(57)【要約】【課題】本発明は、経口でノロウイルス感染症に対して高い効果を有する、食用キノコ由来の抗ノロウイルス剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、マイタケ属、プレロータス属、シメジ属、シロタモギタケ属、キクラゲ属、ハナビラタケ属、キシメジ属、及びシイタケ属からなる群から選択される属に属するキノコの、子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を有効成分として含む、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防用の経口剤等に関する。【選択図】図１
2020002052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイタケ（Grifola）属、プレロータス（Pleurotus）属、シメジ（Lyophyllum）属、シロタモギタケ（Hypsizygus）属、キクラゲ（Auricularia）属、ハナビラタケ（Sparassis）属、キシメジ（Tricholoma）属、及びシイタケ（Lentinula）属からなる群から選択される属に属するキノコの、子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を有効成分として含む、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防用の経口剤。
【請求項２】
キノコが、マイタケ属に属する、請求項１に記載の経口剤。
【請求項３】
キノコが、マイタケ（Grifola frondosa）、シロマイタケ（Grifola albicans）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus）、トキイロヒラタケ（Pleurotus djamor）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）、キクラゲ（Auricularia auricula-judae）、ハナビラタケ（Sparassis crispa）、マツタケ（Tricholoma matsutake）、及びシイタケ（Lentinula edodes）からなる群から選択される種である、請求項１に記載の経口剤。
【請求項４】
キノコが、マイタケである、請求項３に記載の経口剤。
【請求項５】
キノコの子実体若しくは菌糸体の乾燥物を有効成分として含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の経口剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコの子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を有効成分として含む、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防用の経口剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは約7,500塩基を持つ、プラス鎖の一本鎖RNAウイルスに分類されるエンベロープを持たないウイルスの属名であり、感染性胃腸炎の主要な原因となっている。ノロウイルス感染による症状には個人差があるが、主な症状は突発的な激しい吐き気や嘔吐、下痢、腹痛、悪寒、38℃程度の発熱で、嘔吐の数時間前から胃に膨満感やもたれを感じる場合もある。これらの症状は通常1〜3日持続後治癒し、後遺症が残ることもない。ただし、免疫力の低下した老人や乳幼児では症状が4〜6日間持続する場合があり、死亡した例（吐瀉物を喉に詰まらせることによる窒息、誤嚥性肺炎による死亡転帰）も報告されている。また、感染しても発症しないまま終わる場合（不顕性感染）や風邪症候群と同様の症状が現れるのみの場合もあるが、これらの人でもウイルスによる感染は成立しており、糞便中にはウイルス粒子が長期間にわたり排出される場合があるため、注意が必要である。
【０００３】
ノロウイルス感染症は近年増加傾向にある。ノロウイルスは変異を繰り返して、ヒトからヒトへ感染することがあり、変異した新型のノロウイルスに対しては抗体が存在しないため大流行することが多い。ノロウイルスに対するワクチンは、一部有効性が認められるものもあるがまだ開発途上にあって、新たなノロウイルスワクチンの開発や、新規メカニズムのノロウイルス治療剤の開発が望まれている。
【０００４】
本願出願人は、これまでにマイタケ由来の抽出画分に、抗インフルエンザウイルス活性が存在すること（特許文献１）を見出したが、食用キノコの関連物質が抗ノロウイルス活性を有することは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2008-106018号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ノロウイルス感染症に対して高い効果を有する、食用キノコ由来の抗ノロウイルス剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、マイタケ属等に属するキノコの子実体若しくは菌糸体等が、経口投与でノロウイルス感染症に対して高い効果を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
