(57)【要約】【課題】本発明は、発がんにおけるｌｎｃＲＮＡの機能を明らかにすることにより、がんの新たな治療標的、診断または予後のマーカー、および診断・治療法を提供することを課題とする。【解決手段】本明細書において、ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤；ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを発現するベクター；該ベクターが導入されている細胞；前記のがん治療剤、ベクター、または細胞を含む、がんを治療するための医薬組成物；ヒト対象が、がんを発症するか否かを予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法；および、がん治療を開始したヒトがん対象の、治療開始時点から５〜１０年後の予後を予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法が提供される。【選択図】図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＥＵ１（Deleted in lymphocytic leukemia 1）の発現の抑制剤を含む、がん治療剤。
【請求項２】
ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤が、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のがん治療剤。
【請求項３】
ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤が、ｓｉＲＮＡである、請求項２に記載のがん治療剤。
【請求項４】
がんが、固形がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のがん治療剤。
【請求項５】
がんが、口腔扁平上皮癌である、請求項４に記載のがん治療剤。
【請求項６】
ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを発現する、ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが導入されている、細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のがん治療剤、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の細胞を含む、がんを治療するための医薬組成物。
【請求項９】
ヒト対象が、がんを発症するか否かを予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合に、ヒト対象が、がんを発症すると予測すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
がん治療を開始したヒトがん対象の、治療開始時点から５〜１０年後の予後を予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合に、前記予後が、不良であると予測すること
を含む、前記方法。
【請求項１１】
（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象が、がんを発症すると予測する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）において、がん治療を開始したヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、治療開始時点から５〜１０年後の予後が、不良であると予測する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
がんが、固形がんである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
がんが、口腔扁平上皮癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト対象が、前がん状態である、請求項９、１１、１３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖非コードＲＮＡを標的とするがん治療剤およびがん診断・予後の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、全世界で口腔がんの新しい症例が300,000にも達し（すべてのがんの２．１％）、この疾患により145,000人が死亡した（すべてのがんの２．１％）（非特許文献１）。口腔がんの約９０％は、病理組織学的に扁平上皮癌として分類される（非特許文献２）。口腔がんの処置として、外科手術や化学療法、放射線治療と併用する学際的なアプローチが推奨されている（非特許文献３）。これらの処置は、早期がんには有効であるものの、進行がんや再発がんに対しては不充分なことが多い。結果として、口腔がん患者の５年生存率は、約５０％しかない（非特許文献４）。手術不可能なまたは化学療法耐性な口腔がんの場合は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブなどの分子標的薬の有効性が報告されている（非特許文献５、６）。しかしながら、セツキシマブは、ＫＲＡＳ変異のがんには有効性が低いことが知られており、口腔がんの新しい治療標的の発見が必要とされている（非特許文献７）。
【０００３】
ところで、近年のゲノムおよびトランスクリプトームの解析によって、ゲノムのたった２％しかタンパク質へ翻訳されないことが明らかとなった。翻訳されないＤＮＡの一部は、無数の非コードＲＮＡへ転写される（非特許文献８）。長鎖非コードＲＮＡ（long non-coding RNA：ｌｎｃＲＮＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって合成され、ｍＲＮＡとその生物学的特徴の多くで共通するが、タンパク質をコードしない（非特許文献９）。それにもかかわらず、ｌｎｃＲＮＡがヒト悪性腫瘍において極めて重要な役割を果たすことを示す証拠がある。例えば、ＨＯＴＡＩＲというｌｎｃＲＮＡは、乳がんや消化管がんなどの様々な悪性腫瘍におけるその発現の上昇と、転移および予後不良とに関連がある（非特許文献１０、１１）。加えて、ＨＯＴＡＩＲは、がん細胞内でＰＲＣ２（Polycomb repressive complex 2）タンパク質を動員することによって、転移抑制遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを誘導する（非特許文献１０）。同様に、ＴＵＧ１は、神経膠腫細胞において過剰発現しており、その細胞内、ＴＵＧ１は、ＰＲＣ２と相互作用することで、分化関連遺伝子を抑制する（非特許文献１２）。反対に、ＭＥＧ３は、報告によると、腫瘍抑制因子として作用し、その発現は、髄膜種、神経膠腫、胃がんなどの様々な腫瘍において下方調節されている（非特許文献１３）。いくつかの研究グループは、ＨＯＴＡＩＲの発現上昇が、口腔扁平上皮癌（oral squamous cell carcinoma：ＯＳＣＣ）細胞の浸潤、転移および幹細胞性に関連すると報告している（非特許文献１４、１５）。またＴＵＧ１は、Ｗｎｔ／β−カテニンのシグナル伝達を活性化することによってＯＳＣＣの進行も促進すると報告されている（非特許文献１６）。ＭＥＧ３の発現低下は口腔がんの予後不良に関連するが、このことと、ＭＥＧ３がＷｎｔ／β−カテニンのシグナル伝達を抑制することによってＯＳＣＣの細胞成長および転移を阻害するという所見とは矛盾しない（非特許文献１７、１８）。すなわち、口腔がんにおけるｌｎｃＲＮＡの役割については、依然として不明な点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ferlay J, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 136, E359-386 (2015).
【非特許文献２】Johnson NW, Jayasekara P, Amarasinghe AA. Squamous cell carcinoma and precursor lesions of the oral cavity: epidemiology and aetiology. Periodontol. 2000 57, 19-37 (2011).
【非特許文献３】Shah JP, Gil Z. Current concepts in management of oral cancer--surgery. Oral Oncol. 45, 394-401 (2009).
【非特許文献４】Marsh D, et al. Stromal features are predictive of disease mortality in oral cancer patients. J Pathol 223, 470-481 (2011).
【非特許文献５】Bonner JA, et al. Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med 354, 567-578 (2006).
【非特許文献６】Vermorken JB, et al. Platinum-based chemotherapy plus cetuximab in head and neck cancer. N Engl J Med 359, 1116-1127 (2008).
【非特許文献７】Karapetis CS, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med 359, 1757-1765 (2008).
【非特許文献８】Djebali S, et al. Landscape of transcription in human cells. Nature 489, 101-108 (2012).
【非特許文献９】Prensner JR, Chinnaiyan AM. The emergence of lncRNAs in cancer biology. Cancer Discov 1, 391-407 (2011).
【非特許文献１０】Gupta RA, et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature 464, 1071-1076 (2010).
【非特許文献１１】Niinuma T, et al. Upregulation of miR-196a and HOTAIR drive malignant character in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 72, 1126-1136 (2012).
【非特許文献１２】Katsushima K, et al. Targeting the Notch-regulated non-coding RNA TUG1 for glioma treatment. Nat Commun 7, 13616 (2016).
