(57)【要約】【課題】ある反応によるシグナルの強度を考慮し、かつその反応時間を、基準となる別の反応の反応時間に基づいて考慮したアッセイを行う。【解決手段】アッセイプログラムは、検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるアッセイ装置内のマイクロ流路において、前記検体を特異的に検出する第１反応により生じる第１シグナルと前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応により生じる第２シグナルとを写した画像を取得するステップＳＴ４と、前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２反応の反応時間を算出するステップＳＴ１０と、前記第２反応の反応時間を前記第１反応のみなし反応時間とし、該みなし反応時間と、前記画像における前記第１シグナルの画素データとに基づいて、前記検体の濃度を算出するステップＳＴ１１とをコンピュータに実行させる。【選択図】図４
2020016460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるアッセイ装置内のマイクロ流路において、前記検体を特異的に検出する第１反応により生じる第１シグナルと前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応により生じる第２シグナルとを写した画像を取得する取得ステップと、
前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する反応時間算出ステップと、
前記反応時間算出ステップにより算出された前記第２反応の反応時間を前記第１反応のみなし反応時間とし、前記第１反応のみなし反応時間と、前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データとに基づいて、前記検体の濃度を算出する濃度算出ステップと
をコンピュータに実行させるアッセイプログラム。
【請求項２】
前記反応時間算出ステップが、
前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２シグナルの強度を算出するとともに、前記第２シグナルの強度に基づいて、前記第２反応による生成物の量を算出する第１サブステップと、
前記第１サブステップにより算出された前記生成物の量に基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する第２サブステップと
を含む、請求項１に記載のアッセイプログラム。
【請求項３】
前記濃度算出ステップが、
前記第１シグナルの強度と前記検体の濃度との関係を前記第１反応の反応時間に応じて表す複数の検量線から、前記第１反応のみなし反応時間に基づいて、少なくとも一つの検量線を選択する第３サブステップと、
前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データに基づいて、前記第１シグナルの強度を算出するとともに、算出された前記第１シグナルの強度と、前記第３サブステップにより選択された前記少なくとも一つの検量線とに基づいて、前記検体の濃度を算出する第４サブステップと
を含む、請求項１又は２に記載のアッセイプログラム。
【請求項４】
検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるアッセイ装置内のマイクロ流路において、前記検体を特異的に検出する第１反応により生じる第１シグナルと前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応により生じる第２シグナルとを写した画像を取得する取得部と、
前記取得部により取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する反応時間算出部と、
前記反応時間算出部により算出された前記第２反応の反応時間を前記第１反応のみなし反応時間とし、前記第１反応のみなし反応時間と、前記取得部により取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データとに基づいて、前記検体の濃度を算出する濃度算出部と
を備えるアッセイ支援装置。
【請求項５】
前記反応時間算出部が、
前記取得部により取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２シグナルの強度を算出するとともに、前記第２シグナルの強度に基づいて、前記第２反応による生成物の量を算出し、
算出された前記生成物の量に基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する、請求項４に記載のアッセイ支援装置。
【請求項６】
前記濃度算出部が、
前記第１シグナルの強度と前記検体の濃度との関係を前記第１反応の反応時間に応じて表す複数の検量線から、前記第１反応のみなし反応時間に基づいて、少なくとも一つの検量線を選択し、
前記取得部により取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データに基づいて、前記第１シグナルの強度を算出するとともに、算出された前記第１シグナルの強度と、選択された前記少なくとも一つの検量線とに基づいて、前記検体の濃度を算出する、請求項４又は５に記載のアッセイ支援装置。
【請求項７】
検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるマイクロ流路と、
前記マイクロ流路に設けられ、前記検体を特異的に検出する第１反応が生じる第１領域と、
前記マイクロ流路において前記第１領域と隣接するように設けられ、前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応が生じる第２領域と
