(57)【要約】【課題】播種性血管内凝固症候群の検出のための新規なペプチドマーカーの提供。【解決手段】被験者における播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出方法は、被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、その部分ペプチド、９０％以上の数の同一アミノ酸配列を有するペプチド、又はその変異体ペプチドを測定することを含む。【選択図】  図１
2020016453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを測定することを含む、該被験者における播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出方法。
（ａ）被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【請求項２】
配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のリシン、１０番目のプロリン、１７番目のプロリン、２０番目のプロリン、２９番目のプロリン、及び３４番目のプロリンが酸化されている請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のプロリン、１０番目のプロリン、１２番目のプロリン、３１番目のプロリン、３３番目のプロリン、及び３６番目のプロリンが酸化されており、２８番目のグルタミンが脱アミド化されている請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料を質量分析にかけることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を含む播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【請求項９】
下記(ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを測定することを含む、該被験者における敗血症性ショックの検出方法。
（ａ）被験者の生物試料中の、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【請求項１０】
配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されている請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体試料を質量分析にかけることを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを特異的に認識する抗体を含む敗血症性ショックの検出キット。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【請求項１５】
下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドからなる播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出用ペプチド。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【請求項１６】
下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドからなる敗血症性ショックの検出用ペプチド。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドマーカーを用いた敗血症に関連する疾患の検出方法に関し、より詳細には、ペプチドマーカーを用いた敗血症に関連する疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、早期診断のための検査方法、早期治療のための検査方法、及び物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、感染に対する宿主生体反応の調節不全で、生命を脅かす臓器障害である。
【０００３】
敗血症が重症化すると、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)の合併率が高まったり、敗血症性ショックを発症したりする。
【０００４】
ＤＩＣは、国際血栓止血学会の定義によると、さまざまな原因によって引き起こされる広範な血管内の凝固亢進を特徴とする後天的な症候群であり、極めて重症になると臓器障害をきたすことがある。ＤＩＣの診断基準としては、旧厚生労働省ＤＩＣ診断基準、国際血栓止血学会（ＩＳＴＨ）ＤＩＣ診断基準、日本救急医学会急性期ＤＩＣ診断基準が従来から知られており、これらの基準は、基礎疾患臨床症状に加え、血小板数、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）濃度、プロトロンビン時間、フィブリノゲン濃度、等の一般的止血系検査によるスコアリングでＤＩＣの診断を行うものであるが（非特許文献１）、迅速かつ高精度なＤＩＣの診断が求められている。
【０００５】
敗血症性ショックは、敗血症のなかでも、実質的に死亡率を上昇させる重度の循環・細胞・代謝の異常を呈するものである。敗血症ショックは、循環不全と細胞機能及び代謝の異常により、死亡率が高くなった状態であるため、迅速かつ高精度なＤＩＣの早期診断が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本内科学会雑誌 第98巻 第7号・平成21年7月10日＜URL：https://www.jstage.jst.go.jp/article/naika/98/7/98_1634/_pdf＞［平成29年10月30日検索］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＤＩＣ及び敗血症性ショック等の敗血症に関連する疾患の迅速かつ高精度な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の項に記載の主題を包含する。
【０００９】
項１．下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを測定することを含む、該被験者における播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出方法。
【００１０】
（ａ）被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【００１１】
項２．配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のリシン、１０番目のプロリン、１７番目のプロリン、２０番目のプロリン、２９番目のプロリン、及び３４番目のプロリンが酸化されている項１に記載の検出方法。
【００１２】
項３．配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のプロリン、１０番目のプロリン、１２番目のプロリン、３１番目のプロリン、３３番目のプロリン、及び３６番目のプロリンが酸化されており、２８番目のグルタミンが脱アミド化されている項１に記載の方法。
【００１３】
項４．配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されている項１に記載の方法。
