(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘマトクリットを上昇させ、哺乳動物における血液障害を治療する方法の提供。【解決手段】インターロイキン１受容体アンタゴニストとＦｃドメインとを含むキメラタンパク質であるインターロイキン１インヒビターとエポエチン等のエリスロポエチン受容体アゴニストを該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン１（ＩＬ−１）インヒビターを含む治療的に有効な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、哺乳動物における血液障害の治療方法。
【請求項２】
該血液障害の治療が該哺乳動物におけるヘマトクリットを上昇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該目標ヘマトクリットが少なくとも約３０％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該医薬組成物が、医薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および佐剤の少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該希釈剤がクエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムのバッファー溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該希釈剤がクエン酸ナトリウムのバッファー溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該可溶化剤がポリソルベート８０である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
該医薬組成物が医薬上許容される希釈剤および可溶化剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
該希釈剤がクエン酸ナトリウムであり、該可溶化剤がポリソルベート８０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ＩＬ−１インヒビターがインターロイキン１受容体アンタゴニストである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
該ＩＬ−１インヒビターが、インターロイキン１受容体アンタゴニストとＦｃドメインとを含むキメラタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
該ＩＬ−１インヒビターがＦｃ−ＩＬ−１ｒａである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該哺乳動物が、腎機能の低下または喪失に関連した貧血に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
該哺乳動物が、関節リウマチに関連した貧血に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
該哺乳動物が、骨髄抑制療法に関連した貧血に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
該骨髄抑制療法が化学療法剤または抗ウイルス薬を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該哺乳動物が、過度の出血に関連した貧血に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
治療的に有効な量の鉄を投与することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における血液障害の治療方法であって、治療的に有効な量のＩＬ−１インヒビターおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２１】
該血液障害の治療が該哺乳動物におけるヘマトクリットを上昇させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該血液障害が鉄貯蔵障害である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該ＩＬ−１インヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを別々の組成物中で投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該ＩＬ−１インヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを、別々の組成物中で、異なる時点で投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
該ＩＬ−１インヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを、別々の組成物中で、同時に投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
該ＩＬ−１インヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを同じ組成物中で投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
該ＩＬ−１受容体アンタゴニストがＦｃ−ＩＬ−１ｒａである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチン（ｅｐｏｉｅｔｉｎ）αである、請求項に２０に記載の方法。
【請求項３０】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチン（ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）αである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラまたはＦｃ−ＩＬ−１ｒａであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラまたはＦｃ−ＩＬ−１ｒａであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを該哺乳動物に週２回または週３回投与し、ダーベポエチンαを該哺乳動物に２週間に１回投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
治療する血液障害が慢性疾患の貧血である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
該哺乳動物が、腎機能の低下または喪失に関連した貧血に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
該哺乳動物が、関節リウマチに関連した貧血に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
該哺乳動物が、骨髄抑制療法に関連した貧血に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
該骨髄抑制療法が化学療法剤または抗ウイルス薬を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
該哺乳動物が、過度の出血に関連した貧血に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを含んでなる組成物。
【請求項４１】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
該ＩＬ−１インヒビターがＦｃ−ＩＬ−１ｒａである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラまたはＦｃ−ＩＬ−１ｒａであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４５】
該ＩＬ−１インヒビターがアナキンラまたはＦｃ−ＩＬ−１ｒａであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
該組成物が、医薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および佐剤の少なくとも１つを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物における血液障害の治療方法であって、治療的に有効な量のＴＮＦインヒビターおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項４８】
該血液障害の治療が該哺乳動物におけるヘマトクリットを上昇させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
該ＴＮＦインヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを別々の組成物中で投与する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
該ＴＮＦインヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを、別々の組成物中で、異なる時点で投与する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
該ＴＮＦインヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを、別々の組成物中で、同時に投与する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
該ＴＮＦインヒビターおよび該ＥＰＯ受容体アゴニストを同じ組成物中で投与する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
該ＴＮＦインヒビターが、ｓＴＮＦ−ＲＩ、Ｄ２Ｅ７、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、ＣＤＰ  ８７０、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）およびエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）から選ばれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
該ＴＮＦインヒビターがｓＴＮＦ−ＲＩである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
該ＴＮＦインヒビターがｓＴＮＦ−ＲＩであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
該ＴＮＦインヒビターがｓＴＮＦ−ＲＩであり、該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
該ｓＴＮＦ−ＲＩを該哺乳動物に週１回または週２回投与し、ダーベポエチンαを該哺乳動物に２週間に１回投与する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
治療する血液障害が慢性疾患の貧血である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
該哺乳動物が、腎機能の低下または喪失に関連した貧血に罹患している、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
該哺乳動物が、関節リウマチに関連した貧血に罹患している、請求項４７に記載の方法。
【請求項６３】
該哺乳動物が、骨髄抑制療法に関連した貧血に罹患している、請求項４７に記載の方法。
【請求項６４】
該骨髄抑制療法が化学療法剤または抗ウイルス薬を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
該哺乳動物が、過度の出血に関連した貧血に罹患している、請求項４７に記載の方法。
【請求項６６】
ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを含んでなる組成物。
【請求項６７】
該ＴＮＦインヒビターが、ｓＴＮＦ−ＲＩ、Ｄ２Ｅ７、オネルセプト、ＣＤＰ  ８７０、インフリキシマブおよびエタネルセプトから選ばれる、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
該ＴＮＦインヒビターがｓＴＮＦ−ＲＩである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６９】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項７０】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７１】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがダーベポエチンαである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７２】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項７３】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７４】
該ＥＰＯ受容体アゴニストがエポエチンαである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７５】
該組成物が、医薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および佐剤の少なくとも１つを更に含む、請求項６５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１（ＩＬ−１）インヒビターを使用する血液障害の治療に関する。本発明はまた、ＩＬ−１インヒビター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビターおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを使用する、哺乳動物における血液障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の障害は多数の重要な健康問題を引き起こす。例えば、ヘマトクリットの減少、例えば少ない赤血球数、赤血球容積の減少またはヘモグロビン濃度の減少は、貧血（これに限定されるものではない）のような病態の指標となる。貧血の症状には、疲労、眩暈、頭痛、胸痛、息切れ及び抑うつが含まれうる。
【０００３】
貧血のような血液障害の治療は、患者のヘマトクリットを増加させることを含みうる。貧血の治療方法の１つは赤血球輸血を行うことである。しかし、この方法は、それに伴うリスクを有しうる。ドナーと患者との間で血液が正しく且つ完全に一致しなければ、輸血反応が生じる可能性があり、輸血されている血液は幾つかの疾患、特にウイルス疾患を伴う可能性がある。未だ証明されていない理論的な懸念は、感染症から身体を防御する免疫系を頻繁な輸血が損ないうることである。
【０００４】
慢性腎不全（ＣＲＦ）に伴う貧血、ＨＩＶ感染患者におけるＡＺＴ（ジドブジン）での治療に関連した貧血、化学療法を受けている非骨髄性悪性疾患の患者における貧血、および同種血輸血の必要性を減少させるための手術を受けている患者における貧血の治療のための組換えヒトエリスロポエチンが、規制機関により承認されている。
【０００５】
ヘマトクリットの減少に関連した状態のような血液障害から生じる重篤な健康問題のため、これらの障害を治療しうる他の物質を開発することに関心が持たれている。これらの物質には、ヘマトクリットレベルを増加させる物質（これに限定されるものではない）が含まれる。
【発明の概要】
【０００６】
ある実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＩＬ−１インヒビターを投与することを含んでなる、哺乳動物においてヘマトクリットを上昇させる方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、哺乳動物においてヘマトクリットを維持するための方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＩＬ−１インヒビターを投与することを含んでなる、哺乳動物における血液障害の治療方法を提供する。
【０００７】
ある実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物における血液障害の治療方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物においてヘマトクリットを上昇させ及び／又は維持する方法を提供する。ある実施形態においては、該ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを別々に、または同時に又は異なる時点で投与することができる。ある実施形態においては、該ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを同時に一緒に投与することができる。
