(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト上皮細胞増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）発現レベル上昇により特徴付けられる多くの疾患又は障害、例えば食道癌を処置する方法の提供。【解決手段】食道でＨＥＲ３発現が上昇している患者を選択し、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの投与を含み、抗体又はそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２及び４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達及びリガンド非依存性シグナル伝達を遮断し、障害を処置する、方法。特に、食道癌、他、胃癌、頭頸部癌、良性前立腺肥大、女性化乳房、子宮内膜症の処置にも用いられる。抗体又はフラグメントが生理学的に許容される担体・添加物又は希釈剤を含む医薬組成物を投与する方法。更にＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｎＴＯＲ阻害剤及びＰＩ３キナーゼ阻害剤から選ばれる他の阻害剤を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道におけるＨＥＲ３発現レベル増加により特徴付けられる障害を処置する方法であっ
て：
食道でＨＥＲ３発現が上昇している患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより該障害を処置する、方法。
【請求項２】
障害が食道癌およびバレット食道癌から成る群から選択される、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに他の治療剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項５に記載の
方法。
【請求項７】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
胃癌の処置であって：
胃癌を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより胃癌を処置する、方法。
【請求項１１】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
さらに他の治療剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項１３に記載
の方法。
【請求項１５】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
頭頸部癌の処置方法であって：
頭頸部癌を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより頭頸部癌を処置する、方法。
【請求項１９】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
さらに他の治療剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項２１に記載
の方法。
【請求項２３】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
良性前立腺肥大の処置方法であって：
良性前立腺肥大を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより良性前立腺肥大を処置する、方法
。
【請求項２７】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
さらに他の治療剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項２９に記載
の方法。
【請求項３１】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
女性化乳房の処置方法であって：
女性化乳房を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより女性化乳房を処置する、方法。
【請求項３５】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
さらに他の治療剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項３７に記載
の方法。
【請求項３９】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
子宮内膜症の処置方法であって：
子宮内膜症を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより子宮内膜症を処置する、方法。
【請求項４３】
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
さらに他の治療剤を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項４５に記載
の方法。
【請求項４７】
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
食道障害の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体または
そのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のド
メイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガン
ド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
【請求項５１】
胃癌の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはその
フラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイ
ン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依
存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
【請求項５２】
頭頸部癌の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体または
そのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のド
メイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガン
ド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
【請求項５３】
良性前立腺肥大(ＢＰＨ)の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合
する抗体またはそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥ
Ｒ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと
結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮
断する、使用。
【請求項５４】
女性化乳房の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体また
はそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体の
ドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガ
ンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用
。
【請求項５５】
子宮内膜症の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体また
はそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体の
ドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガ
ンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１２月５日出願の米国仮出願番号６１／５６６,８９０に対する
優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、ＨＥＲファミリーの受容体、例えば、ＨＥＲ３受容体と相互作用
する抗体またはそのフラグメントに関する。特に、それは、ドメイン２および４の両者由
来の残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造エピトープを認識し、リガンド依存性シグナル
伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも阻害し、かつリガンド結合(例えば
、ニューレグリン)を可能にしながら、シグナル伝達のリガンド誘発活性化を防止する抗
体またはそのフラグメントに関する。これらの抗体またはフラグメントは、ＨＥＲ３発現
レベル上昇により特徴付けられる多くの疾患または障害(例えば、食道癌)の処置に使用で
きる。これらの抗体またはフラグメントは、組織重量(例えば、前立腺または子宮重量)を
減少させるまたは組織萎縮(例えば、男性乳房萎縮)を誘発する抗体またはフラグメントの
能力により特徴付けられる多くの疾患または障害の処置のために使用できる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ３としても知られる)は、受容体タ
ンパク質チロシンキナーゼであり、受容体タンパク質チロシンキナーゼ群の上皮細胞増殖
因子受容体(ＥＧＦＲ)サブファミリーに属し、ＥＧＦＲ(ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ
２(ＥｒｂＢ２、Ｎｅｕ)およびＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)もまた誘発する(Plowman et al., (
1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909; Kraus et al., (1989) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 86:9193-9197;およびKraus et al., (1993) Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 90:2900-2904)。プロトタイプ上皮細胞増殖因子受容体と同様、膜貫通型受容
体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン(ＥＣＤ)、ＥＣＤ内に二量体化ドメイン、膜
貫通型ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼ様ドメイン(ＴＫＤ)およびＣ末端リ
ン酸化ドメインから成る。他のＨＥＲファミリーメンバーと異なり、ＨＥＲ３のキナーゼ
ドメインは極めて低い内因性キナーゼ活性を示す。
【０００４】
リガンドニューレグリン(ＮＲＧ)１またはニューレグリン２は、ＨＥＲ３の細胞外ドメ
インと結合し、他の二量体化パートナー、例えばＨＥＲ２との二量体化を促進することに
より受容体仲介シグナル伝達経路を活性化する。ヘテロ二量体化はＨＥＲ３の細胞内ドメ
インの活性化およびトランスリン酸化を誘発し、シグナル多様化だけでなく、またシグナ
ル増幅のための手段である。さらに、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化はまた活性化リガンド非存
在下でも起こることができ、これは、通常リガンド非依存性ＨＥＲ３活性化と呼ばれる。
例えば、ＨＥＲ２が、遺伝子増幅の結果として高レベルで発現されたとき(例えば乳癌、
肺癌、卵巣癌または胃癌において)、自発性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体が形成され得る。
この状況において、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３は最も活性なＥｒｂＢシグナル伝達二量体であり
、それゆえに、高度にトランスフォーミングであると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＥＲ３増加は数タイプの癌、例えば乳癌、肺癌、消化器癌および膵癌で発見されてい
る。興味深いことに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３発現と非浸潤段階から浸潤段階への進行の相関
が示されている(Alimandi et al., (1995) Oncogene 10:1813-1821; DeFazio et al., (2
000) Cancer 87:487-498; Naidu et al., (1988) Br. J. Cancer 78:1385-1390)。従って
、ＨＥＲ３仲介シグナル伝達を妨害する薬物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む、ＨＥＲ３
受容体の立体構造エピトープに結合する抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはそのフ
ラグメント)の発見に基づく。抗体またはそのフラグメントとドメイン２およびドメイン
４のこの結合はＨＥＲ３受容体を、ＨＥＲ３活性化が阻害されるように不活性または閉鎖
立体配座で安定化させる。驚くべきことに、抗体またはそのフラグメントとのこの立体構
造エピトープの結合は、リガンド依存性(例えばニューレグリン)およびリガンド非依存性
ＨＥＲ３シグナル伝達経路のいずれも阻害する。さらに、リガンド誘発シグナル伝達の抗
体仲介阻害が、おそらくＨＥＲ３が活性化に必要な立体構造再配列に付されることができ
ないためにリガンド結合を遮断することなく起こる(すなわち、リガンドおよび抗体のい
ずれもＨＥＲ３と結合できる)。また開示されているのは、ＨＥＲ３の発現増加により特
徴付けられる多くの疾患または障害および組織重量(例えば、前立腺または子宮重量)を減
少させるまたは組織萎縮(例えば、男性乳房萎縮)を誘発する抗体またはフラグメントの能
力により特徴付けられる多くの疾患または障害の処置のための本抗体またはそのフラグメ
ントの使用方法である。
【０００７】
従って、一つの面において、本発明は、食道でＨＥＲ３発現が上昇している患者を選択
し；ＨＥＲ３受容体と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを、該抗体またはそ
のフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む
立体構造エピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグ
ナル伝達のいずれも遮断し、それにより該障害を処置するように投与することを含む、食
道におけるＨＥＲ３発現レベル増加により特徴付けられる障害の処置方法に関する。一つ
の態様において、障害は食道癌およびバレット食道癌から成る群から選択される。
【０００８】
他の面において、本発明は、胃癌を有する患者を選択し；抗体またはそのフラグメント
がＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピト
ープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいず
れも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを、
それにより胃癌を処置するように投与することを含む、胃癌の処置方法に関する。
【０００９】
他の面において、本発明は、頭頸部癌を有する患者を選択し；抗体またはそのフラグメ
ントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エ
ピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達の
いずれも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント
を、それにより頭頸部癌を処置するように投与することを含む、頭頸部癌の処置方法に関
する。
【００１０】
他の面において、本発明は、良性前立腺肥大を有する患者を選択し；抗体またはそのフ
ラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体
構造エピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル
伝達のいずれも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグ
メントを、それにより良性前立腺肥大を処置するように投与することを含む、良性前立腺
肥大の処置方法に関する。
【００１１】
さらに別の面において、本発明は、女性化乳房を有する患者を選択し；抗体またはその
フラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立
体構造エピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナ
ル伝達のいずれも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラ
グメントを、それにより女性化乳房を処置するように投与することを含む、女性化乳房の
処置方法に関する。
【００１２】
さらに別の面において、本発明は、子宮内膜症を有する患者を選択し；抗体またはその
フラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立
体構造エピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナ
ル伝達のいずれも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラ
グメントを、それにより子宮内膜症を処置するように投与することを含む、子宮内膜症の
処置方法に関する。
【００１３】
一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳
室内、実質内、髄腔内、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択さ
れる経路により投与する。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、生理学
的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬組成物に製剤する。他の態様におい
て、医薬組成物は他の治療剤を含む。一つの態様において、他の治療剤はＨＥＲ１阻害剤
、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナ
ーゼ阻害剤から成る群から選択される。一つの態様において、他の治療剤は、マツズマブ
(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベクティビックス(登録商標)／
パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)／ゲフィチニブ、CI-1033(P
D183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／トシル酸ラパチニブ、タル
セバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およびTovok(登録商標)から成
る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツマブ、MM-111、ネラチニブ
、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商標)から選択されるＨＥＲ２
阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)
、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ３を阻害する小分子から成る
群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤である。一つの態様において、
他の治療剤はテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリム
ス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択さ
れるｍＴＯＲ阻害剤である。一つの態様において、他の治療剤はGDC 0941、BEZ235、BMK1
20およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である。
【００１４】
他の面において、本発明は、食道障害または胃癌または頭頸部癌または良性前立腺肥大
(ＢＰＨ)または女性化乳房または子宮内膜症の処置用医薬の製造のための、抗体またはそ
のフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む
立体構造エピトープと結合してリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグ
ナル伝達のいずれも遮断するようにＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフ
ラグメントの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＨＥＲ３で得た代表的MOR10701  ＳＥＴ曲線。
【図２】ＦＡＣＳタイトレーションにより決定したSK-Br-3細胞結合。
【図３】ＨＥＲ３ドメイン結合ＥＬＩＳＡ。
【図４Ａ】水素重水素交換エピトープマッピング。Ａ)  ＨＤＸ−ＭＳ分析に回収したHER3 ECDペプチドを点線で示す。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を強調する。Ｂ)  ＭＳにより同定したペプチドで見られる重水素化の相対比。Ｃ)  公開されたＨＥＲ３結晶構造上に位置づけした保護残基。
【図４Ｂ】水素重水素交換エピトープマッピング。Ａ)  ＨＤＸ−ＭＳ分析に回収したHER3 ECDペプチドを点線で示す。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を強調する。Ｂ)  ＭＳにより同定したペプチドで見られる重水素化の相対比。Ｃ)  公開されたＨＥＲ３結晶構造上に位置づけした保護残基。
【図４Ｃ】水素重水素交換エピトープマッピング。Ａ)  ＨＤＸ−ＭＳ分析に回収したHER3 ECDペプチドを点線で示す。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を強調する。Ｂ)  ＭＳにより同定したペプチドで見られる重水素化の相対比。Ｃ)  公開されたＨＥＲ３結晶構造上に位置づけした保護残基。
【図５Ａ】Ａ)  ＨＥＲ３／MOR09823およびＨＥＲ３／MOR09825  ｘ線結晶構造の表面表現。ＨＥＲ３(明るい灰色)は閉鎖立体配座内にあり、MOR09823またはMOR09825(最も濃い灰色)はドメイン２および４の両者に結合する。Ｂ)  (Ａ)と類似の方向に示すＨＥＲ３／MOR09823構造からのＨＥＲ３の表面図。MOR09823は明瞭にするために除いた。Ｃ)  パネル(Ａ)、(Ｂ)および(Ｄ)から９０°回転で見たリボン構造として記載するＨＥＲ３／MOR09823構造。Ｄ)  ドメイン２／ドメイン４界面の近景を伴うMOR09823 Fabにより認識される不活性ＨＥＲ３配座のリボン表示、Ｆａｂの５Å以内のＨＥＲ３残基を強調。Ｅ)  ＥＬＩＳＡタイトレーションによる変異体ＨＥＲ３／MOR10703結合決定。
【図５Ｂ】Ａ)  ＨＥＲ３／MOR09823およびＨＥＲ３／MOR09825  ｘ線結晶構造の表面表現。ＨＥＲ３(明るい灰色)は閉鎖立体配座内にあり、MOR09823またはMOR09825(最も濃い灰色)はドメイン２および４の両者に結合する。Ｂ)  (Ａ)と類似の方向に示すＨＥＲ３／MOR09823構造からのＨＥＲ３の表面図。MOR09823は明瞭にするために除いた。Ｃ)  パネル(Ａ)、(Ｂ)および(Ｄ)から９０°回転で見たリボン構造として記載するＨＥＲ３／MOR09823構造。Ｄ)  ドメイン２／ドメイン４界面の近景を伴うMOR09823 Fabにより認識される不活性ＨＥＲ３配座のリボン表示、Ｆａｂの５Å以内のＨＥＲ３残基を強調。Ｅ)  ＥＬＩＳＡタイトレーションによる変異体ＨＥＲ３／MOR10703結合決定。
【図５Ｃ】Ａ)  ＨＥＲ３／MOR09823およびＨＥＲ３／MOR09825  ｘ線結晶構造の表面表現。ＨＥＲ３(明るい灰色)は閉鎖立体配座内にあり、MOR09823またはMOR09825(最も濃い灰色)はドメイン２および４の両者に結合する。Ｂ)  (Ａ)と類似の方向に示すＨＥＲ３／MOR09823構造からのＨＥＲ３の表面図。MOR09823は明瞭にするために除いた。Ｃ)  パネル(Ａ)、(Ｂ)および(Ｄ)から９０°回転で見たリボン構造として記載するＨＥＲ３／MOR09823構造。Ｄ)  ドメイン２／ドメイン４界面の近景を伴うMOR09823 Fabにより認識される不活性ＨＥＲ３配座のリボン表示、Ｆａｂの５Å以内のＨＥＲ３残基を強調。Ｅ)  ＥＬＩＳＡタイトレーションによる変異体ＨＥＲ３／MOR10703結合決定。
【図５Ｄ】Ａ)  ＨＥＲ３／MOR09823およびＨＥＲ３／MOR09825  ｘ線結晶構造の表面表現。ＨＥＲ３(明るい灰色)は閉鎖立体配座内にあり、MOR09823またはMOR09825(最も濃い灰色)はドメイン２および４の両者に結合する。Ｂ)  (Ａ)と類似の方向に示すＨＥＲ３／MOR09823構造からのＨＥＲ３の表面図。MOR09823は明瞭にするために除いた。Ｃ)  パネル(Ａ)、(Ｂ)および(Ｄ)から９０°回転で見たリボン構造として記載するＨＥＲ３／MOR09823構造。Ｄ)  ドメイン２／ドメイン４界面の近景を伴うMOR09823 Fabにより認識される不活性ＨＥＲ３配座のリボン表示、Ｆａｂの５Å以内のＨＥＲ３残基を強調。Ｅ)  ＥＬＩＳＡタイトレーションによる変異体ＨＥＲ３／MOR10703結合決定。
【図５Ｅ】Ａ)  ＨＥＲ３／MOR09823およびＨＥＲ３／MOR09825  ｘ線結晶構造の表面表現。ＨＥＲ３(明るい灰色)は閉鎖立体配座内にあり、MOR09823またはMOR09825(最も濃い灰色)はドメイン２および４の両者に結合する。Ｂ)  (Ａ)と類似の方向に示すＨＥＲ３／MOR09823構造からのＨＥＲ３の表面図。MOR09823は明瞭にするために除いた。Ｃ)  パネル(Ａ)、(Ｂ)および(Ｄ)から９０°回転で見たリボン構造として記載するＨＥＲ３／MOR09823構造。Ｄ)  ドメイン２／ドメイン４界面の近景を伴うMOR09823 Fabにより認識される不活性ＨＥＲ３配座のリボン表示、Ｆａｂの５Å以内のＨＥＲ３残基を強調。Ｅ)  ＥＬＩＳＡタイトレーションによる変異体ＨＥＲ３／MOR10703結合決定。
【図６】リガンド誘発(Ａ)またはリガンド非依存性(Ｂ)ＨＥＲ３リン酸化の阻害。
【図７】ＨＥＲ２増幅細胞株におけるＨＥＲ３依存性下流シグナル伝達経路阻害。
【図８】Ａ)BT-474およびＢ)ニューレグリン刺激MCF7細胞における細胞増殖に対するＨＥＲ３阻害の影響。
【図９】MCF7細胞へのニューレグリン結合によるMOR09823およびMOR09825の効果。
【図１０】BiacoreＴＭで評価してＨＥＲ３／ニューレグリン複合体形成に対するMOR09823結合の影響。抗体無し(黒色棒)、MOR09823(白色棒)、１０５.５(灰色)および対照ＩｇＧ(斜線棒)。
【図１１】インビボでの(Ａ)リガンド非依存性(BT-474)および(Ｂ)リガンド依存性(BxPC3)ＨＥＲ３シグナル伝達のMOR09823仲介阻害。
【図１２】BT-474腫瘍増殖に対するMOR10701およびMOR10703の影響。
【図１３】BxPC3腫瘍増殖に対するMOR10701およびMOR10703の影響。
【図１４−１】MOR10703インビトロ薬物組み合わせアイソボログラム(Ａ)MOR09823／トラスツマブ、(Ｂ)MOR09823／ラパチニブ、(Ｃ)MOR10703／BEZ235、(Ｄ)MOR10703／BKM120、(Ｅ)MOR10703／BYL719、(Ｆ)MOR10703／RAD001、(Ｇ)MOR10703／セツキシマブおよび(Ｈ)MOR10703／エルロチニブ。
【図１４−２】MOR10703インビトロ薬物組み合わせアイソボログラム(Ａ)MOR09823／トラスツマブ、(Ｂ)MOR09823／ラパチニブ、(Ｃ)MOR10703／BEZ235、(Ｄ)MOR10703／BKM120、(Ｅ)MOR10703／BYL719、(Ｆ)MOR10703／RAD001、(Ｇ)MOR10703／セツキシマブおよび(Ｈ)MOR10703／エルロチニブ。
【図１５】BT-474およびL3.3におけるMOR10701またはMOR10703と(Ａ)トラスツマブおよび(Ｂ)エルロチニブとのインビボでの組み合わせ。
【図１６】食道細胞におけるMOR10703単独またはMOR10703と(Ａ)セツキシマブおよび(Ｂ)BYL719とのインビトロでの組み合わせ。
【図１７】KYSE140およびKYSE180食道腫瘍モデルにおけるMOR10703単独またはMOR10703と(Ａ)セツキシマブおよび(Ｂ)BYL719とのインビボでの組み合わせ。
【図１８】CHE007食道腫瘍モデルにおけるMOR10703単独またはMOR10703と(Ａ)セツキシマブおよび(Ｂ)BYL719のインビボでの組み合わせおよび(Ｃ)CHES015食道腫瘍モデルにおけるMOR10703単独またはMOR10703とセツキシマブとのインビボでの組み合わせ。
【図１９】N87胃腫瘍モデルにおけるMOR10703単独またはMOR10703とBYL719とのインビボは長期腫瘍緩解を示す。
【図２０】A253 SCCHNモデルにおけるMOR10703単独またはMOR10703とセツキシマブとのインビボ組み合わせ。MOR10703またはセツキシマブいずれかの単剤での処置は腫瘍静止をもたらした。MOR10703とセツキシマブの組み合わせは腫瘍緩解をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な記載
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語をまず定義する。更なる定義は詳
細な説明中で随時示す。
【００１７】
ここで使用する用語“シグナル伝達”または“シグナル伝達活性”は、一般的にタンパ
ク質−タンパク質相互作用、例えば増殖因子の受容体への結合により開始され、細胞の一
つの部位から細胞の他の部位へのシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係を意味する
。ＨＥＲ３では、伝達は、シグナル伝達を起こす一連の反応における１個以上のタンパク
質上の１個以上のチロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基の特異的リン酸化を含
む。最後から２番目の過程は、典型的に核事象を含み、遺伝子発現を変化させる。
【００１８】
“ＨＥＲ受容体”は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナ
ーゼであり、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４受容体ならびに将来同定され
るであろうこのファミリーの他のメンバーを含む。ＨＥＲ受容体は、一般的にＨＥＲリガ
ンドを結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通型ドメイン；保存された細胞内チロシン
キナーゼドメイン；およびリン酸化できる数個のチロシン残基を担持するカルボキシル末
端シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、ＨＥＲ受容体は天然配列ヒトＨＥＲ受容体
である。
【００１９】
用語“ＨＥＲ１”、“ＥｒｂＢ１”、“上皮細胞増殖因子受容体”および“ＥＧＦＲ”
はここでは互換的に使用し、その天然に存在する変異体形態(例えばHumphrey et al., (1
990) PNAS (USA) 87:4207-4211における欠失変異体ＥＧＦＲ)を含む、例えば、Carpenter
et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されている、ＥＧＦＲを意味する
。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。
【００２０】
用語“ＨＥＲ２”および“ＥｒｂＢ２”はここでは互換的に使用し、例えば、Semba et
al., (1985) PNAS (USA) 82:6497-6501およびYamamoto et al.(1986) Nature 319:230-2
34 (Genebank accession number X03363)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質を意味す
る。用語“ｅｒｂＢ２”はヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を言い、“ｎｅｕ”はラッ
トｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を意味する。
【００２１】
用語“ＨＥＲ４”および“ＥｒｂＢ４”は、ここでは、例えば、１９９９年４月２２公
開のＷＯ９９／１９４８８に開示されているそのアイソフォーム類を含む、例えば、欧州
特許出願番号５９９,２７４; Plowman et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90
:1746-1750;およびPlowman et al., (1993) Nature, 366:473-475に開示された受容体ポ
リペチドを意味する。
【００２２】
用語“ＨＥＲ３”または“ＨＥＲ３受容体”は“ＥｒｂＢ３”としても知られ、ここで
は哺乳動物ＨＥＲ３タンパク質を言い、“ｈｅｒ３”または“ｅｒｂＢ３”は哺乳動物ｈ
ｅｒ３遺伝子を意味する。好ましいＨＥＲ３タンパク質は、細胞の細胞膜に存在するヒト
ＨＥＲ３タンパク質である。ヒトｈｅｒ３遺伝子は米国特許番号５,４８０,９６８および
Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909に記載されている
。
【００２３】
ヒトＨＥＲ３はAccession No. NP_001973(ヒト)で規定され、下に配列番号１として示
す。全ての命名法は完全長、未成熟ＨＥＲ３(アミノ酸１〜１３４２)である。未成熟ＨＥ
Ｒ３は１９位と２０位の間で開裂し、成熟ＨＥＲ３タンパク質(２０〜１３４２アミノ酸)
となる。
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tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededeeyeym
nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd lsaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy
eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd
safdnpdywh srlfpkanaq rt  (配列番号１)
【００２４】
ここで使用する用語“ＨＥＲリガンド”は、ＨＥＲ受容体、例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ２
、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４と結合し、活性化するポリペチドを意味する。ＨＥＲリガンド
の例は、ニューレグリン(ＮＲＧ)１、ニューレグリン２、ニューレグリン３、ニューレグ
リン４、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、エピレギュリン、上皮細胞増
殖因子、アンフィレギュリンおよびトランスフォーミング増殖因子アルファを含むが、こ
れらに限定されない。本用語は、天然に存在するポリペチドの生物学的活性フラグメント
および／または変異体を含む。
【００２５】
ここで使用する用語“ＨＥＲ３リガンド”は、ＨＥＲ３と結合し、活性化するポリペチ
ドを意味する。ＨＥＲ３リガンドの例は、ニューレグリン(ＮＲＧ)１およびニューレグリ
ン２、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子およびエピレギュリンを含むが、
これらに限定されない。本用語は、天然に存在するポリペチドの生物学的活性フラグメン
トおよび／または変異体を含む。
【００２６】
“ＨＥＲ−ＨＥＲタンパク質複合体”は、あらゆる組み合わせでＨＥＲ共同受容体を含
む非共有結合的に結合したオリゴマーを意味する(例えば、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ
１−ＨＥＲ３、ＨＥＲ１−ＨＥＲ４、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、ＨＥＲ３−ＨＥＲ４など)。
この複合体は、これらの受容体の両者を発現する細胞がＨＥＲリガンド、例えば、ＮＲＧ
に暴露されたときまたはＨＥＲ受容体が活性または過発現されたときに形成できる。
【００２７】
“ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体”は、ＨＥＲ２受容体およびＨＥＲ３受容体を
含む非共有結合的に結合したオリゴマーである。この複合体は、これらの受容体の両者を
発現する細胞がＨＥＲ３リガンド、例えば、ＮＲＧに暴露されたときまたはＨＥＲ２が活
性／過発現されたときに形成できる。
【００２８】
ここで使用する句“ＨＥＲ３活性”または“ＨＥＲ３活性化”は、オリゴマー形成増加
(例えばＨＥＲ３含有複合体増加)、ＨＥＲ３リン酸化、立体構造再配列(例えばリガンド
により誘発されるもの)およびＨＥＲ３仲介下流シグナル伝達を含む。
【００２９】
ＨＥＲ３の文脈で使用する用語“安定化”または“安定化する”は、リガンド結合がも
はやＨＥＲ３を活性化できないように、ＨＥＲ３へのリガンド結合を遮断することなくＨ
ＥＲ３の不活性状態または配座を直接維持(ロック、係留、保持、優先的結合、支持)する
抗体またはそのフラグメントを意味する。実施例に記載するアッセイ、例えば、Biacore
アッセイを使用して、ＨＥＲ３受容体を安定化するリガンド結合を測定できる。
【００３０】
ここで使用する用語“リガンド依存性シグナル伝達”は、リガンドを介するＨＥＲ(例
えば、ＨＥＲ３)の活性化を意味する。ＨＥＲ３活性化は、下流シグナル伝達経路(例えば
ＰＩ３Ｋ)が活性化されるように、オリゴマー形成(例えばヘテロ二量体化)および／また
はＨＥＲ３リン酸化の増加により証明される。抗体またはそのフラグメントは、実施例に
記載するアッセイを使用して測定して、未処置(対照)細胞に対して、抗体またはそのフラ
グメントに暴露された刺激細胞におけるリン酸化ＨＥＲ３の量を統計学的有意に減少でき
る。ＨＥＲ３を発現する細胞は天然に存在する細胞株(例えばMCF7)でも、宿主細胞へのＨ
ＥＲ３タンパク質をコードする核酸の導入により組み換えにより産生されてもよい。細胞
刺激は活性化ＨＥＲ３リガンドの外因性添加または活性化リガンドの内因性発現により起
こり得る。
【００３１】
“細胞におけるニューレグリン誘発ＨＥＲ３活性化を減少する”抗体またはそのフラグ
メントは、実施例に記載するアッセイを使用して測定して、未処置(対照)細胞に対してＨ
ＥＲ３チロシンリン酸化を統計学的有意に減少させる。これは、ＨＥＲ３のＮＲＧおよび
目的の抗体への暴露後のＨＥＲ３ホスホチロシンレベルに基づき決定できる。ＨＥＲ３を
発現する細胞タンパク質天然に存在する細胞または細胞株(例えばMCF7)でも、組み換えに
より産生してもよい。
【００３２】
ここで使用する用語“リガンド非依存性シグナル伝達”は、リガンド結合に対する要求
非存在下での細胞性ＨＥＲ３活性(例えばリン酸化)を意味する。例えば、リガンド非依存
性ＨＥＲ３活性化は、ＨＥＲ２過発現またはＨＥＲ３ヘテロ二量体パートナー、例えばＥ
ＧＦＲおよびＨＥＲ２における活性化変異の結果であり得る。抗体またはそのフラグメン
トは、未処置(対照)細胞に対して、抗原結合タンパク質(例えば、抗体)に暴露された細胞
におけるリン酸化ＨＥＲ３の量を統計学的有意に減少できる。ＨＥＲ３を発現する細胞は
天然に存在する細胞株(例えばSK-Br-3)でも、宿主細胞へのＨＥＲ３タンパク質をコード
する核酸の導入による組み換えにより産生してもよい。
【００３３】
ここで使用する用語“遮断”は、相互作用または過程の停止または阻止、例えば、リガ
ンド依存性またはリガンド非依存性シグナル伝達停止を意味する。
【００３４】
ここで使用する用語“認識”は、立体構造エピトープを発見し、相互作用(例えば、結
合)する抗体またはそのフラグメントを意味する。
【００３５】
ここで使用する用語“同時結合”は、ＨＥＲ受容体上のリガンド結合部位にＨＥＲ抗体
と共に結合できるＨＥＲリガンドを意味する。これは、本抗体およびリガンドの両者がＨ
ＥＲ受容体に一緒に結合できることを意味する。単なる説明として、ＨＥＲ３リガンドＮ
ＲＧは、ＨＥＲ３受容体にＨＥＲ３抗体と共に結合できる。リガンドおよび抗体の同時結
合を測定するためのアッセイは実施例部分に記載する(例えば、Biacore)。
【００３６】
ここで使用する用語“失敗”は、特定の事象をもたらさない抗体またはそのフラグメン
トを意味する。例えば、“シグナル伝達の活性化を失敗した”抗体またはそのフラグメン
トはシグナル伝達を誘発しないもの；“立体構造変化の誘発に失敗した”抗体またはその
フラグメントは、ＨＥＲ受容体における構造変化を起こさないもの；ＨＥＲ受容体が“二
量体化に失敗する”ように不活性状態でＨＥＲ受容体を安定化する抗体またはそのフラグ
メントは、タンパク質−タンパク質複合体を形成しないものである。
【００３７】
ここで使用する用語“抗体”は、ＨＥＲ３エピトープと相互作用(例えば、結合、立体
障害、安定化／不安定化、空間配置により)し、シグナル伝達を阻害する全抗体を意味す
る。天然に存在する“抗体”は、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２個の
重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(こ
こではＶＨと略す)および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およ
びＣＨ３の３ドメインから成る。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖
定常領域から成る。軽鎖定常領域はＣＬである１ドメインから成る。ＶＨ領域およびＶＬ
領域はさらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれるより保存性の領域に分散した相補性
決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域に細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ
末端からカルボキシ末端に次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３
、ＦＲ４の順番で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから成る。重鎖および軽鎖の
可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリ
ンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体活性化経路の第
一補体(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合を仲介し得る。用語“抗体”は、例え
ば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆ
ｖｓ(ｓｃＦｖ)、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’)
フラグメントおよび抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体(例えば、本発明の抗体への抗Ｉｄ抗
体を含む)および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。抗体は任意のア
イソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、クラス(
例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサ
ブクラスのものであり得る。
【００３８】
軽鎖および重鎖のいずれも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語“定
常”および“可変”は機能的に使用する。これに関して、当然であるが、軽(ＶＬ)鎖およ
び重(ＶＨ)鎖部分の両者の可変ドメインは抗原認識および特異性を決定する。逆に、軽鎖
(ＣＬ)および重鎖(ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３)の定常ドメインは重要な生物学的特性、
例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。慣例により定常領
域ドメインの番号は抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるに連れて増える。
Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは実際そ
れぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００３９】
ここで使用する用語“抗体フラグメント”は、ＨＥＲ３エピトープと特異的に相互作用
し(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間配置により)、シグナル伝達を阻害
する能力を維持する抗体の１個以上の部分を意味する。結合フラグメントの例は、Ｆａｂ
フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメント；ヒン
ジ領域でジスルフィド架橋により結合した１個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメ
ントであるＦ(ａｂ)２フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメン
ト；抗体の単アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメイン
から成るｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および単離さ
れた相補性決定領域(ＣＤＲ)を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは別の遺伝子により
コードされるが、これらは、組み換え方法により、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価分
子を形成する、一タンパク質鎖として製造されることを可能とする合成リンカーによりあ
わせることができる(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al., (198
8) Science 242:423-426;およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:587
9-5883参照)。このような一本鎖抗体もまた用語“抗体フラグメント”に包含されること
が意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用法を使用して得て、フ
ラグメントを、インタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングする。
【００４１】
抗体フラグメントはまた一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二
重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも
含まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-113
6参照)。抗体フラグメントはポリペチドに基づきスキャフォールド、例えばフィブロネク
チンIII型(Ｆｎ３)に接木され得る(フィブロネクチンポリペチドモノボディを記載する米
国特許番号６,７０３,１９９参照)。
【００４２】
抗体フラグメントは、直列Ｆｖセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)の対を含む一
本鎖分子に包含され、相補的軽鎖ポリペチドと共に、抗原結合領域の対を形成し得る(Zap
ata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; および米国特許番号５,６４１,８７０)
。
【００４３】
用語“エピトープ”は、免疫グロブリンと特異的結合できるまたは他に分子と相互作用
する、あらゆるタンパク質決定基を意味する。エピトープ決定基は、一般的に分子の化学
活性表面グルーピング、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖から成り、特異的三
次元構造的特徴、ならびに特異的電荷特徴を有し得る。エピトープは“直線状”でも“立
体構造”でもよい。
【００４４】
用語“直線状エピトープ”は、タンパク質と相互作用分子(例えば抗体)の相互作用の全
ての点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線状に生じるエピトープを意味する
(連続的)。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば、本明細書に記載する技術
を使用して該エピトープに対する抗体を産生できる。あるいは、発見過程で、抗体の産生
および特徴づけは、望ましいエピトープに関する情報を明らかにし得る。この情報から、
続いて、同エピトープに対して結合抗体を競合的スクリーニングできる。これを達成する
ための方法は、互いに競合的に結合する抗体、例えば抗原に対する結合を競合する抗体を
発見するための交差競合試験の実施である。交差競合に基づく“ビンニング”抗体のため
のハイスループット方法は、国際特許出願番号ＷＯ２００３／４８７３１に記載されてい
る。当業者に認識されるとおり、抗体が特異的に結合できるものは実際的にエピトープで
あり得る。エピトープは、抗体が結合する残基を含み得る。
【００４５】
用語“立体構造エピトープ”は、不連続的アミノ酸が三次元立体構造となるエピトープ
を意味する。立体構造エピトープにおいて、相互作用の点は、互いに離れたタンパク質上
のアミノ酸残基を通して生じる。一つの態様において、エピトープは、本明細書の実施例
に記載するものである。一つの態様において、立体構造エピトープは、配列番号１の(ｉ)
ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５〜２７７および３１５(ドメイン２の)および(ii)ＨＥＲ３ア
ミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５
(ドメイン４の)またはそのサブセットにより定義される。当業者に認識されるとおり、分
子の形を作る残基または側鎖により占拠されている空間はエピトープが何であるかの決定
を助ける。
【００４６】
一般的に、特定の標的抗原に対する抗体特異的は、タンパク質および／または巨大分子
の複合体混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【００４７】
エピトープを含むポリペチドのある領域は、当分野で周知のエピトープマッピング技術
を任意に使用して同定できる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Mole
cular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Je
rsey参照。例えば、直線状エピトープは、例えば、固体支持体上に多数のペプチドを同時
に合成し、該ペプチドはタンパク質分子の部分に対応し、該ペプチドと抗体を、ペプチド
を支持体に結合させたまま反応させることにより決定できる。このような技術は当分野で
知られ、例えば、米国特許番号４,７０８,８７１；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. 
Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、
立体構造エピトープは、例えば、アミノ酸の空間的立体構造を、例えば、水素／重水素交
換、ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴によって決定することにより容易に同定できる。
例えば、Epitope Mapping Protocols, supra参照。タンパク質の抗原領域もまた、例えば
標準的抗原性およびヒドロパシープロットを使用して、例えば、Oxford Molecular Group
から入手可能なOmiga version 1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算することによ
り同定できる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの決定にHopp/Woods
法(Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828)を使用し、ヒドロパ
シープロットのためにKyte-Doolittle技術(Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-
132)を使用する。
【００４８】
ここで使用する用語“パラトープ”は、エピトープへの結合を決定する結合領域の一般
的構造を意味する。この構造は、結合領域がエピトープに結合するか否か、およびどのよ
うな方法で結合するかに影響する。パラトープは、抗体またはそのフラグメントを抗原性
決定基に結合させる、抗体の抗原性部位と意味することができる。パラトープはまた抗体
のイディオトープおよびエピトープに結合する相補的決定領域(ＣＤＲ)も意味する。一つ
の態様において、パラトープは、(ｉ)ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５〜２７７および３１５
(ドメイン２の)および(ii)配列番号１のＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、
５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５(ドメイン４の)またはそのサブセット
を含む立体構造エピトープと結合する抗体の領域である。一つの態様において、パラトー
プは、ＣＤＲ配列を含む抗体の領域である。一つの態様において、パラトープは、表１に
挙げる配列を含む。一つの態様において、パラトープは、ＨＥＲ３残基と結合する少なく
とも１個のアミノ酸残基を含む：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２
６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉ
ｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、
Ｌｙｓ５９７。一つの態様において、パラトープは、ＨＥＲ３残基と結合する少なくとも
１個のアミノ酸残基を含む：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０
、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６
０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。当業
者に認識されるとおり、抗体またはその変異体のパラトープは、本明細書に示す方法によ
り決定できる。
【００４９】
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”は、
アミノ酸配列が実質的に同一であるかまたは同じ遺伝的起源に由来する抗体、抗体フラグ
メント、二重特異性抗体などを含むポリペチドを意味する。この用語はまた単一分子組成
物の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、単一結合特異性および特定
のエピトープに対する親和性を示す。
【００５０】
ここで使用する用語“ヒト抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれもヒト
起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含むなら
ば、定常領域はまたこのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列
突然変異型配列またはヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配
列を含むヒト配列に由来する(例えば、Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86に
記載のとおり)。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、周
知の番号付けスキーム、例えば、Kabat番号付けスキーム、Chothia番号付けスキームまた
はKabat-Chothiaの組合せスキームを使用して規定し得る(例えば、Sequences of Protein
s of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991)
, eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et
al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Pub
lication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al
., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; 
およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948参照)。
【００５１】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでよい(例え
ば、インビトロでの無作為または部位特異的突然変異誘発により導入された変異またはイ
ンビボでの体細胞変異または安定性または製造容易性を増進するための保存的置換)。
【００５２】
ここで使用する用語“ヒトモノクローナル抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域
のいずれもヒト配列由来である可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を意味する
。一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入
遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例
えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される
。
【００５３】
ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、組み換え手段により製造、発現、創製ま
たは単離された全てのヒト抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェ
ニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離された抗体ま
たはそれらから調製されたハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿
主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組み換え、コンビナトリア
ルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまた
は一部のスプライシング、他のＤＮＡ配列に対する配列決定を含む他の手段により製造、
発現、創製または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワー
クおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を含む。ある
態様において、しかしながら、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(
または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用するとき、インビボ体細
胞突然変異誘発)に付し、それゆえに、組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ
酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連はしているものの、インビボ
でヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在し得ない配列であり得る。
【００５４】
２個の物体の間の特異的結合は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−
１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、
少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、
少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少な
くとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少な
くとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なく
とも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、
少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１
、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４
Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１または少なくとも５×１０１５Ｍ−１の平衡定数(Ｋ
Ａ)(ｋｏｎ／ｋｏｆｆ)での結合を意味する。
【００５５】
抗体(例えば、ＨＥＲ３結合抗体)に“特異的に(または選択的に)結合する”という用語
は、タンパク質および他の生物製剤の異種性集団中の同族抗原(例えば、ヒトＨＥＲ３)の
存在の決定因である結合反応を意味する。上記平衡定数(ＫＡ)に加えて、本発明のＨＥＲ
３結合抗体は、典型的にまた５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満
、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−
５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満
、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１
０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１
０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１
０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満また
はそれより低い解離速度定数(ＫＤ)(ｋｏｆｆ／ｋｏｎ)を有し、ＨＥＲ３に非特異的抗原
(例えば、ＨＳＡ)への結合に対する親和性より少なくとも２倍高い親和性で結合する。
【００５６】
一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ここに記載するまたは当業者に
知られた方法(例えば、Biacoreアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ)(Biacore Inte
rnational AB, Uppsala, Sweden)で評価して、３０００pM未満、２５００pM未満、２００
０pM未満、１５００pM未満、１０００pM未満、７５０pM未満、５００pM未満、２５０pM未
満、２００pM未満、１５０pM未満、１００pM未満、７５pM未満、１０pM未満、１pM未満の
解離定数(Ｋｄ)を有する。ここで使用する用語“Ｋａｓｓｏｃ”または“Ｋａ”は特定の
抗体−抗原相互作用の会合速度を意味し、一方、ここで使用する用語“Ｋｄｉｓ”または
“Ｋｄ”は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。ここで使用する用語“ＫＤ
”は、Ｋｄ対Ｋａ比(すなわちＫｄ／Ｋａ)により得られる解離定数を言い、モル濃度(Ｍ)
として表す。抗体のＫＤ価は、当分野で十分確立されている方法を使用して決定できる。
抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を使用するまたはバイオセンサーシス
テム、例えばBiacore(登録商標)システムを使用することによる。
【００５７】
ここで使用する用語“親和性”は、一抗原性部位での抗体と抗原の相互作用の強度を意
味する。各抗原性部位内で、抗体“アーム”の可変領域は、抗原と多くの部位で弱い非共
有結合的力を介して相互作用し、相互作用が多いほど、親和性が強くなる。
【００５８】
ここで使用する用語“結合活性”は、抗体−抗原複合体の全体的安定性または強度の情
報手段である。これは、抗体エピトープ親和性；抗原および抗体両者の結合価；および相
互作用部分の構造的配置である３つの主要な因子により制御される。最終的にこれらの因
子は抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が的確な抗原エピトープに結合する可能性を規
定する。
【００５９】
ここで使用する用語“結合価”は、ポリペチド中の潜在的標的結合部位の数を意味する
。各標的結合部位は、１個の標的分子または標的分子上の特異的部位(すなわち、エピト
ープ)と特異的に結合する。ポリペチドが１個を超える標的結合部位を含むとき、各標的
結合部位は、同一または異なる分子(例えば、異なる分子、例えば、同一分子上の異なる
抗原または異なるエピトープ)と特異的に結合し得る。
【００６０】
ここで使用する用語“アンタゴニスト抗体”は、ＨＥＲ３と結合し、ＨＥＲ３シグナル
伝達の生物学的活性を中和する、例えば、ホスホ−ＨＥＲ３またはホスホ−Ａｋｔアッセ
イにおいて、例えば、ＨＥＲ３誘発シグナル伝達活性を減少、減弱および／または阻害す
る抗体である。アッセイの例は後記実施例にさらに詳細に記載する。従って、当分野で知
られるおよびここに記載する方法に従い決定して、これらのＨＥＲ３機能的特性(例えば
、生化学、免疫化学、細胞、生理学的または他の生物学的活性など)の１個以上を“阻害
”する抗体は、該抗体非存在下(例えばまたは無関係の特異性の対照抗体が存在するとき)
に見られるものに対する特定の活性の統計学的に有意な減少と関連すると理解される。Ｈ
ＥＲ３活性を阻害する抗体は、測定パラメータの少なくとも１０％少なくとも５０％、８
０％または９０％の統計学的に有意な減少を起こし、ある態様において、本発明の抗体は
、細胞性ＨＥＲ３リン酸化レベルの減少により証明されるところによれば、ＨＥＲ３機能
的活性を９５％、９８％または９９％を超えて阻害し得る。
【００６１】
用語“単離抗体”は、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を
意味する(例えば、ＨＥＲ３と特異的に結合する単離抗体は、ＨＥＲ３以外の抗原と特異
的に結合する抗体を実質的に含まない)。ＨＥＲ３と特異的に結合する単離抗体は、しか
しながら、他の抗原と交差反応し得る。さらに、単離抗体は他の細胞性物質および／また
は化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００６２】
用語“保存的修飾変異体”はアミノ酸および核酸配列のいずれにも使用する。特定の核
酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコード
する核酸または核酸がアミノ酸配列をコードしないとき本質的に同一の配列を意味する。
遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸があるタンパク質をコードする。例え
ば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。
それゆえに、アラニンがコードにより特定される全ての位置で、該コドンは、コードされ
るポリペチドを変えることなく、記載した対応するコドンのいずれかに変えることができ
る。このような核酸多様性は“サイレント多様性”であり、これは、保存的修飾多様性の
１種である。ポリペチドをコードするここでの全ての核酸配列も、核酸の全ての可能なサ
イレント多様性を記載する。当業者は、核酸における各コドン(通常メチオニンの唯一の
コドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外)を修飾
して、機能的に同一の分子が得られることを認識する。従って、ポリペチドをコードする
核酸の各サイレント多様性は、記載した配列の各々に潜在する。
【００６３】
ポリペチド配列に関して、“保存的修飾変異体”は、あるアミノ酸の化学的に類似のア
ミノ酸への置換を起こす、ポリペチド配列への個々の置換、欠失または付加を含む。機能
的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当分野で周知である。このような保存的
修飾変異体は本発明の多型変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えられ、これらを除
外しない。次の８群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１)アラニン(Ａ)、グ
リシン(Ｇ)；２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；３)アスパラギン(Ｎ)、グルタ
ミン(Ｑ)；４)アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)；５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチ
オニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ
)；７)セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)；および８)システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)(例えば
、Creighton, Proteins (1984)参照)。ある態様において、用語“保存的配列修飾”は、
該アミノ酸配列が包含される抗体の結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸
修飾を意味するために使用する。
【００６４】
用語“交差競合”および“交差競合する”は、ここでは互換的に、抗体または他の結合
剤が、標準的競合的結合アッセイにおいてＨＥＲ３への他の抗体または結合剤の結合を妨
害する能力を意味するために使用する。
【００６５】
抗体または他の結合剤が他の抗体または結合分子のＨＥＲ３への結合を妨害する能力ま
たは程度、すなわち、本発明において交差競合と言えるか否かは、標準的競合結合アッセ
イを使用して決定できる。一つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴方法を使用して
相互作用の程度を測定できるBiacore法(例えばBiacore 3000装置(Biacore, Uppsala, Swe
den)の使用による)の使用を含む。交差競合を測定する他のアッセイはＥＬＩＳＡに基づ
く方法を使用する。
【００６６】
ここで使用する用語“最適化”は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般的
に真核細胞、例えば、ピキア属の細胞、トリコデルマ属の細胞、チャイニーズハムスター
卵巣細胞(ＣＨＯ)またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコー
ドするように変えられていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、“親”配列と
しても知られる出発ヌクレオチド配列により元々コードされていたアミノ酸配列を完全に
または最大限残すように加工する。
【００６７】
多様な種のＨＥＲ３に対して抗体の結合能力を評価する標準的アッセイは当分野で知ら
れ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適切なアッセイは実
施例に詳述する。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、当分野で知られた標準的アッ
セイ、例えばBiacore分析またはＦＡＣＳ相対親和性(Scatchard)により評価できる。ＨＥ
Ｒ３の機能的特性(例えば、Ｈｅｒ経路を調節する、受容体結合アッセイ)に対する抗体の
効果を評価するためのアッセイは実施例にさらに詳述する。
【００６８】
用語“同一パーセント”または“同一性パーセント”は、２個以上の核酸またはポリペ
チド配列について、同じである２個以上の配列または部分配列を意味する。２個の配列は
、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、または手動整列および目視により測定し
て比較ウィンドウまたは指定領域で最大一致について比較し、整列したとき、２個の配列
の特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一であるならば、“実質
的に同一”である(すなわち、特定の領域にわたり、または特定していないとき、全配列
にわたり６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９５％または９９％同一性)。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(ま
たは１０アミノ酸)長以上である領域、好ましくは１００〜５００または１０００または
それ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)である領
域にわたり存在する。
【００６９】
配列比較のために、典型的に１個の配列は参照配列として置き、それに対し試験配列を
比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに
入力し、必要であるならば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメ
ータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用しても、別のパラメータを指定
してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配
列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算する。
【００７０】
ここで使用する“比較ウィンドウ”は、配列を、２個の配列を最適に整列後同数の連続
位置の参照配列と比較し得る、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに一般的には
約１００〜約１５０から成る群から選択される連続位置の数のいずれか一つのセグメント
を意味する。比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。比較のための配列の最
適整列は、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性
アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性整列アル
ゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性
方オフの試験、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行(Wisconsin Genetics Soft
ware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動整列および目視(例えば、Bren
t et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)により実施できる。
【００７１】
配列同一性パーセントおよび配列類似度決定に適切な二つのアルゴリズムの例は、BLAS
TアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al., (1977) 
Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-
410にそれぞれ記載されている。BLAST解析実施用ソフトウェアはNational Center for Bi
otechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初にクエ
リー配列中の短ワード長Ｗの同定により高スコア配列対(ＨＳＰ)を同定し、これは、デー
タベース配列中の同じ長さのワードと整列したとき、ある正値閾値スコアＴとマッチする
かまたは充足する。Ｔは隣接ワードスコア閾値を意味する(Altschul et al., supra)。こ
れらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの探索を開始するための種
として作用する。ワードヒットは累積的整列スコアが増え続ける限り、各配列に沿って両
方向に伸長する。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ(整合残
基対の報酬スコア；常に＞０)およびＮ(不整合残基のペナルティスコア；常に＜０)を使
用して計算する。アミノ酸配列については、スコア付けマトリクスを使用して、累積的ス
コアを計算する。各方向でのワードヒット伸長は、累積的整列スコアがその達成した最大
価から数Ｘ落ちたとき、累積的スコアが１個以上の負のスコアの残基整列の蓄積により０
以下になったとき、またはいずれかの配列末端に達したとき停止する。BLASTアルゴリズ
ムパラメータＷ、ＴおよびＸは、感受性および整列速度を決定する。BLASTＮプログラム(
ヌクレオチド配列について)はデフォルトとしてワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)１０、Ｍ
＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTＰプログラ
ムは、デフォルトとして、ワード長３および期待値(Ｅ)１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコ
ア付けマトリクス(HenikoffおよびHenikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10
915参照)、整列(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用す
る。
【００７２】
BLASTアルゴリズムはまた２配列間の類似度の統計学的分析も行う(例えば、Karlin and
Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照)。BLASTアルゴリズ
ムにより提供される類似度の一つの指標は、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間
のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))である。例えば、核
酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０.２未満、より好ま
しくは約０.０１未満および最も好ましくは約０.００１未満であるならば、参照配列と類
似であると見なす。
【００７３】
２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペ
ナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2
.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-
17のアルゴリズムを使用する。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Bl
ossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２
、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧ
ソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)におけるＧＡＰプログラムに組み込ま
れている、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用
して決定できる。
【００７４】
上記配列同一性パーセンテージ以外に、２個の核酸配列またはポリペチドが実質的に同
一との他の指標は、下記のとおり、第一核酸によりコードされるポリペチドが、第二核酸
によりコードされるポリペチドに対して惹起した抗体と免疫学的に交差反応性であること
である。それゆえに、ポリペチドは、例えば、２個のペプチドが保存的置換によってのみ
異なるとき、第二ポリペチドと典型的に実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に
同一である他の指標は、下記のとおり２個の分子またはそれらの補体がストリンジェント
な条件下で互いにハイブリダイズすることである。２個の核酸配列が実質的に同一である
さらに他の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
【００７５】
用語“核酸”は、ここでは用語“ポリヌクレオチド”と互換的に使用し、一本鎖または
二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれら
のポリマーを意味する。本用語は、既知ヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基
または結合を含み、合成され、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照核酸と類似の
結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される核酸を意味する。このよう
なアナログの例は、ホスホロチオエート類、ホスホロアミデート類、メチルホスホネート
類、キラル−メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸
(ＰＮＡ)を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的修飾変異体(例えば、コドン置換
変性)および相補的配列、ならびに明示的に示す配列も潜在的に包含する。具体的に、下
記のとおり、コドン置換変性は、１個以上の選択した(または全)コドンの３位が混合残基
および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成し得る(Bat
zer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Ch
em. 260:2605-2608; およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98)。
【００７７】
用語“操作可能に結合”は、２個以上のポリヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)セグメント
間の機能的関係を意味する。典型的に、転写調節配列と転写配列との機能的関連を意味す
る。例えば、プロモータまたはエンハンサ配列は、適当な宿主細胞または他の発現系にお
いてコーディング配列の転写を刺激または調節するならば、コーディング配列に操作可能
に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合しているプロモータ転写調節配列
は、転写配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしな
がら、ある転写調節配列、例えばエンハンサは、転写を促進するコーディング配列に物理
的に連続しているか近接している必要はない。
【００７８】
用語“ポリペチド”および“タンパク質”は、ここでは互換的にアミノ酸残基のポリマ
ーを意味する。本用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の
人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーお
よび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。特に断らない限り、特定のポリペチ
ド配列はまたその保存的修飾変異体を潜在的に包含する。
【００７９】
用語“対象”はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は全脊椎動物、例えば、哺乳
動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、トリ、両生類および
爬虫類を含む。示していない限り、用語“患者”または“対象”はここでは互換的に使用
する。
【００８０】
用語“抗癌剤”は、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線治療剤、標的抗
癌剤および免疫治療剤を含む、細胞増殖性障害、例えば癌の処置に使用できる薬剤を意味
する。
【００８１】
“腫瘍”は、悪性であれ良性であれ、新生物細胞成長および増殖、および全前癌性およ
び癌性細胞および組織を意味する。
【００８２】
用語“抗腫瘍活性”は、腫瘍細胞増殖速度、生存能または転移活性の減少を意味する。
抗腫瘍活性を示す可能な方法は、治療中の異常細胞の増殖速度減少または腫瘍サイズ安定
化または減少の提示である。このような活性は、異種移植片モデル、同種移植片モデル、
ＭＭＴＶモデルおよび他の抗腫瘍活性の試験において当分野で知られた既知モデルを含む
が、これらに限定されない認められたインビトロまたはインビボ腫瘍モデルを使用して評
価できる。
【００８３】
用語“悪性腫瘍”は、非良性腫瘍または癌を意味する。ここで使用する、用語“癌”は
、調節解除されたまたは制御されない細胞増殖により特徴付けられる悪性腫瘍を意味する
。癌の例は、癌腫、肉腫、白血病およびリンパ腫を含む。用語“癌”は原発悪性腫瘍(例
えば、細胞が元の腫瘍以外の対象体内の他の部位に郵送していない)および二次的悪性腫
瘍(例えば、元の腫瘍の部位と異なる二次的部位への腫瘍細胞の遊走である転移)を含む。
【００８４】
本発明の種々の面を次のセクションおよびサブセクションでさらに詳述する。
【００８５】
ＨＥＲ受容体の構造および活性化機構
全４種のＨＥＲ受容体は細胞外リガンド結合ドメイン、一膜貫通型ドメインおよび細胞
質チロシンキナーゼ含有ドメインを有する。ＨＥＲ受容体の細胞内チロシンキナーゼドメ
インは高度に保存されているが、ＨＥＲ３のキナーゼドメインは、重大なアミノ酸の置換
を有し、それゆえにキナーゼ活性を欠く(Guy et al., (1994):PNAS 91, 8132-8136)。Ｈ
ＥＲ受容体のリガンド誘発二量体化は、キナーゼの活性化、Ｃ末端テイルのチロシン残基
の受容体トランスリン酸化、続く細胞内シグナル伝達エフェクターの動員および活性化を
誘発する(Yarden and Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen et al., (
2003) Exp Cell Res 284, 31-53)。
【００８６】
ＨＥＲの細胞外ドメインの結晶構造は、リガンド誘発受容体活性化の過程について幾分
見識を提供する(Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672)。各ＨＥＲ受容体の細胞外ド
メインは４サブドメインから成る：サブドメインＩおよびIIIはリガンド結合部位形成に
協調し、一方サブドメインII(およびおそらくサブドメインIV)は、直接受容体−受容体相
互作用を介する受容体二量体化に関与する。リガンド結合ＨＥＲ１の構造において、サブ
ドメインIIのβハルピン(二量体化ループと呼ばれる)はパートナー受容体の二量体化ルー
と相互作用し、受容体二量体化を仲介する(Garrett et al, (2002) Cell 110, 763-773; 
Ogiso et al., (2002) Cell 110, 775-787)。対照的に、不活性ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およ
びＨＥＲ４の構造において、二量体化ループは、サブドメインIVとの分子内相互作用に関
与し、これはリガンド非存在下での受容体二量体化を阻止する(Cho and Leahy, (2002) S
cience 297, 1330-1333; Ferguson et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Bouyan et a
l., (2005) PNAS102, 15024-15029)。ＨＥＲ２の構造はＨＥＲ群の中で独特である。リガ
ンド非存在下で、ＨＥＲ２は、他のＨＥＲ受容体との相互作用に利用可能な突出二量体化
ループと共に、ＨＥＲ１のリガンド活性化状態を模倣する立体構造を有する(Cho et al.,
(2003) Nature 421, 756-760; Garrett et al., (2003) Mol Cell 11, 495-505)。これ
は、ＨＥＲ２の亢進されたヘテロ二量体化能を説明し得る。
【００８７】
ＨＥＲ受容体結晶構造は、ＨＥＲ受容体ホモおよびヘテロ二量体化のモデルを提供する
が、あるＨＥＲホモおよびヘテロ二量体が他より多いこと(Franklin et al., (2004) Can
cer Cell 5, 317-328)ならびに受容体二量体化および自己阻害における各ドメインの立体
構造(Burgess et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoon et al., (2004) PNAS101
, 923-928)の役割はまた幾分未解明のままである。下記のとおり、ＨＥＲ３Ｘ線結晶構造
はさらなる見識を提供する。
【００８８】
ＨＥＲ３構造および立体構造エピトープ
抗原結合タンパク質、例えば、抗ＨＥＲ３抗体が結合する立体構造エピトープをここに
提供する。初めて、抗体と複合体化したＨＥＲ３の細胞外ドメインの切断型(残基２０〜
６４０)の三次元構造が示された。ＨＥＲ３−MOR09823 Fab複合体およびＨＥＲ３−MOR09
825は３.２Åおよび３.４Å分解能でそれぞれ決定されており、図５Ａに示す。ここでの
開示はまた初めて不活性状態のＨＥＲ３と結合し、該受容体を不活性状態で安定化させる
抗体またはそのフラグメントも示す。本発明の抗体はまたＨＥＲ３リガンド、例えばニュ
ーレグリンとＨＥＲ３受容体の同時結合を可能にする。
【００８９】
理論の提示は要求されないが、作用機序の一つの可能なモデルは、ＨＥＲ３が典型的に
不活性(閉鎖、係留)または活性(開放)状態で存在することである。リガンド結合は、ヘテ
ロ二量体パートナーを結合できる活性(開放)状態で存在するＨＥＲ３が下流シグナル伝達
を不活性化するように立体構造変化を誘発する。抗体、例えばMOR09823は不活性(係留)状
態のＨＥＲ３と結合するが、リガンド結合部位を遮断しない。抗体、例えばMOR09823は、
ＨＥＲ３が活性立体構造に遷移するために必要なリガンド誘発構造再配列の阻止によりＨ
ＥＲ３を阻害し、それによりシグナル伝達を阻止する。一つの態様において、本発明の抗
体またはそのフラグメントは不活性(係留)状態のＨＥＲ３と結合するが、リガンド結合部
位を遮断しない。他の態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３が活性立
体構造に遷移するために必要なリガンド誘発構造再配列の阻止によりＨＥＲ３を阻害し、
それによりシグナル伝達を阻止する。他の態様において、抗体またはそのフラグメントは
、ＨＥＲ３受容体を不活性状態または立体構造で安定化する(直接的に維持、ロック、係
留、保持、優先的結合または支持する)。一つの態様において、不活性ＨＥＲ３受容体は
、細胞表面ＨＥＲ３受容体喪失に至るような優先的内部移行または分解に感受性であり得
る。実施例セクションに示す生物学的データはこれらの態様を支持する。
【００９０】
ＨＥＲ３の結晶は、ＨＥＲ３またはその変異体をコードするヌクレオチド配列を適切な
宿主細胞で発現させ、関連ＨＥＲ３標的Ｆａｂ存在下で精製タンパク質を結晶化させるこ
とにより製造し得る。好ましくはＨＥＲ３ポリペチドは細胞外ドメインを含むが(ヒトポ
リペチドのアミノ酸２０〜６４０またはその切断変異体、好ましくはアミノ酸２０〜６４
０を含む)、膜貫通型および細胞内ドメインを欠く。
【００９１】
ＨＥＲ３ポリペチドはまた、例えば抽出および精製の助けとなるように、融合タンパク
質として製造してもよい。融合タンパク質パートナーの例は、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ(ＧＳＴ)、ヒスチジン(ＨＩＳ)、ヘキサヒスチジン(６ＨＩＳ)、ＧＡＬ４(
ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン)およびベータ−ガラクトシダーゼを含む
。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質パートナーと目的のタ
ンパク質配列の間にタンパク分解開裂部位を包含させるのも好都合である。
【００９２】
発現後、タンパク質を、例えば固定化金属親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィーおよび／またはゲル濾過により、精製および／または濃縮してよい。
【００９３】
タンパク質を、ここに記載する技術を使用して結晶化させ得る。一般に、結晶化工程に
おいて、タンパク質溶液含有液滴を結晶化緩衝液と混合し、密閉容器中で平衡化させる。
平衡化は既知技術、例えば“懸滴”または“座滴”方法により達成し得る。これらの方法
において、液滴をはるかに大きな結晶化緩衝液貯蔵部の上に吊るすかまたは横に置き、平
衡化を蒸気拡散により達成する。あるいは、平衡化を他の方法で、例えば油下、半透膜ま
たは自由界面拡散により行ってよい(例えば、Chayen et al., (2008) Nature Methods  5
, 147 - 153参照)。
【００９４】
結晶が得られたら、構造を既知Ｘ線回折技術で解析し得る。多くの技術が、近似相への
化学的修飾、例えば重原子誘導体化により修飾した結晶を使用する。実施に際し、結晶を
、結晶を通して拡散し、タンパク質表面に結合できる、重金属原子塩類または有機金属化
合物、例えば、塩化鉛、チオマレイン酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニル含有溶液に
浸漬する。結合重金属原子の位置を、次いで、浸漬結晶のＸ線回折分析により決定できる
。結晶の原子(散乱中心)によるＸ線の単色ビームの回折により得られたパターンを、数式
により解析して、数学的座標を得る。回折データを使用して、結晶の反復単位の電子密度
地図を計算する。相情報を得る他の方法は、分子置換として知られる技術である。この方
法において、回転性アルゴリズムおよび翻訳アルゴリズムを、関連構造に由来する検索モ
デルに適用し、目的のタンパク質について凡その方向を得る(Rossmann, (1990) Acta Cry
stals A 46, 73-82参照)。電子密度地図を使用して、結晶単位セル内の個々の原子の位置
を確定する(Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press)。
【００９５】
本明細書は、初めて、ＨＥＲ３および抗ＨＥＲ３抗体のＦａｂの三次元構造を記載する
。ＨＥＲ３の細胞外ドメインの凡そのドメイン境界は次のとおりである；ドメイン１：ア
ミノ酸２０〜２０７；ドメイン２：アミノ酸２０８〜３２８；ドメイン３：アミノ酸３２
９〜４９８；およびドメイン４：アミノ酸４９９〜６４２。ＨＥＲ３および抗体の三次元
構造はまた潜在的ＨＥＲ３モジュレーターに対する標的結合部位の同定も可能にする。好
ましい標的結合部位はＨＥＲ３の活性化に含まれるものである。一つの態様において、標
的結合部位は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内に位置する。それゆえに、ドメ
イン２またはドメイン４および好ましくは両ドメインに結合する抗体またはそのフラグメ
ントは、ドメインが互いに解離することを妨げることによりまたはドメインの相対位置を
修飾することにより、ＨＥＲ３活性化を調節する。それゆえに、抗体またはそのフラグメ
ントのドメイン２またはドメイン４内のアミノ酸残基への結合は、タンパク質を、活性化
を阻止する立体構造に適用させる。ここでの開示はまた、初めて、ＨＥＲ３リガンド、例
えばニューレグリンと同時に結合できる抗体またはそのフラグメントを示す。
【００９６】
ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、抗体またはそのフラグメントが、
ＨＥＲ３を共同受容体(ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４を含むが、これらに限定され
ない)と相互作用するのを妨げるように、ＨＥＲ３の特異的立体構造状態を認識する。あ
る態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体を不活または遮断状態
で安定化することによりＨＥＲ３が共同受容体と相互作用するのを阻止する。一つの態様
において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内の
アミノ酸残基との結合によりＨＥＲ３受容体を安定化させる。この不活性状態で、ドメイ
ン２内に位置する二量体化ループは露出せず、それゆえに、他の共同受容体(ＨＥＲ１、
ＨＥＲ２およびＨＥＲ４を含むが、これらに限定されない)との二量体化に利用できない
。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、配列番号１の(ｉ)ＨＥＲ３アミノ
酸残基２６５〜２７７および３１５(ドメイン２の)および(ii)ＨＥＲ３アミノ酸残基５７
１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５(ドメイン４の)
またはそのサブセットを含む立体構造エピトープを有するヒトＨＥＲ３タンパク質と結合
する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、配列番号１のアミノ酸残基２
６５〜２７７および３１５(ドメイン２の)および(ii)ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８
２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５(ドメイン４の)内のまた
は重複するアミノ酸と結合する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、配
列番号１のアミノ酸２６５〜２７７および３１５(ドメイン２の)および(ii)ＨＥＲ３アミ
ノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５(
ドメイン４の)またはそのサブセット内(および／またはこれらから成るアミノ酸配列)の
アミノ酸と結合する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ドメイン２お
よびドメイン４の移動性を制限し、不活性または閉鎖立体構造で安定化するように立体構
造エピトープと結合する。活性立体構造形成の失敗は、活性化シグナル伝達失敗をもたら
す。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ドメイン２内の二量体化ループ
を妨げ、それにより受容体−受容体相互作用のためにそれを利用不可能とするように立体
構造エピトープと結合する。ホモまたはヘテロ二量体形成失敗は、活性化シグナル伝達失
敗をもたらす。
【００９７】
他の面において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ受容体、例えばＨＥＲ３受容
体の立体構造エピトープと結合する。一つの態様において、抗体またはそのフラグメント
はＨＥＲ３受容体を不活性状態で安定化する。他の態様において、抗体またはそのフラグ
メントは活性状態のＨＥＲ３受容体と結合し、不活性状態にする。それゆえに、抗体また
はそのフラグメントは活性または不活性状態のＨＥＲ３と結合できるが、不活性状態の形
成を優先し、活性状態のＨＥＲ３を不活性状態とし、活性化シグナル伝達の阻止をもたら
す。
【００９８】
他の面において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ受容体、例えばＨＥＲ３受容体
の立体構造エピトープと結合し、ここで、抗体またはそのフラグメントの結合は、ＨＥＲ
３受容体を、ＨＥＲ３受容体が受容体−受容体複合体を形成するための共同受容体との二
量体化に失敗するように不活性状態で安定化させる。受容体−受容体複合体形成の不達成
は、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達の両者の活性化を
阻止する。
【００９９】
他の面において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ受容体、例えばＨＥＲ３受容体
の立体構造エピトープと結合し、ここで、抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体
への結合は、不活性受容体−受容体複合体を形成するための共同受容体との二量体化を可
能にする。不活性受容体−受容体複合体の形成は、リガンド非依存性シグナル伝達活性化
を阻止する。例えば、リガンド非依存性シグナル伝達において、ＨＥＲ３は不活性状態で
存在し得るが、しかしながらＨＥＲ２の過発現はＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体形成を起こし
、いずれにしてもこれらの得られた複合体は不活性であり、リガンド非依存性シグナル伝
達の活性化を阻止する。
【０１００】
記載した構造はまた抗体またはそのフラグメント(例えば、MOR09823)とＨＥＲ３の相互
作用界面の特異的コアＨＥＲ３アミノ酸残基の同定を可能にする。これは、MOR09823タン
パク質ＶＨ鎖から５Å以内の残基と定義された。コア残基は次のとおりである：Ａｓｎ２
６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒ
ｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、
Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。
【０１０１】
この構造はまた抗体またはそのフラグメント(例えば、MOR09823)内の相互作用界面につ
いての境界ＨＥＲ３アミノ酸残基の同定を可能にする。これらの残基は、MOR09823タンパ
ク質ＶＨ鎖から５〜８ÅであったＨＥＲ３残基であり得る。境界残基は次のとおりである
：Ｐｒｏ２６２、Ｖａｌ２６４、Ｔｙｒ２６５、Ｐｈｅ２７０、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２
７８、Ｌｙｓ３１４、Ｇｌｙ３１６、Ｇｌｕ３２１、Ａｓｎ５６６、Ｓｅｒ５６８、Ｇｌ
ｙ５６９、Ｓｅｒ５７０、Ｔｈｒ５７２、Ａｒｇ５８０、Ａｓｐ５８１、Ｇｌｙ５８２、
Ｇｌｙ５９５、Ｇｌｙ５９８、Ｉｌｅ６００。
【０１０２】
記載した構造はまた抗体またはそのフラグメント(例えば、MOR09823)とＨＥＲ３の相互
作用界面についての特異的コアＨＥＲ３アミノ酸残基の同定を可能にする。これは、MOR0
9823タンパク質ＶＬ鎖から５Å以内の残基と定義された。コア残基は次のとおりである：
Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８
３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ
６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。
【０１０３】
この構造はまた抗体またはそのフラグメント(例えば、MOR09823)との相互作用界面につ
いての境界ＨＥＲ３アミノ酸残基の同定を可能にする。これらの残基は、MOR09823タンパ
ク質ＶＬ鎖から５〜８ÅであったＨＥＲ３残基であり得る。境界残基は次のとおりである
：Ａｓｎ２６６、Ｔｈｒ２６９、Ａｓｐ５７１、Ａｒｇ５８０、Ａｓｐ５８１、Ｈｉｓ５
８４、Ｐｒｏ５９０、Ａｌａ５９６、Ｐｒｏ５９９、Ｔｙｒ６０１、Ｔｙｒ６０３、Ａｓ
ｐ６０５、Ｇｌｎ６０７、Ｃｙｓ６１０、Ａｓｎ６１６、Ｃｙｓ６１７、Ｃｙｓ６２１、
Ｇｌｙ６２３、Ｐｒｏ６２４。
【０１０４】
表１１および１２(MOR09823)および表１３および１４(MOR09825)にそれぞれ証明すると
おり、重鎖は主に抗原結合タンパク質がエピトープ内のドメイン２のアミノ酸残基とおよ
び少ない相互作用でドメイン４のアミノ酸残基と結合することに関し、一方、軽鎖は、主
に、エピトープのドメイン４内のアミノ酸残基とおよび少ない相互作用でドメイン２内の
アミノ酸残基と結合と結合することに関する。
【０１０５】
従って、本教示を知った当業者は、抗原結合タンパク質のどの残基および領域が、抗原
結合タンパク質のＨＥＲ３と結合する能力を過度に阻害することなく変更できるか予測で
きる。
【０１０６】
コア相互作用界面アミノ酸は、ＨＥＲ３パートナータンパク質から５Åもしくはそれよ
り少なくとも１原子少ない全アミノ酸残基であると決定された。５Åは、ファンデルワー
ルス半径＋可能な水仲介水素結合内の原子を斟酌してコア領域カットオフ距離として選択
した。境界相互作用界面アミノ酸は、ＨＥＲ３パートナータンパク質から８Åまたはそれ
より少なくとも１原子少ない、コア相互作用一覧には包含されない全アミノ酸残基と決定
された。
【０１０７】
ある態様において、MOR09823と結合し、覆い、上記残基との相互作用を阻止する抗原結
合タンパク質を、ＨＥＲ３との結合または中和に使用し得る。ある態様において、抗体ま
たはそのフラグメントは、次のＨＥＲ３残基(配列番号１)の少なくとも１個と結合または
相互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７
１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ
３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。あ
る態様において、抗体およびそのフラグメントは、次のＨＥＲ３残基(配列番号１)の少な
くとも１個と結合または相互作用する：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐ
ｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２
、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６
１５。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、次のＨＥＲ３残基(配列番号
１)の少なくとも１個と結合または相互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ
２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐ
ｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４
、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７、Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２
７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌ
ｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。
ある態様において、抗体またはそのフラグメンは、次のＨＥＲ３残基(配列番号１)の組み
合わせと結合または相互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ
２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈ
ｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６
、Ｌｙｓ５９７、Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５
８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒ
ｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。ある態様におい
て、抗体またはそのフラグメントｂは、次のＨＥＲ３残基(配列番号１)の全てと結合また
は相互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２
７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓ
ｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７、
Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８
３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ
６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。ある態様において、抗体またはそ
のフラグメントは上記残基の１個以上から５Å以内である。ある態様において、抗体また
はそのフラグメントは上記残基の１個以上から５〜８Åである。ある態様において、抗体
またはそのフラグメントは、上記残基の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８
個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個
、３５個、４０個、４５個または５０個と相互作用し、遮断し、または８Å以内である。
【０１０８】
ＨＥＲ３およびＨＥＲ３：MOR09823の複合体の３Ｄ構造の利用可能性は、例えば、他の
ＨＥＲ３抗体をさらに詳細に調査するフレームワークを提供する。ＨＥＲ３の３Ｄ構造は
、あるものが細胞増殖を阻害し、あるものが刺激し、他のものは効果がないために、モノ
クローナル抗体についてのエピトープを位置づけ、それらの作用機序を推測することを可
能にする。MOR09823に対する立体構造エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２および４に位
置している。この受容体の３Ｄ構造の利用可能性は、これらの阻害剤の的確な作用機序の
決定およびＨＥＲ３受容体機能を妨害する新しい試みの設計を促進する。一つの態様にお
いて、本発明の抗体は、MOR09823と同じ立体構造エピトープに結合する。
【０１０９】
ある態様において、表１に挙げた抗体のいずれかと結合する立体構造エピトープが特に
有用である。ある態様において、ＨＥＲ３立体構造エピトープを使用して、ＨＥＲ３に結
合する抗体またはそのフラグメントを単離できる。ある態様において、ＨＥＲ３立体構造
エピトープを使用して、ＨＥＲ３に結合する抗体またはそのフラグメントを産生できる。
ある態様において、ＨＥＲ３立体構造エピトープをＨＥＲ３立体構造エピトープと結合す
る抗体またはそのフラグメントを作製するための免疫原として使用できる。ある態様にお
いて、ＨＥＲ３立体構造エピトープを動物に投与し、ＨＥＲ３と結合する抗体を続いて該
動物から得ることができる。
【０１１０】
ある態様において、抗体と接触するまたは抗体に包埋される残基を含むドメイン／領域
を、ＨＥＲ３(例えば、野生型抗原)における特異的残基を突然変異させ、抗体またはその
フラグメントが該変異体、または変異体ＨＥＲ３タンパク質と結合できるかを決定するま
たは野生型からの親和性変化を測定することにより同定できる。多数の個々の変異を製造
することにより、結合に直接役割を有するまたは変異が抗体と抗原の結合に影響を与え得
るように抗体と十分に極めて接近している残基を同定できる。これらのアミノ酸の知識か
ら、抗体と接触するまたは抗体に覆われる残基を含む抗原(ＨＥＲ３)のドメインまたは領
域を解明できる。既知技術、例えばアラニン走査を使用した突然変異誘発は、機能的に関
連するエピトープの定義を助ける。アルギニン／グルタミン酸走査プロトコルを使用する
突然変異誘発もまた使用できる(例えば、Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270
(37):21619-21625 and Zupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473
参照)。一般に、アルギニンおよびグルタミン酸は、これらのアミノ酸が荷電を有し、嵩
高く、それゆえに、変異が導入される抗原の領域における抗原結合タンパク質と抗原の結
合を破壊する可能性があるために、野生型ポリペチドにおいてはアミノ酸に置換されてい
る(典型的に個々に)。野生型抗原に存在するアルギニンはグルタミン酸に置き換える。多
様なこのような個々の変異体を得て、集めた結合結果を分析して、どの残基が結合に影響
するか決定できる。一連の変異体ＨＥＲ３抗原を創製し、この各々一変異を有する変異体
抗原である。種々のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントとの各変異体ＨＥＲ３抗原の結
合を測定し、選択した抗体またはそのフラグメントが野生型ＨＥＲ３(配列番号１)と結合
する能力を比較し得る。
【０１１１】
ここで使用する抗体またはそのフラグメントと突然変異体または変異体ＨＥＲ３との結
合の変更(例えば減少または増加)は、結合親和性(例えば、既知方法、例えば下記実施例
に記載するBiacore試験またはビーズベースのアッセイで測定して)、ＥＣ５０における変
化および／または抗原結合タンパク質の総結合能(例えば、抗原結合タンパク質濃度対抗
原濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明される)における変化(例えば減少)
があることを意味する。結合の顕著な変更は、変異残基が抗体またはそのフラグメントへ
の結合に関与していることを示す。
【０１１２】
ある態様において、結合の顕著な減少は、抗体またはそのフラグメントと変異体ＨＥＲ
３抗原の間の結合親和性、ＥＣ５０および／または能力が抗体またはそのフラグメントと
野生型ＨＥＲ３(例えば、配列番号１)の結合に対して１０％を超えて、２０％を超えて、
４０％を超えて、５０％を超えて、５５％を超えて、６０％を超えて、６５％を超えて、
７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えてま
たは９５％を超えて減少していることを意味する。
【０１１３】
ある態様において、抗体またはそのフラグメントの結合は、野生型ＨＥＲ３タンパク質
(例えば、配列番号１)と比較して１箇所以上(例えば、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所
、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所またはそれ以上)の変異を有する
変異体ＨＥＲ３タンパク質に対して顕著に減少または増加している。
【０１１４】
変異体形態は、配列番号１に示す野生型配列を参照して述べているが、当然であるが、
ＨＥＲ３の対立遺伝子またはスプライス変異体において、アミノ酸は異なり得る。このよ
うなＨＥＲ３の対立遺伝子形質について顕著に変更された結合(例えば、低いまたは高い