【００１４】
項５．前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【００１５】
項６．生体試料を質量分析にかけることを含む、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【００１６】
項７．前記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
項８．下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を含む播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出キット。
【００１８】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【００１９】
項９．下記(ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを測定することを含む、該被験者における敗血症性ショックの検出方法。
【００２０】
（ａ）被験者の生物試料中の、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【００２１】
項１０．配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されている項９に記載の方法。
【００２２】
項１１．前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、項９又は１０に記載の方法。
【００２３】
項１２．生体試料を質量分析にかけることを含む、項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
項１３．前記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
項１４．下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドを特異的に認識する抗体を含む敗血症性ショックの検出キット。
【００２６】
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【００２７】
項１５．下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドからなる播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の検出用ペプチド。
【００２８】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【００２９】
項１６．下記  (ａ)、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のペプチドからなる敗血症性ショックの検出用ペプチド。
【００３０】
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド
（ｂ）上記（ａ）の各ペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、１種又は２種以上のペプチド
（ｄ）上記（ａ）のペプチドのアミノ酸配列の各々において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、１種又は２種以上のペプチド
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、敗血症に関連する疾患、特にはＤＩＣ及び敗血症性ショックを迅速かつ極めて高い信頼性で判定できるため、該疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、早期診断、早期治療のための検査方法、及び物質のスクリーニング方法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（Ａ）１番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図２】（Ａ）２番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図３】（Ａ）３番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図４】（Ａ）４番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図５】（Ａ）５番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図６】（Ａ）６番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図７】（Ａ）７番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図８】（Ａ）８番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)非ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１２)、（右）ＤＩＣ患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝８)。（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図９】（Ａ）９番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)敗血症性ショックに罹患していない敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)、（右）敗血症性ショックに罹患している敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図１０】（Ａ）１０番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)敗血症性ショックに罹患していない敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)、（右）敗血症性ショックに罹患している敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【図１１】（Ａ）８番目のバイオマーカーペプチドの箱ひげ図。縦軸：BLOTCHIP(登録商標)-MSにより分析した各ペプチドのピーク強度、横軸：(左)敗血症性ショックに罹患していない敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)、（右）敗血症性ショックに罹患している敗血症患者群から採取した血液のサンプル(ｎ＝１０)（Ｂ）（Ａ）のＲＯＣ曲線図。縦軸：感度（Sens;有病正診率）、横軸：特異度（Spec;無病正診率）。AUC値及びカットオフ値を図中に示した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、新規かつ有用な、敗血症に関連する疾患の検出マーカーペプチド（以下、包括して「本発明のペプチド」という場合もある）を提供する。
【００３４】
