(57)【要約】【課題】反応性標識化合物およびその使用を提供すること。【解決手段】式（Ｉ）のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物、式（ＩＶ）のシクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブ、および式（ＶＩ）の活性をベースとするプローブを提供する。これらの化合物は、アジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）を受け、トリアゾリル生成物を形成する。提供された化合物は、アルキン含有、またはアジド含有分子の検出およびイメージングのために有用である。本開示の化合物を使用した生体分子を検出およびイメージングする方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物：
【化１１７】
2020002139.tif 000136
（式中、Ｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ウンベリフェリル、クマリンオキシド、トリフレート、メシレート、トシレート、ハロゲン、アルコキシ、フェノキシ、ベンゾエート、ペンタフルオロフェノキシ、または４−ニトロフェノキシからなる群から選択される）。
【請求項２】
Ｌが、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌが、ウンベリフェリルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、化合物６０１：
【化１１８】
2020002139.tif 000137
である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記シアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含み、
前記化合物の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法。
【請求項６】
試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
（ａ）請求項２に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記シアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含み、
前記化合物の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法。
【請求項７】
試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記シアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含み、
前記化合物の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法。
【請求項８】
試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記シアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含み、
前記化合物の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本開示は、２０１４年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／９７１，３１３号の優先権の利益を主張する。その内容は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、シクロオクチンが縮合した蛍光発生プローブのトリアゾール形成、アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物、ならびにアルキン含有またはアジド含有生体分子の診断およびイメージングのための蛍光で切断されるプローブの分野に関する。本開示は、アジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）による蛍光増強戦略に関する。
【背景技術】
【０００３】
銅によって触媒されるアジド−アルキン１，３−双極子環化付加（ＣｕＡＡＣ）は、複雑な混合物における生体分子の標識化、ならびに固定細胞および組織のイメージングなどの用途のために化学生物学において広範囲に使用されてきた。（Kolbら、Angew.  Chem.
Int.  Ed.、２００１年、４０巻、２００４頁；Rostovtsevら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２００２年、４１巻、２５９６頁；WuおよびFokin、Aldrichimica  Acta、２００７年、４０巻、７頁。）これらの天然の細胞環境内のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質およびグリカン中への蛍光プローブの組込みは、イメージング、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの役割の理解のための機会を実現する。（Best、Biochemistry、２００９年、４８巻、６５７１頁。）
【０００４】
例えば、タンパク質中のグリカンは、細胞表面上に表示され、これは多数の生理学的および病理学的プロセスにおいて意味を持っている。異常細胞の表面上の異常なグリコシル化は、病的状態、例えば、炎症およびがん転移において観察されることが多い。特に、発現の場所、ならびにシアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのレベルの変化からもたらされると考えられる変化した末端シアリル化およびフコシル化は、悪性腫瘍と関連している。タンパク質または脂質のいずれかに付着している、がんのバイオマーカーとしてのグリカンの生物学的情報内容を探索する能力は、グライコミクス研究の主要な過程となってきた。（Hsuら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.、２００
７年、１０４巻、２６１４頁；Sawaら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.、２００６年、１０３巻、１２３７１頁。）
【０００５】
生物系におけるグリコシル化パターンの変化の分析が今や可能である。（PrescherおよびBertozzi、Nat.  Chem.  Bio.、２００５年、１巻、１３頁。）細胞生合成機構への、
生体直交型化学レポーターとして作用する特有な官能基を含有する非天然炭水化物の代謝的組込みによってプロセスが開始する。次いで、修飾されたグリカンは加工され、細胞表面上で構築される。相補的生体直交型官能基を備えた検出可能な蛍光プローブとのそれに続く反応によって、組み込まれた非天然グリカンの検出が可能となる。（SlettenおよびBertozzi、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２００９年、４８巻、２頁。）
【０００６】
生体直交型化学レポーターの概念は、タンパク質におけるグリコシル化、および生物系における細胞表面の化学的リモデリングのプロテオミクス解析に適用されてきた。生体直交型化学反応はまた、他の用途、例えば、タンパク質標識化、活性をベースとするタンパク質フォールディング、タンパク質の標的の同定、翻訳後修飾、および細胞増殖モニタリングのために使用されてきた。生体直交型化学レポーター戦略による生細胞上の特定の官能基の標識化は、細胞生物学においてますます有力となってきた。過去数年において、生
物系において生体適合性および選択性を特に示す、生体直交型化学において著しい進歩がなされてきた。これらのアプローチは、これらの固有の選択性および調整可能な電子工学によって、理想的な生体直交型反応としての環化付加に基づくことが多い。しかし、特に、細胞および生命体への用途の観点から、この分野が直面する多くの課題がまだ存在する。例えば、大部分の生体直交型レポーター戦略は、フルオロフォア（fluorophroe）標識
された反応体パートナーを使用する多段階の手順が伴い、これは細胞内環境または組織から除去することが困難である高いバックグラウンド蛍光ノイズをもたらすことが多い。さらに、これらの方法は、検出可能なシグナルを達成するために高濃度の試薬および触媒を必要とする。
【０００７】
いくつかの最近の試みは、ライゲーションして高度に蛍光性のトリアゾール錯体を得ることができる非蛍光性アルキンまたはアジドとのＣｕＡＡＣ反応による、非蛍光または弱蛍光プローブの設計に焦点を当ててきた（図２）。（ZhouおよびFahrni、J.  Am.  Chem.
Soc.、２００４年、１２６巻、８８６２頁；Sivakumarら、Org.  Lett.、２００４年、２４巻、４６０３頁；Sawaら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.、２００６年、１０３巻、１２３７１頁；Xieら、Tetrahedron、２００８年、６４巻、２９０６頁；Liら、Org.  Lett.、２００９年、１１巻、３００８頁；Le  Droumaguetら、Chem.  Soc.  Rev.、２０１０年、３９巻、１２２３頁；Qiら、Bioconjugate  Chem.、２０１１年、２２巻
、１７５８頁；Chaoら、Sci.  China  Chemistry、２０１２年、５５巻、１２５頁；Hernerら、Org.  Biomol.  Chem.、２０１３年、１１巻、３２９７頁。）高効率で起こるこのタイプのＣｕＡＡＣ反応は、出発材料のバックグラウンド蛍光ノイズを伴わないトリアゾールの形成における明確な蛍光特性によって、細胞生物学および機能的プロテオミクスの台頭しつつある分野において広範な用途を有する。しかし、これらのアジドおよびアルキニル官能化されたプローブは通常、ＵＶ領域における励起を必要とし、水溶液中で乏しい量子収率を伴って青色の光を発光する。このような光学特性は、生物学的用途のために理想的ではない。
【０００８】
高度に効率的なＣｕＡＡＣ反応によって誘発される明確な蛍光増強は、細胞生物学および機能的プロテオミクスの台頭しつつある分野において広範な用途を有する（Le  Droumaguet,  C.；Wang,  C.；Wang,  Q.、Chem.  Soc.  Rev.、２０１０年、３９巻、１２３３〜１２３９頁；Sawa,  M.；Hsu,  T.-L.；Itoh,  T.；Sugiyama,  M.；Hanson,  S.  R.
；Vogt,  P.  K.；Wong,  C.-H.、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、２００６年、１０３巻、１２３７１〜１２３７６頁、Shie,  J.-J.；Liu,  Y.-C.；Lee,  Y.-M.；Lim,  C.；Fang,  J.-M.；Wong,  C.-H.、J.  Am.  Chem.  Soc.、２０１４年、１３６巻、９９５３〜９９６１頁；Hsu,  T.-L.；Hanson,  S.  R.；Kishikawa,  K.；Wang,  S.-K.；Sawa,  M.；Wong,  C.-H.、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、２００７年、１０４巻、２６１４〜２６１９頁、Tsai,  C.-S.；Liu,  P.-Y.；Yen,  H.-Y.；Hsu,  T.-L.；Wong
C.-H.、Chem.  Commun.、２０１０年、４６巻、５５７５〜５５７７頁）。しかし、Ｃ
ｕ（Ｉ）の毒性は、生物系におけるＣｕＡＡＣの使用を妨げてきた。
【０００９】
金属触媒と関連する細胞毒性の問題を回避するために、環ひずみによって促進されるアジド−アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）が、代替の戦略として開発されてきた（Jewett,
J.  C.；Bertozzi,  C.  R.、Chem.  Soc.  Rev.、２０１０年、３９巻、１２７２〜１２７９頁、Debets,  M.  F.；van  Berkel,  S.  S.；Dommerholt,  J.；Dirks,  A.  T.
J.；Rutjes,  F.  P.  J.  T.；van  Delft,  F.  L.  Acc.  Chem.  Res.、２０１１
年、４４巻、８０５〜８１５頁）。シクロオクチン部分は、基部構造としてＳＰＡＡＣ試薬、例えば、二フッ化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）および誘導体中に組み込まれることが多い（Agard,  N.  J.；Prescher,  J.  A.；Bertozzi,  C.  R.  J.  Am.  Chem.  Soc.、２００４年、１２６巻、１５０４６〜１５０４７頁、Codelli,  J.  A.；Baskin,  J.
M.；Agard,  N.  J.；Bertozzi,  C.R.  J.  Am.  Chem.  Soc.、２００８年、１３０
巻、１１４８６〜１１４９３頁）。環ひずみを増加させるために、シクロオクチン部分は、他の環と縮合して、より高い反応性を有するＳＰＡＡＣ試薬、例えば、ジベンジルシクロオクチン（ＤＩＢＯ）（Ning,  X.；Guo,  J.；Wolfert,  M.  A.；Boons,  G.-J.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２００８年、４７巻、２２５３〜２２５５頁、Poloukhtine,  A.  A.；Mbua,  N.  E.；Wolfert,  M.  A.；Boons,  G.-J.；Popik,  V.  V.  J.  Am.
Chem.  Soc.、２００９年、１３１巻、１５７６９〜１５７７７頁、Stockmann,  H.；Neves,  A.  A.；Stairs,  S.；Ireland-Zecchini,  H.；Brindle,  K.  M.；Leeper,  F.
J.  Chem.  Sci.、２０１１年、２巻、９３２〜９３６頁、Friscourt,  F.；Ledin,  P.  A.；Mbua,  N.  E.；Flanagan-Steet,  H.  R.；Wolfert,  M.  A.；Steet,  R.；Boons,  G.-J.  J.  Am.  Chem.  Soc.、２０１２年、１３４巻、５３８１〜５３８９頁）、ジアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）（Jewett,  J.  C.；Sletten,  E.  M.
；Bertozzi,  C.  R.  J.  Am.  Chem.  Soc.、２０１０年、１３２巻、３６８８〜３６
９０頁）およびビシクロノニン（ＢＣＮ）（Dommerholt,  J.；Schmidt,  S.；Temming,
R.；Hendriks,  L.  J.  A.；Rutjes,  F.  P.  J.  T.；van  Hest,  J.  C.  M.；Lefeber,  D.  J.；Friedl,  P.；van  Delft,  F.  L.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２０１０年、４９巻、９４２２〜９４２５頁）を得ることができる。縮小７員環を担持するテトラメチルチアシクロヘプチン（ＴＭＴＨ）はまた、アジドとの環化付加反応において反応性を示す（de  Almeida,  G.；Sletten,  E.  M.；Nakamura,  H.；Palaniappan,  K.
K.；Bertozzi,  C.  R.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２０１２年、５１巻、２４４３
〜２４４７頁、King,  M.,  Baati,  R.；Wagner,  A.  Chem.  Commun.、２０１２年、
４８巻、９３０８〜９３０９頁）。２種のシクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブであるＣｏｕｍＢＡＲＡＣ（Jewett,  J.  C.；Bertozzi,  C.  R.  Org.  Lett.、２
０１１年、１３巻、５９３７〜５９３９頁）およびＦｌ−ＤＩＢＯ（Friscourt,  F.；Fahrni,  C.  J.；Boons,  G.-J.  J.  Am.  Chem.  Soc.、２０１２年、１３４巻、１８８０９〜１８８１５頁）は、それぞれBertozziおよびBoonsのグループによって記載されて
きた。
【００１０】
４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹとしてまた公知である）色素は、多くの生物学的用途のための一般的なフルオロフォアの１タイプである。ＢＯＤＩＰＹ色素は、良好な化学的および光物理的安定性、相対的に高いモル吸光係数および蛍光量子収率（φｆｌ）、可視スペクトル領域（５００ｎｍ超）における励起波長／発光波長、ならびに高いピーク強度を伴う狭い発光バンド幅を含めた多数の利点を有する。（LoudetおよびBurgess、Chem.  Rev.、２００７年、１０７巻、４８９１頁；Ulrichら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２００８年、４７巻、１１８４頁；Boensら、Chem.  Soc.  Rev.、２０１２年、４１巻、１１３０頁；Kamkaewら、Chem.  Soc.  Rev.、２０１３年、４２巻、７７頁。）
いくつかのアジド−ＢＯＤＩＰＹ誘導体が、ＣｕＡＡＣ反応による蛍光標識化のために開発されてきた。（Liら、J.  Org.  Chem.、２００８年、７３巻、１９６３頁。）具体
的には、低蛍光３−アジド−ＢＯＤＩＰＹ誘導体は、ＣｕＡＡＣ反応を受けて、増強された蛍光を有する対応するトリアゾールを得ることが示されてきた。トリアゾール生成物は、アジド−ＢＯＤＩＰＹと比較して３００倍増加した発光を実現し、低い蛍光量子収率（φｆｌ＜０．０３）を示したが、未反応のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物は不安定であり、生理学的条件下でアルキニル生体分子と反応することができず、多くの生物学的用途と不適合性なものとしている。（Wangら、Sci.  China  Chemistry、２０１２年、５５巻、１２５頁；Chauhanら、Tetrahedron  Lett.、２０１４年、５５巻、２４４頁。）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kolbら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、２００１年、４０巻、２００４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、細胞標識化、細胞における生体分子の局在化を検出および／または可視化するための、細胞環境に適している分子プローブの新規な設計が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本開示は、細胞環境に適している緑色を発光するＢＯＤＩＰＹスカフォールドを含有する新規な一連のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物に関する。ＢＯＤＩＰＹスカフォールドは、その魅力的な合成および蛍光性フィーチャのために出発モジュールとして使用される。例示的なＢＯＤＩＰＹは、８位において容易に修飾される。この位置におけるアリール化は、アリール部分およびＢＯＤＩＰＹコアがねじれており、コンジュゲーションが脱カップリングしているため、吸収および発光波長に対して実質的な影響を有さない。
【００１４】
これらの例示的な化合物は、洗浄プロセスを伴わないアルキン官能化されたタンパク質による標識化のために有用であり、かつ共焦点顕微鏡観察による細胞中のアルキンタグ付きグリコシルコンジュゲートの局在化を可視化するのに適している。さらに、アルキニル−糖類修飾された細胞は、溶解して、富化を伴わないプローブ標識された糖タンパク質の直接の検出のためのＡｚＢＯＣＥｔ標識化を使用することによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することができる。
【００１５】
本開示はまた、アルキン官能化された部分に反応することができる、シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブに関する。いくつかの態様では、シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブは、細胞中に存在することができる。いくつかの態様では、シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブを使用して、細胞中のアジド−複合糖質を検出することができる。
【００１６】
本開示はまた、試料と、式（Ｉ）のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物および／または式（ＩＶ）のシクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブとをデュアルイメージングモードで接触させることによる、アジド官能化された複合糖質およびアルキニル官能化された複合糖質（glyconjugates）の両方のデュアルイメージングに関する。
【００１７】
本開示はまた、酵素の活性部位と共有結合を形成するように設計したプローブを使用して酵素の活性を測定することに関し、前記プローブは、アジド含有蛍光発生プローブによるさらなる検出のためのアルキン部分を含む。酵素は、シアリダーゼでよい。蛍光発生シアリダーゼプローブは、機序に基づく阻害剤として３−フルオロシアリルフルオリドをベースとすることができる。
【００１８】
したがって、本開示は、アジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）を受ける例示的な新規な式（Ｉ）のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物に関する。アジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）は、ひずみまたは触媒（金属もしくは有機物）により促進されるものであり得る。いくつかの実施形態では、触媒は、金属触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、銅（Ｉ）である。
【００１９】
本明細書に記載されている例示的なアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、アルキン化合物と反応して、検出を促進する増強された蛍光を有する安定的なトリアゾール生成物を得ることができる。提供される例示的な化合物は、洗浄プロセスを伴わない細胞−イメージングにおいてかなりの進歩を表し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に細胞ライセートからのアルキンタグ付き糖タンパク質の直接のゲル内検出に適用可能である。
【００２０】
本開示の一態様は、式（Ｉ）のアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物：
【化１】
2020002139.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物［式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４ａ、Ｇ４ｂ、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８およびｎは、本明細書に記載の通りである］に関する。
【００２１】
別の態様において、本開示は、アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物の調製のための合成法を提供する。本開示はまた、本明細書に記載されているアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物が、有機アルキンと反応して、増強された蛍光を有するトリアゾール生成物を形成することができることを示す。
【００２２】
別の態様において、本開示は、式（ＩＩＩ）のトリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物：
【化２】
2020002139.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物［式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４ａ、Ｇ４ｂ、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８およびｎは、本明細書に記載の通りである。標的分子は、これらに限定されないが、生体分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質およびグリカンを含む］を提供する。
【００２３】
アジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）は、ひずみまたは触媒（金属もしくは有機物）により促進されるものであり得る。いくつかの実施形態では、触媒は、金属触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、銅（Ｉ）である。
【００２４】
さらに別の態様において、本開示は、生体分子を検出および／またはイメージングする方法に関する。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本開示は、アルキン含有分子をイメージングする方法であって、
（ａ）分子のアルキン基への本明細書に記載のような化合物のライゲーションを可能とする条件下で、化合物を、アルキン含有分子を含有する試料と共にインキュベートして、トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｂ）トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを検出するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態では、本開示は、試料中のアルキン含有分子を検出する方法であって、
（ａ）本明細書に記載のような化合物と、アルキン含有分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料から放出される蛍光シグナルのレベルを検出するステップと、
（ｃ）試料中のアルキン含有分子の存在を決定するステップと
を含み、
分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アルキン含有分子の存在を示す、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、式（ＩＶ）のシクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブ：
【化３】
2020002139.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物［式中、
Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７およびＧ１８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択でハロゲン、任意選択でニトロソ、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ９およびＧ１０はそれぞれの場合、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロソ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリールオキシのアリール基およびアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールの
いずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｍは、１であり、
ｎは、０、１、２、３、または４である
］を提供する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、アジド含有分子をイメージングする方法であって、
（ａ）分子のアジド基への式（ＩＶ）の化合物のライゲーションを可能とする条件下で、化合物を、アジド含有分子を含有する試料と共にインキュベートして、トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｂ）トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを検出するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本開示は、試料中のアジド含有分子を検出する方法であって、
（ａ）式（ＩＶ）の化合物と、アジド含有分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料から放出される蛍光シグナルのレベルを検出するステップと、
（ｃ）試料中のアジド含有分子の存在を決定するステップと
を含み、
分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法を提供する。
【００２９】
別の態様において、本開示は、式（Ｖ）の化合物：
【化４】
2020002139.tif 000005
（式中、Ｌは、ハロゲン、アルコキシ、フェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、４−ニトロフェノキシ、ウンベリフェリル、アルカノエート、ベンゾエート、トリフレート、メシレート、またはトシレートからなる群から選択される）に関する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本開示は、シアリダーゼ酵素の活性部位をイメージングする方法であって、
（ａ）シアリダーゼ酵素の活性部位への請求項４１に記載の化合物のライゲーションのための条件下で、化合物と、シアリダーゼ酵素を含むことが疑われる試料とを接触させ、共有結合生成物を形成させるステップと、
（ｂ）共有結合生成物と、本明細書に記載のようなアジド含有蛍光発生プローブとを接触
させて、蛍光発生トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｃ）トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを測定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、本開示は、
（ａ）請求項４４に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）試料中のシアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含む、試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法を提供する。
本発明の実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
式（Ｉ）の化合物：
【化１０８】
2020002139.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物
［式中、
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ４ａおよびＧ４ｂはそれぞれの場合、フルオロ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリール基およびアリールオキシのアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールのいずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｎは、０、１、２、３、または４である］。
