(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌作用を有し、改善した腫瘍指向性を有する複合体を提供する。【解決手段】プリナブリン誘導体ユニットＰＤ、リンカーユニットＬ、ペプチドユニットＰＵ、及び抗体ユニットＡＢの各ユニットを、架橋によりＰＤーＬ−ＰＵーＡＢで示される複合体とする。また、上記各ユニットを架橋することによる複合体の製造方法についても提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される複合体：
【化１】
2020189806.tif 000040
式１中、
ＰＤは、下記式２−１または２−２： 
【化２】
2020189806.tif 000041
［式２−１および２−２中、
Ａｒ１は、下記式３−１〜３−３で表される基からなる群から選択され（ただし４−イミダゾリル基、４−オキサゾリル基および４−チアゾリル基を除く）、
【化３】
2020189806.tif 000042
（式３−１〜３−３中、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、環員原子数５または６の含窒素複素環を形成し、
Ｒ２は、前記含窒素複素環上に存在する、水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択される基を表し、
Ｙ１は、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚ１〜Ｚ３は、それぞれ独立して、炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される）
Ａｒ２は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリール基および下記式４−１で表される基からなる群から選択され、
【化４】
2020189806.tif 000043
（式４−１中、Ｙ２は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ−ＯＲ５）−、−（Ｃ＝ＮＲ５）−、−（Ｃ＝Ｎ−ＯＲ５）−、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−（Ｃ＝Ｓ）−または−Ｓ−であり、この際、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ６は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基または炭素数１〜４のアシル基を表し；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択され；ｌは、０〜４の整数であり；ｍは、０〜５の整数である）
Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数を表し、
＊は、Ｌとの結合部位である］
で表されるプリナブリン誘導体ユニットであり；
Ｌは、ＰＤおよびＰＵ間のリンカーユニットを表し；
ＰＵは、下記式５：
【化５】
2020189806.tif 000044
［式５中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、２−アミノブタン酸および２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ４およびＸ１４は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、２−アミノブタン酸およびＳ−メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ４およびＸ１４の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
Ｘ５は、Ａｌａ残基であり、
Ｘ６は、任意の芳香族アミノ酸残基であり、
Ｘ７は、Ｈｉｓ残基であり、
Ｘ８は、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ５−アセチルオルニチン、２−アミノ−４−アセチルアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、３−シクロヘキシルアラニンおよび下記式５−１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
【化６】
2020189806.tif 000045
（上記式５−１中、Ｋ１は、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＮＨ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−およびこれらの組み合わせからなる群から選択される）
Ｘ９は、ＧｌｙおよびＣｙｓを除く任意のＤ−アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１０は、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、Ｌｅｕ残基であり、
Ｘ１２は、Ｖａｌ残基であり、
Ｘ１３は、Ｔｒｐ残基であり、
Ｘ１５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２−アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、３−シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ１７は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損である］
で表され、アミノ酸残基数１３〜１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチドユニットであり；
ＡＢは、抗体ユニットを表す。
【請求項２】
前記Ａｒ１が下記式３−４〜３−２２で表される基からなる群から選択される、請求項１に記載の複合体：
【化７】
2020189806.tif 000046
式３−４〜３−２２中、Ｒ２は、請求項１において定義した通りである。
【請求項３】
前記Ａｒ２が置換または非置換の炭素数６〜１４のアリール基および下記式４−２で表される基からなる群から選択される、請求項１または２に記載の複合体：
【化８】
2020189806.tif 000047
式４−２中、Ｒ３、Ｒ４、ｌおよびｍは、請求項１において定義した通りである。
【請求項４】
前記リンカーユニットＬが下記式６で表される構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体：
【化９】
2020189806.tif 000048
式６中、
Ｌ１は、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコール鎖およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、
ＲＧは、マレイミド基、ハロゲン化アセチル基、アクリロイル基またはＳ−Ｎｐｙｓ（Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）由来の反応性官能基であり、
＊１は、前記ＰＤとの連結部位であり、
＊２は、前記ＰＵとの連結部位である。
【請求項５】
前記Ｌ１が下記式７で表される構造を有する、請求項４に記載の複合体：
【化１０】
2020189806.tif 000049
式７中、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基および置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基からなる群から選択される。
【請求項６】
前記式５中、
Ｘ６がＴｙｒ、Ｔｒｐ、２−アミノ−３−（１−ナフチル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（２−ナフチル）プロピオン酸、２−メチルアミノ−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロピオン酸および下記式５−２で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
【化１１】
2020189806.tif 000050
Ｘ９がＧｌｙ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ＳｅｒおよびＤ−Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記式５中、
Ｘ３がＡｓｐ、Ｇｌｕおよび２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ４およびＸ１４がＣｙｓ残基であり、
Ｘ１６がＰｈｅ、Ｈｉｓおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１７がＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記式５で表されるポリペプチドが配列番号１〜７のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記式５で表されるポリペプチドにおいて、Ｘ４のＣｙｓ残基およびＸ１４のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、またはＸ４およびＸ１４のＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式８で表される２価の基により連結されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【化１２】
2020189806.tif 000051
【請求項１０】
前記ペプチドユニットＰＵにおいて、
前記ポリペプチドのＸ８が前記抗体ユニットと結合するための架橋性基を有し、
前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が前記リンカーユニットＬと連結するための連結基を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記架橋性基がＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＭＡ（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＳ（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＴＢＰ（３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）およびＤＳＰ（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群から選択される化合物由来の基である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記架橋性基がＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）またはＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）由来の基である、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記抗体ユニットＡＢが抗ＨＥＲ２抗体および抗ＣＤ２３９抗体から選択される抗体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複合体の製造方法であって、
（Ｉ）前記抗体ユニットＡＢが由来する抗体と前記抗体のＦｃ部位に結合する化合物とを混合して、第１の架橋体を形成することと、
（ＩＩ）前記第１の架橋体と、前記ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体とを混合して、第２の架橋体を形成することと、
を有する、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリナブリン（Ｐｌｉｎａｂｕｌｉｎ）は、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）から単離・構造決定されたチューブリン阻害物質Ｓ−（−）−フェニラヒスチンをリード化合物として構造活性相関研究を展開することで創製された、チューブリン重合阻害作用を有する化合物である（特許文献１）。プリナブリンは、チューブリン重合阻害作用に加え、腫瘍部に誘導される新生血管内皮細胞への傷害作用を示す。現在、プリナブリンは、抗癌剤候補化合物として治験が始まり、第ＩＩＩ相臨床試験に供されている。また一方で、プリナブリン誘導体として、より活性の高い誘導体も報告されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
プリナブリンは、有望な医薬候補化合物であるが、溶解性が悪い性質を有しており、これまでに水溶性プロドラッグの創薬研究が実施されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１０２４５４号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３５４３６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamazaki Y., Hayashi, Y. et al., J. Med. Chem., 2012, 55, 1056-1071
