(57)【要約】【課題】脂肪由来幹細胞由来の骨三次元構造体を製造できる方法を提供する。【解決手段】骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートから得られた骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を融合して、骨三次元構造体を作製することができることを確認した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨密度が400 mg/cm3以上である脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体。
【請求項２】
前記骨三次元構造体は、２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊から構成されている請求項１に記載の骨三次元構造体。
【請求項３】
前記骨三次元構造体は、前記２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊が融合して構成されている請求項２に記載の骨三次元構造体。
【請求項４】
以下の工程を含む作製方法から得られる骨密度が400 mg/cm3以上である骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む作製方法から得られる請求項１〜３のいずれか１に記載の骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む作製方法から得られる請求項１〜３のいずれか１に記載の骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程、
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（３）前記（２）の細胞塊を融合する工程、及び
（４）前記（３）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【請求項７】
以下の工程を含む骨三次元構造体の作製方法、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【請求項８】
以下の工程を含む骨三次元構造体の作製方法、
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程、
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（３）前記（２）の細胞塊を融合する工程、及び
（４）前記（３）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１に記載の骨三次元構造体の骨密度が600 mg/cm3以上であることを特徴とする骨三次元構造体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１に記載の骨三次元構造体は、皮質骨様、海綿骨様及び骨髄腔様を有することを特徴とする骨三次元構造体。
【請求項１１】
請求項７又は８に記載の骨三次元構造体の作製方法で得られた骨三次元構造体が600 mg/cm3以上であることを特徴とする骨三次元構造体の作成方法。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載の骨三次元構造体の作製方法で得られた骨三次元構造体は、皮質骨様、海綿骨様及び骨髄腔様を有することを特徴とする骨三次元構造体の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体の作製方法、並びに該作製方法で作製された脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体に関する。
詳しくは、本発明は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートから得られた骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を融合して、骨三次元構造体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ(ｓ)）は、回収が容易であり、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣｓ）に近い再生能を有するため、再生医療の理想的な体性幹細胞として認識されている。ＡＤＳＣｓは、皮下脂肪組織から採取され、脂肪吸引によって得られ得る間質血管画分（ＳＶＦ）に由来する。脂肪吸引からＡＤＳＣｓ培養までの手順は、長年にわたり既に確立されている。
本発明者らが開発したＡＤＳＣシートには、Ｉ型コラーゲンが多く含まれている。このコラーゲンは、細胞をつなぎ合わせ、必要な場所への細胞の固定を手伝う。さらに、Ｉ型コラーゲンは、骨形成誘導因子の一種であり、間葉系幹細胞の骨形成プロセスを促進し得る。以前の研究より、ＡＤＳＣシートの骨形成能を確認している。さらに、本発明者らの以前の研究により、ＡＤＳＣシートの骨形成がインビトロで実現されている。
【０００３】
（再生医療）
近年、再生医療が注目され、整形外科分野でも、骨再生を目的とした再生医療が実施されている。幹細胞を骨形成系列に分化させ、続いて骨再生に使用することは再生医療における主要な目標である。再生医療分野において、重要な３つのファクターである細胞、制御因子及び足場｛以下、スキャホールド（scaffolds）と称する場合がある｝が、その地位を確立してきている。
【０００４】
（骨芽細胞）
骨形成においては骨芽細胞が重要な役割を果たしている。骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、タンパク質等を産生及び分泌して骨基質をつくる。具体的には、骨芽細胞は、生体内でコラーゲン等の基質タンパク質を分泌し、そこに基質小胞（matrix vesicle）を作る。この基質小胞の周囲にリン酸カルシウムが沈着して骨の基質が完成し、骨芽細胞は最終的にはこの基質の中で骨細胞となる。
骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化するものであり、間葉系幹細胞にデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を作用させることにより分化誘導できることが知られている。
また、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞を、骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein；ＢＭＰ）−４、アスコルビン酸−２−リン酸塩、デキサメタゾン及びβ−グリセロリン酸塩を含む培養培地を使用して、ゼラチンでコートした培養プレートで培養することにより、骨芽細胞に分化誘導できたことが開示されている（特許文献１）。
【０００５】
（脂肪由来幹細胞）
