(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌、乳酸発酵による漬物の製造方法、および、乳酸発酵により得られる漬物の提供。【解決手段】本発明の乳酸菌は、胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、胆汁酸加水分解酵素活性およびコレステロール吸着能を有し、必要に応じて、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうちの少なくとも１つを有し、抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能のうちの少なくとも１つを有する乳酸菌株。
【請求項２】
胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能を有する請求項１に記載の乳酸菌株。
【請求項３】
前記胆汁酸耐性は、前記乳酸菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を０．３％胆汁末を含む該ＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する場合において、該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地において培養する前と比較して該０．３％胆汁末を含む培地の濁度の増加が約０．１以上であることを意味し、
前記低ｐＨ耐性は、該菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置した後、１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する場合において、該塩酸での処理後にもコロニー形成がみられた場合を意味し、
前記コレステロール吸着能は、該菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清（５００μＬ）に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温し、ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する場合において、該菌株の培養菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いことを意味し、
前記胆汁酸加水分解酵素活性能は、タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した該菌株を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養し、形成されたコロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットし、ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴噴霧して発色させる場合において、デオキシコール酸に由来するスポットが観察されることを意味し、
ここで、ＭＲＳ培地は、精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）および硫酸マンガン（０．０５ｇ）という組成を有し、
ＭＲＳ寒天培地［  ＭＲＳに１．５％の寒天を添加したもの］は、精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）、硫酸マンガン（０．０５ｇ）および寒天（１５．０ｇ）という組成を有する、
請求項１または２に記載の乳酸菌株。
【請求項４】
前記乳酸菌株は、抗メタボリックシンドローム作用を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項５】
前記乳酸菌株が、内臓脂肪の減少能、空腹時血糖値の減少能、空腹時血清中の総コレステロールの減少能、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能および肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能のうちの少なくとも１つを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項６】
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定するとき、
前記内蔵脂肪の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、摘出した副睾丸脂肪組織の重量を測定する場合において、副睾丸脂肪組織重量が約１０％以上低いことを意味し、
前記空腹時血糖値の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定する場合において、約５％以上の空腹時血清中のグルコースの減少を意味し、
前記空腹時血清中の総コレステロールの減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定する場合において、約５％以上の血清中の総コレステロールの減少を意味し、
前記肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、約１０％以上の肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少を意味し、
前記肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子に対するプライマー（配列番号３３および３４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、約１０％以上の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少を意味し、
ここで、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料はコーンスターチ（４６．５６９２％）、カゼイン（１４．０％）、アルファー化コーンスターチ（１５．５％）、グラニュー糖（１０．０％）、大豆油（４．０％）、セルロースパウダー（５．０％）、ＡＩＮ−９３Ｍミネラル混合（３．５％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．１８％）、重酒石酸コリン（０．２５％）、第三ブチルヒドロキノン（０．０００８％）という組成を有し、
ＨＦＤ６０はアルファー化コーンスターチ（１６．０％）、カゼイン（２５．６％）、グラニュー糖（５．５％）、マルトデキストリン（６．０％）、大豆油（２．０％）、ラード（３３．０％）、セルロースパウダー（６．６１％）、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合（３．５％）、炭酸カルシウム（０．１８％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．３６％）、重酒石酸コリン（０．２５％）という組成を有する、
請求項１〜５のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項７】
前記乳酸菌株は、インターロイキン（ＩＬ）−１０産生誘導能、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうち少なくとも１つを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項８】
前記ＩＬ−１０産生誘導能は、マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した前記菌株の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株の菌体無添加のものと比較して、約３倍以上のＩＬ−１０濃度の上昇を誘導することを意味し、
前記ＩＦＮ−γ産生誘導能は、マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株の菌体無添加のものと比較して、約１０倍以上のＩＦＮ−γ濃度の上昇を誘導することを意味し、
前記腸管上皮バリア機能維持能は、トランズウェル上にて小腸上皮様細胞を培養し、トランズウェル上部に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する場合において、該菌株の菌体無添加と比較して、細胞単層膜を通過した後のマンニトール量を約２０％以上低減することを意味し、
前記レジスチン抑制活性は、ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養し、培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する場合において、該菌株の菌体無添加と比較して、約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導することを意味し、
ここで、ＲＰＭＩ１６４０培地は、精製水１０００ｍＬに対して、硝酸カルシウム（０．１ｇ）、硫酸マグネシウム（０．０４８８４ｇ）、塩化カリウム（０．４ｇ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ）、塩化ナトリウム（６ｇ）、リン酸二ナトリウム（０．８ｇ）、Ｌ―アルギニン（０．２ｇ）、Ｌ―アスパラギン（０．０５ｇ）、Ｌ―アスパルギン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―シスチン塩酸塩（０．０６５２ｇ）、Ｌ―グルタミン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―グルタミン（０．３ｇ）、グリシン（０．０１ｇ）、Ｌ―ヒスチジン（０．０１５ｇ）、ヒドロキシーＬ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―イソロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―ロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―リジン塩酸塩（０．０４ｇ）、Ｌ―メチオニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―フェニルアラニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―セリン（０．０３ｇ）、Ｌ―スレオニン（０．０２ｇ）、Ｌ―トリプロファン（０．００５ｇ）、Ｌ―チロシン（０．０２８８３ｇ）、Ｌ―バリン（０．０２ｇ）、Ｄ―ビオチン（０．００２ｇ）、塩化コリン（０．００３ｇ）、葉酸（０．００１ｇ）、ｍｙｏ―イノシトール（０．０３５ｇ）、ナイアシンアミド（０．００１ｇ）、ｐ―アミノ安息香酸（０．００１ｇ）、Ｄ―パントテン酸（０．０００２５ｇ）、ピリドキシン塩酸塩（０．００１ｇ）、リボフラビン（０．０００２ｇ）、チアミン塩酸塩（０．００１ｇ）、ビタミンＢ１２（０．０００００５ｇ）、Ｄ―グルコース（２ｇ）、グルタチオン（０．００１ｇ）、フェノールレッド（０．００５３ｇ）という組成を有する、
請求項１〜７のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項９】
桿菌である、請求項１〜８のいずれかに記載の乳酸菌株。
【請求項１０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
【請求項１１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
【請求項１２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）の誘導株であって、請求項１〜１１のいずれか一項または複数に記載の乳酸菌の特徴を有する、誘導株である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
【請求項１３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  （Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム核酸配列またはその部分配列を含む核酸分子。
【請求項１４】
配列番号３９（Ｎ−０７株の全ゲノム配列）もしくは配列番号３９において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列を含む核酸分子。
【請求項１５】
ＣＤＳ番号１〜３４４６に記載の核酸配列もしくはＣＤＳ番号１〜３４４６において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列のうち１種または複数種を含む核酸分子。
【請求項１６】
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子を含む、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株を検出するための組成物。
【請求項１７】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸分子が標識を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ａ）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子、および
ｂ）核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬
を含む、キット。
【請求項２３】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記核酸分子が標識を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬が、核酸ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、および緩衝液のうちの少なくとも１種を含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
試料中のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出する方法であって、
１）前記試料からＤＮＡを抽出するステップと、
２）前記試料から抽出した前記ＤＮＡを、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子と接触させるステップと、
３）核酸増幅アッセイを実施して、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を増幅するステップと、
４）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記核酸分子が標識を含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸配列と同一の核酸配列、または
（ｂ）（ａ）の核酸配列において１以上の置換、付加または欠失を有し、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の生物学的活性
を有する、乳酸菌株。
【請求項３６】
乳酸菌株をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で乳酸菌の菌株候補を１日培養して、該菌株候補の培養菌体を０．３％胆汁末を含む該ＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する場合において、該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地において培養する前と比較して、該菌株候補を培養した後の該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地の濁度の増加が約０．１以上であるかどうかを調べる工程と、
Ｂ）ＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株候補の培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置した後１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する場合において、塩酸での処理後にもコロニー形成がみられるかどうかを調べる工程と、
Ｃ）該菌株候補について、以下、ｃ１）該菌株候補をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株候補の培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温し、ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する場合において、該菌株候補の菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いかどうか、およびｃ２）タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した該菌株候補を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養し、形成されたコロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットし、ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴噴霧して発色させる場合において、デオキシコール酸に由来するスポットが観察されるかどうかを調べる工程と
Ｄ）Ａ）工程、Ｂ）工程およびＣ）工程の全てにおいて陽性という条件を満たすかどうかを判定し、満たすものを抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株として選抜する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
Ｅ）ｅ１）マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した前記菌株候補を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株候補無添加のものと比較して、約３倍以上のＩＬ−１０濃度の上昇を誘導するかどうか、ｅ２）マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した該菌株候補を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株候補無添加のものと比較して、約１０倍以上のＩＦＮ−γ濃度の上昇を誘導するかどうか、ｅ３）トランズウェル上にて小腸上皮様細胞を培養し、トランズウェル上部に加熱殺菌した該菌株候補を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する場合において、該候補乳酸菌無添加と比較して、細胞単層膜を通過した後のマンニトール量を約２０％以上低減するかどうか、およびｅ４）ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した該候補乳酸菌を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養し、培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する場合において、該菌株候補無添加と比較して、約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導するかどうかのうちの少なくとも１つを確認する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記菌株候補が、抗メタボリックシンドローム作用を有するかどうかを確認する工程をさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｆ）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの前記菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定するとき、
ｆ１）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、摘出した副睾丸脂肪組織の重量を測定する場合において、副睾丸脂肪組織重量が約１０％以上低いかどうか、
ｆ２）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定する場合において、空腹時血清中のグルコースが約５％以上減少するかどうか、
ｆ３）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定する場合において、血清中の総コレステロール量が約５％以上低いかどうか、
