(57)【要約】【課題】標的物質をより正確に計数することができる標的物質の計数方法等を提供する。【解決手段】１以上の標的物質６１と１以上の標識物質６３と１以上の磁性体６５とを結合させて結合体６０を形成し、結合体６０に励起光を照射し、結合体６０に磁場を印加し、励起光が照射され、かつ、磁場が印加されている間に、結合体６０に含まれる１以上の標識物質６１による蛍光又は散乱光を撮像することにより、第１画像と第１画像より後の第２画像とを取得し、第１画像及び第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、結合体６０に含まれる１以上の標的物質６１の数を算出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させて結合体を形成し、
前記結合体に励起光を照射し、
前記結合体に磁場を印加し、
前記励起光が前記結合体に照射され、かつ、前記磁場が前記結合体に印加されている間に、前記結合体に含まれる前記１以上の標識物質による蛍光又は散乱光を撮像することにより、第１画像と前記第１画像より後の第２画像とを取得し、
前記第１画像及び前記第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を算出する、
標的物質の計数方法。
【請求項２】
前記移動する輝点の移動速度が、所定速度範囲に含まれない場合に、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を２以上と算出する、
請求項１に記載の標的物質の計数方法。
【請求項３】
前記移動する輝点のサイズが、閾値サイズよりも大きい場合に、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を２以上と算出する、
請求項２に記載の標的物質の計数方法。
【請求項４】
前記結合体の形成では、複数の前記結合体を形成し、
前記閾値サイズは、複数の前記移動する輝点のサイズの分布に基づいて決定される、
請求項３に記載の標的物質の計数方法。
【請求項５】
前記所定速度範囲は、複数の前記移動する輝点のうちの前記閾値サイズよりサイズが小さい輝点の中で、最も移動速度の遅い輝点の移動速度に基づいて決定される、
請求項４に記載の標的物質の計数方法。
【請求項６】
前記１以上の標的物質の数を算出する際に、
前記移動する輝点に対応する前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を１と算出し、
前記移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に応じて、前記１以上の標的物質の数を補正する、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的物質の計数方法。
【請求項７】
前記励起光は、近接場光である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的物質の計数方法。
【請求項８】
前記標識物質は、蛍光体である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的物質の計数方法。
【請求項９】
前記標識物質は、蛍光体を含むポリスチレンビーズ、シリカビーズ、ポリ乳酸ビーズ、又はアクリルビーズである、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の標的物質の計数方法。
【請求項１０】
前記移動速度は、一定時間における平均値である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の標的物質の計数方法。
【請求項１１】
１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させた結合体に励起光が照射され、かつ、前記結合体に磁場が印加されている間に、前記結合体に含まれる前記１以上の標識物質による蛍光又は散乱光が撮像された、第１画像と前記第１画像より後の第２画像とを取得する取得部と、
取得された前記第１画像及び前記第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を算出する算出部と、を備える、
計数装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、試料溶液中に存在する標的物質の計数方法、及び当該標的物質の計数装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、溶液中に存在する微小物質、特にウイルス等の生体関連物質を検出、又は定量する方法が開発されている。例えば、特許文献１には、近接場（近接場光）を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を輝点として検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１７／１８７７４４号
【特許文献２】特開２００２−２３６２５８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／１９４６６３号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sensors and Actuators B 121 (2007) 158-177
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に開示された方法では、標的物質を正確に計数することが難しい場合がある。
【０００６】
本開示は、上記の問題を解決しようとするものであり、標的物質をより正確に計数することができる標的物質の計数方法、及び当該計数方法を実施可能な標的物質の計数装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本開示に係る標的物質の計数方法の一態様においては、１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させて結合体を形成し、前記結合体に励起光を照射し、前記結合体に磁場を印加し、前記励起光が前記結合体に照射され、かつ、前記磁場が前記結合体に印加されている間に、前記結合体に含まれる前記１以上の標識物質による蛍光又は散乱光を撮像することにより、第１画像と前記第１画像より後の第２画像とを取得し、前記第１画像及び前記第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を算出する。
【０００８】
また、本開示に係る計数装置の一態様においては、１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させた結合体に励起光が照射され、かつ、前記結合体に磁場が印加されている間に、前記結合体に含まれる前記１以上の標識物質による蛍光又は散乱光が撮像された、第１画像と前記第１画像より後の第２画像とを取得する取得部と、取得された前記第１画像及び前記第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を算出する算出部と、を備える。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、標的物質をより正確に計数することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施の形態に係る光学的検出システムの全体構成を示す図である。
【図２Ａ】実施の形態に係る光学的検出装置の全体構成を示す図である。
【図２Ｂ】実施の形態に係る結合体の一例について説明する図である。
【図３Ａ】実施の形態に係る標的物質の計数方法について説明するフローチャートである。
【図３Ｂ】実施の形態に係る標的物質の計数方法について詳細に説明するフローチャートである。
【図４】実施の形態に係る動画像データをある時点で静止した場合の図である。
【図５】実施例に係る標的物質の計数について説明する図である。
【図６】変形例に係る結合体の態様と標的物質の計数との関係について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（開示の基礎となった知見）
近年、溶液中に存在する微小物質、特にウイルス等の生体関連物質を検出、又は定量する方法が開発されている。例えば、表面プラズモン共鳴イムノアッセイ法、全反射照明蛍光顕微鏡、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法等が挙げられる。
【００１２】
表面プラズモン共鳴イムノアッセイ法は、抗原抗体反応の特異的選択性と高感度な屈折率計である表面プラズモン共鳴センサを組み合わせた方法である。当該方法によれば、入射した光が全反射される金薄膜表面に生じる増強電場内の抗原及び抗体の結合形成をリアルタイムかつ高精度で検出、又は定量することができる（非特許文献１参照）。
【００１３】
全反射照明蛍光顕微鏡は、試料とカバーガラス又はスライドガラスとの界面で入射光を全反射させ、これによって生じるエバネッセント場を励起光として利用する装置である。当該装置を用いれば、ノイズとなるバックグラウンド光が少ない蛍光観察を行うことができる（特許文献２参照）。また、当該装置は、超解像を実現可能であり、これにより単分子観察が可能となる。
