(57)【要約】【課題】ＧＰＣ１陽性のがんを効果的に治療する医薬組成物、キット及び技術を提供する。【解決手段】グリピカン１（ＧＰＣ１）に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞を有効成分とし、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンで免疫チェックポイント阻害剤と共に投与することにより前記Ｔ細胞の抗腫瘍活性を維持するための、がん治療用医薬。  （ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する  （ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリピカン１（ＧＰＣ１）に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞を有効成分とし、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンで免疫チェックポイント阻害剤と共に投与することにより前記Ｔ細胞の抗腫瘍活性を維持するための、がん治療用医薬。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
【請求項２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ３抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のがん治療用医薬。
【請求項３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項２に記載のがん治療用医薬。
【請求項４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体である、請求項３に記載のがん治療用医薬。
【請求項５】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ニボルマブである、請求項４に記載のがん治療用医薬。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体が、ＧＰＣ１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞質シグナルドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のがん治療用医薬。
【請求項７】
前記ＧＰＣ１結合ドメインが、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載のがん治療用医薬。
【請求項８】
前記ＧＰＣ１結合ドメインが、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質からなるか、又は配列番号１５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり且つＧＰＣ１に結合するタンパク質からなる、請求項６又は７に記載のがん治療用医薬。
【請求項９】
前記ＧＰＣ１結合ドメインが、ヒト化されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載のがん治療用医薬。
【請求項１０】
前記がんが、食道がん、子宮頸がん、乳がん、膵がん、神経膠腫、中皮腫、甲状腺がん、肺がん、肝臓がん、大腸がん、頭頸部がん、尿路上皮がん、卵巣がん、黒色腫及び前立腺がんからなる群より選択されるがんである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のがん治療用医薬。
【請求項１１】
前記がんが食道がんである、請求項１０に記載のがん治療用医薬。
【請求項１２】
免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とし、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンでＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞と共に投与して用いるための、前記Ｔ細胞の抗腫瘍活性維持剤。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
【請求項１３】
ＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞と免疫チェックポイント阻害剤との複合体を有効成分として含有する、がん治療用医薬。
【請求項１４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ３抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載のがん治療用医薬。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項１４に記載のがん治療用医薬。
【請求項１６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、請求項１５に記載のがん治療用医薬。
【請求項１７】
前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、請求項１６に記載のがん治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療用医薬に関する。本願は、２０１９年５月１５日に、日本に出願された特願２０１９−０９２０６９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
グリピカン１（ＧＰＣ１）は細胞表面に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、胎児組織、腫瘍組織等で発現が認められる。ＧＰＣ１の主な機能は胎生期の脳の発達への関与であると考えられている。
【０００３】
ＧＰＣ１ノックアウトマウスは、胎生期の初期段階で引き起こされる脳容積のわずかな減少を除いて、成体の形態、行動、寿命の異常を示さないことが知られている。ＧＰＣ１は、健康な成人の体では重要な機能を持たないと考えられている。一方、食道がん、子宮頸がん、乳がん、膵がん、神経膠腫、中皮腫を含む多くの腫瘍でＧＰＣ１の過剰発現が報告されている。また、特許文献１には、ＧＰＣ１に特異的なキメラ抗原受容体（以下、「ＣＡＲ」という場合がある。）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／２０８７５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＧＰＣ１陽性のがんを効果的に治療する医薬組成物、キット及び技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］グリピカン１（ＧＰＣ１）に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞を有効成分とし、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンで免疫チェックポイント阻害剤と共に投与することにより前記Ｔ細胞の抗腫瘍活性を維持するための、がん治療用医薬。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
［２］前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ３抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］に記載のがん治療用医薬。
［３］前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体である、［２］に記載のがん治療用医薬。
［４］前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体である、［３］に記載のがん治療用医薬。
［５］前記抗ＰＤ−１抗体が、ニボルマブである、［４］に記載のがん治療用医薬。
［６］前記キメラ抗原受容体が、ＧＰＣ１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞質シグナルドメインを含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のがん治療用医薬。
［７］前記ＧＰＣ１結合ドメインが、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、［６］に記載のがん治療用医薬。
［８］前記ＧＰＣ１結合ドメインが、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質からなるか、又は配列番号１５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり且つＧＰＣ１に結合するタンパク質からなる、［６］又は［７］に記載のがん治療用医薬。
［９］前記ＧＰＣ１結合ドメインが、ヒト化されている、［６］〜［８］のいずれかに記載のがん治療用医薬。
［１０］前記がんが、食道がん、子宮頸がん、乳がん、膵がん、神経膠腫、中皮腫、甲状腺がん、肺がん、肝臓がん、大腸がん、頭頸部がん、尿路上皮がん、卵巣がん、黒色腫及び前立腺がんからなる群より選択されるがんである、［１］〜［９］のいずれかに記載のがん治療用医薬。
［１１］前記がんが食道がんである、［１０］に記載のがん治療用医薬。
［１２］免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とし、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンでＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞と共に投与して用いるための、前記Ｔ細胞の抗腫瘍活性維持剤。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
［１３］ＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞の抗腫瘍活性を維持する方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンで、前記Ｔ細胞と共に免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
［１４］ＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞と免疫チェックポイント阻害剤との複合体を有効成分として含有する、がん治療用医薬。
［１５］前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ３抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、［１４］に記載のがん治療用医薬。
［１６］前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体である、［１５］に記載のがん治療用医薬。
［１７］前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、［１６］に記載のがん治療用医薬。
［１８］前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、［１７］に記載のがん治療用医薬。
［１９］ＧＰＣ１に結合するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞及び免疫チェックポイント阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、がんの治療方法。
