(57)【要約】【課題】本発明の目的は、高感度なラマン散乱分光分析に用いることのできる担体を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体の製造方法であって、前記製造方法が、（１）支持体に還元剤を付着させる工程と、（２）前記還元剤が付着した支持体を、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる工程と、（３）前記金属粒子が析出した支持体に還元剤を付着させる工程と、（４）前記金属粒子が析出し、かつ還元剤が付着した支持体を、前記金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる又は成長させる工程と、を含む金属粒子含有支持体の製造方法によって、解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体の製造方法であって、前記製造方法が、
（１）支持体に還元剤を付着させる工程と、
（２）前記還元剤が付着した支持体を、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる工程と、
（３）前記金属粒子が析出した支持体に還元剤を付着させる工程と、
（４）前記金属粒子が析出し、かつ還元剤が付着した支持体を、前記金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる又は成長させる工程と、
を含む金属粒子含有支持体の製造方法。
【請求項２】
前記支持体がカルシウム化合物粒子である、請求項１に記載の金属粒子含有支持体の製造方法。
【請求項３】
前記支持体が多孔質粒子である、請求項１又は２に記載の金属粒子含有支持体の製造方法。
【請求項４】
前記工程（４）の後に、前記工程（３）及び工程（４）に準ずる工程を、更に１回以上実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の金属粒子含有支持体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法によって得られる金属粒子含有支持体。
【請求項６】
支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体であって、
金属粒子のＦＥ−ＳＥＭ観察像から得られる平均粒子径が４０〜５４ｎｍである金属粒子含有支持体。
【請求項７】
前記支持体がカルシウム化合物粒子である、請求項６に記載の金属粒子含有支持体の製造方法。
【請求項８】
前記支持体が多孔質粒子である、請求項６又は７に記載の金属粒子含有支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属粒子含有支持体の製造方法及び金属粒子含有支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン散乱分光分析は、測定される対象物質の分子構造（固有振動）によるスペクトルを検出するため、ラベリングなしに対象物質の分析が可能である。また、予め測定されたライブラリと照合することにより、複数の対象物質を一度に分析することも可能である。しかしながら、ラマン散乱分光分析は、検出強度が微弱であり、高感度に対象物質を検出できなかった。
ラマン散乱分光分析の感度を向上させる手段として、表面増強ラマン散乱と呼ばれる貴金属のナノ粒子の局所表面プラズモンを利用することが考えられている。プラズモン活性金属粒子が、ある一定の距離で配列すると、光照射で誘起される局所表面プラズモンによる増強電場、ホットスポットが発生する。対象物質が金属粒子の近傍に接近すると、対象物質に特有なラマン散乱が生じ、特にホットスポット付近でラマン散乱が１×１０８〜１０１４倍も増強される。これが、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）と呼ばれる現象である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１７／１５０５３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、銀含有カルシウム化合物多孔質粒子を、ラマン分光分析における対象物質を担持させる担体として用いることによりラマン分光分析を行うことができることを見いだした（特許文献１）。この担体は、高感度なラマン散乱分光分析を可能にしたが、更に高感度な担体の開発が望まれていた。
本発明の目的は、高感度なラマン散乱分光分析に用いることのできる担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ラマン散乱分光分析の感度を向上させることのできる担体は、担体に担持される金属粒子の平均粒子径を制御することにより、得られるのではないかと考えた。
本発明者は、担体に担持される金属粒子の平均粒子径を制御する手段について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、金属粒子の支持体（担体）への析出を２回以上繰り返すことにより、容易に平均粒子径を増加できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体の製造方法であって、前記製造方法が、（１）支持体に還元剤を付着させる工程と、（２）前記還元剤が付着した支持体を、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる工程と、（３）前記金属粒子が析出した支持体に還元剤を付着させる工程と、（４）前記金属粒子が析出し、かつ還元剤が付着した支持体を、前記金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる又は成長させる工程と、を含む金属粒子含有支持体の製造方法、
［２］前記支持体がカルシウム化合物粒子である、［１］に記載の金属粒子含有支持体の製造方法、
［３］前記支持体が多孔質粒子である、［１］又は［２］に記載の金属粒子含有支持体の製造方法、
［４］前記工程（４）の後に、前記工程（３）及び工程（４）に準ずる工程を更に１回以上実施する、［１］〜［３］のいずれかに記載の金属粒子含有支持体の製造方法、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法によって得られる金属粒子含有支持体、
［６］支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体であって、金属粒子のＦＥ−ＳＥＭ観察像から得られる平均粒子径が４０〜５４ｎｍである金属粒子含有支持体、
［７］前記支持体がカルシウム化合物粒子である、［６］に記載の金属粒子含有支持体の製造方法、及び
［８］前記支持体が多孔質粒子である、［６］又は［７］に記載の金属粒子含有支持体、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の金属粒子含有支持体の製造方法によれば、金属粒子含有支持体に担持された金属粒子の含有量及び金属粒子の平均粒子径を容易に制御することができる。また、本発明の金属粒子含有支持体は、ラマン散乱分光分析において対象物質を担持させる担体として用いることにより、高感度に対象物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１又は実施例２の支持体への銀の担持量を、比較例１〜５の支持体への銀の担持量を比較したグラフ（Ａ）、及び実施例３の支持体への銀の担持量を、比較例１〜５の支持体への銀の担持量を比較したグラフ（Ｂ）である。
【図２】比較例２〜３、実施例１〜３、参考例１で得られた金属粒子含有支持体の銀粒子の平均粒子径（Ａ）及び粒子数（Ｂ）を示したグラフである。
【図３】比較例２〜５で得られた金属粒子含有支持体の銀粒子の平均粒子径（Ａ）及び粒子数（Ｂ）を示したグラフである。