【００１４】
表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法は、クレッチマン配置と呼ばれる光学配置を適用して、蛍光観察を行う技術である。当該技術では、プリズムに接したガラス表面の金薄膜層に対して、プリズム側から入射光を照射する。ガラス表面と金薄膜層との界面で入射光が全反射され、金薄膜層上に表面プラズモン共鳴が励起される。これにより、金薄膜表面近傍において増強された光を励起光として、増強電場内に存在する蛍光分子を励起し、強い蛍光を生じさせ、バックグラウンド光が少ない蛍光観察を行うことが可能となる（特許文献３参照）。
【００１５】
また、近接場を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を光信号として検出する方法もある。当該技術では、結合体は、標的物質と磁性体の結合によって形成される。結合体を検出板の表面に平行な方向に移動させる磁場を印加し、結合体の移動によって生じる光信号（輝点）の変化を計測して、標的物質を検出することを特徴とする光学的検出方法である。結合体は、標的物質と磁性体とによって形成される。また、結合体は、さらに、標的物質と磁性体と標識物質とによって形成される場合もある（特許文献１参照）。当該方法によれば、検出板の表面に非特異的に吸着してしまう夾雑物又は標識物質によるノイズ等を排除し、高感度かつ高速に標的物質の検出が可能となる。
【００１６】
中でも特に、近接場を用いて標的物質を含む結合体を、結合体の移動により光学的に検出する方法は、装置構成が簡単であり、かつ高感度であるため、近年注目されている。しかしながら、当該方法では、溶液中の標的物質の濃度が高くなると、結合体の移動によって移動する輝点（動光点）に基づく標的物質の計測数が実際の標的物質の濃度に比例しないという課題が生じる。
【００１７】
これは、１つの動光点を形成する結合体内に、複数の標的物質を介して結合した複数の磁性体及び標識物質が結合しているためである。これは、動光点の移動速度が全て一致せず、移動速度が速いもの及び遅いものが存在していることから予測し得る。例えば、動光点の移動速度が速いものは磁性体が複数結合していることを示している。また、例えば、動光点の移動速度が遅く、動光点の輝度が高い（発光強度が強い）もの、及び動光点のサイズの大きいものは、標識物質が複数結合していることを示している。
【００１８】
このような、多数の標的物質が結合した結合体の形成が起こると、動光点の数をカウントするのみの従来の方法では、標的物質を正確に計数することができない。より具体的には、標的物質を正確に計数できる標的物質の濃度範囲が制限され、センサとしての実用性が不十分になるという問題が発生する。
【００１９】
本開示は、上記の問題を解決しようとするものである。つまり、標的物質を含む結合体を、結合体の移動により光学的に検出する方法において、撮像した動画像データから、動光点の移動速度及びサイズの情報をもとに、１つの動光点を生じさせる結合体内に含まれる標的物質の個数を算出する。本開示では、以上により、試料溶液中の標的物質の個数をより正確に計数できる標的物質の計数方法、及び標的物質の個数を精度よく検出することが可能な光学的検出装置を提供することを目的とする。
【００２０】
したがって、本開示によれば、標的物質を含む結合体を、結合体の移動により光学的に検出する方法において、撮像した動画像データから、動光点の移動速度及びサイズの情報をもとに、１つの動光点を形成する結合体内に含まれる標的物質の個数を算出することにより、試料溶液中の標的物質の個数をより精度よく検出することが可能となる。よって、カビ、バクテリア、又はウイルス等、及びこれらの生体物質が産生する物質をより正確に検出できる。ひいては、これらの物質が感染性物質である場合に生じ得る感染リスク等をより精度よく予測することができる。
【００２１】
（開示の概要）
上記の目的を達成するための、本開示に係る標的物質の計数方法及び計数装置の一態様の概要は、以下のとおりである。
【００２２】
本開示に係る標的物質の計数方法の一態様は、１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させて結合体を形成し、結合体に励起光を照射し、結合体に磁場を印加し、励起光が結合体に照射され、かつ、磁場が結合体に印加されている間に、結合体に含まれる１以上の標識物質による蛍光又は散乱光を撮像することにより、第１画像と第１画像より後の第２画像とを取得し、第１画像及び第２画像の間で移動する輝点（動光点）の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、結合体に含まれる１以上の標的物質の数を算出する。
【００２３】
これによれば、第１画像及び第２画像の間で移動する輝点（動光点）の移動速度及びサイズのうち少なくとも一方に基づいて、結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、動光点の数をそのまま標的物質の数と算出する場合よりも、より正確に標的物質を計数することができる。例えば、結合体に含まれる磁性体の数と標的物質及び標識物質の数との比が変化すれば、結合体の移動速度も変化する。したがって、結合体に対応する動光点の移動速度に基づいて、結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、標的物質をより正確に計数することができる。また例えば、結合体に含まれる標的物質が増加すれば、標的物質の数が増加するとともに、結合体に対応する動光点のサイズが増加する。したがって、動光点のサイズに基づいて結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、標的物質をより正確に計数することができる。
【００２４】
また、例えば、動光点の移動速度が、所定速度範囲に含まれない場合に、結合体に含まれる１以上の標的物質の数を２以上と算出してもよい。
【００２５】
結合体に２以上の標的物質が含まれ、その２以上の標的物質に２以上の磁性体が結合されている場合には、結合体の移動速度は増加する。また、結合体に２以上の標的物質が含まれ、その２以上の標的物質に２以上の標識物質が結合されているが、１つの磁性体しか含まれない場合には、結合体の移動速度は減少する。したがって、動光点の移動速度が、１つの標的物質と１つの標識物質と１つの磁性体とからなる結合体の移動速度に対応する速度範囲である所定速度範囲に含まれない場合に、結合体に含まれる標的物質の数を２つ以上と算出することで、標的物質をより正確に計数できる。
【００２６】
また、例えば、動光点のサイズが、閾値サイズよりも大きい場合に、結合体に含まれる１以上の標的物質の数を２以上と算出してもよい。
【００２７】
結合体に２以上の標的物質が含まれ、その２以上の標的物質に２以上の標識物質が結合されている場合には、動光点のサイズは増大する。したがって、動光点のサイズが、１つの標的物質と１つの標識物質と１つの磁性体とからなる結合体のサイズに対応するサイズである閾値サイズよりも大きい場合に、結合体に含まれる標的物質の数を２つ以上と算出することで、標的物質をより正確に計数できる。
【００２８】
また、例えば、結合体の形成では、複数の結合体を形成し、閾値サイズは、複数の移動する輝点のサイズの分布に基づいて決定されてもよい。
【００２９】
これによれば、試料溶液中の標的物質の数を計数する実測条件において閾値サイズを決定できる。実測条件において閾値サイズを決定することで、試料溶液に含まれる標的物質の数をより正確に計数できる。
【００３０】
また、例えば、所定速度範囲は、複数の移動する輝点のうちの閾値サイズよりサイズが小さい輝点の中で、最も移動速度の遅い輝点の移動速度に基づいて決定されてもよい。
【００３１】
これによれば、試料溶液中の標的物質の数を計数する実測条件において所定速度範囲を決定できる。実測条件において所定速度範囲を決定することで、試料溶液に含まれる標的物質の数をより正確に計数できる。
【００３２】
また、例えば、１以上の標的物質の数を算出する際に、移動する輝点に対応する結合体に含まれる１以上の標的物質の数を１と算出し、移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に応じて、１以上の標的物質の数を補正してもよい。
【００３３】
これによれば、移動する輝点の移動速度及びサイズに基づき、必要な動光点のみについて、対応する結合体に含まれる標的物質の数を加算補正できる。つまり、その他の動光点については、対応する結合体に含まれる標的物質の数を１と算出できる。よって、試料溶液に含まれる標的物質の数の計数処理が簡易化され、高速に標的物質を計数できる。
【００３４】
また、例えば、励起光は、近接場光であってもよい。
【００３５】
これによれば、限られた領域にのみ伝搬する近接場光によって標識物質へ励起光の照射を行うことができる。近接場光を用いることにより、磁場の印加によって結合体を集合させた一部の領域のみに励起光を照射することができ、試料溶液中の夾雑物への励起光の照射を低減できる。よってバックグラウンドの上昇を抑制し、試料溶液に含まれる標的物質の数をより正確に計数できる。
【００３６】
また、例えば、標識物質は、蛍光体であってもよい。
【００３７】
