(57)【要約】【課題】本発明は、歯髄から象牙芽細胞を分化誘導し、更に最終分化である象牙質石灰化を促すことが可能な歯髄の覆髄剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る覆髄剤は、ゲラニルゲラニオール誘導体を有効成分として含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニオール誘導体を有効成分として含むことを特徴とする覆髄剤。
【請求項２】
上記ゲラニルゲラニオール誘導体が、ゲラニルゲラニオール、プラウノトール、アビエチン酸、カロテン、ゲラニルゲラニルピロリン酸、ファルネシルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、およびゲラニオールから必須的になる群より選択される１以上の化合物である請求項１に記載の覆髄剤。
【請求項３】
生分解性マイクロカプセル内に上記ゲラニルゲラニオール誘導体が含まれるものである請求項１または２に記載の覆髄剤。
【請求項４】
上記生分解性マイクロカプセルが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、または乳酸−グリコール酸共重合体から必須的になるものである請求項１〜３のいずれかに記載の覆髄剤。
【請求項５】
上記生分解性マイクロカプセルが軟膏基剤に分散しているものである請求項３または４に記載の覆髄剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯髄から象牙芽細胞を分化誘導し、更に最終分化である象牙質石灰化を促すことが可能な歯髄の覆髄剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯は、最表面がヒドロキシアパタイトで構成されるエナメル質で覆われ、その内側には象牙質があり、象牙質内の空洞には血管や神経を含む結合組織からなる歯髄があるという構造を有する。象牙質の内側の歯髄に接した面には単層の象牙芽細胞があり、生理的な或いは病的な刺激で象牙質を厚くすることが知られている。
【０００３】
齲蝕が深部象牙質まで進行した症例の歯科保存治療では、齲蝕の原因菌の感染で軟化した象牙質を除去した後、覆髄材を塗布して歯髄を守る間接覆髄法、無菌的に歯髄が一部露出した場合に、覆髄剤を露髄面に直接塗布する直接覆髄法、あるいは感染象牙質を除去すると露髄が予想される場合、意図的に感染象牙質を残し覆髄材を貼付することで、感染象牙質を無菌化や再石灰化させ、修復象牙質の形成を期待する暫間的間接覆髄法で処置する。
【０００４】
歯髄が炎症を起こすと保存治療が困難であることにより、直接覆髄法や暫間的間接覆髄法では炎症による自発痛がないことが条件である。歯髄が不可逆的炎症を起こすと保存治療を断念し、抜髄とガッタパーチャーからなる根管充填材で歯髄腔を封鎖する治療が行われる。根管充填された歯は、象牙質への栄養の供給が絶たれ、強度不足からくる歯牙破折を起こしやすくなる。近年では、できるだけ歯髄を保存し、健康的な歯を残すことが重要であると考えられている。
【０００５】
現在、覆髄剤には、水酸化カルシウム製剤、タンニン・フッ化物合材配合カルボキシレートセメント、およびミネラルトリオキサイドアグリゲイト（ＭＴＡ）が主に用いられる。水酸化カルシウム製剤は、強アルカリの水酸化カルシウムの刺激により、殺菌と象牙質の石灰化を促進すると考えられている。また、タンニン・フッ化物合材配合カルボキシレートセメントは、タンニンによる殺菌効果とフッ化物による象牙質石灰化促進効果が期待されている（非特許文献１）。更に、ミネラルトリオキサイドアグリゲイト（ＭＴＡ）は、ケイ酸二カルシウム、ケイ酸三カルシウム、アルミン酸三カルシウム、石膏、酸化ビスマスを含み、強アルカリによる殺菌作用とカルシウム放出作用による硬組織形成作用があり、その歯髄組織反応は水酸化カルシウム製剤と類似点が多いものの、水酸化カルシウム製剤より優れているといわれている。即ち、ＭＴＡに接した歯髄は変性し、周囲から増殖・遊走した細胞が象牙芽細胞へ分化し、硬組織が形成される（非特許文献２）が、これらの覆髄剤に共通して、強アルカリによる刺激性が強いことから、発疹や皮膚炎などの過敏症の患者に使うことができない。
【０００６】
