(57)【要約】【課題】少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸を、試料中に混在する二本鎖ＤＮＡやＡＡＶベクター遺伝子断片の影響を受けず、かつ一定温度で高感度、迅速、簡便に増幅定量可能な試薬、ならびに前記試薬を用いた前記一本鎖核酸の増幅方法を提供すること。【解決手段】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素と、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有した第一のプライマーと、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有した第二のプライマー（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうち、いずれか一方にはその５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）とを含む増幅試薬、および当該試薬を用いた増幅方法により、前記課題を解決する。【選択図】図２
2020162550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（７）を少なくとも含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅試薬（ただし、以下の（６）および（７）のうちいずれか一方には、その５’末端側に以下の（４）の酵素のプロモータ配列を付加している）；
（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素；
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（５）鎖置換活性を有する酵素；
（６）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー；および
（７）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー。
【請求項２】
前記（１）、前記（２）および前記（３）がＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１に記載の増幅試薬。
【請求項３】
以下の（Ｉ）から（ＶＩＩＩ）の工程を少なくとも含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅方法；
（Ｉ）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記一本鎖核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程；
（ＩＩ）鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（Ｉ）で合成したＤＮＡを３’末端側に相補領域を有した一本鎖ＤＮＡとする工程；
（ＩＩＩ）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素とを用いて、前記一本鎖核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程；
（ＩＶ）前記第一のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうちいずれか一方が有するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した前記（ＩＩＩ）で合成したＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（Ｖ）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記二本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物を合成する工程；
（ＶＩ）前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうち前記ＲＮＡ転写産物と相補的な配列を有したプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程；
（ＶＩＩ）リボヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、前記ｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程；および
（ＶＩＩＩ）前記（ＶＩＩ）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、連続的にＲＮＡ転写産物を合成する工程。
【請求項４】
請求項３に記載の一本鎖核酸の増幅方法を用いてＲＮＡ転写産物を合成する工程；および
ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成することで形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＲＮＡ転写産物を検出する工程を含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の検出方法。
【請求項５】
ウイルスベクターを含む試料の品質を評価する方法であって、
請求項４に記載の一本鎖核酸の検出方法における一本鎖核酸がウイルスベクターの一本
鎖核酸であり、当該一本鎖核酸の検出方法を用いて前記試料中に含まれる前記ウイルスベクターを定性的および／または定量的に検出し、当該検出結果に基づき、前記ウイルスベクターを含む試料の品質を評価する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる標的核酸の増幅方法および増幅試薬に関する。特に本発明は、アデノ随伴ウイルスに代表されるパルボウイルス科のウイルスゲノムといった、末端に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅試薬および増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子疾患の治療において、当該治療のための遺伝子を含むウイルスベクターを用いて細胞に導入する方法が、当該細胞への導入効率がよい点で広く用いられている。ウイルスベクターの中でもアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ自体に病原性がなく、当該ベクターに挿入した遺伝子を効率よく非分裂細胞に導入でき、かつ導入した遺伝子の発現が長期間持続するため、近年特に注目されている（非特許文献１）。
【０００３】
ＡＡＶはゲノムがカプシドタンパク質に内包された直径２０ｎｍから２６ｎｍの粒子である。ＡＡＶのゲノムは４．７ｋｂの線状の一本鎖ＤＮＡであり、その３’末端側および５’末端側には逆位反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ、以下ＩＴＲと略記）配列と呼ばれるＴ字型のループ構造が存在する。遺伝子治療用のＡＡＶベクターとして前記ゲノムを用いる際は、前記ゲノムの両末端側にあるＩＴＲ配列に挟まれたＲｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子を、遺伝子を導入したい組織に特異的なプロモータ配列、遺伝子治療に用いる遺伝子、ポリＡシグナル配列などに置換する。
【０００４】
ＡＡＶベクターの製造は、前述した方法で遺伝子治療に用いる遺伝子に置換したＡＡＶゲノムと、Ｒｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子を含むベクター、およびアデノウイルスやヘルペスシンプレックスウイルスなどのヘルパーウイルスとを、宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞やＨｅＬａ細胞など）へ同時にトランスフェクションし製造する。なお近年では、前記ヘルパーウイルスの代わりに、より安全性の高い、アデノウイルスの複製遺伝子をクローニングしたＡｄｖヘルパープラスミドを用いた方法も行なわれている。
【０００５】
前述した方法で製造したＡＡＶベクターの中には、遺伝子治療に必要なＡＡＶゲノムがないベクター（いわゆる空ベクター）も存在する。したがって、産生したＡＡＶベクターを遺伝子治療に用いるためには、当該ベクター中に前記ＡＡＶゲノムが存在するかの確認や、ＡＡＶベクターを含む試料（細胞培養液など）中に含まれるＡＡＶゲノムの定量が必要であった。
