(57)【要約】【課題】質量分析により、微生物に含まれる分子をより再現性よく安定検出する。【解決手段】微生物分析用試料の調製方法は、微生物の濃度が、１×１０６ＣＦＵ／μＬ以上６×１０７ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液を調製することと、試料溶液の遠心分離を行うことと、遠心分離により得られた上清を用いて、質量分析用試料を調製することとを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の濃度が、１×１０６ＣＦＵ／μＬ以上６×１０７ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液を調製することと、
前記試料溶液の遠心分離を行うことと、
前記遠心分離により得られた上清を用いて、質量分析用試料を調製することと
を備える微生物分析用試料の調製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
前記遠心分離の前に、前記試料溶液に超音波処理を行うこと
を備える微生物分析用試料の調製方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
マトリックスを含む溶液に前記微生物を加えた後、前記溶液の濁度を調整するか、若しくは、前記微生物を含む溶液の濁度を調製した後、マトリックスを含む溶液と混合すること、または、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物をマトリックスを含む溶液に加えるか、若しくは、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物を含む溶液を調製した後、マトリックスを含む溶液と混合することにより前記試料溶液を調製する微生物分析用試料の調製方法。
【請求項４】
請求項３に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
前記マトリックスの添加剤としてホスホン酸基を含む化合物および界面活性剤の少なくとも一つを用いて前記質量分析用試料を調製する微生物分析用試料の調製方法。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
前記添加剤は、メチレンジホスホン酸およびＮ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである微生物分析用試料の調製方法。
【請求項６】
請求項３から５までのいずれか一項に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
前記マトリックスは、シナピン酸である微生物分析用試料の調製方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の微生物分析用試料の調製方法において、
前記微生物は、サルモネラ属の細菌である微生物分析用試料の調製方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の微生物分析用試料の調製方法を用いて微生物分析用試料を調製することと、
調製された微生物分析用試料の第１質量分析を行うことと
を備える微生物の分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の微生物の分析方法において、
前記第１質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化する微生物の分析方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の微生物の分析方法において、
前記第１質量分析では、１００００以上のｍ／ｚに対応するピークを検出する微生物の分析方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微生物の分析方法において、
前記微生物とは異なる微生物から調製された質量分析用試料の第２質量分析を行い、前記第２質量分析により得られたデータに基づいて前記第１質量分析における検出器の電圧を設定することとを備える微生物の分析方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微生物の分析方法において、
前記第２質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化する微生物の分析方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の微生物の分析方法において、
前記第２質量分析において、大腸菌のマススペクトルのｍ／ｚ  ２２０００以上２３０００以下の範囲における最も強度の大きいピーク、および、前記マススペクトルのｍ／ｚ  ２３０００以上２４０００以下の範囲における最も強度の大きいピークの少なくとも一つの強度に基づいて、前記検出器の電圧を設定する微生物の分析方法。
【請求項１４】
請求項８から１３までのいずれか一項に記載の微生物の分析方法において、
前記第１質量分析により、マススペクトルに対応するマススペクトルデータを取得することと、
前記マススペクトルデータにおいて、ｍ／ｚに基づいて異なるスムージングを行うこととを備える微生物の分析方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微生物の分析方法において、
前記マススペクトルデータにおいて、ｍ／ｚの第１範囲におけるスムージングよりも、前記第１範囲よりも高いｍ／ｚを有する第２範囲において、各データ点に対応する強度をより多くのまたはより広い範囲のデータ点を用いて修正する微生物の分析方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の微生物の分析方法において、
前記第１範囲および前記第２範囲は、閾値に基づいて設定され、前記閾値はｍ／ｚ  １５０００以上２００００以下である微生物の分析方法。
【請求項１７】
請求項８から１６までのいずれか一項に記載の微生物の分析方法を用いて微生物の識別を行う微生物の識別方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の微生物の識別方法において、
前記微生物は、サルモネラ属の細菌であり、
前記第１質量分析では、ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦおよびＳｏｄＡからなる群から選択される少なくとも一つのサルモネラ由来のタンパク質の検出を行う微生物の識別方法。
【請求項１９】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の微生物分析用試料の調製方法、請求項８から１６までのいずれか一項に記載の微生物の分析方法、または請求項１７または１８に記載の微生物の識別方法を行うための微生物分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物分析用試料の調製方法、微生物の分析方法、微生物の識別方法および微生物分析用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析により、微生物に含まれる分子を解析することが行われている。特に、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）質量分析（ＭＡＬＤＩ質量分析）により微生物の種類の識別を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を決定し当該配列に基づいて識別を行う方法よりも迅速に行うことができるため極めて有用である。この場合、得られたマススペクトルにおける予め定められたピークの位置に基づいて、微生物の識別が行われる（特許文献１参照）。微生物の識別の精度を上げるためには、ピークに対応するタンパク質などの分子が微生物に存在しているときに、再現性良く当該分子のイオンをピークとして検出する必要がある。このように、より精密に微生物に含まれる分子を解析するためには、質量分析の精度を上げることが望ましい。質量分析の精度を上げるためには、ピーク検出の感度向上および再現性の向上が望まれる。
【０００３】
サルモネラの血清型あるいは株の識別に有効なマーカータンパク質１２種類と、その解析法が報告されている（非特許文献１）。より再現性の高い安定した解析を行うためには、マーカータンパク質に対応するピークの感度を上げたり、分析条件のばらつきを低下させたりすることが考えられる。  
【０００４】
ＭＡＬＤＩ質量分析における感度を上げるために、マトリックスの添加剤として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid：ＭＤＰＮＡ）(特許文献２、非特許文献２)、および界面活性剤であるＮ-デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）(非特許文献３、非特許文献４)を用いることが提案されている。
【０００５】
微生物のＭＡＬＤＩ質量分析の分析条件については、再現性または検出限界等の観点から、非特許文献５、非特許文献７および非特許文献９の総説をはじめとする幾つかの文献で報告されている。非特許文献６では、コクシエラ菌（Coxiella burnetti）を異なる複数の濃度で含む試料溶液についてＭＡＬＤＩ質量分析を行ったことが報告されている。非特許文献８では、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis; Salmonella Choleraesuis）に、免疫磁気分離法と組み合わせたＭＡＬＤＩ質量分析の検出限界が報告されている。非特許文献１０では、所定の濃度の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、セレウス菌（Bacillus cereus）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の所定の濃度におけるＭＡＬＤＩ質量分析が報告されている。非特許文献１１および非特許文献１２では、免疫磁気分離法および／またはファージ増幅と組み合わせた所定の濃度の大腸菌のＭＡＬＤＩ質量分析が報告されている。非特許文献１３および非特許文献１４では、磁性ナノ粒子を用いた黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、腐性ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）または大腸菌のＭＡＬＤＩ質量分析の検出限界が報告されている。
【０００６】
超音波処理を用いたＭＡＬＤＩ質量分析用試料の調製については、非特許文献１５に、大腸菌への適用が報告されている。さらに、グラム陽性菌、およびグラム陰性菌の細胞分解の目的でも使用されている（非特許文献１６）。非特許文献１７には、加水分解酵素リゾチームを用いた分解処理と超音波処理とを組み合わせた例が報告されている。 
【０００７】
遠心分離を用いた質量分析用試料の調製については、病原性の菌の不活性化の際、菌体を、トリフルオロ酢酸を含む溶液で処理した後、懸濁液を遠心分離、およびろ過する方法などが、提案されている（非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１５−１８４０２０号公報
【特許文献２】特開２００９−１２１８５７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ojima-Kato  T, Yamamoto N, Nagai S, Shima K, Akiyama Y, Ota J, Tamura H. "Application of proteotyping Strain SolutionTM ver. 2 software and theoretically calculated mass database in MALDI-TOF MS typing of Salmonella serotype" Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, Vol．101，Ｎｏ．23-24，pp.8557-8569 [Applied Microbiology and Biotechnology,（ドイツ）, Springer International, 2017年10月14日、Volume 101, Issue 23-24, pp.8557-8569]
【非特許文献２】Kuyama  H, Sonomura K, Nishimura O. "Sensitive detection of phosphopeptides by matrix‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: use of alkylphosphonic acids as matrix additives" Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008, Vol.22, pp.1109-1116 [Rapid Communications in Mass Spectrometry, （英国）, John Wiley And Sons Ltd., 2008年4月30日、Volume 22, pp.1109-1116]
