(57)【要約】      （修正有）【課題】ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ阻害活性を有するピラゾール−アミド化合物の製造方法の提供。【解決手段】下記化合物２の製造方法であって、最初の工程で、２’−クロロ−４’−メトキシビフェニル−２−カルボン酸エチルを生成することを含む。2020189855.tif 000061【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物(2)：
【化１】
2020189855.tif 000048
又はその製薬上許容される塩の製造方法であって、下記式：
【化２】
2020189855.tif 000049
で表される化合物又はその塩をEaton試薬と反応させて下記式：
【化３】
2020189855.tif 000050
で表される化合物を得る工程、得られた化合物のメトキシ基を脱メチル化して下記式：
【化４】
2020189855.tif 000051
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を4-ブロモ酪酸エチルと反応させて下記式：
【化５】
2020189855.tif 000052
で表される化合物を得る工程、得られた化合物をトリメチル（トリフルオロメチル）シランと反応させて下記式：
【化６】
2020189855.tif 000053
で表される化合物を得る工程、得られた化合物を加水分解して下記式：
【化７】
2020189855.tif 000054
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を(1S)-1-(4-メチルフェニル)エチルアミンと反応させて下記式：
【化８】
2020189855.tif 000055
で表される化合物を得る工程、得られた化合物を塩酸で処理して下記式：
【化９】
2020189855.tif 000056
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を脱3-カルボキシプロピル化して下記式：
【化１０】
2020189855.tif 000057
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩をトルエン-4-スルホン酸  3-ヒドロキシ-3-メチルブチルエステルと反応させて下記式：
【化１１】
2020189855.tif 000058
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩をパラジウム触媒存在下、2-メチル-2-[4-(4,4,5,5-テトラメチル[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]プロピオン酸エチルと反応させて下記式：
【化１２】
2020189855.tif 000059
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を加水分解して下記式：
【化１３】
2020189855.tif 000060
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び得られた化合物又はその塩を縮合剤存在下、アンモニアと反応させて前記の化合物(2)又はその製薬上許容される塩を得る工程、を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾール−アミド化合物およびその医薬用途である。より詳細には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（以下、ＰＤＨＫと略記する。）阻害活性を有するピラゾール−アミド化合物またはその製薬上許容される塩、それらを含む医薬組成物、および糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の予防または治療剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織内において、エネルギーを使う反応、例えば、生合成、能動輸送、筋肉の収縮等ではアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解により、エネルギーが供給される。ＡＴＰはグルコースまたは遊離脂肪酸のようなエネルギーの多い代謝燃料の酸化により生成される。筋肉のような酸化的組織において、ＡＴＰの大部分はクエン酸サイクルに入るアセチルＣｏＡから生じる。アセチルＣｏＡは解糖経路によるグルコースの酸化または遊離脂肪酸のβ酸化によって生成される。グルコースからのアセチルＣｏＡ産生を調節する司令的役割を果たす酵素はＰＤＨである。ＰＤＨはピルビン酸からアセチルＣｏＡおよび二酸化炭素への酸化と同時に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のＮＡＤＨへの還元を触媒する（例えば、非特許文献１、２）。
【０００３】
ＰＤＨは、ミトコンドリアマトリックスに局在する３つの酵素成分（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）といくつかのサブユニットからなる多重酵素複合体である。Ｅ１、Ｅ２およびＥ３は、それぞれ、ピルビン酸の脱炭酸、アセチルＣｏＡの生成およびＮＡＤの還元によるＮＡＤＨの生成を行う。
ＰＤＨには、調節的役割をもつ２種類の酵素が結合している。一つはＰＤＨＫであり、ＰＤＨに特異性を示すプロテインキナーゼである。その役割は、複合体のＥ１αサブユニットをリン酸化して不活性化することである。他の一つはＰＤＨホスファターゼであり、Ｅ１αサブユニットの脱リン酸化を介してＰＤＨを活性化する特異的なプロテインホスファターゼである。活性（脱リン酸化）状態のＰＤＨの割合は、キナーゼ活性とホスファターゼ活性のバランスにより決定される。キナーゼ活性は、代謝基質の相対濃度により調節を受ける。例えば、キナーゼ活性は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ、アセチルＣｏＡ／ＣｏＡおよびＡＴＰ／アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の各比率の上昇により活性化し、ピルビン酸で阻害される（例えば、非特許文献３）。
【０００４】
哺乳類の組織においては４種のＰＤＨＫアイソザイムが同定されている。なかでも、ＰＤＨＫ２は、糖代謝に関与する肝臓、骨格筋、脂肪組織を含む広範囲な組織に発現している。さらに、ＰＤＨＫ２は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤやアセチルＣｏＡ／ＣｏＡの上昇による活性化およびピルビン酸による阻害への感受性が比較的高いことから、短期的な糖代謝調節に関与することが示唆される（例えば、非特許文献４）。
【０００５】
また、ＰＤＨＫ１は、心筋、骨格筋、膵β細胞等に多く発現している。さらに、ＰＤＨＫ１は、虚血状態において、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）1の活性化を介して発現が誘導されることから、虚血性疾患や癌性疾患に関与することが示唆される（例えば、非特許文献５）。
【０００６】
インスリン依存性（１型）糖尿病および非インスリン依存性（２型）糖尿病等の疾患では、脂質の酸化が亢進し、同時にグルコースの利用が低下する。このグルコース利用低下が高血糖を呈する一因となる。１型および２型糖尿病、肥満のような酸化的グルコース代謝が低下した状態においてＰＤＨ活性は低下していることから、１型および２型糖尿病におけるグルコース利用の低下にはＰＤＨ活性の低下が関与することが示唆される（例えば、非特許文献６、７）。
また、１型および２型糖尿病では肝臓における糖新生が亢進しており、このことも高血糖を呈する一因となる。ＰＤＨ活性の低下はピルビン酸を上昇させ、その結果、肝臓における糖新生基質としての乳酸利用能が増大する。このことから、１型および２型糖尿病における糖新生の亢進にＰＤＨ活性の低下が関与する可能性がある（例えば、非特許文献８、９）。
ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化すると、グルコース酸化速度が増加すると考えられる。その結果、生体のグルコース利用が亢進し、また、肝臓における糖新生が抑制されることで、１型および２型糖尿病における高血糖を改善することができると期待される（例えば、非特許文献１０、１１、１２）。
糖尿病に関与する別の因子はインスリン分泌障害であり、これには膵β細胞におけるＰＤＨ活性の低下やＰＤＨＫ１、２および４の誘導が関与することが知られている（例えば、非特許文献１３、１４）。
また、糖尿病による持続的な高血糖は糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の合併症を起こすことが知られている。チアミンやα−リポ酸は補酵素としてＰＤＨの活性化に寄与する。これら、もしくは、チアミン誘導体やα−リポ酸誘導体は糖尿病合併症の治療に有望な効果を有することが示されている。従って、ＰＤＨの活性化は、糖尿病合併症を改善することができると期待される（例えば、非特許文献１５、１６）。
【０００７】
虚血状態では、酸素供給が限られるため、グルコースおよび脂肪酸両方の酸化が低下し、組織における酸化的リン酸化によって産生されるＡＴＰ量が減少する。十分な酸素がない状態では、ＡＴＰレベルを維持しようとして嫌気的解糖が亢進する。その結果、乳酸の増加および細胞内ｐＨの低下が起こる。エネルギーを消費してイオンの恒常性を維持しようとするが、異常に低いＡＴＰレベルおよび細胞の浸透性崩壊の結果、細胞死が起こる。加えて、アデノシン一リン酸活性化キナーゼが虚血中に活性化されてリン酸化することで、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを不活化する。組織のマロニルＣｏＡレベルが低下することで、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−Ｉ活性が上昇し、アシルＣｏＡのミトコンドリア内への輸送が促進されるため、脂肪酸酸化がグルコース酸化よりも有利となる。グルコースの酸化は、脂肪酸の酸化より消費される酸素１分子あたりのＡＴＰ産生量が高い。よって、虚血状態では、ＰＤＨを活性化することによりエネルギー代謝をグルコース酸化優位に移行させると、ＡＴＰレベルを維持する能力が高まると考えられる（例えば、非特許文献１７）。
また、ＰＤＨを活性化すると、解糖を経て生成したピルビン酸が酸化され、乳酸産生が低下するので、虚血組織におけるプロトン負荷の正味の低下が起こると考えられる。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、虚血性疾患、例えば、心筋虚血において、保護的に作用することが期待される（例えば、非特許文献１８、１９）。
【０００８】
ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化する薬剤は、ピルビン酸代謝を亢進させることにより、乳酸産生を減少させると考えられる。従って、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症または敗血症のような高乳酸血症に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２０）。
【０００９】
癌細胞では、ＰＤＨＫ１または２の発現が上昇している。また、癌細胞では、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生が低下し、細胞質における嫌気的解糖系を介したＡＴＰ産生が増加している。ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化すると、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化が亢進し、活性酸素の産生が高まることで、癌細胞のアポトーシスが誘導されると期待される。よって、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は癌性疾患治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２１）。
【００１０】
また、肺高血圧症は肺動脈の細胞増殖が亢進し、肺動脈が部分的に縮小することにより血圧が高くなることを特徴とする疾患である。肺高血圧症における肺動脈細胞のＰＤＨを活性化すると、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化が亢進し、活性酸素の産生が高まることで、肺動脈細胞のアポトーシスを誘導することが期待される。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、肺高血圧症に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２２）。
【００１１】
アルツハイマー病では大脳におけるエネルギー産生及びグルコース代謝が低下し、また、ＰＤＨ活性が低下している。ＰＤＨ活性が低下するとアセチルＣｏＡの産生が低下する。アセチルＣｏＡはクエン酸回路を介して電子伝達系でＡＴＰ産生に利用される。また、アセチルＣｏＡは神経伝達物質の一つであるアセチルコリンを合成する原料である。よって、アルツハイマー病における脳ＰＤＨ活性の低下は、ＡＴＰ産生の低下によって神経細胞死を引き起こすと考えられる。また、コリン作動性神経において、その伝達物質であるアセチルコリン合成が抑制され、記憶力の低下等を引き起こすと考えられる。アルツハイマー病において脳のＰＤＨを活性化すると、エネルギー産生及びアセチルコリン合成の亢進が期待される。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、アルツハイマー病に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２３、２４）。
【００１２】
ＰＤＨ活性化作用を有する薬剤であるジクロロ酢酸は、糖尿病、心筋虚血、心筋梗塞、狭心症、心不全、高乳酸血症、脳虚血症、脳卒中、末梢動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、癌性疾患、肺高血圧症の治療に有望な効果を有することが示されている（例えば、非特許文献１０、１８、２０、２２、２５、２６、２７）。
【００１３】
これらの知見から、ＰＤＨＫ阻害剤は、グルコース利用障害に関連した疾患、例えば、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）の治療または予防に有益であると考えられる。また、ＰＤＨＫ阻害剤は、組織へのエネルギー基質供給が制限される疾患、例えば、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症および脳卒中の治療または予防に有益であると考えられる。さらに、ＰＤＨＫ阻害剤はミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症等の治療または予防に有益であると考えられる。
【００１４】
したがって、ＰＤＨＫ阻害剤は、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の治療または予防に有益であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Reed LJ, HackertML. Structure-function relationships in dihydrolipoamideacyltransferases. J Biol Chem. 1990 Jun 5;265(16):8971-4.
