(57)【要約】【課題】  非侵襲性であり、生体の深部であっても計測ができ、神経伝達の状態を計測できる計測方法および計測装置を提供する。【解決手段】  電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測方法であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る第１ステップと、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る第２ステップとを含む、計測方法。電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測装置であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る信号取得手段と、前記信号取得手段で得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る神経伝達状態取得手段とを含む、計測装置。【選択図】  図５
2020016649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測方法であって、
電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る第１ステップと、
前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る第２ステップとを含む、計測方法。
【請求項２】
前記第２ステップは、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号を画像化するステップを含む、請求項１に記載の計測方法。
【請求項３】
前記磁気共鳴法が、電子スピン共鳴法またはオーバーハウザーＭＲＩである、請求項１または２に記載の計測方法。
【請求項４】
前記電位応答性分子が、下記一般式（１）で表される分子である、請求項１から３のいずれかに記載の計測方法。
【化１】
2020016649.tif 000007
一般式（１）において、Ｒ1は、アルキル基、フェニル基、アミノ基、およびアザシクロアルキル基からなる群から選択されるいずれかを表し、
Ｒ2、Ｒ3は、それぞれ独立に、アルキル基を表し、
Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立に、アルキル基、フェニル基、およびアルキルカルボキシル基からなる群から選択されるいずれかを表す。
【請求項５】
電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測装置であって、
電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る信号取得手段と、
前記信号取得手段で得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る神経伝達状態取得手段とを含む、計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伝達の状態を計測する計測方法および神経伝達の状態を計測する計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、電気信号を受け取ると、膜電位を変化させてナトリウムチャネルやナトリウムチャネルの開閉を制御することにより、軸索の末端まで信号を伝える。軸索の末端まで電気信号が伝わると、神経伝達物質が放出され、この神経伝達物質が次の神経細胞を刺激することで、次の神経細胞が電気信号を受け取る。このように電気信号を伝えていくことで、神経伝達が行われる。
【０００３】
膜電位の変化の一例を挙げると、ヤリイカの神経軸索を用いた研究がある（例えば、非特許文献１）。図８は膜電位変化の例、図９は、神経活動に伴う電位伝搬を示す図で、ヤリイカの巨大軸索における時空間変化である。チャネル開閉等に伴う膜電位変化は、数ミリ秒の時間枠で１００ｍＶ程度であることが明らかになっている。
【０００４】
膜電位の計測方法としては、微小電極を細胞に結合させて電位を計測する方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０９−０２４０３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃｈａｎｇ著，化学・生命科学系のための物理化学，東京化学同人
【非特許文献２】ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（米），２０１４，ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．２，ｐ．１０４５−１０５２
【非特許文献３】Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，（蘭）,２０１０，ｖｏｌ．２０２，Ｎｏ．２，ｐ．２６７−２７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