【非特許文献１３】Zhou Y, Zhang X, Klibanski A. MEG3 noncoding RNA: a tumor suppressor. J. Mol. Endocrinol. 48, R45-53 (2012).
【非特許文献１４】Wu Y, et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes tumor cell invasion and metastasis by recruiting EZH2 and repressing E-cadherin in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 46, 2586-2594 (2015).
【非特許文献１５】Lu MY, et al. Targeting LncRNA HOTAIR suppresses cancer stemness and metastasis in oral carcinomas stem cells through modulation of EMT. Oncotarget 8, 98542-98552 (2017).
【非特許文献１６】Liang S, et al. LncRNA, TUG1 regulates the oral squamous cell carcinoma progression possibly via interacting with Wnt/beta-catenin signaling. Gene 608, 49-57 (2017).
【非特許文献１７】Jia LF, et al. Expression, regulation and roles of miR-26a and MEG3 in tongue squamous cell carcinoma. Int J Cancer 135, 2282-2293 (2014).
【非特許文献１８】Liu Z, Wu C, Xie N, Wang P. Long non-coding RNA MEG3 inhibits the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma by regulating the WNT/beta-catenin signaling pathway. Oncol Lett 14, 4053-4058 (2017).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、発がんにおけるｌｎｃＲＮＡの機能を明らかにすることにより、がんの新たな治療標的、診断または予後のマーカー、および診断・治療法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、ＯＳＣＣの発症を含む発がんに関与するｌｎｃＲＮＡを同定することを目的とし、トランスクリプトームのデータセットを包括的に解析することによって、ＯＳＣＣにおいて過剰発現した一連のｌｎｃＲＮＡを同定した。次に、候補ｌｎｃＲＮＡの機能的スクリーニングを実施し、新規ＯＳＣＣ関連ｌｎｃＲＮＡとしてＤＬＥＵ１（deleted in lymphocytic leukemia 1）を同定した。本発明者らは、ＤＬＥＵ１の発現上昇が、ＯＳＣＣの発症および進行を促進し得ること、ＤＬＥＵ１が、ＯＳＣＣの有用かつ新しい治療標的となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含む、がん治療剤。
［２］ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤が、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、［１］に記載のがん治療剤。
［３］ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤が、ｓｉＲＮＡである、［２］に記載のがん治療剤。
［４］がんが、固形がんである、［１］〜［３］のいずれかに記載のがん治療剤。
［５］がんが、口腔扁平上皮癌である、［４］に記載のがん治療剤。
【０００８】
［６］ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを発現する、ベクター。
［７］［６］に記載のベクターが導入されている、細胞。
［８］［１］〜［５］のいずれかに記載のがん治療剤、［６］に記載のベクター、または［７］に記載の細胞を含む、がんを治療するための医薬組成物。
［９］ヒト対象が、がんを発症するか否かを予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合に、ヒト対象が、がんを発症すると予測すること
を含む、前記方法。
【０００９】
［１０］がん治療を開始したヒトがん対象の、治療開始時点から５〜１０年後の予後を予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合に、前記予後が、不良であると予測すること
を含む、前記方法。
［１１］（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象が、がんを発症すると予測する、［９］に記載の方法。
［１２］（ｃ）において、がん治療を開始したヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、治療開始時点から５〜１０年後の予後が、不良であると予測する、［１０］に記載の方法。
［１３］がんが、固形がんである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］がんが、口腔扁平上皮癌である、［１３］に記載の方法。
［１５］ヒト対象が、前がん状態である、［９］、［１１］、［１３］および［１４］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のがん治療剤および医薬組成物は、ＤＬＥＵ１の発現を抑制することにより、がんにおいて、細胞増殖抑制効果を発揮することができる。
本発明の方法により、前がん段階において、がん発症の可能性を予測することができ、さらに、がん治療を開始したヒトがん対象の、治療開始時点から５〜１０年後の予後を予測することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｂ】ＯＳＣＣにおいて異常な発現を示すｌｎｃＲＮＡのスクリーニング。（Ａ）ＯＳＣＣに関連する新規ｌｎｃＲＮＡを同定するためのスクリーニングのワークフロー。（Ｂ）１８種類のＯＳＣＣ細胞株において選択された６種類のｌｎｃＲＮＡおよび正常舌検体のｑＲＴ−ＰＣＲの結果。結果（グラフの縦軸）は、正常舌検体（Normal tongue）の発現レベルに対し正規化している。３通りの実験の平均を示す。エラーバーは、ＳＤを表す。
【図１Ｃ】（Ｃ）１８種類のＯＳＣＣ細胞株における１４種類のｌｎｃＲＮＡの発現を正常舌検体に対して正規化したもの。この図の１行〜６行目までに記載の６種類のｌｎｃＲＮＡ、すなわち「DLEU1」、「LINCO00941」、「LINCO00460」、「TCONS_00015845」、「TCONS_00025137」、および「TCONS_00005474」を選択し、図１Ｂも含め、さらなる解析に使用した。
【００１２】
【図２Ａ−Ｂ】ＯＳＣＣ細胞増殖に対するｌｎｃＲＮＡノックダウンの効果。（Ａ）ｌｎｃＲＮＡがノックダウンされたＯＳＣＣ細胞株における細胞生存アッセイの概要。各細胞には夫々、ｌｎｃＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡまたは陰性コントロール（Negative control）がトランスフェクトされ、細胞生存は、トランスフェクションから９６時間後に判定された（Absorbanceが低いほど、当該ｓｉＲＮＡの各細胞株への増殖抑制効果が高い）。結果は９通りの平均を示し、エラーバーはＳＤを表す。（Ｂ）ＯＳＣＣ細胞株におけるＤＬＥＵ１ノックダウンを示すｑＲＴ−ＰＣＲ。細胞は、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌ）またはＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡがトランスフェクトされ、トランスフェクションから７２時間後に回収された。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＤＬＥＵ１がノックダウンされたＯＳＣＣ細胞株の細胞生存アッセイ。各細胞には、凡例のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされ、細胞生存は、横軸の時点にて判定された。図２の結果は９通りの平均であり、エラーバーはＳＤを表し、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【００１３】
【図３Ａ−Ｃ】ＯＳＣＣ細胞中のＤＬＥＵ１の機能解析。ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（siCtrl）がトランスフェクトされた（Ａ）ＫＯＮ細胞、（Ｂ）ＨＳＣ−３細胞、および（Ｃ）Ｃａ９−２２細胞の遊走(migration)アッセイおよび浸潤(invasion)アッセイの結果。顕微鏡画像については代表的な結果を示すものを選択し、グラフについては、１メンブレンにつき無作為選択された５つの顕微鏡視野の平均を示す。エラーバーはＳＤを表す。
