(57)【要約】      （修正有）【課題】電気泳動法による鑑別方法において更に鑑別精度を向上させ、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛に対しても比較的簡単な鑑別操作で正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供する。【解決手段】被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、抽出した前記タンパク質群を所定の消化酵素で一部分解する酵素処理工程、酵素処理したタンパク質及び分解残渣を含有する試料を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する鑑別工程を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を所定の消化酵素で一部分解する酵素処理工程、
酵素処理した消化産物を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する鑑別工程を有する獣毛繊維の鑑別方法。
【請求項２】
前記酵素処理工程において、前記所定の消化酵素は、前記被検獣毛繊維に対して選択された特定のエンドプロテアーゼであることを特徴とする請求項１に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
【請求項３】
前記被検獣毛繊維がイヌ科の動物の獣毛である場合に、
前記エンドプロテアーゼは、Ｔｒｙｐｓｉｎ又はＡｒｇ−Ｃであることを特徴とする請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
【請求項４】
前記単一獣毛繊維の電気泳動パターンを複数準備し、これらに対して各バンドの濃度と移動度との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程と、
前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、各バンドの濃度と移動度との関係を解析する工程とを有し、
前記鑑別工程において、前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する獣毛繊維の鑑別方法に関するものである。特に、タンパク質組成の点で類似性が高く鑑別精度が得られない場合のある「同属異種」又は「同属同種異亜種」どうしの鑑別精度を向上した獣毛繊維の鑑別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
市場には多くの獣毛繊維を用いた繊維製品が高級品として流通している。獣毛繊維の中でも特に高級品とされるカシミヤを用いた繊維製品には、他の獣毛繊維を混合しての偽装が多く行われている。従って、一般の消費者が繊維製品を購入する際に偽装を見分けることができず、公正取引上の大きな問題となっている。例えば、カシミヤ（ヤギ属）と見分けが付きにくいヤク（ウシ属）の毛を混合し、或いは、ウール（ヒツジ属）のスケールを除去（「脱スケール」という。）して混合するなど手の込んだ偽装が行われている。
【０００３】
そこで、繊維製品の輸出入の際には、各国の繊維関係の検査機関で鑑別して取引の安全を図っている。これらの検査機関では、例えば日本においては、ＪＩＳＬ １０３０‐１（繊維製品の混用率試験方法‐第１部：繊維鑑別）、及び、ＪＩＳＬ １０３０‐２（繊維製品の混用率試験方法‐第２部：繊維混用率）に基づいて鑑別を行っている。
【０００４】
この鑑別方法において獣毛繊維を鑑別するには、検査員が光学顕微鏡を用いて目視により検査対象の獣毛繊維を標準写真見本と対比させて行っている。また、この鑑別方法において獣毛繊維の混用率を求めるには、検査員が光学顕微鏡を用いて目視により検査対象の獣毛繊維に含まれる異種の獣毛繊維の本数や直径を求め、或いは、分別してそれぞれの重量を測定するなどの方法で行っている。
【０００５】
従って、これらの方法においては、各検査機関の検査員の経験とノウハウの違いによる鑑別結果のばらつきが生じるという問題があった。また、混用率を求める場合には、検査員による非常に煩雑で長時間に亘る作業が伴うという問題があった。更に、獣毛繊維に手の込んだ偽装が行われている場合には、上記方法のみでは正確な鑑別が行えないという問題があった。
【０００６】
これに対して、上記の光学顕微鏡を用いた目視による鑑別方法を補完する方法が提案されている。例えば、下記特許文献１においては、ＤＮＡによる獣毛繊維の同定方法が提案されている。この方法によれば、獣毛繊維試料から抽出したＤＮＡと動物種に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によってＤＮＡを増幅し、この増幅成分の塩基配列を分析して獣毛繊維試料の起源となる動物種を鑑別するというものである。
【０００７】
下記特許文献１の同定方法は、獣毛繊維から抽出したＤＮＡの遺伝子配列により、獣毛繊維の起源となる動物種を鑑別するものである。これらの方法は、動物種ごとに遺伝子配列が異なることを利用するものであり、生物学的に客観的な結果を与えることが期待される。
【０００８】
