(57)【要約】【課題】尿サンプルから対象物質（ＭＯＩ）を単離するためのデバイス及び方法がここに開示される。【解決手段】結果として単離されたＭＯＩは、その上に及び／又はその中に発現したバイオマーカーのレベル及び／又はパターンについて分析され得る。ＭＯＩにおけるバイオマーカーの検出レベル及び／又はパターンは、被検体の病理学的状態の診断及び／又は予後推測のためのインジケーターとして作用し得る。本開示のデバイスは、直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．２０μｍのサイズを独立して有する少なくとも３個の個体群のＭＯＩを保持するように構成された少なくとも１つのフィルターを含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから対象物質（ＭＯＩ）を単離するための、カートリッジを具備するデバイスであって、直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．２０μｍのサイズを独立して有する少なくとも３個の個体群のＭＯＩを保持するように構成された少なくとも１つのフィルターを具備するデバイス。
【請求項２】
前記フィルターが、サイズ排除デバイス、クロマトグラフィーデバイス、エルトリエーター又は多孔質膜である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記クロマトグラフィーデバイスが、アニオン交換又はアフィニティーチップである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記フィルターが多孔質膜である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記カートリッジが、直径約０．８〜１μｍ、０．２０〜０．２２μｍ及び０．０３〜０．０５μｍの複数の孔を独立して具備する３個のフィルターを具備する、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
直径１．０〜２０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は細胞を含み、
直径０．２０〜１．０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は微小小胞体を含み、
直径０．０５〜０．２０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群はエクソソームを含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項７】
前記生物学的サンプルを収容するために前記カートリッジの上流側に配置された第１の貯蔵容器と、
直径０．０５μｍ未満の可溶性分子を含む濾過液を収集するために前記カートリッジの下流側に配置された第２の貯蔵容器と、
をさらに具備する請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ＭＯＩ及び前記可溶性分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グリカン、脂質又はその組合せを独立して含む、請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記フィルターが、セラミック、樹脂、金属、ポリマー、中空繊維又はその組合せで構成され、
前記セラミックは、ゼオライト、シリカ、シリコンカーバイド、アルミナ、チタン酸アルミニウム、スピネル、ムライト、リン酸ジルコニウム、ペロブスカイト及びその組合せからなる群から選択される材料で構成され、
前記樹脂は、有機化合物、合成化合物及びその組合せからなる群から選択される材料で構成され、
前記金属は、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、銀、金、カドミウム、コバルト、鉄、モリブデン、ニオブ、銅、パラジウム、白金、ロジウム、ルテニウム、タンタル、チタン、タングステン、ジルコニウム、合金及びその組合せからなる群から選択され、
前記ポリマーは、ポリセルロース、ポリエステル、ポリエーテル、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオレフィン、ポリウレア、ポリエステル−アミド、ポリエチレン−テレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシロキサン、ポリスルホン、ポリエステル−ウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル及びその組合せからなる群から選択され、
前記中空繊維は、炭素繊維、ガラス繊維、金属繊維又はその組合せである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項１０】
請求項１に記載のデバイスの使用によって尿サンプルから対象物質（ＭＯＩ）を単離する方法であって、
（ａ）前記フィルターにおいて直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．２０μｍのサイズを独立して有する少なくとも３個の個体群のＭＯＩを保持するように、前記尿サンプルを請求項１に記載のデバイスの前記カートリッジに通過させるステップと、
（ｂ）前記カートリッジから溶出された濾過液を収集するステップであって、前記濾過液は０．０５μｍ未満の可溶性分子を含む、ステップと、
（ｃ）前記フィルターから、及び前記ステップ（ｂ）において収集された前記濾過液からＭＯＴをそれぞれ収穫するステップと、
を具備する方法。
【請求項１１】
前記フィルターが、サイズ排除デバイス、クロマトグラフィーデバイス、エルトリエーター又は多孔質膜である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）において収穫された前記ＭＯＩ、前記ステップ（ｂ）において可溶性高分子を含む前記濾過液、又は前記ステップ（ａ）においてＭＯＩがそこに保持された前記フィルターに対して、その上又はその中の少なくとも１つのバイオマーカーを検知するための免疫ブロット法、チップ分析、蛍光プローブ分析、酵素又は電気化学反応が行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーは、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、８−オキソヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−シヌクレイン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、β４インテグリン、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、コクリン、アルギナーゼ１（Ａｒｇ−１）、β−ガラクトシダーゼ、インターフェロンガンマ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、成長制御アルファタンパク質（ＧＲＯ−α）、シンデカン１、シンデカン４、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ゾヌリン、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）又は核酸のいずれか１つである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年３月１５日に出願の米国仮特許出願第６２／８１８７５６号に関するとともにその利益を主張し、同出願の内容がその全体において参照によりここに取り込まれる。
【０００２】
本開示は、概略として、生物学的サンプルから対象物質（ＭＯＴ）を分離及び単離する分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞、エクソソーム（Ｅｘｏ）及び微小小胞体（ＭＶ）を含む細胞外小胞（ＥＶ）並びに可溶性分子は、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、羊水、気管支肺胞洗浄液及び唾液などの種々の組織液源に存在する。細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子のタンパク質及び／又は核酸レベルは組織のヒト生理学及び病理学の状況を反映するので、細胞、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子は疾患の予測、診断及び予防のための好適な手段であり、細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子のタンパク質及び／又は核酸レベルが検出されて正常な健常被検体のものと比較され得る。
【０００４】
細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子は、病気であっても正常であっても、種々の種類の細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、白血球など）に由来し得るものであり、遠隔組織（例えば、脳、心臓、肝臓、骨髄、肺、腎臓、並びに胎児、母体及び胎盤組織を含む生殖組織）から放出され得ることから、関連技術において被検体の生物学的サンプルから細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子を単離するための手段の必要性が存在するので、単離された細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子は単離された細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又は可溶性分子におけるバイオマーカーのインサイチュ又はエクスサイチュの指定された生体分析を受け得ることになり、被検体の分析されるバイオマーカーに関する疾患及び／又は状態に診断又は予防を与え得る。好ましくは、分析されたバイオマーカーに基づいて、適切な治療が被検体に施されて、疾患及び／又は状態に関連する症状を緩和及び／又は改善し得る。