これによれば、励起光が照射されることによって励起された蛍光体が発する蛍光を撮像することで第１画像及び第２画像を取得することができる。蛍光体の励起及び蛍光発光の波長には波長選択性があり、特定の波長範囲に含まれる励起光を選択し、かつ特定の波長範囲の発光を撮像することで、蛍光体選択的な撮像を行うことができる。よって、蛍光体を含む結合体を選択的に検出することができ、試料溶液中の結合体に含まれた標的物質の数をより正確に計数できる。
【００３８】
また、例えば、標識物質は、蛍光体を含むポリスチレンビーズ、シリカビーズ、ポリ乳酸ビーズ、又はアクリルビーズであってもよい。
【００３９】
これによれば、１つの標識物質に含まれる蛍光体の数を多くすることができ、標識物質が発する蛍光をより大きくすることができ、画像上における結合体の観察を容易にすることができる。
【００４０】
また、例えば、移動速度は、一定時間における平均値であってもよい。
【００４１】
これによれば、結合体の移動速度が、磁場のむら、ならびに、他の粒子及び表面構造などへの衝突等によって、各時点において変化する場合に、一過的な加減速に影響されず、より正確な動光点の移動速度を算出することができる。より正確な動光点の移動速度に基づいて、１つの結合体に含まれる標的物質の数をより正確に算出できる。よって、試料溶液に含まれる標的物質の数をより正確に計数できる。
【００４２】
また、本開示に係る計数装置の一態様は、１以上の標的物質と１以上の標識物質と１以上の磁性体とを結合させた結合体に励起光が照射され、かつ、前記結合体に磁場が印加されている間に、前記結合体に含まれる前記１以上の標識物質による蛍光又は散乱光が撮像された、第１画像と前記第１画像より後の第２画像とを取得する取得部と、取得された前記第１画像及び前記第２画像の間で移動する輝点の移動速度及びサイズの少なくとも一方に基づいて、前記結合体に含まれる前記１以上の標的物質の数を算出する算出部と、を備える。
【００４３】
これによれば、第１画像及び第２画像の間で移動する輝点（動光点）の移動速度及びサイズのうち少なくとも一方に基づいて結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、動光点の数をそのまま標的物質の数と算出する場合よりも、より正確に標的物質を計数することができる。例えば、結合体に含まれる磁性体の数と標的物質及び標識物質の数との比が変化すれば、結合体の移動速度も変化する。したがって、結合体に対応する動光点の移動速度に基づいて、結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、標的物質をより正確に計数することができる。また例えば、結合体に含まれる標的物質が増加すれば、標識物質の数が増加するとともに、結合体に対応する動光点のサイズが増加する。したがって、動光点のサイズに基づいて結合体に含まれる標的物質の数を算出することで、標的物質をより正確に計数することができる。
【００４４】
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
【００４５】
（実施の形態）
以下では、本開示の実施の形態について図面とともに説明する。
【００４６】
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置、及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００４７】
なお、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００４８】
また、本明細書において、平行などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形などの要素の形状を示す用語、ならびに、数値、及び、数値範囲は、厳格な意味のみを表す表現ではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の誤差等の差異も含むことを意味する表現である。
【００４９】
［光学的検出システム］
はじめに、本実施の形態に係る光学的検出システムの概要について図１を用いて説明する。図１は、実施の形態に係る光学的検出システムの全体構成を示す図である。
【００５０】
図１に示すように、本実施の形態に係る光学的検出システム１００は、光学的検出装置１０１、コントローラ１０２、データ解析装置１０３、及びモニタ１０４で構成される。
【００５１】
光学的検出装置１０１は、標的物質を含み得る試料溶液から、標的物質を検出するための装置である。光学的検出装置１０１は、試料溶液と、磁性体及び標識物質とを混合した混合溶液に対して励起光を照射し、発生する蛍光又は散乱光を、撮像装置３０によって撮像することで、標的物質を検出する。光学的検出装置１０１のより詳細な説明については、図２Ａを用いて後述する。
【００５２】
コントローラ１０２は、プロセッサ等の演算装置を用いて、メモリ等に格納されたプログラムに従い、光学的検出装置１０１に備えられた撮像装置３０を制御する制御装置である。したがって、コントローラ１０２は撮像装置３０と通信可能に接続されている。コントローラ１０２は、撮像装置３０を制御することにより、撮像装置３０が第１時点において撮像した第１画像、及び第１時点よりも後の第２時点において撮像した第２画像を取得する。
【００５３】
なお、コントローラ１０２は、さらに、光学的検出装置１０１の各種動作を制御する制御装置であってもよい。また、コントローラ１０２は、光学的検出装置１０１、又は後述するデータ解析装置１０３と一体化されていてもよい。また、コントローラ１０２の一部の機能を光学的検出装置１０１、又は後述するデータ解析装置１０３が備えていてもよい。
【００５４】
データ解析装置１０３は、コントローラ１０２が取得した第１画像及び第２画像を含む複数の画像を処理するための処理装置である。データ解析装置１０３は、第１画像及び第２画像を含む複数の画像を取得する取得部１０３ａと、第１画像及び第２画像を含む複数の画像を用いて結合体に含まれる標的物質の数を算出する算出部１０３ｂとを備える計数装置の一例である。
【００５５】
取得部１０３ａは、例えば、コントローラ１０２から複数の画像を取得するための通信インタフェースである。したがって、取得部１０３ａは、コントローラ１０２と通信可能に接続され、コントローラ１０２から送信された複数の画像を受信する。取得部１０３ａは、コントローラ１０２から受信することにより取得した第１画像及び第２画像を含む複数の画像を算出部へと送信する。
【００５６】
算出部１０３ｂは、第１画像及び第２画像を含む複数の画像を処理することにより、動光点に対応する結合体に含まれる標的物質の数を算出する。したがって、算出部１０３ｂは、データ解析装置１０３による画像処理を担う処理装置である。算出部１０３ｂは、一例としてプロセッサとメモリとを備え、当該メモリに格納されたプログラムをプロセッサが実行することによって実現される。
【００５７】
算出部１０３ｂは、第１画像及び第２画像を含む複数の画像を時系列に沿って並べた動画像データを生成する。算出部１０３ｂは、生成された動画像データを用いて、混合溶液に含まれる結合体の検出処理を実施する。算出部１０３ｂは、さらに、検出した結合体を基に試料溶液に含まれた標的物質の計数処理を実施する。算出部１０３ｂによる検出処理及び計数処理については後述する。
【００５８】
モニタ１０４は、算出部１０３ｂの処理内容を可視化するための表示装置である。光学的検出システム１００のユーザは、モニタ１０４に表示された情報を視認することで、算出部１０３ｂによる処理内容を把握することができる。また、モニタ１０４は、算出部１０３ｂの処理条件等を入力するためのＧＵＩを表示してもよい。ユーザは、当該ＧＵＩを視認しながら、入力装置（不図示）を用いて算出部１０３ｂに対して処理条件等の入力を行ってもよい。
【００５９】
［光学的検出装置］
次に、本実施の形態に係る標的物質の検出について図２Ａ及び図２Ｂを用いて説明する。まず、本実施の形態に係る光学的検出装置１０１の概要について図２Ａを用いて説明する。図２Ａは、実施の形態に係る光学的検出装置の全体構成を示す図である。
【００６０】
図２Ａに示すように、本実施の形態に係る光学的検出装置１０１は、光照射部１０と溶液保持部２０と撮像装置３０と磁場印加部４０とを備える。
【００６１】
光照射部１０は、溶液保持部２０に光を照射する、発光装置である。光照射部１０の構成としては、溶液保持部２０に光を照射することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、及び全反射照明蛍光顕微鏡等に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。図２Ａに示す例では、全反射照明蛍光顕微鏡に用いられる公知の光照射部を採用している。
【００６２】
光学的検出装置１０１では、光照射部１０から照射された照射光１５により溶液保持部２０内に近接場光を形成し、溶液保持部２０内に保持された混合溶液に含まれる結合体が近接場光により照射されることで発生する蛍光又は散乱光を撮像装置３０によって受光することで結合体を検出する。ここで、磁場印加部４０により、溶液保持部２０内における結合体の位置を制御することで、結合体を近接場光に照射される位置に誘導する。また、磁場印加部４０は、さらに、結合体を移動させることにより、結合体が発生する蛍光又は散乱光を、撮像装置３０の検出領域内で移動させる。撮像装置３０では、撮像された画像内に、結合体が発する蛍光又は散乱光に基づく輝点が形成される。このような輝点は、磁場の印加により移動する結合体に対応しており、取得された画像ごとに位置が変化する。つまり、第１画像及び第２画像を含む動画像データ上において移動する輝点（動光点）が形成される。