【図４】比較例１、実施例１、実施例２及び参考例１で得られた金属粒子含有支持体を用いて、表面増強ラマン散乱による葉酸の測定を実施した場合の、ラマン強度比を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］金属粒子含有支持体の製造方法
本発明の金属粒子含有支持体の製造方法は、支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体の製造方法であって、前記製造方法が、（１）支持体に還元剤を付着させる工程と、（２）前記還元剤が付着した支持体を、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、前記支持体に金属粒子を析出させる工程と、（３）前記金属粒子が析出した支持体に還元剤を付着させる工程と、（４）前記金属粒子が析出し、かつ還元剤が付着した支持体を、前記金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる又は成長させる工程と、を含む。
【０００９】
《支持体》
本発明に用いる支持体は、金属粒子を担持できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばカルシウム化合物、シリカ、又は炭素質が挙げられるが、カルシウム化合物又は炭素質が好ましい。すなわち、本明細書において「支持体」とは、金属粒子を表面に担持できる担体を意味し、担体の形状は限定されるものではないが、粒子形状、立方体形状、直方体形状、角柱形状、又は円柱形状などが挙げられる。また、前記粒子は、円形や楕円形の粒子のみでなく、破砕された粒子を含む。更に前記支持体は、好ましくは多孔質体である。多孔質体であることにより、金属粒子が効率的に担持される。
【００１０】
支持体として、焼成されていない支持体を用いることができるが、焼成されている支持体が好ましい。焼成温度は、特に限定されるものではないが、好ましくは２００℃以上であり、より好ましくは５００℃以上であり、更に好ましくは８００℃以上である。焼成温度の上限は、特に限定されるものではないが、１４００℃以下であり、好ましくは１３００℃以下であり、更に好ましくは１２００℃以下である。前記温度で焼成することにより、気孔が減少し支持体表面に金属粒子が効率的に析出できる。焼成の雰囲気も特に限定されるものではないが、大気中、又は不活性ガス中で実施できる。焼成方法としては、電気炉を用いた焼成を挙げることができる。
【００１１】
支持体の平均粒子径は、特に限定されるものではないが、平均粒子径の上限は好ましくは３００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下であり、更に好ましくは４０μｍ以下である。平均粒子径の下限は、好ましくは０．１μｍ以上であり、より好ましくは１μｍ以上であり、更に好ましくは２．５μｍ以上であり、最も好ましくは４μｍ以上である。
また、支持体の直径（粒子径）も特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜３０００μｍであり、より好ましくは０．５〜３００μｍであり、更に好ましくは１〜２０μｍである。
支持体の粒度分布も、特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜３０００μｍであり、より好ましくは０．５〜３００μｍであり、更に好ましくは１〜２０μｍである。
支持体のＢＥＴ法による比表面積は、特に限定されるものではないが、例えば１〜５０ｍ２／ｇである。
支持体の気孔容積は、限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜２ｍＬ／ｇであり、より好ましくは０．００５〜１ｍＬ／ｇであり、更に好ましくは０．０１〜０．２ｍＬ／ｇである。気孔容積は、例えばアルキメデス法（ＪＩＳ  Ｒ  １６３４）によって測定することができる。
支持体の平均粒子径、粒度分布、比表面積、及び／又は気孔容積が前記の範囲であることによって、特に支持体表面に金属粒子を効果的に析出させることができる。
【００１２】
（カルシウム化合物粒子）
支持体の材料となり得るカルシウム化合物は、特定のものに限定されるものではないが、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、又はカルシウム酸化物が挙げられる。好ましくはリン酸カルシウムである。リン酸カルシウムは、特に限定されるものではなく、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸二水素カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２））、リン酸二水素カルシウム水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）・Ｈ２Ｏ）、リン酸一水素カルシウム（ＣａＨＰＯ４）、リン酸一水素カルシウム水和物（（ＣａＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ））、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）、メタリン酸カルシウム（Ｃａ（ＰＯ３）２）、ピロリン酸カルシウム（Ｃａ２Ｐ２Ｏ７）又はリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）が挙げられるが、特には、水酸アパタイト、リン酸四カルシウム、又はリン酸三カルシウムが好ましく、水酸アパタイトが最も好ましい。水酸アパタイトは、結晶構造が六方晶であり、Ｃａによりａ面が正に帯電し、ＯＨとＰＯ４によりＣ面が負に帯電している。従って、ＳＥＲＳの担体として用いる場合、測定する物質が正に帯電した物質であっても、負に帯電した物質であっても、吸着させることができるからである。水酸アパタイトは、生体骨の成分の６０〜８０％を占めるリン酸カルシウムの１種であり、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の組成式で示される化合物を基本成分とする。水酸アパタイトのＣａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｙ、Ｌａ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｎａ、Ｋ、Ｈ、Ａｇ等から選ばれる１種以上で置換されてもよく、また（ＰＯ４）成分の一部分が、ＶＯ４、ＢＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３、ＴｉＯ４、ＳｉＯ４等から選ばれる１種以上で置換されてもよく、更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ３等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠損していてもよい。
【００１３】
（リン酸カルシウム多孔質粒子の製造）
カルシウム化合物の１種であるリン酸カルシウム多孔質粒子は、リン酸カルシウム結晶を作製し、それを粒子にすることによって得られる。例えば、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）、メタリン酸カルシウム（Ｃａ（ＰＯ３）２）、ピロリン酸カルシウム（Ｃａ２Ｐ２Ｏ７）等のリン酸カルシウムを用いて、リン酸カルシウム結晶を調製することが可能である。リン酸カルシウム結晶の製造方法は、湿式法、乾式法、水熱法、アルコシキド法、フラックス法などの常法に従って行うことができるが、例えば水酸アパタイト結晶は、以下の湿式法によって製造することができる。
【００１４】