ｆ４）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現量が約１０％以上低いかどうか、ならびに
ｆ５）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現量が約１０％以上低いかどうか
のうち、少なくとも１つを確認することを含む請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｅ）においてｅ１）〜ｅ４）の少なくとも２つ、少なくともの３つまたは４つを調べる工程を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法によって同定された乳酸菌株。
【請求項４２】
Ａ）工程、Ｂ）工程およびＣ）工程の全てにおいて陽性という条件を満たす乳酸菌株。
【請求項４３】
野菜を原料とする発酵食品を製造する方法であって、前記野菜にスターターとして請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を添加して発酵させることを特徴とする、方法。
【請求項４４】
前記野菜が野沢菜である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記発酵食品が漬物である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法により製造される、発酵食品。
【請求項４７】
漬物である、請求項４６に記載の発酵食品。
【請求項４８】
請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む、食品。
【請求項４９】
請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む、キット。
【請求項５０】
アミノ酸または核酸を含有する調味料をさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む食品の製造方法。
【請求項５２】
請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を培養した後の培養液。
【請求項５３】
請求項１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株または請求項５２に記載の培養液を含む、メタボリックシンドロームを改善または抑制するための組成物。
【請求項５４】
ＣＤＳ番号１〜３４４６のいずれか１つまたは複数に記載の核酸配列もしくはＣＤＳ番号１〜３４４６において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列によってコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株、これを取得する方法、ならびにこの乳酸菌株を用いて得られる加工食品（例えば、漬物）およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
野菜の摂取は種々の疾病の発症リスクを低下させることが疫学研究で明らかとなっている。漬物は野菜の加工形態の一つであるが、野菜を発酵させて製造する漬物は、発酵させないいわゆる浅漬け漬物と比較すると、その製造量はごく僅かである。乳酸菌や乳酸発酵食品の健康機能性が注目されているにもかかわらず、工業的な漬物製造において乳酸発酵が利用されない要因は品質の安定化が困難であることが挙げられる。
【０００３】
一方で、メタボリックシンドロームの増加が医療費増加の一因となっている。メタボリックシンドロームは、食生活をはじめとする生活習慣の乱れが最大の原因であるため、薬物療法よりも運動療法や食事療法等生活週間を見直すことがより重要とされている。そこで、日常的に摂取でき、長期にわたって摂取しても安全性が高い抗メタボリックシンドローム作用を有する食品素材が求められている。
【０００４】
工業的な漬物製造において品質の安定した乳酸発酵を実現するためには、スターター乳酸菌の使用が有効であり、漬物製造用の乳酸菌スターターが上市されている。しかしながら、嗜好的にも優れた漬物が製造可能、かつ抗メタボリックシンドローム作用を有する漬物製造用乳酸菌スターターはこれまでになかった。多くの漬物は減塩が進んでいるにも関わらず、漬物の生産量は減少傾向が続いている一因は、漬物による塩分摂取による健康へのネガティブイメージであると考えられている。本発明による抗メタボリックシンドローム作用を有する機能性漬物は、漬物の消費拡大、ひいては野菜の消費拡大につながるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究した結果、新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株とそれを用いて得られる漬物およびその製造方法を見出した。本発明の乳酸菌株は、胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、胆汁酸加水分解酵素活性およびコレステロール吸着能を有し、必要に応じて、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうちの少なくとも１つを有し、抗メタボリックシンドローム作用を有する。
【０００６】
本発明は、新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株とそれを用いて得られる漬物およびその製造方法を提供する。
【０００７】
本発明は例えば、以下を提供する。
(項目１)
胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能のうちの少なくとも１つを有する乳酸菌株。
(項目２)
胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能を有する項目１に記載の乳酸菌株。
(項目３)
前記胆汁酸耐性は、前記乳酸菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を０．３％胆汁末を含む該ＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する場合において、該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地において培養する前と比較して該０．３％胆汁末を含む培地の濁度の増加が約０．１以上であることを意味し、
前記低ｐＨ耐性は、該菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置した後、１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する場合において、該塩酸での処理後にもコロニー形成がみられた場合を意味し、
前記コレステロール吸着能は、該菌株をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株の培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清（５００μＬ）に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温し、ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する場合において、該菌株の培養菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いことを意味し、
前記胆汁酸加水分解酵素活性能は、タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した該菌株を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養し、形成されたコロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットし、ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴噴霧して発色させる場合において、デオキシコール酸に由来するスポットが観察されることを意味し、
ここで、ＭＲＳ培地は、精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）および硫酸マンガン（０．０５ｇ）という組成を有し、
ＭＲＳ寒天培地［  ＭＲＳに１．５％の寒天を添加したもの］は、精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）、硫酸マンガン（０．０５ｇ）および寒天（１５．０ｇ）という組成を有する、
項目１または２に記載の乳酸菌株。
(項目４)
前記乳酸菌株は、抗メタボリックシンドローム作用を有する、項目１〜３のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目５)
前記乳酸菌株が、内臓脂肪の減少能、空腹時血糖値の減少能、空腹時血清中の総コレステロールの減少能、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能および肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能のうちの少なくとも１つを有する、項目１〜４のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目６)
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定するとき、
前記内蔵脂肪の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、摘出した副睾丸脂肪組織の重量を測定する場合において、副睾丸脂肪組織重量が約１０％以上低いことを意味し、
前記空腹時血糖値の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定する場合において、約５％以上の空腹時血清中のグルコースの減少を意味し、
前記空腹時血清中の総コレステロールの減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定する場合において、約５％以上の血清中の総コレステロールの減少を意味し、
前記肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、約１０％以上の肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少を意味し、
前記肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能は、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子に対するプライマー（配列番号３３および３４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、約１０％以上の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少を意味し、
ここで、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料はコーンスターチ（４６．５６９２％）、カゼイン（１４．０％）、アルファー化コーンスターチ（１５．５％）、グラニュー糖（１０．０％）、大豆油（４．０％）、セルロースパウダー（５．０％）、ＡＩＮ−９３Ｍミネラル混合（３．５％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．１８％）、重酒石酸コリン（０．２５％）、第三ブチルヒドロキノン（０．０００８％）という組成を有し、ＨＦＤ６０はアルファー化コーンスターチ（１６．０％）、カゼイン（２５．６％）、グラニュー糖（５．５％）、マルトデキストリン（６．０％）、大豆油（２．０％）、ラード（３３．０％）、セルロースパウダー（６．６１％）、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合（３．５％）、炭酸カルシウム（０．１８％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．３６％）、重酒石酸コリン（０．２５％）という組成を有する、
項目１〜５のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目７)
前記乳酸菌株は、インターロイキン（ＩＬ）−１０産生誘導能、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうち少なくとも１つを有する、項目１〜６のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目８)
前記ＩＬ−１０産生誘導能は、マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した前記菌株の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株の菌体無添加のものと比較して、約３倍以上のＩＬ−１０濃度の上昇を誘導することを意味し、
前記ＩＦＮ−γ産生誘導能は、マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株の菌体無添加のものと比較して、約１０倍以上のＩＦＮ−γ濃度の上昇を誘導することを意味し、
前記腸管上皮バリア機能維持能は、トランズウェル上にて小腸上皮様細胞を培養し、トランズウェル上部に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する場合において、該菌株の菌体無添加と比較して、細胞単層膜を通過した後のマンニトール量を約２０％以上低減することを意味し、
前記レジスチン抑制活性は、ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した該菌株の乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養し、培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する場合において、該菌株の菌体無添加と比較して、約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導することを意味し、
ここで、ＲＰＭＩ１６４０培地は、精製水１０００ｍＬに対して、硝酸カルシウム（０．１ｇ）、硫酸マグネシウム（０．０４８８４ｇ）、塩化カリウム（０．４ｇ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ）、塩化ナトリウム（６ｇ）、リン酸二ナトリウム（０．８ｇ）、Ｌ―アルギニン（０．２ｇ）、Ｌ―アスパラギン（０．０５ｇ）、Ｌ―アスパルギン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―シスチン塩酸塩（０．０６５２ｇ）、Ｌ―グルタミン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―グルタミン（０．３ｇ）、グリシン（０．０１ｇ）、Ｌ―ヒスチジン（０．０１５ｇ）、ヒドロキシーＬ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―イソロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―ロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―リジン塩酸塩（０．０４ｇ）、Ｌ―メチオニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―フェニルアラニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―セリン（０．０３ｇ）、Ｌ―スレオニン（０．０２ｇ）、Ｌ―トリプロファン（０．００５ｇ）、Ｌ―チロシン（０．０２８８３ｇ）、Ｌ―バリン（０．０２ｇ）、Ｄ―ビオチン（０．００２ｇ）、塩化コリン（０．００３ｇ）、葉酸（０．００１ｇ）、ｍｙｏ―イノシトール（０．０３５ｇ）、ナイアシンアミド（０．００１ｇ）、ｐ―アミノ安息香酸（０．００１ｇ）、Ｄ―パントテン酸（０．０００２５ｇ）、ピリドキシン塩酸塩（０．００１ｇ）、リボフラビン（０．０００２ｇ）、チアミン塩酸塩（０．００１ｇ）、ビタミンＢ１２（０．０００００５ｇ）、Ｄ―グルコース（２ｇ）、グルタチオン（０．００１ｇ）、フェノールレッド（０．００５３ｇ）という組成を有する、
項目１〜７のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目９)
桿菌である、項目１〜８のいずれかに記載の乳酸菌株。
(項目１０)
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属である、項目１〜９のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
(項目１１)
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
(項目１２)
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）の誘導株であって、項目１〜１１のいずれか一項または複数に記載の乳酸菌の特徴を有する、誘導株である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の乳酸菌株。
(項目１３)
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  （Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム核酸配列またはその部分配列を含む核酸分子。
(項目１４)
配列番号３９（Ｎ−０７株の全ゲノム配列）もしくは配列番号３９において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列を含む核酸分子。
(項目１５)
ＣＤＳ番号１〜３４４６に記載の核酸配列もしくはＣＤＳ番号１〜３４４６において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列のうち１種または複数種を含む核酸分子。
(項目１６)
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子を含む、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株を検出するための組成物。
(項目１７)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目１６に記載の組成物。
(項目１８)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目１６に記載の組成物。
(項目１９)
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２０)
前記核酸分子が標識を含む、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２１)
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、項目２０に記載の組成物。
(項目２２)
ａ）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子、および
ｂ）核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬
を含む、キット。
(項目２３)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目２２に記載のキット。
(項目２４)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目２２に記載のキット。
(項目２５)
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６)
前記核酸分子が標識を含む、項目２２〜２５のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７)
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、項目２６に記載のキット。
(項目２８)
前記核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬が、核酸ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、および緩衝液のうちの少なくとも１種を含む、項目２２〜２７のいずれか一項に記載のキット。
(項目２９)
試料中のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出する方法であって、
１）前記試料からＤＮＡを抽出するステップと、
２）前記試料から抽出した前記ＤＮＡを、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子と接触させるステップと、
