(57)【要約】【課題】新規な抗老化剤を提供すること。【解決手段】バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、抗老化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、抗老化剤。
【請求項２】
前記バガスの分解抽出物は、アルカリ処理、水熱処理、酸処理、亜臨界水処理及び爆砕処理からなる群より選ばれる少なくとも１種の分解処理により得られる分解処理液である、請求項１に記載の抗老化剤。
【請求項３】
前記バガスの分解抽出物は、前記分解処理液を、固定担体を充填したカラムに通液することより得られる画分である、請求項２に記載の抗老化剤。
【請求項４】
前記固定担体は、合成吸着剤又はイオン交換樹脂である、請求項３に記載の抗老化剤。
【請求項５】
前記固定担体が合成吸着剤であり、前記バガスの分解抽出物は、該合成吸着剤に吸着された成分を、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒で溶出させることにより得られる画分である、請求項３に記載の抗老化剤。
【請求項６】
前記合成吸着剤は、芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂、又はアクリロニトリル脂肪族系樹脂である、請求項４又は５に記載の抗老化剤。
【請求項７】
前記バガスの分解抽出物は、前記分解処理液を、固定担体としての合成吸着剤を充填したカラムに通液し、該合成吸着剤に吸着された成分を、エタノール及び水の混合溶媒で溶出させて得られる画分であり、
前記合成吸着剤は、無置換基型の芳香族系樹脂であり、
前記カラムの温度は２０〜６０℃であり、
前記混合溶媒のエタノール及び水の体積比（エタノール／水）は５０／５０〜６０／４０である、請求項２に記載の抗老化剤。
【請求項８】
バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項９】
バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、線維芽細胞賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗老化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織の三層構造となっている。真皮においては、Ｉ型コラーゲンが集まって束を形成することにより真皮の支柱としての役割を果たしており、その周囲にはエラスチン、ヒアルロン酸等の成分が存在している。加齢又は紫外線の照射等に起因してこれらの成分が減少したり分解されたりすると、皮膚の張り及び艶が失われ、皺が形成されやすくなる。
【０００３】
このような皮膚の老化を抑制するために、種々の抗老化剤が検討されている。特許文献１は、檸条及び／又は油茶からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤を開示する。特許文献２は、マキ科マキ属植物より選ばれる１種又は２種以上の植物の抽出物を含有する抗老化剤を開示する。特許文献３は、イブキジャコウソウの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤を開示する。特許文献４は、ゴレンシの葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、及びエラスターゼ阻害剤を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−８３７８６号公報
【特許文献２】特開２０１０−７０５０１号公報
【特許文献３】特開平１１−７９９７１号公報
【特許文献４】特開２００２−２２６３２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な抗老化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験によって、バガスの分解抽出物が抗老化効果を有することを見出した。
【０００７】
本発明は、一態様として、バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、抗老化剤を提供する。本発明の抗老化剤は、バガスの分解抽出物を有効成分として含むことにより、抗老化効果に優れている。
【０００８】
バガスの分解抽出物は、アルカリ処理、水熱処理、酸処理、亜臨界水処理及び爆砕処理からなる群より選ばれる少なくとも１種の分解処理により得られる分解処理液であってよい。
【０００９】
バガスの分解抽出物は、分解処理液を、固定担体を充填したカラムに通液することより得られる画分であってもよい。固定担体は、好ましくは、合成吸着剤又はイオン交換樹脂である。
【００１０】
固定担体が合成吸着剤である場合、バガスの分解抽出物は、該合成吸着剤に吸着された成分を、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒で溶出させることにより得られる画分であってもよい。
【００１１】
合成吸着剤は、好ましくは、芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂、又はアクリロニトリル脂肪族系樹脂である。
【００１２】
バガスの分解抽出物は、分解処理液を、固定担体としての合成吸着剤を充填したカラムに通液し、該合成吸着剤に吸着された成分を、エタノール及び水の混合溶媒で溶出させて得られる画分であってよく、この場合、合成吸着剤は、無置換基型の芳香族系樹脂であり、カラムの温度は２０〜６０℃であり、混合溶媒のエタノール及び水の体積比（エタノール／水）は５０／５０〜６０／４０であってもよい。
【００１３】
本発明は、他の態様として、バガスの分解抽出物を有効成分として含有する、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供するということもできる。本発明は、更なる他の態様として、線維芽細胞賦活剤を提供するということもできる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規な抗老化剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗老化剤は、抗老化作用を有する。抗老化作用は、皮膚の老化を抑制する作用であってよく、より具体的には、加齢、紫外線の照射等による皮膚の機能低下を抑制及び／又は改善する作用であってよい。抗老化作用は、皮膚のしわ、たるみ、硬化等を抑制及び／又は改善する作用であってもよい。
