(57)【要約】【課題】産地、採取年度、エキス抽出法などの要因による、薬効のばらつきを低減した、効果品質の保証されたクマザサエキスを有効成分として含む治癒剤組成物に用いるための薬剤を提供すること。【解決手段】クマザサ熱水抽出分画から水非混和性溶剤に分画された精製濃縮エキスを逆相クロマトグラフィーにより分離分画された低極性の精製濃縮エキスがアクアポリン発現亢進活性および毛乳頭細胞増殖亢進作用を有することを見出した。これにより、アクアポリン発現亢進剤および毛乳頭細胞増殖亢進に基づく、治癒促進効果のある医薬や食品の有効成分が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クマザサエキス調製品の有効成分を含む、アクアポリン発現亢進剤。
【請求項２】
アクアポリンがアクアポリン１及び／又はアクアポリン３である、請求項１記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項３】
さらに、毛乳頭細胞増殖亢進作用を有する、請求項１又は２記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項４】
クマザサエキス調製品がクマザサの熱水抽出分画エキスである、請求項１〜３のいずれか一項記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項５】
クマザサエキス調製品が、熱水抽出分画エキスから、水非混和性溶剤に分画された精製濃縮エキスである、請求項１から４のいずれか一項記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項６】
クマザサエキス調製品が、熱水抽出分画エキスから水非混和性溶剤に分画された精製濃縮エキスを逆相クロマトグラフィーにより分離分画された低極性の精製濃縮エキスである、請求項１から５のいずれか一項記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項７】
クマザサエキス調製品が、熱水抽出分画エキスから水非混和性溶剤に分画された精製濃縮エキスおよび、さらに逆相クロマトグラフィーにより分離分画分された低極性の精製濃縮エキスの中の一つからゲル濾過により分画された精製濃縮エキスである、請求項１から６のいずれか一項記載のアクアポリン発現亢進剤。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項記載のアクアポリン発現亢進剤を有効成分として含む、治癒促進剤。
【請求項９】
クマザサからその作用機序効果を指標として、熱水による抽出工程に続き、さらに水非混和性溶剤による分画工程、逆相クロマトグラフィーによる低極性成分分画工程、ならびにゲル濾過分離により特定の分子量成分を精製濃縮する工程、の一つまたは、その組み合わせを行うことを特徴とする、クマザサ精製濃縮エキス製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クマザサエキスの作用機序因子ならびに作用機序を見出し、その作用機序効果を指標として分画されたクマザサ調製品を有効成分として含むことを特徴とするアクアポリン発現亢進剤、それを含む治癒促進剤及びそれらの製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリン（aquaporin：以下ＡＱＰと略すことがある）は、膜６回貫通蛋白質で、細胞内の水分量を調節する水チャネルとして機能する重要な蛋白質である。アクアポリンは細菌から哺乳類に至るまで普遍的に存在しており、これまでに哺乳類で、ＡＱＰ０からＡＱＰ１２まで１３種類のアクアポリンが確認されている。（非特許文献１）
【０００３】
これまでにアクアポリンの臓器における減少とその疾患に対する影響に関しては、次のようなことが知られている。潰瘍性大腸炎では、大腸のAQP3の減少により、下痢、下血、体重減少が生じる。また抗がん剤の臓器に与える影響として、腎臓においてAQP1,2,3の発現が減少し、腎毒性発症につながること、大腸においてAQP3の発現が減少し、下痢につながることが知られている。さらには、皮膚においてAQP3の発現減少が、ドライスキン、老人性乾皮症、毛髪の成長抑制に影響を及ぼすといわれている。腎臓においてはAQP9が減少し、脂肪肝などの腎臓疾患との関連が報告されている。（非特許文献２）
【０００４】
その観点に立ち、それぞれの臓器におけるアクアポリンの発現調節剤（発現亢進、発現産生、発現抑制）として、有効な成分の研究、並びにその用途の研究開発がすすめられてきた。
【０００５】
リラキシンによる哺乳動物組織でのアクアポリンの調節が開示されている（特許文献１）。
ケイガイエキスを有効成分とする、創傷治癒促進剤として用いるためのアクアポリン３の発現亢進剤が開示されている（特許文献２）。
美白剤、抗老化剤、皮膚化粧料として用いるためのアクアポリン３産生・発現促進剤としての、種々の植物エキスが開示されている（特許文献３、特許文献４）。
【０００６】