結合)を示す抗体またはそのフラグメントも意図される。
【０１１５】
抗体の一般的構造的側面に加えて、パラトープとエピトープの間のより特異的な相互作
用を構造的手法を介して試験し得る。一つの態様において、ＣＤＲの構造はパラトープに
寄与し、これを介して抗体はエピトープに結合できる。このようなパラトープの形態は多
くの方法で決定し得る。伝統的構造的試験手法、例えばＮＭＲまたはｘ線結晶学を使用で
きる。これらの手法はパラトープ単独またはエピトープに結合中の形を試験できる。ある
いは、分子モデルをインシリコで作成し得る。構造を、商用パッケージ、例えばAccelrys
(San Diego, Calif.)のInsightIIモデリングパッケージの助けを借りて相同性モデリング
を介して作成し得る。要約すれば、既知構造のタンパク質のデータベース、例えばProtei
n Data Bankに対して検索するために試験すべき抗体の配列を使用できる。既知構造との
相同タンパク質を同定したら、これらの相同タンパク質をモデリング鋳型として使用する
。可能な鋳型の各々を整列し、そうして、鋳型の構造に基づく配列整列を作成できる。未
知構造の抗体の配列を、次いで、これらの鋳型と整列させて、未知構造を有する抗体の分
子モデルを作成できる。当業者に認識されるとおり、このような構造をインシリコで作成
する多くの代替法があり、このいずれも使用し得る。例えば、QUANTA(Polygen Corp., Wa
ltham, Mass.)およびＣＨアーム(Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4:187)を用い
る米国特許番号５,９５８,７０８として発行されたHardman et al.に記載のものに準じる
方法を使用し得る(引用によりその全体を本明細書に包含させる)。
【０１１６】
パラトープの形が、可能なパラトープがエピトープと結合するか，そしてどのように結
合するかを決定するだけでなく、エピトープとパラトープの間の相互作用それ自体も変異
体抗体の設計における大きな情報源である。当業者には認識されるとおり、この相互作用
を試験できる多様な方法がある。ひとつの方法は、おそらく上記のとおり作成した構造的
モデルを使用し、次いで、とりわけ、パラトープとそのエピトープの間の立体構造および
方向性空間のMonte Carloサーチの実施を可能にするドッキングモジュールを有する例え
ばInsightII(Accelrys, San Diego, Calif.)を使用する。結果は、エピトープがパラトー
プとどこでどのように相互作用するかを推測できるものである。一つの態様において、エ
ピトープの一つのフラグメントまたは変異体のみを使用して対応する相互作用の決定を助
ける。一つの態様において、エピトープ全体を、パラトープとエピトープの間の相互作用
のモデリングに使用する。
【０１１７】
これらのモデル構造を使用して、どの残基がエピトープとパラトープの間の相互作用に
最も重要であるか予測できる。それゆえに、一つの態様において、どの残基を、抗体の結
合特徴を変えるために変化させるかを容易に選択できる。例えば、ドッキングモデルから
、パラトープのある残基の側鎖は、エピトープの結合を立体的に障害し、それゆえに、こ
れらの残基の小さな側鎖を有する残基への変更が有利であ可能性があることは明らかであ
る。これを多くの方法で決定できる。例えば、２個のモデルを単に調査し、官能基および
接近状態に基づき相互作用を推定し得る。あるいは、より有利なエネルギー相互作用を得
るために、上記のとおりエピトープとパラトープの反復対合を行い得る。また、抗体がエ
ピトープと結合し得る、別の方法で決定するために、抗体の多様な変異体のこれらの相互
作用も決定できる。また、所望である特定の特徴を有する抗体を得るために、抗体の構造
をどのように変えるべきかを決定するための多様なモデルを組み合わせることができる。
【０１１８】
上で決定したモデルを種々の技術により試験できる。例えば、相互作用エネルギーを、
どの変異体をさらに試験すべきかを決定するために上記プログラムで決定できる。また、
クーロン力およびファンデルワールス相互作用を使用して、エピトープと変異体パラトー
プの相互作用エネルギーを決定できる。また部位特異的突然変異誘発を使用して、抗体構
造における予測した変化が、実際結合特徴における所望の変化をもたらすかに使用する。
あるいは、モデルが正しいことを確認し、またはパラトープとエピトープの間で起こり得
る一般的結合テーマを決定するために、エピトープを変化させ得る。
【０１１９】
当業者に認識されるとおり、これらのモデルは本態様の抗体およびその変異体の製造に
必要なガイダンスを提供するが、おそらく、インビトロを介する、インシリコモデルの日
常的試験の実施がなお望ましいことがある。さらに、当業者に明らかなとおり、修飾はま
た抗体の活性に付加的副作用を有し得る。例えば、結合を強くすると予測される何らかの
変更が、大きな結合を誘発し得るが、また抗体の活性を減少または変更する他の構造的変
化も起こし得る。これが当てはまるか否かの決定は当分野で日常的であり、多くの方法で
達成できる。例えば、活性を、ＥＬＩＳＡ試験を介して試験できる。あるいは、サンプル
を、表面プラズモン共鳴デバイスの使用を介して試験できる。
【０１２０】
ＨＥＲ３抗体
本発明は、ＨＥＲ３の立体構造エピトープを認識する抗体を提供する。本発明は、ＨＥ
Ｒ３に対する一群の抗体がリガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達
経路のいずれも遮断できるとの驚くべき発見に基づく。ＨＥＲ３の特定の立体構造エピト
ープと結合する一群の抗体を表１に開示する。一つの態様において、抗体はリガンド依存
性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達の両者を阻害する。他の態様において、
抗体はＨＥＲ３と結合し、リガンド結合部位へのＨＥＲリガンド結合を遮断しない(すな
わちリガンドおよび抗体の両者が同時にＨＥＲ３に結合できる)。
【０１２１】
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と
特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号１５、３３、５１、６９、８７、１
０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２
８５、３０３、３２１、３３９、３５７および３７５のアミノ酸配列を有するＶＨドメイ
ンを含む。本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨ
ＥＲ３)と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号１４、３２、５０、６８
、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、
２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６および３７４のアミノ酸配列を有する
ＶＬドメインを含む。本発明はまたＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカ
ニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、下記表１に挙げたＶ
Ｈ  ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む。特に、本発明は
、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結
合する抗体を提供し、該抗体は、下記表１に挙げたＶＨ  ＣＤＲのいずれか一つのアミノ
酸配列を有する１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む(あ
るいは、これらから成る)。
【０１２２】
本発明の他の抗体は、ＣＤＲ領域において変異されているが、表１に記載する配列に示
すＣＤＲ領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一性
を有するアミノ酸を含む。ある態様において、表１に記載する配列に示すＣＤＲ領域と比
較したとき、ＣＤＲ領域において１個、２個、３個、４個または５個を超えないアミノ酸
が変異されているが、なお元の抗体のエピトープへの特異性を維持する変異アミノ酸配列
を含む。
【０１２３】
本発明の他の抗体は、フレームワーク領域において変異されているが、表１に記載する
配列に示すフレームワーク領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％ま
たは９８％同一性を有するアミノ酸を有する。ある態様において、表１に記載する配列に
示すフレームワーク領域と比較したときフレームワーク領域において１個、２個、３個、
４個、５個、６個または７個を超えないアミノ酸が変異されているが、なお元の抗体のエ
ピトープへの特異性を維持する変異アミノ酸配列を含む。本発明はまた、ＨＥＲ３タンパ
ク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体のＶＨ
、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。
【０１２４】
本発明のＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４からのアミノ酸残基
を含むＨＥＲ３の立体構造エピトープと結合する。
【０１２５】
【表１】
2020007349.tif 000002
【表２】
2020007349.tif 000003
【０１２６】
【表３】
2020007349.tif 000004
【表４】
2020007349.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2020007349.tif 000006
【表６】
2020007349.tif 000007
【０１２８】
【表７】
2020007349.tif 000008
【表８】
2020007349.tif 000009
【０１２９】
【表９】
2020007349.tif 000010
【表１０】
2020007349.tif 000011
【０１３０】
【表１１】
2020007349.tif 000012
【表１２】
2020007349.tif 000013
【０１３１】
【表１３】
2020007349.tif 000014
【表１４】
2020007349.tif 000015
【０１３２】
【表１５】
2020007349.tif 000016
【表１６】
2020007349.tif 000017
【０１３３】
【表１７】
2020007349.tif 000018
【表１８】
2020007349.tif 000019
【０１３４】
【表１９】
2020007349.tif 000020
【０１３５】
本発明の他の抗体は、アミノ酸または該アミノ酸をコードする核酸は変異されているが
、表１に記載する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、
９７％、９８％および９９％同一性を有するものを含む。ある態様において、表１に記載
する配列に示す可変領域と比較したとき可変領域において１個、２個、３個、４個または
５個を超えないアミノ酸が変異されているが、実質的に同じ治療活性を維持する変異アミ
ノ酸配列を含む。
【０１３６】
これらの抗体またはそのフラグメントの各々がＨＥＲ３に結合できるため、ＶＨ、ＶＬ
、完全長軽鎖および完全長重鎖配列(アミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列)は、他の本発明のＨＥＲ３結合抗体を創製するために“混合および整合
”させ得る。このような“混合および整合”したＨＥＲ３結合抗体を、当分野で知られた
結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例セクションに記載する他のアッセイ)を使
用して試験できる。これらの鎖を混合および整合するとき、特定のＶＨ／ＶＬ対合からの
ＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えなければならない。同様に特定の完全
長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置
き換えなければならない。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列を、構造的に類
似するＶＬ配列と置き換えなければならない。同様に特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合
からの完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えなければならない
。従って、一つの面において、本発明は、配列番号１５、３３、５１、６９、８７、１０
５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８
５、３０３、３２１、３３９、３５７および３７５から成る群から選択されるアミノ酸配
列を含む重鎖可変領域；および配列番号１４、３２、５０、６８、８６、１０４、１２２
、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６、２８４、３０２
、３２０、３３８、３５６および３７４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽
鎖可変領域を有する単離モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供し、ここで、
該抗体はＨＥＲ３(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル)に特異的に結合する。
【０１３７】
他の面において、本発明は、表１に記載する重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および
ＣＤＲ３またはこれらの組み合わせを含むＨＥＲ３結合抗体を提供する。抗体のＶＨ  Ｃ
ＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４、
８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７０
、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６０
、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５０
、３６２および３６８に示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号３、９、
２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２
９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１
９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０
９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３６９に示す。抗体のＶＨ
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、
７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６
、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６
、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６
、３５２、３６４および３７０に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号
５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、
１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、
２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、
２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５および３７１に示す
。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、
６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１
５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２
４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３
３６、３４８、３５４、３６６および３７２に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配
列は配列番号７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０
３、１１５、１２１、１３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９
３、２０５、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８
３、２９５、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および
３７３に示す。ＣＤＲ領域はKabatシステムを使用して描かれる(Kabat et al., (1991) S
equences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department o
f Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al., (1987)
J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; およびAl
-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948)。
【０１３８】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ１
；配列番号３のＣＤＲ２；配列番号４のＣＤＲ３；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号６のＣＤＲ２；および配列番号７のＣＤＲ３を含む。
【０１３９】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２０の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号２１のＣＤＲ２；配列番号２２のＣＤＲ３；配列番号２３の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号２４のＣＤＲ２；および配列番号２５のＣＤＲ３を含む。
【０１４０】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３８の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号３９のＣＤＲ２；配列番号４０のＣＤＲ３；配列番号４１の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号４２のＣＤＲ２；および配列番号４３のＣＤＲ３を含む。
【０１４１】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号５６の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号５７のＣＤＲ２；配列番号５８のＣＤＲ３；配列番号５９の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号６０のＣＤＲ２；および配列番号６１のＣＤＲ３を含む。
【０１４２】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号７４の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号７５のＣＤＲ２；配列番号７６のＣＤＲ３；配列番号７７の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号７８のＣＤＲ２；および配列番号７９のＣＤＲ３を含む。
【０１４３】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号９２の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号９３のＣＤＲ２；配列番号９４のＣＤＲ３；配列番号９５の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号９６のＣＤＲ２；および配列番号９７のＣＤＲ３を含む。
【０１４４】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１１０の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号１１１のＣＤＲ２；配列番号１１２のＣＤＲ３；配列番号１１３の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号１１４のＣＤＲ２；および配列番号１１５のＣＤＲ３を含む。
【０１４５】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号１２９のＣＤＲ２；配列番号１３０のＣＤＲ３；配列番号１３１の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号１３２のＣＤＲ２；および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。
【０１４６】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１４６の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号１４７のＣＤＲ２；配列番号１４８のＣＤＲ３；配列番号１４９の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号１５０のＣＤＲ２；および配列番号１５１のＣＤＲ３を含む。
【０１４７】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１６４の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号１６５のＣＤＲ２；配列番号１６６のＣＤＲ３；配列番号１６７の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号１６８のＣＤＲ２；および配列番号１６９のＣＤＲ３を含む。
【０１４８】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１８２の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号１８３のＣＤＲ２；配列番号１８４のＣＤＲ３；配列番号１８５の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号１８６のＣＤＲ２；および配列番号１８７のＣＤＲ３を含む。
【０１４９】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２００の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２０１のＣＤＲ２；配列番号２０２のＣＤＲ３；配列番号２０３の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２０４のＣＤＲ２；および配列番号２０５のＣＤＲ３を含む。
【０１５０】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２１８の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２１９のＣＤＲ２；配列番号２２０のＣＤＲ３；配列番号２２１の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２２２のＣＤＲ２；および配列番号２２３のＣＤＲ３を含む。
【０１５１】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２３６の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２３７のＣＤＲ２；配列番号２３８のＣＤＲ３；配列番号２３９の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２４０のＣＤＲ２；および配列番号２４１のＣＤＲ３を含む。
【０１５２】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２５４の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２５５のＣＤＲ２；配列番号２５６のＣＤＲ３；配列番号２５７の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２５８のＣＤＲ２；および配列番号２５９のＣＤＲ３を含む。
【０１５３】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２７２の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２７３のＣＤＲ２；配列番号２７４のＣＤＲ３；配列番号２７５の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２７６のＣＤＲ２；および配列番号２７７のＣＤＲ３を含む。
【０１５４】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２９０の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号２９１のＣＤＲ２；配列番号２９２のＣＤＲ３；配列番号２９３の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号２９４のＣＤＲ２；および配列番号２９５のＣＤＲ３を含む。
【０１５５】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３０８の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号３０９のＣＤＲ２；配列番号３１０のＣＤＲ３；配列番号３１１の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号３１２のＣＤＲ２；および配列番号３１３のＣＤＲ３を含む。
【０１５６】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３２６の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号３２７のＣＤＲ２；配列番号３２８のＣＤＲ３；配列番号３２９の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号３３０のＣＤＲ２；および配列番号３３１のＣＤＲ３を含む。
【０１５７】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３４４の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号３４５のＣＤＲ２；配列番号３４６のＣＤＲ３；配列番号３４７の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号３４８のＣＤＲ２；および配列番号３４９のＣＤＲ３を含む。
【０１５８】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３６２の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号３６３のＣＤＲ２；配列番号３６４のＣＤＲ３；配列番号３６５の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号３６６のＣＤＲ２；および配列番号３６７のＣＤＲ３を含む。
【０１５９】
具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１５のＶＨおよび配列番号
１４のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３３のＶ
Ｈおよび配列番号３２のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、
配列番号５１のＶＨおよび配列番号５０のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に
結合する抗体は、配列番号６９および配列番号６８のＶＬを含む。具体的態様において、
ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号８７のＶＨおよび配列番号８６のＶＬを含む。具体
的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１０５のＶＨおよび配列番号１０
４のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１２３のＶ
Ｈおよび配列番号１２２のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は
、配列番号１４１のＶＨおよび配列番号１４０のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥ
Ｒ３に結合する抗体は、配列番号１５９のＶＨおよび配列番号１５８のＶＬを含む。具体
的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１７７のＶＨおよび配列番号１７
６のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号１９５のＶ
Ｈおよび配列番号１９４のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は
、配列番号２１３のＶＨおよび配列番号２１２のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥ
Ｒ３に結合する抗体は、配列番号２３１のＶＨおよび配列番号２３０のＶＬを含む。具体
的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２４９のＶＨおよび配列番号２４
８のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号２６７のＶ
Ｈおよび配列番号２６６のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は
、配列番号２８５のＶＨおよび配列番号２８４のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥ
Ｒ３に結合する抗体は、配列番号３０３のＶＨおよび配列番号３０２のＶＬを含む。具体
的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３２１のＶＨおよび配列番号３２
０のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号３３９のＶ
Ｈおよび配列番号３３８のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は
、配列番号３５７のＶＨおよび配列番号３５６のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥ
Ｒ３に結合する抗体は、配列番号３７５のＶＨおよび配列番号３７４のＶＬを含む。一つ
の態様において、ＨＥＲ３抗体はアンタゴニスト抗体である。ある態様において、ＨＥＲ
３に結合する抗体は、表１に記載する抗体である。
【０１６０】
ここで使用する、ヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長鎖がヒト生殖系列免疫グロ
ブリン遺伝子を使用する系から得られるならば、特定の生殖系列配列の“産物である”ま
たはこれに“由来する”重鎖または軽鎖可変領域または完全長重鎖または軽鎖を含む。こ
のような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の
抗原で免疫化するかまたはファージ上に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー
を目的の抗原についてスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列
の“産物である”またはこれに“由来する”ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸
配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最
も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより
同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはこれに“由
来する”ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的
導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を有し得る。しかしながら、ＶＨまた
はＶＬフレームワーク領域において、選択したヒト抗体は、典型的に、ヒト生殖系列免疫
グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同
一であり、他種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と
比較したとき、ヒト抗体をヒトと同定するアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒト
抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列
が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％またはさらに少な
くとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。典型的に、組み換えヒト抗
体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリ
ン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０個を超えないアミノ酸差異を示す。ある
場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸
配列と５個を超えないまたは４個、３個、２個または１個を超えないアミノ酸差異を示し
得る。Kabatを使用した、代表的数のＨＥＲ３抗体についてＶＨおよびＶＬ生殖系列配列
を使用する異なる生殖系列化物(germlined versions)を、表２に示す。ＣＤＲ位置を太字
で強調する。表において生殖系列化(germlined)配列と共に使用した注記は次のとおりで
ある：MOR10701−ＶＨ＿３−０７はＶＨ生殖系列配列３−０７のフレームワーク領域内の
MOR10701  ＣＤＲループを意味し(命名法はVbaseに従う)、MOR10703−ＶＫ＿Ｌ１は、Ｖ
Ｋ＿Ｌ１の生殖系列フレームワーク領域のMOR10703からのＣＤＲを意味し、ここで、ＶＫ
はカッパ軽鎖である。
【０１６１】
【表２０】
2020007349.tif 000021
【表２１】
2020007349.tif 000022
【０１６２】
【表２２】
2020007349.tif 000023
【表２３】
2020007349.tif 000024
【０１６３】
【表２４】
2020007349.tif 000025
【０１６４】
【表２５】
2020007349.tif 000026
【０１６５】
【表２６】
2020007349.tif 000027
【０１６６】
ＶＨ−生殖系列化配列とＪＨセグメントの任意の組み合わせを使用できる。組み合わせ
の代表例を表５に示す。
【表２７】
2020007349.tif 000028
【０１６７】
ＶＬ−生殖系列化配列とＪＫセグメントの任意の組み合わせを使用できる。組み合わせ
の代表例を表６に示す。
【表２８】
2020007349.tif 000029
【０１６８】
ＶＨをＪＨとおよびＶＫをＪＫと組み合わせたら、ＶＨまたはＪＨとＶＫまたはＪＫの
任意の組み合わせを使用できる。一つの態様において、各抗体について任意のＶＨ生殖系
列化領域を任意のＶＫ(ＶＬ)生殖系列化領域と組み合わせることができる。組み合わせの
代表的数の例を表７に示す。
【表２９】
2020007349.tif 000030
【０１６９】
一つの態様において、本発明は、Ｘａａ１−ＨＣＤＲ１−Ｘａａ２−ＨＣＤＲ２−Ｘａ
ａ３−ＨＣＤＲ３−Ｘａａ４の配列を含む重鎖可変領域に関し、ここで、重鎖ＨＣＤＲ１
、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は表１および２から選択される任意の重鎖ＣＤＲである。説明
のみを目的として、配列は：
Ｘａａ１−ＳＹＡＭＳ−Ｘａａ２−ＡＩＮＳＱＧＫＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ−Ｘａａ３−Ｗ
ＧＤＥＧＦＤＩ−Ｘａａ４(配列番号４９３)であってよく、ここで、
Ｘａａ１は任意の３０アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ２は任意の１４アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ３は任意の３２アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ４は任意の１１アミノ酸のフレームワーク領域である。
【０１７０】
一つの態様において、本発明は、Ｘａａ１−ＬＣＤＲ１−Ｘａａ２−ＬＣＤＲ２−Ｘａ
ａ３−ＬＣＤＲ３−Ｘａａ４の配列を含む軽鎖可変領域に監視、ここで、軽鎖ＬＣＤＲ１
、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は表１および２から選択される任意の軽鎖ＣＤＲである。説明
のみを目的として、配列は：
Ｘａａ１−ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ−Ｘａａ２−ガスＳＬＱＳ−Ｘａａ３−ＱＱＹＳＳＦ
ＰＴＴ−Ｘａａ４(配列番号４９４)であってよく、ここで、
Ｘａａ１は任意の２３アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ２は任意の１５アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ３は任意の３２アミノ酸のフレームワーク領域であり；
Ｘａａ４は任意の１０アミノ酸のフレームワーク領域である。
【０１７１】
ここに開示する抗体は一本鎖抗体、二重特異性抗体、ドメイン抗体、ナノボディおよび
ユニボディの誘導体であり得る。“一本鎖抗体”(ｓｃＦｖ)は、ＶＨドメインに結合した
ＶＬドメインを含む一ポリペチド鎖から成り、ここで、ＶＬドメインおよびＶＨドメイン
は対合して一価分子を形成する。一本鎖抗体は当分野で知られた方法に従い製造できる(
例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。“摘芽(disbud)”は２本の鎖から成り、各鎖は
、同ポリペチド鎖上の軽鎖可変領域に短ペプチドリンカーを介して結合した重鎖可変領域
を含み、ここで、同じ鎖上の２個の領域は互いに対合しないが、他の鎖上の相補的ドメイ
ンと対合して、二重特異性分子を形成する。二重特異性抗体の製造方法は当分野で知られ
ている(例えば、Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448お
よびPoljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123参照)。ドメイン抗体(ｄＡｂｓ)は抗
体の小さな機能的結合単位であり、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域に対応する。ドメイ
ン抗体は細菌、酵母および哺乳動物細胞系で十分発現する。ドメイン抗体およびその産生
方法のさらなる詳細は当分野で知られている(例えば、米国特許６,２９１,１５８；６,５
８２,９１５；６,５９３,０８１；６,１７２,１９７；６,６９６,２４５；欧州特許０３
６８６８４および０６１６６４０；ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、
ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ
０３／００２６０９参照)。ナノボディは、抗体の重鎖に由来する。ナノボディは典型的
に１個の可変ドメインおよび２個の定常ドメイン(ＣＨ２およびＣＨ３)を含み、元の抗体
の抗原結合能力を維持する。ナノボディは、当分野で知られる方法により製造できる(例
えば、米国特許番号６,７６５,０８７、米国特許番号６,８３８,２５４、ＷＯ０６／０７
９３７２参照)。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１個の軽鎖および１個の重鎖から成る。
ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により製造し得る。ユニボディおよびそ
の製造方法のさらなる詳細はＷＯ２００７／０５９７８２に見ることができる。
【０１７２】
相同抗体
さらに他の態様において、本発明は、表１に記載した配列と相同であるアミノ酸配列を
含む抗体またはそのフラグメントに関し、該抗体はＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトお
よび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と結合し、表１に記載した抗体の所望の機能的特性
を維持する。
【０１７３】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体(
またはその機能的フラグメント)に関し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１５、３３
、５１、６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３
１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７および３７５から成る群
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９
５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１４、３２、５０、６８
、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、
２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６および３７４から成る群から選択され
るアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であ
るアミノ酸配列を含み、該抗体はＨＥＲ３(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨ
ＥＲ３)と結合し、ＨＥＲ３のシグナル伝達活性を中和し、これは、リン酸化アッセイま
たは他のＨＥＲシグナル伝達の指標により測定できる(例えば、実施例に記載するホスホ
−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖およびリガンド遮断アッセイ)
。また本発明の範囲に包含されるのは、可変重鎖および軽鎖親ヌクレオチド配列；および
哺乳動物細胞での発現のための完全長重鎖および軽鎖配列最適化である。本発明の他の抗
体は、変異されているが、上記配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％または９８％同一性を有するアミノ酸または核酸を含む。ある態様において、上記配列
に示す可変領域と比較したとき、可変領域において１個、２個、３個、４個または５個を
超えないアミノ酸がアミノ酸欠失、挿入または置換により置換されている変異アミノ酸配
列を含む。
【０１７４】
他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示す配列と５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
であり得る。他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１個、２個、
３個、４個または５個を超えないアミノ酸位置のアミノ酸置換以外同一である。表１に記
載した抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と高い(すなわち、８０％以上)同一性を有するＶＨ
領域およびＶＬ領域を有する抗体は突然変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ仲介
突然変異誘発)、その後のここに記載する機能的アッセイを使用するコードされた改変さ
れた抗体の残存機能についての試験により得ることができる。
【０１７５】
他の態様において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記配列
と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
であり得る。
【０１７６】
ここで使用する、２配列間の“同一性パーセント”は、２配列の最適整列のために導入
する必要がある、ギャップ数およびギャップ長を考慮に入れた、これらの配列により共有
される同一位置の数の関数(すなわち、％同一性は同一位置数／位置の総数×１００であ
る)である。２配列間の配列比較および同一性パーセント決定は、下記非限定的例に記載
する数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
【０１７７】
これに加えてまたはこれ以外に、本発明のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配
列を同定するための、公的データベースに対する検索を実施するための“クエリー配列”
として使用できる。例えば、このような検索はAltschul et al., (1990) J.Mol. Biol. 2
15:403-10のBLASTプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。
【０１７８】
保存的修飾を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列
を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可
変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１個以上がここに記載する抗体またはその
保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、該抗体は本発明のＨＥＲ３結合抗体の所
望の機能的特性を維持する。
【０１７９】
従って、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領
域およびＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域から成る単
離されたＨＥＲ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供し、ここで、重鎖可
変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、
７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、
１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、
２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、
３５０、３６２および３６８およびその保存的修飾から成る群から選択され、重鎖可変領
域ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５
、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７
１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６
１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５
１、３６３および３６９およびその保存的修飾から成る群から選択され、重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３アミノ酸配列は配列番号４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、
８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７
２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６
２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５
２、３６４および３７０およびその保存的修飾から成る群から選択され、軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１アミノ酸配列は配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、
８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７
３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６
３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５
３、３６５および３７１およびその保存的修飾から成る群から選択され、軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ２アミノ酸配列は配列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、
８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７
４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６
４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５
４、３６６および３７２およびその保存的修飾から成る群から選択され、軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３アミノ酸配列は配列番号７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、
８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７
５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６
５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５
５、３６７および３７３およびその保存的修飾から成る群から選択され、該抗体またはそ
のフラグメントはＨＥＲ３に特異的に結合し、ＨＥＲシグナル伝達経路の阻害によりＨＥ
Ｒ３活性を中和し、これは、リン酸化アッセイまたは他のＨＥＲシグナル伝達の指標によ
り測定できる(例えば、実施例に記載するホスホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔア
ッセイ、細胞増殖およびリガンド遮断アッセイ)。
【０１８０】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１および図７に記載したＨＥＲ３結合抗体と同じエピトープと相互作用(
例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間配置による)する、抗体を提供する。
さらなる抗体は、それゆえに、ＨＥＲ３結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競
合(例えば、統計学的に有意な方法での結合の競合的阻害)する能力に基づき同定できる。
試験抗体が本発明の抗体のＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザ
ルＨＥＲ３)への結合を阻害する能力は、試験抗体がＨＥＲ３への結合について該抗体と
競合することを意味し、このような抗体は、理論に縛られないが、ＨＥＲ３タンパク質上
の競合する抗体と同じまたは関連(例えば、構造的に類似または空間的に近位)エピトープ
に結合する。ある態様において、ＨＥＲ３上の本発明の抗体と同じエピトープに結合する
抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体はここに記載
するとおり製造および単離できる。
【０１８１】
一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２およびド
メイン４の両者に結合し、ＨＥＲ３を不活性立体構造で保持し、これはドメイン２内に存
在する二量体化ループの露出を妨げる。これにより他のファミリーメンバー、例えばＨＥ
Ｒ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４とのヘテロ二量体化が妨げられる。抗体またはそのフラグ
メントはリガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達のいずれも阻害す
る。
【０１８２】
他の態様において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３のドメイン２およびドメイ
ン４の両者に、ＨＥＲ３リガンド、例えばニューレグリンの同時結合を遮断することなく
結合する。理論を述べる必要はないが、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４のいずれ
にも結合する抗体またはそのフラグメントが、ＨＥＲ３上のリガンド結合部位を遮断する
ことなくＨＥＲ３を不活性立体構造に保持することはありそうである。それゆえに、ＨＥ
Ｒ３リガンド(例えば、ニューレグリン)は本抗体またはそのフラグメントと同時にＨＥＲ
３に結合できる。
【０１８３】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のリガンド依存性および非依存性活
性化の両者を、リガンド結合を妨げることなく阻害する。これは次の理由から有利である
と考えられる：
(ｉ)  治療抗体は、各腫瘍型が各機構により誘導されるため、ＨＥＲ３活性化の一機構(
すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体よりも広域の腫瘍に
臨床的有用性を有する。
(ii)  治療抗体は、ＨＲ３活性化の両機構が同時に関与する腫瘍型に有用である。ＨＥＲ
３活性化の一機構(すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体は
これらの腫瘍型にほとんど効果がないかまったく効果がない。
(iii)  リガンド結合を妨げることなくＨＥＲ３のリガンド依存性活性化を阻害する抗体
の効果は、リガンドの濃度増加に悪影響を与える可能性が低い。これは、極めて高濃度の
ＨＥＲ３リガンドにより駆動される腫瘍型における効果の上昇または耐性がＨＥＲ３リガ
ンドの上方制御により仲介されるときの薬物耐性傾向の減少に反映される。
(iv)  不活性形態の安定化によりＨＥＲ３活性化を阻害する抗体は、ＨＥＲ３活性化の代
替機構により駆動される薬物耐性の傾向が低い。
【０１８４】
結果として、本発明の抗体は、既存の治療抗体が臨床的に無力である状態の処置に使用
し得る。
【０１８５】
操作および修飾抗体
本発明の抗体は、さらに、ここに示すＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上を有する
抗体を出発物質として使用して、修飾抗体を設計し、その修飾抗体は出発抗体から変更さ
れた特性を有し得る。抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／また
はＶＬ)内、例えば１個以上のＣＤＲ領域および／または１個以上のフレームワーク領域
内の１個以上の残基の修飾により操作し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は
、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基の修飾により操作
してよい。
【０１８６】
実施できる可変領域走査の一つのタイプはＣＤＲ移植である。抗体は、標的抗原と主に
６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して相互作用
する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも抗体毎によ
り多様性である。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を
有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した特異的天然に存在する抗体由来の
ＣＤＲ配列を含む発現ベクターの構築により、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣
する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann et al., (1998) Na
ture 332:323-327;Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) P
roc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許番号５,２２５,５３９お
よびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２お
よび６,１８０,３７０参照)。
【０１８７】
従って、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５
６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２
、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２
、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２
、３４４、３５０、３６２および３６８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する
ＣＤＲ１配列；配列番号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９
３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３
、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３
、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３
および３６９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号４
、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１
１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２
０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２
９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０から成る
群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；およびそれぞ
れ配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１
、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１
、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１
、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５および３
７１から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号６、１２、
２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１
３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２
２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３
１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２から成る群から選
択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号７、１３、２５、３１、４
３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３５、１３９、
１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２９、
２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１９、
３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３から成る群から選択されるアミノ
酸配列から成るＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離されたＨＥＲ３結合モノ
クローナル抗体またはそのフラグメントに関する。それゆえに、このような抗体はモノク
ローナル抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワ
ーク配列もなお含み得る。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を
含む公的ＤＮＡデータベースまたは公表された刊行物から得ることができる。例えば、ヒ
ト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は“Vase”ヒト生殖系列配列デー
タベース(インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseから入手可能)、ならびにKabat
et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 
U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Choth
ia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:8
77-883; およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Tomlinson et
al., (1992) J. fol. Biol. 227:776-798; およびCox et al., (1994) Eur. J Immunol.