【発明の概要】
【０００５】
以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の詳細な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を詳述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。
【０００６】
ここに具現化され、広く記載されるように、本開示の一態様は、尿サンプルからの対象物質（ＭＯＩ）を単離するためのデバイスに向けられる。該デバイスは、直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．０２μｍのサイズを独立して有する少なくとも３つの個体群のＭＯＩを保持するように構成された少なくとも１つのフィルターを具備するカートリッジを具備する。
【０００７】
本開示の実施形態によると、前記フィルターは、サイズ排除カラム、アフィニティーカラム、エルトリエーター又は多孔質膜であり得る。好適な一実施形態では、前記カートリッジは、アニオン交換カラムであるアフィニティーカラムを具備する。他の好適な実施形態では、前記カートリッジは、相互に直列接続された３段のフィルターを具備し、第１、第２及び第３のフィルターは、それぞれ直径約０．８〜１μｍ、０．２０〜０．２２μｍ及び０．０３〜０．０５μｍの複数の孔を独立して具備する多孔質膜である。
【０００８】
本開示の好適な実施形態によると、直径１．０〜２０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は細胞を含み、直径０．２０〜１．０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は微小小胞体（ＭＶ）を含み、直径０．０５〜０．０２μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群はエクソソーム（Ｅｘｏ）を含む。
【０００９】
代替的又は選択的に、前記デバイスは、前記尿サンプルを収容するために前記カートリッジの上流側に配置された第１の貯蔵容器と、直径０．０５μｍ未満の可溶性分子を含む濾過液を収集するために前記カートリッジの下流側に配置された第２の貯蔵容器とをさらに含み得る。
【００１０】
本開示の実施形態によると、直径０．０５μｍ未満の前記可溶性分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グリカン、脂質又はその組合せを含む。
【００１１】
本開示の実施形態によると、前記フィルターは、セラミック、樹脂、金属、ポリマー、中空繊維又はその組合せで構成される。
【００１２】
本開示の実施形態によると、前記セラミックは、ゼオライト、シリカ、シリコンカーバイド、アルミナ、チタン酸アルミニウム、スピネル、ムライト、リン酸ジルコニウム、ペロブスカイト及びその組合せからなる群から選択される材料で構成される。
【００１３】
本開示の実施形態によると、前記樹脂は、有機化合物、合成化合物及びその組合せからなる群から選択される材料で構成される。
【００１４】
本開示の実施形態によると、前記金属は、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、銀、金、カドミウム、コバルト、鉄、モリブデン、ニオブ、銅、パラジウム、白金、ロジウム、ルテニウム、タンタル、チタン、タングステン、ジルコニウム、合金及びその組合せからなる群から選択される。
【００１５】
本開示の実施形態によると、前記ポリマーは、ポリセルロース、ポリエステル、ポリエーテル、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオレフィン、ポリウレア、ポリエステル−アミド、ポリエチレン−テレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシロキサン、ポリスルホン、ポリエステル−ウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル及びその組合せからなる群から選択さる。
【００１６】
本開示の実施形態によると、前記中空繊維は、炭素繊維、ガラス繊維、金属繊維又はその組合せである。
【００１７】
本開示の第２の態様は、上記デバイスの使用によって尿サンプルから対象物質（ＭＯＩ）を単離する方法を提供することを目的とする。方法は、
（ａ）前記フィルターにおいて直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．０２μｍのサイズを独立して有する少なくとも３個の個体群のＭＯＩを保持するように、前記尿サンプルを請求項１に記載のデバイスの前記カートリッジに通過させるステップと、
（ｂ）前記カートリッジから溶出された濾過液を収集するステップであって、前記濾過液は０．０５μｍ未満の可溶性分子を含む、ステップと、
（ｃ）前記フィルターから、及び前記ステップ（ｂ）において収集された前記濾過液からＭＯＴをそれぞれ収穫するステップと、
を含む。
【００１８】
本開示の好適な実施形態によると、直径１．０〜２０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は細胞を含み、直径０．２０〜１．０μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群は微小小胞体（ＭＶ）を含み、直径０．０５〜０．０２μｍのサイズを有するＭＯＩの前記個体群はエクソソーム（Ｅｘｏ）を含み、直径０．０５μｍ未満の前記可溶性分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グリカン、脂質又はその組合せを含む。
【００１９】
本開示の実施形態によると、前記ステップ（ｃ）において収穫された前記ＭＯＩ、前記ステップ（ｂ）において可溶性高分子を含む前記濾過液、又は前記ステップ（ａ）においてＭＯＩがそこに保持された前記フィルターに対して、その上又はその中の少なくとも１つのバイオマーカーを検知するための免疫ブロット法、チップ分析、蛍光プローブ分析、酵素又は電気化学反応が行われる。
【００２０】
前記ＭＯＩの前記バイオマーカーの例は、これに限定されないが、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢ２、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、８−オキソヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−シヌクレイン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、β４インテグリン、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、コクリン、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ−１）、β−ガラクトシダーゼ、インターフェロンガンマ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、成長制御アルファタンパク質（ＧＲＯ−α）、シンデカン１、シンデカン４、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ゾヌリン、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）又は核酸を含む。
【００２１】
本開示の更なる態様は、本デバイスの補助によって被検体の尿サンプルから疾患の診断又は予後推測を行う方法を提供することを目的とする。尿サンプルは、細胞、微小小胞体、エクソソーム及び可溶性高分子を含み、前記細胞、前記微小小胞体、前記エクソソーム及び前記可溶性分子の各々は、その上及び／又はその中に発現した標的分子を有する。前記方法は、
（ａ）前記尿サンプルを本デバイスのカートリッジに通過させることにより、前記細胞、前記微小小胞体及び前記エクソソームを少なくとも１つのフィルターによって保持するステップと、
（ｂ）前記カートリッジの、可溶性分子を含む濾過液を収集するステップと、
（ｃ）捕捉分子を、ステップ（ｂ）で収穫された前記可溶性分子に、並びにステップ（ａ）で前記少なくとも１つのフィルターによってそれぞれ保持された前記細胞、前記微小小胞体及び前記エクソソームに添加するステップであって、各捕捉分子はレポーター分子に結合され、前記標的分子に対する結合親和性を示す、ステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における前記標的分子に結合された前記レポーター分子のレベルを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記レポーター分子の検出レベルに基づいて診断又は予後推測を行うステップであって、前記レポーター分子の前記検出レベルが健常被検体から得られた基準サンプルのものと異なる場合に、前記被検体は疾患を有し、又は疾患が進行するリスクにある、ステップと、
を具備する。
【００２２】
本開示の実施形態によると、前記レポーター分子は、タグ分子、放射性分子、蛍光分子、燐光分子、化学発光分子及び酵素からなる群から選択される。
【００２３】
本開示の実施形態によると、ステップ（ｄ）において、前記レポーター分子のレベルは電気化学分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、フローサイトメトリーアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、チップアレイ、ビーズアレイ、ウエスタンブロット解析又はキナーゼアッセイによって検出される。
