(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の阻害剤の提供。【解決手段】式ＩＩ等の化合物。2020189857.tif 000025【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄異形成症候群の治療における使用のための、式ＩＩ、ＩＩＩ−Ａ、Ｖ−ＡまたはＶＩ−Ａの化合物:
【化１】
2020189857.tif 000019
（式中、Ｒ３は、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されているアルキル基である）、
【化２】
2020189857.tif 000020
（式中、Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されている）、
【化３】
2020189857.tif 000021
（式中、Ｒ６及びＲ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されている）、
【化４】
2020189857.tif 000022
（式中、Ｒ８及びＲ９は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；ただし、Ｒ８及びＲ９は、両方がメチルとはならない）。
【請求項２】
式ＩＩの化合物であって、Ｒ３は、カルボニル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルまたはニトロによって任意選択的に置換されているアルキル基である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
ＩＣＴ
【化５】
2020189857.tif 000023
である、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
式ＩＶ−Ａの化合物:
【化６】
2020189857.tif 000024
（式中、Ｒ５は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されている）
である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
骨髄由来のサプレッサー細胞の蓄積及び活性化を低減させる、請求項３に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２０１４年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，７５７号、及び２０１４年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，９８５号の優先権の利益を主張し、各々の開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、がんの特質であり、がんの発生及び進行ならびに腫瘍細胞による免疫系の侵襲を促進する。炎症誘発がんは、腫瘍担持宿主において、特に、局所的な腫瘍微環境において蓄積する骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）に起因し得る。ＭＤＳＣは、マウスにおいてＧｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋、ヒトにおいてＨＬＡ−ＤＲ−Ｌｉｎ−ＣＤ３３＋を特徴とし、免疫抑制及び腫瘍形成微環境の主な免疫製作体として同定された（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ，Ｎａｇａｒａｊ  Ｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；９（３）：１６２−７４）。健康な個体において、これらの細胞は、未熟骨髄細胞（ＩＭＣ）として存在し、成熟単球、ＤＣ及び好中球に迅速に分化し得るとき、正常な骨髄造血の一部となる。しかし、炎症及びがんを含めたある特定の病的状態下において、これらのＩＭＣは、該ＩＭＣが可溶性の血管形成因子及び抑制因子、例えばＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、またはＩＬ−１０の放出を通して腫瘍促進及び免疫抑制の両方の細胞として作用する局所組織において活性化されて蓄積する。該ＩＭＣは、腫瘍特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接抑制し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘発することもできる。また、該ＩＭＣは、骨髄前駆細胞の成熟を妨げること、及び造血幹細胞／前駆細胞の発生を調節することによって、がん及び白血病の発症に直接寄与する可能性もある。さらに、反応性の酸素及び窒素種（それぞれＲＯＳ及びＲＮＳ）ならびに活性ＳＴＡＴ３は、ＭＤＳＣ機能に関与し、免疫抑制サイトカイン及び腫瘍促進因子のアップレギュレーションに密接に関連する。そのため、ＭＤＳＣ及びその下流エフェクター機構を標的することが、腫瘍の免疫認識を回復させ、がんの進行を阻害するのに必須である。しかし、現在のところ、これらを含有する有効な治療ストラテジーは存在しない。
【０００３】
ヒトＭＤＳＣは、全ての系譜マーカーを欠失していることにおいて特有のものであり、唯一のキーとなるレセプター：ＣＤ３３；未熟骨髄細胞の周知の表面マーカーによって定義される。これは、シアル酸結合性Ｉｇスーパーファミリーレクチン（ＳＩＧＬＥＣ）のサブセットの原型的なメンバーとしても公知である６７ｋＤａ型１膜貫通シアロ糖タンパク質を表す。この特定のサブグループは、ＣＤ３３が機能上はＳＩＧＬＥＣ３として公知であるＣＤ３３関連ＳＩＧＬＥＣ（ＣＤ３３−ｒ  Ｓｉｇｌｅｃ）として公知である。ヒトにおいて、５０〜９９％の相同性を共有する、ＳＩＧＬＥＣ３、５及び１４を含めた、ＣＤ３３に関連する９つのＳＩＧＬＥＣが存在する。この相同性にも関わらず、各ＳＩＧＬＥＣは、シアル化リガンドに固有の特異性を有し、各タンパク質が異なる機能を媒介する可能性を高くする。全てのＳＩＧＬＥＣは、シアル酸に結合するアミノ末端可変Ｖセット免疫グロブリンドメインを有し、結合する糖部位が知られているが、完全なリガンドは知られていない。ＳＩＧＬＥＣ３を含めたＣＤ３３−ｒ  ＳＩＧＬＥＣの別の特徴は、細胞質領域における２つの保存された免疫−レセプターチロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在である。ＳＩＧＬＥＣ３を抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体と、またはそのリガンドを通して嵌め合わせることにより、Ｓｒｃ相同性−２（ＳＨ２）ドメイン含有チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）を補充して活性化するこれらのチロシンモチーフのリン酸化をもたらす（Ｐａｕｌ  ＳＰら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６（２）：４８３−９０）。常套的に、ＩＴＩＭドメインを有するレセプターは、チロシン及びイノシトールホスファターゼの補充を通してモチーフ（ＩＴＡＭ）の活性化に関連するレセプターから生じる活性化または成熟シグナルを抑制する働きをする。
【０００４】
阻害シグナルよりもむしろ活性化シグナルを送達するさらなるＣＤ３３−ｒ  ＳＩＧＬＥＣが発見された。これらの代替のレセプターは、ＩＴＩＭを欠失しており、代わりにＤＡＰ１２（１２ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質）と相互作用する。この相互作用は、ＤＡＰ１２における負荷電アスパラギン酸残基に非共有結合的に結合する、レセプターの膜貫通ドメインに位置する正荷電アニオン性残基を通して起こる。このアダプター分子は、大部分のＮＫ活性化レセプターによって共有されるＩＴＡＭ担持タンパク質である。これを通したシグナリングは、Ｓｙｋタンパク質チロシンキナーゼ、ホスホイノシタイド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、及びＥＲＫ／ＭＡＰＫの活性化をもたらす。ヒトにおけるＳＩＧＬＥＣ−１４及びマウスにおけるＳＩＧＬＥＣ−Ｈを含めた、活性化レセプターとのＤＡＰ１２パートナーは、造血幹細胞の単球への成熟及び分化ならびにＤＣの成熟及び生存の促進への関与を通して骨髄の発生に役立つ。そのため、ＤＡＰ１２は、ＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭシグナリングに反作用し、成熟細胞へのＭＤＳＣの分化を駆動することによって、ＭＤＳＣ機能をダウンレギュレートし、集団数を増加させることができる。
【０００５】
近年、ＳＩＧＬＥＣ３の内因性リガンドが同定された。ＳＩＧＬＥＣ３−ＩｇＧ  Ｆｃキメラ融合タンパク質を用いて、質量分析により、タンパク質がＳ１００Ａ９であることを同定した。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９（それぞれ、骨髄関連タンパク質（ＭＲＰ）−８及び１４またはカルグラニュリンＡ及びＢとも呼ばれる）が、腫瘍担持体におけるＭＤＳＣ活性化の強力な炎症性メディエーターであり得るため、これは有意である。さらに、ＭＤＳ患者（骨髄異形成症候群、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）に転換する前悪性障害）から単離したＳＩＧＬＥＣ３発現ＭＤＳＣが、正常な造血を破壊する可能性が高いことが分かっている（Ｗｅｉ  Ｓら、ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ．２００９；１１４（２２）：５９７）。
【０００６】
Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９（それぞれ、遺伝子Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９によってコードされる）は、特定の分化段階の間に骨髄細胞において発現されるカルシウム結合性タンパク質であり、内因性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として認識される。Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ヘテロ二量体（カルプロテクチンと呼ばれる）として働き、炎症及びＭＤＳＣ活性化を促進するのに有効な内因性メディエーターとして作用する。さらに、これらは、増加した血清濃度をもたらしかつ炎症の程度と相関する進行中の炎症の部位で放出される。機能性のＳ１００Ａ８／Ａ９を持っていないマウスを用いて、両方のタンパク質がＴｏｌｌ様レセプター−４（ＴＬＲ４）を活性化することができること、それゆえ、炎症を促進するＴＬＲ４媒介シグナリングに関与することが確立された。ＭＤＳＣにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９のアップレギュレーションは、ＤＣの阻害及びマクロファージの分化に役立ち得、がんの発生及び腫瘍の広がりに寄与し得るＭＤＳＣの蓄積を誘発し得る。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、腫瘍担持マウスにおけるＭＤＳＣ数のインビボ増加に関係し得るだけでなく、骨髄細胞の分化に対する阻害効果にも関係し得る。この考えは、正常な骨髄細胞分化及び大幅に低減されたＭＤＳＣを提示したＳ１００Ａ９ノックアウトマウスによってサポートされた。対照的に、ＭＤＳＣの蓄積は、マクロファージの阻害およびＤＣの分化によりＳ１００Ａ９トランスジェニックマウス（Ｔｇ）において向上した（Ｃｈｅｎｇ  Ｐら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８；２０５（１０）：２２３５−４９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がんにおいてＭＤＳＣに有効な標的化された治療が現在欠失していることを、他の炎症関連疾患における役割と併せて考えると、ＭＤＳＣの阻害剤が望ましい。本明細書に開示されている化合物、組成物及び方法は、これら及び他の要求に対処する。
【０００８】
本明細書において具現化され広範に記載されている、開示されている化合物、組成物及び方法によると、開示されている主題は、化合物、組成物、ならびに該組成物を作製及び使用する方法に関する。より詳細な態様において、開示されている主題は、イカリインの誘導体である化合物、該化合物を使用する方法、及び該化合物を含む組成物に関する。ある特定の態様において、開示されている主題は、本明細書において定義されている式Ｉ−ＶＩＩＩに示される化学構造を有する化合物に関する。なおさらなる態様において、開示されている主題は、対象において前がん性症候群を処置するための方法に関する。例えば、本明細書に開示されている方法により、有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物が、前がん性症候群、例えば骨髄異形成症候群を有する、及びその処置を必要とする対象に投与される。
【０００９】
さらなる利点は、一部が、以下に続く詳細な説明、及び図に記載されており、一部が、該詳細な説明から明白であり、または、以下に記載される態様の実施によって学習され得る。以下に記載されている利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素及び組み合わせによって実現及び達成される。以上の一般的な記載及び以下の詳細な記載は、いずれもが具体例であり、例示のみを目的としており、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＭＤＳＣの分化に対するＩＣＡまたはＩＣＴの効果を示す。ＭＤＳＣを４Ｔ１腫瘍担持マウスの脾臓から単離した。示されている成熟マーカーを用いて腫瘍担持マウスにおけるＭＤＳＣの分化及び蓄積を評価した。細胞表現型をフローサイトメトリーによって評価した。
【図２】造血に対するＩＣＡ及びＩＣＴの効果及びその欠失を示す。健常な３ドナーからのＢＭＮＣをＩＣＡまたはＩＣＴによって４８時間処理し、その後、サイトカインを含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３４完全培地を用いてコロニー形成をアセスメントした。ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭを、倒立光学顕微鏡を用いて同定及び計数した。各バーは、複製板による３個体の平均結果を表す。結果は、平均±ＳＤとして表される。
【図３】腫瘍から単離したＭＤＳＣならびにそのＲＯＳ及びＮＯ産生の増加に対するＩＣＡ及びＩＣＴの効果を示す。Ｇｒ１＋細胞を４Ｔ１腫瘍担持マウスの腫瘍から単離した。Ａ）ＭＤＳＣを２０μＭのＩＣＡ、ＩＣＴ、またはＤＭＳＯで４８時間処理した。バーは、フローサイトメトリーによって測定されたＤＭＳＯ処理細胞と比較したＭＤＳＣの相対割合を表す。Ｂ）ＲＯＳの産生、及びＣ）腫瘍組織からの精製ＭＤＳＣのＮＯ活性。
【図４】ＩＣＡ及びＩＣＴに起因する、ＰＢＭＣにおけるＳＩＧＬＥＣ３のＲＮＡ発現のダウンレギュレーションを示す。健常なＰＢＭＣを１μＭのＤＭＳＯ、ＩＣＡまたはＩＣＴによって４８時間培養し、ＳＩＧＬＥＣ３の発現を、Ｑ−ＰＣＲによって測定し、ΔΔＣｔ法によって分析した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【図５】ＰＢＭＣにおけるＳＩＧＬＥＣ３及びＳＩＧＬＥＣ５の発現に対するＩＣＴの効果を示す。健常なドナーからのＰＢＭＣをＤＭＳＯまたはＩＣＴで４８時間処理し、ＳＩＧＬＥＣ３−ＰＥ及びＳＩＧＬＥＣ５／１４−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって細胞外で染色した。
【図６】ＳＩＧＬＥＣ３及びＳ１００Ａ９結合に対するＭＤＳ  ＢＭからのＭＤＳＣの効果を示す。ａ）ＭＤＳ患者（ｎ＝１２）及びこれらの年齢適合健常対照（ｎ＝８）からのＭＤＳＣを、ＳＩＧＬＥＣ３表面発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（＊、Ｐ＜０．０００５）に関するフローサイトメトリーによって分析した。ｂ）ＭＤＳ患者のＢＭからのＭＤＳＣをヒト組み換えＳ１００Ａ９−ＤＤＫによって処理した。洗浄後、細胞をＳＩＧＬＥＣ３（ＦＩＴＣ）及びビオチン標識抗ＤＤＫ（ＡＰＣ）についてサイトスピン及び染色した。
【図７】キメラＳＩＧＬＥＣレセプターＩｇＧ−Ｆｃ分子によるドットブロットを示す。Ｓ１００Ａ９トランスフェクトＡＤ２９３溶解物を３０μｇで開始してニトロセルロース膜上で順次希釈し、ＳＩＧＬＥＣ３キメラでインキュベートした。膜を抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでブロットした。クマシー染色は負荷対照として働いた。
【図８】ＳＩＧＬＥＣ３とＳ１００Ａ９との関連を示す。ＳＪＣＲＨ３０細胞を、示されている構築物で７２時間トランスフェクトした（自己分泌によって放出されるＳ１００Ａ９をＳＩＧＬＥＣ３に結合させることを可能にする）。免疫沈降をＳ１００Ａ９抗体によって実施し、続いて、ＳＩＧＬＥＣ３抗体によるウエスタンブロットを実施した。
【図９】ＰＰ２Ａの活性に対するＩＣＡ及びＩＣＴの効果を示す。ヒトＰＢＭＣを培地、ＤＭＳＯ、１μＭのＩＣＡまたはＩＣＴにより４８時間培養した。細胞溶解物を用いて、市販のインビトロホスファターゼアッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＰ２Ａ活性を分析した。エラーバーは、３つの別々の実験のＳＥＭを表す。
【図１０】ＰＤＥ５へのＰＰ２Ａの結合を示す。ヒトＰＢＭＣを、培地、ＤＭＳＯまたは増加用量のＩＣＴ（それぞれ１、５、１０、２０μＭ）により４８時間培養した。次いで、細胞を溶解し、ＰＤＥ５を抗ＰＰ２Ａによるウエスタンブロットに続いて免疫沈降させた。膜のクマシーブルー染色を負荷対照として示す。
【図１１】ＰＤＥ５のリン酸化に対するＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングの効果を示す。空ベクター、ＳＩＧＬＥＣ３またはＳ１００Ａ９のいずれかによってトランスフェクトしたＳＪＣＲＨ３０を７２時間培養し、ＰＤＥ５またはＰＤＥ５の活性化されたカウンターパートｓｅｒ９２のいずれかについてウエスタンブロットによってアセスメントした。
【図１２】イカリシドＩＩ自己ドッキング及びＩＣＴドッキングのモデリング結果を示す。Ａ）イカリシドＩＩのドッキング及び共結晶化された様態の再生によるモデル検証。イカリシドＩＩは、０．９６のＲＭＳで２Ｈ４４にドッキングし、このことは、２Ｈ４４のモデルがロバストであることならびにイカリシドＩＩ及び関係する化合物の結合を予測することが可能であることを示している。Ｂ）２Ｈ４４におけるＩＣＴの結合様態。予測される水素結合との相互作用を青点線によって示し、Ｆ８２０と重なるポテンシャルｐｉを平行の青点線によって示す。
【図１３】Ｓｙｋ及びＭＡＰＫの活性化に対する活性ＤＡＰ１２の効果を示す。ＡＤ２９３細胞を、ベクターのみ、またはＷＴ−ＤＡＰ１２、ドミナントネガティブＤＡＰ１２（ＤＮ）若しくは活性ＤＡＰ１２（Ｐ１９及び２３）を含有するベクターのいずれかによって４８時間トランスフェクトした。細胞溶解物を調製し、細胞溶解物全体におけるウエスタンブロッティングを実施した。全Ｓｙｋ及び全ＥＲＫを負荷対照として用いた。これは、３つの独立実験を代表するものである。
【図１４】未熟ＤＣの成熟に対する活性ＤＡＰ１２の効果を示す。初代ＤＣを健常なドナーから調製し、示すように、ＧＦＰのみ、ｗｔ−ＤＡＰ１２、ドミナントネガティブＤＡＰ１２（ｄｎＤＡＰ１２）または活性ＤＡＰ１２（ａｄ−Ｐ１９及びＡｄ−Ｐ２３）を含有するアデノウイルスベクターに感染させた。該細胞を、示すように成熟ＤＣ表面マーカーを用いたフローサイトメトリー分析の前に７２時間培養した。モック感染ＤＣ及びアイソタイプＩｇＧを対照群に含めた。各実験構築物を空ベクター対照（充填ヒストグラム）と比較し、感染した細胞を分析前にＧＦＰにおいてゲーティングした。
【図１５】ＩＬ−１０の分泌に対するＳＩＧＬＥＣ１４及びＤＡＰ１２の効果を示す。対照ベクター、ＳＩＧＬＥＣ１４プラスミドまたはＳＩＧＬＥＣ１４及びｗｔ−ＤＡＰ１２によってモックトランスフェクトまたはトランスフェクトのいずれかがなされ、続いて７２時間培養したＡＤ２９３細胞。上澄みを収集し、製造者のプロトコルの通りにＥＬＩＳＡによって測定した。バーは、３つの別々の実験ならびに各実験の３つの別々の測定の平均を表す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図１６】ＮＫ細胞におけるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）の表面発現に対するＩＣＡ及びＩＣＴ処理の効果を示す。健常なドナーからのＰＢＭＣを、フローサイトメトリーによるＣＤ１６発現の分析の前に４８時間、ＩＣＡ／ＩＣＴまたはＤＭＳＯによって処理した。ＮＫ細胞をＣＤ３−集団と定義し、示すようにＣＤ１６＋ＣＤ５６＋細胞の存在について分析した。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３３の発現に対するＩＣＴの効果を示す。
【図１８】ＰＢＭＣにおける抑制因子の発現に対するＩＣＴの効果を示す。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、ＬＰＳ処理ＰＢＭＣにおける抑制サイトカインＩＬ−１０及びＴＧＦｂの発現に対するＩＣＴの効果を示す。
【図２０】図２０Ａ、２０Ｂ、及び２０Ｃは、ＭＤＳ−ＢＭにおけるＣＤ３３及びｉＮＯＳの発現に対するＩＣＴの効果を示す。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、ＭＤＳ  ＢＭＮＣの造血に対するＩＣＡ及びＩＣＴの効果を示す。
【図２２】図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ及び２２Ｄは、コンピュータでのＰＤＥ５Ａ１におけるＩＣＴのドッキングモデルを示す。
【図２３】ＰＤＥ５の酵素活性に対するＩＣＡ及びＩＣＴの効果を示す。
【図２４】ＰＤＥ５シグナリングならびにＰＰ２Ａ及びＳ１００Ａ９との関係のスキームを示す。
