(57)【要約】【課題】アンペロプシンを有効成分とする肺炎球菌の感染予防用組成物及び免疫寛容を抑制する組成物を提供する。【解決手段】アンペロプシンを有効成分として含む感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。【選択図】図１
2020002035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシンを有効成分として含む感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
【請求項２】
肺炎が、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染による肺炎である請求項１に記載の感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
【請求項３】
アンペロプシンが藤茶抽出物由来である請求項１又は２に記載の感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を有効成分として含む感染性肺炎の予防及び／又は治療用の飲食品。
【請求項５】
アンペロプシンを有効成分として含む免疫寛容抑制用組成物。
【請求項６】
免疫寛容がＴｒｅｇ細胞の分化抑制による末梢性免疫寛容である請求項５に記載の免疫寛容抑制用組成物。
【請求項７】
アンペロプシンが藤茶抽出物由来である請求項５又は６に記載の免疫寛容抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンペロプシンを有効成分として含有する細菌感染防御用組成物及び免疫寛容の抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎は肺の炎症性疾患の総称であり、病原体の感染による感染性肺炎は、近年抗生物質耐性菌の出現によって重篤化する場合がある。
感染性肺炎の原因病原体は、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、レジオネラ菌、インフルエンザ桿菌、モラクセラ等の細菌類、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス等のウイルス、ニューモシスチス等の真菌類、マイコプラズマ、クラミジア等の非定型細胞内寄生体等、多岐にわたる。
感染性肺炎の場合、病原体によって薬物療法が選択され、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤等の投与が主な治療方法となる。しかし、喀痰培養による病原体の同定や投与薬剤に対する感受性検査に時間を要するため、緊急時には行われない場合もあり、原因菌の種類を推定し、抗生物質の選択が行われることが多い。
【０００３】
細菌性肺炎の主要な原因病原体である肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、グラム陽性菌の一種で、肺炎や急性中耳炎等の局所感染症、細菌性髄膜炎や播種性血管内凝固等の全身性感染症の原因となる。菌体の表面に多糖類からなる莢膜を有しており、これが病原性に重要な役割を果たすと共に、多核白血球による貪食作用に対する抵抗性を示す。
【０００４】
肺炎球菌による肺炎の治療には、ペニシリン系抗生物質が第１選択となっている。しかし、耐性菌の出現や、アナフィラキシーショック等の副作用をおこすおそれがある。その他のセフェム系抗生物質等が用いられることがあるが、やはり抗生物質耐性菌の出現が問題になっている。
【０００５】
一方、例えば、マイコプラズマ肺炎の場合には、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン等のマクロライド系抗生物質が主に用いられている。しかし薬剤耐性の違いを考慮して、使用する抗生物質の選択を行う必要があるため、感染性肺炎の薬剤治療には、最適な薬剤の選択が困難な場合もある。さらに多剤投与に伴う薬剤耐性菌の出現の問題もある。
【０００６】
感染性肺炎の予防においては、ワクチンの投与が主な選択肢である。例えば、肺炎球菌の予防のために投与される、莢膜を抗原として作製されたワクチンなどがある（特許文献１）。    
特許文献２には、ラクトバチラス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株の発酵物を有効成分として含む肺炎球菌感染予防剤が開示されている。この感染予防剤は上気道内及び肺内の肺炎球菌の感染、増殖を抑制する作用を有している。
また特許文献３には、褐藻類の一種であるアスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）又はそれに含有されるアスコフィランを有効成分として含む感染性肺炎の予防及び治療用組成物が開示されている。アスコフィランは経鼻感染させた肺炎球菌の肺内増殖を抑制する。
【０００７】
このような背景にあって、本発明者らは、天然物や天然抽出物について、肺炎球菌の感染を予防や治療に有効な物質の探索を行っている。そして、中国や東南アジア地域の伝統的な食品である藤茶に体内のナトリウム排泄を促進する作用が存在することを発見した。藤茶には様々な薬効が存在することが知られている。その作用は、急性肝炎などの肝臓疾患治療効果（特許文献４）、抗菌効果（特許文献５）、色素退色防止作用（特許文献６）など多岐にわたっている。しかし藤茶が肺炎球菌の感染予防や治療に有効であることは、食経験の長い食品でありながらこれまでまったく知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１６−０４７８４２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／１３３６３８号
