(57)【要約】【課題】癌細胞の増殖を抑制する効果を有し、安全性が高く、安価かつ大量に供給でき、医薬品としてのみならず食品としても有用な癌細胞増殖抑制用組成物であって、新たな有効成分を含有するものを提供する。【解決手段】シイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物を提供する。また、シイタケ菌糸体培養培地を熱水抽出し、該抽出物の乾燥粉末に対し、エタノール及び酢酸エチルの混合溶媒を添加して抽出物を得ることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物。
【請求項２】
前記培養培地はバガス及び米糠を含む培地である、請求項１に記載の癌細胞増殖抑制用組成物。
【請求項３】
前記脂溶性成分はシイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれるものである、請求項１又は２に記載の癌細胞増殖抑制用組成物。
【請求項４】
前記脂溶性成分を１日当たりの摂取量として２.５〜２５０ｍｇ含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌細胞増殖抑制用組成物。
【請求項５】
シイタケ菌糸体培養培地を熱水抽出し、該抽出物の乾燥粉末に対し、エタノール及び酢酸エチルの混合溶媒を添加して抽出物を得ることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記培養培地はバガス及び米糠を含む培地である、請求項５に記載の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法。
【請求項７】
前記混合溶媒のエタノールと酢酸エチルの含有質量比が２０：８０〜５０：５０である、請求項５又は６に記載の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法。
【請求項８】
前記熱水抽出に用いるシイタケ菌糸体培養培地は、シイタケ菌の自己消化を行って得られたものである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シイタケ菌糸体培養培地抽出物に含まれる脂溶性成分を有効成分とする癌細胞増殖抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国において、癌は、１９８１年より死因の第１位であり、２０１５年には、年間約３７万人が亡くなっている。生涯のうちに、約２人に１人が罹患すると推計され、癌は、国民の生命と健康にとって重大な問題である。このことから、癌細胞の増殖を抑制する組成物の開発が望まれており、その安全性の面からも、食用としても摂取できるものを有効成分とすることが望まれている。
【０００３】
食用としても摂取されるものを有効成分とする癌細胞増殖抑制用組成物としては、例えば、特許文献１には、クマザサエキス、プロポリスエキス、霊芝エキス、大豆エキスからなる群から選択される少なくとも１種以上の食品素材を含有し、癌細胞増殖抑制機能を有する、抗癌剤が記載されている。また、特許文献２には、クロカワのレクチンであって、所定の特徴を有するクロカワ由来のレクチンが記載されている。さらに、特許文献３には、白色ないし黄色鹿角霊芝の子実体から得られ、ヒトに対して生理活性を有する物質を含有することを特徴とする熱水抽出物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１９２６０３号公報
【特許文献２】特開２００３−２４６７９９号公報
【特許文献３】特開２０１０−４３０１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような癌細胞増殖抑制用組成物が報告されているが、新たな有効成分を提供できれば需要者に選択の幅が広がる。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、癌細胞の増殖を抑制する効果を有し、安全性が高く、医薬品としてのみならず食品としても有用な癌細胞増殖抑制用組成物であって、新たな有効成分を含有するものを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意研究した結果、シイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分が癌細胞の増殖を抑制する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の１つは、シイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物を提供するものである。本発明の癌細胞増殖抑制用組成物によれば、癌細胞の増殖を抑制することができるので、癌の治療及び／又は予防に有用である。また、安全性が高く、医薬品としてのみならず食品としても有用である。
【０００９】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の有効成分が含まれる前記培養培地は、バガス及び米糠を含む培地であることが好ましい。これによれば、増殖抑制効果がより高いので、癌の治療及び／又は予防により有用である。