【非特許文献２】Patel MS, Roche TE. Molecular biology and biochemistry of pyruvate dehydrogenase complexes. FASEB J. 1990 Nov;4(14):3224-33.
【非特許文献３】Sugden MC, Holness MJ. Recent advances in mechanisms regulating glucose oxidation at the level of the pyruvate dehydrogenase complex by PDKs. Am J PhysiolEndocrinol Metab. 2003 May;284(5):E855-62.
【非特許文献４】Bowker-Kinley MM, Davis WI, Wu P, Harris RA, Popov KM. Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex. BiochemJ. 1998 Jan 1;329 ( Pt 1):191-6.
【非特許文献５】Kim JW, TchernyshyovI, Semenza GL, Dang CV. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 2006 Mar;3(3):177-85.
【非特許文献６】Morino K, Petersen KF, Dufour S, Befroy D, Frattini J, Shatzkes N, et al. Reduced mitochondrial density and increased IRS-1 serine phosphorylation in muscle of insulin-resistant offspring of type 2 diabetic parents. J Clin Invest. 2005 Dec;115(12):3587-93.
【非特許文献７】Caterson ID, Fuller SJ, Randle PJ. Effect of the fatty acid oxidation inhibitor 2-tetradecylglycidic acid on pyruvate dehydrogenase complex activity in starved and alloxan-diabetic rats. Biochem J. 1982 Oct 15;208(1):53-60.
【非特許文献８】Boden G, Chen X, Stein TP. Gluconeogenesis in moderately and severely hyperglycemic patients with type 2 diabetes mellitus. Am J Physiol EndocrinolMetab. 2001 Jan;280(1):E23-30.
【非特許文献９】Shangraw RE, Fisher DM. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of dichloroacetate in patients with cirrhosis.ClinPharmacolTher. 1999 Oct;66(4):380-90.
【非特許文献１０】Stacpoole PW, Moore GW, Kornhauser DM. Metabolic effects of dichloroacetate in patients with diabetes mellitus and hyperlipoproteinemia. N Engl J Med. 1978 Mar 9;298(10):526-30.
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【非特許文献１２】Jeoung NH, Rahimi Y, Wu P, Lee WN, Harris RA. Fasting induces ketoacidosis and hypothermia in PDHK2/PDHK4-double-knockout mice. BiochemJ. 2012 May 1;443(3):829-39.
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【非特許文献２３】Saxena U. Bioenergetics breakdown in Alzheimer's disease: targets for new therapies. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 2011;3(2):133-9.
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【非特許文献２５】Marangos PJ, Turkel CC, DziewanowskaZE, Fox AW. Dichloroacetate and cerebral ischaemiatherapeutics. Expert OpinInvestig Drugs. 1999 Apr;8(4):373-82.
【非特許文献２６】Calvert LD, Shelley R, Singh SJ, Greenhaff PL, BankartJ, Morgan MD, et al. Dichloroacetate enhances performance and reduces blood lactate during maximal cycle exercise in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir CritCare Med. 2008 May 15;177(10):1090-4.
【非特許文献２７】Flavin DF. Non-Hodgkin's Lymphoma Reversal with Dichloroacetate. J Oncol. Hindawi Publishing Corporation Journal of OncologyVolume 2010, Article ID 414726, 4 pages doi:10.1155/2010/414726.
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、以下の通りである。
［１］式［Ｉ］：
【００１７】
【化１】
2020189855.tif 000002
【００１８】
［式中、ｎは１または２を示す。］
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、
［２］式：
【００１９】
【化２】
2020189855.tif 000003
【００２０】
で表される化合物、
［３］式［ＩＩ］：
【００２１】
【化３】
2020189855.tif 000004
【００２２】
で表される上記［２］記載の化合物、
［４］式［ＩＩｈ］：
【００２３】
【化４】
2020189855.tif 000005
【００２４】
で表される上記［２］記載の化合物、
［５］式［ＩＩＩ］：
【００２５】
【化５】
2020189855.tif 000006
【００２６】
で表される化合物、
［６］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩、および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物、
［７］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、ＰＤＨＫ阻害剤、
［８］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、ＰＤＨＫ１阻害剤、
［９］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、ＰＤＨＫ２阻害剤、
［１０］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、血糖低下剤、
［１１］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、乳酸低下剤、
［１２］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、糖尿病、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症、心不全、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌または肺高血圧症の予防または治療剤、［１２’］上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含む、糖尿病、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症、心不全、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の予防または治療剤、
［１３］糖尿病が、１型糖尿病または２型糖尿病である上記［１２］記載の予防または治療剤、
［１４］糖尿病合併症が、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症および白内障からなる群から選択される、上記［１２］記載の予防または治療剤、
［１５］心不全が、急性心不全または慢性心不全である上記［１２］記載の予防または治療剤、
［１６］（ａ）上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含有する医薬組成物、
［１６’］（ａ）上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含有する医薬組成物、
［１７］（ａ）上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［１７’］（ａ）上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［１８］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ阻害方法、
［１９］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ１阻害方法、
［２０］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ２阻害方法、
［２１］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物における糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌または肺高血圧症の予防または治療方法、
［２１’］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物における糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症またはアルツハイマー病の予防または治療方法、
［２２］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物における血糖値の低下方法、
［２３］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、当該哺乳動物における乳酸値の低下方法、
［２４］ＰＤＨＫ阻害剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２５］ＰＤＨＫ１阻害剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２６］ＰＤＨＫ２阻害剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２７］血糖値低下剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２８］乳酸値低下剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２９］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌または肺高血圧症の予防または治療剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［２９’］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の予防または治療剤を製造するための上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩の使用、
［３０］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌または肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせての、上記［２４］乃至［２９］のいずれかに記載の使用、ならびに［３０’］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症またはアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせての、上記［２４］乃至［２９］のいずれかに記載の使用等に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩は、ＰＤＨＫ活性を阻害するので、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病等の治療剤または予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、非絶食ＳＤ（ＩＧＳ）ラットにおける被験化合物の肝ＰＤＨ活性に対する効果（肝ｔｏｔａｌ  ＰＤＨ活性に対する肝ａｃｔｉｖｅ  ＰＤＨ活性の百分率）を示す（平均±標準偏差（ｎ＝３））。
【図２】図２は、非絶食ＳＤ（ＩＧＳ）ラットにおける被験化合物の脂肪組織ＰＤＨ活性に対する効果（脂肪組織ｔｏｔａｌ  ＰＤＨ活性に対する脂肪組織ａｃｔｉｖｅ  ＰＤＨ活性の百分率）を示す（平均±標準偏差（ｎ＝３））。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明化合物は、一般式［Ｉ］：
【００３０】
【化６】
2020189855.tif 000007
【００３１】
［式中、ｎは１または２を示す。］
で表される化合物（以下、化合物（１）ともいう）またはその製薬上許容される塩である。
【００３２】
本発明化合物は、式［ＩＩ］：
【００３３】
【化７】
2020189855.tif 000008
【００３４】
で表される化合物（２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド）（以下、化合物（２）ともいう）である。
本発明化合物は、式［ＩＩｈ］：
【００３５】
【化８】
2020189855.tif 000009
【００３６】
で表される化合物（２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２-メチルプロパンアミド・１水和物）（以下、化合物（２ｈ）ともいう）である。
【００３７】
本発明化合物は、式［ＩＩＩ］：
【００３８】
【化９】
2020189855.tif 000010
【００３９】
で表される化合物（２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド）（以下、化合物（３）ともいう）である。
【００４０】
本発明化合物の製薬上許容される塩とは、本発明化合物と無毒の塩を形成するものであればいかなる塩でもよく、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、アミノ酸との塩等が挙げられる。
【００４１】
無機酸との塩として、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等との塩が挙げられる。
有機酸との塩として、例えば、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
アミノ酸との塩として、例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。
本発明化合物の製薬上許容される塩として、好ましくは、無機酸との塩である。
【００４２】
また、本発明化合物またはその製薬上許容される塩は、同位元素（例えば、３Ｈ、２Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等）で標識されていてもよい。
【００４３】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩としては、実質的に精製された、化合物（１）またはその製薬上許容される塩が好ましい。さらに好ましくは、８０％以上の純度に精製された、本発明化合物またはその製薬上許容される塩である。
【００４４】
一般式［Ｉ］で表される化合物又はその製薬上許容される塩は溶媒和物として存在することもある。「溶媒和物」とは、一般式［Ｉ］で表される化合物又はその医薬上許容される塩に、溶媒の分子が配位したものであり、水和物も包含される。溶媒和物は、製薬上許容される溶媒和物が好ましい。例えば、一般式［Ｉ］で表される化合物又はその医薬上許容される塩の水和物、エタノール和物、ジメチルスルホキシド和物等が挙げられる。具体的には、一般式［Ｉ］で表される化合物の半水和物、１水和物、２水和物又は１エタノール和物、或いは一般式［Ｉ］で表される化合物の製薬上許容される塩の１水和物又は２塩酸塩の２／３エタノール和物等が挙げられる。公知の方法に従って、その溶媒和物を得ることができる。
【００４５】
「医薬組成物」としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、あるいは外用剤、坐剤、注射剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤等の非経口剤が挙げられる。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、医薬製剤の技術分野において自体公知の方法に従って、本発明化合物またはその製薬上許容される塩を、少なくとも１種以上の製薬上許容される担体等と、適宜、適量混合等することによって、製造される。該医薬組成物中の本発明化合物またはその製薬上許容される塩の含有率は、剤形、投与量等により異なるが、例えば、組成物全体の０．１から１００重量％である。