３）核酸増幅アッセイを実施して、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を増幅するステップと、
４）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出するステップと
を含む、方法。
(項目３０)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である、項目２９に記載の方法。
(項目３２)
前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する、項目２９〜３１のいずれか一項に記載のキット。
(項目３３)
前記核酸分子が標識を含む、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
（ａ）項目１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸配列と同一の核酸配列、または
（ｂ）（ａ）の核酸配列において１以上の置換、付加または欠失を有し、項目１〜１２のいずれか一項に記載の生物学的活性
を有する、乳酸菌株。
(項目３６)
乳酸菌株をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で乳酸菌の菌株候補を１日培養して、該菌株候補の培養菌体を０．３％胆汁末を含む該ＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する場合において、該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地において培養する前と比較して、該菌株候補を培養した後の該０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地の濁度の増加が約０．１以上であるかどうかを調べる工程と、
Ｂ）ＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株候補の培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置した後１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する場合において、塩酸での処理後にもコロニー形成がみられるかどうかを調べる工程と、
Ｃ）該菌株候補について、以下、ｃ１）該菌株候補をＭＲＳ培地において嫌気条件下３７℃で１日培養して、該菌株候補の培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温し、ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する場合において、該菌株候補の菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いかどうか、およびｃ２）タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した該菌株候補を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養し、形成されたコロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットし、ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴噴霧して発色させる場合において、デオキシコール酸に由来するスポットが観察されるかどうかを調べる工程と
Ｄ）Ａ）工程、Ｂ）工程およびＣ）工程の全てにおいて陽性という条件を満たすかどうかを判定し、満たすものを抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株として選抜する工程
を包含する、方法。
(項目３７)
Ｅ）ｅ１）マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した前記菌株候補を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株候補無添加のものと比較して、約３倍以上のＩＬ−１０濃度の上昇を誘導するかどうか、ｅ２）マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した該菌株候補を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する場合において、該菌株候補無添加のものと比較して、約１０倍以上のＩＦＮ−γ濃度の上昇を誘導するかどうか、ｅ３）トランズウェル上にて小腸上皮様細胞を培養し、トランズウェル上部に加熱殺菌した該菌株候補を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する場合において、該候補乳酸菌無添加と比較して、細胞単層膜を通過した後のマンニトール量を約２０％以上低減するかどうか、およびｅ４）ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した該候補乳酸菌を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養し、培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する場合において、該菌株候補無添加と比較して、約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導するかどうかのうちの少なくとも１つを確認する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
(項目３８)
前記菌株候補が、抗メタボリックシンドローム作用を有するかどうかを確認する工程をさらに含む、項目３６または３７に記載の方法。
(項目３９)
Ｆ）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの前記菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定するとき、
ｆ１）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、摘出した副睾丸脂肪組織の重量を測定する場合において、副睾丸脂肪組織重量が約１０％以上低いかどうか、
ｆ２）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定する場合において、空腹時血清中のグルコースが約５％以上減少するかどうか、
ｆ３）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、空腹状態のマウスの心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定する場合において、血清中の総コレステロール量が約５％以上低いかどうか、
ｆ４）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現量が約１０％以上低いかどうか、ならびに
ｆ５）ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す場合において、肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現量が約１０％以上低いかどうか
のうち、少なくとも１つを確認することを含む項目３６〜３８のいずれかに記載の方法。
(項目４０)
前記Ｅ）においてｅ１）〜ｅ４）の少なくとも２つ、少なくともの３つまたは４つを調べる工程を含む、項目３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
項目３６〜４０のいずれか一項に記載の方法によって同定された乳酸菌株。
(項目４２)
Ａ）工程、Ｂ）工程およびＣ）工程の全てにおいて陽性という条件を満たす乳酸菌株。
(項目４３)
野菜を原料とする発酵食品を製造する方法であって、前記野菜にスターターとして項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を添加して発酵させることを特徴とする、方法。
(項目４４)
前記野菜が野沢菜である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記発酵食品が漬物である、項目４３または４４に記載の方法。
(項目４６)
項目４３〜４５のいずれか一項に記載の方法により製造される、発酵食品。
(項目４７)
漬物である、項目４６に記載の発酵食品。
(項目４８)
項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む、食品。
(項目４９)
項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む、キット。
(項目５０)
アミノ酸または核酸を含有する調味料をさらに含む、項目４９に記載のキット。
(項目５１)
項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含む食品の製造方法。
(項目５２)
項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株を培養した後の培養液。
(項目５３)
項目１〜１２、３５および４２のいずれか一項に記載の乳酸菌株または項目５２に記載の培養液を含む、メタボリックシンドロームを改善または抑制するための組成物。
（項目５４）
ＣＤＳ番号１〜３４４６のいずれか１つまたは複数に記載の核酸配列もしくはＣＤＳ番号１〜３４４６において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列によってコードされるポリペプチド。
【０００８】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、漬物製造に好適な乳酸菌株でかつ抗メタボリックシンドローム作用を有し、この菌株を漬物製造時のスターターとして用いることで嗜好性にも優れ、機能性も有する漬物製造が可能な乳酸菌株が提供された。特に、漬物製造に適した乳酸菌株であって、抗メタボリックシンドローム作用をはじめとする機能性を有する乳酸菌株が提供された。また、本発明は、新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌を用いて得られる漬物およびその製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、高脂肪食、高脂肪食および菌株Ａならびに高脂肪食およびＮ−０７株を摂取したマウスの体重および副睾丸脂肪組織重量を示す。
【００１１】
【図２】図２は、高脂肪食、高脂肪食および菌株Ａならびに高脂肪食およびＮ−０７株を摂取したマウスの（Ａ）血清コレステロール、（Ｂ）血糖値ならびに（Ｃ）肝臓におけるＰＰＡＲγおよびａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ遺伝子発現を示す。
【００１２】
【図３】図３は、本開示のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム配列と、公開データベース上のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍゲノムとの比較（ＣＧＶｉｅｗ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｏｏｌを使用）を示す図である。
【００１３】
【図４】図４は、アガロースゲル電気泳動によってＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーの特異性を示す図である。
【００１４】
【図５】図５は、アガロースゲル電気泳動によって、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーが多様な状態のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株を検出可能であることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１７】
（定義等）
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる
Ｌ．：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「乳酸菌」とは、当該分野で使用される最も広義に解され、炭水化物（糖類など）を発酵してエネルギーを獲得し、多量の乳酸を生成する一群の細菌の総称であり、グラム染色で陽性を示し、一般に、カタラーゼ（過酸化水素を分解する酵素）をもたず、芽胞（内生胞子）を形成せず、一般に運動性がないという共通的特徴を有するものであり、２５０種以上の種が正式に認められている。例えば、乳酸菌として、例えば、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（レンサ球菌属）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびビフィドバクテリウム属  （Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などが挙げられる。本発明の菌株は、一般に、乳酸菌に分類される。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ」または「Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ」とは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されるグラム陽性細菌であり、特に、以下の微生物学的特徴を有する菌株をいう。
・１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の配列解析により、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ基準株（例えば、ＪＣＭ１１４９Ｔ株）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ，Ｘ５２６５３）と例えば９９％などの高い相同性を示すこと
・ＣＬＵＳＴＡＬＸ等によるアライメント解析後のＭＥＧＡ等による系統樹解析により、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ基準株と系統学的に近縁な位置関係が認められること
・ｒｅｃＡ遺伝子を標的にしたｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法により、ｒｅｃＡのＰＣＲ増幅産物がＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ基準株の同増副産物と同じ電気泳動パターンを示すこと。
【００２０】
本明細書において「胆汁酸耐性」とは、胆汁末を含む培地における菌体の増殖をいい、トランスポーターによる胆汁酸の排出機能などの特性が例示される。「胆汁酸耐性」は、本明細書において胆汁酸耐性試験の条件および測定方法によって、胆汁酸耐性試験前と比較して、濁度の増加が約０．１以上であることを確認することで特定され、通常は、約０．１以上、好ましくは、約０．５以上、より好ましくは、約１．０以上という値を有することで特定される。胆汁酸耐性試験前と比較した濁度の増加は、例えば、約０．１以上、約０．２以上、約０．３以上、約０．４以上、約０．５以上、約０．６以上、約０．７以上、約０．８以上、約０．９以上または約１．０以上であってもよい。
【００２１】
胆汁酸耐性試験の条件および測定方法を以下に説明する。
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する。濁度の増加が約０．１以上であった分離株を胆汁酸耐性ありと判定する。
ここで、ＭＲＳ培地の組成は、以下のとおりである：精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）、および硫酸マンガン（０．０５ｇ）。
【００２２】
本明細書において「低ｐＨ耐性」とは、代表的には、ｐＨ２．５における耐性であって、低ｐＨに調整された培地で処理した後の一定レベルでのコロニー形成能をいい、菌体内水素イオンの排出能、菌体内ｐＨの上昇機構の保有などの特性が例示される。「低ｐＨ耐性」は、本明細書において低ｐＨ耐性試験の条件および測定方法によって、ｐＨ２．５で処理した場合にコロニーの形成を確認することで特定され、好ましくは、コロニーの形成数がｐＨ２．５で処理しない場合のコロニー形成数の約１／１０万以上、より好ましくは、約１／１万以上、最も好ましくは、約１／１０００以上という値を有することで特定される。
【００２３】
低ｐＨ耐性試験の条件および測定方法を以下に説明する。
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置する。これを１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する。コロニーを形成した分離株を低ｐＨ耐性ありと判定する。
ここで、ＭＲＳ寒天培地の組成は、以下のとおりである：精製水１０００ｍｌに対して、ペプトン（１０．０ｇ）、牛肉エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、ブドウ糖（２０．０ｇ）、リン酸一水素カリウム（２．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．２ｇ）、硫酸マンガン（０．０５ｇ）および寒天（１５．０ｇ）。
【００２４】
本明細書において「コレステロール吸着能」とは、培地からのコレステロール取り込み能をいい、食物等に由来するコレステロールの消化管からの排出を促進することで体内のコレステロールを低下させる機能が期待される。「コレステロール吸着能」は、本明細書においてコレステロール吸着能試験の条件および測定方法によって、菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いことを確認することで特定され、通常は、約１０％以上、好ましくは、約２５％以上、より好ましくは、約５０％以上という値を有することで特定される。菌体を添加しないものと比較した培養上清中のコレステロール濃度は、例えば、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上または約５０％以上であってもよい。
【００２５】
コレステロール吸着能試験の条件および測定方法を以下に説明する。
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養する。１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清（５００μＬ）に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温する。ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する。実験は３反復で行い、菌体を添加しないものと比較して約１０％以上培養上清中のコレステロール濃度が低いものをコレステロール吸着能ありと判定する。
【００２６】
本明細書において「胆汁酸加水分解酵素活性」とは、タウロデオキシコール酸の分解活性をいい、消化管内の胆汁酸組成を変化させることにより、コレステロールや脂質代謝を改善することが期待されている。「胆汁酸加水分解酵素活性」は、本明細書において胆汁酸加水分解酵素活性試験の条件および測定方法によって、デオキシコール酸に由来するスポットが観察することで特定される。このように、「胆汁酸加水分解酵素活性」は定性的に有無を確認することで、本発明の乳酸菌株かどうかの判断に用いることができる。
【００２７】
胆汁酸加水分解酵素活性試験の条件および測定方法を以下に説明する。
タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した乳酸菌分離株を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養する。コロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットする。ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴霧して発色させ、デオキシコール酸に由来するスポットが観察された分離株を胆汁酸分解酵素活性ありと判定する。
【００２８】
本明細書において「インターロイキン（ＩＬ）−１０産生誘導能」とは、細胞（例えば、マウス脾細胞）が産生したＩＬ−１０の培地への分泌能をいい、ＩＬ−１０には抗炎症作用などの特性が例示される。「ＩＬ−１０産生誘導能」は、本明細書において細胞（例えば、マウス脾細胞）におけるＩＬ−１０産生誘導能試験の条件および測定方法によって、菌体無添加のものと比較して、ＩＬ−１０濃度の約２倍以上の上昇を誘導することを確認することで特定され、通常は、約２倍以上、好ましくは、約４倍以上、より好ましくは、約７倍以上という値を有することで特定される。菌体無添加のものと比較したＩＬ−１０濃度上昇は、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍または約７倍誘導されてもよい。
