(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を精製及び／又はコンジュゲートする方法、このような方法のためのキット、並びに従来技術の欠点を克服する抗体組成物を提供する【解決手段】グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、抗体を、活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬と接触させるか、又は抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含む、方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体を標識又は誘導体化試薬にコンジュゲートする方法であって、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、前記抗体を、活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬と接触させるか、又は前記抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で前記標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含み、
前記モノカルボン酸バッファー化合物が、ベタイン、アラニン、β−アラニン、２−アミノ酪酸、プロリン、トリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、及び２−ピコリン酸から選択される少なくともいずれかであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンジュゲーション反応に使用するための抗体組成物、抗体単離キット、単離された抗体を標識にコンジュゲートするための方法、及びこのような組成物、キット又は方法に使用するための緩衝系に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての抗体は、最初に粗製形態（例えば、免疫血清、腹水、ハイブリドーマ組織培養上清）で作製される。抗体は、多くの基礎研究及び診断適用に使用する前に精製して、汚染性の非抗体タンパク質及び小分子（例えばアミノ酸）の多く（又はすべて）を除去しなければならない。
【０００３】
精製は、抗体を、通常「標識化抗体」若しくは「抗体コンジュゲート」と呼ばれるハイブリッド試薬を作り出すために「標識」（例えば、酵素、有機色素、蛍光性タンパク質又は着色粒子）に共有結合によって結合する場合、又は新しい官能基を導入する目的で、誘導体化試薬に共有結合によって結合する場合に、特に重要である。コンジュゲートの抗体成分は、特定の抗原（例えば、タンパク質、薬物、ペプチド又はバイオマーカー）に対する特異性を付与し、標識は測定可能性を付与し、したがってコンジュゲートは、例えばウエスタンブロット、組織切片、培養細胞、血液試料、尿等において抗原を検出し、定量化するために使用することができる。
【０００４】
抗体の精製において非常に重要な工程は、抗体を、抗原アフィニティーカラムに結合させるか、又は抗原の結合に直接関与しない抗体領域と相互作用する、固定化タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ若しくはタンパク質Ｌを担持しているカラムに結合させることである。抗原アフィニティーカラムによる抗体の精製は、粗製試料における無関係の抗原特異性を有する抗体が、カラムには保持されないという点で有利である。このようなアフィニティー精製の方法は、安定しており、信頼でき、血清、腹水及びハイブリドーマ組織培養上清などの粗製試料から抗体を精製するために、広く使用されている。
【０００５】
精製するためにどの手法が使用されるかにかかわらず、カラムに結合した抗体は、通常、低ｐＨのバッファー（典型的にグリシン又はクエン酸を含む）を用いて溶出され、次に低ｐＨによって誘発される抗体の損傷を最小限に抑えるために、例えばｐＨ８．０〜９．０のトリスバッファーを用いて速やかに中和される。（例えば非特許文献１）。低ｐＨのグリシン又はクエン酸バッファーは、低価格であり、抗体と抗原の相互作用の撹乱に必要なｐＨ値において良好な緩衝能を有するので、これらを用いる溶出がよく用いられている。
【０００６】
中和された精製抗体は、保存される前に、通常（常にではない）ＰＢＳ又はいくつかの他のほぼ中性ｐＨのバッファーに対して透析される。透析された抗体には、安定化し、又は微生物の増殖を防止する目的で、しばしば他の物質（例えばＢＳＡ、ナトリウムアジド、洗浄剤）が添加される。
【０００７】
抗体を商業的供給源から購入する場合、精製プロセスに使用される透析工程に関する情報が与えられることは極めて稀である。したがって、精製プロセスに由来するバッファーの成分が、抗体の最終調製物に残存するかどうかは不明な場合がある。このような考察は、抗体を標識化すべき場合、アフィニティーカラムを溶出するために使用されるバッファーが標識化反応においてしばしば重大な干渉を引き起こすので、非常に重要である。
【０００８】
あらゆるタイプの標識が、最も一般的には抗体分子上のリシン残基に結合する。例えば、有機蛍光色素のＮＨＳエステル、及びよく用いられているフルオレセインのイソチオシアネート誘導体（ＦＩＴＣ）は、リシン残基と反応する。他のコンジュゲーション化学（例えばチオールとマレイミド）には、リシン残基が伴うか明らかでない場合があるが、それにもかかわらず、コンジュゲーション化学は、コンジュゲーションプロセスの初期工程において、ほぼ常にリシン修飾に依存する。例えば、マレイミド及び様々な他の官能基（例えば保護されたチオール、アジド、ヨードアセチル基）をタンパク質分子に導入するために、リシンを標的としたヘテロ二官能性ＮＨＳエステル誘導体化試薬が一般に使用される。抗体をカルボキシル化マイクロ粒子又はナノ粒子にコンジュゲートするために使用されるカルボジイミドでは、表面のカルボキシル基が抗体のリシン残基と反応して、アミド結合が形成される。
【０００９】
リシン残基を伴う誘導体化又はコンジュゲーション反応は、第一級アミンを含有する物質、例えば遊離アミノ酸が存在する状態では実施できないことが周知である。これは、このような物質がタンパク質のリシン残基と競合するからである。競合の問題のため、従来技術は、カルボジイミド媒介型反応（カルボキシルとアミンのカップリングを伴う）の場合、カルボキシル又は第一級アミン官能基のいずれかと共に添加剤を使用しないように強く教示している。
【００１０】
したがって、よく用いられている抗体溶出バッファーは、ほとんどすべてのタイプの抗体標識化方法において禁忌である。抗体と標識のカルボジイミド媒介型反応は、アミンとカルボキシル基の縮合を伴うので、このような反応にはグリシンもクエン酸も存在することができない。
【００１１】
例えば、非特許文献２には、「カルボキシラート含有バッファー又はアミン含有バッファー、例えばクエン酸塩、酢酸塩、グリシン、又はトリスは回避すべき」という忠告が示されている。
【００１２】
カルボジイミドカップリングに言及している非特許文献３は、「遊離アミンを含有するバッファー、例えばトリス又はグリシンは回避すべき」と記載している。
【００１３】
カルボキシル含有ミクロスフェアを使用する反応は、非特許文献４に論じられており、「遊離アミンを含有するバッファー、例えばグリシンのトリス［原文通り］は回避すべき」という注意書きが示されている。
【００１４】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のカルボジイミド依存ビオチン化キット（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＧｎ−ビオチン、製品コード２６１３６）は、「第一級アミン（トリス、グリシン等）又はカルボキシル（酢酸塩、クエン酸塩等）を含有するバッファーは、反応をクエンチするので回避すべき」と記載している。
【００１５】
カルボキシルカップリング樹脂に関するＧ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの手順は、「注記：ＥＤＣを使用するカップリング反応については、遊離アミン又はリン酸塩を含有するバッファーがカップリング効率に干渉するため、これらの使用は回避すべき。トリス、酢酸塩及びグリシンバッファーは、すべてＥＤＣ又はカップリング中間体と容易に反応する」と警告している。
【００１６】
最後に、カルボキシル化金コンジュゲーションキットと共に使用するためのプロトコルは、「タンパク質溶液（タンパク質安定剤を含む）における任意の他のアミン含有分子又はカルボキシル含有分子は、コンジュゲーション反応と競合する」（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ、製品コードＧＣＫ）と記載している。
【００１７】
やはりカルボキシル修飾を伴わない、リシンを標的とした修飾反応の場合、クエン酸は許容され得るが、グリシンは常に禁忌であり、例えばＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）アミン反応色素プロトコル（非特許文献５）は、「第一級アミンを含有するバッファー（例えば、トリス又はグリシン）は、ＮＨＳ−エステル部分と反応するので干渉となる」と記載している。
【００１８】
抗体試料において潜在的に干渉する可能性がある小分子、例えばグリシン及びクエン酸は、抗体をコンジュゲーション反応において使用する前に、透析又は脱塩によって除去することができる。透析によるこのような分子の除去効率は、透析バッファーの体積に対する抗体試料の体積、透析バッファーの変更回数、及び次のバッファーに変更する前に平衡に達するかどうかに関係する。このような情報は、市販の抗体ではほとんど知らされない。