水酸アパタイトを製造する場合、例えば、水酸化カルシウム（又は炭酸カルシウム）とリン酸とを溶液中で室温〜８０℃程度の温度下で反応させ、得られた水酸アパタイトの微結晶粉末を１００℃以下で乾燥させることによって得ることができる。より具体的には、水酸化カルシウム水溶液（又は炭酸カルシウム）及びリン酸水溶液を混合することによって、水に不溶な白い懸濁液（いわゆる、スラリー）を得ることができる。水酸化カルシウム水溶液としては、水酸化カルシウムが完全に溶解していない水酸化カルシウム懸濁液を用いることもできる。反応液のｐＨは７〜１１の範囲で、かつ変化の幅を１以内となるようにリン酸水溶液を滴下することが望ましく、ｐＨ７〜９の範囲で、かつ変化の幅を０．５以内とすることがより好ましい。また、得られた懸濁液を５０℃〜１２００℃で焼成することによってリン酸カルシウム結晶懸濁液を得ることができる。より具体的には、０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カルシウム懸濁液（例えば、４リットル）に０．６ｍｏｌ／Ｌのリン酸水溶液（例えば２リットル）を、ゆっくりとｐＨ７．５になるまで滴下する。得られた懸濁液は、１２０℃で乾燥後、１２００℃で３０分間焼成する。合成した水酸アパタイトは、粉末Ｘ線回折測定により単一相であるか否かを確認することができる。
【００１５】
得られたリン酸カルシウム結晶懸濁液を、スプレイドライ法によりリン酸カルシウム多孔質粒子とすることができる。スプレイドライの条件としては、例えば懸濁液の濃度、入口温度、噴霧圧、及び試料の流速などを挙げることができる。スプレイドライ法により得られたリン酸カルシウム多孔質粒子を、更に焼成して、焼成リン酸カルシウム多孔質粒子としてもよい。焼成温度は特に限定されるものではないが、好ましくは２００℃以上であり、より好ましくは５００℃以上であり、更に好ましくは８００℃以上である。焼成温度の上限は、特に限定されるものではないが、１４００℃以下であり、好ましくは１３００℃以下であり、更に好ましくは１２００℃以下である。
【００１６】
（炭酸カルシウム多孔質粒子の製造）
カルシウム化合物の１種である炭酸カルシウムとしては、ＣａＣＯ３、ＣａＣＯ３・２Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３・６Ｈ２Ｏが挙げられる。例えば、炭酸カルシウム多孔質粒子は、以下のように作製することができる。例えば、微量のリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を加えた炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液を調整し、これを塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液に加え、混合する。これにより、球状の炭酸カルシウム多孔質粒子を析出させることができる。
【００１７】
（硫酸カルシウム多孔質粒子の製造）
カルシウム化合物の１種である硫酸カルシウムとしては、ＣａＳＯ４、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＣａＳＯ４・１／２Ｈ２Ｏが挙げられる。硫酸カルシウム多孔質粒子は、例えば、以下のように作成することができる。例えば、エチレングリコールと水を混合した溶媒を用い、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）とナトリウム塩のエチレンジアミン四酢酸とを混合した溶液を９５℃で調整し、更に硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）とナトリウム塩のエチレンジアミン四酢酸とを混合した溶液を９５℃で調整し、二液を混合する。これにより、球状の硫酸カルシウム多孔質粒子を析出させることができる。
【００１８】
（カルシウム酸化物多孔質粒子の製造）
カルシウム化合物の１種であるカルシウム酸化物としては、ＣａＯが挙げられる。カルシウム酸化物多孔質粒子は、例えば、以下のように作製することができる。例えば、炭酸カルシウム多孔質粒子を６００℃以上の温度で焼成し、炭酸ガスとして脱離させることで製造することができる。
【００１９】
《金属粒子》
金属粒子は、表面増強ラマン散乱が生じる金属粒子である限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、金属粒子として、銀粒子、金粒子又は銅粒子が挙げられる。好ましくは銀粒子である。
金属粒子の平均粒子径は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜５００ｎｍ（０．０１〜０．５μｍ）である。すなわち、平均粒子径の上限は好ましくは５００ｎｍ以下であり、より好ましくは２５０ｎｍ以下であり、最も好ましくは５４ｎｍ以下である。平均粒子径の下限は、好ましくは１０ｎｍ以上であり、より好ましくは２０ｎｍ以上であり、最も好ましくは４０ｎｍ以上である。
【００２０】
（１）還元剤付着工程
還元剤付着工程（１）においては、支持体に還元剤を付着させる。
《還元剤》
本発明に用いる還元剤は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではなく、目的とする金属粒子に応じて適宜選択すればよい。還元剤は、例えばアルデヒド、グルコース、又はヒドロキノンを挙げることができる。本発明に用いる還元剤は、支持体に対して金属粒子の金属錯体を還元する作用を有するものである。
【００２１】
還元剤の１つであるアルデヒドは、分子内に、カルボニル炭素に水素原子が一つ置換した構造を有する有機化合物である。アルデヒドは、一般式Ｒ−ＣＨＯで表され、カルボニル基、カルボニル基の炭素原子に結合した水素原子、及び任意の基（−Ｒ）から構成される。
具体的には、アルデヒドとして、ホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）、アセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＨＯ）、プロピオンアルデヒド（Ｃ２Ｈ５ＣＨＯ）、ブタナール（Ｃ３Ｈ７ＣＨＯ）、ヘキサナール（Ｃ５Ｈ１１ＣＨＯ）、グルタルアルデヒド（Ｃ５Ｈ８Ｏ２）、ヘプタナール（Ｃ６Ｈ１３ＣＨＯ）、オクタナール（Ｃ７Ｈ１５ＣＨＯ）、ノナナール（Ｃ８Ｈ１７ＣＨＯ）、デカナール（Ｃ９Ｈ１９ＣＨＯ）、蟻酸（ＨＣＯＯＨ）、アクロレイン（ビニルアルデヒド、ＣＨ２＝ＣＨＣＨＯ）、ベンズアルデヒド（Ｃ６Ｈ５ＣＨＯ）、シンナムアルデヒド（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨＣＨＯ）、ペリルアルデヒド（Ｃ９Ｈ１３ＣＨＯ）、バニリン（Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）（ＯＣＨ３）ＣＨＯ）、又はグリオキサール（（ＣＨＯ）２）を挙げることができるが、好ましくはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、アクロレイン（ビニルアルデヒド）、又はグルタルアルデヒドであり、最も好ましくはグルタルアルデヒドである。
【００２２】
還元剤付着工程（１）においては、前記還元剤を、支持体に付着させる。還元剤の付着方法は、特に限定されるものではないが、例えば還元剤を含む溶液に浸漬させる浸漬法、又は還元剤を蒸発させて付着させる蒸着法を挙げることができる。
【００２３】
浸漬法においては、還元剤を含む溶液に支持体を浸漬することによって、還元剤を付着させる。例えば、アルデヒドを用いる場合、アルデヒド溶液の濃度は、アルデヒドが粒子に付着できる限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％であり、更に好ましくは０．１〜１重量％である。アルデヒド付着の温度は特に限定されるものではないが、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは１０〜５０℃である。また、アルデヒド付着の時間も、特に限定されるものではないが、好ましくは０．５〜４８時間であり、より好ましくは１〜２４時間である。更に、アルデヒドの付着は、限定されるものではないが、撹拌しながら行うことが好ましい。撹拌することによって、支持体に還元剤を均一（効率的）に付着させることができる。