一方、イネ科ササ属のクマザサ（くまざさ、熊笹、隈笹：学名 Ｓａｓａ ａｌｂｏｍａｒｇｉｎａｔａ又はＳａｓａ ｖｅｉｔｉｃｈｉ）の葉は、その抗菌作用や防腐作用を生かして食品の包装材などに広く活用されてきた。薬理学的研究によれば、抗潰瘍作用、抗腫瘍作用、抗炎症作用、鎮静作用、解毒作用、利尿作用を含めた様々な活性が確認されている。加えて、近年では、クマザサエキスにストレス性潰瘍、幽門結紮潰瘍（胃酸による潰瘍）、アスピリンおよびカフェイン等の薬剤性潰瘍に対して抗潰瘍作用が確認されており、抗腫瘍作用、細胞修復促進作用等の効果も報告されている。また、上皮組織および筋組織の再生、抗菌作用、抗腫瘍作用を目的としてクマザサエキスを直接、熱傷や創傷の患部に適用することも行われ、その効果が確認されている。（特許文献５）。クマザサエキスの薬効効果は、商品としては、皮膚外用剤、化粧剤、また養毛剤として開示されているが、その作用機序活性効果を特定した有効成分含有物を開示する特許文献は少ない。
【０００７】
一つの例として、毛髪促進作用にすぐれた養育毛剤（特許文献６）として、植物エキスの中の一つとして、クマザサエキスが示されているが、その活性因子は開示されていない。一方、線維芽細胞増殖因子５の阻害活性を有するササエキス調製品を、少なくとも有効成分として含有することを特徴とする育毛剤組成物（特許文献７）に、そのエキスの抽出
調製法とその阻害活性因子が特定されたものが見られるのみである。
【０００８】
また、クマザサエキスを得る製造方法、抽出法に関しては、先行特許技術に既に多くの開示がある（特許文献８，９，１０，１１）。
さらに熱水による抽出法としては、以下の開示がある。
「クマザサ濃縮エキス及びその製造方法」が開示されている（特許文献１２）。
「竹・笹類抽出物の製造方法」（特許文献１３）においてはクマザサもしくはクマザサ抽出成分を、水非混和性溶剤で抽出する工程を含むことを特徴とするクマザサ抽出物の製造方法が開示されている。
「親水相型クマザサ食品組成物及びその製造方法」（特許文献１４）として、クマザサ由来の親水化成分を抽出する方法とその組成物が示されている。
またクマザサを１ないし３気圧下で熱水抽出する方法及び熱水抽出物を有効成分とする外皮用剤（特許文献１５）が記されている。
【０００９】
しかしながら、クマザサエキスにアクアポリン発現亢進作用及び毛乳頭細胞増殖亢進作用があることを見出し、それを有効成分として含む治癒促進剤としてもちいるための明確な作用機序に基づいて効果を発揮する薬剤（作用機序効果剤）を開示するものは見られない。また、それらの開示技術は、エキスの製法として分画された成分に、作用効果がみられたことを開示するのみであり、アクアポリンの発現亢進活性のような作用機序効果を指標として、クマザサの熱水抽出分画物を、精製・濃縮し、有効成分のみを分画取得する製法、ならびにそのアクアポリン発現亢進剤などの作用機序効果剤としての濃縮組成物は知られていない。植物エキスには、種々の成分が含まれており、しかもその複合的効果と思われる、多様な疾病の治癒促進剤としての有用性が多く謳われてきた。しかし、作用機序効果としてのアクアポリンなどの発現亢進作用を指標として、その精製、濃縮をすすめる工程からなる製法、ならびに、アクアポリンなどの発現亢進作用を有する有効成分のみを抽出、精製、濃縮されたクマザサエキスによる治癒促進剤に用いるための作用機序効果剤は知られていない。さらに、作用機序効果を指標とすることにより、その作用機序に無効な成分が排除され、天然物エキスの特定治癒効果の強化と副作用の低減が図れる概念は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表2013-522225
【特許文献２】特開2011-32191
【特許文献３】特開2012-162487
【特許文献４】特開2011-190185
【特許文献５】特開2006-347999
【特許文献６】特開平10-045539
【特許文献７】特許第4757665号
【特許文献８】特公平03-067052
【特許文献９】特公平03-076053
【特許文献１０】特公平03-067054
【特許文献１１】特公平03-073527
【特許文献１２】特開2003-321384
【特許文献１３】特開2004-359628
【特許文献１４】特開2005-210912
【特許文献１５】特開2005-298460
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】生化学 第８６巻第１号，pp.４１−５３（２０１４）「アクアポリンの構造，機能，およびその多様性」  脊椎動物を中心として
【非特許文献２】日薬理誌第122巻第3号 2003年9月  「薬物ターゲットとしての水チャネル」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
作用機序の観点から、天然物エキスを見出し特定することは、その有効成分を含有する治癒促進剤の効果品質を保証する上で、重要な課題である。また、多様な治癒促進効果のある天然エキスから、特定の治癒効果を強化するエキスを得ることも重要な課題である。しかしながら、特定の治癒効果を評価するには多大な資源投入が必要であり、簡便な評価手法により強化エキスを得ることも大きな課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、アクアポリンの薬理学的研究として、アクアポリンの発現する細胞とその疾病、薬効との作用機序を見出す研究をすすめる中で、アクアポリンの発現亢進活性のある物質を、従来から薬効が知られている天然物エキスの中に見出す検討をすすめてきた。そして、臓器由来細胞株を用いてアクアポリンの誘導能を検討する過程で、クマザサエキスにその活性を見出した。
