(57)【要約】【課題】多重化単一細胞の遺伝子発現分析のための方法及び組成物を提供する。【解決手段】いくつかの方法及び組成物は、固有のバーコード、例えば固有分子バーコード（ＵＭＩ）を保持する小滴及び／又はビーズの使用を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、複数個の単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する方法：
各単一細胞からｍＲＮＡを遊離させて個々のｍＲＮＡの複数個のサンプルを提供する工程であって、個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡが１つの単一細胞に由来する工程；
個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡからｃＤＮＡの第一鎖を第一鎖合成プライマーにより合成し、さらに当該ｃＤＮＡにタグを取り込み複数個のタグ付加ｃＤＮＡサンプルを提供する工程であって、各タグ付加ｃＤＮＡサンプルのｃＤＮＡが１つの単一細胞に由来するｍＲＮＡと相補性であり、さらに当該タグが細胞特異的識別子配列及び場合により固有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む工程；
当該タグ付加ｃＤＮＡサンプルをプールする工程；
任意で、当該プールしたｃＤＮＡサンプルを増幅させて二本鎖ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを生成する工程；及び
タグメンテーション反応を実施し同時に各ｃＤＮＡを切断して当該ｃＤＮＡの各鎖にアダプターを取り込み、それによって複数個のタグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程。
【請求項２】
さらに、当該タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを増幅して増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅工程が追加の配列を当該増幅生成物の５’末端に付加する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
当該追加の配列が固相支持体上での増幅のためにプライマー結合配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、当該増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを固相支持体上で増幅させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、固相支持体上で増幅生成物をシークエンシングする工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
当該タグメンテーション反応が、第一鎖合成プライマーでは見出されないアダプター配列を含むトランスポザーゼ混合物と二本鎖ｃＤＮＡを接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
当該トランスポザーゼ混合物が本質的に、１つのタイプのアダプター配列を有するトランスポソームから成る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、当該タグ付加ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
シークエンシング工程が３’タグの計測を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
シークエンシング工程が全トランスクリプトームの分析を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第一鎖の合成が、ランダムプライマーの混合物を用いて実施され、当該ランダムプライマーがさらにタグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
当該第一鎖合成プライマーが二本鎖部分を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
当該第一鎖合成プライマーが、一本鎖の第一鎖合成プライマーと比較して連結副産物を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
当該第一鎖合成プライマーがヘアピンを形成できる領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
当該第一鎖合成プライマーがＲＮＡ領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
当該第一鎖合成プライマーが相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
複数個のビーズであって、各ビーズが複数個のオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドが、
（ａ）リンカー、
（ｂ）増幅プライマー結合部位、
（ｃ）任意で、各オリゴヌクレオチドで相違する固有分子識別子、
（ｄ）ビーズの各オリゴヌクレオチドで同じであるが、他のビーズでは相違する、ビーズ特異的配列、及び
（ｅ）ｍＲＮＡを捕捉し逆転写をプライミングする捕捉配列、
を含む、前記複数個のビーズ。
【請求項１９】
当該捕捉配列がオリゴｄＴを含む、請求項１８に記載の複数個のビーズ。
【請求項２０】
各ビーズが、他のビーズから隔離された分離小滴に存在する、請求項１８に記載の複数個のビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願６２／２１１，５９７（２０１５年８月２８日出願）に対し優先権を主張し、さらに本出願は、米国仮特許出願６１／９８５，９８３（２０１４年４月２９日出願）及び６１／９８７，４３３（２０１４年５月１日出願）に対して優先権を主張するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／２８０６２（２０１５年４月２８日出願）の部分継続出願である。これらのより早い出願の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（政府補助）
本発明は、公衆衛生サービス（ＰＨＳ）が提供する国立衛生研究所（ＮＩＨ）グラント番号ＭＨ０９８９７７の下で政府の補助を受けて達成された。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
細胞又は組織のｍＲＮＡの内容の決定（すなわち“遺伝子発現プロファイリング”）は、正常並びに病的組織及び器官の機能分析のための方法を提供する。通常では、遺伝子発現プロファイリングは、組織サンプルからｍＲＮＡを単離しこのｍＲＮＡをマイクロアレイハイブリダイゼーションに付すことによって実施される。しかしながら、そのような方法は、既に公知の遺伝子の分析を可能にするだけであって、また別のスプライシング、プロモータ及びポリアデニル化シグナルの分析に用いることはできない。加えて、マイクロアレイは２つの主要な欠点を有する。すなわち、マイクロアレイは公知の遺伝子に連結されること、及びマイクロアレイは感受性及び動的域に限界があることである。
組織のｍＲＮＡの内容の全て又は部分の直接的シークエンシングの利用は増え続けている。しかしながら、直接的シークエンシングによって細胞のｍＲＮＡの内容を分析する従来の方法は、典型的には何百万の細胞を含む組織サンプルから得られる大量のｍＲＮＡを分析することを必要とする。このことは、遺伝子発現を大量のｍＲＮＡで分析する場合には単一細胞に存在する機能情報の多くが失われるかあいまいになることを意味する。加えて、動的プロセス（例えば細胞周期）を集団の平均として観察することは不可能である。同様に、複雑な組織（例えば脳）の別個の細胞型は細胞を個々に分析する場合にのみ調べることが可能である。
調べようとする単一細胞の単離に使用される適切な細胞表面マーカーはしばしば存在せず、マーカーが存在するときでさえも、少数の単一細胞では遺伝子発現の自然な変動域を捉えるには十分ではない。必要なことは、複数個の単一細胞における遺伝子発現の分析に用いることができるｃＤＮＡライブラリーを調製する方法である。
【０００３】
（配列表）
本出願は電子書式の配列表とともに出願されている。当該配列表は、ＩＰ−１３８８−ＵＳ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと表題を付したファイル（２０１５年９月１５日作成、４Ｋｂ）として提供される。当該配列表の電子書式情報は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【発明の概要】
【０００４】
単一細胞に由来する核酸及び／又は単一細胞の核及び細胞小器官に由来する核酸の分析のための方法及び組成物が本明細書で提示される。いくつかの方法及び組成物は、多重化単一細胞の遺伝子発現分析のために用いることができる。いくつかの方法及び組成物は、固有のバーコード（例えば固有分子バーコード（ＵＭＩ））を保持する小滴及び／又はビーズの使用を含む。
ある実施態様では、１つの単一細胞に由来する核酸を分析する方法及び組成物が本明細書で提示される。いくつかの実施態様では、当該核酸配列分析方法及び組成物を用いて、１つの単一細胞小器官に由来する核酸からシークエンシングライブラリーを調製できる。いくつかの実施態様では、細胞小器官は１つの単一細胞に由来する核であってもよい。いくつかの実施態様では、細胞小器官は単一細胞から入手される。他の例示的細胞小器官にはミトコンドリア及びリボソームが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０００５】
ある実施態様では、当該方法は、複数の細胞から核を遊離させて複数個の核を提供する工程を含み、ここで各々の核は１つの単一細胞に由来する。当該複数の核は空間的に互に分離され、したがって１つの核は空間的隔離区画に存在する。ｃＤＮＡの第一鎖は、個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡから第一鎖合成プライマーにより合成される。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはオリゴｄＴプライマーであり、前記はさらに第一の増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはランダマーである。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはランダマーであり、前記はさらに第一の増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはオリゴｄＴプライマー及びランダマーの混合物であり、各々はさらに第一の増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、当該方法はさらに、鋳型切換えオリゴヌクレオチドプライマー（ＴＳＯプライマー）をオリゴｄＴ及びランダマーの混合物と一緒に取り込む工程を含み、オリゴｄＴプライマー及びランダマーの各々はさらに第一の増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、ＴＳＯプライマーはさらに第二の増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはｍＲＮＡ鋳型を超えて伸長され、さらにＴＳＯプライマー鎖をコピーする。いくつかの実施態様では、ｃＤＮＡの第二鎖はＴＳＯプライマーを用いて合成される。いくつかの実施態様では、ｃＤＮＡの第二鎖は、ｃＤＮＡの第一鎖に相補的な第二の増幅プライマーを用いて合成され、前記はｍＲＮＡ鋳型を超えて伸長され相補性ＴＳＯ鎖を包含する。いくつかの実施態様では、二本鎖ｃＤＮＡは第一及び第二の増幅プライマーにより増幅される。いくつかの実施態様では、第一、第二、及び第一第二両増幅プライマーは固相支持体に固定される。例示的固相支持体にはビーズ、フローセル、マイクロウェルが含まれる。
【０００６】
いくつかの実施態様では、二本鎖ｃＤＮＡはタグメンテーション反応に付され、したがって、バーコードを二本鎖ｃＤＮＡに導入できる。タグメンテーションの例示的方法は、米国特許９，１１５，３９６号、９，０８０，２１１号、９，０４０，２５６号、米国特許出願広報２０１４／０１９４３２４に開示されている。前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる。いくつかの実施態様では、当該バーコードを用いて、配列の隣接情報を決定できる。いくつかの実施態様では、バーコードをソース識別子として用いることができる。
いくつかの実施態様では、当該方法は、ｃＤＮＡにタグを取り込んで複数個のタグ付加ｃＤＮＡサンプルを提供する工程を含み、ここで各タグ付加ｃＤＮＡサンプルのｃＤＮＡは１つの単一細胞に由来するｍＲＮＡに相補性である。ある実施態様では、タグは細胞特異的識別子配列及び固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはタグを含む。いくつかの実施態様では、ＴＳＯプライマーはタグを含む。いくつかの実施態様では、複数の単一細胞の核に由来するタグ付加ｃＤＮＡをプールし、場合により増幅させることができる。
いくつかの実施態様では、当該方法は、１つの単一細胞に由来するミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、又はミトコンドリアＤＮＡからシークエンシングライブラリーを調製する工程を含む。当該方法は、１つの単一細胞から複数の細胞小器官を遊離させて複数個の細胞小器官を提供する工程を含む。当該複数の細胞小器官は空間的に互に分離され、したがって１つの小器官は空間的隔離区画に存在する。ＤＮＡの第一鎖は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、又は第一鎖合成プライマーから第一鎖合成プライマーにより合成される。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはランダマーである。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはランダマーであり、さらにプライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーは、第一鎖特異的合成プライマー及びランダマーの混合物である。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーは第一鎖特異的合成プライマー及びランダマーの混合物であり、各々はさらに第一の増幅プライマー結合部位を含む。
【０００７】
いくつかの実施態様では、第一のプライマー結合部位と結合するプライマーは増幅プライマーである。いくつかの実施態様では、当該方法はさらに、鋳型切換えオリゴヌクレオチドプライマー（ＴＳＯプライマー）を第一鎖特異的合成プライマー及びランダマーの混合物と一緒に取り込む工程を含み、第一鎖特異的合成プライマー及びランダマーはさらに第一のプライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、ＴＳＯプライマーはさらに第二のプライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、第二のプライマー結合部位に結合するプライマーは増幅プライマーである。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーは、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、又はミトコンドリアＤＮＡ鋳型を超えて伸長し、さらにＴＳＯプライマー鎖をコピーする。いくつかの実施態様では、ＤＮＡの第二鎖はＴＳＯプライマーを用いて合成される。いくつかの実施態様では、ＤＮＡの第二鎖はＤＮＡの第一鎖に相補的な第二のプライマーを用いて合成され、前記は鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡを超えて伸長されて相補性ＴＳＯ鎖を包含する。いくつかの実施態様では、二本鎖ＤＮＡは第一及び第二のプライマーにより増幅される。
ある実施態様では、複数の細胞小器官（例えば核、ミトコンドリア、リボソーム）は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって空間的に分離され、各細胞小器官は、空間的隔離区画（例えば単一マイクロウェル又はフリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）Ｃ１チップ）中に選別される。いくつかの実施態様では、各細胞小器官は、固体表面に固定されることによって空間的隔離区画中に空間的に分離される。例えば、前記は抗体を介して実施され、この場合、抗体は細胞小器官に特異的に結合し、かつ抗体は固体表面に固定される。いくつかの実施態様では、固体表面はフローセル又はビーズである。
【０００８】
いくつかの実施態様では、ランダマーは、以下から成る群から選択される１つ以上の準ランダムプライマーを含む：ランダム増幅プライマーのＡＴ−リッチセット；ＡＴ−リッチ５’末端を含むランダム増幅プライマーセット；長さ変動性ランダム増幅プライマーセット（この場合、各プライマーはランダム３’部分及び縮退５’末端を含み、前記の縮退５’末端はプライマーのランダム３’部分のＡ／Ｔ含量に対して長さが比例し得る）；Ｔｍ標準化ランダムプライマーセット（この場合、当該セットの各プライマーは、当該プライマーセット中の他のプライマーのＴｍに対して各プライマーのＴｍを標準化できる１つ以上の塩基アナローグを含む）；ランダムプライマーセット（この場合、各プライマーは、ランダム３’部分及び定常５’プライミング部分を含む）；ランダム増幅プライマーセット（この場合、各プライマーは、ランダム３’部分及び定常５’プライミング部分を含み、さらにランダム３’部分はＲＮＡを含む）；ランダム増幅プライマーセット（この場合、各プライマーは、ランダム３’部分及び定常５’プライミング部分を含み、さらにランダム３’部分は、以下を含む核酸から成る群から選択される少なくとも１つ非天然塩基を含む：２′−デオキシ−２−チオチミジン（２−チオ−ｄＴ）、２−アミノプリン−２′−デオキシリボシド（２−アミノ−ｄＡ）、Ｎ４−エチル−２′−デオキシシチジン（Ｎ４−Ｅｔ−ｄＣ）、Ｎ４−メチルデオキシシチジン（Ｎ４−Ｍｅ−ｄＣ）、２′−デオキシイノシン、７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）、７−ヨード−７−デアザグアニン（Ｉ−デアザＧ）、７−メチル−７−デアザグアニン（ＭｅｃＧ）、７−エチル−７−デアザグアニン（ＥｔｃＧ））；及び前述のプライマーセットの任意の組合せ。上記に示す準ランダムプライマーは、本明細書でさらに詳細に述べる。本明細書に記載されるいくつかの実施態様では、準ランダムプライマーはペア又はセットで提供される。
【０００９】
