(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を含む安定した水性医薬製剤の提供。【解決手段】モノクローナル抗体、トレハロース、緩衝剤、及び任意選択の界面活性剤を含み、前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が０．４１以上かつ１．６５未満であり、約５．５〜約７．０の範囲のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦと結合する、水性医薬製剤。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定した水性医薬製剤であって、モノクローナル抗体、トレハロース、及び緩衝剤を含み、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満であり、前記製剤が、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦと結合する、前記水性医薬製剤。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４９〜１．４７である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１〜０．７３である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．７３〜１．４７である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体が、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体が、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬである、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体が、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬである、請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤中の前記トレハロースが、約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記製剤中の前記トレハロースが、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤中の前記トレハロースが、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】
前記緩衝剤が、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記緩衝剤が、ヒスチジンを含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウムを含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
安定した水性医薬製剤であって、（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、（ｂ）約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭの量のトレハロース、及び（ｃ）３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、前記製剤が約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満であり、前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦと結合する、前記水性医薬製剤。
【請求項１５】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１〜０．７３である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．７３〜１．４７である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、約５０ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記トレハロースが、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭの量である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記トレハロースが、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭの量である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記トレハロースが、約６０ｍＭの量である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記リン酸ナトリウムが、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭの量である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
前記リン酸ナトリウムが、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭの量である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
前記リン酸ナトリウムが、約５１ｍＭの量である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
界面活性剤を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
前記界面活性剤が、ポリソルベートまたはポロキサマーである、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記ポリソルベートがポリソルベート２０である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記ポロキサマーがポロキサマー１８８である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項３０】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜約０．１％である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３１】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜約０．０５％である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０４％である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
前記製剤が、約５．９〜約６．５のｐＨを有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
前記製剤が、約６．２または約６．０のｐＨを有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体が、事前に凍結乾燥を受けない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体が完全長抗体である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧｌ抗体である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
前記モノクローナル抗体が、抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項１〜３５、３７及び３８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
前記抗体断片が、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記抗体がベバシズマブである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体が凝集しやすい、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４３】
前記製剤が、−２０℃で少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、または少なくとも２４ヶ月間安定している、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４４】
滅菌である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４５】
前記製剤が、対象に投与するためである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４６】
静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）、眼内（ＩＯ）、筋肉内（ＩＭ）投与用である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の安定した水性医薬製剤を保持する容器を含む、製品。
【請求項４８】
治療用モノクローナル抗体の凝集の低減方法であって、約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭの量のトレハロース、及び３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む製剤中に前記抗体を製剤化することを含み、前記製剤が、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体が、前記製剤中に約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤化され、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満であり、前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦと結合する、前記方法。
【請求項４９】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１〜０．７３である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．７３〜１．４７である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記リン酸ナトリウムが、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭの量である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記リン酸ナトリウムが、約５１ｍＭの量である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
治療用モノクローナル抗体の凝集の低減方法であって、トレハロース及び緩衝剤を含む製剤中に前記抗体を製剤化することを含み、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満であり、前記製剤が、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦと結合する、前記方法。
【請求項５４】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１、０．４９、０．５８、０．６５、０．７３、０．７４、０．８３、０．９７、１．１６、及び１．４７のいずれかである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４９〜１．４７である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１〜０．７３である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．７３〜１．４７である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記モノクローナル抗体が、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記モノクローナル抗体が、約５０ｍｇ／ｍＬの量である、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記モノクローナル抗体が、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記トレハロースが、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭの量である、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記トレハロースが、約６０ｍＭの量である、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記トレハロースが、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭの量である、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記製剤が界面活性剤を更に含む、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記界面活性剤が、ポリソルベートまたはポロキサマーである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリソルベートがポリソルベート２０である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポロキサマーがポロキサマー１８８である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜約０．１％である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜約０．０５％である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０４％である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記製剤が、約５．９〜約６．５のｐＨを有する、請求項４８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記製剤が、約６．２または６．０のｐＨを有する、請求項４８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記緩衝剤が、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む、請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体がベバシズマブである、請求項４８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
医薬製剤の作製方法であって、
（ａ）請求項１〜４６のいずれか一項に記載の製剤を調製することと、
（ｂ）前記製剤中の前記抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することと、を含む、前記方法。
【請求項７６】
対象における疾患または障害の治療方法であって、前記疾患または障害を治療するのに有効な量で対象に請求項１〜４６のいずれか一項に記載の製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７７】
静脈内投与用の安定した水性医薬製剤であって、（ａ）約１００ｍｇ／ｍＬ以下の量のモノクローナル抗体、及び（ｂ）約５０ｍＭ〜約６００ｍＭの量のトレハロースを含み、前記製剤が、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満である、前記水性医薬製剤。
【請求項７８】
皮下または眼内投与用の安定した水性医薬製剤であって、（ａ）約１００ｍｇ／ｍＬ以下の量のモノクローナル抗体、及び（ｂ）約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの量のトレハロースを含み、前記製剤が、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、前記製剤中の前記モノクローナル抗体の前記トレハロースに対する重量比が、０．４１以上かつ１．６５未満である、前記水性医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１５日に出願された米国仮出願第６２／０５０７３９号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの次の提出の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２８２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日付：２０１５年９月３日、サイズ：２９ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、抗体を含む安定した水性医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
過去数年、バイオテクノロジーの進歩により、組換えＤＮＡ技術を用いて、医薬用途用の様々なタンパク質を生産することが可能となった。タンパク質は、従来の有機及び無機薬物よりも大きく、複雑であるため（例えば、複雑な三次元構造に加えて複数の官能基を有する）、そのようなタンパク質の製剤は特別な問題を提起する。タンパク質が生物学的活性を維持するために、製剤は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の立体構造的完全性をそのまま保持する一方で、同時に、タンパク質の複数の官能基を分解から保護しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（例えば、新規化学成分をもたらす結合形成または切断によるタンパク質の修飾を伴うあらゆるプロセス）または物理的不安定性（例えば、タンパク質の高次構造の変化）を伴う場合がある。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離、またはジスルフィド交換に起因し得る。物理的不安定性は、例えば、変性、凝集、沈殿、または吸着に起因し得る。最も一般的な３つのタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、脱アミド化、及び酸化である。Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０（４）：３０７−３７７（１９９３）。
【０００５】
医薬用途に使用されるタンパク質には、抗体が含まれる。安定した水性製剤が、医薬抗体のために開発されてきた。例えば、ＷＯ２０１１／０８４７５０を参照されたい。当該技術分野において、二量体、可溶性凝集体、及び微粒子の形成を軽減する、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＣＤ２０抗体などの抗体を含む安定した水性医薬製剤の必要性が尚も存在する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、安定した水性医薬製剤を提供し、この製剤は、モノクローナル抗体、トレハロース、及び緩衝剤を含み、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満であり、本製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４９〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、約０．４１〜０．７３である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、約０．７３〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、及び１．６４のいずれかであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの量である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン（例えば、酢酸ヒスチジン、ヒスチジン塩酸塩）またはリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）を含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、（ｂ）約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭの量のトレハロース、及び（ｃ）３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウム、ならびに任意選択の界面活性剤を含む、安定した水性医薬製剤を提供し、該製剤は、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１〜０．７３である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．７３〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４９〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、及び１．６４のいずれかであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、安定した水性医薬製剤を提供し、この製剤は、（ａ）約１００ｍｇ／ｍＬ以下の量の抗体（例えばモノクローナル抗体）、及び（ｂ）約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの量のトレハロースを含み、該製剤は、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。いくつかの実施形態では、本製剤は皮下投与用である。いくつかの実施形態では、本製剤は眼内投与用である。いくつかの実施形態では、本製剤は等張性である。いくつかの実施形態では、本製剤は、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧を有する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、安定した水性医薬製剤を提供し、この製剤は、（ａ）約１００ｍｇ／ｍＬ以下の量の抗体（例えばモノクローナル抗体）、及び（ｂ）約５０ｍＭ〜約６００ｍＭの量のトレハロースを含み、該製剤は、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。いくつかの実施形態において、本製剤は静脈内投与用である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤中のモノクローナル抗体は、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬの量である。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、約４５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍｍ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６１０ｍＭ、約６２０ｍＭ、約６３０ｍＭ、または約６３４ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてリン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸塩緩衝剤（例えばリン酸ナトリウム）は、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）は、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてヒスチジン（Ｌ−ヒスチジンなど）を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート（ポリソルベート２０など）またはポロキサマー（ポロキサマー１８８など）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．０５％、または約０．０２％〜約０．０４％である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、または約０．１％であり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、約５．５〜約６．５、約５．８〜約６．８、約５．９〜約６．５、約６．０〜約６．５、約６．０〜約６．４、または約６．０〜約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、または約７．０のｐＨを有し、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤中のモノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＶＥＧＦと結合する。いくつかの実施形態では、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤中のモノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＣＤ２０と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、本明細書に記載のヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、配列番号３〜配列番号１９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１５ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約１９ヶ月間、少なくとも約２０ヶ月間、または少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施形態では、本製剤は減菌である。いくつかの実施形態では、本製剤は対象に投与するためである。いくつかの実施形態では、本製剤は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）、眼内（ＩＯ）、または筋肉内（ＩＭ）投与用である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の安定した水性医薬製剤を保持する容器を含む、製品を提供する。いくつかの実施形態では、本製剤は、モノクローナル抗体、トレハロース、及び緩衝剤を含み、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満であり、本製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本製剤は、（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、（ｂ）約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭの量のトレハロース、及び（ｃ）３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウム、ならびに任意選択の界面活性剤を含み、該製剤は、約５．５〜約７．０のｐＨを有し、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６未満である。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１〜０．７３である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．７３〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４９〜１．４７である。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、及び１．６４のいずれかであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本製剤は、約４５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６１０ｍＭ、約６２０ｍＭ、約６３０ｍＭ、または約６３４ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてヒスチジン（Ｌ−ヒスチジンなど）を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本製剤は界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート（ポリソルベート２０など）またはポロキサマー（ポロキサマー１８８など）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．０５％、または約０．０２％〜約０．０４％である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、または約０．１％であり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本製剤は、約５．５〜約６．５、約５．８〜約６．８、約５．９〜約６．５、約６．０〜約６．５、約６．０〜約６．４、または約６．０〜約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、または約７．０のｐＨを有し、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＶＥＧＦと結合する。いくつかの実施形態では、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＣＤ２０と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、本明細書に記載のヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、配列番号３〜配列番号１９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本製剤は、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１５ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約１９ヶ月間、少なくとも約２０ヶ月間、または少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施形態では、本製剤は減菌である。いくつかの実施形態では、本製剤は対象に投与するためである。いくつかの実施形態では、本製剤は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）、眼内（ＩＯ）、または筋肉内（ＩＭ）投与用である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、容器は、シリンジによって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり、このバイアルは本明細書に記載の製剤のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、バイアルは約２〜８℃で保存される。いくつかの実施形態では、バイアルは約−２０℃で保存される。いくつかの実施形態では、バイアルは、３ｃｃ、２０ｃｃ、または５０ｃｃのバイアルである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、タンク内に本明細書に記載の製剤のうちのいずれか１つを含むステンレス鋼タンクを提供する。いくつかの実施形態では、本製剤は凍結される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、治療用モノクローナル抗体の凝集を低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、トレハロース及び緩衝剤を含む製剤中にモノクローナル抗体を製剤化することを含み、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満であり、本製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本方法は、約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの量のトレハロース、及び３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む製剤中に抗体を製剤化することを含み、該製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有し、該モノクローナル抗体は、製剤中に約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤化され、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。
