(57)【要約】      （修正有）【課題】あらかじめ変性剤で生体試料中の糖タンパク質を処理することなく、糖タンパク質の糖鎖と特異的に反応する抗体等の選択的結合性物質を作成する方法、当該方法で作成された選択的結合性物質、および当該選択的結合性物質を用いて糖タンパク質を特異的に検出する方法の提供。【解決手段】糖タンパク質を抗原として用いる際の糖タンパク質の処理方法であって、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって糖鎖を切断することを含む、糖タンパク質の処理方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質を抗原として用いる際の糖タンパク質の処理方法であって、
糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって糖鎖を切断することを含む、
糖タンパク質の処理方法。
【請求項２】
前記糖鎖を切断する工程が、
当該切断によって糖鎖に内在しているエピトープを選択的結合性物質によって認識可能な状態にするものである、
請求項１に記載の糖タンパク質の処理方法。
【請求項３】
前記糖鎖特異的な糖鎖切断酵素が、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ３から選択される、請求項１または２に記載の糖タンパク質の処理方法。
【請求項４】
前記糖タンパク質がＡＦＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法を使用する、選択的結合性物質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法を使用する、生体試料中の糖タンパク質の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法で処理された糖タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原の処理方法により処理された糖タンパク質に結合し、当該処理を受けていない同一の糖タンパク質に結合しない選択的結合性物質。
【請求項９】
抗体または抗体の抗原結合フラグメントである、請求項８に記載の選択的結合性物質。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原の処理方法により処理された糖タンパク質を抗原として用いることを含む、請求項８または９に記載の選択的結合性物質の製造方法。
【請求項１１】
化学合成あるいは遺伝子組み換え技術により得られた糖タンパク質を抗原として用いることを含む、ものである、請求項８または９に記載の選択的結合性物質の製造方法。
【請求項１２】
糖タンパク質の検出方法であって、
該糖タンパク質を含む可能性のある試料を糖鎖切断酵素によって処理する工程、
前記糖鎖切断酵素によって処理された糖タンパク質に、請求項８に記載の選択的結合性物質を作用させて、該糖タンパク質と該選択的結合性物質との反応物を得る工程、及び、
前記反応物を検出する工程
を含む、前記糖タンパク質の検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、糖タンパク質を、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理する工程と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程を、同時に行う前記方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法に使用するための試薬キットであって、糖タンパク質を、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理するための試薬と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得るための試薬を、同一の組成物に含有する、前記試薬キット。
【請求項１５】
生体内に存在しないか存在しても極めて稀な糖鎖構造を有する抗原を用いた抗体の製造方法。
【請求項１６】
前記抗原が、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理された糖タンパク質である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、化学合成あるいは遺伝子組み換え技術により得られたものである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体等の選択的結合性物質を製造するために用いる抗原の処理方法、当該処理された抗原を用いて抗体等の選択的結合性物質を製造する方法、当該方法で製造された抗体等の選択的結合性物質、当該抗体等の選択的結合性物質を用いた糖タンパク質の検出方法、およびこれらの方法に用いるためのキットに関連する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は様々な構成の糖鎖を有しており、これら個々の糖鎖を認識する抗体を利用することができれば、生体の状態等に関して様々な情報を得ることが可能である。
【０００３】
一方、糖タンパク質の糖鎖特異的な抗体を取得することは困難であることが知られており、これは、抗体産生宿主動物に存在する類似の糖鎖が原因の一つであると考えられている。この困難を克服するために様々な努力がなされている。例えば、特許文献１は、糖ペプチドのフコース部分とペプチド部分の両方から構成される抗原を用いて、これらをエピトープとする抗体を作成する方法が開示されている。
【０００４】
しかしながら、当該方法で作成された抗体によって生体試料における糖タンパク質を検出するためには、あらかじめＳＤＳなどの変性剤にて生体試料を処理し、糖タンパク質を変性させる必要があり、当該方法は実用的とは言えなかった。
【０００５】
また、特許文献２には、糖タンパク質をタンパク質分解酵素で処理することにより、糖タンパク質と糖結合化合物との反応による反応物の検出レベルを増大させる方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、当該方法では、タンパク質分解酵素の活性は糖鎖構造非特異的であるため、特定の糖鎖を有する糖タンパク質を特異的に検出することはできない。
【０００７】
したがって、あらかじめ変性剤で生体試料を処理することなく、糖タンパク質の糖鎖と特異的に反応する抗体を作成する汎用的な方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１７−２１４３４８
【特許文献２】国際公開２０１７／１３１０２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、あらかじめ変性剤で生体試料を処理することなく、糖タンパク質の糖鎖と特異的に反応する抗体等の選択的結合性物質を作成する方法、当該方法で作成された抗体等の選択的結合性物質、および当該抗体等の選択的結合性物質を用いて糖タンパク質を特異的に検出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、緩和な条件下で糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって糖タンパク質を処理することにより、糖タンパク質の糖鎖と特異的に反応する抗体を作成し得ることを見出し、本発明を完成した。
理論に縛られるわけではないが、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理された糖鎖は、動物生体内で極めて稀な糖鎖構造、例えばフコシル化糖ペプチド構造を生み出すため、抗体産生動物内での抗体産生が妨げられない点が理由として考えられる。
【００１１】
すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する。
[項目１]
糖タンパク質を抗原として用いる際の糖タンパク質の処理方法であって、
糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって糖鎖を切断することを含む、
糖タンパク質の処理方法。
[項目２]
前記糖鎖を切断する工程が、
当該切断によって糖鎖に内在しているエピトープを選択的結合性物質によって認識可能な状態にするものである、
項目１に記載の糖タンパク質の処理方法。
[項目３]
前記糖鎖特異的な糖鎖切断酵素が、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ３から選択される、項目１または２に記載の糖タンパク質の処理方法。
[項目４]
前記糖タンパク質がＡＦＰである、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗原の処理方法。
[項目５]
項目１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法を使用する、選択的結合性物質の製造方法。
[項目６]
項目１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法を使用する、生体試料中の糖タンパク質の検出方法。
[項目７]
項目１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の処理方法で処理された糖タンパク質。
