(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から心筋系統又は心外膜系統細胞集団を得るための方法の提供。【解決手段】心血管中胚葉プログラミングカクテルと、プログラミングカクテルがｈＰＳＣに浸透するのに適した条件下で接触、培養するステップと；心血管中胚葉細胞集団を心血管前駆細胞特定化カクテルと接触、培養するステップと；心血管前駆細胞集団を、成熟カクテルと接触、培養するステップのうちの１つ又は複数のステップとを含む、心筋系統又は心外膜系統細胞集団を得るための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から心筋系統又は心外膜系統細胞集団を得る方法であって、（ａ）ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣを、前記ｈＰＳＣが心血管中胚葉細胞集団に分化するよう誘導するのに適した心血管中胚葉プログラミングカクテルと、前記プログラミングカクテルが前記ｈＰＳＣに浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記ｈＰＳＣを、ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｂ）前記心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を特定化するのに適した心血管前駆細胞特定化カクテルと、前記特定化カクテルが前記心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｄ）前記心血管前駆細胞集団を、成熟カクテルと、前記成熟カクテルが前記心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管前駆細胞集団を心血管集団、任意に、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び／若しくはＳＩＲＰＡを発現する心筋系統細胞並びに／又はＷＴ１を発現する心外膜系統細胞を生成する時間、培養するステップとを含む、上記方法。
【請求項２】
前記ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣは、前記ｈＰＳＣをＢＭＰ成分と約１日から約２日間、接触させることによって作製され、任意に、前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心血管中胚葉プログラミングカクテルは、ＢＭＰ成分及びアクチビン成分並びに任意に、ＦＧＦ成分を含み、前記心血管中胚葉プログラミングカクテルは、約３日から約５日間、前記ｈＰＳＣと接触させられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦ成分はｂＦＧＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アクチビン成分はアクチビンＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ｈＰＳＣは胚様体に含まれる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｈＰＳＣからＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を得るための方法であって、（ａ）任意に、請求項１に記載のステップａで定義されるとおり、ｈＰＳＣからＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を得るステップと；（ｂ）前記ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を、心血管前駆細胞特定化カクテルと、前記特定化カクテルが前記心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管中胚葉細胞集団をＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成するのに十分な時間、培養するステップとを含む、上記方法。
【請求項９】
前記ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団は、前記心血管前駆細胞特定化カクテルと接触させることに先立って分離される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心血管中胚葉細胞集団は、前記心血管前駆細胞特定化カクテルと少なくとも１２時間から約４８時間、接触させられる、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管前駆細胞特定化カクテルは、心筋系統促進成分を含み、前記心筋促進成分は、心筋細胞の発生を促進するのに適した濃度であり、ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団を特定化する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記心筋促進成分は、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満若しくは２５ｎｇ／ｍＬ未満及び／又は１２．５ｎｇ／ｍＬ超の濃度のノギンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心筋促進成分は、ドルソモルフィン１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．２５μＭ未満又は０．１μＭ未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記心筋促進成分は、０．６３未満、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、０．４ｎｇ／ｍＬ未満又は０．３ｎｇ／ｍＬ未満の濃度のＢＭＰ４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記心血管前駆細胞特定化カクテルは、１）Ｗｎｔ阻害物質、任意に、ＤＫＫ１、ＸＡＶ９３９及びＩＷＰ２から選択されるＷｎｔ阻害物質と、ＢＭＰ成分であって、任意に、前記ＢＭＰ成分は少なくとも０．０１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬであるが、１０ｎｇ／ｍｌ未満若しくは１５ｎｇ／ｍＬ未満若しくは好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４である、ＢＭＰ成分との組み合わせ；又は２）ノギン若しくはドルソモルフィンなどのＢＭＰ阻害物質、任意に、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満若しくは２５ｎｇ／ｍＬ未満及び／若しくは１２．５ｎｇ／ｍＬ超の濃度のノギン；３）Ｗｎｔ阻害物質、並びに／或いは４）心筋細胞系統濃度のＢＭＰ成分であって、任意に、ＢＭＰ４、例えば、前記ＢＭＰ４は、０．６３ｎｇ／ｍＬ未満、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、０．４ｎｇ／ｍＬ未満若しくは０．３ｎｇ／ｍＬ未満の濃度であるＢＭＰ成分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉集団及び／又は前記ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は単離される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は、ＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルとさらに接触させられる、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心筋トロポニンＴ＋（ｃＴｎＴ）心筋系統細胞集団を生成するための方法であって、（ａ）請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法によりＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団を得るステップと；（ｂ）前記心血管前駆細胞集団を、ＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルと、前記成熟カクテルが前記心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させるステップと；（ｂ）接触させた前記心血管前駆細胞集団を、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を発現する心筋細胞を生成するのに十分な時間、培養するステップとを含む、上記方法。
【請求項１９】
前記ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は、前記成熟カクテルと約４日以上、任意に、約４日、約５日、約９日、約１５日又は約２０日間、任意に、成熟した収縮心筋細胞が生成されるまで接触させられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を生成する方法であって、（ａ）任意に、請求項１に記載のステップａで定義されるとおり、ｈＰＳＣからＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を得るステップと；（ｂ）前記心血管中胚葉細胞集団を、心外膜系統促進成分を含む心血管前駆細胞特定化カクテルと、前記特定化カクテルが前記心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管中胚葉細胞集団を、ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成するのに十分な時間、培養するステップとを含む、上記方法。
【請求項２１】
前記心血管前駆細胞特定化カクテルは、心外膜細胞促進成分を含み、任意に、前記心外膜細胞促進成分は、心外膜細胞の発生を促進するのに適した濃度のＢＭＰ４を含む、請求項１から１０まで又は２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記心外膜細胞促進成分は、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記心外膜細胞促進成分は、Ｗｎｔ成分、任意に、ＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記心外膜細胞促進成分は、ＢＭＰ４及びＷｎｔ成分、任意に、ＣＨＩＲ９９０２１を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団は、ＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルと接触させられる、請求項１から１０まで、２０から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団は、前記成熟カクテルと４日以上、任意に、約４日、約５日、約９日、約１５日又は約２０日間、接触させられて、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を生成する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は単離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は培養されて、ゾナオクルディン１（ＺＯ１）＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を得、任意に、前記ＺＯ１＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は単離される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団及び／又は前記ＺＯ１＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）カクテルと接触させられ、一定時間、培養される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＭＴカクテルは、１）ＴＧＦβ成分；２）ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分であって、任意に、前記ＴＧＦβ成分及び前記ＦＧＦ成分は連続的に投与される、ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分、又は；３）ＦＧＦ成分を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＭＴカクテルは、１）約４日間のＴＧＦβ−１に続き約４日間の追加の因子はなし（ＴＧＦβ）、２）約４日間のＴＧＦβ−１に続き約４日間のｂＦＧＦ（ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ）又は３）約８日間のｂＦＧＦ（ｂＦＧＦ）のスケジュールに従って前記ＷＴ１＋集団の細胞と接触させられる、請求項請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＭＴカクテルは、１）ＴＧＦβ成分又は２）ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分を含み、前記細胞集団は、任意に、フローサイトメトリーによって測定されるＳＮＡＩ１若しくはＳＮＡＩ２などのＥＭＴマーカー、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又はＳＭＡなどの平滑筋マーカーの発現或いは平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮの発現をもたらす時間、培養される、請求項２９から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記集団の細胞は、前記集団の細胞が平滑筋マーカー若しくは血管平滑筋系統細胞集団を得るための転写物を発現するまで、任意に、前記集団の細胞が増加したレベルの間葉系マーカー、任意に、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０を発現するまで又は刺激時にある割合の細胞がカルシウムトランジェントを示すまで培養される、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＥＭＴカクテルは、ＦＧＦ成分を含み、前記細胞集団は、任意に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される心外膜由来線維芽細胞マーカー、任意に、ＴＣＦ２１を発現する線維芽細胞系統細胞集団を生成する時間、培養される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記集団の細胞は、ＴＣＦ２１を発現し且つ／又は浸潤性を獲得するよう培養されて線維芽細胞系統細胞集団を得る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団及び／又はＷＴ１＋ＺＯ１＋心外膜系統細胞集団は、レチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団を得る時間、培養され、任意に、前記レチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団はＡＬＤＨ１Ａ２を発現するか、又はＡｌｄｅｆｌｕｏｒ染色が陽性であり、任意に、前記細胞集団は少なくとも５０％がＡｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）陽性である、請求項１〜１０まで及び２６から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記血管平滑筋系統細胞集団、線維芽細胞系統細胞集団及び／又はレチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団は単離される、請求項３３から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
心血管前駆細胞特定化カクテルは、アクチビン／ノーダル阻害物質、任意に、ＳＢ４３１５４２をさらに含む、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｈＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系及び／又はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系である、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｉＰＳＣは、線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１から４０までのいずれか一項に記載の方法により生成された心血管系統細胞及び／又は細胞心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）の集団。
【請求項４２】
１）心血管系統細胞又はＥＰＤＣに発現する、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＮＫＸ２−５＋、ＷＴ１、ＺＯ１、ＳＮＡＩ１及び／若しくはＳＮＡＩ２などのＥＭＴマーカー、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又はＳＭＡなどの平滑筋マーカー、平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮ、ＴＣＦ２１、レチノールデヒドロゲナーゼから選択されるマーカーの発現並びに／或いはＡｌｄｅｆｌｕｏｒ活性を測定するための薬剤；並びに／或いは２）心血管系統細胞集団の分化を誘導するための成分であって、前記成分は、心筋細胞を特定化するための濃度のＢＭＰ成分又は心外膜の特定化のためのＢＭＰ成分及びＷｎｔ成分を含む、ことから選択される、成分を含む、キット。
【請求項４３】