神経伝達の状態を計測することで、痛みの伝達可視化や鎮痛作用の薬効評価等に応用することができる。
しかしながら、既存の電位計測法は、電極挿入による侵襲性、プローブ設置部位の計測のみなど応用制限を有する。また、プローブ設置部位の計測を行う既存の電位計測法は、生体の深部の電位は困難であるという問題がある。
本発明は、非侵襲性であり、生体の深部であっても計測ができ、神経伝達の状態を計測できる計測方法および計測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測方法であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る第１ステップと、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る第２ステップとを含む、計測方法。
＜２＞  前記第２ステップは、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号を画像化するステップを含む、前記＜１＞に記載の計測方法。
＜３＞  前記磁気共鳴法が、電子スピン共鳴法またはオーバーハウザーＭＲＩである、前記＜１＞または＜２＞に記載の計測方法。
＜４＞  前記電位応答性分子が、下記一般式（１）で表される分子である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の計測方法。
【化１】
2020016649.tif 000003
一般式（１）において、Ｒ1は、アルキル基、フェニル基、アミノ基、およびアザシクロアルキル基からなる群から選択されるいずれかを表し、Ｒ2、Ｒ3は、それぞれ独立に、アルキル基を表し、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立に、アルキル基、フェニル基、およびアルキルカルボキシル基からなる群から選択されるいずれかを表す。
＜５＞  電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測装置であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る信号取得手段と、前記信号取得手段で得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る神経伝達状態取得手段とを含む、計測装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、非侵襲性であり、生体の深部であっても計測ができ、神経伝達の状態を計測できる計測方法および計測装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の計測方法の概念図を示す。
【図２】電位変化に伴う積分形ＥＰＲスペクトル移動と画像強度の変化の模式図である。
【図３】電位変化に伴う微分型ＥＰＲスペクトルを示す図である。
【図４】平衡電位におけるＯＭＲＩ画像である。
【図５】電子応答性分子溶液の電位変動による電子スピン共鳴スペクトル強度の時間変化を示した図である。
【図６】本発明に係る計測装置１を示す図である。
【図７】本発明に係る計測装置２を示す図である。
【図８】膜電位変化の例を示す図である。
【図９】軸索における時空間変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。
【００１３】
本発明の計測方法は、電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測方法であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る第１ステップと、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る第２ステップとを含む計測方法である。
【００１４】
本発明の計測方法の特徴は以下である。
（１）磁気共鳴手法によること。
（２）電位変化を検出する造影剤を用いること。
（３）電位変化を、スペクトル変化を利用して検出すること。
（４）電位変化の対象内伝搬を計測、または可視化する手法であること。
【００１５】
電位応答性分子を含む造影剤を用いることで、神経伝達における信号伝達のために生じる膜電位の変化に追従し、電位応答性分子の状態が変化する。このような電位応答性分子を含む造影剤を含む計測対象に対して磁気共鳴法を適用することで、膜電位の変化に応じた電位応答性分子の状態によって、異なる磁気共鳴信号が検出され、この磁気共鳴信号を神経伝達の状態として捉えることができる。
【００１６】
本発明の計測方法は、磁気共鳴法と電位応答性分子を含む造影剤を用いるもので、原理的に生体全身、生体深部の神経伝達マッピングを実現しうる手法である。したがって、その応用範囲は、痛みの伝達可視化や鎮痛作用の薬効評価のみならず、触覚や随時運動全般に関わる。期待される波及効果は非常に大きい。