【００２４】
本開示の実施形態によると、前記捕捉分子は、アプタマー、グリカン、抗体又はその組合せである。
【００２５】
本開示の実施形態によると、前記標的分子は、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、８−オキソヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−シヌクレイン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、β４インテグリン、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、コクリン、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ−１）、β−ガラクトシダーゼ、インターフェロンガンマ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、成長制御アルファタンパク質（ＧＲＯ−α）、シンデカン１、シンデカン４、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ゾヌリン、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）又は核酸のいずれかである。
【００２６】
本開示の実施形態によると、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【００２７】
本開示の実施形態によると、前記疾患は、癌、炎症性疾患、変性疾患、感染症疾患又は生殖疾患であり得る。
【００２８】
前記癌の例は、これに限定されないが、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部癌を含む。
【００２９】
前記炎症性疾患の例は、これに限定されないが、乾癬、大腸炎、火傷、急性腎障害、外傷性脳損傷、皮膚損傷、関節炎及び自己免疫疾患を含む。
【００３０】
前記変性疾患の例は、これに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、脳卒中、慢性腎臓病、慢性肺疾患、良性前立腺肥大及び難聴を含む。
【００３１】
前記感染症疾患の例は、これに限定されないが、バクテリア、ウイルス又は菌類によってもたらされる感染を含む。
【００３２】
前記生殖疾患の例は、これに限定されないが、自然流産、子宮内遅延、子宮内感染、先天性異常、早期分娩、子癇前症及び妊婦糖尿病を含む。
【００３３】
本方法の前記被検体は、好ましくは哺乳類である。本開示の幾つかの実施例によると、前記被検体はヒトである。
【００３４】
本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。
【００３５】
特許又は出願は、カラーで示された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有するこの特許公報又は特許出願公開公報の複製は、要求及び必要な料金の支払に応じて特許庁によって提供されることになる。本記載は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の一実施形態によって構築された生物学的サンプルからＭＯＩを単離するためのデバイス１００を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示の選択的実施形態による図１Ａのデバイス１００を示す模式図である。
【図２】図２は、本開示の一実施形態による、尿ＭＯＩ間のＥ−カドヘリンの差次的発現を示す写真である。
【図３】図３は、本開示の一実施形態によるアニオン交換クロマトグラフィーによるＥＶの単離を示す写真である。
【図４】図４は、本開示の一実施形態による、若年被検体（Ｙ）と高齢被検体（Ｏ）との間の細胞、ＭＶ、ＥＶ間の（Ａ）神経細胞接着分子Ｌ１（ＬＩＣＡＭ）、（Ｂ）神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）及び（Ｃ）好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）の差次的発現を示す写真である。
【図５】図５は、本開示の一実施形態による、正常分娩（Ｎ）又は早期分娩（Ｐ）の妊娠女性間での本デバイスによって独立して単離された細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ（ＥＶ）及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間の種々の血管伝達物質及びサイトカインの差次的発現を示す棒グラフである。
【図６】図６は、本開示の一実施形態による、ＭＶ、Ｅｘｏ及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間の種々のバイオマーカーの差次的発現を示す棒グラフである。
【図７】図７は、本開示の一実施形態による、若年成人被検体（ＡＶＧ−Ｙｏｕｎｇ）と高齢成人被検体（ＡＶＧ−Ｏｌｄ）との間のＭＶ、Ｅｘｏ及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間の種々のバイオマーカーの差次的発現を示す棒グラフである。
【図８】図８は、本開示の一実施形態による、パーキンソン病を有する成人（ＡＶＧ−ＰＤ）と同年齢の健常な成人（ＡＶＧ−Ｃ）との間のＭＶ、Ｅｘｏ及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間の種々のバイオマーカーの差次的発現を示す棒グラフである。
【図９】図９は、本開示の一実施形態による、若年被検体（Ｙ１、Ｙ２）、高齢被検体（Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３及びＯ４）及びＰＤ被検体（ＰＤ１、ＰＤ２）の間のロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）の発現を示す写真である。
【図１０】図１０は、本開示の一実施形態による、若年成人被検体と高齢（Ｏｌｄ）成人被検体との間のＭＶ、Ｅｘｏ及び濾過液（Ｓｏｌｎ）間のＤＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、本開示の一実施形態による、ＰＤを有する又は有さない高齢被検体間のＭＶ、Ｅｘｏ及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間の８ＯＨｄＧのレベルを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、本開示の一実施形態による、デングウイルス感染に罹患した被検体におけるＭＶ、Ｅｘｏ及び可溶性濾過液（Ｓｏｌｎ）間のデングウイルスＮＳ１抗原、タンパク質バイオマーカー及びＤＮＡのレベルのデータを示し、（Ａ）はＮＳ１抗原のウエスタンブロット解析であり、（Ｂ）及び（Ｃ）は（Ｂ）臨床的前兆を示さなかったデング被検体及び（Ｃ）臨床的前兆を示したデング被検体におけるＭＶ及びＥｘｏ間のバイオマーカーの差次的発現をそれぞれ示す棒グラフであり、（Ｄ）は健常な被検体とデングウイルス感染した被検体との間のＭＶ及びＥｘｏ間の８ＯＨｄＧのレベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップのシーケンスを説明する。ただし、同一又は同等の機能及びシーケンスは、異なる実施例によっても実現され得る。
【００３８】
１．定義
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的専門用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の語はその複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
【００３９】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって検討される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【００４０】
ここで使用される用語「対象物質（ＭＯＩ）」とは、本開示のデバイスによって保持され得る細胞、小胞体、微小小胞体（ＭＶ）及びエクソソーム（Ｅｘｏ）のような物質のことをいい、特に、直径０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６７、０．６６、０．６７、０．６８、０．０６９、０．７、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９及び１．０μｍなど、少なくとも直径０．０５μｍの物質、そして、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカインなどと同様の可溶性分子のような、本デバイスの濾過液に存在する直径０．０５μｍ未満の可溶性分子（すなわち、デバイスを通過して最終濾過液となる分子）のことをいう。
【００４１】
ここで使用される用語「診断」とは、当業者が  患者が所与の疾患又は状態を患っているか否かの確率（可能性）を推定及び／又は特定することができる方法のことをいう。本開示の場合では、「診断」は、サンプルが取得及び測定される被検体について、本発明の特異的な標的分子の発現レベルを選択的に他の臨床的特徴とともに用いて、癌、変性疾患、感染症疾患又は老化の診断（すなわち、発生又は未発生）に帰着することを含む。そのような診断が「特定される」ことは、診断が１００％正確であることを示唆することを意味しない。多数のバイオマーカーが、複数の状態を示す。熟練臨床医は情報空白時にはバイオマーカーの結果を用いるのではなく、試験結果が他の臨床的インディシアとともに用いられて診断に帰着する。したがって、所定の診断閾値の一方の側の測定バイオマーカーレベルは、所定の診断閾値の他方の側の測定レベルに対して、被検体における疾患の発生のより大きな可能性を示す。
