(57)【要約】【課題】台湾産のヤエヤマキランソウのアルコール抽出物を提供する。【解決手段】本発明は、台湾産のヤエヤマキランソウのアルコール抽出物を提供するものである。当該ヤエヤマキランソウのアルコール抽出物は、ヒトＷＩ−３８肺線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞の老化を阻害することに対して著しい効果を有することが見出された。さらに、当該ヤエヤマキランソウのアルコール抽出物は、コフィリン−１の発現を阻害し、コフィリン−１がアクチンダイナミクス（アクチン動態）と細胞形態に関与するタンパク質であって、老化細胞で増加することが見出された。細胞の老化に対するこの植物抽出物の阻害効果は、細胞の生存率と成長を過度に阻害することもなく、低濃度ではより効果的である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−Ｏ−アセチルハルパギドを含むヤエヤマキランソウのアルコールによる抽出物。
【請求項２】
エタノール水溶液でヤエヤマキランソウの地上部を抽出処理することにより得られる請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
１種又は複数種の亜画分をさらに含む請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
前記亜画分は酢酸エチル可溶性画分、ブタノール可溶性画分及び水溶性画分を含む請求項３に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１に記載の抽出物を老化防止剤として含む老化防止組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤をさらに含む請求項５に記載の老化防止組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の老化防止組成物の有効量を、老化防止及び／又は治療を必要としているヒト以外の被験者に投与することを含む老化防止及び／又は治療のための方法。
【請求項８】
前記老化防止組成物は、コフィリン−１の発現を阻害する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記老化防止組成物は、ｐ５３、ｐ２７、ＲＯＳ又はそれらの組み合わせの発現を阻害する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記老化防止組成物は、ＳＩＲＴ１の発現を増加させる請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヤエヤマキランソウ（Ajuga taiwanensis）抽出物及びそれを使用してヒト以外の被験者の細胞老化を治療する方法に関する。具体的には、当該方法は、有効量の老化防止組成物をヒト以外の被験者に投与することを含み、当該老化防止組成物が台湾産ヤエヤマキランソウ（A.taiwanensis Nakai ex Murata）のアルコール抽出物を含む。
【背景技術】
【０００２】
細胞が継続的に分裂するにつれて染色体のテロメアが短くなるため、細胞の老化は不可逆的な生理学的過程である。また、細胞の形が大きく平らになり、細胞周期がＧ０期に入り、ＤＮＡの複製を防ぐ。
老化細胞のテロメアの短縮を直接制御することは不可能であるが、老化細胞を補充するか、老化の表現型を一時的に逆転させて細胞の形状を再形成できる成長因子を使用する努力が行われてきた。
【０００３】
老化の様子は、皮膚構造の変化を通じて容易に観察できる。これは、不可逆的な生理学的過程である。細胞が分裂するにつれて染色体テロメアが短くなるため、細胞の形は大きくて平らになる。
コフィリン−１（Cofilin-1）は、アクチン解重合因子（ＡＤＦ）／コフィリンファミリーに属する分子であり、細胞形態の維持に重要な役割を果たしている。その基本的なメカニズムは不明であるが、コフィリン−１の発現レベルの影響が細胞の老化に関連しているという証拠は、すでにたくさんある。
【０００４】
コフィリン−１（ＣＦＬ−１）は真核生物に存在している小さなタンパク質（約１９ｋＤ）であり、アクチン解重合因子（ＡＤＦ）／コフィリンファミリー（非特許文献１）に属する。
ＡＤＦ／コフィリンファミリーはＡＤＦ、ＣＦＬ−１及びＣＦＬ−２からなる。ＣＦＬ−１及びＡＤＦはいずれも非筋型アイソフォームである。ただし、哺乳類の動物細胞では、ＣＦＬ−１はＡＤＦよりも豊富である。
ＣＦＬ−１遺伝子の欠失はマウスの死を引き起こすことができ、これはＣＦＬ−１及びＡＤＦの機能が不要ではないことを示している（非特許文献２）。
一方、ＡＤＦ／コフィリンファミリータンパク質を阻害することは、酵母、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル割球の細胞分裂の失敗を引き起こす恐れがあるが、染色体分離が生じない（非特許文献３、４）。