【００２９】
マウス脾細胞におけるＩＬ−１０産生誘導能試験の条件および測定方法を以下に説明する。
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養する。培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量し、ＩＬ−１０濃度が菌体無添加のものと比較して約２倍以上の上昇を誘導した分離株をサイトカイン産生誘導能ありと判定する。
ここで、ＲＰＭＩ１６４０培地の組成は、以下のとおりである：精製水１０００ｍＬに対して、硝酸カルシウム（０．１ｇ）、硫酸マグネシウム（０．０４８８４ｇ）、塩化カリウム（０．４ｇ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ）、塩化ナトリウム（６ｇ）、リン酸二ナトリウム（０．８ｇ）、Ｌ―アルギニン（０．２ｇ）、Ｌ―アスパラギン（０．０５ｇ）、Ｌ―アスパルギン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―シスチン塩酸塩（０．０６５２ｇ）、Ｌ―グルタミン酸（０．０２ｇ）、Ｌ―グルタミン（０．３ｇ）、グリシン（０．０１ｇ）、Ｌ―ヒスチジン（０．０１５ｇ）、ヒドロキシーＬ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―イソロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―ロイシン（０．０５ｇ）、Ｌ―リジン塩酸塩（０．０４ｇ）、Ｌ―メチオニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―フェニルアラニン（０．０１５ｇ）、Ｌ―プロリン（０．０２ｇ）、Ｌ―セリン（０．０３ｇ）、Ｌ―スレオニン（０．０２ｇ）、Ｌ―トリプロファン（０．００５ｇ）、Ｌ―チロシン（０．０２８８３ｇ）、Ｌ―バリン（０．０２ｇ）、Ｄ―ビオチン（０．００２ｇ）、塩化コリン（０．００３ｇ）、葉酸（０．００１ｇ）、ｍｙｏ―イノシトール（０．０３５ｇ）、ナイアシンアミド（０．００１ｇ）、ｐ―アミノ安息香酸（０．００１ｇ）、Ｄ―パントテン酸（０．０００２５ｇ）、ピリドキシン塩酸塩（０．００１ｇ）、リボフラビン（０．０００２ｇ）、チアミン塩酸塩（０．００１ｇ）、ビタミンＢ１２（０．０００００５ｇ）、Ｄ―グルコース（２ｇ）、グルタチオン（０．００１ｇ）、フェノールレッド（０．００５３ｇ）。
【００３０】
本明細書において「インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生誘導能」とは、細胞（例えば、マウス脾細胞）が産生したＩＦＮ−γの培地への分泌能をいい、ＩＦＮ−γには抗アレルギー作用などの特性が例示される。「ＩＦＮ−γ産生誘導能」は、本明細書において細胞（例えば、マウス脾細胞）におけるＩＦＮ−γ産生誘導能試験の条件および測定方法によって、菌体無添加のものと比較して、ＩＦＮ−γ濃度の約５倍以上の上昇を誘導することを確認することで特定され、通常は、約５倍以上、好ましくは、約１０倍以上、より好ましくは、約４０倍以上という値を有することで特定される。菌体無添加のものと比較したＩＦＮ−γ濃度上昇は、例えば、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍または約４０倍誘導されてもよい。
【００３１】
マウス脾細胞におけるＩＦＮ−γ産生誘導能試験の条件および測定方法を以下に説明する。
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養する。培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量し、ＩＦＮ−γ濃度が菌体無添加のものと比較して約５倍以上の上昇を誘導した分離株をサイトカイン産生誘導能ありと判定する。
【００３２】
本明細書において「腸管バリア機能維持能」とは、トランズウェル上部からＣａｃｏ−２細胞単層膜を通過してトランズウェル下部に透過するマンニトール量の低減能をいい、メタボリックシンドロームの発症には腸管バリア機能の破綻が関与すると考えられている。「腸管バリア機能維持能」は、本明細書において腸管上皮バリア維持機能試験の条件および測定方法によって、菌体無添加と比較して、トランズウェル上部から下部へのマンニトール透過量の約２０％以上の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約２０％以上、好ましくは、約４０％以上、より好ましくは、約６０％以上という値を有することで特定される。菌体無添加と比較した細胞単層膜を通過した後のマンニトール量は、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上減少してもよい。
【００３３】
腸管上皮バリア維持機能試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ヒト結腸がん由来細胞株Ｃａｃｏ−２を腸上皮細胞分化エンバイロメント（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、トランズウェル上にて培養し、小腸上皮様細胞に分化誘導する。トランズウェル上部に加熱殺菌した乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する。菌体無添加と比較して、トランズウェル上部から下部へのマンニトール透過量を約２０％以上減少させた分離株を腸管上皮機能バリア維持機能ありと判定する。
【００３４】
本明細書において「レジスチン抑制活性」とは、高グルコース刺激下における細胞（例えば、Ｕ９３７細胞）におけるレジスチン産生減少の誘導能をいい、レジスチンにはインスリン抵抗性誘導、動脈硬化誘導などの特性が例示される。「レジスチン抑制活性」は、本明細書においてレジスチン抑制活性試験の条件および測定方法によって、菌体無添加と比較して約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約２０％以上、好ましくは、約５０％以上、より好ましくは、約７０％以上という値を有することで特定される。菌体無添加と比較したレジスチン産生減少は、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上または約７０％以上誘導されてもよい。
【００３５】
レジスチン抑制活性試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養する。培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する。菌体無添加と比較して約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導した分離株をレジスチン抑制活性ありと判定する。
【００３６】
本明細書において「内臓脂肪の減少能」とは、内臓脂肪を減少させる能力をいい、メタボリックシンドロームの改善に寄与すると考えられている指標であり、一般に、動物実験において体脂肪を最も一般的に測定される副睾丸脂肪組織の減少能により測定することができる。「内臓脂肪の減少能」は、本明細書において副睾丸脂肪組織重量の測定試験の条件および測定方法によって、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、有意な副睾丸脂肪組織重量の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、脂肪組織重量の減少率が、約１０％以上、好ましくは、約２０％以上、より好ましくは、約２５％以上という値を有することで特定される。
ここで、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料の組成は、以下のとおりである：コーンスターチ（４６．５６９２％）、カゼイン（１４．０％）、アルファー化コーンスターチ（１５．５％）、グラニュー糖（１０．０％）、大豆油（４．０％）、セルロースパウダー（５．０％）、ＡＩＮ−９３Ｍ−ＭＸミネラル混合（３．５％）、ＡＩＮ−９３ＶＸビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．１８％）、重酒石酸コリン（０．２５％）、第三ブチルヒドロキノン（０．０００８％）。
【００３７】
副睾丸脂肪組織重量の測定試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株（候補菌株）を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。解剖時に副睾丸脂肪組織を摘出し、その重量を測定することにより内臓脂肪の減少能を判定する。ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の副睾丸脂肪組織重量の減少を誘導した菌株を内臓脂肪の減少能ありと判定する。
ここで、ＨＦＤ６０高脂肪食の組成は、アルファー化コーンスターチ（１６．０％）、カゼイン（２５．６％）、グラニュー糖（５．５％）、マルトデキストリン（６．０％）、大豆油（２．０％）、ラード（３３．０％）、セルロースパウダー（６．６１％）、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合（３．５％）、炭酸カルシウム（０．１８％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、Ｌ―シスチン（０．３６％）、重酒石酸コリン（０．２５％）。
【００３８】
本明細書において「空腹時血糖値の減少能」とは、空腹時における血清中のグルコースを減少させる能力をいい、一般に、血清中のグルコースの測定により測定することができる。内臓脂肪蓄積の指標である腹囲と空腹時血糖値の上昇がメタボリックシンドロームの判断基準であり、空腹時血糖値の減少はメタボリックシンドローム発症の抑制につながる。「空腹時血糖値の減少能」は、本明細書において空腹時血糖値測定試験の条件および測定方法によって、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、有意な血糖値の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約５％以上、好ましくは、約１０％以上、より好ましくは、約１５％以上という値を有することで特定される。
【００３９】
空腹時血糖値測定試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株（候補菌株）を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。空腹状態のマウスの解剖時に心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定することにより、空腹時血糖値の減少能を測定する。ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約５％以上の空腹時血糖値の減少を誘導した菌株を空腹時血糖値の減少能ありと判定する。
【００４０】
本明細書において「空腹時血清中の総コレステロールの減少能」とは、空腹時における血清中のコレステロールを減少させる能力をいい、動脈硬化の発症抑制が期待される。「空腹時血清中の総コレステロールの減少能」は、本明細書において空腹時における血清中の総コレステロール濃度測定試験の条件および測定方法によって、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、有意な血清中の総コレステロール濃度の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約５％以上、好ましくは、約１０％以上、より好ましくは、約１５％以上という値を有することで特定される。
【００４１】
空腹時における血清中の総コレステロール濃度測定試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株（候補菌株）を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。空腹状態のマウスの解剖時に心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定することにより、血清中の総コレステロールの減少能を測定する。ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約５％以上の血清中の総コレステロール濃度の減少を誘導した菌株を空腹時血清中の総コレステロールの減少能ありと判定する。
【００４２】
本明細書において「肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能」とは、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子の発現を減少させる能力をいい、脂肪細胞への分化抑制などの特性が例示される。「肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能」は、本明細書において肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現レベル測定試験の条件および測定方法によって、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、有意な肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約１０％以上、好ましくは、約２５％以上、より好ましくは、約４０％以上という値を有することで特定される。
【００４３】
肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現レベル測定試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株（候補菌株）を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。解剖時に肝臓を採取し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャー）を用いて総ＲＮＡを抽出する。得られた総ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（キアゲン）を用いて精製し、オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得る。カパサイバー・ファストｑＰＣＲキット（日本ジェネティクス）、およびＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表すことにより、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能を測定する。ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少を誘導した菌株を肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能ありと判定する。
【００４４】
本明細書において「肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能」とは、肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩの遺伝子発現を減少させる能力をいい、脂肪酸の体内における合成抑制などの特性が例示される。「肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能」は、本明細書において肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現レベル測定試験の条件および測定方法によって、ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、有意な肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少を誘導することを確認することで特定され、通常は、約１０％以上、好ましくは、約２０％以上、より好ましくは、約３０％以上という値を有することで特定される。
【００４５】
肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現レベル測定試験の条件および測定方法を以下に説明する。
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌分離株（候補菌株）を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。解剖時に肝臓を採取し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャー）を用いて総ＲＮＡを抽出する。得られた総ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（キアゲン）を用いて精製し、オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得る。カパサイバー・ファストｑＰＣＲキット（日本ジェネティクス）、およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子に対するプライマー（配列番号３３および３４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表すことにより、肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能を測定する。ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少を誘導した分離株を肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能ありと判定する。
【００４６】
本明細書において、「Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列」とは、そのゲノム配列が、使用される対象となる同種の乳酸菌株のすべて（例えば、公知のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株、あるいは、スクリーニングまたは品質検査で想定されるすべてのＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株）と、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株とを比較した場合に、ゲノム配列が、使用される対象となる同種の乳酸菌株には存在しないが、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株にのみ存在する配列またはその組み合わせをいう。Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム配列中の特定配列に相補的な配列がアニーリングできるかどうかによって特異的かどうかを判定することもできる。例えば、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム配列中の特定配列に相補的な配列が、複数の野沢菜漬けから得られた、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株以外のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株由来のＤＮＡにはアニーリングしないが、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来のＤＮＡにはアニーリングするような場合、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株に特異的であると判定することができる。
【００４７】
本明細書において「桿菌」とは、個々の細胞の形状が細長い棒状または円筒状を示す細菌をいう。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「発酵食品」とは、食品材料を発酵することにより得られる食品をいう。具体的には、例えば、漬物、発酵乳、発酵豆乳および乳酸菌飲料などが挙げられる。
【００４９】