[項目８]
項目１〜４のいずれか一項に記載の抗原の処理方法により処理された糖タンパク質に結合し、当該処理を受けていない同一の糖タンパク質に結合しない選択的結合性物質。
[項目９]
抗体または抗体の抗原結合フラグメントである、項目８に記載の選択的結合性物質。
[項目１０]
項目１〜４のいずれか一項に記載の抗原の処理方法により処理された糖タンパク質を抗原として用いることを含む、項目８または９に記載の選択的結合性物質の製造方法。
[項目１１]
化学合成あるいは遺伝子組み換え技術により得られた糖タンパク質を抗原として用いることを含む、ものである、項目８または９に記載の選択的結合性物質の製造方法。
[項目１２]
糖タンパク質の検出方法であって、
該糖タンパク質を含む可能性のある試料を糖鎖切断酵素によって処理する工程、
前記糖鎖切断酵素によって処理された糖タンパク質に、項目８に記載の選択的結合性物質を作用させて、該糖タンパク質と該選択的結合性物質との反応物を得る工程、及び、
前記反応物を検出する工程
を含む、前記糖タンパク質の検出方法。
[項目１３]
項目１２に記載の方法であって、糖タンパク質を、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理する工程と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程を、同時に行う前記方法。
[項目１４]
項目１２または１３に記載の方法に使用するための試薬キットであって、糖タンパク質を、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理するための試薬と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得るための試薬を、同一の組成物に含有する、前記試薬キット。
[項目１５]
生体内に存在しないか存在しても極めて稀な糖鎖構造を有する抗原を用いた抗体の製造方法。
[項目１６]
前記抗原が、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理された糖タンパク質である項目１５に記載の方法。
[項目１７]
前記抗原が、化学合成あるいは遺伝子組み換え技術により得られたものである、項目１５に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の糖タンパク質の処理方法を利用することにより、試料中の糖タンパク質を変性させることなく、緩和な条件の処理のみで糖タンパク質を検出する抗体等の選択的結合性物質を作成することが可能となった。
さらに、本発明の方法で作成された抗体等の選択的結合性物質を用いた糖タンパク質の検出方法は、生体試料を変性させることなく適用可能であるため、変性条件下では利用不可能な他の検査と組み合せて使用可能であり、生体試料についてより詳細な情報を得ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素で糖タンパク質を処理することにより、抗体を産生する方法の概略を示す図である。
【図２】図２は、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素で糖タンパク質を処理することにより、糖鎖が切断されたことを示す図である。
【図３】図３は、糖ペプチドの模式図を示す図である。
【図４】図４は、ＡＦＰをＥｎｄｏ−Ｆ２又はＥｎｄｏ−Ｆ３で処理した結果を示す図である。いずれの酵素も、ＡＦＰの糖鎖を消化可能であることを示している。
【図５】図５は、２糖ペプチドをタンパク質と架橋した免疫原を使用した場合の、免疫動物の抗血清を用いた抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。免疫動物の抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度の２糖ペプチドに対する抗体が含まれていることを示している。
【図６】図６は、抗ＡＦＰ抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いた抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。２糖ペプチドを免疫した動物からは、２糖ペプチドに反応し単糖ペプチドに反応しない抗体産生株が複数確認することができたことを示している。
【図７】図７は、ＨｅｐＧ２の培養上清から精製したＡＦＰを、Ｅｎｄｏ−Ｆ３で処理し、酵素を除去したものも免疫原とした場合の、免疫動物の抗血清を用いた抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。免疫動物の抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度の２糖ペプチドに対する抗体が含まれていることを示している。
【図８】図８は、抗ＡＦＰ抗体産生ハイブリドーマに対する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。２糖ペプチドを免疫した動物からは２糖ペプチドに反応し、単糖ペプチドに反応しない抗体産生株が複数確認することができたことを示している。
【図９】図９は、モノクローナル抗体の特異性分析の結果を示す図である。Ｓ２０２０５Ｒ抗体またはＳ２０２０６Ｒ抗体は酵素処理によって生じる糖分解ＡＦＰのみを認識することを示している。
【図１０】図１０は、Ｅｎｄｏ−Ｆ３またはＰＮＧａｓｅＦによるＡＦＰの処理結果を示す図である。いずれの酵素によってもＡＦＰが消化されたことを示している。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体の特異性分析の結果を示す図である。Ｓ２０２０５Ｒ抗体、Ｓ２０２０６Ｒ抗体は、Ｅｎｄｏ−Ｆ３によって生じる糖鎖を認識部位の一部として含むことを示している。
【図１２ａ】図１２ａは、本発明の抗体を用いた既存抗体とのサンドウィッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。Ｓ２０２０５Ｒ抗体を用いた場合、酵素処理したＡＦＰに対して濃度依存的に吸光度が上昇したことを示している。
【図１２ｂ】図１２ｂは、本発明の抗体を用いた既存抗体とのサンドウィッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。標識した検出抗体としてＳ２０２０６Ｒ抗体を用いた場合、酵素処理したＡＦＰに対して濃度依存的に吸光度が上昇したことを示している。
【図１３ａ】図１３ａは、各酵素処理物に対する反応性分析の結果を示す図である。ＥＬＩＳＡ分析における標識化した検出抗体として既存抗ＡＦＰ抗体を用いた場合、酵素処理の有無に関わらず、ＡＦＰ濃度依存的に吸光度が増大したことを示している。
【図１３ｂ】図１３ｂは、各酵素処理物に対する反応性分析の結果を示す図である。Ｓ２０２０６Ｒ抗体を用いた場合、Ｅｎｄｏ−Ｆ２及びＥｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰのみ、濃度依存的に吸光度が増大したことを示している。
【図１４】図１４は、血清中酵素処理の結果を示す図である。血清中においてもＡＦＰに対してＥｎｄｏ−Ｆ３が作用し、本発明の抗体によって酵素処理されたＡＦＰが検出可能であることを示している。
【図１５】図１５は、酵素処理のｐＨ条件検討の結果を示す図である。本発明に用いる酵素はｐＨによらず使用できることを示している。
【図１６】図１６は、オンプレート酵素処理の結果を示す図である。抗原抗体反応と抗原酵素反応は同時に行うことができることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】
（定義）
特に指示がない場合、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解される意味を有する。
【００１６】
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
【００１７】
本明細書において、「糖タンパク質」とは、ポリペプチド鎖に共有結合的に付着された１つ以上の炭水化物基を含むタンパク質のことを意味する。例えば、糖タンパク質は、不定の組成の多くの比較的短い分枝状のオリゴ糖鎖の形態の１重量％〜６０重量％の炭水化物を含む。
【００１８】
ほとんどの天然ペプチドおよびタンパク質は、主要なペプチドまたはタンパク質鎖の長さに沿った選ばれた数のアミノ酸への特異的な結合を介してペプチドまたはタンパク質に結合した炭水化物部分を含有している。任意のペプチドまたはタンパク質上のグリコシル化パターンの変異性が、そのペプチドまたはタンパク質の機能に影響を及ぼし得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質上のＮ結合型グリカンの構造が、細胞または生物中のペプチドまたはタンパク質のプロテアーゼ感受性、細胞内輸送、分泌、組織標的化、生物学的半減期および抗原性を含む、ペプチドまたはタンパク質の種々の特性に影響を及ぼし得る。
【００１９】
これらの特性の１つまたは複数の変化は、その自然環境でのペプチドまたはタンパク質の有効性に影響を及ぼし得る。
【００２０】
また、例えば、５９０アミノ酸からなるペプチドを有する糖タンパク質ＡＦＰは、異なる糖鎖構造を有するＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３と呼ばれる状態で生体内に存在することが知られている。このうち、ＡＦＰ−Ｌ３のみが、肝癌特異的に存在することが知られている。
