(57)【要約】      （修正有）【課題】心疾患において、効果的な治療選択肢となりうる方法の提供。【解決手段】（i）特定の複数の配列から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の発現および／または活性を促進する化合物、ならびに／または（ii）別の特定の複数の配列から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物を含む医薬組成物。当該組成物は、心肥大の治療または予防に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の発現および／または活性を促進する化合物、ならびに／または
（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物
を含む医薬組成物。
【請求項２】
心肥大の治療または予防における使用のための、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を促進する、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物。
【請求項３】
心肥大が心室肥大である、請求項2記載の使用のための化合物。
【請求項４】
（ii）において定められている化合物が、
（a）配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの少なくとも12個の連続的ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（b）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの相補鎖と少なくとも69％同一であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（c）UがTにより置換された（a）または（b）に記載のヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（d）（a）〜（c）のいずれか1つにおいて定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または  （e）（d）の発現ベクターを含む宿主
である、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
【請求項５】
（ii）において定められている化合物がアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物または小分子インヒビターである、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
【請求項６】
（i）において定められている化合物が、
（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの核酸配列またはそれに対して少なくとも69％同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（b）（a）において定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または
（c）（b）の発現ベクターを含む宿主
である、請求項1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
【請求項７】
（i）において定められている化合物が、
（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を促進する転写因子、ならびに／または
（b）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子
である、請求項1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
【請求項８】
（a）患者から得たサンプルにおいて、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルを検出し、
（b）前記の1以上のlncRNAの発現レベルを、健常被験者から得たサンプルにおけるこれらの1以上のlncRNAの発現レベルと比較することを含む、患者における心肥大を診断するための方法であって、
配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるダウンレギュレーション、ならびに／または配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるアップレギュレーションが、患者における心肥大を示す、方法。
【請求項９】
サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
該サンプルが心臓組織サンプルである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
1以上のlncRNAの発現レベルの検出が、
（a）定量的PCR、好ましくは定量的リアルタイムPCR、または
（b）鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定を含む、請求項8〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
該方法が、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび／または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む、請求項8〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
患者における心肥大を診断するためのキットであって、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキット。
【請求項１４】
該手段が、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
1以上のlncRNAが少なくとも3個のlncRNA、好ましくは少なくとも5個のlncRNAである、請求項1〜14のいずれか1項記載の医薬組成物、使用のための化合物、方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の発現および／または活性を促進する化合物、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、心肥大の治療または予防における使用のための、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を促進する、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物に関する。
【０００２】
本明細書においては、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多数の文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとはみなされないが、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。より詳細には、全ての参照文書を、各個の文書が参照により組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物トランスクリプトームの大規模分析は、ゲノムの転写が、複雑な比率のRNA分子を与え、そのうちのごく一部しかタンパク質合成のための鋳型として働かないことを明らかにした。幾つかの研究は、これらのノンコーディングRNA（ncRNA）がそれらのタンパク質コード化対応物として重要な生物学的機能を有することを示しており、ncRNAの発現または機能の変化が、心血管疾患、例えば心肥大および線維症、冠動脈障害、および心筋梗塞をもたらすことを示唆している。
【０００４】
心血管研究において最も結果が反映されたncRNAはマイクロRNA（miRNA、miR）である。これらは、それらの標的の安定性および／または翻訳を低減する他の転写産物に結合する約20〜22ヌクレオチドから構成される内因性一本鎖RNAである。例えば、miR-21およびmiR-132はそれぞれ心臓線維症または肥大を誘発すること、ならびに特定のアンタゴミル（antagomiR；アンタゴmiR）（miRNAをサイレンシングする化学的に改変されたオリゴヌクレオチドである）によるこれらのmiRNAのインビボ抑制が圧負荷の心疾患モデルにおける線維症または肥大をレスキューすることが示された（Thumら, Nature. 2008 456(7224):980-4.; UcarおよびGuptaら, Nat Commun. 2012 3:1078）。別の研究において、miR-24は虚血性心疾患における血管新生の決定的に重要な調節因子として作用することが見出された（Fiedlerら, Circulation. 2011 124(6):720-30）。
【０００５】
より最近の研究は、miRNAと同様に、長いncRNA（lncRNA）も様々な生物学的過程において重要な役割を果たしうることを示している。LncRNAは200ヌクレオチドから100キロベースまでの範囲のmRNA様転写産物であり、タンパク質コード遺伝子に対するそれらのゲノム分布に基づいて分類される（センス対エクソンおよび／またはイントロン、アンチセンス、双方向または遺伝子間）。幾つかのlncRNA転写産物は専ら核に限定されるが、他のものは細胞質にも見出される。ここで、それらはタンパク質ならびに他のRNAまたはDNA分子と相互作用して、lncRNAが、クロマチン修飾、ゲノムインプリンティング、核区画化および構造ならびに転写および転写後調節を含む様々な遺伝子調節メカニズムに影響を及ぼすことを可能にする（Schonrockら, Circ Res. 2012 Oct 26;111(10):1349-62.; Caleyら, ScientificWorldJournal. 2010 10:90-102）。 驚くべきことではないが、lncRNAは癌、代謝障害およびニューロン障害のようなヒト疾患に関与する。
【０００６】
しかし、心臓血管生物学におけるそれらの役割についてはほとんど知られていない。最近の研究は、心筋細胞の分化ならびに心臓および体壁における側方中胚葉組織の発生に、それぞれ、2つのlncRNA、すなわち、Braveheart（Bvht）およびFOXF1に隣接する非コード化発生調節RNA（Fendrr）が必要であることを示した（Klattenhoffら, Cell. 2013 152(3):570-83.; Groteら, Dev Cell. 2013 24(2):206-14）。どちらのlncRNAも、クロマチン修飾複合体との相互作用を介して細胞のエピジェネティックプロファイルをモジュレーションする。最近の報告は心血管疾患におけるlncRNAの役割をも探求し始めている。ゲノムワイド関連研究（GWAS）は、心筋梗塞または冠状動脈疾患のリスクに関連していると思われるlncRNA MIAT（心筋梗塞関連転写物）またはANRIL（INK4遺伝子座におけるアンチセンス非コード化RNA）をコードする遺伝子座における一塩基多型（SNP）を特定した（Ishiiら, J Hum Genet. 2006 51(12):1087-99.; McPhersonら, Science. 2007 316(5830):1488-91）。lncRNA Kcnq1ot1は、カリウムチャネルをコードするそのアンチセンス遺伝子Kcnq1の発現を制御する。カリウムチャネル活性は正常な心臓機能に必須であるため、lncRNAに関連する調節の変化は異常な心臓機能をもたらしうるであろう（Korostowskiら, PLoS Genet. 2012 8(9):e1002956）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Thumら, Nature. 2008 456(7224):980-4.; Ucar
【非特許文献２】Guptaら, Nat Commun. 2012 3:1078
【非特許文献３】Fiedlerら, Circulation. 2011 124(6):720-30
【非特許文献４】Schonrockら, Circ Res. 2012 Oct 26;111(10):1349-62.;
【非特許文献５】Caleyら, ScientificWorldJournal. 2010 10:90-102
【非特許文献６】Klattenhoffら, Cell. 2013 152(3):570-83.;
【非特許文献７】Groteら, Dev Cell. 2013 24(2):206-14
【非特許文献８】Ishiiら, J Hum Genet. 2006 51(12):1087-99.;
【非特許文献９】McPhersonら, Science. 2007 316(5830):1488-91
【非特許文献１０】Korostowskiら, PLoS Genet. 2012 8(9):e1002956
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
心疾患研究における主な課題の1つは、それ自体が効果的な治療選択肢となりうる又は既存の治療戦略の効率を高める可能性を有しうる遺伝子ネットワークまたは特定の細胞内シグナル伝達経路をモジュレーションするための新規かつ効果的なアプローチを特定することである。驚くべきことに、特定のlncRNAが心肥大の発生において或る役割を果たし、それにより、新規治療戦略を提供することが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、第1の態様において、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の発現および／または活性を促進する化合物、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明においては、「医薬組成物」なる語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物を意味する。本発明の医薬組成物は前記化合物を含む。それは、所望により、本発明の化合物の特性を改変して、例えば、それらの機能を安定化、モジュレーションおよび／または活性化しうる他の分子を含みうる。該組成物は、固体、液体または気体形態であることが可能であり、とりわけ、散剤（粉末）、錠剤、溶液またはエアゾール剤の形態でありうる。本発明の医薬組成物は、所望により、更に、医薬上許容される担体または賦形剤を含みうる。適当な医薬担体および賦形剤の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば油／水エマルション、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液、有機溶媒、例えばDMSOなどを包含する。そのような担体または賦形剤を含む組成物は、よく知られた通常の方法により製剤化されうる。これらの医薬組成物は適当な用量で対象に投与されうる。投与レジメンは主治医および臨床的要因によって決定される。医学分野においてよく知られているとおり、任意の1人の患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多数の要因に左右される。与えられた状況に関する治療的有効量は通常の実験によって容易に決定され、通常の臨床家または医師の技量および判断の範囲内である。一般に、医薬組成物の規則的投与としてのレジメンは1日当たり1μg〜5g単位の範囲内であるべきである。しかし、より好ましい投与量は、1日あたり0.01mg〜100mg、より一層好ましくは0.01mg〜50mg、最も好ましくは0.01mg〜10mgの範囲でありうる。更に、例えば、該化合物がsiRNAのような核酸配列である場合、投与される医薬組成物の、薬学的に有効な総量は、典型的には体重1kg当たり約75mg未満、例えば、体重1kg当たり約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001または0.0005mg未満である。より好ましくは、該量は、体重1kg当たり核酸2000nmol未満（例えば、約4.4×10 16コピー）、例えば、体重1kg当たりsiRNA剤1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075または0.00015 nmolである。
【００１１】
変化を観察するために必要な治療の長さ、および応答が生じるための治療後の間隔は、所望の効果に応じて変動する。個々の量は、当業者によく知られた通常の試験により決定されうる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、医薬上許容される担体または賦形剤を含む。「医薬上許容される担体または賦形剤」は任意のタイプの無毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤助剤を意味する（Handbook of Pharmaceutical Excipients 6ed. 2010, Pharmaceutical Press発行も参照されたい）。該医薬組成物は、例えば、経口的、非経口的、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経皮的、経粘膜、硬膜下、局所的または局部的に、イオントフェレーシスにより、舌下に、吸入スプレーにより、エアロゾルにより、または直腸などへ、通常の医薬上許容される担体または賦形剤を所望により含んでいてもよい投与単位製剤として投与されうる。
【００１２】
本明細書中で用いる「ncRNA」または「ノンコーディング（非コード化）RNA」なる語は、タンパク質に翻訳されない機能性RNA分子を示す。非コードRNAが転写されるDNA配列は、当技術分野ではしばしばRNA遺伝子と称される。「lncRNA」または「長鎖ノンコーディング（非コード化）RNA」なる語は当技術分野で一般に用いられており、200個を超えるヌクレオチドを含むncRNAを示す。配列番号12、1〜11,13,27および28は132〜1598ヌクレオチドの範囲の配列を含む。
【００１３】