本明細書において「野菜」とは、広義に解釈され、食用の草本を指し、蔬菜と同義である。好ましくは、野菜は、乳酸菌によって発酵され得るものが使用される。本明細書で使用される代表的な野菜としては、野沢菜等のアブラナ科植物を挙げることができる。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「漬物」とは、野菜等の食材を食塩、酢、酒粕などの漬け込み材料とともに漬け込み、保存性を高めるとともに熟成させ、風味を良くした食品をいい、代表的には食材として野菜を使用する場合に野菜を発酵させて製造する野菜の加工形態の一つである。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「食品」とは、当該分野で日常的に使用される意味を有し、人間が食することができるすべての食料（飲料を含む）を指し、一実施形態としては加工品を挙げることができる。たとえば菓子類、乳製品、穀類加工品などの加工食品に、本発明の乳酸菌等を混入させることができる。また、「健康食品」および「機能性食品」とは、当該分野で一般的に使用される意味を有し、抗メタボリックシンドローム作用のために特別に処方された、医薬品または一般の食品とは区別される食品の一種を指す。このような食品の例としては、例えば、食事前または食事とともに被験者に一定期間摂取させる食品を想定することができるがこれに限定されない。
【００５２】
本明細書において「調味料」とは、料理の調味に使う材料をいい、砂糖、塩、酢、醤油、味噌などの他、アミノ酸、核酸などの生体物質またはそれに由来する物質なども含む。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「添加剤」とは、主成分に対して、何らかの目的で添加される任意の薬剤をいう。例えば、抗メタボリックシンドローム作用のための添加剤等を例示することができる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「メタボリックシンドローム」または「代謝（性）疾患」とは、代謝異常に起因する任意の疾患を指し、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血症、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態をはじめとした代謝異常疾患を表し、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群、マルチプルリスクファクター症候群などの呼称でも知られている。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「抗メタボリックシンドローム作用」とは、上記の病態群より選ばれる少なくとも１つ以上の病態を予防又は治療する作用を有することを意味し、通常、ある対象物について論ずるとき、その対象物を被験者に投与した時にメタボリックシンドロームに対して抵抗性を付与する活性を有することをいい、代表的に、本明細書において脂肪組織量測定試験の条件および測定方法によって、対照群と比較して、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔにおいてｐ＜０．０５を有することを確認することで特定される。抗メタボリックシンドローム作用を有するかどうかの指標としては、例えば、マウスを高脂肪食で飼育した際に誘導される体重増加、副睾丸脂肪組織重量の増加、血清コレステロール濃度の上昇、空腹時血糖値の上昇、および肝臓における脂質代謝遺伝子発現の上昇などのメタボリックシンドロームの特徴を抑制する効果として特徴付けられる。メタボリックシンドロームの特徴を抑制する効果としては、例えば、体重低下、副睾丸脂肪組織重量低下、血清コレステロール濃度低下、血糖値低下、および肝臓における脂質代謝遺伝子発現の低下等を挙げることができる。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「治療」または「予防」とは、抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌等を投与することによって、そのような処置を必要とする症状、状態、障害または疾患（腸内バランスの悪化による症状、状態、障害または疾患等）を有意に改善、緩和または予防することを意味する。本発明によりメタボリックシンドロームによる症状、状態、障害または疾患等が改善される。
【００５７】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う１つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。
【００５８】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、食道がん等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される１つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。
【００５９】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、食道がん等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００６０】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
経口投与の場合、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等の種々の形状に製剤化して用いてもよく、製剤中に一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加剤を含有させてもよい。また、これらのほか、経口投与の場合における製剤は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液体状態として製剤化してもよく、使用時に再溶解される乾燥状態のものとして製剤化してもよい。
【００６２】
非経口投与の場合、単位投与量アンプルもしくは多投与量容器またはチューブ内に収容された状態に製剤化してもよく、また、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有させてもよい。また、非経口投与の場合における製剤は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。非経口投与としては、注射による投与、外科的切開による組成物の適用、組織に浸透する非外科的傷害による組成物の適用などが含まれるが、これらに限定されない。また、非経口投与は、非限定的に局所（例えば、任意の皮膚、上皮、又は粘膜表面への投与）、皮下、静脈内、腹腔内、および筋肉内投与を含む。本発明の組成物などは、上記で述べたような方法で、ヒトに投与することにより、治療、予防、進行抑制などに用いることができる。
【００６３】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
［抗メタボリックシンドローム機能付与乳酸菌およびその取得］
【００６４】
一つの局面において、本発明は、抗メタボリックシンドローム機能を付与し得る乳酸菌株であって、漬物などの加工食品の製造に使用し得る乳酸菌株を提供する。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能の少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つあるいは全部を有する乳酸菌株を提供する。このような特性を有する乳酸菌株が、本発明者らが知る限り、抗メタボリックシンドローム機能を付与し得る乳酸菌株であることは本発明者が見出す以前には知られておらず、本発明者の研究によって初めて見いだされたものである。また、本発明は、このような特性を有する乳酸菌株を提供することで、抗メタボリックシンドローム機能を付与することができるという点で、簡便に機能食品を提供することができるという利点を有する。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株は、胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能を有することの他、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうち少なくとも１つを有していてもよい。理論に束縛されることを望まないが、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性は、抗メタボリックシンドローム機能と密接に関連しており、これらの能力を有する乳酸菌株を見出すことによって、より適切に抗メタボリックシンドローム機能を付与する能力のある乳酸菌株を提供することができる。
【００６７】
別の実施形態において、本発明の乳酸菌株は桿菌である。乳酸菌は桿菌のほか球菌としても存在する。理論に束縛されることを望まないが、桿菌が球菌に比べて好ましい抗メタボリックシンドローム機能を付与する能力を有することが見出されている。
【００６８】
他の実施形態において、本発明の乳酸菌株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属であるがこれに限定されず、この類縁種（例えば、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）もまた、同様に本発明の好ましい実施形態でありうる。特に、本発明で提供される抗メタボリックシンドローム機能を付与する乳酸菌株をスクリーニングする方法によって選抜される限り、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の乳酸菌以外の類縁種であっても、同様に抗メタボリックシンドローム機能を付与する乳酸菌株であることが極めて蓋然性高く予想されるためである。
【００６９】
一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍであるがこれに限定されない。特に、本発明で提供される抗メタボリックシンドローム機能を付与する乳酸菌株をスクリーニングする方法によって選抜される限り、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの乳酸菌以外の類縁種であっても、同様に抗メタボリックシンドローム機能を付与する乳酸菌株であることが極めて蓋然性高く予想されるためである。
【００７０】
本明細書において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＬＰ  Ｋ５−３株と同一株を指す。なお、受託書では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＬＰ  Ｋ５−３株として寄託し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８が付与されたが、その後の菌株名の指定において、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株」という名称を付与した。このため、２種の名称が並列しているが、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株」と「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＬＰ  Ｋ５−３株」と同一株を指すものとして取り扱われる。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）およびその子孫の株である。最良の実施形態において、本発明の乳酸菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）である。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明はまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）の誘導株もまた提供することが理解され、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する株を提供する：胆汁酸耐性、低ｐＨ耐性、コレステロール吸着能および胆汁酸耐性能を有し、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうち少なくとも１つを有すること、桿菌であること、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属であること、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍであること、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８で特定される株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）であること。
【００７３】
一実施形態において、本発明の乳酸菌株は抗メタボリックシンドローム作用を有する。特定の実施形態において、抗メタボリックシンドローム作用は、血清コレステロール、血糖値、肝臓における脂質代謝関連遺伝子発現の変動、体重減少または脂肪組織重量減少の少なくとも一つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、あるいはすべてであり得る。特定の実施形態において、肝臓における脂質代謝関連遺伝子は、ＰＰＡＲγまたはａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ遺伝子である。
【００７４】
１つの局面において、本開示は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  （Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム核酸配列またはその部分配列を含む核酸分子を提供する。他の局面において、本開示は、配列番号３９（Ｎ−０７株の全ゲノム配列）またはその部分配列を含む核酸分子を提供する。別の局面において、本開示は、ＣＤＳ番号１〜３４４６に記載の配列またはその部分配列のうち１種または複数種を含む核酸分子を提供する。一部の実施形態において、本開示の核酸は、上記ゲノム核酸配列および／またはＣＤＳ番号１〜３４４６の各々の核酸配列において１以上の置換、付加および／または欠失を有してもよい。一部の実施形態において、本開示は、ＣＤＳ番号１〜３４４６のいずれか１つまたは複数に記載の核酸配列もしくはＣＤＳ番号１〜３４４６において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を含む核酸配列、またはその部分配列によってコードされるポリペプチドをも提供する。
【００７５】
１つの局面において、本開示は、
（ａ）（ｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  （Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム核酸配列またはその部分配列を含む核酸分子、（ｉｉ）配列番号３９またはその部分配列を含む核酸分子、および（ｉｉｉ）ＣＤＳ番号１〜３４４６に記載の配列またはその部分配列のうち１種または複数種を含む核酸分子のいずれか１つに記載の核酸配列と同一の核酸配列、または
（ｂ）（ａ）の核酸配列において１以上の置換、付加または欠失を有し、本開示に記載の乳酸菌と同一の生物学的活性
を有する、乳酸菌株を提供する。１つの実施形態において、本開示の乳酸菌株は、ＣＤＳ番号１〜３４４６に記載の配列またはその部分配列のうちの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を有する。
【００７６】
１つの局面において、本開示は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子を含む、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株を検出するための組成物を提供する。１つの実施形態において、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列は、配列が既知のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株には存在しないが、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株には存在する任意の配列をいう。一部の実施形態において、前記核酸分子は、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および／または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子である。特定の実施形態において、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株の遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在する。別の実施形態において、前記核酸分子は任意の標識を含んでもよい。核酸分子が任意の標識を含むことにより、簡便に検出・識別を行うことが可能となる。特定の実施形態において、前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される。
【００７７】
１つの局面において、本開示は、
ａ）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子、および
ｂ）核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬
を含む、キットを提供する。本キットを用いることにより、簡便かつ精確に、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株の存在／非存在を調べることができる。１つの実施形態において、前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および／または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子であり得る。一部の実施形態において、前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在し得る。特定の実施形態において、前記核酸分子が標識を含んでもよい。特定の実施形態において、前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される。別の実施形態において、前記核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬が、核酸ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、および緩衝液のうちの少なくとも１種を含み得る。
【００７８】
１つの局面において、本開示は、試料中のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出する方法であって、
１）前記試料からＤＮＡを抽出するステップと、
２）前記試料から抽出した前記ＤＮＡを、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列に相補的な配列を含む核酸分子と接触させるステップと、
３）核酸増幅アッセイを実施して、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を増幅するステップと、
４）Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株由来核酸を検出するステップと
を含む、方法を提供する。１つの実施形態において、前記核酸分子が、配列番号３７に示される配列を含む核酸分子および／または配列番号３８に示される配列を含む核酸分子であり得る。一部の実施形態において、前記Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的配列が、遺伝子座１２７９〜１２８３、１２９０〜１２９１または２９１０〜２９１２に存在し得る。特定の実施形態において、前記核酸分子が標識を含んでもよい。特定の実施形態において、前記標識は、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される。別の実施形態において、前記核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬が、核酸ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、および緩衝液のうちの少なくとも１種を含み得る。
［抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌のスクリーニング］
【００７９】
１つの局面において、本発明は、乳酸菌株をスクリーニングする方法であって、
Ａ）菌株候補の胆汁酸耐性を調べる工程と、
Ｂ）菌株候補のｐＨ２．５における耐性を調べる工程と、
Ｃ）菌株候補について、ｃ１）コレステロール吸着能およびｃ２）胆汁酸加水分解酵素活性を調べる工程と
Ｄ）Ａ）工程、Ｂ）工程およびＣ）工程の全てにおいて陽性という条件を満たすかどうかを判定し、満たすものを抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株として選抜する工程
を包含する、方法を提供する。
【００８０】
より詳細に述べると、菌株候補の胆汁酸耐性を調べる工程では、その分析の際、すなわち、胆汁酸耐性を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００８１】
