(57)【要約】      （修正有）【課題】逆転写活性を有し、増幅効率が向上したＤＮＡポリメラーゼの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、前記ＤＮＡポリメラーゼを含有する核酸増幅用試薬、前記核酸増幅用試薬を含む核酸増幅用キット、および、前記ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅用試薬又は核酸増幅用キットを用いる、核酸増幅方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼにおいて、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列において、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼにおいて、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
５４９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びバリンからなる群より選択される非極性側鎖を有する中性アミノ酸への置換である、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
５４９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシンへの置換である、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
逆転写反応が５分以下で完了する、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
逆転写反応が１分以下で完了する、請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
更に、５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変がアルギニンへの置換である、請求項８又は９に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼを含有する、核酸増幅用試薬。
【請求項１２】
ＲＮＡからの核酸増幅のために用いられる、請求項１１に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１３】
ＲＴ−ＰＣＲ方法において用いられる、請求項１１又は１２に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を含む、核酸増幅用キット。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ、請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬、又は請求項１４に記載の核酸増幅用キットを用いる、核酸増幅方法。
【請求項１６】
ＲＮＡを検出対象核酸とする、請求項１５に記載の核酸増幅方法。
【請求項１７】
逆転写反応時間が５分以下である、請求項１５又は１６に記載の核酸増幅方法。
【請求項１８】
逆転写反応時間が１分以下である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項１９】
ＲＴ−ＰＣＲ反応を行う工程を包含する、請求項１５〜１８のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等に用いられる逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体に関する。本発明は、研究分野のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
【０００３】
代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００４】
検出対象核酸がＲＮＡである場合、例えば病原性微生物の検出において対象がＲＮＡウイルスである場合、あるいは遺伝子の発現量をｍＲＮＡの定量によって測定する場合などは、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応（逆転写反応）をＰＣＲの前に行うＲＴ−ＰＣＲも広く用いられている。
【０００５】
ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を用いることが一般的である。しかしＤＮＡポリメラーゼの中には逆転写活性も有するものがあり、近年では、このような逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合がある。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（サーマス・サーモフィルス  ＨＢ８）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｍｕｓ  ｓｐ  Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）などが挙げられる。しかしながら、これらのＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性は高いとは言い難く、さらなる改善が求められていた。また逆転写活性が低いことに起因し、これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ−ＰＣＲでは逆転写の反応時間が２０分程度を要することが一般的である。迅速な検査や診断が求められる場面では、反応時間を短縮することが望まれており、逆転写活性の改良が求められていた。
【０００６】
これまでにも、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体が種々検討されている（特許文献１、２、３）。しかしながらこのような変異体でも、反応を効率よく実施するには十分とは言えない場合があり、更なる性能の高いポリメラーゼの開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５１８９１０１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５０４１８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１８／０９６９６１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記の従来技術に鑑みてなされたものであり、逆転写活性を有し、増幅効率の高いＤＮＡポリメラーゼの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、サーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼの特定部位におけるアミノ酸を改変することで、効率よく増幅できることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は主として以下のような構成からなる。
［項１］  逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼにおいて、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
［項２］  逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列において、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
［項３］  逆転写活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼにおいて、５４９位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