心血管細胞分化促進薬剤を特定するための方法であって、（ａ）試験細胞集団を試験薬剤と請求項１から４０までのいずれか一項に記載のステップで接触させるステップと；（ｂ）前記試験細胞集団及び対照中のＫＤＲ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＮＫＸ２−５＋、ＷＴ１、ＺＯ１、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又はＳＭＡなどの平滑筋マーカー、平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮ、ＴＣＦ２１、レチノールデヒドロゲナーゼから選択されるマーカーの発現、並びに／又はＡｌｄｅｆｌｕｏｒ活性レベルをモニターするステップと；（ｃ）前記試験薬剤が前記心血管系マーカーの発現を誘導する且つ／又は増加させる場合、前記試験薬剤を心血管細胞分化促進薬剤として特定するステップとを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる２０１３年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／８７７，６１８号の優先権に基づき３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の利益を主張する特許協力条約に基づく出願である。
【０００２】
本開示は、ｈＰＳＣを含むＰＳＣから心血管系統細胞を生成するための方法及び組成物並びに心筋細胞及び心外膜系統細胞集団を生成するための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
過去５年にわたって、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（一括して、ヒト多能性幹細胞；ｈＰＳＣと呼ばれる）の分化を心血管系統の細胞型などの特定の細胞型へと向ける技能に進歩があった１、２。この成功は、主としてモデル生物における系統発生及び組織形成の理解をｈＰＳＣ分化培養へとトランスレーションすることに基づくものである１。心血管系に関して、このアプローチが、原条（ＰＳ：ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）様集団の形成、心血管中胚葉の誘導及びこの中胚葉から心血管系統への特定化を含む発生の重要な段階を再現する分化プロトコルの確立につながった３、４。発生生物学は、ＰＳ／中胚葉集団を生じさせるためのアクチビンＡ／ノーダル及びＢＭＰ４シグナル伝達に関する必要条件並びに中胚葉を心血管運命へ特定化するβ−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することの必要性などの発生の進行を制御する重要な調節経路に関する情報も提供してきた４。最近の研究により、心血管発生のさまざまな段階の細胞集団に特異的な表面マーカーが特定されてきた。このマーカーセットとしては、心血管中胚葉に見られるＫＤＲ及びＰＤＧＦＲα５並びに心血管前駆細胞及び分化した心筋細胞に存在するＳＩＲＰＡが挙げられる６。ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα＋集団の出現をモニターすることによって、異なるｈＰＳＣ系は、最適な中胚葉誘導及び心筋細胞発生のために異なる濃度のアクチビンＡ及びＢＭＰ４を必要とすることが示された５。
【０００４】
心外膜系統は、マウスにおいておよそ胚期（Ｅ）９．５に心臓の近傍に発生する心外膜前駆組織（ＰＥＯ：ｐｒｏｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｏｒｇａｎ）として知られる構造に由来する７。転写因子であるウィルムス腫瘍１（ＷＴ１：Ｗｉｌｍｓ  Ｔｕｍｏｒ  １）及びＴＢＸ１８の発現によって特徴づけられる心外膜前駆細胞は、ルーピングの過程においてＰＥＯから初期の心筒に移動し、それを急速に覆って心外膜として知られる外側上皮層を形成する。心外膜は、正常な心臓発生に必須のものであり、急速な心室細胞の増殖及び緻密層心筋の形成を助ける働きをする。心外膜は、心臓線維芽細胞、冠血管平滑筋細胞及び少ない程度ではあるが内皮細胞などの心臓のいくつかの主要な細胞型の供給源でもある。これらの分化した子孫は、心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ：ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）と呼ばれ、心外膜の上皮間葉転換（ＥＭＴ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）により得られる。系譜追跡研究は、心外膜が心筋細胞の供給源でもあることを示唆している８、９。しかしながら、これらの研究の解釈は、追跡実験に使用される遺伝子の心外膜特異性の不確実さから疑問視されている１０。
【０００５】
心外膜は、レチノイン酸（ＲＡ：ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）などのいくつかの因子を産生する、そのうちのいくつかは緻密層心筋の形成に必要な心室筋細胞増殖の移行相に必須である。最近の研究は、ＩＧＦ２が心室の増殖を促進する重要な心外膜由来因子であること１１及びＲＡが肝臓のエリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）を活性化することによりこの機能を間接的に仲介し、ひいては、心外膜のＩＧＦ２を誘導すること１２を示している。Ｇ−アクチン単量体結合タンパク質であるチモシンβ４（Ｔβ４：ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４）の活性による心外膜の心筋制御に関する証拠も存在する１３。Ｔβ４は発生中の心筋によって産生され、適切な心外膜発生及び完全性に必要とされる。
【０００６】
正常な成人心外膜は、ＷＴ１、ＴＢＸ１８又はＲＡＬＤＨ２を発現しないが１４、心筋梗塞などの損傷がこの『胎生期』遺伝子プログラムのアップレギュレーション並びに集団内の細胞の増殖及びＥＭＴの再活性化を引き起こす。梗塞中にＴβ４を注入することにより、これらの変化が高められ、心筋壊死を予防する。これは、活性化した心外膜細胞からのパラクライン因子の産生による可能性が高い１４、１５。成人の系譜追跡研究は、この活性化した心外膜が新しい心筋細胞を形成する能力をいくらか有すること及びこの心臓発生潜在力が梗塞前の心臓をＴβ４により予め刺激することによって増すことを示唆している１５。しかしながら、胎生期の研究のとおり、この概念には議論の余地がある。それは、最近の研究によって、Ｔβ４処理された梗塞心臓の心筋に対して、心外膜が寄与することの実証に失敗したからである１４。
【０００７】
インビトロ研究により、外植片培養物中の心外膜細胞が、ノッチ１６、ＴＧＦβ１７〜１９及びＰＤＧＦＢＢ２０又はＴβ４１５に応答してＥＭＴを起こして、ＥＰＤＣを生じることが示されてきた。Ｔβ４により予め刺激された梗塞を起こした動物の心外膜細胞は、インビボにおいて外植片培養物中で心筋細胞マーカーを発現する細胞に分化する１５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
こうした進歩は、ｈＰＳＣから心筋細胞への効率的でスケーラブルな誘導を可能にしてきたが、これらの分化集団が多くの用途に対して最適な訳ではない。それは、そうした分化集団が未成熟の細胞を含み、集団内の心筋細胞及び心外膜細胞などのさまざまな心臓系統細胞の割合が十分に定義されていないためである。心血管研究及び治療応用におけるｈＰＳＣの潜在能力を具現化するためには、培養系及びヒト心臓をより正確に表わした人工組織を開発することが必要である可能性が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）から心血管系統細胞集団、任意に、心筋系統細胞集団又は心外膜系統細胞集団を得る方法であり、本方法は、（ａ）ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣを、ｈＰＳＣが心血管中胚葉細胞集団に分化するよう誘導するのに適した心血管中胚葉プログラミングカクテルと、プログラミングカクテルがｈＰＳＣに浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させたｈＰＳＣを、ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｂ）心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を特定化するのに適した心血管前駆細胞特定化カクテルと、特定化カクテルが心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管中胚葉細胞集団をＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｄ）心血管前駆細胞集団を、成熟カクテルと、成熟カクテルが心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管前駆細胞集団を心血管系統集団、任意に、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び／若しくはＳＩＲＰＡを発現する心筋系統細胞集団並びに／又は任意に、ＷＴ１を発現する及び／若しくは心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）を含む心外膜系統細胞集団を生成する時間、培養するステップを含む。
【００１０】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、本開示の趣旨及び範囲内のさまざまな変更及び改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるため、詳細な説明及び同時に本開示の好適な実施形態を示す特定の例は、説明のために提供したに過ぎないことが理解されるべきである。
【００１１】
本開示の実施形態をここで以下の図面と関連して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｈＥＳＣからの心筋細胞の特定化。発生の３つの主要な段階である１）中胚葉誘導、２）心血管特定化及び３）成熟を強調した、ｈＥＳＣを心筋細胞系統へ分化させるために使用される手順の模式図である。アクチビンＡ／ＢＭＰ４誘導された４日目の胚様体（ＥＢ：ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）からの細胞がゼラチン被覆されたウェルに単層としてまかれる。ＢＭＰ経路は、ＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビン／ノーダル（ＳＢ−４３１５４２  ５．４μＭ）及びＷｎｔ（ＤＫＫ１  １５０ｎｇ／ｍｌ）阻害物質の存在下で４８時間（４日目〜６日目）操作される。特定化後に、培養物はＶＥＧＦに９日間維持された後、フローサイトメトリーによってｃＴｎＴ＋心筋細胞の存在について分析される。
【図２】ＢＭＰ４は、ｈＥＳＣ由来中胚葉からの心筋細胞の特定化を調節する。        図２ａは、４日目及び５日目におけるＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋集団の存在及び未処理（対照）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＢＭＰ４阻害物質ノギン（４００ｎｇ／ｍｌ）による処理後の培養の１５日目のｃＴｎＴ＋発現を示すフローサイトメトリー分析のグラフである。        図２ｂは、上記のとおり処理された培養物の１５日目におけるウェル当たりの合計の細胞数を示すグラフである。エラーバーは、３つの実験の平均値からの標準偏差を表わす。
【図３】ＢＭＰシグナル伝達は、心筋細胞をｈＥＳＣ由来中胚葉から用量依存的に特定化する。示した量のＢＭＰ４又はノギンにより処理された集団から形成された１５日目の培養物中のパーセントｃＴｎＴ＋細胞を示すフローサイトメトリー分析のグラフ表示である。ＮＴ＝未処理。バーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未処理と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図４】ＢＭＰ処理後の心筋及び心外膜マーカーのｑＲＴ−ＰＣＲ発現を示すグラフである。未処理細胞（対照）、ＢＭＰ４処理された細胞又はノギン（４００ｎｇ／ｍｌ）処理された細胞から形成された集団の培養６日、８日、１０日、１２日及び１５日目の示した遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現。値はハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰを基準とするものである。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未処理と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図５】ＢＭＰ４誘導細胞は心外膜マーカーＷＴ１．Ｂを発現する。培養の１５日目の未処理細胞（対照）、ＢＭＰ４処理された細胞（１０ｎｇ／ｍｌ）及びノギン（４００ｎｇ／ｍｌ）処理された細胞におけるｃＴｎＴ及びＷＴ１の存在を示す蛍光免疫染色分析である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す
【図６】ＷＴ１＋心外膜は、継代後に上皮シートを形成する。        図６ａは、培養の１５日目のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）処理された心外膜細胞の形態並びにＺＯ１及びＷＴ１の存在を示す位相差顕微鏡及び蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。スケールバーは１００μΜに相当する。        図６ｂは、継代後４日目（１５＋４日目）のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）処理された心外膜細胞の形態並びにＺＯ１及びＷＴ１の存在を示す位相差顕微鏡及び蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。スケールバーは１００μΜに相当する。
【図７】１５日目の心筋細胞、１５日目の心外膜及び継代後の心外膜の細胞表面マーカーの発現に関するフローサイトメトリー分析のグラフである。１５日目の心筋細胞、１５日目の心外膜及び継代の４日後（１５＋４日目）の心外膜に関する示したマーカーのフローサイトメトリー分析。灰色で塗られたヒストグラムは未染色の蛍光強度を示す。
【図８】心筋細胞及び心外膜細胞は４日目のＰＤＧＦＲα＋中胚葉に由来する。        図８ａは、４日目のＥＢから単離されたＰＤＧＦＲ＋及びＰＤＧＦＲ−集団を示すグラフである。この細胞は、心筋細胞又はＷＴ１＋細胞の発生を助ける条件下でまかれた。        図８ｂは、心臓発生促進条件下でまかれた１５日目の培養物中のｃＴｎＴ＋細胞を示すフローサイトメトリー分析のグラフである。        図８ｃは、心外膜前駆細胞誘導条件（ＢＭＰ４）下でまかれた１５日目の培養物中のＷＴ１陽性細胞の存在に関する蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。        図８ｄは、心外膜前駆細胞条件下における培養後１５日目の選別された集団の心外膜マーカーＷＴ１及びＴＢＸ１８のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現分析を示すグラフである。値は未選別培養物と比較した倍率変化である。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未選別培養物から＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図９】ＢＭＰ及びＷｎｔシグナル伝達は、心筋細胞及び心外膜細胞特定化を調節する。        図９ａは、示した量のＤＫＫ１若しくはＣＨＩＲと組み合わせた未処理細胞（対照）或いはＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＢＭＰ阻害物質であるドルソモルフィン（ＤＭ  ４μΜ）のいずれかにより処理された細胞から形成された１５日目の培養物のパーセントｃＴｎＴ＋細胞を示すフローサイトメトリー分析のグラフによる描写である。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；ＢＭＰ経路の示した操作の状況における『Ｗｎｔ処理なし』（ＮＴ）の対照と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１        図９ｂは、示した量のＤＫＫ若しくはＣＨＩＲと組み合わせた未処理細胞（対照）或いはＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＤＭ（４μΜ）のいずれかにより処理された細胞から形成された１５日目の培養物におけるＷＴ１発現のｑＲＴ−ＰＣＲベースの分析を示すグラフである。値はハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰを基準とするものである。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；ＢＭＰ経路の示した操作の状況における『Ｗｎｔ処理なし』（ＮＴ）の対照と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。        図９ｃは、示した量のＸＡＶ９３９（ＸＡＶ）と組み合わせた未処理細胞（対照）又はＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＤＭ（４μΜ）のいずれかにより処理された細胞から形成された１５日目の培養物のパーセントｃＴｎＴ＋細胞を示すフローサイトメトリー分析及びＷＴ１発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；特定のＢＭＰ処理の状況においてＷｎｔ処理なし（図９ａ及び９ｂ参照）と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。        図９ｄは、示した量のＩＷＰ２と組み合わせた未処理細胞（対照）又はＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＤＭ（４μΜ）のいずれかにより処理された細胞から形成された１５日目の培養物のパーセントｃＴｎＴ＋細胞を示すフローサイトメトリー分析及びＷＴ１発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；特定のＢＭＰ処理の状況においてＷｎｔ処理なし（図９ａ及び９ｂ参照）と比較された場合、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１０】センダイウイルス由来ｈｉＰＳＣ及びＨ７  ｈＥＳＣからのＷＴ１＋心外膜細胞の形成。          図１０ａは、ｈｉＰＳＣ由来心外膜培養物におけるＷＴ１及びＺＯ１の発現を示す蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。模式図は、操作及び分析のタイミングを示す。          図１０ｂは、Ｈ７  ｈＥＳＣ由来心外膜培養物におけるＷＴ１及びＺＯ１の発現を示す蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。模式図は、操作及び分析のタイミングを示す。