【０００８】
ある実施形態においては、本発明は、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物における血液障害の治療方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物においてヘマトクリットを上昇させ及び／又は維持する方法を提供する。ある実施形態においては、該ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを別々に、または同時に又は異なる時点で投与することができる。ある実施形態においては、該ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを同時に一緒に投与することができる。
【０００９】
更なる実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物における血液障害の治療方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物においてヘマトクリットを上昇させ及び／又は維持する方法を提供する。ある実施形態においては、該ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを別々に、または同時に又は異なる時点で投与することができる。ある実施形態においては、該ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを同時に一緒に投与することができる。更なる実施形態においては、該ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターの代わりに、ＴＮＦおよびＩＬ−１の両方を抑制する単一の分子（例えば、Ｐ３８インヒビター）を使用することができる。
【００１０】
また、ＩＬ−１インヒビターを含んでなる医薬組成物、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを含んでなる医薬組成物、ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを含んでなる医薬組成物、ならびにＩＬ−１およびＴＮＦのインヒビター（例えば、Ｐ３８インヒビター）とＥＰＯ受容体アゴニストとを含んでなる医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者のベースラインデモグラフィックスおよび病歴を示す。
【図２】本出願の実施例１、２および３に記載の研究におけるアナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）での治療およびプラセボでの治療に関するヘマトクリットにおけるベースラインからの変化の分布を比較している。
【図３】関節リウマチおよび貧血を有していた本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者のベースラインデモグラフィックスおよび病歴を示す。
【図４】第２４週でヘマトクリットの改善を示し関節リウマチおよび貧血を有していた本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数および割合（％）を示す。
【図５】ヘマトクリットレベルの増加を示しＡＣＲ２０応答基準をも満たし関節リウマチおよび貧血を有していた本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数および割合（％）を示す。
【図６】ヘマトクリットの改善およびＡＣＲ２０応答の両方を示し関節リウマチおよび貧血を有する本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数と、ヘマトクリットの改善を示し関節リウマチおよび貧血を有する被験者の総数とを比較している。
【図７】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均血液ヘモグロビン濃度に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（ダルベポイエインα）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図８】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの脚の浮腫に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみ及びＦｃ−ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦインヒビター（ＰＥＧｓ  ＴＮＦ  Ｒ１）の効果を示す。
【図９】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均網状赤血球数に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１０】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの赤血球数（ＲＢＣ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１１】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均赤血球容積（ＭＣＶ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１２】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１３】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの全血清鉄濃度（ＴＳＩ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１４】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの全鉄結合能（ＴＩＢＣ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【図１５】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均血液ヘモグロビン濃度に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１６Ａ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＭＣＨに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１６Ｂ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＭＣＶに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１７Ａ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＲＢＣ数に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１７Ｂ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均網状赤血球数に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１８Ａ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＴＳＩに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１８Ｂ】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＴＳＩ変化に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図１９】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの未結合鉄結合能（ＵＩＢＣ）、例えば血清トランスフェリンレベルに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【図２０】本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）レベル（飽和率（％）で表されている）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（図面の説明）
図１は、本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者のベースラインデモグラフィックスおよび病歴を示す。該データは、治療の種類およびレベルにより分類されている。
【００１３】
図２は、本出願の実施例１、２および３に記載の研究におけるアナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）での治療およびプラセボでの治療に関するヘマトクリットにおけるベースラインからの変化の分布を比較している。
【００１４】
図３は、関節リウマチおよび貧血を有していた本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者のベースラインデモグラフィックスおよび病歴を示す。該データは、治療の種類およびレベルにより分類されている。
【００１５】
図４は、第２４週でヘマトクリットの改善を示し関節リウマチおよび貧血を有していた本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数および割合（％）を示す。
【００１６】
図５は、ヘマトクリットレベルの増加を示しＡＣＲ２０応答基準をも満たす関節リウマチおよび貧血を有していた、本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数および割合（％）を示す。該データは、ヘマトクリットの増加のレベルにより分類されている。
【００１７】
図６は、ヘマトクリットの改善およびＡＣＲ２０応答の両方を示し関節リウマチおよび貧血を有する、本出願の実施例１、２および３に記載の研究における被験者の数と、ヘマトクリットの改善を示し関節リウマチおよび貧血を有する被験者の総数とを比較している。
【００１８】
図７は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均血液ヘモグロビン濃度に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（ダルベポイエインα）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、血液Ｈｂレベルの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０２）。
【００１９】
図８は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの脚の浮腫に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみ及びＦｃ−ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦインヒビター（ＰＥＧｓ  ＴＮＦ  Ｒ１）の効果を示す。
【００２０】
図９は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均網状赤血球数に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、網状赤血球レベルの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．００４）。
【００２１】
図１０は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの赤血球数（ＲＢＣ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、ＲＢＣ数の上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０３）。
【００２２】
図１１は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均赤血球容積（ＭＣＶ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、ＭＣＶの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０４）。
【００２３】
図１２は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、ＭＣＶの上昇において、ＡＲＡＮＥＳＰでの単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０１）。
【００２４】
図１３は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの全血清鉄濃度（ＴＳＩ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、ＴＳＩの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０２）。
【００２５】
図１４は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの全鉄結合能（ＴＩＢＣ）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａの効果を示す。
【００２６】
図１５は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均血液ヘモグロビン濃度に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、血液Ｈｂレベルの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０１）。
【００２７】
図１６は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＭＣＨおよびＭＣＶに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、ＭＣＨ（ｐ＜０．０００９）およびＭＣＶ（ｐ＜０．０１）の上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった。
【００２８】
図１７は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの平均網状赤血球数およびＲＢＣ数に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、網状赤血球レベル（ｐ＜０．００２）の上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．００Ｘ）。
【００２９】
図１８は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのＴＳＩおよびＴＳＩ変化に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、血清鉄レベルの上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．０２）。
【００３０】
図１９は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットの未結合鉄結合能（ＵＩＢＣ）、例えば血清トランスフェリンレベルに対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、いずれか一方での単独療法より有意に低いＵＩＢＣを与えた（ｐ＜０．０１５）。
【００３１】
図２０は、本出願の実施例４に記載の研究における慢性障害の貧血に罹患したラットのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）レベル（飽和率（％）で表されている）に対するＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の効果を示す。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ  Ｒ１の４ｍｇ／ｋｇ（週３回）とＡＲＡＮＥＳＰ  ６μｇ／ｋｇ／２週との併用療法は、トランスフェリン飽和の上昇において、いずれか一方での単独療法より有意に良好であった（ｐ＜０．００４）。
【００３２】
定義
本明細書の全体にわたり用いる用語には、特定の場合において特に限定されない限り、以下の定義が適用される。
【００３３】
「付加変異体」は、親分子より少なくとも１つ多いアミノ酸残基を有する変異体を意味する。
【００３４】
「佐剤」は、予測可能な様態で医薬組成物の有効成分の作用に影響を及ぼす、該医薬組成物に添加する物質である。
【００３５】
「投与」は、哺乳動物の体内または体表面に組成物を導入する任意の方法を意味し、本明細書に記載の特定の方法（それらに限定されるものではない）を含む。
【００３６】