【００２１】
したがって、ＡＦＰ−Ｌ３の糖鎖を特異的に検出する抗体を用いることにより、生体内の肝癌の有無を検査することができる。
【００２２】
本明細書において、特定の生体内分子が「生体内に存在しないか存在しても極めて稀である」とは、通常の状態の生体内に存在する当該生体分子の分子量または重量が通常の検出手段により検出できないか、あるいは、類似の生体分子に比して少ないことを意味する。通常の状態の生体とは、例えば、特定の疾患、障害等を有しない安静状態の生体を意味し、少ないとは、例えば、当該生体内分子の分子量または重量が、類似の生体分子に比して１／１００、１／１０００または１／１００００以下であることを意味する。例えば、糖タンパク質について用いる場合、「生体内に存在しないか存在しても極めて稀である」とは、例えば、同一のタンパク質を構成に含み、異なる糖鎖構造を有する糖タンパク質と比して、生体内の存在量が少ないことを意味する。例えば、６糖、４糖あるいは２糖の糖タンパク質（例：２糖のフコシル化糖ペプチド）は生体内では極めて稀である。
【００２３】
本明細書において、「検出する」又は「検出」とは、標的分子の定性的及び定量的な双方の測定を含めた広い意味で使用される。検出は直接的及び間接的な検出を含み、検出する任意の手段を含む。
【００２４】
一つの態様において、本発明の抗体は、生体試料中の糖タンパク質の存在を検出する方法に利用される。特定の実施態様では、本発明の抗体と糖タンパク質の結合を許容する条件下で、本発明の抗体と生体試料を接触させ、当該抗体と糖タンパク質との間に複合体が形成されるかどうかを検出する工程を含む。このような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。１つの実施態様では、本発明の抗体を使用して、患者の状態を表すバイオマーカーを検出する。
【００２５】
本明細書において、抗体等の選択的結合性物質とある化合物が「反応する」、「反応性を示す」、「反応性を有する」、「結合する」、あるいは抗体等の選択的結合性物質がある化合物を「認識する」と表現する場合、本発明の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体等の選択的結合性物質とある化合物とが「反応する」か否かの確認は、当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
【００２６】
本明細書において、本発明の抗体等の選択的結合性物質と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体等の選択的結合性物質とある化合物とが実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、当該化合物の添加によって、抗体等の選択的結合性物質と固相化抗原の結合が実質的に影響を受けないことを意味する。上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できる。
【００２７】
本明細書において、抗体等の選択的結合性物質が「特異的に反応する」こと、または抗体等の選択的結合性物質の「特異性」は、抗体等の選択的結合性物質が検出可能に抗原上に提示されたエピトープに反応する能力であって、一方でその他の抗原との検出可能な反応性が比較的小さいか実質的に反応性が検出されないことをいう。例えば、抗体等の選択的結合性物質が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、当該抗体等の選択的結合性物質は当該抗原に反応する一方、他の抗原には反応しない。好ましい態様において、抗体等の選択的結合性物質が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、例えば抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において固定化された当該抗原と当該抗体等の選択的結合性物質の相互作用が遊離の当該抗原によって阻害される一方で、他の遊離抗原によっては阻害されない。
【００２８】
本明細書において、選択的結合性物質と抗原の「反応物」とは、選択的結合性物質と抗原が特異的に反応した結果生じる物質であって、通常の検出方法で検出され得る物質を意味する。
【００２９】
本明細書において、「選択的結合性物質」または「抗原結合性物質」とは、特定の物質に特異的に結合する天然または非天然の物質を意味し、これらは抗体と同様の用途において用いることができる。たとえば、「選択的結合性物質」には、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等のアプタマー、レクチン、受容体、これらの改変物、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００３０】
本明細書において、「抗原」とは、抗体等の選択的結合性物質による結合を受けることが可能な分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを持つことができ、それぞれ異なる選択的結合性物質、例えば、抗体と相互作用することができる。「抗原」は、抗体等の選択的結合性物質の製造に用いるほか、糖タンパク質の測定時に標準品としても用いることができる。
【００３１】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原の一領域であり、その抗原を標的とする選択的結合性物質がそこに結合する領域を意味する。
【００３２】
本明細書において、「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で相互に連結された２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は、重鎖の変更可能領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）を含む。各軽鎖は、軽鎖の変更可能領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖の定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超変異性の領域に分割され、フレームワーク（ＦＲ）と命名される多く保存できる領域に散在され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミン末端からカルボキシ末端に次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の変更可能領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。用語「抗体」は、また、抗体の全ての遺伝子組替え体、例えば、原核生物で発現する抗体、グリコシル化されていない抗体を含む。
【００３３】
また、Ｐａｄｌａｎ（１９９５  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３−１３９）、Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０：４１５−４２８に示されるように、実際にはＣＤＲ残基の一部のみが抗原に接触することが知られており、抗原に接触しないＣＤＲ残基は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、または経験的に特定できる。ＣＤＲ又はその一つ又は複数の残基が除去される場合、それは、普通は、別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサスにおいて対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ及びアミノ酸内で置換する位置は、また、経験的に選択できる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であってもよい。
【００３４】
本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの非限定的な例は：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインより成る１価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインより成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインより成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインより成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：  ５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）合成リンカーで、場合により、結合されてもよい２つ又はそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；を含む。また、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られるように、遺伝子組み換え法を用いて、合成リンカーによりＶＬ及びＶＨ領域を対に形成する単一タンパク質鎖として作ることもできる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：  ４２３−４２６；  ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ５８７９−５８８３）。また、「抗原結合フラグメント」は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド；（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域；を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られる。