【００４７】
該「製薬上許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機または無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤等、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。さらに必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物が用いられる。
【００４８】
「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム等が挙げられる。
【００４９】
「崩壊剤」としては、例えば、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース等が挙げられる。
【００５０】
「結合剤」としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、結晶セルロース、白糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、アラビアゴム等が挙げられる。
【００５１】
「流動化剤」としては、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００５２】
「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。
【００５３】
「溶剤」としては、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
【００５４】
「溶解補助剤」としては、例えば、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５５】
「懸濁化剤」としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。
【００５６】
「等張化剤」としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【００５７】
「緩衝剤」としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５８】
「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００５９】
「保存剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
【００６０】
「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００６１】
「着色剤」としては、例えば、食用色素（例：食用赤色２号もしくは３号、食用黄色４号もしくは５号等）、β−カロテン等が挙げられる。
【００６２】
「甘味剤」としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム等が挙げられる。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、ヒトはもちろんのこと、ヒト以外の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）に対しても、経口的または非経口的（例：局所、筋肉内、皮下、直腸、静脈投与等）に投与することができる。投与量は、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート等により異なるが、例えば、成人の患者（体重：約６０ｋｇ）に経口投与する場合の投与量は、有効成分である化合物（１）として、１日あたり、通常約１ｍｇから１ｇの範囲である。これらの量を１回から数回に分けて投与することができる。
【００６４】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩は、ＰＤＨＫ（ＰＤＨＫ１および／またはＰＤＨＫ２）を阻害する活性を有するので、グルコース利用障害に関連した疾患、例えば、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）の治療または予防に有益であると考えられる。また、ＰＤＨＫ阻害剤は、組織へのエネルギー基質供給が制限される疾患、例えば、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症および脳卒中の治療または予防に有益であると考えられる。さらに、ＰＤＨＫ阻害剤はミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、アルツハイマー病等の治療または予防に有益であると考えられる。
【００６５】
糖尿病とは、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病である。
【００６６】
糖尿病合併症としては、例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障が挙げられる。
【００６７】
心不全とは、例えば、急性心不全、慢性心不全である。
【００６８】
「ＰＤＨＫを阻害する」とは、ＰＤＨＫの機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味する。「ＰＤＨＫを阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫを阻害する」である。「ＰＤＨＫ阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ阻害剤」である。
【００６９】
「ＰＤＨＫ１を阻害する」とは、ＰＤＨＫ１の機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味し、例えば、後述する試験例１の条件に基づいて、ＰＤＨＫ１の機能を阻害することを意味する。「ＰＤＨＫ１を阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ１を阻害する」である。「ＰＤＨＫ１阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ１阻害剤」である。さらに好ましくは、「ヒト標的臓器におけるＰＤＨＫ１阻害剤」である。
【００７０】
「ＰＤＨＫ２を阻害する」とは、ＰＤＨＫ２の機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味し、例えば、後述する試験例１の条件に基づいて、ＰＤＨＫ２の機能を阻害することを意味する。「ＰＤＨＫ２を阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ２を阻害する」である。「ＰＤＨＫ２阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ２阻害剤」である。さらに好ましくは、「ヒト標的臓器におけるＰＤＨＫ２阻害剤」である。
【００７１】
「ＰＤＨを活性化する」とは、標的臓器（例、肝臓、骨格筋、脂肪組織、心臓、脳）等または癌等のＰＤＨを活性化することを意味する。
【００７２】
「血糖値を低下させる」とは、血中（血清中または血漿中を含む）のグルコース濃度を低下させることを意味し、好ましくは高い血糖値を低下させることを意味する。さらに好ましくは、血糖値を、治療学的に有効なヒトの正常値に低下させることを意味する。
【００７３】
「乳酸値を低下させる」とは、血中（血清中または血漿中を含む）の乳酸濃度を低下させることを意味し、好ましくは高い乳酸値を低下させることを意味する。さらに好ましくは、乳酸値を、治療学的に有効なヒトの正常値に低下させることを意味する。
【００７４】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩を、医薬分野で行われている一般的な方法で、１または複数の他の薬剤（以下、併用薬剤ともいう）と組み合わせて使用（以下、併用ともいう）することができる。
【００７５】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩、および併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、配合剤として投与してもよいし、両製剤を同時にまたは一定の間隔をおいて投与してもよい。また、本発明の医薬組成物および併用薬剤とからなるキットであることを特徴とする医薬として用いてもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート、投与時間、組み合わせ等により適宜選択することができる。併用薬剤の投与形態は、特に限定されず、本発明化合物またはその製薬上許容される塩と併用薬剤とが組み合わされていればよい。
【００７６】
併用薬剤としては、例えば、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の治療剤および／または予防剤等が挙げられ、これらのうち１剤から複数剤と本発明化合物またはその製薬上許容される塩とを組み合わせて用いることができる。
【００７７】
「糖尿病の治療剤および／または予防剤」としては、例えば、インスリン製剤、スルホニルウレア系血糖降下剤、メトフォルミン、ＤＰＰ−４阻害剤、インスリン抵抗性改善薬（例えばチアゾリジン誘導体）、ＧＬＰ−１受容体作動薬等が挙げられる。
【実施例】
【００７８】
次に、本発明化合物またはその製薬上許容される塩の製造方法を実施例によって具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
本製法に記載はなくとも、必要に応じて官能基に保護基を導入し、後工程で脱保護を行う；官能基を前駆体として各工程に処し、しかるべき段階で所望の官能基に変換する；各製法および工程の順序を入れ替える等の工夫により効率のよい製造を実施してもよい。
また、各工程において、反応後の処理は、通常行われる方法で行えばよく、単離精製は、必要に応じて、結晶化、再結晶、蒸留、分液、シリカゲルクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ等の慣用される方法を適宜選択し、また組み合わせて行えばよい。全ての試薬および溶媒は、市販用の品質を備えており、精製することなく使用した。
【００７９】
百分率％は重量％を示す。その他の本文中で用いられている略号は下記の意味を示す。
ｓ：シングレット
ｄ：ダブレット
ｔ：トリプレット
ｑ：カルテット
ｍ：マルチプレット
ｂｒ：ブロード
ｄｄ：ダブルダブレット
ｔｄ：トリプルダブレット
ｄｄｄ：ダブルダブルダブレット
Ｊ：カップリング定数
ＣＤＣｌ３：重クロロホルム
ＤＭＳＯ−Ｄ６：重ジメチルスルホキシド
１Ｈ  ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＤＰＰＡ：ジフェニルリン酸アジド
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−Ｄ６中、テトラメチルシランを内部標準として測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
【００８０】
（１０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０））
リン酸二水素ナトウム（３．６０ｇ）を水（３０００ｍｌ）に溶解し、リン酸を用いてｐＨを２．０にすることで、標題緩衝液を得た。
【００８１】
ＨＰＬＣ分析条件
分析条件１
測定機器：ＨＰＬＣシステム  島津製作所  高速液体クロマトグラフ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：ダイセル  ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−３Ｒ  ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：（Ａ液）１０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０）、（Ｂ液）アセトニトリル
移動相の組成（Ａ液：Ｂ液）を５０：５０から２０：８０まで２０分間かけて直線的に変化させ、その後、２０：８０で５分間保持した。
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２２０ｎｍ）
【００８２】
分析条件２
測定機器：ＨＰＬＣシステム  島津製作所  高速液体クロマトグラフ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：ダイセル  ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−ＲＨ  ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：（Ａ液）１０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０）、（Ｂ液）アセトニトリル
移動相の組成（Ａ液：Ｂ液）を７０：３０から４０：６０まで２０分間かけて直線的に変化させ、その後、４０：６０で１０分間保持した。
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２２０ｎｍ）
【００８３】
分析条件３
測定機器：ＨＰＬＣシステム  島津製作所  高速液体クロマトグラフ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：ダイセル  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−３Ｒ  ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：（Ａ液）１０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０）、（Ｂ液）アセトニトリル
移動相の組成（Ａ液：Ｂ液）を５０：５０から２０：８０まで２０分間かけて直線的に変化させ、その後、２０：８０で５分間保持した。
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２２０ｎｍ）
【００８４】
実施例１
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド（化合物（２））の合成
【００８５】
工程１
２’−クロロ−４’−メトキシビフェニル−２−カルボン酸エチル
【００８６】
【化１０】
2020189855.tif 000011
【００８７】
アルゴン雰囲気下、１−ブロモ−２−クロロ−４−メトキシベンゼン（４４．３ｇ）をトルエン（２２０ｍｌ）に溶解し、２−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸エチル（６０．８ｇ）、水（１３２ｍｌ）、炭酸水素ナトリウム（３３．６ｇ）およびジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（２．８ｇ）を加えた後、油浴温度１２０℃で７時間撹拌した。反応混合物に２−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸エチル（５．２ｇ）を追加し、さらに２時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、トルエン（１００ｍｌ）および水（２００ｍｌ）を加え、一晩撹拌した。反応混合物に活性炭（３ｇ）を加え、さらに１時間撹拌した。不溶物をセライトでろ去し、ろ過物をトルエン（１００ｍｌ）および水（２００ｍｌ）で洗浄した。得られたろ液を合わせて分層した。得られた有機層を水（１００ｍｌ）で洗浄した後、溶媒を留去して、標題化合物（６７．７ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 7.88-7.86 (1H, m), 7.63 (1H, td, J = 7.6, 1.4 Hz), 7.51 (1H, td, J = 7.6, 1.4 Hz), 7.27 (1H, dd, J = 7.6, 0.9 Hz), 7.18 (1H, d, J =8.6 Hz), 7.06 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.95 (1H, dd, J = 8.6, 2.6 Hz), 4.01 (2H, m), 3.80 (3H, s), 0.96 (3H, t, J = 7.1 Hz).
【００８８】
工程２
２’−クロロ−４’−メトキシビフェニル−２−カルボン酸
【００８９】
【化１１】
2020189855.tif 000012
【００９０】
２’−クロロ−４’−メトキシビフェニル−２−カルボン酸エチル（６７．７ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を加え、油浴温度１１０℃で４．５時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、水（２００ｍｌ）およびトルエン（１００ｍｌ）を加えて一晩撹拌した。反応混合物に活性炭（３．６ｇ）を加え、さらに１時間撹拌した。不溶物をセライトろ去し、ろ過物をトルエン（３０ｍｌ）および水（３００ｍｌ）で洗浄した。得られたろ液を合わせて分層した。得られた水層をトルエン（１００ｍｌ）で洗浄した後、水層に濃塩酸（４０ｍｌ）を加えて酸性にし、室温で１時間撹拌した。析出した固体をろ取した。得られた固体を３時間風乾した後、６０℃で一晩減圧乾燥して、標題化合物（５０．２ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.57 (1H, s), 7.90-7.88 (1H, m), 7.60 (1H, td, J = 7.6, 1.3 Hz), 7.49 (1H, td, J = 7.6, 1.3 Hz), 7.24 (1H, dd, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.06 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.95 (1H, dd, J = 8.5, 2.4 Hz), 3.81 (3H, s).