【図３Ｄ−Ｅ】表示のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたＫＯＮ細胞の細胞周期の解析結果（Ｄ）およびアポトーシスの解析結果（Ｅ）。代表的な結果を左に示す。３通りをまとめた結果を右に示す。エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｆ】表示のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた各ＯＳＣＣ細胞株による創傷治癒アッセイの結果。
【図３Ｇ】表示のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたＨＳＣ−３細胞、Ｃａ９−２２細胞、およびＭＯＴ細胞の細胞周期の解析結果。
【図３Ｈ】表示のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたＨＳＣ−３細胞のアポトーシスの解析結果。
【００１４】
【図４】マウスにおけるＯＳＣＣ細胞による異種移植片腫瘍形成に対するＤＬＥＵ１ノックダウンの効果。（Ａ）ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（siCtrl）がトランスフェクトされたＨＳＣ−３を注射したヌードマウスにおける腫瘍成長。ｓｉＲＮＡの腫瘍内注射もまた、横軸の時点にて実施した。４通りの平均を示す。エラーバーはＳＤを表す。（Ｂ）（Ａ）のマウスから摘出された腫瘍（上）および腫瘍重量（下）。４通りの平均を示す。エラーバーはＳＤを表す。（Ｃ）表示のｓｉＲＮＡで処置された腫瘍における、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色（左）およびＫｉ−６７染色（右）の代表的な画像。スケールバーは２００μｍである。（Ｄ）Ｋｉ−６７陽性細胞数のまとめ。４通りの平均を示す。エラーバーはＳＤを表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【００１５】
【図５】ＯＳＣＣ細胞における遺伝子発現プロファイルに対するＤＬＥＵ１ノックダウンの効果。（Ａ）ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡ（siDLEU1-2）またはコントロールｓｉＲＮＡ（siCtrl）でＯＳＣＣ細胞株を処置した後、マイクロアレイ解析を実施した。左は、各ＯＳＣＣ細胞株におけるＤＬＥＵ１ノックダウンによって発現が変動した（＞２倍）遺伝子を示すベン図である。右は、選択された９６３プローブセットの発現のヒートマップである。（Ｂ）９６３プローブセットのＧＯ解析（左）および経路解析（右）の結果。（Ｃ）表示のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたＨＳＣ−３細胞におけるがん関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ。３通りの平均を示し、エラーバーはＳＤを表す。
【００１６】
【図６Ａ−Ｄ】原発腫瘍中のＤＬＥＵ１発現の上昇。（Ａ）ＴＣＧＡデータセットにおける正常組織およびＨＮＳＣＣ原発腫瘍のＤＬＥＵ１発現の概要。（Ｂ）ＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝５０５）の生存率に対するＤＬＥＵ１発現の影響を示すカプラン・マイヤー曲線。（Ｃ）ＯＳＣＣ日本人患者から入手した原発腫瘍（ｎ＝２９）およびその隣接する正常組織（ｎ＝１７）におけるＤＬＥＵ１のｑＲＴ−ＰＣＲの結果のまとめ。（Ｄ）正常組織および原発腫瘍におけるＤＬＥＵ１のｑＲＴ−ＰＣＲ。＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図６Ｅ】ＤＬＥＵ１の発現レベルと、ＴＣＧＡデータセットにおける原発ＨＮＳＣＣの推定される標的遺伝子の発現レベルとの相関。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学に関して用いられる用語、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。
【００１８】
また、別段の定めがない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、およびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992および2000の補遺)；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology-4thEd., Wiley & Sons (1999)；Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)；およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げられる。
【００１９】
本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、ならびに対象の処置に用いるものとする。
【００２０】
また、本発明において用いられるＤＬＥＵ１遺伝子は、例えば、配列番号６９〜７１（夫々variant 1、variant 2、およびvariant 3に相当する）のいずれかで表される塩基配列を含有するＤＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有する。ここで、配列番号６９で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号６９で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等を用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。
【００２１】
また、本明細書において、「がん」という用語を「癌腫」に限らない「悪性腫瘍」という意味でも使用する。
なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＤＬＥＵ１遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＤＬＥＵ１をコードする限り、ＤＬＥＵ１遺伝子に含まれる。
【００２２】
本明細書において、例えば、ＤＬＥＵ１の発現を抑制するための治療剤、組成物、方法およびキット、ならびにＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定することを含むがんの検出方法が提供される。
本治療剤、組成物、方法およびキットは、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡ、例えば配列番号７２〜７４（夫々variant 1、variant 2、およびvariant 3に相当する）のいずれかによって例示されるＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡを結合する核酸分子、例えば、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖(double-stranded)ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））などを使用することを含んでいてもよい。
【００２３】
また、本明細書において、ＤＬＥＵ１の高発現に関連する疾患、状態または障害、例えば細胞増殖疾患、腫瘍、がんなどを治療および／または予防するための治療剤、組成物、方法およびキットも提供される。
さらに、本明細書において、ＤＬＥＵ１の高発現に関連する疾患、状態または障害、例えば細胞増殖疾患、腫瘍、がんなどを診断するための方法も提供される。
【００２４】
ＤＬＥＵ１（Deleted in Lymphocytic Leukemia1）について、これまでにわかっていることを以下に列挙する。
●染色体１３番上にあり、慢性リンパ性白血病患者の約６０％で欠失しており、腫瘍抑制因子（遺伝子）(tumor suppressor)と考えられる。（Edelmann J, et al. High-resolution genomic profiling of chronic lymphocytic leukemia reveals new recurrent genomic alterations. Blood 120, 4783-4794 (2012)）
●バーキットリンパ腫細胞株でＤＬＥＵ１を過剰発現させると、腫瘍細胞の増殖能、遊走能が抑制される。（Sanghoon L, et al. Downregulation of DLEU1 significantly shortened survival in a rituximab-treated DLEU1 knockout human Burkitt lymphoma (BL) xenograft NSG mouse model: DLEU1 may act as a tumor suppressor gene in pediatric BL. Blood 126, 3656 (2013)）
●乳がん細胞株ＭＣＦ−７でＤＬＥＵ１をノックダウンするとＥＳＲ１の発現が低下することから、ＤＬＥＵ１は何らかの形でＥＳＲ１の発現を制御している可能性がある。（Qian W, et al. Analysis of the miRNA-mRNA-lncRNA networks in ER+ and ER- breast cancer cell lines. J Cell Mol Med 19, 2874-2887 (2015)）