［２０］前記Ｔ細胞及び前記免疫チェックポイント阻害剤が、下記（ａ）及び（ｂ）のレジメンで投与される、［１９］に記載のがんの治療方法。
（ａ）がん患者に前記Ｔ細胞の有効量を投与する
（ｂ）前記がん患者に１回あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の前記免疫チェックポイント阻害剤を、１〜５週間ごとに継続投与する
［２１］前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、［１９］又は［２０］に記載のがんの治療方法。
［２２］前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、［２１］に記載のがんの治療方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＧＰＣ１陽性のがんを効果的に治療する医薬組成物、キット及び技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】実験例１における定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】実験例１における免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。
【図２Ａ】実験例２で作製したｈＣＡＲの構造を示す模式図である。
【図２Ｂ】（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実験例２において、ＬＫ２−ｍｏｃｋ（ｈＧＰＣ１陰性肺がん細胞株）、ＬＫ２−ｈＧＰＣ１（ｈＧＰＣ１過剰発現肺がん細胞株）、ＴＥ１４（ｈＧＰＣ１内在性食道がん細胞株）におけるＧＰＣ１の発現をフローサイトメトリー解析により検討した結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】実験例２におけるｈＩＦＮγ分泌アッセイの結果を示すグラフである。
【図２Ｄ】（ａ）〜（ｃ）は、実験例２における５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。
【図２Ｅ】実験例２における腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図２Ｆ】（ａ）は抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（マウス、クローンＣ１８−２５）のヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する反応性を検討した結果を示すグラフである。（ｂ）は、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（マウス、クローンＣ１８−２５）を組み合わせたｈＣＡＲ−Ｔ細胞のＬＫ２−ｈＧＰＣ１に対する細胞傷害活性の評価結果を示すグラフである。
【図３Ａ】実験例３における定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】実験例３における免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。
【図４Ａ】（ａ）〜（ｄ）は、実験例４において、抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）又はアイソタイプコントロール抗体の反応性をフローサイトメトリーにより検討した結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実験例４で作製したｍＣＡＲの構造を示す模式図である。
【図４Ｃ】実験例４におけるＩＦＮγ分泌アッセイの結果を示すグラフである。
【図４Ｄ】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４における５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。
【図４Ｅ】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４において、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞を移植したマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図４Ｆ】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４において、ＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を移植したマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図４Ｇ】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において測定した、末梢血（ａ）及び腫瘍組織（ｂ）由来の総ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性ＣＤ８陽性ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の割合の測定結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例４において実験開始から６０日目の末梢血中においてＧＦＰ陽性ＣＤ８陽性ｍＣＡＲ−Ｔ細胞を検出することで、長期間のｍＣＡＲ−Ｔ細胞の残存をフローサイトメトリーにより検討した結果を示すグラフである。
【図４Ｈ】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４におけるＩＦＮγの濃度の測定結果を示すグラフである。
【図４Ｉ】実験例４におけるｍＩＦＮγの濃度の測定結果を示すグラフである。
【図５Ａ】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において、がん細胞の移植から１５日目の同系マウスモデルの体重を測定した結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】（ａ）は、実験例５におけるヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例５における免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図６Ａ】（ａ）は実験例６において内在性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−１の発現を測定した結果を示すグラフであり、（ｂ）は実験例６において投与したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−１の発現を測定した結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】実験例６における実験スケジュールを示す図である。
【図６Ｃ】実験例６における各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図６Ｄ】（ａ）〜（ｄ）は、実験例６における各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を個別のマウスごとに示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書では、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。
【００１０】
本明細書で例示する各成分は特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で用いることも、任意の２種以上を併用して用いることもできる。また、２種以上の成分を併用したとき、それらの成分が、一の医薬組成物として存在することもできる。
【００１１】
［がん治療用キット］
１実施形態において、本発明は、ＧＰＣ１に結合するＣＡＲを有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）と、免疫チェックポイント阻害剤と、を含む、がん治療用キットを提供する。本実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ１に結合するＣＡＲを発現していてもよいし、例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体に、これとは別に投与した抗ＧＰＣ１抗体が結合してＣＡＲ−Ｔが形成される態様であってもよい。抗ＧＰＣ１抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドである、ＭＨＣ−ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｌｉｋｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＩＣ）タンパク質のα１−α２ドメインとの融合タンパク質であってもよい。また、ＮＫＧ２Ｄ受容体は天然のリガンドに結合しないように改変された改変型ＮＫＧ２Ｄ受容体であってもよく、この場合、α１−α２ドメインは、上記の改変型ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合できるように改変されていてもよい。また、抗ＧＰＣ１抗体は、例えばｓｃＦＶ等の抗体断片であってもよい。
【００１２】
実施例において後述するように、ＧＰＣ１を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞療法と抗ＰＤ−１抗体療法を併用することにより、がん治療に相乗効果が認められることが明らかとなった。したがって、本実施形態のがん治療用キットによれば、ＧＰＣ１陽性のがんを効果的に治療することができる。
【００１３】
ヒトＧＰＣ１（以下「ｈＧＰＣ１」という場合がある。）のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００２０８１．２等である。また、ｈＧＰＣ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００２０７２．２等である。また、マウスＧＰＣ１（以下「ｍＧＰＣ１」という場合がある。）のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０１６６９６．５等である。また、ｍＧＰＣ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０５７９０５．１等である。
【００１４】
本実施形態のがん治療用キットにおいて、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ３抗体からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。なお、抗４−１ＢＢ抗体はＴ細胞活性を増強する共刺激シグナルを伝達するアゴニスト抗体であるが、本明細書においては、免疫チェックポイント阻害剤と併用、又は、免疫チェックポイント阻害剤の代わりに用いることができる。
【００１５】
抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ等が挙げられる。また、抗４−１ＢＢ抗体としては、ウトミルマブが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１６】
本実施形態のがん治療用キットにおいて、ＣＡＲは、ＧＰＣ１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞質シグナルドメインを含み、ＧＰＣ１結合ドメインが、ｈＧＰＣ１及びｍＧＰＣ１の双方に対する結合性を有するものであることが好ましい。