【００９１】
工程３
４−クロロ−２−メトキシ−９Ｈ−フルオレン−９−オン
【００９２】
【化１２】
2020189855.tif 000013
【００９３】
アルゴン雰囲気下、２’−クロロ−４’−メトキシビフェニル−２−カルボン酸（６５．４ｇ）にＥａｔｏｎ試薬（五酸化りん−メタンスルホン酸（重量比１：１０）溶液）（３３０ｍｌ）を加え、油浴温度１００℃で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、水（６５０ｍｌ）をゆっくり滴下した後、室温で１時間撹拌した。析出した固体をろ取し、水（５００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を一晩風乾して、標題化合物を（９２．０ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.01 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.64-7.60 (2H, m), 7.36 (1H, td, J = 7.4, 0.9 Hz), 7.17 (2H, dd, J = 8.4, 2.3 Hz), 3.85 (3H, s). 
【００９４】
工程４
４−クロロ−２−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−９−オン
【００９５】
【化１３】
2020189855.tif 000014
【００９６】
アルゴン雰囲気下、４−クロロ−２−メトキシ−９Ｈ−フルオレン−９−オン（９２．０ｇ）にＮ−メチルピロリドン（１２０ｍｌ）およびピリジン塩酸塩（１４４ｇ）を加えた。反応混合物をディーン・スターク装置で水を留去しながら、油浴温度２００℃で３時間撹拌した。反応混合物を９０℃まで冷却した後、水（６００ｍｌ）を滴下し、室温で２時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物を水（４００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を３日間風乾後、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル  １：１、３００ｍｌ）を加え室温で１時間撹拌した。固体をろ取し、ろ過物をヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、５００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を５０℃で３時間減圧乾燥して、標題化合物（４８．６ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 10.56 (1H, s), 7.96 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.61-7.57 (2H, m), 7.32 (1H, td, J = 7.4, 0.9 Hz), 6.97 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.94 (1H, d, J = 2.2 Hz).
【００９７】
工程５
４−（４−クロロ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ）酪酸エチル
【００９８】
【化１４】
2020189855.tif 000015
【００９９】
４−クロロ−２−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−９−オン（４８．６ｇ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（５８．３ｇ）および４−ブロモ酪酸エチル（３３．５ｍｌ）を加え、６０℃で２時間撹拌した。反応混合物を４０℃まで冷却し、トルエン（３００ｍｌ）および水（３００ｍｌ）を加え、分層した。得られた水層をトルエン（１００ｍｌ）で再抽出した。得られた有機層を合わせて、水（１００ｍｌ）で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムおよび活性炭（２．５ｇ）を加え、室温で５分間撹拌した。不溶物をセライトろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣にヘキサン（２２０ｍｌ）を加え、５０℃で１０分間、室温で１時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物をヘキサンで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥して、標題化合物（６６．９ｇ）を得た。また、得られたろ液は溶媒を留去し、残渣に酢酸エチル（５ｍｌ）およびヘキサン（２０ｍｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物をヘキサンで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥して、標題化合物（２．５ｇ）をさらに得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.01 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.65-7.61 (2H, m), 7.37 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.17-7.14 (2H, m), 4.13-4.05 (4H, m), 2.47 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.02-1.95 (2H, m), 1.19 (3H, td, J = 7.2, 0.7 Hz).
【０１００】
工程６
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸エチル
【０１０１】
【化１５】
2020189855.tif 000016
【０１０２】
アルゴン雰囲気下、４−（４−クロロ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ）酪酸エチル（６９．４ｇ）をＴＨＦ（７００ｍｌ）に溶解し、Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）シンコニジウム  ４−メトキシフェノキシド（６．４ｇ）を加えた。反応混合物に−１６℃でトリメチル（トリフルオロメチル）シラン（５２．０ｍｌ）のＴＨＦ（１４０ｍｌ）溶液を滴下し、同温で１５分間撹拌した。反応混合液に酢酸（２３．０ｍｌ）および１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド／ＴＨＦ溶液（２２２ｍｌ）を順次加えた後、室温で１時間撹拌した。反応混合液の溶媒を留去し、得られた残渣にトルエン（５００ｍｌ）および飽和重曹水（２００ｍｌ）を加え、分層した。得られた有機層を飽和重曹水（１５０ｍｌ）で２回、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、１Ｎ塩酸（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、飽和食塩水（１００ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムおよびシリカゲル（１５０ｇ）を加え、１０分間撹拌した。不溶物をろ去し、ろ過物をトルエン（３００ｍｌ）および酢酸エチル（８００ｍｌ）で順次洗浄した。得られたろ液とトルエン洗浄液を合わせて溶媒を留去し、標題化合物（７２．１ｇ）を得た。また、酢酸エチル洗浄液の溶媒を留去し、得られた残渣にシリカゲル（４０ｇ）ならびに、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（酢酸エチル：ヘキサン  ２：１、３００ｍｌ）を加え、室温で撹拌した。不溶物をろ去し、ろ過物をヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（酢酸エチル：ヘキサン＝２：１、３００ｍｌ）で洗浄した。得られたろ液の溶媒を留去して標題化合物（２０．３ｇ）をさらに得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.14 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz),7.53 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.42-7.38 (2H, m), 7.14 (2H, s), 4.11-4.05 (4H, m), 2.47 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.03-1.96 (2H, m), 1.19 (3H, td, J = 7.1, 0.8 Hz).
【０１０３】
（絶対立体配置について）
後述する工程１０において４−クロロ−２−メチル−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オールの絶対立体配置を同定したことにより、本工程で得られた標題化合物は（Ｒ）体であることが確認された。光学純度は５２．９％ｅ．ｅ．であった。
光学純度は、ＨＰＬＣ分析条件１にて決定した。（Ｓ）体の保持時間１９．６分、（Ｒ）体の保持時間２３．０分。
【０１０４】
工程７
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸
【０１０５】
【化１６】
2020189855.tif 000017
【０１０６】
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸エチル（９２．２ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を加え、８０℃で一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷却した後、水（２００ｍｌ）を加え、トルエン（１００ｍｌ）で２回洗浄した。得られた水層を濃塩酸（４０ｍｌ）で中和し、酢酸エチル（３００ｍｌ）で２回抽出した。得られた酢酸エチル抽出液を水（１００ｍｌ）で２回、飽和食塩水（１００ｍｌ）で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムおよび活性炭（４．２ｇ）を加え、室温で１０分間撹拌した。不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣にクロロホルム（８０ｍｌ）を加え、５０℃に加熱した後、ヘキサン（４００ｍｌ）を滴下し、同温で３０分間、室温で２時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ヘキサンとクロロホルムの混合溶媒（ヘキサン：クロロホルム＝９：１、５０ｍｌ）で洗浄した後、８０℃で２時間減圧乾燥して、標題化合物（７２．５ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.17 (1H, br s), 8.14 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.54 (1H, td, J = 7.7, 1.2 Hz), 7.42-7.30 (2H, m), 7.18-7.15 (2H, m), 4.09 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.00-1.93 (2H, m).
【０１０７】
工程８
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸の（１Ｓ）−１−（４−メチルフェニル）エチルアミンの塩
【０１０８】
【化１７】
2020189855.tif 000018
【０１０９】
窒素雰囲気下、（１Ｓ）−１−（４−メチルフェニル）エチルアミン（１９．５ｇ）を酢酸エチル（７２０ｍｌ）に溶解し、４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸（７２．５ｇ）を加えた。反応混合物を６０℃で２時間、室温で一晩撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物を酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を６０℃で５時間減圧乾燥して、標題化合物（６８．６ｇ）を得た。一方、ろ液から４−［（９Ｓ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸を得ることができた。
【０１１０】
（光学純度について）
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸の光学純度は、ＨＰＬＣ分析条件１にて決定した（光学純度９０．２％ｅ．ｅ．）。（Ｒ）体の保持時間１２．９分、（Ｓ）体の保持時間１０．４分。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.14 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.53 (1H, td, J = 7.6, 1.1 Hz), 7.40 (1H, td, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.26 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.16-7.10 (4H, m), 4.08 (2H, t, J = 6.5 Hz), 4.01 (1H, q, J = 6.7 Hz), 2.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.26 (3H, s), 1.98-1.91 (2H, m), 1.26 (3H, d, J = 6.7 Hz).
【０１１１】
工程９
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸
【０１１２】
【化１８】
2020189855.tif 000019
【０１１３】
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸と（１Ｓ）−１−（４−メチルフェニル）エチルアミンの塩（６８．６ｇ）に酢酸エチル（５００ｍｌ）、２Ｎ塩酸（３００ｍｌ）を加え、室温で１０分撹拌した。この混合液を分層した。得られた有機層を水（２５０ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去して、標題化合物（６０．０ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.17 (1H, br s), 8.14 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.54 (1H, td, J = 7.7, 1.2 Hz), 7.42-7.30 (2H, m), 7.18-7.15 (2H, m), 4.09 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.00-1.93 (2H, m).
【０１１４】
工程１０
（９Ｒ）−４−クロロ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２，９−ジオール
【０１１５】
【化１９】
2020189855.tif 000020
【０１１６】
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸（５０ｇ）に、Ｎ−メチルピロリドン（２００ｍｌ）とピリジン塩酸塩（２９８ｇ）を加え、油浴温度２００℃で２日間撹拌した。反応混合液を室温まで冷却した後、酢酸エチル（５００ｍｌ）で希釈し、水で２回洗浄した。得られた水層を酢酸エチル（３００ｍｌ）で再抽出し、先に得られた有機層と合わせて、水、１Ｎ塩酸、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムおよび活性炭（１０ｇ）を加え、室温で攪拌した後、不溶物をセライトろ去した。得られた有機層の溶媒を留去し、残渣にヘキサンを加え、室温で撹拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥した。得られた粗生成物を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解し、水で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。残渣にヘキサンを加え、室温で撹拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥して、標題化合物（２２．４ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 10.37 (1H, br s), 8.09 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.63 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.50 (1H, td, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.36 (1H, td, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.32 (1H, br s), 7.06 (1H, s), 6.91 (1H, br d, J = 2.0 Hz).