ＡＤＦ／コフィリンの基本的な機能は、アクチンフィラメントを解重合又は切断することにより、アクチンフィラメントの再生を加速する。
興味深いことに、ＣＦＬ−１はアクチン重合を促進し、アクチンフィラメントを破壊することなく、細胞の運動性及びその他の生理学的行動を促進する（非特許文献５）。
細胞の運動性、形態、細胞周期の進行及び細胞分裂はすべて、コフィリン−１によるアクチン細胞骨格の活性調節に依存している。したがって、コフィリン−１の過剰発現は細胞の老化を促進し、老化細胞におけるコフィリン−１の阻害は老化の表現型を減らす。
特許文献１は、培養された細胞又は組織サンプルの細胞老化状態を決定するために、細胞又は組織サンプルにおけるコフィリン−１の発現レベルを検出することを含む方法を開示した。
【０００５】
中国の漢方薬は、老化細胞の補充を含む通常の生理学的機能を、維持及び調節できると考えられている。
ヤエヤマキランソウはシソ科に属し、多年生草本植物である。ヤエヤマキランソウ（A.taiwanensis）は、中国本土、台湾、マレーシア及びアフリカで見られる。
ヤエヤマキランソウの植物全体は、抗炎症、腫れや発赤を和らげるために使用されてきた。台湾の地域では、ヤエヤマキランソウは痛風、抗利尿、マラリア及び炎症関連疾患の治療にも使用されている。
ヤエヤマキランソウは、シトステロール及びフェノール化合物（非特許文献６、７）並びに複数種のネオシクロペンタンジテルペン（非特許文献８、９）及び植物脱皮ステロイド（非特許文献１０）を含むことが知られている。
ただし、ヤエヤマキランソウに老化防止効果、美白効果又は保湿効果があることを示す証拠又は公開コンテンツはない。
本発明において、ヤエヤマキランソウは、コフィリン−１の発現を防止し、ヒト皮膚線維芽細胞における老化関連ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）のレベルを低下できることが確認された。これは、ヤエヤマキランソウが細胞の老化を予防及び／又は治療する効果を持つことを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，５７４，８５２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wang H, et al., Nucleic acids research 29(8):1653-1660, 2001
【非特許文献２】Gurniak CB, Perlas E, & Witke W., Developmental biology 278(1):231-241, 2005
【非特許文献３】Bamburg JR., Annual review of cell and developmental biology 15:185-230, 1999;
【非特許文献４】Bamburg JR, McGough A, & Ono S., Trends in cell biology 9(9):364-370, 1999
【非特許文献５】Elam WA, Kang H, & De la Cruz EM., FEBS letters 587(8):1215-1219, 2013
【非特許文献６】Ardekani MS, et al., Journal of Essential Oil Bearing Plants 13(1):45-51, 2010;
【非特許文献７】Manguro LOA, et al., Journal of Asian natural products research 9(7):617-629, 2007
【非特許文献８】Chiou et al., Phytochemistry 80:64-69, 2012;
【非特許文献９】Castro et al., J Nat Prod 74:1036-1041, 2011
【非特許文献１０】Chan et al., Chem Pharm Bull. 53:836-838
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方、本発明は、老化表現型を一時的に逆転させ、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）モデルにおけるコフィリン−１のレベルを低下できる、ヤエヤマキランソウ（ＡＴＥ）のアルコール抽出物を提供する。このＨＤＦモデルは、集団倍加レベルの式（ＰＤＬ）を通じて老化を評価するために確立されたものでである。
一実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＡＴＥの組成を分析し、その結果は、８−Ｏ−アセチルハルパギド（8-O-acetylharpagide）と呼ばれる活性化合物を含むことを示している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態では、ＡＴＥは、ヒト皮膚線維芽細胞の老化を抑制するのに著しい効果を有することが示されている。
