(57)【要約】【課題】  細胞表面に存在するリン脂質の比率に基づき、異なる組織由来の細胞を識別する方法を提供すること。【解決手段】  細胞表面に存在する、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）から選ばれる少なくともいずれか一つ以上のリン脂質の量を測定し、当該測定により得られるリン脂質の比率に基づき、腫瘍細胞と当該腫瘍細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞とを識別する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面に存在するリン脂質に占める特定のリン脂質の比率に基づき細胞を識別する方法であって、
前記特定のリン脂質が、少なくともスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）、及びホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）から選ばれるいずれか一つ以上であり、
前記細胞の識別が腫瘍細胞と腫瘍細胞以外の細胞との識別であり、
かつ前記腫瘍細胞の由来組織と前記腫瘍細胞以外の細胞の由来組織とが異なる、前記方法。
【請求項２】
細胞の識別が、血液以外の組織由来の腫瘍細胞と血液由来の腫瘍細胞以外の細胞との識別である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン脂質の比率が、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値、および／またはホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象細胞表面に存在するリン脂質の比率が、当該対象細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞表面に存在するリン脂質の比率に対し、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値が増加、および／またはホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値が減少した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別する方法。
【請求項５】
対象細胞表面に存在するリン脂質の比率が、以下の（１）から（６）に示す、いずれか一つ以上に該当した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別する方法：
（１）スフィンゴミエリンの存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る、
（２）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る、
（３）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値があらかじめ設定した基準値を上回る、
（４）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る、
（５）ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る、
（６）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値があらかじめ設定した基準値より下回る。
【請求項６】
細胞表面に存在するリン脂質の測定を質量分析計を用いて行う、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面に存在するリン脂質の比率に基づき、細胞を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、これら分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
ＣＴＣは通常、ＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）などの核標識試薬で標識され、サイトケラチン（ＣＫ）やｐ６３など上皮系細胞に特異的に発現するタンパク質（マーカー）に対する標識抗体で標識され、かつＣＤ４５など白血球に特異的に発現するタンパク質（マーカー）に対する標識抗体では標識されない細胞をＣＴＣとして判定している。しかしながら、ＣＴＣの中には前記上皮系細胞に特異的に発現するタンパク質に対する標識抗体では標識されないＣＴＣもある（特許文献１）ことから、前記標識抗体を使用する方法ではＣＴＣを高精度に検出できない場合がある。
【０００４】
前記標識抗体を使用しない腫瘍細胞の解析方法として、質量分析を用いて細胞表面に存在するリン脂質を測定し数種類の乳がん細胞株および乳腺上皮細胞を識別する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、細胞表面に存在するリン脂質から、上皮細胞（ＣＴＣ）と血球細胞（白血球）といった、異なる組織由来の細胞を識別する方法はこれまで確立していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１１２９５５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｎｗｅｎ  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，５，１１２９８（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、細胞表面に存在するリン脂質の比率に基づき、異なる組織由来の細胞を識別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、細胞表面に存在する特定のリン脂質の比率を用いることで前記課題を解決し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
細胞表面に存在するリン脂質の比率に基づき細胞を識別する方法であって、
前記リン脂質が、少なくともスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）から選ばれるいずれか一つ以上であり、
前記細胞の識別が腫瘍細胞と腫瘍細胞以外の細胞との識別であり、
かつ前記腫瘍細胞の由来組織と前記腫瘍細胞以外の細胞の由来組織とが異なる、前記方法である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、細胞の識別が、血液以外の組織由来の腫瘍細胞と血液由来の腫瘍細胞以外の細胞との識別である、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、リン脂質の比率が、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値、および／またはホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値である、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１２】