「慢性疾患の貧血」（ＡＣＤ）は、外傷、感染症および炎症（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、および新生物性疾患（２ヶ月以上持続するもの）（これらに限定されるものではない）のような慢性疾患に関連した軽度から中等度に重篤な任意の貧血を意味する。
【００３７】
「ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）」は、公開されているＰＣＴ出願番号ＷＯ  ００／２４８９３（“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｅｍｉａ”）（任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載の超シアル酸化（ｓｕｐｅｒ−ｓｉａｌａｔｅｄ）エリスロポエチンタンパク質およびこのタンパク質の任意の誘導体または変異体を意味する。
【００３８】
「キメラポリペプチド」は、２以上の異なるポリペプチドの融合により産生されたポリペプチドを意味する。
【００３９】
「欠失変異体」は、親分子より少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有する変異体を意味する。
【００４０】
「誘導体」は、化学修飾タンパク質であって、該タンパク質に非タンパク質性部分が結合しているものを意味する。
【００４１】
「希釈剤」は、組成物のその他の成分の濃度を減少させる物質である。
【００４２】
「乳化剤」は、疎水性相および水相のエマルションを安定化するために使用する石鹸、界面活性剤、ステロイドまたはタンパク質（これらに限定されるものではない）のような物質である。
【００４３】
「エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニスト」は、多数のメカニズムから生じうるＥＰＯ受容体の活性化を引き起こしうる分子を意味する。ＥＰＯ受容体アゴニストには、本明細書に記載または言及されているもの、例えば、ダーベポエチンα（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標））、エポエチンα（ＥＰＯ、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標））および抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体が含まれる。
【００４４】
「Ｆｃ」は、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全部または一部およびこのドメインの任意の変異体または誘導体を意味する。
【００４５】
「Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ」は、ＩＬ−１ｒａとヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインおよびこのドメインの任意の変異体または誘導体との両方の配列を含む分子を意味する。典型的なＦｃ−ＩＬ−１ｒａとしては、１９９７年６月１４日付け公開のＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／２８８２８（参照により本明細書に組み入れることとする）およびこのポリペプチドの任意の誘導体または変異体が挙げられる。
【００４６】
「インターロイキン−１（ＩＬ−１）インヒビター」は、ＩＬ−１による細胞受容体の活性化を特異的に抑制しうる分子を意味し、これは、いずれかの１以上の数のメカニズムから生じうる。そのようなメカニズムには、ＩＬ−１産生のダウンレギュレーション、遊離ＩＬ−１の結合、ＩＬ−１のその受容体への結合の妨害、ＩＬ−１受容体複合体の形成（すなわち、ＩＬ−１受容体とＩＬ−１受容体補助タンパク質との会合）の妨害、またはＩＬ１受容体への結合後のＩＬ−１シグナリングのモジュレーションの妨害が含まれるが、これらに限定されるものではない。インターロイキン−１インヒビターには、本明細書に記載または言及されているもの、例えば、抗ＩＬ−１受容体抗体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、およびＦｃ−ＩＬ−１ｒａが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
「親分子」は、考察されている特定の変異を欠く変異体分子または未修飾分子を意味する。例えば、親分子の置換変異体を考察する場合には、該親分子は欠失変異体でありうる。
【００４８】
「保存剤」は、組成物に対する化学変化または該組成物の汚染を抑制するために組成物に添加する物質である。
【００４９】
「可溶化剤」は、組成物の成分の溶解性を増加させるために組成物に添加する物質である。
【００５０】
「ｓＴＮＦ−ＲＩ」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のＩ型（ｐ５５）受容体の可溶性形態およびその任意の融合タンパク質、誘導体または変異体を意味する。典型的なｓＴＮＦ−ＲＩはＷＯ  ９８／０１５５５に記載されている。
【００５１】
「置換変異体」は、親分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され異なる残基がその位置に挿入された変異体を意味する。
【００５２】
「治療的に有効な量」は、特定の障害に罹患した哺乳動物における少なくとも１つの臨床的パラメーターの測定可能な改善をもたらす量である。
【００５３】
「変異体」は、参照ポリペプチドに対して少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、該参照ポリペプチドの関連活性の何らかのレベル（減少したレベルを含む）を維持するポリペプチドを意味する。本明細書に記載の相同性（％）は、Ｄａｙｈｏｆｆ  （１９７２），Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、アライメントを補助するために１００アミノ酸長中に４個のギャップが導入されうる場合の、比較されている配列中の同一アミノ酸残基とアライメント（整列）する２つの配列の小さい方に見出されるアミノ酸残基の割合（％）として計算される。変異体は、参照ポリペプチドに基づくものであって、該参照分子と比較して１以上のアミノ酸が欠失した（「欠失変異体」）、挿入された（「付加変異体」）または置換された（「置換変異体」）ものでありうる。
【００５４】
本出願においては、単数としての表現は、明示的に特に示さない限り、複数としての表現を含む。
【００５５】
（発明の詳細な記載）
本出願に引用されているすべての文書を、任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【００５６】
ある実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＩＬ−１インヒビターを投与することを含んでなる、哺乳動物においてヘマトクリットを上昇させる方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、上昇したヘマトクリットを維持することを含む。ある実施形態においては、ＩＬ−１インヒビターを含む医薬組成物を提供する。
【００５７】
本発明は、ある実施形態においては、ＩＬ−１インヒビター、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニスト、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストまたはＩＬ−１インヒビターを、ならびにＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することを含んでなる、哺乳動物における貧血（これに限定されるものではない）のような血液障害を治療することを提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニスト、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストまたはＩＬ−１インヒビター、ならびにＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することによりヘマトクリットを上昇させることを提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニスト、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストまたはＩＬ−１インヒビター、ならびにＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを投与することにより、上昇したヘマトクリットを維持することを含む。ある実施形態においては、ＩＬ−１インヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニスト、ＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストまたはＩＬ−１インヒビター、ならびにＴＮＦインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストを含んでなる医薬組成物を提供する。更なる実施形態においては、そのような組成物を使用する血液障害の治療方法を提供する。
【００５８】
ある実施形態においては、本発明は、以下のものを含む（それらに限定されるものではない）血液障害の治療において使用することができる：
・腎機能の低下または喪失（慢性腎不全）に関連した貧血、
・化学療法薬または抗ウイルス薬（例えば、ＡＺＴ）のような骨髄抑制療法に関連した貧血、
・非骨髄性癌の進行に関連した貧血、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）に関連した貧血、
・相対エリスロポエチン欠損症に関連した貧血、
・うっ血性心不全に関連した貧血、および
・自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）のような慢性疾患の貧血。
【００５９】
ある実施形態においては、本発明は、貧血以外の点では健康な個体における貧血につながりうる状態（例えば、手術中の予想される出血）で使用することができる。ある実施形態においては、治療は、関節リウマチ（ＲＡ）に関連した貧血に対する１日１回の投与を含む。また、血液障害には、造血障害、血色素症、鉄代謝欠損症障害も含まれるが、これらに限定されるものではない。造血は、血液または血液細胞の形成を意味する。
【００６０】
貧血は、関節リウマチ（ＲＡ）の関節外合併症として生じることがあり、通常、疾患活性のマーカーに相関する（Ｐｅｅｔｅｒｓ  ＨＲＭら，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，５５：１６２−６８  １９９６）。本発明者らは、ＩＬ−１インヒビターでのＲＡ患者の治療がこれらの患者のヘマトクリットを増加させることを見出した（図２）。特に、貧血を伴うＲＡ患者におけるヘマトクリットが、プラセボに対して増加した（図４）。さらに、本発明者らは、許容される基準をＲＡ応答（ＡＣＲ２０として公知である）が満たさない患者においてさえも、該ヘマトクリットが改善されることを見出した（図５および６）。
【００６１】
前記のとおり、貧血の１つの形態は慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）である。ＡＣＤは、以下のような状態（それらに限定されるものではない）にしばしば関連している軽度ないしは中等度に重篤な貧血に関する広義の用語である：
・外傷、
・感染性炎症、
・非感染性炎症、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、狼瘡（全身性エリテマトーデスまたはＳＬＥを含む）、多発性硬化症（ＭＳ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心臓血管炎症および新生物性疾患（２ヶ月以上持続するもの）に関連している可能性があるもの。
ある種のＡＣＤの総説としては、Ｍｅａｎｓ（１９９６），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．７０（１）７−１２を参照されたい。ＡＣＤは、先天性および同族免疫応答ならびに炎症性サイトカイン、例えばＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１により種々の度合で媒介される多因性病理発生を有することが公知である（Ｍｅａｎｓ（１９９９），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．７０（１）７−１２；Ｖｏｕｌｇａｒｉら，（１９９９），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：１５３−１６０）。
【００６２】
ペプチドグリカン−多糖重合体でのＬｅｗｉｓ（ルイス）ラットの免疫は、再発性関節炎、およびヒトＡＣＤを良く模擬する二相性ＡＣＤを誘発する。本発明者らは、ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）と共にＦｃ−ＩＬ−１ｒａをこれらのラットに投与すると、平均Ｈｂレベル、網状赤血球数、赤血球数、赤血球容積、赤血球ＨＢレベルおよび全血清鉄濃度が、Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａまたはＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のいずれか一方の単独投与の場合より大きな度合で増加することを見出した（図７〜１５を参照されたい）。
【００６３】
また、本発明者らは、ヒトＡＣＤの同じＬｅｗｉｓラットモデルにおいて、ｓＴＮＦ−ＲＩを単独で及びＡＲＡＮＥＳＰ（商標）と組合せて投与した。ＰＥＧ  ｓＴＮＦ−ＲＩのみで処理したラットは、未処理ラットと比較して、平均Ｈｂレベルにおいては上昇に傾いたが（図１６）、平均脚浮腫においては有意な減少を有することを（図１７）、本発明者らは見出した。ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での単独処理を受けたラットにおける平均Ｈｂレベルは、未処理貧血レベルより上昇した。該併用療法は、同用量のＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩと比較してＨｂレベルを有意に増強し、同用量のＡＲＡＮＥＳＰ（商標）単独の場合と比較してＨｂの上昇を２倍以上にした。該併用療法はまた、同用量のＡＲＡＮＥＳＰ（商標）およびＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩと比較して、より多くの網状赤血球（図１８）および赤血球（図１９）を誘導した。該併用療法は、全血清鉄濃度（図２０Ａおよび２０Ｂ）、赤血球容積（図２１）および赤血球Ｈｂ（図２２）を、ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）単独の場合より大きな度合で増加させた。また、該併用療法は、全血清鉄濃度、赤血球容積および赤血球Ｈｂを、ＰＥＧ  ｓＴＮＦ−ＲＩ単独の場合より増加させた。理論に拘束されるものではないが、そのような結果は、ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）とＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩとの間の見掛け上の相乗効果が、増強したエリトロポエチン応答を介して及び増加した数のＲＢＣの「ヘモグロビン化（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）」を増強することにより（すなわち、ＲＢＣ食作用、鉄隔離および／または鉄動員に有利な影響を及ぼすことにより）媒介されることを示していると、本発明者らは考えている。また、該データはＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩおよびＡＲＡＮＥＳＰ（商標）で得られたものであるが、ｅｐｏＲの他のアゴニストまたはＡＲＡＮＥＳＰ（商標）と組合せた他のＴＮＦ−αアンタゴニスト（後記を参照されたい）も同様の結果を与えるはずである。
【００６４】
本発明の併用療法は、鉄貯蔵障害に関連した状態の治療においても有用でありうる。貯蔵鉄は、多数の疾患または障害における組織損傷を媒介するスーパーオキシドおよび他の反応種の生成に関与する。そのような状態および障害の場合に、該ＩＬ−１インヒビターまたはＴＮＦインヒビターは鉄の遊離を補助しうる。そしてＥＰＯ受容体アゴニストは、赤血球形成により過剰の鉄の消費を補助しうる。この理由または他の理由により、本発明の併用療法は、慢性心臓疾患、心筋梗塞、卒中、認識欠損または障害、血色素症、炎症性腸疾患などの治療において有用でありうる。
【００６５】
ＥＰＯ受容体アゴニスト
エリトロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストは、ＥＰＯ受容体の活性化を引き起こしうる分子であり、これは１以上の任意の数のメカニズムから生じうる。ＥＰＯ受容体アゴニストには、本明細書に記載または言及されているもの、例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）、ＥＰＯおよび抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