（項目２）
Ｇ１およびＧ３が、メチルである、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｇ５およびＧ７が、メチルである、項目１に記載の化合物。
（項目４）
式（ＩＩ）のもの、
【化１０９】
2020002139.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物である、項目１から３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目５）
表１から選択される式によって記載される、項目４に記載の化合物。
（項目６）
【化１１０】
2020002139.tif 000008
からなる群から選択される、項目４に記載の化合物。
（項目７）
アルキン含有分子をイメージングする方法であって、
（ａ）前記分子のアルキン基への項目１に記載の化合物のライゲーションのための条件下で、前記化合物と、前記アルキン含有分子を含有する試料とを接触させ、トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｂ）前記トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを測定するステップと
を含む、方法。
（項目８）
前記接触ステップが、金属触媒の存在下で行われる、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記金属触媒が、銅（Ｉ）である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記化合物が、前記アルキン基に共有結合的に連結している、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記試料が、細胞を含有し、前記アルキン含有分子が、細胞表面上または前記細胞内に位置している、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記化合物が、表１から選択される式によって記載される、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記化合物が、項目６に記載の化合物から選択される、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記アルキン含有分子が、生体分子である、項目７から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記生体分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはグリカンである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記生体分子が、細胞の表面上または近くに位置している、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記生体分子が、細胞内生体分子である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
試料中のアルキン含有分子を検出する方法であって、
（ａ）項目１に記載の化合物と、アルキン含有分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物から放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記アルキン含有分子の存在を決定するステップと
を含み、前記分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、前記アルキン含有分子の存在を示す、方法。
（項目１９）
前記接触ステップが、金属触媒の存在下で行われる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記金属触媒が、銅（Ｉ）である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記試料が、細胞を含有し、前記アルキン含有分子が、細胞の表面上もしくは近く、または細胞内に位置している、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記化合物が、表１から選択される式によって記載される、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記化合物が、項目６に記載の化合物から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記アルキン含有分子が、生体分子である、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記生体分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはグリカンである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記生体分子が、細胞の表面上または近くに位置している、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記生体分子が、細胞内生体分子である、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
細胞におけるデュアル蛍光イメージングのための前記化合物の使用を含む、項目７または１８に記載の方法。
（項目２９）
式（ＩＶ）の化合物：
【化１１１】
2020002139.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物
［式中、
Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７およびＧ１８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択でハロゲン、任意選択でニトロソ、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ９およびＧ１０はそれぞれの場合、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロソ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリールオキシのアリール基およびアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールのいずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｍは、１である］。
（項目３０）
Ｇ９およびＧ１０が、水素である、項目２９に記載の化合物。
（項目３１）
Ｇ９およびＧ１０が、ハロゲンである、項目２９に記載の化合物。
（項目３２）
Ｇ９およびＧ１０が、フッ素である、項目３１に記載の化合物。
（項目３３）
化合物１０１
【化１１２】
2020002139.tif 000010
である、項目２９に記載の化合物。
（項目３４）
アジド含有分子をイメージングする方法であって、
（ａ）前記分子のアジド基への項目２９に記載の化合物のライゲーションのための条件下で、前記化合物と、前記アジド含有分子を含有する試料とを接触させ、トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｂ）前記トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを測定するステップと
を含む、方法。
（項目３５）
試料中のアジド含有分子を検出する方法であって、
（ａ）項目２９に記載の化合物と、アジド含有分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物から放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記アジド含有分子の存在を決定するステップと
を含み、前記分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、前記アジド含有分子の存在を示す、方法。
（項目３６）
（ａ）１−ベンゾスベロンの８位における位置選択的ニトロ化；
（ｂ）１−ベンゾスベロンの８位におけるニトロ基の還元；
（ｃ）還元されたニトロ基の酸条件下でのジアゾ化およびヒドロキシル化による、アルコールの形成；
（ｄ）ベンジルエーテルとしての前記アルコール上のヒドロキシル基の保護；
（ｅ）ＢＦ３・ＯＥｔ２の存在下でのＴＭＳ−ジアゾメタンによる処理による環状ケトン上の環の拡張；
（ｆ）ＮａＢＨ４によるシクロオクタノン上のカルボニル基の還元；
（ｇ）前記還元されたカルボニル基のシリル化による、シリルエーテルの形成；
（ｈ）水素化による前記アルコール上のベンジル保護基の除去による、フェノールの形成；
（ｉ）Ｅｔ３ＮおよびＭｇＣｌ２の存在下での過剰なパラホルムアルデヒドによる前記フェノールの処理による、サリチルアルデヒドの形成；
（ｊ）新たに調製したケテニリデントリフェニルホスホランによる前記サリチルアルデヒドの処理；
（ｋ）前記ケテニリデントリフェニルホスホラン処理したサリチルアルデヒドの脱シリル化および酸化による、ケトンの形成、
（ｌ）エノールトリフレートへの前記ケトン中の前記カルボニル基の変換；
（ｍ）強塩基ＮａＨＭＤＳによる前記エノールトリフレートの処理による脱離反応、それによる最終生成物１０１の生成
を含む、項目３３に記載の化合物を生成する方法。
（項目３７）
式（Ｖ）の化合物：
【化１１３】
2020002139.tif 000011
（式中、Ｌは、ハロゲン、クマリンオキシド、トリフレート、メシレート、トシレート、ハロゲン、アルコキシ、フェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、または４−ニトロフェノキシからなる群から選択される）。
（項目３８）
Ｌが、ハロゲンである、項目３７に記載の化合物。
（項目３９）
Ｌが、フッ素である、項目３８に記載の化合物。
（項目４０）
クマリンである、項目３７に記載の化合物。
（項目４１）
式（ＶＩ）の化合物：
【化１１４】
2020002139.tif 000012
（式中、Ｌは、ハロゲン、アルコキシ、フェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、４−ニトロフェノキシ、ウンベリフェリル、アルカノエート、ベンゾエート、トリフレート、メシレート、またはトシレートからなる群から選択される）。
（項目４２）
Ｌが、ハロゲンである、項目４１に記載の化合物。
（項目４３）
Ｌが、化合物５０１である、項目４１に記載の化合物。
【化１１５】
2020002139.tif 000013
（項目４４）
化合物６０１である、項目４１に記載の化合物。
【化１１６】
2020002139.tif 000014
（項目４５）
シアリダーゼ酵素の活性部位をイメージングする方法であって、
（ａ）前記シアリダーゼ酵素の前記活性部位への項目４１に記載の化合物のライゲーションのための条件下で、前記化合物と、前記シアリダーゼ酵素を含むことが疑われる試料とを接触させ、共有結合生成物を形成させるステップと、
（ｂ）前記共有結合生成物と、本明細書に記載のようなアジド含有蛍光発生プローブとを接触させて、蛍光発生トリアゾール生成物を形成させるステップと、
（ｃ）前記トリアゾール生成物から放出される蛍光シグナルを測定するステップと
を含む、方法。
（項目４６）
試料中のシアリダーゼ酵素の活性部位を検出する方法であって、
（ａ）項目４１に記載の化合物と、シアリダーゼ酵素分子を有することが疑われる試料とを接触させるステップと、
（ｂ）試料混合物中のクマジンから放出される蛍光シグナルのレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記試料中の前記シアリダーゼ酵素分子の存在を決定するステップと
を含み、
前記分子の非存在下での蛍光シグナルのレベルと比較した増強された蛍光シグナルは、アジド含有分子の存在を示す、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＣｕＡＡＣ反応による蛍光スクリーニングにおいて使用されるアジド−置換ＢＯＤＩＰＹ誘導体Ａｚ１〜Ａｚ８の構造を示す。
【００３３】
【図２】図２は、ＵＶランプ励起（λｅｘ＝３６５ｎｍ）を伴うマイクロタイタープレートにおける、対応するトリアゾール誘導体Ｔ１〜Ｔ８を生じさせるＡｚ１〜Ａｚ８のＣｕＡＡＣ反応の蛍光スクリーニングを示す。化合物Ａｚ１〜Ａｚ８およびＴ１〜Ｔ８を、アリール部分の電子密度の増加する順序で分別する。
【００３４】
【図３】図３は、４−ペンチン−１−オールによるＣｕＡＡＣ反応によって得た、アミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ１０、アジド−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｚ２、Ａｚ９〜Ａｚ１１および対応するトリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ  Ｔ２、Ｔ９〜Ｔ１１の構造を示す。
【００３５】
【図４】図４は、２５℃でのエタノール溶液（１２μＭ）中のトリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ  Ｔ１０、アジド−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｚ１０およびアミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ１０の吸収および標準化した発光スペクトルを示す。挿入物：エタノール溶液（１２０μＭ）中のＴ１０、Ａｚ１０およびＡｍ１０の画像。緑色のＴ１０溶液への、黄色のＡｚ１０溶液の変化は明らかであった。
【００３６】
【図５】図５は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）によるアルキン官能化されたＢＳＡ標識化を示す。ゲルは蛍光イメージングによって分析した（λｅｘ＝４８８ｎｍ；λｅｍ＝５２６ｎｍ）。総タンパク質含量は、クマシーブルー染色によって明らかにされた。
【００３７】
【図６Ａ】図６は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）による細胞蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌおよびＡｚ１０を使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧａｌＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間処理した。（Ｂ）蛍光、明視野および重ね合わせ画像。スケールバー：７５μｍ。（Ｃ）ＣＬ１−５細胞中の発現されたグリコシルコンジュゲートの局在化。これらのグリコシルコンジュゲートを、蛍光発生プローブＡｚ１０（緑色）、抗ＧＲＡＳＰ６５（ゴルジマーカー）、それに続いてＣｙ３コンジュゲートされた抗ウサギ（赤色）、およびヘキスト（青色、細胞核マーカー）で標識した。スケールバー：１０μｍ。
【図６Ｂ】図６は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）による細胞蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌおよびＡｚ１０を使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧａｌＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間処理した。（Ｂ）蛍光、明視野および重ね合わせ画像。スケールバー：７５μｍ。（Ｃ）ＣＬ１−５細胞中の発現されたグリコシルコンジュゲートの局在化。これらのグリコシルコンジュゲートを、蛍光発生プローブＡｚ１０（緑色）、抗ＧＲＡＳＰ６５（ゴルジマーカー）、それに続いてＣｙ３コンジュゲートされた抗ウサギ（赤色）、およびヘキスト（青色、細胞核マーカー）で標識した。スケールバー：１０μｍ。
【図６Ｃ】図６は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）による細胞蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌおよびＡｚ１０を使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｌまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧａｌＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間処理した。（Ｂ）蛍光、明視野および重ね合わせ画像。スケールバー：７５μｍ。（Ｃ）ＣＬ１−５細胞中の発現されたグリコシルコンジュゲートの局在化。これらのグリコシルコンジュゲートを、蛍光発生プローブＡｚ１０（緑色）、抗ＧＲＡＳＰ６５（ゴルジマーカー）、それに続いてＣｙ３コンジュゲートされた抗ウサギ（赤色）、およびヘキスト（青色、細胞核マーカー）で標識した。スケールバー：１０μｍ。
【００３８】
【図７】図７は、細胞ライセートからのＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）によるＣｕＡＡＣを使用した、アルキンタグ付き糖タンパク質の直接のゲル内蛍光検出を示す。ゲルを蛍光イメージング（λｅｘ＝４８８ｎｍ；λｅｍ＝５２６ｎｍ）およびクマシーブルー染色によって分析し、総タンパク質含量が明らかとなった。
【００３９】
【図８Ａ】図８は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）による細胞蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。ＣＬ１−５細胞を、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｌまたはＡｃ４ＧｌｃＮＡｃと共に３日間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間処理した。（Ａ）蛍光、明視野および重ね合わせ画像。スケールバー：７５μｍ。（Ｂ）ＣＬ１−５肺細胞における発現しているグルコシルコンジュゲートの局在化。これらのグルコシルコンジュゲートを、蛍光発生プローブＡｚ１０（緑色）、抗ＧＲＡＳＰ６５（ゴルジマーカー）、それに続いてＣｙ３コンジュゲートされた抗ウサギ（赤色）、およびヘキスト（青色、細胞核マーカー）で標識した。スケールバー：１０μｍ。
【図８Ｂ】図８は、ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）による細胞蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。ＣＬ１−５細胞を、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｌまたはＡｃ４ＧｌｃＮＡｃと共に３日間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間処理した。（Ａ）蛍光、明視野および重ね合わせ画像。スケールバー：７５μｍ。（Ｂ）ＣＬ１−５肺細胞における発現しているグルコシルコンジュゲートの局在化。これらのグルコシルコンジュゲートを、蛍光発生プローブＡｚ１０（緑色）、抗ＧＲＡＳＰ６５（ゴルジマーカー）、それに続いてＣｙ３コンジュゲートされた抗ウサギ（赤色）、およびヘキスト（青色、細胞核マーカー）で標識した。スケールバー：１０μｍ。
【００４０】
【図９】図９は、細胞中のＣｕＡＡＣのＡｚＢＯＣＥｔを使用したグリカン輸送の蛍光イメージングを示す。ＣＬ１−５細胞を、５００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌと共に１時間インキュベートし、それに続いてＰＢＳ緩衝液で洗浄し、過剰なＡｃ４ＭａｎＮＡｌを除去した。糖処理した細胞を、それぞれ、培養培地中で１時間、７時間、１４時間および２１時間インキュベートし、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚ１０で１時間標識した。
【００４１】
【図１０】図１０は、ＳＰＡＡＣをベースとする蛍光形成プローブ、比較上のプローブ、および比較上のプローブのトリアゾール生成物を示す。
【００４２】
【図１１】図１１は、シアリダーゼプローブの構造を示す。
【００４３】
【図１２】図１２は、活性をベースとするプローブの一般構造を示す。
【００４４】
【図１３】図１３は、シアリダーゼ酵素の機序および遷移状態を示す。
【００４５】
【図１４】図１４は、シアリダーゼ活性部位のＸ線結晶構造を示す。
【００４６】
【図１５】図１５は、シアリダーゼの同定のための蛍光発生反応を示す。
【００４７】
【図１６−１】図１６Ａ、１６Ｂは、蛍光発生プローブの反応の間の吸光度および発光スペクトルおよび時間経過を示す。
【図１６−２】図１６Ａ、１６Ｂは、蛍光発生プローブの反応の間の吸光度および発光スペクトルおよび時間経過を示す。
【００４８】
【図１７−１】図１７は、１０１およびモデルアジド分子の反応時間の関数としての蛍光発生プローブ濃度の逆数のプロットを示す。
【図１７−２】図１７は、１０１およびモデルアジド分子の反応時間の関数としての蛍光発生プローブ濃度の逆数のプロットを示す。
【００４９】
【図１８−１】図１８は、１０１およびモデルアジド含有グリカンの反応時間の関数としての蛍光発生プローブ濃度の逆数のプロットを示す。１Ｈ−ＮＭＲによってモニターするような、ＣＤ３ＯＤ−Ｄ２Ｏの溶液（５：１、ｖ／ｖ）中の化合物１０１およびＮ−アジドアセチルマンノサミンの反応についての時間に対する１／［１０１］のプロット。
【図１８−２】図１８は、１０１およびモデルアジド含有グリカンの反応時間の関数としての蛍光発生プローブ濃度の逆数のプロットを示す。１Ｈ−ＮＭＲによってモニターするような、ＣＤ３ＯＤ−Ｄ２Ｏの溶液（５：１、ｖ／ｖ）中の化合物１０１およびＮ−アジドアセチルマンノサミンの反応についての時間に対する１／［１０１］のプロット。
【００５０】
【図１９】図１９は、２００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共にインキュベートし、かつ洗浄なしおよび固定なし条件下で１００μＭのプローブ１０１で標識したＣＬ１−５生細胞のタイムラプス蛍光および重ね合わせ画像を示す。
【００５１】
【図２０】図２０は、共焦点顕微鏡観察によって可視化された、ＣＬ１−５細胞におけるプローブ標識したシアリル複合糖質の局在化を示す。
【００５２】
【図２１】図２１は、細胞中のＳＰＡＡＣのｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）を使用した複合糖質輸送の高コントラスト蛍光イメージングを示す。
【００５３】
【図２２】図２２は、２００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共にインキュベートし、かつ１００μＭのプローブ１０１で標識したＣＬ１−５生細胞のタイムラプス蛍光および重ね合わせ画像を示す。
【００５４】
【図２３】図２３は、細胞中のＳＰＡＡＣのｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）を使用した複合糖質輸送の蛍光イメージングを示す。
【００５５】
【図２４Ａ】図２４Ａ、２４Ｂは、ｃｏｕｍＯＣＴ（１）、ＡｚＢＯＣＥｔによる細胞中のデュアル蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。ｃｏｕｍＯＣＴ（１）、ＡｚＢＯＣＥｔによる細胞中のデュアル蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージング。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、１０１およびＡｚＢＯＣＥｔを使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｚまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、これをＳＰＡＡＣ条件下で１００μＭのプローブ１０１で０．５時間処理し、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔと共に１時間インキュベートした。（Ｂ）ＣＬ１−５細胞におけるデュアル蛍光イメージング。これらの複合糖質は、アジド含有複合糖質についてプローブ１０１（シアン）で、およびアルキン含有複合糖質についてＡｚＢＯＣＥｔ（緑色）で標識した。（スケールバー：１０μｍ）
【図２４Ｂ】図２４Ａ、２４Ｂは、ｃｏｕｍＯＣＴ（１）、ＡｚＢＯＣＥｔによる細胞中のデュアル蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。ｃｏｕｍＯＣＴ（１）、ＡｚＢＯＣＥｔによる細胞中のデュアル蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージング。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、１０１およびＡｚＢＯＣＥｔを使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｚまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、これをＳＰＡＡＣ条件下で１００μＭのプローブ１０１で０．５時間処理し、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔと共に１時間インキュベートした。（Ｂ）ＣＬ１−５細胞におけるデュアル蛍光イメージング。これらの複合糖質は、アジド含有複合糖質についてプローブ１０１（シアン）で、およびアルキン含有複合糖質についてＡｚＢＯＣＥｔ（緑色）で標識した。（スケールバー：１０μｍ）
【００５６】
【図２５】図２５は、化合物１０１および３−メルカプトプロピオン酸のＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【００５７】
【図２６】図２６は、化合物１１１および３−メルカプトプロピオン酸のＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
特定の官能基および化学用語の定義を、下記でより詳細に記載する。化学元素は、元素周期表、ＣＡＳバージョン、Handbook  of  Chemistry  and  Physics、第７５版、内表
紙によって同定し、特定の官能基は一般に、その中に記載されている通りに定義する。さらに、有機化学の一般的原理、ならびに特定の官能性部分および反応性は、Organic  Chemistry、Thomas  Sorrell,  University  Science  Books、Sausalito、１９９９年；SmithおよびMarch、March's  Advanced  Organic  Chemistry、第５版、John  Wiley  &  Sons、Inc.、New  York、２００１年；Larock、Comprehensive  Organic  Transformations、VCH  Publishers,  Inc.、New  York、１９８９年；およびCarruthers、Some  Modern
Methods  of  Organic  Synthesis、第３版、Cambridge  University  Press、Cambridge、１９８７年に記載されている。
【００５９】
本明細書に記載されている化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、このように、様々な立体異性体の形態、例えば、エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーで存在することができる。例えば、本明細書に記載されている化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態でよく、あるいはラセミ混合物、および１つまたは複数の立体異性体が富化された混合物を含めた立体異性体の混合物の形態でよい。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キラル塩の形成および結晶化を含めた方法を使用して混合物から単離することができ、または好ましい異性体は、不斉合成によって調製することができる。例えば、Jacquesら、Enantiomers,
Racemates  and  Resolutions（Wiley  Interscience、New  York、１９８１年）；Wilenら、Tetrahedron、３３巻：２７２５頁（１９７７年）；Eliel、E.L.  Stereochemistry  of  Carbon  Compounds（McGraw-Hill、NY、１９６２年）；およびWilen,  S.H.、Tables  of  Resolving  Agents  and  Optical  Resolutions、２６８頁（E.L.  Eliel編、Univ.  of  Notre  Dame  Press、Notre  Dame、１９７２年）を参照されたい。本開示は、他の異性体を実質的に含有しない個々の異性体として、および代わりに、様々な異性体の混合物としての化合物をさらに包含する。
【００６０】
値の範囲が列挙されるとき、その範囲内の各値および部分範囲を包含することを意図す
る。例えば、「Ｃ１〜６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１〜６、Ｃ１〜５、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜６、Ｃ２〜５、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３、Ｃ３〜６、Ｃ３〜５、Ｃ３〜４、Ｃ４〜６、Ｃ４〜５、およびＣ５〜６アルキルを包含することを意図する。
【００６１】
本明細書において使用する場合、「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ１〜１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜２個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキル」）。Ｃ１〜６アルキル基の例には、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、イソ−ブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（Ｃ５）、３−ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３−メチル−２−ブタニル（Ｃ５）、第三級アミル（Ｃ５）、およびｎ−ヘキシル（Ｃ６）が含まれる。アルキル基のさらなる例には、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、ｎ−オクチル（Ｃ８）などが含まれる。他に特定しない限り、アルキル基はそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換アルキル」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１〜１０アルキル（例えば、−ＣＨ３）である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１〜１０アルキルである。
【００６２】
本明細書において使用する場合、「アルケニル」は、２〜１０個の炭素原子および１個または複数の炭素−炭素二重結合（例えば、１個、２個、３個、または４個の二重結合）を有する直鎖状または分岐状炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１個または複数の炭素−炭素二重結合は、内部（例えば、２−ブテニルにおける）または末端（例えば、１−ブテニルにおける）でよい。Ｃ２〜４アルケニル基の例には、エテニル（Ｃ２）、１−プロペニル（Ｃ３）、２−プロペニル（Ｃ３）、１−ブテニル（Ｃ４）、２−ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などが含まれる。Ｃ２〜６アルケニル基の例には、上記のＣ２〜４アルケニル基、およびペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などが含まれる。アルケニルのさらなる例には、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）などが含まれる。他に特定しない限り、アルケニル基はそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換アルケニル」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルケニル」）。ある