しかし、鑑別の試料となる獣毛繊維からＤＮＡを抽出し、これを増幅する操作は非常に煩雑であり、多くの繊維関係の検査機関で通常業務として行うことは容易ではない。また、市場に流通する繊維製品は、通常、種々の前処理や染色加工がなされている。これらの前処理や染色加工は、獣毛繊維に対して物理的或いは化学的な方法で行われ、獣毛繊維自体に何らかのダメージを与えている。従って、前処理や染色加工がなされた獣毛繊維から損傷のないＤＮＡを抽出することは困難であり、正確な鑑別を行うことができないという問題があった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、これらの問題に対処して、下記特許文献２において、獣毛繊維から抽出したタンパク質を電気泳動法で分離し、それらの組成を比較することで獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する方法を提案した。この方法によれば、鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−２１００８４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１４−１４２２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記特許文献２の鑑別方法は、電気泳動法のみによる鑑別方法と電気泳動法と質量分析法との組合せによる鑑別方法との２つの方法を提案する。これらのうち、電気泳動法のみによる鑑別方法は、特に鑑別操作が比較的簡単で装置価格も廉価で客観的な鑑別ができるという点で有効である。この電気泳動法のみによる鑑別方法においては、上述のカシミヤ（ヤギ属）、ヤク（ウシ属）、ウール（ヒツジ属）などの「属」が異なる獣毛を精度よく鑑別でき、本来の目的としたカシミヤの偽装を発見して市場の安定性を図るという意味で価値のある技術である。
【００１２】
一方、市場においては、カシミヤに限らず他の多くの動物の獣毛や毛皮（ファー）が利用される場合があり、その偽装も問題とされる。例えば、ミンク、タヌキ、キツネなどの偽装において、「同属異種」など近縁種の動物の獣毛などが使用される場合もある。また、ワシントン条約で国際取引が規制されている動物の毛皮（ファー）などを扱う犯罪に対しても、精度の高い獣毛鑑別方法が望まれている。
【００１３】
そこで、本発明は、上記問題に対処して、電気泳動法による鑑別方法において更に鑑別精度を向上させ、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛に対しても比較的簡単な鑑別操作で正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題の解決にあたり、本発明者らは、鋭意研究の結果、獣毛から抽出したタンパク質に対して電気泳動の操作の前に酵素処理を行うことにより、鑑別精度が更に向上することを見出し本発明の完成に至った。
【００１５】
即ち、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法は、請求項１の記載によると、
被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を所定の消化酵素で一部分解する酵素処理工程、
酵素処理した消化産物を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する鑑別工程を有する。
【００１６】
また、本発明は、請求項２の記載によると、請求項１に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
前記酵素処理工程において、前記所定の消化酵素は、前記被検獣毛繊維に対して選択された特定のエンドプロテアーゼであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明は、請求項３の記載によると、請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
前記被検獣毛繊維がイヌ科の動物の獣毛である場合に、
前記エンドプロテアーゼは、Ｔｒｙｐｓｉｎ又はＡｒｇ−Ｃであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、請求項４の記載によると、請求項１〜３のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
前記単一獣毛繊維の電気泳動パターンを複数準備し、これらに対して各バンドの濃度と移動度との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程と、
前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、各バンドの濃度と移動度との関係を解析する工程とを有し、
前記鑑別工程において、前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別することを特徴とする法。
【発明の効果】
【００１９】