本明細書で提示するある実施態様は、複数個の単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する方法である。前記方法は以下の工程を含む：各単一細胞からｍＲＮＡを遊離させて個々のｍＲＮＡの複数個のサンプルを提供する工程（ここで、個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡは１つの単一細胞に由来する）；個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡからｃＤＮＡの第一鎖を第一鎖合成プライマーにより合成し、さらに当該ｃＤＮＡにタグを取り込み複数個のタグ付加ｃＤＮＡサンプルを提供する工程（ここで、各タグ付加ｃＤＮＡサンプルのｃＤＮＡは１つの単一細胞に由来するｍＲＮＡに相補性である）。ある実施態様では、タグは細胞特異的識別子配列及び固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。いくつかの実施態様では、タグはＵＭＩをもたない細胞特異的識別子配列を含む。当該方法はさらに以下の工程を含む：タグ付加ｃＤＮＡサンプルをプールする工程；プールしたｃＤＮＡサンプルを場合により増幅させて二本鎖ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを生成する工程；及びタグメンテーション反応を実施し同時に各ｃＤＮＡを切断して当該ｃＤＮＡの各々の鎖にアダプターを取り込み、それによって複数個のタグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程。いくつかの実施態様では、十分な数の単一細胞が存在し、ｃＤＮＡの増幅を回避することができる。ｃＤＮＡの第二鎖は、鋳型切換えオリゴヌクレオチドプライマー（ＴＳＯプライマー）を用いて合成され、対称性ネクストエラ（Ｎｅｘｔｅｒａ）がその後に続く。
ある種の実施態様では、当該方法はさらに、タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを増幅し、増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程を含む。いくつかの特徴では、増幅工程は、追加の配列を増幅生成物の５’末端に付加する工程を含む。
いくつかの特徴では、追加の配列は、固相支持体での増幅のためにプライマー結合配列を含む。いくつかの特徴では、追加の配列は追加のインデックス配列を含む。
ある種の実施態様では、当該方法はさらに、増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを固相支持体上で増幅する工程を含む。
ある種の実施態様では、当該方法はさらに、増幅生成物を固相支持体上でシークエンシングする工程を含む。
【００１０】
いくつかの特徴では、タグメンテーション反応は、第一鎖合成プライマーでは見出されないアダプター配列を含むトランスポザーゼ混合物と二本鎖ｃＤＮＡを接触させる工程を含む。
いくつかの特徴では、トランスポザーゼ混合物は、本質的に１つのタイプのアダプター配列を有するトランスポソームから成る。
ある種の実施態様では、当該方法はさらに、タグ付加ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする工程を含む。
いくつかの特徴では、シークエンシング工程は３’タグの計測を含む。
いくつかの特徴では、シークエンシング工程は全トランスクリプトームの分析を含む。
いくつかの特徴では、第一鎖の合成はランダムプライマーの混合物を用いて実施され、ランダムプライマーはさらにタグを含む。
いくつかの特徴では、第一鎖合成プライマーは二本鎖部分を含む。いくつかの実施態様では、二本鎖部分を含む第一鎖合成プライマーはさらに１つの一本鎖ループを一方の末端に含む。いくつかの特徴では、第一鎖合成プライマーはヘアピンを形成できる領域を含む。
いくつかの特徴では、第一鎖合成プライマーは、一本鎖の第一鎖合成プライマーと比較して連結副産物を減少させる。
いくつかの特徴では、第一鎖合成プライマーはＲＮＡ領域を含む。
いくつかの特徴では、第一鎖合成プライマーは相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成する。
さらにまた複数個のビーズが本明細書で提示され、ここで、各ビーズは複数個のオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは以下を含む：（ａ）リンカー、（ｂ）増幅プライマー結合部位、（ｃ）場合により固有分子識別子（各オリゴヌクレオチドについて相違する）、（ｄ）ビーズ特異的配列（当該ビーズの各オリゴヌクレオチドで同じであるが、他のビーズでは異なる）、及び（ｅ）ｍＲＮＡを捕捉し逆転写をプライミングする捕捉配列。
いくつかの特徴では、捕捉配列はオリゴｄＴを含む。
いくつかの特徴では、各ビーズは、他のビーズから隔離された分離小滴に存在する。
１つ以上の実施態様の詳細が添付の図面及び下記の記述で説明される。他の特色、目的及び利点は、当該記述及び図面からさらに特許請求の範囲から明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】スマーター（ＳＭＡＲＴｅｒ）方法論を用いるｃＤＮＡ合成の概要を示す例示的模式図である。
【図２Ａ】ある実施態様の第一鎖合成を示す例示的模式図である。第一鎖合成はオリゴｄＴによりプライミングされ、その後で鋳型切換え、サンプルプール、単一プライマーＰＣＲが実施される。オリゴｄＴには、場合により分子バーコード（ＵＭＩ）、サンプルバーコード（ＢＣ）、増幅プライマー結合配列（Ｖ２．Ａ１４）及び鋳型スイッチ（ＴＳ）プライマー配列が添付されている。
【図２Ｂ】プールした増幅生成物の対称性ネクストエラによるタグメンテーション、続いて異なるフォワード（Ｖ２．Ｂ１５）及びリバース（Ｖ２．Ａ１４）ＰＣＲプライマーを用いる増幅、さらにその後のペアエンドシーケンシングを示す例示的模式図である。
【図３Ａ】ある実施態様の第一鎖合成を示す例示的模式図である。第一鎖合成はオリゴｄＴによりプライミングされ、その後で鋳型切換え、サンプルプール、単一プライマーＰＣＲが実施される。オリゴｄＴには、サンプルバーコード（ＢＣ）、場合により分子バーコード（ＵＭＩ）、増幅プライマー結合配列（Ｖ２．Ａ１４）及び鋳型スイッチ（ＴＳ）プライマー配列が添付されている。場合によりＵＭＩはＢＣの５’末端に存在する。
【図３Ｂ】ある実施態様における増幅生成物プールのタグメンテーション、増幅及びシークエンシングを示す例示的模式図である。
【図４Ａ】ある実施態様の第一鎖合成を示す例示的模式図である。
【図４Ｂ】ある実施態様における増幅生成物プールのタグメンテーション、増幅及びシークエンシングを示す例示的模式図である。
【図５】ある実施態様にしたがって多重化サンプルをプールしシークエンシングする方法を示す例示的模式図である。
【図６】１００ｐｇのヒト脳参照ＲＮＡを用いる遺伝子発現分析の複数の方法を比較する表である。
【図７】複数の単一細胞を用いる高処理単一細胞遺伝子発現分析の複数の方法を比較する表である。
【図８】ただ１つのトランスポザーゼアダプター（Ｖ２．Ｂ１５）を用いるタグメンテーションに対し２つのトランスポザーゼ（Ｖ２．Ａ１４及びＶ２．Ｂ１５）による標準／非対称性タグメンテーションを用いるタグメンテーションで転写カバー範囲を比較するグラフを示す。
【図９Ａ】ある実施態様における、ランダマー使用第一鎖合成を必要とする全トランスクリプトーム分析を示す模式図である。
【図９Ｂ】第一鎖合成にランダマーを用いたときに生成され得る連結副産物を示す模式図である。
【図１０】連結副産物を減少又は回避させる多様なプライマー設計を示す。
【図１１】ある実施態様の小滴を土台とするバーコード付与を示す模式図である。
【図１２】ある実施態様のビーズを土台とするバーコード付与を示す模式図である。
【図１３】単一核ＲＮＡシークエンシングのワークフローを示す模式図である。
【図１４】単一核からｃＤＮＡを合成する工程を示す。
【図１５】鋳型スイッチスマーター法を用いるｃＤＮＡ合成を示す模式図である。
【図１６】オリゴｄＴプライマーに加えてランダムプライマーの存在下で実施したｃＤＮＡ合成の模式図である。
【図１７】ＳＭＡＲＴ−プラスアッセイ法を用いた場合の利点を示す。図１７Ａは、１０００を超える高品質単一核からコンパイルしたＳＭＡＲＴ−プラスアッセイのアッセイ性能を示す。図１７Ｂは転写カバー域データを示す。
【図１８】ＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ法を超えるＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑプラスの向上したアッセイ感度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
多重化単一細胞遺伝子発現分析のための方法及び組成物が本明細書で提示される。いくつかの方法及び組成物は、固有のバーコード（例えば固有の分子バーコード（ＵＭＩ））を保持する小滴及び／又はビーズの使用を含む。
これまでのところ、単一細胞のＲＮＡ−Ｓｅｑのためにもっとも一般的に用いられる方法は、ＣＬＯＮＴＥＣＨTM  ＳＭＡＲＴ−ＳＥＱTM技術又はその誘導技術を土台とする。簡単に言えば、オリゴ（ｄＴ）プライマーが第一鎖ｃＤＮＡ合成反応をプライミングする。逆転写酵素（ＳＭＡＲＴＳＣＲＩＢＥTM）がｍＲＮＡの５’末端に達するとき、当該酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性はいくつかの付加的な非鋳型ヌクレオチドを当該ｃＤＮＡの３’末端に付加する。鋳型スイッチオリゴ（この非鋳型ヌクレオチドストレッチと塩基対を形成するように設計されている）は、アニーリングして伸長した鋳型を作出し、当該ＲＴが当該オリゴヌクレオチドの末端の複製を継続することを可能にする（図１）。
本明細書で提示される方法は、例えばＵＳ２０１２／００１００９１の開示（参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されているように、サンプル特異的タグを付加したｃＤＮＡを作製する方法を含むことができる。本明細書で用いられるように、単一細胞タグ付加逆転写及びＳＴＲＴという用語は、例えばＵＳ２０１２／００１００９１の参照により本明細書に取り込んだ資料に開示された方法を指す。いくつかの実施態様では、二本鎖ｃＤＮＡはＳＴＲＴ法ではＤＮａｓｅで分解されない。その代わりに、二本鎖ｃＤＮＡは、トランスポザーゼでタグメンテーションされる（例えば標準ネクストエラ）。
二本鎖ｃＤＮＡは続いて、例えば、全トランスクリプトームＲＮＡ−ＳｅｑのためにはＮＥＸＴＲＥＡTM若しくはＴＲＵＳＥＱTMを用い、又は５’末端シークエンシングのためには酵素分解、例えばＤＮａｓｅ  Ｉ若しくはフラグメンターゼを用いその後アダプター連結を実施してシークエンシングライブラリーに変換され得る。両方法には賛否両論がある。すなわち、前者では、サンプルバーコードがライブラリー調製中に導入された後で多重化され得るだけであるが、後者は、バーコードは第一鎖合成工程中に導入できるのでｃＤＮＡ合成後に多重化できる。したがって、サンプル当たりの処理能力が高ければ高いほど及び経費が安ければ安いほど後者が有利である。しかしながら、両方法により得られる情報は異なる用途を有する。すなわち、前者は全トランスクリプトームのシークエンシングを可能にし、後者は遺伝子発現レベルのみ審問する。
【００１３】
本明細書では、単一細胞インプットレベルで適用でき、さらにプロトコルの初期に高レベルのサンプル多重化を可能にする迅速な遺伝子発現ライブラリーの調製が提示される。
いくつかの実施態様では、第一鎖合成は、（定着させた）オリゴｄＴで（或いは場合により１つのランダマー又は２つのランダマーの組合せで）プライミングされ、前記にはサンプルバーコード（ＢＣ）、増幅プライマー結合部位、及び場合により鋳型スイッチ（ＴＳ）プライマー配列が添付される。いくつかの実施態様では、増幅プライマー結合部位はトランスポザーゼアダプター配列であり、例えばネクストエラアダプター配列Ｖ２．Ａ１４又はＶ２．Ｂ１５である。当該バーコードは、分子バーコード（固有分子識別子又は“ＵＭＩ”（前記はＰＣＲ重複物の検出を可能にするであろう））の後ろにあっても前にもあってもよい。逆転写酵素がｍＲＮＡの５’末端に到達するとき、上記及びＵＳ２０１２／００１００９１の本明細書取り込み資料に記載されたように鋳型スイッチが生じる。鋳型スイッチは、ＴＳプライマー配列の相補物を第一鎖ｃＤＮＡに取り込む。サンプルバーコードは第一鎖ｃＤＮＡに取り込まれているので、異なるサンプルがこの時点でプールされ得る。続いて、第一鎖プールは二本鎖にされ、さらに場合によってＴＳプライマーによりＰＣＲ反応で増幅される（図２Ａ）。ｃＤＮＡの両末端が相補性配列を含むという事実のために、ヘアピン構造の形成はより小さなフラグメント（例えば人工産物など）の増幅の抑制をもたらすであろう。
【００１４】
いくつかの実施態様では、図２Ａ及び３Ａに示すように、第一鎖合成はオリゴｄＴでプライミングされ、前記オリゴｄＴには、サンプルバーコード（ＢＣ）、トランスポザーゼアダプター配列（“ネクストエラＶ２．Ａ１４配列”）のコピー、場合により分子バーコード（ＵＭＩ）、及び鋳型スイッチ（ＴＳ）プライマー配列が添付されている。ｃＤＮＡ鎖の３’末端の鋳型スイッチは当該第一鎖の他方の末端でＴＳプライマー配列を取り込む。異なるサンプルのｃＤＮＡをこの時点でプールすることができる。
いくつかの実施態様では、図２Ｂ及び３Ｂに示すように、ｃＤＮＡはＴＳオリゴで増幅される。この単一プライマーＰＣＲは小アンプリコン（例えばプライマーダイマーなど）を抑制する。ｃＤＮＡプールはトランスポザーゼ（例えば“ＮＥＸＴＥＲＡTM”）でタグメンテーションできる。前記トランスポザーゼは、典型的な２つのアダプターではなく１つのアダプターを含むだけである。図２Ｂ及び３Ｂに示す例では、トランスポザーゼはＶ２．Ｂ１５オリゴをローディングされる。タグメンテーションの後で、ｐ５−Ｖ２．Ａ１４及びｐ７−Ｖ２．Ｂ１５増幅プライマーによるＰＣＲは当該ｃＤＮＡの３’末端フラグメントを優先的に増幅する。２つのタグメンテーション事象によって生成されたフラグメント（“対称性フラグメント”）はＰＣＲの間抑制され、シークエンシング可能なフラグメントを生成しないであろう。例えば、図２Ｂ及び３Ｂに示すように、対称性フラグメントから生じる増幅生成物は、増幅生成物の５’及び３’の両末端にＰ７プライマー配列を提示し、Ｐ５及びＰ７増幅プライマーを保持する標準イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）フローセルでシークエンシング可能クラスターを形成しないであろう。加えて、それらは、それらの相補性末端のためにＰＣＲの間抑制されるであろう。対照的に、３’末端フラグメントは増幅後にＰ５及びＰ７プライマー結合部位を保持し、イルミナフローセルでシークエンシング可能なクラスターを形成することができる。ペアエンドシーケンシングは、リード１でサンプルのＢＣ及びＵＭＩをもたらし、リード２でｃＤＮＡ配列をもたらす。
【００１５】
したがって、本明細書で提示するある種の実施態様では、全転写物のシークエンシングを実施するのではなく、３’タグの計測に依拠するデジタル遺伝子発現アッセイ型が実施される。本明細書で提示する方法は、細胞に第一鎖合成工程で個々にバーコードを付す能力を提供する。加えて、安価なオリゴｄＴプライマー又はランダマーによるｃＤＮＡ  ３’末端のバーコード付与は顕著な経費軽減利点を提供する。さらにまた、ｃＤＮＡ合成のためにランダマーを使用することは、３’タグ計測アッセイに加えて当該方法を全ＲＮＡシークエンシングプロトコルにより類似させるので有利である。
その後のプール化、クリーンアップ、単一プライマーｃＤＮＡ  ＰＣＲ増幅、タグメンテーション及びシークエンシングライブラリー調製を、１本の単一チューブで２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又は１００を超える細胞のために実施することができる。したがって、本明細書に記載する方法及び組成物は多重化に極めて馴染みやすい。例として、図５に示すように、本明細書で提供される方法は、細胞レベルの多重化を可能にする（例えば９６ウェルプレートに付き９６サンプル）。さらにまた、当該方法は、固有にバーコードを付したプレートを用いて更なる多重化を可能にする（例えば９６ウェルプレートを識別するバーコードを取り込むためにタグメンテーションを実施する）。これらの方法は自動化に馴染みやすく、経費及び時間の目覚ましい軽減を提供する。
第一鎖合成プライマーにおけるサンプルバーコード及びＵＭＩの順序は変動させることができる。例えば、いくつかの実施態様では、サンプルバーコードはＵＮＩに対し３’に配置される。いくつかの実施態様では、サンプルバーコードはＵＮＩに対し５’に配置される。いくつかの実施態様では、サンプルバーコードはＵＮＩと直に連続する。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード（ＢＣ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上のヌクレオチドによりＵＭＩから隔てられる。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード（ＢＣ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上のヌクレオチドによりＵＭＩとオーバーラップする。
【００１６】
いくつかの実施態様では、タグメンテーションはトランスポザーゼ混合物を用いて実施される（前記トランスポザーゼ混合物は第一鎖合成プライマーでは見出されないアダプター配列を含む）。そのようにして、第一鎖合成プライマーに取り込まれる配列と比較して異なるアダプター配列を保持するタグメンテーションフラグメントが生成される。例えば、いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ混合物は、もっぱら１つのタイプのアダプター配列を有するトランスポソームを含む。このタイプの混合物によって生成されるフラグメントは本明細書では“対称性フラグメント”と称され、イルミナフローセルでシークエンシング可能なクラスターを生じない。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ混合物は第一鎖合成プライマーに取り込まれるいくらかの量の配列を含むことができ、この場合、当該量は、３’ｃＤＮＡフラグメントの全て又は実質的に全てが増幅及びシークエンシングされることをなお可能にするには十分に少ない。例えば、トランスポソーム混合物のアダプター配列は、第一鎖合成プライマーに取り込まれる配列の０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、８％、１９％、２０％未満、又は２５％、３０％、３５％、４０％、４５％未満、又は５０％未満を含むことができる。典型的には２つのトランスポザーゼアダプターが用いられる場合、当該２つのアダプターのどちらか一方は第一鎖合成プライマーに取り込まれ、他方のアダプターはタグメンテーション事象時に用いられ得ることは理解されるであろう。例えば、図３Ａ、３Ｂ、４Ａ及び４Ｂに示す例示的実施態様で、１つのアダプター配列が第一鎖合成プライマーに取り込まれる場合には当該アダプターはタグメンテーション混合物で用いられない。図３Ａ及び３Ｂは、アダプターＶ２．Ａ１４が第一鎖合成プライマーに取り込まれ、アダプターＶ２．Ｂ１５がタグメンテーション工程時にトランスポソームアダプターとして用いられる１つの実施態様を示す。図４Ａ及び４Ｂはまた別の実施態様を示し、この場合は、アダプターＶ２．Ｂ１５が第一鎖合成プライマーに取り込まれ、アダプターＶ２．Ａ１４がタグメンテーション工程時にトランスポソームアダプターとして用いられる。両事例で、得られるタグメンテーションフラグメントは２つのカテゴリーに分けられる。すなわち対称性フラグメント（増幅及び／又はシークエンシングできない）及び非対称性フラグメント（Ｖ２．Ａ１４及びＶ２．Ｂ１５プライマーセットを用いて増幅できる）である。