（条件）
菌株候補をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養する。
（分析方法）
培養した培地の濁度を測定する。
（判定基準）
胆汁酸耐性を調べる前と比較して、濁度の増加が約０．１以上であった分離株を胆汁酸耐性ありと判定する。
【００８２】
より詳細に述べると、菌株候補のｐＨ２．５における耐性を調べる工程では、その分析の際、すなわち、低ｐＨ耐性を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００８３】
（条件）
菌株候補をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置する。
（分析方法）
これを１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数する。
（判定基準）
コロニーを形成した菌株候補を低ｐＨ耐性ありと判定する。
【００８４】
より詳細に述べると、菌株候補のコレステロール吸着能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、コレステロール吸着能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００８５】
（条件）
菌株候補をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養する。培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養する。
（分析方法）
１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清（５００μＬ）に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温する。ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量する。実験は３反復で行う。
（判定基準）
菌株候補の菌体を添加しないものと比較して培養上清中のコレステロール濃度が約１０％以上低いものをコレステロール吸着能ありと判定する。
【００８６】
より詳細に述べると、菌株候補の胆汁酸加水分解酵素活性を調べる工程では、その分析の際、すなわち、胆汁酸耐性を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００８７】
（条件）
タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した菌株候補を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養する。
（分析方法）
コロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットする。ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴霧して発色させる。
（判定基準）
デオキシコール酸に由来するスポットが観察された菌株候補を胆汁酸分解酵素活性ありと判定する。
【００８８】
一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株のスクリーニング方法は、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうちの少なくとも１つを確認する工程をさらに含む。
【００８９】
より詳細に述べると、ＩＬ−１０産生誘導能における耐性を調べる工程では、その分析の際、すなわち、ＩＬ−１０産生誘導能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００９０】
（条件）
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した菌株候補の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養する。
（分析方法）
培養上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する。
（判定基準）
ＩＬ−１０濃度が菌株候補の菌体無添加のものと比較して約２倍以上の上昇を誘導した菌株候補をサイトカイン産生誘導能ありと判定する。
【００９１】
より詳細に述べると、菌株候補のＩＦＮ−γ産生誘導能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、ＩＦＮ−γ産生誘導能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００９２】
（条件）
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞に加熱殺菌した菌株候補の乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養する。
（分析方法）
培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量する。
（判定基準）
ＩＦＮ−γ濃度が菌株候補の菌体無添加のものと比較して約５倍以上の上昇を誘導した菌株候補をサイトカイン産生誘導能ありと判定する。
【００９３】
より詳細に述べると、菌株候補の腸管上皮バリア機能維持能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、腸管上皮バリア機能維持能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００９４】
（条件）
ヒト結腸がん由来細胞株Ｃａｃｏ−２を腸上皮細胞分化エンバイロメント（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、トランズウェル上にて培養し、小腸上皮様細胞に分化誘導する。
（分析方法）
トランズウェル上部に加熱殺菌した菌株候補の乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定する。
（判定基準）
菌株候補の菌体無添加と比較して、トランズウェル上部から下部へのマンニトール透過量の約２０％以上の減少を誘導した分離株を腸管上皮機能バリア維持機能ありと判定する。
【００９５】
より詳細に述べると、菌株候補のレジスチン抑制活性を調べる工程では、その分析の際、すなわち、レジスチン抑制活性を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００９６】
（条件）
ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養する。
（分析方法）
培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する。
（判定基準）
菌体無添加と比較して約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導した分離株をレジスチン抑制活性ありと判定する。
【００９７】
より詳細に述べると、菌株候補の内臓脂肪の減少能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、内臓脂肪の減少能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【００９８】
（条件）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。
（分析方法）
解剖時に副睾丸脂肪組織を摘出し、その重量を測定する。
（判定基準）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の副睾丸脂肪組織重量の減少を誘導した菌株候補を内臓脂肪の減少能ありと判定する。
【００９９】
より詳細に述べると、菌株候補の空腹時血糖値の減少能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、空腹時血糖値の減少能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【０１００】
（条件）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。
（分析方法）
空腹状態のマウスの解剖時に心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得、グルコースＣＩＩ−テストワコーでグルコース濃度を測定する。
（判定基準）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約５％以上の空腹時血糖値の減少を誘導した菌株を空腹時血糖値の減少能ありと判定する。
【０１０１】
より詳細に述べると、菌株候補の空腹時血清中の総コレステロールの減少能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、空腹時血清中の総コレステロールの減少能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【０１０２】
（条件）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。
（分析方法）
空腹状態のマウスの解剖時に心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得コレステロールＥ−テストワコーで、総コレステロール量を測定する。
（判定基準）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約５％以上の血清中の総コレステロール量の減少を誘導した菌株候補を空腹時血清中の総コレステロールの減少能ありと判定する。
【０１０３】
より詳細に述べると、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【０１０４】
（条件）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。
（分析方法）
採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、ＰＰＡＲ−γ遺伝子に対するプライマー（配列番号３１および３２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す。
（判定基準）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少を誘導した菌株候補を肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能ありと判定する。
【０１０５】
より詳細に述べると、菌株候補の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能を調べる工程では、その分析の際、すなわち、肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能を有するかどうかを測定および分析するには以下の条件および測定方法ならびに判定基準を用いることができる。
【０１０６】
（条件）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１×１０９ＣＦＵ／ｇの菌株候補を添加したＨＦＤ６０高脂肪食を与えた群において、飼育開始８週後に測定する。
（分析方法）
採取した肝臓から調製した総ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することでｃＤＮＡを得、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子に対するプライマー（配列番号３３および３４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の発現量を、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表す。
（判定基準）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＦＤ６０高脂肪食を与えた対照群と比較して、約１０％以上の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少を誘導した菌株候補を肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能ありと判定する。
【０１０７】
さらなる実施形態において、本発明の乳酸菌株のスクリーニング方法は、抗メタボリックシンドローム作用を有するかどうかを確認する工程をさらに含む。一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株のスクリーニング方法は、ＩＬ−１０産生誘導能、ＩＦＮ−γ産生誘導能、腸管上皮バリア機能維持能およびレジスチン抑制活性のうちの少なくとも２つ、少なくともの３つまたは４つを調べる工程を含む。別の実施形態において、本発明は、本発明の乳酸菌株のスクリーニング方法において同定された乳酸菌株を提供する。
［加工食品および製造法］
【０１０８】
本発明はまた、本発明の乳酸菌株を利用して製造される加工食品およびその製造法を提供する。
【０１０９】
一つの局面において、本発明は、野菜を原料とする発酵食品を製造する方法であって、前記野菜にスターターとして本発明の乳酸菌株または本発明の乳酸菌株のスクリーニング方法を用いて得られ得る乳酸菌株を添加して発酵させることを特徴とする、方法を提供する。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を用いて発酵された発酵食品を提供する。
【０１１１】
本発明の発酵食品の一部の実施形態において、野菜は、アサツキ、ウド、ウメ、ウリ、カブ、カボチャ、キャベツ、キュウリ、京菜、ゴボウ、小松菜、ザーサイ、山菜、シソ、ショウガ、スイカ、スグキ菜、セロリー、ダイコン、タカナ、タケノコ、ナス、菜の花、ニンジン、ニンニク、野沢菜、白菜、フキ、ミョウガ、メロン、ラッキョウ、ラディッシュおよびレンコンからなる群から選択される。好ましい実施形態において、野菜は野沢菜である。別の実施形態において、本発明は、上記の発酵食品を製造する方法において製造される発酵食品を提供する。一部の実施形態において、発酵食品は、漬物、発酵乳および発酵豆乳からなる群から選択される。好ましい実施形態において、発酵食品は、漬物である。
【０１１２】
一部の実施形態において、本発明の乳酸菌株を用いて製造した食品は嗜好性に優れたものである。特定の実施形態において、本発明の乳酸菌株を用いて製造した食品は抗メタボリック作用を有する。特定の実施形態において、抗メタボリックシンドローム作用は、血清コレステロール、血糖値、肝臓における脂質代謝関連遺伝子発現の変動、体重減少または脂肪組織重量減少である。特定の実施形態において、肝臓における脂質代謝関連遺伝子は、ＰＰＡＲγまたはａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅＩ遺伝子である。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、本発明の乳酸菌株を含む食品を提供する。本発明の乳酸菌株を含む食品は、漬物、発酵乳、乳酸菌飲料、チーズ、発酵豆乳のような食品のタイプを挙げることができる。
【０１１４】
一つの局面においてに、本発明は、本発明の乳酸菌株を含む食品の製造方法を提供する。この食品の製造方法は、代表的には、食品の原料（例えば、野菜）に対して本発明の乳酸菌または本発明の方法によって得られ得る乳酸菌株を添加する工程、および乳酸菌株が添加された食品原料を該乳酸菌が発酵する条件（例えば、温度、時間等）に供する工程を含む。
【０１１５】
一つの局面において、本発明は、本発明の乳酸菌株を培養した後の培養液を提供する。理論に束縛されることを望まないが、この培養液には、メタボリックシンドロームを改善または進行の抑制、あるいは、治療および予防効果があることが見出されており、医薬品、機能性食品（健康食品）などとして利用することができる。
【０１１６】
別の局面において、本発明は、本発明の乳酸菌株または乳酸菌株を培養した後の培養液を含む、メタボリックシンドローム（代謝疾患）を改善または抑制するための組成物を提供する。
【０１１７】
別の局面において、本発明は、本発明の乳酸菌株または乳酸菌株を培養した後の培養液の有効量を被験者に投与する工程を含む、被験者におけるメタボリックシンドローム（代謝疾患）を改善または抑制するための方法を提供する。
【０１１８】
［キット］
一つの局面において、本発明は、本発明の乳酸菌株を含むキットを提供する。
【０１１９】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【０１２０】
本明細書において「指示書」（添付文書や米国ＦＤＡが利用するラベルなどを含む）は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）やラベル（ｌａｂｅｌ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１２１】
このキットの局面の実施形態において、本発明のキットは、アミノ酸、核酸を含有する調味料をさらに含む。特定の実施形態において、アミノ酸、核酸を含有する調味料として、出汁が挙げられる。
【０１２２】
本発明のキットを、スターターとして用いて製造した漬物は、既存の漬物製造用スターター乳酸菌株を用いた場合と比較して嗜好的に遜色ない。
［医薬、処置方法］
【０１２３】
一つの局面において、本発明は本発明の乳酸菌株、またはそれを用いて得られた加工食品または他の加食材料、あるいは、乳酸菌株の培養液等を含む医薬、疾患、障害または症状、あるいは未病状態を改善するための医薬、特に、メタボリックシンドロームを治療または予防するための医薬を提供する。
【０１２４】
一つの局面において、本発明は、疾患、障害または症状、あるいは未病状態を改善するための医薬、特に、メタボリックシンドロームを治療または予防するための、本発明の乳酸菌株、またはそれを用いて得られた加工食品または他の加食材料、あるいは、乳酸菌の培養液等を提供する。
【０１２５】
一つの局面において、本発明は本発明の乳酸菌株、またはそれを用いて得られた加工食品または他の加食材料、あるいは、乳酸菌株の培養液等を含む成分の有効量を被験者に投与する工程を包含する、疾患、障害または症状、あるいは未病状態を改善するための方法、特に、メタボリックシンドロームを治療または予防するための方法を提供する。ここで、未病状態の改善とは、明確な症状が発現していない被験者において、放置するとなんらかの疾患、障害または症状、特にメタボリックシンドロームに罹患するないし発症することが予想される場合に、これを遅延または進行の停止、または改善することをいう。本発明の乳酸菌、またはそれを用いて得られた加工食品または他の加食材料、あるいは、乳酸菌の培養液等を含む成分には、このような成分が含まれていることが実証されている。
【０１２６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、「分子生物学  ゲノミクスとプロテオミクス」（田村隆明  監訳・東京化学同人（東京）２０１８年）および「ブラック微生物学」（神谷茂  監訳・丸善出版（東京）２０１４年）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２７】
（注記）
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つ
の値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【０１２８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１２９】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１３０】
以下に実施例を記載する。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１：乳酸菌株の分離）
野沢菜漬に由来する乳酸菌株を分離するため、野沢菜漬のつけ汁をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁・希釈した。乳酸菌株選択用のｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天培地、およびＭＲＳ寒天培地の糖質源をグルコースからフルクトース、マルトース、あるいはキシロースに変更した培地に希釈した菌を巻き込み、３０℃で４８時間にわたり嫌気条件下で培養した。嫌気培養後の菌を、炭酸カルシウムの溶解を指標にコロニー採取を行い、グリセロールストックを作製した。
【０１３２】
（実施例２：乳酸菌のスクリーニング）
抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌株を選抜するため、野沢菜から分離した乳酸菌株（乳酸菌分離株）を候補菌株として、（１）低ｐＨ耐性試験、（２）胆汁酸耐性試験、（３）コレステロール吸着能試験および（４）胆汁酸加水分解酵素活性試験の試験を含むスクリーニングを行った。各試験の概要は以下の通りであった。
