(57)【要約】【課題】解凍後の細胞生存率の優れた細胞凍結保存方法を提供する。【解決手段】本発明の細胞凍結保存方法は、マルトトリオースを含む培地中に細胞を配置する工程、および上記細胞を配置した上記培地を凍結させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトトリオースを含む培地中に細胞を配置する工程、および
上記細胞を配置した上記培地を凍結させる工程を含むことを特徴とする細胞凍結保存方法。
【請求項２】
上記培地はマルトースを含む、請求項１に記載の細胞凍結保存方法。
【請求項３】
上記培地におけるマルトトリオースの含有量が１質量％以上３０質量％以下である、請求項１または２に記載の細胞凍結保存方法。
【請求項４】
上記培地におけるマルトトリオースおよびマルトースの合計の含有量が１質量％以上４０質量％以下である、請求項２に記載の細胞凍結保存方法。
【請求項５】
上記細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞凍結保存方法。
【請求項６】
細胞を凍結保存するために培地に添加される細胞凍結保存用組成物であって、
マルトトリオースを含むことを特徴とする細胞凍結保存用組成物。
【請求項７】
マルトースをさらに含む、請求項６に記載の細胞凍結保存用組成物。
【請求項８】
培地にマルトトリオースを含むことを特徴とする細胞凍結保存用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凍結保存方法、細胞凍結保存用組成物、および細胞凍結保存用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の保存方法の一つとして、細胞を凍結させて保存する凍結保存が知られており、広く利用されている。また、凍結保存法に関し、様々な技術が開発されている。例えば、動物細胞の凍結保存を行う場合、培養液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセリンを添加することが従来なされているが、ＤＭＳＯまたはグリセリンを用いた場合、解凍後に細胞に損傷を与えることがあるため、その問題を改善する手段の開発がなされている。例えば、特許文献１には、解凍後の細胞の生存率を高めることを目的として、ε−ポリ−Ｌ−リジンをカルボキシル化した両性高分子化合物を含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を用いた凍結保存方法が開示されている。また、特許文献２には、解凍後の細胞の生存率を高めることを目的として、蚕が生産するタンパク質であるセリシンを少なくとも含む細胞凍結保存用組成物を用いた凍結保存方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−２２０６７２号公報
【特許文献２】特開２００６−１１５８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１および２に記載された方法では、特殊な化合物を使用している。当該化合物を準備するとなると手間またはコストがかかるため、これらの方法は必ずしも容易に利用できるものではない。そのため、容易に利用し得る他の代替手段が依然として求められている。
【０００５】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、容易に利用することができ、かつ解凍後の細胞生存率の優れた細胞凍結保存方法、細胞凍結保存用組成物、および細胞凍結保存用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る細胞凍結保存方法は、上記課題を解決するために、マルトトリオースを含む培地中に細胞を配置する工程、および上記細胞を配置した上記培地を凍結させる工程を含むものである。
【０００７】
また、本発明に係る細胞凍結保存方法の一態様では、上記培地はマルトースを含む。
【０００８】
また、本発明に係る細胞凍結保存方法の一態様では、上記培地におけるマルトトリオースの含有量が１質量％以上３０質量％以下である。
【０００９】
また、本発明に係る細胞凍結保存方法の一態様では、上記培地におけるマルトトリオースおよびマルトースの合計の含有量が１質量％以上４０質量％以下である。
【００１０】
また、本発明に係る細胞凍結保存方法の一態様では、上記細胞が哺乳類細胞である。
【００１１】
本発明に係る細胞凍結保存用組成物は、上記課題を解決するために、細胞を凍結保存するために培地に添加される細胞凍結保存用組成物であって、マルトトリオースを含むものである。
【００１２】
また、本発明に細胞凍結保存用組成物の一態様では、マルトースをさらに含んでいる。
【００１３】
本発明に係る細胞凍結保存用培地は、上記課題を解決するために、培地にマルトトリオースを含むものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞凍結保存方法および細胞凍結保存用組成物によれば、解凍後の細胞生存率が優れたものとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