【００１７】
本発明の計測方法は、第２ステップが、前記第１ステップで得られた磁気共鳴信号を画像化するステップを含むことが好ましい。神経伝達の状態を画像化することで、計測対象の空間的な神経伝達の状態が把握しやすいものとできる。
【００１８】
本発明の計測方法は、生体における末端刺激の神経伝達についてリアルタイム可視化を実現する方法とすることができる。本発明は、電子スピンを用いた磁気共鳴法により、生物個体における末端刺激の神経伝達についてリアルタイム可視化を実現する全く新しい計測法を創成する。予想される対象は痛みの伝達可視化、鎮痛作用の薬効評価である。また、発明の計測方法および計測装置は、生体深部の神経伝達活動全般を、原理的に生体まるごと計測可能であり、幅広い波及効果が期待できる。
【００１９】
本発明の計測方法は、磁気共鳴法が、電子スピン共鳴法またはオーバーハウザーＭＲＩであることが好ましい。これらの磁気共鳴法を用いることで、より正確な計測画像を得ることができる。
【００２０】
より好ましくは、電子スピン共鳴法（ＥＳＲまたはＥＰＲ）である。磁場の範囲は２０ｍＴ以下であることが好ましい。
【００２１】
磁気共鳴法は、パルス法が好ましい。パルス法は数百μ秒〜１ｍ秒程度の時間内で計測可能であり、動的な活動転移変化を計測しうる。
【００２２】
本発明の計測方法は、電位応答性分子が、下記一般式（１）で表される分子であることが好ましい。一般式（１）で表される分子は、電位変化に追従した変化がミリ秒レベルで生じやすく、本発明の計測方法に用いられる電位応答性分子として好ましい。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
一般式（１）において、Ｒ1は、アルキル基、フェニル基、アミノ基、およびアザシクロアルキル基からなる群から選択されるいずれかを表し、Ｒ2、Ｒ3は、それぞれ独立に、アルキル基を表し、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立に、アルキル基、フェニル基、およびアルキルカルボキシル基からなる群から選択されるいずれかを表す。
【００２５】
また、本発明の計測装置は、電子スピンを用いた磁気共鳴法により計測対象における神経伝達の状態を計測する計測装置であって、電位応答性分子を含む造影剤を含む前記計測対象に磁気共鳴法を適用して磁気共鳴信号を得る信号取得手段と、前記信号取得手段で得られた磁気共鳴信号から前記計測対象における神経伝達の状態を得る神経伝達状態取得手段とを含む。
また、本発明の計測装置は、生体における末端刺激の神経伝達についてリアルタイム可視化を実現する装置にできる。
本発明の計測装置は、本発明の計測方法を実施するために好適である。
【００２６】
［本発明の計測方法］
図１に、本発明の計測方法の概念図を示す。本発明の計測方法は、生体における電位応答性分子「分子電極」プローブの膜電位応答を用いて、マイクロ秒〜ミリ秒程度の時間スケールで計測・イメージング可能な磁気共鳴法（例えば、パルスＥＳＲ技術やＯＭＲＩ装置）を適用し、神経活動・伝達プロセスの計測やイメージングを実現する手法である。また、本発明の計測方法を利用して、疾患モデルにおける薬効評価、分子電極誘導体開発等を実施することができる。電位のミリ秒程度でのイメージングは感度の点で実現が極めて困難であり発明者が有する高速化技術を用いて初めて実現できるもので、本発明は他者が容易に想起・実現できるものではない。本発明の計測方法は、計測系高速化により、高速動的電位計測を実現することで神経活動イメージングに展開するものである。
【００２７】
本発明の計測方法では、電位応答性分子と磁気共鳴法を利用して、計測対象の膜電位の変化に応じた磁気共鳴信号の変化を取得することで、神経伝達の状態を計測する。
膜電位とは、細胞内外に存在する電位差であり、上述のように、神経細胞は、膜電位を変化させてナトリウムチャネルやナトリウムチャネルの開閉を制御することにより、軸索の末端まで信号を伝える。上記のように、神経活動に伴う電位伝搬では、１２０ｍＶ程度の電位変動が５ｍｓ程度のタイムフレームで生じる。本現象を生体深部で計測・可視化するためには、１ｓ以下（好ましくはｍｓオーダー）の反応速度を有する電位応答性分子、計測・可視化技術を要する。
【００２８】
（計測対象）
本発明の計測対象における計測対象は、試料あるいは生体を対象とする（マウス等に限定されない。）。具体的には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、サル、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどの生体を対象とすることができる。ヒトを除く、ウシ、ウマ、ブタ、サル、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどの生体を対象としてもよい。また、細胞や臓器などの生体以外を計測対象とすることもできる。これらの計測対象に、電子応答性分子を含む造影剤を投与または滴下して含ませた後、本発明の計測方法が行われる。例えば、計測対象が生体である場合、造影剤の投与方法（投与経路）は特に限定されないが、好ましくは、造影剤投与経路が、静脈注射、皮膚塗布、腹腔内投与、皮下投与である。
