(57)【要約】      （修正有）【課題】高温において増殖能力が向上した微生物の提供。【解決手段】染色体中の以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊、又は当該遺伝子の発現を抑制した酢酸菌。（ａ）特定の配列からなる塩基配列がコードする、二成分制御系を構成するヒスチジンキナーゼ遺伝子；（ｂ）特定の配列からなる塩基配列がコードする、二成分制御系を構成する応答制御因子ｋｄｐＥ遺伝子；（ｃ）特定の配列からなる塩基配列がコードする、ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体中の以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊、又は当該遺伝子の発現を抑制した酢酸菌。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列、又は配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成する応答制御因子kdpEをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３若しくは４に示す塩基配列、又は配列番号３若しくは４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、LysRタイプ転写調節因子をコードする遺伝子；
【請求項２】
染色体中の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子の全部又は一部が欠失していることを特徴とする請求項１記載の酢酸菌。
【請求項３】
酢酸菌が、アセトバクター属に属する酢酸菌であることを特徴とする請求項１又は２記載の酢酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温耐性能が増強した酢酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌（Acetobacter pasteurianus）は、伝統的に造酢などに用いられている有用微生物である。この酢酸菌は、アルコール及び酢酸に対する耐性や、多種類の有機物の代謝や、多糖、免疫賦活化剤及び食品添加物をはじめとする有用二次代謝産物の生産など非常に多彩な機能を持つ。そのため、ゲノム解析も進められており、本発明者らは、伝統的に工業利用されれきた造酢株である酢酸菌Acetobacter pasteurianus 3283株（IFO 3208-01株）及び同菌株の高温育種耐性株（IFO 3283-01-42C株）の全ゲノム配列を決定した（非特許文献１参照）。
【０００３】
酢酸菌のなかでも、特にアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobactor）に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。アセトバクター属酢酸菌の培養においては、発酵温度が３０℃より高くなると急激に生育能力及び酢酸発酵能力が低下する。このため、通常の発酵は２５℃〜３０℃で行われる。しかし、夏期には気温が３０℃以上になること、また、発酵によって熱が発生するため、酢酸発酵が進むにつれて発酵槽が４０〜４５℃以上となってしまうことがある。したがって発酵槽を２５℃〜３０℃に保つための冷却設備が必要となるが、その費用負担は大きい。
【０００４】
そこで、高温適応能力を有する変異株の開発が進められている。たとえば、タイで耐熱性発酵微生物を分離し、段階的に培養温度を繰り返し培養することにより３９〜４１℃での適応能力が付与された、酢酸発酵能力を有する酢酸菌（特許文献１、非特許文献２参照）や、ｍａｒＲ遺伝子又はｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子を破壊し、高温下での生育能力や酢酸発酵能力を備えた、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法（特許文献２参照）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１１０２９８号公報
【特許文献２】特開２０１４−０６４４７７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shirai et.al., Nucleic AcidsResearch, 2009, Vol.37, No.17
【非特許文献２】Matsutani M et. al., J Biotechnol.165(2):109-119 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、高温において増殖能力が向上した微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
酢酸菌A. pasteurianusのゲノムの情報解析は、食酢業界やゲノム情報源の展開に大きく貢献するだけでなく、産業利用可能な有用遺伝子の探索にも寄与する。すなわち、（1）菌膜多糖形成機構（菌膜多糖、新規多糖の生成の分子機構）、（2）酢酸耐性機構、さらに、(3)酢酸発酵に有害な酢酸過酸化機構、（4）呼吸鎖およびそのエネルギー代謝全般や生育制御系、等をゲノム情報から解明することで、全く新しい有用遺伝子が探索できる可能性も考えられる。そこで、本発明者らは、産業有用性が高いが遺伝学的に解明が進んでいない酢酸菌の示す特異な現象を、発酵生理学・生化学及び遺伝生化学のレベルで明らかにする研究を進めていた。かかる研究の中で、転写調節因子LysR、２成分制御系ヒスチジンキナーゼ又は２成分制御系の応答制御因子kdpEの発現が酢酸菌の高温耐性能に関与することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）染色体中の以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊、又は当該遺伝子の発現を抑制した酢酸菌。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列、又は配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成する応答制御因子kdpEをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３若しくは４に示す塩基配列、又は配列番号３若しくは４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、LysRタイプ転写調節因子をコードする遺伝子；
（２）染色体中の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子の全部又は一部が欠失していることを特徴とする上記（１）記載の酢酸菌。