【００４２】
ここでの用語「リスク」とは、結果が、望まれない結果、例えば、疾患又は状態の発生、進行又は再発、例えば、早期分娩、変性疾患、感染症疾患、老化などをもたらさない可能性のことをいう。
【００４３】
用語「投与され」、「投与する」又は「投与」は、本発明の薬剤（例えば、抗変性、抗感染症又は抗老化薬剤）を、限定することなく、静脈内に、筋肉内に、関節内に、腫瘍内に、腹腔内に、動脈内に、頭蓋内に、又は皮下に投与することを含む送達のモードをいうのにここでは互換可能に使用される。
【００４４】
ここで使用される「治療／処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患又は状態の防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的な治療／処置を含み、（１）疾患又は状態に罹患しやすいが未だにそれを有していると診断されていない個人において、疾患又は状態（例えば、癌、変性疾患、感染症疾患又は老化）が発生することの防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的な治療、（２）疾患又は状態を（例えば、その進行を阻止することによって）阻害すること、又は（３）疾患又は状態を（例えば、その疾患又は状態に関連する症状を軽減して）緩和することを含む。
【００４５】
ここでいう用語「有効量」は、所望の反応をもたらすのに充分な量の成分を示す。治療の目的のため、有効量は、治癒的に有益な効果が成分の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。薬剤の有効量は、疾患又は状態を治癒することは要件とされないが、疾患若しくは状態の発症が遅延、阻害若しくは予防され、又は疾患若しくは状態の症状が改善されるように、疾患又は状態に対する治療を与えることになる。有効量は、指定期間を通じて１、２又はそれ以上の回数で投与されるように適切な形態で１、２、又はそれ以上の用量に分けられてもよい。具体的な有効な又は充分な量は、治療されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、治療されている哺乳類又は動物の種類、治療の継続期間、（それがある場合には）同時に行われる治療の性質、並びに採用される具体的調剤及び化合物又はその誘導体の構造といった要因とともに変化することになる。有効量は、例えば、細胞数、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで、又は体重の１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｋｇ）として表現され得る。あるいは、有効量は、細胞濃度、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比のような活性成分（例えば、本開示の抗変性又は抗感染症薬剤）の濃度で表現されることもある。当業者であれば、動物モデルから決定された用量に基づいて（本抗変性又は抗感染症薬剤などの）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された工業用ガイダンス「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」に従うことができる。
【００４６】
本開示においてここで使用される用語「被検体」とは、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びウマのことをいう。用語「被検体（被検者）」は、ある性別が具体的に示されない限り、雄／男性及び雌／女性の両方をいうものとする。好適な実施形態によると、被検体はヒトである。
【００４７】
用語「健常被検体（被検体）」とは、疾患又は状態を有さない被検体、例えば、早期分娩の症状、変性疾患若しくは感染症疾患を有さない被検体又は老化状態にない被検体（すなわち、３０歳前後又はそれ未満の被検体）のことをいう。一般に、用語「健常被検体（被検体）」とは、疾患又は状態を有するものと診断されていない被検体のことをいい、疾患又は状態に関連する１以上（例えば、２、３、４又は５個）の症状を示さない被検体のことをいう。
【００４８】
ＩＩ．本発明の説明
１．生物学的サンプルからＭＯＩを単離するためのデバイス及び方法
この発明の全体的な概念は、生物学的サンプルからＭＯＩ（例えば、細胞、微小小胞体、エクソソームなど）を単離することにあり、単離は、サイズ排除、親和性又はイオン強度の変化によって達成される。したがって、デバイスは、サイズ排除カラム、アフィニティーカラム、エルトリエーター又は多孔質膜であり得る少なくとも１つのフィルターの使用によって構成される。そして、結果として単離されたＭＯＩはその中に又はその上に存在するバイオマーカーに対する分析を受けることになるので、生物学的サンプルが由来する被検体の疾患及び／又は状態の診断及び／又は予防が、健常な正常被検体に由来するサンプルであり得る対照サンプルのものとの比較として、バイオマーカーの検出レベルに基づいて行われ得る。
【００４９】
１．１  サイズ排除によるＭＯＩの単離
図１Ａは、本開示の実施例１．１によって構築された生物学的サンプルからＭＯＩを単離するためのデバイス１００を示す模式図である。デバイス１００は、３個の直列接続されたフィルター１１０、１２０及び１３０を内部に備えるカートリッジ１１０を備える。３個のフィルター１１０、１２０及び１３０は、それぞれ多孔質膜であり、降順の孔径で並べられる。具体的には、カートリッジ１１０の注入口１０１から排出口１０２にかけて、１つのフィルターの孔径が後続のフィルターのものよりも大きくなる。言い換えると、第１のフィルターにおける孔径は第２のフィルターのものよりも大きく、それは第３のフィルターのものよりも大きい。本開示の好適な一実施形態によると、第１のフィルター１１０は直径約０．８〜１μｍの孔を備え、第２のフィルター１２０は直径約０．２０〜０．２２μｍの孔を備え、第３のフィルター１３０は直径約０．０３〜０．０５μｍの孔を備える。このフィルターの配置によって、直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．０２μｍのサイズを独立して有するＭＯＩの少なくとも３個の個体群が単離され得る。
【００５０】
動作中、カートリッジ１１０は、好ましくは、カートリッジ１１０の注入口１１０を上向きにし、カートリッジ１１０の排出口１０２を下向きにして直立位置に配置される。生物学的サンプル（例えば、尿サンプル）のアリコートは、注入口１０１から供給され、第１のフィルター１１０を通過して下方に流れ、そこでは直径１．０〜２０μｍ、好ましくは少なくとも直径０．８μｍの生物学的サンプルにおけるＭＯＩ（例えば、細胞）が第１のフィルター１１０に保持され、サンプルの残りが下方に第２のフィルター１２０に流れ続けて、そこでは直径０．２〜１．０μｍ、好ましくは少なくとも直径０．２μｍのＭＯＩ（例えば、ＭＶ）が第２のフィルター１２０に保持され、その後にサンプルの残りが下方に第３のフィルター１３０に流れ続けて、そこでは直径０．２〜０．０５μｍ、好ましくは少なくとも直径０．０５μｍのＭＯＩ（例えば、エクソソーム）が保持される。３個のフィルター１１０、１２０及び１３０のいずれによっても保持できない物質を含有するサンプルの残りは濾過液となり、それはカートリッジ１１０の排出口１０２から収集される。一般に、カートリッジ１１０に供給されるとサンプルのアリコートは、重力の作用によって自然にカートリッジ１１０を通過して流れる。代替的又は選択的に、サンプルは、ポンプ、シリンジなどの補助によって手動的又は自動的に、力の補助によって押し出されてもよい。
【００５１】
代替的又は選択的に、図１Ｂに示すように、デバイス１００は、動作前及び／又は動作中に生物学的サンプルを収容するためにカートリッジ１１０の上流側に配置された第１の貯蔵容器１６０をさらに含んでいてもよい。代替的又は選択的に、生物学的サンプルにおける直径２０μｍ超の分子がカートリッジ１１０に浸入しないようにするために、追加のフィルター１５０（すなわち、第４のフィルター１５０）が、第１の貯蔵容器１６０の後段であってカートリッジ１１０の前段に配置されてもよい。代替的又は選択的に、第２の貯蔵容器１７０が、デバイス１００から溶出された濾過液を収集するためにカートリッジ１１０の排出口１０２の下流側に配置されてもよい。
【００５２】
本開示の実施形態によると、第１のフィルターによって保持される少なくとも０．８μｍのＭＯＩは細胞であり、第２のフィルターによって保持される少なくとも０．２μｍのＭＯＩは微小小胞体（ＭＶ）であり、第３のフィルターによって保持される少なくとも０．０５μｍのＭＯＩはエクソソーム（Ｅｘｏ）である。カートリッジの排出口１０２から収集される濾過液は、直径０．０５μｍ未満のＭＯＩ（すなわち、可溶性高分子）を含む。直径０．０５μｍ未満のＭＯＩ（すなわち、可溶性分子）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グリカン、脂質又はその組合せを含む。
【００５３】
第１、第２及び第３のフィルターによってそれぞれ保持されたＭＯＩ、その他濾過液に存在するＭＯＩは、当業者に周知の被分析バイオマーカーに特異的な適切な手段によってその上又はその中に発現したバイオマーカーのレベル及び／又はパターンについて、独立して収穫及び分析され得る。
【００５４】
１．２  親和性又はイオン強度の変化によるＭＯＩの単離
