(57)【要約】【課題】リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて生物学的組成物をダイアフィルトレーションし、精製された組成物を得ることを含む、生物学的組成物の精製方法を提供する。【解決手段】本願において開示される事項は、生物学的組成物を精製するための方法であって、前記生物学的組成物を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む組成物へとダイアフィルトレーションして精製された組成物を得ることを含む、方法を含む。本願において開示される方法は、前記生物学的組成物から１種以上の不純物、例えばビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）を除去するために特に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｈ１４．１８モノクローナル抗体を含む生物学的組成物を精製するための方法であって、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて前記生物学的組成物をダイアフィルトレーションし、精製された組成物を得ることを含む、方法。
【請求項２】
前記ｃｈ１４．１８モノクローナル抗体が単離されたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的組成物は少なくとも１つの不純物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記不純物はビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的組成物中のＢｉｓ−ｔｒｉｓの濃度は、ｐＨ６．３〜６．７において１０〜５０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ダイアフィルトレーションは、前記生物学的組成物から少なくとも５０％のＢｉｓ−ｔｒｉｓを除去する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ダイアフィルトレーションは、前記生物学的組成物から少なくとも７０％のＢｉｓ−ｔｒｉｓを除去する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＳの濃度は、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００〜２００ｍＭのＮａＣｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｃｈ１４．１８抗体は、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる前に、少なくとも２．０〜５．０ＡＵの濃度に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｃｈ１４．１８抗体は、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる前に、少なくとも４．０〜６．０ＡＵの濃度に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを使用して、前記ｃｈ１４．１８抗体を単離及び精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィーカラム、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィーカラム、及び／又は少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、前記ｃｈ１４．１８抗体を単離及び精製することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｃｈ１４．１８抗体は、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを含む組成物を使用して、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムから溶出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも３容積単位の生物学的組成物は、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも５容積単位の生物学的組成物は、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製された組成物は、ヒスチジンを含む組成物へとさらにダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
（ａ）前記モノクローナル抗体を含む第一の組成物をアフィニティクロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第二の組成物を得；
（ｂ）前記第二の組成物のｐＨを低下させて第三の組成物を得；
（ｃ）溶媒洗浄剤を用いて前記第三の組成物を洗浄して第四の組成物を得；
（ｄ）前記溶媒洗浄剤を除去するために前記第四の組成物を洗浄して第五の組成物を得；
（ｅ）前記第五の組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第六の組成物を得；
（ｆ）前記第六の組成物をナノろ過にかけて、第七の組成物を得；
（ｇ）前記第七の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体及びＢｉｓ−ｔｒｉｓを含む第八の組成物を得；
（ｈ）ＰＢＳを含む組成物へと前記第八の組成物をダイアフィルトレーションして、前記モノクローナル抗体を含むが、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを実質的に含まない第九の組成物を得ること
を含む、方法。
【請求項１９】
