(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギー性疾患や神経系疾患の治療や予防を達成する新規成分の提供。【解決手段】式（Ｉ）で示される新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナン。該化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。2020189823.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：［化１］で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナン。
【化１】
2020189823.tif 000008
式（Ｉ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
【請求項２】
式（ＩＩ）：［化２］で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナン。
【化２】
2020189823.tif 000009
式（ＩＩ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
【請求項３】
請求項１記載あるいは請求項２記載のＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分とする抗アレルギー剤
【請求項４】
請求項１記載あるいは請求項２記載のＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分とするコリンエステラーゼ阻害剤
【請求項５】
前駆体化合物から処理により変化させた請求項１記載あるいは請求項２記載のＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを含むセリ加工物及び製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、セリ（Ｏｅｎａｎｔｈｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）及びセリの加工物の抽出エキス中に含まれる抗アレルギー活性ならびにコリンエステラーゼ阻害活性を示す新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナン及びそれを含有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  セリ（Ｏｅｎａｎｔｈｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）は日本をはじめ東アジアに分布する多年草で、日本では野菜として栽培され流通している植物である。宮城県、茨城県、大分県、秋田県など全国に産地が点在しており、自生する本種を山菜として採取し食用とすることも多い。野菜として天ぷらや浅漬けなどの総菜に利用される他、伝統的に正月の雑煮や七草粥、鍋物の具材として用いられている。［非特許文献１］によると伝承ではセリの全草を生薬「水芹」と称して解熱鎮痛などに用いるとされる他、湯浴料として神経痛やリウマチに用いる。
【非特許文献１】原色牧野和漢薬草大図鑑、北隆館、ｐ．３６６
【０００３】  野菜として広く流通する一方で、これまでにセリに含まれる成分を特定した上でこれを有効成分として薬用効果や有用性を明示して実際に販売に至っている医薬品、健康補助食品、化粧品などの例は極めて少ない。これは薬用効果や有用性の根拠となるセリの含有成分に関する知見やその生物活性に関する知見が限られているため、現行法規に則る形で効果効能を謳い、科学的根拠を明示した商品を開発することが困難であることが要因の一つである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】  セリは野菜であることから、そのエキスや含有される成分を健康補助食品などとして応用するための技術は複数提案されている。例えば［特許文献１］に示されるように、３−ｎ−ブチリデンフタライド、リグスチライド、フェルラ酸のすくなくとも一つが含有されるセリ抽出物を含有し細胞賦活効果から肌荒れや肌のくすみを改善する美容効果を標榜した健康補助食品や、［特許文献２］に示されるセリの根や全草の濃縮物を必須成分とする鎮痛作用、抗アレルギー作用、腹痛緩和、皮膚の美白健康食品が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２８９８２７
【特許文献２】特開昭５９−１３７２６
【０００５】  セリに含まれる成分については、ファルカリンジオール［非特許文献２］、カフェー酸やクロロゲン酸［非特許文献３］、イソラムネチン［非特許文献４］、ビフェニル類［非特許文献５］などが知られている。しかしリグナン類と称されるフェニルプロパン（Ｃ６−Ｃ３）の二量体［非特許文献６］やフェニルプロパン（Ｃ６−Ｃ３）とフェニルエタン（Ｃ６−Ｃ２）で構成されるノルリグナン類についての報告はない。
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，７５１５−７５２１，２０１３．
【非特許文献３】Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，６７，１５４−１６０，２０１４．
【非特許文献４】Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４，７７−８６，２０１７．
【非特許文献５】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，１６，ｅ１８００４８０，２０１９．
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｗｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３，２７３−２８４，２００７．
【０００６】  近年医薬品開発が進んだ結果、多くの疾病や症状に対して効果的な医薬が利用されている。一方でアトピー性皮膚炎や花粉症といったアレルギー性疾患は原因療法が困難であり慢性化しやすい点から、またアルツハイマー型認知症などの神経系疾患は発症後徐々に進行し完治が困難な点から、その症状を改善したり治療したりする方法の開発や予防策を講じることは患者数の多さからも社会的に重大な課題である。また慢性疾患は治療が長期にわたり、また予防も継続的に行う必要がある。そこでその治療・予防には服用や摂取のしやすさ、安価での提供、薬剤感受性の個人差への対応が必要であり治療薬の多様な選択肢が求められている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従来の技術では抗アレルギー活性及びコリンエステラーゼ阻害活性を示すセリに特徴的に含まれる新規成分は示されていない。［先行技術文献］の項で挙げた［特許文献１］の技術では抗アレルギー活性及びコリンエステラーゼ阻害活性を示す成分は対象外であり、また技術の核心となるセリ由来化合物はセリ以外の植物からも得ることが可能な公知の化合物であった。また［特許文献２］の技術ではエキスの状態で提供されるため、セリに特徴的に含まれる抗アレルギー作用を有する活性本体成分を特定した上で精製することはできない。本発明はセリから直接的な抽出操作によって、あるいはセリを加工処理したのちに抽出操作を行うことによって得られ、抗アレルギー剤及びコリンエステラーゼ阻害剤として利用できる新規物質を提供すること。加えてその新規物質を前駆体から変化させることでその含有量を増加させて効果的に得ることを目的に成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、前述した状況を鑑みて上記課題を解決するためにセリの含有成分探索を行った。そのうち単離に至り化学構造を決定した化合物について、抗アレルギー活性の指標となるラット好塩基球白血病細胞株（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株）を用いた脱顆粒抑制活性試験と神経伝達物質アセチルコリンの分解抑制によりアルツハイマー型認知症や重症筋無力症などの治療薬への応用が想定されるコリンエステラーゼ類の阻害活性を評価するために、アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼ阻害活性試験を実施した。その結果、脱顆粒抑制活性、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性、ブチリルコリンエステラーゼ阻害活性のいずれも示す物質として、その構造中Ｃ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とするノルリグナンを新規に見出した。更にその新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナンは、セリに含まれる特定のリグナン類が前駆体となっており、これらに加熱など所定の処理を施すことで新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナンを生成させられることを新規に突き止め、本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）次式（Ｉ）及び（ＩＩ）：