なお、本明細書において、敗血症に関連する疾患の「検出」には、敗血症に関連する疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、診断（特には早期診断）のための検査方法、及び治療（特には早期治療）のための検査方法が含まれる。敗血症に関連する疾患の「判定」には、敗血症に関連する疾患の有無を判定することのみならず、予防的に敗血症に関連する疾患の罹患可能性を判定することや、治療後の敗血症に関連する疾患の予後を予測すること、及び敗血症に関連する疾患の治療剤の治療効果を判定することが含まれる。物質のスクリーニング方法には、敗血症に関連する疾患の「検出」、「判定」及び「治療」に有用な物質のスクリーニング方法が含まれる。
【００３５】
本明細書において、「罹患」には「発症」が含まれる。
【００３６】
本明細書において、「治療」とは、疾患もしくは症状の治癒又は改善、或いは症状の抑制を意味し、「予防」を含む。「予防」とは、疾患又は症状の発現を未然に防ぐことを意味する。
【００３７】
本発明の被験者における敗血症に関連する疾患の検出方法に用いられるペプチドは、被験者の生物試料中に見出される、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなるペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号１〜１０のアミノ酸配列は以下の表１に示す通りである。
【００３８】
【表１】
2020016453.tif 000003
【００３９】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる１番目のペプチドは、α−２−ＨＳ−糖蛋白質の部分配列である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる２番目のペプチドは、血液凝固第Ｉ因子（フィブリノーゲン）α鎖の部分配列である。配列番号３で表される
アミノ酸配列からなる３番目のペプチドは、血液凝固第Ｉ因子（フィブリノーゲン）β鎖
の部分配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる４番目のペプチドは、血清アルブミンの部分配列である。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる５番目のペプチド及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる６番目のペプチドは、コラーゲンα−１の部分配列である。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる７番目のペプチドは、血清アミロイドＡ−２タンパク質の部分配列である。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる８番目のペプチドは、血液凝固第XIII因子（γグルタミルトランスフェラーゼ）の部分配列である。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる９番目のペプチドは、血清アミロイドＡ−１タンパク質の部分配列である。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる１０番目のペプチドは、血液凝固第Ｉ因子（フィブリノーゲン）α鎖の部分
配列である。
【００４０】
１〜８番目のペプチドは、ＤＩＣの検出、特にはＤＩＣの罹患の有無の判定又は診断に有用な特異的マーカーとして使用することができる。ＤＩＣ群患者では、１〜６，８番目のペプチドの量は非ＤＩＣ群患者に比べて減少するが、７番目のペプチドの量が非ＤＩＣ群患者に比べて上昇する。
【００４１】
８〜１０番目のペプチドは、敗血症性ショックの検出、特には敗血症性ショックの罹患の有無の判定又は診断に有用な特異的マーカーとして使用することができる。敗血症性ショック患者では、８番目及び９番目のペプチドの量が敗血症性ショックに罹患していない敗血症患者に比べて減少するが、１０番目のペプチドの量は敗血症性ショックに罹患していない敗血症患者に比べて上昇する。
【００４２】
ＤＩＣ発病及び敗血症性ショックの発症によるこのようなペプチドの増減のデータは今までに存在しなかった。以上の成績と理論から、本特許がカバーするペプチドとそれを使用した検査、判定、診断、診察、物質スクリーニング法は、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)及び敗血症性ショックを含む敗血症に関連する疾患に適応可能である。
【００４３】
本発明においては、上記のインタクトなペプチドをマーカーとして用いることが好ましいが、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であるペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなる変異体ペプチドも、本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。
【００４４】
本発明において使用するペプチドが配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部である場合、かかる部分ペプチドは、配列番号１〜１０の各ペプチドのアミノ酸残基のうち、連続する１０個以上のアミノ酸を意味し、好ましくは連続する１５個以上のアミノ酸を意味し、より好ましくは連続する２０個以上のアミノ酸を意味し、より好ましくは連続する２３個以上、さらにより好ましくは連続する２５個以上のアミノ酸を意味する（ただし、配列番号１〜１０のペプチドの各ペプチドの全長を上限とする）。
【００４５】
配列番号１〜１０に表される全長アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するペプチドは、その全長が、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列の長さ以下であることが好ましい。また、かかるペプチドの配列同一性は、配列番号１〜１０に表される全長アミノ酸配列に対し、９５％以上であることが好ましく、９８％以上であることがより好ましい。
【００４６】
さらに、本発明のペプチドは、特定のアミノ酸に酸素原子が結合して酸化されたり、リン酸化されたり、Ｎ−アセチル化されたり、Ｓ−システイン化されたりしている場合がある。  このような場合も、配列番号１〜１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである限り、本発明の範囲に包含される。
【００４７】
好ましくは、配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のリシン、１０番目のプロリン、１７番目のプロリン、２０番目のプロリン、２９番目のプロリン、及び３４番目のプロリンが酸素で酸化されている。
【００４８】
好ましくは、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のプロリン、１０番目のプロリン、１２番目のプロリン、３１番目のプロリン、３３番目のプロリン、及び３６番目のプロリンが酸素により酸化されており、２８番目のグルタミンが脱アミド化されている。
【００４９】
好ましくは、配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されている。
【００５０】