ｃｈ１４．１８モノクローナル抗体を含む生物学的組成物からビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）を除去するための方法であって、前記生物学的組成物を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いてダイアフィルトレーションし、前記生物学的組成物から少なくとも５０％のｂｉｓ−ｔｒｉｓを除去することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年７月２５日に出願された米国仮出願第６２／０２８，９９４号の利益を請求し、その内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体及び他の生物学的材料を精製するための既知の方法は、望ましくない不純物を除去するためにしばしば必要とされる。それは、生物学的製剤が治療用途のために生産される場合に特に重要である。不純物を除去するための１つの方法は、ダイアフィルトレーション (diafiltration)による方法である。ダイアフィルトレーションは、当核分野で公知であり、そして例えば、Wayne P. Olson, Separations Technology: Pharmaceutical and Biotechnology Applications (Interpharm Press 1995); Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. CRC Press 1998); Stefan Behme, Manufacturing of Pharmaceutical Proteins (Wiley-VCH 2009);及びGlyn N. Stacey, Medicines from Animal Cell Culture (John Wiley 2007)（それらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０００３】
Ｃｈ１４．１８（また、本明細書においては、「ジヌトキシマグ（dinutuximab）」とも呼ばれる）は、抗ＧＤ2モノクローナル抗体であり、そしてその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gillies et al., Journal of Immunological Methods 125:191-202 (1989)に記載されている。治療目的のためにｃｈ１４．１８抗体を用いる場合、モノクローナル抗体の安全性及び有効性を確保するために、不純物、例えばビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）を除去することが重要である。従って、生物学的組成物から所望しない不純物を除去する方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記載される本発明の多くの実施形態は、リン酸緩衝食塩水 （ＰＢＳ）を用いて生物学的組成物をダイアフィルトレーションし、精製された組成物を得ることを含む、生物学的組成物の精製方法に関する。
【０００５】
１つの実施形態によれば、生物学的組成物は、少なくとも１つの単離されたタンパク質を含む。
【０００６】
１つの実施形態によれば、前記単離されたタンパク質はモノクローナル抗体である。１つの実施形態によれば、前記モノクローナル抗体は、ｃｈ１４．１８である。
【０００７】
１つの実施形態によれば、生物学的組成物はさらに、少なくとも１つの不純物を含む。１つの実施形態によれば、不純物は、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミン−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）である。１つの実施形態によれば、生物学的組成物中のＢｉｓ−トリスの濃度は、６．３〜６．７のｐＨで、１０〜５０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓである。
【０００８】
１つの実施形態によれば、ダイアフィルトレーションは、生物学的組成物からＢｉｓ−ｔｒｉｓの少なくとも７０％を除去する。
【０００９】
１つの実施形態によれば、ＰＢＳの濃度は、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００〜２００ｍＭのＮａＣｌである。
【００１０】
１つの実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＰＢＳを含む組成物にダイアフィルトレーションされる前、少なくとも２．０〜５．０ＡＵの濃度に濃縮される。１つの実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＰＢＳを含む組成物にダイアフィルトレーションされる前、少なくとも４．０〜６．０ＡＵの濃度に濃縮される。
【００１１】
１つの実施形態によれば、前記方法はさらに、少なくとも１つのクロマトグラフィーを用いて、モノクローナル抗体を単離し、そして精製することを含む。
【００１２】
１つの実施形態によれば、前記方法は、少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィーカラム、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィーカラム、及び／又は少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、モノクローナル抗体を単離し、そして精製することを含む。１つの実施形態によれば、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラム (adhere column)である。１つの実施形態によれば、モノクローナル抗体は、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを含む組成物を使用して、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムから溶出される。
【００１３】
１つの実施形態によれば、少なくとも３容積単位（volume unit）の生物学的組成物が、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる。１つの実施形態によれば、少なくとも５容積単位（volume unit）の生物学的組成物が、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる。
