(57)【要約】【課題】細胞、組織または器官用保存液の提供。【解決手段】ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織または器官用保存液を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織、または器官用保存液。
【請求項２】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、請求項１に記載の保存液。
【請求項３】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、ＴＲＰＡのアゴニスト、ＴＲＰＭのアゴニスト、ＴＲＰＶのアゴニスト、およびＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上である、請求項１に記載の保存液。
【請求項４】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
イシリン、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド、
２−アミノエトキシジフェニルボラン、
ｌ−メントール、
ポリゴジアール、
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、および
カプサイシン
からなる群から選択される一種または二種以上である、請求項１に記載の保存液。
【請求項５】
両親媒性高分子を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の保存液。
【請求項６】
両親媒性高分子が多糖類または蛋白質である、請求項５に記載の保存液。
【請求項７】
冷蔵保存液である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の保存液。
【請求項８】
保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストが０．１〜１０００μＭ含まれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の保存液。
【請求項９】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを溶液に加える工程を含む、細胞、組織、または器官用保存液の製造方法。
【請求項１０】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを含む溶液を、細胞、組織または器官に加えることを特徴とする、細胞、組織、または器官の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織または器官用保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、または器官を用いた実験や臓器移植等を実施する場合、実施に供する前に細胞、組織、または器官の適切な保存が必要とされる。例えば、臓器移植において、摘出された臓器がレシピエントに移植されるまで品質の低下を抑えるために適切に保存しておく必要がある。
【０００３】
これまでに、冷蔵保存液であり、フリーラジカルを捕捉する物質を含み、低温での細胞状態のバランス最適化（ｐＨ緩衝、膠質浸透圧、エネルギー基質、イオン濃度）が図られたＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（商標）が知られている。また、冷蔵で短期間保存するための保護液であり、生体由来物質および保存補助剤を含まず、無機塩類とグルコースのみで構成された液であるＣＰＳ（商標）−１が知られている。さらに、肺組織／細胞の冷蔵保存液であり、細胞外液に近いイオン組成で、ＤＭＳＯや血清タンパク質が含まれない保存液であるＳｔｅｍＳｕｒｖｉｖｅ−ｌｕｎｇが知られている。また、特許文献１には、細胞傷害に対して細胞を保護するために使用できるクロマン誘導体が開示されている。
【０００４】
臓器移植に際し、ドナーから提供された臓器は代謝低下を目的に低温保存された状態で輸送されている。摘出臓器は血流が遮断され阻血状態となるが低温での代謝抑制により阻血の影響を軽減させている。それでも、臓器移植時の阻血許容時間は心臓で４時間、肺で８時間と臓器に依っては短く、低温保存時間の延長が強く求められている。
【０００５】
また、再生医療に関する研究開発が進み、細胞が原料となる再生医療等製品も開発される状況で、製品の凍結保存はもちろん、冷蔵保存や輸送時の保存の必要性が顕在化してきている。臓器に限らず細胞等の保存性能が高い保存液は未だ希求されているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１６−５１１７４３号公報
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、特定のＴＲＰチャネル作用物質を含む保存液を用いることにより、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存できる保存液を提供する。
【０００９】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織、または器官用保存液。
（２）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、（１）に記載の保存液。
（３）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、ＴＲＰＡのアゴニスト、ＴＲＰＭのアゴニスト、ＴＲＰＶのアゴニスト、およびＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上である、（１）に記載の保存液。
（４）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
イシリン、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド、
２−アミノエトキシジフェニルボラン、
ｌ−メントール、
ポリゴジアール、
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、および
カプサイシン
からなる群から選択される一種または二種以上である、（１）に記載の保存液。
（５）両親媒性高分子を更に含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の保存液。
（６）両親媒性高分子が多糖類または蛋白質である、（５）に記載の保存液。
（７）冷蔵保存液である、（１）〜（６）のいずれかに記載の保存液。
（８）保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストが０．１〜１０００μＭ含まれる、（１）〜（７）のいずれかに記載の保存液。
（９）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを溶液に加える工程を含む、細胞、組織、または器官用保存液の製造方法。
（１０）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを含む溶液を、細胞、組織または器官に加えることを特徴とする、細胞、組織、または器官の保存方法。
【００１０】
本発明の保存液を用いることにより、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存することができる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞生存率への影響を表す。縦軸は０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値を表し、横軸はコントロール（Ｃｔｒ）および各種ＴＲＰチャネル作用物質ならびにそれらの濃度を表す。