【００６３】
［光照射部］
光照射部１０は、光源１１と光導入部１３とを備える。光源１１としては、一例としてレーザ光源を用いることができる。なお、光源１１は、ＬＥＤが用いられてもよく、フィラメント電球又は放電現象を利用したランプ等が用いられても良い。光源１１は、所定の波長の光を含む照射光１５を発する構成であればどのような形態で実現されてもよい。また、光源１１は、さらに、所定の波長の光を含む照射光１５を分光により取り出す分光装置を備えてもよい。
【００６４】
光導入部１３は、光源１１が発した照射光１５が入射される光学部材である。光導入部１３は、屈折及び／又は反射により入射された照射光１５の光路を規定する導光機能を有する。また、光導入部１３は、照射光１５が入射される入射面とは異なる面において、後述する検出板２１の裏面と接合されている。裏面から入射した照射光１５が検出板２１の表面で全反射されるように設計されている。光導入部１３は、例えば、公知のプリズム等により実現される。
【００６５】
［溶液保持部］
溶液保持部２０は、検出板２１と溶液保持槽２３とカバーガラス２５とを備える。検出板２１は、前述したように裏面において光導入部１３に接合されている。また、検出板２１は、光透過性を有する板状部材である。検出板２１の裏面と光導入部１３とは、これらが接合される接合層において照射光１５の損失が極力生じないように密着されていることが望ましい。接合層は、一例として、接着剤を用いて実現され、当該接着材により、光導入部１３と検出板２１とが接着される。なお、接合層は、屈折率マッチングオイル等で実現されてもよく、当該屈折率マッチングオイル等により、光導入部１３と検出板２１とが単に光学的に接触されてもよい。
【００６６】
検出板２１の表面及び裏面は、互いに背向し、かつ平行である。光導入部１３から接合層を介して裏面に入射された照射光１５は、検出板２１の内部を通り、前述したように検出板２１の表面で全反射される。この際に、検出板２１の表面における、照射光１５が反射される側と反対側にエバネッセント場又は増強電場等の近接場光が形成される。近接場光は、検出板２１の表面から遠ざかるにつれて急激に減衰する性質を有する。つまり、近接場光は、検出板２１の表面近傍にのみ形成される。なお、検出板２１の構成としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択されてもよい。したがって、検出板２１は、単層で構成されてもよく、電場増強を目的とした積層体で構成されてもよい。
【００６７】
溶液保持槽２３は、検出板２１に積層されるシート状の部材であり、例えばシリコン樹脂等によって構成される。溶液保持槽２３は、シートの内部（面内方向における内部）において、シートの両主面を貫通してくりぬかれたくりぬき部を有する。溶液保持槽２３は、検出板２１に積層されることで、検出板２１の表面と、くりぬき部の外周（つまり溶液保持槽２３の内側面）とに囲まれた容器形状を形成する。本実施の形態において溶液保持槽２３のくりぬき部は、溶液保持槽２３を平面視した場合に円形である。したがって検出板２１と、溶液保持槽２３とによって形成される容器形状は、円柱状の空間２７である。なお、くりぬき部の形状は、円形に限定されず多角形状等のいかなる形状であってもかまわない。
【００６８】
カバーガラス２５は、溶液保持槽２３にさらに積層される板状の部材である。カバーガラス２５は、透光性の材料によって形成されていれば形状に限定はない。カバーガラス２５は、検出板２１と溶液保持槽２３とによって形成された空間２７の蓋の役割を担うため、平面視において前述したくりぬき部を覆うことができる形状、及び大きさである。なお、カバーガラス２５の材質は、ガラスに加え、樹脂等でもあってもかまわない。カバーガラス２５は、光透過性を有すれば、どのような構成であってもよい。
【００６９】
このようにして、検出板２１、溶液保持槽２３、及びカバーガラス２５によって空間２７は、略密閉可能となる。ここで、空間２７には光学的検出システム１００によって検出される対象の混合溶液が充填される。つまり、混合溶液が溶液保持部２０に充填された状態で、混合溶液に含まれ得る結合体の検出が行われる。混合溶液は、カバーガラス２５を開くことで空間２７に導入される。つまり、カバーガラス２５は、空間２７にアクセス可能な開口を覆う。当該開口は、結合体を含み得る混合溶液が導入される導入部の一例である。なお、空間２７と外部とを連通する細孔を設けてもよく、この場合には、当該細孔が導入部となる。
【００７０】
［撮像装置］
空間２７内で発生した光は、カバーガラス２５を介して外部に透過し、溶液保持部２０に対向して配置された撮像装置３０において受光される。撮像装置３０は、集光性を有する集光部材３１とイメージセンサ３５とが筐体３７に内蔵された受光装置である。また、撮像装置３０は必要に応じて、一部の波長の光を選択的に透過させるフィルタ３３を備えてもよい。つまり、フィルタ３３を備えなくても本開示を実施可能であるが、本実施の形態においては、フィルタ３３により一部の波長の光のみがイメージセンサ３５に入射される例を説明する。集光部材３１は、例えば屈折式のレンズであり、撮像装置３０が受光した光をイメージセンサ３５に集光する。集光部材３１は単一のレンズによって構成されてもよく、複数のレンズを用いて構成されてもよい。
【００７１】
フィルタ３３は、例えば、結合体が発生する蛍光の主要な波長成分のみを透過させ、その他を吸収又は反射する光学特性を有する。これにより、結合体が発生した蛍光又は散乱光のみを高精度に検出することができる。イメージセンサ３５は、フォトダイオードを用いるもの、及び光増倍管を組み合わせたもの等の、公知の光検出手段であってもかまわない。撮像装置３０を用いて撮像される対象は、検出板２１に沿う２次元面であるため、イメージセンサ３５としてＣＣＤイメージセンサ又はＣＭＯＳイメージセンサ等の２次元センサを用いてもよい。これにより、多くの情報を含む第１画像、及び第２画像等を得ることが可能となる。
【００７２】
また、筐体３７は、金属又は樹脂等で構成される。筐体３７は、カバーガラス２５に対向する面に窓を有する。当該窓から受光された光がイメージセンサ３５に入射する。筐体３７には、上記の窓から受光された光の光路に沿って、集光部材３１、フィルタ３３、イメージセンサ３５がこの順に配置され、それぞれの位置関係が一定に保たれるように保持部が形成されている。また、上記の窓は、集光部材３１によって構成されてもよい。つまり、筐体３７の光を受光する面に形成された開口に、集光部材３１がはめ込まれることで上記の窓が構成されてもよい。なお、筐体３７は、集光部材３１に入射する光を除き、その他の外光が筐体３７の内部に入り込まないよう、遮光性を有する材料によって構成されている。
【００７３】
［磁場印加部］
磁場印加部４０は、第１磁場印加部４１と第２磁場印加部４３とを備える。
【００７４】
第１磁場印加部４１は、第１磁場を発生し、空間２７に対して当該第１磁場を印加する。第１磁場印加部４１は、例えばネオジム磁石等の永久磁石によって構成されるが、第１磁場印加部４１の材料に特に限定はない。第１磁場印加部４１は、酸化鉄等を主成分とするフェライト磁石、又はアルミニウム、ニッケル、及びコバルト等を主成分とするアルニコ磁石等で構成されてもよい。
【００７５】
第２磁場印加部４３は、第１磁場の方向と交差する方向の第２磁場を発生し、溶液保持槽２３を介して空間２７に対して当該第２磁場を印加する。第２磁場印加部４３は、例えばネオジム磁石等の永久磁石によって構成されるが、第２磁場印加部４３の材料に特に限定はない。第２磁場印加部４３は、酸化鉄等を主成分とするフェライト磁石、又はアルミニウム、ニッケル、及びコバルト等を主成分とするアルニコ磁石等で構成されてもよい。
【００７６】
第１磁場は、空間２７に印加されると、空間２７内に存在する強磁性体、常磁性体又は超常磁性体等の磁性体を検出板２１の表面に引き寄せる。つまり、第１磁場印加部４１は、空間２７とともに検出板２１を挟む配置である。第１磁場は、検出板２１の表面と交差する方向に印加される。したがって第２磁場は、第１磁場と交差する検出板２１の表面に沿う方向に印加される。よって、第２磁場は、空間２７に印加されると、空間２７内に存在する強磁性体、常磁性体又は超常磁性体等の磁性体を検出板２１の表面に沿って移動させる。つまり、第２磁場印加部４３は、空間２７とともに溶液保持槽２３を挟む配置である。
【００７７】
ここで、磁性体の移動とは、印加される磁場の方向に沿って磁性体の位置が変化することをいう。また、磁性体を含む結合体も同様に印加される磁場の方向に沿って位置が変化し、このような位置の変化を結合体の移動として説明する。
【００７８】
［結合体］
次に、本実施の形態に係る結合体の形成について図２Ｂを用いて説明する。図２Ｂは、実施の形態に係る結合体の一例について説明する図である。
【００７９】
図２Ｂに示すように、本実施の形態において、結合体６０は、標的物質６１、磁性体６５、標識物質６３からなる。標的物質６１は、例えば、ウイルス粒子、微生物、細菌等である、又は、これらの産生する、若しくはこれらを構成するタンパク質、脂質、糖、核酸等の生体関連物質である。磁性体６５は、強磁性、常磁性又は超常磁性等の磁性を有する粒子である。磁性体６５は磁性を有するため、第１磁場及び第２磁場によって引き寄せられる。