●ＤＬＥＵ１は卵巣がんの細胞株および臨床検体で高発現しており、腫瘍の悪性度と関連し、ＤＬＥＵ１の発現抑制は腫瘍細胞の増殖、遊走能を抑制する（Wang LL, et al. DLEU1 contributes to ovarian carcinoma tumourigenesis and development by interacting with miR-490-3p and altering CDK1 expression. J Cell Mol Med 21, 3055-3065 (2017)）。
【００２５】
ＤＬＥＵ１以外の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）については、例えば、ＬＩＮＣ００４６０は、ＨＮＳＣＣおよび腎がんにおいて上方調節されており、その発現上昇は、生存率の悪化と関連する（Wang ZL, et al. Integrative analysis reveals clinical phenotypes and oncogenic potentials of long non-coding RNAs across 15 cancer types. Oncotarget 7, 35044-35055 (2016)）。ＬＩＮＣ００４６０の発現上昇が、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）において、臨床病期の進行、リンパ節転移、および予後不良と関連することと、ＬＩＮＣ００４６０のノックダウンが、ＥＳＣＣ細胞において、細胞周期の停止およびアポトーシスを誘導することが別の研究から明らかとなっている（Liang Y, et al. A novel long noncoding RNA linc00460 up-regulated by CBP/P300 promotes carcinogenesis in esophageal squamous cell carcinoma. Biosci. Rep. 37, (2017)）。対照的に、ＬＩＮＣ００９４１の発現が高くなればなるほど、肺腺癌患者の生存率が良くなることが報告されているが、その機能は依然不明である（Zhang X, Chi Q, Zhao Z. Up-regulation of long non-coding RNA SPRY4-IT1 promotes tumor cell migration and invasion in lung adenocarcinoma. Oncotarget 8, 51058-51065 (2017)）。
このように、近年の研究から、ｌｎｃＲＮＡが、ヒト悪性腫瘍において極めて重要な役割を果たすことが示されているが、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）におけるｌｎｃＲＮＡについては完全には理解されていない。
【００２６】
ここで本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡが、ＯＳＣＣと機能的に関連することを突き止めた。原発性の頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）から得られたＲＮＡ発現データを解析した結果、本発明者らは、がん組織中、異常な発現を示す１５種のｌｎｃＲＮＡを同定した。次にｑＲＴ−ＰＣＲを使用し、ＯＳＣＣ細胞株１８種夫々における上記ｌｎｃＲＮＡの発現を確認し、ＯＳＣＣ中、高頻度に過剰発現していたｌｎｃＲＮＡを６種類同定した。これらのうち、ＤＬＥＵ１をノックダウンすると、ＯＳＣＣ細胞増殖が強力に抑制されるのを見出した。ＤＬＥＵ１のノックダウンはまた、ＯＳＣＣ細胞による遊走、浸潤、異種移植片形成も抑制した。このことは、その発がん性を示唆する。マイクロアレイ解析によると、ＤＬＥＵ１ノックダウンは、ＯＳＣＣ細胞中、ＨＡＳ３、ＣＤ４４、ＴＰ６３などの多数のがん関連遺伝子の発現に著しい影響を及ぼすことが判明した。このことは、ＤＬＥＵ１がＨＡ−ＣＤ４４のシグナル伝達を調節すること示唆する。ＤＬＥＵ１の発現は、原発性ＯＳＣＣ組織の７１％において上昇していた。ＤＬＥＵ１の高発現は、ＨＮＳＣＣ患者の全生存期間をより短縮させることと関連した。これらのデータから、ＤＬＥＵ１発現の上昇がＯＳＣＣの発症に寄与すること、ＤＬＥＵ１がＯＳＣＣの治療標的として有用であることがわかる。
【００２７】
１．本発明のがん治療剤
本発明の一側面は、ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤に関する。
本発明のがん治療剤は、例えば、ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含む。長鎖非コードＲＮＡのＤＬＥＵ１のアノテーションデータは、Human Body Map（Broad Institute）から取得することができる。本明細書において、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡは、配列番号７２、７３、または７４によって示される。
【００２８】
本発明において、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡは、例えば、ヒト由来であり、配列番号７２〜７４のいずれかで示される塩基配列またはこの各塩基配列において、１個もしくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加、または挿入を含む塩基配列、あるいは上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上、または９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
本明細書において、「数個」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００２９】
本発明において、ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するｓｉＲＮＡ（例えば、実施例において使用したものなど、表２を参照）もしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらの修飾ＲＮＡ、あるいはＤＬＥＵ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＤＬＥＵ１の発現の抑制剤は、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡもしくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡもしくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。
【００３０】
ｓｉＲＮＡは、ＤＬＥＵ１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３’末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。
本発明において、ＤＬＥＵ１遺伝子の発現の抑制剤は、例えば、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡの組み合わせであってもよく、例えば、配列番号５５で表されるセンス鎖と配列番号５６で表されるアンチセンス鎖との組み合わせ、および配列番号５７で表されるセンス鎖と配列番号５８で表されるアンチセンス鎖との組み合わせが好ましい。
【００３１】
本発明の治療剤の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、これらに限定されないが、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。
【００３２】
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
【００３３】
２．本発明の医薬組成物
本発明はまた、上記の治療剤を含む医薬組成物に関する。上記の治療剤は、がん細胞の増殖を抑制することができるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記の治療剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
【００３４】
上記医薬組成物は、限定されずに、上記のＤＬＥＵ１高発現に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などの処置に用いることができる。したがって、本発明はまた、ＤＬＥＵ１の高発現が関与する疾患の処置のための有効量の上記のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの抑制剤を含む医薬組成物に関する。
【００３５】
細胞増殖性疾患としては、例えば、これらに限定されないが、良性腫瘍または悪性腫瘍などを含む。本発明の一態様において、細胞増殖性疾患は、がんである。本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、がん細胞の細胞増殖能力を、例えば、ＭＴＴアッセイにおいて、正常細胞の２分の１以下、３分の１以下に抑制することができる。
【００３６】
