(57)【要約】【課題】ＷＴ１抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供すること。【解決手段】本ＴＣＲは、１本鎖フォーマットにおけるＴＣＲの突然変異ライブラリの発生、続いて酵母の表面における改善された安定性及び親和性に関する選択（即ち、指向性進化）を通じて改変された、より高い親和性のＴＣＲを含む。実施形態では、本ＴＣＲは、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子Ｔ細胞設定においてＴ細胞内へ導入される遺伝子として使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の規定の下、２０１３年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９０７，８８７号の利益を主張するものであり、この仮出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本開示は、国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ０１ＧＭ５５７６７号及び第Ｔ３２ＧＭ０７０４２１号の下に米国政府支援によりなされた。米国政府は、本開示において特定の権利を有する。
配列リストに関する記載
【０００３】
本出願に関連付けられる配列リストは、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書に援用される。配列リストが含まれるテキストファイルの名称は、ＩＭＭＵ＿００３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１８ＫＢであり、２０１４年１１月２１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００４】
本開示は、インビトロ技術によって改変された高親和性ＴＣＲを含む、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびに修飾されたＴＣＲ及び１本鎖ＴＣＲを生成する方法、ならびに治療的、診断的、及び撮像的方法のためのＴＣＲの対応する使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗体は、異なる種類の抗原（リガンド）を認識するように進化した分子である（（Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．））。ＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または任意の有核細胞（例えば、赤血球を除くすべてのヒト体内細胞）の表面上に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の生成物の文脈において提示される抗原ペプチドの認識に関与する抗原特異性分子である。対照的に、抗体は典型的には、可溶性または細胞表面抗原を認識し、ＭＨＣによる抗原の提示を必要としない。このシステムは、Ｔ細胞に、短ペプチドへと細胞内で処理され、細胞内ＭＨＣ分子に結合され、ペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐｅｐＭＨＣ）として表面に送達される、細胞（ウイルスタンパク質を含む）によって発現された細胞内抗原の全体的な配置をそれらのＴＣＲを介して認識する潜在的な能力を付与する。このシステムは、事実上、任意の外来タンパク質（例えば、変異した癌抗原またはウイルスタンパク質）または異常に発現されたタンパク質が、Ｔ細胞の標的として機能することを可能にする（（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４；Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．）に概観される）。
【０００６】
ＴＣＲとｐｅｐＭＨＣとの相互作用は、結合の親和性（または解離速度）に応じて、Ｔ細胞を種々の活性化の状態にさせ得る。ＴＣＲ認識プロセスは、Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性を刺激するための閾値を上回るＭＨＣ分子に結合した外来ペプチドに関する結合親和性を有する１つ以上のＴＣＲが存在するであろう可能性が高いＴＣＲの多様なレパートリーを提供することによって、正常な健康な細胞と、例えば、ウイルスまたは悪性腫瘍を介して形質転換されている細胞とを区別することを可能にする（Ｍａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２０，４１７−４２２）。
【０００７】
現在、インビトロで培養することによって特定されたヒトまたはマウスのいずれかのＴ細胞クローンから単離された野生型ＴＣＲは、比較的低い結合親和性（Ｋｄ＝１〜３００μＭ）を有することが示されている（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４）。これについての説明の一部は、胸腺内で発達するＴ細胞は自己ｐｅｐＭＨＣリガンド上で負に選択され（耐性誘導）、その結果、高過ぎる親和性を有するＴ細胞が欠失される（Ｓｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１，１３９−７６）ということであるようである。これらの比較的低い親和性を補うために、Ｔ細胞は、細胞表面分子ＣＤ４及びＣＤ８がＭＨＣ分子（それぞれ、クラスＩＩ及びクラスＩ）に結合し、シグナル伝達活性の媒介においてＴＣＲに相乗作用をもたらす、補助受容体システムを進化させた。ＣＤ８は、このプロセスに特に有効であり、極めて低い親和性（例えば、Ｋｄ＝３００μＭ）を有するＴＣＲが潜在的な抗原特異性活性を媒介することを可能にする。
【０００８】
インビトロで、指向性進化は、特異性ｐｅｐＭＨＣに関するより高い親和性を有するＴＣＲを発生させるために使用されている。使用されてきた３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２；Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，５３８７−９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４）、及びＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）である。３つのすべてのアプローチにおいて、プロセスは、ＴＣＲの突然変異体の親和性が同族ｐｅｐＭＨＣ（そのＴ細胞が特異的であった元の抗原）に対して増加された親和性を有するように、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲを改変または修飾することに関与する。したがって、野生型ＴＣＲが、ＣＤＲのうちの１つ以上における突然変異ライブラリを生成するためのテンプレートとして使用され、より高い親和性を有する突然変異体が、同族ペプチド−ＭＨＣ抗原への結合によって選択された。
【０００９】
本開示では、野生型Ｔ細胞受容体、及び酵母ディスプレイによって改変されたウィルムス腫瘍−１（ＷＴ１）に対して特異的な高親和性Ｔ細胞受容体が開示される。ＷＴ１は、腫瘍抑制剤及び癌遺伝子の両方として機能するように説明されている転写因子である。ＷＴ１は、白血病及び多様な固形腫瘍において高レベルで発現される（Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４０（５）３７７−３８７）。これは、野生型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を使用したワクチン開発、及び種々の養子Ｔ細胞アプローチの標的である。
ＷＴ１は、国立癌研究所による上位７５個の癌抗原の先順位付けリストの第１位となっている（Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１５，５３２３−５３３７）。したがって、例えば、この癌抗原を特異的に標的とする治療剤などの薬剤を特定する必要が存在する。本発明は、例えば、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子Ｔ細胞設定においてＴ細胞内へ導入される遺伝子として使用され得る、インビトロで改変された、より高い親和性のＴＣＲを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＷＴ１抗原に対する野生型Ｔ細胞受容体、及び改善された親和性でＷＴ１抗原に結合するインビトロで改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。より具体的には、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体の配列、ならびに酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面上のライブラリのディスプレイを通じて選択されるそれらの安定化及び親和性突然変異と、改善された親和性で抗原に結合するためのこれらのライブラリから選択されるＴＣＲタンパク質と、治療的、診断的、または撮像的用途のためのインビトロで選択されるＴＣＲ誘導体の使用と、に関する。
【００１２】
本発明の一態様は、Ｔ細胞クローンに由来するＶα及びＶβを含むＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に結合し、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞受容体に関する。一実施形態では、Ｔ細胞受容体を発現する宿主細胞。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞である。
【００１３】
本発明の一態様は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶα及びＶβを含む修飾されたＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、該Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型Ｔ細胞受容体に関して１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に突然変異を含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２として知られるペプチド／ＭＨＣ抗原（ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号６）、ＨＬＡ−Ａ２として知られるＭＨＣ生成物に結合される）に結合する、修飾されたＴ細胞受容体に関する。
【００１４】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβを含み、該Ｔ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合することによって活性を媒介する。
【００１５】
別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号３に記載されるＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶβを含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、１０６Ｍ高い親和性（ＫＡ値）でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する。
【００１６】
別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶαを含み、該Ｔ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合することによって活性を媒介する。
【００１７】
別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号４に記載されるＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶαを含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、１０６Ｍ高い親和性（ＫＡ値）でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する。
【００１８】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖Ｔ細胞受容体である。
【００１９】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列のＳ９５Ｔ、Ｓ９７Ｎ、Ｉ１０３Ｙ、Ｎ１０４Ｌから選択されるＣＤＲ３β内の突然変異のうちの少なくとも１つを含有する。
【００２０】
別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のＶ２９Ｄ、Ｓ３０Ｌ、及びＱ３１Ｇから選択されるＣＤＲ１α内の突然変異のうちの少なくとも１つを含有する。
【００２１】
一実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、突然変異Ｔ細胞受容体の酵母ディスプレイライブラリのインビトロ選択によって発生される。
【００２２】
別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、その標的抗原に結合する可溶性タンパク質として発現される。
【００２３】
別の実施形態では、野生型または修飾されたＴ細胞受容体は、養子Ｔ細胞療法のためにＴ細胞内で発現される。
【００２４】
本発明の一態様は、ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、本明細書に説明される修飾されたＴ細胞受容体を含む、治療剤を提供する。一実施形態では、ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、本明細書に説明される修飾されたＴ細胞受容体を発現するヒトＴ細胞を含む、治療剤。一実施形態は、本明細書に説明される治療剤を投与することを含む、ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法を提供する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｔ細胞クローンに由来するＶα及びＶβを含むＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、前記Ｔ細胞受容体は、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に結合し、前記Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、前記Ｔ細胞受容体。
（項目２）
項目１に記載の前記Ｔ細胞受容体を発現する、宿主細胞。
（項目３）
前記細胞は、ヒトＴ細胞である、項目２に記載の前記宿主細胞。
（項目４）
野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶα及びＶβを含む修飾されたＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、前記Ｖαまたは前記Ｖβ、またはその両方は、前記野生型Ｔ細胞受容体に関して１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に突然変異を含み、前記修飾されたＴ細胞受容体は、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に前記野生型Ｔ細胞受容体よりも高い親和性で結合する、前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目５）
前記修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号３に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号４に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目６）
前記修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有する１本鎖Ｔ細胞受容体を含む、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目７）
配列番号４に記載される前記Ｖαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶα、及び配列番号３に記載される前記Ｖβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶβを含む、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目８）
前記修飾されたＴ細胞受容体は、ＣＤＲ１α２９、ＣＤＲ１α３０、ＣＤＲ１α３１、ＣＤＲ３β９５、ＣＤＲ３β９７、ＣＤＲ３β１０３、及びＣＤＲ３β１０４のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含む、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目９）
前記修飾されたＴ細胞受容体は、以下のアミノ酸突然変異：ＴＣＲ  Ｖβ鎖突然変異Ｓ９５Ｔ、Ｓ９７Ｎ、Ｉ１０３Ｙ、及びＮ１０４Ｌ、ならびにＴＣＲ  Ｖα鎖突然変異Ｖ２９Ｄ、Ｓ３０Ｌ、及びＱ３１Ｇ、のうちの１つ以上を含む、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目１０）
前記ペプチドＷＴ１及び前記ＨＬＡ−Ａ２分子の複合体にナノモルまたはより高い親和性で結合する項目４に記載の修飾されたＴ細胞受容体であって、前記修飾されたＴ細胞受容体は、１０−６Ｍ以下のＫＤ値で前記複合体に結合する、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
（項目１１）
可溶性形態である、項目４に記載の修飾されたＴ細胞受容体。
（項目１２）
前記ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、項目１０に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体を含む、前記治療剤。
（項目１３）
前記ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、項目４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体を発現するヒトＴ細胞を含む、前記治療剤。
（項目１４）
項目１２に記載の前記治療剤を投与することを含む、前記ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法。
（項目１５）
項目１３に記載の前記治療剤を投与することを含む、前記ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本研究からの種々のＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２特異性Ｔ細胞受容体の整列されたアミノ酸配列を示す。ＷＴ１  Ｐ２２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２によって刺激されたヒトＴ細胞クローンから単離された野生型配列を表す。他のＴＣＲ配列は、より大きい表面レベル及びより高い親和性に関する酵母ディスプレイ法によって単離された。長方形でハイライトされたＣＤＲ３β及びＣＤＲ１α内のアミノ酸残基は、酵母ディスプレイによってより高い親和性に関して単離されたＴＣＲ内の突然変異である。Ｖβ鎖に関して示される配列は、上から下へ配列番号１、２１、２１、３、及び３に対応する。描写されるリンカー配列は、配列番号８である。Ｖα鎖に関して示される配列は、上から下へ配列番号２、２２、４、２、及び４に対応する。
【図２】図２ＡはＴＣＲ：ｐｅｐＭＨＣ複合体（Ａ６；ＰＤＢ：１ＡＯ７）の側面図を示す３次元図である。α鎖及びβ鎖の可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域が示される。示される構造は、ＴＣＲのＣα領域を含まない。ＨＬＡ−Ａ２（α１、α２、α３、及びβ２ｍ）は灰色で示され、Ｔａｘペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号７）は黒色で示される。本発明で実験するＡ６  ＴＣＲ及びＷＴ１  ＴＣＲはすべて、Ｖα２セグメント（ＩＭＧＴ命名法に基づいてＴＲＡＶ１２とも称される）を使用する。    図２Ｂはペプチド−ＭＨＣ（Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２）上のＴＣＲ（ＣＤＲ）フットプリントの上視図を示す３次元図である。本開示で使用されるＷＴ１  ＴＣＲに関して結晶構造は説明されてはいないが、α２  ＭＨＣらせん及びペプチドのＮ末端上に位置付けられたＶα領域と、α１  ＭＨＣらせん及びペプチドのＣ末端上に位置付けられたＶβ領域とを有するこの斜結合配向は、現在すべての複合体内に観察されている。
【図３】ペプチド：ＨＬＡ．Ａ２に対する改善された親和性のために１本鎖ＴＣＲを改変するための方法を示す図である。高親和性ＴＣＲを改変するために使用される一般的なプロセスが示される。
【図４】１本鎖Ｔ細胞受容体断片（Ｖα−リンカーＶβまたはＶβ−リンカー−Ｖα）を改変するための酵母ディスプレイシステムの概略図である。
【図５】Ｖβ３上の立体構造エピトープを認識する２つの抗体によるソート後のＷＴ１  １本鎖ＴＣＲ変異性ライブラリのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＷＴ１変異性ライブラリは、Ｔｈｅｒｍａ  ｈＶｂ３．１  ＦＩＴＣ  ＩｇＧ及びＢＣ  ｈＶｂ３．２  ＦＩＴＣ  ＩｇＭ抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ及びヤギ抗マウスＩｇＭ  ＡＰＣの両方の１：１０の希釈物を用いて、合計３回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後に酵母細胞のアリコートは、Ｔｈｅｒｍａ  ｈＶｂ３．１  ＦＩＴＣ  ＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０希釈物と共に定温放置された。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図５Ａ）。３回目のソート後に単離された安定したクローンＷＴ１  Ｄ１３は、Ｔｈｅｒｍａ  ｈＶｂ３．１  ＦＩＴＣ  ＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０希釈物で染色される（図５Ｂ）。
【図６】ＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２によるソート後のＷＴ１  １本鎖ＴＣＲ  Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＷＴ１  Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリは、１００〜２００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて合計５回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後の酵母細胞のアリコートを、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と共に、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体と共に定温放置した。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図６Ａ）。５回目のソート後に単離されたクローンＷＴ１  Ｄ１３．１は、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）で、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体で染色される（図６Ｂ）。
【図７】ＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２によるソート後のＣＤＲ３ライブラリと組み合わされたＷＴ１  １本鎖ＴＣＲ  Ｄ１３．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＣＤＲ３ライブラリと組み合わされたＷＴ１  Ｄ１３．１は、１０〜１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて合計３回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後の酵母細胞のアリコートを、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と共に、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体と共に定温放置した。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図７Ａ）。３回目のソート後に単離された改善された結合クローンＷＴ１  Ｄ１３．１．１は、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体で染色される（図７Ｂ）。
【図８−１】ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー及びモノマーに関する高親和性ＴＣＲ、ＷＴ１  Ｄ１３．１．１の結合特性を示す。図８Ａは、種々の濃度のＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２  Ｉｇダイマー、続いて二次として蛍光標識抗Ｉｇ抗体で染色された高親和性ｓｃＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｂは、種々の濃度のビオチン化ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー、続いて二次的にＳＡ−ＰＥ（１：１００）で染色された高親和性ｓｃＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｃは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー濃度に対してプロットされた、図７Ａのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。図８Ｄは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー濃度に対してプロットされた、図８Ｂのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。
