(57)【要約】      （修正有）【課題】デジタル計測を効率的に実施する方法の提供。【解決手段】標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、を含んでなる方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、
前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、
前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、
前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、
を含んでなる方法。
【請求項２】
陽性区画と陰性区画のシグナル強度比が２．０以上、陰性区画と背景のシグナル強度比が２．０以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法
【請求項３】
標的分子がＤＮＡ及び／又はＲＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
等温反応により、標的分子であるＤＮＡ及び／又はＲＮＡを増幅させることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の物質を検出・定量する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１分子計測にもとづき生体分子や細胞の作動メカニズムを明らかにする１分子生物学が近年は進展しつつあり、中でもデジタル計測技術が注目されている。デジタル計測は、反応液を微小区画に分画し、微小区画毎に反応を行う。その際、１分子単位の分画が可能であり、反応後、各区画に標的分子を含むか（シグナルが陽性）、含まないか（シグナルが陰性）をシグナルの有無で計測し、それぞれの分画のシグナル数を、標的分子の数として換算することで絶対定量が可能であることから、デジタル計測は、高精度、高感度な革新的な計測技術である。しかし、微小区画に反応液を分画して、特異的な反応を行い検出するには、複雑な機器が必要になる可能性があり、コストが増大する。
【０００３】
デジタルＰＣＲでは、特定の配列のＤＮＡの混合物を、多数の微小区画に分配して、個々の微小区画で同時並行にＰＣＲが行われる。１つ又は複数の標的分子を含む微小区画もあれば、標的分子を全く含まない微小区画も存在しており、ＰＣＲ終了後に微小区画毎にＰＣＲ増幅の有無を解析し、ポアソンモデルを用いることで、特定の配列のＤＮＡの絶対数が算出される。
【０００４】
特許文献１は、複数のナノリットルスケールの反応サイトとなる微細孔を有するチップを用いて、生物学的反応を行うためのシステムを開示している。少なくとも２００００個の反応サイトを含むことを特徴としており、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の増幅にも利用できることが記述されている。
特許文献２は、マイクロ流路デバイスを用いて、水、油、および化学的に不活性な液体中で微小な液滴を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応によりターゲット核酸を分析するための液滴に基づくアッセイにおける光検出および信号処理のためのシステムが開示されている。
特許文献３は、ｍＬ容量の単一蛍光液滴の正確な検出を数分以内でできる高処理能を持つ３Ｄ粒子カウンターシステムを開示しており、液滴内部に、細胞表面、細胞内及び／又は分泌マーカーをカプセル化し解析するための３Ｄ粒子ディテクターシステムについて記述されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１５−５１６８０２号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２４１６９号公報
【特許文献３】特表２０１６−５３３１６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、微小区画内で反応を行った後、陽性区画と全区画を簡便に計数する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の一態様は、標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、を含んでなる。
【発明の効果】
【０００９】
反応液を平面上に区画化し反応を行った後、単一の波長での蛍光観察画像を用いた解析により、迅速かつ高精度に陽性区画と陰性区画を計数することで、デジタル計測を効率的に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】反応装置の図（平面図）を示したものである。
【図２】図１に示す反応装置のＡ−Ａ’断面図（正面図）を示したものである。
【図３】反応装置の液滴形成部を示したものである。
【図４】デジタル核酸検出の明視野像及び蛍光画像を示したものである。
【図５】実施例２で取得した蛍光画像（図５Ａは全体画像、図５Ｂは拡大画像）である。
【図６】実施例２で検出した全液滴の検出拡大画像（図６Ａ）及びＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータ（図６Ｂ）である。
【図７】実施例２で検出した陽性液滴の検出拡大画像（図７Ａ）及びＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータ（図７Ｂ）である。
【図８】比較例１で取得した取得した検出画像の拡大図である。
【図９】比較例１で検出した全液滴の検出拡大画像（図９Ａ）及びＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータ（図９Ｂ）である。
【図１０】比較例１で検出した陽性液滴の検出拡大画像（図１０Ａ）及びＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータ（図１０Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
（１）標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程について
標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する方法として、数万個の微細孔（極めて小さいウェル）をもった特殊なプレートを用いて、その微細孔に反応液を分配する方法（微細孔分配方式）、反応液を特別な乳化剤を用いて数万〜１，０００万の微小な液滴（ドロップレット）に分割する方法（ドロップレット方式）などが挙げられる。液滴を作製するのにマイクロ流路デバイスがよく用いられている。また、マイクロ流体デバイスを用いて、２種類の液体を混合させ、液滴を作製することもできる。