を備えるアッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体を用いたアッセイを行うためのアッセイプログラム及びアッセイ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
主に生物学、化学等の分野において、μｌ（マイクロリットル）オーダー、すなわち、約１μｌ以上かつ約１ｍｌ（ミリリットル）未満の微量な試薬、処理薬等の液体を用いて検査、実験、アッセイ等を行う場合、マイクロ流路を含むアッセイ装置が利用されている。このようなアッセイ装置については、近年、費用、操作性、耐久性、及び液体の制御性能を改善すべく、ラテラルフロー型アッセイ装置、フロースルー型アッセイ装置等が用いられてきている。
【０００３】
特に、ラテラルフロー型アッセイ装置は、紙等の親水性の多孔質媒体、セルロース膜等の毛細管現象を利用して液体の移動、操作等を行うように構成されていて、シンプルになっている。そのため、ラテラルフロー型アッセイ装置は、低コストで作製することができ、ポンプ等の外部機構を必要せず、かつ煩雑な操作を必要とせず、ひいては、耐久性を向上可能となっている。そして、ラテラルフロー型アッセイ装置は、特に、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay、酵素免疫アッセイ）法、イムノクロマトグラフィー法等によって、試料中に含まれる抗体又は抗原の濃度を検出又は定量する際に用いられる。
【０００４】
このようなアッセイ装置の一例としては、チャネルと、このチャネルに連結されるアッセイ領域とが、積層された複数の多孔質媒体内に設けられていて、これらチャネル及びアッセイ領域が、積層された複数の多孔質媒体の厚さ方向全体に渡って吸収された重合フォトレジストから成るバリアによって画定されている、アッセイ装置が挙げられる。（例えば、特許文献１を参照。）
【０００５】
上記アッセイ装置の別の一例としては、本願発明者により発明されたアッセイ装置も挙げられる。このアッセイ装置は、マイクロ流路と、当該マイクロ流路の一端部と間隔を空けて配置される多孔質媒体と、マイクロ流路の一端部及び多孔質媒体間に配置される空間部とを有し、マイクロ流路内を移動してきた液体が空間部を超えて多孔質媒体と接触すると共に吸収された後に、かかる流体がマイクロ流路内に留置されるように空間部にて分離される構成である。（例えば、特許文献２を参照。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５１５８７７号公報
【特許文献２】特許第６０３７１８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酵素反応などの反応によって生じるシグナル強度（発色、発光、蛍光増幅等）は、その反応の時間によって変わる。そのため、シグナル強度だけを考慮しても正確なアッセイを行うことは難しい。本発明は、ある反応によるシグナルの強度を考慮し、かつその反応時間を、基準となる別の反応の反応時間に基づいて考慮したアッセイを行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の一態様に係るアッセイプログラムは、検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるアッセイ装置内のマイクロ流路において、前記検体を特異的に検出する第１反応により生じる第１シグナルと前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応により生じる第２シグナルとを写した画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する反応時間算出ステップと、前記反応時間算出ステップにより算出された前記第２反応の反応時間を前記第１反応のみなし反応時間とし、前記第１反応のみなし反応時間と、前記取得ステップにより取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データとに基づいて、前記検体の濃度を算出する濃度算出ステップとをコンピュータに実行させる。
【０００９】
本発明の一態様に係るアッセイ支援装置は、検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるアッセイ装置内のマイクロ流路において、前記検体を特異的に検出する第１反応により生じる第１シグナルと前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応により生じる第２シグナルとを写した画像を取得する取得部と、前記取得部により取得された前記画像における前記第２シグナルの画素データに基づいて、前記第２反応の反応時間を算出する反応時間算出部と、前記反応時間算出部により算出された前記第２反応の反応時間を前記第１反応のみなし反応時間とし、前記第１反応のみなし反応時間と、前記取得部により取得された前記画像における前記第１シグナルの画素データとに基づいて、前記検体の濃度を算出する濃度算出部とを備える。
【００１０】
別の一態様として、アッセイ装置は、検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるマイクロ流路と、前記マイクロ流路に設けられ、前記検体を特異的に検出する第１反応が生じる第１領域と、前記マイクロ流路において前記第１領域と隣接するように設けられ、前記参照物質を特異的に検出する既知の第２反応が生じる第２領域とを備える。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、酵素反応などの反応によるシグナルの強度とその反応の時間とを考慮したアッセイを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、一実施形態に係るアッセイ装置を概略的に示す平面図である。
