(57)【要約】【課題】核酸の回収率を効果的に高めることができる、核酸の回収方法を提供する。【解決手段】核酸を吸着体４に吸着させる工程と、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて、吸着体４に吸着された核酸を回収する工程と、を備える、核酸の回収方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を吸着体に吸着させる工程と、
非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて、前記吸着体に吸着された核酸を回収する工程と、
を備える、核酸の回収方法。
【請求項２】
前記非プロトン性の極性化合物を含む回収液が、水をさらに含む、請求項１に記載の核酸の回収方法。
【請求項３】
前記回収液中における非プロトン性の極性化合物の濃度が、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１又は２に記載の核酸の回収方法。
【請求項４】
前記回収液中における非プロトン性の極性化合物の濃度が、１０ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の回収方法。
【請求項５】
前記非プロトン性の極性化合物が、ピロリドン、ホルムアミド、スルホキシド、アセトアミド、アセトニトリル、及びその誘導体、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、ＴＨＦ、ジオキサン、エチレングリコール、プロピレングリコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、並びにトリリン酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸の回収方法。
【請求項６】
前記非プロトン性の極性化合物が、非プロトン性極性溶媒である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸の回収方法。
【請求項７】
前記吸着体が、シリカ、ガラス、ヒドロキシアパタイト、タルク、モンモリロナイト、及びゼオライトからなる群から選択された少なくとも１種により構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の回収方法。
【請求項８】
前記吸着体が、キトサン及びヒスチジンポリマーのうち少なくとも一方により構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の回収方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸の回収方法により核酸を回収する回収工程と、
前記回収工程で回収した回収液に含まれる前記核酸の増幅反応を行なう核酸増幅工程と、
を備える、核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記核酸増幅工程の前に、前記回収工程で回収した回収液を希釈する希釈工程をさらに備える、請求項９に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記希釈工程により、前記核酸の増幅反応を行なう際の前記非プロトン性の極性化合物の濃度を２ｍｏｌ／Ｌ以下とする、請求項１０に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸の回収方法又は請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸増幅方法に用いられるマイクロ流体デバイスであって、
流体を送液する流路と、前記流路内に配置されており、核酸を吸着及び単離させるための吸着体とを有する、チップを備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
流体を送液する流路と、前記流路内に配置されており、核酸を吸着及び単離させるための吸着体とを有する、チップを備え、
前記流路内に、非プロトン性の極性化合物を含む回収液が配置されている、マイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記チップが、回収された前記核酸を増幅する反応場をさらに有する、請求項１２又は１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
前記チップが、回収液を希釈するための希釈用流路をさらに備える、請求項１４に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の回収方法、核酸増幅方法、及びマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ウイルス、細菌、真菌、又は細胞等の試料に含まれるＲＮＡやＤＮＡなどの核酸を回収する方法として、試料から核酸を抽出した後に、アルコールなどの析出試薬を添加することにより、核酸を析出させ、フィルタリングする方法が広く用いられている。
【０００３】
