔ（ＡＦＫＪＳ−９）、ＣＤ４５、ＣＣＲ６（１４０７０６）に対する抗マウス抗体をBioLegend、eBioscience、及びR&Dから入手した。生存染色のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ定着性黄色染色蛍光色素をInvitrogen／Molecular Probesから購入した。すべての細胞を、ＦｌｏＪｏ（Tree Star）ソフトウェアを用いたＣｙａｎ（Beckman Coulter）又はＦＡＣＳＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）フローサイトメータにより分析した。
【００７３】
抗生物質プロトコール。マウスを、腫瘍移植前の２〜３週間、抗生物質で処置し、そして、実験終了まで続けた。アンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）＋ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）＋コリスチン（１ｍｇ／ｍｌ）（Sigma Aldrich）の混合物、又はバンコマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）又はコリスチン（２＝２１ｅｊ．１０３Ｕ／ｍｌ）だけを無菌の飲料水中に加えられた。溶液とボトルを１週間に２〜３回交換した。抗生物質活性を、盲嚢（拡張）のレベルで観察される巨視的な変化によって、並びにＢＨＩ＋１５％グリセロール中に再懸濁した糞便ペレットを血液寒天平板及び嫌気性血液寒天平板上で、それぞれ好気性条件向けの５％のＣＯ２を用いて３７℃にて４８ｈ又は嫌気性条件で培養することによって、分析した。図４に示した実験で、バンコマイシンは異なった片利共生種（Ｅ．コリ及びクロストリジウム属の別の種など、図１６）に向かって片利共生細菌のレパートリーを偏らせたが、コリスチンはＥ．フェカリスの増殖を促進した。
【００７４】
細菌の分離、培養、及び識別。腸間膜リンパ節と脾臓を、無菌的に摘出し、ＰＢＳ中で打ち崩し、そして、好気性及び嫌気性増殖のためにＣＯＳ寒天平板（BioMerieux）上で平板培養した。培養の４８ｈ後に、単一コロニーを単離し、そして、−８０℃にてグリセロール中に保存した。
【００７５】
未処置マウス又はＮａＣｌ若しくはＣＴＸ、バンコマイシン若しくは広域抗生物質（ＡＴＢ）（アンピシリン＋ストレプトマイシン＋コリスチン）で処置した腫瘍担持体からの糞便の段階希釈物を、ＣＯＳ寒天平板上で平板培養し、そして、４８ｈ後に、単一コロニーを単離し、グラム染色を実施した。具体的な細菌の識別を、形態学的試験とＶＩＴＥＫ（登録商標）自動化システムによる分析（BioMerieux, France）とを組み合わせて実施し、そして、Pasteur Institute, Paris, France.で実施した質量分析法（ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ、以下を参照のこと）によって確認した。
【００７６】
実験に使用されるＰ．ディスタノニスは、長期間の広範囲ＡＴＢで処置されたＳＰＦマウスの糞便から単離され、そして、先に記載したように同定された。試験管内実験のために、Ｅ．ヒラエ、Ｅ．フェカリス、及びＥ．コリをＢＨＩ培地（Fluka analytical）中で培養し、一方で、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．プランタルム及びＬ．ムリヌスはＭＲＳ培地（ＢＤ）中で３７℃にて、増殖が指数関数的になったときに、それらがＯＤ６００＝１に達するまで培養した。Ｌ．ロイテリを、３７℃にて４８ｈ、嫌気性条件でＣＯＳ寒天平板上に培養した。投薬量を評価できるように、菌調製物の段階希釈物を平板培養した。Ｅ．コリＭＣＩ０６１、Ｅ．フェカリスＪＨ２−２、及びＬ．プランタルムＮＣＩＭＢ８８２６は親切なことにI. Gomperts Boneca, Institut Pasteur, Franceによって提供された。Ｐ．ディスタノニスを、嫌気性条件で４８ｈ、ＣＯＳ寒天平板上で培養し、次に、コロニーをＯＤ６００＝１に達するまでＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７７】
細菌の識別をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定法でおこなった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析法を次のように準備した細胞でおこなった。菌株をＭＲＳ寒天上で３７℃にて一晩培養した。約５〜１０ｍｇの細胞を、３００μｌの無菌の超純水及び９００μｌの無水エタノール中に再懸濁し、チューブを軽くたたくことによって均質化し、１３０００ｇで２分間遠心分離し、そして、上清を捨てた。それに続いて、５０μｌのギ酸をペレットに加え、撹拌し、その後、５０μｌのアセトニトリルを添加した。混合物を、１３０００ｇで２分間、再び遠心分離した。１マイクロリットルの上清をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦサンプルプレート上にスポットし、そして、室温で風乾した。各サンプルを１μｌの（ＨＣＣＡ）マトリックス溶液（Bruker Daltonics ref 201344：５０％アセトニトリル−２．５％トリフルオロ酢酸中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の飽和溶液）で覆い、そして、室温で風乾した。計測は、ｆｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア（バージョン３．０）を使用したＡｕｔｏｆｌｅｘ質量分析計（Bruker Daltonik GmbH, Germany）を用いて実施した。スペクトルを、正の直線モード（レーザー周波数、２００Ｈｚ、イオン源Ｉ、２０ｋＶの電位；イオン源２、１８．４ｋＶの電位；レンズ電位、９．１ｋＶ、質量範囲、２０００〜２００００Ｄａ）で記録した。自動化データ解析において、未加工スペクトルを既定の設定を用いてＭＡＬＤＩ ＢｉｏＴｙｐｅｒ２．０ソフトウェア（Bruker Daltonik GmbH, Germany）を使用して加工した。試験した菌株からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ユニバーサルプライマーＡ、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）（８〜２７位、エシェリキア・コリのナンバリング）及びＨ、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’（配列番号２）（１５４１〜１５２２位）（Bottger, 1989）を使用したＰＣＲによって、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）サーマルサイクラー（Perkin- Elmer, Wellesley, MA）及び以下の：９４℃にて４分、２５サイクルの９４℃にて１分、５７℃にて１分、７２℃にて２分、そして、７２℃にて５分の最終的な伸長ステップを伴うパラメーターにより増幅した。ＰＣＲ作製した単位複製配列の配列決定を、プライマーＡ、Ｈ、及び他の２つの配列決定プライマー（Ｅ．コリナンバリングシステム）：Ｂ、５’−ＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号３）、３３９〜３５８位；及びＧ、５’−ＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号４）、９４７〜９６４位を使用してGATC Companyによって実施した。１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子のほとんど完璧な配列を、ソフトウェアＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓバージョン６．６（Applied-Maths, Belgium）を使用して構築し、その後、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムによりブラスト処理した。
【００７８】
腸組織の組織像と免疫蛍光法。小腸全体（十二指腸、空腸、及び回腸）を摘出し、糞便内容物を掃除し、そして、４％のＰＦＡ中で１ｈ固定した。組織の再水和を１５％のスクロース中で１ｈ、そして３０％のスクロース中で一晩実施した。実験によって、小腸を全体的に丸めるか又は小片になるまで細断し、次に、最適なカッティング温度（ＯＣＴ）化合物（Sakura）に包埋し、急速冷凍し、そして、縦又は横６μｍの切片を調製した。
【００７９】