【００２８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．７３〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４９〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、及び１．６４のいずれかであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体は、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本製剤は、約４５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６１０ｍＭ、約６２０ｍＭ、約６３０ｍＭ、または約６３４ｍＭである。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤としてヒスチジン（Ｌ−ヒスチジンなど）を含む。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜３０ｍＭ、約２２ｍＭ〜約２８ｍＭ、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約９０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭであり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本製剤は界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート（ポリソルベート２０など）またはポロキサマー（ポロキサマー１８８など）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．０５％、または約０．０２％〜約０．０４％である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、または約０．１％であり、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本製剤は、約５．５〜約６．５、約５．８〜約６．８、約５．９〜約６．５、約６．０〜約６．５、約６．０〜約６．４、または約６．０〜約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、または約７．０のｐＨを有し、これらの数字の間の全ての値を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＶＥＧＦと結合する。いくつかの実施形態では、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、事前に凍結乾燥を受けない。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はＣＤ２０と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、本明細書に記載のヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０と結合する抗体は、配列番号３〜配列番号１９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本製剤は、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１５ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約１９ヶ月間、少なくとも約２０ヶ月間、または少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施形態では、本製剤は減菌である。いくつかの実施形態では、本製剤は対象に投与するためである。いくつかの実施形態では、本製剤は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）、眼内（ＩＯ）、または筋肉内（ＩＭ）投与用である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載の製剤のうちのいずれか１つを調製すること、及び（ｂ）製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することを含む、医薬製剤の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性は、本製剤が（例えば、−２０℃または−４０℃で）保存された約６ヶ月後、約１２ヶ月後、約１８ヶ月後、または約２４ヶ月後に評価される。
【００３７】
別の態様では、本発明は、疾患または障害を治療するのに有効な量で本明細書に記載の製剤のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む、対象における疾患または障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本製剤は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腎癌、及び神経膠芽腫から選択される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、疾患または障害を治療するのに有効な量で本明細書に記載の製剤のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む、対象における疾患または障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本製剤は、ＣＤ２０に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＣＤ２０発現癌、例えば、リンパ腫、リンパ球性白血病、及び多発性骨髄腫である。
【００３９】
本明細書に記載の様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てが、本発明の他の実施形態を形成するように組み合わされてもよいことを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様が当業者に明らかになるであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態に更に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、（図１Ａ）０．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｂ）２．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｃ）４．０％（重量／体積）トレハロース、及び（図１Ｄ）８．０％（重量／体積）トレハロースという、医薬として適切な濃度のトレハロースを用いて凍結試料の表面上に核形成を誘導した後の、視覚的トレハロース結晶化を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、（図１Ａ）０．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｂ）２．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｃ）４．０％（重量／体積）トレハロース、及び（図１Ｄ）８．０％（重量／体積）トレハロースという、医薬として適切な濃度のトレハロースを用いて凍結試料の表面上に核形成を誘導した後の、視覚的トレハロース結晶化を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、（図１Ａ）０．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｂ）２．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｃ）４．０％（重量／体積）トレハロース、及び（図１Ｄ）８．０％（重量／体積）トレハロースという、医薬として適切な濃度のトレハロースを用いて凍結試料の表面上に核形成を誘導した後の、視覚的トレハロース結晶化を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、（図１Ａ）０．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｂ）２．０％（重量／体積）トレハロース、（図１Ｃ）４．０％（重量／体積）トレハロース、及び（図１Ｄ）８．０％（重量／体積）トレハロースという、医薬として適切な濃度のトレハロースを用いて凍結試料の表面上に核形成を誘導した後の、視覚的トレハロース結晶化を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、標示されるように、温度の関数としてのスクロース（１）、トレハロース（２）、及びマンニトール（３）の溶解度を示す。図２Ｂは、標示されるように、ＨＰ−ＳＥＣにより決定されるとき、−２０℃で２８日間凍結し核形成を誘導する前と後の、様々な凍結保護物質製剤におけるベバシズマブの高分子量種パーセントを示す。
【図２Ｂ】図２Ａは、標示されるように、温度の関数としてのスクロース（１）、トレハロース（２）、及びマンニトール（３）の溶解度を示す。図２Ｂは、標示されるように、ＨＰ−ＳＥＣにより決定されるとき、−２０℃で２８日間凍結し核形成を誘導する前と後の、様々な凍結保護物質製剤におけるベバシズマブの高分子量種パーセントを示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、標示されるように、−２０℃（１）、−１４℃（２）、及び−８℃（３）で凍結保存されたｍＡｂ１（図３Ａ）、ベバシズマブ（図３Ｂ）、及びｍＡｂ３（図３Ｃ）の高速凍結試料の凝集における時間依存的な増加を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、標示されるように、−２０℃（１）、−１４℃（２）、及び−８℃（３）で凍結保存されたｍＡｂ１（図３Ａ）、ベバシズマブ（図３Ｂ）、及びｍＡｂ３（図３Ｃ）の高速凍結試料の凝集における時間依存的な増加を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、標示されるように、−２０℃（１）、−１４℃（２）、及び−８℃（３）で凍結保存されたｍＡｂ１（図３Ａ）、ベバシズマブ（図３Ｂ）、及びｍＡｂ３（図３Ｃ）の高速凍結試料の凝集における時間依存的な増加を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、ｍＡｂ３単量体、二量体、及び高分子量種（ＨＭＷＳ）の代表的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）クロマトグラムを示す。（図４Ａ）凍結速度の作用。緩慢（１）、通常（２）、及び高速（３）凍結速度（標示されるように）で凍結し、−２０℃で１２ヶ月間保存したｍＡｂ３試料。比較のため、研究対照（−７０℃で保存）を示す。（図４Ｂ）保存温度の作用。標示されるように、高速凍結速度で凍結し、−２０℃（３）、−１４℃（２）、及び−８℃（１）で１２ヶ月間保存したｍＡｂ３試料。比較のため、研究対照（−７０℃で保存）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、ｍＡｂ３単量体、二量体、及び高分子量種（ＨＭＷＳ）の代表的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）クロマトグラムを示す。（図４Ａ）凍結速度の作用。緩慢（１）、通常（２）、及び高速（３）凍結速度（標示されるように）で凍結し、−２０℃で１２ヶ月間保存したｍＡｂ３試料。比較のため、研究対照（−７０℃で保存）を示す。（図４Ｂ）保存温度の作用。標示されるように、高速凍結速度で凍結し、−２０℃（３）、−１４℃（２）、及び−８℃（１）で１２ヶ月間保存したｍＡｂ３試料。比較のため、研究対照（−７０℃で保存）を示す。
【図５】本研究で考察した３つのトレハロース形態の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す：標示されるように、非結晶トレハロース（１）、トレハロース無水物（結晶性）（２）、及びトレハロース二水和物（結晶性）（３）。
【図６Ａ１】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ａ２】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ａ３】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｂ１】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｂ２】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｂ３】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｃ１】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｃ２】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図６Ｃ３】図６Ａ１〜図６Ｃ３は、（図６Ａ１、６Ｂ１、及び６Ｃ１）緩慢な凍結、（図６Ａ２、６Ｂ２及び６Ｃ２）通常の凍結、及び（３）高速凍結速度を用いて凍結し、−２０℃、−１４℃、及び−８℃で１２ヶ月間保存した後の（図６Ａ１、６Ａ２、及び６Ａ３）ｍＡｂ１、（図６Ｂ１、６Ｂ２、及び６Ｂ３）ベバシズマブ、及び（図６Ｃ１、６Ｃ２、及び６Ｃ３）ｍＡｂ３試料の正規化されたＮＩＲスペクトルを示す。
【図７Ａ】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ａ）０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、（図７Ｂ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、及び（図７Ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む製剤中の非結晶（１）及び結晶化トレハロース（２）の濃度を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ｄ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ及び（図７Ｅ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含むトレハロース製剤の高分子量種パーセントを表すボックスプロットを示す。
【図７Ｂ】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ａ）０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、（図７Ｂ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、及び（図７Ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む製剤中の非結晶（１）及び結晶化トレハロース（２）の濃度を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ｄ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ及び（図７Ｅ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含むトレハロース製剤の高分子量種パーセントを表すボックスプロットを示す。
【図７Ｃ】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ａ）０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、（図７Ｂ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、及び（図７Ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む製剤中の非結晶（１）及び結晶化トレハロース（２）の濃度を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ｄ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ及び（図７Ｅ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含むトレハロース製剤の高分子量種パーセントを表すボックスプロットを示す。
【図７Ｄ】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ａ）０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、（図７Ｂ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、及び（図７Ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む製剤中の非結晶（１）及び結晶化トレハロース（２）の濃度を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ｄ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ及び（図７Ｅ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含むトレハロース製剤の高分子量種パーセントを表すボックスプロットを示す。
【図７Ｅ】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ａ）０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、（図７Ｂ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、及び（図７Ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む製剤中の非結晶（１）及び結晶化トレハロース（２）の濃度を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、−２０℃で１２ヶ月間保存した後の、（図７Ｄ）２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ及び（図７Ｅ）１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含むトレハロース製剤の高分子量種パーセントを表すボックスプロットを示す。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは、総トレハロース：ｍＡｂ比（重量／重量）の関数として、結晶化無水トレハロースのパーセント（図８Ａ）、及び高分子量種パーセント（図８Ｂ）を示す。高分子量種は、ＨＰ−ＳＥＣを用いて測定し、トレハロース二水和物の濃度は、ＦＴ−ＮＩＲを用いて測定した。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、総トレハロース：ｍＡｂ比（重量／重量）の関数として、結晶化無水トレハロースのパーセント（図８Ａ）、及び高分子量種パーセント（図８Ｂ）を示す。高分子量種は、ＨＰ−ＳＥＣを用いて測定し、トレハロース二水和物の濃度は、ＦＴ−ＮＩＲを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．定義。
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、当然のことながら様々であり得る、特定の組成物または生物系に限定されないことを理解されたい。本明細書に使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することが意図されないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、２つ以上のこのような分子の組み合わせを任意選択で含むなどである。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、本技術分野の当業者に容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象にする実施形態を含む（及び説明する）。
【００４３】
本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態を「含むこと」、それら「からなること」、及びそれら「から本質的になること」を含むことが理解される。
【００４４】
用語「医薬製剤」は、活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与されるであろう対象に許容できないほど毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。このような製剤は減菌である。「医薬的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる有効用量の活性成分を提供するために対象哺乳動物に合理的に投与することができるものである。
【００４５】
「減菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存する微生物及びそれらの胞子を含まないか、若しくは実質的に含まない。
【００４６】
「凍結」製剤は、０℃より低い温度のものである。一般に、凍結製剤は、凍結乾燥されておらず、事前または後の凍結乾燥も受けない。ある特定の実施形態では、凍結製剤は、保存（ステンレス鋼タンク中で）のための凍結原薬、または凍結医薬品（最終バイアル構成で）を含む。
【００４７】
「安定した」製剤は、その中のタンパク質が、保存時に、その物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に維持するものである。好ましくは、本製剤は、保存時に、その物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に維持する。保存期間は一般に、製剤の意図する貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が、当技術分野において利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された期間の間、選択された温度で測定され得る。ある特定の実施形態では、本製剤は、約４０℃で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８日間以上安定している。ある特定の実施形態では、本製剤は、約４０℃で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８週間以上安定している。ある特定の実施形態では、本製剤は、約２５℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４ヶ月間以上安定している。ある特定の実施形態では、本製剤は、約５℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４ヶ月間以上安定している。ある特定の実施形態では、本製剤は、約−２０℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月間以上安定している。ある特定の実施形態では、本製剤は、５℃または−２０℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月間以上安定している。更に、本製剤は、好ましくは、製剤の凍結（例えば、−２０℃、−４０℃、または−７０℃に）及び解凍後、例えば、１、２、３、４、または５回の凍結・解凍サイクル後に、安定している。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することにより、及び／または目視検査により）、陽イオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷の不均一性を評価することにより、アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析、質量分光分析、還元化及び無傷抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析、���物学的活性または抗体の抗原結合機能を評価することなどを含む、様々な異なる方法で定性的及び／または定量的に評価することができる。不安定性は、凝集、脱アミド化（例えばＡｓｎの脱アミド）、酸化（例えばＭｅｔの酸化）、異性化（例えばＡｓｐの異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端のプロセシング、グリコシル化の相違などのうちのいずれか１つ以上を伴い得る。
【００４８】
タンパク質は、色及び／若しくは透明性の目視検査時に、またはＵＶ光散乱により、若しくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定されるとき、凝集、沈殿、及び／または変性の徴候を全くまたは非常に少ししか示さない場合、医薬製剤において「その物理的安定性を維持する」。
【００４９】
タンパク質は、所与の時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるその生物学的活性を尚も維持すると考えられるような場合、医薬製剤において「その化学的安定性を維持する」。化学的安定性は、タンパク質の化学変化した形態を検出及び定量することによって評価することができる。化学変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して評価することができるサイズ変更（例えば、クリッピング）を伴い得る。他の種類の化学変化としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはｉｃＩＥＦによって評価することができる電荷変化（例えば、脱アミド化の結果として生じる）が挙げられる。
【００５０】
抗体は、例えば抗原結合アッセイにおいて決定されるとき、所与の時間での抗体の生物学的活性が、医薬製剤が調製された時間に呈した生物学的活性の約１０％以内（アッセイの誤差内）である場合、医薬製剤において「その生物学的活性を維持する」。抗体の他の「生物学的活性」アッセイは、本明細書において以下に詳述される。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、モノクローナル抗体の「生物学的活性」は、抗原に結合する抗体の能力を指す。抗原に結合し、インビトロまたはインビボで測定することができる測定可能な生物学的応答をもたらす抗体を更に含み得る。このような活性は、アンタゴニスト性またはアゴニスト性であってもよい。
【００５２】
本明細書において「脱アミド化」モノクローナル抗体は、その１つ以上のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に誘導体化されたものである。
【００５３】
「脱アミド化しやすい」抗体は、脱アミド化する傾向にあることが見出された１つ以上の残基を含むものである。
【００５４】
「凝集しやすい」抗体は、特に凍結及び／または撹拌時に、他の抗体分子（複数可）と凝結することが見出されたものである。
【００５５】
「断片化しやすい」抗体は、例えばそのヒンジ領域で、２つ以上の断片に切断されることが見出されたものである。
【００５６】
「脱アミド化、凝集、または断片化を低減する」とは、異なる製剤に製剤化されたモノクローナル抗体と比べて脱アミド化、凝集、若しくは断片化を阻止するか、またはその量を減少させることを意図する。
【００５７】
製剤化される抗体は、好ましくは、本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質（例えば、混入タンパク質などがない）である。「本質的に純粋な」抗体は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％の抗体、好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」抗体は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％の抗体を含む組成物を意味する。
【００５８】
「等張」とは、目的とする製剤が本質的にヒト血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、本製剤は、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧を有する。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「緩衝剤」は、その酸−塩基共役構成成分の作用によってｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の緩衝剤は、好ましくは、約４．５〜約７．０、好ましくは約５．６〜約７．０、例えば５．６〜６．９、５．７〜６．８、５．８〜６．７、５．９〜６．６、５．９〜６．５、６．０、６．０〜６．４、または６．１〜６．３の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝剤は、ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０を有する。例えば、リン酸ナトリウムは、この範囲にｐＨを制御する緩衝剤の例である。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「界面活性剤」は、表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウレル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、若しくはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、若しくはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、若しくはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル（ｐａｌｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−、若しくはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、若しくはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム若しくはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；及びＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えばプルロニック、ＰＦ６８など）などが挙げられる。一実施形態では、本明細書における界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００６１】
薬理学的な意味では、本発明の文脈において、抗体の「治療有効量」は、抗体が有効である治療に関する、障害の予防または治療に有効な量を指す。「障害」は、抗体を用いた治療から利益を受けるであろう任意の状態である。これは、哺乳動物を問題の疾患にかかりやすくするこれらの病的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患を含む。
【００６２】
「保存剤」は、製剤中の細菌の作用を本質的に低減し、よって例えば複数回使用製剤の生産を容易にするために、製剤中に任意選択で含まれ得る化合物である。可能性のある保存剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩化物の混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の種類の保存剤としては、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、ならびにｍ−クレゾールが挙げられる。一実施形態では、本明細書における保存剤はベンジルアルコールである。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」は、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  ５：１８０６により記載されるように、天然に存在する対立遺伝子及びそのプロセシング形態と共に、１６５アミノ酸ヒト血管内皮細胞成長因子、ならびに関連する１２１、１８９、及び２０６アミノ酸ヒト血管内皮細胞成長因子を指す。用語「ＶＥＧＦ」はまた、マウス、ラットまたは霊長類などの非ヒト種からのＶＥＧＦも指す。時折、特定の種からのＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦについてはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦについてはｍＶＥＧＦなどの用語で示される。用語「ＶＥＧＦ」はまた、１６５アミノ酸ヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を指すために使用される。ＶＥＧＦのいずれかのこのような形態への言及は、例えば「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」、または「ＶＥＧＦ１６５」により、本出願において識別され得る。「切断された」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示されるように番号付けされる。例えば、切断された天然ＶＥＧＦ中のアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦにおいても位置１７（メチオニン）である。切断された天然ＶＥＧＦは天然ＶＥＧＦと同程度のＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対する結合親和性を有する。
【００６４】