【図８−２】ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー及びモノマーに関する高親和性ＴＣＲ、ＷＴ１  Ｄ１３．１．１の結合特性を示す。図８Ａは、種々の濃度のＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２  Ｉｇダイマー、続いて二次として蛍光標識抗Ｉｇ抗体で染色された高親和性ｓｃＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｂは、種々の濃度のビオチン化ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー、続いて二次的にＳＡ−ＰＥ（１：１００）で染色された高親和性ｓｃＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｃは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー濃度に対してプロットされた、図７Ａのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。図８Ｄは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー濃度に対してプロットされた、図８Ｂのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。
【図９】大腸菌内で発現された可溶性高親和性ＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１の結合を示す。図９Ａ〜Ｄは、初めに、ペプチドを伴わずに（図９Ａ）、陰性対照ペプチドＴａｘと共に（図９Ｂ）、陰性対照ペプチドＭＡＲＴ−１と共に（図９Ｃ）、またはペプチドＷＴ１と共に（図９Ｄ）定温放置され、続いてビオチン標識ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲと共に定温放置された、ヒトＴ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のヒストグラムである。図９Ｅは、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲは、（この範囲内の親和性の過小評価におけるフローサイトメトリーの細胞洗浄として）少なくとも２６０ｎＭの最小親和性（ＫＤ値）を有したことを示す滴定を描写するグラフである。
【図１０】マウスＴ細胞における野生型Ｐ２２、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１ＴＣＲの活性を示す。単離されたマウスＣＤ８（図１０Ａ）及びＣＤ４（図１０Ｂ）Ｔ細胞は、Ｐ２２、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１ＴＣＲを形質導入された（修飾されたＴＣＲは、Ｖβ領域内のＤ１３「安定化」突然変異：Ｆ４８Ｓ及びＤ５１Ｇを含有しなかった）。形質導入されたＴ細胞は、次にＨＬＡ−Ａ２＋ＡＰＣ及び種々の濃度のＷＴ１ペプチドと共に定温放置された。２４時間の定温放置後、標準ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ濃度が測定された。
【図１１】ＣＤ８  Ｔ細胞内の高親和性ＴＣＲ  ＷＴ１  Ｄ１３．１．１は、ＷＴ１構造的類似ヒトペプチドのパネルに対して活性を示さなかったことを示す。ＷＴ１構造的類似ペプチドは、ＷＴ１ペプチド（配列番号６）の９個の残基の各々において保存的突然変異を有するペプチドに関するヒトプロテオームの探索を通じて決定された。次に、最も高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測された１０個のペプチドが合成された。ペプチド番号１〜１０は、それぞれ配列番号２５〜３４に対応する。マウスＣＤ８  Ｔ細胞は単離され、Ｄ１３．１．１ＴＣＲを形質導入され（Ｖβ領域内のＤ１３安定化突然変異、Ｆ４８Ｓ及びＤ５１Ｇを含有しなかった）、それぞれのペプチド及びＨＬＡ−Ａ２＋ＡＰＣと共に２４時間定温放置された。
【図１２】ＷＴ１−特異性ＴＣＲの例示的な治療的用途を例証する図である。図１２Ａは、可溶性治療用生成物としての使用のためのＴＣＲフォーマットの５つの例を描写する：１）Ｖα−Ｖβ配向またはＶβ−Ｖα配向のいずれかにおける１本鎖ＴＣＲ（変異した高親和性Ｖドメインは、アスタリスクで示される）、２）抗体の定常領域ドメインにフレーム内で融合された１本鎖ＴＣＲ、３）軽鎖または重鎖のいずれかの定常領域へのフレーム内免疫グロブリン融合体、４）薬物に直接結合された１本鎖ＴＣＲ（または２及び３に示される免疫グロブリン融合体）、及び５）二重特異性薬剤を発生させるように１本鎖Ｆｖ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）にフレーム内で連結された１本鎖ＴＣＲ。図１２Ｂは、酵母ディスプレイによって単離された高親和性可変ドメイン（Ｖ）を使用する細胞に基づいた療法の２つの例を描写する（または、野生型ＴＣＲ  ＶドメインもヒトＴ細胞を用いた養子Ｔ細胞療法のために使用されてもよい）。ＴＣＲは、１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）内の１本鎖受容体、ならびに２）全長α及びβ  ＴＣＲとして、養子Ｔ細胞療法においてＴ細胞による発現のために哺乳動物細胞ベクター中にクローン化される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合するＴＣＲ（Ｐ２２）の野生型Ｖβ領域のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合するＴＣＲ（Ｐ２２）の野生型Ｖα領域のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号３は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３．１．１）の修飾されたＶβ領域のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号４は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３．１．１）の修飾されたＶα領域のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号５は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合する１本鎖ＴＣＲ（ＷＴ１−Ｄ１３．１．１）のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号６は、ＷＴ−１抗原のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号７は、Ｔａｘ抗原のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号８は、リンカーのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号９は、プライマーＳｐｌｉｃｅ  ４Ｌのポリヌクレオチド配列であるである。
【００３５】
配列番号１０は、ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００３６】
配列番号１１は、ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００３７】
配列番号１２は、プライマーＴ７のポリヌクレオチド配列であるである。
【００３８】
配列番号１３は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３  β１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００３９】
配列番号１４は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３  β１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００４０】
配列番号１５は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３  β２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号１６は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３  β２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００４２】
配列番号１７は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α１  ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号１８は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α１  ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００４４】
配列番号１９は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α２  ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００４５】
配列番号２０は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α２  ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。
【００４６】
配列番号２１は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３）の修飾されたＶβ領域のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３）の修飾されたＶα領域のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２３は、インフルエンザＡペプチドのアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２４は、変異型インフルエンザＡペプチドのアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２５〜３４は、１０個のＷＴ１変異型ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５１】
以下の説明は、本開示の理解を促進するように意図されるが、限定的であるようには意図されない。
【００５２】
概して、本明細書で使用される用語及び語句は、それらの当該分野において認識される意味を有し、それらは当業者に既知である標準的な文章、参考論文、及び文脈を参照することによって見出すことができる。以下の定義は、本開示の文脈におけるそれらの特定の使用を明確にするために提供される。
【００５３】
本明細書で使用するとき、「連結された」は、２つの基の間の会合を指し、それは共有または非共有結合性会合であり得る。基は、可変長さペプチド構造的鎖、非アミノ酸化学基、または当該技術分野において既知である他の手段を使用して連結されてもよい。リンカー領域は、タンパク質またはペプチドの２つの機能的または構造的ドメインを作動可能に連結するアミノ酸配列であり得る。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「化学療法剤」は、癌細胞、癌細胞集団、腫瘍、または他の悪性組織の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、または広がりを低減または予防することができる任意の物質を指す。この用語はまた、任意の抗腫瘍または抗癌剤を包含するようにも意図される。
【００５５】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、薬学的有効量または治療的有効量などの文脈を包含するように意図される。例えば、特定の実施形態では、有効量は、有益な状態、有益な結果、スクリーニング分析における機能的活性、または臨床症状の改善を達成することができる。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「癌細胞」は、当該技術分野において広範に理解される定義を包含するように意図される。一実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物における癌の臨床症状の一因となり得る異常に調節された細胞を指す。一実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物の身体内の、またはそれらに由来する培養された細胞株または細胞を指し得る。癌細胞は、当該技術分野において理解される通り、多様な分化した細胞、組織、または臓器種類のものであり得る。癌細胞の具体的な例としては、乳癌、結腸癌、皮膚癌、卵巣癌、白血病、肺癌、肝臓癌、精巣癌、食道癌、及び他の種類の癌が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「治療する」または「治療」は、好ましくは臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療は、疾患もしくは状態の症状の改善か、または疾患もしくは状態の進行の遅延を指し得る。
【００５８】
本明細書で使用するとき、「予防」または「予防する」は、疾患または状態の発症または再発の可能性を予防、阻害、または低減するためのアプローチを指す。これはまた、疾患または状態の症状の、発生、または再発の可能性の予防、阻害、または低減も指し、また疾患または状態の発症または再発前の疾患または状態の強度、影響、症状、及び／または負担を低減することも含む。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）を阻害する」または「細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）を阻害する」は、細胞の増殖率の低減または停止を指す。例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、腫瘍の大きさの増加速度は低下され得る。他の実施形態では、腫瘍は、同じ大きさに留まるか、または大きさが減少、即ち、退行し得る。具体的な実施形態では、細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）または細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）の速度は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害される。
【００６０】
用語「野生型」及び「ｗｔ」は、本明細書において互換的に使用され、抗原に対する特異性を有する、自然に発生する、または修飾されていないＴＣＲ、例えば、起源または親Ｔ細胞クローンから単離された可変領域をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチドを有するＴＣＲに関して使用される。
【００６１】
アミノ酸配列を提示する図及び表内では、野生型は、「ｗｔ」と指定される場合もある。下記に提示される配列内の一番上の配列では、ダッシュ記号は、アミノ酸が整列のｗｔまたは一番上の配列に存在するものと同一であることを示す。文字は、一番上の配列からその位置に置換がなされていることを示す。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語「修飾された」、「変異型」、「突然変異体」、「変異した」、及び「由来する」Ｔ細胞受容体は、起源または野生型Ｔ細胞クローンと比較して１つ以上の突然変異を有する可変領域のＴＣＲ配列を指す。修飾されたＴＣＲの例としては、より高い親和性のＴＣＲが挙げられる。
【００６３】
コード配列は、タンパク質のアミノ酸配列、またはｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードする遺伝子またはｃＤＮＡの一部である。
【００６４】
相補または相補的配列は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対規則に従ってクレオチドの別の配列と水素結合２本鎖を形成するヌクレオチドの配列を意味する。
【００６５】
下流は、ＤＮＡまたはＲＮＡ内の相対位置を指し、鎖の３’末端に向かう領域である。
【００６６】
発現は、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、及びタンパク質へのｍＲＮＡのその後の翻訳を指す。
【００６７】
２つの核酸配列は、配列が別々の有機体に由来する場合、かかる有機体が異なる種であるか否かにかかわらず、配列が同一の有機体において同一の配置に一緒に自然に発生しない限り互いに異種である。
【００６８】
相同性は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の範囲を指す。
【００６９】
具体的に例示されるＴＣＲ配列に機能的に等価であるアミノ酸配列は、単一または複数のアミノ酸置換によって、アミノ酸の付加及び／もしくは欠失によって修飾されているか、または１つ以上のアミノ酸が化学的に修飾されているが、それにもかかわらず本開示の細胞結合もしくは可溶性ＴＣＲタンパク質の結合特異性及び高親和性結合活性を保持するアミノ酸配列である。機能に等価であるヌクレオチド配列は、具体的に例示される細胞結合または可溶性ＴＣＲタンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本開示の文脈において、可溶性ＴＣＲタンパク質は、天然細胞結合ＴＣＲの部分を欠損し、溶液中で安定している（即ち、概して、タンパク質溶液の標準的な条件下で本明細書に説明されるように取り扱われるときに溶液中で凝集しない）。
【００７０】
用語「単離された」は、人工的に自然の状態から変更された組成物、化合物、物質、または分子を指す。例えば、自然に発生する組成物または物質は、その元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方である場合、単離されている。例えば、生体動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、本明細書でこの用語が用いられる通り、その自然の状態の共存材料から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。
【００７１】
核酸構築物は、自然に発生する遺伝子から単離されるか、またはさもなくば自然には存在しないであろう様式で組み合わせられるかもしくは並置される核酸のセグメントを含有するように修飾されている核酸分子である。
【００７２】
核酸分子は、３’−５’−リン酸ジエステル結合によって連結されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含有する１本または２本鎖の線状ポリヌクレオチドを意味する。
【００７３】
２つのＤＮＡ配列は、結合の性質が互いに対して正常な機能に影響を及ぼす配列の能力に干渉しない場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーター領域は、プロモーターがコード配列の転写を達成することができる場合、コード配列に作動可能に連結されるであろう。
【００７４】
ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の線状ポリマーである。
【００７５】
用語「プロモーター」は、概して８０〜１２０塩基対長であり、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、正しい転写を開始し得る遺伝子の開始部位の上流に位置する、シス作用ＤＮＡ配列を指す。転写のオン／オフ調節を提供する、及び／または下流コード配列の発現を強化する（増加させる）関連する追加的な転写調節配列が存在し得る。
【００７６】
組み換え核酸分子、例えば、組み換えＤＮＡ分子は、２つ以上の非同種ＤＮＡ分子のライゲーションを通じてインビトロで形成される新規の核酸配列（例えば、少なくとも１つのクローン化部位内にクローン化された外来ＤＮＡの１つ以上の挿入を含有する組み換えプラスミド）である。
【００７７】
用語「形質転換」及び「遺伝子導入」は、異なる遺伝子型の別の細胞に由来する精製された組み換えＤＮＡの外的適用による、その摂取及び対象細胞のゲノム中への統合をもたらす細胞のゲノムの指向修飾を指す。細菌においては、組み換えＤＮＡは、典型的には細菌染色体中に統合されないが、その代わりにプラスミドとして自律的に複製される。用語「形質転換された」及び「遺伝子導入された」は、本明細書において互換的に使用される。例えば、Ｔ細胞は、養子Ｔ細胞処理の前に本明細書に説明される修飾されたまたは高親和性のＴＣＲをコードするＤＮＡ配列を遺伝子導入され得る。
【００７８】
上流は、ＤＮＡまたはＲＮＡ内の任意の部位の５’側を意味する。
【００７９】
ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができ、外来ＤＮＡを受け入れることができる核酸分子である。ベクターは、それ自身の複製の起源と、外来ＤＮＡの挿入のために使用され得る制限エンドヌクレアーゼのための１つ以上の固有の認識部位と、通常、例えば、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、及び多くの場合は挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（例えば、プロモーター）などの選択可能なマーカーとを運ぶ。一般的なベクターとしては、プラスミドベクター及びファージベクターが挙げられる。
【００８０】
高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、野生型ＴＣＲよりも標的リガンドへの強い結合を有する改変されたＴＣＲである。高親和性のいくつかの例としては、約１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍの間、ならびにその中のすべての個々の値及び範囲の標的リガンドの平衡結合定数が挙げられる。この範囲は、野生型親和性であるように報告されるもの（１０−４〜１０−６Ｍ）と指向性進化によって単離されているもの（約１０−１２Ｍ）との間の親和性を包含する。
【００８１】
サイトカインは、他の細胞に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質、ペプチド、または糖タンパク質である。
【００８２】
哺乳類は、ヒト及び非ヒト哺乳類の両方を含む。
【００８３】
遺伝子コードの縮退のため、多数の機能的に等価なヌクレオチド配列が同一のアミノ酸配列をコードすることは、当業者によって理解されるであろう。
Ｔ細胞受容体
【００８４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対をなしてヘテロダイマー受容体を形成する２つの鎖（αβまたはγδ）からなる。αβ  ＴＣＲは、体内のほとんどのＴ細胞上で発現され、ＭＨＣ制限性抗原の認識に関与することが知られている。αβ  ＴＣＲの分子遺伝学、構造、及び生化学は、現在十分に研究されている。各α及びβ鎖は、以下の２つのドメインからなる：タンパク質を細胞膜内に留め、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットに関連する定常ドメイン（Ｃ）、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる６つのループを通じて抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）。Ｖドメインの各々は、３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によってコードされたタンパク質に結合した抗原ペプチド（ｐｅｐＭＨＣ）間で複合体と相互作用する（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４、Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．）。
【００８５】
ＴＣＲの分子遺伝学は、組み合わさってＶドメインのコード領域を形成する複数の遺伝子間での遺伝子組み換えのプロセスを明らかにしている。このプロセスは、重及び軽鎖遺伝子がＢ細胞由来抗体によって示される極めて大きい多様性を発生させるように再配置する抗体発達に類似している（Ｔｏｎｅｇａｗａ（１９８８）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２４，２５３−６５）。Ｔ細胞の場合、α鎖Ｖドメインは、（ヒトでは約７５個のうちの）１つのＶ領域の（ヒトでは約６１個のうちの）１つのジョイニング（Ｊ）遺伝子セグメントへの再配置によって形成される（図５．８、Ｊａｎｅｗａｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）。β鎖Ｖドメインは、（ヒトでは約５２個のうちの）１つのＶ領域の、（ヒトでは２つのうちの）１つの多様性（Ｄ）遺伝子、（ヒトでは１３個のうちの）１つのジョイニング（Ｊ）遺伝子セグメントへの再配置によって形成される（図５．８、（Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．））。ＶαＪα及びＶβＤβＪβ遺伝子の再配置の接合は、各鎖のＣＤＲ３ループをコードし、それらは、１０１５を超える異なるＴＣＲの理論的限界を伴ってαβ  ＴＣＲの極めて大きい多様性（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２）に寄与し、また合計で約１０１１個のＴ細胞しか存在しないためヒトにおける達成可能な多様性を優に上回る（Ｍａｓｏｎ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，１９，３９５−４０４）。これらのループはＶ遺伝子内部でコードされ、ＴＣＲはインビボで体細胞突然変異を受けないため、各鎖の可能なＣＤＲ１及びＣＤＲ２多様性はＶ遺伝子の数によって表される。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループの多様性はＣＤＲ３ループと比較して相対的に限定されているが、ペプチド抗原及び／またはＭＨＣ生成物に基づく特定のＶ領域の選択が存在していることが示されるいくつかの例が存在している。
【００８６】