【化１】
2020189823.tif 000002
式（Ｉ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
【化２】
2020189823.tif 000003
式（ＩＩ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
（２）式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分として含有する抗アレルギー剤
（３）式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分として含有するコリンエステラーゼ阻害剤。
（４）加熱、乾燥、微生物、酸・塩基を利用した加工方法によって式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの含有量を増加させたセリ加工物。
（５）次式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）：
【化３】
2020189823.tif 000004
【化４】
2020189823.tif 000005
（６）加熱、乾燥、微生物、酸・塩基による処理によって次式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される構造の化合物からそれぞれ式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを得る方法。
【００１０】  本発明者らがセリに含まれる成分を精査するなかで、式（Ｉ）で示される化合物［化１］及び式（ＩＩ）で示される化合物［化２］とともにリグナンである式（ＩＩＩ）で示される化合物［化３］及び式（ＩＶ）で示される化合物［化４］が得られた。
【００１１】  本発明において式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるノルリグナンはＥ／Ｚ体混合体として存在することを、それらサンプルをｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）用溶媒に溶解して測定した各種ＮＭＲデータの解析により新たに示した。その混合比はプロトンＮＭＲ上の各構造の水素原子に割り当てられる共鳴の積分比から算出すると室温下およそＥ：Ｚ（３：１）である。本発明ではＥ体及びＺ体の混合比は限定されるものではないが、室温下一般的な居住空間において静置した状態ではおよそＥ：Ｚ（３：１）に収束し、その比率を安定的にとる。ＮＭＲに加えて、逆相系カラムＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０、４．６×２５０ｍｍ（野村化学）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）に同サンプルを処するとクロマトグラム上に２本のピークが観測できるため、同方法により式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるノルリグナンがＥ／Ｚ体混合体として存在することを分析により確認することが可能である。しかしながら、それぞれＥ体及びＺ体と考えられる２本のピークをそのＨＰＬＣクロマトグラムを基準に分離操作を行い分取した場合でも、得た画分いずれについてもＮＭＲを測定するとおよそＥ：Ｚ（３：１）の混合比の自由相互変換状態として観測される。これは各Ｅ体・Ｚ体いずれもが、お互いに混ざり合わない単独の状態で安定的に存在することができないことを示している。以上から、以降は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについておよそＥ：Ｚ（３：１）の存在比にあるものを用いて各種スペクトルデータ収集、脱顆粒抑制活性試験、及びアセチルコリンエステラーゼ阻害活性試験を行った。
【００１２】  式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはセリに対して次の処理を施すことであらかじめセリ中の含有量を増やすことができる。すなわちセリを煮る、焼く、蒸す、炒る、揚げるなどの加熱処理、乾燥処理、微生物により発酵や腐敗させる処理、弱塩基性水溶液に浸漬する処理。
【００１３】  また前項と同様の処理を式（ＩＩＩ）で示される化合物に対して施すことによって、それら化合物を式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンに変化させることができる。同様に式（ＩＶ）で示される化合物についても式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンに変化させることができる。
【００１４】  式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはセリあるいは前項までに示した方法で処理を加えたセリ加工物から、熱水やエタノールをはじめとする溶媒によって抽出し、液々分配やクロマトグラフィーなどを使用した適切な条件で分離操作を重ねて精製することにより効率よく得られる。
【００１５】  ここで用いる抽出溶媒としては、一般には水及び有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等の水混和性溶媒が挙げられる。また溶媒の沸点に応じて４０−１００℃に加温、加熱して抽出操作を行うことで抽出効率を高めることができる。
【００１６】  精製は、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相シリカゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、遠心分離等を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００１７】  以上のようにして得られる式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはＲＢＬ−２Ｈ３細胞株の脱顆粒抑制活性、並びにヒトアセチルコリンエステラーゼ阻害活性、ウマブチリルコリンエステラーゼ阻害活性を示すことから、抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤として使用できる。
【００１８】  本発明に係る化合物の抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤としての用法は式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを含有することを明示した医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品に利用することである。抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤としての本発明化合物の使用量及び使用方法に制限はないが、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの標準サンプルとＨＰＬＣを用いて溶出時間を比較する、あるいはＮＭＲを測定するなどの方法により式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含有されていることを証明する必要がある。
