(57)【要約】      （修正有）【解決手段】2,4-ジニトロフェノール（DNP）の低用量持続放出製剤及び疾患または障害の防止または処置方法。【効果】本発明の組成物は、その必要のある対象における、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、インスリン抵抗性、および／または糖尿病などの疾患または障害の防止または処置のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含む、その必要のある対象における疾患または障害の防止または処置の方法であって、
組成物が、対象において化合物の持続放出を提供し、かつ
疾患または障害が、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、（遺伝性）リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種であり、
それによって、対象における疾患または障害が対象において処置されるかまたは防止される、方法。
【請求項２】
化合物の治療的に有効な用量が、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
組成物の投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
組成物の投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
組成物の投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
対象における化合物の定常状態血漿濃度が、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が経口投与用に製剤化されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1種の付加的な治療剤を対象へ投与する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤が対象へ同時投与される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤が共製剤化されている、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
対象が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含む、その必要のある対象におけるエネルギー消費を増加させる方法であって、
組成物が、対象において化合物の持続放出を提供し、
それによって、対象におけるエネルギー消費が増加する、方法。
【請求項１８】
対象が、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、リポジストロフィー（遺伝性）、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害に罹患している、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
化合物の治療的に有効な用量が、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
組成物の投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
組成物の投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
組成物の投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、請求項17に記載の方法。
【請求項２５】
組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、請求項17に記載の方法。
【請求項２６】
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が経口投与用に製剤化されている、請求項17に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1種の付加的な治療剤を対象へ投与する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２９】
対象が哺乳動物である、請求項17に記載の方法。
【請求項３０】
対象がヒトである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量であって、
化合物が持続放出製剤の中に存在し、かつ
その量の組成物の対象への投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、量。
【請求項３２】
その量の組成物の対象への投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項31に記載の量。
【請求項３３】
その量の組成物の対象への投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、請求項32に記載の量。
【請求項３４】
対象における化合物の定常状態血漿濃度が、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である、請求項31に記載の量。
【請求項３５】
その量の組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、請求項31に記載の量。
【請求項３６】
その量の組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、請求項31に記載の量。
【請求項３７】
その量の組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、請求項37に記載の量。
【請求項３９】
組成物が経口投与用に製剤化されている、請求項31に記載の量。
【請求項４０】
組成物が少なくとも1種の付加的な治療剤をさらに含む、請求項31に記載の量。
【請求項４１】
組成物中の化合物が、ヒドロキシプロピルセルロースおよびエチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種を含むコーティングによってコーティングされている、請求項31に記載の量。
【請求項４２】
コーティングが、タルクおよびセバシン酸ジブチルからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、請求項41に記載の量。
【請求項４３】
化合物がビーズまたは球体の形態にある、請求項31に記載の量。
【請求項４４】
化合物を含むビーズまたは球体が、マンニトール、微結晶セルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、請求項43に記載の量。
【請求項４５】
対象が哺乳動物である、請求項31に記載の量。
【請求項４６】
哺乳動物がヒトである、請求項45に記載の量。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2013年12月20日出願の米国仮特許出願第61/919,003号および2013年8月30日出願の第61/872,294号に基づく35 U.S.C.§119(e)による優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたDK085638、DK040936、およびDK049230の下で政府の支援を受けて作成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）は、2型糖尿病（T2D）の病原における主な要因であり、3人に1人の米国人に影響を与えている（Shulman,2000,J.Clin.Invest.106:171-176（非特許文献1）；Petersen,et al.,2005,Diabetes 54:603-608（非特許文献2）；Samuel & Shulman,2012,Cell 148:852-857（非特許文献3）；Boyle,et al.,2010,Popul.Health.Metr.8:29（非特許文献4））。NAFLDは、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬変、および肝細胞癌の発症のための重要な素因でもある。さらに、米国において、NAFLDによって誘導されたNASHは、肝移植についての最も一般的な適応症として、C型肝炎およびアルコール性肝硬変を間もなくしのぐ可能性がある（Sanyal,et al.,2010,Oncologist 15 Suppl.4:14-22（非特許文献5）；Stickel & Hellerbrand,2010,Gut 59:1303-1307（非特許文献6）；Barry,et al.,2010,J.Hepatol.56:1384-1391（非特許文献7）；White,et al.,2012,Clin.Gastroenterol.Hepatol.10:1342-1359（非特許文献8））。従って、NAFLDの処置のための新しい有効な治療が緊急に必要とされている。
【０００４】
最もよく特徴決定されているミトコンドリア脱共役剤のうちの1種は、ミトコンドリア膜の内外にプロトンを輸送して、ミトコンドリアのプロトン勾配を放散させ、ミトコンドリアの基質酸化に由来するエネルギーの熱放散を促進するプロトノフォア、2,4-ジニトロフェノール（DNP）である。DNPは、1930年代に減量療法として広範囲に使用されたが、致命的な高熱の発生のため、1938年にU.S.Food and Drug Administrationによって販売が禁止された（Tainter,et al.,1934,Am.J.Public Health Nations Health 24:1045-1053（非特許文献9））。
【０００５】
NAFLDならびにその他の疾患および障害の処置のために有用な組成物が、当技術分野において必要とされている。本発明はこの未解決の必要性を解決する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shulman,2000,J.Clin.Invest.106:171-176
【非特許文献２】Petersen,et al.,2005,Diabetes 54:603-608
【非特許文献３】Samuel & Shulman,2012,Cell 148:852-857
【非特許文献４】Boyle,et al.,2010,Popul.Health.Metr.8:29
【非特許文献５】Sanyal,et al.,2010,Oncologist 15 Suppl.4:14-22
【非特許文献６】Stickel & Hellerbrand,2010,Gut 59:1303-1307
【非特許文献７】Barry,et al.,2010,J.Hepatol.56:1384-1391
【非特許文献８】White,et al.,2012,Clin.Gastroenterol.Hepatol.10:1342-1359
【非特許文献９】Tainter,et al.,1934,Am.J.Public Health Nations Health 24:1045-1053
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明は、その必要のある対象における疾患または障害の防止または処置の方法を提供する。本発明は、その必要のある対象におけるエネルギー消費を増加させる方法をさらに提供する。本発明は、化合物が持続放出製剤の中に存在する、2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量をさらに提供する。
【０００８】
ある種の態様において、方法は、DNP、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含む。
【０００９】
ある種の態様において、疾患または障害は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、遺伝性リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種である。
【００１０】
ある種の態様において、対象は、NAFLD、NASH、肝臓脂肪症、T2D、後天性リポジストロフィー、遺伝性リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、ROSの増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害に罹患している。
【００１１】
ある種の態様において、化合物の治療的に有効な用量は、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である。他の態様において、組成物の投与は、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、組成物の投与は、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、組成物の投与は、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。
【００１２】
ある種の態様において、対象における化合物の定常状態血漿濃度は、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である。他の態様において、組成物の投与は、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす。
【００１３】
ある種の態様において、組成物は、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される。他の態様において、組成物の投与は、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない。さらに他の態様において、重大な全身毒性は、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される。さらに他の態様において、組成物は経口投与用に製剤化されている。
【００１４】
ある種の態様において、対象は、少なくとも1種の付加的な治療剤をさらに投与される。他の態様において、組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤は、対象へ同時投与される。さらに他の態様において、組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤は、共製剤化されている。
【００１５】
ある種の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００１６】
ある種の態様において、その量の組成物の対象への投与は、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。他の態様において、その量の組成物の対象への投与は、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、その量の組成物の対象への投与は、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、対象における化合物の定常状態血漿濃度は、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である。さらに他の態様において、その量の組成物の投与は、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす。さらに他の態様において、その量の組成物は、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される。
【００１７】
ある種の態様において、その量の組成物の投与は、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない。他の態様において、重大な全身毒性は、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される。さらに他の態様において、組成物は経口投与用に製剤化されている。さらに他の態様において、組成物は少なくとも1種の付加的な治療剤をさらに含む。
【００１８】
ある種の態様において、組成物中の化合物は、ヒドロキシプロピルセルロースおよびエチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種を含むコーティングによってコーティングされている。他の態様において、コーティングは、タルクおよびセバシン酸ジブチルからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む。さらに他の態様において、化合物はビーズまたは球体の形態にある。さらに他の態様において、化合物を含むビーズまたは球体は、マンニトール、微結晶セルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む。
[本発明1001]
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含む、その必要のある対象における疾患または障害の防止または処置の方法であって、
組成物が、対象において化合物の持続放出を提供し、かつ
疾患または障害が、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、（遺伝性）リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種であり、
それによって、対象における疾患または障害が対象において処置されるかまたは防止される、方法。
[本発明1002]
化合物の治療的に有効な用量が、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
組成物の投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1004]
組成物の投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1003の方法。
[本発明1005]
組成物の投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1004の方法。
[本発明1006]
対象における化合物の定常状態血漿濃度が、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である、本発明1003の方法。
[本発明1007]
組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1008]
組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、本発明1001の方法。
[本発明1010]
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
組成物が経口投与用に製剤化されている、本発明1001の方法。
[本発明1012]
少なくとも1種の付加的な治療剤を対象へ投与する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤が対象へ同時投与される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤が共製剤化されている、本発明1013の方法。
[本発明1015]
対象が哺乳動物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
哺乳動物がヒトである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含む、その必要のある対象におけるエネルギー消費を増加させる方法であって、
組成物が、対象において化合物の持続放出を提供し、
それによって、対象におけるエネルギー消費が増加する、方法。
[本発明1018]
対象が、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、リポジストロフィー（遺伝性）、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害に罹患している、本発明1017の方法。
[本発明1019]
化合物の治療的に有効な用量が、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である、本発明1017の方法。
[本発明1020]
組成物の投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1017の方法。
[本発明1021]
組成物の投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1020の方法。
[本発明1022]
組成物の投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1021の方法。
[本発明1023]
組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、本発明1017の方法。
[本発明1024]
組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、本発明1017の方法。
[本発明1025]
組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、本発明1017の方法。
[本発明1026]
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
組成物が経口投与用に製剤化されている、本発明1017の方法。
[本発明1028]
少なくとも1種の付加的な治療剤を対象へ投与する段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1029]
対象が哺乳動物である、本発明1017の方法。
[本発明1030]
対象がヒトである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物の治療的に有効な量であって、
化合物が持続放出製剤の中に存在し、かつ
その量の組成物の対象への投与が、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、量。
[本発明1032]
その量の組成物の対象への投与が、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1031の量。
[本発明1033]
その量の組成物の対象への投与が、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす、本発明1032の量。
[本発明1034]
対象における化合物の定常状態血漿濃度が、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である、本発明1031の量。
[本発明1035]