【非特許文献３】Meetani MA, Voorhees KJ. "MALDI mass spectrometry analysis of high molecular weight proteins from whole bacterial cells: pretreatment of samples with surfactants" Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2005, Vol.16, pp.1422-1426 [Journal of the American Society for Mass Spectrometry, （米国）, Springer, 2005年7月14日、Volume 16, pp.1422-1426]
【非特許文献４】Nilsson CL. "Finger printing of Helicobacter pylori strains by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis" Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1999, Vol.13, pp.1067-1071 [Rapid Communications in Mass Spectrometry,（英国）, John Wiley And Sons Ltd., 1999年、Volume 13, pp.1067-1071]
【非特許文献５】Sedo O, Sedlacek I, Zdrahal Z. "Sample preparation methods for MALDI-MS profiling of bacteria" Mass spectrometry reviews, 2011, Vol.30, pp.417-434 [Mass spectrometry reviews,（米国）, Wiley, 2010年11月22日、Volume 30, pp.417-434]
【非特許文献６】Shaw EI, Moura H, Woolfitt AR, Ospina M, Thompson HA, Barr JR. "Identification of biomarkers of whole Coxiella burnetii phase I by MALDI-TOF mass spectrometry" Analytical Chemistry, 2004, Vol.76, pp.4017-4022 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 2004年7月15日, Volume 76, Issue 14, pp.4017-4022]
【非特許文献７】Sandrin TR, Goldstein JE, Schumaker S. "MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review" Mass spectrometry reviews, 2013, Vol.32, pp. 188-217 [Mass spectrometry reviews,（米国）, Wiley, 2012年9月19日、Volume 32, pp.188-217]
【非特許文献８】Madonna AJ, Basile F, Furlong E, Voorhees KJ. "Detection of bacteria from biological mixtures using immunomagnetic separation combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2001, Vol.15, pp.1068-1074 [Rapid Communications in Mass Spectrometry,（英国）, John Wiley And Sons Ltd, 2001年、Volume 15, pp.1068-1074]
【非特許文献９】Sandrin TR, Demirev PA. "Characterization of microbial mixtures by mass spectrometry" Mass spectrometry reviews, 2018, Vol. 37, pp.321-349 [Mass spectrometry reviews,（米国）, Wiley, 2018年、Volume 37, pp.321-349]
【非特許文献１０】Li S, Guo Z, Wu HF, Liu Y, Yang Z, Woo CH. "Rapid analysis of Gram-positive bacteria in water via membrane filtration coupled with nanoprobe-based MALDI-MS" Analytical and bioanalytical chemistry, 2010, Vol.397, pp.2465-2476 [Analytical and bioanalytical chemistry,（ドイツ）, Springer-Verlag, 2010年5月29日、Volume 397, pp.2465-2476]
【非特許文献１１】Madonna AJ, Cuyk SV, Voorhees KJ. "Detection of Escherichia coli using immunomagnetic separation and bacteriophage amplification coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2003, Vol.17, pp.257-263 [Rapid Communications in Mass Spectrometry,（英国）, John Wiley And Sons Ltd., 2003年、Volume 17, pp.257-263]
【非特許文献１２】Ochoa ML, Harrington PB. "Immunomagnetic isolation of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 from ground beef and identification by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and database searches" Analytical Chemistry, 2005, Vol.77, pp.5258-5267 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 2005年8月15日, Volume 77, Issue 16, pp.5258-5267]
【非特許文献１３】Lin YS, Tsai PJ, Weng MF, Chen YC. "Affinity capture using vancomycin-bound magnetic nanoparticles for the MALDI-MS analysis of bacteria" Analytical Chemistry, 2005, Vol.77, p.1753-1760 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 2005年, Volume 77,  Issue 6, pp.1753-1760]
【非特許文献１４】Liu JC, Tsai PJ, Lee YC, Chen YC. "Affinity capture of uropathogenic Escherichia coli using pigeon ovalbumin-bound Fe3O4@Al2O3 magnetic nanoparticles" Analytical Chemistry, 2008, Vol. 80, pp.5425-5432 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 2008年7月15日, Volume 80, Issue 14, pp.5425-5432]
【非特許文献１５】Easterling ML, Colangelo CM, Scott RA, Amster IJ. "Monitoring protein expression in whole bacterial cells with MALDI Time-of Flight mass spectroscopy" Analytical Chemistry, 1998, Vol.70, pp.2704-2709 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 1998年7月1日, Volume 70, Issue 13, pp.2704-2709]
【非特許文献１６】Cain TC, Lubman DM, Weber Jr WJ. "Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1994, Vol.8, pp.1026-1030 [Rapid Communications in Mass Spectrometry,（英国）, John Wiley And Sons Ltd., 1994年、Volume 8, pp.1026-1030]
【非特許文献１７】Smole SC, King LA, Leopold PE, Arbeit RD. "Sample preparation of Gram-positive bacteria for identification by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight" Journal of microbiological methods, 2002, Vol.48, pp.107-115 [Journal of microbiological methods,（オランダ）, Elsevier Biomedical, 2002年、Volume 48, pp.107-115]
【非特許文献１８】Lasch P, Nattermann H, Erhard M, Stammler M, Grunow R, Bannert N, Appel B, Naumann D. "MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores" Analytical Chemistry, 2008, Vol.80, pp.2026-2034 [Analytical Chemistry,（米国）, American Chemical Society, 2008年3月15日, Volume 80, Issue 6, pp.2026-2034]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
微生物の質量分析におけるピーク検出が不安定で、微生物に含まれる分子のピーク検出の再現性が低い場合があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、微生物の濃度が、１×１０６ＣＦＵ／μＬ以上６×１０７ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液を調製することと、前記試料溶液の遠心分離を行うことと、前記遠心分離により得られた上清を用いて、質量分析用試料を調製することとを備える微生物分析用試料の調製方法に関する。
本発明の第２の態様は、第１の態様の微生物分析用試料の調製方法を用いて微生物分析用試料を調製することと、調製された微生物分析用試料の第１質量分析を行うこととを備える微生物の分析方法に関する。
本発明の第３の態様は、第２の態様の微生物の分析方法を用いて微生物の識別を行う微生物の識別方法に関する。
本発明の第４の態様は、第１の態様の微生物分析用試料の調製方法、第２の態様の微生物の分析方法、または第３の態様の微生物の識別方法を行うための微生物分析用キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、微生物の質量分析のピーク検出が安定し、微生物に含まれる分子のピーク検出の再現性を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、一実施形態の分析方法を示す概念図である。
【図２】図２は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図３】図３（表１−Ａ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、従来の方法で、複数の菌濃度の試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、各マーカーの検出率を示す表である。