還元剤を含む溶液の濃度、温度、時間、及び撹拌は当業者が適宜決定することができる。例えば、還元剤を含む溶液の濃度が高い方が還元剤の付着量は多くなり、温度が高い方が還元剤の付着量が多くなり、時間が長い方が還元剤の付着量が多くなり、撹拌を行った方が還元剤の付着量が多くなりやすい。従って、当業者は、目的の還元剤の付着量を得るために、適宜還元剤を含む溶液の濃度、温度、時間、及び撹拌を組み合わせて、浸漬法を実施することができる。
【００２４】
蒸着法においては、還元剤を蒸発させて支持体に還元剤を付着させる。蒸着法を用いることにより、支持体により多くの還元剤を付着させることができる。例えば、還元剤を含む水溶液を真空デシケーターの底に入れ、そして支持体をデシケーターの上部に入れて、減圧させた後に静置することによって、還元剤を蒸着させることができる。例えば、アルデヒドを用いる場合、アルデヒド溶液の濃度は、アルデヒドが支持体に付着できる限りにおいて限定されるものではないが、例えば１〜２５重量％であり、より好ましくは２〜２０重量％であり、更に好ましくは５〜１５重量％である。蒸着の温度は特に限定されるものではないが、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは１０〜６０℃である。
還元剤を含む溶液の濃度、温度、及び時間は当業者が適宜決定することができる。例えば、還元剤を含む溶液の濃度が高い方が還元剤を含む溶液の蒸着量は多くなり、温度が高い方が還元剤の蒸着量が多くなり、時間が長い方が還元剤の蒸着量が多くなりやすい。従って、当業者は、目的の還元剤の蒸着量を得るために、適宜還元剤を含む溶液の濃度、温度、及び時間を組み合わせて、蒸着法を実施することができる。
【００２５】
（２）金属粒子析出工程
金属粒子析出工程（２）においては、前記還元剤が付着した支持体を、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる
【００２６】
（金属錯体を含む水溶液）
析出させる金属粒子としては、例えば銀粒子、又は銅粒子が挙げられる。銀イオン源としては特に限定されるものではないが、例えば硝酸銀、臭化銀、又はヨウ化銀が挙げられる。銅イオン源としては特に限定されるものではないが、例えば硫酸銅が挙げられる。
【００２７】
また、錯化剤としては、特に限定されるものではないが、例えばアンモニア、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、又はヨウ化カリウムを挙げることができる。これを混合することで、金属錯体を含む水溶液を得ることができる。この時、ｐＨの調整に水酸化ナトリウム等の調整剤を用いる場合もある。また、銅の場合、更に酒石酸ナトリウムカリウムを用いることが好ましい。
金属錯体は、分子の中心に金属、又は金属イオンが存在し、それを取り囲むように非共有電子対を持つ配位子が存在する化合物である。
【００２８】
例えば、銀錯体を含む水溶液としてアンモニア性硝酸銀水溶液を用いる場合、常法に従って調製することができる。具体的には、２５％のアンモニア水（０．２ｍＬ）を超純水（５０ｍＬ）に加えたアンモニア水溶液を調製する、このアンモニア水溶液に０．１７５ｇの硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を混合することによって、アンモニア性硝酸銀水溶液を得ることができる。
アンモニア性硝酸銀水溶液のｐＨは、アルカリ性である限りは限定されるものではないが、好ましくはｐＨ９．５〜１２であり、より好ましくはｐＨ１０〜１１である。
また、アンモニア性硝酸銀水溶液に含まれる銀の濃度は、アルデヒド基と反応する限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは１〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
アンモニア性硝酸銀水溶液への浸漬温度は特に限定されるものではないが、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは３０〜７５℃である。また、浸漬時間も、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜２４時間であり、より好ましくは１〜１２時間である。前記の範囲であることによって、支持体に付着したアルデヒドと、銀錯体が反応して銀単体として析出させることができる。また、支持体に率良く銀を析出させるために、撹拌を行うことが好ましい。撹拌することによって、支持体表面で均一に反応を起こすことができ、銀粒子（金属粒子）を均一に析出させることができる。
【００２９】
他の金属錯体も同様の濃度、温度、時間で実施することができるが、当業者であれば、金属イオン源及び錯化剤に応じて、金属粒子析出工程の適宜、濃度、温度、及び時間を調整することができる。
【００３０】
（３）第２還元剤付着工程
第２還元剤付着工程（３）では、前記金属粒子が析出した支持体に還元剤を付着させる。本工程（３）は、支持体に金属粒子が付着していることを除いては、還元剤付着工程（１）に準じて実施することができる。例えば、本工程（３）は、還元剤付着工程（１）と同じ条件で実施してもよいが、異なる条件で実施することもできる。異なる条件で実施することにより、支持体への還元剤の付着量を制御し、そして支持体への金属の担持量（平均粒子径）を、細かく制御することができる。
すなわち、本工程（３）において、還元剤付着工程（１）と同じ還元剤を用いてもよいが、異なる還元剤を用いてもよい。また、還元剤を含む溶液の濃度、反応温度、反応時間、及び撹拌の有無若しくは回転数を、還元剤付着工程（１）と同じ条件で行ってもよいが、異なる条件で行ってもよい。なお、還元剤の付着は、限定されるものではなく、浸漬法又は蒸着法を用いることができるが、工程（２）で析出した金属粒子が脱離しにくいことから、蒸着法が好ましい。
【００３１】
工程（２）の後に、工程（３）を実施する場合、金属が担持された支持体を乾燥させる工程を経ることが好ましい。乾燥は、例えば真空乾燥、又は大気中での乾燥によって実施することができる。乾燥温度は限定されるものではないが、例えば３０〜１００℃であり、好ましくは５０〜７０℃である。乾燥時間も、特に限定されるものではないが、１２〜３６時間であり、好ましくは１８〜３０時間である。
乾燥工程は、例えば、以下のように実施することができる。銀鏡反応終了後、遠心分離（例えば、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を実施し、沈殿物を取得する。洗浄を目的として、得られた沈殿物に純水を加え、軽く振り混ぜたのち、遠心分離を実施する。例えば、洗浄工程を２回実施した後、水分を含んだ沈殿物を乾燥させる。乾燥の結果、得られた粉末に対して、２回目還元剤の蒸着を実施する。乾燥工程は、後述の工程（６）の後にも同様の工程で実施することができる。
【００３２】
（４）第２金属粒子析出工程
第２金属粒子析出工程（４）においては、前記金属粒子が析出し、かつ還元剤が付着した支持体を、前記工程（２）における金属粒子の金属錯体を含む水溶液と同じか又は異なる、金属粒子の金属錯体を含む水溶液に浸漬し、支持体に金属粒子を析出させる。本工程（４）は、支持体に金属粒子が付着しそして還元剤が付着していることを除いては、金属粒子析出工程（２）に準じて実施することができる。例えば本工程（４）は、金属粒子析出工程（２）と同じ条件で実施してもよいが、異なる条件で実施することもできる。異なる条件で実施することにより、支持体への金属の担持量（平均粒子径）を、細かく制御することができる。