（１）マイタケ（Grifola）属、プレロータス（Pleurotus）属、シメジ（Lyophyllum）属、シロタモギタケ（Hypsizygus）属、キクラゲ（Auricularia）属、ハナビラタケ（Sparassis）属、キシメジ（Tricholoma）属、及びシイタケ（Lentinula）属からなる群から選択される属に属するキノコの、子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を有効成分として含む、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防用の経口剤。
（２）キノコが、マイタケ属に属する、（１）に記載の経口剤。
（３）キノコが、マイタケ（Grifola frondosa）、シロマイタケ（Grifola albicans）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus）、トキイロヒラタケ（Pleurotus djamor）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）、キクラゲ（Auricularia auricula-judae）、ハナビラタケ（Sparassis crispa）、マツタケ（Tricholoma matsutake）、及びシイタケ（Lentinula edodes）からなる群から選択される種である、（１）に記載の経口剤。
（４）キノコが、マイタケである、（３）に記載の経口剤。
（５）キノコの子実体若しくは菌糸体の乾燥物を有効成分として含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の経口剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のキノコの子実体若しくは菌糸体等を含む経口剤は、ノロウイルス感染症に対して高い効果を示す。また、本発明の経口剤は、長年の食経験を有する食用キノコ等から製造される為、安全性が高く、副作用が少ないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、5-FU非投与群における、MNV感染1/3日後（8時間後）から21日後までのマイタケ投与区及び対照区の排泄物中のウイルス量を示す。
【図２】図2は、5-FU投与群における、MNV感染1/3日後（8時間後）から21日後までのマイタケ投与区及び対照区の排泄物中のウイルス量を示す。
【図３】図3は、図1におけるMNV感染10日後から21日後までのウイルス量を、最大値を1,000PFU/10mgに変更して示したものである。
【図４】図4は、図2におけるMNV感染10日後から21日後までのウイルス量を、最大値を1,000PFU/10mgに変更して示したものである。
【図５】図5は、A群（5-FU非投与群）及びB群（5-FU投与群）における、マイタケ投与区及び対照区の中和抗体価の測定結果を示す。*はp<0.05を、**はp<0.01を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様において、本発明は、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防用の経口剤に関する。本発明の経口剤は、マイタケ（Grifola）属、プレロータス（Pleurotus）属、シメジ（Lyophyllum）属、シロタモギタケ（Hypsizygus）属、キクラゲ（Auricularia）属、ハナビラタケ（Sparassis）属、キシメジ（Tricholoma）属、及びシイタケ（Lentinula）属からなる群から選択される属、好ましくはマイタケ属、プレロータス属、シロタモギタケ属、キクラゲ属、及びシイタケ属からなる群から選択される属、さらに好ましくはマイタケ属に属するキノコの、子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を有効成分として含む。
【００１２】
本明細書において、「マイタケ（Grifola）属」キノコには、狭義のマイタケ（Grifola frondosa）、シロマイタケ（Grifola albicans）、チョレイマイタケ（Grifola umbellata）、及びトンビマイタケ（Grifola gigantea）等が含まれるが、好ましくは、本明細書におけるマイタケ属キノコは、マイタケ又はシロマイタケ、さらに好ましくはマイタケを指す。
【００１３】
本明細書において、「プレロータス（Pleurotus）属」キノコには、エリンギ（Pleurotus eryngii）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus）、トキイロヒラタケ（Pleurotus djamor）、及びウスヒラタケ（Pleurotus pulmonarius）が含まれる。
【００１４】
本明細書において、「シメジ（Lyophyllum）属」キノコには、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、及びハタケシメジ（Lyophyllum decastes）が含まれる。