間葉系幹細胞の１つとして認められている脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cells；以下、ＡＤＳＣｓ又はＡＤＳＣと称することがある）も、ＢＭＳＣｓ、ＥＳＣｓ及びｉＰＳＣｓに加えて、骨再生医療における使用が検討されている。損傷を受けた組織及び臓器の修復及び再建へのＡＤＳＣｓの利用にはいくつかの選択肢がある。
修復部位へＡＤＳＣｓを直接注入する方法が知られている。また、ＡＤＳＣｓをフィブリン糊などの生物学的接着剤に混ぜて修復部位に注入する方法が知られている。しかしながら、これら方法では皮質骨表面への細胞の生着や固定が困難であった。
また、ＡＤＳＣｓを様々な担体と共に移植する方法が知られている。心血管疾患における幹細胞治療において、天然の生物分解性マトリクス（biodegradable matrixes）で構成されたスキャホールドを使用することにより、該治療の大きな制約であった細胞生着の不足を回避することができた（非特許文献１）。しかしながら、この様な方法によっても、細胞を移植部位に確実に固定することは困難であり、細胞が経時的に脱落する問題があった。
【０００６】
一方、個々の分散状態にあるＡＤＳＣｓ（以下、分散ＡＤＳＣｓと称する場合がある）がシート状に形成してなるＡＤＳＣｓシートが、心血管分野及び形成外科分野において、組織再生に一定の成果を挙げていることが報告されている。
現在利用できるＡＤＳＣｓシートは、大まかに２種類に分けることができ、一方は、CellSeed社の製品などのような特別な担体を支持体とするＡＤＳＣｓシートであり、もう一方は、コラーゲンタンパク質担体と共に移植部位に移植するＡＤＳＣｓシートである。
【０００７】
（細胞シート）
細胞シートの製造方法は、様々な報告がある。例えば、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、又は脂肪由来幹細胞を、支持体や担体上で培養することにより製造する方法が報告されている（特許文献２、３）。また、間葉系幹細胞、滑膜細胞、及び胚性幹細胞から選択される細胞を細胞培養支持体上で培養して、該培養した細胞を、シート状三次元構造体として作製する方法が報告されている（特許文献４）。さらに、脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、ａ）温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程、ｂ）培養液の温度を、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とする工程、ｃ）細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程、さらに工程ｃ）の前にｄ）培養液にアスコルビン酸又はその誘導体を加える工程を含む方法が開示されている（特許文献５）。
【０００８】
本願発明者らは、骨塊を液体窒素中で凍結後に骨マトリクスを維持し、その後、それを元の位置に戻して固定する液体窒素療法を開発している（非特許文献２−４）。
なお、整形外科分野でのＡＤＳＣｓの応用は、分散ＡＤＳＣｓと他の物質、例えば標準生理食塩水、フィブリンゲル及びコラーゲンゲルなどとの混合物を海綿質骨に注入するといった方法により行われているのみである。
しかしながら、ＡＤＳＣｓは、整形外科分野においては、移植箇所で固定するためにフィブリン糊様の物質を構成成分とする混合物として使用されるため、そのような混合物に含まれるＡＤＳＣｓの濃度には制限がある。
従来、ＡＤＳＣシートから骨三次元構造体を形成するには特性のホルダーが必要であった。ホルダーによる制約や細胞間結合性の欠如のため、大型化可能な略球形構造又は小型の緻密な構造を有する骨三次元構造体を製造することは困難であった。
【０００９】
（先行技術）
脂肪由来幹細胞を骨芽細胞に分化する試みも知られている。
本発明者らは、脂肪由来幹細胞シートを市販の骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨芽細胞に分化できることを確認したが、骨形成まで確認できなかった（非特許文献５）。
また、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩で誘導した脂肪由来幹細胞を公知の培地で培養し、骨形成を示すマーカーを検出できたことが報告されているが、骨形成まで確認できていない（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０６５０２号パンフレット
【特許文献２】特許第０４９２１３５３号公報
【特許文献３】特許第０４６２０１１０号公報
【特許文献４】特許第０４９４３８４４号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／０６７９８３号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Arana M, Pena E, Abizanda G, Cilla M, Ochoa I, et al. (2013)Preparation and characterization of collagen-based ADSC-carrier sheets forcardiovascular application. Acta Biomater. 9(4):6075-83.
【非特許文献２】Tsuchiya H, Wan S. L, Sakayama K, Yamamoto N, Nishida H, et al.(2005) Reconstruction using an autograft containing tumour treated by liquidnitrogen. J Bone Joint Surg. 87-B: 218-25.
【非特許文献３】Hayashi K, Tsuchiya H, Yamamoto N, Takeuchi A, Tomita K. (2008)Functional outcome in patients with osteosarcoma around the knee joint treatedby minimised surgery. Int Orthop. 32(1): 63-68.
【非特許文献４】Yamamoto N, Tsuchiya H, Tomita K. (2003) Effects of liquid nitrogentreatment on the proliferation of osteosarcoma and the biomechanical propertiesof normal bone. J Orthop Sci. 8(3):374-80.
【非特許文献５】Xiang Fang,  Hideki Murakami,  Satoru Demura, et al. (2014) A Novel Method to Apply OsteogenicPotential of Adipose Derived Stem Cells in Orthopaedic Surgery. PLOS ONE.Volume 9 Issue 2 e8874.