インターロイキン１インヒビター
インターロイキン１は、単球およびいくつかのマクロファージを含む多数の細胞型により産生されるタンパク質である。該タンパク質は、多数の種々の標的細胞に対する重要な生理的効果を有する。インターロイキン１インヒビターには、ＩＬ−１に対する細胞性応答の活性化を特異的に妨げうる分子（これは、１以上の任意の数のメカニズムから生じうる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなメカニズムには、ＩＬ−１産生のダウンレギュレーション、遊離ＩＬ−１の結合、ＩＬ−１のその受容体への結合の妨害、ＩＬ−１受容体複合体の形成（すなわち、ＩＬ−１受容体とＩＬ−１受容体補助タンパク質との会合）の妨害、またはＩＬ−１受容体への結合後のＩＬ−１シグナリングのモジュレーションの妨害が含まれるが、これらに限定されるものではない。インターロイキン１インヒビターのクラスには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
・後記のＩＬ−１ｒａのようなインターロイキン１受容体アンタゴニスト、
・抗ＩＬ−１受容体モノクローナル抗体（例えば、ＥＰ  ６２３６７４（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））、
・ＩＬ−１結合性タンパク質、例えば、可溶性ＩＬ−１受容体（例えば、米国特許第５，４９２，８８８号、米国特許第５，４８８，０３２号および米国特許第５，４６４，９３７号、米国特許第５，３１９，０７１号および米国特許第５，１８０，８１２号（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））、
・抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、ＷＯ  ９５０１９９７、ＷＯ  ９４０２６２７、ＷＯ  ９００６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ  ３６４７７８、ＥＰ  ２６７６１１およびＥＰ  ２２００６３（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））、
・ＩＬ−１受容体補助タンパク質およびそれに対する抗体（例えば、ＷＯ  ９６／２３０６７およびＷＯ  ９９／３７７７３（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））、
・ＩＬ−１βの産生および分泌を抑制するために使用しうる、インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）またはカスパーゼＩのインヒビター（例えば、ＷＯ  ９９／４６２４８、ＷＯ  ９９／４７５４５およびＷＯ  ９９／４７１５４（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））、
・インターロイキン１βプロテアーゼインヒビター、
・ならびにＩＬ−１のインビボ合成または細胞外遊離を遮断する他の化合物およびタンパク質。
【００６７】
典型的なＩＬ−１インヒビターは以下の参考文献に開示されている：
米国特許第５，７４７，４４４号、第５，３５９，０３２号、第５，６０８，０３５号、第５，８４３，９０５号、第５，３５９，０３２号、第５，８６６，５７６号、第５，８６９，６６０号、第５，８６９，３１５号、第５，８７２，０９５号、第５，９５５，４８０号および第５，９６５，５６４号；
国際（ＷＯ）特許出願９８／２１９５７、９６／０９３２３、９１／１７１８４、９６／４０９０７、９８／３２７３３、９８／４２３２５、９８／４４９４０、９８／４７８９２、９８／５６３７７、９９／０３８３７、９９／０６４２６、９９／０６０４２、９１／１７２４９、９８／３２７３３、９８／１７６６１、９７／０８１７４、９５／３４３２６、９９／３６４２６、９９／３６４１５；
欧州（ＥＰ）特許出願５３４９７８および８９４７９５；ならにび
フランス国特許出願ＦＲ  ２７６２５１４。
【００６８】
前記参考文献のすべての開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【００６９】
本発明の或る実施形態は、ＩＬ−１インヒビターの変異体を提供し、これは、貧血を治療するためにそれを使用する能力に実質的に悪影響を及ぼさない。そのような付加、欠失および置換は該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在することが可能であり、あるいはその内部に存在することが可能である。一般には、比較的小さな欠失または付加がＩＬ−１インヒビターの構造および／または機能に影響を及ぼす可能性は低い。ある実施形態においては、欠失、付加または置換は、５〜１０アミノ酸残基、２〜５アミノ酸残基、または１〜２アミノ酸残基でありうる。
【００７０】
前記参考文献に記載の分子ならびに後記のそれらの変異体および誘導体は「ＩＬ−１インヒビター」と総称される。
【００７１】
インターロイキン１受容体アンタゴニスト
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン１の天然インヒビターとして作用する、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを含む（これらに限定されるものではない）ＩＬ−１ファミリーのメンバーであるヒトタンパク質である。ある受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａならびにその変異体および誘導体を含む）ならびにその製造および使用方法が、米国特許第５，０７５，２２２号、ＷＯ  ９１／０８２８５、ＷＯ  ９１／１７１８４、ＡＵ  ９１７３６３６、ＷＯ  ９２／１６２２１、ＷＯ  ９３／２１９４６、ＷＯ  ９４／０６４５７、ＷＯ  ９４／２１２７５、ＦＲ  ２７０６７７２、ＷＯ  ９４／２１２３５、ＤＥ  ４２１９６２６、ＷＯ  ９４／２０５１７、ＷＯ  ９６／２２７９３、ＷＯ  ９７／２８８２８およびＷＯ  ９９／３６５４１（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００７２】
特に、米国特許第５，０７５，２２２号は、いくつかの形態のＩＬ−１ｒａを記載している。それらのうちの１つであるＩＬ−１ｒａα（該’２２２特許においては「ＩＬ−１ｉ」と称されている）は、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．６）中の約５２ｍＭ  ＮａＣｌにおいてＭｏｎｏ  Ｑ  ＦＰＬＣカラムから溶出する、約４．８の等電点を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２２〜２３ｋＤの分子として特徴づけられる。もう１つのＩＬ−１ｒａβは、４８ｍＭ  ＮａＣｌにおいてＭｏｎｏ  Ｑカラムから溶出する２２〜２３ｋＤのタンパク質として特徴づけられる。ＩＬ−１ｒａαおよびＩＬ−１ｒａβの両方はグリコシル化されている。第３のＩＬ−１ｒａｘは、４８ｍＭ  ＮａＣｌにおいてＭｏｎｏ  Ｑカラムから溶出する２０ｋＤのタンパク質として特徴づけられ、非グリコシル化体である。該５，０７５，２２２特許はまた、該インヒビターのコード化をもたらす遺伝子を単離し、適当なベクターおよび細胞型内に遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現させて該インヒビターを製造するための或る方法を開示している。該タンパク質は、グリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１受容体アンタゴニストを含む。ある実施形態においては、グリコシル化ＩＬ−１受容体アンタゴニストは、ヒト細胞、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞内で発現されうる。本発明の目的においては、ＩＬ−１ｒａならびにその変異体および誘導体（後記のもの）は「ＩＬ−１ｒａタンパク質」と総称される。
【００７３】
ＴＮＦ−αインヒビター
ＴＮＦ−αインヒビターは、ＴＮＦ産生のダウンレギュレーションまたは抑制、遊離ＴＮＦへの結合、ＴＮＦのその受容体への結合の妨害、またはＴＮＦ受容体への結合後のＴＮＦシグナリングのモジュレーションの妨害により作用しうる。したがって、「ＴＮＦ−αインヒビター」なる語は、可溶化ＴＮＦ受容体、ＴＮＦに対する抗体、ＴＮＦ受容体に対する抗体、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のインヒビター、およびＴＮＦ活性を損なう他の分子を含む。本発明の範囲内の良く知られたＴＮＦ−αインヒビターには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
・ＴＮＦ−α中和抗体、例えば、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））およびＤ２Ｅ７、
・抗体フラグメント、例えば、ＣＤＰ  ８７０、
・ＴＮＦ−α受容体アンタゴニストＡｂｓ、
・可溶性ＴＮＦ−ＲＩ分子、例えば、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、
・可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ分子、例えば、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、
・ＴＮＦ−α産生インヒビター、および
・小分子インヒビター、例えば、Ｐ３８インヒビター。
【００７４】
種々の種類のＴＮＦ−αインヒビターが、当技術分野において以下の参考文献などに開示されている：
欧州特許出願ＥＰ  ３０８  ３７８、ＥＰ  ４２２  ３３９、ＧＢ  ２  ２１８  １０１、ＥＰ  ３９３  ４３８、ＷＯ  ９０／１３５７５、ＥＰ  ３９８  ３２７、ＥＰ  ４１２  ４８６、ＷＯ  ９１／０３５５３、ＥＰ  ４１８  ０１４、４１７  ５６３、ＪＰ  １２７，８００／１９９１、ＥＰ  ４３３  ９００、米国特許第５，１３６，０２１号、ＧＢ  ２  ２４６  ５６９、ＥＰ  ４６４  ５３３、ＷＯ  ９２／０１００２、ＷＯ  ９２／１３０９５、ＷＯ  ９２／１６２２１、ＥＰ  ５１２  ５２８、ＥＰ  ５２６  ９０５、ＷＯ  ９３／０７８６３、ＥＰ  ５６８  ９２８、ＥＰ  ６０７  ７７６（ＴＮＦ−αの抑制のためのレフルノミドの使用）、６６３  ２１０、５４２  ７９５、８１８  ４３９、６６４  １２８、５４２  ７９５、７４１  ７０７、８７４  ８１９、８８２  ７１４、８８０  ９７０、６４８  ７８３、７３１  ７９１、８９５  ９８８、５５０  ３７６、  ８８２  ７１４、８５３  ０８３、５５０  ３７６、９４３  ６１６、９３９  １２１、６１４  ９８４、８５３  ０８３、
米国特許第５，１３６，０２１号、第５，９２９，１１７号、第５，９４８，６３８号、第５，８０７，８６２号、第５，６９５，９５３号、第５，８３４，４３５号、第５，８１７，８２２号、第５８３０７４２号、第５，８３４，４３５号、第５，８５１，５５６号、第５，８５３，９７７号、第５，３５９，０３７号、第５，５１２，５４４号、第５，６９５，９５３号、第５，８１１，２６１号、第５，６３３，１４５号、第５，８６３，９２６号、第５，８６６，６１６号、第５，６４１，６７３号、第５，８６９，６７７号、第５，８６９，５１１号、第５，８７２，１４６号、第５，８５４，００３号、第５，８５６，１６１号、第５，８７７，２２２号、第５，８７７，２００号、第５，８７７，１５１号、第５，８８６，０１０号、第５，８６９，６６０号、第５，８５９，２０７号、第５，８９１，８８３号、第５，８７７，１８０号、第５，９５５，４８０号、第５，９５５，４７６号、第５，９５５，４３５号、第５，９９４，３５１号、第５，９９０，１１９号、第５，９５２，３２０号、第５，９６２，４８１号、
国際（ＷＯ）特許出願９０／１３５７５、９１／０３５５３、９２／０１００２、９２／１３０９５、９２／１６２２１、９３／０７８６３、ＷＯ  ９３／２１９４６、ＷＯ  ９３／１９７７７、ＥＰ  ４１７  ５６３、ＷＯ  ９５／３４３２６、ＷＯ  ９６／２８５４６、９８／２７２９８、９８／３０５４１、９６／３８１５０、９６／３８１５０、９７／１８２０７、９７／１５５６１、９７／１２９０２、９６／２５８６１、９６／１２７３５、９６  １１２０９、９８／３９３２６、９８／３９３１６、９８／３８８５９、９８／３９３１５、９８／４２６５９、９８／３９３２９、９８／４３９５９、９８／４５２６８、９８／４７８６３、９６／３３１７２、９６／２０９２６、９７／３７９７４、９７／３７９７３、９７／４７５９９、９６／３５７１１、９８／５１６６５、９８／４３９４６、９５／０４０４５、９８／５６３７７、９７／１２２４４、９９／００３６４、９９／００３６３、９８／５７９３６、９９／０１４４９、９９／０１１３９、９８／５６７８８、９８／５６７５６、９８／５３８４２、９８／５２９４８、９８／５２９３７、９９／０２５１０、９７／４３２５０、９９／０６４１０、９９／０６０４２、９９／０９０２２、９９／０８６８８、９９／０７６７９、９９／０９９６５、９９／０７７０４、９９／０６０４１、９９／３７８１８、９９／３７６２５、９７／１１６６８、９９／５０２３８、９９／４７６７２、９９／４８４９１、
日本国（ＪＰ）特許出願１０１４７５３１、１０２３１２８５、１０２５９１４０および１０１３０１４９、１０１３０１４９、１０３１６５７０、１１００１４８１および１２７，８００／１９９１、
ドイツ国（ＤＥ）特許出願１９７３１５２１、
英国（ＧＢ）特許出願２  ２１８  １０１、２  ３２６  ８８１、２  ２４６  ５６９およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４。
【００７５】
本発明の目的においては、これらの参考文献に開示されている分子およびｓＴＮＦＲおよびｓＴＮＦＲの変異体および誘導体および後記参考文献に開示されている分子は、「ＴＮＦ−αインヒビター」と総称される。
【００７６】
例えば、ＥＰ  ３９３  ４３８およびＥＰ  ４２２  ３３９は、「ｓＴＮＦＲ」と総称される可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ−Ｉまたは３０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターとしても公知である）および可溶性ＴＮＦ受容体ＩＩ型（ｓＴＮＦ−ＩＩまたは４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターとしても公知である）ならびにそれらの修飾形態（例えば、断片、機能的誘導体および変異体）のアミノ酸および核酸配列を教示している。ＥＰ  ３９３  ４３８およびＥＰ  ４２２  ３３９はまた、該インヒビターのコード化をもたらす遺伝子を単離し、適当なベクターおよび細胞型内に遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現させて該インヒビターを製造するための方法を開示している。
【００７７】
ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ラットＴ細胞抗原ＭＲＣ  ＯＸ４０、ｆａｓ抗原ならびにＣＤ２７およびＣＤ３０抗原を含む、受容体の神経成長因子／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｓｍｉｔｈら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３）。細胞表面受容体のこのグループにおいて最も保存された特徴は、システインに富む細胞外リガンド結合ドメインであり、これは、約４０アミノ酸の４つの反復モチーフに分類されることが可能であり、良く保存された位置に４〜６個のシステイン残基を含有する（Ｓｍｉｔｈら（１９９０），前掲）。
【００７８】
ＥＰ  ３９３  ４３８は、４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターΔ５１および４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターΔ５３を教示しており、これらは、成熟タンパク質のカルボキシル末端のそれぞれ５１個または５３個のアミノ酸残基が除去された、完全長組換え４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビタータンパク質のトランケート化（短小化）形態である。
【００７９】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４は、第４ドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ｔｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）、第３ドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）の一部、そして場合によっては第１ドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）の一部を含有しないトランケート化形態のｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩを教示している。本発明の該トランケート化ｓＴＮＦＲには、式Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２およびＲ４−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ５で表されるタンパク質が含まれる。これらのタンパク質は、それぞれｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩのトランケート化形態である。