【図２】本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞生存率への影響を表す。縦軸は０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値を表し、横軸はコントロール（Ｃｔｒ）、イシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）、およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）ならびにその濃度を表す。
【図３】本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞生存率への影響を表す。縦軸は０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値を表し、横軸はコントロール（Ｃｔｒ）および各種ＴＲＰチャネル作用物質ならびにそれらの濃度を表す。
【図４】本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞生存率への影響を表す。縦軸は０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値を表し、横軸はコントロール（Ｃｔｒ）およびイシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）ならびにそれらの濃度を表す。
【図５】本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞増殖能への影響を表す。縦軸は４８ｈ保存時の吸光度を１００としたときの２４ｈ回復時の相対値を表し、横軸はコントロール（Ｃｔｒ）およびイシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）ならびにそれらの濃度を表す。
【発明の具体的説明】
【００１２】
保存液
本発明によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルの（サブファミリー）ＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織、または器官用保存液を提供することができる。
【００１３】
ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルとは、ショウジョウバエの光受容応答変異株の原因遺伝子として発見されたチャネル分子であり、哺乳類においては２８種の遺伝子が同定され、Ｃ、Ｍ、Ｖ、ＭＬ、Ｐ、Ａといった６つのサブファミリーを構成し、それぞれのサブファミリーは、ＴＲＰＣ、ＴＲＰＭ、ＴＲＰＶ、ＴＲＰＭＬ、ＴＲＰＰ、およびＴＲＰＡという。
【００１４】
ＴＲＰチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、ＴＲＰ  ｃｌａｓｓｉｃ（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（ＴＲＰＣ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｃ１遺伝子、Ｔｒｐｃ２遺伝子、Ｔｒｐｃ３遺伝子、Ｔｒｐｃ４遺伝子、Ｔｒｐｃ５遺伝子、Ｔｒｐｃ６遺伝子、Ｔｒｐｃ７遺伝子）、ＴＲＰ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ（ＴＲＰＭ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍ１遺伝子、Ｔｒｐｍ２遺伝子、Ｔｒｐｍ３遺伝子、Ｔｒｐｍ４遺伝子、Ｔｒｐｍ５遺伝子、Ｔｒｐｍ６遺伝子、Ｔｒｐｍ７遺伝子、Ｔｒｐｍ８遺伝子）、ＴＲＰ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＰＶ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｖ１遺伝子、Ｔｒｐｖ２遺伝子、Ｔｒｐｖ３遺伝子、Ｔｒｐｖ４遺伝子、Ｔｒｐｖ５遺伝子、Ｔｒｐｖ６遺伝子）、ＴＲＰ  ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ（ＴＲＰＭＬ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍｌ１遺伝子、Ｔｒｐｍｌ２遺伝子、Ｔｒｐｍｌ３遺伝子）、ＴＲＰ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ（ＴＲＰＰ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｐ１遺伝子、Ｔｒｐｐ２遺伝子、Ｔｒｐｐ３遺伝子、Ｔｒｐｐ５遺伝子）、ＴＲＰ  アンキリン（ＴＲＰＡ）遺伝子（Ｔｒｐａ遺伝子）等が挙げられる。ここで、ＴＲＰチャネル作用物質とは、ＴＲＰチャネルに作用する物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を意味する。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、細胞、組織、または器官用保存液が提供される。
【００１６】
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとしては、特に限定されるものではないが、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡのアゴニスト、ＴＲＰＭのアゴニスト、ＴＲＰＶのアゴニスト、およびＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上であることが好ましく、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡ１のアゴニスト、ＴＲＰＭ８のアゴニスト、ＴＲＰＶ１〜Ｖ３のアゴニスト、ＴＲＰＣ１のアンタゴニスト、およびＴＲＰＣ１〜７のアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上であることがより好ましく、ＴＲＰＭ８のアゴニスト、ＴＲＰＡ１のアゴニスト、またはＴＲＰＣ３〜６のアンタゴニストであることがさらに好ましく、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡ１のアゴニストまたはＴＲＰＭ８のアゴニストであることが特に好ましい。
【００１７】
また、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下の化合物が挙げられる。
イシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）（３，６−ジヒドロ−１−（２−ヒドロキシフェニル）−４−（３−ニトロフェニル）−２（１Ｈ）−ピリミジノン（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−１−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ））（ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＭ８のアゴニスト）、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド（ＳＫＦ９６３６５）（１−［２−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−［３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７のアンタゴニスト）、
２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）（ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｎｅ）（ＴＲＰＶ１〜Ｖ３のアゴニスト並びにＴＲＰＣ１、Ｃ３、Ｃ５、およびＣ６のアンタゴニスト）、
ｌ−メントール（５−メチル−２−（プロパン−２−イル）シクロヘキサン−１−オール（５−Ｍｅｔｈｙｌ−２−（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎ−１−ｏｌ））（ＴＲＰＡ１、Ｍ８、およびＶ３のアゴニスト）、