上記構成によれば、本発明は、抽出工程、酵素処理工程、電気泳動工程、及び、鑑別工程を有している。抽出工程は、被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する。酵素処理工程は、抽出したタンパク質群を所定の消化酵素で一部分解する。電気泳動工程は、酵素処理した消化産物を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る。鑑別工程は、得られた電気泳動パターンを起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。
【００２０】
電気泳動法による鑑別は、獣毛繊維を構成するタンパク質群の組合せが、動物の種類により異なることを根拠とする。更に、タンパク質群を所定の消化酵素で一部分解することで得られた消化産物を使用することにより、タンパク質群のみで得られた電気泳動パターンよりも多くの情報が得られる。
【００２１】
従って、電気泳動法による鑑別方法において更に鑑別精度が向上する。このことにより、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛に対しても比較的簡単な鑑別操作で正確な鑑別結果を得ることができる。
【００２２】
また、上記構成によれば、酵素処理工程に使用する所定の消化酵素は、被検獣毛繊維に対して選択された特定のエンドプロテアーゼであってもよい。このことにより、上述の作用効果をより一層具体的に発揮することができる。
【００２３】
また、上記構成によれば、被検獣毛繊維がイヌ科の動物の獣毛である場合には、エンドプロテアーゼとして、Ｔｒｙｐｓｉｎ又はＡｒｇ−Ｃであってもよい。このことにより、上述の作用効果をより一層具体的に発揮することができる。
【００２４】
また、上記構成によれば、単一獣毛繊維の電気泳動パターンを複数準備し、これらに対して各バンドの濃度と移動度との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程を有していてもよい。更に、被検獣毛繊維から得られた電気泳動パターンについて、各バンドの濃度と移動度との関係を解析する工程を有していてもよい。これらのことにより、鑑別工程において、被検獣毛繊維の解析データをデータベースのデータ群と照合して、解析データとデータベースのデータ群との一致性を指標として、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する。このことにより、上述の作用効果をより一層具体的に発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る鑑別方法でイヌ科の獣毛を鑑別した電気泳動パターンを示すゲル画像である。
【図２】従来の鑑別方法でイヌ科の獣毛を鑑別した電気泳動パターンを示すゲル画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明において、獣毛繊維とは、一般に動物の毛からなる繊維に加え動物起源のタンパク質を繊維化したものも含む広い概念である。ここで、一般に動物の毛から得られる繊維は、天然ケラチン質を主成分とする毛繊維の全てを含むものである。従って、一般的なものとしては、羊の「ウール」、カシミヤ山羊の「カシミヤ」、アンゴラ山羊の「モヘア」、アンゴラ兎の「アンゴラ」、牛の一種ヤクの「ヤク」、ラクダの「キャメル」、小型こぶなしラクダのアルパカの「アルパカ」、同じく小型こぶなしラクダのビクーニャの「ビキューナ」、同じく小型こぶなしラクダのリャマの「リャマ」などが挙げられる。
【００２７】
また、これら以外にも毛皮（ファー）として使用されるものも含まれる。例えば、キツネの「フォックス」、イタチの一種ミンクの「ミンク」、ネズミの一種チンチラの「チンチラ」、ウサギの「ラビット」、アライグマの「ラクーン」、タヌキの「チャイナラクーン、フィンラクーン」、有袋類の「オポッサム」、などの獣毛も挙げられる。
【００２８】
本発明において、獣毛繊維を用いた繊維製品とは、例えば、獣毛繊維を紡績した糸を用いた織物や編物或いはフェルトなどの不織布を挙げることができる。しかし、これらに限らず、毛皮（ファー）なども含み、更に、毛繊維のまま詰め物などに使用される場合も含むものとする。また、これらの繊維製品には、染色加工或いは各種仕上加工が施されたものも含む。
【００２９】
また、本発明において、動物の種類とは、生物学上の分類単位としての「種」のみを意味するものではなく、「属」或いは「科」まで遡った広い意味でも使用するものとする。従って、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法で鑑別する動物の種類とは、当該獣毛繊維の起源となる動物の「種」を鑑別することに限らず、起源となる動物の「属」を鑑別すること、或いは、起源となる動物の「科」を鑑別することを意味する場合もある。
【００３０】
これらの中で、アライグマ（アライグマ科アライグマ属）の毛「ラクーン」とタヌキ（イヌ科タヌキ属）の毛「チャイナラクーン、フィンラクーン」の区別が必要とされる場合もある。また、コヨーテ（イヌ科イヌ属コヨーテ種）の毛「コヨーテ」、オオカミ（イヌ科イヌ属オオカミ種）の毛「オオカミ」、及び、イエイヌ（イヌ科イヌ属オオカミ種イエイヌ亜種）の毛「イエイヌ」の区別が必要とされる場合もある。
【００３１】
以下、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法について、実施形態により詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態にのみ限定されるものではない。