【図２】図２は、一実施形態に係るアッセイ装置を概略的に示す分解斜視図である。
【図３】図３（ａ）〜図３（ｄ）は、一実施形態に係るアッセイ装置に試料液体を供給してアッセイを行う際のマイクロ流路の様子を示す、図１のＡ−Ａ線断面図である。
【図４】図４は、一実施形態に係るアッセイ方法を示すフローチャートである。
【図５】図５は、アッセイ支援装置の機能構成例を示す説明図である。
【図６】図６は、アッセイ支援装置のコンピュータハードウェア構成例を示す説明図である。
【図７】図７は、反応時間とその反応による生成物の量との関係の一例を示すグラフである。
【図８】図８は、複数の検量線の一例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の実施形態を説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態によって限定されるものではない。
【００１４】
後述するアッセイ装置に適用し得る試料液体は、アッセイ装置内を流れることができるものであれば、特に限定されない。かかるアッセイ装置に適用し得る試料液体は、典型的には後述する検体を含む可能性があり、そのほかに気体、別の液体又は固体を液体に溶解、分散、又は懸濁したものも含むことができる。
【００１５】
例えば、試料液体は親水性であるとよく、親水性の試料液体としては、例えば、ヒト又は動物の全血、血清、血漿、血球、尿、糞便希釈液、唾液、汗、涙、爪の抽出液、皮膚の抽出液、毛髪の抽出液、又は脳脊髄液等の生体由来の試料液体が挙げられる。この場合、アッセイ装置においては、妊娠検査、尿検査、便検査、成人病検査、アレルギー検査、感染症検査、薬物検査、がん検査等のための体外診断用医薬品、一般用検査薬、ＰＯＣＴ（PointOfCareTesting）等の用途にて、試料液体中の臨床検査、診断、又は分析上有効な検体を測定し得るが、アッセイ装置の用途は特に限定されない。また、親水性の試料液体としては生体由来の試料液体に限定されず、例えば、食品の懸濁液、飲用水、河川の水、土壌懸濁物等も挙げられる。この場合、アッセイ装置において、食品や飲用水の中の病原体を測定し得るか、又は河川の水の中や土壌中の汚染物質を測定し得る。これら親水性の液体は、典型的には、水を溶媒とするものであってよい。
【００１６】
本願明細書において、「ラテラルフロー」は、重力沈降が駆動力となることによって移動する液体の流れを指す。ラテラルフローに基づく液体の移動は、重力沈降による液体の駆動力が支配的（優位）に作用する液体の移動を指す。これに対して、毛管力（毛細管現象）に基づく液体の移動は、界面張力が支配的（優位）に作用する液体の移動を指す。ラテラルフローに基づく液体の移動と毛管力に基づく液体の移動とは異なるものである。
【００１７】
本願明細書において、「検体」は、試料液体中に存在し、かつ検出又は測定される化合物又は組成物を指す。例えば、「検体」は、糖類（例えば、グルコース）、タンパク質若しくはペプチド（例えば、血清タンパク質、ホルモン、酵素、免疫調節因子、リンホカイン、モノカイン、サイトカイン、糖タンパク質、ワクチン抗原、抗体、成長因子、若しくは増殖因子）、脂肪、アミノ酸、核酸、細胞、ステロイド、ビタミン、病原体若しくはその抗原、天然物質若しくは合成化学物質、汚染物質、治療目的の薬物若しくは違法な薬物若しくは毒物、又はこれらの物質の代謝物若しくは抗体を含むものであるとよいが、特定の検体には限定されない。なお、試料液体には、検体が含まれていない場合、あるいは検体が検出可能な量で含まれていない場合もある。「参照物質」は、検体濃度の検出のために試料液体に既知の量で添加する、検体とは異なる既知の物質である。参照物質は、検体と同様に、上記の選択肢の中から選択することができ、検体との関係で選択することができる。特には、検体と相互作用することがなく、安定な物質から選択することができる。
【００１８】
本願明細書において、「マイクロ流路」は、μｌ（マイクロリットル）オーダー、すなわち、約０．１μｌ以上かつ約１ｍｌ（ミリリットル）未満の微量な試料液体を用いて検体を検出又は測定するために、アッセイ装置内にて液体を流すように構成される経路を指す。
【００１９】
本願明細書において、「フィルム」は、約２００μｍ（マイクロメートル）以下の厚さを有する膜状物体を指し、かつ「シート」は、約２００μｍを超える厚さを有する膜状物体又は板状物体を指す。
【００２０】
本願明細書において、「プラスチック」は、重合し得る材料又はポリマー材料を必須成分として使用するように重合又は成形したものを指す。プラスチックは、２種類以上のポリマーを組み合わせたポリマーアロイもまた含む。
【００２１】
本願明細書において、「多孔質媒体」は、複数かつ多数の微細孔を有し、かつ試料液体を吸引かつ通過可能とする部材、又は固形物を捕捉若しくは濃縮できる部材であってもよく、紙、セルロース膜、不織布、ガラスファイバー、高分子ゲル、プラスチック等を含む部材を指す。例えば、「多孔質媒体」は、試料液体が親水性である場合には親水性を有するとよく、かつ試料液体が疎水性である場合には疎水性であるとよい。特に、「多孔質媒体」は、親水性を有するとよく、かつ多数の繊維を含んで成る紙、脱脂綿等であるとよい。さらに、「多孔質媒体」は、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、濾紙、ティッシュペーパー、トイレットペーパー、ペーパータオル、布地、綿、又は水を透過する親水性多孔質ポリマーのうちの１つ以上とすることができる。
【００２２】
図１〜図３に示すように、アッセイ装置ＡＳは、３つのマイクロ流路組立体ＭＣを有する。マイクロ流路組立体ＭＣは、試料液体を流すことができるように構成されるマイクロ流路１を有する。このマイクロ流路１は、下流に位置する先端部１ａと、上流に位置する基端部１ｂとを有する。以下において、このようなマイクロ流路１内における試料液体の流れに沿った方向（矢印Ｃにより示す）を「流れ方向」と呼ぶ。
【００２３】