【００１５】
本明細書において、「シロタモギタケ（Hypsizygus）属」キノコには、ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）が含まれる。
【００１６】
本明細書において、「シイタケ（Lentinula）属」キノコには、シイタケ（Lentinula edodes）が含まれる。
【００１７】
本明細書において、「キクラゲ（Auricularia）属」キノコには、キクラゲ（Auricularia auricula-judae）が含まれる。
【００１８】
本明細書において、「ハナビラタケ（Sparassis）属」キノコには、ハナビラタケ（Sparassis crispa）が含まれる。
【００１９】
本明細書において、「キシメジ（Tricholoma）属」キノコには、マツタケ（Tricholoma matsutake）が含まれる。
【００２０】
キノコは、好ましくは、マイタケ、シロマイタケ、エリンギ、タモギタケ、ブナシメジ、キクラゲ、及びシイタケからなる群から選択される種であり、さらに好ましくは、マイタケである。
【００２１】
本発明の経口剤は、好ましくは上記属又は種のいずれかに属するキノコの子実体若しくは菌糸体の乾燥物を含む。キノコの乾燥方法は特に限定されず、公知の乾燥法、例えば加熱乾燥、真空乾燥、及び風乾、好ましくは加熱乾燥及び真空乾燥によりキノコを乾燥することができる。
【００２２】
例えば、加熱乾燥の例として熱風乾燥が挙げられる。加熱温度は、低すぎると乾燥効率が低下し、高すぎるとキノコの成分に化学変化が生じる恐れがあるため、適切な範囲に設定することが好ましい。乾燥は、30℃以上、40℃以上、50℃以上、60℃以上、好ましくは70℃以上、また150℃以下、120℃以下、100℃以下、好ましくは90℃以下、80℃以下、又は70℃以下の条件で、例えば30℃〜100℃、40℃〜80℃、又は50℃〜70℃の条件で、例えば熱風を目的の物質に送風することによって行うことができる。加熱時間はキノコ中の水分が除かれる限り特に限定されず、例えば1時間以上、2時間以上、4時間以上、6時間以上、終夜、又は一昼夜とすることができる。
【００２３】
また、加熱乾燥の例として、温風乾燥（露点制御法）が挙げられる。熱風乾燥と比較して、乾球温度、湿球温度を設定することで、庫内の温度と湿度をコントロールすることによりキノコ表面の急激な乾燥を防ぎ、キノコ内部から水分を均一に分散させ、乾燥することができる。また、キノコ成分の高熱による物質の変性を防ぐことができる。一方で、温度をコントロールすることでキノコ中の酵素活性を促すことも可能である。乾燥は、乾球温度が30℃以上、40℃以上、50℃以上、また80℃以下、70℃以下、60℃以下、50℃以下の条件で、例えば、30℃〜80℃、30℃〜60℃、又は40℃〜50℃の条件で、湿球温度が20℃以上、30℃以上、40℃以上、50℃以上、また80℃以下、70℃以下、60℃以下、50℃以下の条件で、例えば、20℃〜80℃、20℃〜60℃、又は20℃〜30℃の条件で、例えば温風を目的の物質に送風しかつ乾燥機庫内の湿度をコントロールすることによって行うことができる。加熱時間はキノコ中の水分が除かれる限り特に限定されず、例えば1時間以上、2時間以上、4時間以上、6時間以上、終夜、又は一昼夜とすることができる。
【００２４】
また、真空乾燥の例として、凍結乾燥が挙げられる。真空乾燥は、キノコを加熱する必要がなく、低温で乾燥を行うことから、キノコの成分に化学変化が生じる恐れが少ない。真空乾燥は、完全な真空下で行ってもよいし、実質的な真空下、例えば100Pa以下、50Pa以下、又は20Pa以下等で行ってもよい。真空乾燥は、当業者に公知の方法により、例えば市販の真空乾燥機を用いて行うことができ、真空乾燥の時間は、キノコから水分が除かれる限り特に限定されず、例えば1時間以上、2時間以上、4時間以上、6時間以上、終夜、又は一昼夜行うことができる。
キノコは、乾燥後、必要に応じて細断又は粉末化してもよい。
【００２５】
本発明の経口剤は、上記属又は種のいずれかに属するキノコの子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物を、一種のみ含んでもよいし、数種類、例えば2種以上、3種以上、4種以上、又は5種以上組み合わせて含んでもよい。
【００２６】
本発明の経口剤によって治療及び／又は予防され得るノロウイルスは、カリシウイルス科ノロウイルス属に属するウイルスを意味する。本願出願時において、ノロウイルス属に属するウイルスは、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）だけであるが、今後見出され得るノロウイルス属の新たなウイルスも本発明の「ノロウイルス」に含まれる。ノロウイルスは、ゲノムの相同性に基づきゲノグループ1（GI）からGVの5つの遺伝子群に分類されるが、本発明のノロウイルスには5つの遺伝子群の全てが含まれる。ノロウイルスの分類法は、例えば、Hansman GS. et al., Journal of General Virology 87, 909-919 (2006)に記載されている。
【００２７】
