(57)【要約】【課題】効率よくＡＭＰＫ及び／又はＡＣＣのリン酸化を促進する方法を提供すること。【解決手段】トリホリン及びアストラガリンを含有し、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が、１：０．２〜３である、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリホリン及びアストラガリンを含有し、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が、１：０．２〜３である、組成物。
【請求項２】
トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が、１：０．５〜２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらに、ヒペロシド及び／又はイソケルシトリンを含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化用、及び／又はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ不活性用である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
血中糖濃度低減用である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
食品、医薬部外品、又は医薬品である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール配糖体（特にトリホリン及びアストラガリン）含有組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：ＡＭＰＫ）は真核細胞に高度に保存されているセリン／スレオニンキナーゼ（セリン／スレオニンリン酸化酵素）の一種で、細胞内のエネルギーのセンサーとして重要な役割を担っている。例えば、グルコース取り込み、解糖系、脂肪酸β酸化等を促進する作用や、グリコーゲンの合成や糖新生、脂肪酸やコレステロールの合成を抑制する作用を有する。このため、ＡＭＰＫの活性化をコントロールすることは、各種疾病（例えば糖尿病や肥満、癌）の予防又は治療のために重要である。
【０００３】
血糖値を低下させる生理機能の一つとして、「血管（血液）から骨格筋へ血中の糖を取り込んで代謝する機能」が存在する。当該機能の機序の一つとして、「骨格筋の収縮が細胞内のＡＭＰキナーゼのリン酸化（活性化）を促進し、結果的に細胞質内のグルコーストランスポーター４が細胞膜中に移動することにより骨格筋の細胞内に血中の糖が取り込まれる」作用が知られている。さらに、この骨格筋の細胞内への糖の取り込みは、骨格筋の収縮を必須の要素とするものではなく、ＡＭＰキナーゼが活性化することで生じることが判っている。したがって、運動により骨格筋を収縮させることができない状況においても、運動した場合と同様に血中の糖を骨格筋に取り込ませる機能の発現を実現できる可能性がある。近年、この点に着目した「ＡＭＰキナーゼを活性化させる物質を経口摂取することで、血中の糖濃度を低減させる試み」が幾つか提案されている（特許文献１及び２）。
【０００４】
また、ＡＭＰＫのリン酸化は、その直接のリン酸化ターゲットであるＡＣＣ（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）のリン酸化を促進するため、ＡＣＣのリン酸化はＡＭＰＫ活性化度合を示す指標でもある。ＡＣＣのリン酸化はＡＣＣを不活性化し、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへの変換が阻害され、それに続く脂質代謝が制御されると考えられている。よって、ＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化が促進されるほど、糖取り込みおよび脂質酸化（異化）が活性化されるといえる。
【０００５】
このため、特に、骨格筋細胞において、ＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化が促進されれば、血中の糖濃度を低減でき、また肥満の予防・改善ができると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−３７３２３号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７７３２号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／０３３８９８号
【特許文献４】特開２０１４−１９８６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よくＡＭＰＫ及び／又はＡＣＣのリン酸化を促進する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トリホリン及びアストラガリンを特定の質量比で組み合わせて用いることにより、特に優れたＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化促進効果が得られる可能性を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
トリホリン及びアストラガリンを含有し、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が、１：０．２〜３である、組成物。
項２．
トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が、１：０．５〜２である、項１に記載の組成物。
項３．
さらに、ヒペロシド及び／又はイソケルシトリンを含有する、項１又は２に記載の組成物。
項４．
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化用、及び／又はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ不活性用である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項５．