（３）酢酸菌が、アセトバクター属に属する酢酸菌であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の酢酸菌。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酢酸菌を用いることで、高温で培養しても増殖が可能となり、培養時のコストを低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施例に用いた菌株の名称、特徴、及び入手源を示す図である。
【図２】本実施例に用いたプラスミドの名称、構造、及び入手源を示す図である。
【図３】本実施例に用いたプライマーの名称、ターゲット遺伝子、及び塩基配列を示す図である。
【図４Ａ】本実施例に用いたｐＲＣプラスミドの構築方法を示す図である。
【図４Ｂ】本実施例に用いたｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１３８３０、ｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１３８９０、ｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１５９１０＿１５９２０、ｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１５９１０、及びｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１５９２０プラスミドの構築方法を示す図である。
【図４Ｃ】本実施例に用いたｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１５９３０＿１５９５０、及びｐＲＣ−ＰｏｍｐＡ＿１５９６０プラスミドの構築方法を示す図である。
【図４Ｄ】本実施例に用いたｐΔ０３７９０、ｐΔ１３８３０、ｐΔ１３８９０、及びｐΔ４１７００プラスミドの構築方法を示す図である。
【図５】温度感受性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１）及び高温耐性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ）の網羅的ｍＲＮＡ発現解析により得られた、トランスクリプトームのマッピング結果を示す図である。
【図６】４１℃の温度条件下で、高温耐性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ）において温度感受性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１）よりも発現が低い遺伝子を示す図である。
【図７】４１℃の温度条件下で、高温耐性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ）において温度感受性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１）よりも発現が高い遺伝子を示す図である。
【図８】温度感受性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１）及び高温耐性菌株（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ）の網羅的ｍＲＮＡ発現解析により得られた、ＭＡプロットを示す図である。グラフ中のスポットは各遺伝子の発現レベルを、（Ｌｏｇ２ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋Ｌｏｇ２ＩＦＯ３２８３−０１）／２対ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ（Ｌｏｇ２ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ−Ｌｏｇ２ＩＦＯ３２８３−０１）として示している。３０℃における▲、４１℃における◆で示されるスポットが有意に変化した遺伝子を示す（ＦＤＲ＜０．０１）。
【図９】ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子が、A. pasteurianusの高温耐性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。図中、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８３０」及び「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８９０」は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２ＣにＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子（ＡＰＡ０１＿１３８３０又はＡＰＡ０１＿１３８９０）を導入した菌株をそれぞれ示す。なお、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８３０」は図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01-42C-PompA-APA01_13830」に対応し、「ＩＦＯ ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８９０」は、図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01-42C-PompA-APA01_13890」に対応する。
【図１０】ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子又はそのホモログ遺伝子の破壊が、A.pasteurianusの高温耐性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。図中、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８９０」及び「ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０」は、ＩＦＯ３２８３−０１において、ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子であるＡＰＡ０１＿１３８９０又はＡＰＡ０１＿１３８３０を破壊した菌株をそれぞれ示し、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ０３７９０」及び「ＩＦＯ３２８３−０１Δ４１７００」は、ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子（ＡＰＡ０１＿１３８３０）のホモログであるＡＰＡ０１＿０３７９０又はＡＰＡ０１＿４１７００を破壊した菌株をそれぞれ示す。なお、、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８９０」は図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01ΔAPA01_13890」に対応し、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０」は図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01ΔAPA01_13830」に対応し、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ３７９０」は図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01ΔAPA01_03790」に対応し、「ＩＦＯ３２８３−０１Δ４１７００」は図１中の「A.pasteurianus IFO 3283-01ΔAPA01_41700」に対応する。