本発明の経口剤は、ノロウイルス感染症に罹患した患者に対して、ノロウイルス感染症又はそれに伴う症状、例えば吐き気、嘔吐、下痢、腹痛、悪寒、発熱、及び糞便中へのウイルスの排出等の症状の少なくとも一つを治療、緩和、又は低減するものであってもよい。また、本発明の経口剤は、ノロウイルス感染症に罹患するリスクのある患者に対して、例えば、ノロウイルス流行期又は流行期前において、ノロウイルス感染症の症状が発症する前から投与することにより、予防的に用いることができる。
【００２８】
本発明の経口剤の使用態様は特に限定されず、例えば健康補助食品等の食品又は食品組成物、サプリメント、及び医薬組成物等のいずれであってもよい。
【００２９】
本発明の経口剤は、常法により製剤化され得る。製剤化は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【００３０】
投与形態は特に制限されず、必要に応じ適宜選択されるが、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、及びエリキシル剤等として投与することができる。
【００３１】
本発明の経口剤は、上記キノコの子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物に加えて、他の成分、例えば担体又は溶媒等の他の成分を含んでもよい。担体又は溶媒の例として、滅菌水、生理食塩水、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、pH調整剤、安定化剤、矯味剤、着色剤、及び香料等が挙げられ、これらの他の成分は上記投与形態に応じて適宜選択される。本発明の経口剤が他の成分を含む場合、組成物中のキノコの子実体若しくは菌糸体又はその乾燥物の割合は特に限定されず、例えば、組成物全体の重量に対して、例えば1%〜99%、10%〜90%、又は20%〜80%であってよい。
【００３２】
本発明の経口剤が投与され得る被験体としては、限定されるものではないが、哺乳動物（例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒト）、鳥類（ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の家禽類、インコ、オウム、ジュウシマツ等の愛玩鳥）、及び魚類（マグロ、タイ、ハマチ、ブリ等の養殖魚、ニシキゴイ、キンギョ等の観賞用魚）、好ましくは哺乳動物である。
本発明の経口剤は、免疫機能が低下した被験体に対して投与することもできる。
【００３３】
本発明の経口剤の投与量、投与間隔、及び投与期間は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢（月齢、週齢）、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、経口剤の投与量又は治療有効量は、1日当たり約0.1mg〜10g/kg体重、好ましくは1mg〜1,000mg/kg体重、又は250〜500mg/kg体重であってよい。また、投与回数は、限定するものではないが、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1カ月に1回等であってよい。また、投与期間は、限定するものではないが、1日、2日、3日、1週間、2週間、1カ月、半年、一年、又はそれ以上であってよい。
【００３４】
一態様において、本発明は、被験体に上記経口剤を経口投与することを含む、ノロウイルス感染症の治療及び／又は予防方法に関する。本方法における被験体、ノロウイルス感染症、組成物の投与量、投与間隔、及び投与期間等は、経口剤について記載した通りであるからここでは記載を省略する。
【実施例】
【００３５】
本実施例では、マウスノロウイルス（MNV）感染系を用いて、ノロウイルス感染症に対するマイタケの感染症治療効果を評価した。また、胃腸炎症状は、免疫機能低下時に重症化することが知られていることから、免疫機能の低下がウイルス排泄や抗体産生に及ぼす影響も検討した。
【００３６】
［実施例1：熱風乾燥キノコ子実体の調製］
人工栽培により得られたキノコ子実体（茎部及び傘部）を厚さ1cm以下になるように切って、50〜70℃で乾燥機にて4〜8時間かけて熱風乾燥した。次いで乾燥子実体を手で細かく砕いたのち、ブレンダーで30秒間粉砕し、微粉末の熱風乾燥キノコを得た。
【００３７】
［実施例2：温風乾燥（露点制御法）キノコ子実体の調製］
人工栽培により得られたキノコ子実体（茎部及び傘部）を厚さ1cm以下になるように切って、乾球温度40〜50℃、湿球温度26〜29℃で1日かけて温風乾燥機（露点制御乾燥機）にて乾燥した。次いで乾燥子実体を手で細かく砕いたのち、ブレンダーで30秒間粉砕し、微粉末の温風乾燥キノコを得た。
【００３８】
［実施例3：凍結乾燥キノコ子実体の調製］
人工栽培により得られたキノコ子実体（茎部及び傘部）を厚さ1cm以下になるように切って、−30℃で凍結させ、真空凍結乾燥機を用いて乾燥した。乾燥機内は20Paまで減圧され、およそ4日かけて乾燥した。次いで乾燥子実体を手で細かく砕いたのち、ブレンダーで30秒間粉砕し、微粉末の凍結乾燥キノコを得た。
【００３９】
［実施例4：マウスノロウイルス感染症に対する予防及び治療効果］