ポリゴジアール（Ｐｏｌｙｇｏｄｉａｌ）（（１Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−１，４，４ａ，６，７，８−ヘキサヒドロナフタレン−１，２−ジカルボキサアルデヒド（（１Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−１，４，４ａ，６，７，８−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ））（ＴＲＰＡ１のアゴニスト）、
２−［［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］安息香酸（Ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（２−［［３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））（ＴＲＰＣ６のアゴニスト並びにＴＲＰＣ３およびＣ７のアンタゴニスト）
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）（Ｎ−Ｂｕｔｙｌ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））（ＴＲＰＣ４およびＣ５のアンタゴニスト）、
（３β）−３−（スルホオキシ）−プレグン−５−エン−２０−オン  ナトリウム塩（硫酸プレグネノロンナトリウム塩）（Ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）（（（３β）−３−（Ｓｕｌｆｏｏｘｙ）−ｐｒｅｇｎ−５−ｅｎ−２０−ｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ））（ＴＲＰＭ３のアゴニスト）、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド（ＷＳ１２）（（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−２−（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（ＴＲＰＭ８のアゴニスト）、
２−［２−（３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−１（２Ｈ）−キノリニル）−２−オキソエチル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＭＬ−ＳＡ１）（２−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２，２，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−１（２Ｈ）−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ−１，３（２Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）（ＴＲＰＭＬ１〜ＴＲＰＭＬ３のアゴニスト）、
カプサイシン（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）（６−ノネン、Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−８−メチル−、（６Ｅ）−（６−Ｎｏｎｅｎａｍｉｄｅ，Ｎ−［（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−８−ｍｅｔｈｙｌ−，（６Ｅ）−））（ＴＲＰＶ１のアゴニスト）、および
１−（４−クロロ−２−ニトロフェニル）  スルホニル−４−ベンジルピペラジン（ＲＮ−１７４７）（１−（４−Ｃｈｌｏｒｏ−２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ−４−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）（ＴＲＰＶ４のアゴニスト）。
【００１８】
本発明の保存液に用いられるＴＲＰチャネルのアゴニストまたはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとして好ましくは、イシリン、１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド（ＳＫＦ９６３６５）、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）、ｌ−メントール、ポリゴジアール、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）、（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド（ＷＳ１２）、およびカプサイシンからなる群から選択される一種または二種以上であり、より好ましくはイシリン、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）、およびカプサイシンからなる群から選択される一種または二種以上であり、さらに好ましくは、イシリン、Ｍ０８４塩酸塩、カプサイシン、または２−ＡＰＢであり、特に好ましくはイシリンである。
【００１９】
本発明の保存液に含まれる、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される好ましい二種以上の組合せとしては以下の通りである：
（１）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニスト、ＴＲＰＡアゴニスト、およびＴＲＰＶアゴニストからなる群から選択される少なくとも一種との組合せ、
（２）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニストおよびＴＲＰＡアゴニストからなる群から選択される少なくとも一種との組合せ、
（３）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニストの少なくとも一種との組合せ。
【００２０】
本発明の保存液に含まれる、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択されるより好ましい二種以上の組合せとしては以下の通りである：
（ｉ）イシリンと、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）との組合せ、
（ｉｉ）イシリンと、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）との組合せ、
（ｉｉｉ）イシリンと、カプサイシン（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）との組合せ。
【００２１】
本発明の保存液は、一種以上のＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／または一種以上のＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストに加えて、両親媒性高分子をさらに含むことが好ましい。両親媒性高分子は、疎水性基および親水性基を有する高分子であれば特に限定されないが、多糖類または蛋白質が好ましく、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キチン、キトサン、または不凍蛋白質がより好ましく、ヒドロキシプロピルセルロースおよび／またはヒドロキシエチルスターチがさらに好ましく、ヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。これらの両親媒性高分子は、イシリンと共に用いて本発明の保存液とすることにより、より細胞等の保存効果、また細胞等の増殖能維持効果、生存率が高まる。
【００２２】
本発明の保存液は、抗酸化剤を更に含んでもよい。抗酸化剤としてはアスコルビン酸、グルタチオン、Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ、ビタミンＥ、ユビキノン、カロチノイド、α−トコフェノール、β‐カロテン、ポリフェノールが挙げられ、その他、日本薬局法に抗酸化機能を保持する記述がある既存の抗酸化剤より選択される一種または二種以上の混合物を併用して添加することもできる。