その量の組成物の投与が、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす、本発明1031の量。
[本発明1036]
その量の組成物が、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される、本発明1031の量。
[本発明1037]
その量の組成物の投与が、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない、本発明1031の方法。
[本発明1038]
重大な全身毒性が、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される、本発明1037の量。
[本発明1039]
組成物が経口投与用に製剤化されている、本発明1031の量。
[本発明1040]
組成物が少なくとも1種の付加的な治療剤をさらに含む、本発明1031の量。
[本発明1041]
組成物中の化合物が、ヒドロキシプロピルセルロースおよびエチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種を含むコーティングによってコーティングされている、本発明1031の量。
[本発明1042]
コーティングが、タルクおよびセバシン酸ジブチルからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、本発明1041の量。
[本発明1043]
化合物がビーズまたは球体の形態にある、本発明1031の量。
[本発明1044]
化合物を含むビーズまたは球体が、マンニトール、微結晶セルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、本発明1043の量。
[本発明1045]
対象が哺乳動物である、本発明1031の量。
[本発明1046]
哺乳動物がヒトである、本発明1045の量。
【００１９】
本発明の具体的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読まれた時によりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のため、図面には具体的な態様が示される。しかしながら、本発明は、図面に示される態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、2,4-ジニトロフェノール（DNP）の構造を例示する。
【図２Ａ】図2A〜2Hを含む図2は、NAFLDおよび全身インスリン抵抗性のラットモデルにおいて、DNPの低用量胃内注入が、グルコース、トリグリセリド、およびインスリンの血漿濃度を低下させ、肝臓脂肪症および全身インスリン抵抗性も低下させるという所見を例示する。図2Aは、血漿、肝臓、および四頭筋のDNP濃度を例示するグラフである。図2Bは、肝臓トリグリセリド含量を例示するグラフである。図2Cは、筋肉トリグリセリド含量を例示するグラフである。図2Dは、肝臓ジアシルグリセロール含量を例示するグラフである。図2Eは、筋肉ジアシルグリセロール含量を例示するグラフである。図2Fは、空腹時血漿グルコース濃度を例示するグラフである。図2Gは、空腹時血漿トリグリセリド濃度を例示するグラフである。図2Hは、空腹時血漿インスリン濃度を例示するグラフである。1群当たりn＝3〜4。
【図２Ｂ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｃ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｄ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｅ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｆ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｇ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｈ】図2Aの説明を参照のこと。
【図３】図3は、ゼロ時点でピーナッツバター中の長期放出DNP（ERDNP）（1mg/kg）をラットへ与えた後の血漿DNP濃度を例示するグラフである。ERDNPによる処置は、少なくとも12時間、持続的な3〜8μMのDNPの血漿濃度を達成した。
【図４Ａ】図4A〜4Dを含む図4は、ERDNPが、DNPより500倍広い、有効用量と安全用量との比を有するという所見を例示する。図4A〜4B：DNPまたはERDNPによって急性処置されたラットの直腸温度。図4C〜4D：DNPまたはERDNPによって5日間処置された高脂肪摂取ラットにおける肝臓トリアシルグリセロール濃度。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001（ビヒクルによって処置された群との比較）。1用量当たり1群当たりn＝3。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5A〜5Fを含む図5は、ERDNPが、より低い血漿および組織のDNP濃度をもたらすため、DNPより耐容性が良いという所見を例示する。図5A：DNP（25mg/kg、毒性用量；黒丸）またはERDNP（1mg/kg；赤四角）の投与後の血漿濃度。図5B：25mg/kg DNPによる処置の1時間後の組織DNP濃度。図5C〜5D：1mg/kg ERDNPの1回または5回の毎日投与後の組織DNP濃度。図5E：1mg/kg ERDNPによる6週間の毎日処置後の組織DNP濃度。図5F：ERDNP処置の24時間後の組織DNP濃度。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝3。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｅ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｆ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６Ａ】図6A〜6Gを含む図6は、高脂肪摂取スプラーグドーリーラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、5日間）が、NAFLDを逆転させ、耐糖能およびインスリン感受性を改善するという所見を例示する。図6A〜6C:グルコース、トリグリセリド、およびインスリンの空腹時血漿濃度。図6D:血漿コレステロール濃度。図6E〜6F:IP糖負荷試験における血漿のグルコースおよびインスリンの濃度。図6G:空腹時血漿非エステル化脂肪酸濃度。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝6〜8。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｆ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｇ】図6Aの説明を参照のこと。
【図７Ａ】図7A〜7Dを含む図7は、高脂肪摂取ラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、5日間）が、インスリン感受性を改善するという所見を例示する。図7A：高インスリン正常血糖クランプ法において正常血糖を維持するためのグルコース注入速度。図7B：四頭筋におけるインスリンによって刺激されたグルコース取り込み。図7C：基底時（実線バー）およびインスリン刺激時（破線バー）の肝臓グルコース生成。図7D：肝臓グルコース生成のインスリンによって刺激された抑制。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝6〜8。
【図７Ｂ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｄ】図7Aの説明を参照のこと。
【図８Ａ】図8A〜8Fを含む図8は、高脂肪摂取ラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、5日間）が、肝糖新生を低下させるという所見を例示する。図8A〜8B：肝臓および四頭筋のトリアシルグリセロール。図8C：肝臓ピルビン酸カルボキシラーゼフラックス。図8D：肝臓アセチルCoA濃度。図8E：脂肪酸酸化からの炭素によって供給された肝臓トリカルボン酸（TCA）回路フラックス（実線バー）、およびPDHフラックスを通した肝臓TCA回路フラックス（破線バー）。図8F：肝臓トリグリセリド運び出し。1群当たりn＝6。
【図８Ｂ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｃ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｄ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｅ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｆ】図8Aの説明を参照のこと。
【図９Ａ】図9A〜9Hを含む図9は、ズッカー糖尿病肥満ラットにおいて、経口ERDNP（1日当たり1mg/kg、14日間）が、NAFLDを逆転させ、耐糖能を改善するという所見を例示する。図9A：ビヒクルによって処置されたラット（黒丸）およびERDNPによって処置されたラット（赤四角）におけるランダムな血漿グルコース濃度。図9B〜9D：グルコース、トリグリセリド、およびインスリンの空腹時血漿濃度。図9E〜9F：腹腔内糖負荷試験におけるグルコースおよびインスリンの濃度。図9G〜9H：ALTおよびASTの濃度。図9I：肝臓組織学（ヘマトキシロン＆エオシン染色）。全てのパネルにおいて、*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001。1群当たりn＝6〜7。
【図９Ｂ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｃ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｄ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｅ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｆ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｇ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｈ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｉ】図9Aの説明を参照のこと。
【図１０】図10は、空腹時血漿グルコースを例示するグラフである。ラットを6時間絶食させた。インスリン抵抗性およびNAFLDの高脂肪摂取ラットモデルにおいて、5日間のERDNP経口投薬（1mg/kg、12時間毎）は、空腹時血漿グルコース濃度の有意な低下をもたらす。
【図１１】図11A〜11Bを含む図11は、ビヒクルまたはERDNPによる処置後の組織TAG含量を例示する。図11Aは、肝臓TAG含量を例示するグラフである。図11Bは、四頭筋TAG含量を例示するグラフである。ラットを6時間絶食させた。インスリン抵抗性およびNAFLDの高脂肪摂取ラットモデルにおいて、5日間のERDNP経口投薬（1mg/kg、12時間毎）は、肝臓トリグリセリド濃度の有意な低下および筋肉トリグリセリド含量の低下の強い傾向をもたらした。
【図１２】図12は、長期放出DNP（ERDNP）の1日1回の5日間の投薬が、血漿インスリン濃度を低下させる強力な傾向を示す様子を例示するグラフである。ラットを、1mg/kg ERDNPまたはビヒクルによって、1日1回、5日間処置した。屠殺前に、ラットを6時間絶食させた。
【図１３】図13は、長期放出DNP（ERDNP）の1日1回の5日間の投薬が、HOMA-IRの有意な低下をもたらす様子を例示するグラフである。HOMA-IRのこの低下は、インスリン抵抗性の高脂肪齧歯類モデルにおいて、ERDNPの1日1回投薬が全身インスリン抵抗性を低下させることを証明した。
【図１４Ａ】図14A〜14Lを含む図14は、ラットにおいて、慢性胃内DNP注入（1日当たり2mg/kg）が、NAFLDを安全に逆転させるという所見を例示する。図14A〜14B：肝臓および四頭筋のジアシルグリセロール。図14C〜14D：肝臓および四頭筋のDAG種。図14E〜14F：肝臓および四頭筋のセラミド。図14G〜14J：ALT、AST、BUN、およびクレアチニンの濃度。図14K：処置の前後の体重。図14L：処置期間中の1日カロリー摂取量。1群当たりn＝4。
【図１４Ｂ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｃ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｄ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｅ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｆ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｇ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｈ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｉ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｊ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｋ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｌ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１５Ａ】図15A〜15Hを含む図15は、ERDNPが、DNPより500倍広い、有効用量と安全用量との比を有するという所見を例示する。図15A〜15B：変動する用量のDNPまたはERDNPによって5日間処置されたラットにおけるALT。図15C〜15D：変動する用量のDNPまたはERDNPによって5日間処置されたラットにおけるAST。図15E〜15F：変動する用量のDNPまたはERDNPによって5日間処置されたラットにおけるBUN。図15G〜15H：変動する用量のDNPによって5日間処置された、2週間高脂肪を摂取したラットにおけるクレアチニン。1群当たり1用量当たりn＝3。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｅ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｆ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｇ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｈ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６Ａ】図16A〜16Hを含む図16は、ラットにおいて、6週間のERDNP処置（1日当たり1mg/kg）が、耐容性が良いという所見を例示する。図16A〜16D：ALT、AST、BUN、およびクレアチニン。図16E〜16F：それぞれヘマトキシロンおよびエオシンによって染色された肝臓および腎臓の代表的な画像。図16G：直腸温度。図16H：ERDNPの最後の投与の8時間後の組織DNP濃度。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝3〜6。
【図１６Ｂ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｃ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｄ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｅ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｆ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｇ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｈ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１７Ａ】図17A〜17Kを含む図17は、高脂肪摂取スプラーグドーリーラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、5日間）が、NAFLDを逆転させ、耐糖能およびインスリン感受性を改善するという所見を例示する。図17A：処置期間の終了時の体重。図17B：非エステル化遊離脂肪酸濃度。図17C：ウエスタンブロット。図17D〜17F：ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、およびフルクトース-1,6-ビスホスファターゼタンパク質。図17G〜17H：IP糖負荷試験における血漿のグルコースおよびインスリンの曲線下面積。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝6〜8。図17I：脂肪酸化フラックスとTCA回路フラックスとの比。黒バー、ビヒクル；赤／灰色バー、ERDNP。図17J：白色脂肪組織重量。図17K：血漿コレステロール。黒バー、ビヒクル；赤／灰色バー、ERDNP。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｅ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｆ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｇ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｈ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｉ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｊ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｋ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１８Ａ】図18A〜18Zを含む図18は、高脂肪摂取ラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、5日間）が、NAFLDを寛解させ、インスリン感受性を改善するという所見を例示する。図18A：120分高インスリン正常血糖クランプ法の終了時の血漿インスリン濃度。図18B：クランプ法の間の血漿グルコース濃度。図18C：クランプ法の間のグルコース注入速度。図18D〜18E：肝臓および四頭筋のDAG種。図18F〜18G：肝臓PKCεおよび四頭筋PKCθのトランスロケーション。図18H〜18J：肝臓アシルカルニチン濃度。図18K〜18M：四頭筋アシルカルニチン濃度。図18N〜18O：肝臓および四頭筋のセラミド濃度。図18P：肝臓グリコーゲン含量。図18Q：血漿炎症性サイトカイン濃度。1群当たりn＝3。図18R〜18S：血漿のアディポネクチンおよびFGF-21の濃度。図18T：四頭筋におけるインスリンによって刺激されたグルコース取り込み。図18U〜18V：肝臓および四頭筋のDAG含量。図18X：肩甲骨間褐色脂肪組織量。図18Y：アクチンに対して標準化されたBAT UCP1 mRNA発現。図18Z：褐色脂肪組織におけるインスリンによって刺激されたグルコース取り込み。他に示されない限り、1群当たりn＝6〜8。
【図１８Ｂ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｃ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｄ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｅ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｆ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｇ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｈ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｉ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｊ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｋ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｌ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｍ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｎ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｏ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｐ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｑ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｒ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｓ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｔ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｕ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｖ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｘ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｙ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１８Ｚ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１９Ａ】図19A〜19Lを含む図19は、ズッカー糖尿病肥満ラットにおいて、ERDNP（1日当たり1mg/kg、14日間）が、NAFLDを逆転させ、耐糖能を改善するという所見を例示する。図19A：ビヒクル（黒バー）またはERDNP（赤バー）による処置の前後の体重。図19B〜19C：IP糖負荷試験におけるグルコースおよびインスリンの曲線下面積。図19D〜19E：肝臓および四頭筋のTAG濃度。図19F〜19I：ALT、AST、BUN、およびクレアチニンの濃度。図19J〜19K：肝臓のアセチルCoAおよびマロニルCoAの濃度。図19L：肝臓アセチルCoA濃度。全てのパネルにおいて、1群当たりn＝6〜7。