【図１１】ＷＴ１＋心外膜細胞はＴＧＦβ１及びｂＦＧＦ処理に応答してＥＭＴを起こす。          図１１ａは、ＥＭＴ誘導に使用される手順の模式図である。１５日目のＷＴ１＋培養物が継代され、１日置かれた後、４日間のＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）に続く未処理（ＴＧＦβ）、４日間のＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）に続く４日間のｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の逐次的な処理（ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ）又は８日間のｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）処理（ｂＦＧＦ）により処理される。未処理の培養物は対照の役割を果たす。          図１１ｂは、細胞表面間葉系マーカーＣＤ９０に関するＥＭＴの開始後８日目の培養物のフローサイトメトリー分析のグラフである。灰色で塗られたヒストグラムは、対照培養物の蛍光強度を示す。          図１１ｃは、ＥＭＴ開始後２日、４日、６日及び８日目の心外膜遺伝子ＷＴ１並びにＥＭＴ誘導遺伝子ＳＮＡＩ１及びＳＮＡＩ２のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現を示すグラフである。値は実験と一致する継代前１５日目のＷＴ１＋培養物に対する倍率変化として表わされる。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未処理の対照と比較して、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１２】ＥＭＴに応答してＷＴ１及びＺＯ１発現が失われる。示した因子によるＥＭＴ開始後８日目の心外膜培養物中の細胞形態並びにＺＯ１及びＷＴ１タンパク質の発現を示す位相差及び蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。
【図１３】ＥＰＤＣは蛍光免疫染色による線維芽細胞及び血管平滑筋細胞マーカーの特徴的な発現を示す。示した因子によるＥＭＴ開始後８日目の培養物中のα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ：Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）及びビメンチン（ＶＩＭ：Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）タンパク質を示す蛍光免疫染色である。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。
【図１４】ＥＰＤＣはｑＲＴ−ＰＣＲによる線維芽細胞及び血管平滑筋細胞マーカーの特徴的な発現を示す。ＥＭＴ開始後８日目の示した培養物中の平滑筋遺伝子ＣＣＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮ並びに心外膜／心臓線維芽細胞遺伝子ＴＣＦ２１のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現分析を示すグラフである。値は実験と一致する継代前１５日目のＷＴ１＋心外膜培養物に対する倍率変化として表わされる。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未処理の培養物の対照と比較して、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１５】ｈＥＳＣ心外膜由来平滑筋様細胞は刺激されると活動電位を生じる。          図１５ａは、示した処理に関して測定されたＥＭＴ誘導培養物中の活発に循環する細胞の全割合を示すグラフである。ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦによる処理は、アゴニストに応答して最大の割合の活発に循環する細胞を含む集団を形成した。バーは平均値の標準誤差を表わす；Ｎ＝３／群、チューキー事後検定を用いた一元配置分散分析法により比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。          図１５ｂは、基準時及びＮＥ及びＰＥ添加後に、示した条件における活発に循環する細胞のカルシウム循環の頻度を示すグラフである。積み重ね棒は、基準の記録時（斜線）及びＮＥ（白色）又はＰＥ（黒色）処理後のカルシウム循環の頻度への寄与を表わす。          図１５ｃは、ＥＭＴ誘導培養物へのＮＥ及びＰＥ添加後のカルシウムトランジェントの大きさを示すグラフである。未処理  ＮＥ  Ｎ＝６細胞、ＰＥ  Ｎ＝４細胞；ＴＧＦβ  ＮＥ  Ｎ＝６細胞、ＰＥ  Ｎ＝１２細胞；ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ  ＮＥ  Ｎ＝１３細胞、ＰＥ  Ｎ＝２５細胞。チューキー事後検定を用いた一元配置分散分析法により比較して、＊Ｐ＜０．０５。          図１５ｄは、ＥＭＴ誘導培養物へのＮＥ及びＰＥ添加後のカルシウムトランジェントの持続時間を示すグラフである。未処理  ＮＥ  Ｎ＝６細胞、ＰＥ  Ｎ＝４細胞；ＴＧＦβ  ＮＥ  Ｎ＝６細胞、ＰＥ  Ｎ＝１２細胞；ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ  ＮＥ  Ｎ＝１３細胞、ＰＥ  Ｎ＝２５細胞。チューキー事後検定を用いた一元配置分散分析法により比較して、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６】ｈＥＳＣ心外膜由来線維芽細胞様細胞は三次元ゲルを浸潤する。          図１６ａは、ＥＭＴ誘導後８日目におけるマトリゲル浸潤アッセイのＸＹ平面（上面図）及び三次元再構築（側面図）の代表的な視野である。          図１６ｂは、ＥＭＴ開始後８日目におけるマトリゲル浸潤の最大深さを示すグラフである。バーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値の標準誤差を表わす；スチューデントＴ検定によって分析されたとおり未処理対照と比較して＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１７】ＷＴ１＋心外膜細胞は、継代後にＡＬＤＨ１Ａ２発現をアップレギュレートし、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示す。          図１７ａは、１５日目のＷＴ＋心外膜培養物及び１５＋８日目の継代後の未処理の心外膜培養物中のＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ２及びＡＬＤＨ１Ａ３のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現分析を示すグラフである。値はハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰを基準とするものである。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；ＡＬＤＨ１Ａ２発現レベルと比較して、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。          図１７ｂは、ＥＭＴの開始後２日、４日、６日及び８日目におけるＡＬＤＨ１Ａ２のｑＲＴ−ＰＣＲベースの発現分析を示すグラフである。値は実験と一致する継代前１５日目のＷＴ１＋心外膜培養物に対する倍率変化として表わされる。エラーバーは３つの独立した実験（Ｎ＝３）の値の平均値からの標準偏差を表わす；未処理の対照培養物と比較して、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。          図１７ｃは、４日から６日目までＤＭ（非心臓、非心外膜）、ＢＭＰ４＋ＸＡＶ（心筋細胞）又はＢＭＰ４＋ＣＨＩＲ（ＷＴ１＋心外膜細胞）により処理された細胞から形成された１５日目の集団に対するＡｌｄｅｆｌｕｏｒのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。          図１７ｄは、示した処理によるＥＭＴの開始後８日目のＷＴ１＋心外膜由来培養物に対するＡｌｄｅｆｌｕｏｒのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１８】ｈＰＳＣ由来中胚葉からの心筋細胞、心外膜及びＥＰＤＣの発生を示す分化の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．定義
「アクチビン成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ又は複数の成分或いは上記成分（単数若しくは複数）を含む組成物、任意に、アクチビンＡ及び／若しくはノーダルなどのノーダルシグナル伝達、任意に、アクチビンＡ活性を活性化する分子を含む培養培地を意味する。
【００１４】
「アクチビン」又は「ＡｃｔＡ」という用語は、本明細書中で使用される場合、「アクチビンＡ」、（例えば、遺伝子ＩＤ：３６２４）、例えば、ヒトアクチビンＡ、並びに例えば、ノーダルシグナル伝達を活性化することができる、任意に、天然に生じる活性複合体及びフラグメントを含むその活性複合体及びフラグメント、並びに天然に生じる活性複合体及びフラグメントを含むその活性複合体及びフラグメントを指す。
【００１５】
「アクチビン／ノーダル阻害物質」及び／又は「アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βＲ阻害物質」という用語は、本明細書中で使用される場合。アクチビン／ノーダル経路のシグナルを阻害するあらゆる分子、特に、レセプターＡＬＫ４、ＡＬＫ７及び／又はＴＧＦ−βＲＩを阻害する任意の分子を意味し、以下に限定されるものではないが、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９２９）、Ｄ  ４４７６、ＧＷ  ７８８３８８、ＬＹ  ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ  ５０５１２４、ＳＢ  ５２５３３４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＳＤ  ２０８が挙げられる。
【００１６】
「ｗｎｔ阻害物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、ｗｎｔシグナル伝達を阻害するあらゆる化合物及び／又はタンパク質を含むあらゆる薬剤を意味し、以下に限定されるものではないが、Ｗｎｔリガンド自体若しくはＷｎｔレセプターのいずれかと結合するＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）タンパク質、Ｗｎｔ阻害因子−１（ＷＩＦ：Ｗｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ−１）及び分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）などのｗｎｔアンタゴニスト、並びにｗｎｔインバースアゴニスト（例えば、アゴニストと同じレセプターに結合するが、アゴニストの薬理学的反応と反対の薬理学的反応を引き起こす薬剤）が挙げられる。Ｗｎｔ阻害物質の例としては、共にＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なｗｎｔプロセシングの阻害物質であるＸＡＶ９３９、ＩＷＰ  ２、及びβ−カテニン応答性転写（ＣＲＴ）の強力な阻害物質であるｉＣＲＴ１４、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１７】
「ｗｎｔ成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、心血管細胞のｗｎｔ／ベータ−カテニンレセプターシグナル伝達を活性化するあらゆる分子を意味し、例えば、Ｗｎｔ３ａ及び並びにＧＳＫ３選択的阻害物質、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））又はＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）が挙げられる。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の選択的阻害物質である。意図されるＧＳＫ３選択的阻害物質は、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路のＧＳＫ−３α／βに対する選択的阻害物質である。
【００１８】
「ＦＧＦ成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、ＦＧＦを含むサイトカインなどの分子又はＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する、例えば、ＦＧＦレセプターと結合し、活性化する小分子を意味する。「ＦＧＦ」という用語は、本明細書中で使用される場合、あらゆる線維芽細胞成長因子を指し、例えば、ヒトＦＧＦ１（遺伝子ＩＤ：２２４６）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られている；遺伝子ＩＤ：２２４７）、ＦＧＦ３（遺伝子ＩＤ：２２４８）、ＦＧＦ４（遺伝子ＩＤ：２２４９）、ＦＧＦ５（遺伝子ＩＤ：２２５０）、ＦＧＦ６（遺伝子ＩＤ：２２５１）、ＦＧＦ７（遺伝子ＩＤ：２２５２）、ＦＧＦ８（遺伝子ＩＤ：２２５３）、ＦＧＦ９（遺伝子ＩＤ：２２５４）及びＦＧＦ１０（遺伝子ＩＤ：２２５５）であり、任意に、天然に生じる活性複合体及びフラグメントを含むそれらの活性複合体及びフラグメントを含む。特定の実施形態において、ＦＧＦは、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４及び／又はＦＧＦ２である。
【００１９】
「ＢＭＰ成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、あらゆる分子、任意に、あらゆるＢＭＰ、又はＢＭＰ４に対するレセプターを活性化する成長分化因子（ＧＤＦ）を意味し、例えば、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２が挙げられる。
【００２０】
「ＢＭＰ阻害物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＢＭＰシグナル伝達のあらゆる阻害物質を意味し、例えば、１型ＢＭＰレセプター阻害物質、ＢＭＰリガンド及び／又は可溶性ＢＭＰレセプターが挙げられる。任意に、ドルソモルフィン（ＤＭ）、ノギン、コーディン、ＬＤＮ−１９３１８９、可溶性ＢＭＰＲ１ａ、及び／又は可溶性ＢＭＰＲ１ｂから選択される。
【００２１】
「ＢＭＰ４」（例えば、遺伝子ＩＤ：６５２）という用語は、本明細書中で使用される場合、骨形成タンパク質４、例えば、ヒトＢＭＰ４並びに、例えば、ＢＭＰ４レセプターシグナル伝達を活性化することができる、任意に天然に生じる活性複合体及びフラグメントを含むそれらの活性複合体及びフラグメントを指す。
【００２２】
「ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＢＭＰ成分と少なくとも１２時間、好ましくは、少なくとも２４時間又はより好ましくは、少なくとも４８時間、接触させられたｈＰＳＣを意味する。一般に、これらの細胞は、胚様体又は単層培養物である。
【００２３】
「心血管系統細胞」という用語は、心血管中胚葉、心筋細胞又は心外膜遺伝子発現パターン、例えば、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲα、ＮＫ２ホメオボックス５（ＮＫＸ２−５）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ）若しくはウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を発現し、予め刺激されるか、或いは本明細書に記載される心筋系統細胞及び／又は心外膜系統細胞或いは血管平滑筋様細胞若しくは線維芽細胞様細胞などの心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）に分化する能力を有する細胞を指す。
【００２４】
「心血管中胚葉プログラミングカクテル」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＢＭＰ成分とアクチビン成分と任意にＦＧＦ成分とを含む組み合わせであり、この心血管中胚葉プログラミングカクテルは、約３日から約５日間、ｈＰＳＣと接触させられる。
【００２５】
「心血管前駆細胞特定化カクテル」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を特定化するための１つ又は複数の成分、上記成分（単数又は複数）を含む組成物を意味し、例えば、ＮＫＸ２−５＋心筋系統前駆細胞集団を特定化するための心筋促進成分又はＷＴ１＋心外膜系統前駆細胞集団を特定化するための心外膜促進成分である。
【００２６】