なお、配列番号１〜１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの上記修飾体は、質量分析にて非修飾体（インタクト）と区別が可能であり、疾患の検出、判定及び治療等には修飾ペプチドまたは非修飾ペプチドのいずれを適切な状況で使用することも本発明の範囲に包含される。
【００５１】
本発明は、被験者の生物試料中の、上記の１０個の本発明のペプチドのうちの１種又は２種以上を測定することを含む、該被験者における敗血症に関連する疾患の検出又は判定方法を包含する。
【００５２】
好ましい一つの実施形態において、被験者における敗血症に関連する疾患は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）であり、本発明のペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチドである。
【００５３】
別の一つの実施形態において、被験者における敗血症に関連する疾患は敗血症性ショックであり、本発明のペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチドである。
【００５４】
被験者には、敗血症に関連する疾患に罹患していると疑われる患者を含み、「敗血症に関連する疾患に罹患していると疑われる被検者」は、被検者本人が主観的に疑いを抱く者（何らかの自覚症状がある者に限らず、単に予防検診の受診を希望する者を含む）であっても、何らかの客観的な根拠に基づく者（例えば、従来公知の臨床検査（例、心拍、血圧、血液又は尿検査）および／または診察の結果、敗血症に関連する疾患の合理的な罹患可能性があると医師が判断した者）であってもよい。
【００５５】
「ペプチドを測定する」とはペプチドの濃度、量、又はシグナル強度を測定することを指す。
【００５６】
被験試料となる被検者由来の生体試料は特に限定されないが、被検者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液、リンパ液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。一実施形態では、生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる。血清や血漿を用いる場合、常法に従って被検者から採血し、前処理を施さず直接、又は液性成分を分離することにより分析にかける被験試料を調製することができる。検出対象である本発明のペプチドは必要に応じて、抗体カラムやスピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。
【００５７】
生体試料中の、本発明のペプチドの検出は、例えば、生体試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、および質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体ペプチドを内部標準にした質量分析計、免疫顕微鏡計など）を組み合わせる方法等に供し、該ペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明のペプチドを精製してそれらを認識する抗体を作製し、ELISA, RIA,イムノクロマト法、表面プラズモン共鳴法、ウェスタンブロッティング、免疫質量分析法や各種イムノアッセイ、免疫顕微鏡法により該ペプチドを検出する方法もまた、好ましく用いられ得る。さらに上記方法のハイブリッド型検出法も有効である。
【００５９】
本発明の検出又は判定方法における特に好ましい測定法の１つは、飛行時間型質量分析に使用するプレートの表面に被験試料を接触させ、該プレート表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法が挙げられる。飛行時間型質量分析計に適合可能なプレートは、検出対象である本発明のペプチドを効率よく吸着し得る表面構造（例：官能基付加ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改質シリコン、種々のゲルまたはポリマーのコーティング）を有している限り、いかなるものであってもよい。
【００６０】
好ましい実施態様においては、質量分析用プレートとして用いられる支持体は、ポリビニリデンジフロリド（PVDF）、ニトロセルロースまたはシリカゲル、特に好ましくはPVDFで薄層コーティングされた基材である（WO 2004/031759を参照）。かかる基材は、質量分析用プレートにおいて使用されているものであれば、特に限定されず、例えば、絶縁体、金属、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられる。かかるPVDFで薄層コーティングされた質量分析用プレートとして、好ましくは株式会社プロトセラ社のブロットチップ（BLOTCHIP，登録商標）などが挙げられる。BLOTCHIP(登録商標)を用いると、一つのステップでペプチドを直接転写でき、アルブミン等によるサンプルの前処理が不要であり、従来は検出できなかった低濃度（フェムトモル〜ピコモル）のペプチドが検出できる。
代わりに、質量分析用プレートは、支持体表面を塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷、スパッタリング等の公知の手段でコーティングすることにより、公知の方法により調製することもできる。また、質量分析用プレート上の分子を質量分析する方法自体は公知である（例えばWO 2004/031759）。WO 2004/031759に記載の方法を、必要に応じて適宜改変して使用することができる。
【００６１】
被験試料の質量分析用プレート（支持体）への移行は、被験試料となる被検者由来の生体試料を未処理のままで、あるいは抗体カラムその他の方法で高分子タンパク質を除去、濃縮した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは等電点電気泳動に付し、泳動後ゲルをプレートと接触させて転写（ブロッティング）することにより行われる。転写の方法自体は公知であり、好ましくは電気転写が用いられる。電気転写時に使用する緩衝液としては、pH 7〜9、低塩濃度の公知の緩衝液を用いることが好ましい（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）。
【００６２】
上記の方法により支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子である本発明のペプチドの存在および量を同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、非罹患がん患者、処置後の患者（フォローアップ）、もしくは健常人由来の生体試料における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。
【００６３】