【図４】図４（表１−Ｂ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、一実施形態の方法で調製した複数の菌濃度の試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、各マーカーの検出率を示す表である。
【図５】図５（表１−Ｃ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、一実施形態の方法で複数のチューブ（Ｎｏ.１〜８）に調製した１×１０７個／ウェルの菌濃度の試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、各チューブにおける各マーカーの検出率を示す表である。
【図６】図６は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、菌濃度の調整を行わなかった場合（比較例２）、および菌濃度の調整を行った場合（実施例２）における各ウェルの菌濃度のばらつきを示す箱ひげ図である。
【図７】図７は、（ａ）従来の方法(比較例３)、および（ｂ）一実施形態の方法（実施例３）で調製した２つの異なる菌株のサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313）をそれぞれ含む質量分析用試料のＭＡＬＤＩプレ−ト上の結晶画像を示す図である。
【図８】図８は、６つの異なる菌株のサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）のそれぞれについて、遠心分離を行い、（ａ）得られた遠心上清を用いて分析用試料を調製した場合と、（ｂ）遠心分離を行わずに分析用試料を調製した場合における、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図９】図９は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）に対し、（ａ）超音波懸濁により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）ニードル懸濁により分析用試料を調製した場合における、マススペクトルのＹｃｉＦに対応するピークを示す図である。
【図１０】図１０は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）に対し、（ａ）超音波懸濁により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）ボルテックスミキサーを用いた懸濁により分析用試料を調製した場合における、マススペクトルのＹｃｉＦに対応するピークを示す図である。
【図１１】図１１は、大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を対象とし、（ａ）ｍ／ｚ  ２１５００〜２３０００、および（ｂ）ｍ／ｚ  ２１５００〜２４０００のマススペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）を対象とし、基準電圧から、（ａ）９０Ｖ、（ｂ）７０Ｖ、（ｃ）５０Ｖ、（ｄ）３０Ｖ、および（ｅ）０Ｖ高く検出器電圧を設定した場合の、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１３】図１３は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を対象とし、基準電圧から、（ａ）７０Ｖ、（ｂ）５０Ｖ、（ｃ）３０Ｖ、および（ｄ）０Ｖ高く検出器電圧を設定した場合の、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１４】図１４は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を対象とし、基準電圧から、（ａ）７０Ｖ、（ｂ）５０Ｖ、（ｃ）３０Ｖ、および（ｄ）０Ｖ高く検出器電圧を設定した場合の、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１５】図１５は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を対象とし、（ａ）比較的低いスムージング値（５０）を用いて処理を行った場合と、（ｂ）比較的高いスムージング値（２００）を用いて処理を行った場合の、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１６】図１６は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）を対象とし、（ａ）従来の方法により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１７】図１７は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を対象とし、（ａ）従来の方法により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１８】図１８は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を対象とし、（ａ）従来の方法により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図１９】図１９は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe1402-4）を対象とし、（ａ）従来の方法により分析用試料を調製した場合と、（ｂ）一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図２０】図２０は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図２１】図２１は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, 3313）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図２２】図２２は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe1402-4）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図２３】図２３は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Thompson, ATCC BAA-1738）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、各ウェルの、マススペクトルのＳｏｄＡに対応するピークを示す図である。
【図２４】図２４（表１２−Ａ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）を対象とし、従来の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図２５】図２５（表１２−Ｂ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図２６】図２６（表１２−Ｃ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を対象とし、従来の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図２７】図２７（表１２−Ｄ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図２８】図２８（表１２−Ｅ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を対象とし、従来の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図２９】図２９（表１２−Ｆ）は、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を対象とし、一実施形態の方法により分析用試料を調製した場合における、日程ごとのマーカーの検出率を示す表である。
【図３０】図３０（表１３−Ａ）は、従来の方法で調製したサルモネラ・エンテリカ６菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）の各試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、１２マーカーの検出率を示す表である。
【図３１】図３１（表１３−Ｂ）は、図３０（表１３−Ａ）とは異なる日程で、従来の方法で調製したサルモネラ・エンテリカ６菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）の各試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、１２マーカーの検出率を示す表である。
【図３２】図３２（表１３−Ｃ）は、一実施形態の方法で調製したサルモネラ・エンテリカ６菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）の各試料をＭＡＬＤＩ質量分析した際の、１２マーカーの検出率を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
【００１５】
−第１実施形態−
第１実施形態の微生物の分析方法では、所定の濃度の微生物を含む試料溶液が調製され、この試料溶液の遠心分離により得られた上清を用いて質量分析用試料が調製される。調製された質量分析用試料は質量分析に供される。
【００１６】
図１は、本実施形態の微生物の分析方法を示す概念図である。微生物を含む試料Ｓが含まれる試料溶液ＭＳが調製される。微生物の秤量または試料溶液ＭＳの濁度調整により、試料溶液ＭＳの菌濃度は、予め定められた後述する濃度となっている。微生物の秤量を行う場合、秤量の後に混合が行われ（矢印Ａ１１）、秤量の結果に基づいた適切な量のマトリックス溶液Ｍと試料Ｓとが混合され（矢印Ａ１２）、懸濁されて試料溶液ＭＳが得られる（矢印Ａ２１）。マトリックス溶液は、マトリックスを含む溶液であり、マトリックスの添加剤をさらに含むことが好ましい。濁度調整を行う場合、マトリックス溶液Ｍと試料Ｓとが混合され（矢印Ａ１３）、得られた試料溶液ＭＳの濁度の測定および調整が行われ（矢印Ａ１４）、懸濁されて試料溶液ＭＳが得られる（矢印Ａ２２）。
なお、このとき、試料Ｓを含む溶液の濁度を調整後、マトリックス溶液Ｍに混合し、試料溶液ＭＳが得られてもよい。または、試料Ｓを秤量後、菌濃度が調整された試料Ｓを含む溶液を調製し、これをマトリックス溶液Ｍと混合し、試料溶液ＭＳが得られてもよい。また、マトリックス溶液Ｍと試料Ｓの混合は、秤量または濁度調整と、後述する超音波処理および遠心分離の少なくとも一つを含む一連の処理を行った試料Ｓを含む溶液を試料プレートに滴下後、マトリックス溶液Ｍを試料プレートに滴下し、試料プレート上で試料Ｓとマトリックスを混合してもよい。
【００１７】
試料溶液ＭＳは超音波処理に供され（矢印Ａ３で模式的に示した）、その後、遠心分離が行われる（矢印Ａ４）。試料溶液ＭＳは、遠心分離の後、上清Ｓｎと沈殿物Ｐｒに分かれる。上清Ｓｎが試料プレート１０のウェル１１に滴下（矢印Ａ５１）された後乾燥に供され（矢印Ａ５）、質量分析用試料の調製が完了する。その後、検出器電圧の調整が行われ（矢印Ａ６）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（以下、ＭＡＬＤＩと呼ぶ）を用いた質量分析（以下、ＭＡＬＤＩ質量分析と呼ぶ）が行われる（矢印Ａ７）。
【００１８】
（試料について）
試料Ｓは微生物を含めば特に限定されない。採取された対象物に含まれる微生物を分析に供する場合、対象物から微生物を含む部分を取り出し、当該部分を培地に塗布して、微生物の培養を行う。この培養により得られたコロニーを回収し、コロニーに含まれる微生物を試料Ｓとすることができる。例えば、環境から採取された標本、食品または生物の体液等を対象物とすると、本実施形態の方法によりこれらに含まれる微生物の種類を好適に識別することができる。
【００１９】
試料Ｓは、サルモネラ属に属する細菌を含むことが好ましく、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）種の細菌を含むことがより好ましく、サルモネラ・エンテリカ種のエンテリカ亜種（Subspecies  enterica）の細菌を含むことがさらに好ましい。エンテリカ亜種における血清型としては、S． Choleraesuis、S．  Typhimurium、S. Enteritidis、S. Thompson、S. Infantis、およびS．Orionなどが好ましい。
【００２０】
（試料溶液の菌濃度について）
秤量または濁度調整により調整される試料溶液ＭＳの菌濃度は、１×１０６ＣＦＵ／μＬ以上となることが好ましく、３×１０６ＣＦＵ／μＬ以上となることがより好ましい。菌濃度を高くすると、より大きいｍ／ｚに対応するピークをより確実に検出できるようになる。同様の観点から、当該試料溶液ＭＳの濁度は、３ＭＦＵ以上となることが好ましく、１×１０ＭＦＵ以上となることがより好ましい。以下において、ＭＦＵはマクファーランドユニットを示す。