すなわち、本工程（４）において、同じ金属錯体を用いてもよいが、異なる金属錯体を用いてもよい。金属錯体を含む水溶液も同じ濃度の水溶液を用いてもよく、異なる濃度の水溶液を用いてもよい。また、反応温度、反応時間、及び撹拌の有無若しくは回転数を、金属粒子析出工程（２）と同じ条件で行ってもよいが、異なる条件で行ってもよい。なお、「工程（２）における金属粒子の金属錯体を含む水溶液と同じか又は異なる」における「同じ」とは、水溶液の条件（濃度など）が同じことを意味する。例えば、工程（２）において、金属錯体の濃度が高い場合、金属原子がすべて析出せずに溶液中に残存することがある。その場合、工程（２）で使用した水溶液を、工程（４）で使用することもできる。しかし、この場合金属錯体の濃度が工程（２）の水溶液中の金属錯体の濃度と異なるため、「同じ」ではなく「異なる」水溶液となる。
【００３３】
本発明の製造方法においては、前記第２金属粒子析出工程（４）の後に、更に前記第２還元剤付着工程（３）及び第２金属粒子析出工程（４）に準ずる工程（５）（６）を更に１回以上実施してもよい。すなわち、工程（３）及び工程（４）に準ずる工程を複数回実施してもよい。実施回数の上限は限定されず、実施回数に、比例して金属粒子の担持量を増加させることができる。また、実施回数の増加に従い、金属粒子の平均粒子径を増加させることができる。すなわち、金属粒子の担持量及び平均粒子径を制御することができる。実施回数は、限定されるものではないが、好ましくは２〜１０回であり、より好ましくは２〜６回であり、更に好ましくは２〜４回であり、最も好ましくは２〜３回である。
【００３４】
また、工程（５）は、工程（１）及び／又は１回目の工程（３）と同じ条件で実施してもよいが、異なる条件で実施することもできる。異なる条件で実施することにより、支持体への還元剤の付着量を制御し、そして支持体への金属の担持量（平均粒子径）を、細かく制御することができる。例えば、２回目以降の工程（３）において、還元剤付着工程（１）及び／又は１回目の工程（３）と同じ還元剤を用いてもよいが、異なる還元剤を用いてもよい。また、還元剤を含む溶液の濃度、反応温度、反応時間、及び撹拌の有無若しくは回転数を、還元剤付着工程（１）及び／又は１回目の工程（３）と同じ条件で行ってもよいが、異なる条件で行ってもよい。
また、工程（６）も、工程（２）及び／又は１回目の工程（４）と同じ条件で実施してもよいが、異なる条件で実施することもできる。異なる条件で実施することにより、支持体への金属の担持量（平均粒子径）を、細かく制御することができる。例えば、２回目以降の工程（４）において、同じ金属錯体を用いてもよいが、異なる金属錯体を用いてもよい。金属錯体を含む水溶液も同じ濃度の水溶液を用いてもよく、異なる濃度の水溶液を用いてもよい。また、反応温度、反応時間、及び撹拌の有無若しくは回転数を、金属粒子析出工程（２）及び／又は１回目の工程（４）と同じ条件で行ってもよいが、異なる条件で行ってもよい。
【００３５】
金属粒子析出工程（２）及び第２金属粒子析出工程（４）において、金属錯体を含む水溶液中に含まれる金属のほぼすべてを、金属粒子として析出させることにより、実施回数に応じて、金属粒子の担持量を増加させることができる。また、実施回数に応じて、金属粒子の平均粒子径を増加させることができる。
従って、金属錯体を含む水溶液中の金属の濃度は、金属粒子析出工程（２）及び第２金属粒子析出工程（４）において、金属のほぼすべてを還元させることのできる濃度が好ましい。
例えば、１つのアルデヒド基を有する還元剤を使用する場合、１ｍｏｌの還元剤で理論的には２ｍｏｌの銀錯体を還元し、２ｍｏｌの銀を析出できる。そのため、１つのアルデヒド基を有する還元剤の場合、アルデヒド：銀錯体＝１ｍｏｌ：２ｍｏｌの割合で反応させることが最適となる。金属のほぼすべてを還元させるためには、前記還元剤付着工程（１）、及び第２還元剤付着工程（３）において、アルデヒドを過剰に付着させることが好ましい。過剰に付着したアルデヒドに対して還元されるモル以下の金属であれば、金属のほぼすべてを還元させることができる。例えば、前記の１つのアルデヒド基を有する還元剤及び銀錯体であれば、１０ｍｏｌのアルデヒドが支持体に付着している場合、２０ｍｏｌ以下の銀錯体を還元することができる。従って、２０ｍｏｌ以下の硝酸銀濃度であれば、銀錯体のほぼすべてを還元させることができる。換言すれば、過剰なアルデヒドを支持体に付着させ、それに最大限対応する金属のモル以下であれば、金属のほぼすべてを還元させることができる。
【００３６】
金属のほぼすべてを還元することにより、金属の析出量を容易に制御することができる。金属濃度の下限は限定されるものではないが、実施回数を減少させて、効率的に金属粒子を担持させる観点から、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、更に好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。また、金属濃度の上限も限定されるものではないが、好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、更に好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、最も好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
しかしながら、金属濃度の上限が高い場合でも、反応温度を上昇させること、反応時間（浸漬時間）を長くすること、撹拌することにより、１回の金属粒子析出工程（２）第２金属粒子析出工程（４）において、金属のほぼすべてを還元させることができる。例えば、撹拌の速度は、特に限定されるものではないが、例えば４００〜１０００ｒｐｍであり、より好ましくは６００〜８００ｒｐｍである。更に、還元剤付着工程（１）及び第２還元剤付着工程（３）の還元剤の濃度（蒸着量）を増加させることによっても、金属粒子析出工程（２）及び第２金属粒子析出工程（４）において、金属のほぼすべてを還元させることができる。
【００３７】
本発明の金属粒子含有支持体の製造方法においては、工程（１）〜工程（４）を実施するために、予め金属錯体を含む水溶液を実施回数に応じて調製することが好ましい。複数の金属錯体を含む水溶液の金属濃度は、同じでもよく、異なっていてもよい。また、金属濃度が異なる場合には、第２金属粒子析出工程（４）で使用する水溶液の金属濃度は、金属粒子析出工程（２）で使用する水溶液の金属濃度よりも小さくてもよい。また、第２金属粒子析出工程（４）で使用する水溶液の金属濃度は、金属粒子析出工程（２）で使用する水溶液の金属濃度よりも大きくてもよい。異なる金属濃度の水溶液を用いることによって、支持体への金属の担持量（平均粒子径）を、細かく制御することができる。
また、工程（４）の析出時間は、工程（２）の析出時間よりも短くてもよい。また、工程（４）の析出時間は、工程（２）の析出時間よりも長くてもよい。また、工程（４）で使用する水溶液の温度は、工程（２）で使用する水溶液の温度よりも高くてもよい。また、工程（４）で使用する水溶液の温度は、工程（２）で使用する水溶液の温度よりも低くてもよい。
また、本発明の金属粒子含有支持体の製造方法においては、第２還元剤付着工程（３）及び第２金属粒子析出工程（４）の後の工程（５）（６）によって、金属粒子の粒子数の増加を低減しつつ、水溶液中の金属を既存の金属粒子に使用できる。従って、既存の金属粒子に使用される金属によって、金属粒子の粒子径が大きくなり、金属粒子の平均粒子径が増加する。換言すると、金属粒子の粒子数の増加を低減し、平均粒子径を増加させることによって、金属粒子の平均粒子径を制御することができる。更に、金属錯体を含む水溶液中の金属濃度を変更することにより、金属の担持量を制御し、平均粒子径を制御することができる。
【００３８】
《焼成》
本発明の金属粒子含有支持体の製造方法においては、金属粒子が析出した金属粒子含有支持体を焼成してもよい。焼成温度は、金属粒子が溶解しない温度である限りにおいて、特に限定されるものではないが、ある態様としては、２００〜９００℃で焼成してもよく、別の態様としては、２００〜８００℃で焼成してもよく、更に別の態様としては２００〜７００℃で焼成してもよい。焼成方法としては、電気炉を用いた焼成を挙げることができる。
