(57)【要約】      （修正有）【課題】上皮間葉移行の活性化を効果的に抑制することにより器官又は組織の線維化を効果的に抑制することができ、既に線維化してしまった細胞を本来の正常な形態に戻すことができるため、線維症が進んでいる中期又は末期の症状も治療することができる医薬組成物の提供。【解決手段】化学式１で表されるクロモン誘導体を有効成分として含有する医薬組成物。2020007345.tif 000017（式中R1-R6は特定の置換基を表す）【選択図】図１１
2020007345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されるクロモン誘導体及びその製薬学的に許容される塩から選択され
た化合物を有効成分として含有する、生体の器官または組織の線維化による疾患の予防及
び治療用医薬組成物。
【化１】
2020007345.tif 000016
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、トリフルオロメチル基またはアセ
トキシ基であり、
Ｒ２はメチル基、エチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基または
ベンジル基であり、
Ｒ３は水素、エチル基、アセチル基、アセトキシ基、カルボキシル基、ベンゾイルオキ
シ基または３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキシ基であり、
Ｒ４乃至Ｒ６はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、アセ
トキシ基、カルボキシル基またはベンゾイルオキシ基である。）
【請求項２】
前記疾患が、特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis)、骨髄線維症(myelofib
rosis)、肝線維症(liver fibrosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)よりなる群から選
択された疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｒ１がヒドロキシル基またはメトキシ基であり、
前記Ｒ２がメチル基であり、
前記Ｒ３が水素であり、
前記Ｒ５がヒドロキシル基またはメトキシ基であり、
前記Ｒ４及びＲ６がそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基またはメトキシ基であるこ
とを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記クロモン誘導体が、
２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン
、
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロ
モン、
５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−６−メトキ
シ−クロモン、
５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−メトキシ−クロモン、
５−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン、及
び
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシ−クロ
モンの中から選択されたいずれかであることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロモン誘導体の上皮間葉移行抑制活性を利用した線維症予防及び治療用医
薬組成物としての新規用途に係り、具体的には、クロモン誘導体が上皮間葉移行(Epithel
ial Mesenchymal Transition、ＥＭＴ)を抑制することができることを新たに見出すこと
により、このような活性を利用して線維症の予防及び治療剤として使用する新規用途に関
する。
【背景技術】
【０００２】
線維症(fibrosis)は、再生または発生過程で器官または組織に過度な線維性結合組織が
形成される疾患である。このような線維性結合組織は、正常な線維組織の形成とは対照的
である。器官または組織に線維性結合組織が過剰に形成されると、組織が硬くなり、体液
の流入が減少するなど、生体内で本来の機能を十分に行うことができなくなる。その原因
としては、傷害、炎症、火傷、放射線、化学療法、リンパ浮腫などが知られている。この
ような線維症に起因する問題は、線維性結合組織が形成される位置によって異なるが、主
に肝、分泌器官、肺などが損傷を受ける。線維症には、代表的に、特発性肺線維症(idiop
athic pulmonary fibrosis、ＩＰＦ)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver fib
rosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)がある。
【０００３】
特発性肺線維症は、慢性的に進行する間質性肺疾患の一つであって、病気の経過が良く
なく、未だ証明された治療方法がない疾患である。肺の組織検査の結果、ハニカム形状や
不定な形状などが確認されるときに診断する。徐々に呼吸困難を誘発し、低酸素症または
心筋梗塞により死亡にまで至るなど、経過が良くない。今まで原因として解明されたもの
はないが、環境、ウイルス、遺伝、毒性化合物などの様々な因子により肺に炎症が誘発さ
れ、その炎症が治癒される過程で線維細胞が過剰に増殖して肺に線維化が生じるものと考
えられている。
【０００４】
骨髄線維症は、骨髄組織の線維が過剰発育する疾患であって、血を作る機能が低下し、
赤血球及び白血球の数、これらの作用に変化が起こるようになる。特発性と続発性に区分
される。これらの中でも、特発性の骨髄線維症は、全身骨髄の深刻な線維増殖、肥大症状
を示し、末梢血中に有核赤血球や幼若顆粒球が現れる。その原因は確かではなく、骨髄の
中毒や炎症などがその原因として考えられている。続発性の骨髄線維症は、白血病、悪性
リンパ腫、癌の骨髄転移、化学薬品の中毒などの経過中に生じる。効果的な治療剤は未だ
開発されていない。
【０００５】
肝線維症は、肝硬変症とも呼ばれる。肝線維症は、慢性的な炎症により正常な肝組織が
再生結節などの線維化組織に変わって肝の機能が低下する疾患である。慢性Ｂ型肝炎やＣ
型肝炎、飲み過ぎ、肝毒性物質などにより肝の炎症状態が持続する場合に主に発生する。
治療は、症状の進行を最大限遅らせることを目当てに行われており、その原因に応じて抗
ウイルス剤などが使われているが、原因が異なる場合、その効果は未知数である。
【０００６】
腎臓線維症は、細胞外基質が蓄積されて腎臓に線維化が生じる進行性疾患であり、糸球
体硬化症と尿細管間質性線維症が特徴である。腎臓の線維化により腎臓の機能に副作用が
もたらされる。その原因には外傷、感染、手術、環境的な要因、化学物質、放射線被ばく
などがあり、疼痛、排尿関連問題、吐き気、嘔吐などの症状が生じることがある。薬物や
腎移植によって症状を管理するが、やはり効果的な治療剤の開発が求められる。
【０００７】
一方、Ｇｒａｎｄｅ等は、最近、上皮間葉移行(Epithelial Mesenchymal Transition、
ＥＭＴ)（以下、「ＥＭＴ」という。）の主要調節因子であるＴｗｉｓｔあるいはＳｎａ
ｉｌが腎臓の線維化で重要な役割を担うという研究結果を提示しており、Ｌｏｖｉｓａ等
も、ＥＭＴが腎臓線維症で重要な役割を果たすと提示している。ＥＭＴは、正常細胞が腫
瘍細胞に変わりながら中間段階である細胞骨格の変化により、細胞が移動しやすい間葉細
胞(mesenchymal cell)の形状に遺伝的に再プログラミング(genetic reprogramming)され
る現象をいう。したがって、ＥＭＴ関与タンパク質の発現を抑制すると、腫瘍の転移及び
増殖を抑制することができると考え、様々な研究者が、腫瘍治療剤を開発するために、こ
のようなＥＭＴに関する研究を行っている。このＥＭＴの調節因子としては、Ｔｗｉｓｔ
、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｃｏｌｌａｇｅｎ
１ α１など、約数百個のものが知られている。
【０００８】
Ｓｕｚｕｋｉ等は、ＤＥＣ２（ＢＨＬＨＥ４１）が、このようなＥＭＴ調節因子である
Ｔｗｉｓｔの転写抑制因子であり、その発現を阻害すると、ＥＭＴが活性化されて悪性腫
瘍に転換されることを報告した。また、Ｓａｔｏ等は、ＤＥＣ２が、ＥＭＴ調節因子であ
るＳｌｕｇの発現を抑制し、これにより、ＴＧＦ−βで誘導される悪性腫瘍化を抑制する
ことを報告した。この他にも、様々な研究者等が、ＤＥＣ２などのＥＭＴ調節因子ががん
転移などに関連することを報告している。
【０００９】
このようにＥＭＴ及び該ＥＭＴの調節因子に関する研究は、ほとんど、がんまたは腫瘍
についてのみ行われてきた。しかし、本発明者は、従来の一部の研究結果に基づいてＥＭ
Ｔと線維症との連関性に着目し、ＥＭＴを調節することができれば線維症を予防及び治療
することもできるものと期待している。
【００１０】
一方、クロモン（クロモン(chromone)、クロメン−４−オン(chromen-4-one)、４Ｈ−
クロメン−４−オン(4H-chromen-4-one)）構造を持つ自然化合物には、代表的に、オイパ
チリン(eupatilin)、オウゴニン(wogonin)、ミリセチン(myricetin)などがあり、これら
の中でも、オイパチリンは、ニシヨモギ（ヨモギ、Artemisia asiatica）に含まれる成分
として知られており、従来から主に抗がん効果についての研究が行われてきた。本発明者
は、ＥＭＴと線維症との連関性、及びＤＥＣ２とＥＭＴとの連関性に着目し、オイパチリ