さらに本発明の第四の態様は、対象細胞表面に存在するリン脂質の比率が、当該対象細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞表面に存在するリン脂質の比率に対し、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値が増加、および／またはホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値が減少した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別する方法である。
【００１３】
また本発明の第五の態様は、対象細胞表面に存在するリン脂質の比率が、以下の（１）から（６）に示す、いずれか一つ以上に該当した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別する方法である：
（１）スフィンゴミエリンの存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る、
（２）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る、
（３）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値があらかじめ設定した基準値を上回る、
（４）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る、
（５）ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る、
（６）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値があらかじめ設定した基準値より下回る。
【００１４】
また本発明の第六の態様は、細胞表面に存在するリン脂質の測定を質量分析計を用いて行う、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において、細胞表面に存在するリン脂質とは、細胞膜を構成するリン脂質を意味する。このうち、細胞の識別に用いるリン脂質は、少なくともスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）から選ばれるいずれか一つ以上である。細胞表面に存在するリン脂質は、細胞の種類によってその構成比率が異なる。本発明では、これらリン脂質を検出し、その比率を解析することで、細胞を識別する。なお、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）は、１位に炭素数１８の飽和脂肪酸（不飽和度としては０価）、２位に炭素数１８の４価の不飽和脂肪酸からなるホスファチジルコリンを、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）は、１位に炭素数１８の飽和脂肪酸、２位に炭素数２０の４価の不飽和脂肪酸からなるホスファチジルイノシトールを、ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）は、１位に炭素数１６の飽和脂肪酸、２位に炭素数１８の飽和脂肪酸からなるホスファチジルイノシトールを、それぞれ意味する。
【００１７】
対象細胞を含む試料が血液試料の場合、本発明における細胞の識別の例として、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの血液試料中に含まれる血液以外の組織由来の細胞と同試料中に含まれる血液由来の腫瘍細胞以外の細胞との識別があげられる。血液由来の腫瘍細胞以外の細胞の一例として、血液試料中に多く含まれる白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）や赤血球があげられる。中でも本発明は、血液試料中に含まれる血液以外の組織由来の腫瘍細胞と白血球との識別に適した方法である。血液試料中に含まれる腫瘍細胞を検出する場合は、通常、血液試料を塩化アンモニウムなどで溶血する前処理を行ない、血液試料中に含まれる赤血球を破砕する。従って、血液試料中に含まれる組織由来の腫瘍細胞と赤血球との識別であれば、前記前処理を行なえば十分である。
【００１８】
なお本発明において血液試料とは、識別対象である血液以外の組織由来の腫瘍細胞ならびに赤血球や白血球などの血液成分（血液由来の腫瘍細胞以外の細胞）を少なくとも含む試料であればよく、具体的には、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの血液由来成分を含み得る試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前述した試料または組織懸濁液より分離して得られる、試料または組織由来の細胞を含む画分、などがあげられる。このうち試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００１９】
本発明で識別する細胞（対象細胞）の数は一細胞が好ましいが、細胞間で一定の均質性を有していれば（例えば、対象細胞の由来組織が同一であれば）細胞集団（複数個）ごと対象細胞として取扱ってもよい。
【００２０】
細胞表面に存在するリン脂質の量を測定する方法の一例として、二次元薄層クロマトグラフィー（２Ｄ−ＴＬＣ）で分離し得られた各リン脂質類のスポット濃度に基づき測定する方法、リンに結合した物質の違いによって各リン脂質類を分類する３１Ｐ−ＮＭＲ法、ＨＰＬＣを用いて各リン脂質類を分離して測定する方法、質量分析計を用いて細胞表面に存在するリン脂質類を直接測定する方法があげられる。中でも、質量分析計を用いた方法は、細胞を破砕してリン脂質を分離する必要がなく、前処理操作が容易、かつ形態学的情報が失われない点で好ましい。
【００２１】
前述した方法で細胞表面に存在する、少なくともスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）、ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）から選ばれるいずれか一つ以上のリン脂質の量を測定し、当該測定値から算出されるリン脂質の比率を解析することで、細胞を識別できる。なおリン脂質の比率を算出するには、二つ以上のリン脂質の量を測定する必要がある。したがって、測定するリン脂質は、前述した四つのリン脂質の中から二つ以上、または前述した四つのリン脂質の中から一つ以上、かつ他のリン脂質から一つ以上となる。解析に用いるリン脂質の比率は、絶対値、すなわち測定した全てのリン脂質量に占める特定のリン脂質量の割合（本明細書では、存在量比または存在比率ともいう）であってもよく、相対値、すなわち測定した前記特定のリン脂質量（存在比率であってもよい、以下同じ）を、測定した他のリン脂質量で除した値であってもよいが、相対値のほうが、細胞の識別がより明確となる点で好ましい。相対値の好ましい例として、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）の量をスフィンゴミエリン量で除した値や、ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値があげられる。