また、象牙質の形成を促進する成分としては、ウシの血液抽出物（特許文献１）、グルコサミノグリカン等の多糖類（特許文献２）、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質−２）等の骨形成因子（特許文献３）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（特許文献４）、ＴＧＦ−β１等の成長因子（特許文献５）が報告されている。
【０００７】
ところで、ゲラニルゲラニオールは香料として用いられる精油中の芳香物質として知られており、抗炎症作用を示すことが知られている（非特許文献３）。特許文献６には、ポリリン酸とゲラニルゲラニオールなどを含む口腔用組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３６３０８４号公報
【特許文献２】特開平０６−２５６１３２号公報
【特許文献３】特開平０６−３４０５５５号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／１２０７２０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７／０１３４３０号パンフレット
【特許文献６】特開平０２−５９５１２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】日本歯科保存学会  ＡＩＰＣ（非侵襲性歯髄覆罩）のガイドライン
【非特許文献２】吉羽邦彦ら，新潟歯学会誌，３９，１８１−１８２，２００９
【非特許文献３】Ｍａｒｃｕｚｚｉ  Ａら，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１０（６）：６３９−６４２，２０１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の水酸化カルシウム製剤、タンニン・フッ化物合材配合カルボキシレートセメント、またはミネラルトリオキサイドアグリゲイト（ＭＴＡ）を含む覆髄材による象牙質形成促進作用は、覆髄材の成分に含まれる強アルカリの無機質の刺激により歯髄変性が引き起こされ、その修復機転で象牙質が石灰化されるが、その修復には時間を要し、予後が不確定であるだけでなく、皮膚炎や過敏症などの患者には使えないなどの制限がある。また、象牙質分化を促すとされているウシ血液や多糖類は、未知の感染源や汚染物質の混入の可能性が否定できない。骨形成因子や成長因子は、遺伝子組換え技術により製造し、更に精製しなければならないため高価である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるスタチンは、横紋筋融解症などの副作用の問題が残る。
なお、特許文献６に記載の口腔用組成物では、ゲラニルゲラニオールは、歯石の形成抑制効果を示すポリリン酸を安定化するための成分として配合されているに過ぎず、また、当該口腔用組成物は歯磨類、洗口剤、トローチ、チューインガムなどとしての利用が志向されているのみである。
このような状況に鑑み、本発明は、歯髄から象牙芽細胞を分化誘導し、更に最終分化である象牙質石灰化を促すことが可能な歯髄の覆髄剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、香料として用いられる精油中の芳香物質などとして知られているゲラニルゲラニオール誘導体が、歯髄から象牙芽細胞の分化を促し、そして、最終分化である象牙質石灰化を促進することを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【００１２】
［１］  ゲラニルゲラニオール誘導体を有効成分として含むことを特徴とする覆髄剤。
［２］  上記ゲラニルゲラニオール誘導体が、ゲラニルゲラニオール、プラウノトール、アビエチン酸、カロテン、ゲラニルゲラニルピロリン酸、ファルネシルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、およびゲラニオールから必須的になる群より選択される１以上の化合物である上記［１］に記載の覆髄剤。
［３］  生分解性マイクロカプセル内に上記ゲラニルゲラニオール誘導体が含まれるものである上記［１］または［２］に記載の覆髄剤。
［４］  上記生分解性マイクロカプセルが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、または乳酸−グリコール酸共重合体から必須的になるものである上記［１］〜［３］のいずれかに記載の覆髄剤。