【００２１】
秤量または濁度調整により調整される試料溶液ＭＳの菌濃度は、６×１０７ＣＦＵ／μＬ以下となることが好ましく、３×１０７ＣＦＵ／μＬ以下となることがより好ましい。菌濃度が高すぎると、イオン化阻害物質の影響が現れ、ピークを検出できない場合があるからである。同様の観点から、当該試料溶液ＭＳの濁度は、２×１０２ＭＦＵ以下となることが好ましく、１×１０２ＭＦＵ以下となることがより好ましい。
【００２２】
（菌濃度の調整について）
秤量を行う場合、その方法は特に限定されないが、微量天秤等の天秤を用いて微生物の量を測定することが好ましい。秤量で得られた試料Ｓの量に対して適切な量のマトリックス溶液を加えることにより、菌濃度が調整された試料溶液ＭＳが得られる。
【００２３】
濁度調整を行う場合、菌濃度が得られる濁度測定を行えば特にその方法は限定されないが、マクファーランド比濁法により濁度を測定することが好ましい。濁度の測定と、微生物の量または溶液の量の調整とを適宜行うことにより、上述した好ましい菌濃度に調整することができる。
【００２４】
（超音波処理について）
超音波処理の方法は特に限定されず、公知の方法等を用いることができる。超音波洗浄器または超音波破砕機により、試料溶液ＭＳに連続的または断続的に超音波を放射して行うことができる。超音波処理を行う時間も特に限定されず、例えば３０秒〜５分等に適宜設定することができる。
【００２５】
（遠心分離について）
遠心分離の方法は特に限定されず、遠心分離機を用いた公知の方法等により行うことができる。遠心分離の条件は特に限定されないが、回転数は６０００ｒｐｍ以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。さらに、回転数は１５０００ｒｐｍ以下が好ましく、１３０００以下がより好ましい。遠心分離を行う時間も特に限定されず、１分〜５分等に適宜設定することができる。
【００２６】
（質量分析について）
質量分析は、質量分析計により行われる。検出対象のピークを検出することができれば質量分析の方法は特に限定されない。しかし、解析しやすい測定データを得る観点から、一価のイオンが生成しやすい上述のＭＡＬＤＩによりイオン化を行うことが好ましい。また、１００００以上のｍ／ｚに対応する高質量のイオンを精度よく分析する観点から、上述の飛行時間型質量分析を行うことが好ましい。飛行時間型質量分析のイオンの飛行経路は特に限定されず、リニアモードまたはリフレクトロンモード等を適宜用いることができる。ＭＡＬＤＩ法によるイオン化が可能なＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計（以下、ＭＡＬＤＩ−ＭＳと呼ぶ）を用いて、ＭＡＬＤＩ法でイオン化されたイオンの飛行時間型質量分析を行うことがより好ましい。ＭＡＬＤＩ法は、ソフトイオン化法の一種であり、レーザ光を吸収しにくい物質、またはタンパク質等のレーザ光により損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光を吸収しやすくイオン化しやすいマトリックスと分析対象物質とを混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、シングル質量分析計により行ってもよいし、多段階でフラグメントイオンの解析を行ってもよい。
【００２７】
ＭＡＬＤＩを行う場合、検出対象のピークを検出することができればマトリックスは特に限定されないが、高質量のイオンを効率よく生成する観点からシナピン酸を用いることが好ましい。
【００２８】
マトリックスの添加剤としては、質量分析において、ノイズを低下させたり分析対象のイオンの検出感度を高くしたり等の何らかの効果が期待されるものであれば特に限定されない。添加剤は、検出感度を上げる観点から、ホスホン酸基を含む化合物および界面活性剤の少なくとも一つを含むことが好ましい。ホスホン酸基を含む化合物は、アルキルホスホン酸がより好ましく、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid：ＭＤＰＮＡ）がさらに好ましい。界面活性剤は、Ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）が好ましい。
【００２９】
マトリックス溶液は、マトリックスおよび添加剤が溶媒に加えられて調製される。この溶媒は、有機溶媒か、有機溶媒と水系溶媒とを混合して得られた溶媒が好ましく、有機溶媒や水系溶媒の種類は特に限定されない。一例を挙げると、この溶媒は０．１％以上３％以下等の所定の体積パーセント濃度で調製されたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と任意の濃度のアセトニトリル（ＡＣＮ）とを含む溶液で構成される。アセトニトリルの体積パーセント濃度は、３０％以上７０％以下に設定することが好ましい。このように有機溶媒を含んで調製された溶媒を用いてマトリックス溶液を調製することにより、マトリックス等を容易に溶解することができる。
なお、質量分析用試料を試料プレートのウェルに滴下する前に、ウェルにプリコートを行ってもよい。プリコートは、例えば、エタノール等のアルコールを溶媒としたマトリックス溶液をウェルに滴下することにより行われる。プリコートにより、質量分析用試料が滴下された後、適切な位置に安定して保持されやすくなり、加えてイオン化効率を上げることができる。
【００３０】
試料Ｓに含まれる分析対象の微生物とは異なる微生物を質量分析して得られたデータに基づいて、分析対象の微生物を質量分析する際の検出器電圧を設定することが好ましい。以下では、分析対象の微生物の質量分析を第１質量分析、検出器電圧の調整のための微生物の質量分析を第２質量分析と適宜呼んで区別する。
【００３１】
第２質量分析では、大腸菌を含んで調製された質量分析用試料を質量分析することが好ましい。大腸菌は微生物の質量分析の分野ではよく用いられ入手しやすい微生物であり、ＭＡＬＤＩ分析におけるキャリブレーションにも用いられるため、当該キャリブレーションも同時に行うことができるという利点がある。第２質量分析の質量分析用試料の調製方法は特に限定されず、例えば、大腸菌の培養で得られたコロニーが上述のマトリックス溶液に加えられ、ニードル懸濁等が行なわれた後、懸濁液が試料プレートに滴下され乾燥されて質量分析用試料が得られる。この質量分析用試料が、本実施形態で調製される微生物分析用試料に対応する。
【００３２】
検出器電圧の調整では、第２質量分析により、大腸菌に含まれる分子に対応する所定のピークが所定の大きさで検出される検出器電圧（以下、基準電圧と呼ぶ）を導出し、基準電圧と所定の電圧だけ異なった電圧を第１質量分析における検出器電圧として設定する。例えば、所定のピークは、大腸菌におけるｍ／ｚ  ２２０００以上２３０００以下の範囲で最も強度の大きいピーク、およびｍ／ｚ ２３０００以上２４０００以下の範囲で最も強度の大きいピークの少なくとも一つである。このピークが、例えば０．１ｍＶ以上０．５ ｍＶ以下、好ましくは前者が０．１〜０．３ ｍＶの大きさ、後者が０．１〜０．４ ｍＶの大きさで検出される検出器電圧が基準電圧として導出され、基準電圧よりも５０Ｖ以上７０Ｖ以下高い電圧が第１質量分析の検出器電圧として設定される。検出器電圧が基準電圧から５０Ｖ以上７０Ｖ以下高い電圧に設定されると、質量分析におけるＳ／Ｎ比がこの範囲外の電圧を設定した場合のＳ／Ｎ比よりも高くなる。この検出器電圧の調整は、質量分析計に設置された、または質量分析計と通信可能に接続された制御装置における、ＣＰＵ等を備える処理装置により行われる。
なお、検出器電圧の調整は適宜省略してもよい。
【００３３】
第１質量分析により得られたデータは、解析装置に配置された、ＣＰＵを備える処理装置に入力され、この処理装置が、当該データに基づいて、マススペクトルに対応するデータ（以下、マススペクトルデータと呼ぶ）を生成する等、解析装置により行われる様々なデータ解析の主体となる。このデータ解析の方法は特に限定されない。解析装置は電子計算機等の任意の情報処理装置により構成することができる。解析装置が上記制御装置を構成してもよい。
【００３４】
（スムージング処理）
上述の処理装置により、第１質量分析で得られたマススペクトルデータにスムージング処理を行われることが好ましい。このスムージング処理では、ｍ／ｚの値に応じて、異なるスムージング処理が行われる。例えば、閾値を１５０００以上２００００以下のいずれかの値とする。ここで、当該閾値以上のｍ／ｚに対応するデータ点のスムージング処理では、当該閾値未満のｍ／ｚに対応するデータ点のスムージング処理よりも、１つのデータ点に対してより多くのまたはより広い範囲のデータ点を用いてスムージングを行うことができる。このように、処理装置は、ｍ／ｚの第１範囲におけるスムージングよりも、第１範囲よりも高いｍ／ｚを有する第２範囲において、各データ点に対応する強度をより多くのデータ点を用いて修正する。第１範囲は、例えば、上記閾値以下の範囲から設定され、第２範囲は、上記閾値よりも大きい範囲から設定される。
【００３５】
一般に、質量分析では、一つのマススペクトルに対し、一つのスム−ジング値が適用される。しかし、後述するサルモネラのマーカータンパク質（表１）のように、ｍ/ｚ ６０００〜２３０００のような比較的広い質量範囲を対象とする場合には、一つのスムージング値ではマススペクトルの全域にわたって精度の良い解析ができないときがある。低質量側の第１範囲と高質量側の第２範囲のそれぞれに、適切なスムージング値を適用することにより、マススペクトルの全域で、より確実に、安定した、ピークに対応するｍ／ｚ値を取得できる。特に、解析ソフトウェアを用いてマーカーの解析を行う場合は、後述するようにマーカーに対応するｍ／ｚ値のリストを解析に用いるため、解析前に、スムージング値を適切に補正することで、より確実な解析が可能となる。このように、ｍ／ｚの値に応じて適切にスムージング処理を行うことで、ノイズ等によりピークの位置がずれてしまうこと等を低減することができる。
なお、スムージング処理は適宜省略してもよい。
【００３６】
（微生物の識別）
微生物の識別を行う場合、第１質量分析で得られたマススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較が行われる。当該データベースには、微生物の種類（属名、種形容語、亜種名、血清型等）と、マススペクトルにおいて観察されるピークのｍ／ｚとが紐づけられたデータが記憶されている。
【００３７】
上述の処理装置は、質量分析の精度に基づいて定められる誤差範囲に基づいて、データベースに示されたｍ／ｚに対応するピークが、第１質量分析により得られたマススペクトルに存在するかを判定し、当該判定に基づいて類似度を算出する。類似度は、データベース上の微生物と分析対象の微生物とのマススペクトル間の類似の度合を示すパラメータであり、類似度が高い方がマススペクトル同士がより類似すると定義される。当該処理装置は、算出された類似度が一定以上で、かつ最も高い、データベース上の微生物の種類を、試料Ｓに含まれる微生物の種類として同定する。
なお、第１質量分析で得られたデータに基づいて微生物の識別を行う方法は特に限定されず、例えば、データベースには、各ｍ／ｚに対応するピークが各種類の微生物のマススペクトルにおいて観察される割合や確率等に基づいた重みづけ情報を含んでもよく、当該重み付け情報に基づいて類似度が算出されてもよい。
【００３８】
サルモネラの場合、ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦおよびＳｏｄＡの１２のタンパク質がマーカーとして知られている。第１質量分析において、これらのタンパク質が検出されたか否かに基づいて、サルモネラの血清型の分類を行うことができる。言い換えれば、これらのタンパク質に対応するｍ／ｚから質量分析の精度に基づく誤差範囲（例えば、高質量側および低質量側それぞれに８００ｐｐｍ等）にピークが検出されたか否かに基づいて、サルモネラの血清型の分類を行うことができる。表１にサルモネラのマーカータンパク質に対応するピークのｍ／ｚの理論値の例を示す。表１に示した値は、サルモネラの少なくとも一つの菌株において見られる値を例示したものである。各菌株におけるマーカーのｍ／ｚは、非特許文献１を参照されたい。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
図２は、本実施形態の微生物の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、微生物を含む試料が用意される。以下では、質量分析計が、質量分析計の各部を制御する制御部および解析装置を備えるものとして記載する。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、微生物の濃度が所定の濃度になるように、微生物およびマトリックスを含む試料溶液ＭＳが調製される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。
【００４１】
ステップＳ１００５において、試料溶液ＭＳが超音波処理に供される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、試料溶液ＭＳが遠心分離に供される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。