組織学分析のために、縦切片をヘマトキシリンとエオシンによって対比染色した。組織学的定量分析法のために、炎症性病巣、変化した絨毛、及び粘膜固有層の厚さを各部分についてスコア化し、それと同時に、杯細胞の数を各絨毛についてカウントした。パネート細胞のカウントのために、縦切片を、０．５％のトリトンで１５分間、透過処理し、そしてそれを、０．１％のトリトン、５％の血清、及び１％のＢＳＡの溶液で１ｈブロックした。次に、リゾチームタンパク質対するウサギポリクローナル抗体（１：５００で１ｈ、Thermo Scientific）及びヤギ抗ウサギＩｇＧのAlexa Fluor 488 Fragment（１：３００で１ｈ、Molecular Probes）を使用した。すべてのステップを室温で実施した。リゾチーム陽性面積を、モザイク像に対してＨｉｓｔｏｌａｂソフトウェア（Micro vision Instruments）を使用して定量化した。パネート細胞の定量を、リゾチーム陽性クラスタ（パネート細胞の群）の平均面積、並びにそれらのクラスタの放出／μｍ２、を計測することで実施した（未掲載）。
【００８０】
腸の白血球の蛍光抗体法。γδＴＣＲ＋とγδＴＣＲ− Ｔ細胞の定量化のために、横切片を０．１％のトリトン及び１０％のヤギ正常血清の溶液で１ｈブロックした。次に、切片を、ハムスター抗γδＴＣＲ（１０μｇ／ｍｌ Ｏ／Ｎ ４℃、BD Pharmingen）及び二次抗体としてのヤギ抗ハムスターＡ４８８（７．５μｇ／ｍｌで４５分、Jackson ImmunoResearch）、又はハムスター抗マウスＣＤ３ Ａ６４７（５ｇ／ｍｌで２ｈ、Biolegend）を用いて免疫染色した。各切片について、全細胞、γδＴＣＲ＋ＣＤ３＋及びＣＤ３＋細胞の数をカウントして、γδＴＣＲ＋とγδＴＣＲ− Ｔ細胞のパーセンテージを決定した。
【００８１】
生体内における腸透過性アッセイ。腸のバリア完全性を、ＦｌＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ、Sigma Aldrich）の透過性によって評価した。１００又は２００ｍｇ／ｋｇのＮａＣｌ又はＣＴＸのｉ．ｐ．注射の１４時間後に、マウスを４時間絶食させ、次に、０．６ｍｇ／ｇ体重（ＮａＣｌ中に８０ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ／ＣＴＸ処置の１８ｈ後）にてＦＩＴＣ−デキストランを経口的に摂取させた。３〜４ｈ後、マウスを安楽死させ、そして、心臓の穿刺によって放血させた。血漿ＦＩＴＣレベルをそれに続いて分光蛍光光度計を使用して決定した（λｅｘ／λｅｍ＝４８５／５３５ｎｍ）。
【００８２】
小腸からの粘膜固有層細胞の分離。十二指腸及び回腸の全体を採取し、パイアー斑、並びにすべての脂肪部分及び糞便内容物を取り除いた。全長に沿った第一の長軸方向でそれらを切り、次に、１〜２ｃｍの長さの小片に横方向に切ることによって、小さな断片を得た。上皮内リンパ球（ＩＥＬｓ）を取り除いた後に、腸の小片をさらに切り、粘膜固有層細胞（ＬＰＣｓ）を単離するために、振盪しながら３７℃にて４０分間、０．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＶＩＩＩ及び１０Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩと共にインキュベートした。消化後に、腸の小片を細胞濾過器で潰した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞懸濁液を２１００ＲＰＭにて２０分のパーコールグラジエントにかけ、同時にＲＮＡ抽出のために、細胞をＲＬＴバッファー（Qiagen）中で直接溶解し、そして、−８０℃にて凍らせた。
【００８３】
ＣＴＸで処置した小腸の樹枝状細胞サブセットの分析。
マウス脾臓及びリンパ節からの細胞懸濁液を、コラゲナーゼ及びＤＮアーゼで６０分間消化し、それに続いて７０μｍのメッシュを通して裏漉しすることによって調製した。結腸及び小腸のリンパ球を、先に記載したとおり（Schlitzer et al., 2013）単離した。要するに、結腸及び小腸を、３７℃にて振盪しながら５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳで消化した。最初の消化後、結腸及び小腸組織の小片を、ＲＰＭＩ培地を含んでいるコラゲナーゼ／Ｄｎａｓｅ中で３０分間消化した。組織小片を７０μｍのメッシュを通してさらに裏漉しした。フローサイトメトリー分析のために、細胞懸濁液を、以下の表面マーカー：ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ１１ｂ（ｍｌ／７０）、Ｌｙ６ｃ（ＨＫ１．４）、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、ＣＤ６４（Ｘ５４−５／７．１）、ＣＤ３１７（ｅｂｉｏ９２７）、ＣＤ４５（３０Ｆ１１）、Ｆ４／８０（Ｃ１：Ａ３−１）、ＣＤ８α（５３−６．７）、に対する抗体で染色した。ＤＡＰＩを死細胞を除外するのに使用した。抗体を、eBioscience、BD Biosciences又はBioLegendからそれぞれ購入した。細胞集団に次のようにゲートをかけた：小腸（移動画分）：ＣＤ１０３＋ ＤＣ（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１０３＋ ＣＤ２４＋）、ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ１０３＋（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ 、ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１０３＋ ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２４＋）、ＣＤ１１ｂ＋（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２４＋）、炎症性ＤＣ（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ６４＋ Ｌｙ６ｃ＋）、大腸：ＣＤ１０３＋ ＤＣ（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１０３＋ ＣＤ２４＋）、ＣＤ１１ｂ＋（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２４＋）、炎症性ＤＣ（ＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ−ＩＩ＋ ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ６４＋ Ｌｙ６ｃ＋）。
【００８４】
微生物叢の再構成。ＳＦＢのＧＦマウスへの接種のために、糞便ペレットを、殺菌試験管を用いてＳＦＢ単独定着マウスから回収した。糞便ペレットを水中に均質化することによって得た２００μｌの懸濁液の経口強制飼養によって、定着を実施した。効果的な定着を腫瘍接種前にまず確認した。
【００８５】
Ｅ．ヒラエ、Ｌ．ジョンソニー、及びＬ．プランタルムを、ＢＨＩ（Fluka analytical）及びＭＲＳ（ＢＤ）ブロスそれぞれで３７℃にて一晩培養した。細菌を遠心分離し、一度洗浄し、そして、１のＯＤ（６００ｎｍ）にて無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてそれは１ｘ１０９コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍｌに相当する。それぞれの菌懸濁液の等容積を混合して、１ｘ１０９細菌／ｍｌのそれぞれの細菌型の均一な割合の懸濁液を得た。Ｌ．ロイテリをＣＯＳ寒天平板上、嫌気性条件で３７℃にて４８ｈ培養した。Ｐ．ディスタノニス定着のために、マウスをアンピシリン／ストレプトマイシン／コリスチン（ＡＴＢ）の混合物で４週間処置し、そして、ＭＣＡ２０５接種後４日、２００μｌのＰＢＳ中に１０９ＣＦＵを経口的に接種をした。他の実験のために、ＡＴＢ後２〜３週間、処置を中止し、そして、ＣＴＸ投与１日後そして、懸濁液処置０〜３日後、マウスに１０９ＣＦＵのＥ．ヒラエ＋Ｌ．ジョンソニー又はＬ．プランタルム又はＬ．ロイテリを経口的に強制飼養した。
【００８６】