［５］  上記生分解性マイクロカプセルが軟膏基剤に分散しているものである上記［３］または［４］に記載の覆髄剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る覆髄剤の有効成分であるゲラニルゲラニオール誘導体は、水酸化カルシウム製剤など従来の主要な覆髄剤の様に強アルカリによる歯髄変性を引き起こして象牙質の石灰化を促すものではないので、皮膚炎や過敏症などの患者にも使用可能な安全なものである。また、ゲラニルゲラニオール誘導体は、いわゆるテルペン類であって、タンパク質とは異なり比較的シンプルな化学構造を有するので、天然から高純度のものを単離することも可能であるし、或いは高純度なものを化学合成することが可能である点からも安全であり、且つ安価であるといえる。更に、ゲラニルゲラニオール誘導体は生体由来のものであるか、或いは生体由来化合物から合成可能であることから生体適合性に優れる。また、本発明者は、ゲラニルゲラニオール誘導体が歯髄から象牙芽細胞への分化を誘導し、優れた象牙質石灰化作用を示すことを実験的に見出している。よって本発明に係る覆髄剤は、齲蝕の治療に用いられる歯髄の覆髄剤として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、単離した歯髄細胞を、ゲラニルゲラニオールの存在下または非存在下、未分化培地または分化培地で培養し、象牙芽細胞の石灰化をアリザリンレッドＳ染色とフォンコッサ染色により可視化した写真である。
【図２】図２は、本発明に係る徐放性マイクロカプセルからのゲラニルゲラニオールの経時的な放出量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る覆髄剤は、ゲラニルゲラニオール誘導体を有効成分として含む。
一般に、ゲラニルゲラニオール誘導体には、メバロン酸に由来するイソプレンユニットを基本骨格として、最終生成物であるプラウノトール、アビエチン酸、およびα−、β−またはγ−カロテンなどをはじめ、これらの最終生成物に至るまでの生合成中間体であるゲラニルゲラニオール、ゲラニルゲラニルピロリン酸、およびこれらの前駆体であるファルネシルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、ゲラニオールなどが含まれる。以下、これら化合物の化学構造式を示す。
【００１６】
【化１】
2020002071.tif 000002
【００１７】
プラウノトールは胃炎薬として用いられており、ゲラニルゲラニオールまたはゲラニルゲラニルピロリン酸への水酸基の導入によって生成されると考えられているが、ゲラニルゲラニオール自身も抗炎症作用を示すことが知られている。
【００１８】
ゲラニルゲラニオールは、主に化学合成法により合成されるが、化学合成した場合、炭素骨格が同じで１種または２種以上の二重結合がシス体との混合物として合成されるので、工業的に重要な二重結合が全てトランス体であるゲラニルゲラニオールの生産に関して様々な方法が開示されている（特開平９−２３８６９２号公報，特開２００５−１３７２８７号公報などを参照）。一方、ゲラニルゲラニオールは、中央〜南アフリカに自生する植物のアナトー（ベニノキ科ベニノキ）の種子から抽出される。古くからカロテノイド系色素として抽出されるアナトー色素は、酸性で黄色、中性が赤色になることから、食品添加物として様々な加工食品に使用されるが、化粧品用の口紅などにも使用されている。更に、最近では、アナトー色素を除去した抽出物の残渣から、ゲラニルゲラニオールの回収法が示されている（米国特許第６，３５０，４５３号明細書を参照）。本発明で用いるゲラニルゲラニオールは、公知方法に従って化学合成されたものであってもよいし、抽出されたものであってもよい。その他のゲラニルゲラニオール誘導体も、化学合成されたものであってもよいし、天然由来のものであってもよいし、また、他のゲラニルゲラニオール誘導体を原料として合成されたものであってもよい。
【００１９】
なお、ゲラニルゲラニオールは、化学合成され、ビタミンＥ、ビタミンＫ２、胃炎薬プラウノトールなどの原料となるが、天然物由来として、アナトー種子由来のゲラニルゲラニオール５０％油脂の商品名「ゲラニルゲラニオール」（タマ生化学工業社製）、および商品名「ゲラニルゲラニオール−５０」（三菱ケミカルフーズ社製）などが、化粧品や健康食品に使用されている。