「心筋促進成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ又は複数の成分又は上記成分（単数又は複数）を含む組成物を意味し、上記１つ又は複数の成分は、以下のものを含む：１）任意に、ＤＫＫ１、ＸＡＶ９３９及びＩＷＰ２から選択されるＷｎｔ阻害物質とＢＭＰ成分の組み合わせ、任意に、ＢＭＰ成分は、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬであるが、１０ｎｇ／ｍｌ未満若しくは１５ｎｇ／ｍＬ未満又は好ましくは約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４である；或いは２）ノギン又はドルソモルフィンなどのＢＭＰ阻害物質、例えば、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満若しくは２５ｎｇ／ｍＬ未満及び／又は１２．５ｎｇ／ｍＬ超の濃度のノギン；３）例えば、産生された十分な内在性ＢＭＰ４がある場合は、Ｗｎｔ阻害物質、並びに／或いは４）例えば、ＢＭＰ４が０．６３ｎｇ／ｍＬ未満、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、０．４ｎｇ／ｍＬ未満又は０．３ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である場合は、心筋細胞系統濃度のＢＭＰ成分、任意に、ＢＭＰ４。効果的な濃度及び／又は組み合わせは、ＮＫＸ２−５発現及び／又はＴＮＮＴ２／ｃＴｎＴ発現に関してモニターし、最適化することによって決定することができる。
【００２７】
「心外膜系統促進成分」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ又は複数の成分又は上記成分（単数又は複数）を含む組成物を意味し、１つ又は複数の成分は、心外膜系統を促進する濃度のＢＭＰ成分、任意に、ＢＭＰ４と、任意に、Ｗｎｔ成分とを含む。任意に、ＢＭＰ４は、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ若しくは少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度であり且つ／又はＷｎｔ成分はＣＨＩＲ９９０２１である。効果的な濃度及び／又は組み合わせは、ＷＴ１発現、バソヌクリン１（ＢＮＣ１）発現、アネキシンＡ８（ＡＮＸＡ８）発現及び／又はＴ−ボックス１８（ＴＢＸ１８）発現に関してモニターし、最適化することによって決定することができる。
【００２８】
「心筋系統細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＮＫＸ２−５＋であり、例えば、本明細書に記載の方法を使用して心筋細胞に分化することができる細胞を指す。
【００２９】
「心外膜系統細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＷＴ１＋であり、例えば、本明細書に記載の方法を使用して心外膜細胞及び／又は心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）に分化することができる細胞を指す。
【００３０】
「培養すること」という用語は、本明細書中で使用される場合、単層、ビーズ、フラスコ若しくは三次元培養物を含む集団の細胞を維持及び／又は増殖させる任意のインビトロ法が挙げられ、任意に、周囲条件はインキュベーターなどで制御され、任意に細胞の継代を伴う。
【００３１】
「上皮間葉転換（ＥＭＴ）カクテル」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＥＭＴを誘導するための１つ又は複数の成分又は上記成分（単数又は複数）を含む組成物を意味し、１つ又は複数の成分としては、ＴＧＦβなどのＴＧＦβ成分又はＴＧＦβ成分と、ｂＦＧＦなどのＦＧＦ成分とを含む組み合わせが挙げられる。
【００３２】
「ＴＧＦβ成分」という用語又は本明細書中で使用される場合、ＴＧＦβシグナル伝達を促進する成分若しくは上記成分を含む組成物並びに、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及び／又はＴＧＦβ３が挙げられる。
【００３３】
「ＫＤＲ＋細胞」は、本明細書中で使用される場合、「キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター」（ＫＤＲ：ｋｉｎａｓｅ−ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ−  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）細胞表面発現を示す細胞を意味し、「ＫＤＲ＋細胞集団」は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％以上の細胞がＫＤＲ細胞表面発現を示す集団の細胞を意味する。
【００３４】
「ＰＤＧＦＲα＋細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、「血小板由来成長因子レセプターα」細胞表面発現を示す細胞を意味し、ＰＤＧＦＲα＋細胞集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％以上の細胞がＰＤＧＦＲα細胞表面発現を示す集団の細胞を意味する。
【００３５】
「濃度」という用語は、細胞培養培地における希釈濃度を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、集団の細胞に関する「精製集団」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞の混合された若しくは不均質な集団及び／又は培養培地などのその他の成分から取り除かれ、分離された（例えば、単離された）集団の細胞を指す。一部の実施形態において、精製集団は、細胞が単離又は濃縮されたもとの不均質な集団と比較した場合、実質的に純粋な集団の細胞である。
【００３７】
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約６５％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％純粋な集団の細胞を指す。同様に、「例えば、ＷＴ１＋細胞の実質的に純粋な」集団に関しては、ＷＴ１＋ではない細胞を約３０％未満、約２０％未満、より好ましくは、約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは、約５％、４％、３％、２％、１％未満又は１％未満含む集団の細胞を指す。
【００３８】
「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物を含む動物界のすべてのメンバーを含み、適切にはヒトを指す。
【００３９】
「処理する」、「処理すること」、「処理」などの用語は、細胞に対して使用される場合、細胞をあらゆる種類の工程若しくは条件に供すること又は細胞に対するあらゆる種類の操作若しくは手順を実施することを含む。対象に対して使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、医学的又は外科的行為、看護又は管理を個体に提供することを指す。
【００４０】
「治療」という用語は、本明細書中で対象に適用して使用される場合、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得ることを目的としたアプローチを指し、例えば、薬学的介入、手術、放射線療法及び自然療法的介入並びに癌を治療するための試験処置を含む医学的手技及び適用が挙げられる。有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されるものではないが、１つ若しくは複数の症状又は状態の軽減又は改善、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の広がりの予防、疾患の進行を遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び検出可能であろうと検出不可能であろうと（部分であろうと完全であろうと）寛解を挙げることができる。「治療」とは、治療を受けなかった場合に予測される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味する場合がある。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、結果として導入された細胞が所望の部位で少なくとも部分的に局在することになる方法又は経路による対象への細胞の送達と関連した「投与すること」、「導入すること」及び「移植すること」という用語は、同義に使用される。
【００４２】
「接触させること」という用語は、成分（単数又は複数）と細胞を一緒にインビトロでインキュベートすることを含むことが意図され（例えば、化合物を培養中の細胞に添加すること）、接触させるステップは、任意の適した様式で行われてもよい。例えば、細胞は、接着培養若しくは浮遊培養、三次元培養において処理されてもよく、又は細胞がビーズ上で培養される場合、カクテル成分は、一時的に実質的に同時に又は連続的（例えば、第１の成分の添加から１時間以内）に添加されてもよい。細胞は、細胞を安定させるため若しくは細胞をさらに分化させるために、成長因子若しくはその他の分化薬剤などの別の薬剤又は環境と接触させられてもよく、例えば、実施例でさらに記載されるとおり、多能性（及び／又は分化した）集団を培養するための当該技術分野において既知の条件下で細胞を培養することを含む。
【００４３】
「細胞培養培地」（本明細書中で「培養培地」若しくは「培地」とも呼ばれる）という用語は、本明細書中で言及される場合、細胞生存率を維持し、増殖及び任意に分化を助ける栄養素を含む、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のものいずれかを適切な組み合わせで含んでもよい：塩（単数又は複数）、バッファー（単数又は複数）、アミノ酸、グルコース又はその他の糖（単数又は複数）、抗生物質、血清又は血清代替品、及びその他の成分、例えば、ペプチド成長因子、ビタミンなど。特定の細胞型に対して通常使用される細胞培養培地は当業者に知られている。
【００４４】
「多能性幹細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、さまざまな条件下で２つ以上の分化細胞型に分化する能力、例えば、三胚葉に特徴的な細胞型に分化する能力をもつ細胞を指し、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞が挙げられる。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して２つ以上の細胞型に分化する細胞の能力によって特徴づけられる。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞マーカーの発現によって証明される。本明細書中で使用される場合、多能性幹としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などの細胞系を挙げることができる。ある実施形態において、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「ｉＰＳＣ」及び「人工多能性幹細胞」という用語は、同義に使用され、非多能性細胞、一般に成体の体細胞から、例えば、１つ又は複数の遺伝子（以下に制限されるものではないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ；７９７２７）と組み合わせてＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ；５４６０）を含む）の発現を誘導することによって人工的に得られた（例えば、誘発された又は完全な逆転による）多能性幹細胞を指す。
【００４６】
「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号を参照）。そのような細胞は、体細胞核移植から得られたブラストシストの内部細胞塊からも得られる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照）。胚性幹細胞の際だった特徴は、胚性幹細胞の表現型を定義する。したがって、細胞が、その細胞を他の細胞と区別できるような１つ又は複数の胚性幹細胞の独特な特徴をもつ場合、その細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例となる際だった胚性幹細胞の特徴としては、遺伝子発現プロフィール、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する反応性などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質の産生、さらに、適切な場合、タンパク質の分泌に関与する細胞内プロセス並びに細胞表面発現を指し、適用できる場合、以下に限定されるものではないが、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾及びプロセシングを含む。「発現産物」としては、遺伝子から転写されたＲＮＡ及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られるポリペプチドが挙げられる。
【００４８】
本開示の範囲を解釈する際、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその派生語は、本明細書中で使用される場合、明記した特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を指定するが、他の明記していない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を除外しない非制限用語であることが意図される。前述のことは、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの派生語などの類似の意味を有する単語にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度の用語は、本明細書中で使用される場合、修飾される用語の最終結果が著しく変わらないような適度な量のずれを意味する。これらの程度の用語は、このずれが、それが修飾する単語の意味を打ち消さない場合、修飾される用語の少なくとも±５％のずれを含むものと解釈されるべきである。
【００４９】
本開示の範囲を解釈する際、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその派生語は、本明細書中で使用される場合、明記した特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を指定し、且つ他の明記していない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在は除外する制限用語であることが意図される。
【００５０】
本明細書における端点による数量的な範囲の詳述は、その範囲内に包含されるすべての数及び小数部を含む（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４及び５を含む）。そのすべての数及び小数部は「約」という用語によって修飾されるものとみなされることも理解されるべきである。さらに、内容が明らかに別のことを指示しない限り、「１つ（ａ）、（ａｎ）」及び「その、前記（ｔｈｅ）」は、複数の指示対象を含むものと解釈されるべきである。「約」という用語は、言及される数のプラス又はマイナス０．１から５０％、５〜５０％若しくは１０〜４０％、好ましくは、１０〜２０％、より好ましくは、１０％又は１５％を意味する。
【００５１】
さらに、特定の節に記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるであろうように、それらが本明細書中に記載されている適した他の実施形態に適用できることが意図される。例えば、以下の節において、本発明のさまざまな特徴がさらに詳細に定義される。そのように定義されたそれぞれの態様は、明らかに反対のことが示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わされてもよい。特に、好ましい又は有利であると示された任意の特徴は、好ましい又は有利であると示された任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わされてもよい。
【００５２】
ＩＩ．方法及び生成物
心筋系統細胞、心外膜系統細胞及び心外膜由来細胞を含む心血管系統細胞を生成するための方法が本明細書に記載される。こうした細胞型を特定化するための成分及び条件並びにこうした細胞型の発生をモニターするためのマーカーが記載される。
【００５３】
したがって、一態様は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、任意に、ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）から心血管系統細胞集団、任意に、心筋系統細胞集団又は心外膜系統細胞集団を得る方法を含み、本方法は、（ａ）ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣを、ｈＰＳＣが心血管中胚葉細胞集団に分化するよう誘導するのに適した心血管中胚葉プログラミングカクテルと、プログラミングカクテルがｈＰＳＣに浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させたｈＰＳＣを、ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｂ）心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を特定化するのに適した心血管前駆細胞特定化カクテルと、特定化カクテルが心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｃ）心血管前駆細胞集団を成熟カクテルと、成熟カクテルが心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管前駆細胞集団を心血管系統集団、任意に、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び／若しくはＳＩＲＰＡを発現する心筋系統細胞並びに／又は任意にＷＴ１を発現する及び／若しくはＥＰＤＣを含む心外膜系統細胞集団を生成する時間、培養するステップとを含む。
【００５４】
心血管中胚葉細胞集団の発生をモニターするためにＫＤＲ及びＰＤＧＦＲαを使用することができる。ＫＤＲの発現は、ＫＤＲに特異的な抗体を使用してモニターすることができ且つ／又はＰＤＧＦＲαの発現は、ＰＤＧＦＲαに特異的な抗体を使用してモニターすることができる。共に細胞表面に発現するものであるため、ＫＤＲ及びＰＤＧＦＲα発現は細胞表面発現を測定することによってモニターすることができる。例えば、ＫＤＲ及びＰＤＧＦＲαの発現は、フローサイトメトリーを使用してモニターすることができる。
【００５５】
