(57)【要約】【課題】合成済みの核酸又は天然から抽出される核酸を、当該核酸の機能を損なうことなく、断片化されても高感度で検出可能に標識できる核酸の標識方法を提供する。【解決手段】核酸の標識方法は、標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ標識対象の核酸における標識の標的となる標的塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、標識対象の核酸にハイブリダイズさせる反応ステップと、標識対象の核酸における標的塩基を含むヌクレオチド残基に、反応性塩基誘導体に含まれる転移基を転移させる転移ステップと、ヌクレオチド残基に転移した転移基を放射性物質で標識する標識ステップと、を含む。【選択図】図４
2020162476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ前記標識対象の核酸における標識の標的となる標的塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせる反応ステップと、
前記標識対象の核酸における前記標的塩基を含むヌクレオチド残基に、前記反応性塩基誘導体に含まれる転移基を転移させる転移ステップと、
前記ヌクレオチド残基に転移した前記転移基を放射性物質で標識する標識ステップと、
を含む、核酸の標識方法。
【請求項２】
前記転移基はピリジンケト転移基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのシトシン塩基又はアデニン塩基に前記ピリジンケト転移基を転移させる、
請求項１に記載の核酸の標識方法。
【請求項３】
前記転移基はジケト転移基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのグアニン塩基に前記ジケト転移基を転移させる、
請求項１又は２に記載の核酸の標識方法。
【請求項４】
前記転移基はアセチル基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのウラシル塩基を含むヌクレオチド残基のリボースの２’位にアセチル基を転移させる、
請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸の標識方法。
【請求項５】
前記標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ前記標的塩基とは前記標識対象の核酸における位置が異なる塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせる第１のステップと、
前記第１のステップで前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせた前記核酸プローブにおける前記反応性塩基誘導体に含まれる転移基を、前記標識対象の核酸における前記異なる塩基を含むヌクレオチド残基に転移させる第２のステップと、
前記異なる塩基を含むヌクレオチド残基に転移した前記転移基を、前記標識ステップにおける前記放射性物質とは異なる種類の放射性物質で標識する第３のステップと、
をさらに含む、
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸の標識方法。
【請求項６】
前記放射性物質は、
トリチウムである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス薬、アプタマー薬及びｓｉＲＮＡ薬等の核酸医薬は、ＤＮＡ又はＲＮＡの短い断片と疾患関連遺伝子のＲＮＡとの特異的な塩基対形成に基づいて作用を発揮する。核酸医薬は、タンパク質をコードするＲＮＡに限らず、ノンコーディング領域も標的にできる。低分子及び抗体医薬では治療できない疾患の治療薬として核酸医薬による創薬が展開され、遺伝性疾患及び癌等の難治性疾患に対して数多くの臨床研究が進められている。
【０００３】
実用化されたアンチセンス薬は、生体内での酵素加水分解を防ぐため、多くの化学修飾体から構成されている。当該化学修飾体に由来する副作用又は毒性が大きな課題になっている。アンチセンス薬が多くの化学修飾体を含むのに対して、ｓｉＲＮＡの成分には、作用機構の関係で天然型核酸が多い。そのため、ｓｉＲＮＡ薬は生体内分解を回避するため薬物送達システム（ＤＤＳ）に封入され使用される。しかし、ＤＤＳは毒性の原因になることがあり、ｓｉＲＮＡのみならず、ＤＤＳに由来する毒性の回避が課題になっている。
【０００４】
低分子医薬では、開発段階から薬物動態が検討され、薬効向上とともに毒性回避が検討される。低分子医薬の開発と比較すると、核酸医薬の動態解析は十分ではない。これは、核酸医薬の分子量が通常数千Ｄａ以上と大きいことに加え、代謝物の構造が多岐に渡るため、質量分析及びＨＰＬＣ分析等が適用できないことに起因する。特に、ｓｉＲＮＡ薬では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を取り込んだ活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＩＳＣ）が細胞内で極めて低濃度で作用を発揮する。動態解析の対象となる核酸は、検出限界以下の極めて低濃度になることが多い。
【０００５】
放射能は高感度で検出可能であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験にはもちろんのこと、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）及びＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）のようにヒトでも核酸の追跡に使用できる可能性がある。
【０００６】
放射能で標識した核酸、すなわち放射ラベル化核酸には、核酸の塩基配列の末端を標識した末端ラベル体と、末端ではない部位を標識した内部ラベル体とがある。非特許文献１〜６には末端ラベル体が開示されている。末端ラベル体の場合、生体内で核酸が断片に分解されると、放射能で標識された末端を含む断片しか検出できない。このため、末端ラベル体は、上述のように分解が抑制されたアンチセンス薬の動態研究に適している。
【０００７】
一方、成分として天然型核酸が多いｓｉＲＮＡの場合、酵素加水分解により断片化を受けやすいことに加えて、活性化ＲＩＳＣが生成する過程で、活性化ＲＩＳＣに取り込まれないセンス鎖は分解代謝される。したがって、ｓｉＲＮＡの活性化ＲＩＳＣへの取り込みとその動態を検出するためには、核酸の所望の位置を選択的に放射能で標識した内部ラベル体が求められる。
【０００８】
ソラーレン等の光反応剤又はポリメラーゼを用いることで、内部ラベル体が得られる。しかし、光反応剤又はポリメラーゼで標識できる核酸上の位置はランダムであり、核酸の所望の位置を選択的に放射能で標識できない。
【０００９】
非特許文献７〜１０では内部ラベル体が報告されている。これらの内部ラベル体は、いずれも核酸合成段階においてラベル化前駆体を組み込み、核酸合成後に放射性元素を導入する。非特許文献７では、核酸合成装置を用いた固相法での核酸の合成中にリボースの５位水酸基を酸化し、トリチウムを有する水素化ホウ素ナトリウムで還元する方法が開示されている。
【００１０】
非特許文献８では、ｓｉＲＮＡの合成段階において組み込んだウラシルが有するＢｒを、加圧下でトリチウムガスと反応させることでトリチウムに置換する方法が開示されている。放射性元素はトリチウムに限らない。例えば、非特許文献９では、ヨウ素の同位体が用いられている。また、非特許文献１０では、インジウムの同位体を含む金属錯体が核酸に導入されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｏｌｌｅ，Ｆ．、外４名、「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  １８Ｆ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｊ．Ｌａｂｅｌ．Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、１９９７年、３９、３１９−３３０
【非特許文献２】Ｈａｔａｎａｋａ，Ｋ．、外７名、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、２０１０年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０１０年、２１、７５６−７６３