【図２５】ＩＣＴの効果を示す。Ａ）ビヒクルまたはＩＣＴのいずれかによって処置した（一日おきに４０日間５０μｇ／ｋｇ）高齢Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスのカプランマイヤー生存。Ｂ）フローサイトメトリーによって測定した、Ａにおけるマウスの処置前後のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋未熟骨髄細胞の割合。これらの実験に続いて、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスにおいて３ヶ月齢で開始し９ヶ月齢までの長期処置実験を実施した。循環Ｓ１００Ａ９のレベルを、Ｃ）末梢血（安楽死後の心臓穿刺によって得られるＰＢ）及びＤ）（ＢＭ収集から上澄みを除去し、１Ｋスピンフィルタにおいて５００μＬに濃縮することによる）ＢＭ血漿のＥＬＩＳＡによって測定した。同じ血漿を用いてＥ）ＰＢ及びＦ）ＢＭ中のグルコースを測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載されている化合物、組成物及び方法は、開示されている主題の具体的な態様の以下の詳細な説明、ならびに本明細書に含まれる実施例及び図を参照することによって、より容易に理解されてよい。
【００１２】
本化合物、組成物及び方法を開示及び記載する前に、以下に記載されている態様は、特定の合成方法または特定の試薬に限定されず、そのため、当然ながら、変動してよいことを理解されたい。また、本明細書において用いられている技術は、特定の態様のみを記載する目的のものであり、限定しようとするものではないことも理解されたい。
【００１３】
また、本明細書を通して、種々の公報が参照されている。これらの公報の開示は、開示されている事項が関係する技術の記述をより完全に説明するために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。開示されている参照文献もまた、参照文献が置かれている文章において議論されている、該文献に含まれる題材について、参照により個々にかつ具体的に本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本明細書及びこれに続く特許請求の範囲において、参照されている多くの用語は、以下の意味を有すると定義される。
【００１５】
本明細書の詳細な説明及び請求項を通して、語句「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び該語句の他の形態、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、限定されないが、例えば、他の添加物、構成要素、整数または工程を含むことを意味し、これらを排除することは意図されていない。
【００１６】
詳細な説明及び添付の請求項において用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の場合を明確に指示していない限り、複数の指示対象も含む。そのため、例えば、「１つの組成物」への言及は、２つ以上のかかる組成物の混合物を含み、「１つの剤」への言及は、２つ以上のかかる剤の混合物を含み、「構成要素」への言及は、２つ以上のかかる構成要素の混合物などを含む。
【００１７】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載されている事象または状態が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに、該記載が、該事象または状態が起こる例及び起こらない例を含むことを意味する。
【００１８】
本明細書において、「約」１の特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までの範囲が表示されている場合がある。「約」によって、値の５％以内、例えば、値の４、３、２、または１％以内が意味される。かかる範囲が表示されているとき、別の態様は、１の特定の値から、及び／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」を用いて近似として表示されているとき、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。各範囲の終点は、他の終点に関係して、また、他の終点からは独立してのいずれにおいても有意であることがさらに理解されよう。
【００１９】
用語「阻害する」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータの減少を称する。これは、限定されないが、活性、応答、状態、または疾患の完全切除を含む。これはまた、例えば、ネイティブまたは対照レベルと比較したとき、活性、応答、状態、または疾患の１０％低減を含んでいてもよい。このように、低減は、ネイティブまたは対照レベルと比較したとき、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または間にあるいずれの量であることもできる。
【００２０】
「対象」は、本明細書において用いられているとき、個体を意味する。そのため、「対象」として、家庭動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、及びトリを挙げることができる。「対象」として、哺乳動物、例えば霊長類またはヒトを挙げることもできる。
【００２１】
「低減する」または該語句の他の形態、例えば「低減すること」または「低減」は、事象または特徴（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは、典型的には、ある基準値または予期される値に関係し、換言すると、関係があるが、称される該基準値または関係値に常に必要とされるわけではないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減する」は、基準または対照と比較して腫瘍の成長の速度を低減することを意味する。
【００２２】
「防止する」または該語句の他の形態、例えば「防止すること」または「防止」は、特定の事象若しくは特徴を停止させる、特定の事象若しくは特徴の発生若しくは進行を安定若しくは遅延させる、または特定の事象若しくは特徴が生じる機会を最小にすることを意味する。防止するとは、例えば、低減するよりも典型的には絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書において用いられているとき、ある事柄は低減され得るが防止されない、しかし、低減されるある事柄は防止され得る。同じく、ある事柄は防止され得るが低減されない、しかし、防止されるある事柄は低減され得る。低減するまたは防止するが用いられるとき、別途特に示されていない限り、他の語句の使用もまた明確に開示されることが理解される。
【００２３】
「処置する」または該語句の他の形態、例えば「処置された」または「処置」は、特定の特徴または事象（例えば、腫瘍成長または生存）を低減、防止、阻害または排除するために、組成物を投与するまたは方法を実施することを意味する。用語「制御する」は、用語「処置する」と同義的に用いられる。
【００２４】
用語「抗がん」は、任意の濃度において細胞増殖及び／または腫瘍成長を処置または制御する能力を称する。
【００２５】
化学的定義
本明細書において用いられているとき、用語「置換されている」は、有機化合物の全ての許可可能な置換基を含むことが企図される。広範な態様において、許可可能な置換基として、有機化合物の、非環式及び環式の、分枝及び非分枝の、炭素環式及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の置換基が挙げられる。例示的な置換基として、例えば、以下に記載されているものが挙げられる。許可可能な置換基は、適当な有機化合物について、１つ以上であってよく、同じであっても異なっていてもよい。本開示の目的で、ヘテロ原子、例えば窒素は、ヘテロ原子の価数を満たす、水素置換基及び／または本明細書に記載されている有機化合物の任意の許可可能な置換基を有することができる。本開示は、有機化合物の許可可能な置換基によっていずれの方式に限定されることも意図されていない。また、用語「置換」または「によって置換されている」とは、かかる置換が、置換原子及び置換基の許可価数に従うものであること、ならびに該置換が、安定な化合物、例えば、再配置、環化、脱離などによる転換を自発的に経ない化合物を生じさせるという黙示的な条件を含む。
【００２６】
「Ｚ１」、「Ｚ２」、「Ｚ３」、及び「Ｚ４」は、種々の具体的な置換基を表す全体記号として本明細書において用いられる。これらの記号は、本明細書に開示されているものに限定されない任意の置換基であり得、一例において、ある特定の置換基であると定義されているとき、別の例においては、何らかの他の置換基として定義され得る。
【００２７】
用語「脂肪族」は、本明細書において用いられているとき、非芳香族炭化水素基を称し、分枝及び非分枝アルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む。
【００２８】
用語「アルキル」は、本明細書において用いられているとき、１〜２４個の炭素原子、例えば１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１５個の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基はまた、置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル基は、限定されないが、以下に記載されているように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。
【００２９】
本明細書を通して、「アルキル」は、非置換アルキル基及び置換アルキル基の両方を称するのに一般に用いられる；しかし、置換アルキル基はまた、アルキル基における具体的な置換基を同定することによって、本明細書において具体的に称される。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、１つ以上のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素によって置換されているアルキル基を具体的に称する。用語「アルコキシアルキル」は、以下に記載されているように、１つ以上のアルコキシ基によって置換されているアルキル基を具体的に称する。用語「アルキルアミノ」は、以下に記載されているように、１つ以上のアミノ基などによって置換されているアルキル基を具体的に称する。「アルキル」が一例において用いられ、具体的な用語、例えば「アルキルアルコール」が別に用いられているとき、用語「アルキル」は、具体的な用語、例えば「アルキルアルコール」なども称さないということを示唆することは意味していない。
【００３０】
この慣例はまた、本明細書に記載されている他の基にも用いられる。すなわち、用語、例えば「シクロアルキル」は、非置換及び置換シクロアルキル部位の両方を称するが、該置換部位は、加えて、本明細書において具体的に同定され得る；例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」と称され得る。同様に、置換アルコキシは、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」と具体的に称され得、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。また、一般用語、例えば「シクロアルキル」、及び具体的な用語、例えば「アルキルシクロアルキル」を用いる慣例は、一般用語が具体的な用語も含まないということを示唆することは意味していない。
【００３１】
用語「アルコキシ」は、本明細書において用いられているとき、単一の、末端エーテル連結を通して結合されたアルキル基である；すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＺ１：ここで、Ｚ１は、上記に定義されているアルキルである；として定義され得る。
【００３２】
用語「アルケニル」は、本明細書において用いられているとき、２〜２４個の炭素原子、例えば、２〜５、２〜１０、２〜１５、または２〜２０個の炭素原子の炭化水素基であり、構造式が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有している。非対称構造、例えば（Ｚ１Ｚ２）Ｃ＝Ｃ（Ｚ３Ｚ４）は、Ｅ及びＺ異性体の両方を含むことが意図される。このことは、本明細書における構造式において推定され得、式中、非対称アルケンが存在するか、または結合記号Ｃ＝Ｃによって明確に示され得る。アルケニル基は、限定されないが、以下に記載されているように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。
【００３３】
用語「アルキニル」は、本明細書において用いられているとき、２〜２４個の炭素原子、例えば２〜５、２〜１０、２〜１５、または２〜２０個の炭素原子の炭化水素基であり、構造式が、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有している。アルキニル基は、限定されないが、以下に記載されているように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。
【００３４】
用語「アリール」は、本明細書において用いられているとき、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを含めた任意の炭素系芳香族基を含有する基である。用語「ヘテロアリール」は、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含有する基として定義される。ヘテロ原子の例として、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、及びリンが挙げられる。用語「アリール」に含まれる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含有しない芳香族基を含有する基を定義する。アリールまたはヘテロアリール基は、置換されていても置換されていなくてもよい。アリールまたはヘテロアリール基は、限定されないが、本明細書に記載されているように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。用語「ビアリール」は、アリール基の具体的なタイプであり、アリールの定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンにおけるように、縮合環構造を介して一緒に結合されている、またはビフェニルにおけるように、１つ以上の炭素−炭素結合を介して付着している２つのアリール基を称する。
【００３５】
用語「シクロアルキル」は、本明細書において用いられているとき、少なくとも３個の炭素原子から構成される非芳香族炭素系環である。シクロアルキル基の例として、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の炭素原子の少なくとも１個がヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンによって置換されている上述されているシクロアルキル基である。シクロアルキル基及びヘテロシクロアルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。シクロアルキル基及びヘテロシクロアルキル基は、限定されないが、本明細書に記載されているようにアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。
【００３６】
用語「シクロアルケニル」は、本明細書において用いられているとき、少なくとも３個の炭素原子から構成され、少なくとも１つの二重結合、すなわち、Ｃ＝Ｃを含有する非芳香族炭素系環である。シクロアルケニル基の例として、限定されないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられる。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上述されているシクロアルケニル基のタイプであり、環の炭素原子の少なくとも１個がヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンによって置換されている用語「シクロアルケニル」の意味に含まれる。シクロアルケニル基及びヘテロシクロアルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。シクロアルケニル基及びヘテロシクロアルケニル基は、限定されないが、本明細書に記載されているように、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含めた１つ以上の基によって置換されていてよい。
【００３７】
用語「環式基」は、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基）、または両方のいずれかを称するのに本明細書において用いられる。環式基は、置換されていても置換されていなくてもよい１つ以上の環系を有する。環式基は、１つ以上のアリール基、１つ以上の非アリール基、または１つ以上のアリール基及び１つ以上の非アリール基を含有することができる。
【００３８】
用語「カルボニル」は、本明細書において用いられているとき、式-Ｃ（Ｏ）Ｚ１：式中、Ｚ１は、上述の、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。本明細書を通して、「Ｃ（Ｏ）」または「ＣＯ」は、Ｃ＝Ｏの簡易表記である。
【００３９】
用語「アルデヒド」は、本明細書において用いられているとき、式−Ｃ（Ｏ）Ｈによって表される。
【００４０】
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書において用いられているとき、式−ＮＺ１Ｚ２：式中、Ｚ１及びＺ２は、それぞれ、本明細書に記載されている置換基、例えば、上述の、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２である。
【００４１】
用語「カルボン酸」は、本明細書において用いられているとき、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表される。「カルボキシレート」または「カルボキシ」基は、本明細書において用いられているとき、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって表される。
【００４２】
用語「エステル」は、本明細書において用いられているとき、式−ＯＣ（Ｏ）Ｚ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１：式中、Ｚ１は、上述の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。
【００４３】
用語「エーテル」は、本明細書において用いられているとき、式Ｚ１ＯＺ２：式中、Ｚ１及びＺ２は、独立して、上述の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。
【００４４】
用語「ケトン」は、本明細書において用いられているとき、式Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｚ２：式中、Ｚ１及びＺ２は、独立して、上述の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。
【００４５】
用語「ハライド」または「ハロゲン」は、本明細書において用いられているとき、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を称する。
【００４６】
用語「ヒドロキシル」は、本明細書において用いられているとき、式−ＯＨによって表される。
【００４７】
用語「ニトロ」は、本明細書において用いられているとき、式−ＮＯ２によって表される。
【００４８】
用語「シリル」は、本明細書において用いられているとき、式−ＳｉＺ１Ｚ２Ｚ３：式中、Ｚ１、Ｚ２、及びＺ３は、独立して、上述の、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表される。
【００４９】
用語「スルホニル」は、式−Ｓ（Ｏ）２Ｚ１：式中、Ｚ１は、上述の、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい；によって表されるスルホオキソ基を称するのに本明細書において用いられる。
【００５０】
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書において用いられているとき、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−によって表される。
【００５１】
用語「チオール」は、本明細書において用いられているとき、式−ＳＨによって表される。
【００５２】
用語「チオ」は、本明細書において用いられているとき、式−Ｓ−によって表される。
【００５３】
「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」、「Ｒｎ」など（ｎは何らかの整数である）は、本明細書において用いられているとき、上記に列挙した基のうち１つ以上を独立して保有することができる。例えば、Ｒ１が直鎖アルキル基であるとき、アルキル基の水素原子のうち１つが、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミン基、アルキル基、ハライドなどによって任意選択的に置換されていてよい。選択される基に応じて、第１基は、第２基内に組み込まれていてよく、または、代替的には、第１基は、第２基へのペンダント（すなわち、付着している）であってよい。例えば、句「アミノ基を含むアルキル基」では、アミノ基が、アルキル基の骨格内に組み込まれていてよい。代替的には、アミノ基が、アルキル基の骨格に付着していてよい。選択された基の性質は、第１基が第２基に埋め込まれるか付着されるかを決定する。
【００５４】
反対であることが記述されていない限り、実線のみで示され、くさび形または破線では示されていない化学結合を有する式は、それぞれ可能性のある異性体、例えば、各エナンチオマー、ジアステレオマー、及びメソ化合物、ならびに異性体の混合物、例えばラセミまたはスカレミック混合物を企図している。
【００５５】
開示されている材料、化合物、組成物、物品、及び方法の具体的な態様を詳細に参照し、その例を、添付の実施例及び図に示す。
【００５６】
化合物
イカリイン（ＩＣＡ）は、イカリソウ植物由来のフラボノイドグリコシドである。イカリソウ植物はまた、西洋においてはホーニーゴートウィードとして、中国薬局においてはインヨウカクとしても公知であり、豊富なフラボノイドグリコシドを含有する。イカリイン及びその脱グリコシル誘導体イカリチン（３，５，７−トリヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）−８−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、抗炎症性及び抗腫瘍形成活性の向上を含めた、これらの植物のハーブ抽出物から観察される効果に関与していると考えられる。