マイクロ流路組立体ＭＣは、マイクロ流路１の先端部１ａに配置された吸収用多孔質媒体２を有する。吸収用多孔質媒体２は、マイクロ流路１の基端部１ｂから先端部１ａへと流れてきた試料液体を吸収可能とするように構成されている。
【００２４】
マイクロ流路組立体ＭＣは、マイクロ流路の流れ方向Ｃ及び幅方向Ｗに直交する高さ方向（矢印Ｈにより示す）にて互いに対向する頂面及び底面を有する。マイクロ流路組立体ＭＣは、その使用状態では、高さ方向を鉛直方向に向けるように配置されるとよく、この場合、マイクロ流路組立体ＭＣの頂面及び底面はそれぞれ上方及び下方を向く。かかるマイクロ流路組立体ＭＣは、その頂面から底面に向かって順に並ぶ第１層部材Ｓ１、第２層部材Ｓ２及び第３層部材Ｓ３を有する。第１層部材Ｓ１と第２層部材Ｓ２と第３層部材Ｓ３とはそれぞれ実質的に層状に形成されるとよい。
【００２５】
第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３は、試料液体を透過させず、後述するアッセイ領域及び確認領域からのシグナルを吸収しないような素材を用いて構成される。第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３の接触角は９０度よりも小さいとよい。第１層部材Ｓ１は透明又は半透明であるとよい。第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３の少なくとも一方は、マイクロ流路組立体ＭＣに試料液体を通過させたときに試料液体の圧力により弾性変形可能となっていることが望ましいが、これに限定されない。
【００２６】
第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３のそれぞれは、プラスチックを用いて作製されるとよい。さらに、第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３のそれぞれの素材は、プラスチック製のシート又はフィルムであるとよい。例えば、このようなプラスチックとしては、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ＡＢＳ樹脂（ＡＢＳ）、ＡＳ樹脂（ＳＡＮ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ)、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレンテレフタラート(ＰＥＴ)、ポリ塩化ビニール（ＰＶＣ）、ポリオレフィン（ＰＯ）、ナイロン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）等の生分解性プラスチック若しくはその他のポリマー又はそれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら、第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３の少なくとも一方が、流体が浸透しない材料であれば、プラスチック以外の材料を用いて作製することもでき、このようなプラスチック以外の材料は、樹脂、ガラス、金属等とすることもできる。このような第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３に用いられる材料又は素材は同一であっても異なっていてもよい。
【００２７】
第２層部材Ｓ２は両面接着テープであるとよい。かかる第２層部材Ｓ２の頂面及び底面が接着性を有する。第１層部材Ｓ１の底面が第２層部材Ｓ２の頂面に接合され、かつ第２層部材Ｓ２の底面が第３層部材Ｓ３の頂面に接合される。しかしながら、第２層部材は、上述のように第１及び第３層部材に用いられ得る材料又は素材として示したものを用いて作製することもできる。この場合、第２層部材は、接着剤、溶着等の接合手段を用いて第１及び第３層部材と接合されるとよく、第２層部材に用いられる材料又は素材は、第１又は第３層部材に用いられるものと同一であっても異なっていてもよい。
【００２８】
図２に示すように、マイクロ流路１は、第２層部材Ｓ２を貫通するように形成される。すなわち、マイクロ流路１の幅方向に対向する２つの側面は、第２層部材Ｓ２によって画定される。マイクロ流路１の頂面及び底面は、それぞれ、第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３によって画定される。図２に示すように、マイクロ流路１は略直線状に形成されるとよい。しかしながら、本発明においては、マイクロ流路を湾曲又は屈曲するように形成することもできる。
【００２９】
マイクロ流路１を画定する表面は親水処理されるとよい。かかる親水処理は、試料液体中に特異的結合体が含まれる場合において、特異的結合体がこれらの表面に吸着することを防ぐことを可能にするブロッキング剤を用いた処理を含む。ブロッキング剤としては、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ等の市販のブロッキング剤、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、界面活性剤、ポリビニルアルコール、グロブリン、血清（例えば、ウシ胎仔血清又は正常ウサギ血清）、エタノール、ＭＰＣポリマー等が挙げられる。かかるブロッキング剤は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３０】
吸収用多孔質媒体２と第１層部材Ｓ１との間には２つの両面接着テープＴが配置される。２つの両面接着テープＴは互いに幅方向に間隔を空けて位置している。吸収用多孔質媒体２は、これらの両面接着テープＴによって第１層部材Ｓ１に接合されている。しかしながら、吸収用多孔質媒体は、両面接着テープ以外の接合手段によって接合されてもよく、例えば、接合手段は接着剤、溶着等であってもよい。さらに、吸収用多孔質媒体は、両面接着テープ、又は両面接着テープ以外の接合手段によって第３層部材に接合されてもよい。