特定の実施形態では、アルケニル基は、非置換Ｃ２〜１０アルケニルである。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、置換Ｃ２〜１０アルケニルである。
【００６３】
本明細書において使用する場合、「アルキニル」は、２〜１０個の炭素原子および１個または複数の炭素−炭素三重結合（例えば、１個、２個、３個、または４個の三重結合）を有する直鎖状または分岐状炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ２〜１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１個または複数の炭素−炭素三重結合は、内部（例えば、２−ブチニルにおける）または末端（例えば、１−ブチニルにおける）でよい。Ｃ２〜４アルキニル基の例には、これらに限定されないが、エチニル（Ｃ２）、１−プロピニル（Ｃ３）、２−プロピニル（Ｃ３）、１−ブチニル（Ｃ４）、２−ブチニル（Ｃ４）などが含まれる。Ｃ２〜６アルケニル基の例には、上記のＣ２〜４アルキニル基、およびペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）などが含まれる。アルキニルのさらなる例には、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）などが含まれる。他に特定しない限り、アルキニル基はそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換アルキニル」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルキニル」）。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、非置換Ｃ２〜１０アルキニルである。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、置換Ｃ２〜１０アルキニルである。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「カルボシクリル」または「炭素環式」は、非芳香族環系において３〜１０個の環炭素原子（「Ｃ３〜１０カルボシクリル」）および０個のヘテロ原子を有する非芳香族環状炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜８カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜７個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜７カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、４〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、５〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、５〜１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜１０カルボシクリル」）。例示的なＣ３〜６カルボシクリル基には、これらに限定されないが、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）などが含まれる。例示的なＣ３〜８カルボシクリル基には、これらに限定されないが、上記のＣ３〜６カルボシクリル基、およびシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）などが含まれる。例示的なＣ３〜１０カルボシクリル基には、これらに限定されないが、上記のＣ３〜８カルボシクリル基、およびシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ−１Ｈ−インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などが含まれる。上記の例が例
示するように、ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、単環式（「単環式カルボシクリル」）または多環式（例えば、縮合環、架橋環もしくはスピロ環系、例えば、二環式系（「二環式カルボシクリル」）または三環式系（「三環式カルボシクリル」）を含有する）のいずれかであり、飽和していてもよいか、または１個もしくは複数の炭素−炭素二重結合もしくは三重結合を含有することができる。「カルボシクリル」はまた、上記に定義されているようなカルボシクリル環が、１個または複数のアリールまたはヘテロアリール基と縮合しており、付着点がカルボシクリル環上にある、環系を含み、このような場合には、炭素の数は、炭素環式環系における炭素の数を示し続ける。他に特定しない限り、カルボシクリル基はそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換カルボシクリル」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換カルボシクリル」）。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、非置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子を有する３〜１４員の非芳香族環系のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される（「３〜１４員のヘテロシクリル」）。１個または複数の窒素原子を含有するヘテロシクリル基において、付着点は、原子価が許容するような、炭素または窒素原子でよい。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または多環式（例えば、縮合環、架橋環もしくはスピロ環系、例えば、二環式系（「二環式ヘテロシクリル」）または三環式系（「三環式ヘテロシクリル」））のいずれかでよく、飽和していてよいか、または１個もしくは複数の炭素−炭素二重結合もしくは三重結合を含有することができる。ヘテロシクリル多環式環系は、１つまたは両方の環において１個または複数のヘテロ原子を含むことができる。「ヘテロシクリル」はまた、上記に定義されているようなヘテロシクリル環が、１個または複数のカルボシクリル基と縮合しており、付着点がカルボシクリル環上またはヘテロシクリル環上のいずれかにある環系、あるいは上記に定義されているようなヘテロシクリル環が、１個または複数のアリールまたはヘテロアリール基と縮合しており、付着点がヘテロシクリル環上にある、環系を含み、このような場合には、環員の数が、ヘテロシクリル環系における環員の数を示し続ける。他に特定しない限り、ヘテロシクリルはそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換ヘテロシクリル」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、非置換３〜１４員のヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、置換３〜１４員のヘテロシクリルである。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「アリール」は、芳香族環系において提供される６〜１４個の環炭素原子および０個のヘテロ原子を有する、単環式または多環式（例えば、二環式もしくは三環式）の４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環状配置において共有されている６個、１０個、もしくは１４個のπ電子を有する）のラジカルを指す（「Ｃ６〜１４アリール」）。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、ナフチル、例えば、１−ナフチルおよび２−ナフチル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」はまた、上記に定義されているようなアリール環が、１個または複数のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合しており、ラジカルまたは付着点がアリール環上にある、環系を含み、このような場合には、炭素原子の数は、アリール環系における炭素原子の数を示し続ける。他に特定しない限り、アリール基はそれぞれの場合、独立に、非置換（「非置換アリール」）であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されている（「置換アリール」）。ある特定の実施形態では、アリール基は、非置換Ｃ６〜１４アリールである。ある特定の実施形
態では、アリール基は、置換Ｃ６〜１４アリールである。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「ヘテロアリール」は、芳香族環系において提供される環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子を有する、５〜１４員の単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）の４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環状配置において共有されている６個、１０個、もしくは１４個のπ電子を有する）のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される（「５〜１４員のヘテロアリール」）。１個または複数の窒素原子を含有するヘテロアリール基において、付着点は、原子価が許容するような、炭素原子または窒素原子でよい。ヘテロアリール多環式環系は、１つまたは両方の環において１個または複数のヘテロ原子を含むことができる。「ヘテロアリール」は、上記に定義されているようなヘテロアリール環が、１個または複数のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合しており、付着点がヘテロアリール環上にある、環系を含み、このような場合には、環員の数は、ヘテロアリール環系における環員の数を示し続ける。「ヘテロアリール」はまた、上記に定義されているようなヘテロアリール環が、１個または複数のアリール基と縮合しており、付着点がアリール環上またはヘテロアリール環上のいずれかにある、環系を含み、このような場合には、環員の数は、縮合多環式（アリール／ヘテロアリール）環系における環員の数を示す。１個の環がヘテロ原子を含有しない多環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）において、付着点は、いずれかの環、すなわち、ヘテロ原子を担持するいずれかの環（例えば、２−インドリル）またはヘテロ原子を含有しない環（例えば、５−インドリル）上でよい。
【００６８】
上記から理解されるように、本明細書に定義されているようなアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、ある特定の実施形態では、任意選択で置換されている。任意選択で置換されているとは、置換されているか、または非置換であり得る基を指す（例えば、「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルケニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキニル、「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリール、または「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、用語「置換されている」は、基上に存在する少なくとも１個の水素が、許容できる置換基、例えば、置換によって、安定的な化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応による転換を自発的に受けない化合物をもたらす置換基で置き換えられていることを意味する。他に示さない限り、「置換されている」基は、基の１個または複数の置換可能な位置において置換基を有し、任意の所与の構造における複数の位置が置換されているとき、置換基は、各位置において同じまたは異なる。用語「置換されている」は、有機化合物の全ての許容できる置換基による置換を含むことを企図し、本明細書に記載されている置換基のいずれかは、安定的な化合物の形成をもたらす。本開示は、安定的な化合物に到達するために、ありとあらゆるこのような組合せを企図する。本開示の目的のために、ヘテロ原子、例えば、窒素は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たし、かつ安定的な部分の形成をもたらす本明細書に記載のような任意の適切な置換基を有し得る。
【００６９】
例示的な炭素原子置換基には、これらに限定されないが、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−ＯＮ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、−ＳＨ、−ＳＲａａ、−ＳＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨＯ、−Ｃ（ＯＲｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ
、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｒｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２ＯＲａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−ＯＳｉ（Ｒａａ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−Ｂ（Ｒａａ）２、−Ｂ（ＯＲｃｃ）２、−ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１４カルボシクリル、３〜１４員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員のヘテロアリールが含まれ、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｄｄ基で独立に置換されており、
あるいは炭素原子上の２個のジェミナルな水素は、基＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂ、または＝ＮＯＲｃｃで置き換えられており、
Ｒａａはそれぞれの場合、独立に、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員のヘテロアリールから選択され、あるいは２個のＲａａ基は接合して、３〜１４員のヘテロシクリルまたは５〜１４員のヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｄｄ基で独立に置換されており、
Ｒｂｂはそれぞれの場合、独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員のヘテロアリールから選択され、あるいは２個のＲｂｂ基は接合して、３〜１４員のヘテロシクリルまたは５〜１４員のヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｄｄ基で独立に置換されており、
Ｒｃｃはそれぞれの場合、独立に、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３
〜１４員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員のヘテロアリールから選択され、あるいは２個のＲｃｃ基は接合して、３〜１４員のヘテロシクリルまたは５〜１４員のヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｄｄ基で独立に置換されており、
Ｒｄｄはそれぞれの場合、独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲｅｅ、−ＯＮ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、−ＳＨ、−ＳＲｅｅ、−ＳＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＯＣＯ２Ｒｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｒｆｆ）ＯＲｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２ＯＲｅｅ、−ＯＳＯ２Ｒｅｅ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、−ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリールから選択され、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｇｇ基で独立に置換されており、あるいは２個のジェミナルなＲｄｄ置換基は接合して、＝Ｏまたは＝Ｓを形成することができ、
Ｒｅｅはそれぞれの場合、独立に、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員のヘテロシクリル、および３〜１０員のヘテロアリールから選択され、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｇｇ基で独立に置換されており、
Ｒｆｆはそれぞれの場合、独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリールおよび５〜１０員のヘテロアリールから選択され、あるいは２個のＲｆｆ基は接合して、３〜１４員のヘテロシクリルまたは５〜１４員のヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｇｇ基で独立に置換されており、
Ｒｇｇはそれぞれの場合、独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＮ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）３＋Ｘ−、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）２＋Ｘ−、−ＮＨ２（Ｃ１〜６アルキル）＋Ｘ−、−ＮＨ３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＣ１〜６アルキル）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（ＯＨ）、−ＳＨ、−ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＳ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６ア
ルキル）、−ＯＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１〜６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯＣ１〜６アルキル、−Ｓｉ（Ｃ１〜６アルキル）３、−ＯＳｉ（Ｃ１〜６アルキル）３  −Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−Ｐ（＝Ｏ）２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１〜６アルキル）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員のヘテロシクリル、５〜１０員のヘテロアリールであり、あるいは２個のジェミナルなＲｇｇ置換基は接合して、＝Ｏまたは＝Ｓを形成することができ、式中、Ｘ−は、対イオンである。
【００７０】
本明細書において使用する場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、−Ｉ）を指す。
【００７１】
ある特定の実施形態では、窒素原子上に存在する置換基は、窒素保護基である（また、本明細書において、「アミノ保護基」と称される）。窒素保護基には、これらに限定されないが、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、Ｃ１〜１０アルキル（例えば、アラルキル、ヘテロアラルキル）、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員のヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員のヘテロアリール基が含まれ、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、およびヘテロアリールは、０個、１個、２個、３個、４個、または５個のＲｄｄ基で独立に置換されており、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、ＲｃｃおよびＲｄｄは、本明細書に定義されている通りである。窒素保護基は、参照により本明細書中に組み込まれているProtecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年に詳細に記載されているものを含む。
【００７２】
例えば、窒素保護基、例えば、アミド基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）には、これらに限定されないが、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル
誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド（nitophenylacetamide）、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（
Ｎ’−ジチオベンジルオキシアシルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンアミド（nitrocinnamide）、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミドおよびｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミドが含まれる。
【００７３】
窒素保護基、例えば、カルバメート基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）には、これらに限定されないが、メチルカルバメート、エチルカルバメート（carbamante）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルイル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジル（nitobenzyl）カルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フ���ニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシアシルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメ
ート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（isoborynl）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、
ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、および２，４，６−トリメチルベンジルカルバメートが含まれる。
【００７４】
窒素保護基、例えば、スルホンアミド基（例えば、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）には、これらに限定されないが、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナシルスルホンアミドが含まれる。
【００７５】
他の窒素保護基には、これらに限定されないが、フェノチアジニル−（１０）−アシル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノアシル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオアシル誘導体、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加体（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（pyroolin）−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタアシルクロムまたはタングステン）アシル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニ
トロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホロアミデート、ジベンジルホスホロアミデート、ジフェニルホスホロアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、および３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）が含まれる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、酸素原子上に存在する置換基は、酸素保護基である（また、本明細書において「ヒドロキシル保護基」と称される）。酸素保護基には、これらに限定されないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２が含まれ、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書に定義されている通りである。酸素保護基は、参照により本明細書中に組み込まれているProtecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年に詳細に記載されているものを含む。
【００７７】
例示的な酸素保護基には、これらに限定されないが、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４’’−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビ
ス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバレート（pivaloate）、アダマントエート（adamantoate）、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート（mesitoate））、メチルカーボネート、９−フルオレニルメチル
カーボネート（Ｆｍｏｃ）、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、ｔ−ブチルカーボネート（ＢＯＣ）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチル（napththyl）カ
ーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシネート（monosuccinoate）、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシアシル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）が含まれる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、硫黄原子上に存在する置換基は、硫黄保護基である（また、「チオール保護基」と称される）。硫黄保護基には、これらに限定されないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２が含まれ、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｅｅは、本明細書に定義されている通りである。硫黄保護基は、参照により本明細書中に組み込まれているProtecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年に詳細に記載されているものを含む。
【００７９】
本明細書において使用する場合、２つの実体が互いに「コンジュゲート」または「ライゲーション」されているとき、これらは直接または間接の共有結合的または非共有結合的相互作用によって連結されている。ある特定の実施形態では、会合は、共有結合である。他の実施形態では、会合は、非共有結合である。非共有結合的相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、磁性相互作用、静電相互作用などを含む。ある特定の実施形態では、２つの実体は、任意選択でリンカー基を介して共有結合的に接続している。
【００８０】
本明細書において使用する場合、用語「塩」は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび下等動物の組織と接触する使用に適したこれらの塩を指し、かつ合理的な利益／リスク比と釣り合っている、薬学的に許容される塩を含めたありとあらゆる塩を指す（以下を参照されたい。Bergeらは、薬学的に
許容される塩について詳細にJ.  Pharmaceutical  Sciences（１９７７年）６６巻：１〜１９頁において記載している）。薬学的に許容される無毒性の酸性塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸と共に、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸と共に、あるいは当技術分野で使用される他の方法、例えば、イオン交換を使用することによって形成される、アミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。適当な塩基に由来する薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩を含む。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な場合、対イオン、例えば、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホネートイオン、およびアリールスルホネートイオンを使用して形成される、無毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。
【００８１】
投与を企図する「対象」には、これらに限定されないが、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児対象（例えば、乳児、児童、青年期）または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、または高齢成人））ならびに／あるいは他の非ヒト動物、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；商業的に関連性のある哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／またはイヌ）ならびに鳥（例えば、商業的に関連性のある鳥、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウ）が含まれる。ある特定の実施形態では、動物は、哺乳動物である。動物は、雄性または雌性であり、任意の発達段階のものでよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であり得る。