【図１１】本発明の遺伝子破壊A. pasteurianus菌株における、ＡＰＡ０１＿０３２７０、ＡＰＡ０１＿０３２９０、ＡＰＡ０１＿１５３２０、ＡＰＡ０１＿１５５００、ＡＰＡ０１＿０５８６０、ＡＰＡ０１＿０６２５０、ＡＰＡ０１＿０７４２０、ＡＰＡ０１＿１６４３０、及びＡＰＡ０１＿１５９２０のｍＲＮＡ発現量を調べた結果を示す図である。
【図１２】本発明の遺伝子破壊A. pasteurianus菌株における、ＡＰＡ０１＿１５９１０、及びＡＰＡ０１＿１５９６０のｍＲＮＡ発現量を調べた結果を示す図である。
【図１３】本発明の遺伝子過剰発現A. pasteurianus菌株の、温度感受性試験の結果を示す図である。図中、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９６０」は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２ＣにおいてＡＰＡ０１＿１５９６０を過剰発現させた菌株を、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９３０＿１５９５０」は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２ＣにおいてＡＰＡ０１＿１５９３０−ＡＰＡ０１＿１５９５０を過剰発現させた菌株を、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９１０＿１５９２０」はＩＦＯ３２８３−０１−４２ＣにおいてＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９２０を過剰発現させた菌株をそれぞれ示す。また、図中、「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９２０」及び「ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９１０」は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２ＣにおいてＡＰＡ０１＿１５９１０又はＡＰＡ０１＿１５９２０を剰発現させた菌株をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明における酢酸菌としては、染色体上の以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊、又は当該遺伝子の発現を抑制した酢酸菌であればよく、かかる酢酸菌を用いれば高温での培養も可能となり、培養時のコストを低減することが可能となる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列、又は配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、二成分制御系を構成する応答制御因子kdpEをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３若しくは４に示す塩基配列、又は配列番号３若しくは４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、LysRタイプ転写調節因子をコードする遺伝子；
【００１３】
本明細書における酢酸菌は、野生型の酢酸菌と比較して４０℃〜４２℃、好ましくは４１℃の高温条件下において培養した場合に増殖能力が高い酢酸菌である。上記増殖能力は、例えば、野生型の酢酸菌及び評価対象の酢酸菌を４１℃条件下で、ＹＰＧＤアガロース培地（上記非特許文献１）等の一般的な酢酸菌培養培地で４８時間培養した後の増殖を確認する方法や、ＹＰＧＤ液体培地で４８時間培養した後の濁度を測定し、その濁度を指標として確認する方法を挙げることができる。培地の濁度は、例えばクレットサマーソン光電光度計（ベルアート社製）を用いて測定することができる。
【００１４】
配列番号１に示す塩基配列からなる、二成分制御系を構成するヒスチジンキナーゼ遺伝子は、アセトバクター・パスツリアナス  ＩＦＯ  ３２８３−０１株の染色体に含まれる遺伝子であり、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてＬｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ０１−ＲＳ０８０４５（Ｏｌｄ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ−１＿１５９１０）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４３５６０７として登録されている。なお、「二成分制御系（two-component system）」とは、細菌の細胞膜に主に存在しており、自己リン酸化活性を示すヒスチジンキナーゼと、リン酸化されたヒスチジンキナーゼと相互作用して応答制御因子から構成されるものである。
【００１５】
配列番号２に示す塩基配列からなる、二成分制御系を構成する応答制御因子kdpE遺伝子は、アセトバクター・パスツリアナス  ＩＦＯ  ３２８３−０１株の染色体に含まれる遺伝子であり、上記ＮＣＢＩにおいてＬｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ０１＿ＲＳ０８０５０（Ｏｌｄ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ−１＿１５９２０）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４３５６０８として登録されている。
【００１６】
