(57)【要約】      （修正有）【課題】パーキンソン病のより簡便な診断方法を提供する。【解決手段】被検者がパーキンソン病に罹患している可能性を判定するための情報を提供する方法であって、（ｉ）該被検者の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定すること、（ｉｉ）同様に測定された陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルと（ｉ）で測定されたｐ３−Ａｌｃαレベルとを比較すること、（ｉｉｉ）陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者をパーキンソン病に罹患している可能性が高いとの情報を提供する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者がパーキンソン病に罹患している可能性を判定するための情報を提供する方法であって、
（ｉ）該被検者の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定すること、
（ｉｉ）同様に測定された陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルと前記（ｉ）で測定されたｐ３−Ａｌｃαレベルとを比較すること、
（ｉｉｉ）陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者をパーキンソン病に罹患している可能性が高いとの情報が提供される方法、
ここで、前記陰性対照は、パーキンソン病に罹患していない者又は健常者である。
【請求項２】
陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが、複数の陰性対照の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルの平均値＋２標準偏差である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐ３−Ａｌｃαレベルの測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行われることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液検体が血液検体である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｐ３−Ａｌｃαからなるパーキンソン病のバイオマーカー。
【請求項６】
ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする、パーキンソン病に罹患している可能性を判定するためのキット。
【請求項７】
ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体、をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項８】
（１）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項９】
標識と反応する基質をさらに含む請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
（１）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテン、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の診断の領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）は進行性の神経変性疾患であり、黒質ドパミン神経の変性により投射先の線条体においてドパミンが減少し、これに起因する安静時振戦・筋固縮・無動・姿勢障害等を主徴とする。６０才以上では１％程度の有病率を表するコモンディジーズであり、超高齢化社会の健全性を維持する上で克服すべき疾病の一つである。しかしながら、その診断には病識認知後の精密検査が必要であり、簡便な診断マーカーが求められている。こうしたＰＤ診断指標として、これまでにαアドレナリン受容体作動薬含有点眼剤と、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬及び／又はノルアドレナリン放出薬含有点眼剤とを用いた診断薬（特許文献１）、神経栄養因子である血液中のＮＲＧ１タイプＩＩＩの濃度を測定する方法（特許文献２）、脳脊髄液サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量を測定する方法（特許文献３）、皮膚ガス又は汗中のベンジルアルコール等の量を測定する方法（特許文献４）生体由来試料中の中鎖〜長鎖アシルカルニチン及び２次胆汁酸から選ばれる成分の濃度を測定する方法（特許文献５）が報告されている。しかしながら、これらは採取時の侵襲性が高い脳脊髄液を検体としたり高価な検査機器が必要とされたりする等の問題があり、より簡便性の高い指標が求められている。
【０００３】
アルカデイン（Ａｌｃａｄｅｉｎ：以下、「Ａｌｃ」という）は、主に神経細胞に発現している、進化的に保存されたタイプＩ膜タンパク質のファミリーから構成される。Ａｌｃは、神経特異的アダプタータンパク質Ｘ１１Ｌ結合タンパク質（非特許文献１）、及び、シナプス後のＣａ２＋結合タンパク質（カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）とも呼ばれている）（非特許文献２）の両方として個別に同定されてきた。哺乳類では、Ａｌｃには次の４つの異性体が報告されている：Ａｌｃα１（ヒトでは９７１アミノ酸）、Ａｌｃα２（ヒトでは９８１アミノ酸）、Ａｌｃβ（ヒトでは９５６アミノ酸）、及び、Ａｌｃγ（ヒトでは９５５アミノ酸）（非特許文献３）。Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγは、独立した遺伝子によりコードされる一方、Ａｌｃα１及びＡｌｃα２はＡｌｃα遺伝子のスプライスバリアントである。
【０００４】
ＡＰＰのｐ３ドメインに該当する、Ａｌｃα由来の短鎖ペプチド（以下、「ｐ３−Ａｌｃα」という）が、Ａｌｃ  ＣＴＦのγセクレターゼによる切断により分泌されることから、Ａｌｃの二次切断（Ａｌｃ  ＣＴＦの切断）には、プレセニン（以下、「ＰＳ」という）依存性γセクレターゼが関与していることが報告されている。（特許文献６）。
【０００５】
また、細胞培養実験により、野生型及び家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異の発現は、延長し又は短縮したｐ３−Ａｌｃ種を生成させるような切断を生じ、変異型ＰＳ１が産生するＡβの分子種の比率を変化させるのと同様に、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−ＡｌｃγのＣ末断端が異なる分子種の産生比率変化をひき起こすこと、及び、プレセニリンの変異型を有する家族性アルツハイマー病患者の脳髄液中のｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγについても検出される分子種比率変化が認められることが報告されている（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１６２６９３号公報
【特許文献２】特開２０１３−１８１８２３号公報