【００３９】
《作用》
本発明の金属粒子含有支持体の製造方法においては、工程（３）及び（４）を実施した場合（更に、工程（５）及び（６）を１回以上実施した場合）、金属粒子の粒子数の増加を低減し、残存した金属粒子に金属が担持するため、既存の金属粒子の粒子径が大きくなり、結果として平均粒子径が増加する。従って、工程（３）及び（４）の実施（更に、工程（５）及び（６）の１回以上の実施）によって、平均粒子径を制御することができる。
工程（３）及び（４）の実施（更に、工程（５）及び（６）の１回以上の実施）によって、既存の金属粒子の粒子径が増加するメカニズムは、完全に解明されたわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、以下の説明によって、本発明は限定されるものではない。
本発明の金属の析出反応においては、金属粒子の核生成よりも、金属粒子の成長が優勢になっているものと推定される。すなわち、金属粒子の核生成に必要なエネルギーより、金属粒子の成長に必要なエネルギーの方が低いため、金属粒子が存在することで、金属粒子の成長起点となる金属表面が多数存在し、金属粒子の成長にかかる溶液中の金属の消費が早く、金属粒子の新たな核の生成が低減されるものと考えられる。
【００４０】
《金属粒子含有支持体》
本発明の金属粒子含有支持体の第１の実施態様は、前記の「金属粒子含有支持体の製造方法」によって製造された金属粒子含有支持体である。本発明の金属粒子含有支持体は、前記製造方法により、金属粒子の平均粒子径が制御された金属粒子含有支持体である限りにおいて、限定されるものではない。例えば、金属粒子の平均粒子径は、特に限定されない。
【００４１】
［２］金属粒子含有支持体
本発明の金属粒子含有支持体の第２の実施態様は、支持体の表面に金属粒子を有する金属粒子含有支持体であって、金属粒子のＦＥ−ＳＥＭ観察像から得られる平均粒子径が４０〜５４ｎｍである。金属粒子の平均粒子径は、好ましくは４２〜５３ｎｍであり、より好ましくは４４〜５２ｎｍである。前記の平均粒子径の範囲であることにより、高感度のラマン分光分析を行うことができる。本発明の第２の実施態様の金属粒子含有支持体は、前記金属粒子含有支持体の製造方法によって製造されたものでもよいが、それ以外の製造法方法によって製造されたものを含む。
また、本発明の金属粒子含有支持体は、支持体に金属粒子を含有させた後に、焼成したものでもよい。
【００４２】
本発明の金属粒子含有支持体は、前記「[１]金属粒子含有支持体の製造方法」の項に記載の支持体に金属粒子が含まれるものである。すなわち、本発明の金属粒子含有支持体における金属粒子の担体は、前記「[１]金属粒子含有支持体の製造方法」の項に記載の「支持体」である。
例えば、支持体としては、カルシウム化合物粒子、シリカ粒子、又は炭素質粒子が挙げられるが、カルシウム化合物粒子又は炭素質粒子が好ましい。
【００４３】
金属粒子含有支持体の平均粒子径は、特に限定されるものではないが、平均粒子径の上限は好ましくは３００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下であり、更に好ましくは４０μｍ以下である。平均粒子径の下限は、好ましくは０．１μｍ以上であり、より好ましくは１μｍ以上であり、更に好ましくは２．５μｍ以上であり、最も好ましくは４μｍ以上である。ＳＥＲＳにおいては、支持体の表面上に析出した金属粒子が重要な役割を果たすため、支持体自体は金属粒子が析出する表面構造を有していればよく、その平均粒子径は、ＳＥＲＳに影響しないと考えられる。
また、金属粒子含有支持体の直径（粒子径）も特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜３０００μｍであり、より好ましくは０．５〜３００μｍであり、更に好ましくは１〜２０μｍである。
金属粒子含有支持体の粒度分布も、特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜３０００μｍであり、より好ましくは０．５〜３００μｍであり、更に好ましくは１〜２０μｍである。平均粒子径、直径（粒子径）及び粒度分布は、例えばレーザー回折散乱法を用いたレーザー回折式粒度分布測定装置、又は走査型電子顕微鏡像によって測定することができる。
金属粒子含有支持体のＢＥＴ法による比表面積は、特に限定されるものではないが、例えば１〜５０ｍ２／ｇである。ＢＥＴ法による比表面積は、ＪＩＳ  Ｚ１６２６：１９９６に定められた方法に基づいて測定することができる。
金属粒子含有支持体の気孔容積は、限定されるものではないが、０．００１〜２ｍＬ／ｇであり、より好ましくは０．００５〜１ｍＬ／ｇであり、更に好ましくは０．０１〜０．２ｍＬ／ｇである。
【００４４】
《金属粒子》
本発明の金属粒子含有支持体に含まれる金属粒子は、平均粒子径を除いては、「[１]金属粒子含有支持体の製造方法」に記載の金属粒子である。
例えば、金属粒子として、銀粒子、金粒子、又は銅粒子が挙げられる。
【００４５】
（金属粒子の含有量）
金属粒子含有支持体における金属粒子の含有量は、特に限定されるものではないが、下限は好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは１重量％以上であり、更に好ましくは１．６重量％以上であり、最も好ましくは２．０重量％以上である。金属粒子の含有量の上限も限定されるものではないが、好ましくは１２重量％以下であり、より好ましくは１０重量％以下であり、更に好ましくは８重量％以下であり、最も好ましくは６重量％以下である。前記含有量の範囲であることにより、効率的にラマン分光分析を実施することが可能である。
【００４６】
金属粒子の含有量の測定は、金属の種類に応じて、公知の方法によって測定することができる。例えば、銀の含有量は、以下のように測定することができる。
所定量の銀粒子含有支持体を粉砕し、所定量の粉末を０．１ｍｏｌ／Ｌの硝酸水溶液に完全に溶解させ、誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ）を用いて溶液中の銀イオンを定量することで、銀粒子含有支持体中の銀の重量％を求めることができる。
【００４７】
（平均粒子径）
前記金属粒子の平均粒子径は、４０〜５４ｎｍであり、好ましくは４２〜５３ｎｍであり、より好ましくは４４〜５２ｎｍである。本明細書において、前記平均粒子径は、金属粒子のＦＥ−ＳＥＭ観察像から、以下のように測定される。
電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて、加速電圧５．０ｋＶ、倍率３万倍にて銀含有水酸アパタイト多孔体粒子の反射電子像を観察する。得られた観察像に対して、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて二値化処理を実施し、銀粒子の平均粒子径を算出する。なお、１０ｎｍ以下の輝点はノイズとして除外する。
前記の平均粒子径の範囲であることにより、高感度のラマン分光分析を行うことができる。
【００４８】
（金属粒子の密度）
前記金属粒子の支持体上における密度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜２００個／μｍ２であり、より好ましくは２０〜６０個／μｍ２である。前記の密度の範囲であることにより、高感度のラマン分光分析を行うことができる。金属粒子の粒子数及び密度は、電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて測定することができる。例えば、加速電圧５．０ｋＶ、倍率３万倍にて銀粒子含有支持体の反射電子像を観察する。得られた観察像に対して、例えばＩｍａｇｅ  Ｊを用いて二値化処理を実施し、１０ｎｍ以下の輝点はノイズとして除外し、金属粒子の粒子数、及び単位面積当たりの金属粒子の密度測定することができる。