好ましい実施形態では、ＰＤＬは、３．３２×ｌｏｇ（Ｘｅ／Ｘｂ）＋Ｓであり、ここで、Ｘｂは、インキュベーション開始時の細胞数であり、Ｘｅは、細胞インキュベーションの終了時の細胞数であり、Ｓは、開始時間点のＰＤＬである。
別の好ましい実施形態では、ＰＤＬの式は、ｎ＝３．３２（ｌｏｇＵＣＹ−ｌｏｇＩ）＋Ｘであり、ここで、ｎは、所与の継代培養の終了時における最終的なＰＤＬ回数であり、ＵＣＹは、当該時点の細胞収量であり、Ｉは継代培養を開始するための播種細胞の数であり、Ｘは継代培養を開始するために定量化される播種細胞の倍加レベルである。
【００１０】
一実施形態では、ＡＴＥはコフィリン−１の発現を防止し、コフィリン−１がアクチンダイナミクス（アクチン動態）及び細胞形態に関与するタンパク質であって、老化細胞において増加することが見出されている。さらに、ＡＴＥが老化細胞における長寿遺伝子ＳＩＲＴ１の発現を回復できることがわかる。
【００１１】
他の実施形態では、酢酸エチル可溶性画分、ブタノール可溶性画分及び水溶性画分を含む、ＡＴＥの亜画分の老化防止効果も評価された。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ヤエヤマキランソウ（ＡＴＥ）のアルコール抽出物を含む老化防止組成物を提供する。
本発明の一実施形態において、老化したＨＤＦ細胞を、異なる濃度のＡＴＥ亜画分で２４時間処理し、次いで、ＳＡ−β−ｇａｌ染色によって解析する。ＡＴＥ亜画分による処理は、老化を改善することができる。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、ＡＴＥ処理後に、細胞成長速度は増加する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、ＡＴＥは、ｐ５３、ｐ２７及び老化関連分子コフィリン−１を含む細胞周期チェックポイント分子の発現を阻害又は防止する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＡＴＥのＨＰＬＣ分析を示す。
【図２】老化の評価のために確立されたヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）モデルを示す。（Ａ）集団倍加レベルの式は、ＨＤＦ細胞株の成長をシミュレートするために使用される。（Ｂ）免疫蛍光染色は、ＨＤＦ細胞におけるアクチン細胞骨格の分布と細胞形態をチェックするために使用される。（Ｃ）若いＨＤＦ細胞と老化したＨＤＦ細胞の細胞形態の比較。（Ｄ）若いＨＤＦ細胞と老化したＨＤＦ細胞の細胞周期の違い。（Ｅ）若いＨＤＦ細胞と老化したＨＤＦ細胞間の老化関連分子ｐ５３及びコフィリン−１の発現。
【図３】ＡＴＥの細胞毒性評価の結果を示す。ＡＴＥに細胞毒性とＩＣ50値があるか否かを確認するために、ＨＤＦ細胞を異なる濃度のＡＴＥで処理する。
【図４】ＡＴＥの老化防止効果を示す。ＨＤＦ細胞を異なる濃度のＡＴＥと共培養し、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）で染色する。さらに、ＳＡ−β−ｇａｌの発現の変化を観察するために、ＢｅＳＯ4及びＤ−ガラクトースによって誘導された老化細胞を、異なる濃度のＡＴＥで処理する。（Ａ）異なる濃度のＡＴＥで処理した若いＨＤＦ細胞と老化ＨＤＦ細胞との間のＳＡ−β−ｇａｌ染色結果の比較。（Ｂ）ＳＡ−β−ｇａｌ染色結果の定量化。（Ｃ）異なる濃度のＡＴＥ（５０及び１００ μｇ／ｍｌ）で処理された若いＨＤＦ細胞及び老化のＨＤＦ細胞の細胞成長曲線。（Ｄ）ＡＴＥ（１００μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＤＦ細胞の細胞周期分布。（Ｅ）ＡＴＥ処理後の老化ＨＤＦ細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの発現。（Ｆ）ＡＴＥ処理後に、ＢｅＳ０4によって誘導された老化細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの発現。（Ｇ）ＡＴＥ処理後に、Ｄ−ガラクトースにより誘導された老化細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの発現。
【図５】老化関連分子ｐ５３及びｐ２７に対するＡＴＥの阻害効果、及び長寿マーカーＳＩＲＴ１に対するＡＴＥの増加効果を示す。（Ａ）ＨＤＦ細胞におけるコフィリン−１、ｐ５３及びｐ２７の発現低下に対するＡＴＥ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）の効果を評価するために、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析を行う。（Ｂ）異なる濃度のＡＴＥ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＤＦで発現されたコフィリン−１、ｐ５３及びｐ２７のＷｅｓｔｅｒｎブロット定量結果。（Ｃ）ＨＤＦ細胞におけるＳＩＲＴ１発現の増加に対するＡＴＥ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）の効果を評価するために、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析を行う。（Ｄ）異なる濃度のＡＴＥ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＤＦにおいて、発現したＳＩＲＴ１のＷｅｓｔｅｒｎブロット定量結果。