【非特許文献６】Yu J, Tu YK, Tang YB, Cheng NC.(2014) Stemness andtransdifferentiation of adipose-derived stem cells using L-ascorbic acid2-phosphate-induced cell sheet formation. Biomaterials. 2014Apr;35(11):3516-26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来、脂肪由来幹細胞から骨三次元構造体を製造することは困難であった。
これにより、本発明の課題は、脂肪由来幹細胞由来の骨三次元構造体を製造できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を行った結果、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートから得られた骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を融合して、骨三次元構造体を作製することができることを確認した。
以上により、本発明は、これら知見により達成したものである。
【００１４】
即ち、本発明は以下に関する。
１．骨密度が400 mg/cm3以上である脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体。
２．前記骨三次元構造体は、２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊から構成されている前項１に記載の骨三次元構造体。
３．前記骨三次元構造体は、前記２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊が融合して構成されている前項２に記載の骨三次元構造体。
４．以下の工程を含む作製方法から得られる骨密度が400 mg/cm3以上である骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
５．以下の工程を含む作製方法から得られる前項１〜３のいずれか１に記載の骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
６．以下の工程を含む作製方法から得られる前項１〜３のいずれか１に記載の骨三次元構造体、
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程、
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（３）前記（２）の細胞塊を融合する工程、及び
（４）前記（３）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
７．以下の工程を含む骨三次元構造体の作製方法、
（１）脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（２）前記（１）の複数の細胞塊を融合する工程、及び
（３）前記（２）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
８．以下の工程を含む骨三次元構造体の作製方法、
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程、
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程、
（３）前記（２）の細胞塊を融合する工程、及び
（４）前記（３）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
９．前項１〜６のいずれか１に記載の骨三次元構造体の骨密度が600 mg/cm3以上であることを特徴とする骨三次元構造体。
１０．前項１〜６のいずれか１に記載の骨三次元構造体は、皮質骨様、海綿骨様及び骨髄腔様を有することを特徴とする骨三次元構造体。
１１．前項７又は８に記載の骨三次元構造体の作製方法で得られた骨三次元構造体が600 mg/cm3以上であることを特徴とする骨三次元構造体の作成方法。
１２．前項７又は８に記載の骨三次元構造体の作製方法で得られた骨三次元構造体は、皮質骨様、海綿骨様及び骨髄腔様を有することを特徴とする骨三次元構造体の作成方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の作製方法によれば、インビトロでＡＤＳＣシート由来の骨三次元構造体を作製できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キャスチングの概念図。左から順に、遠心チューブ投入直後のＡＤＳＣ、遠心中のＡＤＳＣ、振盪培養中のＡＤＳＣ、キャスチングによりＡＤＳＣが細胞融合した細胞塊を示す。
【図２】ＡＤＳＣビーズを示す。標準プロトコルに従って、各ウェルの中のＡＤＳＣシートはビーズになった。
【図３】10培地での培養３日目のアセンブルされたＡＤＳＣビーズ。
【図４】10培地での培養７日目のアセンブルされたＡＤＳＣビーズ。
【図５】ＡＤＳＣビーズ融合の概念図。左から順に、ＡＤＳＣビーズ融合開始前のＡＤＳＣビーズ、ＡＤＳＣビーズ融合中のＡＤＳＣビーズ、ＡＤＳＣビーズ融合後のＡＤＳＣビーズの融合体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明の概要）
本発明は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートから得られた骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を融合して、骨三次元構造体を作製する。
なお、本発明での「骨三次元構造体」とは、インビトロでＡＤＳＣシート由来の生体骨と同様の構造・性質を有する骨を意味する。より詳しくは、以下のいずれか１以上の特性を有する。
本発明の骨三次元構造体は、少なくとも以下のいずれか１以上の特性を有する。
（１）骨密度が400 mg/cm3以上である
（２）２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊から構成されている。
（３）２以上の脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊が融合して構成されている。
（４）生体骨と同様に、均一な内部構造ではなく、外側は皮質骨（緻密骨）様を有し、内部は海綿骨様・骨髄腔様を有する。
