(57)【要約】【課題】スクアレンを含有するアジュバント組成物であって、広範囲の粒子径で安定なエマルションとすることができ、しかも必要に応じて安定な凍結乾燥製剤とすることができ、さらに、成分の酸化や分解が抑制された組成物を提供する。【解決手段】スクアレン、界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソール、並びにクエン酸緩衝剤を含むアジュバント組成物。この組成物は、水中油型エマルションであるか、又は凍結乾燥された組成物であり得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクアレン、界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソール、並びにクエン酸緩衝剤を含むアジュバント組成物。
【請求項２】
水中油型エマルションであるか、又は凍結乾燥されたものである、請求項1に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
界面活性剤が、脂肪酸エステルである請求項１又は２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートである請求項３に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
スクアレン１重量部に対して、総量で０．００１〜３０重量部の界面活性剤、総量で０．００００３〜０．０５重量部のジブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソール、並びに０．００５〜２０重量部のクエン酸緩衝剤を含む、請求項１〜４の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
水中油型エマルションであり、エマルションの全量に対して、スクアレンを０．０１〜５０重量％含む、請求項１〜５の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
凍結乾燥製剤であり、凍結乾燥製剤の全量に対して、スクアレンを１〜５０重量％含む、請求項１〜５の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
さらに賦形剤を含有する、請求項１〜７の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
その他の免疫賦活薬剤、又は免疫低下が一因となる疾患ないしは免疫賦活により予防、改善、又は治療できる疾患の予防、改善、又は治療剤と同時に、組み合わせて、又は混合して使用される請求項１〜８の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
さらに、ワクチン抗原を含有する請求項１〜８の何れかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
ワクチン抗原がＢＣＧワクチン抗原である請求項１０に記載のアジュバント組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクアレンを含有するアジュバント組成物、特に水中油型エマルションの形態又は凍結乾燥された形態のアジュバント組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザワクチンなどのワクチン製剤は、細菌やウイルスなどの感染症を予防するのに非常に有効であり、多くのワクチン製剤が作製されてきた。例えば、アジュバントを含んだ高齢者用のインフルエンザの不活化ワクチンであるＦｌａｕｄ（商品名）については、１９９７年にイタリアで最初に推奨され、２０１５年までに、カナダ及び欧州の１５か国を含む３８か国で推奨され使用されている。
【０００３】
このインフルエンザワクチンの基剤として使用されているのが、ノバルティス社のＭＦ５９（商品名）である。その組成は、５ｖ／ｖ％のスクアレン、０．５ｗ／ｖ％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５ｗ／ｖ％のソルビタントリオレアート（商品名：Ｓｐａｎ８５）が、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸緩衝液に含有されるものである。さらに、このＭＦ５９が、アジュバント効果をもたらすとされており、そのメカニズムも解明されつつある（非特許文献１）。また、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、α―トコフェロール、リン酸緩衝剤、及びチメロサールを含むグラクソスミソクライン社のＡＳ０３（商品名）も、アジュバントとして臨床で用いられている（非特許文献２）。
これらのスクアレン含有アジュバントは水中油型のエマルションの形態を取っている。
【０００４】
アジュバントは多様な作用メカニズムによりワクチン抗原に対する免疫応答を増強する。アジュバントの作用としては、ワクチン抗原の組織滞留性やリンパ組織への移行を改善したり、抗原提示細胞によるワクチン抗原の取り込みなどを改善することでワクチン抗原に対する免疫応答を増強する作用や、それ自体が自然免疫反応を惹起する免疫賦活作用が知られている。
【０００５】
エマルションタイプのアジュバントの作用メカニズムは解明途上であるが、例えば、異物認識機構を利用してマクロファージを刺激しサイトカイン放出を活性化する作用や、ワクチン投与箇所に好中球などの免疫細胞をリクルートする作用があり、これらに適した粒子サイズとして０．２μｍ以下が選択されたことが報告されている（非特許文献３）。
また、エマルションタイプのアジュバントは、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞に貪食され、多様な免疫反応を惹起する。抗原提示細胞に貪食され易い粒子径は、１〜３μｍ程度であることが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。
また、アジュバントがリンパ節に移行して全身に運ばれるのに適した粒子径や、ワクチン抗原の組織滞留性やリンパ組織への移行を改善したり、抗原提示細胞によるワクチン抗原の取り込みなどを改善するのに適した粒子径は、それら各作用メカニズムに対応するために、０．０５〜３μｍ程度である（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
このように、作用メカニズムにより乳化粒子の最適な粒子径が異なることから、目的に応じた作用を有するものとするために、エマルションタイプのアジュバントは、粒子径を０．０５〜３μｍ程度に変化させても安定なエマルションを維持できる組成とすることが望まれる。
しかし、従来のスクアレン含有アジュバントのエマルションの粒子径は０．１〜０．２μｍに限定されているため、使用目的に応じた作用メカニズムを得ることができない場合もある。また、それ自体の免疫賦活作用が十分ではなく、従って、ワクチン抗原に対する免疫応答の増強作用が十分に発揮できない。
【０００７】
また、ワクチンやアジュバントは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、膀胱内、腟内、直腸内、胸腔内、腹腔内、及び経肺投与（吸入）などの多くの投与形態のものがある。エマルションタイプのアジュバントは、投与形態により最適な粒子径が異なると考えられる。従って、目的に応じた投与経路を自由に選択できるアジュバントとするためにも、広範囲の粒子径で安定なエマルションとすることができるアジュバントが求められている。
【０００８】
さらに、従来のスクアレン含有アジュバントに含まれるスクアレンと、界面活性剤のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート及びソルビタントリオレアートは、不飽和結合を有するため酸化され易いこと、極端なｐＨ下ではポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート及びソルビタントリオレアートの加水分解が生じることが知られている（非特許文献１、非特許文献８）。特に、スクアレン酸化物の一つであるスクアレンモノヒドロペルオキシドは、培養細胞に中程度の細胞毒性を示すことが知られている（非特許文献９）。
このため、ＭＦ５９やＡＳ０３のようなスクアレンを含有するエマルション製剤は、スクアレンの酸化物に由来すると考えられる成分の潜在的毒性により、その使用が制限されている（特許文献１ 段落００２０）。
【０００９】
従って、アジュバント効果のあるスクアレンエマルション製剤を活用し、医薬品として汎用するためには、スクアレンの酸化が抑制されたエマルション製剤を作製する必要がある。
しかし、現状では、抗原の有効性を探索する試みが多く、スクアレンエマルション製剤の安定性を向上させる試みは少ない。このため、化学的に安定なスクワランや流動パラフィンなどがエマルションタイプのアジュバントの油成分として汎用されており、スクアレンはアジュバント効果があるとはいえ、敬遠される傾向があった（非特許文献１）。
【００１０】
また、ＭＦ５９は凍結できないことが知られている（非特許文献１）。また、ＭＦ５９と同じ組成の非臨床アジュバントとして、インビボジェン社のＡｄｄａＶａｘ（商品名）が市販されているが、その製品説明書には、４℃で保存すれば２年間安定であるが、凍結してはならないと記載されている。また、実際に、これらのスクアレン含有アジュバントの凍結乾燥製剤は開発されていない。
しかし、医薬組成物は、長期保存や輸送のために、特に暑い地方での長期保存や輸送のためには、一般に、液状より固形状であることが望ましく、アジュバントも凍結乾燥製剤が望まれている。また、より安定な液剤のアジュバントが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表2013-501756号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】C.B.Fox, Moleculles 2009, 14, 3286-3312, Rossella Cioncada et al., PLOS ONE, 0185843 October 31, 2017
【非特許文献２】Frontiers in Immunology, 2017, vol.8, pp1-17, Amanda L. Wilkins et. al.