【００３２】
本実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、抽出工程、酵素処理工程、電気泳動工程、及び、鑑別工程を有している。特に、電気泳動工程の前に酵素処理工程を有することを特徴とする。まず、本実施形態においては、検査対象である獣毛繊維（以下、「被検獣毛繊維」という。）から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する（抽出工程）。次に、抽出したタンパク質群を特定の消化酵素で一部分解して消化産物を得る（酵素処理工程）。次に、この消化産物を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターン（タンパク質パターン及びペプチドパターン）を得る（電気泳動工程）。
【００３３】
そして、得られた電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。その結果、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別することができる（鑑別工程）。以下、本実施形態における各工程を詳細に説明する。
【００３４】
≪抽出工程≫
獣毛繊維の主要構成タンパク質は、主にケラチン及びケラチン関連タンパク質であり、これらのタンパク質には、構造の良く似た多種類の分子種が存在する。これらのタンパク質群は、動物の種類によりその組み合わせが異なっている。上記特許文献２においては、これらのタンパク質群の構成、即ち複数のタンパク質の組合せを解析することにより、獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別するものである。
【００３５】
しかし、同属異種又は同属同種異亜種など近縁種の動物の獣毛においては、タンパク質の組合せが類似しており鑑別し辛い、或いは、鑑別精度が十分でないことがある。よって、本実施形態においては、消化酵素による酵素処理工程の採用が鑑別精度向上に効果的である（詳細は後述する）。
【００３６】
本実施形態においては、獣毛繊維からこれを構成するタンパク質群を抽出する。このように、獣毛繊維を構成するタンパク質群に着目することにより、獣毛繊維の表面に脱スケールなどの偽装加工がなされていても、獣毛そのものが残っている限りタンパク質を抽出することができる。この点において、偽装加工がなされた獣毛繊維からＤＮＡを抽出することが非常に困難であることと対照的である。
【００３７】
本発明者らは、上記特許文献２の開発段階において、獣毛繊維の原毛そのもの、粉砕した原毛、漂白した獣毛、及び、脱スケールした獣毛について、それぞれ同様にしてタンパク質群を抽出して電気泳動パターンを検討した。その結果、これらの電気泳動パターンには大きな変化がないことを確認した。従って、本実施形態においても、被検獣毛繊維を粉砕してからタンパク質を抽出するようにしてもよく、或いは、粉砕することなく獣毛の形状を維持したままタンパク質を抽出するようにしてもよい。但し、脱スケールした獣毛繊維については、脱スケールの程度が不明なため、被検獣毛繊維をある程度粉砕してからタンパク質を抽出するようにすることが好ましい。
【００３８】
具体的なタンパク質の抽出操作は、以下のようにして行う。まず、被検獣毛繊維に染色加工などがなされている場合には、電気泳動パターンが乱れることがある。本実施形態においては、染料、仕上剤及び補助剤などの除去操作をタンパク質抽出前に行うことが好ましい。このことにより、続く酵素処理工程及び電気泳動工程において染料等の影響を受けることがなく、電気泳動パターンの精度が上がり正確な鑑別を行うことができる。
【００３９】
この洗浄操作には、タンパク質を抽出することのないように、例えば、デオキシコール酸とラウロイルサルコシ酸とを含有する洗浄液などを用いて、７０℃〜１００℃、好ましくは９０℃〜９５℃程度の温度で数回洗浄を行うなどの方法が好ましい。また、染色された被検獣毛繊維に対しては、染料種別に合わせた脱色処理を行うようにしてもよい。例えば、酸化処理、還元処理、酸処理、アルカリ処理或いはキレート処理などが挙げられる。これらの場合、タンパク質が破壊されず且つ抽出されない条件で行うことが好ましい。
【００４０】
次に、タンパク質の抽出操作を行う。タンパク質の抽出液としては、一般に各種界面活性剤を含有する水溶液などを使用することができる。使用する界面活性剤は、タンパク質にダメージを与えずに可溶化するものであれば特に限定するものではないが、例えば、ケラチンタンパク質の溶解性を高める界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用することが好ましい。
【００４１】
また、タンパク質の抽出に際しては、タンパク質内のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を還元して開裂し、システイン残基とすることで可溶化が容易となる。そのため、抽出液には還元剤を併用することが好ましい。これらの還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などが挙げられる。
【００４２】