ンが、骨髄細胞から分化されたマクロファージのＤＥＣ２ ｍＲＮＡを上方調節するとい
う観察から、オイパチリンを含むクロモン誘導体の線維症治療剤としての可能性を研究す
るようになった。その結果、このようなクロモン誘導体がＥＭＴを抑制することができる
ことを、細胞モデル及び動物モデルを用いて新たに明らかにし、これにより、ＥＭＴの活
性化による器官または組織の線維化をこれらの化合物が効果的に抑制することができるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Grande MT, Sanchez-Laorden B, Lopez-Blau C, De Frutos CA, Boutet A, Arevalo M, Rowe RG, Weiss SJ, Lopez-Novoa JM, Nieto MA. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 2015 Sep;21(9):989-97.
【非特許文献２】Lovisa S, LeBleu VS, Tampe B, Sugimoto H, Vadnagara K, Carstens JL, Wu CC, Hagos Y, Burckhardt BC, Pentcheva-Hoang T, Nischal H, Allison JP, Zeisberg M, Kalluri R. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 2015 Sep;21(9):998-1009.
【非特許文献３】Suzuki M, Sato F, Bhawal UK. The basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor DEC2 negatively regulates Twist1 through an E-box element. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Dec 12;455(3-4):390-5.
【非特許文献４】Sato F, Kawamura H, Wu Y, Sato H, Jin D, Bhawal UK, Kawamoto T, Fujimoto K, Noshiro M, Seino H, Morohashi S, Kato Y, Kijima H. The basic helix-loop-helix transcription factor DEC2 inhibits TGF-β-induced tumor progression in human pancreatic cancer BxPC-3 cells. Int J Mol Med. 2012 Sep;30(3):495-501.
【非特許文献５】Dong Y, Geng Y, Li L, Li X, Yan X, Fang Y, Li X, Dong S, Liu X, Li X, Yang X, Zheng X, Xie T, Liang J, Dai H, Liu X, Yin Z, Noble PW, Jiang D, Ning W. Blocking follistatin-like 1 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. J Exp Med. 2015 Feb 9;212(2):235-52.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の主な目的は、クロモン誘導体を線維症の予防及び治療剤として使用する新規用
途を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、線維症の予防及び治療のための新規な医薬組成物を提供すること
にある。本発明の別の目的は、線維症を効果的に予防及び治療する方法を提供することに
ある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、本発明は、下記化学式１で表されるクロモン誘導体及びその
製薬学的に許容される塩から選択された化合物を有効成分として含有する、生体の器官ま
たは組織の線維化による疾患の予防及び治療用医薬組成物を提供する。
【００１５】
【化１】
2020007345.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、トリフルオロメチル基またはアセ
トキシ基であり、Ｒ２はメチル基、エチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フ
ェニル基またはベンジル基であり、Ｒ３は水素、エチル基、アセチル基、アセトキシ基、
カルボキシル基、ベンゾイルオキシ基または３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキ
シ基であり、Ｒ４乃至Ｒ６はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基、メチル基、メトキ
シ基、アセトキシ基、カルボキシル基またはベンゾイルオキシ基である。）
本発明の医薬組成物は、生体の器官または組織の線維化による疾患の中でも、特発性肺
線維症(idiopathic pulmonary fibrosis)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver
fibrosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)よりなる群から選択された疾患の予防及び
治療に特に効果的であり得る。
【００１７】
本発明の医薬組成物において、前記Ｒ１はヒドロキシル基またはメトキシ基であり、前
記Ｒ２はメチル基であり、前記Ｒ３は水素であり、前記Ｒ５はヒドロキシル基またはメト
キシ基であり、前記Ｒ４及びＲ６はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基またはメトキ
シ基であることが好ましい。
【００１８】
本発明の医薬組成物において、前記クロモン誘導体は、２−（３，４−ジメトキシフェ
ニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（オイパチリン、化学式２）、
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモ
ン（化学式３）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル
）−６−メトキシ−クロモン（化学式４）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキ
シフェニル）−６−メトキシ−クロモン（化学式５）、５−ヒドロキシ−２−（４−ヒド
ロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式６）、及び２−（３，４−ジ
ヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式７）の
中から選択されたいずれかであり得る。
【００１９】
【化２】
2020007345.tif 000004
【発明の効果】
【００２０】
本発明の医薬組成物は、化学式１のクロモン誘導体を有効成分として含有することによ
り、ＥＭＴの活性化を効果的に抑制することができ、これにより、ＥＭＴの活性化により
誘導される器官または組織の線維化を効果的に抑制することができる。特に、既に線維化
してしまった細胞を本来の正常な形態に戻すことができるため、線維症を予防または初期
対応することに止まらず、線維症が進行している中期または末期の症状も治療することが
できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のクロモン誘導体の一つであるオイパチリンの合成過程を示す図である。
【図２】骨髄細胞から分化したマクロファージにおけるオイパチリンのＤＥＣ２ ｍＲＮＡ発現増加効果を示すグラフである。
【図３】オイパチリンの線維化阻害効果を示すもので、各実験群のマウス１匹から３部分の肺組織を回収した後、マッソントリクローム染色(masson's trichrome staining)して顕微鏡で撮影した写真である。正常対照群：ブレオマイシン及びオイパチリン(Eupatilin)を投与せず、ビヒクル(Vehicle)だけを投与して飼育した正常マウス、ブレオマイシン投与群：ブレオマイシンを投与して肺線維化を誘導したマウス、ブレオマイシン＋オイパチリン投与群：ブレオマイシンを投与して肺線維化を誘導し、オイパチリン（４０μｇ）を投与したマウス。
【図４】線維化細胞モデルで製造したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株のＩＨＣ分析結果を示すもので、この細胞株が中胚葉由来の細胞であって肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）ではないので、肝星状細胞(Hepatic Stellate Cells、ＨＳＣ)（以下、「ＨＳＣ」という。）系統の細胞であることが分かる。左：ａｎｔｉ−ＧＡＴＡ４抗体反応陽性化を用いたＩＨＣの結果、右：ａｎｔｉ−ＣＫ−１８抗体反応陰性化を用いたＩＨＣの結果。
【図５】ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株のＦＡＣＳ分析結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１は、肝の間葉幹細胞であって、生体膜タンパク質であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ１０６を発現する。