【００１９】
残念ながら、抗体は、典型的に少量で購入されるので（例えば抗体約１ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｕｌ）、材料を著しく喪失せずに市販の抗体を透析／脱塩することは困難である。更に、透析中には試料の希釈が行われ得るが、抗体標識化反応における使用に必要な最小濃度（典型的に１ｍｇ／ｍｌ）に達するためには、おそらくはその後、抗体の濃縮工程が必要となる（その結果、材料が更に喪失する）。ミリグラム量の抗体の透析は、相対的に容易であるが、そのプロセスは必然的に時間がかかり、バッファーを数回変更することが必要な場合には１〜２日かかる場合がある。透析膜、及び高い値のミリグラム尺度で必要とされる大量の透析バッファーにより、製造費用もかさむ。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｒｅｆ  １６０１６１７  ０７／０８
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ＧＴ、１９９５年、ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８、１０２頁（及び２００８年の最新版である第２版ＩＳＢＮ  ９７８０１２３７０５０１３の１１７頁）
【非特許文献３】Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ、ｔｅｃｈ  ｎｏｔｅ  ２０５
【非特許文献４】「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」、２００６年、Ｇｕｉｓａｎ  ＪＭ編、２２３頁、ＩＳＢＮ  １−５８８２９−２９０−８
【非特許文献５】Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ  ２０３２．１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、抗体を精製及び／又はコンジュゲートする方法、このような方法のためのキット、並びに従来技術の欠点を克服する抗体組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
抗体標識化技術は、特にプロセスの単純化に関して、ここ数年で著しく進化している。多段階コンジュゲーション方法は、操作者側に特定の化学知識を要することのない単純な一段階プロセスで置き換えられつつある。
【００２３】
時間がかかり、高価であり、抗体の喪失をもたらす透析工程の介在を回避するためには、抗体精製手順と標識化反応を上手く統合することが必要である。抗体精製を行う科学者によって最初に採用されたバッファーは、ほとんどのコンジュゲーション化学と適合性がないため、「コンジュゲーションに利用しやすい溶出バッファー」（ＣＦＥＢ）は明らかに必要である。ここで本発明者らは、ＣＦＥＢを、よく用いられているコンジュゲーション方法において干渉を引き起こさない（すなわち、抗体とカルボジイミド、ＮＨＳエステル、イソチオシアネート、マレイミド及びチオール化（thiolation）試薬の反応が最小限に抑えられる）、１及び４の間のｐＫａを有するバッファーと定義する。
【００２４】
第１の態様では、本発明は、コンジュゲーション反応に使用するための抗体組成物を提供する。該組成物は、緩衝系中に単離された抗体を含み、該緩衝系は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む。
【００２５】
更なる一態様では、本発明は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含むバッファーの、固相から抗体を溶出するための使用を提供する。
【００２６】
更なる一態様では、本発明は、抗体を結合するための固相アフィニティーマトリックスと、抗体がアフィニティーマトリックスに結合した場合に抗体を溶出するためのバッファーとを含む抗体単離キットであって、バッファーが、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む、抗体単離キットを提供する。
【００２７】
更なる一態様では、本発明は、単離された抗体を標識にコンジュゲートする方法を提供する。該方法は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で活性化標識又は標識と接触させる工程を含む。
【００２８】
驚くべきことに、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸化合物を含む緩衝系は、抗体コンジュゲーション反応に使用できることが見出された。このような緩衝系は、抗体精製手順とコンジュゲーション反応の両方に使用することができ、それによって望ましくない透析工程の必要性が回避される。
【００２９】
カルボジイミド反応における、市販の抗体に見出される可能性が高い分子（例えば、グリシン、クエン酸、アジド）の干渉度を決定するために、本発明者らは、抗体と市販のカルボキシル化ナノ粒子の反応について研究した。本発明者らは、グリシンが、高濃度でも干渉を引き起こさなかったことに驚いた。グリシンは、アミン官能基とカルボキシル官能基の両方を有しており、従来技術では明らかに禁忌である。本発明者らは、この予期しなかった知見を利用して新しい精製キットを開発し、その精製キットの抗体製品は、事前のコンジュゲーション抗体透析工程を必要とせずに、カルボジイミド反応だけでなく、よく用いられているすべての他のコンジュゲーション化学にも使用することができる。本発明を、以下により完全に記載する。
【００３０】
モノカルボン酸バッファー化合物は、α位又はβ位にアミン置換基を有し、コンジュゲーション反応に干渉できないという条件で、１つ又は複数の他の置換基を更に含むことができる。典型的に、更なる置換基が存在する場合、それらの置換基は、１つ又は複数の非アミン置換基である。バッファー化合物上には、更なる置換基が存在しないことが好ましい。
【００３１】
第二級又は第三級アミンは、典型的に、コンジュゲーション反応において第一級アミンよりも反応性が低いので、アミン置換基として好ましい。アミン置換基は、好ましくは第四級アンモニウム置換基である。特にモノカルボン酸バッファー化合物として適している好ましいクラスの化合物は、ベタインである。ベタインは、第四級アンモニウム置換基を含有する。好ましいベタインは、グリシンベタインとしても公知のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンである。
【００３２】
それにもかかわらず、モノカルボン酸バッファー化合物のアミン置換基は、第一級アミンであり得る。モノカルボン酸が第一級アミノ酸である場合、モノカルボン酸は、アラニン、βアラニン又は２アミノ酪酸であり得る。典型的な第二級又は第三級アミンには、プロリン、トリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン又は２−ピコリン酸が含まれる。
【００３３】
モノカルボン酸バッファー化合物にアミン置換基が存在すると、電子求引効果を介してカルボン酸アニオンが安定化されることによって、カルボキシル基のｐＫａが低下する。典型的に、モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基は、１〜４の範囲、好ましくは１．５〜３．５の範囲のｐＫａを有する。モノカルボン酸バッファー化合物のアミンは、典型的に８を超える、好ましくは９を超えるｐＫａを有する。ｐＨ５におけるコンジュゲーション反応では、アミンは、大部分はプロトン化形態であり、したがってコンジュゲーション反応において非反応性である。
【００３４】
モノカルボン酸バッファー化合物は、抗体組成物中に、２００ｍＭ未満、好ましくは１００ｍＭ未満、より好ましくは５０ｍＭ未満の濃度で存在する。
【００３５】
一構成では、緩衝系は、５．５を超えるｐＫａを有する中和バッファー化合物を更に含む。中和バッファー化合物は、抗体をどのように単離したかにより緩衝系中に存在し得る。これについて、以下に更に詳説する。抗体組成物のｐＨは、典型的に５〜９の範囲にある。中和バッファーは、好ましくは、より低いｐＨの固相から溶出した後に、組成物のｐＨを増大するように存在する。抗体組成物を低ｐＨに長時間曝露することは、抗体タンパク質の損傷を誘発するおそれがあるので望ましくない。
【００３６】
緩衝系は、６〜８の範囲のｐＫａを有するキャッチバッファー化合物（catch buffer compound）を更に含むことができる。この構成では、中和バッファー化合物は、好ましくは８を超えるｐＫａを有し、より好ましくは８〜１１の範囲にある。キャッチバッファー化合物の濃度は、好ましくは中和バッファー化合物の濃度未満である。キャッチバッファーを、以下に更に詳説する。
【００３７】
一構成では、単離された抗体は、標識にコンジュゲートされている。標識は、酵素、蛍光性タンパク質、有機色素、着色粒子、ビオチン、ストレプトアビジン又はポリマーを含むことができる。
【００３８】
一構成では、緩衝系は、抗体又は抗体コンジュゲートのための保存媒体として使用される。このように、抗体組成物は、使用前に透析工程を必要とせずに、使用できる状態で保存することができる。
【００３９】
モノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系が、固相から抗体を溶出するために使用される場合、固相は、カラム内に配置することができる。典型的に、固相は、抗体のためのアフィニティーマトリックスを含む。バッファーのｐＨは、典型的に１．８〜４．８の範囲にある。この種の酸性ｐＨは、抗体が固相に特異的に結合した場合、抗体を除去するために必要である。
【００４０】
