(57)【要約】      （修正有）【課題】受光した光の強度におけるノイズの低減を実現する測定方法を提供する。【解決手段】測定方法は、自家蛍光を示す対象物に第１の光を照射するフォトブリーチング工程（Ｓ１００５〜Ｓ１００９）を行い、本測定で測定する全ての領域についてフォトブリーチング処理が完了したかを判定し（Ｓ１０１１）、フォトブリーチング工程での照射条件、測定データ等の情報を表示部に表示し（Ｓ１０１３）、対象物に第２の光を照射し、対象物からの測定光を測定する測定工程Ｓ１０１５で、本測定を行い、取得したデータから分光スペクトルを取得する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自家蛍光を示す対象物に第１の光を照射するフォトブリーチング工程と、
前記対象物に第２の光を照射し、前記対象物からの測定光を測定する測定工程と、
前記測定工程で取得したデータから分光スペクトルを取得することと、
を備える測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の測定方法において、
前記対象物は、生体の一部、培養組織、又は培養細胞である測定方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の測定方法において、
前記フォトブリーチング工程は、前記第１の光を励起光として生じる前記対象物からの受光光を受光する工程を含む測定方法。
【請求項４】
請求項３に記載の測定方法において、
前記受光光は、前記第１の光を前記対象物に照射して生じた散乱光と、前記第１の光を励起光として生じる前記対象物の自家蛍光と、を含む測定方法。
【請求項５】
請求項４に記載の測定方法において、
前記第１の光の照射時間は、前記第１の光を励起光として生じる前記対象物の自家蛍光の減少量に基づいて定められる測定方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載の測定方法において、
前記受光光の強度の単位時間当たりの低下率が所定の値以下となった場合に前記第１の光の照射を終える測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の測定方法において、
前記受光光の強度は、特定の波長における強度、又は、一部若しくは全部の波長範囲に基づく強度である測定方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の測定方法において、
前記フォトブリーチング工程において、前記対象物に第３の光を照射し、前記第３の光を励起光とした前記対象物からの蛍光を受光し、前記蛍光の強度の単位時間当たりの低下率が所定の値以下となった場合に前記第１の光の照射を終える測定方法。
【請求項９】
請求項８に記載の測定方法において、
前記蛍光の強度の前記第１の光の単位照射時間当たりの低下率が所定の値以下となった場合に前記第１の光の照射を終える測定方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の測定方法において、
前記第１の光と前記第２の光とは同一の発振装置により発振される測定方法。
【請求項１１】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の測定方法において、
前記第１の光と前記第２の光とが、別の発振装置により発振される測定方法。
【請求項１２】
自家蛍光を示す対象物に照射光を照射する照射部と、
前記対象物からの光を受光する受光部と、
前記照射光を照射しているときに、前記受光部が受光した光の強度に基づいて、前記照射光の照射位置における照射時間を制御する照射制御部と、
を備える測定装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の測定装置において、
前記照射光により前記対象物を照射しているときに、前記受光部が受光した光の強度の単位時間あたりの低下率を算出する算出部を備える測定装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の測定装置において、
前記強度の前記単位時間あたりの低下率に基づいて、前記照射光の照射を続けるか否かを判定する判定部を備える測定装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の測定装置において、
前記照射制御部は、前記算出部または前記判定部からの出力に基づいて、前記対象物においてラマン散乱光の測定を行う測定領域の全体に順次、前記照射光を照射する測定装置。
【請求項１６】
請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の測定装置において、
前記対象物からの光を分光する分光部を備え、
前記算出部は、前記照射光を照射しているときに、前記受光部が受光した光の分光スペクトルにおける特定の波長または一部若しくは全部の波長範囲に基づく強度の単位時間あたりの低下率を算出する測定装置。
【請求項１７】
請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の測定装置において、