【００３５】
本発明に使用可能な抗体又はその抗原結合フラグメントは、鳥、哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。好ましくは、抗体又はフラグメントは、ヒト、チンパンジ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源である。本発明の抗体は、ある種から誘導された抗体の定常領域が、他種から誘導された抗原結合サイトと組み合わされたキメラ分子を含む。更に、本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウス起源）から誘導された抗体の抗原結合サイトと、ヒト起源の定常領域とフレームワーク領域を組合せたヒト化分子を含む。
【００３６】
本発明の抗体は、当該抗体を発現するハイブリドーマ、または、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。
【００３７】
また、本発明の抗体は、遺伝子組み換え技術を用いて遺伝子導入された非ヒト動物又は植物において製造することができる。一つの態様において、所望の抗体を産生するハイブリドーマの遺伝子を解析することにより、当該抗体と同一の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体を、遺伝子組み換え技術を用いることで、他のホスト細胞から発現させることができる。
【００３８】
本発明における抗体として、例えばハイブリドーマＳ２０２０５ＲまたはＳ２０２０６Ｒが産生するモノクローナル抗体が好ましい。上記ハイブリドーマは下記のようにブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関の住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室（郵便番号２９２−０８１８）、寄託日：２０１９年３月２２日。
受領番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９２６（ハイブリドーマ  Ｓ２０２０５Ｒ）
受領番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９２７（ハイブリドーマ  Ｓ２０２０６Ｒ）
【００３９】
本発明において使用する糖鎖特異的な糖鎖切断酵素は、特に限定されず、生体内の糖タンパク質の糖鎖を切断する様々な公知の酵素を使用可能であり、複数の酵素を組み合わせて用いることもできる。一つの態様において、本発明の糖鎖特異的な糖鎖切断酵素またはその組み合わせは、処理の結果、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の長さの糖鎖を生成することが好ましい。
【００４０】
一態様において、このような糖鎖特異的な糖鎖切断酵素として、Ｎ−結合型糖鎖の基本骨格を構成するＮ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオース構造（ＧｌｃＮＡｃβ１，４  ＧｌｃＮＡｃ）を含む構造を選択的に認識し、タンパク質側にＮ−アセチルグルコサミン１残基（フコースが付加してもよい）を残して糖鎖を切断、遊離させる糖鎖切断酵素が好ましく、特に、糖タンパク質の糖鎖のコアフコース認識し、選択的にタンパク質側にコアフコースを含む２糖を有する糖鎖を残して糖鎖を切断する酵素を使用することが好ましい。
【００４１】
一態様において、このような糖鎖特異的な糖鎖切断酵素として、例えばエンドグリコシダーゼを使用することができる。特にエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）に属する酵素から選択して使用することが好ましい。酵素の選択は、当業者が通常行う範囲の酵素反応条件の検討によって可能である。酵素反応によって所望の糖鎖切断が行われたか否かは、汎用の分析方法によって確認することができ、例えば、酵素反応によって生じた物質を質量分析計等によって分析することにより確認することができる。
【００４２】
具体的な糖鎖特異的な糖鎖切断酵素の非限定的な例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のＥｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＥｎｄｏ−Ｄ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のＥｎｄｏ−Ｆ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ３といったエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを使用することができる。一態様において、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のＥｎｄｏ−Ｆ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ３を使用することが好ましく、Ｅｎｄｏ−Ｆ３を使用することがさらに好ましい。
【００４３】
糖鎖特異的な糖鎖切断酵素で試料中の糖タンパク質を処理する条件は、使用する酵素に応じて適宜変更可能であるが、例えば、５〜８または６〜７のｐＨにおいて、２５〜４０℃、２８〜３９℃、３０〜３７℃、３２℃〜３６℃、３３℃〜３５℃、または３４℃において、５〜６０分、７〜５０分、１０〜４０分、１５〜３０分の間、糖タンパク質と糖鎖特異的な糖鎖切断酵素を混合することで処理される。
【００４４】
本発明の糖鎖構造を有する糖タンパク質は、抗原として抗体等の選択的結合性物質の製造に用いるほか、糖タンパク質の測定時に標準品としても用いることができる。
【００４５】
（本発明の糖タンパク質の糖鎖構造と特異的に反応する抗体を作成する方法）
上記の方法により得られた、生体内に存在しないか存在しても極めて稀な糖鎖構造を有する本発明の糖タンパク質を抗原として用いることにより、当該糖鎖構造と特異的に反応する抗体を作成することができる。本発明の糖タンパク質の糖鎖と特異的に反応する抗体を作成する方法の概要を図１に示す。
【００４６】
具体的には、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素で糖タンパク質を処理することにより、生体内に存在しないか存在しても極めて稀な糖鎖構造を生み出し、当該構造を抗原として用いることで、抗体の作成を容易とする。当該抗原は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））などに記載される既知の方法により、マウス等の哺乳動物に免疫される。当該動物の脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、ミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製する。作成したハイブリドーマ細胞集団から、上記抗原に反応するものを単離し、モノクローナル抗体を取得することができる。
【００４７】
本発明の糖鎖構造を有する抗原を免疫原として用いる場合、上記糖鎖切断酵素による処理によって得られた抗原をそのまま用いてもよいし、当該抗原を汎用の担体に結合して用いてもよい。このような単体および抗原と単体の結合方法は当業者に周知であり、例えば、担体としてＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社７７６００）等のタンパク質を、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ社２２３２２）等のリンカーを用いて抗原に結合させることができる。
【００４８】
本発明の糖鎖構造を有する抗原としては、上記のように糖タンパク質を糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理する方法によって得られた抗原のほか、化学合成や遺伝子組み換え技術等公知の方法により得られた、本発明によって得られた抗原と同構造を持つ化合物を抗原として用いることもできる。また、エピトープ以外の部分に改変を加えたものを、抗原として用いることもできる。例えば、糖タンパク質を糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理する方法によって得られる糖タンパク質中に存在する、選択的結合性物質と結合する部位と同一のアミノ酸及び糖鎖配列を有する糖ペプチドを、抗原として用いることができる。これら抗原として用いることのできる糖ペプチドまたは化学合成や遺伝子組み換えにより得られた化合物は、抗体等の選択的結合性物質の製造に用いるほか、糖タンパク質の測定時に標準品としても用いることができる。