具体的には、クマザサエキスは、臓器由来細胞株である皮膚上皮由来細胞、大腸由来細胞には、AQP3の濃度依存的発現亢進効果を発揮することを見出し、また、毛髪の毛乳頭細胞においてAQP1の濃度依存的な発現亢進という作用機序因子効果、および毛乳頭細胞の増殖促進活性という作用機序効果を発揮することを見出した。
【００１４】
本発明者らは、アクアポリンの研究の過程で、クマザサエキスに、アクアポリン１，アクアポリン３の濃度依存的発現亢進の作用機序因子効果を見出し、その治癒剤としての有用性を見出した。さらには、アクアポリンの発現亢進を有効成分の分画の指標として、クマザサからの熱水抽出物を、分画精製濃縮する工程をへることにより、無効分画分を除去して、少量有効成分からなる作用効果の強化されたエキス組成物を得ることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
本発明の治癒促進剤組成物に用いるための薬剤（アクアポリン発現亢進剤）は、アクアポリンの発現亢進活性を有するクマザサエキス（以下、本発明のクマザサエキスとよぶことがある）を少なくとも有効成分として含有しているものである。クマザサから、抽出、分画、精製により、微量でアクアポリンの発現亢進活性等を有する治癒促進剤組成物に用いるための薬剤の有効成分を得ることができる。
【００１６】
本発明のクマザサエキスは、例えば、クマザサの生葉を乾燥し細かく剪断させ、これを浸水し、水溶性物質を滲出させて煮沸し、適宜濃縮したものである。濃縮の方法としては、熱を加えない一般的な減圧濃縮調製品にてもアクアポリン発現亢進作用を有するが、好ましくは、高圧下での水の高温煮沸による加水分解を伴う加熱抽出濃縮クマザサエキスが明らかにより高いアクアポリン発現亢進作用を示す。また、本発明のクマザサエキスは、さらに、アクアポリンの発現亢進活性を指標として、水非混和溶媒での分画、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの精製、濃縮により、微量のクマザサエキスで、同等のアクアポリン活性を得ることが可能である。
【００１７】
本発明のクマザサエキスのアクアポリンの発現亢進活性は、毛髪、皮膚、大腸のAQP誘導能を評価するために、細胞として、臓器由来細胞株を用いて見出されたものである。毛髪は毛乳頭細胞、皮膚上皮由来細胞はKeratinocyte細胞、結腸癌由来細胞はHT-29細胞が好ましい。播種した細胞に、希釈倍率により濃度を変化させてエキスを添加し、培養し数点条件を変え、クマザサエキスの製法の違いによる、皮膚、大腸中のAQPｍRNA発現量を指
標として評価することによりアクアポリンの発現亢進活性が見出された。クマザサエキスの活性作用として、毛乳頭細胞においては、AQP1の濃度依存的発現誘導亢進作用とともに、毛乳頭細胞の増殖促進が見出された。皮膚、大腸由来の細胞株においてはAQP3が、クマザサエキスに対し濃度依存的に発現誘導亢進する作用を有することが見出された。クマザサエキスのこれらアクアポリン発現亢進により、毛髪、皮膚、大腸における治癒促進効果が期待される。本発明は、なお、それらを有効成分とする予防治療薬、食品添加物、健康・機能食品などとしても提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、臓器由来細胞株による、アクアポリンの発現亢進などの作用機序効果を指標として、天然物エキスであるが故の、産地、採取年度、エキス抽出法などの要因による、薬効のばらつきを低減した、効果品質の保証されたクマザサエキスを有効成分として含む治癒剤組成物に用いるための明確な作用機序に基づく効果を奏する薬剤（作用機序効果剤）が提供される。また、アクアポリンの発現亢進などの作用機序効果を指標として、クマザサエキスを、分画、精製、濃縮することで、真に有効な活性成分を含む組成物ならびにその製造方法が提供される。
【００１９】
本発明のクマザサエキス含有治癒促進剤に用いるための薬剤は、毛乳頭細胞でのAQP1の発現亢進、細胞の増殖亢進や、皮膚上皮細胞や大腸細胞での、AQP3の発現亢進を促すことから、細胞増殖が活発になり、皮膚や消化管の上皮細胞や口腔の上皮細胞の傷がなおる創傷治癒効果を示す。なお、クマザサエキスの精製、濃縮の製造工程でアクアポリン発現亢進などの作用機序効果を指標として評価するプロセス管理により、天然物由来の治癒剤によくみられる薬効のばらつきの低減を図るとともに、指標とする作用機序の非有効成分を排除することによる副作用の低減に伴う安全性の更なる確保と少量有効成分のみによる治癒効果の強化増進の効果もしめす。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、ホシ隈笹エキスの分画スキームを示す。
【図２】図2は、ホシ隈笹エキスのAQP3誘導活性試験の結果を示す。