【００２０】
本発明に係る覆髄剤としては、ゲラニルゲラニオール誘導体が生分解性マイクロカプセル内に含まれており、ゲラニルゲラニオール誘導体が徐放される徐放性覆髄剤が好ましい。従来の覆髄剤は強アルカリにより歯髄を刺激して石灰化を促すものであるのに対して、本発明に係る徐放性覆髄剤は、有効成分であるゲラニルゲラニオール誘導体を徐放して石灰化を持続的に促進することができる。
【００２１】
生分解性マイクロカプセルを構成する生分解性ポリマーは、生体内で分解されてゲラニルゲラニオール誘導体を放出できるものであれば特に制限されないが、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、およびヒドロキシトリカルボン酸から必須的になる群より選択される少なくとも１種のヒドロキシカルボン酸の重縮合ホモポリマーまたはコポリマーが好ましく、α−ヒドロキシカルボン酸に由来する繰り返し単位を有するポリマーがより好ましい。更に、上記生分解性ポリマーとしては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、および乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられ、これらを１種または２種以上用いてもよいが、より好ましくは、乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００２２】
本開示で用いられるポリグリコール酸、ポリ乳酸、および乳酸−グルコール酸共重合体は、Ｄ−体、Ｌ−体、およびこれらの混合物のいずれでもよいが、ラセミ体が好ましい。
【００２３】
ポリグリコール酸およびポリ乳酸の重量平均分子量としては、１０，０００以上、２８，０００以下が好ましく、乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量としては、４，０００以上、１１６，０００以下が好ましく、２４，０００以上、３８，０００以下がより好ましい。
【００２４】
乳酸−グリコール酸共重合体の共重合比（乳酸／グリコール酸（モル％））としては、１５／８５〜５０／５０が好ましく、２５／７５〜３５／６５がより好ましい。
【００２５】
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、および乳酸−グリコール酸共重合体の末端基は、アルキルエステルあるいはカルボン酸のいずれでもよく、長時間の徐放性を求める場合はアルキルエステルが好ましいが、徐放制御の目的に応じて選べばよい。
【００２６】
上記生分解性マイクロカプセルの粒子径は、適宜調整すればよいが、例えばゲラニルゲラニオール誘導体を封入できる程度の大きさであればよく、軟膏基剤への分散性や、そのまま液体分散した後の通針性を考慮すると好ましくは１μｍ以上、１００μｍ以下であるが、これによって何ら限定されるものではない。
【００２７】
本発明に徐放性覆髄剤は、
少なくともゲラニルゲラニオール誘導体、生分解性ポリマー、および親油性溶媒を含む溶液を調製する工程、
上記溶液を水系溶媒中に分散させてＯ／Ｗ型マイクロエマルションを調製する工程、および、
上記Ｏ／Ｗ型マイクロエマルションから上記親油性溶媒を留去する工程を含む方法により製造することができる。
【００２８】
ゲラニルゲラニオール誘導体と生分解性ポリマーを溶解する親油性溶媒は、ゲラニルゲラニオール誘導体と生分解性ポリマーに対して適度な溶解性を示し、且つ水に対して不溶性または難溶性を示し、常温で液状であるものであれば特に制限されない。なお、ここで「水に対して不溶性または難溶性」とは、２５±５℃において、１ｇまたは１ｍＬの親油性溶媒を溶解するには１０００ｍＬ以上の水が必要であることをいう。親油性溶媒としては、例えば、パーム油、菜種油、オリーブ油、ごま油などの植物油；ステアリングリセリド、パルミチングリセリド、ラウリングリセリドなどのトリ−、ジ−、モノ−脂肪酸グリセリド；ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、流動パラフィンなどの脂肪族炭化水素溶媒；トルエン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼンなどの芳香族炭化水素溶媒；ジクロロメタン、モノフルオロメタン、ジフルオロメタン、パーフルオロヘキサンなどのハロゲン化炭化水素溶媒；酢酸エチルや酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル溶媒などを挙げることができる。また、これら２種以上の混合溶媒を用いてもよいし、また、ゲラニルゲラニオール誘導体と生分解性ポリマーの溶解のために必要であれば、メタノールやエタノールなど、親水性溶媒を併用してもよい。