【００４９】
ハイブリドーマの作成は、当該分野で公知の方法に従って行うことができ、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
【００５０】
得られた抗体は、上記ハイブリドーマから直接産生する以外に、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞を調製し、当該ホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる
【００５１】
（その他の選択的結合性物質の製造方法）
本発明の糖タンパク質の処理方法によって得られた糖タンパク質は、抗体のほか、当該糖タンパク質を特異的に選択する他の選択的結合性物質、例えば、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等のアプタマー、レクチン、受容体、これらの改変物、およびこれらの組み合わせを製造するために用いることができる。この目的においても、糖タンパク質として、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素によって処理する方法によって得られたもののほか、化学合成や遺伝子組み換え技術等公知の方法により得られた同構造を持つ化合物、またはこれらの改変物を使用することができる。
【００５２】
ＤＮＡアプタマーおよびＲＮＡアプタマーといった核酸アプタマーについては、当業者の公知の方法、例えば、インビトロ選択または指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）の反復ラウンドなどを使用することにより、本発明の糖タンパク質の処理方法によって得られた糖タンパク質に特異的に結合するアプタマーを得ることができるが、これに限定されない。
【００５３】
ペプチドアプタマーについては、公知の方法、例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ２００９：１０９（５）：１９４８−１９９８に開示される方法等により、本発明の糖タンパク質の処理方法によって得られた糖タンパク質に特異的に結合するアプタマーを得ることができるが、これに限定されない。
【００５４】
レクチンを選択的結合性物質として用いる場合、使用するレクチンは植物、動物、酵母菌、細菌、原生動物などを含む任意の生物から得ることができる。レクチンはこれらの天然に存在する源から単離することができ、または当業者に周知の方法により組換え的に発現および精製することができる。また、精製された市販のレクチンを使用してもよい。フコースを有する糖鎖に特異的に結合する選択的結合性物質として、例えば、フコース特異的レクチン（Ｍａｎｓｏｕｒ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２１０：３３５−４８等参照）を使用してもよい。本発明の糖タンパク質の処理方法によって得られた糖タンパク質に特異的に結合するレクチンを取得するためには、本発明の糖タンパク質と特異的に結合するものを既に入手済みのレクチンからスクリーニングしてもよいし、遺伝子組換え技術を利用して、本発明の糖タンパク質と特異的に結合する改変レクチンをスクリーニングしてもよい。レクチンと同様の目的で、レクチン様ドメインを有するタンパク質（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ  Ｋ  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ９：５８５−９０等参照）を単離、使用することもできる。
【００５５】
受容体を選択的結合性物質として用いる場合、既知の糖タンパク結合受容体から、本発明の糖タンパク質と特異的に結合する受容体をスクリーニングしてもよいし、遺伝子組換え技術を利用して、本発明の糖タンパク質と特異的に結合する改変受容体をスクリーニングしてもよい。受容体と同様の目的で、受容体の一部を抗体のＦｃ領域等、他のタンパク質と結合した改変受容体を単離、使用することもできる。
【００５６】
（本発明の選択的結合性物質の用途）
本発明の方法により得られた抗体等の選択的結合性物質は、バイオマーカーなどとして機能する糖タンパク質を生体試料において検出するために使用することができる。
【００５７】
（試料中の糖タンパク質を特異的に検出する方法）
本発明による試料中の糖タンパク質を特異的に検出する方法を行う際には、糖タンパク質を含む可能性のある試料は糖鎖特異的な糖鎖切断酵素で処理され得る。当該糖鎖特異的な糖鎖切断酵素は、抗体等の選択的結合性物質を作成する際に用いた糖鎖特異的な糖鎖切断酵素と同じであってもよいし、異なっていてもよい。一態様において、同じ酵素または酵素の組み合わせを用いることが好ましい。
【００５８】
糖鎖切断酵素を用いる場合、上記糖タンパク質を含む可能性のある試料に、糖鎖特異的な糖鎖切断酵素を加えることで酵素処理を行ってもよく、あるいは、上記試料から糖タンパク質をある程度精製した後に、糖鎖切断酵素による酵素処理を行ってもよい。また、糖タンパク質について糖鎖切断酵素による酵素処理をする工程を行った後に、選択的結合性物質と糖タンパク質の反応物を得る工程を適用してもよく、また、糖タンパク質について糖鎖切断酵素による酵素処理する工程と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程を同時に行ってもよい。一態様において、糖タンパク質について糖鎖切断酵素による酵素処理する工程と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程同時に行うことが好ましい。糖タンパク質について糖鎖切断酵素による酵素処理する工程と、前記糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程を同時に行う場合には、選択的結合性物質として、糖鎖切断酵素による影響を受けない物質を選択することが好ましい。
【００５９】
選択的結合性物質と抗原が特異的に反応した反応物を検出する方法として、公知の方法を利用することができる。例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析法、免疫拡散法、免疫凝集測定法、免疫比濁法、粒子免疫測定法およびその他の技法をもちいることができるが、これらに限定されない（例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。一つの態様において、本発明の抗体等の選択的結合性物質は、不溶性担体上に固定された固定（固相）化物質や、標識物質で標識したされた標識化物質（例えば、検出抗体）として使用することができる。このような固定化選択的結合性物質や標識化選択的結合性物質はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体に本発明の選択的結合性物質を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化選択的結合性物質を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることがでる。その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子や磁性粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
【００６０】
標識化選択的結合性物質を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と選択的結合性物質との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができる。固定化選択的結合性物質や標識化選択的結合性物質の種類、及びそれらの製造方法は特に限定されることはなく、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰということがある）などの酵素を標識物質として用いることができる。この場合、当該酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰということがある）の場合には、例えば１，２−フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤということがある）あるいは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
【００６１】
本発明の選択的結合性物質を用いた検出に用いる試料は、特段限定されることなく、様々な試料を用いることができる。一態様において、血液、血漿、血清、尿、唾液等の液体生体試料、皮膚、糞、生検組織等の固体生体試料などの生体試料を用いることができる。
【００６２】
本発明の選択的結合性物質は、上記糖タンパク質の検出方法に用いるための測定試薬として提供され得る。当該試薬は、本発明の選択的結合性物質に加えて、当該検出方法の実施に必要な他の構成要素、例えば、緩衝液、保存剤等を含んでもよい。
【００６３】
一態様において、例えば本発明の選択的結合性物質が酵素を標識物質として含む場合には、その特異的基質を含む試薬と共に、キットの形態で提供されてもよい。
【００６４】