［項４］  ５４９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びバリンからなる群より選択される非極性側鎖を有する中性アミノ酸への置換である、項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項５］  ５４９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシンへの置換である、項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項６］  逆転写反応が５分以下で完了する、項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項７］  逆転写反応が１分以下で完了する、項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項８］  更に、５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変を含む、項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項９］  ５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、項８に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項１０］  ５０９位に相当する部位のアミノ酸の改変がアルギニンへの置換である、項８又は９に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［項１１］  項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼを含有する、核酸増幅用試薬。
［項１２］  ＲＮＡからの核酸増幅のために用いられる、項１１に記載の核酸増幅用試薬。
［項１３］  ＲＴ−ＰＣＲ方法において用いられる、項１１又は１２に記載の核酸増幅用試薬。
［項１４］  項１１〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を含む、核酸増幅用キット。
［項１５］  項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ、項１１〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬、又は項１４に記載の核酸増幅用キットを用いる、核酸増幅方法。
［項１６］  ＲＮＡを検出対象核酸とする、項１５に記載の核酸増幅方法。
［項１７］  逆転写反応時間が５分以下である、項１５又は１６に記載の核酸増幅方法。
［項１８］  逆転写反応時間が１分以下である、項１５〜１７のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［項１９］  ＲＴ−ＰＣＲ反応を行う工程を包含する、項１５〜１８のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、逆転写活性を有し、増幅効率が向上した新規ＤＮＡポリメラーゼが提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、効率よくＲＮＡから核酸増幅を行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明は、逆転写活性を有する改変型ＤＮＡポリメラーゼに関する。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力（これを「逆転写活性」（ＲＴ活性）ともいう）及びＤＮＡを増幅する能力（これを「ＤＮＡポリメラーゼ活性」ともいう）を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼとは、１本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖を合成する酵素を意味する。逆転写活性の有無は、例えば、ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにおいて核酸増幅反応が成立するか否かで判定することができ、具体的には、後述の逆転写活性（ＲＴ活性）の評価方法に記載の手順により測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性の有無は、後述のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法において記載の方法に従って測定することができる。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼにおいて、５４９位に相当する部位でアミノ酸改変を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する。このサーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼの全長アミノ酸配列を配列番号１に示す。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするサーマス・サーモフィルス由来の遺伝子配列を配列番号２に示す。
【００１５】
一つの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、５４９位に相当する部位のアミノ酸に変異（好ましくは、他のアミノ酸への置換）を含む改変型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。改変前のアミノ酸配列は、配列番号１と完全に同一である場合に限られるものではなく、逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性が維持されている限り特に制限されないが、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列との同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更により好ましくは９８％以上、なかでも９９％以上であるアミノ酸配列から構成されるものが好適である。さらに、改変前のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで「１又は数個」とは、逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性が維持される限り特に制限されないが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個である。前記のような改変前のアミノ酸配列は、例えば、遺伝子工学的な手法により人為的に作製するものであってもよいし、天然に由来するタンパク質のアミノ酸配列であってもよい。このような天然に由来するアミノ酸配列としては、特に限定するものではないが、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）の他、Ｔｈｅｍｕｓ  ｓｐ  Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）やＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）など挙げられる。好ましくは、Ｔｔｈ又はＺ０５由来のアミノ酸配列であり、なかでもＴｔｈ由来のアミノ酸配列がとりわけ好適である。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１におけるアミノ酸配列又は前記のような配列番号１と特定の関係にあるアミノ酸配列において、５４９位のアスパラギン酸（Ｄ５４９）に相当する部位でアミノ酸改変を有する。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ５４９位に相当する部位におけるアミノ酸改変以外に、本発明の効果を奏する限りにおいて、他のアミノ酸部位においても任意のアミノ酸改変を含んでいてもよい。ＲＮＡからの核酸増幅をより確実に効率よく行うことが可能であるという観点から、配列番号１におけるアミノ酸配列又は前記のような配列番号１と特定の関係にあるアミノ酸配列において、５０９位のグルタミンに相当する部位（Ｑ５０９位）に更にアミノ酸改変を有するものとするものが好適である。
【００１７】