【００２２】
前記好ましい態様で解析した場合、対象細胞表面に存在するリン脂質の比率が、当該対象細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞表面に存在するリン脂質の比率に対し、ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値が増加、および／またはホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値が減少した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別すればよい。
【００２３】
また、別の態様として、腫瘍細胞と当該腫瘍細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞とを、絶対評価により識別してもよい。ここでいう絶対評価とは、すなわち基準値（しきい値）を設ける方法であり、対象細胞におけるリン脂質の存在比率の絶対値または相対値が基準値を上回る、または下回る場合に、対象細胞を腫瘍細胞と識別すればよい。具体的には、以下の（１）から（６）に示す、いずれか一つ以上に該当した場合、前記対象細胞を腫瘍細胞と識別すればよい。
（１）スフィンゴミエリンの存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る
（２）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る
（３）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値があらかじめ設定した基準値を上回る
（４）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）の存在比率があらかじめ設定した基準値より下回る
（５）ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）の存在比率があらかじめ設定した基準値を上回る
（６）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値があらかじめ設定した基準値より下回る
前記基準値は、対象細胞（腫瘍細胞）と夾雑細胞（前記腫瘍細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞）の態様により適宜設定すればよい。例えば、対象細胞が血液試料中に含まれる血液以外の組織由来の腫瘍細胞であり、夾雑細胞が血液試料中に含まれる白血球（リンパ球、単球および好中球）である場合、
（１）スフィンゴミエリンの存在比率で識別する場合は、５２．０％から６５．０％の間に基準値を設ければよく、５８．０％から６０．０％の間に基準値を設けるとより好ましい。
（２）ホスファチジルコリン（１８：０／１８：４）の存在比率で識別する場合は、３６．０％から４８．０％の間に基準値を設ければよく、３９．０％から４１．０％の間に基準値を設けるとより好ましい。
（３）ホスファチジルコリン（１８：０／１０：４）量をスフィンゴミエリン量で除した値で識別する場合は、０．５６から０．９４の間に基準値を設ければよく、０．７８から０．８２の間に基準値を設けるとより好ましい。
（４）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）の存在比率で識別する場合は、８５．０％前後に基準値を設ければよい。
（５）ホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）の存在比率で識別する場合は、１５．０％前後に基準値を設ければよい。
（６）ホスファチジルイノシトール（１８：０／２０：４）量をホスファチジルイノシトール（１６：０／１８：０）量で除した値で識別する場合は、５．４前後に基準値を設ければよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、細胞表面に存在するリン脂質の比率の違いから、例えば、血液試料中に存在する血液由来の夾雑細胞（例えば、リンパ球、単球、好中球といった白血球）と血液以外の組織由来の腫瘍細胞とを識別できる。具体的には、本発明を血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出に適用することで、上皮系細胞マーカー（サイトケラチン、ｐ５３など）を用いた従来の方法では検出困難なＣＴＣであっても検出できるため、ＣＴＣ数を精度高く測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１および２の結果を示した図である。
【図２】実施例３の結果を示した図である。
【図３】腫瘍細胞と白血球とで、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例１）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例２）のときの、それぞれ結果である。
【図４】腫瘍細胞と白血球とで、ＳＭの存在比率を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例１）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例２）のときの、それぞれ結果である。
【図５】腫瘍細胞と白血球とで、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例１）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例２）のときの、それぞれ結果である。
【図６】実施例４および５の結果を示した図である。
【図７】実施例６の結果を示した図である。
【図８】腫瘍細胞と白血球とで、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例４）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例５）のときの、それぞれ結果である。
【図９】腫瘍細胞と白血球とで、ＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例４）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例５）のときの、それぞれ結果である。
【図１０】腫瘍細胞と白血球とで、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を比較した図である。（ａ）が腫瘍細胞がＰＣ９（実施例４）のときの、（ｂ）が腫瘍細胞がＰＣ１４（実施例５）のときの、それぞれ結果である。
【図１１】腫瘍細胞と白血球とで、（ａ）ＳＭの存在比率、および（ｂ）ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率を比較した図である。