本開示の代替的実施形態によると、生物学的サンプルからのＭＯＩの単離は、アフィニティーカラムの使用によって達成される。したがって、デバイスは、ＭＯＩを単離するためのフィルターとして作用するアニオン交換カラムを備える。この特定の実施形態では、生物学的サンプル（例えば、尿サンプル）のアリコートが、アニオン交換カラムを備える本デバイスに供給され、そして所望のサイズのＭＯＩが高濃度の塩類溶液によって溶出される。この態様によって、直径１．０〜２０μｍ、０．２０〜１．０μｍ又は０．０５〜０．２０μｍのサイズを独立して有するＭＯＩの少なくとも３個の個体群が単離される。具体的には、直径１．０〜２０μｍのサイズを有するＭＯＩの個体群は細胞を含み、直径０．２０〜１．０μｍのサイズを有するＭＯＩの個体群は微小小胞体（ＭＶ）を含み、直径０．０５〜０．２０μｍのサイズを有するＭＯＩの個体群はエクソソーム（Ｅｘｏ）を含む。
【００５５】
１．３  本デバイスのフィルター
本開示の実施形態によると、本デバイス及び／又は方法の使用に適したフィルターは、フィルターで構成される材料は所望のサイズ及び特性のＭＯＩを保持することができることを条件として、セラミック、樹脂、金属、ポリマー、中空繊維又はその組合せによって構成され得る。
【００５６】
本デバイスのフィルターを構成するのに適したセラミックの例は、これに限定されないが、ゼオライト、シリカ、シリコンカーバイド、アルミナ、チタン酸アルミニウム、スピネル、ムライト、リン酸ジルコニウム、ペロブスカイト及びその組合せを含む。
【００５７】
本デバイスのフィルターを構成するのに適した樹脂の例は、これに限定されないが、有機化合物、合成化合物及びその組合せを含む。
【００５８】
本デバイスのフィルターを構成するのに適した金属の例は、これに限定されないが、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、銀、金、カドミウム、コバルト、鉄、モリブデン、ニオビウム、銅、パラジウム、白金、ロジウム、ルテニウム、タンタル、チタン、タングステン、ジルコニウム、合金及びその組合せを含む。
【００５９】
本デバイスのフィルターを構成するのに適したポリマーの例は、これに限定されないが、ポリセルロース、ポリエステル、ポリエーテル、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオレフィン、ポリウレア、ポリエステル−アミド、ポリエチレン−テレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシロキサン、ポリスルホン、ポリエステル−ウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル及びその組合せを含む。
【００６０】
本デバイスのフィルターを構成するのに適した中空繊維の例は、これに限定されないが、炭素繊維、ガラス繊維、金属繊維及びその組合せを含む。
【００６１】
本開示の実施形態によると、ＭＯＩを単離するのに適した生物学的サンプルの例は、これに限定されないが、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、羊水、気管支肺胞洗浄液、血液又は唾液を含む。好ましくは、ＭＯＩを単離するのに尿が用いられる。
【００６２】
２．本方法及び／又はデバイスによって保持及び／又は単離されたＭＯＩの使用
本デバイスは、上記の１個のアフィニティーカラム又は上述の３個の直列接続された多孔質膜フィルターのいずれかを備え、手動的又は自動的に動作するように設計され得る。手動モードでは、所望のＭＯＩがそこに保持された各フィルターが、カートリッジから手動で分解され、ユーザのニーズ及び／又はインストラクションに応じて、ＤＮＡ、バイオマーカーなどのレベルの測定などの後の分析を受け得る。代替的又は選択的に、デバイスは自動的に動作するように設定されてもよく、そこではデバイスは適切な分析器に結合されてもよく、それにより、ＭＯＩの単離が完了すると、所望のＭＯＩがそこに保持された各フィルターは、ユーザのニーズ及び／又はインストラクションに応じて、免疫測定法、クロマトグラフィー分析、チップアレイ分析、電気化学分析などのような予め指定されたアッセイを自動的に受ける。
【００６３】
フィルターに保持されたＭＯＩ及び濾過液に存在するＭＯＩを含む、本方法及び／又はデバイスによって単離されたＭＯＩは、当業者に周知の被分析バイオマーカーに特異的な適切な手段によってその上又はその中に発現したバイオマーカーのレベル及び／又はパターンについて、独立して収穫及び分析され得る。ＭＯＩにおけるバイオマーカーの検出されたレベル及び／又はパターンは、被検体における病理学上の状態の診断及び／又は予防のためのインジケーターとして作用し得る。
【００６４】
本開示の一実施形態では、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）のような血管伝達物質のレベル及び発現パターン、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、その他ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）及びインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）を含むサイトカインが、妊娠女性の尿サンプルから単離されたＭＯＩ（本デバイスに保持された細胞、ＭＶ及びエクソソームを含む）においてそれぞれ検出される。本開示の実施形態によると、ｓＦｌｔ１／ＩＬ−１０、ＰＡＰＰＡ／ＩＬ−１０又はＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１０の比が比較的高いほど、妊娠女性の早期分娩のリスクは高くなる。
【００６５】
他の実施形態では、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのバイオマーカーのレベル及び／又は発現パターンは、若年又は高齢被検体の尿サンプルから単離されたＭＯＩ（フィルターに保持された細胞、ＭＶ及びエクソソーム並びにカートリッジから溶出された濾過液を含む）においてそれぞれ検出される。好適な実施形態によると、高齢被検体は高いレベルの、ＭＶにおけるＦＧＦ−１、エクソソームにおけるＶＥＧＦ−Ｄ及び可溶性フラクション（すなわち、本方法及び／又はデバイスの最終濾過液）におけるＰＬＧＦを有する一方で、若年被検体は高いレベルの、ＭＶにおけるＦＧＦ−２を有する。
【００６６】
更なる実施形態では、ＦＧＦ−１、ＨＢ−ＥＧＦ及びレプチンなどのバイオマーカーのレベル及び／又は発現パターンは、パーキンソン病（ＰＤ）を有する又を有さない高齢被検体の尿サンプルから単離されたＭＯＩ（フィルターに保持された細胞、ＭＶ及びエクソソーム並びにカートリッジから溶出された濾過液を含む）においてそれぞれ検出される。好適な一実施形態によると、ＰＤ被検体の単離されたエクソソームは、高いレベルのレプチンを示したが、同年齢の健常な成人においては無視できる量のレプチンしか見られなかった。
【００６７】
更なる実施形態では、デングウイルスＮＳ１抗原のレベル、そしてＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＦＧ−Ａ、レプチンなどのようなバイオマーカーのレベル及び／又は発現パターンが、デングウイルス感染を患う被検体の尿サンプルから単離されたＭＯＩ（フィルターに保持された細胞、ＭＶ及びエクソソーム並びにカートリッジから溶出された濾過液を含む）においてそれぞれ検出される。好適な一実施形態によると、著しいレベルのＮＳ１抗原が、デング患者から単離されたＭＶで見られた。また、デング患者の尿ＭＶ及びＥｘｏは著しく高いレベルのＥＧＦを有したが、尿エクソソームだけはＧ−ＣＳＦの発現を有した。また、臨床的前兆を示すデング被検体は、前兆のないデング患者のものと比較して、高いレベルのレプチン及びＶＥＧＦ−Ａを有したが、低いレベルのＧ−ＣＳＦを有した。
【００６８】
２．１  本デバイス及び／又は方法の補助による被検体の病理学的状態の予後推測
そこで、本開示はまた、生物学的サンプルが本デバイス及び／又は方法によって単離されたＭＯＩを備える被検体の生物学的サンプルから疾患の診断又は予後推測を行う方法を提供する。したがって、単離されるＭＯＩは細胞、微小小胞体、エクソソーム及び可溶性高分子の場合があり、細胞、微小小胞体、エクソソーム及び可溶性分子の各々はその上及び／又はその中に発現した標的分子を有する。方法は、
（ａ）生物学的サンプルを本デバイスのカートリッジに通過させることにより、細胞、微小小胞体及びエクソソームをそれぞれ保持するステップと、
（ｂ）カートリッジの、可溶性分子を含む濾過液を収集するステップと、
（ｃ）捕捉分子を、ステップ（ｂ）で収穫された可溶性分子に、並びにステップ（ａ）で本デバイスによってそれぞれ保持された細胞、微小小胞体及びエクソソームに添加するステップであって、各捕捉分子はレポーター分子に結合され、標的分子に対する結合親和性を示す、ステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における標的分子に結合されたレポーター分子のレベルを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）におけるレポーター分子の検出レベルに基づいて診断又は予後推測を行うステップであって、レポーター分子の検出レベルが健常被検体から得られた基準サンプルのものと異なる場合には、被検体は疾患を有し又は疾患が進行するリスクにある、ステップと、
を備える。
【００６９】
本方法における使用に適したレポーター分子の例は、これに限定されないが、タグ分子、放射性分子、蛍光分子、燐光分子、化学発光分子及び酵素を含む。
【００７０】
本開示の実施形態によると、ステップ（ｄ）において、レポーター分子のレベルは電気化学分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、フローサイトメトリーアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、チップアレイ、ビーズアレイ、ウエスタンブロット解析又はキナーゼアッセイによって検出される。