前記受光部は、分光器により分光されていない前記対象物からの光を受光し、
前記算出部は、前記受光部が受光した光の強度の単位時間あたりの低下率を算出する測定装置。
【請求項１８】
請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の測定装置において、
前記照射部が、点状またはライン状の前記照射光を走査して照射する第１照射部と、ラマン散乱の励起光を照射する第２照射部と、を備える測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
対象物からの光を測定する方法において、ノイズに含まれる自家蛍光を低減させる方法が提案されている。例えば、ラマン測定では、アンチストークス領域を測定すること等が行われている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開第２０１５−１９７３３６号
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様によると、測定方法は、自家蛍光を示す対象物に第１の光を照射するフォトブリーチング工程と、前記対象物に第２の光を照射し、前記対象物からの測定光を測定する測定工程と、前記測定工程で取得したデータから分光スペクトルを取得することと、を備える。
本発明の第２の態様によると、測定装置は、自家蛍光を示す対象物に照射光を照射する照射部と、前記対象物からの光を受光する受光部と、前記照射光を照射しているときに、前記受光部が受光した光の強度に基づいて、前記照射光の照射位置における照射時間を制御する照射制御部と、を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】一実施形態の測定方法に関する測定装置の構成を示す概念図である。
【図２】情報処理装置の構成を示す概念図である。
【図３】切片と測定領域とを示す概念図である。
【図４】強度の定量化の方法を説明するための概念図である。
【図５】強度の変化の定量化の方法を説明するための概念図である。
【図６】一実施形態の測定方法の流れを示すフローチャートである。
【図７】一実施形態の測定方法に関する測定装置の構成を示す概念図である。
【図８】一実施形態の測定方法の流れを示すフローチャートである。
【図９】一実施形態の測定方法に関する測定装置の構成を示す概念図である。
【図１０】生体組織を測定した結果をグラフにより示す図である。
【図１１】生体組織を測定した結果をグラフにより示す図である。
【図１２】生体組織を測定した結果をグラフにより示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の測定方法および測定装置等について説明する。本実施形態の測定方法では、生体の一部、培養組織、又は培養細胞等の対象物からの光を測定し分光スペクトル等を取得する本測定の前に、当該対象物に光を照射するフォトブリーチング工程を行う。
【０００７】
生体組織等からのラマン散乱光を測定するラマン測定は、病理組織の分析等、医療分野での応用を含め非常に有用である。しかしながら、生体組織のラマン測定では、分光スペクトルにおける各物質または原子間結合に対応するピークの大きさに比べて自家蛍光が比較的強いことが多く、信号対雑音比（以下、Ｓ／Ｎ比と呼ぶ）が低くなる場合があることが難点であった。
【０００８】
本実施形態の測定方法は、上記のフォトブリーチング工程により、自家蛍光を低減し信号対雑音比を改善するものである。
なお、対象物は、生体の一部、培養組織又は培養細胞でなくともよく、自家蛍光が存在する対象物であれば特に限定されない。
【０００９】
図１は、本実施形態の測定方法に用いられる測定装置１００の構成を示す概念図である。本実施形態において、測定装置１００は、ラマン散乱光の分光スペクトルを測定する。測定装置１００は、測定部２と、情報処理装置４０とを備える。測定部２は、照射光学系１０と、対物光学系２０−１と、検出光学系３０とを備える。照射光学系１０は、光源装置１１と、ガルバノスキャナ１２と、リレーレンズ１３ａ、１３ｂと、光学ミラー１４とを備える。対物光学系２０−１は、光学ミラー２１と、対物レンズ２２と、ステージ２３とを備える。プレパラート９は、ステージ２３に載置される。検出光学系３０は、ダイクロイックミラー３１と、リレーレンズ３２ａ、３２ｂと、分光器３３とを備える。図１では、照射光および検出光を一点鎖線を用いて模式的に示した。
なお、図１では後方散乱された光を解析する構成になっているが、前方散乱された光を解析する構成にしてもよい。プレパラート９に固定された対象物からの光から解析可能な分光スペクトルが得られれば、測定装置１００の構成は特に限定されない。
【００１０】
光源装置１１は、半導体レーザ等のレーザ発振装置等を含んで構成される。光源装置１１が発振する光の波長は、散乱光の分光スペクトルが測定可能なら特に限定されないが、測定感度等の観点から４８８ｎｍ、５３２ｎｍ等の波長を適宜用いることができる。光源装置１１から出射された光は、ガルバノスキャナ１２に入射する。
【００１１】