中和バッファーは、相対的に酸性の溶出バッファーによるｐＨによって誘発される損傷を回避するために、抗体の単離において使用され得る。中和バッファーは、モルホリノ、ピペリジン又はＮ−シクロヘキシル化合物を含むことができる。好ましくは、中和バッファーは、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ又はＨＥＰＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）又は３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）を含む。
【００４１】
中和バッファーのｐＨは、好ましくは６を超える。したがって、酸性ｐＨで溶出された抗体を含む組成物に、十分な量の中和バッファーを導入すると、抗体が相対的に安定になるレベルまでｐＨが増大する。
【００４２】
いくつかの構成では、中和バッファーのｐＨは、８を超え、最も好ましくは８．５〜１１、例えば９〜９．５の範囲にある。中和バッファーは、典型的に、ｐＨ値１単位内のｐＫａを有する。中和バッファーが８を超える場合、６〜８の範囲のｐＫａを有するキャッチバッファーを更に使用することが好ましい。キャッチバッファーの目的は、溶出された抗体を含む組成物のｐＨを過度に上昇させる中和バッファーの使用を防止することである。キャッチバッファーとして使用するのに適したバッファー化合物には、ＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳが含まれる。キャッチバッファーは、典型的に６〜８の範囲のｐＨを有する溶液として添加され得る。或いは、キャッチバッファーは、中和バッファーと組み合わせることができる。この場合、組み合わせた溶液のｐＨは、典型的に、キャッチバッファーのｐＫａを十分に超え、典型的にｐＨ８を超える。
【００４３】
単離された抗体を標識若しくは誘導体化試薬にコンジュゲートする方法は、緩衝系中で、抗体を活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬を接触させるか、又は抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含む。抗体コンジュゲーション試薬、活性化標識又は活性化誘導体化試薬は、典型的に、以下の反応基、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、イソチオシアネート又はチオール化試薬の１つ又は複数を含む。単離された抗体を標識にコンジュゲートする方法は、典型的に５〜９の範囲のｐＨで実施される。有利には、抗体を標識に接触させる工程の前に、抗体は、本明細書に記載の通り固相から抗体を溶出する工程によって単離される。本発明によれば、単離された抗体を標識にコンジュゲートするための緩衝系は、抗体を溶出する工程に使用されるバッファーを含む。このように、透析工程などのバッファーの任意の交換工程は必要ない。
【００４４】
ここで、本発明を、以下の実施例及び添付の図を参照しながら、単に例示的なものとして更に詳説する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】フルオレセインコンジュゲーション反応に対するベタインの効果を示す図である。
【図２】フィコエリトリンコンジュゲーション反応に対するトリシンの効果を示す図である。
【図３】イソチオシアネート（フルオレセイン）コンジュゲーション反応に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。
【図４】ＮＨＳエステル（フルオレセイン）コンジュゲーション反応に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。
【図５】イミノチオランの安定性に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。
【図６】キャッチバッファーが存在する状態及び存在しない状態の、高ｐＫａ成分によるＣＦＥＢの中和を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
コンジュゲーション反応における、市販の抗体に一般に見出される様々な物質の干渉度を決定するための実験では、本発明者らは、従来技術における確かな証拠に反して、高濃度のグリシンが、抗体とカルボキシル化金ナノ粒子のカルボジイミド媒介型反応に干渉しないことを発見した。
【００４７】
反応における様々な種の濃度は、典型的に、抗体１６．６７ｎＭ、抗体リシン１ｕＭ（抗体分子１個当たりリシン６０個と想定する）、ＥＤＣ０．１ｍＭ、及びグリシン５０ｍＭであった。したがって、抗体リシン及びＥＤＣの両方よりも膨大なモル過剰のグリシンが存在しているが、グリシンの酸基及びアミン基は、抗体上のリシン残基と金ナノ粒子上のカルボキシル基の生産的コンジュゲーション反応を防止しない。ＥＤＣは、この反応では必須であることが見出され、コンジュゲートは、カルボジイミドが存在しない状態では形成されない。
【００４８】
官能基の化学反応性は、しばしばそのｐＫａ＊及び反応混合物のｐＨに関する。［＊下記のｐＫａ値は、２５℃の温度に関する値である］。
【００４９】
グリシンにおけるカルボキシル基のｐＫａ（２．３５）は、α−アミノ基の安定化（電子求引）効果の結果として、他の同等の脂肪酸（例えば酢酸、ｐＫａ４．７６）と比較して、相対的に低い。ヘンダーソン−ハッセルバルヒ（Hasselbach）式を使用した算出では、グリシンのアミン基（ｐＫａ９．８）が、ｐＨ５．０でほぼ完全にその非反応性プロトン化形態であることが示され、それによって、グリシンのアミノ基がカルボジイミド反応において許容され得る理由が部分的に説明され得る。
【００５０】
しかし、カルボジイミド媒介型反応の第１の工程は、ＥＤＣとカルボキシル基の反応を含み、理論では、ｐＨ５ではグリシンの９９．７８％がイオン化されている（すなわちＣＯＯ−）ことを示している。この形態は、水溶液中のプロトン化カルボジイミドを攻撃する形態であるため、ｐＫａの考察では、グリシンによる干渉が生じないことを明確に説明することができない。むしろイオン化カルボキシル基は、カルボキシル活性化サイクルを介して、次に急速な加水分解又は任意の利用可能なアミンとの反応のいずれかによってＥＤＣを消費すると予測することができ、したがって、抗体とカルボキシル化ナノ粒子の反応に干渉すると思われる。
【００５１】
抗体とナノ粒子のカルボジイミド媒介型コンジュゲーション反応におけるグリシンの効果に関する、誤解を招くおそれがある従来技術の既述を考慮すると、本発明者らは、他のアミン含有物質及びカルボキシル含有物質が、コンジュゲーションに利用しやすい潜在的に可能な物質として見落とされていたのではないかと考えた。より重要なことに、本発明者らは、カルボジイミド媒介型反応と適合性のある物質だけでなく、複数の抗体コンジュゲーション技術と適合性のある物質を同定したいと考えた。
【００５２】
本発明者らは、抗体アフィニティーカラムの溶出のためのバッファーとして使用するのに適している約１〜４のｐＫａ値を有する有機酸に関する試験に焦点を合わせた。また本発明者らは、他の一般的な抗体添加剤、並びに様々な酸、アミノ酸及び他の誘導体を含む本発明者らの研究を拡張して、カルボジイミド反応においてグリシンによる干渉が生じないことの背後にある機序の理解に努めた。
【００５３】
最初に分子を、カルボキシル化金粒子（ＩｎｎｏｖａＣｏａｔ  ＧＯＬＤ、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とのＥＤＣ媒介型反応においてｐＨ５で試験した。このスクリーニング実施から得た、潜在的に可能性な興味深い分子を、ＮＨＳエステル反応、イソチオシアネート反応及びイミノチオランを伴うチオール化反応において更に評価した。これらの反応のすべてが、抗体コンジュゲーション分野で広く使用されるが、すべてが、グリシンが存在する状態では干渉されるという欠点があると予測され得る。
【００５４】
カルボジイミド媒介型反応によるスクリーニング結果を、表１に示す。
【００５５】
抗体における一般的な添加剤であるリン酸塩及びナトリウムアジドは、ＥＤＣと直接反応することによって、ほぼ確実に干渉を引き起こした。一般的な第一級アミンを含有する中和バッファー又は保存バッファーであるトリスは、激しい干渉を引き起こした。
【００５６】
効果をほとんど又は全く示さない、アラニン、ＤＬ−２−アミノ酪酸、ベタイン（グリシンベタイン；Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、β−アラニン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、２−ピコリン酸（２−ピリジンカルボン酸）、トリシン［（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］及びプロリンを含めたいくつかのアミノ酸及び関連分子が同定された。
【００５７】
ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）及びニコチン酸を含めた他のアミノ酸は、著しい干渉を示した。
【００５８】
２つの酸性基を有するモノアミノ酸（例えばアスパラギン酸）は、激しい干渉を引き起こした（データ示さず）。
【００５９】
激しい干渉を引き起こした他の酸（すなわちアミンを含まない酸）には、クエン酸、コハク酸、トリクロロ酢酸、及び２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸が含まれていた。
【００６０】
著しい干渉を引き起こしたが、コンジュゲーション反応を完全には消失させなかった酸には、シクロヘキサンカルボン酸、酢酸ナトリウム及びピバル酸が含まれていた。
【００６１】
まとめると、これらのデータは、カルボジイミド反応における干渉を最小限に抑えるようにＣＦＥＢバッファーに設計されなければならない構造的特徴を例示している。
