(57)【要約】【課題】二次元光電変換センサから得られた蛍光信号を用いて、微小粒子の解析に用いる評価値を提供する。【解決手段】微小粒子解析装置は、光源と、二次元光電変換センサと、算出部と、を備える。光源は、微小粒子が流れる流路内に励起光を照射する。二次元光電変換センサは、微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する。算出部は、蛍光信号の画像に含まれる複数の蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する。【選択図】図１
2020139824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内に流れる微小粒子に励起光を照射する光源と、
前記微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータを取得する二次元光電変換センサと、
前記蛍光信号のデータに含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する算出部と、
を備える微小粒子解析装置。
【請求項２】
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の各々から予め定めたオフセット値を減算した減算結果の前記合計値を、前記面積として算出する、
請求項１に記載の微小粒子解析装置。
【請求項３】
前記算出部は、
前記減算結果に予め定めた換算ゲインを乗算した乗算結果の前記合計値を、前記面積として算出する、
請求項２に記載の微小粒子解析装置。
【請求項４】
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の内の最大値を更に含む、前記評価値を算出する、
請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の微小粒子解析装置。
【請求項５】
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる、前記受光部から出力可能な最大の電荷値を示す前記蓄積電荷値の数の割合を示す飽和度を更に含む、前記評価値を算出する、
請求項１に記載の微小粒子解析装置。
【請求項６】
前記蛍光信号の画像は、複数の前記受光部の各々に対応する画素ごとに前記蓄積電荷値を規定した画像であり、
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる、複数の蛍光受光領域であるスポット領域ごとに、前記評価値を算出する、
請求項１に記載の微小粒子解析装置。
【請求項７】
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる前記スポット領域の中心を通る直線に沿って配列された複数の前記画素の内、第１の閾値以上の前記蓄積電荷値を示す前記画素の数である幅を更に含む、前記評価値を算出する、
請求項６に記載の微小粒子解析装置。
【請求項８】
前記算出部は、
前記幅が第２の閾値以下の場合、
該幅の算出に用いた前記スポット領域と、該幅の算出に用いた前記蛍光信号の画像に対して時系列に連続して取得した蛍光信号の画像に含まれる前記幅が前記第２の閾値以下の前記スポット領域と、を連結した連結スポット領域に基づいて、前記評価値を再算出する、
請求項７に記載の微小粒子解析装置。
【請求項９】
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析する解析部、
を備える、
請求項１〜請求項８の何れか１項に記載の微小粒子解析装置。
【請求項１０】
前記解析部は、
前記評価値に基づいて、前記励起光の照射光量、および、前記二次元光電変換センサのアナログデジタル変換ゲインの少なくとも一方を制御する、
請求項９に記載の微小粒子解析装置。
【請求項１１】
前記解析部は、
複数の前記評価値の内、予め定めた範囲内の値を示す前記評価値を解析対象とする、請求項９に記載の微小粒子解析装置。
【請求項１２】
微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサから、前記蛍光信号の画像を取得する蛍光信号取得部と、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する算出部と、
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析する解析部と、
を備える解析装置。
【請求項１３】
微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサから、前記蛍光信号の画像を取得するステップと、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出するステップと、
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析するステップと、
をコンピュータに実行させるための解析プログラム。
【請求項１４】
測定部と、前記測定部の動作の制御に使われるソフトウェアと、を含んで構成される微小粒子解析システムであって、
前記ソフトウェアは情報処理装置に搭載されており、
前記測定部は、
微小粒子が流れる流路内に励起光を照射する光源と、
前記微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサと、
を含み、
前記ソフトウェアは、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積、前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の内の最大値、および前記蛍光信号の画像に含まれる前記受光部から出力可能な最大の電荷値を示す前記蓄積電荷値の数の割合を示す飽和度、の少なくとも１つを含む、評価値を算出し、
前記評価値に基づいて、前記光源から照射される前記励起光の照射光量、および、前記二次元光電変換センサのアナログデジタル変換ゲイン、の少なくとも一方を制御する、
微小粒子解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、微小粒子解析装置、解析装置、解析プログラム、および微小粒子解析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞などの微小粒子から発せられた蛍光を用いて、微小粒子を解析する技術が知られている。例えば、微小粒子から発せられた蛍光を、光電子増倍管を用いてパルス波形として取得する。そして、パルス波形の面積、高さ、およびパルス幅を用いて、微小粒子を解析する技術が開示されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−５８３６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、蓄積された電荷を出力する二次元光電変換センサで蛍光を受光する場合、蛍光のパルス波形が得られない。パルス波形が得られないと、パルス波形の面積、高さ、およびパルス幅が得られない。このため、従来では、二次元光電変換センサから得られた蛍光信号を用いて、微小粒子の解析を行うことは困難であった。
【０００５】
そこで、本開示では、二次元光電変換センサから得られた蛍光信号を用いて、微小粒子の解析に用いる評価値を提供することができる、微小粒子解析装置、解析装置、解析プログラム、および解析システムを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本開示に係る一形態の微小粒子解析装置は、流路内に流れる微小粒子に励起光を照射する光源と、前記微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータを取得する二次元光電変換センサと、前記蛍光信号のデータに含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する算出部と、を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本開示の実施形態に係る微小粒子解析装置の一例を示す模式図である。
【図２】本開示の実施形態に係る二次元光電変換センサの一例を示す模式図である。