本発明の化合物は小胞、例えばリポソームとして製剤化されうる。リポソームは、薬物送達の観点から、それらがもたらすその特異性および作用持続時間ゆえに、大きな関心を集めている。リポソーム送達系は、siRNAのような核酸をインビボで細胞に効果的に送達させるために使用されている（Zimmermannら, (2006) Nature, 441:111-114）。リポソームは、親油性物質から構成される膜と水性内部とを有する単層または多層の小胞である。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージおよび他の細胞によって貪食される。本明細書において項目（ii）で定められている、配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現を抑制する化合物は、本発明に従えば、配列番号1〜7、27および28の選択されたlncRNAをコードする遺伝子の1以上の転写を低減し又は妨げる化合物である。そのような化合物には、転写装置を妨げる、ならびに／または該遺伝子のプロモーターおよび／もしくはプロモーターから離れた発現制御要素、例えばエンハンサーとのその相互作用を妨げる化合物が含まれる。配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの発現を抑制する化合物は、例えば、lncRNAの発現を制御するプロモーター領域を特異的に阻害することにより、前記lncRNAの発現を特異的に抑制する。好ましくは、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの転写は、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、例えば少なくとも90％または95％、より一層好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは約100％低減される。本発明に従い本明細書において項目（ii）で定められている、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの活性を抑制する化合物は、該lncRNAがその機能を低い効率で果たすようにする。配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの活性を阻害する化合物は該lncRNAの活性を特異的に抑制する。好ましくは、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの活性は、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、例えば少なくとも90％または95％、より一層好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは約100％低減される。RNAの活性の低減を測定するための手段および方法は当技術分野で確立されており、例えば、Esauら, (2004), JBC, 279:52361-52365またはGribbingsら, (2009), Nature Cell Biology 11, 1143-1149に記載されている。本明細書において項目（ii）で定められている化合物はアンチセンス分子、siRNA、shRNA、抗体、リボザイム、アプタマーまたは小分子でありうる。これら及び他の化合物は本明細書中で以下にさらに詳細に説明される。
【００１４】
抑制性化合物の効率は、インヒビターの存在下の活性のレベルをインヒビターの非存在下の活性レベルと比較する方法によって定量されうる。例えば、活性尺度として、形成されるlncRNAの量の変化が用いられうる。そのような方法は、幾つかの抑制性化合物の効率を同時に試験するために、ハイスループット形式で行われうる。ハイスループットアッセイは、生化学アッセイ、細胞アッセイまたは他のアッセイから独立して、一般に、マイクロタイタープレートのウェル内で実施可能であり、この場合、各プレートは96、384または1536ウェルを含有しうる。周囲温度以外の温度でのインキュベーションおよび試験化合物とアッセイ混合物との接触を含む、プレートの取り扱いは、好ましくは、ピペット装置を含む1以上のコンピューター制御ロボットシステムの影響を受ける。試験化合物の大きなライブラリーをスクリーニングし、および／または短時間でスクリーニングを行う場合、例えば10、20、30、40、50または100個の試験化合物の混合物が各ウェルに添加されうる。ウェルが、予想される活性を示す場合、試験化合物の該混合物は、該活性を与える該混合物中の1以上の試験化合物を特定するためにデコンボリューションされうる。
【００１５】
本明細書において項目（i）で定められている、配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を促進する化合物は、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAの転写を増強またはアップレギュレートする任意の化合物でありうる。そのような化合物の非限定的な例として、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAをコードする遺伝子の転写を増強する転写因子、または配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子である。転写因子は、特定のDNA配列に結合することによりDNAからRNAへの遺伝子情報の転写を制御するタンパク質である。小分子は、その名が示すとおりポリマーではない低分子化合物である。本明細書において項目（i）で定められている、配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの活性を促進する化合物は、該lncRNAに細胞内でその機能を効果的に果たさせる任意の化合物でありうる。したがって、最も単純な形態では、そのような化合物は、配列番号12、8〜11および13から選択される組換え産生または単離されたlncRNA、あるいはその任意の前駆体または断片でありうる。この実施形態においては、組換え産生または単離されたlncRNAの投与は、治療される対象におけるlncRNAの濃度を増加させる。このより高い濃度は対象におけるそれぞれのlncRNAの全体的活性を増強する。該断片は完全長lncRNAの機能を保持または実質的に保持していなければならない。そのような化合物はまた、そのようなlncRNAを産生しうるベクターまたは宿主でありうる。したがって、該断片は機能的断片でなければならない。また、異なる種に由来する配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAのオーソログまたは相同（ホモローガス）配列（その前駆体またはその機能的断片を含む）が使用されうる。これに関して、配列番号12、8〜11および13のヒトlncRNAの好ましい相同配列は配列番号25、21〜24および26のそれぞれのマウスホモログである。最も好ましい相同配列は配列番号12である。あるいは、そのような化合物は、lncRNAと直接的または間接的に相互作用することにより、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAの活性を維持し又は更には増強する化合物でありうる。例えば、そのような化合物は、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAがRNアーゼによって変性されるのを防ぐことが可能であり、または、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAに結合しその活性を促進する相互作用相手（例えば、別のlncRNA）でありうる。本明細書において項目（i）で定められている化合物は本明細書において後記で更に詳細に説明される。
【００１６】
また、本明細書において項目（i）で定められている化合物の効率は、lncRNAの発現および／または活性促進性化合物（例えば、転写因子）の存在下の、配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAの発現および／または活性のレベルを、該化合物の非存在下の場合と比較する方法により定量されうる。例えば、活性測定値として、生じるlncRNAの量の変化が用いられうる。該方法は、好ましくは、本明細書中に前記で更に詳細に記載されているとおり、ハイスループット形式で行われる。
【００１７】
本発明は、第2の態様において、心肥大の治療または予防における使用のための、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を促進する、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物に関する。
【００１８】
本明細書において項目（i）および（ii）で定められている化合物は、本発明の第1の態様に関連して前記で詳細に記載されている。本発明の第2の態様において、同じ化合物が使用されうる。
【００１９】
心肥大は、筋細胞数の増加を伴わない心臓サイズの増加として定義される。これは心臓壁の肥厚をもたらす。病理学的な心肥大は、高血圧、弁疾患および心筋梗塞（MI）のような種々の形態のストレスに起因する血行力学的過負荷に応答して生じる。心臓の長期的な肥大成長は心臓不整脈、心不全をもたらし、突然死を招きうる（Frey N, Olson EN. Cardiac hypertrophy: the good, the bad, and the ugly. Annu Rev Physiol. 2003; 65: 45-79）。したがって、心肥大は、本発明においては、不健康な心肥大（または病的肥大）、例えば、ストレスまたは疾患、例えば高血圧、心筋傷害（心筋梗塞）、心不全または神経ホルモンに応答する心肥大である。不健康な心肥大は、例えば健全な運動または妊娠に応答した心臓の正常な応答である健康な心肥大（生理的肥大または「スポーツ心臓」）とは異なるとみなされるべきである。健康な被験者の中ではボートの漕ぎ手またはサイクリストは平均心室壁厚が1.3センチメートルの最大の心臓を有する傾向にあり、一方、平均成人の平均心室壁厚は1.1センチメートルである。
【００２０】
心肥大の発生に関与するlncRNAを特定するために、横行大動脈狭窄（TAC）マウスモデルを使用した（deAlmeidaら, (2010), J Vis Exp. 2010 Apr, (38)）。TACマウスモデルは1991年に確立された。それ以来、このモデルは、ヒトの心肥大を模擬するための、そして心肥大反応に関わる基本的なシグナル伝達過程を解明するための貴重な手段として広く使用されている。TACマウスからの単離RNAを、全心臓における全体的lncRNAプロファイリングならびにプラットフォームNCodeおよびArraystarを適用する心筋細胞特異的サンプルのために使用した。驚くべきことに、特定のlncRNAは、陰性対照マウスと比較して、TACマウスにおいて有意に調節解除されていることが見出された。これらのlncRNAをプロファイリングデータから選択した（表5を参照されたい）。マウス心臓組織における転写産物の存在をPCRによって確認し、調節解除をリアルタイムPCRによって確認した。
【００２１】
後記実施例から明らかなとおり、本発明は、意外にも、配列番号1〜7、27および28のヒトlncRNAのマウスホモログ（すなわち、配列番号14〜20のlncRNA）が、陰性対照マウスと比較して、TACマウスモデルにおいて有意にアップレギュレートされることを見出した。この点において、ヒト配列番号1、27および28の配列は全て、配列番号14のマウス配列のホモログであることに注目されたい。ヒトとマウスとを区別するゲノム重複事象ゆえに、複数のヒトホモログが存在する。3つのヒトホモログは全て、ヒトの心臓組織で発現することが判明し、大動脈狭窄を有する患者からの肥大心臓においてアップレギュレートされることが最も顕著に認められた（図13Bを参照されたい）。これらのマウスおよびヒトの相同lncRNAのアップレギュレーションは心肥大の発生と明らかに関連している。したがって、配列番号14〜20のマウスlncRNAならびに配列番号1〜7、27および28の相同ヒトlncRNAは肥大促進性lncRNAである。相同ヒトlncRNAはマウスlncRNAと同じ機能を有すると予想されうる。したがって、ヒトにおける配列番号1〜7、27および28のlncRNAの発現および／または活性の抑制は心肥大の治療または予防に有益である。
【００２２】
更に後記実施例から明らかなとおり、本発明は、配列番号12、8〜11および13のヒトlncRNAのマウスホモログ（すなわち、配列番号25、21〜24および26のlncRNA）が、陰性対照マウスと比較して、TACマウスモデルにおいて有意にダウンレギュレートされることを明らかにしている。これらのマウスlncRNAのダウンレギュレーションは心肥大の発生と明らかに関連している。したがって、配列番号25、21〜24および26のマウスlncRNAならびに配列番号12、8〜11および13の相同ヒトlncRNAは抗肥大性lncRNAである。したがって、ヒトにおける配列番号12、8〜11および13のlncRNAの発現および／または活性の促進は心肥大の治療または予防に有益である。
【００２３】
配列番号14〜20のマウスlncRNAが肥大促進性lncRNAであり、配列番号25、21〜24および26のマウスlncRNAが抗肥大性lncRNAであるという結論は、肥大促進性RNA 1ncRNA Gm11641（配列番号14; ヒトホモログ配列番号1、27および28）、抗肥大性lncRNA Gm17499（配列番号21、ヒトホモログ配列番号8）および抗肥大性lncRNA H19（配列番号25; ヒトホモログ配列番号12）に関して、独立したインビトロモデルにおいて更に実験的に証明されている。Gm11641は本明細書においてChast（心肥大関連転写産物）とも称される。肥大化心筋細胞の特徴は、非肥大細胞と比較した場合の細胞サイズの増加である。インビトロ肥大成長およびHL-1マウス心筋細胞の細胞サイズの増加はフェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）によって誘導されうる。したがって、第1の実験設定においては、PEおよびISOでの刺激の後のHL-1マウス心筋細胞の細胞サイズを、（a）lncRNA Gm11641の発現が抑制される条件下、および（b）lncRNA Gm11641の発現が上昇する条件下で調べた。（図11を参照されたい）。TACマウスモデルの結果と合致して、lncRNA Gm11641の過剰発現は陰性対照と比較して細胞サイズの増加をもたらすが、lncRNA Gm11641の抑制は心筋細胞サイズを減少させ、細胞サイズのPE/ISO誘発性増加を更に低下させることが判明した。更に、Gm11641の過剰発現は左心室の筋肉量を増加させ、心筋細胞の増殖を誘導する（図38）。これらの結果はlncRNA Gm11641の肥大促進性機能を示している。lncRNA Gm17499およびH19を使用するそれぞれ第2および第3の実験設定において、対応実験を行った。同様にTACマウスモデルの結果と合致して、lncRNA Gm17499の発現の増強は肥大促進刺激によるHL-1細胞サイズの増加を妨げ、一方、lncRNA Gm17499のサイレンシングはHL-1心筋細胞の拡大をもたらし、このことはこの転写産物の抗肥大機能を示している（図22を参照されたい）。これらの結果はlncRNA Gm17499の抗肥大機能を示している。lncRNA H19の抑制を伴う実験においても同様の結果が観察された（図28〜30を参照されたい）。重要なことに、H19の発現をヒトの健常心臓および肥大心臓（大動脈狭窄によるもの）組織で調べたところ、H19は肥大心臓において強くダウンレギュレートされることが判明した（図31を参照されたい）。また、H19ノックダウンマウスのインビボ結果は、H19が肥大遺伝子プログラムに対して有益な効果をもたらし、抗肥大治療に有用であることを示している（図34および35を参照されたい）。
【００２４】
本発明の第2の態様の好ましい実施形態においては、心肥大は心室肥大である。
【００２５】
心肥大のほとんどの症例が心室に影響を及ぼす。左心室肥大がより一般的であるが、心肥大は右心室または両方の心室でも生じうる。心室は、肺（右心室）または体の残りの部分（左心室）に血液を送り出す心臓の室である。
【００２６】
本発明の第1および第2の態様の好ましい実施形態においては、（ii）で定められている化合物は、（a）配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの少なくとも12個の連続的ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、（b）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの相補鎖と少なくとも69％同一であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、（c）UがTにより置換された（a）または（b）に記載のヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、（d）（a）〜（c）のいずれか1つにおいて定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、あるいは（e）（d）の発現ベクターを含む宿主である。
【００２７】
本発明においては、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」なる語は、DNA、例えばcDNA、または好ましい実施形態においてはゲノムDNA、およびRNAを含む。本明細書中で用いる「RNA」なる語は全ての形態のRNA、例えば好ましい実施形態においてはmRNAまたはmiRNAを含むと理解される。「核酸配列」なる語は、本発明においては、「ポリヌクレオチド」なる語と互換的に使用される。
【００２８】
この好ましい実施形態の項目（a）〜（c）において定められている核酸配列は、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAのヌクレオチドを含む又はそれに相補的な配列を含む又はそれからなる。したがって、これらの核酸配列はアンチセンス核酸配列を含む又はアンチセンス核酸配列である。標的遺伝子の発現をサイレンシングするためのアンチセンス技術は十分に確立されており、様々な疾患を治療するために当技術分野で広く使用されている。
【００２９】
本発明のこの好ましい実施形態の項目（a）に記載の分子は、配列番号1〜7、27および28の少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチドまたは全23ヌクレオチド、または全23個のヌクレオチド（この順序で好ましさが増加する）に相補的な配列を含む又は該配列からなる。これらの少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチドまたは少なくとも21ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1〜7、27および28の連続部分であり、すなわち、該ヌクレオチドはそれぞれの配列番号において連続している。
【００３０】