【００６２】
１つの酸官能基を有しており、窒素原子を有していない（すなわち第一級、第二級若しくは第三級アミンを有していない、又は四級化アンモニウムイオンを有していない）あらゆる分子は、干渉を引き起こした。２つの酸官能基を有する分子も、アミンが存在しているかどうかにかかわらず干渉を引き起こした。したがって、いずれかがカルボジイミド反応において禁忌であると予測されるアミンとカルボキシル基の両方が存在すると、ある場合には一緒になって干渉を実際に防止することができる。
【００６３】
酸（典型的にカルボキシル）基に対するアミンの位置は、非常に重要であることが明らかである。最小限の干渉を示す化合物については、アミン官能基とカルボキシル官能基は、１つの原子によって分離されている。２つの介在原子を有するいくつかの分子は、それなりに十分に許容されるものであったが、３つの介在原子を有する化合物は、著しい干渉を引き起こす。
【００６４】
ＧＡＢＡでは、アミノ官能基とカルボキシル官能基は、３つの原子によって分離されており、アミンは、酸（ｐＫａ４．２３）のｐＫａを低減しない。酸基のほとんど（８５．５％）は、ｐＨ５では推定的な反応性ＣＯＯ−形態で存在し、それと比較して、グリシンについては更により多量に反応性形態で存在する（約９９．８％）。しかしＧＡＢＡは、カルボジイミド媒介型反応を著しく阻害する一方、グリシン（ｐＫａ２．３）は阻害しない。極めて近接している（すなわち１つの原子によって分離されている）アミノ官能基及びカルボン酸官能基を有するＧＡＢＡ異性体であるＤＬ−２アミノ酪酸（ｐＫａ２．２９）は、干渉を示さなかった。
【００６５】
類似の結果が、芳香族酸であるニコチン酸、ｐＫａ２．２について見られ、これらはカルボジイミド反応において部分的な干渉を示したが、極めて近接しているアミン窒素及びカルボキシル基を有しているその異性体であるピコリン酸（ｐＫａ１．０７）は、効果がなかった。
【００６６】
したがって、極めて近接しているアミンが存在しない状態のカルボン酸は、特に低ｐＫａ値を有しており、ｐＨ５で著しくイオン化されている場合に干渉を引き起こす。ＴＣＡ（ｐＫａ０．７）は、ｐＨ５で本質的に完全にイオン化されており、激しい干渉を引き起こす。それに対して、ピバル酸（ｐＫａ＝５．０３、すなわちｐＨ５で約５０％がイオン化されており、トリクロロ酢酸の塩素原子が、メチル基で置き換えられている）は、部分的にしか阻害を示さなかった。
【００６７】
したがって、水溶液中の本発明者らによるカルボジイミド反応においてグリシンの効果が生じないことは、負電荷及び正電荷の中心が、水素結合を介して相互作用して分子内環を形成し、カルボキシル基の反応性を低減することによるものであると、最も簡潔に説明される。またこのような相互作用には、グリシンが気相中では双性イオンを形成しないので、１つ又は複数の水分子が関与しなければならない。グリシンなどの単純なアミノ酸でも、その溶液構造は非常に複雑であり、いくつかの水分子は、グリシン双性イオンの安定化に関与すると考えられる（Ｘｕら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１１９、１０６９６〜１０７０１頁、２００３年）。
【００６８】
一般に化学では、５員又は６員環の形成は、高度に歪みを有する３員若しくは４員環、又は７個以上の原子を有する環よりも有利であるとされる傾向がある。したがって、本発明者らによるカルボジイミド反応に干渉しないモノカルボン化合物は、互いに直接的に又は架橋溶媒分子（又は場合によりイオン）を介して間接的に相互作用して低エネルギー状態の５員又は６員環を生じることができる、帯電したアミン及びカルボキシルを有している可能性が高いと思われる。しかし、帯電した基が、より離れている（すなわち３つの原子によって分離されている）場合、分子内の環は、大きすぎて熱力学的に不利になり、イオン化カルボキシル基は、プロトン化カルボジイミドと自由に反応する。
【００６９】
したがって、非常に重要な構造的特徴、すなわち極めて近接しているアミン及びカルボキシルを有しており（及び他の干渉基を有していない）、各基が実質的にイオン化されている任意の分子は、ｐＨ５でカルボジイミド反応において低い反応性を呈する可能性が高い。カルボキシルのｐＫａが十分に低い場合（＜４）、分子は、抗体カラムの溶出にも適している。
【００７０】
非常に重要な構造的特徴を有するバッファーは、他に応用することができる。例えば、ピコリン酸（アミンのｐＫａ５．５２）は、５未満のｐＨ値でＭＥＳ（ｐＫａ６．１５）よりもはるかに良好なバッファーである。これらのｐＨ値では、２−ピコリン酸のアミンは、大部分がプロトン化され、したがってカルボキシル基を非活性化する。興味深いことに、ＭＥＳは、ｐＨ４．７では有効なバッファーにはなり得ないにもかかわらず、ＭＥＳバッファーは、一般にこのｐＨでカルボジイミド反応において使用される。このｐＨでＭＥＳを使用する理由は、おそらくはアミン基及びカルボキシル基を有するバッファーによる干渉が予測される懸念があることによって説明がつく。
【００７１】
グリシンは、約ｐＨ５で抗体とカルボキシル化粒子のカルボジイミド反応において許容され得るが、アミン基はプロトン化される可能性がそれほど高くないので、グリシンの第一級アミンは、より高いｐＨ値で実施されるコンジュゲーション反応（例えばＮＨＳエステル反応）の方がはるかに反応性が高くなる可能性がある。本発明者らは、第二級若しくは第三級アミン、又は四級化アンモニウム塩を組み込まれた酸分子が、第一級アミン（グリシンなどにおける）とは反対に、より高いｐＨ値で実施されるリシンベースのコンジュゲーション反応において干渉の低減を示す場合があると同時に、約ｐＨ５ではカルボジイミド反応においてカルボキシル基の活性も抑制すると推論した。
【００７２】
カルボジイミド媒介型反応の初期試験から得られた推定上のＣＦＥＢを、市販のアミンベースのコンジュゲーション技術（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ；Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；英国特許第２４４６０８８号明細書及び英国特許第２４６７０４１号明細書）で試験した。グリシン（データ示さず）及びプロリン（第二級アミン）は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋフルオレセインコンジュゲーション反応において５０ｍＭの濃度で著しい干渉を引き起こした。２−ピコリン酸は、中程度の干渉を示した。グリシンベタイン（四級化アンモニウム塩）及びＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（第三級アミン）は、ほとんど又は全く効果がなかった（５０ｍＭの濃度でそれぞれ対照値％の９８％、９６％）。全用量応答曲線を、グリシンベタイン対添加剤なしの対照が存在する状態で調製したコンジュゲートについて示す（図１）。図は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ反応において様々な濃度でベタインの濃度依存効果がないことを示している。対照（ベタインなし）、四角；１ｍＭのベタイン、三角；１０ｍＭのベタイン、白丸；５０ｍＭのベタイン、黒丸。
【００７３】
トリシン（第二級アミン）を、蛍光性タンパク質であるフィコエリトリンとのＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ反応において評価した。５０ｍＭの濃度によるコンジュゲーション反応では、中程度の干渉度があった（対照の９１％）。用量応答曲線を図２に示す。図は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ反応において様々な濃度でトリシンの濃度依存効果がないことを示している。対照（トリシンなし）、四角；１ｍＭのトリシン、三角；１０ｍＭのトリシン、白丸；５０ｍＭのトリシン、黒丸。
【００７４】
グリシンベタインを、イソチオシアネート（図３）及びＮＨＳ−エステル（図４）反応において、抗体精製作業で使用される２つの最も一般的なバッファーであるグリシン及びクエン酸と比較して、更に評価した。図３は、様々な添加剤が存在する状態で蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて調製した抗体色素コンジュゲートに関する、色素とタンパク質のモル比を示している。ベタイン及びクエン酸によって、対照（添加剤なし）の結果に類似した結果が得られた。グリシンは、著しい干渉を示した。図４は、様々な添加剤が存在する状態でフルオレセインＮＨＳエステルを用いて調製した抗体色素コンジュゲートに関する、色素とタンパク質のモル比を示している。ベタイン及びクエン酸によって、対照（添加剤なし）の結果に類似した結果が得られた。グリシンは、実質的な干渉を示した。カルボジイミド反応におけるグリシンの強力な阻害効果とは対照的に（表１）、クエン酸は、アミン依存反応において許容され得る。予想通り、グリシンは、特にＮＨＳエステルの場合に著しい干渉を引き起こした。グリシンベタインは、両方の試験において十分に許容されるものであった。
【００７５】
グリシンの第一級アミンが存在しなければ、ＮＨＳエステル又はイソチオシアネートの反応において抗体リシンとの任意の競合が防止され得るが、酸基のｐＫａ（４．７６）が高すぎるので、得られる分子（すなわち酢酸）は、アフィニティーカラムの溶出には適しておらず、したがって必要なｐＨ範囲においてバッファーとして作用することができない。更に、酢酸は、非反応性プロトン化形態では著しい割合のカルボキシルを有しているにもかかわらず、カルボジイミド反応においてグリシンよりも大きい干渉を示す。
【００７６】