【０１３３】
（１）低ｐＨ耐性試験
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養した。この菌株の培養菌体を塩酸でｐＨを２．５に調整したＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２時間静置した。これを１００倍以上に希釈してＭＲＳ寒天培地上に塗布して嫌気条件下３７℃で１日培養し、コロニーを計数した。コロニーを形成した分離株を低ｐＨ耐性ありと判定した。
【０１３４】
（２）胆汁酸耐性試験
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養した。この菌株の培養菌体を０．３％胆汁末を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２０時間培養した。濁度の増加が０．１以上であった分離株を胆汁酸耐性ありと判定した。
【０１３５】
（３）コレステロール吸着能試験
乳酸菌分離株をＭＲＳ培地で嫌気条件下３７℃で１日培養した。この菌株の培養菌体を０．３％胆汁末、０．３ｍｇ／ｍＬ  コレステロール−ＰＥＧ６００を含むＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下３７℃で２４時間培養した。１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により得た培養上清（５００μＬ）に４Ｍ水酸化ナトリウム（５００μＬ）とエタノール（４ｍＬ）を加え、６０℃で１０分間加温した。ヘキサンを加えてコレステロールを抽出し、窒素気流下でヘキサンを蒸発させたのち、ｏ−フタルアルデヒド溶液と硫酸を加え、５５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中のコレステロール濃度を定量した。実験は３反復で行い、菌体を添加しないものと比較して有意に培養上清中のコレステロール濃度が低いものをコレステロール吸着能ありと判定した。
【０１３６】
（４）胆汁酸加水分解酵素活性試験
タウロデオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ寒天培地上に、フィルターディスクに接種した乳酸菌分離株を置き、嫌気条件下３７℃で３日培養した。コロニーをアセトンに懸濁した後に遠心分離し、得られた上清を少量のメタノールに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットした。ＴＬＣプレートをｎ−ヘキサン／２−プロパノール／酢酸＝１０：２：０．１で展開し、硫酸エタノール溶液を噴霧して発色させ、デオキシコール酸に由来するスポットが観察された分離株を胆汁酸分解酵素活性ありと判定した。
【０１３７】
野沢菜由来の分離株を、最も多くの検体を評価できる試験である（２）胆汁酸耐性試験に供し、耐性ありと判定した分離株をさらに（１）低ｐＨ耐性試験へと供した。（１）と（２）との両方の試験において耐性ありと判定した株は、消化管内環境で生存できると想定されるため、さらに（３）コレステロール吸着能試験および（４）胆汁酸加水分解酵素活性試験へと供した。（１）〜（４）の全ての試験において陽性と判定した細胞を「抗メタボ有望株」とした。これらの分離株を、（５）マウス脾細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生誘導能試験、（６）腸管上皮バリア維持機能試験、または（７）レジスチン抑制活性試験に供し、これらの試験のうちの少なくとも１つについて陽性の株を更に選抜した。各試験の概要は以下の通りであった。
【０１３８】
（５）マウス脾細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生誘導能試験
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞（初代培養細胞）に加熱殺菌した乳酸菌体を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％炭酸ガス存在下で３７℃で２日培養した。培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキットにより定量た。培養上清中のＩＬ−１０濃度が菌体無添加のものと比較して約２倍以上の上昇を誘導した分離株をＩＦＮ−γ産生誘導能ありと判定し、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度が菌体無添加のものと比較して約５倍以上の上昇を誘導した分離株をＩＬ−１０産生誘導能ありと判定した。
【０１３９】
（６）腸管上皮バリア維持機能試験
ヒト結腸がん由来細胞株Ｃａｃｏ−２を腸上皮細胞分化エンバイロメント（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、トランズウェル上にて培養し、小腸上皮様細胞に分化誘導した。トランズウェル上部に加熱殺菌した乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍＬ）と１ｍＭマンニトールとをトランズウェル上部に加え、４８時間後にトランズウェル下部の溶液を採取してマンニトール透過量を測定した。菌体無添加と比較して、トランズウェル上部から下部へのマンニトール透過量の約２０％以上の減少を誘導した分離株を腸管上皮機能バリア維持機能ありと判定した。
【０１４０】
（７）レジスチン抑制活性試験
ヒト単球系細胞株Ｕ９３７の培養系に加熱殺菌した乳酸菌体を添加して２４時間培養した後、高グルコース含有培地（グルコース濃度４．５ｇ／Ｌ）に交換してさらに２４時間培養した。培地中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。菌体無添加と比較して約２０％以上のレジスチン産生の減少を誘導した分離株をレジスチン抑制活性ありと判定した。
【０１４１】
これらの試験結果に基づき、Ｌｐ  ２Ｆ２、Ｌｐ  Ｋ４−１、Ｋ４Ｇ４およびＮ−０７を選抜した。これらの分離株の各試験における結果を以下の表１に示す。
【表１】
2020162595.tif 000002
【０１４２】
（実施例３：乳酸菌株の同定）
特に優れた腸管上皮バリア維持機能試験を有するＮ−０７株の種を決定するため、既知の株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＮ−０７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較した。まず、Ｎ−０７株培養菌体からビーズ破砕法によりＤＮＡを抽出し、プライマー２７Ｆ（配列番号１）および１４９２Ｒ（配列番号２）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。精製後、１０ｘＡ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｍｉｘ（東洋紡）を用いてＰＣＲ産物にｄＡを付与したのち、ＴベクターｐＭＤ２０に連結した。大腸菌ＤＨ５ａによりプラスミドを増幅し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドを精製した。プライマー２７Ｆ（配列番号１）、５２９Ｒ（配列番号３）、７８６Ｆ（配列番号４）、９２６Ｒ（配列番号５）、１４９２Ｒ（配列番号２）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてシーケンス反応を行い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を得た（配列番号６）。得られた塩基配列をクエリーとし、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより既知の乳酸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と塩基配列を比較した。
配列表について暫定的に示す。
２７Ｆ：  ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）
１４９２Ｒ：  ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号２）
５２９Ｒ：  ＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧＧＣ（配列番号３）
７８６Ｆ：  ＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号４）
９２６Ｒ：  ＣＣＧＴＣＡＡＴ  ＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ（配列番号５）
【０１４３】
次に、アピ５０ＣＨキット（ビオメリュー）を用いて、添付の説明に記載の手順に従い糖資化性試験を行った。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と塩基配列および糖資化性試験の結果、Ｎ−０７株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍと同定した。
【０１４４】
（実施例４：他の乳酸菌株との塩基配列の比較）
さらに、Ｎ−０７株が新規の菌株であるかどうかを判定するため、Ｎ−０７株培養菌体から得られたＤＮＡを鋳型とし、８種類の遺伝子（ｐｈｅＳ、ｐｒｙＧ、ｕｖｒＣ、ｒｅｃＡ、ｃｌｐＸ、ｍｕｒＣ、ｇｒｏＥＬ、ｍｕｒＥ）の断片をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた。
ｐｈｅＳ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡ（配列番号７）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＣＣＴＡＡＣＣＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡ（配列番号８）
ｐｙｒＧ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＡＧＴＧＡＴＴＴＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＡ（配列番号９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＴＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡ（配列番号１０）
ｕｖｒＣ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＧＧＣ（配列番号１１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＴＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＣ（配列番号１２）
ｒｅｃＡ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣ（配列番号１３）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＴＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＣＴＴＴ（配列番号１４）
ｃｌｐＸ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡ（配列番号１５）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＡＴＡＡＴＣＧＡＧＣＧＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号１６）
ｍｕｒＣ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＴＡＴＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴＡ（配列番号１７）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴ（配列番号１８）
ｇｒｏＥＬ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＣＧＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣＡ（配列番号１９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＧＣＣＴＴＣＴＡＡＡＣＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号２０）
ｍｕｒＥ用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄ：  ＡＣＴＡＡＴＡＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴ（配列番号２２）
１．５％  アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲ増幅に用いたプライマーと同一のプライマーを用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と同様に塩基配列情報を得た（配列番号２３〜３０）。得られた８種類の遺伝子の配列をクエリーとし、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより既知の乳酸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と塩基配列を比較した。比較した結果、全ての遺伝子配列が完全に一致したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ分離株は見出せなかったことより、新規の菌株と判定した。
【０１４５】
（実施例５：乳酸菌Ｎ−０７株の抗メタボリックシンドローム作用の評価）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、乳酸菌Ｎ−０７株の抗メタボリックシンドローム作用を評価した。マウスは１群あたり８匹とし、対照群にはＨＦＤ６０高脂肪食（オリエンタル酵母）を与えた。試験群には、１×１０９ＣＦＵ／ｇのＮ−０７株または別の野沢菜分離株であるＡ株をＨＦＤ６０に添加した飼料を与えた。飼料および飲料水は自由摂取とし、体重を１日おきに計測した。８週間の試験飼育後に屠殺し、副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現を測定した。副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現は以下のように測定した。
【０１４６】
（副睾丸脂肪組織重量の測定）
解剖時に副睾丸脂肪組織を摘出し、その重量を測定した。対照群と比較して、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔにおいてｐ＜０．０５を有することを副睾丸脂肪組織重量（内臓脂肪重量）現象効果ありと判定した。
【０１４７】
（血糖値・総コレステロールの測定）
空腹状態のマウスの解剖時に心臓に穿刺して採血し、遠心分離により血清を得た。グルコースＣＩＩ−テストワコーあるいはコレステロールＥ−テストワコーにより、グルコースおよび総コレステロールを測定し、対照群と比較して、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔにおいてｐ＜０．１を有することを空腹時血糖値の減少能または空腹時血清中の総コレステロールの減少能ありと判定した。
【０１４８】
（肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の測定）
解剖時に肝臓を採取し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャー）を用いて総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（キアゲン）を用いて得られた総ＲＮＡを精製し、オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得た。カパサイバー・ファストｑＰＣＲキット（日本ジェネティクス）、およびＰＰＡＲ−γあるいはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子に対するプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。各遺伝子の発現量は、４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８の発現量で補正した相対値として表し、対照群と比較して、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔにおいてｐ＜０．０５を有することを発現抑制効果ありと判定した。増幅用プライマーとして以下のプライマーを使用した。
ＰＰＡＲ−γ用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：  ＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号３１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣ（配列３２）
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：  ＴＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＡＧＡＡ（配列番号３３）Ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＧＧＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＧＴＡ（配列番号３４）
４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：  ＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＴＧＣＴＧＡ（配列番号３５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡ（配列番号３６）
【０１４９】
Ｎ−０７株を含む高脂肪食を摂取したマウスでは、飼育開始８週後の体重が減少傾向を示し、副睾丸脂肪組織重量は有意に低値を示した。一方、Ａ株含む高脂肪食を摂取したマウスでは、体重・脂肪組織重量への影響は認められなかった（図１）。また、Ｎ−０７株投与により、対照群と比較して空腹時の血清コレステロール、血糖値に低下傾向が見られた（図２ＡおよびＢ）。さらに、肝臓中での遺伝子発現を比較したところ、脂質代謝に関与する転写因子ＰＰＡＲ−γおよび脂肪酸合成に関与するａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの発現がＮ−０７株の投与により抑制された（図２Ｃ）。以上より、野沢菜漬けから分離したＮ−０７株の肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用が示された。一方で、野沢菜漬けから分離したＡ株にはそのような作用は認められず、Ｎ−０７株に特異的な作用と考えられた。
【０１５０】
（実施例６：乳酸菌Ｎ−０７株およびＨＳ−１株を用いた野沢菜漬けの製造と官能評価）
下漬けした野沢菜に食塩濃度が１％となるように水を加え、Ｎ−０７株あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ−１株（茨城県産業技術イノベーションセンターより分与）を野沢菜１ｋｇあたり１×１０１０ＣＦＵ添加し、１０℃で７日間発酵させた。得られた野沢菜漬けの食味に差異が見いだせるかを６名のパネルによる３点識別法で評価した。その結果、正答率は１／４であり、確率的に正答となる１／３よりも低かった。以上より、Ｎ−０７株を用いて発酵させた野沢菜漬けは、嗜好的に好まれることが知られた特許菌株を用いて発酵させたものと食味的に差異がなく、嗜好的に好まれる野沢菜漬けであると考えられた。
【０１５１】
以上より、新規乳酸菌株Ｎ−０７を用いることにより、野沢菜漬けに機能性を付与することが可能であり、既存の漬物製造用スターター乳酸菌株を用いた場合と比較して嗜好的に遜色ない漬物が製造可能であった。
【０１５２】
（実施例７：他の菌株同定）
実施例１〜４に記載の各手順を用いて、他の菌株についても同様のスクリーニング方法を実施する。その結果得られた菌株について、実施例５などに記載の機能評価を行う。
（材料および方法）
・試料となる菌株候補の供給源：すんき漬けのつけ汁
・実施例１〜４の手法に準じて、スクリーニングする。
（評価）
実施例５の評価系に準じて、内臓脂肪の減少能、空腹時血糖値の減少能、空腹時血清中の総コレステロールの減少能、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能および肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能を調べる。