【００１７】
真皮に含まれるＩ型コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の成分は、細胞外マトリックス成分とも呼ばれる。細胞外マトリックス成分は線維芽細胞から産生される。皮膚の老化の一因は、細胞外マトリックス成分の分解又は減少である。
【００１８】
細胞外マトリックス成分の分解は、細胞外マトリックス分解酵素によって生ずる。例えば、Ｉ型コラーゲンは、細胞外マトリックス分解酵素の１種であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１）により分解される。ＭＭＰ−１は、紫外線の照射によってタンパク量が増加し、活性が亢進される。ＭＭＰ−１の産生及び活性亢進の結果、コラーゲンの減少、変性が起こり、皮膚の弾力性が失われ、皮膚の皺又はたるみの形成の原因になり得る。一方、エラスチンは、細胞外マトリックス分解酵素の１種であるエラスターゼにより分解される。エラスチンはコラーゲン線維間を繋ぐバネのような役割をしているが、エラスターゼがエラスチンを分解することによっても、皮膚の弾力性が失われ、皮膚の皺又はたるみの形成の原因になり得る。
【００１９】
本発明の抗老化剤は、細胞外マトリックス分解酵素を阻害する作用（細胞外マトリックス分解酵素の産生を抑制する作用、細胞外マトリックス分解酵素の活性を低下させる作用）を有しており、例えば、Ｉ型コラーゲンを分解するＭＭＰ−１を阻害する作用、及び／又はエラスチンを分解するエラスターゼを阻害する作用を有する。これにより、皮膚の老化が抑制される。すなわち本発明の抗老化剤は、細胞外マトリックス分解酵素の阻害作用に基づくものであるということができ、より具体的には、ＭＭＰ−１の阻害作用、又はエラスターゼの阻害作用に基づくものであるということもできる。また、本発明は、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供するということができ、より具体的には、ＭＭＰ−１阻害剤、又はエラスターゼ阻害剤を提供するということもできる。
【００２０】
ＭＭＰ−１を阻害する作用は、より具体的には、ＭＭＰ−１の産生を阻害する作用であってよく、ＭＭＰ−１の活性を阻害する作用であってもよい。エラスターゼを阻害する作用は、より具体的には、エラスターゼの産生を阻害する作用であってよく、エラスターゼの活性を阻害する作用であってもよい。すなわち本発明の抗老化剤は、ＭＭＰ−１の産生阻害作用、ＭＭＰ−１の活性阻害作用、エラスターゼの産生阻害作用、及びエラスターゼの活性阻害作用のうち少なくとも１つの作用に基づくものであってよい。本発明の抗老化剤は、ＭＭＰ−１の産生阻害作用及び／又はエラスターゼの活性阻害作用に基づくものであってもよい。また、本発明は、ＭＭＰ−１産生阻害剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ産生阻害剤、又はエラスターゼ活性阻害剤を提供するということができる。本発明は、ＭＭＰ−１産生阻害剤、又はエラスターゼ活性阻害剤を提供するということもできる。
【００２１】
一方、細胞外マトリックス成分の産生量は、加齢による線維芽細胞の衰え、紫外線照射等により減少する。線維芽細胞を賦活化させることにより、細胞外マトリックス成分の産生量の減少を抑制することができる。本発明の抗老化剤は、線維芽細胞を賦活化させる作用も有するため、より一層皮膚の老化が抑制される。すなわち本発明の抗老化剤は、線維芽細胞の賦活作用に基づくものであるということもできる。また、本発明は、線維芽細胞賦活剤を提供するということもできる。
【００２２】
一実施形態に係る抗老化剤は、バガスの分解抽出物を有効成分として含有する。バガスの分解抽出物には、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、カフェ酸及びバニリン等のフェニルプロパノイド、並びにリグニン及びその分解物からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれていることが好ましい。
【００２３】
「バガス」とは、典型的には原料糖製造工程における製糖過程で排出されるバガスをいう。原料糖工場における製糖過程で排出されるバガスには、最終圧搾機を出た最終バガスだけではなく、第１圧搾機を含む以降の圧搾機に食い込まれた細裂甘蔗をも含む。好適なバガスは、原料糖工場において圧搾工程により糖汁を圧搾した後に排出されるバガスである。当該バガスは、甘蔗の種類、収穫時期等により、その含まれる水分、糖分及びそれらの組成比が異なるが、本発明においては、これらのバガスを任意に用いることができる。さらに、本実施形態では、原料のバガスとして、原料糖工場と同様に、例えば黒糖製造工場において排出される甘蔗圧搾後に残るバガス、又は実験室レベルの小規模な実施により甘蔗から糖液を圧搾した後のバガスも用いることができる。
【００２４】
バガスの分解抽出物は、一実施形態において、バガス（及び／又はその加工物）の分解処理液であってよい。分解処理液は、アルカリ処理、水熱処理、酸処理、亜臨界水処理及び爆砕処理からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の分解処理により得ることができる。本明細書におけるバガスの分解処理は、リグニン、セルロース、及び／又はヘミセルロースの化学構造の一部又は全部が壊れることが必要である。分解処理は、バガスの分解抽出物を得やすい観点から、好ましくはアルカリ処理又は水熱処理である。
【００２５】
アルカリ処理は、バガスにアルカリ性溶液を接触させる処理であってよい。アルカリ性溶液を接触させる方法としては、例えば、アルカリ性溶液をバガスに振りかける方法、バガスをアルカリ性溶液に浸漬させる方法等が挙げられる。バガスをアルカリ性溶液に浸漬させる方法においては、バガス及びアルカリ性溶液の混合物を撹拌しながら浸漬させてもよい。
【００２６】