【００５７】
ＩＣＡ及び誘導体３，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシ−８−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−フラボン）（ＩＣＴ）は、ＭＤＳＣに関連する炎症反応を効果的に阻害することが最近確認された（Ｚｈｏｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１１（７）：８９０−８；Ｗｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１２（１）：７４−９（ＩＣＡ及びＩＣＴ、ならびにこれらのＭＤＳＣ及びがんに対する効果及び使用の教示に関して全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの化合物は、発現を低減することによってＳ１００Ａ８／Ａ９の相互作用を崩壊させ、末梢及び腫瘍内ＭＤＳＣの数の減少ならびにこれらの活性の不活化をもたらし、結果として腫瘍組織量を低減させる。したがって、一態様において、ＩＣＡ、イカリチン、及び／またはＩＣＴを、薬学的担体ならびに任意選択的な抗がん剤及び／または抗炎症剤と共に含む医薬組成物を本明細書において開示する。また、一態様において、イカリソウ植物の抽出物を、薬学的担体ならびに任意選択的な抗がん剤及び／または抗炎症剤と共に含む医薬組成物を本明細書において開示する。
【００５８】
さらなる態様において、ＩＣＡ及び／またはＩＣＴの誘導体である化合物を本明細書において開示する。例えば、式Ｉを有する化合物：
【００５９】
【化１】
2020189857.tif 000002
式中、Ｙは、Ｎ、ＣＯＨ、ＣＯＲ、及びＣＲ１から選択され；
Ｘは、ＮＨ及びＯから選択され、ただし、ＹがＮであるとき、ＸがＮＨであり、ＹがＣＯＨ、ＣＯＲ、またはＣＲ１であるとき、ＸがＯであることを条件とし；
各Ｄは、他から独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、及びハロゲンから選択され；
Ｒは、アルキルまたはモノグルコシドであり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、
カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
各Ｒ２は、任意の他から独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホニル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されており；
ｎは、０、１、２、３、４または５である；
またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを本明細書において開示する。
【００６０】
ある特定の例において、各Ｄは、他から独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、及びハロゲンから選択される。他の具体例において、１つのＤがＨである。他の例において、両方のＤがＨである。さらに他の例において、１つのＤがＯＨである。他の例において、両方のＤがＯＨである。なおさらなる例において、１つのＤがＯＲである。さらに他の例において、両方のＤがＯＲである。
【００６１】
ある特定の例において、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、またはアルコキシルであり、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、またはヒドロキシルによって任意選択的に置換されている。アルキルまたはアルケニルは、長さが、Ｃ１〜Ｃ２４、より詳細には、Ｃ１〜Ｃ１２、より詳細には、Ｃ１〜Ｃ８、例えばＣ３〜Ｃ６であってよい。
【００６２】
ある特定の例において、Ｒ２は、アルキル、アルケニル、またはアルコキシルであり、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されている。例えば、Ｒ２は、メトキシル、エトキシル、プロピルオキシル、メチル、エチル、またはプロピルであってよい。
【００６３】
ある特定の例において、開示されている化合物は、イカリインまたはイカリチンを含まない。そのため、式Ｉの化合物は、ＸがＯではなく、ＹがＣＯＨまたはＣＯＲではなく、各Ｄは、両方がＯＨまたは両方がＯＲではなく、Ｒが単糖類であり、Ｒ１が３−メチル−２−ブテニルではなく、Ｒ２がｎ−メトキシではないという条件を含むことができる。しかし、イカリイン及びイカリチンを、薬学的担体及び任意選択的な抗がん剤または抗炎症剤と共に含む組成物を本明細書において開示する。
【００６４】
ＹがＣＯＨでありＸがＯである式Ｉのいくつかの具体例において、化合物は、式Ｉ−Ａ：
【００６５】
【化２】
2020189857.tif 000003
式中、Ｄ、Ｒ１、ｎ、及びＲ２は、本明細書において定義されている通りである；を有する。
【００６６】
ＹがＣＯＨでありＸがＯである式Ｉのいくつかの具体例において、化合物は、式Ｉ−Ｂ：
【００６７】
【化３】
2020189857.tif 000004
式中、Ｄ、Ｒ１、ｎ、及びＲ２は、本明細書において定義されている通りである；を有する。
【００６８】
各ＤがＯＨであり、ＹがＣＯＨであり、ＸがＯであり、ｎが１であり、Ｒ２がメトキシルであり、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ２Ｒ３である式Ｉのいくつかの具体例において、化合物は、式ＩＩ：
【００６９】
【化４】
2020189857.tif 000005
式中、Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
ただし、Ｒ３が、クロロイソプロピル、ヒドロキシイソプロピル、イソプロピルアセトアミド、アミノイソプロピル、メトキシイソプロピルではないことを条件とする；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。上記に記述したイカリイン及びイカリチンの条件は、式ＩＩに適用することもできる。
【００７０】
式ＩＩのいくつかの例において、Ｒ３は、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されているアルケニル基である。他の例において、Ｒ３は、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されているアル
キル基である。
【００７１】
１つの具体例において、化合物はＩＣＴである
【００７２】
【化５】
2020189857.tif 000006
【００７３】
Ｒ３がＮＨＲ４であるいくつかのさらなる例において、化合物は、式ＩＩＩ：
【００７４】
【化６】
2020189857.tif 000007
式中、Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
各Ｒ２は、任意の他から独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホニル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されており；
ｎは、０、１、２、３、４または５である；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００７５】
式ＩＩＩの化合物のさらなる例は、Ｒ２がパラメトキシであり、式ＩＩＩ−Ａによって表される：
【００７６】
【化７】
2020189857.tif 000008
【００７７】
Ｒ４がＣ（Ｏ）Ｒ５である式ＩＩＩのいくつかの具体例において、化合物は、式ＩＶ：
【００７８】
【化８】
2020189857.tif 000009
式中、Ｒ５は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
各Ｒ２は、任意の他から独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホニル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されており；
ｎは、０、１、２、３、４または５である；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００７９】
式ＩＶの化合物のさらなる例は、Ｒ２がパラメトキシであり、式ＩＶ−Ａによって表される：
【００８０】
【化９】
2020189857.tif 000010
【００８１】
各ＤがＯＨであり、ＹがＣＯＨであり、ＸがＯであり、ｎが１であり、Ｒ２がメトキシルであり、Ｒ１がＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７である式Ｉのいくつかのさらなる実施形態において、化合物は、式Ｖ：
【００８２】
【化１０】
2020189857.tif 000011
式中、Ｒ６及びＲ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
各Ｒ２は、任意の他から独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホニル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されており；
ｎは、０、１、２、３、４または５である；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００８３】
式Ｖの化合物のさらなる例は、Ｒ２がパラメトキシであり、式Ｖ−Ａによって表される：
【００８４】
【化１１】
2020189857.tif 000012
【００８５】
各ＤがＯＨであり、ＹがＣＯＨであり、ＸがＯであり、ｎが１であり、Ｒ２がメトキシルであり、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ＝ＣＲ８Ｒ９である式Ｉのいくつかの実施形態において、化合物は、式ＶＩ：
【００８６】
【化１２】
2020189857.tif 000013
式中、Ｒ８及びＲ９は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されており；
ただし、Ｒ８及びＲ９は、両方がメチルとはならないことを条件とし；
各Ｒ２は、任意の他から独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホニル、アミノ、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから選択され、これらの任意のものが、アセチル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、スルホニル、またはスルホニルアミノによって任意選択的に置換されており；
ｎは、０、１、２、３、４または５である；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００８７】
式ＶＩの化合物のさらなる例は、Ｒ２がパラメトキシであり、式ＶＩ−Ａによって表される：
【００８８】
【化１３】
2020189857.tif 000014
【００８９】
各ＤがＯＨであり、ＹがＮであり、ＸがＮＨであり、ｎが２であり、１つのＲ２がＯＣＨ２ＣＨ３であり、他のＲ２がＳ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７である式Ｉのいくつかの実施形態において、化合物は、式ＶＩＩ：
【００９０】
【化１４】
2020189857.tif 000015
式中、Ｒ６及びＲ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されている；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００９１】
各ＤがＨであり、ＹがＮであり、ＸがＮＨであり、ｎが２であり、１つのＲ２がＯＣＨ２ＣＨ３であり、他のＲ２がＳ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７である式Ｉのいくつかの実施形態において、化合物は、式ＶＩＩＩ：
【００９２】
【化１５】
2020189857.tif 000016
式中、Ｒ６及びＲ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アリール、アルキルヘテロアリール、またはヘテロアリールから独立して選択され、これらの任意のものが、カルボニル、アルキル、アミノ、アミド、アルコキシル、アルキルヒドロキシル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル、ハロゲン、ヒドロキシル、
チオール、シアノ、またはニトロによって任意選択的に置換されている；
を有し、またはその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである。
【００９３】
各ＤがＨであり、ＹがＣＯＨであり、ＸがＯであり、ｎが２であり、１つのＲ２がＯＣＨ２ＣＨ３であり、他のＲ２がＳ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７である式Ｉのいくつかの実施形態において、Ｒ６及びＲ７は、本明細書において定義されている通りである。
【００９４】
開示されている化合物の薬学的に許容可能な塩及びプロドラッグもまた、本明細書において開示する。薬学的に許容可能な塩は、化合物において見られる具体的な置換基に応じて、酸または塩基によって調製される、開示されている化合物の塩を含む。本明細書に開示されている化合物が安定な非毒性の酸または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である条件下では、塩としての化合物の投与が適切であり得る。薬学的に許容可能な塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、またはマグネシウム塩が挙げられる。生理学的に許容可能な酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、炭酸、硫酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マンデル酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、マロン酸、アスコルビン酸、α−ケトグルタル酸、α−糖リン酸、マレイン酸、トシル酸、及びメタンスルホン酸のような有機酸などが挙げられる。したがって、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、アセテート、プロピオネート、ベンゾエート、スクシネート、フマレート、マンデレート、オキサレート、シトレート、タルトレート、マロネート、アスコルベート、α−ケトグルタレート、α−糖ホスフェート、マレエート、トシレート、及びメシレート塩を本明細書において開示する。化合物の薬学的に許容可能な塩は、当該分野において周知の標準的な手順、例えば、十分に塩基性の化合物、例えばアミンを、好適な酸と反応させて、生理学的に許容可能なアニオンを付与することによって得られ得る。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム若しくはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩が作製されてもよい。
【００９５】
式Ｉ−ＶＩＩＩの化合物は、イカリチンから出発して調製され得る。例えば、イカリチンにおけるイソプレニル部位は、酸化されてアルデヒドとなり得、還元アミノ化されてアミン若しくはアミド、またはエステルとなり得、アミドに転換され得る。さらには、イソプレニル部位は、酸化されてカルボニルとなり得、置換反応に好適な脱離基に転換され得る。
【００９６】
使用の方法
本明細書に開示されているＩＣＡ、イカリチン、ＩＣＴ及びこれらの誘導体は、ＭＤＳＣの活性化を調節し、ＭＤＳＣによって作り出される腫瘍微環境を改変するのに用いられ得る。これらの化合物、及びこれらを含有する組成物は、ＭＤＳＣの機能の根本となるＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングのダウンレギュレーションを通して作用し得る。本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体によって標的されるシグナリング事象は、ＰＤＥ５の直接または間接的阻害及びＰＰ２Ａの活性化を含むことができ、ＭＤＳＣによって産生されるＮＯを含む炎症性メディエーターを制御する。本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体は、ＤＡＰ１２を活性化することにより、ＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭシグナリングを阻害し、また、ＭＤＳＣの数をＭＤＳＣの成熟を駆動することによって低減するのに用いられてもよい。本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びその誘導体による処理は、ＮＯの産生を媒介するＴＮＦαを低減することができる。本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びその誘導体はまた、ＭＤＳＣの増加、ならびに腫瘍の確立に利益になる抑制サイトカイン（例えば、ＴＧＦβ）、血管形成因子（ＶＥＧＦ）及び生存因子の産生のための確立された転写因子であるＳＴＡＴ３のレベルをダウンレギュレートすることもできる。これらの経路をトリガーするレセプター／リガンド相互作用は明らかではないが、ＴＬＲ４は、炎症及びがんをもたらすＭ
ＤＳＣの発生における主なトリガーとして好まれていた。ＴＬＲ４は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）ならびに内因性危険シグナル（ＤＡＭＰ）を含む、外因性だけでなく内因性の危険シグナルも認識することができる特殊なレセプターである。Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ＴＬＲ４を活性化する細胞によって放出される強力なＤＡＭＰである。ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＩＲＡＫ経路は、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ及びＳＴＡＴ３を含めた多数の下流エフェクター経路の活性化に重要であり得る。これらのマーカーのいずれかの欠失は、低減された腫瘍成長と関連し得る。これらのＤＡＭＰ／レセプター相互作用の最も重要な腫瘍促進性の１つは、ＭＤＳＣを腫瘍部位に補充する能力であることが示唆されている。そのため、無菌環境におけるがんに関して、ＤＡＭＰは、腫瘍の進行及び局所的な免疫抑制を促進する炎症反応を始動させる原因となり得る。
【００９７】
したがって、対象におけるがんを処置または防止する方法であって、対象に有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物を投与することを含む方法を本明細書において開示する。さらに、対象において前がん性症候群を処置する方法であって、対象に有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物を投与することを含む方法を本明細書において提供する。前がん性症候群の例として、限定されないが、骨髄異形成症候群、本態性血小板血症、骨髄線維症、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、真性多血症、腺腫様ポリープ、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非腺腫性結腸がん、粘膜下線維症、扁平苔癬、表皮水疱症、円板状エリテマトーデス、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内腫瘍形成、扁平上皮内病変、上皮過形成、腺管がん、及びパジェット病が挙げられる。また、腫瘍を標準のケア治療に敏感にさせる方法であって、対象に有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物を投与することを含む方法も提供する。
【００９８】
腫瘍細胞を殺傷する方法も本明細書において提供する。該方法は、腫瘍細胞を有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物と接触させることを含む。該方法は、第２化合物または組成物（例えば、抗がん剤）を投与することまたは有効量のイオン化放射線を対象に投与することをさらに含むことができる。
【００９９】
腫瘍微環境を変更する方法も本明細書において提供する。該方法は、腫瘍を有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物と接触させることを含む。微環境の変更は、対照と比較したときのＭＤＳＣの低減を特徴とすることができる。該方法は、第２化合物または組成物（例えば、抗がん剤）を投与することまたは有効量のイオン化放射線を対象に投与することをさらに含むことができる。
【０１００】
また、腫瘍の放射線治療方法であって、腫瘍を有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物と接触させること、及び腫瘍を有効量のイオン化放射線で照射することを含む方法も本明細書において提供する。対象において炎症を処置する方法も本明細書においてさらに提供し、該方法は、対象に有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物を投与することを含む。任意選択的に、該方法は、第２化合物または組成物（例えば、抗炎症剤）投与することをさらに含むことができる。
【０１０１】