本発明が対象とするがんとしては、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡが発現している限り限定されないが、例えば、固形がん、例として口腔扁平上皮癌、脳腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎癌、子宮癌、卵巣癌などの癌腫などが挙げられる。
【００３７】
がん細胞がＤＬＥＵ１を発現しているか否かは、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現を、遺伝子レベルで検出することにより判断できる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。本発明の一態様において、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量は、正常細胞に比べ、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましく１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上増加している。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤などをさらに含んでもよい。
抗腫瘍剤としては、例えば、これらに限定されないが、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどが挙げられる。
【００３９】
抗炎症剤としては、限定されずに、ステロイド系抗炎症剤（プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等）や非ステロイド系抗炎症剤（アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等）、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などが挙げられる。
【００４０】
本発明のがん治療剤、医薬組成物などにおいて、２種以上のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を組み合わせて用いる場合、２種以上の分子を単一の組成物に含めても、複数の組成物に別々に含ませ、それらを組み合わせて用いてもよい。例えば、核酸分子であれば、２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込んでも、それぞれ１種類ずつの核酸分子を含む複数種の核酸構築物またはベクターの組み合わせとして調製してもよい。
【００４１】
本発明の種々の態様において、上記のがん治療剤は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、例えば、これらに限定されないが、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（例えば、Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。
【００４２】
本発明の治療剤や医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年、上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。
【００４３】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【００４４】
３．本発明のキット
本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の治療剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
【００４５】
４．本発明のがん診断方法
本発明の一態様は、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡを標的とするがんの診断方法に関する。
【００４６】
本発明の一態様は、ヒト対象ががんを発症するか否かを予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合、またはヒト健常者の発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測すること
を含む。
【００４７】
本発明の別の一態様において、（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも、例えば、３倍、５倍、１０倍、または２０倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測される。
【００４８】
本発明の診断方法において、がんは、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡを発現している限り限定されないが、例えば固形がんであることが好ましく、例えば口腔扁平上皮癌であることがより好ましく、例えば、ヒト対象は、前がん状態のヒト対象である。
【００４９】
５．本発明の予後予測方法
本発明の一態様は、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡを標的とするがん対象の予後を予測する方法に関する。
【００５０】
本発明の一態様は、がん治療を開始したヒトがん対象の、治療開始時点から５〜１０年後の予後を予測するための指標として、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；
（ｂ）ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること；および
（ｃ）前記ヒトがん対象に由来する試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者に由来する対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量を有意に超える場合に、前記予後が、不良であると予測すること
を含む。ここで上記がん治療は、本発明のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤または医薬組成物を用いる処置ではなく、当該がんの治療として従来用いられているものを指す。
【００５１】
本発明の別の一態様において、（ｃ）において、がん治療を開始したヒトがん対象由来の試験サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも、例えば、３倍、５倍、１０倍、または２０倍を超える場合に、治療開始時点から５〜１０年後の予後が不良であると予測される。
【００５２】
本発明の予後予測方法において、がんは、ＤＬＥＵ１の転写体ＲＮＡを発現している限り限定されないが、例えば固形がんであることが好ましく、例えば口腔扁平上皮癌であることがより好ましい。
【００５３】
６．本発明のがん処置方法
本発明のさらなる態様は、本発明のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤または医薬組成物を用いる疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、本発明のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤または医薬組成物を対象に投与する工程を含む。投与される対象は、典型的には、本発明のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、上記のＤＬＥＵ１の高発現に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、本発明のＤＬＥＵ１の発現の抑制剤を含む治療剤または医薬組成物による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。
【００５４】
本発明の処置方法においては、本発明の治療剤または医薬組成物を、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することができる。本発明の治療剤または医薬組成物により、化学療法や放射線治療に対するがんの感受性が改善することが期待される。疾患の処置において、本発明の治療剤または医薬組成物と併用し得る作用物質、例えば、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤などは、医薬組成物に関して上記したとおりである。また、本発明の処置方法は、放射線治療などの物理療法や外科手術などの外科的治療などと併用することができる。
【００５５】
本発明の処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【００５６】
本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の処置方法に用いる薬物の用量は、好ましくは、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇである。本発明の処置方法に用いる薬物の濃度は、好ましくは、ｓｉＲＮＡの場合、１ｎＭ〜２００μＭが好ましく、５ｎＭ〜１８０μＭがより好ましく、１０ｎＭ〜１６０μＭが特に好ましい。
【００５７】
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００５９】