【００１９】  式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含まれることを明示するセリ加工品においても、前項と同様の方法で式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含まれることを証明する必要がある。
【００２０】  式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナン及び式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される化合物から式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへと変化させるに際して、材料であり前駆体となる式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される化合物をセリあるいはその他の植物をはじめ生物を材料として得るか、あるいは化学合成により得るかは限定されるものではない。例えば式（ＩＩＩ）で示される化合物はセリ以外の植物［非特許文献７］あるいは化学合成による方法［非特許文献８］によっても得ることができる。また材料であり前駆体として使用する式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）で示される化合物のＣ−７′位及びＣ−８′位のキラル中心の各絶対立体配置も限定されるものではない。これは生成する式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造において前駆体の各絶対立体配置は関係しないことによる。
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６７，１５８８−１５９０，２００４．
【非特許文献８】Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３５，１２３１−１２３８，２００５．
【発明を実施するための形態】
【００２１】  以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【実施例１】
【００２２】（１）単離操作
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの抽出と精製
生鮮セリ根部１．４ｋｇを１００℃の水にて抽出して後に水を留去して乾固させ、粗抽出エキスとした。次にこれを水で溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（７５０ｍＬ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出にはメタノールと水の混合液を用い、水１，０００ｍＬ、２０％メタノール１，０００ｍＬ、４０％メタノール１，０００ｍＬ、６０％メタノール１，０００ｍＬ、８０％メタノール１，０００ｍＬ、メタノール１，０００ｍＬにより順次溶出した。これらのうち、８０％メタノール、メタノール溶出画分について更にＨＰＬＣ（ポンプ：６．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＡＲ−ＩＩ，２０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出：紫外吸収３３０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成を用いた。式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは２７分後にクロマトグラム上やや幅広い形状のピークを示し、そのピークに相当する溶出液を濃縮乾固することで式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを合計３１．５ｍｇ得た。
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの抽出と精製
生鮮セリ全草１０ｋｇを１００℃の水にて抽出して後に水を留去して乾固させ、粗抽出エキスとした。次にこれを水で溶解させてＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（１０００ｍＬ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出にはエタノールと水の混合液を用い、２０％エタノール１，０００ｍＬ、４０％エタノール１，０００ｍＬ、６０％エタノール１，０００ｍＬ、８０％エタノール１，０００ｍＬ、エタノール１，０００ｍＬにより順次溶出した。これらのうち、８０％エタノール溶出画分について更にＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  １２０Ｔ，２１．５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍで分画、ポンプ：６．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０  ２０．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出：紫外吸収３３０ｎｍで精製）により単離操作を行った。溶出溶媒にはそれぞれ３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成及び３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成を用いた。式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは４１分後にクロマトグラム上に幅広い形状のピークを示した。それらのピークに相当する溶出液を濃縮乾固することで式（ＩＩ）で示される化合物を合計３．１ｍｇ得た。【００２３】（２）構造決定
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造解析
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは黄色不定形固体として得られた。高分解能電気イオン化マススペクトラム（ＨＲＥＩＭＳ）ではｍ／ｚ２８２．０８９０［Ｍ］＋の分子イオンピークを得たため、分子式はＣ１７Ｈ１４Ｏ４であると推定した。紫外吸収スペクトルは
（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇε）２６５（４．０１），３４２（４．３５）ｎｍに極大吸収が見られた。重メタノールに溶解した式（Ｉ）で示される化合物の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲ及び１００ＭＨｚカーボンＮＭＲのデータを［表１］に示し、ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｏｎｄ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＭＢＣ）相関並びにｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ（ＮＯＥ）相関を併記した。これらにより各核種のアサインを行い、本化学構造を［化１］に示す通り決定した。
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造解析
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは黄色不定形固体として得られた。高分解能電気イオン化マススペクトラム（ＨＲＥＩＭＳ）ではｍ／ｚ３１２．１００７［Ｍ］＋の分子イオンピークを得たため、分子式はＣ１８Ｈ１６Ｏ５であると推定した。重メタノールに溶解した式（ＩＩ）で示される化合物の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲ及び１００ＭＨｚカーボンＮＭＲのデータを［表２］に示した。これらについて式（Ｉ）と同様に各核種のアサインを行い、本化学構造を［化２］に示す通り決定した。【００２４】
【表１】
2020189823.tif 000006
【表２】
2020189823.tif 000007