【非特許文献２】Yamazaki Y., Hayashi, Y. et al., Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 4279-4289
【非特許文献３】Hayashi Y., Hayashi, Y. et al., ACS Med. Chem. Lett., 2014, 5, 1094-1098
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２に記載されているように、プリナブリンを水溶性プロドラッグ化することにより、溶解性の問題を解決することができる。一方で、溶解性の向上に加えて、腫瘍指向性の向上が望まれている。
【０００７】
そこで本発明は、抗癌作用を有し、改善した腫瘍指向性を有する複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、下記式１で表される複合体によって上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
【化１】
2020189806.tif 000002
【００１０】
式１中、
ＰＤは、下記式２−１または２−２： 
【００１１】
【化２】
2020189806.tif 000003
【００１２】
［式２−１および２−２中、
Ａｒ１は、下記式３−１〜３−３で表される基からなる群から選択され（ただし４−イミダゾリル基、４−オキサゾリル基および４−チアゾリル基を除く）、
【００１３】
【化３】
2020189806.tif 000004
【００１４】
（式３−１〜３−３中、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、環員原子数５または６の含窒素複素環を形成し、
Ｒ２は、前記含窒素複素環上に存在する、水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択される基を表し、
Ｙ１は、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚ１〜Ｚ３は、それぞれ独立して、炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される）
Ａｒ２は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリール基および下記式４−１で表される基からなる群から選択され、
【００１５】
【化４】
2020189806.tif 000005
【００１６】
（式４−１中、Ｙ２は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ−ＯＲ５）−、−（Ｃ＝ＮＲ５）−、−（Ｃ＝Ｎ−ＯＲ５）−、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−（Ｃ＝Ｓ）−または−Ｓ−であり、この際、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ６は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基または炭素数１〜４のアシル基を表し；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択され；ｌは、０〜４の整数であり；ｍは、０〜５の整数である）
Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数を表し、
＊は、Ｌとの結合部位である］
で表されるプリナブリン誘導体ユニットであり；
Ｌは、ＰＤおよびＰＵ間のリンカーユニットを表し；
ＰＵは、下記式５：
【００１７】
【化５】
2020189806.tif 000006
【００１８】
［式５中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、２−アミノブタン酸および２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ４およびＸ１４は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、２−アミノブタン酸およびＳ−メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ４およびＸ１４の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
Ｘ５は、Ａｌａ残基であり、
Ｘ６は、任意の芳香族アミノ酸残基であり、
Ｘ７は、Ｈｉｓ残基であり、
Ｘ８は、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ５−アセチルオルニチン、２−アミノ−４−アセチルアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、３−シクロヘキシルアラニンおよび下記式５−１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
【００１９】
【化６】
2020189806.tif 000007
【００２０】
（上記式５−１中、Ｋ１は、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＮＨ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−およびこれらの組み合わせからなる群から選択される）
Ｘ９は、ＧｌｙおよびＣｙｓを除く任意のＤ−アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１０は、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、Ｌｅｕ残基であり、
Ｘ１２は、Ｖａｌ残基であり、
Ｘ１３は、Ｔｒｐ残基であり、
Ｘ１５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２−アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、３−シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ１７は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損である］
で表され、アミノ酸残基数１３〜１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチドユニットであり；
ＡＢは、抗体ユニットを表す。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、抗癌作用を有し、改善した腫瘍指向性を有する複合体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例における殺細胞活性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００２４】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００２５】
本明細書において、ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１，３−ジメチルブチル基、１−イソプロピルプロピル基、１，２−ジメチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、１，４−ジメチルペンチル基、２−メチル−１−イソプロピルプロピル基、１−エチル−３−メチルブチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、３−メチル−１−イソプロピルブチル基、２−メチル−１−イソプロピル基、１−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチルプロピル基などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、アルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、ペンテニル基、１−ヘキセニル基、３，３−ジメチル−１−ブテニル基などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、アルキニル基の例としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、３−メチル−１−プロピニル基、２−メチル−３−プロピニル基、ペンチニル基、１−ヘキシニル基、３−メチル−１−ブチニル基、３，３−ジメチル−１−ブチニル基などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、シクロアルキル基の例としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、シクロアルケニル基の例としては、シクロブテニル基、シクロペンチニル基、シクロヘキシニル基などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、アルコキシ基の例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基などが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、アリール基の例としては、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アントラセニル基、２−アントラセニル基、９−アントラセニル基などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、ヘテロアリール基の例としては、２−チエニル基、４−ピリジル基、３−ピリジル基、２−ピリジル基、１−ピリジル基、２−フリル基、２−ピリミジニル基、２−ベンゾチアゾリル基、１−イミダゾリル基、１−ピラゾリル基、ベンゾトリアゾール−１−イル基、７−アザベンゾトリアゾール−１−イル基などが挙げられる。
【００３４】
本明細書において、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、アリーレン基およびヘテロアリーレン基の例としては、それぞれ上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基およびシクロアリール基の例を２価とした基が挙げられる。
【００３５】
本明細書において、アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、２−メチルプロパノイル基などが挙げられる。
【００３６】
本明細書において、ある基が「置換されている」という場合、当該基を置換しうる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ホルミル基、メルカプト基、スルホ基、スルフィン酸基、グアニジノ基、カルバモイル基、チオール基、チオエーテル基、メシル基、ｐ−トルエンスルホニル基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリメチルシリル基、ホスフィニコ基、ホスホノ基などが挙げられる。これらの置換基もまた、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基などによってさらに置換されていてもよい。ただし、置換された後の基が置換される前の基と同じ定義に含まれるような置換は考えないものとする。
【００３７】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、ペプチドまたはタンパク質分子上で、ペプチドまたはタンパク質を構成しているアミノ酸の一単位に当たる部分を意味する。より具体的には、以下の式のように表される、α−アミノ酸から誘導される２価の基を意味する：
【００３８】
【化７】
2020189806.tif 000008
【００３９】
上記式中、Ｒ０はアミノ酸の側鎖であり、例えばＧｌｙであれば水素原子、Ａｌａであればメチル基である。
【００４０】