項目（a）に記載の分子は、好ましくは「siRNA」である。本発明における「siRNA」なる語は低分子干渉RNA（短い干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても公知であ）を意味する。siRNAは、生物学において様々な役割を果たす、18〜30、好ましくは20〜25、最も好ましくは21〜23または21ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子のクラスである。最も顕著なことに、siRNAは、siRNAが特定の遺伝子の発現を妨害するRNA干渉（RNAi）経路に関与する。RNAi経路におけるそれらの役割に加えて、siRNAはまた、例えば抗ウイルスメカニズムとして、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際に、RNAi関連経路において作用する。siRNAは、明確な構造、すなわち、短い二本鎖のRNA（dsRNA）を有し、有利には、オーバーハング（突出部）を有する少なくとも1つのRNA鎖を伴う。各鎖は、典型的には、5'リン酸基および3'ドロキシル（-OH）基を有する。この構造は、長いdsRNAまたは小さなヘアピンRNAのいずれかをsiRNAに変換する酵素であるダイサー（dicer）によるプロセシングの結果である。siRNAはまた、細胞内に外因的に（人工的に）導入されて、関心のある遺伝子の特異的ノックダウンをもたらしうる。したがって、配列が知られている任意の遺伝子は、原則として、適切に操作されたsiRNAとの配列相補性に基づいて標的化されうる。二本鎖RNA分子またはその代謝加工産物は、標的特異的核酸修飾、特にRNA干渉および／またはDNAメチル化を媒介しうる。また、好ましくは、少なくとも1つのRNA鎖は5'-および／または3'-オーバーハングを有する。好ましくは、二本鎖の一端または両端は、1〜5ヌクレオチド、より好ましくは1〜3ヌクレオチド、最も好ましくは2ヌクレオチドの3'-オーバーハングを有する。一般に、siRNAとして作用するのに適した任意のRNA分子が本発明において想定される。最も効率的なサイレンシングは、2ntの3'-オーバーハングを有するように対になった、21ntのセンスおよび21ntのアンチセンス鎖から構成されるsiRNA二本鎖を使用して、これまでに得られている。2ntの3'オーバーハングの配列は、第1の塩基対に隣接する不対ヌクレオチドに限定された標的認識の特異性に小さな寄与をする（Elbashirら, Nature, 2001年5月24日; 411（6836）：494-8 ）。3 'オーバーハング中の2'-デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同等に効率的であるが、しばしば、安価に合成でき、おそらく、ヌクレアーゼに対して、より耐性である。本発明のsiRNAは、配列番号1〜7、27および28の少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、または全23ヌクレオチド（この順序で好ましさが増加する）に相補的な配列を含む又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。これらの少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、または少なくとも21ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1〜7、27および28の連続部分であり、すなわち、該ヌクレオチドはそれぞれの配列番号において連続している。
【００３１】
項目（a）に記載の分子はまた、好ましくは「shRNA」である。本発明における「shRNA」は、短いヘアピンRNAであり、これは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするためにも使用されうる（タイトな）ヘアピンターンを作るRNAの配列である。shRNAは、好ましくは、その発現のためにU6プロモーターを利用する。shRNAヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAに切断され、ついでこれはRNA誘導性サイレンシング複合体（RISC）に結合する。この複合体は、それに結合しているshRNAに合致したmRNAに結合し、それを切断する。本発明のshRNAは、配列番号1〜7、27および28の少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、または全23ヌクレオチド（この順序で好ましさが増加する）に相補的な配列を含む又はそれからなる。これらの少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、または少なくとも21ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1〜7、27および28の連続部分であり、すなわち、該ヌクレオチドはそれぞれの配列番号において連続している。
【００３２】
本発明の前記の好ましい実施形態の項目（b）の分子は標的lncRNAと相互作用することが可能であり、より詳細には、ハイブリダイズすることが可能である。ハイブリッドの形成により、lncRNAの機能が低減または遮断される。そのようなアンチセンス技術に関する標準的な方法が記載されている（例えば、Melaniら, Cancer Res. （1991） 51：2897-2901を参照されたい）。したがって、本発明における「アンチセンス分子」なる語は、与えられたlncRNA、すなわち「センス」配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子、好ましくはRNA分子を意味する。
【００３３】
項目（b）に記載の分子の特に好ましい例は、エンドリボヌクレアーゼにより調製されたsiRNA（esiRNA）である。esiRNAは、大腸菌(Escherichia coli)RNaseIIIまたはダイサーのようなエンドリボヌクレアーゼによる項目（b）における長い二本鎖RNA（dsRNA）の切断から生じるsiRNAオリゴヌクレオチドの混合物である。esiRNAはRNA干渉（RNAi）のための化学合成siRNAの利用のもう1つの概念である。esiRNAはインビトロにおける長い二本鎖RNAの酵素消化物である。esiRNAの生成のために、lncRNA鋳型のcDNAをPCRによって増幅し、2つのバクテリオファージ - プロモーター配列でタグ付けすることが可能である。ついで、RNAポリメラーゼを使用して、標的遺伝子cDNAに相補的な長い二本鎖RNAを生成させる。ついで、この相補的RNAは大腸菌（Escherichia coli）由来のRNアーゼIIIで消化されて、18〜25塩基対の長さを有するsiRNAの短い重複断片を与えうる。短い二本鎖RNAのこの複雑な混合物は、インビボでのダイサー（Dicer）切断によって生成される混合物に類似しており、したがって、エンドリボヌクレアーゼ調製siRNAまたは短いesiRNAと称される。したがって、esiRNAは、同じmRNA配列を全てが標的とするsiRNAの不均一混合物である。 esiRNAは非常に特異的かつ効果的な遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００３４】
配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAに対する項目（b）に記載の分子の配列同一性は少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％および100％（この順序で好ましさが増加する）である。配列同一性を決定するための手段および方法は当技術分野で公知である。好ましくは、配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAに対する配列同一性を決定するためにBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを使用する。配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの相補鎖に対して少なくとも69％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸配列の好ましい例としては、配列番号14〜20から選択される1以上のlncRNAの相補鎖が挙げられる。
【００３５】
本発明のアンチセンス分子、siRNAおよびshRNAは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび通常のRNA合成装置を使用して化学的に合成される。RNA合成試薬の供給業者には、Proligo（Hamburg, Germany）、Dharmacon Research（Lafayette, CO, USA）、Pierce Chemical（Perbio Scienceの一部問, Rockford,IL, USA）、Glen Research（Sterling, VA, USA）、ChemGenes（Ashland, MA, USA）およびCruachem（Glasgow, UK）が含まれる。
【００３６】
インビボでlncRNAおよび遺伝子を強力に、しかし可逆的にサイレンシングするアンチセンス分子、siRNA、およびshRNAの能力は、これらの分子を本発明の医薬組成物における使用に特によく適したものにする。ヒトへのsiRNAの投与方法は、De Fougerollesら, Current Opinion in Pharmacology, 2008, 8：280-285に記載されている。そのような方法は、shRNAのような他の小型RNA分子の投与にも適している。したがって、そのような医薬組成物は、生理食塩水として直接製剤化して、リポソームベースおよびポリマーベースのナノ粒子アプローチを介して、コンジュゲート化または複合体化医薬組成物として、あるいはウイルス送達系を介して投与されうる。直接投与は組織への注射、鼻腔内および気管内投与を含む。リポソームベースおよびポリマーベースのナノ粒子アプローチは、カチオン性脂質であるジェンザイム脂質（Genzyme Lipid）（GL）67、カチオン性リポソーム、キトサンナノ粒子およびカチオン性細胞浸透性ペプチド（CPP）を含む。コンジュゲート化または複合体化医薬組成物はPEI複合体化アンチセンス分子、siRNA、shRNAまたはmiRNAを含む。更に、ウイルス送達系はインフルエンザウイルスエンベロープおよびビロソームを含む。
【００３７】
アンチセンス分子、siRNA、shRNAはロックト核酸（LNA）のような修飾ヌクレオチドを含みうる。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2'酸素と4'炭素とを接続する追加的な架橋で修飾されている。該架橋は、A型二本鎖でしばしば見出される3'エンド（ノース）コンホメーションでリボースを「ロック（固定）」する。必要に応じて、LNAヌクレオチドはオリゴヌクレオチド中のDNAまたはRNA残基と混合されうる。そのようなオリゴマーは化学的に合成され、商業的に入手可能である。ロックされたリボースコンホメーションは塩基の重層およびバックボーンの予備構成を増強する。これはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）を有意に増加させる。siRNAの特に好ましい例は、GapmeR（LNATM GapmeR（Exigon））である。 GapmeRは、mRNAおよびlncRNA機能の非常に効率的な抑制に使用される強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。GapmeRは、LNAのブロックに隣接するDNAモノマーの中央伸長を含有する。GapmeRは、好ましくは、14〜16ヌクレオチド長であり、所望により、完全にホスホロチオアート化されうる。DNAギャップは標的RNAのRNAse H媒介性分解を活性化し、転写産物を核内で直接標的化するのにも適している。GapmeRは、例えば、心筋細胞系HL-1においてlncRNA Gm11641（配列番号14）をダウンレギュレートするために、実施例において使用されている（図9）。
【００３８】
前記の好ましい実施形態の項目（d）に関して使用されうる適当な発現ベクターの例は後記に詳細に記載されている。
【００３９】
本発明の第1および第2の態様の更に好ましい実施形態によれば、（ii）で定められている化合物はアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物または小分子インヒビターである。
【００４０】
この実施形態のアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物または小分子インヒビターは、配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAに特異的に結合し、それにより、配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの活性を抑制する。
【００４１】
本発明における「アプタマー」なる語は、他の分子と結合する能力に基づいてランダムプールから選択された、天然のD-コンホメーションまたはL-コンホメーション（「シュピーゲルマー」）のいずれかであるDNAまたはRNA分子を意味する。核酸、タンパク質、有機低分子化合物、更には生物全体に結合するアプタマーが選択されている。アプタマーのデータベースはhttp://aptamer.icmb.utexas.edu/で管理されている。より詳細には、アプタマーはDNAもしくはRNAアプタマーまたはペプチドアプタマーとして分類されうる。前者はオリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなり、後者は、両末端においてタンパク質スカフォールドに結合した短い可変ペプチドドメインからなる。核酸アプタマーは、反復ラウンドのインビトロ選択によって、または同等に、SELEX（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）によって操作されて、小分子、タンパク質、核酸、そして更には細胞、組織および生物のような様々な分子標的に結合するようにされた核酸種である。本発明により想定される分子標的は、核酸、すなわち、1〜7、27および28から選択されるlncRNAである。したがって、アプタマーは本発明の標的分子に対して産生されうる。ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨げるように設計されたペプチドである。それらは、タンパク質スカフォールドに両末端において結合した可変ペプチドループからなる。この二重の構造的制約は、ペプチドアプタマーの結合アフィニティを、抗体のものに匹敵するレベル（ナノモル範囲）へと著しく増加させる。可変ループ長は、典型的には10〜20アミノ酸から構成され、スカフォールドは、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質でありうる。現在、細菌タンパク質であるチオレドキシン-Aが、最も使用されているスカフォールドタンパク質であり、野生型タンパク質における-Cys-Gly-Pro-Cysループである還元性活性部位内にその可変ループが挿入されており、2つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成しうる。ペプチドアプタマーの選択は、種々の系を使用して行われうるが、現在最もよく使用されているのは酵母ツーハイブリッドシステムである。
【００４２】
アプタマーは、一般に使用されている生体分子、特に抗体の分子認識特性に匹敵する分子認識特性をもたらすため、バイオテクノロジーおよび治療用途に有用である。アプタマーは、それらの識別的な認識に加えて、試験管内で完全に操作可能であり、化学合成によって容易に産生され、所望の保存特性を有し、治療用途において免疫原性をほとんど又は全く惹起しないため、抗体と比較した場合の利点をもたらす。非修飾アプタマーは数分〜数時間の半減期で血流から迅速に除去される。これは、主に、ヌクレアーゼ分解、および腎臓による身体からのクリアランスによるものであり、アプタマーの本質的に低い分子量の結果である。アプタマーの迅速なクリアランスはインビボ診断イメージングのような用途において有利でありうる。2'-フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（PEG）結合などのような幾つかの修飾が科学者に利用可能であり、それにより、アプタマーの半減期が日または更には週の時間スケールにまで容易に増加されうる。
【００４３】
「リボザイム」なる語は、タンパク質の非存在下で酵素として作用するRNA分子を意味する。これらのRNA分子は触媒的または自己触媒的に作用し、例えば特定の標的部位で他のRNAを切断しうるが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見出されている。適切な標的部位および対応するリボザイムの選択は、例えばZaherおよびUnrau (2007), RNA 13（7）：1017-1026に記載されているとおりに行われうる。
【００４４】
よく特徴づけされた小さな自己切断性RNAの例として、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびインビトロ選択リード依存性リボザイムが挙げられる。これらの小さな触媒の構成は、グループIイントロンのようなより大きなリボザイムのものとは対照的である。触媒的自己切断の原理は過去10年間に十分に確立された。ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム活性を有するRNA分子の中で最もよく特徴付けられている。ハンマーヘッド構造は異種RNA配列内に組み込まれることが可能であること、およびそれによってリボザイム活性がこれらの分子に転移されうることが示されたため、標的配列が潜在的合致切断部位を含有するならば、ほとんどあらゆる標的配列に対する触媒配列が作製されうるようである。
【００４５】
ハンマーヘッドリボザイムを構築する基本原理は以下の通りである。GUC（またはCUC）トリプレットを含有する、RNAの関心領域を選択する。各々6〜8ヌクレオチドを有する2つのオリゴヌクレオチド鎖を採取し、それらの間に触媒ハンマーヘッド配列を挿入する。このタイプの分子を多数の標的配列について合成した。それらは、インビトロおよび場合によってはインビボで触媒活性を示した。最良の結果は、通常、短いリボザイムおよび標的配列で得られる。標的配列は、短いRNA配列、すなわち、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAであるため、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAは、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAを特異的に切断しうるリボザイムの作製のための真正の標的である。
【００４６】
また、アプタマーおよびリボザイムはロックト核酸（LNA）のような修飾ヌクレオチドを含みうる。
【００４７】
本発明において用いる「抗体」なる語は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む。更に、結合特異性を依然として保持しているその誘導体または断片も「抗体」なる語に含まれる。抗体フラグメントまたは誘導体は、とりわけ、FabまたはFab 'フラグメント、Fd、F（ab'）2、FvまたはscFvフラグメント、単一ドメインVHまたはV様ドメイン、例えばVhHまたはV-NARドメイン、および多量体形態、例えばミニボディ、ジアボディ、トリボディ、テトラボディ、または化学的にコンジュゲート化されたFab'-多量体を含む（例えば、Altshulerら, 2010., HolligerおよびHudson, 2005を参照されたい）。「抗体」なる語はまた、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトCDR以外はヒト抗体）抗体などの実施形態も含む。
【００４８】