【００２９】
（造影剤）
本発明の計測対象に含まれる造影剤は、電子応答性分子を含む。電位応答性分子とは、その構造が電位変化により可逆的に変化できる分子のことである。
本発明で用いられる電子応答性分子は、「分子電極」プローブとして用いられるものであり、不対電子を有し、計測対象の膜電位の変化に追随して分子構造が変化し不対電子の電子状態が変化する分子である。
具体的には、電位応答性分子は、１ｓ以下の電位スイッチング速度を有する分子が好ましい。なお、電位スイッチング速度とは、電位変化により引き起こされる分子の構造変化の速さである。電位スイッチング速度は、磁気共鳴法などの公知の手法で計測できる。
【００３０】
神経伝達の状態をより正確に計測するためには、電位スイッチング速度はミリ秒（ｍ秒）レベル以下とすることが好ましく、５００ｍ秒以下が好ましい。電位スイッチング速度は、３００ｍ秒以下や、２００ｍ秒以下、１００ｍ秒以下、８０ｍ秒以下、５０ｍ秒以下、３０ｍ秒以下、１０ｍ秒以下、５ｍ秒以下、１ｍ秒以下などとしてもよい。また、電位スイッチング速度は、マイクロ秒（μ秒）レベルとしてもよく、５０μ秒以上、１００μ秒以上、５００μ秒以上などとすることもできる。
【００３１】
図２は、電位変化に伴う積分形ＥＰＲスペクトル移動と画像強度の変化の模式図である。例えば、陽イオンの結合前の試料Ａ（例えば、下記式（２）の構造Ａの分子）は、電位１を持つとする。陽イオンの結合後の試料Ｂ（例えば、下記式（２）の構造Ｂの分子）は電位２を持つとする。電位１を持つ試料のＥＰＲスペクトル（図２中のｓａｍｐｌｅ １のスペクトル１）は、電位変化に伴い、電位２を持つ試料のＥＰＲスペクトル（図２中のｓａｍｐｌｅ ２のスペクトル２）に変化する。このとき、スペクトルの最大吸収位置（図２中のＣｏｎｄｉｔｉｏｎ １またはＣｏｎｎｄｉｔｉｏｎ ２）の条件で計測・撮像をしていたならば、図２の表に示す強度変化を示すので、電位の画像化ができる。電位応答性を含む造影剤を用いることで、電位依存的な電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル位置の変化が得られる。
【００３２】
本発明の計測方法において、電位応答性分子の構造は特に限定されない。下記一般式（１）で表される分子は、本発明の計測方法に用いられる電位応答性分子として好ましい。下記一般式（１）で表される分子は、電位変化により構造変化し、異なる磁気共鳴挙動を示すことができる。また、電位変化に追従してミリ秒レベル変化しやすく、そのため、膜電位の変化を検出するために好適である。
【００３３】
【化３】
2020016649.tif 000005
【００３４】
一般式（１）において、Ｒ1は、アルキル基、フェニル基、アミノ基、およびアザシクロアルキル基からなる群から選択されるいずれかを表し、Ｒ2、Ｒ3は、それぞれ独立に、アルキル基を表し、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立に、アルキル基、フェニル基、およびアルキルカルボキシル基からなる群から選択されるいずれかを表す。
【００３５】
アルキル基は、直鎖であっても分岐であっても環状であってもよい。アルキル基は、炭素数１〜８や炭素数１〜５のアルキル基を挙げることができる。具体的には、メチル基やエチル基等が挙げられる。
【００３６】
フェニル基は、無置換でも置換基を有するものであってもよい。
【００３７】
アミノ基は、「−ＮＲ6Ｒ7」で表される官能基であり、Ｒ6、Ｒ7は、それぞれ独立に、炭素数１〜８や炭素数１〜５のアルキル基が挙げられる。具体的には、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルエチルアミノ基等が挙げられる。
【００３８】
アザシクロアルキル基は、シクロアルキル基の１つの炭素原子が窒素原子で置換された官能基である。アザシクロアルキル基は、４〜１０員環や５〜８員環とすることができる。アザシクロアルキル基は、窒素原子でイミダゾリン骨格の炭素原子に結合していることが好ましい。具体的には、ピロリジル基、ピペリジル基、アゼパニル基、アゾカニル基等が挙げられる。
【００３９】
アルキルカルボキシル基は、「−Ｒ8−ＣＯＯＨ」で表されるアルキル基とカルボキシル基とが結合した官能基である。Ｒ8は、炭素数１〜８や炭素数１〜５のアルキル基が挙げられる。
【００４０】
一般式（１）において、Ｒ1は、アルキル基、フェニル基、およびアザシクロアルキル基からなる群から選択されるいずれかであることが好ましく、アザシクロアルキル基がより好ましい。