【００８０】
また、磁性体６５は、前述した標的物質６１と結合する性質を有する。これは例えば、磁性体６５の表面に配置された抗体６７によって実現される。なお、標的物質６１と磁性体６５との結合形態は、これに限らず、磁性体６５を第１磁場及び第２磁場により引き寄せる際に解離しない結合強度を有する結合形態であればどのような形態であってもよい。結合形態は、標的物質６１に合わせて適宜選択されればよい。
【００８１】
標識物質６３は、結合体６０を標識し、検出可能にする物質であり、例えば光の照射により励起されて蛍光を発生する蛍光体により実現される。つまり、標識物質６３によって結合体６０が蛍光を発生する。なお、結合体６０を構成する標的物質６１が蛍光を発生する場合もあり、その際、結合体６０は、標識物質６３を備えなくてもよい。本実施の形態において、具体的には、標識物質６３は、蛍光体が分散されたポリスチレンを粒子状に形成した蛍光ビーズとして実現される。
【００８２】
ここで、蛍光ビーズの直径は、１００ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光ビーズの直径が１００ｎｍよりも小さい場合には、発する蛍光の強度が弱くなり、検出しにくくなることが想定される。また蛍光ビーズの直径は、１μｍ以下であることが好ましい。蛍光ビーズの直径が１μｍよりも大きい場合には、近接場光が形成される（伝搬する）領域内に当該蛍光ビーズが入りにくくなることが想定される。また、蛍光ビーズの直径が１μｍよりも大きい場合には、磁性体６５による移動が生じにくくなることが想定される。よって、本実施の形態に用いられる蛍光ビーズは、直径が１００ｎｍ以上、かつ１μｍ以下の範囲内で設計される。なお、蛍光ビーズは、ポリスチレンを用いて構成されるポリスチレンビーズ以外にも、シリカガラスを用いて構成されるシリカビーズ、ポリ乳酸を用いて構成されるポリ乳酸ビーズ、アクリルを用いて構成されるアクリルビーズなど、公知のビーズを適宜選択可能である。したがって、蛍光ビーズの材料は、特に限定はなく、標的物質６１及び溶液条件等に適したビーズを選択して用いてもよい。
【００８３】
また、標識物質６３は、磁性体６５と同様に抗体６７によって標的物質６１に結合する。なお、標的物質６１と磁性体６５とを結合する抗体６７、及び標的物質６１と標識物質６３とを結合する抗体６７は、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよい。また、標的物質６１と標識物質６３との結合形態は、これに限らず、磁性体６５を第１磁場及び第２磁場により引き寄せる際に解離しない結合強度を有する結合形態であればどのような形態であってもよい。結合形態は、標的物質６１に合わせて適宜選択されればよい。
【００８４】
なお、以上は、１つの標的物質６１に対して、１つの標識物質６３及び１つの磁性体６５が結合した理想的な結合体６０の一態様の例示である。以降において、結合体６０は、全ての態様の結合体を含むものとして説明する。なお、実際に形成されることが想定される結合体のいくつかの態様についても図６を用いて後述する。
【００８５】
［結合体の検出］
次に、本実施の形態における結合体６０の検出について、図３Ａ及び図３Ｂを用いて説明する。図３Ａは、実施の形態に係る標的物質の計数方法について説明するフローチャートである。また、図３Ｂは、実施の形態に係る標的物質の計数方法について詳細に説明するフローチャートである。
【００８６】
まず、光学的検出装置１０１の溶液保持部２０の空間２７には、混合溶液が導入される。混合溶液内においては、標的物質６１が標識物質６３及び磁性体６５の有する抗体６７によって捕捉され、結合体６０が形成される。
【００８７】
コントローラ１０２は、磁場印加部４０を制御することにより、空間２７に対して磁場を印加する。より具体的には、第１磁場印加部４１を制御することにより、混合溶液に第１磁場を印加する。これにより、混合溶液内で形成された結合体６０は、第１磁場印加部４１に向かって（図２Ａの紙面下向きに）引き寄せられ、検出板２１の表面に略接する状態となる。さらに、コントローラ１０２は、第２磁場印加部４３を制御することにより、混合溶液に第２磁場を印加する。これにより、混合溶液内で形成された結合体６０は、第２磁場印加部４３に向かって（図２Ａの紙面左向きに）引き寄せられる。
【００８８】
コントローラ１０２は、さらに、光照射部１０を制御することにより、照射光１５を光源１１から出射させる。照射光１５は、検出板２１の表面に近接場光を形成する。近接場光は、検出板２１の表面近傍において、混合溶液に照射される。ここで、近接場光が照射される混合溶液の一部の領域には、第１磁場によって引き寄せられた結合体６０が存在している。したがって、結合体６０には、近接場光が照射さる。近接場光の照射により、結合体６０に含まれる標識物質６３の蛍光体が励起される。つまり、近接場光は、励起光の一例である。
【００８９】
ここで、コントローラ１０２は、撮像装置３０を制御して混合溶液を撮像することで、第１画像及び第２画像を取得する。より詳しくは、コントローラ１０２は、混合溶液に対して、第２磁場が印加され、かつ、近接場光が照射されている間の第１時点において撮像装置３０を制御して混合溶液を撮像する。
【００９０】
混合溶液に含まれる結合体６０は、近接場光の照射により蛍光を発しており、当該蛍光が撮像された第１画像が取得される。また、コントローラ１０２は、混合溶液に対して、第２磁場が印加され、かつ、近接場光が照射されている間の第２時点において撮像装置３０を制御して混合溶液を撮像する。第２時点は、第１時点よりも後である。混合溶液に含まれる結合体６０は、第２磁場の印加により移動しており、第１時点及び第２時点の間で移動した結合体６０が発する蛍光が撮像された第２画像が取得される。撮像装置３０は、この動作を繰り返し、第１画像及び第２画像を含む複数の画像を取得する。なお、標識物質が散乱光を発する場合は、蛍光に代えて散乱光が撮像される。
【００９１】
取得された第１画像及び第２画像を含む複数の画像は、データ解析装置１０３へと送信される。データ解析装置１０３は、取得部１０３ａを用いて第１画像及び第２画像含む複数の画像を取得し（Ｓ１０）、算出部１０３ｂを用いてこれらの画像の解析を行う。より具体的には、データ解析装置１０３は、第１画像及び第２画像を含む複数の画像のそれぞれについて、結合体６０に対応する蛍光の輝度の高い輝点ではないと判断できる背景箇所において取得された輝度を画像全体から差引くことで、背景光分の輝度補正を行う（Ｓ１１）。
【００９２】
さらに、データ解析装置１０３は、第１画像及び第２画像を含む複数の画像のそれぞれについて、所定の閾値を用いて、画像の二値化を行う（Ｓ１２）。所定の閾値とは、例えば、画像上における最も高い輝度と最も低い輝度の中間値である。なお、所定の閾値は、これに限られず、任意に設定された値であってもよい。二値化された各画像は、結合体６０の発する蛍光の輝点と背景箇所とのコントラストが上昇し、画像処理における判別処理が容易になる。
【００９３】
なお、データ解析装置１０３は、背景光を用いた輝度補正（Ｓ１１）及び各画像の二値化処理（Ｓ１２）を実施しなくてもよい。データ解析装置１０３は、取得された第１画像及び第２画像を含む複数の画像が、そのまま以降の処理に使用可能な鮮明な画像であれば上記の処理を省略してもよい。
【００９４】
続いて、データ解析装置１０３は、以上の処理が完了した第１画像及び第２画像を含む複数の画像を時系列に沿って並べた動画像データを生成する。データ解析装置１０３は、生成した動画像データを用いて、複数の輝点から、第１画像及び第２画像の間で移動する輝点である動光点を抽出する。
【００９５】
より具体的には、データ解析装置１０３は、二値化された第１画像上において輝点を抽出する。同様に、データ解析装置１０３は、二値化された第２画像上において輝点を抽出する。そして、データ解析装置１０３は、第１画像及び第２画像の各々において抽出された輝点の位置に基づいて、第１画像及び第２画像の間で輝点の対応付けを行う。
【００９６】
ここで、データ解析装置１０３は、対応付けられた輝点のペアのうち、第１画像から第２画像までの間で所定の距離以上移動した輝点のペアを抽出する。所定の距離として、混合溶液中の夾雑物等を含む各粒子がブラウン運動等により移動する距離を排除できる距離を設定することで、第２磁場の印加により移動した結合体６０に対応する移動した輝点が抽出される。以上の処理により、データ解析装置１０３は、移動する輝点である動光点の抽出を行う。データ解析装置１０３は、抽出された動光点の数ｉをカウントする（Ｓ１３）。
【００９７】
データ解析装置１０３は、混合溶液中に含まれる標的物質６１の数ｊを、カウントされた動光点の数ｉにより初期化する（Ｓ１４）。これにより、１つの動光点に対応する１つの結合体６０には、少なくとも１つの標的物質６１が含まれることが標的物質６１の数ｊに反映される。
【００９８】
続いて、データ解析装置１０３は、対応付けられた輝点のペアについて移動速度を算出する。また、データ解析装置１０３は、輝点のペアについて輝点のサイズを算出する。
【００９９】
輝点のサイズは、結合体６０に含まれる標識物質６３の数に応じて大きくなる。つまり、データ解析装置１０３は、輝点のサイズの分布に基づき、１つの標識物質６３を含む結合体６０に対応する輝点サイズと、２つの標識物質６３を含む結合体６０に対応する輝点サイズとの境界に閾値サイズを設定できる。