【００２９】
上記溶液には、金属の塩および／または金属の酸化物を添加してもよい。かかる金属塩／金属酸化物を添加することにより、生分解性ポリマー中へのゲラニルゲラニオール誘導体の封入率が高くなったり、象牙芽細胞の分化や骨形成が促進される場合がある。また、リチウムイオンなどにより、石灰化がより一層促進されることも期待できる。上記金属塩／金属酸化物を構成する金属としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどの第２属元素；亜鉛などの卑金属；チタン、ジルコニウムなどの遷移金属などを挙げることができる。また、上記金属塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、チオシアン酸塩などの無機酸塩；酢酸塩などの脂肪族カルボン酸塩；安息香酸塩などの芳香族カルボン酸塩などが挙げられる。
【００３０】
上記溶液における各成分の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、生分解性ポリマーの濃度を３０質量％以上、８０質量％以下とすることができる。生分解性ポリマーに対するゲラニルゲラニオール誘導体の割合としては、１質量％以上、３０質量％以下とすることができ、２質量％以上、３０質量％以下が好ましい。上記溶液における金属塩／金属酸化物の濃度としては、０．００１質量％以上、１質量％以下が好ましい。
【００３１】
次に、上記溶液を水系溶媒中に分散させてＯ／Ｗ型マイクロエマルションを調製する。水系溶媒とは、水、および水と水混和性有機溶媒との混合溶媒をいう。水混和性有機溶媒とは、水と制限無く混和可能な親水性有機溶媒をいい、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール溶媒；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール溶媒などを挙げることができる。上記混合溶媒における水混和性有機溶媒の割合は、適宜調整すればよいが、４０質量％以下が好ましく、２０質量％以下または１０質量％以下がより好ましく、５質量％以下がより更に好ましい。
【００３２】
マイクロエマルションの安定化のために、水溶性高分子や界面活性剤などのエマルション安定化剤を用いてもよい。水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコールなどを挙げることができる。界面活性剤としては、ソルビタン脂肪族エステルなどの非イオン界面活性剤を用いることができる。エマルション安定化剤の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、水系溶媒に対して０．０１質量％以上、１質量％以下とすることができる。
【００３３】
上記溶液と水系溶媒の割合は、適宜調整すればよい。例えば、上記溶液と水系溶媒との合計に対する上記溶液の割合を０．１質量％以上、２０質量％以下とすることができ、０．５質量％以上、１０質量％以下が好ましい。
【００３４】
Ｏ／Ｗ型マイクロエマルションの調製方法としては、常法を用いることができる。例えば、上記溶液と水系溶媒を混合した後、プロペラ型またはタービン型などの攪拌機、ホモミキサーなどを用いて攪拌・混合すればよい。
【００３５】
次に、Ｏ／Ｗ型マイクロエマルションから親油性溶媒を留去することにより、ゲラニルゲラニオール誘導体を含む生分解性マイクロカプセルを調製することができる。親油性溶媒の留去には、例えば、減圧および／または加熱などの常法を用いればよい。水系溶媒よりも沸点の低い親油性溶媒を用いた場合には、親油性溶媒を選択的に留去することも可能である。
【００３６】