【００２３】
本発明の保存液は、細胞、組織、または器官用の保存液として用いられる。細胞、組織、または器官は、特に限定されず、微生物、細菌、動物、植物などのいずれの細胞、組織、または器官であってもよい。本発明においては、細胞、組織、または器官は、動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。本発明における動物の細胞、組織、または器官としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、どのような形式のものであってもよい。
【００２４】
本発明の保存液の好ましい態様によれば、細胞、組織、または器官用の冷蔵保存液である。本発明において、冷蔵保存とは、凍らない程度に低温に冷却して保存することを意味し、好ましくは１０℃以下であり、より好ましくは０〜８℃であり、さらに好ましくは３〜５℃である。
【００２５】
本発明の保存液は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが０．１〜１０００μＭ含まれ、より好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが０．５〜２００μＭ含まれ、さらに好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが１０〜２００μＭ含まれ、特に好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが２０〜１５０μＭ含まれる。
【００２６】
本発明の保存液は、細胞、組織、または器官用の市販の培地へ、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）、保存液としてもよいが、無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、脂質、タンパク質、ペプチド、血清などと共に、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）作成したものを本発明の保存液とし、この保存液を市販の培地へ加えて用いてもよい。また、保存液としての含有成分（緩衝剤、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖類、脂質、ビタミン、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ｐＨ指示薬、キレート剤、浸透圧調整剤）を最適化したものにＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）保存液として用いてもよい。
【００２７】
保存対象の細胞に関しては接着状態、懸濁液状態でもよく、また組織、器官に関してはシート、スフェロイドでもよく、血管または血管様組織を含むものに関しては保存液を灌流させて用いてもよい。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを溶液に加える工程を含む、細胞、組織または器官用保存液の製造方法が提供される。ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニスト等は、上記の本発明の保存液と同じであってもよく、更に両親媒性高分子を加える工程を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む溶液を、細胞、組織または器官に加えることを特徴とする、細胞、組織または器官の保存方法（好ましくは、冷蔵保存方法）が提供される。ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニスト等は、上記の本発明の保存液と同じであってもよく、更に両親媒性高分子を加える工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３１】
試験例１：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞冷蔵保存安定性評価１
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であるイシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−ＡＰＢ（富士フィルム和光純薬株式会社製）、ｌ−メントール（富士フィルム和光純薬株式会社製）、ポリゴジアール（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−［［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］安息香酸（Ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｍ０８４塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、（３β）−３−（スルホオキシ）−プレグン−５−エン−２０−オン  ナトリウム塩（硫酸プレグネノロンナトリウム塩）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＷＳ１２（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、またはカプサイシン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれる本発明の各種ＴＲＰチャネル作用物質の濃度は図１に記載の通り（１００μＭまたは５０μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
【００３２】
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
【００３３】
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図１に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
【００３４】
図１の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であればいずれの物質であっても、また１００μＭおよび５０μＭのいずれの濃度であっても、コントロールに比べて吸光度（相対値）が高くなり、細胞の生存率が高いことが分かった。
また、本発明のＴＲＰチャネル作用物質ではないが、カルシウムチャネル阻害剤として知られるＹＭ−５８４８３（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、ＲＯＣＫインヒビターとして知られるＹ２７６３２（富士フィルム和光純薬株式会社製）とについて、本発明のＴＲＰチャネル作用物質と同様に、これらの物質を前培養後に加えて、吸光度を測定した（データには示さず）。その結果、ＹＭ−５８４８３およびＹ２７６３２はコントロールとほぼ同程度の吸光度（相対値）を示し、コントロールとほぼ同程度の細胞の生存率であることが分かった。
【００３５】
試験例２：本発明のＴＲＰチャネル作用物質及び両親媒性高分子添加による細胞の冷蔵保存安定性評価２
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（セルニー：日本曹達株式会社製）を組み合わせて、または単独で混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンおよびヒドロキシプロピルセルロースの濃度は図２に記載の通り（イシリン：１２μＭまたは０．６μＭ、ＨＰＣ：５０ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬ）に調製した。イシリンおよびヒドロキシプロピルセルロースを含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
【００３６】
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