（結果）
実施例１〜４に準じてスクリーニングした場合、他のサンプル供給源でも、これらと同様に、肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用を示す菌株を入手することができる。  
【０１５３】
（実施例８：他の菌株同定）
実施例１〜４に記載の各手順を用いて、他の菌株についても同様のスクリーニング方法を実施する。その結果得られた菌株について、実施例５などに記載の機能評価を行う。
（材料および方法）
・試料となる菌株候補の供給源：キムチ
・実施例１〜４の手法に準じて、スクリーニングする。
（評価）
実施例５の評価系に準じて、内臓脂肪の減少能、空腹時血糖値の減少能、空腹時血清中の総コレステロールの減少能、肝臓におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子発現の減少能および肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現の減少能を調べる。
（結果）
実施例１〜４に準じてスクリーニングした場合、他のサンプル供給源でも、これらと同様に、肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用を示す菌株を入手することができる。  
【０１５４】
（実施例９：乳酸菌Ｌｐ  ２Ｆ２株の抗メタボリックシンドローム作用の評価）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、乳酸菌Ｌｐ  ２Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５で特定される株）の抗メタボリックシンドローム作用を評価する。マウスは１群あたり８匹とし、対照群にはＨＦＤ６０高脂肪食（オリエンタル酵母）を与える。試験群には、１×１０９ＣＦＵ／ｇのＬｐ  ２Ｆ２株または別の野沢菜分離株であるＡ株をＨＦＤ６０に添加した飼料を与える。飼料および飲料水は自由摂取とし、体重を１日おきに計測する。８週間の試験飼育後に屠殺し、副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現を測定する。副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現は実施例５と同様の方法で測定する。
【０１５５】
Ｌｐ  ２Ｆ２株を含む高脂肪食を摂取したマウスでは、飼育開始８週後の体重が減少傾向を示し、副睾丸脂肪組織重量は有意に低値を示す。一方、Ａ株含む高脂肪食を摂取したマウスでは、体重・脂肪組織重量への影響は認められない。また、Ｌｐ  ２Ｆ２株投与により、対照群と比較して空腹時の血清コレステロール、血糖値に低下傾向が見られる。さらに、肝臓中での遺伝子発現を比較したところ、脂質代謝に関与する転写因子ＰＰＡＲ−γおよび脂肪酸合成に関与するａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの発現がＬｐ  ２Ｆ２株の投与により抑制される。以上より、野沢菜漬けから分離したＬＰ２Ｆ２株の肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用が示される。
【０１５６】
（実施例１０：乳酸菌Ｌｐ  Ｋ４−１株の抗メタボリックシンドローム作用の評価）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、乳酸菌Ｌｐ  Ｋ４−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６で特定される株）の抗メタボリックシンドローム作用を評価する。マウスは１群あたり８匹とし、対照群にはＨＦＤ６０高脂肪食（オリエンタル酵母）を与える。試験群には、１×１０９ＣＦＵ／ｇのＬｐ  Ｋ４−１株または別の野沢菜分離株であるＡ株をＨＦＤ６０に添加した飼料を与える。飼料および飲料水は自由摂取とし、体重を１日おきに計測する。８週間の試験飼育後に屠殺し、副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現を測定する。副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現は実施例５と同様の方法で測定する。
【０１５７】
Ｌｐ  Ｋ４−１株を含む高脂肪食を摂取したマウスでは、飼育開始８週後の体重が減少傾向を示し、副睾丸脂肪組織重量は有意に低値を示す。一方、Ａ株含む高脂肪食を摂取したマウスでは、体重・脂肪組織重量への影響は認められない。また、Ｌｐ  Ｋ４−１株投与により、対照群と比較して空腹時の血清コレステロール、血糖値に低下傾向が見られる。さらに、肝臓中での遺伝子発現を比較したところ、脂質代謝に関与する転写因子ＰＰＡＲ−γおよび脂肪酸合成に関与するａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの発現がＬｐ  Ｋ４−１株の投与により抑制される。以上より、野沢菜漬けから分離したＬｐ
Ｋ４−１株の肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用が示される。
【０１５８】
（実施例１１：乳酸菌Ｋ４Ｇ４株の抗メタボリックシンドローム作用の評価）
ＡＩＮ−９３Ｍ粉末飼料で１週間予備飼育した５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、乳酸菌Ｋ４Ｇ４株の抗メタボリックシンドローム作用を評価する。マウスは１群あたり８匹とし、対照群にはＨＦＤ６０高脂肪食（オリエンタル酵母）を与える。試験群には、１×１０９ＣＦＵ／ｇのＫ４Ｇ４株または別の野沢菜分離株であるＡ株をＨＦＤ６０に添加した飼料を与える。飼料および飲料水は自由摂取とし、体重を１日おきに計測する。８週間の試験飼育後に屠殺し、副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現を測定する。副睾丸脂肪組織重量、空腹時血糖値・総コレステロール、肝臓におけるＰＰＡＲ−γおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ遺伝子発現は実施例５と同様の方法で測定する。
【０１５９】
Ｋ４Ｇ４株を含む高脂肪食を摂取したマウスでは、飼育開始８週後の体重が減少傾向を示し、副睾丸脂肪組織重量は有意に低値を示す。一方、Ａ株含む高脂肪食を摂取したマウスでは、体重・脂肪組織重量への影響は認められない。また、Ｋ４Ｇ４株投与により、対照群と比較して空腹時の血清コレステロール、血糖値に低下傾向が見られる。さらに、肝臓中での遺伝子発現を比較したところ、脂質代謝に関与する転写因子ＰＰＡＲ−γおよび脂肪酸合成に関与するａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの発現がＫ４Ｇ４株の投与により抑制される。以上より、野沢菜漬けから分離したＫ４Ｇ４株の肥満・メタボリックシンドロームに対する抑制作用が示される。
【０１６０】
（実施例１２：Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム配列の取得）
Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株をＭＲＳ培地で培養し、遠心分離により菌体を得た。菌体より、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉｓｅｑおよびＮａｎｏｐｒｅ  Ｍｉｎｉｏｎを使用して、調製したゲノムＤＮＡからゲノム配列を得た。
【０１６１】
（実施例１３：Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株ゲノム配列からＣＤＳの特定）
Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株をＭＲＳ培地で培養し、遠心分離により菌体を得た。菌体より、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。得られたゲノムシーケンスより、ＤＦＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｆａｓｔ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）により、ＣＤＳを特定した。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−８４】
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【表２−８８】
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【表２−８９】
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【表２−１０３】
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【０１６２】
（実施例１４：Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株と配列既知のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株との配列比較）
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株と、配列がデータベースから入手可能なＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株とのゲノム配列比較を行った。具体的には以下の通りである。
・ゲノム情報のアセンブル（ＳＰＡｄｅｓというアセンブラを使用）
・アノテーション（ｄｆａｓｔを使用）
・公開データベース上のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍゲノムとの比較（ＣＧＶｉｅｗ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｏｏｌを使用）
ゲノム配列の比較図を図３に示す。
【０１６３】
（実施例１５：Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーの設計）
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株のゲノム情報をもとに、特異的と考えられる領域の塩基配列からプライマーを設計した。
以下の手順に従い、プライマー設計を行うことでＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーを設計した。
・ゲノム情報を取得する（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉｓｅｑとＮａｎｏｐｒｅ  Ｍｉｎｉｏｎを使用）
・ゲノム情報のアセンブル（ＳＰＡｄｅｓというアセンブラを使用）
・アノテーション（ｄｆａｓｔを使用）
・公開データベース上のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍゲノムとの比較（ＣＧＶｉｅｗ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｏｏｌを使用）
・他のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍゲノムとの相同性が低い領域を選択し、Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを用いてプライマーを設計
上記手順に従い、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的と考えられるＰＣＲプライマーセットを設計した。配列を以下に示す。
フォーワードプライマー：ＧＣＧＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＡ（配列番号３７）
リバースプライマー：ＡＴＣＧＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号３８）
この手順を用いることで、他のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーを設計することができる。
【０１６４】
（実施例１６：Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異性検証）
上記のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的と考えられるＰＣＲプライマーがＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的なものかどうかを調べた。
【０１６５】
（方法）
３種類の野沢菜漬けの漬け汁を遠心分離して得られた沈殿をビーズ破砕し、スピンカラムを用いてＤＮＡを精製した。さらにＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株からＤＮＡを抽出した。得られた野沢菜漬けＤＮＡ単独、あるいはＮ−０７由来ＤＮＡを添加したものを鋳型として、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的と考えられるＰＣＲプライマーセット（配列番号３７および３８）およびＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的プライマーセット（配列番号４０および４１）を用いてＰＣＲ法でＤＮＡを増幅した。
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的プライマーセットの配列を以下に示す。
フォーワードプライマー：ＣＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡ（配列番号４０）
リバースプライマー：ＴＣＧＧＧＡＴＴＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＡＣ（配列番号４１）
ＰＣＲ条件は以下の通りである。
ＰＣＲ反応液の組成：  １ｘ  ＫＯＤ  ＦＸ−Ｎｅｏ  ｂｕｆｆｅｒ，  ０．４ｍＭ  ｅａｃｈ  ｏｆ  ｄＮＴＰ，  １００ｐＭ  プライマー，  ０．６Ｕ  ＫＯＤ−ＦＸ  Ｎｅｏ  （液量２５  ｕＬ）
ＰＣＲ温度条件：  ９４  ℃  ３ｍｉｎ，  ［９４℃    ３０ｓｅｃ，  ５４℃    １０ｓｅｃ，  ７２℃    ３０ｓｅｃ］ｘ３０サイクル，  ７２℃    ５ｍｉｎ
ＰＣＲ生成物を１．５％  アガロースゲルで分離し、観察した。
【０１６６】
（結果）
３種類の野沢菜漬Ａ〜Ｃ由来ＤＮＡ（レーン３〜５）は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的ＰＣＲプライマーにより増幅されたが、Ｎ−０７特異的と考えられるＰＣＲプライマーでは増幅されなかった。Ｎ−０７由来ＤＮＡ（レーン２）およびＮ−０７由来ＤＮＡを添加した野沢菜漬Ａ〜Ｃ由来ＤＮＡ（レーン６〜８）では、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的ＰＣＲプライマーおよびＮ−０７特異的と考えられるＰＣＲプライマーによる増幅が認められた（図４）。これらの実験から、配列番号３７および３８に示される配列がＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的であることが分かった。
【０１６７】
（実施例１７：プライマー性能検証）
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的プライマーを用いて、（Ａ）無処理、（Ｂ）オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）および（Ｃ）煮沸処理（９５℃、３０分）したＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株から得られたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅可能か調べた。ＰＣＲ条件は、実施例と同一である。この結果、いずれの条件でもＤＮＡを増幅可能であることが分かった（図５）。
【０１６８】
（注記）
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明は、新規な抗メタボリックシンドローム作用を有する乳酸菌ならびにそれを用いて得られる漬物およびその製造方法を提供し、このような乳酸菌およびそれを用いて得られる漬物を使用し、またはその製造方法を実施することにより、日常的に摂取でき、長期にわたって摂取しても安全性が高い抗メタボリックシンドローム作用を有する食品素材を提供することができる。
【受託番号】
【０１７０】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６８
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１５
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１６
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
配列番号１：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマー２７Ｆ
配列番号２：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマー１４９２Ｒ
配列番号３：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマー５２９Ｒ
配列番号４：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマー７８６Ｆ
配列番号５：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマー９２６Ｒ
配列番号６：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列
配列番号７：ｐｈｅＳ用フォーワードプライマー
配列番号８：ｐｈｅＳ用リバースプライマー
配列番号９：ｐｙｒＧ用フォーワードプライマー
配列番号１０：ｐｙｒＧ用リバースプライマー
配列番号１１：ｕｖｒＣ用フォーワードプライマー
配列番号１２：ｕｖｒＣ用リバースプライマー
配列番号１３：ｒｅｃＡ用フォーワードプライマー
配列番号１４：ｒｅｃＡ用リバースプライマー
配列番号１５：ｃｌｐＸ用フォーワードプライマー
配列番号１６：ｃｌｐＸ用リバースプライマー
配列番号１７：ｍｕｒＣ用フォーワードプライマー
配列番号１８：ｍｕｒＣ用リバースプライマー
配列番号１９：ｇｒｏＥＬ用フォーワードプライマー
配列番号２０：ｇｒｏＥＬ用リバースプライマー
配列番号２１：ｍｕｒＥ用フォーワードプライマー
配列番号２２：ｍｕｒＥ用リバースプライマー
配列番号２３：ｐｈｅＳ遺伝子の核酸配列
配列番号２４：ｐｙｒＧ遺伝子の核酸配列
配列番号２５：ｕｖｒＣ遺伝子の核酸配列
配列番号２６：ｒｅｃＡ遺伝子の核酸配列
配列番号２７：ｃｌｐＸ遺伝子の核酸配列
配列番号２８：ｍｕｒＣ遺伝子の核酸配列
配列番号２９：ｇｒｏＥＬ遺伝子の核酸配列
配列番号３０：ｍｕｒＥ遺伝子の核酸配列
配列番号３１：ＰＰＡＲ−γ用フォーワードプライマー
配列番号３２：ＰＰＡＲ−γ用リバースプライマー
配列番号３３：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ用フォーワードプライマー
配列番号３４：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＩ用リバースプライマー
配列番号３５：４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８用フォーワードプライマー
配列番号３６：４０ＳリボゾーマルプロテインＳ１８用リバースプライマー
配列番号３７：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的フォーワードプライマー
配列番号３８：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株特異的リバースプライマー
配列番号３９：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｓｈｉｎｓｈｕ  Ｎ−０７株ゲノム配列
配列番号４０：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的フォーワードプライマー
配列番号４１：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ特異的リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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