「ＶＥＧＦの生物学的活性」は、任意のＶＥＧＦ受容体への結合または正常及び異常な血管新生ならびに脈管形成の調節などの任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４−２５、Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−５４３）、胚性脈管形成及び血管新生の促進（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５−４３９、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２）、ならびに女性の生殖器官における、及び骨成長ならびに軟骨形成のための周期的な血管増殖の調節（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３３６−３４０、Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：６２３−６２８）を含む。血管新生及び脈管形成における血管新生因子であることに加えて、ＶＥＧＦは、多面的な成長因子として、内皮細胞生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入などの他の生理学的プロセスにおいて複数の生物学的作用を呈する（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）、上記、及びＣｅｂｅ−Ｓｕａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６３：６０１−６１５（２００６））。更に、最近の研究では、網膜色素上皮細胞、膵管細胞、及びシュワン細胞などのいくつかの非内皮細胞型に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Ｇｕｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５−３９４、Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５−１３２、Ｓｏｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１−５７４０。
【００６５】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」または「ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦ発現レベルを低減する、または限定するものではないが、１つ以上のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合、ならびにＶＥＧＦ媒介血管新生及び内皮細胞生存または増殖を含むＶＥＧＦの生物学的活性を中和する、遮断する、阻害する、抑止する、低減する、若しくはそれに干渉することができる分子を指す。本発明の方法において有用なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストとしては、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより、１つ以上の受容体へのその結合を隔離する受容体分子及び誘導体、融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、ならびにＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）が含まれる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニストバリアント、ＶＥＧＦに向けられるアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦに向けられる小ＲＮＡ分子、ＲＮＡアプタマー、ペプチボディ、及びＶＥＧＦに対するリボザイムも含まれる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合して、ＶＥＧＦの生物学的活性を遮断、阻害、抑止、低減、またはそれに干渉することができる非ペプチド小分子も含む。よって、用語「ＶＥＧＦ活性」は、具体的に、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介生物学的活性を含む。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベルまたは生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低減または阻害する。
【００６６】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。ある特定の実施形態では、選択された抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分な結合親和性を有し、例えば、抗体は、１００ｎＭ−１ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願公開第  ＷＯ２００５／０１２３５９号に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び競合アッセイ（例えばＲＩＡのもの）によって決定され得る。
【００６７】
ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または状態を標的とし、それに干渉する治療剤として使用され得る。また、抗体は、例えば治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを受けることができる。このようなアッセイは、当該技術分野において既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載される）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許  第５，５００，３６２号）、ならびにアゴニスト性活性または造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照されたい）が挙げられる。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦ相同体にも、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの他の成長因子にも結合しない。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、限定するものではないが、ベバシズマブ（ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として知られる抗体を含む、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９により生成された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。
【００６８】
「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９により生成された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１からの変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域及び抗原結合相補性決定領域を含む。フレームワーク領域の大半を含む、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％は、マウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、米国特許第  ６，８８４，８７９号（２００５年２月２６日発行）に更に記載されており、  その全開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「Ｂ２０シリーズポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｂ２０シリーズポリペプチドは、米国公開第２００６０２８０７４７号、米国公開第２００７０１４１０６５号、及び／若しくは米国公開第２００７００２０２６７号（これらの特許出願の内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載のＢ２０抗体またはＢ２０由来抗体の配列に由来する抗体を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、米国公開第２００６０２８０７４７号、米国公開第２００７０１４１０６５号、及び／または米国公開第２００７００２０２６７号に記載されるように、Ｂ２０シリーズポリペプチドはＢ２０−４．１である。別の実施形態では、Ｂ２０シリーズポリペプチドは、米国特許第７，９１０，０９８号（その全開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載のＢ２０−４．１．１である。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｇ６シリーズポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｇ６シリーズポリペプチドは、米国公開第２００６０２８０７４７号、米国公開第２００７０１４１０６５号、及び／若しくは米国公開第２００７００２０２６７号に記載されるＧ６抗体またはＧ６由来抗体の配列に由来する抗体を含む。Ｇ６シリーズポリペプチドは、米国公開第２００６０２８０７４７号、米国公開第２００７０１４１０６５号、及び／または米国公開第２００７００２０２６７号に記載されるように、Ｇ６−８、Ｇ６−２３、及びＧ６−３１を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
更なる抗体については、米国特許  第７，０６０，２６９号、第６，５８２，９５９号、第６，７０３，０２０号、第６，０５４，２９７号、ＷＯ９８／４５３３２、ＷＯ９６／３００４６、ＷＯ９４／１０２０２、ＥＰ０６６６８６８Ｂ１、米国特許出願公開第２００６００９３６０号、第２００５０１８６２０８号、第２００３０２０６８９９号、第２００３０１９０３１７号、第２００３０２０３４０９号、及び第２００５０１１２１２６号、ならびにＰｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）を参照されたい。ある特定の実施形態では、他の抗体は、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４からなるか、または代替的に、残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３、及びＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能性エピトープに結合するものを含む。
【００７２】
他の抗ＶＥＧＦ抗体も既知であり、例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，９５１−９６１（２００６）に記載されている。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ２０」は、ヒトＢリンパ球抗原ＣＤ２０（ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５としても知られ、その配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６によって特徴付けられる）を指し、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置する、およそ３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）（１９８９  １１２８２−１１２８７、Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５（１９８８）２０８−１２、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７（１９８８）１９７５−８０、Ｅｉｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１９８８）７１１−７、Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２（１９８９）２５６０−８）。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られる膜貫通の４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似するイントロン／エキソンスプライス境界を特徴とし、造血細胞及び非リンパ系組織の中でも固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発生及び分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中の１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写バリアントをもたらす。
【００７４】
用語「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」は本明細書において交換可能に使用され、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ２０遺伝子でトランスフェクトされた細胞上に発現されるヒトＣＤ２０の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を含む。ＣＤ２０抗原への本発明の抗体の結合は、ＣＤ２０を不活性化することにより、ＣＤ２０を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現する細胞の死滅は、次のメカニズムのうちの１つ以上によって生じ得る：細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣ。
【００７５】
ＣＤ２０の同義語には、当該技術分野で認識されているように、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５を含む。
【００７６】
本発明による用語「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体である。ＣＤ２０抗原に対する抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物学的活性により、２種類の抗ＣＤ２０抗体（Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）が、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０３（２００４）２７３８−２７４３、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１（２００３）１０４５−１０５２により区別され得る。表１を参照されたい。
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【００７７】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えば、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／０４４８５９に開示されているキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７に開示されている）、及びＡＴ８０  ＩｇＧ１が挙げられる。典型的に、ＩｇＧ１アイソタイプのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は特徴的なＣＤＣ特性を示す。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比較して減少したＣＤＣ（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）を有する。
【００７８】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えばリツキシマブ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／１０３０８１に開示されている）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７及びＷＯ２００５／１０３０８１に開示されている）、及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０５６３１２に開示されている）が挙げられる。
【００７９】
本発明による非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ２０抗体は、ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に記載されるように、好ましくは、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、より好ましくは非フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００８０】
「リツキシマブ」抗体（参照抗体、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトＣＤ２０抗原に対して向けられたモノクローナル抗体を含有する遺伝子操作されたキメラヒトガンマ１マウス定常ドメインである。しかしながら、この抗体は、糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されず、非フコシル化されず、よって少なくとも８５％のフコース量を有する。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含み、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された、１９９８年４月１７日に発行されたＵＳ５，７３６，１３７（Ａｎｄｅｒｓｅｎら）において「Ｃ２Ｂ８」という名称によって識別される。リツキシマブは、再発性若しくは屈折低悪性度または濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に承認されている。インビトロの作用機序の研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を呈することを示した（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ．ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ８３（２）（１９９４）４３５−４４５）。更に、それは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて活性を呈する。
【００８１】
用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に開示されるヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指し、これらは、ＩｇＧ１からのヒト定常ドメインとのキメラ化、及びその後のヒト化により、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖（ＶＨ）の可変領域：配列番号１、マウス軽鎖（ＶＬ）の可変領域：配列番号２、Ｐｏｐｐｅｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｖｉｓｓｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｓｔ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３（１９８７）１３１−１３９を参照されたい）から得た（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５）を参照されたい）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に詳細に開示されている。
【００８２】
一実施形態では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号３〜配列番号１９（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２〜Ｂ−ＨＨ９及びＢ−ＨＬ８〜Ｂ−ＨＬ１７）の群から選択される重鎖（ＶＨ）の可変領域を有する。特定の一実施形態では、このような可変ドメインは、配列番号３、４、７、９、１１、１３、及び１５（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１、及びＢ−ＨＬ１３）からなる群から選択される。特定の一実施形態では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号２０（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）の軽鎖（ＶＬ）の可変領域を有する。特定の一実施形態では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ６）の重鎖（ＶＨ）の可変領域、及び配列番号２０（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）の軽鎖（ＶＬ）の可変領域を有する。更に、一実施形態では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＩｇＧ１抗体である。本発明によると、このような非フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＷＯ２００５／０４４８５９、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０、及びＷＯ９９／１５４３４２に記載の手順によりＦｃ領域において糖操作（ＧＥ）される。一実施形態では、非フコシル化された糖操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１は、Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥである。一実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、オビヌツズマブである（推奨されるＩＮＮ、ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４，２０１２，ｐ．４５３）。本明細書で使用されるとき、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１またはＲＯ５０７２７５９の同義である。これは、全ての旧版を差し替え（例えば、Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２０１１，ｐ．７５−７６）、以前はアフツズマブとして知られる（推奨されるＩＮＮ、ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２，２００９，ｐ．１７６；Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２，２００８，ｐ．１２４）。いくつかの実施形態では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号２１の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、及び配列番号２２の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。
重鎖（配列番号２１）
2020189842.tif 000004
軽鎖（配列番号２２）
2020189842.tif 000005
【００８３】
いくつかの実施形態では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は非フコシル化された糖操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１である。このような糖操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の変化したパターンを有し、好ましくは、減少したレベルのフコース残基を有する。好ましくは、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖の合計量の６０％以下である（一実施形態では、フコースの量は４０％〜６０％であり、別の実施形態では、フコースの量は５０％以下であり、更に別の実施形態では、フコースの量は３０％以下である）。更に、Ｆｃ領域のオリゴ糖は好ましくはニ分される。これらの糖操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、増加したＡＤＣＣを有する。
【００８４】
オリゴ糖構成成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物学的活性を含む、治療用糖タンパク質の効力に関連する特性に有意に影響を及ぼし得る。このような特性は、オリゴ糖の有無だけでなく、特定の構造にも依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間にいくつかの一般化を行うことができる。例えば、ある特定のオリゴ糖構造は、特定の炭水化物結合タンパク質との相互作用を通して血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介する一方で、他は、抗体によって結合され、望ましくない免疫反応を引き起こす場合がある。（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５−８１）。
【００８５】
哺乳類細胞は、ヒトへの適用に最も適合した形態でタンパク質をグリコシル化するそれらの能力のため、治療用糖タンパク質の産生に好ましい宿主である。（Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １（１９９１）１１５−３０、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５−８１）。細菌はごく稀にしかタンパク質をグリコシル化せず、酵母、糸状菌、昆虫、及び植物細胞などの他の種類の一般的な宿主のように、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、及びいくつかの特定の場合において、生物学的活性の減少と関連するグリコシル化パターンをもたらす。哺乳類細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は過去２０年間、最も一般的に使用されてきた。好適なグリコシル化パターンをもたらすことに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定した、非常に生産的なクローン細胞系の一貫した生成を可能にする。これらの細胞は、無血清培地を使用して、単純なバイオリアクター中で高密度に培養され、安全かつ再現可能なバイオプロセスの開発を可能にする。他の一般的に使用される動物細胞としては、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ及びＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞が挙げられる。より最近では、トランスジェニック動物からの産生も試験されている。（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５−９８１）。
【００８６】
全ての抗体は、重鎖定常領域の保存位置で炭水化物構造を含み、各アイソタイプは、タンパク質アセンブリ、分泌、または機能活性に様々に影響を及ぼすＮ結合型炭水化物構造の個別のアレイを有する。（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）２６−３２）。結合されたＮ結合型炭水化物の構造はプロセシングの程度によりかなり変化し、高マンノース型、多重分岐型、ならびに二分岐複合型オリゴ糖を含み得る。（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）２６−３２）。典型的には、モノクローナル抗体でも複数の糖形態として存在するように、特定のグリコシル化部位で結合したコアオリゴ糖構造の不均質なプロセシングが存在する。同様に、抗体グリコシル化における主な相違が細胞系間で生じ、更に小さな相違が異なる培養条件下で成長させた所与の細胞系について見られることが示されてきた。（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）（１９９５）８１３−２２）。
【００８７】
単純な生産プロセスを維持し、潜在的に重要な、望ましくない副作用を回避しながら、効力の大きな増加を得るための一つの方法は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０及びＵＳ６，６０２，６８４に記載される、それらのオリゴ糖構成成分を操作することによってモノクローナル抗体の天然の細胞媒介性エフェクター機能を増強することである。癌免疫療法において最も一般的に使用される抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７で保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合型二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、そしてそれらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するのに不可欠である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１９９５）８１３−８２２、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３（１９９８）５９−７６、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）２６−３２）。
【００８８】
二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ１１（“ＧｎＴＩＩ１７ｙ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、操作されたＣＨＯ細胞によって産生される抗神経芽腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を大幅に増加させることが以前に示された。（Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０、及びＷＯ９９／１５４３４２号を参照されたい、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体ｃｈＣＥ７は、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、ＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く標準的な産業用細胞系において生産される場合、効力が小さすぎて臨床的に有用ではない非結合モノクローナル抗体の大きいクラスに属する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０）。その研究は、二分非フコシル化オリゴ糖を含む定常領域（Ｆｃ）関連二分オリゴ糖の割合の増加にもつながる、ＧｎＴＩＩＩを発現するように抗体産生細胞を操作することによって、天然に存在する抗体において見出されるレベルを上回るＡＤＣＣ活性の大きな増加が得ることができることを最初に示した。
【００８９】
「治療」は、治療処置及び予防または防止措置の両方を指す。治療を必要とするものは、すでに障害を有するもの、ならびに障害が予防されるものを含む。
【００９０】
「障害」は、限定するものではないが、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくするこれらの病的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患を含む、治療から利益を受けるであろう任意の状態である。障害には、血管新生障害が含まれる。本明細書で使用されるとき、「血管新生障害」は、異常な血管新生または異常な血管透過性若しくは漏出を伴う任意の状態を指す。本明細書において治療される血管新生障害の非限定的な例としては、悪性及び良性腫瘍、非白血病及びリンパ性悪性腫瘍、ならびに特に、腫瘍（癌）の転移が挙げられる。
【００９１】
「異常な血管新生」は、新しい血管が、疾患状態において、または疾患状態をもたらすように、過剰またはそうでなければ不適切のいずれかに成長するとき（例えば、血管新生の位置、タイミング、程度、または開始が医療的観点から望ましくない）に生じる。いくつかの場合では、疾患状態の悪化または疾患状態の原因に寄与する新しい血管成長があるときに、過剰な、未制御の、またはそうでなければ不適切な血管新生が生じる。新しい血管は、疾患組織に供給し、正常組織を破壊し、癌の場合には、新しい血管は、腫瘍細胞を循環中に逃がし、他の器官に留まらせる（腫瘍転移）ことができる。異常な血管新生を伴う障害の例としては、癌、特に血管形成固形腫瘍及び転移性腫瘍（結腸、肺癌（特に小細胞肺癌）または前立腺癌）、眼内血管新生によって引き起こされる疾患、特に糖尿病性失明、網膜症、主に糖尿病性網膜症若しくは加齢黄斑変性症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生及び虹彩血管新生；乾癬、乾癬性関節炎、血管腫などの血管芽腫；糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症若しくは高血圧性腎硬化症などの炎症性腎疾患；関節炎、特に関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、動脈性動脈硬化症、及び移植、子宮内膜症若しくは慢性喘息の後に生じる疾患などの様々な炎症性疾患、ならびに他の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