実施できる可能な誘導体化反応の範囲を拡大するために、新しい官能基（例えば保護されたチオール）が、抗体（及び他のアミン含有物質）にしばしば導入される。これらの修飾では、ほとんど常に、一方の端部にＮＨＳエステル基を有するヘテロ二官能性分子が使用される。ＮＨＳ誘導体は、すべて、第一級アミンと本質的に同じ反応性を示すので、ベタインは、よく用いられている非常に広い範囲のＮＨＳコンジュゲーション反応と適合性がある。
【００７７】
チオールは、非ＮＨＳエステル依存技術を使用して、抗体に直接組み込むこともできる。例えば、２−イミノチオランを使用してリシン残基を修飾して、チオール基を組み込むことができる。図５は、グリシンが２−イミノチオランと急速に反応し、したがって、抗体又は他のアミン含有物質と２−イミノチオランの反応においては許容できないことを示している。クエン酸は、予想通り、この特定のアミン依存反応に対して効果を及ぼさず、第四級アンモニウム化合物であるグリシンベタインも効果がなかった。
【００７８】
他の第四級アンモニウム化合物、例えばプロリンベタインも、グリシンベタインと同様に適切なＣＦＥＢである。
【００７９】
好ましくは第一級アミンは、＞９若しくは＞１０のｐＫａ値を有しており、又はそのｐＫａ値は、アミンは大部分がプロトン化され、相対的に非反応性になるように、所期のコンジュゲーション反応のｐＨを少なくとも１単位若しくは好ましくは２単位超えるべきである。第二級アミンは、第一級アミンよりも好ましく、第三級アミンは、第二級アミンよりも好ましい。窒素原子は、ｐＨのすべての値で正電荷を保持するので、第四級アンモニウム塩が特に好ましい。
【００８０】
アフィニティークロマトグラフィーでは、高い回収率を達成するために、カラムは一般にｐＨ２．３及びｐＨ３．５の間で溶出される。最も一般的には、ｐＨは、ｐＨ２．３、ｐＨ２．８、又はｐＨ３．０である。溶出された抗体は、ｐＨによって誘発される損傷を回避するために速やかに中和されなければならない。ＣＦＥＢの場合、単にコンジュゲーションの前に溶液を中和すればよく（すなわち非常に重要なことに、透析が必要ない）、その後更に、対象となる特定のコンジュゲーション反応の要件を満たすために、必要に応じてｐＨを単に調節すればよい。
【００８１】
好ましくは、ＣＦＥＢは、アフィニティーカラムの溶出に使用されるｐＨ未満のｐＫａを有するべきである。
【００８２】
従来、ｐＫａ値に近いｐＨ値のバッファーが使用されているが、本発明では、中和工程中にｐＨ変化に対するＣＦＥＢの最大抵抗点を移動させなくてもよく、すなわちｐＨがｐＫａ値に等しくなる点を移動させなくてもよいという明白な利点がある。それにもかかわらず、ＣＦＥＢは、使用されることになるｐＨ値でも有効なバッファーでなくてはならない。一般に、有用な緩衝化範囲は、ｐＫａ＋／−１単位であるとみなされる。有用な緩衝化範囲の上端近くのｐＨを使用することによって、より少量の中和バッファーで済み、次に中和された抗体は、可能な限り低い全体的緩衝能を有する。このことは、その後のコンジュゲーション反応を多くの異なるｐＨ値で実施することができ、抗体が精製され中和される場合には抗体の所期の使用がわからない場合があるため、重要である。抗体が配合される溶液が、低い緩衝能を有する場合、抗体は、より強力なバッファーを添加することによって任意の新しいｐＨ値に容易に調節することができる。
【００８３】
ＣＦＥＢの濃度は、抗体の結合を撹乱するのに十分な濃度にすべきであるが、その後の中和工程を容易にするために、絶対的に必要な濃度程度が使用されるべきである。ＣＦＥＢの濃度は、好ましくは２００ｍＭ未満、より好ましくは１００ｍＭ未満、更により好ましくは５０ｍＭ未満である。
【００８４】
溶出前のカラムは、非抗体タンパク質を除去するために典型的に約ｐＨ７．５のバッファーを用いて洗浄されるので、アフィニティーカラムからの溶出効率は、ＣＦＥＢの濃度によって部分的に決定される。したがって、洗浄バッファーが５０ｍＭである場合、新しいバッファーが導入されるときにカラムの上部でバッファーが必然的にいくらか混合されるので、例えば１０ｍＭのＣＦＥＢを用いる低ｐＨへの移行は、５０ｍＭのＣＦＥＢを用いる場合ほど急激ではない。
【００８５】
したがって理想的には、ＣＦＥＢを添加する前に、少量の約ｐＨ７の弱いバッファーを使用して、より強力な平衡化／洗浄バッファーを置き換えるのがよい。或いはより好ましくは、低ｐＨで溶出する前にカラムを平衡化し、相対的に低い緩衝能を有する単一溶液で洗浄すべきである。イオン強度は、バッファー濃度を低減した後でも、非緩衝化塩（例えば、強酸及び強塩基の塩）、例えばＮａＣｌを添加することによって必要に応じて維持することができる。
【００８６】
小規模の抗体精製の場合、カラム洗浄バッファーは、液体を除去するためにアフィニティーカラムマトリックスを遠心分離処理することによって大部分が排除され得るが、乾燥は、結合した抗体に損傷を与えるおそれがあるので、マトリックスが乾燥しないように注意を払うべきである。
【００８７】
本発明の特に好ましい一実施形態では、ＣＦＥＢは、第四級アンモニウム化合物であるグリシンベタインであり、これはアフィニティーカラムを溶出するために通常使用されるｐＨ（例えばｐＨ２．３及びｐＨ２．８）を著しく下回るｐＫａ１．８を有する。
【００８８】
カラムを、より高いｐＨ（例えばｐＨ３．０）で溶出すべき場合、それよりわずかに高いｐＫａを有する溶出バッファーを選択することができ、例えばカルボキシル基についてグリシンのｐＫａ値（ｐＫａ２．３）と同等のｐＫａ値を有するトリシンを選択することができる。或いは、それよりわずかに高い濃度のベタイン、例えばグリシンベタインを使用すると、通常の緩衝化範囲外（すなわち先の例では、ｐＨ＝ｐＫａ＋１．０ではなくｐＫａ＋１．２）であっても必要な緩衝能を維持することができる。
【００８９】
また、抗体の精製に使用される他の物質（カラム平衡化バッファー、洗浄バッファー及び中和物質）は、溶出のためにＣＦＥＢを使用することによる利益を打ち消さないように、所期のコンジュゲーション反応と適合性がなければならない。
【００９０】
ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）及びＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて平衡化／洗浄バッファーとして一般に使用されるが、事前に溶出バッファーを置き換える戦略が使用されない限り、これらのいずれもＣＦＥＢベースの抗体精製手順において好ましくない。トリスは、アミン依存反応に干渉し、ＰＢＳは、カルボジイミド反応に干渉する。
【００９１】
しかし、生物学で使用される、６を超えるｐＫａ値を有する多くのバッファーは、コンジュゲーション反応において使用するのに適している。スルホナート基及びピペラジン環又はモルホリノ環のいずれかを有するバッファーが一般に使用されており、これらはほとんどのコンジュゲーション反応と適合性があるが、これは、潜在的に干渉する可能性がある他の官能基がこのバッファーに含まれていないからであると推定される。これらのバッファーは、メチレン基又はヒドロキシル置換基の数及び位置だけがクラス内でしばしば変わる。
【００９２】
ピペラジンクラスのバッファーには、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＫａ７．５）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ又はＨＥＰＰＳ）（ｐＫａ８．０）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）（ｐＫａ６．７６）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）（ｐＫａ７．８）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）（ｐＫａ８．３）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
モルホリノクラスのバッファーには、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）（ｐＫａ６．９）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＫａ６．１）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＫａ７．２）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
相対的に高いｐＫａ値を有する別のクラスのバッファーには、Ｎ−シクロヘキシル誘導体であるＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）（ｐＫａ９．５）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＫａ１０．４）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）（ｐＫａ１０．７）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）（９．６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
先のバッファーには、他の構造的変動が存在し、より詳細な一覧は、Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｆ．Ｄａｔａ、Ｖｏｌ．３１、Ｎｏ．２、２００２年）に見られる。
【００９６】
一般に、先のバッファーのすべては、潜在的に有用な中和物質及び／又は緩衝化物質であり、ほとんどのコンジュゲーション反応において許容される。１種又は複数のバッファーの選択は、抗体の所期の使用、特に最終的な溶液に必要とされるｐＨに応じて変わる。
【００９７】