【図６】オイパチリン（以下、図面における「パイパチリン（Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ）」の略字である「Ｅｕｐ」を使用）処理下の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の培養時間（６時間、１２時間、２４時間、４８時間経過時点）及び薬物処理による顕微鏡写真を示すものである。対照群：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、６ｈ〜４８ｈ ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ、以下の他の図面においても、ＴＧＦ−βは５ｎｇ／ｍＬの濃度で処理したものである。）を添加し、６〜４８時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、６ｈ〜４８ｈ ＴＧＦβ Ｅｕｐ（５０μＭ）：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリン（５０μＭ、以下の他の図面においても、オイパチリン及びクロモン誘導体は５０μＭの濃度で処理したものである。）を添加し、６〜４８時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。
【図７】オイパチリンの線維化阻害効果の実験結果を示すもので、オイパチリンをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＳＯ：培養液にＤＭＳＯ（オイパチリンの溶媒）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＤＭＳＯ：培養液にＴＧＦ−β及びＤＭＳＯを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ−２ｈｒ〜６ｈｒＴＧＦβ：培養液にオイパチリンを添加し、２〜６時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した実験群。
【図８】オイパチリンの線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＳＯ：培養液にＤＭＳＯ（オイパチリンの溶媒）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＤＭＳＯ：培養液にＴＧＦ−β及びＤＭＳＯを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ−１ｈｒ〜１２ｈｒＥｕｐ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、１〜１２時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを添加して２４時間培養した実験群。
【図９】オイパチリンの線維化逆転効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンまたはＴＧＦ−βを処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＴＧＦβ ２４ｈｒ ＆ ｗａｓｈ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、さらにＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリン（５０μＭ）及びＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した実験群。
【図１０】オイパチリンのＥＭＴ阻害効果の実験結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の処理によるＣｏｌ１、Ｖｉｍ及びＴｗｉｓｔの発現様相を分析した実時間ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。Ｃｏｎｔ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した実験群。
【図１１】クロモン誘導体の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導し、各５０μＭのクロモン誘導体を処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＥＭ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＡ１００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＡ１００（化学式８）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＩ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＩ３００（化学式３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＣ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＣ２００（化学式５）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ２００（化学式６）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ２００（化学式７）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ｗｏｇｏｎｉｎ：培養液にＴＧＦ−β及びオウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）（化学式９）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＢ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＢ２００（化学式１０）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ３００（化学式１１）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ２００（化学式１２）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ３００（化学式１３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ４００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ４００（化学式１４）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。
【図１２】クロモン誘導体の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導し、各５０μＭのクロモン誘導体を処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＥＭ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＡ１００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＡ１００（化学式８）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＩ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＩ３００（化学式３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＣ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＣ２００（化学式５）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ２００（化学式６）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ２００（化学式７）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ｗｏｇｏｎｉｎ：培養液にＴＧＦ−β及びオウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）（化学式９）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＢ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＢ２００（化学式１０）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ３００（化学式１１）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ２００（化学式１２）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ３００（化学式１３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ４００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ４００（化学式１４）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。
【図１３】対照群ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞のトランスクリプトーム(transcriptome)を分析した結果を示すものである。対照群：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。