抗体およびそのフラグメントの製造のための様々な技術は当技術分野でよく知られており、例えば、Altshulerら, 2010に記載されている。例えば、ポリクローナル抗体は、添加物およびアジュバントと混合された抗原での免疫化の後の動物の血液から入手可能であり、モノクローナル抗体は、連続細胞系培養によって産生される抗体を与える任意の技術によって製造されうる。そのような技術の例は、例えばHarlowおよびLane（1988）および（1999）に記載されており、KohlerおよびMilstein, 1975により最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor, 1983; Liら, 2006を参照されたい）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら, 1985）を含む。更に、組換え抗体はモノクローナル抗体から入手可能であり、あるいはファージ、リボソーム、mRNAまたは細胞ディスプレイのようなディスプレ法を用いてデノボ（de novo）製造されうる。組換え（ヒト化）抗体またはそのフラグメントの発現のための適切な系は、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳類細胞系またはトランスジェニック動物もしくは植物（例えば、米国特許第6,080,560号; HolligerおよびHudson, 2005）から選択されうる。更に、一本鎖抗体の製造に関して記載されている技術（とりわけ、米国特許第4,946,778号を参照されたい）は、本発明の標的に特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることができる。BIAcore系で使用される表面プラズモン共鳴を用いて、ファージ抗体の効率を高めることができる。
【００４９】
「タンパク質薬物」なる語は、ヒトタンパク質の誘導体であるデザイナー薬物を示す。これらのタンパク質は、十分に確立されたスクリーニング法によってタンパク質薬物を作製するための骨格（スカフォールド）として使用される（Tomlinsonら（2004）, NATURE BIOTECHNOLOGY, 22(5): 521-522を参照されたい）。タンパク質薬物を設計するための骨格として役立つヒトタンパク質の非限定的な例としては、トランスフェリン、C型レクチン、トリネクチン、ドメイン抗体、クニッツドメイン、リポカリンおよびFyn SH3ドメインが挙げられる。
【００５０】
小分子インヒビターは、その名が示すとおりポリマーではない低分子量有機化合物である。本発明の小分子は、好ましくは、配列番号1〜7、27および28のlncRNAに高いアフィニティで結合する分子であって、更には、配列番号1〜7、27および28のlncRNAの活性を抑制する分子である。小分子の上限分子量は、好ましくは1500Daであり、より好ましくは1000Daであり、最も好ましくは800Daであり、これは、それが細胞内の作用部位に到達しうるように細胞膜を急速に拡散する可能性をもたらす。小有機分子のライブラリー、およびそのようなライブラリーを特異的標的分子（この場合には、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNA）でスクリーニングするためのハイスループット技術は当技術分野において確立されている。
【００５１】
アンチセンス分子、siRNA、shRNA、抗体、酵素、リボザイム、アプタマー、タンパク質薬物または小分子インヒビターはコレステロールのような脂質に融合されうる。脂質修飾、特に核酸分子へのコレステロール修飾を導入するための手段および方法はKrutzfeldtら, 2005（Nature 438, 685-689）に記載されている。例えば、コレステロールはヒドロキシルプロリノール結合を介して核酸分子に連結されうる。そのような修飾は細胞内への核酸分子、特に小さなRNAの取り込みの効率を高める。
【００５２】
本発明の第1および第2の態様のもう1つの好ましい実施形態においては、（i）で定められている化合物は、（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの核酸配列またはそれに対して少なくとも69％同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸配列、（b）（a）で定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、又は（c）（b）の発現ベクターを含む宿主である。
【００５３】
この好ましい実施形態の項目（a）に記載の核酸配列は、配列番号12、8〜11および13から選択される組換え産生または単離されたlncRNA、その任意の前駆体またはそれらの任意の断片であることが可能であるが、この場合、配列番号12および8〜11および13から選択されるlncRNAの全長にわたって少なくとも69％の配列同一性が維持されていなければならない。また、異なる種に由来する配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAのオーソログまたはホモローガス配列（その前駆体または機能的断片を含む）が使用されうる。好ましくは、配列番号21〜26のそれぞれのマウスホモログが使用される。該断片は完全長lncRNAの機能を保持または実質的に保持していなければならない。したがって、該断片は機能的断片でなければならない。配列番号8〜13のlncRNAと少なくとも69％同一である核酸配列を含む配列の特に好ましい例としては、それぞれ配列番号21〜26のマウス相同lncRNAが挙げられる。最も好ましいマウス相同lncRNAは配列番号25である。
【００５４】
配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAに対する項目（a）に記載の核酸配列の配列同一性は少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％および100％（この順序で好ましさが増加する）である。配列同一性を決定するための手段および方法は当技術分野で公知である。好ましくは、配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAに対する配列同一性を決定するために、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムが使用される。
【００５５】
前記の好ましい実施形態の項目（b）および（c）においては、そのような化合物は、項目（a）で定められている核酸配列を産生しうる発現ベクターまたは宿主でありうる。
【００５６】
発現ベクターは、特定の転写産物を標的細胞内に導入するために使用されるプラスミドでありうる。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によりコードされるタンパク質が細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体により産生される。該プラスミドは、一般に、制御配列を含有するように操作され、該制御配列はエンハンサーおよび／またはプロモーター領域として作用し、転写産物の効率的な転写をもたらす。本発明においては、発現ベクターは、好ましくは、心臓特異的プロモーターを含有する。心臓特異的プロモーターは当技術分野において、例えばBoeckerら (2004), Mol Imagin,; 3(2): 69-75から公知である。これは、該核酸配列が心臓でのみ発現されることを保証し、他の臓器での発現による潜在的な望ましくない副作用を回避しうる。
【００５７】
発現ベクターの非限定的な例には、原核性プラスミドベクター、例えば、pUC系列、pBluescript（Stratagene）、発現ベクターのpET系列（Novagen）またはpCRTOPO（Invitrogen）、および哺乳類細胞における発現に和合性のベクター、例えばpREP（Invitrogen）、pcDNA3（Invitrogen）、pCEP4（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR（Clontech）、pIRES-EGFP（Clontech）、pEAK-10（Edge Biosystems） pTriEx-Hygro（Novagen）およびpCINeo（Promega）が含まれる。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）に適したプラスミドベクターの例は、例えば、プラスミドpAO815、pPIC9KおよびpPIC3.5K（全てIntvitrogen）を含む。医薬組成物の製剤の場合、優良医薬品製造基準に従って適当なベクターが選択される。そのようなベクターは、当技術分野において、例えばAusubelら, Hum Gene Ther. 2011 Apr; 22(4): 489-97またはAllayら, Hum Gene Ther. May 2011; 22(5): 595-604から公知である。
【００５８】
典型的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写の開始をもたらすプロモーター要素、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写産物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。更に、複製起点、薬剤耐性遺伝子、調節因子（誘導性プロモーターの一部として）のような要素も含まれうる。lacプロモーターは、原核細胞に有用な典型的な誘導性プロモーターであり、これは、ラクトース類似体であるイソプロピルチオール-b-D-ガラクトシド（「IPTG」）を使用して誘導されうる。組換え発現および分泌のためには、関心のあるポリヌクレオチドは、例えば、pHEN4（Ghahroudiら, 1997, FEBS Letters 414:521-526に記載されている）と称されるファージミドにおける遺伝子IIIとpelBリーダーシグナル（これは組換えタンパク質をペリプラズムに導く）との間に連結されうる。追加的な要素には、エンハンサー、コザック（Kozak）配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列を含まれうるであろう。高効率転写は、SV40由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIに由来する長末端反復配列（LTR）、ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーターを使用して達成されうる。しかし、細胞要素（例えば、ヒトアクチンプロモーター）も使用されうる。本発明の実施に使用される適当な発現ベクターには、例えば、pSVLおよびpMSG（Pharmacia, Uppsala, Sweden）、pRSVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）およびpBC12MI（ATCC 67109）のようなベクターが含まれる。あるいは、組換え（ポリ）ペプチドは、染色体内に組み込まれた遺伝子構築物を含有する安定な細胞系において発現されうる。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択マーカーとのコトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。トランスフェクトされた核酸は、コードされた（ポリ）ペプチドを大量に発現するように増幅されることも可能である。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、関心のある遺伝子の数百または更には数千コピーを保有する細胞系を開発するために有用である。もう1つの有用な選択マーカーとしては、酵素グルタミンシンターゼ（GS）が挙げられる（Murphyら, Biochem J. 227：277-279; Bebbingtonら, 1992, Bio / Technology 10: 169-175）。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択培地内で増殖させ、最高の耐性を有する細胞を選択する。前記のとおり、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核細胞培養のためのG418またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（E. coli）および他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ベクター修飾技術に関しては、ambrookおよびRussel (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Vol.を参照されたい。一般に、ベクターは、クローニングまたは発現のための1以上の複製起点（ori）および継代系、宿主における選択のための1以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、ならびに1以上の発現カセットを含有しうる。適当な複製起点（ori）には、例えばCol E1、SV40ウイルスおよびM13複製起点が含まれる。
【００５９】
ベクター内に挿入されたコード配列は、例えば、標準的な方法によって合成可能であり、あるいは天然源から単離されうる。転写調節要素および／または他のアミノ酸コード配列へのコード配列の連結は、確立された方法を用いて行われうる。原核生物または真核細胞における発現を保証する転写調節要素（発現カセットの一部）は当業者によく知られている。これらの要素は、転写の開始を保証する調節配列（例えば、翻訳開始コドン、プロモーター、エンハンサー、および／または絶縁体）、内部リボソーム侵入部位（IRES）（Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476）、そして場合によっては、転写の終結および転写産物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。追加的な調節要素には、転写および翻訳エンハンサー、ならびに／または天然で付随している又は異種のプロモーター領域が含まれうる。好ましくは、本発明の前記の好ましい実施形態の項目（a）で定められているヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞における発現を可能にするそのような発現制御配列に作動的に連結される。
【００６０】
宿主は原核細胞または真核細胞でありうる。適当な真核宿主は哺乳動物細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞でありうる。細菌細胞の代表例としては大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）細胞が挙げられ、真菌細胞の代表例としては酵母細胞が挙げられ、昆虫細胞の代表例としてはショウジョウバエ（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞が挙げられる。細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞であることが好ましい。使用されうる哺乳類宿主細胞には、ヒトHela、293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、COS 1、COS 7およびCV1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が含まれる。細胞は細胞系の一部、好ましくはヒト細胞系の一部でありうる。前記宿主細胞のための適当な培地および条件は当技術分野において公知である。宿主は、好ましくは、宿主細胞、より好ましくは、単離された宿主細胞である。宿主はまた、好ましくは、非ヒト宿主である。
【００６１】
本発明の第1および第2の態様のもう1つの好ましい実施形態においては、（i）で定められている化合物は、（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を促進する転写因子、ならびに／または（b）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子である。
【００６２】
本明細書中で用いる「転写因子」なる語は、特定のDNA配列に結合して、配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAをコードする遺伝子の転写を制御するタンパク質またはペプチドを意味する。配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAの発現を活性化する際の転写因子の効率は、転写因子の存在下のlncRNAのレベルと転写因子の非存在下のlncRNAのレベルとを比較する方法により定量されうる。例えば、活性尺度として、生じたlncRNAの量の変化が用いられうる。そのような方法は、幾つかの抑制性化合物の効率を同時に試験するために、ハイスループット形式で行われうる。ハイスループット形式については前記に更に詳細に記載されている。
【００６３】
配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子は、その名が示すとおりポリマーではない低分子量有機化合物である。本発明の小分子は、好ましくは、配列番号12、8〜11および13のlncRNAに高いアフィニティで結合する分子であって、更に、配列番号11、8〜11および13のlncRNAの活性を増強する分子である。小分子の上限分子量は、好ましくは1500Daであり、より好ましくは1000Daであり、最も好ましくは800Daであり、これは、それが細胞内の作用部位に到達しうるように細胞膜を急速に拡散する可能性をもたらす。小有機分子のライブラリー、およびそのようなライブラリーを特異的標的分子（この場合には、配列番号12、8〜11、13から選択されるlncRNA）でスクリーニングするためのハイスループット技術は当技術分野において確立されている。
【００６４】
第3の態様においては、本発明は、（a）患者から得たサンプルにおいて、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルを検出し、（b）前記の1以上のlncRNAの発現レベルを、健常被験者から得たサンプルにおけるこれらの1以上のlncRNAの発現レベルと比較することを含む、患者における心肥大を診断するための方法であって、配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの、2倍（２フォールド）を超えるダウンレギュレーション、ならびに／または配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの、2倍（２フォールド）を超えるアップレギュレーションが、患者における心肥大を示す、方法に関する。
【００６５】
本発明の第3の態様による方法はまた、配列番号12、1〜11、13、27および28のいずれか1つに対して少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％、および少なくとも99.5％（この順序で好ましさが増加する）同一である1以上のlncNAの発現レベルを検出し、比較することをも含みうる。配列同一性を決定するための手段および方法は当技術分野で公知である。好ましくは、配列番号1〜7、27および28ならびに／または12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAに対する配列同一性を決定するために、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムが使用される。本発明の第3の態様による方法は更に、配列番号1〜7、27および28ならびに／または12、8〜11および13と比較して10個以下、例えば5、4、3、2または1個（この順序で好ましさが増加する）のヌクレオチドが異なる1以上のlncRNAの発現レベルを検出し、比較することを含みうる。ヌクレオチドの相違はヌクレオチドの付加、欠失および／または置換でありうる。また、発現が比較される配列は、相同であっても、10個以下、例えば5、4、3、2または1個（この順序で好ましさが増加する）のヌクレオチドが互いに異なりうる。