高精度な質量分析結果を得るためには、高速液体クロマトグラフィに接続した三連四重極型等の質量分析装置を用いて分析する。標的分子の安定同位体標識ペプチドを合成して、それを既知量の内部標準品として被験試料に混合し、逆相固相担体等でペプチド画分の粗精製を実施する。高速液体クロマトグラフィに導入後、分離された各ペプチドは質量分析装置内でイオン化され、その後コリジョンセル内で断片化、得られたペプチドフラグメントをmultiple reaction monitoring法により定量する。この際、安定同位体標識ペプチドを内部標準として用いることでCV値が5%以下の実測データを取得できる。安定同位体標識ペプチドは、Cambridge Isotope Laboratory（MA, USA）より購入した安定同位体標識アミノ酸（アミノ酸a(13C6,15N2)は、安定同位体炭素（原子量13）6個と、安定同位体窒素（原子量15）2個で置換された質量数が元のアミノ酸より８原子量増加したアミノ酸aを例示）を元のアミノ酸の配列位置に置換して既存の合成法（たとえばF-mocによる固相反応）により得られる。質量分析は株式会社プロトセラ社のBLOTCHIP（登録商標）システムでも実施可能であり、これらの方法は抗体を使用しない検出装置として臨床使用できる。
【００６４】
上記の質量分析による検出において、タンデム質量分析（MS/MS）法を用いてペプチドを同定することができ、かかる同定法としては、MS/MSスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するde novo sequencing法と、MS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報（質量タグ）を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。また、MS/MS法を用いることにより、直接本発明のペプチドのアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを以下の抗体に対する抗原として利用することもできる。
【００６５】
本発明のペプチドの測定は、それに対する抗体を用いて行うこともできる。よって、本発明は、ペプチドを特異的に認識する抗体を用いた敗血症に関連する疾患の検出又は判定方法、かかる抗体を含む敗血症に関連する疾患の検出又は判定剤、ならびにかかる抗体を含む敗血症に関連する疾患の検出又は判定キットを含む。かかる方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、上記質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に該ペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
【００６６】
本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のペプチドを、これを発現する患者由来の生体試料から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチドの量が少量である場合は、RT-PCRによる該ペプチドをコードするcDNA断片の増幅等の周知の遺伝子工学的手法によりペプチドを大量に調製することができ、あるいはかかるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチドを取得することもできる。さらに有機合成法により大量に調製することも可能である。
【００６７】
本発明のペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、およびminibody等が挙げられる。
【００６８】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し、最終免疫後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、モルモット、ハムスターなど、目的の抗体を得ることができる哺乳動物が挙げられる。
【００６９】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。モノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、Stites et al, Basic and Clinical Immunology．(Lang Medical Publications Los Altos．CA．4th Edition） and references therein, 、in particular Koehler, G．& Milstein, C．Nature 256, 495-497 (1975).に見出され得る。例えば、本発明のペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
【００７０】
抗体を用いる本発明の検出又は判定方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。測定に際し、抗体または抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、または発光物質等の標識剤と結合され得る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。これら個々の免疫学的測定法は、当業者の通常の技能により、本発明の定量方法に適用可能である。
【００７１】
本発明のペプチドはタンパク質分解産物からなるため、未分解のタンパク質や、切断部位が共通の類似ペプチド等様々な分子が測定値に影響を与える可能性がある。そこで、第１工程において、生体試料を抗体により免疫アフィニティ精製し、抗体に結合したフラクションを、第２工程において質量分析に付し、精緻な分子量を基準に同定、定量する、いわゆる免疫質量分析法を利用することができる（例えば、Rapid Commun．Mass Spectrom．2007, 21: 352-358を参照）。免疫質量分析法によれば、未分解のタンパク質も類似ペプチドも、質量分析計で完全に分離され、バイオマーカーの正確な分子量を基準に高い特異度と感度で定量が可能となる。
【００７２】
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検出又は判定方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るチップの表面上に固定化し、該チップ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
【００７３】
上記のいずれかの方法により測定された被検者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが、非敗血症に関連する疾患患者、処置後の患者もしくは健常人由来の対照試料中の該ペプチドレベルに比べて有意に変動している場合、該被検者は敗血症に関連する疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。
【００７４】
本発明のペプチドは、それぞれ単独でも敗血症に関連する疾患の検出マーカーとして利用することができるが、２種以上を組み合わせることにより、感度（有病正診率）および特異度（無病正診率）をより高めることができる。
【００７５】