一般式（１）において、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立に、アルキル基またはフェニル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。
【００４１】
一般式（１）で表される分子は、以下の式（２）に示すように、イミダゾリン環の３位の窒素原子に陽イオン（Ｘ+）が化学結合または配位結合することができる分子である。イミダゾリン環の３位の窒素原子への陽イオンの脱着により、酸素ラジカルが結合する１位の窒素原子の電子密度が変化し（式（２）中の点線）、その結果、窒素核に由来する３本の電子スピン共鳴吸収位置が変化する。この現象を利用して電位を計測することができる。
【００４２】
【化４】
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【００４３】
一般式（１）で表される分子としては、（４−アミノ−２，２，５，５−テトラエチル−２−イミダゾリン−１−イルオキシル）ラジカル、（４−（ピロリジン−１−イル）−２，２，５，５−テトラエチル−２−イミダゾリン−１−イルオキシル）ラジカル、（４−（アゼパン−１−イル）−２，２，５，５−テトラエチル−２−イミダゾリン−１−イルオキシル）ラジカルや、非特許文献２、３に挙げられる分子を用いることができる。
【００４４】
図３、図４は、本発明につながる実験結果である。
【００４５】
図３は、電位の異なる２つの試料を、それぞれの静的状態で計測した微分型ＥＰＲスペクトルを重ねたものであり、電位変化に伴う微分型ＥＰＲスペクトルである。計測は以下の条件で行った。
【００４６】
試料の調製：
一般式（１）で表される電位応答性分子として、４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−３−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌを用いた。４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−３−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌをリン酸緩衝液に最終濃度１００μＭとなるよう溶解し、塩酸溶液及び水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６あるいはｐＨ８．０に調製した。これにより、電位の異なる試料として、４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−３−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌ（上記式（２）の構造Ａに対応）と、４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌ（上記式（２）の構造Ｂに対応）の試料を得た。
・Ｘ−ｂａｎｄ測定条件：
ＪＥＯＬ  Ｘ−  ｂａｎｄ  ＥＳＲ  ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ、磁場強度３，３３０Ｇａｕｓｓ、掃引幅＋／−５ｍＴ、掃引時間１０秒、磁場変調  １００ｋＨｚ，０．０５ｍＴ、マイクロ波９．４５ＧＨｚ，１ｍＷ
・スペクトルの磁場位置：
磁場掃引モードでスペクトル取得しているため、周波数一定。
【００４７】
図３に示すように、電位変化に伴い、Ｘ−ｂａｎｄ  ＥＰＲスペクトルは、スペクトルＡからスペクトルＢへ変化している。スペクトルＡの右側の磁場位置は３，３４５ＧＨｚ、スペクトルＢの右側の磁場位置は３，３４５．７ＧＨｚである。
【００４８】
図４は、電位応答性分子の溶液のスペクトルイメージングの実験結果を示す図である。異なる電位を有する、電位応答性分子の溶液のスペクトルイメージングを行うことで、数秒程度の（静的）現象に対して、電位をイメージングした。図４に示す平衡電位におけるＯＭＲＩ画像において、各溶液の電位差は上部から反時計回りに０、９０、２５０ｍＶである。
【００４９】
図５は、電子応答性分子溶液の電位変動による電子スピン共鳴スペクトル強度の時間変化を示したものである。計測は、以下の条件で行った。
【００５０】
・試料の調製：
一般式（１）で表される電位応答性分子として、４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌを用いた。４−ａｍｉｎｏ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｙｌｏｘｙｌ・ｒａｄｉｃａｌをリン酸緩衝液に最終濃度１００μＭとなるよう溶解し、塩酸溶液及び水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６に調製した。
・Ｘ−ｂａｎｄ測定条件：
ＪＥＯＬ  Ｘ−  ｂａｎｄ  ＥＳＲ  ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ、磁場強度３，３４５Ｇａｕｓｓ  固定、磁場変調１００ｋＨｚ，０．０５ｍＴ、マイクロ波９．４５ＧＨｚ、１ｍＷ