クラスＩ  ＭＨＣ生成物は、８〜１０のアミノ酸長のペプチドに結合し、それらは体内のすべての有核細胞上で発現される（（Ｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９９）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７，７３９−７９）によって概観される）。抗体抗原間相互作用のすべての結合エネルギーは外来抗原に集中されるのに対して、ＴＣＲ−ペプチド：ＭＨＣの結合エネルギーの大部分は、自己ＭＨＣ分子に指向される（Ｍａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２０，４１７−４２２）。実際、より最近の研究は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２ループの特定の残基は、ＭＨＣらせん上の特定の残基と相互作用し、それによってＭＨＣ制限性のプロセスの主要因であるＭＨＣのための基礎的な親和性を提供するように進化してきたことを示唆している（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０，１４３−７、Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６，１７１−２０３）。
【００８７】
１）ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（ＣＤ８補助受容体を欠損する）の活性を駆動するため、または２）「エフェクター」分子（例えば、二重特異性タンパク質を形成するための抗体Ｆｃ領域、毒性薬物、または抗ＣＤ３抗体などの抗体ｓｃＦｖ）を付着させることによって、細胞の直接的標的のために使用され得る可溶性ＴＣＲを発達させるために、正常範囲を超えるペプチド−ＭＨＣ抗原（クラスＩ）に対する親和性を有するＴＣＲ（所謂、より高い親和性のＴＣＲ）の使用に関心が寄せられてきた（（Ａｓｈｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ（２００６）ＩＤｒｕｇｓ，９，５５４−９、Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎ（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，１０６７９−８１、Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，５３８７−９２、Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５，４３８−４３、Ｒｉｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ（２００７）Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ，２４，３６１−７３）。このアプローチはまた、Ｔ細胞が（一部には耐性胸腺及び末梢プロセスにより）潜在的な腫瘍抗原に対する適切な特異性及び結合親和性を有するＴＣＲを発現しないという、一部の癌患者が直面する問題を克服することができた。例えば、３００を超えるＭＨＣ制限性のＴ細胞によって規定される腫瘍抗原が特定されている（ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／）（Ｂｏｏｎ  ａｎｄ  Ｏｌｄ（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，６８１−３；Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１５，５３２３−３７）。これらの腫瘍抗原としては、変異したペプチド、分化抗原、及び過剰に発現された抗原が挙げられ、これらのすべては療法の標的として機能することができたであろう。何故なら、目下説明されている癌抗原の大部分は、ＭＨＣ分子の文脈にて細胞表面においてのみ標的とされ得る細胞内タンパク質に由来したためである。ＴＣＲは、この種類の抗原を認識するように進化しているため、治療薬の理想的な候補を作製する。
【００８８】
同様に、ＴＣＲは、感染細胞中で自然に処理され、細胞表面上にＭＨＣ分子によってディスプレイされているウイルスタンパク質に由来するペプチドを検出し得る。ＨＩＶ及びＨＴＬＶ中のウイルスゲノムに由来するペプチドを含む、多数のウイルス抗原標的が過去２５年間で特定されている（例えば、Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２，ｅ３２１、Ｔｓｏｍｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８０，１２８３−９３、Ｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０，８４３−５１）。しかしながら、これらの疾患を有する患者は、感染細胞の結合及び破壊のための最適なＴＣＲを欠損する場合がある。最後に、ＴＣＲが、高度に特異的であるプロセスにおいて自己免疫標的の受容体拮抗薬として、または局所免疫細胞応答を免疫抑制するための送達剤として使用され得、それによって、一般的な免疫抑制を回避した可能性がある（Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５，４３８−４３、Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ））。
修飾されたＴ細胞受容体
【００８９】
指向性進化は、特異性ｐｅｐＭＨＣに関するより高い親和性を有するＴＣＲを発生させるために使用されている。使用されてきた３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２；Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，５３８７−９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４）、及びＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）である。３つのすべてのアプローチにおいて、プロセスは、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲの改変に関与し、その結果、ＴＣＲの突然変異体は、特異性ｐｅｐＭＨＣに対して（即ち、Ｔ細胞が特異的であった元の抗原に対して）改善された親和性を有した。したがって、野生型ＴＣＲは、ＣＤＲのうちの１つ以上における突然変異ライブラリを生成するためのテンプレートとして使用され、続いて、同族ペプチド−ＭＨＣ抗原への結合によって、より高い親和性を有する突然変異体が選択された。かかるインビトロでの指向性進化は、野生型親和性の単に数倍のみではなくそれを超える親和性を改変するために必要であることは、当該技術分野において周知である。
【００９０】
酵母ディスプレイは、関心のタンパク質がＡｇａ２−融合体として表面上に発現されることを可能にする（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，５５３−５５７、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２８，４３０−４４）。このシステムは、より高い親和性のＴＣＲ、１本鎖抗体、フィブロネクチン、及び他のタンパク質の改変において成功裏に使用されている。酵母ディスプレイシステムでは、ＴＣＲは、Ｖβ−リンカー−ＶαもしくはＶα−リンカー−Ｖβ形態の安定化１本鎖タンパク質として（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ
ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，５３８７−９２、Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９６，５６５１−６、Ｒｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−１６、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０２，１９０３３−８）、または２本鎖ヘテロダイマーとして（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｒｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−１６）ディスプレイされている。２つのマウスＴＣＲが、このシステムを使用してより高い親和性に関して改変されている：２Ｃ（ＭＨＣクラスＩ制限性）及び３．Ｌ２（ＭＨＣクラスＩＩ制限性）（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，５３８７−９２、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０２，１９０３３−８）。ヒトＴＣＲ１本鎖ＶαＶβ断片（ｓｃＴｖまたはｓｃＴＣＲと呼ばれる）もまた、Ｖα２と呼ばれ、ＩＭＧＴ命名法によりＴＣＲＡ１２としても既知であるヒトＶα領域の例外的な安定性を利用することによって、近年発達されている（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２）。この場合、インビトロで改変された１本鎖フォーマットの高親和性Ｔ細胞受容体は、安定したタンパク質として酵母表面上に、かつ可溶性形態で大腸菌から発現され得るヒト安定化ｓｃＴｖ断片（Ｖβ−リンカー−Ｖα）を単離するために使用された。ＴＣＲは、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルスＴａｘタンパク質に由来するペプチドに対して特異的なＡ６  ｓｃＴｖと、ヒト免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質に由来するペプチド（ペプチド：ＳＬ９７７−８５）に対して特異的な８６８ｓｃＴｖとの２つの安定化ヒトｓｃＴｖ断片を含んだ。これらのＴＣＲのどちらも、Ｖα２遺伝子（ＩＭＧＴ：ＴＲＡＶ１２ファミリー）を使用したが、ＴＣＲが単離された起源Ｔ細胞クローンに由来するＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３β残基を有した。したがって、これらのｓｃＴＣＲのより高い親和性の突然変異体は、それらの同族ペプチド−ＭＨＣ抗原に対してそれらの起源（親）ＴＣＲに各々由来した。
【００９１】
第２のシステム、ファージディスプレイでは、関心のタンパク質は、ウイルスコートタンパク質のＮ末端に融合される（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−９０）。Ａ６、８６８、及び１Ｇ４（ＭＨＣクラスＩ制限性）と呼ばれるものを含む種々のＴＣＲが、この方法を使用してより高い親和性に関して改変されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４、Ｓａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２０，３９７−４０３、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１４，１３９０−５）。これらのＴＣＲのファージディスプレイは、α及びβ鎖の対作成を促進するために、２つのＣドメイン間に非天然ジスルフィド結合を導入することによって可能になった。したがって、このシステムは、それらの同族ペプチド−ＭＨＣに対して改変するために起源Ｔ細胞クローンに由来する全長（ＶαＣα／ＶβＣβ）ヘテロダイマータンパク質を使用する。
【００９２】
ＴＣＲを改変するために報告されている第３のシステムは、哺乳動物細胞ディスプレイである（Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４、Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，１４５７８−８３）。このシステムは、レトロウイルスベクターを使用して、ＴＣＲα及びβ鎖をＴＣＲ陰性Ｔ細胞ハイブリドーマ内へ導入する。ある研究では（Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７，１４５７８−８３）、選択された突然変異ＴＣＲは、同族ペプチド（ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ対ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ、それぞれ配列番号２３及び２４）に構造的に極めて類似したペプチドに結合することが示された。他の研究では、突然変異ＴＣＲの親和性は、同族ｐｅｐＭＨＣに関して増加されることが示された（Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）。かかるより高い親和性のＴＣＲはまた、同族ペプチドの構造的に類似の変異型に対してより高い親和性を示すことも多くの研究で示されている（例えば、（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２））。哺乳動物細胞ディスプレイシステムでは、導入されたＴＣＲは、ＣＤ３サブユニットとの複合体においてその天然立体構造の表面上に発現され、完全に機能的なＴ細胞（シグナル伝達免疫適格）を可能にした。したがって、それらの天然宿主中の全長ヘテロダイマーＴＣＲは、この方法を使用して改変された。
ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する高親和性ＴＣＲ
【００９３】
本発明は、野生型ＴＣＲ及び周知の癌抗原ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に対する種々の高親和性ＴＣＲを提供する。特定の実施形態では、改変されたＴＣＲは、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子移入方法もしくは治療においてＴ細胞によって組み換え発現されて使用され得る。具体的な実施形態では、ＴＣＲの１本鎖ＶαＶβ形態（ｓｃＴＣＲ）骨格は、エフェクター分子をＴＣＲが結合する場所（例えば、腫瘍）へ送達するために、サイトカイン、毒素、放射性同位体、化学療法剤、または（抗体−薬物結合体に類似した）薬物などのペイロードと共に調製及び使用され得る。ＴＣＲはまた、ＷＴ１を発現する癌細胞に対する応答を媒介するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子移入などの細胞療法においても使用され得る。本明細書に提供されるｓｃＴＣＲ骨格はまた、例えば、放射性同位体または蛍光部分などの検出可能な基への共有結合によって、例えば、ＴＣＲのアミン反応性またはスルフヒドリル反応性アミノ酸側鎖を通じて、腫瘍性またはウイルス会合細胞表面抗原の特定を通じて、例えば、悪性またはウイルス感染細胞の診断のためにも使用され得る。
【００９４】
一実施形態では、本明細書に説明されるｓｃＴＣＲタンパク質は、酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面上にディスプレイ可能であり、ＷＴ１抗原へのさらにより高い親和性を有するＴＣＲを改変するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に説明されるｓｃＴＣＲタンパク質は、原核細胞、例えば、大腸菌、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フィクウム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）、アワモリコウジカビ、ニホンコウジカビ、トリコデルマ・リーゼイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、バチルス・スブチリスもしくはバチルス・リケニフォルミスなど、昆虫細胞（例えば、キイロショウジョウバエ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）などの細胞株を含む哺乳動物細胞、または例えば、植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）、または他の当該技術分野において既知であるタンパク質発現源中で発現され、大量に生成され得る。ＴＣＲはまた、例えば、単なる例ではあるが、細胞の表面上の特異性ペプチド／ＭＨＣを検出するためにも使用され得る。一実施形態では、開示されるｓｃＴＣＲ遺伝子は、ＤＮＡ構築物中にコードされる好適なペプチド配列の使用によってシグナル伝達ドメインのための遺伝子に連結され、標的とされる細胞を取り除き得るＴ細胞内へ導入され得る。これらの構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれており、ｓｃＴＣＲを含有するＣＡＲの使用を含む、当該分野において現在広く使用される。
【００９５】
提供される１本鎖ＶαＶβ  ＴＣＲタンパク質において、可変α及び可変β鎖は、抗体１本鎖Ｆｖ結合などの当該技術分野において既知であるものを含む、任意の好適なペプチドリンカーを使用して接続される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９０，６４４４−８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，１１０５−１６、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ
ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０５，４３−５４）。一実施形態では、Ｖα−Ｌ−ＶβまたはＶβ−Ｌ−Ｖαの構造を有する可溶性ヒト１本鎖ＴＣＲであって、Ｌは、ＶβをＶαと連結するリンカーペプチドであり、Ｖβは、ＴＣＲ可変β領域であり、Ｖαは、ＴＣＲ可変α領域である、可溶性ヒト１本鎖ＴＣＲが提供される。
【００９６】
一実施形態では、ＶβＶα  ＴＣＲは、ＷＴ１  Ｄ１３．１．１と呼ばれ、Ｖβは、グループ３のＴＣＲ可変β領域であり、Ｖα２は、グループ２のＴＣＲ可変α領域である（Ｕｔｚ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）（Ａｇｇｅｎ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００９７】
一実施形態では、リンカーペプチドは、５個を超えるリジン残基を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、５〜３０個のアミノ酸を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、提供されるｓｃＶβＶα  ＴＣＲは、定常領域を含有しない。本明細書でｓｃＶβＶα  ＴＣＲという専門用語が使用されるとき、ｓｃＶβＶα  ＴＣＲはまた、当該技術分野において理解及び使用される専門用語として含まれることが理解される。したがって、Ｖβ及びＶα鎖は、リンカーを通じて任意の構成で互いに接続され得る。
【００９８】
本開示の態様では、本開示のＶβＶα  ＴＣＲは、約１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍの平衡結合定数ＫＤでリガンドに特異的に結合する。本開示のこの態様の一実施形態では、リガンドは、ペプチド／ＭＨＣリガンドである。一実施形態では、本開示のＶβＶα  ＴＣＲは、正常な野生型ＴＣＲの親和性と比較してリガンドに対して強化された親和性を有する。
【００９９】
生物学的に活性な基
生物学的に活性な基を含む本明細書に説明されるＶβＶα  ＴＣＲタンパク質も、提供される。本明細書で使用するとき、「生物学的に活性な基」は、生物学的システムにおいて測定可能または検出可能な効果を引き起こす基である。一実施形態では、生物学的に活性な基は、以下から選択される：抗腫瘍剤、例えば、限定されるものではないが、血管形成阻害剤、酵素阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ挿入剤もしくは架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤など、サイトカイン、例えば、限定されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、もしくはＬＴ−α（Ｓｃｈｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，５，１４７−５９、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２４，３７３−８３）、抗炎症基、例えば、限定されるものではないが、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３７、ＩＬ−１０（Ｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１，１０１４−２２、Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、放射性同位体、例えば、限定されるものではないが、９０Ｙもしくは１３１Ｉなど（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ａｎｄ  Ｖａｌｇｅ−Ａｒｃｈｅｒ（２００７）Ｎａｔ
Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，６，３４９−５６）、毒素、例えば、限定されるものではないが、緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、もしくはリシンのＡ鎖（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，６，５５９−６５、Ｓｃｈｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，５，１４７−５９）、薬物、または例えば、１本鎖Ｆｖなどの抗体。
【０１００】
本開示のこの態様の一実施形態では、生物学的に活性な基は、細胞毒性分子であり、薬物（例えば、用語「抗体薬物結合体」において）と称される場合もある。本明細書で使用するとき、「細胞毒性」は、細胞に対する毒性を意味する。細胞毒性分子の例としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、メトトレキサート、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、ズオカルマイシン、オーリスタチン、マイタンシン、カリチェアミシン、及び上述の分子の類似物が挙げられる（Ｊａｒｖｉｓ  （２０１２）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，９０，１２−１８、Ｌｉｔｖａｋ−Ｇｒｅｅｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｈａｒ（２０１２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、Ｒｉｃａｒｔ  ａｎｄ  Ｔｏｌｃｈｅｒ（２００７）Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ，４，２４５−５５）。細胞毒性分子は、完全な細胞死を引き起こす必要はないが、むしろ、測定可能もしくは検出可能な増殖の阻害または細胞活性の減少を引き起こす必要がある。
【０１０１】
一実施形態では、本明細書に説明されるＴＣＲは、プロドラッグを薬物に転換することができる酵素に連結される。これは、例えば、薬物の活性形態がＴＣＲによって標的とされる場所において（例えば、腫瘍部位において）作成されることを可能にすることによって、有用である。
【０１０２】
一実施形態では、生物学的に活性な基は、リンカーを通じて１本鎖ＴＣＲに結合され、それは、例えば、ＴＣＲの遊離アミン基またはスルフヒドリル基との、標準的な化学反応を通じて達成され得る。
【０１０３】
別の実施形態では、ＴＣＲは、１本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に付着されて、二重特異性薬剤を発生させる。腫瘍抗原に対する１つのｓｃＦｖと、Ｔ細胞のＣＤ３分子に対する１つのｓｃＦｖと、を含有する二重特異性抗体が、現在医院において成功裏に使用されている（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１，９７４−７）。加えて、ＣＤ３に対するＴＣＲ及びｓｃＦｖを含有する二重特異性薬剤も報告されている（Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１８，９８０−７）。
【０１０４】
検出可能な基を含む本明細書に説明される１本鎖ＶβＶα  ＴＣＲも、提供される。一実施形態では、検出可能な基は、分光法または酵素に基づいた方法によって検出され得る基である。一実施形態では、検出可能な基は、蛍光基、例えば、限定されるものではないが、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、テキサスレッド、もしくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）など、放射性標識基、例えば、限定されるものではないが、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９ｍＴｃなど、吸収基、または検出可能な生成物を発生させる特性を有する酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはアルカリホスファターゼなどである。
【０１０５】
当該技術分野において既知である通り、生物学的に活性な基、検出可能な基、またはＴＣＲに付着した他の基は、可撓性ペプチドリンカーを使用してか、または化学的結合によって付着され得、ＴＣＲに共有的または非共有的に付着され得る。
【０１０６】
治療的に有効な分子に連結された有効量の修飾されたＴＣＲを哺乳類に投与することを含む、哺乳類における癌を治療または予防する方法における使用のためのヒトＴＣＲも、本明細書に提供される。具体的な実施形態では、哺乳類は、ヒトである。別の実施形態では、哺乳類は、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、齧歯動物、ウマ）または家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）である。
【０１０７】
本明細書に説明される単離された１本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）、及び大腸菌中で１本鎖を生成するための方法も、提供される。本明細書に説明されるｓｃＴＣＲと、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物も提供される。
【０１０８】
Ｔ細胞の表面上に活性ＴＣＲを生じるシグナル伝達ドメインに連結されている本明細書に説明されるｓｃＶαＶβ  ＴＣＲも、提供される。一実施形態では、このｓｃＴＣＲは、ＴＣＲをベクター中にクローン化することと、ベクターを患者のＴ細胞内へ導入することと、Ｔ細胞を患者へと戻して養子移入することと、を含む、哺乳類における癌を治療する方法において使用され得る。
修飾されたＴＣＲポリペプチド及びポリヌクレオチド
【０１０９】
本開示は、１本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含むＤＮＡベクターを企図する。
【０１１０】