２種以上のペプチドをマーカーとして用いる場合の検出手法としては、例えば、(1) 測定対象であるすべてのペプチドについてレベルが有意に変動する場合に敗血症に関連する疾患に罹患していると判定し、いずれかのペプチドについてレベルが有意に変動しない場合に敗血症に関連する疾患に罹患していないと判定する方法、(2) 測定対象であるすべてのペプチドについてレベルが有意に変動しない場合に敗血症に関連する疾患に罹患していないと判定し、いずれかのペプチドについてレベルが有意に変動した場合に敗血症に関連する疾患に罹患していると判定する方法、(3) 測定対象であるn個のペプチドのうち、例えば、2〜(n-1)個以上のペプチドについて、レベルが有意に変動する場合に敗血症に関連する疾患に罹患していると判定する方法、さらに各ペプチド間で重みを持たせる方法、ならびに(4) バギング法、ブースティング法、ランダムフォレスト法などの機械学習法、などが考えられるが、特には複数のマーカーペプチドを１つのマーカーセットとして取り扱うことが出来る解析手法である多変量ロジスティック回帰分析を用いることが好ましい。この場合、マーカーとして用いるペプチドの数は特に限定されないが、好ましくは２種以上、より好ましくは３〜６種、さらにより好ましくは３〜５種である。
【００７６】
本願では、質量分析により特定された候補ペプチドの多変量ロジスティック回帰モデルを最尤法により構築したところ、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）が高い（５つのマーカーペプチドで０．９を超える）極めて信頼性の高い敗血症に関連する疾患の検出又は判定が可能であることを見出した。検出又は測定されるペプチドの数が多いほど、検査の精度は向上する。
【００７７】
検出又は測定されるペプチドの数は、本発明の検査方法におけるＡＵＣが或る閾値を超える値となる数であることが好ましい。閾値は０．５を超えることが好ましく、０．６を超えることがより好ましく、０．７を超えることがさらに好ましい。ペプチドの数を増やすほど約１に近づけることが可能である。
【００７８】
配列番号１〜１０で表わされるアミノ酸配列を有する複数のペプチドの血中濃度の関数であるロジスティック回帰モデルによれば、ＡＵＣがより１に近づき、高い精度で敗血症に関連する疾患を検出することができる。
【００７９】
本発明の検出方法は、患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明のペプチドの発現の経時変化を調べることにより行うこともできる。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、患者のＱＯＬを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血漿もしくは血清を試料として用いる場合、約１日〜約１月間の間隔で採血を行うことが好ましい。
【００８０】
さらに、上記時系列的なサンプリングによる敗血症に関連する疾患の検出方法は、前回サンプリングと当回サンプリングとの間に、被検者である患者に対して該疾患の治療措置が講じられた場合に、当該措置による治療効果を評価するのに用いることができる。即ち、治療の前後にサンプリングした試料について、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められると判定された場合に、当該治療の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該治療の効果がなかったと評価することができる。
【００８１】
さらに、上記時系列的なサンプリングによる敗血症に関連する疾患の検出のための検査方法は、食事療法、禁煙、運動療法、有害環境からの隔離等、敗血症に関連する疾患の罹患リスク低減措置後の予防効果を評価するのに用いることができる。即ち、罹患リスクの低減措置の施行の前後にサンプリングした試料について、施行後の状態が施行前の状態と比較して病態の発症もしくは進行が認められないと判定された場合に、当該措置の施行の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該措置の施行の効果がなかったと評価することができる。
【００８２】
従って、本発明のペプチドならびに方法は、敗血症に関連する疾患を診断または検出するマーカーのみならず、敗血症に関連する疾患の予後を予測するマーカー、ならびに治療効果判定のマーカーともなり得る。すなわち、本発明のペプチドならびに方法は、敗血症に関連する疾患の治療の創薬標的分子のスクリーニングに、および／または患者（リスポンダー）の選別もしくは薬の投与量（用量）の調節のためのコンパニオン診断薬として使用することができる。
【００８３】
また、本発明のペプチドならびに方法は、物質のスクリーニング方法に使用できる。この場合の物質には、敗血症に関連する疾患を未病段階で防止する健康食品やトクホ製品などの食品類、敗血症に関連する疾患を診断または検出するマーカー類、及び罹患後の敗血症に関連する疾患を治療する治療薬医薬品類が含まれる。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有するペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、または配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドの各々に対する抗体を含む敗血症に関連する疾患の検出キットを包含する。
【００８５】
上記検出キットの好ましい一つの実施形態において、被験者における敗血症に関連する疾患は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）であり、上記抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有するペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、または配列番号１〜８に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドの各々に対する抗体である。
【００８６】
上記検出キットの別の好ましい一つの実施形態において、敗血症に関連する疾患は敗血症性ショックであり、上記抗体は、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有するペプチド、配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、または配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドの各々に対する抗体である。
【００８７】
本発明のペプチドは、敗血症に関連する疾患の創薬ターゲットを提供することもできる。即ち、該ペプチドそれ自体が該疾患の治療（寛解）方向に生理機能を持つ（「治療ペプチド」という）場合、該ペプチドの量もしくは活性を増大させる物質を患者に投与することにより、該疾患を治療することができる。
【００８８】
本発明はまた、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質を含有してなる、敗血症に関連する疾患の治療剤を提供する。そのような治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質の有効量が、敗血症に関連する疾患の患者に投与される。
【００８９】
上記治療剤の好ましい一つの実施形態において、被験者における敗血症に関連する疾患は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）であり、上記治療ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有するペプチド、配列番号１〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、または配列番号１〜８に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドである。