【００１３】
（２）標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程について
シグナルを生じる反応としては特に限定はなく、酵素反応などが例示できる。なお、標的分子がＤＮＡやＲＮＡなどの核酸である場合、等温反応により増幅させてもよい。
酵素反応により発生するシグナルは一般的なバイオ研究分野で使用されている標識物質を用いることで得ることができる。具体例としては、酵素、蛍光色素、金粒子、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ等）、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができる。酵素を標識物質として用いる場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を該酵素と反応させ、その結果発生する発色、蛍光、発光等のシグナルを検出すればよい。
微小区画内でのＤＮＡやＲＮＡの増幅工程において、反応液に検出用試薬を添加しておくことで、反応液の蛍光や化学発光強度を測定することで、標的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを検出することができる。
検出用試薬としては、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の一本鎖オリゴヌクレオチド、モレキュラービーコン、ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブなどや、インターカレーター性色素などを用いることができる。
【００１４】
標的分子が存在する区画である陽性区画では、標識物質により発色、蛍光、発光等シグナルが発生する。反応液中の標的分子数を計数するためには、ポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出する必要があるため、標的分子が存在しない区画である陰性区画も計数する必要がある。しかしながら、陰性区画においては、シグナルが生じないためバックグラウンドと見極めが困難であることがある。そのため、画像データを取得する際に、陰性区画に微弱なシグナルを生じるよう試薬を添加する。
例えば、蛍光色素であるテトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）を蛍光基とするモレキュラービーコンを核酸増幅の検出用プローブと使用した場合、微量のフルオレセインなどの蛍光基質を添加しておくことができる。
【００１５】
（３）複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程について
個々のシグナルを空間的に分解するのに適切な照明および解像度を有するカメラ又はイメージング装置を用いて蛍光画像を取得する。カメラまたはイメージング装置としては、公知のものが利用でき、例えばカメラは、電荷結合素子（ＣＣＤ）、電荷注入装置（ＣＩＤ）、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）または相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）を含む任意の普通の半導体イメージセンサを使用することができる。また検出の際、励起／放射された光の偏光を使用することによって改善することができる。例えば、蛍光シグナルを発する液滴を検出する場合、その検出領域を大きな視野を持つ光学ユニットによって一括で撮影することで、迅速かつハイスループットなシグナル検出を行なうことが可能になる。
【００１６】
（４）画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程について
陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画と背景のシグナル強度比は、いずれも２．０以上となると、視認性が増すため好ましい。シグナル強度比を２．０以上とするには、前述した蛍光色素の添加などが方法として挙げられる。なお、「背景のシグナル」とは、液滴がない部分のシグナルを指し、全体蛍光画像から液滴がない背景部分の蛍光強度を５箇所程度測定し、平均値を算出して用いればよい。
さらに、解析ソフトを用いて、パラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値や陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定することで自動解析することも可能である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例及び比較例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例及び比較例で用いるマイクロ流路チップは、特開２０１９−１７０３６３号公報の実施例１に記載の方法で作製し、流路の幅、高さ、角度等も同一である。
【００１８】
実施例１
マイクロ流路チップ１００を備えた反応装置１（図１〜３参照）を用いて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ（配列番号１）のデジタル等温核酸増幅に適用した。
（１）ＨＣＶ遺伝子が挿入されたプラスミドから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりＨＣＶ標準ＲＮＡ（配列番号１）を調製した。当該標準ＲＮＡを注射用水を用いて１０４コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料とした。
（２）１０μＬ中に  以下の組成を含む水溶液を調製し、これを標準ＲＮＡを含む反応液とした。なおモレキュラービーコンプローブ（配列番号７）は、標準ＲＮＡの相同鎖の５’末端側および３’末端側に、当該標準ＲＮＡと相補的二本鎖を形成しないときにはステムループ構造を形成できるようなオリゴヌクレオチドを、それぞれ６塩基付加しており（５’側の１塩基のみ重複している）、さらに５’末端側にはＦＡＭを、３’末端側にはＩＤＴ社製ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱをそれぞれ結合させている。
１３２ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
５．０％（ｖ／ｖ）  グリセロール
各０．６６ｍＭ      ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．０ｍＭ        ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
６．６ｍＭ          ＩＴＰ