当業者は、標準的な突然変異誘発技術を通じて、本明細書に説明される分析と併せて、変更されたＴＣＲ配列を得て、それらを特定の結合親和性及び／または特異性に関して試験することができる。当該技術分野において既知である有用な突然変異誘発技術としては、限定されるものではないが、デノボ遺伝子合成、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発、領域特異性突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、及びＰＣＲによる部位指向突然変異誘発が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）を参照）。
【０１１１】
修飾されたＴＣＲコード配列の獲得において、当業者は、生物学的活性の損失または低減を伴わずに特定のアミノ酸置換、付加、欠失、及び翻訳後修飾によって修飾され得るＴＣＲ由来タンパク質を認識するであろう。具体的には、保存的アミノ酸置換、即ち、１個のアミノ酸の、類似の大きさ、電荷、極性、及び立体構造の別のアミノ酸への置換は、タンパク質の機能を著しく変更する可能性は低いことは周知である。タンパク質の構成要素である２０個の標準的なアミノ酸は、以下の通り、４つの群の保存的アミノ酸に広範に分類され得る：非極性（疎水性）基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンを含み、極性（非荷電、中性）基は、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、及びチロシンを含み、正荷電（塩基性）基は、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンを含有し、負荷電（酸性）基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含有する。１個のアミノ酸のタンパク質の同一の群内の別のものへの置換は、タンパク質の生物学的活性に悪影響を有する可能性は低い。
【０１１２】
一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、安定化されたタンパク質をもたらす可変ドメインの任意の領域（単数または複数）内の追加の突然変異を含有してもよい。一実施形態では、１つ以上の追加の突然変異は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＨＶ４、ＣＤＲ３、ＦＲ２、及びＦＲ３内のうちの１つ以上である。突然変異誘発に使用される領域は、結晶構造または分子モデルを使用して、関心のリガンド（例えば、抗原）と相互作用するＴＣＲの領域を発生させる、指向性進化によって決定され得る。他の例では、可変領域は、アミノ酸を付加または欠失させて、ｓｃＴＣＲとリガンドとの間の所望の相互作用を改変することによって、再成形され得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、修飾されたＴＣＲ、及びその抗原結合断片（例えば、ｓｃＴＣＲ）、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」、及び「糖タンパク質」は、互換的に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、糖化、リン酸化、及びシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１つ以上の鎖であって、各鎖がペプチド結合によって共有的に連結されたアミノ酸を含み、該ポリペプチドまたはタンパク質は、天然タンパク質、即ち、自然に発生する細胞、特に非組み換え細胞、または遺伝子的に改変された細胞、もしくは組み換え細胞によって生成されるタンパク質の配列を有する、ペプチド結合によって非共有的及び／または共有的に一緒に連結された複数の鎖を含むことができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を有する分子を含むことができる、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、本開示の修飾されたＴＣＲ、もしくはその抗原結合断片、または修飾されたＴＣＲ、もしくはその抗原結合断片の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸鎖のうちの１つ（「モノマー」と呼ばれる）または複数（「マルチマー」と呼ばれる）を含むことができる。
【０１１４】
本明細書で言及される用語「単離されたタンパク質」は、（１）典型的には自然に共に見出されるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同一の源に由来する、例えば、同一の種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、（４）少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくはそれが自然に共に会合される他の材料から分離されているか、（５）「単離されたタンパク質」が自然に共に会合されるタンパク質の部分と、（共有もしくは非共有相互作用によって）会合されていないか、（６）それが自然に会合されないポリペプチドと、（共有または非共有相互作用によって）作動可能に会合されるか、または（７）自然には発生しない、対象タンパク質を意味する。かかる単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成起源のものであり得る他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせによってコードされ得る。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、その（治療的、診断的、予防的、研究、ないしは別の）使用に干渉するであろう、その自然環境で見いだされるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【０１１５】
具体的な実施形態では、対象の修飾されたＴＣＲは：ａ）本明細書に説明される修飾されたＴＣＲのα鎖可変領域に対して少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖可変領域と、ｂ）本明細書に説明される修飾されたＴＣＲのβ鎖可変領域に対して少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域と、を有してもよい。
【０１１６】
具体的な実施形態では、修飾されたＴＣＲは：ａ）ｉ．本明細書に説明される選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ１領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ２領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、及びｉｉｉ．選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ３領域に対してアミノ酸が同一であるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲ  α鎖可変領域と、ｂ）ｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ１領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ２領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、及びｉｉｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ３領域に対してアミノ酸が同一であるＣＤＲ３領域を含む、β鎖可変領域と、を含んでもよく、この場合、ＴＣＲはＷＴ１抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、修飾されたＴＣＲ、またはその抗原結合断片は、変異型の修飾されたＴＣＲであり、この場合、該変異型は、Ｖα及びＶβ領域のＣＤＲ領域中の最大８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個以上のアミノ酸置換を除いて、選択された修飾されたＴＣＲに同一であるα鎖及びβ鎖を含む。この点において、選択された変異型の修飾されたＴＣＲのＣＤＲ領域内に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または特定の実施形態では、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個以上のアミノ酸置換が存在してもよい。置換は、Ｖα及び／またはＶβ領域のいずれかのＣＤＲにあってもよい。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７を参照）。
【０１１７】
一実施形態では、修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、またはその抗原結合断片が提供される。他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの変異型であってもよい。ポリヌクレオチド変異型は、本明細書に説明される修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列に対して実質的同一性を有してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に説明されるＴＣＲをコードする配列などの基準ポリヌクレオチド配列と比較して、本明細書に説明される方法（例えば、下記に説明される、標準的パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含むポリヌクレオチドであってもよい。当業者は、これらの値は、コドン縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように、適切に調整され得ることを認識するであろう。
【０１１８】
典型的には、ポリヌクレオチド変異型は、好ましくは、その変異型ポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性が、具体的に本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲと比べて実質的に縮小されないように、１つ以上の置換、付加、欠失、及び／または挿入を含有するであろう。
【０１１９】
ポリヌクレオチド配列を比較するとき、下記に説明される通り、最大一致に関して整列されたときに２つの配列中のヌクレオチドの配列が同じであれば、２つの配列は「同一である」と言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較窓上で比較して、配列類似性の局所領域を特定及び比較することによって実施される。本明細書で使用するとき、「比較窓」は、通常３０〜約７５個、４０〜約５０個、少なくとも約２０個の連続的な位置のセグメントを指し、その中で、２つの配列が最適に整列された後に、配列が同一数の連続的な位置の基準配列と比較され得る。
【０１２０】
比較のための配列の最適な整列は、生物情報工学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメータを使用して実施されてもよい。このプログラムは、以下の参考文献に説明されるいくつかの整列スキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ，ｐｐ．６２６−６４５（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５（１９７１）、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５（１９８７）、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９７３）、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０（１９８３）。
【０１２１】
別法として、比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によって（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）または調査によって実施されてもよい。
【０１２２】
パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズム１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に説明される。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０は、２つ以上のポリヌクレオチド間のパーセント配列同一性を決定するために、例えば、本明細書に説明されるパラメータと共に使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である。１つの例証的な例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（整合残基の対に対する獲得スコア、常に＞０）及びＮ（不整合残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して算出され得る。各方向のワードヒットの伸長は、累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ降下するとき、累積スコアが、１つ以上の負のスコアを有する残基整列の蓄積によりゼロ以下になるとき、またはどちらかの配列の末端に到達するときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感受性及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）及び１０の予測（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列、５０の（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【０１２３】
特定の実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を少なくとも２０個の位置の比較の窓上で比較することによって決定され、比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に関して基準配列（付加または欠失を含まない）と比較されるときに、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一である核酸塩基が両配列内で発生する位置の数を決定して、整合位置の数を作成し、整合位置の数を基準配列内の位置の総数（即ち、窓の大きさ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを作成することによって算出される。
【０１２４】
遺伝子コードの縮退の結果として、本明細書に説明されるＴＣＲをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、例えば、同一抗原に結合する、修飾されたＴＣＲをコードする天然または起源ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対して最小の配列同一性を有する。にもかかわらず、コドン利用の差により変化するポリヌクレオチドは、本開示によって明白に企図される。特定の実施形態では、哺乳動物発現に関してコドン最適化されている配列が、特に企図される。
【０１２５】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関与する酵素反応のクローン化、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための標準的な技術、ならびに種々の分離技術は、当業者に既知であり、当業者によって一般的に用いられるものである。多数の標準的な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｕ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｗｕ（ｅｄ．）（１９７９）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１、Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５、Ｍｉｌｌｅｒ（ｅｄ．）（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｓｃｈｌｅｉｆ  ａｎｄ  Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．）（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ及びＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ．）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、ならびにＳｅｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに説明される。略語及び命名法は、用いられる場合、当該分野における標準的なものと見なされ、本明細書に記載されるものなどの専門的な論文に一般的に使用される。
【０１２６】
ヌクレオチド配列間の相同性は、２本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性が発生する塩基対の範囲に依存するＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定され得る。高温及び／または低塩含量の条件は、ハイブリッドの安定性を低減させ、選択された度合いより低い相同性を有する配列のアニールを予防するために変化され得る。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含量を有する配列に関して、４０〜５０℃、６Ｘ  ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝材）、及び０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５℃、１Ｘ  ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約８２〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１Ｘ  ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約９９〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する（及び、相同性の度合いを測定する）ための広範なコンピュータプログラムも利用可能であり、市販のソフトウェア及び無料ソフトウェアの両方の提供元リストは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に見出される。容易に入手可能な配列比較アルゴリズム及び複数配列整列アルゴリズムは、それぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてインターネット上で入手可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンはｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにて入手可能である。
【０１２７】
微生物（例えば、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フィクウム、アワモリコウジカビ、ニホンコウジカビ、トリコデルマ・リーゼイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、大腸菌、バチルス・スブチリス、またはバチルス・リケニフォルミス）、昆虫（ショウジョウバエ）、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＣＨＯ）、または植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）の工業用細胞株は、ＴＣＲタンパク質の組み換え生成のための宿主細胞として使用されてもよい。特定の実施形態では、高親和性ＴＣＲタンパク質または可溶性タンパク質の異種発現の第１のステップでは、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲコード配列及び制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターなどを含むように、発現構築物が組み立てられる。シグナル配列などの他の配列及び選択可能なマーカーも、含まれてもよい。ＴＣＲの細胞外発現を達成するために、発現構築物は、分泌シグナル配列を含んでもよい。実施形態では、シグナル配列は、細胞質発現が所望される場合、発現構築物上に含まれない。実施形態では、プロモーター及びシグナル配列は、宿主細胞中で機能的であり、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲタンパク質の発現及び分泌を提供する。効率的な転写を確実にするために、転写ターミネーターが含まれてもよい。発現またはタンパク質精製を強化する補助的な配列も、発現構築物中に含まれてもよい。
【０１２８】
種々のプロモーター（転写開始調節領域）が、本開示に従って使用されてもよい。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存してもよい。異種源に由来するプロモーターは、それらは選択される宿主中で機能的である限り、使用されてもよい。
【０１２９】
プロモーターの選択はまた、ペプチドまたはタンパク質生成の所望の効率及びレベルにも依存する。ｔａｃなどの誘導性プロモーターは、大腸菌中でのタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるために用いられることが多い。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞にとって有害な場合もある。その故、宿主細胞増殖は、制限されてもよい。誘導性プロモーターシステムの使用は、宿主細胞が、遺伝子発現の誘導の前に許容される密度で培養され、それによってより高い生成物収率を促進することを可能にする。
【０１３０】
種々のシグナル配列が、本開示に従って使用されてもよい。ＴＣＲコード配列と同種であるシグナル配列が、使用されてもよい。別法として、発現宿主中での効率的な分泌及び処理のために選択または設計されたシグナル配列も、使用されてもよい。例えば、好適なシグナル配列／宿主細胞対としては、Ｂ．スブチリス中での分泌のためのＢ．スブチリスｓａｃＢシグナル配列、及びＰ．パストリス分泌のためのサッカロマイセス・セレビシエα−接合因子またはＰ．パストリス酸ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を直接通じてタンパク質コード配列に結合されてもよく、または通常１０個未満のコドンからなる短ヌクレオチド架橋を通じてもよく、この場合、架橋は下流ＴＣＲ配列の正しいリーディングフレームを確実にする。
【０１３１】
転写及び翻訳を強化するための要素は、真核生物タンパク質発現システムに関して特定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを、異種プロモーターのどちらかの側に位置付けることは、植物細胞において転写レベルを１０〜４００倍上昇させ得る。発現構築物はまた、適切な翻訳開始配列も含むべきである。適当な翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列を含むような発現構築物の修飾は、翻訳のレベルを１０倍増加させ得る。
【０１３２】
多くの場合、選択的なマーカーが用いられ、これは発現構築物の一部であってもよく、またはそれから分離していてもよく（例えば、発現ベクターによって運ばれる）、その結果、マーカーは関心の遺伝子とは異なる部位で統合する。例としては、抗生物質に対する抵抗力を付与する（例えば、ｂｌａは大腸菌宿主細胞に関してアンピシリンに対する抵抗力を付与し、ｎｐｔＩＩは多様な原核及び真核細胞にカナマイシンに対する抵抗力を付与する）か、または宿主が最小培地上で増殖することを可能にする（例えば、ＨＩＳ４はＰ．パストリスまたはＨｉｓ−Ｓ．セレビシエがヒスチジンの不在下で増殖することを可能にする）マーカーが挙げられる。選択可能なマーカーは、マーカーの独立した発現を可能にするために、それ自身の転写及び翻訳開始及び終了調節領域を有する。抗生物質抵抗性がマーカーとして用いられる場合、選択のための抗生物質の濃度は、概して培地１ｍｌ当たり１０〜６００μｇの抗生物質の範囲で、その抗生物質に応じて変動するであろう。
【０１３３】
発現構築物は、既知の組み換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を用いることによって組み立てられる。制限酵素消化及びライゲーションは、ＤＮＡの２つの断片を結合するために用いられる基本的なステップである。ＤＮＡ断片の末端は、ライゲーションの前に修飾を必要とする場合があり、これは、突出の充填、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）による断片（単数または複数）の末端部分の欠失、部位指向突然変異誘発、またはＰＣＲによる新規の塩基対の付加によって達成されてもよい。選択される断片の結合を促進するために、ポリリンカー及びアダプターが用いられてもよい。発現構築物は典型的には、一連の制限、ライゲーション、及び大腸菌の形質転換を用いる段階で組み立てられる。発現構築物の構築に好適な多数のクローン化ベクターは、当該技術分野において既知であり（λＺＡＰ  ａｎｄ  ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；ｐＥＴ，Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ−Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に記載）、具体的な選択は本開示にとって重要ではない。クローン化ベクターの選択は、発現構築物を宿主細胞内へ導入するために選択される遺伝子移入システムの影響を受けるであろう。各段階の最後に、結果として得られる構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ分析によって分析されてもよい。
【０１３４】
発現構築物は、線状かもしくは環状かのいずれかのクローン化ベクター構築物として宿主へ形質転換されてもよく、またはクローン化ベクターから除去され、そのまま使用されるか、もしくは送達ベクター上へ導入されてもよい。送達ベクターは、選択される宿主細胞型中での発現構築物の導入及び維持を促進する。発現構築物は、多数の既知の遺伝子移入システムのいずれかによって宿主細胞内へ導入される（例えば、ナチュラルコンピテンス、化学的に媒介された形質転換、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法、遺伝子銃形質転換、遺伝子導入、または結合）（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子移入システムは、使用される宿主細胞及びベクターシステムに依存する。