【０１１７】
（絶対立体配置について）
標題化合物の絶対立体配置は、下記の工程（工程Ａ−１から工程Ａ−２および工程Ｂ−１）により調製した化合物（１００Ａ）と化合物（１００Ｂ）の光学活性カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって決定した。
【０１１８】
工程Ａ−１
【０１１９】
【化２０】
2020189855.tif 000021
【０１２０】
４−クロロ−２−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−オンに対して、トリフルオロメチル化、ブロモ酢酸エチルとの反応、および加水分解を行い、［４−クロロ−２−メチル−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−イルオキシ］酢酸を得た。この化合物を（１Ｒ）−１−フェニルエチルアミンを用いて光学分割し、得られた（１Ｒ）−１−フェニルエチルアミンの塩（１００ＡＡ）を単結晶Ｘ線構造解析により、絶対立体配置を（Ｒ）と決定した。
【０１２１】
工程Ａ−２
【０１２２】
【化２１】
2020189855.tif 000022
【０１２３】
化合物１００ＡＡから酸処理等により、（９Ｒ）−４−クロロ−２−メチル−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール（化合物（１００Ａ））を合成した。
【０１２４】
工程Ｂ−１
【０１２５】
【化２２】
2020189855.tif 000023
【０１２６】
工程１０で得られた４−クロロ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２，９−ジオールの２位水酸基を、上記の方法によりメチル基に変換し、４−クロロ−２−メチル−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール（化合物（１００Ｂ））を得た。
【０１２７】
（光学活性カラムを用いたＨＰＬＣ分析）
化合物（１００）の両対掌体は、光学活性カラムを用いたＨＰＬＣで分離することができた（ＨＰＬＣ分析条件３）。化合物１００ＡのＨＰＬＣ分析結果から、（Ｒ）体の保持時間１８．４分、（Ｓ）体の保持時間１７．０分であることが明らかとなった。このＨＰＬＣ条件により、化合物（１００Ａ）と化合物（１００Ｂ）を分析したところ、保持時間が一致した。
上記化合物（１００Ａ）および化合物（１００Ｂ）の製造の際に、不斉炭素の立体配置の変換は起こらないと考えられる。この結果から、工程１０で得られた４−クロロ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２，９−ジオールは（Ｒ）の絶対立体配置を持つことが確認された。
【０１２８】
工程１１
（９Ｒ）−４−クロロ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール
【０１２９】
【化２３】
2020189855.tif 000024
【０１３０】
窒素雰囲気下、（９Ｒ）−４−クロロ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２，９−ジオール（５５．５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５５０ｍｌ）に溶解し、トルエン−４−スルホン酸  ３−ヒドロキシ−３−メチルブチルエステル（４９．６ｇ）と炭酸カリウム（３９．５ｇ）を加え、油浴温度７０℃で一晩撹拌した。反応混合液にトルエン−４−スルホン酸  ３−ヒドロキシ−３−メチルブチルエステル（４．０ｇ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を追加し、同温でさらに９．５時間撹拌した。反応混合液を氷冷後、水（８００ｍｌ）を加え、酢酸エチル（９００ｍｌ）で抽出した。得られた有機層を水（５００ｍｌ）で３回、飽和食塩水（５００ｍｌ）で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まず混合比３：１（ヘキサン：酢酸エチル）の混合液を溶出した。ついで混合比２：１の混合液で溶出し、さらに混合比３：２の混合液で溶出した。）で精製して、標題化合物（４９．５ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.12 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.64 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.52 (1H, td, J = 7.6, 0.9 Hz), 7.40-7.36 (2H, m), 7.15-7.13 (2H, m), 4.41 (1H,s), 4.16 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.85 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.17 (6H, s).
【０１３１】
工程１２
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸エチル
【０１３２】
【化２４】
2020189855.tif 000025
【０１３３】
アルゴン雰囲気下、（９Ｒ）−４−クロロ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール（４９．５ｇ）をトルエン（４４５ｍｌ）に溶解し、２−メチル−２−［４−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロピオン酸エチル（５９．２ｇ）、水（１４９ｍｌ）、リン酸三カリウム（５４．３ｇ）、酢酸パラジウム（２．９ｇ）および２−ジシクロヘキシルフォスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル（ＳＰｈｏｓ）（１０．５ｇ）を加え、油浴温度１００℃で３．５時間撹拌した。反応混合液を室温まで冷却し、水（３００ｍｌ）を加えた後、不溶物をセライトろ去し、トルエン（１５０ｍｌ）および水（５０ｍｌ）で洗浄した。得られたろ液を合わせて分層した。得られた有機層を水（５００ｍｌ）、飽和食塩水（５００ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まず混合比２：１（ヘキサン：酢酸エチル）の混合液を溶出した。ついで混合比１：１、２：３の混合液で溶出し、さらに混合比１：２の混合液で溶出した。）にて精製した。さらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンとアセトンの混合液を用いた。まず混合比２：１（ヘキサン：アセトン）の混合液を溶出した。ついで混合比４：１、３：１、２：１、１：１、２：３の混合液で順次溶出し、さらに混合比１：２の混合液にて溶出した。）で精製し、標題化合物（６８．４ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.18 (1H, s), 7.65 (1H, s), 7.59-7.57 (1H, m), 7.25-7.21 (4H, m), 7.13 (1H, br d, J = 1.6 Hz), 6.84 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.38 (1H, s), 4.16-4.11 (4H, m), 1.86 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.84 (6H, s), 1.16 (6H, s), 1.13 (3H, t, J = 7.0 Hz).
【０１３４】
工程１３
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸
【０１３５】
【化２５】
2020189855.tif 000026
【０１３６】
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸エチル（６８．４ｇ）をエタノール（２５６ｍｌ）に溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１２８ｍｌ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、２Ｎ塩酸（３３３ｍｌ）を滴下後、酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出した。得られた有機層を水（４００ｍｌ）で２回、飽和食塩水（４００ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去して、標題化合物（７０．０ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ:13.06 (1H, br s), 8.14 (1H, s), 7.62 (1H, s), 7.57 (1H, dd, J = 6.4, 0.6 Hz), 7.27-7.19 (4H, m), 7.12 (1H, s), 6.84 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.38 (1H, s), 4.14 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.85 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.82 (3H,s), 1.81 (3H, s), 1.16 (6H, s).
【０１３７】
工程１４
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２-メチルプロパンアミド（化合物（２））
【０１３８】
【化２６】
2020189855.tif 000027
【０１３９】
窒素雰囲気下、２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸（６６．７ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４８０ｍｌ）に溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１水和物（２７．６ｇ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）塩酸塩（３４．６ｇ）および２８％アンモニア水（２４．５ｍｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物を氷冷し、水（６３０ｍｌ）および２Ｎ塩酸（３３０ｍｌ）を滴下後、酢酸エチル（８００ｍｌ）で抽出した。得られた水層を酢酸エチル（５００ｍｌ）で再抽出した。得られた有機層を合わせて、水（５００ｍｌ）で２回、飽和重曹水（５００ｍｌ）、飽和食塩水（５００ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去して、標題化合物（６０．０ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.08 (1H, s), 7.66 (1H, s), 7.58-7.56 (1H, m), 7.32-7.30 (1H, m), 7.25-7.22 (4H, m), 7.12 (1H, br s), 6.96 (1H, brs), 6.87 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.38 (1H, s), 4.14 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.85 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.78 (3H, s), 1.78 (3H, s), 1.17 (6H, s).
【０１４０】
工程１５
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド・１水和物（化合物（２ｈ））
【０１４１】
【化２７】
2020189855.tif 000028
【０１４２】
前工程で得られた２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２-メチルプロパンアミド（化合物（２））（６０．０ｇ）を酢酸エチル（１０９ｍｌ）に溶解し、水（２ｍｌ）を加え、５０℃に加熱した。この混合液にヘキサン（２２６ｍｌ）、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル  ２：１、１５０ｍｌ）を順次滴下した後、室温に戻し一晩撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物をヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、１８０ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を室温で一晩減圧乾燥して、標題化合物（５２．２ｇ、光学純度９８．６％ｅ．ｅ．）を得た。光学純度は、ＨＰＬＣ分析条件２にて決定した。（Ｒ）体の保持時間１１．３分、（Ｓ）体の保持時間１３．９分。
比旋光度[α]Ｄ  ＋３７．９°（ｃ＝１．０１  ＭｅＯＨ  ２５℃)．
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.08 (1H, s), 7.66 (1H, s), 7.58-7.56 (1H, m), 7.32-7.30 (1H, m), 7.25-7.22 (4H, m), 7.12 (1H, br s), 6.96 (1H, brs), 6.87 (1H, d,J= 2.3 Hz), 4.38 (1H, s), 4.14 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.85 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.78 (3H, s), 1.78 (3H, s), 1.17 (6H, s).
（元素分析測定）
元素分析結果は、化合物（２ｈ）の理論値と良く一致した。
計算値：Ｃ，59.88；Ｈ，5.80；Ｎ，8.06（１水和物としての計算値）
実測値：Ｃ，59.86；Ｈ，5.74；Ｎ，8.00．
【０１４３】
工程１６
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド（化合物（２））
【０１４４】
【化２８】
2020189855.tif 000029
【０１４５】
前工程で得られた２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２メチルプロパンアミド・１水和物（化合物（２ｈ））（２２．６３ｇ）にトルエン（３４０ｍｌ）を加えた。窒素雰囲気下、反応混合物をディーン・スターク装置で脱水しながら、油浴温度１３０℃で２時間攪拌した。反応混合物を油浴温度７０℃でさらに１時間半攪拌した後、室温に戻し一晩撹拌した。析出した固体をろ取し、ろ過物をトルエン（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を室温で３日間減圧乾燥後、さらに６０℃で１日減圧乾燥して、標題化合物（２１．５ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.08 (1H, s), 7.66 (1H, s), 7.58-7.56 (1H, m), 7.32-7.30 (1H, m), 7.25-7.22 (4H, m), 7.12 (1H, br s), 6.96 (1H, brs), 6.87 (1H, d,J= 2.3 Hz), 4.38 (1H, s), 4.14 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.85 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.78 (3H, s), 1.78 (3H, s), 1.17 (6H, s).
（元素分析測定）
元素分析結果は、化合物（２）の理論値と良く一致した。
計算値：Ｃ，62.02；Ｈ，5.61；Ｎ，8.35（無水和物としての計算値）
実測値：Ｃ，62.17；Ｈ，5.60；Ｎ，8.47．
【０１４６】
工程Ｃ−１
Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）シンコニジウムブロミドの合成
【０１４７】
【化２９】
2020189855.tif 000030
【０１４８】
シンコニジン（１０．６ｇ）をテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）に溶解し、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルブロミド（１０．１ｇ）、テトラブチルアンモニウムヨージド（０．６６ｇ）を加え、７０℃で一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷却した後、固体をろ取し、酢酸エチル（５０ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を一晩減圧乾燥して、標題化合物（１８．５ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.99 (1H, d, J = 4.4 Hz), 8.27 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.11 (1H, dd, J = 8.5, 1.0 Hz), 7.89-7.79 (2H, m), 7.78-7.71 (1H, m), 7.63 (2H,d, J = 8.4 Hz), 7.59 (2H, t, J = 8.4 Hz), 6.72 (1H, d, J = 4.2 Hz), 6.57-6.51 (1H, brs), 5.67 (1H, ddd, J = 17.0, 10.4, 6.4 Hz), 5.14 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.08 (1H, d, J = 12.6 Hz), 5.00-4.90 (2H, m), 4.30-4.18 (1H, m), 3.91 (1H, t, J = 8.7 Hz), 3.74-3.64 (1H, m), 3.35-3.18 (2H, m), 2.76-2.65 (1H, m), 2.18-1.94 (3H,m), 1.90-1.78 (1H, m), 1.40-1.22 (1H, m), 1.34 (9H, s).