【非特許文献３】Pharm Biotechnol. 1995;6:277-96.MF59. Design and evaluation of a safe and potent adjuvant for human vaccines.Ott G1, Barchfeld GL, Chernoff D, Radhakrishnan R, van Hoogevest P, Van Nest G.
【非特許文献４】Role of Particle Size in Phagocytosis of Polymeric Microspheres Julie A. Champion、Pharm Res. Author manuscript; available in PMC 2009 December 15.
【非特許文献５】Macrophages Recognize Size and Shape of Their Targets Nishit Doshi, Samir Mitragotri、PLOS ONE、2010、Volume 5、Issue 4 e10051
【非特許文献６】Intracellular trafficking of particles inside endosomal vesicles is regulated by particle size. J Control Release, 2017 Jun 13;260:183-193.
【非特許文献７】科研費成果報告書三里一貴「多機能型蛋白性ナノ粒子の最適設計による新規感染症ワクチンの開発」
【非特許文献８】The Subunit and Adjuvant Approach;Plenum Press:1995;pp.141-228
【非特許文献９】河野善行、高橋元治、油化学Vol.44(4), 248-255(1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、スクアレンを含有するアジュバント組成物であって、広範囲の粒子径で安定なエマルションとすることができ、しかも必要に応じて安定な凍結乾燥製剤とすることができ、さらに、成分の酸化や分解が抑制された組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
（１）  スクアレン、界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン（以下「ＢＨＴ」ということもある）及び／又はブチルヒドロキシアニソール（以下「ＢＨＡ」ということもある）、並びにクエン酸緩衝剤を含む水中油型エマルションであるアジュバント組成物は、０．０５〜３μｍという広範囲の粒径の乳化粒子を含むエマルションとすることができ、このエマルションは、高温（例えば、４０℃〜９０℃）下でも、乳化粒子の性状や成分が変化せず、非常に安定である。
（２）  スクアレンと界面活性剤を含むエマルションは、抗酸化剤を配合しない場合、スクアレンの酸化と、界面活性剤の加水分解及び遊離する脂肪酸の酸化が著しく進行するが、本発明のアジュバント組成物のエマルションは、抗酸化剤の中でも特にＢＨＴ及び／又はＢＨＡを含むことにより、また、クエン酸緩衝剤との相乗作用により、このような酸化及び分解が効果的に抑制されている。
（３）  スクアレン、界面活性剤、ＢＨＴ及び／又はＢＨＡ、並びにクエン酸緩衝剤を含む水中油型エマルションであるアジュバント組成物は、凍結乾燥製剤とした場合の安定性が高く、高温（例えば、４０℃〜６０℃）下で保存した後、再溶解しても、目的のエマルションを再現することができる。
（４）  スクアレンを含有する従来の水中油型エマルションタイプのアジュバントは、ワクチンへの免疫応答の増強作用と免疫賦活作用を有することが知られている。スクアレン、界面活性剤、ＢＨＴ及び／又はＢＨＡ、並びにクエン酸緩衝剤を含むアジュバント組成物も、ワクチンに対する免疫応答を著しく増強すると共に、それ自体、強い免疫賦活作用を有する。
【００１５】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記のアジュバント組成物を提供する。
項１．  スクアレン、界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソール、並びにクエン酸緩衝剤を含むアジュバント組成物。
項２．  水中油型エマルションであるか、又は凍結乾燥されたものである、項1に記載のアジュバント組成物。
項３．  界面活性剤が、脂肪酸エステルである項１又は２に記載のアジュバント組成物。
項４．  脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートである項３に記載のアジュバント組成物。
項５．  スクアレン１重量部に対して、総量で０．００１〜３０重量部の界面活性剤、総量で０．００００３〜０．０５重量部のジブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソール、並びに０．００５〜２０重量部のクエン酸緩衝剤を含む、項１〜４のいずれかに記載のアジュバント組成物。
項６．  水中油型エマルションであり、エマルションの全量に対して、スクアレンを０．０１〜５０重量％含む、項１〜５のいずれかに記載のアジュバント組成物。
項７．  凍結乾燥製剤であり、凍結乾燥製剤の全量に対して、スクアレンを１〜５０重量％含む、項１〜５の何れかに記載のアジュバント組成物。
項８．  さらに賦形剤を含有する、項１〜７の何れかに記載のアジュバント組成物。
項９．  その他の免疫賦活薬剤、又は免疫低下が一因となる疾患ないしは免疫賦活により予防、改善、又は治療できる疾患の予防、改善、又は治療剤と同時に、組み合わせて、又は混合して使用される項１〜８の何れかに記載のアジュバント組成物。
項１０．  さらに、ワクチン抗原を含有する項１〜８の何れかに記載のアジュバント組成物。
項１１．  ワクチン抗原がＢＣＧワクチン抗原である項１０に記載のアジュバント組成物。
【発明の効果】
【００１６】
アジュバントは多様な作用メカニズムにより免疫を賦活する。前述した通り、作用メカニズムの詳細は解明途上であるが、エマルションタイプのアジュバントは、例えば、異物認識機構を利用してマクロファージを刺激しサイトカイン放出を活性化したり、ワクチン投与箇所に好中球などの免疫細胞をリクルートするが、これらに適した粒子サイズとして０．２μｍ以下が選択されたことが報告されている。また、エマルションタイプのアジュバントは、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞に貪食されて、多様な免疫反応を惹起するが、抗原提示細胞に貪食され易い粒子径は、１〜３μｍ程度であることが報告されている。
また、アジュバントがリンパ節に移行して全身に運ばれるのに適した粒子径や、ワクチン抗原の組織滞留性やリンパ組織への移行を改善したり、抗原提示細胞によるワクチン抗原の取り込みなどを改善するのに適した粒子径は、それら各作用メカニズムに対応するために、０．０５〜３μｍ程度である。
【００１７】
従来のスクアレン含有エマルションアジュバントは、乳化粒子の粒径が０．１〜０．２μｍ程度に限定されているため、作用メカニズムが限定されている。従って、免疫賦活作用やワクチン抗原に対する免疫応答の増強作用が十分に得られない場合がある。
これに対して、本発明のアジュバント組成物は、乳化粒子の粒子径を、例えば０．０５〜３μｍ程度に変化させても安定なエマルションを調製することができる。また、これらの粒径の乳化粒子を含むエマルションは、例えば４０〜９０℃という高温下で保存した後も、乳化粒子の粒径及び粒度分布が変化せず、非常に安定なものである。従って、本発明のアジュバント組成物は、免疫を賦活する作用メカニズムを目的に応じて多様に変化又は調整することができる。また、粒径が異なる複数種の乳化粒子を含むエマルションとすれば、多様な作用メカニズムで免疫を賦活できるものとなる。即ち、本発明により、目的に応じたエマルションデザインが可能となり、幅広い用途が可能となった。
【００１８】