【０１００】
さらに、データ解析装置１０３は、当該閾値サイズよりも輝点のサイズが小さい動光点の中から、最も移動速度の遅い輝点を特定し、特定された輝点の移動速度に基づいて所定速度範囲を設定する。
【０１０１】
所定速度範囲は、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の移動速度に対応する速度であり、このような結合体６０がとり得る速度分の範囲を有する基準速度である。つまり、基準速度は、例えば、動画像データ内の動光点のうち、特定された輝点の移動速度を中心とし、第１閾値から第２閾値までの所定の範囲を有して決定される。
【０１０２】
例えば、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の移動速度と、２つの標的物質６１と２つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の移動速度との中間値を第１閾値としてもよい。また、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の移動速度と、２つの標的物質６１と１つの標識物質６３と２つの磁性体６５とからなる結合体６０の移動速度との中間値を第２閾値としてもよい。
【０１０３】
また、前述した閾値サイズは、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の輝点のサイズに対応する基準サイズである。つまり、基準サイズは、例えば、動画像データ内の動光点のうち、最小の輝点のサイズを起点とし、当該起点から第３閾値までの所定の範囲を有して決定される。
【０１０４】
例えば、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の輝点のサイズと、２つの標的物質６１と２つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０の輝点のサイズとの中間値を第３閾値としてもよい。
【０１０５】
以上のようにして、データ解析装置１０３は、基準速度及び基準サイズを決定する（Ｓ１５）。
【０１０６】
なお、基準速度及び基準サイズは、人為的に１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とからなる結合体６０を形成させることにより、あらかじめ決定していてもよい。また、第１画像及び第２画像の間と、第２画像及び第２画像の次の画像の間とで、移動速度及び輝度サイズが変化する場合があるため、単位時間ごとの移動速度及び輝度サイズの平均値を用いてもよい。
【０１０７】
続いて、データ解析装置１０３は、動画像データ内の各動光点について、各々の移動速度及び輝度サイズに基づき、それぞれの動光点に対応する結合体６０に含まれる標的物質６１の数ｊを補正する（Ｓ１６）。
【０１０８】
図３Ｂに示すように、ステップＳ１６では、まず、画像中に存在する複数の動光点のうちの１つを選択する（Ｓ２１）。データ解析装置１０３は、選択された動光点について、移動速度及び輝度サイズに基づき、標的物質６１の数ｊを加算して補正するか否かの判定を行う。
【０１０９】
より具体的には、まず、動光点の移動速度が基準速度より速いか否かを判定する（Ｓ２２）。つまり、データ解析装置１０３は、動光点の移動速度が第２閾値より速いか否かの判定を行う。
【０１１０】
ここで、図４は、実施の形態に係る動画像データをある時点で静止した場合の図である。図４は、モニタ１０４に表示される情報の一例であり、動画像データを表示するソフトウェア１０４ａを用いて、動画像データをある時点で静止させた状態を示している。図４に示すソフトウェア１０４ａには、動画像データのある時点に対応する画像が表示されている。当該画像上には、ある時点における輝点Ｐ１〜Ｐ４が円形で示されている。ここで、破線円で示す輝点Ｐ２は、移動しない輝点であり、結合体６０に対応しない。輝点Ｐ１は、移動する輝点であり、結合体６０に対応する動光点である。輝点Ｐ１は、比較的小さく、標識物質６３を１つ含む結合体６０に対応すると考えられる。よって、基準速度及び基準サイズは、輝点Ｐ１のうちのいずれかを基に決定される。
【０１１１】
一方で、輝点Ｐ３は、ある時点に対応する画像内で線形に延びた楕円形である。輝点Ｐ３は、画像を取得するために撮像装置３０が露光を行った時間内に画像上の１ピクセルよりも大きく移動した結合体６０に対応している。つまり、輝点Ｐ３は、移動速度が速いことを示している。輝点Ｐ３は、輝点Ｐ１に対応する結合体６０よりも移動速度が速い結合体６０に対応している。
【０１１２】
図３Ｂに戻り、図４の輝点Ｐ３のように、動光点の移動速度が基準速度よりも速いと判定された場合（Ｓ２２でＹｅｓ）、当該動光点に対応する結合体６０に含まれる標的物質６１の数が１よりも多いと判断し、標的物質６１の数ｊを＋Ｌ個加算する（Ｓ２５）（Ｌは１以上の整数）。
【０１１３】
一方で、図４の輝点Ｐ１のように、動光点の移動速度が基準速度よりも速いと判定されなかった場合（Ｓ２２でＮｏ）、動光点の移動速度が基準速度より遅いか否かを判定する（Ｓ２３）。より具体的には、データ解析装置１０３は、動光点の移動速度が第１閾値より遅いか否かの判定を行う。動光点の移動速度が基準速度よりも遅いと判定された場合（Ｓ２３でＹｅｓ）、当該動光点に対応する結合体６０に含まれる標的物質６１の数が１よりも多いと判断し、標的物質６１の数ｊを＋Ｍ個加算する（Ｓ２６）（Ｍは１以上の整数）。
【０１１４】
続いて、動光点の移動速度が基準速度よりも遅いと判定されなかった場合（Ｓ２３でＮｏ）、動光点の輝度サイズが基準サイズよりも大きいか否かを判定する（Ｓ２４）。より具体的には、データ解析装置１０３は、動光点の輝度サイズが第３閾値より大きいか否かの判定を行う。
【０１１５】
ここで、再び図４を参照し、輝点Ｐ４は、比較的大きな輝点であり、輝点Ｐ１に対応する結合体６０よりも輝度サイズが大きい結合体６０に対応している。このように輝点サイズが大きくなるためには、結合体６０内において蛍光を発する標識物質６３が空間的に広がっている場合と、標識物質６３が発する蛍光の空間的な広がりが大きい（蛍光強度が大きい）場合とが考えられる。標識物質６３は、略均一な大きさに形成された粒子状であり、粒子内には略均一に分散された蛍光体が内包される。つまり、結合している標識物質６３の数が変わらない場合、蛍光強度は略同様であるといえる。すなわち、輝度サイズが大きい動光点に対応する結合体６０は、標識物質６３を複数含んでいる。
【０１１６】
図３Ｂに戻り、図４の輝点Ｐ４のように、動光点の輝度サイズが基準サイズよりも大きいと判定された場合（Ｓ２４でＹｅｓ）、当該動光点に対応する結合体６０に含まれる標的物質６１の数が１よりも多いと判断し、標的物質６１の数ｊを＋Ｎ個加算する（Ｓ２７）（Ｎは１以上の整数）。
【０１１７】
一方で、図４の輝点Ｐ１のように、動光点の輝度サイズが基準サイズよりも大きいと判定されなかった場合（Ｓ２４でＮｏ）、画像中に存在する動光点のうち、全ての動光点について、補正するか否かの判定を行うために選択されたか否かを判定する（Ｓ２８）。少なくとも一部の動光点について、補正するか否かの判定を行うために選択されていないと判定された場合（Ｓ２８でＮｏ）、ステップＳ２１に戻り、異なる動光点について再度、補正するか否かの判定を行う。一方、全ての動光点について、補正するか否かの判定を行うために選択されたと判定された場合（Ｓ２８でＹｅｓ）、処理を終了する。
【０１１８】
以上のように、動光点の移動速度及び輝点サイズは独立に判定される。言い換えると、動光点の移動速度が第１閾値から第２閾値までの所定の範囲に含まれない場合に、標的物質６１の数を２以上と判定することができる。また、動光点の輝度サイズが第３閾値よりも大きい場合に、標的物質６１の数を２以上と判定することができる。
【０１１９】
以上で説明した、標的物質６１の数に加算されるＬ、Ｍ、及びＮは、移動速度及び輝点サイズに比例して変化する。つまり、結合体６０に含まれる磁性体６５の数が２個の場合よりも３個の場合の方が移動速度は速くなる。また、結合体６０に含まれる標識物質６３の数が２個の場合よりも３個の場合の方が輝度サイズは大きくなる。したがって、磁性体６５及び標識物質６３の数に応じて、さらに、複数の閾値を設定してもよい。
【０１２０】
以上のように、本実施の形態によれば、各々の結合体６０に含まれる、より正確な標的物質６１の数を算出し、それぞれを合計することにより、試料溶液に含まれている標的物質６１の数をより正確に計数することができる。
【０１２１】
（実施例）
以下、実施例に基づき、本開示の標的物質６１の計数方法を具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
【０１２２】
本実施例では、上記の実施の形態において説明した光学的検出装置１０１を標的物質６１の計数に用いた。したがって、以下では、図２Ａに示した光学的検出装置１０１を適宜参照して標的物質６１の計数方法を説明する。また、標的物質６１が含まれる試料溶液として、以下の条件を用いた。なお、本実施例に示す条件等も一例であり、目的とする標的物質６１に応じて適宜変更して実施してもよい。
【０１２３】
まず、磁性体６５として、直径２００ｎｍの、強磁性を示す磁性粒子を用いた。磁性粒子の表面には、抗アルブミン抗体として作用するＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）抗体を、抗体６７として付加修飾した。