【００１７】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法に関する前臨床試験の大部分は、ヒト腫瘍が免疫不全マウスに異種移植された異種マウスモデルを用いて行われている。なぜなら、ＣＡＲが相同マウス抗原に対する交差反応性を示さないことが通常であるため、ヒト腫瘍を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞療法の開発に利用可能な唯一の選択肢であることが多いためである。
【００１８】
しかしながら、異種マウスモデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞療法の試験では、オンターゲット／オフ腫瘍毒性を十分に評価することができない。オンターゲット／オフ腫瘍毒性は、主に、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、標的抗原を発現する通常細胞を認識して攻撃することにより生じると考えられている。つまり、オフ腫瘍毒性は副作用である。異種マウスモデルでは、ヒト正常細胞（非腫瘍性ヒト細胞）が存在しないので、これらに対するＣＡＲ−Ｔ細胞の毒性を評価することができない。
【００１９】
ここで、ＣＡＲがヒトの標的抗原及び相同マウス抗原の双方に対する結合性（交差反応性）を有するものであると、健常マウスにマウスがんを移植した同系マウスモデルを用いてＣＡＲ−Ｔ細胞の試験を行うことができる。
【００２０】
健常マウス組織は標的抗原を低レベルで発現し、ヒト患者における発現パターンを反映しているので、同系マウスモデルを用いることにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞のオンターゲット／オフ腫瘍毒性を明らかにすることができる。
【００２１】
実施例において後述するように、異種マウスモデルでは異種移植Ｔ細胞による移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び不適当な宿主免疫のためにＣＡＲ−Ｔ細胞の評価が中断されてしまう。これに対し、同系マウスモデルを用いることができれば、オンターゲット／オフ腫瘍毒性を十分に評価できることに加えて、宿主抗腫瘍免疫及び種特異的免疫抑制性腫瘍との相互作用等、ヒトにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性に重大な影響を及ぼすと思われる現実的要因の分析が可能になる。
【００２２】
本実施形態のがん治療用キットにおいて、ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、抗ＧＰＣ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。ここで、９５％以上の配列同一性とは、アミノ酸配列が、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一であることを意味する。
【００２３】
後述する実施例で使用したＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、ニワトリを免疫して作製した抗体に由来する。実施例で使用したＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、重鎖可変領域が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有している。また、ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、ＧＰＣ１に対する結合性を有している限り、重鎖可変領域が配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。
【００２４】
本明細書において、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）に割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔの定義にしたがって規定される（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｋａｂａｔ  Ｅ、  Ｗｕ  Ｔ、  Ｐｅｒｒｙ  Ｈ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  Ｋ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  １９８７  ａｎｄ  １９９１）。
【００２５】
ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、前記軽鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。ここで、９５％以上の配列同一性とは、アミノ酸配列が、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一であることを意味する。
【００２６】
後述する実施例で使用したＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、前記軽鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有している。また、ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、ＧＰＣ１に対する結合性を有している限り、軽鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。
【００２７】
ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、Ｎ末端側から、重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域の順に連結された単鎖抗体であってもよい。
【００２８】
実施例において後述するように、発明者らはＧＰＣ１結合ドメインが、Ｎ末端側から、重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域の順に連結された単鎖抗体であるＣＡＲ（以下、「ＨＬ型」という場合がある。）及びＮ末端側から、軽鎖可変領域、リンカー、重鎖可変領域の順に連結された単鎖抗体であるＣＡＲ（以下、「ＬＨ型」という場合がある。）の双方を作製し、抗腫瘍効果を検討した。その結果、ＧＰＣ１結合ドメインが、Ｎ末端側から、重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域の順に連結された単鎖抗体であるＣＡＲ（ＨＬ型）を有するＣＡＲ−Ｔ細胞のほうが高い抗腫瘍活性を示す傾向が認められた。
【００２９】
単鎖抗体のリンカーとしては、単鎖抗体のリンカーとして通常用いられるリンカーであれば特に限定されないが、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるリンカーを好適に用いることができる。
【００３０】
ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、重鎖可変領域が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、軽鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものであってもよい。ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、ＧＰＣ１に対する結合性を有している限り、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるものであってもよく、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよく、ＣＡＲが配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるものであってもよく、配列番号１５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、９５％以上の配列同一性とは、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一であることを意味する。
【００３１】
ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト化されていてもよい。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト化されているとは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を構成するフレームワーク領域（ＦＲ）がヒト由来のアミノ酸配列に置換されていること等が挙げられる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲのアミノ酸配列及びヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲのアミノ酸配列及びヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入して発現ベクターを構築し、抗体発現用細胞に導入することにより製造することができる。また、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡを一の発現ベクターに挿入して構築した発現ベクターを用いてヒト化抗体を製造することもできる。
【００３２】
ＣＡＲのＧＰＣ１結合ドメインがヒト化されていると、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。また、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞を患者に複数回投与すること等が可能になる。
【００３３】
本実施形態のがん治療用キットが治療対象とするがんとしては、ＧＰＣ１陽性がんが挙げられる。特に、食道がん、子宮頸がん、乳がん、膵がん、神経膠腫、中皮腫、甲状腺がん、肺がん、肝臓がん、大腸がん、頭頸部がん、尿路上皮がん、卵巣がん、黒色腫、前立腺がん等が挙げられる。本実施形態のがん治療用キットが治療対象とするがんとして、好ましくは、食道がんである。これらのがんはＧＰＣ１を発現していることが知られており、本実施形態のがん治療用キットにより効果的に治療することができる。
【００３４】
本実施形態のがん治療用キットにおいて、ＣＡＲを有するＴ細胞は、患者に移植した場合に拒絶反応が抑制されたＴ細胞であることが好ましい。このようなＴ細胞の具体例としては、例えば、患者由来のＴ細胞、患者とＨＬＡ型が許容可能な程度に一致したＴ細胞、ＨＬＡタンパク質の発現が抑制されたＴ細胞等が挙げられる。ＨＬＡタンパク質の発現が抑制されたＴ細胞は遺伝子改変された細胞であってもよい。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化細胞から分化誘導して作製したＴ細胞であってもよい。
【００３５】
本実施形態のがん治療用キットにおいて、ＧＰＣ１を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞と、免疫チェックポイント阻害剤は、混合して同時に投与してもよいし、別々に投与してもよい。また、ＧＰＣ１を標的とすると免疫チェックポイント阻害剤を、一の医薬組成物として患者に投与してもよい。免疫チェックポイント阻害剤は、ＧＰＣ１を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後、複数回投与してもよい。
【００３６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞及び免疫チェックポイント阻害剤は、それぞれ医薬組成物として製剤化されていてもよく、一の医薬組成物として製剤化されていてもよい。