【図１４】正常なＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞で発現が変化する遺伝子の遺伝子誘導倍率(induction fold)及びｐ値(p-value)を比較して示すボルケーノプロット(volcano plot)である。
【図１５】正常なＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞で発現が有意に変化する遺伝子のインタラクトーム(interactome)を偏りなく(unbiased manner)分析して示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示
するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものと解釈されて
ならない。
クロモン誘導体
本実施例では、２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メ
トキシ−クロモン（化学式２）（オイパチリン）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル
）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（化学式３）（以下、「ＯＮＧＩ３
００」という。）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−メト
キシ−クロモン（化学式５）（以下、「ＯＮＧＥ２００」という。）、５−ヒドロキシ−
２−（４−ヒドロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式６）（以下、
「ＯＮＧＣ２００」という。）、及び２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒド
ロキシ−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式７）（以下、「ＯＮＧＨ２００」という
。）を含んで、オウゴニンなど、化学式８乃至１４のクロモン誘導体を使用した。
【００２３】
本実施例でのオイパチリンは、図１の過程を経て合成して使用した。
【００２４】
実施例１．ＤＥＣ２発現増加効果の確認
ＤＥＣ２は、ＥＭＴの調節因子であるＴｗｉｓｔ及びＳｌｕｇの転写抑制因子として知ら
れている。本発明者は、ＤＥＣ２の発現が増加すると、Ｔｗｉｓｔ及びＳｌｕｇなどのＥ
ＭＴ調節因子の転写が抑制され、これによりＥＭＴが抑制されるので、組織の線維化が抑
制されるものと判断した。
【００２５】
よって、本発明のクロモン誘導体によりＤＥＣ２の発現が増加するかを確認した。この
とき、クロモン誘導体としてはオイパチリンを使用した。
【００２６】
マウス骨髄細胞(mouse bone marrow cells、ＭＢＭＣ)にＭ−ＣＳＦ(macrophage-colon
y stimulating factor)及びＲＡＮＫ(receptor activator of NFκB)リガンド（ＲＡＮＫ
Ｌ）を処理して活性化させ、ここにオイパチリンを５０μＭの濃度で処理して４日間培養
した後、ＤＥＣ２の発現様相を確認した。
【００２７】
その結果、図２に示すように、オイパチリンは、ＤＥＣ２のｍＲＮＡ発現を７〜８倍に
増加させるＤＥＣ２誘導剤(inducer)として作用することを確認することができた。
【００２８】
実施例２．ブレオマイシンによって誘導された肺組織の線維化における効果の確認
前記実施例１から、オイパチリンがＤＥＣ２の発現を増加させることを確認したので、
オイパチリンが線維化を抑制することの可能性を確認することができた。これを基に、実
際の動物モデルを用いて、オイパチリンが実際に組織線維化を抑制することができるか否
かを確認した。
【００２９】
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重１８．２〜２０．５ｇ）（ＫＯＡＴＥＣＨ、
韓国）を実験動物として用いた。実験動物は、各群当たり５匹ずつであって、下記表１の
ような群に分けた。
【００３０】
【表１】
2020007345.tif 000005
【００３１】
実験動物は、ＳＰＦ(Specific Pathogen Free)、ＢＳＬ(Bio Safety Level)２等級施設
でポリスルホン(polysulfone)材質、３６９Ｌ×１５６Ｗ×１３２Ｈ（ｍｍ）（ＥＵ、Ｕ
ＳＡ、ＵＫ ＧＬ ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）規格の飼育箱を使って飼育した。飼育箱当たり
の収容動物の数は検疫・馴化期間に２〜３匹、試験期間に２〜３匹とし、温度２２±２℃
、相対湿度５０．０±１５．０％、換気回数１０〜２０回／時間、明暗周期（照明時間）
１２時間／日（０７：００〜１９：００）、照度１５０〜３００Ｌｕｘの条件下で飼育し
た。
【００３２】
肺線維化を誘導するために、Ｋｒｅｍｅｒ等、Ｌａｘｅｒ等及びＢｅｒｋｍａｎ等の気
管内注入(intratracheal instillation、ＩＴ)方法によってブレオマイシン(bleomycin)
溶液を気管(trachea)を介して直接肺内に注入する方法を使用した。つまり、Ｃ５７ＢＬ
／６Ｊマウスを７０％Ｎ２Ｏ、３０％Ｏ２ガス及び１．５％イソフルラン(isoflurane)で
吸入麻酔させた状態で、前頚部の皮膚を切開し、筋肉を整理して気管を露出させた後、眼
科用手術ハサミで気管を少し切開した。先端を丸くした１９ゲージ(gauge)の注射針を装
着した１ｍＬの注射器を使って、ブレオマイシンを溶かした蒸留水溶液５０μＬを、切開
された気管を介して直接肺内に一気に注入した。注入直後すぐに切開した前頚部の皮膚を
縫合し、麻酔から覚めるようにした後、一般飼育ケージに入れて飼育した。ブレオマイシ
ンの投与は、ビジュアルインスチロボット(visual instillobot)を使って行い、ブレオマ
イシン−ＨＣｌ４０μｇ／５０μＬを１回投与して１２日間の肺線維化疾患誘導期間を設
定した。
【００３３】
オイパチリンは、ＤＰＢＳバッファ（１％ＤＭＳＯ含有）に溶かして使用し、オイパチ
リンの投与液量は１ｍＬ／ｋｇとした。個体ごとの投与量は最近の体重測定を基準に算出
した。ブレオマイシン投与１２日後、マイクロピペットを用いて１日１回（週５回）、１
週間強制鼻腔投与した。オイパチリン投与後２〜３日間の毒性症状及び死亡の有無を観察
したが、ブレオマイシンとオイパチリンを投与した後、何らの異常症状も観察されなかっ
た。
【００３４】
各実験群当たり３匹を選定して肺組織を分離した。分離された肺組織をマッソントリク
ローム染色(masson's trichrome staining)して顕微鏡で観察した結果、ブレオマイシン
の処理で肺線維化が誘導されたことと、オイパチリン２０μｇ投与群及びオイパチリン４
０μｇ投与群でオイパチリンの投与により肺線維化が阻害されることを確認することがで
きた。特に、オイパチリン４０μｇ投与群で肺線維化のより効果的な阻害を確認すること
ができた（図３参照）。
【００３５】
このような結果は、オイパチリンが線維化疾患、特に肺線維症の効果的な治療剤として
使用できるということを明確に裏付ける。
【００３６】
実施例３．肝線維化における効果の確認
クロモン誘導体が肝線維化に及ぼす影響を確認するために、ＨＳＣを製作し、ここにＴ
ＧＦ−βを処理して肝線維化が誘導される過程でクロモン誘導体の効果を確認した。
【００３７】
３−１．ＨＳＣ製作
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝組織を取り外した後、単細胞懸濁液(single cell suspensio
n)を作って継続的な培養を介して無限に増殖する細胞を得、ＲＴ−ＰＣＲ(reverse trans
cription polymerase chain reaction)、ＩＨＣ(immunohistochemistry)、ＦＡＣＳ(fluo
rescence-activated cell sorting)実験によってＨＳＣ類の間葉幹細胞(mesenchymal ste
m cell、ＭＳＣ)の細胞株であることを確認した。この細胞株をＯＮＧＨＥＰＡ１と命名
し、韓国生命工学研究院の生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号（ＫＣＴＣ
１３０８６ＢＰ）を付与された。
ＨＳＣは、肝線維症に密接な関連がある。ＨＳＣが筋線維芽細胞に転換され、ＥＭＴ(Epi
thelial Mesenchymal Transition)に関与する様々なタンパク質を分泌することにより、
肝線維化が生じる。よって、ＨＳＣ類の間葉幹細胞は、非常に優れた肝線維化モデルにな
ることができる。
【００３８】
＊ＲＴ−ＰＣＲ結果：アルブミン陰性であって、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝細胞(hep
atocytes)ではないことを確認した。因みに、ＨＳＣは肝細胞ではなく、よって、アルブ
ミンを発現しない。
【００３９】
＊ＩＨＣ分析結果：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株を固定した後、ａｎｔｉ−ＧＡＴＡ４とａ
ｎｔｉ−ＣＫ−１８抗体を用いてＩＨＣを行った結果、ＧＡＴＡ４及びＣＫ−１８、すな
わち中胚葉（ｅｎｄｏ）／外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）マーカーが発現することが分
かった。これはＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝細胞ではないことを示す（図４参照）。
