(57)【要約】      （修正有）【課題】全４種類の血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、及び、ＤＥＮＶ−４に対するデングサブユニットワクチンの提供。【解決手段】ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、及び、ＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、発現された核酸のＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１２の核酸配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドにコードされた組み換えポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１のアミノ酸配列を有する請求項３に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または請求項２のポリヌクレオチドを含むように、請求項１または請求項２のポリヌクレオチドを用いて形質転換又は遺伝子導入され、ＨＢｓＡｇを発現する、宿主細胞。
【請求項６】
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子であって、該ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４であり、該組み換えポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、前記バイオナノ粒子。
【請求項７】
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子の製造方法であって、適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養し、発現された組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収することを含み、該ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４であり、該組み換えポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項８】
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを含むウイルス様粒子であって、該ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４であり、該組み換えポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、前記ウイルス様粒子。
【請求項９】
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを含むワクチンであって、該ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４であり、該組み換えポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、前記ワクチン。
【請求項１０】
請求項６に記載のバイオナノ粒子を含むワクチン。
【請求項１１】
請求項８に記載のウイルス様粒子を含むワクチン。
【請求項１２】
４つのデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれに対するＤＥＮＶ血清型特異的中和抗体を生成する、請求項９、１０および１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
４種類の血清型のそれぞれに対する均衡のとれた中和抗体を生成する、請求項９、１０および１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
デングウイルス感染の治療または予防における使用のための、請求項９、１０および１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
４つのデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれに対する中和抗体力価の誘導において使用するための請求項９、１０および１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
デングウイルス感染の治療または予防における使用のための請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１７】
デングウイルス感染の治療または予防における使用のための請求項６に記載のバイオナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デング熱の全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３
、ＤＥＮＶ−４に対する組み換えデングサブユニットワクチンに関する。本発明は、四価
ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む組み換えＶ
ＬＰに基づくデング四価ワクチン候補にも関する。本発明は、組み換えＶＬＰ（ウイルス
様粒子）に基づくデング四価ワクチン候補の生成のための工程にも関する。
【背景技術】
【０００２】
４種類の抗原的に別個のデングウイルス（ＤＥＮＶ）により引き起こされるデング疾患
は、世界の１５０を超える国において、特にインドのような非常に流行している国におい
て、重大な健康上の懸念である。この疾患は、この１０年間、増加の一途を辿っており、
有効なワクチンまたは抗ウイルス療法がないため、世界規模の公衆衛生学的な脅威となっ
てきた。デング疾患は、特に大流行中は医療システムにとって世界規模の難題であり、媒
介動物の駆除のために毎年数百万ドルが費やされている。費用効率が高い、効率的で安全
なワクチンがあれば、デングウイルスが蔓延国に課す負担を解決し得る。疾患の拡大を制
限するための予防的なワクチンを開発するための過去３０年間にわたる集中的な取り組み
にもかかわらず、市場に認可されたワクチンは未だに存在しない。世界中の研究グループ
／会社が、デングウイルスの全血清型に対する有効な四価ワクチンを開発するために努力
を重ねている。以前の開発ワクチンの殆どが生、弱毒化キメラウイルスに基づくものであ
り、これらのうち一部は現在臨床治験中である。しかし、ウイルス干渉などの制限ゆえに
、研究の焦点は、特にデングウイルスの外被（Ｅ）タンパク質のドメインＩＩＩを使用し
たサブユニットワクチンに移ってきている。このドメインを利用する多くの特許／刊行物
も報告されている。
【０００３】
生フラビウイルスに基づくデングワクチンが第ＩＩＩ相臨床試験に入っているものの、
ウイルス干渉ゆえの問題が報告されている。ウイルス干渉は、おそらく４種類のワクチン
ウイルス株の複製能および免疫原性の相違ゆえに生じる。
【０００４】
非複製サブユニットワクチンは、生ウイルスワクチンと関連するウイルス干渉のリスク
を克服する可能性を有する［Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００９）
，Ｄｅｎｇｕｅ：Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃ
ｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３］。組み換えＤＮＡおよびタンパ
ク質に基づくサブユニットワクチンを使用したいくつかのアプローチが研究されている。
このような組み換えサブユニットワクチンの殆どは、主要外被（Ｅ）タンパク質に焦点を