【図６】ＡＴＥ亜画分によるＨＤＥ細胞の細胞毒性評価結果、及びＡＴＥ亜画分で処理された後のＨＤＦ細胞の細胞増殖速度を示す。ＨＤＦ細胞における３つのＡＴＥ亜画分の細胞毒性及び増殖効果を検証するために、ＡＴＥの酢酸エチル（ＥＡ）可溶性画分（ＡＴＥ−ＥＡ）、ＡＴＥのブタノール（ＢｕＯＨ）可溶性画分（ＡＴＥ−ＢｕＯＨ）、ＡＴＥの水溶性画分（ＡＴＥ−Ｈ2Ｏ）などの、異なる濃度のＡＴＥ亜画分で、ＨＤＦ細胞を処理する。
【図７】ＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−ＥＡ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏの亜画分の老化防止効果を示す。（Ａ）異なる濃度のＡＴＥ−ＢｕＯＨで処理されたＨＤＦ細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ発現。（Ｂ）異なる濃度のＡＴＥ−ＥＡで処理されたＨＤＦ細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ発現。（Ｃ）異なる濃度のＡＴＥ−Ｈ2Ｏで処理されたＨＤＦ細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ発現。（Ｄ）Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析を通じて、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−ＥＡ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏで処理されたＨＤＦ細胞におけるコフィリン−１及びｐ５３の発現を評価する。（Ｅ）ＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−ＥＡ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏで処理されたＨＤＦ細胞と対照ＨＤＦ細胞間のＳＩＲＴ１、ｐ５３、及びコフィリン−１のＷｅｓｔｅｒｎブロット定量結果の比較。
【図８】ＡＴＥ、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−Ｈ2Ｏ、及び水（対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として）で処置されたマウスにおけるｐ５３の発現の変化を示す。（Ａ）肝臓及び皮膚組織におけるｐ５３の免疫組織化学（ＩＣＨ）染色。（Ｂ）皮膚ｐ５３のＩＨＣ染色強度の定量化。（Ｃ）肝臓ｐ５３のＩＨＣ染色強度の定量結果。
【図９】ＡＴＥ、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−Ｈ2Ｏ及び水（対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として）で処置されたマウスにおけるコフィリン−１（ＣＦＬ）の発現の変化を示す。（Ａ）肝臓及び皮膚のＣＦＬのＩＨＣ染色。（Ｂ）肝臓ＣＦＬのＩＨＣ染色強度の定量化。（Ｃ）皮膚ＣＦＬのＩＨＣ染色強度の定量化。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に定義が示されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１７】
本明細書で使用される、単数形「１つ（a）」、「１種（an）」、及び「当該（the）」は、文脈が複数の言及を含まないことを明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「サンプル（a sample）」の内容は、当業者に既知の、複数種のそのようなサンプル及びそれらの同等物を含む。
【００１８】
本発明で使用される医薬組成物に基づいて、１種又は複数種の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で調製することができ、当該担体は、活性化合物を医薬的に使用可能なものに加工するのに役立つ、賦形剤及びアジュバントを含む。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【００１９】
（実施例）
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例においてさらに説明及び記載される。本明細書に記載された実施例は、本発明を説明するために使用され、本発明を限定するものではない。