【００８０】
「Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２」は、［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］がＴＮＦＲ−Ｉの残基１９〜１０３（比較が容易となるよう、そのアミノ酸残基番号付けは図１に示されている）を表す１以上のタンパク質を意味し、ここで、Ｒ１は、Ｃｙｓ１９の又はＣｙｓ１８〜Ａｓｐ１のいずれかから選ばれるアミノ末端アミノ酸残基のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し、Ｒ２は、Ｃｙｓ１０３の又はＰｈｅ１０４〜Ｌｅｕ１１０のいずれかから選ばれるカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を表す。
【００８１】
本発明の典型的なトランケート化ｓＴＮＦＲ−Ｉには以下の分子（２．６Ｄ  ｓＴＮＦＲ−Ｉと総称される）が含まれる：ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０５とも称される）、ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０６とも称される）、ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ａｓｎ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｎ１０５とも称される）、ＮＨ２−［Ｔｙｒ９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ８とも称される）、ＮＨ２−［Ｃｙｓ１９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１８とも称される）、およびＮＨ２−［Ｓｅｒ１６−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１５とも称される）（メチオニル化体または非メチオニル化体でありうる）、ならびにそれらの変異体および誘導体。
【００８２】
「Ｒ３−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ４」は、［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］がｓＴＮＦＲ−ＩＩの残基Ｃｙｓ３２〜Ｃｙｓ１１５（比較が容易となるよう、そのアミノ酸残基番号付けは図２に示されている）表す１以上のタンパク質を意味し、ここで、Ｒ３は、Ｃｙｓ３２の又はＣｙｓ３１〜Ｌｅｕ１のいずれかから選ばれるアミノ末端アミノ酸残基のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し、Ｒ４は、Ｃｙｓ１１５の又はＡｌａ１１６〜Ａｒｇ１２２のいずれかから選ばれるカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を表す。
【００８３】
タンパク質の変異体
変異体は、参照ポリペプチドに対して少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し該参照ポリペプチドの関連活性の何らかのレベル（減少したレベルを含む）を維持するポリペプチドを意味する。本明細書に記載の相同性（％）は、Ｄａｙｈｏｆｆ  （１９７２），Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、アライメントを補助するために１００アミノ酸長中に４個のギャップが導入されうる場合の、比較されている配列中の同一アミノ酸残基とアライメント（整列）する２つの配列の小さい方に見出されるアミノ酸残基の割合（％）として計算される。「実質的に相同」なる語には、親分子アミノ酸配列に対する抗体との交差反応性により単離されうる親分子の変異体が含まれ、その遺伝子は、高度にストリンジェントな又は中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、親分子またはそのセグメントのＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより単離されうる。
【００８４】
当業者は、アミノ酸が欠失した（「欠失変異体」）、挿入された（「付加変異体」）および／または置換された（「置換変異体」）、ＩＬ−１インヒビターまたはＥＰＯ受容体アゴニストに基づく多数の変異体を製造しうると理解するであろう。しかし、そのような変異体は、未修飾または「親」分子の或る関連活性を何らかのレベル（減少したレベルを含む）で維持するはずであり、したがって、ＩＬ−１インヒビターまたはＥＰＯ受容体アゴニストとして使用することができる。
【００８５】
変異体は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１００，４６８−５００（１９８３）；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｗｅｌｌｓら  Ｇｅｎｅ  ３４，３１５−３２３（１９８５））（これらに限定されるものではない）のような当業者に利用可能な種々の突然変異誘発技術により製造することができる。変異体は、それらの物理的特性を評価するために迅速にスクリーニングすることができる。そのような変異体は、対応親分子と必ずしも同じ特性の全てではなく必ずしも同じ度合というわけではないが、該未修飾分子と同様の特性を示すことが明らかであろう。
【００８６】
アミノ酸配列変異体の構築においては、典型的には２つの主要変数（すなわち、該突然変異部位の位置および該突然変異の性質）が存在する。変異体の設計においては、各突然変異部位の位置および各突然変異の性質は、修飾される生化学的特性に左右されうる。ある実施形態においては、各突然変異部位は、例えば、（１）標的アミノ酸残基を欠失させることにより、（２）位置する部位の隣に１以上のアミノ酸残基を挿入することにより、または（３）まず、同類アミノ酸選択物で置換し、ついで、達成された結果に応じて、より根本的な選択物で置換することにより、個々に又は順次修飾することができる。
【００８７】
ある実施形態においては、アミノ酸配列の欠失は、約１〜３０個のアミノ酸残基、約１〜２０個のアミノ酸残基、約１〜１０個のアミノ酸残基、または約１〜５個の連続したアミノ酸残基に及ぶものである。欠失には、アミノ末端、カルボキシ末端および内部配列内が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＩＬ−１ｒａの場合、ある実施形態においては、欠失は、ＩＬ−１ファミリー（これはＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａを含む）における低い相同性の領域内に施されうる。該ファミリーの他のメンバーに対して相当な相同性を有する領域における欠失は、典型的には、該生物活性を有意に修飾する可能性が高いであろう。
【００８８】
ある実施形態においては、アミノ酸配列の付加には、１残基〜１００残基以上の長さに及ぶアミノおよび／またはカルボキシ末端融合体の挿入、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の内部配列内挿入が含まれる。ある実施形態においては、内部付加は、約１〜２０アミノ酸残基、約１〜１０アミノ酸残基、約１〜５アミノ酸残基、または約１〜３アミノ酸残基に及ぶものでありうる。
【００８９】
アミノ末端の付加は、メチオニンの付加（例えば、細菌組換え細胞培養内での直接発現の人工産物）（これに限定されるものではない）を包含する意である。アミノ末端付加のもう１つの例には、組換え宿主細胞からの成熟分子の分泌を促進するためにシグナル配列が成熟分子のアミノ末端に融合されたもの（これらに限定されるものではない）が含まれる。そのようなシグナル配列は、典型的には、意図される宿主細胞種から得られ、したがって該宿主細胞種と相同であろう。該成熟分子の天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞の場合、該シグナル配列は、ある実施形態において選ばれる原核性シグナル配列により置換されうる。ある実施形態においては、該天然シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー配列により置換されうる。酵母細胞内での発現の場合、ある実施形態においては、該シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子または酸性ホスファターゼリーダー配列から選ばれうる。哺乳類細胞での発現の場合、ある実施形態においては、該天然シグナル配列で十分であるが、他の哺乳類シグナル配列も適当でありうる。
【００９０】
ある実施形態においては、アミノまたはカルボキシ末端の付加体には、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全部または一部とのＩＬ−１インヒビター親分子またはＥＰＯ受容体アゴニスト親分子のアミノ末端またはカルボキシ末端の融合を含むキメラタンパク質（個々に又は一まとめに「Ｆｃ変異体」と称される）が含まれうる。ある実施形態においては、各キメラタンパク質の免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３）、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥのようなヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域の第１ドメイン以外の該ドメインの全部を含む。例えば、ある実施形態においては、ＩＬ−１インヒビターは、ＩＬ−１ｒａとＦｃドメイン（特にヒトＩｇＧ１のもの）とを含むキメラタンパク質である。例えば、ＷＯ  ９７／２８８２８（これを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。当業者は、ある実施形態においては、該親分子がその関連活性の何らかのレベルを維持し該免疫グロブリン部分がその特徴的特性の１以上を示す限り、該免疫グロブリン部分の任意のアミノ酸が欠失されたり又は１以上のアミノ酸で置換されることが可能であり、あるいは１以上のアミノ酸が付加されることが可能であると理解するであろう。
【００９１】
もう１つの変異体群はアミノ酸置換変異体である。これらは、親分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されその位置に異なる残基が挿入された変異体である。置換変異体には、アミノ酸の変化を引き起こしうる又は引き起こしえない種集団における天然に生じるヌクレオチド配列変化により特徴づけられる対立遺伝子変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、可能な変異部位の選択において、ポリペプチドの結合または活性部位に関する公知の任意の情報を利用することが可能である。
【００９２】
ある実施形態においては、タンパク質の突然変異誘発のためのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５）（これを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、「アラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と称される。この方法では、標的残基のアミノ酸残基または基を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕのような荷電残基）、それを中性の又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）により置換して、該アミノ酸と細胞内外における周囲の水性環境との相互作用に影響を与える。ついで、該置換に対して機能的感受性を示すドメイン／残基を、追加的または代替的な残基を置換部位に導入することにより改良する。このようにして、アミノ酸配列修飾を導入するための部位を予め決定する。与えられた部位における突然変異の性能を最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行うことが可能であり、該変異体を、ある実施形態において所望の活性と活性の程度との最適な組合せに関してスクリーニングすることができる。
【００９３】
置換突然変異誘発において最も関心のある部位には、側鎖の嵩高さ、電荷および／または疎水性の点で親分子中の特定のアミノ酸残基が他の種または他のファミリーメンバーとは実質的に異なっている部位が含まれる。関心のある他の部位には、親分子の特定の残基が他の種または他のファミリーメンバー間で同一であるものが含まれる。なぜなら、そのような位置は、典型的には、タンパク質の生物活性に重要だからである。
【００９４】
ある実施形態においては、まず、部位を比較的に保存的な様態で置換しうると当業者は理解するであろう。保存的アミノ酸変化は、１つのアミノ酸を、構造および／または機能において類似した別のアミノ酸（例えば、サイズ、電化および形状において類似した側鎖を有するアミノ酸）で置換することを含みうる。そのような保存置換の具体例には、表１の「好ましい置換」の項目に示すものが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような置換が生物活性における実質的な変化を引き起こさない場合には、より実質的な変化（典型的な置換）を導入することが可能であり、および／または、他の付加／欠失を施すことが可能であり、得られた産物をスクリーニングすることが可能である。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
そのような変化を施す際には、ある実施形態においては、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮されうる。タンパク質に対する相互作用性生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において概ね理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１）（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）。あるアミノ酸は、類似したヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されることが可能であり、類似した生物活性を尚も保有しうることが公知である。
【００９７】
また、類似したアミノ酸の置換は、親水性に基づいても有効に行いうることが、当技術分野において理解されており、それにより生成した機能的に等価なタンパク質またはペプチドを免疫学的実施形態で使用することを意図する場合には特に、そのような置換が有効に行われうる。タンパク質の最大局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性により支配される場合には、その免疫原性および抗原性、すなわち、該タンパク質の生物学的特性と相関することが、米国特許４，５５４，１０１８（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００９８】
これに対して、ある実施形態においては、親分子の機能的および／または化学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせんコンホメーションとしての構造）、（ｂ）標的部位における該タンパク質の相対電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対するその効果の点で有意に異なる置換を選択することにより達成することができる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づき、以下のグループに分類されうる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
６）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。
【００９９】
非保存的置換は、これらのグループの１つのメンバーを別のものと交換することを含みうる。
【０１００】
ポリペプチド誘導体