ある実施形態において、ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣは、ｈＰＳＣをＢＭＰ成分と約１日から約２日間、接触させることによって作製され、任意に、ＢＭＰ成分はＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２である。
【００５６】
ある実施形態において、心血管中胚葉プログラミングカクテルは、ＢＭＰ成分及びアクチビン成分並びに任意に、ＦＧＦ成分を含み、この心血管中胚葉プログラミングカクテルは、約３日から約５日間、ｈＰＳＣと接触させられる。
【００５７】
ある実施形態において、ＦＧＦ成分は、ｂＦＧＦを含む。
【００５８】
ある実施形態において、ＢＭＰ成分は、ＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２を含む。
【００５９】
ある実施形態において、アクチビン成分は、アクチビンＡを含む。
【００６０】
アクチビン成分及びＢＭＰ成分の濃度は、記載のとおりに最適化することができる５。
【００６１】
ある実施形態において、ＰＳＣは、胚様体に含まれる。
【００６２】
例えば、上記ステップａ）及びｂ）を使用して、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を得ることができることが本明細書中で証明されている。
【００６３】
したがって、さらなる態様は、ＰＳＣ、任意に、ｈＰＳＣからＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を得るための方法を含み、本方法は、（ａ）任意に上記のとおりｈＰＳＣからＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉細胞集団を得るステップと；（ｂ）ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉細胞集団を、心血管前駆細胞特定化カクテルと、特定化カクテルが心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管中胚葉細胞集団をＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成するのに十分な時間、培養するステップとを含む。
【００６４】
ある実施形態において、ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉細胞集団は、心血管前駆細胞特定化カクテルと接触させることに先立って分離される。
【００６５】
一部の実施形態において、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα＋発現細胞は、心血管前駆細胞特定化カクテルと接触させることの前に精製される。
【００６６】
別の実施形態では、心血管中胚葉細胞集団は、心血管前駆細胞特定化カクテルと少なくとも１２時間から約４８時間又は１２から４８時間の間の任意の時間、接触させられる。
【００６７】
ある実施形態において、心血管前駆細胞特定化カクテルは、心筋系統促進成分を含み、心筋促進成分は、心筋細胞の発生を促進するのに適した濃度であり、ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団を特定化する。
【００６８】
ある実施形態において、心筋促進成分は、例えば、心筋細胞の特定化を阻害するレベルのＢＭＰを内因的に発現する心血管中胚葉細胞集団とともに使用するためのＢＭＰ阻害物質を含む。
【００６９】
ある実施形態において、心筋促進成分は、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満若しくは２５ｎｇ／ｍＬ未満及び／又は１２．５ｎｇ／ｍＬ超の濃度でノギンを含む。
【００７０】
別の実施形態では、心筋促進成分は、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．２５μＭ未満又は０．１μＭ未満の濃度のドルソモルフィンである。
【００７１】
別の実施形態では、心筋促進成分は、０．６３ｎｇ／ｍＬ未満、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、０．４ｎｇ／ｍＬ未満又は０．３ｎｇ／ｍＬ未満の濃度のＢＭＰ４である。
【００７２】
別の実施形態では、心血管前駆細胞特定化カクテルは、１）Ｗｎｔ阻害物質、任意に、ＤＫＫ１、ＸＡＶ９３９及びＩＷＰ２から選択されるＷｎｔ阻害物質と、ＢＭＰ成分であって、任意に、ＢＭＰ成分は少なくとも０．０１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬであるが、１０ｎｇ／ｍｌ未満若しくは１５ｎｇ／ｍＬ未満若しくは好ましくは約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４である、ＢＭＰ成分との組み合わせ；又は２）ノギン若しくはドルソモルフィンなどのＢＭＰ阻害物質、例えば、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、２５ｎｇ／ｍＬ未満若しくは１２．５ｎｇ／ｍＬ超の濃度のノギン；３）例えば、産生された十分な内在性ＢＭＰ４がある場合、Ｗｎｔ阻害物質；並びに／或いは４）心筋細胞系統濃度のＢＭＰ成分であって、任意に、ＢＭＰ４、例えば、ＢＭＰ４は、０．６３ｎｇ／ｍＬ未満、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、０．４ｎｇ／ｍＬ未満若しくは０．３ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である、ＢＭＰ成分を含む。効果的な濃度及び／又は組み合わせは、ＮＫＸ２−５発現及び／又はＴＮＮＴ２／ｃＴｎＴ発現に関してモニターし、最適化することによって決定することができる。
【００７３】
Ｗｎｔ阻害物質は、例えば、中胚葉集団の細胞が十分な内在性ＢＭＰ成分を産生する場合、心筋細胞の特定化を誘導するためのＢＭＰを用いずに使用されてもよい。
【００７４】
例えば、中胚葉集団の細胞が十分な内在性ＢＭＰ成分を産生しない場合、心筋細胞の特定化を促進する濃度でＢＭＰ成分が使用されてもよい。
【００７５】
分泌されるＢＭＰ４又はＢＭＰ２などの内在性成分の量は、ＥＬＩＳＡ若しくはその他の定量的イムノアッセイ又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。
【００７６】
別の実施形態では、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα＋心血管中胚葉集団及び／又はＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は精製／単離される。
【００７７】
別の実施形態では、ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は、任意にＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルとさらに接触させられる。成熟カクテルは、細胞型に適した培養培地であってもよく且つ／又は付加的な成分を含んでもよい。
【００７８】
さらなる態様は、心筋トロポニンＴ＋（ｃＴｎＴ）心筋系統細胞集団を生成するための方法であり、本方法は、（ａ）請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法によりＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団を得るステップと；（ｂ）心血管前駆細胞集団を、ＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルと、成熟カクテルが心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させるステップと；（ｂ）接触させた心血管前駆細胞集団を、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を発現する心筋細胞を生成するのに十分な時間、培養するステップとを含む。
【００７９】
ある実施形態において、ＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞集団は、成熟カクテルと４日以上、例えば、少なくとも約４日間、任意に、約５日、約９日、約１５日又は約２０日間、任意に、成熟した収縮心筋細胞が生成されるまで接触させられる。この細胞は、成熟させるために所望の細胞集団が得られるまで培養を続けてもよい。
【００８０】
さらなる態様は、ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を生成する方法であり、本方法は、（ａ）任意に、上記のとおり、ｈＰＳＣからＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を得るステップと；（ｂ）心血管中胚葉細胞集団を、心外膜系統促進成分を含む心血管前駆細胞特定化カクテルと、特定化カクテルが前記心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた心血管中胚葉細胞集団を、ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成するのに十分な時間、培養するステップとを含む。
【００８１】
ある実施形態において、心血管前駆細胞特定化カクテルは、心外膜細胞促進成分を含み、任意に、心外膜細胞促進成分は、心外膜細胞の発生を促進するのに適した濃度のＢＭＰ４を含む。
【００８２】
別の実施形態では、心外膜細胞促進成分は、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４を含む。
【００８３】
別の実施形態では、心外膜細胞促進成分は、Ｗｎｔ成分、任意に、ＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。
【００８４】
さらに別の実施形態では、心外膜細胞促進成分は、ＢＭＰ４及びＷｎｔ成分、任意に、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【００８５】
別の実施形態では、ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団は、ＶＥＧＦ成分を含む成熟カクテルと接触させられる。
【００８６】
別の実施形態では、ＷＴ１＋心血管前駆細胞集団は、成熟カクテルと約４日以上、任意に、約５日、約９日、約１５日又は約２０日間、接触させられて、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を生成する。
【００８７】
別の実施形態では、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は精製／単離される。
【００８８】
別の実施形態では、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は培養されて、ゾナオクルディン１（ＺＯ１）＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団を得、任意に、ＺＯ１＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は精製／単離される。
【００８９】
別の実施形態では、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団及び／又はＺＯ１＋ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）カクテルと接触させられ、一定時間、培養される。
【００９０】
別の実施形態では、ＥＭＴカクテルは、１）ＴＧＦβ成分；２）ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分であって、任意に、ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分は連続的に投与される、ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分；又は３）ＦＧＦ成分を含む。
【００９１】
ある実施形態において、ＴＧＦｂ成分はＴＧＦｂ−１である。ある実施形態において、ＦＧＦ成分はｂＦＧＦである。
【００９２】
例２に示されるとおり、ＴＧＦｂを含むＷＴ１＋細胞ＥＭＴカクテルの処理は機能的な平滑筋細胞を生じさせ、ＴＧＦｂ及びｂＦＧＦを含むＥＭＴカクテルによるＷＴ１＋細胞の処理はさらに高い割合の平滑筋細胞を生じさせる。
【００９３】
ある実施形態において、ＷＴ１＋細胞は、ＥＭＴカクテルと約１日から最大３週間、例えば、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日若しくは約１０日又は約１週、２週若しくは週間、接触させられる。例えば、ＥＭＴカクテルが連続的に投与される成分を含む場合、それぞれの成分は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日若しくは約１０日又は約１週、約２週若しくは約３週間、投与されてもよい。
【００９４】
ある実施形態において、ＴＧＦｂ成分はＴＧＦβ−１であり、濃度は、約０．２５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ又は０．２５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間で０．１ｎｇ／ｍｌ単位で増加する任意の１つである。同様のＴＧＦｂシグナル伝達経路の活性化もたらす同等の濃度の他のＴＧＦｂ成分が使用されてもよい。
【００９５】
ある実施形態において、ＦＧＦ成分はｂＦＧＦであり、濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間で１ｎｇ／ｍｌ単位で増加する任意のものである。同様のＦＧＦシグナル伝達経路の活性化をもたらす同等の濃度の他のＦＧＦ成分が使用されてもよい。
【００９６】
さらに別の実施形態では、ＥＭＴカクテルは、１）約４日間のＴＧＦβ−１（例えば、約０．２５から約１０ｎｇ／ｍｌ）に続き４日間の追加の因子はなし（ＴＧＦβ）、２）約４日間のＴＧＦβ−１（例えば、約０．２５から約１０ｎｇ／ｍｌ）に続き約４日間のｂＦＧＦ（例えば、約１から約５０ｎｇ／ｍｌ）（ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ）又は３）約８日間のｂＦＧＦ（例えば、約１から約５０ｎｇ／ｍｌ）（ｂＦＧＦ）のスケジュールに従ってＷＴ１＋集団の細胞と接触させられる。
【００９７】
別の実施形態では、ＥＭＴカクテルは、１）ＴＧＦβ成分又は２）ＴＧＦβ成分及びＦＧＦ成分を含み、細胞集団は、任意に、フローサイトメトリーによって測定される（例えば、ＳＮＡＩ１及び／若しくはＳＮＡＩ２転写物の発現レベルを測定することによって検出可能な）ＳＮＡＩ１及び／若しくはＳＮＡＩ２などのＥＭＴマーカー、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又は、ＳＭＡなどの平滑筋マーカーの発現或いは平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮの発現をもたらす時間、培養される。
【００９８】
例２で証明されるとおり、ＥＭＴ後に形成された平滑筋様細胞は、ＮＥ及びＰＥ誘発カルシウムトランジェントを示した。カルシウムトランジェントを示す細胞の割合は、ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦによって誘発された集団で最も高かった（７０％）。このことは、このシグナル伝達経路の組み合わせが収縮できる平滑筋細胞の発生を効率的に促進したことを示す（図１６ａ）。ある実施形態において、細胞集団は、集団の細胞を生成するのに十分な時間、培養され、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％がＮＥ又はＰＥ刺激時にカルシウムトランジェントを示す。
【００９９】
別の実施形態において、集団の細胞は、集団の細胞が平滑筋マーカー又は血管平滑筋系統細胞集団を得るための転写物を発現するまで、任意に、集団の細胞が増加したレベルの間葉系マーカー、任意に、ビメンチン及び／又はＣＤ９０を発現するまで培養される。
【０１００】
別の実施形態において、ＥＭＴカクテルは、ＦＧＦ成分を含み、細胞集団は、培養されて、任意に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される心外膜由来線維芽細胞マーカー、任意に、ＴＣＦ２１を発現する線維芽細胞系統細胞集団を生成する。
【０１０１】
ＥＭＴ誘導されたｈＰＳＣ由来Ｅｐｉ細胞は、浸潤性を獲得する場合があることが例２でさらに証明されている。例えば、ＥＭＴの誘導後８日間、浸潤がモニターされ、ｂＦＧＦ単独により誘導された細胞が最も移動性があり、マトリゲルを最も深く浸潤した。ｂＦＧＦ処理はまた、関心領域内（ＲＯＩ；例えば、記録が行われた範囲）で合計細胞数を増加させた。したがって、別の実施形態において、細胞集団は、集団の細胞を生成するのに十分な時間、培養され、集団の細胞の一部が浸潤性を獲得する。浸潤性は、例えば、例２に記載されるとおりのマトリゲルアッセイにおいて少なくとも１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ又は６００μｍ移動することができる細胞を含む。
【０１０２】
ある実施形態において、細胞集団は、任意に、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）含むフローサイトメトリー、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、免疫染色及び／又は細胞傷害性薬剤に対する耐性を使用して精製／単離される。他の実施形態において、精製／単離は、非表面発現マーカーの検出に基づき、これは、アリコートを、例えば、定量的ＲＴ又はその他のＰＣＲ及びウエスタンブロットなどの免疫ベースのアッセイによりモニターすることによって達成することができる。
【０１０３】
別の実施形態において、集団の細胞は、ＴＣＦ２１を発現するよう培養されて線維芽細胞系統細胞集団を得る。
【０１０４】
別の実施形態において、成熟カクテル接触ＷＴ１＋心外膜系統細胞集団及び／又はＷＴ１＋ＺＯ１＋心外膜系統細胞集団は、レチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団を得る時間、培養され、任意に、レチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団はＡＬＤＨ１Ａ２を発現するか、又はＡｌｄｅｆｌｕｏｒ染色が陽性であり、任意に、細胞集団は少なくとも５０％がＡｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性である。