ガルバノスキャナ１２は、不図示の可動ミラー等を含んで構成され、レーザ光の出射方向を変化させ走査させる。ガルバノスキャナ１２を出射した光は、リレーレンズ１３ａおよび１３ｂに入射する。リレーレンズ１３ａ、１３ｂを通過した光は光学ミラー１４、ダイクロイックミラー３１で反射された後、対物光学系２０−１に入射する。
【００１２】
対物光学系２０−１に入射した光は、光学ミラー２１で反射され、対物レンズ２２で屈折され、プレパラート９に固定された対象物に入射する。
【００１３】
プレパラート９に固定された対象物で散乱された光は、対物レンズ２２を透過して光学ミラー２１で反射され、検出光学系３０に入射する。
【００１４】
検出光学系３０に入射した光は、ダイクロイックミラー３１を透過してリレーレンズ３２ａ、３２ｂを透過し、分光器３３に入射する。分光器３３は、グレーティングやＣＣＤ等の検出器等を含んで構成され、入射した光を分光して波長ごとの強度を取得する。分光器３３で波長ごとの強度が取得されたら、当該強度等のデータは情報処理装置４０に出力（図１の実線矢印で情報の流れを示した）され、後述の記憶部４４に記憶される。
なお、フォトブリーチング工程では、散乱光の測定を適宜省略してもよい。
【００１５】
図２は、情報処理装置４０の構成を示した図である。情報処理装置４０は、入力部４１と、表示部４２と、通信部４３と、記憶部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、照射制御部５１と、情報出力部５４とを備える。照射制御部５１は、強度算出部５２と、判定部５３とを備える。
【００１６】
入力部４１は、キーボードやタッチパネル等の入力装置により構成され、フォトブリーチング工程および本測定における、照射範囲等の照射条件や露光時間等の受光条件等を含む入力データを受け付ける。入力部４１は、受け付けた入力データを記憶部４４に記憶させる。
なお、入力データは、後述の通信部４３を介して取得してもよい。
【００１７】
表示部４２は、液晶モニタ等の表示装置により構成され、フォトブリーチング工程および本測定における、上記照射条件や受光条件に関する情報や、取得したデータに関する情報を表示する。
【００１８】
通信部４３は、インターネット等の通信網を利用して通信を行う通信装置により構成され、フォトブリーチング工程および本測定で取得したデータを送信し、また、適宜必要なデータを送受信する。記憶部４４は、不揮発性メモリ等により構成され、制御部５０に処理を行わせるプログラム、分光器３３から出力された測定データ等を記憶する。
【００１９】
制御部５０は、ＣＰＵ等の処理装置により構成され、測定装置１００を制御する動作の主体として機能し、記憶部４４または不図示の記憶媒体に搭載されているプログラムを実行することにより、フォトブリーチング工程および本測定に関する処理、出力処理等の各種処理を行う。
【００２０】
制御部５０の照射制御部５１は、入力された本測定における照射範囲（以下、測定領域と呼ぶ）を含む領域全体で自家蛍光が低減するように、照射光（以下、フォトブリーチング光と呼ぶ）の照射を制御する。
【００２１】
図３は、プレパラート９の構造を示す概念図である。プレパラート９は、ラマン測定の対象物である切片９０とスライドグラス９２により構成される。切片９０には、入力データ等に基づいて測定領域９１が設定されている。測定領域９１は、図３中では領域９１ａ，９１ｂ，９１ｃ，９１ｄの４カ所に離散的に配置されているが、１つの連続した領域でもよいし、任意の数の領域に分かれて離散的に配置されてもよい。すなわち、形状は特に限定されない。
【００２２】
照射制御部５１は、測定領域９１の全体の自家蛍光の減少が所定の基準を満たすように、測定領域９１の全体にフォトブリーチング光を照射する。照射制御部５１は、最初に測定領域９１ａにフォトブリーチング光の照射を開始し、照射を続けながら測定領域９１ａからの散乱光を含む光（以下、受光光と呼ぶ）を受光し、一定の時間間隔で受光光の強度を定量化した値（以下、強度パラメータと呼ぶ）を求める。受光光には、散乱光に加えてフォトブリーチング光に励起される自家蛍光が含まれる。強度パラメータは、自家蛍光を定量化するものが好ましい。
【００２３】
図４は、受光光の強度を定量化する方法を説明するための概念図である。照射制御部５１の強度算出部５２は、強度パラメータとして、受光光の分光スペクトルの所定の波長範囲における強度の積分値を算出する。図４では、強度算出部５２が、ラマンシフトにおける９００ｃｍ−１〜１１００ｃｍ−１の範囲の強度の積分値（図４の面積Ｓに相当）を求める例を示した。
なお、受光光の強度を定量化する際の波長範囲は、受光光の分光スペクトルの全部の波長範囲としてもよいし、本測定で取得する波長範囲に基づいて定めてもよいし、ある特定の波長での強度としてもよい。受光光の強度を定量化する方法は、適宜分光スペクトルから計算したパラメータを用いて定めることができる。
【００２４】
照射制御部５１は、強度算出部５２が算出し出力した強度パラメータの変化に基づいて、測定領域９１ａへの光照射の継続または終了を制御する。例えば、強度算出部５２は、所定の時間間隔で算出される強度パラメータの変化量を算出し、照射制御部５１の判定部５３は、当該変化量を当該変化の直前に算出された強度パラメータの値で割った値で定義される強度パラメータの低下率が所定の値、例えば０．１、０．０５、０．０３以下になったか否かを判定する。