【００３７】
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図２に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
【００３８】
図２の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）を単独で用いた場合でもコントロールに比べて、吸光度（相対値）が高くなり細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かるが、イシリンと、ヒドロキシプロピルセルロースとを組み合わせた場合の方が、吸光度（相対値）がより高くなり、細胞生存率がより高くなることが分かった。
【００３９】
試験例３：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞の冷蔵保存安定性評価３
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であるイシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−ＡＰＢ（富士フィルム和光純薬株式会社製）、Ｍ０８４塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、およびカプサイシン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を図３に記載の通りに単独で、または組み合わせて混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれる本発明のＴＲＰチャネル作用物質の濃度は図３に記載の通り（イシリン：１２μＭ、２−ＡＰＢ：４０μＭ、Ｍ０８４塩酸塩：８０μＭ、カプサイシン：８０μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
【００４０】
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
【００４１】
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図３に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
【００４２】
図３の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を単独で用いた場合であっても、組み合わせて用いた場合であっても、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かった。また、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を図３のように組み合わせて用いた場合の方が、単独で用いるよりも吸光度（相対値）がより高くなり、細胞の生存率がより高いことが分かった。
【００４３】
試験例４：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞の冷蔵保存安定性評価４
（１）上記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とは異なるＣａｃｏ−２細胞（由来：ヒト結腸癌）を、８×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンの濃度は図４に記載の通り（イシリン：１２μＭまたは６μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
【００４４】
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製））を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
【００４５】
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製））を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図４に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
【００４６】
図４の結果から、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とは異なるＣａｃｏ−２細胞を用いた場合であっても、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）を用いた場合には、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かった。すなわち、本発明のＴＲＰチャネル作用物質の効果は、特定の細胞に依存しないことが分かった。
【００４７】
試験例５：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞増殖能の評価
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンの濃度は図５に記載の通り（イシリン：１２μＭ、６μＭ、または０．６μＭ）に調製した。イシリンを含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
【００４８】
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
【００４９】
４８ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで回復培養前サンプルとして６０分間培養をし、２４時間回復培養後サンプルとして２４時間回復培養を行った。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を回復培養前サンプルと、２４時間回復培養後サンプルとのそれぞれの各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で４時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、回復培養前サンプル（回復培養前）と、２４時間回復培養後サンプル（２４時間の回復培養後）の細胞について、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図５に示す（グラフの縦軸は、各サンプルにおける回復培養前のサンプル（４８ｈ保存時）の吸光度を１００としたときの２４時間回復培養後のサンプルの相対値である）。
【００５０】
図５の結果によれば、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を用いた場合、２４時間の回復培養後で、イシリンを添加した場合の方が、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の増殖能がより保存されていることが分かる。
【００５１】
一方、図５には示していないが、市販品であるＲＯＫＥＰＩＥ（商標）（Ｓｕｌｆａｔｅｑ  Ｂ．Ｖ．社製）、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）、またはＣＰＳ（商標）−１（株式会社細胞科学研究所製）を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）の代わりに添加して上記の回復能の評価を行った。これらの市販品では、２４時間の回復培養後で、回復培養前と比べて吸光度はほとんど上昇せずに、コントロールと同様に細胞の増殖が止まってしまうことが分かり、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）の方が細胞の増殖能の保存の点で優れた効果を示すことが分かった。
【図１】
2020162441.tif 000002
【図２】
2020162441.tif 000003
【図３】
2020162441.tif 000004
【図４】
2020162441.tif 000005
【図５】
2020162441.tif 000006