【００３１】
マイクロ流路１の先端部１ａの頂面を画定する第１層部材Ｓ１の先端部には、空気を流通可能とするように構成される通気口６が設けられている。この通気口６は、マイクロ流路組立体ＭＣの外部とマイクロ流路１の先端部１ａとを連通するように構成されるとよい。液体がマイクロ流路１を基端部１ｂから先端部１ａへと流れるときに、マイクロ流路１内の空気が通気口６を経てマイクロ流路組立体ＭＣの外部へ出てゆく。
【００３２】
マイクロ流路組立体ＭＣは、液体をマイクロ流路１に流入させるように構成される注入口８を有する。注入口８は、マイクロ流路１の基端部１ｂの頂面を画定する第１層部材Ｓ１の基端部を貫通するように形成される。
【００３３】
マイクロ流路組立体ＭＣはさらに、注入口８に対応するようにマイクロ流路１の基端部１ｂ内に配置される展開用多孔質媒体９を有する。この展開用多孔質媒体９の材料と吸収用多孔質媒体２の材料とは同一であっても異なっていてもよい。しかしながら、後述するようにマイクロ流路にて液体のラテラルフローを生じさせることができれば、マイクロ流路組立体ＭＣは、展開用多孔質媒体９を有さないように構成することもできる。なお、図３においては、展開用多孔質媒体９の図示を省略している。
【００３４】
図１及び図３に示すように、マイクロ流路１の流れ方向Ｃの中間部には、アッセイ領域１０が設けられる。かかるアッセイ領域１０には、アッセイにおいて、検体に特異的に結合する試薬が固定されている。以下、本明細書において、検体及び参照物質に由来するシグナル発生に関与する試薬を、アッセイ試薬と指称する。アッセイ試薬には、マイクロ流路に予め固定して用いられる固定化試薬と、アッセイのステップにおいてマイクロ流路に添加して用いられる添加試薬がある。アッセイ領域１０に設けられる固定化試薬は、試料液体中の検体と特異的に反応し、かつ添加試薬とともに当該検体を検出可能な結果を生じさせるものである。検体を検出可能な結果は、例えば、色の変化等に基づいて、肉眼により観察可能に表れてもよく、又は検体を検出可能な結果は、分光計又は他の測定手段のみによって検出可能に表れてもよい。このアッセイ領域を第１領域とも呼ぶ。
【００３５】
アッセイ領域１０に設けられる固定化試薬は、酵素、抗体、エピトープ、核酸、細胞、アプタマー、ペプチド、分子インプリントポリマー、吸着ポリマー、吸着ゲル、検体との反応により呈色する鉄（ＩＩＩ）イオン等の化学物質、呈色試薬、又は検体と反応することによって検出可能な結果を生じさせる任意の他の物質であってよく、典型的には固定化試薬は抗体である。固定化試薬は、物理吸着法、化学吸着法等の周知の固定化技術によってアッセイ領域１０に固定されるとよい。固定化試薬には、検出シグナルを分析又は増幅させるために、放射性同位元素、酵素、金コロイド、呈色試薬、量子ドット、ラテックス等の着色分子、色素、電気化学反応物質、蛍光物質、又は発光物質等の任意の標識物質を結合されてもよい。あるいは、これらの標識物質は、アッセイのステップにおいてマイクロ流路に添加して用いられる添加試薬に結合されていてもよい。具体的には、固定化試薬は、第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３のいずれか又は両方に固定することができる。
【００３６】
かかるアッセイ装置のアッセイにおいては、試料液体がマイクロ流路１内にて流動した状態、又は試料液体がマイクロ流路１内にて静置されるか又は一時的に停止した状態で、アッセイが行われ、典型的には試料液体中の検体濃度が検出可能となる。
【００３７】
図１に示すように、アッセイ装置ＡＳの頂面かつアッセイ領域１０の近傍に、色見本ＣＳを配置することができる。この色見本と、アッセイ領域１０において生じたシグナルと照らし合わせることにより、そのシグナルの強度を確認することができる。
【００３８】
さらに、本実施形態に係るマイクロ流路組立体においては、図１及び図３に示すように、アッセイ領域１０に隣接し、アッセイ領域１０の下流に確認領域１２が設けられている。アッセイ領域１０と確認領域１２とは、各領域から発生するシグナルを区別可能に検出可能な程度に離間していれば良い。この確認領域１２は、アッセイ領域１０において生じる第１反応（後述）と反応時間が同じであるとみなすことができる既知の第２反応（後述）が生じるように構成されている。この確認領域１２を第２領域とも呼ぶ。確認領域１２には、参照物質に特異的に結合する固定化試薬が設けられる。確認領域１２の固定化試薬もまた、アッセイ領域１０の固定化試薬と同様に、抗体等であってよく、固定化試薬には任意の標識物質が結合されていてもよく、固定化試薬は、第１層部材Ｓ１及び第３層部材Ｓ３のいずれか又は両方に固定することができる。
【００３９】
図３は、固定化試薬として、抗体を用いる場合のアッセイ領域１０及び確認領域１２を模式的に示す図である。図３を参照して、アッセイ試薬と検体、並びに参照物質の反応およびこれによる検体濃度検出のメカニズムを説明する。図３（ａ）に示すように、アッセイ領域１０には、固定化試薬である第１の抗体Ｙ１１が固定されており、確認領域１２には、第１の抗体Ｙ１１とは異なる固定化試薬である第２の抗体Ｙ１２が固定されている。そして、検体である第１の抗原Ｘ１１を含む可能性があり、かつ第２の抗原Ｘ１２を既知の量だけ含む試料液体が、注入口８から注入される。第２の抗原Ｘ１２は、検体である第１の抗原Ｘ１１とは異なる既知の参照物質であり、アッセイ実施者により意図的に所定の既知量で前記試料液体中に含められる。第１の抗原Ｘ１１は第１の抗体Ｙ１１により特異的に認識され、第２の抗原Ｘ１２は第２の抗体Ｙ１２により特異的に認識される。
【００４０】
次に、図３（ｂ）に示すように、第１の検出抗体Ｙ２１と第２の検出抗体Ｙ２２とを含む添加試薬である第１の試薬が、注入口８から注入される。第１の検出抗体Ｙ２１は第１の抗原Ｘ１１を特異的に認識し、第２の検出抗体Ｙ２２は第２の抗原Ｘ１２を特異的に認識する。第１の試薬に含まれる成分である、第１の検出抗体Ｙ２１と第２の検出抗体Ｙ２２とは、検体及び参照物質との関係で決定することができる。