24:827-836に見ることができ；これらの内容は、本明細書に引用により明示的に包含さ
せる。
【０１８８】
本発明の抗体で使用するためのフレームワーク配列の例は、選択した本発明の抗体によ
り使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用され
るコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するものである。
ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列をフレームワー
ク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一配列を有するフレ
ームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１個以上の変異を
含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合には抗体の抗原結合能力の維持
または亢進のためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判
明している(例えば、Queen et alの米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,
６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
【０１８９】
他のタイプの可変領域修飾は、“親和性成熟”として知られる、ＶＨおよび／またはＶ
Ｌ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それ
により目的の抗体の１個以上の結合特性(例えば、親和性)を改善させることである。部位
特異的突然変異誘発またはＰＣＲ仲介突然変異誘発を変異の導入のために行ってよく、目
的の抗体結合または他の機能的特性に対する影響をここに記載するおよび実施例に提供す
るインビトロまたはインビボアッセイで評価できる。保存的修飾(上記のとおり)を導入で
きる。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的にＣＤＲ領域内
の１個、２個、３個、４個または５個を超えない残基を変更する。
【０１９０】
従って、他の態様において、本発明は、配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５
６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４,１４６、１５２
、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２
、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２
、３４４、３５０、３６２および３６８から成る群から選択されるアミノ酸配列またはア
ミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付
加を有するアミノ酸配列から成るＶＨ  ＣＤＲ１領域；配列番号３、９、２１、２７、３
９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１
４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２
３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３
２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３６９から成る群から選択されるアミノ酸
配列または配列番号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、
９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１
８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２
７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３およ
び３６９と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加
を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号４、１０、２２、２８、４
０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、
１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、
２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、
３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０から成る群から選択されるアミノ
酸配列または配列番号４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９
４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８
４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７
４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６
４および３７０と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失また
は付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域；配列番号５、１１、２３、２
９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１
３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２
２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３
１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５および３７１から成る群から選択される
アミノ酸配列または配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８
３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３
、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３
、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３
、３６５および３７１と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠
失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号６、１２、２
４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３
２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２
２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１
２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２から成る群から選択
されるアミノ酸配列または配列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７
８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、
１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、
２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、
３５４、３６６および３７２と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置
換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；および配列番号
７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、
１２１、１３５、１３９、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、
２０５、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、
２９５、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７
３から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７、１３、２５、３１、４３、
４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３５、１３９、１３
９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２
９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１
９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３と比較して１個、２個、３個
、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  
ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域から成る、単離されたＨＥＲ３結合モノクローナル抗
体またはそのフラグメントに関する。
【０１９１】
抗体フラグメントの代替的フレームワークまたはスキャフォールドへの移植
得られたポリペチドがＨＥＲ３と特異的に結合する少なくとも１個の結合領域を含む限
り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを用いるこ
とができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドはヒト免疫グロブリンの
５個の主用なイディオタイプまたはそのフラグメントを含み、好ましくはヒト化側面を有
する他の動物種の免疫グロブリンを含む。新規フレームワーク、スキャフォールドおよび
フラグメントは当業者により発見および開発され続けている。
【０１９２】
一つの面において、本発明は、本発明のＣＤＲが移植できる非免疫グロブリンスキャフ
ォールドを使用する非免疫グロブリンに基づく抗体の製造方法に関する。現在または将来
的に知られる非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを、標的ＨＥＲ３
タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)に特異的な結合領域を含
む限り、用い得る。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、
フィブロネクチン(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular
Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAお
よびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, G
ermany)、小モジュラー免疫薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボ
ディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびア
フィリン(ガンマ結晶またはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含むが
、これらに限定されない。
【０１９３】
フィブロネクチンスキャフォールドはフィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブ
ロネクチンIII型の第１０モジュール(１０Ｆｎ３ドメイン))に基づく。フィブロネクチン
III型ドメインは、７個または８個のベータ鎖を有し、これは２個のベータシートに分散
し、これ自体互いに包装されて、タンパク質のコアを形成し、さらにループ(ＣＤＲに類
似)を含み、これはベータ鎖を互いに連結し、溶媒に晒される。ベータシートサンドイッ
チの各端に少なくとも３個のこのようなループがあり、ここで、該端はベータ鎖の方向に
対して垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８参照)。これらのフィブロネ
クチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的折り畳みは、ラク
ダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認識単位を含む重鎖の可変領域である、最小機能的抗
体フラグメントのものと密接に関連する。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、
自然に近い抗原結合特性および抗体の親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、
インビボの抗体親和性成熟の過程に類似するインビトロでのループ無作為化およびシャフ
リング方法に使用できる。これらのフィブロネクチンに基づく分子をスキャフォールドと
して使用でき、そこで、分子のループ領域を標準的クローニング技術を使用して本発明の
ＣＤＲに置き換えることができる。
【０１９４】
アンキリン方法は、アンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質を、異なる標的
への結合に使用できる可変領域を担持するスキャフォールドとして使用することに基づく
。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンから成る３３アミノ
酸ポリペチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用してほとんど最
適化される。
【０１９５】
アビマーは天然Ａドメイン含有タンパク質、例えばＨＥＲ３由来である。これらのドメ
インは、本来タンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトに置いて２５０を超える
タンパク質が構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合
する多くの異なる“Ａドメイン”モノマー(２−１０)から成る。アビマーは、例えば、米
国特許出願公開２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５
１２；および２００６０００８８４４に記載する方法を使用して、標的抗原に結合できる
ように創製できる。
【０１９６】
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個のスキャフ
ォールドに基づく３螺旋束から成る小さく、単純なタンパク質である。プロテインＡは黄
色ブドウ球菌である細菌由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは
５８アミノ酸から成り、そのうち１３個は無作為化されて、多数のリガンド変異体と共に
アフィボディライブラリーを産生する(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２参照)。アフィボデ
ィ分子は抗体を模倣し、１５０kDaである抗体の分子量と比較して、６kDaの分子量を有す
る。サイズが小さいにも係らず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものに類似する。
【０１９７】
アンチカリンはPieris ProteoLab AG社により開発された製品である。リポカリンに由
来し、通常化学的に感受性のまたは不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵する、小さ
く、堅牢なタンパク質のどこにでもある群である。数種の天然リポカリンはヒト組織また
は体液に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンを暗示し、強固なフレームワークの頂
上に超可変ループがある。しかしながら、抗体またはそれらの組み換えフラグメントとは
対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基の一ポリペチド鎖から成り、一免
疫グロブリンドメインよりほんのわずかだけ大きい。結合ポケットを形成する４個のルー
プの組は明白な構造的可塑性を示し、多様な側鎖を許容する。結合部位は、それゆえに、
高親和性および特異性で異なる形の処方標的分子を認識するために、独自の工程で再形成
され得る。リポカリンファミリーの１タンパク質であるPieris Brassicaeのビリン結合タ
ンパク質(ＢＢＰ)は、４個のループの組の突然変異誘発によりアンチカリンを開発するた
めに使用されている。アンチカリンを記載する特許の一例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９
９１６８７３である。
【０１９８】
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性のために設計された
小非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリン分子を２個のライブラリーから極
めて迅速に選択でき、その各々は異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく。
アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対する構造的相同性を示さない。現在、２
種のアフィリンスキャフォールドが用いられ、その一方はヒト構造的眼水晶体タンパク質
であるガンマ結晶であり、他方は“ユビキチン”スーファーファミリータンパク質である
。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤
にほとんど耐性である。この高安定性は主にタンパク質のベータシート構造の伸長による
。ガンマ結晶由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載させ、“ユビキチン様
”タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載される。
【０１９９】
タンパク質エピトープ模倣物(ＰＥＭ)は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する
主二次構造であるタンパク質のベータハルピン二次構造を模倣する中程度のサイズの、環
状、ペプチド様分子(ＭＷ  １〜２kDa)である。
【０２００】
ある態様において、Ｆｃ領域を変えることにより、ＦａｂｓをサイレントＩｇＧ１形式
に変換する。例えば、表１の抗体をＩｇＧ形式に変えることができる。
【０２０１】
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル／マウス／
ラットＨＥＲ３)に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体
と比較して、本発明のヒトＨＥＲ３結合抗体は、ヒト対象に投与したとき、抗原性がさら
に低減されている。
【０２０２】
ヒトＨＥＲ３結合抗体は当分野で知られている方法を使用して産生できる。例えば、ヒ
ューマニアリング方法が非ヒト抗体の改変ヒト抗体への変換に使用されている。米国特許
公開２００５０００８６２５は、非ヒト抗体と比較して同じまたは良好な結合特徴を維持
しながら、抗体において非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域と置き換えるインビボ方法を
記載する。本方法は、非ヒト参照抗体の完全ヒト抗体への可変領域のエピトープ誘導置換
に依存する。得られたヒト抗体は、一般的に参照非ヒト抗体と構造的に関連しないが、参
照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。要約すると、連続的エピトープ誘導相
補性置換手法が、抗原の試験抗体への結合に応答するレポーターシステムの存在下、限定
的量の抗原に対する結合について、細胞を“コンペティター”と参照抗体の多様なハイブ
リッドのライブラリー(“試験抗体”)の間で競合させることにより可能となる。コンペテ
ィターは参照抗体またはその誘導体、例えば一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る。コンペ
ティターはまた参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工リガンドであ
り得る。コンペティターに対する唯一の条件は、参照抗体と同じエピトープに結合するこ
とおよび抗原結合について参照抗体と競合することである。試験抗体は、非ヒト参照抗体
由来の抗原結合Ｖ領域を共通しておよび多様な源、例えばヒト抗体のレパートリーライブ
ラリーから無作為に選択された他のＶ領域を有する。参照抗体からの共通Ｖ領域は、選択
が参照抗体に対する最高抗原結合忠実度に偏向されるようにガイドとして働き、試験抗体
を抗原上の同じエピトープに同じ方向に配置する。
【０２０３】
多くのタイプのレポーターシステムを使用して、試験抗体と抗原の所望の相互作用を決
定できる。例えば、フラグメント相補性によるレポーター活性化が、試験抗体が抗原と結
合したときしか起こらないように、相補レポーターフラグメントをそれぞれ抗原および試
験抗体と関連させ得る。試験抗体−および抗原−レポーターフラグメント融合体がコンペ
ティターと共発現されたとき、レポーター活性化は、コンペティターと競合する試験抗体
の能力に依存性となり、これは、該抗原に対する試験抗体の親和性と比例する。使用でき
る他のレポーターシステムは、米国特許出願１０／２０８,７３０(公開番号２００３０１
９８９７１)に開示された自己阻害レポーター再活性化系(ＲＡＩＲ)のリアクティベータ
ーまたは米国特許出願１０／０７６,８４５(公開番号２００３０１５７５７９)に開示さ
れた競合的活性化システムを含む。
【０２０４】
連続的エピトープ誘導相補性置換システムで、コンペティター、抗原およびレポーター
成分と共に一試験抗体を発現する細胞を同定するために選択する。これらの細胞において
、各試験抗体は、限定的量の抗原への結合について一対一でコンペティターと競合する。
レポーターの活性は試験抗体に結合した抗原の量に比例し、これは試験抗体の抗原に対す
る親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体を、最初に、試験抗体として発現
されたとき参照抗体に対する活性に基づき選択する。第一回目の選択の結果は、一連の“
ハイブリッド”抗体であり、その各々は参照抗体由来の同じ非ヒトＶ領域およびライブラ
リー由来のヒトＶ領域から成り、その各々は抗原の参照抗体と同じエピトープに結合する
。第一回目で選択した１個以上のハイブリッド抗体は、抗原に対して参照抗体と同等また
は高い親和性を有する。
【０２０５】
第二Ｖ領域置換工程において、第一工程で選択したヒトＶ領域を、残りの非ヒト参照抗
体Ｖ領域について同族ヒトＶ領域の多様なライブラリーでのヒト置換の選択のためのガイ
ドとして使用する。第一回目で選択されたハイブリッド抗体はまた第二回目の選択のコン
ペティターとして使用できる。第二回目の選択の結果は、参照抗体と構造的に異なるが、
同じ抗原への結合について参照抗体と競合する一連の完全ヒト抗体である。選択したヒト
抗体のいくつかは、同じ抗原上の参照抗体と同じエピトープに結合する。これらの選択し
たヒト抗体の中で、１個以上が、参照抗体と同等または高い親和性で同じエピトープに結
合する。
【０２０６】
上に参照抗体として記載したマウスまたはキメラＨＥＲ３結合抗体の一つを使用して、
この方法を使用して、同じ結合特異性および同じまたは良好な結合親和性でヒトＨＥＲ３
と結合するヒト抗体を容易に産生できる。さらに、このようなヒトＨＥＲ３結合抗体はま
たヒト抗体を慣習的に製造する会社、例えば、KaloBios, Inc. (Mountain View, CA)から
商業的に得ることもできる。
【０２０７】
ラクダ科抗体
新世界メンバー、例えばラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)を含む
ラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)ファミリ
ーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象への抗原
性について特徴づけされている。哺乳動物のこのファミリー由来のある種のＩｇＧ抗体は
生来軽鎖を欠き、それゆえに、他の動物由来の抗体の２個の重鎖および２個の軽鎖の典型
的４鎖四次構造と構造的に区別されることが判明している。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１
４(１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７８)参照。
【０２０８】
ＶＨＨとして同定される小さな一可変ドメインであるラクダ科抗体の領域は、標的に対
して高親和性を有する小タンパク質を産生するために遺伝子操作することにより得ること
ができ、“ラクダ科ナノボディ”として知られる低分子量抗体由来タンパク質をもたらす
。１９９８年６月２日発行の米国特許番号５,７５９,８０８参照；またStijlemans et al
., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788;
Pleschberger et al., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo et al
., (2002) Int J Cancer 89:456-62; およびLauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-
3520も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは、例えば
、Ablynx、Ghent、Belgium(例えば、ＵＳ２００６０１１５４７０；Domantis(ＵＳ２００
７００６５４４０、ＵＳ２００９０１４８４３４)から商業的に入手可能である。非ヒト
起源の他の抗体と同様、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組み換えにより変更して、ヒト配
列をより密接に模倣する配列を得ることができ、すなわち、ナノボディを“ヒト化”でき
る。こうして、ラクダ科抗体のヒトに対する天然の低抗原性をさらに減らすことができる
。
【０２０９】
ラクダ科ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の１／１０の分子量であり、タンパク質はわず
か数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことによる一つの結果は、ラク
ダ科ナノボディが大型抗体タンパク質で機能的に探知されない抗原性部位に結合する能力
であり、すなわち、ラクダ科ナノボディは古典的免疫学的技術を使用して他の場合には隠
れている抗原を検出する試薬としておよび可能な治療剤として有用である。それゆえに、
サイズが小さいことによる別の結果は、ラクダ科ナノボディが標的タンパク質の溝または
狭い隙間における特異的部位への結合の結果阻害でき、それゆえに古典的抗体よりも古典
的低分子量剤の機能をより模倣した能力において役立ち得ることである。
【０２１０】
低分子量および小型サイズにより、さらに、ラクダ科ナノボディは極めて熱安定であり
、厳しいｐＨおよびタンパク分解消化に安定であり、抗原性が低い。他の結果は、ラクダ
科ナノボディが循環系から組織に容易に移動し、血液脳関門すら通過し、神経組織に影響
する障害を処置できることである。ナノボディはさらに血液脳関門を通過する薬物輸送を
促進できる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願２００４０１６１７３８参照。こ
れらの特性は、ヒトへの低抗原性と組み合わさって、大きな治療可能性を示す。さらに、
これらの分子は原核細胞、例えば大腸菌で完全に発現でき、バクテリオファージと融合タ
ンパク質で発現され、機能的である。
【０２１１】
従って、本発明の特性は、ＨＥＲ３に対する高親和性を有するラクダ科抗体またはナノ
ボディである。ここでのある種の態様において、ラクダ科抗体またはナノボディはラクダ
科動物で天然に産生され、すなわち、ラクダ科でここで他の抗体について記載した技術を
使用したＨＥＲ３またはそのペプチドフラグメントでの免疫化後に産生される。あるいは
、ＨＥＲ３結合ラクダ科ナノボディは改変され、すなわち、例えば、ここでの実施例に記
載するとおりＨＥＲ３を標的として用いるパニング法を使用した、突然変異誘発したラク
ダ科ナノボディタンパク質を適当に示すファージのライブラリーからの選択により製造す
る。改変ナノボディは、さらにレシピエント対象における４５分〜２週間の半減期を有す
るように遺伝子操作によりカスタマイズできる。具体的態様において、ラクダ科抗体また
はナノボディは、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、例えばＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９３／０２２１４に記載のとおり、ナノボディまたは一ドメイン抗体フレームワーク配
列に移植することにより得る。一つの態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、
次のＨＥＲ３残基の少なくとも１個と結合する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２
６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒ
ｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、
Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。一つの態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、
次のＨＥＲ３残基の少なくとも１個と結合する：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２
６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙ
ｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、
Ｇｌｕ６１５。
【０２１２】
二重特異性分子および多価抗体
他の面において、本発明は、本発明のＨＥＲ３結合抗体またはそのフラグメントを含む
二重パラトープ、二重特異性または多特異的分子に関する。本発明の抗体またはそのフラ
グメントを誘導体化または他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例
えば、他の抗体または受容体に対するリガンド)と結合して、少なくとも２つの異なる結
合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を産生できる。本発明の抗体は、実際、
誘導体化または１個を超える他の機能的分子と結合して、２個を超える異なる結合部位お
よび／または標的分子と結合する二重パラトープまたは多特異的分子を産生できる；この
ような二重パラトープまたは多特異的分子。本発明の二重特異性分子を製造するために、
本発明の抗体を、二重特異性分子が得られるように、１個以上の他の結合分子、例えば他
の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物と機能的に結合(例えば、化学カ
ップリング、遺伝的融合、非共有結合的結合またはその他)できる。
【０２１３】
さらに臨床的利益が、１抗体への２個以上の抗原の結合により提供され得る(Coloma et
al., (1997); Merchant et al., (1998); Alt et al., (1999); Zuo et al., (2000); L
u et al., (2004); Lu et al., (2005); Marvin et al., (2005); Marvin et al., (2006
); Shen et al., (2007); Wu et al., (2007); Dimasi et al., (2009); Michaelson et 
al., (2009)).  (Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt et al. (
1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13:361-367;
Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu et al., (2005) JBC 280:19665-19672;  Ma
rvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin et al., (2006)
Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen et al., (2007) J Immun Methods 218:
65-74; Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi et al., (2009) J M
ol Biol. 393:672-692; およびMichaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141)。
【０２１４】
二重特異性分子は、当分野で知られた方法を使用して、成分結合特異性をコンジュゲー
トすることにより製造できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に製造し、
次いで互いにコンジュゲートし、例えば、多様なカップリングまたは架橋剤を共有結合に
使用できる。架橋剤の例はプロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−
アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴ
ＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリ
ジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミ
ドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)(例えば、Karpovsk
y et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 82:8648)。他の方法はPaulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132; Brenn
an et al., (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al., (1987) J. Immunol. 139
: 2367-2375参照)に記載のものを含む。コンジュゲーション剤(Conjugating agent)はＳ
ＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co.(Rockford, IL)か
ら入手可能である。
【０２１５】
結合特異性が抗体であるとき、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合に
よりコンジュゲートできる。具体的態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前
に奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。
【０２１６】
あるいは、両結合特異性を同じベクターでコード化させ、発現させ、同じ宿主細胞で集
合させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×
Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき特に有用である。本発明
の二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２個の
結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個
の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子の製造方法は、例えば米国特許番号５,２６０,
２０３；米国特許番号５,４５５,０３０；米国特許番号４,８８１,１７５；米国特許番号
５,１３２,４０５；米国特許番号５,０９１,５１３；米国特許番号５,４７６,７８６；米
国特許番号５,０１３,６５３；米国特許番号５,２５８,４９８；および米国特許番号５,
４８２,８５８に記載されている。
【０２１７】
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬ
ＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＥＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害
)またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイの各々は、一
般的に特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を、目的の複合体に特異的な標識試薬
(例えば、抗体)を用いて検出する。
【０２１８】
他の面において、本発明は、本発明のＨＥＲ３に結合する抗体の少なくとも２個の同一
または異なるフラグメントを含む多価化合物を提供する。抗体フラグメントは、タンパク
質融合または共有結合または非共有結合的結合を介して互いに結合できる。四価化合物は
、例えば、本発明の抗体の抗体と本発明の抗体の定常領域と結合する抗体、例えばＦｃま
たはヒンジ領域の架橋により得ることができる。三量体形成ドメインは、例えばBoreanの
特許ＥＰ１０１２２８０Ｂ１に記載されている。五量体形成モジュールは例えばＰＣＴ／
ＥＰ９７／０５８９７に記載されている。
【０２１９】
一つの態様において、二重パラトープ／二重特異性は、ＨＥＲ３のドメイン２およびド
メイン４内のアミノ酸残基と結合する。
【０２２０】
他の態様において、本発明は、一モノクローナル抗体が抗原結合部位が１個を超える抗
原と結合するように修飾された二重機能抗体、例えばＨＥＲ３と他の抗原(例えば、ＨＥ
Ｒ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４)のいずれにも結合する二重機能抗体に関する。他の態様
において、本発明は、同じ立体構造を有する抗原、例えば“閉”または“不活性”状態の
ＨＥＲ３と同じ立体構造を有する抗原を標的とする二重機能抗体を提供する。“閉”また
は“不活性”状態のＨＥＲ３と同じ立体構造を有する抗原の例は、ＨＥＲ１およびＨＥＲ
４を含むが、これらに限定されない。それゆえに、二重機能抗体はＨＥＲ３とＨＥＲ１、
ＨＥＲ３とＨＥＲ４またはＨＥＲ１とＨＥＲ４に結合し得る。二重機能抗体の二重結合特
異性は、さらに二重の活性または活性阻害に反映され得る(例えば、Jenny Bostrom et al
., (2009) Science:323;1610-1614参照)。
【０２２１】
半減期が延長した抗体
本発明は、インビボでの半減期が延長したＨＥＲ３タンパク質と特異的に結合する抗体
を提供する。
【０２２２】
多くの因子がインビボでのタンパク質の半減期に影響し得る。例は、腎臓濾過、肝臓で
の代謝、タンパク分解酵素(プロテアーゼ類)での分解および免疫原性応答(例えば、抗体
によるタンパク質中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取り込み)である。多
様な戦略が本発明の抗体の半減期を伸ばすために使用できる。例えば、ポリエチレングリ
コール(ＰＥＧ)、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸(ＰＳＡ)
、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)、アルブミン結合リガンドおよび炭水化物シールド
への化学結合；血清タンパク質に結合するタンパク質、例えばアルブミン、ＩｇＧ、Ｆｃ
Ｒｎおよび移行への遺伝子融合；血清タンパク質に結合する他の結合部分、例えばナノボ
ディ、Ｆａｂｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンへのカッ
プリング(遺伝的または化学的)；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブ
ミン結合タンパク質およびＦｃへの遺伝子融合；またはナノ担体、徐放性製剤または医療
デバイスへの取り込み。
【０２２３】
インビボでの抗体の血清循環を延長するために、不活性ポリマー分子、例えば高分子量
ＰＥＧを、ＰＥＧの抗体のＮ末端またはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションまたは
リシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能的リンカーと共にまたは伴
わず、抗体またはそのフラグメントに結合できる。抗体をペグ化するために、抗体または
そのフラグメントは、典型的にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えばＰＥＧの反応性
エステルまたはアルデヒド誘導体と、１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメント
と結合する条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶
性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。ここで使用する
、用語“ポリエチレングリコール”は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているあら
ゆる形態のＰＥＧ、例えばモノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリ
エチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図す
る。ある態様において、ペグ化する抗体は非グリコシル化抗体である。生物学的活性の最
小限の喪失となる直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化を有する。コンジュゲーション程度
はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトロメトリーにより厳しくモニターし、抗体へのＰ
ＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確実にする。未反応ＰＥＧを、分子ふるいまたは
イオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。ＰＥ
Ｇ誘導体化抗体を、当業者に周知の方法を使用して、例えば、ここに記載した免疫アッセ
イにより結合活性ならびにインビボ有効性について試験できる。タンパク質のペグ化方法
は当分野で知られ、本発明の抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１
５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照。
【０２２４】
他の修飾ペグ化方法は、再構成化学的直交操作技術(ReCODE PEG)であり、これは、化学
的に特定の側鎖を生合成タンパク質に、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構
成システムを介して取り込む。この方法は、３０を超える新アミノ酸の大腸菌、酵母およ
び哺乳動物細胞における生合成タンパク質への取り込みを可能にする。ｔＲＮＡは非天然
アミノ酸を、アンバーコドンが位置する任意の場所に取り込み、アンバーを停止コドンか
ら化学的に特定のアミノ酸の取り込みのシグナルとなるものに変換する。
【０２２５】
組み換えペグ化方法(ｒＰＥＧ)も血清半減期延長に使用できる。この方法は、３００〜
６００アミノ酸の不定形タンパク質尾部に既存の医薬タンパク質を遺伝的融合させること
を含む。このような不定形タンパク質鎖の見かけの分子量がその実際の分子量の約１５倍
大きくなるため、タンパク質の血清半減期は、大きくのびる。化学コンジュゲーションお
よび再精製を必要とする伝統的ペグ化と比較して、製造工程は極めて単純であり、産物は
均質である。
【０２２６】
ポリシアル化は他の方法であり、これは、治療ペプチドおよびタンパク質の活性寿命を
延長し、安定性を改善するのに天然ポリマーポリシアル酸(ＰＳＡ)を使用する。ＰＳＡは
、シアル酸(糖)のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達にしようした
とき、ポリシアル酸はコンジュゲーションに保護的微小環境を提供する。これが循環中の
治療タンパク質の活性寿命を延ばし、免疫系により認識されるのを妨げる。ＰＳＡポリマ
ーはヒト体内で天然に見られる。何百万年もの間、壁をこれで覆うように進化したある種
の細菌により導入された。これらの天然にポリシアル化された細菌は、次いで、分子模写
により、体内の防御系から逃れることに成功した。ＰＳＡは、天然の最終的な隠蔽方法で
あり、このような細菌により大量に、予定された物理的特徴で産生できる。細菌ＰＳＡは
、ヒト体内でのＰＳＡと化学的同一である限り、タンパク質とカップリングしたときでさ
え完全に非免疫原性である。
【０２２７】
他の方法は、抗体に結合したヒドロキシエチルデンプン(“ＨＥＳ”)誘導体である。Ｈ
ＥＳは、蝋状トウモロコシ澱粉由来の修飾天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝さ
れ得る。ＨＥＳ溶液を、通常血液量不足を補い、血液のレオロジー的特性を改善するため
に投与する。抗体のヘシル化(hesylation)は、分子の安定性の増加ならびに腎クリアラン
ス減少により循環半減期の延長を可能にし、生物学的活性を高める。種々のパラメータ、
例えばＨＥＳの分子量を変えることにより、広範なＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマ
イズできる。
【０２２８】
インビボで長い半減期を有する抗体はまたＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合
フラグメント(好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント)への１個以上のア
ミノ酸修飾(すなわち、置換、挿入または欠失)の導入によっても産生できる。例えば、国
際公開番号ＷＯ９８／２３２８９；国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１；および米国特許
番号６,２７７,３７５参照。
【０２２９】
さらに、抗体または抗体フラグメントをインビボでより安定にし、またはインビボで半
減期を長くするために、抗体をアルブミンとコンジュゲートできる。本技術は当分野で周
知であり、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷ
Ｏ０１／７７１３７；および欧州特許番号ＥＰ４１３,６２２を参照のこと。
【０２３０】
ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントはまた１個以上のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)ポ
リペチドまたはその一部と融合させ得る。成熟形態で５８５アミノ酸のタンパク質である
ＨＳＡは、血清浸透圧の相当な割合を担い、また内因性および外因性リガンドの担体とし
て機能する。アルブミンの担体分子としての役割およびその不活性性質は、インビボでの
ポリペチドの担体および輸送体として使用するために望ましい特性である。種々のタンパ
ク質の担体としてアルブミン融合タンパク質の成分としてアルブミンを使用することは、
ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＥＰ４１３６２２に示唆されている
。ポリペチドへの融合のためのＨＳＡのＮ末端フラグメントの使用も提唱されている(Ｅ
Ｐ３９９６６６)。従って、抗体またはそのフラグメントのアルブミンへの遺伝的または
化学的融合またはコンジュゲートにより、インビトロおよび／またはインビボで溶液で安
定化でき、貯蔵寿命を延ばしおよび／または分子の活性を長時間維持できる。
【０２３１】
アルブミンの他のタンパク質への融合は、ＨＳＡまたはそのフラグメントをコードする
ＤＮＡが該タンパク質をコードするＤＮＡと連結するような遺伝子操作により達成できる
。次いで適切な宿主を融合ヌクレオチド配列で形質転換または形質移入し、融合ポリペチ
ドが発現されるように適切なプラスミド上に配置させる。発現は、インビトロで、例えば
、原核または真核細胞からまたはインビボで例えばトランスジェニック生物から行い得る
。ＨＳＡ融合に関連するさらなる方法は、例えば、ＷＯ２００１０７７１３７およびＷＯ
２００３０６００７に見ることができ、本明細書に引用により包含させる。具体的態様に
おいて、融合タンパク質の発現を哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株で行う。低また
は高ｐＨでの抗体の受容体に対する変えられた示差的結合も本発明の範囲内で考慮される
。例えば、抗体の親和性を、その受容体に低ｐＨ、例えば、リソソーム(lyzozome)内での
低ｐＨで結合し続けるように、抗体をさらなるアミノ酸、例えばヒスチジン(histine)を
抗体のＣＤＲに含むように修飾することにより、修飾してよい(例えば、Tomoyuki Igawa 
et al. (2010) Nature Biotechnology;28, 1203-1207参照)。
【０２３２】
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を産生するために異種タンパク質またはポリペチド(または
そのフラグメント、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少な
くとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少な
くとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペチド)と組み換え的融合または化学
的結合(共有結合および非共有結合の両者を含む)したＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合
する抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、ここに記載する抗体フラ
グメント(例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ(ａｂ
)２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  ＣＤＲ)およ
び異種タンパク質、ポリペチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパ
ク質、ポリペチドまたはペプチドを抗体または抗体フラグメントと融合または結合する方
法は当分野で知られている。例えば、米国特許５,３３６,６０３、５,６２２,９２９、５
,３５９,０４６、５,３４９,０５３、５,４４７,８５１および５,１１２,９４６；欧州特
許番号ＥＰ３０７,４３４およびＥＰ３６７,１６６；国際公開番号ＷＯ９６／０４３８８
およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 
88:10535-10539; Zheng et al., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; およびVil et al.
, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341参照)。
【０２３３】
さらなる融合タンパク質を、遺伝子混合、モチーフ混合、エクソン混合および／または
コドン混合(ここでは纏めて“ＤＮＡ混合”と呼ぶ)の技術を介して産生し得る。ＤＮＡ混
合は、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性改変に使用し得る(例えば、高親和性
および低解離速度の抗体またはそのフラグメント)。一般的に、米国特許５,６０５,７９
３、５,８１１,２３８、５,８３０,７２１、５,８３４,２５２および５,８３７,４５８；
Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trend
s Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およ
びLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313参照(これら特許および刊
行物の各々は、引用によりその全体を本明細書に包含させる)。抗体またはそのフラグメ
ントまたはコードする抗体またはそのフラグメントは、組換え前にエラープローンＰＣＲ
、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為突然変異誘発に付すことにより変
え得る。ＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードす
るポリヌクレオチドを１個以上の異種分子の１個以上の成分、モチーフ、セクション、パ
ーツ、ドメイン、フラグメントなどと組み換えし得る。
【０２３４】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、マーカー配列、例えば精製を容易にするため
のペプチドと融合し得る。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒス
チジンペプチド、例えばとりわけｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Cha
tsworth, CA, 91311)で提供されるタグであり、その多くが市販されている。Gentz et al
., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のとおり、例えば、ヘキサ−
ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。精製に有用な他のペプ
チドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球
凝集素(“ＨＡ”)タグ(Wilson et al., (1984) Cell 37:767)および“フラッグ”タグを
含むが、これらに限定されない。
【０２３５】
他の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは診断剤または検出可能剤と
オン樹ゲートできる。このような抗体は、臨床的試験法の一部として疾患または障害の発
症、進展、進行および／または重症度のモニタリングまたは予後診断、例えば特定の治療
の有効性の決定に有用であり得る。このような診断および検出は、例えば、オースラディ
ッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはア
セチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない種々の酵素；例えば、ストレ
プトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンであるがこれらに限定されない接合団
；例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロ
ーダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィ
コエリトリンであるが、これらに限定されない蛍光物質；例えば、ルミノールであるが、
これに限定されない発光物質；例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン
であるが、これらに限定されない生物発光物質；例えば、ヨウ素(１３１Ｉ、１２５Ｉ、
１２３Ｉおよび１２１Ｉ)、炭素(１４Ｃ)、硫黄(３５Ｓ)、トリチウム(３Ｈ)、インジウ
ム(１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ)、テクネチウム(９９Ｔｃ)、
タリウム(２０１Ｔｉ)、ガリウム(６８Ｇａ、６７Ｇａ)、パラジウム(１０３Ｐｄ)、モリ
ブデン(９９Ｍｏ)、キセノン(１３３Ｘｅ)、フッ素(１８Ｆ)、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、
１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１
８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５
Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１
１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎであるが、これらに限定されない放射性物質；および種々の
陽電子放出断層撮影および非放射性常磁性金属イオンを使用する陽電子放出金属を含むが
、これらに限定されない検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成できる
。
【０２３６】
本発明は、さらに治療部分とコンジュゲートした抗体またはそのフラグメントの使用を
包含する。抗体またはそのフラグメントは治療部分、例えば細胞毒、例えば、細胞増殖抑
制または細胞破壊的薬剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ−エミッタ
ーとコンジュゲートし得る。細胞毒または細胞毒性剤は細胞に有害な薬剤を含む。
【０２３７】
さらに、抗体またはそのフラグメントを、ある生物学的応答を修飾する治療部分または
薬物部分とコンジュゲートし得る。治療部分または薬物部分は古典的化学治療剤に限定さ
れると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク
質、ペプチドまたはポリペチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、毒素、例
えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素；タ
ンパク質、例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増
殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血
管形成剤；または生物学的応答修飾剤、例えば、例えば、リンホカインを含み得る。一つ
の態様において、抗ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントは治療部分、例えば細胞毒、薬
物(例えば、免疫抑制剤)または放射性毒素とコンジュゲートする。このようなコンジュゲ
ートはここでは“免疫コンジュゲート”と呼ぶ。１個以上の細胞毒を含む免疫コンジュゲ
ートは“免疫毒素”と呼ぶ。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害(例えば、殺す)薬剤
を含む。例はタクソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン
、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ.コ
ルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキ
サントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピ
ューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログを含む。治療剤はまた、例えば、代謝
拮抗剤(例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラ
ビン、５−フルオロウラシルデカルバジン)、切除剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ
クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＳＮＵ)およびロムスチン(ＣＣＮＵ)、
シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイ
トマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金(II)(ＤＤＰ)シスプラチン、アントラ
サイクリン類(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生
物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシ
ンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ))および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよび
ビンブラスチン)を含む(例えば、Seattle Genetics ＵＳ２００９０３０４７２１参照)。
【０２３８】
本発明の抗体とコンジュゲートできる治療細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン類、
カリチアマイシン類、マイタンシン類およびオーリスタチンおよびその誘導体を含む。カ
リチアマイシン抗体コンジュゲートの例は市販品である(MylotargTm;Wyeth-Ayerst)。
【０２３９】
細胞毒を、当分野で利用可能なリンカー方法を使用して本発明の抗体とコンジュゲート
できる。細胞毒を抗体とコンジュゲートするのに使用されているリンカータイプの例は、
ヒドラゾン類、チオエーテル類、エステル類、ジスルフィド類およびペプチド含有リンカ
ーを含むが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低ｐＨに感受性である
ようにまたはプロテアーゼ類、例えば腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼ類、例
えばカテプシン類(例えば、カテプシン類Ｂ、Ｃ、Ｄ)での分解に感受性であるようにリン
カーを選択できる。
【０２４０】
細胞毒のタイプ、リンカーおよび治療剤を抗体とコンジュゲートするための方法につい
てのさらなる記載は、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail
et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cel
l 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (200
2) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Dru
g Deliv. Rev. 53:247-264もまた参照のこと。
【０２４１】
本発明の抗体はまた放射性同位体とコンジュゲートして、放射免疫コンジュゲートとも
呼ぶ細胞毒性放射性医薬を産生し得る。診断的または治療的に使用するための抗体とコン
ジュゲートできる放射性同位体の例は、ヨウ素ｌ３１、インジウム１１１、イットリウム
９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射免疫コンジュゲート
の製造方法は当分野で確立されている。放射免疫コンジュゲートの例は、ZevalinＴＭ(DE
C Pharmaceuticals)およびBexxarＴＭ(Corixa Pharmaceuticals)を含む市販品であり、類
似方法を、本発明の抗体を使用する放射免疫コンジュゲートの製造に使用でいる。ある態
様において、大環状キレート剤は１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ’,
Ｎ”,Ｎ”’−四酢酸(ＤＯＴＡ)であり、これはリンカー分子を介して抗体に結合できる
。このようなリンカー分子は通常当分野で知られ、Denardo et al., (1998) Clin Cancer
Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およ
びZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載され、各々その全体
を引用により本明細書に包含させる。
【０２４２】
治療部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は周知であり、例えば、Arnon et al., “
Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoc
lonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Contro
lled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker,
Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: 
A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, P
inchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prosp
ective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in M
onoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp
. 303-16 (Academic Press 1985)およびThorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62:119-5
8を参照のこと。
【０２４３】
抗体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である固体支持体とも結合し得
る。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポ
リスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されな
い。
【０２４４】
抗体組み合わせ
他の面において、本発明は、他の治療剤、例えば他の抗体、小分子阻害剤、ｍＴＯＲ阻
害剤またはＰＩ３キナーゼ阻害剤と使用する本発明のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメン
トに関する。例は、次のものを含むが、これらに限定されない：
ＨＥＲ１阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ１阻害剤と共に使用でき
、これは、マツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ(Imclone)
、ベクティビックス(登録商標)／パニツムマブ(Amgen)、mAb 806およびニモツズマブ(The
raCIM)、イレッサ(登録商標)／ゲフィチニブ(Astrazeneca)；CI-1033(PD183805)(Pfizer)
、ラパチニブ(GW-572016)(GlaxoSmithKline)、タイケルブ(登録商標)／トシル酸ラパチニ
ブ(SmithKlineBeecham)、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)(OSI Pharm
a)およびPKI-166(Novartis)およびＮ−[４−[(３−クロロ−４−フルオロフェニル)アミ
ノ]−７−[[(３”Ｓ”)−テトラヒドロ−３−フラニル]オキシ]−６−キナゾリニル]−４
(ジメチルアミノ)−２−ブテンアミド(商品名Tovok(登録商標)でBoehringer Ingelheimが
販売)を含むが、これらに限定されない。
【０２４５】
ＨＥＲ２阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ２阻害剤と共に使用でき
、これは、ペルツズマブ(商品名Omnitarg(登録商標)でGenentechが販売)、トラスツマブ(
商品名Herceptin(登録商標)でGenentech／Rocheが販売)、MM-111、ネラチニブ(別名HKI-2
72、(２Ｅ)−Ｎ−[４−[[３−クロロ−４−[(ピリジン−２−イル)メトキシ]フェニル]ア
ミノ]−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル]−４−(ジメチルアミノ)ブト−２
−エナミドおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０２８４４３に記載)、ラパチニブまたはト
シル酸ラパチニブ(商品名タイケルブ(登録商標)でGlaxoSmithKlineが販売)を含むが、こ
れらに限定されない。
【０２４６】
ＨＥＲ３阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ３阻害剤と共に使用でき
、これは、MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Ave
o)、MEHD7945A(Genentech)およびＨＥＲ３を阻害する小分子を含むが、これらに限定され
ない。
【０２４７】
ＨＥＲ４阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ４阻害剤と共に使用でき
る。
【０２４８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＰＩ３キナーゼ阻害剤と共に使
用でき、これは、４−[２−(１Ｈ−インダゾール−４−イル)−６−[[４−(メチルスルホ
ニル)ピペラジン−１−イル]メチル]チエノ[３,２−ｄ]ピリミジン−４−イル]モルホリ
ン(別名GDC 0941およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０３６０８２およびＷＯ０９／０５５
７３０に記載)、２−メチル−２−[４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−
イル)−２,３−ジヒドロイミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル]プロピオニ
トリル(別名BEZ 235またはNVP-BEZ 235およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／１２２８０６に
記載)、BKM120およびBYL719を含むが、これらに限定されない。
【０２４９】
ｍＴＯＲ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをｍＴＯＲ阻害剤と共に使用でき
、これは、テムシロリムス(商品名トーリセル(登録商標)でPfizerが販売)、リダフォロリ
ムス(旧名称デフォロリムス、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−」[(１Ｒ,９Ｓ,１２
Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ
,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２
９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−
４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−
テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネー
ト、別名デフォロリムス、AP23573およびMK8669(Ariad Pharm.)およびＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ０３／０６４３８３に記載)、エベロリムス(RAD001)(商品名Afinitor(登録商標)でNova
rtisが販売)を含むが、これらに限定されない。１種以上の治療剤を、本発明のＨＥＲ３
抗体またはそのフラグメントの投与と同時に前にまたは後に投与し得る。
【０２５０】
本発明の抗体の製造方法
(ｉ)  抗体をコードする核酸
本発明は、上記ＨＥＲ３結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペチドをコ
ードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、ＨＥＲ３
抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域をコードす
るヌクレオチド配列を含む。具体的態様において、核酸分子は表１に同定したものである
。ある別の本発明の核酸分子は、表１に同定したヌクレオチド配列と実質的に同一(例え
ば、少なくとも６５、８０％、９５％または９９％)なヌクレオチド配列である。適当な
発現ベクターから発現されたとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
チドはＨＥＲ３抗原結合能力を示すことができる。
【０２５１】
また本発明で提供されるのは、上記ＨＥＲ３結合抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも１
個のＣＤＲ領域および通常全３個のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドである。い
くつかの他のポリヌクレオチドは、上記ＨＥＲ３結合抗体の重鎖および／または軽鎖の全
てまたは実質的に全ての可変領域配列をコードする。コード縮重のため、多様な核酸配列
が免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードする。
【０２５２】
本発明の核酸分子は抗体の可変領域および定常領域のいずれもコードし得る。本発明の
核酸配列のいくつかは、表１に示すＨＥＲ３抗体の成熟重鎖可変領域配列と実質的に同一
(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)な成熟重鎖可変領域配列をコードする
ヌクレオチドである。いくつかの他の核酸配列は、表１に示すＨＥＲ３抗体の成熟軽鎖可
変領域配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)な成熟軽鎖
可変領域配列をコードするヌクレオチドである。
【０２５３】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成またはＨＥＲ３結合抗体またはその結
合フラグメントをコードする既存配列(例えば、下記実施例に記載する配列)のＰＣＲ突然
変異誘発により製造できる。核酸の直接化学合成は当分野で知られる方法、例えばNarang
et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル方法；Brown et al., (197
9) Meth. Enzymol. 68:109のホスホジエステル方法；Beaucage et al., (1981) Tetra. L
ett., 22:1859のジエチルホスホロアミデート方法；および米国特許番号４,４５８,０６
６の固体支持方法により達成できる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異導入は
、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A
. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods a
nd Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattil
a et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; およびEckert et al., (1991) PCR Meth
ods and Applications 1:17に記載のとおり達成できる。
【０２５４】
また本発明で提供されるのは、上記ＨＥＲ３結合抗体の製造のための発現ベクターおよ
び宿主細胞である。種々の発現ベクターを、ＨＥＲ３結合抗体鎖または結合フラグメント
をコードするポリヌクレオチドの発現に使用できる。ウイルスベースおよび非ウイルス発
現ベクターの両方とも、哺乳動物宿主細胞での抗体の産生に使用できる。非ウイルスベク
ターおよびシステムは、プラスミド、典型的にタンパク質またはＲＮＡを発現するための
発現カセットを伴うエピソームベクターおよびヒト人工的染色体を含む(例えば、Harring
ton et al., (1997) Nat Genet 15:345参照)。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞での
ＨＥＲ３結合ポリヌクレオチドおよびポリペチド発現に有用な非ウイルスベクターは、pT
hioHis A、BおよびC、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、BおよびC(Invitrogen, San Diego, CA)
、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質を発現することが当分野で知られる多数の他の
ベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０を使用したベクター、乳頭腫ウイルス、ＨＢ
Ｐエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイル
ス(ＳＦＶ)に基づくベクターを含む。Brent et al., (1995) supra; Smith, Annu. Rev. 