「異常な血管透過性」とは、血管と血管外コンパートメント間の流体、分子（例えばイオン及び栄養素）、及び細胞（例えばリンパ球）の流れが、疾患状態において、または疾患状態をもたらすように、過剰またはそうでなければ不適切であるとき（例えば、血管透過性の位置、タイミング、程度、または開始が医療的観点から望ましくない）に生じる。異常な血管透過性は、血管系を通してイオン、水、栄養素、若しくは細胞の過剰なまたはそうでなければ不適切な「漏出」につながる可能性がある。いくつかの場合では、過剰な、未制御の、若しくはそうでなければ不適切な血管透過性または血管漏出は、例えば、脳腫瘍を含む腫瘍に関連する浮腫；悪性腫瘍に関連する腹水；メグズ症候群；肺の炎症；ネフローゼ症候群；心嚢液貯留；胸水；心筋梗塞及び脳卒中などの後の状態などの心血管疾患に関連する透過性を含む疾患状態を悪化または誘発させる。本発明は、異常な血管透過性または漏出に関連する疾患及び障害を発症した、または発症するリスクがあるこれらの患者の治療を想定する。
【００９３】
用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。一実施形態では、細胞増殖性障害は腫瘍である。
【００９４】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、全ての新生物の細胞成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性細胞ならびに組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」は、本明細書に参照されるように相互に排他的ではない。
【００９５】
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には未調節の細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌及び消化間質癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜若しくは子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓若しくは腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレーム・マクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メグズ症候群、脳ならびに頭頸部癌、及び関連転移が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明の抗体による治療に適している癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は、小細胞肺癌、神経膠芽腫（ｇｌｉｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽腫、黒色腫、乳癌腫、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌腫から選択される。またいくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫、及び乳癌腫（これらの癌の転移形態を含む）から選択される。
【００９６】
用語「抗癌療法」は、癌の治療に有用な療法を指す。抗癌療法剤の例としては、例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性薬、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、ならびに抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、血小板由来成長因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、次の標的：ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、若しくはＶＥＧＦ受容体（複数可）のうちの１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生理活性及び有機化学剤などの癌を治療するための他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組み合わせも本明細書に含まれる。
【００９７】
「血管新生因子または薬剤」は、血管の発達を刺激することに関与する、例えば、血管新生、内皮細胞成長、血管の安定性、及び／若しくは脈管形成を促進する成長因子またはその受容体である。例えば、血管新生因子は、例えば、ＶＥＧＦならびにＶＥＧＦファミリーのメンバー及びそれらの受容体（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、エフリン、Ｂｖ８、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ１２、レプチン、ミッドカイン、ニューロピリン、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲ−アルファ、またはＰＤＧＦＲ−ベータ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、Ａｌｋ１、ＣＸＣＲ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｆ、Ｒｏｂｏ４などを含むが、これらに限定されない。これにはＥＳＭ１及びパールカンなどの血管新生を促進する因子が更に含まれるであろう。これには、成長ホルモン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ様ドメイン、マルチプル７（ＥＧＦＬ７）、ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの創傷治癒を促進する因子も含まれるだろう。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９、Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９、Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４、Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、既知の血管新生因子を列記する表１）、及びＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６を参照されたい。
【００９８】
「抗血管新生剤」または「血管新生阻害剤」は、直接または間接的のいずれかで、血管新生、脈管形成、または望ましくない血管透過性を阻害する、小分子量物質、ポリヌクレオチド（例えば阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）を含む）、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはこれらの複合体若しくは融合タンパク質を指す。抗血管新生剤は、血管新生因子またはその受容体に結合し、その血管新生活性を遮断するこれらの薬剤を含むことを理解するべきである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義される血管新生剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ若しくはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体またはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体、抗ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を遮断する小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＡＭＧ７０６、または例えば国際特許出願ＷＯ２００４／１１３３０４に記載されているもの）である。抗血管新生剤としては、次の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、ＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ、Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＴＩＥ２阻害剤、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤、ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）阻害剤、及びＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）阻害剤などのＶＥＧＦ阻害剤、ＣＰ−５４７，６３２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）、アキシチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．；ＡＧ−０１３７３６）、ＺＤ−６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＺＤ−２１７１）、ＶＥＧＦトラップ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４としても知られる：Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＆  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ａ  Ｇ）、マキュジェン（ペガプタニブオクタソジウム（ｏｃｔａｓｏｄｉｕｍ）、ＮＸ−１８３８、ＥＹＥ−００１、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．／Ｇｉｌｅａｄ／Ｅｙｅｔｅｃｈ）、ＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈ．，ＵＳＡ）、ならびにリボザイム（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）及びカイロン（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）からの合成リボザイムであるアンジオザイム、ならびにそれらの組み合わせ。他の血管新生阻害剤は、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＸＶＩＩＩを含む。ＶＥＧＦ阻害剤は、米国特許  第６，５３４，５２４号及び第６，２３５，７６４号に開示されており、これらの両方は全ての目的においてそれらの全体が組み込まれる。抗血管新生剤は、天然の血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．��３：２１７−３９、Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９（例えば悪性黒色腫における抗血管新生療法を列記する表３）、Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４、Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば既知の血管新生因子を列記する表２）、及びＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば臨床試験に使用される抗血管新生剤を列記する表１）を参照されたい。
【００９９】
用語「抗血管新生療法」は、抗血管新生剤の投与を含む、血管新生を阻害するのに有用な療法を指す。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ２０発現癌」は、癌細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全ての癌を指す。好ましくは、本明細書で使用されるＣＤ２０発現癌は、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ球性白血病を指す。このようなリンパ腫及びリンパ球性白血病としては、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、孤発性バーキットリンパ腫、及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、及び脾性辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞性腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病が挙げられる。
【０１０１】
より好ましくは、ＣＤ２０発現癌は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。特に、ＣＤ２０発現癌は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、有毛細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症、または原発性ＣＮＳリンパ腫である。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞傷害性薬」は、細胞機能を阻害または阻止し、かつ／または細胞死若しくは破壊をもたらす物質を指す。本用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、ならびに小分子毒素、または細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素（これらの断片及び／またはバリアントを含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤若しくは抗癌剤を含むことが意図される。他の細胞傷害性薬は以下に記載される。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊をもたらす。
【０１０３】
「毒素」は、細胞の成長または増殖に対して有害な作用を有することができる任意の物質である。
【０１０４】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア；エネジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩｌ（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；経口アルファ−４インテグリン阻害剤であるＣＤＰ３２３；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグリル化（ｐｅｇｌｙｌａｔｅｄ）リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；コンブレタスタチン；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉ���ｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｍｅ−Ｐｏｕｌｅｎｅ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなどの白金剤；チューブリン重合が微小管を形成するのを防止するビンカス（ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む）；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド（ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む）；クロドロネートなどのビスホスホネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）（例えばエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））など；ならびに細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（ｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）などのＢｃｌ−２阻害剤）；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ラ���マイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）などのセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤）；ロナファーニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ  ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；ならびに上記のうちのいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体、ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰならびにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵ及びロイコボリンと併用する治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどの、上記のうちの２剤以上の組み合わせ、及び上記のうちのいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体、ならびに上記のうちの２剤以上の組み合わせが挙げられる。
【０１０５】
本明細書で定義される化学療法剤には、癌の成長を促進し得るホルモンの作用を調節、低減、遮断、または阻害するように働く「抗ホルモン剤」または「内分泌治療剤」が含まれる。これらは、それら自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ．ｃｎｄｏｔ．トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどの、副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関与しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓなど；ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許  第４，６７５，１８７号を参照）、及び上記のうちのいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記のうちの２剤以上の組み合わせを含む。
【０１０６】
本明細書において使用されるとき、「成長阻害剤」は、細胞の成長をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。一実施形態において、成長阻害剤は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を阻止または低減する成長阻害抗体である。別の実施形態では、成長阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものであり得る。成長阻害剤の例としては、Ｇ１停止またはＭ期停止を誘発する薬剤など、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。またＧ１を停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びアラ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤である。更なる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば１３頁に見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管のアセンブリを促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を阻止することによって微小管を安定させる。
【０１０７】
「放射線療法」とは、正常に機能する細胞の能力を制限するため、または完全に細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のガンマ線またはベータ線の使用を意味する。治療の線量及び継続期間を決定するために当該技術分野において既知の多くの方法があることが理解される。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０〜２００単位（グレイ）の範囲の典型的な線量として施される。
【０１０８】
治療の目的のための「対象」または「個体」とは、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等などの、ヒト、家畜及び農場動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０９】
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
【０１１０】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から特定及び分離され、かつ／または回収されたものである。その自然環境の汚染構成成分とは、その抗体の研究、診断、または治療の使用に干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えばローリー法で決定されたとき、抗体の９５重量％を超えるまで、及びいくつかの実施形態では９９重量％を超えるまで、（２）例えばスピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用することにより、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、または（３）例えばクーマシーブルーまたは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性が示されるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュで抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【０１１１】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、いくつかの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、そしてその他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと整合され、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整合される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる。
【０１１２】
用語「定常ドメイン」は、免疫グロブリンの他の部分である抗原結合部位を含む可変ドメインと比べてより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の一部を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）と、軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインと、を含む。
【０１１３】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称される場合がある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称される場合がある。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【０１１４】
用語「可変」は、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列が広範囲に異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布していない。可変性は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域（ＨＶＲ）と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ領域（３つのＨＶＲによって連結され、この３つのＨＶＲはベータシート構造を連結し、場合によってはベータシート構造の一部を形成するループを形成する）を含み、これは、主としてベータシート構成をとる。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域により近接して一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を呈する。
【０１１５】
任意の哺乳類種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に区別される型のうちの１つが割り当てられ得る。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、用語ＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」は、免疫グロブリンの、それらの定常領域の化学的及び抗原性特徴によって定義される、サブクラスのいずれかを意味する。
【０１１７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構成は周知であり、一般的に、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に記載されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの抗体の共有または非共有結合によって形成されるより大きな融合分子の一部であってもよい。
【０１１８】
用語「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」は、本明細書において、その実質的に無傷形態の抗体を指すように交換可能に使用され、以下に定義するような抗体断片を意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０１１９】
本明細書における目的に対する「裸抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識に結合されていない抗体である。
【０１２０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０１２１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産し、その各々は単一の抗原結合部位を有し、残りは容易に結晶化するその能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、尚も抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【０１２２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施形態において、２本鎖「Ｆｖ」種は、堅固な非共有結合にある１本の重鎖と１本の軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、軽鎖及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種に類似した「二量体」構造で結合することができるように、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインは、可動性ペプチドリンカーによって共有結合することができる。この構成において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定するように相互作用する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でも、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【０１２３】
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
【０１２４】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦＶが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【０１２５】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。非常に短いため同じ鎖上で２つのドメイン間で対合ができないリンカーを使用して、ドメインを、別の鎖の相補ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは二価または二重特異性であってよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１２６】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得た抗体を指し、例えば、その集団に含まれる個々の抗体は、可能性のある突然変異、例えば少量で存在し得る、天然に存在する突然変異を除き、同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は典型的には、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られた。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンから固有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変更して、例えば標的に対する親和性を改善する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作製することなどができ、また変更した標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることを理解するべきである。典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが他の免疫グロブリンで典型的には汚染されていないという点で有利である。
【０１２７】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られたする抗体の性質を示し、任意の特定の方法で抗体を生産することを必要とすると解釈されない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，２５６：４９５−９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許  第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座若しくは遺伝子の一部または全てを有する動物において、ヒトまたはヒト様抗体を生産するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許  第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、及び第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を含む、様々な技術によって作製され得る。
【０１２８】
本明細書において、モノクローナル抗体は、重鎖及び／若しくは軽鎖の一部分が特定の種に由来する、または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である一方で、鎖（複数可）の残りが別の種に由来する、または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の生物活性を呈する限り、そのような抗体の断片を具体的に含む（例えば、米国特許  第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が例えば目的とする抗原でマカクザルを免疫化することによって生産される抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【０１２９】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、若しくは非ヒト霊長動物などの非ヒト種のＨＶＲ（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合で、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するために行われてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、ならびに米国特許  第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【０１３０】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり、かつ／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該技術分野において既知の様々な技術を用いて生産され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原刺激に応答してこのような抗体を生産するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効にされたトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）に抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許  第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関するＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【０１３１】