【００４０】
＊ＦＡＣＳ分析結果：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝のＭＳＣであるかを確認するために
、ＭＳＣマーカー抗体でＦＡＣＳを行った。ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ１０
６が細胞の表面に発現することが分かった。ＯＮＧＨＥＰＡ１はＭＳＣであることが確認
された（図５参照）。
【００４１】
３−２．肝線維化細胞株の線維化特性分析
肝線維化の最も重要な原因細胞はＨＳＣである。ＨＳＣは、複数の細胞に分化され、そ
れらの一つが筋線維芽細胞(myofibroblast)である。また、ＨＳＣは、多量の細胞外基質
タンパク質(extracellular matrix protein、ＥＣＭ)を細胞の間に分泌して細胞の動きを
鈍化させる。コラーゲンα１(Collagen α1)が最も多いＥＣＭタンパク質である。同時に
、線維芽細胞にαＳＭアクチニン(alpha smooth muscle actinin)が過発現して細胞骨格
を硬化させる。
【００４２】
上述したようなＨＳＣ特性を用いてＯＮＧＨＥＰＡ１の線維化特性を確認した。線維化
を誘導するために、ＴＧＦ−β(transforming growth factor beta)を処理し、６時間、
１２時間、２４時間、４８時間が経過した時点で細胞の形態を観察した結果、２４時間が
経過した時点でかなりの線維化が進行し、４８時間が経過した時点ではさらに線維化が進
行したことを確認した（図６のＡを参照）。
【００４３】
３−３．オイパチリンの効果分析
上記の３−２からＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の線維化特性を確認し、これを基にオイパチリ
ンの効果を分析するための実験を行った。
【００４４】
ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養しながらＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導するが、培養
液上に５０μＭの濃度でオイパチリンを添加した。その結果、ＴＧＦ−βを処理した線維
化実験群（実施例３−２の結果、図６のＡを参照）とは異なり、２４時間後にＨＳＣが筋
線維芽細胞(myofibroblast)に分化する現象及び線維化現象が観察されなかった（図６の
Ｂ参照）。このような結果は、オイパチリンが肝線維化の最も大きな原因であるＭＳＣ由
来のＨＳＣが筋線維芽細胞に分化することを効果的に遮断することができることを示す。
【００４５】
前述したオイパチリンの効果をより明確に確認するために、前述と同様の方法でオイパ
チリンをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧ
Ｆ−βを処理して線維化を誘導したときの様相を調べた。その結果、図７に示すように、
事前にオイパチリンを処理したとしても、線維化が進行している状態にオイバチリンが存
在しなければ、線維化の進行を抑制することができないことが分かった。これはオイパチ
リン線維化の進行過程に直接関与して線維化の進行を抑制することを示す。
【００４６】
また、逆に、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、
洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを処理したときの様相を調べた。その結果、
図８に示すように、事前にＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導したにも拘らず、オイパチ
リンの処理により対照群と同様の正常な細胞状態を維持することが分かった。これは、既
に線維化してしまったとしても、オイパチリンが細胞を本来の正常な状態に戻すことがで
きる可能性を示す。
【００４７】
細胞の線維化が生じた後、オイパチリンが線維化細胞を正常細胞に戻すことができるか
をより明確に確認するために、ＴＧＦ−βをＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に２４時間処理して完
全に線維化するようにした後、オイパチリンを処理したときの様相を調べた。その結果、
図９のようにＴＧＦ−βの処理により完全に線維化してしまった状態でも、オイパチリン
は細胞を正常な状態に戻すことができることが分かった。これは線維化がかなり進行した
状態の線維症もオイパチリンが効果的に治療することができることを示す。
また、前述したようなオイパチリンの効果がオイパチリンのＥＭＴに対する影響によるも
のであるかを確認するために、各実験群で２４時間培養した細胞を対象に、ＥＣＭである
Ｃｏｌ１(type1 Collagen)、Ｖｉｍ(Vimentin)及びＴｗｉｓｔの発現様相を実時間ＲＴ−
ＰＣＲによって確認した結果、図１０に示すように、ＴＧＦ−βの処理により線維化が誘
導されてＥＭＴ調節因子の発現が増加する一方で、オイパチリンの処理によりそれらの発
現が抑制されることが分かった。
前述したような結果は、オイパチリンが線維化疾患、特に肝線維症の効果的な治療剤とし
て使用できるということを明確に裏付ける。
【００４８】
３−４．オイパチリン以外のクロモン誘導体の効果分析
実施例３−３と同様の方法でオイパチリン以外の様々なクロモン誘導体の線維化に対す
る効果を調べた。ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養しながらＴＧＦ−βを処理して線維化を誘
導するが、培養液上に５０μＭの濃度でクロモン誘導体を添加した。
【００４９】
その結果、図１１に示すように、ＯＮＧＩ３００、ＯＮＧＣ２００、ＯＮＧＥ２００及
びＯＮＧＨ２００のクロモン誘導体も線維化の進行を抑制するのに優れた効果があること
が分かった。一方、図１１及び図１２に示すように、オウゴニン(Wogonin)を始めとして
、ＯＮＧＡ１００、ＯＮＧＢ２００及びＯＮＧＥ３００は線維化進行抑制効果がないか非
常に低く、ＯＮＧＤ２００、ＯＮＧＨ３００及びＯＮＧＤ４００は細胞に壊死を起こすな
どの毒性を示した。
【００５０】
実施例４．グローバル遺伝子発現様相の分析
前述したような線維症治療効果に対するメカニズムを調べるために、ＤＭＳＯを処理し
たＯＮＧＨＥＰＡ１細胞（対照群）、ＴＧＦ−βの処理により線維化が誘導されたＯＮＧ
ＨＥＰＡ１細胞、及びＴＧＦ−βとオイパチリンを一緒に処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞
のグローバル遺伝子発現様相を調べた。
【００５１】
ＤＭＳＯ、ＴＧＦ−βまたはオイパチリンをそれぞれ処理し、２４時間後にトータルＲ
ＮＡを分離してライブラリを製作した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｇｈ−ｓｅｑシーケン
サで３０Ｇｉｇａの全トランスクリプトーム(transcriptome)約１０，０００個の発現し
たｍＲＮＡを分析した。
【００５２】
その結果、次の結果が得られた（図１３参照）。
【００５３】
１）３つの実験群に共通して発現する遺伝子の数：９０３３個
２）対照群ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株に特異的に発現する遺伝子の数：６２８個
３）ＴＧＦ−β処理時に特異的に発現する遺伝子の数：１６９個
４）ＴＧＦ−βとオイパチリン処理時に特異的に発現する遺伝子の数：１５０個
５）ＴＧＦ−β処理群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群に共通して発現する遺伝子
の数：６５７個
６）対照群及びＴＧＦ−β処理群に共通して発現する遺伝子の数：１７１個
７）対照群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群に共通して発現する遺伝子の数：１８
８個
これにより、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株にＴＧＦ−βを処理すると、８２６（＝１６９＋
６５７）個の遺伝子の発現が誘導されてＥＭＴプログラムが活性化され、これにオイパチ
リンを処理すると、３３８（＝１５０＋１８８）個の遺伝子の発現がさらに誘導されてＥ
ＭＴプログラムを本来の状態に逆転させる分化転換(trans-differentiation)が発生する
ことが分かった。
【００５４】
ＴＧＦ−β処理群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群で発現が変化する遺伝子の遺伝
子誘導倍率(induction fold)及びｐ値(p-value)を比較して図１４のようなボルケーノプ
ロット(volcano plot)で示した。
【００５５】
ＥＭＴは、腫瘍の発生、幹細胞の分化及び線維化に関与するセルラープログラム(cellu
lar program)であって、現在までに数百個の遺伝子が関与することが知られている。Ｃｏ
ｌｌａｇｅｎ α１、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ａｓｍａｃｔｉｎｉｎ、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉ
ｌ１、Ｓｎａｉｌ２（＝Ｓｌｕｇ）、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎなどが代表的なＥＭＴマーカ
ーである。前記実施例においてオイパチリンがＴＧＦ−βによるＣｏｌｌａｇｅｎ α１
、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及びＴｗｉｓｔ遺伝子の発現を抑制することが分かった。また、ＲＮ