なお、強度パラメータの低下率は上記変化量を上記変化の直後に算出された強度パラメータで割った値として定義してもよい。受光光の強度の減少を定量化することができれば強度パラメータの設定方法は特に限定されない。
【００２５】
図５は、強度パラメータの変化を説明するための概念図である。図５は、横軸にフォトブリーチング光の照射時間をとり、縦軸に強度パラメータとして、フォトブリーチング光を励起光としたラマンスペクトルの所定の波長範囲の強度積分値をとったグラフである。強度積分値は最初に算出された値（横軸で照射時間が０秒に対応する点）を１として規格化した。
【００２６】
最初の測定点と２番目の測定点との間の２秒間での強度パラメータの変化量をΔ（１，２）、２番目の測定点と３番目の測定点との間の２秒間での強度パラメータの変化量をΔ（２，３）、ｋ番目の測定点とｋ＋１番目の測定点との間の２秒間での強度パラメータの変化量をΔ（ｋ，ｋ＋１）として例示した。最初の測定点の相対強度をＩ１（＝１）、２番目の測定点の相対強度Ｉ２、ｋ番目の測定点の相対強度をＩｋとすると、強度パラメータの低下率は、最初の２秒間がΔ（１，２）／Ｉ１、２〜４秒がΔ（２，３）／Ｉ２、２ｋ〜２ｋ＋２秒がΔ（ｋ，ｋ＋１）／Ｉｋとなる。
【００２７】
図５に示されるように、光照射の照射時間が長くなると共に、強度パラメータの値は横軸に漸近していく。強度パラメータの減少量および低下率は、フォトブリーチされていない蛍光分子の数に依存するため、フォトブリーチされた蛍光分子の割合が増加すると、強度パラメータの低下率も小さくなっていく。強度パラメータの低下率をモニタリングすることで、自家蛍光の低減が効果的に行われているかを調べることができ、当該低下率が小さくなった場合にフォトブリーチングを終えることで、測定領域９１に対し効率的にフォトブリーチングすることが可能になる。
【００２８】
判定部５３が、強度パラメータの低下率が所定の値以下となったことを判定したら、照射制御部５１は、判定部５３から出力された当該判定に基づいて、測定領域９１ａへのフォトブリーチング光の照射を終え、測定領域９１ｂへのフォトブリーチング光の照射を開始する。測定領域９１ｂへのフォトブリーチングについても、測定領域９１ａへの照射と同様、判定部５３が、強度パラメータの低下率が所定の値以下となったと判定するまで行う。当該判定後、照射制御部５１は、測定領域９１ｂへのフォトブリーチングを終え、測定領域９１ｃへのフォトブリーチングを開始する。同様に、残りの測定領域９１ｃ，９１ｄについてもフォトブリーチングを行う。
なお、測定領域９１の内部において、フォトブリーチング光を照射する順序は特に限定されない。上述のように、各測定領域９１ａ，９１ｂ，９１ｃ，９１ｄへのフォトブリーチングに関し、１つの領域が終わったら次の領域を開始、というように順次行うのではなく、各測定領域９１に対し順番に何度も光を照射して、時間的に並行してフォトブリーチングを行ってもよい。強度パラメータの変化に基づいて各測定領域９１の照射が制御されれば、光照射の順番等の態様は特に限定されない。
【００２９】
フォトブリーチング光が測定領域９１に与える光エネルギーは、本測定において励起光が測定領域９１与える光エネルギーと等しくても異なっていてもよい。実施例のデータ（図１１，１２）では、フォトブリーチングとラマンスペクトルの測定との両方を同時に継続して行っている。すなわち、フォトブリーチング光が、本測定の励起光も兼ねており、計ｎ秒照射時のデータは、ｎ−２秒間のフォトブリーチングと、最後の２秒間の本測定と解釈し得る。例えば、実施例において計４秒照射時のデータでは、対象物９０には同じ光が照射し続けていたものだが、最初の２秒がフォトブリーチング光、後の２秒が本測定の励起光と解釈できる。したがって、この場合、測定領域９１に本測定の励起光が与えた光エネルギーと、測定領域９１にフォトブリーチング光が与えた光エネルギーは略等しいと解釈できる。
【００３０】
また、フォトブリーチング光の光エネルギーは、自家蛍光が十分に低減される限り、本測定の励起光が与える光エネルギーより小さくすることもできる。これにより測定試料に対するダメージを抑制することができる。
【００３１】
本実施形態の測定方法または測定装置では、フォトブリーチング光と本測定の励起光とは同一の発振装置により発振される。これにより、装置構成が複雑になることを防ぎ、またフォトブリーチング光と本測定の励起光とをより精密に同じ位置に照射し、正確にフォトブリーチングすることができる。
【００３２】
制御部５０の情報出力部５４は、フォトブリーチング工程での照射条件、測定データ、または進捗状況等、および、分光スペクトル等を含む本測定で取得したデータ等の、表示用画像を作成し、表示部４２に出力する。
【００３３】