【００３７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む医薬組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞に加えて、１種又は２種以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、添加剤、抗体等を含んでいてもよい。薬学的又は生理学的に許容される担体としては、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液；ブドウ糖、マンノース、ショ糖、デキストラン、マンニトール等の炭水化物；グリシン等のアミノ酸等が挙げられる。添加剤としては、例えばＩＬ−２等のサイトカイン、酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、水酸化アルミニウム等のアジュバント、保存剤等が挙げられる。抗体としては、免疫チェックポイント阻害剤が挙げられ、特に抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７−１）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ３抗体が好適に用いられる。ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されることが好ましい。
【００３８】
免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、１種又は２種以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、添加剤等を含んでいてもよい。
【００３９】
薬学的又は生理学的に許容される担体としては、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液；ブドウ糖、マンノース、ショ糖、デキストラン、マンニトール等の炭水化物；グリシン等のアミノ酸等が挙げられる。添加剤としては、例えば、酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、水酸化アルミニウム等のアジュバント、保存剤等が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されることが好ましい。
【００４０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与量は、患者の状態、患者の疾患の種類及び重症度等の因子により適宜調整することができるが、患者一人当たり１×１０９個〜１×１０１２個程度が一般的に許容されると考えられる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は１回のみ投与してもよいし、複数回投与してもよい。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与前に、化学療法を実施してもよい。例えば、シクロホスファミド（１日量６０ｍｇ／ｋｇ体重）及びフルダラビン（１日量２０ｍｇ／ｍ２（体表面積））を投与してもよい。また、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の際に、投与日からインターロイキン（ＩＬ）−２を投与してもよい。ＩＬ−２の投与レジメンとして、ＴＩＬ療法において、Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ（７２，００００ＩＵ／ｋｇ体重を８時間ごとに最大１２回）及びＬｏｗ−ｄｏｓｅ（７２，０００ＩＵ／ｋｇ体重を８時間ごとに最大１５回）が例示され、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与においても投与量を適宜調整しＩＬ−２を投与しうる。（Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２；２５（３）：２４３−２５１．）
【００４１】
免疫チェックポイント阻害剤の投与量は、患者の状態、患者の疾患の種類及び重症度等の因子により適宜調整することができる。初回投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与と同時であってもよいし、別々であってもよい。下記表１〜８に、主な治療のレジメンを例示する。
【００４２】
【表１】
2020189835.tif 000002
【００４３】
【表２】
2020189835.tif 000003
【００４４】
【表３】
2020189835.tif 000004
【００４５】
【表４】
2020189835.tif 000005
【００４６】
【表５】
2020189835.tif 000006
【００４７】
【表６】
2020189835.tif 000007
【００４８】
【表７】
2020189835.tif 000008
【００４９】
【表８】
2020189835.tif 000009
【００５０】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＧＰＣ１に結合するＣＡＲを有するＴ細胞及び免疫チェックポイント阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。本実施形態において、ＧＰＣ１に結合するＣＡＲ、ＣＡＲを有するＴ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、投与量、投与方法等は、上述したものと同様である。
【実施例】
【００５１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［材料及び方法］
（組織試料）
正常ヒト組織の凍結組織アレイスライド（ＦＤＡ標準凍結組織アレイ−ヒト成人正常、Ｔ６２３４７０１−１）はバイオチェーン社から購入した。正常マウスの凍結組織スライド（Ｃ５７ＢＬ／６）は自作した。副作用を評価するために、Ｔ細胞を移植したマウスを４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した後、全身組織を採取し、採取した組織をホルマリン固定しパラフィン包埋した。
【００５３】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡ合成及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは標準的なプロトコルを用いて実施した。ＧＡＰＤＨ遺伝子を定量的リアルタイムＰＣＲ正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。ｈＧＰＣ１遺伝子及びｍＧＰＣ１遺伝子の定量のためのＴａｑＭａｎプローブ（カタログ番号「Ｍｍ００４９７３０５＿ｍ１」）及びＲＴ−ＰＣＲプライマー（ＧＰＣ１）はサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。
【００５４】
（免疫染色）
免疫染色は、ヒト及びマウスの全身組織の凍結切片（ＧＰＣ１の場合）又はホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＧＦＰの場合）について、標準的なプロトコルを用いて行った。一次抗体として、抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２、０．５μｇ／ｍＬ、Ｈａｒａｄａ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  ８  （１５），  ２４７４１−２４７５２，  ２０１７）及び抗ＧＦＰ抗体（クローン１Ｅ４、０．５μｇ／ｍＬ、Ｍ０４８−３、株式会社医学生物学研究所）を使用した。
【００５５】
（細胞株及び培地）
ヒト食道扁平上皮がん細胞株（ＴＥ１４）、ヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＫ２にｈＧＰＣ１を強制発現させた細胞株（ＬＫ２−ｈＧＰＣ１）、ＬＫ２に空ベクターを導入した細胞株（ＬＫ２−ｍｏｃｋ）を使用した。マウス結腸腺がん細胞株（ＭＣ３８）、マウス肉腫細胞株（ＭＣＡ−２０５）及びマウスＴ細胞リンパ腫（ＥＬ４）は、米国国立がん研究所から入手した。
【００５６】
また、ＭＣ３８及びＭＣＡ２０５細胞に、ｍＧＰＣ１  ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。以下、ｍＧＰＣ１を安定に発現するＭＣ３８及びＭＣＡ２０５を、それぞれＭＣ３８−ｍＧＰＣ１及びＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１という場合がある。
【００５７】
ヒトＴ細胞用培地として、１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＧＥＭＩＮＩ社、１００−５１２）及び３００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２、ニプロ、８７−８９０）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、０８７０１１２ＤＫ）を使用した。マウスＴ細胞用培地として、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＳＩＧＭＡ、１７２０１２−５００ｍｌ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｌ−ＨＥＰＥＳ（ギブコ、１５６３０−０８０）及び５０ＩＵ／ｍＬの遺伝子組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を含むＲＰＭＩ培地（ナカライテスク、３０２６４−５６）を使用した。
【００５８】
（レトロウイルスベクターデザイン）
ＶＬ−ＶＨ（ＬＨ型）又はＶＨ−ＶＬ（ＨＬ型）である抗ＧＰＣ１  単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする塩基配列は、ヒト及びマウスのＧＰＣ１を認識する抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２）の塩基配列に基づいて作製した。
【００５９】
図２Ａに示すように、ヒトＣＡＲ（ｈＣＡＲ）は、ヒトＣＤ８ａのリーダー配列、抗ＧＰＣ１  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ２８の細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内ドメイン、ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインを含んでいる。ｈＣＡＲ（ＬＨ型）の塩基配列を配列番号４に示す。また、ｈＣＡＲ（ＨＬ型）の塩基配列を配列番号５に示す。また、図４Ａに示すように、マウスＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、マウスＣＤ８ａのリーダー配列、抗ＧＰＣ１  ｓｃＦｖ、マウスＣＤ２８の細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内ドメイン、マウスＣＤ３ζの細胞内ドメインを含んでいる。ｍＣＡＲの塩基配列を配列番号６に示す。これらのｈＣＡＲ遺伝子及びｍＣＡＲ遺伝子は、レトロウイルスベクターにインフレームでクローニングした。
【００６０】
（ｈＣＡＲ−Ｔ細胞及びｍＣＡＲ−Ｔ細胞の調製）