本発明の一実施形態では、ｐＫａ＝８＋／−１単位の範囲のｐＫａ値を有する前述のバッファーは、好ましい平衡化バッファー及び洗浄バッファーである。これらには、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳが含まれるが、この選択に限定されない。
【００９８】
中和バッファーに関して、前述のバッファーのいずれも、潜在的に適切なバッファーである。しかし、１種のバッファー（又は複数のバッファー、以下参照）の選択には、必要な最終ｐＨ及びバッファーのｐＫａ値（複数可）の適切性を考慮しなければならない。
【００９９】
本発明の好ましい一実施形態では、中和バッファーは、そのｐＫａ値を超えるｐＨを有しており、それによって、ＣＦＥＢを含有する抗体溶液を中和するのに、可能な限り少量のバッファー物質で済む。例えば、ＥＰＰＳバッファー（ｐＫａ８．０）の溶液は、ｐＨ９．０で調製することができる。特定体積の中和バッファーを、ＣＦＥＢ中特定濃度で、特定体積の溶出された抗体に添加することによって、最終ｐＨを、やはりＥＰＰＳバッファーの有用な緩衝化範囲内にある生理的ｐＨに近くなるように設計することができる。
【０１００】
有用な緩衝化範囲外の中和バッファーを使用することも可能である。例えば、Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＫａ７．５）は、約ｐＨ９で使用される場合があるが、これは、ｐＨを非常に低い緩衝能領域内に調節する場合にオーバーシュートの危険性を回避するために、細心の注意が払われるからであると推定される。したがって、バッファーを、その通常の緩衝化範囲（すなわちｐＫａ＋／−１単位）外に上昇させた過剰の塩基（例えばＮａＯＨ）は、溶出された抗体における酸の一部を中和し、塩を形成し、したがって実際の中和バッファー物質（すなわちこの場合、Ｈｅｐｅｓ）の質量及び最終濃度を最小限に抑える。
【０１０１】
最も一般的な反応は、ＮＨＳエステル（典型的に約ｐＨ８で反応）、マレイミド（約６．５〜７．５）、カルボジイミド（通常、約ｐＨ５〜６）及びチオール化試薬（典型的に約ｐＨ８〜８．５）を伴うので、ほとんどの抗体コンジュゲーション反応は、ｐＨ５及びｐＨ９の間で行われる。
【０１０２】
本発明の好ましい一実施形態では、中和バッファーは、２種の緩衝化物質を含み、一方（「高ｐＫａ成分」）は８を超えるｐＫａ、例えば好ましくは約ｐＫａ９又はｐＫａ１０を有しており、他方（「キャッチバッファー」）は、約７のｐＫａを有する。
【０１０３】
中和バッファーの２種の成分は、別個に又は混合物として添加され得る。
【０１０４】
２種の成分が別個に添加される場合、好ましくは高ｐＫａ成分の前にキャッチバッファーを添加して、高ｐＫａ成分が添加されるときに高ｐＨ値にオーバーシュートするのを回避する。
【０１０５】
新しいＣＦＥＢを用いた予備研究には、高ｐＫａ成分を徐々に添加することができ、ｐＨを各添加後に測定できる通り、別個に添加できるという利点がある。その後、組み合わせた高ｐＫａ成分／キャッチバッファーの溶液を１回添加すると、必要量の２種の物質を事前に混合することによって得られるのと同じ終点を達成することができる。
【０１０６】
或いは、公知の体積の潜在的に可能ないくつかのＣＦＥＢ（又は異なるｐＨ値の１種のＣＦＥＢ）を、様々な体積の一連の潜在的に可能な中和バッファーのそれぞれと混合することができ、各場合の最終ｐＨを決定し、作表することができる。その後の実験では、表を参照して、ＣＦＥＢ中の測定された抗体の体積に応じてどの中和バッファーを使用するか、及び必要な最終ｐＨを達成するためにどれ程添加するかを決定することができる。
【０１０７】
溶出された抗体を中和する２種のバッファー成分を添加すると、ＣＦＥＢ、高ｐＫａ成分及びキャッチバッファー（抗体及び非常に低濃度で存在する任意の他の緩衝化種を無視する）を含む三重緩衝系が作り出される。
【０１０８】
高ｐＫａ成分は、一般に相対的に高いｐＫａ値を有するＮ−シクロヘキシルシリーズのバッファーに由来する可能性が高いが、それに限定されることを意味しない。
【０１０９】
中和バッファーのｐＨは、好ましくはｐＨ７を超え、より好ましくは８を超え、更により好ましくはｐＨ８．５及びｐＨ１１の間である。約ｐＨ９〜９．５のｐＨが特に有用であり、このｐＨは、ＣＦＥＢ混合物の接触時に抗体に損傷を与える可能性が低い。より低いｐＨは、当然のことながら、高ｐＨに対して感度が高い抗体の場合に使用することができる。
【０１１０】
高ｐＫａ成分が使用される場合、中和溶液のｐＨは、理想的には、ｐＫａ値の１単位以内にある。ｐＨがｐＫａ値を超える場合、ＣＦＥＢを中和するのに、ｐＨがｐＫａ未満である場合よりも少量のバッファー物質で済む。しかし、高ｐＫａ成分は、中性ｐＨの近くでは緩衝力をほとんど備えていないので、ＣＦＥＢを中和するのに使用される量は、特に重要ではなく、必要に応じてｐＨがｐＨ７から更に移行しても、高ｐＫａ成分によって抵抗されない。
【０１１１】
中和バッファーが、ＣＦＥＢによって溶出された典型的に約ｐＨ２．３〜３．０の抗体に添加されると、混合物は、より中性になる。抗体の体積（ＣＦＥＢにおける）及び中和バッファーの賢明な選択により、キャッチバッファーは、ｐＨ６及び８の間の範囲のｐＨ（すなわちキャッチバッファーのｐＫａ＋／−１ｐＨ単位）を保持（すなわち「キャッチ」）することができる。
【０１１２】
それにもかかわらず、理想的には可能な限り低い濃度で存在するキャッチバッファーは、ＣＦＥＢ溶液と中和バッファーの体積比のわずかな変動が、例えばピペット操作又は測定の不正確さに起因して生じ得る場合には、その変動に耐容性を示すのに十分な量で存在して、ｐＨが抗体の保存にとって望ましい範囲内にあるようにしなければならない。最終濃度は約１０ｍＭであることが望ましいが、これに限定されない。
【０１１３】
キャッチバッファーは、普通は主要な中和物質ではないので、キャッチバッファーが高ｐＫａ成分よりも前に添加される場合、高ｐＫａ成分は速やかに添加されるべきである。
【０１１４】
抗体試料が中和された後、中和溶液に由来する高ｐＫａ成分は、もはや有効なバッファーではない。同様に、カラム溶出ｐＨ（すなわち約ｐＨ２．５の領域）の近くに広がる（ただし好ましくはそれ未満の）ｐＫａを有するＣＦＥＢは、ｐＨ７では有効なバッファーではない。その代わりに、相対的に低い濃度で存在する「キャッチ」バッファー（ｐＫａ約７を有する）は、有効な緩衝力のすべてを発揮するが、溶液のｐＨは、第４のバッファー（又は酸若しくは塩基）を添加することによって、ｐＨ５〜ｐＨ９の範囲内の新しいｐＨ値まで、相対的に容易に移行させることができる。この広範囲の値以内であっても、高ｐＫａバッファー成分（ｐＫａ＞９、好ましくは９．５以上と想定）もＣＦＥＢも、ｐＨの任意の所望の変化に抵抗するのに特に有効ではない。
【０１１５】
キャッチバッファーの構造的特徴は、理想的には約ｐＨ７のｐＫａ値を有するべきであることを除いて、中和バッファーに求められる構造的特徴に類似している。好ましくはｐＫａは、ｐＨ６及び８の間であるべきであり、最終ｐＨは約７〜７．５であるべきであるが、選択された最終ｐＨ値において抗体が安定であると想定される、この範囲外で操作することが可能な場合がある。
【０１１６】
好ましいキャッチバッファーには、ＭＯＰＳ（ｐＫａ７．２）及びＨＥＰＥＳ（ｐＫａ７．５）が含まれるが、これらに限定されない。類似のｐＫａ値を有する他のバッファーを、キャッチバッファーとして使用することもできる。
【０１１７】
高ｐＫａ成分とキャッチバッファーの好ましい組合せ（別個に添加されようと又は一緒に添加されようと）には、ＣＨＥＳとＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳのいずれかが含まれる。やはり、これらの組合せに限定されない。
【０１１８】
最後に、適切なｐＨ値のいくつかのアミン含有カルボン酸バッファーを、ＣＦＥＢ又は中和バッファー（例えばトリシン、及び関連分子であるビシン）のいずれかとして使用することができる。
【０１１９】
約ｐＨ７の多くの可変多成分の低緩衝能溶液は、異なるＣＦＥＢを、高ｐＫａ成分及びキャッチバッファーを含む中和溶液と組み合わせることによって作り出すことができることが、バッファーの理論から明らかとなろう。中和バッファーにおける特定の成分は、所期のコンジュゲーション反応に干渉する官能基をいずれも明らかに有していてはならないことを除いて、制限されない。
【０１２０】
本発明の方法を使用するコンジュゲーション反応は、適切なｐＨの抗体／ＣＦＥＢ混合物を、活性化標識（又は標識と活性化化学物質）、バッファー、及び必要に応じて他の添加剤を含む成分混合物と接触させることからなる。ある場合には、標識ではなく、有用な官能基を担持している小分子が結合して、典型的に官能基を介して小分子が標識に結合する。正確な添加順は、コンジュゲーション反応の性質に応じて変わり得るが、最終的にＣＦＥＢ、キャッチバッファー及び／又は中和バッファー（複数可）、標識（又は誘導体化試薬）及び抗体（又は標識されるタンパク質）は、コンジュゲーション反応の開始時に互いに同時に接触させられ、これは、本発明の手法の独特の態様である。この概念は、ある特定の環境においてグリシンなどのアミノ酸が、抗体とナノ粒子のカルボジイミド（carbodimide）媒介型反応において許容され得るという予期しなかった知見を得た後に展開された。
【０１２１】
任意の標識化反応において、中和された抗体の溶液を反応に添加しても、混合物のｐＨが所望のコンジュゲーションｐＨから移行しないことが重要である。抗体が全反応体積のうち少ない割合を占め、抗体溶液の緩衝能が低い場合、著しいｐＨ変化が生じる確率は低い。したがって、ＣＦＥＢ及び適切な中和バッファーと配合され、適切な体積で添加された抗体は、多くの異なる緩衝化コンジュゲーション反応と適合性がある。
【０１２２】