【００４２】
ステップＳ１００９において、遠心分離により得られた上清Ｓｎが、試料プレート１０に滴下されて乾燥に供され、質量分析用試料が調製される。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、質量分析計は、大腸菌を含む質量分析用試料を質量分析（第２質量分析）し、得られたデータに基づいて検出器の電圧を設定する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。
【００４３】
ステップＳ１０１３において、質量分析計は、ステップＳ１００９で得られた質量分析用試料を質量分析（第１質量分析）し、マススペクトルデータを取得する。ステップＳ１０１３が終了したらステップＳ１０１５が開始される。ステップＳ１０１５において、適宜、マススペクトルデータにスムージング処理が行われる。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７が開始される。
【００４４】
ステップＳ１０１７において、既知のマーカータンパク質に対応するｍ／ｚに対応してピークが検出されるか否かに基づいて、微生物の識別が行われる。ステップＳ１０１７が終了したら、全処理が完了する。
【００４５】
（微生物分析用キットについて）
本実施形態に係る微生物分析用試料の調製、微生物の質量分析および微生物の識別に好適に用いられる微生物分析用キットが提供される。分析用キットには、上述の微生物分析用試料の調製、質量分析および微生物の識別で用いられる任意の消耗品等が含まれる。さらに、微生物分析用キットには、微生物分析用試料の調製方法または微生物の分析方法を示す文書や電子データ等が含まれる。微生物分析用キットを用いることで、微生物分析用試料の調製、分析、および微生物の識別等を効率的に行うことができる。
【００４６】
上述の実施形態によれば、次の作用効果が得られる。
（第１項目）一態様による微生物分析用試料の調製方法は、微生物の濃度が、１×１０６ＣＦＵ／μＬ以上６×１０７ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液（ＭＳ）を調製することと、前記試料溶液（ＭＳ）の遠心分離を行うことと、前記遠心分離により得られた上清（Ｓｎ）を用いて、質量分析用試料を調製することとを備える。これにより、質量分析におけるピーク検出を安定させ、微生物に含まれる分子のピーク検出の再現性を向上することができる。従来、マーカータンパク質に対応するピ−クに対し、ウェル間、日程間などで、検出状況が再現しない場合があった。加えて、微生物の属、種に加え、亜種、血清型、株などを判別するためのマーカータンパク質は、（属、種までを判別するためのマーカータンパク質に比べ）ピークの検出感度が低く、再現性の低いことが多かった。本実施形態の分析方法では、例えば、このようなマーカータンパク質に対応するピークについて、検出感度や再現性の向上が可能となる。
【００４７】
（第２項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第１項目に記載された微生物分析用試料の調製方法において、前記遠心分離の前に、前記試料溶液（ＭＳ）に超音波処理を行うことを備える。これにより、質量分析におけるピーク検出をさらに安定させ、例えば、サルモネラにおけるＹｃｉＦのピークを検出する可能性を上げることができる。
【００４８】
（第３項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第１項目または第２項目に記載された微生物分析用試料の調製方法において、マトリックスを含む溶液に前記微生物を加えた後、前記溶液の濁度を調整するか、若しくは、前記微生物を含む溶液の濁度を調製した後、マトリックスを含む溶液と混合すること、または、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物をマトリックスを含む溶液に加えるか、若しくは、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物を含む溶液を調製した後、マトリックスを含む溶液と混合することにより前記試料溶液を調製する。これにより、菌濃度のばらつきを低減し、質量分析において再現性良くピークを検出することができる。
【００４９】
（第４項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第３項目に記載された微生物分析用試料の調製方法において、前記マトリックスの添加剤としてホスホン酸基を含む化合物および界面活性剤の少なくとも一つを用いて前記質量分析用試料を調製する。これにより、検出感度を高め、ピークを検出する可能性をさらに高めることができる。
【００５０】
（第５項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第４項目に記載された微生物分析用試料の調製方法において、前記添加剤は、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）およびＮ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）である。これにより、検出感度をより一層高めることができる。
【００５１】
（第６項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第３項目から第５項目までのいずれかに記載された微生物分析用試料の調製方法において、前記マトリックスは、シナピン酸である。これにより、高質量のイオンを効率的に生成することができる。
【００５２】
（第７項目）他の一態様による微生物分析用試料の調製方法では、第１項目から第６項目までのいずれかに記載された微生物分析用試料の調製方法において、前記微生物は、サルモネラ属の細菌である。これにより、サルモネラの血清型を判別するためのマーカータンパク質を検出しやすくする等、サルモネラの質量分析におけるピーク検出を安定させることができる。
【００５３】
（第８項目）一態様による微生物の分析方法は、第１から第７までのいずれかの態様の微生物分析用試料の調製方法を用いて微生物分析用試料を調製することと、調製された微生物分析用試料の第１質量分析を行うこととを備える。これにより、ピーク検出の安定した質量分析を行うことができ、微生物に含まれる分子のピーク検出の再現性を向上することができる。
【００５４】
（第９項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第８項目に記載された微生物の分析方法において、前記第１質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化する。これにより、一価のイオンが検出されやすくなり、解析しやすいマススペクトルを取得することができる。
【００５５】
（第１０項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第８項目または第９項目に記載された微生物の分析方法において、前記第１質量分析では、１００００以上のｍ／ｚに対応するピークを検出する。これにより、検出の難しい高質量のイオンを検出する可能性を高めることができる。
【００５６】
（第１１項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第１０項目に記載された微生物の分析方法において、前記微生物とは異なる微生物から調製された質量分析用試料の第２質量分析を行い、前記第２質量分析により得られたデータに基づいて前記第１質量分析における検出器の電圧を設定することとを備える。これにより、質量分析におけるピーク検出をさらに安定させ、例えば、サルモネラにおけるＳｏｄＡのピーク検出の再現性を向上することができる。
【００５７】
（第１２項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第１１項目に記載された微生物の分析方法において、前記第２質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化する。これにより、解析しやすいマススペクトルを用いて検出器電圧の設定を容易に行うことができる。
【００５８】
（第１３項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第１１項目または第１２項目に記載された微生物の分析方法において、前記第２質量分析において、大腸菌のマススペクトルのｍ／ｚ  ２２０００以上２３０００以下の範囲における最も強度の大きいピーク、および、前記マススペクトルのｍ／ｚ  ２３０００以上２４０００以下の範囲における最も強度の大きいピークの少なくとも一つの強度に基づいて、前記検出器の電圧を設定する。
これにより、検出の難しい高質量イオンのピーク検出の再現性を高め、幅広いｍ／ｚの範囲において、安定性（再現性）の高いマススペクトルを提供することができる。
【００５９】
（第１４項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第８項目から第１３項目までのいずれかに記載された微生物の分析方法において、前記第１質量分析により、マススペクトルに対応するマススペクトルデータを取得することと、前記マススペクトルデータにおいて、ｍ／ｚに基づいて異なるスムージングを行うこととを備える。これにより、様々なｍ／ｚのデータ点に対して適切なスムージング処理を行うことができ、幅広いｍ／ｚの範囲について、精度の高いマススペクトルを提供することができる。
【００６０】
（第１５項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第１４項目に記載された微生物の分析方法において、前記マススペクトルデータにおいて、ｍ／ｚの第１範囲におけるスムージングよりも、前記第１範囲よりも高いｍ／ｚを有する第２範囲において、各データ点に対応する強度をより多くのまたはより広い範囲のデータ点を用いて修正する。これにより、検出の難しい高質量のイオンに対応するデータ点に対して適切なスムージング処理を行うことができ、幅広いｍ／ｚの範囲について、精度の高いマススペクトルを提供することができる。
【００６１】
（第１６項目）他の一態様による微生物の分析方法では、第１５項目に記載された微生物の分析方法において、前記第１範囲および前記第２範囲は、閾値に基づいて設定され、前記閾値はｍ／ｚ  １５０００以上２００００以下である。これにより、特に検出の難しい上記閾値以上のｍ／ｚを有するイオンに対応するデータ点に対して適切にスムージング処理を行うことができ、幅広いｍ／ｚの範囲について、精度の高いマススペクトルを提供することができる。
【００６２】
（第１７項目）一態様による微生物の識別方法は、第８項目から第１６項目までのいずれかに記載された微生物の分析方法を用いて微生物の識別を行う。これにより、マーカーに対応するイオンが高質量である場合も含め、微生物が当該マーカーを有する場合に当該イオンを再現性良く検出することができ、精度よく微生物の識別を行うことができる。
【００６３】
（第１８項目）他の一態様による微生物の識別方法では、前記微生物は、サルモネラ属の細菌であり、前記第１質量分析では、ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦおよびＳｏｄＡからなる群から選択される少なくとも一つのサルモネラ由来のタンパク質の検出を行う。これにより、精度よくサルモネラの血清型の判別を行うことができる。この際、複数のサルモネラ由来のタンパク質に対し、各タンパク質の複数の質量値候補のうちの少なくともひとつに対応するｍ／ｚ値で、ピーク検出を行う（または未検出を示す）ことができる。これらのマーカータンパク質の群の、各マーカータンパク質として検出されるピ−クのｍ／ｚ値（あるいは未検出）の組み合わせにより、精度よくサルモネラの血清型の判別を行うことができる。
【００６４】
（第１９項目）一態様による微生物分析用キットは、第１項目から第７項目までのいずれかに記載された微生物分析用試料の調製方法、第８項目から第１６項目までのいずれかに記載された微生物の分析方法、および第１７項目または第１８項目に記載された微生物の識別方法を行うためのものである。これにより、ピーク検出の安定性（再現性）を高めた質量分析を、効率よく行うことができる。
【００６５】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００６６】
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例の数値または装置等の条件に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
実施例１では、最適菌濃度について、特に、添加剤を加えていないマトリックス溶液を用い遠心分離を行わずに調製した微生物分析用試料（以下、単に分析用試料と記載する）と、添加剤を加えたマトリックス溶液を用い遠心分離を行い調製した分析用試料に対しMALDI質量分析を行い、菌濃度とマーカーピークの検出率との関係を評価した。
【００６８】
＜方法＞
以下の1.〜9.を時系列順に各操作を行った。以下の各実施例でも、同様に番号の順に各操作を行った。