ＴＣＲとＴ細胞の試験。架橋実験のために、（赤血球溶解後）１ウェルあたり２×１０５個の総脾細胞を、抗ＣＤ３ε ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１）（１ウェルあたり０．５μｇ；eBioscience）及び／又は抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（３７．５１）（２μｇ／ｍｌ；ＢＤ）で前もってコートしたＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）でインキュベートした。上清を、マウスＩＬ−１７Ａ（eBioscience）とＩＦＮγ（ＢＤ）について４８ｈにＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＴＩＬ分析において、腫瘍を取り出し、小片になるまで細断し、そして、Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＭ（Roche）及びＤＮアーゼＩで３７℃にて３０分間、消化した。シリンジプランジャーで消化した組織をつぶし、そして、１００μΜの細胞濾過器を通して濾過することによって、単一細胞懸濁液を得た。菌体内に関して、細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、１μｇ／ｍｌのイオノマイシン及びＢＤ Ｇｏｌｇｉ ＳＴＯＰ（商標）と共に３７℃にて４ｈインキュベートした。膜染色後に、細胞を、eBioscienceのＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセットを使用して抗ＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮγ、Ｔ−ｂｅｔ、及びＲＯＲγｔを用いて染色した。
【００８７】
インビトロにおけるＴ細胞の極性化と増殖。Ｔｈ１７細胞（病原性又は制御性Ｔｈ１７）の養子移植。未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉ）をＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスの脾臓及びリンパ節から得た。次に、細胞をフローサイトメトリー（BD ARIA III with FACSDiva Software）によって適切に選別した。単離したＴ細胞数の純度は常に９５％を超えていた。未感作Ｔ細胞を、組み換えマウスＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍｌ）（ｐＴｈ１７）又はＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（Ｔｈ１７）（Miltenyi）のいずれかの存在下、ＣＤ３ε（１４５〜２Ｃ１１、μｇ／の２ｍｌ）及びＣＤ２８（ポリビニール−１、μｇ／の２ｍｌ）に対するプレート結合抗体で刺激した。制御性Ｔｈ１７（Ｔｈ１７）をＴＧＦ−β（２，５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６の分化から得たのに対し、病原性Ｔｈ１７（ｐＴｈ１７）をＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−２３におけるインキュベーションから得た。マウスに３×１０６個のＴ細胞を静脈内に注射した。インビトロにおけるＴ細胞の感作。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び頸節から作出し、Ｊ５５８上清（４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ含有）、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μΜの２−メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）含有Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地（Sigma-Aldrich）中で８日間培養し、３〜４日ごとに分割した。８日目に、ＢＭＤＣｓを、抗生物質を含まない適切な培地中で３７℃にて１ｈ、１：５０のＭＯＩ（感染多重度）の分離細菌株と共に感染させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補った完全培地中でインキュベートし、細胞外の細菌を殺滅した。２４ｈ後に、ＢＭＤＣｓを脾臓及びリンパ節から精製した未感作ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（Miltenyi）と一緒に１：１の比で４日間培養した。次に、培養上清をＩＬ−１７及びＩＦＮγについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫記憶応答。ＢＭＤＣｓを、先に記載した様々な細菌用量（細胞：細菌の比１：２、１：１０、及び１：５０）で感染させ、そして２４ｈ後に、ＣＴＸ又はＮａＣＩで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞（Miltenyi）と共に１：１で培養した。２４ｈ後に、培養上清をＩＬ−１７とＩＦＮγについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【００８８】
養子Ｔ細胞移植。Ｂ６．ＣＢｉｒｌ ＴＣＲトランスジェニック（ＣＢｉｒｌ Ｔｇ）マウス（Cong et al., 2009）を、BirminghamのUniversity of AlabamaのAnimal Facilityにおいて作出し、そして、飼育した。すべての実験は、Institutional Animal Care及びUse Committee of the University of Alabama at Birminghamによってレビューされ、そして、承認された。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗マウスＣＤ４磁性ビーズを使用してＢ６．ＣＢｉｒｌ ＴＣＲ Ｔｇマウスから単離した。簡単に言えば、脾細胞を、二度洗浄し、抗ＣＤ４磁性ビーズと共に４℃にて３０分インキュベートし、次に、磁場によって分離した。フローサイトメトリーによって確認すると、細胞の９５％超がＣＤ４＋Ｔ細胞であった。１００万個のＣＢｉｒｌ Ｔｇ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋）を、化学治療法の２日後に、ＣＴＸ又はＮａＣｌ処置した未処置類遺伝子性（ＣＤ４５．２＋）マウスにｉ．ｖ．により養子移植し、そして、フローサイトメトリー分析及び生体外脾細胞再刺激のために、
移植後５〜７日目に脾臓を採取した。フローサイトメトリー分析を、モネンジンの存在下でのＰＭＡ／イオノマイシン再刺激の５ｈ後の細胞内ＩＬ−１７＋又はＩＦＮγ＋細胞のパーセンテージを正確に評価するためにＣＤ４５．１＋細胞に対してゲートをかけた。他の脾細胞を、１００万個／ｍｌにて２４ウェル平底プレート内、三連でインキュベートし、１μｇ／ｍｌのＣＢｉｒｌペプチド４５５−４７５（ＤＭＡＴＥＭＶＫＹＳＮＡＮＩＬＳＱＡＧＱ）あり又はなしで培養し、そして、上清を抗ＩＦＮγ特異的な市販のＥＬＩＳＡを使用して分析した。
【００８９】
抗微生物ペプチド測定のための定量的ＲＴ−ＰＣＲ。粘膜固有層細胞を、ＣＴＸ後１８ｈの十二指腸、回腸、及び結腸から単離し、そして、全ＲＮＡ抽出及びゲノムＤＮＡ除去を、製造業者の取扱説明書に従って、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）で実施した。回腸又は十二指腸の全ＲＮＡ抽出及びゲノムＤＮＡ除去を、製造業者の取扱説明書に従って、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）で実施した。次に、全ＲＮＡを、ランダムプライマー（Promega, Charbonnieres, France）及びDeoxynucleoside Triphosphate Set、ＰＣＲグレード（Roche Diagnostics, Meylan, France）の存在下、Superscript III Reverse Transcriptase and the RNaseOUT（商標） Recombinant Ribonuclease Inhibitor（Life Technologies, Saint Aubin, France）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＲｅｇＩＩＩγ（Ｍｍ００４４１１２７＿ｍｌ）及びＬｙｓＭ（ＭｍＯｌ６１２７４ｌ＿ｍｌ）関連遺伝子の発現を、TaqMan（登録商標） Gene Expression Assays using the Universal Master Mix II on a StepOnePlus（商標） Real-Time PCR System（Life Technologies, France）を使用して分析した。定量的ＲＴ−ＰＣＲデータを、２−ΔＣｔ法を用いてハウスキーピング遺伝子ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（Ｐｐｉａ）の発現レベルに対して標準化した。
【００９０】