【特許文献３】特表２０１３−５０４７６６号公報
【特許文献４】特開２０１５−５５６２０号公報
【特許文献５】特開２０１７−１３８１４１
【特許文献６】国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７
【特許文献７】国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４，１７−２６．
【非特許文献２】Ｇｒａｆｆ−Ｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６４，３５４−３６２．
【非特許文献３】Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、パーキンソン病のより簡便な診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＤ患者に特徴的なバイオマーカーについて探索した結果、中枢神経系に発現する１回膜貫通型タンパク質Ａｌｃαの限定分解代謝物であるｐ３−ＡｌｃαがＰＤ患者の血液中に高レベルで存在することを見出し、新たな血液診断マーカーとなり得ることを初めて見出した。更に、本発明者らは、これまでｐ３−Ａｌｃαの測定に必要であったクロロホルム・メタノール抽出が、血中のｐ３−Ａｌｃα測定においては不要であることを見出した。これにより、血液を希釈するのみでＰＤ診断に用いることができることから、従来の方法と比較してより簡便で迅速なＰＤの血液診断を提供することに成功した。
【００１０】
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、以下の発明に関する：
（１）  被検者がＰＤに罹患している可能性を判定するための情報を提供する方法であって、
（ｉ）該被検者の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定すること、
（ｉｉ）同様に測定された陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルと前記（ｉ）で測定されたｐ３−Ａｌｃαレベルとを比較すること、
（ｉｉｉ）陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者をＰＤに罹患している可能性が高いとの情報が提供される方法、
ここで、前記陰性対照は、ＰＤに罹患していない者又は健常者である。
（２）  陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが、複数の陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルの平均値＋２標準偏差である、（１）に記載の方法。
（３）  ｐ３−Ａｌｃαレベルの測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行われることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  体液検体が血液検体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）  血液検体がクロロホルム・メタノール抽出されていないことを特徴とする、（４）に記載の方法。
（６）  ＰＤの治療方法であって、
（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法により被検者がＰＤに罹患している可能性を判定するための情報を提供すること、及び
ＰＤに罹患している可能性が高いとの情報が提供された被検者にＰＤ治療薬を投与することを含む方法。
（７）  被検者由来の血液中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定する方法であって、
該被検者の血液検体を調製すること、及び
前記血液検体中のｐ３−ＡｌｃαレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定することを含む方法。
（８）  前記血液検体がクロロホルム・メタノール抽出されていないことを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）  ｐ３−Ａｌｃαからなるパーキンソン病のバイオマーカー。
（１０）  ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする、パーキンソン病に罹患している可能性を判定するためのキット。
（１１）  ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体、をさらに含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１２）  （ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１３）  標識と反応する基質をさらに含む（１２）に記載のキット。
（１４）（１）ヒトｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテン、
を含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１５）  前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質をさらに含むことを特徴とする（１４）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法は血液検体を用いてＰＤの診断が可能であることから、また、診療や検診の際に行われる採血で実施することができることから、早期かつ簡便なＰＤの発見に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】健常者４０人とＰＤと診断された患者２７人の血漿中のｐ３−Ａｌｃα濃度を測定した結果を示すグラフである。Ｎｏｒｍａｌは健常者、ＰＤはＰＤと診断された患者を示す。縦軸はｐ３−Ａｌｃαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ＰＤ患者において血漿中のｐ３−Ａｌｃα濃度が有意に高値を示した。
【図２】血漿希釈サンプルと血漿をクロロホルム・メタノール抽出したサンプルの測定値を比較したグラフである。黒色が血漿希釈サンプルを示し、灰色が血漿からロホルム・メタノール抽出したサンプルを示す。縦軸はｐ３−Ａｌｃαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。横軸のＡ〜Ｅはサンプルが由来した異なる個人を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ｐ３−Ａｌｃα）