親油性溶媒の留去後は、通常の後処理を行うことが好ましい。例えば、水系溶媒よりも沸点の低い親油性溶媒を用いた場合には、親油性溶媒の除去により、生分解性マイクロカプセルの分散液が得られる。当該生分解性マイクロカプセルを濾過や遠心分離などにより水系溶媒から分離し、水系溶媒で洗浄し、最後に乾燥すればよい。また、親油性溶媒と共に、水系溶媒の一部または全部も留去してもよい。その場合でも、生分解性マイクロカプセルの洗浄や単離を同様に行うことができる。
【００３７】
本発明に係る覆髄剤の剤形は特に制限されず、軟膏剤や液剤など、齲蝕の治療に適した剤形とすることができる。また、本発明の覆髄剤には、必要に応じて殺菌剤、抗生物質、抗炎症剤など、その他の薬効成分を配合することで、より効果的な治療剤とすることが期待できる。本発明の覆髄剤には、その剤形などに応じて、基剤、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などを配合することができる。例えば軟膏基剤としては、白色ワセリン、黄色ワセリン、流動パラフィン、プラスチベース(R)、シリコン、植物油、豚脂、ミツロウなどの疎水性基剤や、親水ワセリン、精製ラノリン、マクロゴール(R)などの親水性基剤を挙げることができる。
【００３８】
本発明に係る覆髄剤における有効成分であるゲラニルゲラニオール誘導体の割合は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、２０質量％以上、８０質量％以下程度とすることができる。
【００３９】
より具体的には、例えば、ゲラニルゲラニオール誘導体が生分解性マイクロカプセル内に含まれている徐放性覆髄剤を、既存の覆髄剤の基剤であるＴＭＲ−ＭＴＡセメント（ケイ酸カルシウム、アルミン酸カルシウム、酸化ジルコニウム、二酸化ケイ素など）などに分散・混合して患部に投与することができる。また、液剤や軟膏剤などの本発明に係る覆髄剤を患部に直接投与した後、ＴＭＲ−ＭＴＡセメントや、有機質レジンマトリックスと無機質フィラーから成る歯科充填用光重合型コンポジットレジンを用いて被覆・保護することもできる。
【００４０】
本発明の覆髄剤は、ゲラニルゲラニオール誘導体を露髄面あるいは感染象牙質から歯髄内に放出することで、歯髄から象牙芽細胞の分化誘導を促進し、象牙質石灰化を促すと共に、ゲラニルゲラニオール誘導体の抗炎症作用により患部の炎症を緩和し、修復象牙質が形成され、歯髄炎症や修復物の加圧による象牙質損傷を防ぐことができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４２】
実施例１：  マイクロカプセルの製造
生分解性ポリマーとして乳酸−グリコール酸共重合体を用いて、Ｏ／Ｗ型エマルション経由でゲラニルゲラニオールをマイクロカプセル化した。
具体的には、乳酸−グリコール酸共重合体（共重合比：５０／５０，重量平均分子量：２４，０００〜３８，０００）２．０ｇ、酸化亜鉛１ｍｇ、およびゲラニルゲラニオール２５ｍｇを、ジクロロメタン４ｍＬとメタノール１ｍＬの混合溶媒に溶解して、薬剤−生体内分解性ポリマー溶液（以下、「Ｏ相」という）を調製した。
乳化剤としてポリビニルアルコール（「ポバール」クラレトレーディング社製）を水に溶解し、０．１質量％水溶液（以下、「Ｗ相」という）を調製した。
ガラスビーカーに上記Ｗ相４４５ｍＬを加え、続いて上記Ｏ相５ｍＬを加えた後、ホモミキサー（「ＭＯＤＥＬ  ＨＭ−３００」ＨＳＩＡＮＧＴＡＩ社製）を用い、６，０００ｒｐｍで１分間乳化し、混合物（以下、「Ｏ／Ｗ型エマルション」という）を得た。
上記Ｏ／Ｗ型エマルションを１Ｌナス型フラスコに移し変え、ロータリーエバポレーター（「Ｎ−１Ｎ型」東京理科化学社製）を用いて、２５℃で２時間、水中で有機溶媒を留去した。その後、この混合物を遠沈管に取り、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた沈渣に精製水を加え、再度、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した後、この沈渣に少量の精製水を加えてよく懸濁した。この懸濁液を、ブフナロート（「３Ｇ  Ｎｏ．１」富士理科工業社製，細孔径：１００〜１２０μｍ）を用いて吸引濾過した。
得られた濾液をナス型フラスコに移し、−４０℃で予備凍結した後、１０Ｐａで１２時間、続いて−１０℃に昇温し、２４時間真空凍結乾燥し、更に２５℃に昇温し、４８時間真空乾燥し、ゲラニルゲラニオール徐放性マイクロカプセルを得た。
【００４３】
実施例２：  マイクロカプセルの製造