【０１４９】
工程Ｃ−２
Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）シンコニジウム  ４−メトキシフェノキシドの合成
【０１５０】
【化３０】
2020189855.tif 000031
【０１５１】
Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）シンコニジウムブロミド（１８．５ｇ）、アンバーリスト（登録商標）Ａ２６（スチレン、ジビニルベンゼンマトリックスの強塩基性イオン交換樹脂）（１８．５ｇ）およびメタノール（２８０ｍｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。不溶物をセライトろ去し、メタノール（１００ｍｌ）で洗浄した。ろ液に４−メトキシフェノール（４．８ｇ）を加え、溶媒を留去した。残渣をトルエン（１００ｍｌ）で３回共沸後、トルエン（２０ｍｌ）を加え、次いでジイソプロピルエーテル（２００ｍｌ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄した後、室温で一晩減圧乾燥して標題化合物（２１．８ｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.91 (1H, d, J = 4.4 Hz), 8.17 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.07 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.89 (1H, d, J = 4.4 Hz), 7.79 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.64 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.57-7.52 (5H, m), 6.56-6.55 (2H, m), 6.43-6.42 (3H, m), 5.67-5.59 (1H, m), 5.28 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.12 (1H, d, J = 17.2 Hz), 4.92 (1H, d, J = 10.6 Hz), 4.84 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.65-4.53 (1H, m), 3.80 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.65-3.63 (1H, m), 3.57 (3H, s), 3.25 (1H, t, J = 11.6 Hz), 3.10-3.07 (1H, m), 2.67 (1H, br s), 2.07-2.02 (2H, m), 1.95 (1H, br s), 1.79-1.76 (1H, br m), 1.33 (9H, s), 1.16-1.11 (1H, m).
【０１５２】
工程Ｄ
トルエン−４−スルホン酸  ３−ヒドロキシ−３−メチルブチルエステルの合成
【０１５３】
【化３１】
2020189855.tif 000032
【０１５４】
窒素雰囲気下、３−メチルブタン−１，３−ジオール（３００ｇ）をピリジン（９００ｍｌ）に溶解し、４−メチルベンゼンスルホニルクロリド（５００ｇ）のトルエン（９００ｍｌ）、アセトニトリル（１２５ｍｌ）溶液を２時間かけて滴下した。反応混合物を室温で４時間撹拌した後、トルエン（５００ｍｌ）と水（１８００ｍｌ）を加え、分層した。得られた有機層を硫酸水、水２回で順次洗浄した。得られた有機層の溶媒を留去した後、トルエン（５００ｍｌ）で共沸して、標題化合物（５３５ｇ）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.81-7.76 (2H, m), 7.36-7.31 (2H, m), 4.20 (2H, td, J = 6.8, 1.6 Hz), 2.44 (3H, s), 1.85 (2H, td, J = 6.8, 1.6 Hz), 1.33 (1H, s), 1.21 (6H, s).
【０１５５】
実施例２
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド（化合物（３））の合成
【０１５６】
工程１
４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸エチル
【０１５７】
【化３２】
2020189855.tif 000033
【０１５８】
実施例１工程１０で得られた（９Ｒ）−４−クロロ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２，９−ジオール（２００ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１８５ｍｇ）および４−ブロモ酪酸エチル（１０５μｌ）を加え、室温で７時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を、水で２回、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まず混合比５：１（ヘキサン：酢酸エチル）の混合液にて溶出した。ついで混合比３：１の混合液にて順次溶出し、さらに混合比２：１の混合液にて溶出した。）にて精製し、標題化合物（１９７ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.19 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.46 (1H, td, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.32 (1H, td, J = 7.6, 1.0 Hz), 7.16 (1H, br s), 6.93 (1H, d, J = 2.1 Hz), 4.14 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.82 (1H, s), 2.50 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.15-2.06 (2H, m), 1.25 (3H, t, J = 7.1 Hz).
【０１５９】
工程２
（９Ｒ）−４−クロロ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール
【０１６０】
【化３３】
2020189855.tif 000034
【０１６１】
窒素雰囲気下、４−［（９Ｒ）−４−クロロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−２−イルオキシ］酪酸エチル（１９７ｍｇ）をＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解し、０℃でメチルリチウム／ジエチルエーテル溶液（１．０７Ｍ、２．２ｍｌ）を滴下した。反応混合液を同温で２時間撹拌した後、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を水で２回、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まず混合比３：１（ヘキサン：酢酸エチル）の混合液を溶出した。ついで混合比２：１の混合液にて溶出した。）にて精製して、標題化合物（１６９ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.19 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.66 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.47 (1H, td, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.32 (1H, td, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.17 (1H, br s), 6.93 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.02 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.82 (1H, s), 1.92-1.85 (2H, m), 1.65-1.62 (2H, m), 1.26 (3H, s), 1.25 (3H, s).
【０１６２】
工程３
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸エチル
【０１６３】
【化３４】
2020189855.tif 000035
【０１６４】
アルゴン雰囲気下、（９Ｒ）−４−クロロ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール（１６９ｍｇ）を１，４−ジオキサン（１．５ｍｌ）で溶解し、２−メチル−２−［４−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロピオン酸エチル（１９４ｍｇ）、水（０．５ｍｌ）、リン酸三カリウム（１７８ｍｇ）、酢酸パラジウム（９ｍｇ）、ＳＰｈｏｓ（３３ｍｇ）を加え、１００℃で４．５時間撹拌した。反応混合液を室温まで冷却した後、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を、水で２回、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒として混合比１：１（ヘキサン：酢酸エチル）の混合液にて溶出した。）にて精製して、標題化合物（２１８ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7.69 (1H, s), 7.63-7.62 (2H, m), 7.21-7.19 (4H, m), 6.81 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.21 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.04 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.82 (1H, s), 1.92 (3H, s), 1.91 (3H, s), 1.89-1.88 (2H, m), 1.66-1.64 (2H, m), 1.26 (6H, s), 1.26-1.23 (3H, m).
【０１６５】
工程４
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸
【０１６６】
【化３５】
2020189855.tif 000036
【０１６７】
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸エチル（２１８ｍｇ）をエタノール（２．２ｍｌ）に溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３２０μｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合液を１Ｎ塩酸で中和し、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を水で２回、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去して、標題化合物（１７９ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7.73 (1H, s), 7.68 (1H, s), 7.63-7.62 (1H, m), 7.23-7.09 (4H, m), 6.78 (1H, d, J = 2.6 Hz), 4.02 (2H, t, J = 6.3 Hz), 1.93 (6H, s), 1.89-1.86 (2H, m), 1.65-1.61 (2H, m), 1.25 (6H, s).
【０１６８】
工程５
２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド（化合物（３））
【０１６９】
【化３６】
2020189855.tif 000037
【０１７０】
窒素雰囲気下、２−｛４−［（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルオキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロピオン酸（８９ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解し、塩化アンモニウム（２８ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４８μｌ）および１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）（９９ｍｇ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合液に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を、食塩水で２回、飽和食塩水で１回順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒としてクロロホルムとメタノールの混合液を用いた。混合比９：１（クロロホルム：メタノール）の混合液を用いた。）にて精製して、標題化合物（４８ｍｇ、光学純度９６．９％ｅ．ｅ．）を得た。光学純度は、ＨＰＬＣ分析条件２にて決定した。（Ｒ）体の保持時間１３．０分、（Ｓ）体の保持時間１４．４分。
比旋光度[α]Ｄ  ＋３７．５°（ｃ＝１．０４  ＭｅＯＨ  ２５℃）．
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.07 (1H, s), 7.66 (1H, s), 7.57-7.55 (1H, m), 7.34-7.31 (1H, m), 7.24-7.23 (3H, m), 7.18 (1H, s), 7.11 (1H, br s), 6.94 (1H, br s), 6.86 (1H, d, J = 2.3 Hz), 4.16 (1H, s), 4.03 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.80 (3H, s), 1.79 (3H, s), 1.80-1.75 (2H, m), 1.51-1.47 (2H, m), 1.11 (6H, s).