（５）細胞塊同士の接触箇所が石灰化している。
（６）圧縮強度が1 MPa以上、5 MPa以上、10 MPa以上、15 MPa以上、20 MPa以上、25 MPa以上、30 MPa以上、40 MPa以上、50 MPa以上、75 MPa以上又は100 MPa以上である。
【００１８】
より詳しくは、以下の工程で得られる脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体である。
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程。
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程。
（３）前記（２）の細胞塊を融合する工程。なお、細胞塊を融合する方法として、各種のキャスチング方法（細胞塊同士を糸で縫合する方法、疎水性表面を有する遠心チューブ内での撹拌方法）
（４）前記（３）の融合した細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【００１９】
別の態様として、本発明は、以下の工程で得られる脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体であってもよい。
（１）脂肪由来幹細胞をシート培地で培養して、脂肪由来幹細胞シートを作製する工程。
（２）前記（１）の脂肪由来幹細胞シートを骨三次元構造体が所望の形状になるように形成された容器内の骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート由来の細胞塊を作製する工程。
（３）前記（２）の細胞塊を骨形成培地で培養して、骨三次元構造体を作製する工程。
【００２０】
本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、従来の分散した脂肪由来幹細胞よりも骨形成能が高いという利点を有する。
また、本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、従来の分散した脂肪由来幹細胞よりも機械的強度が高いという利点を有する。
また、本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、その力学的強度が高いため、それ自身を単独で修復部位に移植されたときにその部位に固定できる利点を有する。
また、本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、大型化可能な略球形構造を有することにより、培養系をスケールアップすることで大型化可能であるという利点を有する。
【００２１】
（幹細胞）
「幹細胞（stem cell）」とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいう。幹細胞は、発生の過程や組織・器官の維持において細胞を供給する役割を担っている。幹細胞には、全ての系統の細胞に分化することのできる胚性幹細胞、通常は分化系統が限定されている成体幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）、胚体外組織を除く全ての系統に分化する多能性を有し、人工的に作製された人工多能性幹細胞等が知られている。
【００２２】
（脂肪由来幹細胞）
「脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cells；ＡＤＳＣｓ）」は、脂肪組織に存在する幹細胞である。主に間葉系幹細胞で構成され、骨髄由来の幹細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、血管内皮細胞及びインスリン分泌細胞等の多種類の細胞に分化することができる多能性を有する。脂肪組織は採取が容易であり、また多量の幹細胞を含むため、脂肪由来幹細胞は容易かつ大量に調製することが可能である。
【００２３】
（脂肪由来幹細胞の分離及び精製）
脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の分離及び精製は、従来報告された公知の方法を参考にして実施できる。例えば、文献Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29:1723-1729に記載の方法を用いることができる。あるいは、市販のヒト脂肪由来幹細胞（例：Invitrogen社製品）を使用することもできる。
【００２４】
（脂肪由来幹細胞シート）
「脂肪由来幹細胞シート（ＡＤＳＣｓシート）」は、個々別々の分散状態にある脂肪由来幹細胞がシート状を形成してなる細胞構築物をいう。
「単層の脂肪由来幹細胞シート」とは、脂肪由来幹細胞が一層のシート状態を形成してなり、重層構造や三次元構造を形成していない細胞構築物をいう。
本明細書において、個々別々の分散状態にあるＡＤＳＣｓを単にＡＤＳＣｓ又は分散ＡＤＳＣｓといい、シート状に形成してなるＡＤＳＣｓをＡＤＳＣｓシートという。
【００２５】
（脂肪由来幹細胞の由来）
ＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートは、哺乳動物の脂肪由来のものであればいずれでもよく、哺乳動物として、ヒト、サル、ブタ、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等を例示できる。
好ましくは、ヒトの脂肪由来のＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートである。
さらに、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、骨形成用生体材料として使用される場合、同種ＡＤＳＣｓ及び同種ＡＤＳＣｓシート由来であることが好ましく、自家ＡＤＳＣｓ及び自家ＡＤＳＣｓシート由来であることがさらに好ましい。
同種ＡＤＳＣｓ及び同種ＡＤＳＣｓシートとは、同じ動物種に由来するＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートを意味する。
自家脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨とは、骨移植を受ける対象自身に由来するＡＤＳＣｓシート由来の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨であることを意味する。
【００２６】
（骨分化能）