【図３Ａ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図３Ｂ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図４Ａ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図４Ｂ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図５Ａ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図５Ｂ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図６Ａ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図７Ａ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】本開示の実施形態に係る蛍光信号の一例を示す模式図である。
【図８Ａ】本開示の実施形態に係るスポット領域の連結処理の一例の説明図である。
【図８Ｂ】本開示の実施形態に係るスポット領域の連結処理の一例の説明図である。
【図８Ｃ】本開示の実施形態に係るスポット領域の連結処理の一例の説明図である。
【図９】本開示の実施形態に係る最大値と面積との関係を示す分布図である。
【図１０Ａ】本開示の実施形態に係る面積のヒストグラムの一例を示す模式図である。
【図１０Ｂ】本開示の実施形態に係るピークの平均値および標準偏差を示す図である。
【図１１】本開示の実施形態に係る情報処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図１２】本開示の実施形態に係る解析装置の機能を実現するコンピュータの一例を示すハードウェア構成図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、本開示の実施形態について図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下の各実施形態において、同一の部位には同一の符号を付与し、重複する説明を省略する。
【０００９】
図１は、本実施形態の微小粒子解析装置１の一例を示す模式図である。
【００１０】
微小粒子解析装置１は、解析装置１０と、測定部１２と、を備える。
【００１１】
測定部１２は、微小粒子から発せられた蛍光を受光し、蛍光信号を解析装置１０へ出力するシステムである。測定部１２、または測定部１２を含む微小粒子解析装置１は、例えば、フローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ：ＦＣＭ）に適用される。
【００１２】
微小粒子は、解析対象の粒子である。微小とは、１０００μｍ以下を示す。微小粒子は、例えば、無機粒子、微生物、細胞、リポソーム、血液中の赤血球、白血球、血小板、血管内皮細胞、および、上皮組織の微小細胞片、等である。
【００１３】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
【００１４】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。
【００１５】
さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００１６】
測定部１２は、流路システム１４と、光源１６と、二次元光電変換センサ２８と、を備える。さらに集光レンズ１８と、光学フィルタ２０と、２２と、光学フィルタ２４と、フォトダイオード２６を備えてもよい。
【００１７】
流路システム１４は、円筒状のフローセル１４Ａを備える。フローセル１４Ａの内側には、フローセル１４Ａの同軸上に円筒状のチューブ１４Ｂが配置されている。なお、流路システム１４は、フローセルに代えて、マイクロ流路を有するチップを用いる形態であってもよい。
【００１８】
フローセル１４Ａとチューブ１４Ｂとの間には、サンプル液とシース液が図中の矢印Ｚ方向に流されて、流路１４Ｃ内で合流する。微小粒子Ｍは、一列に配列された状態で、サンプル液の流れに沿って流路１４Ｃ内を流れる。
【００１９】
光源１６は、流路１４Ｃ内に流れる微小粒子Ｍに励起光Ｌ１を照射する。励起光Ｌ１は、解析対象の微小粒子Ｍが染色した蛍光を励起する波長領域の光である。
【００２０】
光源１６は、励起光Ｌ１を照射する光源であればよい。図１には、光源１６が、光源１６Ａと、光源１６Ｂと、を含む構成を一例として示した。光源１６Ａと光源１６Ｂとは、互いに異なる波長領域の励起光Ｌ１を照射する。例えば、光源１６Ａは、波長６３５ｎｍの励起光Ｌ１を照射する光源である。また、光源１６Ｂは、波長４８８ｎｍの励起光Ｌ１を照射する光源である。なお、光源１６を構成する光源の数は、２個に限定されない。また、光源１６から照射される励起光Ｌ１の波長は、上記に限定されない。また、光源１６Ａの光軸と光源１６Ｂの光軸は、同軸でもよいし、異軸でもよい。
【００２１】
光源１６から照射された励起光Ｌ１は、集光レンズ１８によって流路１４Ｃ内に集光される。このため、流路１４Ｃ内を通過する微小粒子Ｍに、励起光Ｌ１が照射される。
【００２２】
微小粒子Ｍが励起光Ｌ１を通過する部分は、インテロゲーションエリア、または、レーザーインターセプト、または光検出部と称される。
【００２３】
励起光Ｌ１が微小粒子Ｍに照射されると、微小粒子Ｍは、散乱光（Ｌ２および蛍光Ｌ３を発する。散乱光は、前方散乱光（ＦＳＣ：Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ  Ｌｉｇｈｔ）、側方散乱光、後方散乱光から少なくとも一つである。
【００２４】
前方散乱光Ｌ２は、光学フィルタ２０を介して、フォトダイオード２６で受光される。光学フィルタ２０は、前方散乱光Ｌ２を選択的に透過させる光学フィルタである。
【００２５】
フォトダイオード２６は、前方散乱光Ｌ２を受光し、ＦＳＣ信号を解析装置１０へ出力する。ＦＳＣ信号は、微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過したことを示す信号である。ここで、前方散乱光Ｌ２は、光量の大きい光である。このため、フォトダイオード２６は、前方散乱光Ｌ２の受光によって微小粒子Ｍの通過を検出し、ＦＳＣ信号を解析装置１０へ出力することができる。
【００２６】
一方、蛍光Ｌ３は、ダイクロイックミラー２２および光学フィルタ２４を介して、二次元光電変換センサ２８に到り、二次元光電変換センサ２８で受光される。なお、蛍光Ｌ３は、集光レンズによって平行光とされた後に、ダイクロイックミラー２２および光学フィルタ２４を介して、マルチモードの光ファイバーにより二次元光電変換センサ２８の受光面に到る。
【００２７】
なお、フローサイトメータにおける蛍光検出には、フィルタなどの波長選択素子を用いて不連続な波長域の光を複数選択し、各波長域の光の強度を計測する方法の他に、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測する方法もある。蛍光スペクトルの計測が可能なスペクトル型フローサイトメータでは、微小粒子から発せられる蛍光を、プリズム又はグレーティングなどの分光素子を用いて分光する。そして、分光された蛍光を、検出波長域が異なる複数の受光素子が配列された受光素子アレイを用いて検出する。受光素子アレイには、ＰＭＴ又はフォトダイオードなどの受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、あるいはＣＣＤ又はＣＭＯＳなどの２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが用いられている。
【００２８】
図１には、測定部１２が、複数の二次元光電変換センサ２８（二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄ）を備える形態を一例として示した。これらの複数の二次元光電変換センサ２８は、互いに異なる波長領域の蛍光Ｌ３を受光する。
【００２９】
複数の二次元光電変換センサ２８の各々の蛍光Ｌ３の入射方向の上流側には、ダイクロイックミラー２２および光学フィルタ２４が設けられている。
【００３０】
ダイクロイックミラー２２は、特定の波長領域の蛍光Ｌ３を反射し、該波長領域以外の波長の蛍光Ｌ３を透過する。光学フィルタ２４は、特定の波長領域の蛍光Ｌ３を透過する。
【００３１】
本実施形態では、測定部１２は、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄの各々に対応する、ダイクロイックミラー２２Ａ〜ダイクロイックミラー２２Ｄ、および、光学フィルタ２４Ａ〜光学フィルタ２４Ｄを備える。
【００３２】
微小粒子Ｍから発せられた蛍光Ｌ３は、波長領域ごとに、ダイクロイックミラー２２Ａ〜ダイクロイックミラー２２Ｄの各々によって反射され、光学フィルタ２４Ａ〜光学フィルタ２４Ｄの各々を透過することで、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄの各々に到る。
【００３３】