また、前述した通り、ワクチンやアジュバント混合ワクチンとして、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、膀胱内、腟内、直腸内、胸腔内、腹腔内、及び経肺投与（吸入）など多様な経路で投与されるものが開発されている。従って、アジュバントも、多様な経路で投与できるものとすることが求められている。アジュバントの最適な投与経路は、目的及び成分組成によって定まるが、エマルションタイプのアジュバントでは、乳化粒子の粒径によっても異なる。従って、ニーズに応じた経路で投与できるアジュバントとするためには、幅広い粒子径で安定なエマルションであることが必要である。
この点、本発明のアジュバント組成物は、０．０５〜３μｍという広範囲の粒子径で安定なエマルションとすることができるため、多様な投与経路に対応したアジュバント組成物とすることができる。また、これにより多様なワクチンの基剤としたり、多様なワクチンと組み合わせて投与できるものとなる。
【００１９】
本発明者の検討によれば、スクアレン含有エマルションは、抗酸化剤を含まない場合、スクアレンの酸化、及び界面活性剤の加水分解と遊離する脂肪酸の酸化が著しく進行する。界面活性剤の加水分解は、エマルションを崩壊させることになり、また、遊離脂肪酸によりｐＨが低下して、使用時（再溶解時）に適したｐＨを維持できなくなる。また、スクアレンの酸化や界面活性剤由来脂肪酸の酸化により生成する過酸化物は、ワクチン抗原を酸化するため、免疫応答誘導作用を低減する。また、前述した通り、スクアレンの酸化生成物であるスクアレンモノヒドロペルオキシドは培養細胞に中程度の細胞毒性を有することが知られており、その生成は極力抑えるべきである。
【００２０】
この点、本発明のアジュバント組成物は、スクアレンの酸化、及び界面活性剤の加水分解と遊離する脂肪酸の酸化が効果的に抑えられている。また、この効果は、組成物を例えば６０℃という高温で保存した場合にも得られる。従って、本発明のアジュバント組成物のエマルションは安定であり、また、例えばワクチンと混合した場合にワクチンの酸化が抑えられているため少量のワクチンでも十分な免疫誘導作用が維持され、また、ｐＨが変動しないため予定した目標（規格内）のｐＨで使用することができる。また、凍結乾燥し再溶解した後も予定したｐＨで使用することができる。
【００２１】
また、本発明のアジュバント組成物のエマルションは、緩衝剤の中でも特にクエン酸緩衝剤を含むことにより、界面活性剤の分解により生じた脂肪酸によるｐＨの低下が効果的に抑制されている。また、この効果は、例えば４０〜６０℃という高温で組成物を保存した場合にも得られる。このように、本発明のアジュバント組成物は、ＢＨＴ及び／又はＢＨＡとクエン酸緩衝剤との相乗作用により、界面活性剤の分解が効果的に抑制されている。
【００２２】
また、スクアレンを油剤とする水中油型のエマルションはアジュバント効果が高いが、従来、凍結乾燥製剤がなかった。また、従来のスクアレン含有エマルションアジュバントは、凍結してはならないことが知られていた。
本発明のアジュバント組成物は、前述した通り、エマルションの状態で非常に安定であるが、凍結乾燥した後も非常に安定であり、凍結乾燥品を４０〜６０℃という高温下で保存した後も、再溶解により、粒径０．０５〜３μｍ程度の目的とするエマルションを調製することができる。従って、本発明のアジュバント組成物は、必要に応じて凍結乾燥製剤にすることもできる。
【００２３】
また、従来のスクアレン含有エマルションタイプのアジュバントは、ワクチンへの免疫応答の増強作用と免疫賦活作用を有することが公知であり、本発明のアジュバント組成物も、ワクチンに対する免疫応答を著しく増強すると共に、それ自体、強い免疫賦活作用を有する。
例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、メス）にＯＶＡ発現Ｅ．Ｇ７細胞株（マウスリンパ腫由来細胞株）を皮内接種し、１４日目に評価サンプルを皮内投与し、細胞移植後３週目までの腫瘍径を測定し、２１日目に剖検し腫瘍重量を秤量する評価系において、水中油型エマルション凍結乾燥製剤の再溶解液（メディアン径２．０μｍ）をマウスに投与した場合、移植腫瘍の生着及び増殖を抑制する。また、メディアン径２．０μｍのエマルションとＢＣＧワクチンとの混合液をマウスに皮内投与した場合、ワクチン単独投与の場合よりＰＰＤ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ；結核菌培養ろ液精製抗原）刺激時の脾臓細胞からのサイトカイン（ＩＦＮ―γ）の産生量を有意差をもって増大させた。
【００２４】
本発明により、粒径０．０５〜３μｍ程度に変化させ得る、実用可能なスクアレン含有エマルションタイプのアジュバント組成物であって、凍結乾燥にも耐える組成物が、初めて提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明エマルションとその凍結乾燥製剤再溶解液の粒度分布を示す図である。実施例１−１のエマルション(エマルション１−１ａ[マンニトールあり])、その製造に用いた乳化原液−１、及びその凍結乾燥製剤（凍乾品３−１ａ、実施例３）の再溶解液の粒度分布を示す。
【図２】高圧乳化法により製造した本発明小径粒子エマルションの粒度分布を示す図である。
【図３】ＳＰＧ膜処理による本発明エマルションの小径粒子エマルション化を示す図である。エマルション１−１ａ（実施例１−１）及び、それをＳＰＧ膜処理したエマルション２−１（実施例２）の各エマルションの粒度分布を示す。
【図４】ＰＳ８０水溶液に対するクエン酸緩衝液のｐＨ安定化効果を示す図である。クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、緩衝液なしのＰＳ８０水溶液のｐＨ経時変化の比較評価した。
【図５】本発明エマルションの安定性（９０℃、粒度分布）を示す図である。本発明エマルション（エマルション１−１ｂ、実施例１−１）、公知処方エマルション（参考エマルション２−１）、及びＢＨＴを含まない参考エマルション１−１の９０℃、２日間における粒度分布経の経時変化を示す。
【図６】本発明エマルション凍結乾燥製剤の安定性（４０℃、粒度分布）を示す図である。本発明エマルション凍結乾燥製剤（凍乾品３−１ｂ、実施例３−１）と公知処方エマルションの凍結乾燥製剤（参考凍乾品２−２ｂ、参考例２）の４０℃保存前後の再溶解液粒度分布の変化を比較した。
【図７】本発明エマルション凍結乾燥製剤の再溶解液によるＢＣＧ生菌の免疫賦活作用の増強を示す図である。ＢＣＧ生菌単独、或いはＢＣＧ生菌と本発明エマルション凍結乾燥製剤再溶解液を混合し皮内投与後４週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、雌）の脾臓細胞（５×１０＾６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）にＰＰＤ（１０μｇ／ｍｌ）刺激後、２４時間後の培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のアジュバント組成物は、スクアレン、界面活性剤、ＢＨＴ及び／又はＢＨＡ、並びにクエン酸緩衝剤を含む組成物である。この組成物は、水中油型エマルションであるか、又は凍結乾燥された組成物であり得る。
【００２７】
（１）水中油型エマルション
水中油型エマルションは、各成分を水中で混合し乳化処理することにより調製したものであってもよく、水中油型エマルションを凍結乾燥し、さらに再溶解して得た水中油型エマルションであってもよい。
本発明のアジュバント組成物は、水中油型エマルションとして生体に投与される。従って、水中油型エマルションに求められる好ましい又は適切な組成や性状は、各成分を水中で混合し乳化処理することにより調製したものと、凍結乾燥製剤の再溶解により得られたものとで同じである。
【００２８】
スクアレン
水中油型エマルション中のスクアレンの濃度は、エマルションの全量に対して、例えば０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％を挙げることができる。また、１〜３重量％も挙げられる。上記範囲であれば、適切なアジュバント効果が得られる。