アルカリ性溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液等が挙げられる。アルカリ性溶液は、これらの溶液を１種単独で又は２種以上を混合して用いられてよい。アルカリ性溶液は、安価であり、食品製造工程で容易に用いられる観点から、好ましくは水酸化ナトリウム水溶液である。
【００２７】
アルカリ性溶液の温度（液温）は、分解処理の処理時間を短縮する観点から、好ましくは４０℃以上であり、より好ましくは１００℃以上であり、更に好ましくは１３０℃以上である。アルカリ性溶液の温度は、分解処理液に多糖類を残存させないようにする観点から、好ましくは２５０℃以下であり、より好ましくは２００℃以下であり、更に好ましくは１５０℃以下である。
【００２８】
アルカリ処理は、常圧下で行われてよく、加圧して行われてもよい。加圧する場合、圧力は、０．１ＭＰａ以上、又は０．２ＭＰａ以上であってよく、４．０ＭＰａ以下、１．６ＭＰａ以下、又は０．５ＭＰａ以下であってよい。
【００２９】
水熱処理は、バガスに高温の水又は水蒸気を高圧下で接触させる処理であってよい。水熱処理は、より具体的には、例えば、バガスの固形物濃度が０．１〜５０％となるように水を加え、高温・高圧条件下で分解処理を行う方法であってもよい。水又は水蒸気の温度は１３０〜２５０℃であることが好ましく、加える圧力は、各温度の水の飽和水蒸気圧に、更に０．１〜０．５ＭＰａ高い圧力であることが好ましい。
【００３０】
酸処理は、バガスに酸性溶液を接触させる処理であってよい。酸性溶液としては、希硫酸等が挙げられる。バガスに酸性溶液を接触させる方法、酸処理における酸溶液の温度、酸処理における圧力条件は、上述したアルカリ処理における方法又は条件と同様であってよい。
【００３１】
亜臨界水処理は、バガスに亜臨界水を接触させる処理であってよい。バガスに亜臨界水を接触させる方法は、上述したアルカリ処理における方法と同様であってよい。亜臨界水処理の条件は特に制限されないが、亜臨界水の温度を１６０〜２４０℃とし、処理時間を１〜９０分間とすることが好ましい。
【００３２】
爆砕処理は、水熱処理によりバガスに含まれる不溶性キシランをある程度分解させた後、耐圧反応容器に設けられたバルブを一気に開放すること等によって、瞬間的に大気圧に放出することによりバガスを粉砕する処理であってよい。
【００３３】
分解処理液においては、上述した分解処理の後、固形分及び液分を分離する処理がなされてもよい。この場合、分離後に得られた液分を分解処理液とすることができる。固形分及び液分を分離する方法は、ストレーナー、ろ過、遠心分離、デカンテーション等による分離であってよい。
【００３４】
分解処理液においては、膜分離により多糖類等の高分子成分が除去されてもよい。この場合、膜分離後の液分を分解処理液とすることができる。分離膜は、限外濾過膜（ＵＦ膜）であれば特に限定されない。限外濾過膜の分画分子量は、好ましくは２５００〜５００００であり、より好ましくは２５００〜５０００である。
【００３５】
限外濾過膜の素材としては、ポリイミド、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ四フッ化エチレン等を使用することができる。
【００３６】
限外濾過膜の濾過方式は、デッドエンド濾過、クロスフロー濾過であってよいが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフロー濾過であることが好ましい。
【００３７】
限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型等、適宜の形態のものが使用できる。より具体的には、ＧＥ  Ｐｏｗｅｒ＆ＷａｔｅｒのＧＥシリーズ、ＧＨシリーズ、ＧＫシリーズ、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０等が挙げられる。
【００３８】
バガスの分解抽出物は、他の実施形態において、上述した分解処理液を、固定担体を充填したカラムに通液することより得られる画分であってもよい。分解処理液をカラムに通液することにより、分解処理液中の抗老化作用を有する成分（有効成分）が固定担体に吸着され、糖類及び無機塩類の大部分がそのまま流出する。
【００３９】
上述した分解処理液は、直接又は水で任意の濃度に調整して、カラムに通液することができる。分解処理液においては、カラムの通液前にｐＨを調整してもよい。吸着率を向上させる観点から、分解処理液は、ｐＨ６以下に調整されていることが好ましい。分解処理液のｐＨは、４．５を超え６以下であってもよい。
【００４０】
固定担体は、好ましくは、合成吸着剤又はイオン交換樹脂のいずれかである。
【００４１】
合成吸着剤は、好ましくは合成多孔質吸着剤である。合成吸着剤（合成多孔質吸着剤）としては、好ましくは有機系樹脂が用いられる。有機系樹脂は、好ましくは、芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂、又はアクリロニトリル脂肪族系樹脂である。
【００４２】
芳香族系樹脂としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂が挙げられる。芳香族系樹脂としては、疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、無置換基型の芳香族系樹脂、無置換基型に特殊処理をした芳香族系樹脂等の多孔質性樹脂も挙げられ、このうち、無置換基型の芳香族系樹脂又は無置換基型に特殊処理をした芳香族系樹脂が好ましい。
【００４３】