【００１４】
１つの実施形態によれば、精製された組成物は、ヒスチジンを含む組成物へと、さらにダイアフィルトレーションされる。
【００１５】
モノクローナル抗体を精製するための方法がさらに記載され、ここで前記方法は、（ａ）前記モノクローナル抗体を含む第一の組成物をアフィニティクロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第二の組成物を得；（ｂ）前記第二の組成物のｐＨを低下させて第三の組成物を得；（ｃ）溶媒洗浄剤（solvent-detergent）を用いて前記第三の組成物を洗浄して第四の組成物を得；（ｄ）前記溶媒洗浄剤を除去するために前記第四の組成物を洗浄して第五の組成物を得；（ｅ）前記第五の組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第六の組成物を得；（ｆ）前記第六の組成物をナノろ過にかけて、第七の組成物を得；（ｇ）前記第七の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体及びＢｉｓ−ｔｒｉｓを含む第八の組成物を得；（ｈ）ＰＢＳを含む組成物へと前記第八の組成物をダイアフィルトレーションして、前記モノクローナル抗体を含むが、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを実質的に含まない第九の組成物を得ること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＰＢＳを用いたダイアフィルトレーションの後、ｃｈ１４．１８の弱陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。ラインＡは、ＰＢＳを用いてダイアフィルトレーションされたｃｈ１４．１８を表す。ラインＢは、ＨＢＳへとダイアフィルトレーションされたｃｈ１４．１８を表す。
【図２】図２は、弱陽イオン交換ＨＰＬＣカラムにロードされた２５ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓのサンプルを示し、そして約７分の保持時間を有するピークがＢｉｓ−ｔｒｉｓによるものであることを示す。弱陽イオン交換による２５ｍＭのＢｉｓ−ｔｉｓの評価。ラインＡは２１５ｎｍでモニターされた吸光度を示す。ラインＢは、２８０ｎｍでモニターされた吸光度を示す。
【図３】図３は、新規又は使用済み樹脂からのＣａｐｔｏ（商標）吸着溶離液プールの弱陽イオンＨＰＬＣを示し、そして約７分でのピークがＢｉｓ−ｔｒｉｓによるものであり、そして以前の使用からのカラム上のいくらかの汚染物質によるものではないことを実証する。Ｃａｐｔｏ（商標）吸着溶離液プールのサンプルは、新規又は使用済みクロマトグラフィーカラム由来のｃｈ１４．１８を有さない。ラインＡは、新規カラム由来のサンプルに関する。ラインＢは、使用済みカラム由来である。
【図４】図４は、ＰＢＳへのダイアフィルトレーションの前、汚染物質によりスパイクされた(spiked)、ｃｈ１４．１８の弱陽イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。ラインＡは、汚染物質のスパイクなしでのｃｈ１４．１８を表す。ラインＢは、リン酸トリブチル及びポリソルベート８０によりスパイクされたｃｈ１４．１８を表す。ラインＣは、メトトレキセートによりスパイクされたｃｈ１４．１８を表す。精製方法由来の微量添加物のいずれも、約７分でのピークに関与していない（図１及び２）。
【図５】図５は、モノクローナル抗体（例えば、ｃｈ１４．１８）を精製するためのプロセスフローチャートの１つの実施形態を示す略図を提供する。この精製方法は、当初は、国立癌研究所（ＮＣＩ）により開発され（実施例２を参照のこと）、そして続いて、United Therapeutics Corpにより改良された（実施例１を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書に記載される多くの実施形態は、精製された組成物を得るために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により生物学的組成物をダイアフィルトレーションすることを含む、生物学的組成物の精製方法に関する。
【００１８】
生物学的組成物
【００１９】
当核分野で公知の多くの生物学的組成物は、本明細書に記載される方法を用いて精製され得る。生物学的組成物は、化学的に合成された材料よりもむしろ、生物学的に創造された少なくとも１つの材料、例えばタンパク質、核酸、細胞、組織、ワクチン及び血液、又はそれらの成分を含むことができる。
【００２０】
生物学的組成物は、例えば組換えタンパク質を含む、少なくとも１つの単離されたタンパク質を含むことができる。生物学的組成物は、例えば少なくとも１つの単離された核酸を含むことができる。生物学的組成物は、例えば少なくとも１つのモノクローナル抗体を含むことができる。
【００２１】
１つの特定の実施形態によれば、生物学的組成物は、少なくとも１つのｃｈ１４．１８モノクローナル抗体を含むが、但し他の抗体及び生物製剤は本明細書に開示される教示により精製され得る。
【００２２】
生物学的組成物は、例えば少なくとも１つの不純物を含むことができる。その不純物は、例えば所望しない塩、例えばＢｉｓ−ｔｒｉｓであり得る。生物学的組成物中のＢｉｓ−ｔｒｉｓ不純物の濃度は、例えば１〜１００ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓ、又は１０〜５０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓ、又は２０〜４０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓであり得る。ｐＨは、例えば、６〜７、又は６．３〜６．７、又は６．４〜６．６であり得る。
【００２３】
ＰＢＳを用いるダイアフィルトレーション