【０１３５】
例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換または電気穿孔法によってＳ．セレビシエ細胞内へ導入され得る。Ｓ．セレビシエの電気穿孔法は、容易に達成され、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率をもたらす。
【０１３６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル、特に、リガンド結合部位以外の部位においてＴＣＲタンパク質と反応性であるものは、当該技術分野において既知である方法によって作製することができ、また多くのものが市販されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１３７】
特定の標的リガンドに対して特異的である細胞結合または可溶性形態のＴＣＲは、例えば、生物学的標本（細胞、組織標本、生検材料、体液など）をスクリーニングするための、または試験標本中の標的リガンドの存在を検出するための診断プローブとして、有用である。しばしば、ＴＣＲは、共有的に、または非共有的にのいずれかで、検出可能なシグナルを提供する物質に結合することによって標識される。好適な標識としては、限定されるものではないが、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発色剤、磁性粒子などが挙げられる。加えて、ＴＣＲは、第２の結合分子のためのリガンドに結合され得、例えば、ＴＣＲはビオチン化され得る。次に、標的細胞または分子に結合したＴＣＲの検出は、検出可能なストレプトアビジン（蛍光性、放射性、化学発色性、もしくは他の検出可能な分子が付着されるか、または利用可能な発色基質がそれに対して存在する酵素が利用可能であるストレプトアビジン）の結合によって達成され得る。かかる標識及び／または毒性化合物のｓｃＴＣＲに共有結合されるような使用を説明する米国特許としては、限定されるものではないが、第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９２７，１９３号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，６４０，５６１号、第４，３６６，２４１号、第ＲＥ３５，５００号、第５，２９９，２５３号、第５，１０１，８２７号、第５，０５９，４１３号が挙げられる。
【０１３８】
標識ＴＣＲは、使用される標識に適切な観察機器または方法を使用して検出され得る。蛍光顕微鏡法または蛍光活性化細胞ソートは、標識が蛍光部分であり、標識が放射性核種、γ計数、オートラジオグラフィー、または液体シンチレーション計数である場合に使用することができ、例えば、その方法が分析されている標本及び使用される放射性核種に適切であるという条件で使用することができる。加えて、本明細書に記されるように、ＭＨＣ構成要素の不在下で標的リガンドのための結合部位の一部ではないＴＣＲの部分を認識した検出可能な分子または粒子が存在する場合に用いられる、二次検出分子または粒子が存在し得る。現場での診断的撮像に有用な化合物は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１０１，８２７号、同第５，０５９，４１３号を参照されたい。インビボでの療法及び／撮像に有用な放射性核種としては、１１１Ｉｎｄｉｕｍ、９７Ｒｕｂｉｄｉｕｍ、１２５Ｉｏｄｉｎｅ、１３１Ｉｏｄｉｎｅ、１２３Ｉｏｄｉｎｅ、６７Ｇａｌｌｉｕｍ、９９Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍが挙げられる。毒素としては、とりわけジフテリア毒素、リシン、及びトウゴマの実毒素が挙げられるが、但し、ＴＣＲ−毒素複合体が細胞に結合した後、毒性部分はその細胞毒性効果を発揮し得るように内面化されることが条件である。抗毒素技術は、当該技術分野において周知であり、好適な毒性分子としては、限定されるものではないが、化学療法薬、例えば、ビンデシンなど、抗葉酸剤、例えば、メトトレキサート、シスプラチン、マイトマイシン、アントロシクリン（ａｎｔｈｒｏｃｙｃｌｉｎｅ）、例えば、ダウノマイシン、ダウノルビシン、またはアドリアマイシンなど、及び細胞毒性タンパク質、例えば、リボソーム不活性化タンパク質など（例えば、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン、緑膿菌外毒素Ａ、またはそれらの組み換え誘導体など）が挙げられる。例えば、概してＯｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌ（１９８２）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２５：３５５−３８１、及びＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｄｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ａｎｄ  Ｂｙｅｒｓ，ｐｐ．１５９−１７９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５を参照されたい。
【０１３９】
ペプチド：主要組織適合性複合体への結合を含むＴＣＲ分子の一般的な構造ならびに作製及び使用の方法は、開示されている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３号、第ＷＯ９９／６０１２０号を参照されたい。
薬学的組成物及び治療剤
【０１４０】
特定の標的リガンドに対して特異的なＴＣＲは、特定の抗原に関連付けられる疾患、例えば、癌などの腫瘍性疾患または障害に罹患すると考えられる、ヒトを含む動物及び哺乳類の治療に有用である。本明細書に説明される方法に従って治療され得る癌の種類の例としては、限定されるものではないが、ウィルムス腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎性癌、皮膚癌、小細胞肺癌、及び精巣癌が挙げられる。
【０１４１】
治療用生成物は、本明細書に示される材料を使用して作製され得る。治療用生成物の有効量は、対象における測定可能な効果を生み出す最小用量である。治療用生成物は、当業者によって容易に調製される。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、患者に直接投与される。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、当該技術分野において既知である通りＰＥＧまたは免疫グロブリン定常領域に連結される。この実施形態は、血清クリアランスを伸ばす。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、薬物を癌細胞などの標的細胞へ送達するために化学療法剤または薬物に連結される。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、サイトカインなどの生物学的エフェクター分子に連結される（Ｔａｙａｌ  ａｎｄ  Ｋａｌｒａ（２００８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５７９，１−１２）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＴＮＦαなどの抗腫瘍活性を有するサイトカインに連結される（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２４，３７３−８３）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３などの免疫阻害サイトカイン連結される（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、別の抗原結合分子に連結されて、二重特異性薬剤を形成する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２３，５４９−５７、Ｔｈａｋｕｒ  ａｎｄ  Ｌｕｍ（２０１０）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１２，３４０−９）。一実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＤ３などの１本鎖Ｆｖに連結されたｓｃＴＣＲで構成され（（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１，９７４−７、Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１８，９８０−７）、Ｔ細胞及び罹患細胞を架橋する。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＣＤ３などのＴＣＲシグナル伝達ドメインに連結されて、キメラ抗原受容体を形成する（（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６５，７２５−３３、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１，２１５−２３、Ｓｔｒｏｎｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，１０，４８）。これらの方法及び、静脈内投与などの他の投与方法は、当該技術分野において既知である。有用用量は、当業者によって決定され得る。
【０１４２】
ｓｃＴＣＲ組成物は、当該技術分野において既知である手段のいずれかによって製剤化され得る。それらは典型的には、注射物質、特に、静脈内、腹腔内、もしくは骨膜投与（特定の疾患によって決定される経路による）のためのものとして、または液体溶液かもしくは懸濁液のいずれかとして経鼻もしくは経口投与用の製剤として調製され得る。注射または他の投与の前の、液体中溶液または懸濁液に好適な固体形態も、調製され得る。調製物はまた、例えば、乳化されてもよく、またはリポソーム中にカプセル化されたタンパク質（単数または複数）／ペプチド（単数または複数）であってもよい。
【０１４３】
活性成分は、薬学的に許容され、また活性成分に適合する賦形剤または担体などの任意選択的な薬学的添加剤と混合されることが多い。好適な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせが挙げられる。注射物質、エアロゾル、または経鼻製剤中のｓｃＴＣＲの濃度は、通常０．０５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。具体的な有効用量の選択は、当業者によって知られており、過度の実験をすることなく実施される。類似の用量は、他の粘膜表面に投与され得る。
【０１４４】
加えて、所望により、ｓｃＴＣＲを含み得るワクチンは、ワクチンの有効性を強化する湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／または補助剤などの補助物質などの微量の薬学的添加剤を含有してもよい。有効であり得る補助剤の例としては、限定されるものではないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄイソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニルｌ−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、及び、細菌から抽出される３つの構成要素、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０乳液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。かかる追加的な製剤、及び当該技術分野において既知である投与形態もまた、使用されてもよい。
【０１４５】
本開示のｓｃＴＣＲ、及び／またはＴＣＲ可変領域に類似（９０％超の同一性）の一次構造を有し、標的リガンドに対する高親和性を維持する結合断片は、中性または塩形態としてワクチン中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、限定されるものではないが、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、及び例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマレイン酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など、ならびに有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ−エタノール、ヒスチジン、及びプロカインに由来してもよい。
【０１４６】
治療的使用のためのｓｃＴＣＲは、当該技術分野における既知のものに従って、用量製剤に適合した様式で、予防的及び／または治療的に有効である量及び様式で投与される。一般的には１回の投薬量当たり約１００〜２０，０００μｇのタンパク質の範囲、より一般的には１回の投薬量当たり約１０００〜１０，０００μｇの範囲である、投与される量。類似の組成物は、例えば、標的リガンドが結合される細胞を検出するために、撮像における使用のための標識ｓｃＴＣＲを使用して、類似の方法で投与され得る。投与が必要とされる活性成分の正確な量は、医師または獣医の判断に依存してもよく、またそれぞれに特有であってもよいが、かかる決定は施術者の技術の範囲内である。
【０１４７】
ＴＣＲ生成物は、単回投薬で、２回投薬計画で、例えば、２〜８週間空けて、または複数回投与計画で付与されてもよい。複数回投与計画は、治療の主要なコースが１〜１０以上の別々の投薬量と、続いて応答を維持及び／または強化するために必要に応じてその後の時間間隔で投与される他の投薬量と、を含み得るものである。
【０１４８】
説明または例示されるすべての製剤または構成要素の組み合わせは、別段に記載のない限り、本開示の実践のために使用され得る。物質の具体的な名称は、当業者が同一の物質に異なる名称を付け得ることが知られる通り、例示的であるように意図される。化合物が、その化合物の特定のイソマーまたはエナンチオマーが明示されないように、例えば、式または化学名で、本明細書に説明されるとき、その説明は、説明される化合物の各イソマー及びエナンチオマーを個々にまたは任意の組み合わせで含むように意図される。当業者は、具体的に例示されるもの以外の方法、標的リガンド、生物学的に活性な基、開始材料、及び合成法が、過度の実験に頼ることなく本開示の実践に用いられ得ることを理解するであろう。任意のかかる方法、標的リガンド、生物学的に活性な基、開始材料、及び合成法のすべての当該技術分野において既知である機能的等価物は、本開示に含まれるように意図される。例えば、温度範囲、時間範囲、または組成物範囲など本明細書において範囲が付与される場合はいかなるときも、その所与の範囲に含まれるすべての中間範囲及び部分範囲ならびに個々の値は、本開示に含まれるように意図される。
【０１４９】
実際の製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１ｐ．１を参照）。
【０１５０】
主治医は、毒性のためまたは機能不全のため、投与をどのように及びいつ終了、中断、または調節するかを理解するあろうことに留意するべきである。反対に、主治医はまた、臨床応答が適切でない場合に治療をより高いレベルに調整することも理解するであろう。関心の障害の管理において投与される投薬量の規模は、治療される状態の重篤度及び投与の経路と共に変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、一部には標準的な予測評価法によって評価されてもよい。さらに、投薬量及び恐らくは投薬回数はまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答に従って変動するであろう。上述のものに匹敵するプログラムはまた、獣医学においても使用され得る。
【０１５１】
治療されている具体的な状態及び選択される標的化法に応じて、かかる薬剤は、製剤化され、全身的または局所的に投与されてもよい。製剤化及び投与の技術は、Ａｌｆｏｎｓｏ  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）に見出され得る。好適な経路としては、例えば、経口、直腸、経皮、膣内、経粘膜、または腸内投与、筋肉内、皮下、または髄内注射を含む非経口送達、及びくも膜下腔内、静脈内、または腹腔内注射が挙げられ得る。
【０１５２】
注射のために、本開示の薬剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝剤などの生理的に適合可能な緩衝剤中で製剤化されてもよい。経粘膜投与のために、浸透される障壁に適切である浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、概して当該技術分野において既知である。
【０１５３】
全身投与に好適な用量への本開示の実践のための本明細書に開示される化合物を製剤化するための薬学的に許容される担体の使用は、本開示の範囲内である。担体の適当な選択及び好適な製造実践により、本開示の組成物、特に溶液として製剤化されるものは、静脈内注射などによって非経口的に投与されてもよい。適切な化合物は、当該技術分野において周知である薬学的に許容される担体を使用して、経口投与に好適な用量へ容易に製剤化され得る。かかる担体は、本開示の化合物が、治療される患者による経口摂取のために錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。
【０１５４】
細胞内に投与されるように意図される薬剤は、当業者に周知である技術を使用して投与されてもよい。例えば、かかる薬剤は、リポソーム内にカプセル化され、次に上記に説明される通りに投与されてもよい。リポソームは、水性内部を有する球状脂質二重層である。リポソーム形成時に水溶液中に存在するすべての分子は、水性内部に組み込まれる。リポソームの内容物は、外部の微環境から保護され、かつ、リポソームは細胞膜と融合するため、細胞質内に効率的に送達される。さらに、それらの疎水性により、小有機分子は細胞内に直接投与され得る。
【０１５５】
本開示における使用に好適な薬学的組成物としては、意図される目的を達成するような有効量で活性成分が含有される組成物が挙げられる。有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５６】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への処理を促進する賦形剤及び補助物質を含む好適な薬学的に許容される担体を含有してもよい。経口投与のために製剤化される調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、または溶液の形態であってもよく、遅延放出のために製剤化されるか、または調剤が小腸もしくは大腸に達するときにのみ放出されるように製剤化されるものを含む。
【０１５７】
本開示の薬学的組成物は、それ自体既知である様式で、例えば、従来的な混合、溶解、粒状化、糖衣錠作製、レビテーティング（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。
【０１５８】
非経口投与のための薬学的な製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が、好適な油性注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または化合物の可溶性を増加させて、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。
【０１５９】
経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、結果として得られた混合物を任意選択的に粉末化し、必要に応じて、好適な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得られ得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖など、セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望により、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤が添加されてもよい。
【０１６０】
糖衣錠コアは、好適なコーティングを用いて提供される。この目的のために、濃縮糖液が使用されてもよく、それは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶剤または溶剤混合物を任意選択的に含有してもよい。活性化合物投薬量の異なる組み合わせを特定するまたは特徴付けるために、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。
【０１６１】
経口的に使用され得る薬学的な調製物としては、ゼラチンから作製される押し込み型カプセル、及びゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作製される軟らかい封止カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意選択的に安定剤の混合物中に、活性成分を含有し得る。軟カプセル中では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が添加されてもよい。
治療法
【０１６２】
高親和性ＴＣＲ及び高親和性ＴＣＲを含む薬学的組成物は、例えば、癌、腫瘍、悪性腫瘍、または腫瘍性疾患もしくは障害を有する患者を治療するために使用されてもよい。一実施形態では、癌を有する患者を治療する方法は、本明細書に説明される高親和性ＴＣＲを投与することを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、ＷＴ１に対して特異的である。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＶβを含む。別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＶαを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖ＴＣＲである。別の実施形態では、高親和性ＴＣＲは、例えば、化学療法剤などの治療剤と組み合わせて投与される。また別の実施形態では、高親和性ＴＣＲは、生物学的に活性な基に結合される。
【０１６３】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者に対するＴ細胞の養子移入のための方法であって、本明細書に説明される野生型ＴＣＲまたは高親和性ＴＣＲのいずれかを発現するＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＷＴ１に対して特異的であるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子導入されている。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＶβを含む。別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＶαを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖ＴＣＲである。
【実施例】
【０１６４】
以下の実施例は、本開示の非限定的な実施例をさらに説明する。
【０１６５】
実施例１
ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２抗原に対するより高い親和性のためのＴＣＲの改変
改善された親和性及び安定性のための１本鎖ＴＣＲの発見または発生のために使用される一般的な戦略が、図３に示される。このプロセスは、例証される通り６つのステップに関与する。
【０１６６】
１）ディスプレイのための１本鎖ＴＣＲフォーマットとしての、Ｐ２２などのＴ細胞クローンに由来するＶα及びＶβＴＣＲ遺伝子（図１に示される配列、及び配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むＶβと配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むＶα）のクローン化。Ｖ領域は、ＨＬＡ−Ａ２との複合体中のＨＬＡ−Ａ２制限性抗原ペプチドＷＴ１（配列番号６）を認識する。本発明では、クローンＰ２２に由来するＴＣＲ  Ｖ領域遺伝子（例えば、Ｄｏｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１７（４），７４２）を１本鎖フォーマット（Ｖβ−リンカー−Ｖα）としてクローン化し、酵母表面上での発現のために酵母ディスプレイベクター内に導入した（図４）。
【０１６７】
２）変異性ライブラリの発生、及び抗Ｖβ抗体による安定化された変異型に関するＦＡＣＳまたは電磁ビーズ選択。１本鎖Ｖα及びＶβ  ＴＣＲは安定化定常領域の欠損により不安定であることが多いため、変異性の突然変異誘発ライブラリは、酵母の表面上での安定した発現を可能にする突然変異の安定化のために選択されるように発生されるが、但し、ファージ及び哺乳動物を含むがこれらに現地されない他のディスプレイフォーマットが使用されてもよい。ファージディスプレイベクター及びクローン化は、１０１１のライブラリサイズを生じ、一方酵母ディスプレイベクター及び同種組み換えステップは、１０１０のライブラリサイズを生じている（（Ｂｅｎａｔｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２３，１５５−９）。固定化したリガンドへの親和性に基づく結合（ファージディスプレイ）または抗原による磁性粒子選択（酵母ディスプレイ）、または標識ペプチド−ＭＨＣ抗原による蛍光活性化細胞のソート（酵母ディスプレイ）を含む、変異型の選択のために種々の方法が使用されている。折り畳まれたエピトープを認識するＴＣＲ  Ｖβに対する抗体の利用、蛍光活性化された細胞ソート（ＦＡＣＳ）、または電磁ビーズ選択が、本実施例において改善された抗体結合を有する変異型を単離するために使用される。
【０１６８】
３）変異性ライブラリの選択から単離したｓｃＴＣＲクローンを、熱安定性に関して評定し、安定化された変異型を、親和性成熟のためのテンプレートとして選択し、配列決定する。典型的には、酵母上の増加された表面レベル及び溶液中でのより高い安定性に寄与する単一部位突然変異が特定される。
【０１６９】