【００７１】
本開示の実施形態によると、捕捉分子は、アプタマー、グリカン、レクチン、抗体又はその組合せであり得る。
【００７２】
ＭＯＩにおける標的分子の例は、これに限定されないが、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、８−オキソヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−シヌクレイン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、β４インテグリン、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、コクリン、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ−１）、β−ガラクトシダーゼ、インターフェロンガンマ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、成長制御アルファタンパク質（ＧＲＯ−α）、シンデカン１、シンデカン４、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ゾヌリン、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）及び核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含む。
【００７３】
本開示の実施形態によると、適切な方法（例えば、免疫ブロット法、チップ分析、蛍光プローブ分析、酵素又は電気化学反応）を介して検知された、種々の特異的なマーカーの発現パターン及び／又は特定のマーカーの発現レベルの比が、疾患の診断及び／又は予後推測を行うのに使用可能である。
【００７４】
本開示の実施形態によると、本方法によって診断され得る疾患は、これに限定されないが、癌、炎症性疾患、変性疾患、感染症疾患又は生殖疾患を含む。
【００７５】
本方法によって診断され得る癌の例は、これに限定されないが、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部癌を含む。
【００７６】
本方法によって診断され得る炎症性疾患の例は、これに限定されないが、乾癬、大腸炎、火傷、急性腎障害、外傷性脳損傷、皮膚損傷、関節炎及び自己免疫疾患を含む。
【００７７】
本方法によって診断され得る変性疾患の例は、これに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、脳卒中、慢性腎臓病、慢性肺疾患、良性前立腺肥大及び難聴を含む。
【００７８】
本方法によって診断され得る感染症疾患の例は、これに限定されないが、バクテリア、ウイルス又は菌類によってもたらされる感染を含む。
【００７９】
本方法によって診断され得る生殖疾患の例は、これに限定されないが、自然流産、子宮内遅延、子宮内感染、先天性異常、早期分娩、子癇前症及び妊婦糖尿病を含む。
【００８０】
２．２  疾患及び／又は状態の治療の方法
ここに開示するのは、本開示の方法の予後又は診断結果に基づいて被検体における早産、変性疾患又は感染症疾患を治療する方法でもある。具体的には、被検体における早産、変性疾患又は感染症疾患を治療する方法は、
（ａ）被検体から生物学的サンプルを取得するステップと、
（ｂ）本デバイスの使用によって生物学的サンプルからＭＯＩを単離するステップと、
（ｃ）ＭＯＩの少なくとも１つの標的分子の発現レベルを検出するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された少なくとも１つの標的分子の発現レベルに基づいて被検体を治療するステップと、
（ｄ）ＭＯＩの少なくとも１つの標的分子の発現レベル又は２つの標的分子の発現レベルの比が、健常被検体から得られた基準サンプルのものとは異なる（すなわち、より高い又はより低い）場合に、有効量の治療薬剤を被検体に投与するステップと、
を備える。
【００８１】
治療方法のステップ（ａ）〜（ｃ）は、本開示の１．１又は１．２章において説明した方法のステップと同様であるので、説明の簡明化のため、ここではその詳細な説明を省略する。
【００８２】
ステップ（ｄ）において、当業者又は臨床医は、ステップ（ｃ）で検出された発現レベルに応じて有効量の治療薬剤（例えば、抗変性薬剤又は抗感染症薬剤）を、それを必要とする被検体に投与することができる。具体的には、上述したように、基準サンプルの物とは異なる、１以上の標的分子の発現レベル又は２つの標的分子の発現レベルの比を有する被検体は、被検体が変性疾患又は感染症疾患を有し又はそれを進行させるリスクにあることを示し、それに従って、当業者又は臨床医は、適切な治療をそのような被検体に施すことにより、変性疾患又は感染症疾患の発生又はそれに関連する症状を予防、軽減及び／又は改善することができる。
【００８３】
本開示では、治療薬剤は、健常被検体の物とは異なるＭＯＩ（例えば、ＭＶ）における１以上の標的分子の発現パターンを有する被検体に投与され、ここで治療薬剤は被検体のＭＯＩにおける１以上の標的分子の発現パターンを取り戻し得るアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。
【００８４】
早産を予防し得る治療薬剤の例は、これに限定されないが、プロゲステロン、コルチコステロイド、ニフェジピンなどを含む。
【００８５】
変性疾患を治療する際に有効な治療薬剤の例は、これに限定されないが、クルクミン、分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリンを含む、ＢＣＡＡ）、コリンエステラーゼ阻害剤（ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、ガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）及びリバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ））、メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）、オメガ−３脂肪酸、イチョウ、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ及びビタミンＥを含む）、レボドパ、カルビドパ、ドーパミンアゴニスト（プラミペキソール（Ｍｉｒａｐｅｘ）、ロピニロール（Ｒｅｑｕｉｐ）、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ）及びアポモルヒネ（Ａｐｏｋｙｎ）など）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（セレギリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ、Ｚｅｌａｐａｒ）、ラサギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）、サフィナミド（Ｘａｄａｇｏ）などのＭＡＯ阻害剤）、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤（エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ）及びトルカポン（Ｔａｓｍａｒ）など、ＣＯＭＴ阻害剤）、抗コリン薬（ベンザトロピン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ）及びトリヘキシフェニジルなど）及びアマンタジンを含む。
【００８６】
感染症を治療する際に有効な治療薬剤の例は、これに限定されないが、抗ウイルス抗体、抗生物質、インターフェロンアルファ、アプタマーなどを含む。
【００８７】
治療薬剤は、適切な経路、例えば、局所的、粘膜的（例えば、結膜内、鼻腔内、気管内）、経口、脊髄内（例えば、髄腔内）、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、関節内、心室内、脳室内、腹腔内、腫瘍内及び中耳内投与によって被検体に投与され得る。
【００８８】
理解されるように、本方法は、単独で、又は変性疾患、感染症疾患若しくは早期分娩の治療に何らかの有益な効果を有する追加の療法と組み合わせて、被検体に適用可能である。意図される目的に応じて、本方法は、追加の療法の投与前、投与中又は投与後に被検体に適用可能である。
【００８９】
２．３  標的分子の使用
本開示の他の態様は、キットの製造のためのバイオマーカーとして作用する標的分子の使用に向けられる。本開示の使用は、
バイオマーカーは、ＭＯＩ内又はＭＯＩ上に発現する標的分子であり、
キットは、被検体が早産、変性疾患又は感染症疾患を有し又はその進行のリスクにあるかの診断又は予後推測を行うのに有用であり、
早産の予後推測又は診断においては、標的分子は、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ及びその組合せからなる群から選択され、
変性疾患の予後推測又は診断においては、標的分子は、ＥＧＦ−１、レプチン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−２、ＨＧＦ、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン、フラクタルキン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−３、核酸（ＤＮＡなど）及びその組合せからなる群から選択され、
感染症疾患の診断又は予後推測においては、標的分子は、ＮＳ−１であり、
ＭＯＩの標的分子の発現レベル又は２つの標的分子の発現レベルの比が、健常被検体から取得された基準サンプルのものとは異なる（すなわち、より高い又はより低い）場合に、被検体は、早産、変性疾患又は感染症疾患を有し又はその進行のリスクにあることを示すことを特徴とする。