【０１０５】
別の実施形態において、血管平滑筋系統細胞集団、線維芽細胞系統細胞集団及び／又はレチノールデヒドロゲナーゼ発現心外膜系統細胞集団は、精製／単離される。
【０１０６】
別の実施形態において、心血管前駆細胞特定化カクテルは、アクチビン／ノーダル阻害物質、任意に、ＳＢ４３１５４２をさらに含む。例えば、心血管の特定化段階中に添加されたＳＢ４３１５４２は、心筋及び心外膜の特定化の両方を促進することができる。
【０１０７】
別の実施形態において、ＰＳＣはヒトＰＳＣである。さらに別の実施形態では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系、任意に、ヒトｉＰＳＣ及び／又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）系、任意に、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）である。ある実施形態において、ｉＰＳＣは、線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系である。
【０１０８】
さらなる態様は、心血管系統細胞若しくは細胞集団の精製集団及び／又は本明細書に記載の方法により生成されたそれから分化した細胞若しくは細胞集団を含む。例えば、心筋細胞又は心外膜系統細胞は夾雑細胞型とともに特定化することができることがここで証明されている。ある実施形態において、精製集団は、ゲル、任意に、マトリゲルに含まれる。したがって、所望の集団は、最小限の介入により精製することができる。
【０１０９】
ある実施形態において、細胞は、皿又はフラスコなどの固体支持体に付着させられる。
【０１１０】
別の態様は、精製／単離された心血管系統細胞若しくは細胞集団及び／又は本明細書に記載の方法により生成されたそれから分化した細胞若しくは細胞集団並びに適した希釈液を含む組成物を含む。
【０１１１】
適した希釈液は、例えば、血清、血清代替品若しくは血清サプリメント及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールメチルセルロース若しくはポリビニルピロリドンなどの適した凍結保護物質を含む、適した培養培地又は凍結保存用培地を含む。
【０１１２】
別の態様は、培養培地サプリメントを含み、任意に、ＢＭＰ成分を、心筋細胞を特定化するための濃度で含む又は心外膜の特定化のためのＢＭＰ成分及びＷｎｔ成分を含む心血管前駆細胞特定化カクテルを含む。本成分は、液体又は戻すための粉末形態であってもよい。
【０１１３】
本成分は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｔｅｍＰｒｏ−３４などの基本培地に添加される１つのサプリメントとして含まれてもよい。サプリメントの成分の量は、例えば、培養培地において希釈された場合（例えば、４５０ｍＬの基本培地において希釈された場合）に、本明細書に記載される濃度をもたらす量とすることができる。
【０１１４】
別の態様は、任意に、心筋細胞を特定化するための濃度でＢＭＰ成分を含む特定化カクテルを含む又は心外膜の特定化のためのＢＭＰ成分及びＷｎｔ成分を含む培養培地を含む。などの典型的な培養培地成分も含まれてもよい
【０１１５】
さらに、別の態様に含まれるのは、１）心血管系統細胞又はそれから分化した細胞に発現するマーカーであって、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲα、ＮＫＸ２−５＋、ＷＴ１、ＺＯ１、ＳＮＡＩ１及び／若しくはＳＮＡＩ２などのＥＭＴマーカー、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又はＳＭＡなどの平滑筋マーカー、平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮ、ＴＣＦ２１、レチノールデヒドロゲナーゼから選択されるマーカーの発現並びに／或いはＡｌｄｅｆｌｕｏｒ活性を測定するための薬剤；並びに／或いは２）心血管系統細胞集団の分化を誘導するための成分又は上記成分を含む培養培地などの組成物であって、この成分は、任意に、心筋細胞を特定化するための濃度のＢＭＰ成分を含む又は心外膜の特定化のためのＢＭＰ成分及びＷｎｔ成分を含むカクテルから選択される、成分又は上記成分を含む培養培地などの組成物を含むキットである。
【０１１６】
薬剤は、例えば、イムノアッセイ及びフローベースの方法のための抗体若しくはそのフラグメント、特定の転写物を検出するためのプライマー並びに／又はＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳｍａｒｔＦｌａｒｅなどのプローブベースの方法によって発現を検出するためのプローブであってもよい。
【０１１７】
本組成物及びキット構成要素は、本明細書中の別の場所に記載される任意の成分及び任意に、使用のための説明書を含んでもよい。例えば、ある実施形態において、本キットは、本明細書に記載される１つ又は複数の段階又は系統の分化を誘導するための成分などを含むサプリメントを含む（例えば、実施例に記載される成分を含む）。ある実施形態において、本キットは、基本培養培地、任意に、本明細書に記載の基本培養培地及び本明細書に記載の培養培地サプリメントを含む。
【０１１８】
本明細書に記載の方法により生成される細胞は、心血管系統細胞の分化を促進及び／又は阻害する薬剤を選別するために使用されてもよい。
【０１１９】
したがって、さらなる態様は、心血管細胞分化促進薬剤を特定するための方法を含み、本方法は、（ａ）試験細胞集団を試験薬剤と本明細書に記載の方法のステップで接触させるステップと；（ｂ）試験細胞集団及び対照中のＫＤＲ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＮＫＸ２−５＋、ＷＴ１、ＺＯ１、ビメンチン及び／若しくはＣＤ９０などの間葉系マーカー並びに／又はＳＭＡなどの平滑筋マーカー、平滑筋遺伝子、任意に、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮ、ＴＣＦ２１、レチノールデヒドロゲナーゼから選択されるマーカーの発現、並びに／或いはＡｌｄｅｆｌｕｏｒ活性レベルをモニターするステップと；（ｃ）試験薬剤が心血管系マーカーの発現を誘導する且つ／若しくは増加させる並びに／又は心筋細胞、心外膜若しくはＥＰＤＣの特定化を誘導する場合、この試験薬剤を心血管細胞分化促進薬剤として特定するステップとを含む。
【０１２０】
例えば、共培養アッセイが行われてもよく、その場合、ｈＰＳＣ由来心外膜及び心筋細胞は、凝集又は単層様式のいずれかで混合され、まかれてもよい。予め決められた時間の後に、培養物は、遺伝子及びタンパク質発現の変化に関してｑＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー又は免疫ベースの方法によってアッセイされてもよい。培養物は、例えば、アルファアクチニン、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ：ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、及び／又は脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ：ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に対する染色によって筋節組織に関して；例えば、フローサイトメトリー及び／又は免疫学的方法を使用して評価することができるミトコンドリアの成熟に関して；主として成体の心房筋で発現するミオシン制御軽鎖７（ＭＹＬ７：ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ７）に関して並びに／又はＷＴ１のダウンレギュレーション（例えば、心外膜の成熟を表わす）に関して評価されてもよい。フローサイトメトリー及び免疫学的方法の例を実施例で示す。
【０１２１】
ある実施形態において、本方法は、例えば、心臓及び／若しくは血管リモデリングを促進すること且つ／又は妨げるための心血管用薬物の薬物スクリーニングのために使用される。
【０１２２】
ある実施形態において、ｈＰＳＣ由来心筋細胞及び心外膜系統細胞及び／又は本明細書に記載の方法を使用して生成される組織は、１）共培養、任意に、内皮細胞とともに共培養され；２）試験薬剤と接触させられ；３）対照と比較してｉ）細胞死若しくはｉｉ）増殖の増加、任意に、内皮細胞数における；及び／又はｉｉｉ）変化した組織の組織化に関して評価され、対照と比較して細胞死の低減、増殖１つ又は複数の細胞系統の増加及び／又はＩ）低減した若しくはＩＩ）増加した細胞の組織化は、試験薬剤が心血管用薬物であると推定されることを示す。内皮細胞数は、例えば、ＣＤ３１の染色によって評価することができ、細胞死及び／又は増殖は、例えば、フローサイトメトリー、細胞計数法及び／又はフローサイトメトリーによって評価することができ、細胞の組織化は、視覚的に評価することができる。
【０１２３】
ある実施形態において、本方法は、心外膜分化、瘢痕組織の置換、虚血領域の血管再生などを促進すると推定される薬剤を特定するためのものである。ある実施形態において、ＨＰＳＣ由来心筋細胞及び心外膜系統細胞並びに／又は本明細書に記載の方法を使用して生成される組織は、１）共培養、任意に、内皮細胞とともに共培養され；２）低酸素条件又は心臓に悪影響のあるその他の条件下で試験薬剤と接触させられ；３）対照と比較してｉ）細胞死若しくはｉｉ）増殖の増加、任意に、内皮細胞数において；及び／又はｉｉｉ）低酸素条件下における変化した組織の組織化に関して評価され、対照と比較して細胞死の低減、増殖１つ又は複数の細胞系統の増加及び／又はＩ）低減した若しくはＩＩ）増加した細胞の組織化は、試験薬剤が心外膜分化、瘢痕組織の置換、虚血領域の血管再生を促進する薬剤であると推定されることを示す。内皮細胞数は、例えば、ＣＤ３１の染色によって評価することができ、細胞死及び／又は増殖は、例えば、フローサイトメトリー、細胞計数法及び／又はフローサイトメトリーによって評価することができ、細胞の組織化は、視覚的に評価することができる。
【０１２４】
心筋梗塞は、さまざまなモデル生物において誘発することができ、ｈＰＳＣ由来心外膜細胞は心臓の外側層（ｏｕｔｅｒ  ｌａｙ）に移植することができる。心機能回復、筋細胞の増殖／生存及びＥＰＤＣの寄与がアッセイされてもよい。
【０１２５】
したがって、さらなる態様は、心血管集団の細胞を、それを必要とする対象に導入する方法を含み、本明細書に記載の方法により集団の細胞を生成するステップと、細胞集団を精製するステップと、上記集団の細胞を、それを必要とする対象に投与するステップとを含む。
【０１２６】
この集団の細胞は、対象への投与に適した等張組成物に任意に含まれる。
【０１２７】
さらなる態様は、対象に本明細書に記載の方法により生成された集団の細胞、任意に、精製された細胞集団を移植することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を含む。
【０１２８】
ある実施形態において、対象は、一過性虚血発作を起こしたか又は起こしている。ある実施形態において、対象は虚血性心疾患がある。
【０１２９】
ある実施形態において、対象は、ｈＰＳＣから生成された集団を投与され、そのｈＰＳＣは自家ｉＰＳＣである。
【０１３０】
いくつかの遺伝子及び遺伝子産物が本明細書に記載される。ＴＮＮＴ２−ＮＭ＿００１２７６３４５．１、ＮＫＸ２−５−ＮＭ＿００４３８７．３、ＷＴ１−ＮＭ＿０２４４２６．４、ＴＢＸ１８−ＮＭ＿００１０８０５０８．２、ＧＡＴＡ４−ＮＭ＿００２０５２．３、ＧＡＴＡ５−ＮＭ＿０８０４７３．４、ＩＳＬ１−ＮＭ＿００２２０２．２、ＴＢＸ５−ＮＭ＿０００１９２．３、ＢＮＣ１−ＮＭ＿００１７１７．３、ＡＮＸＡ８−ＮＭ＿００１２７１７０２．１、ＳＮＡＩ１−ＮＭ＿００５９８５．３、ＳＮＡＩ２−ＮＭ＿００３０６８．４、ＣＣＮ１−ＮＭ＿００１２９９．４、ＭＹＨ１１−ＮＭ＿００１０４０１１３．１、ＴＡＧＬＮ−ＮＭ＿００１００１５２２．１、ＳＭＴＮ−ＮＭ＿００１２０７０１７．１、ＴＣＦ２１−ＮＭ＿１９８３９２．２、ＡＬＤＨ１Ａ１−ＮＭ＿０００６８９．４、ＡＬＤＨ１Ａ２−ＮＭ＿００３８８８．３、ａｎｄＡＬＤＨ１Ａ３−ＮＭ＿０００６９３．２を含む言及される遺伝子及び遺伝子産物に関するすべての参照受託番号、それと関連づけられる配列はその全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【０１３１】
上記開示は、一般的に本出願を記載している。以下の特定の実施例を参照することによってさらに完全な理解が得られる。これらの実施例は、単に説明のために記載されているに過ぎず、本出願の範囲を限定することは意図していない。状況が示唆する又は好都合にする可能性もある場合は、形態の変更及び等価物の置換が意図される。特定の用語が本明細書中で利用されてきたが、そのような用語は説明的な意味を意図しており、限定の目的ではない。
【０１３２】
以下の非限定的実施例は、本開示を説明するものである。
【実施例】
【０１３３】
（例１）
１０ｎｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのアスコルビン酸及び４  ３  １０＿４Ｍ  モノチオグリセロール（ＭＴＧ）（Ｓｉｇｍａ）を加えたＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる培地。ヒト−ＢＭＰ４、ヒト−ｂＦＧＦ、ヒト−アクチビンＡ、ヒト−ＤＫＫ１及びヒト−ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を示した時点に示した濃度で添加した。それぞれＳＢ−４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ、エリスヴィル、ミズーリ州）及びドルソモルフィン（Ｓｉｇｍａ）を用いてアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−ｂ及びＢＭＰ阻害実験を行った。Ｗｎｔシグナル伝達に関する実験については、示した濃度のＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＸＡＶ−９３９（Ｒ＆Ｄ）又はＩＷＰ２（Ｒ＆Ｄ）を使用した。培養物を５％Ｃ０２、５％０２、９０％Ｎ２環境に最初の１０〜１２日間維持した後、残りの培養期間は５％Ｃ０２空気環境に移した。示した時点で、細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析するか、又は細胞を選別した。
【０１３４】
結果
心筋細胞特定化。心血管系統のｈＰＳＣからの発生は、少なくとも３つの個別のステップ、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲ＋心血管中胚葉の誘導及び結果としてＮＫＸ２−５＋心血管前駆細胞の発生をもたらすこの中胚葉の心血管運命への特定化並びに、その後の収縮心筋細胞の成熟により進行する（図１）。アクチビンＡ及びＢＭＰ４は最初の段階の重要な調節因子であるが５、心臓の特定化を制御する経路はあまり十分に理解されておらず、誘導ステップと異なる可能性が高い。特定化ステップを調べるために、この発生の段階の間のシグナル伝達経路を容易に操作することができるモデルを確立した（図１）。このアプローチを用いて、記載されるとおり最適な濃度のアクチビン及びＢＭＰ４によりＥＢの心血管中胚葉を誘導する５。中胚葉誘導の４日目に、ＥＢを分離し、細胞をマイクロタイターウェルに単層でまき（ウェル当たり１×１０５）、さまざまな経路アゴニスト及びアンタゴニストで２４〜４８時間、処理する。この特定化ステップ後に、培養物をＶＥＧＦの存在下で維持し、１５日目に心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び／又はＳＩＲＰＡを発現する収縮細胞の存在について分析する。初期の研究は、心筋細胞がＷｎｔ阻害物質ＤＫＫ１及びアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ阻害物質ＳＢ４３１５４２の存在下において通常どおりに発生することを示し、このことは、これらの経路が特定化に必要とされないことを示す。一方、高レベルのＢＭＰ４又は阻害物質ノギン若しくはドルソモルフィンの添加が完全に心筋細胞発生を妨害したため、ＢＭＰシグナル伝達はこの段階に重大な影響を与える（図２ａ）。いずれの操作も中胚葉発生に劇的な影響は与えなかったが、ノギンはＫＤＲのレベルをある程度まで低下させた。４８時間の処理後の各群の細胞数が大きく異ならなかったため、心筋細胞発生の阻害は大幅な細胞死によるものではなかった（図２ｂ）。
【０１３５】
Ｃ．２．心外膜細胞の発生。この特定化ステップにおけるアゴニスト及びアンタゴニストの滴定により、心筋細胞発生には、（分化細胞によって産生される）内在性レベルによって達成されるか、又は低レベルのノギン（１２．５〜２００ｎｇ／ｍｌ）若しくは低レベルのＢＭＰ４（０．３１ｎｇ／ｍｌ）の添加による低レベルのＢＭＰシグナル伝達が必要とされることが明らかにされた（図３）。高濃度のノギン並びに０．６３ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＢＭＰ４の添加が心筋細胞の特定化を阻害した。すべての群の細胞数が類似していたため（図２ｂ）、これらの観察結果は、シグナル伝達の不在下又はさらに高いレベルのシグナル伝達の存在下ではその他の系統が形成されることを示唆する。最初のアプローチとしてこれらの細胞を特定するために、これらの細胞を心筋及び心外膜遺伝子のパネルの発現に関して６〜１５日間の時間経過にわたって分析した。予想どおり、対照培養物では、ＴＮＮＴ２及びＮＫＸ２−５などの心筋細胞発生を示す遺伝子のみが発現した（図４）。興味深いことに、２つの心外膜マーカーであるＷＴ１及びＴＢＸ１８が、ＢＭＰ４処理中胚葉から形成された細胞で排他的に（ＷＴ１）又は主として（ＴＢＸ１８）発現した。このことは、これらのマーカーが発生中の心外膜系統を表わす可能性を示している。最近、特定された心外膜マーカー、ＢＮＣ１及びＡＮＸＡ８２２もＢＭＰ４処理細胞において高度に発現した。対照及びＢＭＰ４処理培養物の両方においてある程度、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＩＳＬ１及びＴＢＸ５を含むその他の心臓系統マーカーの発現が発現した。ノギン処理培養物は、これらの遺伝子のいずれも著しいレベルでは発現しなかった。免疫染色によりＷＴ１（核）がＢＭＰ４により誘導された細胞においてのみ検出されたのに対し、ｃＴｎＴは未処理群の細胞にのみ存在した（図５）ことが明らかにされ、これは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析（図４）を裏付けるものである。インビボにおいて、心外膜細胞は、発生中の心臓を取り囲む上皮層を形成する１８。それらの明確な形態に加えて、培養中の上皮細胞は、ゾナオクルディン１（ＺＯ１）タンパク質の存在によってモニターすることができるタイトジャンクションを形成する能力によって特徴づけられる。培養の１５日目に、ＷＴ１発現培養物は一般的な上皮の形態を示さず、ＺＯ１の発現は観察されなかった（図６ａ）。しかしながら、さらに大きな様式における（９６ウェルから６ウェルプレート）継代及び４日間の培養後に、ＷＴ細胞が増えて上皮の形態をもつコンフルエントな単層を形成した（図６ｂ）。まとめて、これらの観察結果は、ＢＭＰ４処理細胞がｈＰＳＣ由来心外膜（Ｅｐｉ）細胞であることを強く示唆している。ゼブラフィッシュにおいて、ＢＭＰ経路がＰＥＯの発生に必須であることが確認された２３。