４）安定化させたｓｃＴＣＲ配列を、通常ＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ３β内でのＣＤＲライブラリの発生のためのテンプレートとして使用するが、但し、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ２β、及びＨＶ４を含むがこれらに限定されない他の領域も使用され得る。本開示では、電磁ビーズ選択及び／または蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ）を使用することによって、酵母ディスプレイされた変異型をペプチド：ＭＨＣへの改善された結合に関してＣＤＲライブラリから選択するが、但し、ファージディスプレイによるパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）または磁気選択または哺乳動物ディスプレイによるＦＡＣＳを含むがこれらに限定されない他の方法を利用した選択が使用されてもよい。
【０１７０】
５）ＣＤＲライブラリの選択から単離したｓｃＴＣＲクローンを、それらが改変されたペプチド：ＭＨＣへの特異的結合に関して評定する。プラスミドを酵母クローンから取り出し、配列決定する。
【０１７１】
６）親和性のさらなる改善が必要とされる場合、ステップ５において選択したｓｃＴＣＲクローンが、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ３βなどの突然変異を選択しなかった他のループまたは領域におけるさらなるライブラリの発生のためのテンプレートとして使用され得るが、但し、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ２β、及びＨＶ４を含むがこれらに限定されない他の領域も使用され得る。これらのステップの各々の例は、下記にさらに説明される。
【０１７２】
実施例２
Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２との複合体におけるＶα２を使用するヒトＴＣＲ  Ａ６の分析
ＴＣＲはすべて、類似のＩｇ折り畳み及び結合角度を採用し、ｐｅｐＭＨＣのＴＣＲ認識は、ＣＤＲループ上の特異性残基によって完全に媒介される（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０，１４３−７、Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６，１７１−２０３、Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４，４１９−６６））。ＷＴ１  ＴＣＲの結晶構造は本開示の時点で利用可能ではないが、ＷＴ１  Ｐ２２  ＴＣＲの同一のＶα２ドメインを使用したＡ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２複合体（ＰＤＢ：１ＡＯ７）の構造（Ｇａｒｂｏｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ，３８４，１３４−１４１）が示される。複合体の側面図は、６つのＣＤＲを含有する可変ドメインの末端が、結合部位の中心領域がペプチドＴａｘ上に位置付けられた状態でＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２分子上に結合することを示した（図２Ａ）。結晶構造は定常領域αを含まないが、但し、定常領域は全長構築物を安定化させるのに役立つ。上記に説明されるステップ２において選択される安定化突然変異は、フレームワーク領域内で、例えば、Ｖα／Ｖβ接触面、または全長ＴＣＲ内でＣα／ＶαもしくはＣβ／Ｖβ接触面の接合が生じる場所などで選択されることが多い。
【０１７３】
６つのＣＤＲループを除く、ＴＣＲが「除去された」Ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２複合体の上視図が示される（図２Ｂ）。この図は、ＴＣＲが  ペプチド−ＭＨＣ上の対角位置を採用することを示し、この発見は現在すべてのＴＣＲ：ペプチド−ＭＨＣ構造に関して観察されている。この配向では、２つのＣＤＲ３ループはペプチド上に位置付けられ、またＭＨＣ分子のらせんと主に相互作用するＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループに由来する種々の残基が存在する。ステップ４及び６における親和性成熟の目的のために、これらのループは、親和性成熟ライブラリの発生の標的とされることが多いが、但し、他の領域が使用されてもよい。
【０１７４】
実施例３
ＷＴ１  ＴＣＲの酵母ディスプレイ
改善された安定性（ステップ２）または改善された親和性（ステップ５）に関する選択を実施するために、ＴＣＲ突然変異体のライブラリが立体構造エピトープまたはペプチド：ＭＨＣリガンドをそれぞれ認識する抗体に結合するためにスクリーニングされ得るディスプレイシステムを使用することが必要である。３つのディスプレイシステムが、より高い親和性に関してＴＣＲを改変するために使用されており、また酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、及びＴ細胞（哺乳動物細胞）ディスプレイのプロセスのために使用することができた。リボソーム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＣＩＳディスプレイなどの代替的なディスプレイ方法も、このプロセスに好適であり得る。これらのすべての場合において、抗原に対して低い親和性を有する野生型ＴＣＲがシステム中にクローン化され、強化された安定性及びペプチド：ＭＨＣリガンドに対する親和性を有するＴＣＲを改変するためのテンプレートとして使用された。これらのシステムのいずれも、単一のＴＣＲがライブラリ及び強化された結合特性を有するＴＣＲの選択のためのテンプレートとして使用される、本明細書に説明されるアプローチに適用することができた。
【０１７５】
本実施例では、酵母ディスプレイをプラットフォームとして使用した（図４）。ＷＴ１
ＴＣＲを、変異性突然変異誘発を介した安定化突然変異のためのテンプレートとして使用し、選択から単離した安定化させたクローンを、親和性成熟のためのテンプレートとして使用した。
【０１７６】
実施例４
安定化させたＷＴ１  ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３の変異性のライブラリの構築及び選択Ｐ２２と呼ばれるＷＴ１反応性細胞株をテンプレートとして利用して、ＷＴ１変異性のライブラリをこれまでに説明されている通りに発生させた（Ｒｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５０４，３２３−３５０）。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１変異性ＰＣＲ生成物、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合併せることによって、ヒトＷＴ１変異性ｓｃＴＣＲライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。約２．３×１０７個の独立クローンを含有する結果として得られたライブラリを、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判断した。ライブラリを、表１に従うＦＡＣＳによって、ヒトｈＶβ３、抗ｈＶβ３．１  ＦＩＴＣ  ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び抗ｈＶβ３  ＦＩＴＣ  ＩｇＭ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を認識する２つの抗体に結合するために選択した。
【表１】
2020007374.tif 000002
【０１７７】
熱変性研究を使用して、Ｖβ３上で折り畳まれたエピトープの認識のためのこれらの抗体を特定した（データは示されていない）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びヤギ抗マウスＩｇＭ  ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体を使用して、シグナルを増幅させた。３回の反復ソート中に、Ｖβ３陽性染色集団が現れた（図５Ａ）。３回目のソート後に、改善されたＶβ３蛍光に関してＷＴ１−Ｄ１３と呼ばれるクローンが単離され（図５Ｂ）、８０℃に加熱したときに熱安定性を示した（データは示されていない）。ＷＴ１−Ｄ１３クローンを、親和性成熟のためのテンプレートとして使用した。
【０１７８】
実施例５
ＣＤＲ１αライブラリ構築、及びＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ１．１に対する強化された結合を有するＷＴ１  ＴＣＲの選択
重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）によって、変異性のＰＣＲライブラリの選択から単離した安定化ＷＴ１−Ｄ１３クローンを、４個の隣接する残基にわたるＣＤＲ１αライブラリの発生のためのテンプレートとして使用した（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリＰＣＲ生成物、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合わせることによって、ヒトＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１Α  α
ｓｃＴＣＲライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。約３．１×１０６個の独立クローンを含有する結果として得られたライブラリを、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判断した。ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリを、表２に従ってＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２／Ｉｇ  ダイマー（ＢＤ  ＤｉｍｅｒＸ）への結合に関してＦＡＣＳソートした。
【表２】
2020007374.tif 000003
【０１７９】
ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇダイマーを用いたＦＡＣＳによる５回の選択後、やや陽性の染色集団が現れ始めた（図６Ａ）。５回目のソート後に単離したクローンＷＴ１−Ｄ１３．１は、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２に対する穏やかな結合改善を示し、さらなる親和性成熟のためのテンプレートとして使用された（図６Ｂ）。
【０１８０】
実施例６
ＣＤＲ３ライブラリ構築、及びＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ１．１．１へのさらに強化された結合を有するＷＴ１  ＴＣＲの選択
ＷＴ１  ｓｃＴＣＲの親和し得をさらに改善するために、ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリから単離したＷＴ１−Ｄ１３．１クローンをテンプレートとして使用して、ＣＤＲ３ライブラリを発生させた。各ＣＤＲ３中に５個の隣接するコドンにわたる縮重コドンを同時に作製する重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲによって、ＷＴ１−Ｄ１３．１  ＣＤＲ３ライブラリを発生さた。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１−Ｄ１３．１  ＣＤＲ３  ＰＣＲ生成物（即ち、ＣＤＲ３α１、ＣＤＲ３α２、ＣＤＲ３β１、またはＣＤＲ３β２ライブラリ）、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合わせることによって、各ＷＴ１−Ｄ１３．１  ＣＤＲ３ライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。４つの結果として得られたライブラリをプールし、結果として得られた組み合わせられたライブラリは、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判定するときに、約３．５×１０６個の独立クローンを含有した。ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ３を組み合わせたライブラリを、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２／Ｉｇダイマー（ＢＤ  ＤｉｍｅｒＸ）への結合に関して表３のチャートに従ってＦＡＣＳソートした。
【表３】
2020007374.tif 000004
【０１８１】
ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号８）／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇダイマーを用いたＦＡＣＳによる３回の選択後、陽性染色集団が現れ始めた（図７Ａ）。３回目のソート後に単離したクローンＷＴ１−Ｄ１３．１．１は、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号８）／ＨＬＡ．Ａ２に対する増加した結合を示した（図７Ｂ）。
【０１８２】
実施例７
高親和性ＷＴ１  ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１の結合分析
ＣＤＲ３ライブラリの選択から単離したＷＴ１−Ｄ１３．１．１クローンの結合を評定するために、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１をディスプレイする酵母を、大腸菌から発現及び精製したＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２ダイマーＨＬＡ−Ａ２−Ｉｇ）及びモノマーで滴定した。ＷＴ−１／Ａ２ダイマーは１６０ｐＭ〜５００ｎＭで分析し（図８Ａ）、モノマーは６．４ｎＭ〜４μＭで分析した（図８Ｂ）。次に、酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＷＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２複合体の濃度に対して各ヒストグラムに関してプロットした。非線形回帰分析を使用して値を正規化し、ディマー（ｄｉｍｍｅｒ）及びモノマーに関して、２５ｎＭ及び２４０ｎＭのＫＤ，ａｐｐ値をそれぞれ決定した（図８Ｃ及び８Ｄ）。したがって、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１はナノモル親和性を示した。
【０１８３】
実施例８
可溶性高親和性ＷＴ１  ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１の結合分析
ＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ｓｃＴｖが高い親和性でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に特異的に結合することをさらに示すために、可溶性形態のＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ｓｃＴｖを、大腸菌封入体及びＣ末端ＢｉｒＡタグを介したビオチン化から発現させ、再折り畳みした（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０４，４９−５５）。ヒト細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）を、１μＭのＴａｘ、ＭＡＲＴ−１、またはＷＴ１ペプチドと共に定温放置し、洗浄した。ペプチドを事前添加していないＴ２細胞（図９Ａ）、または陰性ペプチドＴａｘを事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｂ）、ヌルペプチドＭＡＲＴ−１を事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｃ）、ＷＴ１を事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｄ）上で滴定した。細胞を洗浄し、ＳＡ−ＰＥと共に定温放置し、フローサイトメトリーによって分析した。ＷＴ１ペプチドを添加した細胞のみがＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲによって結合され（図９Ａ〜Ｄ）、可溶性ＴＣＲはＷＴ１に対して特異的であることを示した。ＷＴ１滴定のＴＣＲ濃度に対するＭＦＩのプロットの非線形回帰は、可溶性ＴＣＲが２６０ｎＭの最小ＫＤ値を示すことを示した（図９Ｅ）。
【０１８４】
実施例９
ＷＴ１抗原に対する改善された親和性に関する単離されたＴＣＲの配列分析
ＷＴ１特異性（Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１）１本鎖ＴＣＲの配列が、単離したプラスミドから決定され、図１に示される。Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１のＶβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、２１、２１、３、及び３に記載され、Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１のＶα鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、２２、４、２、及び４に記載される。Ｄ１３．０．１は、最終的な親和性成熟ｓｃＴＣＲ  Ｄ１３．１．１（配列番号５）からＣＤＲ１α突然変異体を除去することによって構築されたことに留意されたい。図１の下線付きのアミノ酸位置は、安定化突然変異のための変異性ライブラリ選択から生じた突然変異を示す。ボックス内のアミノ酸位置は、ＣＤＲライブラリから選択された親和性強化突然変異体を示す。
【０１８５】
実施例１０
ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞におけるＷＴ１−Ｐ２２、ＷＴ１−Ｄ１３．１、ＷＴ１−Ｄ１３．０．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲのインビトロ活性
Ｔ細胞における異なるＷＴ１特異性ＴＣＲの活性を評定するために、ＣＤ８（図１０Ａ）及びＣＤ４（図１０Ｂ）を、ＡＡＤ遺伝子組み換えマウスから単離した（これらは、ＨＬＡ−Ａ２のα１及びα２ドメインならびにマウスＤｂのα３ドメインからなるハイブリッドクラスＩ遺伝子を有するマウスであり、これらのＡＡＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である）。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体に結合したビーズを用いて細胞を活性化させ、次に、Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０（６）：６３４−４４に説明される通り、ＷＴ１−Ｐ２２、ＷＴ１−Ｄ１３．１、ＷＴ１−Ｄ１３．０．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ＴＣＲを形質導入した（配列は、Ｄ１３安定化突然変異、Ｖβ  Ｆ４８Ｓ、及びＤ５１Ｇを含有しなかった）。Ｔ細胞を、ＡＡＤマウスに由来する脾細胞のコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎ）Ａ刺激によって調製した異なる濃度のペプチドＷＴ１及びＡＡＤ芽細胞と共に定温放置した。２４時間の定温放置後、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ濃度に関して上清を分析した。ＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｄ１３．０．１及びＤ１３．１．１  ＴＣＲによって最も高い活性を示した（図１０Ａ）。ＣＤ４  Ｔ細胞は、Ｄ１３．１．１  ＴＣＲによってのみ活性化され、Ｄ１３．１．１はＣＤ８とは独立に活性を媒介し得ることを示している（図１０Ｂ）。ＭＡＲＴ１などの他のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドとの反応性は観察されなかった。
【０１８６】
実施例１１
ＣＤ８  Ｔ細胞中のＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ＴＣＲは、ＷＴ１に構造的に類似したヒトペプチドと反応性ではない
高親和性ＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ＴＣＲの特異性をさらに決定するために、ＷＴ１ペプチドに構造的に類似したペプチドによるインビトロ活性を評定した。ＷＴ１ペプチドに構造的に類似したペプチドに関して、ＷＴ１の９個の残基における保存的突然変異に基づいてプロテオーム探索を実施した。次に、予測アルゴリズムを介してＨＬＡ−Ａ２に対する結合能力に関してヒトプロテオーム中に存在するペプチドにアクセスした。最も高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測された１０個のペプチド（図１１）を合成し、高親和性ＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ＴＣＲを形質導入した活性化されたＣＤ８  Ｔ細胞に対する能力に関して試験した。これらのペプチドのいずれも活性を示さず、このＴＣＲは、これらの１０個の構造的に類似したペプチドと共に提示されるときに特異性を維持することを示唆している。
【０１８７】
実施例１２
ＷＴ１、ＷＴ１−Ｄ１３．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１  ＴＣＲの治療的フォーマット
より高い親和性のＴＣＲは、対応する抗原を発現する細胞を標的とするために種々のフォーマットにおいて使用され得ることは、現在よく知られている。したがって、上記に示される改変戦略から発生されるＴＣＲは、図１２に例証される通り、可溶性形態で、または養子Ｔ細胞療法のためのＴＣＲ遺伝子療法においてのいずれかで使用され得ることは、明らかである。
【０１８８】
材料及び方法
抗体、ペプチド：ＨＬＡ−Ａ２、ＭＡＣＳ、及びフローサイトメトリー試薬
酵母表面発現を検出するために使用される抗体としては、抗ＨＡエピトープタグ（クローン  ＨＡ．１１、Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ｈＶβ３  ＦＩＴＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＣＨ９２、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗ｈＶβ３．１  ＦＩＴＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ  ８Ｆ１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ｈＶβ２０抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＥＬＬ１．４、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、我々の実験室で発生された抗Ｖα２モノクローナル抗体（データは示されていない）、ヤギ抗マウスＩｇＭ  ＡＰＣ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ：ＰＥ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及びＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）が挙げられる。
【０１８９】
ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチド［ＷＴ１２６−１３４：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号６）］を、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈｅｒｓｈｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、標準的なＦ−ｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学によって合成した。ＦＡＣＳ及びフローサイトメトリー分析のために、組み換え可溶性ダイマーＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質（ＢＤ（商標）ＤｉｍｅｒＸ）を使用した。加えて、ＵＶ光下でのＵＶ開裂可能ペプチドの別のＨＬＡ．Ａ２制限性ペプチドとの交換によって発生させたモノマーＨＬＡ．Ａ２−ビオチン試薬を、フローサイトメトリー及びＭＡＣＳ選択のために利用した（Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，１，１１２０−１１３２、Ｔｏｅｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１２，２４６−２５１）。
【０１９０】
酵母ディスプレイベクターにおけるｓｃＴｖのクローン化及び発現
ＴＣＲ可変領域断片（ｓｃＴｖ）を、Ｔｒｐ培地中の増殖を可能にするガラクトース誘導性ＡＧＡ２融合体を含有する酵母ディスプレイプラスミドｐＣＴ３０２（Ｖβ−Ｌ−Ｖα）中で発現させた（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２８，４３０−４４４）。ｓｃＴｖ遺伝子の誘導は、形質転換されたＥＢＹ１００酵母細胞の選択媒体中での定常期への増殖、続いてガラクトース含有培地への移入に関与する。テンプレートＷＴ１  １本鎖ＴＣＲ遺伝子を、構築物のＶα２ドメイン中にＦ４９Ｓ突然変異を有する状態でＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって合成した（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２４，３６１−３７２）。
【０１９１】
ＷＴ１特異性ＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬクローンから単離し（Ｐｈｉｌｌｉｐ  ＧｒｅｅｎｂｅｒｇからのＷＴ１に対するＴＣＲ遺伝子、例えば、Ｄｏｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１７（４），７４２）、その遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成し、１本鎖フォーマット（Ｖβ−リンカー−Ｖα）としてクローン化し、酵母の表面上での発現のために酵母ディスプレイベクター内へ導入した。ｓｃＴｖｓｈは、リンカー領域ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号８）によって付着される可変的な含有物（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ）で構成された（Ｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９，４７５９−４７６３、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０２，１９０３３−１９０３８、Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２４，３６１−３７２）。ｓｃＴｖを、ｐＣＴ３０２のＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位内へ導入した。