【特許文献３】特開２０１８−０５２８３４号公報
【特許文献４】特開２００３−０２６５８４号公報
【特許文献５】特開２００２−１５９５６６号公報
【特許文献６】特開２００２−０６５２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記のような背景技術をもとに研究を行い、藤茶抽出物が肺炎球菌の感染及び増殖を抑制する作用を有していることを見出した。そして、さらに研究を進めたところ、この作用の本質が藤茶中に含まれるフラボノイドの一種であるアンペロプシンであること、またアンペロプシンが末梢性免疫寛容を制御するＴｒｅｇ細胞の分化を抑制することを知見し、本発明をなした。
すなわち、本発明の課題はアンペロプシンを有効成分とする肺炎球菌の感染予防用組成物及び免疫寛容を抑制する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アンペロプシンを有効成分として含む感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
（２）肺炎が、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染による肺炎である（１）に記載の感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
（３）アンペロプシンが藤茶抽出物由来である（１）又は（２）に記載の感染性肺炎の予防及び／又は治療用組成物。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物を有効成分として含む感染性肺炎の予防及び／又は治療用の飲食品。
（５）アンペロプシンを有効成分として含む免疫寛容抑制用組成物。
（６）免疫寛容がＴｒｅｇ細胞の分化抑制による末梢性免疫寛容である（５）に記載の免疫寛容抑制用組成物。
（７）アンペロプシンが藤茶抽出物由来である（５）又は（６）に記載の免疫寛容抑制用組成物。 
【発明の効果】
【００１１】
本発明による組成物は、肺炎の原因病原体の感染予防と感染性肺炎の治療効果を併せ持つ。また肺炎の治療に用いられる抗生物質とは異なっており、抗生物質耐性菌の出現のおそれが少なく、副作用が少ないという特徴を有している。
また本発明による組成物は、末梢性の免疫寛容に関わるＴｒｅｇ細胞の分化を抑制することによって、免疫寛容を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウスに対する肺炎球菌感染予防効果を確認した動物試験の結果を示すグラフである。
【図２】Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−４及びＴＧＦβの存在下で培養したときのＴｒｅｇ出現率を示すグラフである。
【図３】Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−６抗体及びＴＧＦβの存在下で培養したときのＴｒｅｇ出現率を示すグラフである。
【図４】Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びＴＧＦβの存在下で培養したときのＴｒｅｇ出現率を示すグラフである。
【図５】アンペロプシンを投与することによってＴ細胞のサブタイプに及ぼす影響を確認した動物試験の結果を示すグラフである。上段は腸間膜、下段は脾臓における抗ＩＦＮγ抗体に陽性反応を示す細胞の比率を示すグラフである。
【図６】アンペロプシンを投与することによってＴ細胞のサブタイプに及ぼす影響を確認した動物試験の結果を示すグラフである。上段は腸間膜、下段は脾臓における抗ＩＬ−１７抗体に陽性反応を示す細胞の比率を示すグラフである。
【図７】アンペロプシンを投与することによってＴ細胞のサブタイプに及ぼす影響を確認した動物試験の結果を示すグラフである。上段は腸間膜、下段は脾臓におけるＴｈ１７（ＰＥ−ｅＦｌｕｏｒ６１０−抗ＲＯＲγｔ抗体陽性）の比率を示すグラフである。
【図８】アンペロプシンを投与することによってＴ細胞のサブタイプに及ぼす影響を確認した動物試験の結果を示すグラフである。上段は腸間膜、下段は脾臓におけるＴｒｅｇ（ＰＥ−抗Ｆｏｘ３抗体陽性細胞）の比率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アンペロプシンを有効成分として含む感染性肺炎の予防及び治療用組成物又は免疫寛容抑制用組成物に関する。
藤茶は、ブドウ科蛇葡萄属の植物であり、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａである。主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料を常用しており、風邪、のどの痛みの治療などにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す肝臓疾患の治療作用や抗菌作用の活性本体として特定されている。
【００１４】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１５】
【化１】
2020002035.tif 000003
【００１６】
アンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物より単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。
【００１７】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ−２０  三菱ケミカル株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１８】