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される方法は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６容積単位の生物学的組成物を１容積単位のＰＢＳへとダイアフィルトレーションすることを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、生物学的組成物は、所望しないＢｉｓ−ｔｒｉｓを含み、そして本明細書に記載される方法は、ＰＢＳダイアフィルトレーションにより、生物学的組成物からＢｉｓ−ｔｒｉｓの少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を除去することを含む。
【００２６】
ＰＢＳの濃度は、例えば１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び１００〜２００ｍＭのＮａＣｌであり得る。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、ＰＢＳによるダイアフィルトレーションの前、生物学的組成物は最初に、濃縮される。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、ＰＢＳダイアフィルトレーションの後、生物学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０塩水（ＨＢＳ）を含む製剤へダイアフィルトレーションされる。
【００２９】
モノクローナル抗体の単離
【００３０】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態によれば、前記方法はまた、ＰＢＳダイアフィルトレーションの前、モノクローナル抗体を単離し、そして精製することも含む。モノクローナル抗体は、例えば少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムにより単離され、そして精製され得る。モノクローナル抗体は、例えば、少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィーカラム、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィーカラム、及び／又は少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにより単離され、そして精製され得る。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムであり得る。
【００３１】
Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムは、当核技術分野において公知であり、そしてGE Healthcare Life Sciencesから市販されている。それは、充填層クロマトグラフィーによるプロテインＡ媒体への捕捉の後、モノクローナル抗体の中間精製及び研磨のためのマルチモーダル媒体である。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムを用いてのモノクローナル抗体の精製を含み、ここで前記モノクローナル抗体は、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を含む組成物により溶離される。次に、溶離された抗体製剤は、上記で論じられたように、ＰＢＳを含む製剤にダイアフィルトレーションされ、そして任意にはさらに、ＨＢＳを含む製剤にダイアフィルトレーションされる。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、例えば産生されたモノクローナル抗体を含む生物学的組成物を濃縮することを、さらに含むことができる。
【００３３】
本明細書に記載される方法は、例えばプロテインＡ平衡化緩衝液への生物学的組成物のダイアフィルトレーションを、さらに含むことができる。特定の態様によれば、プロテインＡ平衡化緩衝液は、７．０〜８．０のｐＨであって、２５〜１００ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５〜２．０ＭのＮａＣｌを含むことができる。
【００３４】
本明細書に記載される方法は、例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム、例えばプロテインＡ親和性カラムに生物学的組成物を通すことを、さらに含むことができる。
【００３５】
本明細書に記載される方法は、例えば生物学的組成物のｐＨを下げることによるウィルス不活性化を、さらに含むことができる。
【００３６】
本明細書に記載される方法は、例えば溶媒洗浄剤による生物学的組成物の洗浄によるウィルス不活性化を、さらに含むことができる。特定の態様によれば、溶媒洗浄剤は、１０〜２５％のポリソルベート（ＴＷＥＥＮ）、５〜１０％のリン酸トリブチルを含む。
【００３７】
本明細書に記載される方法は、例えば、何れかの溶媒洗浄剤を除去するために生物学的組成物を洗浄することを、さらに含むことができる。
【００３８】
本明細書に記載される方法は、例えば５０ＨＳ平衡化緩衝液に生物学的組成物をダイアフィルトレーションすることを、さらに含むことができる。特定の態様によれば、５０ＨＳ平衡化緩衝液は、４．０〜５．５のｐＨであって、５〜２０ｍＭのクエン酸塩、５〜３０ｍＭのリン酸塩、１５〜１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００３９】
本明細書に記載される方法は、例えば陽イオン交換アフィニティクロマトグラフィーカラム、例えば５０ＨＳカラムに生物学的組成物を通すことを、さらに含むことができる。
【００４０】
本明細書に記載される方法は、例えば生物学的組成物を、ナノろ過にかけることを、さらに含むことができる。
【００４１】
本明細書に記載される方法は、例えば陰イオン交換アフィニティクロマトグラフィーカラム、例えばＣａｐｔｏ（商標）吸着カラムに、ＰＢＳダイアフィルトレーションの前、生物学的組成物を通すことを、さらに含むことができる。モノクローナル抗体は、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムから溶離され得る。
【００４２】
本明細書に記載される方法は、例えばＰＢＳダイアフィルトレーションの後、ヒスチジン緩衝液に生物学的組成物をダイアフィルトレーションすることを、さらに含むことができる。
【００４３】
１つの実施形態によれば、本明細書に記載される方法は、以下の工程：