【図１２】腫瘍細胞と白血球とで、（ａ）ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値、および（ｂ）ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率を比較した図である。
【図１３】腫瘍細胞と白血球とで、（ａ）ＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率、および（ｂ）ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を比較した図である。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９）を、５％ＣＯ２環境下、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離した。剥離した前記細胞を、３００ｍＭマンニトールを含む溶液に添加し、前記溶液で２×１０５個／ｍＬに調整した。
【００２８】
（２）ポリマー製スライドガラス型ＭＡＬＤＩプレート（ＦｌｅｘｉＭａｓｓ−ＤＳ、島津製作所社製）に２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＢ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むエタノール溶液１μＬを滴下し、乾燥させた。前記溶液を滴下した領域を含む近傍に、（１）で調製した前記細胞を含む懸濁液を２μＬ滴下し、乾燥させた。さらにエタノールを０．２μＬ滴下、乾燥させることでＤＨＢを再結晶化し、細胞測定試料を作製した。
【００２９】
（３）（２）で作製した細胞測定試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（島津製作所社製、ＭＡＬＤＩ−７０９０）で測定した。前記測定の条件として、測定モードはＬｉｎｅａｒ、極性はＰｏｓｉｔｉｖｅ、レーザー波長は３５５ｎｍ、レーザー強度は８０、レーザー直径は５０μｍ、測定質量範囲は５００から１０００まで、質量補正はアンジオテンシンＩＩ（外部標準）で行なった。
【００３０】
（４）（３）の測定で検出したリン脂質に由来するピークのうち、代表的な検出物である分子量７８２．７であるホスファチジルコリン（ＰＣ（１８：０／１８：４））のピーク、および分子量７２５．７であるスフィンゴミエリン（ＳＭ）のピークを抽出し、ＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率（存在量比と同じ、以下同じ）、およびＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を算出した。なお各リン脂質の存在比率は、各細胞について測定を９回行ない、得られたピーク強度から算出した存在比率の平均値とした。また、算出したＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率が外れ値であった場合は、当該外れ値を除却した数値から存在比率を算出した。
【００３１】
実施例２
実施例１において、細胞としてヒト肺がん細胞（ＰＣ１４）を用い、各リン脂質の存在比率を、各細胞について測定を１２回行ない、得られたピーク強度から算出した存在比率の平均値とした他は、実施例１（１）から（４）と同様な方法で、ＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率、およびＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を算出した。
【００３２】
実施例３
（１）インフォームドコンセントを取得した健常者血液から、下記［ａ］のキットを用いてリンパ球を、下記［ｂ］のキットを用いて単球を、下記［ｃ］のキットを用いて好中球を、それぞれ分離した。
［ａ］ＥａｓｙＳｅｐ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＳＴ−１９６５５、ベリタス社製）
［ｂ］ＥａｓｙＳｅｐ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＳＴ−１９６６９、ベリタス社製）
［ｃ］ＥａｓｙＳｅｐ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＳＴ−１９６６６、ベリタス社製）
（２）（１）で分離したリンパ球、単球および好中球を、３００ｍＭマンニトールを含む水溶液にそれぞれ添加し、前記溶液でそれぞれ２×１０５個／ｍＬに調製した。
【００３３】
（３）実施例１（２）と同様な方法で細胞測定試料を作製した。
【００３４】
（４）各リン脂質の存在比率を、各細胞について測定を１２回行ない、得られたピーク強度から算出した存在比率の平均値とした他は、実施例１（３）から（４）と同様な方法で、ＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率、およびＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を算出した。
【００３５】
実施例１で得られた質量スペクトルを図１（ａ）、実施例２で得られた質量スペクトルを図１（ｂ）、実施例３で得られた質量スペクトルを図２に、それぞれ示す。図１および２では、細胞膜に存在するホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に由来するピークが検出されている。
【００３６】
実施例１から３で算出した、各細胞におけるＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率［％］、およびＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を表１から５に示す。表１はＰＣ９（実施例１）の結果であり、表２はＰＣ１４（実施例２）の結果であり、表３はリンパ球（実施例３）の結果であり、表４は単球（実施例３）の結果であり、表５は好中球（実施例３）の結果である。なお本実施例において存在比率は、ＰＣまたはＳＭの分子量（ｍ／ｚ値）から２大きい値までの範囲で最も高い強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示したピークより算出した値である。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
【表２】
2020190424.tif 000003
【００３９】
【表３】
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【００４０】
【表４】
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【００４１】
【表５】
2020190424.tif 000006
【００４２】