また、上記のアンペロプシンを１０質量％以上含有するものであれば本発明の感染性肺炎の予防及び治療用組成物又は免疫寛容抑制用組成物として使用可能である。このような組成物を藤茶から得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１９】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２１】
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出し、アンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００２２】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調製
試料（抽出物）約２０ｍｇを精秤し、蒸留水を加えて超音波処理して溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液２ｍＬを５０ｍＬに正確に希釈し、試料溶液とする。  
・標準溶液の調製と検量線作成  
標準品（Ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．００ｍｇを精秤し、１００％アセトニトリルを適量加えて超音波処理して溶解し、さらにアセトニトリルを加えて正確に２５ｍＬとし、アンペロプシン標準原液８０μｇ／ｍＬを調製する。この標準原液を蒸留水にて正確に５倍希釈して、１６μｇ／ｍＬアンペロプシン標準溶液を調製する。ＨＰＬＣへの注入量を１０、２０、４０μＬとし、アンペロプシンのピークに基づいて検量線を作成する。
・ＨＰＬＣ測定条件
下記表１の条件に設定する。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本発明の感染性肺炎の予防及び治療用組成物又は免疫寛容抑制用組成物は、そのまま、あるいは各種賦形剤を添加して製剤化する。製剤としては顆粒剤、錠剤、カプセル剤を例示することができる。
また組成物をそのまま飲食品として用いること、あるいは製剤化したものを医薬又は飲食品として用いることもできる。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
なお本発明の組成物には、アンペロプシンをヒト１日当たりの摂取量として１０〜２５００ｍｇ含有するように調製する。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の組成物の製造例及びこの組成物を用いた試験例を示し、本発明をさらに
説明する。
＜藤茶抽出物の製造例１＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出し、ろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物８５ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、６８質量％であった。
【００２６】
＜藤茶抽出物の製造例２＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して５０％エタノール水溶液を１５倍量加え、還流冷却機を付して加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に同様に５０％エタノール水溶液を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物７８．１ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、５２．９質量％であった。
【００２７】
＜藤茶抽出物の製造例３＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出し、ろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを得た。さらにグァーガム分解物を、濃縮液あたり７８ｇ添加し、−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１６３．１ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、２４．７質量％であった。
【００２８】
＜藤茶抽出物の製造例４＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出し、ろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを得た。さらにγシクロデキストリンを、濃縮液中に７８ｇ添加し、−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１５１．４ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、２６．４質量％であった。
【００２９】
＜肺炎球菌感染試験＞
（１）試験試料
市販の藤茶抽出物（丸善製薬株式会社製）を試験試料とした。この抽出物中にはＨＰＬＣ法で測定したとき、固形物重量あたりアンペロプシンが３０質量％含有されていた。
【００３０】
（２）試験動物
ＣＢＡ／Ｊマウス（３週齢、雄性）を１週間の予備飼育の後、１群７匹とし、３群（Ｎｏｒｍａｌ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、アンペロプシン投与群）に群分けし、これを試験動物として用いた。
【００３１】
（３）アンペロプシンの投与
感染試験開始の１４日前から試験終了前日まで、１日１回、シリンジとゾンデを用いて滅菌水で溶解した試験試料（藤茶抽出物）を５００ｍｇ（アンペロプシンとして１５０ｍｇ含有）／１０ｍｌ／ｋｇ強制的に経口投与した。