〔細胞凍結保存方法〕
本発明に係る細胞凍結保存方法の一実施形態について、以下に説明する。
【００１６】
本実施形態の細胞凍結保存方法は、培地中に細胞を配置する工程、および細胞を配置した培地を凍結させる工程を少なくとも含むものである。
【００１７】
（培地）
本実施形態の細胞凍結保存方法において、細胞を配置する培地には、マルトトリオースが含まれている。培地におけるマルトトリオースの含有量は、１質量％以上３０質量％以下が好ましく、１．５質量％以上２０質量％以下がより好ましく、４質量％以上１２．５質量％以下がさらに好ましい。
【００１８】
マルトトリオースは市販のものを用いることができる。また、澱粉を原料として酵素反応を行って調製したものでもよい。培地に添加されるマルトトリオースは精製されていても、精製されていなくてもよい。
【００１９】
また、培地には、マルトトリオースの他、単糖類、二糖類、マルトトリオース以外の他の三糖類および四糖以上の多糖類から選択される他の糖類が含まれていてもよい。他の糖類としては、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ｍｙｏ−イノシトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、ラクチトール、マルチトール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、イヌリン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ラフィノース、スタキオース、キサンタンガム、グルコサミン、およびガラクトサミンマルトトリオースなどが挙げられる。
【００２０】
単糖類をさらに含む場合、培地における単糖類の含有量は、０．０１質量％以上１０質量％以下とすることでき、０．０５質量％以上５質量％以下であり得、さらに０．２５質量％以上０．８５質量％以下であり得る。
【００２１】
二糖類をさらに含む場合、培地における二糖類の含有量は、０．１質量％以上１０質量％以下とすることでき、０．５質量％以上７．５質量％以下であり得、さらに１．５質量％以上５質量％以下であり得る。
【００２２】
マルトトリオース以外の他の三糖類を含む場合、培地における他の三糖類の含有量は、５質量％以下とすることでき、２質量％以下であり得、さらに１質量％以下であり得る。
【００２３】
四糖以上の多糖類をさらに含む場合、培地における四糖以上の多糖類の含有量は、０．１質量％以上１０質量％以下とすることでき、０．２５質量％以上６質量％以下であり得、さらに１質量％以上３．５質量％以下であり得る。
【００２４】
他の糖類を含む場合、他の糖類としてはマルトースが好ましい。他の糖類としてマルトースを含む場合、培地におけるマルトトリオースおよびマルトースの合計の含有量は、１質量％以上４０質量％以下であることが好ましく、２質量％以上３０質量％以下がより好ましく、５質量％以上１７．５質量％以下がさらに好ましい。
【００２５】
なお、「マルトトリオースを含む培地中に細胞を配置する」とは、凍結処理の前に、マルトトリオースを含む培地中に細胞が存在している状態となっていればよい。したがって、マルトトリオースを含んでいない培地中に細胞を移した後、凍結を行う前にそこにマルトトリオースを加え、懸濁するものであってもよく、あるいは、予め培地にマルトトリオースを添加しておき、そこに細胞を加えるものであってもよい。
【００２６】
本実施形態の細胞凍結保存方法における培地には、上述の糖類の他に、細胞凍結保存における保護成分として従来用いられている他の成分が含まれていてもよい。従来用いられている他の成分としては、例えば、血清、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール等が挙げられる。
【００２７】
さらには、培地には、アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、ペニシリンおよびストレプトマイシン等の抗生物質、コラーゲン前駆体、微量金属イオンまたはその錯体、各種塩等が添加されていてもよい。
【００２８】
培地の成分は、細胞凍結保存方法を適用する細胞に応じて、適した培地を選択すればよい。例えば、動物細胞に用いられる培地の典型的な例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）が挙げられる。どのような培地が適しているかは、当該細胞を取り扱う技術分野における当業者であれば容易に理解することができる。
【００２９】
本実施形態の細胞凍結保存方法においては、以上のように、細胞を配置する培地にマルトトリオースが含まれていることで、解凍後の細胞生存率が優れたものとなる。なお、本明細書において「解凍後の細胞生存率が優れる」とは、解凍直後の生死判定により、生きている細胞の割合が高い場合を指すことの他、解凍後に所定期間培養を行う工程をはさみ、当該培養後の細胞の量が他との比較で多くなる場合も、「解凍後の細胞生存率が優れる」ものとする。
【００３０】
（細胞）