この抽出操作においては、界面活性剤と還元剤とを併用した抽出液に被検獣毛繊維を浸漬し、７０℃〜１００℃、好ましくは９０℃〜９５℃程度の温度で抽出して抽出液を回収する操作を数回繰り返す。これらの抽出液を回収後、所定濃度に濃縮して続く酵素処理工程に使用する。
【００４３】
ここで、タンパク質のシステイン残基が再度ジスルフィド結合を形成することのないよう、システイン残基を封鎖しておくことが好ましい。システイン残基の封鎖には、一般的な方法を使用すればよく、例えば、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、アクリルアミドなどを使用してアルキル化するなどの方法が挙げられる。なお、このようにして得られたタンパク質の総量は、定量しておくことが好ましい。
【００４４】
≪酵素処理工程≫
この工程が、本発明の大きな特徴であって、この工程を経ることにより電気泳動パターンの情報量が増して、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛に対しても正確な鑑別結果を得ることができる。なお、本発明の用途は、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛の鑑別にのみ限定されるものではなく、電気泳動法により獣毛或いはタンパク質繊維を鑑別する際に、情報量を増やす方法として広く使用できるものである。
【００４５】
この工程においては、抽出したタンパク質群に消化酵素を作用させて一部を分解してペプチド群に切断する。消化酵素を作用させた後のタンパク質群（以下「消化産物」という）の中には、消化酵素により分解されてタンパク質から脱離したペプチドと、その分解残渣であるタンパク質と、使用した消化酵素で分解されないタンパク質とが含まれる。従って、消化産物には、分子量の異なる一連のタンパク質群（分解残渣も含む）と、分子量の異なる一連のペプチド群とが含まれるものと考えられる。
【００４６】
使用する消化酵素は、特に限定するものではないが、タンパク質を構成するアミノ酸を所定の位置で切断するエンドプロテアーゼを使用することが好ましい。なお、消化産物の分子量が電気泳動での検出範囲内に入ることが必要である。従って、消化産物の電気泳動パターンにおいて消化産物の分子量が６０ｋＤａ〜２ｋＤａの範囲内に複数本検出されることが好ましい。また、タンパク質の切断箇所が特定のアミノ酸に制限されている消化酵素が好ましい。切断箇所がランダムに起きる消化酵素を使用すると、毎回得られる切断パターンが異なり、鑑別の精度が向上しないからである。
【００４７】
これらのことから、消化産物の分子量が被検獣毛繊維の動物種に特有の電気泳動パターンを示す消化酵素を選択することが好ましい。これらの消化酵素としては、例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃなどタンパク質の消化に一般的に使用される消化酵素を使用することができる。従って、被検獣毛繊維の動物種に対して、これらの消化酵素を使用して予め消化産物の電気泳動パターンを調べ、被検獣毛繊維に特定の消化酵素を選択しておくことが好ましい。本発明者らによれば、例えば、イヌ科の動物の鑑別に対して、特にＴｒｙｐｓｉｎとＡｒｇ−Ｃが有効であるとの結果を得た。
【００４８】
酵素処理工程の操作は、上述の抽出工程と同様の或いは別の抽出液に消化酵素を溶解した酵素液をタンパク質群に混合し、その酵素の至適温度（例えば、３７℃付近）で酵素による分解処理を行う。分解処理後の消化産物を所定濃度に濃縮して続く電気泳動工程に使用する。このように、本実施形態においては、抽出したタンパク質群に特定の消化酵素を作用させることにより、続く電気泳動工程の鑑別精度が大幅に向上する。
【００４９】
≪電気泳動工程≫
次に、酵素処理工程で得られた消化産物に対して、電気泳動法を用いて構成タンパク質及びペプチドを分離する。使用する電気泳動法は、特に限定するものではなく、どのような方法であってもよいが、本実施形態においては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を用いることが好ましい。
【００５０】
一般に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に使用するポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドとその架橋剤であるＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドとの共重合により三次元構造を有している。このアクリルアミドとＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドとの総和をゲル濃度といい、一般に１０％〜２０％程度のゲルを使用することができる。本実施形態において使用するポリアクリルアミドゲルは、特にケラチンタンパク質等をより高分解能で分離するために、１５％〜２０％程度のゲルを使用することが好ましい。
【００５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法の操作は、特に限定するものではなく一般的な方法を使用すればよい。例えば、泳動用緩衝液や通電条件においても電気泳動パターンの分解能と鮮明性を考慮して条件設定することが好ましい。例えば、本発明者らは、獣毛繊維の鑑別において、分子量が２５ｋＤａ以下の領域における分解能が良好なゲルを使用することにより、高い鑑別結果を得ることができることを確認した。また、電気泳動パターンを得る際には、内部標準を併用することが好ましい。内部標準としては、例えば、牛の血清アルブミンなどを使用して、電気泳動パターンの移動度補正に使用する。