共生細菌に対する細菌ＤＮＡ抽出、４５４パイロシークエンシング、及び定量的ＰＣＲ。全ＤＮＡを、物理的溶解及び化学的溶解の両方を使用して、先に記載したように（Lepage et al., 2005; Seksik et al, 2003）粘膜サンプル（〜５０−１００μｇ）から抽出した。ＤＮＡ濃度と完全性を、エチジウムブロマイド含有１％アガロースゲルによる電気泳動によって視覚的に、及びNanodrop施設（Thermo Scientific）を使用することによって分光光度測定的に測定した。
【００９１】
微生物叢組成物を、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を標的とした４５４パイロシークエンシング（GS FLX Ti technology）によって評価した（Ｖ３ｆｗｄ：５’ＴＡＣＧＧＲＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’、配列番号５；Ｖ４ｒｅｖ：５’ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ３’、配列番号６）。配列を、バーコード、ＰＣＲプライマー、及び最短配列長３００ｐｂ、最低塩基品質閾値２７、最長ホモポリマー長６に調整した。得られた配列を、ＲＤＰデータベース（リリース１０、アップデート３１）を使用して異なった分類学レベル、門から属までに割り当てた（Cole et al., 2009）。配列を、ＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏら、２０１０）及びｃｄｈｉｔ（李とＧｏｄｚｉｋ、２００６）を使用して９７％の同一性にてＯＴＵｓ（操作的分類単位又はファイロタイプ）へとさらにクラスタ化した。ＯＴＵｓを、Ｓｅｑｍａｔｃｈ（ＲＤＰ）及びＢｌａｓｔａｌｌ（ＮＣＢＩ）を使用して最も近い分類的近縁及び関連細菌種に割り当てた。各ＯＴＵｓと他の分類学レベル（門から属まで）の相対量を各サンプルについて計算して、複数の個人を通じた様々なサンプリングレベルを考慮した。調整後に、各ＯＴＵｓ（又は他の分類学レベル）にクラスタ化された配列の数を、それぞれ個人のそれぞれの特徴に関する相対寄与を表す割合に変換した。色分け地図表示のために、ｌｏｇ１０変換を相対量データ行列に適用し、そしてそれが、サンプルの相対量の１％未満を構成し得る群落のメンバーに影響するサンプル間の類似点又は相違点を可視化できる。様々なマウス微生物叢の主成分分析法を、細菌属組成物に基づいて計算した。それぞれのクラスタ化結果のロバスト性を、モンテカルロ順位検定（ｎ＝１００００反復、ｐ＜０．０５）（Romesburg, 1985）を使用して評価した。細菌数に関するさらなる洞察を得るために、定量的ＰＣＲを適用した。標的化ｑＰＣＲシステムを、（すべての細菌領域、クロストリジウム・レプツム群（Ｍａｙｅｕｒら、２０１３）を標的とするシステムについて、又はＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（ラクトバチルス／リューコノストック／ペディオコッカス群（Ｍａｙｅｕｒら、２０１３）、エンテロコッカス群（フューレら、２００９）、ＳＦＢ（陰ら、２０１３）及びＴＭ７（Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚら、２００１）を標的とするシステムについて）Ｔａｑｍａｎ技術を使用して適用した。ＳＦＢ及びＴＭ７又はクロストリジウム群ＸＩＶの相対量のＣＴＸ特異的調節が、ＣＴＸ後７日目の時点で全く観察されなかった（未掲載）。定量的ＰＣＲを、ソフトウェアバージョン１．２．３（Applied Biosystems）を餅田ABI 7000 Sequence Detection Systemを使用して実施した。増幅及び検出を、先に記載したＤＮＡサンプルの適切な希釈物１０μｌを含んでいる終量２５μｌの二連で、TaqMan Universal PCR 2_MasterMix（Applied Biosystems）又はSYBR-Green PCR 2_Master Mix（Applied Biosystems）のいずれかを使用して実施した。増幅を、以下のランピングプロファイル：９５℃にて１０分間を１サイクル、続いて９５℃にて３０秒間、６０℃にて１分間を４０サイクル、を使用して実施した。ＳＹＢＲ−グリーン増幅のために、溶解ステップを加えた（Yin et al., 2013）。細菌群の定量化のために、検量線を、各群の代表からの既知濃度のゲノムＤＮＡ��段階希釈物から作り出した。検量線を、閾値サイクル（Ｃｔ）対細菌量（ＣＦＵ）でプロッティングすることによって作り出した。細菌の総数（ＣＦＵ）を平均した検量線から補完した。
【００９２】
定量的ＰＣＲ分析による養子移植Ｔｈ１７細胞の特徴づけ。Ｔ細胞からの全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen）と共に抽出した。１００〜３００ｎｇのＲＮＡを、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ランダムプライマー、及びＲＮａｓｅＯＵＴ阻害剤（Invitrogen）によってｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、Ｆａｓｔ７５００検出システム（Applied Biosystems, France）においてＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲキット（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムＰＣＲによって定量化した。相対ｍＲＮＡ値をΔＣｔ法で測定した。値をシクロフィリンＡに対して表した。使用されるオリゴヌクレオチドの配列を、以下に記載する。
【００９３】
【表１】
2020050664.tif 000002
【００９４】
生命情報工学と統計。β回帰及び負の二項配分によってそれぞれ比較した割合及び計数データの例外では、それらの本来の尺度又は対数尺度でのパラメーターに対する処置の影響を評価するために、直鎖モデリングを適用した。モデル残基の系統的な検査法及び各方法それぞれへの診断ツールの適用では、データの適切な当てはめを確認した。細菌内容物に対する腫瘍及びＣＴＸ処置の影響を、先に記載した検出した測定値から成るのではなく、最尤法によって推測した（Helsel, 2005）。両パラメーターで未検出となる可能性を考慮して、ケンドールのタウ（Newton and Rudel, 2007）を、ブートストラッピング（Ｂ＝１９９９）で見積もられた回帰直線の標準誤差バンドに満足するＩＬ−１７／ＩＦＮγと細菌との間の相関研究のために計算した。同様の結果を、データへの同じ手順の適用、非検出が除外されたサンプル、及びｐ値の決定を含めた、さらなる妥当性検討によって得た。腫瘍増殖モデリングを、ログ未加工腫瘍表面に対する線形混合効果モデリングによって実施した（Demidenko, 2006; Sugar et al., 2012）。報告したｐ値は、腫瘍増殖スロープと切片（対数尺度にて）の両方が着目の処置群の間で同じである、連帯した試験から得られた。明確さのために、試験の結果は、ｐ＜０．０５の有意差が見られた比較についてのみ与えられる。１回のサンプリング時点での事後対検定では、グラフに関して報告した効果を確認した。腫瘍面積に有意差がないものは処置時点で処置群間を強調したことに注意する。「腫瘍の存在／不存在と腫瘍増殖」の発現率をFirthのペナルティー付き尤度のロジスティック回帰と比べた（Heinze, 2006）。報告したすべての検定が、両側検定であり、且つ、有意であると見なされた：＊、ｐ値＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。
【００９５】
結果
当該実施例において、小腸微生物叢に対するＣＴＸの影響、及び抗腫瘍免疫応答に対するその後の効果を説明した。
腸上皮バリアの炎症状況は、未処置マウスにおいて、骨髄非破壊的用量のＣＴＸ又はアントラサイクリン系ドキソルビシンを用いた処置後４８時間で特徴づけられた。両剤とも、粘膜固有層（ＬＰ）における小腸絨毛の短縮、上皮バリアの不連続、組織間腔の水腫、及び単核細胞の巣状滞留を引き起こした（図１Ａ〜Ｂ）。化学療法後、杯細胞及びパネート細胞の数は、それぞれ絨毛（図１Ｃ）及び陰窩（図１Ｄ）で増加した。抗菌酵素リゾチーム（殺微生物性ペプチドＲｅｇＩＩＩγでなく）は、ＣＴＸで処置したマウスの十二指腸で上方制御された（図１Ｅ）。経口的投与されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストランは、ＣＴＸ後１８ｈで血液中（Yang et al., 2013）で検出可能になり、腸透過性の増大を確認した（図１Ｆ）。腸バリアの破損は、ＣＴＸ後４８ｈで良好に検出可能であった腸間膜リンパ節及び脾臓への＞５０％のマウスにおける共生細菌の有意な移行を伴い、ドキソルビシン処置後にそれは少なくなった（図２Ａ）。ラクトバチルス・ジョンソニー（＞４０％の場合で増殖）、ラクトバチルス・ムリヌス及びエンテロコッカス・ヒラエを含めた数種類のグラム＋細菌種が、これらのリンパ器官から培養される場合がある（図２Ｂ）。