「アミノ酸残基」は、天然もしくは非天然のα−アミノ酸に由来し、光学活性体があり得る場合、Ｌ体、Ｄ体の何れであってもよいが、Ｌ体が好ましい。より具体的には、「アミノ酸残基」は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅ、ならびにこれらの類縁体が例示できる。上記の類縁体としては、例えば上記２０種のアミノ酸残基の側鎖が任意の置換基で置換された誘導体等であってもよく、例えば、上記２０種のアミノ酸残基のハロゲン化誘導体（例えば、３−クロロアラニン）、２−アミノ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、イソバリン、２−アミノイソ酪酸、ホモフェニルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノブタン酸、オルニチン、２−ヒドロキシグリシン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、３，４−ジデヒドロプロリン、ホモプロリン、ホモシステイン、ホモメチオニン、アスパラギン酸エステル（例えば、アスパラギン酸−メチルエステル、アスパラギン酸−エチルエステル、アスパラギン酸−プロピルエステル、アスパラギン酸−シクロヘキシルエステル、アスパラギン酸−ベンジルエステルなど）、グルタミン酸エステル（グルタミン酸−シクロヘキシルエステル、グルタミン酸−エチルエステル、グルタミン酸−プロピルエステル、グルタミン酸−メチルエステル、グルタミン酸−ベンジルエステルなど）、ホルミルトリプトファン、２−シクロペンチルグリシン、２−シクロヘキシルグリシン、２−フェニルグリシン、２−ピリジルアラニン、３−シクロペンチルアラニン、３−シクロヘキシルアラニン、３−ピリジルアラニン、３−ピラゾリルアラニン、３−フラニルアラニン、３−チエニルアラニン、メトキシフェニルアラニン、３−ナフチルアラニン、および４−ピリジルアラニン等のアミノ酸に由来するアミノ酸残基が例示できるが、これらに制限されない。また、ＩｌｅやＴｈｒのように、側鎖に不斉炭素を有するジアステレオマーが存在するものについては、天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｒ＊）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸）および非天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｓ＊）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸）が特に区別なく使用され得る。すなわち、「Ｉｌｅ」は（２Ｒ＊，３Ｒ＊）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸の両方を含む意味として使用され、「Ｔｈｒ」は（２Ｒ＊，３Ｓ＊）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸の両方を含む意味として使用される。好ましくは、天然型ジアステレオマー（すなわち、Ｉｌｅであれば（２Ｒ＊，３Ｒ＊）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸、Ｔｈｒであれば（２Ｒ＊，３Ｓ＊）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸）が使用される。
【００４１】
本明細書に記載のアミノ酸配列は、特に言及がない限り、慣例に従ってＮ末端（アミノ末端）側からＣ末端（カルボキシル末端）側への方向に表記される。
【００４２】
各アミノ酸残基は、その側鎖の相違に基づいて、類似の性質を有するアミノ酸残基と置換し得ることが本技術分野において知られている（保存的置換）。例えば、脂肪族疎水性アミノ酸であるＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、およびイソバリン（Ｉｖａ）は相互に置換し得る。側鎖が水素原子またはメチル基であるＧｌｙ、Ａｌａおよび２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）は相互に置換し得る。中性極性アミノ酸であるＡｓｎおよびＧｌｎは相互に置換し得る。２，４−ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）は相互に置換し得る。Ｐｒｏと、ホモプロリン（ｈｏｍｏＰｒｏ）とは、相互に置換し得る。
【００４３】
＜複合体＞
本発明の一形態は、以下の式１で表される複合体を提供する。
【００４４】
【化８】
2020189806.tif 000009
【００４５】
式１中、
ＰＤは、下記式２−１または２−２： 
【００４６】
【化９】
2020189806.tif 000010
【００４７】
［式２−１および２−２中、
Ａｒ１は、下記式３−１〜３−３で表される基からなる群から選択され（ただし４−イミダゾリル基、４−オキサゾリル基および４−チアゾリル基を除く）、
【００４８】
【化１０】
2020189806.tif 000011
【００４９】
（式３−１〜３−３中、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、環員原子数５または６の含窒素複素環を形成し、
Ｒ２は、前記含窒素複素環上に存在する、水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択される基を表し、
Ｙ１は、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚ１〜Ｚ３は、それぞれ独立して、炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される）
Ａｒ２は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリール基および下記式４−１で表される基からなる群から選択され、
【００５０】
【化１１】
2020189806.tif 000012
【００５１】
（式４−１中、Ｙ２は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ−ＯＲ５）−、−（Ｃ＝ＮＲ５）−、−（Ｃ＝Ｎ−ＯＲ５）−、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−（Ｃ＝Ｓ）−または−Ｓ−であり、この際、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ６は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基または炭素数１〜４のアシル基を表し；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択され；ｌは、０〜４の整数であり；ｍは、０〜５の整数である）
Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数を表し、
＊は、Ｌとの結合部位である］
で表されるプリナブリン誘導体ユニットであり；
Ｌは、ＰＤおよびＰＵ間のリンカーユニットを表し；
ＰＵは、下記式５：
【００５２】
【化１２】
2020189806.tif 000013
【００５３】
［式５中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、２−アミノブタン酸および２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ４およびＸ１４は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、２−アミノブタン酸およびＳ−メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ４およびＸ１４の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
Ｘ５は、Ａｌａ残基であり、
Ｘ６は、任意の芳香族アミノ酸残基であり、
Ｘ７は、Ｈｉｓ残基であり、
Ｘ８は、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ５−アセチルオルニチン、２−アミノ−４−アセチルアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、３−シクロヘキシルアラニンおよび下記式５−１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
【００５４】
【化１３】
2020189806.tif 000014
【００５５】
（上記式５−１中、Ｋ１は、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＮＨ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−およびこれらの組み合わせからなる群から選択される）
Ｘ９は、ＧｌｙおよびＣｙｓを除く任意のＤ−アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１０は、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、Ｌｅｕ残基であり、
Ｘ１２は、Ｖａｌ残基であり、
Ｘ１３は、Ｔｒｐ残基であり、
Ｘ１５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２−アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、３−シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、
Ｘ１７は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損である］
で表され、アミノ酸残基数１３〜１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチドユニットであり；
ＡＢは、抗体ユニットを表す。
【００５６】
本発明に係る複合体（抗体薬物複合体）は、各ユニットが共有結合により連結されていることで、非共有結合型の抗体薬物複合体と比べて、血液中での複合体の解離を抑制でき、よって抗癌作用と腫瘍指向性の向上とを両立させることができる。
【００５７】
（プリナブリン誘導体ユニット（ＰＤ））
式１において、ＰＤは、下記式２−１または２−２で表されるプリナブリン誘導体ユニットである。プリナブリン誘導体は、薬剤としての役割を有し、上述のとおり、チューブリン重合阻害作用に加え、腫瘍部に誘導される新生血管内皮細胞への傷害作用を示すことができる。
【００５８】
【化１４】
2020189806.tif 000015
【００５９】
式２−１および２−２において、Ａｒ１は、下記式３−１〜３−３で表される基からなる群から選択される（ただし４−イミダゾリル基、４−オキサゾリル基および４−チアゾリル基を除く）。
【００６０】
【化１５】
2020189806.tif 000016
【００６１】
式３−１〜３−２において、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、環員原子数５または６の含窒素複素環を形成する。
【００６２】
環員原子数５または６の含窒素複素環の例としては、ピロール環、イミダゾール環、ピラゾール環、ピリジン環、ピラジン環、オキサゾール環、チアゾール環、ピリミジン環、ピラジン環、ピリダジン環、トリアジン環、イソキサゾリン環、イソチアゾール環、トリアゾール環などが挙げられる。環員原子数５または６の含窒素複素環は、好ましくはピリジン環またはイミダゾール環である。
【００６３】
式３−１〜３−３において、Ｒ２は、前記含窒素複素環上に存在する置換基を表し、ハロゲン原子、または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択される。Ｒ２は、好ましくは水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基から選択され、より好ましくは水素原子または炭素数１〜３のアルキル基から選択される。Ｒ２で表される置換基は、さらに置換されていてもよい。
【００６４】
式３−３において、Ｙ１は、酸素原子または硫黄原子である。
【００６５】
式３−３において、Ｚ１〜Ｚ３は、それぞれ独立して、炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択され、好ましくは炭素原子および窒素原子から選択される。
【００６６】
Ａｒ１は、好ましくは下記式３−４〜３−２２で表される基からなる群から選択される。
【００６７】
【化１６】
2020189806.tif 000017
【００６８】
式３−４〜３−２２中、Ｒ２は、上記で定義した通りである。
【００６９】
Ａｒ１は、より好ましくは式３−４または式３−１８で表される基である。
【００７０】
式２−１および２−２において、Ａｒ２は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリール基および下記式４−１で表される基からなる群から選択される。
【００７１】
【化１７】
2020189806.tif 000018
【００７２】
式４−１において、Ｙ２は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ−ＯＲ５）−、−（Ｃ＝ＮＲ５）−、−（Ｃ＝Ｎ−ＯＲ５）−、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−（Ｃ＝Ｓ）−または−Ｓ−であり、この際、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ６は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基または炭素数１〜４のアシル基を表す。
【００７３】
式４−１において、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルキニル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、フェニル基、チエニル基、ピリジル基、フリル基、ピリミジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、アシル基、ホルミル基、チオール基、スルホキシド基およびスルホン基からなる群から選択され、好ましくはハロゲン原子および炭素数１〜６のアルキル基からなる群から選択され、より好ましくはハロゲン原子である。