【００５２】
ポリアクリルアミドゲルの分解能を向上させる方法は、特に限定するものではないが、例えば、ゲル長（支持体距離に対応）を長くして分解能を向上させるようにしてもよい。一般にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に使用するポリアクリルアミドゲルは、ゲル長が８ｃｍ程度のものを使用する。例えば、このゲル長が８ｃｍのゲルから１２ｃｍのゲルに変更することで、より高分解能で分離することができる。
【００５３】
電気泳動後のゲルは、染色液を用いてタンパク質及びペプチドを染色する。染色には、一般に染料染色法、銀染色法、或いは蛍光染色法などが使用される。ここで、銀染色法は感度が高いが操作が煩雑であるという欠点を有している。そこで、本実施形態においては、染料染色法、或いは蛍光染色法を使用することが好ましい。
【００５４】
染料染色法は、感度は高くないが操作が簡単であるという利点を有しており、例えば、クマシーブリリアントブルー−Ｒ（以下「ＣＢＢ−Ｒ」という。）などの染料を使用することが好ましい。これに対して、蛍光染色法は、感度が高く操作も簡単であり、本発明の目的である高精度で鑑別するためには、感度が高い蛍光染色法を使用することがより好ましい。
【００５５】
蛍光染色法に使用する蛍光物質は特に限定するものではなく、タンパク質と結合することにより蛍光を発する物質、或いは、色素自体が蛍光を発光する蛍光色素などを使用することができる。例えば、蛍光色素としては、Ｆｌａｍｉｎｇｏ蛍光ゲルステイン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、以下「Ｆｌａｍｉｎｇｏ」という。）、及び、ＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）などが挙げられる。
【００５６】
これらの蛍光色素は、高感度でダイナミックレンジが広く、且つ、長時間安定した発色を示すので取り扱いが容易である。また、バックグラウンドが低いため、染色後のゲル洗浄操作も不要、或いは短時間で済むという利点を有しており、染料染色法よりも操作が容易である。このことにより、蛍光染色法は、染料染色法に比べて鑑別精度が向上することに加え、鑑別に要する時間が大幅に短縮されて作業効率が向上するという利点を有している。
【００５７】
このようにして、染料染色法或いは蛍光染色法で染色したゲルは、分子量によって移動度（移動距離に対応）の異なる複数のバンドから構成される電気泳動パターンを表している。この電気泳動パターンを解析するために撮影したものを「ゲル画像」という。
【００５８】
≪鑑別工程≫
動物の種類ごとに遺伝子の配列は異なり、タンパク質は遺伝子にコードされている。従って、動物の種類ごとにタンパク質のアミノ酸配列は異なるため、獣毛繊維から抽出したタンパク質群の電気泳動パターンは動物の種類固有のものとなる。そのため、従来の方法（上記特許文献２の方法）は、このことを根拠として、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較することにより、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する。
【００５９】
一方、本実施形態に係る鑑別方法は、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離する前に所定の消化酵素により消化して一部を分解する。酵素処理工程後の消化産物から電気泳動法で得られた電気泳動パターン（ゲル画像）は、獣毛繊維の起源となる動物の種類に固有のものとなる。本実施形態においては、電気泳動工程で得られた電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。
【００６０】
このため、動物の種類が既知の複数種類の単一獣毛繊維に対して、上記と同様の工程による電気泳動パターンを予め準備する。また、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを作成する際に、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンを同時に作成するようにしてもよい。このようにすることで、より正確な鑑別をすることができる。
【００６１】
ここで、得られた電気泳動パターンをより客観的に比較する方法について説明する。まず、得られた電気泳動パターンのゲル画像をスキャナーで取り込み、各バンドの位置（分子量に対応）を移動度Ｒｆとして数値化し、各バンドの濃度（タンパク質量、ペプチド質量に対応）を定量する。このとき、複数の試料間のバンドの移動度Ｒｆは、補正しておくことが好ましい。なお、電気泳動パターンのゲル画像の解析法は、一般の方法でよく、また上記特許文献２にも詳しく記載されておりここでは省略する。
【００６２】