【０００６】
ＡＡＶベクター中に含まれるＡＡＶゲノムの定性的および／または定量的測定法として、透過型電子顕微鏡によるＡＡＶベクター粒子の画像解析や、分析超遠心法や、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法や、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）法や、ドットブロット法や、電気泳動法が知られている。これらのうちｑＰＣＲ法は、操作の簡便性や迅速性から、ＡＡＶベクターの定量に広く用いられている。しかしながら、ｑＰＣＲ法と電気泳動法など他の方法とで定量結果に相関性がとれない点や、測定の対象とする遺伝子領域によっても定量結果が異なる点などの問題があった（非特許文献２から４、ならびに特許文献１および２）。またｑＰＣＲ法やｄｄＰＣＲ法といったＰＣＲを利用した方法は、急激に反応温度を昇降させる必要があるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化の点で問題があった。
【０００７】
反応工程の省力化や反応装置の低コスト化が比較的容易な核酸増幅方法として、比較的低温（例えば４０℃から５０℃の範囲）の一定温度で核酸増幅が可能な、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法が知られている。これら増幅法は通常一本鎖ＲＮＡを標的核酸とした増幅法であるが、反応系を工夫することでＤＮＡの増幅も可能である。
【０００８】
例えば特許文献３には、ＴＲＣ法によるＲＮＡ増幅で用いる酵素群およびプライマーセット、ならびに鎖置換酵素および／または増幅した核酸を一本化するためのプライマーを含む試薬を用いた、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の増幅を開示している。特許文献４には、ＴＲＣ法によるＲＮＡ増幅で用いる酵素群およびプライマーセットを含む試薬を用いた、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の増幅を開示している。しかしながら、ＡＡＶゲノムといった、末端に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅については、特許文献３および４を含め、これまで開示がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−２３５５６２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０８０２２３
【特許文献３】特開２０１５−１１６１３６号公報
【特許文献４】特開２０１４−１４０３６７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】小澤敬也、ウイルス、５７（１）、４７−５６（２００７）
【非特許文献２】Ｐ．Ｆａｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂ、２３、１−７（２０１２）
【非特許文献３】Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５、１１５−１２５（２０１４）
【非特許文献４】Ｓ．Ｄ’Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５、１６０１９（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸を、試料中に混在する二本鎖ＤＮＡやＡＡＶベクター遺伝子断片の影響を受けず、かつ一定温度で高感度、迅速、簡便に増幅定量可能な試薬、ならびに前記試薬を用いた前記一本鎖核酸の増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法によるＲＮＡ増幅で用いる酵素群に、鎖置換活性酵素および少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的および相同的な配列を有したプライマーセットを少なくとも添加した試薬により、前記一本鎖核酸を一定温度で高感度、迅速、簡便に増幅定量できることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１３】
すなわち本発明の第一の態様は、
以下の（１）から（７）を少なくとも含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅試薬である（ただし、以下の（６）および（７）のうちいずれか一方には、その５’末端側に以下の（４）の酵素のプロモータ配列を付加している）。
（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素；
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（５）鎖置換活性を有する酵素；
（６）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー；および
（７）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー。
【００１４】
また本発明の第二の態様は、前記（１）、前記（２）および前記（３）がＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一の態様に記載の増幅試薬である。
【００１５】
さらに本発明の第三の態様は、
以下の（Ｉ）から（ＶＩＩＩ）の工程を少なくとも含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅方法である。
（Ｉ）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記一本鎖核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程；
（ＩＩ）鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（Ｉ）で合成したＤＮＡを３’末端側に相補領域を有した一本鎖ＤＮＡとする工程；
（ＩＩＩ）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素とを用いて、前記一本鎖核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程；
（ＩＶ）前記第一のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうちいずれか一方が有するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した前記（ＩＩＩ）で合成したＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（Ｖ）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記二本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物を合成する工程；
（ＶＩ）前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうち前記ＲＮＡ転写産物と相補的な配列を有したプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程；
（ＶＩＩ）リボヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、前記ｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程；および
（ＶＩＩＩ）前記（ＶＩＩ）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、連続的にＲＮＡ転写産物を合成する工程。
なお、上記各工程は、同時的、連続的および／または、自動的に行われるものであってよい。
【００１６】