【００８２】
本明細書において使用する場合、用語「状態」、「疾患」および「障害」は、互換的に使用される。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「阻害」、「阻害すること」、「阻害する」および「阻害剤」などは、特定の生物学的プロセスの活性を低減させるか、遅延させるか、停止させるか、または防止する化合物の能力を指す。
【００８４】
本明細書において使用する場合、用語「細胞」は、任意の属または種の真核細胞および原核細胞を包含することを意味し、哺乳動物細胞が特に目的である。「細胞」はまた、正常細胞および異常細胞の両方、例えば、がん性細胞を包含することを意味する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞は、生細胞である。
【００８５】
本明細書において使用する場合、用語「試料」は、任意の化学的試料または生体試料を含む。化学的試料は、任意の化学的混合物または化合物を指す。生体試料は、これらに限定されないが、細胞培養物またはその抽出物；動物（例えば、哺乳動物）から得た生検材料、またはその抽出物；および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙、もしくは他の体液、またはそれらの抽出物を含む。例えば、用語「生体試料」は、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）ならびに多細胞生物を含めた任意の生きている生物（例えば、植物および動物、例えば、脊椎動物または哺乳動物、特に、健康なもしくは明らかに健康なヒト対象、または診断もしくは研究される状態もしくは疾患に冒されているヒト患者）から得られるか、これらによって排泄されるか、またはこれらによって分泌される、任意の固体または液体試料を指す。生体試料は、固体材料、例えば、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、細胞ホモジネート、もしくは細胞画分；または生検材料、または体液を含めた任意の形態でよい。体液は、任意の部位（例えば、血液、唾液（もしくは口腔内頬側細胞を含有する口内洗浄液）、涙、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、羊水、腹水、および胸水、またはそこからの細胞、眼房水もしくは硝子体液、または任意の分泌液）、漏出液、浸出液（例えば、膿瘍、または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得た液体）、あるいは関節（例えば、正常な関節、または疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、痛風もしくは敗血症性関節炎に冒された関節）から得た液体から得ることができ、生体試料は、任意の器官もしくは組織（生検もしくは剖検材料を含めた）から得ることができ、あるいは細胞（初代細胞もしくは培養細胞）または任意の細胞、組織もしくは器官によって条件調整される媒体を含み得る。生体試料はまた、組織のセクション、例えば、組織学的目的のために採取された凍結したセクションを含み得る。生体試料はまた、細胞または組織ホモジネートの部分的または完全な分画によって生じたタンパク質、脂質、炭水化物および核酸を含めた生物学的分子の混合物を含む。試料は好ましくはヒト対象から採取されるが、生体試料は、任意の動物、植物、細菌、ウイルス、酵母などからでよい。動物という用語は、本明細書において使用する場合、例えば、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、虫および単細胞を含めた、任意の発達段階のヒトならびに非ヒト動物を指す。細胞培養物および生組織試料は、複数の動物であると考えられる。特定の例示的な実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。動物は、トランスジェニック動物またはヒトクローンであり得る。必要に応じて、生体試料は、予備的分離技術を含めた予備的加工に供し得る。
【００８６】
用語「生理学的条件」は、生細胞と適合性のこれらの条件、例えば、主に、生細胞と適合性である温度、ｐＨ、塩分などの水性条件を包含することを意味する。
【００８７】
本開示は、新規な一連の反応性標識化化合物の設計および化学合成に基づいている。化合物は、細胞環境に適している緑色を発光するＢＯＤＩＰＹスカフォールドを含有するアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物でよい。ＢＯＤＩＰＹスカフォールドは、その魅力的な合成および蛍光性フィーチャのために出発モジュールとして使用される。ＢＯＤＩＰＹは８位において容易に修飾される。この位置におけるアリール化は、アリール部分およびＢＯＤＩＰＹコアがねじれており、コンジュゲーションが脱カップリングしているため吸収および
発光波長に対して実質的な影響を有さない。
【００８８】
本明細書に記載されているのは、触媒の存在下でアルキン含有分子とアジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）を受け、分子の検出を促進する増強された蛍光を示すトリアゾリル生成物を形成する、アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物である。アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、洗浄プロセスを伴わない細胞イメージングにおける進歩を表し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に細胞ライセートからのアルキンタグ付き糖タンパク質の直接のゲル内検出に適用可能である。
【００８９】
反応性標識化化合物はまた、シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブでよい。シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブは、クマリン部分に連結したシクロオクチンをさらに含むことができる。また、本明細書に記載されているのは、触媒の存在下でアジド含有分子と共にアジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）を受け、分子の検出を促進する増強された蛍光を示すトリアゾリル生成物を形成させる、シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブ化合物である。
【００９０】
本明細書に記載されているのは、生細胞中のアジド含有複合糖質およびアルキニル含有複合糖質をイメージングするためのアジド−ＢＯＤＩＰＹおよびシクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブの両方を使用する方法である。
【００９１】
本明細書に記載されているのは、酵素の活性部位へのコンジュゲーションのための化合物、および前記化合物を使用する方法である。いくつかの実施形態では、酵素は、シアリダーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、化合物は、アルキニル含有化合物である。いくつかの実施形態では、化合物は、シアリダーゼ酵素の活性部位と共有結合を形成する。
アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物
【００９２】
アジド−ＢＯＢＩＰＹ化合物は、式（Ｉ）：
【化５】
2020002139.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物であり、式中、
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ
、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ４ａおよびＧ４ｂはそれぞれの場合、フルオロ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリールオキシのアリール基およびアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールのいずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｎは、０、１、２、３、または４である。
【００９３】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＲＢであり、式中、
ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９４】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ２は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９５】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ３は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は
、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９６】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ５は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９７】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ６は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ
）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９８】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ７は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ
６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【００９９】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ８は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１００】
ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている炭素環または複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている５員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されているフェニルを形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、非置換フェニルを形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、またはＯの１個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている５員の複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、およびＯの群からそれぞれ独立に
選択される２個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている５員の複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、またはＯの１個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、およびＯからなる群から各々独立に選択される２個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５およびＧ７の少なくとも２つは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５およびＧ７の少なくとも２つは、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。いくつかの実施形態では、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５およびＧ７のそれぞれは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５およびＧ７のそれぞれは、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５およびＧ７のそれぞれは、メチルである。ある特定の実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）の化合物：
【化６】
2020002139.tif 000016
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を対象とし、式中、Ｇ２、Ｇ４ａ、Ｇ４ｂ、Ｇ６、Ｇ８およびｎは、本明細書に記載の通りである。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、
【化７】
2020002139.tif 000017
は、式：
【化８】
2020002139.tif 000018
のものである。本明細書において使用する場合、Ｒ８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、任意選択で置換されているＣ
１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、メチルまたはエチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、酸素保護基である。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、
【化９】
2020002139.tif 000019
は、式：
【化１０】
2020002139.tif 000020
のものである。本明細書において使用する場合、Ｒ９はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、メチルまたはエチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、酸素保護基である。Ｇ４ａおよびＧ４ｂはそれぞれの場合、フルオロ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルである。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、置換基は、化合物の光学異性および／または立体異性をもたらし得る。化合物の塩、溶媒和物、水和物、およびプロドラッグ形態はまた目的のものである。全てのこのような形態は、本開示によって包含される。このように、本明細書に記載されている化合物は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および異性体を含めた、その塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および異性体形態を含む。ある特定の実施形態では、化合物は、薬学的活性誘導体へと代謝し得る。
【０１０５】
式（Ｉ）および（ＩＩ）の例示的な化合物を、表１において示す。
【表１−１】
2020002139.tif 000021
【表１−２】
2020002139.tif 000022
【表１−３】
2020002139.tif 000023
【表１−４】
2020002139.tif 000024
【表１−５】
2020002139.tif 000025
【表１−６】
2020002139.tif 000026
【０１０６】
例示的なアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物を使用して、アルキニル付属生体分子を含めたアルキン化合物を検出した。アルキン化合物とのＡＡＣ反応の後、トリアゾール環の形成によって蛍光消光を放出し、蛍光増強現象がもたらされる。化合物Ｔ２およびＴ９〜Ｔ１１は、アジドとのＡＡＣを受け、蛍光性トリアゾール生成物を生じさせるこのようなタイプのプローブの例である。
アルキン含有分子
【０１０７】
本開示に記載されているアルキン含有分子は、式
【化１１】
2020002139.tif 000027
のものである。
【０１０８】
例示的なアルキン含有標的分子には、これらに限定されないが、少なくとも１個のアルキンを含有するか、または含有するように修飾されている、アミノ酸およびアミノ酸残基、ポリペプチド（ペプチドおよびタンパク質を含めた）、糖または糖残基などが含まれる
。
【０１０９】
例示的な標的分子には、これらに限定されないが、生体分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはグリカンが含まれ、これは天然に存在し得るか、または合成的にもしくは組換え技術によって産生されてもよく、単離されるか、実質的に精製されるか、またはアルキン含有標的分子がベースとしている無修飾分子の天然環境（例えば、宿主動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス宿主（例えば、ラット、マウス）、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなど内を含めた、細胞表面上または細胞内）内に存在し得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無細胞反応において存在する。他の実施形態では、標的分子は、細胞中に存在し、かつ／または細胞の表面上に表示される。目的の多くの実施形態では、標的分子は、生細胞中；生細胞の表面上；生きている生物、例えば、生きている多細胞生物中にある。適切な生細胞は、生きている多細胞生物の部分である細胞；多細胞生物から単離された細胞；不死化細胞系などを含む。
【０１１０】
標的分子がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、または両方からなってもよく、天然に、合成的に、または組換え技術のいずれかによってさらに修飾されて、他の部分を含み得る。例えば、標的ポリペプチドは、リポタンパク質、糖タンパク質、または他のこのような修飾されたタンパク質であり得る。
【０１１１】
一般に、有用な標的分子は、本開示による修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹとの反応のための少なくとも１個のアルキンを含むが、２個またはそれ超、３個またはそれ超、５個またはそれ超、１０個またはそれ超のアルキンを含み得る。反応の最終生成物の意図する用途、標的分子自体の性質、および本明細書に開示されている本開示の実施において当業者には容易に明らかである他の理由によって、適切な標的分子中に存在し得るアルキンの数は変化する。
【０１１２】
本開示のこの実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的分子の修飾において特に有用である。この実施形態では、標的基質は修飾されて、修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹへの連結が望ましいポイントにおいてアルキニル基を含む。例えば、標的基質がポリペプチドである場合、ポリペプチドは修飾されて、Ｎ−末端アルキンを含有する。標的基質が糖タンパク質である場合、糖タンパク質の糖残基は、修飾されて、アルキンを含有することができる。アルキンで修飾されていないが、アルキンでこれから修飾される標的分子は、本明細書において「標的基質」と称される。アルキンで修飾された標的分子は、本明細書において「アルキン修飾された標的分子」または「アルキン含有標的分子」と称される。
【０１１３】
標的基質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ、次いで、細胞中に導入されることができ（例えば、マイクロインジェクション、リポソームまたはリポフェクチンが媒介する送達、電気穿孔などによる）、修飾のために標的とされる基質の性質によってこの方法は変化し、当業者が容易および適切に選択することができる。最終標的基質はまた、宿主細胞の天然の生合成機構を活用することによってｉｎ  ｖｉｖｏで生じさせることができる。例えば、細胞は所望の標的分子の合成のための基質の生体適合性アルキン誘導体と共に提供することができ、基質は、細胞によって加工され、所望の最終標的基質のアルキン誘導体が得られる。例えば、標的基質が細胞表面糖タンパク質である場合、細胞は、糖タンパク質内に見出される糖残基のアルキン誘導体と共に提供することができ、これはそれに続いて天然の生合成プロセスを通して細胞によって加工され、アクセス可能なアルキン基を含む少なくとも１つの修飾された糖部分を有する修飾された糖タンパク質が生じる。
【０１１４】
標的基質はまた、方法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで産生させることができる。例えば、アルキンを有する非天然アミノ酸は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現している組換えポリペプチド中に組み込むことができる（例えば、Kiickら（２０００年）Tetrahedron、５６巻：
９４８７頁を参照されたい）。このような組換え技術によって産生されたポリペプチドは、本開示による修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹと選択的に反応することができる。
【０１１５】
一例では、アルキン基は、所望の生体ポリマー標的基質のための合成構造ブロックを有する細胞（例えば、生体ポリマー、例えば、タンパク質をグリコシル化する真核細胞）を提供することによって標的分子中に組み込まれる。例えば、細胞は、糖タンパク質中のアルキン基の組込みを実現するアルキン基を含む糖分子と共に提供することができる。いくつかの実施形態では、糖タンパク質は、細胞表面上に発現している。代わりに、アルキン基は、アミノ酸中に組み込むことができ、これはそれに続いて細胞によって合成されるペプチドまたはポリペプチド中に組み込まれる。生体ポリマー中に非天然構造ブロックを組み込むためにいくつかの方法が利用可能である。標的分子として細胞表面オリゴ糖類に制限する必要はない。例えば、vanHestら（１９９８年）FEBS  Lett.４２８巻：６８頁；およびNowakら（１９９５年）Science、２６８巻：４３９頁を参照されたい。
【０１１６】
一実施形態では、標的分子は、炭水化物含有分子（例えば、糖タンパク質；多糖類など）であり、アルキン基は、合成基質を使用して標的分子中に導入される。いくつかの実施形態では、合成基質は、グリコシル化分子の産生において利用される糖のアルキン誘導体である。いくつかの実施形態では、合成基質は、例えば、糖タンパク質生合成経路において細胞表面分子の産生において利用される糖のアルキン誘導体である。例えば、宿主細胞は、合成シアル酸アルキニル誘導体と共に提供することができ、これはシアル酸生合成のための経路中に組み込まれ、最終的に糖タンパク質における合成糖残基の組込みがもたらされる。いくつかの実施形態では、糖タンパク質は、細胞表面上に表示されている。
【０１１７】
一例では、合成基質は、一般式
【化１２】
2020002139.tif 000028
のマンノサミンのアルキニル誘導体であり、式中、ｎは、０〜７、一般に１〜４、より通常には１〜２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素またはアセチルである。いくつかの実施形態では、基質は、Ｎ−３−ブチノイルマンノサミン（ｎ＝０）もしくはそのアセチル化誘導体、またはＮ−４−ペンチノイルマンノサミン（ｎ＝１）もしくはそのアセチル化形態である。
【０１１８】
別の実施形態では、合成基質は、例えば、
【化１３】
2020002139.tif 000029
の一般式のアルキニル糖誘導体であり、これらのいずれかは、シアル酸生合成経路中に組み込むことができ、式中、ｎは、１〜６、一般に１〜４、より通常には１〜２であり、Ｒ
２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素またはアセチルである。
【０１１９】
別の実施形態では、合成基質は、例えば、
【化１４】
2020002139.tif 000030
の一般式のアルキニル糖誘導体であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素またはアセチルであり、合成基質は、フコースを伴う生合成経路中に組み込まれている。
【０１２０】
別の実施形態では、合成基質は、例えば、
【化１５】
2020002139.tif 000031
の一般式のアルキニル糖誘導体であり、式中、ｎは、１〜６、一般に１〜４、より通常には１〜２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素またはアセチルであり、これはガラクトースを伴う生合成経路中に組み込まれている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、対象の方法を使用して、細胞の表面を修飾する。このように、一態様において、本開示は、細胞の表面をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで修飾する方法をフィーチャする。この方法は一般に、アルキニル基を含む標的分子中のアルキン基と、修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹとを反応させ、細胞表面における化学選択的ライゲーションを実現することを伴う。多くの実施形態では、方法は、細胞表面上の標的分子をアルキニル基で修飾するステップと、標的分子中のアルキニル基と修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹとを反応させるステップとを含む。例えば、上記のように、アルキニル糖は生細胞に提供され、このアルキニル糖は、細胞表面上に表示されている糖タンパク質中に組み込まれる。
【０１２２】
対象の修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物、および対象の修飾方法は、研究用途および診断用途を含めた種々の用途において有用である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、対象の修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物、および対象の修飾方法は、研究用途において有用である。目的の用途は、研究用途、例えば、受容体の機能的および物理的特性を探索すること；プロテオミクス；メタボロミクスなどを含み、研究用途はまた、創薬または他のスクリーニング用途を含む。
【０１２４】
プロテオミクスは、タンパク質を検出、同定、および定量化して、生物学的に関連性のある情報を得ることを目的とする。メタボロミクスは、代謝物および他の小分子、例えば、脂質および炭水化物の検出、同定、および定量化である。Fiehn（２００１年）Comparative  and  Functional  Genomics、２巻：１５５〜１６８頁；および米国特許第６，８
７３，９１４号。
【０１２５】
創薬用途には、これらに限定されないが、がん細胞生存率および／または成長を阻害す
る薬剤を同定することが含まれる。このように、いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞生存率および／または成長を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は一般に、細胞の成分を修飾して、アルキンを含む第１の反応性パートナーを含むことと、試験薬剤の存在下で細胞と、修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹを含む第２の反応性パートナーとを接触させることであって、接触は生理学的条件下であり、接触によって、第１の反応性パートナーのアルキニル基、および第２の反応性パートナーのアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物の間の反応がもたらされ、それによって細胞成分を合成的におよび共有結合的に修飾することと、存在する場合、第２の反応性パートナーによる細胞の修飾のレベルに対する試験薬剤の効果を決定することとを伴う。
【０１２６】
がん細胞が同じ細胞型の正常（非がん）細胞より多い量の炭水化物を生成するものである場合、方法は、がん性細胞の成長および／または生存能を低減させる薬剤を同定することを実現する。
【０１２７】
目的の用途はまた、診断用途、例えば、がんの検出などのためを含み、検出可能な標識を含む対象の修飾されたシクロアルキンを使用して、がん細胞上に存在するアルキン修飾された標的分子、例えば、アルキン標識された標的分子を標識する。目的の用途はまた、治療用途を含み、薬物または他の治療剤は、共有結合的に連結された薬物または他の治療剤を含む対象の修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物を使用して、アルキン修飾された標的分子に送達される。
【０１２８】
本開示の特定の実施形態は、例えば、生物、例えば、個体における細胞の代謝または他の状況を決定するｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングのために使用される。非限定的な一例として、対象の方法は、個体（例えば、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、およびヒトを含めた哺乳動物）におけるがん細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングに適用することができる。
【０１２９】
対象のアジド−アルキン環化付加の１つの例示的な非限定的用途は、細胞がそれらの表現型を変化させるにつれ起こる細胞における代謝的変化の検出にある。一例として、変化したグリコシル化パターンは、天然に存在するグリカンの過小発現および過剰発現の両方、ならびに胚発生の間の発現に通常制限されているグリカンの表示からなる、腫瘍表現型の顕著な特徴である。形質転換細胞と関連する一般の抗原の例は、シアリルＬｅｗｉｓ  ａ、シアリルＬｅｗｉｓ  ｘ、シアリルＴ、シアリルＴｎ、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）である。Jorgensenら（１９９５年）Cancer  Res.５５巻、１８１７〜１８１９頁；Sell（１９９０年）Hum.  Pathology、２１巻、１００３〜１０１９頁；Takiら（１９８８年）J.  Biochem.、１０３巻、９９８〜１００３頁；Gabius（１９８８年）Angew.  Chem.
Int.  Ed.  Engl.、２７巻、１２６７〜１２７６頁；Feizi（１９９１年）Trends  Biochem.  Sci.、１６巻、８４〜８６頁；Taylor-PapadimitriouおよびEpenetos（１９９４
年）Trends  Biotech.、１２巻、２２７〜２３３頁；HakomoriおよびZhang（１９９７年
）Chem.  Biol.、４巻、９７〜１０４頁；Dohiら（１９９４年）Cancer、７３巻、１５５２頁。これらの抗原は、これらがそれぞれ末端シアル酸を含有するという重要なフィーチャを共有する。ＰＳＡは、長さが５０単位までのシアル酸残基のホモポリマーである。上昇したレベルのシアル酸は、胃（Dohiら（１９９４年）Cancer、７３巻、１５５２頁；およびYamashitaら（１９９５年）J.  Natl.  Cancer  Inst.、８７巻、４４１〜４４６頁
）、結腸（Yamashitaら（１９９５年）J.  Natl.  Cancer  Inst.、８７巻、４４１〜４