乳酸−グリコール酸共重合体（共重合比：５０／５０，重量平均分子量７，０００〜１７，０００）２．０ｇおよびゲラニルゲラニオール２５ｍｇを、ジクロロメタン４ｍＬとメタノール１ｍＬの混合溶媒に溶解して、薬剤−生分解性ポリマー溶液（Ｏ相）を調製した以外は上記実施例１と同様にして、ゲラニルゲラニオール徐放性マイクロカプセルを得た。
【００４４】
実施例３：  マイクロカプセルの製造
乳酸−グリコール酸共重合体（共重合比：６５／３５，重量平均分子量：２４，０００〜３８，０００）２．０ｇ、酸化亜鉛１ｍｇ、およびゲラニルゲラニオール２５ｍｇを、ジクロロメタン４ｍＬとメタノール１ｍＬの混合溶媒に溶解して、薬剤−生分解性ポリマー溶液（Ｏ相）を調製した以外は上記実施例１と同様にして、ゲラニルゲラニオール徐放性マイクロカプセルを得た。
【００４５】
実施例４：  マイクロカプセルの製造
乳酸−グリコール酸共重合体（共重合比：７５／２５，重量平均分子量：４，０００〜１５，０００）２．０ｇ、酸化亜鉛１ｍｇ、およびゲラニルゲラニオール２５ｍｇを、ジクロロメタン４ｍＬとメタノール１ｍＬの混合溶媒に溶解して、薬剤−生分解性ポリマー溶液（Ｏ相）を調製した以外は上記実施例１と同様にして、ゲラニルゲラニオール徐放性マイクロカプセルを得た。
【００４６】
試験例１：  石灰化効果の評価
（１）歯髄幹細胞の単離と培養
マウス切歯からの歯髄細胞の単離と培養には、Ａｋｍａｌ  ＭＲＮ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４（４）：３２７−３３１，２０１４  ｄｏｉ：１０．３９２３／ｊｂｓ．２０１４．３２７．３３１）の改変法を用いた。具体的には、マウス下顎骨より切歯歯髄を取り出し、細切後、１型コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ，和光純薬工業社製）とディスパーゼＩＩ（４ｍｇ／ｍＬ，エーディア社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中、３７℃で３０分間振盪消化した。容量１０００μＬのマイクロピペットチップと、次いで容量２００μＬのマイクロピペットを用い、消化物をポンピングしながらほぐした。得られた細胞懸濁液を４０μｍ径のセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ社製）で濾過して未消化組織を除き、細胞を含む濾液を１，０００回転で５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、２０％ウシ胎児血清を含むα最小必須培地（「α−ＭＥＭ」和光純薬工業社製）に懸濁し、培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種後、５％ＣＯ2下で培養した。培地は３日毎に交換した。
【００４７】
（２）ゲラニルゲラニオールによる象牙芽細胞への効果の確認
培養によりコンフルエントに達した細胞を、１０％活性炭処理ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、５０ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、および１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むα−ＭＥＭの分化誘導培地に交換して、象牙芽細胞へ分化させた。培地交換は３日毎に行った。
分化誘導培地への培地交換と同時に、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したゲラニルゲラニオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、１０μＭまたは２０μＭの濃度となるよう添加した。対照として、同量のＤＭＳＯを添加した分化誘導培地または血清入りα−ＭＥＭの未分化培地を用いた。分化誘導培地への培地交換から１５日目にアリザリンレッドＳ染色とｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を行い、石灰化を評価した。