【図１９Ｂ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｃ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｄ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｅ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｆ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｇ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｈ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｉ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｊ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｋ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｌ】図19Aの説明を参照のこと。
【図２０Ａ】図20A〜20Lを含む図20は、メチオニン／コリン欠損ラットにおいて、経口ERDNP（1日当たり1mg/kg）がNASHを寛解させ、肝臓合成機能を改善するという所見を例示する。図20A：肝臓トリグリセリド含量。図20B〜20C：血漿のASTおよびALTの濃度。図20D：全タンパク質に対して標準化された肝臓炎症性サイトカイン濃度。1群当たりn＝4。図20E：肝臓組織学。図20F：繊維症スコア。図20G：肝臓コラーゲンmRNA発現。図20H：肝臓平滑筋アクチンタンパク質。図20I：肝臓ヒドロキシプロリン含量。図20J〜20K：肝臓のカスパーゼ3タンパク質およびカスパーゼ9タンパク質。図20L：血漿アルブミン濃度。他に明記されない限り、1群当たりn＝6〜8。
【図２０Ｂ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｃ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｄ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｅ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｆ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｇ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｈ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｉ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｊ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｋ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２０Ｌ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２１Ａ】図21〜21Lを含む図21は、ERDNPが、より低い血漿および組織のDNP濃度をもたらすため、DNPより耐容性が良いという所見を例示する。図21A〜21B：ゼロ時点における1mg/kg（図21A）または25mg/kg（図21B）のDNPの後の血漿DNP濃度。n＝3〜4。図21C〜21D：ゼロ時点における1mg/kg（図21C）または25mg/kg（図21D）のERDNPの後の血漿DNP濃度。n＝6〜9。図21E：1mg/kg DNP（n＝4）またはERDNP（n＝9）による経口処置後の血漿DNP濃度の24時間曲線下面積。図21F：10〜50mg/kg DNPによって処置されたラットにおける直腸温度と血漿DNP濃度との間の相関。図21G：25mg/kg DNPによる処置の1時間後の組織DNP濃度。n＝3。図21H：1mg/kg ERDNPの単回経口投与の8時間後の組織DNP濃度。n＝3。図21I：1mg/kg経口ERDNP後の様々な時点における血漿:組織DNP比。n＝3。図21J：5回の毎日の1mg/kg ERDNP投与の最後の8時間後の組織DNP濃度。n＝3。図21K：経口ERDNP用量と投薬の8時間後に測定された組織DNP濃度との間の直線相関。n＝3。図21L：1mg/kg ERDNPの単回投与後および5回の毎日投与の最後の後の血漿DNP濃度。未処置ラットについてのデータは、図21Cからコピーされる。慢性処置されたラットについてn＝4。
【図２１Ｂ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｃ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｄ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｅ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｆ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｇ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｈ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｉ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｊ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｋ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２１Ｌ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２２Ａ】図22A〜22Fを含む図22は、同時に高脂肪食を摂取したラットにおいて、2週間の毎日のERDNP処置（1mg/kg）が、NAFLDおよびインスリン抵抗性を防止したという所見を例示する。図22A〜22C：グルコース、NEFA、およびインスリンの空腹時血漿濃度。図22D〜22F：肝臓、血漿、および四頭筋のトリグリセリド含量。1群当たりn＝8。
【図２２Ｂ】図22Aの説明を参照のこと。
【図２２Ｃ】図22Aの説明を参照のこと。
【図２２Ｄ】図22Aの説明を参照のこと。
【図２２Ｅ】図22Aの説明を参照のこと。
【図２２Ｆ】図22Aの説明を参照のこと。
【図２３Ａ】図23A〜23Hを含む図23は、ERDNPがマウスにおける代謝ケージ分析において測定されたパラメータの生理学的に有意な差を引き起こさなかったという所見を例示する。図23A：酸素消費量（VO2）。図23B：二酸化炭素生成量（VCO2）。図23C：呼吸商。図23D：1日の間の運動量。図23E：1日の間のエネルギー消費量。図23F：全1日摂水量。図23G：全1日摂食量。図23H：1日の間の摂食量。*P＜0.05、**P＜0.01。1群当たりn＝8。
【図２３Ｂ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｃ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｄ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｅ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｆ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｇ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｈ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２４Ａ】図24A〜24Eを含む図24は、メチオニン／コリン欠損ラットにおいて、6週間の毎日のERDNP処置（1日当たり1mg/kg）が、NASHを寛解させ、肝臓合成機能を改善するという所見を例示する。図24A：全タンパク質に対して標準化された肝臓炎症性サイトカインタンパク質含量。図24B：肝臓CD69タンパク質。図24C：TUNEL陽性細胞について染色された肝臓（褐色染色）。図24D：空腹時血漿グルコース濃度。図24E：肝臓グリコーゲン含量。1群当たりn＝6〜8。
【図２４Ｂ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２４Ｃ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２４Ｄ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２４Ｅ】図24Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、2,4-ジニトロフェノール（DNP）、またはその塩もしくは溶媒和化合物、またはそれらの任意の組み合わせの低い持続的な用量が、高熱および全身毒性を引き起こすことなく、肝臓脂肪症の低下、インスリン感受性の改善、耐糖能の改善、血糖の低下、および／または肝炎症の逆転を提供するという予想外の発見に関する。
【００２２】
ある種の態様において、本発明の組成物は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、（遺伝性）リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害の処置または防止において有用である。他の態様において、本発明の組成物は、対象の体重の管理、維持、および／または増加の防止において有用である。さらに他の態様において、本発明の組成物は、対象の体重の低下において有用である。
【００２３】
一つの局面において、本明細書に記載された研究は、薬物動態を改変することによって、（DNPのような）ミトコンドリアプロトノフォアの全身毒性を、肝臓ミトコンドリア脱共役を促進し、肝臓脂肪酸化を増加させる能力から分離することができることを証明する。本明細書に記載された所見は、2,4-DNPの長期放出製剤に限定されると解釈されるべきでなく、以下に限定されないが、2,4-DNPの異性体および／または類似体（例えば、β-2,4-DNPおよび2,6-ジニトロフェノール）、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラジン（CCCP）、ならびにカルボニルシアニドp-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（FCCP）のような任意の公知の有用なミトコンドリアプロトノフォアまたはその類似体／誘導体の長期放出製剤に適用可能である。
【００２４】
本明細書に記載されるように、肝臓脂肪症、インスリン抵抗性、および糖尿病に対するDNPの新規の長期放出経口製剤（ERDNP）の安全性および効力が、NAFLDおよびT2Dのラットモデルにおいて研究された。そのようなモデルは、DNPの毒性閾値の50分の1〜100分の1である、DNPの持続的な血漿濃度（24時間にわたる1〜10μM）を達成した。非限定的な態様において、低濃度（1〜5μM）のDNPは、DNPの毒性血漿閾値（およそ400μM）より十分に低くありながら、肝臓ミトコンドリア脱共役の軽微な増加を促進することが見出された。
【００２５】
ERDNPは、DNPより500倍大きい治療指数を有することが見出された。慢性ERDNP処置は、NAFLDおよびT2Dのラットモデルにおいて、高トリグリセリド血症、肝臓脂肪症、インスリン抵抗性、および糖尿病を低下させた。さらに、ERDNPは、NASHのメチオニン／コリン欠損ラットモデルにおいて、血漿トランスアミナーゼ濃度を正常化し、肝線維症を寛解させ、血漿アルブミン濃度の増加によって反映されるように肝臓タンパク質合成機能を改善した。さらに、慢性ERDNPは、耐容性が良く、全身毒性に関連していなかった。これらのデータは、T2D、NASH、肝線維症、およびメタボリックシンドロームの関連流行病の処置においてERDNPが使用され得ることを示す。
【００２６】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。
【００２７】
本明細書において使用されるように、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連した意味を有する。
【００２８】
冠詞「（a）」および「（an）」は、冠詞の文法上の目的語の1または複数（即ち、少なくとも1）をさすために本明細書において使用される。例えば、「要素」とは、1つの要素または複数の要素を意味する。
【００２９】
「異常」という用語は、生物、組織、細胞、またはそれらの成分に関して本明細書において使用される時、「正常な」（予想される）それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞、またはそれらの成分と、少なくとも一つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、齢、処置、時刻等）が異なる、生物、組織、細胞、またはそれらの成分をさす。ある細胞または組織の型について正常であるかまたは予想される特徴が、異なる細胞または組織の型については異常であり得る。
【００３０】
本明細書において使用されるように、明記された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらに好ましくは±1％、さらに好ましくは±0.1％の変動は、開示された方法を実施するのに適切であるため、「約」という用語は、量、時間の長さ等のような測定可能な値をさす時、そのような変動を包含するものとする。
【００３１】
疾患もしくは障害の症状の重症度、そのような症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が低下する場合、疾患または障害は「軽減される」または「処置される」。
【００３２】
本明細書において使用されるように、「ALT」という用語は、アラニンアミノトランスフェラーゼをさす。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「AST」という用語は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをさす。
【００３４】
本明細書において使用されるように、「BUN」という用語は、血中尿素窒素をさす。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、本発明において有用な少なくとも1種の化合物と薬学的に許容される担体との混合物をさす。薬学的組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、鼻腔内、頬、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼、肺、および局所の投与を含むが、これらに限定されない、化合物投与の複数の技術が、当技術分野に存在する。
【００３６】
本明細書において使用されるように、「CRMP」という用語は、ミトコンドリアプロトノフォアの制御放出経口製剤をさす。本明細書において使用されるように、「ERDNP」および「CRMP」という用語は、交換可能に使用される。
【００３７】
本明細書において使用されるように、「DAG」という用語は、ジアシルグリセロールをさす。
【００３８】
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が寛解しない場合には動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態である。
【００３９】
対照的に、動物における「障害」とは、動物がホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康状態が、障害が存在しない場合より不都合である健康状態である。未処置にされた場合、障害は、動物の健康状態のさらなる減少を必ずしも引き起こさない。
【００４０】
本明細書において使用されるように、「DNP」および「2,4-DNP」という用語は、2,4-ジニトロフェノール、またはその塩もしくは溶媒和化合物、またはそれらの任意の組み合わせをさす（図1）。
【００４１】
送達ビヒクルの「有効量」とは、効果的に化合物に結合するかまたは化合物を送達するのに十分な量である。
【００４２】
本明細書において使用されるように、「有効量」、「薬学的に有効な量」、および「治療的に有効な量」という用語は、無毒であるが所望の生物学的結果を提供するために十分な薬剤の量をさす。結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の低下および／もしくは軽減、または生物学的系の他の所望の改変であり得る。個々の症例における適切な治療量は、ルーチンの実験を使用して、当業者によって決定され得る。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「効力」という用語は、アッセイにおいて達成される最大効果（Emax）をさす。
【００４４】
本明細書において使用されるように、「ERDNP」という用語は、長期放出型の2,4-ジニトロフェノール、その塩もしくは溶媒和化合物、またはそれらの任意の組み合わせをさす。
【００４５】
本明細書において使用されるように、「LC/MS/MS」という用語は、液体クロマトグラフィ／質量分析／質量分析をさす。
【００４６】
本明細書において使用されるように、「NAFLD」という用語は、非アルコール性脂肪肝疾患をさす。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「NMR」という用語は、核磁気共鳴法をさす。
【００４８】
本明細書において使用されるように、「患者」、「個体」、または「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物をさす。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ類、ウシ類、ブタ類、イヌ類、ネコ類、およびマウス類の哺乳動物などの家畜およびペットが含まれる。好ましくは、患者、個体、または対象は、ヒトである。
【００４９】
本明細書において使用されるように、「PC」という用語は、ピルビン酸カルボキシラーゼをさす。
【００５０】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を抑止せず、比較的無毒である担体または希釈剤などの材料をさす。即ち、材料は、不要な生物学的効果を引き起こすことなく、それが含有されている組成物の成分のいずれかと有害に相互作用することなく、個体へ投与され得る。
【００５１】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、意図された機能を実施するよう、患者における、または患者への、本発明において有用な化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液状または固形の増量剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料を意味する。典型的には、そのような構築物は、ある器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分へ運搬されるかまたは輸送される。各担体は、本発明において有用な化合物を含む製剤の他の成分と適合性であって、患者にとって有害でないという意味で、「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として役立つ材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：乳糖、グルコース、およびショ糖などの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ロウなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；界面活性剤；アルギン酸；発熱性物質不含水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤において利用されるその他の無毒の適合性の物質。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の活性と適合性であり、患者に対して生理学的に許容される、全てのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤も含まれる。補足的な活性化合物が組成物へ組み入れられてもよい。「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩がさらに含まれ得る。本発明の実施において使用される薬学的組成物に含まれ得るその他の付加的な成分は、当技術分野において公知であり、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences（Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA）に記載されている。
【００５２】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される塩」という語は、無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基、それらの溶媒和化合物、水和物、およびクラスレートを含む、薬学的に許容される無毒の酸および塩基から調製された、投与される化合物の塩をさす。適当な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製され得る。無機酸の例には、硫酸塩、硫酸水素塩、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、ならびにリン酸（リン酸水素塩およびリン酸二水素塩を含む）が含まれる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、アラリファティック（araliphatic）、複素環式、カルボン酸クラス、およびスルホン酸クラスの有機酸より選択され得、それらの例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン（パモ）酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、βヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸が含まれる。本発明の化合物の適当な薬学的に許容される塩基付加塩には、例えば、アンモニウム塩、ならびに、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、および亜鉛塩などの、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および遷移金属塩を含む金属塩が含まれる。薬学的に許容される塩基付加塩には、例えば、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインなどの塩基性アミンから作成された有機塩も含まれる。これらの塩は、全て、例えば、適切な酸または塩基を化合物と反応させることによって、対応する化合物から調製され得る。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「PKCε」という用語は、プロテインキナーゼCεをさす。