【００９６】
次に、腸微生物叢の全体的な組成を、高速大量処理４５４パイロシークエンシングと、それに続く領域細菌及び特有の細菌群を標的とする定量的ＰＣＲによって分析した。ＣＴＸは初期時点（２４〜４８ｈ、図５）にて主要な微生物叢失調の原因とならなかったが、ＣＴＸは、その投与後１週間で皮下癌（すなわち、転移性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ及び非転移性ＭＣＡ２０５肉腫）を担持しているマウスの小腸（しかし盲嚢については変更しない）の微生物組成を有意に変更した（図２Ｃ、図５）。患者の糞便サンプルに関する以前の報告（Zwielehner et al., 2011）と一致して、ＣＴＸは、ＣＴＸ処置動物の粘液において４つの属及び群（クロストリジウム属クラスタＸＩＶａ、ロゼブリア、未分類ラクノスピラ、コプロコッカス、表２）の中に配分するファーミキューテス門（図５）からの細菌種の低減を誘発した。
【００９７】
【表２】
2020050664.tif 000003
【００９８】
定量的ＰＣＲを、ＣＴＸ対ビヒクル処置した未処置及び癌担持マウスからの小腸粘膜中のすべての細菌及び標的とした群の細菌（ラクトバチルス、エンテロコッカス、クロストリジウム・レプツムクラスタＩＶ群）の細菌数を決定するために適用した。腫瘍担持体では、ＣＴＸ後７日間の小腸の総細菌量、並びにクロストリジウム・レプツムの細菌数は影響を受けなかった（図２Ｄ）。しかしながら、ＣＴＸ処置はラクトバチルス属とエンテロコッカスの存在量の低減につながった（図２Ｄ）。要するに、これらのデータは、明白なグラム＋細菌種の選択的移行と、その後の小腸微生物叢の有意な変化を引き起こすＣＴＸの能力を明らかにする。
【００９９】
ＣＴＸ後７日間の微生物叢失調と同時に、ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞（図７Ａ）及びＴＣＲαβ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（図７Ｂ）が転写因子ＲＯＲγｔを発現する頻度は、分離組織（図７Ｂ）及びインサイツ蛍光抗体染色（図７Ｃ）のフローサイトメトリーによって明らかにされるように、（結腸ではなく）小腸の粘膜固有層（ＬＰ）で有意に減少した。ＲＯＲγｔは、Ｔｈ１７細胞（インターロイキン−１７、ＩＬ−１７を生じさせる）の産生のために必要であり、そして、腸常駐と全身的Ｔｈ１７応答との間の強い連結は、関節、脳又は膵臓（Ghiringhelli et al., 2004; Lee et al., 201 1 ; Wu et al., 2010）に影響する自己免疫疾患との関連を確立した。先行研究（Michaud et al., 2011 ; Viaud et al, 2011）を確認して、ＣＴＸは、Ｔｈ１（インターフェロン−γ［ＩＦＮγ］産生）及びＴｈ１７（図３Ａ、図７Ｄ）に向かう脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の極性化を引き起こした。この効果はドキソルビシンに関して見られなかった（図８）。腸微生物叢は、ＣＴＸに対応して未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−１７産生菌への転換を連動させるのに不可欠であった。実際、ＴＣＲによって刺激された脾細胞による生体外ＩＬ−１７放出は、特定病原菌未感染（ＳＰＦ）マウスのＣＴＸ処置によって増大したが、無菌（ＧＦ）マウスではそうならかった（図３Ａ、左のパネル）。広域抗生物質（ＡＴＢ、コリスチン、アンピシリン、及びストレプトマイシンの組み合わせ、図９）による腸の滅菌もまた、ＩＬ−１７（図３Ａ、右のパネル）のＣＴＸ刺激された分泌を抑え、そして、ＴＣＲ刺激された脾細胞によるＩＦＮγも抑えた（図７Ｄ）。グラム＋細菌に特異的な抗生物質（Rice, 2006）であるバンコマイシンによるマウスの処置もまた、ＣＴＸ誘発Ｔｈ１７転換を低減した（図３Ａ、右のパネル）。従来のＳＰＦマウスでは、小腸粘膜（図２Ｄ）で計測されたラクトバチルス属及びＳＦＢの数は、脾細胞のＴｈ１とＴｈ１７の極性化とプラスに関連したが（図３Ｂ、図７Ｅ）、クロストリジウム属クラスタＩＶとは関連しなかった（図３Ｂ）。要するに、これらの結果は、腸粘膜（及び時折リンパ器官）に存在する特定の微生物と、ＣＴＸ処置によって誘発されたＴｈ応答の極性との間の特異的関連を示す。
【０１００】
ＣＴＸは「病原性」Ｔｈ１７（ｐＴｈ１７）細胞の頻度を増強し、そしてそれは、脾臓内の、Ｔｈ１細胞（転写因子Ｔ−ｂｅｔの核発現、ＩＦＮγの細胞質発現、及びケモカイン受容体ＣＸＣＲ３の表面露出）及びＴｈ１７細胞（ＲＯＲγｔ、ＩＬ−１７及びＣＣＲ６の発現）の顕著な特徴を共有する（Ghoreschi et al? 2010; Lee et al., 2012）（図７Ｆ、図３Ｃ）。同様に、この応答は腸微生物叢に依存した（図３Ｃ）。そのうえ、ｐＴｈ１７細胞の増大は、骨髄分化の一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）の発現を必要として、そしてそれは、トール様受容体の下流にシグナル伝達し（図１０Ａ）、且つ、いくつかの腫瘍モデルにおける抗癌化学療法の治療学的な成功に必要である（Apetoh et al., 2007）。対照的に、２つのパターン認識受容体（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有（Ｎｏｄ）１及びＮｏｄ２）は、脾臓ｐＴｈ１７細胞におけるＣＴＸ誘発性上昇及びＣＴＸの腫瘍増殖遅延効果に不必要であった（図１０Ｂ）。これらの結果は、ＣＴＸが抗癌効果と互いに関連して、腸内細菌とＭｙＤ８８にかかわる複雑な回路網を通してｐＴｈ１７細胞を刺激する能力を確立する。ｐＴｈ１７細胞の頻度への一般的効果を超えて、ＣＴＸは、共生細菌に対してＴＣＲによって制限された抗原特異的免疫反応を引き起こした（図１１）。したがって、発明者らは、ＣＴＸに対応して二次リンパ器官に移行したグラム＋細菌種が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１又はＴｈ１７に向かって分極する場合があるかどうか対応した（図２Ａ）。Ｌ．ジョンソニーとＥ．ヒラエの両方が、骨髄由来の樹状細胞の存在下で生体外における未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１とＴｈ１７細胞への分化を刺激した一方で、トール様受容体４を賦活する精製した細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）又はＥ．コリの両方が、わずかな効果を有した（図１２）。そのうえ、経口的に摂取したＬ．ジョンソニー及びＥ．ヒラエは、ＡＴＢで処置したＳＰＦマウスの脾臓でのｐＴｈ１７細胞のプールの再構成容易にしたが、Ｌ、プランタルム（移行実験で検出されなかった細菌、図２Ｂ）でもＬ．ロイテリ（図３Ｄ）でもなかった。Ｌ．ジョンソニーに対するＴｈ１免疫記憶応答は、ＣＴＸを受けたマウスの５０％で一貫して検出されたが（図３Ｅ）、対照マウスでは検出されず、骨髄由来の樹状細胞でのＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ再刺激がＬ．ジョンソニー（そしてＥ．ヒラエをより少ない程度までだが、他の片利共生又は病原性細菌ではなかった）を増加させた。これらの結果は、特定のセットのグラム＋片利共生細菌の移行が、ｐＴｈ１７細胞及びＴｈ１細菌特異的な免疫記憶Ｔ細胞応答のＣＴＸ駆動蓄積を媒介し得ることを示す。
【０１０１】
共生細菌はＣＴＸ後に腸及び全身性免疫を調節するので、発明者らはさらに、ＣＴＸ媒介腫瘍増殖阻害に対する抗生物質の効果を調査した。広域スペクトルＡＴＢでの長期間の処置は、ＣＴＸがシンジェニックＤＢＡ２マウスにおいて確立したＰ８１５肥満細胞腫を治癒する能力を低下させる（図４Ａ型、図１３Ａ）。そのうえ、ＭＣＡ２０５肉腫に対してＣＴＸによって媒介される抗癌効果は、ＳＰＦマウスと比較してＧＦで低下した（図４Ｂ、左及び中央のパネル）。ＣＴＸがグラム＋細菌の移行をほとんど引き起こす、及びグラム＋細菌が脾臓Ｔｈ１／Ｔｈ１７極性化と相関するという観察によって動かされ、発明者らは、いくつかのＡＴＢ投薬計画の能力、すなわち、バンコマイシン（グラム＋細菌を枯渇させる）及びコリスチン（ほとんどのグラム−細菌を枯渇させる）がＣＴＸの腫瘍増殖阻害効果を妨げる能力を比較した。バンコマイシン、及びそれほどではないにせよコリスチンは、ＭＣＡ２０５肉腫に対するＣＴＸの抗腫瘍効果を低下させる（図４Ｃ、図１３Ｂ）。制御性ｐ５３欠失に連動した発癌性Ｋ−Ｒａｓによって駆動された自所肺発癌のトランスジェニック腫瘍モデルを使用して（Cortez- Retamozo et al., 2013）、ＣＴＸベースの化学療法レジメンの抗腫瘍効果に対するバンコマイシンの阻害的役割を確認した（図４Ｄ）。バンコマイシンはまた、脾臓におけるｐＴｈ１７のＣＴＸ誘発蓄積を妨げ（図４Ｅ）、且つ、腫瘍浸潤性ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＴｈ１細胞の頻度を低減した（図４Ｆ）。