【００２０】
本発明の実施において使用される技術には、細胞生物学及び細胞培養の従来の技術が含まれ、それらは当技術分野の通常の技術の範囲内にある。そのような技術は先行技術文献で完全に説明されている。
【００２１】
（ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）モデル）
ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞（ATCC（登録商標）PCS-201-010）は、２％ウシ胎児血清を含む線維芽細胞成長キット−低血清（ATCC（登録商標）PCS-201-041）で培養され、標準的な培養条件（３７℃、湿度９５％の空気及び５％ＣＯ2）を使用する。ＨＤＦ細胞は４８時間ごとに培養され、継代ごとに老化する。集団倍加レベル（ＰＤＬ）の式は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC（登録商標））に基づくものである。ＰＤＬ＝３．３２×ｌｏｇ（Ｘｅ／Ｘｂ）＋Ｓであり、ここで、Ｘｂはインキュベーション開始時の細胞数であり、Ｘｅは、細胞インキュベーション終了時の細胞数であり、Ｓは、開始時間点のＰＤＬである。さらに、ＰＤＬ式はｎ＝３．３２（ｌｏｇＵＣＹ−ｌｏｇＩ）＋Ｘであり、ここで、ｎは、所与の継代培養の終了時における最終的なＰＤＬ回数であり、ＵＣＹは、当該時点の細胞収量であり、Ｉは継代培養を開始するための播種細胞の数であり、Ｘは継代培養を開始するために定量化される播種細胞の倍加レベルである。
【００２２】
（ＡＴＥ及びその亜画分の調製）
乾燥したヤエヤマキランソウの地上部を研磨し、エタノール溶液（８０％）で抽出し、減圧下で濃縮して粗抽出物（ＡＴＥ）を得る。粗抽出物を水に懸濁し、順次に酢酸エチル（ＥＡ）とエタノール（ＢｕＯＨ）で分画して、それぞれＥＡ、ＢｕＯＨ、Ｈ2Ｏの可溶性画分を得る。各画分は、次の実験に使用される。
【００２３】
（細胞成長曲線分析）
まず、ＨＤＦ細胞（１０5個細胞）を６０ｍｍのペトリ皿に播種し、３７℃、湿度９５％の空気、及び５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。次に、ＨＤＦ細胞を２つの濃度（５０及び１００μｇ／ｍｌ）のＡＴＥで２４時間処理する。トリプシン消化後、各群の細胞数を計数し、７日間毎日細胞を計数する。
【００２４】
（ＭＴＴアッセイ）
一実施形態では、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）で細胞生存率を検出する。ＨＤＦ細胞を９６ウェルプレート（２０００細胞／ウェル）に播種する。３７℃のインキュベーターにおいて、各ウェルを異なる濃度のＡＴＥで２４時間処理し、培地を０．５ｍＭのＭＴＴ無血清培地に４時間ごとに交換する。培養液を廃棄し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加してクリスタルバイオレットを形成する。最後に、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して、波長５７０ｍｍでのＯＤ値を測定する。
【００２５】
別の実施形態では、同じステップで、ＨＤＦ細胞に対するＡＴＥ−ＥＡ、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏの細胞毒性を評価する。
【００２６】
（老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色）
３７℃で、０．２％のグルタルアルデヒドに２％のホルムアルデヒドを添加して細胞を５分間固定し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄する。ペトリ皿に染色溶液（１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、４０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０））を添加して、３７・Ｃで、２４時間インキュベートする。染色された細胞を、デジタルカメラを備えた光学顕微鏡（Olympus, Center Valley, PA, USA）で、視覚化する。ランダムに選択された１００個の細胞ごとに陽性染色された細胞の数を数えることにより、定量化する。
【００２７】
（Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析）