下記の特許文献１には、生物学的試料から核酸を回収する方法が開示されている。特許文献１では、水溶性の中性ポリマーが、酸化セリウムの表面に吸着した担体に核酸を吸着させ、該核酸が吸着した担体に溶出液を加えることにより、核酸が回収されている。また、特許文献１では、核酸を回収するための溶出液として、緩衝液が好ましい旨が記載されている。また、非特許文献１では、核酸を吸着させる担体にキトサンが用いられることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１７／１５９７６３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Weidong Cao et al. Analytical Chemistry, Vol. 78, No. 20, 7222-7228, October 15, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、吸着体に吸着した核酸を回収するに際しては、特許文献１のような緩衝液や、水が用いられることが多い。
【０００７】
本発明者らは、核酸を回収するに際して、回収液に緩衝液や水を用いた場合、吸着体に強固に吸着した核酸を回収することが難しく、核酸の回収率を十分に高められない場合があることを見出した。また、非特許文献１のように吸着体にポリアミン系化合物を用いた場合、アミンを非電離状態にして核酸との結合力を低下させるため、回収液を塩基性にする必要があるが、この場合、後工程における検査や分析において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅反応が阻害されることがあることを見出した。
【０００８】
本発明の目的は、核酸の回収率を効率よく高めることができる、核酸の回収方法、核酸増幅方法、及びマイクロ流体デバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸の回収方法は、核酸を吸着体に吸着させる工程と、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて、前記吸着体に吸着された核酸を回収する工程と、を備える。
【００１０】
本発明に係る核酸の回収方法のある特定の局面では、前記非プロトン性の極性化合物を含む回収液が、水をさらに含む。
【００１１】
本発明に係る核酸の回収方法の他の特定の局面では、前記回収液中における非プロトン性の極性化合物の濃度が、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上である。
【００１２】
本発明に係る核酸の回収方法のさらに他の特定の局面では、前記回収液中における非プロトン性の極性化合物の濃度が、１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１３】
本発明に係る核酸の回収方法のさらに他の特定の局面では、前記非プロトン性の極性化合物が、ピロリドン、ホルムアミド、スルホキシド、アセトアミド、アセトニトリル、及びその誘導体、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン等のケトン類、ＴＨＦ、ジオキサン等のエーテル類、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル、並びにトリリン酸エステル等のエステル類からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００１４】
本発明に係る核酸の回収方法のさらに他の特定の局面では、前記非プロトン性の極性化合物が、非プロトン性極性溶媒である。
【００１５】
本発明に係る核酸の回収方法のさらに他の特定の局面では、前記吸着体が、シリカ、ガラス、ヒドロキシアパタイト、タルク、モンモリロナイト、及びゼオライトからなる群から選択された少なくとも１種により構成されている。
【００１６】
本発明に係る核酸の回収方法のさらに他の特定の局面では、前記吸着体が、キトサン及びヒスチジンポリマーのうち少なくとも一方により構成されている。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅方法は、本発明に従って構成される核酸の回収方法により核酸を回収する回収工程と、前記回収工程で回収した回収液に含まれる前記核酸の増幅反応を行なう核酸増幅工程と、を備える。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅方法のある特定の局面では、前記核酸増幅工程の前に、前記回収工程で回収した回収液を希釈する希釈工程をさらに備える。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅方法の他の特定の局面では、前記希釈工程により、前記核酸の増幅反応を行なう際の前記非プロトン性の極性化合物の濃度を２ｍｏｌ／Ｌ以下とする。
【００２０】
本発明に係るマイクロ流体デバイスの広い局面では、本発明に従って構成される核酸の回収方法又は核酸増幅方法に用いられるマイクロ流体デバイスであって、流体を送液する流路と、前記流路内に配置されており、核酸を吸着及び単離させるための吸着体とを有する、チップを備える。
【００２１】