なお、Ｎｏｒｍａｌ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群には同量の滅菌水を投与した。
【００３２】
（４）試験動物への肺炎球菌の感染
アンペロプシン（藤茶抽出物）投与開始から１４日後に、イソフルラン吸入麻酔下で、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、アンペロプシン投与群の試験動物１個体あたり、鼻腔内に肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＮＢＲＣ  １０２６４２）２×１０７ｃｆｕ／５０μｌを接種して感染させ、接種後４日間継続して飼育した。
なお肺炎球菌の培養は、次の操作手順に従って行った。
１０％ＦＢＳ含有ＢＨＩ液体培地５００ｍＬにストックした菌液１００μＬを加え、嫌気条件下（三菱ガス化学株式会社製、アネロパック  Ａ−０３）で３７℃、２日間培養する。培養終了後、あらかじめ作成した検量線を用いて菌数を算出し、菌液を６０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離後に、生理食塩液を用いて４×１０８ｃｆｕ／ｍＬに調製する。
菌接種終了後、接種菌数を確認するために、血液寒天培地（ＢＨＩ＋馬脱繊維血液）を用いて嫌気条件下で３７℃、２日間培養し、コロニー数を確認する。
【００３３】
（５）感染予防効果の判定
接種４日後に安楽死させ、その後、解剖して肺を採取した。
採取した肺に、生理食塩液を２００μＬ加え、ホモジナイズ（株式会社ニッピ製、パワーマッシャーＩＩ）し、さらに生理食塩液を８００μＬ追加しさらにホモジナイズした。得られた肺ホモジナイズ液（原液）は、生理食塩液を用いて１０倍から１０５倍希釈まで段階希釈した。血液寒天培地に原液から１０５希釈液まで１００μＬずつ塗布後、嫌気条件下で３７℃、２日間培養した。培養終了後、発生したコロニー数をカウントして、希釈倍率を乗じて肺内に感染した菌数を測定した。
【００３４】
（６）結果
各群の肺炎球菌数測定結果を７匹の平均値及び標準偏差値で表した結果を図１に示す。
図１に示すように、アンペロプシンの投与により、肺から検出される肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）数が減少していた。
すなわちアンペロプシンの事前投与によって、肺への肺炎球菌感染を予防できることが明らかとなった。
【００３５】
＜免疫細胞に対する効果試験＞
１．インビトロ試験（Ｔ細胞分化誘導試験）
細菌感染の成立に関与することが知られているＴ細胞からの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化に及ぼすアンペロプシンの影響を評価した。
（１）試験方法
１）試験試料
動物試験で用いた藤茶抽出物（アンペロプシン３０質量％含有品）及び精製アンペロプシンを用いた。
【００３６】
２）試験方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスより摘出した脾臓およびリンパ節を、７０μｍのセルストレイナー上ですりつぶすことにより単離した細胞に、ＡＣＫ緩衝溶液を入れ、溶血させた。その後、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク株式会社製）を用い、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。
次に、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ／ｃｙ７−抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ−抗ＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ−抗ＣＤ６２Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色を行った。次いでセルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によってＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２ｈｉｇｈの細胞をソーティングした。ソーティングした細胞を、抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＩＬ−４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＩＦＮｇ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＴＧＦβの存在下で、最終濃度３０ｍｇ（アンペロプシン９ｍｇ）／ｍｌの藤茶抽出物、１０または１００μＭのアンペロプシンと共に抗ＣＤ３抗体をコーティングした９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで４日間培養した。
培養終了後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ，  ｆｏｒ  ＵＶ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて死細胞を染色した。