【００２９】
界面活性剤
界面活性剤は、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば、制限なく使用でき、例えば、リン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。
リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、レシチン（大豆レシチン、卵黄レシチンなど）などを挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質、例えば水素添加レシチンなども使用することができる。
【００３０】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアレートのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；
ソルビタンモノラウレート（商品名：Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノパルミテート（商品名：Ｓｐａｎ４０）、ソルビタンモノステアレート（商品名：Ｓｐａｎ６０）、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノオレアート（商品名：Ｓｐａｎ８０）、ソルビタントリオレアート（商品名：Ｓｐａｎ８５）、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタンのようなソルビタン脂肪酸エステル；
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０（商品名：ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−４０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（商品名：ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（商品名：ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−６０）、及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油８０（商品名：ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−８０）のようなポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；
自己乳化型モノステアリン酸グリセリンなどのモノステアリン酸グリセリン；
ショ糖脂肪酸エステル；
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（商品名：プルロニックＦ６８）のようなポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレングリコールなどが挙げられる。
【００３１】
本発明のアジュバント組成物は、界面活性剤の加水分解とそれにより生じる脂肪酸の酸化が効果的に抑制されるため、脂肪酸エステルである非イオン性界面活性剤を好適に用いることができる。
脂肪酸エステルである非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられ、中でも、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが好ましく、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０）がより好ましく、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０）が特に好ましい。
なお、本発明のアジュバント組成物は、ソルビタン脂肪酸エステル、特にソルビタントリオレアート（商品名：Ｓｐａｎ８５）を含まないものとすることができる。
【００３２】
界面活性剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３３】
水中油型エマルション中の界面活性剤の濃度は、エマルションの全量に対して、総量で、例えば０．００５〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．０５〜３重量重量％を挙げることができる。また、０．３〜１重量％も挙げられる。上記範囲であれば、安定な乳化粒子が得られる。
また、水中油型エマルション中の界面活性剤の含有量は、スクアレン１重量部に対して、総量で、例えば０．００１〜３０重量部、好ましくは０．０１〜１０重量部、より好ましくは０．０５〜５重量部を挙げることができる。また、０．１〜１重量部も挙げられる。上記範囲であれば、安定な乳化粒子が得られる。
【００３４】
ＢＨＴ・ＢＨＡ
ＢＨＴ、ＢＨＡの中では、ＢＨＴが好ましい。
水中油型エマルション中のＢＨＴ及び／又はＢＨＡの濃度は、エマルション全量に対して、総量で、例えば０．００００５〜０．１重量％、好ましくは０．０００１〜０．０３重量％、より好ましくは０．０００３〜０．００５重量重量％を挙げることができる。また、０．０００５〜０．００３重量％も挙げられる。上記範囲であれば、成分の酸化及び加水分解が効果的に抑制され、また、多様な粒径の安定な乳化粒子を得ることができる。
また、水中油型エマルション中のＢＨＴ及び／又はＢＨＡの含有量は、スクアレン１重量部に対して、総量で、例えば０．００００３〜０．０５重量部、好ましくは０．００００５〜０．０１重量部、より好ましくは０．０００１〜０．００５重量部を挙げることができる。また、０．０００３〜０．００１重量部も挙げられる。上記範囲であれば、成分の酸化及び加水分解が効果的に抑制され、また、多様な粒径の安定な乳化粒子を得ることができる。
【００３５】
緩衝剤
水中油型エマルションは、ｐＨ５．５〜８．５、中でも６〜７．５となるように、クエン酸緩衝剤を含む。クエン酸緩衝剤は、例えば、クエン酸と、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸一カリウム、クエン酸二カリウム、クエン酸三カリウム、及び／又はこれらの水和物とを組み合わせ、さらに必要に応じて、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを添加したものであればよい。
クエン酸緩衝剤を含むことにより、界面活性剤の加水分解によるエマルションのｐＨ低下が効果的に抑制される。
【００３６】
また、水中油型エマルションは、本発明の効果を損なわない範囲で、１又は２種以上のその他の緩衝剤を含むことができる。その他の緩衝剤としては、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、アミノ酸緩衝剤などが挙げられる。
【００３７】
水中油型エマルション中の緩衝剤の濃度は、十分な緩衝能を発揮するために十分な量であれば良いが、好ましくは、総量で５〜５０ｍＭである。特に、緩衝剤としてクエン酸緩衝剤のみを含むことが好ましく、その場合はクエン酸緩衝剤の総量は好ましくは５〜５０ｍＭである。賦形剤としてアミノ酸などの緩衝作用を有する物質を用いる場合には、適宜緩衝剤の添加量を調整すればよい。
水中油型エマルション中のクエン酸緩衝剤の濃度は、エマルション全量に対して、総量で、例えば０．００５〜５重量％、好ましくは０．０１〜３重量％、より好ましくは０．０５〜１重量重量％を挙げることができる。また、０．１〜０．５重量％も挙げられる。
また、水中油型エマルション中のクエン酸緩衝剤の含有量は、スクアレン１重量部に対して、例えば０．００５〜２０重量部、好ましくは０．０１〜１０重量部、より好ましくは０．０５〜１重量部を挙げることができる。また、０．１〜０．５重量部も挙げられる。