Microbiol. 49:807; およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143参照。
【０２５５】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現する意図する宿主細胞による。典型的に、発現
ベクターは、ＨＥＲ３結合抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操
作可能に結合したプロモータおよび他の調節配列(例えば、エンハンサ)を含む。ある態様
において、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下以外での挿入配列の発現を阻止する
。誘導性プロモータは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ
またはヒートショックプロモータを含む。形質転換生物培養を、発現産物が宿主細胞に十
分に耐容性であるコーディング配列に対して集団を偏向させることなく、非誘導条件下で
伸長できる。プロモータに加えて、他の調節要素がＨＥＲ３結合抗体鎖またはフラグメン
トの効率的発現のために必要であるかまたは望ましいことがある。これらの要素は、典型
的にＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボゾーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発
現効率は、使用する細胞系への適当なエンハンサの導入により高められ得る(例えば、Sch
arf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125; およびBittner et al., (19
87) Meth. Enzymol., 153:516参照)。例えば、ＳＶ４０エンハンサまたはＣＭＶエンハン
サを、哺乳動物宿主細胞における発現増加に使用し得る。
【０２５６】
発現ベクターはまた挿入されたＨＥＲ３結合抗体配列によりコードされるポリペチドと
の融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供し得る。大抵、挿入され
たＨＥＲ３結合抗体配列は、ベクターへの挿入前にシグナル配列と結合する。ＨＥＲ３結
合抗体軽および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け入れるために使用するベクター
は、しばしば定常領域またはその一部もコードする。このようなベクターは、定常領域と
の融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それにより、インタクト抗体また
はそのフラグメントの産生に至る。典型的に、このような定常領域はヒトのである。
【０２５７】
ＨＥＲ３結合抗体鎖の担持および発現用の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な原核宿主の一つ
である。使用に適する他の微生物宿主は、桿菌、例えばバチルス・スブチリスおよび他の
腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチアおよび種々のシュードモナス種を含む。これら
の原核宿主において、典型的に宿主細胞に適合性の制御配列(例えば、複製開始点)を含む
発現ベクターも製造できる。さらに、任意の数の多様な周知のプロモータ、例えばラクト
ースプロモータシステム、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモータシステム、ベータ−ラクタ
マーゼプロモータシステムまたはファージラムダのプロモータシステムが存在し得る。プ
ロモータは、典型的に発現を、所望によりオペレータ配列と共に制御し、転写および翻訳
の開始および完了のためのリボゾーム結合部位配列などを含む。他の微生物、例えば酵母
も本発明のＨＥＲ３結合ポリペチドの発現に使用できる。バキュロウイルスベクターと組
み合わせた昆虫細胞も使用できる。
【０２５８】
ある好ましい態様において、哺乳動物宿主細胞を、本発明のＨＥＲ３結合ポリペチドの
発現および産生に使用する。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリド
ーマ細胞株(例えば、実施例に記載する１Ｄ６.Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン)また
は外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞株(例えば、下に例示するＳＰ２／０骨髄
腫細胞)であり得る。これらは、任意の正常致死または正常または異常不死動物またはヒ
ト細胞を含む。例えば、インタクト免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株
が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、
形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む。ポリペチド発現のための哺乳動物組織細胞
培養の使用は、一般的に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers,
N.Y., N.Y., 1987に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、発現
制御配列、例えば複製開始点、プロモータおよびエンハンサ(例えば、Queen et al., (19
86) Immunol. Rev. 89:49-68参照)および必要な処理情報部位、例えばリボゾーム結合部
位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネータ配列を含み得る
。これらの発現ベクター通常は、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモー
タを含む。適切なプロモータは構成的、細胞型特異的、段階特異的および／または調節可
能または制御可能であり得る。有用なプロモータは、メタロチオネインプロモータ、構成
的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメサゾン−誘導性ＭＭＴＶプロモータ、Ｓ
Ｖ４０プロモータ、MRP polIIIプロモータ、構成的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリ
ン−誘導性ＣＭＶプロモータ(例えばヒト最初期ＣＭＶプロモータ)、構成的ＣＭＶプロモ
ータおよび当分野で知られるプロモータ−エンハンサ組み合わせを含むが、これら限定さ
れない。
【０２５９】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの挿入方法は細胞性宿主のタイプによ
る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞で通常利用され、一方リン
酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞性宿主で使用され得る(一般
的にSambrook, et al., supra参照)。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リ
ン酸カルシウム処理、リポソーム仲介形質転換、注入および微量注入、弾道的方法、ビロ
ソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工
的ウイルス粒子、ヘルペスウイルス構造的タンパク質ＶＰ２２への融合(Elliot and O'Ha
re, (1997) Cell 88:223)、ＤＮＡ取り込みの薬剤による亢進およびエクスビボ形質導入
を含む。組み換えタンパク質の長期、高収率産生のために、安定な発現がしばしば望まれ
る。例えば、ＨＥＲ３結合抗体鎖または結合フラグメントを安定に発現する細胞株を、ウ
イルス複製開始点または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含む本発明の発
現ベクターを使用して製造できる。ベクター導入後、細胞を１〜２日間富化培地で増殖さ
せ、選択培地に移す。選択可能マーカーの目的は選択への耐性の付与であり、その存在に
より、選択培地中の導入配列の完全発現を成功させた細胞の増殖を可能にする。耐性の、
安定形質移入細胞を、細胞型に適当な組織培養技術を使用して増殖できる。
【０２６０】
(ii)  本発明のモノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)を、慣用のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler
and Milstein, (1975) Nature 256:495の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含
む多様な技術により製造できる。モノクローナル抗体製造のための多くの技術は、例えば
、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を使用し得る。
【０２６１】
ハイブリドーマ製造のための動物系はマウス系である。マウスで産生されるハイブリド
ーマは確立された方法である。免疫化プロトコルおよび融合のための免疫化脾細胞の単離
のための技術は当分野で知られている。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)およ
び融合法も知られている。
【０２６２】
本発明のキメラまたはヒト化抗体を、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体
の配列に基づき製造できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的の
マウスハイブリドーマから得て、標準的分子生物学技術を使用して非マウス(例えばヒト)
免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を製造するために、マ
ウス可変領域を、当分野で知られた方法を使用してヒト定常領域と結合できる(例えば、C
abilly et al.の米国特許番号４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を賛成するために、マ
ウスＣＤＲ領域を、当分野で知られた方法を使用してヒトフレームワークに挿入できる。
例えば、Winterの米国特許番号５２２５５３９およびQueen et alの米国特許５５３０１
０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０参照。
【０２６３】
ある態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＨＥＲ３に対する
このようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するト
ランスジェニックまたは染色体転移マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェ
ニックおよび染色体転移マウスは、ここではそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウス
と呼び、ここでは纏めて“ヒトＩｇマウス”と呼ぶ。
【０２６４】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)および
κ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座を、不活
性化内因性μおよびκ鎖座である標的変異と共に含む(例えば、Lonberg et al., (1994) 
Nature 368(6474):856-859参照)。従って、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現が低く
、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス転換および体細胞
変異に付され、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg et al., (1994
) supra; reviewed in Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:4
9-101; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93およびHarding and
Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546参照)。ＨｕＭＡｂマウスの産生
および使用およびこのようなマウスで行うゲノム修飾は、さらにTaylor et al., (1992) 
Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunolog
y 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Ch
oi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al., (1993) EMBO J. 12:821-
830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al., (1994) In
ternational Immunology 579-591; およびFishwild et al., (1996) Nature Biotechnolo
gy 14:845-851に記載され、その内容全体を引用によりその全体を特に本明細書に包含さ
せる。さらに、米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,
６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,
３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；全てLonbergおよびKay；Surani e
t al.の米国特許番号５,５４５,８０７；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９
２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２
、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et alのＰＣＴ公開
番号ＷＯ０１／１４４２４も参照のこと。
【０２６５】
他の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グ
ロブリン配列を担持するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を
担持するマウスを使用して惹起できる。このようなマウスは“ＫＭマウス”と呼び、Ishi
da et alのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳述されている。
【０２６６】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が当
分野で利用可能であり、本発明のＨＥＲ３結合抗体の惹起に使用できる。例えば、Xenomo
use(Abgenix, Inc.)と呼ぶ代替トランスジェニック系を使用できる。このようなマウスは
、例えば、Kucherlapati et alの米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１
１４,５９８；６、１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載されている。
【０２６７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替染色体転移動物系が当分野で利用可
能であり、本発明のＨＥＲ３結合抗体の惹起に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と呼
ぶヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両者を担持するマウスを使用でき、こ
のようなマウスはTomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に
記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載さ
れており(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明のＨＥＲ
３結合抗体の惹起に使用できる。
【０２６８】
ヒト本発明のモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをス
クリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用しても製造できる。ヒト抗体を
単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立され、下記実施例に
記載する。例えば：Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；お
よび５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１
７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；およびGri
ffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,
５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照。
【０２６９】
ヒト本発明のモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が免疫化によ
り産生されるように再構成されているＳＣＩＤマウスを使用しても製造できる。このよう
なマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６
７に記載されている。
【０２７０】
(iii)  フレームワークまたはＦｃ操作
改変された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／または
ＶＬ内のフレームワーク残基に修飾されているものを含む。典型的にこのようなフレーム
ワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすために行う。例えば、一つの手法は、１個以上の
フレームワーク残基の対応する生殖系列配列への“復帰突然変異”である。より具体的に
、体細胞変異に付された抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残
基を有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と抗体が由来する生殖系列配
列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、
体細胞変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発により生殖系列配列に“復帰突然変異”
させる。このような“復帰突然変異”抗体もまた本発明に包含されることを意図する。
【０２７１】
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜
在的免疫原性を減らすために、フレームワーク領域または１個以上のＣＤＲ領域内でさえ
１個以上の残基を突然変異させることを含む。この技法は“脱免疫原性化”と呼ばれ、Ca
rr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３にさらに詳述される。
【０２７２】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で成される修飾に加えてまたはそれとは別に、本発
明の抗体は、典型的に抗体の１個以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定化、Ｆ
ｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内に修飾を含
むように改変し得る。さらに、本発明の抗体は、同様に抗体の１個以上の機能的特性を変
えるために化学的修飾(例えば、１個以上の化学部分を抗体に結合できる)できまたはその
グリコシル化を変えるように修飾し得る。これらの態様の各々を下に詳述する。Ｆｃ領域
の残基の番号付けは、KabatのＥＵ指数である。
【０２７３】
一つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域におけるシステイン残基数が
変わるように、例えば、増えるまたは得るように修飾する。この技法はさらにBodmer et 
al.の米国特許番号５,６７７,４２５に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残
基数を、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するまたは抗体の安定性を上昇または減少
させるために変える。
【０２７４】
他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減らすように変
異する。より具体的に、１個以上のアミノ酸変異を、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインｐ
Ａ結合に対してブドウ球菌性プロテインＡ(ＳｐＡ)結合が障害されるように、Ｆｃ−ヒン
ジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この技法はさらにWard e
t al.の米国特許番号６,１６５,７４５に詳述される。
【０２７５】
さらに別の態様において、Ｆｃ領域を、抗体のエフェクター機能を変えるために少なく
とも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変える。例えば、１
個以上のアミノ酸を、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変わるが、親抗体の
抗原結合能力を維持するように異なるアミノ酸残基で置換する。親和性が変えられるエフ
ェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この技法は
、Winter et al.の米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０にさらに詳述され
る。
【０２７６】
他の態様において、アミノ酸残基から選択された１個以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ
結合が変えられおよび／または補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)が減らされるかまたはなくな
るように異なるアミノ酸残基で置換する。この技法は、Idusogie et al.の米国特許６,１
９４,５５１にさらに詳述される。
【０２７７】
他の態様において、１個以上のアミノ酸残基を変え、それにより、抗体が補体を固定す
る能力を変える。この技法はBodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに
詳述される。
【０２７８】
さらに他の態様において、Ｆｃ領域を、１個以上のアミノ酸修飾により、抗体が抗体依
存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を仲介する能力を高めるおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対
する親和性を高めるように修飾する。この技法はPrestaのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７
２にさらに詳述される。さらに、ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIII
およびＦｃＲｎに対する結合部位は位置づけられており、結合が改善された変異体が記載
されている(Shields et al., (2001) J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照)。
【０２７９】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗
体(すなわち、グリコシル化を欠く抗体)を製造できる。グリコシル化は、例えば、抗体の
“抗原”への親和性を高めるために変え得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体
配列内の１箇所以上のグリコシル化部位を変えることにより達成できる。例えば、１個以
上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除き、それによりその部位でのグリコシ
ル化を無くすような１個以上のアミノ酸置換を行う。このような非グリコシル化は、抗原
に対する抗体の親和性を高める。このような手法は、Co et al.の米国特許５,７１４,３
５０および６,３５０,８６１にさらに詳述される。
【０２８０】
これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、グリコシル化のタイプが変わるように修飾
でき、例えばフコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が
多い抗体である。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を
高めることが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が
変更された宿主細胞での抗体の発現により達成できる。グリコシル化機構が変えられた細
胞は文献に記載され、組み換え本発明の抗体を発現し、それによりグリコシル化が変えら
れた抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Hang et al.のＥＰ１,１７６,
１９５は、細胞株で発現された抗体が低フコシル化であるような、フコシルトランスフェ
ラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載する。PrestaのＰ
ＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合させ
る能力が減少し、また宿主細胞で発現された抗体が低フコシル化である変異体ＣＨＯ細胞
株、Ｌｅｃｌ３細胞を記載する(またShields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733
-26740参照)。Umana et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、改変細胞株で発現さ
れた抗体で二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加されるように糖タンパク質修飾グリコシルトラン
スフェラーゼ類(例えば、ベータ(１,４)−Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
III(ＧｎＴIII))が改変された細胞株を記載し、これは抗体のＡＤＣＣ活性を高める(また
Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180参照)。
【０２８１】
他の態様において、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。種々の手
法が可能である。例えば、Wardの米国特許番号６,２７７,３７５に記載のとおり次の変異
の１個以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半
減期を延長するために、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０
２２に記載のとおり、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で修飾して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣ
Ｈ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように変更で
きる。
【０２８２】
(iv)  改変抗体の製造方法
上記のとおり、ここで示すＶＨおよびＶＬ配列または完全長重鎖および軽鎖配列を有す
るＨＥＲ３結合抗体を使用して、完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／また
はＶＬ配列またはそれに結合した定常領域の修飾により新規ＨＥＲ３結合抗体を製造でき
る。それゆえに、本発明の他の面において、本発明のＨＥＲ３結合抗体の構造的特性を使
用して、本発明の抗体機能的特性の少なくとも１個、例えばヒトＨＥＲ３への結合を維持
し、またＨＥＲ３の１個以上の機能的特性を阻害する構造的に関連するＨＥＲ３結合抗体
の製造に使用する。例えば、本発明の抗体またはその変異の１個以上のＣＤＲ領域を、上
記のとおり、組み換え的に既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わ
せて、さらなる、組み換え的に改変された、本発明のＨＥＲ３結合抗体を製造できる。他
のタイプの修飾は先のセクションに記載したものを含む。製造方法のための出発物質は、
ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域
である。改変抗体を製造するために、実際ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の
１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体の製造(すなわち、タンパク質と
しての発現)が必要である。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元
の配列由来の“第二世代”配列を製造し、次いで“第二世代”配列を製造し、タンパク質
として発現させる。
【０２８３】
従って、他の態様において、本発明は、配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５
６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２
、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２
、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２
、３４４、３５０、３６２および３６８から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番
号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１
１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２
０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２
９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３６９から成る
群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号４、１０、２２、２８、４０、
４６、５８、６４、７５、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４
８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３
８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２
８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０から成る群から選択されるＣＤＲ３配
列を有する重鎖可変領域抗体配列；および配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、
５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１
５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２
４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３
３５、３４７、３５３、３６５および３７１から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配
列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１
１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２
０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２
９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２
から成る群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号７、１３、２５、３１
、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３３、１３
９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２
９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１
９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３から成る群から選択されるＣ
ＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列から成るＨＥＲ３結合抗体の製造方法であって
、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミ
ノ酸残基を少なくとも１個の変更された抗体配列を作るように変更し、変更された抗体配
列をタンパク質として発現させることを含む、方法を提供する。変更された抗体配列はま
たＵＳ２００５０２５５５５２に記載のとおり固定されたＣＤＲ３配列または最小必須結
合決定基およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーのスクリ
ーニングにより製造できる。スクリーニングは、抗体を抗体ライブラリーからスクリーニ
ングするのに適当なスクリーニング方法、例えばファージディスプレイ方法により実施で
きる。
【０２８４】
標準的分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を製造および発現できる。変更
された抗体配列によりコードされる抗体は、ここに記載するＨＥＲ３結合抗体の機能的特
性の１個、いくつかまたは全てを維持し、該機能的特性は、ヒトおよび／またはカニクイ
ザルＨＥＲ３への特異的結合を含み；該抗体はＨＥＲ３と結合し、ホスホ−ＨＥＲアッセ
イにおいてＨＥＲシグナル伝達活性阻害によりＨＥＲ３生物学的活性を中和する。
【０２８５】
変更された抗体の機能的特性は、当分野で利用可能なおよび／またはここに記載する、
例えば実施例に示す標準的アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)を使用して評価できる。
【０２８６】
本発明の抗体の製造方法のある種の態様において、変異を無作為にまたは選択的にＨＥ
Ｒ３結合抗体コーディング配列の全てまたは一部に導入でき、得られた修飾ＨＥＲ３結合
抗体を、ここに記載するとおり結合活性および／または他の機能的特性についてスクリー
ニングできる。変異的方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０
２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの
組み合わせを使用する抗体変異の創製およびスクリーニング方法を記載する。あるいは、
Lazar et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の生理化学特性を最適化する
ためのコンピュータ利用スクリーニング方法を記載する。
【０２８７】
本発明の抗体の特徴づけ
本発明の抗体は、種々の機能的アッセイにより特徴づけできる。例えば、ここに記載す
るホスホ−ＨＥＲアッセイにおけるＨＥＲシグナル伝達阻害により生物学的活性を中和す
る能力、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)への親
和性、エピトープビンニング、タンパク質分解に対する抵抗性およびＨＥＲ３下流シグナ
ル伝達を遮断する能力により特徴づけできる。種々の方法を使用して、ＨＥＲ３仲介シグ
ナル伝達を測定できる。例えば、ＨＥＲシグナル伝達経路は(ｉ)ホスホ−ＨＥＲ３測定；
(ii)ＨＥＲ３または他の下流シグナル伝達タンパク質(例えばＡｋｔ)のリン酸化測定、(i
ii)ここに記載するリガンド遮断アッセイ、(iv)ヘテロ二量体形成、(ｖ)ＨＥＲ３依存性
遺伝子発現特徴、(vi)受容体内部移行および(vii)ＨＥＲ３駆動細胞表現型(例えば増殖)
によりモニタできる。
【０２８８】
抗体がＨＥＲ３に結合する能力は、目的の抗体をラベリングすることにより直接的にま
たは該抗体はラベリングされてなくてよく、結合を間接的に当分野で知られる種々のサン
ドイッチアッセイ形式で検出できる。
【０２８９】
ある態様において、本発明のＨＥＲ３結合抗体は、ＨＥＲ３ポリペチドまたはタンパク
質への参照ＨＥＲ３結合抗体の結合を遮断または競合する。これらはまた完全ヒト上記Ｈ
ＥＲ３結合抗体であり得る。これらはまた参照抗体と同じエピトープに結合する他のマウ
ス、キメラまたはヒト化ＨＥＲ３結合抗体であり得る。参照抗体結合を遮断または競合す
る能力は、試験下のＨＥＲ３結合抗体が参照抗体で規定されるのと同じまたは類似のエピ
トープまたは参照ＨＥＲ３結合抗体が結合するエピトープと十分に近位のエピトープに結
合することを示す。このような抗体は、特に参照抗体で同定された有益な特性を共有する
可能性が高い。参照抗体を遮断または競合する能力は、例えば、競合結合アッセイにより
決定できる。競合結合アッセイで、試験下の抗体を、共通抗原、例えばＨＥＲ３ポリペチ
ドまたはタンパク質への参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験する。試験抗
体は、過剰の試験抗体が実質的に参照抗体の結合を阻害するならば、抗原への特異的結合
に対して参照抗体と競合する。実質的阻害は、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常少
なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％減らすことを意味する。
【０２９０】
ＨＥＲ３タンパク質への結合についてＨＥＲ３結合抗体と参照ＨＥＲ３結合抗体の競合
を評価するために使用できる多くの既知の競合結合アッセイがある。これらは、例えば、
固相直接または間接放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素免疫アッセイ(
ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:
242-253参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., (1986) J. Immuno
l. 137:3614-3619参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイHar
low & Lane, supra参照)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al.,
(1988) Molec. Immunol. 25:7-15参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et
al., (1990) Virology 176:546-552)；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., (19
90) Scand. J. Immunol. 32:77-82)を含む。典型的に、このようなアッセイは、これらの
非標識試験ＨＥＲ３結合抗体および標識参照抗体のいずれかを担持する固体表面または細
胞への精製抗原の結合の使用を含む。競合的阻害は、試験抗体存在下での固体表面または
細胞に結合した標識の量の決定により測定する。通常試験抗体は過剰に存在する。競合ア
ッセイ(競争抗体)で同定した抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および立
体障害が起きるのに参照抗体が結合したエピトープと十分に近位の隣接エピトープに結合
する抗体を含む。
【０２９１】
選択したＨＥＲ３結合モノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか否かを決定
するために、各抗体を、市販の試薬(例えば、Pierce, Rockford, ILの試薬)を使用してビ
オチニル化し得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を
使用する競合試験を、ＨＥＲ３ポリペチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して行い得る。
ビオチニル化ＭＡｂ結合をストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出
できる。精製ＨＥＲ３結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳ
Ａを実施できる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒトＩｇ
Ｇで、一夜、４℃で被覆し得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下のモノ
クローナルＨＥＲ３結合抗体または精製アイソタイプコントロールと、環境温度で１〜２
時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧｌまたはヒトＩｇＭ−特異的アルカリホスフ
ァターゼ−コンジュゲートプローブと反応させる。次いでプレートを発色させ、精製抗体
のアイソタイプが決定できるように分析する。
【０２９２】
モノクローナルＨＥＲ３結合抗体のＨＥＲ３ポリペチドを発現する生存細胞への結合を
証明するために、フローサイトメトリーを使用できる。要約すると、ＨＥＲ３発現細胞株
(標準的増殖条件下で増殖)を種々の濃度のＨＥＲ３結合抗体と、０.１％ＢＳＡおよび１
０％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ中で混合し、４℃で１時間インキュベートし得る。洗浄後、
細胞をフルオレセイン−標識抗ヒトＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させ
る。サンプルを、一細胞上で開閉される光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ
装置により分析できる。蛍光顕微鏡を使用する別のアッセイをフローサイトメトリーアッ
セイに加えてまたは変わりに使用できる。細胞をまさに長期のように染色し、蛍光顕微鏡
で試験できる。この方法は個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原密度により感受性が
低下し得る。
【０２９３】
本発明のＨＥＲ３結合抗体を、ウェスタンブロッティングによりＨＥＲ３ポリペチドま
たは抗原性フラグメントとの反応性についてさらに試験し得る。要約すると、精製ＨＥＲ
３ポリペチドまたは融合タンパク質またはＨＥＲ３発現細胞から抽出した細胞抽出物を調
製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。電気泳動後、分
離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清で遮断し、試験するモノク
ローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧ結合を、ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを
使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で発色で
きる。
【０２９４】
多くの読み出し情報を、リガンド誘発ヘテロ二量体形成の細胞ベースのアッセイにおけ
るＨＥＲ３抗体の有効性および特異性の評価に使用できる。活性を次の１個以上により評
価できる：
(ｉ)  標的細胞株、例えばMCF-7乳癌細胞中の他のＥＧＦファミリーメンバーでのＨＥＲ
２のリガンド誘発ヘテロ二量体化の阻害。細胞ライセートからのＨＥＲ２複合体の免疫沈
殿を、他のＥＧＦ受容体の非存在下／存在下で受容体−特異的抗体と共に実施でき、複合
体内のそれらの生物学的に関連するリガンドを他のＥＧＦ受容体に対する抗体のプロービ
ングによる電気泳動／ウェスタン伝達後に分析できる。
【０２９５】
(ii)  リガンド活性化ヘテロ二量体によるシグナル伝達経路活性化の阻害。ＨＥＲ３との
結合は、受容体のＥＧＦファミリーの他のメンバーがリガンド結合後に最大細胞性応答を
誘発するためのキーであるように見える。キナーゼ欠損ＨＥＲ３の場合、ＨＥＲ２は、後
の増殖因子リガンドの結合が起こるようにシグナル伝達を可能にするために機能的チロシ
ンキナーゼドメインを提供する。それゆえに、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を共発現する細胞
をリガンド、例えばヘレグリンで、阻害剤非存在下および存在下に処理し、ＨＥＲ３チロ
シンリン酸化に対する影響を処置細胞ライセートからのＨＥＲ３の免疫沈殿および続く抗
ホスホチロシン抗体を使用するウェスタンブロッティングを含む多くの方法によりモニタ
ーできる(詳細はAgus op. cit. 参照)。あるいは、Waddleton et al., (2002) Anal. Bio
chem. 309:150-157に記載のとおり、ハイスループットアッセイを、ＨＥＲ３を可溶化ラ
イセートを抗ＨＥＲ３受容体抗体で被覆した９６ウェルプレートのウェルに捕捉し、チロ
シンリン酸化を、例えば、ユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体を使用して測定するこ
とにより開発できる。
【０２９６】
この手法の拡大版として、活性化受容体ヘテロ二量体の下流を活性化することが知られ
るエフェクター分子、例えばマイトージェン−活性タンパク質キナーゼ群  (ＭＡＰＫ)お
よびＡｋｔを直接、処置ライセートから免疫沈殿し、これらのタンパク質の活性化形態を
検出する抗体とブロッティングするかまたはこれらのタンパク質が特異的基質を修飾／活
性化する能力を分析することにより分析してよい。
【０２９７】
(iii)  リガンド誘発細胞性増殖の阻害。多様な細胞株、例えば多くの乳房および前立腺
癌細胞株は、ＥｒｂＢ受容体の組み合わせを共発現することが知られている。アッセイを
２４／４８／９６ウェル形式で、ＤＮＡ合成(トリチウム標識チミジン取り込み)、細胞数
増加(クリスタルバイオレット染色)などに基づく読み出し情報で実施できる。
【０２９８】
多くの読み出し情報を使用して、リガンド非依存性ホモおよびヘテロ二量体形成の細胞
ベースのアッセイにおけるＨＥＲ３抗体の有効性および特異性を評価できる。例えば、Ｈ
ＥＲ２過発現は、自発性二量体形成の結果としてキナーゼドメインのリガンド非依存性活
性化を誘発する。過発現したＨＥＲ２は、他のＨＥＲ分子、例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ３お
よびＨＥＲ４とホモまたはヘテロ二量体を形成する。
【０２９９】
抗体またはそのフラグメントが、腫瘍原性表現型がＨＥＲ３ヘテロ二量体細胞シグナル
伝達のリガンド活性化に少なくとも一部依存性であることが知られるヒト腫瘍細胞株、例
えばBxPC3膵癌細胞などの腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻止する能力。これは、免疫
不全マウスを単独でまたは当該細胞株に適当な細胞毒性剤と組み合わせて用いて評価でき
る。機能的アッセイの例は下記実施例セクションにも記載する。
【０３００】
予防および治療使用
本発明は、有効量の本発明の抗体を処置を必要とする対象に投与することによる、ＨＥ
Ｒ３シグナル伝達経路と関連する疾患または障害の処置方法を提供する。具体的態様にお
いて、本発明は、有効量の本発明の抗体を処置を必要とする対象に投与することによる、
癌(例えば、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性
骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュ
ワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫
、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性
化乳房および子宮内膜症)の処置方法を提供する。ある態様において、本発明は、有効量
の本発明の抗体を処置を必要とする対象に投与することによる、ＨＥＲシグナル伝達経路
と関連する癌の処置または予防方法を提供する。
【０３０１】
具体的態様において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝
癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、
末梢神経鞘腫瘍シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、
軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺
肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症を含むが、これらに限定されないＨＥＲシグ
ナル伝達経路と関連する癌の処置方法を提供する。
【０３０２】
一つの態様において、本発明は、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントを使用する食道
癌の処置方法を提供する。
【０３０３】
一つの態様において、本発明は、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントを使用する良性
前立腺肥大(ＢＰＨ)の処置に関連する。ＢＨＰは、高齢男性に一般的な疾患であり、尿道
の圧迫を起こし、排尿および膀胱問題に至る前立腺の非新生物拡大により特徴付けられる
(Mahapokai1 W, van Sluijs FJ & Schalken JA. 2000 Prostate Cancer and Prostatic D
iseases 3, 28-33)。ＢＰＨの解剖的または顕微鏡的証拠が６０〜７０歳の男性の約５５
％の剖検で存在する。前立腺の経尿道的切除は長年処置選択肢である。結果として、ＢＰ
Ｈは、高齢男性の外科的介入の最も一般的な理由の一つである。処置の低浸潤性方法は次
のものを含む：
(ｉ)  アルファ１−ブロッカー(ドキサゾシン、プラゾシン、タムスロシン、テラゾシン
およびアルフゾシン)は、高血圧の処置にも使用される一群の薬である。これらの薬物は
膀胱頚部および前立腺の筋肉を弛緩させ、排尿を容易にする。
(ii)  フィナステリドおよびデュタステライドは、アンドロゲンレベルを下げ、そうして
前立腺のサイズを小さくし、尿流速を上げ、ＢＰＨの症状を軽減する。症状改善が観察さ
れるまで３〜６ヶ月間かかり得る。フィナステリドおよびデュタステライドの使用と関連
する潜在的副作用は性欲低下と不能を含む。
【０３０４】
実験の章での結果は、初めて、ＢＰＨがニューレグリン依存性適応症であることを証明
した。本知見はまたMOR10703が、性的成熟ラットでホルモンレベルに影響することなく前
立腺サイズを顕著に減少させることも示し、MOR10703がＢＰＨの処置に有用であることを
示唆する。
【０３０５】
ＢＰＨ治療剤としてMOR10703および他のＨＥＲ３抗体をさらに試験するために、一次ヒ
トＢＰＨ外科的標本を、無胸腺マウスまたはラットに移植し、Ｈｅｒ３抗体の効果をモデ
ルを使用して試験し得る(Otto U et al. Urol Int 1992;48:167 -170)。あるいは、ＢＰ
Ｈの側面を５α−アンドロスタン−３α,１７β−ジオールとエストラジオールの長期投
与を介して去勢イヌに誘発し、ＨＥＲ３抗体をこれらのイヌモデルで試験できる(Walsh P
C, Wilson JD. J Clin Invest 1976;57:1093 - 1097)。
【０３０６】
一つの態様において、本発明は、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントを使用する女性
化乳房の処置に関する。女性化乳房の物理的顕在化は、男性での乳房拡大であり、通常両
側の乳房で起こるが、片方のみのこともあり、非対称的または一側性女性化乳房として知
られる。女性化乳房の原因は通常次のものである：
(ｉ)  テストステロン対エストロゲン比を不均衡にする高エストロゲンレベル。
(ii)  前立腺癌またはＢＰＨ処置に使用したアンドロゲンアンタゴニストまたは抗アンド
ロゲン。これらの薬物はテストステロンを抑制するが、テストステロン抑制により、エス
トロゲンが上昇し始める。
【０３０７】
多くの治験薬が現在試験されているが、現在女性化乳房で承認された処置はない。結果
として、女性化乳房は乳房組織の外科的切除により処置される。男性乳腺のMOR10703誘発
不可逆性萎縮の観察は、女性化乳房の処置に有益であり得ることを示す。
【０３０８】
ヒト女性化乳房の処置におけるMOR10703および他のＨＥＲ３抗体をさらに試験するため
に、女性化乳房のトランスジェニックマウスモデルを使用できる。これらのモデルは、マ
ウス乳腺にヒトアロマターゼを発現させることにより開発され、ヒト女性化乳房の多くの
面を再現する(Li et al., Endocrinology 2002;143:4074-4083; Tekmal et al., Cancer 
Res 1996;56:3180-318)。
【０３０９】
一つの態様において、本発明は、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントを使用する女性
化乳房の処置に関する。MOR10703および他のＨＥＲ３抗体はまた、子宮の裏側(子宮内膜)
からの細胞が子宮腔外に出現し、増殖する婦人科学的状態である子宮内膜症の処置につい
ても試験する。子宮内膜症の主であるが、普遍的ではない症状は、種々の顕性化での骨盤
痛である。子宮内膜症の根底の原因は十分に特徴付けられていないが、エストロゲン存在
に依存性であると考えられる。雌マウスにおけるMOR10703誘発子宮内膜萎縮が子宮重量を
減少させたため、子宮内膜症処置に使用し得る。MOR10703および他のＨＥＲ３抗体の子宮
内膜症に対する効果をさらに試験するために、正常循環および卵巣摘出無胸腺マウスまた
は循環非肥満糖尿病性(ＮＯＤ)−重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスに増殖期のヒト子宮
内膜を腹腔を移植し、これらのＳＣＩＤマウスをモデルとして使用できる(Grummer et al
., 2001. Human Reproduction; 16; 1736-1743)。
【０３１０】
ＨＥＲ３抗体はまた呼吸器疾患、骨粗鬆症、骨関節症、多嚢胞性腎臓疾患、糖尿病、統
合失調症、血管疾患、心臓疾患、非発癌性増殖性疾患、線維症および神経変性疾患、例え
ばアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない他の異常または欠損ＨＥＲシグナル
伝達と関連する障害の処置または予防にも使用できる。
【０３１１】
ＨＥＲ３結合抗体との組み合わせ処置に適切な薬剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を調
節できることが知られる標準治療剤を含む。ＨＥＲ２の標準治療剤の適切な例は、Hercep
tinおよびタイケルブを含むが、これらに限定されない。ＥＧＦＲの標準治療剤の適切な
例は、イレッサ、タルセバ、アービタックスおよびベクティビックスを含むが、これらに
限定されない。ＨＥＲ３結合抗体との組み合わせ処置に適切な他の薬剤は、受容体チロシ
ンキナーゼ群、Ｇ−タンパク質共役受容体、増殖／生存シグナル伝達経路、核ホルモン受
容体、アポトーシス経路、細胞周期および血管形成を調節するものを含み得るが、これら
に限定されない。
【０３１２】
診断的使用
一つの面において、本発明は、生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、組織)ま
たは癌を有するまたは癌を発症するリスクのある個体の状況においてＨＥＲ３タンパク質
および／または核酸発現ならびにＨＥＲ３タンパク質機能を決定する診断的アッセイを包
含する。
【０３１３】
診断的アッセイ、例えば競合的アッセイは、共通結合パートナーの限られた数の結合部
位について標識アナログ(“トレーサー”)が試験サンプル検体と競合する能力に基づく。
結合パートナーは、一般的に競合の前または後に不溶化され、次いで、結合パートナーに
結合したトレーサーおよび検体を非結合トレーサーおよび検体と分離する。この分離は傾
捨(結合パートナーが予め不溶化されているとき)または遠心分離(結合パートナーが競合
的反応後沈殿するとき)により達成される。試験サンプル検体の量は、マーカー物質の量
により測定した結合トレーサー量と反比例する。試験サンプルに存在する検体の量を定量
的に決定するために、既知の量の検体での用量−応答曲線を調製し、試験結果と比較する
。これらのアッセイは、酵素を検出可能マーカーとして使用するときＥＬＩＳＡシステム
と呼ばれる。この形態のアッセイにおいて、抗体とＨＥＲ３結合抗体の競合的結合が、血
清サンプル中の抗体、最も具体的に、血清サンプル中の中和抗体の指標である、結合ＨＥ
Ｒ３タンパク質、好ましくは本発明のＨＥＲ３エピトープをもたらす。
【０３１４】
本アッセイの顕著な利点は、測定が抗体を直接中和することである(すなわち、ＨＥＲ
３タンパク質、具体的に、エピトープの結合を妨害するもの)。このようなアッセイ、特
にＥＬＩＳＡ試験の形態は臨床環境および日常的血液スクリーニングで広く適用されてい
る。
【０３１５】
本発明の他の面は、個体におけるＨＥＲ３核酸発現またはＨＥＲ３タンパク質活性を決
定し、それにより該個体に適当な治療または予防剤を選択する方法を提供する(ここでは
“薬理ゲノミクス”と呼ぶ)。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型(例えば、個体が特定の
薬剤に応答する能力を決定するために試験した個体の遺伝子型)に基づく個体の治療また
は予防処置のための薬剤(例えば、薬物)の選択を可能にする。
【０３１６】
本発明のさらに別の面は、治験におけるＨＥＲ３タンパク質の発現または活性に対する
薬剤(例えば、薬物)の影響のモニタリングに関する。
【０３１７】
医薬組成物
ＨＥＲ３結合抗体(インタクトまたは結合フラグメント)を含む医薬または無菌組成物を
製造するために、ＨＥＲ３結合抗体(インタクトまたは結合フラグメント)を薬学的に許容
される担体または添加物と混合する。組成物は、癌(乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨
髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、
扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道
癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立
腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症)の処置または予防に適切
な１種以上の他の治療剤をさらに含み得る。
【０３１８】
治療および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローションま
たは懸濁液の形で、生理学的に許容される担体、添加物または安定化剤との混合により製
造できる(例えば、Hardman et al., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological
Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: T
he Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York
, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medic
ations, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage
Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutic
al Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000
) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.参照)。
【０３１９】
治療のための投与レジメンの選択は、該物体の血清または組織代謝回転速度、症状のレ
ベル、物体の免疫原性および生物学的マトリクスにおける標的細胞の接近性を含む、数種
の因子による。ある態様において、投与レジメンは、許容されるレベルの副作用に一致し
て、患者に送達される治療の量を最大化する。従って、送達される生物剤の量は、一部、
特定の物質および処置する状態の重症度による。適当な投与量の抗体、サイトカインおよ
び小分子の選択のための指標は利用可能である(例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody T
herapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclon
al Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.
) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marce
l Dekker, New York, N.Y.; Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Mi
lgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., (2001) New 
Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:61
3-619; Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al., (2000) N
ew Engl. J. Med. 343:1594-1602参照)。
【０３２０】
適当な投与量の決定は、例えば、当分野で処置に影響することが知られたまたは処置に
影響することが予測されるパラメータまたは因子を使用して、臨床医が行う。一般的に、
最適投与量より幾分少ない量で投与を開始し、その後、何らかの負の副作用に対して所望
のまたは最適効果が得られるまで少しずつ増加させる。重要な診断的指標は、例えば、炎
症の症状、または産生される炎症性サイトカインレベルである。
【０３２１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定
の患者、組成物および投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得
るために、変わり得る。選択した投与量は、用いる特定の本発明の組成物またはそのエス
テル、塩またはアミドの活性、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、他
の薬物、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する化合物および／または物質、処置す
る患者の年齢、性別、体重、状態、一般的状態および薬歴などの医学分野で知られた因子
を含む、多様な薬物動態因子による。
【０３２２】
本発明の抗体またはそのフラグメントを含む組成物は、連続的注入でまたは、例えば、
１日、１週間または週１〜７回の間隔での投与により提供され得る。静脈内、皮下、局所
的、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内または吸入により投与され得る。特異的投与プロト
コルは、顕著な望ましくない副作用を避ける最大投与量または投与頻度を含む。総週投与
量は少なくとも０.０５μg／kg体重、少なくとも０.２μg／kg、少なくとも０.５μg／kg
、少なくとも１μg／kg、少なくとも１０μg／kg、少なくとも１００μg／kg、少なくと
も０.２mg／kg、少なくとも１.０mg／kg、少なくとも２.０mg／kg、少なくとも１０mg／k
g、少なくとも２５mg／kgまたは少なくとも５０mg／kgである(例えば、Yang et al., (20
03) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1
692-1698; Liu et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji 
et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144参照)。抗体またはそのフラグ
メントの所望の投与量は、モル濃度／kg体重ベースの抗体またはポリペチドとほぼ同じで
ある。抗体またはそのフラグメントの所望の血漿濃度は、モル濃度／kg体重でおおよそで
ある。投与量は少なくとも１５μg、少なくとも２０μg、少なくとも２５μg、少なくと
も３０μg、少なくとも３５μg、少なくとも４０μg、少なくとも４５μg、少なくとも５
０μg、少なくとも５５μg、少なくとも６０μg、少なくとも６５μg、少なくとも７０μ
g、少なくとも７５μg、少なくとも８０μg、少なくとも８５μg、少なくとも９０μg、
少なくとも９５μgまたは少なくとも１００μgであり得る。対象への投与は少なくとも１
回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回ま
たはそれ以上の回数であり得る。
【０３２３】
本発明の抗体またはそのフラグメントについて、患者に投与される投与量は、０.００
０１mg／kg〜１００mg／kg患者体重であり得る。投与量は０.０００１mg／kgおよび２０m
g／kg、０.０００１mg／kgおよび１０mg／kg、０.０００１mg／kgおよび５mg／kg、０.０
００１および２mg／kg、０.０００１および１mg／kg、０.０００１mg／kgおよび０.７５m
g／kg、０.０００１mg／kgおよび０.５mg／kg、０.０００１mg／kg〜０.２５mg／kg、０.
０００１〜０.１５mg／kg、０.０００１〜０.１０mg／kg、０.００１〜０.５mg／kg、０.
０１〜０.２５mg／kgまたは０.０１〜０.１０mg／kg患者体重であり得る。
【０３２４】
発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、患者の体重キログラム(kg)をmg／kgで
投与すべき投与量に掛けて計算する。本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は患
者体重で１５０μg／kg以下、１２５μg／kg以下、１００μg／kg以下、９５μg／kg以下
、９０μg／kg以下、８５μg／kg以下、８０μg／kg以下、７５μg／kg以下、７０μg／k
g以下、６５μg／kg以下、６０μg／kg以下、５５μg／kg以下、５０μg／kg以下、４５
μg／kg以下、４０μg／kg以下、３５μg／kg以下、３０μg／kg以下、２５μg／kg以下
、２０μg／kg以下、１５μg／kg以下、１０μg／kg以下、５μg／kg以下、２.５μg／kg
以下、２μg／kg以下、１.５μg／kg以下、１μg／kg以下、０.５μg／kg以下または０.
５μg／kg以下であり得る。
【０３２５】
本発明の抗体またはそのフラグメントの単位投与量は０.１mg〜２０mg、０.１mg〜１５
mg、０.１mg〜１２mg、０.１mg〜１０mg、０.１mg〜８mg、０.１mg〜７mg、０.１mg〜５m
g、０.１〜２.５mg、０.２５mg〜２０mg、０.２５〜１５mg、０.２５〜１２mg、０.２５
〜１０mg、０.２５〜８mg、０.２５mg〜７mg、０.２５mg〜５mg、０.５mg〜２.５mg、１m
g〜２０mg、１mg〜１５mg、１mg〜１２mg、１mg〜１０mg、１mg〜８mg、１mg〜７mg、１m
g〜５mgまたは１mg〜２.５mgであり得る。
【０３２６】
本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、対象において少なくとも０.１μg／
ml、少なくとも０.５μg／ml、少なくとも１μg／ml、少なくとも２μg／ml、少なくとも
５μg／ml、少なくとも６μg／ml、少なくとも１０μg／ml、少なくとも１５μg／ml、少
なくとも２０μg／ml、少なくとも２５μg／ml、少なくとも５０μg／ml、少なくとも１
００μg／ml、少なくとも１２５μg／ml、少なくとも１５０μg／ml、少なくとも１７５
μg／ml、少なくとも２００μg／ml、少なくとも２２５μg／ml、少なくとも２５０μg／
ml、少なくとも２７５μg／ml、少なくとも３００μg／ml、少なくとも３２５μg／ml、
少なくとも３５０μg／ml、少なくとも３７５μg／mlまたは少なくとも４００μg／mlの
血清力価を達成し得る。あるいは、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、対
象において少なくとも０.１μg／ml、少なくとも０.５μg／ml、少なくとも１μg／ml、
少なくとも、２μg／ml、少なくとも５μg／ml、少なくとも６μg／ml、少なくとも１０
μg／ml、少なくとも１５μg／ml、少なくとも２０.ｍｕ.ｇ／ml、少なくとも２５μg／m
l、少なくとも５０μg／ml、少なくとも１００μg／ml、少なくとも１２５μg／ml、少な
くとも１５０μg／ml、少なくとも１７５μg／ml、少なくとも２００μg／ml、少なくと
も２２５μg／ml、少なくとも２５０μg／ml、少なくとも２７５μg／ml、少なくとも３
００μg／ml、少なくとも３２５μg／ml、少なくとも３５０μg／ml、少なくとも３７５
μg／mlまたは少なくとも４００μg／mlの血清力価を達成し得る。
【０３２７】
本発明の抗体またはそのフラグメントの投与を繰り返してよく、投与を少なくとも１日
、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５
日間、３ヶ月間または少なくとも６ヶ月間離してよい。
【０３２８】
特定の患者への有効量は、例えば、処置する状態、患者の全体的健康、投与方法、経路
および投与量ならびに副作用の重症度の因子により変わり得る(例えば、Maynard et al.,
(1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Ra
ton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., L
ondon, UK参照)。
【０３２９】
投与経路は、例えば、局所または皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動
脈内、脳脊髄内、病巣内への注射または注入または徐放系またはインプラントにより得る
(例えば、Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer et al., (1981) J. 
Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein et 
al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al., (1980) Proc. 
Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; 米国特許６,３５０,４６６および６,３１６,０２
４参照)。必要であれば、組成物はまた注射部位の疼痛を軽減するために可溶化剤および
局所麻酔剤、例えばリドカインも含み得る。さらに、肺投与を、また、例えば吸入器また
はネブライザーおよびエアロゾル化剤を用いる製剤の使用により行い得る。例えば、米国
特許６,０１９,９６８、５,９８５,３２０、５,９８５,３０９、５,９３４,２７２、５,
８７４,０６４、５,８５５,９１３、５,２９０,５４０および４,８８０,０７８；および
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、
ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３参照、その各々は引用によりその全体
を本明細書に包含させる。
【０３３０】
本発明の組成物は、多様な当分野で知られる方法の１種以上を使用して１個以上の投与
経路で投与してもよい。当業者には当然であるが、投与経路および／または投与方法は所
望の結果により変わる。本発明の抗体またはそのフラグメントのための選択した投与経路
は、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他
の非経腸投与経路を含む。非経腸投与は、経腸および局所投与以外の投与経路を意味しえ
て、通常注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心内、皮内、
腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内
注射および注入を含む。あるいは、本発明の組成物は、非経腸以外の経路、例えば局所、
上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与で
きる。一つの態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントを注入により投与する
。他の態様において、本発明の多特異的エピトープ結合タンパク質を皮下に投与する。
【０３３１】
本発明の抗体またはそのフラグメントを制御放出または徐放系で投与するとき、制御放
出または徐放系を達成するためにポンプを使用してよい(Langer, supra; Sefton, (1987)
CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., (1980), Surgery 88:507; Saud
ek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574参照)。重合物質を使用して、本発明の治
療剤の制御放出または徐放系を達成を達成できる(例えば、Medical Applications of Con
trolled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Con
trolled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ba
ll (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. R
ev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., (1985) Science 228:190; During 
et al., (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 7 1:105
；米国特許番号５,６７９,３７７；米国特許番号５,９１６,５９７；米国特許番号５,９
１２,０１５；米国特許番号５,９８９,４６３；米国特許番号５,１２８,３２６；ＰＣＴ
公開番号ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３参照)。徐
放性製剤に使用するポリマーの例は、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ
(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、
ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(Ｎ−ビニルピロリド
ン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ
ラクチド(ＰＬＡ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびポリオルトエステ
ルを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、徐放性製剤に使用するポリマ
ーは不活性であり、溶出可能不純物がなく、貯蔵に安定であり、無菌および生分解性であ
る。制御放出または徐放系は、予防または治療標的の近接に設置でき、それゆえに、全身
投与量の一部しか必要ではない(例えば、Goodson, in Medical Applications of Control
led Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照)。
【０３３２】
制御放出系はLanger, (1990), Science 249:1527-1533)のレビューに記載されている。
当業者に知られるあらゆる技術を、１個以上の本発明の抗体またはそのフラグメントを含
むの徐放性製剤に使用できる。例えば、米国特許番号４,５２６,９３８、ＰＣＴ公開ＷＯ
９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ning et al., (1996), Radiother
apy & Oncology 39:179-189, Song et al., (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Sci
ence & Technology 50:372-397, Cleek et al., (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Re
l. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., (1997) Proc. Int'l. Symp. Control 
Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照、その各々は引用によりその全体を本明細書に包含
させる。
【０３３３】
本発明の抗体またはそのフラグメンを局所的に投与するならば、軟膏、クリーム、経皮
パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンま
たは当業者に周知の他の形態に製剤できる。例えば、Remington's Pharmaceutical Scien
ces and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Ea
ston, Pa. (1995)参照。非スプレー可能局所投与形態について、担体または１個以上の添
加物を含む半固体または固体形態への粘性は、局所適用に適用し、ある場合、水より大き
い動的粘性を典型的に用いる。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、
軟膏、粉末、リニメント剤、軟膏(salves)などを含むが、これらに限定されず、所望であ
れば、滅菌しまたは補助剤(例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液または塩類)と混
合して、種々の特性、例えば、例えば、浸透圧を変える。他の適切な局所投与形態は、ス
プレー可能エアロゾル製剤を含み、ここで、ある場合、固体または液体不活性担体と組み
合わせた活性成分は、加圧揮発物(例えば、ガス状噴射剤、例えばフレオン)と混合物であ
るかまたは圧搾ビンに入れられている。加湿剤または湿潤剤も、所望であれば、医薬組成
物および投与形態に添加してよい。このようなさらなる成分の例は当分野で周知である。
【０３３４】
抗体またはそのフラグメントを含む組成物を鼻腔内投与するならば、エアロゾル形態、
スプレー、ミストまたは液滴の形態に製剤できる。特に、本発明に従い使用するための予
防または治療剤は、適切な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフル
オロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス)を使用
して、エアロゾルスプレーの形で送達するのが好都合であり得る。加圧エアロゾルの場合
、投与量単位を、定量を送達するためのバルブを備えることにより規定し得る。吸入器ま
たは吹き入れ器(insufflator)で使用するためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼ
ラチンから成る)を、化合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンを
含んで製剤してよい。
【０３３５】
第二治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線
と共投与または処置するための方法は当分野で知られている(例えば、Hardman et al., (
eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.
sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharma
cotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams 
& Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and 
Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.Hardman et al., (eds.) (2
001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th e
d., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherap
eutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkin
s, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biothera
py, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.参照)。有効量の治療剤は、少なくと
も１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％または少なくとも
５０％症状を軽減し得る。
【０３３６】
本発明の抗体またはそのフラグメントと組み合わせて投与し得る他の治療剤(例えば、
予防または治療剤)は本発明の抗体またはそのフラグメントから５分未満離れて、３０分
未満離れて、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１〜約２時間離れて、約２時間〜約
３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６
時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時
間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、約１１時間〜
約１２時間離れて、約１２時間〜１８時間離れて、１８時間〜２４時間離れて、２４時間
〜３６時間離れて、３６時間〜４８時間離れて、４８時間〜５２時間離れて、５２時間〜
６０時間離れて、６０時間〜７２時間離れて、７２時間〜８４時間離れて、８４時間〜９
６時間離れてまたは９６時間〜１２０時間離れて投与してよい。２個以上の治療剤を、同
じ患者の来院時に投与してよい。
【０３３７】
本発明の抗体またはそのフラグメントおよび他の治療剤を、周期的投与してよい。周期
治療は、一定期間の第一治療(例えば、第一予防または治療剤)の投与、続く一定期間の第
二治療(例えば、第二予防または治療剤の投与、所望により、続く一定期間の第三治療(例
えば、予防または治療剤)の投与などを含み、この連続的投与を繰り返し、すなわち、治
療剤の一つに対する耐性の発生を減らすために、治療剤の一つの副作用を減らすまたは避
けるためにおよび／または治療剤の有効性を改善するために周期とする。
【０３３８】
ある態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、インビボでの適切な分配
を確実にするために製剤できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は多くの高親水性化合物を
排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(望むならば)
、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームの製造方法について、例えば、米国特許
４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１参照のこと。リポソーム
は、特異的細胞または臓器に選択的に輸送される１個以上の部分を含み、それゆえに、標
的薬物送達を促進し得る(例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)。ター
ゲティング部分の例は、フォレートまたはビオチン(例えば、Low et alの米国特許番号５
,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 153:1038)；抗体(Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (
1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Brisco
e et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al, (1994) J. B
iol. Chem. 269:9090)であり、またK. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 3
46:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273参照のこと。
【０３３９】
本発明は、処置を必要とする対象への、本発明の抗体またはそのフラグメントを単独ま
たはでまたは他の治療剤と組み合わせて含む医薬組成物の投与のプロトコルを提供する。
本発明の組み合わせ治療剤の治療剤(例えば、予防または治療剤)は、対象に同時にまたは
連続的に投与してよい。本発明の組み合わせ治療剤の治療(例えば、予防または治療剤)は
また周期的投与してよい。周期治療、一定期間の第一治療(例えば、第一予防または治療
剤)の投与、続く一定期間の第二治療(例えば、第二予防または治療剤の投与を含み、この
連続的投与を繰り返し、すなわち、治療剤の一つに対する耐性の発生を減らすために、治
療剤の一つの副作用を減らすまたは避けるためにおよび／または治療剤の有効性を改善す
るために周期とする。
【０３４０】
本発明の組み合わせ治療剤の治療剤(例えば、予防または治療剤)は、対象に同時に投与
してよい。用語“同時”は、正確に同じ時間の治療剤(例えば、予防または治療剤)の投与
に限定されず、むしろ本発明の抗体が、他の治療と、他の方法で投与されたよりも大きな
利益を提供できるような時間間隔内で、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む医薬
組成物を対象に連続的に投与することを意味する。例えば、各治療を、対象に同時にまた
は連続的に、異なる時点に任意の順番で投与してよい；しかしながら、同時に投与しない
ならば、所望の治療または予防効果を提供するために十分に近い時間に投与しなければな
らない。各治療を対象に別々に任意の適当な形態および任意の適切な経路で投与できる。
種々の態様において、治療剤(例えば、予防または治療剤)を、対象に、１５分未満離れて
、３０分未満離れて、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間〜約２時間離れて、
約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約
５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８
時間〜約９時間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、
約１１時間〜約１２時間離れて、２４時間離れて、４８時間離れて、７２時間離れてまた
は１週間離れて投与してよい。他の態様において、２個以上の治療剤(例えば、予防また
は治療剤)を、同じ患者の来院時に投与してよい。
【０３４１】
組み合わせ治療剤の予防または治療剤を、対象に同じ医薬組成物で投与できる。あるい
は、組み合わせ治療剤の予防または治療剤を、対象に同時に別々の医薬組成物で投与でき
る。予防または治療剤を対象に同一または異なる投与経路で投与できる。
【０３４２】
本発明を十分に記載しているが、次の実施例および特許請求の範囲によりさらに説明し
、これらは説明的でありさらに限定することを意図しない。
【実施例】
【０３４３】
実施例１：抗体のための方法、材料およびスクリーニング
(ｉ)  細胞株
BXPC-3、SK-Br-3、BT-474、MDA-MB-453、FaDuおよびMCF-7細胞株をATCCから購入し、１
０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加増殖培地で一般的に増殖させた。
【０３４４】
(ii)  組み換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＨＥＲ３ベクター
マウスＨＥＲ３細胞外ドメイをマウス脳ｃＤＮＡ(Clontech)からＰＣＲ増幅し、配列を
Refseq NM_010153との比較により確認した。ラットHER3 ECDをRat-2細胞ｍＲＮＡから逆
転写させ、配列をNM_017218との比較により確認した。カニクイザルHER3 cDNA鋳型を、種
々のカニクイザル組織(Zyagen Laboratories)のＲＮＡを使用して製造し、ＲＴ−ＰＣＲ
産物をpCR(登録商標)-TOPO-XL(Invitrogen)にクローン化し、両鎖を配列決定した。ヒト
ＨＥＲ３は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー(Source)由来であり、配列をNM_001982と
の比較により確認した。
【０３４５】
タグ付け組み換えタンパク質を産生するために、ヒト、マウス、ラットおよびカニクイ
ザルＨＥＲ３をPwo Taqポリメラーゼ(Roche Diagnostics)を使用してＰＣＲ増幅した。増
幅ＰＣＲ産物をゲル精製し、フレーム内Ｎ末端ＣＤ３３リーダー配列およびＣ末端タグ、
例えば、フラッグタグを含むように予め修飾されたpDonR201(Invitrogen)gatewayエント
リーベクターにクローン化した。ＴＡＧは、抗ＴＡＧモノクローナル抗体を介する単量体
タンパク質の精製を可能にする。標的遺伝子をＡｔｔＢ１およびＡｔｔＢ２と隣接させ、
Gateway(登録商標)クローニング方法(Invitrogen)を使用して、Gateway適応専売目的地ベ
クター(例えば、pcDNA3.1)に組換えした。組換え反応を、ＣＭＶプロモータを含む専売目
的地ベクターとGateway LR反応を用いて行い、タグ発現ベクターを創製したが、任意の市
販ベクターを使用できる。
【０３４６】
さらに、HER3 ECDを、Ｃ末端因子Ｘ開裂部位上流およびヒトＩｇＧヒンジおよびＦｃド
メインを融合する組み換えＨＥＲ３タンパク質を産生し、Ｆｃタグ付タンパク質を創製し
た。これを達成するために、種々のHER3 ECDをＰＣＲ増幅し、因子Ｘ部位ヒンジ−ｈＦｃ
のフレーム内Ｃ末端融合を含むように修飾したベクター(例えば、ｐｃＤＮＡ３.１)にク
ローン化した。産生したオープンリーディングフレームを、Gateway(登録商標)組み換え
クローニング方法(Invitrogen)を用いてさらにクローニングするためにＡｔｔＢ１および
ＡｔｔＢ２部位に隣接させた。LR Gateway反応を使用して、HER3-FcをＣＭＶプロモータ
含有目的地発現構築物に伝達した。ＨＥＲ３点変異発現構築物を、標準的部位特異的突然
変異誘発プロトコルを使用して産生し、得られたベクター配列を確認した。
【０３４７】
【表３０】
2020007349.tif 000031
【０３４８】
(iii)  組み換えＨＥＲ３タンパク質発現
所望のＨＥＲ３組み換えタンパク質を、予め懸濁液培養に適用させ、Novartis専売無血
清培地で培養したＨＥＫ２９３由来細胞株で発現させた。小規模発現検証を、リポフェク
ションに基づき、一過性６ウェルプレートトランスフェクションアッセイで行った。一過
性トランスフェクションを介する大規模タンパク質産生を１０〜２０Ｌ規模でWaveTM bio
reactorシステム(Wave Biotech)で行った。ＤＮＡポリエチレンイミン(Polysciences)を
プラスミド担体として、１：３(ｗ：ｗ)比で使用した。細胞培養上清をトランスフェクシ
ョン７〜１０日後に回収し、精製前にクロスフロー濾過およびダイアフィルトレーション
により濃縮した。
【０３４９】
(iv)  タグ付タンパク質精製
組み換えタグ付ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ＴＡＧ−ＨＥＲ３)を、細胞培養上清を回
収し、１０kDaカットオフフィルター(Fresenius)でクロスフロー濾過することにより１０
倍濃縮して精製した。抗ＴＡＧカラムを、抗ＴＡＧモノクローナル抗体のＣＮＢｒ活性化
セファロース４Ｂへの、最終比１０mg抗体／樹脂mLでのカップリングにより調製した。濃
縮上清を、３５ml抗Ｔａｇカラムに流速１〜２mL／分で適用した。ＰＢＳでのベースライ
ン洗浄後、結合物質を１００mM  グリシン(ｐＨ２.７)で溶出し、中和し、濾過滅菌した
。タンパク質濃度を２８０nmの吸光度測定により決定し、理論的計数０.６６ＡＵ／mgを
使用して返還した。精製タンパク質を最後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端配列決定およびＬ
Ｃ−ＭＳにより特徴づけした。
【０３５０】
(ｖ)  Ｆｃタグ精製
濃縮細胞培養上清を５０mlプロテインＡセファロースFast Ｆlowカラムに流速１ml／分
で適用した。ＰＢＳでのベースライン洗浄後、カラムを１０カラム体積の１０mM  ＮａＨ
２ＰＯ４／３０％(ｖ／ｖ)イソプロパノール、ｐＨ７.３、続いて５カラム体積のＰＢＳ
で洗浄した。最後に、結合物質を５０mMシトレート／１４０mM  ＮａＣｌ(ｐＨ２.７)で
溶出し、中和し、濾過滅菌した。
【０３５１】
(vi)  過発現細胞株の産生
高レベルのＨＥＲ３を細胞表面に発現する細胞株を産生するために、ヒトＥＧＦＲのア
ミノ酸残基６６９〜１２１０のフレーム内に融合したヒトＨＥＲ３のアミノ酸残基２０〜
６６７の上流のＣＤ３３リーダー配列をコードするインサートを含む哺乳動物発現ベクタ
ーを構築した。哺乳動物細胞で発現されたとき、得られたキメラタンパク質はＮ末端ＨＥ
Ｒ３細胞外および膜貫通型ドメインおよびＣ末端ＥＧＦＲ細胞質ドメインを含む。ＨＥＲ
３／１ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen)に形質移入し、安定なプールを抗生物質選
択後産生した。得られた細胞株(CHO HER3/1)は高レベルのＨＥＲ３細胞外ドメインをその
細胞表面に発現した。
【０３５２】
(vii)  HuCAL GOLD(登録商標)パニング
ヒトＨＥＲ３を認識する抗体を選択するために、複数パニング戦略を用いた。ヒトＨＥ
Ｒ３タンパク質に対する治療抗体を、抗体変異体タンパク質源として市販のファージディ
スプレイライブラリー、MorphoSys HuCAL GOLD(登録商標)ライブラリーを使用して、高結
合親和性を有するクローンの選択により産生した。ファージミドライブラリーはHuCAL(登
録商標)コンセプト(Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86)に基づき、ファージ
表面へのＦａｂ提示にＣｙｓディスプレイ(登録商標)方法を使用する(LohningのＷＯ０１
／０５９５０)。
抗ＨＥＲ３抗体単離のために、標準的ならびにＲａpMＡＴパニング戦略を固相、溶液、
全細胞および示差全細胞パニング手法を使用して実施した。
【０３５３】
(viii)  固相パニング
抗ＨＥＲ３抗体を同定するために、多様な固相パニング戦略を種々の組み換えＨＥＲ３
タンパク質を使用して行った。各回の固相パニングを行うために、Maxisorpプレート(Nun
c)をＨＥＲ３タンパク質でコートした。タグ付タンパク質を、抗Ｆｃ(ヤギまたはマウス
抗ヒトＩｇＧ、Jackson Immuno Research)、抗Ｔａｇ抗体で予めコートしたプレートまた
は受動的吸着を介して捕捉した。被覆プレートをＰＢＳで洗浄し、遮断した。被覆プレー
トをＰＢＳで２回添加し、HuCAL GOLD(登録商標)ファージ−抗体を、２時間、室温でシェ
ーカーで添加した。結合ファージを溶出し、大腸菌ＴＧ−１に添加し、ファージ感染のた
めにインキュベートした。続いて感染細菌を単離し、寒天プレートで平板培養した。コロ
ニーをプレートからかきとり、ファージをレスキューし、増幅した。各ＨＥＲ３パニング
戦略は個々のパニングから成り、特有の抗原、抗原濃度および洗浄強度を含む。
【０３５４】
(ix)  溶液相パニング
各回の溶液相パニングを、ニューレグリン１−β１(R&D Systems)存在下または非存在
下で種々のビオチニル化組み換えＨＥＲ３タンパク質を使用して行った。タンパク質をＥ
Ｚ−結合スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチニル化キット(Pierce)を、製造者の指示に従い使用
して、ビオチニル化した。８００μlのストレプトアビジン結合磁気ビーズ(Dynabeads, D
ynal)をＰＢＳで１回洗浄し、一夜、Chemiblocker(Chemicon)で遮断した。HuCAL GOLD(登
録商標)ファージ−抗体および適当なビオチニル化ＨＥＲ３を反応チューブでインキュベ
ートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを２０分添加し、磁気粒子分離機(Dynal)で回
収した。結合ファージは、ＤＴＴ含有緩衝液の各チューブへの添加によりDynabeadsから
溶出し、大腸菌ＴＧ−１に添加した。ファージ感染を固相パニングで記載したのと同じ方
法で行った。各ＨＥＲ３パニング戦略は個々のパニングから成り、特有の抗原、抗原濃度
および洗浄強度を含む。
【０３５５】
(ｘ)  細胞ベースのパニング
細胞パニングのために、HuCAL GOLD(登録商標)ファージ−抗体を、約１０７細胞でロー
テータ上で２時間、室温でインキュベートし、続いて遠心分離した。細胞ペレットを単離
し、ファージを細胞から溶出した。上清を回収し、大腸菌ＴＧ−１に添加し、培養を上記
の方法で続けた。２細胞ベースの戦略を抗ＨＥＲ３抗体同定に使用した：
ａ)  全細胞パニング：この戦略において、多様なインタクト細胞株を抗原として使用し
た。
ｂ)  示差全細胞パニング：この戦略において、抗原は、連続的に細胞および組み換えＨ
ＥＲ３タンパク質から成った(例として1981.09参照)。細胞ベースのパニングを上記のと
おり行い、組み換えタンパク質を抗原として用いるとき固相パニングプロトコルを使用し
た。洗浄はＰＢＳ(２−３Ｘ)およびＰＢＳＴ(２−３Ｘ)を使用して行った。
【０３５６】
(xi)  RapMATＴＭライブラリー産生およびパニング
ライブラリー多様性を維持しながら抗体結合親和性を増やすために、溶液および固相パ
ニング両者の第二ラウンドアウトプットを、RapMATＴＭプロセスに入れ、一方全細胞およ
び示差全細胞パニング戦略の第三ラウンドアウトプットを入れた(Prassler et al., (200
9) Immunotherapy; 1: 571-583)。RapMATＴＭライブラリーを、ディスプレイベクターpMO
RPH(登録商標)25_bla_LHCへのパニングにより選択したファージのＦａｂコード化インサ
ートのサブクローニングにより産生し、さらにH-CDR2 RapMATTＭライブラリーおよびL-CD
R3 RapMATＴＭライブラリーを産生するために、特異的制限酵素を使用して消化した。イ
ンサートを、プール組成物に従いH-CDR2またはL-CDR3についてＴＲＩＭ成熟カセット(Vir
nekas et al., (1994) Nucleic Acids Research 22:5600- 5607)で置き換えた。ライブラ
リーサイズは８×１０６〜１×１０８クローンの範囲と概算された。RapMAT抗体−ファー
ジを産生し、さらに先に記載の実験法を使用する２回の溶液、固相または細胞ベースパニ
ングに付した。
【０３５７】
実施例２：抗ＨＥＲ３  ＩｇＧの一過性発現
懸濁液適応HEK293-6E細胞を、BioWave20で約２×１０６生存可能細胞／mLの密度まで培
養した。細胞を、関連無菌ＤＮＡ：PEI-MIXで一過性に形質移入し、さらに培養した。ト
ランスフェクション７日後、細胞をFreseniusフィルター(０.２μm)を使用してクロスフ
ロー濾過した。無細胞物質を、１０kDaカットオフフィルター(Fresenius)を使用するクロ
スフロー濾過で濃縮し、濃縮物をステリカップフィルター(０.２２μm)で濾過滅菌した。
無菌上清を４℃で貯蔵した。
【０３５８】
実施例３：抗ＨＥＲ３  ＩｇＧの精製
ＩｇＧの精製を、AEKTA 100explorer Airクロマトグラフィーシステムで、６℃で、冷
却キャビネットで、ＸＫ１６／２０カラムと２５mLの自己充填MabSelect SuRe樹脂(全GE 
Healthcare)を使用して行った。全流速は、充填以外、５バールの圧力限界で３.５mL／分
であった。カラムを３カラム体積のＰＢＳで平衡化し、濾過発酵上清に２.０mL／分で充
填した。カラムを８カラム体積のＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧを、５０mMシトレート／７０
mM  ＮａＣｌ(ｐＨ４.５)で開始し、１２カラム体積で５０mMシトレート／７０mM  Ｎａ
Ｃｌ(ｐＨ２.５)まで直線的に低下するｐＨ勾配、続いて同じｐＨ２.５緩衝液で２カラム
体積定常工程で溶出した。ＩｇＧ含有フラクションをプールし、直ちに中和し、濾過滅菌
(Millipore Steriflip、０.２２μm)した。ＯＤ２８０を測定し、タンパク質濃度を配列
データに基づき計算した。プールを、凝集(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)および純度(ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびＭＳ)について別々に試験した。
【０３５９】
実施例４：大腸菌中のHuCAL(登録商標)−Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１細胞中のpMORPH(登録商標)X9_Fab_MHによりコードされるＦａｂフラグメント
の発現を、シェーカーフラスコ培養で、５００mLの３４μg／mLクロラムフェニコール添
加２×ＹＴ培地で行った。培養を３０℃でＯＤ６００nmが０.５に達するまで振盪した。
０.７５mM  ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド)添加により、２
０時間、３０℃で発現を誘発した。細胞をリゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ
付ＦａｂフラグメントをＩＭＡＣ(Bio-Rad)により単離した。１×ダルベッコＰＢＳ(ｐＨ
７.２)への緩衝液交換をＰＤ１０カラムを使用して行った。サンプルを濾過滅菌(０.２μ
m)した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法で決定した。サンプルの純度を変性、還元１５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。Ｆａｂ調製物の均一性を天然状態で、分子ふるいクロマ
トグラフィー(ＨＰ−ＳＥＣ)により検量標準と共に決定した。
【０３６０】
実施例５：溶液平衡タイトレーション(ＳＥＴ)によるＨＥＲ３抗体親和性(ＫＤ)測定
溶液での親和性決定を、本質的に先に記載のとおり行った(Friguet et al., (1985) J 
Immunol Methods 77:305-19)。ＳＥＴ方法の感受性および精度を改善するために、古典的
ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの方法に変えた(Haenel et al., (2005) Anal biochem 339:
182-84)。
先に記載した非標識ＨＥＲ３タグ(ヒト、ラット、マウスまたはカニクイザル)を、ＳＥ
Ｔによる親和性決定に使用した。
【０３６１】
データを、カスタマイズしたフィッティングモデルを適用するXLfitソフトウェア(ID B
usiness Solutions)で評価した。各ＩｇＧのＫＤ決定について、下記モデルを使用した(P
iehler, et al (Piehler et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206)に基づき変更
)。
【数１】
2020007349.tif 000032
[ＩｇＧ]：適用した総ＩｇＧ濃度
ｘ：適用した総可溶性抗原濃度(結合部位)
Ｂｍａｘ：抗原なしのＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
【０３６２】
実施例６：ＦＡＣＳによる抗体細胞結合決定
ヒト癌細胞で発現する内因性ヒト抗原に対する抗体の結合をＦＡＣＳで評価した。抗体
ＥＣ５０価を決定するために、SK-Br-3細胞をaccutaseを用いて回収し、１×１０６細胞
／mLにＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０.２％ＮａＮ３)で希釈した。１×１０５
細胞／ウェルを９６ウェルプレート(Nunc)の各ウェルに添加し、２１０ｇで５分、４℃で
遠心分離し、上清を取った。試験抗体の連続的希釈物(ＦＡＣＳ緩衝液で１：４希釈工程
で希釈)をペレット化細胞に添加し、１時間、氷上でインキュベートした。１００μL  Ｆ
ＡＣＳ緩衝液で３回細胞を洗浄し、ペレット化した。ＦＡＣＳ緩衝液で１／２００希釈し
たＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch)を細胞に添加し、氷上
で１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程を１００μL  ＦＡＣＳ緩衝液で３回行
い、続いて２１０ｇで５分、４℃で遠心分離した。最後に、細胞を２００μL  ＦＡＣＳ
緩衝液に再懸濁し、蛍光価をFACSArray(BD Biosciences)で測定した。細胞表面結合抗Ｈ
ＥＲ３抗体の量を、平均チャネル蛍光の測定により評価した。
【０３６３】
実施例７：ＨＥＲ３ドメインおよび変異体結合
９６ウェルMaxisorpプレート(Nunc)を、一夜、４℃で２００ngの適当な組み換えヒトタ
ンパク質(ＨＥＲ３タグ、D1-2タグ、D2タグ、D3-4タグ、D4タグ、HER3 K267Aタグ、HER3 
L268Aタグ、HER3 K267A/L268Aおよびタグ付無関係対照)で被覆した。全ウェルをＰＢＳ／
０.１％Tween-20で３回洗浄し、１時間ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％Tween-20で遮断し、
ＰＢＳ／０.１％Tween-20で３回洗浄した。抗ＨＥＲ３抗体を、関連ウェルに最終濃度１