（ａ）前記モノクローナル抗体を含む第一の組成物をアフィニティクロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第二の組成物を得；
（ｂ）前記第二の組成物のｐＨを低下させて第三の組成物を得；
（ｃ）溶媒洗浄剤（solvent-detergent）を用いて前記第三の組成物を洗浄して第四の組成物を得；
（ｄ）前記溶媒洗浄剤を除去するために前記第四の組成物を洗浄して第五の組成物を得；
（ｅ）前記第五の組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第六の組成物を得；
（ｆ）前記第六の組成物をナノろ過にかけて、第七の組成物を得；
（ｇ）前記第七の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体及びＢｉｓ−ｔｒｉｓを含む第八の組成物を得；
（ｈ）ＰＢＳを含む組成物へと前記第八の組成物をダイアフィルトレーションして、前記モノクローナル抗体を含むが、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを実質的に含まない第九の組成物を得ること、を含む。
【実施例】
【００４４】
実施例１−弱陽イオン交換ＨＰＬＣアッセイの開発
【００４５】
ｃｈ１４．１８精製方法の開発において、目的は、国立癌研究所（ＨＣＩ）により最初に開発された精製方法を改善することであった（ＮＣＩにより最初に開発された方法については、図５を参照のこと）。さらなる目的は、使用の前、樹脂を衛生的にするのに有用であり得る、より良好な容量、より良好な流動特性を有するか、又はより苛酷な化学物質に耐性があるクロマトグラフィー樹脂にアップグレートすることであった（例えば、GE HealthcareのＣａｐｔｏ（商標）吸着樹脂）。
【００４６】
最後の２つのクロマトグラフィー工程（図５のセクション１８及び１９を参照のこと）に関しては、ＮＣＩは、Superdex 200サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、ｃｈ１４．１８の凝集体及び二量体を除去し、続いて研磨樹脂としてQ Sepharose 陰イオン交換樹脂を使用した。それらは、ウィルス、凝集体及び微量汚染物を除去する樹脂、すなわちGE Healthcare のＣａｐｔｏ（商標）吸着樹脂（例えば、GE Healthcare Life Sciences, Instructions 28-9064-05 Capto（商標） 吸着アフィニティクロマトグラフィー製品マニュアルを参照のこと、その内容は参照により本明細書に完全に組み込まれ、そしてhttps://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1334667780708/litdoc28906405_20120420104439.pdfで入手できる）にアップグレートされた。この樹脂は、混合モード樹脂であり、陰イオン交換と疎水性相互作用との組み合わせである。それは、フリースルーモードで操作され、ここで汚染物は、樹脂に結合し、一方では、ｃｈ１４．１８モノクローナル抗体は結合せず、そしてフロースルーに残存した。
【００４７】
ｃｈ１４．１８の精製が修正されるのと同時に、品質指示アッセイもまた開発された。それらの１つは、弱陽イオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣアッセイであった。このために、TOSOHのTSKGEL CM-3SWカラムを使用し、ｃｈ１４．１８の純度を評価した。この分析に関しては、カラムに結合され、そして塩勾配としてカラムを溶出される抗体を、カラムに通した。カラムを、低塩のリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ）により平衡化し、そして勾配を、高められた濃度のリン酸ナトリウム／過塩素酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ｂ）で生ぜしめた。この分離方法を用いて、カラム溶出液を、２１５ｎｍでモニターし、そしてｃｈ１４．１８ピークを、注入の約１５〜１９分後、カラムから溶出した。ｃｈ１４．１８の保持時間は、前記方法及び勾配が最適化されるにつれて、変化した。アッセイの開発の間、ｃｈ１４．１８の種々のサンプルを試験し、そしてそれらのいくつかにおいては、約７．５分の保持時間を有する、かなり大きなピークが観察された。この汚染物を同定しようとする際、ｃｈ１４．１８のサンプルを、製造方法において初期で添加された汚染物によりスパイクした（図１を参照のこと）。汚染物を含まなかったｃｈ１４．１８のサンプルを、メトトレキセート又はリン酸トリブチル及びポリソルベート８０によりスパイクした。それらの汚染物の何れも、７．５分の保持時間を有するピークの源であるとは思えなかった。
【００４８】
サンプル源を追跡し、そしてサンプルが精製方法のどの工程から得られたかを通して、問題のピークは、精製方法における最終研磨工程であるＣａｐｔｏ（商標）吸着クロマトグラフィー処理の後にのみ見られたことが注目された。汚染物は、いくらかの微量汚染物、例えばカラム上で共精製され、そして濃縮する、細胞培養方法由来の宿主細胞であると思われた。使用済みカラム又は新しいカラム上にロードされた、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラム上での模擬試験からのサンプルを、弱陽イオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣにより評価した（図２を参照のこと）。ほぼ同じ濃度で、７．５分の汚染ピークが両サンプルに見出され、このことは、汚染物が上流の汚染物に由来しなかったことを示唆する。
【００４９】
サンプルを含む、ｃｈ１４．１８のサンプルの起源及び、それを含まないサンプルの起源を追跡することにより、汚染物は、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着精製工程のために使用される緩衝塩であるＢｉｓ−ｔｒｉｓであることが明らかになった（図３を参照のこと）。
【００５０】