「種依存性抗体」は、第２の哺乳類種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、第１の哺乳類種からの抗原に対してより強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（例えば、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは約１ｘ１０−８Ｍ以下、及び好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）に「特異的に結合」するが、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳類種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義した様々な型の抗体のいずれかであり得るが、好ましくはヒト化またはヒト抗体である。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」は、配列において超可変であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含み、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つ含む。天然の抗体において、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を提示し、特にＨ３は抗体に高度な特異性を付与するのに固有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物の抗体は、軽鎖の不存在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【０１３３】
いくつかのＨＶＲの描写が使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれからの残基は以下に記される。
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【０１３４】
ＨＶＲは、次の「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【０１３５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。
【０１３６】
用語「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」及びそれらの変形は、上記のＫａｂａｔらにおける抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いることによって、実際の線形のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮またはそれらへの挿入に相当する、より少ないまたは付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同領域で「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列と整合することによって、所与の抗体について決定され得る。
【０１３７】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指す場合に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を指す場合には、一般に「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」を用いる（例えば、上記のＫａｂａｔらに報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【０１３８】
「線形抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体を指す。簡単に言えば、これらの抗体は、直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含み、これは相補的軽鎖ポリペプチドと共に、抗原結合領域の対を形成する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１３９】
ＩＩ．抗体製剤及び調製物
本明細書の発明は、抗体を含む安定した水性製剤に関する。いくつかの実施形態では、本製剤は、モノクローナル抗体、トレハロース、及び緩衝剤を含み、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満であり、本製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本製剤は、緩衝剤（リン酸ナトリウムまたはヒスチジンなど）を更に含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、（ｂ）約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭの量のトレハロース、及び（ｃ）３５ｍＭ超〜約１００ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、該製剤は約５．５〜約７．０のｐＨを有し、製剤中の該モノクローナル抗体の該トレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体は、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、または少なくとも約１８ヶ月間安定している。いくつかの実施形態では、トレハロースは非トレハロースポリオールに置換され得る。いくつかの実施形態では、抗体はＶＥＧＦと結合する。
【０１４０】
Ａ．抗体調製物
製剤中の抗体は、抗体を生成するために当該技術分野において利用可能な技術を使用して調製され、その例示的な方法は、以下の項でより詳細に説明される。
【０１４１】
抗体は、目的とする抗原に対して向けられる。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療利益をもたらし得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対して向けられる抗体も想定される。
【０１４２】
抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えば受容体）または成長因子などのリガンドであり得る。例示的な抗原としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ−ＬＤＬ；ｏｘ−ＡｐｏＢ１００；レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ若しくはヒトの尿または組織型プラスミノゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノゲン活性剤；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；ヒトのマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクティビン；ホルモン若しくは成長因子の受容体；プロテインＡ若しくはＤ；リウマチ因子；骨由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、若しくはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭなどのインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｎｓ）；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、若しくはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに上に列記されるポリペプチドのうちのいずれかの断片などの分子が挙げられる。
【０１４３】
本発明のある特定の実施形態では、本発明に包含される抗体に関する分子標的は、ＶＥＧＦ及びＣＤ２０を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、ヒトＶＥＧＦに結合するものである。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、ヒトＣＤ２０に結合するものである。
【０１４４】
（ｉ）抗原調製物
任意選択で他の分子に結合される可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子に関して、これらの断片（例えば受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然源（例えば癌細胞系）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するために組換え技術によって形質転換された細胞であってもよい。抗体を調製するのに有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
【０１４５】
（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物において生じる。二官能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に結合させることが有用であり得る。
【０１４６】
動物は、例えば１００μｇ若しくは５μｇのタンパク質または複合体（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を、３体積のフロイント完全アジュバントと混合し、この溶液を複数部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、フロイント完全アジュバント中のペプチド若しくは複合体の元の量の１／５〜１／１０で複数部位に皮下注射することにより、追加免疫される。７〜１４日後、動物は採血され、抗体価について血清がアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原の複合体であるが、異なるタンパク質に結合された、及び／または異なる架橋試薬による結合された複合体で追加免疫される。複合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養においても作製され得る。また、ミョウバンなどの凝集剤は、免疫応答を高めるために適切に使用される。
【０１４７】
本発明のモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって説明され、更に、例えば、ヒト−ヒトハイブリドーマに関してＨｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０  １９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）に説明されるハイブリドーマ法を用いて作製され得る。更なる方法は、ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生産に関して、例えば、米国特許  第７，１８９，８２６号に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１４８】
様々な他のハイブリドーマ技術に関しては、例えば、ＵＳ２００６／２５８８４１、ＵＳ２００６／１８３８８７（完全ヒト抗体）、ＵＳ２００６／０５９５７５、ＵＳ２００５／２８７１４９、ＵＳ２００５／１００５４６、ＵＳ２００５／０２６２２９、ならびに米国特許  第７，０７８，４９２号及び第７，１５３，５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を生産するための例示的なプロトコルは以下のように説明される。一実施形態では、マウスまたはハムスターなどの他の適切な宿主動物を免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生産する、または生産することが可能なリンパ球を誘発する。本発明のポリペプチド若しくはその断片、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジクリノミコレート（ＴＤＭ）（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｃｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）  などのアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射するにより動物において抗体を生じさせる。本発明のポリペプチド（例えば抗原）またはその断片は、組換え方法などの当該技術分野において周知の方法を用いて調製され得、そのうちのいくつかは本明細書において更に説明される。免疫化動物からの血清を抗抗原抗体に関してアッセイし、追加免疫が任意選択で投与される。抗抗原抗体を生産する動物のリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。
【０１４９】
次に、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合されてハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である骨髄腫細胞が使用され得る。例示的な骨髄腫細胞としては、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、  ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系が挙げられるが、これらに限定されない。  ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系もヒトモノクローナル抗体の生産に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１５０】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好適な培養培地、例えば融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む培地中に播種し成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を阻止する。好ましくは、無血清ハイブリドーマ細胞培養法は、例えば、Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（３），１０５−１０８（２００６）に記載されるように、ウシ胎仔血清などの動物由来の血清の使用を低減するために使用される。
【０１５１】
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１１−１２２（２００５）に記載されている。具体的には、標準的な培養培地は、ある特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、またはタンパク質加水分解物の画分で富化され、アポトーシスは３〜６個のアミノ酸残基からなる合成オリゴペプチドにより大幅に抑制され得る。ペプチドは、ミリモル以上の濃度で存在する。
【０１５２】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、本発明の抗体に結合するモノクローナル抗体の生産に関してアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード分析により決定され得る。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を参照されたい。
【０１５３】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、限界希釈手順によりクローンをサブクローニングし、標準的な方法により成長させることができる。例えば、上記のＧｏｄｉｎｇを参照されたい。この目的のための好適な培養培地としては、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、動物において腹水腫瘍としてハイブリドーマ細胞をインビボで成長させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための手順の１つは、ＵＳ２００５／１７６１２２及び米国特許  第６，９１９，４３６号に記載されている。本方法は、結合プロセスにおけるリオトロピック塩などの最小塩の使用、及び好ましくは溶出プロセスにおける少量の有機溶媒の使用も含む。
【０１５４】
（ｉｉｉ）ある特定のライブラリスクリーニング方法
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを使用して作製され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特徴を有する抗体に関してこのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野において既知である。このような方法は一般的に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に記載されている。例えば、目的とする抗体を生成する方法の１つは、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されるファージ抗体ライブラリを使用することによる。
【０１５５】
原則として、合成抗体クローンはファージコートタンパク質に融合される抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を提示するファージを含むファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合が可能なＦｖ断片を発現するクローンが抗原に吸着され、よってライブラリ内の非結合クローンから単離される。次に結合クローンは抗原から溶出され、抗原吸着／溶出の追加サイクルによって更に濃縮され得る。本発明の抗体のいずれかは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載される、目的とするファージクローンを選択するように好適な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、目的とするファージクローンからのＦｖ配列及び好適な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて完全長抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、両方とも３つの超可変ループ（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖からそれぞれ１つずつの、約１１０個のアミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短い可動性ペプチドにより共有結合される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらが各々定常ドメインに融合され、非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのいずれかで、ファージ上に機能的に提示され得る。本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、集合的に「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称される。
【０１５７】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリにおいてランダムに組換えることができ、これは、次に抗原結合クローンについて検索することができる。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、未処理のレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）により記載されるように、免疫化を全く行うことなく、多種多様な非自己及び同様に自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するようにクローニングされ得る。最後に、未処理のライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）により記載されるように、幹細胞からの再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配置を達成するようにランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成的にも作製され得る。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、小コートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片を示すために、糸状ファージが使用される。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖上で連結される単鎖Ｆｖ断片として、または例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されるように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合され、他方が、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが野生型コートタンパク質の一部を置換することによりファージ表面上に提示されるようになる細菌宿主細胞周辺質内に分泌されるＦａｂ断片として提示され得る。
【０１５９】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取した免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに有利なように偏ったライブラリが所望される場合、対象は抗体応答を生成するために抗原で免疫化され、脾臓細胞及び／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）はライブラリ構築のために回収される。一実施形態では、抗抗原クローンに有利なように偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、抗原免疫化が抗原に対してヒト抗体を生産するＢ細胞を生じるように、機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（及び機能性内因性抗体生産系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて抗抗原抗体応答を生成することにより得られる。ヒト抗体生産トランスジェニックマウスの生成は以下に記載される。
【０１６０】
抗抗原反応性細胞集団の更なる富化は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離するために、好適なスクリーニング手順を使用することにより、例えば、抗原親和性クロマトグラフィーまたは細胞の蛍光色素標識抗原への吸着と、その後の流動標示式細胞分取（ｆｌｏｗ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を使用した細胞分離によって得ることができる。
【０１６１】
あるいは、免疫化されていないドナーからの脾臓細胞及び／またはＢ細胞若しくは他のＰＢＬを使用することにより、可能な抗体レパートリーのより良好な標示が提供され、また抗原が抗原性ではない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用した抗体ライブラリの構築も可能にする。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込むライブラリに関して、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供するために、幹細胞が対象から採取される。目的とする免疫細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン（ｌｕｐｒｉｎｅ）、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリの種などの様々な動物種から得ることができる。
【０１６２】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、目的とする細胞から回収して増幅する。再配置したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されるように、リンパ球からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、続いて再配置したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と一致するプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることが可能であり、これにより発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）及びＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：  ５４４−５４６（１９８９）に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエキソンの５’末端のバックプライマーとＪセグメント内に基づいた順方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されるようにリーダーエキソンに、順方向プライマーは、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されるように定常領域内に基づくことも可能である。相補性を最大にするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）またはＳａｓｔｒｙら（１９８９）に記載されるように、縮重をプライマーに組み込むことが可能である。ある実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されるように、またはＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されるように、免疫細胞の核酸試料に存在する全ての入手可能なＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを使用して、ライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）に記載されるように一端にタグとしてＰＣＲプライマー内に、またはＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるようにタグプライマーを用いた更なるＰＣＲ増幅によって導入することができる。
【０１６３】
合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導することができる。大半のヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）  に報告されている）、マッピングされている（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３）に報告されている；これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要な立体構造を含む）は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成するために使用され得る。ＶＨレパートリーはまた、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されるように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせた全ての配列多様性を伴って作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３））に報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するために使用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性の抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅後、生殖系Ｖ遺伝子セグメントを、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配置することができる。
【０１６４】
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることにより構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばＨｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されるようにインビトロで、または組み合わせ感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、例えばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されるｌｏｘＰ系によってインビボで組換えることができる。このインビボ組換えアプローチでは、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリのサイズの限界を克服するために、Ｆａｂ断片の２本鎖の性質が利用される。未処理のＶＨ及びＶＬレパートリーは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターへと別個にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリのサイズが、存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。両方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボ組換えシグナルを有する。これらの巨大なライブラリは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）の多くの多様な抗体を提供する。
【０１６５】
あるいは、このレパートリーは、例えばＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように同じベクター内に連続してクローニングされるか、またはＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるようにＰＣＲによって一緒にアセンブリした後にクローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリはまた、ＶＨ及びＶＬのＤＮＡ（ＤＮＡは、可動性ペプチドスペーサーをコードする）を連結させて、単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するために使用され得る。更に別の技術では、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」が、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されるように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするために使用される。
【０１６６】
未処理のライブラリ（天然または合成のいずれか）によって生産された抗体は中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものであり得るが、上記のＷｉｎｔｅｒら（１９９４）に記載されるように二次ライブラリから構築し再選択することによって、親和性成熟もインビトロで模倣することが可能である。例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法、またはＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法においてエラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５（１９８９）で報告されている）を使用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。  加えて、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、目的とするＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを使用して、１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させ、より高い親和性クローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を行うことが可能である。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年  ３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に突然変異誘発を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリを作製するための方法を記載した。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、非免疫化ドナーから得た天然に存在するＶドメインバリアントのレパートリーのファージディスプレイによって選択されたＶＨまたはＶＬドメインを組換えること、及び数回のチェーンリシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）で高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の生産を可能にする。