【００１７】
いくつかの実施態様では、多重化できる単一細胞の数は、トランスポソームアダプター配列にインデックスを取り込ませることによって顕著に増加する。図５に示すように、細胞特異的バーコードを用いて個々の細胞の各々を識別でき、さらに、複数の細胞の各セットをトランスポソームアダプター配列にプレート特異的バーコードを取り込ませたタグメンテーション混合物と接触させることができる。図５に示す例では、プレートの９６細胞の各々に由来するｃＤＮＡをタグメンテーションの前にプールし、続いてタグメンテーション実施サンプルを多重化シークエンシングの前にプールする。任意の数の細胞をタグメンテーションの前にプールできること、及び９６ウェルプレートの使用は単に多様な実施態様の１つであることは理解されるであろう。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００個の細胞、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個を超える細胞、又は１０００個を超える細胞、及びその間に介在する任意の数の細胞のセットをタグメンテーションのためにプールすることができる。第一鎖合成は、任意の単一ウェル又はマルチウェル容器（例えばマルチウェルプレート、チップ、微小流体装置、エマルジョン、ビーズ混合物、又は複数個の細胞の多重操作のために適切な他の任意の様式）で実施できる。
図７（複数の単一細胞）に示すように、非対称性タグメンテーション（ネクストエラＶ２．Ｂ１５／Ｖ２．Ａ１４バージョン）と比較してどちらかの対称性タグメンテーション（ネクストエラＶ２．Ｂ１５バージョン）を用いて遺伝子発現を分析したとき、顕著な数の遺伝子が検出され、さらに他のメトリックが得られた。図８は、２つのトランスポザーゼアダプター（Ｖ２．Ａ１４及びＶ２．Ｂ１５）を用いるタグメンテーションに対してただ１つのトランスポザーゼアダプター（Ｖ２．Ｂ１５）を用いて実施したときには、転写カバー域が転写物の３’末端に向けてほぼ完全に偏向することを示す。
【００１８】
いくつかの実施態様では、サンプル及びＵＭＩのバーコード付与は個々の細胞を小滴に隔離することによって実施される。いくつかの実施態様では、小滴はエマルジョン中で互に隔離される。いくつかの実施態様では、小滴は、小滴アクチュエータを用いて形成及び／又は操作される。特定の実施態様では、１つ以上の小滴はバーコード含有第一鎖合成プライマーの種々のセットを含む。いくつかの実施態様では、各小滴は多数の第一鎖合成プライマーを含み、これらのプライマーの各々は同一のバーコードを含む同一の配列を有し、さらに１つの小滴のバーコードは別の小滴のバーコードと異なるが、当該第一鎖合成プライマーの残りの部分は小滴間で同じものを維持する。したがって、これらの実施態様では、バーコードは、小滴の識別子として作用するとともに小滴に包含される単一細胞の識別子としても作用する。特定の実施態様では、１つ以上の小滴はＵＭＩ含有第一鎖合成プライマーの種々のセットを含む。したがって、各小滴に溶解される個々の細胞の各々は各小滴中のバーコードによって識別可能であろう。図１１に示すように、小滴によるバーコード付与は、単一細胞を含む小滴を固有のバーコードセットを含む他の小滴と混ぜ合わせることによって実施できる。この様式は、マルチウォール様式で利用できるもの以外の追加の多重性を可能にする。第一鎖合成及び鋳型切換えは個々の小滴の各々の中で実施される。いくつかの実施態様では、２つ以上の小滴をＰＣＲ前に混ぜ合わせることができる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、タグメンテーションの前に小滴を混ぜ合わせることができる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、ＰＣＲの後でかつタグメンテーションの前に小滴を混ぜ合わせることができる。例えば、いくつかの実施態様では、個々の小滴で第一鎖合成を実施した後で、タグ付加ｃＤＮＡを混ぜ合わせ、したがってｃＤＮＡをプールすることができる。
同様に、いくつかの実施態様では、サンプル及びＵＭＩバーコード付与は、ＵＭＩ及び／又は第一鎖合成用バーコードタグ付加プライマーを保持するビーズとともに個々の細胞を隔離することによって実施できる。いくつかの実施態様では、ビーズはエマルジョン中の小滴に隔離される。いくつかの実施態様では、ビーズは小滴アクチュエータを用いて隔離及び／又は操作される。図１２に示すように、ビーズによるバーコード付与は、ビーズのセットを作成することによって実施できる（各ビーズは１つ又は複数の固有バーコードセットを保持する）。
【００１９】
全トランスクリプトームのシークエンシング
いくつかの実施態様では、本明細書で提供される方法を利用して、全トランスクリプトームシークエンシングを実施することができる。そのような実施態様では、第一鎖合成はランダマーを用いて拡張される。図９Ａに示すように、ランダムプライミングは、ランダマーがハイブリダイズし第一鎖合成をプライミングできる転写物の全長に沿って任意の場所でシークエンシング可能なフラグメントのウィンドウを拡張する。ランダマーは、他のアダプター及びプライマー結合部位（例えばトランスポソームアダプター配列及び／又は鋳型切換え（ＴＳ）プライマー）に加えて、サンプルバーコード及び固有の分子識別子の同じ組合せを含むことができる。鋳型切換え及び第二鎖合成は、オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡ合成について上記で述べたように実施できる。得られた二本鎖ｃＤＮＡを上記に述べたように続いてタグメンテーション反応に付すことができる。オリゴｄＴプライマーに対しランダマーを使用する違いは、転写物の３’部分ではなくて転写物の完全な又は実質的に完全な配列を得ることができるということである。図６（１００ｐｇのＲＮＡ）に示すように、第一鎖合成のためのオリゴｄＴ及びランダマーの混合物と比較して、どちらかのオリゴｄＴを用いて遺伝子発現を分析したとき、顕著な数の遺伝子が検出されさらに他のメトリックが得られた。
第一鎖合成のプライミングにランダマーを用いたときに生じ得る副産物の１つのタイプは連結副産物である。特に、図９Ｂに示すいくつかの状況では、ランダマーは他のランダムプライマーとハイブリダイズし、ＲＮＡ転写物とのアニーリングを打ち負かすことがある。生じたｃＤＮＡ生成物はさらにまたランダムプライミングに付され、鋳型切換え事象の連鎖が生じ得る。この連鎖は、連結副産物の形成（鋳型切換えオリゴヌクレオチドの存在に依存し得る）をもたらし得る。
【００２０】
そのような副産物の形成を減少させ及び／又は最小限にするために、副産物形成確率を減少させる多様なプライマー設計が本明細書で提示される。例示的な設計は図１０に示されるが、ただし本明細書に示すプライマー組成の範囲は当該図に示す例を超えるものであることは理解されよう。ある実施態様では、プライマーはヘアピンを形成するように構成され、バーコード、アダプター又は増幅プライマー結合領域のいずれの部分に対するランダマープライミングも妨げ或いは最小限にすることができる。プライマー自体によって形成される二本鎖部分は、したがってランダムハイブリダイゼーションを打ち負かすことができる。いくつかの実施態様では、ヘアピンの二本鎖部分は、トランスポザーゼアダプターのモザイク末端（ＭＥ）配列を含む。また別に或いはさらに加えて、いくつかの実施態様では、二本鎖部分は、モザイク末端配列を超えてトランスポザーゼアダプター配列のいくつか又は全部を含むことができる。いくつかの実施態様では、アダプター配列は短いＲＮＡ配列で完全に入れ替えられ、したがってプライマーの長さを短縮しランダマーがプライマーとハイブリダイズする潜在能力を最小限にすることができる。いくつかの実施態様では、短いＲＮＡ配列の相補物がプライマーの５’末端に又はその近くに提供され、したがってヘアピンの形成を可能にする。いくつかの実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドをアダプター及び／又はプライマー部分とアニーリングさせることによって二本鎖領域が形成され、したがってバーコード、アダプター又は増幅プライマー結合領域のいずれの部分に対するランダマープライミングも妨げ或いは最小限にし、それによって連結化副産物を減少させ或いは回避する。
【００２１】
ランダマー又はランダムプライマー：
本明細書で用いられるように、“ランダマー”及び“ランダムプライマー”という用語は互換的に用いられる。ランダマーという用語は、各位置で４倍縮退性を示すことができるランダムプライマーを指す。
いくつかの実施態様では、ランダマーは、当業界で公知の多様なランダム配列長を有する任意の核酸プライマーである。例えば、ランダマーは、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２０を超えるヌクレオチドの長さを有するランダム配列を含むことができる。ある種の実施態様では、複数個のランダムプライマーは多様な長さを有するランダマーを含むことができる。ある種の実施態様では、複数個のランダマーは長さが等しいランダマーを含むことができる。ある種の実施態様では、複数個のランダマーは約５から約１８ヌクレオチドの長さであるランダム配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、複数個のランダマーはランダムヘキサマーを含む。ランダムプライマー（及び特にランダムヘキサマー）は市場で入手でき、増幅反応（例えばマルチ入れ替え増幅（ＭＤＡ））で広く用いられる（ＭＤＡはＲＥＰＬＩ−ｇ全ゲノム増幅キット（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）で具体化される）。本明細書に提示する方法及び組成物では任意の適切な長さのランダマーを用い得ることは理解されよう。
３’ランダム配列部分及び５’指定配列部分を含む例示的ランダマー配列を以下に示す：
ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴ  ＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣ  ＣＧＴＡＴＣＡＴＴＮ  ＮＮＮＮ
ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴ  ＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣ  ＣＧＴＡＴＣＡＴＴＮ  ＮＮＮＮＮ
ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴ  ＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣ  ＣＧＴＡＴＣＡＴＴＮ  ＮＮＮＮＮＮ
ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴ  ＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣ  ＣＧＴＡＴＣＡＴＴＮ  ＮＮＮＮＮＮＮ
ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴ  ＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣ  ＣＧＴＡＴＣＡＴＴＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮ
ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧ  ＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧ  ＣＴＴＧＮＮＮＮＮ
ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧ  ＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧ  ＣＴＴＧＮＮＮＮＮＮ
ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧ  ＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧ  ＣＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮ
ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧ  ＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧ  ＣＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮ
ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧ  ＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧ  ＣＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
本明細書で用いられるように、“ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑプラス”という用語はＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法を指し、前記方法は第一鎖合成プライマー（第一増幅プライマー
結合部位を含む）、ランダマー（第一増幅プライマー結合部位を含む）、及びオリゴヌクレオチド切換えオリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡの第一鎖に部分的に相補性であり、さらに第二増幅プライマー結合部位を含む）を用いる。いくつかの実施態様では、第一鎖合成プライマーはオリゴ（ｄＴ）部分を含む。
【００２２】
バーコード及びＵＭＩ：
本明細書で用いられるように、“バーコード”又は“ＢＣ”は、サンプル又は核酸物質の供給源を識別するために用いることができる核酸タグを指す。したがって、核酸サンプルが複数の供給源に由来する場合、各核酸サンプルの核酸は異なる核酸タグを付され、したがってサンプルの供給源を識別することができる。バーコード（一般的にはインデックス、タグなどと称される）は当業者に周知である。当業界で公知であり、米国特許８，０５３，１９２号及びＰＣＴ公開広報ＷＯ０５／０６８６５６の開示でも例示されている、任意の適切なバーコード又はバーコードセットを用いることができる（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。単一細胞のバーコード付与は、例えばＵ．Ｓ．２０１３／０２７４１１７（参照によりその全体が本明細書に含まれる）の開示に記載されているように実施できる。
１つ以上の供給源に由来する核酸は多様なタグ配列を取り込むことができる。このタグ配列は、長さが好ましくは１００ヌクレオチド（二本鎖分子の場合は塩基対）まで、好ましくは長さが１から１０ヌクレオチド、もっとも好ましくは長さが４、５又は６ヌクレオチドであり、さらにヌクレオチドの組合せを含む。例えばある実施態様で、タグの形成に６塩基対が選択され４つの異なるヌクレオチドの並べ替えが用いられる場合、合計４０９６の核酸アンカー（例えばヘアピン）（その各々が固有の６塩基タグを有する）を作成できる。
本明細書で用いられるように、ＵＭＩ、固有識別子、及び固有の分子識別子という用語は、複数個の核酸分子の各々に添付される固有の核酸配列を指す。例えば第一鎖合成時に核酸分子に取り込まれるとき、ＵＭＩはその後の増幅偏向の修正に用いることができる。前記偏向の修正は、増幅後にシークエンシングされる固有の分子識別子（ＵＭＩ）を直接計測することによって実施される。ＵＭＩの設計、取り込み、及び適用は、当業界で公知のように、例えば以下の文献の開示で例示されるように実施できる：ＷＯ  ２０１２／１４２２１３；Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１４）  １１：１６３−１６６；及びＫｉｖｉｏｊａ，  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１２）  ９：  ７２−７４（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００２３】
タグメンテーション：
本明細書で用いられるように、“タグメンテーション”という用語は、トランスポソーム複合体によるＤＮＡの改変を指し、前記トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体を形成したトランスポザーゼ酵素を含む。タグメンテーションは、ＤＮＡの同時断片化及び二重体フラグメントの両鎖の５’末端へのアダプターの連結をもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去する精製工程に続いて、例えばＰＣＲ、連結、又は当業者に公知の他の適切な方法によって当該改造フラグメントの末端に追加配列を付加することができる。
本発明の方法は、トランスポザーゼ末端配列を受け入れて標的核酸を断片化でき、移転末端を添付するが非移転末端を添付しない任意のトランスポザーゼを利用することができる。“トランスポソーム”は少なくとも１つのトランスポザーゼ酵素及びトランスポザーゼ認識部位で構成される。“トランスポソーム”と呼ばれるいくつかのそのような系では、トランスポザーゼはトランスポゾン認識部位と機能的な複合体を形成することができ、前記は転移反応を触媒することができる。トランスポザーゼ又はインテグラーゼはトランスポザーゼ認識部位と結合し、トランスポザーゼ認識部位を標的核酸に挿入できる。前記プロセスはときに“タグメンテーション”と称される。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポザーゼ認識部位の一方の鎖が標的核酸に挿入され得る。
標準的なサンプル調製方法では、各鋳型は挿入物のどちらかの末端にアダプターを含み、さらにしばしば多数の工程が、ＤＮＡ又はＲＮＡの改変及び改変反応の所望の生成物の精製の両方のために必要とされる。これらの工程は、改造フラグメントをフローセルに付加する前に溶液中で実施され、そこで当該フラグメントはプライマー伸長反応によって表面に連結される（前記伸長反応は、当該表面に共有結合したプライマーの末端にハイブリダイズしたフラグメントをコピーする）。続いて、これらの“シード”鋳型は、数回の増幅サイクルによりコピーされた鋳型のモノクローン性クラスターを生じる。