【００９０】
上記治療剤の別の好ましい一つの実施形態において、敗血症に関連する疾患は敗血症性ショックであり、上記治療ペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド、配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する１０個以上のアミノ酸を有するペプチド、配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチド、または配列番号８〜１０に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が修飾、特には欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドである。
【００９１】
具体的には、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの活性を増大させる物質としては、該ペプチド自体あるいはそれと同様のアゴニスト作用を有する分子が挙げられる。あるいは、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの活性を増大させる物質として、該ペプチドの非中和抗体、好ましくはアゴニスト抗体なども挙げることができる。
【００９２】
治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質は、常套手段に従って製剤化することができる。
【００９３】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。かかる経口剤には、脳血管障壁(BBB)を通過する性状を持つものも含まれる。
【００９４】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤F、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。注射剤、坐剤などでは、有効成分（該ペプチド）の血中濃度の延長や吸収効率の増加を目的に、既存の方法による化学修飾（糖鎖、ＰＥＧその他）体が使用される。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。かかる注射剤には、脳血管障壁(BBB)を通過する性状を持つものも含まれる。
【００９５】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり非生物学的製剤では通常5〜500ｍｇ、とりわけ注射剤では5〜100ｍｇ、その他の剤形では10〜250ｍｇの上記化合物が含有され、生物学的製剤の注射剤では10〜50000mgの上記化合物が含有されていることが好ましい。
【００９６】
なお前記した各組成物は、上記治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質との配合により、好ましくない相互作用を生じない限り、他の活性成分を含有してもよい。
【００９７】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトに対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００９８】
治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質の投与量は、その作用、投与ルート、患者の重篤度、年齢、体重、薬物受容性などにより差異はあるが、例えば、成人１日あたり活性成分量として非生物学的製剤では約0.0008〜約25ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約0.008〜約2ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。生物学的製剤の注射剤では10〜5000mg/kg, 好ましくは約10〜約2000ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。
【００９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【０１００】
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
（材料および方法）
１．被験者
入院中の敗血症に罹患した２０名の成人患者が本研究に参加した。これらの患者はＤＩＣ発症の有無でＤＩＣ未発症検体群（ｎｏｎ−ＤＩＣ）およびＤＩＣ発症検体群（ＤＩＣ）の２群に群分けされると共に、敗血症性ショックの有無で敗血症性ショックに罹患していない敗血症検体群（敗血症）と敗血症性ショックに罹患している敗血症性ショック検体群（敗血症性ショック）との群分けされた（表２）。
DICの診断基準
International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH)による DIC 診断基準 （Thromb Haemost．2001 Nov;86(5):1327-30参照）を用いた。
敗血症の診断基準
感染によって発症した全身性炎症反応症候群（SIRS）と定義し、SIRS はBoneらの基準 (Crit Care Med 1989; 17(5): 389-93参照) により診断した。
敗血症性ショックの診断基準
重症敗血症の中で、血圧低下を伴い、十分な急速輸液負荷をおこなっても血圧が回復しないものと定義し、American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conferenceによる診断基準 (Crit Care Med 1992; 20(6): 864-74参照) を用いた。
【０１０２】
【表２】
2020016453.tif 000004
【０１０３】
２．血液サンプルの採取
患者の動脈血のサンプルを22G針を用いて橈骨動脈より動脈血を採取し、血液採取管に入れた。それらのサンプルを室温で1時間静置し、3,000rpmで10分間室温にて遠心分離し、血清を得た。上清を使用するまで-80℃で分けて保存した。
【０１０４】
３．BLOTCHIP（登録商標）による質量分析
血清中の質量分析によるペプチド解析を、ペプチドームプロファイリングの迅速定量法である、ワンステップの直接転写技術のBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った（Biochem．Biophys．Res．Commun．2009;379(1):110-4）。
【０１０５】
まず、血清サンプルをドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）に供し、ペプチドをタンパク質と分離した。次に、ゲル中のペプチドをBLOTCHIP（登録商標）（株式会社プロトセラ、尼崎市所在）に電気転写した。転写終了後、チップの表面を超純水でリンスし、BLOTCHIP（登録商標）に直接マトリックス（α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸, Sigma-Aldrich Co., アメリカ合衆国ミズーリ州）を塗布後、UltraFlexII TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics社製、アメリカ州マサチューセッツ州)の反射モードで、Proteomics 11:2727-2737.に記載された通りに質量分析を行い、ペプチドプロファイルを得た。