ＧＰＣ１特異的ｈＣＡＲ遺伝子（ＬＨ型又はＨＬ型）又はｍＣＡＲ遺伝子（ＨＬ型）を刺激したヒトＴ細胞又はマウスＴ細胞に導入した。まず、Ｈｉｌｙ  Ｍａｘ（同仁化学研究所、Ｈ３５７）を使用して、ヒト又はマウスのＣＡＲプラスミド、ＥＣＯエンベロープをコードするプラスミド、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミドを、Ｇ３Ｔｈｉ細胞に共導入することにより、一過性レトロウイルス上清を作製した。１２時間後、上清を新鮮な培地と交換し、培地の交換から２４時間後にレトロウイルス上清を回収した。ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の作製にはこのレトロウイルスを用いた。ｈＣＡＲ−Ｔ細胞の作製のためには、さらにこのレトロウイルスをＰＧ１３細胞に感染させ、その上清中に産生されるＧａＬＶエンベロープのレトロウイルスを用いた。それぞれのレトロウイルス上清を、レトロネクチン（（登録商標）タカラバイオ社、Ｔ１００Ｂ）でコーティングしたプレート上で、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心し、レトロウイルスプレートとした。
【００６１】
ｈＣＡＲ−Ｔ細胞の作製については、続いて、健康なドナー由来の末梢血単核球細胞を、形質導入前に２日間、可溶性ＯＫＴ−３（５０ｎｇ／ｍＬ、バイオレジェンド社、３１７３４７）で刺激した。続いて、レトロウイルスプレート上に、刺激した細胞を播種し、１０００×ｇで１０分間スピンダウンすることにより形質導入した。
【００６２】
またｍＣＡＲ−Ｔ細胞の作製については、ＣＡＧプロモーターの制御下で恒常的にＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスからマウス脾細胞を回収し、０日目に２．５ｍｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（シグマアルドリッチ社、Ｃ５２７５）で活性化した。続いて、形質導入の１日前に、２μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ、１ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン７（ｒｍＩＬ−７、ぺプロテック社、２１７−１７）及び５０ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２をマウス脾細胞に添加し刺激した。続いて、刺激した脾細胞をレトロウイルスプレート上に１０００×ｇで１０分間スピンダウンすることにより形質導入した。
【００６３】
（フローサイトメトリー解析）
腫瘍細胞株を抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２）で染色した。形質導入したＴ細胞について、ＡＰＣ標識ロバ抗ニワトリＩｇＹ抗体（ジャクソン社、７０３−１３６−１５５）を用いて細胞表面に発現したＣＡＲを染色した。なお、抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２）はニワトリ由来の抗体である。組織及び血液中のマウス細胞は抗ＣＤ４５抗体（Ｖ５００、３０−Ｆ１１、ＢＤバイオサイエンス社、５６１４８７）、抗ＣＤ３抗体（ＢＶ−４２１、１４５−２Ｃ１１、バイオレジェンド社、１００３３６）及び抗ＣＤ８抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、５３−６．７、ＢＤバイオサイエンス社、５５７９５９）で染色した。
【００６４】
（フローサイトメトリー解析、抗ＴＩＧＩＴ抗体の評価）
抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（マウス）（医学生物学研究所、クローンＣ１８−２５）及び２次抗体としてＰＥ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｐｏｌｙ４０５３、バイオレジェンド社、４０５３０７）を用いて、ＨＥＫ２９３−ＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ過剰発現ヒト胎児腎細胞株）の細胞表面に発現したＴＩＧＩＴを染色した。
【００６５】
（細胞傷害活性）
ＬＫ２−ｈＧＰＣ１をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、同仁化学社、Ｃ３７５）で標識し、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を１０μｇ／ｍＬになるように添加し、さらにＬＫ２−ｈＧＰＣ１と同数のＧＰＣ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を加え、３７℃で６時間インキュベーションした後に、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（バイオレジェンド社、４２２２０１）に再分散し、さらにＡＰＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（バイオレジェンド社、６４０９４１）を加えて、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞をフローサイトメトリーで評価した。
【００６６】
（ＩＦＮγ分泌アッセイ）
培養腫瘍細胞株を刺激細胞として使用した。Ｔ細胞を刺激細胞と共培養し、上清を２４時間後に回収した。ヒト及びマウスのインターフェロン（ＩＦＮ）γの濃度を、それぞれヒトＩＦＮγ（ｈＩＦＮγ）ＥＬＩＳＡセット（Ｅｎｄｏｇｅｎ社：Ｍ７００ＡとＭ７００Ｂ）又はマウスＩＦＮγ（ｍＩＦＮγ）ＥＬＩＳＡセット（ＢＤバイオサイエンス社、５５５１３８）を用いて測定した。
【００６７】
（クロム放出アッセイ）
標的細胞を５１Ｃｒで標識し、複数の混合比率で、形質導入細胞と混合した。３７℃で４時間インキュベートした後、遊離５１Ｃｒの放出を測定した（Ｙａｇｕｃｈｉ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ／β−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １８９  （５），  ２１１０−２１１７，  ２０１２）。
【００６８】
（マウスモデル解析）
異種マウスモデルでは、３×１０６個のＴＥ１４細胞を６〜１０週齢の（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ−２γｎｕｌｌ、ＮＯＧ）マウスの脇腹に皮下接種した。培養したｈＣＡＲ−Ｔ細胞又はｈＣｏｎｔ−Ｔ細胞（２×１０７細胞／マウス）を９日目に静脈内投与した。ここで、ｈＣｏｎｔ−Ｔ細胞とは、ＣＡＲを形質導入していないヒトＴ細胞を意味する。
【００６９】
同系マウスモデルでは、５×１０５個のＭＣ３８−ｍＧＰＣ１又はＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下接種した。培養したｍＣＡＲ−Ｔ細胞又はｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞（２×１０６細胞／マウス）を３日目に静脈内投与した。ここで、ｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞とは、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を意味する。Ｔ細胞移植の直前にマウスに５Ｇｙの全身照射を行い、１日２回ｒｈＩＬ−２を腹腔内投与した。ｒｈＩＬ−２の投与は５０，０００ＩＵ／マウスの投与量で６回行った。
【００７０】
併用療法モデルでは、２、６、１４及び１８日目に２００ｍｇ／マウスの抗ＰＤ−１抗体（Ｊ４３、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、ＢＥ００３３−２）又はアイソタイプ抗体（ＰＩＰ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、ＢＥ０２６０）を腹腔内注射した。腫瘍体積は下記式（１）にしたがって計算した。
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２  …（１）
【００７１】
（腫瘍特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞応答の評価）
内因性腫瘍抗原に特異的なＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞の免疫応答を評価するために、ソートしたＣＤ８陽性Ｔ細胞を、１ｍｇ／ｍＬ  ｇｐ７０ペプチド（配列番号７）又は対照ペプチド（Ｈ−２Ｋｂに拘束されたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）由来のペプチド、配列番号８）でパルスしたＥＬ４細胞で２４時間再刺激し、ＩＦＮγ分泌を評価した。
【００７２】
（統計解析）
全ての結果は平均値±標準偏差で表した。データの統計分析（対応がないｔ検定及びボンフェローニ／ダン検定）を行い、実験群、処理群及び対照群の平均間の差を決定した。統計計算にはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０を用いた。Ｐ＜０．０５（＊）及びＰ＜０．０１（＊＊）を統計学的に有意であると判断した。
【００７３】
［実験例１］
（ヒト成人正常全身組織におけるｈＧＰＣ１の発現の検討）
ヒト成人正常全身組織におけるｈＧＰＣ１の発現を検討した。まず、ｍＲＮＡレベルでのｈＧＰＣ１発現の特異性を評価するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により、胎児脳組織におけるｈＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現量と、様々な成人ヒト正常組織におけるｈＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現量を比較した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを内部標準として使用した。
【００７４】
図１Ａは定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。その結果、ほとんど全ての組織において、ごくわずかだが検出可能なｈＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現が認められることが明らかとなった。
【００７５】
続いて、ｈＧＰＣ１及びｍＧＰＣ１に特異的に反応する抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）の反応性を、様々なヒト正常組織に対して評価した。
【００７６】
図１Ｂは免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍを示す。その結果、ヒト食道がん組織における強いＧＰＣ１発現と比較して、正常組織は抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２）により明確に染色されないことが明らかとなった。年齢及び性別が異なる３人のドナーの組織サンプルについて、同様の結果が確認された。
【００７７】
以上の結果から、定量的ＲＴ−ＰＣＲではｈＧＰＣ１  ｍＲＮＡが検出されるものの、ｈＧＰＣ１のタンパク質レベルでの発現はヒト成人正常組織では検出されないことが明らかとなった。この結果は、ＧＰＣ１がＣＡＲ−Ｔ細胞療法のための有望な治療標的であり、抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）をＧＰＣ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の開発に使用できることを示す。
【００７８】
［実験例２］
（ＧＰＣ１特異的ｈＣＡＲ−Ｔ細胞の検討）
抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）由来の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖフラグメント、ヒトＣＤ２８及びＣＤ３ζのシグナルドメインを含むＧＰＣ１特異的ｈＣＡＲ（ｈＣＡＲ、ＬＨ型及びＨＬ型）をコードするレトロウイルス発現ベクターを作製した。