汚染物を同定すると、全精製工程を経た、精製されたｃｈ１４．１８のいくつかは、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓピークを含んでいたのに対して、他のサンプルは含んでいなかった理由が次に調べられた。ＮＣＩにより使用されるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の処方物から移行された、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０生理食塩水（ＨＢＳ）中の最終抗体製剤もまた、開発されている。ｃｈ１４．１８を含むＣａｐｔｏ（商標）吸着生成物プールを、ＨＢＳ緩衝液に直接ダイアフィルトレーションした場合、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓピークが保持液プールからダイアフィルトレーションしなかったことに注目すべきである。しかしながら、このプールがまず、リン酸緩衝食塩水に、次に、ＨＢＳ緩衝液にダイアフィルトレーションされる場合、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓは溶液から完全に除去された。図４は、ＨＢＳにダイアフィルトレーションされるか又はＰＢＳによりダイアフィルトレーションされたＣａｐｔｏ（商標）吸着クロマトグラフィー工程からのｃｈ１４．１８を示す。
【００５１】
結論として、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムは、モノクローナル抗体の精製のためにバイオテクノロジー産業において一般的に使用される。それは、微量汚染物、例えば残留プロテインＡリガンド、残留宿主細胞ＤＮＡ、残留宿主細胞タンパク質、抗体凝集体、及びウィルスの除去に有用である。ＰＢＳを用いるダイアフィルトレーションが、モノクローナル抗体、例えばｃｈ１４．１８の最終製剤化の前、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ不純物を除去するのに効果的手段であることが判明した。
【００５２】
実施例２−プロセスフローチャート
【００５３】
プロセスフローチャートが、モノクローナル抗体（例えば、ｃｈ１４．１８）を精製するための１つの実施形態を示す図５に提供されている。示される工程は、厳密に限定されることを意味するものではなく、そして当面の方法の特定の必要性及び状況に応じて調整され得る。図５の方法は一般的に次の工程を参照している：
【００５４】
セクション８．モノクローナル抗体の産物 (harvest)（例えば、粗産物）の初期プール及びろ過。
【００５５】
セクション９．セクション８の産物をアフィニティクロマトグラフィーカラム（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーカラム）に通して、モノクローナル抗体を含む第２組成物を得ること。
【００５６】
セクション１０．第２組成物のｐＨを下げることによりウィルスを不活性化し、第３組成物を入手すること。次に、第３組成物を、溶媒洗浄剤により洗浄し、第４組成物を得、次にこれを、再び洗浄し、溶媒洗浄剤を除去し、第５組成物を得る。
【００５７】
セクション１１．第５組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、ＳＰセファロースＦＦクロマトグラフィー）に通し、モノクローナル抗体を含む第６組成物を得ること。プロテインＡクロマトグラフィーは反復され（セクション１２）、続いてウィルス不活性化が反復され（セクション１３）、続いて陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、セファロース）が反復され得る（セクション１４）。次に、セファロースのランをプールし、第６組成物を形成する。
【００５８】
セクション１６、第６組成物を、ナノろ過にかけ、さらにウィルスを除去し、第７組成物を得ること。
【００５９】
セクション１７、１８、１９。第７組成物を、Superdex 200サイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体の凝集体及びダイマーを除去し、モノクローナル抗体を濃縮すること。組成物をQセファロース陰イオン交換樹脂に通し、モノクローナル抗体を含む第８組成物を入手する。
【００６０】
セクション２０。濃縮及び最終ろ過。その後、第８組成物を濃縮及び最終ろ過し、例えばＰＢＳを含む組成物へのダイアフィルトレーションにかけ、モノクローナル抗体を含む第９組成物を入手する。
【００６１】
さらなる実施形態
【００６２】
実施形態１−リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて生物学的組成物をダイアフィルトレーションし、精製された組成物を得ることを含む、生物学的組成物を精製するための方法。
実施形態２−前記生物学的組成物は少なくとも１つの単離されたタンパク質を含む、実施形態１の方法。
実施形態３−前記生物学的組成物は少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体、例えばｃｈ１４．１８を含む、実施形態１〜２の方法。
実施形態４−前記生物学的組成物はさらに、少なくとも１つの不純物、例えばビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）を含む、実施形態１〜３のいずれかの方法。
実施形態５−前記生物学的組成物はさらに、ｐＨ６．３〜６．７において１０〜５０ｍＭの濃度で、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓをさらに含む、実施形態１〜４のいずれかの方法。
実施形態６−前記ダイアフィルトレーションは、前記生物学的組成物から少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％のＢｉｓ−ｔｒｉｓを除去する、実施形態１〜５のいずれかの方法。
実施形態７−前記ＰＢＳの濃度は、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００〜２００ｍＭのＮａＣｌである、実施形態１〜６のいずれかの方法。
実施形態８−前記モノクローナル抗体は、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる前に、少なくとも２．０〜５．０ＡＵの濃度に濃縮される、実施形態１〜７のいずれかの方法。