図６は、本実施形態の測定方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、測定装置１００のユーザ等は、生体の一部、培養組織又は培養細胞等（対象物９０）をスライドグラス等に固定してプレパラートを用意する。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。ステップＳ１００３において、ユーザ等は、ステップＳ１００１で用意した対象物９０をキシレンに浸す等して、当該切片または細胞に対し、包埋剤の影響を低減する処理を行う。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
なお、包埋剤を使用しない場合や、測定に影響しない包埋剤を使用する場合は、ステップ１００１の後、直接ステップＳ１００５に進むことができる。
【００３４】
ステップＳ１００５において、照射制御部５１は、フォトブリーチングが完了していない対象物９０の少なくとも一部の領域に、光照射を開始する。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。ステップＳ１００７において、分光器３３は、対象物９０からの光を受光し、強度算出部５２は、受光した光の単位時間あたりの強度の低下率を算出する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９に進む。
【００３５】
ステップＳ１００９において、判定部５３は、単位時間当たりの強度パラメータの低下率が０．１等の所定の値以下であるかを判定する。判定部５３は、当該低下率が所定の値以下であった場合、ステップＳ１００９を肯定判定してステップＳ１０１１に進む。判定部５３は、当該低下率が所定の値よりも大きかった場合、ステップＳ１００９を否定判定してステップＳ１００７に戻る。
【００３６】
ステップＳ１０１１において、制御部５０は、本測定で測定する全ての領域についてフォトブリーチング処理が完了したかを判定する。制御部５０は、当該処理が完了していた場合、ステップＳ１０１１を肯定判定してステップＳ１０１３に進む。判定部５３は、当該処理が完了していなかった場合、ステップＳ１０１３を否定判定してステップＳ１００５に戻る。
【００３７】
ステップＳ１０１３において、情報出力部５４は、フォトブリーチング工程での照射条件、測定データ等の情報を表示部４２に表示する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５に進む。ステップＳ１０１５において、測定装置１００は、本測定を行い、情報出力部５４は、取得した分光スペクトル等の結果を表示する。本測定での測定光、すなわち本測定での励起光を照射したときに測定装置１００の検出光学系３０によって検出される光は、対象物による散乱光に加えて自家蛍光を含むが、自家蛍光はフォトブリーチング工程によって十分に弱められている。ステップＳ１０１５が終了したら、処理を終了する。
【００３８】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
【００３９】
（１）本実施形態の測定方法は、対象物９０にフォトブリーチング光を照射するフォトブリーチング工程を備える。これにより、自家蛍光が低減した、信号対雑音比の高い分光スペクトルを取得することができる。
【００４０】
（２）本実施形態の測定方法において、フォトブリーチング光を励起光として生じる対象物９０からの受光光を受光する。これにより、フォトブリーチングの効果を確認しつつ、適切にフォトブリーチング光の照射時間等の照射条件を設定することができる。
【００４１】
（３）本実施形態の測定方法は、フォトブリーチング工程においてフォトブリーチング光を励起光とした対象物９０からの光を受光し、当該光の強度の単位時間当たりの低下率が０．１、０．０５、０．０３等の所定の値以下となった場合にフォトブリーチング光の照射を終える。これにより、比較的効率の良くないフォトブリーチングを続けることを防ぎ、より効率的にフォトブリーチングを行うことができる。上記光の強度は、特定の波長における強度であってもよく、一部または全部の波長範囲の強度であってもよい。
【００４２】
（４）本実施形態の測定方法において、フォトブリーチング光の照射時間は、フォトブリーチング光の単位照射時間当たりの、対象物９０の自家蛍光の減少量に基づいて定められる。これにより、観察される自家蛍光に基づいて、効率よくフォトブリーチングを行うことができる。
【００４３】
（５）本実施形態の測定装置は、対象物９０に照射光を照射する対物光学系２０−１と、対象物９０からの光を受光する分光器３３と、照射光を照射しているときに、分光器３３が受光した光の強度に基づいて、照射光の各測定領域９１ａ，９１ｂ，９１ｃ，９１ｄにおける照射時間を制御する照射制御部５１と、を備える。これにより、効率よくフォトブリーチングを行い、本測定において正確に対象物９０の分析を行うことができる。
【００４４】
（６）本実施形態の測定装置は、照射光により対象物９０を照射しているときに、分光器３３が受光した光における特定の波長または一部若しくは全部の波長範囲に基づく強度の単位時間あたりの低下率を算出する強度算出部５２を備える。これにより、光照射中のフォトブリーチングの効率を判定し、フォトブリーチング光の照射制御を効率的に行うことができる。
【００４５】