Ａ−Ｓｅｑ結果をみると、９７６個の遺伝子がＴＧＦ−βまたはオイパチリン処理によっ
て新たに発現することが分かった。すべての処理から共通して発見される９０３３個の遺
伝子の発現も微視的に発現増減があって、これらのすべては直、間接的にＥＭＴに影響を
及ぼすものと判断される。よって、ＴＧＦ−β＋オイパチリン処理によって統計的にｐ＜
０．０５以下に発現が調節されるこれらの１０，０００個の遺伝子を全て選択し、選択し
た遺伝子それぞれに対して遺伝子がコードするタンパク質のすべての機能を統合したビッ
グデータ(big data)ベースの遺伝子インタラクトーム(interactome)を偏りなく(unbiased
manner)分析して、これらの間のネットワークを調べてみた（図１５参照）。
【００５６】
驚くべきことに、これらの遺伝子ネットワークのハブ(hub)は、８個であって、複数の
ノード(node)を媒介として１つのネットワークフレームワークを構成し、８つのハブがほ
とんどＥＭＴに関連する遺伝子から構成されていることが分かった。細胞骨格プロテオー
ムハブ（Ｉ）とコラーゼンプロテオームハブ（II）は、ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１（Ｉｔｇ
ａ１）ノードによってネットワークが形成され、ＥＭＴの重要因子として知られているＣ
ｙｃｌｉｎ Ｂ１を含むｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−１（III）はプロテイン
キナーゼＣアルファ(proteinkinase C alpha)（ＰＫＣＡ）ノードに接続され、前記３つ
のプロテオームハブと共にｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ３（Ｉｔｂｇ３）ノードによって
強固なネットワークを構築していることが分かった。他の２番目のｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ
ハブ−２（IV）は、転写因子Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａ
ｃｔｏｒ １（Ｌｅｆ１）ノードがＣｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｃｃｄｎ１）によって接続され、
Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ９（Ａｄｃｙ９）シグナル伝達ハブが、ＥＭＴに重
要なキモカインＣＸＣＬ１６を媒介としてＥＭＴ因子Ｃ−Ｆｏｓ、ＣＣＬ２、Ｊｕｎｂと
ネットワークで接続されていることが分かった。ここで、Ａｄｃｙ９シグナル伝達ハブは
、オイパチリンによって影響を受ける新しいＥＭＴレギュレータであると思われる。がん
細胞のＥＭＴに大きな影響を与えることが知られているＣＤ４４ハブ（Ｖ）は、細胞移動
(cell migration)及び浸潤(invasion)に関与するｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ １（Ｓｐｐ１／オステオポンチン(Osteopontin)）ノードに接続されているこ
とが分かった。Ｓｐｐ１（オステオポンチン(Osteopontin)）も重要なＥＭＴ因子として
知られている。Ｓｐｐ１ノードは、ＥＣＭプロテアーゼ(protease)であるＭｍｐ３とネッ
トワークで接続されていた。ＥＣＭマトリックスの重要タンパク質であり且つＥＭＴの主
要因子であるフィブリン(Fibrillin)とエラスチン(Elastin)を含むハブ（VI）は、ｃｅｎ
ｔｒａｌノードであるｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂ３（Ｉｔｇｂ３）に接続されていることが分
かった。ＥＭＴ原因サイトカインｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
ｂ２プロテオームハブ（VII）は、ｓｅｒｐｉｎｅ１及びＦｉｇｆ（＝ＶｅｇｆＤ）を含
み、ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｋｄｒ）ノードとネ
ットワークを構築していることが分かった。ＥＭＴの重要受容体として知られているｓｅ
ｍａｐｈｏｒｉｎとコレステロール受容体（Ｖｌｄｒ）ハブ（VIII）には、ｐｌｅｘｉｎ
Ｄ、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ ３Ｅ、ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ及びＮＧＦを含んでおり、
ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ受容体ハブは、Ｋｄｒノードとネットワークを形成していることが
分かった。Ｖｌｄｒ受容体ハブは、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（Ｎｇｆ）を
介してｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ２Ｉ（ｒｓ２）に接続さ
れてシグナル伝達軸が形成されていることが分かった。ＥＭＴの主要転写因子であるＳｎ
ａｉｌ２（＝Ｓｌｕｇ）−Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ（＝Ｃａｄｈ１）ノードは、ｃｅｌｌ ｃ
ｙｃｌｅプロテオームハブ（II）とネットワークを構築し、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎは、重要
なＥＭＴ因子であるＭｍｐ３、ｃａｖｉｏｌｉｎ（Ｃａｖ）、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ（Ｔ
ｎｃ）及びＰＫＣａに接続されていることが分かった。ＰＫＣａは、ｉｎｔｅｇｒｉｎ 
ｂ４によって細胞骨格及びコラーゲンプロテオームハブとネットワークを構築していた。
Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃはｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂ３に直接接続されていた。
【００５７】
＜ハブI．細胞骨格プロテオームハブ＞
Ｔｒｏｐｏｎｉｎ I１ ＆ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ２、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ２、Ｔｒ
ａｎｓｇｅｌｉｎ、α２ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、Ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａ
ｖｙ ｃｈａｉｎ ９ ＆ １１、Ｌｅｉｏｍｏｄｉｎ １、γ２ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌ
ｅ ａｃｉｔｉｎ、Ｌａｍｉｎｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ α４
＜ハブII．コラーゲンプロテオームハブ＞
Ｃｏｌｌａｇｅｎ ４ α５ ＆ α６、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ５ α１ ＆ α３、Ｃｏｌｌａｇ
ｅｎ ６ α３、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ８ α１ ＆ α５、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １１ α１、Ｃｏ
ｌｌａｇｅｎ １２ α１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １５ α１
＜ハブIII．ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−１＞
Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｆ、ＡＳＰＭ、ＮＩＭＡ−ｒｅｌａ
ｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｋ２）、Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ
＜ハブIV．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−２＞
Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、Ｃｄｋ１４、Ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７
＜ハブＶ．ＣＤ４４関連プロテオームハブ＞
Ｃｄ４４、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ １（Ｈｙｏｕ１）、Ｎｃａｍ、Ｃ
ａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ ＧＴＰａｓｅ Ｍ（Ｉｒｇ
ｍ１）、Ｐａｒｐ４、Ｐａｒｐ９、Ｐｄｉａ４ ＆ Ｐｄｉａ６
＜ハブVI．Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎプロテオームハブ＞
Ｅｆｅｍｐ２（ＥＧＦ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｉｂｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｅｘｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ５（Ｆｂｎ５