また本発明の第四の態様は、第三の態様に記載の一本鎖核酸の増幅方法を用いてＲＮＡ転写産物を合成する工程；およびＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成することで形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＲＮＡ転写産物を検出する工程を含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の検出方法である。
【００１７】
さら本発明の第五の態様は、ウイルスベクターを含む試料の品質を評価する方法であって、前記第四の態様に記載の一本鎖核酸の検出方法における一本鎖核酸がウイルスベクターの一本鎖核酸であり、当該一本鎖核酸の検出方法を用いて前記試料中に含まれる前記ウイルスベクターを定性的および／または定量的に検出し、当該検出結果に基づき、前記ウイルスベクターを含む試料の品質を評価する工程、を含む方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の増幅試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素と、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有した第一のプライマーと、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有した第二のプライマー（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうち、いずれか一方にはその５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）と、を含むことを特徴としている。
【００１９】
本発明の増幅試薬により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度で核酸を増幅する方法で、高特異的、高感度、かつ迅速に前記一本鎖核酸を増幅できる。なお本発明の増幅試薬で増幅される一本鎖核酸に、５’末端側の相補領域が含まれる場合には、検出用オリゴヌクレオチドプローブを前記相補領域に設定すると、ＰＣＲ法による検出で問題となっている、挿入した目的遺伝子が同時検出される問題も解消できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのうち、３’末端側の逆位反復（ＩＴＲ）配列を含む領域（配列番号２０の塩基番号４５２６〜４６７５）を示した図である。配列番号２０の塩基番号４５５１〜４６７５がＩＴＲ配列に相当する。
【図２】増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸の増幅方法の一例を示した図である。
【図３】増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸の増幅方法の別の例を示した図である。
【図４】増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、かつそれ以外の領域にも相補領域を有している一本鎖ＤＮＡである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸の増幅方法のさらに別の例を示した図である。
【図５】増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、かつそれ以外の領域にも相補領域を有している一本鎖ＤＮＡである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸の増幅方法のさらに別の例を示した図である。
【図６】増幅対象の一本鎖核酸が、３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸の増幅方法の一例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様は、以下の（１）から（７）を少なくとも含む、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅試薬（ただし、以下の（６）および（７）のうちいずれか一方には、その５’末端側に以下の（４）の酵素のプロモータ配列を付加している）に関する。
（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素；
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素；
（５）鎖置換活性を有する酵素；
（６）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー；および
（７）前記一本鎖核酸のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有する第
二のプライマー。
【００２２】
＜一本鎖核酸＞
本発明が増幅対象とする一本鎖核酸とは、本発明の増幅試薬および増幅方法で増幅される一本鎖核酸領域、または当該領域を含む少なくとも３’末端側に有する相補領域を含めた核酸全体のことをいう。一本鎖核酸は、好ましくはＤＮＡである。
【００２３】
本発明の一本鎖核酸の増幅試薬は、少なくとも３’末端側に相補領域を有した任意の一本鎖核酸を対象として実施することができる。一本鎖核酸は、さらに５’末端側に相補領域を有していてもよい。ＤＮＡを増幅対象とする場合には、人工的に作製されたＤＮＡ、環境由来試料や生物由来中に存在するＤＮＡが例示される。本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡの由来としては、ウイルス、好ましくはＡＡＶが例示される。
【００２４】
本明細書において相補領域とは、一本鎖核酸の数塩基から数十塩基が、数塩基から数十塩基からなるループ構造を介して一本鎖核酸の内側の核酸（５’末端相補領域の場合はループ構造を介して３’末端側に位置する核酸、３’末端相補領域の場合はループ構造を介して５’末端側に位置する核酸）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし二重鎖を形成した領域（二重鎖形成領域）をいう。本発明が増幅対象とする一本鎖核酸は、少なくとも３’末端側に相補領域を有する。なお、相補領域の末端の塩基は、対応する塩基とハイブリダイズする。ただし、一本鎖核酸のうち、３’末端側に有する相補領域の５’末端側領域（一本鎖核酸が、５’末端側と３’末端側の両方に相補領域を有している場合は、両末端側の相補領域に挟まれた領域）に存在する、当該一本鎖核酸の二次構造に由来した相補的二本鎖は、本発明の増幅工程において用いられる相補領域には含めない。
【００２５】
ここでストリンジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的に本発明におけるストリンジェントな条件の例として、限定されないが、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール、０．１％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件があげられる。
【００２６】
相補領域のうち、二重鎖形成領域の長さは、上記ストリンジェントな条件で、ループ構造を介した状態を維持しながら、二重鎖を形成可能な長さであれば特に限定はなく、一例として２塩基から１５０塩基、２塩基から１００塩基、２塩基から５０塩基、または２塩基から３０塩基である。
【００２７】
相補領域のうちループ構造とは、二重鎖形成領域において、二重鎖形成領域で挟まれた領域のうち、少なくとも一塩基が、一本鎖核酸の内側の核酸とはハイブリダイズしない構造を意味し、当該ループ構造の一部に一本鎖核酸の内側の核酸と二重鎖を形成する領域があってもよい。ループ構造を形成する塩基長に特に限定はなく、一例として１塩基から１００塩基、１塩基から５０塩基、１塩基から４０塩基、または１塩基から３０塩基である。ループ構造の塩基配列は、相補領域中の二重鎖形成領域におけるハイブリダイズを妨げない限り、任意の配列としてよい。
【００２８】
一本鎖核酸の内側の核酸と二重鎖を形成する領域を一部有したループ構造の例として、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムの逆位反復（ＩＴＲ）配列があげられる