【００２５】  単離操作と構造解析の項目で用いた装置は、旋光計（ＪＡＳＣＯ  Ｐ−２３００  ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ、日本分光）、紫外可視光吸光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＭＰＳ−２４５０、島津製作所）、核磁気共鳴ＮＭＲ（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００  ＦＴ−ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、日本電子）、高分解能質量分析ＨＲＥＩＭＳ（ＪＥＯＬ  ＪＭＳ７００  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、日本分光）、分取ＨＰＬＣシステム（ＪＡＳＣＯ  ２０８９、日本分光）である。【００２６】（３）式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへの改変
例として式（ＩＩＩ）で示される化合物の水溶液を６０℃、８０℃、１００℃で加熱した際の式（Ｉ）で示される化合物への変化について［図１］に示す。温度は限定されるものではないが、６０℃で徐々に変化が見られ、８０℃及び１００℃では、１時間でおよそ半分の式（ＩＩＩ）で示される化合物を式（Ｉ）で示される化合物に変化させることができる。このほかに弱塩基性水溶液で長期保存する処理によっても式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへの変化が見られるが、加熱処理が短時間で最も効率的に式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを生成させることができる。
【図１】
【００２７】式（ＩＩＩ）で示される化合物から式（Ｉ）で示される化合物への変化
【００２８】（４）式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンのＨＰＬＣを使用した分析
例として式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについて逆相系カラムを用いたＨＰＬＣにより分析する方法を以下に示す。標準サンプルを分析ＨＰＬＣシステム［ポンプ：、検出器：、検出波長：ＵＶ３３０ｎｍ、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０，４．６×２５０ｍｍ、移動相溶媒：３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）、移動相流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ］に処し、溶出時間１１．５ｍｉｎ及び１２．６ｍｉｎにそれぞれ化合物検出ピークを認める。
【実施例２】
【００２９】（１）抗アレルギー効果
抗アレルギー効果の指標として一般に用いられる脱顆粒抑制活性試験を［非特許文献９−１１］に記載された方法に則り実施した。本法はＩ型アレルギー反応における抗原による刺激の結果引き起こされるマスト細胞脱顆粒の段階を、マスト細胞と同様の性質を有するラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を使用して評価する方法である。すなわちＲＢＬ−２Ｈ３を式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンで処理した後にそれぞれモノクローナルＩｇＥ＋ＤＮＰによる刺激、Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７による刺激、Ａ２３１８７とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ直接活性化剤ＰＭＡによる刺激を与えることで脱顆粒を誘導した。脱顆粒の結果として放出されるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅを定量することで脱顆粒率（％）を測定した結果、［図２］に示した通り式（Ｉ）で示される化合物による処理はいずれの刺激の場合でも濃度依存的に脱顆粒を抑制した。一方で式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについて細胞毒性測定キット（ＣＣＫ−８）を用いて細胞毒性を評価したところ、脱顆粒抑制活性を示した濃度で式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを培養液に添加した場合に［図３］に示した通りＲＢＬ−２Ｈ３に対する直接的な細胞毒性は認められなかった。
【非特許文献９】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７８，６１７６−６１８０，１９８１．
【非特許文献１０】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２６，１３８−１４５，１９８１．
【非特許文献１１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２７，１３３９−１３４４，１９８１．
【図２】
【００３０】式（Ｉ）で示される化合物の脱顆粒抑制活性
【図３】
【００３１】式（Ｉ）で示される化合物のＲＢＬ−２Ｈ３に対する細胞毒性
【００３２】（２）アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及びブチリルコリンエステラーゼ阻害活性
ヒト由来アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）並びにウマ由来ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）を用いて、アセチルチオコリンヨージド、並びにブチリルチオコリンヨージドの分解を指標にコリンエステラーゼ阻害活性を評価した。試験方法については［非特許文献１２］に記載された方法に則り実施した。その結果、式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはヒト由来ＡＣｈＥに対してＩＣ５００．６１±０．０８ｍＭで、またウマ由来ＢＣｈＥに対してＩＣ５００．２１±０．０３ｍＭでそれぞれ阻害活性を有することを見出した。
【非特許文献１２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３０，１５２−１５８，２０１６．
【産業上の利用可能性】
【００３３】本発明に係る式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは抗アレルギー作用及びコリンエステラーゼ阻害作用を示すので、本化合物または本化合物を含有する組成物によって抗アレルギー剤として各種アレルギー病態の症状緩和に寄与する医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などが提供される。あるいはコリンエステラーゼ阻害作用によってアセチルコリン量の維持が機序となる用途、例えばアルツハイマー型認知症や重症筋無力症などの予防と進行の抑制に寄与する医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などが提供される。式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンも式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンと類似した物性から同様の作用が期待される。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはカルボキシル基とフェノール性水酸基を有しており、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの金属イオンとまたアンモニムイオンなど塩基性有機化合物と塩形態をとることができる。これにより塩形態にすることで水溶性を上げた形で前記の医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などを提供することも可能である。式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを添加するだけではなく、セリの乾燥粉末や抽出物、そして式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを本発明に係る方法で増加させる処理を行ったセリ加工物を用いることができる。すなわち、医薬としてアトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の治療を目的として、またアルツハイマー型認知症の進行を遅延させたり周辺症状を緩和させたりするなどの治療を目的として用いることができる。また医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品としてはアレルギー症状を和らげるあるいは予防する、また認知症症状を和らげるあるいは予防することを目的に食品添加剤、スキンケア用品、入浴剤などに配合できる。