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。
2.  マトリックス溶液として、SA-1、SA-2およびSA-3の各溶液を調製した。各マトリックス溶液の組成は以下の通りである。SA-1: 25 mg/mL; シナピン酸(SA) in エタノール(EtOH)（以下、「in」の後の液体は溶媒を示す）、SA-2: 25 mg/mL; SA in 0.6％ トリフルオロ酢酸(TFA), 50％ アセトニトリル(ACN)、SA-3: 25 mg/mL; SA in 1％ MDPNA, 1mM DMP, 0.6％ TFA 50％ ACN。以下の各実施例でも同様であるが、SAはWako社製、MDPNAおよびDMPはSigma-Aldrich社製を、それぞれ用いた。  
【００６９】
3.  比較例１として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、2.のマトリックス溶液SA-2を加え、複数の菌濃度の試料溶液を調製し、ニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。  
4.  実施例１として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、2.のマトリックス溶液SA-3を加え、複数の菌濃度の試料溶液を調製し、ニードルで懸濁し、得られた懸濁液を、遠心分離にかけた（12000 rpm、5 min）。  
【００７０】
5.  1.のマトリックス溶液SA-1を、MALDI試料プレート（以下、MALDIプレートと呼ぶ）に、0.5 μＬずつ滴下した（プリコート）。
6.  比較例１として、3.で調製された懸濁液を、5.でプリコートされた各ウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
7.  実施例１として、4.の遠心分離で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされた各ウェル上に、1 μＬずつ滴下した。  
【００７１】
8.  6.および7.で滴下された液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、MALDI-MS（AXIMA Performance, 島津製作所製）にMALDIプレートを挿入した。その後、ウェル上の結晶上を、同じ点数、同じ間隔で自動照射するラスター分析法によりレーザを照射し、リニアモード、正イオンモードで測定を行った。  
9.  測定後、得られた測定データに自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルを比較評価した。高質量イオンに対応するピークでピークトップ（ピークの上部）が割れているものに対しては、スム−ジング補正（Axima PerformanceのPeak Processingのスムージング設定を、50から200へ変更）を行った。サルモネラの12マーカー（以下の実施例では、単にマーカーと呼ぶ）のピークに対応するm/zの理論値に対し、800 ppm以内にピークピッキングされているか否かにより、当該マーカーが検出されたか否かを判定した。マーカーの検出率は、各試料に対する複数のウェル中、何ウェルでピーク検出されたかの割合（％）として算出した。    
【００７２】
＜結果＞
図３の表１−Ａおよび図４の表１−Ｂは、それぞれ比較例１および実施例１における、複数の菌濃度（濁度）における12マーカーに対応するそれぞれのピークの検出率（n=4）を示す。比較例１および実施例１において、菌濃度（濁度）が濃すぎても薄すぎても検出率が低下する一方、比較的検出率の高い最適菌濃度（最適濁度）が存在することが、確認された。表１−Ａおよび表１−Ｂで、特に検出率の高い最適菌濃度の部分を、太枠Ｆで囲っている。最適菌濃度は、比較例１では6×106〜1×107個/ウェル（2×10〜3×10 MFU）、実施例１では3×106〜3×107個/ウェル（1×10〜1×102MFU）と、実施例１の方が、最適範囲が広かった。全体的にみても、比較例１に比べ、実施例１で、検出率の高い傾向が確認された。これは、添加剤による高質量域を含む感度向上効果と、主に実施例３および実施例４で後述する、遠心上清を用いることによる、感度向上および結晶均一性の向上による効果の少なくとも一つによると考えられた。実施例１では、1×107個/ウェル（3×10 MFU）で、マーカーに対応するピークの感度が特に高かった。
【００７３】
図５の表１−Ｃに、実施例１で調製した分析用試料のうち、菌濃度1×107個/ウェル（濁度3×10 MFU）の分析用試料8チューブ（n=8）における、12マーカーに対応するピークの検出率を示す。8チューブ（n=8）の全てで、12マーカー全ての検出が確認された。最適菌濃度で分析することにより、マーカーのピーク検出が安定し、再現性が向上することが確認された。  
【００７４】
なお、実施例２で後述するように、最適濃度の換算値として、サルモネラ・エンテリカの4菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738;血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、同じ値であることが確かめられた。  
【実施例２】
【００７５】
実施例２では、菌体の秤量による菌濃度の調整の効果について、評価した。
【００７６】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  比較例２として、各菌株のコロニーを、熟練者の勘を排除するようランダムに約1 cm分ニードルで採り、生理的食塩水に加えて懸濁し、懸濁液を調製した（n=4）。上記約1 cm分の菌体が、懸濁液10μＬに含まれるように調製された。
3.  実施例２として、各菌株のコロニーを約1 mg秤量し、生理的食塩水に加えて懸濁し、段階希釈し、複数の濃度の懸濁液を調製した（n=4）。 
4.  比較例２および実施例２で調製された懸濁液を、濁度計（DensiCHEK（登録商標） plus; BIOMERIEUX）を用いて、濁度を測定した。
5.  4.で測定された濁度から、マックファーランド比濁法により、1ウェルあたりの菌数（×107個/μＬ）を算出し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL濃度の1 μＬ分）と、比較例２と実施例２の1ウェルあたりのばらつきを評価した。
【００７７】
＜結果＞
マックファ−ランド比濁法により、表１−Ａおよび表１−Ｂに示す複数の菌濃度を含む、各実施例に示す菌濃度と濁度を換算した。このとき、例えば、最適濃度の換算値として、サルモネラ・エンテリカの4菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738;血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対し、同じ値であることを確かめた。
【００７８】
図６は、1ウェル当たりの菌量のばらつきをグラフ（箱ひげ図）で示したものである。比較例２および実施例２における、1ウェルあたりの菌量のCV（Coefficient of Variation）値は、それぞれ0.90および0.07となった。明らかに、実施例２では、比較例２に比べて、菌量のばらつきが軽減されたことがわかる。これにより、菌濃度（あるいは濁度）を調整することで、ウェルあたりの菌数のばらつきが小さくなり、測定対象の微生物の菌量の再現性が向上することが確認された。
【実施例３】
【００７９】
実施例３では、質量分析用試料の結晶の均一化について、評価した。
【００８０】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。
3.  比較例３として、1.のサルモネラについて、2.のマトリックスSA-2溶液10 μＬに、コロニー約1 cm分をニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。  
4.  実施例３として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックスSA-3溶液を加え、ニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。得られた懸濁液を、超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
【００８１】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。  
6.  比較例３として、3.で調製された懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1.2 μＬずつ滴下した。
7.  実施例３として、4.の遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。  
8.  6.および7.で滴下された液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得たのち、MALDIプレート上の結晶の写真を撮影した。
【００８２】
＜結果＞
図７に、(a)比較例３および(b)実施例３で得られた結晶写真を示す。比較例３では、表面に凹凸をもつ比較的厚めの結晶が形成されたのに対し、実施例３では、比較的均一な薄膜状の結晶が形成された。これは、比較例３では遠心分離に供していない菌の懸濁液を滴下したのに対し、実施例３では遠心上清液を滴下したことによる効果だと考えられた。また、同じ理由で、比較例３ではウェル間により結晶にばらつきが生じやすいのに対し、実施例３では比較的同一の結晶が得られる傾向がみられた。これにより、結晶の不均一性が改善され、ウェル上および異なるウェル間における再現性が向上した。
【実施例４】
【００８３】
実施例４では、遠心上清を使用する効果について、特に高質量マーカーピークの検出状況から評価した。
【００８４】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカの6菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。   
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1およびSA-3を調製した。
【００８５】
3.  遠心分離を行わない例（実施例４−１）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。得られた懸濁液を、超音波処理（1 min）に供した。  
4.  遠心分離を行う例（実施例４−２）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックスSA-3溶液を加え、ニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。得られた懸濁液を、超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
【００８６】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。  
6.  実施例４−１として、3.で調製された懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
7.  実施例４−２として、4.で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。  
8.  6.および7.で滴下された液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例１と同様の条件で質量分析を行った。質量分析後、得られたデータに自己キャリブレーションを適用後、得られたマススペクトルを比較評価した。
【００８７】
＜結果＞
図８は、(a) 実施例４−２（遠心上清: 遠心分離後、遠心上清を用いた場合）と、(b)実施例４−１（遠心なし: 遠心分離を行わず、懸濁液を用いた場合）のサルモネラ・エンテリカの上記6菌株のSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。6菌株全てに対し、遠心上清を用いた場合は、遠心を行わなかった場合に対し、SodAのピークが、明らかに、感度高く検出された。これは、遠心を行うことで、懸濁液中のイオン化阻害物質が沈殿し、マーカータンパク質と分離されたことで、遠心上清液中のマーカーに対応するピークの感度が向上したと考えられた。特に、検出が不安定だったSodAなど高質量のマーカーピークが、安定して、再現性高く、検出されるようになった。遠心分離の条件を変えて同様の実験を行ったところ、具体的に6000 rpm、12000 rpm、または15000 rpmで、1 minあるいは5 minで、遠心分離を行ったところ、6000 rpmおよび15000 rpmの場合もある程度の感度および安定性が得られたが、特に12000 rpmで5 min行った場合、マーカーピークの感度がより高く、より安定して検出された。
【実施例５】
【００８８】