配列番号３に示す塩基配列からなる、LysRタイプ転写調節因子遺伝子は、アセトバクター・パスツリアナス  ＩＦＯ  ３２８３−０１株の染色体に含まれる遺伝子であり、上記ＮＣＢＩにおいてＬｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ０１−ＲＳ０６９８０（Ｏｌｄ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ−１＿１３８３０）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４３５４３４として登録されている。なお、「LysRタイプ転写調節因子（LysR type transcriptional
regulator）」とは、DNAに結合して転写を調節するタンパク質である。上記非特許文献１に記載のように、酢酸菌の染色体中にLysRタイプ転写調節因子遺伝子をコードする塩基配列は１０か所以上存在していることが知られている。
【００１７】
配列番号４に示す塩基配列からなる、LysRタイプ転写調節因子遺伝子は、アセトバクター・パスツリアナス  ＩＦＯ  ３２８３−０１株の染色体に含まれる遺伝子であり、上記ＮＣＢＩにおいてＬｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ０１−ＲＳ０１９０５（Ｏｌｄ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ：ＡＰＡ−１＿０３７９０）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４３４６１７として登録されている。
【００１８】
本明細書において、「９０％以上の配列同一性」とは、配列同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を意味する。
【００１９】
上記酢酸菌としては特に制限されないが、アセトバクター・パスツリアヌス、アセトバクター・アセチ（A.aceti）、アセトバクター・アルトアセチゲネス（A.altoacetigenes）等のアセトバクター属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、タンチカロエニア属、アサイア属、アシドモナス属、グラニュリバクター属に属する細菌を挙げることができ、好ましくはアセトバクター属、より好ましくはアセトバクター・パスツリアナスを挙げることができる。
【００２０】
本発明における、「（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊した」とは、（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が改変され、その遺伝子本来の機能を低下又は欠失させることを意味する。遺伝子を改変する方法としては、対象となる遺伝子をコードする塩基配列情報に基づき、かかる遺伝子をコードする塩基配列の全部又は一部の塩基の欠失、置換、若しくは挿入をさせる方法や、かかる遺伝子に紫外線照射やニトロソグアニジン等の突然変異誘導物質処理により突然変異を誘導する方法を挙げることができる。なお、遺伝子をコードする塩基配列の全部又は一部の塩基の欠失、置換、若しくは挿入は、相同組換え技術や、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、若しくはCRISPR-Cas9の組み合わせを利用したゲノム編集技術等により行うことができる。
【００２１】
本明細書において、「遺伝子の全部又は一部が欠失」とは、遺伝子を構成する全ての塩基が欠失、又は遺伝子を構成する塩基のうち、例えば９５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは５％以上の塩基が欠失することを意味する。
【００２２】
本発明における、「（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子の発現を抑制した」とは、（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子の発現量が低下若しくは発現を失うことを意味する。遺伝子の発現を抑制する方法としては、対象となる遺伝子をコードする塩基配列情報に基づき設計され、前記対象となる遺伝子の発現を抑制するsiRNA、shRNA、miRNA又はリボザイムを用いる方法を挙げることができる。
【００２３】
（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の遺伝子が破壊、又は発現が抑制したか否かは、ターゲットとする遺伝子をＰＣＲによって増幅して確認する方法や、破壊又は発現を抑制した遺伝子のｍＲＮＡの発現量やかかる遺伝子がコードするタンパク質の量を公知の遺伝子解析手法若しくはタンパク質解析手法により解析する方法によって確認することができる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［材料と方法］
（１）菌株、培地、培養条件、及びプラスミド
本実施例において使用した全ての菌株を図１に示す。遺伝子操作のための大腸菌（Escherichia  coli:E.  coli）株はluria-bertani  medium（Sambrook,  J.,  E.F.Fritsch  and  T.Maniatis.  (1989).  Molecular  Cloning:  A Laboratory  Manual,  2nd  edn.  Cold  Spring  Harbor,  NY:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press.）を用いて培養した。
【００２６】
アセトバクター属酢酸菌（A. pasteurianus）及び組換え菌株は、１．０％酵母エキス、１．０％ポリペプトン、２．０％グリセロール、及び０．５％グルコースを含むＹＰＧＤ培地を用いて、３０℃又は４１℃で培養した。また、ＲＮＡシークエンス(RNA-seq)及び定量ＰＣＲ（Quantitative PCR:ｑPCR）のためのA. pasteurianusは、上記ＹＰＧＤ培地によって対数増殖期（ＯＤ６００＝０．５）まで培養した。必要に応じて、大腸菌用の培地にはカナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように、A. pasteurianus用の培地にはカナマイシンを最終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、本明細書において使用した全てのプラスミドを図２に示す。プラスミドの作製は、QIAprep  Spin  Miniprep  kit（キアゲン社製）を用い、キットに添付の使用説明書に沿って行った。
【００２７】
（２）ＲＮＡシークエンスライブラリの作製