このため、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄは、互いに異なる波長領域の蛍光Ｌ３を受光する。なお、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄは、互いに異なる波長領域の蛍光Ｌ３を受光すればよい。このため、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄの各々に蛍光Ｌ３を受光させる光学系は、上記構成に限定されない。例えば、分光器を設けることで、二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄが、互いに異なる波長領域の蛍光Ｌ３を受光する構成としてもよい。
【００３４】
なお、微小粒子解析装置１に設けられる二次元光電変換センサ２８の数は、１個以上であればよく、４つに限定されない。
【００３５】
また、以下では、複数の二次元光電変換センサ２８（二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄ）を総称して説明する場合には、単に、二次元光電変換センサ２８と称して説明する。
【００３６】
二次元光電変換センサ２８は、微小粒子Ｍから発せられた蛍光Ｌ３を受光し、蛍光信号の画像を出力する。二次元光電変換センサ２８は、例えば、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサ、または、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）イメージセンサである。
【００３７】
図２は、二次元光電変換センサ２８の構成の一例を示す模式図である。図２には、一例として、ＣＭＯＳイメージセンサを示した。
【００３８】
二次元光電変換センサ２８は、複数の受光部３２が二次元平面である受光面３０に沿って二次元配列されたセンサである。また、二次元光電変換センサ２８は、電荷を蓄積し、蓄積された電荷に応じた蛍光信号の画像を出力する。なお、二次元配列とは、受光面３０における互いに直交する２方向に沿って複数の受光部３２が配列されていることを示す。
【００３９】
受光部３２は、フォトダイオードである。受光部３２は、受光した蛍光Ｌ３を電荷に変換して蓄積する。蓄積された電荷は、増幅器３４によって電圧に変換および増幅される。増幅された電圧は、スイッチ３６のオンオフの制御により、ラインごとに垂直信号線３８に転送される。垂直信号線３８に転送された電圧は、垂直信号線３８ごとに配置された列回路４０に一時的に保管される。列回路４０に保管された電圧は、スイッチ４２のオンオフの制御により、水平信号線４４へ送られ、Ａ／Ｄ（アナログデジタル）変換器４６によってアナログ信号からデジタル信号に変換されることで、蛍光信号の画像として出力される。
【００４０】
蛍光信号の画像は、二次元光電変換センサ２８に設けられた複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値を含む画像である。蓄積電荷値とは、蓄積された電荷値を示す。すなわち、蛍光信号の画像は、複数の受光部３２の各々で蓄積された電荷値を示す画像である。なお、少なくとも２以上の蓄積された電荷値を、蛍光信号のデータと称する。すなわち、「画像」ではないデータであっても、少なくとも２以上の電荷値を含むデータであれば、「蛍光信号のデータ」に相当する。このため、蛍光信号の画像は、蛍光信号のデータの一例に相当する。
【００４１】
なお、受光部３２が、１または複数の画素毎に設けられていると想定する。この場合、蛍光信号の画像は、複数の受光部３２の各々に対応する画素ごとに蓄積電荷値を規定した画像である。この場合、蓄積電荷値は、画素値に相当する。
【００４２】
図１に戻り説明を続ける。次に、解析装置１０について説明する。解析装置１０は、情報処理装置の一例である。解析装置１０は、蛍光信号を解析する。
【００４３】
解析装置１０は、フォトダイオード２６、二次元光電変換センサ２８（二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄ）、および光源１６と、データまたは信号を授受可能に接続されている。
【００４４】
解析装置１０は、ＦＳＣ信号取得部１０Ａと、蛍光信号取得部１０Ｂと、算出部１０Ｃと、解析部１０Ｄと、を備える。
【００４５】
ＦＳＣ信号取得部１０Ａ、蛍光信号取得部１０Ｂ、算出部１０Ｃ、および解析部１０Ｄの一部またはすべては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などの処理装置にプログラムを実行させること、すなわち、ソフトウェアにより実現してもよいし、ＩＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）などのハードウェアにより実現してもよいし、ソフトウェアおよびハードウェアを併用して実現してもよい。
【００４６】
ＦＳＣ信号取得部１０Ａは、フォトダイオード２６からＦＳＣ信号を取得する。ＦＳＣ信号取得部１０Ａは、ＦＳＣ信号を取得することで、微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過したことを検出する。
【００４７】
蛍光信号取得部１０Ｂは、二次元光電変換センサ２８から蛍光信号を取得する。ＦＳＣ信号取得部１０Ａによって微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過したことが検出されると、蛍光信号取得部１０Ｂは、スイッチ制御信号を二次元光電変換センサ２８へ出力する。スイッチ制御信号は、二次元光電変換センサ２８のスイッチ３６およびスイッチ４２を制御することで、複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値を読出すための信号である。例えば、スイッチ制御信号は、読出開始を示す立下りと蓄積開始を示す立ち上がりからなるパルス信号で表される。二次元光電変換センサ２８は、蛍光信号取得部１０Ｂからスイッチ制御信号を受信すると、複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値である蛍光信号の画像を、解析装置１０へ出力する。
【００４８】
このため、蛍光信号の画像は、微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過する期間に、受光部３２の各々に蓄積された蓄積電荷値を示す画像となる。
【００４９】
蛍光信号取得部１０Ｂは、微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過したことが検出されるごとに、複数の二次元光電変換センサ２８（二次元光電変換センサ２８Ａ〜二次元光電変換センサ２８Ｄ）の各々から、異なる波長の蛍光信号の画像を取得する。
【００５０】
なお、以下では、説明を簡略化するために、１つの二次元光電変換センサ２８（例えば、二次元光電変換センサ２８Ａ）から、蛍光信号の画像を取得する形態を一例として説明する。なお、複数の二次元光電変換センサ２８の各々から蛍光信号の画像を取得する場合についても、同様の処理を実行すればよい。
【００５１】
算出部１０Ｃは、蛍光信号のデータを用いて評価値を算出する。上述したように、本実施形態では、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像を用いて評価値を算出する。
【００５２】
評価値は、面積、最大値、飽和度、および幅の少なくとも１つを含む。
【００５３】
面積は、蛍光信号の画像に含まれる複数の蓄積電荷値の合計値を示す。面積は、微小粒子Ｍの種類またはサイズを導出するための値として用いられる。算出部１０Ｃは、蛍光信号である蛍光信号の画像を構成する画素（受光部３２）ごとの蓄積電荷値を読取り、これらの複数の蓄積電荷値の合計値を算出する。算出部１０Ｃは、算出した合計値を、面積として算出する。
【００５４】
図３Ａおよび図３Ｂは、蛍光信号の画像５０の一例を示す模式図である。図３Ａおよび図３Ｂは、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製  ８  Ｐｅａｋ  Ｒａｉｎｂｏｗビーズを流路システム１４に流し、フレームレート４８０ｆｐｓの二次元光電変換センサ２８で取得した蛍光信号の画像５０の一例である。また、後述する図４Ａ〜図７Ｂも同様の条件で取得した蛍光信号の画像５０の一例である（詳細後述）。
【００５５】
図３Ａは、蛍光信号の画像５０の一例を示す模式図である。図３Ａは、３２６×２１６ピクセルの画像全体における、中央の３６×３６ピクセル部分を拡大して示した画像である。図３Ａに示す例では、微小粒子Ｍから発せられた蛍光Ｌ３は、直径３０ピクセルの円状に受光面３０に入射している。図３Ｂは、蛍光信号の画像５０を横断するライン上に沿って配列された画素の各々の蓄積電荷値を示す線図である。図３Ｂの横軸は、該ライン上における位置を示し、縦軸は、蓄積電荷値を示す。
【００５６】