【図１】
2020189823.tif 000011
【図２】
2020189823.tif 000012
【図３】
2020189823.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月12日(2019.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、セリ（Ｏｅｎａｎｔｈｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）及びセリの加工物の抽出エキス中に含まれる抗アレルギー活性ならびにコリンエステラーゼ阻害活性を示す新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナン及びそれを含有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】セリ（Ｏｅｎａｎｔｈｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）は日本をはじめ東アジアに分布する多年草で、日本では野菜として栽培され流通している植物である。宮城県、茨城県、大分県、秋田県など全国に産地が点在しており、自生する本種を山菜として採取し食用とすることも多い。野菜として天ぷらや浅漬けなどの総菜に利用される他、伝統的に正月の雑煮や七草粥、鍋物の具材として用いられている。［非特許文献１］によると伝承ではセリの全草を生薬「水芹」と称して解熱鎮痛などに用いるとされる他、湯浴料として神経痛やリウマチに用いる。
【非特許文献１】原色牧野和漢薬草大図鑑、北隆館、ｐ．３６６
【０００３】野菜として広く流通する一方で、これまでにセリに含まれる成分を特定した上でこれを有効成分として薬用効果や有用性を明示して実際に販売に至っている医薬品、健康補助食品、化粧品などの例は極めて少ない。これは薬用効果や有用性の根拠となるセリの含有成分に関する知見やその生物活性に関する知見が限られているため、現行法規に則る形で効果効能を謳い、科学的根拠を明示した商品を開発することが困難であることが要因の一つである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】  セリは野菜であることから、そのエキスや含有される成分を健康補助食品などとして応用するための技術は複数提案されている。例えば［特許文献１］に示されるように、３−ｎ−ブチリデンフタライド、リグスチライド、フェルラ酸のすくなくとも一つが含有されるセリ抽出物を含有し細胞賦活効果から肌荒れや肌のくすみを改善する美容効果を標榜した健康補助食品や、［特許文献２］に示されるセリの根や全草の濃縮物を必須成分とする鎮痛作用、抗アレルギー作用、腹痛緩和、皮膚の美白健康食品が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２８９８２７
【特許文献２】特開昭５９−１３７２６
【０００５】セリに含まれる成分については、ファルカリンジオール［非特許文献２］、カフェー酸やクロロゲン酸［非特許文献３］、イソラムネチン［非特許文献４］、ビフェニル類［非特許文献５］などが知られている。しかしリグナン類と称されるフェニルプロパン（Ｃ６−Ｃ３）の二量体［非特許文献６］やフェニルプロパン（Ｃ６−Ｃ３）とフェニルエタン（Ｃ６−Ｃ２）で構成されるノルリグナン類についての報告はない。
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，７５１５−７５２１，２０１３．
【非特許文献３】Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，６７，１５４−１６０，２０１４．
【非特許文献４】Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４，７７−８６，２０１７．
【非特許文献５】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，１６，ｅ１８００４８０，２０１９．
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｗｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３，２７３−２８４，２００７．
【０００６】  近年医薬品開発が進んだ結果、多くの疾病や症状に対して効果的な医薬が利用されている。一方でアトピー性皮膚炎や花粉症といったアレルギー性疾患は原因療法が困難であり慢性化しやすい点から、またアルツハイマー型認知症などの神経系疾患は発症後徐々に進行し完治が困難な点から、その症状を改善したり治療したりする方法の開発や予防策を講じることは患者数の多さからも社会的に重大な課題である。また慢性疾患は治療が長期にわたり、また予防も継続的に行う必要がある。そこでその治療・予防には服用や摂取のしやすさ、安価での提供、薬剤感受性の個人差への対応が必要であり治療薬の多様な選択肢が求められている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従来の技術では抗アレルギー活性及びコリンエステラーゼ阻害活性を示すセリに特徴的に含まれる新規成分は示されていない。［先行技術文献］の項で挙げた［特許文献１］の技術では抗アレルギー活性及びコリンエステラーゼ阻害活性を示す成分は対象外であり、また技術の核心となるセリ由来化合物はセリ以外の植物からも得ることが可能な公知の化合物であった。また［特許文献２］の技術ではエキスの状態で提供されるため、セリに特徴的に含まれる抗アレルギー作用を有する活性本体成分を特定した上で精製することはできない。本発明はセリから直接的な抽出操作によって、あるいはセリを加工処理したのちに抽出操作を行うことによって得られ、抗アレルギー剤及びコリンエステラーゼ阻害剤として利用できる新規物質を提供すること。加えてその新規物質を前駆体から変化させることでその含有量を増加させて効果的に得ることを目的に成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、前述した状況を鑑みて上記課題を解決するためにセリの含有成分探索を行った。そのうち単離に至り化学構造を決定した化合物について、抗アレルギー活性の指標となるラット好塩基球白血病細胞株（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株）を用いた脱顆粒抑制活性試験と神経伝達物質アセチルコリンの分解抑制によりアルツハイマー型認知症や重症筋無力症などの治療薬への応用が想定されるコリンエステラーゼ類の阻害活性を評価するために、アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼ阻害活性試験を実施した。その結果、脱顆粒抑制活性、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性、ブチリルコリンエステラーゼ阻害活性のいずれも示す物質として、その構造中Ｃ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とするノルリグナンを新規に見出した。更にその新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナンは、セリに含まれる特定のリグナン類が前駆体となっており、これらに加熱など所定の処理を施すことで新規Ｅ／Ｚ体混合ノルリグナンを生成させられることを新規に突き止め、本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）次式（Ｉ）及び（ＩＩ）：