「骨分化能」とは、骨芽細胞、骨細胞又はそれらの前駆細胞に分化する能力をいう。すなわち、骨分化誘導条件下で、骨芽細胞、骨細胞又はそれらの前駆細胞に分化する能力をいう。骨分化誘導条件は、インビボ及びインビトロのいずれの条件下であってもよい。インビトロの骨分化誘導として、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を含む培地での培養や、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸塩、デキサメタゾン及びβ−グリセロリン酸塩を含む培養培地での培養を例示できる。
【００２７】
（脂肪由来幹細胞シートの作製方法）
本発明の脂肪由来幹細胞シート（特に、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート）の作製方法では、細胞培養支持体を添加していない培養容器内に、細胞分化誘導剤を含まない細胞培養培地にアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した溶液（本発明の「シート培地」）を加え、該溶液中で、脂肪由来幹細胞を培養することを特徴とする。
【００２８】
細胞培養に使用する容器は、細胞培養用に一般的に使用されているものであれば特に限定されず、シャーレやフラスコなどの細胞培養容器を例示できる。接着性の細胞であれば、このような細胞培養容器の壁面に接着して増殖し、浮遊性の細胞であれば、培養溶液中に遊離の状態で増殖する。このような細胞培養容器を基体と称することがある。
【００２９】
（細胞培養支持体）
「細胞培養支持体」とは、細胞の付着及び増殖、あるいは細胞による三次元構造の構築を目的として基体に被覆又は積層されたコーティング材料で形成された構造体をいう。細胞培養支持体として、高分子が架橋した三次元網目構造体であるハイドロゲルやコラーゲンマトリクス等を好ましく例示できる。
細胞培養支持体を添加していない培養容器として、例えば通常市販されているシャーレや細胞培養フラスコ等を例示できる。
【００３０】
（アスコルビン酸又はその塩）
本発明に係る方法で使用するアスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体、例えばＬ−アスコルビン酸−２−グルコシドやＬ−アスコルビン酸−２−リン酸等であり、好ましくはＬ−アスコルビン酸−２−リン酸である。
アスコルビン酸の塩とは、ナトリウム塩又はカルシウム塩等の薬理学的に許容される塩であればいずれの塩であってもよい。
アスコルビン酸−２−リン酸は、間葉系細胞のコラーゲンタンパク質分泌を増加させるが、該細胞に他の影響は何ら与えないことが報告されている。
細胞培養培地に添加されるアスコルビン酸又はその塩は、最終濃度が１０μＭ〜８００μＭ、好ましくは３０μＭ〜５００μＭ、より好ましくは３０μＭ〜２５０μＭ、最も好ましくは約５０μＭ〜２００μＭになるように細胞培養培地に添加する。
【００３１】
（細胞培養培地）
細胞培養培地（本発明での「共通培地」）は、ＡＤＳＣｓの培養に一般的に使用されている培養培地を使用することができる。例えば、必要に応じて牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ）等の細胞培養用抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium；ＤＭＥＭ）、α−最小必須培地（alpha-Minimum EssentialMedia；α−ＭＥＭ）を好ましく例示できるが、特に限定されない。
【００３２】
（脂肪由来幹細胞の培養条件）
ＡＤＳＣｓの培養条件は一般的に知られている培養条件を採用することができる。
ＡＤＳＣｓシートの作製のためのＡＤＳＣｓ培養日数は、３日〜１５日、好ましくは４日〜１３日、より好ましくは５日〜１０日、さらに好ましくは７日〜１０日、最も好ましくは約７日間である。
【００３３】
（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シート）
本発明の骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞シートを、骨芽細胞分化誘導培地で培養して得ることができる。
【００３４】
（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートの作製方法）
骨芽細胞分化誘導培地は、好ましくは、カルシウム濃度が１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌ含まれており、必須成分として骨芽細胞分化誘導剤を含む。
骨芽細胞分化誘導剤とは、幹細胞や骨系列前駆細胞を、骨芽細胞に分化させ得る薬剤をいう。骨芽細胞分化誘導剤として、公知の骨芽細胞分化誘導剤をいずれも使用することができるが、デキサメタゾン、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸塩、β−グリセロリン酸、ＢＭＰ−４、β−グリセロリン酸塩を例示することができる。
インビトロにおける骨芽細胞分化誘導は、骨芽細胞分化誘導剤を加えた培養培地中で、幹細胞や骨系列前駆細胞を、培養することにより実施できる。骨芽細胞分化誘導剤を加える培養培地は、一般的に使用されている培地であればいずれも使用できるが、必要に応じてＦＢＳ等の血清、Ｐ／Ｓ等の細胞培養用抗生物質を添加したＤＭＥＭ、α−ＭＥＭを好ましく例示することができる。
培養条件は、骨芽細胞分化誘導剤を含む細胞培養培地中で、本発明に係る作製方法で作製された脂肪幹細胞シートを培養し、該シート中での骨芽細胞の分化誘導を検出することにより適宜変更して設定することができる。
骨芽細胞の分化誘導の検出は、公知方法、例えばＡＬＰ染色（ALP staining）やアリザリンレッド染色、あるいはＡＬＰ活性の測定により実施することができる。
【００３５】
（脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体）
本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養して得ることができる。
脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体は、好ましくは実際の骨のような形状や硬さまで分化された状態を意味する。
【００３６】
（脂肪由来幹細胞シート由来の骨三次元構造体の作製方法）