【００７９】
図２ＡはｈＣＡＲの構造を示す模式図である。図２Ａに示すように、ＬＨ型は、Ｎ末端側から順に軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する。また、ＨＬ型は、Ｎ末端側から順に重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。
【００８０】
続いて、作製したｈＣＡＲベクターをヒト活性化Ｔ細胞に形質導入した。ＬＨ型及びＨＬ型の両方において、形質導入されたＴ細胞（ｈＣＡＲ−Ｔ細胞）の形質導入効率は約６０％であった。トランスフェクション後のｈＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖能において、ＬＨ型とＨＬ型の間に有意差はなかった。
【００８１】
標的抗原に応答したＴ細胞によるＩＦＮγ分泌及び腫瘍細胞（標的細胞）殺傷活性は、抗原特異的抗腫瘍免疫応答において重要である。発明者らは、ＩＦＮγ分泌アッセイ及び５１Ｃｒ放出アッセイによってＣＡＲ−Ｔ細胞のこれらの能力を試験した。
【００８２】
図２Ｂ（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、ＬＫ２−ｍｏｃｋ（ｈＧＰＣ１陰性肺がん細胞株）、ＬＫ２−ｈＧＰＣ１（ｈＧＰＣ１過剰発現肺がん細胞株）、ＴＥ１４（ｈＧＰＣ１内在性食道がん細胞株）におけるＧＰＣ１の発現をフローサイトメトリー解析により検討した結果を示すグラフである。ｈＣＡＲ−Ｔ細胞を、これらの細胞とそれぞれ共培養し、ＩＦＮγ分泌アッセイ及び５１Ｃｒ放出アッセイを行った。
【００８３】
図２ＣはＩＦＮγ分泌アッセイの結果を示すグラフである。図２Ｃ中、「ｈＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないヒトＴ細胞の結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＬＨ」はＬＨ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞の結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＨＬ」はＨＬ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞の結果であることを示し、「Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｏｎｅ」は、比較のために各種Ｔ細胞のみを培養した結果であることを示し、「ＬＫ２−ｈＧＰＣ１」は各種細胞をＬＫ２−ｈＧＰＣ１細胞と共培養した結果であることを示し、「ＬＫ２−ｍｏｃｋ」は各種Ｔ細胞をＬＫ２−ｍｏｃｋ細胞と共培養した結果であることを示し、「ＴＥ１４」は各種Ｔ細胞をＴＥ１４細胞と共培養した結果であることを示す。その結果、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞はｈＧＰＣ１特異的にＩＦＮγを放出したことが明らかとなった。ＣＡＲ−Ｔ細胞は抗原を認識すると、ＩＦＮγを産生し、細胞傷害活性を発揮することから、ＩＦＮγの産生上昇は、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＬＫ２−ｈＧＰＣ１を標的としていることを示す。
【００８４】
図２Ｄ（ａ）〜（ｃ）は、５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。図２Ｄ（ａ）〜（ｃ）中、「ｈＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないヒトＴ細胞の結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＬＨ」はＬＨ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞の結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＨＬ」はＨＬ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞の結果であることを示す。図２Ｄ（ａ）〜（ｃ）中、縦軸は５１Ｃｒの放出により測定した細胞の特異的な溶解を示し、横軸は、Ｔ細胞とがん細胞の混合比（Ｔ細胞：がん細胞）を示す。
【００８５】
図２Ｄ（ａ）は各種Ｔ細胞をＬＫ２−ｍｏｃｋ細胞と共培養した結果であり、図２Ｄ（ｂ）は各種Ｔ細胞をＬＫ２−ｈＧＰＣ１細胞と共培養した結果であり、図２Ｄ（ｃ）は各種Ｔ細胞をＴＥ１４細胞と共培養した結果である。その結果、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞はｈＧＰＣ１に特異的にＩＦＮγを放出し、標的細胞を殺傷したことが明らかとなった。
【００８６】
続いて、発明者らは、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＴＥ１４異種移植ＮＯＧマウスに静脈内投与し、インビボにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を検討した。ｈＣＡＲ−Ｔ細胞（ＬＨ型及びＨＬ型）又はＣＡＲを形質導入していないヒトＴ細胞を２×１０７細胞／マウスの投与量で静脈内投与し、腫瘍体積の経時変化を測定した。
【００８７】
図２Ｅは、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図２Ｅ中、「ｈＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないヒトＴ細胞を投与したマウスの結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＬＨ」はＬＨ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞を投与したマウスの結果であることを示し、「ｈＣＡＲ−Ｔ−ＨＬ」はＨＬ型のｈＣＡＲを導入したＴ細胞を投与したマウスの結果であることを示す。その結果、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＬＨ型、ＨＬ型ともに、ｈＣｏｎｔ−Ｔ細胞と比較して、腫瘍の増殖を効果的に阻害したことが明らかとなった。
【００８８】
また、図２Ｆ（ａ）は、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（マウス、クローンＣ１８−２５）のヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する反応性を検討した結果である。この抗体を用いて、細胞傷害活性を評価した。図２Ｆ（ａ）中、「ＴＩＧＩＴ（Ｃ１８−２５）」は、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（マウス、クローンＣ１８−２５）を示し、「２ｎｄＰＥ」はＰＥ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を示す。
【００８９】
図２Ｆ（ｂ）は、ＧＰＣ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（ｈＣＡＲ−Ｔ−ＨＬ）に抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ａｎｔｉ−ＴＩＧＩＴ）を添加した際の、ＬＫ２−ｈＧＰＣ１に対する細胞傷害活性を評価した結果である。その結果、抗ＴＩＧＩＴ抗体を添加することにより、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞が標的細胞をより効果的に殺傷したことが明らかとなった。
【００９０】
以上の結果から、ＧＰＣ１特異的ｈＣＡＲ−Ｔ細胞が、ｈＧＰＣ１発現ヒト腫瘍に対する特異的認識及び強い抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。
【００９１】
［実験例３］
（マウス正常全身組織におけるｍＧＰＣ１の発現の検討）
実験例２では、異種Ｔ細胞を投与したため、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞を移植した全てのＮＯＧマウスは重度の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患して死亡した。このように、このモデルではオンターゲット／オフ腫瘍毒性を評価することは不可能である。そこで、発明者らは、同系マウスモデルを、オンターゲット／オフ腫瘍毒性の評価に使用した。
【００９２】
まず、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により、様々なマウス正常組織におけるｍＧＰＣ１のｍＲＮＡ発現量を検討した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを内部標準として使用した。
【００９３】
図３Ａは定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。その結果、ほとんど全ての組織において、ごくわずかであるが検出可能なｍＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現が認められることが明らかとなった。また、上述した図１Ａ及び図３Ａの結果から、心臓、肺及び脳は、ヒト及びマウスの両方において相対的に高いＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現を示すことが明らかとなった。
【００９４】
続いて、抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）の反応性を、様々なマウス正常組織に対して評価した。
【００９５】
図３Ｂは免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍを示す。その結果、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞（ｍＧＰＣ１を強制発現させたマウス結腸腺がん細胞株）では、強く均一なＧＰＣ１発現が認められた。これに対し、正常組織は抗ＧＰＣ１抗体（クローン１−１２）により明確には染色されないことが明らかとなった。この結果は、上述した図１Ｂにおけるヒトの結果と同様であった。
【００９６】
以上の結果は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルでのヒトとマウスとの間のＧＰＣ１の発現パターンが類似していることを示す。したがって、同系マウスモデル（Ｃ５７ＢＬ／６）をオンターゲット／オフ腫瘍毒性の評価に使用することができる。
【００９７】
［実験例４］
（ＧＰＣ１特異的ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の検討）
図４Ａ（ａ）〜（ｄ）は、抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）又はアイソタイプコントロール抗体の反応性をフローサイトメトリーにより検討した結果を示すグラフである。
【００９８】
図４Ａ（ａ）はヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＫ２に空ベクターを導入した細胞株（ＬＫ２−ｍｏｃｋ）の結果であり、図４Ａ（ｂ）はＬＫ２にｈＧＰＣ１を強制発現させた細胞株（ＬＫ２−ｈＧＰＣ１）の結果であり、図４Ａ（ｃ）はマウス結腸腺がん細胞株（ＭＣ３８）にｍＧＰＣ１を強制発現させた細胞株（ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１）の結果であり、図４Ａ（ｄ）はマウス肉腫細胞株（ＭＣＡ−２０５）にｍＧＰＣ１を強制発現させた細胞株（ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１）の結果である。