【００３８】
賦形剤
水中油型エマルションは、賦形剤を含むことができる。賦形剤は、水中油型エマルションの浸透圧比を調整するために使用できる。また、賦形剤は、水中油型エマルションから凍結乾燥製剤を製造する場合は、凍結乾燥製剤の安定性を維持又は向上するために使用できる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、糖アルコール、アミノ酸、タンパク質、ウレア、無機塩などを挙げることができる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース等を挙げることができる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等を挙げることができる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸を好ましく挙げることができ、中でもグリシンがより好ましい。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等を好ましく挙げることができる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等を挙げることができる。
中でも、単糖類、糖アルコールが好ましく、マンニトール、スクロース、トレハロースがより好ましい。
賦形剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３９】
水中油型エマルション中の賦形剤の濃度は、例えば０．０５〜２５重量％、好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２〜８重量％を挙げることができる。また、３〜６重量％も挙げられる。賦形剤の好適な濃度は、賦形剤の種類によって異なるが、エマルションの製造スケールやその他の成分の濃度に応じて、適宜調整することができる。
水中油型エマルション中の賦形剤の濃度は、賦形剤がアミノ酸である場合、例えばグリシンでは２〜１２重量％が好ましく、７重量％が特に好ましい。賦形剤がマンニトールである場合、例えば０．０５〜２５重量％、好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２〜８重量重量％を挙げることができる。また、３〜６重量％も挙げられる。マンニトールを賦形剤として用いることにより、体液と等張程度の濃度でマンニトールを用いることができるため、一層生体に負担の少ない製剤を調製することができる。賦形剤がスクロースである場合、１〜２０重量％が好ましく、３〜１５重量％がより好ましい。賦形剤がトレハロースである場合、０．５〜６重量％が好ましく、２〜５重量％がより好ましい。
また、水中油型エマルション中の賦形剤（特に、マンニトール）の含有量は、スクアレン１重量部に対して、例えば０．１〜２５０重量部、好ましくは０．２〜１００重量部、より好ましくは０．５〜１０重量部を挙げることができる。また、１〜５重量部も挙げられる。
【００４０】
上記の賦形剤として挙げた物質は、等張化剤を兼ねることができる。また、賦形剤とは異なる物質を等張化剤として添加してもよい。等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、総量で、通常０．１〜３０重量％とすればよく、１〜１０重量％が好ましい。
【００４１】
粒径
本発明において、水中油型エマルション中の乳化粒子の粒径は、粒度分布測定装置を用いて粒度分布を評価し、粒度分布から算出したメディアン径をいう。具体的には、実施例で使用の粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）を用いて求めたメディアン径をいうが、どのような機種の粒度分布測定装置を用いても、通常、同じメディアン径が得られる。
乳化粒子の粒径は、例えば０．０５〜３μｍ、好ましくは０．１〜２μｍから選択できる。乳化粒子の粒径は、０．２μｍを超えることができ、また、０．３μｍ以上、０．４μｍ以上、０．５μｍ以上、又は１μｍ以上とすることができる。乳化粒子の粒径の上限値は、３μｍ程度であり得る。
また、水中油型エマルション中の乳化粒子は、単一ピークの粒度分布を有するものであってもよく、複数ピークの粒度分布を有するものであってもよい。即ち、水中油型エマルションは、特定の粒径の乳化粒子を含むものであってもよく、粒径が異なる複数種の乳化粒子を含むものであってもよい。
【００４２】
製造方法
水中油型エマルションは、スクアレンを界面活性剤の存在下に水中で乳化することで調製できる。ＢＨＴ及び／又はＢＨＡは、乳化前にスクアレンと混合すればよい。また、界面活性剤は、乳化前にスクアレンと混合すればよいが、乳化液をさらに界面活性剤水溶液と混合してもよい。また、乳化液にクエン酸緩衝剤を添加するか、又は乳化液とクエン酸緩衝剤を含む水溶液とを混合すればよい。その他の任意に配合できる成分、例えば、賦形剤、等張化剤などは、乳化液に添加するか、又は乳化液と賦形剤、等張化剤などを含む水溶液とを混合すればよい。
【００４３】
本発明において、「乳化」は、分離している２つの液体をエマルションにすることをいう。エマルションは、水と油のように互いに溶解しない液相の一方が他の一方に微細な液滴として分散したものであり（Ｗ．Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｂｌａｃｋｓｔｏｎｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４３）、互いに溶解しない２つ以上の液相等からエマルションを形成する過程は乳化と称される（Ｐ．Ｂｅｃｈｅｒ，  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｉｃｅ，  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６５）。
【００４４】
乳化は、ホモミキサーや高圧乳化機のような公知の乳化機を用いて行え、適宜条件を調整することで、粒子径０．０５〜３μｍのエマルションを容易に作製できる。また、例えば２〜３μｍ程度の粒径のエマルションを作製した後、さらに高圧乳化や透過膜乳化などにより、例えば０．１〜１μｍ程度に小粒径化することもできる。また、例えば２〜３μｍ程度の粒径のエマルションから製造した凍結乾燥製剤を再溶解して得られた粒径２〜３μｍ程度の乳化粒子を含むエマルションを、高圧乳化や透過膜乳化などにより、例えば０．１〜１μｍ程度に小粒径化することもできる。臨床現場などでは、例えば２〜３μｍ程度の粒径のエマルションから製造した凍結乾燥製剤を再溶解し、ＳＰＧ（Ｓｈｉｒａｓｕ  ｐｏｒｏｕｓ  ｇｌａｓｓ）膜ポンピングコネクタなどを用いた膜乳化などにより、例えば０．１〜１μｍの適切な粒子径にサイズ制御することもできる。
【００４５】
再溶解水中油型エマルション
前述した通り、凍結乾燥製剤の再溶解、再懸濁、ないしは復水により得られる水中油型エマルションも本発明に包含される。再溶解は、水、生理食塩水、界面活性剤水溶液、緩衝液などの水性溶媒を用いて行える。但し、生理食塩水や緩衝液は、本発明の効果を損なわないものを選択し、その濃度も本発明の効果を損なわない範囲とし、かつ生体に投与される場合に等張液となるように調製されることが望ましい。
【００４６】
再溶解により、０．０５〜３μｍ程度の目的とする粒径の乳化粒子を含む水中油型エマルションが得られる。
【００４７】
（２）凍結乾燥製剤
凍結乾燥製剤は、上記説明した水中油型エマルションの凍結乾燥により得られる。
凍結乾燥製剤中のスクアレンの含有量は、組成物の全量に対して、１〜５０重量％、好ましくは５〜４０重量％、より好ましくは２０〜３５重量％が挙げられる。界面活性剤、ＢＨＴ／ＢＴＡ、及びクエン酸緩衝剤の各含有量のスクアレン含有量に対する比率は、上記説明した水中油型エマルションと同じである。
【００４８】
（３）使用方法