骨形成培地とは、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを骨細胞又は骨に分化させ得る培地を意味する。骨形成培地は、公知の培地（必要に応じてＦＢＳ等の血清、Ｐ／Ｓ等の細胞培養用抗生物質を添加したα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ培地等）に、好ましくは、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸、アスコルビン酸、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸塩、β−グリセロリン酸塩、及び／又は、プロピオン酸カルシウムを含む。
なお、骨形成培地中のカルシウム濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３．００ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、公知の培地を使用する場合において、培地のカルシウム濃度を調整するために、好ましくは、プロピオン酸カルシウムを使用する。
【００３７】
培養条件は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを骨形成培地で培養し、該シート中での骨細胞又は骨の分化誘導を検出することにより適宜変更して設定することができる。
培養時間は、特に限定されないが、１日〜２４か月である。
培養温度は、特に限定されないが、室温でも十分に分化誘導することできるが、好ましくは約３７℃である。
骨細胞又は骨の分化誘導の検出は、公知方法、例えばＡＬＰ染色、ＨＥ染色やアリザリンレッド染色、あるいはＡＬＰ活性の測定により実施することができる。
【００３８】
（骨形成用生体材料）
骨形成用生体材料とは、骨移植、骨再生及び骨再建のために使用する材料をいう。
本発明の骨形成用生体材料は、本発明の作製方法により作製された骨三次元構造体を含む。特に、本発明の骨三次元構造体では、力学的強度を有し、かつ自身単独で骨修復部位に移植して固定されるので、スキャホールドを必要としないことが特徴である。
【００３９】
（オーバーコンフルエント）
脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ）等の接着細胞は表面に接着しなければ生存できない。このため、培養容器の底面積、容積等により生存できる細胞数には上限がある。本明細書において、「オーバーコンフルエント」（オーバーコンフルエント状態）とは、細胞数がこれ以上増えないことを確認した状態（培養している細胞数が上限に達した状態）をいう。
【００４０】
（キャスチング）
本明細書において、キャスチング（キャスティング）とは、培養中の細胞を培養容器の形状を鋳型として融合させ細胞塊を成型する又は細胞塊同士を糸等で縫合して成型することを意味する。
例えば、細胞、幹細胞又は脂肪由来幹細胞、好ましくは細胞シート、幹細胞シート又は脂肪由来幹細胞シート、より好ましくはオーバーコンフルエント細胞、オーバーコンフルエント幹細胞又はオーバーコンフルエント脂肪由来幹細胞（オーバーコンフルエントＡＤＳＣ）を、培養容器（例えば遠心チューブ、シャーレ等）から剥離して、遠心して、底に沈めたものを振盪培養することで、遠心チューブ、好ましくは疎水性表面を有する遠心チューブの底部を鋳型とした成形により、あるいは、遠心チューブの底部との物理的接触を利用した成形により、細胞融合させて細胞塊を形成させる。さらに、前記細胞塊を振盪培養して成長、成熟、及び／又は分化（例えば骨形成）させる工程を含んでもよい。キャスチングを行う前に、細胞融合を促進するコラーゲンタンパク質の分泌を促進するために、アスコルビン酸又はその塩を含有する培地を用いて前培養することが好ましい。キャスチングの概念図を図１に示す。
複雑な構造や大きい構造をキャスチングする場合、構造を分解した、小さい、簡単な部分をキャスチングしてから、さらにそれらを組み合わせてキャスチングしてもよい。
【００４１】
（疎水性表面を有する培養容器）
本発明において、疎水性表面を有する培養容器とは、表面（培養物が接触する表面）が疎水性である培養容器（好ましくは遠心チューブ）のことをいう。
疎水性表面を有する培養容器としては、特に限定されないが、例えば、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製の疎水性表面を有する遠心チューブが挙げられる。
疎水性表面を有する遠心チューブは、市販品でもよく、特に限定されないが、例えば、CELLSTAR（商標） CELLreactor（商標）, Polypropylene Filter Top Tubes, Greiner Bio-One（Greiner Bio-One社）等が挙げられる。
【００４２】
（骨密度）
本発明の骨三次元構造体の骨密度が２００ｍｇ／ｃｍ３以上、３００ｍｇ／ｃｍ３以上、４００ｍｇ／ｃｍ３以上、５００ｍｇ／ｃｍ３以上、６００ｍｇ／ｃｍ３以上、８００ｍｇ／ｃｍ３以上、好ましくは４００ｍｇ／ｃｍ３以上、より好ましくは５００ｍｇ／ｃｍ３以上であるとき、骨形成されたと判定する。
骨形成の確認は、培養後の細胞塊の骨密度を測定することで確認できる。
【００４３】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
＜ＡＤＳＣビーズ（細胞塊）作製＞
以下の方法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪由来幹細胞由来の骨三次元構造体を製造した。詳細は、以下の通りである。
【００４５】
（細胞の調製）
脂肪由来幹細胞をウサギから単離し、以下の工程に用いた。
【００４６】
（ＡＤＳＣの培養）
脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ）を６ウェルプレートのウェル内で１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ）を加えたＤＭＥＭ（和光純薬工業製）（以下、「共通培地」と称する場合がある）を用いて培養して、オーバーコンフルエントＡＤＳＣを作製した。
また、培養開始前に、ビーズの数を1 well = 1 ADSC sheet = 1 ADSC beadとした。ＡＤＳＣシートのサイズ（直径）は、ＡＤＳＣシートを作製するウェル底面の面積により設計できる。例えば、２４ウェルプレートの場合は直径１５ｍｍ、１２ウェルプレートの場合は直径２１ｍｍ、６ウェルプレートの場合は直径３４ｍｍのＡＤＳＣシートを作成することができる。
【００４７】
（ＡＤＳＣシートの作製）