また、本発明においては、予め準備した起源となる動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維の電気泳動パターンの解析データをデータベース化することにより、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うことができる。この方法においては、まず、獣毛繊維の起源が明確な多くの標準試料（単一獣毛繊維）について、タンパク質群を抽出し（抽出工程）、次に、抽出したタンパク質群を特定の消化酵素で一部分解して消化産物を得る（酵素処理工程）。次に、この消化産物を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターンを得る（電気泳動工程）。
【００６３】
このようにして得られた多くの電気泳動パターンに対して、ゲル画像をスキャナーで取り込み、各バンドの位置（分子量に対応）を移動度Ｒｆとして数値化し、各バンドの濃度（タンパク質量、ペプチド質量に対応）をピーク面積として定量する。このようにして得られた多くの数値データをその標準試料の履歴と共にデータベース化する（データベース蓄積工程）。
【００６４】
次に、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを解析して数値データを得る（被検獣毛繊維解析工程）。次に、得られた被検獣毛繊維の数値データをデータベースの数値群と照合して、当該被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する（鑑別工程）。なお、この鑑別工程においては、主成分分析などの多変量解析を使用することが好ましい。このようにして、鑑別工程において客観的な鑑別を行うことができる。
【実施例】
【００６５】
本実施例は、本実施形態により同科同属異種の獣毛を鑑別するものである。具体的には、コヨーテ（イヌ科イヌ属コヨーテ種）、オオカミ（イヌ科イヌ属オオカミ種）、イエイヌ（イヌ科イヌ属オオカミ種イエイヌ亜種）の獣毛を鑑別する。イエイヌの犬種としては、ビジョンフリーゼの毛と柴犬の毛を使用した。なお、酵素処理工程においては、消化酵素としてイヌ科の獣毛に対して発明者らが選択したＡｒｇ−Ｃ及びＴｒｙｐｓｉｎ（比較例としてＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）を使用した。
【００６６】
≪抽出工程≫
本実施例においては、いずれの獣毛に対しても洗浄操作を行うことなくタンパク質抽出を行った。タンパク質の抽出は、２０ｍｇの試料に対して４００μＬの抽出液（５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／２００ｍＭ ＤＴＴ／２％ＳＤＳ）を添加し、９５℃で５分間、加熱した。その後、遠心分離し上清をタンパク質抽出液として回収した。抽出操作は計８回繰り返した。
【００６７】
酵素処理前にタンパク質を濃縮するためにアセトン沈殿を行った。アセトン沈殿は、まず、試料量に対して３倍量の冷アセトンを添加し攪拌した。試料を−８０℃で２時間静置した後、遠心分離を行った。上清を除去した後、試料を遠心濃縮機で乾燥させた。タンパク質は、２２．５μＬの再溶解液（５０ｍＭＴＥＡＢ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／２ｍＭＥＤＴＡ）で溶解した。
【００６８】
その後、システイン側鎖をアルキル化するために、常温に戻した試料に２．５μＬ（終濃度１５ｍＭ）のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加し、３０分間、室温、暗所でインキュベートした。抽出したタンパク質の量は６６０ｎｍにて吸光度を測定して定量した。
【００６９】
≪酵素処理工程≫
試料を再溶解液（５０ｍＭ ＴＥＡＢ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／２ｍＭ ＥＤＴＡ）で１０００μＬに希釈した後、希釈液（５０ｍＭ ＴＥＡＢ）で１００μｇ／ｍＬ間で希釈した。次に、消化酵素を再溶解液（５０ｍＭＴＥＡＢ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／２ｍＭＥＤＴＡ）で溶解した消化酵素溶液（１０μｇ／５０ｍＬ）を準備した。試料１００μＬに対して消化酵素を１ｍＬずつ添加して溶解した。次に、この試料に溶液（５０ｍＭＴＥＡＢ／５０ｍＭ ＤＴＴ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて３７℃でインキュベートした。次に、この試料を遠心濃縮機で乾燥させて試料とした。
【００７０】
≪電気泳動工程≫
次に、乾燥させた試料を電気泳動用試料調製液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２％ ＳＤＳ／１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．００５％ＢＰＢ／４．２５％ ２−ＭＥ）で溶解した。電気泳動槽はＢＥ−２１１（株式会社バイオクラフト）を使用し、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（テフコ株式会社：８ｃｍ長ゲル）を用いて、１枚あたり２５ｍＡ→３４ｍＡの電流で電気泳動を行った。
【００７１】