【図３】図3は、ホシ隈笹エキス精製分画のAQP3誘導活性試験の結果を示す。Aはクロロホルム分配抽出により得られた画分、Bはさらに5溶媒系で分配抽出した画分、Cはさらに4溶媒系で分配抽出した画分、Dはさらに逆相クロマトグラフィーにより精製した画分、Eはさらにゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより得られた画分のAQP3誘導活性試験の結果を示す。
【図４】図4は、ホシ隈笹エキス及びその精製分画G2のAQP1誘導活性試験の結果を示す。
【図５】図5は、ホシ隈笹エキス及びその精製分画G2の毛乳頭細胞増殖促進試験の結果を示す。
【図６】図6は、ホシ隈笹エキス及びその精製分画G2の表皮角化細胞におけるAQP3誘導活性試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を、クマザサエキスの抽出、分画による精製濃縮工程、アクアポリンの発現亢進について詳細に説明する。
【００２２】
クマザサエキス調製品
本発明におけるクマザサエキス調製品の一態様は、クマザサから得られる、図1に示された、抽出、精製、濃縮された活性のある有効成分組成物であり、クマザサの熱水抽出分画エキス、水非混和性溶剤による分画精製濃縮されたエキス、逆相クロマトグラフィーにより分画されたエキス、ゲル濾過カラムによる分画されたエキスを包含するものである。
【００２３】
クマザサはイネ科ササ属のクマザサ（くまざさ、熊笹、隈笹：学名 Ｓａｓａ ａｌｂｏｍａｒｇｉｎａｔａ又はＳａｓａ ｖｅｉｔｉｃｈｉ）と呼称されるものであり、特に好ましくは、クマザサの葉から有効成分を得るものである。本発明では、図１のどの抽出、精製濃縮工程で得られる分画分をエキスとして用いても良いが、熱水抽出物から、各分画工程で、精製され、有効成分のみ濃縮されていく、同等の活性を保持する、より少量の組成物が望ましい。特に好ましいのは、すべての分画工程を経て、最終分画工程であるゲル濾過カラムにより分画されたエキスである。
【００２４】
クマザサの熱水抽出エキス
熱水抽出エキスは、有機溶媒などの抽出でなく、水のみを抽出溶媒とするエキスであり、その熱水の温度などの抽出条件に関しては、特に限定されるわけではないが、以下の方法により、より好適に得ることができる。まず、クマザサの生葉を乾燥し細かく剪断させ、これを浸水し、水溶性物質を滲出させて煮沸し、適宜濃縮する。濃縮の方法としては、熱を加えない減圧濃縮が挙げられ、更に好ましくは、高圧下において煮沸し、抽出および二回目の濃縮を行う。ここで行われる濃縮は、抽出溶媒である水を減らすことによる水分濃度濃縮である。なお、好適な煮沸の条件は、圧力は約７気圧、煮沸温度はカラメル変質温度２００℃に達しない有効温度、例えば約１２０〜１６０℃、煮沸時間は６〜１２時間である。この方法では、高圧下において加熱水抽出を行うことにより、抽出温度を高温とすることができ、特殊な溶剤を使用せずに、クマザサに含まれる有効成分を効率的に抽出および濃縮を行うことができる。
【００２５】
また、上記方法のように高圧下により沸点を上昇させるのではなく、媒体、例えば、約１２０℃〜１６０℃の過熱水蒸気、重曹、空気等を装入することにより、沸点を上昇させ、煮沸温度を上昇させることもできる。その他、上記二回目の濃縮工程の際に、既に二回の濃縮を終了した濃縮溶液を添加して濃縮を行い、得られた溶液に温水を加えて煮沸し、上澄み液を取り、濃縮した後、冷却させ沈殿させる工程を順次施して最終薬効成分を得る方法も好適に使用することができる。
【００２６】
なお、クマザサエキスの好適に使用できる熱水抽出エキスの市販品としては、ホシ隈笹（クマザサ）エキス（星製薬（株）製）を挙げることができる。
【００２７】
水非混和性溶剤による分画精製濃縮されたエキス
水非混和性溶剤は、水混和性溶剤と組み合わせることにより、クマザサの熱水抽出成分を、液液分配し分画するために用いる溶剤で、混合により、2層に分離し、そのそれぞれの層に溶解させることにより分画するために用いる。したがって、水、メタノール、エタノール、アセトンは水非混和性溶剤に含まれない。水非混和溶剤の具体例としては、一般的にヘキサン、シクロヘキサン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどがあげられる。
【００２８】
本発明においては、好ましくは、クマザサの熱水抽出物をクロロホルムにて、液液分配を行い、まずは、クロロホルム層に分配された水非混和性溶剤分画分を得たのち、クロロホルム層を減圧濃縮して、精製固形物をまず得る。さらに、このクロロホルム分画分をヘキサン−酢酸エチル−２-プロパノール−エタノール−水の5溶媒系に溶解し、その2層系で、液液分配を行う。その結果、有機溶媒を主成分とした上層と水を主成分とした下層が得られるので、両相のアクアポリン活性の評価を行う。上層にのみ活性が確認されたため、さらに、ヘキサン−クロロホルム−メタノール−水からなる4溶媒系に溶解し、その2層系で液液分配を行う。有機溶媒を主成分とした下層と水を主成分とした上層が得られ、下層のみに活性が見られることから、水非混和性溶剤による分画精製濃縮が行われた。
【００２９】
逆相クロマトグラフィーにより分画されたエキス
分離精製クロマトグラフィーということで、好ましくはシリカゲルを基材としたODSカラムを用い、逆相クロマトグラフィーにより、４溶媒系の下層に得られた分画精製物のさらなる分離を行う。ステップワイズモードの分離により、６０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノールを移動相として用い、3つの溶出画分を得た。１００％メタノール層に強い活性が見られることから、低極性成分に活性効果があることが見出された。