ＰＣ（１８：０／１８：４）とＳＭとの存在比率（平均値）は、ＰＣ９（実施例１）で６６．０％と３４．０％（表１）であり、ＰＣ１４（実施例２）で７４．４％と２５．６％（表２）であり、リンパ球（実施例３）で１７．８％と８２．２％（表３）であり、単球（実施例３）で１５．７％と８４．３％（表４）であり、好中球（実施例３）で２４．８％と７５．２％（表５）であった。またＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値（平均値）は、ＰＣ９（実施例１）で２．３８（表１）であり、ＰＣ１４（実施例２）で３．６２（表２）であり、リンパ球（実施例３）で０．２２２（表３）であり、単球（実施例３）で０．１９２（表４）であり、好中球（実施例３）で０．３４１（表５）であった。
【００４３】
腫瘍細胞（ＰＣ９［実施例１］またはＰＣ１４［実施例２］）と白血球（リンパ球、単球および好中球［実施例３］）とで、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率を比較した結果を図３に、ＳＭの存在比率を比較した結果を図４に、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を比較した結果を図５に、それぞれ示す。図３からＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率は、ＰＣ９（実施例１）、ＰＣ１４（実施例２）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例３）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）高いことがわかる。図４からＳＭの存在比率は、ＰＣ９（実施例１）、ＰＣ１４（実施例２）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例３）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）低いことがわかる。図５からＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値は、ＰＣ９（実施例１）、ＰＣ１４（実施例２）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例３）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）高いことがわかる。
【００４４】
以上の結果から、
対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）における、ＰＣ（１８：０／１８：４）およびＳＭのピーク強度（量に相当）から算出される、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球および好中球）における前記値よりも増加しているか、
同様に前記存在量から算出される、対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）におけるＳＭの存在比率が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球および好中球）における前記値よりも減少しているか、
対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）における、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率（量）をＳＭの存在比率（量）で除した値が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球および好中球）における前記値よりも増加していると、
前記対象細胞を腫瘍細胞として識別できることがわかる。
【００４５】
実施例４
（１）実施例１において、マトリックス溶液として９−Ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ（９−ＡＡ）を含む水溶液を用いた他は、実施例１（１）から（２）と同様な方法で、細胞測定試料を作製した。
【００４６】
（２）（１）で作製した細胞測定試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（島津製作所社製、ＭＡＬＤＩ−７０９０）で測定した。前記測定の条件として、測定モードはＬｉｎｅａｒ、極性はＮｅｇａｔｉｖｅ、レーザー波長は３５５ｎｍ、レーザー強度は９０、レーザー直径は１００μｍ、測定質量範囲は５００から１０００まで、質量補正はアンジオテンシンＩＩ（外部標準）で行なった。
【００４７】
（３）（２）の測定で検出したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に由来するピークのうち、代表的な検出物である分子量８８５．５であるＰＩ（１８：０／２０：４）のピーク、および分子量８３５．５であるＰＩ（１６：０／１８：０）のピークを抽出し、ＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率、およびＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を算出した。なお各リン脂質の存在比率は、各細胞について測定を１２回行ない、得られたピーク強度から算出した存在比率の平均値とした。また、算出したＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率が外れ値であった場合は、当該外れ値を除却した数値から存在比率を算出した。
【００４８】
実施例５
（１）実施例４において、細胞としてヒト肺がん細胞（ＰＣ１４）を用いた他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で、ＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率、およびＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を算出した。
【００４９】
実施例６
（１）実施例３において、マトリックス溶液として９−ＡＡを含む水溶液を用いた他は、実施例３（１）から（３）と同様な方法で、細胞測定試料を作製した。
【００５０】
（２）実施例４（２）から（３）と同様な方法で、ＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率、およびＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を算出した。
【００５１】
実施例４で得られた質量スペクトルを図６（ａ）、実施例５で得られた質量スペクトルを図６（ｂ）、実施例６で得られた質量スペクトルを図７に、それぞれ示す。図３および４では、細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に由来するピークが検出されている。
【００５２】