開示されている主題は、腫瘍性障害または状態を有する対象を処置するための方法にも関する。一実施形態において、有効量の１つ以上の本明細書に開示されている化合物または組成物が、腫瘍性障害を有しその処置を必要とする対象に投与される。開示されている方法は、腫瘍性障害の処置を必要とするまたは必要とし得る対象を同定することを任意選択的に含むことができる。対象は、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジー、類人猿など）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、マウスまたは腫瘍性障害を有する他の動物であってよい。対象に投与用化合物を投与及び処方するための手段は、当該分野において公知であり、その例は、本明細書に記載されている。腫瘍性障害として、限定されないが、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸（結腸及び直腸を含む）、乳房、眼、胆嚢、腎臓、口腔、喉頭、食道、胃、睾丸、頸部、頭部、首部、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、陰門、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血液細胞（リンパ球及び他の免疫系細胞を含む）、ならびに脳の前がん性症候群（例えばＭＤＳ）、がん及び／または腫瘍が挙げられる。処置が企図される具体的ながんとして、Ｂ細胞がん、例えば白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性など）、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、ならびに多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１０２】
本明細書に開示されている方法によって処置され得るがんの他の例は、副腎皮質がん、副腎皮質がん、小脳星細胞腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、頸部がん、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、毛様細胞白血病、頭部及び首部のがん、肝細胞（肝臓）がん、下咽頭がん、視床下部及び視経路神経膠腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、島細胞がん（内分泌膵臓）、喉頭がん、唇及び口腔がん、肝臓がん、髄芽腫、メルケル細胞がん、潜在性菌状息肉腫を伴う頸部扁平上皮がん、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、骨盤及び尿管の移行細胞がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、膣がん、陰門がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０１０３】
開示されている主題はまた、それを必要とする患者において感染を処置し及び／または敗血症を防止するための方法にも関する。敗血症は、重篤な感染、最も一般的な細菌だけでなく、血液、尿路、肺、皮膚または他の組織における菌類、ウイルス、及び寄生生物に対する免疫系の応答によって引き起こされる。
【０１０４】
開示されている主題はまた、炎症性及び／または自己免疫障害または状態を有する対象を処置するための方法にも関する。ＭＤＳＣは、自然及び適応の両方の免疫反応を混乱させることによって免疫を抑制する。例えば、ＭＤＳＣは、アルギニンの取り込み、及びＴ細胞活性化に必須のアミノ酸であるアルギニンの周囲を枯渇させるアルギナーゼの高い細胞内レベルによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制することによってＴ細胞活性化に間接的に影響する。また、ＭＤＳＣ産生ＲＯＳ及び過酸化亜硝酸は、ＴＣＲのニトロ化を触媒し、これによりＴ細胞−ペプチド−ＭＨＣ相互作用を防止することによってＣＤ８＋Ｔ細胞を阻害する。ＭＤＳＣはまた、腫瘍免疫を腫瘍促進性のタイプ２表現型に歪曲することによって腫瘍免疫を混乱させる。ＭＤＳＣは、このことを、タイプ２サイトカインＩＬ−１０を産生することによって、また、タイプ１サイトカインＩＬ−１２のマクロファージ産生をダウンレギュレートすることによって行う。この効果は、ＩＬ−１０のＭＤＳＣ産生を増加させるマクロファージによって増幅される。ＭＤＳＣの蓄積及び活性化はまた、慢性炎症によっても同定される。例えば、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６ならびに生物活性脂質ＰＧＥ２は、ＭＤＳＣを誘発することが知られている。
【０１０５】
開示されている化合物によって処置され得る炎症性及び自己免疫障害または状態として、限定されないが、全身性エリテマトーデス、橋本病、関節リウマチ、痛風性関節炎、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、炎症性腸疾患、例えばクローン病、大腸炎、非定型大腸炎、薬剤性大腸炎；コラーゲン蓄積大腸炎、遠位大腸炎、空置性大腸炎：劇症大腸炎、不確定大腸炎、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、リンパ球性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、胃腸炎、ヒルシュスプルング病、炎症性消化器系疾患、クローン病、非慢性または慢性消化器系疾患、非慢性または慢性炎症性消化器系疾患；限局性腸炎及び潰瘍性大腸炎、自己免疫性溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血小板減少性紫斑病、インスリン依存性真性糖尿病、アレルギー；ぜんそく、アトピー性疾患；動脈硬化；心筋炎；心筋症；糸球体腎炎；再生不良性貧血；肺、前立腺、肝臓、卵巣、結腸、頸部、リンパ及び乳房組織の臓器移植及び多数の悪性腫瘍後の拒絶、乾癬、尋常性座瘡、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、サルコイドーシス、脈管炎、間質性膀胱炎、１型過敏症、全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、ならびに封入体筋炎が挙げられる。
【０１０６】
一実施形態において、有効量の１つ以上の本明細書に開示されている化合物または組成物が、炎症性または自己免疫障害を有しその処置を必要とする対象に投与される。開示されている方法は、炎症性または自己免疫障害の処置を必要とするまたは必要とし得る対象を同定することを任意選択的に含むことができる。対象は、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジー、類人猿など）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、マウスまたは炎症性障害を有する他の動物であってよい。対象に投与用化合物を投与及び処方するための手段は、当該分野において公知であり、その例は、本明細書に記載されている。
【０１０７】
神経変性疾患または障害を有する対象を処置する方法も開示する。本明細書において用いられているとき、「神経変性疾患」として、「タンパク質凝集障害」、「タンパク質形態障害」、または「タンパク質オパシー」とも称される、タンパク質凝集関連神経変性疾患が挙げられる。タンパク質凝集関連神経変性疾患として、有害な細胞内タンパク質凝集体（例えば、サイトゾル若しくは核における含有物）または細胞外タンパク質凝集体（例えば、血小板）の形成を特徴とする疾患または障害が挙げられる。「有害なタンパク質凝集」は、２以上のヘテロまたはホモマータンパク質またはペプチドの望ましくない害になる蓄積、オリゴマー化、フィブリル化または凝集体である。有害なタンパク質凝集体は、特徴が疾患を示す場合が多く疾患特異性タンパク質を含有している体、含有物または血小板に堆積され得る。例えば、スーパーオキシドディスムターゼ−１凝集体は、ＡＬＳに関連し、ポリＱ凝集体は、ハンチントン病に関連し、α−シヌクレイン含有レビー小体は、パーキンソン病に関連する。
【０１０８】
神経疾患はまた、疾患誘発実体に間接または直接関係する因子に起因して、免疫系が含む能力を超える疾患誘発因子のレベル、または、免疫機能が疾患進行に付随して低下するまたは抑制される状況を増加させることに関係する免疫不良にも関連する。ＭＤＳＣは、エフェクターＴ細胞活性を抑制することによりＴ細胞欠乏を引き起こし、これにより、免疫不良に関連する神経変性疾患を促進させる可能性がある。
【０１０９】
タンパク質凝集障害またはプロテオパシーの代表例として、タンパク質形態障害、α−シヌクレイン病、ポリグルタミン病、セルピノパシー、タウロパシーまたは他の関係する障害が挙げられる。神経疾患の他の例として、限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋緊張性異栄養症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮（ＤＲＰＬＡ）、フリードライヒ失調症、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、マシャドジョセフ病（ＭＪＤまたはＳＣＡ３）、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病としても知られている）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡｌ）遺伝子、脊髄小脳変性症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳変性症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳変性症７型（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）、慢性肝臓疾患、ニューロセルピン封入体を伴う家族性脳疾患（ＦＥＮＩＢ）、ピック病、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症症候群、白内障、セルピノパシー、溶血性貧血、嚢胞性線維症、ウィルソン病、神経線維腫症２型、脱髄性末梢神経障害、網膜色素変性、マルファン症候群、肺気腫、突発性肺線維症、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症／パーキンソニズム、ハレルフォルデンスパッツ疾患、ニーマンピック疾患Ｃ型、亜急性硬化性全脳炎、認知症を含めた認知障害（アルツハイマー病、局所貧血、心的外傷、血管問題若しくは脳卒中、ＨＩＶ疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、周生期低酸素症、他の全身状態若しくは薬物乱用に関連）；せん妄、健忘障害若しくは加齢に関係のある認知低下；急性ストレス障害、広場恐怖症、全般性不安障害、強迫性障害、パニック発作、パニック障害、心的外傷後ストレス障害、分離不安障害、社会恐怖症、特定恐怖症、物質誘発性不安障害、及び全身状態に起因する不安を含む不安障害；統合失調症（妄想型、解体型、緊張型若しくは未分化型）、統合失調症様障害、統合失調性障害、妄想性障害、簡単な精神病性障害、共有精神病性障害、全身状態に起因する精神病性障害、及び物質誘発性精神病性障害を含めた統合失調症若しくは精神病；物質関連障害及び常習行動（物質誘発性せん妄、持続性認知症、持続性健忘障害、精神病性障害若しくは不安障害；アルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、ニコチン、オピオイド、フェンシクリジン、鎮静剤、睡眠薬若しくは抗不安薬を含む物質からの我慢、依存若しくは離脱を含む）；無動症及び無動−硬直症候群（パーキンソン病、薬物誘発性パーキンソニズム、脳炎後のパーキンソニズム、進行性核上まひ、大脳皮質基底核変性症、パーキンソニズム−ＡＬＳ認知症症候群及び基底核石灰化を含む）を含めた運動障害、薬剤誘発性パーキンソニズム（例えば、神経遮断薬誘発性パーキンソニズム、神経遮断薬悪性症候群、神経遮断薬誘発性急性ジストニー、神経遮断薬誘発性急性アカンジア、神経遮断薬誘発性遅発性ジスキ���ジー及び薬剤誘発性体位性振戦）、ジルドラトゥレット症候群、てんかん、及びジスキネジー、例として、振戦（例えば静止時振戦、体位性振戦及び企図振戦）、舞踏病（例えば、シデナム舞踏病、ハンチントン病、良性遺伝性舞踏病、神経有棘赤血球増加症、症候性舞踏病、薬物誘発性舞踏病及び片側バリズム）、ミオクローヌス（全身性ミオクローヌス及び限局性ミオクローヌスを含む）、チック（単純チック、複合チック及び症候性チックを含む）、ならびにジストニー（全身性ジストニー、例えば特発性ジストニー、薬物誘発性ジストニー、症候性ジストニー及び発作性ジストニー、ならびに限局性ジストニー、例えば眼瞼痙攣、口下顎ジストニー、痙攣性発声障害、痙攣性斜頸、軸性ジストニー、ジストニア書痙及び片麻痺性ジストニーを含む）が挙げられる；肥満、神経性過食症及び強迫性接触障害；骨及び関節痛（変形性関節症）、反復運動痛、歯痛、がん性疼痛、筋膜痛（筋肉損傷、線維筋痛）、周術期痛（一般手術、婦人科）、慢性疼痛、神経障害性疼痛、外傷後疼痛、三叉神経痛、偏頭痛及び片頭痛を含む疼痛；過剰飲食に関連する肥満及び摂食障害ならびにこれに関係する合併症；注意欠陥過活動性障害；行為障害；抑鬱障害、双極性障害、全身状態に起因する気分障害、及び物質誘発性気分障害を含む気分障害；振戦を含む、筋痙直または衰弱に関連する筋肉の痙攣及び障害；尿失禁；筋萎縮性側索硬化症；眼損傷、眼の網膜症若しくは黄斑変性、聴力損失若しくは耳鳴りを含めた神経損傷；嘔吐、脳水腫、及びナルコレプシーを含む睡眠障害、ならびに運動ニューロン細胞のアポトーシスが挙げられる。神経障害性疼痛の例示的な例として、糖尿病性多発神経障害、エントラップメントニューロパシー、幻想痛、脳卒中後の視床痛、ヘルペス後神経痛、抜歯後の非定型顔面神経痛など、脊髄損傷、麻薬性鎮痛薬、例えばモルヒネに耐性の三叉神経痛及びがん性疼痛が挙げられる。神経障害性疼痛として、中枢または末梢のいずれかの神経障害によって引き起こされる疼痛が挙げられる。また、単発ニューロパシーまたは多発ニューロパシーのいずれかによって引き起こされる疼痛が挙げられる。
【０１１０】
さらに、対象における慢性疾患の貧血（がん関連貧血を含む）を処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示されている化合物または組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１１１】
開示されている化合物、及びこれを含有する組成物のインビボ適用は、当業者に現在またはこれまで公知である任意の好適な方法または技術によって達成され得る。例えば、開示されている化合物は、生理学的または薬学的に許容可能な形態に製剤化され、当該分野において公知の任意の好適な経路、例えば、経口、経鼻、直腸、局所、及び非経口投与経路によって投与され得る。本明細書において用いられているとき、用語「非経口」として、例えば注射による皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、及び胸骨内投与が挙げられる。開示されている化合物または組成物の投与は、当業者によって容易に決定され得るように、単回投与であっても、連続または異なる間隔であってもよい。
【０１１２】
本明細書に開示されている化合物及びこれを含む組成物はまた、リポソーム技術、除放性カプセル、埋め込みポンプ、及び生分解性容器を利用して投与され得る。これらの送達方法は、長期間にわたって均一な投薬量を有利に提供することができる。化合物はまた、塩誘導体形態または結晶形態で投与され得る。
【０１１３】
本明細書に開示されている化合物は、薬学的に許容可能な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化され得る。製剤化は、当業者に周知の容易に入手可能な多くのソースにおいて詳細に記載されている。例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）には、開示されている方法と併せて用いられ得る製剤が記載されている。一般に、本明細書に開示されている化合物は、有効量の該化合物が該化合物の有効な投与を容易にするために好適な担体と組み合わされるように製剤化され得る。用いられる組成物はまた、種々の形態であり得る。これらの例として、固体、半固体、及び液体の剤形、例えば、錠剤、丸薬、粉末、液体溶液または懸濁液、坐薬、注射可能及び注入可能溶液、ならびにスプレーが挙げられる。好ましい形態は、意図される投与形態及び治療用途に依る。組成物はまた、当業者に公知の従来の薬学的に許容可能な担体及び希釈剤も好ましくは含む。化合物と共に用いられる担体または希釈剤の例として、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルミナ、デンプン、生理食塩水、ならびに等価の担体及び希釈剤が挙げられる。所望の治療的処置のためのかかる剤形の投与を提供するために、本明細書に開示されている組成物は、有利には、担体または希釈剤を含む組成物全体の重量を基準にして対象化合物のうちの１つ以上の合計が約０．１％〜１００重量％の間であり得る。
【０１１４】
投与に好適な製剤として、例えば、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする酸化防止剤、バッファ、静菌薬、及び溶質を含有することができる水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁液が挙げられる。該製剤は、単回投与または複数回投与容器、例えば、封止されたアンプル及びバイアルにおいて付与され得、使用の前には、無菌液体担体、例えば、注射用水の状態のみを必要とする凍結乾燥された（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液及び懸濁液は、無菌粉末、顆粒、錠剤などから調製され得る。本明細書に開示されている組成物は、上記に特に言及した成分に加えて、対象となる製剤のタイプを考慮して有する当該分野において従来的な他の剤を含むことができることが理解されるべきである。
【０１１５】
本明細書に開示されている化合物及びこれを含む組成物は、細胞との直接接触を通してまたは担体手段を介してのいずれかで細胞に送達され得る。化合物及び組成物を細胞に送達するための担体手段は、当該分野において公知であり、例えば、リポソーム部位における組成物のカプセル化が挙げられる。本明細書に開示されている化合物及び組成物の細胞への送達の別の手段は、標的となるタンパク質または核酸に化合物を付着させて、標的細胞に送達することを含む。米国特許第６，９６０，６４８号ならびに米国特許出願公開第２００３００３２５９４号及び同第２００２０１２０１００号には、別の組成物にカップリングされ得、生体膜を横切って組成物が移行することを可能にするアミノ酸配列が開示されている。米国特許出願公開第２００２００３５２４３号にはまた、細胞膜を横切って生体部位を輸送し細胞内送達させるための組成物も記載されている。化合物はまた、ポリマー内に組み込まれ得、ポリマーの例として、頭蓋内腫瘍についてはポリ（Ｄ−Ｌラクチド−コ−グリコリド）ポリマー；２０：８０のモル比（ＧＬＩＡＤＥＬにおいて用いられるとき）のポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン：セバシン酸］；キチン；ならびにキトサンが挙げられる。
【０１１６】
腫瘍性障害の処置のために、本明細書に開示されている化合物は、処置を必要とする患者に、他の抗腫瘍若しくは抗がん物質、ならびに／または放射線及び／若しくは光力学治療、ならびに／または手術処置と組み合わせて投与されて、腫瘍を除去することができる。これらの他の物質または処置は、本明細書に開示されている化合物と同時にまたは異なるときに付与され得る。例えば、本明細書に開示されている化合物は、分裂阻害剤、例えばタキソール若しくはビンブラスチン、アルキル化剤、例えばシクロホスファミド若しくはイフォスファミド、代謝拮抗薬、例えば５−フルオロウラシル若しくはヒドロキシウレア、ＤＮＡインターカレータ、例えばアドリアマイシン若しくはブレオマイシン、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばエトポシド若しくはカンプトテシン、抗血管形成剤、例えばアンギオスタチン、抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン、ならびに／または他の抗がん薬若しくは抗体、例えば、それぞれ、ＧＬＥＥＶＥＣ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）など、あるいは免疫療法薬、例えばイピリムマブ及びボルテゾミブと併用され得る。他の態様において、開示されている化合物は、ＡＣＹ−１２１５、Ｔｕｂａｃｉｎ、ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡ、ＳＴ−３−０６、またはＳＴ−２−９２のような他のＨＤＡＣ阻害剤と同時投与される。
【０１１７】
ある特定の例において、本明細書に開示されている化合物及び組成物は、１つ以上の解剖学的部位、例えば望ましくない細胞成長（例えば腫瘍部位または良性皮膚成長、例えば、腫瘍または皮膚成長に注射または局所適用される）の部位において、薬学的に許容可能な担体、例えば不活性希釈剤と任意選択的に組み合わされて局所投与され得る。本明細書に開示されている化合物及び組成物は、薬学的に許容可能な担体、例えば、不活性希釈剤、または経口送達用の吸収可能な食用担体と任意選択的に組み合わされて全身投与、例えば静脈内または経口投与され得る。該化合物及び組成物は、硬若しくは軟シェルゼラチンカプセルに封入され得、錠剤内に圧縮され得、または患者の食事の食品と共に直接組み込まれ得る。経口治療投与では、活性化合物は、１つ以上の賦形剤と組み合わされて、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ、エアゾールスプレーなどの形態で用いられ得る。
【０１１８】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、バインダー、例えばトラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン若しくはゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；及び甘味剤、例えばスクロース、フルクトース、ラクトース若しくはアスパルテームを含有することもでき、または、香味剤、例えばペパーミント、ウインターグリーン油、若しくはチェリー香味料が添加され得る。単位剤形がカプセルであるとき、上記タイプの材料に加えて、液体担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得、または他の場合には、固体単位剤形の物理的形態を変更することができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック、または糖などでコーティングされ得る。シロップまたはエリキシルは、甘味剤として活性化合物、スクロースまたはフルクトース、保存料としてメチル及びプロピルパラベン、染料、ならびに香味料、例えばチェリーまたはオレンジフレーバーを含有することができる。当然ながら、あらゆる単位剤形の調製の際に用いられるあらゆる材料は、薬学的に許容可能であって、かつ、使用量で実質的に非毒性であるべきである。また、活性化合物は、除放性の調製物及びデバイス内に組み込まれ得る。