本発明に係るマイクロ流体デバイスの他の広い局面では、流体を送液する流路と、前記流路内に配置されており、核酸を吸着及び単離させるための吸着体とを有する、チップを備え、前記流路内に、非プロトン性の極性化合物を含む回収液が配置されている。
【００２２】
本発明に係るマイクロ流体デバイスのある特定の局面では、前記チップが、回収された前記核酸を増幅する反応場をさらに有する。
【００２３】
本発明に係るマイクロ流体デバイスの他の特定の局面では、前記チップが、回収液を希釈するための希釈用流路をさらに備える。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、核酸の回収率を効率よく高めることができる、核酸の回収方法、核酸増幅方法、及びマイクロ流体デバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る核酸の回収方法で用いるチップを示す模式的平面図である。
【図２】図２は、図１中のＡ−Ａ線に沿う部分の模式的断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００２７】
本発明に係る核酸の回収方法においては、まず、核酸を吸着体に吸着させる。次に、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて、吸着体に吸着された核酸を回収する。
【００２８】
本発明に係る核酸の回収方法は、上記の構成を備えるので、核酸の回収率を効果的に高めることができる。
【００２９】
従来、核酸を回収するに際して、回収液に緩衝液や水を用いた場合、吸着体に強固に吸着した核酸を回収することが難しく、核酸の回収率を十分に高められないという問題がある。また、吸着体にポリアミン系化合物を用いた場合、アミンを非電離状態にして核酸との結合力を低下させるため、回収液を塩基性にする必要があるが、この場合、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応が阻害されるという問題がある。
【００３０】
本発明者らは、非プロトン性の極性化合物を含む回収液に着目し、回収液に非プロトン性の極性化合物を含む溶液を用いることにより、核酸の回収率が効果的に高められることを見出した。具体的に、この点については、以下のように説明することができる。
【００３１】
核酸は、主鎖にリン酸基部を有し、この部分は極性溶媒に親和的である一方、プロトンが供給されると、非電離状態となり溶解し難くなることから、核酸の回収率が十分に高められなくなる場合がある。これに対して、本発明では、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いているので、核酸の溶解性を高めることができ、その結果、核酸の回収率を効果的に高めることができる。
【００３２】
また、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いることにより、吸着体にポリアミン系化合物を用いた場合においても、回収液を塩基性にせずとも、核酸を効率よく回収することができる。そのため、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応が阻害され難い。
【００３３】
また、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いることにより、ＰＣＲ時の特異性向上や、熱変性温度を低下させることもできる。
【００３４】
本発明においては、核酸を吸着体に吸着させるに先立って、核酸を含む試料と核酸抽出溶液とを接触させ、核酸を抽出しておくことが望ましい。また、さらにエタノール等のアルコールを添加して核酸を析出させた液体試料としてもよい。
【００３５】
核酸を含む試料とは、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を含む、ウイルス、細菌、真菌、又は細胞等が挙げられる。
【００３６】
核酸抽出溶液としては、例えば、タンパク変性剤と、極性溶媒と、核酸凝集剤とを含む溶液を用いることができる。
【００３７】
タンパク変性剤は、タンパクと相互作用することで、タンパクの高次構造を崩す役割を有するものである。タンパク変性剤としては、例えば、界面活性剤、還元剤、又はグアニジン誘導体、チオ尿素、尿素、もしくはこれらの塩等を用いることができる。界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等を用いることができる。還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等を用いることができる。また、上記塩としては、例えば、グアニジン塩酸塩等の塩を用いることができる。これらのタンパク変性剤は、１種単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【００３８】
核酸抽出溶液中におけるタンパク変性剤の濃度は、特に限定されないが、好ましくは２ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは４ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは８ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。タンパク変性剤の濃度を上記範囲内とすることにより、核酸をより一層確実に抽出することができる。なお、タンパク変性剤を２種以上有する場合は、合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