本願において「ｐ３−Ａｌｃα」とは、ヒトＡｌｃα（配列番号１）がα−セクレターゼにより一次切断を受けて生じたＡｌｃの細胞結合型Ｃ末端断片（ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、以下「ＣＴＦ」という）が、更に膜間部切断プロテアーゼ（γ−セクレターゼ）により二次切断されて生じたＣＴＦのＮ末端側のペプチド断片である。アルカデインのαセクレターゼ切断部位及びγセクレターゼ切断部位として複数の部位が存在する（国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７及び国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４参照）ことから、ｐ３−Ａｌｃとしては複数種類が存在し得る。よって、ｐ３−ＡｌｃαのＮ末端のアミノ酸としては、Ａｌｃαの８１５〜８１７番目のアミノ酸、又は当該アミノ酸に近接する１〜数個隣のアミノ酸（すなわち、Ａｌｃαの８１２〜８２０番目のアミノ酸）であってもよい。また、ｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸長としては、３０〜４５アミノ酸であり、好ましくは、３２〜４２アミノ酸、又は３４〜４０アミノ酸である。具体的には、ｐ３−Ａｌｃαは、ｐ３−Ａｌｃα３４（配列番号２）、ｐ３−Ａｌｃα３５（配列番号３）、ｐ３−Ａｌｃα３６（配列番号４）、ｐ３−Ａｌｃα３７（配列番号５）、ｐ３−Ａｌｃα３８（配列番号６）、ｐ３−Ａｌｃα３９（配列番号７）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５（配列番号８）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８（配列番号９）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３９（配列番号１０）、及びｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋４０（配列番号１１）を含む（国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４参照）。ここで、「ｐ３−ＡｌｃαＸ」とは、Ａｌｃα１の８１７番目のアラニン（Ａ）から（８１６＋Ｘ）番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するＸ個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。また、「ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋Ｙ」とは、Ａｌｃαの８１５番目のメチオニン（Ｍ）から（８１４＋Ｙ）番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するＹ個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。本明細書においてｐ３−Ａｌｃαとは、これらの全てのｐ３−Ａｌｃα種を包含する。例えば、ｐ３−Ａｌｃαは、全てのｐ３−Ａｌｃα種、２種類又はそれ以上のｐ３−Ａｌｃα種、又は１種類のｐ３−Ａｌｃαであってもよく、好ましくは全てのｐ３−Ａｌｃα種である。また、ヒトＡｌｃαは個体差により配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１〜数個又はそれ以上の変異を含んでいる可能性がある。よって、本願のｐ３−Ａｌｃαは、厳密に配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部である必要はなく、ヒトＡｌｃαがα−セクレターゼとγ−セクレターゼにより切断されて生じたペプチド断片である限り、このようなヒトＡｌｃαの変異に由来する変異を含んでいてもよい。
【００１４】
（体液検体）
本願において、体液検体とは、ヒトの体液そのもの又は体液を処理して得られる検体を意味する。体液としては、血液（血漿、血清）、脳脊髄液、リンパ液、尿、漿液、関節液、眼房水、涙液、唾液等を挙げることができる。体液を処理して得られる検体としては、体液の分画物若しくは処理物を挙げることができる。検出用検体は、被検者から採取した検体の種類及び検出方法に応じて適宜調製することができる。例えば脳脊髄液のようにそのまま検出に使用できる場合、適宜遠心分離、希釈等により検出用検体を調整してもよい。また、血液のように被検者から採取した検体中に検出を阻害する物質が含まれる場合には、前処理（例えば、プロテインＧカラムによるイムノグロブリン除去）によって阻害物質を除去／不活化して検出用検体を調整してもよい。また、血液検体の場合、低極性有機溶媒及び親水性有機溶媒（双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒及び双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒であり、典型的には、クロロホルム：メタノール）により脱脂処理された検体であってもよい。あるいは、体液検体は、体液から所望のｐ３−Ａｌｃαを分離した分離検体であってもよい。体液からのｐ３−Ａｌｃαの分離は、ペプチドの分離に使用される方法であって、当業者周知の方法により行うことができ、例えば、免疫沈降、ウエスタンブロット、又は、アフィニティクロマトグラフィ等により行うことができる。好ましくは、体液は血液であり、クロロホルム：メタノールによる脱脂処理はされない検体である。
【００１５】
（体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルの測定）
体液検体中のｐ３−Ａｌｃαの測定は、例えば、ｐ３−Ａｌｃαに特異的な抗体を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等等で測定することもできる。また、分離検体を用いる場合、ペプチドのアミノ酸配列、分子量、物理的性質、又は、化学的性質に関する情報であって、ｐ３−Ａｌｃαを特定可能な情報が得られる方法を用いることができ、例えば、マススペクトル、プロテインシーケンサー、ウェスタンブロッティング、又はＥＬＩＳＡ等で測定することもできる。例えば、体液検体中のｐ３−Ａｌｃαは、抗ｐ３−Ａｌｃα抗体を用いてｐ３−Ａｌｃαペプチドを免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳや、ＬＣ−ＭＳで定量する方法により測定することもできる。
【００１６】
例えば、ＥＬＩＳＡ法は、Ｈｎａｓｋｏ，  Ｒｏｂｅｒｔ，  “ＥＬＩＳＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２０１５  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  １０，  ２０１５）や試薬メーカー提供のプロトコルに従って行うことができる。また、ｐ３−ＡｌｃαレベルをＥＬＩＳＡにより測定する方法は、国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４及び本明細書記載を参照して行うこともできる。
【００１７】
ｐ３−Ａｌｃαの測定は、定性的、定量的又は半定量的とすることができるが、好ましくは定量的である。
【００１８】
（陰性対照）
本願において、「陰性対照」とは、ＰＤに罹患していない被検者又は健常者を意味する。ｐ３−Ａｌｃα値は若年層では低く、高年齢層では高くなる傾向があるため、被検者と陰性対照の年代は同じか又は近いことが好ましい。例えば、被検者が５０〜７０代の場合には、陰性対照はＰＤに罹患していない被検者又は健常者のうち５０代から７０代の者を意味してもよい。「陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベル」は、陰性比較対象におけるｐ３−Ａｌｃαレベルを上述の方法に従って被検者の体液検体と同様に測定することにより決定することができる。あるいは、被検者の体液検体とは異なる場所及び／又は異なる時に測定した陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが既に得られている場合には、そのようなレベルを陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルとして利用することもできる。また、陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルが既に知られている場合、当該レベルと同量のｐ３−Ａｌｃαを含有する比較検体を陰性対照の体液検体の代わりに用いて、その測定値を陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルとしてもよい。