【０１９２】
変異したｓｃＴｖ酵母ディスプレイライブラリの発生、ディスプレイ、及び選択
変異性のＰＣＲを使用して、これまでに説明されている通りに無作為突然変異を発生させた（Ｒｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−９１６）。同時に４〜５個の隣接するコドンにわたる重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲによって、ＣＤＲ１及び３ライブラリを発生させた（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。
【０１９３】
ＷＴ１−Ｄ１３  ＣＤＲ１αライブラリのために、以下のプライマー対を利用してｐｒｅ−ＳＯＥ  ＰＣＲ生成物を発生させた：５’−ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＴＡＴ−３’（Ｓｐｌｉｃｅ  ４Ｌ）（配列番号９）及び５’−ＡＣＧ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ−３’（配列番号１０）、ならびに５’−ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＣＧ−３’（配列番号１１）及び５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’（Ｔ７）（配列番号１２）。各対応するＰｒｅ−ＳＯＥを用いて、Ｔ７及びＳｐｌｉｃｅ  ４Ｌの両方に沿ってＳＯＥ  ＰＣＲを実施した。
【０１９４】
ＷＴ１−Ｄ１３．１  ＣＤＲ３ライブラリのために、以下のプライマー対を利用して、４つのライブラリの各々に関してｐｒｅ−ＳＯＥ  ＰＣＲ生成物を発生させた：β１：  ５’−ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＴＡＴ−３’（Ｓｐｌｉｃｅ  ４Ｌ）（配列番号９）、及び５’−ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ
ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１４）及び５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’（Ｔ７）（配列番号１２）；β２：Ｓｐｌｉｃｅ  ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ−３’（配列番号１５）、及び５’−ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１６）及びＴ７（配列番号１２）；α１：Ｓｐｌｉｃｅ  ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ
ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＡＴＧ−３’（配列番号１８）及びＴ７（配列番号１２）；α２：Ｓｐｌｉｃｅ  ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ−３’（配列番号１９）、及び５’−ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＡＴＧ−３’（配列番号２０）及びＴ７（配列番号１２）。
【０１９５】
ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ消化ｐＣＴ３０２に沿って変異性またはＳＯＥ  ＰＣＲ生成物を電気穿孔することにより、ＥＢＹ１００酵母における同種組み換えによって酵母ライブラリを作製した（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。ライブラリを、ガラクトース含有培地（ＳＧ−ＣＡＡ）内に４８時間誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、抗体またはペプチド：ＭＨＣ試薬を用いて図４Ａ、５Ａ、６Ａ、８Ａ、及び９Ａに示される濃度で染色した。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、最も蛍光であった細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速ソーターを使用してか、またはＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）上でＭＡＣＳ  ＬＳカラムによって選択した。単離したクローンの熱安定性を試験するために、染色プロトコルの前に酵母を高温で３０分間定温放置した（データは示されていない）。
【０１９６】
高親和性クローンの単離及び染色
選択の後、限界希釈物をプレーティングすることによってライブラリクローンを単離した。コロニーを増殖させ、ガラクトース含有培地（ＳＧ−ＣＡＡ）内に４８時間誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、種々の濃度のペプチド／ＨＬＡ．Ａ２  ＤｉｍｅｒＸ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体、または種々の濃度のＵＶ交換ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２、ＳＡ−ＰＥを用いて染色した。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメータで分析した。
【０１９７】
Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミドを回収し、Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）ＤＨ５α（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への熱ショック形質転換により大腸菌内へ導入した。大腸菌細胞を増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。個々のクローンの配列を、サンガー法シーケンシングによって決定した。
【０１９８】
参照による援用及び変異形態に関する記載
【０１９９】
本明細書に記載されるすべての参考文献、例えば、発行または付与された特許または等価物を含む特許文書、特許出願及び公開、ならびに非特許文献または他の原資料は、各参考文献が本出願において本開示と少なくとも部分的に矛盾しない範囲で、あたかも参照により個々に援用されるかのようにその全体が参照により本明細書に援用され、（例えば、部分的に矛盾する参考文献は、その参考文献の部分的に矛盾する部分を除き参照により援用される）。
【０２００】
本明細書に言及されるすべての特許及び公開は、本開示が付随する当該技術分野の技術者の技術のレベルを示す。本明細書に記載される参考文献は、最先端技術を、場合によりそれらの出願日時点のものを示すようにその全体が参照により本明細書に援用され、この情報が本明細書において用いられ得ることが意図され、また必要に応じて、先行研究における特定の実施形態を除外し（例えば、請求権を放棄する）、本明細書内の開示における方法または材料の特定の包含を伴うことなく最先端の方法または材料を使用する。例えば、化合物が特許請求される場合、本明細書に開示される参考文献中に開示される特定の化合物を含む先行研究において（特に参照される特許文書において）既知である化合物は、特許請求の範囲に含まれるように意図されないことが理解されるべきである。
【０２０１】
本明細書においてマーカッシュ群または他の群分類が使用されるとき、その群のすべての個々の構成員ならびにすべての可能な組み合わせ及び部分的組み合わせは、本開示に個々に含まれるように意図される。
【０２０２】
本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それらは、言及される記載の特長、整数、ステップ、または構成要素の存在を明示するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特長、整数、ステップ、構成要素、またはその群の存在または追加を除外するべきではない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」が、例えば、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）／なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）／から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの文法的に類似の用語に任意選択的に置き換えられて、それによって必ずしも同一の広がりを有するとは限らないさらなる実施形態を説明する、開示の別個の実施形態も包含されるように意図される。明確化のために、本明細書で使用するとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「によって特徴付けられる」と同義語であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で使用するとき、「からなる」は、特許請求の範囲における要素に明示されていない任意の要素、ステップ、構成要素、または成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない（例えば、活性成分に影響を及ぼさない）材料またはステップを除外しない。本明細書における各例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる」、及び「からなる」のうちの任意のものは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。本明細書において例証的に説明される本開示は、本明細書において具体的には開示されない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の不在下で実践されてもよい。
【０２０３】
本開示を、種々の具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して説明してきた。しかしながら、多数の変異形態及び修正形態が本開示の精神及び範囲内でなされ得ることが理解されるべきである。本明細書に具体的に説明されるもの以外の組成物、方法、機器、機器要素、材料、任意選択的な特長、手順、及び技術が、過度の実験に頼ることなく本明細書に広範に開示される通りに本開示の実践に適用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。本明細書に説明される組成物、方法、機器、機器要素、材料、手順、及び技術の当該技術分野において既知であるすべての機能的等価物、ならびにそれらの一部分は、本開示によって包含されるように意図される。範囲が開示される場合はいかなるときも、すべての部分範囲及び個々の値が包含されるように意図される。本開示は、図面に示されるかまたは本明細書に例示されるものを含む、開示される実施形態によって限定されるべきではなく、それらは限定のためではなく例または例証のために付与されている。本明細書に提供されるいくつかの参考文献は、追加の開始材料、追加の合成方法、及び追加の分析方法、及び本開示の追加の使用に関する詳細を提供するために、参照により本明細書に援用される。
【０２０４】
当業者は、本開示が目標を実行し、記述される目的及び利点ならびに本明細書に本来備わる目的及び利点を得るように十分に適応されることを、容易に理解するであろう。好ましい実施形態の目下の代表的なものとして本明細書に説明される組成物及び方法及び付属の方法は、例示的であり、本開示の範囲に対する限定であるように意図されない。本開示の趣旨に包含されるそれらの変化及び他の使用は、当業者には想到されるであろう。
参考文献
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６．  Ｂａｒｇｏｕ  Ｒ．，Ｌｅｏ  Ｅ．，Ｚｕｇｍａｉｅｒ  Ｇ．，Ｋｌｉｎｇｅｒ  Ｍ．，Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  Ｍ．，Ｋｎｏｐ  Ｓ．，Ｎｏｐｐｅｎｅｙ  Ｒ．，Ｖｉａｒｄｏｔ  Ａ．，Ｈｅｓｓ  Ｇ．，Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｍ．，Ｅｉｎｓｅｌｅ  Ｈ．，Ｂｒａｎｄｌ  Ｃ．，Ｗｏｌｆ  Ａ．，Ｋｉｒｃｈｉｎｇｅｒ  Ｐ．，Ｋｌａｐｐｅｒｓ  Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ．，Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ  Ｇ．，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ．，Ｂａｅｕｅｒｌｅ  Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．（２００８）Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｅｎｇａｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９７４−７．
７．  Ｂｅｎａｔｕｉｌ  Ｌ．，Ｐｅｒｅｚ  Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｌｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｈｓｉｅｈ  Ｃ．Ｍ．（２０１０）Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３，１５５−９．
８．  Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．，Ｈａｒｄｍａｎ  Ｋ．Ｄ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｊ．Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ．，Ｋａｕｆｍａｎ  Ｂ．Ｍ．，Ｌｅｅ  Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ  Ｔ．，Ｐｏｐｅ  Ｓ．Ｈ．，Ｒｉｏｒｄａｎ  Ｇ．Ｓ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ  Ｍ．（１９８８）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６．
９．  Ｂｏｄｅｒ  Ｅ．Ｔ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．（１９９７）Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，５５３−５５７．
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１１．  Ｂｏｏｎ  Ｔ．ａｎｄ  Ｏｌｄ  Ｌ．Ｊ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，６８１−３．
１２．  Ｂｏｒｂｕｌｅｖｙｃｈ  Ｏ．Ｙ．，Ｓａｎｔｈａｎａｇｏｐｏｌａｎ  Ｓ．Ｍ．，Ｈｏｓｓａｉｎ  Ｍ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｍ．（２０１１）ＴＣＲｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｖｉａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７，２４５３−６３．
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１５．  Ｃｈｅｅｖｅｒ  Ｍ．Ａ．，Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｊ．Ｐ．，Ｆｅｒｒｉｓ  Ａ．Ｓ．，Ｆｉｎｎ  Ｏ．Ｊ．，Ｈａｓｔｉｎｇｓ  Ｂ．Ｍ．，Ｈｅｃｈｔ  Ｔ．Ｔ．，Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．，Ｐｒｉｎｄｉｖｉｌｌｅ  Ｓ．Ａ．，Ｖｉｎｅｒ  Ｊ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｅｒ  Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ  Ｌ．Ｍ．（２００９）Ｔｈｅ  ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ａ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｐｉｌｏｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５，５３２３−３７．
１６．  Ｃｈｅｒｖｉｎ  Ａ．Ｓ．，Ａｇｇｅｎ  Ｄ．Ｈ．，Ｒａｓｅｍａｎ  Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００８）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈｅｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３９，１７５−８４．
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１８．  Ｃｏｌｂｙ  Ｄ．Ｗ．，Ｋｅｌｌｏｇｇ  Ｂ．Ａ．，Ｇｒａｆｆ  Ｃ．Ｐ．，Ｙｅｕｎｇ  Ｙ．Ａ．，Ｓｗｅｒｓ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．（２００４）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｙ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３８８，３４８−５８．
１９．  Ｄａｖｉｓ  Ｍ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ  Ｐ．Ｊ．（１９８８）Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４，３９５−４０２．
２０．  Ｄａｖｉｓ  Ｍ．Ｍ．，Ｂｏｎｉｆａｃｅ  Ｊ．Ｊ．，Ｒｅｉｃｈ  Ｚ．，Ｌｙｏｎｓ  Ｄ．，Ｈａｍｐｌ  Ｊ．，Ａｒｄｅｎ  Ｂ．ａｎｄ  Ｃｈｉｅｎ  Ｙ．（１９９８）Ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｐｈａ  ｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，５２３−５４４．２１．  Ｄｉｎｇ  Ｙ．Ｈ．，Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｍ．，Ｇａｒｂｏｃｚｉ  Ｄ．Ｎ．，Ｂｉｄｄｉｓｏｎ  Ｗ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｄ．Ｃ．（１９９９）Ｆｏｕｒ  Ａ６−ＴＣＲ／ｐｅｐｔｉｄｅ／ＨＬＡ−Ａ２  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｔｈａｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖｅｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｎｅａｒｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，４５−５６．
２２．  Ｆｏｏｔｅ  Ｊ．ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎ  Ｈ．Ｎ．（２０００）Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｅｉｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，１０６７９−８１．
２３．  Ｇａｒｂｏｃｚｉ  Ｄ．Ｎ．，Ｇｈｏｓｈ  Ｐ．，Ｕｔｚ  Ｕ．，Ｆａｎ  Ｑ．Ｒ．，Ｂｉｄｄｉｓｏｎ  Ｗ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｄ．Ｃ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ａ２．Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，１３４−１４１．
２４．  Ｇａｒｃｉａ  Ｋ．Ｃ．，Ａｄａｍｓ  Ｊ．Ｊ．，Ｆｅｎｇ  Ｄ．ａｎｄ  Ｅｌｙ  Ｌ．Ｋ．（２００９）Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｂｉａｓ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｉｓ  ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇｌｙ  ｓｉｍｐｌｅ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，１４３−７．
２５．  Ｈａｉｄａｒ  Ｊ．Ｎ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂ．，Ｙｕ  Ｙ．，Ｔｏｎｇ  Ｗ．，Ｌｉ  Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｎｇ  Ｚ．（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｎｅａｒｌｙ  １００−ｆｏｌｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐＭＨＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７４，９４８−６０．
２６．  Ｈａｒｋｉｏｌａｋｉ  Ｍ．，Ｈｏｌｍｅｓ  Ｓ．Ｌ．，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  Ｐ．，Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｗ．，Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ．Ｔ．，ＭｃＭａｈｏｎ  Ｒ．，Ｆｒｉｅｓｅ  Ｍ．Ａ．，ｖａｎ  Ｂｏｘｅｌ  Ｇ．，Ｅｔｚｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  Ｒ．，Ｔｚａｒｔｏｓ  Ｊ．Ｓ．，Ｋｒａｎｃ  Ｋ．，Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｓ．，Ｈａｒｌｏｓ  Ｋ．，Ｍｅｌｌｉｎｓ  Ｅ．Ｄ．，Ｐａｌａｃｅ  Ｊ．，Ｅｓｉｒｉ  Ｍ．Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  Ｐ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．Ｙ．ａｎｄ  Ｆｕｇｇｅｒ  Ｌ．（２００９）Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０，３４８−５７．
２７．  Ｈａｗｓｅ  Ｗ．Ｆ．，Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｍ．Ｍ．，Ｊｏｙｃｅ  Ｍ．Ｖ．，Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｌ．Ｍ．，Ｈｏｓｓａｉｎ  Ｍ．，Ｒｙａｎ  Ｖ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂ．Ｇ．，Ｗｅｎｇ  Ｚ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｍ．（２０１２）Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｄｒｉｖｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８８，５８１９−２３．
２８．  Ｈｏｌｌｅｒ  Ｐ．Ｄ．，Ｃｈｌｅｗｉｃｋｉ  Ｌ．Ｋ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００３）ＴＣＲｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐＭＨＣ  ｓｈｏｗ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，５５−６２．
２９．  Ｈｏｌｌｅｒ  Ｐ．Ｄ．，Ｈｏｌｍａｎ  Ｐ．Ｏ．，Ｓｈｕｓｔａ  Ｅ．Ｖ．，Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ  Ｓ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，５３８７−９２．
３０．  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  Ｔ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．（１９９３）”Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，６４４４−８．
３１．  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，１１０５−１６．
３２．  ＪＪａｒｖｉｓ  Ｌ．Ｍ．（２０１２）Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ９０，１２−１８．
３３．  Ｋｅｓｓｅｌｓ  Ｈ．Ｗ．，ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｍ  Ｍ．Ｄ．，Ｓｐｉｔｓ  Ｈ．，Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  Ｅ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｔ．Ｎ．（２０００）Ｃｈａｎｇｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，１４５７８−８３．
