(57)【要約】【課題】本発明の課題は、再現性良く、高精度に結果の得られる、カラムの抗体に対する保持力の測定方法を提供することにある。【解決手段】Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する工程と、平衡化した前記カラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で前記抗体を溶出させる工程と、を含んでなる前記カラムの前記抗体に対する保持力の測定方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する工程と、
平衡化した前記カラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、
クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で前記抗体を溶出させる工程と、
を含んでなる前記カラムの前記抗体に対する保持力の測定方法。
【請求項２】
前記抗体に対する保持力として保持時間又は保持係数を指標とすることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質として、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびそのアミノ酸変異体を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
溶離液が１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下のクエン酸二ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
測定温度として４℃以上５０℃以下で実施することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラムの抗体に対する保持力の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬品）が用いられている。抗体医薬品に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製して製造するが、前記抗体は酸化、還元、異性化、糖鎖付加等の修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。特に、抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖の構造は多岐に渡り、抗体医薬品の薬効や副作用に大きく関わる重要な因子であるが、その構造をコントロールする方法は限定的である（非特許文献１参照）。
【０００３】
ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩＡ）をリガンドとして用いた分析カラムが開発されたことにより（非特許文献２参照）、ｐＨグラジェント溶出法を用いることで、抗体の糖鎖構造や活性に基づいた分析が可能となった（非特許文献３参照）。しかしながら、ｐＨグラジェント溶出法は一定程度の測定誤差が生じるため、カラムの保持力を正確に評価することができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９、９、９３６−９４９（２００９）
【非特許文献２】東ソー研究・技術報告、第６１巻（２０１７）、３３−４１
【非特許文献３】Ｍａｓａｔｏ  Ｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ、８：３９５５（２０１８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、再現性良く、高精度に結果の得られる、カラムの抗体に対する保持力の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る抗体に対する保持力の測定方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する工程と、平衡化した前記カラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で前記抗体を溶出させる工程とを含んでなる。
【０００７】
また、本発明に係る測定方法の一態様においては、前記抗体に対する保持力として保持時間又は保持係数を指標とする。
【０００８】
また、本発明に係る測定方法の一態様においては、Ｆｃ結合性タンパク質として、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびそのアミノ酸変異体を使用する。
【０００９】
また、本発明に係る測定方法の一態様においては、溶離液が１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下のクエン酸二ナトリウムを含む。
【００１０】
また、本発明に係る測定方法の一態様においては、測定温度として４℃以上５０℃以下で実施する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、アイソクラティック法で抗体を溶出させるため、再現性良く、高精度に、カラムの抗体に対する保持力を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗体保持力の異なる５種のカラムについて抗体（サングロポール）を分離して得られたクロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗体に対する保持力の測定方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する工程と、平衡化した前記カラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で前記抗体を溶出させる工程とを含んでなる。以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１４】
なお、抗体に対する保持力とは、前記カラムの前記抗体に対する保持時間又は保持係数を指標とすることが好ましい。
【００１５】
まず、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する。
【００１６】
Ｆｃ結合性タンパク質としては、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＩ、補体タンパク質Ｃ１ｑ、マウスＦｃγＲＩ、マウスＦｃγＲＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＶが挙げられ、各々を構成するアミノ酸が部分的に置換した変異体を用いてもよい。
【００１７】
不溶性担体としては、抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
【００１８】
上述したＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラム（以下、単に「カラム」ということがある）として、ＴＳＫｇｅｌ  ＦｃＲ−ＩＩＩＡ−ＮＰＲ（東ソー社製）を例示することができる。