【００１０】
また、本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の有効成分である前記脂溶性成分は、シイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれるものであることが好ましい。これによれば、癌細胞の増殖抑制効果がより高いので、癌の治療及び／又は予防により有用である。
【００１１】
さらに、本発明の癌細胞増殖抑制用組成物は、前記脂溶性成分を１日当たりの摂取量として２.５〜２５０ｍｇ含有することが好ましい。これによれば、効率よく有効成分である脂溶性成分を摂取することができる。
【００１２】
なお、本発明において、上記脂溶性成分の含有量は、後述する実施例に記載された方法に従って採取される有効成分である、mL361610＋mL1001610の合計の含有量として規定することとする。
【００１３】
また、本発明のもう１つは、シイタケ菌糸体培養培地を熱水抽出し、該抽出物の乾燥粉末に対し、エタノール及び酢酸エチルの混合溶媒を添加して抽出物を得ることを特徴とする癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法を提供するものである。本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法によれば、癌細胞の増殖を抑制することで、癌の治療及び／又は予防に有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。また、安全性が高く、安価かつ大量に供給でき、医薬品としてのみならず食品としても有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。
【００１４】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法において、前記培養培地はバガス及び米糠を含む培地であることが好ましい。これによれば、癌細胞の増殖抑制効果がより高いので、癌の治療及び／又は予防により有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。
【００１５】
また、本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法において、前記混合溶媒のエタノールと酢酸エチルの含有質量比が２５：７５〜５０：５０であることが好ましい。これによれば、癌細胞の増殖抑制効果がより高い抽出物を得ることができ、癌の治療及び／又は予防により有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。
【００１６】
また、本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法において、前記熱水抽出に用いるシイタケ菌糸体培養培地は、シイタケ菌の自己消化を行って得られたものであることが好ましい。これによれば、癌細胞の増殖抑制効果がより高い抽出物を得ることができ、癌の治療及び／又は予防により有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物によれば、癌細胞の増殖を抑制することができるので、癌の治療及び／又は予防に有用である。また、安全性が高く、医薬品としてのみならず食品としても有用である。したがって、癌の治療及び／又は予防のための食品として、日常的に摂取することも可能である。
【００１８】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の製造方法によれば、癌細胞の増殖を抑制する効果に優れ、癌の治療及び／又は予防に有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。また、安全性が高く、医薬品としてのみならず食品としても有用な癌細胞増殖抑制用組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】シイタケ菌糸体培養培地抽出物（ＬＥＭ）中に含まれる脂溶性成分の調製方法を示す工程図である。
【図２】ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０について、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる成分分析の結果を示す図表である。
【図３】ＬＥＭと比較したｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０の、ラジカル消去活性解析結果を示す図表であって、濃度依存的な活性（Ａ）、反応速度（Ｂ）の結果を示す図表である。
【図４】ＬＥＭ（Ａ）とｍＬ３６１６０（Ｂ）の、Ｋ５６２細胞に対する細胞増殖抑制解析結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に用いられるシイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分は、シイタケ菌糸体を培養した培地から抽出される。