中和された抗体が、ある程度希釈され、その添加体積が、全アッセイ体積のうち著しい分率を占めることができる場合、コンジュゲーション反応における主要な緩衝化種は、任意の著しいｐＨ変化なしに抗体試料を受け入れるのに十分に濃縮されなければならない。或いは、添加される体積は、当技術分野で周知の簡単な技術（例えばマイクロ濃縮（microconcentration））を使用して抗体濃度を増大することによって、低減することができる。
【０１２３】
しかし、わずか１つのタイプのコンジュゲーション反応の実施を目的とする場合、ＣＦＥＢにおける抗体を中和し、必要なコンジュゲーションｐＨまで直接調節することができる。この場合、ｐＨを他の値に調節する柔軟性は必要なく、事前のコンジュゲーション透析工程を回避できるという大きな利益も損なわれない。
【０１２４】
例えば、コンジュゲーション反応をｐＨ９で実施すべき場合、抗体は、ｐＨ９に簡単に調節することができる。この想定では、約７のｐＫａを有するキャッチバッファーを使用することは必須ではなく、むしろｐＨ９をわずかに上回る（及び理想的には約９のｐＫａを有する）バッファーを、必要な体積比で溶出された抗体と混合して、必要な最終ｐＨを達成することができる。
【０１２５】
抗体の一部だけをｐＨ９でコンジュゲートすべき場合、単に抗体の一部をｐＨ９に調節するか、又は高ｐＫａ中和バッファーと組み合わせた適切なキャッチバッファーを使用して、ＣＦＥＢ抗体溶液全体を約ｐＨ７に中和することが好ましいと思われる。次に、中和された溶液の一部のｐＨを、必要に応じて、また必要な場合にはｐＨ９に上昇させることができる。
【０１２６】
ＣＦＥＢ中の溶出された抗体を、正確な体積の中和バッファーで中和する必要性は、大量の抗体を取り扱う場合（すなわち数ｍｌ又は更には数リットル）、後にｐＨプローブが抗体溶液に挿入され得るので、あまり重要ではない。望ましくは、適切なｐＫａを有するアルカリバッファー（又はキャッチバッファーと高ｐＫａ成分の適切なｐＨの組合せ）は、ｐＨによって誘発される抗体への損傷を最小限に抑えるのに最終ｐＨを十分上昇させなければならないことを除いては正確な最終ｐＨに関する懸念を伴わずに、ＣＦＥＢに速やかに添加され、好ましくはそのｐＨは、最終的に必要とされるｐＨ未満の点で止まる。次に、ｐＨメータを使用し、ｐＨが中和工程中にオーバーシュートする場合には適切な塩基（例えばＮａＯＨ溶液又はバッファー）又は酸（例えば希ＨＣｌ）を添加して、正確なｐＨに最終調節することができる。
【０１２７】
溶出バッファー、その濃度、そのイオン化できる基のｐＫａ、及び溶出バッファーのｐＨ（特にそのｐＫａ値に対する）を注意深く選択することによって、異なるタイプのコンジュゲーション反応において将来的な抗体の使用をいかなる方式でも制限せずに、より高いｐＨを有する（及び注意深く選択されたｐＫａ値を有する）バッファー又はバッファーの組合せを用いて、抗体を容易に中和することができる。
【０１２８】
低ｐＨ溶液の代わりに高ｐＨ溶液（ｐＨ＞１０）を用いて抗原アフィニティーカラムを溶出することも可能である。ここで、ＣＦＥＢの同じ要件が適用されるが、溶出バッファーは、所期のタイプのコンジュゲーション反応と適合性がなくてはならない。低ｐＨから高ｐＨにおける溶出に戦略を切り替えると、明白なバッファー（グリシン、クエン酸）が、よく用いられている多くのコンジュゲーション化学に許容されないので、適切な中和（すなわち酸性）バッファーの選択はより困難になる。しかし、非アミン依存反応が予定される場合には、クエン酸を中和バッファーとして使用することが可能な場合がある。カルボジイミド反応が想定される場合には、中和バッファーは、おそらくは適切なキャッチバッファーと共に使用される低ｐＨグリシンになり得るが、低ｐＨグリシンベタインとキャッチバッファーが、好ましいと思われる。
【０１２９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（アミンのｐＫａ９．８）は、高ｐＨにおけるアフィニティーカラムの溶出にとって良好な候補である。この場合、中和バッファーは、約７のｐＫａを有し、ｐＨ６の溶液として添加され得る。いずれのバッファーも、高ｐＨのＣＦＥＢを中和するのに十分に濃縮されなければならず、又は可能ならばｐＨメータを用いることによってモニタしながら酸（ただし多くの場合、クエン酸、酢酸又は低ｐＨのグリシンではない）を添加して、ｐＨを調節することができる。次に、約７のｐＫａを有するバッファーをキャッチバッファーとして作用させて、非常に低いｐＨ値にオーバーシュートするのを防止する。適切な濃度の塩酸は、限定的ではないが明白な中和酸の選択肢となり得る。或いは、好ましくはｐＫａ約７のキャッチバッファーと組み合わされた低ｐＨのグリシンベタインは、前述の通り、アフィニティーカラムの溶出に使用される高ｐＨ溶液を中和するために使用することができる。
【０１３０】
本発明の方法を使用すると、注意深く選択された濃度及びｐＫａ値を有するバッファー混合物を、ＣＦＥＢバッファーにおける溶出された抗体の調製物と組み合わせるだけで、抗体を保存するための多成分中性溶液を提供し、その後その溶液のｐＨを、ｐＨ５〜９の範囲内に容易に変化させて、ほとんどいかなるコンジュゲーション反応にも、すなわちＮＨＳエステル反応、イソチオシアネート反応、チオール化試薬を伴う反応、及び抗体とナノ粒子のカルボジイミド媒介型コンジュゲーションを含む反応にも適したものにすることができる。
【０１３１】
実施例：
実施例１．ラテラルフローアッセイ
ラテラルフロー試験ストリップ（４ｍｍ幅）を、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（試験ライン）及びビオチン−ＢＳＡ（対照ライン）でスジ状としたニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｉ  Ｆｌｏｗ  ｐｌｕｓ  ９０）から調製した。ストリップをプラスチックカートリッジに収容し、金コンジュゲート試料（８０ｕｌ）を、試料パッドに添加した。カートリッジを３０分間静置し、次にＥＳＥ−Ｑｕａｎｔ  ＧＯＬＤリーダー−ＱＩＡＧＥＮを使用して読み取った。各試料に、対照ラインに結合する一定量のストレプトアビジン−金（Ｉｎｎｏｖａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−製品コード：２５０−０２００）を添加（spiked）して、各試験ストリップの動作が正確であること、及び試験ラインデータが有効であることをチェックした。
【０１３２】
実施例２．蛍光アッセイ
黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（コード６５５０７７））を、ウサギＩｇＧ５０ｕｌ（１ｕｇ／ウェル）と共に４℃において一晩インキュベートした。プレートをＴＢＳ／０．１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ（洗浄バッファー）で５回洗浄した。蛍光性抗体コンジュゲートを、ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡで連続希釈し、一定分量５０ｕｌをウェルに三連で添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを５回洗浄し、蛍光発光を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダーとｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  １．４ソフトウェアを使用して、適切な励起／発光設定（フルオレセイン、４９０ｎｍ／５３５ｎｍ；フィコエリトリン（phycoeythrin）、５３５ｎｍ／５７５ｎｍ）で読み取った。蛍光データを、コンジュゲート希釈関数としてプロットした。異なる実験で試験した添加剤に関する結果を比較するために、データを対照値（すなわち任意の試験添加剤が存在しない状態で調製したコンジュゲートのシグナル）の百分率に変換した。
【０１３３】
実施例３．カルボキシル化金とのコンジュゲーション反応
ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）１０μｇを、１０．０ＯＤにおいてカルボキシル官能基を有するコーティングされた４０ｎｍのナノ粒子（ＩｎｎｏｖａＣｏａｔ  ＧＯＬＤ、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１ｍｌ当たり、最終濃度５０ｍＭの添加剤が存在する状態で使用した。典型的に、以下の添加剤を用いて反応を引き起こした。４０ｎｍのＩｎｎｏｖａＣｏａｔ（カルボキシル化）金ナノ粒子（nanopartcles）４０μｌを、０．１ｍｇ／ｍｌのＧＡＲ４μｌ、水２０μｌ、及び１００ｍＭの添加剤、ｐＨ５．０を含有する１００ｍＭのＭＥＳバッファー８０μｌと共に５分間インキュベートした。次に、１ｍＭのＥＤＣ１６μｌを添加し、２２℃で１０分間インキュベーションした後、２０μｌの１０×ＴＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ２０及び水２０μｌを添加して、２ＯＤのコンジュゲートを得た。
【０１３４】
必要な場合には、金コンジュゲートをウサギＩｇＧ（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と２２℃で混合した。コンジュゲートは、０．２ＯＤの最終濃度（すなわち原液コンジュゲートの１／１０希釈）であった。試料を、実施例１に記載の通り、ラテラルフロー試験ストリップで三連で作動させた。
【０１３５】
実施例４．Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋフルオレセインコンジュゲーション反応に対する様々な添加剤の効果