【００３９】
極性溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、メトキシプロパノール、ポリエチレングリコール、ペンタンジオール、プロパンジオール、アミノエタノール、ジエタノールアミン等を用いることができる。これらの極性溶媒は、１種単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。なお、核酸抽出溶液中に極性溶媒は含まれていなくてもよい。また、核酸抽出溶液中には、極性溶媒以外の溶媒が含まれていてもよい。もっとも、核酸をより一層確実に抽出する観点からは、核酸抽出溶液中に水等の極性溶媒が含まれていることが好ましい。極性溶媒は、核酸抽出溶液中に５０％以上含まれていることが好ましい。
【００４０】
核酸凝集剤としては、キャリアＤＮＡ、キャリアＲＮＡ、又はポリアデニン等が挙げられる。これらは、１種を単独で用いてもよく、複数を併用してもよい。核酸凝集剤を添加することにより、複数の核酸を凝集させることができ、核酸を後述する吸着体により一層効率的に吸着させることができる。
【００４１】
核酸抽出溶液中における核酸凝集剤の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下である。核酸凝集剤の濃度を上記範囲内とすることにより、核酸を後述する吸着体により一層効率的に吸着させることができる。
【００４２】
このようにして抽出された核酸を回収する方法としては、例えば、以下に示す第１の方法（核酸の回収工程−１）や第２の方法（核酸の回収工程−２）を用いることができる。
【００４３】
（核酸の回収工程−１）
第１の方法では、図１及び図２を参照して、上記のようにして抽出された核酸を回収する工程について説明する。
【００４４】
図１は、本発明の一実施形態に係る核酸の回収方法で用いるチップを示す模式的平面図である。また、図２は、図１のＡ−Ａ線に沿う模式的断面図である。
【００４５】
図１及び図２に示すように、チップ１は、流体が送液される流路２を有する。流路２の途中には、回収部３が設けられている。従って、流路２は、回収部３より上流側に設けられた上流側流路２ａと、回収部３より下流側に設けられた下流側流路２ｂとを有する。
【００４６】
また、回収部３には、核酸を吸着させ、回収するための吸着体４が配置されている。吸着体４は、核酸を担持させるための担持体である。本実施形態において、吸着体４は、セルロースフィルタ部５と、セルロースフィルタ部５の内部に充填されている複数の粒子６により構成されている。本実施形態において、粒子６は、シリカ粒子である。
【００４７】
もっとも、吸着体４の形態は、特に限定されず、例えば、膜、フィルター、プレート、チューブ、繊維状、粒子状、又は多孔質状等の形態で用いることができる。吸着体４は、繊維状、粒子状、又は多孔質状であることが好ましい。本実施形態のように、複数の形態を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
吸着体４としては、特に限定されないが、例えば、ケイ素化合物類、リン酸塩鉱物類、ケイ酸塩鉱物類、又はアルミノケイ酸塩鉱物類等により構成することができる。ケイ素化合物類としては、例えば、シリカ、ガラス等が挙げられる。リン酸塩鉱物類としては、ヒドロキシアパタイト等が挙げられる。ケイ酸塩鉱物類としては、タルク、モンモリロナイト等が挙げられる。アルミノケイ酸塩鉱物類としては、ゼオライト等が挙げられる。また、吸着体４は、キトサンや、ヒスチジンポリマーなどのポリアミン系化合物であってもよい。これらは、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【００４９】
本実施形態の回収方法では、チップ１における注入口から、上記のようにして抽出された核酸を含む液体試料を上流側流路２ａに注入し、回収部３に送液する。それによって、回収部３における吸着体４に核酸を吸着させる。
【００５０】
次に、洗浄液を回収部３に送液する。それによって、吸着体４に吸着した核酸を洗浄する。洗浄液としては、特に限定されないが、例えば、エタノール等のアルコールが挙げられる。次に、回収液を回収部３に送液し、核酸を吸着体４から単離させつつ、下流側流路２ｂ側へ送液し、回収口から核酸を回収する。
【００５１】
本実施形態の回収方法では、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて核酸を回収する。そのため、上述したように、核酸の回収率を効率よく高めることができる。また、吸着体４にポリアミン系の化合物を用いた場合においても、回収液を塩基性にせずとも、核酸を効率よく回収することができる。そのため、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応が阻害され難い。
【００５２】