実施例５では、超音波処理の効果について、超音波懸濁を行う場合と、超音波懸濁を行わずにニードル懸濁を行う場合を比較評価した。
【００８９】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。   
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1およびSA-3を調製した。
3.  超音波処理を行わずニードルによる懸濁のみ行う例（実施例５−１）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。
4.  超音波による懸濁を行う例（実施例５−２）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
【００９０】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。
6.  3.および4.の懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
7.  6.で滴下された液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを比較評価した。
【００９１】
＜結果＞
図９は、(a)超音波懸濁を行った場合（実施例５−２）、および(b)ニードル懸濁を行い超音波処理を行わなかった場合（実施例５−１）の、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）の、マーカーYciFに対応するピークを含むマススペクトルを示す。従来、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）におけるマーカーYciFは、特にマーカーピークの感度が低く、検出が不安定だった。本実施例では、YciFのピークは、超音波懸濁を行い分析用試料を調製することにより、より安定して検出されるようになった。超音波懸濁を行わなかった場合に比べ、超音波懸濁を行った場合、溶液中に、より多くのYciFが溶出された可能性が考えられた。  
【実施例６】
【００９２】
実施例６では、超音波処理の効果について、超音波懸濁を行う場合と、超音波懸濁を行わずにボルテックスミキサーによる懸濁を行う場合を比較評価した。
【００９３】
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）を、LB寒天培地で、37℃、20時間で、培養した。   
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1およびSA-3を調製した。
3.  超音波処理を行わずボルテックスミキサーによる懸濁を行う例（実施例６−１）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁し、その後、ボルテックスミキサーで懸濁（5 min）し懸濁液を調製した。得られた懸濁液を、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
4.  超音波による懸濁を行う例（実施例６−２）として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁し、その後、超音波処理（1 min）に供し懸濁液を調製した。得られた懸濁液を、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。
【００９４】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。
6.  3.および4.で得られた懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
7. 6.で滴下された液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを比較評価した。
【００９５】
＜結果＞
図10は、(a)超音波懸濁を行った場合（実施例６−２）と、(b)ボルテックスミキサーによる懸濁を行った場合（実施例６−１）の、サルモネラ・エンテリカ（血清型Enteritidis, NBRC3313）の、マーカーYciFに対応するピークを含むマススペクトルを示す。ボルテックスミキサーによる懸濁に比べ、超音波懸濁を行った場合では、YciFに対応するピークは、より高感度に検出された。YciF以外のピークを含むマススペクトル全体でも、ピーク感度の向上が確認された。ボルテックスミキサーによる懸濁に比べ、超音波懸濁を行った場合では、懸濁液中に、より多くのYciFを含むタンパク質が溶出されたと考えられた。
【実施例７】
【００９６】
実施例７では、質量分析計の検出器電圧の調整の効果について、評価した。
【００９７】
1.  サルモネラ・エンテリカの3菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。
3.  検出器電圧調整の基準となる、大腸菌の懸濁液として、E. coli DH5α Electro-Cells (TKR 9027、タカラバイオ)を、2.のSA-2溶液で1/50倍希釈した懸濁液を調製した。  
【００９８】
4.  実施例７に係るサルモネラ懸濁液として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁し、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った後、4.の遠心上清液を、プリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
6.  3.で得られた大腸菌の懸濁液を、MALDIプレ−トに、1 μＬずつ滴下した。
【００９９】
7.  5.および6.の液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、MALDI-MS（AXIMA Performance, 島津製作所製）にプレートを挿入し、ラスター分析により、リニアモード、正イオンモードで測定を行った。大腸菌試料、およびサルモネラ試料のマススペクトルには、いずれも自己キャリブレーションを適用後、得られたマススペクトルを評価した。
【０１００】
この質量分析では、大腸菌の質量分析を行った後、サルモネラ3菌株の質量分析を行った。大腸菌の質量分析では、複数の検出器電圧を用いて、特にm/z 23000付近のピークに注目して測定し、後述の図１１に示すように、m/z 22000〜23000における最大のピークののピーク強度が0.1〜0.3 mV、または、m/z 23000〜24000における最大のピークのピーク強度が0.1〜0.4 mVで、それぞれ安定して検出できる、検出器電圧値を確認した。その確認した検出器電圧値から、0〜90V高い検出器電圧値を用いて、上記サルモネラ3菌株を測定した。
【０１０１】
＜結果＞
図１１は、大腸菌の質量分析で得られた、(a)m/z 21500〜23000、および(b)m/z 21500〜24000のマススペクトルを示す。図１１のマススペクトルを取得した際の検出器電圧においては、m/z 22000付近のピーク強度は0.1〜0.3 mV、m/z 23000付近のピーク強度は0.1〜0.4mVで、比較的安定して検出された。
【０１０２】
図１２は、図１１に示すマススペクトルを取得した際の検出器電圧（この電圧値をEC （V）とする）に対し、(a)90,(b)70, (c)50, (d) 30、または(e)0 V高い検出器電圧を使用した場合の、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）の、マーカーSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。結果、EC Vから50 Vおよび70 V高い検出器電圧値(EC+50、EC+70)で、最も感度およびS/N比の高いピークが確認された。EC Vから90 V高い検出器電圧値(EC +90)では、EC+50 VあるいはEC+70 Vに比べ、S/N比が少し低下した。  
【０１０３】
図１３および図１４は、図１１に示すマススペクトルを取得した際の検出器電圧（EC （V））に対し、(a)70、(b)50、(c)30、または(d)0 V高い検出器電圧を使用した場合の、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）それぞれの、マーカーSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。いずれの菌株でも、EC Vから50 vおよび70 V高い検出器電圧値(EC+50、EC+70)で、最も感度およびS/N比の高いマススペクトルが得られた。
【０１０４】
本実施例により、検出器電圧が、特に高質量のマーカーピークの検出に寄与することが確認され、本実施例のような調整基準を定めることにより、より安定した、再現性の高いマーカーピークの検出が可能となることが確かめられた。  
【実施例８】
【０１０５】
実施例８では、マススペクトルに対するスムージング処理の効果について、評価した。
【０１０６】
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1およびSA-3を調製した。
3.  1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックスSA-3溶液を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。  
【０１０７】
4.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。
5.  3.で得られた遠心上清液を、4.のプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。  
6.  5.で滴下した液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例１と同様の条件で質量分析を行った。質量分析後、得られたデータに自己キャリブレーションを適用後、得られたマススペクトルを評価した。実施例１と同様の基準でマーカーピークが検出されたか否かを判定した。高質量のイオンに対応するピークでピークトップが割れているものに対しては、スムージング補正（Axima PerformanceのPeak Processing のスムージング設定を、50から200へ変更）を行い、補正前後でピーク検出への影響を評価した。
【０１０８】
＜結果＞
図１５は、(a)Axima PerformanceのPeak Processing設定において、スムージング値: 50を用いた場合と、(b)スムージング値: 200を用いた場合の、サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）の、マーカーSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。
【０１０９】
サルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）のSodA のピークに対するm/zの理論値は22948.82である。(a)では、当該理論値から800 ppm外であるため、SodAのピークは非検出と判定されていた。(b)のスムージング補正後は、800 ppm内であるため、SodAのピークは検出されたと判定された。これは、(a)のスムージング値: 50を用いた場合のSodAに対応するピークは、ピークの上部が割れ、ピークに対応するm/z値が高質量側に傾いたのに対し、(b)のスムージング値: 200を用いた場合は、ピークの形状がまるめられ、ピークに対応するm/z値がピークの中心（重心）に向けて補正され、ピークに対応するm/z値がより正確になったためと考えられた。すなわち、図１５の(a)と(b)を比較すると、(b)は、より高質量のイオンに適したスムージング値が適用されたため、ピークのm/z値がより正確になった、と考えられた。
【実施例９】
【０１１０】
実施例９では、今回の実施形態の方法の効果について、高質量マーカーピークの感度の点から、評価した。
【０１１１】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。  
3.  比較例９として、1.のサルモネラについて、2.のマトリックス溶液SA-2 10 μＬに、コロニー約1 cm分をニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。
4.  実施例９として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックスSA-3溶液を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。 
【０１１２】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。
6.  比較例９では、3.で得られた懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1.2 μＬずつ滴下した。