【００５４】
本明細書において使用されるように、「PKCθ」という用語は、プロテインキナーゼCθをさす。
【００５５】
本明細書において使用されるように、「効力」という用語は、最大の半分の応答を生ずるために必要とされる用量（ED50）をさす。
【００５６】
本明細書において使用されるように、「防止する」または「防止」という用語は、障害もしくは疾患が起こっていない場合、障害もしくは疾患の発症がないことを意味し、または、障害もしくは疾患の発症が既に存在する場合、障害もしくは疾患のさらなる発症がないことを意味する。障害または疾患に関連した症状のいくつかまたは全部を防止する能力も考慮される。
【００５７】
本明細書において使用されるように、対象における「重大な体温上昇」という用語は、対象に対する有害効果に関連した体温上昇をさし、疾病、身体的な不快または疼痛、昏睡、および死亡に限定されない。一つの非限定的な態様において、重大な体温上昇は、約0.5℃、約1℃、約1.5℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、またはそれ以上の増加である。別の非限定的な態様において、重大な体温上昇は、約5分、約15分、約30分、約45分、約1時間、約1.5時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約12時間、約14時間、約16時間、約18時間、約20時間、約22時間、約24時間、またはそれ以上続く。
【００５８】
本明細書において使用されるように、対象における「重大な全身毒性」という用語は、対象に対する有害効果に関連した全身毒性をさし、疾病、身体的な不快または疼痛、昏睡、および死亡に限定されない。一つの非限定的な態様において、重大な全身毒性は、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される。
【００５９】
本明細書において使用されるように、「TAG」という用語は、トリアシルグリセロールをさす。
【００６０】
本明細書において使用されるように、「T2D」という用語は、2型糖尿病をさす。
【００６１】
本明細書において使用されるように、「TCA」という用語は、トリカルボン酸回路をさす。
【００６２】
「治療的」処置とは、それらの兆候を減弱させるかまたは排除する目的で、病理の兆候を示す対象へ投与される処置である。
【００６３】
本明細書において使用されるように、「処置」または「処置すること」という用語は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を治療するか、治癒させるか、軽減するか、緩和するか、改変するか、矯正するか、寛解させるか、改善するか、または影響を与える目的での、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者への（単独のもしくは他の薬学的薬剤と組み合わせられた）治療剤、即ち、本発明において有用な化合物の適用もしくは投与、または（例えば、診断もしくはエクスビボ適用のための）患者から単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。そのような処置は、薬理ゲノミクスの領域から入手された知識に基づき、具体的に調整されるかまたは修飾され得る。
【００６４】
本明細書において使用されるように、「VLDL」という用語は、超低密度リポタンパク質をさす。
【００６５】
本明細書において使用されるように、「WAT」という用語は、白色脂肪組織をさす。
【００６６】
本明細書において使用されるように、「ZDF」という用語は、ズッカー糖尿病肥満をさす。
【００６７】
範囲：本開示の全体にわたって、本発明の様々な局面が、範囲フォーマットで提示され得る。範囲フォーマットでの記載は、便宜および簡潔さのためのものに過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の幅に関わらず当てはまる。
【００６８】
説明
本発明は、DNPの低い持続的な用量が、対象において高熱および全身毒性を引き起こすことなく、対象において肝臓脂肪症を低下させ、インスリン感受性を改善し、耐糖能を改善し、血糖を低下させ、かつ／または肝炎症を逆転させるという予想外の発見に関する。ある種の態様において、対象は哺乳動物である。さらに他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００６９】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）のラットモデルにおいて、極低用量のDNP（またはその他のミトコンドリアプロトノフォア）の連続注入を投与することによって、関連した全身毒性なしに、有意な肝臓ミトコンドリア脱共役を達成し、肝臓脂肪酸酸化の増加、肝臓脂肪含量の減少、ならびに肝臓および末梢のインスリン抵抗性の逆転をもたらすことができるという予想外の発見に、一部分、関する。先行技術研究におけるDNPの毒性は、治療効果を達成するために必要とされるものより何倍も大きいピーク血漿濃度をもたらす経口DNPの薬物動態によるものであった。DNPの高熱および関連する毒性が全身性ミトコンドリア脱共役に関係するオンターゲット効果であるという事実を考慮すると、DNPの徐放製剤は、ミトコンドリア脱共役剤によって典型的に起こる高熱および関連する全身毒性を回避しながら、肝臓トリグリセリドの代謝を促進するための有効で安全なアプローチである。
【００７０】
一つの局面において、本発明は、本発明の組成物および方法におけるミトコンドリア脱共役剤の使用を企図する。ある種の態様において、ミトコンドリア脱共役剤には、DNPが含まれる。さらに他の態様において、ミトコンドリア脱共役剤には、CCCP、FCCP、2,6-ジニトロフェノール、または任意の公知の2,4-DNP類似体／誘導体／異性体が含まれる。
【００７１】
本明細書において証明されるように、DNPの連続的な低用量胃内注入において達成された0.5μM〜50μM、例えば、1〜3μMのDNPの持続的な血漿および肝臓の濃度は、NAFLDのよく確立されている高脂肪ラットモデルにおいて、脂肪肝および全身インスリン抵抗性を逆転させた。これらの血漿DNP濃度は、DNP毒性が最初に検出される閾値のおよそ100分の1であった。これらの結果に基づき、24時間にわたり低い持続的な血漿DNP濃度をもたらすDNPの長期放出調製物を製剤化した。それによって、DNPと比較して、ERDNPの毒性用量と有効用量との比の500倍の改善がもたらされた。
【００７２】
ERDNP処置の慢性の安全性および効力の研究を実施した。慢性の毎日のERDNP処置は、6週間まで、ラットにおいて耐容性が良く、行動、体温、摂食量、運動量、または体重の変化はなかった。さらに、慢性ERDNP処置は、肝酵素、BUN、もしくはクレアチニンの上昇、または肝臓もしくは腎臓の組織学の有害な変化の欠如によって示されたように、全身または肝／腎毒性に関連していなかった。
【００７３】
効力に関して、慢性ERDNP処置は、肝臓TAG含量の50％の低下をもたらした。肝臓脂肪含量のこの低下は、肝臓ミトコンドリアVTCA回路フラックスの60％の増加に起因するものであり得、それは、完全に肝臓脂肪酸化の70％の増加によるものであった。肝臓脂質含量のこの低下は、空腹時血漿グルコース濃度、肝臓グルコース生成の基底速度の著しい低下、および全身インスリン感受性の改善に関連していた。肝臓グルコース生成の基底速度の低下は、VPCフラックスの25％の低下に起因するものであり得、それは、PC活性の重要なアロステリック制御因子であるアセチルCoAの濃度の50％の低下による二次的なものである可能性が最も高かった。対照的に、肝臓のPEP-CK、PC、またはG6Paseタンパク質発現に対するERDNP処置の効果はなかった。
【００７４】
次に、全身インスリン感受性のERDNPによる改善は、高血糖正常血糖クランプ法における肝臓グルコース生成の抑制の2.5倍の増加およびインスリンによって刺激される末梢グルコース取り込みの3倍の増加によって反映されたような、肝臓および筋肉の両方のインスリン応答性の増加に起因するものであり得る。このERDNPによって誘導された肝臓および筋肉のインスリン感受性の増加は、それぞれ、肝臓および筋肉のDAG含量、ならび肝臓および筋肉におけるPKCεおよびPKCθの活性の＞50％の低下に起因するものであり得る。DAG-nPKC活性化は、NAFLDのヒトモデルおよび動物モデルの両方において肝臓および筋肉のインスリン抵抗性を引き起こすことに関与している。観察されたERDNPによるTAG/DAG含量の低下は、少なくとも一部分、肝臓VLDL運び出しの80％の低下に起因するものであり得る。理論によって拘束されることは望まないが、ERDNPは骨格筋においてミトコンドリア脱共役を促進し得るが、20倍高いDNP濃度が四頭筋において有意なミトコンドリア脱共役を引き起こさなかったという事実から、この可能性はより低い。
【００７５】
ERDNPの安全性および効力を、NASHに関連したT2Dのモデル、ZDFラットにおいて調査した。これらの動物において、2週間のERDNP処置は、肝臓脂肪含量の65％の低下、ならびに血漿のALTおよびASTの正常化によって反映されるような肝炎症の逆転をもたらし、NASHの逆転におけるERDNPの可能性のある役割を強調した。さらに、ZDFラットにおいて、ERDNPは、空腹時血漿グルコース濃度の400mg/dLの低下を引き起こした。それは、腹腔内糖負荷試験におけるより低い血漿のグルコースおよびインスリンの濃度によって反映されるような、全身インスリン感受性の著しい改善に起因するものであり得る。他の動物研究において観察された全身毒性の欠如と一致して、ZDFラットにおける慢性ERDNP処置は、耐容性が良く、行動、体温、摂食行動、体重、または運動量の改変を引き起こさず、腎機能の変化に関連していなかった。
【００７６】
一つの局面において、本研究は、低い持続的な全身放出を促進するため、DNPの薬物動態を改変することによって、DNPの治療域が500倍超増加することを示す。慢性ERDNP投与は、全身、肝臓、または腎臓の毒性なしに、ラットにおいて、NAFLD/NASH、インスリン抵抗性、および2型糖尿病を逆転させた。総合すると、これらのデータは、NAFLD/NASHの関連流行病、メタボリックシンドローム、および2型糖尿病の処置のためのERDNPの利用可能性を支持する。
【００７７】
DNPの治療用低用量持続放出製剤を含む本発明の組成物は、以下に限定されないが、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、リポジストロフィー（遺伝性）、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌などの疾患または障害の処置において有用である。
【００７８】
ある種の態様において、本発明の組成物および方法は、以下に限定されないが、NAFLD、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、後天性リポジストロフィー、遺伝性リポジストロフィー、部分的リポジストロフィー、インスリン抵抗性、2型糖尿病（T2D）、肥満、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、肝線維症、肝硬変、肝細胞癌、フリーラジカルによって媒介される酸化的損傷が組織変性をもたらす疾患、および細胞が不適切にアポトーシスを受ける疾患などの疾患または障害を処置するかまたは防止するために使用され得、自己免疫疾患、先天性筋ジストロフィー、致死性乳児ミオパチー、「遅発性」ミオパチー、MELAS（ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中）、MIDD（ミトコンドリア糖尿病・難聴）、MERRF（赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）、関節炎、NARP（神経障害；運動失調；網膜色素変性）、MNGIE（ミオパチーおよび外眼筋麻痺；神経障害；胃腸；脳症）、LHON（レーバー；遺伝性；視；神経障害）、カーンズ・セイヤー病、ピアソン症候群、PEO（進行性外眼筋麻痺）、ウォルフラム症候群、DIDMOAD（尿崩症、糖尿病、視神経萎縮症、難聴）、ADPD（アルツハイマー病；パーキンソン病）、AMFD（運動失調、ミオクローヌス、および難聴）、CIPO（慢性偽性腸閉塞；ミオパチー；眼筋麻痺）、CPEO（慢性進行性外眼筋麻痺）、母系遺伝難聴、アミノグリコシド誘発難聴、DEMCHO（認知症；舞踏病）、DMDF（糖尿病；難聴）、運動耐容能低下、ESOC（てんかん；脳卒中；視神経萎縮症；認知機能低下）、FBSN（家族性両側性線条体壊死）、FICP（致死性乳児心筋症およびMELAS関連心筋症）、GER（胃腸逆流症）、LIMM（致死性乳児ミトコンドリアミオパチー）、LDYT（レーバー遺伝性視神経障害およびジストニア）、MDM（ミオパチー；糖尿病）、MEPR（ミオクローヌスてんかん；精神運動機能低下）、MERME（MERRF/MELASオーバーラップ疾患）、MHCM（母系遺伝肥大型心筋症）、MICM（母系遺伝心筋症）、MILS（母系遺伝リー症候群）、ミトコンドリア脳心筋症、ミトコンドリア脳筋症、ミトコンドリア筋症、MMC（母系ミオパチー；心筋症）、多系ミトコンドリア障害（ミオパチー；脳症；失明；聴覚消失；末梢神経障害）、NIDDM（インスリン非依存性糖尿病）、PEM（進行性脳症）、PME（進行性ミオクローヌスてんかん）、レット症候群、SIDS（乳幼児突然死症候群）、SNHL（感音難聴）、リー症候群、ジストニア、統合失調症、および乾癬を含むが、これらに限定されない、多様な疾患の処置を含む。
【００７９】
ある種の態様において、疾患または障害は、NAFLDである。さらに他の態様において、疾患または障害は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）である。さらに他の態様において、疾患または障害は、肝臓脂肪症である。さらに他の態様において、疾患または障害は、2型糖尿病である。さらに他の態様において、疾患または障害は、後天性リポジストロフィーである。さらに他の態様において、疾患または障害は、遺伝性リポジストロフィーである。さらに他の態様において、疾患または障害は、部分的リポジストロフィーである。さらに他の態様において、疾患または障害は、高トリグリセリド血症である。さらに他の態様において、疾患または障害は、肥満である。さらに他の態様において、疾患または障害は、メタボリックシンドロームである。さらに他の態様において、疾患または障害は、インスリン抵抗性である。さらに他の態様において、疾患または障害は、レット症候群である。さらに他の態様において、疾患または障害は、加齢に関連したメタボリックシンドロームである。さらに他の態様において、疾患または障害は、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患である。さらに他の態様において、疾患または障害は、フリートライヒ運動失調症である。さらに他の態様において、疾患は、肝線維症である。さらに他の態様において、疾患は、肝硬変である。さらに他の態様において、疾患は、肝細胞癌である。
【００８０】
持続放出製剤および制御放出製剤
一つの局面において、本発明は、DNPの持続放出のための製剤を提供する。ある種の態様において、本発明は、治療的に有効な量のDNPまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和化合物を含む、DNPの持続放出製剤を提供する。本明細書において使用されるように、「持続放出」または「長期放出」とは、DNPまたは薬学的に許容されるその塩の（毒性レベルより低い）治療的に有益な血中レベルが長期間にわたり維持されるよう調節された速度で、DNPまたは薬学的に許容されるその塩が、製剤から放出されるという事実をさす。あるいは、「持続放出」または「長期放出」とは、所望の薬理学的効果が長期間にわたり維持されることを意味する。
【００８１】
一つの局面において、本発明は、投薬の頻度を低下させることによって、患者の便宜が増強される可能性を提供する。別の局面において、より低い投薬頻度は、患者が経時的に薬物のより低いピーク濃度に曝されるため、低下した副作用を提供する。
【００８２】
ある種の態様において、本発明は経口持続放出製剤を提供する。さらに他の態様において、本発明の組成物は経口持続放出用に製剤化される。しかしながら、本発明は経口製剤のみに限定されると解釈されるべきでなく、DNPの低用量持続放出を提供する製剤の任意の形態を包含する。
【００８３】
ある種の態様において、本発明の持続放出製剤は、注射可能なまたは即時放出型の製剤について観察されるものより長い期間（例えば、少なくとも約8〜12時間）にわたり薬物の制御放出を提供する。他の態様において、持続放出は、1ヶ月以上ほどの長さであり得る期間にわたるものであり、ボーラス形態で投与された同量の薬剤より長い放出であるべきである。さらに他の態様において、期間は、約1日、約2日、約1週間、約2週間、約1ヶ月、約2ヶ月、およびその間の全ての範囲より長い。さらに他の態様において、期間は約12〜約24時間である。さらに他の態様において、期間は約12時間である。さらに他の態様において、期間は約14時間である。さらに他の態様において、期間は約24時間である。
【００８４】
ある種の態様において、持続放出製剤は1日1回投与される。他の態様において、持続放出製剤は1日2回投与される。さらに他の態様において、持続放出製剤は1日3回投与される。
【００８５】
ある種の態様において、持続放出は、対象において本発明のプロトノフォアの定常状態血漿濃度を提供する。他の態様において、定常状態血漿濃度は、約0.05μM〜約200μMの範囲である。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約0.05μM〜約50μMの範囲である。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約0.5μM〜約50μMの範囲である。さらに他の態様において、ピーク血漿濃度は、約400μM以下である。さらに他の態様において、ピーク血漿濃度は、約300μM以下である。さらに他の態様において、ピーク血漿濃度は、約30μM以下である。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約1μM〜約10μMの範囲である。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約1μM〜約5μMの範囲である。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約5μMである。さらに他の態様において、定常状態血漿濃度は、約3μMである。
【００８６】
ある種の態様において、持続放出製剤は、対象において本発明の化合物の組織濃度を提供する。他の態様において、組織濃度は、10μM以下である。さらに他の態様において、組織濃度は、5μM以下である。さらに他の態様において、組織濃度は、2μM以下である。
【００８７】
本発明の化合物またはその塩は、持続放出送達系に均質に分散していてよい。ある種の態様において、化合物は、約1mg〜約200mg；約1mg〜約150mg；約1mg〜約125mg；または約1mg〜約100mgの量で組成物中に存在する。ある種の態様において、化合物または薬学的に許容されるその塩は、約2mg〜約5mg；約5mg〜約80mg；約10mg〜約70mg；約15mg〜約60mg；約40mg〜約80mg；約50mg〜約70mg；または約45mg〜約60mgの量で組成物中に存在する。ある種の態様において、化合物または薬学的に許容されるその塩は、約2mg；約20mg、約40mg、約60mg、約75mg、約80mg、約100mg、約120mg、約140mg、約150mg、約160mg、約175mg、約180mg、または約200mgの量で組成物中に存在する。
【００８８】
ある種の態様において、組成物中の化合物または薬学的に許容されるその塩と持続放出送達系との比は、一般に、約4:1〜約1:25である。いくつかの態様において、化合物または薬学的に許容されるその塩と持続放出送達系との比は、一般に、約2.5:1〜約1:4である。いくつかの態様において、化合物または薬学的に許容されるその塩と持続放出送達系との比は、約5:1〜約1:5、約4：1〜約1:4、約3:1〜約1:3、約2:1〜約1:2、約1:1〜約1：5、約1:1〜約1:4、約1:1〜約1:3、約1:1〜約1.2、および約1:2〜約1:3である。いくつかの態様において、化合物または薬学的に許容されるその塩と持続放出送達系との比は、約1:1、約1:2、約1:2.5、約1:3、約1:4、または約1:5である。
【００８９】
持続放出のため、化合物は、化合物に持続放出特性を提供する適当なポリマーまたは疎水性材料によって製剤化され得る。そのため、化合物は、例えば、注射によって、微粒子の形態で、または移植によって、ウエハもしくはディスクの形態で投与され得る。
【００９０】
ある種の態様において、本発明の化合物は、持続放出製剤を使用して、単独でまたは他の薬学的薬剤と組み合わせて、患者へ投与される。
【００９１】
ある種の態様において、本発明の化合物の持続放出製剤は、経口投与可能な固形投薬製剤である。経口固形投薬製剤の非限定的な例には、錠剤、多数の顆粒を含むカプセル、舌下錠、粉末、顆粒、シロップ、およびバッカル剤形が含まれる。ある種の態様において、錠剤は、腸溶性コーティングまたは親水性コーティングを有する。
【００９２】