【０１１９】
薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを含む、本明細書に開示されている化合物及び組成物は、注入または注射によって静脈内、筋肉内、または腹腔内投与され得る。活性剤またはその塩の溶液は、水において調製され得、任意選択的に、非毒性の界面活性剤と混合され得る。ディスパージョンはまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びこれらの混合物において、また、油においても調製され得る。通常の保存及び使用状態下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存料を含有することができる。
【０１２０】
注射または注入に好適な薬学的剤形は、無菌の注射可能または注入可能な溶液またはディスパージョンの即時調製に適合し、任意選択的には、リポソームにカプセル化される、活性成分を含む無菌水性溶液若しくはディスパージョンまたは無菌粉末を含み得る。最終剤形は、無菌の流体であって、製造及び保存条件下に安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒または液体ディスパージョン媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、ディスパージョンの場合には所要の粒径の保持によって、または界面活性剤の使用によって維持され得る。任意選択的に、微生物の作用の防止は、種々の他の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、バッファまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含によってもたらされ得る。
【０１２１】
無菌の注射可能溶液は、適切な溶媒中に、本明細書に開示されている化合物及び／または剤を所要の量で、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と共に組み入れ、続いて、ろ過滅菌をすることによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、予め滅菌ろ過した溶液に存在する活性成分及び任意のさらなる所望の成分の粉末を生じさせる。
【０１２２】
局所投与では、本明細書に開示されている化合物及び剤は、液体または固体として適用され得る。しかし、皮膚科学的に許容可能な担体と組み合わされて、固体または液体であり得る組成物として皮膚に局所的に投与されることが一般に望ましい。本明細書に開示されている化合物及び剤は、対象の皮膚に局所適用されて、悪性または良性腫瘍のサイズを低減することができ（及び完全な除去を含むことができる）、または感染部位を処置することができる。本明細書に開示されている化合物及び剤は、腫瘍または感染部位に直接適用され得る。好ましくは、化合物及び剤は、腫瘍または感染部位に、製剤、例えば軟膏、クリーム、ローション、液剤、チンキ剤などで適用される。
【０１２３】
有用な固体担体として、微細に分割された固体、例えばタルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体担体として、化合物が任意選択的には非毒性界面活性剤の補助によって有効なレベルで溶解または分散され得る、水、アルコール若しくはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられる。アジュバント、例えば香料及びさらなる抗微生物剤は、所与の使用のために特性を最適化するように添加され得る。得られる液体組成物は、帯具及び他の包帯に含浸させるのに用いられる吸収パッドから適用され得、または例えばポンプ型若しくはエアゾール噴霧器を用いて患部に噴霧され得る。
【０１２４】
増粘剤、例えば合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性鉱物材料もまた、ユーザーの皮膚に直接適用するために展開可能なペースト、ジェル、軟膏、石鹸などを形成するのに液体担体と共に使用され得る。
【０１２５】
本明細書に開示されている化合物及び剤ならびに医薬組成物の有用な投薬量は、動物モデルにおいてインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の動物において有効な投薬量をヒトに外挿するための方法は、当該分野において公知である。
【０１２６】
また、本明細書に開示されている化合物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物も開示する。ある量の化合物を含む、経口、局所または非経口投与に適合される医薬組成物は、好ましい態様を構成する。患者、特にヒトに投与される用量は、致死毒性を有さず、好ましくは、副作用または病的状態が許容可能なレベルを超えないようにして、合理的な時間枠にわたって患者において治療応答を達成するのに十分であるべきである。当業者は、投薬量が、対象の状態（健康）、対象の体重、同時に行う処置の種類、もしあれば、処置の頻度、治療可能比、ならびに病態の重篤度及びステージを含めた種々の因子に依存することを認識する。
【０１２７】
また、本明細書に開示されている化合物を含む組成物を１つ以上の容器に含むキットも開示する。開示されているキットは、薬学的に許容可能な担体及び／または希釈剤を任意選択的に含むことができる。一実施形態において、キットは、本明細書に記載されているように、１つ以上の他の構成要素、付属物、またはアジュバントを含む。別の実施形態において、キットは、１つ以上の抗がん剤、例えば本明細書に記載されている抗がん剤を含む。一実施形態において、キットは、キットの化合物または組成物をどのように投与するかを記載している指示書または包装材料を含む。キットの容器は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などを有し、任意の好適なサイズ、形状、または構成を有し得る。一実施形態において、本明細書に開示されている化合物及び／または剤は、固体、例えば錠剤、丸薬、または粉末形態としてキットにおいて提供される。別の実施形態において、本明細書に開示されている化合物及び／または剤は、液体または溶液としてキットにおいて提供される。一実施形態において、キットは、本明細書に開示されている化合物及び／または剤を液体または溶液形態で含有するアンプルまたはシリンジを含む。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、開示されている主題による方法及び結果を示すのに記載される。これらの実施例は、本明細書に開示されている主題の全ての態様の包含を意図しておらず、むしろ、代表的な方法及び結果を示すことを意図している。これらの実施例は、当業者に明らかである、本発明の等価物及び変形例を排除することを意図していない。
【０１２９】
数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するよう努力しているが、いくらかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されていない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。反応条件の多数の変形例及び組み合わせ、例えば、成分濃度、温度、圧力、ならびに、記載のプロセスから得られる生成物の純度及び収率を最適化するのに用いられ得る他の反応範囲及び条件が存在する。かかるプロセス条件を最適化するのに、合理的かつ常套的な実験のみが必要とされる。
【０１３０】
実施例１：ＩＣＡ／ＩＣＴはＭＤＳＣの調節によりインビボ腫瘍成長を防止する
ＩＣＡ及びＩＣＴの最も顕著な特徴の１つは、インビボでの抗腫瘍形成能である。５匹のマウスからの直径１ｃｍの４Ｔ１腫瘍を感染後７日でＢＡＬＢ／ｃマウスに確立させた。マウスを１００ｍｇ／ｋｇのＩＣＡ、ＩＣＴまたはビヒクル（ｉ．ｐ．）で１週間に３回処置し、腫瘍サイズ（平均及びＳＤ）を２〜３日毎にモニタリングした。二重陽性のＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣの割合を１群あたり５匹のマウスの脾臓について求めた。細胞表現型をフローサイトメトリーによって評価した。ＩＣＡ及びＩＣＴは、ＭＤＳＣを循環させる割合をそれぞれ５０．２８％〜３３．３５％及び２６．９７％だけ有意にダウンレギュレートすることができることが分かる（図１）。ＩＣＡ及びＩＣＴは、循環するＭＤＳＣの蓄積及び活性化を減少させることによってインビボ腫瘍成長を阻害することができることが分かる（Ｚｈｏｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１１（７）：８９０−８；Ｗｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１２（１）：７４−９）。
ＭＤＳＣの分化におけるＩＣＡまたはＩＣＴ。
【０１３１】
さらに、これらの化合物の毒性を腫瘍細胞及び免疫細胞において試験したところ、ＩＣＡ及びＩＣＴが造血または骨髄由来の細胞、例えばＰＢＭＣ、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）、またはＵ９３７細胞（ＩＣ５０＞１００μＭ）に毒性でなく、造血に影響しないことが分かる（図２）。具体的には、健常な３ドナーからのＢＭＮＣを異なる濃度のＩＣＡまたはＩＣＴで４８時間処理し、その後、サイトカインを含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４４３４完全培地を用いてコロニー形成をアセスメントした。混合物を３５ｍｍの培養皿（１×１０５細胞／各皿）に置き、５％ＣＯ２中３７℃で約７〜１４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭのコロニーを同定し、倒立光学顕微鏡を用いて計数した。この観察により、腫瘍微環境におけるＭＤＳＣのダウンレギュレーションと、本明細書に開示されているＩＣＡ、ＩＣＴ及び誘導体による処理との間の強い相関が実証される。しかし、これらの細胞を脾臓から得たが、ＩＣＡ／ＩＣＴは、腫瘍組織から単離したＭＤＳＣに同様の影響を及ぼすことも分かった。ここでは、Ｇｒ１＋細胞を４Ｔ１腫瘍担持マウスの腫瘍から得た。ＭＤＳＣを２０μＭのＩＣＡ、ＩＣＴ、またはＤＭＳＯで４８時間処理した。バーは、フローサイトメトリーによって測定したＤＭＳＯ処理細胞と比較したＭＤＳＣの相対割合を表す（図３Ａ）。腫瘍組織からの精製ＭＤＳＣのＲＯＳ（図３Ｂ）及びＮＯ（図３Ｃ）活性の産生も測定した。
【０１３２】
実施例２：ＩＣＡ及びＩＣＴは、ヒトＰＢＭＣにおいてＳＩＧＬＥＣ３／ＣＤ３３発現を阻害することができる
ＳＩＧＬＥＣ３は、ＡＭＬを有する患者から単離されるＭＤＳＣにおいて高度に発現される（図６ａ）。ＩＣＡ及びＩＣＴは、ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の発現レベルでＳＩＧＬＥＣ３をダウンレギュレートすることが可能であることが分かった（図４及び５）（Ｚｈｏｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１１（７）：８９０−８）。具体的には、健常なＰＢＭＣを１μＭのＤＭＳＯ、ＩＣＡまたはＩＣＴで４８時間培養し、ＳＩＧＬＥＣ３の発現をＱ−ＰＣＲによって測定し、ΔΔＣｔ法によって分析した。また、健常なドナーからのＰＢＭＣをＤＭＳＯまたはＩＣＴで４８時間処理し、ＳＩＧＬＥＣ３−ＰＥ及びＳＩＧＬＥＣ５／１４−ＡＰＣ抗体によって細胞外染色した（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。Ｓ１００Ａ９は、ＳＩＧＬＥＣ３によってライゲーションすることができ、ＭＤＳＣ活性化の調節を標的とする特定のストラテジーの同定に関係し得る未特性化経路の存在を表している。
【０１３３】
実施例３：ＳＩＧＬＥＣ３の内因性リガンドとしてのＳ１００Ａ９の同定
ＰＤＥ５、及びＳ１００Ａ９経路とのその相互作用は、腫瘍におけるＭＤＳＣの蓄積及び活性化に必須であり得るが、その具体的な上流経路はあまり理解されていない。白血病を有する患者のＭＤＳＣにおけるＳＩＧＬＥＣ３の顕著な増加が実証されている（図１０ａ）（Ｗｅｉ  Ｓら、ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ．２００９；１１４（２２）：５９７）。ＳＩＧＬＥＣ３は、ＭＤＳＣ用マーカーであり、ＩＴＩＭモチーフを通して抑制シグナリングを媒介し得るが、その関係するリガンドまたは
以下の経路は、依然として未知である。そのため、ＳＩＧＬＥＣ３の細胞外ドメインのキメラをヒトＩｇＧ−Ｆｃによって作り出し、該キメラを用いて、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）に転換する前悪性障害）を有する患者の骨髄（ＢＭ）から単離したＭＤＳＣの溶解物からのリガンドを免疫沈降させ、質量分析によって分析した。最も顕著なバンドは１０及び１５ｋＤａの間にあり、また、質量分析後の最も顕著なヒットの１つはＳ１００Ａ９であった。ＳＩＮＧＬＥ３とＳ１−Ａ９との間の相関は確立されているため、インビトロでの直接結合アッセイを実施して、単離された系におけるこれらの２つの成分間での親和性を裏付けた。図７において分かるように、ＳＩＧＬＥＣ３キメラが直接結合したＳ１００Ａ９は、トランスフェクトＡＤ２９３細胞において発現した（同様の結果が、ＳＪＣＲＨ３０横紋筋肉腫細胞、ＳＩＧＬＥＣ３の発現を欠失する細胞株において得られた）。さらに、免疫沈降Ｓ１００Ａ９は、ＳＩＧＬＥＣ３に直接特異性を示し、また、このレセプターを発現する細胞、例えばＭＤＳ患者からのＭＤＳＣは、ＳＩＧＬＥＣ３との共局在によって実証されているように、組み換えヒト（ｒｈ）Ｓ１００Ａ９に結合することができる（図８及び図６ｂ）。興味深いことに、Ｓ１００Ａ９と通常対をなすＳ１００Ａ８は、個々にではなく、ヘテロ多量体の部分としてのみ生じ、Ｓ１００Ａ９が、ＳＩＧＬＥＣ３の実際のリガンドであり得ることを示している。
【０１３４】
実施例４：Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３は、ＭＤＳＣにおけるＰＤＥ５及びタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の両方の活性に関係し得、ＩＣＡ及びＩＣＴによって調節され得る
ＩＣＡ／ＩＣＴは、処理後のＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫの脱リン酸化と相関する（Ｚｈｏｕ  Ｊら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；１１（７）：８９０−８）、インビトロでのＰＰ２Ａのホスファターゼ活性をアップレギュレートすることができる（図９）。これら２つのタンパク質の直接的な会合または結合を、ＰＰ１について最近実証されている（Ｍｕｒｔｈｙ  ＫＳ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８；１５３（６）：１２１４−２４）ように試験した。予想外にも、ＰＰ２Ａは、ＰＰ２Ａによるウエスタンブロッティングに続いてＰＤＥ５の共免疫沈降によって実証されるように、ＰＤＥ５に構造的に結合していることが分かった（図１０）。Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３及びＰＤＥ５の活性化を相関する関係が存在するかを理解するために、ＳＪＣＲＨ３０細胞を、ベクター、Ｓ１００Ａ９またはＳＩＧＬＥＣ３のいずれかによってトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後７２時間溶解させ、ＰＤＥ５またはそのリン酸化されたカウンターパートのいずれかについてのウエスタンブロットによってアセスメントした。ＳＩＧＬＥＣ３の過剰発現は、ＰＤＥ５の活性化をアップレギュレートしたが（リン−Ｓｅｒ９２に特異的な抗体を用いるウエスタンブロットによって検出され得る、ＰＤＥ５におけるＳｅｒ９２でのリン酸化の向上によって実証される、増加したＰＤＥ５活性化）、その発現は、依然として変化しなかった（図１１）。これは、本明細書に開示されているＩＣＡ、ＩＣＴ、及びこれらの誘導体によって具体的に標的とされ得る新規のＭＤＳＣ活性化経路を表す。
【０１３５】
実施例５：ＰＤＥ５へのＩＣＡ及びＩＣＴの結合形態のモデリング
ＩＣＡ及びＩＣＴは、他のＰＤＥ５阻害剤に同様の影響を及ぼし得るが、ＰＤＥ５分子における阻害箇所に結合することが可能であるかは実証されていない。イカリシドＩＩであるＩＣＡの代謝産物は、共結晶構造を有し、モデル構築体を用いて、この部位についてのＩＣＡ及びＩＣＴ化合物の結合親和性を実証した。
【０１３６】
ここで用いた結晶構造は、２Ｈ４４であり、タンパク質データバンクから得た。これは、１．０Åの分解能でイカリシドＩＩによって複合体化されたＰＤＥ５Ａ１を特徴とする（Ｗａｎｇ  Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；２８１（３０）：２１４６９−７９）。小さな分子構造をＰｕｂＣｈｅｍから得、該構造は：イカリイン（ＣＩＤ：５３１８９９７）、イカリチン（ＣＩＤ：５３１８９８０）、及びイカリシドＩＩ（ＣＩＤ：６８５２２１４）を含み；ＩＣＴ（３，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシ−８−（３−ヒドロキシ−３メチルブチル）−フラボン）は、イカリチン構造体から生じた。
【０１３７】
シュレディンガーのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）をドッキング研究のために用いた。ＬｉｇＰｒｅｐ２．４（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を、５．０〜９．０の範囲のｐＨ値についてＥｐｉｋを用いての互換異性体及び代替のイオン化状態の生成を含む構造ライブラリの作製のために、また、必要に応じて立体異性体の生成のために用いた。シュレディンガーのＧＬＩＤＥ５．６（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を、２Ｈ４４についてレセプターグリッドを生成するために、また、基準精度（ＳＰ）、続いて超高精度（ＸＰ）を用いたドッキングのために用いた。Ｓｉｔｅｍａｐ２．４（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を、疎水性領域、水素結合供与領域、及び水素結合受容領域を含む２Ｈ４４の結合部位の化学的性質を決定するために用いた。２Ｈ４４を調製して、欠落原子に起因する側鎖を補正し、タンパク質内の水素結合を最適化し、水分子を除去し、ＯＰＬＳ−２００５力場を用いて０．３０Å以下のＲＭＳＤに対して拘束エネルギー最小化を実施するタンパク質調製ワークフローを用いた研究をモデル化した。
【０１３８】
２Ｈ４４結晶構造体を、デフォルト値を用いて上記のように調製した。レセプターグリッドを、共結晶化リガンド、イカリシドＩＩを用いて生成し、グリッド中心を決定した。他の設定を、最大に設定したグリッドサイズを除いてデフォルト値にした。イカリシドＩＩを２Ｈ４４結晶構造体から抽出し、ＬｉｇＰｒｅｐを用いることによって調製した。合計３２の構造体を得、モデルが２Ｈ４４においてイカリシドＩＩの共結晶化様態を再生させる可能性を検証するドッキングシミュレーションのための試験ライブラリを形成した（図１２Ａ）。ＧＬＩＤＥをデフォルト設定で用い、基準精度（ＳＰ）ドッキング、続いてＰＤＥ５Ａ１に対するイカリシドＩＩの超高精度再調整（ＸＰ）を実行した。最低のエネルギー様態は、−１７．２２ｋｃａｌ／ｍｏｌのＧｓｃｏｒｅを有し、イカリシドＩＩの共結晶位置（０．９５５８のＲＭＳ、図１２Ａ）と重なる。水素結合は、Ｓ６６８、Ｈ６１３、及びＩ６６５で同定され、これらの全てが、元々の結晶学的様態に存在する。これらの結果は、モデルがイカリシドＩＩに関する分子の結合様態を予測するのに好適であるという確実性を提供する。
【０１３９】
ＩＣＴを、先の構造（５３１８９８０ＰｕｂＣｈｅｍ構造）を修飾することにより生じさせた。ＩＣＴを調製し、上記のようにＬｉｇＰｒｅｐを用いてイカリシドＩＩとドッキングした。対照ドッキングとして、ＸＰ再調整によるＳＰドッキングを、イカリシドＩＩドッキングにおいてＰＤＥ５Ａ１で先に生成したリガンドライブラリ及びレセプターグリッドとしてのＩＣＴのＬｉｇＰｒｅｐ結果（１構造体のみ）を用いて実行した。−１３．０１３Ｋｃａｌ／ｍｏｌのｇｌｉｄｅスコア（Ｇｓｃｏｒｅ）を有する、単一の様態をＸＰドッキングから得た。この様態は、３つの水素結合相互作用Ｓ６６３、Ｈ６１３、Ｄ７６４（点線）、及びＦ８２０と重なるポテンシャルｐｉを提示する（平行な点線）（図１２Ｂ）。この結果は、リガンドの最適化を実行するのに必要とされる情報を提供する。予測されるコンピュータでの相互作用の検証をサポートするために、ＩＣＡ及びＩＣＴの両方が、環式ヌクレオチドホスホジエステラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）によってＰＤＥ５のホスホジエステラーゼ活性を遮断することができることをインビトロで実証した。
【０１４０】
実施例６：ＳＩＧＬＥＣ３／ＣＤ３３レセプターへのＳ１００Ａ９結合を介した炎症性ＭＤＳＣの活性化