ある実施形態においては、本発明はまた、ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦ−αインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストの親分子の化学修飾誘導体、ならびにその用途を含み、ここで、該タンパク質は、特性を修飾するために非タンパク質性部分（例えば、重合体）に結合している。これらの化学的に修飾された親分子は、本発明では「誘導体」と称される。そのような誘導体は、本明細書の開示に基づき当業者により製造されうる。ある実施形態においては、グリコシル化、非グリコシル化または脱グリコシル化親分子および適当な化学的部分を使用して、コンジュゲートを製造することができる。ある実施形態においては、非グリコシル化親分子および水溶性重合体を使用する。ある実施形態においては、本発明に含まれる誘導体は、翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸バックボーンへの化学的部分の結合、およびＮ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖の化学的修飾が含まれる。ある実施形態においては、該ポリペプチドはまた、該タンパク質の検出および単離を可能にするための酵素標識、蛍光標識、同位体標識またはアフィニティー標識のような検出可能な標識により修飾することができる。そのようなポリペプチド誘導体は、親分子の相対活性を何らかのレベル（減少したレベルを含む）で維持するはずであり、したがって、ＩＬ−１インヒビターまたはＥＰＯ受容体アゴニストとして使用することができる。
【０１０１】
ある実施形態においては、水溶性重合体が望ましい。なぜなら、それぞれが結合しているタンパク質は、典型的には、水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないからである。ある実施形態においては、該重合体は、治療用産物または組成物の製造のために医薬上許容されるものである。当業者は、該重合体／タンパク質コンジュゲートを治療用に使用するか否かの考慮、また、そうであれば該タンパク質の治療プロフィール（例えば、徐放性の持続時間、タンパク質分解に対する抵抗性、投与量に対する有りうる影響、生物活性、取り扱い易さ、抗原性の度合または欠如、および治療用タンパク質に対する水溶性重合体の他の公知効果）（これらに限定されるものではない）のような考慮事項に基づき、所望の重合体を選択することが可能であろう。
【０１０２】
適当な臨床的に許容される水溶性重合体には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ（β−アミノ酸）アミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）または他の炭水化物重合体、フィコールまたはデキストラン、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の形態（例えば、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含する意である。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造上有利でありうる。
【０１０３】
該水溶性重合体はそれぞれ、任意の分子量のものであってもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。典型的には、該分子量が大きくなればなるほど、あるいは分枝が多くなればなるほど、該重合体：タンパク質比は大きくなる。該水溶性重合体はそれぞれ、典型的には、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」なる語は、水溶性重合体の調製物中、いくつかの分子は、示されている分子量より大きく、いくつかの分子は該分子量より小さいことを示す）。ある実施形態においては、各水溶性重合体の平均分子量は、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、または約１５ｋＤａ〜約３０ｋＤａである。
【０１０４】
ある実施形態においては、該タンパク質にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合している。なぜなら、ＰＥＧは、典型的には、哺乳動物において非常に低い毒性を有するからである［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８，３５−４０（１９７１）］。アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加体は、重篤な複合型免疫不全症候群の治療のためのヒトにおける使用に関して米国において承認されている。ＰＥＧのコンジュゲート化によりもたらされうる第２の利点は、異種タンパク質の免疫原性および抗原性を有効に減少させることである。例えば、ある実施形態においては、ヒトタンパク質のＰＥＧ付加体は、激しい免疫応答を誘導するリスクを伴なうことなく、他の哺乳動物種における疾患の治療に有用でありうる。
【０１０５】
ある実施形態においては、ＰＥＧのような重合体を、タンパク質中の１以上の反応性アミノ酸残基、例えば、アミノ末端アミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖のεアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパルチルおよびグルタミル側鎖のカルボキシル基、カルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロシン側鎖へ、または或るアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基に結合したグリコシル鎖の活性化誘導体へ簡便に結合させることが可能である。タンパク質との直接反応に適したＰＥＧの多数の活性化形態が記載されている。ある実施形態においては、タンパク質アミノ基との反応のためのＰＥＧ試薬には、カルボン酸の活性エステルまたはカルボナート誘導体、特に、脱離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホナートであるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。マレイミドまたはハロアセチル基を含有するＰＥＧ誘導体は、タンパク質の遊離スルフヒドリル基の修飾のための有用な試薬である。同様に、アミノ、ヒドラジンまたはヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬は、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化により生成するアルデヒドとの反応に有用である。
【０１０６】
反応性水溶性分子とのアシル化反応またはアルキル化反応を含む多数の結合方法が当業者に利用可能である。ある実施形態においては、そのような反応は、アミノ末端化学修飾タンパク質を与える。例えば、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４；Ｍａｌｉｋら（１９９２），Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：１０２８−１０３５；Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２），Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｃｏｕｒｔ，Ｆｒｉｅｒｎ  Ｂａｒｎｅｔ  Ｌａｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎ２０  ＯＬＤ，ＵＫ発行）；ＥＰ  ０  １５４  ３１６；ＥＰ  ０  ４０１  ３８４；ＷＯ  ９２／１６２２１；ＷＯ  ９５／３４３２６；ＷＯ  ９５／１３３１２；ＷＯ  ９６／１１９５３；ＷＯ  ９６／１９４５９およびＷＯ９６／１９４５９およびペジル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）に関する本明細書に引用されている他の刊行物（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０１０７】
ある実施形態においては、ペジル化はまた、特に、少なくとも１つの反応性ヒドロキシ基（例えば、ポリエチレングリコール）を有する水溶性重合体を使用して行うことができる。ある実施形態においては、該水溶性重合体を活性化基と反応させ、それにより、種々のタンパク質の修飾に有用な「活性化リンカー」を形成させることができる。該活性化リンカーは、単官能性、二官能性または多官能性でありうる。
【０１０８】
該水溶性重合体を２以上のタンパク質に連結するために使用しうる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジジリン、オキシランおよび５−ピピリジルが含まれるが、これらに限定されるものではない。該方法において使用しうる反応性スルホン基を有する有用な試薬には、クロロスルホン、ビニルスルホンおよびジビニルスルホンが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのＰＥＧ誘導体は、典型的には、約１１以下のｐＨの水性環境中で長期間にわたり加水分解に対して安定であり、同様に加水分解に安定なコンジュゲートを形成するよう分子との連結を形成しうる。有用なホモ二官能性誘導体には、ＰＥＧ−ビス−クロロスルホンおよびＰＥＧ−ビス−ビニルスルホンが含まれるが、これらに限定されるものではない（ＷＯ  ９５／１３３１２を参照されたい）。
【０１０９】
ＷＯ  ９７／０４００３（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）は、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を得、該ヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換して活性化リンカーを形成させることによる（該変換のための溶媒としてはテトラヒドロフランを使用する）、スルホン活性化リンカーの製造方法を教示している。該出願はまた、サイズおよび末端基官能性に基づき該リンカーを分離するために疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する、該活性化リンカーの精製方法を教示している。
【０１１０】
例えば、分子の化学修飾誘導体は、安定性の増加、循環時間の増加または免疫原性の減少のような利点をもたらしうる（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど（これらに限定されるものではない）のような水溶性重合体から選ばれうる。ある実施形態においては、該ポリペプチドは、該分子内のランダムな位置または該分子内の所定の位置において修飾されることが可能であり、１個、２個、３個またはそれ以上の結合した化学的部分を含みうる。
【０１１１】
ある実施形態においては、Ｎ末端化学修飾タンパク質が特に望まれうる。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いて説明すると、ある実施形態においては、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、行なうペジル化反応の型、および選択したＮ末端ペジル化タンパク質の入手方法を、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによる）から選択することができる。ある実施形態においては、Ｎ末端ペジル化調製物の入手方法（すなわち、必要に応じて、この部分を他のモノペジル化部分から分離すること）は、ペジル化タンパク質分子の集団からＮ末端ペジル化物質を精製することによるものでありうる。ある実施形態においては、選択的なＮ末端化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なるタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化により達成されうる。適当な反応条件下、カルボニル基含有重合体による、Ｎ末端での該タンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１１２】
多価形態
多価形態の形成のための技術には、光化学的架橋（例えば、紫外線に対する曝露）、化学的架橋（例えば、ポリエチレングリコールのような二官能性リンカー分子によるもの）および突然変異誘発（例えば、付加システイン残基の導入）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
多価形態は、少なくとも１つの親分子および別の部分を任意の臨床的に許容されるリンカー（例えば、水溶性重合体）と化学的にカップリングすることにより構築することができる。原則として、該リンカーは、典型的には、新たな免疫原性を付与すべきではない。また、ある実施形態においては、該リンカーは、典型的には、その新たなアミノ酸残基により該構造体の疎水性および電荷平衡（これは、その生物分布およびクリアランスに影響を及ぼす）を改変するものであるべきではない。該タンパク質二量体のどのような特性が望まれるのかに応じて、種々の化学的架橋剤を使用することができる。例えば、ある実施形態においては、架橋剤は短く且つ比較的強固である、またはより長く且つより柔軟であることが可能であり、あるいは生物学的に可逆的であることが可能であり、減弱した免疫原性またはより長い薬物動態学的半減期を与えることが可能である。
【０１１４】
ある実施形態においては、分子は、２工程の合成によりアミノ末端を介して連結される。第１工程においては、１つの分子をアミノ末端において化学的に修飾して、保護されたチオールを導入し、それを、精製後、脱保護し、第２分子との種々の架橋剤を介した部位特異的コンジュゲート化のための結合点として使用する。アミノ末端架橋には、ジスルフィド結合、短鎖二官能性脂肪族架橋剤を使用するチオエーテル連結、および種々の長さの二官能性ポリエチレングリコール架橋剤に対するチオエーテル連結（ＰＥＧ「ダンベル（ｄｕｍｂｂｅｌｌ）」）が含まれるが、これらに限定されるものではない。「モノベル（ｍｏｎｏｂｅｌｌ）」と称されるそのような合成の副生成物も、二量体のＰＥＧダンベル合成に含まれる。モノベルには、遊離重合体末端を有する直鎖状二官能性ＰＥＧにカップリングされた単量体が含まれるが、これに限定されるものではない。あるいは、ある実施形態においては、ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ）、ｐ−ベンゾキノン（ｐＢＱ）またはビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）のような試薬および当技術分野で公知の他の試薬を含む種々のアミン特異的ホモ二官能性架橋技術により、分子を直接的に架橋することができる。ある実施形態においては、種々の二官能性チオール特異的架橋剤（例えば、ＰＥＧビスマレイミド）の存在下、イミノチオランのような試薬で分子を直接的にチオール化し、１工程法で二量体化および／またはダンベル化を達成することも可能である。
【０１１５】
ある実施形態においては、この多価形態用の水溶性重合体は、本明細書に記載のホモ重合体に基づけば、ランダムまたはブロック共重合体、ターポリマー（直鎖状または分枝状、置換または非置換のもの）でありうる。該重合体は、任意の長さ又は分子量のものでありうるが、これらの特性は生物学的特性に影響を及ぼしうる。医薬用途におけるクリアランス率を減少させるのに特に有用な重合体平均分子量は、典型的には、２，０００〜３５，０００ダルトンの範囲内である。また、ある実施形態においては、該重合体の長さは、所望の生物活性を最適化または付与するように様々に変更されうる。
【０１１６】
ある実施形態においては、二価分子は、ポリペプチドリンカー領域により隔てられた親分子の２つの縦列反復配列を含みうる。該ポリペプチドリンカーの設計は、タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ設計におけるドメイン間の短いループ配列の挿入（Ｍｕｔｔｅｒ（１９８８），ＴＩＢＳ，１３：２６０−２６５ならびにＲｅｇａｎおよびＤｅＧｒａｄｏ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：９７６−９７８（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））と、設計の点で同様でありうる。いくつかの異なるリンカー構築物が構築されており、一本鎖抗体の形成に有用であることが示されている。最も機能的なリンカーは、典型的には、一緒になって親水性配列を構成する１２〜２５アミノ酸（無反応性側鎖基を有するアミノ酸、例えば、アラニン、セリンおよびグリシン）の様々なサイズを有し、可溶性を増強するよう少数の逆に荷電した残基を有し、柔軟である（ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ  （１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５；およびＢｒｉｇｉｄｏら  （１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：４６９−４７９（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））。一本鎖抗体に適したリンカーは、ヒトｓＴＮＦＲ−ＩＩの二量体形態の製造に有効であることが示されている（Ｎｅｖｅら  （１９９６），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，８（５）：３６５−３７０（その開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））。