非プロトン性の極性化合物としては、特に限定されないが、例えば、ピロリドン、ホルムアミド、スルホキシド、アセトアミド、アセトニトリル、若しくはその誘導体、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン等のケトン類、ＴＨＦ、ジオキサン等のエーテル類、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル、又はトリリン酸エステル等のエステル類が挙げられる。なかでも、非プロトン性の極性化合物は、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はＴＨＦが好ましく、Ｎ−メチルピロリドン又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がより好ましい。Ｎ−メチルピロリドン又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた場合、核酸の回収率をより一層効果的に高めつつ、ＰＣＲ等の反応をより一層阻害され難くすることができる。なお、これらの非プロトン性の極性化合物は、１種を単独で用いもよく、複数種を併用してもよい。
【００５３】
非プロトン性の極性化合物は、固体であってもよいが、常温で液体、すなわち非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。非プロトン性極性溶媒の沸点は、９０℃以上であることが好ましい。非プロトン性極性溶媒の沸点が、上記下限値以上である場合、ＰＣＲ時により一層揮発し難くすることができる。なお、非プロトン性極性溶媒の沸点の上限値は、特に限定されないが、例えば、３００℃とすることができる。
【００５４】
非プロトン性の極性化合物を含む回収液は、非プロトン性の極性化合物と水との混合液であってもよい。回収液に含まれる非プロトン性の極性化合物の濃度は、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。非プロトン性の極性化合物の濃度が上記下限値以上である場合、核酸の回収率をより一層効果的に高めることができる。なお、上記水は、緩衝液であってもよい。
【００５５】
回収液に含まれる非プロトン性の極性化合物の濃度の上限値は特に限定されないが、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは７ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以下である。非プロトン性の極性化合物の濃度が上記上限値以下である場合、後述する核酸増幅工程に持ち込まれる非プロトン性の極性化合物の終濃度を下げるための過度な希釈がより不要となるため、核酸増幅効率をより一層高めることができる。
【００５６】
以下、本実施形態の回収方法に用いるマイクロ流体デバイスを構成するチップの詳細について説明する。
【００５７】
チップ１は、特に限定されないが、本実施形態では、図２に示すように、板状の基板７を有する。
【００５８】
基板７を構成する材料は、特に限定されず、例えば、合成樹脂、ゴム、金属などを用いることができる。合成樹脂としては、特に限定されず、例えばジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン樹脂や、フェノール樹脂、ポリウレタン樹脂等の硬化性樹脂や熱可塑性樹脂などが挙げられる。生産性等の観点からは、特に熱可塑性樹脂であることが好ましい。なかでも、熱可塑性樹脂としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、又はポリプロピレンなどを用いることができる。これらは、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【００５９】
基板７は、上記熱可塑性樹脂の成型体からなることが好ましい。成型方法としては、特に限定されず、公知の成型方法を用いることができる。成型方法としては、例えば、射出成型、射出圧縮成型、ガスアシスト法射出成型、押し出し成型、多層押し出し成型、回転成形、熱プレス成型、ブロー成形、又は発泡成形などの方法が挙げられる。なかでも、射出成型であることが好ましい。
【００６０】
基板７は、複数枚の合成樹脂のシートを積層することにより形成されていてもよい。基板７は、ベースシートと、ベースシート上に設けられた貫通孔を有する基板本体と、基板本体上に設けられたカバーシートとにより構成されていてもよい。
【００６１】
ベースシート及びカバーシートは、それぞれ、例えば、樹脂フィルムなどの可撓性を有する材料により構成することができる。樹脂フィルムとしては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、又はポリプロピレン等の熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００６２】
また、ベースシート及びカバーシートは、それぞれ、弾性部材により構成されていてもよい。弾性部材としては、特に限定されないが、エラストマーであることが好ましい。
【００６３】
基板７内には、流体が送液される上述した流路２が設けられている。ここでは、流路２がマイクロ流路である。流路２は、マイクロ流路ではなく、マイクロ流路よりも断面積の大きな流路であってもよい。もっとも、マイクロ流路であることが好ましい。それによって、微量の試料により、様々な分析を行うことができる。