算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０を構成する画素の各々の蓄積電荷値の合計値を算出することで、面積を算出する。
【００５７】
なお、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の蓄積電荷値の各々から、予め定めたオフセット値を減算した減算結果の合計値を、面積として算出してもよい。
【００５８】
オフセット値は、二次元光電変換センサ２８のオフセット電圧の値である。詳細には、オフセット値は、二次元光電変換センサ２８に蛍光Ｌ３が入射していないときに、二次元光電変換センサ２８の受光部３２から出力される蓄積電荷値である。オフセット値は、例えば、２４０であるが、この値に限定されない。算出部１０Ｃは、二次元光電変換センサ２８のオフセット電圧の値を予め取得し、面積の算出に用いればよい。
【００５９】
また、算出部１０Ｃは、更に、上記減算結果に予め定めた換算ゲインを乗算した乗算結果の合計値を、面積として算出してもよい。すなわち、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０を構成する複数の画素の各々の蓄積電荷値から上記オフセット値を減算した後に、減算結果に上記換算ゲインを乗算する。そして、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の画素の各々の、この乗算結果の合計値を、面積として算出する。
【００６０】
なお、換算ゲインは、二次元光電変換センサ２８に応じて予め設定すればよい。換算ゲインは、１未満の値、および、１以上の値、の何れであってもよい。
【００６１】
例えば、二次元光電変換センサ２８のＡ／Ｄ変換器４６が、１２ビットのＡ／Ｄ変換器であると想定する。そして、二次元光電変換センサ２８によって１２ビットでＡ／Ｄ変換された蓄積電荷値（ＬＳＢ）が、０．６個の光電子に相当すると想定する。この場合、換算ゲインは、０．６［ｅ−／ＬＳＢ］とすればよい。なお、換算ゲインの単位を［ｅ−／ＬＳＢ］とした場合、面積の単位は［ｅ−］となる。なお、換算ゲインの単位、および、面積の単位は、解析内容に応じて定めればよく、この単位に限定されない。
【００６２】
なお、オフセット値の減算や換算ゲインの乗算は、解析部１０Ｄ側で実行してもよい。
【００６３】
次に、最大値の算出について説明する。算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の蓄積電荷値の内の最大値を算出する。算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の蓄積電荷値を読取り、最も大きい値の蓄積電荷値を、最大値として算出すればよい。
【００６４】
次に、飽和度の算出について説明する。算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０から飽和度を算出する。飽和度は、蛍光信号の画像５０に含まれる、受光部３２から出力可能な最大の電荷値を示す蓄積電荷値の数の割合を示す。受光部３２から出力可能な最大の蓄積電荷値は、飽和値と称される場合もある。言い換えると、飽和度は、蛍光信号の画像５０を構成する画素の総数（全画素数）に対する、飽和値と一致する蓄積電荷値を示す画素の数、の割合を示す。
【００６５】
受光部３２の飽和値は、二次元光電変換センサ２８によって異なる。算出部１０Ｃは、予め二次元光電変換センサ２８から飽和値を示す情報を取得し、飽和度の算出に用いればよい。
【００６６】
例えば、二次元光電変換センサ２８のＡ／Ｄ変換器４６が、１２ビットのＡ／Ｄ変換器であると想定する。この場合、二次元光電変換センサ２８のダイナミック・レンジは、０〜４０９５であり、二次元光電変換センサ２８の飽和値は、４０９５となる。
【００６７】
なお、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれるスポット領域Ｓごとに、評価値を算出してもよい。すなわち、算出部１０Ｃは、１つの蛍光信号の画像５０に含まれるスポット領域Ｓごとに、面積、最大値、および飽和度を算出してもよい。
【００６８】
スポット領域Ｓとは、蛍光信号の画像５０における、１または複数の蛍光受光領域である。詳細には、スポット領域Ｓは、蛍光信号の画像５０における、微小粒子Ｍから発せられた蛍光Ｌ３の受光領域である。
【００６９】
蛍光信号の画像５０に含まれるスポット領域Ｓは、１つの微小粒子Ｍから発せられた蛍光Ｌ３の受光領域である。図１における４つのＬ３に相当する複数の蛍光信号を、一つの二次元光電変換センサで取得するように構成することも可能である。この場合には、蛍光信号の画像５０には、複数のスポット領域Ｓが含まれることとなる。
【００７０】
このため、算出部１０Ｃは、スポット領域Ｓごとに、面積、最大値、および飽和度を算出することが好ましい。
【００７１】
なお、蛍光信号の画像５０におけるスポット領域Ｓの位置は、固定である。複数の蛍光信号をひとつ二次元光電変換センサに入射する際に、それぞれの蛍光信号が重なることが無いように配置されるからである。
【００７２】
このため、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０における予め定めた領域をスポット領域Ｓとして特定し、評価値の算出に用いればよい。なお、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０における、隣接する画素の蓄積電荷値の差が閾値以上の箇所をスポット領域Ｓのエッジとして特定し、該エッジ内の領域を、スポット領域Ｓとして特定してもよい。また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０における、蛍光Ｌ３を受光したとみなす最低の蓄積電荷値以上の領域を、スポット領域Ｓとして特定してもよい。
【００７３】
次に、幅の算出について説明する。算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０のスポット領域Ｓの中心Ｃを通る直線Ａに沿って配列された複数の画素の内、第１の閾値以上の蓄積電荷値を示す画素の数を、幅として算出する。スポット領域Ｓの中心Ｃとは、スポット領域Ｓの中心位置を示す。
【００７４】
第１の閾値には、蛍光Ｌ３を受光したと判別するための蓄積電荷値の最低値を予め定めればよい。例えば、第１の閾値は、蓄積電荷値“４００”であるが、この値に限定されない。すなわち、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる連続した閾値以上の画素の最大長を、幅として算出する（図３Ａ、図３Ｂ中、幅Ｗ参照）。
【００７５】
なお、幅の算出時に用いる直線Ａの延伸方向は、スポット領域Ｓの中心Ｃを通り、且つ、蛍光信号の画像５０の読出方向に一致する方向であることが好ましい。
【００７６】
図２を用いて説明したように、蛍光信号の画像５０は、複数の垂直信号線３８の配列方向（水平信号線４４の延伸方向）に、複数の受光部３２の蓄積電荷値を順次読取ることで得られたものである。このため、読出方向である走査方向は、複数の垂直信号線３８の配列方向、すなわち、水平信号線４４の延伸方向に沿った読出方向に一致する。
【００７７】
このようにして、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０を取得する毎に、評価値を算出する。
【００７８】
図４Ａ〜図６Ｂには、蛍光信号の画像５０の別の例を示した。図３Ａと同様に、図４Ａ、図５Ａ、および図６Ａは、３２６×２１６ピクセルの画像全体における、中央の３６×３６ピクセル部分を拡大して示した画像である。図４Ｂ、図５Ｂ、および図６Ｂは、蛍光信号の画像５０を横断するライン上に沿って配列された画素の各々の蓄積電荷値を示す線図である。図４Ｂ、図５Ｂ、および図６Ｂの横軸は、該ライン上における位置を示し、縦軸は、蓄積電荷値を示す。
【００７９】
図４Ａおよび図４Ｂは、明るい蛍光信号の画像５０の一例を示す模式図である。図４Ａおよび図４Ｂには、面積“５．４２×１０５”、最大値“２１９２”、幅“２８”、飽和度“０”％の蛍光信号の画像５０の一例を示した。なお、上記最大値“２１９２”は、例えば、二次元光電変換センサ２８のダイナミック・レンジ（例えば０〜４０９５）の約１／２の値である。
【００８０】
図５Ａおよび図５Ｂは、暗い蛍光信号の画像５０の一例を示す模式図である。図５Ａおよび図５Ｂには、面積“２．６４×１０４”、最大値“３５６”、幅“０”、飽和度“０”％の蛍光信号の画像５０の一例を示した。なお、上記最大値“３５６”は、二次元光電変換センサ２８のダイナミック・レンジ（例えば０〜４０９５）の約１／１０の値である。なお、幅は、第１の閾値の一例である蓄積電荷値“４００”を超える蓄積電荷値が含まれなかったため、“０”であった。
【００８１】