【００１９】
（レベル）
本明細書全体において、「レベル」とは、数値化されたｐ３−Ａｌｃαの存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる数値化可能なあらゆる指標を含む。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度や量に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位体積又は単位面積当たりの存在量など）であっても良いし、又は相対的な数値であってもよい。更に、同一サンプルについて（同時に又は異なる時期に）複数回測定した場合には、レベルはその平均値又は中央値とすることができる。
【００２０】
（ＰＤの罹患可能性の判定）
ＰＤの罹患可能性の判定は、決定されたｐ３−Ａｌｃαレベルを利用して行うことができる。判定ステップは、決定された被検者のｐ３−Ａｌｃαレベルを、陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較することにより行うことができる。被検者由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルが、対応する陰性対照の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルよりも高い場合には、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す。このように、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者は、ＰＤに罹患している可能性が高いと判定される。逆に、被検者由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルが、陰性対照由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較して同等か低い場合には、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示さない。このように、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示さない被検者は、ＰＤに罹患している可能性が低いと判定される。
【００２１】
また、ＰＤの罹患可能性の判定は、決定された被検者のｐ３−Ａｌｃαレベルを、特定の閾値（カットオフ値）と比較することにより行うことができる。このような閾値は、過去の被検者とＰＤへの罹患の有無から得られたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線に基づいて、感度及び特異度が最適となるカットオフ値（例えば、｛感度（１−特異度）｝が最大となる数値）として得ることができる。あるいは、感度を優先する場合には、被検者の体液検体の測定と同時に又はそれ以前に測定された複数の陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルの｛平均値＋２×（標準偏差）｝をカットオフ値として用いることもできる。
【００２２】
ＰＤの罹患可能性の判定は、それにより被検者の疾病の有無を推測することを意味し、疾病の有無を１００％の正確さで判定可能であることを意味するものではない。ＰＤの罹患可能性の判定は、疾病発症のリスクが増大しているか否かを意味するものである。即ち、ＰＤの罹患可能性の判定結果は、体液中のｐ３−Ａｌｃαレベルが上昇している被検者において、そのような特徴を示さない被検者と比較して、ＰＤの罹患可能性がより高いことを意味する。
【００２３】
（ＰＤの治療方法）
本発明はさらに、上記方法によりＰＤに罹患している可能性が高いと判定された被検者にＰＤ治療薬を投与することを含むＰＤの治療方法に関する。ＰＤ治療薬としてはレボドパ、カルビドパ、ベンセラジド、エンダカポン、アマンタジン、イストラデフィリン、及び／又はドロキシドパなどが挙げられる。これらの治療薬の投与は当該治療薬の添付文書に従って行うことができる。
【００２４】
（マーカー）
本発明はさらに、血液や尿などの体液や組織に含まれる、タンパク質や遺伝子などの生体内の物質で、病気の変化や治療に対する反応に相関する指標、すなわちマーカーに関する。本発明者らの見出したところによれば、ＰＤ患者の血中においてｐ３−Ａｌｃαレベルが上昇していることから、ｐ３−ＡｌｃαはＰＤのマーカー、特には血中マーカーとして利用することができる。
【００２５】
（キット）
また、本発明は、ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とするキットに関する。すなわち、本願のキットは免疫化学測定用キットである。本発明のキットは、更に、ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体を含んでいてもよい。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。
【００２６】
本発明のキットは、定性的、定量的又は半定量的分析用とすることができるが、好ましくは定量的分析用である。また、本発明のキットが含有する抗体は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域）であってもよい。
【００２７】
例えば、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相又はハプテン、及び（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
または、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、及び、（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。
【００２９】
あるいは、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された不溶性担体、及び、（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化された不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。
【００３０】
本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、セファロースビーズ、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
【００３１】
本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【００３２】
本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。