【０１３６】
ＷＴ１＋Ｅｐｉ細胞をさらに特徴づけるために、１５日目の集団及び継代した集団をさまざまな表面抗原の発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。これらの集団の発現パターンを１５日目の心筋細胞の発現パターンと比較した（図７）。心筋細胞及び両ＷＴ１発現Ｅｐｉ集団は、発生中のマウス心筋細胞及び成体マウスの心外膜に見られ２２、２４、細胞移動に関連すると考えられる膜貫通糖タンパク質であるポドプラニン（ＰＤＰＮ）の染色が陽性だった。興味深いことに、両Ｅｐｉ集団は、レセプターがｈＰＳＣ由来及び胎生心筋細胞に発現することが以前にわかっている６ＳＩＲＰαに関しても陽性であった。ＷＴ１＋Ｅｐｉ集団は間葉系／線維芽細胞マーカーＣＤ９０を発現したが、そのレベルは継代によりダウンレギュレートされた。本発明者らの以前の発見と一致して、心筋細胞はＣＤ９０を発現しなかった６。マウスの胚の心外膜に発現するＰＤＧＦＲβは、両Ｅｐｉ集団において低いレベルで検出された２５。対照的に、中胚葉前駆細胞マーカーＰＤＧＦＲαは、いずれの集団でも発現しなかった、このことは、このマーカーが系統特定化によりダウンレギュレートされることを示している。汎上皮マーカーＥＰＣＡＭは心筋細胞には存在したが、いずれのＥｐｉ集団にも存在しなかった。ＥＰＣＡＭ発現は、心外膜に発現するとは報告されておらず、その単純な鱗状の形態による可能性が最も高い２６、２７。どの集団もＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン又はｃＫＩＴを発現しなかった。このことは、内皮及び造血細胞型が夾雑していないことを示す。まとめて、これらのフローサイトメトリー分析の結果は、ＢＭＰを用いた中胚葉処理から形成されたＥｐｉ細胞がマウスの心外膜と表現型的に類似していることを示唆する。
【０１３７】
推定されるＥｐｉ細胞が中胚葉起源であることを実証するために、４日目の集団からＰＤＧＦＲα＋（中胚葉）及びＰＤＧＦＲα−（非中胚葉）画分を単離し、分析した。図８に示したとおり、心筋細胞（図７ｂ）及びＷＴ１＋ＴＢＸ１８＋Ｅｐｉ細胞（図７ｃ、ｄ）は陽性集団からのみ形成された。このことは、これらの細胞が中胚葉起源であることを示している。これらの観察結果は、ヒト多能性幹細胞から心外膜細胞を形成することが可能であるという最初の実証を示す。
【０１３８】
ＢＭＰ４がＷｎｔ及びアクチビン／ノーダル阻害物質の存在下で心筋細胞及びＷＴ１＋心外膜様系統を特定化することができるという発見は、これらの経路が心血管発生のこの段階において役割を果たしていないことを示唆する。しかしながら、この解釈は、Ｄｋｋ１−／−Ｄｋｋ２−／−ヌルマウスの心臓が野生型同腹子と比較して心外膜の厚さが増加し、心筋の大きさが低減されているという観察結果と一致せず、このことは、Ｗｎｔシグナル伝達が、実際には、この系統の発生において一部の役割を果たすことを示唆している２８。これらの差異を両立させるために、Ｗｎｔシグナル伝達を段階２の過程においてさらに操作した。具体的には、ＢＭＰ４若しくは小分子阻害物質のＢＭＰドルソモルフィン（ＤＭ、ノギンの代わり）のいずれかの存在下２９又は対照のＢＭＰ経路調節因子の不在下（未処理）におけるＤＫＫ１又は小分子アンタゴニストであるＸＡＶ９３９若しくはＩＷＰ２の滴定による経路の阻害に注目した。図９ａに示すとおり、漸増量のＤＫＫ１はＢＭＰ４処理培養物の運命を変え、ＷＴ１＋Ｅｐｉ集団よりむしろ心筋細胞の発生を促進した。ＸＡＶ９３９又はＩＷＰ２の添加は、高濃度のＤＫＫ１の添加と同様の影響があった（図９ｃ及びｄ）。ＤＭ処理培養物及び非ＢＭＰ培養物の心筋細胞を生じる能力は、これらの操作による影響をほとんど受けなかった（図９ａ、ｃ及びｄ）。予想どおり、小分子ＷｎｔアゴニストであるＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）の添加によるＷｎｔ経路の活性化は内在性ＢＭＰ対照における心筋細胞発生を阻害したが、ＤＭ処理培養物はＣＨＩＲ添加による影響を受けなかった（図９ａ）。
【０１３９】
発現分析は、より高い濃度のＤＫＫ１又は小分子アンタゴニストであるＸＡＶ９３９及びＩＷＰ２の添加がＢＭＰ４処理細胞のＷＴ１発現を低減させたことを示しており、このことは、心外膜集団の減少及びむしろ心筋細胞系統の特定化を示す（図９ｂ〜ｄ）。ＣＨＩＲによるＷｎｔ経路の活性化はＢＭＰ４処理細胞のＷＴ１発現に影響を及ぼさなかったが、内在性ＢＭＰ集団ではレベルを増加させたのに対して、ＤＭ処理培養物はＷＴ１発現が変化しなかった（図９ｂ）。まとめると、これらの観察結果は、Ｗｎｔシグナル伝達が心外膜系統の特定化に必要であることを実証している。
【０１４０】
すべての残りの研究に関して、ＢＭＰ４及びＸＡＶ９３９を４日目の中胚葉に添加することによって心筋細胞が形成されるのに対して、ＢＭＰ４及びＣＨＩＲの組み合わせがＷＴ１＋心外膜系統を誘導するために使用される。ＢＭＰ阻害物質であるＤＭにより処理された細胞を非心筋細胞、非心外膜対照集団として使用した。この手順を使用して、ヒト線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（センダイｈｉＰＳＣ）及びｈＥＳＣ系Ｈ７などのその他のｈＰＳＣ系からＷＴ１＋心外膜様細胞を形成することができた（図１０ａ及びｂ）。
【０１４１】
ｈＥＳＣ由来ＷＴ１＋心外膜様細胞がＥＭＴを起こすことができるかを判定するために、１５日目の心外膜細胞を継代し、１日回復させた後、合計８日間４つの処理計画のうちの１つで処理するアッセイを設計した。この計画は以下から成る：１）４日間のＴＧＦβ−１に続いて４日間の追加の因子なし（ＴＧＦβ）、２）４日間のＴＧＦβ−１に続いて４日間のｂＦＧＦ（ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ）、３）８日間のｂＦＧＦ（ｂＦＧＦ）又は４）８日間の追加の因子なし（図１１ａ）。異なる条件下における培養後に、細胞を回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーにより分析した。
【０１４２】
ＷＴ１の発現レベルは継代の直後にダウンレギュレートされ、その後、８日間の培養期間にわたって徐々にアップレギュレートされた（図１１ｃ）。ＴＧＦβ又はＴＧＦβ＋ｂＦＧＦにいずれかにより処理された細胞は時間とともにＷＴ１発現が一様に低減されたことは、心外膜同一性の喪失を示している（図１１ｃ）。対照的に、ＷＴ１発現のレベルは、ｂＦＧＦ処理細胞の対照のレベルよりは低下しなかった。ＥＭＴマーカーＳＮＡＩ１及びＳＮＡＩ２の発現も処理された集団で増加したが、そのレベルはサイトカインの組み合わせにより変化した。ＴＧＦβ、ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ及びｂＦＧＦのすべてがＳＮＡＩ２発現を増加させたが、ｂＦＧＦのみがＳＮＡＩ１の発現を誘導した（図１１ｃ）。免疫染色分析は、ＺＯ１発現がＴＧＦβ又はｂＦＧＦ処理後に内部移行するか、又は失われたことを示した（図１２）。免疫染色によるＷＴ１の発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された転写物発現と一致した。ＷＴ１及びＺＯ１発現の最も大幅な低下はＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ処理細胞で観察されたが、ＴＧＦβのみにより処理されたものとは形態的に区別できなかった。フローサイトメトリー分析は、すべての処理群の細胞が未処理の対照と比較して間葉系マーカーＣＤ９０をアップレギュレートしたことを示した（図１１ｂ）、このことは、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦがＥＭＴを開始したという解釈を裏付ける。まとめると、これらの結果は、ＷＴ１＋細胞がＴＧＦβ及びｂＦＧＦ経路の活性化後にＥＭＴを起こすことができることを示し、したがって、これらが、インビトロにおける、発生中の心外膜に対応するものであるというさらなる証拠を示している。
【０１４３】
ＥＭＴ誘導の過程において特定化される細胞型を特定するために、誘導された集団を免疫染色により間葉系マーカーであるビメンチン（ＶＩＭ）及び平滑筋マーカーであるα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現に関して、さらにｑＲＴ−ＰＣＲにより平滑筋遺伝子ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮの転写物３０並びに心外膜由来線維芽細胞マーカーＴＣＦ２１３１に関して分析した。すべての集団でＶＩＭがある程度発現したが、ｂＦＧＦ単独により処理された細胞よりもＴＧＦβ及びＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ処理細胞で実質的により明るい染色が観察された（図１３）。ＳＭＡも、ｂＦＧＦとともに又は因子の不在下で培養された細胞と比較してＴＧＦβ及びＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ処理細胞においてより高いレベルで検出された。これらのパターンは、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ＋ｂＦＧＦのいずれかにより処理された細胞が血管平滑筋系統に沿って発達していることを示唆する。これを裏付けるのは、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ＋ｂＦＧＦのいずれかにより処理された細胞は、ＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮの発現をアップレギュレートするがＴＣＦ２１の発現はアップレギュレートしないという観察結果である（図１４）。対照的に、ｂＦＧＦ誘導集団は、ＣＮＮ１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮに加えてＴＣＦ２１を発現した（図１４）。しかしながら、これらの細胞はＭＹＨ１１を発現しなかった。まとめて、これらの結果は、ＴＧＦβがｈＥＳＣ由来ＷＴ１＋心外膜細胞を平滑筋様運命へ特定化するのに対して、ｂＦＧＦは線維芽細胞様細胞の発生を促進することを示している。ＴＧＦβ後のｂＦＧＦ処理は、これらの細胞でＣＮＮ１、ＭＹＨ１１、ＴＡＧＬＮ及びＳＭＴＮの発現が増加したことによって確認されるとおり平滑筋様運命を高めるようであった。
【０１４４】
ＴＧＦβ及びＴＧＦβ＋ｂＦＧＦにより誘導されたＥＭＴ後に形成された平滑筋様細胞の収縮を引き起こす機能を試験するために、以前に記載された方法３２を使用したノルエピネフリン（ＮＥ）及びフェニレフリン（ＰＥ）による刺激後にカルシウムトランジェントが測定された。カルシウムトランジェントを示す細胞の割合は、ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦによって誘発された集団で最も高く（７０％）、このことは、このシグナル伝達経路の組み合わせが収縮可能な平滑筋細胞の発生を効率的に促進したことを示す（図１５ａ）。カルシウムトランジェントを示す細胞のうち、ＴＧＦβ及びＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ誘導細胞でＰＥ刺激後に類似の循環の速度が確認された。両集団からの細胞は、誘導されていない対照培養物のものよりも速いカルシウム循環速度を示す（図１５ｂ）。このカルシウム応答の大きさは、対照培養物と比較してＰＥ処理されたＴＧＦβ細胞で最も大きかった（図１５ｃ）。最後に、ＰＥ処理後のカルシウムトランジェントの持続時間は、ＴＧＦβにより処理された細胞又は対照集団の細胞よりもＴＧＦＢ＋ｂＦＧＦ誘導細胞で著しく長かった（図１５ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦの組み合わせ（又はより少ない程度のＴＧＦｂ）によるＥｐｉ細胞の誘導が、平滑筋活動電位及び収縮性を助長する場合もあるカルシウム移動を増加させるアゴニストに応答することができる平滑筋細胞の発生を促進することを実証している。
【０１４５】
心臓発生中に、ＥＰＤＣ及び特に心臓線維芽細胞が心筋層に浸潤することは十分に確認されている３３。ｈＰＳＣ由来Ｅｐｉ細胞のこの潜在力を評価するために、さまざまな因子によるＥＭＴの誘導後に三次元層のマトリゲルを浸潤する細胞の能力を測定した。細胞の移動を容易に追跡できるように、Ｅｐｉ集団はＧＦＰ発現ｈＥＳＣ４８から形成した。ＥＭＴの誘導後８日間、マトリゲル浸潤を共焦点顕微鏡法によりモニターし、三次元画像再構築を使用して評価した（図１６ａ）。ｂＦＧＦ単独により誘導された細胞が最も移動性があり、マトリゲルを最も深く浸潤した（図１６ｂ）。このことは、これらの細胞が本質的に線維芽細胞のものであるという解釈を裏付けている。浸潤と同時に、ｂＦＧＦ処理はまた、関心領域（ＲＯＩ）内で合計細胞数を増加させた。他のどの群もこの増加は示さなかった（未処理、ＲＯＩ当たり７３．８±６．１細胞；ＴＧＦβ、ＲＯＩ当たり５６．８±９．５細胞；ｂＦＧＦ、ＲＯＩ当たり３７９．７±４０．５細胞、ｐ＝０．００１７；ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ、ＲＯＩ当たり８０．３±１７．１細胞）。特に、ＴＧＦβ単独により誘導された集団はマトリゲルを浸潤する能力をほとんど示さず、線維芽細胞系統への自然発生的なＥＭＴを起こしたいくらかの細胞を含む可能性のある未処理対照よりもさらに低かった（白い矢じり形）。ＴＧＦβ＋ｂＦＧＦの組み合わせにより誘導された細胞は、対照集団と同様に挙動し、ｂＦＧＦ単独により誘導された細胞よりも大幅に浸潤性が低かった。浸潤の程度をさらに定量化するために、さまざまな深さにまで移動した各集団の細胞の割合を算出した。非誘導集団、ＴＧＦβ−誘導集団及びＴＧＦβ＋ｂＦＧＦ誘導集団の細胞の実質的にすべてがゲルの最初の２００μｍ以内で検出された。対照的に、ｂＦＧＦ誘導集団のおよそ半分の細胞は、この深さを超えて移動し、一部は６００μｍまで移動した。まとめて、これらの結果は、ｂＦＧＦ誘導集団がインビボにおいてＥＰＤＣに予想されたものと一致した移動性挙動を示すことを実証している。平滑筋の特徴を有する細胞がこの潜在力を示さないという観察結果は、組織への移動後にこの系統の成熟が起こる可能性が高いことを示唆している。
【０１４６】
心外膜が発生中及び心臓の損傷後にレチノールデヒドロゲナーゼであるＡＬＤＨ１Ａ２のアップレギュレーションによりレチノイン酸を産生することは十分に認められている。分化の１５日目にＷＴ１＋心外膜細胞はＡＬＤＨ１Ａ２を発現せず（図１５ａ）、フローサイトメトリーによるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーであるＡｌｄｅｆｌｕｏｒに対する染色も陽性でなかった（図１５ｃ）。しかしながら、継代後にこの集団はＡＬＤＨ１Ａ２発現が一様に増加した（図１５ａ及びｂ）。レチノイン酸の合成に関与するが、心外膜とは関連づけられないレチノールデヒドロゲナーゼであるＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ１Ａ３は低レベルでしか発現しなかった（図１５ａ）。継代の８日後、心外膜様集団は、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ染色によって測定するとアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を実質的にアップレギュレートし、７８％を超える細胞が陽性であった（図１５ｄ）。ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ又はＴＧＦβ＋ｂＦＧＦによりＥＭＴを誘導した培養物は、劇的に低いレベルのＡＬＤＨ１Ａ２発現及びＡｌｄｅｆｌｕｏｒ染色を示し、培養物がもはや心外膜細胞ではないという解釈と一致した（図１５ｂ）。
【０１４７】
まとめると、こうした研究により、継代されたＷＴ１＋心外膜細胞は、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦシグナル伝達に応答してＥＭＴを起こして平滑筋様及び線維芽細胞様細胞に向かう能力を有することが示されている。ＥＭＴ誘導シグナルの不在下において、ＷＴ＋細胞は、上皮様形態及びＡＬＤＨ１Ａ２のアップレギュレーションによるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を得る、このことは、この細胞のＲＡを合成する能力を示している（図１８）。
【０１４８】
本出願は、現在、好適な例と考えられるものに関して記載されてきたが、本出願は開示された例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれるさまざまな改変及び同等の取り合わせを範囲に含むことが意図される。
【０１４９】
すべての公報、特許及び特許出願は、それぞれ個別の公報、特許又は特許出願の全体が参照により組み込まれることが明確に及び個別に示されたのと同程度までその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表又は他の場所に示された受託番号並びに／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／若しくは核酸）を含む本明細書中で示された各受託番号と関連づけられる配列の全体が参照により組み込まれる。
本明細書中で参照した参考文献の引用
１．Ｍｕｒｒｙ，  Ｃ．Ｅ．及びＫｅｌｌｅｒ，  Ｇ．  胚性幹細胞の臨床的に関連した集団への分化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）：胚発生からの教え（ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．  Ｃｅｌｌ  １３２、６６１〜６８０ページ（２００８年）。