（図１）。図１において、本発明における相補領域はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｂ’−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ’−Ａ’の領域のことを、二重鎖形成領域はＡ−Ａ’の領域のことを、ループ構造はＢ−Ｃ−Ｂ’−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ’の領域のことを、それぞれ指す。
【００２９】
一本鎖核酸の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、必要な目的物量等に応じて、適宜設定可能である。
【００３０】
＜プライマー＞
本発明の増幅試薬で用いるプライマーは、
増幅対象の一本鎖核酸のうち、前述した相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有した第一のプライマー、および
増幅対象の一本鎖核酸のうち、前述した相補領域以外の領域の一部と相同的な配列を有した第二のプライマーであり、
ただし前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのうちいずれか一方には、その５’末端側に後述するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している。
【００３１】
なお本明細書において、「相補的な配列を有する」とは対象核酸に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、「相同的な配列を有する」とは対象核酸の相補鎖に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。したがって、前記ハイブリダイズが維持される限り、プライマーは、１又は数塩基程度（例えば、プライマー配列の１０％以下程度）の置換、欠失、付加、または修飾などが生じていてもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。プライマーの具体例としては、限定されないが、配列番号１１〜１７に記載の配列を有するものが挙げられる。
プライマーは１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。プライマーの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定することができる。プライマーは、本明細書の記載および公知技術に基づいて、設計および製造することができる。
【００３２】
例えば、一本鎖核酸が５’末端側および３’末端側にＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲ（図１）を有した核酸の場合、前記ＩＴＲ以外の領域の一部と相補的な配列を有し、かつ当該配列の５’末端側に後述するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したオリゴヌクレオチドを本発明の増幅試薬で用いる第一のプライマーとして、前記ＩＴＲ以外の領域（ただし、前記第一のプライマーに対して、一本鎖核酸に対し３’末端側の位置）の一部と相同的な配列を有したオリゴヌクレオチドを本発明の増幅試薬で用いる第二のプライマーとして、それぞれ用いればよい。なお前述した例では、第一のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加しているが、第二のプライマーの５’末端側に前記プロモータ配列を付加してもよい（その場合は第一のプライマーへの前記プロモータ配列の付加は不要である）。また前記相補的な配列は、一本鎖核酸の中央部より３’末端側の位置に設定すると好ましい。
【００３３】
＜ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素＞
本発明の増幅試薬で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素として、限定されないが、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。前述したプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、例えば公知のＴ７プロモータを用いればよい。これらの１種または２種以上を組み
合わせて使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
【００３４】
＜ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素＞
本発明の増幅試薬には、前述したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素も含んでいる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素は、いくつかの活性を併せ持つ酵素を用いてもよく、それぞれの活性を有する複数の酵素を用いてもよい。トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素ならびにこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性のすべてを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素およびその誘導体が特に好ましい。これらの１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。各酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
【００３５】
＜鎖置換活性を有する酵素＞
本発明の増幅試薬で用いる鎖置換活性を有する酵素は、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素のことをいう。なお、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が鎖置換活性を有する酵素としても機能するものであれば、これらの活性を併せ持つ酵素を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換活性を有する酵素として、使用してもよい。限定されないが、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７またはＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体などがあげられる。またヘリカーゼも、鎖置換効果、すなわち、同じ配列の核酸合成と結びつけられた核酸の置換を生じることから、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。さらにＲｅｃＡや一本鎖結合蛋白質も、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。これらの１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。鎖置換活性を有する酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
【００３６】
＜その他の成分＞
本発明の増幅試薬には、本発明の効果を妨げない限り、上記成分以外に、さらに任意の反応、検出等に用いられる成分、例えば、反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、およびインターカレーティング色素等から選択される少なくとも１種を含んでもよい。
【００３７】
本発明の増幅試薬に、標的核酸である、５’末端側および３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸を含む試料を添加し、一定温度で反応させることで、当該一本鎖核酸（正確にはＲＮＡ転写産物）を増幅できる。すなわち、本発明の増幅試薬は、例えば、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度で核酸を増幅する方法に好適に適用できる。反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマーのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー
の長さが１７塩基から３０塩基の範囲である場合は、３５℃から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０℃から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。反応時間は、必要な目的物量等に応じて、適宜設定可能である。
【００３８】
＜検出方法＞
本発明の増幅試薬および増幅方法で増幅した一本鎖核酸（ＲＮＡ転写産物）を検出する（本発明の検出方法を行なう）ことで、測定試料中の一本鎖核酸の有無や当該試料中に含まれる一本鎖核酸の量を測定できる。検出には従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（ｉ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（ｉｉ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（ｉｉｉ）前記一本鎖核酸の塩基配列の一部とハイブリダイズ（相補的二本鎖を形成）することで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
などがあげられる。前記標識オリゴヌクレオチドプローブとしては、本明細書の記載および公知の公知の合成技術に基づき合成したもの、または、市販のものを使用可能である。前記（ｉｉｉ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。
【００３９】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、増幅した一本鎖核酸の特定塩基配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブは増幅した一本鎖核酸の特定塩基配列と相補的二本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的二本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
【００４０】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、増幅した一本鎖核酸とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。このようなオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ本発明の増幅試薬に添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。また蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了可能である。
【００４１】
本発明の検出方法により、少なくとも３’末端側に相補領域を有した一本鎖核酸を有するベクターの品質を評価できる。具体例として、少なくとも３’末端側がＡＡＶゲノムのＩＴＲ（図１）のようなウイルスゲノムが有する相補領域であり、当該３’末端側に有する相補領域の５’末端側領域に目的遺伝子を挿入した、ウイルスベクターを評価する際は、当該目的遺伝子の位置にプライマーを設計し、本発明の検出方法を行なえばよい。検出できた場合は前記ウイルスベクターに目的遺伝子が挿入されていることが、検出できなか
った場合は前記ウイルスベクターに目的遺伝子が挿入されていない（いわゆる空ベクターである）ことが、それぞれわかる（定性的検出）。また検出できた場合、その量を測定することで試料中に含まれるウイルスベクター量が適切か、評価できる（定量的検出）。
【００４２】
以下、図を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの図に記載の態様に限定されるものではない。
【００４３】
増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域（両相補領域に挟まれた領域）が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーが第二のプライマーである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸増幅の流れを以下に説明する（図２）。なお以下の（Ａ−１０）以降の工程は、通常のＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法による増幅工程と同じため、図２では「ＴＲＣ反応」と略している。
【００４４】
（Ａ−１）増幅対象の一本鎖ＤＮＡ（鋳型一本鎖ＤＮＡ）のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有した第一のプライマーを、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ａ−２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび鋳型一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ａ−３）鎖置換活性を有する酵素および伸長した鋳型一本鎖ＤＮＡにより、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ａ−４）第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な（鋳型一本鎖ＤＮＡに対しては相同的な）配列を有し、かつ当該配列の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した第二のプライマーを、（Ａ−３）で遊離した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。（Ａ−５）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよびプロモータを付加した（第二のプライマー由来の）一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ａ−６）鎖置換活性を有する酵素および伸長した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにより、プロモータを付加した一本鎖ＤＮＡを第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ａ−７）第一のプライマーを、（Ａ−６）で遊離したプロモータを付加した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ａ−８）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、５’末端側にプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する。
（Ａ−９）（Ａ−８）で合成したプロモータ付加二本鎖ＤＮＡに、当該プロモータに対応したＲＮＡポリメラーゼを作用させて、ＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
（Ａ−１０）第一のプライマーを、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ａ−１１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する（ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の合成）。
（Ａ−１２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、（Ａ−１１）で合成したｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする（ＲＮＡ転写産物の分解）。
（Ａ−１３）（Ａ−１２）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として連続的にＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
【００４５】
次に、増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、それ
以外の領域（両相補領域に挟まれた領域）が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーが第一のプライマーである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸増幅の流れを以下に説明する（図３）。なお図３も、図２と同様、ＴＲＣ法による増幅工程（以下の（Ｂ−１０）以降の工程）は「ＴＲＣ反応」と略している。