１９３．２ｍＭ      トレハロース
１００ｎＭ          モレキュラービーコンプローブ（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［              配列番号１の１０７番目から１２３番目まで］を含む：配列番号７）
２．０μＭ          第一のプライマー（配列番号３）
２．０μＭ          第二のプライマー（配列番号４）
２．５Ｕ            Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇ                        ｔｈ
８．５Ｕ            ＡＭＶ逆転写酵素
９４Ｕ  Ｔ７        ＲＮＡポリメラーゼ
１０４コピー        標準ＲＮＡ
第一のプライマー（配列番号３）は、標準ＲＮＡの相補鎖の部分配列（具体的には配列番号１の１２５番目から１４５番目まで：配列番号５）及び当該配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号６）を付加したオリゴヌクレオチドである。また第二のプライマー（配列番号４）は、標準ＲＮＡの相同鎖の部分配列（具体的には、配列番号１の１番目から１６番目まで）からなるオリゴヌクレオチドである。さらに、ＴＯ（ＩＮＡＦプローブの合成に使用する色素）、フルオロセイン、ＦＩＴＣ、ＲＯＸなどの色素を、ＴＲＣ反応を阻害しない濃度で添加した。
【００１９】
（３）１０μＬ中に以下の組成を含む水溶液を調製し、これを開始液とした。
３６．８ｍＭ        塩化マグネシウム
１８０．０ｍＭ      塩化カリウム
０．２％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０
１８．０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ
５．０％（ｖ／ｖ）  グリセロール
２００ｎＭ          モレキュラービーコンプローブ（配列番号７）
（４）マイクロ流路チップ１００をサーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｎｅｘｕｓ  ｆｌａｔ  ｅｃｏ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）の上に固定して、４６℃に加熱した。
（５）マイクロ流路チップ１００内にオイルを充填後、液体保持部２０にオイルを１００μＬ滴下した。
（６）反応液保持部１０ａ／１０ｂ内のオイルを取り除いてから、反応液保持部１０ａには（２）で作製した反応液を、反応液保持部１０ｂには（３）で作製した開始液を、それぞれ液温４６℃の条件下で１０μＬ滴下した。
（７）排出口８０からオイルを吸引した。吸引開始後１から２分で反応合流部３０付近は層流となり、液滴形成部４０で反応液と開始液とが概ね１：１の液滴生成が開始された。
（８）吸引開始後３から５分後に当該吸引を停止し、そのまま４６℃で２０分間放置することで、液滴内等温増幅反応を完了させた。
（９）（８）の反応終了後のマイクロ流路チップ１００を検出した。検出は、蛍光イメージング用の光源としてＸ−Ｃｉｔｅ  １１０ＬＥＤ、画像を取り込むためのＣＣＤカメラとして、Ｃｏｏｌｉｎｇ  Ｃａｍｅｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、台湾）を使用して行った。
【００２０】
（１０）画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を利用して、前記全体蛍光画像から蛍光強度の高い陽性液滴と、蛍光強度が低い陰性液滴、液滴がない背景部分の蛍光強度を５箇所測定し、平均値を算出した。
（９）で取得した明視野像及び蛍光画像を図４に、（１０）で得られた値を表１に示す。陽性と陰性との蛍光強度比および陰性と背景との蛍光強度比がどちらも高い（蛍光強度比２．０以上）と、視認性が増し、検出することが容易であった。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２
実施例１と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ１００を検出した。なお、添加した蛍光色素としてはフルオロセインを選択し、検出時の露光時間は７．５ｓｅｃとした。
取得した蛍光画像として全体画像を図５−Ａ、拡大画像を図５−Ｂに示す。解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ２０１８の機能である円形図形分離機能内に存在するパラメータを操作し、下記手順に従い全体液滴数の計数、陽性液滴の計数を行った。
１）ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値に設定することで全体液滴数を計数した。
２）ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定した。
本工程により検出した全液滴の検出拡大画像を図６Ａ、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータを図６Ｂ、陽性液滴の検出拡大画像図７Ａ、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータを図７Ｂに示す。
【００２３】
比較例１
実施例１と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ１００を検出した。なお、蛍光色素は添加せず、検出時の露光時間は１０．０ｓｅｃとした。
取得した検出画像の拡大図を図８に示す。また、全液滴検出の検出拡大画像を図９Ａ、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータを図９Ｂに示す。図中の×印が検出漏れの陰性液滴である。陽性液滴の検出拡大画像図１０Ａ、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１８での円形図形分離パラメータを図１０Ｂに示す。
【符号の説明】
【００２４】
１：反応装置
１００：マイクロ流路チップ
１０１：ポリマー基板
１０２：カバーガラス（ガラス基板）
１０：反応液保持部
１１、２１：流路
２０：液体保持部
３０：反応液合流部
４０：液滴形成部
５０：流路出口
６０：分岐流路
７０：液滴保持部
８０：排出口
２００：温調ブロック
３００：ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020162591.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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