今回本発明者により、本発明の抑制剤が、ＤＬＥＵ１の発現を抑制することにより、各種がん細胞株において細胞増殖を抑制できる結果、免疫応答に関与する遺伝子群の発現の低下を生じることが明らかになった。
したがって、本発明の抑制剤は、細胞増殖阻害以外に、免疫応答の惹起または維持の作用をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、上記抑制剤を含む、上記作用を提供するための組成物、上記抑制剤の上記作用を提供するための組成物の製造における使用、上記作用を提供するための上記抑制剤、上記作用を提供するための有効量の上記抑制剤を含む組成物、ならびに、上記抑制剤の上記作用を提供するための使用にも関する。
【実施例】
【００６０】
本発明を、以下の例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの例に限定されないものとする。
［材料および方法］
（１）細胞株および組織サンプル
ＯＳＣＣ細胞株は、Sogabe Y, et al. Epigenetic inactivation of SFRP genes in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 32, 1253-1261 (2008)の記載と同様に入手し、培養を行った。ＯＳＣＣの一次組織は、札幌医科大学口腔外科にて2015〜2017年の間に外科切除された日本人の患者から採取された。ＯＳＣＣ一次組織の２９サンプル、およびそれに隣接する非腫瘍組織の１７サンプルは、外科切除または生検から入手した。なお、患者はすべて、かかる研究についてのインフォームド・コンセントには同意している（必要なら、札幌医科大学の施設内倫理委員会（IRB）から入手可能である）。トータルＲＮＡを、RNeasy Mini kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して抽出した。健常者由来の正常舌組織からのトータルＲＮＡは、BioChain（Hayward, CA, USA）から購入した。
【００６１】
（２）定量的逆転写ＰＣＲ
一本鎖ｃＤＮＡは、PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time（Takara Bio Inc, Kusatsu, Japan）を使用して調製した。定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、SYBR Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific）および7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して実施した。ＡＣＴＢ（β−アクチン）を、ｑＲＴ−ＰＣＲ用の内在性コントロールとして使用した。プライマーの配列を以下の表１に示す。なお、ＤＬＥＵ１については、主にプライマー対＃１を発現解析のために使用し、プライマー対＃２をノックダウン効率の評価のために使用した。
【００６２】
【表１−１】
2020007260.tif 000003
【００６３】
【表１−２】
2020007260.tif 000004
【００６４】
（３）ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉によって誘導されるｌｎｃＲＮＡのノックダウンにおいて、ＯＳＣＣ細胞（９６ウェルの場合５×１０３細胞／ウェル、または６ウェルの場合１×１０６細胞／ウェル）に対し、Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を使用して製造元の指示に従い、ｌｎｃＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）またはMission siRNA Universal Negative Control #1（Sigma-Aldrich）をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの配列を以下の表２に示す。なお、ＤＬＥＵ１遺伝子から転写されるバリアントには３種類あり（RefSeqデータベースにおいて夫々、NR_109973、NR_002605、およびNR_109974）、ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡは、３種類すべてのバリアントを標的にしている。
【００６５】
【表２】
2020007260.tif 000005
【００６６】
（４）細胞生存(cell viability)アッセイ
ＯＳＣＣ細胞（９６ウェルプレートにおいて５×１０３細胞／ウェル）に対して、上に記載のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｌｎｃＲＮＡの効果を判定するため、Cell Counting kit-8（Dojindo, Kumamoto, Japan）を使用しその製造元の指示どおりに、トランスフェクションから９６時間後に細胞生存アッセイを実行した。ＤＬＥＵ１のノックダウンの効果を判定するため、トランスフェクションから９６時間後に細胞生存アッセイを実行した。
【００６７】
（５）細胞遊走アッセイおよび細胞浸潤アッセイ
上に記載のｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。細胞遊走および浸潤を解析するためにTranswellチャンバーを使用した。細胞遊走の場合は、BioCoat Control Insert 24-well plate 8.0 μm（Corning Inc., Corning, NY, USA）を、細胞浸潤の場合は、BioCoat Matrigel Invasion Chamber 24-well plate 8.0 μm（Corning Inc.）を使用した。トランスフェクションから２４時間後に細胞を回収し、無血清RPMI 1640培地中に再懸濁した後、５×１０４細胞を上側のチャンバーへ加えた。１０％ウシ胎仔血清含有RPMI 1640培地を下側のウェルへ加えた。３７℃での２４時間のインキュベーション後、フィルターの下側表面上へ遊走したかまたは浸潤した細胞を固定化し、Diff-Quik staining kit（Sysmex, Tokyo, Japan）を使用して染色した。細胞数は、１メンブレンあたり無作為選択された５つの顕微鏡視野中で計数することによって決定した。
【００６８】
（６）創傷治癒アッセイ
ＯＳＣＣ細胞（６ウェルプレート中１×１０６細胞／ウェル）に対し、上に記載のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、ピペットチップを使用して単層の線条痕を形成し、さらに１８時間細胞をインキュベートした。瘢痕および浸潤した細胞の顕微鏡写真を撮り、創傷閉鎖を評価した各条件に対し３通りの実験を実施した。
【００６９】
（７）フローサイトメトリー
ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトして７２時間インキュベートした後、Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）またはApoScreen Annexin V Apoptosis Kit（Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）を使用しそれらの製造元の指示に従い、処置した。フローサイトメトリーによる解析は、BD FACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）ともにBD FACSCanto II（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）を使用して実施した。データ解析は、FlowJoソフトウェア（FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA）を使用して実施した。
【００７０】
（８）異種移植片研究(Xenograft Studies)
すべての動物研究は、札幌医科大学にて施設内動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。０．２ｍｌのMatrigel基底膜マトリクス（Corning Inc. Corning, NY, USA）をプラスした、ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた１×１０７個のＨＳＣ−３細胞の混合物を、６週齢メスBALB/cAJcl-nuマウスの左右の大腿に皮下注射した。次いで、in vivoでのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、AteloGene Local Use Quick Gelation（Koken Co, Tokyo, Japan）を使用し製造元の指示に従い、実施した。腫瘍細胞の接種から１週間後、ｓｉＲＮＡ（２５０ｐｍｏｌ）とアテロコラーゲンとの混合物（５０μｌ）を４日毎に腫瘍内注射した。腫瘍サイズを、デジタル式ノギスを使用して４日毎に測定し、腫瘍体積を、長さ×幅２／２の式を使用して算出した。腫瘍組織を、マウス抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体（MIB-1、１：１００希釈、M7240）（Dako, Glostrup, Denmark）を使用して免疫組織化学的に染色した。Ｋｉ−６７陽性細胞の数は、腫瘍あたり無作為選択された５つの顕微鏡視野中で計数することによって決定した。