本実施例では、実施例1で調製したマイタケ子実体乾燥粉末によるマウスノロウイルス感染症に対する効果を検証した。BALB/cマウス（6週齢）を2つの群に分け、一方の群（A群）には5-fluorouracil（5-FU）を投与せず免疫機能正常群とし、もう一方の群（B群）には、5-FU（0.25mg/日-+/mouse）を1日おきに、ウイルス接種7日前から21日後まで皮下注射し、免疫機能低下群とした。なお、A群、B群ともにn=3とした。
以下の表1に試験区を示す。
【００４０】
【表１】
2020002052.tif 000003
【００４１】
各マウスにMNV（日本大学 生物資源学部より分与）（1×106PFU/0.2mL/mouse）を経口接種し、実施例1で調製したサンプルをウイルス接種7日前から21日後まで1日2回（9時及び18時）経口投与した。
【００４２】
糞便中のウイルス排出量の測定
ウイルス接種してから、1/3日後（8時間後）、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、8日後、10日後、12日後、14日後、16日後、18日後、21日後に、各マウスを1匹ずつ空の飼育ケージに15〜30分間入れその間排泄した糞便を採取した。採取した糞便は5mLチューブに収集し、-80℃で保存し試験に供した。
【００４３】
具体的には、糞便に1mg当たりPBS10μLを添加後、超音波処理して均一に分散させた後、遠心（3,000rpm、15分間、4℃）し上清を得た。上清をPBSで100、101、102、103倍希釈しウイルス希釈液とし試験に用いた。24穴プレート内で1日培養したRAW264.7細胞から培地を除去し、上記ウイルス液希釈液を1穴当たり100μL加え室温で1時間感染させた。感染処理後、ウイルス液を除去し、次いで1.5% SeaPlaqueTM agaroseを加えたDMEMを重層した。ウイルス感染処理2日後に、ニュートラルレッド液を1穴当たり500μL重層し37℃で１時間処理した。染色後、ニュートラルレッド液を除去し、直ちに顕微鏡下でプラーク数を測定した。
【００４４】
中和抗体価の測定
感染21日後に全採血し遠心（3,000rpm、5分間、4℃）して血清を得て、これを10、50、200、1,000、5,000倍希釈し血清希釈液とした。ウイルス（2,000PFU/mL）100μLを上記血清希釈液100μLと混合(200PFU/200μL/well)した後、37℃、上記と同様にRAW264.7細胞に1時間感染処理した。なお、対照区は血清の代わりにPBSを加えた。感染処理後、ウイルス液を除去し1.5% SeaPlaqueTM agaroseを加えたDMEM（FBS不含）を1穴当たり500μL重層した。感染処理2日〜3日後、ニュートラルレッド液を1穴当たり約500μL加え37℃、1時間処理した。染色後、ニュートラルレッド液を除去し、直ちに顕微鏡下でプラーク数を測定した。対照区のプラーク数を100とした時の各希釈液のプラーク数の割合を計算し、プラーク形成を50%阻害する血清希釈倍数をグラフ上で求め、それを中和抗体価とした。
【００４５】
（結果）
（１）糞便中のウイルス量
5-FUで処理していないA群、及び5-FUで処理したB群におけるMNV感染8時間後から21日後までの排泄物中のウイルス量を、それぞれ図1及び図2に示す。また、A群及びB群におけるMNV感染10日後から21日後までの排泄物中のウイルス量を、最大値を1,000PFU/10mgに変更して、それぞれ図3及び図4に示す。
【００４６】
A群及びB群ともに、ウイルス排泄量は、感染1日後に最大となった。5-FUで処理したB群では、5-FUで処理していないA群と比較して、ウイルス排泄量が多く、かつウイルスを長期間排出した。特にB群の対照区群では、感染3週間後にもウイルスが検出された。
【００４７】
図1〜4に示される通り、マイタケ投与により、対照区群に比べて、ウイルス排出が抑制され、早期にウイルス排泄が停止した。
【００４８】
（２）中和抗体価
中和抗体価の測定結果を図5に示す。A群では、マイタケの投与によって、抗体価が有意に（p<0.01）上昇した。B群でも、A群に比較すると低値であったが、マイタケ投与によって有意の（p<0.05）の抗体価上昇がみられ、かつ、この値はA群のマイタケ非投与区に比べても高値であった。
【００４９】
これらの結果より、免疫機能が低下した場合には、ノロウイルスの腸管からの排泄が長期に及び、これは、中和抗体産生量が低いことと関連している可能性があると推察された。また、マイタケ投与には、免疫機能の正常時にも低下時にも、腸管内でのノロウイルス量を減少させ、ウイルス排泄期間を短縮する効果が認められた。これには、中和抗体量の増加が少なくとも一部寄与している可能性がある。  
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の食用キノコ又はその乾燥物は、ノロウイルス感染症に対して高い効果を示す。また、本発明のノロウイルス感染症の治療及び／又は予防剤は、長年の食経験を有する食用キノコから製造される為、安全性が高く、副作用が少ないと考えられる。したがって、本発明によって、ノロウイルス感染症に対して有効であり、かつ副作用が少ないノロウイルス感染症の治療及び／又は予防剤が提供され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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