【００３０】
ゲル濾過カラムによる分画されたエキス
ゲル濾過カラムにより、好ましくは移動相としてクロロホルムを用い、分離はアイソクラティックモードで行う。3つの時間内に溶出した画分をえて、分子量としての分画を行い、各画分のアクアポリン活性を評価し、精製濃縮組成物を得るのが望ましい。
【００３１】
クマザサエキスの精製、濃縮による各分画の固形分重量変化
実施例においては、クロロホルム分画分固形物約100グラムが、次の5溶媒系の有機溶媒を主成分とする上層画分として、約70gに精製濃縮され、さらに4溶媒系において、50gが有効成分として得られる。その５０ｇが、逆相クロマトグラフィーによるメタノール１００％移送液画分として、より低極性の有効成分として、約３ｇが得られる。ゲル濾過カラムにより、分子量として3画分に分画し、その中で、分子量として、中間の画分が、有効成分として約１ｇが得られる。
【００３２】
作用機序効果およびアクアポリン発現亢進剤
本発明においては作用機序効果として、作用機序因子として見出されたアクアポリンの発現亢進効果、特に、アクアポリン１、アクアポリン３の発現亢進のことを指す。さらには、作用機序因子そのものではないが、毛乳頭細胞増殖亢進という作用機序を見出したことによる作用機序効果のことも含む。作用機序効果を指標として調製されたクマザサエキス調製品を有効成分とするアクアポリン発現亢進剤は、好ましくは、アクアポリン１発現亢進剤、および／またはアクアポリン３発現亢進剤を指す。さらには、毛乳頭細胞増殖亢進剤も含む。
ただし、作用機序効果に関しては、これらに限定されるものではなく、アクアポリン発現亢進剤はアクアポリン発現亢進および毛乳頭細胞増殖亢進以外にも、治癒促進に有効な作用機序を有していてもよい。
【００３３】
クマザサエキスの精製、濃縮による各分画のアクアポリン活性
各精製、濃縮の段階で、アクアポリン活性、特にアクアポリン３の発現亢進活性を指標として、有効分画のみを得ることにより、例えば、当初の約100gから１００分の１の最終分画分、約１ｇの精製、濃縮組成物が得られる。
【００３４】
それぞれの分画分でのアクアポリン活性強度は、当初と同等のアクアポリン濃度依存的亢進活性を示すのに必要な各画分の濃度を評価することで得られる。図２、図３には、クマザサエキスの各画分のAQP3の発現亢進活性に必要な濃度が示されており、熱水抽出エキスと比較して、最終分画であるゲル濾過分離の有効分画では、２０００分の１の微量で同等のAQP3発現亢進が見出された。図４に示す如く当初の熱水抽出有効成分と同等のAQP1発現亢進効果が、最終有効分画分では約50分の1の量で得られる。また、図５に示す如く、毛乳頭細胞増殖促進効果が約50分の１の量で得られる。このように、アクアポリンの活性を指標として、精製、濃縮することでアクアポリンの活性に有効な成分よりなる組成物のみを得ることが見出され、特に、AQP3の発現効果においてはそれが、著しいことが見出された。本発明により、アクアポリン発現亢進を介しての治療促進剤の効果が増強されたクマザサエキスの精製濃縮組成物、その製法が見出された。
【００３５】
クマザサエキスのアクアポリンの活性・治癒効果
以下、本発明のアクアポリンの評価手法及び活性・治癒効果を詳細に説明する。
【００３６】
アクアポリン
非特許文献１に示されるように、AQPは内在性膜タンパク質の一種であり，構造上，主要内在性タンパク質（major intrinsic protein：MIP）スーパー ファミリーに属する。哺乳類のAQPとしては，主に１３種類（AQP０〜AQP１２）報告されている。これらは，その特性や構造により，水のみを透過 させる狭義AQP（classical AQP），そして水だけでなくグリセロールや尿素などの電気的中性の低分子も透過させるアクアグリセロポリン（aquaglyceroporin）に大別される。本発明によって見出されたアクアポリン発現亢進作用の中でAQP1は水のみを透過させる狭義AQPであり、AQP3は水だけでなく、グリセロールや尿素などの電気的中性の低分子も透過させるというアクアグリセロポリンに属すという共通の特徴を示す。
その意味では、本発明のクマザサエキスは、狭義のみならず、広義のAQPの機序にも幅広い効果があることが見出された。
【００３７】
アクアポリン１
AQP1は、赤血球のみならず、脳、腎臓、肺、胆管、眼、内耳など様々な組織に発現しており、また血管では内皮細胞と平滑筋細胞に発現するといわれている。AQP1は、水のみを透過させる狭義のAQPに属するが、水チャンネルとしてだけでなく、血管拡張に寄与するNOを通すガスチャンネルとしても機能するといわれている。本発明では、毛髪に関与する毛乳頭細胞にAQP1が発現し、クマザサエキスによるその発現亢進作用が見出された。また、クマザサエキスにより毛乳頭細胞の増殖亢進作用が見出されており、毛母細胞、血管などとの相互効果により、毛髪剤、特に養毛剤、育毛剤としての治癒促進剤としての有用性に関連する。
【００３８】
アクアポリン３