Ｓ１００Ａ９によるＳＩＧＬＥＣ３のライゲーションに続く下流シグナリング事象は、健常なドナーの骨髄から単離したＩＭＣ（ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−Ｌｉｎ−）（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入）を用いてアセスメントすることができる。組み換えヒトＳ１００Ａ９−ＤＤＫを用いて、ＰＢＭＣまたはＩＭＣのいずれかを１５、３０、４５または６０分間刺激することができ、その後、サイトスピンし、蛍光コンジュゲート抗ＭＹＣ及び抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体によって染色することができる。次いで、２つのタンパク質の共局在、及び結合後の複合体の内部箇所を観察することができる。ＳＩＧＬＥＣ３をアデノウイルスまたはレンチウイルス（ＬＶ）ベクターにおいて調製することができ、ｒｈＳ１００Ａ９−ＤＤＫによる２４、４８、または７２時間の処理の前に、ＩＭＣまたはＳＪＣＲＨ３０のいずれかの細胞において（図７及び図８にてなされるように）過剰発現することができる。このストラテジーは、Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３を通してのシグナリングがＩＭＣを活性化し、ＭＤＳＣへの分化を誘発することができるかを確認するのに用いることができる。Ｓ１００Ａ９をＳＩＧＬＥＣ３と嵌め合わせた後、培養上澄みを収集し、抑制可溶性因子：ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＲＯＳ及びＮＯの産生について分析することができる。ＳＩＧＬＥＣ３、ＰＤＥ５、ＰＫＣ及びＰＰ２Ａの発現は、ＱＰＣＲによって試験することができ、活性化は、リン酸化状態または活性化のいずれかによってウエスタンブロット分析により測定することができる。Ｓ１００Ａ９のカルシウム結合活性がレセプターへの結合親和性に影響を及ぼすかをアセスメントするために、また、糖ライゲーションの役割を理解するために、キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグリコシダーゼ（Ｓ１００Ａ９の糖部位を除去する）を添加することができる。Ｓ１００Ａ９によるライゲーションの際、ＩＭＣは活性化してＭＤＳＣとして振る舞い、Ｓ１００９／ＳＩＧＬＥＣ３ライゲーションがＭＤＳＣの活性化に重要であるという明らかな証拠を提供することができる。同様のストラテジーに続いて、ＳＩＧＬＥＣ３を発現するＩＭＣをＩＣＡ／ＩＣＴで処理することができ、その後、Ｓ１００Ａ９によってライゲーションして、この経路をＩＣＡ／ＩＣＴによって調節することができるかを調査する。これらの化合物による処理の際、Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３媒介シグナリングを遮断することができ、これにより、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、低減されたＩＭＣ−ＭＤＳＣ転移、減少された抑制サイトカイン産生及びＮＯ／ＲＯＳ産生をもたらす。
【０１４１】
ＭＤＳＣのＳＩＧＬＥＣ３シグナリングにおける細胞内ＩＴＩＭドメインの責任をアセスメントするために、ＩＴＩＭチロシン部位のいくつかのＣＤ３３ドミナントネガティブ変異体（ＣＤ３３Ｙ３４０Ｆ、ＣＤ３３Ｙ３５８Ｆ及びＣＤ３３Ｙ３４０／Ｙ３５８Ｆ）を作製することができる（フェニルアラニンによるまたはアラニンによるチロシン置換）。これらの変異体及び野生型（ｗｔ）ＳＩＧＬＥＣ３をＡＤ２９３またはＳＪＣＲＨ３０細胞にトランスフェクトすることができる。これらの横紋筋肉腫細胞は、内因性ＳＩＧＬＥＣ３及びＳ１００Ａ９を発現しない。３つの主な下流シグナリング機能は、ｒｈＳ１００Ａ９によるライゲーション後、これらのＳＩＧＬＥＣ３発現細胞においてアセスメントすることができる。まず、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性化を、抗リン−ＭＡＰＫによるウエスタンブロット分析を用いてアセスメントすることができる。ＭＡＰＫは、ＩＴＩＭシグナリングの下流標的であり得る（Ｙｏｄｅｒ  ＪＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１；９８（１２）：６７７１−６）。ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングの特異性は、アイソタイプ抗体または非関連リガンド、例えばＳ１００Ａ７を用いて制御することができる。対照として、培地のみで培養し、対照ベクターでトランスフェクトし、ＳＩＧＬＥＣをトランスフェクトすることなく非関連リガンドでライゲーションしたＡＤ２９３またはＳＪＣＲＨ３０細胞を含むこともできる。ｗｔ−ＳＩＧＬＥＣ３トランスフェクト細胞におけるＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングは、ＭＡＰＫのリン酸化レベルを低減するＳＨＰ１／２を補充することができる。しかし、ＳＩＧＬＥＣ３変異体群において、架橋ＳＩＧＬＥＣ３は、ＳＨＰ１／２ホスファターゼの補充に失敗して、結果として、ＭＡＰＫのリン酸化レベルの増加または持続のいずれかをもたらす可能性がある。第２に、ＳＩＧＬＥＣ３トランスフェクタントにおけるＩＴＩＭシグナリングは、Ｓ１００Ａ９によるライゲーションに続いて直接測定することができる。ＭＤＳＣは、ＳＩＧＬＥＣ関連ＩＴＩＭを使用して、抑制機能を媒介する。ＳＩＧＬＥＣ３をＳ１００Ａ９と嵌め合わせた後、ＩＴＩＭにおけるチロシンがリン酸化状態となり、チロシンホスファターゼＳＨＰ１／ＳＨＰ２を補充及び活性化することができる。そのため、ＩＴＩＭモチーフのリン酸化または細胞質チロシンホスファターゼの補充は、抗ＣＤ３３ｍＡｂを用いたＳＩＧＬＥＣ３の免疫沈降、続いて抗ホスホチロシンまたは抗ホスファターゼ抗体それぞれによるウエスタンブロット分析によって測定することができる。第３に、ＳＩＧＬＥＣ３トランスフェクタントを４８〜７２時間培養することができ、上澄みを、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０及びＶＥＧＦの産生ならびにＲＯＳ及びＮＯの産生についてアセスメントすることができる。ＳＩＧＬＥＣ３の特異的架橋により、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０及びＶＥＧＦの産生の増加をもたらすことができる。これらの細胞において過剰発現したｗｔ−ＳＩＧＬＥＣ３はまた、これらのサイトカインを増加させることもできる。対照的に、ＳＩＧＬＥＣ３変異体−トランスフェクト細胞は、これらの細胞におけるＩＴＩＭシグナリングの欠失に起因する抑���サイトカイン産生の減少も表示することができる。
【０１４２】
初代細胞における結果を確認するために、健常なドナーからのヒトＩＭＣにおけるＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングの分子機構を調査することができる。このため、全てのＳＩＧＬＥＣ３構築物をレンチウイルスベクター（ＬＶ）に変換して、ＩＭＣにおいて発現することができる。ＬＶ−ＳＩＧＬＥＣ３構築物をＩＭＣに導入することができ、Ｓ１００Ａ９との架橋後、１）サイトカイン、ＲＯＳ及びＮＯの産生のアセスメント、２）骨髄細胞の成熟を遮断し、ＭＤＳＣ蓄積を誘発する、ＩＭＣにおけるｗｔ−ＳＩＧＬＥＣ３の長期（１４日間）過剰発現のモニタリング；に用いることができる。
【０１４３】
ＩＴＩＭのリン酸化を測定して、トランスフェクタントにおけるＳＩＧＬＥＣ３シグナリングに対するＩＣＡ／ＩＣＴの影響を決定することができる。種々の濃度及び時間で細胞をＩＣＡ／ＩＣＴによって処理した後、ＩＴＩＭのリン酸化及びホスファターゼの補充を、ＳＩＧＬＥＣ３レセプターの免疫沈降、続いて抗ホスホチロシンまたは抗ホスファターゼ抗体それぞれを用いるウエスタンブロット分析によって測定することができる。このストラテジーは、ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングがＩＣＡ／ＩＣＴ機能に関与しているか否かを明らかにすることができ、かつ／またはＩＣＡ／ＩＣＴがレセプターレベルでＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリング経路を破壊し得るかを確認することができる。
【０１４４】
ＳＩＧＬＥＣ３は、腫瘍組織からのＭＤＳＣにおいて過剰発現するため（図６ａ）、ＳＩＧＬＥＣ３を用いて、ＩＣＡ／ＩＣＴによる処理によりまたは該処理によらずにＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３によって媒介されるシグナリング事象を試験することができる。ＳＩＧＬＥＣ３は、がんから単離したＭＤＳＣにおけるＳ１００Ａ９及びＳＩＧＬＥＣ３の発現レベル；抑制サイトカインの産生（例えば、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０など）；該ＭＤＳＣにおけるＲＯＳ及びＮＯの産生；ならびにＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングの下流分子の変化；を調査するのに用いることができる。先に観察したＩＣＡ／ＩＣＴの効果に基づいて、ＭＤＳＣにおけるＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３及びＴＬＲ４の活性化を、ＳＩＧＬＥＣ３／Ｓ１００Ａ９抑制経路の成分としての役割に起因して試験することができる。
【０１４５】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、インビボでＴＬＲ４を活性化することができることが報告されている（Ｅｈｒｃｈｅｎ  ＪＭら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２００９；８６（３）：５５７−６６）。このように、本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体は、ＴＬＲ４シグナリングを阻害することができ、ＴＬＲ４及びＳＩＧＬＥＣ３の両方の経路に直接または間接的に影響してよい。このことは、ＩＣＡ／ＩＣＴによって標的とされる特異的な経路を同定すること、ならびにＳＩＧＬＥＣ３及びＴＬＲ４経路が炎症の際にＭＤＳＣ活性化をどのように画策するかの知識を取得することを助けることができる。いくつかのアプローチを用いて、ＳＩＧＬＥＣ３及びＴＬＲ４が、ＮＦ−κＢ及びＭｙＤ８８欠失マウスを含めて、これらの剤による処理への応答においてどのようにクロストークしてよいかを調査することができる。ＲＮＡｉストラテジーを用いてこの問題に対処することができる。ｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ｓｈＲＮＡ）を含有するＬＶベクターは、ＩＣＡ／ＩＣＴ処理の後の下流事象を調査し、両方の経路に対するこれらの化合物の影響を比較するために、特異的なシグナリングタンパク質をノックダウンするのに用いることができる。Ｓ１００Ａ９、ＳＩＧＬＥＣ３、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８に特異的なｓｈＲＮＡは、ＬＶベクター内に設計及び構成することができる。このＬＶ−ｓｈＲＮＡは、発現がＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３またはＴＬＲ４シグナリングに直接関係するかを決定するためのこれらの遺伝子の強制的なサイレンシングに用いることができる。ウイルスベクター／モック−感染細胞、ＧＦＰ含有ベクターまたは非標的ｓｈＲＮＡのトランスフェクションを対照として用いることができる。トランスフェクション速度及びタンパク質特異的発現を、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、及びＱ−ＰＣＲによって検証することができる。上記ｓｈＲＮＡを用いるＳＩＧＬＥＣ３またはＴＬＲ４経路のいずれかのタンパク質特異的ノックダウンの後、細胞を、ＳＬＧＬＥＣシグナリングのためのｒｈＳ１００Ａ９、またはＴＬＲ４シグナリングのためのＬＰＳのいずれかによって、下流シグナル事象の測定の前に処理することができる。Ｓ１００Ａ７を非特異的な対照として用いることができる。特異的なｓｈＲＮＡは、Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングまたはＴＬＲシグナリングのいずれかを崩壊し得る。この点において、これらのＴＬＲ４またはＳＩＧＬＥＣ３欠失細胞を用いて、下流のＭＤＳＣ活性の測定により、ＩＣＴ／ＩＣＡ処理に直接または間接的に応答することができるかを決定することができる。これは、ＭＤＳＣ活性化だけでなくＩＣＡ／ＩＣＴ応答にも関与するシグナル変換経路として価値のある見識を提供することができる。ＴＬＲ４活性を、リン−ＩκＢαまたはＮＦ−κＢ核転座のレベルを測定することによってアセスメントすることができる。
【０１４６】
実施例７：ＩＣＡ及びＩＣＴによるプロ炎症性メディエーターの不活化におけるＰＰ２ＡによるＰＤＥ５阻害の役割
ＲＮＳは、ＭＤＳＣにおける強力な炎症性メディエーターであり、ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ５）によって誘発される酵素ｉＮＯＳの制御下にあることが知られている。このように、活性化されたＰＤＥ５は、ＭＤＳＣによるＮＯのロバスト産生を誘発し、免疫抑制を媒介することができる。ＰＤＥ５は、Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３ライゲーションによって誘発され得る。例えばシルデナフィルによる、ＭＤＳＣにおけるＰＤＥ５阻害は、マウスにおいて腫瘍成長を防止するのに効果的であり得；作用は、インビボでのＭＤＳＣの抑制に対してトレースすることができる（Ｓｅｒａｆｉｎｉ  Ｐら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６；２０３（１２）：２６９１−７０２）。そのため、ｉＮＯＳの上流にあるＰＤＥ５は、ＭＤＳＣの活性化及び機能のための因子であり得る。
【０１４７】
本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体は、ＭＤＳＣ及びｉＮＯＳを低減するシルデナフィルと同じ効果を有することができ、ＩＣＡ／ＩＣＴは、ＰＤＥ５阻害を介して作動して、この成果を達成することができる。実際、ＩＣＡ及びＩＣＴは、ＰＤＥ５に結合することができる（図１２）。ＩＣＡ／ＩＣＴは、腫瘍担持マウスの組織から単離されたＭＤＳＣによってＮＯ及びＲＯＳの産生を阻害することができ、腫瘍部位においてＭＤＳＣの蓄積を阻害することができる（図３）。そのため、本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体は、ＭＤＳＣにおけるＰＤＥ５活性の調節を通して作用し得る。
【０１４８】
ＭＤＳＣを上記のように単離して、ＰＤＥ５またはＰＤＥ４（ＰＤＥ５阻害剤によって影響されないホスホジエステラーゼ）に特異的なＬＶ−ｓｈＲＮＡによって処理して、ノックダウンＰＤＥ５が単独でＭＤＳＣの機能的活性化を低減するのに十分であるか否かを確認することができる。次いで、ＬＶ−ＰＤＥ５をＭＤＳＣ、ＩＭＣまたはＳＪＣＲＨ３０において過剰発現させ、続いて、ＩＣＡ／ＩＣＴ処理をすることができる。全ＭＤＳＣの生物学的機能を評価して、ＩＣＡ／ＩＣＴがＰＤＥ５とどのように相互作用するかに対処することができる。トランスフェクトされた細胞を異なる用量（１、５、１０及び２０μＭ）で異なる時間（２４、４８または７２時間）にわたってＩＣＡ／ＩＣＴで処理することができる。次いで、該細胞を、ａ）ＥＬＩＳＡ及びＱ−ＰＣＲにより、ｉＮＯＳ、ＴＧＦβ及びＩＬ−１０の発現；ｂ）ウエスタンブロットにより、ＩベータＢα、ｐ３８、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３を含む炎症マーカーのリン酸化状態；ｃ）ＩＭＣ成熟状態（ＰＤＥ５の過剰発現は、ＩＭＣ成熟を遮断し、ＭＤＳＣの増加を促進することができる）；ならびにｄ）（抗ＣＤ３及びＣＤ２８またはＰＨＡ活性化（１μｇ／ｍｌ）によって）刺激された自家移植ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞と共に種々の比で処理ＭＤＳＣを共培養することにより、Ｔ細胞抑制；について分析することができる。低減されたＴ細胞増殖は、ＭＤＳＣ活性化の１つの指標であり、ＩＣＡ／ＩＣＴは、ＰＤＥ５活性を遮断することによってＭＤＳＣの阻害に起因してＴ細胞増殖を改善することができた。そのため、ノックダウンＰＤＥ５は、ＩＣＡ／ＩＣＴの効果を複製することができる一方で、ＰＤＥ５の過剰発現は、ＭＤＳＣに対するＰＤＥ５及びＩＣＡ／ＩＣＴの両方の効果を立証することができる。
【０１４９】
ＳＩＧＬＥＣ３をＰＤＥ５に間接的に関連させることができるが、これらの関係は、直接研究されてはいない。Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングに対するＰＤＥ５の応答は、増加された活性化であり得るという証拠がある（図１１）。ＰＤＥ５は、ＩＣＡ／ＩＣＴ処理後に減少する会合であるＰＤＥ５のセリン９２を脱リン酸化することができるレギュレーター、ホスファターゼ−２Ａ（ＰＰ２Ａ）と構造的に会合することができることも示されている（図１０）。ＩＣＡ／ＩＣＴは、ＰＰ２Ａ酵素活性を有意にアップレギュレートすることができ（図９）、ＰＤＥ５の直接阻害の他に、ＰＰ２Ａを代替的に刺激してＰＤＥ５を抑制することができることを示している。ＰＰ２Ａは、腫瘍サプレッサー及び細胞成長の阻害剤として最もよく知られており、活性化するとき、標的細胞にアポトーシスを経るようにさせることができる。このホスファターゼは、がん患者においてダウンレギュレートされるため、その発現及び活性がＭＤＳＣにおいて低減され得、抑制機構の一部となり得ることも確立されている。ＰＰ２Ａ（ＰＰ２Ａｃａ）の触媒サブユニットにおけるｔｙｒ−３０７のリン酸化は、酵素活性の不活化に関与し得る。そのため、ＭＤＳＣからのＰＰ２Ａのｔｙｒ−３０７のリン酸化状態を、Ｓ１００Ａ９によるライゲーション後にウエスタンブロットによってアセスメントし、ＰＰ２Ａ活性がＭＤＳＣにおいて低減するかを調査することができる。その後、ＭＤＳＣにおいて減少したＰＰ２Ａ活性をＩＣＡ／ＩＣＴ処理によって取り返すことができるかを調査することができる。抗ＳＩＧＬＥＣ３による共免疫沈降を実施して、ＰＰ２Ａ、ＰＤＥ５及びＳＩＧＬＥＣ３が同じ複合体に共存するかを確認することができる。Ｓｅｒ９２のリン酸化を、ＳＩＧＬＥＣ３免疫沈降、またはＭＤＳＣから調製された細胞溶解物全体においてウエスタンブロットによってモニタリングすることができる。ＭＤＳＣの生存をモニタリングして、アポトーシスまたはＧ１アレストがＩＣＡ／ＩＣＴによる処理後に増加するかを調査することができる。増加したＰＰ２Ａ活性は、ＩＣＡ／ＩＣＴによって誘発される低減されたＭＤＳＣ蓄積に寄与する機構の１つであり得る。
【０１５０】
ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性もまた、インビトロホスファターゼアッセイキットを用いることによって検証することができる。ＰＰ２Ａ活性ホルスコリンの試験に含まれる全てのアッセイにおいて、ＰＰ２Ａのアクチベーターを陽性対照として含むことができ、阻害剤であるオカダ酸を陰性対照として用いることができる。Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３シグナリングは、ＰＤＥ５の活性化及びＰＰ２Ａの阻害をもたらし得るが、ＩＣＡ／ＩＣＴまたはホルスコリンによる処理の際には、ＰＰ２Ａ活性が増加し得る。特に、ＰＤＥ５のＳｅｒ９２におけるリン酸化をＰＰ２Ａによって減少させ、ＭＤＳＣに対するＩＣＡ／ＩＣＴの特異的な効果を支持する証拠を提供することができる。代替的には、ＰＰ２Ａｃａを含有するＬＶ−またはアデノウイルスベクターを用いて、ＭＤＳＣにおいてＰＰ２Ａを過剰発現させることができる。リンパ腫細胞株であるナマルバ細胞におけるＰＰ２Ａｃａの過剰発現は、ＰＰ２Ａシグナリング経路を活性化することができる。そのため、ＭＤＳＣにおけるＰＰ２Ａｃａの過剰発現を用いて、上記のように、リン−ＰＤＥ５、アポトーシス、Ｓ１００Ａ９／ＳＬＧＬＥＣ３の発現、ＮＯ及び炎症性サイトカインの産生を調査することによりＩＣＡ／ＩＣＴの効果を立証することができる。
【０１５１】
健常なドナーまたはがんを有する患者からの細胞の使用に起因する変動が存在してよいため、代替のストラテジーは、ＳＩＧＬＥＣ３を発現するＳＪＣＲＨ３０細胞を用いるためのものであり得る。このストラテジーを用いることにより、本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体による処理に続いてこれらの細胞においてＰＤＥ５またはＰＰ２Ａのいずれかを過剰発現させることによって、アプローチを強化することができる。ＰＤＥ５の過剰発現のこれらの実験を用いて、ＩＣＡ／ＩＣＴ誘発のＰＰ２Ａ活性化に打ち勝つ可能性を実証することができる。対照的に、ＰＰ２Ａを過剰発現させることによって、ＩＣＡ／ＩＣＴの作用を、ＰＤＥ５活性化のダウンレギュレーションを通して向上させることができる。
【０１５２】
各々の下流経路を特異的な阻害剤（ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０若しくはＥＲＫ１／２阻害剤ＰＤ９８０５９、またはＳＨＰ１／２阻害剤、ならびに、Ｓ１００Ａ９ライゲーションにおけるＣａ＋＋及び糖部位の役割を理解するためのキレート剤ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ及びグリコシラーゼ）によって阻害して、ＰＤＥ５、ＰＰ２Ａ、Ｓ１００Ａ９及びＳＩＧＬＥＣが炎症において重要な他の経路に関係するかをアセスメントし、異なる経路間でクロストークが存在するか、またはいずれの経路がＭＤＳＣにおけるＩＣＡ及びＩＣＴの調節機能においてより重要であるかを理解することができる。Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ３の両方の発現ならびにＰＤＥ５及びＰＰ２Ａの活性化を測定して、これらの経路のうちいずれがこれら２つのタンパク質と共に関係するかをアセスメントすることができる。これらの実験から読み取れることは、ウエスタンブロットによるリン−ＰＤＥ５及びリン−ＰＰ２Ａ、フローサイトメトリーによるＳＩＧＬＥＣ３発現、ならびに抑制サイトカイン及び可溶性メディエーターの下流での産生である。生物学的結果を経路特異的ｓｈＲＮＡ処理によってさらに立証して、結果を確認し、ＩＣＡ及びＩＣＴの作用における各成分の特異性を示すことができる。特異的タンパク質のサイレンシング及び本明細書に開示されているＩＣＡ、ＩＣＴまたはこれらの誘導体による処理の後、ＮＦ−κＢ、Ａｋｔ、ｐ３８及びＳＴＡＴ３経路の成分のリン酸化状態をウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１５３】
これらの結果は、コンピュータでＰＤＥ５阻害に重要なキーとなるアミノ酸を修飾してＰＤＥ５酵素の最も良好な変異体の選択をガイドし、触媒ポケットへのＩＣＴの結合、ならびにリン酸化部位におけるＰＰ２Ａの親和性を変化させ得る生化学的構造を理解するためのモデルを研究することによって裏付けることができる。結合ポケットにおいて各々別々のアミノ酸における変異体：ＰＤＥ５のＨ６１３、Ｄ７６４、Ｆ８２０、及びＳ６６３を生化学的特性に基づいて作製することができ、最も良好な変化を、ＰＤＥ５の全構造に対してほとんど修飾のないまたは修飾のない結合を防止し得るコンピュータモデルに基づいて選択することができる。このことは、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてインビトロで試験する変異体の選択を助けることができる。これらのクローンを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｐｌｕｓを用いてＦＡＣＳソートＭＤＳＣまたはＩＭＣのいずれかに導入することができる。ＰＤＥ５の野生型過剰発現を有するものと比較したときの差をアセスメントすることができる。これらの細胞を異なる用量の化合物で異なる時間長さにわたって処理することができ、その後、細胞毒性／増殖をフローサイトメトリーによって測定することができ、ＰＰ２Ａ及びＰＤＥ５の共免疫沈降（野生型及び変異体）を測定して、ＰＤＥ５変異体がＰＤＥ５へのＰＰ２Ａ結合に影響するかを調査することができ、ｉＮＯＳの発現及びＮＯの産生を測定することができ、キーとなる経路の成分Ｉκｂ、ｐ３８、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化をウエスタンブロットによって測定することができ、サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０及びＴＧＦβの放出をＥＬＩＳＡ及びＱ−ＰＣＲによって測定することができる。