【００４１】
続いて、図３（ｃ）に示すように、第１の標識酵素で標識された第１の標識抗体Ｙ３１と、第２の標識酵素で標識された第２の標識抗体Ｙ３２とを含む添加試薬である第２の試薬が、注入口８から注入される。第１の標識抗体Ｙ３１は第１の検出抗体Ｙ２１を特異的に認識し、第２の標識抗体Ｙ３２は第２の検出抗体Ｙ２２を特異的に認識する。
【００４２】
第１の標識酵素と第２の標識酵素は、同一であってもよく、異なっていてもよい。両標識酵素が異なっている場合は、基質との反応条件、特にｐＨ（水素イオン指数）が同程度であることが好ましい。好ましくは、第１の標識酵素と第２の標識酵素は同一である。標識酵素としては、ＥＬＩＳＡ反応において一般的に用いられる、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどを用いることができるが、これらには限定されない。
【００４３】
図３（ｄ）に示すように、第１の基質Ｚ１１と第２の基質Ｚ１２とを含む添加試薬である基質溶液が、注入口８から注入される。その後、第１の基質Ｚ１１が関与するとともに第１の標識酵素が触媒する第１の酵素反応と、第２の基質Ｚ１２が関与するとともに第２の標識酵素が触媒する第２の酵素反応とが進行する。第１の酵素反応により、あるシグナル強度（発色、発光、蛍光増幅など）を有する第１シグナルＳＧ１が得られ、第２の酵素反応により、別のシグナル強度を有する第２シグナルＳＧ２が得られる。基質は、標識酵素との関係で決定することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質としては、青色に発色する３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、橙黄色に発色するＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、緑色に発色する２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）などが挙げられる。また、アルカリフォスファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジナトリウム塩（ＰＮＰＰ）が挙げられる。
【００４４】
このように、第１の酵素反応は、検体である第１の抗原Ｘ１１を特異的に認識する物質が関与して、検体を定量的に検出する反応である。また、第２の酵素反応は、参照物質である第２の抗原Ｘ１２を特異的に認識する物質が関与して、参照物質を定量的に検出する既知の反応である。これらの反応は、酵素結合免疫吸着法の原理に基づくものであり、具体的な固定化試薬及び添加試薬の各成分は、所望の検体及び参照物質に適合するように、当業者が適宜選択することができる。第１の酵素反応及び第２の酵素反応をそれぞれ、第１反応及び第２反応とも呼ぶ。
【００４５】
確認領域１２において、第２反応に関与する抗原量、抗体量、酵素量は一定であり、かつ既知とする。そして、第２反応の反応時間は、第１反応の反応時間と同じであるとみなすことができる。
なお、本発明におけるアッセイ試薬と、検体及び参照物質との反応様式は、図３を参照して説明した態様には限定されない。アッセイ領域及び確認領域のそれぞれにおいて、アッセイ試薬の各成分が検体及び参照物質と、定量的かつ特異的に反応し、検体及び参照物質に対応する量のシグナルを発生することができる反応様式であれば、任意の態様であってよい。したがって、本発明は、上記のような第１の試薬、第２の試薬及び基質溶液のすべてを用いるアッセイを必須とするものではない。
【００４６】
図４に、一実施形態におけるアッセイのフローを示す。後述するように、本フローにおける一部のステップは、図５に示すアッセイ支援装置１００により行われる。アッセイ支援装置１００は、取得部１１０と反応時間算出部１２０と濃度算出部１３０とを備えている。アッセイ支援装置１００は、例えばスマートフォンとすることができる。
【００４７】
図６に、アッセイ支援装置１００のコンピュータハードウェア構成例を示す。アッセイ支援装置１００は、ＣＰＵ１８１と、インタフェース装置１８２と、表示装置１８３と、入力装置１８４と、ドライブ装置１８５と、補助記憶装置１８６と、メモリ装置１８７と、カメラ１９０とを備えており、これらがバス１８８により相互に接続されている。
【００４８】
アッセイ支援装置１００の機能を実現するアッセイ支援プログラム（単に、「アッセイプログラム」又は「プログラム」とも呼ぶ）は、メモリーカード等の記録媒体１８９によって提供される。プログラムを記録した記録媒体１８９がドライブ装置１８５にセットされると、プログラムが記録媒体１８９からドライブ装置１８５を介して補助記憶装置１８６にインストールされる。あるいは、プログラムのインストールは必ずしも記録媒体１８９により行う必要はなく、ネットワークを介して他のコンピュータからダウンロードすることもできる。補助記憶装置１８６は、インストールされたプログラムを格納すると共に、必要なファイルやデータ等を格納する。
【００４９】
メモリ装置１８７は、プログラムの起動指示があった場合に、補助記憶装置１８６からプログラムを読み出して格納する。ＣＰＵ１８１は、メモリ装置１８７に格納されたプログラムにしたがってアッセイ支援装置１００の機能を実現する。インタフェース装置１８２は、ネットワークを通して他のコンピュータに接続するためのインタフェースとして用いられる。表示装置１８３は、プログラムによるＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）等を表示する。入力装置１８４はキーボード及びマウス等である。カメラ１９０は、例えばデジタルカメラとすることができる。
【００５０】