【００６６】
「サンプル」なる語は組織サンプルまたは体液サンプルを意味する。体液サンプルは、好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、羊水、脳脊髄液およびリンパから選択される。組織サンプルは、好ましくは、臓器サンプル、例えば心臓、肝臓または腎臓サンプルである。この方法を体液サンプルに適用する場合、lncRNAの発現レベルはlncRNAの濃度に対応すると理解されるべきである。なぜなら、lncRNAは体液中で直接発現されるのではなく、lncRNAを発現する細胞から体液中に分泌されるからである。
【００６７】
本明細書で言及される「患者」または「対象（被験者）」はヒトである。
【００６８】
「lncRNAの発現レベルを検出する」なる語は、lncRNAの量または収率を決定することを意味する。lncRNAは最初は細胞内で発現される。本発明においては、配列番号1〜7、27および28および／または12、8〜11および13のlncRNAは患者のサンプル、特に心臓組織サンプルにおいて検出されうることが見出された。したがって、「サンプルにおいて発現される」lncRNAは、後記で更に詳細に記載されている手段および方法によって発現レベルがサンプルにおいて検出されうるlncRNAである。試験サンプルにおいてncRNAがアップレギュレートされていると言えるのは、ncRNAの量または収率が対照サンプルにおける対応ncRNAの量または収率と比較して有意に大きい場合である。同様に、試験サンプルにおいてncRNAがダウンレギュレートされていると言えるのは、ncRNAの量または収率が対照サンプルにおける対応ncRNAの量または収率と比較して有意に小さい場合である。この文脈においては、「ncRNAを対応させる（対応ncRNA）」は、例えば、試験サンプルにおける配列番号1のlncRNAの発現レベルを対照サンプルにおける配列番号1のlncRNAの発現レベルと比較すること、あるいは同様に、試験サンプルにおける配列番号2のlncRNAの発現レベルを対照サンプルにおける配列番号2のlncRNAの発現レベルと比較することを意味する。これは、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される複数のlncRNAの発現を決定する場合に、必要な変更を加えて適用される。例えば、配列番号12、1〜11、13、27および28の全lncRNAの発現レベルを試験サンプルにおいて決定する場合、それを、対照サンプルにおける配列番号12、1〜11、13および28の全lncRNAの発現レベルと比較する。
【００６９】
サンプルにおける発現レベルは、当技術分野で利用可能な任意の適当な手段および方法により定量されうる。一般に、相対的および絶対的な定量化の手段および方法が用いられうる。絶対的定量化においては、既知の標準または対照は必要ではない。発現レベルは直接的に定量化されうる。当技術分野でよく知られているとおり、絶対的定量化は、予め決定された標準曲線に基づくものでありうる。相対的定量においては、発現レベルは基準（例えば、既知の対照発現レベル）に対して定量化される。対照の非存在下でも、例えば蛍光強度を比較する場合、発現レベルを相対的に定量化することが可能である。
【００７０】
RNA濃度を評価するための方法は、例えば、核酸に結合し、結合すると選択的に蛍光を発する色素の蛍光強度を測定することを含みうる。そのような方法は逆転写反応およびcDNAの産生を含み、この場合、cDNAの量を決定し、それにより、RNAの量を間接的に決定する。RNA濃度が低すぎて分光測光法では正確に評価できない場合、および／または260nmで吸収する汚染物質が分光光度法による正確な定量化を困難もしくは不可能にする場合、蛍光に基づく方法が特に有用である。異なるサンプル間で1以上のlncRNAの発現レベルを比較する場合、比較の信頼性は、好ましくは、潜在的なサンプル間変動を補正するための不変の内在性対照（参照遺伝子の発現）を含めることにより改善される。不変の内在性対照に対するそのような標準化は当技術分野において通常行われている。例えば、リアルタイムRT-PCR（例えば、Bustin, Journal of Molecular Endocrinology, (2002) 29, 23-39を参照されたい）またはマイクロアレイ発現分析（例えば、CalzaおよびBalwitan, Methods Mol Biol. 2010; 673: 37-52を参照されたい）における、発現レベルの標準化のための手段および方法は十分に確立されている。また、小さなRNAの配列の発現レベルの標準化のための方法が確立されている（例えば、Mestdaghら (2009) Genome Biol.; 10(6): R64を参照されたい）。本発明において発現レベルを決定するためにRT-PCRまたはマイクロアレイを用いる場合、発現レベルは、好ましくは、スパイクイン（spiked-in）RNAに対して標準化される（例えば、McCormickら (2011), Silence, 2:2）。既知量のスパイクインRNAを、調製中のサンプルと混合する。より好ましくは、サンプルが血漿および／または血清である場合、RNA単離プロセスを行う前に、該RNAを血漿および／または血清に外部から添加する。スパイクインRNA技術はよく知られており、多数の製造業者から市販キットが入手可能である。スパイクインRNAは、好ましくは、スパイクイン  シー・エレガンス（C. elegans）RNAである。
【００７１】
後記実施例から明らかなとおり、14〜20および15〜26から選択される1以上のマウスlncRNAのレベルの調節解除は、TACマウスモデルにおいて証明されているとおり、心肥大の指標となる。したがって、12、1〜11、13、27および28から選択されるそれぞれの1以上のヒト相同lncRNAの発現レベルを決定することは、患者における心肥大を診断するために予後判断上重要であると予想されうる。12、1〜11、13、27および28から選択されるlncRNAは、診断方法の信頼性を高めるために、心肥大に関する他の診断マーカーと組合されうる。1〜7、27および28から選択されるlncRNAの高い発現レベルおよび12、8〜11および13から選択されるlncRNAの低い発現レベルは心肥大の指標となる。
【００７２】
後記実施例においては、lncRNAの発現レベルを検出するために、配列番号29〜62のプライマー配列を使用した。この場合、奇数はフォワードプライマーであり、偶数はリバースプライマーである。配列番号29および30、配列番号31および32、配列番号33および34などのような連続番号はプライマーペアである。配列番号29/30のプライマーペアはマウスlncRNA H19（配列番号25）の発現レベルの検出用であり、配列番号31/32のプライマーペアはヒトlncRNA H19（配列番号12）の発現レベルの検出用である。配列番号39/40のプライマーペアはマウスlncRNA Gm11641（配列番号14）の発現レベルの検出用であり、3つのヒト相同lncRNAである配列番号1、27および28の発現レベルは、それぞれ配列番号33/34、配列番号35/36および配列番号37/38のプライマーペアにより検出されうる。
【００７３】
これらのプライマーペアの1以上は、好ましくは、本発明の第3の態様による診断方法において使用される。これらのプライマーペアの1以上は、好ましくは、後記の本発明のキットに同様に組み込まれる。2倍（２フォールド）より大きなダウンレギュレーションとしては、3倍より大きなダウンレギュレーション、4倍より大きなダウンレギュレーション、5倍より大きなダウンレギュレーション、6倍より大きなダウンレギュレーション、7倍より大きなダウンレギュレーション、および8倍（２フォールド）より大きなダウンレギュレーション（この順序で好ましさが増加する）が挙げられる。同様に、2倍（２フォールド）より大きなアップレギュレーションとしては、3倍より大きなアップレギュレーション、4倍より大きなアップレギュレーション、5倍より大きなアップレギュレーション、6倍より大きなアップレギュレーション、7倍より大きなアップレギュレーション、および8倍（２フォールド）より大きなアップレギュレーション（この順序で好ましさが増加する）が挙げられる。アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションに関する、より高い閾値は、本発明の第3の態様の方法の信頼性を高めうる。
【００７４】
本発明の第3の態様の好ましい実施形態においては、サンプルは血液サンプルまたは血液由来サンプルである。
【００７５】
血液由来サンプルは、好ましくは血漿または血清である。
【００７６】
本発明の第3の態様のもう1つの好ましい実施形態によれば、サンプルは心臓組織サンプルである。
【００７７】
心臓組織サンプルは、好ましくは心臓壁の筋肉細胞、最も好ましくは心室壁の筋肉細胞を含む。
【００７８】
本発明の第3の態様のもう1つの好ましい実施形態においては、1以上のlncRNAの発現レベルの検出は、（a）定量的PCR、好ましくは定量的リアルタイムPCR、または（b）鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定を含む。
【００７９】
定量的PCR（qPCR）では、増幅産物の量は、蛍光レポーター分子を使用して蛍光強度に関連づけられる。初期鋳型量を計算するために蛍光シグナルが測定される時点は反応終了時（終点半定量的PCR）であっても、増幅が尚も進行中（リアルタイムqPCR）であってもよい。
【００８０】
終点半定量的PCRにおいては、増幅反応が完了した後、通常は30〜40サイクル後に蛍光データを収集し、この最終蛍光を用いて、PCR前に存在する鋳型の量を逆算する。
【００８１】
感度および再現性がより高いリアルタイムqPCR法は、増幅が進行するにつれて各サイクルで蛍光を測定する。これは、試薬の制限、インヒビターの蓄積またはポリメラーゼの不活性化が増幅効率に影響を及ぼし始める前に、増幅の指数関数的段階中の蛍光シグナルに基づく鋳型の定量を可能にする。反応のこれらのより早いサイクルでの蛍光読み取りは、増幅された鋳型量を測定し、この場合、反応は、終点におけるよりも再現性がサンプル間で遥かに高い。
【００８２】
鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光または発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定の非限定的な例としては、転写媒介増幅（TMA）およびハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）が挙げられる。より詳細には、そのような方法は、配列番号12、1〜11、13、27および28のいずれかに相補的な1以上のオリゴヌクレオチド（「捕捉オリゴヌクレオチド」）をハイブリダイズさせることを含みうる。配列番号12、1〜11、13、27および28の2以上を標的とする場合、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される各配列に対して別個の捕捉オリゴヌクレオチドを使用する。ついで、ハイブリダイズした標的配列を磁気微粒子上に捕捉し、それを磁場内でサンプルから分離する。外来成分を除去するために洗浄工程が利用されうる。標的増幅は典型的にはTMAによって行い、TMAは、2つの酵素、すなわち、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素およびT7 RNAポリメラーゼを利用する、転写に基づく核酸増幅法である。配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される各標的配列に対して特有のプライマーセットを使用する。標的配列のDNAコピー（T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含む）を得るために逆転写酵素を使用する。T7 RNAポリメラーゼはDNAコピーからのRNAアンプリコンの複数コピーを産生する。lncRNA発現レベルの検出は、1以上のアンプリコンに相補的な一本鎖化学発光標識核酸プローブを使用するHPAにより達成される。好ましくは、識別可能な様態で標識されたプローブを各標的アンプリコンに対して使用する。標識核酸プローブはアンプリコンに特異的にハイブリダイズする。ついで「選択試薬」が、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識を不活性化することにより、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブとを区別する。検出工程中に、ハイブリダイズしたプローブにより産生された化学発光シグナルをルミノメーターで測定し、「相対光単位」（RLU）として表し、それによりlncRNA発現レベルを定量する。
【００８３】
本発明の第3の態様の更にもう1つの好ましい実施形態においては、該方法は、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび／または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む。
【００８４】
予備増幅工程の実施は、少量の（試験および／または対照）サンプルしか利用できない場合に特に有利である。予備増幅工程は、発現レベルの分析に進む前に、サンプル内のRNAの量を増加させる。RNAの予備増幅のための手段および方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Vermeulenら (2009) BMC Res Notes., 2: 235を参照されたい）。試験サンプルおよび対照サンプル中の両方のRNAを予備増幅する場合には、好ましくは、対照サンプルと比較した場合の試験サンプルのRNAの相対量が維持されるように、予備増幅工程には同じ方法を用いる。試験サンプルまたは対照サンプルのRNAのみを予備増幅する場合、あるいはそれらの2つのRNAサンプルを、異なる方法により予備増幅する場合には、発現レベルデータを予備増幅工程に関して標準化する必要があるかもしれない。例えば、Mestdaghら (2009), Genome Biology 2009, 10:R64を参照されたい。
【００８５】
第4の態様においては、本発明は、患者における心肥大を診断するためのキットであって、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキットに関する。
【００８６】
キットの使用方法の説明は、好ましくは、とりわけ、配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの高い発現レベル、ならびに配列番号12、8〜11および13から選択されるlncRNAの低い発現レベルが心肥大の指標となることを知らせる。
【００８７】
配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段は、好ましくは、（a）定量的PCR、好ましくは定量的リアルタイムPCR、または（b）鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定に必要とされる手段である。これらの手段は本発明の第3の態様に関して前記で更に詳細に記載されており、キットに含まれていてもよい。したがって、該手段は、好ましくは、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAに特異的にハイブリダイズする蛍光ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーのようなオリゴヌクレオチドを含む。キットの追加的成分は蛍光または発光色素であり、これは、好ましくは、該オリゴヌクレオチドに結合している。また、キットの追加的成分は、酵素、例えば逆転写酵素および／またはポリメラーゼでありうる。
【００８８】
本発明のキットにおいては、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段は、好ましくは、配列番号12のlncRNAの検出のための手段を含む。
【００８９】
キットの種々の成分が、1以上の容器、例えば1以上のバイアル内にパッケージングされうる。該バイアルは、該成分に加えて、保存剤または保存用バッファーを含みうる。
【００９０】
本発明の第4の態様の好ましい実施形態においては、該手段は、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである。
【００９１】
本発明の全4態様の好ましい実施形態においては、1以上のlncRNAは少なくとも3個のlncRNAであり、好ましくは少なくとも5個のlncRNAである。
【００９２】
配列番号12、1〜11、13、27および28の少なくとも3個のlncRNA、好ましくは少なくとも5個のlncRNA、より好ましくは少なくとも10個のlncRNA、より一層好ましくは少なくとも20個のlncRNA、最も好ましくは全てのlncRNAを使用すると、本発明の医薬組成物、医学的使用、方法およびキットの有効性が更に向上するであろう。これらの数のlncRNAを使用することにより、本発明の方法およびキットに関して使用される特定の化合物、プローブまたは方法に関連した潜在的な相違を補いうる。本発明の医薬組成物および医学的使用においては、これらの数のlncRNAは治療対象にとって有益な効果を増加させうる。
【００９３】
本発明の全4態様の好ましい実施形態においては、1以上のlncRNAは配列番号12のlncRNAである又はそれを含む。
【００９４】
配列番号12はヒトlncRNA H19である。相同マウスlncRNA H19は配列番号25により表される。lncRNA H19の抗肥大性は後記の実施例3において実証されている。H19 lncRNAの遺伝子はヒトおよび他の哺乳動物において見出される。H19遺伝子の調節はゲノムインプリンティングの例として十分に記載されており、更にヒトの遺伝的障害および癌に関与している。出生後、H19は主に筋肉組織で発現され、ここにおいてそれは分化および再生を促進する。心臓におけるlncRNAの生物学的機能は依然として不明であった。本発明者らが知る限りでは、心肥大におけるH19の役割または機能は先行技術からは公知ではなく、驚くべきことに、本発明に関して見出された。H19は、マウスおよびヒトを含む種々の哺乳動物種にわたって進化的に保存されている（図32および33を参照されたい）。
【００９５】
本発明の全4態様のもう1つの好ましい実施形態においては、1以上のlncRNAは配列番号1、27または28である、あるいは配列番号1、27または28を含み、ここで、配列番号1が最も好ましい。
【００９６】