【０１５４】
実施例８：アダプタータンパク質ＤＡＰ１２を活性化してＭＤＳＣの成熟の誘発を通して腫瘍微環境を改善することによるＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭシグナリングの反作用
ＩＴＡＭモチーフを持つＤＡＰ１２に関連するレセプターは、ＩＴＩＭ担持分子から発せられるシグナルに打ち勝つ活性化レセプターとして機能することができる。該レセプターは、ＰＩ−３Ｋ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫの活性化をもたらすことができるＳｙｋ／Ｚａｐ７０を補充することによってそのようにすることができる。ＩＴＡＭとＩＴＩＭとの間の最終的なバランスを、各レセプターに関連する特異的な機能によって決定及び画策することができる。いくつかのＣＤ３３関連ＳＩＧＬＥＣ、例えばＩＴＩＭを欠失するＳＩＧＬＥＣ−ＨまたはＳＩＧＬＥＣ−１４は、これにより、ＤＡＰ１２と直接相互作用することができる。ＤＡＰ１２の重要性は、いくつかのレセプター複合体とパートナーになることができ、骨髄を発生させる役割をすることができることである。ＤＡＰ１２は、幹細胞の単球への成熟に特に関与し、ＤＣの成熟及び生存を促進することができる。がんにおける障害は、ＭＤＳＣ表現型を有する未熟骨髄細胞の有意な蓄積である。これらの細胞における蓄積ＭＤＳＣ及びＳＩＧＬＥＣ３の過剰発現により、ＩＴＩＭ及びＩＴＡＭ媒介シグナリングの不均衡を結果として生じさせ得、ＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭシグナリングがＤＡＰ１２（ＩＴＡＭシグナル）からの活性化シグナルを支配する。このように、未熟骨髄細胞が、さらなる分化及び成熟を経ることを防止することができる。そのため、骨髄分化及び成熟を誘発するためにＤＡＰ１２経路を活性化させることは、腫瘍微環境においてＭＤＳＣを減少させ、腫瘍免疫を改善するための潜在的なストラテジーであり得る。
【０１５５】
これを達成するために、ＤＡＰ１２の２つの構成的活性形態を作り出し、アデノウイルスベクターに挿入した。複数の分析（生物学的アッセイ、生化学的アッセイ、ならびに免疫化学的評価及びシグナリングアッセイなど）の後、これらの構築物が下流の標的をシグナリングして生物学的機能を誘発することができることを確認した。ＡＤ２９３細胞を用いることで、ＤＡＰ１２のこれら２つの活性形態（Ｐ１９及びＰ２３）がＳｙｋ７０／Ｚａｐ７０に結合してＥＲＫ／ＭＡＰＫ活性化をもたらすことができた（図１３）。これらの構築物を用いる利点の１つは、活性ＤＡＰ１２が自身においてシグナリングして、活性化レセプターに関する必要性をバイパスことができることである。図１４に示すように、生じたデータは、これらの構築物が、３日間の感染後のＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７のような骨髄成熟マーカーの増加した発現によって示されるように、未熟ＤＣの成熟を促進させるという実現可能性を示している。これらの結果は、活性ＤＡＰ１２が未熟骨髄細胞の成熟を駆動させる潜在性を有して、ＭＤＳＣの低減された蓄積または抑制機能のダウンレギュレーションのいずれかをもたらすことができることを示唆している。これらの所見は、ＤＡＰ１２によって媒介されるシグナリング経路を標的にするこの目的で提案されている実験を行うための論理的根拠を裏付けている。
【０１５６】
アデノウイルスベクターは、細胞に対して毒性であるとき、長期アッセイには好適でない。それゆえ、レンチウイルスベクターを、非分割細胞を形質導入する可能性のある腫瘍担持マウスにインビボで用いる。ＤＡＰ１２及びＤＡＰ１２変異体をアデノウイルスからＬＶベクターに転換することができる。ＤＡＰ１２構築物は、野生型（ｗｔ−ＤＡＰ１２）、ドミナントネガティブＤＡＰ１２（ｄｎＤＡＰ１２）ならびにＤＡＰ１２の２つの活性形態（Ｐ１９及びＰ２３）を含むことができる。ＥＧＦＰのみを有するＬＶもまた、ベクター対照として、及び感染をモニタリングするための手段として用いることができる。
【０１５７】
ＭＤＳ／ＡＭＬを有する患者から単離したＭＤＳＣにおいてＤＡＰ１２ｍＲＮＡ発現を低減することができるため、がん患者からのＭＤＳＣにおける低レベル発現またはシグナリング欠乏が可能である。それゆえ、がんからＦＡＣＳソーティングにより単離されたＭＤＳＣにおけるＤＡＰ１２の遺伝子発現を、ＤＡＰ１２発現に関する定量的なリアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって評価することができる。この研究において、健常なドナーからの未熟骨髄細胞を対照として用いることができる。ＤＡＰ１２のシグナリング事象は、ｍＡｂを用いて、ＤＡＰ１２関連活性化レセプター、ＴＲＥＭ（骨髄細胞において発現されるトリガリングレセプター）を架橋することと、続いて抗ＤＡＰ１２による免疫沈降及び抗チロシンリン酸化抗体によるウエスタンブロットとによって分析することができる。対照細胞におけるＴＲＥＭの架橋は、ＤＡＰ１２におけるＩＴＡＭのチロシン部位において増加したリン酸化を引き起こし得、また、Ｓｙｋの増加された補充ならびにＰＩ−３キナーゼ及びＥＲＫの活性化をもたらし得、これらは、図１３に記載されるウエスタンブロットによって容易に検出することができる。一方で、がん患者から単離したＭＤＳＣにおけるシグナリング事象は、対照と比較したとき、減少または阻害され得る。この相関係数を算出し、ＤＡＰ１２ｍＲＮＡの低減が機能性欠乏と相関するかを決定することができる。これらのアッセイはいずれも、ＤＡＰ１２の発現及び機能の検出において信頼性がある。これらの実験は、ＤＡＰ１２が未熟骨髄分化に重要であるか否かを実証することができる。加えて、がん患者に存在する場合があるいずれかのＤＡＰ１２（またはこの経路における他の分子）の欠乏の情報を提供することができる。
【０１５８】
ＭＤＳＣにおける成熟表面マーカーの発現を、ＤＡＰ１２構築物の導入後に分析することができる。がん患者からのＭＤＳＣを、ＤＡＰ１２構築物の種々の変異体を含有するＬＶに感染させることができる。細胞を０、３、５及び７日で採取することができ、これらの表現型を、ＭＤＳＣまたは成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７、ＣＤ１４、ＣＤ１５及びＨＬＡ−ＤＲを含む）のいずれかの抗体によって分析することができる。患者の細胞におけるＤＡＰ１２の過剰発現は、ＭＤＳＣ集団の減少を誘発し、単球または顆粒球成熟マーカー（それぞれＣＤ１４及びＣＤ１５）による成熟細胞集団を増加させることができる。この表現型変化は、活性ＤＡＰ１２の導入に続いて時間依存的に起こり得る。
【０１５９】
活性ＤＡＰ１２によるトランスフェクション後のＭＤＳＣの抑制機能を調査することができる。該調査は、抑制サイトカイン（ＴＧＧβ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦなど）の産生、ならびに抑制可溶性メディエーターの生成（ＲＯＳ、ＮＯ及びアルギナーゼ産生など）を調査することを含むことができる。ＭＤＳＣにおける活性ＤＡＰ１２の導入は、ＭＤＳＣ関連サイトカイン及び可溶性因子の産生を遮断することによってＭＤＳＣ抑制機能を低減することができる。
【０１６０】
ＭＤＳＣの認識されている機能的特性として、抗原刺激またはＣＤ３刺激したＴ細胞増殖及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の抑制が挙げられる。それゆえ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激及びＩＦＮ−γ産生に応答するＴ細胞増殖は、自家移植Ｔ細胞をＬＶ−ＤＡＰ１２構築物感染のＭＤＳＣによって５〜７日間培養し、その後、３Ｈ−チミジンの組み込みによる増殖、及びＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮ−γ産生を調査することによってモニタリングすることができる。
【０１６１】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現レベルもまた、活性ＤＡＰ１２の過剰発現後にウエスタンブロット分析によって決定して、Ｓ１００Ａ８／Ａ９シグナリングとＤＡＰ１２シグナリング経路との間のあらゆる相関をアセスメントすることができる。
【０１６２】
活性ＤＡＰ１２の過剰発現、及び、活性ＤＡＰ１２がＳ１００Ａ９または対照リガンドＳ１００Ａ７によるライゲーションに続いてＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭ媒介シグナリングを阻害する能力もまた調査することができる。ＳＩＧＬＥＣ３のＩＴＩＭシグナリングをアセスメントするために、ＩＴＩＭモチーフのリン酸化または細胞質ＳＨＰ１／２の補充を、抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体を用いたＳＩＧＬＥＣ３レセプターの免疫沈降、続いてそれぞれ抗ホスホチロシンまたは抗ホスファターゼ抗体によるウエスタンブロット分析によって測定することができる。これらの実験を用いて、ＭＤＳＣにおいて非常に活性なＣＤ３３シグナリング経路を活性ＤＡＰ１２の過剰発現によってダウンレギュレートすることができるかを決定することができる。
【０１６３】
これらの阻害レセプターの発現をさらに低減するために、活性ＤＡＰ１２に加えて、ＬＶ−ｓｈＳＩＧＬＥＣ３３を発現させることができる。がん患者における腫瘍微環境の変更におけるこれらのシグナリング分子の組み合わされた役割を調査することができる。がん患者から単離したＭＤＳＣを、ＬＶ−ＤＡＰ１２またはＬＶ−ｓｈＲＮＡのいずれかによってＳＩＧＬＥＣ３に二重感染させることができ、これらの細胞を、成熟表面マーカーの発現及び抑制活性について調査することができる。この組み合わされたストラテジーは、ＭＤＳＣ媒介活性を阻害し、腫瘍微環境を改善することができる。
【０１６４】
ＳＩＧＬＥＣ５及びＳＩＧＬＥＣ１４ならびにこれらの変異形態を含むいくつかのＣＤ３３−ｒＳＩＧＬＥＣ発現構築物を作製し、両方の活性の研究及びシグナルの阻害に用いることができる。中でも、ＳＩＧＬＥＣ１４は、成熟シグナルを送達するＤＡＰ１２に関連する活性ＳＩＧＬＥＣである。ＳＩＧＬＥＣ１４及びＤＡＰ１２は、抗ＳＩＧＬＥＣ１４抗体と架橋する前にＡＤ２９３細胞内に共トランスフェクトしている。図１５に示すように、ＳＩＧＬＥＣ１４及びＤＡＰ１２と共トランスフェクトした架橋細胞は、低減されたＩＬ−１０産生によって示されるようにこれらの細胞に内因性のＳＩＧＬＥＣ３−ＩＴＩＭ経路を抑制した。
【０１６５】
インビボでのＭＤＳＣ成熟におけるＤＡＰ１２について、特に、腫瘍の発生において潜在的な役割を有するか否かについてはほとんど知られていない。それゆえ、ＤＡＰ１２ノックアウトマウス（ＤＡＰ１２−／−）を用いて、上記で議論したインビトロ研究をさらに立証することができる。結果は、ＤＡＰ１２媒介シグナリングがＮＫ細胞の活性化及び成熟に重要であり得ること、ならびにこれらのマウスにおいて損失したＮＫ機能を他のＩＴＡＭ担持アダプターによって補償することができないことを示している。これらのデータは、ＤＡＰ１２が、これらの細胞における特異的な活性化レセプターとパートナーになるとき、特有の生物学的役割を媒介することができることを示唆している。
【０１６６】
ＤＡＰ１２−／−マウスの脾臓及び骨髄からのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合及び発現を、フローサイトメトリーベースのアプローチを用いて調査することができる。これらの実験は、ＤＡＰ１２の欠乏及びＤＡＰ１２媒介活性化シグナルの次の不在が未熟骨髄細胞の成熟及び／または蓄積に影響し得るか否かを決定することができる。野生型（ｗｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照マウスとして用いることができる。炎症及びがんは、加齢プロセスと関連するため、ＤＡＰ１２−／−及びｗｔ−マウスを、１、３、６、９、１２、１５、１８、及び２１ヶ月を含む種々の齢でＧｒ−１及びＣＤ１１ｂ発現について調査することができる。これらの実験は、１）ＭＤＳＣがＤＡＰ１２−／−マウスにおいて蓄積または展開するか否か、ならびに２）ＭＤＳＣの蓄積及び増加がＤＡＰ１２欠乏を伴う加齢プロセスによって加速するか否かに対処することができる。インビトロでのデータに基づくと、ｗｔ−マウスとは対照的に、ＤＡＰ１２−／−マウスにおいて未熟骨髄細胞の分化及び成熟の遮断が存在し得る。それゆえ、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋表面マーカー発現を有する未熟骨髄細胞集団をＤＡＰ１２−／−マウスの骨髄に蓄積及び展開することができる。さらに、増加したＭＤＳＣ数を高齢マウスにおいて見出すことができ、このプロセスを、ＤＡＰ１２の非存在下に加速することができる。
【０１６７】
以下の実験を用いて、ＤＡＰ１２−／−マウスから単離したＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が悪性腫瘍及び他の病態において見られる常套的なＭＤＳＣとして機能するかを評価することができる。
【０１６８】
抑制サイトカイン及び可溶性抑制メディエーターの両方、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、アルギナーゼ及びＮＯＳの産生をモニタリングすることができる。活性ＤＡＰ１２発現は、ＳＩＧＬＥＣ３またはＳＩＧＬＥＣ５（ＩＴＩＭ担持）によって媒介される抑制サイトカイン産生に打ち勝つことができたため、ＤＡＰ１２シグナリングの非存在は、ＳＩＧＬＥＣ３またはＳＩＧＬＥＣ５から発せられる阻害シグナリングにおける不均衡に起因して抑制メディエーター及びサイトカインの過剰産生を結果として生じ得る。
【０１６９】
ＤＡＰ１２−／−マウスにおけるＴ細胞応答を調査することができる。ＤＡＰ１２−／−マウスの骨髄細胞におけるＤＡＰ１２シグナリングの欠失は、細胞の分化／成熟を防止することができ、抑制メディエーター及びサイトカインの産生に伴うＭＤＳＣ蓄積を増加させ、また、損なわれたＴ細胞増殖及び低減されたＩＦＮγ産生を表示することができる。
【０１７０】
ＭＤＳＣの発生におけるＤＡＰ１２の特異的な役割をさらに立証するために、ＤＡＰ１２の活性形態（同じ活性ＤＡＰ１２構築物を、高い相同性に起因してヒト及びマウスの両方において用いることができる）を、ＤＡＰ１２−／−マウスから単離されたＭＤＳＣに導入することができ、また、これを用いて、上昇したＤＡＰ１２発現及び活性化したＤＡＰ１２が、抑制サイトカインの産生（ＴＧＦ−β、ＩＬ１０及びＶＥＧＦ）を阻害し、Ｔ細胞応答を増加させ、ならびに／またはＭＤＳＣ分化／成熟を駆動させることができるか否かを、成熟表面マーカーを測定することによりアセスメントすることができる。
【０１７１】
実施例９：腫瘍担持モデルにおける腫瘍微環境でのＩＣＡ／ＩＣＴの調節機構
ＭＤＳＣを、上記で議論したインビボモデルからの脾臓または腫瘍組織から単離することができる。Ｓ１００Ａ９免疫沈降、続いて、質量分析を実施して、関与するマウスＳＩＧＬＥＣを同定及び確認することができる。結合レセプターをヒトカウンターパートについて上記のように試験し、マウスＳ１００Ａ９及び／または対応するＳＩＧＬＥＣによってマウスＮＩＨ３Ｔ３（インビトロでのトランスフェクションモデル）に共トランスフェクトし、リガンド／レセプターとして裏付けることができる。特異的なマウスＳ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ結合及び共局在／内在化を免疫染色によってモニタリングすることができる。Ｓ１００Ａ９における特異的なシグナリング及び対応するＳＩＧＬＥＣライゲーションを、ＩＴＩＭのリン酸化、ＳＨＰ１／２の補充、ＰＤＥ５の活性化及びそのＰＰ２Ａとの関連ならびにその抑制の調査を含めて、生化学的にアセスメントすることができる。これらの生化学的実験は、野生型（ＷＴ）、Ｓ１００Ａ９ノックアウト（ＫＯ）及びＳ１００Ａ９トランスジェニックマウス（Ｔｇ）から単離されたＭＤＳＣを用いることができる。
【０１７２】
ＩＣＡ／ＩＣＴによる処理後の腫瘍環境の特性決定を先に記載したようにマウスモデルにおいてアセスメントすることができる。簡潔に言えば、６〜８週の高齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０５の４Ｔ１−Ｎｅｕ乳がん細胞またはマウスルイス肺がんを脇腹において皮下（ｓ．ｃ．）接種することができる。腫瘍成長を２〜３日間毎にキャリパーを用いた二方向腫瘍測定によってモニタリングすることができ、腫瘍体積を算出することができる。３つの用量の１２、２５または５０ｍｇ／ｋｇの本明細書に開示されているＩＣＡ、ＩＣＴ、または誘導体を、腫瘍接種後７日目に開始して実験の終了まで１週間に３回、経口または腹腔内（ｉ．ｐ．）のいずれかの注射によって付与することができる。対照群に、いずれかの経路によって等量のビヒクルを付与することができる。腫瘍及び脾臓ＭＤＳＣを収集することができる。
【０１７３】
腫瘍を免疫細胞及び腫瘍細胞にパラフィン埋め込みまたは分離し、再培養することができる。いずれかのソースから、単離した細胞を、調製した抗体パネルによって細胞内で染色し、キーとなる経路の状態のリン酸化を測定することができる。種々の用量の本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴまたはこれらの誘導体及び時間による動態研究を用いて、ＰＤＥ５活性がインビボでのＩＣＡ／ＩＣＴ注射によって抑制されるかをモニタリングすることができる。ＰＰ２Ａ活性をモニタリングして、インビボでのホスファターゼ活性の向上におけるＩＣＡ／ＩＣＴの役割を確認することができる。ＩＣＡ／ＩＣＴによる処理後、ビヒクルで処理したマウスと比較したとき、ＰＤＥ５活性を阻害することができ、ＰＰ２Ａ活性をインビボで増加させることができる。この二歯状のシグナリング事象に取り組みことにより、ＭＤＳＣ活性を抑制することができ、腫瘍微環境を改善することができる。このことは、脾臓及び局所腫瘍におけるＭＤＳＣの割合の変化を測定し、ＩＣＡ／ＩＣＴによる処理後の、ＭＤＳＣから正常な成熟骨髄細胞へのシフトをアセスメントすること；ＩＣＡ／ＩＣＴがＭＤＳＣによって生じる抑制サイトカインのレベルを低減することができるかを測定すること；及びＩＣＡ／ＩＣＴがＭＤＳＣからの可溶性抑制メディエーターの産生を阻害することができるかを試験することによって立証することができる。
【０１７４】
抗原（Ａｇ）特異的なＴ細胞応答の阻害は、ＭＤＳＣ活性化を示すことができる。それゆえ、Ａｇ特異的なＴ細胞応答を、ＴＲＰ−１欠失マウスの脾臓から単離されたＴ細胞を用いて試験することができる。このモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６同系マウスにおいて注射される黒色腫Ｂ１６細胞腫瘍における免疫反応の抑制を研究するのに用いられてきた。ＴＲＰ−１抗原によるＷＴ及びＴＲＰ−１欠失マウスのワクチン接種は、抑制成分が腫瘍を維持する能力を強調させ、それゆえ、Ｂ１６黒色腫を有するマウスに挑んだ後にＩＣＡ／ＩＣＴによるＭＤＳＣ抑制の調節を研究するのに好適なモデルを提供することができる。注射後、これらのマウスをＩＣＡ／ＩＣＴによって処置することができ、ＷＴまたはＴＲＰ−１欠失マウスにおける特異的なＴＲＰ−１抗原に応答した特異的なＴ細胞活性化をＣＤ８＋細胞におけるＴ細胞増殖及びＩＦＮγ産生によってモニタリングすることができる。特異的なＴＲＰ−１由来ペプチド及び対照ペプチドに対する刺激に応答するＩＦＮγ産生細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて評価することができる。Ｔ細胞増殖を３Ｈチミジンの組み込みによって評価することができる。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＭＤＳＣをＢ１６注射ＷＴまたはＴＲＰ−１欠失マウスから単離し、Ｔ細胞増殖またはＩＦＮ−γ産生の評価の前にＴＲＰ−１由来ペプチド及び対照ペプチドの存在下で健常なマウスから単離したＴ細胞に対して異なる比で添加することができる。ＭＤＳＣによるＡｇ特異的な免疫抑制を、本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴまたはこれらの誘導体によって前処理したＭＤＳＣと共培養したＴ細胞において低減することができる。
【０１７５】
Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、腫瘍組織においてＭＤＳＣ蓄積を向上させているが、Ｓ１００Ａ９ＫＯマウスは、低減したＭＤＳＣ集団による腫瘍に対しての本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴまたはこれらの誘導体の直接的な効果のアセスメントを可能にする腫瘍設定においてさえもＭＤＳＣのレベルを低減させている（Ｃｈｅｎｇ  Ｐら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８；２０５（１０）：２２３５−４９）。この実験設定は、定義されるインビボでのＩＣＡ及びＩＣＴ腫瘍抑制の機構におけるＳ１００Ａ９及びＭＤＳＣの機能的役割を可能にすることができる。Ｓ１００Ａ９／ＳＩＧＬＥＣ経路と腫瘍部位における抑制の維持との間に相関があり得るため、ＩＣＡ及びＩＣＴの機能においてなす役割をアセスメントする。単核細胞（ＭＮＣ）を、除去した腫瘍、脾臓から、またはマウスの大腿骨及び頸骨から単離して、市販のキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて富化することができる。次いで、これらを表現型分析に用いることができ、ＭＤＳＣの量をＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋の発現に関してアセスメントすることができる。これらの細胞は、Ｓ１００Ａ９ＫＯ及びＷＴマウスと比較したとき、腫瘍、脾臓及び末梢血に蓄積することができる。ＭＤＳＣをＳ１００Ａ９Ｔｇの腫瘍においてＩＣＡ及びＩＣＴ処理後にどのように調節するかを決定するために、ＭＤＳＣを、ＤＭＳＯまたはＩＣＡ／ＩＣＴで処理したＳ１００Ａ９Ｔｇ及び対照マウスの両方から精製することができ、これを用いて