具体的には、分化誘導後、細胞を冷却したＰＢＳで洗浄し、冷却した７０％エタノールで数分間固定した。風乾後、４０ｍＭアリザリンレッドＳ（コスモ・バイオ社製，ｐＨ４．２）により室温で１０分間染色し、脱イオン水で水洗後、検鏡した。また、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色のため、１０％ホルマリンを含むＰＢＳ（和光純薬工業社製）で細胞を室温３０分間固定した。脱イオン水で洗浄後、５％硝酸銀水溶液で３０分間、蛍光灯下で発色させた。５％チオ硫酸ナトリウムを加え、反応を停止した。脱イオン水で水洗後、検鏡した。結果を図１に示す。
図１の通り、未分化培地で１５日間培養した歯髄細胞は、未分化であるためか、石灰化の指標となるアリザリンレッド染色とｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色されなかった。一方、培地を分化培地に交換すると、培養１５日目でアリザリンレッド染色とｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色による陽性染色像が出現し、象牙芽細胞へ分化することが示されている。更に、ゲラニルゲラニオールを含む分化培地で培養すると、ゲラニルゲラニオールの添加濃度に依存したアリザリンレッド染色とｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色における強陽性像が出現した。かかる結果により、ゲラニルゲラニオール添加によって歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化と石灰化が促進されることが実証された。
【００４８】
試験例２：  徐放性マイクロカプセルからのゲラニルゲラニオールの放出試験
上記実施例３で調製した徐放性マイクロカプセル０．５ｇをｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液１ｍＬに混合して懸濁液を調製し、予め０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で膨潤させた透析チューブ（「ＲＣメンブレンポア３」家田貿易社製，ＭＷＣＯ：３，５００）に加えた試料を６個用意して、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍＬに浸漬し、室温で透析を行った。透析チューブを１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に取り出し、供試試料とした。
上記供試試料をエッペンドルフチェーブに入れ、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上清を丁寧に取り除き、その沈殿物に４ｍＬのｎ−ヘキサンに加え、試料とした。また、１０ｍｇのゲラニルゲラニオールを２０ｇのｎ−ヘキサンに溶解した標準液を調製した。ゲラニルゲラニオールの定量は、公知方法（Ｅ．Ｋ．Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，７８：  １５９−１６８，２０１５）に従い、ＨＰＬＣによって行った。即ち、４０℃に加温したＣ１８カラム（ＫＩＮＥＴＥＸ社製，１００ｍｍ×４．６ｍｍ×２．６μｍ）と、移動相としてメタノール／５０ｍＭ酢酸アンモニウム液＝９０／１０（Ｖ／Ｖ）を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、吸光度２１０ｎｍでゲラニルゲラニオールを検出した。調製したゲラニルゲラニオール標準液の濃度を、ヘキサンを用いて種々の濃度に調整し、その１０μＬをそれぞれ採取し、ナイロン膜フィルター（０．４５μｍ）を通してＨＰＬＣ−ＰＤＡ（「Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｅ２６９５」Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて定量し、検量線を作成した。試料の測定値から、検量線と下記式を用いて、ゲラニルゲラニオールの徐放量を求めた。結果を図２に示す。
徐放量（質量％）＝［（供試試料中含量−沈殿物中試料含量）／供試試料中含量］×１００
図２の通り、本発明に係るゲラニルゲラニオール徐放性マイクロカプセルは、ゲラニルゲラニオールを持続的に放出できることが実証された。
【図１】
2020002071.tif 000003
【図２】
2020002071.tif 000004