３４．  Ｋｉｅｋｅ  Ｍ．Ｃ．，Ｓｈｕｓｔａ  Ｅ．Ｖ．，Ｂｏｄｅｒ  Ｅ．Ｔ．，Ｔｅｙｔｏｎ  Ｌ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（１９９９）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ−  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，５６５１−６．
３５．  Ｌａｕｃｋ  Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ａ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  Ｇ．Ｆ．，Ｈｕｍｐｈｒｉｓ  Ｅ．Ｌ．ａｎｄ  Ｋｏｒｔｅｍｍｅ  Ｔ．（２０１０）ＲｏｓｅｔｔａＢａｃｋｒｕｂ−−ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，Ｗ５６９−７５．
３６．  Ｌｉ  Ｙ．，Ｍｏｙｓｅｙ  Ｒ．，Ｍｏｌｌｏｙ  Ｐ．Ｅ．，Ｖｕｉｄｅｐｏｔ  Ａ．Ｌ．，Ｍａｈｏｎ  Ｔ．，Ｂａｓｔｏｎ  Ｅ．，Ｄｕｎｎ  Ｓ．，Ｌｉｄｄｙ  Ｎ．，Ｊａｃｏｂ  Ｊ．，Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｏｕｌｔｅｒ  Ｊ．Ｍ．（２００５）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，３４９−５４．
３７．  Ｌｉｄｄｙ  Ｎ．，Ｂｏｓｓｉ  Ｇ．，Ａｄａｍｓ  Ｋ．Ｊ．，Ｌｉｓｓｉｎａ  Ａ．，Ｍａｈｏｎ  Ｔ．Ｍ．，Ｈａｓｓａｎ  Ｎ．Ｊ．，Ｇａｖａｒｒｅｔ  Ｊ．，Ｂｉａｎｃｈｉ  Ｆ．Ｃ．，Ｐｕｍｐｈｒｅｙ  Ｎ．Ｊ．，Ｌａｄｅｌｌ  Ｋ．，Ｇｏｓｔｉｃｋ  Ｅ．，Ｓｅｗｅｌｌ  Ａ．Ｋ．，Ｌｉｓｓｉｎ  Ｎ．Ｍ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｎ．Ｅ．，Ｍｏｌｌｏｙ  Ｐ．Ｅ．，Ｌｉ  Ｙ．，Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｂ．Ｊ．，Ｓａｍｉ  Ｍ．，Ｂａｓｔｏｎ  Ｅ．Ｅ．，Ｔｏｄｏｒｏｖ  Ｐ．Ｔ．，Ｐａｓｔｏｎ  Ｓ．Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓ  Ｒ．Ｅ．，Ｈａｒｐｅｒ  Ｊ．Ｖ．，Ｄｕｎｎ  Ｓ．Ｍ．，Ａｓｈｆｉｅｌｄ  Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ．，ＭｃＧｒａｔｈ  Ｙ．，Ｐｌｅｓａ  Ｇ．，Ｊｕｎｅ  Ｃ．Ｈ．，Ｋａｌｏｓ  Ｍ．，Ｐｒｉｃｅ  Ｄ．Ａ．，Ｖｕｉｄｅｐｏｔ  Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ｄ．，Ｓｕｔｔｏｎ  Ｄ．Ｈ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．（２０１２）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＴＣＲ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．
３８．  Ｌｉｔｖａｋ−Ｇｒｅｅｎｆｅｌｄ  Ｄ．ａｎｄ  Ｂｅｎｈａｒ  Ｉ．（２０１２）Ｒｉｓｋｓ  ａｎｄ  ｕｎｔｏｗａｒｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．
３９．  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（１９９９）Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０，４１７−４２２．
４０．  Ｍａｒｒａｃｋ  Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ−Ｂｒｏｗｎｅ  Ｊ．Ｐ．，Ｄａｉ  Ｓ．，Ｇａｐｉｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ｋａｐｐｌｅｒ  Ｊ．Ｗ．（２００８）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＴＣＲ−ＭＨＣ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６，１７１−２０３．
４１．  Ｍａｒｓｈ  Ｓ．Ｇ．Ｅ．，Ｐａｒｈａｍ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ  Ｌ．Ｄ．（２０００）Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．
４２．  Ｍａｓｏｎ  Ｄ．（１９９８）Ａ  ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９，３９５−４０４．
４３．  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｂ．Ｒ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ  Ｓ．Ｊ．，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．，Ｈｕａｎｇ  Ｆ．，Ｗｕ  Ｘ．，Ｓｎｙｄｅｒ  Ｗ．Ｂ．，Ｃｒｏｎｅｒ  Ｌ．Ｊ．，Ｗａｎｇ  Ｎ．，Ａｍａｔｕｃｃｉ  Ａ．，Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｇｌａｓｅｒ  Ｓ．Ｍ．（２０１０）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｃＦｖｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３，５４９−５７．
４４．  Ｍｏｌｌｏｙ  Ｐ．Ｅ．，Ｓｅｗｅｌｌ  Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．（２００５）Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５，４３８−４３．
４５．  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｋ．（２０１２）Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
４６．  Ｎｏｌｄ  Ｍ．Ｆ．，Ｎｏｌｄ−Ｐｅｔｒｙ  Ｃ．Ａ．，Ｚｅｐｐ  Ｊ．Ａ．，Ｐａｌｍｅｒ  Ｂ．Ｅ．，Ｂｕｆｌｅｒ  Ｐ．ａｎｄ  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  Ｃ．Ａ．（２０１０）ＩＬ−３７  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，１０１４−２２．４７．  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．，Ｈａｓｓａｎ  Ｒ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，５５９−６５．
４８．  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂ．Ｇ．，Ｈａｉｄａｒ  Ｊ．Ｎ．，Ｙｕ  Ｙ．ａｎｄ  Ｗｅｎｇ  Ｚ．（２０１０）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌ  ｈｉｇｈｌｙ  ｎｏｎａｄｄｉｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，７０５０−９．
４９．  Ｐｏｒｔｅｒ  Ｄ．Ｌ．，Ｌｅｖｉｎｅ  Ｂ．Ｌ．，Ｋａｌｏｓ  Ｍ．，Ｂａｇｇ  Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｎｅ  Ｃ．Ｈ．（２０１１）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５，７２５−３３．
５０．  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｖａｌｇｅ−Ａｒｃｈｅｒ  Ｖ．Ｅ．（２００７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６，３４９−５６．
５１．  Ｒｉｃａｒｔ  Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｔｏｌｃｈｅｒ  Ａ．Ｗ．（２００７）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｓｉｇｈｔ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ４，２４５−５５．
５２．  Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｓ．Ａ．，Ａｇｇｅｎ  Ｄ．Ｈ．，Ｄｏｓｓｅｔｔ  Ｍ．Ｌ．，Ｄｏｎｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ  Ｐ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｎａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＶａｌｐｈａＶｂｅｔａ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６，９０２−１６．
５３．  Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００７）Ｄｉｓｐｌａｙ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ  ２４，３６１−７３．
５４．  Ｒｏｃｋ  Ｋ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ａ．Ｌ．（１９９９）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７，７３９−７９．
５５．  Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｍ．Ｇ．，Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｉ．Ａ．（２００６）Ｈｏｗ  ＴＣＲｓ  ｂｉｎｄ  ＭＨＣｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，４１９−６６．
５６．  Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  Ｒ．ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｉ．（２００９）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，２１５−２３．
５７．  Ｓａｍｉ  Ｍ．，Ｒｉｚｋａｌｌａｈ  Ｐ．Ｊ．，Ｄｕｎｎ  Ｓ．，Ｍｏｌｌｏｙ  Ｐ．，Ｍｏｙｓｅｙ  Ｒ．，Ｖｕｉｄｅｐｏｔ  Ａ．，Ｂａｓｔｏｎ  Ｅ．，Ｔｏｄｏｒｏｖ  Ｐ．，Ｌｉ  Ｙ．，Ｇａｏ  Ｆ．，Ｂｏｕｌｔｅｒ  Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．（２００７）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｖｅａｌ  ｎａｔｉｖｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０，３９７−４０３．
５８．  Ｓｃｈｒａｍａ  Ｄ．，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｊ．Ｃ．（２００６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，１４７−５９．
５９．  Ｓｃｏｔｔ  Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−９０．
６０．  Ｓｋｏｗｅｒａ  Ａ．，Ｅｌｌｉｓ  Ｒ．Ｊ．，Ｖａｒｅｌａ−Ｃａｌｖｉｎｏ  Ｒ．，Ａｒｉｆ  Ｓ．，Ｈｕａｎｇ  Ｇ．Ｃ．，Ｖａｎ−Ｋｒｉｎｋｓ  Ｃ．，Ｚａｒｅｍｂａ  Ａ．，Ｒａｃｋｈａｍ  Ｃ．，Ａｌｌｅｎ  Ｊ．Ｓ．，Ｔｒｅｅ  Ｔ．Ｉ．，Ｚｈａｏ  Ｍ．，Ｄａｙａｎ  Ｃ．Ｍ．，Ｓｅｗｅｌｌ  Ａ．Ｋ．，Ｕｎｇｅｒ  Ｗ．Ｗ．，Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ  Ｊ．Ｗ．，Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  Ｆ．，Ｒｏｅｐ  Ｂ．Ｏ．ａｎｄ  Ｐｅａｋｍａｎ  Ｍ．（２００８）ＣＴＬｓ  ａｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，３３９０−４０２．
６１．  Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｏｒｔｅｍｍｅ  Ｔ．（２００８）Ｂａｃｋｒｕｂ−ｌｉｋｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８０，７４２−５６．
６２．  Ｓｏｏ  Ｈｏｏ  Ｗ．Ｆ．，Ｌａｃｙ  Ｍ．Ｊ．，Ｄｅｎｚｉｎ  Ｌ．Ｋ．，Ｖｏｓｓ  Ｅ．Ｗ．Ｊ．，Ｈａｒｄｍａｎ  Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，４７５９−４７６３．
６３．  Ｓｔａｒｒ  Ｔ．Ｋ．，Ｊａｍｅｓｏｎ  Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｈｏｇｑｕｉｓｔ  Ｋ．Ａ．（２００３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，１３９−７６．６４．  Ｓｔａｒｗａｌｔ  Ｓ．Ｅ．，Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ  Ｅ．Ｌ．，Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００３）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＭＨＣ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｙ  ｙｅａｓｔ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １６，１４７−５６．
６５．  Ｓｔｏｎｅ  Ｊ．Ｄ．，Ｃｈｅｒｖｉｎ  Ａ．Ｓ．，Ａｇｇｅｎ  Ｄ．Ｈ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２０１２）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５０３，１８９−２２２．
６６．  Ｓｔｏｎｅ  Ｊ．Ｄ．，Ｙｉｎ  Ｙ．，Ｍｏ  Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ  Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｎｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ  Ｐ．Ｍ．，Ｍａｒｉｕｚｚａ  Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２０１２）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋａｕｍａｙａ  Ｐ．）．ＩｎＴｅｃｈ．
６７．  Ｓｔｒｏｎｃｅｋ  Ｄ．Ｆ．，Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．，Ｃｈｅｅｖｅｒ  Ｍ．Ａ．，Ｃｈｉｌｄｓ  Ｒ．Ｗ．，Ｄｕｄｌｅｙ  Ｍ．Ｅ．，Ｆｌｙｎｎ  Ｐ．，Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ．，Ｈｅａｔｈ  Ｊ．Ｒ．，Ｋａｌｏｓ  Ｍ．，Ｍａｒｉｎｃｏｌａ  Ｆ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｓ．，Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ  Ｇ．，Ｐｏｗｅｌｌ  Ｄ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｒａｏ  Ｍ．，Ｒｅｓｔｉｆｏ  Ｎ．Ｐ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．，Ｏ’Ｓｈｅａ  Ｊ．ａｎｄ  Ｍｅｌｉｅｆ  Ｃ．Ｊ．（２０１２）Ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｍｍｉｔ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １０，４８．
６８．  Ｓｗｅｒｓ  Ｊ．Ｓ．，Ｋｅｌｌｏｇｇ  Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．（２００４）Ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２，ｅ３６．
６９．  Ｔａｙａｌ  Ｖ．ａｎｄ  Ｋａｌｒａ  Ｂ．Ｓ．（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−−ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５７９，１−１２．
７０．  Ｔｈａｋｕｒ  Ａ．ａｎｄ  Ｌｕｍ  Ｌ．Ｇ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，３４０−９．
７１．  Ｔｏｎｅｇａｗａ  Ｓ．（１９８８）Ｎｏｂｅｌ  ｌｅｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ−−１９８７．Ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４，２５３−６５．
７２．  Ｔｓｏｍｉｄｅｓ  Ｔ．Ｊ．，Ａｌｄｏｖｉｎｉ  Ａ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ．Ｐ．，Ｗａｌｋｅｒ  Ｂ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎ  Ｈ．Ｎ．（１９９４）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０，１２８３−９３．
７３．  Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄ．Ｊ．，Ｒｉｔｔｅｒ  Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．Ｊ．（１９９７）Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５，４３−５４．
７４．  Ｕｔｚ  Ｕ．，Ｂａｎｋｓ  Ｄ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｂｉｄｄｉｓｏｎ  Ｗ．Ｅ．（１９９６）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １（ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０，８４３−５１．
７５．  Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  Ａ．，Ｍｏｌｌｏｙ  Ｐ．Ｅ．，Ｄｕｎｎ  Ｓ．Ｍ．，Ｌｉ  Ｙ．，Ｓｕｈｏｓｋｉ  Ｍ．Ｍ．，Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｒ．Ｇ．，Ｍｉｌｉｃｉｃ  Ａ．，Ｍａｈｏｎ  Ｔ．，Ｓｕｔｔｏｎ  Ｄ．Ｈ．，Ｌａｕｇｅｌ  Ｂ．，Ｍｏｙｓｅｙ  Ｒ．，Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｂ．Ｊ．，Ｖｕｉｄｅｐｏｔ  Ａ．，Ｐｕｒｂｈｏｏ  Ｍ．Ａ．，Ｃｏｌｅ  Ｄ．Ｋ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｒ．Ｅ．，Ｊｕｎｅ  Ｃ．Ｈ．，Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．，Ｓｅｗｅｌｌ  Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｒｉｌｅｙ  Ｊ．Ｌ．（２００８）Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，１３９０−５．
７６．  Ｗｅｂｅｒ  Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｎｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ  Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ  Ｄ．Ｍ．（２００５）Ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｉｎｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２，１９０３３−８．
７７．  Ｗｏｎｇ  Ｒ．Ｌ．，Ｌｉｕ  Ｂ．，Ｚｈｕ  Ｘ．，Ｙｏｕ  Ｌ．，Ｋｏｎｇ  Ｌ．，Ｈａｎ  Ｋ．Ｐ．，Ｌｅｅ  Ｈ．Ｉ．，Ｃｈａｖａｉｌｌａｚ  Ｐ．Ａ．，Ｊｉｎ  Ｍ．，Ｗａｎｇ  Ｙ．，Ｒｈｏｄｅ  Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ  Ｈ．Ｃ．（２０１１）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ
Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２４，３７３−８３．
米国特許
第７，５６９，３５７号、２００４年２月２０日出願、２００９年８月４日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＣＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．
第７，４６５，７８７号、２００３年１２月１６日出願、２００８年１２月１６日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第６，７５９，２４３号、２０００年１２月６日出願、２００４７月６日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＣＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．
第６，６９９，６５８号、１９９８年１月２０日出願、２００４年３月２日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第６，６９６，２５１号、２０００年１１月２８日出願、２００４年２月２４日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第６，４２３，５３８号、２０００年１１月２８日出願、２００２年７月２３日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第６，３００，０６５号、１９９８年８月２６日出願、２００１年１０月９日発行、Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第８，１４３，３７６号、２００５年５月１８日出願、２０１２年３月２７日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＮＹ−ＥＳＯ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．
第８，０８８，３７９号、２００７年９月２６日出願、２０１２年１月３日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．
第８，０１７，７３０号、２００６年５月１９日出願、２０１１年９月１３日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ−ＨＬＡ−Ａ２４．
第７，７６３，７１８号、２００７年１０月２９日出願、２０１０年７月２７日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．
第７，６６６，６０４号、２００３年７月９日出願、２０１０年２月２３日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．
第７，６０８，４１０号、２００８年１０月７日出願、２００９年１０月２７日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ｕｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．
第７，５６９，６６４号、２００３年１０月３日出願、２００９年８月４日発行、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．
第８，１０５，８３０号、２００２年１１月５日出願、２０１２年１月３１日発行、Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
第６，５３４，６３３号、１９９９年１０月２１日出願、２００３年３月１８日、Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｏｆ．
【図１】
2020007374.tif 000005
【図２】
2020007374.tif 000006
【図３】
2020007374.tif 000007
【図４】
2020007374.tif 000008
【図５】
2020007374.tif 000009
【図６】
2020007374.tif 000010
【図７】
2020007374.tif 000011
【図８−１】
2020007374.tif 000012
【図８−２】
2020007374.tif 000013
【図９】
2020007374.tif 000014
【図１０】
2020007374.tif 000015
【図１１】
2020007374.tif 000016
【図１２】
2020007374.tif 000017
【配列表】
2020007374000001.app
【外国語明細書】
2020007374000001.pdf