RNeasy  Mini  kit（キアゲン社製）を用いてA.  pasteurianusから全ＲＮＡを抽出し、さらに、Ribo-zero rRNA  Removal  Kit  for  Gram-negative  bacteria（Epicentre社製）を用いてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を除去した。サンプルは、対数増殖期（ＯＤ６００＝０．５）の培養物（ｎ＝３）から採取した。ｒＲＮＡを除去した全ＲＮＡは、分光光度計（NanoDrop, ND-1000；Thermo Fisher Scientific社製）により定量し、ゲル電気泳動及びキャピラリー電気泳動（Bioanalyzer；Agilent Technologcies社製）により純度を確認した。ＲＮＡ（２００ｎｇ以上）を、ＲＮａｓｅIIIを用いて３７℃で１０分間処理して断片化し、スピンカラムにより精製した。逆転写反応では、ＲＮＡにアダプターをライゲートさせた後、ArrayScript（Thermo Fisher Scientific社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。磁気ビーズ（AMPure XP；Beckman Coulter Inc社製）を用いて精製した後、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Thermo Fisher Scientific社製）及びバーコード標識３’プライマーを用いて、ｃＤＮＡを１５サイクル増幅した。PureLink PCR Nano columnにより増幅産物を精製した後に、かかる増幅産物の濃度及び純度を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）を用いた定量ＰＣＲ及びBioanalyzerによりそれぞれ測定した。
【００２８】
（３）ＳＯＬｉＤ５５００によるＲＮＡ配列解析
SOLiD EZ Bead Emulsifier（Thermo Fisher Scientific社製）及びＥ２０ビーズを用い、使用説明書に従って８pmolのｃＤＮＡライブラリを乳化し、さらに、SOLiD EZ Bead
Amplifier（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物とビーズの混合物をSOLiD Enricher（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて濃縮し、NanoDropにより定量した。ビーズ（３．６×１０８ビーズ）が混在したｃＤＮＡをSOLiD5500シークエンサーにアプライし、全ＤＮＡ配列を自動反応により決定した。配列の生データはＤＲＡ研究アクセッション番号ＤＲＡ００６３０５としてＤＤＢＪデータベースにデポジットされた。バイオプロジェクトＩＤはＰＲＪＤＢ６４８１である。
【００２９】
（４）リード解析
参照ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＰ０１１１２１）に対するショートリード配列のマッピング、及びリードのカウントは、市販のCLC Genomics Workbench（ＣＬＣ Ｂｉｏ社製）を用いて行った。ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析は次のパラメータにより行った。リードのトリミングについては、「ambiguous limit」を２に、「minimum number of
nucleotides in the reads」を２に、「quality limit」を０．０１にそれぞれ設定した。リードのマッピングについては、「number of mismatch」を２に、「number of insertions」を３に、「number of deletions」を３に、「number of color
errors」を３にそれぞれ設定した。ＲＰＫＭ（Reads Per Kilobase of exon
Model per million mapped reads）は、Mortazaviらの論文（Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L. & Wold,
B. (2008). Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat
Methods 5, 621-628.）の手法を用いて算出した。
【００３０】
（５）発現変動遺伝子解析
発現変動遺伝子（ＤＥＧｓ）は、リード数データ及びＤＥＳｅｑパッケージ（Anders,  S.  &  Huber,  W.  (2010).  Differential  expression  analysis  for  sequence  countdata.  Genome  Biol  11,  R106.）を用いて同定した。上記ＤＥＳｅｑパッケージは上記ＤＥＧｓを同定するためにfalse discovery rate（ＦＤＲ）を使用した。本解析においては、ＦＤＲが０．０１未満の遺伝子をＤＥＧｓと見なした。
【００３１】
（６）定量ＰＣＲ
対数増殖期（ＯＤ６００＝０．５）にあるA. pasteurianusの各株から、RNeasy Mini kit (キアゲン社製)を用いて全ＲＮＡを抽出した。RNase-Free DNase RQ1処理により（プロメガ社製）、全ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去した。具体的には、５μｇの全ＲＮＡに１ユニットのRNase-Free DNase RQ1を加え、３７℃で３０分間処理した。処理後の全ＲＮＡをRNeasy Mini（キアゲン社製）を用いて精製した。逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、ＰＣ−８１８サーマルサイクラー（ＡＳＴＥＣ社製）において逆転写反応を行った。具体的には、２．５ｐｍｏｌの９ｍｅｒランダムプライマー（タカラバイオ社製）及び２００ユニットの逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅを含む、４０μの反応液中で２００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写を行った。
【００３２】
また、定量ＰＣＲは、SYBR Green PCR Master Mixを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ
ｑＰＣＲサーマルサイクラー（Thermo Fisher Scientific社製）において行った。具体的には、各ターゲット遺伝子に対して、１．２５ｎｇのｃＤＮＡを用いてｑＰＣＲを行った。
【００３３】
検量線は、ＩＦＯ３２８３−０１のｃＤＮＡを用いて、各遺伝子に対して作成し、ターゲットｍＲＮＡの量を相対的に定量した。各サンプルにおいて、ターゲットｍＲＮＡは１６ＳリボソームＲＮＡの発現に対して標準化した。全てのｑＰＣＲ実験はデュプリケイトで行った。
【００３４】
（７）組換えプラスミドの構築
本実施例に使用した全てのプライマーを図３に示す。ＰＣＲは、Prime Star HS（タカラバイオ社製）を用い、その使用説明書に従って、ＰＣ−８１８サーマルサイクラー（ＡＳＴＥＣ社製）において行った。全てのプラスミドの構築は図４Ａ〜Ｄに示すとおりに行った。