【００４９】
《ラマン分光分析方法》
本発明の金属粒子含有支持体を用いることによって、被験物質の高感度なラマン分光分析（Surface-enhanced Raman Spectroscopy；ＳＥＲＳ）を行うことができる。本発明においては、金属粒子含有支持体を用いることを除いては、通常のラマン分光分析方法に用いる装置及び方法（条件）にしたがって、ラマン分光分析方法を実施することができる。
ラマン分光分析は、物質に振動数Ｖｉの単色光を当てて散乱されると、ラマン効果により、ストークス線及び反ストークス線のラマン線が現れることを利用した物質の分析方法である。ラマン線の波長及び散乱強度（ラマンスペクトル）を測定することにより、物質のエネルギー準位の測定、物質の同定、及び物質の定量などを行うことができる。
ラマン分光の測定には、光源、試料照射部、分光器、及び散乱光検出器を有するラマン分光高度計を用いる。
【００５０】
（被験物質付着工程）
本発明のラマン分光分析方法は、前記金属粒子含有支持体に測定される物質（被験物質）を付着させる工程（以下、被験物質付着工程（１）と称することがある）を含む。
被験物質の付着方法は、ラマン散乱光を測定できる限りにおいて特に限定されるものではないが、測定される物質を含む液体への金属粒子含有支持体の浸漬により行うことができる。また、被験物質の付着は、測定される物質を含む液体の金属粒子含有支持体への戴置によって行うこともできる。
被験物質を含む液への浸漬は、金属粒子含有支持体に物質が付着する限りにおいて、特に限定されるものではない。液体中の被験物質の濃度は、特に限定されるものではないが、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましい。浸漬又は戴置に用いる液も特に限定されるものではないが、例えば塩化ナトリウム水溶液、リン酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、血清、血液又は粘膜液などを挙げることができる。また、血清、血液又は粘膜液などを、そのまま、又は緩衝液に希釈して測定することができる。
【００５１】
（レーザー光照射工程）
本発明のラマン分光分析方法は、（２）測定物質が付着した金属粒子含有支持体にレーザー光を照射する工程（以下、レーザー照射工程（２）と称することがある）を含む。
レーザー波長（励起波長）、パワー、露光時間、及び平均回数などのレーザー光照射条件は、被験物質に応じて、適宜決定することができる。例えば、レーザー光の波長は、基本的に短い波長を選択するが、蛍光が生じる場合などは長波長のレーザーを使用してもよい。レーザーパワーは、被験物質にダメージを与えない範囲で、強い方が好ましい。レーザーパワーが強いことによって、得られるラマンスペクトルのＳ／Ｎ比が高くなる。露光時間は用いるレーザーパワーにおいて、ラマンスペクトルの強度が十分に得られる時間に設定すればよい。例えば、レーザー光の波長として、３２０〜６５０ｎｍで測定することができるが、好ましくは５３２ｎｍである。
【００５２】
（散乱光検出工程）
本発明のラマン分光分析方法は、（３）ラマン散乱光を検出する工程（以下検出工程（３）と称することがある）を含む。
ラマン散乱光の検出器としては、光電子増倍管、又はＣＣＤ検出器を用いることができる。これらの機器を用いることにより、弱い散乱光を検出することができる。
【００５３】
《作用》
本発明の金属粒子含有支持体を用いることによって、高感度にラマン分光分析が可能なるメカニズムは、完全に解明されたわけではないが、以下のように推定することができる。しかしながら、以下の説明によって、本発明は限定されるものではない。
金属ナノ粒子の局所表面プラズモンによる表面増強ラマン散乱においては、平均粒子径が４８〜６３ｎｍの金属粒子によって、高感度のＳＥＲＳを発現できると推定される。すなわち、平均粒子径が４８〜６３ｎｍの金属粒子と、支持体との組み合わせによって、測定される対象物の吸着量及びラマン光が増強されると推定される。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
《製造例》
本製造例では、水酸アパタイトの多孔質粒子の製造を行った。
（１）水酸アパタイトナノ結晶の合成
炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を１０５０℃で３時間焼成した酸化カルシウム（ＣａＯ）に、三倍量の精製水を３回に分けて加え、加水消化して、水酸化カルシウムを得た。水酸アパタイトナノ結晶は、０．５ｍｏｌ／Ｌに調整した水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）懸濁液（２Ｌ）に０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）水溶液（２Ｌ）を滴下して合成した。反応させた懸濁液の最終ｐＨを８．０になるように調整し、吸引濾過し、１００℃で乾燥後、更に１２００℃で焼成し、粉末Ｘ線回折測定により水酸アパタイトの単相であることを確認した。
【００５６】
（２）水酸アパタイト多孔質粒子の作製
作製した水酸アパタイトナノ結晶懸濁液をスプレイドライ（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０、Ｂｕｃｈｉ）を用いて、多孔質粒子を作製した。入口温度１８０−１８５℃、アスピレーター７５、及びＱ−Ｆｌｏｗ３０に設定した。また、出口温度は６０−７０℃であり、ポンプ速度を２０とした。作製した水酸アパタイト粒子は、平均粒子径５μｍで１−２０μｍの粒度分布であった。また、ＢＥＴ測定から、比表面積は８８ｍ２／ｇで、気孔容積は０．４４ｍＬ／ｇであった。得られた粒子を、ＨＡｐ−６０と称する。前記ＨＡｐ−６０を、更に１０００℃で焼成した。１０００℃で焼成した水酸アパタイト粒子の比表面積は４．８ｍ２／ｇ、気孔容積は０．０１５ｍＬ／ｇであった。１０００℃で焼成した試料を、ＨＡｐ−１０００と称する。
【００５７】
《実施例１及び２》
本実施例では、２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が１重量％）を用い、工程（１）〜（４）の実施（実施例１：２回反応）又は工程（３）及び（４）を更に１回実施（実施例２：３回反応）して、金属粒子含有支持体を得た。
蒸着法によりグルタルアルデヒドを、水酸アパタイト多孔質粒子であるＨＡｐ−１０００に付着させた。１０重量％のグルタルアルデヒド水溶液５ｍＬを真空デシケーターの底に入れ、１．０ｇのＨＡｐ−１０００を入れて、減圧させたのち、３７℃で２４時間静置した。その後、８．５７×１０−３ｇの硝酸銀を、２５％アンモニア水（０．２ｍＬ）を超純水２５ｍＬに加えて調整した溶液に入れて、グルタルアルデヒドを付着させた水酸アパタイト多孔質粒子を加えて、撹拌を行った。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、沈殿物取得した。得られた沈殿物に超純水を加え、軽く振り混ぜた後、遠心分離を行った。２回の洗浄を行った後、６０℃で真空乾燥させた。
真空乾燥によって得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子に、前記蒸着法によるグルタルアルデヒドの付着、及びアンモニア性硝酸銀水溶液による銀粒子の析出を繰り返し、２回反応の銀含有水酸アパタイト多孔質粒子（実施例１）を得た。その粒子に、更に蒸着法によるグルタルアルデヒドの付着、及びアンモニア性硝酸銀水溶液による銀粒子の析出を繰り返し、３回反応の銀含有水酸アパタイト多孔質粒子（実施例２）を得た。
【００５８】
《実施例３》
本実施例では、４．１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が２重量％）を用い、工程（１）〜（４）を実施（２回反応）して、金属粒子含有支持体を得た。