当てている。多くの証拠から、Ｅタンパク質のワクチン特性の多くがドメインＩＩＩ（Ｅ
ＤＩＩＩ）と関連していることがさらに示されている。
【０００５】
ＤＥＮＶ外被ドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）は、宿主細胞受容体の認識および中和抗体
の作製に関与することが示されている［Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（
２００９）．Ｄｅｎｇｕｅ：Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  
ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３；Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．
Ｇ  Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．，Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｌ，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｒ．，Ｇｕｉｌｌ
ｅｎ，Ｇ．（２０１０）．Ｄｏｍａｉｎ  ＩＩ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒ
ｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔ］。さらに、ＥＤ
ＩＩＩは、交差反応性抗体を誘導するための本来備わっている可能性がごく僅かしかない
ことが報告されている［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｍ．，Ｗｕ，Ｓ．Ｊ
．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｄｅｎｇｕｅ
ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇａｉｎｓ
ｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ２  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ；Ａｍ．Ｊ．
Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５８：６５５−６６２；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｍｕｒｐｈ
ｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（２００１）．Ｓｈｏｒｔ  ｒｅｐｏｒｔ：ａｎｔ
ｉ−ｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  
ａ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：１５
９−１６１］。これらの性状により、ＥＤＩＩＩは優れたワクチン候補となる。四価タン
パク質の形態の潜在的なデングワクチン抗原としてのＥＤＩＩＩの有効性は、発明者らに
より既に裏付けられている［Ｅｔｅｍａｄ，Ｂ．，Ｂａｔｒａ，Ｇ，Ｒａｕｔ，Ｒ．，Ｄ
ａｈｉｙａ，Ｓ．，Ｋｈａｎａｍ，Ｓ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｋｈａｎｎａ
，Ｎ．（２００８）］。
【０００６】
デングウイルスの外被（Ｅ）タンパク質のドメインＩＩＩを開拓する多くの特許／刊行
物、すなわち
Ｓｕｚａｒｔｅ，Ｅ．，Ｇｉｌ，Ｌ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ｌａ
ｚｏ，Ｌ．，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，．．．＆  Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．（２０１５）
，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙが報告されており、ｄｘｖ０１１
は、デングウイルスからの４個の凝集したドメインＩＩＩキャプシドタンパク質を組み合
わせた新規の四価処方物が、マウスおよびサルにおいて機能的免疫反応を誘導することを
開示する。この参考文献は、２つの異なるウイルス領域、外被タンパク質のドメインＩＩ
Ｉおよびキャプシドタンパク質に基づく、デングウイルスに対するワクチン候補を教示し
、ここではこのＤＩＩＩＣタンパク質の四価処方物が使用された。デング−２ウイルスか
らの新規キメラタンパク質（ドメインＩＩＩ−キャプシド（ＤＩＩＩＣ−２））は、オリ
ゴデオキシヌクレオチドを組み込む凝集体として提示される場合、抗ウイルスおよび中和
抗体、細胞性免疫反応を誘導し、マウスおよびサルに対する顕著な防御を付与した。残り
のコンストラクトが既に得られ、的確に特性評価された。これらの証拠に基づき、本研究
は、一価および四価処方物としての、各血清型のキメラタンパク質ＤＩＩＩＣのマウスで
の免疫反応を評価することを目的とした。本発明者らは、処方物テトラＤＩＩＩＣを形成
する混合物での抗原競合なしで、液性および細胞介在性免疫に関して各タンパク質の免疫
原性を明らかにした。したがって、マウス脳炎モデルにおける限定的ウイルス負荷により
測定されるように、顕著な防御が可能になった。非ヒト霊長類における四価処方物の評価
も行った。この動物モデルにおいて、使用される免疫付与経路にかかわらず、この処方物
が、中和抗体およびＩＦＮ−γ分泌および細胞傷害能を伴うメモリー細胞介在性の免疫反
応を誘導したことが明らかになった。ＤＩＩＩＣタンパク質の四価処方物は、デングウイ
ルスに対する有望なワクチン候補を構成する。
【０００７】
Ｚｕｅｓｔ，Ｒ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｔ
ｏｈ，Ｙ．Ｘ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．，．．．＆  Ｆｉｎｋ，Ｋ．（２０１５），Ｖａｃｃｉ
ｎｅ  ３３（１２），１４７４−１４８２は、デングウイルスに対する免疫を付与するた
めの、デング血清型１〜４（テトラＤＩＩＩＣ）のＥドメインＩＩＩおよびキャプシドタ
ンパク質からなる組み換え融合タンパク質の四価処方物の免疫原性を開示する。キャプシ
ドタンパク質がＴ細胞エピトープを含有する一方で、ＥドメインＩＩＩは、効率的な中和
抗体に対するエピトープである。ＢおよびＴ細胞エピトープを組み合わせることに加えて
、テトラＤＩＩＩＣは、その凝集体型および２成分アジュバントゆえに非常に免疫原性が
高い。一価ＤＩＩＩＣ処方物を評価する先行研究後、マウスにおけるテトラＤＩＩＩＣの
Ｔ細胞および抗体反応の質および幅に取り組んだ。テトラＤＩＩＩＣは、全４種類のＤＥ
ＮＶ血清型に対してＴｈ１型反応を誘導し、デング特異的な抗体は主にＩｇＧ１およびＩ
ｇＧ２ａおよび中和であり、一方で中和抗体の誘導はＩＦＮシグナル伝達に依存した。重
要なこととして、ＤＩＩＩＣワクチンアプローチのＴｈ１およびＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａプ
ロファイルは効率的な天然の抗デング反応と同様である。
【０００８】
Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｇｉｌ，Ｌ．，Ｍ
ａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｍ．，およびＧｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ．（２０１４）