本発明のアジュバント組成物は、それ自体、免疫賦活作用を有するため、免疫異常、特に免疫低下が一因となる疾患、ないしは免疫賦活により予防、改善、又は治療できる疾患の予防、改善、又は治療剤として使用できる。
また、このような疾患の予防、改善、又は治療剤と同時に、組み合わせて、又は混合して生体に投与することができる。また、本発明のアジュバント組成物は、免疫賦活作用を有するその他の薬剤と同時に、組み合わせて、又は混合して生体に投与することができる。本発明のアジュバント組成物は、これらの薬剤の薬効を著しく増強することができる。
免疫低下が一因となる疾患、ないしは免疫賦活により予防、改善、又は治療できる疾患として、感染症、ガン、自己免疫疾患、関節リウマチ、脊椎関節炎、血管炎症候群、アレルギー疾患（喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎など）、糖尿病(PLOS ONE, 7(8), e41756(2012))、パーキンソン病(PLOS ONE, 6(1), e16610(2011))などが挙げられる。
【００４９】
本発明のアジュバント組成物は、中でも、感染症ワクチン、ガンワクチン、若しくはこれらに含まれるワクチン抗原、又はその他の免疫賦活薬剤との混合剤や併用剤とするのに適している。
【００５０】
現在、日本の予防接種法による定期接種のワクチンとしては、麻疹風疹混合ワクチン（ＭＲ）、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、ＢＣＧワクチンなどの生ワクチン、ジフテリア百日せき破傷風混合ワクチン（改良ＤＰＴ三混ワクチン）、ジフテリア破傷風混合ワクチン（ＤＴ二混ワクチン）、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチンなどの不活化ワクチンが用いられている。また、任意接種のワクチンとしては、おたふくかぜ（流行性耳下腺炎）ワクチン、水痘ワクチン、海外渡航時の予防接種ワクチンであるコレラワクチンや黄熱ワクチンのような生ワクチン、狂犬病ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、破傷風トキソイドワクチン、成人用ジフテリアトキソイドワクチン、肺炎球菌ワクチン、ワイル病秋やみワクチンなどの不活化ワクチンが用いられている。また、ワクチン接種緊急促進事業の対象となるワクチンとして、肺炎球菌ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、ヒトパピローマウィルスワクチンなどの不活化ワクチンが用いられている。感染症ワクチンとしては、例えばこれらのワクチンが挙げられる。中でも、ＢＣＧワクチンが好ましい。
【００５１】
また、免疫賦活薬剤としては、ＢＣＧ(Bacillus Calmette-Guerin)−ＣＷＳ(Cell Wall Skeleton)などのマイコバクテリウム属細菌及びその類縁菌のＣＷＳが好ましい。ＢＣＧ−ＣＷＳは、免疫賦活作用を有し、動物モデルを用いた実験的腫瘍や、ヒトのガンの免疫療法において、抗腫瘍活性を示すことが知られている。また、ＢＣＧ−ＣＷＳを油剤中に含む水中油型エマルションは、免疫賦活作用による抗腫瘍活性が非常に高いことが知られている（A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 70, Ser. B 205-209(1994)、A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 74, Ser. B 50-56(1998)）。
ＢＣＧ-ＣＷＳは、例えば、I. Azuma et al., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 52, No.1 95-101(1974)に記載の方法で製造することができる。また、特許第5578390号に記載の方法を用いれば高純度のＢＣＧ-ＣＷＳを効率よく製造することができる。
【００５２】
ガンワクチンとしては、種々のワクチン抗原を含むものが知られており、制限なく使用できる。例えば、ＭＡＧＥファミリー、ＳＳＸファミリーなどのガン精巣抗原、Ｒａｓ、ＥＧＦＲｖＩＩＩなどの変異抗原、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、ｐ５３などの過剰発現抗原、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−ＭＡＲＴ−１などの分化抗原、ＨＰＶＥ６、ＨＰＶＥ７などのウィルス抗原、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＰなどの腫瘍血管又は間質抗原などが挙げられる。
対象となる癌の種類は限定されず、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌、乳癌、急性骨髄性白血病、舌癌、咽頭癌、卵巣癌、脳腫瘍等が挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
【００５４】
（実施例１）本発明のスクアレンエマルションの製造
（実施例１−１）メディアン径２μｍのスクアレンエマルション
（１）方法
Ａ．クエン酸希釈液−１の調製
ポリソルベート８０が６ｍｇ／ｍＬ、Ｄ（−）マンニトールが９０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸緩衝液が２０ｍＭ（ｐＨ７．０）となるように混合した。
Ｂ．クエン酸希釈液−２の調製
クエン酸希釈液−１と同様に調製した、但し、ポリソルベート８０とＤ（−）マンニトールは含有していない。
Ｃ．乳化
スクアレン（岸本特殊肝油工業製）５．４ｇ、ＢＨＴ（東京化成工業）１．５ｍｇにｎ−ヘプタン／エタノール（９：１、容積／容積）溶液約３０ｍＬを加え、攪拌した後、超音波照射により室温で分散した。その後、乾燥窒素気流下６０℃に加熱し有機溶媒を留去した。次いで、０．０２重量％ポリソルベート８０水溶液１３５ｇを添加し、ホモミキサー（ラボ・リューション、ＰＲＩＭＩＸ社）を用いて６０℃、７，０００回転、５分間予備乳化を行った。更に、８．７３ｇの１０重量％ポリソルベート８０水溶液を添加し、６０℃、１２，０００回転、５分間本乳化を行い、乳化原液―１を得た。
Ｄ．エマルション調製
上記乳化原液―１液に、等容量のクエン酸希釈液―１を添加し、本発明のスクアレンエマルションを得た。終濃度（仕込み量）は、それぞれ、スクアレンが１８ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０が６ｍｇ／ｍＬ、Ｄ（−）マンニトールが４５ｍｇ／ｍＬ、クエン酸緩衝液が１０ｍＭ（ｐＨ７．０：クエン酸３Ｎａ―２．５ｍｇ／ｍＬ、クエン酸―０．０４ｍｇ／ｍＬ）、ＢＨＴが１０ｐｐｍに調製した。
【００５５】
（２）結果
乳化原液―１、エマルションの粒度分布を粒度分布計（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）で測定した（図１ａ、１ｂ）。それぞれメディアン径１．９μｍ（乳化原液―１）、１．９μｍ（エマルション１−１ａ[マンニトールあり]）の、クエン酸希釈液−１の添加前後で同一な粒子径で単一の粒度分布かつ外観均一な水中油型エマルションが得られた（図１）（エマルション中スクアレン含量は１８ｍｇ／ｍＬ、定量；ガスクロマトグラフィー法）。
また、同様の小実験乳化機（Ｏｍｎｉ−ｍｉｘｅｒ[Ｏｍｎｉ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ]）を用いた１／３０スケール製造（乳化：２４，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、６０℃、希釈：クエン酸希釈液−２を使用）において、メディアン径２．２μｍ、単一ピークの粒度分布を示すエマルション１０ｍＬが得られた（エマルション１−１ｂ）。
【００５６】
（実施例１−２）本発明のスクアレン小径粒子エマルションの製造
（１）方法
Ａ．小径粒子化高圧処理