【００７４】
式４−１において、ｌは、０〜４の整数であり、ｍは、０〜５の整数である。好ましくは、ｌは、０であり、ｍは、１である。
【００７５】
式２−１および２−２において、Ａｒ２は、好ましくは置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基および上記式４−１で表される基からなる群から選択される。
【００７６】
Ａｒ２が置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール基である場合、Ａｒ２は、より好ましくはフェニル基である。
【００７７】
Ａｒ２が上記式４−１で表される基である場合、Ａｒ２は、より好ましくは下記式４−２で表される基である。
【００７８】
【化１８】
2020189806.tif 000019
【００７９】
式２−１および２−２において、Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜６のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選択される。Ｒ１は、好ましくは炭素数１〜８のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基から選択され、特に好ましくはエチル基である。
【００８０】
式２−１において、ｎは、０〜１０の整数を表す。ｎは、好ましくは０〜５の整数であり、より好ましくは、１〜４の整数であり、さらに好ましくは２または３であり、特に好ましくは３である。
【００８１】
式２−１および２−２において、＊は、Ｌとの結合部位である。
【００８２】
式２−１および２−２で表される化合物は、好ましくは下記式２−１−１〜２−１−３および式２−２−１〜２−２−３から選択される化合物である。
【００８３】
【化１９】
2020189806.tif 000020
【００８４】
上記式２−１−１〜２−１−３および式２−２−１〜２−２−３において、Ｒ１およびｎは、上記で定義した通りである。
【００８５】
以下、式２−１および２−２で表される化合物を具体的に例示する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されない。
【００８６】
【化２０】
2020189806.tif 000021
【００８７】
上記ＰＤ−１〜ＰＤ−６の中でも、ＰＤ−１およびＰＤ−４から選択されることが特に好ましい。
【００８８】
（リンカーユニット（Ｌ））
式１において、Ｌは、ＰＤおよびＰＵ間のリンカーユニットを表す。リンカーユニットは、血液中では非特異的な解離をすることなく、標的となる細胞に取り込まれた後で薬剤を外す特性を有している。
【００８９】
このようなリンカーユニットの具体的な構造について特に制限はないが、例えば、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコールおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
一実施形態では、Ｌは、下記式６で表される構造を有する。
【００９１】
【化２１】
2020189806.tif 000022
【００９２】
式６において、Ｌ１は、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコール鎖およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９３】
Ｌ１は、好ましくは下記式７で表される構造を有する。
【００９４】
【化２２】
2020189806.tif 000023
【００９５】
式７において、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基および置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基からなる群から選択される。
【００９６】
式６において、ＲＧは、マレイミド基、ハロゲン化アセチル基、アクリロイル基またはＳ−Ｎｐｙｓ（Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）由来の反応性官能基である。
【００９７】
式６において、＊１は、プリナブリン誘導体ユニットＰＤとの連結部位であり、＊２は、ペプチドユニットＰＵとの連結部位である。
【００９８】
以下、Ｌの具体的な構造を例示する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されない。
【００９９】
【化２３】
2020189806.tif 000024
【０１００】
Ｌ−１およびＬ−２において、＊１は、プリナブリン誘導体ユニットＰＤとの連結部位であり、＊２は、ペプチドユニットＰＵとの連結部位である。
【０１０１】
（ペプチドユニット（ＰＵ））
式１において、ＰＵは、下記式５で表され、アミノ酸残基数１３〜１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチドユニットである。
【０１０２】
【化２４】
2020189806.tif 000025
【０１０３】
式５において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸残基または欠損である。
【０１０４】
Ｘ１は、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａおよび２−アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、より好ましくはＧｌｙである。
【０１０５】
Ｘ２は、好ましくはＰｒｏ残基またはホモプロリン残基から選択される、または欠損であり、より好ましくはＰｒｏ残基である。
【０１０６】
式５において、Ｘ３は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、２−アミノブタン酸および２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕおよび２−アミノ−３−スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはＡｓｐ残基である。
【０１０７】
式５において、Ｘ４およびＸ１４は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、２−アミノブタン酸およびＳ−メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ４およびＸ１４の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基である。Ｘ４およびＸ１４は、好ましくはＣｙｓ残基である。
【０１０８】
式５において、Ｘ５は、Ａｌａ残基である。
【０１０９】
式５において、Ｘ６は、任意の芳香族アミノ酸残基である。Ｘ６は、好ましくはＴｙｒ、Ｔｒｐ、２−アミノ−３−（１−ナフチル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（２−ナフチル）プロピオン酸、２−メチルアミノ−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロピオン酸および下記式５−２で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【０１１０】
【化２５】
2020189806.tif 000026
【０１１１】
Ｘ６は、より好ましくはＴｙｒ残基である。
【０１１２】
式５において、Ｘ７は、Ｈｉｓ残基である。
【０１１３】
式５において、Ｘ８は、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ５−アセチルオルニチン、２−アミノ−４−アセチルアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、３−シクロヘキシルアラニンおよび下記式５−１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【０１１４】
【化２６】
2020189806.tif 000027
【０１１５】
上記式５−１中、Ｋ１は、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＮＨ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１１６】
Ｘ８は、好ましくはＬｙｓ残基である。
【０１１７】
式５において、Ｘ９は、ＧｌｙおよびＣｙｓを除く任意のＤ−アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ＳｅｒおよびＤ−Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくは、Ｇｌｙ残基である。
【０１１８】
式５において、Ｘ１０は、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはＧｌｕ残基である。
【０１１９】
式５において、Ｘ１１は、Ｌｅｕ残基である。
【０１２０】
式５において、Ｘ１２は、Ｖａｌ残基である。
【０１２１】
式５において、Ｘ１３は、Ｔｒｐ残基である。
【０１２２】
式５において、Ｘ１５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２−アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはＴｈｒ残基である。
【０１２３】
式５において、Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、３−シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、好ましくはＰｈｅ、Ｈｉｓおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはＰｈｅ残基である。
【０１２４】
式５において、Ｘ１７は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基または欠損であり、好ましくはＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３−（２−ピリジル）アラニン、３−（３−ピリジル）アラニンおよび３−（４−ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはＨｉｓ残基である。
【０１２５】
式５で表されるポリペプチドは、好ましくはポリペプチドが配列番号１〜７のアミノ酸配列からなる群から選択され、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列である。
【０１２６】
一実施形態では、式５で表されるポリペプチドにおいて、Ｘ４のＣｙｓ残基およびＸ１４のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、またはＸ４およびＸ１４のＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式８で表される２価の基により連結されている。
【０１２７】
【化２７】
2020189806.tif 000028
【０１２８】
一実施形態では、ペプチドユニットＰＵにおいて、前記ポリペプチドのＸ８が前記抗体と結合するための架橋性基を有し、前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が前記リンカーユニットＬと連結するための連結基を有する。好ましくは前記ポリペプチドのＮ末端が前記リンカーユニットＬと連結するための連結基を有する。
【０１２９】
前記架橋性基は、特に制限されないが、好ましくはＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＭＡ（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＳ（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＴＢＰ（３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）およびＤＳＰ（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群から選択される化合物由来の基であり、より好ましくはＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）またはＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）由来の基である。
【０１３０】
ペプチドユニットＰＵは、架橋性基を介して、抗体Ｆｃ部位に結合することができる。具体的には、ヒトＩｇＧ  ＦｃにおけるＥｕ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８残基に選択的に結合することができる。そのため、ペプチドユニットＰＵは、抗体の抗原結合部分への修飾などによる抗体の活性低下を抑制することができる。