実施形態９−少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを使用して、前記モノクローナル抗体を単離及び精製することをさらに含む、実施形態１〜８のいずれかの方法。
実施形態１０−少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィーカラム、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィーカラム、及び／又は少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＣａｐｔｏ（商標）吸着カラムを使用して、前記モノクローナル抗体を単離及び精製することをさらに含む、実施形態１〜９のいずれかの方法。
実施形態１１−前記モノクローナル抗体は、ＰＢＳによりダイアフィルトレーションされる前に、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを含む組成物を使用して、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムから溶出される、実施形態１〜１０のいずれかの方法。
実施形態１２−少なくとも３容積単位 (volume unit)、少なくとも４容積単位、少なくとも５容積単位、又は少なくとも６容積単位の生物学的組成物は、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる、実施形態１〜１１のいずれかの方法。
実施形態１３−前記精製された組成物は、ヒスチジンを含む組成物へとさらにダイアフィルトレーションされる、実施形態１〜１２のいずれかの方法。
実施形態１４−（ａ）前記モノクローナル抗体を含む第一の組成物をアフィニティクロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第二の組成物を得；（ｂ）前記第二の組成物のｐＨを低下させて第三の組成物を得；（ｃ）溶媒洗浄剤を用いて前記第三の組成物を洗浄して第四の組成物を得；（ｄ）前記溶媒洗浄剤を除去するために前記第四の組成物を洗浄して第五の組成物を得；（ｅ）前記第五の組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第六の組成物を得；（ｆ）前記第六の組成物をナノろ過にかけて、第七の組成物を得；（ｇ）前記第七の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体及びＢｉｓ−ｔｒｉｓを含む第八の組成物を得；（ｈ）ＰＢＳを含む組成物へと前記第八の組成物をダイアフィルトレーションして、前記モノクローナル抗体を含むが、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを実質的に含まない第九の組成物を得ることを含む、モノクローナル抗体を精製するための方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月5日(2020.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
（ａ）前記モノクローナル抗体を含む第一の組成物をアフィニティクロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第二の組成物を得；
（ｂ）前記第二の組成物のｐＨを低下させて第三の組成物を得；
（ｃ）溶媒洗浄剤を用いて前記第三の組成物を洗浄して第四の組成物を得；
（ｄ）前記溶媒洗浄剤を除去するために前記第四の組成物を洗浄して第五の組成物を得；
（ｅ）前記第五の組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体を含む第六の組成物を得；
（ｆ）前記第六の組成物をナノろ過にかけて、第七の組成物を得；
（ｇ）前記第七の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて、前記モノクローナル抗体及びＢｉｓ−ｔｒｉｓを含む第八の組成物を得；および
（ｈ）ＰＢＳを含む組成物へと前記第八の組成物をダイアフィルトレーションして、前記モノクローナル抗体を含むが、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓを実質的に含まない第九の組成物を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体がｃｈ１４．１８モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第八の組成物中のＢｉｓ−ｔｒｉｓの濃度は、ｐＨ６．３〜６．７において１０〜５０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＢＳの濃度は、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００〜２００ｍＭのＮａＣｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、前記第九の組成物へとダイアフィルトレーションされる前に、少なくとも２．０〜５．０ＡＵの濃度に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体は、前記第九の組成物へとダイアフィルトレーションされる前に、少なくとも４．０〜６．０ＡＵの濃度に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、Ｃａｐｔｏ（商標）吸着カラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも３容積単位の前記第八の組成物は、１容積単位の、ＰＢＳを含む前記第九の組成物へとダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも５容積単位の生物学的組成物は、１容積単位の、ＰＢＳを含む組成物へとダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第九の組成物は、ヒスチジンを含む組成物へとさらにダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。