４６頁；Hanskiら、（１９９５年）Cancer  Res.、５５巻、９２８〜９３３頁；Hanskiら（１９９３年）Cancer  Res.、５３巻、４０８２〜４０８８頁；Yangら（１９９４年）Glycobiology、４巻、８７３〜８８４頁；Saitohら（１９９２年）J.  Biol.  Chem.、２６７巻、５７００〜５７１１頁）、膵臓（Sawadaら（１９９４年）Int.  J.  Cancer、５７巻、９０１〜９０７頁）、肝臓（Sawadaら（１９９４年）J.  Biol.  Chem.、２６９巻、
１４２５〜１４３１頁）、肺（Weibelら（１９８８年）Cancer  Res.、４８巻、４３１８〜４３２３頁）、前立腺（Jorgensenら（１９９５年）Cancer  Res.、５５巻、１８１７
〜１８１９頁）、腎臓（Rothら（１９８８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８５巻、２９９９〜３０００頁）、および乳がん（Choら（１９９４年）Cancer  Res.、５４巻
、６３０２〜６３０５頁）、ならびにいくつかのタイプの白血病（Joshiら（１９８７年
）Cancer  Res.、４７巻、３５５１〜３５５７頁；Altevogtら（１９８３年）Cancer  Res.、４３巻、５１３８〜５１４４頁；Okadaら（１９９４年）Cancer、７３巻、１８１１
〜１８１６頁）を含めた多くのがんにおける形質転換された表現型と高度に相関している。細胞表面シアル酸のレベルおよび転移能の間の強い相関関係がまた、いくつかの異なる腫瘍タイプにおいて観察されてきた（Kakejiら（１９９５年）Brit.  J.  Cancer、７１
巻、１９１〜１９５頁；Takanoら（１９９４年）Glycobiology、４巻、６６５〜６７４頁）。単一のがん細胞上の複数のシアル酸付加抗原の集団的表示は、抗原の同一の補体を必ずしも発現することなく多くの異なる腫瘍タイプが高度なシアル酸表現型を共有するという事実を説明することができる（Rothら（１９８８年）、上述）。結果的に、シアル酸レベルに基づいて細胞を標的とする診断または治療方針は、多くのがんへの広範な適用性を有する。
【０１３０】
生きている動物への非天然アルキニル糖（ＭａｎＮＡｌ、ＧａｌＮＡｌ）の導入および組込みは、代謝の状況における変化の検出を実現する。適当なエピトープタグの付着によって、修飾されたアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、生きている生物におけるこれらの細胞を標識し、結果的に代謝の状況における変化を検出する。腫瘍化細胞の早期の検出およびそれに続くインターベンションは、がん患者についての重症度を低減させ、生存率を増加させる。
トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物
【０１３１】
トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物とアルキン含有分子とをアジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）によって反応させることによって形成される。トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、対応するアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物と比較して増強された蛍光を示す。本開示において記載するトリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、式（ＩＩＩ）のもの：
【化１６】
2020002139.tif 000032
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物であり、
式中、
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ４ａおよびＧ４ｂはそれぞれの場合、フルオロ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリールオキシのアリール基およびアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールのいずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｎは、０、１、２、３、または４である。
【０１３２】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独
立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３３】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ２は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３４】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ３は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、メチル、エチル、またはｎ−プ
ロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３５】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ５は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ５は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３６】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ６は、水素、ハロゲン、任意選択で
置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ６は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３７】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ７は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１
〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ７は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３８】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ８は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、−Ｎ（ＲＢ）２であり、式中、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＣＨ３またはＮＨＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｇ８は、ＮＨＲＢであり、式中、ＲＢは、窒素保護基である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている炭素環または複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている５員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されているフェニルを形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、非置換フェニルを形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２
つは、これらの介在する原子と一緒になって、任意選択で置換されている複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、またはＯの１個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている５員の複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、およびＯの群からそれぞれ独立に選択される２個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている５員の複素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、またはＯの１個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、互いに隣接しているＧ８基の２つは、これらの介在する原子と一緒になって、Ｓ、Ｎ、およびＯからなる群から各々独立に選択される２個のヘテロ原子を有する任意選択で置換されている６員の炭素環を形成する。
【０１４０】
本開示の１つまたは複数の実施形態の有効性を、下記の記載において記載する。本開示の他のフィーチャまたは利点は、下記の図面およびいくつかの実施形態の詳細な記載から、ならびにまた添付の特許請求の範囲から明らかである。
シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブ
シクロオクチンをベースとする蛍光発生プローブは、式（ＩＶ）：
【化１７】
2020002139.tif 000033
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物であり、式中、
Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７およびＧ１８はそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜６アルケニル、任意選択でハロゲン、任意選択でニトロソ、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢであり、
Ｒはそれぞれの場合、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ３ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＢから独立に選択され、
各ＲＡは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、
各ＲＢは、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから独立に選択され、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成し、
Ｇ９およびＧ１０はそれぞれの場合、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ
ソ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキニルであり、
アルキルおよびアルコキシ基は、非分岐飽和であり、１〜４個の炭素原子を有し、アリールオキシのアリール基およびアリール基は、炭素環式アリールまたは複素環式アリールのいずれかでよく、炭素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で６〜２０個の炭素原子を有し、複素環式アリール基は、置換基の炭素原子を含めて全部で５〜２０個の炭素原子を有し、カルボアルコキシ基は、カルボン酸のアルキルエステルであり、アルキル基は、上記に定義されている通りであり、各アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ベンゾ、およびカルボアルコキシは、独立に、非置換であるか、または１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、アルキル置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、またはアリールであり、アリール置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、ニトロ、またはカルボキシルであり、ハロ置換基は、フルオロまたはクロロであり、
ｍは、１である。
【０１４１】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ９は、水素、ハロゲン、ニトロソ、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＣ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択される。ある特定の実施形態では、Ｇ９は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｇ９は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｇ９は、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｇ９は、−ＯＲＡであり、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基である。ある特定の実施形態では、Ｇ９は、フルオロである。
【０１４２】
本明細書において一般に定義されているように、Ｇ１０は、水素、ハロゲン、ニトロソ、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲＡ、−ＣＨ２ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝Ｎ−ＯＲＡ、＝Ｎ−ＮＨ２、＝Ｎ−ＮＨＲＡ、＝Ｎ−Ｎ（ＲＢ）２、および−ＮＨＳＯ２ＲＡから独立に選択され、式中、ＲＡは、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、または酸素に付着しているとき、酸素保護基、または硫黄に付着しているとき、硫黄保護基であり、ＲＢはそれぞれの場合、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリール、または窒素保護基であり、あるいは２個のＲＢは、介在する窒素と一緒になって、複素環を形成する。ある特定の実施形態では、Ｇ１０は、フルオロである。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本開示は、１０１の化合物を対象とする。
【化１８】
2020002139.tif 000034
【０１４４】
シクロオクチンとクマリンフルオロフォアとを縮合させることによって設計される新規な蛍光形成プローブ１０１は、洗浄なしおよび固定なし条件、ならびに触媒非含有条件下での生細胞中のアジド含有複合糖質のリアルタイムイメージングのために本明細書に記載されている。このプローブは、低い細胞毒性を伴って細胞透過性であり、トリアゾール形成後に蛍光を生じさせ、したがって、良好な蛍光シグナルを伴う糖タンパク質局在化および輸送の細胞内イメージングを可能とする。さらに、１０１および本明細書に記載されているアジド−ＢＯＤＩＰＹプローブの組合せは、それぞれ、二重標識化実験における生細胞中のトリアゾール形成によって、２種の異なる代謝的に組み込まれたアジドおよびアルキン含有複合糖質の検出を可能とする。
【０１４５】
低蛍光７−アルキニルクマリン１０２は、ＣｕＡＡＣ反応を受けて、トリアゾール環の電子供与性特性によって増強された蛍光を有するトリアゾール１０３が得られることが示されてきた。６ｃこのように、クマリン部分１０１へのシクロオクチンの組込みは、蛍光を減少し得るが、アジドとの１０１のＳＰＡＡＣ反応によって、高感度検出のための高度に蛍光性のトリアゾール生成物を得ることができる。本開示において、本発明者らは、ＳＰＡＡＣをベースとする蛍光形成プローブ１０１（図１０）、すなわち、洗浄なしおよび固定なし条件下での生細胞中のアジドタグ付きグリカンの時間経過イメージングのために使用することができるｃｏｕｍＯＣＴについて報告する。
【化１９】
2020002139.tif 000035
【０１４６】
図１０．生細胞中のアジド含有複合糖質のイメージングのためのトリアゾール形成による高い蛍光を示す、ＳＰＡＡＣをベースとする蛍光形成プローブ１０１の設計。比較のために、７−アルキニルクマリン１０２は、アジドとＣｕＡＡＣ反応を受けて、高度に蛍光性のトリアゾール１０３を形成する弱蛍光プローブである。
活性をベースとする酵素プローブ
【０１４７】
本開示は、機序に基づく阻害剤として３−フルオロシアリルフルオリドから、およびレポーターライゲーションのためにアルキン基を組み込むことによって調製される、一連の活性をベースとするシアリダーゼプローブであるＤＦＳＡ（５０１）、およびＣｏｕｍＦＳＡ（６０１）について記載する。ＤＦＳＡ（５０１）は、全ての試験したシアリダーゼの活性部位失活剤である。この報告において、本発明者らは、活性をベースとするシアリダーゼプローブであるＣｏｕｍＦＳＡ（６０１）、およびＤＦＳＡ（５０１）の化学合成を記載してきた。
【化２０−１】
2020002139.tif 000036
図１１．シアリダーゼプローブＤＦＳＡ５０１およびＣｏｕｍＦＳＡ６０１の構造。
【化２０−２】
2020002139.tif 000037
スキーム５００．ＣｏｕｍＦＳＡの化学合成。
【化２１】
2020002139.tif 000038
スキーム６００．ＤＦＳＡ（５０１）の化学合成。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、一連の活性をベースとする酵素プローブは、化合物２０６に加える脱離基Ｌを変化させることによって合成することができる。スキーム７００において示すように、弱酸の塩の任意の選択物（ナトリウム塩は示す通りであるが、任意のカチオン対イオンを使用することができる）を、許容される脱離基として使用することができる。例えば、Ｌは、アルコキシ、フェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、４−ニトロフェノキシ、クマリン、アルカノエート、ベンゾエート、トリフレート、メシレート、またはトシレートでよい。
【化２２】
2020002139.tif 000039
スキーム７００．脱離基塩Ｌ−Ｎａ＋の選択による化合物２０９のバリアントの化学合成。
【０１４９】
図１２は、活性をベースとする酵素プローブ（ＡＢＰ）の一般構造を示す。ＡＢＰは、反応性基、スペーサーまたは結合基、およびレポータータグを含有する。反応性基は、酵素標的の触媒的機序に基づいて設計され、これは酵素活性部位における求核性残基と反応して、共有結合付加体を形成することができる求電子試薬を含有することができる。フルオロフォアおよびビオチン、ならびに「クリッカブル」ハンドル、例えば、アジドおよびアセチレンを含めた種々のレポータータグを、酵素の可視化および富化のために使用することができる。
【０１５０】
本開示は、特にシアリダーゼのための活性をベースとする酵素プローブの設計を記載する。３−フルオロシアリルフルオリドは、動力学的モデルによって、野性型ｔｒａｎｓ−シアリダーゼを時間依存的様式で不活性化する。強い電子吸引基によって、フッ素は、正に帯電しているオキソ−カルベニウムイオン様遷移状態を不安定化し（図８０１）、それによって共有結合中間体の形成および加水分解の両方を遅延させることができる。
【化２３】
2020002139.tif 000040
【０１５１】
図１３．基質上に作用するシアリダーゼ酵素の機序および遷移状態。
【０１５２】
シアリダーゼ酵素の結晶構造が、３−フルオロシアリルフルオリドとのノイラミニダーゼ−共有結合性複合体を支持し、これはさらに修飾されて、新規な化学官能基を活性部位中に組み込むことができることを本発明者らは認識してきた。図８０２に示すように、ノイラミニダーゼ（neurminidase）（シアリダーゼ）活性部位におけるＴｙｒ４０６は、３−フルオロシアリルフルオリド基質上のＣ−２に対して求核攻撃を行う（Nat  Commun、
２０１３年、４巻、１４９１頁）。したがって、脱離基によるＣ−２の修飾は、Ｔｙｒ４０６および３−フルオロシアリルフルオリド基質の間の共有結合を生じさせる。アルキル官能基を含める３−フルオロシアリルフルオリド基質のさらなる修飾は、共有結合された基質が、アジド含有蛍光発生プローブ、例えば、本明細書に記載されているこれらの化合物によって検出されることを可能とする。図１４．３−フルオロシアリルフルオリド基質とのノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）活性部位の結晶構造。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている活性をベースとするプローブ（ＡＢＰ）を使用して、シアリダーゼ酵素を検出および同定することができる。図２６において示すように、ＡＢＰは、シアリダーゼの活性部位と反応して、共有結合を形成することができる。細胞を任意選択で溶解することができる。ＡＢＰは、アジド含有レポーター分子（例えば、本明細書に記載されているアジド含有蛍光発生プローブ）とさらに反応して、トリアゾール錯体を形成することができる。次いで、トリアゾール錯体を、検出することができる（例えば、質量分析法、蛍光、ルミネセンス、吸収分光法による）。図１５．シアリダーゼの同定のための蛍光発生反応。
【実施例】
【０１５３】
（実施例１）
アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物の合成
材料
他に示さない限り、全ての試薬は市販であり、それ以上精製することなく使用した。他に示さない限り、全ての溶媒は無水グレードであった。特に断りのない限り、全ての非水性反応は、アルゴンの僅かな陽圧下でオーブン乾燥させたガラス器具中で行った。反応を磁気的に撹拌し、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィーによってモニターした。カラムクロマトグラフィーは、４０〜６３μｍ粒径のシリカゲル上で行った。収率は分光学的に純粋な化合物について報告する。
機器
【０１５４】
融点をＥｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ＭＥＬ−ＴＥＭＰ（登録商標）１１０１Ｄ融点装置で記録し、補正しなかった。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ６００分光計（６００ＭＨｚ）で記録した。化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するδ値で示す。結合定数ＪはＨｚで示す。内部標準は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルについてＣＤＣｌ３（δＨ＝７．２４）、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルについてＣＤＣｌ３（δＣ＝７７．０）であった。分裂パターンは、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重項）、ｂｒ（幅広い）およびｄｄ（二重線の二重線）として報告する。高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ分光計で記録した。吸光度スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ３５紫外可視分光光度計で記録した。蛍光スペクトルは、ＡＭＩＮＣＯ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２ルミネセンス分光計で記録した。全ての写真は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡で収集した。
【０１５５】
アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ａｚ１、Ａｚ２、Ａｚ３、Ａｚ４、Ａｚ５、Ａｚ６、Ａｚ７およびＡｚ８の合成のための好都合な経路を、本明細書において開示する。調製は、重要なニトロ中間体１、２、３、４、５、６、７および８を使用し、これらは対応するアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物に効果的に変換された。アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ａｚ１、Ａｚ２、Ａｚ３、Ａｚ４、Ａｚ５、Ａｚ６、Ａｚ７およびＡｚ８の構造を図１に示す。合成経路における試薬およびステップは下記の通りである。
【０１５６】
ステップ１．置換ニトロベンズアルデヒドとの２，４−ジメチル−３−エチルピロールの酸によって触媒される縮合、それに続く穏やかな条件中でのＤＤＱによる酸化によって、ジピロメテン中間体を得て、これをＢＦ３・ＯＥｔ２で処理し、対応するニトロ−ＢＯＤＩＰＹ１〜８を得た。
【化２４】
2020002139.tif 000041
ステップ２．従前に報告された方法によって、アミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ１〜Ａｍ８を、１０％Ｐｄ／Ｃの存在下でヒドラジンによるニトロ−ＢＯＤＩＰＹの還元によって妥当な収率で得た。穏やかな条件におけるトリフリルアジド（ＴｆＮ３）による処理によって、アミノ−ＢＯＤＩＰＹを、標的アジド−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｚ１〜Ａｚ８に変換した。（Li,L.；Han,  J.；Nguyen, B.；Burgess,  K.  J  Org.  Chem.、２００８年、７３巻、１９６３〜１９７０頁。）
【化２５】
2020002139.tif 000042
【０１５７】
アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ａｚ９、Ａｚ１０およびＡｚ１１の合成のための好都合な
経路を、本明細書において開示する。調製は、重要なニトロ中間体９、１０および１１を使用し、これらは対応するアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物に効果的に変換された。アジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ａｚ９、Ａｚ１０およびＡｚ１１の構造を図３に示す。合成経路における試薬およびステップは、下記の通りである。
【０１５８】
ステップ１．２−メトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドとの２，４−ジメチル−３−置換ピロールの酸によって触媒される縮合、それに続く穏やかな条件中でのＤＤＱによる酸化によって、ジピロメテン中間体を得て、これをＢＦ３・ＯＥｔ２で処理し、対応するニトロ−ＢＯＤＩＰＹ９〜１１を得た。
【化２６】
2020002139.tif 000043
ステップ２．従前に報告された方法によって、アミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ９〜Ａｍ１１を、１０％Ｐｄ／Ｃの存在下でのヒドラジンによるニトロ−ＢＯＤＩＰＹの還元によって妥当な収率で得た。穏やかな条件におけるトリフリルアジド（ＴｆＮ３）による処理によって、アミノ−ＢＯＤＩＰＹを、標的アジド−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｚ９〜Ａｚ１１に変換した。（Li,  L.；Han,  J.；Nguyen,  B.；Burgess,  K.、J  Org.  Chem.、２００８年、７３巻、１９６３〜１９７０頁。）
【化２７】
2020002139.tif 000044
（実施例２）
トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物の合成
【０１５９】
トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ｔ２、Ｔ９、Ｔ１０およびＴ１１の合成のための好都合な経路を、本明細書において開示する。トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ｔ２、Ｔ９、Ｔ１０およびＴ１１の構造を図３に示す。合成経路における試薬およびステップは、下記の通りである。
【０１６０】
トリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ｔ２、Ｔ９、Ｔ１０およびＴ１１を、トリプロパルギルアミンおよびエチルアジドアセテートから調製したＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、トリス−トリアゾールリガンドを含有するＣｕＡＡＣ条件において、４−ペンチン−１−オールによるアジド−ＢＯＤＩＰＹ化合物Ａｚ２、Ａｚ９、Ａｚ１０およびＡｚ１１の１，３−双極子環化付加によって妥当な収率で得た。（Zhou,  Z.；Fahrni,  C.J.
、  J.  Am.  Chem.  Soc.、２００４年、１２６巻、８８６２〜８８６３頁）。
【化２８】
2020002139.tif 000045
ニトロ−ＢＯＤＩＰＹの一般合成手順および生成物特性決定。
【０１６１】
置換ニトロベンズアルデヒド（３ｍｍｏｌ）および３−置換２，４−ジメチルピロール（６ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下で無水ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（１滴）を加え、このように得られた溶液を室温にて一晩撹拌した。ＴＬＣ分析によって示されるように１２〜１８時間の反応体の完全な消費の後、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ、３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌し、次いで、ブライン（４００ｍＬ）で洗浄し、有機画分をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗化合物を短いアルミナオキシドカラム（ＣＨ２Ｃｌ２）上で精製し、ジピロメテンの茶色の固体を得た。粗ジピロメテン生成物およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（４０ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１５０ｍＬ）に溶解し、室温にて１０分間撹拌した。ＢＦ３・ＯＥｔ２（５５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、撹拌を１時間続けた。反応混合物を水（３×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンまたはＥｔＯＡｃ／ヘキサンによる溶出によるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、対応するニトロ−ＢＯＤＩＰＹ生成物１〜１１を得た。２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（３−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１）。
【化２９】
2020002139.tif 000046
【０１６２】
化合物１は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび３−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて１５％収率で調製した。Ｃ２３Ｈ２６ＢＦ２Ｎ３Ｏ２、暗赤色の固体、ｍｐ２４６〜２４８℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．３８；
【化３０】
2020002139.tif 000047
ＨＲＭＳ、Ｃ２３Ｈ２７ＢＦ２Ｎ３Ｏ２：計算値４２６．２１６４、実測値：ｍ／ｚ４２６．２１６７［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（２）
。
【化３１】
2020002139.tif 000048
【０１６３】
化合物２は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２−メトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて５１％収率で調製した。Ｃ２４Ｈ２８ＢＦ２Ｎ３Ｏ３、暗赤色の固体、ｍｐ２１０〜２１２℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．３３；