、（ａ）ＥＬＩＳＡまたはフローによってサイトカインの産生をアセスメントし、（ｂ）ＭＤＳＣ抑制可溶性因子（ＲＯＳ及びＮＯ）の産生ならびにこれらの調節遺伝子ＡＲＧ２及びＮＯＳ２の発現の変化をアセスメントし、（ｃ）ＰＤＥ５活性をアッセイし、（ｄ）ＰＤＥ５活性またはＰＰ２Ａホスファターゼ活性をアッセイすることができる。実験は、対照としてのＷＴ及びＳ１００Ａ９ＫＯマウスと並行して行うことができる。Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスにおけるＭＤＳＣ媒介活性は、ＤＭＳＯ処理マウスまたはＳ１００Ａ９ＫＯマウスと比較して、ＩＣＡ／ＩＣＴによる処理後に抑制機能が大幅に低減し得る。
【０１７６】
養子導入ストラテジーを用いて、ＳＩＧＬＥＣ、Ｓ１００Ａ９及びＭＤＳＣの関与を直接明らかにすることができる。このことは、処理したＳ１００Ａ９ＴｇまたはＫＯマウスから単離されたＭＤＳＣを未処理のカウンターパートに養子導入することによってなすことができる。ＷＴマウスにおいて抑制を媒介することにおけるＳ１００Ａ９及びＭＤＳＣの特異性を研究することができ、腫瘍成長における遅延がＭＤＳＣのみに依存するかを決定することができる。上記の濃度でＩＣＡまたはＩＣＴによって処理したＳ１００Ａ９ＴｇからのＦＡＣＳ精製ＭＤＳＣを、尾静脈注射によってＷＴ同系レシピエントに導入することができる。ＣＤ４５．１遺伝子マーカーを発現するＳ１００Ａ９ＴｇマウスからのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣの養子導入を、ＣＤ４５．２レシピエントに養子導入して、発生の間の集団を個々にモニタリングすることができる。ＭＤＳＣ媒介の機能的免疫抑制活性を、ＭＤＳＣ発現、及び脾臓内での蓄積によってアセスメントすることができる。ＷＴ  ＣＤ４５．２マウスからの成熟した骨髄細胞（Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｃ＋ＤＥＣ２０５＋Ｆ４／８０＋）及びＳ１００Ａ９ＫＯマウスからのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞をＳ１００Ａ９に関する陰性対照としてレシピエントマウスに養子導入することができる。注射後、これらのマウスを毎月観察し（動態研究）、脾臓におけるＭＤＳＣ発現、ＭＤＳＣ関連サイトカイン産生、及び免疫抑制について試験することができる。動態研究に加えて、可変数のＭＤＳＣをレシピエントに導入し、任意の免疫抑制機能、例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８に応答するＴ細胞増殖について分析することができる。このストラテジーを用いて、Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスからのドナーＭＤＳＣの嵌め合わせを定量することができる。ＤＭＳＯで処理したＳ１００Ａ９ＴｇマウスからのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣの養子導入のレシピエントの脾臓において、高い割合のＭＤＳＣ蓄積及びサイトカイン産生を観察することができる。これらのレシピエントは、増加した抑制サイトカイン産生及び減少したＴ細胞増殖によって示される有意な免疫抑制を表示することができる。対照的に、ＩＣＡ／ＩＣＴで処理したマウスからのＭＤＳＣを受け取ったレシピエントは、正常な骨髄細胞成熟及び低減された免疫抑制を表示することができる。この設定において、ＩＣＡ／ＩＣＴ処理後のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの低減された蓄積及び増加を、異なる処理からそれぞれ養子導入したＷＴマウス及びＳ１００Ａ９ＫＯにおけるフローサイトメトリー分析によって検出することができる。精製した処理ＭＤＳＣによるサイトカイン及び可溶性因子の産生を減少させ、機能性を確認することができる。
【０１７７】
ヒト肺腺がん（例えばＡ５４９）または肝臓肝細胞がん（例えばＨｅｐＧ２）の細胞株を、ＭＤＳＣ機能に対する及びヒト腫瘍成長に対するＩＣＴ／ＩＣＡの効果を研究するために、ＮＳＧ免疫不全マウスにおいて成長させることができる。ＮＳＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒ−／−）マウスモデルは、ヒト腫瘍移植片及び多系譜造血再構成に関して優れた可能性を有する。
【０１７８】
予備研究を実施して、腫瘍異種移植の成長曲線を決定し、本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体の生理学的効果に関する基本的な情報を得ることができる。マウスを、２〜３週間、１日１回、１２、２５及び５０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍接種後５〜７日にビヒクル対照及び実験群（ｎ＝１２）にランダム化することができる。腫瘍細胞の注射後２５日に、マウスの半分を犠牲にし、種々の実験に用いることができる。これらを用いて腫瘍体積及び重量を測定することができる。ＭＤＳＣを腫瘍組織から精製することができ、リン−ＰＤＥ５及びＰＰ２Ａ活性をウエスタンブロットによってモニタリングして、活性化に対するＩＣＡ／ＩＣＴの遮断効果が存在するかを調査することができる。リン−ＭＡＰＫ、リン−ＡＫＴ、リン−ＳＴＡＴ３及びリン−ＮＦ−ｋＢ抗体を用いて、化合物がヒト異種移植片の炎症性反応に対してインビボ阻害効果を有するかをチェックすることができる。
【０１７９】
免疫再構成実験を実施して、ＭＤＳＣに対する本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴ及びこれらの誘導体の特異的な効果を調査し、免疫反応を回復または向上させることができる。簡潔には、腫瘍細胞の注射後２５日に、ヒトＴ細胞及びＣＤ３３＋骨髄細胞を尾静脈注射によりマウスに付与することができる。これらの骨髄細胞の成功裏の生着に約２ヶ月を要し得る。マウスは上記のように対照及び実験群に分けられて、２週間に１回、ビヒクル、ＩＣＡまたはＩＣＴを受け取り、次いで種々の実験に用いることができる。フローサイトメトリーを用いて、腫瘍組織の単一の細胞懸濁液からのヒトＭＤＳＣ表面マーカー：ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＬＩＮ−を用いて染み込ませるヒトＭＤＳＣの数を調査することができる。ＩＣＡ／ＩＣＴで処理したマウスは、おそらくはＩＣＴ／ＩＣＡ誘発ＰＰ２Ａ活性化により、ＭＤＳＣ増加に対するＩＣＴ／ＩＣＡの阻害効果に起因してＭＤＳＣを発現するＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＬＩＮ−の数が低下し得、ＭＤＳＣの分化及び成熟を促進することにより結果としてＭＤＳＣがアポトーシスを経るようにしてよい。血液サンプルを収集することができ、血漿を調製して、特定のＥＬＩＳＡキットを用いてヒトＴＧＦ−β、ＩＬ−１０及びＶＥＧＦの産生を調査することができる。ＩＣＡ／ＩＣＴを用いたＳ１００、ＳＩＧＬＥＣ及びＴＬＲシグナリングの阻害により、ＭＤＳＣを活性化し、抑制サイトカインを生じさせる能力を減少させることができる。腫瘍組織の一部をパラフィン埋め込みして、免疫染色によるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の局所染み込みを研究することができる。ヒトの器官のＴ細胞を腫瘍組織、脾臓、または末梢血のいずれかから単離し、ＩＦＮ−γ産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴによって決定することができる。ＩＣＡ、ＩＣＴまたはビヒクル処理マウスから単離したＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって刺激することができ、細胞増殖アッセイを、３Ｈ組み込みを測定することによって実施することができる。Ｔ細胞増殖及びＩＦＮγ産生細胞の数は、対照のＤＭＳＯ処理マウスと比較したとき、ＩＣＴ／ＩＣＡ処理マウスにおいて有意に高くなることができる。
【０１８０】
代替のストラテジーは、ＳＩＧＬＥＣ３＋ＭＤＳＣにおけるＮＫ媒介抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を測定することによって実施することができる。ＩＣＡは、腫瘍患者及び健常なドナーの両方においてＮＫ細胞活性及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）活性（０．１〜１．０μｇ／ｍｌ）を増加させることができる（Ｈｅ  Ｗら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９５；４５（８）：９１０−３）。近年、ＩＣＡ／ＩＣＴが化合物による処理の４８時間後にＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞においてＦｃレセプター（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩ）の発現レベルを増加させることができることが分かった（図１６）。これらのＦｃレセプターは、ＡＤＣＣの発生、ＮＫ細胞の細胞毒性機能に重要であり得るため、これは、特に興味深いことである。この機能は、標的細胞をトリガーしてパーフォリン及びグランザイムを含有する細胞毒性顆粒の放出を通してアポトーシスを経ることができる、標的細胞に既に結合している抗体によるＣＤ１６のライゲーションを通したＮＫ細胞の活性化に関与することができる。ヒト化抗ＳＩＧＬＥＣ３／ＣＤ３３抗体を用いてストラテジーを適用し、ＮＫ媒介ＡＤＣＣによってＭＤＳＣを枯渇させることができる。
【０１８１】
ＭＤＳＣを標的とすることが免疫反応を回復させ腫瘍微環境を改善させるか否かを調査するために、以下の実験を実施して、ＳＩＧＬＥＣ３＋標的細胞に対するＩＣＡ／ＩＣＴ誘発ＮＫ媒介ＡＤＣＣのインビトロ及びインビボの両方の効能を試験することができる。
【０１８２】
インビトロでのＮＫ媒介ＡＤＣＣを測定するために、健常なドナーの末梢血からのＮＫ細胞を単離し、ＩＣＡ／ＩＣＴまたはＤＭＳＯで４８時間処理することができる。ＮＫ細胞によって殺傷され得ない内皮細胞株であるＣＲＬ−２５９７を、ＳＩＧＬＥＣ３でトランスフェクトし、標識化し、氷上での抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体またはアイソタイプＩｇＧのいずれかによる３０分間のインキュベーションに続いてクロム−５１［Ｃｒ５１］において標的として用いることができる（Ｃｈｅｎ  Ｘら、Ｂｌｏｏｄ．２００８）。ＮＫ細胞との４時間の共培養の後、［Ｃｒ５１］の放出を測定することができる。ＩＣＡ／ＩＣＴ処理ＮＫ細胞は、ＤＭＳＯ処理ＮＫ細胞と比較したとき、ＳＩＧＬＥＣ３トランスフェクトＣＲＬ−２５９７に対して増加したＡＤＣＣを有することができる。また、抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体によって培養した標的細胞は、アイソタイプＩｇＧによって予めインキュベートされた標的細胞と比較したとき、さらなる［Ｃｒ５１］放出を有することができる。
【０１８３】
記載されているＭＤＳＣの機能的基準の区別は、抗原シミュレーションまたはＣＤ３刺激したＴ細胞増殖及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の抑制を含む。それゆえ、ＮＫ  ＡＤＣＣによるＭＤＳＣの枯渇後にＴ細胞応答を調査するために、ＭＤＳＣをがん患者の末梢血から単離することができる。抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体またはアイソタイプＩｇＧによるインキュベーション後、これらのＭＤＳＣを、ＩＣＡ／ＩＣＴによって既に処理したまたは処理していない自家移植ＰＢＭＣと共培養することができる。５〜７日間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によるＴＣＲの再シミュレーションの後、Ｔ細胞増殖をＢｒｄｕ組み込みによってモニタリングし、ＣＤ３＋Ｔ細胞においてフローサイトメトリーによって分析することができる。これらのＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生もまた、細胞内染色によってモニタリングすることができる。ＳＩＧＬＥＣ３＋ＭＤＳＣの枯渇は、ＡＤＣＣが本明細書に開示されているＩＣＡ／ＩＣＴまたはこれらの誘導体による処理後に増加したＰＢＭＣに存在するＮＫ細胞によるＭＤＳＣの枯渇に起因して、アイソタイプＩｇＧ及びＤＭＳＯ処理群と比較してＴ細胞応答を改善することができる。
【０１８４】
同様の設定に続いて、抑制サイトカイン、ＮＯ及びＲＯＳをＥＬＩＳＡによって調査することができる。これらの抑制因子の産生は、ＮＫ媒介ＡＤＣＣによるＭＤＳＣ枯渇に起因して大幅に低減し得る。
【０１８５】
インビボアプローチは、上記の異種移植腫瘍モデルにＮＫ細胞及び抗ＳＩＧＬＥＣ３抗体の両方を投与する前に化合物を用いてまたは用いずにＮＫ細胞を処理することによって使用することができる。アイソタイプＩｇＧによって処理されたＮＫ細胞及びＤＭＳＯによって処理されたＮＫ細胞を対照として用いることができる。ＭＤＳＣの生物学的機能を、上述したようにモニタリングすることができる。ＭＤＳＣの蓄積及び増加をモニタリングすることができる。免疫抑制及び腫瘍成長を試験することができる。ＮＫ媒介ＡＤＣＣによるインビボでのＭＤＳＣの枯渇は、免疫及び腫瘍微環境を改善することができ、腫瘍成長を低減することにより腫瘍担持宿主に利益を与えることができる。
【０１８６】
実施例１０：
ＩＣＴは、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３３の発現をダウンレギュレートすることができる（図１７）。Ｑ−ＰＣＲによるＳＩＧＬＥＣ３の相対発現を図１７Ａに示す。健常なＰＢＭＣを２０μＭのＰＤＥ５阻害剤ＩＣＴによって４８時間培養し、ＳＩＧＬＥＣ３の発現をＤＤＣｔ法によって測定した。実験対象は、ＤＭＳＯで処理したＰＢＭＣであり、内部対照はＧＡＰＤＨであった。エラーバーは、３つの別々のドナー／実験のＳＥＭを示す。２０μＭ  ＩＣＴによって処理したＰＢＭＣにおけるＣＤ３３の発現についてのフローサイトメトリー分析を図１７Ｂに示す。
【０１８７】
ＩＣＴは、ＰＢＭＣにおける抑制因子の発現をダウンレギュレートすることができる（図１８）。Ｑ−ＰＣＲによるＩＬ−１０、ＴＧＦｂ、ＴＮＦａ、ＡＲＧ２及びＮＯＳ２の相対発現を図１８に示す。健常なＰＢＭＣを２０μＭで４８時間培養し、遺伝子抑制因子の発現をＤＤＣｔ法によって測定した。実験対象は、ＤＭＳＯで処理したＰＢＭＣであり、内部対照はＧＡＰＤＨであった。エラーバーは、３つの別々のドナー／実験のＳＥＭを示す。
【０１８８】
ＩＣＴはまた、ＬＰＳ処理ＰＢＭＣにおける抑制サイトカインＩＬ−１０及びＴＧＦｂの発現をダウンレギュレートすることもできる（図１９）。Ｑ−ＰＣＲによるＩＬ−１０及びＴＧＦｂの相対発現を図１９Ａ及びＢにそれぞれ示す。健常なＰＢＭＣを２０μＭ  ＩＣＴによって４８時間培養し、遺伝子発現をＤＤＣｔ法によって測定した。実験対象は、ＤＭＳＯで４８時間処理したＰＢＭＣであり、内部対照はＧＡＰＤＨであった。エラーバーは、３つの別々のドナー／実験のＳＥＭを示す。
【０１８９】
ＩＣＴは、ＭＤＳ−ＢＭにおけるＣＤ３３及びｉＮＯＳの発現をダウンレギュレートすることができる（図２０）。２０μＭ  ＩＣＴで処理したＰＢＭＣにおけるＣＤ３３の発現についてのフローサイトメトリー分析を図２０Ａに示す。Ｑ−ＰＣＲによるＭＤＳ−ＢＭにおけるＣＤ３３の相対発現を図２０Ｂに示す。健常なＰＢＭＣを、ＩＣＡ、ＩＣＴまたはＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルによって４８時間培養し、ＳＩＧＬＥＣ３の発現をΔΔＣｔ法によって測定した。実験対象は、ＤＭＳＯで４８時間処理したＰＢＭＣであり、内部対照はＧＡＰＤＨであった。エラーバーは、３つの別々のドナー／実験のＳＥＭを示す。ＭＤＳ−ＢＭにおけるＮＯＳ２の相対発現をＢについて記載のように測定し、図２０Ｃに示す。
【０１９０】
種々の細胞株におけるＩＣＴのＩＣ５０値を表１に示す。種々の細胞株におけるＩＣＴの異なる用量でのアポトーシス速度を表２に示す。
【０１９１】
【表１】
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【０１９２】
【表２】
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【０１９３】
ＩＣＡ及びＩＣＴは、ＭＤＳ  ＢＭＮＣの造血を増加させることができる（図２１）。ＭＤＳ患者からの骨髄単核細胞（ＢＭＣ）を２０μＭ  ＩＣＴで４８時間処理し、次いで、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４４３４完全培地内に播種し、混合物を３５ｍｍの培養皿（１×１０５細胞／各皿）に置き、５％ＣＯ２中３７℃で１４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅのコロニーを同定し、倒立光学顕微鏡を用いて計数した（図２１Ａ及びＢにそれぞれ示す）。各点は、正常な３個体の平均結果を表し、各実験点は、複製プレートを表す。結果を平均値±ＳＤとして表す。
【０１９４】
コンピュータでのＰＤＥ５Ａ１へのＩＣＴのドッキングモデルを図２２に示す。ＩＣＴの３Ｄワーキングモデルを生じさせ、デフォルト値を用い、全ての水を除去してＰＤＥ５の利用可能な結晶構造に組み込んだ（２Ｈ４４．ｐｄｂ）。レセプターグリッドを、本発明化合物の代謝産物である共結晶化リガンドイカリシドＩＩを用いて生成した。ＬｉｇＰｒｅｐを用いて、イカリシドＩＩを、ドッキングシミュレーション用に作製した２Ｈ４４．ｐｄｂ及びライブラリから除去した（図２２Ａ）。ＧＬＩＤＥは、ドッキングスコア（Ｇｓｃｏｒｅｓ）を提供し、先に生成したグリッドを用いて、タンパク質に対するリガンドの自由エネルギーのおおよその結合を表した。２Ｈ４４．ｐｄｂからの結晶構造様態を最も良好なものに類似させる様態は、−１３．６７６Ｋｃａｌ／ｍｏｌのｇｌｉｄｅスコア（Ｇｓｃｏｒｅ）を有する。ＳＰシミュレーションでは、選択された様態が、イカリシドＩＩの共結晶位置（０．３４７１のＲＭＳ）と重なり合い、イカリシドＩＩにおいて、残基Ｄ７６４の側鎖、及び水素を含む残基Ｉ６６５の骨格原子を含む同様の水素結合ネットワークを形成する（図２２Ｂ）。ＧＬＩＤＥの超高精度（ＸＰ）ドッキングシミュレーションは、入力したリガンド及び最低エネルギー様態（Ｇｓｃｏｒｅ：−１７．２１５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が０．９５５８のＲＭＳを有する共結晶構造様態に密接に接近するとき、ＳＰドッキング結果からの最も良好な様態によって行った（図２２Ｃ）。この様態でのＨ結合相互作用は、イカリシドＩＩによるＳ６６８と、イカリシドＩＩによるＨ６１３と、イカリシドＩＩによるＩ６６５との間で起こり、これらの全てもまた、結晶学的様態に存在する。イカリシドＩＩと、モデルにおいて生成されたイカリシドＩＩのＸＰドッキング様態との重なり合った結晶構造（図２２Ｄ）。これらの結果は、モデルが、ＸＰで用いられるとき好適であり、イカリシドＩＩに関する分子について予測される結合様態及び相互作用が信頼できるという確実性を提供する。それゆえ、このモデルは、リガンドの設計及び最適化研究に適切である。ＩＣＴをイカリチンの修飾によって生成させ、ＩＣＴのＬｉｇＰｒｅｐ結果（１つの構造のみ）を、イカリシドＩＩドッキングにおいてＰＤＥ５Ａ１について先に生成したリガンドライブラリ及びレセプターグリッドとして用いて、ＳＰドッキングシミュレーションを実行した。シュレディンガーのＳｉｔｅｍａｐ２．４（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を用いて、ＰＤＥ５Ａ１における潜在的な結合ポケットを検索した。ＩＣＴでは、最も良好な相互作用を有する様態が、−１０．７６４Ｋｃａｌ／ｍｏｌのｇｌｉｄｅスコア（Ｇｓｃｏｒｅ）を有し；この様態においてＩＣＴ及びＰＤＥ５Ａ１間：ＩＣＴ及びＤ７６４、ＩＣＴ及びＱ８１７間；ＩＣＴ及びＳ６６３間；ならびにＩＣＴ及びＨ６１３間の４つのＨ結合相互作用が存在する。また、この様態は、結晶構造様態がなすときにかなり良好なサイトマップ結果の疎水性領域と適合する。
【０１９５】
ＩＣＡ及びＩＣＴは、ＰＤＥ５の酵素活性を阻害することができる（図２３）。ＩＣＡ及びＩＣＴによるホスホジエステラーゼ阻害を、ＧＭＰ特異的組み換えウシホスホジエステラーゼタイプＶを用いて、製造者の指示書に示されているように活性対照と同じ濃度でシルデナフィルを用い、ＰｒｏｍｅｇａのＰＤＥ−Ｇｌｏシステムによって測定した。
【０１９６】
ＰＤＥ５シグナリングのスキーム及びそのＰＰ２Ａ及びＳ１００Ａ９との関係を図２４に示す。ＧＴＰは、グアニリルシクラーゼの作用を通してｃＧＭＰに変換される。ＰＤＥ５は、次いで、ＮＯ及びさらなるＧＣのレベルを増加させるＧＭＰの産生に関与する。これは、ＰＤＥ５を含む多くのシグナリング分子をリン酸化するＰＫＣをシミュレーションする。これらのプロセスは、全て、カルシウム、ＳＩＧＬＥＣ３及びＳＩＧＬＥＣ５ならびにＳ１００Ａ９発現の低下をもたらす。Ｓ１００Ａ９は、カルシウムを調節し、サイクルを再開する細胞内の濃度を増加させることが知られている。対照的に、ＰＰ２Ａの活性化は、脱リン酸化、及びＰＤＥ５を含む経路のその後のダウンレギュレーションをもたらす。
【０１９７】
明白であり本発明に固有である他の利点は、当業者に明らかである。ある特定の特徴及びサブ組み合わせは、有用性を有しており、他の特徴及びサブコンビネーションを参照せずに使用されてよいことが理解される。これは、特許請求の範囲によって実施され、該範囲内にある。本発明の多くの可能な実施形態が本発明の範囲から逸脱することなくなされてよいため、添付の図に記載されまたは示されている本明細書における全ての事項は、説明的であって限定的な意味ではないと解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【０１９８】
別途定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、開示されている発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において列挙されている公報、及び該公報が列挙している題材は、具体的に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
当業者は、単なる常套的な実験を用いて、本明細書に記載されている発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識し、または解明することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【外国語明細書】
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