【００９９】
その結果、抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン１−１２）は、ｈＧＰＣ１及びｍＧＰＣ１の双方に対する反応性を有することが明らかとなった。この結果は、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植した同系マウスモデルを用いて有害作用を評価することができることを示す。
【０１００】
実験例２において、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞（ＨＬ型）は、ｈＣＡＲ−Ｔ細胞（ＬＨ型）と比較してより高い抗腫瘍活性を示したため、本実験例では、ＨＬ型のｍＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。
【０１０１】
図４ＢはｍＣＡＲの構造を示す模式図である。図４Ｂに示すように、ｈＣＡＲベクター（ＨＬ型）中の、ヒトＣＤ３及びＣＤ２８配列を相同マウス配列に変換して、ｍＣＡＲベクターを作製した。
【０１０２】
続いて、恒常的にＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウス由来の活性化Ｔ細胞に、ｍＣＡＲベクターを形質導入した。続いて、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的活性を評価するために、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞をＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞と共培養し、ＩＦＮγ分泌アッセイ及び５１Ｃｒ放出アッセイを行った。
【０１０３】
図４ＣはＩＦＮγ分泌アッセイの結果を示すグラフである。図４Ｃ中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞の結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞の結果であることを示し、「ｎｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ」は腫瘍細胞のみを培養した結果であることを示し、「Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｏｎｅ」は、比較のために各種Ｔ細胞のみを培養した結果であることを示し、「ＭＣ３８−ｍｏｃｋ」は各種Ｔ細胞をＭＣ３８−ｍｏｃｋ細胞と共培養した結果であることを示し、「ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１」は各種Ｔ細胞をＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞と共培養した結果であることを示す。その結果、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞はｍＧＰＣ１特異的にＩＦＮγを放出したことが明らかとなった。
【０１０４】
図４Ｄ（ａ）及び（ｂ）は、５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。図４Ｄ（ａ）及び（ｂ）中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞の結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞の結果であることを示す。図４Ｄ（ａ）及び（ｂ）中、縦軸は５１Ｃｒの放出により測定した細胞の特異的な溶解を示し、横軸は、Ｔ細胞とがん細胞の混合比（Ｔ細胞：がん細胞）を示す。
【０１０５】
図４Ｄ（ａ）は各種Ｔ細胞をＭＣ３８−ｍｏｃｋ細胞と共培養した結果であり、図４Ｄ（ｂ）は各種Ｔ細胞をＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞と共培養した結果である。その結果、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞はｍＧＰＣ１に特異的に標的細胞を殺傷したことが明らかとなった。
【０１０６】
続いて、発明者らは、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞又はＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を移植した同系マウスモデルに静脈内投与し、インビボにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を検討した。ｍＣＡＲ−Ｔ細胞又はＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞をがん細胞の移植から３日目に２×１０６細胞／マウスの投与量で静脈内投与し、腫瘍体積の経時変化を測定した。
【０１０７】
図４Ｅ（ａ）〜（ｃ）及び図４Ｆ（ａ）〜（ｃ）は、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図４Ｅ（ａ）〜（ｃ）はＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞を移植したマウスの結果を示す。図４Ｅ（ａ）は、各群のマウスの結果の平均値を示すグラフであり、図４Ｅ（ｂ）はＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞（ｍＣｏｎｔ−Ｔ）を移植したマウスの個別の結果を示すグラフであり、図４Ｅ（ｃ）はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植したマウスの個別の結果を示すグラフである。
【０１０８】
その結果、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１マウスモデルでは、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞はｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞と比較して、腫瘍の増殖を効果的に抑制したことが明らかとなった。
【０１０９】
また、図４Ｆ（ａ）〜（ｃ）はＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を移植したマウスの結果を示す。図４Ｆ（ａ）は、各群のマウスの結果の平均値を示すグラフであり、図４Ｆ（ｂ）はＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞（ｍＣｏｎｔ−Ｔ）を移植したマウスの個別の結果を示すグラフであり、図４Ｆ（ｃ）はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植したマウスの個別の結果を示すグラフである。
【０１１０】
その結果、ＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１マウスモデルでは、５匹のうち４匹のマウスにおいて、腫瘍の完全な根絶が認められ、少なくとも１００日間維持された。
【０１１１】
以上の結果から、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞はｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞と比較して、腫瘍の増殖を効果的に抑制したことが明らかとなった。
【０１１２】
続いて、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１マウスモデルを用いてｍＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボにおける持続性を評価した。具体的には、実験開始から１５日目の末梢血及び腫瘍組織由来の総ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性ＣＤ８陽性ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の割合を測定した。
【０１１３】
図４Ｇ（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、末梢血及び腫瘍組織由来の総ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性ＣＤ８陽性ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の割合の測定結果を示すグラフである。各点は各マウスを示す。その結果、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１担がんマウスにおいて末梢血中で効率的に持続し、腫瘍に浸潤したことが明らかとなった。
【０１１４】
また、ＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１マウスモデルにおいて、完全な腫瘍根絶を示したマウスは、実験開始から６０日目の末梢血中においてＧＦＰ陽性ＣＤ８陽性ｍＣＡＲ−Ｔ細胞が検出され、長期間のｍＣＡＲ−Ｔ細胞の残存が確認された（図４Ｇ（ｃ））。
【０１１５】
続いて、ＩＦＮγの分泌を評価することにより、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的な持続性を評価した。実験開始から１５日目に、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１マウスモデルの脾臓及び腫瘍浸潤リンパ球から、移植したｍＣＡＲ−Ｔ細胞を含む全ＣＤ８陽性Ｔ細胞を回収した。続いて、刺激細胞としてのＬＫ２−ｈＧＰＣ１細胞又はＬＫ２−ｍｏｃｋ細胞と共培養し、上清中のマウスＩＦＮγの濃度を測定した。
【０１１６】
図４Ｈ（ａ）及び（ｂ）は、ＩＦＮγの濃度の測定結果を示すグラフである。図４Ｈ（ａ）は脾臓由来の細胞の結果であり、図４Ｈ（ｂ）は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の結果である。図４Ｈ（ａ）及び（ｂ）中、「Ｎｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ」は刺激細胞と共培養しなかった結果であることを示し、「ＬＫ２−ｍｏｃｋ」はＬＫ２−ｍｏｃｋ細胞と共培養した結果であることを示し、「ＬＫ２−ｈＧＰＣ１」はＬＫ２−ｈＧＰＣ１細胞と共培養した結果であることを示し、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞の結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞の結果であることを示す。
【０１１７】
その結果、実験開始から１５日目においてもｍＣＡＲ−Ｔ細胞は機能性を有することが明らかとなった。
【０１１８】
次に、発明者らは、単一抗原を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞が、他の内因性抗原に対するＴ細胞応答の誘導を増強し得るかどうかを検討した。抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球を、刺激物質としてのｇｐ７０ペプチド（配列番号７）又は対照としてβ−ｇａｌペプチド（配列番号８）で再刺激し、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞の誘導をＩＦＮγ放出アッセイによって評価した。
【０１１９】