【０１０２】
ＡＴＢで処置したほとんどのＳＰＦマウスの糞便は通常培養できる細菌を含んでいないが（図９）、一部のマウスは、腸制御性Ｔ細胞のレパートリーの一部を維持すること、及び局所的な抗炎症効果を媒介することが報告された種であるパラバクテロイデス・ディスタノニスの増殖を経験することがあった（Geuking et al., 2011; Kverka et al., 2011 ; Lathrop et al., 2011）。この細菌混入は、樹立されたＭＣＡ２０５肉腫に対する免疫原性化学療法（ドキソルビシン）の不全に関連していた（図１４Ａ）。そのうえ、Ｐ．ディスタノニスを用いたＡＴＢ滅菌処置マウスの実験的なコロニー再形成は、ドキソルビシンの抗癌効果を低下させ（図１４Ｂ）、微生物叢失調が抗癌療法を拒絶することを実証した。最終的に、ＬＰにおけるＴｈ１７細胞分化を促進する（Hooper et al., 2012; Lee et al, 2012; Wu et al., 2010）ＳＦＢを用いた癌担持ＧＦマウスの単独定着はまた、ＣＴＸの腫瘍増殖阻害効果にも有害な影響を有した（図４Ｂ、右のパネル）。
【０１０３】
前述の結果は、腸微生物叢における特定のＣＴＸ誘発変化である、脾臓でのｐＴｈ１７細胞の蓄積と、化学療法の成功との間の関連を強調する。これらの現象間の直接的な因果関係を証明するために、発明者らは、バンコマイシンで処置したマウスにＴｈ１７又はｐＴｈ１７集団を養子移植し、そして、ＣＴＸ媒介性腫瘍増殖遅延を回復させるそれらの能力を評価した。生体外で増殖したｐＴｈ１７は、ＣＴＸ誘発した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞によって生体内で発現されたものと同様の遺伝子発現のパターンを呈した（図１５）。Ｔｈ１７細胞ではなく、ｐＴｈ１７だけがＣＴＸ媒介性処置効果に対するバンコマイシンの負の影響を取り戻すことができた（図４Ｇ）。これらの結果は、ＣＴＸ媒介性抗癌免疫応答のためのｐＴｈ１７細胞の重要性を強調する。
【０１０４】
腸微生物叢と細胞の抗癌性免疫との連結についてさらなる洞察を得るために、２つの異なった実験的アプローチを使用した。
最初に、発明者らは、Ｋ−Ｒａｓ及びＰ５３の発癌活性化から生じた自発性非小細胞肺癌の微小環境に対するバンコマイシンの影響を分析し、そして、ＣＴＸベースの化学療法で処置した。彼らは、化学療法後の抗腫瘍ＣＴＬｓの動員に重要であることが知られているγδΤ１７細胞による化学療法で処置した腫瘍床の浸潤に対するバンコマイシンの影響を分析した（Ma et al., 2011）。バンコマイシン又は広域スペクトルＡＴＢで処置したマウスでは、水で処置した化学治療法レシピエントとは対照的に、腫瘍床は治療法後のγδΤ１７を欠いていた（図１７）。
【０１０５】
第二に、彼らは、様々な抗生物質投与計画を用いて腸微生物叢に影響を与えることが、ポリ（Ｉ：Ｃ）にＴＬＲ３作動薬を組み合わせ、そして、ＣＴＸを受けた、抗生物質で処置された又は未処置マウスのフッドパッドに注射された、幅広く試験されているモデル抗原（ニワトリオボアルブミン及びその免疫優性Ｈ−２ｂ制限性エピトープ）に対するＴｈ１又はＴｃ１一次免疫反応の惹起が妨げられることがあるか分析した。使用した抗生物質はいずれも、が流入領域リンパ節細胞によるＩＦＮγ産生を阻害することができなかった。同様に、ＯＶＡのＨ−２ｂによって制限されたＳＩＩＮＦＥＫＬ免疫優性ペプチドを用いた再刺激によって誘発されたＩＦＮγ分泌がバンコマイシンで処置したマウスにおいて維持され、Ｔｈ１（又はＴｃ１）免疫応答が腸微生物叢によって影響を受けないことを示した（図１８）。そのように、このモデルにおいて、抗生物質が媒介した共生細菌の排除がＣＤ８＋／Ｆｏｘｐ３比の低下（図２０）と鈍化したＴｈ１応答（図４）を伴った同族の抗腫瘍免疫応答（エフェクターメモリＴＩＬｓ）の調節をもたらす先天性免疫（腫瘍内微小環境におけるγδΤ１７の細胞の喪失）のレベルの低下を引き起こす。
【０１０６】
上皮細胞、腸微生物叢及び腸管免疫間の複雑な相互作用を統制する詳細な分子機序の多くがいまだに解読されていないが、当該試験は、化学療法が誘発した抗癌免疫応答に対する腸微生物叢の予想外の影響を明らかにする。上記データは癌処置中の抗生物質薬物療法に関連した新たな危険性、並びに腸微生物叢を操作することの潜在的な治療的有用性を明確に示している。
【０１０７】
実施例２：腸微生物叢はシクロホスファミドの抗癌性免疫効果を調節する−ヒト腫瘍形成を模倣する前臨床モデルの結果。
（T. Jacks, Cell 2012によって最初に記載されたように）制御性Ｐ５３欠失に結合した発癌性Ｋ−Ｒａｓによって駆動された自所ＮＳＣＬＣのトランスジェニック腫瘍モデルを、オキサリプラチンとＣＴＸの組み合わせの抗腫瘍効果に対するバンコマイシンベースの抗生物質療法の阻害的役割を試験するのに使用した。ヒト腫瘍形成を模倣するこの前臨床モデルでは、バンコマイシンによるグラム陽性細菌の根絶がＣＴＸベースの化学療法の有効性を低下さ（図１９Ａ及び図４Ｄ）、低下した腫瘍内ＣＤ８＋Ｔエフェクター／Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞比（図１９Ｂ）と相関するという概念が正当であると確認された。
これにより、グラム陽性細菌が、ＣＴＸ誘発抗癌免疫応答及び腫瘍体積低減に関する最適な有効性に必要であると思われる。
【０１０８】
実施例３：ヒトでの結果：癌患者の共生細菌に対して向けられたシクロホスファミド誘発ＴＨ１及びＴＨ１０免疫応答。
マウスと同様にヒトにおいてもＣＴＸが二次リンパ組織への細菌トランスロケーションを引き起こすことをさらに実証するために、発明者らは、規則的なシクロホスファミド（ＣＴＸ）での処置前後の進行性癌患者の一群の細菌に特異的な、末梢血中での、免疫記憶ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞応答を評価した。観察した応答には、エンテロコッカス（Ｅ．ヒラエ及びＥ．フェカリス、ＣＴＸを受けたマウスにおいて両方とも免疫原性）、ラクトバチルス属（Ｌ．ジョンソニーとそれほどでもないがＬ．プランタルム）、及びＥ．コリに対するものが含まれた。結果を、ＣＴＸ＋アバスチンで処置した移行性卵巣癌を患っている６人の患者（Viaud et al., 2011）、ＤＣベースのエキソソームフェーズＩＩワクチントライアル前にＣＴＸで処置した３人のＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）患者（Chaput et al., 2006）、及びＣＴＸによって先行した標的化免疫療法のフェーズＩトライアルに組み入れられた２人の黒色腫患者（Chaput et al., 2013）から得た。これらの１１人の患者のうち、６人（５４％）がエンテロコッカスに対して、２人がＬ．ジョンソニーに対して（１８％）、２人（１８％）がＥ．コリに対して免疫記憶Ｔｈ１応答を発現し他のに対して、彼らのうちのひとり（９％）がＬ．プランタルムに対して細胞免疫反応を高めた（図２０）。興味深いことに、一部の個人が、Ｅ．フェカリス（高いＩＬ−１０及び低いＩＦＮγ産生、患者５及び６の場合）に対してＴｈ１０免疫応答を発揮した（すなわち、癌進行に関連していることが多いＩＬ−１０放出）。
【０１０９】
概要では、サイトカイン放出の３つのパターン：
（ｉ）サイトカイン放出なし、すなわち、片利共生への免疫記憶応答がない；（ｉｉ）Ｔｈ１０表現型の免疫記憶応答；及び（ｉｉｉ）Ｔｈ１表現型の免疫記憶応答、がこれらの実験条件で観察された。
【０１１０】
発明者らは、３パターンだけが化学療法の恩恵を受けると予想し、そして、彼らは現在、この抗片利共生細菌の免疫応答を臨床結果と関連させている。この薬力学的アッセイは、３〜６週（１〜２サイクルの化学療法）後に斯かるＣＴＸベースの化学療法がアジュバント免疫応答及び臨床上の利益を引き起こすかどうか予測するために有用である。
【０１１１】
実施例４：ヒト結果：オキサリプラチンベースの化学療法は、腸微生物叢における細菌種の配分の変化、及び腸微生物叢によるＴ−ｂｅｔ転写の増大を引き起こす。