１％のプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファー（Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA）でタンパク質ライセートを調製する。等量の総タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけ、その後、ニトロセルロース膜に移す（PALL Co., Port Washington, NY, USA）。ブロッティング用メンブレン及びブロッキングバッファー（４％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ）を室温で１時間インキュベートし、次に一次抗体と４℃で一晩ハイブリダイズし、その後に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でインキュベートする。強化型化学発光試薬（Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA）を使用して信号を出させ、Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ−４０００イメージングシステム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）に記録する。
【００２８】
（実施形態１．ＡＴＥのクロマトグラフィー分析）
ＡＴＥの化学スペクトルは、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ｓｔａｒ  ＲＰ−１８エンドキャップ処理されたクロマトグラフィーカラム（５μｍ）（１５０ｘ４．６ｍｍ）において、ＨＰＬＣにより行われ、Ｈｉｔａｃｈｉ（登録商標）５１６０で操作する。移動相は、溶媒Ａ（０．２％Ｈ3ＰＯ4）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）からなり、次の勾配プログラムを使用する：０〜５ｍｉｎ、３０％Ｂ，５〜２０ｍｉｎ、３０〜６０％Ｂ，２０〜３０ｍｉｎ、６０〜８０％Ｂ，３０〜３５ｍｉｎ、８０％Ｂ，１．０ｍｌ／ｍｉｎ流量。注入量及びＵＶ検出器をそれぞれ１０μｌ及び２０３ｎｍに設定する。その結果は、ＡＴＥには、８−ヤエヤマキランソウ（図１）と呼ばれる主成分があることを示している。
【００２９】
（実施形態２．ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞モデルの確立）
集団倍加レベルの式（ＰＤＬ）を使用して細胞老化（図２Ａ）を評価するために、ヒト皮膚線維芽細胞モデルを確立する。老化したＨＤＦ細胞は平らで大きくなり、ゆっくりと増殖する（図２Ｃ）。世代数が増えると、細胞骨格も拡大する（図２Ｂ）。また、細胞成長速度と細胞形態の変化に加えて、若い細胞と老化細胞の細胞周期分布も評価した。若いＨＤＦ細胞のＧ１／Ｇ０期の比率は７２．８％であるが、老化細胞のＧ１／Ｇ０期は８９．１％に増加する（図２Ｄ）。
【００３０】
（実施形態３．ＡＴＥの細胞毒性）
ＨＤＦ細胞に対するＡＴＥの細胞毒性は、ＭＴＴアッセイを使用して分析する。図３に示すように、ＨＤＦ細胞の生存率は、低濃度のＡＴＥ（１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）で処理された細胞でわずかに増加した。さらに、ＡＴＥの半致死濃度（ＩＣ５０）が約１５００μｇ／μｍｌであるため、本発明では、５０及び１００μｇ／μｍｌを選択する。
【００３１】
（実施形態４．ＡＴＥの老化防止効果）
若い細胞及び老化細胞によるモデルを確立して、ＡＴＥが無毒であることを確認した後、ＡＴＥの老化防止効果をさらに評価する。まず、ＨＤＥ細胞を５０及び１００μｇ／ｍｌのＡＴＥで２４時間処理し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色により分析する。その結果は、対照群と比較して、処理後の老化細胞ＳＡ−β−ｇａｌの発現レベルが著しく低下することを示す（図４Ａ）。定量結果から、両方の濃度の抽出物も発現レベルを低下できることがより明確にわかる（図４Ｂ）。１００μｇ／ｍｌのＡＴＥの老化防止効果がより優れている。
【００３２】
次に、ＡＴＥで処理された老化細胞の細胞成長速度を検出する。その結果は、ＡＴＥで処理された老化細胞の細胞成長速度が対照群よりも明らかに高いことを示し、５０及び１００μｇ／ｍｌ群から同じ結果が得られた（図４Ｃ）。老化細胞の成長速度を正常細胞のレベルに戻すことはできないが、それはＡＴＥ処理が老化を遅らせ、細胞成長を促進するのに著しい効果があることを示している。
【００３３】
老化関連のβ−ガラクトシダーゼ染色を使用し、成長速度の変化を観察することに加えて、細胞周期の回復をさらに評価した。その結果は、ＡＴＥで処理されたＨＤＦ細胞のＧ１／Ｇ０期が８５．２％から７５．３％に減少したことを示しており、若い群の７３．５％に近い値だった（図４Ｄ）。これは、ＡＴＥがＨＤＦ細胞の分裂と成長を再開させるように促進することを示す。そして、ＳＡ−β−ｇａｌの発現を評価することにより、ＡＴＥ処理は老化ＨＤＦ細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの発現を減少させることができる（図４Ｅ）。
【００３４】