実施例４から６で算出した、ＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率［％］、およびＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を表６から１０に示す。表６はＰＣ９（実施例４）の結果であり、表７はＰＣ１４（実施例５）の結果であり、表８はリンパ球（実施例６）の結果であり、表９は単球（実施例６）の結果であり、表１０は好中球（実施例６）の結果である。なお本実施例において存在比率は、各ＰＩの分子量（ｍ／ｚ値）から２大きい値までの範囲で最も高い強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示したピークより算出した値である。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【００５６】
【表９】
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【００５７】
【表１０】
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【００５８】
ＰＩ（１８：０／２０：４）とＰＩ（１６：０／１８：０）との存在比率（平均値）は、ＰＣ９（実施例４）で８３．８％と１６．２％（表６）であり、ＰＣ１４（実施例５）で４９．７％と５０．３％（表７）であり、リンパ球（実施例６）で９６．９％と３．１４％（表８）であり、単球（実施例６）で９２．０％と７．９７％（表９）であり、好中球（実施例６）で９５．４％と４．６２％（表１０）であった。またＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値（平均値）は、ＰＣ９細胞（実施例４）で５．１９（表６）であり、ＰＣ１４細胞（実施例５）で０．９８７（表７）であり、リンパ球（実施例６）で７２．１（表８）であり、単球（実施例６）で１５．８（表９）であり、好中球（実施例６）で３０．６（表１０）であった。
【００５９】
腫瘍細胞（ＰＣ９［実施例４］またはＰＣ１４［実施例５］）と白血球（リンパ球、単球および好中球［実施例６］）とで、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率を比較した結果を図８に、ＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率を比較した結果を図９に、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を比較した結果を図１０に、それぞれ示す。図８からＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率は、ＰＣ９（実施例４）、ＰＣ１４（実施例５）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例６）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）低いことがわかる。図９からＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率は、ＰＣ９（実施例４）、ＰＣ１４（実施例５）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例６）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）高いことがわかる。図１０からＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値は、ＰＣ９（実施例４）、ＰＣ１４（実施例５）ともに白血球（リンパ球、単球および好中球）（実施例６）と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低いことがわかる。
【００６０】
以上の結果から、
対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）における、ＰＩ（１８：０／２０：４）およびＰＩ（１６：０／１８：０）のピーク強度（量に相当）から算出される、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球および好中球）における前記値よりも減少しているか、
同様に前記存在量から算出される、対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）におけるＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球および好中球）における前記値よりも増加しているか、
対象細胞（ＰＣ９またはＰＣ１４）における、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率（量）をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率（量）で除した値が、対象細胞（肺由来細胞）とは異なる組織（血液）由来の、腫瘍細胞以外の細胞である、白血球（リンパ球、単球、好中球）における前記値よりも減少していると、
前記対象細胞を腫瘍細胞として識別できることがわかる。
【００６１】
実施例７
実施例１から６で取得したデータ（表１から表１０）に基づき、腫瘍細胞（ＰＣ９およびＰＣ１４）と当該腫瘍細胞とは異なる組織由来の腫瘍細胞以外の細胞である白血球（リンパ球、単球および好中球）のそれぞれのｂｏｘ  ｐｌｏｔを作成した。
【００６２】
腫瘍細胞（ＰＣ９およびＰＣ１４）と白血球（リンパ球、単球および好中球）とで、ＳＭの存在比率を比較した結果を図１１（ａ）に、ＰＣ（１８：０／１８：４）の存在比率を比較した結果を図１１（ｂ）に、ＰＣ（１８：０／２０：４）の存在比率をＳＭの存在比率で除した値を比較した結果を図１２（ａ）に、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率を比較した結果を図１２（ｂ）に、ＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率を比較した結果を図１３（ａ）に、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率で除した値を比較した結果を図１３（ｂ）に、それぞれ示す。
【００６３】
ＳＭの存在比率を用いる場合は６０％前後（図１１（ａ））を、ＰＣ（１８：０／２０：４）の存在比率を用いる場合は４０％前後（図１１（ｂ））を、ＰＣ（１８：０／２０；４）の存在比率（量）をＳＭの存在比率（量）で除した値を用いる場合は０．８０前後（図１２（ａ））を、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率を用いる場合は８５．０％前後（図１２（ｂ））を、ＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率を用いる場合は１５．０％前後（図１３（ａ））を、ＰＩ（１８：０／２０：４）の存在比率（量）をＰＩ（１６：０／１８：０）の存在比率（量）で除した値を用いる場合は５．４前後を、それぞれ基準値（しきい値）に設定することで、腫瘍細胞（ＰＣ９および／またはＰＣ１４）と白血球（リンパ球、単球および好中球）とを識別できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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