２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液に代えて、４．１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を得た。
【００５９】
《比較例１〜５》
本比較例では、工程（１）及び（２）の１回の実施により銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を得た。
２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液に代えて、１．０３ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が０．５重量％；比較例１）、２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が１重量％；比較例２）、４．１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が２重量％；比較例３）、６．１８ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が３重量％；比較例４）、又は８．２４ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液（ＨＡｐに対して、銀元素の濃度が４重量％；比較例５）を用いたこと、及び工程（１）及び（２）を１回しか行わなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を得た。
【００６０】
《参考例１》
本参考例では、２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用い、工程（３）及び（４）を３回実施して（４回反応）、金属粒子含有支持体を得た。
工程（３）及び（４）の操作を１回実施したことに代えて、工程（３）及び（４）の操作を３回繰り返したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を得た。
【００６１】
《銀含有量の測定》
得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子の銀含有量は、０．１ｍｏｌ／Ｌの硝酸水溶液（１０ｍＬ）に１ｍｇの試料を完全に溶解させ、ＩＣＰ発光分析により定量した。
実施例１及び２並びに比較例１〜５の結果を図１Ａに示す。また、実施例３及び比較例１〜５の結果を図１Ｂに示す。
４．１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いた比較例３と比較して、実施例１に示すように、２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いて、２回反応の実施例１の方が、銀の担持量は増加した（図１Ａ）。また、６．１８ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いた比較例４と比較して、２．０６ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いて、３回反応の実施例２の方が、銀の担持量は増加した（図１Ａ）。更に、８．２４ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いた比較例５と比較して、４．１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア性硝酸銀水溶液を用いて、２回反応の実施例３の方が、銀の担持量は増加した（図１Ｂ）。なお、比較例１〜５に示すように、硝酸銀の濃度を増加させても、銀の担持量は比例して増加することはなかった。
【００６２】
《平均粒子径の測定》
得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の平均粒子径をＦＥ−ＳＥＭ観察像から以下のように計算した。
電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて、加速電圧５．０ｋＶ、倍率３万倍にて銀含有水酸アパタイト多孔体粒子の反射電子像を観察した。得られた観察像に対して、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて二値化処理を実施し、１０ｎｍ以下の輝点はノイズとして除外し、銀粒子の平均粒子径を算出した。
比較例２、実施例１、実施例２、参考例１、比較例３、及び実施例３で得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の平均粒子径を図２（Ａ）に示す。反応を繰り返すことにより、銀粒子の平均粒子径が増加することが分かった。
また、比較例２〜４で得られた水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の平均粒子径を図３（Ａ）に示す。反応が１回の場合、硝酸銀水溶液濃度が増加しても、平均粒子径は４０ｎｍ未満であった。
【００６３】
《粒子数の測定》
得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の単位面積あたりの粒子数をＦＥ−ＳＥＭ観察像から以下のように計算した。
電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて、加速電圧５．０ｋＶ、倍率３万倍にて銀含有水酸アパタイト多孔体粒子の反射電子像を観察した。得られた観察像に対して、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて二値化処理を実施し、１０ｎｍ以下の輝点はノイズとして除外し、銀粒子の平粒子数を算出した。
比較例２、実施例１、実施例２、参考例１、比較例３、及び実施例３で得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の単位面積あたりの粒子数を図２（Ｂ）に示す。反応を繰り返しても、銀粒子の粒子数は増加しなかった。
本発明の製造方法の反応を繰り返した場合、銀含有水酸アパタイト多孔質粒子における銀粒子の粒子数は増加せずに、平均粒子径が増加することがわかった。
また、比較例２〜４で得られた水酸アパタイト多孔質粒子の銀粒子の粒子数を図３（Ｂ）に示す。反応が１回の場合、硝酸銀水溶液濃度が増加すると、粒子数が増加する傾向が見られた。
【００６４】
《銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を用いた表面増強ラマン散乱による葉酸の測定》
前記比較例２、実施例１、実施例２及び参考例１で得られた銀含有水酸アパタイト多孔質粒子を用い、一定濃度の葉酸水溶液中における葉酸の表面増強ラマン散乱を測定した。
塩化ナトリウム水溶液（０．０６ｍｏｌ／Ｌ）に、葉酸の濃度を１×１０−６ｍｏｌ／Ｌに調整し、これに各銀担持水酸アパタイト多孔質粒子を加えて、波長５３２．１８ｎｍのレーザー光源によるラマン分光分析を行った。水酸アパタイトのリン酸に帰属される９５９ｃｍ−１のラマン強度に対する葉酸に帰属される１５８９ｃｍ−１のラマン強度比を計算した。図３に示すように、平均粒子径が約４０〜５４ｎｍの間で、ラマン強度比が２．０以上となった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の金属粒子含有支持体は、ラマン分光分析の被験物質の担体として用いることができる。また、本発明の金属粒子含有支持体の製造方法によって得られる銀粒子含有支持体は、銀による抗菌作用を有していることから、医療用途、生活雑貨、光触媒、及び空調材などの様々な分野において、抗菌作用を有する抗菌材料として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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