【００１９】
添加するクエン酸二ナトリウム水溶液とは、緩衝機能を有する任意の濃度でクエン酸二ナトリウム溶解させた水溶液であり、具体的には１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であることが好ましく、２０ｍＭ以上３００ｍＭ以下であることがより好ましい。カラムを平衡化するにはカラムボリューム（単位：ＣＶ）を基準に１ＣＶ以上通液すればよく、３ＣＶ以上通液することがより好ましい。
【００２０】
次に、平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する。
【００２１】
抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体やそれらのアミノ酸置換体が挙げられる。抗体の由来問わず、ヒト血液から製造されるガンマグロブリンでもよいし、動物細胞培養によって得られたリコンビナントタンパク質であっても使用できる。抗体の種類としては、Ｆｃ結合性タンパク質に親和性を有しておればよく、動物種や構造を問わない。また、Ｆｃ融合タンパク質や、抗体を分解して得られるＦｃ部位の断片も広義の抗体として利用できる。
【００２２】
抗体を含む溶液としては、抗体を濃度として１００μｇ／Ｌ以上含む溶液と定義できる。カラムに添加する抗体量としては、クロマト装置の検出器で検出できればよく、０．１μｇ以上１ｇ以下が好ましい。また、本溶液の添加剤として、緩衝剤、塩類、防腐剤、界面活性剤が含まれていてもよい。
【００２３】
次に、クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で抗体を溶出させる。
【００２４】
溶離液に含まれるクエン酸二ナトリウムは、１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であることが好ましく、２０ｍＭ以上３００ｍＭ以下であることがより好ましい。
【００２５】
アイソクラティック法とは、溶離液の送液が行われている間中、その組成を変化させず、同一のまま行う手法であり、溶離液の組成が分離の間に変化するグラジェント法と比べて、再現性が高い。
【００２６】
なお、カラムは、その親和性において温度依存性があるため、カラムオーブンなどを使用して恒温状態を保つのが望ましい。測定温度としては、カラム内が凍結しない温度以上であり、また、リガンドとして固定したＦｃ結合性タンパク質が変性しない温度以下であればよい。具体的には、４℃以上５０℃以下が好ましく、１５℃以上３５℃以下がより好ましい。
【００２７】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００２８】
以下の通り、実施例で用いる溶離液等の調製を行った。
（１）溶離液
クエン酸水素二ナトリウム１．５水和物（ナカライテスク製）を６．５７８ｇ取り、ミリＱ水に溶解後、メスフラスコで５００ｍＬにメスアップした。溶液を０．２μｍのフィルターでろ過し、５０ｍＭクエン酸二ナトリウム水溶液を調製した。同様の手順で、１０ｍＭから３００ｍＭのクエン酸二ナトリウム水溶液も調製した。
（２）カラム洗浄緩衝液
（１）と同様の手順で、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を調製した。
（３）抗体サンプル
市販の抗体２種（サングロポール：ＣＳＬベーリング製、グロブリン筋注：ＪＢ製）を終濃度２ｇ／Ｌとなるように５０ｍＭのクエン酸二ナトリウム水溶液で希釈し、調製した。
【００２９】
（実施例１）  抗体保持力
溶離液（濃度  ５０ｍＭ）と抗体サンプル（サングロポール）をクロマト装置（東ソー製）に設置した。カラムオーブン温度は２５℃、流速は０．３ｍＬ／分、検出器は２８０ｎｍの吸光度測定に設定した。様々な抗体保持力を有する５種のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ固定化カラムを、それぞれクロマト装置に設置後、溶離液にて平衡化した。抗体を負荷量１０μＬにてカラムに添加後、アイソクラティック法で溶出することで抗体保持力を評価した結果を図１に示す。各々のカラムが抗体を４つのピークに分離することが判明した。また、抗体保持力に準じた保持時間の増減が確認できた。
【００３０】
（実施例２）  分析再現性
溶離液（濃度：５０ｍＭ）と抗体サンプル（サングロポールおよびグロブリン筋注）をクロマト装置（島津製）に設置した。カラムオーブン温度は２５℃、抗体負荷量は１０μＬ、流速は０．３ｍＬ／分、検出器は２８０ｎｍの吸光度測定に設定した。２本のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ固定化カラムについて、それぞれクロマト装置に設置後、溶離液にて平衡化した。抗体をカラムに添加後、アイソクラティック法で溶出することで抗体保持力を測定した。測定終了後、カラム洗浄液（５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５））にて５分間カラムを洗浄し、溶離液にて再平衡化することでカラム性能を再生した。本操作を３回繰り返し分析した。得られたクロマトグラムを解析し、ピーク３の保持時間とバラつきの評価をした結果を表１に示す。ＣＶ％値より、本法はバラつきの少ない優れた分析再現性があることが判明した。
【００３１】
【表１】
2020002028.tif 000003
【００３２】
（実施例３）  溶離液濃度の影響
溶離液（濃度：１０〜３００ｍＭ）と抗体サンプル（サングロポール）をクロマト装置（東ソー製）に設置した。カラムオーブン温度は２５℃、サンプル負荷量は１０μＬ、流速は０．３ｍＬ／分、検出器は２８０ｎｍの吸光度測定に設定した。２種のカラム（低親和性型ＦｃγＲＩＩＩＡ固定化カラムおよび高親和性型ＦｃγＲＩＩＩＡ固定化カラム）を用いて、溶離液によるカラム平衡化、抗体添加、アイソクラティック法による分析、カラム洗浄液による再生、溶離液による再平衡化を各溶離液条件にて行った。溶離液濃度の影響を評価した結果を表２に示す。溶離液濃度が高いほど溶出力が強くなり、保持時間が短くなることが判明した。リガンド密度やＦｃ結合性タンパク質の親和性が高い場合は、クエン酸二ナトリウム水溶液の濃度を調整することで対応できることが判明した。
【００３３】
【表２】
2020002028.tif 000004
【００３４】
（実施例４）  カラムオーブン温度の影響
溶離液（濃度：５０ｍＭ）と抗体サンプル（サングロポール）をクロマト装置（東ソー製）に設置した。カラムオーブン温度は１５℃から３５℃、サンプル負荷量は１０μＬ、流速は０．３ｍＬ／分、検出器は２８０ｎｍの吸光度測定に設定した。単一のカラムを用いて、溶離液によるカラム平衡化、抗体添加、アイソクラティック法による分析、カラム洗浄液による再生、溶離液による再平衡化を各温度条件にて行った。測定温度の影響を評価した結果を表３に示す。温度が高いほど保持時間が短くなることが判明した。
【００３５】
【表３】
2020002028.tif 000005
【図１】
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