【０１６７】
ライブラリのスクリーニングは当該分野において既知の様々な技術によって達成することができる。例えば、抗原は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるために使用するか、または細胞選別で使用する、あるいはストレプトアビジンでコーティングしたビーズで捕獲するためにビオチンに結合させる、あるいはファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法において使用することが可能である。
【０１６８】
ファージ粒子の少なくとも一部分を吸着剤と結合させるのに適した条件下で、ファージライブラリ試料を固定化した抗原と接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相に結合したファージを洗浄し、その後、例えばＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように、酸で、または例えばＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載にされるように、アルカリで、または例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法に類似する手順で抗原競合によって溶出する。ファージは、１回の選択で２０〜１，０００倍濃縮することができる。更に、この濃縮されたファージを細菌培養において成長させ、更なる回の選択に供することができる。
【０１６９】
選択の効率は、洗浄の間の解離の動態、及び単一ファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と係合するかどうかを含む多くの要因に依存する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相における抗原の高いコーティング密度の使用によって維持することができる。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されているような長い洗浄と一価ファージディスプレイの使用、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されているような抗原の低コーティング密度によって促進することができる。
【０１７０】
親和性に僅かな違いがあったとしても、抗原に対する異なる親和性のファージ抗体の間で選択することが可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム突然変異（例えば、いくつかの親和性成熟技術で行われているような）は、多くの変異体を生じやすく、その大半が抗原に結合し、より高い親和性を有するのは僅かである。抗原を限定すると、希な高親和性ファージが競合して除かれる場合がある。全てのより高い親和性の変異体を維持するために、ファージを、過剰のビオチン化抗原とインキュベートすることができるが、抗原の標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化抗原と共にインキュベートすることができる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズによって捕獲することができる。このような「平衡捕獲」は、それらの結合の親和性により、親和性のより低い大過剰のファージから、２倍ほど高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相に結合したファージを洗浄するのに使用される条件を操作して、解離速度に基づいて識別することもできる。
【０１７１】
抗抗原クローンは活性に基づいて選択され得る。ある特定の実施形態では、本発明は、抗原を自然に発現する生存細胞に結合するか、または遊離浮遊抗原若しくは他の細胞構造に付着した抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。このような抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のファージライブラリから抗抗原クローンを単離し、任意選択で、好適な細菌宿主中で集団を成長させることにより、ファージクローンの単離された集団を増幅し、（２）それぞれ、遮断活性及び非遮断活性が望まれる抗原及び第２タンパク質を選択し、（３）固定化した抗原に抗抗原ファージクローンを吸着させ、（４）過剰の第２タンパク質を使用して、第２タンパク質の結合決定基とオーバラップするかまたは共有される抗原結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出し、（５）工程（４）の後に吸着されたままのクローンを溶出することにより選択することができる。任意選択で、所望の遮断／非遮断特性を有するクローンは、本明細書に記載の選択手順を１回以上繰り返すことによって、更に濃縮することができる。
【０１７２】
本発明のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、ハイブリドーマからの目的とする重鎖及び軽鎖コード領域またはファージＤＮＡテンプレートを特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）容易に単離され、配列決定される。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次いでこれを、別様では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が挙げられる。
【０１７３】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば適切なＤＮＡ配列は上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．から得ることができる）と組み合わせて、完全長または部分長の重鎖及び／または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。この目的のために、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含むいずれかのアイソタイプの定常領域を使用することができ、このような定常領域は任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されるであろう。一動物（例えばヒト）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、次いで「ハイブリッド」の完全長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成するために別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書に使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある特定の実施形態では、ヒト可変ＤＮＡ由来のＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長若しくは部分長のヒト重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。
【０１７４】
本発明のハイブリドーマ由来の抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換する（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法にあるような）ことによっても修飾され得る。ハイブリドーマまたはＦｖクローン由来の抗体若しくは断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を共有結合させることによって更に修飾され得る。このようにして、本発明のＦｖクローン若しくはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１７５】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当該技術分野において知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をゲッ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って本質的に行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷未満のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第  ４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基がゲッ歯類抗体の類似する部位からの残基で置換されるヒト抗体である。
【０１７６】
ヒト化抗体の作製に使用される、軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法によると、ゲッ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。次に、ゲッ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１７７】
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施形態によると、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。３次元の免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定３次元立体構造を図示し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１７８】
本発明のヒト抗体は、上述の既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を組み合わせることにより構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系は、例えばＫｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）により記載されている。
【０１７９】
内因性の免疫グロブリン生産がなくとも、免疫化により、ヒト抗体の全レパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が内因性抗体生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原刺激時にヒト抗体の生産をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、及びＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。
【０１８０】
非ヒト、例えばゲッ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャフリングを使用することもでき、ここでヒト抗体は、出発非ヒト抗体に類似した親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法により、本明細書に記載されるファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかがヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を作り出す。抗原を用いた選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離を生じ、このヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローンにおける、対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を回復させる、すなわち、エピトープはヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りの非ヒト鎖を置き換えるために、プロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された  ＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲグラフトによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体が提供される。
【０１８１】
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化などの伝統的な手段により、または組換え技術により生成され得る。ある特定の状況では、全抗体よりも抗体断片を使用する方が有利である。より小さいサイズの断片は、迅速なクリアランスが可能であり、固形腫瘍への改善されたアクセスにつながる可能性がある。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい。
【０１８２】
抗体断片を生産するための様々な技術が開発されてきた。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接生成することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌において発現され、それから分泌され得、よって多量のこれらの断片を容易に生産することが可能である。抗体断片は上記で論じられる抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第  ５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を生産するための他の技術が当業者には明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許  第５，５７１，８９４号、及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠く、無傷結合部位を有する唯一の種であり、よって、それらはインビボ使用中の低減された非特異的結合に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築され得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、上記を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第  ５，６４１，８７０号に記載されるように、「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体は単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１８３】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、エピトープが通常異なる抗原からである、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープと結合するだけであるが（つまり二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体は、本明細書で使用されるとき、この表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１８４】
二重特異性抗体の作製方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖がランダムに取り揃えられているため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生産し、そのうち１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、親和性クロマトグラフィー工程によって通常なされるが、むしろ面倒であり、産生物収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１８５】
異なるアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合のうちの少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び所望する場合、免疫グロブリン軽鎖を別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時にトランスフェクトする。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不均一な比率が、最適収率をもたらす場合の実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互割合の調節に、高い柔軟性が提供される。しかしながら、均一な比率で少なくとも２のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または比率が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード化配列を挿入することが可能である。
【０１８６】
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することによって容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチはＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を生成する更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１８７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載の別のアプローチによると、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。１つの界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖（複数可）と同一または類似するサイズの代償的「空洞」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体などの他の不要の最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増大させるメカニズムが提供される。
【０１８８】
二重特異性抗体は、架橋したまたは「異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体を含む。例えば、異種結合体における抗体の一方はアビジンにカップリングし、他方はビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化するために（米国特許第  ４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）提案されている。異種結合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許  第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１８９】
抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術も文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体をタンパク分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定させ、分子間ジスルヒド形成を阻止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１９０】
最近の進歩により、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１９１】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製し、単離する様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の生産に対しても使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供している。断片は、非常に短いため同一鎖上の２つのドメイン間で対合ができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対合させられ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１９２】
二価より多い抗体も想定される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１９３】
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、または軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む、単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許  第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全てまたは一部からなる。
【０１９４】
（ｖｉｉｉ）抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が想定される。例えば、抗体の結合親和性及び／または生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／またはそれへの挿入及び／またはその置換を含む。最終構成物に到達するように、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われてもよいが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸改変は、配列が作製されるときに、対象抗体アミノ酸配列に導入することができる。
【０１９５】
（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の抗体は、当該技術分野に既知であり、容易に利用可能である付加的な非タンパク質部分を含むように更に修飾され得る。ある特定の実施形態では、抗体の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン若しくはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性により、製造において有利であり得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝状または非分枝状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は変動し得、２つ以上のポリマーが結合される場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかなどにかかわらず、改善される抗体の特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
【０１９６】
（ｘ）ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して生産することもできる。抗抗原抗体の組換え生産では、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分としては、一般に、限定されるものではないが、次のうちの１つ以上が含まれる：シグナル配列、複製の起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１９７】
（ａ）シグナル配列構成成分
本発明の抗体は、直接的に組換えにより生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産され得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識され、プロセシング（例えば、シグナルペプチターゼによる切断）されるものである。天然の抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。酵母分泌では、天然のシグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、ａ因子リーダー（酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルで置換され得る。哺乳類細胞の発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１９８】
（ｂ）複製の起点
発現及びクローニングベクターは両方とも１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能にするものであり、複製の起点または自己複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスにおいてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点は大半のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製の起点の構成成分は哺乳類発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は典型的に、それが初期プロモーターを含むためだけから使用され得る）。
【０１９９】
（ｃ）選択遺伝子構成成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠陥を補う、あるいは（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０２００】
選択スキームの一例では、宿主細胞の成長を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子を用いて良好に形質転換されたこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を生成し、よって、選択レジメンで生存する。このような優性選択の例には、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンが使用される。
【０２０１】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの、抗体をコードする核酸を取り込む細胞構成成分を特定することができるものである。
【０２０２】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を用いて形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地において、形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。内在性ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）を使用することができる。
【０２０３】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地中で形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用することができる。
【０２０４】
あるいは、目的とする抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能なマーカーで形質転換したまたは同時形質転換した宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択可能なマーカーに対する選択剤を含む培地において細胞成長させることによって選択され得る。米国特許  第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２０５】
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の変異菌株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの不在下での成長による、形質転換の検出に効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母菌株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０２０６】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターは、クルイベロミセス酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模生産用の発現系は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）について報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。クルイベロミセスの工業用菌株による成熟した組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０２０７】
（ｄ）プロモーター構成成分
発現及びクローニングベクターは、一般的に、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に作動可能に結合されるプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ、及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用するためのプロモーターは抗体をコードするＤＮＡに作動可能に結合されるシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
【０２０８】
真核生物についてのプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ豊富領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から、７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであってよいＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核生物遺伝子の３’末端では、コード化配列の３’末端への、ポリＡ末尾の付加のためのシグナルであってよいＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全てが、真核生物発現ベクター内に適切に挿入される。
【０２０９】
酵母宿主と使用するのに好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のためのプロモーターが挙げられる。
【０２１０】
成長条件によって転写が制御される追加利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現に使用するのに好適なベクター及びプロモーターはＥＰ７３，６５７に更に記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０２１１】
哺乳類の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、但し、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性があることを条件とする。
【０２１２】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として、簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用して、哺乳類宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許  第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許  第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、プロモーターとして、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を使用することもできる。
【０２１３】
（ｅ）エンハンサー要素構成成分
より高等な真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加される。哺乳類遺伝子からの多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための要素の増強については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）を参照されたい。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５’または３’位でベクター内にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。
【０２１４】
（ｆ）転写終結構成成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）に使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。他の有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照されたい。