２．Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，  Ｐ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．、Ｇｏｌｄ，  Ｊ．Ｄ．及びＷｕ，  Ｊ．Ｃ．  新規心筋細胞の生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）：ヒト多能性幹細胞の分化及び直接的リプログラミング（ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）．  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １０、１６〜２８ページ（２０１２年）。
３．Ｌａｆｌａｍｍｅ，  Ｍ．Ａ．ら．  生存促進性因子中のヒト胚性幹細胞から誘導された心筋細胞が梗塞を起こしたラット心臓の機能を向上させる（Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔｓ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５、１０１５〜１０２４ページ（２００７年）。
４．Ｙａｎｇ，  Ｌ．ら．  ヒト心血管前駆細胞がＫＤＲ＋胚性幹細胞由来集団から発生する（Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３、５２４〜５２８ページ（２００８年）。
５．Ｋａｔｔｍａｎ，  Ｓ．Ｊ．ら．  アクチビン／ノーダル及びＢＭＰシグナル伝達の段階特異的な最適化がマウス及びヒト多能性幹細胞系の心臓の分化を促進する（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）．  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ８、２２８〜２４０ページ（２０１１年）。
６．Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｎ．Ｃ．ら．  ＳＩＲＰＡはヒト多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を単離するための特異的細胞表面マーカーである（ＳＩＲＰＡ  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９、１０１１〜１０１８ページ（２０１２年）。
７．Ｌｉｍａｎａ，  Ｆ．、Ｃａｐｏｇｒｏｓｓｉ，  Ｍ．Ｃ．及びＧｅｒｍａｎｉ，  Ａ．  心臓修復における心外膜：幹細胞の観点から（Ｔｈｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐａｉｒ：  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｖｉｅｗ）．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２９、８２〜９６ページ（２０１１年）。
８．Ｃａｉ，  Ｃ．Ｌ．ら．  Ｔｂｘ１８心外膜細胞に由来する心筋系統（Ａ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｒｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｂｘ１８  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５４、１０４〜１０８ページ（２００８年）。
９．Ｚｈｏｕ，  Ｂ．ら．  発生中の心臓では心外膜前駆細胞が心筋細胞系統の一部を担う（Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｅａｒｔ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５４、１０９〜１１３ページ（２００８年）。
１０．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ，  Ｖ．Ｍ．ら．  Ｔｂｘ１８及び心外膜前駆細胞の運命（Ｔｂｘ１８  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８、Ｅ８〜９ページ；考察Ｅ９〜１０ページ（２００９年）。
１１．Ｌｉ，  Ｐ．ら．  胚心臓発生の間にＩＧＦシグナル伝達が心室心筋細胞増殖を誘導する（ＩＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ケンブリッジ、イギリス）１３８、１７９５〜１８０５ページ（２０１１年）。
１２．Ｂｒａｄｅ，  Ｔ．ら．  心外膜Ｉｇｆ２を活性化する肝臓エリスロポエチンの誘導によってレチノイン酸が心筋増殖を刺激する（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  Ｉｇｆ２）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ケンブリッジ、イギリス）１３８、１３９〜１４８ページ（２０１１年）。
１３．Ｓｍａｒｔ，  Ｎ．ら．  チモシンベータ−４は冠血管発生に必須であり、成人心外膜による新血管形成を促進する（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ−４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｄｕｌｔ  ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ）．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１１２、１７１〜１８８ページ（２００７年）。
１４．Ｚｈｏｕ，  Ｂ．ら．  成体マウスの心外膜はパラクライン因子を分泌することによって心筋の損傷を調整する（Ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１、１８９４〜１９０４ページ（２０１１年）。
１５．Ｓｍａｒｔ，  Ｎ．ら．  損傷後に活性化された成体心臓内部から生じた新規心筋細胞（Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｈｅａｒｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７４、６４０〜６４４ページ（２０１１年）。
１６．Ｇｒｉｅｓｋａｍｐ，  Ｔ．、Ｒｕｄａｔ，  Ｃ、Ｌｕｄｔｋｅ，  Ｔ．Ｈ．、Ｎｏｒｄｅｎ，  Ｊ．及びＫｉｓｐｅｒｔ，  Ａ．  ノッチシグナル伝達が心外膜由来細胞の平滑筋分化を調節する（Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０８、８１３〜８２３ページ（２０１１年）。
１７．ｖａｎ  Ｔｕｙｎ，  Ｊ．ら．  ヒト成人の心外膜細胞はインビトロにおいて上皮間葉転換を起こして平滑筋細胞の特徴を獲得することができる（Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｃａｎ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｂｔａｉｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２５、２７１〜２７８ページ（２００７年）。
１８．Ａｕｓｔｉｎ，  Ａ．Ｆ．、Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｌ．Ａ．、Ｌｏｖｅ，  Ｊ．Ｄ．、Ｂｒｏｗｎ，  Ｃ．Ｂ．及びＢａｒｎｅｔｔ，  Ｊ．  Ｖ．  初代及び不死化マウス心外膜細胞はＴＧＦベータに応答して分化する（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＴＧＦｂｅｔａ）．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２３７、３６６〜３７６ページ（２００８年）。
１９．Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｌ．Ａ．、Ｐｏｔａｓｈ，  Ｄ．Ａ．、Ｍｕｎｄｅｌｌ，  Ｎ．Ａ．及びＢａｒｎｅｔｔ，  Ｊ．Ｖ．  トランスフォーミング成長因子ベータは心外膜細胞における上皮特性の喪失及び平滑筋細胞分化を誘導する（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓの公式刊行物２３５、８２〜９３ページ（２００６年）。
２０．Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．Ｌ．、Ｂａｅｋ，  Ｓ．Ｔ．、Ｓｕｎｇ，  Ｃ．Ｙ．及びＴａｌｌｑｕｉｓｔ，  Ｍ．Ｄ．  心外膜由来細胞の上皮間葉転換及び運命決定にはＰＤＧＦレセプターシグナル伝達が必要とされる（Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １０８、ｅ１５〜２６ページ（２０１１年）。
２１．Ｗｅｅｋｅ−Ｋｌｉｍｐ，  Ａ．ら．  心外膜由来細胞は心筋細胞の増殖、細胞の成熟及び整列を向上させる（Ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ４９、６０６〜６１６ページ（２０１０年）。
２２．Ｂｏｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら．  トランスクリプトミクスにより新規のマウス心外膜細胞マーカーを明らかにする（Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｎｅｗ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５、ｅ１１４２９ページ（２０１０年）。
２３．Ｌｉｕ，  Ｊ．及びＳｔａｉｎｉｅｒ，  Ｄ．Ｙ．  ゼブラフィッシュにおける心外膜原基特定化にＴｂｘ５及びＢｍｐシグナル伝達が必須である（Ｔｂｘ５  ａｎｄ  Ｂｍｐ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０６、１８１８〜１８２８ページ（２０１０年）。
２４．Ｍａｈｔａｂ，  Ｅ．Ａ．ら．  ポドプラニンノックアウトマウス胚における心臓形成異常及び心筋異常：異常な心外膜発生との相関（Ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ：  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２３７、８４７〜８５７ページ（２００８年）。
２５．Ｍｅｌｌｇｒｅｎ，  Ａ．Ｍ．ら．  効率的な心外膜細胞移動及び２つの異なる冠血管平滑筋細胞集団の発生には血小板由来増殖因子レセプターベータシグナル伝達が必要とされる（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０３、１３９３〜１４０１ページ（２００８年）。
２６．Ｍｏｍｂｕｒｇ，  Ｆ．、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ，  Ｇ．、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，  Ｇ．Ｊ．及びＭｏｌｌｅｒ，  Ｐ．  正常組織及び悪性組織におけるＭｒ３４，０００ヒト上皮特異的表面糖タンパク質の発現の免疫組織化学的研究（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｒ  ３４，０００  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７、２８８３〜２８９１ページ（１９８７年）。
２７．Ｂｕｍｏｌ，  Ｔ．Ｆ．、Ｍａｒｄｅｒ，  Ｐ．、ＤｅＨｅｒｄｔ，  Ｓ．Ｖ．、Ｂｏｒｏｗｉｔｚ，  Ｍ．Ｊ．及びＡｐｅｌｇｒｅｎ，  Ｌ．Ｄ．  ＫＳ１／４モノクローナル抗体のヒト腫瘍組織及び正常組織反応性の特徴づけ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＫＳ１／４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ７、４０７〜４１５ページ（１９８８年）。
２８．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｍ．Ｄ．、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｍ．、Ｐｏｓｃａｂｌｏ，  Ｃ．及びＷｅｓｔｐｈａｌ，  Ｈ．  マウスの心臓発生過程においてＤｋｋ１及びＤｋｋ２が心外膜の特定化を調節する（Ｄｋｋ１  ａｎｄ  Ｄｋｋ２  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １５０、１８６〜１９２ページ（２０１１年）。
２９．Ｙｕ，  Ｐ．Ｂ．ら．  ドルソモルフィンが胚発生及び鉄代謝に必要とされるＢＭＰシグナルを阻害する（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４、３３〜４１ページ（２００８年）。
３０．Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｃ、Ｂｅｒｎａｒｄｏ，  Ａ．Ｓ．、Ｔｒｏｔｔｅｒ，  Ｍ．Ｗ．、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｒ．Ａ．及びＳｉｎｈａ，  Ｓ．  ヒト血管平滑筋サブタイプの形成により発生学的起源に依存する疾患の感受性に関する知見を得る（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｒｉｇｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０、１６５〜１７３ページ（２０１２年）。
３１．Ａｃｈａｒｙａ，  Ａ．ら．  ｂＨＬＨ転写因子Ｔｃｆ２１は心臓線維芽前駆細胞の系列特異的なＥＭＴに必要とされる（Ｔｈｅ  ｂＨＬＨ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｔｃｆ２１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＥＭＴ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ケンブリッジ、イギリス）１３９、２１３９〜２１４９ページ（２０１２年）。
３２．Ｅｌ−Ｍｏｕｎａｙｒｉ，  Ｏ．ら．  胚性幹細胞からの機能的なヒト冠動脈様血管平滑筋細胞の無血清分化（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ−ｌｉｋｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９８、１２５〜１３５ページ（２０１３年）。
３３．Ｌｉｅ−Ｖｅｎｅｍａ，  Ｈ．ら．  正常及び異常な心臓発生における心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）の起源、運命及び機能（Ｏｒｉｇｉｎ，  ｆａｔｅ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  （ＥＰＤＣｓ）  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．  ＳｃｉｅｎｔｉｆｌｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ  ７、１７７７〜１７９８ページ（２００７年）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月24日(2020.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から心筋系統又は心外膜系統細胞集団を得る方法であって、（ａ）ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣを、前記ｈＰＳＣが心血管中胚葉細胞集団に分化するよう誘導するのに
適した心血管中胚葉プログラミングカクテルと、前記プログラミングカクテルが前記ｈＰＳＣに浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記ｈＰＳＣを、ＫＤＲ＋及びＰＤＧＦＲアルファ＋心血管中胚葉細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｂ）前記心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を特定化するのに適した心血管前駆細胞特定化カクテルと、前記特定化カクテルが前記心血管中胚葉細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管中胚葉細胞集団を、ＮＫＸ２−５＋又はＷＴ１＋心血管前駆細胞集団を形成する時間、培養するステップと；（ｄ）前記心血管前駆細胞集団を、成熟カクテルと、前記成熟カクテルが前記心血管前駆細胞集団に浸透するのに適した条件下で接触させ、接触させた前記心血管前駆細胞集団を心血管集団、任意に、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び／若しくはＳＩＲＰＡを発現する心筋系統細胞並びに／又はＷＴ１を発現する心外膜系統細胞を生成する時間、培養するステップとを含む、上記方法。
【請求項２】
前記ＢＭＰ成分刺激されたｈＰＳＣは、前記ｈＰＳＣをＢＭＰ成分と約１日から約２日間、接触させることによって作製され、任意に、前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心血管中胚葉プログラミングカクテルは、ＢＭＰ成分及びアクチビン成分並びに任意に、ＦＧＦ成分を含み、前記心血管中胚葉プログラミングカクテルは、約３日から約５日間、前記ｈＰＳＣと接触させられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦ成分はｂＦＧＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アクチビン成分はアクチビンＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ｈＰＳＣは胚様体に含まれる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020162608000001.pdf