【００３５】
（８）組換え菌株の作製
ライゲーションした組換えプラスミドを用いて、E. coliの形質転換を行った。コンピテント細胞はInoue法（Inoue, H., Nojima, H. & Okayama,  H.  (1990).  High  efficiency  transformation  of  Escherichia  coli  with  plasmids.  Gene  96,  23-28.）によって作製した。ターゲット遺伝子を除去するために、配列番号64に示すプライマーｉｎｓＦ及び配列番号65に示すプライマーｉｎｓＲ（図３）を用いたＰＣＲにより、プラスミド（ｐΔ０３７９０、ｐΔ１３８３０、ｐΔ１３８９０、又はｐΔ４１７００）の関連領域を増幅した。具体的には、A. pasteurianusを１８℃のＹＰＧＤ培養液中で対数増殖期（ＯＤ６００＝０．５）まで培養し、遠心分離（５０００Ｇ、５分間）によって回収した。７％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＴＢバッファー（１２．４ｍＭ
ＰＩＰＥＳ、２１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、３１１．８ｍＭ ＫＣｌ、８０．７ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．８）によりペレットを懸濁した後に、１μｇのＰＣＲ断片を加え、４２℃で９０秒間ヒートショックを行った。ヒートショック後のA. pasteurianusにＹＰＧＤブロスを加えて、３０℃で２時間インキュベートした。かかる溶液を、カナマイシンを含むＹＰＧＤアガロースプレートに塗布し、３０℃で４８時間インキュベートした。ターゲット遺伝子の欠損は、適切なプライマーを用い、組換え菌株コロニーをテンプレートとして用いたＰＣＲによって確認した。
【００３６】
（９）温度感受性試験
培養後の各菌株を、同一の細胞数となるように希釈し、３０℃又は４１℃のＹＰＧＤアガロースプレートにスポットした。
【実施例２】
【００３７】
［網羅的ｍＲＮＡ発現解析のためのＲＮＡ−ｓｅｑ］
酢酸菌ＩＦＯ３２８３−０１及びＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ（非特許文献１参照）をそれぞれ３０℃及び４１℃で培養した後に、ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて網羅的ｍＲＮＡ発現解析を行い、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの高温耐性に寄与する遺伝子を同定した。これまでの研究において、Azumaらは制限温度として４２℃における高温耐性を調べ、ＩＦＯ３２８３−０１が４０．５℃又はそれ以上の環境では増殖しないことを非特許文献１において報告している。このため、本発明者らは、高温が遺伝子発現に及ぼす影響を最小化するために、制限温度として４１℃を選択した。以上の解析によるトランスクリプトームのマッピング結果を図５に、ＦＤＲ＜０．０１の発現変動遺伝子（ＤＥＧｓ）は図６及び図７に、ＭＡプロット（３０℃におけるＩＦＯ３２８３−０１  ｖｓ  ４１℃におけるＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ）は図８にそれぞれ示す。
【００３８】
４１℃で増殖させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおいて、ＩＦＯ３２８３−０１よりも発現が低い遺伝子は、ＡＰＡ０１＿０３２６０、ＡＰＡ０１＿０３２７０、ＡＰＡ０１＿０３２８０、ＡＰＡ０１＿０３２９０、ＡＰＡ０１＿１５３２０、ＡＰＡ０１＿１５４９０、ＡＰＡ０１＿１５５００、ＡＰＡ０１＿１５９２０、ＡＰＡ０１＿１５９４０、ＡＰＡ０１＿１５９５０、及びＡＰＡ０１＿１５９６０であった。なお、「ＡＰＡ０１−ＸＸＸＸＸ」とは、非特許文献１のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔａｂｌｅ  Ｓ２において記載されているＩＦＯ３２８３−０１の染色体の位置を表す。これらの遺伝子のいくつかは、ゲノム上でクラスターを形成していると考えられた。そのようなクラスターとしては、ＡＰＡ０１＿０３２６０−ＡＰＡ０１＿０３２７０−ＡＰＡ０１＿０３２８０、ＡＰＡ０１＿１５４９０−ＡＰＡ０１＿１５５００、及びＡＰＡ０１＿１５９２０−ＡＰＡ０１＿１５９４０−ＡＰＡ０１＿１５９５０−ＡＰＡ０１＿１５９６０（ＡＰＡ０１＿１５９１０からＡＰＡ０１＿１５９６０の遺伝子クラスターの一部）を挙げることができる（図６）。
【００３９】
４１℃で増殖させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおいて、ＩＦＯ３２８３−０１よりも発現が高い遺伝子は、ＡＰＡ０１＿０５８６０、ＡＰＡ０１＿０６２５０、ＡＰＡ０１＿０７４２０、ＡＰＡ０１＿１６３３０、ＡＰＡ０１＿１６３４０、ＡＰＡ０１＿１６３５０、ＡＰＡ０１＿１６３７０、ＡＰＡ０１＿１６３８０、ＡＰＡ０１＿１６３９０、ＡＰＡ０１＿１６４００、ＡＰＡ０１＿１６４１０、ＡＰＡ０１＿１６４２０、及びＡＰＡ０１＿１６４３０であった。これらの遺伝子のうち、ＡＰＡ０１＿１６３３０、ＡＰＡ０１＿１６３４０、ＡＰＡ０１＿１６３５０、ＡＰＡ０１＿１６３７０、ＡＰＡ０１＿１６３８０、ＡＰＡ０１＿１６３９０、ＡＰＡ０１＿１６４００、ＡＰＡ０１＿１６４１０、ＡＰＡ０１＿１６４２０、及びＡＰＡ０１＿１６４３０はゲノム上でクラスター（ＡＰＡ０１＿１６３３０からＡＰＡ０１＿１６４３０の遺伝子クラスターの一部）を形成していると考えられた（図７）。
【００４０】
また、以下の実施例５で述べるように、ＡＰＡ０１＿０３２７０、ＡＰＡ０１＿０３２９０、ＡＰＡ０１＿１５３２０、ＡＰＡ０１＿１５５００、ＡＰＡ０１＿１５９２０、ＡＰＡ０１＿０５８６０、ＡＰＡ０１＿０６２５０、ＡＰＡ０１＿０７４２０、及びＡＰＡ０１＿１６４３０の発現はｑＰＣＲによってさらに確認した（図１１）。その結果、上記解析結果と同様の結果が、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によっても認められた。以上のことから、４１℃で増殖させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃでは、ＩＦＯ３２８３−０１と比較して、様々な遺伝子の発現が変動することが明らかとなった。このような遺伝子の変動には、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおける９２ｋｂの広域ゲノム欠損領域においてコードされる転写調節因子が関与している可能性が考えられた。
【実施例３】
【００４１】
［ＬｙｓＲタイプ転写調節因子ＡＰＡ０１＿１３８３０の再導入による、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの高温耐性の消失］