【００４６】
（Ｂ−１）増幅対象の一本鎖ＤＮＡ（鋳型一本鎖ＤＮＡ）のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有し、かつ当該配列の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した第一のプライマーを、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｂ−２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび鋳型一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｂ−３）鎖置換活性を有する酵素および伸長した鋳型一本鎖ＤＮＡにより、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｂ−４）第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な（鋳型一本鎖ＤＮＡに対しては相同的な）配列を有した第二のプライマーを、（Ｂ−３）で遊離した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（Ｂ−５）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび第二のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｂ−６）鎖置換活性を有する酵素および伸長した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにより、第二のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｂ−７）第一のプライマーを、（Ｂ−６）で遊離した第二のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｂ−８）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、５’末端側にプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する。
（Ｂ−９）（Ｂ−８）で合成したプロモータ付加二本鎖ＤＮＡに、当該プロモータに対応したＲＮＡポリメラーゼを作用させて、ＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
（Ｂ−１０）第二のプライマーを、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（Ｂ−１１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する（ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の合成）。
（Ｂ−１２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、（Ｂ−１１）で合成したｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする（ＲＮＡ転写産物の分解）。
（Ｂ−１３）（Ｂ−１２）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として連続的にＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
【００４７】
次に、増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、かつそれ以外の領域（両相補領域に挟まれた領域）にも相補領域を有している一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーが第二のプライマーである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸増幅の流れを以下に説明する（図４）。なお図４も、図２と同様、ＴＲＣ法による増幅工程（以下の（Ｃ−１１）以降の工程）は「ＴＲＣ反応」と略している。
【００４８】
（Ｃ−１）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素により、増幅対象の一本鎖ＤＮＡ（鋳型一本鎖ＤＮＡ）を伸長させ、相補領域における結合を解離させる。
（Ｃ−２）（Ｃ−１）で解離した領域の一部と相補的な配列を有した第一のプライマーを
、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｃ−３）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素を用いて、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび鋳型一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｃ−４）鎖置換活性を有する酵素および伸長した鋳型一本鎖ＤＮＡにより、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｃ−５）第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な（鋳型一本鎖ＤＮＡに対しては相同的な）配列を有し、かつ当該配列の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した第二のプライマーを、（Ｃ−４）で遊離した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。（Ｃ−６）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよびプロモータを付加した（第二のプライマー由来の）一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｃ−７）鎖置換活性を有する酵素および伸長した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにより、プライマーを付加した一本鎖ＤＮＡを第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｃ−８）第一のプライマーを、（Ｃ−７）で遊離したプライマーを付加した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｃ−９）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、５’末端側にプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する。
（Ｃ−１０）（Ｃ−９）で合成したプロモータ付加二本鎖ＤＮＡに、当該プロモータに対応したＲＮＡポリメラーゼを作用させて、ＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
（Ｃ−１１）第一のプライマーを、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｃ−１２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する（ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の合成）。
（Ｃ−１３）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、（Ｃ−１２）で合成したｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする（ＲＮＡ転写産物の分解）。
（Ｃ−１４）（Ｃ−１３）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として連続的にＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
【００４９】