【化３２−１】
2020002139.tif 000049
【化３２−２】
2020002139.tif 000050
ＨＲＭＳ、Ｃ２４Ｈ２９ＢＦ２Ｎ３Ｏ３：計算値４５６．２２７０、実測値：ｍ／ｚ４５６．２２６７［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（３，４−ジメトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（３）。
【化３３】
2020002139.tif 000051
【０１６４】
化合物３は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび３，４−ジメトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて４５％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ３Ｏ４、暗赤色の固体、ｍｐ１９０〜１９２℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）Ｒｆ＝０．５；
【化３４】
2020002139.tif 000052
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ３Ｏ４：計算値４８６．２３７６、実測値：ｍ／ｚ４８６．２３７７［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（２，３−ジメトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
（４）。
【化３５】
2020002139.tif 000053
【０１６５】
化合物４は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２，３−ジメトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて４１％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ３Ｏ４、暗赤色の固体、ｍｐ１８５〜１８７℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．３５；
【化３６】
2020002139.tif 000054
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ３Ｏ４：計算値４８６．２３７６、実測値：ｍ／ｚ４８６．２３７８［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（２，５−ジメトキシ−３−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（５）。
【化３７】
2020002139.tif 000055
【０１６６】
化合物５は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２，５−ジメトキシ−３−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて３６％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ３Ｏ４、暗赤色の固体、ｍｐ１８１〜１８３℃；ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．５；
【化３８】
2020002139.tif 000056
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ３Ｏ４：計算値４８６．２３７６、実測値：ｍ／ｚ４８６．２３７８［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（２−モルホリノ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（６）。
【化３９】
2020002139.tif 000057
化合物６は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２−モルホリノ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて３８％収率で調製した。Ｃ２７Ｈ３３ＢＦ２Ｎ４Ｏ３、暗赤色の固体、ｍｐ１７９〜１８１℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．２５；
【化４０】
2020002139.tif 000058
ＨＲＭＳ、Ｃ２７Ｈ３４ＢＦ２Ｎ４Ｏ３：計算値５１１．２６９２、実測値：ｍ／ｚ５１１．２６９５［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−［２−（４−メチルピペラジノ）−５−ニトロフェニル］−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（７）。
【化４１】
2020002139.tif 000059
【０１６７】
化合物７は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２−（４−メチルピペラジノ）−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて４８％収率で調製した。Ｃ２８Ｈ３６ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、暗赤色の固体、ｍｐ１７５〜１７７℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．２５；
【化４２】
2020002139.tif 000060
ＨＲＭＳ、Ｃ２８Ｈ３７ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値５２４．３００８、実測値：ｍ／ｚ５２４．３０１０［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（２−ピペリジノ−５−ニトロフェニル−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（８）。
【化４３】
2020002139.tif 000061
化合物８は、２，４−ジメチル−３−エチルピロールおよび２−ピペリジノ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて４０％収率で調製した。Ｃ２８Ｈ３５ＢＦ２Ｎ４Ｏ２、暗赤色の固体、ｍｐ２０１〜２０３℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．３８；
【化４４】
2020002139.tif 000062
ＨＲＭＳ、Ｃ２８Ｈ３６ＢＦ２Ｎ４Ｏ２：計算値５０９．２８９９、実測値：ｍ／ｚ５０９．２９０１［Ｍ＋Ｈ］＋。
４，４−ジフルオロ−８−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（９）。
【化４５】
2020002139.tif 000063
化合物９は、２，４−ジメチルピロールおよび２−メトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて３９％収率で調製した。Ｃ２０Ｈ２０ＢＦ２Ｎ３Ｏ３、暗赤色の固体、ｍｐ１７８〜１８０℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．３１；
【化４６】
2020002139.tif 000064
ＨＲＭＳ、Ｃ２０Ｈ２１ＢＦ２Ｎ３Ｏ３：計算値４００．１６４４、実測値：ｍ／ｚ４００．１６４０［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエトキシカルボニル−４，４−ジフルオロ−８−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イン
ダセン（１０）。
【化４７】
2020002139.tif 000065
化合物１０は、２，４−ジメチル（dimethy）−４−エトキシカルボニルピロールおよ
び２−メトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて６０％収率で調製した。Ｃ２６Ｈ２８ＢＦ２Ｎ３Ｏ７、橙赤色の固体、ｍｐ１８１〜１８３℃；ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、７：３）Ｒｆ＝０．１８；
【化４８】
2020002139.tif 000066
ＨＲＭＳ、Ｃ２６Ｈ２９ＢＦ２Ｎ３Ｏ７：計算値５４４．２０６７、実測値：ｍ／ｚ５４４．２０６１［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジシアノ−４，４−ジフルオロ−８−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１１）。
【化４９】
2020002139.tif 000067
【０１６８】
化合物１１は、３−シアノ−２，４−ジメチルピロールＳ７および２−メトキシ−５−ニトロベンズアルデヒドから３つのステップについて１３％収率で調製した。Ｃ２２Ｈ１８ＢＦ２Ｎ５Ｏ３、赤色の固体、ｍｐ２７８〜２８０℃；ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、７：３）Ｒｆ＝０．１８；
【化５０】
2020002139.tif 000068
ＨＲＭＳ、Ｃ２２Ｈ１９ＢＦ２Ｎ５Ｏ３：計算値４５０．１５４９、実測値：ｍ／ｚ４５０．１５４６［Ｍ＋Ｈ］＋。
アジド−ＢＯＤＩＰＹ（Ａｚ１〜Ａｚ１１）の一般合成手順および生成物特性決定。
【０１６９】
ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）の混合溶媒中のニトロ−ＢＯＤＩＰＹ
１〜１１（０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、Ａｒで１０分間パージした。ヒドラジン一水和物（０．３ｍＬ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（６０ｍｇ、０．１当量）を加えた。反応混合物を３０分間加熱還流し、次いで、Ｐｄ／Ｃを真空濾過によって除去した。溶媒の蒸発後、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、アミノ−ＢＯＤＩＰＹの赤色の固体を得た。アミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ１〜Ａｍ１１の粗生成物を、５０ｍＬの丸底フラスコ中でＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、１．５ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４の溶液（０．１ｍＬの水中２５μｍｏｌ）を、フラスコに加えた。新たに調製したトリフリルアジド（ＴｆＮ３）の溶液（３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中１．５ｍｍｏｌ）を次いで加え、メタノール（０．５ｍＬ）を加えることによって混合物を均質なものとした。室温にて３時間撹拌した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンまたはＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２による溶出によるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、対応するアジド−ＢＯＤＩＰＹ生成物Ａｚ１〜Ａｚ１１を得た。
８−（５−アミノ−２−メトキシフェニル）−２，６−ジエトキシカルボニル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｍ１０）。
【化５１】
2020002139.tif 000069
【０１７０】
化合物Ａｍ１０は、化合物１０から８３％収率で調製した。Ｃ２６Ｈ３０ＢＦ２Ｎ３Ｏ５、暗赤色の固体、ｍｐ１８８〜１９０℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．２３；
【化５２】
2020002139.tif 000070
ＨＲＭＳ、Ｃ２６Ｈ３１ＢＦ２Ｎ３Ｏ５：計算値５１４．２３２５、実測値：ｍ／ｚ５１４．２３２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（３−アジドフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ１）。
【化５３】
2020002139.tif 000071
【０１７１】
化合物Ａｚ１は、化合物１から２つのステップについて４７％収率で調製した。Ｃ２３
Ｈ２６ＢＦ２Ｎ５、暗赤色の固体、ｍｐ１５１〜１５３℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．３８；
【化５４】
2020002139.tif 000072
ＨＲＭＳ、Ｃ２３Ｈ２７ＢＦ２Ｎ５：計算値４２２．２３２８、実測値：ｍ／ｚ４２２．２３３０［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−メトキシフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ２）。
【化５５】
2020002139.tif 000073
【０１７２】
化合物Ａｚ２は、化合物２から２つのステップについて５９％収率で調製した。Ｃ２４Ｈ２８ＢＦ２Ｎ５Ｏ、暗赤色の固体、ｍｐ１６３〜１６５℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．５２；
【化５６】
2020002139.tif 000074
ＨＲＭＳ、Ｃ２４Ｈ２９ＢＦ２Ｎ５Ｏ：計算値４５２．２４３３、実測値：ｍ／ｚ４５２．２４２９［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（３−アジド−４．５−ジメトキシフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ３）。
【化５７】
2020002139.tif 000075
【０１７３】
化合物Ａｚ３は、化合物３から２つのステップについて５１％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、橙赤色の固体、ｍｐ１５６〜１５８℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．４１；
【化５８】
2020002139.tif 000076
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値４８２．２５３９、実測値：ｍ／ｚ４８２．２５４２［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２．３−ジメトキシフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ４）。
【化５９】
2020002139.tif 000077
【０１７４】
化合物Ａｚ４は、化合物４から２つのステップについて５４％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、暗赤色の固体、ｍｐ１５８〜１６０℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．４８；
【化６０】
2020002139.tif 000078
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値４８２．２５３９、実測値：ｍ／ｚ４８２．２５４１［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（３−アジド−２，５−ジメトキシフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ５）。
【化６１】
2020002139.tif 000079
【０１７５】
化合物Ａｚ５は、化合物５から２つのステップについて５４％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ３０ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、暗赤色の固体、ｍｐ１５０〜１５２℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．４５；
【化６２】
2020002139.tif 000080
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ３１ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値４８２．２５３９、実測値：ｍ／ｚ４８２．２５４３［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−モルホリノフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ６）。
【化６３−１】
2020002139.tif 000081
【０１７６】
化合物Ａｚ６は、化合物６から２つのステップについて６２％収率で調製した。Ｃ２７Ｈ３３ＢＦ２Ｎ６Ｏ、暗赤色の油；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．４；
【化６３−２】
2020002139.tif 000082
ＨＲＭＳ、Ｃ２７Ｈ３４ＢＦ２Ｎ６Ｏ：計算値５０７．２８５５、実測値：ｍ／ｚ５０７．２８５８［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−［５−アジド−２−（４−メチルピペラジノ）フェニル］−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ７）。
【化６４】
2020002139.tif 000083
【０１７７】
化合物Ａｚ７は、化合物７から２つのステップについて７２％収率で調製した。Ｃ２８Ｈ３６ＢＦ２Ｎ７、暗赤色の泡；ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：１９）Ｒｆ＝０．３３；
【化６５】
2020002139.tif 000084
ＨＲＭＳ、Ｃ２８Ｈ３７ＢＦ２Ｎ７：計算値５２０．３１７２、実測値：ｍ／ｚ５２０．３１７７［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−ピペリジノフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ８）。
【化６６】
2020002139.tif 000085
【０１７８】
化合物Ａｚ８は、化合物８から２つのステップについて６９％収率で調製した。Ｃ２８Ｈ３５ＢＦ２Ｎ６、暗赤色の油；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．６７；
【化６７】
2020002139.tif 000086
ＨＲＭＳ、Ｃ２８Ｈ３６ＢＦ２Ｎ６：計算値５０５．３０６３、実測値：ｍ／ｚ５０５．３０６６［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−メトキシフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ９）。
【化６８】
2020002139.tif 000087
【０１７９】
化合物Ａｚ９は、化合物９から２つのステップについて７１％収率で調製した。Ｃ２０Ｈ２０ＢＦ２Ｎ５Ｏ、暗赤色の固体、ｍｐ１５２〜１５４℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．５１；
【化６９】
2020002139.tif 000088
ＨＲＭＳ、Ｃ２０Ｈ２１ＢＦ２Ｎ５Ｏ：計算値３９６．１８０７、実測値：ｍ／ｚ３９６．１８０５［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−メトキシフェニル）−２，６−ジエトキシカルボニル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ１０）。
【化７０】
2020002139.tif 000089
【０１８０】
化合物Ａｚ１０は、化合物Ａｍ１０から５８％収率で調製した。Ｃ２６Ｈ２８ＢＦ２Ｎ５Ｏ５、赤色の固体、ｍｐ８６〜８８℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．４１；
【化７１】
2020002139.tif 000090
ＨＲＭＳ、Ｃ２６Ｈ２９ＢＦ２Ｎ５Ｏ５：計算値５４０．２２３０、実測値：ｍ／ｚ５４０．２２２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
８−（５−アジド−２−メトキシフェニル）−２，６−ジシアノ−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ａｚ１１）。
【化７２】
2020002139.tif 000091
【０１８１】
化合物Ａｚ１１は、化合物１１から２つのステップについて６１％収率で調製した。Ｃ２２Ｈ１８ＢＦ２Ｎ７Ｏ、赤色の固体、ｍｐ１４１〜１４３℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、７：３）Ｒｆ＝０．３１；
【化７３】
2020002139.tif 000092
ＨＲＭＳ、Ｃ２２Ｈ１９ＢＦ２Ｎ７Ｏ：計算値４４６．１７１２、実測値：ｍ／ｚ４４６．１７１４［Ｍ＋Ｈ］＋。
４−ペンチン−１−オールとのアジド−ＢＯＤＩＰＹの銅（Ｉ）によって触媒されるアジド−アルキン環化付加反応のための手順。
【０１８２】
アジド−ＢＯＤＩＰＹ（Ａｚ２またはＡｚ９〜Ａｚ１１、０．１ｍｍｏｌ）および４−ペンチン−１−オール（０．１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。アスコルビン酸ナトリウムの新たに調製した１Ｍ溶液（０．２ｍＬの水中０．２ｍｍｏｌ）を加え、それに続いて銅（ＩＩ）五水和物（０．１ｍＬの水中０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。メタノール（０．５ｍＬ）を加えることによって混合物を均質なものとし、次いで、室温にて１２時間撹拌した。ＴＬＣモニタリングは、１２時間で反応体の完全な消費を示した。溶媒の蒸発の後、残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンによる溶出によるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、対応するトリアゾール生成物Ｔ２およびＴ９〜Ｔ１１を得た。
２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−｛３−［４−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］−２−メトキシフェニル｝−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ｔ２）。
【化７４】
2020002139.tif 000093
【０１８３】
化合物Ｔ２は、化合物Ａｚ２から７１％収率で調製した。Ｃ２９Ｈ３６ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、赤色の固体、ｍｐ１８０〜１８２℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）Ｒｆ＝０．１５；
【化７５−１】
2020002139.tif 000094
【化７５−２】
2020002139.tif 000095
ＨＲＭＳ、Ｃ２９Ｈ３７ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値５３６．３００８、実測値：ｍ／ｚ５３６．３００５［Ｍ＋Ｈ］＋。
４，４−ジフルオロ−８−｛３−［４−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］−２−メトキシフェニル｝−１，３，５，７−テトラメチル
−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ｔ９）。
【化７６】
2020002139.tif 000096
【０１８４】
化合物Ｔ９は、化合物Ａｚ９から７９％収率で調製した。Ｃ２５Ｈ２８ＢＦ２Ｎ５Ｏ２、赤色の固体、ｍｐ１６５〜１６７℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）Ｒｆ＝０．２３；
【化７７】
2020002139.tif 000097
ＨＲＭＳ、Ｃ２５Ｈ２９ＢＦ２Ｎ５Ｏ２：計算値４８０．２３８２、実測値：ｍ／ｚ４８０．２３７９［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジエトキシカルボニル−４，４−ジフルオロ−８−｛３−［４−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］−２−メトキシフェニル｝−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ｔ１０）。
【化７８】
2020002139.tif 000098
【０１８５】
化合物Ｔ１０は、化合物Ａｚ１０から９０％収率で調製した。Ｃ３１Ｈ３６ＢＦ２Ｎ５Ｏ６、赤色の固体、ｍｐ１５７〜１５９℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、４：１）Ｒｆ＝０．３２；
【化７９−１】
2020002139.tif 000099
【化７９−２】
2020002139.tif 000100
ＨＲＭＳ、Ｃ３１Ｈ３７ＢＦ２Ｎ５Ｏ６：計算値６２４．２８０５、実測値：ｍ／ｚ６２４．２８０１［Ｍ＋Ｈ］＋。
２，６−ジシアノ−４，４−ジフルオロ−８−｛３−［４−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Ｔ１１）。
【化８０】
2020002139.tif 000101
【０１８６】
化合物Ｔ１１は、化合物Ａｚ１１から７８％収率で調製した。Ｃ２７Ｈ２６ＢＦ２Ｎ７Ｏ２、赤色の固体、ｍｐ１７５〜１７７℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）Ｒｆ＝０．４２；
【化８１】
2020002139.tif 000102
ＨＲＭＳ、Ｃ２７Ｈ２７ＢＦ２Ｎ７Ｏ２：計算値５３０．２２８７、実測値：ｍ／ｚ５３０．２２８９［Ｍ＋Ｈ］＋。
（実施例３）
生体分子の検出およびイメージング
分光学的測定
【０１８７】
アミノ−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｍ１０、アジド−ＢＯＤＩＰＹ  Ａｚ２およびＡｚ９〜Ａｚ１１、ならびに対応するトリアゾリル−ＢＯＤＩＰＹ  Ｔ２およびＴ９〜Ｔ１１の全ての分光学的測定は、１ｃｍのパス長を有するキュベットを使用して２５±０．１℃にてエタノール中で行った。測定前に、全ての溶液をアルゴン下で数分間脱気した。各実験のために、スリット幅は、励起および発光の両方について２．０ｎｍであった。０．０７〜０．７の吸光度範囲内で吸光度スペクトルを測定した（ｌ＝１０ｃｍ）。蛍光量子収率測定を、蛍光光度計およびＵＶ−Ｖｉｓ機器で行った。相対的量子効率は、補正した発光スペクトル下面積を比較することによって得た。報告した量子収率は、下記の等式によって４つのポイントの平均として計算した。
φ試料＝φ標準（Ａ標準／Ａ試料）（Ｆ試料／Ｆ標準）（ｎ試料／ｎ標準）２
式中、「φ」は、量子収率であり、「Ａ」は、励起頻度における吸光度であり、「Ｆ」は、発光曲線下積分面積であり、「ｎ」は、使用した溶媒の屈折率である。０．１ＭのＮａＯＨ水溶液中のフルオレセイン（φｆ＝０．８５）、およびエタノール中のローダミン６Ｇ（φｆ＝０．９５）は、蛍光標準である。（Parker,  C.  A.；Rees,  W.  T.  Analyst、１９６０年、８５巻、５８７〜６００頁；Kubin,  R.  F.；Fletcher,  A.  N.  J.  
Luminescence、１９８２年、２７巻、４５５〜４６２頁。）
マイクロタイタープレートにおけるＣｕＡＡＣ反応の蛍光スクリーニングの手順。
【０１８８】
９６ウェルブラックボトムマイクロタイタープレートを実験のために使用し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５分光計を使用して蛍光測定を行った。上の列において、各ウェルは、ＥｔＯＨ／水（１：１）中の２００μＬのアジド−ＢＯＤＩＰＹ（Ａｚ１〜Ａｚ８）（１５μＭ）を含有した。下の列において、各ウェルにおける全体的な容量は、アジド−ＢＯＤＩＰＹ（Ａｚ１〜Ａｚ８）（１５μＭ）、４−ペンチン−１−オール（７５μＭ）、ＣｕＳＯ４（１５０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（３００μＭ）およびトリス−トリアゾールリガンド（１５０μＭ）のＥｔＯＨ／水（１：１）溶液を含有して２００μＬであった。ＴＬＣまたはＭＳ分析によってモニターするように、プレートを室温にて６時間インキュベートし、次いで、蛍光測定（λｅｘ＝４８８ｎｍ）をｉｎ  ｓｉｔｕで行った。蛍光性または非蛍光性トリアゾール化合物の形成は、ＵＶランプによる３６５ｎｍでの照射によって識別することができた（図２）。
ＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）によるタンパク質標識化
【０１８９】
タンパク質標識化実験のために、９０：１０のｐＨ７．４ＰＢＳ／ＤＭＳＯ中の、６０μｇ／ｍＬのアルキニル官能化されたＢＳＡおよび無修飾のＢＳＡを、１００μＭのトリス−トリアゾールリガンド、１ｍＭのＣｕＳＯ４、２ｍＭの新たに調製したアスコルビン酸ナトリウム、および０〜１００μＭのＡｚ１０と共に室温にて暗中１時間インキュベートした。各混合物（３０μＬ）を、５％β−メルカプトエタノールを含有する１０μＬ（４×）のＳＤＳ添加色素と混合し、４０μＬのそれぞれを、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に徐々に添加した。ゲルを、１００Ｖにて２．５時間流した。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（λｅｘ＝４８８ｎｍ；λｅｍ＝５２６ｎｍ）を使用して画像化し、クマシーブルーで染色した（図５）。
細胞中の蛍光標識化の顕微鏡分析
【０１９０】
ＣＬ１−５細胞をチャンバースライド上に播種し（ウェル毎に１×１０４個の細胞／１ｍＬ）、培養培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で１００μＭのそれぞれのアルキニル−糖または対照と共に３日間インキュベートした。アルキニル−糖は、過アセチル化アルキニル−Ｎ−アセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ）、過アセチル化アルキニル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｌ）および過アセチル化アルキニル−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｌ）を含む。対照糖は、過アセチル化Ｎ−アセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ）、過アセチル化Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｃ）および過アセチル化Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｃ）を含む。
【０１９１】