合成吸着剤で市販のものとしては、ダイヤイオン（商標）ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０（以上、無置換基型の芳香族系樹脂、いずれも商品名、三菱ケミカル株式会社製）；ＳＰ−８２５、ＳＰ−８００、ＳＰ−８５０、ＳＰ−８７５、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００（以上、無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂、いずれも商品名、三菱ケミカル株式会社製）；ＳＰ−９００（芳香族系樹脂、商品名、三菱ケミカル株式会社製）；アンバーライト（商標）ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−２０００（以上、芳香族系樹脂、いずれも商品名、株式会社オルガノ製）；ダイヤイオン（商標）ＳＰ−２０５、ＳＰ−２０６、ＳＰ−２０７（以上、疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、いずれも商品名、三菱ケミカル株式会社製）；ＨＰ−２ＭＧ、ＥＸ−００２１（以上、疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、いずれも商品名、三菱ケミカル株式会社製）；アンバーライト（商標）ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８（以上、アクリル酸エステル樹脂、いずれも商品名、株式会社オルガノ製）；ダイヤイオン（商標）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（以上、アクリル酸メタクリル樹脂、いずれも商品名、三菱ケミカル株式会社製）；セファデックス（商標）ＬＨ２０、ＬＨ６０（以上、架橋デキストランの誘導体、いずれも商品名、ファルマシア  バイオテク株式会社製）等が挙げられる。中でも、無置換基型の芳香族系樹脂（例えば、ＨＰ−２０）又は無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂（例えば、ＳＰ−８５０）が好ましい。
【００４４】
カラムに充填する合成吸着剤の量は、カラムの大きさ、合成吸着剤の種類等によって適宜決定することができる。
【００４５】
固定担体として合成吸着剤を用いる場合、分解処理液を通液するときの通液速度は、カラムの大きさ、溶出溶媒の種類、合成吸着剤の種類等によって適宜変更が可能であるが、好ましくは、ＳＶ＝１〜３０時間−１である。なお、ＳＶ（Ｓｐａｃｅ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ、空間速度）は、１時間当たり樹脂容量の何倍量の液体を通液するかという単位である。
【００４６】
合成吸着剤に吸着された吸着成分（有効成分）は、溶媒（溶出溶媒）により溶出させることができる。吸着成分をより効率よく回収する観点から、吸着成分を溶出させる前に、カラムに残留する糖類及び無機塩類を水洗により洗い流すことが好ましい。この場合、溶出させた成分をバガスの分解抽出物とすることができる。
【００４７】
固定担体として合成吸着剤を用いる場合、溶出溶媒は、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物からなる群より選ばれる少なくとも１種であってよい。溶出溶媒は、アルコール及び水の混合溶媒が好ましく、エタノール及び水の混合溶媒がより好ましく、吸着成分が室温においてより効率よく溶出可能となる観点から、体積比が５０／５０〜６０／４０（エタノール／水）であるエタノール及び水の混合溶媒が更に好ましい。
【００４８】
固定担体として合成吸着剤を用いる場合、溶出する際のカラムの温度（カラム温度）は室温であってよいが、室温よりもカラム温度を高温にすることにより、エタノール及び水の混合溶媒においてエタノールの混合割合を減らすことができ、吸着成分をより効率的に溶出させることができる。温度は、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは４０〜６０℃である。カラム内は常圧条件下であっても、加圧条件下であってもよい。
【００４９】
固定担体として合成吸着剤を用いる場合、溶出速度は、カラムの大きさ、溶出溶媒の種類、合成吸着剤の種類等によって適宜設定することが可能であるが、好ましくは、ＳＶ＝０．１〜１０時間−１である。
【００５０】
イオン交換樹脂は、樹脂の形態に基づいて、ゲル型樹脂と、ポーラス型、マイクロポーラス型又はハイポーラス型等の多孔性樹脂とに分類されるが、特に制限はない。イオン交換樹脂は、好ましくは陰イオン交換樹脂である。陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂又は弱塩基性陰イオン交換樹脂が用いられてよい。アルカリ処理液を原料として使用する場合、好ましくは、強塩基性陰イオン交換樹脂が用いられるが、その他の処理による分解処理液を原料とする場合は特に制限はない。
【００５１】
市販の強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ダイヤイオン（商標）ＰＡ３０６、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ、ＨＰＡ２５、ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＳＡ２０Ａ、ＵＢＡ１２０（以上、三菱ケミカル株式会社製）、アンバーライト（商標）ＩＲＡ４００Ｊ、ＩＲＡ４０２Ｂｌ、ＩＲＡ４０４Ｊ、ＩＲＡ９００Ｊ、ＩＲＡ９０４、ＩＲＡ４５８ＲＦ、ＩＲＡ９５８、ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ４１１、ＩＲＡ９１０ＣＴ（以上、オルガノ株式会社製）、ダウエックス（商標）マラソンＡ、マラソンＭＳＡ、ＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ５５０Ａ、マラソンＡ２（以上、ダウケミカル日本株式会社製）等が挙げられる。
【００５２】
市販の弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、ダイヤイオン（商標）ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０（以上、三菱ケミカル株式会社製）、アンバーライト（商標）ＩＲＡ４７８ＲＦ、ＩＲＡ６７、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９８、ＸＥ５８３（以上、オルガノ株式会社製）、ダウエックス（商標）マラソンＷＢＡ、６６、ＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ６６、ＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ７７（以上、ダウケミカル日本株式会社製）等が挙げられる。