【０１１７】
また、ある実施形態においては、多価形態は、置換変異体を使用して形成させることができる。ある実施形態においては、鎖間ジスルフィド結合形成のための不対システイン残基を生成させるための部位特異的突然変異誘発により、二量体または多量体を形成させるために、親分子を修飾することができる。
【０１１８】
また、ある実施形態においては、親分子をビオチンに化学的にカップリング（共役）させることが可能であり、ついで、得られたコンジュゲートをアビジンに結合させて四価アビジン／ビオチン／親分子を得ることが可能である。また、ある実施形態においては、親分子をジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有的にカップリングさせて、得られたコンジュゲートを抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈降させて十量体コンジュゲートを形成させることができる。
【０１１９】
ある実施形態においては、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全部または一部に（だだし、少なくとも１つの定常ドメインに）アミノ末端またはカルボキシ末端で融合した親分子配列を各組換えキメラ分子が有する組換え融合タンパク質が産生されうる。ある実施形態においては、重鎖キメラ遺伝子の又は軽鎖含有遺伝子および重鎖キメラ遺伝子の転写および翻訳の後、該遺伝子産物は、二価で提示される親分子を有する一本鎖キメラ分子に合体されうる。そのようなキメラ分子の構築に関する更なる詳細は、例えば、米国特許第５，１１６，９６４号、ＷＯ  ８９／０９６２２、ＷＯ  ９１／１６４３７、ＷＯ  ９７／２３６１４およびＥＰ  ３１５０６２（それらの開示を任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
【０１２０】
医薬組成物
特に示さない限り、本明細書における医薬組成物に関するすべての記載は、ＩＬ−１インヒビター、ＥＰＯ受容体アゴニスト、ＴＮＦ−αインヒビター、またはＥＰＯ受容体アゴニストおよびＩＬ−１インヒビターおよび／またはＴＮＦ−αインヒビターの組合せを含む組成物に関するものである。
【０１２１】
ある実施形態においては、本発明は、医薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または佐剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態においては、それらの治療用分子を一緒に製剤化したり、一緒にキットにパッケージ化することができる。ある実施形態においては、該組成物は、液体または凍結乾燥形態であることが可能であり、種々のｐＨ値およびイオン強度を有する希釈剤（Ｔｒｉｓ、酢酸塩またはリン酸バッファー）、可溶化剤（例えば、ＴｗｅｅｎまたはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、担体（例えば、ヒト血清アルブミンまたはゼラチン）、保存剤（例えば、チメロサールまたはベンジルアルコール）および抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウム）を含む。また、ある実施形態には、可溶性または安定性を増加させるために水溶性重合体で修飾された治療用分子のいずれかを含む組成物が含まれる。ある実施形態においては、組成物はまた、長期にわたる制御運搬のためのリポソーム、マイクロエマルション、ミセルまたは小胞内への該治療用分子のいずれかの取り込みを伴いうる。
【０１２２】
特に、ある実施形態においては、本明細書に記載の組成物は、ヒドロゲル、ポリエチレン、エチレン−ビニルアセタート共重合体または生分解性重合体のような重合体マトリックス内への取り込みを伴いうる。ヒドロゲルの具体例には、ポリヒドロキシアルキルメタクリラート（ｐ−ＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよび種々の高分子電解質複合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。生分解性重合体の具体例には、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとの共重合体、ポリアミド、およびポリアミドとポリエステルとの共重合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の制御放出製剤には、マイクロカプセル、ミクロスフェア、巨大分子複合体および重合性ビーズ（注射により投与されうるもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
個々の組成物の選択は、治療する状態、投与経路および所望の薬物動態学的パラメーターを含む（これらに限定されるものではない）多数の要因に左右される。医薬組成物に適した更に詳細な成分の概説が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）（それを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に見出される。
【０１２４】
ある実施形態においては、該治療用分子の有効量は、例えば、治療目的、投与経路および患者の状態に左右される。したがって、ある実施形態においては、治療者は該用量を力価測定し、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与経路を改変することが可能である。典型的な１日量は、前記の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でありうる。ある実施形態においては、臨床家は、所望のヘマトクリットの増加または血液障害の臨床的改善が得られる投与量に達するまで、該組成物を投与することが可能である。
【０１２５】
ある実施形態においては、該組成物は、該治療用分子の１以上の１回量として又は２以上の用量として投与することができる。これらの用量は、該治療用分子の同じ又は異なる量よりなるものであることが可能であり、同じ又は異なる投与経路により、同じ又は異なる時点で投与することができる。ある実施形態においては、該組成物は、該治療用分子のいずれか１つ又はいずれかの組合せを含む組成物として投与することができる。ある実施形態においては、該組合せは、同じ又は異なる量の該治療用分子を含みうる。ある実施形態においては、該組成物は、移植装置またはカテーテルを介した連続的注入として投与することができる。該連続的注入が２以上の治療用分子を含有する或る実施形態においては、それは、同じ又は異なる濃度の該治療用分子を含有しうる。
【０１２６】
更なる研究が行われるにつれて、種々の患者における種々の状態の治療のための適当な投与量レベルに関する情報が得られるであろう。当業者は、治療状況、治療中の障害のタイプ、被投与体の年齢および全身健康状態を考慮して、適当な投与量を確認することが可能であろう。
【０１２７】
インビボ投与に使用する組成物は、典型的には無菌性である。ある実施形態においては、これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成することができる。該組成物を凍結乾燥する場合には、これらの方法を用いる滅菌を、凍結乾燥および再構成（還元）の前または後に行うことができる。ある実施形態においては、非経口投与用の組成物を凍結乾燥形態または溶液として保存することができる。
【０１２８】
ある実施形態においては、無菌連絡口を有する容器、例えば静脈内用液バッグ、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアル内に配置する。
【０１２９】
該組成物の投与経路は、公知方法、例えば、経口的、経鼻、肺内、直腸内投与、または皮下、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病変内経路による注射もしくは注入、または徐放系もしくは移植装置（所望によりカテーテルの使用を伴いうる）など（これらに限定されるものではない）によるものである。ある実施形態においては、該組成物は、連続的に、注入により、ボーラス注射により、または移植装置により投与することができる。
【０１３０】
ある実施形態においては、組成物は、該治療用分子が吸収された膜、スポンジまたは他の適当な物質の、罹患領域内への移植により、局所的に投与することができる。ある実施形態においては、移植装置を使用する場合には、該装置は、任意の適当な組織または器官内に移植することが可能であり、該組成物の運搬は、連続的注入を用いるカテーテルによる又は連続的投与による又はボーラスによる該装置を介した直接的なものでありうる。
【０１３１】
ある実施形態においては、徐放性処方または製剤として投与することができる。徐放製剤の適当な具体例には、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性重合体マトリックスが含まれるが、これらに限定されるものではない。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７［１９８１］およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５［１９８２］）、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、徐放組成物には、当技術分野で公知のいくつかの方法（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２［１９８５］；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９）のいずれかにより製造することができるリポソームが含まれうるが、これに限定されるものではない。
【０１３２】
ある実施形態においては、エクスビボ様態で組成物を使用することが望ましいかもしれない。この場合、患者から摘出した細胞、組織または器官を組成物にさらし、ついで該細胞、組織および／または器官を該患者内に再び移植する。
【０１３３】
ある実施形態においては、該ポリペプチド、断片、変異体または誘導体を発現させ分泌させるために当技術分野で公知の方法を用いて遺伝的に操作した或る細胞を患者に移植することにより、組成物を運搬することができる。ある実施形態においては、そのような細胞は動物またはヒト細胞であることが可能であり、患者自身の組織またはヒトもしくは非ヒト性の別の起源に由来するものでありうる。ある実施形態においては、該細胞を不死化することができる。しかし、免疫応答の機会を減少させるために、ある実施形態においては、該細胞をカプセル化（封入）して周辺細胞の浸潤を避けることができる。該カプセル化物質は、典型的には、該タンパク質産物の放出を可能にするが患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による該細胞の破壊を妨げる生体適合性半浸透性重合体封入容器または膜である。
【０１３４】
細胞の膜封入のために使用する方法は当業者によく知られており、封入された細胞の製造および患者へのその移植は、過度な実験を行わなくても達成されうる。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号；第５，０１１，４７２号；および第５，１０６，６２７号を参照されたい。生きた細胞を封入するための系はＰＣＴ  ＷＯ  ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。種々の他の徐放または制御（コントロールド）運搬産物、例えば、リポソーム担体、生分解性粒子またはビーズを製剤化するための技術も当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，６５３，９７５号（Ｂａｅｔｇｅら，ＣｙｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている。ある実施形態においては、該細胞は、封入されたものも封入されていないものも、患者の適当な身体組織または器官に移植することができる。
【０１３５】
タンパク質は、非経口的に投与されると、循環から急速に消失する可能性があり、したがって、比較的短寿命の薬理学的活性を惹起しうる。したがって、生物活性タンパク質の比較的大用量の頻繁な注射を用いて、この投与方法での治療効力を維持することができる。水溶性重合体（例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリン）の共有結合により修飾されたタンパク質は、静脈注射後、対応する未修飾タンパク質より実質的に長い血中半減期を示すことが公知である［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｉｎ：“Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ”，Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇら編，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，３６７−３８３（１９８１），Ｎｅｗｍａｒｋら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９（１９８２）およびＫａｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，１４８７−１４９１（１９７１）（それらを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）］。また、そのような修飾は、水溶液中のタンパク質の溶解性を増加させ、凝集を排除または減少させ、該タンパク質の物理的および化学的安定性を増強し、該タンパク質の免疫原性および抗原性を著しく減少させうる。その結果、ある実施形態においては、そのような重合体−タンパク質付加体を該未修飾タンパク質より低頻度または低用量で投与することによっても、所望のインビボ生物活性が達成されうる。ある実施形態においては、ＩＬ−１インヒビターおよび／またはＴＮＦインヒビターは、単独で又は１以上の追加的な造血因子もしくは他の治療用分子、例えばＥＰＯ（Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標））、新規赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ，Ａｒａｎｅｓｐ（商標））、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））およびその誘導体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、Ｌ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８インヒビター（例えば、ＩＬ−１８抗体）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）インヒビター（例えば、ＩＦＮ−γ抗体）、ＩＧＦ−１またはＬＩＦ（白血病阻害因子）と共に、造血障害の治療において使用することができる。
【０１３６】
ある実施形態においては、ＩＬ−１および／またはＴＮＦインヒビターあるいはそのようなインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストで多数の疾患が治療可能でありうる。これらには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：骨髄線維症、骨髄硬化症、大理石骨病、転移性癌、急性白血病、多発性骨髄症、ホジキン病、リンパ腫、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、レトラー・シーヴェ病、不応性赤芽球性貧血、ディ・ググリエルモ症候群、うっ血性巨脾症、ホジキン病、カラアザール、サルコイドーシス、原発性脾性汎血球減少症、粟粒結核症、散在性真菌症、劇症性敗血症、マラリア、ビタミンＢ１２および葉酸欠乏症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、色素沈着減少障害、例えばまだら症および白斑。
【０１３７】
ある実施形態においては、ＩＬ−１および／またはＴＮＦインヒビターあるいはそのようなインヒビターおよびＥＰＯ受容体アゴニストでの治療は、急性出血後の造血回復の増強にも使用することができる。
【０１３８】
ヘマトクリットレベルを増加させるための治療のための適当な化合物を試験するために、そのような活性を試験する任意のアッセイまたはインビボプロトコールを使用することができる。そのようなアッセイおよびインビボプロトコールの具体例は、国際特許出願ＷＯ  ００／２４８９３（それを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。当業者は、適当なアッセイを熟知しているであろう。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために記載されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１４０】
実施例１
ＩＬ−１ｒａ類似体の投与はヘマトクリットレベルを増加させる