２つのＬｙｓＲタイプ転写調節因子（ＡＰＡ０１＿１３８３０及びＡＰＡ０１＿１３８９０）は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおける９２ｋｂの広域ゲノム欠損領域においてコードされている。これらの２つの遺伝子が、高温耐性の表現型に及ぼす影響を調べるために、それぞれの遺伝子をクローン化してＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃに導入し、温度感受性試験を行った。
【００４２】
この試験では、ＡＰＡ０１＿１３８３０及びＡＰＡ０１＿１３８９０を発現させるためにｏｍｐＲプロモーターを用いた。なぜなら、ｏｍｐＲは３０℃及び４１℃の温度条件において、ＩＦＯ３２８３−０１及びＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃに常に発現しているからである（３０℃でのＩＦＯ３２８３−０１におけるｏｍｐＲのＲＰＫＭ＝９１４８６、４１℃でのＩＦＯ３２８３−０１におけるｏｍｐＲのＲＰＫＭ＝４７８６５、３０℃でのＩＦＯ３２８３−０１−４２におけるｏｍｐＲのＲＰＫＭ＝１４７２８０、４１℃でのＩＦＯ３２８３−０１−４２におけるｏｍｐＲのＲＰＫＭ＝７７９７６）。
【００４３】
温度感受性試験の結果、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ、及び、ＡＰＡ０１＿１３８９０を発現するように形質転換されたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８９０と名付けた）は、４１℃において耐熱性を示すことが明らかとなった（図９  上から２段目、４段目。一方、ＩＦＯ３２８３−０１及びＡＰＡ０１＿１３８３０により形質転換されたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１３８３０と名付けた）は、４１℃において温度感受性を示すことが明らかとなった（図９  上から１段目、３段目）。これらの結果から、ＬｙｓＲタイプ転写調節因子ＡＰＡ０１＿１３８３０の欠損が、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおける高温耐性の一因となっていることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４４】
［ＡＰＡ０１＿１３８３０の破壊による、ＩＦＯ３２８３−０１株の高温耐性獲得］
A. pasteurianusにおける高温耐性へのＡＰＡ０１＿１３８３０の関与を確認するために、カナマイシン耐性カセットのダブルクロスオーバーによる相同組換えを介して、ＩＦＯ３２８３−０１株のＡＰＡ０１＿１３８３０を欠損するように破壊し、温度感受性試験を行った。ＡＰＡ０１＿１３８３０破壊ＩＦＯ３２８３−０１（ＩＦＯ３２８３−１Δ１３８３０と名付けた）は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃと類似した高温耐性を示した（図１０）。この結果から、ＡＰＡ０１＿１３８３０の欠損が、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおける高温耐性の主な原因となることが示唆された。
【００４５】
また、ＩＦＯ３２８３−０１のゲノムには、ＡＰＡ０１＿１３８３０のホモログが複数認められる。これらのホモログのうち、ＡＰＡ０１＿０３７９０はＡＰＡ０１＿１３８３０と高い類似性を示す（ｅ値＝４ｅ−３１）。そこで、本発明者らはＡＰＡ０１＿０３７９０を破壊して、高温耐性に及ぼす影響を調べた。ＡＰＡ０１＿０３７９０破壊ＩＦＯ３２８３−０１（ＩＦＯ３２８３−０１Δ０３７９０と名付けた）は、ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０及びＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃと比較して、部分的な高温耐性を示した（図１０）。
【００４６】
さらに、ＩＦＯ３２８３−０１プラスミド中でコードされているＡＰＡ０１＿４１７００も、ＡＰＡ０１＿１３８３０と高い類似性を示す（ｅ値＝５ｅ−３６）。このため、本発明者らはＡＰＡ０１＿４１７００を破壊して、高温耐性に及ぼす影響を調べた。しかし、ＡＰＡ０１＿４１７００破壊ＩＦＯ３２８３−０１（ＩＦＯ３２８３−０１Δ４１７００と名付けた）は、ＩＦＯ３２８３−０１と同様に、高温耐性を示さなかった（図１０）。また、本発明者らはＡＰＡ０１＿１３８９０破壊ＩＦＯ３２８３−０１（ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８９０と名付けた）を作製してその高温耐性を調べた。図１０に示すように、ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８９０は、ＩＦＯ３２８３−０１と同様に、高温耐性を示さなかった。
【００４７】
これらの結果から、ＡＰＡ０１＿１３８３０（ＬｙｓＲタイプ転写調節因子遺伝子）、及びＡＰＡ０１＿０３７９０（ＩＦＯ３２８３−０１のゲノム上に存在するＡＰＡ０１＿１３８３０のホモログ遺伝子）の欠損によって、A. pasteurianusが高温耐性を獲得することが示唆された。参照のために、以下の表１に実施例４において作製された遺伝子破壊A. pasteurianus株をまとめた。
【００４８】
【表１】
2020162500.tif 000002
【実施例５】
【００４９】
［ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０における、二成分制御系因子ＡＰＡ０１＿１５９２０のダウンレギュレート］
ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの高温耐性に関連する遺伝子を同定するために、ｑＰＣＲによって高温耐性菌株ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ、温度感受性菌株ＩＦＯ３２８３−０１、及びＡＰＡ０１−１３８３０欠損ＩＦＯ３２８３−０１（ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０）における、３０℃又は４１℃培養条件下での以下の（ａ）〜（ｉ）の遺伝子発現を調べた。
（ａ）トランスポーターＥａｍＡであるＡＰＡ０１＿０３２７０（ＡＰＡ０１＿０３２６０−ＡＰＡ０１＿０３２８０遺伝子クラスターによりコードされる）；
（ｂ）仮想タンパク質であるＡＰＡ０１＿０３２９０；
（ｃ）仮想タンパク質であるＡＰＡ０１＿１５３２０；
（ｄ）アスパラギン酸：アラニンアンチポーターであるＡＰＡ０１＿１５５００（ＡＰＡ０１＿１５４９０−ＡＰＡ０１＿１５５００遺伝子クラスターによりコードされる）；
（ｅ）仮想タンパク質であるＡＰＡ０１＿０５８６０；