，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（１０），２５９７−２６０４は
、ドメインＩＩＩ−Ｐ６４ｋおよびドメインＩＩＩ−キャプシドタンパク質の混合物を含
有する四価デングワクチンがマウスにおいて防御反応を誘導することを開示する。この参
考文献は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）からのＰ６４ｋタンパク質に融合されたデングウイルス（１、３および４型）外
被タンパク質のドメインＩＩＩおよび２型デングウイルス（Ｄ２）のドメインＩＩＩを含
有するワクチン候補が免疫原性であることが分かったことを教示する。ナイセリア・メニ
ンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＰ６４ｋタン
パク質に融合されたデングウイルス外被タンパク質のドメインＩＩＩおよびこの血清型の
キャプシドタンパク質に融合された２型（Ｄ２）デングウイルスのドメインＩＩＩを含有
する組み換え融合タンパク質は免疫原性であり、この四価処方物で免疫付与したマウスに
おいて、致死的曝露に対するマウスでの付与された防御性を評価した。
【０００９】
デング熱に対して最も有効なアプローチと考えられる弱毒生ワクチン（ＬＡＶ）は、こ
の期待を裏切った。最先端のＬＡＶ候補の有効性試験からの最新データから、３０％の全
体的な有効性が示され、ＤＥＮＶ−２については有効性がなかった。これにより、デング
ワクチンを開発するための代替的なアプローチの本格的な探索が必要になった。ＶＬＰに
基づくデング四価ワクチン候補、「ＤＳＶ４」は、開発されるＤＥＮＶの４種類の血清型
に対応する全４種類のＥＤＩＩＩを提示するＨＢｓＡｇに基づくＶＬＰである。
【００１０】
最初に、インド国特許第２６１７４９号明細書で開示されるように、ペンタグリシンリ
ンカーを通じて互いに連結される、デングウイルスの全４種類の血清型、デング−１、２
、３および４のドメインＩＩＩを含む単一のキメラポリペプチドである、四価ドメインＩ
ＩＩタンパク質（ｒＴＤＩＩＩ）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現についてコドン
最適化された。
【００１１】
別のインド国特許出願第１２５９／ＤＥＬ／２００７号明細書は、デングウイルスの４
種類の血清型、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４のそれぞれに対し
て防御免疫反応を誘発する分泌性シグナルペプチドがあるかまたはない、組み換え外被ド
メイン−ＩＩＩに基づく四価タンパク質を開示しているが、このタンパク質は、真核発現
系での発現に対してコドン最適化されたポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１２】
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が外来エピトープの提示および表示のためのプラット
フォームとなる能力は、マラリアワクチン候補ＲＴＳ，Ｓの成功によってよく例証される
。ＥＤＩＩＩ−Ｔの免疫原性を向上させるために、発明者らは、ＨＢｓＡｇがその表示に
対してよく働き得るか否かを調べた。したがって、ＨＢｓＡｇとの融合物において、およ
びＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カ
セットの基礎環境で、ＥＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした（図１Ａ）。このＤＳＶ４の設
計は、ＲＴＳ，Ｓと同様であり（対応特許：国際公開第９３１０１５２号パンフレット、
メキシコ国特許第９２０６５７４号明細書、欧州特許第０６１４４６５号明細書など）、
これはＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ上でマラリアエピトープを提示する。
【００１３】
本発明の新規性は、ＨＢｓＡｇを伴う、ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセ
ットの基礎環境におけるＥＤＩＩＩ−Ｔのコンストラクトにある。したがって、このＥＤ
ＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇの設計（「ＤＳＶ４」と呼ばれる。）は新規とみなされ得る
。本発明の発明性は、提示のためおよびＶＬＰになるように組み立てるための同時発現Ｈ
ＢｓＡｇタンパク質のためのプラットフォームとして働くことにより発現タンパク質の免
疫原性を向上させるためのＨＢｓＡｇとのＥＤＩＩＩ−Ｔの融合にある。ＤＳＶ４ウイル
ス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＨＢｓＡｇとの融合において、単一組み換え四
価ドメイン（ＥＤＩＩＩ−Ｔ）をクローニングし、ＨＢｓＡｇと同時発現させる。サブユ
ニット四価ワクチンＤＳＶ４は、ＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を生成させ、デング熱
の４種類の血清型のそれぞれに対して有効である。
【００１４】
本発明は、既存の提案されているワクチンを上回る次の長所を有する／有すると予想さ
れる。
【００１５】
現在第３相試験下のＳａｎｏｆｉ弱毒生ワクチンは、全４種類の血清型に対する均衡の
とれた中和抗体を誘発するために、１２カ月の長期間の投与スケジュールにわたり３回の
免疫付与を必要とし（０、６および１２）、一方でＧｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ
（第１相試験中）は、２８日あけて２回投与するタイプの投与スケジュールを目指してお
り、武田薬品工業（第２相試験完了）では僅か３か月あけて２回投与するという免疫付与
計画である。したがって、予備データにより、本発明のワクチンの免疫付与スケジュール
は、試験中のＳａｎｏｆｉのワクチンよりも短くなろう。さらに、本発明のワクチンは、
単一組み換えタンパク質として全４種類のＤＥＮＶ血清型のＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓ
Ａｇを含み、一方で、Ｓａｎｏｆｉの弱毒生ウイルスワクチンを含む治験中の他の全ての
ワクチン候補は、４種類の血清型に対応する４種類の候補の混合物である。
【００１６】
さらに、ＨＢｓＡｇとの組み換えＥＤＩＩＩ−Ｔの融合の結果、ＶＬＰの形成および組
み換え免疫原性タンパク質およびＢ型肝炎表面抗原の同時発現が起こるだけでなく、デン
グ熱とともにＢ型肝炎に対する防御／免疫付与を提供し得る。これは、二重ワクチンの開
発につながり得、デング熱ならびにＢ型肝炎の全ての血清型に対する同時免疫付与がもた
らされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】インド国特許第２６１７４９号明細書
【特許文献２】インド国特許出願第１２５９／ＤＥＬ／２００７号明細書
【特許文献３】国際公開第９３１０１５２号パンフレット
【特許文献４】メキシコ国特許第９２０６５７４号明細書
【特許文献５】欧州特許第０６１４４６５号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３
【非特許文献２】Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ  Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．，Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｌ，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｇ．（２０１０）