【００５３】
カラムに充填するイオン交換樹脂の量は、カラムの大きさ、イオン交換樹脂の種類などによって適宜決定できるが、分解処理液の固形分に対して２〜１０，０００倍湿潤体積量が好ましく、５〜５００倍湿潤体積量がより好ましい。
【００５４】
通液条件は、前処理液の種類、イオン交換樹脂の種類等により適宜設定することが可能である。好ましくは、流速はＳＶ＝０．３〜３０時間−１であり、通液する液量はイオン交換樹脂の１００〜３００％であり、カラム温度は４０〜９０℃である。カラム内は常圧又は加圧された状態であってもよい。
【００５５】
固定担体としてイオン交換樹脂を用いる場合、バガスの分解抽出物は、イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、塩や酸、アルコール又はこれらの混合水溶液等の溶離液で溶出させることで得られる画分であってもよい。溶離液は脱気処理されていてもよい。
【００５６】
バガスの分解抽出物は、一実施形態においては、上述した分解処理液又は画分を濃縮した濃縮物であってもよい。濃縮方法は公知の方法であってよく、例えば、減圧下での溶媒留去、凍結乾燥等の方法であってよい。濃縮を行う場合、分解処理液又は画分を１５〜３０倍に濃縮して、濃縮後の成分をバガスの分解抽出物とすることができる。
【００５７】
バガスの分解抽出物は、例えば、次のようにして得ることができる。バガスに、固形物濃度が０．１〜５０％となるように１質量％の水酸化ナトリウム水溶液を添加して１００℃で煮沸を行い、分解処理液（アルカリ処理液）を得る。分解処理液を分画分子量２５００〜５０００のＵＦ膜にて限外濾過を行い、得られた濾過液を酸性に調整してから、無置換基型の芳香族系樹脂を充填したカラムに、カラム温度２０〜６０℃にて通液する。その後、カラムに吸着された成分を、カラム温度２０〜６０℃にて、体積比が５０／５０〜６０／４０（エタノール／水）のエタノール及び水の混合溶媒（溶出溶媒）で溶出させ、エタノール及び水の混合溶媒での溶出開始時点から集めた溶出液の量が該芳香族系樹脂の４５倍湿潤体積量以内に溶出する画分を回収する。回収された画分（抗老化作用を有する成分を含む画分）を集め、慣用の手段（減圧下での溶媒留去、凍結乾燥等）により濃縮して、バガスの分解抽出物を得ることができる。このようにして得られたバガスの分解抽出物は、固形分が３０質量％以上になるように濃縮した液状又は粉末状の抽出物として保存することができる。抽出物の保存は、当該抽出物が液状の場合、冷蔵で行うことが好ましい。
【００５８】
バガスの分解抽出物は、他の例として、例えば、次のようにして得ることもできる。すなわち、バガスに固形物濃度が０．１〜５０％となるように加水して、１３０〜２５０℃の水により、０．２〜４．０ＭＰａの圧力下で水熱処理を行い、濾過による固液分離で分解処理液（水熱処理液）を得る。得られた水熱処理液について、無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂を充填したカラムに、温度２０〜６０℃にて通液した後、カラムに吸着された成分を、カラム温度２０〜６０℃にて、体積比が５０／５０〜６０／４０（エタノール／水）のエタノール及び水の混合溶媒（溶出溶媒）で溶出させ、エタノール及び水の混合溶媒での溶出開始時点から集めた溶出液の量が該芳香族系樹脂の５倍湿潤体積量以内に溶出する画分を回収する。回収された画分（抗老化作用を有する成分を含む画分）を集め、慣用の手段（減圧下での溶媒留去、凍結乾燥等）により濃縮して、バガスの分解抽出物を得ることができる。このようにして得られたバガスの分解抽出物は、固形分が３０質量％以上になるように濃縮した液状又は粉末状の抽出物として保存することができる。抽出物の保存は、当該抽出物が液状の場合、冷蔵で行うことが好ましい。
【００５９】
上述した各実施形態におけるバガスの分解抽出物は、液状又は粉末状であってよい。粉末状のバガスの分解抽出物は、例えば、液状のバガス分解抽出物を用いて、スプレードライ法、凍結乾燥法、流動層造粒法、又は賦形剤を用いた粉末化法等により製造することができる。
【００６０】
抗老化剤は、化粧品、食品組成物、医薬品又は医薬部外品として用いることができる。食品組成物は、例えば、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、栄養機能食品、サプリメント等の形態で提供されてもよい。
【００６１】
抗老化剤は、有効成分であるバガスの分解抽出物のみからなってもよく、化粧品、食品組成物、医薬部外品又は医薬品に使用可能な素材を更に配合してもよい。化粧品、食品組成物、医薬部外品又は医薬品に使用可能な素材としては、特に制限されるものではないが、例えば、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、油脂、甘味料、ミネラル、ビタミン、香料、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等が挙げられる。
【００６２】
タンパク質としては、例えば、ミルクカゼイン、ホエイ、大豆タンパク、小麦タンパク、卵白等が挙げられる。炭水化物としては、例えば、コーンスターチ、セルロース、α化デンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン等が挙げられる。油脂としては、例えば、サラダ油、コーン油、大豆油、ベニバナ油、オリーブ油、パーム油等が挙げられる。甘味料としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖等の糖類、キシリトール、エリスリトール、マルチトール等の糖アルコール、スクラロース、アスパルテーム、サッカリン、アセスルファムＫ等の人工甘味料、ステビア甘味料等が挙げられる。ミネラルとしては、例えば、カルシウム、カリウム、リン、ナトリウム、マンガン、鉄、亜鉛、マグネシウム等、及びこれらの塩類等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ類、ビオチン、ナイアシン等が挙げられる。賦形剤としては、例えば、デキストリン、デンプン、乳糖、結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、クエン酸、乳酸、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン等が挙げられる。基剤としては、例えば、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは１種単独で、又は２種以上を組み合わせて使用されてもよい。