（ｆ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼであるＡＰＡ０１＿０６２５０；
（ｇ）ＮＡＤＨ−キノン酸化還元酵素ｃｈａｉｎ ＭであるＡＰＡ０１＿０７４２０；
（ｈ）ＮＡＤＨ−キノン酸化還元酵素ｃｈａｉｎ ＡであるＡＰＡ０１＿１６４３０（ＡＰＡ０１＿１６３３０−ＡＰＡ０１＿１６４３０遺伝子クラスターによりコードされる）；
（ｉ）二成分制御系因子ＫｄｐＥであるＡＰＡ０１＿１５９２０（ＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９６０遺伝子クラスターによりコードされる)；
【００５０】
図１１に示すように、４１℃条件下で、ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０における、上記（ａ）〜（ｈ）の発現は、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃではなく、ＩＦＯ３２８３−０１と類似していた。一方、４１℃条件下で、ＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０における上記（ｉ）の発現はＩＦＯ３２８３−０１ではなく、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃと類似している、すなわちＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０においてＡＰＡ０１＿１５９２０（二成分制御系因子ＫｄｐＥ）は４１℃の培養条件下ではダウンレギュレートされていることが明らかとなった。
【００５１】
３０℃条件下でのＡＰＡ０１＿１５９２０（二成分制御系因子ＫｄｐＥ）の発現比はＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０、ＩＦＯ ３２８３−０１、及びＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの間でほぼ同一であった（図１１）。
【００５２】
また、ＡＰＡ０１＿１５９１０（二成分制御系因子ヒスチジンキナーゼ）やＡＰＡ０１＿１５９６０（仮想タンパク質）の発現比もＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃではなく、ＩＦＯ３２８３−０１及びＩＦＯ３２８３−０１Δ１３８３０と類似していた（図１２）。
【００５３】
以上の結果から、ＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９６０遺伝子クラスターによりコードされる遺伝子の発現レベルの変化が、A. pasteurianusの高温耐性獲得に関与することが示唆された。
【実施例６】
【００５４】
［二成分制御系センサー及び応答因子ＡＰＡ０１＿１５９１０−１５９２０の過剰発現による、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの高温耐性の低下］
ＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９６０遺伝子クラスターに含まれる遺伝子をＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃにおいて過剰発現させ、高温耐性に寄与する遺伝子を同定するための試験を行った。ＡＰＡ０１＿１５９６０又はＡＰＡ０１＿１５９３０−ＡＰＡ０１＿１５９５０を過剰発現させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ（それぞれＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９６０、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９３０＿１５９５０と名付けた）では、４１℃においてＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃと同程度の高温耐性が認められた（図１２）。一方、ＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９２０を過剰発現させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ（ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９１０＿１５９２０と名付けた）では、４１℃において温度感受性が認められた（図１３）。
【００５５】
続いて、ＡＰＡ０１＿１５９１０又はＡＰＡ０１＿１５９２０を剰発現させたＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃを作製し（それぞれＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９１０、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃ＋１５９２０と名付けた）、４１℃の条件下で高温耐性を調べた結果、両方の株でＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃと同程度の高温耐性が認められた（図１３）。
【００５６】
以上の結果から、ＡＰＡ０１＿１５９１０−ＡＰＡ０１＿１５９６０遺伝子クラスターに含まれる遺伝子のうち、二成分制御系遺伝子ＡＰＡ０１＿１５９１０−１５９２０が高温耐性に関与することが示唆された。また、ＩＦＯ３２８３−０１−４２Ｃの高温耐性を抑制するためには、ＡＰＡ０１＿１５９１０及びＡＰＡ０１＿１５９２０のいずれかの発現を抑制すればよいことが示唆された。参照のために、以下の表２に実施例６において作製された遺伝子過剰発現A. pasteurianus株をまとめた。
【００５７】
【表２】
2020162500.tif 000003
【図１】
2020162500.tif 000004
【図２】
2020162500.tif 000005
【図３】
2020162500.tif 000006
【図４Ａ】
2020162500.tif 000007
【図４Ｂ】
2020162500.tif 000008
【図４Ｃ】
2020162500.tif 000009
【図４Ｄ】
2020162500.tif 000010
【図５】
2020162500.tif 000011
【図６】
2020162500.tif 000012
【図７】
2020162500.tif 000013
【図８】
2020162500.tif 000014
【図９】
2020162500.tif 000015
【図１０】
2020162500.tif 000016
【図１１】
2020162500.tif 000017
【図１２】
2020162500.tif 000018
【図１３】
2020162500.tif 000019
【配列表】
2020162500000001.app