図６Ａおよび図６Ｂは、飽和度の高い蛍光信号の一例を示す模式図である。図６Ａおよび図６Ｂには、面積“９．８８×１０５”、最大値“４０９５”、飽和度“１０５／（３２６×２１６）”％の蛍光信号の画像５０の一例を示した。
【００８２】
なお、図４Ａおよび図４Ｂと、図５Ａおよび図５Ｂと、図６Ａおよび図６Ｂとは、互いに異なる種類の微小粒子Ｍの蛍光信号の画像５０の一例である。
【００８３】
図４Ａ〜図６Ｂに示すように、微小粒子Ｍの種類によって、蛍光信号の画像５０に含まれる蓄積電荷値の範囲およびバラツキが異なる。このため、算出部１０Ｃが、蛍光信号の画像５０を用いて評価値を算出することで、微小粒子Ｍの各々の評価値を算出することができる。
【００８４】
ここで、蛍光信号の画像５０に含まれるスポット領域Ｓの一部に欠けが発生している場合がある。図７Ａおよび図７Ｂは、欠けの発生したスポット領域Ｓを含む蛍光信号の一例を示す模式図である。
【００８５】
上述したように、蛍光信号の画像５０は、微小粒子Ｍがインテロゲーションポイントを通過する毎に取得された信号である。上述したように、微小粒子Ｍが通過するタイミングに合わせて画像を取得するようなシステムであればこのような断片画像は生じないはずであるが、一定の周期で画像を取得するような二次元光電変換センサであれば、このような断片画像が発生し、２つの画像にまたがって蛍光信号が取得されることがある。
【００８６】
そこで、算出部１０Ｃは、算出した上記幅が第２の閾値以下の場合、スポット領域Ｓに欠けが発生していると判断する。第２の閾値には、１つの微小粒子Ｍに対応するスポット領域Ｓと判断するための、幅の下限値を定めればよい。
【００８７】
算出部１０Ｃは、算出した上記幅が第２の閾値以下であると判断すると、スポット領域Ｓの連結処理を実行する。詳細には、算出部１０Ｃは、該幅の算出に用いたスポット領域Ｓと、該幅の算出に用いた蛍光信号の画像５０に対して時系列に連続して取得した蛍光信号の画像５０に含まれる、幅が第２の閾値以下のスポット領域Ｓと、を連結した連結スポット領域を生成する。
【００８８】
図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃは、算出部１０Ｃによるスポット領域Ｓの連結処理の一例の説明図である。
【００８９】
例えば、蛍光信号取得部１０Ｂが、幅が第２の閾値以下のスポット領域Ｓ１を含む蛍光信号の画像５０Ｅ１と、幅が第２の閾値以下のスポット領域Ｓ２を含む蛍光信号の画像５０Ｅ２と、を時系順に連続して取得したと想定する（図８Ａ、図８Ｂ参照）。また、これらのスポット領域Ｓの幅の合計値が、欠けの無いスポット領域Ｓの幅の基準値（例えば、幅“２８”）以上となると想定する。この場合、算出部１０Ｃは、スポット領域Ｓ１とスポット領域Ｓ２とを上記走査方向に連結することで、連結スポット領域Ｓ３を生成する。連結スポット領域Ｓ３の生成には、公知の画像合成技術を用いればよい。
【００９０】
そして、算出部１０Ｃは、幅が第２の閾値未満のスポット領域Ｓ（スポット領域Ｓ１、スポット領域Ｓ２）に代えて、連結した連結スポット領域Ｓ３を用いて、面積、最大値、飽和度、および幅の少なくとも１つを含む評価値を、再算出すればよい。
【００９１】
なお、算出部１０Ｃは、幅が第２の閾値未満のスポット領域Ｓを解析対象外としてもよい。この場合、算出部１０Ｃは、該スポット領域Ｓの連結処理を実行せず、該スポット領域Ｓの評価値を後述する解析部１０Ｄへ出力しない構成とすればよい。
【００９２】
図１に戻り説明を続ける。
【００９３】
解析部１０Ｄは、評価値に基づいて、微小粒子Ｍを解析する。
【００９４】
詳細には、解析部１０Ｄは、評価値に含まれる面積を用いて、微小粒子Ｍの種類およびサイズの少なくとも一方を解析する。
【００９５】
例えば、算出部１０Ｃが、スポット領域Ｓごと（すなわち蛍光の種類ごと）に評価値を算出すると想定する。この場合、算出部１０Ｃは、複数の蛍光の各々の面積と、微小粒子Ｍの種類およびサイズと、の相関を予め特定する。そして、算出部１０Ｃは、算出した評価値と一致または類似する相関を示す、微小粒子Ｍの種類およびサイズを特定することで、微小粒子Ｍの種類およびサイズを解析すればよい。
【００９６】
なお、上記では、算出部１０Ｃが、評価値に含まれる幅に基づいてスポット領域Ｓの欠けを検出する例を説明した。しかし、解析部１０Ｄが、評価値に含まれる幅に基づいて、スポット領域Ｓの欠けを検出してもよい。この場合、解析部１０Ｄが、算出部１０Ｃと同様にして、スポット領域Ｓの欠けを検出し、結合スポット領域の生成および評価値の再算出を実行すればよい。
【００９７】
また、解析部１０Ｄは、評価値に基づいて、励起光Ｌ１の照射光量、および、二次元光電変換センサ２８のアナログデジタル変換ゲイン、の少なくとも一方を制御する。
【００９８】
詳細には、解析部１０Ｄは、評価値に含まれる、面積、最大値、および飽和度を用いて、光源１６および二次元光電変換センサ２８の少なくとも一方を制御する。
【００９９】
具体的には、解析部１０Ｄは、複数の微小粒子Ｍの各々の評価値を用いて、最大値と面積との関係を示す分布図を生成する。
【０１００】
図９は、最大値と面積との関係を示す分布図である。図９中、横軸は最大値を示し、縦軸は面積を示す。解析部１０Ｄは、複数の評価値の各々を、分布図における、評価値に示される最大値および面積を示す位置にプロットする。
【０１０１】
すると、図９に示すように、複数の評価値を示す複数のプロットは、最大値と面積との相関によって表される位置に応じて、複数の群（例えば、群Ｅ１〜群Ｅ８）に分類される。
【０１０２】
これらの群Ｅ１〜群Ｅ８の各々に属するプロットの内、最大値および面積の双方が第３の閾値以下の範囲内に位置する群Ｅ１に属するプロットは、スポット領域Ｓを含まない蛍光信号の画像５０の評価値を示すプロットである。第３の閾値には、蛍光Ｌ３の受光領域であるスポット領域Ｓを含まない蛍光信号の画像５０である、と判断するための下限値を予め定めればよい。
【０１０３】
図９に示すように、複数の評価値の各々に含まれる最大値と面積との関係には、特有の相関が示される。図９に示す例では、面積と最大値との関係は、線形性を示す。しかし、この線形性を示す相関から外れた位置にも、評価値を示すプロットが存在する場合がある。
【０１０４】
このため、解析部１０Ｄは、複数の評価値の内、最大値および面積の少なくとも一方が予め定めた範囲内の値を示す評価値を解析対象とし、該範囲外の値を示す評価値を解析対象外とすることが好ましい。
【０１０５】
例えば、解析部１０Ｄは、線形性を示す群Ｅ１〜群Ｅ８に属するプロットを含む群Ｅ１０内の評価値を、解析対象とする。そして、解析部１０Ｄは、この群Ｅ１０以外の範囲に位置する評価値（例えば、群Ｅ１１、群Ｅ１２）を、解析対象外とする。このため、解析部１０Ｄは、解析精度の向上を図ることができる。
【０１０６】
そして、解析部１０Ｄは、解析対象とした複数の評価値を用いて、面積のヒストグラムと、ヒストグラムよって表されるピークの標準偏差と、を算出する。
【０１０７】
図１０Ａは、面積のヒストグラムの一例を示す模式図である。図１０Ａ中、横軸は面積を示し、縦軸は評価値のカウント値を示す。
【０１０８】
図１０Ａ中、ピークＰ１〜ピークＰ８は、それぞれ、図９中の評価値の群Ｅ１〜群Ｅ８の各々に対応する。図１０Ｂは、各ピークの平均値および標準偏差（ｒＳＤ）を示す図である。
【０１０９】
そして、解析部１０Ｄは、解析対象とした複数の評価値の、最大値と面積との相関、面積のヒストグラム、およびピークの標準偏差を用いて、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタル変換ゲインの少なくとも一方を制御する。
【０１１０】
ここで、評価値に示される最大値が小さいほど、評価値に示される面積のＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）が悪化する。ノイズ低減を図るために、評価値に含まれる最大値を大きくするためには、励起光Ｌ１の照射光量の増加、および、二次元光電変換センサ２８のアナログデジタルゲインの増加、の少なくとも一方を行う必要がある。
【０１１１】
しかし、評価値に含まれる最大値が大きくなるほど、飽和度が高くなる。飽和度が高くなると、面積と最大値との相関を示す線形性が損なわれる。具体的には、図９に示す分布図の場合、飽和度が最も高い評価値を示すプロットの群である群Ｅ８に属するプロットの数が多くなり、線形性が損なわれる。
【０１１２】
評価値の飽和度を低下させるためには、励起光Ｌ１の照射光量の低下、および、二次元光電変換センサ２８のアナログデジタルゲインの低下、の少なくとも一方を行う必要がある。
【０１１３】
但し、励起光Ｌ１の照射光量が低下しすぎる、または、フォトダイオード２６のアナログデジタルゲインが低下しすぎると、ノイズの増加や、スポット領域Ｓを含まない蛍光信号の画像５０の増加などが発生する。
【０１１４】