【００２４】
クラスター形成及びシークエンシングに使えるように、ＤＮＡを溶液中でアダプター改変鋳型に変換するために必要とされる工程数は、トランスポザーゼ媒介断片化及びタグ添付の使用によって最小限にすることができる。
いくつかの実施態様では、トランスポゾン系技術をＤＮＡ断片化のために利用することができる。前記技術は、例えばＮＥＸＴＥＲＡTM  ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）のためのワークフローで具体化され、この場合、ゲノムＤＮＡは操作されたトランスポゾンによって断片化することができる（前記操作されたトランスポゾンは、インプットＤＮＡを同時に断片化及びタグ付加し（“タグメンテーション”）、それによって当該フラグメントの末端に固有のアダプター配列を含む断片化核酸分子の集団を作製する）。
いくつかの実施態様は以下の使用を含む：超活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポザーゼ認識部位（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７３：７３６７，  １９９８）、又はＭｕＡトランスポザーゼ並びにＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｃｅｌｌ，  ３５：  ７８５，  １９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：  ４８９３，  １９９５）。超活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成する例示的なトランスポザーゼ認識部位は、例えばＥＺ−Ｔｎ５TMトランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）である。
本明細書で提供するある種の実施態様で用いることができる転移系の更なる例には以下が含まれる：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８３：  ２３８４−８，  ２００１；Ｋｉｒｂｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４３：  １７３−８６，  ２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ  ＆  Ｂｏｅｋｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２：  ３７６５−７２，  １９９４；及び国際特許公開ＷＯ  ９５／２３８７５）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，  Ｎ  Ｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：  １５１２，  １９９６；Ｃｒａｉｇ，  Ｎ  Ｌ，  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ：  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：２７−４８，  １９９６）、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：４９−８２，  １９９６）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ  Ｄ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １５：  ５４７０−９，  １９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  Ｒ  Ｈ，  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：  １２５−４３，  １９９６）、Ｐエレメント（Ｇｌｏｏｒ，  Ｇ  Ｂ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２６０：  ９７−１１４，  ２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ＆  Ｏｈｔｓｕｂｏ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９−３２，  １９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ  ＆  Ｓｅｋｉｎｅ，  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：  １−２６，  １９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：２５２５−９，  １９８９）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ  ＆  Ｃｏｒｃｅｓ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３−３４，  １９８９）。更なる例には以下が含まれる：ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の操作バージョン（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００６８９．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ．１６；Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１：３３２−５）。
【００２５】
簡単に記せば、“転移反応”は、１つ以上のトランスポゾンが標的核酸のランダムな部位に又はほぼランダムな部位に挿入される反応である。転移反応の必須の成分はトランスポザーゼ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドはトランスポゾン配列を提示し、移転トランスポゾン配列及びその相補物（すなわち非移転トランスポゾン末端配列）とともに機能的転移又はトランスポソーム複合体の形成に必要な他の成分を含む。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、必要な又は所望される追加の配列（例えばアダプター又はプライマー配列）をさらに含むことができる。略記すれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移は、トランスポゾン複合体及び標的ＤＮＡを接触させることによって開始させることができる。本開示のトランスポザーゼとの使用に容易に適合し得る例示的な転移手順及び系は、例えばＷＯ  １０／０４８６０５；ＵＳ  ２０１２／０３０１９２５；ＵＳ  ２０１３／０１４３７７４に記載されている（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
核酸の５’及び／又は３’末端に付加されるアダプターはユニバーサル配列を含むことができる。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子と共通である（すなわち共有される）ヌクレオチド配列の領域である。場合により、当該２つ以上の核酸分子はまた配列相違領域を有する。したがって、例えば５’アダプターは同一又はユニバーサル核酸配列を含むことができ、３’アダプターは同一又はユニバーサル配列を含むことができる。複数個の核酸分子の種々のメンバーに存在し得るユニバーサル配列は、ただ１つのユニバーサルプライマー（当該ユニバーサル配列に相補性である）を用いて多くの種々の配列の複製又は増幅を可能にすることができる。本明細書に提示する例で用いられるいくつかのユニバーサルプライマー配列には、Ｖ２．Ａ１４及びＶ２．Ｂ１５  ＮＥＸＴＥＲＡTM配列が含まれる。しかしながら、任意の適切なアダプター配列を本明細書に提示する方法及び組成物で利用できることは理解されよう。例えば、Ｔｎ５モザイク末端配列（Ｍｏｓａｉｃ  Ｅｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ａ１４（Ｔｎ５ＭＥＡ）及び／又はＴｎ５モザイク末端配列Ｂ１５（Ｔｎ５ＭＥＢ）（下記に示す相補性非移転配列（ＮＴＳ）を含む）を本明細書で提供する方法に用いることができる。
Ｔｎ５ＭＥＡ：５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：１）
Ｔｎ５ＭＥＢ：５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：２）
Ｔｎ５  ＮＴＳ：５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’（配列番号：３）
【００２６】
小滴のバーコード及びＵＭＩ
いくつかの実施態様では、サンプルバーコードを保持するプライマーは溶液中に存在できる。加えて或いはまた別に、ＵＭＩ配列を保持するプライマーは溶液中に存在できる。例えば、固相支持体は１つ以上の小滴でもよい。したがって、ある種の実施態様では、複数個の小滴が存在でき、この場合、当該複数個の小滴の各々は固有のサンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列（前記の各々は分子に固有である）を保持する。したがって、いくつかの実施態様では、バーコードは小滴に固有であること、及びＵＭＩは分子に固有でありしたがって小滴収集物内でＵＭＩは何度も繰り返されることは当業者には理解されるであろう。いくつかの実施態様では、個々の細胞を識別するために、サンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列の固有のセットを有する小滴と個々の細胞を接触させる。いくつかの実施態様では、個々の細胞の溶解物を識別するために、サンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列の固有のセットを有する小滴と個々の細胞の溶解物を接触させる。いくつかの実施態様では、個々の細胞の精製核酸を識別するために、サンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列の固有のセットを有する小滴と個々の細胞の精製核酸を接触させる。
複数個の小滴の各々がサンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列の固有のセットを保持する本明細書に提示する実施態様では、小滴を形成及び操作するために任意の適切な系を用いることができる。
【００２７】
“小滴アクチュエータ”は小滴を操作するための装置を意味する。小滴アクチュエータの例は例えば以下を参照されたい：米国特許６，９１１，１３２号（Ｐａｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（エレクトロウェッティング系技術による小滴操作装置）”（２００５年６月２８日交付）；米国特許公開Ｎｏ．２００６０１９４３３１（Ｐａｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｏｎ  ａ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｂｏａｒｄ（プリント基板上で小滴を操作する装置及び方法）”（２００６年８月３１日公開）；国際特許公開ＷＯ／２００７／１２０２４１（Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（小滴系の生化学）”（２００７年１０月２５日公開）；米国特許６，７７３，５６６号（Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖ）、発明の名称：“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ（微小流体工学のための静電気アクチュエータ及び前記を使用する方法）”（２００４年８月１０日交付）；米国特許６，５６５，７２７号（Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖ）、発明の名称：“Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｐａｒｔｓ（パーツの移動のない微小流体工学のためのアクチュエータ）”（２００３年５月２０日交付）；米国特許公開Ｎｏ．２００３０２０５６３２（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称：“Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｍｉｃｒｏｐｕｍｐｉｎｇ（エレクトロウェッティング駆動微小ポンプ）”（２００３年１１月６日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００６０１６４４９０（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｄｒｏｐｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｎｏｚｚｌｅ（ノズルから液滴の完全な移転を容易にする方法及び装置）”（２００６年７月２７日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００７００２３２９２（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｓｍａｌｌ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｍｏｖｉｎｇ  ｏｎ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｂｏａｒｄ（プリント基板上を移動する小物体）”（２００７年２月１日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００９０２８３４０７（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（小滴微小流体工学で磁性粒子を用いる方法）”（２００９年１１月１９日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２０１０００９６２６６（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｆｅｅｄｂａｃｋ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｏ���  Ｃｈｉｐ（チップ上の小滴の電気的操作によるリアルタイムフィードバック制御のための方法及び装置）”（２０１０年４月２２日公開）；米国特許７，５４７，３８０号（Ｖｅｌｅｖ）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ（流動体表面を有する小滴移送装置及び方法）”（２００９年６月１６日交付）；米国特許７，１６３，６１２号（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ，  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ，  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｉｋｅ（化学、生化学及び生物学的アッセイなどのためのエレクトロウェッティングによる微小流動体の制御のための方法、装置及び物品）”（２００７年１月１６日交付）；米国特許７，６４１，７７９号（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（プログラム可能な流動体プロセッシングのための方法及び装置）”（２０１０年１月５日交付）；米国特許６，９７７，０３３号（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（プログラム可能な流動体プロセッシングのための方法及び装置）”（２００５年１２月２０日交付）；米国特許７，３２８，９７９号（Ｄｅｃｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄ（流動体本体の操作のための系）”（２００８年２月１２日交付）；米国特許公開Ｎｏ．２００６００３９８２３（Ｙａｍａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（化学分析装置）”（２００６年２月２３日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２０１１００４８９５１（Ｗｕ）、発明の名称“Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｔ−ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（熱交換化学プロセスのためのデジタル微小流体工学による装置）”（２０１１年３月３日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００９０１９２０４４（Ｆｏｕｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ（電極指定方法）”（２００９年７月３０日公開）；米国特許７，０５２，２４４号（Ｆｏｕｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ａｌｏｎｇ  ａ  Ｍｉｃｒｏ−ｃａｔｅｎａｒｙ  Ｌｉｎｅ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｆｏｒｃｅｓ（静電力による微小懸垂線における小体積流動体の入れ替え装置）”（２００６年５月３０日交付）；米国特許公開Ｎｏ．２００８０１２４２５２（Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、発明��名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ（小滴マイクロリアクター）”（２００８年５月２９日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００９０３２１２６２（Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（流動体移転装置）”（２００９年１２月３１日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００５０１７９７４６（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｗｏ  ｏｒ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（２つ又はいくつかの固相間の小滴の入れ替えを制御する装置）”（２００５年８月１８日公開）；及びＤｈｉｎｄｓａらの論文（Ｄｈｉｎｄｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ：  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  １０：８３２−８３６，  ２０１０）（前記文献の全ての開示は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００２８】