【００７１】
（９）遺伝子発現マイクロアレイ解析
上に記載のｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、その７２時間後にトータルＲＮＡを抽出した。遺伝子発現マイクロアレイ解析を、製造元の指示（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）に従い実行した。要約すると、１００ｎｇのトータルＲＮＡを、Low-input Quick Amp Labeling kit One-color（Agilent Technologies）を使用して増幅かつ標識した後、合成したｃＲＮＡを、SurePrint G3 Human GE microarray v2（G4851；Agilent Technologies）に対してハイブリダイズした。マイクロアレイデータを、GeneSpring GX version 13（Agilent Technologies）を使用して解析した。マイクロアレイデータのGene Expression Omnibusの受入番号は、GSE108851である。
【００７２】
（１０）データ解析
ＴＣＧＡ（The Cancer Genome Atlas）データセットにおける頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）由来のＲＮＡ発現データ（RNA-seq data）は、UCSC Cancer Genomics Browser（https://genome-cancer.ucsc.edu）から入手した。量的変数を、スチューデントのｔ検定を使用して解析した。生存率(survival)を、２群の比較について対数順位検定を使用して解析した。Ｐ値＜０．０５（両側）を統計学的に有意であると見なした。統計学的分析を、EZR version 1.32（Saitama Medical Center, Jichi Medical University, Saitama, Japan）を使用して実行した（Kanda Y. Investigation of the freely available easy-to-use software ‘EZR’ for medical statistics. Bone Marrow Transplant. 48, 452-458 (2013)を参照）。
【００７３】
［例１］
（１）ＯＳＣＣにおいて異常な発現を示すｌｎｃＲＮＡのスクリーニング：
ＯＳＣＣＮの発症または進行に関連するｌｎｃＲＮＡを同定するために、本発明者らはまず、ＴＣＧＡ（The Human Cancer Genome Atlas）ネットワーク研究において、ＨＮＳＣＣ原発組織から得られたＲＮＡ発現データを使用した（図１Ａ）。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子はしばしば、多重スプライスバリアントを有することから、それらの遺伝子の各エキソンの発現レベルを解析した。最初に、239,322種のエキソンの発現レベルを、がん組織（ｎ＝４５８）と正常組織（ｎ＝７２）との間で比較した。その結果、49,503種のエキソンの発現レベルが、正常組織よりがん組織で有意に高く（Ｐ＜１×１０−５）、一方8,724種のエキソンの発現は、がん組織で低い（Ｐ＜１×１０−５）ことを見出した。これらの結果をｌｎｃＲＮＡデータベースと比較すると、ｌｎｃＲＮＡをコードする861種のエキソンの発現レベルが、がん組織で増加しており、一方155種のエキソンの発現レベルは、減少していたことがわかった（図１Ａ）（Cabili MN, et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25, 1915-1927 (2011)）。これらのうち、１５種のｌｎｃＲＮＡ遺伝子に対応する３６種のエキソンを選択した。これらの遺伝子は、がんで有意に上方調節されており（Ｐ＜１×１０−３５）、それらの発現レベルを、一連の１８種のＯＳＣＣ細胞株および正常舌組織において評価した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析により、正常組織との比較おいて、１５種のうち１４種のｌｎｃＲＮＡが、複数のＯＳＣＣ細胞株において上方調節されていたことが明らかとなった（図１Ｃ）。６種類のｌｎｃＲＮＡ（DLEU1、LINC00941、LINC00460、TCONS_00015845、TCONS_00025137、およびTCONS_00005474）の発現が、ＯＳＣＣ細胞株の大部分において有意に上昇していた（図１Ｂ）。さらなる解析のために、これらのｌｎｃＲＮＡを選択した。
【００７４】
（２）ＯＳＣＣ細胞増殖に対するｌｎｃＲＮＡノックダウンの効果：
同定されたｌｎｃＲＮＡの機能的な重要性を評価するために、まず、これらのｌｎｃＲＮＡの発現をノックダウンして、ＯＳＣＣ細胞増殖が影響を受けるか判定した（図２Ａ）。ＤＬＥＵ１、ＬＩＮＣ００９４１、ＴＣＯＮＳ＿０００１５８４５、およびＴＣＯＮＳ＿０００２６１３７を標的にするｓｉＲＮＡのすべてが、Ｃａ９−２２細胞やＭＯＴ細胞の増殖を有意に抑制した。ＤＬＥＵ１のノックダウンは、試験したすべての細胞株の成長に対して、最も強力な抑制効果を示したところ、ＤＬＥＵ１を標的とするｓｉＲＮＡをさらに設計した。両ｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＬＥＵ１−１およびｓｉＤＬＥＵ１−２）はともに、ＤＬＥＵ１の発現を顕著に減少させた（図２Ｂ）。細胞生存アッセイから、２つのｓｉＲＮＡのいずれかでＤＬＥＵ１発現をノックダウンすると、ＨＳＣ−３細胞、ＫＯＮ細胞、Ｃａ９−２２細胞、およびＭＯＴ細胞の増殖が有意に抑制されることがわかった（図２Ｃ）。
【００７５】
［例２］ＯＳＣＣ細胞におけるＤＬＥＵ１の発がん機能：
次に、ＤＬＥＵ１が、ＯＳＣＣ細胞による遊走および浸潤に関与するか調べた。Transwellチャンバーアッセイによって、ＤＬＥＵ１ノックダウンが、ＨＳＣ−３細胞、ＫＯＮ細胞、およびＣａ９−２２細胞の遊走を抑制したことが明らかになった（図３Ａ〜Ｃ）。そして、細胞遊走に対するＤＬＥＵ１の阻害効果を、創傷治癒アッセイで確認した（図３Ｆ）。また、Matrigel浸潤アッセイから、ＤＬＥＵ１ノックダウンがＯＳＣＣ細胞による浸潤も抑制したことがわかった（図３Ａ〜Ｃ）。ＤＬＥＵ１ノックダウンはまた、ＫＯＮ細胞、ＨＳＣ−３細胞、Ｃａ９−２２細胞、およびＭＯＴ細胞において、Ｇ２−Ｍ期停止（図３Ｄ、Ｇ）およびアポトーシス（図３Ｅ、Ｈ）をも誘導した。これらの結果は、ＤＬＥＵ１が、ＯＳＣＣ細胞による増殖、遊走および浸潤を促進することによって、かつアポトーシスを阻害することによって、ＯＳＣＣ進行に寄与することを示唆する。
【００７６】
さらに、ＤＬＥＵ１のin vivoでの発がん機能を確認するために、マウス異種移植片実験を実施したところ、ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡが、ヌードマウスにおけるＯＳＣＣ細胞による異種移植片腫瘍形成を有意に抑制したことがわかった（図４Ａ、Ｂ）。免疫組織化学分析によって、Ｋｉ−６７発現が、ＤＬＥＵ１のｓｉＲＮＡで処置された腫瘍において減少したところ（図４Ｃ、Ｄ）、ＤＬＥＵ１ノックダウンが、腫瘍細胞増殖を抑制したことが明らかになった。
【００７７】
［例３］ＯＳＣＣ細胞の遺伝子発現プロファイルに対するＤＬＥＵ１ノックダウンの効果：
ＯＳＣＣにおけるＤＬＥＵ１の分子機能を解明するために、ＤＬＥＵ１を標的にするｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＬＥＵ１−２）またはコントロールｓｉＲＮＡを一過的にトランスフェクトした３種類のＯＳＣＣ細胞株（ＨＳＣ−３、ＫＯＮ、およびＣａ９−２２）を用いて、遺伝子発現マイクロアレイ解析を実施した。９６３種のプローブセット（８１４種のユニークな遺伝子）の発現が、ＤＬＥＵ１のノックダウンによって、試験した３種類すべての細胞株において変動した（＞２倍）（図５Ａ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析から、その影響を受けた遺伝子のうち、「発症」、「分化」および「細胞運動の調節」に関連する遺伝子が増加していたことがわかった（図５Ｂ左）。また経路解析からは、その影響を受けた遺伝子のうち、「マトリクスメタロプロテイナーゼ」、「アポトーシス」、「細胞周期」および「ＭＡＰＫシグナル伝達」に関連する遺伝子が増加していたことが明らかになった（図５Ｂ右）。
【００７８】
マイクロアレイの結果を追認するために実施したｑＲＴ−ＰＣＲによると、以下に詳述するＨＡＳ３、ＣＤ４４、ＳＭＹＤ２、ＳＥＴＤ６、ＫＤＭ１Ｂ、ＴＰ６３などの数多のがん関連遺伝子の発現が、ＤＬＥＵ１標的ｓｉＲＮＡによって減少したのに対して、ＣＤＨ１の発現は、ＤＬＥＵ１のノックダウンによって増加したことがわかった。これは、これらの遺伝子が、ＯＳＣＣ細胞のＤＬＥＵ１の下流の標的であり得ることを示唆する（図５Ｃ）。
【００７９】
●上記がん関連遺伝子について