【００６３】
抗老化剤が他の素材を配合する場合、有効成分であるバガスの分解抽出物の含有量は、後述する抗老化剤の形態、使用目的等に応じて適宜設定すればよいが、抗老化効果をより一層有効に発揮する観点から、好ましくは、固形分として０．５質量％以上であり、より好ましくは１質量％以上であり、更に好ましくは３質量％以上であり、また、好ましくは５０質量％以下であり、より好ましくは４０質量％以下であり、更に好ましくは３０質量％以下である。
【００６４】
抗老化剤の形状は制限されず、固体（粉末、顆粒等）、液体（溶液、懸濁液等）、ペースト等のいずれの形状であってもよく、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００６５】
抗老化剤が化粧品として用いられる場合、化粧品は、化粧水、乳液、ローション、クリーム、美容液、オイル、パック、リップクリームなどの基礎化粧料、ヘアートニック、ヘアーリキッド等の整髪料、育毛・養毛料等の頭髪化粧品、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、アイブロウライナー等のメークアップ化粧料等であってよい。
【００６６】
抗老化剤は経口投与がされてよく、非経口投与がされてもよい。
【００６７】
抗老化剤が経口投与される場合、投与量としては、例えば、バガスの分解抽出物が１回当たり５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、１００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、１５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が１日当たり１５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、３００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、４５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が１回当たり１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、８００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、６００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が１日当たり３０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。この範囲であれば、真皮に十分な濃度で抗老化剤を作用させることができ、抗老化作用をよりよく発現することができる。
【００６８】
抗老化剤が、非経口投与として皮膚へ施用される場合、皮膚への施用量としては、例えば、バガスの分解抽出物が１回当たり５μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのが好ましく、１０μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのがより好ましく、３０μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が１日当たり１０μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのが好ましく、２０μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのがより好ましく、６０μｇ／ｃｍ２以上となるように施用されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が、１回当たり５００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのが好ましく、４００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのがより好ましく、３００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのが更に好ましい。また、バガスの分解抽出物が１日当たり１０００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのが好ましく、８００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのがより好ましく、６００μｇ／ｃｍ２以下となるように施用されるのが更に好ましい。この範囲であれば、真皮に十分な濃度で抗老化剤を作用させることができ、抗老化作用をよりよく発現することができる。
【００６９】
抗老化剤は、飼料、飼料添加物としても用いることができる。飼料としては、ドッグフード、キャットフード等のコンパニオン・アニマル用飼料、家畜用飼料、家禽用飼料、養殖魚介類用飼料等が挙げられる。「飼料」には、動物が栄養目的で経口的に摂取するもの全てが含まれる。より具体的には、養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、または飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
【００７０】
一実施形態に係る細胞外マトリックス分解酵素阻害剤又は線維芽細胞賦活剤の具体的な態様は、上述した抗老化剤における態様と同様であってよい。すなわち、一実施形態に係る細胞外マトリックス分解酵素阻害剤又は線維芽細胞賦活剤は、上述した抗老化剤に関する説明において、「抗老化剤」を「細胞外マトリックス分解酵素阻害剤」又は「線維芽細胞賦活剤」と読み替えたものであってよい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。バガスの分解抽出物は、以下、単に「抽出物」と表現することがある。