【００２１】
シイタケ菌糸体の培養に用いる培地としては、固体培地、液体培地のいずれも使用できる。培地には植物繊維質原料を用いることが好ましく、さらに植物繊維質原料はリグニンを含有する植物から調製されたものを用いることがより好ましい。リグニンを含有する植物としては、禾本科植物、例えばバガス（さとうきびの搾り粕）、トウモロコシの茎葉、小麦ふすま、米糠、稲藁、及び茅等が好ましく用いられる。特に好ましくは、バガス、熊笹の茎葉、及びトウモロコシの茎から選ばれた少なくとも１種と、米糠とを含む培地が用いられる。また、培地には、必要に応じて他の栄養成分として、酵母エキス、乾燥酵母、クロレラ、スピルリナ、コーンミール、おから等を添加混合してもよい。
【００２２】
シイタケ菌糸体の培養は、上記のような植物繊維質原料を含む培地に、シイタケの菌糸を接種して行う。
【００２３】
固体培地の場合は、水分が６０〜８０質量％となるように調製し、常法に従い高圧蒸気滅菌した後、シイタケ菌糸を接種し、例えば温度が１７〜２５℃に空調された培養室で２〜６か月培養する。培養は、培地中にシイタケ菌糸が蔓延した状態で終了する。培養物を破砕し、必要に応じて少量の水を加え、５０℃以上の熱水に浸潤させ、有効成分を１２〜１８時間熱水抽出する。熱水抽出は、例えば１．２ｋｇ／ｃｍ2の蒸気圧下で１２０℃というような加圧高温下で行うこともできる。
【００２４】
一方、液体培地の場合は、上記のような植物繊維質原料を細かく破砕し、必要に応じて米糠等の他の栄養成分を加え、原料が５〜２０質量％となるように培地を調製した後、通気攪拌培養や振盪培養により、好ましくは２０〜２８℃の温度で７〜６０日間程度培養を行う。培養は、培地のｐＨが３〜４.５に低下し、培地中にシイタケ菌糸が蔓延した状態で終了する。次いで、必要に応じて少量の水を加え、５０℃以上、場合によっては高圧条件下（例えば１．２ｋｇ／ｃｍ2の蒸気圧下）に加熱し、熱水抽出物を採取する。
【００２５】
こうして得られた抽出物を、必要に応じて濾過、遠心分離して濾液、又は上清を採取し、さらに必要に応じて凍結乾燥や噴霧乾燥等の手段によって乾燥し、粉末化することにより、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む抽出物を得ることができる。
【００２６】
なお、培養終了後、熱水抽出を行う前に、培養物は、シイタケ菌糸体に内在する酵素を利用してシイタケ菌糸体を自己消化させてもよい。具体的には、固体培地の場合は培養が終了した培養物を破砕し、必要に応じて少量の水を加え、３０〜６０℃で３〜１２時間処理し、シイタケ菌糸体の酵素反応を進め、自己消化させる。一方、液体培地の場合は、培養物全体を３０〜６０℃で３〜６時間処理し、菌糸体を自己消化させ、液体の懸濁培養物を得る。
【００２７】
さらに、この抽出物から脂溶性成分を抽出する。抽出は、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒により行うことが好ましい。
【００２８】
具体的には、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む抽出物の乾燥粉末にエタノールと酢酸エチルの混合溶媒を加え、攪拌する。攪拌終了後、遠心分離し、回収した上清を乾燥させ、粉末化する。上記エタノールと酢酸エチルの混合溶媒は、エタノールと酢酸エチルの含有質量比が、２５：７５〜５０：
５０であることが好ましく、３０：７０〜４０：６０であることがより好ましい。
【００２９】
なお、上記の、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒を用いて脂溶性成分を抽出する前処理として、酢酸エチルや、上記よりもエタノール含有量が少ない、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒を用いて抽出を行い、その沈殿物を採取して上記エタノールと酢酸エチルの混合溶媒による抽出を行ってもよい。この前処理を行うことで、目的の脂溶性成分以外の不要成分を除去することができるので、最終的に得られる脂溶性成分の純度が高いものとなる。不要成分除去のための前処理に用いる混合溶媒のエタノールと酢酸エチルの含有質量比は、０：１００〜３０：７０であることが好ましく、０：１００〜２５：７５であることがより好ましい。
【００３０】
次に、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒で抽出した抽出液から得た上記粉末を、水に溶解させ、さらに水とクロロホルムを加え、攪拌し分液を行う。クロロホルム溶液を回収後、クロロホルムとジエチルエーテルの混合溶媒を加え、攪拌し分液を行う。クロロホルムとジエチルエーテルの混合溶媒溶液を回収後、ジエチルエーテルを加え、攪拌し分液を行う。すべての有機溶媒相を混合し、濃縮後、乾燥させ、粉末化する。
【００３１】