【０１２４】
また、標識物質６３として、直径４００ｎｍの、蛍光を発するマーカ粒子を用いた。マーカ粒子は、ポリスチレンにより蛍光体が分散されたビーズ状である。マーカ粒子の表面には、抗アルブミン抗体として作用するＩｇＧ抗体を、抗体６７として付加修飾した。
【０１２５】
また、標的物質６１として、モデルタンパク質のヒト血清由来のアルブミン（ＨＳＡ：Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を用いた。
【０１２６】
なお、磁性粒子に付加修飾したＩｇＧ抗体と、マーカ粒子に付加修飾したＩｇＧ抗体とは、互いに異なるＩｇＧ抗体であり、標的物質６１の異なるエピトープに結合する。標的物質６１として用いたアルブミンの表面に露出するアミノ酸残基は、繰り返し構造（複数の同一構造のエピトープ）を有しない。つまり、同一のエピトープに結合するＩｇＧ抗体を用いた場合、磁性粒子及びマーカ粒子の表面に修飾された２つの抗体を同時に結合することが困難である。よって、磁性粒子及びマーカ粒子の表面に修飾するＩｇＧ抗体として異なるエピトープに結合するＩｇＧ抗体の組み合わせを用いた。
【０１２７】
また、実施例においては、ＩｇＧ抗体の組み合わせとしては、アルブミンの表面のうち、互いに比較的遠位なエピトープに結合するＩｇＧ抗体の組み合わせを用いた。ＩｇＧ抗体の組み合わせは、これに限らず、磁性粒子及びマーカ粒子の表面に修飾された２つの抗体を同時に結合することが可能であれば、どのような組み合わせでもよい。
【０１２８】
以上に示した、磁性粒子、マーカ粒子、及びアルブミンを混合した混合溶液を調製した。調製した混合溶液中では、磁性粒子、マーカ粒子、及びアルブミンが、ＩｇＧ抗体を介して結合した結合体６０が形成される。続いて、調製した混合溶液を光学的検出装置１０１の空間２７に導入した。
【０１２９】
第１磁場印加部４１により、空間２７に第１磁場を印加し、混合溶液中で結合体が移動するために十分な所定時間だけ、第１磁場印加部４１による磁場の印加を継続した。その後、第２磁場印加部４３を用いて第２磁場を印加し、混合溶液中の磁性粒子を第２磁場印加部４３の方向へと引き寄せた。ここで、第２磁場に沿って磁性粒子が引き寄せられている間に、光源１１から照射光１５を照射した。照射光１５は、光導入部１３、マッチングオイル、及び検出板２１内を導光され、検出板２１の表面で反射される。検出板２１における照射光１５が反射された側と反対側の近傍には励起光である近接場光が形成される。
【０１３０】
マーカ粒子のうち、ＩｇＧ抗体及びアルブミンを介して磁性粒子と結合した結合体６０は、第１磁場によって近接場光が形成される領域に引き寄せられている。したがって、結合体６０を形成するマーカ粒子は、近接場光によって励起されて蛍光を発する。また、結合体６０は、第２磁場印加部４３によって引き寄せられているため、第２磁場に沿って移動しながら蛍光を発している。
【０１３１】
このように、励起光が照射され、かつ、磁場が印加されている間に、撮像装置３０を用いて結合体６０を撮像した。取得された第１画像及び第２画像を含む複数の画像を用いて、データ解析装置１０３により、動画像データを生成した。動画像データ上で、移動する輝点（動光点）として観察されるのは、磁性粒子とマーカ粒子とが、ＩｇＧ抗体及びアルブミンを介して結合した結合体６０の発する蛍光に対応する輝点のみである。
【０１３２】
動画像上において移動する輝点（動光点）の個数、移動速度及び輝度サイズを計測した。計測結果に基づき、試料溶液中に存在するアルブミンの数を計数した。以上の処理を、試料溶液中アルブミン濃度４点（つまり、４種のアルブミン数）について行った。
【０１３３】
なお、第１磁場及び第２磁場を印加して磁性粒子を引き寄せる印加時間、ならびに動画像データの長さに対応する複数の画像の撮像を継続する撮像時間は、試料溶液に応じて適宜決定した。
【０１３４】
以上の結果を図５に示す。図５は、実施例に係る標的物質の計数について説明する図である。
【０１３５】
図５には、各動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を１個としてカウントした場合の試料溶液中アルブミン数に対する、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットを破線で示している。つまり、上記の場合は、動光点の移動速度及び輝度サイズを考慮しない、従来の計数方法を示している。上記の場合は、図３Ｂに示したフローチャートのステップＳ２１のみを実施することでアルブミンの数を計数する。
【０１３６】
また、図５には、各動光点のうち、移動速度の速い動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を２個としてカウントした場合の試料溶液中アルブミン数に対する、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットを２点鎖線で示している。つまり、上記の場合は、動光点の移動速度を考慮した、実施の形態に基づく計数方法を示している。上記の場合は、図３Ｂに示したフローチャートのステップＳ２１、ステップＳ２２、及びステップＳ２５を実施することで標的物質６１の数を計数する。なお、ステップＳ２５において、標的物質６１の数に加算されるＬは１である。
【０１３７】
また、図５には、各動光点のうち、輝度サイズの大きい動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を２個としてカウントした場合の試料溶液中アルブミン数に対する、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットを１点鎖線で示している。つまり、上記の場合は、動光点の輝度サイズを考慮した、実施の形態に基づく計数方法を示している。上記の場合は、図３Ｂに示したフローチャートのステップＳ２１、ステップＳ２４、及びステップＳ２７を実施することで標的物質６１の数を計数する。なお、ステップＳ２７において、標的物質６１の数に加算されるＮは１である。
【０１３８】
また、図５には、各動光点のうち、輝度サイズの大きい動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を２個としてカウントし、移動速度の速い動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を３個としてカウントした場合の試料溶液中アルブミン数に対する、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットを実線で示している。つまり、上記の場合は、動光点の移動速度及び輝度サイズを考慮した、実施の形態に基づく計数方法を示している。上記の場合は、図３Ｂに示したフローチャートのステップＳ２１、ステップＳ２２、ステップＳ２４、ステップＳ２５、及びステップＳ２７を実施することで標的物質６１の数を計数する。なお、ステップＳ２５において、標的物質６１の数に加算されるＬは２であり、ステップＳ２７において、標的物質６１の数に加算されるＮは１である。
【０１３９】
図５に示すように、動光点の移動速度及び輝度サイズを考慮しない、従来の計数方法（破線）では、試料溶液中アルブミン数に対して、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットが直線性を示さず、正確な計数が行われていないことがわかる。
【０１４０】
一方で、動光点の移動速度を考慮する、実施の形態に基づく計数方法（２点鎖線）では、試料溶液中アルブミン数に対して、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットが直線に近づくことが示され、従来の計数方法に比べてより正確にアルブミンの計数が行われていることがわかる。
【０１４１】
また、動光点の輝度サイズを考慮する、実施の形態に基づく計数方法（１点鎖線）では、試料溶液中アルブミン数に対して、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットが直線に近づくことが示され、従来の計数方法に比べてより正確にアルブミンの計数が行われていることがわかる。
【０１４２】
また、動光点の移動速度及び輝度サイズを考慮する、実施の形態に基づく計数方法（実線）では、試料溶液中アルブミン数に対して、標的物質６１として計数されたアルブミン数のプロットが大幅に直線に近づくことが示され、従来の計数方法に比べてより正確にアルブミンの計数が行われていることがわかる。
【０１４３】
ここで、図５に実線で示した動光点の移動速度及び輝度サイズを考慮する、実施の形態に基づく計数方法では、各動光点のうち、輝度サイズの大きい動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を２個としてカウントした。また、移動速度の速い動光点に対応する結合体６０に含まれるアルブミンの数を３個としてカウントした。
【０１４４】
つまり、本実施例の条件においては、結合体６０に含まれるアルブミンの数は３個以上である場合も考えられ得る。つまり、標的物質６１の数が、３個以上である結合体６０も形成され得る。
【０１４５】
（変形例）
以下では、実施の形態の変形例として結合体６０の態様に基づく標的物質６１の計数方法について、図６を用いて説明する。