オーバーコンフルエント状態になった後、１０％ＦＢＳ、１５０μＭアスコルビン酸、１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ（和光純薬工業製）（以下、「シート培地」と称する場合がある）を添加し、１週間培養した。オーバーコンフルエントになった日を０日目とした。シート培地を計３回交換した（０日目５ｍＬ、３日目３ｍＬ及び６日目２ｍＬ）。
なお、ＡＤＳＣシートは、６ウェルプレートで作製された。
【００４８】
（骨形成誘導性ＡＤＳＣビーズ作製）
７日目に１０％ＦＢＳ、４５０μＭアスコルビン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、０．１μＭデキサメタゾン及び１％Ｐ／Ｓを含むα−ＭＥＭ培地（以下、「ビーズ用骨芽細胞分化誘導培地」と称する場合がある）を各ウェル３ｍＬ添加し、１週間細胞を培養した。ビーズ用骨芽細胞分化誘導培地は３日毎に交換した。
１週間の培養終了時点で、ＡＤＳＣシートの大部分は、ウェル底面から剥離し、この段階でビーズ状（ＡＤＳＣビーズ）になった（図２）。５日目に組織学的検査、ＡＬＰ染色及びアリザリンレッド染色は、陽性を示し、ＡＤＳＣビーズの骨形成能を確認した。
【００４９】
（ＡＤＳＣビーズアセンブリング）
３−０ナイロン縫合糸を、ＡＤＳＣビーズの足場として選択した。３０個のＡＤＳＣビーズを３−０のナイロン縫合糸で縫合した。
ＡＤＳＣビーズがアセンブルされた（融合した）。アセンブリングは、ＡＤＳＣビーズの強度、すなわち柔らかいが、しなやかで壊れにくいというＡＤＳＣビーズの特性により実現した。
なお、縫合糸の代わりにスカフォルダ（ｈｏｌｄｅｒ）を用いてＡＤＳＣビーズをアセンブル（融合）してもよい。スカフォルダは３Dプリンタで作製できる。ＡＤＳＣビーズのサイズ、ＡＤＳＣビーズの数、並びにＡＤＳＣビーズの融合体のサイズ及び形状は、スカフォルダにより適宜変更可能である。詳しくは、スカフォルダの形状、サイズにより、一つのビーズ単位又は一つのキャスチング単位での細かい構造を設計でき、骨形成材料の適した構造に作製できる。
【００５０】
（骨芽細胞分化誘導培地ＡＤＳＣビーズ融合）
ＡＤＳＣビーズは、それらがアセンブルされたときには柔らかかった。アセンブルされたＡＤＳＣビーズを、１０％ＦＢＳ、０．１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルビン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩及び１％Ｐ／Ｓを含むα−ＭＥＭ培地（和光純薬工業製）（以下、「骨芽細胞分化誘導培地」と称する場合がある）中で３週間培養した。この工程でＡＤＳＣビーズの骨形成誘導が継続され、さらにＡＤＳＣビーズの融合も進行した。３日毎に骨形成培地を交換した。培養２週間目に骨密度を測定した。
アセンブルされたＡＤＳＣビーズは融合した。一続きにつながれたＡＤＳＣビーズも３週間で融合し、直鎖状にビーズが連結した構造を形成した。放射線及び組織学的検査の両方により、ＡＤＳＣビーズ融合が確認された。
【００５１】
（ＡＤＳＣ由来の骨三次元構造体）
アセンブルされたＡＤＳＣビーズを１０％ＦＢＳ、０．７ｍＭ Ｃａ２＋、５０μＭアスコルビン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、０．１μMデキサメタゾン及び１％Ｐ／Ｓを含むα−ＭＥＭ培地（以下、「骨形成培地」と称する場合がある）を使用して培養した。骨形成培地は、ＡＤＳＣシート及びＡＤＳＣビーズの骨形成を促進するために本発明者らが開発した培地である。骨形成培地は培養期間中３日ごとに交換した。培養２週間目に骨密度を測定した。
ＡＤＳＣビーズの融合の概念図を図５に示す。培養３日目と７日目の骨三次元構造体ビを図３及び図４に示す。
骨密度測定の結果、培養２週間目において骨密度５００ｍｇ／ｃｍ３以上になることを確認した。
【００５２】
（３ヶ月目の骨三次元構造体のＣＴスキャン及び組織学的検査）
骨形成培地での培養の１ヶ月目、２ヶ月目及び３ヶ月目にアセンブルされたＡＤＳＣビーズ由来の骨の骨形成を検査するためにＣＴスキャンを行った。
ＣＴスキャン画像より、一定の培養時間で正常な骨と同様の密度の骨三次元構造体が得られることを確認した。より詳しくは、生体骨と同様に、均一な内部構造ではなく、外側は皮質骨（緻密骨）様であり、内部は海綿骨・骨髄腔様で疎になっていることが明らかになった。細胞塊同士が接触する部分が石灰化していることを確認した。また、ＣＴスキャン画像より、骨三次元構造体は、それぞれ、異なる複雑な構造を有することが明らかになった。
すなわち、本発明の方法は、生体骨と同様の構造・性質を有する骨（骨三次元構造体）を、通常の金属インプラントよりも小型の緻密な構造｛例えば人工骨（β-TCP）等の顆粒｝として作製できることを確認できた。
骨形成培地の培養３ヶ月目に骨三次元構造体の骨の組織学的検査を実施した。試料を４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定した後、ＥＤＴＡ２ＮＡＺｎ溶液｛０．４ｍＬ １％ＺｎＳＯ４（和光純薬工業製）を含有する１００ｍＬ １０％ＥＤＴＡ２ＮＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）溶液｝中で１週間脱灰した。
骨三次元構造体の骨形成活性を試験するためにＡＬＰ染色を実施した。スライドをＡＬＰ染色キットの試薬と共に３７℃で３０分間インキュベートした。その後、スライドを脱イオン水で洗浄し、肉眼及び光学顕微鏡で観察した。
骨三次元構造体の骨形成能を試験するためにアリザリンレッド染色を実施した。スライドをアリザリンレッド染色キットと共に３７℃で３０分間インキュベートした。その後、スライドを脱イオン水で洗浄し、肉眼及び光学顕微鏡で観察した。
骨形成は、ＡＤＳＣビーズがアセンブルされたときに継続した。骨形成培地により骨形成分化し、骨形成培地により石灰化を加速した。組織切片作製のために脱灰を行ったが、放射線照射は密度の増加を示し、アリザリンレッド染色はカルシウム沈着を確認した。
【実施例２】
【００５３】
脂肪由来幹細胞をイヌ、ヒト及びラットから単離し、実施例１と同様に骨三次元構造体を作製した。ヒトの脂肪由来幹細胞はInvitrogenTM LifeTechnologiesから入手した。その結果、実施例１と同様にイヌ、ヒト及びラット由来の骨三次元構造体を作製できた。
【実施例３】
【００５４】
＜ＡＤＳＣキャスチング＞
１．ADSCsをオーバーコンフルエント状態になるまで共通培地で15cmディッシュにて培養した。
２．シート培地に培地を交換した。シート培地は3日間使用した。