【化１】
2020189823.tif 000014
式（Ｉ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
【化２】
2020189823.tif 000015
式（ＩＩ）で示される化合物はＣ−７位とＣ−８位との間の二重結合においてＥ体及びＺ体をとるジアステレオマー混合物であることを特徴とする。
（２）式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分として含有する抗アレルギー剤
（３）式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを有効成分として含有するコリンエステラーゼ阻害剤。
（４）加熱、乾燥、微生物、酸・塩基を利用した加工方法によって式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの含有量を増加させたセリ加工物。
（５）次式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）：
【化３】
2020189823.tif 000016
【化４】
2020189823.tif 000017
（６）加熱、乾燥、微生物、酸・塩基による処理によって次式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される構造の化合物からそれぞれ式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを得る方法。
【００１０】  本発明者らがセリに含まれる成分を精査するなかで、式（Ｉ）で示される化合物［化１］及び式（ＩＩ）で示される化合物［化２］とともにリグナンである式（ＩＩＩ）で示される化合物［化３］及び式（ＩＶ）で示される化合物［化４］が得られた。
【００１１】  本発明において式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるノルリグナンはＥ／Ｚ体混合体として存在することを、それらサンプルをｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）用溶媒に溶解して測定した各種ＮＭＲデータの解析により新たに示した。その混合比はプロトンＮＭＲ上の各構造の水素原子に割り当てられる共鳴の積分比から算出すると室温下およそＥ：Ｚ（３：１）である。本発明ではＥ体及びＺ体の混合比は限定されるものではないが、室温下一般的な居住空間において静置した状態ではおよそＥ：Ｚ（３：１）に収束し、その比率を安定的にとる。ＮＭＲに加えて、逆相系カラムＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０、４．６×２５０ｍｍ（野村化学）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）に同サンプルを処するとクロマトグラム上に２本のピークが観測できるため、同方法により式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるノルリグナンがＥ／Ｚ体混合体として存在することを分析により確認することが可能である。しかしながら、それぞれＥ体及びＺ体と考えられる２本のピークをそのＨＰＬＣクロマトグラムを基準に分離操作を行い分取した場合でも、得た画分いずれについてもＮＭＲを測定するとおよそＥ：Ｚ（３：１）の混合比の自由相互変換状態として観測される。これは各Ｅ体・Ｚ体いずれもが、お互いに混ざり合わない単独の状態で安定的に存在することができないことを示している。以上から、以降は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについておよそＥ：Ｚ（３：１）の存在比にあるものを用いて各種スペクトルデータ収集、脱顆粒抑制活性試験、及びアセチルコリンエステラーゼ阻害活性試験を行った。
【００１２】  式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはセリに対して次の処理を施すことであらかじめセリ中の含有量を増やすことができる。すなわちセリを煮る、焼く、蒸す、炒る、揚げるなどの加熱処理、乾燥処理、微生物により発酵や腐敗させる処理、弱塩基性水溶液に浸漬する処理。
【００１３】  また前項と同様の処理を式（ＩＩＩ）で示される化合物に対して施すことによって、それら化合物を式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンに変化させることができる。同様に式（ＩＶ）で示される化合物についても式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンに変化させることができる。
【００１４】  式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはセリあるいは前項までに示した方法で処理を加えたセリ加工物から、熱水やエタノールをはじめとする溶媒によって抽出し、液々分配やクロマトグラフィーなどを使用した適切な条件で分離操作を重ねて精製することにより効率よく得られる。
【００１５】  ここで用いる抽出溶媒としては、一般には水及び有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等の水混和性溶媒が挙げられる。また溶媒の沸点に応じて４０−１００℃に加温、加熱して抽出操作を行うことで抽出効率を高めることができる。
【００１６】  精製は、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相シリカゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、遠心分離等を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００１７】  以上のようにして得られる式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはＲＢＬ−２Ｈ３細胞株の脱顆粒抑制活性、並びにヒトアセチルコリンエステラーゼ阻害活性、ウマブチリルコリンエステラーゼ阻害活性を示すことから、抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤として使用できる。
【００１８】  本発明に係る化合物の抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤としての用法は式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを含有することを明示した医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品に利用することである。抗アレルギー剤、コリンエステラーゼ阻害剤としての本発明化合物の使用量及び使用方法に制限はないが、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの標準サンプルとＨＰＬＣを用いて溶出時間を比較する、あるいはＮＭＲを測定するなどの方法により式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含有されていることを証明する必要がある。
【００１９】  式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含まれることを明示するセリ加工品においても、前項と同様の方法で式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンが含まれることを証明する必要がある。