また、評価値の群Ｅ１〜群Ｅ８の各々に対応するピークＰ１〜ピークＰ８の各々の標準偏差がより大きいほど、蛍光信号の画像５０に含まれるＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）が低くなる。
【０１１５】
このため、これら標準偏差がより小さい値となるように、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタルゲイン、の少なくとも一方を制御することが好ましい。
【０１１６】
そこで、解析部１０Ｄは、上記条件の少なくとも１つを満たす評価値が得られるように、算出部１０Ｃから取得した評価値に基づいて、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタルゲイン、の少なくとも一方を制御する。上記条件の少なくとも一つとは、評価値に含まれる最大値の増加、評価値に含まれる飽和度の低下、スポット領域Ｓを含まない蛍光信号の画像５０から算出された評価値とスポット領域Ｓを含む蛍光信号の画像５０から算出された評価値との差の増大、面積と最大値との相関の線形性の維持、および、評価値に含まれる面積のヒストグラムのピークの標準偏差の減少、の少なくとも一つである。
【０１１７】
なお、解析部１０Ｄは、上記条件の２以上を満たす評価値が得られるように、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタルゲイン、の少なくとも一方を制御することが好ましい。
【０１１８】
なお、解析部１０Ｄは、二次元光電変換センサ２８が増幅器を含む構成の場合、アナログデジタルゲインと、増幅ゲインと、の少なくとも一方を制御してもよい。
【０１１９】
解析部１０Ｄは、上記条件の少なくとも１つを満たすように、光源１６および二次元光電変換センサ２８の少なくとも一方を制御するための測定条件制御信号を算出する。測定条件制御信号は、照射光量の制御値、アナログデジタルゲインの制御値、の少なくとも一方を含む。
【０１２０】
そして、解析部１０Ｄは、生成した測定条件制御信号を光源１６および二次元光電変換センサ２８の少なくとも一方へ出力する。
【０１２１】
光源１６は、受付けた測定条件制御信号に示される照射光量の制御値となるように、励起光Ｌ１の照射光量を変更する。また、二次元光電変換センサ２８は、受付けた測定条件制御信号に示されるアナログデジタルゲインの制御値となるように、Ａ／Ｄ変換器４６のアナログデジタルゲインを変更する。
【０１２２】
このため、解析部１０Ｄは、より高精度な微小粒子Ｍの解析結果を導出するための評価値が得られるように、測定部１２の測定条件を制御することができる。
【０１２３】
次に、解析装置１０が実行する情報処理の流れの一例を説明する。
【０１２４】
図１１は、情報処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【０１２５】
まず、ＦＳＣ信号取得部１０Ａが、ＦＳＣ信号をフォトダイオード２６から取得したか否かを判断する（ステップＳ１００）。
【０１２６】
ＦＳＣ信号取得部１０Ａは、ＦＳＣ信号を取得したと判断するまで、否定判断を繰返す（ステップＳ１００：Ｎｏ）。ＦＳＣ信号取得部１０ＡがＦＳＣ信号を取得したと判断すると（ステップＳ１００：Ｙｅｓ）、ステップＳ１０２へ進む。
【０１２７】
ステップＳ１０２では、蛍光信号取得部１０Ｂが蛍光信号の画像５０を二次元光電変換センサ２８から取得する（ステップＳ１０２）。
【０１２８】
算出部１０Ｃは、ステップＳ１０２で取得した蛍光信号の画像５０から、評価値を算出する（ステップＳ１０４）。上述したように、本実施形態では、算出部１０Ｃは、蛍光信号から、面積、最大値、飽和度、および幅の少なくとも１つを含む評価値を算出する。
【０１２９】
次に、算出部１０Ｃは、ステップＳ１０６で算出した評価値に含まれる幅が、第２の閾値以下であるか否かを判断する（ステップＳ１０６）。ステップＳ１０６で否定判断すると（ステップＳ１０６：Ｎｏ）、後述するステップＳ１１２へ進む。
【０１３０】
一方、幅が第２の閾値以下であると判断した場合（ステップＳ１０６：Ｙｅｓ）、算出部１０Ｃは、連続する２つの蛍光信号の画像のスポット領域Ｓを連結した連結スポット領域を生成する（ステップＳ１０８）。
【０１３１】
そして、算出部１０Ｃは、ステップＳ１０８で生成した連結スポット領域から、ステップＳ１０４と同様にして評価値を再算出する（ステップＳ１１０）。そして、ステップＳ１１２へ進む。
【０１３２】
ステップＳ１１２では、解析部１０Ｄが、微小粒子Ｍの解析を開始するか否かを判断する（ステップＳ１１２）。例えば、解析部１０Ｄは、所定時間が経過した場合、所定数の評価値が得られた場合、ユーザの操作指示などによって解析開始を示す信号が入力された場合、または、算出部１０Ｃから評価値を受付けた場合に、解析を開始すると判断する。
【０１３３】
ステップＳ１１２で否定判断すると（ステップＳ１１２：Ｎｏ）、上記ステップＳ１１０へ戻る。一方、ステップＳ１１２で肯定判断すると（ステップＳ１１２：Ｙｅｓ）、ステップＳ１１４へ進む。
【０１３４】
解析部１０Ｄは、解析対象の評価値を特定する（ステップＳ１１４）。解析部１０Ｄは、上記ステップＳ１００〜ステップＳ１１０の処理が繰り返されることによって得られた、複数の評価値の内、解析対象の評価値を特定する。上述したように、解析部１０Ｄは、最大値と面積との関係を示す分布図を生成し（図９参照）、最大値および面積の少なくとも一方が予め定めた範囲内の評価値を解析対象として特定する。
【０１３５】
次に、解析部１０Ｄは、解析対象とした評価値に含まれる面積を用いて、微小粒子Ｍの種類およびサイズの少なくとも一方を解析する（ステップＳ１１６）。
【０１３６】
次に、解析部１０Ｄは、解析対象とした評価値に含まれる、面積、最大値、および飽和度を用いて、光源１６および二次元光電変換センサ２８の少なくとも一方を制御するための測定条件制御信号を生成する（ステップＳ１１８）。そして、解析部１０Ｄは、生成した測定条件制御信号を、光源１６および二次元光電変換センサ２８の少なくとも一方へ出力する（ステップＳ１２０）。
【０１３７】
ステップＳ１２０の処理によって、光源１６から照射される励起光Ｌ１の光量、および、二次元光電変換センサ２８のデジタルアナログ変換ゲイン、の少なくとも一方が、より高精度な評価値を導出するための蛍光信号の画像５０が得られるように、制御される。
【０１３８】
次に、解析部１０Ｄは、処理を終了するか否かを判断する（ステップＳ１２２）。例えば、解析部１０Ｄは、ユーザによる操作指示などによって、終了を示す信号を受付けたか否かを判別することで、ステップＳ１２２の判断を行う。ステップＳ１２２で否定判断すると（ステップＳ１２２：Ｎｏ）、上記ステップＳ１００へ戻る。ステップＳ１２２で肯定判断すると（ステップＳ１２２：Ｙｅｓ）、本ルーチンを終了する。
【０１３９】
以上説明したように、本実施形態の微小粒子解析装置１は、光源１６と、二次元光電変換センサ２８と、算出部１０Ｃと、を備える。光源１６は、流路１４Ｃ内に流れる微小粒子Ｍに励起光Ｌ１を照射する。二次元光電変換センサ２８は、微小粒子Ｍから発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部３２を含む受光面３０で受光し、複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータを取得する。算出部１０Ｃは、蛍光信号のデータに含まれる、複数の蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する。
【０１４０】
このように、本実施形態の微小粒子解析装置１は、蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータから、複数の蓄積電荷値の合計値である面積を含む評価値を算出する。
【０１４１】
ここで、従来では、微小粒子から発せられた蛍光を示す信号を、光電子増倍管を用いてパルス波形として取得していた。そして、従来では、パルス波形の面積、高さ、およびパルス幅を用いて、微小粒子を解析していた。しかし、光電子増倍管に代えて、ＣＣＤまたはＣＭＯＳなどの蓄積した電荷を出力するセンサを用いる場合、パルス波形が得られないことから、微小粒子の解析に用いる評価値を得る事が出来なかった。
【０１４２】
一方、本実施形態の微小粒子解析装置１は、複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータを取得する二次元光電変換センサ２８を用いる。そして、微小粒子解析装置１は、二次元光電変換センサ２８から出力された蛍光信号のデータに含まれる蓄積電荷値の合計値を、評価値に用いる面積として算出する。
【０１４３】
従って、本実施形態の微小粒子解析装置１は、二次元光電変換センサ２８から得られた蛍光信号を用いて、微小粒子Ｍの解析に用いる評価値を提供することができる。
【０１４４】