図４Ｉは上清中のＩＦＮγの濃度の測定結果を示すグラフである。図４Ｉ中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を投与したマウスの結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスの結果であることを示す。
【０１２０】
その結果、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球におけるｇｐ７０特異的Ｔ細胞の誘導は、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の投与によって有意に増強されたことが明らかとなった。
【０１２１】
以上の結果から、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞がインビボで機能的に持続し、明らかな副作用なく確立された固形腫瘍を排除し、ＧＰＣ１以外の腫瘍抗原に対する内因性抗腫瘍応答を増強し得ることが明らかとなった。
【０１２２】
［実験例５］
（ＧＰＣ１特異的ｍＣＡＲ−Ｔ細胞による副作用の検討）
インビボでｍＣＡＲ−Ｔ細胞の有害作用を評価するために、臨床症状及び組織学的異常を分析した。
【０１２３】
まず、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞又はＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を移植した同系マウスモデルに、がん細胞の移植から３日目にｍＣＡＲ−Ｔ細胞又はＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を静脈内投与した。
【０１２４】
図５Ａ（ａ）及び（ｂ）は、がん細胞の移植から１５日目の同系マウスモデルの体重を測定した結果を示すグラフである。図５Ａ（ａ）はＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞を移植した同系マウスモデルの結果であり、図５Ａ（ｂ）はＭＣＡ２０５−ｍＧＰＣ１細胞を移植した同系マウスモデルの結果である。図５Ａ（ａ）及び（ｂ）中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ｎｓ」は有意差がなかったことを示す。
【０１２５】
その結果、いずれの同系マウスモデルにおいても、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスの体重は、ｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞を投与したマウスの体重と比較して有意な変化がないことが明らかとなった。また、いずれの同系マウスモデルにおいても、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスの外観及び行動は、ｍＣｏｎｔ−Ｔ細胞を投与したマウスの外観及び行動と比較して差が認められなかった。
【０１２６】
続いて、各同系マウスモデルについて、正常組織及び腫瘍組織のヘマトキシリン・エオシン染色及び抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫染色を行った。図５Ｂ（ａ）は、ヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図５Ｂ（ｂ）は、免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。
【０１２７】
図５Ｂ（ａ）及び（ｂ）中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ＨＥ」はヘマトキシリン・エオシン染色の結果であることを示し、「ＧＦＰ」は抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫染色の結果であることを示す。
【０１２８】
その結果、実験例１及び実験例３において、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＧＰＣ１  ｍＲＮＡの発現が検出された心臓及び脳を含む、試験した正常組織のいずれにおいても、明らかな組織学的組織損傷及び投与されたｍＣＡＲ−Ｔ細胞浸潤は観察されなかった。
【０１２９】
また、正常全身組織についてもヘマトキシリン・エオシン染色及び抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、正常全身組織のいずれにおいても、明らかな組織学的組織損傷は認められなかった。一方、正常全身組織において、投与されたｍＣＡＲ−Ｔ細胞のわずかな浸潤が観察された。
【０１３０】
以上の結果から、いくつかの正常組織におけるわずかなＧＰＣ１  ｍＲＮＡ発現にもかかわらず、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞が明らかな有害作用なしにｍＧＰＣ１陽性腫瘍を除去することができることが明らかとなった。
【０１３１】
［実験例６］
（ＧＰＣ１特異的ｍＣＡＲ−Ｔ細胞療法と抗ＰＤ−１抗体療法の併用）
まず、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞を移植した同系マウスモデルに、がん細胞の移植から３日目にｍＣＡＲ−Ｔ細胞又はＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を静脈内投与した。続いて、がん細胞の移植から１５日目のマウスの腫瘍組織中の内在性ＣＤ８陽性Ｔ細胞及び投与したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−１の発現を検討した。
【０１３２】
図６Ａ（ａ）は内在性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示すグラフであり、図６Ａ（ｂ）は投与したＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示すグラフである。図６Ａ（ａ）及び（ｂ）中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を移植したマウスの結果であることを示す。
【０１３３】
その結果、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１マウスモデルでは、腫瘍組織に存在するほとんどのｍＣＡＲ−Ｔ細胞及び内在性のＴ細胞がＰＤ−１を発現していることが明らかとなった。そこで、抗ＰＤ−１抗体の投与がｍＣＡＲ−Ｔ細胞の投与による抗腫瘍活性を増強するか否かについて検討した。
【０１３４】
図６Ｂは実験スケジュールを示す図である。０日目にマウスにＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞を皮下注射した。続いて、２日目に２×１０６細胞／マウスのＴ細胞を静脈内投与した。また、２、３、４日目にＩＬ−２を腹腔内投与した。また、２、４、６、１０、１４、１８日目に２００ｍｇ／マウスの抗ＰＤ−１抗体を腹腔内投与した。また、ＭＣ３８−ｍＧＰＣ１細胞の移植後、経時的に腫瘍体積を測定した。
【０１３５】
図６Ｃは、各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図６Ｃ中、「ｍＣｏｎｔ−Ｔ」は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞を投与したマウスの結果であることを示し、「Ｉｓｏｔｙｐｅ」はアイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「ａｎｔｉ−ＰＤ−１Ａｂ」は抗ＰＤ−１抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「ｍＣＡＲ−Ｔ」はｍＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスの結果であることを示し、「ＣＲ」は完全奏効を示す。
【０１３６】
また、図６Ｄ（ａ）〜（ｄ）は、各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を個別のマウスごとに示したグラフである。図６Ｄ（ａ）は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞及びアイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果を示し、図６Ｄ（ｂ）は、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞及びアイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果を示し、図６Ｄ（ｃ）は、ＣＡＲを形質導入していないマウスＴ細胞及び抗ＰＤ−１抗体を投与したマウスの結果を示し、図６Ｄ（ｄ）は、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞及び抗ＰＤ−１抗体を投与したマウスの結果を示す。
【０１３７】
その結果、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞療法に抗ＰＤ−１抗体で例示される免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせることにより、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害活性が８日目以降も維持されることが明らかとなった。一方、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞療法のみでは抗腫瘍効果は有意であったが弱かった。免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体）単独では抗腫瘍効果を認めることはできなかったことを併せて考えると、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞療法に、抗ＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤を補助的に用いることで、本来ｍＣＡＲ−Ｔ細胞が有する抗腫瘍効果を長期にわたり維持し、薬効を最大化できることが示された。また、図６Ｂで示される投与スケジュールの通り、ｍＣＡＲ−Ｔ細胞と免疫チェックポイント阻害剤を同日に投与していることから、抗ＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤をｍＣＡＲ−Ｔ細胞表面上に結合させた複合体も薬効を発揮しうる。さらに、明らかに弱った所見を示すマウスはなく全例生存しており、全てのマウスは臨床症状による悪影響を示さなかった。
【０１３８】
以上の結果は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を組み合わせることで、ＧＰＣ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果が維持されることを示す。また、目に見える副作用症状がないことも併せて示す。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明により、ＧＰＣ１陽性のがんを効果的に治療する医薬組成物、キット及び技術を提供することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
2020189835.tif 000027
【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2020189835.tif 000033
【図６Ｄ】
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【配列表】
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