ある種の小滴アクチュエータは、１つ以上の基板であってそれらの間の小滴処理間隙ととともに配置される当該１つ以上の基板、及び当該１つ以上の基板と密接に関係し（その上に重ねられているか、それに添付されているか、及び／又はその中に埋め込まれている）、１つ以上の小滴の作業を遂行するために配置される電極を含むであろう。例えば、ある種の小滴アクチュエータは、ベース（又は底部）基板、当該基板に結合した小滴処理電極、当該基板及び／又は電極の最上部の１つ以上の誘電層、及び場合により当該基板最上部の１つ以上の疎水層、小滴処理表面を形成する誘電層及び／又は電極を含むであろう。上部基板がまた提供され、前記は小滴処理表面から間隙（一般的には小滴処理間隙と称される）によって隔てられる。上部及び／又は底部基板上の多様な電極配置が上記で参照した特許及び特許出願で考察され、ある種の新規な電極配置は本開示の記述中で考察される。小滴処理時に、小滴が外側電極又は参照電極と連続的接触若しくは頻繁な接触を維持することが好ましい。外側又は参照電極は、当該間隙と向き合う上部基板、当該間隙と向き合う底部基板と間隙内で密接に関係することができる。電極が両方の基板上で提供される場合、電極の制御又はモニターのために電極と小滴アクチュエータ装置を連結する電気的接触は一方又は両方のプレートと密接に関係することができる。いくつかの事例では、１つの基板上の電極は、１つの基板のみが小滴アクチュエータと接触するように他方の基板と電気的に連結される。ある実施態様では、導電材料（例えばエポキシ、例えばＭＡＳＴＥＲ  ＢＯＮＤTM  ポリマー系ＥＰ７９（Ｍａｓｔｅｒ  Ｂｏｎｄ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ，  ＮＪ））が、一方の基板の電極と他方の基板の電気路との電気的連絡を提供する。例えば上部基板の外側電極は、そのような導電材料によって底部基板の電気路と連結させることができる。
【００２９】
複数の基板が用いられる場合、当該基板の間にスペーサーが提供され、基板間の間隙の高さを決定しオン−アクチュエータ分配槽を規定することができる。スペーサーの高さは、例えば少なくとも約５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ又は前記を超えることができる。また別に或いは前記に加えて、スペーサーの高さはせいぜい約６００μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ又は前記未満であり得る。スペーサーは、例えば上部又は底部基板からの１層の突起物及び／又は上部基板と底部基板との間に挿入された物質で形成できる。１つ以上の開口部を１つ以上の基板に提供して、当該開口部から流動体が小滴処理間隙にデリバリーできる流動体路を形成できる。いくつかの事例では、１つ以上の開口部を１つ以上の電極との相互作用のために一直線に並べ、例えば、開口部を流れる流動体が１つ以上の小滴処理電極と十分に接近し、当該流動体を用いる小滴処理電極によって小滴処理を遂行可能なように一直線に並べることができる。いくつかの事例では、ベース（又は底部）及び上部基板は、１つの完全成分として形成できる。１つの参照電極をベース（又は底部）及び／又は上部基板上に及び／又は間隙内に提供できる。参照電極の配置例は上記の参照特許及び特許出願に提供されている。多様な実施態様では、小滴アクチュエータによる小滴の操作は電極によって媒介できる。例えばエレクトロウェッティング媒介、又は誘電泳動媒介、又はクーロン力媒介である。本開示の小滴アクチュエータで用いることができる小滴処理制御のための他の技術の例には、流体力学的な流体圧を誘発する装置の使用が含まれ、前記装置は、例えば以下の原理に基づいて作動する装置である：機械的原理（例えば外部注射器ポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電／超音波ポンプ、及び音響力）；電気的又は磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学ポンプ、磁性流体プラグ、電気水力学ポンプ、磁力を利用する吸引又は反発、及び磁性水力学ポンプ）；熱力学原理（例えば気泡発生／相変化誘発体積膨張）；他の種類の表面湿潤化原理（例えばエレクトロウェッティング及びオプトエレクトロウェッティングとともに化学的、熱的、構造的及び放射能的に誘発される表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば毛細管作用）；静電力（例えば電気浸透流）；遠心力流（基板をコンパクトディスクに配置し回転させる）；磁力（例えば振動イオンは流れを引き起こす）；磁性水力学的な力；及び真空又は圧力差。
【００３０】
ある種の実施態様では、前述の技術の２つ以上の組合せを利用して、本開示の小滴アクチュエータで小滴処理を遂行することができる。同様に前述の１つ以上の技術を用いて、小滴処理間隙に例えば別の装置の貯水槽から又は当該小滴アクチュエータの外部の貯水槽（例えばある小滴アクチュエータ基板及び当該貯水槽から当該小滴処理間隙への流路に結合されている貯水槽）から流動体をデリバリーすることができる。本開示のある種の小滴アクチュエータの小滴処理表面は疎水性物質で作製するか、又はそれら表面を疎水性にするために被覆又は処理することができる。例えば、いくつかの事例では、小滴処理表面のいくらかの部分又は全部を低表面エネルギー物質又は化学反応で、例えばポリフッ素化若しくは過フッ素化化合物のような化合物を沈積させるか又は前記を溶液若しくは重合性モノマーで用いるｉｎ  ｓｉｔｕ合成を利用することによって誘導することができる。前記の例には以下が含まれる：ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）  ＡＦ（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる）、サイトップ（ｃｙｔｏｐ）ファミリーのメンバー物質、疎水性及び超疎水性コーティングのＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（商標）でのコーティング（サイトニック社（Ｃｙｔｏｎｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手できる）、シランコーティング、フルオロシランコーティング、疎水性ホスホネート誘導体（例えばアクロン社（Ａｃｕｌｏｎ，  Ｉｎｃ）から販売されているもの）、及びＮＯＶＥＣTMエレクトロニックコーティング（３Ｍ社（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｔ．Ｐａｕｌ，  ＭＮ）から入手できる）、プラズマ強化化学気相蒸着（ＰＥＣＶＤ）のための他のフッ素化モノマー、及びＰＥＣＶＤのためのオルガノシロキサン（例えばＳｉＯＣ）。いくつかの事例では、小滴処理表面は約１０ｎｍから約１，０００ｎｍの範囲の厚さを有する疎水性コーティングを含むことができる。
【００３１】
さらにまたいくつかの実施態様では、小滴アクチュエータの上部基板は導電性有機ポリマーを含み、前記は続いて疎水性コーティングで被覆されるか、そうでなければ小滴処理表面を疎水性にするために処理される。例えば、プラスチック基板に沈積される導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）であり得る。導電性有機ポリマー及び代替導電層の他の例は以下に記載されている：国際特許公開ＷＯ／２０１１／００２９５７（Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（小滴アクチュエータ装置及び方法）”（２０１１年１月６日公開）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。一方又は両方の基板は、プリント回路板（ＰＣＢ）、ガラス、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）被覆ガラス、及び／又は半導体物質を基板として用いて製作され得る。基板がＩＴＯ被覆ガラスであるときは、ＩＴＯ被覆は好ましくは厚さが少なくとも約２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ又は前記を超える。また別に或いは前記に加えて、厚さはせいぜい約２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ又は前記未満でもよい。いくつかの事例では、上部及び／又は底部基板は、誘電体（例えばポリイミド誘電体）で被覆されたＰＣＢ基板を含む。いくつかの事例では、前記はまた小滴処理表面を疎水性にするために被覆されるか或いは処理される。基板がＰＣＢを含むとき、以下の物質が適切な物質の例である：ＭＩＴＳＵＩTM  ＢＮ−３００（三井化学アメリカ社（ＭＩＴＳＵＩ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）から入手できる）；ＡＲＬＯＮTM  １１Ｎ（アーロン社（Ａｒｌｏｎ，  Ｉｎｃ，  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）から入手できる）；ＮＥＬＣＯ（商標）  Ｎ４０００−６及びＮ５０００−３０／３２（パークエレクトロケミカル社（Ｐａｒｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）から入手できる）；ＩＳＯＬＡTM  ＦＲ４０６（イソラグループ（Ｉｓｏｌａ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｃｈａｎｄｌｅｒ，  ＡＺ）から入手できる）、特にＩＳ６２０；フルオロポリマーファミリー（前記は低バックグラウンド蛍光を有するので蛍光検出に適している）；ポリイミドファミリー；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶ポリマー；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；アラミド；  ＴＨＥＲＭＯＵＮＴ（商標）  不織アラミド強化（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる）；ＮＯＭＥＸ（商標）  ブランドファイバー（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる）；及び紙。
【００３２】
多様な物質がまた基板の誘電性成分としての使用に適している。例には以下が含まれる：気相蒸着誘電体、例えば、ＰＡＲＹＬＥＮＥTM  Ｃ（特にガラスに）、ＰＡＲＹＬＥＮＥTM  Ｎ及びＰＡＲＹＬＥＮＥTM  ＨＴ（高温用、約３００℃）（パリレンコーティングサービス社（Ｐａｒｙｌｅｎｅ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｋａｔｙ，  ＴＸ）から入手できる）；ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）  ＡＦコーティング；サイトップ；はんだマスク、例えば流動性写真画像形成はんだマスク（例えばＰＣＢに）、例えばＴＡＩＹＯTM  ＰＳＲ４０００シリーズ、ＴＡＩＹＯTM  ＰＳＲ及びＡＵＳシリーズ（タイヨーアメリカ社（Ｔａｉｙｏ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．Ｃａｒｓｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＮＶ）から入手できる）（熱管理を必要とする適用について良好な熱特性を有する）、及びＰＲＯＢＩＭＥＲTM  ８１６５（ハンツマンアドバーンスドマテリアルズ社（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．，  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  ＣＡ）から入手できる）（熱管理を必要とする適用について良好な熱特性を有する）；ドライフィルムはんだマスク、例えばＶＡＣＲＥＬ（商標）ドライフィルムはんだマスク系のもの（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる）；フィルム誘電体、例えばポリイミドフィルム（例えばＫＡＰＴＯＮ（商標）ポリイミドフィルム（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる））、ポリエチレン、及びフルオロポリマー（例えばＰＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；上記に挙げた任意の他のＰＣＢ基板物質；黒色マトリックス樹脂；ポリプロピレン；及び黒色可撓性回路物質、例えばＤｕＰｏｎｔTM  Ｐｙｒａｌｕｘ（商標）  ＨＸＣ及びＤｕＰｏｎｔTM  Ｋａｐｔｏｎ（商標）  ＭＢＣ（デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）から入手できる）。
【００３３】
小滴移送電圧及び周波数は、具体的なアッセイプロトコルで用いられる試薬の性能により選択できる。設計パラメータは変動可能である。例えば、オン−アクチュエータ貯水槽の数及び配置、独立電極接続数、種々の貯水槽のサイズ（体積）、磁石／ビーズ洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間ピッチ、及び（上部及び底部基板間の）間隙の高さは、具体的な試薬、プロトコル、小滴体積などの使用により変動し得る。いくつかの事例では、本開示の基板は、低表面エネルギー物質又は化学反応で、例えばポリフッ素化若しくは過フッ素化化合物を沈積させるか又は前記を溶液若しくは重合性モノマーで用いるｉｎ  ｓｉｔｕ合成を利用することによって誘導することができる。例には以下が含まれる：浸漬又は噴霧コーティングのためのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）  ＡＦコーティング及びＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（商標）コーティング、プラズマ強化化学蒸着沈積（ＰＥＣＶＤ）のための他のフッ素化モノマー、及びＰＥＣＶＤのための有機シロキサン（例えばＳｉＯＣ）。加えて、いくつかの事例では、小滴処理表面のいくらかの部分又は全体を、ＰＣＢ基板に由来するバックグラウンドノイズ（例えばバックグラウンド蛍光）を軽減する物質で被覆できる。例えば、ノイズ軽減コーティングは、黒色マトリックス樹脂（例えば東レ株式会社（日本）から入手できる黒色マトリックス樹脂）を含むことができる。小滴アクチュエータの電極は典型的にはコントローラー又はプロセッサーで制御され、それ自体は系の部分として提供され、プロセッシング機能とともにデータ及びソフトの保存並びに入出力能力を含むことができる。試薬は、小滴処理間隙又は貯水槽（小滴処理間隙と流体により連結されている）で小滴アクチュエータに提供できる。試薬は液状形（例えば小滴）として存在するか、又はそれらは、小滴処理間隙又は小滴処理間隙と流体により連結されている貯水槽で再構成可能な形態で提供され得る。再構成可能な試薬は、典型的には再構成のために液体と一緒にすることができる。本明細書に示す方法及び装置との使用に適切な再構成可能試薬の例は以下に記載されたものが含まれる：米国特許７，７２７，４６６号（Ｍｅａｔｈｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔａｂｌｅ  Ｆｉｌｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（診断装置のための分解可能フィルム）”（２０１０年６月１日交付）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００３４】
１つ以上の電極に関して“活性化する”とは、１つ以上の電極の電気的状態における変化に影響を与えることを意味し、前記は小滴の存在下で小滴処理を生じる。電極の活性化
は、交流（ＡＣ）又は直流（ＤＣ）を用いて達成できる。任意の適切な電圧を用いることができる。例えば、電極は、約１５０Ｖより強い、又は約２００Ｖより強い、又は約２５０Ｖより強い、又は約２７５Ｖから約１０００Ｖ、又は約３００Ｖの電圧を用いて活性化することができる。ＡＣシグナルが用いられる場合は、任意の適切な周波数を用いることができる。例えば、電極は、約１ｚＨから約１０ＭＨｚ、又は約１０Ｈｚから約６０Ｈｚ、又は約２０Ｈｚから約４０Ｈｚ、又は約３０Ｈｚの周波数を有するＡＣシグナルを用いて活性化することができる。
小滴アクチュエータのビーズに関して“ビーズ”とは、小滴アクチュエータ上の又は小滴アクチュエータに近接する小滴と相互作用することができる任意のビーズ又は粒子を意味する。ビーズは任意の広範囲の形状（例えば球体、大まかな球体、卵形、円盤形、立方形、非晶質、及び他の三次元形状）であり得る。ビーズは、例えば、小滴アクチュエータ上の小滴として小滴処理を受ける能力を有し得るか、又はそうでなければ小滴アクチュエータ上の小滴が小滴アクチュエータ上の及び／又は小滴アクチュエータから離れたビーズと接触することを可能にする態様で、ビーズは小滴アクチュエータに対して構成され得る。ビーズは、小滴内に、小滴処理間隙内に、又は小滴処理表面上に提供され得る。ビーズは、小滴処理間隙に対して外側にあるか、又は小滴処理表面から離れて位置する貯水槽に提供することが可能で、前記貯水槽は、ビーズを含む小滴が小滴処理間隙に到達するか又は小滴処理表面に接触することを可能にする流路と結合され得る。ビーズは、広範囲の物質（例えば樹脂及びポリマーを含む）を用いて製造することができる。ビーズは任意の適切なサイズであることができ、例えばマイクロビーズ、マイクロ粒子、ナノビーズ、ナノ粒子を含む。いくつかの事例では、ビーズは磁気応答性であり、他の事例では、ビーズは顕著には磁気応答性ではない。磁気応答性ビーズのためには、磁気応答性物質が実質的にビーズの全て、ビーズの部分、又はビーズのただ１つの成分を構成することができる。ビーズの残り部分にはとりわけポリマー物質、コーティング、及びアッセイ試薬の添付を可能にする部分が含まれ得る。
【００３５】