実施例１−１で製造した乳化原液―１を、高圧破砕機（ＢＥＲＹＵ  ＭＩＮＩ、株式会社美粒）で高圧処理（８，０００ｐｓｉ、３パス、もしくは２３，０００ｐｓｉ、２０パス）し、高圧処理乳化物−１、高圧処理乳化物―２を得た。
Ｂ．小径粒子エマルション調製
Ａで得られた高圧処理乳化物−１、２を、クエン酸希釈液―１、或いはクエン酸希釈液―２で等倍希釈し、本発明のスクアレン小径粒子エマルションを得た。
【００５７】
（２）結果
高圧処理乳化物―１からはメディアン径０．２μｍの単一ピークの粒度分布、スクアレン含量１９．７ｍｇ／ｍＬを示すエマルション（エマルション１−２ａ）、高圧処理乳化物―２からメディアン径０．１μｍの単一ピークを示すエマルション（エマルション１−２ｂ）が得られた（図２）。
Ｄ（―）マンニトールの有無でメディアン径に差は無かった。エマルション（高圧処理乳化物−からエマルション１−２ａ[マンニトールあり]）、高圧処理物―２からエマルション１−２ｂ[マンニトールあり]）。
なお、同様にして乳化条件を調節することにより、０．３〜１．０μｍなどの粒子径を有する本発明のスクアレンを含有するエマルションを製造することができる。
【００５８】
（実施例２）ＳＰＧ膜ポンピング法による本発明エマルションの小径粒子エマルション化
（１）方法
実施例１−１で得たエマルション１−１ａ（メディアン径１．９μｍ）を、孔径１．０μｍのＳＰＧ膜ポンピングコネクタ（株式会社ＳＰＧテクノ）で１０Ｐａｓｓ処理した。
（２）結果
粒度分布計（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）で測定した結果、メディアン径１．０μｍの単一ピークのエマルション粒子（エマルション２−１）を得た（図３）。
【００５９】
（実施例３）本願処方スクアレンエマルションの凍結乾燥製剤の製造
（実施例３−１）再溶解時メディアン径２μｍの本願スクアレンエマルション凍結乾燥製剤の製造
（１）方法
実施例１―１で、クエン酸希釈液―１(マンニトール含有)で希釈して得た水中油型エマルションを凍結乾燥用バイアル（Φ１８．０）に１ｍＬずつ充填し、−８０℃ディープフリーザーで凍結し、凍結乾燥機（ＧＡＭＭＡ２−１６ＬＳＣｐｌｕｓ、ＭＡＲＴＩＮ  ＣＨＲＩＳＴ社製）を用いて凍結乾燥を行い、凍結乾燥製剤を得た。
（２）結果
得られた凍結乾燥製剤を注射用水（大塚製薬）で再溶解後、凍結乾燥前と同様のメディアン径２．２μｍの単一ピークのエマルションが得られた（凍乾品３−１ａ、図１）（スクアレン含量、１８．４ｍｇ／ｍＬ、ガスクロマトグラフィー法）。また、同様にして、再溶解時にメディアン径２．４μｍとなる凍結乾燥製剤を得た（凍乾品３−１ｂ）。
【００６０】
（実施例３−２）本願処方小径粒子スクアレンエマルションの凍結乾燥製剤の製造
（実施例３−２−１）賦形剤にスクロースを用いた再溶解時メディアン径０．１μｍの凍結乾燥製剤の製造
（１）方法
実施例１−２で製造したメディアン径０．１μｍの本願処方エマルション（エマルション１−２ｂ）を用いて、実施例３−１と同様に凍結乾燥を実施した。但し、賦形剤として、９０ｍｇ／ｍＬのスクロース（和光純薬）を用いた。
（２）結果
得られた凍結乾燥製剤を注射用水で再溶解後、凍結乾燥前と同程度のメディアン径０．１μｍの単一ピークのエマルションが得られた(凍乾品３−２−１)。
【００６１】
（実施例３−２−２）賦形剤にマンニトールを用いた再溶解時メディアン径０．３μｍの凍結乾燥製剤の製造
（１）方法
実施例１−２で製造した０．１μｍの本願処方エマルション（エマルション１−２ｂ）を用いて、実施例３−１と同様にして凍結乾燥した。賦形剤は４５ｍｇ／ｍＬのＤ（−）マンニトールを用いた。
（２）結果
得られた凍結乾燥製剤を注射用水で再溶解後、凍結乾燥前と同程度のメディアン径０．３μｍの単一ピークのエマルションが得られた（凍乾品３−２−２）。
【００６２】
（参考例１）ＢＨＴを含まないエマルション１の調製
ＢＨＴを含まないスクアレンを用いた他は実施例１−１と同様にしてＯｍｎｉ−ｍｉｘｅｒを用いた条件、及びスケールで乳化し、クエン酸希釈液―２で希釈し、ＢＨＴを含まない他は実施例１−１と同様のエマルションを調製した（参考エマルション１−１）。実施例１−１と同様のメディアン径２．０μｍの単一ピークの粒度分布のエマルションが得られた。
【００６３】
（参考例２）公知処方（ＡｄｄａＶａｘ）によるスクアレンエマルション及びその凍結乾燥製剤の調製
スクアレンエマルション市販品（ＡｄｄａＶａｘ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と同処方（スクアレン―１０重量％、Ｓｐａｎ８５―１重量％、ＰＳ８０−１重量％）の乳化原液を、Ｏｍｎｉ−ｍｉｘｅｒを用いた実施例１−１と同スケールの方法に準じて調製し、乳化原液―２を得た。但し、Ｓｐａｎ８５（和光純薬）はスクアレンに予め混合し使用した。
乳化原液―２をスクアレン濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるようにクエン酸希釈液―２（ｐＨ７．０、終濃度１０ｍＭ）、注射用水で希釈し、粒子径２．２μｍの公知処方のエマルションを得た（参考エマルション２−１）。
次いで、この公知処方エマルションに、スクアレン終濃度１８ｍｇ／ｍＬとなるように終濃度４５ｍｇ／ｍＬのＤ（−）マンニトールを添加し、実施例３に準じて凍結乾燥を行ない、公知処方エマルションの凍結乾燥製剤を調製した。再溶解時にメディアン径１．９μｍの単一ピークを示した（参考凍乾品２−２ａ）。また同様にして、メディアン径２．７μｍの単一ピークを示すエマルション凍結乾燥製剤（参考凍乾品２−２ｂ）を得た。
【００６４】
（試験例１）ＢＨＴと他の抗酸化剤とのエマルション安定性比較試験
（１）評価サンプルの調製
終濃度、スクアレン−７．２ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０−７．２ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）―１０ｍＭ、マンニトール−４５ｍｇ／ｍＬとなるように実施例１−１及び実施例３−１に準じた操作で乳化、希釈、凍結乾燥、再溶解し、抗酸化剤を含まないスクアレンエマルションを調製し、サンプルＡ（コントロール）とした。その他のＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの各サンプルは、各々終濃度が１０ｐｐｍになる量の抗酸化剤として、ＤＬ−α−トコフェロール、トコフェロール酢酸エステル、アスコルビン酸、６−Ｏ−ステアロイル−Ｌ−アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を加えて調製した。
【００６５】
（各サンプルに含まれる抗酸化剤）
サンプルＡ：抗酸化剤なし
サンプルＢ：ＤＬ−α−トコフェロール
サンプルＣ：トコフェロール酢酸エステル
サンプルＤ：アスコルビン酸
サンプルＥ：６−Ｏ−ステアロイル−Ｌ−アスコルビン酸
サンプルＦ：ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）
【００６６】
（２）評価方法
各エマルションサンプルを６０℃条件下静置保存し、試験開始時と８日経過後の時点でのｐＨ、スクアレン含有量（下記Ａ法で定量）、オレイン酸含有量（ＰＳ８０分解の指標、下記Ｂ法で定量）を測定した。なお、遊離オレイン酸含有量は、エマルション液から、アルカリ加水分解せずに、オレイン酸を溶媒抽出した後、標識化合物化し、ＨＰＬＣで定量した。
Ａ．スクアレン含量測定法
エマルション液を酢酸エチルで抽出した後、ガスクロマトグラフィー法で定量した。
Ｂ．遊離オレイン酸含有量測定法
エマルション液から遊離脂肪酸をトルエンで抽出した後、ＡＤＡＭ試薬（フナコシ）で蛍光標識化し、液体クロマトグラフィー法で定量した。
【００６７】
（３）結果
開始時の測定値から８日経過後の測定値を引いて、ｐＨ、スクアレン減少量、オレイン酸減少量（ＰＳ８０分解の指標）を算出した。結果を表１に示す。
【表１】
2020002117.tif 000003
