(57)【要約】      （修正有）【課題】無血清培地を用いた場合であっても、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる方法及び組成物の提供。【解決手段】ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤
【請求項２】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む、請求項１のタンパク質産生促進剤
【請求項３】
請求項１又は請求項２のタンパク質促進剤を含む動物細胞用培地
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる培地用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品（抗体医薬品）は、特異的、高活性でかつ副作用が少ないなどの従来の低分子医薬にはない効果を有しており、今後高い成長が見込まれている。また、再生医療に必要な細胞の培養（iPS細胞、ES細胞等）、酵素などの有用物質の生産等にも細胞培養が必要である。そのため企業間の開発競争は激化しており、製造や研究開発の一部外注化が進むと予想されている。
バイオ医薬品の多くが、翻訳後修飾が比較的ヒトに近い等の理由により動物細胞を用いて生産されている。この動物細胞で物質生産するには、動物細胞の増殖に必要な血清や血清中から分離したタンパク質成分を添加した培地がよく使われている。しかし、血清は生物材料であるために、マイコプラズマ、ウイルス、ＢＳＥの原因となる異常プリオンが混入している可能性がある。また、血清はロットごとに生物活性が異なり、品質のよいロットを選択するための検査が必要であるところ、この検査にもコストが発生する。そのため、最近、血清を含まない無血清培地に種々の成分を加えて細胞を増殖させる様々な方法が提案されている（特許文献１）。
【０００３】
そこで、細胞増殖自体の誘起または促進に不可欠な成分に加えて、培養速度を高い水準に維持する役割を果たす補完的な成分の添加が検討されてきた。例えば、大豆由来β−コングリシニン（特許文献２）、リン脂質（特許文献３）などが、報告されている。
【０００４】
一方、バイオ医薬品生産等のために開発される無血清培地の最終目的は組み換えタンパク質生産を高い効率で行うことであるので、生産能力を上げることが望まれている。そのため、無血清培地の細胞増殖の改善だけでなく、タンパク質分泌促進因子を開発することも必要である。無血清培地の培地用添加剤として、リン脂質を血清代替として用いることが報告されている（特許文献４）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２００１４号公報
【特許文献２】特開２０１１‐１８２７３６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／０８０９１９
【特許文献４】特表２０１３−５１２６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような状況に鑑み、無血清培地を用いた場合であっても、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる方法及び組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を無血清培地に添加した培地で動物細胞を培養すると、組み換えタンパク質の生産能力を高めることができることを見出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
（１）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤、
（２）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む、（１）のタンパク質産生促進剤、
（３） （１）又は（２）のタンパク質促進剤を含む動物細胞用培地、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、細胞増殖を促進し、さらに、組み換えタンパク質の産生も促進することができ、有用物質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】HPLC-ELSD分析
【図２】細胞増殖性
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の培地は、遺伝子組み換えタンパク質を生産するための培地であって、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含むことを特徴とする。
【００１２】
本願発明の組成物であるタンパク質産生促進剤は、植物由来及び動物由来のいずれのものを使用してもよい。例えば、ホスファチジルセリンの場合であれば、大豆、魚、獣脳、獣肉、卵、乳製品等さらに酵母などに由来するものを使用することができる。これらの動植物等の組織、酵母などから抽出・単離することで得ることができる。抽出方法は公知の方法を利用でき制限はない。さらに、天然由来のではなく化学合成により、入手したものでも良い。さらに、通常の方法により得られたＰＥやＬＰＥを用いることができるが、さらに精製等によりＰＥ又はＬＰＥを濃縮しても良い。具体的には、リゾホスファチジルエタノールアミンの場合は、例えば、特開２００７−１２６３９８に記載の方法などである。つまり、リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ１ またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収する。
【００１３】
このようにして得られた本願の組成物を動物培養用培地に添加することで動物細胞用培地を得ることができる。添加量は対象となる細胞により異なるが、通常は、ＰＥとＬＥＰの合計量で少なくとも培地濃度が０．０００１重量％以上、好ましくは０．００５重量％以上、さらに好ましくは０．００１重量％以 上の濃度となるように添加する。
【００１４】
本願組成物は、血清培地、低血清培地でも使用できるが、無血清培地の方がより好適に使用できる。培地の組成は、一般的な組成でよく、一般的に市販されている動物細胞用培地も使用することができる。また、宿主細胞に応じで適宜選択することができる。
本発明で用いる動物細胞としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に対して、特にCHO-K1、HEK293等に対して好適である。
【００１５】
本発明の組成物を培地へ添加する方法は、任意である。通常、前述までの方法で得られた、本発明の組成物を噴霧乾燥、凍結乾燥等して使用する。また、乾燥品を使用しなくても良い。
【００１６】
本発明の組成物を動物細胞用培地に添加し、培養することで、組換えタンパク質等の有用物質の発現が促進される。そのため、本願組成物を用いて培養した培地から目的とする有用物質を単離することにより、有用物質を製造することができる。動物細胞から得られる有用物質としては、抗体、酵素、ホルモンなどがある。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
（酵母抽出物の製造例）