０μg／mLまで適当なウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰ
ＢＳ／０.１％Tween-20で３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％Tween-20で１／１０
０００希釈した適当なペルオキシダーゼ結合検出抗体を添加した。使用した検出抗体はヤ
ギ抗マウス(Pierce、３１４３２)、ウサギ抗ヤギ(Pierce、３１４０２)およびヤギ抗ヒト
(Pierce、３１４１２)であった。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０
.１％Tween-20で３回洗浄した。１００μl  ＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベン
ジジン)基質溶液(BioFx)を全ウェルに添加し、６分後、反応を５０μl  ２.５％Ｈ２ＳＯ
４で停止させた。各組み換えタンパク質へのＨＥＲ３抗体の結合の程度を、SpectraMaxプ
レートリーダー(Molecular Devices)を使用してＯＤ４５０を測定して決定した。適当な
とき、用量応答曲線をGraphpad Prismを使用して分析した。
【０３６４】
実施例８：水素／重水素交換マススペクトロメトリーを使用するＨＥＲ３エピトープマッ
ピング
材料
Ｄ２Ｏ緩衝液を、２５mM  ＴＢＳ(ｐＨ７.５)／５００mM  ＮａＣｌを重水(Sigma)に溶
解することにより調製した。還元溶液は、５０mMホルメート緩衝液(ｐＨ４)、５００mM  
ＴＣＥＰであり、クエンチング溶液０.５％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)の水溶液
であった。緩衝液は０.２５％ギ酸／１０％メタノール／１０％エチレングリコールの水
溶液であり、緩衝液Ｂは０.２５％ギ酸のアセトニトリル溶液であった。全化学物質をSig
maから購入し、ＨＰＬＣグレード溶媒をFisher Scientificから購入した。
【０３６５】
液体取扱いおよびクロマトグラフィー
自動化水素−重水素交換マススペクトロメトリー(HDX MS)実験を、Wales et al., (200
6) Anal. Chem. 78:1005-1014)に記載の方法および装置を元に設計した。要約すると、全
液体取扱い操作は、２℃に維持された冷蔵筺体中に入れられたPal HTS液体ハンドラー(LE
AP Technologies)を使用した。６ポート注入バルブおよび洗浄ステーションを液体ハンド
ラーレール上に設置し、クロマトグラフシステムへのサンプル注入およびシリンジ洗浄を
容易にした。クロマトグラフシステムは、さらに１０ポートバルブ、２.１mm×３０mm  P
oroszymeペプシンカラム(Applied Biosystems)、逆相０.５mm×２mm  Ｃａｐトラップカ
ートリッジ(Michrom Bioresources)および分析的カラム(１００μm×〜６０mm、Kinetex 
２.６μm  Ｃ１８、Phenomenex)として自己充填エレクトロスプレーエミッターから成っ
た。１０ポートバルブ頭部、トラップカートリッジおよび分析的カラムを、アルミニウム
から構築された別の筐体に入れ、peltier stackにより−５℃に維持した。バルブおよび
カラムを、サンプルをマススペクトロメーター(LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific)のエ
レクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)源に導入する前に直列タンパク質消化、ペプチド脱塩
および逆相クロマトグラフィーを可能にするよう設計した。
【０３６６】
走査に必要な流体ストリームは２個の別々のＨＰＬＣポンプにより提供した。最初のＨ
ＰＬＣ(Surveyor MSポンプ、Thermo Scientific)は緩衝液Ａを１２５μL／分の定常流速
で送達し、１０ポートバルブをとおしてマウントされた逆相トラップカートリッジ上への
固定化ペプシンカートリッジを介するサンプル送達に使用した。充填および脱塩後、１０
ポートバルを、逆相トラップカートリッジから分析的カラムを通りマススペクトロメータ
ーのイオン源への勾配ポンプ(AQUITY UPLC, Waters)の助けを借りたサンプルの溶出に切
り替えた。固定化酵素カートリッジを勾配溶出中の消耗のために単離した。勾配ポンプは
、０〜４０％移動相Ｂを３５分、５μL／分および４０〜９５％移動相Ｂを５μL／分で１
０分の直線状勾配セグメントを送達した。ポンプからの勾配流は、１０ポートバルブで、
実際の流れがトラップカートリッジおよび分析的カラムを通る勾配溶出が〜１μL／分で
あるように受動的スプリッターで分けた。全クロマトグラフ工程は、洗浄および平衡化工
程を含み、７０分の長さであった。
【０３６７】
マススペクトロメトリー
オンライン消化で得られたタンパク分解性フラグメントの同定を目的として、数個のデ
ータ依存性ＭＳ／ＭＳ実験を行った。これらの獲得のために、直列ＭＳスペクトルをLTQ-
OrbitrapハイブリッドマススペクトロメーターのＬＴＱアナライザーで獲得した。前駆体
マス選択は、Orbitrapアナライザーで獲得したＭＳ走査に基づいた。重水素化レベル決定
を目的とした一段階ＭＳ獲得を、６０,０００の分解能で、Orbitrap(ｍ／ｚ４００〜２０
００にわたり)アナライザーで獲得した。
【０３６８】
タンパク質およびタンパク質：Ｆａｂ複合体の製造
ＨＥＲ３タンパク質を、５０μg  ＨＥＲ３タグを２５mM  ＴＢＳ(ｐＨ７.５)／５００
mM  ＮａＣｌで希釈し、最終体積５０μLとすることにより製造した。タンパク質：Ｆａ
ｂ複合体を、５０μg  ＨＥＲ３タグを、１：１モル比で試験するＦａｂと混合すること
により製造した。次いでタンパク質：Ｆａｂ混合物を最終体積５０μLに２５mM  ＴＢＳ(
ｐＨ７.５)／５００mM  ＮａＣｌで希釈した。
【０３６９】
タンパク質：Ｆａｂ複合体を調製し、少なくとも２時間、４℃でインキュベートした。
４個のサンプル、希釈剤、クエンチおよび還元溶液を含む９６ウェルプレートを、各実験
開始前に液体ハンドラーに充填した。オン−交換実験のために、５０μLのＨＥＲ３また
はＨＥＲ３：Ｆａｂ複合体を１５０μL  Ｄ２Ｏ緩衝液で希釈した。混合物を２００μL  
還元緩衝液で１分処理することにより還元し、６００μLのクエンチ緩衝液でクエンチン
グした。全液体取扱い工程後の総体積は〜１mLであった。混合したら、クエンチした溶液
をクロマトグラフシステムに注入し、そこで自動的に消化され、分離され、ＬＣＭＳによ
り分析された。サンプルとコントロールの重水素化の平均変化を、サンプルとコントロー
ルの重水素取り込みレベルの差異として計算した。
【０３７０】
データ処理
Orbitrap  ＲＡＷファイルを、社内プログラム(RawXtract)を使用してｍｚＸＭＬファ
イルに変換した。続いて、直列ＭＳ獲得をSEQUEST(Yates Lab, Scripps Research Instit
ute, La Jolla, CA)を使用して検索し、検索結果を自動的にDTASelect 2.0 (Yates Lab, 
Scripps Research Institute, La Jolla, CA)を使用してフィルタリングした。ペプチド
配列同定を使用して、社内で書いたプログラムを使用して、各同定配列について一イオン
クロマトグラムを自動的に抽出し、クロマトグラフピークを通した平均スペクトルを作成
した。平均スペクトルを平滑化し、重心中心化(centroided)した。レベルの重水素取り込
みを、重水素化サンプルと非重水素化参照の質量差異として取った。処理データを手動で
確認し、自動化処理工程の不正確さおよび誤差を調節した。重水素取り込みレベルを、各
ペプチドにわたり重水素含量を非局在化することにより、タンパク質配列の各残基に割り
当てた(すなわち、観察された重水素化レベルをペプチドのアミノ酸数で割った)。残基が
１個を超えるペプチドによりカバーされるならば、該残基を覆う全ペプチドの標準化重水
素取り込みを平均化した。
【０３７１】
実施例９：ヒトHER3/MOR09823 FabおよびヒトHER3/MOR09825 Fab複合体のＸ線結晶学的構
造決定
本実施例は、それぞれ３.２Åおよび３.４Å分解能で決定するMOR09823のＦａｂフラグ
メントおよびMOR09825のＦａｂフラグメントに結合する完全長ＨＥＲ３の結晶構造を示す
。タグ付ヒトＨＥＲ３を、ＰＢＳ(ｐＨ７.３)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200 P
repGradeカラム(GE Healthcare)でさらに精製した。大腸菌発現MOR09823およびMOR09825 
Fabを、細胞をリゾチームで溶解し、Ｈｉｓ６タグ付ＦａｂフラグメントをHisTrap_HP (G
E Healthcare)カラムに捕捉することにより単離した。MOR09823 Fabフラグメントを、２
５mM  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)、１５０mM  ＮａＣｌで平行化したSuperdex 75 16/60カラム
(GE Healthcare)でのゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０３７２】
ＨＥＲ３  Ｆａｂ複合体を、過剰のＦａｂとタグ付ＨＥＲ３を、１.３〜１.８：１のモ
ル比(濃度は、ＨＥＲ３およびＦａｂそれぞれ０.９および１.４(mg／ml)−１cm−１の計
算された励起係数を使用して２８０nmの吸光度から計算)で混合することにより調製し、
複合体を２５mM  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)、１５０mM  ＮａＣｌで平衡化したSuperdex 200 
10/300カラム(GE Healthcare)で精製した。ピークフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びＬＣＭＳで分析した。各複合体について、ほぼ等モル比でＨＥＲ３およびＦａｂのいず
れも含むフラクションを溜め、濃縮した。ＨＥＲ３／MOR09823結晶を、２９３Ｋで座滴蒸
気拡散により、１５０nl  ＨＥＲ３／MOR09823複合体および１５０nlのリザーバー溶液(
１００mM  クエン酸ナトリウムｐＨ５.６、２０％PEG 4000および２０％イソプロパノー
ル)を含む液滴から成長させた。結晶をさらに８％グリセロールを含むリザーバー溶液に
移し、液体窒素で急速冷凍した。ＨＥＲ３／MOR09825結晶を、２９３Ｋで、１５０nl  Ｈ
ＥＲ３／MOR09825複合体および１５０nlのリザーバー溶液(１００mM  ビス−ｔｒｉｓ  
ｐＨ６.５、１６％ＰＥＧ  １０,０００)を含む液滴から座滴蒸気拡散により成長させた
。結晶を、１００mM  ビス−ｔｒｉｓ  ｐＨ６.５、１８％ＰＥＧ  １０,０００および２
２％グリセロールに移し、液体窒素で急速冷凍した。
【０３７３】
データをビームライン１７−ＩＤでAdvanced Photon Source(Argonne National Labora
tory)で回収した。HER3/MOR09823 Fab複合体データを処理し、HKL2000(HKL Research Inc
)を空間群Ｉ２２２でセル直径ａ＝１２４.１６、ｂ＝１３９.４４、ｃ＝１８０.２５Åを
使用して３.２Åで良好な統計値で見積もった。HER3/MOR09823 Fab構造を、検索モデルと
してＦａｂフラグメントおよび公開されたHER3 ECD構造1mb6を使用して、Phaser(McCoy e
t al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674)を使用した分子置換により解析した。１分
子のHER3/MOR09823 Fab複合体を非対称単位に含む最終モデルをCOOT(Emsley & Cowtan(20
04) Acta Cryst. 60:2126-2132)に構築し、結合長および結合角それぞれ０.０１０Åおよ
び１.３７°のｒｍｓｄで、BUSTER(Global Phasing, LTD)を使用して、それぞれ１９.０
および２４.５％のＲおよびＲｆｒｅｅ価に精密化した。PyMOL(Schroedinger, LLC)で同
定したMOR09823 Fabの任意の原子から５Å以内に原子を含むＨＥＲ３の残基を表１１およ
び１２に列記する。HER3/MOR09825 Fab複合体データを処理し、自己PROC(Global Phasing
, LTD)を空間群Ｉ２２２でセル直径ａ＝１２４.２３、ｂ＝１４０.９４、ｃ＝１８０.２
５Åを使用して３.４Åで良好な統計値で見積もった。HER3/MOR09825 Fab構造を、検索モ
デルとしてHER3/MOR09823 Fab構造を使用して(McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 4
0:658-674)を使用して分子置換した。１分子のHER3/MOR09825 Fab複合体を非対称単位あ
たりに含む最終モデルをCOOT(Emsley & Cowtan(2004) Acta Cryst. 60:2126-2132)に構築
し、結合長および結合角それぞれ０.００９Åおよび１.２１°のｒｍｓｄで、BUSTER(Glo
bal Phasing, LTD)を使用して、それぞれ１８.８および２４.９％のＲおよびＲｆｒｅｅ
価に精密化した。PyMOL(Schroedinger, LLC)で同定したMOR09825 Fabの任意の原子から５
Å以内に原子を含むＨＥＲ３の残基を表１３および１４に列記する。
【０３７４】
実施例１０：ホスホ−ＨＥＲ３インビトロ細胞アッセイ
MCF-7細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５mM  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣ
Ｓに、およびSK-Br-3をマッコイ５ａ、１０％ＦＣＳ、１.５mM  Ｌ−グルタミン中で一般
的に維持した。完全培地で増殖させたサブコンフルエントMCF7またはSK-Br-3細胞をaccut
ase(PAA Laboratories)で回収し、適当な増殖培地に最終濃度５×１０５細胞／mLで再懸
濁した。次いで１００μLの細胞懸濁液を９６ウェル平底プレート(Nunc)の角ウェルに添
加し、最終密度５×１０４細胞／ウェルとした。MCF7細胞を約３時間付着させ、培地を０
.５％ＦＢＳ含有飢餓培地に交換した。全プレートを次いで一夜、３７℃でインキュベー
トし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体(適当な培地で希釈)で８０分、３７℃で処理した。MCF7
細胞を５０ng／mL  ニューレグリン１−β１  ＥＧＦドメイン(R&D Systems)で最終２０
分処理して、ＨＥＲ３リン酸化を刺激した。全培地を穏やかに吸引し、細胞を１mM  Ｃａ
Ｃｌ２および０.５mM  ＭｇＣｌ２(Gibco)含有氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を５０μL  
氷冷溶解緩衝液(２０mM  Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)／１３７mM  ＮａＣｌ／１０％グリセロー
ル／２mM  ＥＤＴＡ／１％ＮＰ−４０／１mM  オルトバナジン酸ナトリウム、アプロチニ
ン(１０μg／mL)／ロイペプチン(１０μg／mL))で洗浄し、氷上で振盪しながら３０分イ
ンキュベートした。ライセートを次いで回収し、１８００ｇで１５分、４℃で遠心して、
細胞細片を除去した。２０μLのライセートを予め調製した捕捉プレートに添加した。
【０３７５】
ＨＥＲ３捕捉プレートを、炭素プレート(Mesoscale Discovery)を使用して、一夜、４
℃で２０μLのＰＢＳで希釈した４μg／mL  MAB3481捕捉抗体(R&D Systems)でコーティン
グし、続いて３％ウシ血清アルブミンの１×Ｔｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.
１％Tween-20で遮断することにより調製した。ＨＥＲ３を、プレートを室温で１時間振盪
し、ライセートを吸引し、ウェルを１×Ｔｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.１％
Tween-20で洗浄することによりライセートから捕捉した。リン酸化ＨＥＲ３を、室温で１
時間振盪しながらインキュベートすることにより１％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Twe
en-20中に調製した０.７５μg／mL  ビオチニル化抗ホスホチロシン抗体(R&D Systems)で
検出した。ウェルを１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４回洗浄し、ビオチニル化タンパ
ク質を１％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で希釈したＳタグ標識ストレプトア
ビジン(Mesoscale Discovery)と１時間、室温でインキュベートすることにより検出した
。各ウェルを吸引し、１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４回洗浄し、２０μLのRead緩衝
液Ｔと界面活性剤(Mesoscale Discovery)を添加し、シグナルをMesoscale Sector Imager
を使用して定量した。抗体MOR06391またはＭＯＲ０３２０７は、アイソタイプコントロー
ルとしてシグナル伝達実験に組み込んだ。
【０３７６】
実施例１１：ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)インビトロ細胞アッセイ
完全培地で増殖したサブコンフルエントSK-Br-3およびBT-474細胞をaccutase(PAA Labo
ratories)で回収し、適当な増殖培地に最終濃度５×１０５細胞／mLで再懸濁した。１０
０μLの細胞懸濁液を、次いで９６ウェル平底プレート(Nunc)の各ウェルに添加し、最終
密度５×１０４細胞／ウェルとした。全プレートを、次いで、一夜、３７℃でインキュベ
ートし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体(適当な培地で希釈)で８０分、３７℃で処理した。全
培地を穏やかに吸引し、細胞を１mM  ＣａＣｌ２および０.５mM  ＭｇＣｌ２(Gibco)含有
氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を５０μL  氷冷溶解緩衝液(２０mM  Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)
／１３７mM  ＮａＣｌ／１０％グリセロール／２mM  ＥＤＴＡ／１％ＮＰ−４０／１mM  
オルトバナジン酸ナトリウム／アプロチニン(１０μg／mL)／ロイペプチン(１０μg／mL)
)の添加により溶解し、氷上で振盪しながら３０分インキュベートした。次いで、ライセ
ートを回収し、１８００ｇで１５分、４℃で遠心して、細胞細片を除去した。２０μLの
ライセートを、３％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で予め遮断した多スポット
３８４ウェルホスホ−Ａｋｔ炭素プレート(Mesoscale Discovery)に添加した。プレート
を室温で２時間、振盪しながらインキュベートし、ライセートを吸引し、ウェルを１×Ｔ
ｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.１％Tween-20で４回洗浄した。リン酸化Ａｋｔ
を、１％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で５０倍希釈した２０μLのスルホタグ
抗ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)抗体(Mesoscale Discovery)で、振盪しながら室温で２時間
インキュベートすることにより検出した。ウェルを１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４
回洗浄し、２０μLのRead緩衝液Ｔと界面活性剤(Mesoscale Discovery)を添加し、シグナ
ルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。抗体MOR06391またはＭＯＲ０３２０
７をシグナル伝達実験にアイソタイプコントロールとして包含させた。
【０３７７】
実施例１２：細胞株増殖アッセイ
SK-Br-3細胞を１０％ウシ胎児血清の添加により修飾したマッコイで一般的に培養し、B
T-474細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで培養した。サブコンフルエント細胞をトリプ
シン処理し、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地で５×１０４細胞／mLに希釈し、９６ウェル透明
底黒色プレート(Costar 3904)に５０００細胞／ウェルの密度で平板培養した。細胞を一
夜、３７℃でインキュベートし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体(典型的最終濃度の１０また
は１μg／mL)を添加した。プレートを６日間インキュベーターに戻し、CellTiter-Gloを
使用して細胞生存能を評価した。１００μLのCellTiter-Glo溶液を各ウェルに添加し、室
温で穏やかに振盪しながら１０分インキュベートした。発光の量をSpectraMaxプレートリ
ーダー(Molecular Devices)を使用して決定した。各抗体で得られた増殖阻害の程度を各
ＨＥＲ３抗体で得られた発光価を標準的アイソタイプ対照抗体(MOR06391)と比較すること
により計算した。
【０３７８】
増殖アッセイのために、MCF-7細胞を、４mM  Ｌ−グルタミン／１５mM  ＨＥＰＥＳ／
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２(１：１)で一般的に培養した。サブコンフルエント細
胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、４mM  Ｌ−グルタミン／１５mM  ＨＥＰＥＳ／
１０μg／mLヒトトランスフェリン／０.２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２(１：１)で１×
１０５細胞／mLに希釈した。細胞をｍ９６ウェル透明底黒色プレート(Costar)に５０００
細胞／ウェルの密度で平板培養した。適当な濃度のＨＥＲ３抗体(典型的最終濃度の１０
または１μg／mL)を次いで添加した。１０ng／mLのＮＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン(R&D
Systems)も適当なウェルに添加して、細胞増殖を刺激した。プレートを６日間インキュ
ベーターに戻し、CellTiter-Gloを使用して細胞生存能を評価した。各抗体で得られた増
殖阻害の程度を背景(ニューレグリンなし)発光価を減産し、各抗ＨＥＲ３抗体で得られた
価を標準的アイソタイプ対照抗体(MOR06391)と比較することにより計算した。
【０３７９】
実施例１３：リガンド遮断細胞アッセイ
１０％ＦＢＳおよび１μg／mLインスリン(Sigma)添加ＭＥＭで培養したMCF-7細胞を濯
ぎ、小体積のＦＡＣＳｍａｘ細胞解離緩衝液(Genlantis)に回収し、５mLのＦＡＣＳ緩衝
液(ＰＢＳ／１％ＦＢＳ／０.１％ナトリウムアジド)を添加した。細胞密度を計算し、最
終濃度１×１０６細胞／mLに調節した。１００μlの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの
各ウェルに添加し、細胞を遠心分離(２２０ｇ、３分、４℃)によりペレット化した。細胞
ペレットをＦＡＣＳ緩衝液(典型的最終抗体濃度範囲１００〜０.１nM)で希釈した１００
μLの適当な試験抗体に再懸濁し、プレートを氷上で４５分インキュベートした。リガン
ド遮断抗体MAB3481(R&D Systems)を、ポジティブコントロール。細胞を染色緩衝液で２回
洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した１０nM  ＮＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン(R&D Syste
ms)を添加し、氷上で４５分インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、結合
ニューレグリンを、細胞を１０nM抗ヒトＮＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン抗体(R&D Syste
ms)と氷上で４５分インキュベートすることにより検出した。細胞を染色緩衝液で２回洗
浄し、氷上で４５分、ＦＡＣＳ緩衝液で１／５００希釈したＰＥ結合抗ヤギ抗体(Jackson
ImmunoResearch)とインキュベートした。次いで細胞を遠心分離によりペレット化し、ペ
レットを２００μL  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。各サンプルを定量するために、１０,
０００生存細胞をLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で計数し、細胞表面結合
ニューレグリン量を平均チャネル蛍光の測定により検出した。
【０３８０】
実施例１４：リガンド遮断生化学的アッセイ
本方法は、  ＨＥＲ３／抗体複合体がニューレグリンに結合する能力の試験における表
面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)に基づくバイオセンサー(BiacoreＴＭ、GE Healthcare, Uppsa
la, Sweden)の有用性に基づく。
BiacoreＴＭは、結合相互作用の検出および測定に表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の減少
を使用する。典型的Biacore実験において、相互作用分子の一つ(ニューレグリン)をマト
リクス上に固定化し、一方相互作用パートナー(ＨＥＲ３)を表面上を流す。結合相互作用
は、センサー表面上の質量増加およびセンサー表面の近傍の培地の屈折指数の対応する直
接変化をもたらす。屈折指数またはシグナルの変化を共鳴単位(Ｒ.Ｕ.)で記録する。複合
体の会合および解離によるシグナル変化を非浸潤性方法で、連続的におよびリアルタイム
にモニターし、その結果をセンサーグラムとして記録する。
【０３８１】
ここに記載する全実験の実施にBiacoreTMT100(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使
用した。センサー表面調整および相互作用解析を２５℃で行った。緩衝液およびBiacore
試薬をGE Healthcareから購入した。１０mM  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４／１５０mM  ＮａＣ
ｌ、０.０５％Ｐ２０、０.５％ＢＳＡ含有ランニング緩衝液をアッセイをとおして使用し
た。
【０３８２】
ＮＲＧ−１β１細胞外ドメイン(R&D Systems)を、氷上で４５分、５：１モル比のＥＺ
−結合スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン(Pierce)とインキュベートした。過剰のエ
タノールアミン添加により反応停止させ、非共役ビオチンを、ビオチニル化−ＮＲＧから
脱塩スピンカラム(Zeba)を使用して除去した。ビオチニル化−ＮＲＧを、約３０００Ｒ.
Ｕ.のｓｓＤＮＡ−ストレプトアビジン(Biotin CAPtureキット)と予め固定化したセンサ
ーチップＣＡＰで捕捉し、ニューレグリン表面密度を４００〜６００Ｒ.Ｕ.の範囲とした
。参照フローセルを、ｓｓＤＮＡ−ストレプトアビジンのみがフローセル表面に存在する
ように、注入工程からビオチニル化−ＮＲＧを除いて作製した。
【０３８３】
ＨＥＲ３／抗体複合体を、１０nMヒトＨＥＲ３−Ｆｃを適当な試験抗体の濃度を増加さ
せながら(０〜５０nM)、１５分、室温でインキュベートして産生し、BiacoreＴＭと１０
℃でインキュベートした。相互作用解析を、参照およびニューレグリン表面上のＨＥＲ３
／抗体複合体を１８０秒間、流速６０μL／分で連続して注入することにより行った。複
合体解離を、１８０秒間、流速６０μL／分でモニターした。表面再生を各分析サイクル
の最後に、１２０秒間の８Ｍグアニジン：１Ｍ  ＮａＯＨ(３：１)注入、続く１２０秒間
の３０％アセトニトリル／０.２５Ｍ  ＮａＯＨの流速３０μL／分での注入を使用して行
った。
【０３８４】
実施例１５：インビボＰＤ試験
BxPC3およびBT-474細胞を培養し、雌無胸腺nu/nu Balb/Cマウス(Harlan Laboratories)
に実施例１６および１７に記載のとおりインプラントした。
腫瘍が適当なサイズになったら、動物を腫瘍品質について試験した。潰瘍化腫瘍の動物
または液体で満たされた腫瘍の動物を試験から除外した。残りの動物に、静脈内に、側方
尾静脈注射により抗体を投与した。一定時点で、動物をＣＯ２窒息により屠殺し、全血液
を心臓穿刺により回収し、１.５mLエッペンドルフ採取チューブに入れた。腫瘍組織を直
ぐに摘出し、ねじ蓋付ポリプロピレンサンプルチューブに入れ、液体窒素で急速冷凍した
。組織を、ライセートを調製するまで−８０℃で貯蔵した。
【０３８５】
実施例１６：インビボBT-474有効性試験
BT-474細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで、インプラント時まで抗
生物質無しで培養した。
細胞接種１日前、雌無胸腺nu/nu Balb/Cマウス(Harlan Laboratories)に、皮下的に徐
放性１７β−エストラジオールペレット(Innovative Research of America)をインプラン
トし、血清エストロゲンレベルを維持した。１７β−エストラジオールペレットインプラ
ント１日後、５×１０６細胞を同所性に、第四乳房脂肪パッドに、ハンクス平衡塩溶液中
５０％無フェノールレッドマトリゲル(BD Biosciences)を含む懸濁液として注射した。懸
濁液での細胞を含む総注入体積は２００μLであった。細胞インプラント２０日後、腫瘍
体積約２００mm３の動物を有効性試験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹動物を
有効性試験に参加させた。
【０３８６】
単剤試験のために、動物に、MOR10701またはMOR10703を側方尾静脈注射により、静脈内
に投与した。初期負荷量４０mg／kgを第一投与量として与えた。初期投与の後、動物に、
２０mg／kgで、試験の間隔日スケジュールとした。組み合わせ試験のために、動物にMOR1
0701またはMOR10703(２０mg／kg、iv、ｑ２ｄ)および最適以下のトラスツマブ(１mg／kg
、iv、２ｑｗ)投与量を投与した。
【０３８７】
試験期間中、腫瘍体積を、週に２回ノギス測定することにより測定した。処置／対照(
Ｔ／Ｃ)価パーセントを次の式を使用して計算した：
ΔＴ＞０であるならば、％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ
式中
Ｔ＝試験最終日の薬剤処置群の平均腫瘍体積；
ΔＴ＝試験最終日の薬剤処置群の平均腫瘍体積−投与開始日の薬剤処置群の平均腫瘍体積
；
Ｃ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積；および
ΔＣ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積−薬剤処置群の投与開始日の対照群の平均腫瘍
体積。
【０３８８】
体重を週に２回測定し、投与量を体重で調節した。体重変化％を(ＢＷ現在−ＢＷ初期)
／(ＢＷ初期)×１００で計算した。データを、処置開始日からの体重変化パーセントとし
て示す。
全データは、平均±平均の標準誤差(ＳＥＭ)で示した。デルタ腫瘍体積および体重を統
計学的分析に使用した。群間比較を、一方向ＡＮＯＶＡと、続く事後Ｔｕｋｅｙにより行
った。全統計学的評価について、レベルの有意性をｐ＜０.０５と設定した。媒体対照群
と比較した有意性を報告する。
【０３８９】
実施例１７：インビボBxPC3有効性試験
BxPC3細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地で、インプラント時ま
で抗生物質なしでインキュベートした。
雌無胸腺nu/nu Balb/Cマウス(Harlan Laboratories)に、１０×１０６細胞を、５０％
リン酸緩衝化食塩水と５０％マトリゲル中の混合物で皮下的にインプラントした。懸濁液
での細胞を含む総注入体積は２００μLであった。腫瘍が約２００mm３の大きさになった
ら、動物を有効性試験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹動物を有効性試験に参
加させた。異常な腫瘍増殖特徴を示すならば、動物を除外した。
動物に、側方尾静脈注射を介して静脈内投与した。初期負荷量４０mg／kgを第一投与量
として与えた。初期投与の後、動物に、２０mg／kgで、試験の間隔日スケジュールとした
(２５日間、処置下)。腫瘍体積およびＴ／Ｃ価を先に詳述したとおり計算した。
【０３９０】
実施例１８：ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)インビボＰＤアッセイ
約５０mm３凍結腫瘍(例えばBT-474またはBXPC-3)組織を氷上で融解し、ホスファターゼ
(Roche)およびプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含む１００〜３００μLのＴ−ＰＥＲ緩衝液(
Pierce)を各サンプルに添加した。溶解緩衝液の添加体積は、腫瘍サンプルのサイズによ
った。組織を１.５mL乳棒(Fisher Scientific)で破壊し、得られた懸濁液を氷上で１５分
インキュベートして、一夜、−８０℃で凍結した。サンプルを融解し、１５分、１３００
０ｇ、４℃で遠心分離して、上清タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ(Thermo Scientific)
で定量した。組織上清を溶解緩衝液(Mesoscale Discovery)で希釈し、２５μgを、予め遮
断溶液−Ａ(Mesoscale Discovery)で遮断した多スポット９６ウェルホスホ−Ａｋｔ炭素
プレート(Mesoscale Discovery)に添加した。プレートを室温で１時間、振盪しながらイ
ンキュベートし、ライセートを吸引し、ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液(Mesoscale Discove
ry)で４回洗浄した。リン酸化Ａｋｔを、抗体希釈緩衝液で希釈した２５μLのスルホタグ
抗ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)抗体(Mesoscale Discovery)を使用して、室温で１時間振盪
しながらインキュベートすることにより検出した。ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液で４回洗
浄し、１５０μLのRead緩衝液Ｔ(界面活性剤含有)(Mesoscale Discovery)を添加し、シグ
ナルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。
【０３９１】
実施例１９：ホスホＨＥＲ３(Y1197)インビボＰＤアッセイ
約５０mm３凍結腫瘍(例えばBXPC-3)組織を氷上で融解し、ホスファターゼ(Roche)およ
びプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含む１００〜３００μLのＴ−ＰＥＲ緩衝液(Pierce)を各
サンプルに添加した。組織を１.５mL乳棒(Fisher Scientific)を使用して破壊し、得られ
た懸濁液を、氷上で１５分インキュベートし、一夜、−８０℃で凍結した。サンプルを融
解し、１５分、１３０００ｇ、４℃で遠心分離して、上清タンパク質濃度をＢＣＡアッセ
イ(Thermo Scientific)で定量した。組織上清を溶解緩衝液で希釈し、予め４μg／mL  MA
B3481(R&D Systems)で一夜被覆し、３％ミルクで遮断した多スポット９６ウェル炭素プレ
ート(Mesoscale Discovery)に１５０μgを添加した。プレートを室温で２時間、振盪しな
がらインキュベートし、ライセートを吸引し、ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液(Mesoscale D
iscovery)で４回洗浄した。リン酸化ＨＥＲ３は、遮断緩衝液で１／８０００希釈した抗
ＨＥＲ３  ｐY1197と結合させた。室温で１時間インキュベーション後、ウェルをＴｒｉ
ｓ洗浄緩衝液で洗浄し、抗ｐY1197抗体を、遮断緩衝液で１／１０００希釈したＳタグ標
識抗ウサギ抗体(Mesoscale Discovery)で、振盪しながら室温で１時間インキュベートす
ることにより検出した。ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液で４回洗浄し、１５０μlの１／４
希釈Read緩衝液Ｔ(界面活性剤含有)(Mesoscale Discovery)を添加し、シグナルをMesosca
le Sector Imagerを使用して定量した。
【０３９２】
実施例２０：インビトロ薬剤組み合わせ試験
ＨＥＲ３標的抗体が標的治療剤と組み合わさる能力を試験するために、MOR09825または
MOR10703をトラスツマブ、ラパチニブ、BEZ235、BKM120、BYL719、RAD001、エルロチニブ
およびセツキシマブと細胞生存能アッセイで組み合わせた。約１０００〜１５００のSK-B
r-3(マッコイ)、MDA-MB-453(ＲＰＭＩ)、FaDu(ＥＭＥＭ)またはL3.3(ＲＰＭＩ)細胞を、
２％ＦＢＳを添加した適当な培養培地で３８４ウェルプレートに播種し、一夜、３７℃で
付着させた。適当な薬剤組み合わせ(ラパチニブ、BKM120およびBYL719の典型的最終薬剤
濃度は３μM〜１３nM範囲；RAD00は２７nM〜０.００４１nM；エルロチニブ１μM〜０.０
０２５nM範囲；ＭＯＲ１０７３１００nm〜０.０１nm範囲；セツキシマブ１００nM〜０.０
０１５nM；およびトラスツマブ３００nM〜０.０４６nM範囲)を、続いて、各プレートが各
薬剤の用量応答曲線を二次元マトリクスで含むようにウェルに添加した。プレートを３〜
６日間インキュベータに戻し、CellTiter-Gloを使用して細胞生存能を評価した。CellTit
er-Glo溶液を各ウェルに添加し、室温で穏やかに振盪しながら１０分インキュベートした
。発光の量をSpectraMaxプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して決定した。各
組み合わせで得た増殖阻害の程度を計算し、組み合わせ活性をLoewe加算性モデルを使用
して強調した。
【０３９３】
実施例２１：L3.3細胞におけるインビボ薬剤組み合わせ試験
膵臓L3.3細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地でインプラント時ま
で培養した。雌Ｆｏｘｎ１ヌードマウス(Harlan Laboratories)に、皮下的に３×１０６
細胞を無ＦＢＳのＤＭＥＭ中でインプラントした。懸濁液中の細胞を含む総注入体積は１
００μLであった。細胞インプラント１２日後、動物を有効性試験に参加させ、全群平均
腫瘍体積約１００mm３であった。一般に、群あたり計８匹の動物を試験に参加させた。異
常な腫瘍増殖特徴を示すならば、動物を除外した。
動物に、MOR10703を側方尾静脈注射により、２０mg／kg、隔日スケジュールで試験中静
脈内に投与した(１４日間、処置下)。エルロチニブを５０mg／kg(ＰＯ)で毎日単剤または
MOR10703との組み合わせで投与した。腫瘍体積およびＴ／Ｃ価を先に詳述したとおり計算
した。
【０３９４】
結果および考察
まとめると、これらの結果は、一群の抗体がＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内
のアミノ酸残基の立体構造エピトープに結合し、ＨＥＲ３を不活性または閉鎖立体構造で
安定化させることを示す。これらの抗体の結合はリガンド依存性シグナル伝達およびリガ
ンド非依存性シグナル伝達のいずれも阻害する。これらの抗体はまたＨＥＲ３リガンドと
同時に結合する。
【０３９５】
(ｉ)  親和性決定
抗体親和性を、上記のとおり溶液平衡タイトレーション(ＳＥＴ)により決定した。結果
を表９に要約し、MOR10701のタイトレーション曲線の例を図１に示す。データは、ヒト、
カニクイザル、ラットおよびマウスＨＥＲ３と密接に結合する多くの抗体が同定されたこ
とを示す。
【表３１】
2020007349.tif 000033
【０３９６】
(ii)  SK-Br-3細胞ＥＣ５０決定
同定した抗体がＨＥＲ３発現細胞と結合する能力を、ＨＥＲ２増幅細胞株SK-Br-3の結
合についてのＥＣ５０価計算により決定した(図２および表１０参照)。
【表３２】
2020007349.tif 000034
【０３９７】
(iii)  ＨＥＲ３ドメイン結合
抗ＨＥＲ３抗体のサブセットを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＨＥＲ３の多様な細
胞外ドメインと結合する能力について特徴づけした。これを達成するために、ＨＥＲ３の
細胞外ドメインをその４個の構成的ドメインに分割し、これらのドメインの種々の組み合
わせを上記のとおりクローン化し、発現し、非依存性タンパク質として精製した。この戦
略を使用して、下記ドメインは可溶性タンパク質としての産生に成功した：ドメイン１お
よび２(Ｄ１−２)、ドメイン２(Ｄ２)、ドメイン３および４(Ｄ３−４)およびドメイン４
(Ｄ４)。多くの内部的に産生されたマウス抗ヒトＨＥＲ３抗体(８Ｄ７、１Ｆ５および８
Ｐ２)も、各単離ドメインの完全性を証明するためにポジティブコントロールとして試験
した。
【０３９８】
図３に示すとおり、MOR09823およびMOR09825はいずれもＨＥＲ３細胞外ドメインと十分
に結合するが、単離ドメインへの結合は、これらの抗体でのこのアッセイではほとんど見
られなかった。この結合パターンについていくつかの可能な説明がある：
ａ)  MOR09823およびMOR09825は、ドメイン境界に伸びる直線状エピトープと結合し、そ
れゆえに、ドメインが単離タンパク質として発現されたとき、結合エピトープはなくなる
可能性がある。
ｂ)  MOR09823およびMOR09825は、複数ドメインを架橋する非直線状エピトープと結合し
得る。結果として、ＨＥＲ３の成分単位への分離は結合部位を破壊し得る。
ｃ)  ＨＥＲ３の形状／立体構造は、ＨＥＲ３の完全長細胞外ドメインのみがこの形状／
立体構造と適合するように、ＨＥＲ３に対するMOR09823およびMOR09825の結合の成分であ
り、一方単離ドメインはこの立体構造を完全に想定できない。
【０３９９】
(vi)  水素／重水素交換マススペクトロメトリーを使用したＨＥＲ３エピトープマッピン
グ
ＨＥＲ３エピトープを、さらにMOR09823、MOR09824、MOR09825およびMOR09974のＦａｂ
バージョンの存在下および非存在下でHER3 ECDのHDX-MS分析により探索した。図４Ａは、
結合Ｆａｂ非存在下で、約６９％のHER3 ECD配列が、少なくとも１ペプチドにより被覆さ
れたことを示す。被覆内のギャップは、おそらく、これらの領域内の残基のグリコシル化
またはシステイン富領域のジスルフィド結合の不十分な還元により、これは特にドメイン
２で明白である。興味深いことに各Ｆａｂが個々の保護パターンを示すが、強い保護の１
領域がMOR09823、MOR09824、MOR09825およびMOR09974で一貫して見られ(図４Ｂ参照)、こ
れらの高度に関連する抗体ファミリーがＨＥＲ３に同一方法で結合することを示す。最強
保護は、ドメイン２残基２６９〜２８６(TFQLEPNPHTKYQYGGVC)(配列番号１４６)で見られ
、この近傍の残基がｍＡｂ結合に重要である可能性を示す。Ｆａｂ保護残基の公開された
ＨＥＲ３結晶構造(Cho & Leahy, (2002) Science 297:1330-1333)への位置づけは、残基
２６９〜２８６がドメイン２内の機能的に重要なβ−ハルピンループ内および近位である
ことを強調する(図４Ｃ参照)。
【０４００】
(vii)  ＨＥＲ３／MOR09823結晶構造
ＨＥＲ３細胞外ドメインに結合するMOR09823 Fabフラグメントの３.２Å分解能ｘ線結
晶構造を解析し、さらに関連抗体のこのファミリーにより認識されるＨＥＲ３エピトープ
を規定した(図５Ａ参照)。さらに、ヒトＨＥＲ３に結合するMOR09825 Fabフラグメントの
３.４Å構造も解決した。両MOR09823/HER3およびMOR09825/HER3結晶構造において、ＨＥ
Ｒ３は係留(不活性)立体構造である(図５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ参照)。この立体構造は、ド
メイン２のβハルピン二量体化ループが仲介するドメイン２と４の顕著な相互作用界面に
より特徴付けられる。観察されたＨＥＲ３立体構造は、ＨＥＲ３結晶構造をニューレグリ
ン非存在下細胞外ドメインとして公表したCho et al. (Cho & Leahy, (2002), Science 2
97:1330-1333)により先に記載されたものに類似する。ニューレグリンがＨＥＲ３を活性
化できるため、ＨＥＲ３の係留立体構造は不活性であると推定される。類似の係留立体構
造は、関連ＥＧＦＲファミリーメンバーＨＥＲ４(Bouyain et al., (2005) Proc. Natl. 