【０１３１】
好ましい実施形態では、血中半減期を長くできるとの観点から、ペプチドユニットＰＵは、抗体のＦｃ部位の片側のみに結合している。
【０１３２】
前記連結基は、特に制限されない。連結基としては、例えば置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３〜２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコールおよびこれらの組み合わせが挙げられる。連結基は、好ましくはペプチド鎖である。
【０１３３】
ペプチド鎖としては、本技術分野で一般的に使用されるペプチド鎖を使用することができる。ペプチド鎖は、例えば１〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドである。アミノ酸としては、特に制限されないが、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどが挙げられる、一実施形態では、ペプチド鎖は、（ＧＧＧＧＣ）ｑまたは（ＣＧＧＧＧ）ｑで表される。ｑは、整数を表し、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。
【０１３４】
（抗体ユニット（ＡＢ））
式１において、ＡＢは、抗体ユニットを表す。
【０１３５】
抗体ユニットに含まれる抗体は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれでもよく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０１３６】
抗体ユニットに含まれる抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１３７】
抗体ユニットに含まれる抗体は、本発明の効果をより発揮するとの観点から、好ましくは抗ＨＥＲ２抗体または抗ＣＤ２３９抗体である。
【０１３８】
抗ＨＥＲ２抗体としては、例えばトラスツズマブ、ペルツズマブなどが挙げられる。
【０１３９】
本発明に係る複合体は、抗体ユニットを有することにより、腫瘍指向性を向上させることができる。また、本発明に係る複合体は、プリナブリンの水溶性プロドラッグおよび抗体を単独で使用するより優れた抗癌作用（相乗効果）を発揮することができる。
【０１４０】
＜複合体の製造方法＞
本発明に係る複合体の製造方法について特に制限はない。当業者であれば、後述する実施例の欄の記載に基づき、本願の出願時における技術常識を参酌して、本発明に係る複合体を製造することが可能である。
【０１４１】
各ユニットを構成する材料は、例えば以下のようにして得ることができる。
【０１４２】
プリナブリン誘導体ユニットＰＤが由来するプリナブリン誘導体およびリンカーユニットＬが由来するリンカー化合物ならびにこれらの架橋体（プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体）は、例えば国際公開第２０１２／０３５４３６号、特表２００７−５２０５６５号公報、Yamazaki Y., Hayashi, Y. et al., J. Med. Chem., 2012, 55, 1056-1071、Yamazaki Y., Hayashi, Y. et al., Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 4279-4289、Hayashi Y., Hayashi, Y. et al., ACS Med. Chem. Lett., 2014, 5, 1094-1098などの記載を適宜参照して合成することができる。
【０１４３】
ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体は、例えば国際公開第２０１７／２１７３４７号、国際公開第２０１６／１８６２０６号、国際公開第２０１３／０２７７９６号などの記載を適宜参照して合成することができる。
【０１４４】
抗体ユニットＡＢが由来する抗体は、公知の手段によって取得することができる。例えば、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
【０１４５】
抗ＨＥＲ２抗体は、例えば米国特許第５８２１３３７号明細書、米国特許第５７２５８５６号明細書などの記載を適宜参照して得ることができる。
【０１４６】
抗ＣＤ２３９抗体は、例えば特開２０１７−０９５４１７号公報などの記載を適宜参照して得ることができる。
【０１４７】
本発明に係る複合体の製造方法のいくつかの実施形態を説明する。本発明に係る複合体の製造方法は、以下の実施形態に限定されない。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明に係る複合体の製造方法であって、
（Ｉ）抗体ユニットＡＢが由来する抗体と前記抗体のＦｃ部位に結合する化合物とを混合して、第１の架橋体を形成することと、
（ＩＩ）前記第１の架橋体と、ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体とを混合して、第２の架橋体を形成することと、
を有する、製造方法が提供される。当該構成によって、抗体Ｆｃ部位の両側が修飾された二修飾体の形成を抑制でき、抗体Ｆｃ部位の片側を選択的に修飾することができる。本発明に係る抗体ユニットは、抗体がＦｃＲｎ（胎児性Ｆｃ受容体）と相互作用することで、血中半減期を長くすることができる。しかし、二修飾体の場合、ＦｃＲｎとの相互作用が阻害されうるため、血中半減期が短くなる恐れがある。
【０１４９】
本実施形態の製造方法では、抗体ユニットＡＢが由来する抗体と前記抗体のＦｃ部位に結合する化合物とを混合して、第１の架橋体を形成する（工程（Ｉ））。本明細書中、抗体のＦｃ部位に結合する化合物を単に「Ｆｃ部位結合化合物」とも称する。
【０１５０】
Ｆｃ部位結合化合物としては、プロテインＡ、プロテインＧ、上記ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体、ＷＯ２０１７／２１７３４７号に記載のＩｇＧ結合ペプチドなどが挙げられる。
【０１５１】
Ｆｃ部位結合化合物は、好ましくはプロテインＡおよびプロテインＧから選択され、より好ましくはプロテインＡである。
【０１５２】
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁由来のタンパク質であり、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することが知られている。
【０１５３】
プロテインＧは、Ｇ群溶血性レンサ球菌の細胞壁に存在するタンパク質であり、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することが知られている。
【０１５４】
抗体ユニットＡＢが由来する抗体とＦｃ部位結合化合物とを混合する方法は、Ｆｃ部位結合化合物が抗体Ｆｃ部位の片側にのみ結合できれば、特に制限されないが、好ましく抗体ユニットＡＢが由来する抗体と担体に固定化されたＦｃ結合化合物とを混合する方法が挙げられる。
【０１５５】
担体としては、例えばアガロースゲル、アクリルアミドゲル、シリカゲル、ガラスビーズなどを使用できる。
【０１５６】
Ｆｃ部位結合化合物を担体に固定化する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、特開２００５−１１２８２７号公報、特開２０１１−１３３６号公報などに記載の方法を用いて、Ｆｃ部位結合化合物を担体に固定化することができる。
【０１５７】
具体的には、Ｆｃ部位結合化合物が固定化された担体を充填したカラムに抗体ユニットが由来する抗体を添加することで、当該抗体のＦｃ部位の片側とＦｃ部位結合化合物とを結合して、第１の架橋体（Ｆｃ部位結合化合物−抗体架橋体）を形成することができる。
【０１５８】
Ｆｃ部位結合化合物が固定化された担体を充填したカラムとしては、例えばＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）などが挙げられる。
【０１５９】
次に、前記第１の架橋体と、ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体とを混合して、第２の架橋体（Ｆｃ部位結合化合物−抗体−ポリペプチド誘導体架橋体）を形成する（工程（ＩＩ））。
【０１６０】
ペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体は、上記式５で表され、アミノ酸残基数１３〜１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＸ８に位置するアミノ酸残基が架橋剤により修飾されていることが好ましい。
【０１６１】
架橋剤とは、ポリペプチド誘導体と抗体とを共有結合により連結させるための化学物質である。架橋剤としては、特に制限されないが、例えばＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＭＡ（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＳ（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＴＢＰ（３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＳＰ（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）などが挙げられる。
【０１６２】
第１の架橋体とペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体とを混合する方法は、第１の架橋体中の抗体のＦｃ部位とペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体との間で架橋反応が生じる条件で行われれば、特に制限されない。
【０１６３】
例えば、第１の架橋体とペプチドユニットＰＵが由来するポリペプチド誘導体とを、適当なバッファー（例えばリン酸緩衝液など）中において、室温（例えば、１５〜３０℃）で混合することにより、第２の架橋体を形成することができる。
【０１６４】
本実施形態の製造方法は、工程（Ｉ）および（ＩＩ）に加えて、
（ＩＩＩ）第２の架橋体から抗体−ポリペプチド誘導体架橋体を脱離させること、
（ＩＶ）抗体−ポリペプチド誘導体架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを接触させることと、
をさらに有することができる。
【０１６５】
または、本実施形態の製造方法は、工程（Ｉ）および（ＩＩ）に加えて、
（Ｖ）第２の架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを接触させて、第３の架橋体を形成することと、
（ＶＩ）第３の架橋体からプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体架橋体を脱離させることと、
をさらに有することができる。
【０１６６】
工程（ＩＩＩ）において、第２の架橋体から抗体−ポリペプチド誘導体架橋体を得る方法は、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、Ｆｃ部位結合化合物としてプロテインＡまたはプロテインＧを用いる場合、第２の架橋体と適当な溶出バッファー（例えば酢酸水溶液など）とを混合することにより、抗体−ポリペプチド誘導体架橋体を溶出させることができる。
【０１６７】
得られた抗体−ポリペプチド誘導体架橋体は、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。
【０１６８】
工程（ＩＶ）において、抗体−ポリペプチド誘導体架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを連結させることで、本発明に係る複合体を形成することができる。例えば、抗体−ポリペプチド架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを接触させ、ポリペプチド誘導体が有する連結基とリンカー化合物が有する反応性官能基とを架橋反応させることにより、本発明に係る複合体を形成することができる。
【０１６９】
抗体−ポリペプチド誘導体架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを接触させる方法は、ポリペプチド誘導体が有する連結基とリンカー化合物が有する反応性官能基との間で架橋反応が生じる条件で行われれば、特に制限されない。例えば、抗体−ポリペプチド誘導体架橋体を含む緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）とプリナブリン誘導体−リンカー化合物複合体を含む水溶液（例えば、アセトニトリル水溶液）とを、室温（例えば、１５〜３０℃）で混合することにより反応を行うことができる。
【０１７０】
工程（Ｖ）において、第２の架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体とを接触させて、第３の架橋体（プリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体−Ｆｃ部位結合化合物架橋体）を形成する方法は、上記工程（ＩＶ）と同様の方法を適宜修正して使用することができる。
【０１７１】