（７）本実施形態の測定装置は、照射光により対象物９０を照射しているときに、分光器３３が受光した光における特定の波長または一部若しくは全部の波長範囲に基づく強度の単位時間あたりの低下率に基づいて、照射光の照射を続けるか否かを判定する判定部５３を備える。これにより、比較的効率の良くないフォトブリーチングを続けることを防ぎ、より効率的にフォトブリーチングを行うことができる。
【００４６】
（８）本実施形態の測定装置において、照射制御部５１は、強度算出部５２または判定部５３からの出力に基づいて、対象物９０においてラマン散乱光の測定を行う測定領域９１ａ，９１ｂ，９１ｃ，９１ｄの全体に順次、照射光を照射する。これにより、各測定領域９１ａ，９１ｂ，９１ｃ，９１ｄに関し、同じ位置に無駄に光を照射せず効率的にフォトブリーチングを行うことができる。
【００４７】
（９）本実施形態の測定装置は、対象物９０からの光を分光する分光器３３を備え、強度算出部５２は、照射光を照射しているときに、受光器３３が受光した光の分光スペクトルにおける特定の波長または一部若しくは全部の波長範囲に基づく強度の単位時間あたりの低下率を算出する。これにより、本測定に適した波長範囲の強度に基づいて、効率的にフォトブリーチングを行うことができる。
【００４８】
次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。
（変形例１）
上述の実施形態では、フォトブリーチング光を励起光として対象物９０に照射した際の、対象物９０からの受光光を受光し、受光光から得られる情報に基づいて照射制御部５１がフォトブリーチング光の照射時間の制御を行う構成とした。しかしながら、予めフォトブリーチング光による自家蛍光の減少量が過去のデータ等を基に予測できる場合には、照射制御部５１は、フォトブリーチング光を照射することで予測される自家蛍光の変化に基づいてフォトブリーチング光の照射時間を定めてもよい。
【００４９】
本変形例の測定方法では、フォトブリーチング光の照射時間は、フォトブリーチング光の照射時間を単位照射時間だけ延ばしたと仮定したときに、特定の波長または一部若しくは全部の波長範囲に基づく自家蛍光の低下率が所定の値以下となるように定められる。これにより、フォトブリーチング光の照射に並行して分光スペクトルを測定しなくても効率よくフォトブリーチングを行うことができる。
なお、照射制御部５１は、フォトブリーチング光の照射時間を、自家蛍光が本測定で望ましい程度に減少するまでに必要と予測される時間よりも十分長く設定してもよい。これにより、確実にフォトブリーチングを行うことができる。
【００５０】
（第２の実施形態）
第２の実施形態に係る測定装置２００は、第１の実施形態に係る測定装置１００と同様の構成を有しているが、フォトブリーチング光を照射する照射部と、本測定を行う照射部（対物光学系２０−１）とが異なる点が、第１の実施形態とは異なっている。第１の実施形態との同一部分については第１の実施形態と同一の符号で参照し、場合に応じ説明を省略する。
【００５１】
図７は、本実施形態の測定方法に用いられる測定装置２００の構成を示す図である。測定装置２００は、第１の実施形態と同一の構成の測定部２と、情報処理装置４０とに加え、フォトブリーチング光を照射する照射部（以下、ＰＢ照射部と呼ぶ）２０２とを備える。ＰＢ照射部２０２は、光源装置２１１と、ガルバノスキャナ２１２と、リレーレンズ２１３ａ、２１３ｂと、光学ミラー２２１と、ラインジェネレータ２２２と、を備える。図７では、照射光を一点鎖線を用いて模式的に示した。
【００５２】
光源装置２１１は、半導体レーザ等のレーザ発振装置等を含んで構成される。光源装置２１１が発振する光の波長は、本測定における自家蛍光の低減が可能なら特に限定されないが、適宜本測定での照射光の波長に基づいた波長を用いることができる。光源装置２１１から出射された光は、ガルバノスキャナ２１２に入射する。
なお、光源装置２１１は、コヒーレントでない光を出射する構成にしてもよい。
【００５３】
ガルバノスキャナ２１２は、不図示の可動ミラー等を含んで構成され、光源装置２１１からの光の出射方向を変化させ走査させる。ガルバノスキャナ２１２を出射した光は、リレーレンズ２１３ａおよび２１３ｂに入射する。リレーレンズ２１３ａ、２１３ｂを通過した光は光学ミラー２２１で反射された後、ラインジェネレータ２２２で屈折され、ライン光となって測定部２のプレパラート９に固定された対象物に入射する。
なお、対象物への照射光は、ライン光に限らず、点状等の任意の形状の光とすることができる。
【００５４】
本実施形態の測定装置２００は、ＰＢ照射部２０２がフォトブリーチング光を照射する。測定部２は、対象物にフォトブリーチング光とは別の光を照射し、この別の光を励起光とした対象物からの光を受光する構成にすることで、よりフォトブリーチング光の照射装置の設計の自由度を上げることができる。
【００５５】
制御部５０の照射制御部５１は、ＰＢ照射部２０２によるフォトブリーチング光の照射と、測定部２による光照射とを、交互に行う。測定部２は、フォトブリーチング光の照射の対象となっている領域の少なくとも一部の領域に対し、フォトブリーチングの分光スペクトルへの影響をモニタリングするための光（以下、モニタリング光と呼ぶ）を照射する。モニタリング光の態様は、測定部２がモニタリング光を励起光とした分光スペクトルを測定できれば、特に限定されない。