多施設二重盲検用量範囲探索研究において、活性な重篤または非常に重篤な関節リウマチを有する被験者（Ｎ＝４７２）に、プラセボ、３０、７５または１５０ｍｇの組換え非グリコシル化ＩＬ−１ｒａ類似体（「アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）」）の皮下注射を６ヶ月にわたり毎日行った。治療群によるベースラインデモグラフィックおよび病歴に関しては、図１を参照されたい。アナキンラは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で組換え的に製造されたヒトＩＬ−１ｒａの非グリコシル化形態である。
【０１４１】
アナキンラは、懸濁液中の精製アナキンラとして３０、７５または１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で注射した。該懸濁液は、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｗ）  ポリソルベート８０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび滅菌注射用蒸留水を含有していた。プラセボは該懸濁液からなるものであった。アナキンラおよびプラセボ溶液を２０〜８０℃の温度で保存した。すべての溶液のｐＨは６．５であった。
【０１４２】
総容積１ｍｌを毎日注射した。可能な注射部位には、大腿前部、臍の上の腹部、および上腕背部が含まれたが、これらに限定されるものではない。被験者は注射部位を順次変更するよう推奨された。被験者は、該研究液を全２４週にわたり同じ時刻（好ましくは夕刻）に注射するよう指示された。
【０１４３】
ヘマトクリットを、ベースラインにおいて及び該アナキンラ療法の２４週間後に評価した。集められたアナキンラ群と該プラセボ群との間のヘマトクリット（容量％）の、第２４週におけるベースラインからの変化の差を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｅ．Ｌ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃｓ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒａｎｋｓ，１９７５（それを任意の目的のために本明細書に組み入れることとする））により評価し、二標本ｔ検定で確認した。
【０１４４】
アナキンラで処理された被験者の平均ヘマトクリットは６ヶ月で０．２８容量％増加し、一方、プラセボで処理された被験者の平均ヘマトクリットは同期間で０．８６７容量％減少した（図２）。
【０１４５】
実施例２
アナキンラの投与は貧血を改善する
実施例１に記載のヘマトクリットレベルに対するアナキンラの効果の研究において、関節リウマチを有する被験者の亜集団は、該研究の開始に際して、３４％以下のヘマトクリットレベルとして定義される貧血（Ｐｉｎｃｕｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８９：１６１，１９９０（これを任意の目的のために参照により本明細書に組み入れることとする））であった。該アナキンラ処理被験者のうちの５０名（１４．２％）および該プラセボ処理被験者のうちの１３名（１０．７％）が、この度合の貧血で特徴づけられた（ベースラインデモグラフィックスおよび病歴に関しては、図３を参照されたい）。
【０１４６】
この研究における貧血被験者の数は少なかったが、該プラセボ投与被験者より多数のアナキンラ処理患者が、２４週間の治療の後、ヘマトクリットレベルにおける改善を示した。３用量のＩＬ−１ｒａのそれぞれが投与された患者において、貧血が改善した（結果に関しては、図４を参照されたい）。
【０１４７】
実施例３
アナキンラの投与は関節疾患には無関係に貧血を改善する
実施例２に記載の貧血に対するアナキンラの投与の効果の研究において、ヘマトクリットレベルにおける６容量％以上の改善を示した７名のアナキンラ処理患者のうちの３名は、ＡＣＲ２０応答基準を満たさなかった（図５および６）。ＡＣＲ２０は、以下の基準が満たされた場合に被験者を「改善した」と定義する：触れると痛い／痛みを伴う関節の数におけるベースラインからの＞２０％の減少；腫脹関節の数のベースラインからの＞２０％の減少；および以下の５つの基準のうちの３つにおけるベースラインからの＞２０％の減少：１）病気の活性の被験者評価；２）病気の活性の調査者評価；３）痛みの被験者評価；４）健康評価アンケート（ＨＡＱ）；または５）Ｃ反応性タンパク質。したがって、ＩＬ−１ｒａ療法は、関節疾患の活性に対するその効果とは無関係に、関節リウマチ被験者における貧血を改善しうる。
【０１４８】
本発明は、その好ましい実施形態であるとみなされるものに関して記載されているが、本発明は、開示されている実施形態に限定されるべきではなく、それどころか、特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾および均等物を包含すると意図され、特許請求の範囲には、すべてのそのような修飾および均等物を包含するよう最も広い解釈が与えられるべきである。
【０１４９】
実施例４
第０日に、８〜１０週齢の雌Ｌｅｗｉｓラットの群を、０．８５％  食塩水中の１５μｇ／ｋｇの用量のラムノースで平衡化されたペプチドグリカン−多糖重合体（ＰＧ−ＡＰＳ）（Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｙｓｏｎ，ＧＡ）（０．５２０ｍｌの容積中で３ｍｇ／ラット、ラットはストックＰＧ−ＡＰＳで注射）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で免疫した。また、第０日に、別の群の８〜１０週齢の雌Ｌｅｗｉｓラットに０．８５％  食塩水の０．５ｍｌのｉ．ｐ．注射を行って、担体注射ラットを得た。
【０１５０】
第０日から第７７日まで毎週、尾動脈からの血液をＥＤＴＡコート化Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＹ）内に集め、全血球計算（ＣＢＣ）を、ラットの血液に関して校正されたＡＤＶＩＡ  １２０Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）上で行った。第４２日に、該ラットを２群に分けた。１２．０ｇ／ｄＬ未満の平均ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度を有するラットを貧血と称することにした。同様の平均Ｈｂ濃度を有する貧血ラットを実験群に配置した。
【０１５１】
対照群は、互いに同様のＨｂ濃度を有する担体注射ラットよりなるものであった。
【０１５２】
第４３日以降は、該実験群のラットを８つの処理群に細分した。ｎ＝６である担体群を除く全ての群はｎ＝５であった。７つの群を以下の処理法の１つで処理した：ａ）１００ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＩＬ−１ｒａ（３回／週）、ｂ）３μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）、ｃ）６μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）、ｄ）１００ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＩＬ−１ｒａ（３回／週）および３μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）、またはｅ）１００ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＩＬ−１ｒａ（３回／週）および６μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）、ｆ）４ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ  ｓＴＮＲ−Ｒ１（３回／週）、ｇ）４ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ  ｓＴＮＲ−Ｒ１（３回／週）および３μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）、ｈ）４ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ  ｓＴＮＲ−Ｒ１（３回／週）および６μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）（１回／２週）。該実験群の１つの群を、０．４ｍＬの担体溶液で、該サイトカインインヒビターと同じ計画で注射し、すべての該実験群と同様にして収容し採血した。該処理期間は第５７日まで継続した。
【０１５３】
実験データを、尾静脈から採取した血液から得、サンプリングと同じ日に、ＡＤＶＩＡ全血球計算（ＣＢＣ）分析装置（Ｂａｙｅｒ，Ｉｎｃ）上で該製造業者のプロトコールに従い分析した。血清としての血液を遠心分離血清分離装置内に集め、凝固させ、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、血清をエッペンドルフチューブ内にピペットで移し、ドライアイス上での一晩の特急宅配便によりＬａｂＣｏｒｐ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）に運搬するまで−８０℃で保存した。ＣＢＣ用に集めた血液は、第３０、４２、４５、４９、５２、５６、５９、６３、６６、７０、７７日に得た。血清として集めた血液は、第０、４２、４９、５７、６３、７７日に得た。要するに、治療処理を開始した後、ＣＢＣ分析用には週２回、血清採取には週１回、ラットから採血した。
【０１５４】
鉄濃度以外のこれらのパラメーターのすべては、前記で既に説明したＡｄｖｉａ装置分析により同時に得られた「全血球計算」（ＣＢＣ）分析により得たデータの一部である。全血清鉄濃度（ＴＳＩ）およびトランスフェリン全鉄結合能は、ＬａｂＣｏｒｐ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）により測定した。不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）は、ＴＩＢＣ−ＴＳＩ＝ＵＩＢＣとして計算した（“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ”ｐ．２６３−２６４．Ｊｉｒｏ  Ｊ．Ｋａｎｅｋｏ編，Ａｃａｄｅｍｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。脚容積は、Ｆｅｉｇｅ  Ｕら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５７：１４５７−１４７０（２０００）に記載のとおりに測定した。
【０１５５】
Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのみで処理した実験群からのラットは、該実験群からの未処理ラットと比較して、より高い平均血清Ｈｂ濃度に傾き、平均脚浮腫を減少させた。１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの投与は、平均血清Ｈｂ濃度を、未処理ラットの平均血清Ｈｂ濃度に対して１．８ｇ／ｄＬ増加させ（ｐ＝０．１）（図７を参照されたい）、平均脚容積を、未処理ラットの平均脚容積に対して０．４ｍｌ減少させた（ｐ＝０．１）（図８を参照されたい）。３または６μｇ／ｋｇのＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみで処理した実験群からのラットでは、未処理ラットと比較して、平均血清Ｈｂ濃度が上昇した。３μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理は、平均血清Ｈｂ濃度を、未処理ラットの平均Ｈｂ濃度に対して０．４ｇ／ｄＬ増加させた（ｐ＝０．７）（図７を参照されたい）。６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理は、平均血清Ｈｂ濃度を、未処理ラットの平均血清Ｈｂ濃度に対して１．３ｇ／ｄＬ増加させた（ｐ＝０．４）（図７を参照されたい）。
【０１５６】
１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび３μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での該実験群からのラットの処理は、１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのみによる処理と比較して平均血清Ｈｂ濃度を有意に増加させた。しかし、１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での該実験群からのラットの処理は、Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａまたはＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理と比較して、平均血清Ｈｂ濃度における増加を２倍以上にした。１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での処理は、１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＩ−１ｒａのみでの処理からの増加より２．２ｇ／ｄＬ多く平均血清Ｈｂ濃度を増加させた（ｐ＝０．０４）（図７を参照されたい）。１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での処理は、平均血清Ｈｂ濃度を、６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理からの増加より２．７ｇ／ｄＬ多く増加させた（ｐ＝０．０１）（図７を参照されたい）。したがって、ラットにおいて、１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）での処理から生じた、未処理実験ラットに対する平均血清Ｈｂ濃度の増加の合計は、４．０ｇ／ｄＬであった。これは、１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのみ及び６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理から生じた、未処理実験ラットに対する平均血清Ｈｂ濃度の増加（それぞれ、１．８ｇ／ｄＬおよび１．３ｇ／ｄＬ）の和より大きい。
【０１５７】
１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）の両方での該実験群からのラットの処理は、同用量のいずれか一方での単独処理と比較して平均網状赤血球数を増加させ（ｐ＜０．００４）、同用量の６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみの場合と比較して赤血球（ＲＢＣ）数を増加させた（ｐ＜０．０３）。１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）の両方での該実験群からのラットの処理はまた、全血清鉄濃度を、６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみでの処理より４４μｇ／ｄＬ多く増加させた（ｐ＝０．０２）（図１４を参照されたい）。１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａおよび６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）の両方での該実験群からのラットの処理はまた、平均赤血球容積を、６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみの場合（ｐ＝０．００８）または１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのみの場合（ｐ＝０．０４）より多く増加させた（図１１を参照されたい）。この処理はまた、平均赤血球Ｈｂを、６μｇ／ｋｇ  ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）のみの場合（ｐ＝０．００３）または１００ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのみの場合（ｐ＝０．０８）より多く増加させた（図１２を参照されたい）。
【図１】
2020007353.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020007353.tif 000017
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2020007353.tif 000019
【図１７Ａ】
2020007353.tif 000020
【図１７Ｂ】
2020007353.tif 000021
【図１８Ａ】
2020007353.tif 000022
【図１８Ｂ】
2020007353.tif 000023
【図１９】
2020007353.tif 000024
【図２０】
2020007353.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、ヘマトクリットを上昇させるための、治療的に有効な量のｓＴＮＦ−ＲＩ、ダーベポエチンα及びアナキンラを含む、医薬組成物。