【００２０】  式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナン及び式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される化合物から式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへと変化させるに際して、材料であり前駆体となる式（ＩＩＩ）あるいは式（ＩＶ）で示される化合物をセリあるいはその他の植物をはじめ生物を材料として得るか、あるいは化学合成により得るかは限定されるものではない。例えば式（ＩＩＩ）で示される化合物はセリ以外の植物［非特許文献７］あるいは化学合成による方法［非特許文献８］によっても得ることができる。また材料であり前駆体として使用する式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）で示される化合物のＣ−７′位及びＣ−８′位のキラル中心の各絶対立体配置も限定されるものではない。これは生成する式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造において前駆体の各絶対立体配置は関係しないことによる。
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６７，１５８８−１５９０，２００４．
【非特許文献８】Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３５，１２３１−１２３８，２００５．
【発明を実施するための形態】
【００２１】  以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【実施例１】
【００２２】（１）単離操作
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの抽出と精製
生鮮セリ根部１．４ｋｇを１００℃の水にて抽出して後に水を留去して乾固させ、粗抽出エキスとした。次にこれを水で溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（７５０ｍＬ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出にはメタノールと水の混合液を用い、水１，０００ｍＬ、２０％メタノール１，０００ｍＬ、４０％メタノール１，０００ｍＬ、６０％メタノール１，０００ｍＬ、８０％メタノール１，０００ｍＬ、メタノール１，０００ｍＬにより順次溶出した。これらのうち、８０％メタノール、メタノール溶出画分について更にＨＰＬＣ（ポンプ：６．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＡＲ−ＩＩ，２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出：紫外吸収３３０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成を用いた。式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは２７分後にクロマトグラム上やや幅広い形状のピークを示し、そのピークに相当する溶出液を濃縮乾固することで式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを合計３１．５ｍｇ得た。
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの抽出と精製
生鮮セリ全草１０ｋｇを１００℃の水にて抽出して後に水を留去して乾固させ、粗抽出エキスとした。次にこれを水で溶解させてＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（１０００ｍＬ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出にはエタノールと水の混合液を用い、２０％エタノール１，０００ｍＬ、４０％エタノール１，０００ｍＬ、６０％エタノール１，０００ｍＬ、８０％エタノール１，０００ｍＬ、エタノール１，０００ｍＬにより順次溶出した。これらのうち、８０％エタノール溶出画分について更にＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ１２０Ｔ，２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍで分画、ポンプ：６．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０  ２０．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出：紫外吸収３３０ｎｍで精製）により単離操作を行った。溶出溶媒にはそれぞれ３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成及び３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）の組成を用いた。式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは４１分後にクロマトグラム上に幅広い形状のピークを示した。それらのピークに相当する溶出液を濃縮乾固することで式（ＩＩ）で示される化合物を合計３．１ｍｇ得た。【００２３】（２）構造決定
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造解析
式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは黄色不定形固体として得られた。高分解能電気イオン化マススペクトラム（ＨＲＥＩＭＳ）ではｍ／ｚ２８２．０８９０［Ｍ］＋の分子イオンピークを得たため、分子式はＣ１７Ｈ１４Ｏ４であると推定した。紫外吸収スペクトルは（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇ  ε）２６５（４．０１），３４２（４．３５）ｎｍに極大吸収が見られた。重メタノールに溶解した式（Ｉ）で示される化合物の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲ及び１００ＭＨｚカーボンＮＭＲのデータを［表１］に示し、ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｏｎｄ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＭＢＣ）相関並びにｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ（ＮＯＥ）相関を併記した。これらにより各核種のアサインを行い、本化学構造を［化１］に示す通り決定した。
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンの化学構造解析
式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは黄色不定形固体として得られた。高分解能電気イオン化マススペクトラム（ＨＲＥＩＭＳ）ではｍ／ｚ３１２．１００７［Ｍ］＋の分子イオンピークを得たため、分子式はＣ１８Ｈ１６Ｏ５であると推定した。重メタノールに溶解した式（ＩＩ）で示される化合物の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲ及び１００ＭＨｚカーボンＮＭＲのデータを［表２］に示した。これらについて式（Ｉ）と同様に各核種のアサインを行い、本化学構造を［化２］に示す通り決定した。【００２４】
【表１】
2020189823.tif 000018
【表２】
2020189823.tif 000019
【００２５】  単離操作と構造解析の項目で用いた装置は、旋光計（ＪＡＳＣＯ  Ｐ−２３００  ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ、日本分光）、紫外可視光吸光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＭＰＳ−２４５０、島津製作所）、核磁気共鳴ＮＭＲ（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００  ＦＴ−ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、日本電子）、高分解能質量分析ＨＲＥＩＭＳ（ＪＥＯＬ  ＪＭＳ７００  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、日本分光）、分取ＨＰＬＣシステム（ＪＡＳＣＯ  ２０８９、日本分光）である。【００２６】（３）式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへの改変