Acad. Sci. USA, 102:15024-15029)およびＨＥＲ１(Ferguson et al., (2003) Molec.  C
ell 11:507-517)が結晶化されているときにも観察されている。
【０４０１】
不活性(係留)状態でのＨＥＲ３のドメイン１と４の空間的相関は伸長(活性)状態と顕著
に異なる。この知見は、関連ＥＧＦＲファミリーメンバーＨＥＲ２およびリガンド結合Ｈ
ＥＲ１の結晶構造に基づき(Cho et al., (2003) Nature 421:756-760; Ogiso et al., (2
002) Cell 110:775-787; Garrett et al., (2002) Cell 110:763-773)、この両方は伸長(
活性)状態である。伸長状態で、ドメイン２βハルピン二量体化ループは４との阻害相互
作用から放たれ、二量体化パートナータンパク質と自由に相互作用する。それゆえに、ド
メイン２βハルピン二量体化ループは、係留(不活性)状態維持および伸長状態でのＥＧＦ
受容体二量体化の両方に機能的に重要であり、細胞内キナーゼドメインの活性化をもたら
す。MOR09823/HER3およびMOR09825/HER3結晶構造(図５参照)は、それゆえに、MOR09823お
よびMOR09825がいずれもＨＥＲ３の不活性立体構造の安定化により機能することを示唆す
る。
【０４０２】
結晶構造はまた、MOR09823およびMOR09825により認識されるＨＥＲ３エピトープが、ド
メイン２および４の両者からの残基を含む非直線状エピトープであることも確認する(図
５ＣおよびＤ、表１１、１２、１３および１４参照)。高度に関連する抗体このファミリ
ーにより認識されるＨＥＲ３エピトープは、それゆえに、
ドメイン２：残基２６５〜２７７、３１５
ドメイン４残基：５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜
６１５
と規定される。
【０４０３】
ドメイン２および４の両者のMOR09823またはMOR09825による結合は、結果として、ＨＥ
Ｒ３の係留立体構造を安定化させ、そのシグナル伝達能力と拮抗する。
結晶構造で観察されたMOR09823／MOR09825結合モードは、我々の他のエピトープマッピ
ング試験と一致する。具体的に、ＥＬＩＳＡドメイン結合実験は、MOR09823およびMOR098
25の親和性は、単離ドメイン(例えばD1、D1-D2、D3またはD3-D4フラグメント)のいずれよ
りもインタクトＨＥＲ３細胞外タンパク質で有意に大きいことを証明する(図３参照)。ま
た、抗体認識エピトープの一部としてドメイン２βハルピンを同定するHER3 HDX-MSデー
タ(図４Ｂ参照)とも一致する。最後に、両結晶構造は、ＨＥＲ１のドメイン１および３に
準じて位置づけされているＨＥＲ３のリガンド結合表面(Ogiso et al., (2002) Cell, 11
0:775-787; Garrett et al., (2002) Cell, 110:763-773)が、MOR09823またはMOR09825結
合により占拠されないことを示す(図５Ｂ参照)。これは、MOR09823もMOR09825も、ニュー
レグリンのMCF7細胞を遮断しない(図９参照)およびBiacore試験でHER3/MOR09823複合体が
固定化ニューレグリンと結合できる(図１０参照)との我々の発見と一致する。
【０４０４】
【表３３】
2020007349.tif 000035
【０４０５】
【表３４】
2020007349.tif 000036
【０４０６】
【表３５】
2020007349.tif 000037
【０４０７】
【表３６】
2020007349.tif 000038
【０４０８】
MOR09823／MOR09825結晶構造の目視は、ＨＥＲ３残基Ｌｙｓ２６７およびＬｅｕ２６８
が種々の抗体ＣＤＲと複数相互作用を形成することを強調し、抗体結合に重要である可能
性を示唆した。結果として、抗体結合におけるその影響を評価するために、Ｌｙｓ２６７
および／またはＬｅｕ２６８をアラニンに変異し、発現し、得られた組み換えタンパク質
を精製した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、Ｌｙｓ２６７またはＬｅｕ２６８のいずれかの
変異がMOR10703のＨＥＲ３への結合をなくすことを示し(図５Ｆ)、両残基がＨＥＲ３エピ
トープの必須部分であることを示唆し、それゆえに、MOR09823／MOR09825とＨＥＲ３の相
互作用の提案された相互作用を支持する。
【０４０９】
(viii)  細胞シグナル伝達阻害
抗ＨＥＲ３抗体のリガンド依存性ＨＥＲ３活性における影響を確認するために、MCF7細
胞をＩｇＧとインキュベートし、ニューレグリンで刺激した。阻害曲線例を図６Ａに示し
、表１５に要約する。抗ＨＥＲ３抗体のＨＥＲ２−仲介ＨＥＲ３活性化への影響はＨＥＲ
２増幅細胞株SK-Br-3を使用してまた試験した(図６Ｂおよび表１５)。
【０４１０】
【表３７】
2020007349.tif 000039
【０４１１】
ＨＥＲ３活性阻害が下流細胞シグナル伝達Ａｋｔに影響するか否かを決定するために、
リン酸化も、抗ＨＥＲ３抗体後にＨＥＲ２増幅細胞において測定した(図７および表１６
参照)。
【表３８】
2020007349.tif 000040
【０４１２】
要約すると、MOR09823、MOR09824、MOR09825、MOR09974、MOR10701、MOR10702、MOR107
03、MOR12609およびMOR12610は、各々、リガンド依存性およびリガンド非依存性方法の両
者で細胞性ＨＥＲ３活性を阻害できる。
【０４１３】
(ix)  増殖阻害
MOR09823、MOR09824、MOR09825、MOR09974、MOR10701、MOR10702およびMOR10703が全て
ＨＥＲ３活性および下流シグナル伝達を阻害するため、リガンド依存性および非依存性イ
ンビトロ細胞増殖を遮断する能力について試験した(データ例を図８に示し、表１７に要
約する)。試験した抗ＨＥＲ３抗体は、全て有効な細胞増殖阻害剤であった。
【表３９】
2020007349.tif 000041
【０４１４】
(ｘ)  リガンド遮断評価
記載した抗ＨＥＲ３抗体がリガンド結合を遮断する能力を、ニューレグリンのMOR09823
またはMOR09825のいずれかで予め処理したMCF7細胞への結合を試験することにより評価し
た。MOR09823またはMOR09825の存在は、ニューレグリンがMCF7細胞に結合する能力に顕著
な影響を有しないが、実験で使用したポジティブコントロール(Mab3481)は、ニューレグ
リン結合を大いに妨害することができた(図９参照)。これらの結果は、MOR09823がドメイ
ン２および４と結合し、一方ＨＥＲ３のニューレグリンとの相互作用の主接触点はドメイ
ン１および３に重荷群発すると仮説だてられているため、結晶構造と一致する。ニューレ
グリンがＨＥＲ３の不活性立体構造と結合できることを考慮して(Kani et al., (2005) B
iochemistry 44: 15842-15857)、MOR09823およびMOR09825が、シグナル伝達に必要なＨＥ
Ｒ３ドメイン再配列を阻止または受容体二量体化を阻止することにより機能する可能性が
高い。
【０４１５】
(xi)  リガンド遮断評価(生化学)
MOR09823およびニューレグリンがＨＥＲ３と同時に結合できるか否かを探索するために
、生化学的アッセイを、BiacoreＴＭ方法を使用して確立した。相互作用解析を、ビオチ
ニル化ニューレグリンをBiacoreＴＭセンサーチップＣＡＰ(GE Healthcare)上に、Biotin
CAPtureキット(GE Healthcare)を使用して捕捉することにより行った。ＨＥＲ３複合体
を、ヒトＨＥＲ３−ＦｃとMOR09823、105.5(Thermo Scientific)またはヒトＩｇＧのいず
れかの濃度を増やしながらインキュベートして産生した。実施したＨＥＲ３／抗体複合体
を参照を越えて注入し、活性表面およびＨＥＲ３とニューレグリンの相互作用が観察され
た。
【０４１６】
コントロールＩｇＧはＨＥＲ３／ニューレグリン複合体形成に影響しなかったが、105.
5はＨＥＲ３がニューレグリンと結合する能力を顕著に阻害することが観察され、リガン
ド遮断抗体としてのその記載が確認された(図１０)。対照的に、ＨＥＲ３／MOR09823複合
体はニューレグリンと結合でき、MOR09823がリガンド結合を阻止しないことが証明された
。興味深いことに、ＲＵ価の用量依存性増加が、MOR09823/HER3複合体を注入したとき観
察された。このデータは、ニューレグリン、ＨＥＲ３およびMOR09823を含む三量体複合体
がチップ表面上に産生されることを示す。この三量体複合体が形成される能力は、MOR098
23結合がＨＥＲ３のリガンド結合部位を占拠しないためにＨＥＲ３／MOR09823結晶構造か
ら予測され、ニューレグリンおよびMOR09823の結合が相互排他的ではないことを示唆する
。
【０４１７】
他の態様において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３のドメイン２およびドメイ
ン４の両者に結合し、ＨＥＲ３リガンド、例えばニューレグリンの同時結合の遮断がない
。理論を述べる必要はないが、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４のいずれにも結合
する抗体またはそのフラグメント、ＨＥＲ３上のリガンド結合部位を遮断することなくＨ
ＥＲ３を不活性立体構造に保持する可能性が高い。それゆえに、ＨＥＲ３リガンド(例え
ば、ニューレグリン)は、ＨＥＲ３と抗体と同時に結合できる。
【０４１８】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のリガンド依存性および非依存性活
性化の両者をリガンド結合を妨げることなく阻止する。これは次の理由から有利であると
考えられる：
(ｉ)  治療抗体は、各腫瘍型が各機構により誘導されるため、ＨＥＲ３活性化の一機構(
すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体よりも広域の腫瘍に
臨床的有用性を有する。
(ii)  治療抗体は、ＨＲ３活性化の両機構が同時に関与する腫瘍型に有用である。ＨＥＲ
３活性化の一機構(すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体は
これらの腫瘍型にほとんど効果がないかまったく効果がない
(iii)  リガンド結合を妨げることなくＨＥＲ３のリガンド依存性活性化を阻害する抗体
の効果は、リガンドの濃度増加に悪影響を与える可能性が低い。これは、極めて高濃度の
ＨＥＲ３リガンドにより駆動される腫瘍型における効果の上昇または耐性がＨＥＲ３リガ
ンドの上方制御により仲介されるときの薬物耐性傾向の減少に反映される。
(iv)  不活性形態の安定化によりＨＥＲ３活性化を阻害する抗体は、ＨＥＲ３活性化の代
替機構により駆動される薬物耐性の傾向が低い。
結果として、本発明の抗体は、既存の治療抗体が臨床的に無力である状態の処置に使用
し得る。
【０４１９】
(xii)  ＨＥＲ３活性のインビボ阻害および腫瘍増殖に対する影響
記載の抗ＨＥＲ３抗体のインビボ活性を決定するために、MOR09823をBxPC-3およびBT-4
74腫瘍モデルで試験した。MOR09823は、腫瘍ｐＨＥＲ３レベルの顕著な減少により証明さ
れるとおりＨＥＲ３活性を阻害することが証明された(図１１)。ＨＥＲ３のシグナル伝達
下流は、BxPC-3およびBT-474の両者におけるｐＡｋｔレベル減少により証明されるとおり
、同様に阻害された(図１１)。ＨＥＲ２駆動BT-474有効性試験において、反復MOR1070処
置は、腫瘍増殖７４％阻害を生じ(図１２Ａ参照)、一方MOR10703は８３％阻害を生じた。
BxPC3腫瘍増殖モデルにおいて、MOR10701およびMOR10703のいずれもリガンド駆動腫瘍増
殖阻害に極めて有効であった(図１３参照)。
【０４２０】
(xiii)  インビトロ薬剤組み合わせおよび細胞増殖における影響
腫瘍細胞増殖がしばしば複数シグナル伝達経路により駆動されるため、我々は、MOR098
23またはMOR10703と種々の標的剤の組み合わせが細胞増殖遮断に有効であるか否かを評価
した。選択した標的剤は主にＨＥＲ２(トラスツマブ、ラパチニブ)、ＥＧＦＲ(セツキシ
マブ、エルロチニブ)、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ(BEZ235)、ＰＩ３Ｋ(BKM120)、ＰＩＫ３ＣＡ(
BYL719)およびｍＴＯＲ(RAD001)を阻害するものであり、なぜならこれらの標的がヒト腫
瘍で通常活性化されているからである。アイソボログラム分析(図１４参照)は、MOR09823
およびMOR10703がトラスツマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、BEZ235、BK
M120、BYL719およびRAD001と相乗的薬剤組み合わせを示すことを示した。このデータは、
ＨＥＲ３シグナル伝達阻害が、受容体チロシンキナーゼ群またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経
路を標的とする阻害剤で特に有益であることを示唆する。
【０４２１】
(xiv)インビボMOR10703薬剤組み合わせ
インビトロでの受容体チロシンキナーゼ標的剤と組み合わせたＨＥＲ３阻害のため、イ
ンビボでMOR10701またはMOR10703とトラスツマブおよびエルロチニブの組み合わせに影響
を評価した。BT-474異種移植片(図１５Ａ参照)において、MOR10701またはMOR10703(２０m
g／kg)と最適以下のトラスツマブ(１mg／kg)の組み合わせは腫瘍緩解を起こすのに十分で
あった(それぞれ％Ｔ／Ｃ＝−５０および−３７)。L3.3膵臓異種移植片において、MOR107
03(２０mg／kg)と毎日のエルロチニブ(５０mg／kg)の組み合わせは腫瘍静止をもたらした
(％Ｔ／Ｃ＝３、図１５Ｂ参照)。両モデルにおいて、２剤の組み合わせはいずれかの薬剤
単独よりも顕著に有効であり、ＨＥＲ３標的抗体とＥｒｂＢ標的剤の組み合わせの我々の
先のインビトロでの知見を支持する。
要約すると、この抗体のファミリーがＨＥＲ３の不活性立体構造を安定化する特有の能
力は、ＨＥＲ３がリガンド依存性または非依存性方法で活性化されているモデルにおいて
インビボで顕著な有効性をもたらす。さらに、この抗体のファミリーによるＨＥＲ３阻害
は、多種多様な標的治療剤との組み合わせで有益であると考えられる。
【０４２２】
実施例２２：良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症のためのＨＥＲ３抗
体
実験法
約９週齢の性的成熟IGS Wistar Hannoverラットに、静脈内注射により、１週間２回ス
ケジュールで３０、７５および２００mg／kg  MOR10703を投与した。１３週間の投与期間
完了後、各投与群からの１０匹のラットを屠殺し、主臓器をさらなる分析のために採取し
た。さらに、２００mg／kg投与群からの６匹のラットをMOR10703から１０週間回復させて
、何らかの観察される変化の可逆性を決定するために屠殺した。動物屠殺後、臓器重量を
秤量して、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定化した。組織切片を調製し、顕微鏡的試験
で評価した。
【０４２３】
結果
雄ラットにおいて、前立腺重量減少が全投与量で見られ、これは前立腺および精嚢の分
泌低下と相関した(表１８)。これらの効果は、１０週間の回復後可逆性であった。絶対平
均対コントロールの差は次のとおりであった：３０mg／kg：−３１％、７５mg／kg：−４
０％および２００mg／kg：−３５％。ほとんど中程度または顕著な乳腺萎縮が全投与量の
雄で観察され、これは１０週間回復後非可逆性であった。この変化は、雄乳腺で見られる
通常豊富な腺房および小葉発達の非存在により特徴付けられた。コントロールと対照的に
、希薄な小管要素が全処置雄の乳腺に存在した。
【表４０】
2020007349.tif 000042
ａ 群平均の差異％として示す(差異％)。
ｂ 相対的。
ｃ 群平均の統計学的分析に基づき、値は対照群と有意差がある。
【０４２４】
雌において、子宮重量減少が全投与量で観察され、これは１０週間回復後可逆性であっ
た(表１９)。絶対平均対コントロール差は３０mg／kg：−２４％、７５mg／kg：−２７％
および２００mg／kg：−１９％であった。子宮腺上皮の重度の低下として観察される子宮
内膜萎縮は≧３０mg／kg／日の全投与量で処置終了時に見られる子宮重量減少と相関した
。これは、１０週間回復後わずかに可逆性であり、腺上皮量は増加するものの、コントロ
ール動物ほど多くはなかった。他の生殖臓器：卵巣、輸卵管、子宮頸および膣は、観察さ
れ得る周期段階の顕著な差異を考慮して、正常範囲内であると考えられた。
【表４１】
2020007349.tif 000043
ａ 群平均の差異％として示す(差異％)。
ｂ 相対的。
ｃ 群平均の統計学的分析に基づき、値は対照群と有意差がある。実際の有意性レベルお
よび使用した試験データ表を意味する。
【０４２５】
考察
良性前立腺肥大(ＢＰＨ)は、高齢男性に一般的な疾患であり、尿道の圧迫を起こし、排
尿および膀胱問題に至る前立腺の非新生物拡大により特徴付けられる{Mahapokai1 W, van
Sluijs FJ & Schalken JA. 2000 Prostate Cancer and Prostatic Diseases 3, 28-33}
。ＢＰＨの解剖的または顕微鏡的証拠が６０〜７０歳の男性の約５５％の剖検で存在する
。前立腺の経尿道的切除は長年処置選択肢である。結果として、ＢＰＨは、高齢男性の外
科的介入の最も一般的な理由の一つである。処置の低浸潤性方法は次のものを含む：
(ｉ)  アルファ１−ブロッカー(ドキサゾシン、プラゾシン、タムスロシン、テラゾシン
およびアルフゾシン)  は、高血圧の処置にも使用される一群の薬である。これらの薬物
は膀胱頚部および前立腺の筋肉を弛緩させ、排尿を容易にする。
(ii)  フィナステリドおよびデュタステライドは、アンドロゲンレベルを下げ、そうして
前立腺のサイズを小さくし、尿流速を上げ、ＢＰＨの症状を軽減する。症状改善が観察さ
れるまで３〜６ヶ月間かかり得る。フィナステリドおよびデュタステライドの使用と関連
する潜在的副作用は性欲低下と不能を含む。
【０４２６】
実験の章での結果は、初めて、ＢＰＨがニューレグリン依存性適応症であることを証明
した。本知見はまたMOR10703が、性的成熟ラットでホルモンレベルに影響することなく前
立腺サイズを顕著に減少させることも示し、MOR10703がＢＰＨの処置に有用であることを
示唆する。
【０４２７】
ＢＰＨ治療剤としてMOR10703および他のＨＥＲ３抗体をさらに試験するために、一次ヒ
トＢＰＨ外科的標本を、無胸腺マウスまたはラットに移植し、Ｈｅｒ３抗体の効果をモデ
ルを使用して試験し得る(Otto U et al. Urol Int 1992; 48: 167 -170)。あるいは、Ｂ
ＰＨの側面を５α−アンドロスタン−３α,１７β−ジオールとエストラジオールの長期
投与を介して去勢イヌに誘発し、ＨＥＲ３抗体をこれらのイヌモデルで試験できる(Walsh
PC, Wilson JD. J Clin Invest 1976; 57: 1093 - 1097)。
【０４２８】
女性化乳房の物理的顕在化は、男性での乳房拡大であり、通常両側の乳房で起こるが、
片方のみのこともあり、非対称的または一側性女性化乳房として知られる。女性化乳房の
原因は通常次のものである：
(ｉ)  テストステロン対エストロゲン比を不均衡にする高エストロゲンレベル。
(ii)  前立腺癌またはＢＰＨ処置に使用したアンドロゲンアンタゴニストまたは抗アンド
ロゲン。これらの薬物はテストステロンを抑制するが、テストステロン抑制により、エス
トロゲンが上昇し始める。
【０４２９】
多くの治験薬が現在試験されているが、現在女性化乳房で承認された処置はない。結果
として、女性化乳房は乳房組織の外科的切除により処置される。男性乳腺のMOR10703誘発
不可逆性萎縮の観察は、女性化乳房の処置に有益であり得ることを示す。
【０４３０】
ヒト女性化乳房の処置におけるMOR10703および他のＨＥＲ３抗体をさらに試験するため
に、女性化乳房のトランスジェニックマウスモデルを使用できる。これらのモデルは、マ
ウス乳腺にヒトアロマターゼを発現させることにより開発され、ヒト女性化乳房の多くの
面を再現する(Li et al., Endocrinology 2002;143:4074-4083; Tekmal et al., Cancer 
Res 1996;56:3180-318)。
【０４３１】
MOR10703および他のＨＥＲ３抗体はまた、子宮の裏側(子宮内膜)からの細胞が子宮腔外
に出現し、増殖する婦人科学的状態である子宮内膜症の処置についても試験する。子宮内
膜症の主であるが、普遍的ではない症状は、種々の顕性化での骨盤痛である。子宮内膜症
の根底の原因は十分に特徴付けられていないが、エストロゲン存在に依存性であると考え
られる。雌マウスにおけるMOR10703誘発子宮内膜萎縮が子宮重量を減少させたため、子宮
内膜症処置に使用し得る。MOR10703および他のＨＥＲ３抗体の子宮内膜症に対する効果を
さらに試験するために、正常循環および卵巣摘出無胸腺マウスまたは循環非肥満糖尿病性
(ＮＯＤ)−重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスに増殖期のヒト子宮内膜を腹腔を移植し、
これらのＳＣＩＤマウスをモデルとして使用できるGrummer et al., 2001. Human Reprod
uction; 16; 1736-1743)。
【０４３２】
実施例２３：食道癌のためのＨＥＲ３抗体を評価するためのインビトロ試験
インビトロ食道薬剤組み合わせ試験
ＨＥＲ３標的抗体が標的治療剤と組み合わせる能力を試験するために、細胞生存能アッ
セイにおいてMOR10703をセツキシマブまたはBYL719と組み合わせた。約１０００〜１２０
０のKYSE140およびKYSE180細胞を、２％ＦＢＳを添加した適当な培養培地で３８４ウェル
プレートに播種し、一夜、３７℃で付着させた。適当な薬剤組み合わせ(BYL719の典型的
最終薬剤濃度は２.８μM〜３.８nM範囲；セツキシマブは９３nM〜０.１３nM範囲；MOR107
03は１００nM〜４.１nM範囲)を、続いて、各プレートが各薬剤の用量応答曲線を二次元マ
トリクスで含むようにウェルに添加した。処置細胞を、続いて９６〜１２０時間インキュ
ベートした。薬剤処置の最後に、CellTiter-Gloを各ウェルに添加して細胞を溶解し、発
光シグナルをEnvisionプレートリーダーを使用して記録した。各組み合わせで得た増殖阻
害の程度を計算し、組み合わせ活性をLoewe加算性モデルを使用して強調した。
【０４３３】
食道インビトロ薬剤組み合わせおよび細胞増殖に対する影響
腫瘍細胞増殖がしばしば複数シグナル伝達経路により駆動されるため、MOR10703とセツ
キシマブまたはBYL719の組み合わせを評価して、食道癌細胞株の増殖遮断に有益であるか
否かを評価した。選択した標的剤は主にＥＧＦＲ(セツキシマブ)およびＰＩＫ３ＣＡ(BYL
719)を阻害するものであり、なぜならこれらの標的が通常ヒト腫瘍で活性化されているか
らである。アイソボログラム分析(図１６参照)は、MOR10703がセツキシマブおよびBYL719
と相乗的薬剤組み合わせを示すことを示した。このデータは、ＨＥＲ３シグナル伝達の阻
害が、標的受容体チロシンキナーゼ群またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を標的とする阻害
剤で特に有益であることを示唆する。
【０４３４】
実施例２４：食道癌に対するＨＥＲ３抗体を評価するためのインビボ試験
インビボでのＨＥＲ３標的抗体が標的治療剤と組み合わさる能力を試験するために、MO
R10703をセツキシマブまたはBYL719と組み合わせ、２種のインビボ異種移植片モデルで試
験した。
【０４３５】
(ｉ)  インビボKYSE140異種移植片
KYSE140細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有RPMI 1640培地で、抗生物質なしで
インプラント時まで培養した。KYSE140細胞を指数関数的増殖で収穫した。ＰＢＳ／マト
リゲル(５０：５０)と混合した１千万個の細胞をSCID-Beigeマウスの上部右脇腹に皮下的
にインプラントした。２８日目、腫瘍を測定し、腫瘍体積約２００mm３の動物を有効性試
験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹動物を有効性試験に参加させた。単剤およ
び組み合わせ試験のために、動物にMOR10703またはセツキシマブを側方尾静脈注射を介し
て静脈内投与した。BYL719を０.５％メチルセルロース中に製剤し、経口強制喫食により
投与した。
【０４３６】
(ii)  インビボKYSE180異種移植片
KYSE180細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有RPMI 1640培地で、抗生物質なしで
インプラント時まで培養した。KYSE180細胞を指数関数的増殖で収穫した。５００万個の
細胞をヌードマウスの上部右脇腹に皮下的にインプラントした。１８日目、腫瘍を測定し
、腫瘍体積約２００mm３の動物を有効性試験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹
動物を有効性試験に参加させた。単剤および組み合わせ試験のために、動物にMOR10703ま
たはセツキシマブを側方尾静脈注射を介して静脈内投与した。BYL719を０.５％メチルセ
ルロース中に製剤し、経口強制喫食により投与した。
【０４３７】
(iii)  インビボ一次食道異種移植片
ヒト食道一次腫瘍をマウスで継代した。腫瘍サイズが約１５０mm３の大きさになったと
き、動物を有効性試験に参加させた。単剤および組み合わせ試験のために、動物にMOR107
03またはセツキシマブを側方尾静脈注射を介して静脈内投与した。BYL719を０.５％メチ
ルセルロース中に製剤し、経口強制喫食により投与した。
【０４３８】
ＨＥＲ３のインビボ阻害および食道腫瘍増殖に対する効果
記載の抗ＨＥＲ３抗体のインビボ活性を決定するために、MOR10703をKYSE140およびKYS
E180食道腫瘍モデル、ならびに２種の一次食道腫瘍モデル、CHES007およびCHES015で試験
した。KYSE140およびKYSE180インビボモデルの両者で、単剤MOR10703処置は腫瘍増殖を有
効に阻害することが証明された(図１７)。KYSE180において、MOR10703およびBYL719の組
み合わせは顕著な腫瘍緩解の誘発に十分であった。これらの知見は一次食道腫瘍モデルま
で拡張され、ここで、MOR10703とセツキシマブまたはBYL719の組み合わせはまた強力な腫
瘍緩解を誘発した(図１８)。まとめて、これらのデータは、ＨＥＲ３標的抗体とＥＧＦＲ
またはＰＩ３Ｋ標的剤の組み合わせの利益の我々の先のインビトロの知見をさらに支持す
る。
【０４３９】
実施例２５：胃癌におけるBYL719と組み合わせたＨＥＲ３を評価するためのインビボ試験
インビボで胃癌においてＨＥＲ３標的抗体が標的治療剤と組み合わさる能力を評価する
ために、MOR10703をBYL719と組み合わせ、インビボ異種移植片モデルで試験した。
【０４４０】
(ｉ)  インビボＮＣＩ−N87異種移植片
ＮＣＩ−N87細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２mM  Ｌ−グルタミン、１mM  ピルビ
ン酸ナトリウム添加４.５ｇ／ｌ  グルコース含有ＤＭＥＭ培養培地でインプラント時ま
で増殖した。ＮＣＩ−N87腫瘍を、８×１０６〜１×１０７細胞(５０％ｖ／ｖ  マトリゲ
ル含有ＨＢＳＳ中)を皮下的に注射することにより確立した。１０日目に、腫瘍を測定し
、約２５０mm３の腫瘍体積の動物を有効性試験に参加させた。単剤および組み合わせアー
ムのために、動物に、側方尾静脈注射を介してMOR10703を静脈内に投与した。BYL719を０
.５％メチルセルロース中に製剤し、経口強制喫食により投与した。
【０４４１】
N87胃腫瘍増殖に対する組み合わせ処置の効果
食道腫瘍で見られるとおり、MOR10703およびBYL719の組み合わせは顕著で、N87胃腫瘍
モデルにおいて長期の腫瘍緩解を示し、ＨＥＲ３標的抗体とＰＩ３Ｋ標的剤の組み合わせ
の利益をさらに支持する(図１９参照)。
【０４４２】
実施例２６：
頭頸部扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)におけるセツキシマブと組み合わせたＨＥＲ３の評価
のためのインビボ試験
インビボでＳＣＣＨＮにおいてＨＥＲ３標的抗体が標的治療剤と組み合わさる能力を評
価するために、MOR10703をセツキシマブと組み合わせ、インビボ異種移植片モデルで試験
した。
【０４４３】
(ｉ)  インビボＡ２５３異種移植片
Ａ２５３細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで、抗生物質なしでイン
プラント時まで培養した。Ａ２５３細胞を指数関数的増殖で収穫した。２００μl  ＰＢ
Ｓ中５００万個の細胞をヌードマウスの上部右脇腹に皮下的にインプラントした。２５日
目、腫瘍を測定し、腫瘍体積約２００mm３の動物を有効性試験に参加させた。一般に、１
群あたり計９匹の動物を有効性試験に参加させた。単剤および組み合わせ試験のために、
動物にMOR10703またはセツキシマブを側方尾静脈注射を介して静脈内投与した。
【０４４４】
A253 SCCHN腫瘍増殖に対する組み合わせ処置の効果
A253 SCCHNモデルにおいて、MOR10703またはセツキシマブのいずれも単剤として腫瘍静
止をもたらした。MOR10703とセツキシマブの組み合わせは有意により活性であり、腫瘍緩
解をもたらした(図２０参照)。
【０４４５】
まとめると、これらの結果は、単剤としてのMOR10703が腫瘍増殖可能であることを示す
。結果はまた、MOR10703を他の受容体チロシンキナーゼ群またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経
路を標的とする阻害剤と組み合わせたとき、腫瘍緩解に対する相乗効果も示す。
【０４４６】
引用による取り込み
ここに引用した全ての参照文献は、特許、特許出願、論文、教科書などおよびそれらの
中の引用文献を含み、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０４４７】
等価物
上の明細書は当業者が本発明を実施するのに十分であると考える。上の記載および実施
例は、本発明のある種の好ましい態様を詳述し、発明者らにより最良の態様と考慮される
ものを記載する。しかしながら、いかに詳細な記載が上に記載されていたとしても、本発
明は多くの方法で実施でき、本発明は添付する特許請求の範囲およびその均等物に従い解
釈されるべきであることは認識される。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
食道におけるＨＥＲ３発現レベル増加により特徴付けられる障害を処置する方法であっ
て：
食道でＨＥＲ３発現が上昇している患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより該障害を処置する、方法。
［２］
障害が食道癌およびバレット食道癌から成る群から選択される、上記［１］に記載の方
法。
［３］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［１］に記載の方法。
［４］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［１］に記載の方法。
［５］
さらに他の治療剤を含む、上記［４］に記載の方法。
［６］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［５］に記載
の方法。
［７］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、上記［６］に記載の方法。
［８］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［６］に記載の方法。
［９］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［６］に記載の方法。
［１０］
胃癌の処置であって：
胃癌を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより胃癌を処置する、方法。
［１１］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［１０］に記載の方法。
［１３］
さらに他の治療剤を含む、上記［１２］に記載の方法。
［１４］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［１３］に記
載の方法。
［１５］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、上記［１４］に記載の方法。
［１６］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［１４］に記載の方法。
［１７］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［１４］に記載の方法。
［１８］
頭頸部癌の処置方法であって：
頭頸部癌を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより頭頸部癌を処置する、方法。
［１９］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［１８］に記載の方法。
［２１］
さらに他の治療剤を含む、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［２１］に記
載の方法。
［２３］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［２２］に記載の方法。
［２５］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［２２］に記載の方法。
［２６］
良性前立腺肥大の処置方法であって：
良性前立腺肥大を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより良性前立腺肥大を処置する、方法
。
［２７］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［２６］に記載の方法。
［２８］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［２６］に記載の方法。
［２９］
さらに他の治療剤を含む、上記［２８］に記載の方法。
［３０］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［２９］に記
載の方法。
［３１］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ(Lapatinib Ditosylate)、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ
(OSI-774)、PKI-166およびTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；
ペルツズマブ、トラスツマブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニ
ブ／タイケルブ(登録商標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DI
D12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(N
ovartis)およびＨＥＲ３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；お
よびＨＥＲ４阻害剤である、上記［３０］に記載の方法。
［３２］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［３０］に記載の方法。
［３３］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［３０］に記載の方法。
［３４］
女性化乳房の処置方法であって：
女性化乳房を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより女性化乳房を処置する、方法。
［３５］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［３４］に記載の方法。
［３６］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［３４］に記載の方法。
［３７］
さらに他の治療剤を含む、上記［３６］に記載の方法。
［３８］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［３７］に記
載の方法。
［３９］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、上記［３８］に記載の方法。
［４０］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［３８］に記載の方法。
［４１］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［３８］に記載の方法。
［４２］
子宮内膜症の処置方法であって：
子宮内膜症を有する患者を選択し；そして
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、
該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガン
ド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、それにより子宮内膜症を処置する、方法。
［４３］
抗体またはそのフラグメントが経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内
、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与さ
れる、上記［４２］に記載の方法。
［４４］
抗体またはフラグメントが生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む医薬
組成物に製剤される、上記［４２］に記載の方法。
［４５］
さらに他の治療剤を含む、上記［４４］に記載の方法。
［４６］
他の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍ
ＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、上記［４５］に記
載の方法。
［４７］
他の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベク
ティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)
／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／
トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およ
びTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツ
マブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商
標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AM
G888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ
３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤で
ある、上記［４６］に記載の方法。
［４８］
他の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリ
ムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択
されるｍＴＯＲ阻害剤である、上記［４６］に記載の方法。
［４９］
他の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３
キナーゼ阻害剤である、上記［４６］に記載の方法。
［５０］
食道障害の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体または
そのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のド
メイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガン
ド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
［５１］
胃癌の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはその
フラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のドメイ
ン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依
存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
［５２］
頭頸部癌の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体または
そのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体のド
メイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガン
ド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用。
［５３］
良性前立腺肥大(ＢＰＨ)の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合
する抗体またはそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥ
Ｒ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと
結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮
断する、使用。
［５４］
女性化乳房の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体また
はそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体の
ドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガ
ンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用
。
［５５］
子宮内膜症の処置用医薬の製造のための、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体また
はそのフラグメントの使用であって、該抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３受容体の
ドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガ
ンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、使用
。
【図１】
2020007349.tif 000044
【図２】
2020007349.tif 000045
【図３】
2020007349.tif 000046
【図４Ａ】
2020007349.tif 000047
【図４Ｂ】
2020007349.tif 000048
【図４Ｃ】
2020007349.tif 000049
【図５Ａ】
2020007349.tif 000050
【図５Ｂ】
2020007349.tif 000051
【図５Ｃ】
2020007349.tif 000052
【図５Ｄ】
2020007349.tif 000053
【図５Ｅ】
2020007349.tif 000054
【図６】
2020007349.tif 000055
【図７】
2020007349.tif 000056
【図８】
2020007349.tif 000057
【図９】
2020007349.tif 000058
【図１０】
2020007349.tif 000059
【図１１】
2020007349.tif 000060
【図１２】
2020007349.tif 000061
【図１３】
2020007349.tif 000062
【図１４−１】
2020007349.tif 000063
【図１４−２】
2020007349.tif 000064
【図１５】
2020007349.tif 000065
【図１６】
2020007349.tif 000066
【図１７】
2020007349.tif 000067
【図１８】
2020007349.tif 000068
【図１９】
2020007349.tif 000069
【図２０】
2020007349.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月8日(2019.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症を処置するための医薬組成物であって、
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、
前記立体構造エピトープが、（ｉ）配列番号１のＨＥＲ３アミノ酸残基２６５〜２７７および３１５（ドメイン２のアミノ酸残基）および（ｉｉ）配列番号１のＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５（ドメイン４のアミノ酸残基）によって定義される、医薬組成物。
【請求項２】
子宮内膜症を処置するための医薬組成物であって、
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、該抗体またはそのフラグメントは、
（ａ）配列番号３８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号４３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４８の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
（ｃ）配列番号１４１を有する可変重鎖（ＶＨ）配列および配列番号１４０を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列
を含む、医薬組成物。
【請求項３】
子宮内膜症を処置するための医薬組成物であって、
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む立体構造エピトープと結合し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断し、前記抗体またはそのフラグメントは、
配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号２０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号５６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号５８の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６０の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号９２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９４の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９６の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９７の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号１１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１１の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１１２の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号３４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３４６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４８の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
配列番号３６２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３６４の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６６の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３６７の軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントが、
配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体またはそのフラグメントが、
配列番号１５のＶＨおよび配列番号１４のＶＬ、
配列番号３３のＶＨおよび配列番号３２のＶＬ、
配列番号５１のＶＨおよび配列番号５０のＶＬ、
配列番号６９のＶＨおよび配列番号６８のＶＬ、
配列番号１０５のＶＨおよび配列番号１０４のＶＬ、
配列番号１２３のＶＨおよび配列番号１２２のＶＬ、
配列番号３５７のＶＨおよび配列番号３５６のＶＬ、および
配列番号３７５のＶＨおよび配列番号３７４のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号４９３のＶＨおよび配列番号４９４のＶＬを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号１４４の軽鎖配列および配列番号１４５の重鎖配列を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
他の治療剤と組み合わせて使用される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記他の治療剤が、ＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記他の治療剤が、マツズマブ(EMD72000)、セツキシマブ、パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、トシル酸ラパチニブ、エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およびＮ−[４−[(３−クロロ−４−フルオロフェニル)アミノ]−７−[[(３’’Ｓ’’)−テトラヒドロ−３−フラニル]オキシ]−６−キナゾリニル]−４(ジメチルアミノ)−２−ブテンアミドから成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツマブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブからなる群から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)およびＨＥＲ３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記他の治療剤が、テムシロリムス、リダフォロリムス／デフォロリムス、AP23573、MK8669およびエベロリムスから成る群から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記他の治療剤が、GDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
経口、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内、頭蓋内、頬側、粘膜、経鼻および直腸投与から成る群から選択される経路により投与される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。