・実験操作：
Ｘ−ｂａｎｄ用溶液セルに接続した電極より、周期約６０Ｈｚでピーク／ピーク電圧１Ｖの正弦波電圧を外部発振源（ＮＦ  ＷＦ１９７３）より入力し、溶液電位を変調させた。変調に合わせてＥＳＲ出力データをサンプリングレート約５０ｋＨｚで得た。
ΔｐＨ１は約５０ｍＶに相当する。溶液ｐＨ６において、初期位置である最大スペクトル吸収位置から１Ｖ印加すると、本分子で電位応答がプラトーに達し変化しなくなるｐＨ９程度を十分超えたところまで変調させデータ変化を計測した。
【００５１】
図５に示すように、溶液電位を変化させると、対応して信号強度が低下（最大共鳴吸収から非共鳴吸収への移動）または増加（非共鳴吸収から最大共鳴吸収への移動）が観測されることから、電位応答性分子がｍ秒レベルの電位変動に応答し、溶液の電位情報を与えることを示している。本電位応答性分子が電位の高速変動に応答するか、あるいはそれが可視化できるかなどは報告されていなかった。本発明者は、本電位性分子の応答性が高く、ｍ秒レベルで電位変化に追従しスペクトル変化していることを初めて見出した。
【００５２】
電位応答性分子を用いて、ＥＳＲの計測をｍ秒レベルで行い、さらに、連続的なＥＰＲの計測を行うことにより、ｍ秒レベルの電位変動に応答した造影剤の電位情報を得ることができる。
【００５３】
［本発明の計測装置］
本発明の計測装置は、磁気共鳴計測装置と、制御処理部と、表示部と、を備えている。磁気共鳴計測装置が、信号取得手段であり、制御処理部が、神経伝達情報取得手段である。磁気共鳴計測装置で取得した磁気共鳴信号を、制御処理部で解析することで、神経伝達情報を取得することができる。
【００５４】
磁気共鳴計測装置は、ＥＳＲ装置またはオーバーハウザーＭＲＩ装置とすることができる。ＥＳＲ装置は、ＣＷ型でもパルス型でもどちらであってもよい。計測時間の短縮ができることからパルス型であることが好ましい。ＯＭＲＩ装置としては、例えば国際公開公報ＷＯ２０１０／１１０３８４号に開示されている装置が挙げられる。つまり、「計測対象物の磁気共鳴を励起させるための磁場を発生させる磁場発生手段と、計測対象物または磁場発生手段を移動させることにより計測対象物を磁場発生手段の磁場中を移動させる移動手段と、移動手段による移動中に停止することなく、計測対象物の磁場発生手段に対する移動方向ｙおよびこの移動方向ｙに対して直交する方向ｘのいずれか一方または両方に傾斜磁場を掛けて位相エンコードおよび周波数エンコードのいずれか一方または両方により、計測対象物中の計測画像信号を得る計測手段と、計測画像信号に対し、ｙ方向の移動の影響を補正した補正画像信号を得る補正手段と、を有する装置」を用いることができる。
【００５５】
制御処理部は、磁気共鳴計測装置で取得した磁気共鳴信号に基づいたデータに対してフーリエ変換等の処理を行ったり、画像化処理を行うことで、神経伝達の状態を得る。制御処理部には、取得したデータを記憶させることもでき、解析時などに必要なデータを読み出すこともできる。
また、制御処理部は、磁気共鳴計測装置の計測条件等を制御する制御プログラム等が格納されている。制御処理部では、制御プログラムを出力し、磁気共鳴計測装置の計測条件等を制御することができる。
【００５６】
表示部は、制御処理部で処理することで得られたＥＳＲスペクトルやＮＭＲスペクトル、解析画像等を表示させることができる。
【００５７】
［計測方法１］
本発明に係る計測方法１は、パルス型のＥＳＲ装置１００と、制御処理部２００と、表示部３００とを備えた計測装置１（図６参照）を用いた計測方法の一例である。
【００５８】
パルス型のＥＳＲ装置１００は、永久磁石１０ａ、磁場掃引コイル１０ｂ、および磁場勾配コイル１０ｃを有する外部磁場発生装置１０と、ＲＦコイル（共振器）２０と、パルス発生器３０と、ＲＦパルス発生器４０と、検出部５０とを備える。
【００５９】
磁場掃引コイル１０ｂおよび検出部５０は、それぞれ制御処理部に接続されており、制御処理部２００の指令によって制御することができる。また、パルス発生器３０は、制御処理部２００、磁場勾配コイル１０ｃ、およびＲＦパルス発生器４０に接続されている。制御処理部２００からの指令によってパルス発生器３０で生成したパルスシーケンスによって、磁場勾配コイル１０ｃおよびＲＦパルス発生器４０が制御される。表示部３００は、制御処理部２００に接続されており、制御処理部２００で処理された解析データを表示できる。
【００６０】
・第１ステップ
磁場掃引コイル１０ｂを調整して、０超５０ｍＴ以下の範囲（例えば、２０ｍＴ）で所定の静磁場に設定する。計測部位やＳ／Ｎ比などを考慮して、計測に用いるパルスシーケンスを設定する。計測時間は、例えば、１ｓ以下（１００百μ秒〜１ｍ秒、１ｍ秒〜１０ｍ秒、１０〜１００ｍ秒など）に設定する。
まず、計測対象であるマウスをＲＦコイル２０の内部に配置する。この計測対象のマウスは、電位応答性分子Ａを含む造影剤が投与されている。なお、頭や尾などマウスの一部のみを計測部位とすることもできる。