AQP３はアクアグリセロポリンに属し，腎臓，皮膚，消化管，気道などの上皮細胞に発現している。特に、腎臓、消化管での水吸収や皮膚などでの、水、グリセロール吸収に関与しているといわれている。本発明では、皮膚、大腸細胞に対してクマザサエキスは、AQP3の発現亢進を示しており、皮膚、大腸の水の吸収チャンネルという意味では、便秘、下痢などの大腸の代表的な疾患及び皮膚疾患の治癒促進剤としての有用性に関連する。
【００３９】
治癒促進剤
本発明のクマザサエキスはそのアクアポリン発現亢進作用および毛乳頭細胞増殖亢進作用にもとづき、治癒促進剤の有効成分として使用することができる。治癒促進剤としては、便秘、下痢などの大腸疾患及び皮膚疾患などの疾患の治癒促進剤のみならず養毛剤、育毛剤などの毛髪の状態の治癒を促進する薬剤も含まれる。
本発明の治癒促進剤におけるクマザサエキスの含有率は治癒促進効果が発揮される量であればよいが、例えば、１〜５０質量％、好ましくは５〜３０質量％である。
本発明の治癒促進剤はクマザサエキスを、通常の医薬の調製に使用される担体と組み合わせることによって調製することができる。ここで、担体としては薬理学的に許容されるものであればよいが、可溶化剤、ｐH調整剤、賦形剤、保存剤、乳化剤、防腐剤、色素、矯味矯臭剤、増粘剤などが例示される。
本発明の治癒促進剤の剤形としては、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、粉剤、塗布剤、乳剤、噴霧剤、滴剤、散剤、貼付剤、ドレッシング剤などがあり、必要に応じて適当な賦形剤を加えることができる。賦形剤は、一般的に医薬品・医療用機器・医薬部外品等に用いられるものであれば種類を問わない。例えば、ポリビニルアルコール、グリセロール、キトサン、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリプロピレングリコールなどが挙げられる。
【００４０】
アクアポリン活性評価手法
アクアポリンの活性評価を下記に詳細に示す。
【００４１】
細胞実験
毛髪、皮膚、大腸のAQP誘導能を評価するために、細胞として、臓器由来細胞株を用いた。例えば、皮膚上皮由来細胞はKeratinocyte細胞、結腸癌由来細胞はHT-29細胞が好ましい。毛髪に関しては、毛乳頭細胞を用いた。播種した細胞に、希釈倍率により濃度を変化させてエキスを添加し、培養し数点条件を変え評価するのが好ましい。クマザサエキスの抽出、分画、精製濃縮の違いによるスクリーニングが可能となり、毛髪、皮膚、大腸細胞株中のAQPｍRNA発現量を指標として比較した。
【００４２】
細胞からのRNA抽出
培養後、各種細胞株よりtotalRNAを精製し、好ましくは、吸光度測定によりRNA濃度の算出および純度の確認を行う。
【００４３】
Real-time PCR
RNAからｃDNAを合成し、ｈAQP1,ｈAQP3、をtargetとしたプライマーを作成し、real-time PCRを行い、各遺伝子の発現を確認する。ｍRNA発現量はGAPDHｍRNAを用いて標準化した。
【００４４】
毛乳頭細胞増殖活性評価
ヒト頭頂部由来毛乳頭初代培養細胞（Human Follicle Dermal Papilla Cells（HFDPC）；Code No. CA60205a, Cell applications）を用いて、エキスの細胞増殖活性を評価した。
【００４５】
［実施例］
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
ホシ隈笹エキスのAQP3誘導活性を保持した分画
図1に示したホシ隈笹エキスの分画スキームに沿って、クロロホルムを用いた分配抽出、5溶媒系を用いた溶媒抽出、4溶媒系を用いた溶媒抽出、逆相カラムクロマトグラフィー及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用い、活性を2000倍に濃縮したG2画分を得た。
【００４７】
まず、ホシ隈笹エキス 15.5 kg を精製水を用い、容量比で 4 倍希釈し、等量のクロロホルムで2回分配抽出を行った。クロロホルム層は、減圧濃縮し、クロロホルム画分 (CHCl3ext.) 約100 gを得た。
【００４８】
CHCl3 ext.（約100 g）をヘキサン-酢酸エチル-2-プロパノール-エタノール-水 17:40:15:25:40 の5 溶媒からなる 2 層系で液々分配を行い、上層（5sol. upper）約70 g、下層（5sol. lower）約30 gを得た。
【００４９】
5sol. upper画分（約70 g）をヘキサン-クロロホルム-メタノール-水 (1:5:5:2) からなる 2 層系で液々分配し、上層（4sol. upper）約20 g、下層（4sol. lower）約50 gを得た。
【００５０】
4sol. lower画分（約50 g）を ODS を充填剤としたガラスカラム（ODS-SM-50B, 26×300 mm, YAMAZEN）を用いた逆相クロマトグラフィーにより分画した。移動相として60%メタノール、70%メタノール及び100%メタノールを順次用い、流速は 10 mL/min とした。その
結果、60%メタノール溶出画分（MPLC60）約35 g、70%メタノール溶出画分（MPLC70）約7 gおよび100%メタノール溶出画分（MPLC100）約3 g を得た。
【００５１】