工程（ＶＩ）において、第３の架橋体からプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体架橋体（本発明に係る複合体）を脱離させる方法は、上記工程（ＩＩＩ）と同様の方法を適宜修正して使用することができる。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明に係る複合体の製造方法であって、
（Ｉ）抗体ユニットＡＢが由来する抗体と前記抗体のＦｃ部位に結合する化合物とを混合して、第１の架橋体を形成することと、
（ＶＩＩ）第１の架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体架橋体とを混合して、第４の架橋体（プリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体−Ｆｃ部位結合化合物架橋体）を形成することと、
（ＶＩＩＩ）第４の架橋体からプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体架橋体を脱離させることと、
を有する、製造方法が提供される。
【０１７３】
工程（ＶＩＩ）において、第１の架橋体とプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体架橋体とを混合する方法は、上記工程（ＩＩ）と同様の方法を使用することができる。
【０１７４】
プリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体架橋体は、以下の文献に記載された方法を適宜参照して合成することができる：
Ｋｙｏｈｅｉ  Ｍｕｇｕｒｕｍａ，  Ｔａｋｕｙａ  Ｓｈｉｒａｓａｋａ，  Ｄａｉｃｈｉ  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｋｅｎｔａｒｏｕ  Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，  Ａｋｉｈｉｒｏ  Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｋｅｎｔａｒｏ  Ｔａｋａｙａｍａ，  Ａｔｓｕｈｉｋｏ  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｙｏｓｈｉｏ  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｂｙ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  （２０１８）  ５７，  ２１７０−２１７３。
【０１７５】
工程（ＶＩＩＩ）において、第４の架橋体からプリナブリン誘導体−リンカー化合物−ポリペプチド誘導体−抗体架橋体を脱離させる上記工程（ＩＩＩ）と同様の方法を適宜修正して使用することができる。
【０１７６】
以上より、本発明に係る複合体の製造方法は、以下の実施形態を有することができる。
【０１７７】
（１）工程（Ｉ）−工程（ＩＩ）；
（２）工程（Ｉ）−工程（ＩＩ）−工程（ＩＩＩ）−工程（ＩＶ）；
（３）工程（Ｉ）−工程（ＩＩ）−工程（Ｖ）−工程（ＶＩ）；
（４）工程（Ｉ）−工程（ＶＩＩ）−工程（ＶＩＩＩ）。
【０１７８】
＜抗癌剤、癌の治療方法＞
本発明の一実施形態では、本発明に係る複合体を含む抗癌剤が提供される。抗癌剤は、保管およびその後の投与用に調製される医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
【０１７９】
本発明の一実施形態では、本発明に係る複合体の有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法が提供される。
【０１８０】
治療用途のための許容可能な担体または希釈剤は、薬学の技術分野で既知であり、例えば、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．ゲナーロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編．１９８５）に記載されている。防腐剤、安定剤、色素、さらには香味剤を薬学的組成物に供給してもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルなどを防腐剤として添加してもよい。さらに、酸化防止剤、懸濁化剤などを使用してもよい。
【０１８１】
本発明に係る抗癌剤は、経口投与用の錠剤、カプセルまたはエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射可能な投与のための滅菌溶液または懸濁液、経皮投与用のパッチ、および皮下沈積物等として処方および使用されてもよい。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液として、注射若しくは注入の前に液体中の溶液若しくは懸濁液として適切な固体形態として、またはエマルジョンとして、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システインおよびヒト血清アルブミン等である。さらに、所望される場合には、注射可能な抗癌剤は、少量の無毒性の補助物質、例えば湿潤剤およびｐＨ緩衝剤等を含有してもよい。所望される場合には、吸収を増強する調製物（例えば、リポソーム）を利用してもよい。
【０１８２】
非経口投与用の医薬処方物としては、水溶性の形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒または媒質としては、ゴマ油のような脂肪油、またはダイズ油、グレープフルーツ油若しくはアーモンド油のような他の有機油、またはオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の製造を可能にするために、適切な安定剤、または化合物の溶解度を増大させる作用物質を含有してもよい。
【０１８３】
経口投与用の医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、得られた混合物を任意に粉砕すること、および所望される場合には、錠剤またはドラジェコアを得るために適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工処理することにより得てもよい。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖等の充填剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム等のその塩のような崩壊剤を添加してもよい。ドラジェコアには、適切なコーティングが施される。この目的で、濃縮糖溶液を使用してもよく、それは任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。活性化合物の用量の識別のために、または活性化合物の用量の種々の組合せを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤またはドラジェコーティングに添加してもよい。この目的で、濃縮糖溶液を使用してもよく、それは任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。活性化合物の用量の識別のために、または活性化合物の用量の種々の組合せを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤またはドラジェコーティングに添加してもよい。このような処方物は、当該技術分野で公知の方法を用いて製造することができる（例えば、米国特許第５，７３３，８８８号明細書、同第５，７２６，１８１号明細書、同第５，７０７，６４１号明細書、同第５，６６７，８０９号明細書、同第５，５７６，０１２号明細書、同第５，７０７，６１５号明細書、同第５，６８３，６７６号明細書、同第５，６５４，２８６号明細書、同第５，６８８，５２９号明細書、同第５，４４５，８２９号明細書、同第５，６５３，９８７号明細書、同第５，６４１，５１５号明細書および同第５，６０１，８４５号明細書を参照）。
【０１８４】
さらに、眼内、鼻内および耳介内の送達を含む用途のための薬学技術分野で公知の様々な抗癌剤を本明細書中に開示する。医薬処方物としては、点眼薬のような水溶性形態での、またはゲランガム（Ｓｈｅｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ，２３（３）：  ４４０−５０）若しくはヒドロゲル（Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２１０：  １０１−３）中の、活性化合物の水性眼用溶液、眼用軟膏、眼用懸濁液（例えば、微粒子、液体担体媒質中に懸濁される薬物含有高分子小粒子（Ｊｏｓｈｉ，  Ａ．，  １９９４  Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １０：  ２９−４５）、脂質溶解性処方物（Ａｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３１２：  ４４７−５８）、およびミクロスフェア（Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，  １９９９  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ５２：  １０１−６）、および眼挿入物が挙げられる。このような適切な医薬処方物は、ほとんどの場合、および好ましくは、安定性および快適さのために滅菌され、等張性であり、且つ緩衝化されるように処方される。抗癌剤はまた、正常な繊毛作用の維持を確実にするために、多くの場合、多くの点で鼻分泌を刺激するように製造されるドロップおよびスプレーを包含してもよい。「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、第１８版）に開示されるように、また当業者に公知であるように、適切な処方物は、ほとんどの場合、および好ましくは、等張性であり、ｐＨ５．５〜６．５を維持するようにわずかに緩衝化され、またほとんどの場合、および好ましくは、抗菌防腐剤および適切な薬物安定剤を含む。耳介内送達用の医薬処方物としては、耳の中での局所塗布のための懸濁液および軟膏が挙げられる。このような耳用処方物のための通常の溶媒としては、グリセリンおよび水が挙げられる。
【０１８５】
本発明に係る複合体の投与量は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状などによって適宜選択することができる。前記投与量は、１回量として、通常５μｇ〜１００ｍｇ／単位体重、好ましくは５００μｇ〜５０ｍｇ／単位体重であり、より好ましくは１〜１０ｍｇ／単位体重である。また、製剤化の工夫により、前記投与量を低減することが可能である。１日あたりの投与回数も特に制限されず、例えば１日あたり１回〜３回投与することができる。
【０１８６】
本発明に係る複合体の対象となる癌の種類は、特に限定されない。例えば、神経系の癌（例えば、脳腫瘍、頚癌）；消化器系の癌（例えば、口腔癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆道癌、脾臓癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌）；筋骨格系の癌（例えば、肉腫、骨肉種、骨髄腫）；泌尿器系の癌（例えば、膀胱癌、腎癌）；生殖器系の癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌）；呼吸器系の癌（例えば、肺癌）；造血器系の癌（例えば、急性または慢性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫）、血管肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、原発性骨髄線維症、血管外膜細胞腫）；甲状腺癌、副甲状腺癌、舌癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫、皮膚組織球腫、脂肪腫、毛包腫瘍、皮膚乳頭腫、皮脂腺腫、基底細胞癌などが挙げられる。これらのうち、本発明に係る複合体の対象となる癌としては、好ましくは生殖器系の癌または呼吸器系の癌であり、より好ましくは生殖器系の癌であり、さらに好ましくは卵巣癌である。
【実施例】
【０１８７】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【０１８８】
＜ポリペプチド誘導体の合成＞
以下の方法により、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むポリペプチド誘導体を合成した。
【０１８９】
（ペプチド１の合成）
ペプチド１：
Ａｃ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＧＧＧＧＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ
（Ｃ（ＳｔＢｕ）：Ｓ−（ｔ−ブチルチオ）システイン）