【０１０６】
４．ペプチドの統計解析
サンプルはBLOTCHIP（登録商標）質量分析により4回繰り返し解析した。より統計学的に有意なピークを見出すために、4つのデータを独立データとして使用し、解析ソフトClinProTools 2.2 (Bruker Daltonics社製)を使用してウィルコクソン検定のP値を計算し、P値が0.05以下の場合に有意差ありとみなした。
【０１０７】
統計解析ソフトR（R Core Team (2013)．R: A language and environment for statistical computing．R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria．URL http://www.R-project.org/.）によりウィルコクソン検定のｐ値を計算するために、一つのサンプル当たりの4つのデータの平均値を用いてペプチドの診断性能を評価した。モデルの構築には統計解析ソフトR（R Core Team (2013)を使用した。
【０１０８】
構築したモデルの診断能の評価のためにＲＯＣ分析を実施した。Rのパッケージである"Epi パッケージ"（A package for statistical analysis in epidemiology、Version 1.149、http://cran.r-project.org/web/packages/Epi/index.html）を用いた。ＡＵＣはＲＯＣ曲線から計算した。診断のための最適カットオフ値は、Cancer 1950;3:32-5のYouden's indexに従って決定でき、95%信頼区間は、ノンパラメトリックなブートストラップ抽出を用いて推定した。
【０１０９】
５．ペプチドの同定
各標的ペプチドを含む血清を、その同定のために採取した。ペプチドは、Sep-Pak C18固相抽出カートリッジ（Waters Corporation、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて、0.1%トリフルオロ酢酸を含む水に80%v/v アセトニトリル(ACN)で抽出した。溶出液をCC-105 遠心濃縮器(株式会社トミー精工, 東京)を用いて100μL以下に濃縮した。次に溶液を0.065% TFAを含む2%v/v CAN水溶液400μL（溶離液Aと称する）に希釈し、Ｃ１８シリカカラム(COSMOSIL（登録商標） 5C18-AR-II)(ナカライテスク株式会社、京都)を装備したAEKTA精製装置(GE Healthcare UK Ltd, 英国バッキンガムシャー州)にかけた。溶出液を、溶離液Aに対し0.05% TFAを含む80%v/v CANの水溶液で1.0mL/分の流速で0-100%の線形勾配により20個の画分(各1mL)に分けた。各画分をCC-105遠心濃縮器で10μL以下に濃縮し、ペプチドの配列をMALDI-TOF/TOF（UltraFlex II TOF/TOF）及びLC-MS/MS(Q-Exactive;Thermo Fisher Scientific Inc, アメリカ合衆国マサチューセッツ州ワルサム)を用いて分析した。
【０１１０】
（結果）
１．敗血症患者の血清のペプチド解析
血清のペプチド解析をBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った。各ペプチドームプロファイルより得られた質量スペクトルのデータをデータベースに保存した。すべてのＭＳ測定が完了した後、解析ソフトFlexAnalysis2.4を用いて、ｎｏｎ−ＤＩＣ群とＤＩＣ群、敗血症群と敗血症性ショック群の各々の２群間でのディファレンシャル解析をそれぞれ行い、ピークごとに２群間で統計的に有意差があるか検討を行った。
【０１１１】
２．同定されたペプチド
上記で有意差のあったピークについて、逆相クロマトグラフィで部分的に精製した血清ペプチドによりMALDI-TOF/TOF及びLC-MS/MSペプチド配列決定分析を行い、１０個のペプチドを同定した（表３）。
【０１１２】
５番目、６番目、及び８番目のペプチドは修飾を受けていた。
具体的には、５番目のペプチドは、アミノ酸配列のＮ末端から４番目のリシン、１０番目のプロリン、１７番目のプロリン、２０番目のプロリン、２９番目のプロリン、及び３４番目のプロリンが酸素で酸化されていた。
６番目のペプチドは、アミノ酸配列のＮ末端から１番目のプロリン、１０番目のプロリン、１２番目のプロリン、３１番目のプロリン、３３番目のプロリン、及び３６番目のプロリンが酸素により酸化されており、２８番目のグルタミンが脱アミド化されていた。
配列番号８のペプチドは、アミノ酸配列のＮ末端から１番目のセリンがアセチル化されていた。
【０１１３】
【表３】
2020016453.tif 000005
【０１１４】
３．各ペプチドの変化率と診断性能
上記のディファレンシャル解析において有意差のあった１０個のピークに対し、ピークごとに２群間で統計的に有意差があるか検討を行った。
【０１１５】
表４に示すように、ＤＩＣ群では、非ＤＩＣ群患者に比べて、１〜６，８番目のペプチドの量がそれぞれ７７%、７８%、７７%、４６%、５１%、４７%、６２％に有意に減少し、７番目のペプチドの量が非ＤＩＣ群患者に比べて１４０%に有意に上昇していた。
【０１１６】
また、表５に示すように、敗血症性ショック群では、敗血症群に比べて、８番目と９番目のペプチドの量がそれぞれ８７％、５３％に有意に減少し、１０番目のペプチドの量が敗血症群に比べて１５２％に有意に上昇していた。
【０１１７】
図１〜１１は得られた１０個のペプチドの２群間でのピーク強度ＲＯＣ曲線図を示す。図１〜８によると、ＤＩＣ群では、非ＤＩＣ群患者に比べて１〜６，８番目のペプチドの量が有意に減少し、７番目のペプチドの量が有意に上昇していたことが理解される。図９〜１１によると、敗血症性ショック群では、敗血症群に比べて８番目と９番目のペプチドの量が有意に減少し、１０番目のペプチドの量が有意に上昇していたことが理解される。
【０１１８】
これらの結果から、試験された１０個のすべてのペプチドは、ＤＩＣの有無及び敗血症性ショックの有無のうちの少なくとも一方を迅速かつ非常に高い診断性能でもっぱら区別でき、バイオマーカーとして有用であることが示された。
【０１１９】
【表４】
2020016453.tif 000006
【０１２０】
【表５】
2020016453.tif 000007
【図１】
2020016453.tif 000008
【図２】
2020016453.tif 000009
【図３】
2020016453.tif 000010
【図４】
2020016453.tif 000011
【図５】
2020016453.tif 000012
【図６】
2020016453.tif 000013
【図７】
2020016453.tif 000014
【図８】
2020016453.tif 000015
【図９】
2020016453.tif 000016
【図１０】
2020016453.tif 000017
【図１１】
2020016453.tif 000018
【配列表】
2020016453000001.app