7.  実施例９では、4.で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
8.  6.および7.の液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを評価した。なお、質量分析の際の検出器電圧は、比較例９と実施例９で、同じ値を用いた。   
【０１１３】
＜結果＞
図１６はサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）、図１７はサルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）に対する、(a)比較例９および(b)実施例９による、マーカーSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。いずれの菌株の場合も、比較例９では容易でなかったSodAのピーク検出が、実施例９では、安定して、高感度に検出されていることが確認された。従来、SodAのピークは、表１に示されたサルモネラのマーカーにおいて、最も高質量のタンパク質であり、特に感度が低く、検出不安定なピークであることが知られている。実施例９における感度向上は、添加剤による感度向上効果、遠心上清を用いることによりイオン化阻害物質と分離されることによる感度向上効果、超音波によりマーカータンパク質が溶出されることによる感度向上効果など、複数の要素が寄与していると考えられた。
【実施例１０】
【０１１４】
実施例１０では、今回の実施形態の方法の効果について、高質量のマーカーピークの検出状況のウェル間の再現性の点から評価した。
【０１１５】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。
3.  比較例１０として、1.のサルモネラについて、2.のマトリックス溶液SA-2 10 μＬに、コロニー約1 cm分をニードルで懸濁し、懸濁液を調製した。  
4.  実施例１０として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックスSA-3溶液を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。
【０１１６】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。
6.  比較例１０では、3.で得られた懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1.2 μＬずつ滴下した。
7.  実施例１０として、4.で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
8.  6.および7.で滴下した液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを評価した。なお、質量分析の際の検出器電圧は、比較例１０と実施例１０で、同じ値を用いた。
【０１１７】
＜結果＞
図１８はサルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）について、図１９はサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe1402-4）について得られたSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。比較例１０および実施例１０において、8ウェル（n=8）のそれぞれで得られたマススペクトルを示している。図１８および図１９とも、比較例１０ではウェル間で感度またはS/N比等にばらつきが生じているのに対し、実施例１０では、全8ウェルで、ピーク検出状況は、ほぼ再現した。前述の通り、従来、SodAのピークは、表１に示されたサルモネラのマーカーにおいて、最も高質量のタンパク質であり、特に感度が低く、検出不安定なピークであることが知られている。実施例１０における再現性の向上は、添加剤、遠心上清若しくは超音波処理による感度向上効果、または、遠心上清による結晶の均一化若しくはウェル間の再現性向上効果等が、影響していると考えられた。  
【実施例１１】
【０１１８】
実施例１１では、今回の実施形態の方法の効果について、高質量のマーカーピークの検出状況およびウェル間の再現性の点から評価した。
なお、以下の実施例では、実施例７と同様に、大腸菌試料を質量分析して得られたデータに基づき、検出器電圧を設定した。
【０１１９】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, GTC00131; 血清型Infantis, ATCC BAA-1675; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。  
3.  1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。 
【０１２０】
4.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。 
5.  3.で得られた遠心上清液を、4.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。 
6.  5.で滴下した液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例７と同様に検出器電圧を設定した他は実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを評価した。
【０１２１】
＜結果＞
図２０、２１、２２および２３は、それぞれ、サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, GTC00131; 血清型Infantis, ATCC BAA-1675; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738）の、マーカーSodAに対応するピークを含むマススペクトルを示す。図中の各マススペクトルは、4ウェル（n=4）のそれぞれに対応する。いずれの菌株においても、感度、再現性とも高く、安定して、SodAのピーク検出が確認された。実施例１１における、感度および再現性の向上は、添加剤、遠心上清、超音波、または検出器電圧調整による感度向上効果と、遠心上清による結晶の均一化またはウェル間の再現性向上効果が、影響していると考えられた。  
【実施例１２】
【０１２２】
実施例１２では、今回の実施形態の方法の効果について、表１に示したサルモネラの12マーカーに対応するピークが異なる日で再現性良く検出できるかという点から評価した。
【０１２３】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。  
3.  比較例１２として、1.のサルモネラについて、2.のマトリックス溶液SA-2 10 μＬに、コロニー約1 cm分を加えニードルで懸濁し、懸濁液を作製した。 
4.  実施例１２として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。 
【０１２４】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。  
6.  比較例１２では、3.で得られた懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1または1.2 μＬずつ滴下した。  
7.  実施例１２では、4.で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。
8.  6.および7.で滴下した液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例７と同様に検出器電圧を設定した他は実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを評価した。マーカーのピークに対応するm/zの理論値に対し、800 ppm 内でピークピッキングされているか否かにより、当該マーカーが検出されたか否かを判定した。マーカーの検出率は、各試料に対する4ウェルまたは8ウェル中、何ウェルで検出されたかの割合（％）として算出した。
【０１２５】
＜結果＞
図２４の表12-Aおよび図２５の表12-Bに、それぞれ比較例１２および実施例１２のサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC13245）に対する12マーカーの、日ごとの検出率を示した。図２６の表12-Cおよび図２７の表12-Dに、それぞれ比較例１２および実施例１２のサルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis, NBRC 105684）に対応する12マーカーの、日ごとの検出率を示した。図２８の表12-Eおよび図２９の表12-Fに、それぞれ比較例１２および実施例１２のサルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe1402-15）に対応する12のマーカーの、日ごとの検出率を示した。測定日の6桁の数字は、最初の2桁が西暦の年の下2桁を示し、次の2桁が月、最後の2桁が日を表す。表12-B（図２５）の「180117-0309」のように、日付がハイフンで結ばれている場合は、ハイフンで結ばれた前の日付から後の日付までの期間のいずれかの日に測定を行ったことを示す。
【０１２６】
いずれの菌株においても、比較例１２では、日程ごとに、マーカーの検出率がばらつくのに対し、実施例１２では、検出率のばらつきがより少なく、再現良く検出された。この実施例１２による再現性の向上は、菌濃度調整、添加剤、遠心上清、超音波または検出器電圧調整による感度向上効果、および、遠心上清による結晶の均一化またはウェル間の再現性向上効果が、影響していると考えられた。
【実施例１３】
【０１２７】
実施例１３では、今回の実施形態の方法の効果について、サルモネラ6菌株のマーカーピークの検出率を評価した。
【０１２８】
＜方法＞
1.  サルモネラ・エンテリカの6菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）を、LB寒天培地で、37℃で、20時間、培養した。  
2.  マトリックス溶液として、上述のSA-1、SA-2およびSA-3を調製した。  
3.  比較例１３として、1.のサルモネラについて、2.のマトリックス溶液SA-2 10 μＬに、コロニー約1 cm分を加え、ニードルで懸濁し、懸濁液を作製した。 
4.  実施例１３として、1.のサルモネラを約1 mg微量天秤で秤量し、最適菌濃度（1 mg/0.075 mL; 1×107個/μＬ）になるよう2.のマトリックス溶液SA-3を加え、ニードルで懸濁後、得られた懸濁液を超音波処理（1 min）に供し、その後、遠心分離（12000 rpm、5 min）に供した。 
【０１２９】
5.  SA-1溶液を、MALDIプレートに0.5 μＬずつ滴下し、プリコートを行った。  
6.  比較例１３として、3.で得られた懸濁液を、5.でプリコートされたウェル上に、1または1.2 μＬずつ滴下した。  
7.  実施例１３として、4.で得られた遠心上清液を、5.でプリコートされたウェル上に、1 μＬずつ滴下した。  
8.  6.および7.で滴下した液滴を自然乾燥に供し質量分析用試料を得た後、実施例７と同様に検出器電圧を設定した他は実施例４と同様に質量分析を行い、得られたマススペクトルを評価した。マーカーピークに対するm/zの理論値に対し、800ppm内でピークピッキングされたか否かにより、当該マーカーピークが検出されたか否かを判定した。マーカーピークの検出率は、各試料に対応する4ウェル中、何ウェルで検出されたかの割合（％）として算出した。
【０１３０】
＜結果＞
図３０の表13-A、図３１の表13-Bおよび図３２の表13-Cに、サルモネラ・エンテリカの代表6菌株（血清型Typhimurium, NBRC13245; 血清型Enteritidis, NBRC3313; 血清型Thompson, ATCC BAA-1738; 血清型Choleraesuis, NBRC 105684; 血清型Infantis, jfrlSe1402-4; 血清型Orion, jfrlSe1402-15）の、12マーカーの検出率を示す。表13-Aおよび表13-Bは、比較例１３におけるそれぞれ異なる実験日の結果を示す。表13-Cは、実施例１３の結果を示す。
【０１３１】
比較例１３では、菌株ごと、マーカーごとに、検出率にばらつきが見られるのに対し、実施例１３では、6菌株に対し、12マーカー全てで、100％の検出率を示した。これにより、実施例１３における、12マーカーピークの安定した検出が、6菌株に対し確認された。
【符号の説明】
【０１３２】
１０…試料プレート、１１…ウェル、Ｍ…マトリックス溶液、ＭＳ…試料溶液、Ｐｒ…沈殿物、Ｓ…試料、Ｓｎ…上清。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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