（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽で、１８L培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行った。ｐＨのコントロールは、アンモニアで行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌して、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。
（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁する、又は、凍結乾燥、若しくは熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁する。2N NaOHでpH13に調整後、70℃で20分間攪拌し、酵母エキスを抽出した。酵母エキス抽出後の菌体残渣をドラムドライヤーで乾燥し、乾燥物100gを酵母残渣として使用した。
【００１９】
製造例１
上記酵母残渣100ｇに対して95%エタノールを2倍量となるように加え、60℃、9時間抽出した。5℃に降温して1時間保持した後、ろ紙（ADVANTEC社、NO.5C）で濾過し不溶物を取り除いた。さらに、ろ過液をロータリーエバポレーターにて減圧濃縮乾固し、組成物5.5ｇを得た。
トルラオイル5 gを7.5 mLクロロホルムに溶かして、オープンカラムに供した。樹脂はイアトロビーズ6RS-8060を使用した。展開溶媒をクロロホルムとメタノールにし、クロロホルム100％、80％、60％、40％、20％、0％の順に溶媒を各400 mLずつ流し、クロロホルム80％画分を1.32 g回収した。
次に、クロロホルム80％画分1.3 gを5 mLクロロホルムに溶かして、上記と同じオープンカラムに供した。展開溶媒はクロロホルム、アセトン、メタノールを用いた。展開溶媒の割合の下記の順に流し、計6画分を回収し、画分VIを0.32 g回収した。
クロロホルム      アセトン      メタノール 
画分I        400 mL             0 mL            0 mL
画分II       320 mL            80 mL            0 mL
画分III      200 mL           200 mL            0 mL
画分IV         0 mL           400 mL            0 mL
画分V          0 mL           200 mL          200 mL
画分VI         0 mL             0 mL          400 mL
【００２０】
得られた各画分をHPLC-ELSD分析した。
カラム：SIL100A3μm  4.6 x 100 mm
カラムオーブン：35℃
流速：1.0 mL/min
移動層：A:メタノール:水＝95：5
B:クロロホルム
分析条件：
2020162536.tif 000002
【００２１】
結果を図１に示す。
【００２２】
（細胞増殖への影響）
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、細胞増殖への影響を確認した。
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、HEK293の増殖への影響を確認した。
HEK２９３を９６Wellプレートに4×10^3 cells/0.1 mL/wellとなるよう調整し24時間CO2インキュベーター培養後、PBS（−）で各Wellを洗浄後、各画分I〜VIを含む無血清培地に置換した。48時間培養後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を10μL/well添加し、1時間後、４５０ｎｍで吸光度測定した。測定の結果を図２に示す。
画分I、II、V、VIを0.001％添加したWellの増殖性が無血清培地のコントロールよりも増殖性が改善していた。
【００２３】
活性のあった各分は、図１の解析結果より、特に活性の強かった画分VIの検出されたピーク面積から、PEが８６．２１％、LPEが１２．５３％含有していることが分かった。
以上から、無血清培地において、PE及びLPEを添加することで、細胞増殖性を改善できることが確認できた。
【００２４】
画分VIを培地に添加し、Gaussia Luciferase（GLuc）の発現量、Human IL-6（hIL6）の発現量を解析した。使用した培地は、ＲＰＭＩ１６４０（WAKO製 「189-02025」）に、画分VIの組成物を０．０１％添加した無血清培地を用いた。
安定発現株の取得：CHO−K1細胞を1×10^4 cells/mL/24 well plateに播種した。翌日、hIL6遺伝子（500ng/well）をトランスフェクションした。トランスフェクション3日目に、細胞を100mm dishに移して、細胞が80%程度コンフルエントになってから、G418含有培地に切り替え、約1週間培養しながらセレクションを行った。その後、出来上がったコロニーをピックアップして96wellpateで培養し、活性確認を行い、活性があった細胞を更に24well plate、6well plateにスケールアップしてhIL6安定発現株を取得した。
【００２５】
（無血清培地のGluc安定発現株に与える影響）
GLuc安定発現株を前述のｈＩＬ６と同様の方法で取得し、5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、酵母抽出物含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のGluc活性を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
取得した安定株３株（230株、232株、236株）で評価し、３株とも、細胞当たりのGluc活性は、RPMI1640/画分VIがRPMI1640/FBS群やCDM4CHO群よりも高い活性を示した。なお、RPMI1640/FBS群は、ＲＰＭＩ１６４０に、ウシ血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％となるように添加して、CHO−K1細胞を培養する培地として用いた群である。CDM4CHO群は、CHO-K1細胞を培養する培地にCDM4CHO（GE Healthcare社製「HyClone」）のみを用いた群である。
【００２６】
（無血清培地のhIL6安定発現株に与える影響）
取得した安定株２株（HE11A1株、HE12A2株）で評価し、２株を5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、画分VI含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のhIL6発現量を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
HE11A1株、HE12A2株とも、細胞当たりのIL-6産生量はRPMI1640/画分VIが、ほかの2群と比べて明らかに高い値を示した。  
【図１】
2020162536.tif 000003
【図２】
2020162536.tif 000004