【００６４】
ところで、マイクロ流路とは、流体の搬送に際し、マイクロ効果が生じるような微細な流路をいう。このようなマイクロ流路では、液体は、表面張力の影響を強く受け、通常の大寸法の流路を流れる液体とは異なる挙動を示す。
【００６５】
マイクロ流路の横断面形状及び大きさは、上記のマイクロ効果が生じる流路であれば特に限定はされない。例えば、マイクロ流路に流体を流す際、ポンプや重力を用いる場合には、流路抵抗を低下させる観点から、マイクロ流路の横断面形状がおおむね長方形（正方形を含む）の場合には、小さい方の辺の寸法で、２０μｍ以上が好ましく、５０μｍ以上がより好ましく、１００μｍ以上がさらに好ましい。チップ１を用いたマイクロ流体デバイスのより一層の小型化の観点より、小さい方の辺の寸法で、５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ以下がより好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましい。
【００６６】
また、マイクロ流路の横断面形状がおおむね円形の場合には、直径（楕円の場合には、短径）が、２０μｍ以上が好ましく、５０μｍ以上がより好ましく、１００μｍ以上がさらに好ましい。上記マイクロ流体デバイスのより一層の小型化の観点より、直径（楕円の場合には、短径）は、５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ以下がより好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましい。
【００６７】
本実施形態の回収方法では、このようなチップ１を備えるマイクロ流体デバイスを用いて、核酸を回収することができる。非プロトン性の極性化合物を含む回収液は、マイクロ流体デバイスの流路２内に配置してもよいし、マイクロ流体デバイスの外部に配置してもよい。
【００６８】
なお、このようなマイクロ流体デバイスは、さらに送液手段を備えていてもよい。送液手段としては、特に限定されず、例えば、マイクロポンプが挙げられる。具体的には、マイクロポンプを用いて、上流側流路２ａに液体や空気、又は所定のガスを送り込むことにより、回収部３側へ流体を送液する手段である。この場合、マイクロポンプは、チップ１の内部に設けられていてもよいし、チップ１の外部に設けられていてもよい。
【００６９】
また、他の送液手段としては、上流側流路２ａより上流側に連結された空間に配置されたガス発生部材が挙げられる。ガス発生部材とは、光や熱等の外力によりガスを発生する部材である。ガス発生部材に所定のタイミングで外力を加えることによりガスを発生させ、上流側流路２ａにガスを送り込むことができる。それによって、上流側流路２ａから回収部３側へ流体を送液することができる。ガス発生部材としては、例えば、ガス発生テープが挙げられる。
【００７０】
（核酸の回収工程−２）
第２の方法では、上記のようにして抽出された核酸を回収する工程を以下のようにして行う。
【００７１】
ポリプロピレン等のプラスチック製の容器に、核酸を吸着させ、回収するための吸着体を配置する。吸着体は、核酸を担持させるための担持体である。吸着体の形態は、特に限定されないが、例えば、粒子、プレート、繊維状等の形態で用いることができる。
【００７２】
吸着体としては、特に限定されないが、例えば、ケイ素化合物類、リン酸塩鉱物類、ケイ酸塩鉱物類、又はアルミノケイ酸塩鉱物類等により構成することができる。ケイ素化合物類としては、例えば、シリカ、ガラス等が挙げられる。リン酸塩鉱物類としては、ヒドロキシアパタイト等が挙げられる。ケイ酸塩鉱物類としては、タルク、モンモリロナイト等が挙げられる。アルミノケイ酸塩鉱物類としては、ゼオライト等が挙げられる。また、吸着体は、キトサンや、ヒスチジンポリマーなどのポリアミン系化合物であってもよい。これらは、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【００７３】
本実施形態の回収方法では、上記のようにして用意した容器に、上記核酸の抽出工程における核酸抽出後の混合液を注入して、吸着体と撹拌し、吸着体に核酸を吸着させる。撹拌方法としては、特に限定されないが、例えば、ボルテックスミキサー、超音波等を用いて行うことができる。
【００７４】
次に、容器内の溶液を取り出した後、洗浄液を注入し、撹拌する。それによって、吸着体に吸着した核酸を洗浄する。洗浄液としては、特に限定されないが、例えば、エタノール等のアルコールが挙げられる。次に、洗浄液を取り出した後、回収液を注入し、撹拌する。これにより、核酸を吸着体から単離させる。回収液としては、例えば、水やバッファー等の添加剤を含む水溶液を用いることができる。
【００７５】
本実施形態の回収方法では、非プロトン性の極性化合物を含む回収液を用いて核酸を回収する。そのため、上述したように、核酸の回収率を効率よく高めることができる。また、吸着体にポリアミン系化合物を用いた場合においても、回収液を塩基性にせずとも、核酸を効率よく回収することができる。そのため、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応が阻害され難い。