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ５４９Ｇ」などの表記を用いる。「Ｄ５４９Ｇ」は、第５４９番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｑ５０９Ｒ／Ｄ５４９Ｇ」は、第５０９番目のグルタミンをアルギニンに置換し、かつ、第５４９番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したことを示す。なお、本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）に相当する部位とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したときに、配列番号１の当該位置と対応する位置をいうものとする。
【００１８】
また、本明細書において「変異型ＤＮＡポリメラーゼ」又は「改変型ＤＮＡポリメラーゼ」という場合の「変異型」又は「改変型」とは、従来知られたＤＮＡポリメラーゼとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
【００１９】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列等において、５４９位に相当する部位のアミノ酸を中性アミノ酸に改変したものである。好ましくは、５４９位に相当する部位でのアミノ酸を、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、又はトリプトファンに置換したものであり；より好ましくは、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はプロリンに置換したものであり；更に好ましくは、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、又はバリンに置換したものである。なかでも、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリンは、非極性側鎖を有する中性アミノ酸であって、いずれも等電点が約６．０であることが知られており、共通の性質を示し得るアミノ酸として同等の効果が発揮されることが期待できる。
【００２０】
更なる好ましい実施形態において、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列等において、更に５０９位に相当する部位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したものである。好ましくは、５０９位に相当する部位のアミノ酸を、アルギニン、リジン、又はヒスチジンに置換したものである。例えば、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、５０９位に相当する部位のアミノ酸をアルギニン、又はリジンに置換したものであり得る。塩基性アミノ酸として、アルギニンの等電点は約１０．８、リジンの等電点は約９．７、ヒスチジンの等電点は約７．６あることが知られている。つまり、これらの塩基性アミノ酸はいずれも高い等電点を有しているので、共通の性質を示し得るアミノ酸として同等の効果が発揮されることが期待できる。
【００２１】
本発明において改変されたＤＮＡポリメラーゼを製造する方法としては、従来からの公知の方法が使用できる。好ましくは、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型（改変型）ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法が用いられる。
【００２２】
アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換することで、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットであり、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼの作製に好適に用いることができる。
【００２３】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｓｓｏ７ｄやＰＣＮＡの融合タンパク質の形態であってもよい。また、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグなどのタンパク質タグを付加した融合タンパク質であってもよい。
【００２４】
上記ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
【００２５】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００２６】
本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するか否かは、具体的には、下記のような方法により測定することができる。
【００２７】
［逆転写活性（ＲＴ活性）の評価方法］
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、従来のものと比べて逆転写活性に優れ、短時間で逆転写反応を行うことが可能であり得る。具体的には、特に限定はされないが、標的ＲＮＡの全長が例えば５０〜３００ｂｐである場合に、好ましくは１５０〜２５０ｂｐである場合に、その標的ＲＮＡからの逆転写反応が５分以下、好ましくは３分以下、より好ましくは１分以下で完了するものである。ここで、本発明において、逆転写反応が完了するとは、以下のように定義される。すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ反応が成立している条件としては、ＰＣＲ効率が７０〜１３０％以内で、かつ、相関係数ｒ２が０．９７以上であることとする。ＰＣＲ効率とは段階希釈した核酸量をＸ軸、核酸量に対応するＣｔをＹ軸として結果をプロットした検量線の傾き（ｓｌｏｐｅ）より、以下の式（１）に従って求めることができる。
・ＰＣＲ効率（％）  ＝（１０−１／Ｓｌｏｐｅ−１）×１００  ・・・式（１）
相関係数ｒ２は検量線の直線性を表す。このような形で、逆転写反応の後のＰＣＲが可能となっている場合に、逆転写反応が完了しているものとする。
このように逆転写反応が短時間で完了することにより、ＲＮＡを鋳型とする核酸増幅方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ方法）の全体に要する時間を短縮できるので、迅速な検査や診断が求められる場合には非常に有益である。
【００２８】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
本発明においては、純化されたＤＮＡポリメラーゼの活性は、以下に示す方法により測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて、７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ液：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍｌ  仔牛胸腺ＤＮＡ
【００２９】