前記のとおり、配列番号1、27および28はマウスlncRNA Gm11641（配列番号14）のヒト相同lncRNAであり、ゲノム重複事象がヒトおよびマウスを区別し、それぞれのマウスlncRNAの複数の相同ヒトlncRNを与えることに注目されたい（図13AおよびBを参照されたい）。lncRNA Gm11641の肥大促進性は、TACマウスモデルならびにフェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）処理HL-1マウス心筋細胞である2つの独立した心臓肥大試験系により後記実施例において実証されている。
【００９７】
本発明の全4態様の更にもう1つの好ましい実施形態においては、1以上のlncRNAは配列番号8のlncRNAであるか又はそれを含む。
【００９８】
前記のとおり、配列番号8はマウスlncRNA Gm17499（配列番号21）のヒト相同lncRNAである。lncRNA Gm17499の抗肥大性は、独立した試験系により後記実施例において実証されている。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】心臓サンプルにおけるlncRNA Gm11641発現の検証。マウス心臓RNAを逆転写の前にDNAseIで処理した。OligodT（20）またはランダムプライマーセットのいずれかを用いてcDNA合成を行った。
【図２】（A）手術の6週間後の偽（sham）マウスおよびTACマウスの全心臓サンプルにおける候補lncRNA Gm11641（別名チャスト（Chast））のRT-PCRによる検証。FC - 変化倍数。* p <0.05。n = 5。（B）cDNA末端の迅速増幅（RACE）によるGm11641（別名チャスト（Chast））の転写産物の検証。このグラフは、各アプローチに使用したプライマーセットを含む、マウス心臓からのRNAにおける3'および5'RACEからの結果を示す。
【図３】候補lncRNA Gm11641の器官発現。FC - 変化倍数。
【図４】マウス心臓に由来する心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞における候補lncRNAの発現。FC - 変化倍数。
【図５】TAC術の6週間後の心筋細胞、心臓線維芽細胞または内皮細胞におけるlncRNA Gm11641の発現。FC - 変化倍数。*p <0.05。
【図６】候補lncRNAの細胞内局在。β-アクチン（ActB）、GAPDH、XistおよびNeat1を対照として分析した。
【図７】lncRNAの全転写配列（この場合、lncRNA Gm17499）を含有する、pLV+と称されるレンチウイルス過剰発現プラスミドの図示。
【図８】lncRNA Gm11641のレンチウイルス媒介性過剰発現。FC - 変化倍数。***p <0.001。
【図９】HL-1細胞におけるlncRNA Gm11641の抑制。48時間のインキュベーション時間の後に発現レベルを評価した。FC - 変化倍数。*p <0.05、**p <0.01、***p <0.001、ns = 有意ではない。
【図１０】フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）での肥大刺激の際のHL-1細胞におけるLncRNA Gm11641発現。48時間の刺激の後で発現レベルを評価した。**p <0.01。
【図１１】フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）で刺激されたHL-1細胞におけるlncRNA Gm11641のレンチウイルス媒介性過剰発現およびGapmeRに基づくサイレンシング。***p <0.001、*p <0.05。
【図１２】肥大条件下およびlncRNA Gm11641の調節解除下における心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）の発現。 * p <0.05、ns =有意でない。
【図１３−１】（A）UCSCゲノムブラウザの適用による、種々の種におけるlncRNA Gm11641（ENSMUST00000130556）の潜在的ホモログの図示。
【図１３−２】（B）ヒトにおけるLncRNA Gm11641ホモログ。ラットおよびヒトにおけるマウスGm11641およびそのホモログの詳細な配列および構造アライメント（上）。遺伝子特異的PCRによるヒト転写産物の検証（左下; n =少なくとも3回の独立した実験）。健常ドナー心臓組織（n=23）または大動脈狭窄患者（n=21）における配列番号1のヒトGm11641ホモログの発現。*p <0.05。FC =変化倍数。
【図１３−３】図１３−２の続きである。
【図１３−４】図１３−２の続きである。
【図１３−５】図１３−２の続きである。
【図１４】偽動物の組織と比較した場合のTAC心臓の全心臓サンプルにおける候補lncRNAの検証。 FC - 変化倍数。***p <0.001、*p <0.05、ns =有意ではない。
【図１５−１】（A）12週の健常マウスまたは13週の偽マウスからの心筋細胞（CMC）サンプルと13週のTACマウス心臓からの心筋細胞（CMC）サンプルとを比較する、候補lncRNA由来Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0の検証。候補AJ409495は潜在的にタンパク質をコードしており、結果の以下の提示においては考慮されない。FC - 変化倍数。CMC - 心筋細胞。***p <0.001、**p <0.01、*p <0.05、n.s. = 有意ではない。
【図１５−２】（B）TAC後の幾つかの時点の後の全心臓サンプルにおける心肥大によるH19抑制のマイクロアレイ検証（n = 4〜8）。*p <0.05; **p <0.01。FC =変化倍数。（C）連続アンジオテンシンII（ATII）注入の2週間後のマウス心臓におけるH19の発現レベル（n = 4〜5）。*p <0.05。FC =変化倍数。
【図１６−１】候補lncRNAの器官発現。FC - 変化倍数。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】マウス心臓由来の心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞における候補lncRNAの発現。FC - 変化倍数。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８】候補lncRNAの細胞内局在化。β-アクチン、GAPDH、XistおよびNeat1を対照として分析した。
【図１９】lncRNA Gm17499の全転写配列を含有する、pLV + Gm17499と称されるレンチウイルス過剰発現プラスミドの図示。
【図２０】lncRNA Gm17499のレンチウイルス媒介性過剰発現。FC - 変化倍数。**p <0.01。
【図２１−１】候補lncRNA Gm17499を抑制する種々のアンチセンス化学の試験。48時間のインキュベーション時間の後に発現レベルを評価した。FC - 変化倍数。*p <0.05、**p <0.01、***p <0.001、ns =有意ではない。
【図２１−２】図２１−１の続きである。
【図２２−１】フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）で刺激されたHL-1細胞におけるlncRNA Gm17499のsiRNAに基づくサイレンシングおよびレンチウィルス媒介性過剰発現。***p <0.001、**p <0.01、*p <0.05、ns =有意ではない。 a.u. =任意単位。写真のスケールバーは50μMを表す。
【図２２−２】図２２−１の続きである。
【図２３−１】肥大条件下およびlncRNA Gm17499の調節解除下における肥大関連遺伝子の発現。第1行はANPの発現を表し、第2行はBNPの発現を表し、最後の行はMcip1.4レベルを示す。*p <0.05、ns =有意ではない。
【図２３−２】図２３−１の続きである。
【図２４】TAC術の4および6週間後の候補lncRNA H19発現の検証。**p <0.001、*p <0.05。n = 5〜7。
【図２５】肥大促進性フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）での72時間の処理の後の初代新生児ラット心筋細胞（NRCM）におけるLncRNA H19発現。ns - 有意ではない。*p <0.05。
【図２６−１】（A）esiRNAを適用した心筋細胞系HL-1（マウス）およびH9C2（ラット）におけるlncRNA H19の抑制（処理の48時間後）。RLUC - ウミシイタケルシフェラーゼに対するesiRNA（陰性対照）、H19 - H19に対するesiRNA。*p <0.05。
【図２６−２】（B）非標的対照（ウミシイタケルシフェラーゼ, RLUC）と比較した場合のesiRNAによるHL-1心筋細胞におけるH19の抑制。（C）レンチウイルス形質導入（pLV）を適用したH19の過剰発現。n =少なくとも3回の独立した実験。**p <0.01; ***p <0.001。FC =変化倍数。
【図２７−１】（A）肥大刺激性フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）で48時間処理された（esiRNAにより）H19を抑制するマウス心筋細胞系HL-1の細胞サイズ。RLUC - ウミシイタケルシフェラーゼに対するesiRNA（陰性対照）、H19 - H19に対するesiRNA。*p <0.05。ns - 有意ではない。
【図２７−２】（B）H19のレンチウイルス過剰発現（PLV+）の際のHL-1心筋細胞応答。心房および脳ナトリウム利尿ペプチド（ANP、BNP）ならびにβ-ミオシン重鎖（β-MHC）の発現レベルを決定した。n =少なくとも3回の独立した実験。**p <0.01、***p <0.001。FC =変化倍数。
【図２８】肥大刺激性フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）で48時間処理された（esiRNAにより）H19を抑制するラット心筋細胞系H9C2の細胞サイズ。RLUC - ウミシイタケルシフェラーゼに対するesiRNA（陰性対照）、H19 - H19に対するesiRNA。***p <0.001、**p <0.01。ns - 有意ではない。
【図２９】肥大刺激性フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）で48時間処理された（esiRNAにより）H19を抑制する初代新生児ラット心筋細胞（NRCM）の細胞サイズ。RLUC - ウミシイタケルシフェラーゼに対するesiRNA（陰性対照）、H19 - H19に対するesiRNA。***p <0.001、**p <0.01。ns - 有意ではない。
【図３０】肥大刺激性フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）で72時間処理された（esiRNAにより）H19を抑制する初代新生児ラット心筋細胞（NRCM）の細胞サイズ。RLUC - ウミシイタケルシフェラーゼに対するesiRNA（陰性対照）、H19 - H19に対するesiRNA。***p <0.001。ns - 有意ではない。
【図３１】リアルタイムPCR（RT-PCR）によるヒト健常（n=22）および肥大（大動脈狭窄; n=23）心臓組織におけるH19発現分析。AS：大動脈狭窄症。**p <0.01。
【図３２】UCSCゲノムブラウザの適用による、種々の種におけるH19配列の保存の図示。
【図３３−１】Dotplot分析によるH19配列の配列比較。マウスおよびラットならびにマウスおよびヒトの間の強い保存性が認められうる。ブタにもホモログが存在する。
【図３３−２】図３３−１の続きである。
【図３３−３】図３３−１の続きである。
【図３４】H19ノックアウトマウスおよびそれらの同腹子におけるTAC術。6週間後、心臓対体重比の誘導が観察された。n = 2〜8。HW =心臓重量、BW =体重、Wt =野生型。
【図３５】インビボでのAAV9-H19による6週間の過剰発現は肥大遺伝子プログラムの復帰をもたらす（動物当たり2+E12コピー）。n = 3。*p <0.05。FC =変化倍数。
【図３６】Gm11641発現の潜在的転写調節因子。Gm11641プロモーターにおける転写因子結合部位のバイオインフォマティクス予測。これは肥大促進性転写因子NFAT（活性化T細胞の核因子）も含む。構成的に活性化されたNFAT経路を有するカルシニューリントランスジェニックマウス（CnA TG）（n = 4）においては、Gm11641発現が誘導されるが、NFATインヒビター11R-VIVITはHL-1心筋細胞においてGm11641の発現を抑制する（n = 少なくとも3つの独立した実験）。*p <0.05; FC =変化倍数。Gm11641は図36において「Chast」（心臓肥大関連転写産物）と称される。
【図３７】AAV9を適用したマウスにおけるGm11641の心臓特異的過剰発現（注射の6 週間後）。AAV9構築物の図示（左）、および対照ベクターと比較した場合のマウス心臓における過剰発現効率（右）。n = 3。*p <0.05; FC =変化倍数。Gm11641は図36において「Chast」と称される。
【図３８】インビボでのAAV9-Gm11641による6週間の過剰発現は心肥大をもたらす（動物あたり0.5+E12コピー）。これは心臓対体重比および左心室質量の誘導ならびに心筋細胞直径の増加を招いた。n = 3である。*p <0.05。LV質量=左心室質量、DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DNA染色）; WGA =コムギ胚芽凝集素（膜染色）、AU =任意単位は。Gm11641は図36において「Chast」と称される。
【図３９】TA術およびAAV9（動物あたり0.5+E12コピー）によるGm1164の6週間の過剰発現は心臓対体重比の誘導をもたらした。n = 5〜8。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例1 - 肥大促進性lncRNA Gm11641
1.1 lncRNAのプロファイリングおよび検証
TAC（横行大動脈狭窄）の6週間後に全心臓サンプルにおいて調節解除されるlncRNA候補を特定するために、Arraystarにより提供される一般的なlncRNAプロファイリングを行った（Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0）。このプラットフォームから、lncRNA Gm11641（ENSMUST00000130556）を候補として特定した（表1）。
【０１０１】
【表１】
2020007332.tif 000002
【０１０２】
OligodT（20）またはランダムプライマーセットを使用する逆転写の前にDNAseIで処理した心臓RNAに由来するcDNAにおけるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、心臓におけるこのlncRNAの発現を確認した（図1）。転写産物の更なる確認のために、得られたPCRバンドを切り出し、配列決定した。
【０１０３】
TAC術後の候補lncRNA Gm11641のアップレギュレーションをリアルタイムPCR（RT-PCR）によって確認した（図2A）。転写産物の更なる確認のために、得られたPCRバンドを切り出し、配列決定した。第2の工程においては、出発物質としてマウス心臓のRNAを使用するcDNA末端迅速増幅（RACE）により、転写産物配列を分析した。これは両方のエキソンの確認をもたらした（図2B）。
【０１０４】
Gm11641をHL-1細胞において過剰発現させ、小ペプチドを質量分析により評価した。潜在的な短いオープンリーディングフレームに重複するペプチドは見出されなかった。このことは、Gm11641がノンコーディングRNAであることを示している。
【０１０５】
1.2 候補lncRNA Gm11641の器官発現
種々の器官におけるlncRNA Gm11641の存在量および組織特異的発現を決定するために（図3）、その発現を、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて測定した。
【０１０６】
LncRNA Gm11641は、試験されたほぼ全ての器官において発現される。これは心臓および血漿を含み、このことは、この転写産物が潜在的な治療標的および診断バイオマーカーであることを示唆している。
【０１０７】
1.3 心臓の細胞画分における候補lncRNA Gm11641の発現
心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において、lncRNA Gm11641の発現プロファイルを調べた（図4）。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。
【０１０８】
LncRNA Gm11641は全ての心臓細胞型で発現される。
【０１０９】
1.4 TAC後の細胞心臓画分におけるLncRNA Gm11641
lncRNA Gm11641は全ての心臓細胞において発現されるため、全心臓サンプルにおいて観察されるlncRNA Gm11641の肥大誘発性アップレギュレーションに寄与する特定の細胞型を同定することにした（図2）。偽およびTAC術後（手術の6週間後）の心臓を使用する細胞分画実験は、lncRNA Gm11641のこのアップレギュレーションが心筋細胞においては特異的に認められるが、心筋線維芽細胞または内皮細胞において認められないことを示した（図5）。これは心筋細胞肥大におけるlncRNA Gm11641の潜在的役割を示している。
【０１１０】
1.5 候補lncRNA Gm11641の細胞内局在化
lncRNAの生物学的機能はそれらの細胞内局在によって大きく左右される。したがって、HL-1細胞（心筋細胞系）由来の全RNAの、細胞質、核可溶性およびクロマチン関連画分への生化学的分離を行った（Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った）。種々の画分におけるlncRNA Gm11641の相対存在量をRT-PCRにより測定した。公知ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHおよびβ-アクチンならびにlncRNA XistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した（図6）。
【０１１１】
予想どおり、ハウスキーピングmRNAであるGapdhおよびβ-アクチン（ActB）は主として細胞質ゾルにおいて見出されたが、XistおよびNeat1 lncRNAのような公知エピジェネティックモジュレーターは主としてクロマチンに付随して見出された。細胞質転写産物またはクロマチン関連転写産物と比較すると、lncRNA Gm11641は全ての細胞下画分（細胞質ゾル画分、核内可溶性画分およびクロマチン関連画分）に存在するようであり、このことは全ての細胞区画における潜在的役割を示唆している。これは更に、lncRNA Gm11641が転写過程および転写後過程の両方をモジュレーションしうることを示している。
【０１１２】
1.6 候補lncRNA Gm11641の過剰発現