【００７６】
非プロトン性の極性化合物としては、特に限定されないが、例えば、ピロリドン、ホルムアミド、スルホキシド、アセトアミド、アセトニトリル、若しくはその誘導体、アセトンやシクロヘキサノン等のケトン類、ＴＨＦやエチレングリコール等のエーテル類、又は酢酸エチル等のエステル類が挙げられる。なかでも、非プロトン性の極性化合物は、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はＴＨＦが好ましく、Ｎ−メチルピロリドン又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がより好ましい。Ｎ−メチルピロリドン又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた場合、核酸の回収率をより一層効果的に高めつつ、ＰＣＲ等の反応をより一層阻害され難くすることができる。なお、これらの非プロトン性の極性化合物は、１種を単独で用いもよく、複数種を併用してもよい。
【００７７】
非プロトン性の極性化合物は、固体であってもよいが、常温で液体、すなわち非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。非プロトン性極性溶媒の沸点は、９０℃以上であることが好ましい。非プロトン性極性溶媒の沸点が、上記下限値以上である場合、ＰＣＲ時により一層揮発し難くすることができる。なお、非プロトン性極性溶媒の沸点の上限値は、特に限定されないが、例えば、３００℃とすることができる。
【００７８】
非プロトン性の極性化合物を含む回収液は、非プロトン性の極性化合物と水との混合液であってもよい。回収液に含まれる非プロトン性の極性化合物の濃度は、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。非プロトン性の極性化合物の濃度が上記下限値以上である場合、核酸の回収率をより一層効果的に高めることができる。なお、上記水は、緩衝液であってもよい。
【００７９】
回収液に含まれる非プロトン性の極性化合物の濃度の上限値は特に限定されないが、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは７ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以下である。非プロトン性の極性化合物の濃度が上記上限値以下である場合、核酸増幅工程に持ち込まれる非プロトン性の極性化合物の終濃度を下げるための過度な希釈がより不要となるため、核酸増幅効率をより一層高めることができる。
【００８０】
本発明に係る核酸増幅方法は、上述した核酸の回収方法により核酸を回収する回収工程と、回収工程で回収した回収液に含まれる核酸の増幅反応を行なう核酸増幅工程と、を備える。従って、例えば、上述のマイクロ流体デバイスにおいては、回収部より下流側において、さらに回収された核酸を増幅する反応場が設けられていてもよい。反応場においては、例えば、６０℃〜９０℃の加熱及び冷却を繰り返す冷熱サイクル処理が行われることにより、ＰＣＲ等の反応を進行させることができる。
【００８１】
また、核酸増幅工程の前に、回収工程で回収した回収液を希釈する希釈工程をさらに備えていてもよい。この場合、例えば、上述のマイクロ流体デバイスにおいては、回収部と反応場との間に、回収液を希釈するための希釈用流路が設けられていてもよい。
【００８２】
回収液の希釈方法としては、例えば、水を添加する方法が挙げられる。希釈工程により、核酸の増幅反応を行なう際の非プロトン性の極性化合物の濃度（終濃度）を２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることが好ましく、１．５ｍｏｌ／Ｌ以下とすることがより好ましく、１．０ｍｏｌ／Ｌ以下とすることがさらに好ましい。非プロトン性の極性化合物の濃度（終濃度）が上記上限値以下である場合、核酸増幅阻害がより一層起こり難い。なお、核酸の増幅反応を行なう際の非プロトン性の極性化合物の濃度（終濃度）の下限値は、特に限定されないが、例えば、０．００１ｍｏｌ／Ｌとすることができる。
【００８３】
以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を明らかにする。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
（実施例１）