適切なビーズの例には以下が含まれる：フローサイトメトリーマイクロビーズ、ポリスチレンマイクロ粒子及びナノ粒子、官能化ポリスチレマイクロ粒子及びナノ粒子、被覆ポリスチレンマイクロ粒子及びナノ粒子、シリカマイクロビーズ、蛍光性マイクロ球体及びナノ球体、官能化蛍光性マイクロ球体及びナノ球体、被覆マイクロ球体及びナノ球体、着色マイクロ粒子及びナノ粒子、磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、超常磁性マイクロ粒子及びナノ粒子（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）粒子、インビトロゲングループ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から入手できる））、蛍光性マイクロ粒子及びナノ粒子、被覆磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、強磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、被覆強磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、並びに以下に記載されたもの：米国特許公開Ｎｏ．２００５０２６０６８６（Ｗａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙｓ  Ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ（固相として好ましくは磁性粒子が用いられる多重フローアッセイ）”（２００５年１１月２４日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００３０１３２５３８（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）、発明の名称“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｑｕａｎｔａ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（蛍光性粒子の別々の量子の被包化）”（２００３年７月１７日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００５０１１８５７４（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ（臨床標本多重分析装置及び方法）”（２００５年６月２日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００５０２７７１９７（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ（複数の蛍光シグナルを有するマイクロ粒子及び前記を使用する方法）”（２００５年１２月１５日公開）；及び米国特許公開Ｎｏ．２００６０１５９９６２（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（蛍光系適用で用いられる磁性微小球体）”（２００６年７月２０日公開）（ビーズ並びに磁気応答性物質及びビーズに関する前記文献の教示のために、前記文献の全開示内容が参照により本明細書に含まれる）。
【００３６】
ビーズは、生物分子又は生物分子と結合し複合体を形成することができる他の分子と予め連結され得る。ビーズは、抗体、タンパク質若しくは抗原、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ又は所望の標的に対し親和性を有する任意の他の分子と予め連結され得る。磁気応答性ビーズ及び／又は非磁気応答性ビーズを固定する、及び／又はビーズを用いて小滴処理プロトコルを遂行するための小滴アクチュエータ技術の例は以下に記載されている：米国特許公開Ｎｏ．２００８００５３２０５（Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（小滴による粒子選別）”（２００８年３月６日公開）；米国特許出願Ｎｏ．６１／０３９，１８３、発明の名称“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｂｅａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｄｒｏｐｌｅｔ（１つの単一小滴による多重ビーズ検出）”（２００８年３月２５日出願）；米国特許出願Ｎｏ．６１／０４７，７８９（Ｐａｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ビーズを用いる小滴アクチュエータ装置及び小滴処理）”（２００８年４月２５日出願）；米国特許出願Ｎｏ．６１／０８６，１８、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（小滴アクチュエータ装置及びビーズを操作する方法）”（２００８年８月５日出願）；国際特許公開ＷＯ／２００８／０９８２３６（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（小滴アクチュエータ装置及び磁性ビーズを利用する方法）”（２００８年８月１４日出願）；国際特許公開ＷＯ／２００８／１３４１５３（Ｇｒｉｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ビーズ系多重化分析方法及び装置）”（２００８年１１月６日公開）；国際特許公開ＷＯ／２００８／１１６２２１（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｂｅａｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ（小滴アクチュエータでのビーズ選別）”（２００８年９月２５日出願）；国際特許公開ＷＯ／２００７／１２０２４１（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（小滴による生化学）”（２００７年１０月２５日公開）（前記文献の全開示が参照により本明細書に含まれる）。
ビーズの特徴を本開示の多重的特徴で利用することができる。多重化に適切であるとともに、そのようなビーズから放出されるシグナルを検出及び分析する方法に適する特徴を有するビーズの例は以下で見出すことができる：米国特許公開Ｎｏ．２００８０３０５４８１（Ｗｈｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｉｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＰＣＲのリアルタイム多重分析のための系及び方法）”（２００８年１２月１１日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００８０１５１２４０（Ｒｏｔｈ）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ（動的範囲を拡張するための方法及び系）”（２００８年６月２６日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００７０２０７５１３（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ（サンプル中の分析物を識別する方法、製品及びキット）”（２００７年９月６日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００７００６４９９０（Ｒｏｔｈ）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｄａｔａ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（画像データ処理のための方法及び系）”（２００７年３月２２日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００６０１５９９６２（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（蛍光系適用で使用される磁性ミクロ球体）”（２００６年７月２０日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００５０２７７１９７（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ（多重蛍光シグナルを有するミクロ粒子及び前記を用いる方法）”（２００５年１２月１５日公開）；及び米国特許公開Ｎｏ．２００５０１１８５７４（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ（臨床標本の多重化分析装置及び方法）”（２００５年６月２日公開）（前記文献の全ての開示は参照により本明細書に含まれる）。
【００３７】
“小滴”とは小滴アクチュエータ上の大量の液状物を意味する。典型的には、小滴は少なくとも部分的に充填流動体と境界を接する。例えば、小滴は充填流動体によって完全に取り囲まれるか、又は充填流動体及び小滴アクチュエータの１つ以上の表面と境界を接することができる。別の例として、小滴は、充填流動体、小滴アクチュエータの１つ以上の表面、及び／又は大気と境界を接することができる。さらに別の例として、小滴は、充填流動体及び大気と境界を接することができる。小滴は例えば水性又は非水性であることができ、又は水性及び非水性成分を含む混合物又はエマルジョンであってもよい。小滴は多様な形状をもつことができ、非限定的な例には大雑把に以下が含まれる：円盤形、ナメクジ形、切詰められた球体、楕円、球状、部分的に圧縮された球体、半球状、卵形、筒状、そのような形状の組合せ、及び小滴処理中に形成される多様な形状、例えばそのような形状と小滴アクチュエータの１つ以上の表面との接触の結果として出現し分裂し又は形成された形状。本開示のアプローチを用いる小滴処理に付すことができる小滴液状物の例については以下を参照されたい：国際特許公開ＷＯ／２００７／１２０２４１（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（小滴による生化学）”（２００７年１０月２５日公開）（前記文献の全開示は参照により本明細書に含まれる）。
【００３８】
多様な実施態様では、小滴は、生物学的サンプル、例えば全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙液、唾液、痰、脳脊髄液、羊水、膣分泌物、漿液、髄液、心嚢液、腹腔液、胸水、漏出液、浸出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞便サンプル、単一又は複数細胞を含む液、細胞小器官を含む液、液状化組織、液状化器官、多細胞生物を含む液、生物学的スワブ、及び生物学的洗浄液を含むことができる。さらにまた、小滴は、試薬（例えば水、脱イオン水、食塩水溶液、酸性溶液、塩基性溶液、洗剤溶液、及び／又は緩衝液）を含むことができる。小滴は以下を含むことができる：核酸、例えばＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又は前記のアナローグ；ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は前記のアナローグ、例えばターミネータ部分を有するアナローグ（例えば以下に記載されたもの：Ｂｅｎｔｌｅｙらの論文（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９，  ２００８）；国際特許公開ＷＯ／２０１３／１３１９６２（Ｇｏｒｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（核酸シークエンシングの改良方法）”（２０１３年９月１２日公開）；米国特許７，０５７，０２６号（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（標識ヌクレオチド）”（２００６年６月６日交付）；国際特許公開ＷＯ／２００８／０４２０６７（Ｋｏｚｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ヌクレオチドシークエンシングのための組成物及び方法）”（２００８年４月１０日公開）；国際特許公開ＷＯ／２０１３／１１７５９５（Ｒｉｇａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ａ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（支持体上の核酸の標的誘導濃縮及び増幅）”（２０１３年８月１５日公開）；米国特許７，３２９，４９２号（Ｈａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（リアルタイム単一分子配列決定の方法）”（２００８年２月１２日交付）；米国特許７，２１１，４１４号（Ｈａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（酵素的核酸合成：モノマー取り込みフィデリティを改変するための組成物及び方法）”（２００７年５月１日交付）；米国特許７，３１５，０１９号（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ（光閉じ込めアレー及びその使用）”（２００８年１月１日交付）；米国特許７，４０５，２８１号（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｆｌｕｏｒｅｓ���ｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ（蛍光性ヌクレオチドアナローグ及びその使用）”（２００８年７月２９日交付）；及び米国特許公開Ｎｏ．２００８０１０８０８２（Ｒａｎｋｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（核酸シークエンシングの強化のためのポリメラーゼ酵素及び試薬）”（２００８年５月８日公開）（前記文献の全開示は参照により本明細書に含まれる））；酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼ、又はトランスポザーゼ；結合パートナー、例えば抗体、エピトープ、ストレプトアビジン、ビオチン、レシチン、又は炭水化物；又は他の生化学的に活性な分子。小滴の含有物の他の例には試薬、例えば生化学的プロトコル（例えば核酸増幅プロトコル、親和性系アッセイプロトコル、酵素アッセイプロトコル、シークエンシングプロトコル、及び／又は生物学的液体分析用プロトコル）のための試薬が含まれる。小滴は１つ以上のビーズを含むことができる。
【００３９】
“小滴処理”とは、小滴アクチュエータ上の小滴の任意の操作を意味する。小滴処理には例えば以下が含まれる：小滴を小滴アクチュエータにローディングすること、１つ以上の小滴を小滴供給源から分配すること、１つの小滴を２つ以上の小滴に分裂させ分離し又は分割すること、ある場所から任意の方向の別の場所に小滴を移送すること、１つ以上の小滴を１つの単一小滴に合体又は結合させること、小滴を希釈すること、小滴を混合すること、小滴を撹拌すること、小滴を変形させること、小滴を適切な位置に維持すること、小滴をインキュベートすること、小滴を加熱すること、小滴を気化させること、小滴を冷却すること、小滴を処分すること、小滴を小滴アクチュエータの外に移送すること、本明細書に記載する他の小滴処理、及び／又は前述の組合せ。“合体させる”、“合体”、“結合させる”、“結合”などという用語は、２つ以上の小滴から１つの小滴を生成することを言うために用いられる。そのような用語が２つ以上の小滴に関して用いられるときは、２つ以上の小滴の１つの小滴への結合をもたらすために十分な小滴処理の任意の組合せを用いることが可能なことは理解されるべきである。例えば、“小滴Ａの小滴Ｂとの合体”は以下によって達成できる：小滴Ａを移送して静止した小滴Ｂと接触させる；小滴Ｂを移送して静止した小滴Ａと接触させる；又は小滴Ａ及びＢを移送して互に接触させる。“分裂”、“分離”及び“分割”という用語は、生じた小滴の体積（すなわち生じた小滴の体積は同じでも異なってもよい）又は生じた小滴の数（生じた小滴の数は２、３、４、５、又はそれより多くてもよい）に関していずれの特定の結果を示唆することも意図しない。“混合する”という用語は、１つの小滴内の１つ以上の成分のより均質な分布をもたらす小滴処理を指す。小滴処理の“ローディング”の例には、微小透析、圧力補助ローディング、自動ローディング、受動ローディング、及びピペットローディングが含まれる。小滴処理は電極によって媒介され得る。いくつかの事例では、小滴処理は、表面における親水性及び／又は疎水性領域の使用によって、及び／又は物理的障害によってさらに促進される。小滴処理については、“小滴アクチュエータ”の定義の下で上記に引用した特許及び特許出願を参照されたい。
【００４０】
小滴処理の成果を検出又は確認するために、時にインピーダンス若しくは静電容量の検出又は画像化技術を用いることができる。そのような技術の例は、米国特許公開Ｎｏ．２０１００１９４４０８（Ｓｔｕｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ（小滴アクチュエータの静電容量検出）”（２１１０年８月５日公開）に記載されている（前記の全開示は参照により本明細書に含まれる）。一般的に言えば、検出又は画像化技術を用いて、個々の電極における小滴の有無を確認することができる。例えば、小滴分配処理に続いて目的場所の電極に分配された小滴が存在すれば、小滴分配処理は有効であったことが確認される。同様に、アッセイプロトコルの適切な工程である検出箇所に小滴が存在すれば、以前の一連の小滴処理が検出のための小滴を首尾よく生じたことを確認できる。小滴移送時間は極めて速い。例えば、多様な実施態様では、１つの電極から次の電極への小滴の移送は、約１秒、又は約０．１秒、又は約０．０１秒、又は約０．００１秒を超えることができる。ある実施態様では、電極はＡＣモードで作動されるが、画像化のためにＤＣモードに切換えられる。小滴のフットプリント領域がエレクトロウェッティング領域と同様であるように小滴処理を遂行することは有益である。換言すれば、１ｘ−、２ｘ−、３ｘ−小滴が、それぞれ１、２及び３電極を用いて操作されて有効に制御される。小滴フットプリントがある時間の小滴処理の遂行のために利用できる電極数より大きい場合、小滴サイズと電極数の差は典型的には１を超えるべきではない。換言すれば、２ｘ小滴は１つの電極を用いて有効に制御され、３ｘ小滴は２つの電極を用いて有効に制御される。小滴がビーズを含むとき、小滴サイズが小滴を制御する（例えば小滴を移送する）電極数と等しいことは有用である。
【００４１】
“充填流動体”とは、小滴アクチュエータの小滴処理基板と密接な関係を有する流動体を意味し、当該流動体は小滴相と極めて非混和性で、小滴相が電極媒介小滴処理を受けや