本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知の任意の核酸増幅方法において使用することができる。核酸増幅のための温度・時間・反応サイクル等の条件は、増幅したい核酸の種類や塩基の配列、鎖長等によって変わるが、当業者であれば適宜設定できる。一例として、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法として、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを行う場合では、伸長時間を１ｋｂあたり３０秒以下にしてもよい。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、このように伸長時間が短くても十分な核酸増幅反応を行うことが可能であり得る。通常、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲでは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返す。本発明における伸長時間とは、（３）のプライマーを伸長させる反応に必要な１サイクルの時間を示す。また、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲでは、上記の（２）アニーリング及び（３）プライマーの伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。この場合には、本発明の伸長時間とは、便宜上、（２）アニーリング及び（３）伸長を並行して行う時間を伸長時間という。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応サイクルの高温下でも十分に機能し得る程度の耐熱性を備えていることが好ましい。例えば、８５℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないレベルの耐熱性を有するものが好ましい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲに用いられる反応温度としては、特に限定されないが、４０〜８０℃での逆転写反応後に９０〜１００℃での熱変性と４０〜８０℃での会合・伸長反応を行うＰＣＲ反応サイクル条件が挙げられ、好ましくは、５０〜６５℃での逆転写反応後に９４〜９８℃での熱変性と５５〜６５℃での会合・伸長反応を行うＰＣＲ反応サイクル条件（例えば、６０℃での逆転写反応後に９５℃での熱変性と６０℃での会合・伸長反応を行うＰＣＲ反応サイクル条件）を例示することができる。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、このような温度範囲において良好な活性が維持されるものであり、効果的に核酸を増幅することが可能である。
【００３１】
本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応を必要とするＲＮＡからの核酸増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）のみならず、ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）に適用することも可能である。このようなＲＴ−ＰＣＲ法及び／又はＰＣＲ法では、例えば、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法等に適用することが可能である。
【００３２】
更なる実施形態として、本発明は、前記のような改変型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬を提供する。この核酸増幅用試薬は、任意の核酸増幅反応に用いられ得るが、ＤＮＡポリメラーゼ活性だけでなく、逆転写活性も有するＤＮＡポリメラーゼを含むので、例えば、ＲＮＡからの核酸増幅のために使用することができ、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法において使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲとしては、ＲＴ−ＰＣＲやｑＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。即ち、本発明の核酸増幅用試薬は、鋳型となる標的核酸（検出対象核酸）がＤＮＡであるかＲＮＡであるかを問わずに核酸増幅できるため、汎用性の高い核酸増幅試薬とすることができる。本発明の核酸増幅用試薬における前記変異型ＤＮＡポリメラーゼの量は、本発明の効果を奏する限りにおいて限定されないが、例えば、核酸増幅反応における終濃度が０．１〜２０Ｕ／２０μｌとなるような量を例示することができる。
【００３３】
核酸増幅用試薬の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明のＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン及び／またはマンガンイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含むものとすることができる。ＲＴ−ＰＣＲに用いる試薬とする場合には、限定はされないが、例えば、反応液中終濃度が１ｍＭ以上となるマンガン塩及び／又はマグネシウム塩などの塩を含むことが好ましい。マンガン塩としては、例えば、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガン等を挙げることができる。マグネシウム塩としては、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩を挙げることができる。
【００３４】
核酸増幅用試薬の別の実施態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明におけるＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的増幅の軽減に特に有効である。
【００３５】
本発明の更なる別の一態様は、上記のような核酸増幅用試薬を含むキットであり得る。具体的には、本キットは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを鋳型とする核酸増幅のために用いられ得る。当該キットは、逆転写活性が向上したＤＮＡポリメラーゼを含むため、ＲＮＡを鋳型とする核酸増幅反応にも用いることができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等に好適に用いることができる。当該キットには、本発明の核酸増幅方法の手順を記載した添付文書等が含まれていてもよい。
【００３６】
更なる実施形態として、本発明は、前記のような本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼ、当該ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬、又は当該核酸増幅用試薬を含む核酸増幅用キットを用いる核酸増幅方法を提供する。これらのＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅用試薬、及びキットは、優れた逆転写活性と高い増幅効率を発揮することができるので、ＤＮＡからの核酸増幅方法のみならず、ＲＮＡを鋳型とする核酸増幅方法にも好適に使用され得る。従って、本発明の核酸増幅方法は、例えば、ＲＮＡからｃＤＮＡに変換する工程（逆転写反応工程ともいう）を包含するものであり得、更には、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行う工程を包含する方法であり得る。逆転写反応工程は、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを鋳型ＲＮＡと所定条件（例えば、５０〜６５℃で１〜３０分間）下で共存させることにより行うことができる。
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１
ＤＮＡポリメラーゼプラスミドの作製
人工合成により作製したＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、野生型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを組み込んだプラスミドを作製した（ｐＴｔｈ）。変異をもつプラスミドは、ｐＴｔｈを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を取扱い説明書に準じて使用して作製した。二重変異については作製した変異プラスミドを鋳型に、同様のキットを用いてさらに変異を入れることで作製した。プラスミドの作製に使用した鋳型・プライマーを表１に示す。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
【００３９】
【表１】
2020162509.tif 000002
【００４０】
実施例２
ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍｌの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型ＤＮＡポリメラーゼを得た。