ＨＡＳ３（hyaluronan synthase 3）もまた、がん発症に強く関連している。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、細胞接着、遊走、および増殖を調節する、細胞外の細胞表面関連多糖類であり（Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat Rev Cancer 4, 528-539 (2004)）、その合成酵素であるＨＡＳ３の過剰発現は、がん細胞の成長および転移に関連することが報告されている（Liu N, et al. Hyaluronan synthase 3 overexpression promotes the growth of TSU prostate cancer cells. Cancer Res 61, 5207-5214 (2001)；およびBullard KM, et al. Hyaluronan synthase-3 is upregulated in metastatic colon carcinoma cells and manipulation of expression alters matrix retention and cellular growth. Int J Cancer 107, 739-746 (2003)）。また近年の研究からも、ＨＡＳ３が、ＴＮＦαと相互の調節ループを形成することにより、口腔がんの発がん効果を発揮することが示されている（Kuo YZ, et al. Hyaluronan synthase 3 mediated oncogenic action through forming inter-regulation loop with tumor necrosis factor alpha in oral cancer. Oncotarget 8, 15563-15583 (2017)）。
【００８０】
ＣＤ４４は、ＨＮＳＣＣのがん幹細胞マーカーとして知られている膜貫通タンパク質である（Prince ME, et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 973-978 (2007)）。ＣＤ４４は主要なＨＡ受容体であり、ＨＡとＣＤ４４とが相互作用すると、ＥＧＦＲシグナル伝達が活性化されてＨＮＳＣＣの進行および化学療法剤耐性が促進される（Wang SJ, Bourguignon LY. Role of hyaluronan-mediated CD44 signaling in head and neck squamous cell carcinoma progression and chemoresistance. Am J Pathol 178, 956-963 (2011)）。その上、近年の研究から、ｐ６３のアイソフォームであるΔＮｐ６３は、ほとんどのＨＮＳＣＣにおいて過剰発現されているが、ＨＮＳＣＣ中ＨＡＳ３およびＣＤ４４の発現を直接調節することでＨＡの代謝を媒介する（Compagnone M, et al. DeltaNp63-mediated regulation of hyaluronic acid metabolism and signaling supports HNSCC tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 13254-13259 (2017)）。
【００８１】
ＳＭＹＤ２は、ヒストンＨ３Ｋ３６およびｐ５３のＫ３７０に対するリジンメチルトランスフェラーゼ（ＫＭＴ）として同定され、ＨＮＳＣＣを含む様々な腫瘍において過剰発現されている（Komatsu S, et al. Overexpression of SMYD2 relates to tumor cell proliferation and malignant outcome of esophageal squamous cell carcinoma. Carcinogenesis 30, 1139-1146 (2009)；およびOhtomo-Oda R, et al. SMYD2 overexpression is associated with tumor cell proliferation and a worse outcome in human papillomavirus-unrelated nonmultiple head and neck carcinomas. Hum Pathol 49, 145-155 (2016)）。また近年の研究から、ＳＭＹＤ２は、発がんに不可欠なタンパク質（例えば、β−カテニン、ＥＭＬ４−ＡＬＫなど）のメチル化を媒介することも示された（Deng X, et al. Critical roles of SMYD2-mediated beta-catenin methylation for nuclear translocation and activation of Wnt signaling. Oncotarget 8, 55837-55847 (2017)；およびWang R, et al. Effects of SMYD2-mediated EML4-ALK methylation on the signaling pathway and growth in non-small-cell lung cancer cells. Cancer Sci 108, 1203-1209 (2017)）。
【００８２】
ＳＥＴＤ６は、エストロゲン応答遺伝子の発現および乳がん細胞の増殖を制御するヒストンＨ２ＡＺのためのＫＭＴとして最初に同定された（O’Neill DJ, et al. SETD6 controls the expression of estrogen-responsive genes and proliferation of breast carcinoma cells. Epigenetics 9, 942-950 (2014)）。別の研究から、ＳＥＴＤ６は、膀胱がんで過剰発現されて、そこでｐ６５のメチル化を介してＮＦ−κＢのシグナル伝達を刺激することが報告された（Mukherjee N, Cardenas E, Bedolla R, Ghosh R. SETD6 regulates NF-kappaB signaling in urothelial cell survival: Implications for bladder cancer. Oncotarget 8, 15114-15125 (2017)）。
【００８３】
ＫＤＭ１Ｂ（ＬＳＤ２としても知られている）は、ヒストンＨ３Ｋ４デメチラーゼであり、ＤＮＡのメチル化および乳がん細胞の増殖を調節することにも関与することが報告されている（Katz TA, et al. Inhibition of histone demethylase, LSD2 (KDM1B), attenuates DNA methylation and increases sensitivity to DNMT inhibitor-induced apoptosis in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 146, 99-108 (2014)；およびChen L, et al. Functional characterization of lysine-specific demethylase 2 (LSD2/KDM1B) in breast cancer progression. Oncotarget 8, 81737-81753 (2017)）。
【００８４】
［例４］ＯＳＣＣ原発組織におけるＤＬＥＵ１の発現上昇：
ＯＳＣＣにおけるＤＬＥＵ１発現の臨床的関連について、ＴＣＧＡ研究において原発ＨＮＳＣＣから得られたＲＮＡ発現データを使用して調査した。ＤＬＥＵ１の発現は、正常組織（ｎ＝７２）よりがん組織（ｎ＝５０５）の方が有意に高いことを見出した（図６Ａ）。カプラン・マイヤー曲線から、より高いレベルのＤＬＥＵ１発現は、ＨＮＳＣＣ患者全体の生存率が不良であることと関連することが明らかになった（図６Ｂ）。日本人患者から得られたＯＳＣＣ原発組織の２９サンプル、および隣接する正常組織の１７サンプルにおいて、ＤＬＥＵ１発現が、がん組織において有意に上昇したことが観察された（図６Ｃ）。その上、ＯＳＣＣ組織を、同じ患者からの隣接する正常組織の１７対において比較したところ、ＤＬＥＵ１の発現が、１２種の腫瘍（７１％）において、それらの正常組織より高かった（図６Ｄ）。最後に、ＤＬＥＵ１の発現レベルを、ＴＣＧＡデータセットにおける原発ＨＮＳＣＣの推定される標的遺伝子の発現レベルと比較することによって、ＤＬＥＵ１発現が、ＨＡＳ３、ＣＤ４４、ＴＰ６３、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＳＭＹＤ２、ＫＤＭ１Ｂ、およびＧＡＬＮＴ３の発現と正の相関があることが明らかとなった。このことは、これらの遺伝子の発現が、原発腫瘍においてＤＬＥＵ１によって調節され得ることを示唆する（図６Ｅ）。
【図１Ａ−Ｂ】
2020007260.tif 000006
【図１Ｃ】
2020007260.tif 000007
【図２Ａ−Ｂ】
2020007260.tif 000008
【図２Ｃ】
2020007260.tif 000009
【図３Ａ−Ｃ】
2020007260.tif 000010
【図３Ｄ−Ｅ】
2020007260.tif 000011
【図３Ｆ】
2020007260.tif 000012
【図３Ｇ】
2020007260.tif 000013
【図３Ｈ】
2020007260.tif 000014
【図４】
2020007260.tif 000015
【図５】
2020007260.tif 000016
【図６Ａ−Ｄ】
2020007260.tif 000017
【図６Ｅ】
2020007260.tif 000018
【配列表】
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