【０２１５】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するのに好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌類などの腸内細菌、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、ならびにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リチェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの桿菌（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．リチェニフォルミス４１Ｐ）、  緑膿菌などのシュードモナス、及びストレプトミセスを含む。好ましい大腸菌クローニング宿主の１つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の菌株も適している。これらの例は、限定ではなく、例示的なものである。
【０２１６】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、治療用抗体が、腫瘍細胞破壊において、それ自体で有効性を示す細胞傷害剤（例えば毒素）に結合される場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、細菌内で産生させることができる。完全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌での産生は、より速く、費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば最適な発現及び分泌についての翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載する、米国特許  第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許  第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国特許  第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。大腸菌における抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分において、大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプにより、例えばプロテインＡまたはＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスに類似して実施することができる。
【０２１７】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中でも最も一般的に使用される。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クルイベロミセス宿主、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマリーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギルス宿主などの糸状真菌などのいくつかの他の属、種、及び菌株が、本明細書において一般的に入手可能であり、有用である。治療用タンパク質生産のための酵母及び糸状真菌の使用を考察する概説について、例えばＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０２１８】
グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生産をもたらす、ある特定の真菌及び酵母菌株が選択され得る。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を説明している）及び上記のＧｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０２１９】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス菌株及びバリアント、ならびにヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウショウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコなどの宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１バリアント、及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株も公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明によると、特にヨウトガ細胞のトランスフェクション用のウイルスとして使用され得る。
【０２２０】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ（ウキクサ科）、アルファルファ（ウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ））、及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許  第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を説明している）を参照されたい。
【０２２１】
脊椎動物細胞を宿主として使用することができ、培養物（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は日常的な手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３または懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。他の有用な哺乳類宿主細胞系としては、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；及びＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が挙げられる。抗体生産に好適なある特定の哺乳類宿主細胞系の概説については、例えばＹａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【０２２２】
宿主細胞は、上述の抗体生産用の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために、必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養される。
【０２２３】
（ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養され得る。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。更に、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許  第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、若しくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許  第  ３０，９８５号（再発行）に記載される培地のいずれかを宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、ホルモン及び／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質も当業者に既知であろう適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前から使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２２４】
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、または培地に直接分泌される。第１の工程として、抗体が細胞内で産生される場合、宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子状デブリは、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡単に言えば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって解凍する。細胞デブリは、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般的に市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために、前述の工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は不定汚染物質の成長を阻止するために含めることができる。
【０２２５】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは、典型的に好ましい精製工程の一つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４の重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御多孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成されるよりも、流速が速く、処理時間を短縮することができる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質を精製するための他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２２６】
一般的に、研究、試験、及び臨床で使用する抗体を調製するための様々な方法が、当該技術分野において十分に確立されており、上述の方法と一致し、かつ／または目的とする特定の抗体に対して当業者によって適切であると認められている。
【０２２７】
Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するために、上述のように生産された抗体に、１つ以上の「生物学的活性」アッセイを実施することができる。抗体は、それを生じさせる抗原と結合するその能力についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体に関して、抗体の抗原結合特性を、ＶＥＧＦに結合する能力を検出するアッセイにおいて評価することができる。別の例では、抗ＣＤ２０抗体に関して、抗体の抗原結合特性を、ＣＤ２０に結合する能力を検出するアッセイにおいて評価することができる。
【０２２８】
別の実施形態では、抗体の親和性は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ、及び／または競争アッセイ（例えばＲＩＡのもの）によって決定され得る。
【０２２９】
また、抗体は、例えば治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを受けることができる。このようなアッセイは、当該技術分野において既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。
【０２３０】
目的とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、実施例の抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦへの結合を遮断するもの）をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるものなど、日常的な交差遮断アッセイを実施することができる。あるいは、抗体が目的とするエピトープと結合するかを決定するために、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されるエピトープマッピングを行うことができる。
【０２３１】
用語「ＣＤ２０の発現」抗原は、細胞における、好ましくはそれぞれ、腫瘍または癌から、好ましくは非固形腫瘍からのＴまたはＢ細胞の細胞表面上、より好ましくはＢ細胞上に、ＣＤ２０抗原の顕著なレベルの発現を示すことが意図される。「ＣＤ２０発現癌」を有する患者は、当該技術分野において既知の標準的なアッセイにより決定され得る。例えば、ＣＤ２０抗原発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳを使用して、または対応するｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出を介して測定される。
【０２３２】
Ｃ．製剤の調製
目的とする抗体の調製後（例えば、本明細書に開示されるように製剤化され得る抗体を生産するための技法は以下に詳述され、当該技術分野において既知である）抗体を含む医薬製剤が調製される。ある特定の実施形態では、製剤化される抗体は、事前に凍結乾燥を受けず、本明細書の目的とする製剤は水性製剤である。ある特定の実施形態では、抗体は、完全長抗体である。一実施形態では、製剤中の抗体は、完全長抗体に生じ得ない事例問題（例えば、抗体のＦａｂに対するクリッピング）が対処される必要があり得る、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片である。製剤に存在する抗体の治療有効量は、例えば、所望の用量体積及び投与モード（複数可）を考慮して決定される。約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬは、製剤における例示的な抗体濃度である。
【０２３３】
ｐＨ緩衝液中に抗体を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝剤は、約５．５〜約７．０の範囲のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、ｐＨは、ｐＨ５．５〜６．５の範囲、ｐＨ５．７〜６．８の範囲、ｐＨ５．８〜６．５の範囲、ｐＨ５．９〜６．５の範囲、ｐＨ６．０〜６．５の範囲、またはｐＨ６．２〜６．５の範囲である。本発明のある特定の実施形態では、本製剤は、６．２または約６．２のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態では、本製剤は、６．０または約６．０のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを制御する緩衝剤の例としては、リン酸ナトリウム及びヒスチジン（Ｌ−ヒスチジンなど）が挙げられる。本明細書で使用されるとき、製剤または緩衝剤における「ヒスチジン」への言及は、限定するものではないが、ヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン塩酸塩、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン、硫酸ヒスチジンなどを含む、当該技術分野において既知の任意の形態のヒスチジンを指し得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、３５ｍＭ超〜約１００ｍＭ以下の濃度のリン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）を含有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のリン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）を含有する。本発明のある特定の実施形態では、緩衝剤は、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、およそ次の濃度のいずれか未満の濃度のリン酸ナトリウムを含有する：１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５１ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３６ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２５ｍＭ、２２ｍＭ、または２０ｍＭ。いくつかの実施形態では、緩衝液は、およそ次の濃度のいずれかを超える濃度のリン酸ナトリウムを含有する：１５ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、２８ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、または９５ｍＭ。つまり、緩衝剤中のリン酸ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５１ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３６ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２５ｍＭ、２２ｍＭ、または２０ｍＭの上限、及び約１５ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、２８ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、または９５ｍＭの独立して選択された下限を有する濃度範囲のいずれかであってよく、下限は上限未満である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のヒスチジンを含有する。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のヒスチジンを含有する。本発明のある特定の実施形態では、緩衝剤は、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５１ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度のヒスチジンを含有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、およそ次の濃度のいずれか未満の濃度のヒスチジンを含有する：１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５１ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３６ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２５ｍＭ、２２ｍＭ、または２０ｍＭ。いくつかの実施形態では、緩衝液は、およそ次の濃度のいずれかを超える濃度のヒスチジンを含有する：１５ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、２８ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、または９５ｍＭ。つまり、緩衝剤中のヒスチジンの濃度は、約１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５１ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３６ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２５ｍＭ、２２ｍＭ、または２０ｍＭの上限、及び約１５ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、２８ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、または９５ｍＭの独立して選択された下限を有する濃度範囲のいずれかであってよく、下限は上限未満である。
【０２３６】
本製剤は、約４５ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの量のトレハロースを更に含む。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１８０ｍＭ〜約６３４ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のトレハロースは、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約，５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６１０ｍＭ、約６２０ｍＭ、約６３０ｍＭ、または約６３４ｍＭである。いくつかの実施形態では、本製剤は、およそ次の濃度のいずれか未満の濃度のトレハロースを含有する：６３４ｍＭ、６３０ｍＭ、６２０ｍＭ、６１０ｍＭ、６００ｍＭ、５５０ｍＭ、５００ｍＭ、４５０ｍＭ、４００ｍＭ、３５０ｍＭ、３００ｍＭ、２５０ｍＭ、２００ｍＭ、１８０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３５ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、または５０ｍＭ。いくつかの実施形態では、本製剤は、およそ次の濃度のいずれかを超える濃度のトレハロースを含有する：４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６１０ｍＭ、６２０ｍＭ、または６３０ｍＭ。つまり、本製剤中のトレハロースの濃度は、約６３４ｍＭ、６３０ｍＭ、６２０ｍＭ、６１０ｍＭ、６００ｍＭ、５５０ｍＭ、５００ｍＭ、４５０ｍＭ、４００ｍＭ、３５０ｍＭ、３００ｍＭ、２５０ｍＭ、２００ｍＭ、１８０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３５ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、または５０ｍＭの上限、及び約４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６１０ｍＭ、６２０ｍＭ、または６３０ｍＭの独立して選択された下限を有する濃度範囲のいずれかであってよく、下限は上限未満である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１以上かつ１．６５未満である。いくつかの実施形態では、製剤中のモノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１〜０．７３である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．７３〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４９〜１．４７である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のトレハロースに対する重量比は、０．４１、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、及び１．６４のいずれかであり、これらの数字の間の全ての値を含む。本明細書で使用されるとき、抗体のトレハロースに対する重量比を計算するための製剤中のトレハロースの重量は、トレハロース二水和物（ＭＷ３７８．３３）の量に基づく。他の形態のトレハロース（例えば無水トレハロース）が使用される場合、製剤中のトレハロースの重量は、同じモル濃度のトレハロース二水和物の重量に変換されるべきである。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、トレハロースをトレハロース以外のポリオールに置換することができる。トレハロースを、例えばスクロース、マンニトール、ラクトース、グリセロール、及び／またはプロピレングリコールに置換することができる。したがって、本明細書に記載の抗体製剤におけるトレハロースのいずれかに関して、該トレハロースを、トレハロース以外のポリオール（例えば、上に列記されるもの）に任意選択で置換することができる。
【０２３９】
界面活性剤は、抗体製剤に任意選択で添加することができる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減する、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小に抑える、及び／または吸着を低減するような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％〜約０．５％、約０．００５％〜約０．２％、約０．０１％〜約０．１％、若しくは約０．０２％〜約０．０６％、または約０．０３％〜約０．０５％の量で製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、０．０４％または約０．０４％の量で製剤中に存在する。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、０．０２％または約０．０２％の量で製剤中に存在する。一実施形態では、製剤は界面活性剤を含まない。
【０２４０】
一実施形態では、本製剤は、上記に特定される薬剤（例えば、抗体、緩衝剤、トレハロース、及び／または界面活性剤）を含有し、本質的に、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及びベンゼトニウムＣｌなどの１つ以上の保存剤を含まない。別の実施形態では、保存剤は、特に製剤が多用量製剤である場合、製剤に含まれ得る。保存剤の濃度は、約０．１％〜約２％、好ましくは約０．５％〜約１％の範囲であり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載のものなどの、１つ以上の他の医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を製剤に含むことができるが、但し、それらが製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、追加の緩衝剤、共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば亜鉛タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー、及び／または塩形成対イオンを含む。本明細書における例示的な医薬的に許容される担体は、可溶性中性−活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬剤分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２４１】
本明細書において、キレート剤の様々な説明は、多くの場合、ＥＤＴＡに集中するが、他の金属イオンキレート剤も本発明内に包含されることを理解されたい。金属イオンキレート剤は当業者に周知であり、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミンジスクシネート）、ＰＤＴＡ（１，３−プロピレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＡＤＡ（ベータ−アラニン二酢酸）、ＭＧＣＡ（メチルグリシン二酢酸）などを含むが、必ずしもこれらに限定されない。加えて、本明細書のいくつかの実施形態はホスホネート／ホスホン酸キレート剤を含む。
【０２４２】
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症の必要に応じて、２つ以上のタンパク質、好ましくは他のタンパク質に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも含有し得る。例えば、抗体が抗ＶＥＧＦである場合、別の薬剤（例えば化学療法剤及び抗腫瘍剤）と組み合わせることができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性が評価または測定される。安定性及び生物学的活性を評価するために当該技術分野において既知の任意の方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体は、−２０℃で少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２１ヶ月間、または少なくとも約２４ヶ月間（または少なくとも約５２週間）安定している。いくつかの実施形態では、安定性は、保存後の製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成により測定される。いくつかの実施形態では、製剤中のＨＭＷＳのパーセントは、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、または少なくとも約２４ヶ月間の保存後、約０．８％未満、約０．９％未満、または約１％未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、製剤中の総凝集体は、−２０℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、または少なくとも約２４ヶ月間保存の後、約２．５％未満、または約３％未満のいずれかである。
【０２４４】
インビボ投与に使用される製剤は減菌であるべきである。これは、製剤の調製前または調製後に、減菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２４５】
ＩＩＩ．抗体製剤の投与
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される製剤は、対象に投与するためである。本製剤は、ボーラスとしての静脈内投与、または一定の期間にわたる連続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、若しくは吸入経路などの既知の方法により、抗体での治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る。一実施形態では、本製剤は、静脈内投与により哺乳動物に投与される。このような目的に関して、本製剤はシリンジを使用して、または例えばＩＶラインを介して注入され得る。一実施形態では、本製剤は、皮下投与により哺乳動物に投与される。
【０２４６】
抗体の適切な投薬量（「治療有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、抗体が予防的若しくは治療的目的のために投与されるか否か、以前の療法、患者の病歴及び抗体に対する応答、使用される抗体の種類、ならびに従事する医師の判断に依存する。抗体は、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与され、診断以降いつでも患者に投与することができる。抗体は、唯一の治療として、または問題の状態の治療に有用な他の薬剤若しくは療法と組み合わせて投与することができる。
【０２４７】
一般的な提案として、投与される抗体の治療有効量は、１回以上で投与するかにかかわらず、患者の体重の約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される抗体の典型的な範囲は、約０．３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３〜約１５ｍｇ／ｋｇであり、例えば、毎日投与される。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。一実施形態では、アンタゴニストは、約１００または４００ｍｇの用量で、１、２、３、または４週間毎に投与されるか、または約１、３、５、７．５、１０、１５、または２０ｍｇ／ｋｇの用量で、１、２、３、または４週間毎に投与される抗ＶＥＧＦ抗体である。用量は、注入など、単一用量として、または複数用量（例えば、２または３用量）として投与され得る。この療法の進行は従来の技術により容易に監視される。
【０２４８】
ＩＶ．製品
本発明の別の実施形態では、本発明の水性医薬製剤を保持する容器を含む製品が提供され、任意選択でその使用説明書が提供される。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、及びシリンジを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。例示的な容器は、３〜２０ｃｃの単回使用ガラスバイアルである。あるいは、複数用量の製剤については、容器は、３〜１００ｃｃのガラスバイアルであってもよい。容器は製剤を保持し、その容器上の、またはその容器に関連するラベルは使用法を示す場合がある。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用説明書の添付文書を含む、商業的またはユーザの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
【０２４９】
本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考える。本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内である。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２５０】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるだろう。しかしながら、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は単に図示の目的のためであり、それらの観点から様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲及び添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解する。
実施例１：凍結トレハロース製剤におけるｍＡｂ安定性に対する賦形剤溶解度の作用
【０２５１】
この研究は、凍結速度、保存温度、及び製剤組成物の、凍結溶液におけるトレハロース相分布及びタンパク質の安定性に対する作用を評価するために設計された。凍結溶液におけるトレハロース結晶化の相分布の解明に加えて、この研究の結果は多数の実用的な意義がある。おそらく、タンパク質の安定剤としてのトレハロースの有効性は、溶液におけるトレハロースの相分布に依存する。よって、異なる組成物、凍結速度、及び保存温度に起因するトレハロースの相分布を理解することにより、堅固な製剤及び凍結プロセスの開発の情報が得られる。