ＢＨＴ以外の抗酸化剤を含むエマルションＢ〜Ｅは、抗酸化剤を含まないサンプルＡと同程度にｐＨを減少させ、エマルションを酸性化させたのに対して、ＢＨＴを含むサンプルＦは全くｐＨを減少させなかった。
また、ＢＨＴ以外の抗酸化剤を含むサンプルＢ〜Ｅは、スクアレン減少量が抗酸化剤を含まないサンプルＡと同等であったのに対して、ＢＨＴを含むサンプルＦは全くスクアレン含有量を減少させなかった。
また、抗酸化剤を含まないサンプルＡ、及びＢＨＴ以外の抗酸化剤を含むサンプルＢ〜Ｅは、オレイン酸含量が低下したが、一方で、ＢＨＴを含むサンプルＦは、オレイン酸含有量が見かけ上増加した。これは、前者は生成したオレイン酸が例えば酸化反応など２次的反応によって更に異なった生成物に変化したためであり、後者はその反応がＢＨＴによって抑制されたためと考えられる。
以上の結果、スクアレンと界面活性剤とクエン酸緩衝剤を含む本発明のアジュバント組成物において、各種抗酸化剤の中でＢＨＴが最も優れた抗酸化作用を有することが示された。
なお、上記各サンプルの再溶解前の凍結乾燥製剤を静置保存した場合も、同傾向の結果が得られる。
【００６８】
（試験例２）クエン酸緩衝剤の界面活性剤安定化効果
（１）評価サンプルの調製
ＰＳ８０を終濃度６ｍｇ／ｍＬとなる様に、下記の各種緩衝液に添加し、ＰＳ８０溶液を得た。
Ａ：緩衝剤なし
Ｂ：１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｃ：１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（２）評価方法
各評価サンプルを、４０℃で１５０日間、及び６０℃で６０日間静置保存し、経時的にｐＨを測定した。
（３）結果
結果を図４に示す。緩衝剤を配合しない溶液は、リン酸緩衝剤又はクエン酸緩衝剤を添加した溶液に比べてｐＨ低下速度が速かった。また、リン酸緩衝剤に比べてクエン酸緩衝剤のｐＨ保持能力が高かった。
以上の結果から、本製剤の処方条件において各種緩衝剤の中でも汎用されているリン酸緩衝剤よりもクエン酸緩衝剤の方が、界面活性剤存在下で、より高いｐＨ安定化能を示すことが明らかとなった。
【００６９】
（試験例３）本発明処方エマルションの安定性
（１）評価サンプル
実施例１で製造した本発明エマルション、参考例１のＢＨＴ不含エマルション、及び参考例２で得た公知処方エマルションを使用した。
（２）評価方法
各評価サンプルをそれぞれ４０℃―２週間、６０℃―２週間、９０℃―２日間静置し、試験開始時からの粒度分布、スクアレン含量、ｐＨの変化を測定した。
（３）結果
Ａ．メディアン径２μｍのエマルションの安定性
９０℃―２日間の保存条件において、本発明エマルション（エマルション１−１ｂ）はメディアン径、粒度分布、スクアレン含量ともにほぼ保持され、公知処方エマルション（参考エマルション２−１）に比較して安定性が高かった。公知処方のエマルションは粒度分布の悪化、メディアン径の増大に加え、スクアレン含量の減少が生じた。また、ＢＨＴ不含のエマルション（参考エマルション１−１）においても、粒度分布の悪化、メディアン径の増大、スクアレン含量の減少が生じ、不安定であった（表２、図５）。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
Ｂ．小径粒子径（メディアン径０．１〜０．２μｍ）のエマルション安定性
４０℃―２週間、６０℃―２週間の保存条件において、本発明エマルション（エマルション１−２ａ、エマルション１−２ａ[マンニトールあり]、エマルション１−２ｂ、エマルション１−２ｂ[マンニトールあり]）はメディアン径、粒度分布、スクアレン含量に変化がなかった。公知処方エマルションにｐＨの上昇が認められたが、本発明エマルション、公知処方エマルションともに安定であった（表３）。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
（試験例４）本発明エマルションの凍結乾燥製剤安定性
（１）評価サンプル
実施例３の本発明エマルション凍結乾燥製剤（凍乾品３−１ｂ）、参考例２で製造した公知処方凍結乾燥製剤（参考凍乾品２−２ｂ）を使用した。
（２）評価法
各評価サンプルをそれぞれ４０℃―２週間、６０℃―２週間静置し、試験開始時からの粒度分布、スクアレン含量、ｐＨの変化を測定した。
（３）結果
本発明エマルション凍結乾燥製剤は、４０℃―２週間、６０℃―２週間の保存条件いずれにおいても再溶解液のメディアン径、粒度分布、ｐＨに変化がなかった。一方、公知処方の凍結乾燥製剤は、４０℃、２週間保存時に再溶解液の粒度分布波形が悪化し、更に４０℃―２週間、６０℃―２週間いずれの保存においてもｐＨの低下を示した。凍結乾燥製剤においても本発明エマルションは公知処方エマルションに比べて安定性が高かった（表４、図６）。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
（試験例５）本発明エマルション製剤のワクチンとの併用効果
（１）評価サンプルの調製
本発明のスクアレンエマルション凍結乾燥製剤（実施例３）の再溶解液２５μＬと１μｇのＢＣＧ生菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏ  １７２（ＴＯＫＹＯ１７２）を混合し、さらにＰＢＳを添加して１１０μＬのサンプルを作製した。
（２）評価方法
文献公知法（J Immunol. 2012 Oct 15;189(8):4079-87.）に準じて評価を実施した。１週間馴化したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、雌）の頚背部にサンプル液１１０μＬを皮内投与した。投与後４週間目の脾臓を回収し、脾細胞分散液を調製してＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ （０．１４Ｍ 塩化アンモニウム、０．０１７Ｍ Ｔｒｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ７．５６）で溶血処理した。溶血後、培養用培地（ペニシリン／ストレプトマイシン／１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地）で懸濁し、フィルターで赤血球破片を除去後、１５００ ｒｐｍ で５ 分間遠心洗浄を行った。再度培地で細胞を浮遊させ、脾細胞液とした。脾臓細胞液を５×１０＾６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ に調整し、終濃度１０μｇ／ｍｌ になるようにＰＰＤを加えて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。２４ 時間培養後、上清を−８０℃で保存した。この培養液を用いてＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ 社製）を用いて測定した。
（３）結果
本発明のスクアレンエマルション製剤をＢＣＧ生菌と混合投与した群において、ＢＣＧ生菌単独投与群よりも高いＩＦＮ−γ産生が誘導された。一方、スクアレンエマルション製剤単独投与群では、ナイーヴ群と同程度にしかＩＦＮ−γ産生が誘導されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のアジュバント組成物は、０．０５〜３μｍの任意の粒径の安定な粒子を含むエマルションとすることができる。従って、ニーズに応じた投与経路を選択でき、また、目的とする作用メカニズムを有するものとすることができる。また、粒径の異なる複数のエマルション又はその凍結乾燥製剤を組み合わせることにより、多様なメカニズムで強く免疫賦活できるものとなる。また、酸化に対して安定である。さらに、必要に応じて、凍結乾燥製剤とすることもできる。従って、産業上非常に有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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