糖類似体処理した細胞へのＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）の標識化を検出するために、糖処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定した、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温にて２０分間透過性とし、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミンで室温にて３０分間ブロックした。細胞中の蛍光標識されたアルキンタグ付きグリコシルコンジュゲートを観察するために、細胞を、５０％エタノールを有するＰＢＳ緩衝液中の０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔ（Ａｚ１０）、１００μＭのトリス−トリアゾールリガンド、１ｍＭのＣｕＳＯ４、および２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと共に室温にて１時間インキュベートした。細胞の蛍光画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することによって４９６ｎｍの励起にて取得した。アルキニル−グリカンの場所を同定するために、プローブ標識した細胞を、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてゴルジのためのＣｙ３コンジュゲートした抗ウサギ、および細胞核のためのヘキ
ストでさらに染色した（図６）。
細胞抽出物中のアルキンタグ付きシアリル糖タンパク質の検出および同定
【０１９２】
１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｃまたはＡｃ４ＭａｎＮＡｌで３日間処理したＣＬ１−５細胞から収集した細胞抽出物（２０μｇ）を、示した濃度のＡｚ１０、１００μＭのトリス−トリアゾールリガンド、Ｓ３１ｍＭのＣｕＳＯ４、および２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと共に室温にて１時間インキュベートし、ＣｕＡＡＣ反応が進行した。反応した抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分離し、蛍光シグナルをＴｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（λｅｘ＝４８８ｎｍ；λｅｍ＝５２６ｎｍ）によって検出した。クマシーブルーで染色されたタンパク質バンドは、添加対照を表した（図７）。
【０１９３】
蛍光シグナルで標識されたタンパク質を含有する示した１２バンドを切除し、小さな断片に切断した。ゲル断片を５０ｍＭの１：１（ｖ／ｖ）のＮＨ４ＨＣＯ３／ＣＨ３ＣＮで脱染し、次いで、５６℃にて２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）で４５分間再水和した。過剰なＤＴＴを除去し、アルキル化のために２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を室温にて暗中３０分間加えた。過剰なＩＡＡを除去し、ゲルを５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３／ＣＨ３ＣＮ、１：１（ｖ／ｖ）で２回洗浄し、真空遠心分離を使用して乾燥した後にＣＨ３ＣＮで乾燥させた。新たに調製したトリプシン溶液（２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中５ｎｇ／μＬ、４０μＬ）を各ゲル断片に加え、ゲル断片を３７℃に１８時間温めた。消化されたペプチドを、５０％ＣＨ３ＣＮ（５０μＬ）を含有する１％トリフルオロ酢酸（trifluoracetic  acid）（ＴＦＡ）の水溶液で超音波処理下にて１０分間２回抽出した。合わせた抽出物および洗浄剤を、３時間の真空遠心分離を使用して濃縮し、揮発性物質を除去した。消化されたペプチドを分析し、表２において示すようにハイブリッドリニアイオントラップ四重極フーリエ変換（ＬＴＱ−ＦＴ）質量分析計で同定した。
【表２−１】
2020002139.tif 000103
【表２−２】
2020002139.tif 000104
細胞におけるデュアル蛍光標識化の顕微鏡分析
【０１９４】
ＣＬ１−５細胞をチャンバースライド上に播種し（ウェル毎に２．５×１０４個の細胞／０．５ｍＬ）、培養培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で３日間、１００μＭのアルキニル−糖（過アセチル化アルキニル−Ｎ−アセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ）もしくはアジド−糖（過アセチル化アジド−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）のいずれか、もしくは両方と共に、または陰性対照として糖を伴わずにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ中の１００μＭのｃｏｕｍＯＣＴと共に３７℃にて３０分間インキュベートした。１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳによる３回の洗浄、それに続くＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドによる室温にて２０分間の固定の後、細胞を、５０％エタノールを有するＰＢＳ中の０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔ
（Ａｚ１０）、１００μＭのリガンド、１ｍＭのＣｕＳＯ４、および２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと共に室温にて１時間インキュベートし、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤ、Ｌｅｉｃａ）を使用して細胞の蛍光画像を得た（図９）。
（実施例４）
シクロオクチン官能化された蛍光プローブ１０１の合成：
【０１９５】
スキーム１００は、出発材料として１−ベンゾスベロンを使用した化合物１０１の合成を示す。従前に報告された手順に従って、１２１−ベンゾスベロンを、８位において位置選択的ニトロ化に供した。次いで、ニトロ基を還元し、それに続いて酸条件下でのジアゾ化およびヒドロキシル化を行い、アルコール１０４を得た。ベンジルエーテルとしてヒドロキシル基の保護の後、環状ケトン１０５は、ＢＦ３・ＯＥｔ２の存在下でＴＭＳ−ジアゾメタンによる処理によって環拡大を受け、シクロオクタノン生成物１０６を７３％収率で得た。ＮａＢＨ４によるカルボニル基の還元、それに続くシリル化によって、シリルエーテル１０７を９６％収率で得た。１０７におけるベンジル基を水素化によって除去し、フェノール中間体をＥｔ３ＮおよびＭｇＣｌ２の存在下で過剰なパラホルムアルデヒドで処理し、サリチルアルデヒド１０８が形成された。新たに調製したケテニリデントリフェニルホスホラン（ketenylidenetriphenylphosphosphorane）による１０８の処理によって、１０９におけるクマリンスカフォールドを構築した。脱シリル化および酸化の後、ケトン１１０を、７８％収率で得た。化合物１１０におけるカルボニル基を、エノールトリフレートに変換し、これをそれに続いて強塩基ＮａＨＭＤＳで処理し、脱離反応を生じさせ、ｃｏｕｍＯＣＴプローブ１０１を得た。
【０１９６】
スキーム１００．ＳＰＡＡＣをベースとする蛍光形成プローブ１０１、ならびに対応するトリアゾール１１１および１１２の合成。
【化８２】
2020002139.tif 000105
【０１９７】
試薬および条件：（ａ）濃Ｈ２ＳＯ４、ＫＮＯ３、０℃、１．５時間、７２％；（ｂ）Ｓｎ、濃ＨＣｌ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、還流、５０分、８２％；（ｃ）１０％Ｈ２ＳＯ４水溶液、ＮａＮＯ２、０℃から室温、７２時間、７６％；（ｄ）ＢｎＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、室温、２４時間、９８％；（ｅ）ＴＭＳＣＨＮ２、ＢＦ３・ＯＥｔ２、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、１２時間、７３％；（ｆ）ＮａＢＨ４、ＣＨ３ＯＨ、０℃、１時間；（ｇ）ＴＩＰＳＯＴｆ、２，６−ルチジン、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、１時間、２つのステップについて９
６％；（ｈ）Ｈ２、Ｐｄ／Ｃ、ＣＨ３ＯＨ、ＥｔＯＡｃ、１時間；（ｉ）パラホルムアルデヒド、ＭｇＣｌ２、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ３ＣＮ、還流、１２時間、２つのステップについて８７％；（ｊ）Ｐｈ３Ｐ＝Ｃ＝Ｃ＝Ｏ、トルエン、９０℃、１．５時間、８３％；（ｋ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、０℃から室温、１時間；（ｌ）（ＣＯＣｌ）２、ＤＭＳＯ、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃から室温、１時間、２つのステップについて７８％；（ｍ）ＮａＨＭＤＳ、Ｔｆ２ＮＰｈ、−７８℃から室温、２時間、４４％；（ｎ）ＢｎＮ３（１．５当量）、ＣＨ３ＣＮ、室温、２時間、９５％；（ｏ）Ｎ−アジドアセチルマンノサミン（１．５当量）、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、室温、２時間、９２％。３−ニトロ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾシクロヘプテン−５−オン（Ａ）。
【化８３】
2020002139.tif 000106
【０１９８】
１−ベンゾスベロン（４．０ｇ、２５ｍｍｏｌ）の濃Ｈ２ＳＯ４（２８ｍＬ）溶液を０℃にて冷却し、ＫＮＯ３（２．８ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）の濃Ｈ２ＳＯ４（７．５ｍＬ）溶液を３０分の期間に亘り滴下で添加した。混合物を０℃にてさらに１時間撹拌し、次いで、砕いた氷中に注いだ。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、風乾し、黄色の固体を得た。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）によって精製し、純粋なニトロ生成物Ａ（３．６９ｇ、７２％）を得た。Ｃ１１Ｈ１１ＮＯ３、白色の針状物、ｍｐ９０〜９２℃（文献値、Ｓ２ｍｐ８９〜９０℃）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）Ｒｆ＝０．３１；
【化８４−１】
2020002139.tif 000107
【化８４−２】
2020002139.tif 000108
ＨＲＭＳ、Ｃ１１Ｈ１２ＮＯ３：計算値２０６．０８１２、実測値：ｍ／ｚ２０６．０８１４［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−アミノ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾシクロヘプテン−５−オン（Ｂ）。
【化８５】
2020002139.tif 000109
【０１９９】
濃ＨＣｌ（４５ｍＬ）およびエタノール（２５ｍＬ）中のニトロ化合物Ａ（２．０５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＳｎ（８．３１ｇ、７０ｍｍｏｌ）の混合物を、５０分間加熱還流させた。混合物を室温に冷却し、３０％ＮａＯＨ水溶液で塩基性化した。混合物をセライトのパッドを通して濾過し、エタノールで洗浄した。濾液をＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、分析的に純粋なアミノ生成物Ｂ（１．４４ｇ、８２％）を得た。Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ、黄色がかった固体、ｍｐ１０２〜１０４℃（文献値、Ｓ２ｍｐ１０３〜１０５℃）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．２９；
【化８６】
2020002139.tif 000110
ＨＲＭＳ、Ｃ１１Ｈ１４ＮＯ：計算値１７６．１０７０、実測値：ｍ／ｚ１７６．１０６９［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾシクロヘプテン−５−オン（１０４）。
【化８７】
2020002139.tif 000111
【０２００】
Ｈ２ＳＯ４（４０ｍＬの１０％水溶液）中のアミノ化合物Ｂ（１．４５ｇ、８．３ｍｍｏｌ）の冷たい（０℃）溶液を、ＮａＮＯ２（６８７ｍｇ、９．９６ｍｍｏｌ）の水（３ｍＬ）中水溶液に注意深く加えた。反応混合物を０℃にて３０分間撹拌し、次いで、スルファミン酸を加えて、過剰な亜硝酸を破壊した。懸濁液を濾過し、濾液をＨ２ＳＯ４（１００ｍＬ）およびトルエン（５０ｍＬ）の１０％水溶液中に注いだ。混合物を室温にて３日間撹拌した。次いで、層を分離し、水層をＥｔｏＡｃ（５×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）によって精製し、分析的に純粋なアルコール生成物１０４（１．１１ｇ、７６％）を得た。Ｃ１１Ｈ１２Ｏ２、黄色の固体、ｍｐ９８〜１００℃（文献値、Ｓ３ｍｐ９６〜９９℃）；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．３７；
【化８８】
2020002139.tif 000112
ＨＲＭＳ、Ｃ１１Ｈ１３Ｏ２：計算値１７７．０９１０、実測値：ｍ／ｚ１７７．０９１１［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−ベンジルオキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾシクロヘプテン−５−オン（１０５）。
【化８９】
2020002139.tif 000113
【０２０１】
アルコール化合物１０４（１．２５ｇ、７．１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を、臭化ベンジル（１ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２．１ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を室温にて２４時間激しく撹拌した。混合物を水（２０ｍＬ）中に注ぎ、Ｅｔ２Ｏ（４×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を水（３×２０ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘ
キサン、１：９）によって精製し、純粋なベンジルオキシ生成物１０５（１．８５ｇ、９８％）を得た。Ｃ１８Ｈ１８Ｏ２、淡黄色の油；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．３７；
【化９０】
2020002139.tif 000114
ＨＲＭＳ、Ｃ１８Ｈ１９Ｏ２：計算値２６７．１３８０、実測値：ｍ／ｚ２６７．１３８３［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−ベンジルオキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロオクテン−６−オン（１０６）。
【化９１】
2020002139.tif 000115
【０２０２】
撹拌した（トリメチルシリル）ジアゾメタン（５ｍＬ、ヘキサン中約２Ｍ溶液、１０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を、撹拌した化合物１０５（１．６ｇ、６ｍｍｏｌ）およびＢＦ３・ＯＥｔ２（８２０μＬ、１０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液に１時間の期間に亘り０℃にて滴下で添加した。混合物を０℃にて１２時間撹拌し、次いで、砕いた氷中に注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、オレンジ色の油を得て、これをシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１９）によって精製し、純粋なシクロオクタノン生成物１０６（１．２３ｇ、７３％）を得た。Ｃ１９Ｈ２０Ｏ２、無色の油；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．２９；
【化９２】
2020002139.tif 000116
ＨＲＭＳ、Ｃ１９Ｈ２１Ｏ２：計算値２８１．１５３６、実測値：ｍ／ｚ２８１．１５３９［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−ベンジルオキシ−６−トリイソプロピルシリルオキシ−５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロベンゾシクロオクテン（１０７）。
【化９３】
2020002139.tif 000117
【０２０３】
冷たい（０℃）化合物１０６（４．８ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液を、ＮａＢＨ４（９７０ｍｇ、２５．７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を０℃にて１時間撹拌し、次いで、減圧下濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）に溶解し、１ＭのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、粗アルコール生成物を無色の泡（４．８ｇ）として得て、これをそれ以上精製することなく次のステップで使用した。
【０２０４】
上記で調製したアルコール（４．８ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（８ｍＬ、６８．７ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。トリイソプロピルシリルトリフルオロメタンスルホネート（９．２ｍＬ、３４．２ｍｍｏｌ）を、混合物に３分の期間に亘り滴下で添加した。混合物を室温にて１時間撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、１ＭのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）によって精製し、純粋なシリルエーテル生成物１０７（７．２ｇ、２つのステップについて９６％）を得た。Ｃ２８Ｈ４２Ｏ２Ｓｉ、無色のシロップ；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．５１；
【化９４−１】
2020002139.tif 000118
【化９４−２】
2020002139.tif 000119
ＨＲＭＳ、Ｃ２８Ｈ４３Ｏ２Ｓｉ：計算値４３９．３０３２、実測値：ｍ／ｚ４３９．３０２２［Ｍ＋Ｈ］＋。
３−ヒドロキシ−６−トリイソプロピルシリルオキシ−５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロベンゾシクロオクテン−２−カルボキサルデヒド（１０８）。
【化９５】
2020002139.tif 000120
【０２０５】
化合物１０７（７．１ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）溶液を、水素雰囲気下にてＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）で処理した。１時間撹拌した後、混合物をセライトを通して濾過し、ＥｔＯＡｃですすいだ。濾液を減圧下で濃縮し、薄茶色のシロップ（５．６ｇ）を得て、これを無水アセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解し、無水ＭｇＣｌ２（４．６４ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１３．５ｍＬ、９７．２ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（４．８６ｇ、１６２ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を１２時間加熱還流させた。混合物を室温に冷却し、濃い黄色の懸濁液を１ＭのＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）で酸性化した。溶液をＥｔＯＡｃ（５×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳ
Ｏ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１９）によって精製し、純粋なサリチルアルデヒド生成物１０８を得た（５．３ｇ、２つのステップについて８７％）。Ｃ２２Ｈ３６Ｏ３Ｓｉ、淡黄色のシロップ；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．７１；
【化９６】
2020002139.tif 000121
ＨＲＭＳ、Ｃ２２Ｈ３７Ｏ３Ｓｉ：計算値３７７．２５０６、実測値：ｍ／ｚ３７７．２５１１［Ｍ＋Ｈ］＋
６，７，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロ−１０−トリイソプロピルシリルオキシ−シクロオクタ［ｇ］クロメン−２（２Ｈ）−オン（１０９）
【化９７】
2020002139.tif 000122
【０２０６】
ケテニリデントリフェニルホスホランの調製：撹拌したカルボエトキシメチレントリフェニルホスホラン（１０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２００ｍＬ）溶液を、ナトリウムヘキサメチルジシラジドの溶液（１７．５ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ溶液、３５ｍｍｏｌ）に０℃にて滴下で添加した。添加が完了すると、混合物を６０℃にて２４時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、次いで、エーテル（２００ｍＬ）中に注いだ。沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、風乾し、ケテニリデントリフェニルホスホラン（５．８ｇ、６４％）を淡黄色の固体として得た。
【０２０７】
撹拌したサリチルアルデヒド１０８（４．３ｇ、１１．４２ｍｍｏｌ）の無水トルエン（１００ｍＬ）溶液を、新たに調製したケテニリデントリフェニルホスホラン（５．２ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）に室温にて添加した。混合物を９０℃にて１．５時間加熱し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）によって精製し、純粋なクマリン生成物１０９（３．８ｇ、８３％）を得た。Ｃ２４Ｈ３６Ｏ３Ｓｉ、無色の固体、ｍｐ１０３〜１０５℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）Ｒｆ＝０．２５；
【化９８】
2020002139.tif 000123
ＨＲＭＳ、Ｃ２４Ｈ３７Ｏ３Ｓｉ：計算値４０１．２５０６、実測値：ｍ／ｚ４０１．２５１１［Ｍ＋Ｈ］＋。
６，７，８，９−テトラヒドロ−１１Ｈ−１０−オキソ−シクロオクタ［ｇ］クロメン−２（２Ｈ）−オン（１１０）
【化９９】
2020002139.tif 000124
【０２０８】
冷たい（０℃）化合物１０９（３．０ｇ、７．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を、フッ化テトラブチルアンモニウムの溶液（１０ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液、１０ｍｍｏｌ）で処理した。室温にて１時間撹拌した後、混合物を減圧下で濃縮した。残留油をシリカゲルの短いパッド（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）を通して濾過し、濾液を濃縮し、無色の固体（１．６７ｇ）を得た。
【０２０９】
ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ、２１．２ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を、撹拌した塩化オキサリル（０．８９ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に−７８℃にて窒素雰囲気下にて滴下で添加した。混合物を−７８℃にて３０分間撹拌し、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の上記で調製したアルコール（１．６７ｇ）を滴下で添加した。混合物を−７８℃にてさらに３０分間撹拌し、トリエチルアミン（７．１ｍＬ、５０．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間０℃に温め、次いで、水（４０ｍＬ）中に注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（５×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）によって精製し、所望の生成物１１０を得た（１．４５ｇ、２つのステップについて７８％）。Ｃ１５Ｈ１４Ｏ３、無色の固体、ｍｐ１２７〜１２９℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．３２；
【化１００】
2020002139.tif 000125
ＨＲＭＳ、Ｃ１５Ｈ１５Ｏ３：計算値２４３．１０１６、実測値：ｍ／ｚ２４３．１０１６［Ｍ＋Ｈ］＋。
６，７，８，９−テトラヒドロ−１０，１１−ジデヒドロ−シクロオクタ［ｇ］クロメン−２（２Ｈ）−オン（１０１）
【化１０１】
2020002139.tif 000126
【０２１０】
冷たい（−７８℃）化合物１１０（２４５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮ−フェニルビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）（３９３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を、ナトリウムヘキサメチルジシラジドの溶液（０．５５ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ溶液、１．１ｍｍｏｌ）にシリンジによって５分の期間に亘り加えた。混合物を−７８℃にて１時間撹拌し、別のバッチのナトリウムヘキサメチルジシラジド（０．５５ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ溶液、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃に温め、さらに１時間撹拌し、次いで、メタノール（１ｍＬ）でクエンチした。混合物を減圧下で濃縮し、黄色の
シロップを得て、これをシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）によって精製し、標的生成物１０１（７２ｍｇ、４４％）を得た。Ｃ１５Ｈ１２Ｏ２、薄黄色の固体、ｍｐ９８〜１００℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）Ｒｆ＝０．４２；
【化１０２】
2020002139.tif 000127
ＨＲＭＳ、Ｃ１５Ｈ１３Ｏ２：計算値２２５．０９１０、実測値：ｍ／ｚ２２５．０９１０［Ｍ＋Ｈ］＋。
１０−ベンジル−６，７，８，９−テトラヒドロ−シクロオクタトリアゾロ［５，４−ｇ］クロメン−２（２Ｈ）−オン（１１１）
【化１０３】
2020002139.tif 000128
【０２１１】
化合物１０１（５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）溶液を、ベンジルアジド（４４μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）で処理した。室温にて２時間撹拌した後、混合物を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）によって精製し、所望のトリアゾール生成物１１１（７５ｍｇ、９５％）を得た。Ｃ２２Ｈ１９Ｎ３Ｏ２、無色の固体、ｍｐ６０〜６２℃；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）Ｒｆ＝０．３５；
【化１０４】
2020002139.tif 000129
ＨＲＭＳ、Ｃ２２Ｈ２０Ｎ３Ｏ２：計算値３５８．１５５０、実測値：ｍ／ｚ３５８．１５４８［Ｍ＋Ｈ］＋。
Ｎ−［２−（１１−オキソ−４，６，７，１１−テトラヒドロクロメノ［７’，６’：３，４］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−３（５Ｈ）−イル）］アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−マンノピラノース（１１２）
【化１０５】
2020002139.tif 000130
【０２１２】
化合物１０１（５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）および水（１ｍＬ
）溶液を、Ｎ−アジドアセチルマンノサミン（１４２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）で処理した。室温にて２時間撹拌した後、混合物を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：９）によって精製し、所望のトリアゾール生成物１１２（９８ｍｇ、９２％）を得た。Ｃ２３Ｈ２６Ｎ４Ｏ８、無色の固体、ｍｐ１７０〜１７２℃（摂氏温度）；ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：８）Ｒｆ＝０．２５；
【化１０６−１】
2020002139.tif 000131
【化１０６−２】
2020002139.tif 000132
ＨＲＭＳ、Ｃ２３Ｈ２７Ｎ４Ｏ８：計算値４８７．１８２９、実測値：ｍ／ｚ４８７．１８２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
（実施例５）
モデル基質を使用したシクロオクチンが縮合した蛍光発生プローブの反応スコープおよび反応速度の測定
【０２１３】
ＳＰＡＡＣをベースとする蛍光標識化のための試薬としての化合物１０１の実現可能性を評価するために、ベンジルアジドをモデル基質として使用したその反応スコープおよび反応速度を最初に研究した。アセトニトリル中のベンジルアジドとの１０１のＳＰＡＡＣ反応は、室温にて２時間で完了し、トリアゾール１１１を９５％収率で得た（スキーム１００）。ＣＤ３ＣＮ中の１０１とベンジルアジド（１：１）との反応性を、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける複数の化学シフトの積分によって決定し、２５℃にて０．０１２Ｍ−１ｓ−１の二次速度定数を得た。本発明者らはまた、１０１およびＮ−アジドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｚ）の間の環化付加反応を観察したが、同様に進行して、ＣＤ３ＯＤ−Ｄ２Ｏの溶液（５：１、ｖ／ｖ）中で２５℃にて０．０１０Ｍ−１ｓ−１の二次速度定数でトリアゾール１１２を得た（図１７および１８）。
【０２１４】
表３は、シミュレートされた生理学的条件（１０％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）下で記録された、１０１、１１１および１１２の吸収および蛍光データを示す。トリアゾール１１１および１１２の形成は、クマリン発光について標準範囲への大きなストークスシフトを伴って蛍光強度の有意な増加が付随した（図１６ａ）。３３０ｎｍでの励起によって、プローブ１０１は、低い量子収率（φｆ＝０．０１１）を伴う４０５ｎｍに中心がある弱い発光バンドを生じさせ、一方、トリアゾール１１１および１１２の両方は、それぞれ、０．２３および０．２１の量子収率を伴って４３５ｎｍにおいて強い蛍光を示した。