材料及び方法
材料及び試料調製
【０２５２】
およそ１４５キロダトンの分子量を有する３つのＩｇＧ１完全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ベバシズマブ、及びｍＡｂ３）をクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞系において発現させ、精製した。
【０２５３】
保存温度及び凍結速度研究のために、ｍＡｂ１は、２．１％（ｗｔ／ｖ）トレハロース、０．０１％ポリソルベート２０（ｗｔ／ｖ）を含むｐＨ６．０の５ｍＭヒスチジン塩酸塩、及び注射用水ＵＳＰ中２５ｍｇ／ｍＬで製剤化され、ベバシズマブは、５．４％（ｗｔ／ｖ）トレハロース、０．０４％ポリソルベート２０（ｗｔ／ｖ）を含むｐＨ６．２の５１ｍＭリン酸ナトリウム、及び注射用水ＵＳＰ中２５ｍｇ／ｍＬで製剤化され、ｍＡｂ３は、８．２％（ｗｔ／ｖ）トレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｗｔ／ｖ）を含むｐＨ６．２の２０ｍＭ酢酸ヒスチジン、及び注射用水ＵＳＰ中２０ｍｇ／ｍＬで製剤化された。
【０２５４】
賦形剤の溶解度研究のために、ベバシズマブは、６．０％（ｗｔ／ｖ）のスクロース、トレハロース、またはマンニトールのいずれかを用いた、０．０４％ポリソルベート２０（ｗｔ／ｖ）を含むｐＨ６．２の５１ｍＭリン酸ナトリウム、注射用水ＵＳＰ（対照試料）中２５ｍｇ／ｍＬで製剤化された。
【０２５５】
製剤研究のために、ベバシズマブは、様々な量のトレハロース（０％、１．７％、３．４％、５．１％、６．８％、８．６％、１０．３％、１２．０％、１３．７％、１５．４％、１７．１％、２０．５％、２４．０％、２７．４％、３０．８％、及び３４．２％ｗｔ／ｖ）を用いて、０．０４％ポリソルベート２０を含む、または含まない、２０ｍＭヒスチジン塩酸塩（ｐＨ６．０）中３つのｍＡｂ濃度（０、２５、及び１００ｍｇ／ｍＬ）で評価された。これらの６４の異なる製剤ならびに０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含有する３２のビヒクルブランクを、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒマイクロプレート中で製剤化した。
【０２５６】
追加の溶液を、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ヒスチジン、及び注射用水中、０．０、２．０、４．０、及び８．０％（ｗｔ／ｖ）トレハロースで調製した。５０マイクロリットルのｐＨｙｄｒｉｏｎ（ｐＨ範囲：０〜７）ｐＨ指示薬色素（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）を、１０ｃｃのガラスバイアルに分配し、蒸発させた。およそ４ミリリットルの様々なトレハロース製剤をバイアルに添加し、色素を溶液中に溶解させた。凍結トレハロース溶液の写真は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｔｙｌｕｓ  ７７０ＳＷデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，ＮＪ）を使用して、スーパーマクロモードで得た。
【０２５７】
全試料の製剤緩衝剤を、公定グレード（ＵＳＰ、ＮＰ、ＥＰ）の化学物質、及びＥｌｇａ  ＰＵＲＥＬＡＢ  Ｕｌｔｒａ（Ｃｅｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）浄水システムを使用して精製した脱イオン水で調製した。製剤研究試料を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心管（１０ｋＤ  ＭＷＣＯ）を使用して、製剤緩衝剤中に徹底的に透析し、透析した各試料に関してｍＡｂ原液のｐＨを検証した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心濾過装置（１０  ｋＤ  ＭＷＣＯ）を使用して、限外濾過により試料を濃縮した。
【０２５８】
制御凍結
緩慢及び通常の凍結用に試料を調製するために、２ミリリットルの試料アリコートを、高圧蒸気減菌した５ｃｃのガラスバイアルに分注し、層気流で換気されたバイオセーフティフード中で無菌手技を使用して、２０ｍｍのＬｙｏ−Ｓｔｏｐｐｅｒｓで密封した。緩慢な凍結は、試料バイアルを、予冷した棚上の凍結乾燥機に設置することによって達成され、２４時間−１℃〜−３℃で保持された。過冷却を制御するために、氷が形成されるまで各バイアルの横に凍結したＣＯ２を適用することによって氷核形成させ、その後、およそ−０．３℃／分の速度で、１４４時間にわたって温度を線形的に−４０℃まで下げた。
【０２５９】
通常の凍結は、試料が完全に凍結するまで試料バイアルを−２０℃の冷凍庫に設置することによって達成された。過冷却を制御するために、氷が形成されるまで各バイアルの横に凍結したＣＯ２を適用することによって氷核形成させた。
【０２６０】
高速凍結は、５０マイクロリットルの試料アリコートを滴下して液体窒素中で急冷却することにより達成された。凍結エンドポイントは、混濁の増加、及び表面からステンレス鋼メッシュ回収バスケット内へ球体の沈下により決定された。凍結後、原薬凍結ペレットの１ミリリットルのアリコートを液体窒素から取り出し、減菌の予冷した５ｃｃのガラスバイアル中に移した。次いで、バイアルを凍結したＣＯ２上に保管し、２０ｍｍのＬｙｏ−Ｓｔｏｐｐｅｒｓで密封した。液体窒素を使用して、製剤スクリーニング試料を９６ウェルマイクロプレート中で高速凍結させた。マイクロプレートが凍結した直後に、２４ゲージの針（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で氷の表面をひっかくことにより試料を核形成させた。
【０２６１】
等温保持
記載の方法により３つの凍結速度（緩慢、通常、及び高速）で凍結された試料を、凍結保存のため±２℃の範囲の−２０℃、−１４℃、及び−８℃設定点の３つの冷凍ユニットに移した。冷凍庫の温度は、Ｙｏｋｏｇａｗａ温度監視システム（Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｍｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して監視された。０、１、２、３、６、９、及び１２ヶ月間の等温冷凍保存後、試料バイアルを取り出し、周囲条件下（約２２℃）の研究室のカウンターベンチに置き、分析前に解凍させた。
【０２６２】
製剤スクリーニング試料のマイクロプレートを、２つの温度で保管した（−２０±２℃及び−４０±２℃）。冷凍庫の温度は、Ｙｏｋｏｇａｗａ温度監視システム（Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｍｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して監視された。
【０２６３】
ＳＥＣ分析用の試料マイクロプレートは、最大３６５日まで等温で保存された。冷凍保存後、マイクロプレートを周囲条件下（約２２℃）の研究室のカウンターベンチに置き、分析前に解凍した。凍結プロセスの終了直後、対照（０日目）試料を解凍した。３６５日の等温冷凍保存後、ＦＴＩＲ分析用の試料ガラスマイクロプレートを取り出し、トレハロース結晶化分析のために凍結乾燥させた。凍結プロセスの終了直後、対照（０日目）試料を凍結乾燥させた。
【０２６４】
凍結乾燥
最初に、トレハロース結晶化定量用試料を、ＬｙｏＭａｎａｇｅｒ  ＩＩソフトウェア（ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＹ）によって制御されたＬｙｏＳｔａｒ  ＩＩ凍結乾燥機ユニットを使用して凍結乾燥した。凍結試料を予冷した棚に置き、一次乾燥前に−３５℃で７時間保持した。一次乾燥は、１５０μｍ  Ｈｇのシステム圧力下で、０．２℃／分の速度で棚の温度を２０℃まで線形的に増加させ、続いて２０℃で４０時間保持することにより達成された。二次乾燥は、０．２℃／分で棚の温度を３０℃まで線形的に増加させ、続いて３０℃で８時間保持することにより行われた。熱電対を様々な試料バイアルに設置して、凍結乾燥中の温度を監視した。二次乾燥後、分析前に試料が水和されるのを阻止するために、まだ真空下にある間に試料バイアルを密栓した。少量（３００マイクロリットル）の製剤スクリーニング試料を、同じ凍結乾燥方法を用いて９６ウェルガラスプレート（Ｚｉｎｓｓｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で凍結乾燥させた。
【０２６５】
サイズ排除クロマトグラフィー
３つの原薬の分子サイズ分布を測定するために、０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．２移動相溶液を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のＴｏｓｏｈＨａａｓ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷｘｌ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、２５０Å孔径、５μｍ粒子サイズ）カラムまたは同等物を使用してＨＰＳＥＣ（高速サイズ排除クロマトグラフィー）分析を実施した。流量は０．５ｍＬ／分であり、実行時間は３０分であった。試料チャンバの温度は５℃であり、注入物は１００マイクログラムであった。参照シグナルとして３６０ｎｍを用いて、２８０ｎｍでの吸光度を測定するダイオードアレイ検出器でカラム出口シグナルを監視した。次に、各試料に存在する分子の凝集体、単量体、及び断片のパーセントを定量するために、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、データ分析及びＵＶピーク積分を行った。流量１．０ｍＬ／分及び実行時間１５分で説明されるＳＥＣ法を用いて、少量の製剤スクリーニング試料をＧｒｅｉｎｅｒ（ＧＲＥＩＮＥＲ  ＩＮＦＯ，ＣＩＴＹ）９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート中で分析した。ＳＥＣ分析前に、ベバシズマブ試料を２０ｍＭヒスチジン塩酸塩（ｐＨ６．０）に希釈し、ＳＥＣ分析前に解離可能な（ｄｉｓｓｏｃｉａｂｌｅ）凝集体を分解するために３０℃で２４時間保持した。試料チャンバの温度は３０℃であり、注入物は１００マイクログラムであった。
【０２６６】
濃度測定
Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３分光光度計で、１ｃｍの経路長の石英キュベットにおける２７９ｎｍ及び３２０ｎｍでの吸光度を記録することにより、各試料のＵＶ吸光度を測定した。ＵＶ濃度定量は、ｍＡｂ１、ベバシズマブ、及びｍＡｂ３に対してそれぞれ１．５０、１．７０、及び１．４５（ｍｇ／ｍｌ）−１  ｃｍ−１の吸光率を用いることにより計算された。測定は適切な緩衝剤に対してブランクされる。
【０２６７】
濁度分析
Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ＨＰ８４５３分光光度計で、１ｃｍの経路長の石英キュベット（Ｅｃｋｈａｒｄｔ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８：１３６０−４）における３４０〜３６０ｎｍの平均吸光度を記録することにより、試料の濁度を測定した。注射用滅菌水は、分析前に装置をブランクにするために使用された。製剤スクリーニング試料の濁度分析は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を使用して、ＵＶ透過Ｃｏｒｎｉｎｇハーフエリア９６ウェルマイクロプレートで行った。濁度は注射用減菌水ブランクに対して測定され、濁度値は３４０〜３６０ｎｍの吸光度の平均を記録することによって測定された。
【０２６８】
ＦＴ−ＮＩＲ分光法
近赤外拡散反射分光法を用いてトレハロース結晶化パーセントを決定した。本研究で使用されたデータ収集、較正、及び分析方法は、非結晶トレハロースと結晶性トレハロース多形との間のスペクトル差の特徴付けに焦点を当てた以前の研究から適用した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９９（１）：４８−５７）。これらの方法を使用して、積分球モジュールを備えたＮｉｃｏｌｅｔ  Ａｎｔａｒｉｓ  ＦＴ−Ｎｅａｒ  ＩＲ分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で、分解能４ｃｍ−１で、３２の平均走査数を使用して、試料のＮＩＲスペクトルを１０，０００〜４，０００ｃｍ−１で記録した。トレハロース結晶化パーセントは、４３０６ｃｍ−１及び４２９１ｃｍ−１でのバンドの正規化されたピーク強度比を使用して計算された（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９９（１）：４８−５７）。ＭＡＴＬＡＢ（Ｒ２００７ａ，Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ）で線形回帰分析を使用して、データ分析を実施した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９９（１）：４８−５７）。少量（３００マイクロリットル）製剤スクリーニング試料を凍結乾燥し、同じ方法を使用してトレハロース結晶化パーセントについて分析した。
【０２６９】
結果
トレハロースの結晶化が医薬的に妥当な（≦１０％ｗｔ／ｖ）濃度でタンパク質の安定性に影響を及ぼすかを理解することは非常に重要である。賦形剤結晶化に対する公称トレハロース濃度の影響を評価するために、結晶化をより良く可視化するためにｐＨ指示薬色素の存在下で、溶液を０．０、２．０、４．０、及び８．０％（ｗｔ／ｖ）トレハロース二水和物で調製した。通常の凍結速度を使用して試料を凍結し、−２０℃で６日間保存した。核形成誘導後、全ての凍結トレハロース溶液において、トレハロースの結晶化が視覚的に観察された（図１）。凍結溶液の目視検査は、結晶化の程度が公称トレハロース濃度に比例して増加することを示す。例えば、評価した中で最も高い公称トレハロース濃度（図１Ｄ：８．０％ｗｔ／ｖ）は、０．０％（図１Ａ）、２．０％（図１Ｂ）、４．０％（図１Ｃ）トレハロース（ｗｔ／ｖ）を含有した溶液と比較して、実質的により多くの結晶化をもたらした。
【０２７０】
医薬的に妥当なトレハロース濃度（≦１０％ｗｔ／ｖ）は、凍結プロセス中には、未凍結溶液（図２Ａ）の溶解限度を十分に下回るが、トレハロースは実質的に濃縮され、より低温で、トレハロースの溶解度は著しくより低い（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：５７８−９０）。周囲温度で開始されるより高い濃度は、凍結保存温度で溶解度を確実に超える。凍結濃縮においてその溶解限度を上回るトレハロースでは、結晶化を開始させる核形成事象を必要とするのみであろう。
【０２７１】
実施例２：凍結トレハロース製剤中のｍＡｂの安定性に対する賦形剤結晶化の作用
凍結、凍結乾燥、凍結保存中の炭水化物の結晶化は、タンパク質薬剤の物理的安定性に影響を及ぼすことが示されてきた。例えば、マンニトールは凍結乾燥中に結晶化し、様々なタンパク質の立体構造変化、凝集、及び活性の損失をもたらすことが示されている（Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．Ｋ．ａｎｄ  Ｋａｌｏｎｉａ，Ｄ．Ｓ．（２００４）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．５：Ｅ１０、Ｃａｖａｔｕｒ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：８９４−９００）、Ｉｚｕｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４２：５−８）、及びＩｚｕｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：１２３２−７）。＜４０℃でトレハロースはマンニトールより可溶性であるが、スクロースよりも可溶性が非常に低く、これは一般的に非結晶化賦形剤とみなされる（図２Ａ）。
【０２７２】
凍結溶液におけるタンパク質安定性に対する賦形剤溶解度の作用を評価するために、等濃度のスクロース、トレハロース、及びマンニトールでベバシズマブ溶液を調製した。通常の凍結速度で試料を凍結し、核形成を誘導し、−２０℃で２８日間凍結保存した。ＳＥＣデータは、凍結保存後、スクロース製剤において凝集の増加は観察されず、トレハロース製剤において凝集の小さな増加（約１％）が観察され、マンニトール製剤において凝集の大きな増加（約３％）が観察されたことを示す（図２Ｂ）。
【０２７３】
これらの結果により、賦形剤溶解度とタンパク質凝集との間に順位相関関係が確立される。予想通り、−２０℃で溶解度がより低い炭水化物は、凝集においてより大きな増加をもたらす（図２Ｂ）。特に重要なのは、この結果は、−２０℃でのトレハロースの溶解度が十分に低く、トレハロースが結晶化し、医薬的に妥当な濃度（２〜１０％ｗ／ｖ）でタンパク質の凝集をもたらす可能性があることを示唆する。
【０２７４】
実施例３：凍結トレハロース製剤中のｍＡｂの安定性に対する凍結速度の作用
３つのｍＡｂ製剤のＳＥＣデータは、凍結速度がタンパク質の安定性に影響を及ぼすことを示した（下の表１を参照されたい）。
2020189842.tif 000007
【０２７５】
一般に、モノクローナル抗体は、高速（＞１００℃／分）での凍結後に凝集し、より緩慢な凍結速度（＜１℃／分）では凝集しなかった。長期保存温度（表１）にもかかわらず、より緩慢な凍結速度（＜１℃／分）で凍結された３つの原薬（ｍＡｂ１、ベバシズマブ、及びｍＡｂ３）のいずれかにおいて顕著な凝集は測定されなかったことが観察された。しかしながら、より速い凍結速度（＞１００℃／分）で凍結された全てのベバシズマブ及びｍＡｂ３試料は、時間と共に有意な凝集の増加を示した（表１）。陰性対照として含まれた高速凍結ｍＡｂ１でさえ、研究の過程中に凝集の軽微な増加を示した（表１）。全ての高速凍結試料に関して、保存中に観察された大半の凝集は、最初の６ヶ月以内に生じるようである（図３）。その後、凝集の速度は６〜１２ヶ月の間で大幅に減少する、つまり変化はこの期間中十分に小さいため、その測定された凝集は、試料及び／またはアッセイの変動に起因する可能性があり得る。
【０２７６】
理論に拘束されることを望むものではないが、高速での凍結は抗体の安定性の過酷条件を表すと考えられる。例えば、高速での凍結時に、抗体製剤における凝集の変化は、１ヶ月後に観察された一方で、商業的な凍結及び保存条件下で、凝集は９ヶ月以上の間一定のままであり得る。高速凍結は、抗体製剤が商業的な凍結及び保存条件よりも非常に速く凝集を受ける過酷条件を表す。結果として、この過酷条件は、製剤が保存される時間量とは関係なく、抗体製剤の凝集しやすさを評価するために使用され得る。
【０２７７】
３つの凍結速度で凍結し、−２０℃で１２ヶ月間保存したｍＡｂ３試料のＳＥＣオーバーレイは、高速凍結されたｍＡｂ３試料において凝集した種（二量体及び高分子量）の観察可能な増加があったことを示す（図４Ａ）。逆に、緩慢及び通常の凍結速度で凍結された試料は、凝集パーセントにおいて有意な増加を示さず、データオーバーレイは研究対照と近いものであった（図４Ａ）。また、高速凍結ベバシズマブ試料は、濁度分析及び目視検査により決定されるとき、可溶性凝集体（表１）及び沈殿物の形成において増加を示した。これらの沈殿物は、以前にタンパク質関連と特徴付けられており、０．２ミクロンのＰＶＤＦフィルタを用いた濾過によって除去した後、ＵＶ吸光度において同時に減少する。
【０２７８】
線形回帰分析モデルと組み合わせて使用された近赤外拡散反射分光法を適用することにより、４０００〜４５００ｃｍ−１で以前に特徴付けされたスペクトル領域における明確な差を利用することによってタンパク質の存在下の非結晶及び結晶性トレハロースの相対量を定量することが可能であることが証明された（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９９（１）：４８−５７）。３つの既知のトレハロース相の純粋な試料のＦＴ−ＮＩＲスペクトルは、非結晶、結晶性無水物、及び結晶性ニ水和物間の主なスペクトル差を図示した（図５）。ＦＴ−ＮＩＲ分光法による１２ヶ月試料の分析は、ｍＡｂ１（図６Ａ３）、ベバシズマブ（図６Ｂ３）、及びｍＡｂ３（図６Ｃ３）の高速凍結試料において測定可能な量のトレハロース結晶化が存在し（表１）、ｍＡｂ１（図６Ａ１〜２）、ベバシズマブ（図６Ｂ１〜２）、またはｍＡｂ３（図６Ｃ１〜２）の緩慢及び通常の凍結試料において測定可能な量のトレハロース結晶化が存在しなかったことを示す。様々な保存温度での１２ヶ月の凍結保存後に得た高速凍結試料のスペクトルは、トレハロース二水和物に関連する主なスペクトル領域において鋭いピークシフトを示し（図６Ｂ３及び６Ｃ３）、凍結溶液において、３０〜７０パーセント（１．６％〜５．７％ｗｔ／ｖ）の結晶性トレハロース二水和物を含有し、≧２．５％（ｗｔ／ｖ）の非結晶トレハロースを保持する。
【０２７９】
興味深いことに、タンパク質凝集における観察された増加は、トレハロースの結晶化の増加と関連した。例えば、−２０℃で１２ヶ月間保存された高速凍結ｍＡｂ１試料は、０．２％（ｗｔ／ｖ）の結晶性トレハロース二水和物を有し、凝集が０．１％増加したことが分かり、一方、高速凍結され、−２０℃で１２ヶ月間保存されたベバシズマブ及びｍＡｂ３試料は、それぞれ、２．５％及び５．１％（ｗｔ／ｖ）の結晶性トレハロース二水和物を有し、凝集が１．７％及び３．１％増加したことが分かった（表１）。トレハロース二水和物パーセントとｍＡｂ凝集のこの順位相関関係は、結晶化されたトレハロースの濃度がタンパク質の安定性に影響を及ぼしたことを示唆する。
【０２８０】
対照として、結晶形成及びタンパク質凝集に対する急速な冷却及び凍結乾燥の即時的な影響を評価するために、試料を高速凍結し、ＳＥＣ及びＦＴ−ＮＩＲですぐに分析した。タンパク質凝集において変化は観察されなかった（データ示さず）。加えて、高速凍結Ｔ０試料セットに関して得たＦＴ−ＮＩＲスペクトルから、糖が圧倒的に非結晶性質であり、本方法の検出限界に近い５パーセント未満の結晶性トレハロース二水和物を含有したことが明らかである。これらの結果は、高速凍結後のタンパク質凝集及びトレハロース相分布に対して即時的な影響がないことを示す。よって、本研究中のトレハロース結晶化及びタンパク質凝集における測定された増加は、保存中の時間依存様式で生じる変化を表す。
【０２８１】
凍結速度研究の結果は、トレハロース結晶化及びｍＡｂ凝集の両方に対する凍結速度の作用の見識を提供する。前述のように、高速凍結は氷結晶の界面表面積を増加させ、更なる核形成部位を提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、高速凍結試料において形成されたこれらの追加の核形成部位は、核形成事象が生じ得る確率を高めると考えられる。逆に、緩慢な及び通常の凍結速度で凍結された試料において形成されるより大きな氷結晶はより低い表面積を有し、これは核形成事象の確率を減少させると考えられる。
【０２８２】
実施例４：凍結トレハロース製剤におけるｍＡｂ安定性に対する保存温度の作用
１２ヶ月凝集データは、保存温度がタンパク質の安定性に影響を及ぼすことを示す（図３）。一般に、高速凍結され、−２０℃で１２ヶ月間保存されたｍＡｂ３試料は、最大限に凝集した（図３Ｃ）。興味深いことに、ベバシズマブ及びｍＡｂ３の凝集の初期速度は、−１４℃で保存された高速凍結試料においてより迅速であり、凝集の速度は−２０℃で保存されたものよりも早く減少し（図３）、これは核形成事象のカオス的性質に起因し得る。高速凍結され、最も温かい保存温度の−８℃で保存された試料は、一般的に、研究過程全体を通して凝集速度及び程度の両方が最も低いことを示した（図３）。図４Ｂのクロマトグラムオーバーレイは、３つのそれぞれの保存温度で１２ヶ月保存された高速凍結ｍＡｂ３試料のＳＥＣプロファイルにおける観察された差を示す。ベバシズマブ及びｍＡｂ３に関して、より高い温度（例えば−８℃）で保存された高速凍結試料はより少ない程度ではあるが凝集し、逆に、より低い温度（例えば−２０℃）で保存された試料は最大限に凝集した。
【０２８３】
本研究におけるタンパク質凝集の保存温度依存性は、凍結溶液におけるタンパク質凝集のメカニズムの更なる見識をもたらす。興味深いことに、保存温度は、タンパク質凝集とトレハロース結晶化との間の依存性を決定する（表１）。一般に、高速凍結され、−８℃、−１４℃、及び−２０℃で保存された試料は、トレハロース結晶化の程度において有意な差を示さなかったが、より低い温度（−２０℃）で保存された試料は、より高い温度（それぞれ−１４℃及び−８℃）で保存されたものよりも高い程度に凝集した（図３）。例えば、１２ヶ月間保存された高速凍結ｍＡｂ３試料は、全ての保存温度に関して６１％〜６９％のトレハロースが結晶化されたが、凝集の量はより負の保存温度で増加した。例えば、凍結試料は、−８℃、−１４℃、及び−２０℃で１２ヶ月間保存した後、それぞれ、０．３％、２．１％  、及び３．１％凝集した（表１）。この傾向は、２つの試料における類似量のトレハロース結晶化が、より高い温度（それぞれ−１４℃及び−８℃）よりもより低い温度（−２０℃）での保存で、より多くのタンパク質凝集をもたらし得ることを示す。
【０２８４】
これらの温度依存性の傾向は、凍結環境の分子の運動度及び物理的特性（すなわち、氷形態）がトレハロース結晶化誘導タンパク質凝集に重要な役割を果たすことを示唆する。調査される保存温度の範囲（−２０℃、−１４℃、及び−８℃）は、これらの溶液のガラス転移温度（Ｔｇの範囲：−２９．５〜−３２℃）を上回り、よってある程度の運動度が予想される。全ての高速凍結試料を同じ様式で凍結し、よって、おそらく、同じ組成の試料は、凍結直後、類似する氷形態及び溶質分布を有する。しかしながら、凍結後、保存温度は、凍結濃縮物中の長期溶質濃度、ならびにトレハロース及びタンパク質分子の拡散速度を決定する。トレハロース（３４２Ｄａ）とＩｇＧ１（≧１４５，０００Ｄａ）とのサイズが違うため、トレハロース分子が大きい球状タンパク質よりも凍結濃縮物にわたって非常に迅速に拡散すると想定され得る。追加の研究は、トレハロース結晶化が凍結保存の２週間以内にプラトーに達することを示す（データ示さず）。トレハロースの結晶化は早期に生じ、データは様々な保存温度での経時的な凝集動態を示すため、これは、分子の運動度が凍結培地の再配置の速度及び程度を決定し、それにより、ＩｇＧ１モノクローナル抗体の凝集の速度及び程度を決定することを示唆し得る。高速凍結後、−１４℃で保存されたｍＡｂ３試料は早期に凝集が始まるが、３〜６ヶ月でプラトーに達し、一方、−２０℃で保存された試料はその直後に凝集が始まるが、時間依存様式で凝集が続き、６〜１２ヶ月でプラトーに達する（図３Ｃ）。おそらく、より高い温度（−１４℃及び−８℃）での試料はより大きい分子運動度を有するため、タンパク質は初期に一緒に拡散し、凝集体を形成する。しかしながら、相分離された溶液構成成分（つまり、トレハロース）が再分布されるため、タンパク質は、共存する非結晶トレハロース分子と相互作用することにより安定する。
【０２８５】
実施例５：凍結トレハロース製剤中のｍＡｂ安定性に対する製剤組成の作用
凍結保存中のトレハロース結晶化及びｍＡｂ凝集に対する製剤組成の作用を決定するために、トレハロース濃度の範囲でベバシズマブを評価した（［トレハロース］範囲：０〜３４．２％（ｗｔ／ｖ）及びベバシズマブ濃度（［ベバシズマブ］範囲：０、２５、及び１００ｍｇ／ｍＬ）。ガラス転位温度を上回る温度（−２０℃）及び下回る温度（−４０℃）で１２ヶ月間、試料を高速凍結し、トレハロース結晶化及びタンパク質凝集について、それぞれＦＴ−ＮＩＲ及びＳＥＣを使用して分析した。
【０２８６】
本研究の結果は、高速凍結後、トレハロースが−２０℃で１２ヶ月間保存した凍結溶液において結晶化することを示した（図７）。しかしながら、トレハロース結晶化及びｍＡｂ凝集は、−４０℃で１２ヶ月間保存された凍結溶液において観察されなかった。高速凍結しひっかいた直後、結晶化したトレハロースの量は最小である（＜１０％ｗｔ／ｖ）。しかしながら、−２０℃で１２ヶ月凍結保存した後、トレハロース結晶化は大幅に増加する（図７Ａ〜Ｃ）。
【０２８７】
一般に、結果は、トレハロースの濃度の増加がより高い割合の結晶化トレハロースをもたらすことを示す。例えば、トレハロースの濃度が１．７％から３４．２％（ｗｔ／ｖ）に増加すると、結晶化トレハロースパーセントは４７％から８６％（［ベバシズマブ］＝０ｍｇ／ｍＬ）、２２％から６１％（［ベバシズマブ］＝２５ｍｇ／ｍＬ）、及び１０％から４７％（［ベバシズマブ］＝１００ｍｇ／ｍＬ）に増加する（図７）。同様に、ベバシズマブの凝集も−２０℃で１２ヶ月凍結保存した後に増加した（図７Ｄ〜Ｅ）。一般に、この結果は、長期凍結保存中のベバシズマブ溶液を安定させるトレハロースの最適な範囲があることを示す。あるいは、最適な範囲を上回るトレハロース：ｍＡｂ比は、トレハロース結晶化及びタンパク質凝集をもたらす（図７Ｄ〜Ｅ）。最適な範囲を下回るトレハロース：ｍＡｂ比で、タンパク質凝集は増加するが、トレハロース結晶化は増加せず、おそらく別のメカニズムに起因する（例えば、不十分な凍結保護物質）。
【０２８８】
データは、形成された結晶化したトレハロースのパーセントがタンパク質及びトレハロース両方の濃度に依存することを示す。興味深いことに、より高いベバシズマブ濃度は、より低いトレハロース結晶化量をもたらす。例えば、固定したトレハロース濃度（１．７％ｗｔ／ｖ）で、０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬにベバシズマブ濃度を増加することにより、結晶化トレハロースのパーセントが５３％から９％に減少する。
【０２８９】
図８は、トレハロース結晶化（図８Ａ）及びベバシズマブ凝集（図８Ｂ）に対するトレハロースのｍＡｂに対する比率（ｗｔ／ｗｔ）の重要性を示す。図８Ａ及びＢに示されるように、ベバシズマブの物理的安定性の分析は、十分なトレハロース：ｍＡｂ（≧０．２：１ｗｔ／ｗｔ）が長期凍結中のベバシズマブ溶液を安定させるのに必要であるが、過剰なトレハロース：ｍＡｂ（≧２．４：１ｗｔ／ｗｔ）がより高い割合の結晶化トレハロース二水和物及びベバシズマブ凝集の有意な増加をもたらすことを示した。おそらく、トレハロース：ｍＡｂの増加は、凍結溶液中のトレハロースの過飽和をもたらし、トレハロース結晶化及びｍＡｂ凝集をもたらす。これらの結果は、長期凍結保存中のトレハロースによるベバシズマブ製剤の物理的安定性に必要なトレハロース：ｍＡｂ（＞０．２：１及び＜２．４：１ｗｔ／ｗｔ）の最適な範囲を特定する。
【０２９０】
つまり、これらの結果は、長期凍結保存中のトレハロースによるベバシズマブ製剤の物理的安定化に必要なｍＡｂ：トレハロース（＞０．４１７：１及び＜５．０：１ｗｔ／ｗｔ）の最適な範囲を特定する。例えば、図７Ｄに示されるように、２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを使用した、０．４９〜１．４７のｍＡｂ：トレハロースの範囲は低タンパク質凝集及び低試料変動を示した。別の例として、図７Ｅに示されるように、１００ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを使用した、０．４１〜１．４７のｍＡｂ：トレハロースの範囲は低タンパク質凝集及び低試料変動を示した。
【０２９１】
興味深いことに、ポリソルベートは、凍結ベバシズマブ製剤のいずれかにおいて、タンパク質の安定性またはトレハロースの相分布に影響を及ぼさなかった。同等の組成の試料に関して、ポリソルベート（０．０４％ｗｔ／ｖ）の添加により、トレハロース結晶化またはタンパク質凝集において任意の測定可能な変化は生じなかった。
【０２９２】
製剤組成研究の結果は、タンパク質濃度の増加が凍結試料におけるトレハロース結晶化の発生及び程度を減少させることを示す。これらの結果は、過度に高いトレハロース：ｍＡｂ比（≧２．４ｗｔ／ｗｔ）はトレハロース結晶化及びタンパク質凝集をもたらすが、過度に低いトレハロース：ｍＡｂ比（≦０．２ｗｔ／ｗｔ）は最大１００ｍｇ／ｍＬまでのベバシズマブ濃度に適切な凍結保護を提供しなかったことを示す。結果は、長期凍結保存中、高速凍結（＞１００℃／分）製剤においても、ベバシズマブ製剤を物理的に安定させることが可能なトレハロース：ベバシズマブ（ｗｔ／ｗｔ）比の最適な範囲が０．２〜２．４であることを特定する。つまり、これらの結果は、長期凍結保存中、トレハロースによるベバシズマブ製剤の物理的安定化に必要なベバシズマブ：トレハロース（＞０．４１７：１及び＜５．０：１ｗｔ／ｗｔ）の最適な範囲を特定する。
【０２９３】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、文献、及び論文は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ１】
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【図６Ａ２】
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【図６Ａ３】
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【図６Ｂ１】
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【図６Ｂ２】
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【図６Ｂ３】
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【図６Ｃ１】
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【図６Ｃ２】
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【図６Ｃ３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月14日(2020.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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