ペプチドは、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置を用いて合成した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ，８８．９ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中室温で３０分間膨潤させた。膨潤後、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液中、室温で２０分間反応させることで樹脂上の保護基Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトシキカルボニル）基を除去した。ＤＭＦで洗浄し、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ，０．２ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）、Ｏ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホルファート（ＨＡＴＵ，０．２ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ，０．４ｍｍｏｌ，１０ｅｑ．）存在下で、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（０．２ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）を室温で３０分間ＤＭＦ中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるために、ＤＭＦで洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液中、室温で２０分間反応させることで樹脂上の保護基Ｆｍｏｃ基を除去した。以下、同様にして順次Ｃ末端からＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨを導入し、ペプチド鎖を伸長した。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液中、室温で２０分間反応させることで除去した後、無水酢酸（３ｅｑ．）、ＤＩＥＡ（５ｅｑ．）にてアミノ基をアセチル化した。ＤＭＦで５回洗浄、メタノールで５回洗浄、ジエチルエーテルで５回洗浄後、樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）：１，３−ジメトキシベンゼン（５ｍＬ：１２５μＬ：２５０μＬ）溶液にて３時間処理することで、各種側鎖保護基の除去および脱樹脂した。反応液を濾過し、濾液を集め、窒素気流下でＴＦＡを揮発させることにより留去し、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色粉末（ペプチド１）を得た（１６．８ｍｇ，収率１６．７％）。
【０１９０】
（ペプチド２の合成）
ペプチド２：
【０１９１】
【化２８】
2020189806.tif 000029
【０１９２】
ペプチド１（１６．８ｍｇ）のＤＭＦ（６．６ｍＬ）溶液に対して、１，３−ジクロロプロパノン（１．３ｍｇ）とＮ−メチルモルフォリン（２１．８μＬ）とを加え、１時間室温で撹拌した。その後、氷冷下で２．５％  ＮａＨＣＯ３水溶液とＤＴＴ（５０．９ｍｇ）とを加え、１時間室温で撹拌した。反応液を濃縮した後に高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色粉末（ペプチド２）を得た（９．４ｍｇ，収率５５．２％）。ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１０５Ｈ１４６Ｎ２９Ｏ３０Ｓ３  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ２３８８．９９５３  ｆｏｕｎｄ  ２３８８．９９３７。
【０１９３】
（ポリペプチド誘導体の合成）
ポリペプチド誘導体：
【０１９４】
【化２９】
2020189806.tif 000030
【０１９５】
ペプチド２（１ｍｇ）のｐＨ４．５  酢酸緩衝液（２μＬ）／ＤＭＦ（１９８μＬ）溶液に対して、チオ酢酸（０．４４μＬ）を添加し、６０分間室温で反応させた。その後、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。残渣をＤＭＦ（４１．８μＬ）に再度溶解し、ジスクシンイミジルグルタレート（３．４ｍｇ）とＮ−メチルモルホリン（０．４６μＬ）とを添加し、１０分間室温に静置した。反応後、ジエチルエーテル：クロロホルム＝１：１の溶液でペプチドを３回洗浄し、風乾した。得られた残渣をＤＭＦに再度溶解し、高速液体クロマトグラフィーにより精製することで、ポリペプチド誘導体を白色粉末として得た（０．３ｍｇ，収率２８．４％）。
【０１９６】
＜プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体１および２の合成＞
（化合物１ａの合成）
化合物１ａ：
（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル  ４−（１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）ブタノエート
【０１９７】
【化３０】
2020189806.tif 000031
【０１９８】
（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル  ヘクス−５−イノエート（１０ｍｇ）のＤＭＦ（０．１３ｍＬ）／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（０．１３ｍＬ）溶液に３−アジド−１−プロパンアミン（４．３ｍｇ）の水溶液（０．１３ｍＬ）、硫酸銅五水和物（０．５ｍｇ）、アスコルビン酸ナトリウム（１．２ｍｇ）を加え、マイクロ波照射下、５０℃にて２０分間撹拌した。その後、反応溶液を室温に戻し、溶媒を減圧留去した。この溶液を酢酸エチルにより抽出した後、抽出液を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液をろ過し、溶媒を留去した。その残留物を高速液体クロマトグラフィーにより精製し、化合物１ａを黄色固体として得た（２．６ｍｇ，収率１７．７％）。ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ３７Ｎ８Ｏ４  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ５６１．２９３８  ｆｏｕｎｄ  ５６１．２９４３。
【０１９９】
（プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体１の合成）
化合物１：
（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル  ４−（１−（３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）プロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）ブタノエート
【０２００】
【化３１】
2020189806.tif 000032
【０２０１】
化合物１ａ（２．６ｍｇ）のジメチルスルホキシド（３８．５μＬ）溶液にスクシンイミジル  ｔｒａｎｓ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（１．５ｍｇ）とＮ−メチルモルフォリン（２μＬ）を加え、一時間反応させた。その後、高速液体クロマトグラフィーにて精製することで、プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体１を黄色固体として得た（０．８ｍｇ，収率２６．６％）。ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４１Ｈ４９Ｎ９Ｏ７  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ７８０．３８３３  ｆｏｕｎｄ  ７８０．３８３７。
【０２０２】
（化合物２ａの合成）
化合物２ａ：
（２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）エチル）エチルカルバメート
【０２０３】
【化３２】
2020189806.tif 000033
【０２０４】
アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウムのＤＭＦ溶液に対し、２−メチルプロパン−２−チオールを滴下し、１０分間撹拌した。その後、２−ブロモエタン−１−オール（６９８μＬ，８ｍｍｏｌ）を反応液に滴下し、さらに３時間室温で撹拌した。反応後、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液により反応液をｐＨ２とし、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。この溶液をろ過し、溶媒を留去し、２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）エタン−１−オールを得た。この化合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）カルボネート（４．１  ｇ，  １６  ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．１２  ｍＬ，  ８  ｍｍｏｌ）を加え、五時間室温で撹拌した。その後、エチルアミン塩酸塩（１．３  ｇ，  １６  ｍｍｏｌ）を添加し、室温でさらに一昼夜撹拌した。反応の終了後、反応液を水で希釈し、クロロホルムで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。この溶液をろ過し、溶媒を留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル  ＝  ４：１）にて精製することで、目的物を得た（１．３４  ｇ，  収率８１％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ４．６６  （ｓ，  １Ｈ），  ４．１８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｑｕｉｎｔ．，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ９Ｈ），  １．１４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）。
【０２０５】
（化合物２ｂの合成）
化合物２ｂ：
２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）エチル  （クロロメチル）（エチル）カルバメート
【０２０６】
【化３３】
2020189806.tif 000034
【０２０７】
化合物２ａ（６１ｍｇ）のジクロロメタン（１．５ｍＬ）溶液に対して、パラホルムアルデヒド（１２．５ｍｇ）とクロロトリメチルシラン（９４．９μＬ）とを加え、室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮し、精製せずに次の反応に用いた。
【０２０８】
（化合物２ｃの合成）
化合物２ｃ：
２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）エチル  （（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル）（エチル）カルバメート
【０２０９】
【化３４】
2020189806.tif 000035
【０２１０】
プリナブリン（Ｐｌｉｎａｂｕｌｉｎ）（５０ｍｇ）に対して、炭酸セシウムを加え、１０分間室温で撹拌した。その後、化合物２ｂのＤＭＦ溶液を加え、マイクロ波の照射下、１５分撹拌した。反応液を水で希釈したのち、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および濃縮を行った。得られた粗生成物は高速液体クロマトグラフィーにて精製することで、化合物２ｃの黄色固体を得た（２６．４ｍｇ，収率３２．０％）。
【０２１１】
（化合物２ｄの合成）
化合物２ｄ：
Ｓ−（（２−（（（（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−ｏｘｏ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル）（エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）チオ）−Ｌ−システイン
【０２１２】
【化３５】
2020189806.tif 000036
【０２１３】
化合物２ｃ（２６．４ｍｇ）のジクロロメタン（０．５ｍＬ）溶液に対して、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロリド（１８．２ｍｇ）を加え、室温で４時間撹拌した。濃縮した後、残渣を水：アセトニトリル：＝１：１（１ｍＬ）に再度溶解し、Ｌ−システインを添加し、室温で撹拌した。その後、高速液体クロマトグラフィーにて精製することで、化合物２ｄを黄色固体として得た（５．５ｍｇ，収率１８．７％）。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ  ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ３７Ｎ６Ｏ６Ｓ２  ［Ｍ＋Ｈ］＋    ６１７．２２１６，  ｆｏｕｎｄ  ６１７．２２１５。