【００３３】
抗体は、所望のｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒトの免疫動物に免疫することにより作製することができる。また、短い抗原ペプチドのみでは抗原性が低い場合、必要に応じて、例えば前記ペプチドにシステインを付加し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリアタンパクをＳ−Ｓ結合で化学結合したものを抗原として用いることができる。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウス、ラット又はウサギである。
【００３４】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射又は腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩又は尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００３５】
抗体としてモノクローナル抗体を使用する場合、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示した免疫動物の脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、in vitro で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ,２５６,４９５,１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２，１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６,２６９,１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができる。
【００３６】
上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ)等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。
【００３７】
モノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、モノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。
【００３８】
抗体の標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴＭ）  Ｐｉｅｒｃｅ社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）等を用いて標識することもできる。
【００３９】
本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体（又は標識化した抗体）を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
【００４０】
例えば、本発明のキットは、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体固相化プレート、ＨＲＰ標識抗ｐ３−Ａｌｃαポリクローナル抗体溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、標準物質（ｐ３−Ａｌｃペプチド）を備えるキットとして製造することができる。また、別の例として、本発明のキットは、抗ｐ３−Ａｌｃモノクローナル抗体、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットとして製造することができる。当該キットにおいて、テストプレートは、検体を挿入する検体採取部、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体結合金コロイドを含む感作金コロイド塗布部、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体を含む判定部（テストライン）、抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体を含む判定部（リファレンスライン）、吸収剤、及び、メンブレンフィルターを備えていてもよい。
【実施例】
【００４１】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４２】
（実施例１）
健常者４０人、ＰＤと診断された患者２７人の血液を用いて以下の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４３】
（１）希釈サンプルの調製
血漿を希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で二倍に希釈したものを希釈サンプルとして用いた。
【００４４】
（２）抽出サンプルの調製
血漿２００μＬに８００μＬのクロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を加えた後、１０秒間ソニケーターで撹拌し、１時間室温で静置した。１６０μＬの水を加え、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、２０，０００ｇで１５分遠心した。上層（水層）を回収し、Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで乾枯させた後、希釈用緩衝液２５０μＬを加え、３０分間転倒混和により撹拌・溶解したものを抽出サンプルとして用いた。
【００４５】
（３）サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡには、市販のＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）測定用のバッファーセット（＃１９９０３  ＥＩＡ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、株式会社免疫生物研究所、群馬、日本）を用いた。調製したサンプル１００μＬずつを抗ｐ３−Ａｌｃα抗体を固相化させた９６ウェルマイクロプレートに入れ、４℃で一晩反応させた。洗浄液で洗浄後、標識抗体を添加し、４℃で１時間反応させた。再度洗浄液で洗浄後、発色基質としてＴＭＢを加え、室温で遮光しながら反応させ、３０分後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
結果を図１に示す。健常者群とＰＤ患者群との間で明瞭な有意差が確認された（ｐ＝０．００７）。また、健常者値の平均＋２ＳＤをカットオフ値としたときに健常者０人に対しＰＤ患者９人（対象患者数の１／３）が判別された。このことから、血液中のｐ３−ＡｌｃαはＰＤ診断指標として有用であることが示された。
【００４７】
また、（１）で得られた希釈サンプルと（２）で得られた抽出サンプルの測定値の比較結果を図２に示す。従前測定されていた脳脊髄液とは異なり、血漿中のｐ３−Ａｌｃαはクロロホルム・メタノール抽出することなく希釈のみで測定可能であることが見出された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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