本発明の選択的結合性物質を利用した糖タンパク質の検出方法に用いるキットを提供する場合、糖鎖切断酵素による酵素処理を行うための試薬と、糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程に用いる試薬を別々の組成物として提供することもでき、また、糖鎖切断酵素による酵素処理を行うための試薬と、糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程に用いる試薬を、単一の組成物として提供してもよい。一態様において、糖鎖切断酵素による酵素処理を行うための試薬と、糖タンパク質と選択的結合性物質との反応物を得る工程に用いる試薬を、単一の組成物として提供することが好ましい。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
１．糖タンパク質ＡＦＰ−Ｌ３のＥｎｄｏ−Ｆ３による処理
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞の培養上清からアフィニティ精製した糖タンパク質ＡＦＰを下記条件で糖鎖切断酵素：Ｅｎｄｏ−Ｆ３（３８．８ｋＤａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）により処理した。前記精製ＡＦＰには、ＡＦＰ−Ｌ３が含まれている。
[材料および条件]
（１）ＡＦＰ：８μｇに対して、
（２）Ｅｎｄｏ−Ｆ３：１６Ｕ（０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）２０μＬ）を混合し、
処理（酵素反応）時間：１０分または３０分
処理（酵素反応）温度：３７℃
で酵素処理し、酵素処理したＡＦＰ液を得た。
前記酵素処理したＡＦＰ液とトリスＳＤＳサンプル処理液（コスモバイオ社製、４２３４２０）を等量加え、１０分間煮沸した。当該煮沸した試料をマルチゲル(登録商標）ＩＩミニ  ４／２０（１３Ｗ）（コスモバイオ社製、４１４８７９）により、３０ｍＡで７０分間電気泳動を行った後、ゲルを定法のＣＢＢ染色により染色した。
【００６７】
図２に、無処理、処理時間１０分、処理時間３０分の試料を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した結果を示す。無処理レーンにおいて５２ｋＤａから７６ｋＤａの間に検出されたバンドがＡＦＰに由来するバンドであり、レーン１及びレーン２において３８ｋＤａ近傍に検出されたバンドがＥｎｄｏ−Ｆ３に由来するバンドである。前記ＡＦＰに由来するバンドについて、無処理のバンド検出位置と比較し、処理時間１０分及び３０分のバンド検出位置は、分子量が低下する方向へシフトしたことが確認された。以上の結果より、上記処理により、ＡＦＰ―Ｌ３に結合したフコース含有糖鎖が切断されたことが示唆された。
【実施例２】
【００６８】
２．モノクローナル抗体の作成
上記切断された糖鎖を有するＡＦＰを抗原（免疫原）として、公知の方法でマウス又はラットに免疫し、当該マウス又はラットの脾臓より得たＢ細胞からハイブリドーマを作成する。
【００６９】
上記切断された糖鎖を有するＡＦＰを用いてハイブリドーマをスクリーニングし、切断された糖鎖を有するＡＦＰを特異的に検出するモノクローナル抗体を得る。
より詳細には以下の通り試験を行った。
【００７０】
[材料]
（１）フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４−０９５４１
（２）ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
（３）ＲＰＭＩ１６４０，  ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０−０３６
（４）Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ
（５）ＨＡＴ  培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
（６）９６穴プレート：ＮＵＮＣ，１６７００８
（７）ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，１０３１−０５及び３０５０−０５
（８）マルチゲル(登録商標）ＩＩミニ  ４／２０（１３Ｗ）：コスモバイオ社製、４１４８７９
（９）トリスＳＤＳサンプル処理液：コスモバイオ社製、４２３４２０
（１０）糖ペプチド：合成した二糖８ａ．ａ.、及び単糖８ａ．ａ．（配列は図３）
【００７１】
〔試験例１〕酵素処理の確認
１．試験方法
ＨｅｐＧ２の培養上清からアフィニティ精製したＡＦＰ２μＬ（５〜７μｇ）にＥｎｄｏ−Ｆ２（３９．８ｋＤ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を２μＬ（１６Ｕ）またはＥｎｄｏ−Ｆ３を２μＬ（２μｇ）加え、更に０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を１６μＬ加えた。それらの試料を３７℃で１０分間酵素反応させた後に、トリスＳＤＳサンプル処理液を等量加え、１０分間煮沸した。それらの試料を、マルチゲル(登録商標）ＩＩミニ４／２０（１３Ｗ）に１レーン１０μＬ添加し、３０ｍＡで７０分間電気泳動を行った。その後、ゲルを定法のＣＢＢ染色により染色した。
【００７２】
２．試験結果
結果を図４に示す。糖鎖切断酵素を加えていないＡＦＰと、糖鎖切断酵素であるＥｎｄｏ−Ｆ２及びＥｎｄｏ−Ｆ３を加えたＡＦＰでは、検出されるバンドのパターンが異なっており、酵素で処理したＡＦＰでは、特に低分子量側のバンドの濃度が濃くなっていた（図４）。これは、ＡＦＰに修飾された一部の糖鎖が糖鎖切断酵素によって消化切断され、分子量が小さくなっていることを示している。この結果は、糖鎖切断酵素の種類によらずＡＦＰの糖鎖を消化可能であることを示している。
【００７３】
〔試験例２〕モノクローナル抗体の製造方法−１
１．免疫原の調製
ＡＦＰを糖鎖切断酵素処理した際に生じるアミノ酸及び糖鎖配列を模した２糖ペプチドを、ＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社７７６００）等の種々のタンパク質と市販のリンカー試薬を用いて架橋し、免疫原溶液を調製した。
【００７４】
２．糖鎖切断酵素処理ＡＦＰに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）動物への免疫
前記免疫原溶液（０．２〜２ｍｇ／ｍＬ）とフロインド完全アジュバンドを等容量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌマウスまたはＦ３４４ラットに１匹あたり免疫原として１０〜４０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で３〜８回、当該エマルジョンの注射を繰り返した。尾部静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（２）１次スクリーニング（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
前記免疫した動物の抗血清中の糖鎖ペプチドに対する抗体の存在を、免疫原と同様の方法で作製した２糖ペプチドコンジュゲートを固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
【００７５】
（２−１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
２糖ペプチドと免疫原の調製に用いたタンパク質とは異なるタンパク質とのコンジュゲート液を１μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間静置した。
前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
【００７６】
（２−２）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで段階希釈した免疫動物の抗血清及び非免疫動物の血清５０μＬを前記各ウエルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）または５０００倍希釈したＨＲＰ標識ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の高かったマウス又はラットから、脾臓及びリンパ節を摘出して、脾臓及びリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
【００７７】
（２−３）試験結果
結果の一例としてマウスに免疫した場合を図５に示す。非免疫動物の血清と比較して免疫動物の抗血清は希釈倍率が低いほど、２糖の糖ペプチドを固相化して用いた場合のみ高い吸光度を示した。この測定系では、測定される吸光度は採血した動物の血清中に含まれる２糖ペプチドに対する抗体濃度に依存する（図５）。従って、前述の結果は、免疫動物の抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度の２糖ペプチドに対する抗体を含んでいるため抗体価が高い、ということを示している。
【００７８】
（３）細胞融合
前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で１対１の割合で混合し、電気パルス法により細胞融合した。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