さらに抗体の非特異的結合を抑制するため、抗ＣＤ１６／抗ＣＤ３２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて反応を行った。その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７１０−抗ＴＣＲβ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ／ｃｙ７−抗ＣＤ４抗体、ＡＰＣ−抗ＣＤ２５抗体で反応させ、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて細胞を固定した。次に、ＰＥ−抗Ｆｏｘ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて細胞内染色を行い、染色した細胞をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩを用いて解析を行い、Ｔｒｅｇの分化率を測定した。
【００３７】
（２）結果
図２〜４に解析結果グラフを示す。
Ｔｈ９  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ＩＬ−４＋ＴＧＦβ）、Ｔｈ１７  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ＩＬ−６＋ＴＧＦβ）及びＴｒｅｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ＴＧＦβ）の各条件下において、藤茶抽出物またはアンペロプシンを処理したところ、ｎａｉｖｅ  Ｔ細胞からＴｒｅｇへの分化が抑制された。
この実験結果より、各種抗原により活性化される免疫担当細胞の機能を増強させることが期待できる。
【００３８】
２．動物試験
（１）試験方法
正常マウスを用いて、アンペロプシンによるＴ細胞分化のサブタイプバランスに及ぼす影響を評価した。Ｔ細胞のサブタイプは細胞に発現するマーカーを指標とした。
１）試験試料
上記の１−（１）−１）に示した藤茶抽出物（アンペロプシン３０質量％含有品）を用いた。
【００３９】
２）試験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢、雄性）を１週間の予備飼育の後、１群１０匹とし、３群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群、藤茶抽出物低容量群・Ｌｏｗ、藤茶抽出物高容量群・Ｈｉｇｈ）に群分けし、これを試験動物として用いた。
【００４０】
３）アンペロプシンの投与
Ｃｏｎｔｒｏｌ群には滅菌水のみを、また、藤茶抽出物は、低容量群には藤茶抽出物を１００ｍｇ（アンペロプシン３０ｍｇ）／１０ｍｌ／ｋｇ、藤茶抽出物高容量群には藤茶抽出物を５００ｍｇ（アンペロプシン１５０ｍｇ）／１０ｍｌ／ｋｇになるように胃ゾンデを用いて毎日強制的に経口投与した。
【００４１】
４）臓器の摘出
投与試験開始から１０日後、マウスを炭酸ガスで安楽死させた。直ちに脾臓、腸間膜リンパ節を摘出した。
【００４２】
５）Ｔ細胞の分化刺激と分化細胞解析
各臓器を７０μｍセルストレイナー上ですりつぶすことにより単離した細胞に、ＡＣＫ緩衝溶液を入れることで溶血させた。細胞カウント後、ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ及びＧｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により３７℃で４時間刺激をかけた。
刺激後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ，ｆｏｒ  ＵＶ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎにて死細胞を染色した。さらに抗体の非特異的結合を抑制するため、抗ＣＤ１６／抗ＣＤ３２抗体にて反応を行った。
次に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７１０−抗ＴＣＢβ、ＡＰＣ／Ｃｙ７−抗ＣＤ４抗体およびＡＰＣ−抗ＣＤ２５抗体で染色を行い、その後Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔを用いて細胞を固定した。
細胞固定後、ＰＥ−抗Ｆｏｘ３抗体、ＦＩＴＣ−抗ＩＬ−１７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５−抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ−ｅＦｌｕｏｒ６１０−抗ＲＯＲγｔ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて細胞内染色を行った。染色後、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩにて解析を行い、各Ｔ細胞の分化率を定量した。
各抗体は、Ｔ細胞分化サブタイプの細胞に主として発現しているサイトカインやタンパク質と反応することが知られている。
【００４３】
各抗体と細胞の対応は次のとおりである。
ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５−抗ＩＦＮγ抗体：ＩＦＮγ陽性細胞（図５）
ＦＩＴＣ−抗ＩＬ−１７抗体：ＩＬ−１７陽性細胞（図６）
ＰＥ−ｅＦｌｕｏｒ６１０−抗ＲＯＲγｔ抗体：Ｔｈ１７（図７）
ＰＥ−抗Ｆｏｘ３抗体陽性細胞：Ｔｒｅｇ（図８）
【００４４】
（２）結果
図５〜図８に解析結果のグラフを示す。藤茶抽出物は、正常マウスのＴ細胞バランスに影響を及ぼすことが分かった。この結果は、細胞実験の結果と同様、Ｔｒｅｇの分化を抑制し得ることが期待できる。また同時に、Ｔｒｅｇの挙動は必ずしも藤茶等によって抑制されてはいないため、Ｔｈ１７、ＩＦＮγやＩＬ−１７陽性細胞の分化を促進することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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