【０１４６】
図６は、変形例に係る結合体の態様と標的物質の計数との関係について説明する図である。図６には、想定され得る結合体６０の態様と各態様の結合体６０の特性とを一覧表として示している。なお、以降、本変形例において結合体６０とは、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。その他の態様の結合体については、別の符合を付して説明する。
【０１４７】
本変形例に係る標的物質６１の計数方法では、動光点の移動速度と輝度サイズを独立ではなく、複合的に考慮する点で上記の実施の形態とは異なる。
【０１４８】
図６の第１行には、例示的な５つの結合体６０〜６０ｅのそれぞれに対応する列を示す記号（ａ）〜（ｅ）が示されている。また、図６の第２行には、結合体６０〜６０ｅのそれぞれの態様を示す図が示されている。また、図６の第３行には、結合体６０〜６０ｅのそれぞれに対応する動画像データ上の動光点における輝点サイズが示されている。また、図６の第４行には、結合体６０〜６０ｅのそれぞれに対応する動画像データ上の動光点における移動速度が示されている。また、図６の第５行には、結合体６０〜６０ｅのそれぞれについて、含まれる標的物質６１を計数する際に算出された１個に対して加算される標的物質６１の個数が示されている。
【０１４９】
図６に示すように、（ａ）列の結合体６０は、１つの標的物質６１と１つの標識物質６３と１つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。したがって、対応する動光点の輝度サイズは、１つの標識物質６３に対応して比較的小さいサイズ（基準サイズ）である。また、結合体６０に対応する動光点の移動速度は、１つの磁性体６５が１つの標識物質６３を結合して移動する中程度の速度（基準速度）である。したがって、結合体６０に含まれる標的物質６１は、加算が行われず、算出された１個のままである。
【０１５０】
（ｂ）列の結合体６０ｂは、２つの標的物質６１と１つの標識物質６３と２つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。したがって、対応する動光点の輝度サイズは、１つの標識物質６３に対応して比較的小さいサイズである。また、結合体６０ｂに対応する動光点の移動速度は、２つの磁性体６５が１つの標識物質６３を結合して移動する速い速度である。結合体６０ｂに含まれる標的物質６１は、仮定された１個に対して加算が行われる。
【０１５１】
より具体的には、動光点の輝点サイズが小さいため標識物質６３が１つであり、かつ動光点の移動速度が速いため磁性体６５が標識物質６３に対して１：１である１つよりも多い２つであると予測する。したがって、標的物質６１の数として仮定された１個に対して、さらに１つの磁性体６５との結合を仲介する標的物質６１の分として１個の加算が行われる。
【０１５２】
（ｃ）列の結合体６０ｃは、２つの標的物質６１と２つの標識物質６３と１つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。したがって、対応する動光点の輝度サイズは、２つの標識物質６３に対応して比較的大きいサイズ（２倍程度）である。また、結合体６０ｃに対応する動光点の移動速度は、１つの磁性体６５が２つの標識物質６３を結合して移動する遅い速度である。結合体６０ｃに含まれる標的物質６１は、仮定された１個に対して加算が行われる。
【０１５３】
より具体的には、動光点の輝点サイズが大きいため標識物質６３が１つよりも多い２つであり、かつ動光点の移動速度が遅いため磁性体６５が標識物質６３に対して１：１である２つよりも少ない１つであると予測する。したがって、標的物質６１の数として仮定された１個に対して、さらに１つの標識物質６３との結合を仲介する標的物質６１の分として１個の加算が行われる。
【０１５４】
（ｄ）列の結合体６０ｄは、４つの標的物質６１と２つの標識物質６３と３つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。したがって、対応する動光点の輝度サイズは、２つの標識物質６３に対応して比較的大きいサイズ（２倍程度）である。また、結合体６０ｄに対応する動光点の移動速度は、３つの磁性体６５が２つの標識物質６３を結合して移動する速い速度である。結合体６０ｄに含まれる標的物質６１は、仮定された１個に対して加算が行われる。
【０１５５】
より具体的には、動光点の輝点サイズが大きいため標識物質６３が１つよりも多い２つであり、かつ動光点の移動速度が速いため磁性体６５が標識物質６３に対して１：１である２つよりも多い３つであると予測する。したがって、標的物質６１の数として仮定された１個に対して、さらに１つの標識物質６３及び２つの磁性体６５との結合を仲介する標的物質６１の分として３個の加算が行われる。
【０１５６】
（ｅ）列の結合体６０ｅは、３つの標的物質６１と２つの標識物質６３と２つの磁性体６５とが結合した態様の結合体である。したがって、対応する動光点の輝度サイズは、２つの標識物質６３に対応して比較的大きいサイズ（２倍程度）である。また、結合体６０ｅに対応する動光点の移動速度は、２つの磁性体６５が２つの標識物質６３を結合して移動する中程度の速度である。結合体６０ｅに含まれる標的物質６１は、仮定された１個に対して加算が行われる。
【０１５７】
より具体的には、動光点の輝点サイズが大きいため標識物質６３が１つよりも多い２つであり、かつ動光点の移動速度が中程度であるため磁性体６５が標識物質６３に対して１：１である２つであると予測する。したがって、標的物質６１の数として仮定された１個に対して、さらに１つの標識物質６３及び１つの磁性体６５との結合を仲介する標的物質６１の分として２個の加算が行われる。
【０１５８】
以上のように、本変形例に係る標的物質６１の計数方法では、動光点の移動速度と輝度サイズを独立ではなく、複合的に考慮して、より複雑な態様の結合体に対応できる。したがって、標的物質６１の計数を、より詳細な結合体の態様に基づいて行うことができるので、より正確に標的物質６１を計数することができる。
【０１５９】
なお、結合体の態様は、図６に例示した５種以外にも存在し得る。さらに標識物質６３及び磁性体６５の表面に修飾された抗体６７の構成、ならびに標的物質６１、標識物質６３、磁性体６５の粒径等により各態様の結合体の存在比等も異なる。よってシミュレーション等の方法を用いて、事前に形成され得る結合体の態様を把握しておくことが必要である。
【０１６０】
（その他の実施の形態）
以上、実施の形態等について説明したが、本開示は、上記実施の形態等に限定されるものではない。
【０１６１】
また、上記実施の形態等において計数装置を構成する構成要素について例示したが、計数装置が備える構成要素の各機能は、計数装置を構成する複数の部分にどのように振り分けられてもよい。
【０１６２】
その他、実施の形態等に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態、又は、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態等における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本開示に含まれる。
【０１６３】
上記実施の形態においては、動光点の移動速度について、基準速度に対して同程度か、基準速度より遅いか、又は基準速度より速いかのいずれか３種に分類して、標的物質６１の計数に用いた。例えば、どの程度遅いか、又はどの程度速いかを含め、多段階に分類して、標的物質６１の計数に用いてもよい。
【０１６４】
また、例えば、上記の動光点の移動速度と同様に、動光点の輝点サイズを多段階に分類して、標的物質６１の計数に用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本開示は、簡単、高速、高精度な標的物質の検出、観察、及び計数等を目的とする装置等に用いられる。
【符号の説明】
【０１６６】
１０  光照射部
１１  光源
１３  光導入部
１５  照射光
２０  溶液保持部
２１  検出板
２３  溶液保持槽
２５  カバーガラス
２７  空間
３０  撮像装置
３１  集光部材
３３  フィルタ
３５  イメージセンサ
３７  筐体
４０  磁場印加部
４１  第１磁場印加部
４３  第２磁場印加部
６０、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ  結合体
６１  標的物質
６３  標識物質
６５  磁性体
６７  抗体
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４  輝点
１００  光学的検出システム
１０１  光学的検出装置
１０２  コントローラ
１０３  データ解析装置
１０３ａ  取得部
１０３ｂ  算出部
１０４  モニタ
１０４ａ  ソフトウェア
【図１】
2020190428.tif 000003
【図２Ａ】
2020190428.tif 000004
【図２Ｂ】
2020190428.tif 000005
【図３Ａ】
2020190428.tif 000006
【図３Ｂ】
2020190428.tif 000007
【図４】
2020190428.tif 000008
【図５】
2020190428.tif 000009
【図６】
2020190428.tif 000010