次いで、所定のパルスシーケンスで生成したＲＦパルス（周波数５００〜６００ＭＨｚ程度）をＲＦコイル２０内のマウスに照射する。また、所定のパルスシーケンスに応じて磁場勾配コイル１０ｃが駆動し、所定規模の傾斜磁場を所定の回数で生成する。電子スピン共鳴によるＥＳＲ信号は検出部５０で検出される。
所定の間隔で連続的に計測を行い、経時的にＥＳＲ信号を取得する。計測間隔は、例えば、１ｓ以下（１０〜１００ｍ秒や１０〜５００ｍ秒など）に設定する。
【００６１】
・第２ステップ
制御処理部２００で、第１ステップで検出されたＥＳＲ信号は、フーリエ変換等の処理を行い、電位応答性分子Ａの最大スペクトル共鳴吸収位置を含む磁場範囲のデータを抽出し、解析する。電位応答性分子Ａの最大スペクトル共鳴吸収位置の磁場の位置は、例えば、電子応答性分子ＡのＥＳＲスペクトルを事前に計測し、制御処理部２００に保存したデータを用いることができる。
膜電位の電位変化により、電位応答性分子Ａは構造変化し、電位応答性分子Ａの最大スペクトル共鳴吸収位置の吸収強度（信号強度）が減少する。電位応答性分子Ａの吸収強度を経時的に解析することで、電位応答性分子Ａの吸収強度の低い部分を特定でき、痛みの可視化につなげることができる。電位応答性分子Ａの吸収強度の低い部分の移動方向を解析すれば、電位応答性分子Ａの吸収強度の低い部分の移動方向を神経走行方向と判断できる。また、電位応答性分子Ａの吸収強度の減少が観察される部位は、神経伝達が行われていると判断できる。
また、ＥＳＲ信号を処理して画像化してもよい。画像の経時的な変化（信号強度の低い部分の変化）より、神経伝達の状態を可視化することもできる。
【００６２】
計測方法１では、第１ステップは、計測対象における計測部位を変えながら行う（ＲＦコイル２０の場所を変えながらＥＳＲ信号のデータを取得する）こともできる。結果として神経伝達に関する有用な情報が得られる。
【００６３】
計測方法１において、第１ステップは、神経走行に従って２か所以上の点で同時計測することもできる。このように２か所以上の点で同時計測すれば、そのデータ同調性（一定遅延後に同情報が伝わる）から、結果として神経伝達に関する有用な情報が得られる。
【００６４】
計測方法１では、位置情報も取得できる。一方で、計測部位によっては、より短時間での計測時間が必要な場合もある。計測部位や計測目的に応じて、位置情報の取得よりも計測時間の短縮化を優先させる場合には、磁場勾配コイルをオフにして計測を行うことができる。
【００６５】
また、位置情報の取得よりも計測時間の短縮化を優先させる場合には、磁場勾配コイルを有さない構成のパルス型のＥＳＲ装置を有する計測装置を用いて本発明の計測方法を行ってもよい。例えば、永久磁石および磁場掃引コイルを有する外部磁場発生装置と、ＲＦコイル（共振器）と、パルス発生器と、ＲＦパルス発生器と、検出部とを備えるＥＳＲ装置と、制御処理部と、表示部とを有する計測装置を用いて計測を行うことができる。計測方法は、磁場勾配コイルによる操作を行わないこと以外は、計測方法１と同じである。
【００６６】
磁場勾配コイルをオフにしたり、磁場勾配コイルを有さない装置で計測を行う場合であっても、計測対象の計測部位を変えながら計測を行う（例えば、マウスの頭から尾にかけて数点の部位で計測を行う）ことで、電位応答性分子Ａの吸収強度の変化が観察される部位と観察されない部位を判断できる。
また、２点以上の点で同時計測すれば、そのデータ同調性（一定遅延後に同情報が伝わる）から、神経伝達が評価できる。
【００６７】
［計測方法２］
本発明に係る計測方法２は、ＯＭＲＩ（オーバーハウザーＭＲＩ）装置１０１と、制御処理部２００と、表示部３００とを備えた計測装置２（図７参照）を用いた計測方法の一例である。
【００６８】
ＯＭＲＩ装置１０１は、永久磁石１１ａ、磁場掃引コイル１１ｂ、および磁場勾配コイル１１ｃを有する第１の外部磁場発生装置１１と、永久磁石１２ａ、磁場掃引コイル１２ｂ、および磁場勾配コイル１２ｃを有する第２の外部磁場発生装置１２と、ＲＦコイル（共振器）２１と、パルス発生器３１と、ＲＦパルス発生器４１と、検出部５１と、移動手段６１とを備える。
【００６９】
磁場掃引コイル１１ｂ、磁場掃引コイル１２ｂ、および検出部５１は、それぞれ制御処理部２００に接続されており、制御処理部２００の指令によって制御することができる。
パルス発生器３１は、制御処理部２００、磁場勾配コイル１１ｃ、磁場勾配コイル１２ｃおよびＲＦパルス発生器４１に接続されている。制御処理部２００からの指令によってパルス発生器３１で生成したパルスシーケンスによって、磁場勾配コイル１１ｃ、磁場勾配コイル１２ｃ、およびＲＦパルス発生器４１が制御される。
移動手段６１は、ＲＦコイル２１、または、第１および第２の外部磁場発生装置を移動させることにより、ＲＦコイル２１が、第１および第２の外部磁場発生装置の磁場中を順に移動できる手段である。
表示部３００は、制御処理部２００に接続されており、制御処理部２００で処理された解析データを表示できる。
【００７０】
・第１ステップ