電気泳動後のゲルは、固定液（４０％ Ｅｔｈａｎｏｌ／１０％ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）にゲルを入れて９０分間振とうさせた後、蛍光染料Ｆｌａｍｉｎｇｏ溶液に浸漬して振とうさせて染色を行った。このようにして得られた、イヌ科の獣毛を鑑別した電気泳動パターン（ゲル画像）を図１に示す。これに対して、比較例として上記酵素処理工程のみを行わないで得られたイヌ科の獣毛を鑑別した電気泳動パターン（ゲル画像）を図２に示す。
【００７２】
≪鑑別工程≫
次に、得られた本実施例及び比較例の電気泳動パターン（ゲル画像）を比較した。なお、本実施例においては、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較するものではないが、図１及び図２において使用した３種類（比較例は４種類）のイヌ科の獣毛の電気泳動パターンが、それぞれ異なっていることから本発明の有効性を判断できるものである。なお、図１においては、３種類のイヌ科の獣毛の電気泳動パターンは、それぞれ２本ずつ作製され、これらが同一であることからも本発明の有効性を判断できるものである。
【００７３】
すなわち、図１に示す本実施例においては、Ａｒｇ−Ｃ及びＴｒｙｐｓｉｎで酵素処理したオオカミ、コヨーテ、イエイヌ（ビジョンフリーゼ）の電気泳動パターンが異なっていた。特に、判別が難しかったオオカミとコヨーテとの違いが明確になった。これに対して、イヌ科の獣毛で選択されなかったＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎで酵素処理した場合には、特にオオカミとコヨーテとの違いが不明瞭であった。
【００７４】
具体的な判断は、次のようにして行った。まず、Ａｒｇ−Ｃでは、分子量が１０ｋＤａ以下の領域（図示１０ｋＤａの部分から下方）に図１の矢印で示す２本のバンドが出現する場合をコヨーテと判断し、２本のバンドが出現していない場合をイエイヌ若しくはオオカミと判断した。なお、イエイヌとオオカミとの違いは、その他の部分のバンドから判断できる。ここで現れる２本のバンドは、Ａｒｇ−Ｃによる酵素処理で出現したものである。
【００７５】
同様にＴｒｙｐｓｉｎでは、分子量が１０ｋＤａ以下の領域に図１の矢印で示す４本のバンドが出現する場合をコヨーテと判断し、４本のバンドが出現していない場合をイエイヌ若しくはオオカミと判断した。なお、イエイヌとオオカミとの違いは、その他の部分のバンドから判断できる。ここで現れる４本のバンドは、Ｔｒｙｐｓｉｎによる酵素処理で出現したものである。
【００７６】
これに対して、図１のＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎで酵素処理した場合には、分子量が１０ｋＤａ以下の領域、或いはそれ以外の領域においても明確なバンドは出現しなかった。このことにより、イヌ科の獣毛に対して選択した特定の酵素以外では特にオオカミとコヨーテとの違いが鑑別できない。
【００７７】
また、図２に示す比較例においては、酵素処理を行っていないオオカミ、コヨーテ、イエイヌ（ビジョンフリーゼ及び柴犬）の電気泳動パターンにおいて、イエイヌとオオカミ、イエイヌとコヨーテの違いは確認できたが、オオカミとコヨーテとの違いが判別できなかった。これは、分子量が１０ｋＤａ以下の領域に酵素処理によるバンドが出現しなかったことによる。
【００７８】
これらのことから、本発明においては、電気泳動法による鑑別方法において更に鑑別精度を向上させ、「同属異種」又は「同属同種異亜種」など近縁種の動物の獣毛に対しても比較的簡単な鑑別操作で正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することができる。
【００７９】
なお、本発明の実施にあたり、上記実施形態に限らず次のような種々の変形例が挙げられる。
（１）上記実施形態及び実施例においては、イヌ科の獣毛の鑑別について説明したが、これに限るものではなく、その他の近縁種の動物の獣毛の鑑別、或いは、近縁種ではなくても従来の電気泳動法では鑑別精度が好ましくなかった動物の獣毛の鑑別にも本発明を使用することができる。
（２）上記実施形態及び実施例においては、イヌ科の獣毛の鑑別に使用する消化酵素としてＡｒｇ−Ｃ及びＴｒｙｐｓｉｎを挙げて説明したが、これに限るものではなく、イヌ科の獣毛に対して更に有効な消化酵素を選択して使用することもできる。また、イヌ科以外の獣毛の鑑別には、それぞれに適した消化酵素を選択して使用すればよい。
（３）上記実施例においては、データベースの使用については説明していないが、イヌ科の獣毛の鑑別においても、予めデータベースを準備しておくことで、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うことができる。
【符号の説明】
【００８０】
コヨーテ-１、コヨーテ-２、コヨーテ…コヨーテ（イヌ科イヌ属コヨーテ種）の電気泳動パターン、
犬（ピ）-１、犬（ピ）-２、犬（ピ）…イエイヌ：ビジョンフリーゼ（イヌ科イヌ属オオカミ種イエイヌ亜種）の電気泳動パターン、
犬（柴）…イエイヌ：柴犬（イヌ科イヌ属オオカミ種イエイヌ亜種）の電気泳動パターン、
狼-１、狼-２、狼…オオカミ（イヌ科イヌ属オオカミ種）の電気泳動パターン。
【図１】
2020190500.tif 000003
【図２】
2020190500.tif 000004