【００７２】
＜バガスの分解抽出物の製造＞
［製造例１］
サトウキビの搾りかすであるバガス１５ｋｇ（含水率５０質量％）及び０．５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液１００Ｌを混合し、１５０℃の条件でアルカリ処理を行った。アルカリ処理後の混合液を固形分と液分に分離して、液分を約１００Ｌ得た。分画分子量２５００のＵＦ膜（ＧＥウォーター＆プロセス・テクノロジー社、ＧＨ８０４０Ｆ３０）を用いて限外濾過を行い、濾過液８０Ｌを得た。合成吸着剤（三菱ケミカル株式会社製、ＨＰ−２０）１リットルを樹脂塔（内径８０ｍｍ、高さ４００ｍｍ）に充填し、これに上記の濾過液を、ｐＨを６に調整してから流速１０リットル／時間（ＳＶ＝１０．０（時間−１））で通液した。
【００７３】
続いて、５リットルの精製水を、流速１０リットル／時間（ＳＶ＝１０．０（時間−１））で樹脂塔に通液して洗浄した。次に、溶出溶媒として６０％エタノール水溶液（エタノール／水＝６０／４０（体積／体積））２リットルを、流速２リットル／時間（ＳＶ＝２．０（時間−１））で樹脂塔に通液した。続けて、２リットルの精製水を流速２リットル／時間（ＳＶ＝２．０（時間−１））で樹脂塔に通液し、合成吸着剤に吸着した成分を溶出させた。樹脂塔から溶出した画分を、ロータリーエバポレーターにて約１０倍の濃度に減圧濃縮したのち、一晩凍結乾燥して、バガスの分解抽出物として、茶褐色の粉末２０ｇを得た。これを抽出物Ａとした。
【００７４】
［製造例２］
サトウキビの搾りかすであるバガス３０ｋｇ（含水率５０質量％）を、２００℃、１．８ＭＰａの熱水１００Ｌで水熱処理を行った。前処理後の混合液を固形分と液分とに分離して、液分を約８８Ｌ得た。分画分子量２５００のＵＦ膜（ＧＥウォーター＆プロセス・テクノロジー社、ＧＨ８０４０Ｆ３０）を用いて限外濾過を行い、濾過液７０Ｌを得た。合成吸着剤（三菱ケミカル株式会社製、ＳＰ−８５０）１Ｌを樹脂塔（内径８０ｍｍ、高さ４００ｍｍ）に充填し、これに上記の濾過液のうち２５Ｌを、流速２０Ｌ／時間（ＳＶ＝２０．０（時間−１））で通液した。
【００７５】
続いて、３．３Ｌの精製水を、流速２０Ｌ／時間（ＳＶ＝２０．０（時間−１））で樹脂塔に通液して洗浄した。次に、溶出溶媒として６０％エタノール水溶液（エタノール／水＝６０／４０（体積／体積））２Ｌを、流速２Ｌ／時間（ＳＶ＝２．０（時間−１））で樹脂塔に通液した。続けて、２Ｌの精製水を流速２Ｌ／時間（ＳＶ＝２．０（時間−１））で樹脂塔に通液し、合成吸着剤に吸着した成分を溶出させた。樹脂塔から溶出した画分を、ロータリーエバポレーターにて約１０倍の濃度に減圧濃縮したのち、一晩凍結乾燥して、バガスの分解抽出物として、茶褐色の粉末４０ｇを得た。これを抽出物Ｗとした。
【００７６】
＜試験例１：ＭＭＰ−１産生阻害試験＞
抽出物Ａ及び抽出物ＷのＭＭＰ−１の産生阻害効果を、正常ヒト線維芽細胞に対するＭＭＰ−１の阻害作用を評価することにより調べた。
【００７７】
［試験例１−１］
正常ヒト線維芽細胞を培養するための培地としては、５％仔牛血清含有ダルベッコ変法ＭＥＭ培地（倉敷紡績株式会社製、以下、「５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地」ともいう。）を用いた。抽出物Ａを表１の濃度で５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に含有させた培地を調製し、これを試験サンプル含有培地とした。
【００７８】
正常ヒト線維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を、５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と一緒に９６穴マイクロプレートに２．０×１０４細胞／ウェルの密度にて播種した。播種から２４時間経過後、当該マイクロプレート中の上記５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を、抽出物Ａを含む試験サンプル含有培地に交換した。培地交換後更に２４時間培養してから、試験サンプル含有培地をハンクス緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有、ＨＢＳ（＋））に交換した。その後直ちに新鮮な試験サンプル含有培地に交換し、更に２４時間培養した。培養後、培養上清を回収して、ＥＬＩＳＡに供した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡはサンドイッチ法により行い、下記の方法にて実施した。高吸着型ＥＬＩＳＡプレートにAnti-human MMP-1 antibodyを添加後、室温にて一晩コーティングし、次いで、１％牛アルブミン（ＢＳＡ）にて１時間ブロッキングした。ブロッキング後、培養上清及び検量線用のＭＭＰ−１を添加して室温にて２時間インキュベーションし、次いでAnti-human MMP-1 biotinylated antibodyを添加し、室温にて１．５時間インキュベーションした。さらに、ストレプトアビジンＨＲＰを添加して室温にて３０分間インキュベーションした。次に、０．３ｍｇ／ｍＬの２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、及び０．０３％（Ｖ／Ｖ）の過酸化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．０）を添加して２０分間反応させ、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００８０】
培養上清中のＭＭＰ−１量は、市販のＭＭＰ−１にて作成した検量線から算出した。一方、培養後の細胞について、０．５％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１００緩衝液にて溶解し、ＢＣＡ法により総タンパク質を定量した。培養上清中のＭＭＰ−１量を、細胞中の総タンパク質量で除することにより、単位タンパク質量当たりのＭＭＰ−１産生量を算出した。結果を表１に示す。
【００８１】