原発結腸癌、膵臓癌又は胃癌のデバルキング外科手術中、十二指腸（胃及び膵臓腫瘍のため）又は回腸（右結腸癌のため）に接触することは想像できる。斯かる場合、粘膜サンプルは、掻き取り、そして、採取されてもよく（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子パイロシークエンシング分析及び先に記載した異なった分類学レベルにおける粘膜微生物叢組成の説明のために）、並びに（ｑＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡｚｏｌ中で）凍ったまま維持され得る又は（免疫組織化学分析のための）パラフィン包埋組織の状態であり得る粘液であってもよい。
【０１１２】
この外科手術は、化学療法（アジュバント化学療法）前又は化学療法（新アジュバント化学療法）後に実施され得る。
当該実施例では、右結腸癌（ネオアジュバントオキサリプラチンベースの化学療法中の６人の患者及び治療法前の７人の患者）を手術した患者からの回腸粘膜を分析し、回腸微生物叢の組成、並びに結腸癌を担持する患者において、化学療法を既に受けた（≪Ｃｈｅｍｏ≫）又は受けなかった（≪対照≫）を意味する、アジュバント対新アジュバント化学療法の場合に、異なった属及び種の代表株（単離株）の相対的喪失又は獲得を比較した。
【０１１３】
種（第１の相対単離株）レベルでの細菌の配分は、化学療法後の回腸において有意に異なっていた（主成分分析法、モンテカルロ検定、ｐ＝０．０１８）（図２１）。
マウスのように、化学治療法は、ほとんどすべての患者においてクロストリジウム属クラスタＩＶに属する種、より詳しく述べると、属ドレア（Dorea）、コプロコッカス（Coprococcus）、ラクノスピラ、ゲミガー、アリスチペス、及び細菌種フェカリバクテリウム・プラウスニッツイー（図２２と２３、表３）から細菌の減少を誘発した。対照的に、ビフィドバクテリウム及びラクトバチルス属の細菌は、化学療法後に増加する傾向があった（表３、図２４）。
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
発明者らはまた、回腸の腸微生物叢の１６ＳｒＲＮＡのパイロシークエンシング分析と並列して、化学療法を受けた又は受けていない患者の粘膜で検出可能なサイトカイン及び転写因子の転写プロファイリングを調査した。この調査を、同じ患者からの回腸粘膜からｑＲＴ−ＰＣＲによって実施した。ＲＯＲγｔ及びＩＬ−１７は両群においてそれほど異なっていなかったが、Ｔ−ｂｅｔは化学療法後に上方制御され、そして、化学療法後に高レベルのビフィドバクテリウムとラクトバチルス属を有する２人の患者ではＴ−ｂｅｔ転写産物は他の患者と比べてかなり高く、ｐＴｈ１７Ｔ細胞応答が処置によって発揮されたことが示唆された。
【０１１６】
実施例５：Ｅ．ヒラエはＰＴＨ１７／ＴＨ１細菌であり、単独又はラクトバチルス（Ｌ．ジョンソニー）と連動してプロバイオティクス抗癌効果を誘導する。
細菌特異的な病原性ＴＨ１７免疫応答の感作に対する異なった細菌種（具体的には、ＣＴＸ後脾臓に移行できる細菌種）の影響を分析するために、発明者らは１５日間広範囲ＡＴＢでＣ５７ＢＬ／６マウスを処置し（糞便を滅菌した）、ＣＴＸ（１００ｍｇ／ｋｇ）の注射と、それに続く１０９個のＥ．ヒラエ±１０９個のＬ．ジョンソニーの経口強制飼養を実施した。細菌の単独定着又は二重定着後６日間、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＲＯＲγｔ＋又はＣＣＲ６＋Ｔ細胞（以降「ＴＨ１７」と呼ぶ）（図２５Ｂ）から生じることがある、並びに、真正ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋又はＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞（以降ＴＨ１細胞と呼ぶ）（図２５Ｃ）をもたらす場合がある、ＴＨ１７細胞の中のＩＦＮγ＋又はＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞（以降「ｐＴＨ１７」と呼ぶ）（図２５Ａ）に焦点を合わせたフローサイトメトリー解析のために脾細胞を採取した。得られたデータは、Ｌ．ジョンソニーではなく、Ｅ．ヒラエがＣＴＸ後の脾臓においてＴＨ１及びｐＴＨ１７応答を媒介する優位な細菌であることを明らかにし、そしてそれはＬ．ジョンソニーの存在下でさらに拡大される場合がある（図２５Ａ、２５Ｃ）。加えて、発明者らは現在、小腸中のグラム陽性細菌のカクテル（Ｌ．ジョンソニー＋Ｅ．ヒラエ）の存在と、全身的ｐＴＨ１７細胞の単なる惹起だけではなく（図２５）、ＡＴＢで処置したマウスにおけるＣＴＸ誘発抗腫瘍の部分的回復（図２６）との間の因果関係について証拠を挙げている。
【０１１７】
実施例６：Ｅ．ヒラエは生体内における抗癌性免疫応答を促進した。
Ｅ．ヒラエに対する同族ＴＨ応答が、抗癌Ｔ細胞応答を促進する場合があるかどうか調査するために、２つの異なった前臨床モデルがセットアップした。最初に、オブアルブミン抗原（ＯＶＡ）を発現するように遺伝子を組み換えられた腫瘍細胞株（線維肉腫ＭＣＡ２０５ ＯＶＡ）を（又は対照として生理的食塩水）、１４日間の広範囲ＡＴＢ治療後にｓｃ．移植した。動物には、ＯＶＡ３２３−３３９特異的ＭＨＣクラスＩＩ−制御性ＯＴＩＩ ＴＣＲ遺伝子組み換えＴ細胞を養子移植し、そして、ＣＴＸ（又は生理的食塩水）で処置した。発明者らは、脾臓及び腫瘍床における同種同系ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞及び類遺伝子性ＣＤ４５．２＋ＯＴＩＩ細胞の伸長及び活性化に対するＥ．ヒラエの経口強制飼養の「臨床的」影響を観察した（図２７Ａに提示した実験設定）。脾臓では、彼らは、ｐＴＨ１７細胞の蓄積で伴った（図２７Ｂ、右のパネル）ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２７Ｂ、中央パネル）の少なくとも一部の増殖による、宿主（ＣＤ４５．１＋）脾細胞（図２７Ｂ、左のパネル）のＥ．ヒラエ誘発伸長を確認した。実際、彼らは、Ｅ．ヒラエが媒介した細胞分裂、蓄積、及び脾臓（図２７Ｃ）におけるＣＤ４５．２ ＯＴＩＩ細胞を養子移植した免疫記憶Ｔ細胞への分化を実証した。そのうえ、ＣＤ４５．２＋Ｔ細胞を腫瘍床から取り戻し、ＣＤ４４分子を入手し、そして、Ｅ．ヒラエの経口摂取と関連して宿主ＴＩＬｓとほとんど同じくらい効率的に増殖した（図２７Ｄ〜Ｆ）。
【０１１８】
第二に、臨床的に関連しているマウスモデルを模倣するために、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）Ｅ７（F. Sandoval et al, 2013）を発現するＴＣＩ細胞を使用して頭頚部及び肺癌の独自の同所性モデルを設定し、そして、報告した。粘膜ベクターとしてＥ７抗原（ＳＢｘＴ−Ｅ７）に連結した志賀毒素のＢサブユニットで構成した非複製的送達系を使用したマウスに予防注射することによって、腫瘍退縮を得る場合がある。Vingertらは、胸部ＬＮ（そしてマクロファージでない）に存在するＣＤ１０３＋ＤＣを標的とした鼻腔内ワクチン接種だけが粘膜インテグリン（ＣＤ４９ａ及びＣＤ１０３）を発現する多官能性Ｄｂ−Ｅ７３９−４７四量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起する場合があると報告した（B. Vingert et al, 2006）。この実験の実験設定を図２８Ａに示す。ｓｃ．ＴＣＩモデルでは、腫瘍増殖はＳＢｘＴ−Ｅ７及びＣＴＸの組み合わせで有意に低減され、最終的に完全な腫瘍根絶につながる（図２８Ｂ〜Ｃ）。ワクチンの有効性に対する広範囲ＡＴＢの負の影響は図２８Ｂ〜Ｃで示され、ここで、それらのＴＣＩ腫瘍を完全に拒絶する動物のパーセンテージが劇的に低減した。次に、脾臓における多官能性ＤｂＥ７３９−４７四量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞の伸長に対するＥ．ヒラエの経口強制飼養の「臨床的」影響を観察した。実際、Ｅ．ヒラエは、非ＡＴＢ／ＣＴＸ処置した正の対照に示したように（図２８Ｄ）、それらの腫瘍を拒絶したマウス（しかし他には存在しない）のＤｂ−Ｅ７３９−４７四量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞の伸長を復元した。
【０１１９】
要するに、腸殺菌処置マウスへのＥ．ヒラエの単独定着は、ＣＴＸ誘発抗癌免疫応答を部分的に復元し、癌進行を阻止した状態を維持し得る。
【０１２０】
実施例７：Ｅ．ヒラエの様々なクローンの間の比較（ＰＴＨ１７について、ＣＡＣＯ−２の抗アポトーシス効果について）。