例として式（ＩＩＩ）で示される化合物の水溶液を６０℃、８０℃、１００℃で加熱した際の式（ｌ）で示される化合物への変化について［図１］に示す。温度は限定されるものではないが、６０℃で徐々に変化が見られ、８０℃及び１００℃では、１時間でおよそ半分の式（ＩＩＩ）で示される化合物を式（Ｉ）で示される化合物に変化させることができる。このほかに弱塩基性水溶液で長期保存する処理によっても式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンへの変化が見られるが、加熱処理が短時間で最も効率的に式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを生成させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】式（ＩＩＩ）で示される化合物から式（Ｉ）で示される化合物への変化を示す図である。
【図２】式（Ｉ）で示される化合物の脱顆粒抑制活性を示す図である
【図３】式（Ｉ）で示される化合物のＲＢＬ−２Ｈ３に対する細胞毒性を示す図である
【００２８】（４）式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンのＨＰＬＣを使用した分析
例として式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについて逆相系カラムを用いたＨＰＬＣにより分析する方法を以下に示す。標準サンプルを分析ＨＰＬＣシステム［ポンプ：、検出器：、検出波長：ＵＶ３３０ｎｍ、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０，４．６×２５０ｍｍ、移動相溶媒：３５％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）、移動相流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ］に処し、溶出時間１１．５ｍｉｎ及び１２．６ｍｉｎにそれぞれ化合物検出ピークを認める。
【実施例２】
【００２９】（１）抗アレルギー効果
抗アレルギー効果の指標として一般に用いられる脱顆粒抑制活性試験を［非特許文献９−１１］に記載された方法に則り実施した。本法はＩ型アレルギー反応における抗原による刺激の結果引き起こされるマスト細胞脱顆粒の段階を、マスト細胞と同様の性質を有するラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を使用して評価する方法である。すなわちＲＢＬ−２Ｈ３を式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンで処理した後にそれぞれモノクローナルＩｇＥ＋ＤＮＰによる刺激、Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７による刺激、Ａ２３１８７とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ直接活性化剤ＰＭＡによる刺激を与えることで脱顆粒を誘導した。脱顆粒の結果として放出されるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅを定量することで脱顆粒率（％）を測定した結果、［図２］に示した通り式（Ｉ）で示される化合物による処理はいずれの刺激の場合でも濃度依存的に脱顆粒を抑制した。一方で式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンについて細胞毒性測定キット（ＣＣＫ−８）を用いて細胞毒性を評価したところ、脱顆粒抑制活性を示した濃度で式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを培養液に添加した場合に［図３］に示した通りＲＢＬ−２Ｈ３に対する直接的な細胞毒性は認められなかった。
【非特許文献９】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７８，６１７６−６１８０，１９８１．
【非特許文献１０】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２６，１３８−１４５，１９８１．
【非特許文献１１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２７，１３３９−１３４４，１９８１．
【００３０】（２）アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及びブチリルコリンエステラーゼ阻害活性
ヒト由来アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）並びにウマ由来ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）を用いて、アセチルチオコリンヨージド、並びにブチリルチオコリンヨージドの分解を指標にコリンエステラーゼ阻害活性を評価した。試験方法については［非特許文献１２］に記載された方法に則り実施した。その結果、式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはヒト由来ＡＣｈＥに対してＩＣ５００．６１±０．０８ｍＭで、またウマ由来ＢＣｈＥに対してＩＣ５００．２１±０．０３ｍＭでそれぞれ阻害活性を有することを見出した。
【非特許文献１２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３０，１５２−１５８，２０１６．
【産業上の利用可能性】
【００３１】  本発明に係る式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンは抗アレルギー作用及びコリンエステラーゼ阻害作用を示すので、本化合物または本化合物を含有する組成物によって抗アレルギー剤として各種アレルギー病態の症状緩和に寄与する医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などが提供される。あるいはコリンエステラーゼ阻害作用によってアセチルコリン量の維持が機序となる用途、例えばアルツハイマー型認知症や重症筋無力症などの予防と進行の抑制に寄与する医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などが提供される。式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンも式（Ｉ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンと類似した物性から同様の作用が期待される。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンはカルボキシル基とフェノール性水酸基を有しており、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの金属イオンとまたアンモニムイオンなど塩基性有機化合物と塩形態をとることができる。これにより塩形態にすることで水溶性を上げた形で前記の医薬品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品などを提供することも可能である。式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを添加するだけではなく、セリの乾燥粉末や抽出物、そして式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）で示されるＥ／Ｚ体混合ノルリグナンを本発明に係る方法で増加させる処理を行ったセリ加工物を用いることができる。すなわち、医薬としてアトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の治療を目的として、またアルツハイマー型認知症の進行を遅延させたり周辺症状を緩和させたりするなどの治療を目的として用いることができる。また医薬部外品、健康補助食品、化粧品、雑品としてはアレルギー症状を和らげるあるいは予防する、また認知症症状を和らげるあるいは予防することを目的に食品添加剤、スキンケア用品、入浴剤などに配合できる。