ある種の態様において、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩が添加される前に、持続放出送達系が乾式造粒または湿式造粒によって調製されるが、成分は、許容される生成物を作製するため、凝集技術によって一緒にされてもよい。湿式造粒技術においては、成分（例えば、親水性化合物、架橋剤、薬学的希釈剤、カチオン性架橋化合物、疎水性ポリマー等）を共に混合し、次いで、湿塊を作製するため、1種以上の液体（例えば、水、プロピレングリコール、グリセロール、アルコール）によって湿らせ、その後、それを乾燥させる。次いで、乾燥塊を、持続放出送達系の顆粒へと従来の装置によって粉砕する。その後、造粒された組成物を作製するため、持続放出送達系を、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩と所望の量で混合し、任意で、1種以上の湿潤剤、1種以上の滑沢剤、1種以上の緩衝剤、1種以上の着色剤、1種以上の第2の親水性化合物、またはその他の従来の成分と混合する。例えば、高剪断混合機によって、持続放出送達系および本発明の化合物を混和することができる。本発明の化合物は、好ましくは、微細に均質に持続放出送達系に分散させられる。造粒された組成物を、均一な錠剤のバッチを作成するのに十分な量で、典型的な圧縮圧、即ち、約2,000〜16,000psiで、従来の生産規模打錠機における打錠に供する。ある種の態様において、混合物は、その後に液体に曝された時に水和が困難である点にまで圧縮されるべきではない。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、乾式造粒または湿式造粒によって調製される。持続放出送達系の成分は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩と共に添加される。あるいは、許容される生成物を生ずるため、凝集技術によって全成分を一緒にしてもよい。湿式造粒技術においては、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩、および成分（例えば、親水性化合物、架橋剤、薬学的希釈剤、カチオン性架橋化合物、疎水性ポリマー等）を共に混合し、次いで、湿塊を作製するため、1種以上の液体（例えば、水、プロピレングリコール、グリセロール、アルコール）によって湿らせ、その後、それを乾燥させる。次いで、乾燥塊を、従来の装置によって顆粒へと粉砕する。任意で、1種以上の湿潤剤、1種以上の滑沢剤、1種以上の緩衝剤、1種以上の着色剤、1種以上の第2の親水性化合物、またはその他の従来の成分も、造粒物へ添加する。造粒された組成物を、均一な錠剤のバッチを作成するのに十分な量で、典型的な圧縮圧、即ち、約2,000〜16,000psiで、従来の生産規模打錠機における打錠に供する。ある種の態様において、混合物は、その後に液体に曝された時に水和が困難である点にまで圧縮されるべきではない。
【００９４】
ある種の態様において、造粒された組成物の平均粒子サイズは、約50μm〜約400μmである。ある種の態様において、平均粒子サイズは、約185μm〜約265μmである。造粒された組成物の平均密度は、約0.3g/mL〜約0.8g/mLである。ある種の態様において、平均密度は、約0.5g/mL〜約0.7g/mLである。造粒物から形成された錠剤は、一般に、約4Kp〜約22kPの硬度を有する。造粒物の平均流動は、約25〜約40g/秒である。
【００９５】
一つの局面において、本発明は、異なる速度で本発明の化合物を放出するよう層が製剤化されている多層固形剤形を提供する。例えば、ある種の態様において、第2の層は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩と、治療的に有益な血中レベルが長期間（例えば、約8〜約12時間）にわたり維持されるよう調節された速度で本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を放出するよう設計された持続放出送達系とを含む長期放出層である。第1の層は、短期間（例えば、約1〜約2時間）に治療的に有益な血中レベルを達成するため、第2の層の速度より速い速度で本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を放出するよう設計された、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩の製剤を含む即時放出層である。いくつかの態様において、第1の層は持続放出送達系を含む。いくつかの態様において、第1の層は持続放出送達系を含まない。
【００９６】
いくつかの態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約10:1〜約1:10、約9:1〜約1:9、約8:1〜約1:8、約7:1〜約1:7、約6:1〜約1:6、約5:1〜約1:5、約4:1〜約1:4、約3:1〜約1:3、約2:1〜約1:2である。ある種の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約5:1〜約1:5である。さらに他の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約1:1〜約1:2である。さらに別の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約1:1、約1:1.2、約1:1.4、約1:1.6、約1:1.8、または約1:2である。ある種の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約1:2である。ある種の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約1:1.4である。いくつかの態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約3:1、約2.5:1、約2:1、約1.5:1である。ある種の態様において、第2の層と第1の層との重量比は、約2.5:1である。
【００９７】
いくつかの態様において、多層剤形は、薬学的崩壊剤をさらに含む。崩壊剤は、即時放出層からの本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩の溶解および吸収を促進する。薬学的崩壊剤の非限定的な例には、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコレート、クロスポビドン、および未修飾デンプンが含まれる。ある種の態様において、崩壊剤は、剤形の第1の層（即ち、即時放出層）にある。ある種の態様において、崩壊剤は、約1.5mg〜約4.5mgの量で層に存在する。ある種の態様において、崩壊剤は、約2〜10重量％の量で層に存在する。ある種の態様において、崩壊剤は、約5重量％の量で層に存在する。層が持続放出送達系を含有している時、持続放出送達系と崩壊剤との重量比は、約5:1〜約1:5の範囲にある。いくつかの態様において、持続放出送達系と崩壊剤との重量比は、約1:1〜約3:1の範囲にある。他の態様において、持続放出送達系と崩壊剤との重量比は、約2:1の範囲にある。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明の多層錠は、最初に即時放出層混和物および長期放出層混和物を別々に調製することによって調製される。本明細書中に別途記載されるように、長期放出層を調製する。次いで、長期放出層の湿式造粒を乾燥させ、適切なサイズに粉砕する。ステアリン酸マグネシウムを添加し、粉砕された造粒物と混合する。本発明の即時放出層は、最初に、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を、1種以上の希釈剤（例えば、微結晶セルロース）と混合することによって調製される。次いで、この混合物を、1種以上の崩壊剤と任意で混合する。混和物をステアリン酸マグネシウムと混合する。最後に、即時放出層混和物および長期放出層混和物を、多層（例えば、2層）錠へ圧縮する。
【００９９】
ある種の態様において、本発明の製剤は、短期製剤、急速オフセット（rapid-offset）製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、遅延放出製剤およびパルス放出製剤であり得るが、これらに限定されない。
【０１００】
遅延放出という用語は、薬物投与後、いくらかの遅延の後に薬物の初期放出を提供し、必ずしもそうではないが約10分〜約12時間の遅延を含み得る薬物製剤をさすため、その従来の意味で、本明細書において使用される。
【０１０１】
パルス放出という用語は、薬物投与後に薬物のパルス状の血漿プロファイルを生ずるような方式で薬物の放出を提供する薬物製剤をさすため、その従来の意味で、本明細書において使用される。
【０１０２】
即時放出という用語は、薬物投与直後に薬物の放出を提供する薬物製剤をさすため、その従来の意味で使用される。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、短期とは、薬物投与後の約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分までの期間、およびそれらの完全なまたは部分的な増大をさす。
【０１０４】
本明細書において使用されるように、急速オフセットとは、薬物投与後の約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分までの期間、およびそれらの完全なまたは部分的な増大をさす。
【０１０５】
方法
本発明は、その必要のある対象における疾患または障害の防止または処置の方法を含む。方法は、2,4-ジニトロフェノール（DNP）、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含み、対象において化合物の持続放出を提供する薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含み、それによって、対象における疾患または障害が、対象において処置されるかまたは防止される。
【０１０６】
本発明は、その必要のある対象においてエネルギー消費を増加させる方法をさらに含む。方法は、DNP、その塩、その溶媒和化合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含み、対象において化合物の持続放出を提供する薬学的組成物の治療的に有効な量を対象へ投与する段階を含み、それによって、対象においてエネルギー消費が増加する。
【０１０７】
ある種の態様において、疾患または障害は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、リポジストロフィー（遺伝性）、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種である。
【０１０８】
ある種の態様において、対象は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝臓脂肪症、2型糖尿病（T2D）、後天性リポジストロフィー、リポジストロフィー（遺伝性）、部分的リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、肥満、メタボリックシンドローム、レット症候群、加齢に関連したメタボリックシンドローム、活性酸素種（ROS）の増加に関連した代謝疾患、フリートライヒ運動失調症、インスリン抵抗性、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害に罹患している。
【０１０９】
ある種の態様において、化合物の治療的に有効な用量は、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の範囲である。他の態様において、組成物の投与は、対象において約0.05μM〜約200μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、組成物の投与は、対象において約0.5μM〜約50μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、組成物の投与は、対象において約1μM〜約10μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。さらに他の態様において、組成物の投与は、対象において約3μM〜約5μMの範囲の化合物の定常状態血漿濃度をもたらす。
【０１１０】
ある種の態様において、対象における化合物の定常状態血漿濃度は、対象における化合物の毒性濃度の約50分の1〜約100分の1である。
【０１１１】
ある種の態様において、組成物の投与は、約12時間〜約24時間の範囲の期間、対象において化合物の治療的に有効なレベルをもたらす。ある種の態様において、組成物は、1日1回、2回、または3回、対象へ投与される。
【０１１２】
ある種の態様において、組成物の投与は、対象において重大な全身毒性または重大な体温上昇を引き起こさない。他の態様において、重大な全身毒性は、組成物の投与の非存在下での対象における対応するレベルと比較した、肝酵素、血中尿素窒素、またはクレアチニンのレベルの増加によって示される。さらに他の態様において、組成物は経口投与用に製剤化されている。
【０１１３】
ある種の態様において、方法は、少なくとも1種の付加的な治療剤を対象へ投与する段階をさらに含む。他の態様において、組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤は、対象へ同時投与される。さらに他の態様において、組成物および少なくとも1種の付加的な治療剤は、共製剤化されている。
【０１１４】
ある種の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【０１１５】
組み合わせ治療
本発明の方法において有用な化合物は、疾患または障害を処置するために有用な1種以上の付加的な化合物と組み合わせて使用されてもよい。これらの付加的な化合物には、市販されているかまたは当業者が合成によって入手可能である化合物が含まれ得る。これらの付加的な化合物は、疾患または障害を処置するか、防止するか、またはその症状を低下させることが公知である。
【０１１６】
非限定的な例において、本発明において有用な化合物は、以下の治療薬のうちの1種以上と組み合わせて使用され得る。
【０１１７】
肺高血圧薬：アンブリセンタン、ボセンタン、トレプロスチニル、シルデナフィル、エポプロステノール、トレプロステノール（treprostenol）、イロプロスト、スピロノラクトンおよびエプレレノンのようなアルドステロン受容体アンタゴニスト、トランドラプリル、ホシノプリル、エナラプリル、カプトプリル、ラミプリル、モエキシプリル、リシノプリル、キナプリル、ベナゼプリル、およびペリンドプリルなどのアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【０１１８】
アンジオテンシンII阻害剤：エプロサルタン、オルメスミアン（olmesmian）、テルミスミアン（telmismian）、ロサルタン、バルスミアン（valsmian）、カンデサルタン、およびイルベスミアン（irbesmian）、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、および二硝酸イソソルビドのような抗狭心症剤、モリシジン、キニジン、ジソピラミド、フェニロイン（phenyloin）、プロパフェノン、フレカミド（flecamide）、メキシリテン（mexilitene）、リドカイン、プロカインアミド、プロプラノロール、アセブトロール、アミオダロン、ドフェチリド、ドロネダロン、ソタロール、イブチリド、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ニモジピン、フェロジピン、ニカルジピン、クレビジピン、イスラジピン、ベプリジル、ニソルジピン、アデノシン、およびジゴキシンを含む抗不整脈剤。
【０１１９】
βアドレナリン受容体アンタゴニスト：ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、アテノロール、ネビボロール、ナドロール、カルベジロール、ラベタロール、チモロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、およびエスモロール。
【０１２０】
抗糖尿病剤：インスリン、GLP-1アゴニスト、DPP4阻害剤、SGLT-2阻害剤、スルホニル尿素、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリベンクラミド、グリクラジドなどの分泌促進物質、ナテグリニド、セナグリニド（senaglinide）、レパグリニドなどのメグリチニド、ビグアナイド、メトホルミンなどのインスリン感受性改善薬、ロシグリタゾン、イサグリタゾン（isaglitazone）、ダルグリタゾン、エングリタゾン、およびピオグリタゾンなどのチアゾリジンジオン。
【０１２１】
αグルコシダーゼ阻害剤：ミグリトール、ボグリボース、エミグリテート、およびアカルボース。
【０１２２】
グルカゴン様ペプチドの類似体およびアゴニスト：エキセナチド、リラグルチド、およびタスプグルチド（taspglutide）、ビルダグリプチン、シタグリプチン、およびサキサグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ4阻害剤。
【０１２３】
アミリン類似体：プラムリンチド。
【０１２４】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPAR）α、β、δ、およびγのリガンドまたはアゴニスト。
【０１２５】
コレステロール降下剤：例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンなどのスタチンのようなヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムA（HMG-CoA）還元酵素阻害剤。
【０１２６】
レチノイドX受容体（RXR）のアゴニスト：ALRT-268、LG-1268、またはLG-1069；グルコキナーゼ活性化剤、糖新生および／またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素の阻害剤。
【０１２７】
利尿薬：アセタゾラミド、ジクロフェナミド、メタゾラミド、トルセミド、フロセミド、ブメタニド、エタクリン酸、アミロライド、トリアムテレン、インダパミド、メトラゾン、メチルクロチアジド（methylclothiazide）、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、メトラゾン、ベンドロフルメチアジド、ポリチアジド、およびクロルタリドン。
【０１２８】
血管拡張薬：アルプロスタジル、ヒドララジン、ミノキシジル、ネシリチド、およびニトロプルシド。
【０１２９】
抗脂血症剤：コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、プロブコール、またはデキストロチロキシン。
【０１３０】
アディポサイトカイン：レプチン、アディポネクチン、およびメトレレプチン。
【０１３１】
高脂血症の処置のための薬物：フィブラート、ω脂肪酸、魚油、スタチン。
【０１３２】
相乗効果は、例えば、シグモイドEmax式（Holford & Scheiner,1981,Clin.Pharmacokinet.6:429-453）、Loewe相加式（Loewe & Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326）、およびメジアンエフェクト（median-effect）式（Chou & Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22：27-55）のような適当な方法を使用して、例えば、計算され得る。薬物の組み合わせの効果の査定を補助するため、対応するグラフを生成するため、上述の各式を実験データへ適用することができる。上述の式に関連した対応するグラフは、それぞれ、濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、および併用係数曲線である。
【０１３３】
投与／投薬量／製剤
投与の計画は、本発明の組成物の有効用量を構成するものに影響を与え得る。本発明の組成物の治療用量は、疾患または障害の発病の前または後に対象へ投与され得る。さらに、いくつかの分割された投薬量およびスタッガード（staggered）投薬量が、毎日もしくは連続して投与されてもよいし、または用量は、連続注入されてもよいし、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、本発明の組成物の投薬は、治療または予防の状況の緊急性によって示されるように、比例して増加または減少させられ得る。
【０１３４】
患者、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトへの本発明の組成物の投与は、患者における疾患または障害を処置するのに有効な投薬量および期間で、公知の手法を使用して実施され得る。治療効果を達成するのに必要な本発明の組成物の有効量は、患者における疾患または障害の状態；患者の年齢、性別、および体重；ならびに患者における疾患または障害を処置する治療用製剤の能力のような要因に従って変動し得る。本発明の組成物の投薬は、最適の治療応答を提供するために調整され得る。例えば、いくつかの分割された用量が毎日投与されてもよいし、または治療の状況の緊急性によって示されるように、比例して用量が低下させられてもよい。本発明の治療用化合物についての有効用量の範囲の非限定的な例は、約1〜5,000mg/kg(体重)/日である。当業者であれば、過度の実験なしに、関連要因を研究し、本発明の組成物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
【０１３５】
本発明の薬学的組成物の中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与のモードについて、所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を入手するため、変動させられ得る。
【０１３６】
特に、選択された投薬量レベルは、利用される特定の化合物の活性、投与の時間、化合物の排出の速度、処置の期間、化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および過去の病歴等の医学分野において周知の要因を含む多様な要因に依る。
【０１３７】
当技術分野における通常の技術を有する医師、例えば、内科医または獣医は、本発明の組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、内科医または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルより低いレベルで、薬学的組成物において利用される本発明の組成物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることができる。
【０１３８】
具体的な態様において、投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で本発明の組成物を製剤化することが特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書において使用されるように、処置される患者のための単一の投薬量として適した物理的に不連続の単位をさし；各単位は、必要とされた薬学的ビヒクルと共同で所望の治療効果を生ずるために計算された予定された量の治療用化合物を含有している。本発明の投薬単位形態は、（a）治療用化合物の独特の特徴および達成される具体的な治療効果、ならびに（b）患者における疾患または障害の処置のためのそのような治療用化合物の調合／製剤化の分野に固有の制限によって指示され、直接それらに依存する。
【０１３９】