最大で１３個の他のＥ．ヒラエ単離株／クローンを試験して、生体内におけるそれらの特異な免疫原性及び斯かる「抗癌プロバイオティクス」特性を媒介する能力を分析した。Ｅ．ヒラエの様々なクローンの細菌ゲノムパターンの整列を、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）（図２９）で分析し、発明者らによって最初に単離されたクローン（クローン「Villejuif」、番号Ｉ−４８１５で２０１３年１１月７日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes de I'Institut Pasteur, Paris（ＣＮＣＭ）に寄託）がゲノム配列の点で多くの他のものと異なっていることを明らかにした。１つのヒト単離株（クローン７０８）が、クローンＣＮＣＭ Ｉ−４８１５（図３０）よりさらにすばらしいＴＨ１及びＴｃ１可能性を呈した。しかしながら、クローン７０８は、ＣＴＸで処置した樹立ＭＣＡ２０５肉腫の抗癌性プロバイオティクス効果に関してＣＮＣＭ Ｉ−４８１５クローンよりよく働かなかった（未掲載）。種々のＥ．ヒラエ単離株間の配列及び機能の差は、Ｅ．ヒラエ又はＥ．コリのＣＴＸ＋／−種々クローンに晒したＣａｃｏ−２上皮性腸細胞株からＬＤＨ放出（細胞死の特徴）及びヒトβ２デフェンシン分泌を観察することを目的とした試験管内におけるアッセイで確証した。クローンＣＮＣＭ Ｉ−４８１５及びクローン７０８は、おそらく抗微生物ペプチドβ２デフェンシンの産生を促進することによってＣＴＸ誘発Ｃａｃｏ２細胞死を予防し得るが、Ｅ．コリはそれができなかった（未掲載）。
【０１２１】
実施例８：ＴＬＲ４、ＮＯＤ１、及びＮＯＤ２は、ＣＴＸ媒介性細菌トランスロケーション、ＰＴＨ１７惹起、及び殺腫瘍活性を妨げる。
どの腸免疫チェックポイントが、アルキル化剤による治療法中の細菌トランスロケーションをチェックし続け得るのか分析するために、発明者らは、脾臓ｐＴＨ１７細胞の惹起とＭＣＡ２０５担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴＸによって促進された腫瘍制御における腸の恒常性を調整する主要なパターン認識受容体の役割を調査した。
【０１２２】
Ｅ．ヒラエ及びＬ．ジョンソニーの増殖を可能にすること（Viaud et al., Science Nov. 2013）が主に知られている嫌気性条件で脾臓から細菌コロニーを培養することによって分析される細菌トランスロケーションは、ＮＯＤ１ｘＮＯＤ２−／−において促進された（図３１Ａ）。加えて、ＣＴＸ投与に続く脾臓ｐＴＨ１７細胞の感作は、ＮＯＤ２−／−マウスにおいて増大した（一方で、野性型（ＷＴ）マウスと比較して、Ｍｙｄ８８−／−動物においてそれは無効化された）（Viaud et al. Science 2013）（図３１Ｂ）。遺伝子欠損動物を使用して得られたこれらの知見によると、発明者らは、医薬模倣物（pharmacomimetics）、すなわち、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ペプチドグリカンミラミルジペプチド、及びＴｒｉＤＡＰのリガンド、を使用してこれらの効果を表現型模写し、そしてそれは、便で抗微生物ペプチドリポカリン−２の放出を促進することによって局所的に作用し（図３ＩＤ）、その結果、脾臓におけるＣＴＸ媒介性ｐＴＨ１７を低減した（図３１Ｃ）。
【０１２３】
これらの結果は、広範囲ＡＴＢで処置したマウスが、Ｅ．ヒラエの経口強制飼養によって再構成され、腸間膜ＬＮにおける細菌トランスロケーションの動的観察前のＣＴＸで処置される別の実験システムで確証された。この設定では、Ｅ．ヒラエコロニーの頻度がｍＬＮにおいてＣＴＸ後に回復し、且つ、嫌気性条件における増殖の発生がＴＬＲ４、ＮＯＤ１、及びＮＯＤ２ ＫＯマウスにおいて増強されるのが、実際に示された（未掲載）。従って、ＡＴＢで処置したレシピエントにおけるＣＴＸ誘発ｐＴＨ１７細胞の惹起と、それに続くグラム＋細菌の経口強制飼養は、ＴＬＲ４作動薬（ＬＰＳ又はＥ．コリ）の存在下で劇的に低減し（図３２Ａ）、その一方でＣＴＸ誘発ＴＨ１及びＴｃ１細胞は影響を受けなかった（図３２Ｂ）。
【０１２４】
ＣＴＸによって媒介される免疫依存性抗肉腫効果は、ＷＴ対応物（図３３Ａ〜Ｃ）と比べて、単独ノックアウトマウス（ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＲＩＰ２又はＣＡＲＤ１５）で改善されなかったが、ＮＯＤ１−／−ｘＮＯＤ２−／−マウスにおいて有意に高められた（図３３Ｄ〜Ｅ）。そのうえ、ＡＴＢで処置したマウスにおいて、外因性Ｅ．コリ又はＬＰＳを、Ｅ．ヒラエ＋Ｌ．ジョンソニーを含む経口強制飼養に提供することは、グラム＋細菌の抗癌性プロバイオティクス効果が著しく低下させ、ＴＬＲ４シグナル伝達が移行を妨げ、そのためｐＴＨ１７蓄積と、その後の抗癌効果を妨げるという概念を裏付ける（図３４Ａ〜Ｂ）。
【０１２５】
実施例９：ＮＯＤ１−／−ｘＮＯＤ２−／−マウスにおける有益な微生物叢失調は、増強されたＣＴＸの殺腫瘍活性に関連した。
ＷＴ対ＮＯＤ１−／−ｘＮＯＤ２−／−未処置マウスから採取した小腸及び便の両方のバイオフィルム由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子単位複製物のパイロシークエンシング分析を、ＣＴＸ又はＰＢＳ投与の７日後に実施した。原理座標解析は、細菌群集構造がＷＴ対遺伝子欠損マウスからのＣＴＸ群間の有意な違いを明らかにした（門及び属に関する図３５〜３６、ＯＴＵに関する表４）。主にセグメント細菌に起因する（表４）小腸（ＳＩ）におけるクロストリジウム科の（図３６Ａ〜Ｂ）、及びＳＩにおけるエリシペロトリクスの相対喪失を伴う（図３６Ａ〜Ｂ）、便中のポルフィロモナス科の（主にバーンシエラ）（図３５Ａ〜Ｂ）、及びＰＢＳ（図３５Ａ−Ｂ）と比較したＣＴＸ受容ＮＯＤ１−／−ｘＮＯＤ２−／−未処置マウスの糞便中のラクノスピラの過剰発現があった。
【０１２６】
Ｅ．ヒラエ＋ウェルシュ菌の二重定着を用いたＡＴＢ滅菌処置マウスの再構成は、ＣＴＸで処置したマウスにおける付加的／相乗的抗癌性プロバイオティクス効果を媒介した（図３７）。哺乳動物では、Ｅ．ヒラエの、非病原性細菌クロストリジウム属、例えばＳＦＢ、バーンシエラ又はホールデマニアなどとの組み合わせは、Ｅ．ヒラエ＋ウェルシュ菌の組み合わせと同じくらい効果的であって、毒性がより低い。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
実施例１０：グラム陰性菌は抗癌性免疫記憶Ｔ細胞応答に必須である。
より優れた抗癌性応答を呈したＮＯＤ１ｘＮＯＤ２二重ノックアウトマウスにおいて単離されたグラム陰性ＯＴＵの過剰発現を考慮に入れて、発明者らは長期でＣＴＸに関連して使用されるＯＶＡベースの癌ワクチンを使用した作り出される長期保護状態にあるグラム陰性菌の役割に取り組んだ。広範囲ＡＴＢは、ＯＶＡ操作腫瘍細胞と共に致死的攻撃に対して癌ワクチンの長期保護を妨げた。興味深いことに、バンコマイシンは、ワクチンが動物を免疫することを妨げることなく、一方でグラム陰性菌を殺滅するコリスチンはそうした（図３８）。ＣＴＸは腫瘍ワクチンを賦活するためにグラム陰性腸アジュバントを動員し得ると結論づけられる。
【０１２９】
実施例１１：ＣＴＸ媒介性抗癌効果を改善する抗生物質の投薬計画。
ＮＯＤ遺伝的欠損によって媒介又は強化される微生物叢失調はＣＴＸの治療学的な成功を改善し得るので、発明者らは、Zhang Y et al. (2014) に記載の異なったＡＴＢ投薬計画が腫瘍増殖に明確に影響し得るかどうかに取り組んだ。実際、プロトコールは、ファーミキューテスが減少することを報告し、最も特に、ファーミキューテス／バクテロイド比（ネオマイシン＋セファロチン又はバンコマイシン＋イミペナムの組み合わせなど）（図３９Ｃ〜Ｄ）を最終的に、減少させるクロストリジウム科は、ＣＴＸが誘発する抗癌効果を改善し得るが、それに対し、シフロキサシン（対照的に、バクテロイデテスの顕著な抑制を引き起こした）は効果的でなかった（図３９Ｂ）。注意すべきは、ネオマイシン＋セファロチンの組み合わせはＳＦＢ出現を増大させる可能性があり、それに対して、ｖａｎｃｏ＋イミペナムはポルフィロモナスのそれを増強した（Zhang Y et al., 2014）。
【０１３０】
参照文献
【０１３１】
【化１】
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【０１３２】
【化２】
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【０１３３】
【化３】
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【０１３４】
【化４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者に投与される抗腫瘍薬処置に対するアジュバントとしての使用のための、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、セグメント細菌（ＳＦＢ）、ポルフィロモナス、バーンシエラ、ホールデマニア、及びその混合物から成る群から選択される細菌を含むプロバイオティクス組成物。
【外国語明細書】
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