【非特許文献３】Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｍ．，Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５８：６５５−６６２
【非特許文献４】Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（２００１）．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：１５９−１６１
【非特許文献５】Ｅｔｅｍａｄ，Ｂ．，Ｂａｔｒａ，Ｇ，Ｒａｕｔ，Ｒ．，Ｄａｈｉｙａ，Ｓ．，Ｋｈａｎａｍ，Ｓ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００８）
【非特許文献６】Ｓｕｚａｒｔｅ，Ｅ．，Ｇｉｌ，Ｌ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，．．．＆  Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．（２０１５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献７】Ｚｕｅｓｔ，Ｒ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｔｏｈ，Ｙ．Ｘ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．，．．．＆Ｆｉｎｋ，Ｋ．（２０１５），Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３（１２），１４７４−１４８２
【非特許文献８】Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｇｉｌ，Ｌ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｍ．，＆Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ．（２０１４），Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（１０），２５９７−２６０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の重要な目的は、全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−
３、ＤＥＮＶ−４に対するデングサブユニットワクチンを提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ４を提
供することである。
【００２１】
本発明のまた別の目的は、デング熱の４種類の血清型、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、
ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれに対してＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を
生成する組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ４を提供することであ
る。
【００２２】
本発明のさらなる別の目的は、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の作製
のための過程を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、デングウイルスの全４種類の血清型に対して効率的なおよび
安全なワクチン接種アプローチを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
第一の態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清
型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩ
Ｉドメインを含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血
清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメイ
ンを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸を用いて形質転換または遺伝子移入さ
れ、ＨＢｓＡｇを発現する宿主細胞を提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒
子を提供する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、発現さ
れる組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収することを含む、本発明の組み換え
ポリペプチドを含むバイオナノ粒子を作製する方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含むワクチンを提
供する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、本発明のバイオナノ粒子を含むワクチンを提供する
。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチド、本発明のバイオナ
ノ粒子または本発明のワクチンを対象に投与することを含む、デングウイルスを処置また
は予防する方法を提供する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、デングウイルスを処置または予防することにおける
使用のための、本発明の組み換えポリペプチド、本発明のバイオナノ粒子または本発明の
ワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＤＳＶ４の設計：ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇをコードさせるために、ヘキサグリシルリンカーを通じて連結される４種類のＤＥＮＶに対応する４種類のＥＤＩＩＩからなるＥＤＩＩＩ−Ｔを遺伝子操作によりＨＢｓＡｇ（Ｓ）と融合させ、ＨＢｓＡｇの４個の発現カセットを保有するベクターにおいてこれをクローニングした。組み換えプラスミドをＢｇｌＩＩで直線化し、電気穿孔法によりＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞に送り込み、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇを同時発現するクローンを得た。
【図１Ｂ】メタノール誘導：選択したクローンの非誘導（Ｕ）および誘導（Ｉ）バイオマスをメタノール誘導によって調製し、銀染色およびウエスタンブロッティングにより発現について分析した。銀染色したゲルは、誘導試料におけるＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇ（約７２ｋＤａ）およびＨＢｓＡｇ（約２５ｋＤａ）の両方の発現を示す。ＥＤＩＩＩ特異的なｍＡｂを用いたウエスタンブロットにより、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇが検出され、ＨＢｓＡｇ特異的なｍＡｂを用いて、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの両方が検出される。