本実施形態の細胞凍結保存方法を適用し得る細胞に特に制限はなく、動物細胞および植物細胞のほか、細菌、菌類、古細菌および原生生物等の微生物細胞等でもあり得る。本明細書において、「動物」とは、ヒトを含む哺乳類、魚類、爬虫類、両生類および鳥類等の脊椎動物ならびに昆虫等の無脊椎動物を包含するものである。なかでも、本実施形態の細胞凍結保存方法は、動物細胞に対して好適に利用し得、さらには哺乳類細胞に対してより好適に利用し得る。動物細胞は、体細胞および生殖細胞の何れでもあり得る。動物細胞の例としては、非限定的に、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、マウス等の哺乳動物の器官、臓器または組織から分離、培養したプライマリーカルチャー、および繁殖用の家畜の精子細胞等が挙げられる。繁殖用の家畜としては、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ等が挙げられる。また、微生物細胞の例としては、非限定的に、各種酵素、アミノ酸および抗生物質等を生産する糸状菌、キノコ（mushroom）および酵母などの菌類および細菌類等が挙げられる。具体的には、菌類としては、子嚢菌、接合菌、担子菌および不完全菌などが挙げられ、細菌類としては、抗生物質を生産する放線菌を含むグラム陽性細菌および大腸菌などのグラム陰性細菌などが挙げられる。
【００３１】
また、細胞は、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および多能性幹細胞など、いずれの態様の細胞であってもよい。
【００３２】
（凍結保存）
細胞を配置した培地を凍結させる工程における凍結方法は特に制限されない。したがって、チューブ等の凍結保存用の容器内において、マルトトリオースを含む培地中に目的の細胞を入れ、従来知られた凍結方法により凍結を行えばよい。例えば、培地とともに容器に細胞を入れた後、当該容器を−８０℃のフリーザーに入れることにより、細胞を凍結させる急速凍結法を採用することができる。あるいは、細胞を入れた容器をプログラムフリーザーに入れ、冷却速度等を調節しながら緩やかに凍結を行う緩慢凍結法であってもよい。
【００３３】
凍結操作を行った後は、例えば−８０℃のフリーザーを使用していた場合には、そのままフリーザー中で保存してもよいし、凍結操作完了後に液体窒素中に移して保存してもよい。また、プログラムフリーザーを使用していた場合には、凍結操作完了後に液体窒素中に移して保存すればよい。
【００３４】
以上の方法により凍結保存に供された細胞を、使用のために解凍する方法も、特に制限されない。したがって、３７℃の温浴中ですみやかに融解する方法、および室温で穏やかに融解する方法など、従来当業者に知られている手法および条件を採用することができる。
【００３５】
〔細胞凍結保存用組成物〕
次に、本発明に係る細胞凍結保存用組成物の一実施形態について、以下に説明する。
【００３６】
本実施形態の細胞凍結保存用組成物は、細胞の凍結保存のために、凍結処理の前に培地に添加するものであり、マルトトリオースを成分として含むものである。細胞凍結保存用組成物の培地への添加によって、培地における上述のマルトトリオース含有量を実現できるものであれば、細胞凍結保存用組成物におけるマルトトリオースの含有量に特に制限はない。しかしながら、細胞凍結保存用組成物におけるマルトトリオースの含有量の典型的な例としては、５質量％以上９５質量％以下とすることができ、２５質量％以上８０質量％以下であり得、さらには４０質量％以上６５質量％以下であり得る。
【００３７】
細胞凍結保存用組成物は、さらに別の糖類を含んでいてもよい。細胞凍結保存用組成物が含み得る別の糖類の例示としては、上述した、培地が含み得る他の糖類と同じである。他の糖類を含む場合、他の糖類としてはマルトースが好ましい。他の糖類としてマルトースを含む場合、細胞凍結保存用組成物におけるマルトースの含有量は、典型的な例としては、０．１質量％以上９０質量％以下とすることができ、１質量％以上５０質量％以下であり得、さらには１０質量％以上３０質量％以下であり得る。
【００３８】
細胞凍結保存用組成物は、粉体および液体などの形態であり得る。
【００３９】
細胞凍結保存用組成物は、培地にそのまま添加するものであってもよく、あるいは水等の希釈剤で希釈してから培地に添加するものであってもよい。
【００４０】
本発明は、食品分野における用途など、細胞凍結保存とは全く別の用途で用いられているマルトトリオース含有組成物が、細胞凍結保存において優れた効果のあることを見出すことにより、完成されたものである。したがって、食品分野など別の用途で用いられており、商業的に入手可能なマルトトリオース含有組成物を、本実施形態における細胞凍結保存用組成物として用いることができる。このようなマルトトリオース含有組成物としては、群栄化学工業社のピュアトース（登録商標）、日本食品化工社のフジオリゴ（登録商標）＃３６０、昭和産業社のオリゴＭＴ５００ならびに三菱ケミカルフーズ社のオリゴトース等が挙げられる。また、澱粉を原料とし酵素反応した糖化液を精製および濃縮して得られる水飴を、マルトトリオース含有組成物として使用することもできる。
【００４１】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００４２】
（比較例１）
Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシン含有：ＤＳ−ファーマバイオメディカル社製、カタログ番号ＫＢＤＳＭ１０１）に１０％の牛血清アルブミン（ＦＢＳ）を添加した培地（以下、Ｄ−ＭＥＭ＊培地と称す）を調製し、調製したＤ−ＭＥＭ＊培地５ｍＬを、５０ｍＬ容量の滅菌済み遠心チューブに加えた。理化学研究所バイオリソーススタンダードより分譲を受けたＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｋ−１株、ＲＣＢ０２８５）を解凍し、これをＤ−ＭＥＭ＊培地を加えた遠心チューブに移した。細胞を移した遠心チューブを２００×ｇで３分間遠心し、上清を除いた後、Ｄ−ＭＥＭ＊培地を２０ｍＬ添加した。これを、細胞培養用培地を含む底面の大きさが２５ｃｍ２のフラスコに移して、３７℃、ＣＯ２濃度５％の下で７日間、倒立顕微鏡（位相差型）下で観察しながらコンフルエントな状態となるまで培養した。コンフルエントな状態となった後、これに、０．２５％トリプシン溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡ−４ナトリウム溶液に溶解、和光純薬）を添加して緩やかに撹拌しながら３７℃で１０分間インキュベーションすることで、細胞液を得た。得られた細胞液を２００×ｇで３分間遠心分離した後、上清を取り除き、沈殿した細胞に元の培地量の１／２量の体積のＤ−ＭＥＭ＊培地を添加して緩やかに洗浄し、さらに同様の条件で遠心分離した。この操作を再度繰り返し、元の培地量の１／２量の体積のＤ−ＭＥＭ培地＊を添加して懸濁したものを評価用の細胞液とした。
【００４３】
評価用の細胞液を２００μＬずつ１．５ｍＬ容量のプラスティック製クライオチューブ２本に分注し、これに、最終濃度１０％となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２２．２μＬを添加し、緩やかに撹拌した。それぞれを紙製箱容器に入れ−８０℃のフリーザーで凍結した。１４日間保存の後、クライオチューブに入った細胞液を室温（２３℃）にて穏やかに解凍した。解凍した細胞液を２００μＬずつ２４ウェルプレート（ファルコン社製、カタログ番号３５３０４７）に分注し、これに等量のＤ−ＭＥＭ＊培地を加えた。３７℃、５％ＣＯ２の下で７日間培養し（以下、この培養を、「後培養」と称する）、２００倍の倒立顕微鏡下で細胞の確認を行った。凍結融解に伴い死滅した細胞は概ねその形態から識別できるため、これを除いた細胞を生存細胞として計数した。結果、本条件下では生存が確認できた細胞はなかった。
【００４４】
（比較例２）
２２．２μＬのＤＭＳＯの代わりに、水で希釈して５０質量％濃度に調製したトレハロース溶液５０μＬを用いた以外は、比較例１と同様に試験を行った。本比較例で用いたトレハロースは、１０質量％の水を含むものである。
【００４５】
２００倍の倒立顕微鏡下で細胞の確認を行い、比較例１と同様にして細胞数を計数した。その結果、本条件下では約５０％の細胞が生存していた。また、後培養期間に再増殖して、ウェルあたりの細胞数が２ウェルの平均で２．４５×１０３個となった。以下の各実施例では、この細胞数を１００とした相対値で、それぞれの細胞を示している。
【００４６】
（実施例１）
２２．２μＬのＤＭＳＯの代わりに、水で希釈して５０質量％濃度に調製したピュアトース（群栄化学工業製）溶液２２．２μＬを用いた以外は、比較例１と同様に試験を行った。本実施例で用いたピュアトースは、３質量％の水を含む粉末ピュアトースであって、固形分あたりの糖組成として、質量比で、グルコース：マルトース：マルトトリオース：四糖以上＝４：２２：５８：１６の組成を有するものである。
【００４７】
２００倍の倒立顕微鏡下で細胞の確認を行い、比較例１と同様にして細胞数を計数した。その結果、本条件下では後培養期間に再増殖して、ウェルあたりの細胞数が２ウェルの平均で比較例２に対して９１となった。すなわち、細胞凍結保存時の安定剤として知られているトレハロースよりも少ないマルトトリオースの使用量で、トレハロースと同等の効果が得られることが示された。
【００４８】
（実施例２）
実施例１におけるピュアトース溶液の添加量を５０μＬに変更した以外は、実施例１と同様に試験を行った。
【００４９】
２００倍の倒立顕微鏡下で細胞の確認を行い、死滅した細胞を除いた細胞数を計数した。その結果、本条件下では後培養期間に再増殖して、ウェルあたりの細胞数が２ウェルの平均で比較例２に対して２２６となった。すなわち、トレハロースよりも少ないマルトトリオースの使用量で、トレハロースよりも解凍後の細胞生存率に優れることが示された。
【００５０】
（実施例３）
実施例１におけるピュアトース溶液の添加量を１３０μＬに変更した以外は、実施例１と同様に試験を行った。
【００５１】
２００倍の倒立顕微鏡下で細胞の確認を行い、死滅した細胞を除いた細胞数を計数した。その結果、本条件下では後培養期間に再増殖して、ウェルあたりの細胞数が２ウェルの平均で比較例２に対して２２９となった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、細胞の長期保存および保存した細胞を利用する産業において利用することができる。