ある種の態様において、本発明の組成物は、1種以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して製剤化される。ある種の態様において、本発明の製剤は、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む。
【０１４０】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、ならびに植物油を含有している溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコールを、組成物に含めることが好ましい。注射可能組成物の長期的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１４１】
ある種の態様において、本発明の組成物は、1日1〜5回またはそれ以上の範囲の投薬量で患者へ投与される。さらに他の態様において、本発明の製剤は、毎日1回、2日に1回、3日に1回〜1週間に1回および2週間に1回を含むが、これらに限定されない投薬量の範囲で、患者へ投与される。本発明の様々な組み合わせ組成物の投与の頻度は、年齢、処置される疾患または障害、性別、全身健康、およびその他の要因を含むが、これらに限定されない多くの要因に依って、個体間で変動することが、当業者には容易に明白である。従って、本発明は、具体的な投薬計画に限定されると解釈されるべきでなく、患者へ投与される正確な投薬量および組成物は、患者に関する他の全ての要因を考慮して、担当する内科医によって決定される。
【０１４２】
ある種の態様において、本発明は、単独でまたは第2の薬学的薬剤と組み合わせて、治療的に有効な量の本発明の製剤を保持している容器と；患者における疾患または障害を処置するか、防止するか、またはその一つ以上の症状を低下させるために化合物を使用するための説明書とを含む、パッケージングされた薬学的製剤に関する。
【０１４３】
製剤は、経口、非経口、鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野において公知のその他の適当な投与モードのために適当な、従来の賦形剤、即ち、薬学的に許容される有機または無機の担体物質と混合されて利用され得る。薬学的調製物は、滅菌されてもよく、所望により、補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色物質、風味物質、および／または芳香物質等と混合されてもよい。それらは、望まれた場合、他の活性薬剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせられてもよい。
【０１４４】
本発明の組成物の投与ルートには、経口、鼻、直腸、膣内、非経口、頬、舌下、または局所が含まれる。本発明において使用するための化合物は、経口または非経口、例えば、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、鼻（内）および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所の投与のような適当な経路による投与のために製剤化され得る。
【０１４５】
適当な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルカプセル、トローチ、分散物、懸濁物、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮吸収型貼付剤、ゲル、粉末、ペレット、マグマ（magmas）、ロゼンジ、クリーム、ペースト、膏薬、ローション、ディスク、坐薬、経鼻投与または経口投与のための液体スプレー、吸入のための乾燥粉末またはエアロゾル製剤、膀胱内投与のための組成物および製剤等が含まれる。本発明において有用であろう製剤および組成物は、本明細書に記載される具体的な製剤および組成物に限定されないことが、理解されるべきである。
【０１４６】
経口投与
経口適用のため、特に適当であるのは、錠剤、糖衣錠、液体、ドロップ、坐薬、またはカプセル、カプレット、およびゲルカプセルである。経口使用が意図された組成物は、当技術分野において公知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、錠剤の製造のために適当な薬学的に不活性の無毒の賦形剤からなる群より選択される1種以上の薬剤を含有し得る。そのような賦形剤には、例えば、乳糖などの不活性希釈剤；コーンスターチなどの造粒剤および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ならびにステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が含まれる。錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、または外観を美しくするためもしくは活性成分の放出を遅延させるために、公知の技術によってコーティングされていてもよい。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとしても提示され得る。
【０１４７】
経口投与のため、本発明の組成物は、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、コーンスターチ、乳糖、微結晶セルロース、もしくはリン酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態であり得る。所望により、錠剤は、適当な方法、ならびにColorcon（West Point,Pa）から入手可能なOPADRY（商標）フィルムコーティング系（例えば、OPADRY（商標）OYタイプ、OYCタイプ、Organic Enteric OY-Pタイプ、Aqueous Enteric OY-Aタイプ、OY-PMタイプ、およびOPADRY（商標）White,32K18400）などのコーティング材料を使用して、コーティングされてもよい。経口投与用の液状調製物は、溶液、シロップ、または懸濁液の形態であり得る。液状調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油エステル、またはエチルアルコール）；および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはp-ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製され得る。
【０１４８】
活性成分の出発粉末またはその他の粒状材料を修飾するための造粒技術は、薬学分野において周知である。粉末は、典型的には、結合材料と混合され、「造粒物」と呼ばれる、より大きい永久に流動性の凝集物または顆粒にされる。例えば、溶媒を使用する「湿式」造粒過程は、一般に、粉末を、結合材料と合わせ、造粒された湿塊の形成をもたらす条件の下で水または有機溶媒によって湿らせ、次いで、それらから溶媒を蒸発させなければならないことを特徴とする。
【０１４９】
溶融造粒は、一般に、本質的に添加される水またはその他の液状溶媒の非存在下で、粉末材料またはその他の材料の造粒を促進するため、室温で固形または半固形の（即ち、比較的低い軟化点または融点の範囲を有する）材料の使用を含む。低融点固体は、融点範囲の温度に加熱された時、液化して結合剤または造粒ビヒクルとして作用する。液化された固体は、接触した粉末材料の表面上に広がり、冷却により、初1期材料が共に結合した造粒された固形塊が形成される。次いで、得られた溶融造粒を、経口剤形の調製のため、錠剤プレスに提供するかまたはカプセル化することができる。溶融造粒は、固形分散物または固溶体の形成によって、活性物質（即ち、薬物）の溶解速度および生物学的利用能を改善する。
【０１５０】
米国特許第5,169,645号は、改善された流動特性を有する直接圧縮可能なロウ含有顆粒を開示している。ロウを、ある種の流動改善添加剤と溶融混合し、続いて、混合物を冷却し造粒する時、顆粒が入手される。ある種の態様において、ロウと添加剤との溶融組み合わせのうちロウ自体のみが溶融し、他の場合において、ロウおよび添加剤の両方が溶融する。
【０１５１】
本発明は、本発明の1種以上の化合物の遅延放出を提供する層と、疾患または障害の処置のための薬物療法の即時放出を提供するさらなる層とを含む多層錠も含む。ロウ／pH感受性ポリマー混合物を使用して、活性成分が捕捉され、その遅延放出を確実にする胃不溶性組成物を入手することができる。
【０１５２】
非経口投与
非経口投与のため、本発明の組成物は、注射もしくは注入、例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下への注射もしくは注入のために製剤化されてもよいし、またはボーラス投与および／もしくは連続注入のために製剤化されてもよい。任意で、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤のようなその他の製剤化のための薬剤を含有している、油性または水性のビヒクルによる懸濁液、溶液、または乳濁液が使用されてもよい。
【０１５３】
付加的な投与形態
本発明の付加的な剤形には、米国特許第6,340,475号；第6,488,962号；第6,451,808号；第5,972,389号；第5,582,837号；および第5,007,790号に記載されるような剤形が含まれる。本発明の付加的な剤形には、米国特許出願第20030147952号；第20030104062号；第20030104053号；第20030044466号；第20030039688号；および第20020051820号に記載されるような剤形も含まれる。本発明の付加的な剤形には、PCT出願番号WO 03/35041；WO 03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；およびWO 90/11757に記載されるような剤形も含まれる。
【０１５４】
投薬
本発明の組成物の投薬は、患者の年齢、性別、および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに処置されている患者における疾患または障害の進行に依る。当業者は、これらおよびその他の要因に依って適切な投薬量を決定することができる。
【０１５５】
本発明の化合物の適当な用量は、1日当たり約0.001mg〜約5,000mg、例えば、約0.1mg〜約1,000mg、例えば、約1mg〜約500mg、例えば、1日当たり約5mg〜約250mgの範囲にあり得る。用量は、単回投与されてもよいし、または複数回、例えば、1日1〜4回もしくはそれ以上、投与されてもよい。複数回投与が使用される時、各投薬の量は、同一であってもよいしまたは異なっていてもよい。例えば、1日当たり1mgの用量が、約12時間の投与間隔で、0.5mgの2回投与として投与され得る。
【０１５６】
1日当たりの投薬される化合物の量は、非限定的な例において、毎日、隔日、2日毎、3日毎、4日毎、または5日毎に投与され得ることが理解される。例えば、隔日投与の場合、本発明の組成物の投薬が月曜日に開始され、その後の最初の低用量が水曜日に投与され、その後の2回目の低用量が金曜日に投与され、以後同様であり得る。ある種の態様において、化合物は少なくとも1日1回投薬される。さらに他の態様において、化合物は少なくとも1日2回投薬される。
【０１５７】
患者の状態が改善する場合、医師の裁量によって、本発明の阻害剤の投与は、任意で、連続的に与えられる；あるいは、投与される薬物の用量を一時的に低下させるか、またはある程度の時間、一時的に停止する（即ち「休薬」）。休薬の長さは、任意で、2日〜1年の間で変動し、例に過ぎないが、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日、または365日を含む。休薬中の用量低下には、10％〜100％が含まれ、例に過ぎないが、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％が含まれる。
【０１５８】
患者の状態の改善が起こった後、必要であれば、維持低用量を投与する。その後、投薬量もしくは投与の頻度またはその両方を、ウイルス量の関数として、改善された疾患が保持されるレベルにまで低下させる。ある種の態様において、患者は、症状および／または感染の再発により長期的に断続的な処置を必要とする。
【０１５９】
本発明の方法において使用するための化合物は、単位剤形へ製剤化され得る。「単位剤形」という用語は、処置を受ける患者のための単一の投薬量として適した物理的に不連続の単位をさし；各単位は、任意で、適当な薬学的担体と共同で、所望の治療効果を生ずるために計算された予定された量の活性材料を含有している。単位剤形は、1日1回投薬用であってもよいし、または1日複数回投薬（例えば、1日約1〜4回もしくはそれ以上）の1回分であってもよい。1日複数回投与が使用される時、単位剤形は、各用量について同一であってもよいしまたは異なっていてもよい。
【０１６０】
そのような治療計画の毒性および治療効力は、任意で、細胞培養物または実験動物において決定され、LD50（集団の50％に致死の用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）の決定を含むが、これらに限定されない。毒性効果と治療効果との間の用量比は、LD50とED50との間の比として表される治療指数である。細胞培養アッセイおよび動物研究から入手されたデータは、任意で、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を公式化するために使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、最小の毒性と共にED50を含む循環血中濃度の範囲内にある。投薬量は、任意で、利用される剤形および活用される投与ルートに依って、この範囲内で変動する。
【０１６１】
当業者は、本明細書に記載された具体的な手法、態様、請求項、および例の多数の等価物を認識するか、またはルーチンの実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内にあり、本明細書に添付された特許請求の範囲に内含されると見なされた。例えば、当技術分野において認識されている代替法による、ルーチンの実験のみを使用することによる、溶媒、触媒、圧力、雰囲気条件、例えば、窒素雰囲気、および還元剤／酸化剤といった、反応時間、反応サイズ／体積、および実験試薬を含むがこれらに限定されない反応条件における修飾は、本願の範囲内にあると理解されるべきである。
【０１６２】
値および範囲が本明細書において提供される時には必ず、これらの値および範囲に包含される全ての値および範囲が、本発明の範囲内に包含されることを意味することを理解されたい。さらに、これらの範囲内に含まれる全ての値、および値の範囲の上限または下限も、本願によって企図される。
【０１６３】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに例示する。しかしながら、それらは、本明細書に示される本発明の教示または開示を限定するものでは決してない。
【実施例】
【０１６４】
以下、本発明を、以下の実施例に関して説明する。これらの実施例は、例示のために提供されるに過ぎず、本発明は、これらの実施例に限定されず、本明細書に提供される教示の結果として明白である変動を全て包含する。
【０１６５】
動物：
スプラーグドーリーラット（300〜400g）およびズッカー糖尿病肥満ラット（250g）を、Charles River Laboratoriesから注文し、使用前に少なくとも1週間、馴化させた。他に明記されない限り、普通の固形飼料をラットに与えた。NAFLD逆転モデルにおいては、ラットに、明記された期間、ベニバナ油ベースの高脂肪食（カロリーの60％が脂肪由来）（Harlan）を与え、常時自由に水を摂取させた。
【０１６６】
ERDNPがNAFLDを防止するか否かを決定するため、2週間、ERDNP（1mg/kg）またはビヒクルによって毎日処置しながら、ラットにベニバナ油高脂肪食を摂取させた。NASHを誘導するため、ラットに、8週間、メチオニン／コリン欠乏食（Harlan）を摂取させ、次いで、1mg/kg ERDNPまたはビヒクルによって処置しながら、この食事を継続した。
【０１６７】
総頸動脈、頚静脈、および、明記された場合、胃噴門に、ポリエチレンカテーテル（Instech Solomon）（それぞれ、PE50チューブ、PE90チューブ、およびPE90チューブ）を設置するため、イソフルラン麻酔下で手術を実施した。DAG濃度の測定のため、ラットを6時間絶食させ、他の全ての研究のため、一晩（16時間）絶食させた。終末研究のため、静脈内ペントバルビタールによってラットを安楽死させた。
【０１６８】
胃内DNP注入研究のため、事前に2週間高脂肪食を摂取したラットを、カテーテルを保護し、かつ動物がケージへ自由に接近できるようにするため、1軸カウンターバランス付きスイベルマウントおよびステンレススチール1チャネルスイベル（全てInstech Solomon製）に付着したCovanceインフュージョンハーネスに置いた。DNP（1日当たり2mg/kg）またはビヒクル（10％ジメチルスルホキシド／90％生理食塩水ビヒクル）を、5日間、動脈ラインを通して連続注入した。
【０１６９】
ERDNPは、持続放出エチルセルロースコーティングによって、Emerson Resources Inc.（Malvem,PA）によって製剤化された。NAFLD逆転研究のために使用されたラットには、2週間、高脂肪食を摂取させ、その後、ピーナッツバターに馴化させるため、3日間、この食品によって処置した。次いで、5日間毎日、本文に明記された用量で、ピーナッツバターに混合されたERDNPまたはピーナッツバタービヒクルによって毎日処置した。ズッカー糖尿病肥満ラットを、14日間毎日、ピーナッツバター中のERDNP（1mg/kg）またはピーナッツバタービヒクルによって処置した。3日毎に、血糖値測定器（Abbott）によって尾静脈から血糖を測定した。
【０１７０】
NASH逆転研究のために使用されたラットは、上記のように、8週間、メチオニン／コリン欠乏食を摂取させられ、次いで、6週間、メチオニン／コリン欠乏食を継続しながら、1mg/kg ERDNPまたはビヒクルによって毎日処置された。
【０１７１】
正常雄C57BL/6Jマウスを、Jacksonから12週齢で注文し、普通の固形飼料を摂取させた。5日間の馴化の後、それらは代謝ケージ（CLAMS）分析を受けた。報告された摂食量は、ERDNPまたはビヒクルを投与するために使用された少量のピーナッツバター（およそ250mg）に由来するカロリー摂取量を含まない；しかしながら、ピーナッツバター量は群の間でマッチさせた。
【０１７２】
毒性研究：
アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、および血中尿素窒素を、COBAS Mira Plusを使用して測定し、クレアチニンをLC/MS/MSによって測定した。体温を直腸プローブ（Physitemp Instruments）を使用して測定した。組織学スライドを、ヘマトキシロン＆エオシン染色、シリウスレッド染色、およびTUNEL染色によって染色した。
【０１７３】
基礎代謝の研究：
血漿のインスリンおよびグルカゴンを、ラジオイムノアッセイによって測定した。血漿グルコースを、YSI Life Sciences 2700 Select Biochemistry Analyzerによって酵素的に測定した。12種の炎症マーカー、アディポネクチン、およびFGF-21の血漿濃度を、ELISA（それぞれ、QIAGEN、Life Technologies、およびMillipore）によって査定した。肝臓グリコーゲンを、アミログルコシダーゼ消化（Passonneau & Lauderdale,1974,Anal.Biochem.60:405-12）によって測定した。非エステル化脂肪酸濃度を、酵素キット（Wako）によって測定した。
【０１７４】
[3-13C]乳酸を注入されたラットの肝臓から全グルタミン酸濃縮を測定するため、およそ100mgの凍結肝臓を400μLの氷冷50％アセトニトリルにおいて均質化した。試料を10分間10,000gで遠心分離し、上清を単離した。4℃で一晩保管した後、試料を、Nanosep 100k Omegaフィルタ（Pall Life Sciences）を通して10分間10,000gで遠心分離した。フロースルーを、hypercarbカラム（Thermo Scientific；4.6×100mm；5μm粒子サイズ）で分離した後、LC/MS/MS（Applied Biosystems MDS SCIEX、4000 Q-TRAP）による多重反応モニタリング分析のためイオン化した。
【０１７５】
位置的なグルタミン酸およびアラニンの濃縮を測定するため、肝臓試料を核磁気共鳴（NMR）分光法のために抽出した。およそ4〜6gの破砕された肝臓をおよそ30mLの7％過塩素酸において遠心分離した。上清のpHを、必要に応じて30％水酸化カリウムおよび7％過塩素酸を使用して6.5〜7.5に調整し、抽出物を2〜3日間の凍結乾燥によって脱水した。抽出物を、500μLのリン酸カリウム緩衝液：100％D2O中の2.4mM NaCOOH、30mM K2HPO4、10mM KH2PO4、20mM DMSO（内部標準）に再懸濁させた。13C NMRスペクトルを、AVANCE 500-MHz NMR分光計（Bruker Instruments）を使用して収集した。
【０１７６】
緩和時間＝1s、ダミースキャン＝32、および1ブロック当たりのスキャン数＝8,192×3ブロックで、スペクトルを取得した。T1緩和時間の差についての補正率は、天然存在量のグルタミン酸溶液およびグルコース溶液の完全緩和スペクトルから決定された。LC/MS/MSによる全グルタミン酸濃縮を、T1緩和時間について補正された各炭素についての[13C]グルタミン酸のピーク面積に従って代数的に分割した。
【０１７７】
20μLのNMR抽出物を100μLメタノールによって誘導体化し、次いで、Speed-Vacで一晩乾燥させることによって、NMR抽出物中の全グルコース濃縮を決定した。次いで、抽出物を、75μLの1:1無水酢酸:ピリジンに再懸濁させ、65℃で20分間加熱した。試料を冷却し、25μLメタノールによって中止させた。各試料の全m+1グルコース濃縮を、以前に記載された方法（Shulman et al.,1985,J.Clin.Invest.76:757-764）を使用して、ガスクロマトグラフィ／質量分析によって測定した。m+2、m+3、m+4、m+5、およびm+6の濃縮は、無視し得る程度（定常状態で＜5％のm+1濃縮）であることが見出された。13C NMRスペクトルを[13C]グルコースの相対濃度を決定するために使用した。グルタミン酸と同様に、質量分析による全グルコース濃縮を、各グルコース炭素における濃縮を測定するため、代数的に分割した。
【０１７８】
[3-13C]乳酸を注入されたラット肝臓からの位置的なアラニン濃縮を測定するため、肝臓試料を上記のようにNMRのために抽出し、本発明者らが報告したように（Alves et al.,2011,Hepatology 53:1175-1181）、プロトン観察炭素編集（proton-observed,carbon-edited）NMRによって、[2-13C]アラニンおよび[3-13C]アラニンでの濃縮を測定した。
【０１７９】
脂質測定：