lncRNA Gm11641を安定に過剰発現させるために、対応データベース由来の完全長転写産物（表1を参照されたい）をレンチウイルス過剰発現ベクター（Institute of Experimental Hematology, MHHのA. Schambach氏により快く提供していただいた）のマルチクローニングサイト（MCS）内にクローニングした。指標遺伝子GFP（緑色蛍光タンパク質）および選択カセットから物理的に分離しているが、同じ遺伝子調節要素からのものであるlncRNA転写産物の産生を可能にする双方向性プロモーターを、このプラスミドは含有する。レンチウイルス形質導入により、該構築物をHL-1心筋細胞内に導入した（図7を参照されたい）。
【０１１３】
HL-1細胞のレンチウイルス媒介性形質導入は、空ベクター（pLV +空）を含有する細胞または該構築物を欠く細胞（非形質導入細胞）と比較して、lncRNA Gm11641の安定な過剰発現を示した（図8）。
【０１１４】
1.7 lncRNAの抑制
lncRNA Gm11641をダウンレギュレートするために、GapmeRアンチセンスオリゴヌクレオチドを適用した。LNATMGapmeR（Exigon）は、修飾ヌクレオチド（LNA; ロックト核酸）のブロックに隣接するDNAモノマーの中央伸長を含有する。DNAギャップは、標的RNAのRNAse H媒介性分解を活性化し、核内で直接的に転写産物を標的化するのにも適している。この技術により、lncRNA Gm11641は心筋細胞系HL-1において成功裏にダウンレギュレートされた（図9）。
【０１１５】
1.8 候補lncRNA Gm11641の機能的特徴づけ
1.8.1 Gm11641レベルに対する肥大心筋細胞のインビトロ効果
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞を両方の化合物で刺激し、Gm11641の発現に対する影響を調べた（図10）。
【０１１６】
1.8.2心筋細胞サイズに対するGm11641調節解除の影響
肥大心筋細胞の特徴は、非肥大細胞と比較した場合の細胞サイズの増加である。したがって、PEおよびISOで刺激した後、HL-1細胞の細胞サイズを調べ、前記の脱調節手段を適用してlncRNA Gm11641の発現の抑制および上昇を調べた。結果を図11に例示する。
【０１１７】
基底条件下、lncRNA Gm11641の過剰発現は、細胞表面積によって測定される細胞サイズの増加をもたらし、このことは、この転写産物が、心筋細胞肥大を誘導するのに十分であることを示している。したがって、lncRNA Gm11641の、GapmeRに基づく抑制は、心筋細胞のサイズを減少させ、PE/ISOによって誘導される細胞サイズの増加を更に低減した。これらの結果はlncRNA Gm11641の肥大促進性機能を証明している。
【０１１８】
1.8.3 肥大関連遺伝子に対する影響
肥大誘発心筋細胞成長は「胎児遺伝子プログラム」の再誘導を伴う。なぜなら、遺伝子発現パターンは、胚発生中に見られるものに似ているからである。候補lncRNA Gm11641に関して同じ条件（刺激および調節解除）を適用して、ANP、BNP（動脈および脳ナトリウム利尿ペプチド）、Mcip1.4（調節性カルシニューリン相互作用性タンパク質1、エクソン4アイソフォーム）、α-およびβ-MHC（ミオシン重鎖）を含む肥大関連遺伝子の発現レベルを測定した。図12はANPに関する結果を表しているが、その他の遺伝子の測定結果は示されていない。
【０１１９】
細胞サイズの測定と同様に、lncRNA Gm11641の過剰発現は肥大指標ANPの発現誘導をもたらし、一方、ノックダウンはPE/ISO誘導性ANP上昇を増強した。このことは、lncRNA Gm11641が肥大促進性転写産物として作用することを裏付けている。
【０１２０】
1.8.4 マイクロアレイ発現データ
Gm11641によりモジュレーションされる心臓関連遺伝子を特定するために、マウスHL-1心筋細胞系におけるGm11641（別名Chast）のレンチウィルス過剰発現またはGapmeR媒介性抑制に関して包括的（グローバル）マイクロアレイmRNA発現分析を行った。結果は、Gm11641のアップレギュレーションまたは抑制のいずれかがHL-1心筋細胞トランスクリプトームに強い影響を及ぼすことを示した。Axl、Pak3、Myo18B、Egr1、OgnおよびNos1apのような幾つかの心臓関連遺伝子（表2）はGm11641の過剰発現および抑制の後で相互的に調節される。これらの結果は、Gm11641発現の調節解除が転写mRNA発現プロファイルに影響を及ぼし、心筋細胞における肥大促進経路を活性化することを示している。
【０１２１】
【表２】
2020007332.tif 000003
【０１２２】
1.9 保存性
ヒトを含む他の種におけるlncRNA Gm11641のホモログを特定するために、一次DNA配列と配列データベースのライブラリーとの比較のためのアルゴリズムであるBLASTを適用した。このアライメントの結果は以下の結果をもたらす（表2）。
【０１２３】
【表３】
2020007332.tif 000004
【０１２４】
UCSCゲノムブラウザを使用して種間アラインメントを示した（図13A）。このアライメントはマウスlncRNA Gm11641のヒトホモログを特定した。
【０１２５】
Gm11641のより詳細な配列および構造アライメントは、アンチセンス配向でタンパク質コード遺伝子Plekhmのイントロン内に位置するGm11641ホモログがラット、ブタおよびヒトにおいて存在することを示した（図13B）。ヒトホモログは以下のとおりにアノテートされる：
2020007332.tif 000005
【０１２６】
ホモサピエンス第17染色体, 代替アセンブリCHM1_1.1.または
2020007332.tif 000006
【０１２７】
ホモサピエンス第17染色体, GRCh38.p2一次アセンプリ。
【０１２８】
ヒト心臓組織におけるGm11641ホモログの存在を遺伝子特異的PCRにより確認した（図13B）。全ヒト心臓組織から単離したRNAから相補的DNA（cDNA）を調製した。逆転写を伴わないcDNA調製反応を、汚染DNAの考えられうる増幅を排除するための内部対照として用いた。
【０１２９】
次に、このヒトホモログの発現を、大動脈狭窄を有する患者からの21個の肥大心臓および23個の対照心臓において調べた。肥大マウス心臓で得られた結果と合致して、ヒトGm11641ホモログもヒト肥大心臓組織においてアップレギュレートされ（図13B）、このことは、この研究の知見が翻訳上の可能性を示していることを証明している。
【０１３０】
1.10 Gm11641発現の調節
心筋細胞においては、肥大応答は、幾つかのシグナル伝達カスケード、特にカルシウム依存性シグナリングに影響を及ぼす増殖因子およびサイトカインにより調節される。転写因子NFAT（活性化T細胞の核因子）はこの経路における中心的調節因子であり、最終的に肥大促進プログラムの活性化をもたらす。
【０１３１】
したがって、この中心的調節因子がGm11641の発現に影響を及ぼすかどうかを決定した。バイオインフォマティクスツールはGm11641プロモーターにおける幾つかの肥大関連転写因子の結合部位を予測する。これはNFAT結合部位をも含む（図36）。
【０１３２】
NFATの影響をより詳細に研究するために、カルシニューリントランスジェニックマウスの心臓においてGm11641の発現を評価し、構成的に活性化されたNFATシグナリングの際のGm11641発現の誘導が見出された。インビトロで、11R-VIVITによるNFATの抑制はHL-1心筋細胞におけるGm11641レベルの低下をもたらした。このデータは、Gm11641発現が肥大促進性NFAT経路に依存することを示している。
【０１３３】
1.11 Gm11641のインビボ研究
病的肥大は、ストレスまたは疾患、例えば高血圧、心筋の傷害、心臓弁狭窄症または神経ホルモンに対する応答である。これは心筋質量の増加をもたらし、最終的に心室壁、特に左心室の肥厚をもたらす。筋肉量は増加するが、心臓のポンプ能は増加しない。逆に、心臓の機能が妨げられ、最終的に完全な機能不全につながりうる。
【０１３４】
インビボでのGm11641の役割を分析するために、この転写産物を、アデノウイルスベクター（AAV）を用いて過剰発現させた。AAVは、エンベロープを欠く、一本鎖DNAを有する小さなウイルスである。遺伝物質を導入するために、AAVはヘルパーウイルスに依存する。しかし、AAVベクターの導入は、その低い免疫原性に寄与する他のウイルス遺伝子の発現をもたらさない。全ての血清型の中で、AAV9が最も心臓指向性のものであるようである。したがって、心筋細胞に向けられたGm11641の誘導を達成するために、心臓特異的トロポニンTプロモーターの制御下でAAV9を適用した（図37）。
【０１３５】
AAV9-Gm11641構築物を使用して、全心臓サンプルにおいてGm11641の20倍の誘導が達成された。機能レベルでは、心臓対体重比の誘導が観察され（図38、左上）、このことは、Gm11641の過剰発現が左心室の筋肉量を増加させることを示している（図38、右上）。心筋細胞のサイズを更に分析し、Gm11641が心筋細胞成長を誘導することが判明した（図38、下）。
【０１３６】
更に、TAC術により左心室圧負荷を加え、AAV9によりGm11641を6週間にわたって過剰発現させた。予想どおり、大動脈狭窄は心臓対体重比の増加およびAAV9-Gm11641の簡便な注入をもたらした。興味深いことに、TAC術およびAAV9-Gm11641投与は心臓質量の誘導を悪化させた（図39）。
【０１３７】
1.12 結論
結論としては、lncRNA Gm11641に関して試験した心肥大モデルにおける知見に基づけば、このlncRNAは心肥大に関する診断および治療に貴重である。
【０１３８】
実施例2 - 肥大促進性および抗肥大性lncRNAの特定
2.1 lncRNAのプロファイリングおよび検証
一般的なlncRNAプロファイリングを達成するために、Agilent/Life Technologies（NCodeTMマウス・ノンコーディングRNAマイクロアレイ）およびArraystar（Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0）により提供されるプラットフォームを適用して、マイクロアレイ分析を行った。候補転写産物は心臓組織において発現されていることが（DNAseIで処理された又は逆転写前でないRNAに由来するcDNAサンプルにおいて）PCRにより確認され、調節解除がリアルタイムPCRにより確認された。
【０１３９】
以下の表3および4ならびに図14および15は、種々のマイクロアレイから確認された候補lncRNAを要約する。
【０１４０】
【表４】
2020007332.tif 000007
【０１４１】
【表５】
2020007332.tif 000008
【０１４２】
2.2 候補lncRNAの器官発現
種々の器官におけるlncRNAの発現特異性を決定するために（図16）、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて候補転写産物の発現を測定した。ほとんどのlncRNAは幾つかの器官において豊富である。転写産物Gm8459、H19およびGm12224-1は、心臓を含む筋肉組織において最も特異的に豊富に存在するようである。
【０１４３】
2.3 心臓の細胞画分における候補lncRNAの発現
心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において、候補lncRNAの発現プロファイルを調べた（図17）。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。
【０１４４】
2.4 候補lncRNAの細胞内局在化
候補lncRNAの作用メカニズムを更に解明するために、HL-1細胞（心筋細胞系）由来の全RNAを細胞質画分、核可溶性画分およびクロマチン関連画分へと生化学的に分離することにより、細胞内局在を分析した（Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った）。種々の画分における転写産物の相対存在量をRT-PCRにより測定した。既知遺伝子GAPDHおよびβ-アクチンならびにXistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在化またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した（図18）。
【０１４５】
核可溶性lncRNAは候補に含まれていないが、lncRNA候補の半分以上がクロマチン関連体であることが判明している。ただ1つの転写産物のみが細胞質に豊富に存在ていた（Gm8459）。
【０１４６】
2.5 候補lncRNAの過剰発現
lncRNAを安定に過剰発現させるために、対応データベース由来の完全長転写産物をレンチウイルス過剰発現ベクター（Institute of Experimental Hematology, MHHのA. Schambach氏により快く提供していただいた）のマルチクローニングサイト（MCS）内にクローニングした。指標遺伝子GFP（緑色蛍光タンパク質）から物理的に分離しているが、同じ遺伝子調節要素からのものであるlncRNA転写産物の産生を可能にする双方向性プロモーターを、このプラスミドは含有する。レンチウイルス形質導入により、該構築物をHL-1細胞内に導入した（図19を参照されたい）。以下の結果はlncRNA候補Gm17499についての例示である。
【０１４７】
HL-1細胞のレンチウイルス媒介性形質導入は、空ベクター（pLV +空）を含有する細胞または該構築物を欠く細胞（非形質導入細胞）と比較して、lncRNA Gm17499の安定な過剰発現を示した（図20）。
【０１４８】
2.6 lncRNAの抑制
lncRNA転写産物をダウンレギュレートするために、3つの異なるアンチセンス化学物質、すなわち、siRNA、esiRNAおよびGapmeRを適用した。siRNA（低分子干渉RNA）は、マイクロRNAと同様に、RNA干渉経路に関与する短い分子（20〜25ヌクレオチド）である。それらは相補的ヌクレオチド配列に結合し、細胞質局在化機構により、その分解を誘導する。EsiRNA（Eupheria Biotech / Sigma-Aldrich）は、長い二本鎖RNAの切断から生じる、エンドリボヌクレアーゼで調製されるsiRNAである。このアンチセンス種は、siRNAの場合のように1つの特定の配列だけでなく、標的全体にわたって幾つかの配列を標的とする。LNATM GapmeR（Exigon）は、修飾ヌクレオチド（LNA; ロックト核酸）のブロックに隣接するDNAモノマーの中央伸長を含有する。DNAギャップは、標的RNAの分解を活性化し、核内で直接的に転写産物を標的化するのに適している。
【０１４９】
例示的に、3種の化学物質をすべて適用したGm17499の結果を、H19に関する結果と共に示す（図21）。H19はesiRNAおよびMalat1で成功裏にダウンレギュレートされ、GapmeRを適用して抑制された（このlncRNAをGapmeR技術に関する陽性対照として使用した）。
【０１５０】
2.7 候補lncRNAの機能的特徴づけ
2.7.1 心筋細胞サイズに対する影響
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞を両方の化合物で刺激し、変化したmRNAレベルのもとで心筋細胞サイズを調べた。結果をlncRNA Gm17499に関して例示する（図22）。
【０１５１】
lncRNA Gm17499の発現の増強は肥大促進性刺激による細胞サイズの増加を妨げ、一方、そのサイレンシングは心筋細胞の拡大をもたらした。このことはこの転写産物の抗肥大機能を示している。
【０１５２】
2.7.2 肥大関連遺伝子に対する影響
肥大誘発心筋細胞成長は「胎児遺伝子プログラム」の再誘導を伴う。なぜなら、遺伝子発現パターンは、胚発生中に見られるものに似ているからである。候補lncRNA Gm17499に関して同じ条件（刺激および調節解除）を適用して、ANP、BNP（動脈および脳ナトリウム利尿ペプチド）、Mcip1.4（調節性カルシニューリン相互作用性タンパク質1、エクソン4アイソフォーム）、α-およびβ-MHC（ミオシン重鎖）を含む肥大関連遺伝子の発現レベルを測定した（図23）。
【０１５３】
2.8. 結論
結論としては、前記の実験結果に基づけば、試験した心臓肥大モデル（左心室圧負荷）における調節解除lncRNAは心肥大の診断および治療において興味深い。 特に、以下のlncRNAが非常に重要である。
【０１５４】
【表６】
2020007332.tif 000009
【０１５５】
【表７】
2020007332.tif 000010
【０１５６】
実施例3 - 抗肥大性lncRNA H19の更なる特徴づけ
3.1. 4週および6週の偽／TACにおける差次的発現
TAC（横行大動脈狭窄）の6週間後の全心臓サンプルにおいて又はTACの13週間後のマウス心臓からの心筋細胞において調節解除されたlncRNA候補を特定するために、Arraystarにより提供される一般的なlncRNAプロファイリングを行った（Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0）。このプラットフォームから、Gm17499およびGm11641に加えてlncRNA H19（NR 001592.1）が潜在的候補の1つとして特定された（表8および9）。
【０１５７】
【表８】
2020007332.tif 000011
【０１５８】
【表９】
2020007332.tif 000012
【０１５９】
TAC術の4週間後および6週間後の候補lncRNA H19のダウンレギュレーションをリアルタイムPCR（RT-PCR）により確認した（図24AおよびB; 心筋細胞特異的アレイの確認は前記に示されている（表8ならびに図15AおよびB）。TAC術の6週間後に全心臓のサンプルにおいてH19の抑制を確認した。また、この抑制は、肥大および心不全のより早い及び遅い段階で観察された（図15B）。CMC特異的アレイの検証は、この抑制が心筋細胞において見出されうることを示しており（図15A）、このことは、H19が心肥大の発生に関与している可能性があり、H19レベルのモジュレーションが治療上重要であることを示唆している。
【０１６０】
心肥大の第2のモデルはアンジオテンシンII（ATII）の連続注入である。この化合物はレニン-アンジオテンシン系の中心的産物であり、その血管収縮作用により血圧の上昇を引き起こす。アンジオテンシン変換酵素（ACE）インヒビターの効果に関する臨床研究は、ATIIが心肥大、リモデリングおよび心不全の病態生理学においても中心的役割を果たすことを明らかにした。心肥大を誘発するために、浸透圧ミニポンプ（Alzetポンプ）を2週間にわたってマウスに皮下移植する。このモデルにおいては、TACモデルの場合と同じH19レベル低下が観察され、このことは、心肥大におけるこのlncRNAの関連性を際立たせている（図15C）。
【０１６１】
3.2 候補lncRNA H19の器官発現
種々の器官におけるlncRNA H19の存在量および組織特異的発現を決定するために（図16）、その発現を、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて測定した。H19は、心臓、骨格筋および膀胱を含む筋肉組織において強い富化を示す。
【０１６２】
3.3心臓の細胞画分における候補lncRNA H19の発現
lncRNA H19の発現プロフィールを、心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において調べた。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。H19は全ての心臓細胞型において発現されることが判明した（図17）。