すくする。例えば、小滴アクチュエータの小滴処理間隙は典型的には充填流動体で満たされる。充填流動体は、例えば低粘度油（例えばシリコーン油）又はヘキサデカン充填流動体であるか或いは前記を含む。充填流動体はハロゲン化油（例えばフッ素化又は過フッ素化油）であるか、或いは前記を含むことができる。充填流動体は小滴アクチュエータの全間隙を満たすか、又は小滴アクチュエータの１つ以上の表面を被覆することができる。充填流動体は導電性又は非導電性である。充填流動体を選択して以下を達成できる：小滴処理を改善する及び／又は小滴の試薬又は標的物質の損失を減少させる、微小小滴の形成を改善する、小滴間の交差汚染を減少させる、小滴アクチュエータ表面の汚染を減少させる、小滴アクチュエータ材料の分解を減少させる、など。例えば、充填流動体は小滴アクチュエータ材料との適合性のために選択できる。例として、フッ素化充填流動体はフッ素化表面コーティングとともに有利に用いることができる。フッ素化充填流動体は親油性化合物の消失を減少させるために有用である。親油性化合物は、例えばウンベリフェロン基質、例えば６−ヘキサデカノイルアミド−４−メチルウンベリフェロン基質（例えばクラッベ病、ニーマン−ピック病又は他のアッセイで用いる）であり、他のウンベリフェロン基質は以下に記載されている：米国特許公開Ｎｏ．２０１１０１１８１３２（Ｗｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｏｉｌ（油の小滴中でシクロデキストリンとともにウンベリフェロン基質を用いる酵素アッセイ）”（２０１１年５月１９日公開）（前記文献の全開示は参照により本明細書に含まれる）。適切なフッ素化油の例には以下が含まれる：Ｇａｌｄｅｎ系のもの、例えばＧａｌｄｅｎ  ＨＴ１７０（ｂｐ＝１７０℃、粘度＝１．８  ｃＳｔ、密度＝１．７７）、Ｇａｌｄｅｎ  ＨＴ２００（ｂｐ＝２００℃、粘度＝２．４  ｃＳｔ、密度＝１．７９）、Ｇａｌｄｅｎ  ＨＴ２３０（ｂｐ＝２３０℃、粘度＝４．４  ｃＳｔ、密度＝１．８２）（いずれもＳｏｌｖａｙ  Ｓｏｌｅｘｉｓ）：Ｎｏｖｅｃ系、例えばＮｏｖｅｃ  ７５００（ｂｐ＝１２８℃、粘度＝０．８  ｃＳｔ、密度＝１．６１）、フロリナートＦＣ−４０（ｂｐ＝１５５℃、粘度＝１．８  ｃＳｔ、密度＝１．８５）、フロリナートＦＣ−４３（ｂｐ＝１７４℃、粘度＝２．５  ｃＳｔ、密度＝１．８６）（ともに３Ｍ）。
【００４２】
一般的に、過フッ素化充填流動体の選択は動粘度（＜７  ｃＳｔが好ましいが要件ではない）及び沸点（ＤＮＡ／ＲＮＡ系適用（ＰＣＲなど）には＞１５０℃が好ましいが要件ではない）を基準にする。充填流動体には例えば界面活性剤又は他の添加物をドーピングすることができる。例えば、添加物を選択して以下を達成することができる：小滴処理を改善する及び／又は小滴の試薬又は標的物質の損失を減少させる、微小小滴の形成を改善する、小滴間の交差汚染を減少させる、小滴アクチュエータ表面の汚染を減少させる、小滴アクチュエータ材料の分解を減少させる、など。具体的なアッセイプロトコルで用いられる試薬に関する性能、及び小滴アクチュエータ材料との効果的な相互作用又は無相互作用のために、充填流動体の組成（界面活性剤のドーピングを含む）を選択することができる。本明細書に示す方法及び装置とともに使用するために適切な充填流動体及び充填流動体処方の例は以下で提供される：国際特許公開ＷＯ／２０１０／０２７８９４（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｌｕｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（小滴アクチュエータ、改変液及び方法）”（２０１０年６月３日公開）；国際特許公開ＷＯ／２００９／０２１１７３（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ（小滴処理強化のための添加材の使用）”（２００９年２月１２日公開）；国際特許公開ＷＯ／２００８／０９８２３６（Ｓｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（磁性ビーズを使用する小滴アクチュエータ装置及び方法）”（２００９年１月１５日公開）；米国特許公開Ｎｏ．２００８０２８３４１４（Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（エレクトロウェッティング装置）”（２００８年１１月２０日公開）（前記文献の全開示は、本明細書に引用する他の特許及び特許出願とともに参照により本明細書に含まれる）。いくつかの事例では、フッ素化油は、フッ素化界面活性剤（例えばＺｏｎｙｌ  ＦＳＯ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び／又は他のもの）をドーピングされる。充填流動体は典型的には液体である。いくつかの実施態様では、液体の代わりに充填ガスを用いることができる。
【００４３】
磁気応答性ビーズに関して“固定する”とは、ビーズが、小滴アクチュエータ上の小滴で又は充填流動体で位置的に実質的に拘束されることを意味する。例えば、ある実施態様では、固定されたビーズは小滴で位置的に十分に拘束されて小滴分割処理の遂行を可能にし、実質的に全てのビーズを有する１つの小滴及び実質的にビーズを欠く１つの小滴を生じる。
“磁気応答性”とは磁場に応答することを意味する。“磁気応答性ビーズ”は、磁気応答性材料を含むか又は前記で構成される。磁気応答性材料の例には、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が含まれる。適切な常磁性材料の例には、鉄、ニッケル、及びコバルトともに酸化金属、例えばＦｅ3Ｏ4、ＢａＦｅ12Ｏ19、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ2Ｏ3、Ｃｒ2Ｏ3及びＣｏＭｎＰが含まれる。
“貯水槽”とは囲い又は部分的囲いを意味し、液体を保持、貯蔵又は供給するための構造を有する。本開示の小滴アクチュエータ系はオン−カートリッジ貯水槽及び／又はオフ−カートリッジ貯水槽を含むことができる。オン−カートリッジ貯水槽は、（１）オン−アクチュエータ貯水槽（小滴処理間隙内又は小滴処理表面上の貯水槽）；（２）オフ−アクチュエータ貯水槽（小滴アクチュエータカートリッジ上の貯水槽であるが小滴処理間隙の外側にあり、小滴処理表面と接触しない）；又は（３）ハイブリッド貯水槽（オン−アクチュエータ領域及びオフ−アクチュエータ領域を有する）であり得る。オフ−アクチュエータ貯水槽の例は上部基板内の貯水槽である。オフ−アクチュエータ貯水槽は典型的には開口部又は流路により流体連絡があり、前記開口部又は流路は、オフ−アクチュエータ貯水槽から小滴処理間隙に（例えばオン−アクチュエータ貯水槽に）液体を流すために配置される。オフ−カートリッジ貯水槽は、小滴アクチュエータカートリッジの部分では全くないが小滴アクチュエータカートリッジのいくらかの部分へ液体を流す貯水槽であり得る。例えば、オフ−カートリッジ貯水槽は、系の部分又は小滴アクチュエータカートリッジが処理中に連結されるドッキングステーションであってもよい。同様に、オフ−カートリッジ貯水槽は、試薬保存容器又は注射器であることができ、後者はオン−カートリッジ貯水槽に又は小滴処理間隙に流体を強制的に送り込むために用いられる。オフ−カートリッジ貯水槽を用いる系は、典型的には流体移送手段を含み、それによってオフ−カートリッジ貯水槽からオン−カートリッジ貯水槽に又は小滴処理間隙に液体を移すことができる。
【００４４】
本明細書で用いられる、“磁石の磁場への移送”、“磁石に向けて移送する”などは、小滴及び／又は小滴内の磁気応答性ビーズを指し、小滴内の磁気応答性ビーズを実質的に引き付けることができる磁場領域内への移送を指すことを意図する。同様に、本明細書で用いられる“磁石又は磁場から離す”、“磁石の磁場の外へ移送する”などは、小滴及び／又は小滴内の磁気応答性ビーズを指し、小滴又は磁気応答性ビーズが完全に磁場から除去されるか否かにかかわらず、小滴内の磁気応答性ビーズを実質的に引き付けることができる磁場領域から外への移送を指すことを意図する。本明細書に記載のいずれの事例でも、小滴を所望の磁場領域に向けて又はその外へ移送できること、及び／又は所望の磁場領域を小滴に向けて又は小滴から離れるように移動させ得ることは理解されよう。電極、小滴又は磁気応答性ビーズが磁場内に又は磁場に存在するなどというとき、電極が小滴を所望の磁場領域内に及び／又はその外へ移送することを可能にする態様で電極が配置される状況、或いは小滴又は磁気応答性ビーズが所望の磁場領域に配置される状況を指すことが意図され、各々の事例で、所望の領域にある磁場は当該小滴内の一切の磁気応答性ビーズを実質的に引き付ける能力を有する。同様に、電極、小滴又は磁気応答性ビーズが磁場の“外側”又は磁場から“離れて”存在するなどというとき、電極が小滴を一定の磁場領域から外へ移送することを可能にする態様で電極が配置される状況、或いは小滴又は磁気応答性ビーズが一定の磁場領域から離れて配置される状況を指すことが意図され、各々の事例で、そのような領域にある磁場は当該小滴内の一切の磁気応答性ビーズを実質的に引き付ける能力をもたないか、又は一切の残留吸引力は当該領域内で遂行される小滴処理の効力を排除しない。本開示の多様な特徴では、系、小滴アクチュエータ又は系の別の成分が、磁石（例えば１つ以上の常磁性磁石（例えば単一の筒状又は棒状磁石、又はそのような磁石のアレー（例えばハルバッハアレー））、又は電磁石若しくは電磁石アレー）を含み、磁気応答性ビーズ又はチップ上の他の成分と相互作用するために磁場を形成することができる。そのような相互作用には、例えば貯蔵時における又は小滴処理時の小滴における磁気応答性ビーズの移動若しくは流動を実質的に固定又は拘束すること、又は小滴から磁気応答性ビーズを磁力により引き出すことが含まれる。
【００４５】
ビーズの洗浄に関して“洗浄する”とは、ビーズに接触した又はビーズに暴露された１つ以上の物質の量及び／又は濃度をビーズと接触した小滴から減少させることを意味する。当該物質の量及び／又は濃度の減少は、部分的であることも、実質的に完全であることも、又は全く完全であることもある。物質は極めて多様な任意の物質であり得る。例には、更なる分析のための標的物質、及び望ましくない物質（例えばサンプルの成分、夾雑物、及び／又は過剰試薬）が含まれる。いくつかの実施態様では、洗浄処理は、磁気応答性ビーズと接触した出発小滴で開始し、この場合、当該小滴は最初の量及び最初の濃度の物質を含む。洗浄処理は多様な小滴処理を用いて進行させることができる。洗浄処理は、最初の量及び／又は濃度の物質より低い総量及び／又は濃度を有する、磁気応答性ビーズを含む小滴をもたらすことができる。適切な洗浄技術は以下に記載されている：米国特許７，４３９，０１４号（Ｐａｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．）、発明の名称“Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｓｈｉｎｇ（小滴系表面の改変及び洗浄）”（２００８年１０月２１日交付）（前記文献の全開示は参照により本明細書に含まれる）。
“上部”、“底部”、“〜の上方に”、“〜の下に”及び“〜上の”という用語は、小滴アクチュエータの成分の相対的位置、例えば小滴アクチュエータの上部及び底部基板の相対的位置に関する説明を通して用いられる。小滴アクチュエータはその空間的方向性に関係なく機能を有することは理解されよう。
任意の形状の液体（例えば、移動していようと静止していようと小滴又は連続体）が、電極、アレー、マトリックス又は表面“の上に”、“に”、又は“の上方に”存在すると記載されるとき、そのような液体は、当該電極／アレー／マトリックス／表面と直接接触することができるか、又は１つ以上の層若しくはフィルム（当該液体と当該電極／アレー／マトリックス／表面との間に挿入される）と接触することができる。ある実施態様では、充填流動体は、そのような液体と当該電極／アレー／マトリックス／表面との間のフィルムとみなすことができる。
小滴が、小滴アクチュエータの“上に存在する”又は小滴アクチュエータに“ローディングされる”と記載されるとき、小滴アクチュエータを用いて当該小滴での１つ以上の小滴処理の遂行を促進する態様で当該小滴が小滴アクチュエータ上に配置されていること、又は当該小滴から生じるシグナルの特性の検出又はシグナルの検出を促進する態様で当該小滴が小滴アクチュエータ上に配置されていること、及び／又は当該小滴は当該小滴アクチュエータ上で小滴処理に付されていることは理解されるべきである。
【００４６】
ビーズ上のバーコード及びＵＭＩ
いくつかの実施態様では、サンプルバーコードを保持するプライマーは固相支持体に固定できる。加えて或いはまた別に、ＵＭＩ配列を保持するプライマーは固相支持体に固定できる。例えば、固相支持体は１つ以上のビーズであり得る。したがって、ある種の実施態様では、複数個のビーズを提示でき、この場合、複数個のビーズの各々は固有のサンプルバーコード及び／又はＵＭＩ配列を保持する。いくつかの実施態様では、個々の細胞は、個々の細胞の識別のために、固有のサンプルバーコードセット及び／又はＵＭＩ配列を有する１つ以上のビーズと接触される。いくつかの実施態様では、個々の細胞の溶解物は、個々の細胞溶解物の識別のために、固有のサンプルバーコードセット及び／又はＵＭＩ配列を有する１つ以上のビーズと接触される。いくつかの実施態様では、個々の細胞の精製核酸は、個々の細胞の精製核酸の識別のために、固有のサンプルバーコードセット及び／又はＵＭＩ配列を有する１つ以上のビーズと接触される。ビーズは、当業界で公知の任意の適切な態様で、例えば上記に記載の小滴アクチュエータを用いて操作することができる。
“固体表面”、“固相支持体”及び本明細書の他の文法的等価語は、本明細書に記載のプライマー、バーコード及び配列の添付のために適切な、又は添付のために適切であるように改変できる任意の材料を指す。当業者には理解されるところであるが、可能な基板の数は非常に大きい。可能な基板には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ガラス及び改変又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）（ＴｅｆｌｏｎTM）などを含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミクス、樹脂、シリカ又はシリカ系材料（シリコン及び改変シリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、及び他の多様なポリマー。いくつかの実施態様のために特に有用な固相支持体及び固体表面はフローセル装置に存在する。例示的なフローセルは下記でさらに詳細に示される。
【００４７】
いくつかの実施態様では、固相支持体は、本明細書に記載のプライマー、バーコード及び配列を指定のパターンで固定するために適切なパターン化表面を有する。“パターン化表面”は、固相支持体の露出層における又は露出層上の種々の領域の配置を指す。例えば、当該１つ以上の領域は、１つ以上のトランスポソーム複合体が存在する造作であり得る。当該造作は、介在する領域（トランスポソーム複合体は存在しない）によって分離できる。いくつかの実施態様では、造作はｘ−ｙ形式であり、行及び列を形成し得る。いくつかの実施態様では、パターンは造作及び／又は介在領域が繰り返される配置であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは造作及び／又は介在領域のランダムな配置であり得る。いくつかの実施態様では、トランスポソーム複合体は固相支持体上にランダムに分布する。いくつかの実施態様では、トランスポソーム複合体はパターン化表面に分布する。本明細書に示される方法及び組成物で用いることができる例示的なパターン化表面は、ＵＳ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３／６６１，５２４又はＵＳ  Ｐａｔ．Ａｐｐ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．２０１２／０３１６０８６  Ａ１に記載されている（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。
いくつかの実施態様では、固相支持体は表面にウェル又は窪みのアレーを含む。前記は、多様な技術を用い当業界で一般的に知られているように製作できる。前記技術には、例えばフォトリソグラフィー、捺印技術、鋳型技術及び微細エッチング技術が含まれるが、ただしこれらに限定されない。当業者には理解されるところであるが、用いられる技術は、アレー基板の組成及び形状に左右されるであろう。
【００４８】
固相支持体の組成及び幾何学的構造はその使用に応じて変動し得る。いくつかの実施態様では、固相支持体は、平板状構造、例えばスライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレーである。したがって、基板の表面は平板な層の形状であり得る。いくつかの実施態様では、固相支持体はフローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で用いられる“フローセル”という用語は、固体表面を含むチャンバーを指し、その全体にわたって１つ以上の流動試薬を流すことができる。本開示の方法で容易に用いることができるフローセル及び関連する流体系並びに検出プラットフォームの例は、例えば以下に記載されている：Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９，  ２００８；ＷＯ  ０４／０１８４９７；ＵＳ  ７，０５７，０２６；ＷＯ  ９１／０６６７８；ＷＯ  ０７／１２３７４４；ＵＳ  ７，３２９，４９２；ＵＳ  ７，２１１，４１４；ＵＳ  ７，３１５，０１９；ＵＳ  ７，４０５，２８１；及びＵＳ  ２００８／０１０８０８２（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。
いくつかの実施態様では、固相支持体又はその表面は、非平板状、例えば管又は容器の内側若しくは外側表面である。いくつかの実施態様では、固相支持体はマイクロ球体又はビーズを含む。“マイクロ球体”又は“ビーズ”又は“粒子”或いは本明細書の他の文法的等価語は、小さな別々の粒子を意味する。適切なビーズ組成物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：プラスチック、セラミクス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス又は架橋デキストラン、例えばセファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセル及びテフロン(登録商標)。固相支持体のために本明細書で概略した任意の他の材料も同様にいずれも用いることができる。以下のガイドブック（“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ”，  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｄ．））は有用な手引きである。
ビーズは球体である必要はなく、不規則な粒子を用いることができる。また別に或いは前記に加えて、ビーズは多孔性でもよい。ビーズのサイズはナノメートル（すなわち１００ｎｍ）からミリメートル（すなわち１mm）の範囲であり、約０．２ミクロンから約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５から約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、ただしいくつかの実施態様では、それよりも小さい又は大きいビーズを用いることができる。
本出願を通して、多様な刊行物、特許及び／又は特許出願が参照されている。これら刊行物の全開示が参照により本出願に含まれる。