図４を再び参照する。ステップＳＴ１において、アッセイ実施者は、検体である第１の抗原Ｘ１１を含む可能性があり、かつ参照物質である第２の抗原Ｘ１２を既知の量で含む試料液体を注入口８に滴下する。本ステップにおけるマイクロ流路内の様子は、図３（ａ）を参照して先に述べたとおりである。なお、本ステップは、全てのマイクロ流路組立体の各々において行うこともできる。各マイクロ流路組立体の注入口に滴下される試料液体は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。
【００５１】
ステップＳＴ２において、アッセイ実施者は、第１の検出抗体Ｙ２１と第２の検出抗体Ｙ２２とを含む液体である第１の試薬を注入口８に滴下する。本ステップにおいてさらに、アッセイ実施者は、第１の標識酵素で標識された第１の標識抗体Ｙ３１と、第２の標識酵素で標識された第２の標識抗体Ｙ３２とを含む液体である第２の試薬を注入口８に滴下する。本ステップにおけるマイクロ流路内での反応の態様は、図３（ｂ）及び図３（ｃ）を参照して先に述べたとおりである。なお、本ステップは、全てのマイクロ流路組立体の各々において行うこともできる。各マイクロ流路組立体の注入口に滴下される第１の試薬は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。第２の試薬についても同様である。
【００５２】
ステップＳＴ３において、アッセイ実施者は、第１の基質Ｚ１１と第２の基質Ｚ１２とを含む液体である基質溶液を注入口８に滴下する。本ステップにおけるマイクロ流路内の様子は図３（ｄ）を参照して先に述べたとおりである。本ステップＳＴ３により、ステップＳＴ１にて滴下された試料液体に検体が含まれていれば、第１の酵素反応が生じて第１シグナルＳＧ１が得られる。さらに、このステップＳＴ３では、検体の有無とは無関係に、第２の酵素反応が生じて第２シグナルＳＧ２が得られる。両シグナルは、透明又は半透明な第１層部材Ｓ１を通して目視可能である。なお、本ステップは、全てのマイクロ流路組立体の各々において行うこともできる。各マイクロ流路組立体の注入口に滴下される基質溶液は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。
【００５３】
ステップＳＴ４において、アッセイ実施者は、カメラ１９０を備えたアッセイ支援装置１００を用いて、アッセイ装置ＡＳとアッセイ支援装置１００との位置合わせを行った上で写真撮影を行う。この位置合わせは、アッセイ支援装置１００の表示装置１８３に表示される矩形のガイド領域（不図示）が図１のアッセイ装置ＡＳの頂面の外形と重なるように行われる。本ステップにおいて撮影された写真の画像は、アッセイ支援装置１００の取得部１１０により取得される。すなわち、この画像には、ステップＳＴ３にてアッセイ領域１０において生じた第１シグナルＳＧ１と、同ステップにて確認領域１２において生じた第２シグナルＳＧ２とが写っている。
【００５４】
ステップＳＴ５において、アッセイ実施者は撮影環境（外界の光、明度）の確認を行う。例えば、アッセイ実施者は、色見本ＣＳがアッセイ領域１０の付近に置かれているか、各色見本（白）の間の反射光の差が５％以内であるか、色見本（白）の明るさの勾配が所定の許容範囲内かどうか、などを確認する。
【００５５】
ステップＳＴ６において、アッセイ実施者は、ステップＳＴ５における撮影環境の確認の結果に基づき、ステップＳＴ４において取得された画像の補正が必要かどうかを判断する。補正が必要であると判断された場合はステップＳＴ７が行われた後にステップＳＴ８が行われ、さもなければステップＳＴ７が行われることなくステップＳＴ８が行われる。
【００５６】
ステップＳＴ７において、取得部１１０は、ステップＳＴ４において取得した画像の補正を行う。この補正は、例えば、色見本（白）の間の反射光の差が５％以内となり、かつ、色見本（白）の明るさの勾配が所定の許容範囲内となるように行われる。
【００５７】
なお、ステップＳＴ５〜ＳＴ７を省略することもできる。
【００５８】
ステップＳＴ８において、アッセイ実施者は、画像（ステップＳＴ７の補正が行われた場合は補正後の画像）に写っている第２シグナルＳＧ２を目視にて確認する。以下、ステップＳＴ７の補正が行われた場合の補正後の画像も単に「画像」と呼ぶ。
【００５９】
ステップＳＴ９において、アッセイ実施者は、ステップＳＴ８での目視の結果に基づいて、上述した第２の酵素反応が行われたかどうかを判断する。第２の酵素反応が行われたと判断された場合はステップＳＴ１０が行われる。第２の酵素反応が行われたと判断されなかった場合は、後続のステップが行われることはなく、本フローは終了する。その後、本フローをステップＳＴ１から再び行うことができる。
【００６０】
ステップＳＴ１０において、アッセイ支援装置１００の反応時間算出部１２０は、画像における第２シグナルＳＧ２を表す画素の画素データ（色情報）に基づいて、第２シグナルＳＧ２の強度を算出する。具体的には、第２シグナルＳＧ２を表す画素の画素データ（色情報）から、色見本（白）の画素データを引くことにより得られる差を、第２シグナルＳＧ２の強度とすることができる。
【００６１】
例えば、第２の基質Ｚ１２がＴＭＢである場合、第２の酵素反応はＴＭＢ反応である。このＴＭＢ反応による生成物の量は、第２シグナルＳＧ２（赤色反射光）の強度をＲとし、色見本（白）の赤色反射強度をＲ０とすると、Ｒ−Ｒ０の値に反映される。第２シグナルＳＧ２の強度Ｒから色見本（白）の赤色反射強度Ｒ０を引く目的は、撮影条件の影響を除去することにある。
【００６２】
ステップＳＴ１０ではさらに、反応時間算出部１２０は、算出された第２シグナルＳＧ２の強度に基づいて、第２反応による生成物の量を算出する。この算出にあたり、反応時間算出部１２０は、第２シグナルＳＧ２の強度と第２反応による生成物の量との既知の関係を参照する。この関係は、アッセイ支援装置１００の補助記憶装置１８６にあらかじめ記憶されている。
【００６３】