【００４１】
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００４２】
（試薬）
Ａ液：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ  塩化マグネシウム、１５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ液：  １．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ  
Ｃ液：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）  
Ｄ液：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：  １ｍｇ／ｍｌ  仔牛胸腺ＤＮＡ
【００４３】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて、７５℃で１０分間反応させた。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷した。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位は、この条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４４】
上記測定の結果、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を有することが確認された。
【００４５】
実施例３
ＲＴ−ＰＣＲ法での増幅効率の評価（逆転写反応時間５分）
実施例２で作製したＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡから１ステップでのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲにはＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製、反応液中終濃度が約１５ｍＭとなる塩化マグネシウムを含有）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、およびを０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、エンテロウイルスＲＮＡ（約１９６ｂｐ）を増幅する各々４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号７及び８）、４ｐｍｏｌのＴａｑｍａｎプローブ（配列番号９）、１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液に濃度未知のエンテロウイルスＲＮＡを添加し、９０℃、３０秒の前反応の後、６０℃、５分の逆転写反応を行い、それに続いて９５℃、５秒→６０℃、１０秒を４５サイクル繰り返すスケジュールでＳｔｅｐ  Ｏｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）を用いてＰＣＲを行った。酵素には、５４９位に相当する部位でアミノ酸改変を有さない従来公知のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｒ）と、５４９位に相当する部位のアミノ酸改変を有する本発明の改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｒ／Ｄ５４９Ｇ）を使用した。
【００４６】
【表２】
2020162509.tif 000003
【００４７】
表２に、ＲＴ−ＰＣＲのＣｑ値をまとめた結果を示す。Ｃｑ値が小さいほど、ＰＣＲの増幅効率が高いことを示す。表２の結果に示されるように、５４９位に相当する部位でのアミノ酸改変を有していない従来公知のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに比べて、本発明の改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのＣｑ値は明らかに小さく、増幅効率が非常に高いことが確認された。従って、５４９位にアミノ酸改変を有することで、ＲＮＡを鋳型とする逆転写反応を含む核酸増幅方法において、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼが高い増幅感度を有することが示された。
【００４８】
実施例４
ＲＴ−ＰＣＲ法での逆転写反応効率の評価（逆転写反応時間５分、１分）
実施例２で作製した本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｒ／Ｄ５４９Ｇ）を用いて、ＲＮＡから１ステップでのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲにはＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製、反応液中終濃度が約１５ｍＭとなる塩化マグネシウムを含有）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、およびを０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ヒトβ−アクチン（約１８８ｂｐ）を増幅する各々４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１０及び１１）、４ｐｍｏｌのＴａｑｍａｎプローブ（配列番号１２）、１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液にＲＮＡを５００ｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇになるよう添加し、９０℃、３０秒の前反応の後、６０℃で１分または５分の逆転写反応を行い、それに続いて９５℃、１５秒→６０℃、１分を４５サイクル繰り返すスケジュールでＳｔｅｐ−ＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）を用いてＰＣＲを行った。酵素としては、５４９位に相当する部位でアミノ酸改変を有する本発明の改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｒ／Ｄ５４９Ｇ）を使用した。
【００４９】
【表３】
2020162509.tif 000004
【００５０】
【表４】
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【００５１】
表３（逆転写反応時間が５分間の場合）及び表４（逆転写反応時間が１分間の場合）は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるそれぞれのＣｑ値、ＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。この結果、本発明の改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応が５分の場合（表３）と１分の場合（表４）との間でＣｑ値に殆ど変化は無く、いずれの場合でもＰＣＲ効率の条件を満たすことが明らかとなった。従って、Ｄ５４９Ｇの変異を導入した本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、逆転写反応の時間が短くても十分にＲＴ−ＰＣＲを行うことができ、ＲＮＡから効率よく核酸増幅できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、分子生物学の分野において有用な改変されたＤＮＡポリメラーゼ、及びその組成物が提供される。また、本発明により、ＲＮＡを鋳型とする核酸増幅反応に要する時間を大幅に短縮することができる。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【配列表】
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