血漿トリグリセリドをWako試薬を使用して測定した。肝臓および四頭筋のトリアシルグリセロールを、BlighおよびDyer（Bligh & Dyer,1959,Can.J.Biochem.Physiol.37:911-7）の方法を使用して抽出し、Diagnostic Chemicals Ltd製の試薬を使用して分光測光法によって定量化した。肝臓および四頭筋のDAGおよびセラミドの濃度を、液体クロマトグラフィ／質量分析／質量分析（LC/MS/MS）（Yu,et al.,2002,J.Biol.Chem.277:50230-6）によって測定し、アシルカルニチン濃度も同様であった（An,et al.,2004,Nat.Med.10:268-74）。超低密度リポタンパク質（VLDL）運び出しを測定した（Lee,et al ,2011,Hepatology 54:1650-60）。肝臓のアセチルCoAおよびマロニルCoAの濃度を、LC/MS/MS（Hosokawa,et al.,1986,Anal.Biochem.153:45-9；Roughan,1994,Biochem.J.300:355-8）によって測定した。
【０１８０】
肝線維症およびアポトーシスのマーカー：
カスパーゼ3およびカスパーゼ9、平滑筋アクチン、ならびに炎症性サイトカインを、ELISA（それぞれ、MyBioSource、NeoBioLab、MyBioSource、およびSABiosciences）によって肝臓ホモジネートにおいて測定し、ブラッドフォードアッセイによって測定された全タンパク質含量に対して標準化した。肝臓ヒドロキシプロリン含量を測定した（Cai,et al.,2014,J.Pharmacol.Exp.Therap.349:94-98）。qPCR（Kumashiro,et al.,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 108:16381-16385）によって、肝臓においてコラーゲンmRNAを測定し、BATにおいてUCP1 mRNAを測定した。
【０１８１】
糖負荷試験：
ラットに、ゼロ時点で50％デキストロース（1mg/kg）の腹腔内ボーラスを与えた。0分、5分、10分、20分、30分、45分、60分、および90分の時点で、静脈カテーテルからの採血によって血漿を入手し、直ちに遠心分離した。本明細書中に別途記載されるように、血漿のグルコースおよびインスリンの濃度を測定した。
【０１８２】
インスリン感受性および肝臓フラックスの測定：
基底時およびインスリン刺激時のグルコースターンオーバーを、[6,6]2H2グルコースの定常状態（120分）注入を使用して測定した（Erion,et al ,2013,Endocrinology 154:36-44）。
【０１８３】
筋肉およびBATのグルコース取り込みを、静脈ラインへの[14C]2-デオキシグルコースの注射によって測定した（Samuel,et al.,2007,J.Clin.Invest.117:739-45）。
【０１８４】
肝臓および四頭筋におけるPKCεおよびθのトランスロケーションを、それぞれ、ウエスタンブロットによって測定した（Choi,et al.,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 104:16480-5）。
【０１８５】
肝臓PCフラックス（Vpc）、TCA回路を通したフラックス（Vtca）、およびTCA回路への基質の寄与（Vpdh、Vfa）を、定常状態[3-13C]乳酸注入によって測定した（Perry,et al.,2013,Cell.Metab.18:740-8）。
【０１８６】
糖新生タンパク質濃度の測定：
ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、およびフルクトース-1,6-ビスホスファターゼのタンパク質濃度を、Santa Cruz Biotechnology製の抗体を使用して測定した（Kumashiro,et al.,2013,Diabetes 62:2183-94）。CD69を、Novus Biologicals製の抗体を使用して測定した（Kumashiro,etb al.,2013,Diabetes 62:2183-2194）。PKCトランスロケーションを測定した（Samuel,et al.,2007,J.Clin.Inv.117:739-745）。
【０１８７】
DNPおよびERDNPの動態研究：
ラットは、ピーナッツバターに混合された本文に明記された濃度のDNPまたはERDNPを経口消費した。動態研究のために使用された全てのラットが、2分以内にピーナッツバターおよびプロトノフォアを完全に消費した。
【０１８８】
DNP濃度を、LC/MS/MS（Perry,et al.,2013,Cell.Metab.18:740-8）によって、スプラーグドーリーラットの血漿、肝臓、腎臓、WAT、四頭筋、心臓、および脳において測定した。DNPによって処置されたラットを、DNPによる処置の1時間後に屠殺し、ERDNPによって処置されたラットを、処置の8時間後に屠殺した。これらが、血漿DNP研究において、ピーク血漿DNP濃度を表すと決定された時点であったためである（図21A〜21B）。0.05μMが、3回反復の各々において20％未満の誤差で方法によって測定された既知量のDNPのDMSO溶液の最小濃度であったため、方法の最小検出限界は0.05μMであると決定された。
【０１８９】
統計分析：
2群を比較する時には、両側独立スチューデントt検定によって差を査定し、3群を比較する時には、ボンフェローニの多重比較検定を含むANOVAによって査定した。＜0.05のP値を有意と見なした。データは平均値±S.E.M.として報告される。
【０１９０】
組織学研究：
肝臓および腎臓の試料は、Yale Research Histologyコアによって調製され、ヘマトキシロン＆エオシンによって染色され、記載されたように（Kleiner et al.,2005,Hepatology 41:1313-1321）分析された。
【０１９１】
肝臓グリコーゲン含量の測定：
肝臓グリコーゲン含量を、以前に記載された方法（Passonneau and Lauderdale,1974,Anal.Biochem.60:405-412）を使用して、アミログルコシダーゼ消化によって査定した。
【０１９２】
可能性のある糖新生マーカーの査定：
12種の炎症マーカーの血漿濃度を、ELISA（QIAGEN,Valencia,CA）によって測定した。アディポネクチンは、Yale Diabetes Research Center Physiology CoreによってELISAによって測定された。乳酸をCOBASによって測定し、FGF-21をELISA（Millipore）によって測定した。
【０１９３】
血漿および組織のDNP濃度の測定：
LC/MS/MS法の開発および分析を、Shimadzu超高速液体クロマトグラフィ（UFLC）系を装備したApplied Biosystems 4000 QTRAP（Foster City,CA）において実施した。陰イオン検出によるエレクトロスプレーイオン化（ESI）ソースが、DNPの定性分析および定量分析の両方のために最も高感度であることが示された。DNPの定量分析を、イオン対（183.0/109.0）によってMRMモードでモニタリングした。好ましいパラメータは、カーテンガス25；コリジョンガス9、プローブ温度480℃；イオンソースガス1 20；イオンソースガス2 25；デクラスタリング電位（DP）-45V；エントランス電位（EP）-10V；コリジョンエネルギー（CE）-35V、およびコリジョンセルイグジット電位-12V：であった。
【０１９４】
LC/MS/MS分析のための血漿試料からの抽出：
血漿試料（10〜100μL）を、5mlガラスバイアルにおいて、0.01％BHTを含有している予冷クロロホルム／メタノール（v/v：2/1）2.0mlと混合し、そこに、内部標準としての10nmol DNP-D3および10nmol DNPME-D6と共に、250μlの水を添加した。混合物を10秒間ボステックスした後、4000rpmで10分間遠心分離した。底部の有機層を注意深く収集し、窒素ガスの一定流によって乾燥させた。DNPおよび／またはDNPMEの代謝物質についてのLC/MS/MS分析のため、残りを200μlメタノールで再構成した。
【０１９５】
LC/MS/MS分析のための様々な組織試料からの抽出：
凍結組織試料（およそ100mg）を計量し、0.01％BHTおよび金属ビーズを含有している予冷クロロホルム／メタノール（v/v：2/1）1.6mlによって2ml微量遠心管に懸濁させ、次いで、内部標準としての10nmol DNP-d3（Cambridge Isotopes,Andover,MA）を添加した。組織試料を30Hzで15分間Qiagen TissueLyserによって破壊し、次いで、5mlガラスバイアルへ移し、続いて、0.5mlのクロロホルムおよび250μLの水を各試料へ添加した。試料を10秒間ボステックスした後、4000rpmで10分間遠心分離した。底部の有機層を収集し、温和な窒素流によって乾燥させた。DNPのLC/MS/MS分析のため、残りを200μlメタノールで再構成した。
【０１９６】
実施例1：DNPの製剤
DNPを長期放出のために製剤化した。ある種の態様において、DNPの長期放出は、毒性を低下させ、効力を最大にする。他の態様において、DNP製剤は、12〜24時間にわたり1.0mg/kgのDNPを送達するのに適当な投薬量サイズで、持続放出コーティングによってコーティングされた、押し出しまたは薬物レイヤリングによるDNPビーズを含む。
【０１９７】
ある種の態様において、持続放出コーティングにおいて使用されるポリマーは、可溶性ポリマーによって作出された孔を通した放出を可能にする、可溶性ポリマーと不溶性ポリマーとの組み合わせであるため、pH非依存的に機能する。他の態様において、製剤化された薬物は、酸性の胃および／または中性の腸において吸収される。さらに他の態様において、マルチパーティクル系は、溶解速度のより低い分散を可能にする（1個の錠剤におけるコーティングの失敗は、用量の完全な放出をもたらし得るが、多くの粒子のうちの1個におけるコーティングの失敗は、溶解プロファイルの最小の改変をもたらすため）。
【０１９８】
ある種の態様において、DNPビーズは押し出しおよび球形化を使用して調製される。制御放出を達成するため、2種のポリマー系を評価のために選択した：EUDRAGIT（登録商標）RS/RL系およびヒドロキシプロピルセルロース（HPC）/エチルセルロース（EC）系。初期の製剤化研究は、様々なコーティングレベルでの、HPC/EC系およびEUDRAGIT（登録商標）系の評価に焦点を置き、HPC/EC系をさらなる調査のために選択した。表1は、ERDNP球体の調製のために使用された原材料を例示する。
【０１９９】
【表１】
2020002166.tif 000002
【０２００】
コーティングされていない2,4-DNP押し出し球体
ある種の態様において、所望の用量は、要求された用量（1.0〜1.5mg/kg）を対象へ実行可能に送達する投薬量の開発、均一性問題の回避、および持続放出コーティングに関する問題の回避：という三つの要因に基づき選択される。選択された用量およびAPI濃度に基づき、押し出しビーズのための一般的な賦形剤を使用した製剤を開発した。最初のビーズ製剤（NK15-142、CU03-170、CU03-171）は、1.5mg DNP/60mgビーズを送達するよう設計された；しかしながら、これは、1.17mg/60mgビーズにより近い実際のAPI濃度をもたらす、有効活性成分（API）中の22％水分含量を考慮に入れていなかった。その後のバッチは、後者と同様に製剤化されたが、1.0mg DNP/50mgビーズ（または1.17mg/58.5mgビーズ）を送達するよう調整された。表3は、最初のコーティングされていないビーズ製剤の組成を例示する。
【０２０１】
【表２】
2020002166.tif 000003
1 2,4-DNPは22％水分を含有している。％w/w（湿重量）は、そのバッチのために分配された湿APIの重量パーセントを示す。乾重量に基づく％w/wおよびmg/用量は、固体濃度のみを考慮しており、API中の22％の水分は省かれている。
2 水は、加工助剤として使用され、最終生成物中には見られない。％w/wまたは最終バッチ重量では表されておらず、加工のために添加された量を示すためにのみ含まれる。
【０２０２】
コーティングされていない球体を調製するため、固形成分を高剪断混合機に添加し、視覚的に均一になるまで（混合スピード300rpmで1分）混合した。200mlの水を添加し、視覚的に均一になるまで（混合スピード300rpmで2〜3分）溶液を混合した。材料を取り出し、90rpmで、0.7mmダイフェース、9シムで押し出した。押し出し物を2バッチに分割し、各々を、980rpmで2分間、2mmプレートで球形化した。次いで、ビーズをオーブンに置き、最終水分含量が出発重量に基づき＜7.5％になるまで乾燥させた。
【０２０３】
制御放出ビーズ製剤開発
制御（12〜24時間）放出を達成するため、EUDRAGIT（登録商標）RS/RL系およびヒドロキシプロピルセルロース（HPC）/エチルセルロース（EC）系：という2種のポリマー系を評価のために選択した。
【０２０４】
EUDRAGIT（登録商標）系は、透過性および非透過性のpH非依存性膨張ポリマーを組み合わせることによって機能し、透過性ポリマーと非透過性ポリマーとの比および適用されるポリマーの量の両方によって調節される、経時的な薬物の拡散を可能にする。
【０２０５】
HPC/EC系は、経時的に薬物が拡散する孔をコーティング中に作出するため、可溶性ポリマーと不溶性ポリマーとを組み合わせることによって機能し、やはり、ポリマーの比および適用されるポリマーの量によって調節される。2種のコーティング懸濁液についての配合を表3に記載する。
【０２０６】
【表３】
2020002166.tif 000004
【０２０７】
EUDRAGIT（登録商標）系による制御放出コーティングを生成するため、Plasacrylを振とうし混合した。混合しながら、EUDRAGIT（登録商標）、水、TEC、およびPS80を添加した。次いで、懸濁液を30メッシュスクリーンに通し、混合を継続した。本明細書中に別途記載されるように作製されたDNP球体をコーティングするため、1.2mm液体ノズル、3mmエアキャップ、ワースター（Wurster）カラム、400メッシュインレットスクリーン、コニダープレート、および40メッシュフィルタで、ボトムスプレーワースターコーティングによって、FLM1流動層をセットアップした。球体を流動層へロードし、表4のパラメータを使用してコーティングした。次いで、ビーズを40℃のインレット温度で最低10分間乾燥させた。
【０２０８】
【表４】
2020002166.tif 000005
【０２０９】
HPC/EC系によってコーティングされたビーズの2つのロットをコーティングし、3つの理論的な重量増加率（ロットNK15-144については11.7％、13.3％、および15％、ロットNK15-157については7.5％、10％、および11.7％）でサンプリングした。（1mg用量および適用された最大コーティングに基づく）各ロットについての最終的なコーティングされたビーズ製剤を、表5に例示する。
【０２１０】
【表５】
2020002166.tif 000006
【０２１１】
EUDRAGIT（登録商標）系によってコーティングされたビーズは、ランを遮断する（凝集する）傾向を示した。HPC/EC系によって調製された長期放出ビーズを、アッセイおよび溶解について評価した。結果は表6に記載される。
【０２１２】
【表６】
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【０２１３】
例示的なERDNP製剤
持続放出剤形（ビーズ）を、HPC/ECコーティング系を使用して開発した。12時間標的放出プロファイルを、インビトロ溶解試験を通して確認した。DNP薬物球体を表す最終製剤を、表7に例示する。
【０２１４】
【表７】
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【０２１５】
これらの薬物球体を、表8に例示されるような組成を有する制御放出DNP薬物を生成するために使用した。
【０２１６】
【表８】
2020002166.tif 000009
【０２１７】
実施例2：連続低用量胃内DNPは、肝臓および筋肉の脂質含量を低下させ、全身インスリン感受性を改善した
およそ3μMの持続的な血漿DNP濃度を達成するDNPの連続低用量胃内注入が、肝臓脂肪症の低下をもたらし、全身インスリン感受性を改善するか否かを試験するため、ラットに5日間胃内DNP（1日当たり2mg/kg）を注入した。胃内DNPのこの注入速度は、血漿および肝臓において、それぞれ、およそ3μMおよびおよそ1μMの血漿および組織の定常状態DNP濃度をもたらし、骨格筋におけるDNPの濃度は無視し得る程度であった（図2A）。対照的に、ラットにおけるDNPの単回投与（5mg/kg）は、およそ120μMのピーク血漿DNP濃度およびおよそ60μMのピークDNP肝臓濃度をもたらす。
【０２１８】
これらの極めて低いDNPの濃度は、血漿トリグリセリドの著しい（＞80％）低下、ならびに肝臓および筋肉のTAGおよびジアシルグリセロール（DAG）の含量の＞50％の低下をもたらした。肝臓および筋肉のTAG/DAG含量のこれらの低下は、グルコースおよびインスリンのより低い空腹時血漿濃度（図1、14A〜14F、14K〜14L）によって示されるような全身インスリン感受性の著しい改善に関連していた。全身インスリン感受性のこれらの著しい改善とは対照的に、組織セラミド含量の変化は存在せず、肝酵素、血中尿素窒素（BUN）、またはクレアチニンの変化が観察されないことによって反映されるように、これらの慢性胃内DNP注入に関連した全身毒性は存在しなかった（図14F〜14J）。
【０２１９】
実施例3：ERDNPの安全性および効力
これらの連続的な胃内DNP注入研究によって、NAFLDのラットモデルにおいて、1〜3μMの範囲のDNPの持続的な血漿濃度および組織濃度が、肝臓脂肪症およびインスリン抵抗性を逆転させることが証明されたため、少量（およそ1g）のピーナッツバターに混合された製剤をラットに摂取させる、長期放出DNP（ERDNP）製剤の安全性および効力の研究を実施した。
【０２２０】
25mg/kg以上の用量で用量依存的な体温上昇を引き起こしたDNPとは対照的に、ERDNPは、体温に対して無視し得る程度の効果を及ぼし、100mg/kgで0.5℃の増加のみが検出可能であった（図4A〜4B）。
【０２２１】
ERDNPおよびDNPの安全性および食事によって誘導されたNAFLDを逆転させる効力を比較するため、2週間高脂肪を摂取したラットを、変動する用量のERDNPまたはDNPによって5日間毎日処置した。肝臓トリグリセリドを減少させるERDNPの最低有効用量は0.5mg/kgであったが、DNPのそれは5mg/kgであった（図4C〜4D）。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、BUN、またはクレアチニンの変化は、ERDNPのいずれの用量でも観察されなかったが、1mg/kgを超える用量での毎日のDNP処置は、AST濃度を上昇させ、2mg/kgを超える用量は、ALTを上昇させ、最高用量のDNPは、BUNを上昇させた（図15A〜15H）。従って、DNPについての0.4（毒性用量2mg/kg、治療用量5mg/kg）と比較して、ERDNPについての毒性用量（100mg/kg）と治療用量（0.5mg/kg）との比は200であり、ERDNPについての毒性用量と有効用量との比は、DNPと比較して、500倍改善されている。
【０２２２】
実施例4：ERDNPおよびDNPの薬物動態
DNPと比べて改善されたERDNPの安全性効力化は、DNPと比較してはるかに低い、ERDNPによる血漿DNP濃度と相関していた。1mg/kg ERDNP（これらの研究において使用された有効用量）によって処置されたラットにおいて、血漿DNP濃度の曲線下面積は、25mg/kg DNP（体温上昇を生じた最低用量）に対して20倍であり（211±18対4,311±555、P＝0.001；図5A）、DNPの最大濃度の時間は、DNP処置では1時間のみであったのに対し、ERDNPによる処置後は8〜12時間であった。DNP処置によるDNPの最高血漿濃度は、ERDNPより30倍高かったが、ERDNPの半減期は2倍長かった（DNPの8〜12時間に対し、ERDNPは16〜24時間）。血漿濃度データによって予測されるように、組織DNP濃度は、1日または5日間の両方の1mg/kg ERDNPによる処置の後、25mg/kg DNPによって1回処置されたラットの10分の1〜20分の1であった（図5B〜5D）。DNPによって6週間処置されたラットにおいて、1日または5日間処置されたラットと比較して、組織DNP濃度の差はなかった（図5E）。これらのデータによって予測されるように、ERDNPの単回投与の24時間後、組織DNP濃度は検出不可であり（図5F）、ERDNP処置の48時間後および72時間後のDNPの組織濃度も同様であり、このことは、慢性ERDNP処置によってDNPが組織に蓄積しないことを証明している。
【０２２３】
1mg/kg処置後のピーク血漿DNP濃度は、DNPによって処置されたラットとERDNPによって処置されたラットとの間で異なっていなかったが、DNP濃度の曲線下面積は、DNPと比べてCRNDPによる処置では2倍となり、このことが、等モル用量でのERDNPの改善された効力を説明する可能性が高い（図4C〜4D、21A〜21E）。血漿DNP濃度と体温との間に強力な相関が観察された（図21F）。ある種の態様において、DNP毒性は最大血漿DNP濃度の関数である。1mg/kg ERDNP処置（有効用量）後のDNPの組織濃度は、DNPの最低毒性用量（25mg/kg）後のDNP濃度の25分の1〜100分の1であり、血漿DNP濃度がプラトーに達した後は、血漿／組織DNPの比に変化がなかった（図21G〜21I）。ERDNPの単回投与の24時間後の組織DNP濃度は、検出不可であり（方法の検出下限、0.05μMより低く）（図21H）、ERDNP処置の48時間後および72時間後のDNPの組織濃度も同様であり、このことは、慢性ERDNP処置によってDNPが組織に蓄積しないことを証明している。従って、慢性DNP処置後のDNP濃度は、1回のERDNP処置の後の組織濃度と有意に異ならず、全ての組織において10μM未満であった（図21J）。測定されたDNP濃度が方法の検出下限（0.05μM）であった脳以外（図21K）、組織DNP濃度は直線的にERDNP用量と相関しており、このことは、用量依存的な組織DNP代謝が存在しないことを暗示している。これと一致して、1mg/kg ERDNPの慢性（5日毎日）用量の後と、最初の用量の後とで、血漿DNP濃度は異なっていなかった（図21L）。
【０２２４】
1mg/kgのERDNPによる6週間の処置は、同様に、耐容性が良く、行動、摂食量、体重、体温の改変、肝酵素（ALT/AST）、BUN、またはクレアチニンの上昇をもたらさず、肝臓または腎臓の組織学において細胞の損傷または壊死の証拠は存在しなかった（図16A〜16G）。
【０２２５】
最後の用量の後の組織DNP濃度は、ERDNPの1回または5回の毎日投与の後の組織DNP濃度と異ならなかった（図16H）。理論によって制限されることは望まないが、DNP誘導体の毒性は、DNPの最大濃度によって予測され得、その効力は、血漿DNP濃度の曲線下面積によって予測され得る。
【０２２６】