次に、増幅対象の一本鎖核酸が、５’末端側および３’末端側に相補領域を有し、かつそれ以外の領域（両相補領域に挟まれた領域）にも相補領域を有している一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーが第一のプライマーである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸増幅の流れを以下に説明する（図５）。なお図５も、図２と同様、ＴＲＣ法による増幅工程（以下の（Ｄ−１１）以降の工程）は「ＴＲＣ反応」と略している。
【００５０】
（Ｄ−１）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素により、増幅対象の一本鎖ＤＮＡ（鋳型一本鎖ＤＮＡ）を伸長させ、相補領域における結合を解離させる。
（Ｄ−２）（Ｄ−１）で解離した領域の一部と相補的な配列を有し、かつ当該配列の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した第一のプライマーを、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。（Ｄ−３）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素を用いて、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび鋳型一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｄ−４）鎖置換活性を有する酵素および伸長した鋳型一本鎖ＤＮＡにより、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｄ−５）第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な（鋳型一本鎖ＤＮＡに対しては相同的な）配列を有した第二のプライマーを、（Ｄ−４）で遊離した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（Ｄ−６）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび第二のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（Ｄ−７）鎖置換活性を有する酵素および伸長した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにより、第二のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（Ｄ−８）第一のプライマーを、（Ｄ−７）で遊離したプライマーを付加した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（Ｄ−９）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、５’末端側にプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する。
（Ｄ−１０）（Ｄ−９）で合成したプロモータ付加二本鎖ＤＮＡに、当該プロモータに対応したＲＮＡポリメラーゼを作用させて、ＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
（Ｄ−１１）第二のプライマーを、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（Ｄ−１２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する（ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の合成）。
（Ｄ−１３）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、（Ｃ−１２）で合成したｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする（ＲＮＡ転写産物の分解）。
（Ｄ−１４）（Ｄ−１３）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として連続的にＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
【００５１】
次に、増幅対象の一本鎖核酸が、３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域（両相補領域に挟まれた領域）が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーが第一のプライマーである場合の、本発明の増幅試薬を用いた一本鎖核酸増幅の流れを以下に説明する（図６）。なお図６も、図２と同様、ＴＲＣ法による増幅工程（以下の（６）以降の工程）は「ＴＲＣ反応」と略している。
【００５２】
（１）増幅対象の一本鎖ＤＮＡ（鋳型一本鎖ＤＮＡ）のうち、前記相補領域以外の領域の一部と相補的な配列を有し、かつ当該配列の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した第一のプライマーを、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（アンチセンスプライマーの付加）。
（２）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および鎖置換活性を有する酵素により、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡおよび鋳型一本鎖ＤＮＡを伸長させる。
（３）鎖置換活性を有する酵素および伸長した鋳型一本鎖ＤＮＡにより、第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型一本鎖ＤＮＡから遊離させる。
（４）第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な（鋳型一本鎖ＤＮＡに対しては相同的な）配列を有した第二のプライマーを、（３）で遊離した第一のプライマー由来の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（５）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、５’末端側にプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡ（ＴＲＣ反応複合体）を合成する。
（６）（５）で合成したプロモータ付加二本鎖ＤＮＡに、当該プロモータに対応したＲＮＡポリメラーゼを作用させて、ＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
（７）第二のプライマーを、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズさせる（センスプライマーの付加）。
（８）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する（ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の合成）。
（９）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、（８）で合成したｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする（ＲＮＡ転写産物の分解）。
（１０）（９）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として連続的にＲＮＡ転写産物を合成する（ＲＮＡ転写産物の増幅）。
【００５３】
なお（Ａ−９）、（Ａ−１３）、（Ｂ−９）、（Ｂ−１３）、（Ｃ−１０）、（Ｃ−１４）、（Ｄ−１０）、（Ｄ−１４）、（６）、および（１０）で合成したＲＮＡ転写産物の一部とハイブリダイズ（相補的二本鎖を形成）することで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが前記増幅系に含まれていると、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定することで、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