【０２１４】
（プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体２の合成）
化合物２：
Ｓ−（（２−（（（（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル）（エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）チオ）−Ｎ−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）−Ｌ−システイン
【０２１５】
【化３６】
2020189806.tif 000037
【０２１６】
化合物２ｄ（１．２ｍｇ）のＤＭＦ溶液に対して、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（０．６ｍｇ）とＮ−メチルモルホリン（０．９μＬ）とを添加し、２時間室温で撹拌した。０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液により希釈した後、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体２を黄色固体として得た（０．６ｍｇ，収率４０％）。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ  ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ３７Ｎ６Ｏ６Ｓ２  ［Ｍ＋Ｈ］＋    ７６８．２４８５，  ｆｏｕｎｄ  ７６８．２４８４。
【０２１７】
＜Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いた抗体Ｆｃ部位片側修飾＞
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、使用ガイドに従いトラスツズマブ（商品名：ハーセプチン（登録商標））を固相担体上に担持した。すなわち、２００×ｇで１分間遠心することで保存液を除去し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により、樹脂を三回洗浄した。その後、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したトラスツズマブを２００μＬ添加し、３０分間転倒混和することで、トラスツズマブをＰｒｏｔｅｉｎ  Ａに結合させて、プロテインＡ−抗体架橋体を形成した。リン酸緩衝液で樹脂を再度洗浄した。次に、上記で得られたポリペプチド誘導体（３５μＭ，２００μＬ）の０．４％ＤＭＳＯ／リン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５０ｍＭ）を添加し、一時間転倒混和することで、トラスツズマブ−ポリペプチド誘導体間の架橋反応を行い、プロテインＡ−抗体−ポリペプチド架橋体を形成した。その後、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）により洗浄した。２．５％酢酸水溶液で樹脂を洗浄することで、抗体−ポリペプチド誘導体架橋体（Ｆｃ片側修飾体）をＨＰＬＣ収率５８％で得た（未修飾体：２９％，二修飾体：１％）。
【０２１８】
＜複合体の作製＞
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製した抗体−ポリペプチド誘導体架橋体（０．５ｍｇ／ｍＬ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，２５ｍＭ，２５２μＬ）に対し、プリナブリン誘導体−リンカー化合物架橋体１の５０％アセトニトリル水溶液（１０ｍＭ）を２８μＬ添加した。反応１時間後、過剰のマレイミド体を除去するために、３０％アセトニトリル／リン酸緩衝液で希釈および限外濾過の作業を５回繰り返した。その後、同様に限外濾過により、緩衝液交換を行うことで、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した複合体を得た。
【０２１９】
得られた複合体について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ測定による質量分析（装置：ＡＸＩＭＡ（登録商標）  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ、株式会社島津製作所製）を行い、プリナブリン誘導体ユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット−抗体ユニット複合体が形成されたことを確認した。マトリックスとしては、シナピン酸を用いた。
【０２２０】
＜プリナブリンユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット架橋体の作製（比較例）＞
（プリナブリン−ＳＰＭＢの合成）
プリナブリン−ＳＰＭＢ：
（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル  ４−（１−（２−（（４−メトキシベンジル）チオ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）ブタノエート
【０２２１】
【化３７】
2020189806.tif 000038
【０２２２】
（（（Ｚ）−６−（（Ｚ）−ベンジリデン）−３−（（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン）−５−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロピラジン−２−イル）オキシ）メチル  ｈｅｘ−５−イノエート（２４．５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５０ｍＬ）／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（０．５０ｍＬ）溶液に（２−アジドエチル）（４−メトキシベンジル）スルファン（２２．３ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）の水溶液（０．５０ｍＬ）、硫酸銅五水和物（１．２ｍｇ）およびアスコルビン酸ナトリウム（２．８ｍｇ）を加え、５０℃でマイクロ波照射下１０分間撹拌した。その後、反応溶液を室温に戻し、溶媒を留去した後、酢酸エチルを用いて抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液をろ過した後、溶媒を留去した。得られた残留物を高速液体クロマトグラフィーを用いて精製し、化合物３を黄色固体としてを得た（２８ｍｇ，収率７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １２．３８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３６-７．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．０５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．３０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．０１  （ｑｕｉｎｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．４１  （ｓ，  ９Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １７２．２７，  １５９．６８，  １５８．８４，  １５２．６５，  １４６．７１，  １３５．２８，  １３２．３０，  １３１．８９，  １３１．６１，  １２９．９９，  １２９．４８，  １２８．７７，  １２８．３５，  １２７．９１，  １２１．９２，  １２１．５２，  １１４．０６，  １０２．１３，  ８１．７３，  ５５．２９，  ４９．６９，  ３５．７５，  ３３．３１，  ３１．７９，  ３１．０５，  ３０．６５，  ２９．７１，  ２４．６３，  ２４．４２；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３６Ｈ４２Ｎ７Ｏ５Ｓ  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ６８４．２９６８，  ｆｏｕｎｄ  ６８４．２９６１。
【０２２３】
（架橋体の作製）
【０２２４】
【化３８】
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【０２２５】
プリナブリンユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット架橋体は、以前の報告と同様の手法により合成した（Ｋｙｏｈｅｉ  Ｍｕｇｕｒｕｍａ，  Ｔａｋｕｙａ  Ｓｈｉｒａｓａｋａ，  Ｄａｉｃｈｉ  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｋｅｎｔａｒｏｕ  Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，  Ａｋｉｈｉｒｏ  Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｋｅｎｔａｒｏ  Ｔａｋａｙａｍａ，  Ａｔｓｕｈｉｋｏ  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｙｏｓｈｉｏ  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｂｙ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  （２０１８）  ５７，  ２１７０−２１７３．）。Ｎｐｙｓ−Ｂｎ樹脂（１０．４ｍｇ）に対し、塩化スルフリル（２０μＬ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）（１ｍＬ）およびピリジン（３．８μＬ）の混合溶液を加え、氷冷下穏やかに２０分程撹拌した後、溶液を除去し、これを２回繰り返して、Ｎｐｙｓ−Ｃｌ樹脂とした。得られた樹脂に対して、アセトニトリル（０．４ｍＬ）に溶解したプリナブリン−ＳＰＭＢ（０．８２ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌することで、プリナブリンを樹脂上に担持した。樹脂をアセトニトリル（２ｍＬ）および水（２ｍＬ）で洗浄した後、システイン含有抗体結合ペプチド（２．０ｍｇ）のＨ２Ｏ／ＤＭＦ＝１／１（０．２ｍＬ）溶液を加え、１８時間撹拌した。この反応液をろ過後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、架橋体を黄色粉末として得た（０．２５ｍｇ，収率１０％）。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２２Ｈ１６１Ｎ３２Ｏ２９Ｓ４  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ２６６６．１０４７，  ｆｏｕｎｄ  ２６６６．０９９０。
【０２２６】
＜殺細胞活性評価＞
ＨＥＲ２を過剰発現しているヒト卵巣腺腫細胞（ＳＫＯＶ−３細胞）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、５０ｎＭの各化合物（トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン（登録商標）），プリナブリン誘導体ユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット−抗体ユニット複合体，プリナブリンユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット架橋体，トラスツズマブエムタンシン（商品名：カドサイラ（登録商標）））を添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートし、９６時間後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行うことで細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価した（ｎ＝４）。評価結果を図１に示す。
【０２２７】
図１において、Ｈｅｒ、Ｈｅｒ−Ｐｌｉ１およびＰＢＮは、それぞれトラスツズマブ、プリナブリン誘導体ユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット−抗体ユニット複合体およびプリナブリンユニット−リンカーユニット−ペプチドユニット架橋体を示す。
【０２２８】
図１に示すように、本発明に係る複合体は、優れた殺細胞活性を有するため、優れた抗癌作用を発揮できることが分かる。
【図１】
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【配列表】
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