［試験例１−２］
試験例１において、試験サンプル含有培地をハンクス緩衝液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有、ＨＢＳ（＋））に交換した後、４Ｊ／ｃｍ２の線量の紫外線Ａ波（ＵＶＡ）を照射してから、直ちに新鮮な試験サンプル含有培地に交換した以外は、試験例１と同様の方法により、単位タンパク質量当たりのＭＭＰ−１産生量を算出した。結果を表１に示す。
【００８２】
［試験例１−３］
試験例２において、抽出物Ａを抽出物Ｗに変更し、紫外線Ａ波の線量を５Ｊ／ｃｍ２に変更した以外は、試験例１−２と同様の方法により、単位タンパク質量当たりのＭＭＰ−１産生量を算出した。結果を表１に示す。
【００８３】
【表１】
2020007293.tif 000002
１）抽出物Ａ又は抽出物Ｗの濃度が０μｇ／ｍＬである試験例に対する有意差
＊：ｐ＜０．０５、有意な減少
【００８４】
＜試験例２：エラスターゼ活性阻害試験＞
抽出物Ａ及び抽出物Ｗのエラスターゼの活性阻害効果を、正常ヒト線維芽細胞由来エラスターゼの活性阻害作用を評価することにより調べた。
【００８５】
［試験例２−１］
１０ｃｍ２シャーレでコンフルエントに維持している正常ヒト線維芽細胞に対して、０．５％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１００緩衝液（１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）を添加して細胞を溶解し、これを線維芽細胞由来エラスターゼの粗酵素液として用いた。エラスターゼに対する基質としては、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン  ｐ−ニトロアニリド（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＢＡＣＨＥＭ  ＡＧ社製）を用いた。試験液として、抽出物Ａをトリス緩衝液に溶解させ所定濃度の試験液を調製した。陽性対照としては、６．２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを用いた。
【００８６】
試験液を、９６穴マイクロプレートのウェルに５０μＬずつ添加した。また、５ｍｍｏｌ／ＬのＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡを含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、１００μＬずつ添加した。ここにエラスターゼ粗酵素液をそれぞれのウェルに５０μＬずつ添加し、反応液を得た。エラスターゼ粗酵素液添加直後の反応液について、４０５ｎｍにおける吸光度を反応前の吸光度として測定した（ブランク吸光度）。次いで、３７℃にて２時間静置して反応させた後の反応液について、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（反応後吸光度）。反応後吸光度よりブランク吸光度を差し引いた値を用いて、試験液未添加における吸光度をＣ’、試験液を添加した場合における吸光度をＳ’とし、エラスターゼ活性阻害率（％）を次の式より求めた。結果を表２に示す。抽出物Ａは、ｐ＜０．０５にて有意なエラスターゼ活性阻害効果を示した。
エラスターゼ阻害率（％）＝（１−（Ｓ’／Ｃ’））×１００
【００８７】
［試験例２−２］
抽出物Ａを抽出物Ｗに変更した以外は、試験例２−１と同様の方法により、抽出物Ｗのエラスターゼ活性阻害率を求めた。なお、陽性対照としては、１２．２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを用いた。抽出物Ｗにおいても、エラスターゼ活性阻害効果が認められた。
【００８８】
【表２】
2020007293.tif 000003
２）抽出物Ａの濃度が０μｇ／ｍＬである試験例に対する有意差
＊：ｐ＜０．０５、有意な減少
【００８９】
＜試験例３：線維芽細胞賦活試験＞
抽出物Ａの線維芽細胞に対する賦活作用をＭＴＴ法により調べた。
【００９０】
正常ヒト線維芽細胞を培養するための培地としては、試験例１と同様のものを用いた。抽出物Ａを水に溶解させて、抽出物Ａを表３の濃度で１％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に含有させた培地を調製し、これを試験サンプル含有培地として用いた。陽性対照としては、５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を用いた。
【００９１】
正常ヒト線維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を、５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と一緒に９６穴マイクロプレートに２．０×１０４細胞／ウェルの密度にて播種した。播種から２４時間経過後、当該マイクロプレート中の上記５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を、抽出物Ａを含む試験サンプル含有培地に交換した。培地交換後更に４８時間培養してから、０．４ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を含有する１％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、２時間培養した。培地を除去し、２−プロパノールを添加して生成したブルーホルマザンを抽出した。抽出液の５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、これをブルーホルマザン量とした。抽出物Ａの濃度（試験サンプル含有培地全量基準）が０μｇ／ｍＬの場合（コントロール）に生成されたブルーホルマザン量に対する、抽出物Ａを用いた場合のブルーホルマザン量の割合（百分率）を算出して、細胞賦活率とした。細胞賦活率の値が大きい程、細胞賦活作用が高いといえる。結果を表３に示す。
【００９２】
【表３】
2020007293.tif 000004
３）抽出物Ａの濃度が０μｇ／ｍＬである試験例に対する有意差
＊：ｐ＜０．０５、有意な減少