【０１６３】
3.4 候補lncRNA H19の細胞内局在化
lncRNAの生物学的機能はそれらの細胞内局在によって大きく左右される。したがって、HL-1細胞（マウス心筋細胞系）由来の全RNAの、細胞質、核可溶性およびクロマチン関連画分への生化学的分離を行った（Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った）。種々の画分におけるlncRNA H19の相対存在量を定量的RT-PCRにより測定した。公知ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHおよびβ-アクチンならびにlncRNA XistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した。H19は全ての心筋細胞の細胞下画分、サイトゾル、核可溶性およびクロマチン関連区画において見出される（図18）。これは、H19が転写過程および転写後過程の両方をモジュレーションする可能性を有することを示している。
【０１６４】
3.5 候補lncRNA H19の抑制
H19 lncRNAをダウンレギュレートするために、esiRNAと称されるアンチセンス化学を適用した。EsiRNA（Eupheria Biotech / Sigma-Aldrich）は、長い二本鎖RNAの切断から生じる、エンドリボヌクレアーゼで調製されるsiRNAである。このアンチセンス種は、siRNAの場合のように1つの特定の配列だけでなく、標的全体にわたって幾つかの配列を標的とする。
【０１６５】
対照トランスフェクション（RLUC, ウミシイタケルシフェラーゼ）と比較して、lncRNA H19はマウス（HL-1）およびラット（H9C2）由来の2つの異なる心筋細胞系において有意にダウンレギュレートされた（図26AおよびB）。
【０１６６】
この転写産物を安定に過剰発現させるために、完全長転写産物をレンチウイルス過剰発現ベクターのマルチクローニングサイト（MCS）内にクローニングした。指標遺伝子GFP（緑色蛍光タンパク質）および選択カセットから物理的に分離しているが、同じ遺伝子調節要素からのものであるlncRNA転写産物の産生を可能にする双方向性プロモーターを、このプラスミドは含有する。レンチウイルス形質導入により、該構築物をHL-1心筋細胞内に導入した。HL-1細胞のレンチウイルス媒介性形質導入は、対照ベクター（pLV +空）を含有する細胞と比較して、H19の安定な過剰発現を示した（図26C）。
【０１６７】
3.6 lncRNA H19の機能的特徴づけ
3.6.1 H19レベルに対する肥大心筋細胞のインビトロ効果
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン（PE）およびイソプロテレノール（ISO）またはアンジオテンシンII（ATII）を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞をこれらの化合物で刺激し、H19の発現に対するそれらの影響を調べた（図25）。
【０１６８】
3.6.2 心筋細胞サイズに対するH19抑制の影響
肥大心筋細胞の特徴は、非肥大細胞と比較した場合の細胞サイズの増加である。したがって、PEおよびISOまたはATIIで刺激する一方でesiRNAでH19を抑制した後、心筋細胞の細胞サイズを調べた。H19のノックダウンは、48時間後のラットH9C2細胞系における及び72時間後の新生ラット心筋細胞（NRCM）における心筋細胞サイズの有意な増加をもたらした（図28〜30）。この効果は、AT II処理後のNRCMにおいて及びラット心筋細胞系の両方においてPEおよびISOでの処理の後に観察された。HL-1細胞系においても同等の傾向が観察された（図27A）。
【０１６９】
更に、H19はHL-1細胞において過剰発現された。HL-1心筋細胞におけるH19の過剰発現は、心臓ストレスマーカーである心房および脳ナトリウム利尿ペプチド（ANP、BNP）の減少、ならびにもう1つの顕著な心肥大マーカーであるβ-MHC（β-ミオシン重鎖）のレベルの低下をもたらした（図27A）。このことは、H19の誘導が心臓保護作用を有することを更に証明している。
【０１７０】
3.7 健常および罹患ヒト心臓組織におけるH19発現の分析
大動脈狭窄は大動脈弁の石灰化を意味し、これは血流を妨げる。その結果、心臓は高い圧力で血液を送出する必要があり、最終的に心筋の肥大成長を招く。22個の健常心臓組織および23個の肥大（大動脈狭窄）心臓組織においてH19の発現を測定し、肥大心臓においてはH19発現が大きく低下することを見出した（図31）。ヒト被験者からのこのデータは、マウスおよびラットのインビトロモデルにおける本明細書に記載されている知見を裏付けており、更に、H19が心肥大を予防するための真の治療標的であることを証明している。
【０１７１】
3.8. H19の進化的保存
幾つかの研究は、H19配列およびH19のインプリンティングメカニズムがヒトおよびげっ歯類の間で高度に保存されていることを示している。これは、UCSCゲノムブラウザを適用することによっても示されうる（図32）。Dotplot分析による種々のH19配列のより詳細なアライメントはこれらの知見を明確に示しており（図33）、マウスおよびラット配列間ならびにマウスおよびヒト配列間の強い配列上の関係を示している。更なる比較は、ヒトH19がブタにおけるホモログを示しており、これは大きな動物モデルにおけるH19関連治療戦略の実施を可能にするものである。
【０１７２】
3.9 H19に関するインビボ研究
インビボでの心臓リモデリングに対するH19の効果を研究するために、H19ノックアウトマウスを調べた。H19の欠失はH19の3kb転写単位全体およびプロモーターを置換したネオマイシン耐性カセットにより達成された（系統説明: 129S2/SvPasバックグラウンドにおけるH19tm1Lda）。
【０１７３】
H19ノックアウト動物およびそれらの野生型同腹仔（wt）を横行大動脈狭窄術に付した（図34）。予想どおり、手術の6週間後、wtは誘導および心臓対体重比を示した。wtおよびH19ノックアウト動物を比較した場合、心臓質量のこの増加は偽マウスにおいても観察されたが、H19遺伝子を欠くTAC術を受けたマウスは、悪化した表現型を示した。
【０１７４】
心肥大におけるH19の役割のより詳細な分析を行い、潜在的な治療戦略を開発するために、アデノウイルスベクター（AAV）を使用して、この転写産物を過剰発現させた。心筋特異的トロポニンTプロモーターの制御下でAAV9を適用して、心筋細胞に向けられたH19の誘導を達成した（図35）。
【０１７５】
AAV9-H19構築物を適用した場合、H19の150倍の誘導が全心臓サンプルにおいて達成された。心肥大の特異的マーカーの転写レベルの変化を分析した。それらには、心肥大においてダウンレギュレートされる転写産物であるα-MHC、およびアップレギュレートされるβ-MHCが含まれる。H19のインビボ過剰発現により、α-MHCからβ-MHCへの変換の逆転が観察された（図35）。このことは、H19のアデノウイルス投与が肥大遺伝子プログラムに対して有益な影響を及ぼし、治療戦略として役立つことを示している。
【図１】
2020007332.tif 000013
【図２】
2020007332.tif 000014
【図３】
2020007332.tif 000015
【図４】
2020007332.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020007332.tif 000020
【図９】
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【図１０】
2020007332.tif 000022
【図１１】
2020007332.tif 000023
【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４】
2020007332.tif 000060
【図３５】
2020007332.tif 000061
【図３６】
2020007332.tif 000062
【図３７】
2020007332.tif 000063
【図３８】
2020007332.tif 000064
【図３９】
2020007332.tif 000065
【配列表】
2020007332000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月26日(2019.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有するlncRNAの発現及び／又は活性を阻害する化合物を含む医薬組成物であって、前記化合物は、
（a）配列番号1の配列の少なくとも12個の連続的ヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸、
（b）配列番号1のlncRNAの相補鎖配列に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸、
（c）前記（a）又は(b)においてUがTにより置き換えられているヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸、
（d）（a）〜(c)のいずれかに定められている核酸を発現する発現ベクター、或いは
（e）（d）の発現ベクターを含む宿主
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
病的心肥大の治療又は予防に用いるための、配列番号１に記載のlncRNAの発現及び／又は活性を阻害する化合物であって、前記化合物は、
（a）配列番号1の配列の少なくとも12個の連続的ヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸、
（b）配列番号1のlncRNAの相補鎖配列に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸、
（c）前記（a）又は(b)においてUがTにより置き換えられているヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸、
（d）（a）〜(c)のいずれかに定められている核酸を発現する発現ベクター、或いは
（e）（d）の発現ベクターを含む宿主
である、前記化合物。
【請求項３】
発現ベクターが、心臓特異的プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
医薬組成物が、病的心肥大の治療用である、請求項１又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
病的心肥大が心室病的肥大である、請求項４に記載の医薬組成物又は請求項２若しくは３に記載の化合物。
【請求項６】
患者における病的心肥大の診断を補助する方法であって、
（a）前記患者から得られたサンプルにおいて、配列番号1のlncRNAの発現レベルを検出すること、及び
（b）前記のlncRNAの前記発現レベルと、健常被験者から得られたサンプルにおける前記lncRNAの発現レベルとを比較することを含み、
配列番号1のlncRNAの、2倍を超えるダウンレギュレーションが、前記患者における病的心肥大を示すことを補助する、前記方法。
【請求項７】
サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該サンプルが心臓組織サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記１以上のlncRNAの発現レベルの検出が、
（a）定量的PCR、または
（b）鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる前記１以上のlncRNAの発現レベルの決定を含む、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記定量的PCRが定量的リアルタイムPCRである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該方法が、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび／または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む、請求項６〜１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
患者における病的心肥大を診断するためのキットであって、配列番号1のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキット。
【請求項１３】
該手段が、配列番号1のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである、請求項１２に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
AAV9-H19構築物を適用した場合、H19の150倍の誘導が全心臓サンプルにおいて達成された。心肥大の特異的マーカーの転写レベルの変化を分析した。それらには、心肥大においてダウンレギュレートされる転写産物であるα-MHC、およびアップレギュレートされるβ-MHCが含まれる。H19のインビボ過剰発現により、α-MHCからβ-MHCへの変換の逆転が観察された（図35）。このことは、H19のアデノウイルス投与が肥大遺伝子プログラムに対して有益な影響を及ぼし、治療戦略として役立つことを示している。   
本発明は以下の実施形態を包含する。 
[１]  （i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の発現および／または活性を促進する化合物、ならびに／または
（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物
を含む医薬組成物。   
[２]  心肥大の治療または予防における使用のための、（i）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を促進する、ならびに／または（ii）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および／または活性を抑制する化合物。   
[３]  心肥大が心室肥大である、2記載の使用のための化合物。   
[４]  （ii）において定められている化合物が、
（a）配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの少なくとも12個の連続的ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（b）配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの相補鎖と少なくとも69％同一であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（c）UがTにより置換された（a）または（b）に記載のヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（d）（a）〜（c）のいずれか1つにおいて定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または  （e）（d）の発現ベクターを含む宿主
である、1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。   
[５]  （ii）において定められている化合物がアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物または小分子インヒビターである、1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。   
[６]  （i）において定められている化合物が、
（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの核酸配列またはそれに対して少なくとも69％同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸配列、
（b）（a）において定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または
（c）（b）の発現ベクターを含む宿主
である、1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。   
[７]  （i）において定められている化合物が、
（a）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を促進する転写因子、ならびに／または
（b）配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子
である、1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。   
[８]  （a）患者から得たサンプルにおいて、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルを検出し、
（b）前記の1以上のlncRNAの発現レベルを、健常被験者から得たサンプルにおけるこれらの1以上のlncRNAの発現レベルと比較することを含む、患者における心肥大を診断するための方法であって、
配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるダウンレギュレーション、ならびに／または配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるアップレギュレーションが、患者における心肥大を示す、方法。   
[９]  サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである、8記載の方法。   
[１０]  該サンプルが心臓組織サンプルである、8記載の方法。   
[１１]  1以上のlncRNAの発現レベルの検出が、
（a）定量的PCR、好ましくは定量的リアルタイムPCR、または
（b）鋳型／RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定を含む、8〜10のいずれか1項記載の方法。   
[１２]  該方法が、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび／または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む、8〜11のいずれか1項記載の方法。   
[１３]  患者における心肥大を診断するためのキットであって、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキット。   
[１４]  該手段が、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである、13記載のキット。   
[１５]  1以上のlncRNAが少なくとも3個のlncRNA、好ましくは少なくとも5個のlncRNAである、1〜14のいずれか1項記載の医薬組成物、使用のための化合物、方法またはキット。