【０２１５】
生体分子標識化のためにより典型的である条件下でＳＰＡＡＣ反応を探るために、本発明者らは、ＭａｎＮＡｚとの１０１の反応についての蛍光応答および時間経過を調査した。実験によって、９０％超のＭａｎＮＡｚが４０分で消費され、蛍光強度が１時間未満でプラトーに達したことが示された（図１６ｂ）。
【表３】
2020002139.tif 000133
【０２１６】
図１６は、（ａ）１０１（黒色）、１１１（青色）および１１２（赤色）の吸収および蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝３３０ｎｍ）（１０％ＤＭＳＯを含有する４５μＭのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）、（ｂ）１０％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ緩衝液中のＮ−アジドアセチルマンノサミン（３０μＭ）との１０１（３０μＭ）のライゲーション反応についての４３５ｎｍ（λｅｘ＝３３０ｎｍ）での標準化した蛍光強度の時間経過を描写する。
【０２１７】
パートＡ：化合物１０１およびベンジルアジドを、ＣＤ３ＣＮに事前溶解し、次いで、２０ｍＭの等モル濃度で混合した。反応を、１時間の期間に亘り１Ｈ−ＮＭＲ分析によってモニターした。各成分の濃度は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける複数の化学シフトにでの積分によって、最初の化合物１０１の濃度に基づいて決定した。時間（秒）に対する１／［１０１］（Ｍ−１）をプロットすることによって、Ｍ−１ｓ−１の単位での二次速度定数を、線形回帰分析を使用して決定した。この手順を２０ｍＭの濃度で３回繰り返し、０．０１２Ｍ−１ｓ−１の速度定数を２５℃にて得た（図１７）。
【０２１８】
図１７は、１Ｈ−ＮＭＲによってモニターするように、ＣＤ３ＣＮ中の化合物１０１およびベンジルアジドの反応についての時間に対する１／［１０１］のプロットを描写する。
【０２１９】
パートＢ：化合物１０１およびＮ−アジドアセチルマンノサミンを、ＣＤ３ＯＤ／Ｄ２Ｏ（５：１、ｖ／ｖ）に事前溶解し、次いで、２０ｍＭの等モル濃度で混合した。反応を、１時間の期間に亘り１Ｈ−ＮＭＲ分析によってモニターした。各成分の濃度は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける複数の化学シフトでの積分によって、最初の化合物１０１の濃度に基づいて決定した。時間（秒）に対する１／［１０１］（Ｍ−１）をプロットすることによって、線形回帰分析を使用して、Ｍ−１ｓ−１の単位での二次速度定数を決定した。この手順を２０ｍＭの濃度で３回繰り返し、２５℃にて０．０１０Ｍ−１ｓ−１の速度定数を得た（図１８）。
【０２２０】
図１８は、１Ｈ−ＮＭＲによってモニターするように、ＣＤ３ＯＤ−Ｄ２Ｏの溶液（５：１、ｖ／ｖ）中の化合物１０１およびＮ−アジドアセチルマンノサミンの反応について時間に対する１／［１０１］のプロットを描写する。
（実施例６）
シクロオクチン縮合した蛍光発生プローブ１０１を使用した染色された試料の生細胞イメージング：
【０２２１】
生細胞イメージングにおける１０１の性能を評価した。この目的のために、高度にシアル酸付加肺がん細胞であるＣＬ１−５を、過アセチル化Ｎ−アジドアセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）の存在下で３日間培養して、アジド−シアル酸を発現している細
胞を代謝的に産生させた。陰性対照として、ＣＬ１−５細胞を過アセチル化Ｎ−アセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ）の存在下で成長させた。細胞を３０分間隔で洗浄なしおよび固定なし条件下に曝露することによって、時間経過実験を行った（図１９、図２２）。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理された細胞は、蛍光強度の時間依存的増加を示し（上の列：シアン、下の列：青色）、次いで、１．５時間のインキュベーションについて飽和に達した。対照的に、対照細胞は、殆ど蛍光染色を示さなかったが、バックグラウンド標識化が無視できることを支持する。さらに、生細胞中のアジド含有複合糖質の局在化を共焦点顕微鏡観察によって可視化した。プローブ１０１によって標識した細胞を、それに続いて抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてゴルジについてＦＩＴＣコンジュゲートした抗ウサギ、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞核マーカー）で染色した。クマリンプローブに由来する青色の蛍光シグナルが、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃの添加を伴わないＡｃ４ＭａｎＮＡｚ処理された細胞において明らかに示された（図２０）。標識されたシアル酸付加複合糖質を、ｃｏｕｍＯＣＴプローブ（青色蛍光）を使用してサイトゾル中で可視化したが、ゴルジ体（緑色の染色）と有意に重複し、細胞核（赤色の染色）においては重複しなかった。
【０２２２】
図１９は、２００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共にインキュベートし、かつ洗浄なしおよび固定なし条件下で１００μＭのプローブ１０１で標識したＣＬ１−５生細胞のタイムラプス蛍光および重ね合わせ画像を描写する。細胞の蛍光画像（上の列）および細胞の明視野重ね合わせ画像（下の列）。対照：Ａｃ４ＭａｎＮＡｃと共にインキュベートした細胞。（スケールバー：１０μｍ）
【０２２３】
図２０は、共焦点顕微鏡観察によって可視化されるようなＣＬ１−５細胞中のプローブ標識したシアリル複合糖質の局在化を描写する。２００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚまたはＡｃ４ＭａｎＮＡｃと共にインキュベートした細胞を、１００μＭの１０１（青色）で標識し、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてＦＩＴＣコンジュゲートした抗ウサギ（ゴルジについて、緑色）およびヨウ化プロピジウム（細胞核について、赤色）で染色した。（スケールバー：１０μＭ）
【０２２４】
驚いたことに、タイムラプス実験において、青色の蛍光が細胞表面上だけでなく、細胞内で観察された。したがって、本発明者らは、ｃｏｕｍＯＣＴ１０１が生細胞における直接の細胞内標識化のために利用することができる細胞透過性プローブであり得るかを調査した。このゴールに向かって、ＣＬ１−５細胞をＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共に１時間インキュベートし、それに続いて過剰なＡｃ４ＭａｎＮＡｚを除去した。次いで、本発明者らは、シアル酸付加複合糖質の輸送をモニターするためのイメージングを行った。図２１に示すように、シアル酸付加複合糖質は、ｃｏｕｍＯＣＴを使用することによって容易に画像化され、最初の段階においてゴルジ体（赤色）と有意に重複した。しかし、青色の蛍光シグナルの出現は、５時間後に細胞表面上に検出された。蛍光の強度は経時的に増加し、８時間で飽和に達した（図２１および図２３）。本発明者らの結果は、ｃｏｕｍＯＣＴが、細胞透過性プローブであるだけでなく、生細胞中の内在性アジド担持複合糖質の直接の標識化のために特異的であることを示す。
【０２２５】
図２１は、細胞中のＳＰＡＡＣのｃｏｕｍＯＣＴ（１）を使用した複合糖質輸送の蛍光イメージングを描写する。ＣＬ１−５細胞を、５００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共に１時間インキュベートし、それに続いてＰＢＳ緩衝液で洗浄し、過剰なＡｃ４ＭａｎＮＡｚを除去した。糖処理した細胞を、それぞれ、培養培地中で３時間、５時間および８時間インキュベートし、次いで、ＳＰＡＡＣ条件下で１００μＭのプローブ１０１で０．５時間標識した。ゴルジを、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてＣｙ３コンジュゲートした抗ウサギで標識した。（スケールバー：５μｍ）
蛍光分光法による時間経過測定。
【０２２６】
ＰＢＳ緩衝液（２．５ｍＬ）中の１０％ＤＭＳＯの混合物中のプローブ１０１（０．０７５μｍｏｌ）およびＮ−アジドアセチルマンノサミン（０．０７５μｍｏｌ）の溶液を、３７℃にてインキュベートした。３３０ｎｍでの励起による４３５ｎｍでの蛍光発光強度を、５分間隔でモニターした。各ポイントについて、蛍光強度を５秒の期間に亘り測定し、全部で３ポイントに亘り平均化した。対照実験において、Ｎ−アセチルマンノサミン（０．０７５μｍｏｌ）を溶液に加えたこと以外は、同じ条件を使用した。
生細胞における蛍光標識化のタイムラプス顕微鏡分析。
【０２２７】
細胞中の蛍光標識したアジド−複合糖質を観察するために、ＣＬ１−５細胞をチャンバースライド上に播種し（ウェル毎に２．５×１０４個の細胞／０．５ｍＬ）、培養培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で２００μＭの対照糖（過アセチル化Ｎ−アセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ）またはアジド−糖（過アセチル化Ｎ−アジドアセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）のいずれかと共に３日間インキュベートした。
【０２２８】
生細胞のタイムラプスイメージングのために、細胞を培養条件に保持するインキュベーターを備えた共焦点顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤ、Ｌｅｉｃａ）を使用して実験を行った。事前洗浄した細胞を、１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ中の１００μＭのプローブ１０１と共にインキュベートし、従前の実験からの生細胞を１．５時間に亘り蛍光イメージングを行った。画像は、４５０ｎｍの発光にておよび５分間隔で取得した。
【０２２９】
アジド−複合糖質の局在化を比較するために、プローブ標識した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温にて２０分間透過性とし、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミンで室温にて３０分間ブロックした。細胞を、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてゴルジについてＦＩＴＣコンジュゲートした抗ウサギ、および細胞核についてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。
【０２３０】
図２２は、洗浄なしおよび固定なし条件下で、２００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共にインキュベートし、１００μＭのプローブ１０１で標識したＣＬ１−５生細胞のタイムラプス蛍光および重ね合わせ画像を描写する。細胞の蛍光画像（上の列）および細胞の明視野重ね合わせ画像（下の列）。対照：Ａｃ４ＭａｎＮＡｃと共にインキュベートした細胞。（スケールバー：２５μｍ）
生細胞における蛍光標識化によるシアリルコンジュゲート輸送の顕微鏡分析。
【０２３１】
異なる時間による細胞における蛍光標識したシアリルコンジュゲートを観察するために、ＣＬ１−５細胞をチャンバースライド上に播種し（ウェル毎に２．５×１０４個の細胞／０．５ｍＬ）、培養培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で５００μＭのアジド−糖（過アセチル化Ｎ−アジドアセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）と共に１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、培養培地中でインキュベートした。３時間、５時間および８時間後に、細胞を、１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ中の１００μＭのｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。生細胞の蛍光イメージングのために、細胞を培養条件中に保持するインキュベーターを備えた共焦点顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤ、Ｌｅｉｃａ）を使用して実験を行った。
【０２３２】
シアリルコンジュゲートの局在化を比較するために、プローブ標識した細胞をＰＢＳで
洗浄し、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温にて２０分間透過性とし、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミンで室温にて３０分間ブロックした。細胞を、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてゴルジについてＣｙ３コンジュゲートした抗ウサギでさらに染色した。
【０２３３】
図２３は、細胞中のＳＰＡＡＣのｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）を使用した、複合糖質輸送の蛍光イメージングを描写する。ＣＬ１−５細胞を、５００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚと共に１時間インキュベートし、それに続いてＰＢＳ緩衝液で洗浄し、過剰なＡｃ４ＭａｎＮＡｚを除去した。糖処理した細胞を、それぞれ、培養培地中で３時間、５時間および８時間インキュベートし、次いで、ＳＰＡＡＣ条件下で１００μＭのプローブ１０１で０．５時間標識した。ゴルジを、抗ＧＲＡＳＰ６５、それに続いてＣｙ３コンジュゲートした抗ウサギで標識した。（スケールバー：１０μｍ）
実験７：二重標識化実験
【０２３４】
２種の異なる代謝的に組み込まれた複合糖質の併行した蛍光標識化のために、ＣｕＡＡＣと組み合わせたＳＰＡＡＣを使用して二重標識化実験を行った。過アセチル化Ｎ−アセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ）および過アセチル化Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｃ）を、対照糖として用いた。ＭａｎＮＡｃは、細胞中の糖タンパク質および糖脂質の末端単糖類として見出されるシアル酸へと代謝的に変換され、一方、ＧｌｃＮＡｚは、小胞体およびゴルジにおいて産生されるＮ−連結およびＯ−連結グリカンにおいて豊富である内部単糖類である。ＣＬ１−５細胞を、アルキン含有糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ）およびアジド含有糖（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）の両方の存在下で３日間インキュベートした。細胞を、ｃｏｕｍＯＣＴによるＳＰＡＡＣ（アジド糖について）、それに続いてＡｚＢＯＣＥｔ６ｊによるＣｕＡＡＣ（アルキニル糖について）によって染色し、共焦点顕微鏡観察によって調査した（図２４）。
【０２３５】
アジド−およびアルキニル−糖の両方で処理した細胞は、両方の蛍光チャネルにおいて明確なパターン（図２４ａ、２４ｂ、２４ｃ）を示し、一方、いずれかの糖を省略することは、対応するチャネルにおける標識化をもたらさなかった（図２４ｄ、２４ｅ、２４ｆおよび図２４ｇ、２４ｈ、２４ｉ）。興味深いことに、イメージング実験によって、ＭａｎＮＡｌおよびＧｌｃＮＡｚで標識された種が、同じ局在化において、恐らくゴルジ中で相当に示されたことをが明らかになった。さらに、発現されたアルキニル標識されたシアル酸付加複合糖質は、ＡｚＢＯＣＥｔ標識化によって細胞表面上および部分的にサイトゾル中に明らかに観察され、一方、ＧｌｃＮＡｚ標識したグリカンは、ｃｏｕｍＯＣＴプローブを使用してサイトゾル中でのみ示された。シアル酸は通常末端グリコシル化によってＮ−連結およびＯ−連結グリカンに付着しているが、糖タンパク質への非天然ＧｌｃＮＡｚの組込みは、さらなるグリコシル化のためのグリコシルトランスフェラーゼの特異性および効率に影響を与え得る。このように、未熟で異常な糖タンパク質は、分解のためにサイトゾルに移送し得る。これらの知見は、ｃｏｕｍＯＣＴおよびＡｚＢＯＣＥｔが、ＳＰＡＡＣおよびＣｕＡＡＣトリアゾール形成化学による、単一の細胞内のアジドおよびアルキン標識された代謝的に組み込まれた複合糖質の同時の検出のための蛍光形成プローブとして用いられることができることを確認する。
【０２３６】
図２４Ａ、２４Ｂは、細胞におけるｃｏｕｍＯＣＴ（１）、ＡｚＢＯＣＥｔによるデュアル蛍光標識化、および共焦点顕微鏡観察によるイメージングを示す。（Ａ）Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、１０１およびＡｚＢＯＣＥｔを使用した細胞標識化実験の例示。ＣＬ１−５細胞を、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｌおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｚまたは対照糖（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃおよびＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ）と共に３日間インキュベートし、これをＳＰＡＡＣ条件下で１００μＭのプローブ１０１で０．５時間処理し、次いで、ＣｕＡＡＣ条件下で０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔと共に１時間インキュベートした
。（Ｂ）ＣＬ１−５細胞におけるデュアル蛍光イメージング。これらの複合糖質を、アジド含有複合糖質についてプローブ１０１（シアン）で、およびアルキン含有複合糖質についてＡｚＢＯＣＥｔ（緑色）で標識した。（スケールバー：１０μｍ）
細胞におけるデュアル蛍光標識化の顕微鏡分析。
【０２３７】
ＣＬ１−５細胞をチャンバースライド上に播種し（ウェル毎に２．５×１０４個の細胞／０．５ｍＬ）、培養培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で１００μＭのアルキニル−糖（過アセチル化アルキニル−Ｎ−アセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ）もしくはアジド−糖（過アセチル化Ｎ−アジドアセチルグルコサミン、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）のいずれか、もしくは両方と共に、または陰性対照として糖を伴わずに３日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ中の１００μＭのｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳによる３回の洗浄、それに続くＰＢＳ中の室温にて３％パラホルムアルデヒドによる２０分間の固定の後、細胞を、５０％エタノールを有するＰＢＳ中の０．１μＭのＡｚＢＯＣＥｔ、１００μＭのリガンド、１ｍＭのＣｕＳＯ４、および２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと共に室温にて１時間インキュベートし、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤ、Ｌｅｉｃａ）を使用して細胞の蛍光画像を得た。
実験８：３−メルカプトプロピオン酸の存在下での化合物（１０１）および化合物（１１１）の安定性
【０２３８】
シクロオクチンの潜在的な問題のある副反応は、対応するビニルスルフィドへのタンパク性または内在性チオールの添加である。１０１および対応するトリアゾール１１１の潜在的な非特異的染色が、タンパク性または内在性チオールによる三重結合または二重結合へのＳＨ基の添加によって起こり得るかを試験するために、ＣＤＣｌ３中の３−メルカプトプロピオン酸と共の１０１および１１１のインキュベーションによって実験を行った（図２５および２６）。ＮＭＲスペクトル分析は、１０１および１１１が、３−メルカプトプロピオン酸と共のチオール−インまたはチオール−エン添加に対して不活性であることを示唆した。これらの結果は、蛍光形成プローブとしての１０１の適用が、チオール−イン添加による非特異的染色を伴わない、生細胞中の代謝的に組み込まれた複合糖質の驚くべき検出を可能とすることを示し、形成されたトリアゾールは、蛍光をクエンチするチオール−エン添加を受けない。
【０２３９】
化合物１０１および化合物１１１の溶液（ＣＤＣｌ３中２５ｍＭ）を、３−メルカプトプロピオン酸の溶液（ＣＤＣｌ３中３２ｍＭ）と共に室温（２５℃）にてインキュベートした。反応を、１Ｈ−ＮＭＲ分析によって２４時間の期間に亘りモニターした。１Ｈ−ＮＭＲ分析は、１Ｈ−ＮＭＲ分析により３−メルカプトプロピオン酸による化合物１０１および化合物１１１に対して置換効果がないことによって、化合物１０１および化合物１１１がチオールの存在下で高い安定性を有することを示唆した（図２５および図２６）。
【０２４０】
図２５は、化合物１０１および３−メルカプトプロピオン酸単独のＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示し、化合物１０１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、３−メルカプトプロピオン酸で２５℃にて０時間、２時間および２４時間処理した。
【０２４１】
図２６は、化合物１１１および３−メルカプトプロピオン酸単独のＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示し、化合物１１１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、３−メルカプトプロピオン酸で２５℃にて２４時間処理した。
【０２４２】
本開示は、洗浄なしおよび固定なし条件下での生細胞におけるリアルタイムイメージン
グのための新規なＳＰＡＡＣをベースとする蛍光形成プローブｃｏｕｍＯＣＴ（１０１）を記載し、ベンジルアジドおよびＮ−アジドアセチルマンノサミンとの１０１のＳＰＡＡＣ反応は、それぞれ、ＣＤ３ＣＮ中で０．０１２Ｍ−１ｓ−１およびＣＤ３ＯＤ−Ｄ２Ｏの溶液（５：１、ｖ／ｖ）中で０．０１０Ｍ−１ｓ−１の速度定数で進行した。トリアゾール生成物１１１および１１２は、未反応の１０１と比較して量子収率において２０倍の増加を示した（φｆ＝０．２３およびφｆ＝０．２１）。さらに、本開示によって、１０１が、生細胞中のアジド含有複合糖質のイメージングのための蛍光活性化プローブであることが確立される。ＳＰＡＡＣ反応は自発的であり、洗浄ステップは必要としない。さらに、プローブ１０１は無毒性および細胞透過性であり、バックグラウンド標識化の問題を伴わず、これによってＣｕＡＡＣ下でＡｚＢＯＣＥｔと組み合わせた２種の異なる糖の同時の標識化が可能となる。本開示は、細胞イメージングにおける有意な進歩を表し、ｉｎ
ｖｉｖｏでの生化学的事象のリアルタイム検出に潜在的に適用可能であるべきである。
（実施例９）
ＣｏｕｍＦＳＡ（６０１）の合成。
【０２４３】
シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を塩化アセチルで処理して、１Ｈ  ＮＭＲ分析によって９０％超の収率でクロリド中間体を得た。粗生成物をピリジンに溶解し、５０℃に加熱し、それに続いて濃縮および粉砕し、ピリジン塩酸塩を除去し、シアル酸からグリカール２０１を７８％の全収率で得た。Ｎｅｕ５Ｂｏｃ２ｅｎ２０３を、Ｂｏｃ２Ｏで処理することによって化合物２０１から合成し、Ｎ−アセチル−Ｎ−Ｂｏｃ保護された生成物２０２が生成し、これをＺｅｍｐｌｅｎ条件下での脱アセチル化、それに続くアセチル化によって、Ｎ−Ｂｏｃ保護された化合物２０３を得た。８０℃でのＭｅＣＮ中のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）および水による２０３のブロモヒドロキシル化によって、ブロモヒドリン２０４ａおよび２０４ｂ（９１％；２０４ａ／２０４ｂ＝３．１：１）を得た。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）による２０４ａの処理によって、エポキシド２０５（８６％）を得た。Ｃ−３においてヒドロキシル基を有するグリコシルブロミド２０６は、２０５から調製した。アルファ−グリコシド２０７は、無水ＤＭＦ中のナトリウムメチルウンベリフェロンによって５２％収率で得た。水中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による２０７のＢｏｃ基の除去の後、得られたアミン塩を、ＤＭＦ中の塩基ＤＩＰＥＡおよびカップリング試薬ＨＢＴＵの存在下で４−ペンチン酸で処理し、アルキニル生成物２０８を得た。フルオロ化合物２０９を、トリフレートへの２０８の変換によって得て、還流ＴＨＦ中のトリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート（ＴＡＳＦ）との反応を可能とした。アルカリ性条件下での２０９の脱保護によって、逆相カラム上の精製の後、ＣｏｕｍＦＳＡ（６０１）を７５％収率で生成した。
（実施例１０）
ＤＦＳＡ（５０１）の合成。
【０２４４】
室温でのＭｅＮＯ２水溶液中のＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒによる化合物２０３のフルオロヒドロキシル化によって、フルオロヒドリン２１０ａおよび２１０ｂ（５９％；２１０ａ／２１０ｂ＝１．３：１）を得た。三フッ化ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ）による２１０ａの処理によって、ジフルオロ化合物２１１ａおよび２１１ｂを得た（７５％；２１１ａ／２１１ｂ＝５．３：１）。水中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による２１１ａのＢｏｃ基の除去の後、得られたアミン塩を、ＤＭＦ中の塩基ＤＩＰＥＡおよびカップリング試薬ＨＢＴＵの存在下で４−ペンチン酸で処理し、アルキニル生成物２１２を得た。逆相カラム上の精製の後、アルカリ性条件下での２１２の脱保護によって、ＤＦＳＡ（５０１）を５５％収率で生成した。
【０２４５】
クレーム項目において、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、それとは反対のことを示さない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り、１つまたは複数
を意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは記載は、それとは反対のことを示さない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する場合、満たされていると考えられる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する実施形態を含む。本開示は、群メンバーの複数、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する実施形態を含む。
【０２４６】
さらに、本開示は、全てのバリエーション、組合せ、および順列を包含し、ここでは列挙されたクレームの１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、条項、および記述用語は、別のクレームに導入される。例えば、別のクレームに従属する任意のクレームを修飾して、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームにおいて見出される１つまたは複数の限定を含めることができる。要素が例えば、マーカッシュ群フォーマットにおいてリストとして提示される場合、要素の各部分群がまた開示され、任意の要素（複数可）は群から除くことができる。一般に、本開示、または本開示の態様が、特定の要素および／またはフィーチャを含むと言及される場合、本開示の特定の実施形態または本開示の態様は、このような要素および／もしくはフィーチャからなるか、またはこれらから本質的になると理解すべきである。単純化の目的のために、これらの実施形態は、本明細書において特に記載してこなかった。用語「含むこと」および「含有すること」はオープンであることを意図し、さらなる要素またはステップを含むことを許容することがまた留意される。範囲が記載されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、他に示さない限り、または文脈および当業者の理解からその他の点で明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本開示の異なる実施形態における記述した範囲内の任意の特定の値または部分範囲を想定することができる。
【０２４７】
本出願は、様々な発行された特許、公開された特許出願、学術論文、および他の公開資料を参照し、これらの全ては参照により本明細書中に組み込まれている。組み込まれた参照文献のいずれかおよび本明細書の間に矛盾が存在する場合、本明細書が優先するものとする。さらに、従来技術の範囲内に入る本開示の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つまたは複数から明確に除外し得る。このような実施形態は当業者には公知であるとみなされるため、たとえ、除外されることが本明細書において明確に記載されなくても、これらは除外し得る。本開示の任意の特定の実施形態は、従来技術の存在と関連しようとも、関連しなくても、いかなる理由でも任意のクレームから除外することができる。
【０２４８】
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている特定の実施形態の多くの同等物を理解するか、確認することができる。本明細書に記載されている本実施形態の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しないが、むしろ添付の特許請求の範囲に記載の通りである。下記の特許請求の範囲において定義するように、この記載への様々な変化および修飾は、本開示の精神または範囲を逸脱することなく行い得ることを当業者は認識する。
参照文献
【化１０７−１】
2020002139.tif 000134
【化１０７−２】
2020002139.tif 000135
【図１】
2020002139.tif 000138
【図２】
2020002139.tif 000139
【図３】
2020002139.tif 000140
【図４】
2020002139.tif 000141
【図５】
2020002139.tif 000142
【図６Ａ】
2020002139.tif 000143
【図６Ｂ】
2020002139.tif 000144
【図６Ｃ】
2020002139.tif 000145
【図７】
2020002139.tif 000146
【図８Ａ】
2020002139.tif 000147
【図８Ｂ】
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【図９】
2020002139.tif 000149
【図１０】
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【図１１】
2020002139.tif 000151
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020002139.tif 000155
【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
2020002139.tif 000158
【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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