【００７９】
（４）ハイブリドーマの選別  （抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
（４−１）方法
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、免疫動物の抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いたこと、固相化抗原として、２糖ペプチドコンジュゲートに加え、単糖ペプチド、酵素未処理のＡＦＰ及びＥｎｄｏ−Ｆ３処理したＡＦＰ、それぞれのコンジュゲートも用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、単糖ペプチドよりも２糖ペプチドに対する吸光度の高いウエルまたは酵素未処理のＡＦＰよりもＥｎｄｏ−Ｆ３処理したＡＦＰに対する吸光度の高いウエルを、抗２糖ペプチドまたは抗酵素処理ＡＦＰ抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択した。
【００８０】
（４−２）試験結果
結果の一例として２糖ペプチド又は単糖ペプチドを固相化した試験の場合を図６に示す。２糖ペプチドを免疫した動物からは２糖ペプチドに反応し、単糖ペプチドに反応しない抗体産生株を複数確認することができた（図６）。この結果は、２糖ペプチドを免疫原とすることで、酵素処理ＡＦＰの２糖の糖鎖修飾部位近傍領域への抗体産生ハイブリドーマを取得できることを示している。
【００８１】
〔試験例３〕モノクローナル抗体の製造方法−２
１．試験方法
ＨｅｐＧ２の培養上清から精製したＡＦＰを試験例１と同様にＥｎｄｏ−Ｆ３で処理し、酵素を除去したものも免疫原とし〔試験例２〕と同様に実施した。ただし、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法には抗原としてＥｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰを用いた。
【００８２】
２．試験結果
結果の一例としてラットに免疫した場合を図７、８に示す。非免疫動物の血清と比較して免疫動物の抗血清は希釈倍率が低いほど、固相化した酵素処理ＡＦＰに高い吸光度を示した（図７）。この測定系では、測定される吸光度は採血した動物の血清中に含まれる酵素処理ＡＦＰに対する抗体濃度に依存する。つまり、前述の結果は、免疫動物の抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度の酵素処理ＡＦＰに対する抗体を含み、抗体価が高い、ということを示している。
【００８３】
図８に示すように、酵素処理ＡＦＰを免疫した動物からは酵素処理ＡＦＰに反応し、酵素未処理ＡＦＰに反応しない抗体産生株が複数確認することができた。つまり、酵素処理ＡＦＰを免疫原とすることで、酵素処理ＡＦＰに特異的な抗体産生ハイブリドーマを取得できることを示している。
【００８４】
〔試験例４〕クローニング
上述の１次スクリーニング及び２次スクリーニングで選択された抗体産生株ハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。クローン化は定法（限界希釈法、例えば「実験医学別冊  タンパク質実験ハンドブック」ＩＳＢＮ４−８９７０６−３６９−８を参照）で行い、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウエルを選別し、最終的に２種のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（Ｓ２０２０５Ｒ及びＳ２０２０６Ｒ）を得た。
【００８５】
〔試験例５〕本発明のモノクローナル抗体の特異性分析１
Ｓ２０２０５Ｒが産生する抗体、及びＳ２０２０６Ｒが産生する抗体は酵素処理ＡＦＰにどのような特異性で反応しているかを先ず、免疫沈降とウェスタンブロッティングで確認した。
【００８６】
１．試験方法
ＨｅｐＧ２細胞の培養上清４００μＬに０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液を４００μＬ、更にＥｎｄｏ−Ｆ３を７．５μｇ加えて、３７℃、３０分間反応させた後に、８００μＬのＢＳＡ−ＰＢＳＴを加え試料を調製した。次いで、Ｓ２０２０５Ｒ抗体、Ｓ２０２０６Ｒ抗体、既存の抗ＡＦＰ抗体（自社製０２２１１）及びＡＦＰと反応しない抗体の４種類をそれぞれ定法により固定化したセファロースゲル１００μＬ（ＧＥヘルスケア社：ＣＮＢｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１７０９８１０１））に上記の試料をそれぞれ４００μＬ加え、室温で２時間攪拌した。それらを１００００ｇ、２分間遠心し、上清を除去してＰＢＳＴ１ｍＬでよく懸濁し、再び１００００ｇ、２分間遠心した。この操作を２回繰り返した後に上清を除去し、トリスＳＤＳサンプル処理液を６０μＬ加え、１０分間煮沸した。その後、１００００ｇ、２分間遠心し、１レーン１５μＬの量を添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを〔試験例１〕と同様に行った。ここまでの操作を免疫沈降とする。当該電気泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へ定法で転写し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ内で上記ＰＶＤＦ膜を室温１時間で振とうした。その後、検出抗体としてビオチン標識した既存抗ＡＦＰ抗体またはＡＦＰに反応しない抗体を１μｇ／ｍＬに希釈した１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ内で上記ＰＶＤＦ膜を室温１時間で振とうした。次いで、ＰＢＳＴ内で上記ＰＶＤＦ膜を室温５分間振とうし、上清を除去した。この操作を３回繰り返した後に、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを０．３３μｇ／ｍＬに希釈した１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ内で上記ＰＶＤＦ膜を室温３０分間で振とうした。次いで、ＰＢＳＴ内で上記ＰＶＤＦ膜を室温５分間振とうし、上清を除去した。この操作を３回繰り返した後に、０．２ｍｇ／ｍＬのジアミノベンジジン及び０．００１２％の過酸化水素を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に浸し、バンドが目視で十分確認できた後にＰＶＤＦ膜をＲＯ水で洗浄した。
【００８７】
２．試験結果
結果を図９に示す。既存の抗ＡＦＰ抗体で免疫沈降を行い、抗ＡＦＰ抗体で検出した場合（左レーン）は、酵素処理の有無に関わらずバンドが検出された（左レーン中の−及び＋レーン）。更に、酵素処理をした場合はバンドが高分子量側と低分子量側で二重になっていることが確認された（左レーン中の＋レーン）。一方で、Ｓ２０２０５Ｒ抗体（中央左レーン）またはＳ２０２０６Ｒ抗体（中央右レーン）で免疫沈降を行い、抗ＡＦＰ抗体で検出した場合は、酵素処理した場合（中央左、中央右レーン中それぞれの＋レーン）でさらに低分子量側のバンドのみが検出された（図９）。この測定系では、免疫沈降に用いた抗体が結合するＡＦＰのバンドが検出される。つまり、〔試験例１〕に示す通り、酵素処理によって低分子量側のバンドが増大していることと合わせて、Ｓ２０２０５Ｒ抗体またはＳ２０２０６Ｒ抗体は酵素処理によって生じる糖分解ＡＦＰを認識していることを示している。なお、ＡＦＰと反応しない抗体（右レーン）では、実質的なバンドは検出されなかった。
【００８８】
〔試験例６〕本発明のモノクローナル抗体の特異性分析２
１．試験方法
Ｓ２０２０５Ｒ抗体、Ｓ２０２０６Ｒ抗体の特異性を、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で確認した。なお、プレートに固相した抗原はＡＦＰ、Ｅｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰ、酵素ＰＮＧａｓｅＦ（図３の配列中、アミノ基とＧｌｃＮＡｃβ１間の結合を切断する酵素）で処理したＡＦＰである。同時に各ＡＦＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥも〔試験例１〕と同様に行った。
【００８９】
２．試験結果
結果を図１０、図１１に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、酵素未処理のＡＦＰ、Ｅｎｄｏ−Ｆ３処理ＡＦＰ、ＰＮＧａｓｅＦ処理ＡＦＰの何れも異なるバンドパターンを示し、Ｅｎｄｏ−Ｆ３処理したＡＦＰが高分子量側と低分子量側の二重のバンドとなるのに対し、ＰＮＧａｓｅＦしたＡＦＰでは低分子量側のバンドが確認された（図１０）。Ｅｎｄｏ−Ｆ３はＡＦＰの一部の糖鎖を２糖まで切断したのに対して、ＰＮＧａｓｅＦはあらゆるＮ型糖鎖を消化切断し、糖鎖の無いＡＦＰが産生されたことを示している。一方図１１に示すように、既存のＡＦＰ抗体が酵素処理の有無に関わらず吸光度が増大したのに対し、Ｓ２０２０５Ｒ抗体、Ｓ２０２０６Ｒ抗体では吸光度がＥｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰに対してのみ増大した。この測定系ではプレートに固相化されたＡＦＰに対する抗体の反応性が強いほど吸光度が増大する。つまり、Ｓ２０２０５Ｒ抗体、Ｓ２０２０６Ｒ抗体は、Ｅｎｄｏ−Ｆ３によって生じる糖鎖を認識部位の一部として含むことを示している。