こうして、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む脂溶性成分を含む抽出物を得ることができる。この脂溶性成分は、後述する実施例に示されるように、ポリフェノール類、フラボノイド類、カロテノイド類、及び／又はヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物を含有している。
【００３２】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物は、所望の形態にして製品化することができる。この場合、製品中に、上記脂溶性成分を１日当たりの摂取量として２.５〜２５０ｍｇ含有させることが好ましく、１０〜６２.５ｍｇ含有させることがより好ましい。この範囲とすることで、効率よく脂溶性成分を摂取することができる。
【００３３】
なお、本発明において、製品中の脂溶性成分の含有量は、後述する実施例に記載された方法に従って採取される有効成分である、mL361610＋mL1001610の合計の含有量を意味するものとする。
【００３４】
製品形態としては、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液又は懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト状等が挙げられる。また、本発明の癌細胞増殖抑制用組成物は、各種の飲食品の原料として添加して、癌の治療及び／又は予防のための飲食品として製品化することもできる。
【００３５】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物の１日当たりの摂取量としては、上記脂溶性成分（後述する実施例に記載の方法で得られるmL361610＋mL1001610の合計の含有量）の摂取量として２.５〜２５０ｍｇ／日が好ましく、１０〜６２.５ｍｇ／日がより好ましい。摂取量が２.５ｍｇより低いと癌細胞増殖抑制効果が十分に得られず、２５０ｍｇよりも多いと、軟便が生じることがある。ただし、摂取量が上記より多くても安全性には問題はない。
【００３６】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物において、上記に記載したシイタケ菌糸体培養培地抽出物中に含まれる脂溶性成分の他に、本発明の目的を損なわない限り、他の成分を含有することに特に制限はない。例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、発色剤、矯味剤、着香剤、酸化防止剤、防腐剤、呈味剤、酸味剤、甘味剤、強化剤、ビタミン剤、膨張剤、増粘剤、界面活性剤等を添加することができる。
【００３７】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物は、医薬品や、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補助食品等の健康食品や、その他の一般の食品等として製品化することができる。
【００３８】
本発明の癌細胞増殖抑制用組成物は、癌の治療及び／又は予防に効果があるため、癌治療／予防剤として有用である。対象とする癌の種類は、特に限定されず、例えば、神経系の癌（例えば、脳腫瘍、頚癌）；消化器系の癌（例えば、口腔癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆道癌、脾臓癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌）；筋骨格系の癌（例えば、肉腫、骨肉種、骨髄腫）；泌尿器系の癌（例えば、膀胱癌、腎癌）；生殖器系の癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌）；呼吸器系の癌（例えば、肺癌）；造血器系の癌（例えば、急性又は慢性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性又は慢性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫）、血管肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、原発性骨髄線維症、血管外膜細胞腫）；甲状腺癌、副甲状腺癌、舌癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫、皮膚組織球腫、脂肪腫、毛包腫瘍、皮膚乳頭腫、皮脂腺腫、基底細胞癌等が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
＜製造例１＞
（１）シイタケ菌糸体培養培地抽出物（以下「ＬＥＭ」という。）の調製
バガス９０質量部と、脱脂米糠１０質量部とを配合し、水分７０％となるように調製して固形培地を作り、常法通り高圧蒸気滅菌した。この固体培地にシイタケ菌糸を接種し、２２℃に温度調節した培養室内で３か月培養し、培地中に菌糸体が蔓延した後、培地を破砕機で親指程度の大きさに破砕した。
【００４１】
破砕した培地を４０℃で６時間処理し、自己消化を促進させた後、抽出タンクに詰め、６０℃の温水を循環させながら１６時間抽出した。得られた抽出液をカートリッジフィルターで濾過し、更にメンブランフィルターで濾過除菌後、濃縮し、凍結乾燥により褐色の粉末（ＬＥＭ）を得た。