キアゲン社、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキットを用い、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＬ  ５０μＬに、大腸菌（ＮＢＲＣ  １２７１３株、１０，０００コピー）１μＬと、キャリアＲＮＡ２μｇとを加え、１５秒間ボルテックスし室温で１０分間インキュベートした。さらに、９８％エタノール５０μＬを加えて、１５秒ボルテックスすることでサンプル溶液を調製し、平均粒径５μｍのシリカ粒子を充填したマイクロ流体デバイスのチップ１（図１及び図２）に、シリンジポンプを用いて上記サンプル溶液を送液することでサンプルＤＮＡを吸着させた。同じくシリンジポンプを用いて洗浄液１（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１）、洗浄液２（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ２）をそれぞれ１００μＬ送液した後、１００℃のプレート上でシリンジポンプを用いて空気を送りながら、３分加熱して液体を蒸発させた。同じくシリンジポンプを用いて、回収液としてのＮ−メチルピロリドン（回収液添加剤）を４ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように添加した緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＥ）３０μＬを送液することでＤＮＡの回収を行った。
【００８５】
ＰＣＲ反応溶液の調製として、上記回収液のうち２．５μＬを取り出し、水４．５μＬと混合して得られる希釈回収液７μＬとＰＣＲ試薬１０μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）  １μＬ、Ｒｅｖｅｒｅｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）  １μＬ、ＴＡＫＡＲＡ社製、Ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（２５０倍希釈）  １μＬとを混合した。ＰＣＲ試薬は、「Ｔａｑ  ＨＳ  Ｆａｓｔ  Ｄｅｔｅｃｔ」を用いた。また、スタンダードとして、希釈回収液の代わりに、あらかじめ核酸濃度の分かっている大腸菌  ＮＢＲＣ  １２７１３株抽出核酸溶液７μＬを１００，０００、５０，０００、５，０００、５００コピーの４水準調製した。
【００８６】
回収した核酸量の測定は、上記ＰＣＲ反応溶液及びスタンダードＰＣＲ反応溶液をサーマルサイクラー「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）」を用いて測定した。測定は９５℃で２０秒加熱した後、９５℃で３秒と６０℃で５秒の温度サイクル４５回にて実施した。
【００８７】
測定の結果、スタンダードから導かれる核酸量をもとに、下記計算式を用いて核酸回収率を算出した。
【００８８】
核酸回収率（％）＝｛（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの核酸量）×３０／（回収液取り出し量）｝／１０，０００×１００
【００８９】
（実施例２〜１１）
回収液に表１に示す非プロトン性の極性化合物を添加して所定濃度に調製し、送液により得られた回収液から所定量を取り出して、希釈回収液の全量が７μＬになるよう水で調製したこと以外は、実施例１と同様にして、核酸回収率を算出した。
【００９０】
（比較例１）
非プロトン性の極性化合物を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして核酸回収率を算出した。
【００９１】
（実施例１２）
核酸抽出溶液（尿素４ｍｏｌ／Ｌ、グアニジン塩酸塩４ｍｏｌ／Ｌ、グリシン１ｍｏｌ／Ｌ、キャリアＲＮＡ３μｇ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ７．０）を含む水溶液）５０μＬに、大腸菌（ＮＢＲＣ  １２７１３株、１０，０００コピー）１μＬ、キャリアＲＮＡ２μｇを加え、１５秒間ボルテックスした。そして、室温で１０分間インキュベートすることでサンプル溶液を調製した。平均粒径５μｍのキトサン修飾粒子を充填したマイクロ流体デバイスのチップ１（図１及び図２）にシリンジポンプを用いて、上記サンプル溶液を送液することでサンプルＤＮＡを吸着させた。同じくシリンジポンプを用いて塩酸でｐＨ＝４に調製した水を２００μＬ送液した後、１００℃のプレート上でシリンジポンプを用いて空気を送りながら３分加熱して液体を蒸発させた。同じくシリンジポンプを用いて、回収液としてのＮ−メチルピロリドン（回収液添加剤）を４ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように添加し、ｐＨ＝７に調製した水３０μＬを送液することでＤＮＡの回収を行った。ＰＣＲ反応溶液の調製と回収した核酸の測定、核酸回収率の算出は、実施例１と同様の方法で行った。
【００９２】
（実施例１３〜１５）
回収液に表１に示す非プロトン性の極性化合物を添加して所定濃度に調製し、送液により得られた回収液から所定量を取り出して、希釈回収液の全量が７μＬになるよう水で調製したこと以外は、実施例１２と同様にして、核酸回収率を算出した。
【００９３】
（比較例２）
非プロトン性の極性化合物を添加しなかったこと以外は、実施例１２と同様にして核酸回収率を算出した。
【００９４】
【表１】
2020162485.tif 000003
【符号の説明】
【００９５】
１…チップ
２…流路
２ａ…上流側流路
２ｂ…下流側流路
３…回収部
４…吸着体
５…セルロースフィルタ部
６…粒子
７…基板
【図１】
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【図２】
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