MPLC100画分（約3 g）を、ゲルろ過カラム(GPC K801, 8.0×300 mm, Shodex）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分画した。この時移動相はクロロホルムを用いた。その結果、G1: 約1.3 g、G2画分約1 g、G3画分約0.1 gを得た。
【実施例２】
【００５２】
ホシ隈笹エキス各画分のAQP3誘導活性
実施例1で得た各精製画分のAQP3誘導活性の測定を行った。
【００５３】
ヒト結腸癌由来細胞株HT-29細胞を24ウェルプレートに播種し、90%コンフルエントの状態まで37℃、CO25%の条件下で培養した。「ホシ隈笹エキス」およびその精製画分を調製し、細胞に添加後、6時間培養した。トリプシン処理により剥離したHT-29細胞からtotal RNAを精製した。得られたRNA 1 μgから High capacity cDNA synthesis kitを用いてcDNAを合成した。これをTE bufferにて20倍希釈し、cDNA TE buffer溶液とし、real-time PCRを行い、各遺伝子の発現を検出した。mRNA発現量はGAPDH mRNAを用いて標準化した。なお、実験には5〜15系代目の細胞を使用した。
【００５４】
ホシ隈笹エキスのヒト結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、ホシ隈笹エキス未添加と比較してアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図2に結果を示した。
【００５５】
クロロホルム分配抽出により得られた画分の結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、CHCl3 ext. 画分のみがアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図3に結果を示した。
【００５６】
5溶媒系分配抽出により得られた画分の結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、5sol.
upper 画分のみがアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図3に結果を示した。
【００５７】
4溶媒系分配抽出により得られた画分の結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、4sol.
lower 画分のみがアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図3に結果を示した。
【００５８】
逆相クロマトグラフィーにより得られた画分の結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、MPLC100 画分のみがアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図3に結果を示した。
【００５９】
ゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより得られた画分の結腸癌由来細胞への影響を試験した結果、G2画分のみがアクアポリン３の発現量の増加作用を有することが確認できた。尚、図3に結果を示した。
【実施例３】
【００６０】
ホシ隈笹エキス各画分のAQP1誘導活性
実施例1で得た各精製画分のAQP1誘導活性の測定を行った。
【００６１】
ヒト頭頂部由来毛乳頭初代培養細胞（Human Follicle Dermal Papilla Cells（HFDPC）；Code No. CA60205a, Cell applications）を24ウェルプレートに播種し、90%コンフルエントの状態まで37℃、CO25%の条件下で培養した。「ホシ隈笹エキス」およびその精製
画分を調製し、細胞に添加後、6時間培養した。添加にあたっては、無血清状態で添加した。トリプシン処理により剥離したHFDPC細胞からtotal RNAを精製した。得られたRNA 0.5 μgから High capacity cDNA synthesis kitを用いてcDNAを合成した。これをTE bufferにて10倍希釈し、cDNA TE buffer溶液とし、real-time PCRを行い、各遺伝子の発現を検出した。mRNA発現量はGAPDH mRNAを用いて標準化した。なお、実験には2-5代目の細胞を使用した。
【００６２】
（ホシ隈笹エキスのAQP1 誘導活性試験の結果）
ホシ隈笹エキスのヒト頭頂部由来毛乳頭初代培養細胞への影響を試験した結果、ホシ隈笹エキス未添加と比較して500 mg/mLでアクアポリン1の発現量の増加作用を有することが確認できた。また、G2画分も同様に試験した結果、2.5 mg/mL でホシ隈笹エキスと同等の活性を示した。尚、図4に結果を示した。
【実施例４】
【００６３】
ホシ隈笹エキス各画分の毛乳頭細胞増殖誘導活性
実施例1で得た各精製画分の毛乳頭細胞増殖誘導活性の測定を行った。
【００６４】