【００９０】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を明瞭にして本発明の実施の際に当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本発明をその最大の範囲で利用することができるはずである。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。
【実施例】
【００９１】
材料及び方法
ＭＯＩにおけるプロテオミクスプロファイルの検出
尿サンプルに由来するＭＯＩ（すなわち、ＭＶ又はＥｘｏ）のタンパク質ペプチドに、ＩＴＲＡＱ（登録商標）（相対及び絶対定量化のための等圧タグ）のアッセイを行った。各ＭＯＩにおけるタンパク質濃度を、検討の前に測定及び等化した。ＩＴＲＡＱ（登録商標）法は、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分光測定から取得されるタンパク質サンプル間のペプチドの比較に適した等圧フラグメントを生成する化合物で標識化するペプチドに基づくタンパク質定量法である。ＩＴＲＡＱ（登録商標）試薬１１４、ＩＴＲＡＱ（登録商標）試薬１１５、ＩＴＲＡＱ（登録商標）試薬１１６及びＩＴＲＡＱ（登録商標）試薬１１７の４個の等圧試薬のセットとして与えられたアプライドバイオシステムズＩＴＲＡＱ（登録商標）試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、米国）を採用して各ＭＯＩのタンパク質を標識化し、４個のサンプルを作製し、それにより４−プレックスサンプル分析をＬＣ／ＭＳ−ＭＳ実験において行った。各サンプルをトリプシンによってペプチドに消化させ、標準化された個々の等圧フラグメントで標識化し、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析によって読み取った。
【００９２】
Ｅ−カドヘリンレベルの検出
各サンプル（例えば、細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及びＳｏｌｎ）におけるＥ−カドヘリンのレベルを１ｍｌのトリス緩衝液（ＴＢＳ）において２時間にわたってビオチン標識化アプタマー（１００μＭ）と混合することによって検出した。５ｍｌのＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）で３回洗浄した後に、サンプルをストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）溶液で２時間プローブ分析した。５ｍｌの０．１％ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、サンプルをＨＲＰ基質試薬に曝露し、化学発光露光スクリーンが装備されたｍｙＥＣＬイメージャーによって読み取った。
【００９３】
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）レベルの検出
各サンプル（例えば、細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及びＳｏｌｎ）におけるＮＧＡＬのレベルを１ｍｌのトリス緩衝液（ＴＢＳ）において２時間にわたってビオチン標識化特異的抗体（１：５００）によって検出し、その後に５ｍｌのＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄してから、サンプルをストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）溶液で２時間プローブ分析した。５ｍｌの０．１％ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、サンプルをＨＲＰ基質試薬に曝露し、化学発光露光スクリーンが装備されたｍｙＥＣＬイメージャーによって読み取った。
【００９４】
ウエスタンブロットアッセイ
尿サンプルに由来するＭＯＩの総タンパク質の２０マイクログラムに、変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質ゲルを、電気泳動後に、半乾燥転写装置によってニトロセルロース膜に転写した。トリス緩衝液（５０ｍＭ）における非特異的結合のブロッキングのためにその膜を脱脂粉乳とともにインキュベートし、その後、抗体（１：２０００希釈）又はアプタマー（１００ｎＭ、例えば、それぞれＥ−カドヘリン及びムチン５Ａｃに特異的な、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１又は２のアプタマー）とともにインキュベーションを行った。トリス緩衝液で洗浄して未結合の抗体又はアプタマーを除去した後、特異的なタンパク質の発現レベルをストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）化学発光反応を介して検知した。
【００９５】
尿におけるクレアチニンレベルの検出
尿におけるバイオマーカーレベルは様々な病理学的状態（例えば、空腹時又は食後の状態）において尿の濃度に影響を受けることになるので、尿クレアチニンレベルを測定して病理学的状態におけるばらつきからもたらされる変化を補正及び／又は補償した。各サンプル（例えば、細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及びＳｏｌｎ）における総タンパク質を、放射性免疫沈降法アッセイバッファー（ＲＩＰＡバッファー、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット）による溶解の後に、標準分光光度計又は５６２ｎｍにおけるプレートリーダーによって、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いた比色検出法によって測定した。尿クレアチニンレベルをアルカリ性ピクリン酸溶液の比色アッセイキットによって測定した。尿サンプルを希釈し（１０μＬのサンプルが１９０μＬの脱イオン水で希釈された１：２０の希釈）、５０μｌの希釈サンプルを１００μｌのアルカリ性ピクリン酸溶液に添加し、３０分間反応させた。クレアチニン濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いた４９０ｎｍの光学密度における標準曲線（０．３ｍｇ／ｄＬ−２０ｍｇ／ｄＬ）との比較によって検出した。
【実施例１】
【００９６】
実施例１  本デバイスの構築及び試験
１．１  直列接続されたフィルターを備えるデバイスによるＭＯＩの単離
この実施例では、本デバイスのプロトタイプを構築及び試験した。簡単に説明すると、各々が孔径０．８μｍ、０．２μｍ及び／又は０．０５μｍを有する２又は３個のフィルターを直列接続した。フィルターは細胞（サイズ約０．８〜１μｍ）、微小小胞体（サイズ約０．２〜０．８μｍ）及びエクソソーム（サイズ約０．０５〜０．２０μｍ）を捕捉するように独立して設計され、これらフィルターに保持されない物質はいずれもデバイスを通過した濾過液に収集されることになる。
【００９７】
処理を開始するために、生物学的サンプルを第１のフィルター（０．８μｍ）の注入口から供給し、デバイス全体を（例えば、シリンジの使用によって）滴下して通過させ又は押し出して通過させ、各フィルターに保持された物質、そして最終濾過液（すなわち、第３のフィルター（０．０５μｍ）の濾過液）を収集した。さらに、各フィルターを通過した濾過液、そして各フィルターに保持された物質を後の検出のためにサンプリングした。
【００９８】
デバイスを試験するため、尿サンプル（約３０ｍＬ）をデバイスに通過させてから、各フィルターを通過した濾過液、そして各フィルターに保持された物質を独立して収集し、デバイスによって単離されたＭＯＩの各個体群に発現したＥ−カドヘリンのレベルを検出する分析を行った。Ｅ−カドヘリンのレベルをビオチン標識化アプタマーによってモニタリングし、「材料及び方法」の章で説明した化学発光検知によって増幅した。
【００９９】
Ｅ−カドヘリンは細胞、微小小胞体及びエクソソーム間で異なる態様で発現するが、Ｅ−カドヘリンは可溶性高分子が収集された濾過液には見られないことが分かった（図２）。
【０１００】
１．２  イオンクロマトグラフィーによる尿ＥＶの単離
この実施例では、イオン交換カラムを採用して尿ＥＶを単離した。簡単に説明すると、尿サンプル（約３０ｍＬ）をアニオン交換カラム（すなわち、ＡＩＥＸクロマトグラフィー）に通過させ、それを塩化ナトリウム溶液（１Ｍ）で溶出し、単離されたエクソソームをその上のＣＤ９の発現をモニタリングすることによって確認した（図３参照）。
【実施例２】
【０１０１】
実施例２  若年及び高齢被検体におけるＭＯＩ間の神経特異的バイオマーカーの発現パターン及びプロテオミクス表示
ＭＯＩを、「材料及び方法」の章で説明したようにＭＯＩ間の好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）及び神経細胞接着分子Ｌ１（ＬＩＣＡＭ）の発現をビオチン標識化特異的抗体によってモニタリングし、化学発光検知によって増幅したことを除き、実施例１．１で説明した手順に従って若年被検体（３０歳未満）及び高齢被検体（６０歳超）から採取された尿サンプルから単離した。
【０１０２】
ＬＩＣＡＭはＥｘｏ及びＭＶに存在し、高レベルのＮＳＥが若年成人よりも高齢成人に見られることが分かった。また、若年被検体ではＮＧＡＬのレベルはＭＶにおいてより高いが、高齢被検体ではＮＧＡＬの発現が、細胞、ＭＶ及びエクソソーム間で顕著に同様に見られた（図４）。
【０１０３】
若年被検体と高齢被検体の間でのＭＶ及びＥｘｏにおけるプロテオミクス表示のために、合計１９０２個のタンパク質がｉＴＲＡＱ（相対及び絶対定量化のための等圧タグ）質量分光測定によって同定され、６２個が若年被検体（３０歳未満）と高齢被検体（６０歳超）に由来するエクソソーム間で大幅に異なった。データを表１にまとめる。