【図１Ｃ】ＤＳＶ４の精製：誘導バイオマスからの精製ＤＳＶ４の３回の調製（ｐｒｅｐ）。
【図２Ａ】ＤＳＶ４のゲルろ過クロマトグラフィー：ＤＳＶ４は、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した場合、ボイド容量で溶出した。銀染色によるボイド容量中のタンパク質の分析から、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの両方の存在が示される。
【図２Ｂ】ＣｓＣｌ超遠心：ＣｓＣｌカラム上での超遠心におけるＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの共遊走。
【図２Ｃ】ＤＳＶ４ＶＬＰの電子顕微鏡像：電子顕微鏡下でネガティブ染色で観察される場合の２５〜３５ｎｍのサイズのＤＳＶ４ＶＬＰ。
【図３Ａ】ＥＤＩＩＩ配列のソース：対応するＥＤＩＩＩ  ａａ配列が派生した各ＤＥＮＶ血清型の遺伝子型。
【図３Ｂ】ＤＳＶ４抗血清のＥＬＩＳＡ反応性：ＨＢｓＡｇ、ＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３およびＥＤＩＩＩ−４に対するプールされたＤＳＶ４抗血清の反応性。紫色の曲線は、ＤＳＶ４に対する非免疫付与血清の反応性に相当する。
【図３Ｃ】ＤＳＶ４は、均衡のとれた中和力価を生じさせる：各血清型の（１または複数の）指定される遺伝子型に対するＤＳＶ４抗血清のＦＡＣＳに基づく中和力価。
【図３Ｄ】プールされた血清での遺伝子型中和幅。
【図４（ａ）】ＤＥＮＶ−１の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）およびコード核酸（配列番号５）、
【図４（ｂ）】ＤＥＮＶ−２の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号２）およびコード核酸（配列番号６）、
【図４（ｃ）】ＤＥＮＶ−３の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号３）およびコード核酸（配列番号７）、
【図４（ｄ）】ＤＥＮＶ−４の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）およびコード核酸（配列番号８）、
【図４（ｅ）】ＨＢｓＡｇのＮ末端のアミノ酸配列（配列番号９）およびコード核酸（配列番号１０）、
【図４（ｆ）】ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるＤＥＮＶ−１、２、３および４からのＥＤＩＩＩを含む本発明の組み換えポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１）およびコード核酸（配列番号１２）、斜字体の核酸およびアミノ酸配列はヘキサグリシンリンカーであり、下線を付した核酸およびアミノ酸配列はＫｐｎＩ制限部位の翻訳に由来する。ＥＤＩＩＩは連続してＮ末端からＣ末端に、ＤＮＶ−１、ＤＮＶ−３、ＤＮＶ−４およびＤＮＶ−２の順序である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、デングウイルスの全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮ
Ｖ−３およびＤＥＮＶ−４血清型に対するデングサブユニットワクチンを提供する。サブ
ユニットワクチンは、四価ＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇを含む組み換えタンパク質を
含む。本発明はまた、ＤＥＮＶの全４種類の血清型に対するデング疾患の予防のためのＶ
ＬＰに基づく四価ワクチン候補を含むサブユニットワクチンにも関する。
【００３５】
ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端にインフレームで連結されるデング
ウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩ
ＩＩドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を提供する。デングウイル
ス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩド
メインのそれぞれをコードするヌクレオチド配列は、あらゆる順序でＨＢｓＡｇのＮ末端
と連結され得る。
【００３６】
好ましくは、本核酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３および４のアミノ酸配列を有
するデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−
４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインをコードする。好ましくは、デングウイルス血清型Ｄ
ＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそ
れぞれをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号５、６、７および８である。
【００３７】
好ましくは、本核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇをコードす
る。好ましくは、ＨＢｓＡｇをコードする核酸配列は配列番号１０である。
【００３８】
ある実施形態において、核酸配列は、配列番号１０のＮ末端とインフレームで連結され
る配列番号５、６、７および８のヌクレオチド配列のそれぞれを含む。ヌクレオチド配列
、配列番号５、６、７および８は、あらゆる順序で配列番号１０のＮ末端と連結され得る
。
【００３９】
好ましくは、本核酸配列は、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥ
ＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれを連結するリンカーをコー
ドする。好ましくは、この核酸は、可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリン
カーをコードする。好ましくは、本核酸配列は、ＨＢｓＡｇのＮ末端にデングウイルス血
清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメイ
ンを連結するリンカーをコードする。好ましくは、この核酸は、可動性リンカー、最も好
ましくはヘキサグリシンリンカーをコードする。
【００４０】
好ましくは、本核酸配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する組み換えポリペプチ
ドをコードする。好ましくは、組み換えポリペプチドをコード核酸配列は、配列番号１２
の核酸配列である。
【００４１】
ある実施形態において、本核酸配列は、酵母での発現に対して、好ましくはＰ．パスト
リス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現に対して最適化されたコドンである。ある実施形
態において、本核酸は発現ベクターである。
【００４２】
ある態様において、本発明は、本発明の核酸を用いて形質転換または遺伝子移入され、
ＨＢｓＡｇを発現する宿主細胞に関する。ある実施形態において、宿主細胞は、ＨＢｓＡ
ｇをコードする核酸配列を用いて形質転換されるかまたは遺伝子移入される。好ましくは
、宿主細胞は、ＨＢｓＡｇを発現する１、２、３、４個またはそれ以上の核酸配列を用い
て形質転換されるかまたは遺伝子移入される。ある実施形態において、宿主細胞は酵母で