含むという用語は本明細書では制限がないことが意図され、記載の成分だけでなく任意の追加成分をさらに包含する。
多数の実施態様を記載してきた。それにもかかわらず、多様な改変を実施できることは理解されよう。したがって、他の実施態様も以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2020189846.tif 000003
【図２Ａ】
2020189846.tif 000004
【図２Ｂ】
2020189846.tif 000005
【図３Ａ】
2020189846.tif 000006
【図３Ｂ】
2020189846.tif 000007
【図４Ａ】
2020189846.tif 000008
【図４Ｂ】
2020189846.tif 000009
【図５】
2020189846.tif 000010
【図６】
2020189846.tif 000011
【図７】
2020189846.tif 000012
【図８】
2020189846.tif 000013
【図９Ａ】
2020189846.tif 000014
【図９Ｂ】
2020189846.tif 000015
【図１０】
2020189846.tif 000016
【図１１】
2020189846.tif 000017
【図１２】
2020189846.tif 000018
【図１３】
2020189846.tif 000019
【図１４】
2020189846.tif 000020
【図１５】
2020189846.tif 000021
【図１６】
2020189846.tif 000022
【図１７】
2020189846.tif 000023
【図１８】
2020189846.tif 000024
【配列表】
2020189846000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、複数個の単一細胞の細胞小器官からｃＤＮＡシークエンシングライブラリーを調製する方法：
単一細胞の細胞小器官を空間的に分離する工程；
各単一細胞の細胞小器官からｍＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ及び／又はミトコンドリアＲＮＡを遊離させて、複数の個別ＲＮＡサンプルを提供する工程であって、各個別ＲＮＡサンプルのＲＮＡが１つの単一細胞の細胞小器官に由来する工程；
各個別ＲＮＡサンプルのＲＮＡから、ｃＤＮＡの第一鎖を、タグを備える第一鎖合成プライマーにより合成し、それによって、当該タグを当該ｃＤＮＡに取り込み、複数個のタグ付加ｃＤＮＡサンプルを提供する工程であって、各タグ付加ｃＤＮＡサンプルのｃＤＮＡが１つの単一細胞の細胞小器官に由来するＲＮＡと相補性であり、さらに当該タグが細胞特異的識別子配列、及び固有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む工程；
複数の単一細胞の細胞小器官由来のタグ付加ｃＤＮＡサンプルをプールする工程；
当該プールしたｃＤＮＡサンプルを増幅させて、プールされたタグ付加二本鎖ｃＤＮＡを生成する工程；及び
前記プールされたタグ付加ｃＤＮＡを複数のトランスポソーム複合体と接触させることにより、プールされたタグ付加二本鎖ｃＤＮＡサンプルに対してタグメンテーション反応を実施し、
各ｃＤＮＡを同時に切断し、アダプターを各ｃＤＮＡ鎖に取り込み、それによって、複数の単一細胞の細胞小器官由来のｃＤＮＡライブラリーを生成する工程。
【請求項２】
前記第一鎖合成プライマーが、オリゴｄＴプライマーとランダマープライマーとの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タグが、第１リードシーケンシングアダプター配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プールされたｃＤＮＡサンプルを増幅し、プールされたタグ付加二本鎖ｃＤＮＡを生成する工程；及び
プールされたタグ付加ｃＤＮＡを、第２リードシーケンシングアダプター配列を含むトランスポゾンと複合したトランスポザーゼをそれぞれが含む複数のトランスポソーム複合体と接触させることにより、前記プールされたタグ付加二本鎖ｃＤＮＡにタグメンテーション反応を実施し、ｃＤＮＡライブラリーを生成する工程であって、前記第２リードシーケンシングアダプター配列が、第１リードシーケンシングアダプター配列とは異なっており、前記ｃＤＮＡライブラリーが、第１鎖上に前記第１リードシーケンシングアダプター配列を有し、第２鎖上に前記第２リードシーケンシングアダプター配列を有する、複数個のタグ付加ｃＤＮＡフラグメントを有する工程、
を備える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記ｃＤＮＡライブラリーのタグ付加ｃＤＮＡフラグメントを増幅して増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｃＤＮＡライブラリーのタグ付加ｃＤＮＡフラグメントの増幅工程が追加の配列を当該増幅生成物の５’末端に付加する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
当該追加の配列が、固相支持体上での相補的なプライマー結合配列へのハイブリダイゼーションのため、及び、固相支持体上での前記タグ付加ｃＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマー結合配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、固相支持体上で、前記増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを前記相補的なプライマー結合配列にハイブリダイズする工程、及び、当該増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを固相支持体上で増幅させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、固相支持体上で増幅生成物をシークエンシングする工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
当該タグメンテーション反応が、Ｔｎ５トランスポザーゼを含むトランスポザーゼ混合物と二本鎖ｃＤＮＡを接触させる工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のトランスポソーム複合体が本質的に、第２リードシーケンシングアダプター配列を含むトランスポゾンを有するトランスポソームから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記ｃＤＮＡライブラリーの当該タグ付加ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする工程を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
シークエンシング工程が３’タグの計測を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
シークエンシング工程が全トランスクリプトームの分析を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
当該第一鎖合成プライマーが二本鎖部分を含むプライマーを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
当該第一鎖合成プライマーが、一本鎖の第一鎖合成プライマーと比較して連結副産物を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
当該第一鎖合成プライマーが、ヘアピンを形成できる領域を有するプライマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
当該第一鎖合成プライマーが、ＲＮＡ領域を含むプライマーを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
当該第一鎖合成プライマーが、相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成するプライマーを備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１鎖合成プライマーが、ビーズに結合し、前記合成が、タグ付加ｃＤＮＡサンプルを前記ビーズ上に合成することを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡを各単一細胞から遊離する前に、各単一細胞を前記ビーズを有する小滴内に封入することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遊離と、前記各タグ付加ｃＤＮＡサンプルの合成とが、前記小滴内で実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タグ付加ｃＤＮＡサンプルをプールする工程が、前記タグ付加ｃＤＮＡサンプルが結合したビーズをプールすることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記小滴が、小滴アクチュエータを用いて生成される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
単一細胞の細胞小器官を空間的に分離する工程が、ｍＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、及び/又はミトコンドリアＲＮＡを、各単一細胞の細胞小器官から遊離させる前に、前記細胞小器官を空間的隔離区画に分離することを備える、
請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞小器官が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、空間的隔離区画に分離される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞小器官が、固体表面に固定されることによって、空間的隔離区画に分離される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞小器官が、前記細胞小器官に特異的に結合する抗体を介して固体表面に固定され、前記抗体が固体表面に固定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固体表面が、フローセル又はビーズである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞小器官が、核、ミトコンドリア、及びリボソームから選択される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
固相支持体の組成及び幾何学的構造はその使用に応じて変動し得る。いくつかの実施態様では、固相支持体は、平板状構造、例えばスライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレーである。したがって、基板の表面は平板な層の形状であり得る。いくつかの実施態様では、固相支持体はフローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で用いられる“フローセル”という用語は、固体表面を含むチャンバーを指し、その全体にわたって１つ以上の流動試薬を流すことができる。本開示の方法で容易に用いることができるフローセル及び関連する流体系並びに検出プラットフォームの例は、例えば以下に記載されている：Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９，  ２００８；ＷＯ  ０４／０１８４９７；ＵＳ  ７，０５７，０２６；ＷＯ  ９１／０６６７８；ＷＯ  ０７／１２３７４４；ＵＳ  ７，３２９，４９２；ＵＳ  ７，２１１，４１４；ＵＳ  ７，３１５，０１９；ＵＳ  ７，４０５，２８１；及びＵＳ  ２００８／０１０８０８２（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。
いくつかの実施態様では、固相支持体又はその表面は、非平板状、例えば管又は容器の内側若しくは外側表面である。いくつかの実施態様では、固相支持体はマイクロ球体又はビーズを含む。“マイクロ球体”又は“ビーズ”又は“粒子”或いは本明細書の他の文法的等価語は、小さな別々の粒子を意味する。適切なビーズ組成物には以下が含まれる（た
だしこれらに限定されない）：プラスチック、セラミクス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス又は架橋デキストラン、例えばセファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセル及びテフロン(登録商標)。固相支持体のために本明細書で概略した任意の他の材料も同様にいずれも用いることができる。以下のガイドブック（“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ”，  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｄ．））は有用な手引きである。
ビーズは球体である必要はなく、不規則な粒子を用いることができる。また別に或いは前記に加えて、ビーズは多孔性でもよい。ビーズのサイズはナノメートル（すなわち１００ｎｍ）からミリメートル（すなわち１mm）の範囲であり、約０．２ミクロンから約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５から約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、ただしいくつかの実施態様では、それよりも小さい又は大きいビーズを用いることができる。
本出願を通して、多様な刊行物、特許及び／又は特許出願が参照されている。これら刊行物の全開示が参照により本出願に含まれる。
含むという用語は本明細書では制限がないことが意図され、記載の成分だけでなく任意の追加成分をさらに包含する。
多数の実施態様を記載してきた。それにもかかわらず、多様な改変を実施できることは理解されよう。したがって、他の実施態様も以下の特許請求の範囲内である。
本発明は以下の事項を含んでいるともいえる。
（付記１）
以下の工程を含む、複数個の単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する方法：
各単一細胞からｍＲＮＡを遊離させて個々のｍＲＮＡの複数個のサンプルを提供する工程であって、個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡが１つの単一細胞に由来する工程；
個々のｍＲＮＡサンプルの各々のｍＲＮＡからｃＤＮＡの第一鎖を第一鎖合成プライマーにより合成し、さらに当該ｃＤＮＡにタグを取り込み複数個のタグ付加ｃＤＮＡサンプルを提供する工程であって、各タグ付加ｃＤＮＡサンプルのｃＤＮＡが１つの単一細胞に由来するｍＲＮＡと相補性であり、さらに当該タグが細胞特異的識別子配列及び場合により固有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む工程；
当該タグ付加ｃＤＮＡサンプルをプールする工程；
任意で、当該プールしたｃＤＮＡサンプルを増幅させて二本鎖ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを生成する工程；及び
タグメンテーション反応を実施し同時に各ｃＤＮＡを切断して当該ｃＤＮＡの各鎖にアダプターを取り込み、それによって複数個のタグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程。
（付記２）
さらに、当該タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを増幅して増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを生成する工程を含む、付記１に記載の方法。
（付記３）
増幅工程が追加の配列を当該増幅生成物の５’末端に付加する工程を含む、付記２に記載の方法。
（付記４）
当該追加の配列が固相支持体上での増幅のためにプライマー結合配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記５）
さらに、当該増幅タグ付加ｃＤＮＡフラグメントを固相支持体上で増幅させる工程を含む、付記４に記載の方法。
（付記６）
さらに、固相支持体上で増幅生成物をシークエンシングする工程を含む、付記５に記載の方法。
（付記７）
当該タグメンテーション反応が、第一鎖合成プライマーでは見出されないアダプター配列を含むトランスポザーゼ混合物と二本鎖ｃＤＮＡを接触させる工程を含む、付記１に記載の方法。
（付記８）
当該トランスポザーゼ混合物が本質的に、１つのタイプのアダプター配列を有するトランスポソームから成る、付記７に記載の方法。
（付記９）
さらに、当該タグ付加ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする工程を含む、付記１に記載の方法。
（付記１０）
シークエンシング工程が３’タグの計測を含む、付記９に記載の方法。
（付記１１）
シークエンシング工程が全トランスクリプトームの分析を含む、付記９に記載の方法。
（付記１２）
第一鎖の合成が、ランダムプライマーの混合物を用いて実施され、当該ランダムプライマーがさらにタグを含む、付記１に記載の方法。
（付記１３）
当該第一鎖合成プライマーが二本鎖部分を含む、付記１２に記載の方法。
（付記１４）
当該第一鎖合成プライマーが、一本鎖の第一鎖合成プライマーと比較して連結副産物を減少させる、付記１３に記載の方法。
（付記１５）
当該第一鎖合成プライマーがヘアピンを形成できる領域を含む、付記１３に記載の方法。
（付記１６）
当該第一鎖合成プライマーがＲＮＡ領域を含む、付記１３に記載の方法。
（付記１７）
当該第一鎖合成プライマーが相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成する、付記１３に記載の方法。
（付記１８）
複数個のビーズであって、各ビーズが複数個のオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドが、
（ａ）リンカー、
（ｂ）増幅プライマー結合部位、
（ｃ）任意で、各オリゴヌクレオチドで相違する固有分子識別子、
（ｄ）ビーズの各オリゴヌクレオチドで同じであるが、他のビーズでは相違する、ビーズ特異的配列、及び
（ｅ）ｍＲＮＡを捕捉し逆転写をプライミングする捕捉配列、
を含む、前記複数個のビーズ。
（付記１９）
当該捕捉配列がオリゴｄＴを含む、付記１８に記載の複数個のビーズ。
（付記２０）
各ビーズが、他のビーズから隔離された分離小滴に存在する、付記１８に記載の複数個のビーズ。
【外国語明細書】
2020189846000001.pdf