３．PBSで細胞を3回洗浄した。
４．3 mlのトリス−EDTA緩衝液をディッシュに加え、37℃で5分間インキュベートした。
５．EDTA緩衝液を除去した。
６．一般的な培地で皿を洗浄（flash）した。ＡＤＳＣを培養容器底面から剥離するため、トリプシン（和光純薬工業製）で処理した。50 ml遠心管に細胞を集めた。1200 rpm、3分間遠心分離した。
７．50 mlチューブ内の培地を除去した。
８．細胞を培養管（culturing tube）に移した。10 cmの深さまでシート培地を加えた。
９．細胞を1日につき10分、2回遠心分離し、沈殿のまま（キャスチング）で37℃、５％CO2インキュベーターにて培養する工程を7日間（400 g / 10 min / 2 times / 1 day for 7 days）行った。
１０．組織学的検査および免疫組織学的検査により、ADSCキャスチング（骨を形成する途中段階）における生存細胞およびI型コラーゲンの存在の有無を調べた。
【００５５】
（結果）
ＨＥ染色の結果、ADSCキャスチングにおける細胞は生存しており、壊死領域はなかった。
細胞は細胞自身が分泌したマトリックス（主に一型コラーゲン）により囲まれていたことから、ADSCキャスチング形成の間にADSCがコラーゲンを分泌し続けることを確認することができた。コラーゲンは、細胞の接着、生存、増殖等の足場、カルシウム沈着の足場になる。よって、分離されたADSCは互いに融合して固体塊（solid mass）−ADSCキャスチングを形成できた。
I型コラーゲンは、ADSCキャスチングにおいて活発に合成されたことを確認した。
ADSCキャスチングにおいてADSCによって分泌されたI型コラーゲンは、細胞同士を接着するだけでなく、ADSCに対する足場でもあった。
ADSCは、生存、増殖および分化のために足場に付着することを必要とする細胞の一種である。
ADSCキャスチングにおいて多数の生存細胞およびI型コラーゲンが多く含まれていることが示された。
さらに、得られたADSCキャスチング（細胞塊）を実施例１と同様に骨芽細胞分化誘導培地及び／又は骨形成培地で培養することにより、骨三次元構造体を作製することができる。
【００５６】
（総論）
ＡＤＳＣビーズは、ＡＤＳＣシートのコンセプトから開発された。ＡＤＳＣシートは、インビトロで脂肪組織から骨組織への道筋を啓発した。足場フリーのＡＤＳＣシート由来の骨はインビトロで作製されているが、骨のサイズ及び形状の精密な制御を実現することは困難である。骨組織成分のより小さいユニットが、この課題の解決策になることが示唆された。設計した足場に沿って小さいユニットをアセンブリングすることにより、成分を大きいサイズにすることができた。
シート培地は、骨由来のＡＤＳＣビーズおよびＡＤＳＣビーズを作製するための鍵の１つである。アスコルビン酸の濃度を精巧に改変することにより、コンフルエント状態のＡＤＳＣをＡＤＳＣシートにすることができた。
培養容器からの自発的剥離は、成熟ＡＤＳＣシートの特徴の１つである。従来の方法でＡＤＳＣシート及びＡＤＳＣシート由来の骨を作製することは好ましくないが、細胞の状態に合わせて培養培地を精巧に改変することによって、ＡＤＳＣシートを作製する手順を管理することが可能である。これはビーズ用骨芽細胞分化誘導培地の機能の１つである。微小環境は、ＡＤＳＣシートを作製して骨由来のＡＤＳＣビーズを製造するまでのプロセスを管理するために不可欠な要素である。Ｃａ２＋の濃度は、ＡＤＳＣビーズの石灰化及び骨形成に重要である。低濃度のＣａ２＋では、ＡＤＳＣビーズ中の高密度の細胞の効果的な石灰化を支持することができない。本発明者らが開発した骨形成培地は、骨形成プロセスに十分なＣａ２＋を提供することができた。
アセンブルされたＡＤＳＣビーズは、培養により融合する。複数のＡＤＳＣビーズを繋いだ複合体のサイズ及び形状は、除去可能若しくは吸収性の材料又は微細設計のケンザンピンホルダー（ｋｅｎｚａｎ ｐｉｎｈｏｌｄｅｒｓ）で作られた足場により多様でありうる。糸上にＡＤＳＣビーズをつなげるためにＡＤＳＣビーズを使用した。
【００５７】
ADSCビーズは、脂肪由来幹細胞由来骨の作製の標準化ができる。サイズが均一化したADSCビーズはアセンブルの単位として、デザインのように組み立てることができる。脂肪由来幹細胞シート由来三次元培養骨が自由に縮んで形の制御が難しい弱点を克服できる。
脂肪由来幹細胞由来骨の作製の時間標準化ができる。脂肪由来幹細胞シート由来三次元培養骨の作製は10 cm以上の培養皿を使用する。ADSCビーズのアセンブルの単位の作製環境（6-well plate）は小さく均一化しやすい。脂肪由来幹細胞ビーズ由来骨の作製ペースを制御できる。
脂肪由来幹細胞由来骨の作製の効率が良くなります。ADSCビーズのアセンブルの単位のサイズが小さくて、脂肪由来幹細胞の骨芽細胞への分化、骨形成のプロセス中細胞の物質交換の面積を確保しやすいので、脂肪由来幹細胞由来骨の作製の効率が良くなります。簡潔には、半径rの球の表面積はS=4πr2、球の体積はV=4/3πr3である。S/V=3/r。サイズが小さくなって、有効物質交換面積が大きくなる。
以上より、脂肪由来幹細胞由来骨の作製の成功率は高い。
【００５８】
ＡＤＳＣビーズは、設計された足場にしたがってアセンブルすることが可能であり、高い骨形成活性及び能力を示したことから、有望な骨形成材料である。ＡＤＳＣビーズ由来の骨は、設計された形状及びサイズで作製することができた。
ＡＤＳＣビーズは、再生成分の一種であり、設計された足場にしたがってアセンブルすることができた。これによりＡＤＳＣビーズは、ＡＤＳＣシート由来の骨よりも強い実用性を有する。本実施例により、骨三次元構造体の実用性が確認された。
【００５９】
（１）本発明の方法は、インビトロでＡＤＳＣシート由来の生体骨と同様の構造・性質を有する骨（骨三次元構造体）を、作製できる。
（２）本発明の方法は、インビトロでＡＤＳＣシート由来の大型化（直径１ｃｍとすること）が可能な略球形構造を有する骨（骨三次元構造体）を、作製できる。
（３）本発明の方法は、インビトロでＡＤＳＣシート由来の小型の緻密な構造を有する骨（骨三次元構造体）を、作製できる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、生体骨と同様の構造・性質を有する骨を作製することができる脂肪由来幹細胞シート由来の三次元構造体の作製方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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