血中糖濃度低減用である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項６．
食品、医薬部外品、又は医薬品である、項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
優れたＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化促進効果を奏する手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トリホリン及びアストラガリンの組み合わせ量を変化させたときの、ＡＭＰキナーゼ及びＡＣＣ（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）の総量とリン酸化されたものの量とを解析した、ウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図２ａ】トリホリン及びアストラガリンの組み合わせ量を変化させたときの、ＡＭＰキナーゼの活性度合いを示す。
【図２ｂ】トリホリン及びアストラガリンの組み合わせ量を変化させたときの、ＡＣＣ（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）のリン酸化度合いを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本発明は、特定の組成物並びにその用途及び製造方法等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本発明は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
【００１３】
本発明に包含される組成物は、トリホリン及びアストラガリンを含有し、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比が１：０．２〜３である。なお、当該組成物を「本発明の組成物」ということがある。
【００１４】
前述の通り、本発明の組成物は、トリホリン及びアストラガリンを質量比１：０．２〜３で含有する。これらはポリフェノール配糖体（特にフラボノイド配糖体）であり、より限定的にはケンフェロール配糖体である。トリホリン（Trifolin）は、ケンフェロール−３−Ｏ−ガラクトシド（ＫＧＡ）とも呼ばれる。また、アストラガリン（Astragalin）は、ケンフェロール−３−Ｏ−グルコシド（ＫＧＵ）とも呼ばれる。
【００１５】
【化１】
2020002089.tif 000002
【００１６】
上記の通り、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比（トリホリン：アストラガリン）は、１：０．２〜３である。当該比率範囲の上限若しくは下限は、例えば０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、又は２．９であってもよい。例えば、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比は、１：０．３〜２．５であることがより好ましく、１：０．５〜２であることがさらに好ましく、１：１〜２であることがよりさらに好ましい。
【００１７】
本発明の組成物は、さらに別のポリフェノール配糖体を含有してもよい。別のポリフェノール配糖体としては、フラボノイド配糖体が好ましく、ケルセチン配糖体がより好ましく、中でもヒペロシド及び／又はイソケルシトリンを含有することが好ましい。ヒペロシド（hyperoside）は、ケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシド（ＱＧＡ）とも呼ばれる。また、イソケルシトリン（isoquercitin）は、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシド（ＱＧＵ）とも呼ばれる。
【００１８】
【化２】
2020002089.tif 000003
【００１９】
本発明の組成物がヒペロシド及びイソケルシトリンを含有する場合、例えば、ヒペロシド及びイソケルシトリンの含有質量比（ヒペロシド：イソケルシトリン）が、１：０．２〜３であることが好ましい。当該比率範囲の上限若しくは下限は、例えば０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、又は２．９であってもよい。例えば、トリホリン及びアストラガリンの含有質量比は、１：０．３〜２．８であることがより好ましく、１：０．５〜２．５であることがさらに好ましく、１：１〜２．３であることがよりさらに好ましい。
【００２０】
なお、このようなポリフェノール配糖体は、公知の化合物であり、公知の方法又は公知の方法から容易に想到する方法により調製することができる。また、市販品を購入して用いることもできる。例えば、EXTRASYNTHESE S.A.、TOCRIC BIO-TECNOLOGY、Sigma-Aldrich、AOBIOUS INC、EMMX Biotechnology LLC、Quality Phytochemicals LLC、INDOFINE Chemical Company, Inc等から購入することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、さらにその他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的又は食品衛生学的に許容され得る担体などが挙げられる。このような担体としては、例えばそれぞれの技術分野において公知のものを用いることができる。なお、本発明の組成物におけるトリホリン及びアストラガリンの含有量は、本発明の効果が奏される範囲であれば特に制限されないが、例えば０．００１〜１００質量％程度、０．００５〜５０質量％程度、又は０．０１〜３０質量％程度とすることができる。
【００２２】