ある。最も好ましくは、宿主細胞はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００４３】
ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型
ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩ
ドメインを含む組み換えポリペプチドを提供する。デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、
ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれをコー
ドするアミノ酸配列は、あらゆる順序でＨＢｓＡｇのＮ末端と連結され得る。好ましくは
、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４
のＥＤＩＩＩドメインは、連続してＮ末端からＣ末端に、配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−
３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合される。
【００４４】
好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３および
ＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、
２、３および４である。好ましくは、ＨＢｓＡｇのＮ末端は、配列番号９のポリペプチド
配列を有する。好ましくは、組み換えポリペプチドは、配列番号９のＮ末端に連結される
アミノ酸配列、配列番号１、２、３および４のそれぞれを含む。アミノ酸配列、配列番号
１、２、３および４は、あらゆる順序で配列番号９のＮ末端と連結され得る。好ましくは
、組み換えポリペプチドは、連続的にＮ末端からＣ末端に、配列、配列番号１、配列番号
３、配列番号４および配列番号２で、アミノ酸配列、配列番号１、２、３および４を含む
。
【００４５】
好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３および
ＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインは、リンカーにより、好ましくは可動性リ
ンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリンカーにより連結される。好ましくは、ＥＤＩ
ＩＩドメインは、リンカーにより、好ましくは可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグ
リシンリンカーによりＨＢｓＡｇのＮ末端に連結される。
【００４６】
ある態様において、組み換えポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
【００４７】
本発明の形質転換または遺伝子移入宿主細胞は、ＨＢｓＡｇおよび本発明の組み換えポ
リペプチドの両方を合成する。発明者らは、これらの２つのポリペプチドが自発的に共集
合してバイオナノ粒子となることを示した。ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇお
よび本発明の本発明の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子を含む。
【００４８】
ある態様において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、発現された
組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収することを含む、組み換えタンパク質ま
たはバイオナノ粒子を調製する方法を提供する。
【００４９】
ある態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドまたはバイオナノ粒子を
含むワクチンに関する。好ましくは、本ワクチンは、医薬的に許容可能な担体または適切
な希釈剤中で本発明の組み換えポリペプチドまたはバイオナノ粒子を含む。
【００５０】
ある態様において、本発明は、本発明の組み換えタンパク質、バイオナノ粒子またはワ
クチンを対象に投与することを含む、デングウイルスを処置または予防する方法を提供す
る。ある実施形態において、デングウイルスは、血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、Ｄ
ＥＮＶ−３またはＤＥＮＶ−４である。
【００５１】
図１Ａで示されるような可動性グリシルリンカーを通じて一緒に連結された全４種類の
ＥＤＩＩＩを含有するように設計された、四価ＥＤＩＩＩに基づく分子、ＥＤＩＩＩ−Ｔ
が開発された。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＥＤＩ
ＩＩ−Ｔを発現させ、精製し、マウスにおいて免疫原性であることが分かった。ＥＤＩＩ
Ｉ−Ｔ分子の構築は、インド国特許第２６１７４９号明細書で提供される。
【００５２】
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が外来エピトープの提示および表示のため
のプラットフォームとなる能力は、国際公開第９３／１０１５２号パンフレットで、マラ
リアワクチン候補ＲＴＳ，Ｓの成功によりよく例証される。
【００５３】
本発明は、ＨＢｓＡｇが、ＥＤＩＩＩ−Ｔの免疫原性を向上させるために働き得るか否
かの可能性を探る。したがって、図１Ａで示されるように、ＨＢｓＡｇとの融合において
、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の
発現カセットの基礎環境で、ＥＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした。このＥＤＩＩＩ−Ｔお
よびＨＢｓＡｇの構造は「ＤＳＶ４」と呼ばれ、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ上でマラリアエピト
ープを提示する、国際公開第９３１０１５２号パンフレットのＲＴＳ，Ｓのものと同等で
ある。
【００５４】
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において電気穿孔法により組み換えプラスミ
ドを送り込み、クローンのメタノール誘導により、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨ
ＢｓＡｇタンパク質の同時発現についてコロニーをスクリーニングした。図１Ｂで示され
るようにこの２種類のタンパク質を同時発現する陽性クローンのうち１個をさらなる実験
のために選択した。誘導バイオマスを溶解させ、膜に結合するタンパク質を抽出し、３０
０ｋＤａ膜を通じた透析に供した。この段階は、２つの同時発現タンパク質が集合してＤ
ＳＶ４  ＶＬＰになることを考慮して、大きいサイズのタンパク質の濃縮を可能にするよ
うに設計した。図１Ｃで示されるように高純度でフェニル６００Ｍ樹脂を通じて残余分を
精製した。
【００５５】
図２Ａで示されるようなゲルろ過、図２Ｂで示されるようなＣｓＣｌ超遠心および図２
Ｃで示されるような電子顕微鏡を通じて、同時発現タンパク質が集合してＶＬＰになる能
力を評価した。ＤＳＶ４のタンパク質構成要素の両方が図２Ａで示されるようにゲルろ過
中にボイド容量中で一緒に溶出され、図２Ｂで示されるようにＣｓＣｌ超遠心中に共遊走
したことが観察された。電子顕微鏡下で可視化した場合、これらは、図２Ｃで示されるよ
うに、集合して２５〜３５ｎｍのＶＬＰとなることが観察された。