第１の外部磁場発生装置１１の磁場強度は、０超５０ｍＴ以下の範囲（例えば、２０ｍＴ）で所定の静磁場に設定する。第２の外部磁場発生装置１２の磁場強度は、０超１１Ｔ以下の範囲で第１の外部磁場発生装置１１の磁場強度よりも大きい値（例えば、１．５Ｔ）に設定する。また、計測部位やＳ／Ｎ比などを考慮して、計測に用いるパルスシーケンスを設定する。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）の計測時間が１ｓ以下（１００百μ秒〜１ｍ秒、１ｍ秒〜１０ｍ秒、１０〜１００ｍ秒など）となるように設定する。
【００７１】
まず、マウスを内部に配置したＲＦコイル２１を第１の外部磁場発生装置１１の磁場中に配置する。この計測対象のマウスは、電位応答性分子Ａを含む造影剤が投与されている。
次いで、所定のパルスシーケンスで生成したＲＦパルス（周波数５００〜６００ＭＨｚ程度）をＲＦコイル２１内のマウスに照射することで電子スピンを励起させる。
電子スピンを励起させた後、移動手段６２によって、ＲＦコイル２１を第２の外部磁場発生装置１２の磁場中に移動させる。このとき、移動は数秒以下（例えば、１〜１０ｓなど）とする。
【００７２】
ＲＦコイル２１を第２の外部磁場発生装置１２の磁場中に移動させた後、ＲＦコイル２１からＲＦパルス（周波数７００〜８００ＭＨｚ）を印加し、核磁気共鳴を生じさせる。また、所定のパルスシーケンスに応じて磁場勾配コイル１２ｃを制御することで、所定規模の傾斜磁場を所定の回数で生成する。核磁気共鳴により発せられるＮＭＲ信号は検出部５１で検出される。
ＲＦコイル２１を、移動手段６２により第１の外部磁場発生装置１１中に移動させ、同様の操作を繰り返すことで、経時的にＮＭＲ信号を取得する。
【００７３】
・第２ステップ
制御処理部２００で、第１ステップで検出されたＮＭＲ信号に対してフーリエ変換等の処理を行い、電位応答性分子Ａの最大スペクトル共鳴吸収位置を含む磁場範囲のデータを抽出し、解析する。
計測方法１と同様に、電位応答性分子Ａの吸収強度の変化を解析することで、神経伝達に関する情報を得ることができる。また、ＮＭＲ信号を処理して画像化してもよい。画像の経時的な変化より、神経伝達の状態を可視化することも可能である。
【００７４】
計測方法２は、計測方法１と同様に、第１ステップにおいて、計測部位を変えながら計測を行ってもよいし、２か所以上の点で同時に計測を行う方法としてもよい。
【００７５】
なお、本発明の計測方法は、計測方法１および計測方法２に限定されない。
例えば、本発明の計測方法の第１ステップは、図９に示す計測装置を用いて、第１の外部磁場発生装置の磁場中で電子スピンを励起させた後、ＲＦコイルを移動させずに、第１の外部磁場発生装置の磁場中でＲＦパルス（周波数７００〜８００ＭＨｚ）を印加し、核磁気共鳴を生じさせるステップとしてもよい。
【００７６】
また、パルス型のＥＳＲ装置の代わりにＣＷ型のＥＳＲ装置を有する計測装置を用いて、電位応答性分子を含む造影剤を含む計測対象の計測を行ってもよい。ＣＷ型のＥＳＲ装置を有する計測装置を用いて計測を行う場合、第１ステップは、一定のマイクロ波を照射しながら、所定の範囲にわたり磁場を掃引することで計測を行うステップとできる。
【００７７】
また、本発明の計測方法の第１ステップは、ＣＷ型のＥＳＲ装置を有する計測装置を用いて、計測対象が含む電位応答性分子の最大スペクトル共鳴吸収位置の磁場の位置を含む２〜５点に磁場を固定し、マイクロ波の照射とＥＳＲ信号の取得を、所定の計測間隔（例えば、１秒以下または１０〜１００ｍ秒）で行うステップとしてもよい。
【００７８】
また、本発明の計測装置は、計測装置１および計測装置２に限定されない。計測対象や本発明の計測方法等に応じて、本発明の計測装置は適宜選択できる。例えば、磁場勾配コイルを有さない装置を用いてもよい。また、磁場発生源が電磁石である装置を用いてもよい。例えば、ＥＳＲ装置１００の永久磁石１０ａに代えて電磁石が用いたり、ＯＭＲＩ装置１０１の永久磁石１１ａ、１２ａに代えて電磁石が用いたりすることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の計測方法および計測装置は、生体深部の神経伝達活動全般を、原理的に生体まるごと計測可能であり、幅広い波及効果が期待できる。
【符号の説明】
【００８０】
１，２  本発明に係る計測装置
１０  外部磁場発生装置
１１  第１の外部磁場発生装置
１２  第２の外部磁場発生装置
１０ａ，１１ａ，１２ａ  永久磁石
１０ｂ，１１ｂ，１２ｂ  磁場掃引コイル
１０ｃ，１１ｃ，１２ｃ  磁場勾配コイル
２０，２１  ＲＦコイル
３０，３１  パルス発生器
４０，４１  ＲＦパルス発生器
５０，５１  検出部
６１  移動手段
１００  ＥＳＲ装置
１０１  ＯＭＲＩ装置
２００  制御処理部
３００  表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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