【００４２】
（２）ＬＥＭ中に含まれる脂溶性成分の調製
図１にＬＥＭ中に含まれる脂溶性成分の調製方法の工程図を示した。
【００４３】
ＬＥＭ（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量の酢酸エチルを加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化させた。
【００４４】
粉末化した沈殿物（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノール：酢酸エチル＝１３質量％：８７質量％の混合溶媒を加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化させた。
【００４５】
さらに、粉末化した沈殿物（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノール：酢酸エチル＝３６質量％：６４質量％の混合溶媒を加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した上清を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６ｓとした。遠心分離で回収した沈殿物は凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６ｐとした。
【００４６】
得られたｍＬ３６ｐ（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノールを加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ１００ｓとした。
【００４７】
得られたｍＬ３６ｓを超純水に溶解させ、分液ロートに入れた。その後、超純水と等量のクロロホルムを加え、激しく撹拌させ分液を行った。クロロホルム溶液を回収後、超純水と等量のクロロホルム：ジエチルエーテル＝１：１混合溶媒を加え、激しく撹拌させ分液を行った。クロロホルム・ジエチルエーテル混合溶媒溶液を回収後、超純水と等量のジエチルエーテルを加え、激しく撹拌させ分液を行った。全ての有機溶媒相は混合し、エバポレーターで濃縮後、凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６１６１０とした。
【００４８】
得られたｍＬ１００ｓも同様に分液操作を行い、有機溶媒相を粉末化したものをｍＬ１００１６１０とした。
【００４９】
＜実験例１＞
得られた画分ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０について、ＨＰＬＣによる含有成分の分析を行った。
【００５０】
（１）方法
カラムはWakosil-II 5C18 HG（製品名、富士フィルム和光純薬株式会社）を用い、機器はLC-2010C（製品名、株式会社島津製作所）を使用した。移動相はアセトニトリル、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、１−５１％のグラジエントにて逆相クロマトグラフィーを行った。検出波長は２５４、２８０、３５０ｎｍで行った。
【００５１】
（２）結果
図２に、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる成分分析の結果を示した。クロマトチャートの通り、ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０の間に、明確な違いが存在する。メジャーピークとして、ｍＬ３６１６１０では７物質が含有されており、ｍＬ１００１６１０では６物質が含有されている。ｍＬ１００１６１０では、検出波長２５４ｎｍにおける１物質（図２（Ｂ））が完全に消失しており、検出波長３５０ｎｍにおける１物質（図２Ａ）が１／４以下にまで減少している。従って、この２物質は３６％エタノール／酢酸エチル混合溶媒の極性に溶解した物質であり、残りの物質はエタノールに溶解可能な物質であると結論できる。
【００５２】
検出波長２５４ｎｍは、ヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物、及び／又は一連の共役した結合であるカロテノイド類を検出する。検出波長２８０ｎｍは、ヒドロキシ基を持つ芳香環を検出するため、ポリフェノール類と判断される。検出波長３５０ｎｍは、フラボン構造とフラバン構造を検出するため、フラボノイド類と判断される。
【００５３】
以上のことから、ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０には共通に、ポリフェノール類が含有していると考えられる。一方で、ｍＬ３６１６１０には特異的に、カロテノイド類、フラボノイド類、ヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物、及び／又は一連の共役した結合であるカロテノイド類も含有していると考えられる。
【００５４】
＜実験例２＞