）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ２（Ｆｂｎ２）、Ｅｌａｓｔｉｎ（Ｅｌｎ）、Ｆｉｂｒｉｌｌ
ｉｎ １（Ｆｂｎ１）
＜ハブVII．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ ２プロ
テオームハブ＞
ＲＡＲ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（Ｒｏｒａ）、Ｎｅｕｒｏ
ｎａｌ ＰＡＳ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２（Ｎｐａｓ２）、Ｓｅｒｐｉｎｅ １、
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ｔｇｆｂ２）、Ｖ
ａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｄ（Ｆｉｇｆ）
＜ハブVIII．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ＆ Ｖｌｄｒ受容体プロテオームハブ＞
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ｅ、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ、Ｎｅ
ｕｒｏｐｉｌｉｎ １、Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ、Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｎｇｆ）
＜ＴＧＦ−β−Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅの主要ネットワークノー
ド＞
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β３、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β４、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ α、Ｌｅｆ１、Ｓｌｕｇ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ １（＝Ｅ−Ｃａｄｈ
ｅｒｉｎ）、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ９、Ｓｐｐ１（＝Ｏｓｔｅｏｐｏｉｎ
ｔｉｎ）、Ｆｉｂｒｉｌｉｎ １、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ １
（Ｄｏｃｋ１）、Ｓｙｋ２、Ｎｏｔｃｈ４など
前述したような結果は、オイパチリンがＴＧＦ−β処理で誘導されるＥＭＴプログラム
を逆転させ、このときのメカニズムは、８つのＥＭＴプロテオームハブ、すなわち細胞骨
格プロテオームハブ（I）、コラーゲンプロテオームハブ（II）、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプ
ロテオームハブ−１（III）、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−２（IV）、ＣＤ４
４関連プロテオームハブ（Ｖ）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎプロテオームハブ（VI）、ＴＧＦ−
β２プロテオームハブ（VII）、並びにＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ及びＶｌｄｒ受容体プロテ
オームハブ（VIII）の生成と消滅からなり、ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１、ｉｎｔｅｒｇｒｉ
ｎ β３、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃα、Ｓｎａｌｉ２、Ｋｄｒ、Ｅｃａｄｈｅｒ
ｉｎ、ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ９が重要なノードとしてネットワーク接続さ
れることを示す。
【００５８】
実施例５．標的遺伝子の分析
前記実施例４でのグローバル遺伝子発現様相の調査結果に基づいて、ＯＮＧＨＥＰＡ１
細胞においてＴＧＦ−β処理によって発現が誘導され、ここにオイパチリンを処理した場
合に発現が退行する遺伝子、すなわち、ＴＧＦ−β処理群とオイパチリン処理群との間に
発現差が現れる遺伝子のうち、ＴＧＦ−β処理で発現が大きく増加してからオイパチリン
処理でほとんど発現しない程度に大きな変化を示す遺伝子を選別した。
その結果を下記表２及び表５の１０３個の遺伝子が選別された。
【００５９】
【表２−１】
2020007345.tif 000006
【００６０】
【表２−２】
2020007345.tif 000007
【００６１】
【表３−１】
2020007345.tif 000008
【００６２】
【表３−２】
2020007345.tif 000009
【００６３】
【表４−１】
2020007345.tif 000010
【００６４】
【表４−２】
2020007345.tif 000011
【００６５】
【表５】
2020007345.tif 000012
【００６６】
前記１０３個の遺伝子の機能及び関連研究結果を調べた結果、ほとんどがＥＭＴに関与
する因子として確認された。特に、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １（Ｆｓｔｌ１
）遺伝子の場合、これをノックアウトさせると、ブレオマイシンで肺線維化を誘導しても
、ほとんど肺線維化しないという研究結果(Dong et al., 2015)があった。
【実施例】
【００６７】
ＥＭＴが腎臓線維症において重要な役目をし(Grande et al., 2015及びLovisa et al.,
2015)、このようなＥＭＴがＤＥＣ２によって調節できるという既存の研究結果(Suzuki 
et al., 2014及びSato et al., 2012)を基に、ＥＭＴと線維症との連関性、及びＤＥＣ２
とＥＭＴとの連関性に着目するようになった。ＤＥＣ２を調節することができれば、ＥＭ
Ｔを調節することができ、結果的に線維症を予防及び治療することができると判断した。
【００６８】
ＤＥＣ２は、ＥＭＴの調節因子であるＴｗｉｓｔ及びＳｌｕｇの転写抑制因子として知
られているので、ＤＥＣ２の発現を増加させることができれば、ＥＭＴ調節因子の発現が
抑制され、ＥＭＴが抑制され、結果として線維化が抑制されるだろう。
そこで、まず、本発明のクロモン誘導体のうちオイパチリンのＤＥＣ２発現調節可能性を
調べた結果、オイパチリンがＤＥＣ２のｍＲＮＡ発現を大きく増加させることが確認され
、オイパチリンの線維症治療可能性を発見した（図２参照）。
【００６９】
オイパチリンの線維症治療可能性をより明確に確認するために、マウスの肺にブレオマ
イシン(bleomycin)を注入して肺線維化を誘導し、このとき、オイパチリンの効果を調べ
た結果、ブレオマイシンにより誘導された肺組織の線維化をオイパチリンが効果的に抑制
することが確認され、オイパチリンが実際に特発性肺線維症などの肺組織線維化を抑制す
ることができるという事実を発見することができた（図３参照）。
【００７０】
ここで止まらず、オイパチリンが肺線維症以外に他の組織の線維症も抑制することがで
きるかを確認しようとした。これを確認するためのモデルとして、肝線維症と密接な関係
があることが知られているＨＳＣに注目した。ＨＳＣは、正常な状態では休止状態で存在
しており、炎症などのストレスにより肝細胞が損傷すると、ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦな
どの細胞成長因子によって活性化され、細胞外基質(extra cellular matrix、ＥＣＭ)を
多量生産することにより組織を硬化させ、自分が筋線維芽細胞(myofibroblast、ＭＦＢ)
に分化して組織の線維化を引き起こすことがある。したがって、このＨＳＣの不死化細胞
(immortalized cell)を得、ここにＴＧＦ−βを処理すると、線維化を誘導することがで
きて線維化に対する有用なモデルになることができるものと期待した。結果的に不死化Ｈ
ＳＣを得ることができ、ＴＧＦ−βの処理によって、実際に筋線維芽細胞に１００％分化
する細胞株を確立することができた（図４及び５を参照）。この細胞株をＯＮＧＨＥＰＡ
１（ＫＣＴＣ１３０８６ＢＰ）と命名した。
【００７１】
前述したようなＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を用いてオイパチリンの線維化抑制効果を確認し
た結果、ＴＧＦ−βの処理によって誘導された線維化をオイパチリンが効果的に抑制する
ことが確認され、オイパチリンが実際に肝線維症などの肝組織線維化を抑制することがで
きることを発見することができた（図６参照）。また、オイパチリンをＯＮＧＨＥＰＡ１
細胞に前処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘
導した場合には、何らの変化もないことが分かり、オイパチリンが正常ＨＳＣには何らの
影響も及ばないことも発見することができた（図７参照）。
【００７２】
これまでは、組織または細胞の線維化過程でオイパチリンの効果を確認してオイパチリ
ンが線維化の進行を抑制することを解明したが、既に線維化してしまった状態ではどんな
効果を示すかをさらに確認する必要があった。このため、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞にＴＧＦ
−βを処理し、一定時間が経過するようにして線維化を進めた後にオイパチリンを処理し
たときの変化を調べた結果、既に線維化してしまったＯＮＧＨＥＰＡ１細胞をオイパチリ
ンが本来の正常な形態に戻すことができることを発見することができた（図８及び９を参
照）。これはオイパチリンが線維症を予防または初期対応することに止まらず、線維症が
進んでいる中期または末期の症状も治療することができることを意味する。
【００７３】
研究の初期に予想していたように線維症の治療効果がＥＭＴの抑制によって得られたか
を確認するために、ＥＭＴに関与する因子であるＣｏｌ１(type 1 Collagen)、Ｖｉｍ(Vi
mentin)及びＴｗｉｓｔの発現を調べた結果、オイパチリンがこれらの遺伝子の発現を抑
制することが確認され、予想のとおり、オパチリンがＥＭＴを抑制することにより線維化
を抑制するということが確認された（図１０参照）。
【００７４】
オイパチリンの線維症治療効果がＥＭＴを抑制するからであるかをより明確に調べるた
めに、正常細胞に比べて線維化が誘導されるとき、及びオイパチリンの処理で線維化が抑
制されるときの総ｍＲＮＡ分析によって、発現における有意な差を示す遺伝子を調べ、そ
れらの遺伝子間の相互作用体（インタラクトーム）を調べた。その結果、８つの遺伝子ネ
ットワークハブをなし、これらのハブがほとんどＥＭＴ関連遺伝子から構成されており、
これらのハブを接続するノード遺伝子がＥＭＴの非常に重要な因子であることが確認され
、オイパチリンの線維症治療効果がＥＭＴの調節によって得られることが明らかになった
（図１３乃至１５参照）。
また、総ｍＲＮＡ分析結果のうち、特に発現差の大きい遺伝子を分析した結果、１０３個
の遺伝子の発現がＴＧＦ−β処理線維化誘導により大幅に増加し、オイパチリン処理で線
維化が抑制されながら、ほとんど発現されない程度に差異があることを発見することがで
きた。すなわち、これらの遺伝子はオイパチリンの標的遺伝子であるといえる。これらの
遺伝子はまた、ほとんどＥＭＴに関与する因子であり、既存の研究結果から、線維化にお
ける重要な因子として知られているものであった（表２乃至表５参照）。
特にＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １（Ｆｓｔｌ１）遺伝子の場合、この遺伝子の
発現を抑制させると、ブレオマイシンで肺線維化を誘導しても、ほとんど肺線維化しない
という研究結果(Dongetal., 2015)があったが、オイパチリンがこのようなＦｓｔｌ１の
発現をほぼゼロに近く抑制するという結果は、オイパチリンの肺線維化治療効果をより明
確に説明するものであり、上述したような仮説と共に、オパチリンが強力な線維症治療剤
になれることを裏付ける。
【００７５】
また、前記１０３個の遺伝子は、ＨＳＣ細胞だけでなく、他の線維芽細胞やがん細胞に
おいても発現する遺伝子であって、上述したような結果は、オイパチリンが肝線維化だけ
でなく、他の組織または細胞の線維化も治療することができることを示唆する。
【００７６】
これらの結果に基づいて、オイパチリンの線維症治療効果を確認した。このような効果
がオイパチリンの特異的な構造によるものと予想した。よって、オイパチリンと類似の構
造を持つ化合物も類似の効果を示すだろうと判断した。また、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞モデ
ルを用いて同様の方法でオイパチリン以外にクロモン誘導体の線維症治療効果を調べた。
その結果、化学式２、化学式３、化学式５及び化学式７のオイパチリンと類似の構造を持
つクロモン誘導体が優れた線維化抑制効果を示した。これに対し、オイパチリンと類似の
構造を持つクロモン誘導体であるものの、化学式８、化学式９（オウゴニン、ｗｏｇｏｎ
ｉｎ）、化学式１０、化学式１１のように、化学式１の構造で−Ｏ−Ｒ２の置換基がＨで
ある構造の化合物は、いずれも線維化抑制効果がなかった。また、化学式１２のように−
ＯＲ２の置換基が−ＯＨである構造の化合物と、化学式１３及び化学式１４のようにＲ３
の置換基が−Ｏ−ＣＨ３（メトキシ）である構造の化合物は、細胞に壊死を起こすなどの
毒性を示した（図１１及び図１２を参照）。
【００７７】
【化３】
2020007345.tif 000013
【００７８】
このように、線維化抑制効果のためには、化学式１の構造において−Ｏ−Ｒ２の置換基
とＲ３の置換基が非常に重要であることが分かった。これにより、化学式１の構造におい
て−Ｏ−Ｒ２の置換基がＨまたは−ＯＨではなく、Ｒ３の置換基が−Ｏ−ＣＨ３ではない
場合、線維化抑制効果を示すことができるものと判断される。
【００７９】
本発明のクロモン誘導体は、通常の方法、例えば、図１のような方法またはその変形に
よって製造でき、化合物を合成または販売する会社から容易に入手することができる。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、全体組成物の重量に対して、本発明のクロモン誘導体を０．１
乃至９０重量％で含有することができる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、臨床投与の際に経口または非経口投与が可能であり、非経口投
与の際に腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内頚膜注射、
脳血管内注射または胸部内注射によって投与でき、一般な医薬品製剤の形で使用できる。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン療法、化学治療及
び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物の１日投与量は、組成物に含有された本発明のクロモン誘導体を基
準に、体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ
であり、１日１回乃至数回に分けて投与できるが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、
食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である
。
【００８４】
実際の臨床投与の際に非経口のさまざまな剤形で投与できるが、製剤化する場合には、
通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤また
は賦形剤を用いて調製することができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶
液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれ得る。非水性溶剤、懸濁溶
剤としては、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリ
ーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる
。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン
（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、本発明のクロモン誘導体に、さらに同一または類似の機能を示
す有効成分を１種以上含有することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の医薬組成物は、線維症、特に特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis
、ＩＰＦ)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver fibrosis)及び腎臓線維症(kid
ney fibrosis)の予防及び治療に有用に使用できる。特に、既に線維化してしまった細胞
を本来の正常な形態に戻すことができるため、線維症を予防または初期対応することに止
まらず、線維症が進んでいる中期または末期の症状も効果的に治療することができる。
【００８７】
［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ １３０８６ＢＰ
受託日：２０１６年８月２５日
2020007345.tif 000014
2020007345.tif 000015
【図１】
2020007345.tif 000018
【図２】
2020007345.tif 000019
【図３】
2020007345.tif 000020
【図４】
2020007345.tif 000021
【図５】
2020007345.tif 000022
【図６】
2020007345.tif 000023
【図７】
2020007345.tif 000024
【図８】
2020007345.tif 000025
【図９】
2020007345.tif 000026
【図１０】
2020007345.tif 000027
【図１１】
2020007345.tif 000028
【図１２】
2020007345.tif 000029
【図１３】
2020007345.tif 000030
【図１４】
2020007345.tif 000031
【図１５】
2020007345.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月25日(2019.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン及びその薬学的に許容される塩から選択された化合物を有効成分として含有する、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の予防及び治療用医薬組成物。
【外国語明細書】
2020007345000001.pdf