【００５６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ方式において特徴がよく分かっているｍＡｂによる重大な意味
があるＥＤＩＩＩエピトープの認識を通じて、ＤＳＶ４  ＶＬＰにおける全４種類のＤＥ
ＮＶのＥＤＩＩＩの立体構造的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒ
ｉｔｙ）を評価した。
【００５７】
図３で示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの免疫付与によって、これらのＶＬＰが
この４種類のＤＥＮＶ血清型に対して強い免疫反応を開始させる可能性を評価した。第０
、３０および９０日に６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群において腹腔内に精製ＤＳＶ４  Ｖ
ＬＰで免疫付与を行った（ＰＢＳ中アルハイドロゲル／１００μＬとして２０μｇ／５０
０μｇ  Ａｌ）。第１００日に終了時血液（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄ）を採取し、
ＥＬＩＳＡによってＤＳＶ４に対する反応について分析した。陽性反応者からの血清をプ
ールし、全てのその５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩ
ＩＩ−３、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇに対する抗体の反応について特性評価した（
図３Ｂ）。これらの全てに対して強い免疫反応が生じたことが観察された。抗デング反応
が４つのＤＥＮＶを中和可能であったか否かを判定することは必須であった。したがって
、ＦＡＣＳに基づくアッセイを通じて、プールした血清をその中和能について評価し、実
際にＤＳＶ４−抗血清は、全４種類のＤＥＮＶを中和可能であったことが観察された（図
３Ｃ）。図３Ａは、ＤＳＶ４の設計および対応するＥＤＩＩＩａａ配列が得られた株を図
示する。図３Ｃは、（指定される株の）４種類のＤＥＮＶおよびＤＥＮＶ−３の２つのさ
らなる遺伝子型の株に対するＤＳＶ４−抗血清の中和力価を説明する。中和アッセイで使
用されるＤＥＮＶ−２、−３および−４遺伝子型は、ＥＤＩＩＩ配列が得られた遺伝子型
とは異なり、これがＤＳＶ４抗血清の中和の可能性に悪影響を与えなかったことが明らか
であり、このことから、生じた免疫反応の強度が高いことが示される。さらに、様々な遺
伝子型に対する全体的な反応も均衡がとれていると思われ、図３Ｄで示されるように有望
なデングワクチンとしてＤＳＶ４が候補に上がる。ＤＳＶ４は、評価される様々なアジュ
バントを用いて同等な程度まで有効であると思われる（図３Ｄ）。
【００５８】
本発明を次の実施例に関して説明するが、これらの実施例は、本発明を単に説明し、明
らかにするために含まれる。これらの具体例は、何ら、本発明の範囲を制限するものとし
て解釈されるべきものではない。
【００５９】
［実施例１］：組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の構築
図１Ａで示されるように、ＨＢｓＡｇとの融合において、およびＰ．パストリス（Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセットの基礎環境で、Ｅ
ＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした。このＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇの構造は「ＤＳ
Ｖ４」と称するＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において電気穿孔法により組み
換えプラスミドを送り込み、クローンのメタノール誘導により、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓ
ＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の同時発現についてコロニーをスクリーニングした。
【００６０】
［実施例２］：デング四価ワクチン候補−ＤＳＶ４の特性評価
図１Ｂで示されるようにこの２種類のタンパク質を同時発現する陽性クローンのうち１
個をさらなる実験のために選択した。誘導バイオマスを溶解させ、膜に結合するタンパク
質を抽出し、３００ｋＤａ膜を通じた透析に供した。この段階は、２つの同時発現タンパ
ク質が集合してＤＳＶ４  ＶＬＰになることを考慮して、大きいサイズのタンパク質の濃
縮を可能にするように設計した。図１Ｃで示されるように高純度でフェニル６００Ｍ樹脂
を通じて残余分を精製した。
【００６１】
［実施例３］：ＶＬＰの同定および特性評価
図２Ａで示されるようなゲルろ過、図２Ｂで示されるようなＣｓＣｌ超遠心および図２
Ｃで示されるような電子顕微鏡を通じて、同時発現タンパク質が集合してＶＬＰになる能
力を評価した。ＤＳＶ４のタンパク質構成要素の両方が図２Ａで示されるようにゲルろ過
中にボイド容量中で一緒に溶出され、図２Ｂで示されるようにＣｓＣｌ超遠心中に共遊走
したことが観察された。電子顕微鏡下で可視化した場合、これらは、図２Ｃで示されるよ
うに、集合して２５〜３５ｎｍのＶＬＰとなることが観察された。
【００６２】
［実施例４］：ｍＡｂによるＤＳＶ４  ＶＬＰにおける全４種類のＤＥＮＶの立体構造
的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の評価
サンドイッチＥＬＩＳＡ方式において、特徴がよく分かっているｍＡｂによる重大な意
味があるＥＤＩＩＩエピトープの認識を通じて、ＤＳＶ４  ＶＬＰにおける全４種類のＤ
ＥＮＶのＥＤＩＩＩの立体構造的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇ
ｒｉｔｙ）を評価した。デング特異的なｍＡｂでマイクロタイターウェルをコーティング
し、ＤＳＶ４  ＶＬＰを添加した。ペルオキシダーゼ標識抗ＨＢｓＡｇヘプノスティカ（
Ｈｅｐｎｏｓｔｉｋａ）を通じて、結合したＶＬＰが明らかになった。これらのｍＡｂの
殆どは、強い中和免疫反応を生じさせるのに必須であると考えられる、ＥＤＩＩＩのＡ鎖
および外側隆線領域（ｌａｔｅｒａｌ  ｒｉｄｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）に対するものであっ
た。２１種類のデング熱ｍＡｂ（ＥＤＩＩＩおよび非ＥＤＩＩＩ特異的なｍＡｂ）による
ＤＳＶ４のＥＬＩＳＡ反応性を表１で説明し、この結果から、全４種類のＤＥＮＶのＥＤ
ＩＩＩエピトープがＤＳＶ４  ＶＬＰにおいてインタクトであることが示される。
【表１】
2020162611.tif 000002
【００６３】
［実施例５］：精製ＤＳＶ４  ＶＬＰによるマウスの免疫付与
図３で示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの免疫付与によって、これらのＶＬＰが
この４種類のＤＥＮＶ血清型に対して強い免疫反応を開始させる可能性を評価した。第０
、３０および９０日に６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群において腹腔内に精製ＤＳＶ４ＶＬ
Ｐで免疫付与を行った（ＰＢＳ中アルハイドロゲル／１００μＬとして２０μｇ／５００
μｇ  Ａｌ）。第１００日に終了時血液（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄ）を採取し、Ｅ
ＬＩＳＡによってＤＳＶ４に対する反応について分析した。陽性反応者からの血清をプー
ルし、図３Ｂで示されるように、全てのその５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、
ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇに対する抗体の存在
について特性評価し、図３Ｄで示されるように、様々なアジュバントとともに生じたＤＳ
Ｖ４抗血清のさらなる遺伝子型中和幅を決定した。
【００６４】
免疫反応
これらの５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３
、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇの全てに対して強い免疫反応が生じたことが観察され
た。抗デング反応が４つのＤＥＮＶを中和可能であったか否かを判定することは必須であ
った。したがって、ＦＡＣＳに基づくアッセイを通じてその中和能についてプールした血
清を評価し、実際にＤＳＶ４抗血清は、４種類のＷＨＯ参考株ＤＥＮＶおよびＤＥＮＶ−
３の２つのさらなる遺伝子型の株に対してＤＳＶ４−抗血清の中和力価を説明する図３Ｃ
で示されるように、全４種類のＤＥＮＶを中和可能であったことが観察された。中和アッ
セイで使用されるＤＥＮＶ−２、−３および−４遺伝子型は、ＥＤＩＩＩ配列が得られた
遺伝子型とは異なり、これがＤＳＶ４抗血清の中和の可能性に悪影響を与えなかったこと
が明らかであり、このことから、生じた免疫反応の強度が高いことが示される。さらに、
様々な血清型に対する全体的な反応も均衡がとれていると思われ、有望なデングワクチン
としてＤＳＶ４が候補に挙がる。以下の表２は、血清型特異的な中和Ａｂを誘発するＥＤ
ＩＩＩ−３−ＭＢＰにおけるＦＮＴ枯渇後（ｐｏｓｔ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を説明する
。
【表２】
2020162611.tif 000003
【００６５】
本発明はまた、次の具体的な態様も含む：
態様１．四価ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を
含む組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。
【００６６】
態様２．ＤＳＶ４と呼ばれる組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。
【００６７】
態様３．四価ＥＤＩＩＩ分子がＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥ
ＮＶ−４のＥＤＩＩＩを含む、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ
４。
【００６８】
態様４．ＤＳＶ４が、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４
に対してＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を生じさせる、本発明の態様２に記載されるよ
うな組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。
【００６９】
態様５．請求項１に記載のような組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の作
製のための過程は、次の段階を含む：
ｉ）ＨＢｓＡｇの４個の発現カセットを保有する組み換えコンストラクト中でのＨＢｓ
Ａｇとの融合におけるＥＤＩＩＩ−Ｔのクローニング、
ｉｉ）ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇを同時発現するクローンを得るた
めの、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞への組み換えプラス
ミドの電気穿孔法。
【００７０】
ｉｉｉ）ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の同時発現に対する
スクリーニング、
ｉｖ）銀染色およびウエスタンブロッティングによりＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよ
びＨＢｓＡｇタンパク質の発現を分析すること、
ｖ）誘導されるバイオマスの溶解、
ｖｉ）膜に結合するタンパク質の抽出および透析に供すること、
ｖｉｉ）ＤＳＶ４の精製。
【００７１】
態様６．段階（ｉｉｉ）のスクリーニングがクローンのメタノール誘導により行われる
、態様５に記載のような過程。
【００７２】
態様７．態様１に記載のような組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補を含む
、デングサブユニットワクチン。
【００７３】
態様８．デングウイルスのＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ
−４血清型に対して活性がある、態様７に記載のようなデングサブユニットワクチン。
【００７４】
態様９．腹腔内にまたは筋肉内に投与され得る、態様８に記載のようなデングサブユニ
ットワクチン。
【００７５】
態様１０．四価ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
を含むデングサブユニットワクチン候補としての使用のための組み換えＶＬＰに基づくデ
ング四価ワクチン候補。
【００７６】
本発明は更に次の具体的な態様も含む：
態様１．
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む、組み換えポリペプチド。
【００７７】
態様２．
ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えタンパク質をコードする、核酸配列。
【００７８】
態様３．
態様２に記載の核酸を用いて形質転換または遺伝子移入され、ＨＢｓＡｇを発現する、宿主細胞。
【００７９】
態様４．
態様１に記載の組み換えポリペプチドを含む、バイオナノ粒子。
【００８０】
態様５．
適切な条件下で態様４に記載の宿主細胞を培養する段階と、発現される組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収する段階とを含む、態様１に記載の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子を作製する方法。
【００８１】
態様６．
態様１に記載の組み換えポリペプチドを含む、ワクチン。
【００８２】
態様７．
態様４に記載のバイオナノ粒子を含む、ワクチン。
【００８３】
態様８．
態様１に記載の組み換えポリペプチド、態様４に記載のバイオナノ粒子または態様６もしくは態様７に記載のワクチンを対象に投与する段階を含む、デングウイルスを処置または予防する方法。
【００８４】
態様９．
デングウイルスを処置または予防することにおける使用のための、態様１に記載の組み換えポリペプチド、態様４に記載のバイオナノ粒子または態様６もしくは態様７に記載のワクチン。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図４（ｄ）】
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【図４（ｅ）】
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【図４（ｆ）−１】
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【図４（ｆ）−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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