【０１７１】
（化合物（３）の結晶の調製例）
上記実施例の手順で合成した化合物（３）（４０ｍｇ）にＭｅＯＨと水の混合液（容量比１：３（０．５ｍＬ））を添加した。ついで、この溶液に化合物（２ｈ）の結晶（０．５ｍｇ）を添加し室温にて３日間撹拌した。析出した固体を濾取し、化合物（３）の結晶（４１ｍｇ）を得た。
【０１７２】
（化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）の合成）
下記式で表される化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）及び化合物（Ｄ）は、国際公開第２０１０／０４１７４８号に記載の製造方法に従い、それぞれ光学活性体として得た。
【０１７３】
【化３７】
2020189855.tif 000038
【０１７４】
化合物（Ａ）
２−（４−｛（９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−［２−（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）エトキシ］−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル｝−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）酢酸アミド
【０１７５】
【化３８】
2020189855.tif 000039
【０１７６】
化合物（Ｂ）
（９Ｒ）−２−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール
【０１７７】
【化３９】
2020189855.tif 000040
【０１７８】
化合物（Ｃ）
（９Ｒ）−４−［１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−９−オール
【０１７９】
【化４０】
2020189855.tif 000041
【０１８０】
化合物（Ｄ）
２−｛４−［（９Ｒ）−２−フルオロ−９−ヒドロキシ−９−（トリフルオロメチル）−９Ｈ−フルオレン−４−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝−２−メチルプロパンアミド
【０１８１】
本発明の製剤例としては、例えば下記の製剤が挙げられる。しかしながら、本発明はこれら製剤例によって限定されるものではない。
【０１８２】
製剤例１（カプセルの製造）
１）実施例１の化合物（化合物（２））             ３０ｍｇ
２）微結晶セルロース                             １０ｍｇ
３）乳糖                                         １９ｍｇ
４）ステアリン酸マグネシウム                       １ｍｇ
１）、２）、３）および４）を混合して、ゼラチンカプセルに充填する。
【０１８３】
製剤例２（錠剤の製造）
１）実施例１の化合物（化合物（２））             １０ｇ
２）乳糖                                         ５０ｇ
３）トウモロコシデンプン                         １５ｇ
４）カルメロースカルシウム                       ４４ｇ
５）ステアリン酸マグネシウム                       １ｇ
１）、２）、３）の全量および３０ｇの４）を水で練合し、真空乾燥後、整粒を行う。この整粒末に１４ｇの４）および１ｇの５）を混合し、打錠機により打錠する。このようにして、１錠あたり実施例１の化合物（化合物（２））１０ｍｇを含有する錠剤１０００錠を得る。
【０１８４】
試験例１：インビトロにおけるＰＤＨＫ活性阻害作用
ＰＤＨＫ活性阻害作用は被験化合物存在下においてキナーゼ反応を行い、その後、残存したＰＤＨ活性を測定することにより、間接的に評価した。
【０１８５】
（ＰＤＨＫ１活性阻害作用）
ヒトＰＤＨＫ１（ｈＰＤＨＫ１，ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号Ｌ４２４５０．１）の場合、このタンパク質をコードする１．３ｋｂｐフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒト肝ｃＤＮＡから単離した。ＰＣＲでＮ末端にＦＬＡＧ−Ｔａｇ配列を付加した改変ｈＰＤＨＫ１  ｃＤＮＡを作製し、ベクター（ｐＥＴ１７ｂ−Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。組換え構築体を大腸菌（ＤＨ５α−ＴＯＹＯＢＯ社）内へ形質転換した。組換えクローンを同定し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列分析した。予想核酸配列を持つ１クローンを発現作業用に選択した。
【０１８６】
ｈＰＤＨＫ１活性発現のために、改変ｈＰＤＨＫ１  ｃＤＮＡを含むｐＥＴ１７ｂベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質転換した。大腸菌を光学濃度０．６（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）に達するまで３０℃で増殖させた。５００μｍｏｌ／Ｌ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導した。大腸菌を３０℃で５時間培養した後、遠心分離により採集した。大腸菌ペースト再懸濁液をマイクロフロイダイザーにより破砕した。ＦＬＡＧ−Ｔａｇ付加タンパク質を、ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ社）により分離した。
【０１８７】
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム（ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１％  エチレングリコール、０．１％  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＦ−６８）（ｐＨ８．０）でゲルを洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチド、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１％  エチレングリコール、０．１％  プルロニックＦ−６８（ｐＨ８．０）で結合タンパク質を溶離した。
【０１８８】
ＦＬＡＧ−Ｔａｇ付加タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％  エチレングリコール、０．１％  プルロニックＦ−６８（ｐＨ８．０）に対し透析し、−８０℃に保存した。アッセイに際し、ｈＰＤＨＫ１の酵素濃度は９０％を上回るＰＤＨ活性抑制を示す最少濃度に設定した。
【０１８９】
緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ３−モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＨ７．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸水素二カリウム、６０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．２％  プルロニックＦ−６８、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ジチオスレイトール）中において、０．０５Ｕ／ｍＬ  ＰＤＨ（ブタ心臓ＰＤＨ複合体、Ｓｉｇｍａ社  Ｐ７０３２）および１．０μｇ／ｍＬ  ｈＰＤＨＫ１を混合し、４℃で一晩インキュベーションしてＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ１複合体を調製した。
【０１９０】
被験化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。９６穴ハーフエリアＵＶ透過マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社  ３６７９）にＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ１複合体２０μＬ、被験化合物１．５μＬおよび３．５３μｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ（緩衝液にて希釈）８．５μＬを添加し、室温で４５分間ＰＤＨＫ反応を行った。対照ウェルには被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加した。また、ＰＤＨ反応の最大速度を測定するためのブランクウェルには、被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加し、ｈＰＤＨＫ１を除いた。
【０１９１】
続いて、基質（５ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  コエンザイムＡ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  チアミンピロリン酸、緩衝液にて希釈）を１０μＬ添加し、室温で９０分間インキュベーションすることにより、残存ＰＤＨ活性を測定した。
【０１９２】
ＰＤＨ反応前後における３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定することにより、ＰＤＨ反応により産生されるＮＡＤＨを検出した。被験化合物のｈＰＤＨＫ１阻害率（％）は式［｛（被験化合物のＰＤＨ活性−対照のＰＤＨ活性）／ブランクのＰＤＨ活性−対照のＰＤＨ活性）｝×１００］から算出した。ＩＣ５０値はｈＰＤＨＫ１阻害率５０％を挟む２点の被験化合物濃度より算出した。
被験化合物として化合物（２）、化合物（２ｈ）および化合物（３）を用いた場合に得られた結果を以下の表１に示す。
【０１９３】
（ＰＤＨＫ２活性阻害作用）
ヒトＰＤＨＫ２（ｈＰＤＨＫ２、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号ＢＣ０４０４７８．１）の場合、ｈＰＤＨＫ２  ｃＤＮＡクローン（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０１／ＰＤＫ２−ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を基に、ＰＣＲでＮ末端にＦＬＡＧ−Ｔａｇ配列を付加した改変ｈＰＤＨＫ２  ｃＤＮＡを作製し、ベクター（ｐＥＴ１７ｂ−Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。組換え構築体を大腸菌（ＤＨ５α−ＴＯＹＯＢＯ社）内へ形質転換した。組換えクローンを同定し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列分析した。予想核酸配列を持つ１クローンを発現作業用に選択した。
【０１９４】
ｈＰＤＨＫ２活性発現のために、改変ｈＰＤＨＫ２  ｃＤＮＡを含むｐＥＴ１７ｂベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質転換した。大腸菌を光学濃度０．６（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）に達するまで３０℃で増殖させた。５００μｍｏｌ／Ｌ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導した。大腸菌を３０℃で５時間培養した後、遠心分離により採集した。大腸菌ペースト再懸濁液をマイクロフロイダイザーにより破砕した。ＦＬＡＧ−Ｔａｇ付加タンパク質を、ＦＬＡＧアフィニティーゲルにより分離した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１％  エチレングリコール、０．１％  プルロニックＦ−６８（ｐＨ８．０）でゲルを洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチド、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１％  エチレングリコール、０．１％  プルロニックＦ−６８（ｐＨ８．０）で結合タンパク質を溶離した。ＦＬＡＧ−Ｔａｇ付加タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１％  エチレングリコール、０．１％  プルロニックＦ−６８（ｐＨ８．０）に対し透析し、−８０℃に保存した。アッセイに際し、ｈＰＤＨＫ２の酵素濃度は９０％を上回るＰＤＨ活性抑制を示す最少濃度に設定した。
【０１９５】
緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ３−モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＨ７．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸水素二カリウム、６０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．２％  プルロニックＦ−６８、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ジチオスレイトール）中において、０．０５Ｕ／ｍＬ  ＰＤＨおよび０．８μｇ／ｍＬ  ｈＰＤＨＫ２を混合し、４℃で一晩インキュベーションしてＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ２複合体を調製した。被験化合物はＤＭＳＯで希釈した。９６穴ハーフエリアＵＶ透過マイクロプレートにＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ２複合体２０μＬ、被験化合物１．５μＬおよび３．５３μｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ（緩衝液にて希釈）８．５μＬを添加し、室温で４５分間ＰＤＨＫ反応を行った。対照ウェルには被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加した。また、ＰＤＨ反応の最大速度を測定するためのブランクウェルには、化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加し、ｈＰＤＨＫ２を除いた。続いて、基質（５ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  コエンザイムＡ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  チアミンピロリン酸、緩衝液にて希釈）を１０μＬ添加し、室温で９０分間インキュベーションすることにより、残存ＰＤＨ活性を測定した。ＰＤＨ反応前後における３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定することにより、ＰＤＨ反応により産生されるＮＡＤＨを検出した。被験化合物のｈＰＤＨＫ２阻害率（％）は式［｛（被験化合物のＰＤＨ活性−対照のＰＤＨ活性）／ブランクのＰＤＨ活性−対照のＰＤＨ活性）｝×１００］から算出した。ＩＣ５０値はｈＰＤＨＫ２阻害率５０％を挟む２点の被験化合物濃度より算出した。
被験化合物として化合物（２）、化合物（２ｈ）、化合物（３）、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、および化合物（Ｄ）を用いた場合に得られた結果を以下の表１に示す。
【０１９６】
【表１】
2020189855.tif 000042
【０１９７】
試験例２：Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＰＤＨ活性化試験
（試験方法）
被験化合物を投与した動物における組織のＰＤＨ活性化作用を評価した。ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）共役系を介してＮＡＤＨ生成を検出することによりＰＤＨ活性を測定した。
正常な雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを媒体群または被験化合物群にランダムに群分けした。ラットに媒体（０．５％メチルセルロース水溶液，５ｍＬ／ｋｇ）または被験化合物を経口投与した。投与後、５または２０時間後に、ペントバルビタールナトリウム６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して麻酔を施し、肝切片および副睾丸上脂肪組織を摘出した。
摘出した肝切片に湿重量の９倍容の氷冷したホモジナイズ緩衝液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  スクロース、５ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）を速やかに添加し、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを６００×ｇ、４℃、１０分間遠心して上清を回収した。上清１ｍＬを１６０００×ｇ、４℃、１０分間遠心して沈殿を得た。この沈殿をホモジナイズ緩衝液１ｍＬに再懸濁し、同様に遠心して沈殿を洗浄した。この沈殿を肝ミトコンドリア画分とし、液体窒素にて凍結後、−８０℃に保存した。
摘出した脂肪組織に湿重量の３倍容の氷冷したホモジナイズ緩衝液を速やかに添加し、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを６００×ｇ、４℃、１０分間遠心して上清を回収した。上清全量を１６０００×ｇ、４℃、１０分間遠心して沈殿を得た。この沈殿をホモジナイズ緩衝液１ｍＬに再懸濁し、同様に遠心して沈殿を洗浄した。この沈殿を脂肪組織ミトコンドリア画分とし、液体窒素にて凍結後、−８０℃に保存した。