【００５６】
本実施形態の照射制御部５１は、モニタリング光を励起光とした分光スペクトルから算出された強度パラメータおよび強度パラメータの低下率に基づいて、フォトブリーチング光の照射制御を行う。
【００５７】
図８は、本実施形態の測定方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１およびステップＳ２００３は、それぞれ図６のフローチャートのステップＳ１００１およびステップＳ１００３と同一であるため記載を省略する。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。
【００５８】
ステップＳ２００５において、制御部５０は、フォトブリーチングが完了していない、対象物９０の一部の領域を、フォトブリーチングを行う領域として選択する。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。ステップＳ２００７において、照射制御部５１は、ステップＳ２００５で選択された領域に、フォトブリーチング光の照射を一定時間行う。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。
【００５９】
ステップＳ２００９において、照射制御部５１は、ステップＳ２００５で選択された領域の少なくとも一部の領域に、モニタリング光の照射を行う。ステップＳ２００９が終了したら、ステップＳ２０１１に進む。ステップＳ２０１１において、分光器３３は、モニタリング光を励起光とした、対象物９０からの光を受光し、強度算出部５２は、受光した光の単位時間あたりの強度の低下率を算出する。ステップＳ２０１１が終了したら、ステップＳ２０１３に進む。
【００６０】
ステップＳ２０１３において、判定部５３は、単位時間、すなわち上述でフォトブリーチング光を照射した一定時間当たりの強度パラメータの低下率が０．１等の所定の値以下であるかを判定する。判定部５３は、当該低下率が所定の値以下であった場合、ステップＳ２０１３を肯定判定してステップＳ２０１５に進む。判定部５３は、当該低下率が所定の値よりも大きかった場合、ステップＳ２０１３を否定判定してステップＳ２００７に戻る。
【００６１】
ステップＳ２０１５において、制御部５０は、本測定で測定する全ての領域についてフォトブリーチングを行うという処理が完了したかを判定する。制御部５０は、当該処理が完了していた場合、ステップＳ２０１５を肯定判定してステップＳ２０１７に進む。判定部５３は、当該処理が完了していなかった場合、ステップＳ２０１５を否定判定してステップＳ２００５に戻る。
【００６２】
ステップＳ２０１７において、情報出力部５４は、フォトブリーチング工程での照射条件、測定データ等の情報を表示部４２に表示する。ステップＳ２０１７が終了したら、ステップＳ２０１９に進む。ステップＳ２０１９において、測定装置２００は、本測定を行い、情報出力部５４は、取得した分光スペクトル等の結果を表示する。ステップＳ２０１９が終了したら、処理を終了する。
【００６３】
上述の第２の実施の形態によれば、第１の実施の形態により得られる作用効果の他に、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の測定方法では、対象物９０にモニタリング光を照射し、モニタリング光を励起光とした対象物９０からの蛍光を受光し、当該蛍光の強度の単位時間当たりの低下率が所定の値以下となった場合にフォトブリーチング光の照射を終える。。これにより、フォトブリーチングを行う照射部と本測定における照射部とを異ならせることができ、様々な態様のフォトブリーチング光を用いて効率よくフォトブリーチングを行うことができる。
【００６４】
（２）本実施形態の測定装置は、点状またはライン状のフォトブリーチング光を走査して照射するＰＢ照射部と、ラマン散乱の励起光を照射する測定部２の照射部と、を備える。これにより、本測定における照射部の態様に制限されず、点状またはライン状のフォトブリーチング光を用いて、効率よくフォトブリーチングを行うことができる。
【００６５】
次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。
（変形例１）
上述の実施形態の測定装置では、分光スペクトルによりフォトブリーチング光の自家蛍光の影響をモニタリングしたが、分光器３３を用いずに、フォトダイオードや光電子増倍管等で対象物９０からの散乱光を受光してもよい。本変形例に係る測定装置３００は、測定装置２００と同様の構成を有しているが、フォトブリーチング光を励起光とした対象物９０からの散乱光を受光するフォトダイオードや光電子増倍管を備える点が、測定装置２００とは異なっている。測定装置２００との同一部分については測定装置２００と同一の符号で参照し、場合に応じ説明を省略する。
【００６６】