また、本発明の組成物は、食品、医薬品、又は医薬部外品として用いることができる。また、本発明の組成物の摂取方法は、本発明の効果が奏される限り特に制限されないが、例えば経口摂取、経血管投与、皮膚投与等が挙げられ、特に経口投与が好ましい。なお、食品としては、通常の食品のみならず、例えば機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、運動療法用食品、痩身用食品等が好ましく挙げられる。
【００２３】
本発明の組成物の形態としては特に限定されないが、経口組成物として利用する場合には、例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、サプリメント、チュアブル錠、飲料、粉末飲料、顆粒、フィルムなどの形態とすることができる。また、例えば、茶系飲料、スポーツ飲料、美容飲料、果汁飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、水や湯、炭酸水等で希釈する濃縮タイプの飲料等の飲料、水や湯等に溶解又は懸濁させて飲用する粉末や顆粒、タブレット等の乾燥固形物、タブレット菓子、ゼリー類、スナック類、焼き菓子、揚げ菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、グミなどの菓子類、スープ類、めん類、米飯類、シリアル等などの食品形態にすることもできる。このうち通常の生活において利用する場合には、サプリメントタイプ、チュアブル錠、ワンショットドリンクタイプなどの形態が好ましく、運動効果を高める目的で摂取する場合には、スポーツ飲料などの飲料の形態が最も好ましい。さらに、これらの経口組成物は容器に充填された容器詰食品として消費者に提供することができる。
【００２４】
本発明の組成物は、ＡＭＰキナーゼ活性化（すなわちリン酸化促進）効果、及びＡＣＣ（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）のリン酸化促進（すなわち不活性化促進）効果を奏する。当該効果は、骨格筋細胞において特に好ましく奏される。これにより、例えば糖代謝を改善する効果、特に血中糖濃度低減効果を好ましく奏し得る。本発明の組成物は、これらの効果を得るために、好ましく用いることができる。特に、ＡＣＣのリン酸化促進（すなわち、ＡＣＣの不活性化促進）効果については、トリホリン単独ではほとんど効果が無いところ、トリホリン及びアストラガリンを上記特定質量比率で含有することによって、特に優れた効果を得ることができる。
【００２５】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００２６】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００２８】
表１に示すように、トリホリン（ＫＧＡ）及び／又はアストラガリン（ＫＧＵ）の合計濃度が２０μＭとなるよう、低グルコースＤＭＥＭ培地に加えて溶解し、以下の実験に用いた。なお、トリホリン及びアストラガリンは分子量が同じなので、これらの濃度比は質量比と同値である。ネガティブコントロールとしては何も添加していない培地、ポジティブコントロールとしてＡＩＣＡＲ（最終濃度２ｍＭ）を用いた。なお、ＡＩＣＡＲは、細胞に取り込まれると代謝されてＡＭＰの疑似体になる物質で、骨格筋でＡＭＰＫをよく活性化させることが知られている。
【００２９】
マウス骨格筋管細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を６穴細胞培養プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清および１％抗菌剤を添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％二酸化炭素存在下で３日間培養した。細胞がコンフルエントになった状態で２％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに培養して筋管へ分化させた細胞を実験に用いた。細胞を３時間無血清培地にてスタベーション後、最終濃度の１０倍に調製しておいたトリホリン及び／又はアストラガリンの含有培地を１／１０量加え、２時間処理した。ＰＢＳ（−）で二度細胞を洗浄後、フォスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を添加した細胞溶解バッファーを８０μＬ加え、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。細胞溶解後、遠心分離にて上清を回収した。上清は測定に用いるまで−８０℃で保存した。上清のタンパク質濃度を測定し、サンプル間のタンパク濃度を一定に調整した。上清のタンパク濃度を調整後、サンプルバッファ（サーモ）を加え、熱変性させたものをウェスタンブロッティングに用いた。
【００３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ブロッキング後、１次抗体としてウサギをホストした抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体、抗総ＡＭＰＫα抗体、抗リン酸化ＡＣＣ抗体、又は抗総ＡＣＣ抗体（すべてＣＳＴ）を反応させた。よく洗浄後、ＨＲＰラベルされた抗ウサギ二次抗体を反応させた。よく洗浄後、ＣＣＤカメラ画像解析装置（ＧＥ）を用いてメンブレン上の化学発光（バンド）を検出した（図１）。ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）によりバンドの濃さを定量した。活性の度合い（すなわち、「リン酸化ＡＭＰＫ／総ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ／ｔＡＭＰＫ）」又は「リン酸化ＡＣＣ／総ＡＣＣ（ｐＡＣＣ／ｔＡＣＣ）」）はネガティブコントロール群を１とした相対値で示した（図２ａ及び図２ｂ）。
【００３１】
【表１】
2020002089.tif 000004
【図１】
2020002089.tif 000005
【図２ａ】
2020002089.tif 000006
【図２ｂ】
2020002089.tif 000007