【０１０４】
表１  若年被検体と高齢被検体の間のＭＶ及びＥｘｏにおけるタンパク質の差次的表示
【表１】
2020162588.tif 000003
【実施例３】
【０１０５】
実施例３  正常出産又は早産の妊娠女性におけるＭＯＩ間の血管伝達物質及びサイトカインの差次的発現
妊娠女性における早期分娩を誘発し得る要因を同定するために、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、その他ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）及びインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）を含む種々の血管伝達物質レベルを、妊娠女性から採取された尿サンプルにおけるＭＯＩ間でそれぞれ検出した。
【０１０６】
合計１５０人の妊娠女性を、事前の書類による同意の下で本研究のために採用した。尿サンプル（各４０ｍＬ）を妊娠期間（ＧＡ）１２週と１６週の間で採取し、１５０人の妊娠女性のうちの１０人が平均３２週間と５日のＧＡ（２２週間と５日から３５週間と５日のＧＡ）において早期分娩となった。この１０個の尿サンプル（すなわち、早期分娩の女性）を、同じ分娩期間中の正常分娩の女性から採取された他の１０個の尿サンプルと照合した。全ての尿サンプル（各４０ｍＬ）に、実施例１．１．１で説明したＭＯＩ（すなわち、細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ（ＥＶ）及びＳｏｌｎ）の分離を行った。そして、各ＭＯＩに、成長因子（すなわち、ｓＦｌｔ１、ＰＡＰＰＡ、ＢＮＤＦ、ＩＧＦＢＰ１）及びサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ１ｒａ）のそれぞれのレベルの検出のためにマイクロ流体チップアッセイを行った。結果を図５に示す。
【０１０７】
早期分娩の妊娠女性（Ｐ）の尿サンプルから単離された細胞、ＭＶ、Ｅｘｏ及び／又はＳｏｌｎは、正常分娩の妊娠女性（Ｎ）からのものと比較して、高いレベルのｓＦｌｔ１、ＰＡＰＰＡ及びＩＬ−１ｒａ並びに低いレベルのＩＬ−１０を有することが分かった。全てのＭＯＩにおけるｓＦｌｔ１のレベルは早期分娩のグループにおいて非常に高く、ＭＶ又はＥｘｏフラクションにおけるＩＬ−１０のレベルは早期分娩のグループにおいて非常に低かった（図５の左パネル参照）。
【０１０８】
また、ｓＦｌｔ１／ＩＬ−１０、ＰＡＰＰＡ／ＩＬ−１０及びＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１０を含む、成長因子（すなわち、ｓＦｌｔ１及びＰＡＰＰＡ）とサイトカイン（すなわち、ＩＬ−１０）との比を計算し、図５の右パネルに示した。ｓＦｌｔ１／ＩＬ−１０、ＰＡＰＰＡ／ＩＬ−１０又はＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１０の比が高いほど、女性の早期分娩のリスクは高くなることが分かった。
【実施例４】
【０１０９】
実施例４  若年及び高齢被検体又はパーキンソン病（ＰＤ）の被検体におけるＭＯＩ間の血管伝達物質及び／又はＤＮＡの差次的発現
４．１  若年被検体と高齢被検体の間でのＭＯＩ間の成長因子の差次的発現
この実施例では、若年成人被検体（すなわち、３０歳）又は高齢被検体（すなわち、６０歳）から採取した尿サンプルからＭＯＩが単離され、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、レプチン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現、そしてＤＮＡレベルを独立して検出した。結果を図６及び７に示す。
【０１１０】
まず、ＦＧＦ−１、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＨＧＦの発現がＥｘｏにおいて排他的に見られるがＭＶ又は可溶性高分子を含有するフラクションには見られない一方で、レプチン、ＦＧＦ−２及びＨＢ−ＥＧＦの発現はＭＶ及びＥｘｏの双方で見られることが分かった。
【０１１１】
また、分析によって、高齢被検体（すなわち、ＡＶＧ−Ｏｌｄ）は正常被検体（すなわち、ＡＶＧ−Ｙｏｕｎｇ）のものと比較して（ＭＶにおける）ＦＧＦ−１及び（可溶性高分子フラクションにおける）ＰＬＧＦの顕著な発現を有するが、若年被検体には、より高い（ＭＶにおける）ＦＧＦ−２の発現があることが分かった。
【０１１２】
４．２  パーキンソン病（ＰＤ）を有する又は有さない高齢被検体の間でのＭＯＩ間の成長因子の差次的発現
この実施例では、ＰＤを有する又は有さない高齢被検体の尿サンプルからＭＯＩが単離され、ＦＧＦ−１、ＨＢ−ＥＧＦ及びレプチンの発現をそれぞれ検出した。結果を図８に示す。
【０１１３】
ＭＶにおけるＦＧＦ−１及びＥｘｏにおけるＦＧＦ−２は正常高齢被検体（すなわち、ＡＶＧ−Ｃ）においてのみ発現する一方で、レプチンはＰＤ被検体（すなわち、ＡＶＧ−ＰＤ）において排他的に発現することが分かった。また、正常高齢被検体は、ＰＤ被検体のものと比較して（ＭＶにおいて）比較的高いレベルのＨＢ−ＥＧＦを有していた。
【０１１４】
４．３  若年被検体、高齢被検体及びＰＤ被検体の間のロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）及びＣＤ９の発現
若年被検体、高齢被検体及びＰＤ被検体の尿サンプルからエクソソームが単離され、ＬＲＧ１及びＣＤ９のレベルをそれぞれウエスタンブロット解析によって検出した。結果を図９に示す。
【０１１５】
データは、若年成人（Ｙ）及び高齢成人（Ｏ）は同様の発現レベルのエクソソームＣＤ９を有するが、高齢成人（６０歳超）は顕著に高いレベルのＬＲＧ１発現を有することを示した。ＰＤ被検体（すなわち、ケース１（ＰＤ１）、ケース２（ＰＤ２））は同様の発現レベルのＣＤ９を有する一方で、ＬＲＧ１のレベルは正常高齢成人（Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３及びＯ４）のものよりも低かった。
【０１１６】
４．４  若年被検体及び高齢被検体におけるＭＯＩ間の差次的ＤＮＡレベル
実施例１．１の手順に従って、若年及び高齢成人被検体の尿サンプル、そしてＰＤ被検体からＭＯＩが単離された。各ＭＯＩにおける総ＤＮＡレベル及びＤＮＡ損傷のマーカーである８−ヒドロキシ−２´−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）のレベルを検出した。総ＤＮＡレベルをナノドロップ分光測定によって検出した。８ＯＨｄＧのレベルを、製造者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）によって提供されたプロトコルに従って酵素結合免疫測定法によって検出した。
【０１１７】
高齢被検体はエクソソーム及び可溶性フラクション（すなわち、可溶性高分子を含有するフラクション）の双方において比較的高い合計レベルのＤＮＡを有することが分かった（図１０）。また、正常高齢被検体に由来するＥｘｏは、ＭＶよりも大幅に高い８ＯＨｄＧのレベルを有したが、ＭＶ又はＥｘｏにおける８ＯＨｄＧのレベルは正常高齢被検体とＰＤ被検体の間で大幅には異ならなかった（図１１）。
【実施例５】
【０１１８】
実施例５  デング感染症の被検体のＭＯＩ間のＮＳ１抗原、血管伝達物質及び８ＯＨｄＧの差次的発現
実施例１．１の手順に従って、臨床的前兆（例えば、不安定なバイタルサイン、血液濃縮、血小板減少など）のある又はないデング感染症を有する被検体の尿サンプルからＭＯＩを単離した。デングウイルスＮＳ１抗原のレベル、種々の血管伝達物質及び８ＯＨｄＧを検出した。結果を図１２に示す。
【０１１９】
デング被検体から単離されたＭＶに顕著なレベルのＮＳ１抗原が見られ、Ｅｘｏ部分にある程度のものが見られた（図１１、パネル（Ａ））。血管伝達物質の発現について、デング被検体の尿ＭＶ及びＥｘｏは非常に高いレベルのＥＧＦを有した一方で、尿エクソソームのみがＧ−ＣＳＦの発現を有した（図１１、パネル（Ｂ））。また、臨床的前兆を示すデング被検体（すなわち、ＡＶＧ−Ｗ）は、前兆のないデング被検体（すなわち、ＡＶＧ−Ｃ）のものと比較して高いレベルのレプチン及びＶＥＧＦ−Ａを有するが低いレベルのＧ−ＣＳＦを有した（図１１、パネル（Ｃ））。さらに、正常被検体のものと比較してデング被検体のＭＶにも高いレベルの８ＯＨｄＧが見られた。
【０１２０】
結論として、本開示は、病理学的状態（例えば、老化、ウイルス感染、変性疾患、早期分娩など）を患う被検体における細胞、微小小胞体、エクソソーム及び可溶性フラクションにおいて種々のバイオマーカーが異なる態様で発現することを示した。細胞、微小小胞体、エクソソーム及び／又は可溶性因子は、本開示のデバイス及び／又は方法の使用によって容易に単離されて、そのような被検体の容易な特定を可能とし、それにより、適切な医薬品及び／又は測定がそのような被検体に施されて被検体における疾患状態に関連する症状を予防及び／又は緩和することができる。
【０１２１】
実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図１Ａ】
2020162588.tif 000004
【図１Ｂ】
2020162588.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020162588.tif 000011
【図８】
2020162588.tif 000012
【図９】
2020162588.tif 000013
【図１０】
2020162588.tif 000014
【図１１】
2020162588.tif 000015
【図１２】
2020162588.tif 000016
【外国語明細書】
2020162588000001.pdf