図９は、本変形例の測定装置３００の構成を示す図である。測定装置３００は、測定装置２００と同一の構成の測定部２と、情報処理装置４０とに加え、ＰＢ測定部３０１を備える。ＰＢ測定部３０１は、測定装置２００のＰＢ照射部２０２と略同一の光学系だが、光学ミラー２１４、ダイクロイックミラー２３１、レンズ２３４、フォトダイオード２３５をさらに備える点が異なる。図９では、照射光および対象物からの散乱光を一点鎖線を用いて模式的に示した。
なお、フォトダイオード２３５の代わりに、光電子増倍管を備えてもよい。
【００６７】
本変形例の強度算出部５２は、フォトダイオード２３４または光電子増倍管から出力された強度の値を、上述の強度パラメータとする。強度算出部５２は、時刻ｔ１、ｔ２の当該強度パラメータの値をそれぞれＩ（ｔ１）、Ｉ（ｔ２）とした場合、一定時間（ｔ２−ｔ１）あたりの強度パラメータの低下率は（Ｉ（ｔ１）−Ｉ（ｔ２））／ｔ１として算出することができる。
なお、強度パラメータの低下率の分母はｔ２としてもよく、モニタリング光の対象物９０による散乱光強度の減少を定量化することができればその算出方法は特に限定されない。
【００６８】
本変形例の測定方法の流れは、図６のフローチャートに沿うものであり、ステップＳ１００５におけるフォトブリーチング光の照射がＰＢ測定部３０１で行われることと、ステップＳ１００７、Ｓ１００９における強度パラメータの定義が上述のように異なる他は、内容が重複するため、説明を省略する。
【００６９】
本実施形態の測定装置において、受光部２３５は、分光器により分光されていない対象物からの光を受光し、強度算出部５２は、受光部が受光した光の強度の単位時間あたりの低下率を算出する。これにより、分光器を必要とせず、分光スペクトルよりも小さなデータ量で迅速にフォトブリーチング光の分析を行うことができる。
【００７０】
（変形例２）
上述の実施形態において、ＰＢ照射部２０２は、フォトブリーチング光として、水銀灯等からの白色光を対象物９０に照射することができる。ここで、白色光とは、白色に視認される可視光に限らず、異なる複数の波長の光を含む光を指す。白色光をフォトブリーチング光として対象物９０に照射する場合、対象物９０の自家蛍光と白色光の波長が重なっていると両者の区別ができない。従って、この場合は、照射する白色光の一部の波長を光学フィルタ等によりカットする。フォトブリーチング光として白色光を用いることにより、より幅広い自由度で測定装置を構成することができる。
【００７１】
（実施例１）
ヒトの直腸の病理組織の１か所にレーザ光を照射し、ラマン測定における自家蛍光の推移を観察した。
レーザ光の波長は４８８ｎｍであった。レーザ光は計５０秒照射し、照射と同時に病理組織からの散乱光の分光スペクトルを測定した。得られた５０秒間の分光スペクトルを解析した。
【００７２】
図１０は、直腸の病理組織から取得した分光スペクトルを示す図である。最初の２秒間で得られた分光スペクトルを「２秒照射時」、照射開始後２〜４秒間で得られた分光スペクトルを「計４秒照射時」、照射開始後４８〜５０秒間で得られた分光スペクトルを「計５０秒照射時」として示した。フォトブリーチング光の照射により、取得される光強度の顕著な減少が観察された。
【００７３】
（実施例２）
ヒトの結腸の病理組織が固定された標本を作成し、１０〜１０００μｍ２程度の面積の領域を設定し、当該領域を複数の単位領域に分割し、各単位領域に対し１μｍ程度のビーム径の波長５３２ｎｍのレーザ光を２秒ずつ４回照射し、、照射と同時に当該病理組織からの散乱光の分光スペクトルを測定した。得られた計８秒の分光スペクトルを解析した。
【００７４】
図１１は、結腸の病理組織から取得した分光スペクトルを示す図である。１回目の２秒間の照射で得られた分光スペクトルを「２秒照射時」、２回目の２秒間の照射で得られた分光スペクトルを「計４秒照射時」、３回目の２秒間で得られた分光スペクトルを「計６秒照射時」、４回目の２秒間で得られた分光スペクトルを「計８秒照射時」として示した。実施例１とは異なる組織でも、フォトブリーチング光の照射により、取得される光強度の顕著な減少が観察された。
【００７５】
図１２は、図１１の分光スペクトルのうち、「計２秒照射時」と「計８秒照射時」のデータを拡大して示す図である。「計８秒照射時」のデータ（図１２右側のグラフ）では、２秒間の測定の前の６秒間のフォトブリーチングにより、「２秒照射時」と比べて信号対雑音比が上がり、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３等のピークの存在が容易に識別できるようになっている。
【００７６】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００７７】
２…測定部、１０…照射光学系、２０−１…対物光学系、３０…検出光学系、３３…分光器、４０…情報処理装置、５０…制御部、５１…照射制御部、５２…強度算出部、５３…判定部、５４…情報出力部、９０…対象物、９１…測定領域、１００，２００，３００…計測装置、２０２…ＰＢ照射部、３０１…ＰＢ測定部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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