また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の蓄積電荷値の各々から予め定めたオフセット値を減算した減算結果の合計値を、面積として算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、高精度に微小粒子Ｍを解析するための面積を、評価値として提供することができる。
【０１４５】
また、算出部１０Ｃは、上記減算結果に予め定めた換算ゲインを乗算した乗算結果の合計値を、面積として算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、更に高精度に微小粒子Ｍを解析するための面積を、評価値として提供することができる。
【０１４６】
また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像に含まれる複数の蓄積電荷値の内の最大値を更に含む、評価値を算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタル変換ゲインなどの測定条件の調整に用いる事の可能な評価値を提供することができる。
【０１４７】
また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる、受光部３２から出力可能な最大の電荷値を示す蓄積電荷値の数の割合を示す飽和度を更に含む、評価値を算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、励起光Ｌ１の照射光量および二次元光電変換センサ２８のアナログデジタル変換ゲインなどの測定条件の調整に用いる事の可能な評価値を提供することができる。
【０１４８】
また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる、複数の蛍光受光領域であるスポット領域Ｓごとに、評価値を算出する。１つの蛍光信号の画像５０に、複数の蛍光のスポット領域Ｓが含まれる場合がある。このため、スポット領域Ｓごとに評価値を算出することで、微小粒子解析装置１は、精度の高い評価値を提供することができる。
【０１４９】
また、算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれるスポット領域Ｓの中心Ｃを通る直線Ａに沿って配列された複数の画素の内、第１の閾値以上の蓄積電荷値を示す画素の数である幅を更に含む、評価値を算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、スポット領域Ｓの欠けの判断に用いる事の可能な評価値を提供することができる。
【０１５０】
また、算出部１０Ｃは、幅が第２の閾値以下の場合、該幅の算出に用いたスポット領域Ｓと、該幅の算出に用いた蛍光信号に対して時系列に連続して取得した蛍光信号の画像５０に含まれる幅が第２の閾値以下のスポット領域と、を連結した連結スポット領域に基づいて、評価値を再算出する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、スポット領域Ｓに欠けが生じていた場合であっても、精度良く評価値を算出することができる。
【０１５１】
解析部１０Ｄは、評価値に基づいて、微小粒子Ｍの種類およびサイズの少なくとも一方を解析する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、二次元光電変換センサ２８から得られた蛍光信号の画像５０を用いて、微小粒子Ｍの種類および微小粒子Ｍのサイズの少なくとも一方を解析することができる。
【０１５２】
また、解析部１０Ｄは、評価値に基づいて、励起光Ｌ１の照射光量、および、二次元光電変換センサ２８のアナログデジタル変換ゲインの少なくとも一方を制御する。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、二次元光電変換センサ２８から得られた蛍光信号の画像５０を用いて、微小粒子Ｍの測定時の測定条件を制御することができる。
【０１５３】
また、解析部１０Ｄは、複数の評価値の内、最大値および面積の少なくとも一方が予め定めた範囲内の評価値を解析対象とする。このため、本実施形態の微小粒子解析装置１は、精度良く微小粒子Ｍを解析、および、精度良く微小粒子Ｍの測定時の測定条件の制御、を行うことができる。
【０１５４】
また、本実施形態の解析装置１０は、蛍光信号取得部１０Ｂと、算出部１０Ｃと、解析部１０Ｄと、を備える。算出部１０Ｃは、微小粒子Ｍから発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部３２を含む受光面３０で受光し、複数の受光部３２の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像５０を出力する二次元光電変換センサ２８から、蛍光信号を取得する。算出部１０Ｃは、蛍光信号の画像５０に含まれる複数の蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する。解析部１０Ｄは、評価値に基づいて、微小粒子Ｍの種類およびサイズの少なくとも一方を解析する。
【０１５５】
従って、本実施形態の解析装置１０は、二次元光電変換センサ２８から得られた蛍光信号の画像５０を用いて、微小粒子Ｍを解析することができる。
【０１５６】
［変形例］
なお、上記実施形態では、解析装置１０が、ＦＳＣ信号取得部１０Ａ、蛍光信号取得部１０Ｂ、算出部１０Ｃ、および解析部１０Ｄを備えた構成である場合を一例として説明した。
【０１５７】
しかし、解析装置１０は、ＦＳＣ信号取得部１０Ａ、蛍光信号取得部１０Ｂ、算出部１０Ｃ、および解析部１０Ｄの少なくとも一つを、別体として構成してもよい。例えば、ＦＳＣ信号取得部１０Ａ、蛍光信号取得部１０Ｂ、および算出部１０Ｃを１つの装置として構成し、解析部１０Ｄを別の装置として構成してもよい。この場合、解析部１０Ｄを含む装置は、算出部１０Ｃを含む装置から評価値を取得し、微小粒子Ｍの解析に用いればよい。
【０１５８】
なお、上記には、本開示の実施形態および変形例を説明したが、上述した実施形態および変形例に係る処理は、上記実施形態および変形例以外にも種々の異なる形態にて実施されてよい。また、上述してきた実施形態および変形例は、処理内容を矛盾させない範囲で適宜組み合わせることが可能である。
【０１５９】
また、本明細書に記載された効果はあくまで例示であって限定されるものでは無く、また他の効果があってもよい。
【０１６０】
（ハードウェア構成）
図１２は、上記実施形態および変形例に係る解析装置１０の機能を実現するコンピュータ１０００の一例を示すハードウェア構成図である。
【０１６１】
コンピュータ１０００は、ＣＰＵ１１００、ＲＡＭ１２００、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）１３００、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ  Ｄｉｓｋ  Ｄｒｉｖｅ）１４００、通信インターフェース１５００、及び入出力インターフェース１６００を有する。コンピュータ１０００の各部は、バス１０５０によって接続される。
【０１６２】
ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００又はＨＤＤ１４００に格納されたプログラムに基づいて動作し、各部の制御を行う。例えば、ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００又はＨＤＤ１４００に格納されたプログラムをＲＡＭ１２００に展開し、各種プログラムに対応した処理を実行する。
【０１６３】
ＲＯＭ１３００は、コンピュータ１０００の起動時にＣＰＵ１１００によって実行されるＢＩＯＳ（Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｐｕｔ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）等のブートプログラムや、コンピュータ１０００のハードウェアに依存するプログラム等を格納する。
【０１６４】
ＨＤＤ１４００は、ＣＰＵ１１００によって実行されるプログラム、及び、かかるプログラムによって使用されるデータ等を非一時的に記録する、コンピュータが読み取り可能な記録媒体である。具体的には、ＨＤＤ１４００は、プログラムデータ１４５０の一例である本開示に係る画像処理プログラムを記録する記録媒体である。
【０１６５】
通信インターフェース１５００は、コンピュータ１０００が外部ネットワーク１５５０（例えばインターネット）と接続するためのインターフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、通信インターフェース１５００を介して、他の機器からデータを受信したり、ＣＰＵ１１００が生成したデータを他の機器へ送信する。