【００９０】
〔試験例７〕既存抗体とのサンドウィッチＥＬＩＳＡ
これまではプレート上に固相化した抗原に対する反応性を評価していたが、液相中に存在する抗原に対する反応性の評価も行った。試験方法は以下の通りである。
【００９１】
１．試験方法
（１）サンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
精製ＡＦＰを免疫原として作製し、酵素処理の有無に関わらず反応する既存の抗ＡＦＰモノクローナル抗体（社内品）含有液を５μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬをそれぞれ９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間静置した。
前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをサンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。
【００９２】
（２）サンドウィッチＥＬＩＳＡ法
〔試験例１〕と同様にＥｎｄｏ−Ｆ３処理したＡＦＰをＢＳＡ−ＰＢＳＴで段階希釈した。これを抗原含有液とする。前記サンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルから液を除去した後に、抗原含有液を前記各ウエルに５０μＬ添加し、室温で１５分間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１５００倍希釈したＨＲＰ標識Ｓ２０２０５Ｒ抗体又はＨＲＰ標識Ｓ２０２０６Ｒ抗体を前記プレートに５０μＬ各ウエルに分注し、室温で１５分間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９３】
２．試験結果
結果を図１２ａ，ｂに示す。酵素処理したＡＦＰに対して濃度依存的に吸光度が上昇している（図１２ａ，ｂ）。この測定系ではプレートに固相化された既存抗ＡＦＰ抗体と結合した液相中酵素処理ＡＦＰに、ＨＲＰ標識Ｓ２０２０５Ｒ抗体及びＨＲＰ標識Ｓ２０２０６Ｒ抗体が反応することで吸光度が増大する。つまり、これらの抗体が液相中の酵素処理ＡＦＰと特異的に反応することを示す。
これまでの結果よりＳ２０２０５Ｒ抗体とＳ２０２０６Ｒ抗体の特性はほとんど同一であったため、以降の評価ではＳ２０２０６Ｒ抗体のみを用いている。
【００９４】
〔試験例８〕サンドウィッチＥＬＩＳＡによる各酵素処理物に対する反応性分析
１．試験方法
試験方法は〔試験例７〕と同様である。ただし抗原は〔試験例１〕と同様に調製したＥｎｄｏ−Ｆ２あるいはＥｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰを用いた。また、〔試験例７〕でＨＲＰ標識抗体を添加する工程において、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで６０００倍希釈したＨＲＰ標識した既存抗ＡＦＰポリクローナル抗体も同時に試験に用いた。
【００９５】
２．試験結果
結果を図１３ａ，ｂに示す。既存のＡＦＰ抗体同士で測定した場合には、酵素処理の有無に関わらず、ＡＦＰ濃度依存的に吸光度が増大した（図１３ａ）。一方で、Ｓ２０２０６Ｒ抗体を用いた場合にはＥｎｄｏ−Ｆ２及びＥｎｄｏ−Ｆ３で処理したＡＦＰのみ、濃度依存的に吸光度が増大した（図１３ｂ）。つまり、Ｅｎｄｏ−Ｆ２を用いてもＥｎｄｏ−Ｆ３によって生じるものと同様の糖分解ＡＦＰが生じており、Ｅｎｄｏ−Ｆ３以外の酵素を用いた場合でもこれまでの試験例と同様の測定が可能であることを示している。
【００９６】
〔試験例９〕血清中での酵素処理の検討
これまでは精製したＡＦＰに酵素や緩衝液を添加して、酵素処理を行っていた。しかし、実際に臨床検査で想定される測定用検体は血清であり、血清にはＡＦＰ以外に非常に高濃度のＮ型糖鎖タンパク質が混在していることが予想される。そこで、血清中でも酵素がＡＦＰに作用するかどうかを試験した。
【００９７】
１．試験方法
試験方法は〔試験例７〕と同様である。ただし、用いた抗原はＨｅｐＧ２由来のＡＦＰ２００ｎｇに３例の健常者血清を２５μＬ加え、更に０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）２５μＬ及び２μｇのＥｎｄｏ−Ｆ３を添加した。これらを３７℃で１０分間反応させた後に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ｍＬｍＬ加え、ＡＦＰ濃度を２００ｎｇ／ｍＬとしたものを抗原含有液とした。
【００９８】
２．試験結果
結果を図１４に示す。ＡＦＰを健常者血清に添加した場合も、緩衝液に添加した場合と同様に、本発明によるサンドウィッチＥＬＩＳＡで、酵素処理ＡＦＰ特異的に吸光度が増大した（図１４）。つまり、血清中においてもＡＦＰに対してＥｎｄｏ−Ｆ３が作用していることを示している。
【００９９】
〔試験例１０〕酵素処理のｐＨ条件検討
１．試験方法
これまでは緩衝液として０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を主に用いていたが、他の緩衝液（ｐＨ）でも使用可能かを検討した。試験方法は〔試験例７〕と同様である。ただし、酵素処理時に用いた緩衝液を表１に示す。
2020162572.tif 000002
酵素処理後はＡＦＰ濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈し、サンドウィッチＥＬＩＳＡに用いた。
【０１００】
２．試験結果
結果を図１５に示す。ｐＨ０．５程度からｐＨ１２．５程度の領域で吸光度が０．１以上となっており、反応していると言える（図１５）。これは分子生物学で用いる通常の緩衝液のｐＨ領域を十分に満たしており、本発明に用いる酵素はｐＨによらず使用できることを示している。
【０１０１】
〔試験例１１〕オンプレート酵素処理の検討
これまではＡＦＰを酵素処理後にＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈した後に、サンドウィッチＥＬＩＳＡで測定を行っていた。そこで、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおける抗原抗体反応と同時にＡＦＰの酵素処理をすることが可能か検討した。
【０１０２】
１．試験方法
プレートの調製までは〔試験例７〕と同様である。
（１）オンプレート酵素処理
Ｅｎｄｏ−Ｆ３を０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）により０．３３ｍｇ／ｍＬに希釈し、これを酵素含有液とした。またＡＦＰを含むＨｅｐＧ２培養上清を０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）により段階希釈し、これを抗原含有液とした。
前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルから液を除去した後に、酵素含有液を前記各ウエルに３０μＬ添加した。次いで、前記各ウエルに抗原含有液を３０μＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１５００倍希釈したＨＲＰ標識Ｓ２０２０６Ｒ抗体を前記プレートに５０μＬ各ウエルに分注し、室温で１５分間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０３】
２．試験結果
結果を図１６に示す。これまでの結果と同様に酵素を添加した場合で、濃度依存的に吸光度が増大した（図１６）。本測定系においては、固相化した抗体と抗原が反応するのと同時に、抗原と酵素が反応している。つまり、抗原抗体反応と抗原の酵素処理反応は同時に行うことができると示している。
【０１０４】
以上具体例を用いて本発明を説明したが、本発明の範囲は上記具体例に限定されるものではない。当業者は本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることを理解する。
【図１】
2020162572.tif 000003
【図２】
2020162572.tif 000004
【図３】
2020162572.tif 000005
【図４】
2020162572.tif 000006
【図５】
2020162572.tif 000007
【図６】
2020162572.tif 000008
【図７】
2020162572.tif 000009
【図８】
2020162572.tif 000010
【図９】
2020162572.tif 000011
【図１０】
2020162572.tif 000012
【図１１】
2020162572.tif 000013
【図１２ａ】
2020162572.tif 000014
【図１２ｂ】
2020162572.tif 000015
【図１３ａ】
2020162572.tif 000016
【図１３ｂ】
2020162572.tif 000017
【図１４】
2020162572.tif 000018
【図１５】
2020162572.tif 000019
【図１６】
2020162572.tif 000020