＜実施例１＞  一本鎖ＤＮＡの合成
一本鎖ＤＮＡの合成には、Ｌｏｎｇ  ｓｓＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ３．０  ｋｂ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用いた。
【００５６】
（１）キット付属のｐＬＳＯＤＮ−３（配列番号３）を、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。具体的には、以下の組成からなる反応液を滅菌水で２０μＬとなるようＰＣＲチューブ１６本それぞれに調製し、９８℃２分、（９８℃１０秒、６５℃５秒、７２℃３５秒）×４０サイクル、７２℃１分で反応した。
【００５７】
反応液の組成：
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  Ｐｒｅｍｉｘ
０．２μＭ  Ｆプライマー（配列番号１）
０．２μＭ  Ｒプライマー（配列番号２）
１ｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号３）
【００５８】
増幅したＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル電気泳動により泳動し、目的と思われるバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ社製）を用いて精製し、ベクターとした。
【００５９】
（２）ｐＡＡＶ−ＣＭＶ（配列番号４）を、配列番号５および配列番号６のプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した産物Ｌ１および配列番号７および配列番号６のプライマーを用いて増幅した産物Ｌ２を作製した。具体的には、以下の組成からなる反応液を滅菌水で２０μＬとなるようＰＣＲチューブ８本それぞれに調製し、９８℃２分、（９８℃１０秒、６０．４℃５秒、７２℃１２秒）×４０サイクル、７２℃１分で反応した。
【００６０】
反応液の組成：
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  Ｐｒｅｍｉｘ
０．２μＭ  Ｆプライマー（配列番号５もしくは７）
０．２μＭ  Ｒプライマー（配列番号６）
１ｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号４）
【００６１】
増幅したＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル電気泳動により泳動し、目的と思われるバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ社製）を用いて精製し、Ｌ１もしくはＬ２とした。さらに、Ｌ１を鋳型として、配列番号５および配列番号８、Ｌ２を鋳型として、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号８、配列番号７および配列番号１０のそれぞれのプライマーの組み合わせで上記同様ＰＣＲ増幅し、それぞれＳ２、Ｓ３、Ｓ４−２、Ｓ５とした。なお、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５はＰＣＲの伸長を７２℃１５秒、Ｓ４−２は７２℃５秒で増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル電気泳動により泳動し、目的と思われるバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製
）を用いて精製し、それぞれインサートＳ２、Ｓ３、Ｓ４−２、Ｓ５とした。
【００６２】
（３）（１）で作製したベクターおよび（２）で作製したインサートＳ２、Ｓ３、Ｓ４−２、Ｓ５をＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ試薬を用いてプラスミドを合成した。ベクターを約５０ｎｇ、インサートを各約４５ｎｇ使用し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅを添加し、５０℃１５分反応後、一部をＪＭ１０９に形質転換した。カルベニシリンナトリウムを含む寒天培地に塗布し、３７℃でＯ／Ｎで培養した。コロニーを培養し、プラスミドを抽出してシーケンスした。目的のインサートが含まれるプラスミドを約１５μｇ〜２８μｇ調製した。
【００６３】
（４）調製した各プラスミドを、ニッキング酵素Ｎｔ  ＢｓｐＱＩおよびＮｂ  ＢｓｒＤＩを用いて、インサート部位にニックを挿入した。エタノール沈殿後、Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、一本鎖ＤＮＡを遊離した状態で、アガロースゲル電気泳動により泳動した。一本鎖ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、一本鎖ＤＮＡ標準サンプルＳ２、Ｓ３、Ｓ４−２、Ｓ５とした。
【００６４】
（５）各一本鎖ＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて吸光度測定により濃度を求め、塩基長からコピー数を算出した。
【００６５】
＜実施例２＞  一本鎖ＤＮＡのＴＲＣ反応による検出
各種１本鎖ＤＮＡ（３’末端側に相補領域を有し、それ以外の領域が相補領域を有していない一本鎖ＤＮＡ）をＴＲＣ反応により増幅した。
（１）一本鎖ＤＮＡのＳ４−２（配列番号１９；以下、単に標準ＤＮＡとも表記する）を、０．０１％コール酸ナトリウム、０．０１％アジ化ナトリウムを含むＴＥバッファーを用いて１０５コピー／２μＬとなるように希釈し、これを一本鎖ＤＮＡ試料とした。
【００６６】
（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記ＤＮＡ試料２μＬを添加した。なお、標準ＤＮＡ検出用プローブには、ＴａｑＭａｎプローブ（ＩＤＴ社製）を用いた。ここで、第一のプライマーがプロモーター付きアンチセンスプライマー、第二のプライマーがセンスプライマーである。
【００６７】
反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
６７ｍＭ  トレハロース
２５ｎＭ  ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１８）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号１１〜１５）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号１６もしくは１７）
２Ｕ  ９６−７ＤＮＡポリメラーゼ
４．３Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
【００６８】
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１９．０ｍＭ  塩化マグネシウム
９５．０ｍＭ  塩化カリウム
３．８％（ｗ／ｖ）  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１０．５％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ
【００６９】
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．８を超えた場合を陽性判定とした。３０分以内に陽性判定となった場合を（＋）、陽性判定とならなかった（陰性判定）場合を（−）とした。結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
３’末端に反復配列を有するＳ４−２は、第二のプライマーが配列番号１６の場合に、配列番号１１〜１５で増幅が可能であることがわかった。また、配列番号１７の場合には、配列番号１３との組み合わせで増幅が確認された。なお、増幅効率には、プライマーの選択が検出に重要であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、試薬等に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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