【０１６６】
入出力インターフェース１６００は、入出力デバイス１６５０とコンピュータ１０００とを接続するためのインターフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、入出力インターフェース１６００を介して、キーボードやマウス等の入力デバイスからデータを受信する。また、ＣＰＵ１１００は、入出力インターフェース１６００を介して、ディスプレイやスピーカやプリンタ等の出力デバイスにデータを送信する。また、入出力インターフェース１６００は、所定の記録媒体（メディア）に記録されたプログラム等を読み取るメディアインターフェイスとして機能してもよい。メディアとは、例えばＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｃ）、ＰＤ（Ｐｈａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｒｅｗｒｉｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｋ）等の光学記録媒体、ＭＯ（Ｍａｇｎｅｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｉｓｋ）等の光磁気記録媒体、テープ媒体、磁気記録媒体、または半導体メモリ等である。
【０１６７】
例えば、コンピュータ１０００が上記実施形態に係る解析装置１０として機能する場合、コンピュータ１０００のＣＰＵ１１００は、ＲＡＭ１２００上にロードされた情報処理プログラムを実行することにより、ＦＳＣ信号取得部１０Ａ等の機能を実現する。また、ＨＤＤ１４００には、本開示に係るプログラムおよびデータが格納される。なお、ＣＰＵ１１００は、プログラムデータ１４５０をＨＤＤ１４００から読み取って実行するが、他の例として、外部ネットワーク１５５０を介して、他の装置からこれらのプログラムを取得してもよい。
【０１６８】
なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）
流路内に流れる微小粒子に励起光を照射する光源と、
前記微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号のデータを取得する二次元光電変換センサと、
前記蛍光信号のデータに含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する算出部と、
を備える微小粒子解析装置。
（２）
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の各々から予め定めたオフセット値を減算した減算結果の前記合計値を、前記面積として算出する、
上記（１）に記載の微小粒子解析装置。
（３）
前記算出部は、
前記減算結果に予め定めた換算ゲインを乗算した乗算結果の前記合計値を、前記面積として算出する、
上記（２）に記載の微小粒子解析装置。
（４）
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の内の最大値を更に含む、前記評価値を算出する、
上記（１）〜（３）の何れか１つに記載の微小粒子解析装置。
（５）
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる、前記受光部から出力可能な最大の電荷値を示す前記蓄積電荷値の数の割合を示す飽和度を更に含む、前記評価値を算出する、
上記（１）〜（４）の何れか１つに記載の微小粒子解析装置。
（６）
前記蛍光信号の画像は、複数の前記受光部の各々に対応する画素ごとに前記蓄積電荷値を規定した画像であり、
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる、複数の蛍光受光領域であるスポット領域ごとに、前記評価値を算出する、
上記（１）〜（５）の何れか１つに記載の微小粒子解析装置。
（７）
前記算出部は、
前記蛍光信号の画像に含まれる前記スポット領域の中心を通る直線に沿って配列された複数の前記画素の内、第１の閾値以上の前記蓄積電荷値を示す前記画素の数である幅を更に含む、前記評価値を算出する、
上記（６）に記載の微小粒子解析装置。
（８）
前記算出部は、
前記幅が第２の閾値以下の場合、
該幅の算出に用いた前記スポット領域と、該幅の算出に用いた前記蛍光信号の画像に対して時系列に連続して取得した蛍光信号の画像に含まれる前記幅が前記第２の閾値以下の前記スポット領域と、を連結した連結スポット領域に基づいて、前記評価値を再算出する、
上記（７）に記載の微小粒子解析装置。
（９）
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析する解析部、
を備える、
上記（１）〜（８）の何れか１つに記載の微小粒子解析装置。
（１０）
前記解析部は、
前記評価値に基づいて、前記励起光の照射光量、および、前記二次元光電変換センサのアナログデジタル変換ゲインの少なくとも一方を制御する、
上記（９）に記載の微小解析装置。
（１１）
前記解析部は、
複数の前記評価値の内、予め定めた範囲内の値を示す前記評価値を解析対象とする、上記（９）に記載の微小解析装置。
（１２）
微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサから、前記蛍光信号の画像を取得する蛍光信号取得部と、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出する算出部と、
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析する解析部と、
を備える解析装置。
（１３）
微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサから、前記蛍光信号の画像を取得するステップと、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積を含む、評価値を算出するステップと、
前記評価値に基づいて、前記微小粒子の種類およびサイズの少なくとも一方を解析するステップと、
をコンピュータに実行させるための解析プログラム。
（１４）
測定部と、前記測定部の動作の制御に使われるソフトウェアと、を含んで構成される微小粒子解析システムであって、
前記ソフトウェアは情報処理装置に搭載されており、
前記測定部は、
微小粒子が流れる流路内に励起光を照射する光源と、
前記微小粒子から発せられた蛍光を、二次元配列された複数の受光部を含む受光面で受光し、複数の前記受光部の各々の蓄積電荷値を含む蛍光信号の画像を出力する二次元光電変換センサと、
を含み、
前記ソフトウェアは、
前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の合計値である面積、前記蛍光信号の画像に含まれる複数の前記蓄積電荷値の内の最大値、および前記蛍光信号の画像に含まれる前記受光部から出力可能な最大の電荷値を示す前記蓄積電荷値の数の割合を示す飽和度、の少なくとも１つを含む、評価値を算出し、
前記評価値に基づいて、前記光源から照射される前記励起光の照射光量、および、前記二次元光電変換センサのアナログデジタル変換ゲイン、の少なくとも一方を制御する、
微小粒子解析システム。
【符号の説明】
【０１６９】
１  微小粒子解析装置
１０Ｂ  蛍光信号取得部
１０Ｃ  算出部
１０Ｄ  解析部
１２  測定部
１６  光源
２８  二次元光電変換センサ
３０  受光面
３２  受光部
５０  蛍光信号の画像
【図１】
2020139824.tif 000003
【図２】
2020139824.tif 000004
【図３Ａ】
2020139824.tif 000005
【図３Ｂ】
2020139824.tif 000006
【図４Ａ】
2020139824.tif 000007
【図４Ｂ】
2020139824.tif 000008
【図５Ａ】
2020139824.tif 000009
【図５Ｂ】
2020139824.tif 000010
【図６Ａ】
2020139824.tif 000011
【図６Ｂ】
2020139824.tif 000012
【図７Ａ】
2020139824.tif 000013
【図７Ｂ】
2020139824.tif 000014
【図８Ａ】
2020139824.tif 000015
【図８Ｂ】
2020139824.tif 000016
【図８Ｃ】
2020139824.tif 000017
【図９】
2020139824.tif 000018
【図１０Ａ】
2020139824.tif 000019
【図１０Ｂ】
2020139824.tif 000020
【図１１】
2020139824.tif 000021
【図１２】
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