さらに、他の老化モデルを使用して、ＡＴＥの老化防止効果、例えば、ＢｅＳＯ4及びＤ−ガラクトースによって誘導される老化細胞を検出する。上記のように、２つの老化細胞モデルを異なる濃度のＡＴＥで２４時間処理した後、これら２つのモデルのＳＡ−β−ｇａｌ発現を評価及び定量化する。結果として、ＡＴＥで処理された細胞のＳＡ−β−ｇａｌ発現は大幅に減少した（図４Ｆ〜４Ｇ）。
【００３５】
（実施形態５．ＡＴＥで処理されたＨＤＥ細胞の分子発現）
ＡＴＥ処理を通じて、老化ＨＤＦ細胞は、成長能力を回復し、成長速度を増大させ、細胞分裂周期に再び入ることができる。このため、ｐ５３、ｐ２７及び老化関連分子コフィリン−１などの細胞周期チェックポイントで発現した分子をさらに評価した。その結果は、５０及び１００μｇ／ｍｌＡＴＥを使用した後、ｐ５３、ｐ２７及びコフィリン−１の発現レベルが著しく減少したことを示す（図５Ａ及び５Ｂ）。
【００３６】
一方、長寿マーカーＳＩＲＴ１の発現も評価した。Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析は、ＡＴＥ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）がＨＤＦ細胞におけるＳＩＲＴ１の発現を増加させることを示す（図５Ｃ）。ＳＩＲＴ１のＷｅｓｔｅｒｎブロット定量結果は、ＳＩＲＴ１の発現増加におけるＡＴＥの老化防止効果が用量依存的であることを示す（図５Ｄ）。
【００３７】
（実施形態６．ＨＤＦ細胞に対するＡＴＥ亜画分の細胞毒性及びＡＴＥ亜画分による処理後のＨＤＦ細胞の細胞増殖速度）
ＡＴＥを水に懸濁し、次いで、酢酸エチル（ＥＡ）及びブタノール（ＢｕＯＨ）で分画して、ＥＡ（ＡＴＥ−ＥＡ）、ＢｕＯＨ（ＡＴＥ−ＢｕＯＨ）及びＨ2Ｏ可溶性（ＡＴＥ−Ｈ２Ｏ）を得る。ＨＤＦ細胞に対するＡＴＥ亜画分の細胞毒性を、ＭＴＴアッセイを使用して分析する。図６Ａ〜６Ｃに示されるように、その結果は、ＡＴＥ、ＡＴＥ−ＥＡ、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏの３つの亜画分がＨＤＦ細胞に対して細胞毒性がないことを示している。ＨＤＦ細胞を最高用量のＡＴＥの３つの亜画分で処理した場合でも、細胞生存率は依然として約８０％だった。
【００３８】
細胞増殖速度について、細胞増殖アッセイは、２４時間〜７２時間に、異なる濃度のＡＢＥ亜画分を用いるか又は用いずに処理された群の細胞数を計数することによって行われる。血球計算盤を使用して細胞数を計数し、各時点での細胞数を最初に播種した細胞数（０時間）と比較して比率を得る。要するに、異なる濃度（１００μｇ／ｍｌまで）のＡＢＥ亜画分は著しく細胞死を引き起こすことはなく、細胞増殖速度を阻害した（図６Ｄ−６Ｆ）。
【００３９】
（実施形態７．ＡＴＥ亜画分の老化防止効果）
さらに、ＡＴＥ亜画分の老化防止効果も評価した。図７Ａ〜７Ｃに示すように、ＨＤＦ細胞をＡＴＥ−ＢｕＯＨ、ＡＴＥ−ＥＡ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏ亜画分で処理して、ＳＡ−β−ｇａｌの活性により、これらの亜画分の老化防止効果を定量的に検証する。結果は、ＡＴＥの亜画分にも老化防止能力があることを示している。さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットを使用して、ＡＴＥ亜画分で処理されたか又は処理されていないＨＤＦ細胞で発現した長寿マーカーＳＩＲＴ１と老化マーカーｐ５３及びコフィリン−１を推定する（図７Ｄ）。Ｗｅｓｔｅｒｎブロットの定量結果は、これらの亜画分がＨＤＦ細胞におけるＳＩＲＴ１の発現を大幅に増加させ、ｐ５３及びコフィリン−１の発現を減少することができたこと、水溶性亜画分が最も効果的であることを示した（図７Ｅ）。
【００４０】
（実施形態８．ＡＴＥ及びＡＴＥの亜画分で処理されたマウスにおけるｐ５３及びＣＦＬ−１発現の変化）
１１〜１２か月のＢａｌｂ／Ｃマウスは中年モデルとみなされ、ＡＴＥ、ＡＴＥ−Ｈ2Ｏ、ＡＴＥ−ＢｕＯＨの老化防止効果の評価に使用される。マウスを対照群、ＡＴＥ群、ＡＴＥ−Ｈ2Ｏ群及びＡＴＥ−ＢｕＯＨ群の４群に分け、１日２回、毎週５日に１ヶ月間給餌する。各組にマウスが２匹ずつあり、ＡＴＥの投与量を、各マウスで３５ｍｇ／ｋｇとし、ＡＴＥ−ＢｕＯＨ及びＡＴＥ−Ｈ2Ｏの投与量をそれぞれ７ｍｇ／ｋｇとする。処理後、すべてのマウスを犠牲にしてｐ５３とコフィリン−１（ＣＦＬ）ＩＨＣ染色を行う。図８Ａ〜８Ｃ及び９Ａ〜９Ｃに示すように、肝臓と皮膚のＩＨＣ結果は、ＡＴＥとその亜画分が、対照群と比較して老化分子マーカーｐ５３とコフィリン−１の発現を大幅に減少させることができることを示した。但し、比較すると、ＡＴＥ−ＢｕＯＨのｐ５３を防ぐ能力は例外的に弱い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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