実施例5：ERDNP処置は高トリグリセリド血症、肝臓脂肪症、およびインスリン抵抗性を低下させる
ERDNPが組織脂質含量を低下させ、全身インスリン感受性を改善するか否かを調査するため、よく確立されているNAFLDおよびインスリン抵抗性の高脂肪摂取ラットモデルを、ERDNP（1mg/kg）またはビヒクルによって5日間毎日処置した。研究の時点での体重は同一であったにも関わらず、ERDNPによって処置されたラットは、グルコース、脂肪酸、およびトリグリセリドの空腹時血漿濃度のおよそ30〜40％の低下、高密度リポタンパク質濃度の30％増加、ならびに血漿インスリン濃度の50％の低下を有していた（図6A〜6D、17A〜17B）。
【０２２７】
ERDNPによって処置されたラットは、腹腔内（IP）糖負荷試験において、改善された耐糖能を示し、より低い血漿のグルコースおよびインスリンの濃度を有していた（図6E〜6F、17G〜17H）。
【０２２８】
全身インスリン感受性に対するERDNPの効果をより完全に査定するため、肝臓および骨格筋におけるインスリン作用を査定するため、放射標識グルコースと組み合わせた高インスリン正常血糖クランプ法を実施した（図18A〜18B）。IP糖負荷試験による改善された全身インスリン感受性と一致して、ERDNPによって処置されたラットは、高インスリン正常血糖クランプ研究において正常血糖を維持するために2倍多くのグルコースを必要とした（図7A、18C）。ERDNPによって処置された動物におけるインスリンによって刺激される全身グルコース代謝のこの改善は、インスリンによって刺激される末梢筋肉のグルコース取り込みの2.5倍の増加（図7B）および高インスリン正常血糖クランプ法におけるERDNPによって処置されたラットにおける肝臓グルコース産生の3倍大きい抑制（図7C〜7D）によって反映されるような、肝臓および筋肉の両方のインスリン感受性の増加に起因するものであり得る。
【０２２９】
ジアシルグリセロール（DAG）によって誘導されたnPKC活性化と肝臓および骨格筋におけるインスリン抵抗性との間には、強力な因果関係が存在し得る。一貫して、ERDNPによって処置されたラットは、肝臓および骨格筋に、それぞれ、より低いトリアシルグリセロール（TAG）およびDAGの含量、ならびに減少したプロテインキナーゼC（PKC）εおよびPKCθのトランスロケーションを有していた（図8A〜8B、18D〜18G）。より低い空腹時血漿グルコース濃度によって予測されるように、ERDNPによって処置されたラットにおけるピルビン酸カルボキシラーゼを通したフラックスは、対照より25％低くフラックス、PCフラックスのこの低下は、PC活性の重要なアロステリック制御因子である肝臓アセチルCoAの60％の低下に関連していた（図8C〜8D）。対照的に、ERDNPによって処置されたラットにおける糖新生タンパク質発現には、対照動物と比較して、差はなかった（図17C〜17F）。
【０２３０】
実施例6：ERDNP処置は、肝臓ピルビン酸カルボキシラーゼフラックスを低下させ、肝臓ミトコンドリア脂肪酸化の速度を増加させる
肝臓ミトコンドリアTCA（VTCA）フラックス、VPDHフラックス、Vfaフラックス、およびVPCフラックスの速度に対するERDNPの効果を、新規の組み合わせNMR-LC/MS/MS法（Perry,et al.,2013,Cell.Metab.18:740-8）を使用して査定した。1日の処置の後、ERDNPによって処置されたラットにおいては、低下した肝臓脂質含量と一致して、肝臓TCA回路フラックスが60％増加した。さらに、このVTCAフラックスの増加は、完全に、肝臓脂肪酸化の速度の65〜70％の増加によるものであった（図8E）。対照的に、腎臓、脳、心臓、または骨格筋においてはVTCAに関連した脂肪酸化に差が存在せず、ERDNPの脱共役効果が肝臓に制限されることが示された（図17I）。
【０２３１】
一つの局面において、より低い骨格筋TAG含量は、増加した肝臓脂肪酸酸化の結果として低下した肝臓超低密度リポタンパク質（VLDL）運び出しに、少なくとも一部分、よるものであり得る。ERDNPによって処置された動物において、肝臓VLDL運び出しは80％低下した（図8F）。
【０２３２】
対照的に、肝臓または四頭筋のアシルカルニチンおよびセラミド、肝臓グリコーゲン含量、12種の炎症マーカー、アディポネクチン、またはFGF-21の血漿濃度には差が観察されず、従って、これらの代謝物質およびアディポサイトカインは、ERDNPによって誘導された肝臓および筋肉のインスリン応答性の改善から分離される（図18H〜18S）。さらに、褐色脂肪組織量、インスリンによって刺激されるグルコース取り込み、または脱共役タンパク質1（UCP1）mRNA発現には、差が存在しなかった（図18X〜18Z）。
【０２３３】
ERDNPによる脱共役が組織脂質含量を低下させ、インスリン感受性を改善するか否かを調査するため、NAFLDおよびインスリン抵抗性のよく確立されている高脂肪摂取ラットモデルを、5日間毎日、ERDNP（1mg/kg）またはビヒクルによって処置した。研究の時点で体重および白色脂肪組織含量は同一であったにも関わらず、ERDNPによって処置されたラットは、ビヒクルによって処置されたカウンターパートより著しくインスリン感受性が高く、グルコース、脂肪酸、およびトリグリセリドの空腹時血漿濃度の30〜40％の低下、高密度リポタンパク質濃度の30％の増加、ならびに血漿インスリン濃度の50％の低下を示し、肝臓糖新生タンパク質発現には差がなかった（図6A、6C、6G、17A、17C〜17F、17J〜17K）。
【０２３４】
実施例7：ERDNPは全身インスリン抵抗性を改善する
ERDNPによって処置されたラットは、改善された耐糖能を示し、腹腔内（IP）糖負荷試験の間中、より低い血漿のグルコースおよびインスリンの濃度を有していた（図6E〜6F、17I〜17J）。全身インスリン感受性に対するERDNPの効果をより完全に査定するため、肝臓および骨格筋におけるインスリン作用を査定するため、放射標識グルコースを用いた高インスリン正常血糖クランプ法を実施した（図18A〜18B）。改善された全身インスリン感受性と一致して、ERDNPによって処置されたラットは、高インスリン正常血糖クランプ研究において正常血糖を維持するため2倍多くのグルコースを必要とした（図7A、18C）。理論によって限定されることは望まないが、ERDNPによって処置されたラットにおけるインスリンによって刺激される全身グルコース代謝のこの改善は、インスリンによって刺激される末梢筋肉グルコース取り込みの2.5倍の増加、および高インスリン正常血糖クランプ法におけるERDNPによって処置された動物における肝臓グルコース産生の3倍大きい抑制によって反映されるような、肝臓および筋肉の両方のインスリン感受性の増加に起因するものであり得る（図7C、18T）。異所ジアシルグリセロール（DAG）蓄積と、肝臓および骨格筋におけるインスリン抵抗性との間には、強力な因果関係が存在する。ERDNPによって処置されたラットは、より低いトリアシルグリセロール（TAG）およびDAGの含量、ならびにそれぞれ肝臓および骨格筋における減少したプロテインキナーゼCε（PKCε）およびPKCθのトランスロケーションを有していた（図8A〜8B、18D〜18F、18U〜18V）。骨格筋トリグリセリドの低下は、40％低い血漿トリグリセリド濃度および肝臓超低密度リポタンパク質（VLDL）運び出しの80％の低下に関連しており（図6B、8F）、これは、肝臓に特異的な脱共役の結果として低下した筋肉脂質含量を説明する。
【０２３５】
本明細書に提示されたデータは、ラットにおける高熱の欠如を示しており、飲料水中のはるかに高い用量のDNP（およそ89mg/[kg・日]）によって処置されたマウスにおいて低下したUCP1 mRNA発現と対照的であり、本発明の製剤の安全性を強調している。ERDNPは、NAFLDの発症を防止するためにも同様に有効であった：2週間高脂肪食を摂取し、同時にERDNPを摂取したラットは、肝臓、血漿、および骨格筋におけるトリグリセリド濃度の50〜90％の低下に関連した、グルコース、NEFA、およびインスリンのより低い空腹時血漿濃度を有していた（図22A〜22F）。全身エネルギー代謝に対するERDNP処置の効果をより決定的に調査するため、実験動物総合モニタリングシステム（CLAMS）代謝ケージ研究を、ERDNPまたはビヒクルを摂取したマウスにおいて実施したところ、調査されたいずれのパラメータにも差は観察されなかった（図23A〜23H）。これらのデータは、比較的低感度のCLAMS研究では測定され得ない、肝臓に制限された極めて低レベルの脱共役が、摂食量、行動、または全身エネルギー消費に影響を与えることなく、肝臓脂肪含量を低下させ、全身インスリン抵抗性を改善するのに十分であることを再び示している。
【０２３６】
実施例8：ERDNP処置はズッカー糖尿病肥満ラットにおける糖尿病を逆転させる
ERDNP処置は、高脂肪摂取ラットにおいて、NAFLD、高トリグリセリド血症、ならびに肝臓および末梢のインスリン抵抗性を安全に逆転させた。ある種の態様において、ERDNPは、T2Dのよく確立されている肥満ラットモデル、ズッカー糖尿病肥満（ZDF）ラット（過食症レプチン欠損肥満ラットモデル）において、高血糖、高トリグリセリド血症、および肝臓脂肪症を逆転させることができた。
【０２３７】
この目的のため、高脂肪摂取ZDFラットを、14日間毎日、ERDNP（1mg/kg）によって処置した。ERDNP処置は、処置の前後で体重は同一であったにも関わらず、2週間の処置の後、空腹時血漿インスリン濃度の80％の減少と共に、血漿グルコース濃度の進行性の低下および空腹時血漿グルコース濃度の400mg/dLの減少に関連していた（図9A〜9B、19A）。改善されたインスリン感受性と一致して、ZDFラットは、14日間のERDNP処置の後、より低い空腹時血漿トリグリセリド濃度も有していた（図8C〜8D）。ERDNPによって処置されたラットは、糖尿病動物における糖新生および糖血症の重要な制御因子である肝臓アセチルCoA含量の60％の低下も示した（図19L）。
【０２３８】
ERDNPによって処置されたラットは、腹腔内糖負荷試験において改善された耐糖能を示し、ERDNPによって処置された群においては、GTT中の各時点での血漿のグルコースおよびインスリンの濃度が50〜80％低下し、グルコースおよびインスリンの全曲線下面積が60〜70％低下した（図9E〜9F、19B〜19C）。インスリン感受性および耐糖能のこれらの改善は、肝臓および四頭筋のTAG濃度のそれぞれ65％および55％の低下に関連していた（図19D〜19E）。血漿BUNの不変およびクレアチニン濃度の中程度の低下によって反映されるように、この2週間の処置による検出可能な腎毒性は存在しなかった（図19F〜19I）。対照的に、調節不良糖尿病動物における肝炎症に関連した肝臓脂肪症を反映して、処置前のZDFラットにおいては、肝酵素（AST、ALT）および肝臓TAG含量が増加しており；ERDNP処置は、これらのパラメータを正常化した（図19F〜19I）。これは、NASHおよびT2Dのこのラットモデルにおける肝臓脂肪症および肝炎症のERDNP処置による逆転を反映している。組織学的分析は、この調節不良糖尿病モデルにおけるERDNP処置によるNAFLDの消散を確認し（図9I）、ERDNPがNAFLD関連肝疾患のための治療剤となる可能性を強調した。
【０２３９】
実施例9：ERDNPはNAFLDによって誘導されたNASHを処置する
NAFLDによって誘導されたNASHをERDNPが寛解させるかまたは処置する可能性を調査するため、NASHを誘導するため、8週間、メチオニン／コリン欠乏食（MCD）をラットに摂取させた。6週間のERDNP処置は、肝臓トリグリセリド濃度を90％低下させ、血漿トランスアミナーゼ濃度を正常化した（図20A〜20C）。トランスアミナーゼ濃度の正常化によって示された肝炎症の低下と一致して、ERDNPによって処置されたラットは、対照ラットと比べて、肝臓における5種の炎症サイトカインのより低い濃度、および活性化T細胞のマーカーである肝臓CD69タンパク質の低下を示した（図20D、24A〜24B）。組織学的分析は、ERDNPによって処置されたラット肝臓におけるNAFLDおよび肝線維症の消散を確認し、肝線維症スコアは90％低下し、それに伴い、コラーゲンmRNA、平滑筋アクチンタンパク質、およびヒドロキシプロリンの濃度が低下した（図20F〜20I）。ERDNPによって処置されたラットは、より低いカスパーゼ3タンパク質およびカスパーゼ9タンパク質の発現を含むアポトーシスの低下も示したが、TUNEL染色に検出可能な差はなかった（図20J〜20K、24C）。肝硬変を有する患者は、低下した食後肝臓グリコーゲン合成を示すため、MCDを摂取したラット肝臓において肝臓グリコーゲン含量を測定した。ERDNPによって処置されたラットにおいては、これらの動物における空腹時低血糖の逆転に関連して、肝臓グリコーゲン合成の80％の増加が観察された（図24D〜24E）。ERDNPは、血漿アルブミン濃度の20％の増加によって示されるように、肝臓合成機能を改善した（図20L）。これらのデータは、NASHモデルにおける、肝線維症の逆転に加えた、肝臓のタンパク質および炭水化物の合成機能の改善を証明しており、肝硬変を防止し、肝細胞癌を潜在的に防止するためのNAFLD関連NASHの治療剤としてのERDNPの効力を強調している。
【０２４０】
本明細書に引用された全ての各々の特許、特許出願、および公開の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。本発明は具体的な態様に関して開示されているが、本発明の他の態様および変動が本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明白である。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変動を全て含むと解釈されるものとする。
【図１】
2020002166.tif 000010
【図２Ａ】
2020002166.tif 000011
【図２Ｂ】
2020002166.tif 000012
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2020002166.tif 000020
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2020002166.tif 000024
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2020002166.tif 000026
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2020002166.tif 000029
【図６Ａ】
2020002166.tif 000030
【図６Ｂ】
2020002166.tif 000031
【図６Ｃ】
2020002166.tif 000032
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
2020002166.tif 000037
【図７Ｂ】
2020002166.tif 000038
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2020002166.tif 000040
【図８Ａ】
2020002166.tif 000041
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
2020002166.tif 000047
【図９Ｂ】
2020002166.tif 000048
【図９Ｃ】
2020002166.tif 000049
【図９Ｄ】
2020002166.tif 000050
【図９Ｅ】
2020002166.tif 000051
【図９Ｆ】
2020002166.tif 000052
【図９Ｇ】
2020002166.tif 000053
【図９Ｈ】
2020002166.tif 000054
【図９Ｉ】
2020002166.tif 000055
【図１０】
2020002166.tif 000056
【図１１】
2020002166.tif 000057
【図１２】
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【図１３】
2020002166.tif 000059
【図１４Ａ】
2020002166.tif 000060
【図１４Ｂ】
2020002166.tif 000061
【図１４Ｃ】
2020002166.tif 000062
【図１４Ｄ】
2020002166.tif 000063
【図１４Ｅ】
2020002166.tif 000064
【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
2020002166.tif 000066
【図１４Ｈ】
2020002166.tif 000067
【図１４Ｉ】
2020002166.tif 000068
【図１４Ｊ】
2020002166.tif 000069
【図１４Ｋ】
2020002166.tif 000070
【図１４Ｌ】
2020002166.tif 000071
【図１５Ａ】
2020002166.tif 000072
【図１５Ｂ】
2020002166.tif 000073
【図１５Ｃ】
2020002166.tif 000074
【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2020002166.tif 000076
【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
2020002166.tif 000078
【図１５Ｈ】
2020002166.tif 000079
【図１６Ａ】
2020002166.tif 000080
【図１６Ｂ】
2020002166.tif 000081
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2020002166.tif 000089
【図１７Ｃ】
2020002166.tif 000090
【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
2020002166.tif 000096
【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１８Ａ】
2020002166.tif 000099
【図１８Ｂ】
2020002166.tif 000100
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
2020002166.tif 000105
【図１８Ｈ】
2020002166.tif 000106
【図１８Ｉ】
2020002166.tif 000107
【図１８Ｊ】
2020002166.tif 000108
【図１８Ｋ】
2020002166.tif 000109
【図１８Ｌ】
2020002166.tif 000110
【図１８Ｍ】
2020002166.tif 000111
【図１８Ｎ】
2020002166.tif 000112
【図１８Ｏ】
2020002166.tif 000113
【図１８Ｐ】
2020002166.tif 000114
【図１８Ｑ】
2020002166.tif 000115
【図１８Ｒ】
2020002166.tif 000116
【図１８Ｓ】
2020002166.tif 000117
【図１８Ｔ】
2020002166.tif 000118
【図１８Ｕ】
2020002166.tif 000119
【図１８Ｖ】
2020002166.tif 000120
【図１８Ｘ】
2020002166.tif 000121
【図１８Ｙ】
2020002166.tif 000122
【図１８Ｚ】
2020002166.tif 000123
【図１９Ａ】
2020002166.tif 000124
【図１９Ｂ】
2020002166.tif 000125
【図１９Ｃ】
2020002166.tif 000126
【図１９Ｄ】
2020002166.tif 000127
【図１９Ｅ】
2020002166.tif 000128
【図１９Ｆ】
2020002166.tif 000129
【図１９Ｇ】
2020002166.tif 000130
【図１９Ｈ】
2020002166.tif 000131
【図１９Ｉ】
2020002166.tif 000132
【図１９Ｊ】
2020002166.tif 000133
【図１９Ｋ】
2020002166.tif 000134
【図１９Ｌ】
2020002166.tif 000135
【図２０Ａ】
2020002166.tif 000136
【図２０Ｂ】
2020002166.tif 000137
【図２０Ｃ】
2020002166.tif 000138
【図２０Ｄ】
2020002166.tif 000139
【図２０Ｅ】
2020002166.tif 000140
【図２０Ｆ】
2020002166.tif 000141
【図２０Ｇ】
2020002166.tif 000142
【図２０Ｈ】
2020002166.tif 000143
【図２０Ｉ】
2020002166.tif 000144
【図２０Ｊ】
2020002166.tif 000145
【図２０Ｋ】
2020002166.tif 000146
【図２０Ｌ】
2020002166.tif 000147
【図２１Ａ】
2020002166.tif 000148
【図２１Ｂ】
2020002166.tif 000149
【図２１Ｃ】
2020002166.tif 000150
【図２１Ｄ】
2020002166.tif 000151
【図２１Ｅ】
2020002166.tif 000152
【図２１Ｆ】
2020002166.tif 000153
【図２１Ｇ】
2020002166.tif 000154
【図２１Ｈ】
2020002166.tif 000155
【図２１Ｉ】
2020002166.tif 000156
【図２１Ｊ】
2020002166.tif 000157
【図２１Ｋ】
2020002166.tif 000158
【図２１Ｌ】
2020002166.tif 000159
【図２２Ａ】
2020002166.tif 000160
【図２２Ｂ】
2020002166.tif 000161
【図２２Ｃ】
2020002166.tif 000162
【図２２Ｄ】
2020002166.tif 000163
【図２２Ｅ】
2020002166.tif 000164
【図２２Ｆ】
2020002166.tif 000165
【図２３Ａ】
2020002166.tif 000166
【図２３Ｂ】
2020002166.tif 000167
【図２３Ｃ】
2020002166.tif 000168
【図２３Ｄ】
2020002166.tif 000169
【図２３Ｅ】
2020002166.tif 000170
【図２３Ｆ】
2020002166.tif 000171
【図２３Ｇ】
2020002166.tif 000172
【図２３Ｈ】
2020002166.tif 000173
【図２４Ａ】
2020002166.tif 000174
【図２４Ｂ】
2020002166.tif 000175
【図２４Ｃ】
2020002166.tif 000176
【図２４Ｄ】
2020002166.tif 000177
【図２４Ｅ】
2020002166.tif 000178