得られた画分ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０について、ラジカル消去活性解析を行った。ラジカルの消去活性は物質の抗酸化活性能を示し、活性消去割合が高ければ抗酸化活性が高いことになる。一般的に、生理活性を示す物質は抗酸化活性を示すことが多いため、ＤＰＰＨラジカル消去活性解析を行うことで、物性の大まかな指標となりうる。さらに得られた画分には、ポリフェノール類が含有していることが判明しており、ＬＥＭと比較して高い活性を示すことは、即ち、画分手法の成否にもなる。
【００５５】
（１）方法
100 mM Tris-HCl (pH 7.4)：ＤＭＳＯ：エタノール＝１：１：１の混合溶媒を調整し、ＤＰＰＨ希釈溶液とした。また、２．０ｍｇ／ｍＬとなる様に1,1  - Diphenyl -2- picrylhydrazylをエタノールで溶解し、さらに０．５ｍｇ／ｍＬとなる様にＤＰＰＨ希釈溶液で調整した物を、ＤＰＰＨ溶液とした。
【００５６】
１０μＬのサンプルに９０μＬ  ＤＰＰＨ溶液を加えた物をＳ、１０μＬのサンプルに９０μＬの希釈溶液を加えた物をＳＢ、１０μＬのサンプル希釈溶媒に９０μＬ  ＤＰＰＨ溶液を加えた物をＤ、１０μＬのサンプル希釈溶媒に９０μＬの希釈溶液を加えた物をＤＢとして、室温で反応を行い、２、４、６、８、１０ｍｉｎのそれぞれの時点で５４０ｎｍにて吸光度を測定した。
【００５７】
ＤＰＰＨラジカル消去活性は、ＤＰＰＨラジカル消去割合（％）＝｛１−（Ｓ−ＳＢ）／（Ｄ−ＤＢ）｝×１００として、GraphPad Prism（製品名、有限会社エムデーエフ）を使用して解析した。
【００５８】
（２）結果
図３に、ＬＥＭと比較したｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０の、ラジカル消去活性解析結果を示した。
【００５９】
図３Ａに、濃度依存的な活性の結果を示した。画分どちらもＬＥＭより高い活性を示し、ｍＬ３６１６１０では約７．８倍、ｍＬ１００１６１０では約３．３倍となった。
【００６０】
図３Ｂに、反応速度の結果を示した。画分どちらもＬＥＭより速い反応速度を示し、ｍＬ３６１６１０では約４．４倍、ｍＬ１００１６１０では１．３倍となった。
【００６１】
以上の結果から、得られた画分は、高い抗酸化活性を示す物質を含有していると結論する。また、ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０の違いは２つの物質であるが、この物質の違いが抗酸化活性能の違いを生み出していると結論できる。
【００６２】
＜実験例３＞
得られた画分ｍＬ３６１６１０は、癌細胞に対する細胞増殖抑制効果を有しているか検証した。
【００６３】
（１）方法
ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞（RIKEN CELL BANK）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ/ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ/ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。
【００６４】
細胞を０．６×１０4個となる様に９６ｗｅｌｌプレートに播種した後にサンプルを加えたものをＳ、細胞を播種せずサンプルを加えたものをＳＢ、細胞を０．６×１０4個となる様に９６ｗｅｌｌプレートに播種した後にサンプル希釈溶媒を加えたものをＣ、細胞を播種せず希釈溶媒のみサンプルを加えたものをＣＢとして、２４及び４８時間後の生細胞数を測定することにより、細胞増殖抑制効果を解析した。
【００６５】
生細胞数は、Cell Counting Kit-8（製品名、同仁化学研究所）を用いて、VersaMax Microplate Reader（製品名、モレキュラーデバイスジャパン株式会社）を使用し４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【００６６】
細胞増殖抑制効果は、細胞生存率（％）＝（Ｓ−ＳＢ）／（Ｃ−ＣＢ）×１００として、SoftMax Pro（製品名、
モレキュラーデバイスジャパン株式会社）を使用して数値解析した。
【００６７】
（２）結果
図４に、ＬＥＭ（図４（Ａ））とｍＬ３６１６０（図４（Ｂ））の、Ｋ５６２細胞に対する細胞増殖抑制解析結果を示す。丸は添加２４時間後、四角は添加４８時間後を示し、横軸は添加濃度、縦軸は生細胞の割合を示しており縦軸の値が小さければ小さいほど効果が高いことを示す。
【００６８】
ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は、どちらも濃度依存的に細胞増殖抑制効果を示したが、ｍＬ３６１６１０の方が低い濃度でも細胞増殖抑制効果があることがわかった。
【００６９】
表１に、それぞれのＩＣ50を示す。
【００７０】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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