反応は、添加剤がヤギ−抗ラビットＩｇＧのコンジュゲーション反応では最大５０ｍＭの濃度で含まれていたことを除いて、製造者の標準プロトコルに従って、フルオレセインＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋキット（製品コード７０７−００１０、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を使用して実施した。コンジュゲートを、実施例２に記載のプロトコルに従って試験した。グリシンベタインが存在する状態で調製したコンジュゲートの用量応答曲線を図１に示す。以下の化合物が存在する状態で調製したコンジュゲート（１／１００希釈）の対照値に対する％（括弧内の値）は、添加剤を含まない対照（１００％）と比較して、プロリン（５３％）、グリシンベタイン（９８％）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（９６％）、２ピコリン酸（８３％）であった。
【０１３６】
実施例５．Ｌｉｇｈｔ−Ｌｉｎｋフィコエリトリンコンジュゲーション反応におけるトリシンの効果
この方法は、ヤギ抗−ウサギＩｇＧを、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  ＰＥコンジュゲーションキット（７０３−０００５）を使用して蛍光性タンパク質フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートしたことを除いて、実施例４に記載した通りであった。トリシンが存在する状態で調製したフィコエリトリンコンジュゲートの用量応答曲線を、図２に示す。トリシンは、試験濃度範囲では、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  ＰＥコンジュゲーション反応に対してほとんど効果がない。この場合、最高濃度のトリシン（５０ｍＭ）で調製したコンジュゲートにより、添加剤が存在しない状態の対照値の９１％というシグナルが得られた。
【０１３７】
実施例６．イソチオシアネート（isothicyanate）反応に対する添加剤の効果
１０ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧ４０μｇを、５０ｍＭの添加物（１つはグリシンベタイン、クエン酸又はグリシンから）を含有する８０ｍＭのＣＨＥＳバッファーｐＨ９．０中、５０μＭのＦＩＴＣと共に、暗室中２２℃で一晩インキュベートした。コンジュゲートを、ＴＢＳバッファー中、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、溶出された溶液の吸光度値を、２８０ｎｍ及び４９５ｎｍで決定した。様々な添加剤が存在する状態の抗体色素コンジュゲートに関する色素とタンパク質のモル比を、図３に示す。グリシンは、著しい干渉を示したが、グリシンベタイン及びクエン酸は、対照（すなわち添加剤なし）の結果に類似した結果を示した。
【０１３８】
実施例７．ＮＨＳエステル反応に対する添加剤の効果
１０ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧ４０μｇを、５０ｍＭの様々な添加物の１つ（グリシンベタイン、クエン酸又はグリシンから）を含有する８０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０中、５０μＭのフルオレセイン−ＮＨＳ色素と共に、暗室中２２℃で３０分間インキュベートした。コンジュゲートを、ＴＢＳバッファー中で平衡化したＰＤ１０カラムで脱塩し、溶出された溶液の吸光度値を、２８０ｎｍ及び４９５ｎｍで決定した。様々な添加剤が存在する状態の抗体色素コンジュゲートに関する色素とタンパク質のモル比を、図４に示す。グリシンベタイン及びクエン酸は、対照（添加剤なし）の結果に類似した結果を示したが、グリシンは、実質的な干渉を示した。
【０１３９】
実施例８．チオール化試薬である２−イミノチオランに対する添加剤の効果
８０ｕｇ／ｍｌのＤＴＮＢ及び５０ｍＭの添加剤（グリシンベタイン、クエン酸又はグリシン）を含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、２００μｌの試料を、透明９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、コード６５５０７７）に三連で添加した。２ｍＭの２−イミノチオラン２０μｌを各ウェルに添加し、速やかに混合し、吸光度値を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダーとｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  １．４ソフトウェアを使用して、４０５ｎｍで３０分間かけて毎分読み取った。２−イミノチオランからのチオールの放出を、図５に示す。図は、２−イミノチオランの開環反応におけるチオールの放出を示している。対照反応では、試薬が水によって加水分解されるので、吸光度は着実に線形増加する。ベタイン又はクエン酸が存在する状態では、この比率は増大しない（対照の曲線と重ね合わせた曲線）。グリシンが存在する状態では、急速な加水分解及び２−イミノチオランの開環が生じる。グリシンベタインもクエン酸も、対照反応（添加剤なし）ほど急速にチオールを放出しなかったことが観測された。ベースラインの上昇は、アルカリｐＨ値における加水分解に対する２−イミノチオランの公知の感度に寄与し得る。
【０１４０】
実施例９．ＣＦＥＢ試料を中和するためのキャッチバッファー及び高ｐＫａ成分の使用
グリシンベタイン３ｍｌ、ｐＨ２．２５に、「キャッチ」バッファー（１ＭのＨｅｐｅｓ３０ｕｌ、ｐＨ７．５）を添加した後、高ｐＫａ成分（０．５ＭのＣＨＥＳバッファー、ｐＨ９．５）１０ｕｌの添加を反復した。ｐＨを、各添加後に測定した。ｐＨ９．５のＣＨＥＳバッファー７０ｕｌ、８０ｕｌ及び９０ｕｌを添加した後、混合物のｐＨ値は、７．２７、７．４５、及び７．６であった。図６は、キャッチバッファーが存在する場合及び存在しない場合の完全なｐＨプロファイルを示している。図は、キャッチバッファー（１ＭのＨｅｐｅｓ３０ｕｌ、ｐＨ７．５）が存在する状態（黒丸）又は存在しない状態（白丸）のいずれかで、ＣＦＥＢ（ベタイン、ｐＨ２．２５）３ｍｌを中和した後、０．５ＭのＣＨＥＳバッファー１０ｕｌ、ｐＨ９．５の添加を反復したことを示している。キャッチバッファーを添加すると、ｐＨは約１ｐＨ単位上昇したので、曲線は異なる出発位置を有している。より重要なことに、キャッチバッファー（ｐＫａ７．５）は、ｐＨ７及びｐＨ８の間のｐＨ変化に抵抗するので、ｐＨ９．５の中和バッファーを添加しても、ｐＨをｐＨ７．５近くの任意の値に調節することが容易になる。キャッチバッファーが存在しない状態では、ＣＨＥＳバッファー１０ｕｌを１回増やすと（９０ｕｌから１００ｕｌまで）、ｐＨ４．８７からｐＨ８．１９への急激な移行が見られる。
【０１４１】
実施例１０．提示用カラム
ヤギ抗−マウスセファロースビーズを、使い捨てのカラムに充填した（充填体積０．５ｍｌ）。ＴＢＳ中、マウスＩｇＧを含有する試料と共に２時間インキュベートした後、カラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウム／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、次に１０ｍＭのベタイン、ｐＨ２．３で溶出した。１００ｕｌの画分を収集し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（キャッチバッファー）及び９０ｍＭのＣＨＥＳ（高ｐＫａ成分）を含む１０×バッファーＡ１１．１ｕｌですぐに中和した。１０×バッファーＡは、適切な体積の１ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．５ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．５、及び水を混合することによって調製した。抗体（ベタイン中）と中和バッファーの体積比によって、最終キャッチバッファー濃度５ｍＭ、及びｐＨ７．１が得られる。或いは、溶出された画分を、１０×バッファーＢ（３０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び１０５ｍＭのＣＨＥＳバッファー）１１．１ｕｌで中和して、最終ｐＨが７．５５の、より弱く緩衝化された抗体調製物（すなわち３ｍＭのキャッチバッファー）を得た。
【０１４２】
精製した抗体（１ｕｇ）を、５０ｍＭのＭＥＳバッファー、ｐＨ５．０中でカルボキシル化ＩｎｎｏｖａＣｏａｔ金ナノ粒子（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートし、マウスＩｇＧ（実施例１に類似しているが、試験ラインでは異なる抗体を用いた）を剥がしたラテラルフロー膜で、ヤギ抗−マウスＩｇＧを架橋試薬として使用して試験した。ラテラルフローシグナルは、クロマトグラフィー処理しなかったマウスＩｇＧの値である１９３単位、及び架橋試薬なしの対照の値である０と比較して、異なる実験によるコンジュゲートについて１６５〜２７７単位であった。
【０１４３】
コンジュゲーション反応に使用した５０ｍＭのＭＥＳバッファー、ｐＨ５．０（最終濃度）は、その有用な緩衝化範囲の極大値であるが、３ｍＭ及び５ｍＭの濃度のキャッチバッファーを容易に克服することができた。実際、約４０ｍＭのＭＥＳは、２つの試料のｐＨをｐＨ５．０に低減するのに十分であった。最終キャッチバッファー濃度がちょうど１ｍＭのＨｅｐｅｓ（及び１０．５ｍＭのＣＨＥＳ）を用いると、ｐＨを最終的な反応ｐＨ５．０に低減するのに、わずか２２ｍＭのＭＥＳで済む。
【０１４４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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