ミトコンドリア画分を解凍し、サンプル緩衝液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  スクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム、１ｍＬ／Ｌ  ４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（トリトンＸ−１００））に懸濁した。ＰＤＨ活性は活性型ＰＤＨ活性（ＰＤＨａ活性）と総ＰＤＨ活性（ＰＤＨｔ活性）の２種類を測定した。ＰＤＨｔ活性を測定するために、ミトコンドリア懸濁液と活性化緩衝液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  スクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム、１ｍＬ／Ｌ  トリトンＸ−１００、４ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ジクロロ酢酸ナトリウム）を等量混合し、３７℃にて１０分間インキュベーションした。サンプル緩衝液で希釈したミトコンドリア懸濁液４０μＬを活性測定用およびブランク測定用としてそれぞれ９６穴マイクロプレートに添加した。これに反応混合液（０．０５６ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５．６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＬ−カルニチン、２．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤ、０．２２ｍｍｏｌ／Ｌ  チアミンピロリン酸、０．１１ｍｍｏｌ／Ｌ  コエンザイムＡ、１．１ｍＬ／Ｌ  トリトンＸ−１００、１．１ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１．１ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、０．６７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＮＴ、７．２μｍｏｌ／Ｌ  フェナジンメトサルフェート、２８ｍｍｏｌ／Ｌ  オキサミド酸ナトリウム）を１８０μＬ添加した。活性測定用に５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウムを、ブランク測定用に精製水をそれぞれ２０μＬ添加し、室温、遮光下にてインキュベーションした。最終的な電子受容体であるＩＮＴの還元に起因する５００−７５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて経時的に測定して吸光度変化を算出した。活性測定ウェルの吸光度変化からブランクウェルの吸光度変化を差し引いて、ＰＤＨ活性とした。ＰＤＨｔ活性に対するＰＤＨａ活性の百分率を算出し、ＰＤＨ活性化の指標とした。
被験化合物として化合物（２ｈ）、化合物（３）、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）および化合物（Ｄ）を用いた場合に得られた結果を表２、図１（肝）及び図２（脂肪組織）に示す。また、化合物（２）を用いた場合に得られた結果を表３に示す。
【０１９８】
【表２】
2020189855.tif 000043
【０１９９】
【表３】
2020189855.tif 000044
【０２００】
試験例３：ＺＤＦラットにおける被験化合物反復投与のＨｂＡ１ｃに対する効果
（試験方法）
精製飼料（５．９％  ｆａｔ  ｄｉｅｔ、オリエンタル酵母工業）を供与した２型糖尿病モデルＺｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙラット（雄、７週齢、日本チャールス・リバー）を血糖値、血漿中インスリン濃度、ＨｂＡ１ｃおよび体重に差がでないように、媒体群および被験化合物群に群わけを行った。ラットに被験化合物（１ｍｇ／ｋｇ／５ｍＬ）を暗期３時間前に１日１回反復経口投与した。媒体群のラットには０．５％メチルセルロース水溶液を同様に経口投与した。投与１４日目に尾静脈から採血を行い、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定した。統計的有意性は、Ｄｕｎｎｅｔｔ法により検定し、危険率ｐ＜０．０５を有意とみなした。
被験化合物として化合物（２）および化合物（３）を用いた場合に得られた結果を以下の表４に示す。
【０２０１】
【表４】
2020189855.tif 000045
【０２０２】
試験例４：ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ）ホールセルパッチクランプ試験
（試験方法）
Ｈｕｍａｎ  ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ（ｈＥＲＧ）導入ＨＥＫ２９３細胞（Ｃｙｔｏｍｙｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、ｈＥＲＧ電流に及ぼす影響をホールセルパッチクランプ法により検討した。ｈＥＲＧ導入ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＯ２インキュベーター（ＢＮＡ−１１１、タバイエスペック株式会社）を使用し、温度３７℃、炭酸ガス濃度５％、飽和湿度の設定条件下で継代培養した。培養容器には、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏａｔｅｄ  ７５ｃｍ２フラスコ（４１２３−０１０、旭テクノグラス株式会社）およびＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏａｔｅｄ  ３５ｍｍ培養皿（４０００−０１０、旭テクノグラス株式会社）を使用した。培養液には１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、バイオウェスト社）、１％ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＥＡＡ、インビトロジェン株式会社）を添加したＥ−ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、株式会社日研生物医学研究所））を使用した。これにｈＥＲＧ遺伝子発現細胞を選別するためのｇｅｎｅｔｉｃｉｎを４００μｇ／ｍＬの濃度になるように加えた。測定用の細胞として、ｈＥＲＧ電流測定の４から７日前に、３５ｍｍ培養皿に３×１０４個のｈＥＲＧ導入ＨＥＫ２９３細胞を播種した。測定用に作製する培養皿内には、上記培養液にｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（インビトロジェン株式会社）を加えないものを使用した。
各化合物の評価最高濃度は、標準細胞外液（ＮａＣｌ：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ：２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２：２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２：２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｇｌｕｃｏｓｅ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを用いてｐＨ７．４に調整））中で析出の認められなかった最高濃度から設定した。適用方法として、細胞に近接（約２ｍｍ）させた先端径約０．２５ｍｍのＹ−ｔｕｂｅにより各適用液を噴出させて細胞に適用した。噴出速度は、約０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
実験は室温、位相差顕微鏡下にて行った。細胞を播種した３５ｍｍ培養皿を測定装置にセットし、細胞に常時Ｙ−ｔｕｂｅより標準細胞外液を与えた。測定用ガラス電極内には細胞内液（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ：１３０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２：１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＴＰ−Ｍｇ：５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＧＴＡ：３．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを用いてｐＨ７．２に調整））を充填した。細胞にｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐ法を適用し、保持電位を−８０ｍＶとした。電位固定下に全細胞電流をパッチクランプ用アンプ（ＡＸＯＰＡＴＣＨ−２００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．）により増幅し、データ取得解析ソフトウェア（ｐＣＬＡＭＰ  ９．２、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデータをコンピュータ（ＩＭＣ−Ｐ６４２４００、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に取り込んだ。
ｈＥＲＧ電流の測定は次の２段階で実施した。なお、どちらの場合においてもｃｏｍｍａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（保持電位−８０ｍＶ、ｐｒｅｐｕｌｓｅ  ＋２０ｍＶ、１．５秒間、ｔｅｓｔ−ｐｕｌｓｅ  −５０ｍＶ、１．５秒間）を与えてｈＥＲＧ電流を惹起させた。
工程（１）：上記ｃｏｍｍａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌを０．１Ｈｚで２分間与えた。
工程（２）：上記ｃｏｍｍａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌにｐＣＬＡＭＰ  ９．２のＰ／３  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎを行なって、ｌｅａｋ電流を取り除き、これを３度繰り返してその平均をｈＥＲＧ電流とした。
工程（１）に続いて工程（２）を行い（約３分間）、工程（２）の方法で得られたｈＥＲＧ電流のｔｅｓｔ−ｐｕｌｓｅにおけるｔａｉｌ電流の最大値をｈＥＲＧ電流値とした。以後、実験終了まで（１）、（２）の操作を交互に繰り返し行い、ｈＥＲＧ電流値を測定した。
安定したｈＥＲＧ電流値を３回記録した（約１０分間）後、標準細胞外液を各適用液に瞬時に交換した。適用液灌流中も同様にｈＥＲＧ電流値を３回測定し（約１０分間）、３回目の測定で得られた電流値を適用液灌流後のｈＥＲＧ電流値とした。
データは各細胞において、適用液灌流前の約１０分間で記録した３回のｈＥＲＧ電流値の平均値（Ｂｅｆｏｒｅ値）を１００％とする相対値に変換した。これを２細胞について測定し、その平均値をＲｅｌａｔｉｖｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ（％）として算出した。
Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ（％）＝１００×Ａ÷Ｂ
Ａ：適用液灌流後のｈＥＲＧ電流値
Ｂ：適用液灌流前の約１０分間で記録した３回のｈＥＲＧ電流値の平均値（Ｂｅｆｏｒｅ値）
また、ＤＭＳＯ群に対する抑制率を以下の式に従い算出した。
抑制率（％）＝１００−（Ｃ÷Ｄ）×１００
Ｃ：各被験化合物群のＲｅｌａｔｉｖｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ（％）の平均値
Ｄ：ＤＭＳＯ群のＲｅｌａｔｉｖｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ（％）の平均値
被験化合物として化合物（２）、化合物（３）、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）および化合物（Ｄ）を用いた場合に得られた結果を表５に示す。
【０２０３】
【表５】
2020189855.tif 000046
【０２０４】
試験例５：肝ミクロソーム中での代謝安定性試験
（試験方法）
ヒトの肝ミクロソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製、Ｈ０６２０、終濃度（希釈後）、０．２ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４、β−ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：１．３ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：３．３ｍＭ、塩化マグネシウム：３．３ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：０．４５Ｕ／ｍＬを含む）に懸濁し、さらに、ＭｅＣＮ／ＤＭＳＯ（９５／５）にて溶解した被験化合物（終濃度５μＭ）と混合した。混合液を３７℃にて１０分および６０分インキュベート後、ギ酸（終濃度０．１％）を含むアセトニトリルを加え、遠心分離した上清中の被験化合物（未変化体）を高速液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＬＣ：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ、ＭＳ：ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒまたは  ＴＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて測定した。得られた測定値より、残存率（％）を算出した。
被験化合物として化合物（２）、化合物（３）、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）および化合物（Ｄ）を用いた場合に得られた結果を表６に示す。
【０２０５】
【表６】
2020189855.tif 000047
【産業上の利用可能性】
【０２０６】
本発明化合物またはその製薬上許容される塩は、ＰＤＨＫ阻害活性を有するので、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の予防または治療のための医薬の有効成分として有用である。 
【図１】
2020189855.tif 000062
【図２】
2020189855.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月3日(2020.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物(2)：
【化１】
2020189855.tif 000064
又はその製薬上許容される塩の製造方法であって、下記式：
【化２】
2020189855.tif 000065
で表される化合物のメトキシ基を脱メチル化して下記式：
【化３】
2020189855.tif 000066
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を4-ブロモ酪酸エチルと反応させて下記式：
【化４】
2020189855.tif 000067
で表される化合物を得る工程、得られた化合物をトリメチル（トリフルオロメチル）シランと反応させて下記式：
【化５】
2020189855.tif 000068
で表される化合物を得る工程、得られた化合物を加水分解して下記式：
【化６】
2020189855.tif 000069
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を(1S)-1-(4-メチルフェニル)エチルアミンと反応させて下記式：
【化７】
2020189855.tif 000070
で表される化合物を得る工程、得られた化合物を塩酸で処理して下記式：
【化８】
2020189855.tif 000071
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を脱3-カルボキシプロピル化して下記式：
【化９】
2020189855.tif 000072
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩をトルエン-4-スルホン酸  3-ヒドロキシ-3-メチルブチルエステルと反応させて下記式：
【化１０】
2020189855.tif 000073
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩をパラジウム触媒存在下、2-メチル-2-[4-(4,4,5,5-テトラメチル[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]プロピオン酸エチルと反応させて下記式：
【化１１】
2020189855.tif 000074
で表される化合物又はその塩を得る工程、得られた化合物又はその塩を加水分解して下記式：
【化１２】
2020189855.tif 000075
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び得られた化合物又はその塩を縮合剤存在下、アンモニアと反応させて前記の化合物(2)又はその製薬上許容される塩を得る工程、を含む製造方法。
【請求項２】
前記の化合物(2)又はその製薬上許容される塩を水と反応させて化合物(2h)：
【化１３】
2020189855.tif 000076
又はその製薬上許容される塩を得る工程を更に含む、請求項1記載の製造方法。