ヒト頭頂部由来毛乳頭初代培養細胞（Human Follicle Dermal Papilla Cells（HFDPC）；Code No. CA60205a, Cell applications）を密度5×102 cell/wellで96ウェルプレートに播種し、48時間、37℃、CO25%の条件下で培養した。48時間後、「ホシ隈笹エキス」およびG2画分を調製し、細胞に添加後、48時間培養した。48時間後、エキス添加培地を除去し、10% Cell Proliferation Reagent WST-1試薬含有培地に変更した。その後、4時間経過後の吸光度（主波長；450 nm、副波長；660 nm）をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００６５】
ホシ隈笹エキスの毛乳頭細胞の増殖への影響を試験した結果、ホシ隈笹エキス未添加と比較して250 mg/mLで毛乳頭細胞の増殖誘導作用を有することが確認できた。また、G2画分も同様に試験した結果、5 mg/mL でホシ隈笹エキスと同等の活性を示した。尚、図5に結果を示した。
【実施例５】
【００６６】
ホシ隈笹エキス各画分のAQP3誘導活性
実施例1で得た各精製画分のAQP3誘導活性の測定を行った。
【００６７】
ヒト表皮角化細胞株HaCaT細胞を24ウェルプレートに播種し、90%コンフルエントの状態まで37℃、CO25%の条件下で培養した。「ホシ隈笹エキス」およびその精製画分を調製し、細胞に添加後、6時間培養した。添加にあたっては、無血清状態のMCDB153培地を用いて添加した。トリプシン処理により剥離したHaCaT細胞からtotal RNAを精製した。得られたRNA 1 μgから High capacity cDNA synthesis kitを用いてcDNAを合成した。これをTE bufferにて20倍希釈し、cDNA TE buffer溶液とし、real-time PCRを行い、各遺伝子の発現を検出した。mRNA発現量はGAPDH mRNAを用いて標準化した。なお、実験には5-15代目の細胞を用いた。
【００６８】
（ホシ隈笹エキスのAQP3 誘導活性試験の結果）
ホシ隈笹エキスのヒト表皮角化細胞株への影響を試験した結果、ホシ隈笹エキス未添加と比較して500 mg/mLでアクアポリン3の発現量の増加作用を有することが確認できた。また、G2画分も同様に試験した結果、25 mg/mL でホシ隈笹エキスと同等の活性を示した。尚、図6に結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
天然物エキスは、現在トクホ、機能性表示食品としても広く用いられているが、科学的根拠、すなわち作用機序にもとづいての、疾病予防への品質の安定した機能効果が強く求められている。また、天然物由来のエキスであり、抽出源である天然物原料の成分、エキス抽出法のばらつきにより、そのエキス成分、その作用効果の再現性、安定性、品質保証などに課題があった。本発明は、エキスの作用機序効果、すなわちクマザサエキスのアクアポリン発現亢進活性を見出し、さらにはそれを指標としてのクマザサエキスを分画精製濃縮する工程により、その作用機序効果に対する無効組成成分を排除し、作用効果の強化された有効組成成分からなる濃縮組成物を得ることが可能になった。そのため、少量で効果を発揮する、機能性添加剤、錠剤形態のサプリメントなども可能となる。また、その無効成分による副作用の低減にも資することが可能になった。その意味では、複雑な成分からなる天然エキス組成物から、作用効果のみ強化された精製・濃縮有効組成物を得る手法として、さらには、単なる疾病予防効果をうたう従来の機能表示ではなく、作用機序成分をそのエキスの有効成分量表示として記載できる等の進歩性、有用性が得られ、品質の安定した天然物エキスの産業上の利用可能性に大きく貢献する。
【００７０】
このことにより、天然物エキスという様々な成分を含む組成物ならではの相乗効果的な効果を生かしつつ、その作用機序効果を指標として分画、精製濃縮することにより、作用機序の作用効果が強化された、より有効な成分のみによる組成物エキスの提供は、科学的根拠に基づく、効果品質の安定した天然エキスを機能性素材として利用したいという産業的な課題を解決するものである。
【００７１】
更には、産業的な意味合いにおいて、アクアポリンのAQPｍRNA発現量を指標とすることにより、クマザサ原料、製法プロセスの条件などの違いによる品質バラツキをなくし、治癒剤としての機能の品質保証ならびに安全性の課題の解決手段にもつながる。特に、天然エキスは様々な成分が含まれており、その成分の相乗的な複合効果により、疾病の治癒促進につかわれており、その天然エキスからより有効な成分からなる組成物をえて、その治癒効果を強化しようとして、精製、濃縮する際には、その成分並びに組成比がすべて特定されているわけではない場合が多く、何を指標として分画していくかが大きな課題であった。本発明は、クマザサエキスのアクアポリン亢進作用を見出し、さらにそれを指標として、精製・濃縮工程で有効な成分を分画することにより、従来の課題を解決し、より作用の強化された治癒促進組成物を得るという産業上有用な特徴を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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