同じくステップＳＴ１０において、反応時間算出部１２０は、算出された第２反応による生成物の量に基づいて、第２反応の反応時間（第２反応に費やされた時間）を算出する。この算出にあたり、反応時間算出部１２０は、第２反応の反応時間と第２反応による生成物の量との既知の関係を参照する。この関係の一例を図７に示す。この既知の関係は、アッセイ支援装置１００の補助記憶装置１８６にあらかじめ記憶されている。
【００６４】
ステップＳＴ１１において、濃度算出部１３０は、ステップＳＴ１０にて得られた第２反応の反応時間を第１反応のみなし反応時間とした上で、このみなし反応時間に基づいて複数の検量線の中から単一の検量線を選択する。複数の検量線は、第１シグナルＳＧ１の強度と検体の濃度との関係を第１反応の反応時間に応じて表すものである。複数の検量線の例を図８に示す。複数の検量線ＷＣ１〜ＷＣ６に対応する反応時間は、それぞれ、２分、３分、４分、５分、６分、及び７分である。
【００６５】
ステップＳＴ１１ではさらに、濃度算出部１３０は、画像における第１シグナルＳＧ１を表す画素の画素データ（色情報）に基づいて、第１シグナルＳＧ１の強度を算出する。本ステップではさらに、濃度算出部１３０は、算出された第１シグナルＳＧ１の強度と、先に選択された単一の検量線とに基づいて、検体である第１の抗原Ｘ１１の濃度を算出する。
【００６６】
例えば、ステップＳＴ１０にて得られた第２反応の反応時間が「５分」であったとする（図７）。ステップＳＴ１１では、この「５分」が、第１反応のみなし反応時間と定められる。同ステップではさらに、図８に示す複数の検量線ＷＣ１〜ＷＣ６の中から、第１反応のみなし反応時間である「５分」に対応する検量線ＷＣ４が選択される。そして、第１シグナルＳＧ１の強度が算出され、算出された第１シグナルＳＧ１の強度と検量線ＷＣ４に基づいて、検体の濃度が算出される。
【００６７】
また、別の例として、第１反応のみなし反応時間が「７．２分」である場合は、図８に示す複数の検量線ＷＣ１〜ＷＣ６の中から、反応時間が「７分」である検量線ＷＣ６が選択される。第１反応のみなし反応時間が「６．８分」である場合も、反応時間が「７分」である検量線ＷＣ６が選択される。第１反応のみなし反応時間が「６．４分」である場合は、反応時間が「６分」である検量線ＷＣ５が選択される。
【００６８】
このように、第１反応のみなし反応時間との差が最小の反応時間に対応する検量線が選択される。なお、第１反応のみなし反応時間が「６．５分」である場合は、反応時間が「６分」である検量線ＷＣ５と反応時間が「７分」である検量線ＷＣ６とのいずれか一方を適宜選択することができる。
【００６９】
あるいは、ステップＳＴ１１にて、複数の検量線を選択することもできる。例えば、第１反応のみなし反応時間が「７．２分」である場合に、反応時間が「７分」である検量線ＷＣ６と、反応時間が「８分」である検量線（不図示）とを選択することができる。そして、検量線ＷＣ６から得た濃度Ａと、反応時間が「８分」である検量線から得た濃度Ｂとを案分し、（Ａ×０．８＋Ｂ×０．２）の値を検体の濃度として得ることもできる。
【００７０】
このように、ステップＳＴ１１では、少なくとも１つの検量線を選択した上で、検体の濃度を得ることができる。
【００７１】
本実施形態におけるアッセイ装置は、検体を含む可能性があり、かつ前記検体とは異なる既知の参照物質を含む試料液体を流すことができるように構成されるマイクロ流路１と、マイクロ流路１に設けられ、検体を特異的に検出する第１反応が生じる第１領域１０と、マイクロ流路１において第１領域１０と隣接するように設けられ、参照物質を特異的に検出する既知の第２反応が生じる第２領域１２とを備える。本装置によれば、第２反応が参照物質を特異的に検出する既知の反応であることから、第２反応の反応時間を第２反応による第２シグナルに基づいて算出することができる。そして、この第２反応の反応時間は第１反応の反応時間とみなすことができる。この第１反応のみなし反応時間と、第１反応による第１シグナルの強度とを考慮して、より正確なアッセイを行うことができる。
【００７２】
本実施形態におけるアッセイプログラムによれば、アッセイ実施者により意図的に試料液体に含められた参照物質を特異的に検出する第２反応の反応時間が算出される。この第２反応の反応時間は、検体を特異的に検出する第１反応の反応時間とみなされる。そして、第１反応による第１シグナルと第１反応のみなし反応時間とに基づいて、検体の濃度が算出される。第１シグナルの強度だけではなく、第１反応のみなし反応時間をも考慮することにより、シグナル強度のみを考慮した場合に比べて正確なアッセイを行うことができる。
【００７３】
［その他］
アッセイ装置ＡＳは、１以上のマイクロ流路組立体を備えていればよい。
【００７４】
図４のステップＳＴ５〜ＳＴ９を省略することも可能である。
【００７５】
ステップＳＴ１０における第２反応の反応時間算出に関して、第２シグナルの強度と第２反応の反応時間との関係をあらかじめ決定し、補助記憶装置１８６に記憶することができる。そして、反応時間算出部１２０は、第２反応の反応時間算出にあたり、この関係を参照することができる。この場合、反応時間算出部１２０は、第２反応による生成物の量を算出する必要はない。そのため、計算量を減らすことができる。
【００７６】
図３に、アッセイ領域（第１領域）１０が１つ設けられている例を示したが、これに限られず、複数のアッセイ領域１０が設けられていてもよい。
【符号の説明】
【００７７】
ＡＳ…アッセイ装置、ＭＣ…マイクロ流路組立体、１…マイクロ流路、１ａ…先端部、１ｂ…基端部、２…吸収用多孔質媒体、６…通気口、Ｃ…流れ方向、Ｗ…幅方向、Ｈ…高さ方向、Ｓ１…第１層部材、Ｓ２…第２層部材、Ｓ３…第３層部材、８…注入口、９…展開用多孔質媒体、１０…アッセイ領域、１２…確認領域
１００…アッセイ支援装置、１１０…取得部、１２０…反応時間算出部、１３０…濃度算出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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