【非特許文献３】Ｋｕｂｏｙａｍａ，Ｔ．、外１０名、「Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ−ｆｏｃｕｓｅｄ  １８Ｆ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｋｙｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｚｉｄｏ（［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｕ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｈｕｉｓｇｅｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、１９、２４９−２５５
【非特許文献４】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｄ．Ｗ．、外４名、「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００７年、１０４、１５５４９−１５５５４
【非特許文献５】Ｌｉｕ，Ｇ．、外５名、「Ｔｕｍｏｒ  ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ９９ｍＴｃ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ，  ａ  ＤＮＡ  ａｎａｌｏｇ」、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２００２年、４３、３８４−３９１
【非特許文献６】Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ，Ａ．、外１１名、「６８Ｇａ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＰＥＴ」、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２００４年、４５、３４７−３５５
【非特許文献７】Ｔａｎ，Ｗ．、外３名、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ［３Ｈ］ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｄｏｘ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６、２１、ｐ．３６３１−３６３４
【非特許文献８】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．、外５名、「Ｔｒｉｔｉｕｍ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」、Ｊ．Ｌａｂｅｌ．Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２０１２年、５５，１８９−１９６
【非特許文献９】Ｄｏｕｇａｎ，Ｈ．、外３名、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｎｎｙｌ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、２５、ｐ．２８９７−２９０１
【非特許文献１０】Ｆｕｊｉｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．、外７名、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  １１１Ｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  （ＭＣＳ−Ｐｒｏｂｅ）  ｓｈｏｗｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．、１９９９年、２６、ｐ．１７−２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
非特許文献７〜１０で報告された内部ラベル体は、核酸の合成段階においてラベル化前駆体を組み込む必要があるため、既に合成された、あるいは天然から抽出された核酸を標識することができない。また、非特許文献９に開示された方法では、加圧下でトリチウムガスと反応させる必要があるので実施できる施設が限定される。さらに、非特許文献１０に開示された金属錯体による内部ラベル化体は立体的に嵩高いため、核酸の機能を損なうおそれがある。
【００１３】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、合成済みの核酸又は天然から抽出される核酸を、当該核酸の機能を損なうことなく、断片化されても高感度で検出可能に標識できる核酸の標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の観点に係る核酸の標識方法は、
標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ前記標識対象の核酸における標識の標的となる標的塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせる反応ステップと、
前記標識対象の核酸における前記標的塩基を含むヌクレオチド残基に、前記反応性塩基誘導体に含まれる転移基を転移させる転移ステップと、
前記ヌクレオチド残基に転移した前記転移基を放射性物質で標識する標識ステップと、
を含む。
【００１５】
この場合、前記転移基はピリジンケト転移基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのシトシン塩基又はアデニン塩基に前記ピリジンケト転移基を転移させる、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記転移基はジケト転移基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのグアニン塩基に前記ジケト転移基を転移させる、
こととしてもよい。
【００１７】
また、前記転移基はアセチル基であって、
前記転移ステップでは、
前記標的塩基としてのウラシル塩基を含むヌクレオチド残基のリボースの２’位にアセチル基を転移させる、
こととしてもよい。
【００１８】
また、前記標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ前記標的塩基とは前記標識対象の核酸における位置が異なる塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせる第１のステップと、
前記第１のステップで前記標識対象の核酸にハイブリダイズさせた前記核酸プローブにおける前記反応性塩基誘導体に含まれる転移基を、前記標識対象の核酸における前記異なる塩基を含むヌクレオチド残基に転移させる第２のステップと、
前記異なる塩基を含むヌクレオチド残基に転移した前記転移基を、前記標識ステップにおける前記放射性物質とは異なる種類の放射性物質で標識する第３のステップと、
をさらに含む、
こととしてもよい。
【００１９】
また、前記放射性物質は、
トリチウムである、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、合成済みの核酸又は天然から抽出される核酸を、当該核酸の機能を損なうことなく、断片化されても高感度で検出可能に標識できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１に係る標識したｓｉＲＮＡのセンス鎖の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による精製の結果を示す図である。（Ａ）は反応粗生成物の紫外線（ＵＶ）ピークを示す図である。（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す図である。
【図２】実施例１に係る標識したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のＨＰＬＣによる精製の結果を示す図である。（Ａ）は反応粗生成物のＵＶピークを示す図である。（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す図である。
【図３】試験例１に係る眼球における放射線量の減衰率を示す図である。
【図４】試験例１に係るマウス眼球の組織ごとの放射活性の経時変化を示す図である。
【図５】実施例２に係る標識した合成ｍＲＮＡのＨＰＬＣによる精製の結果を示す図である。（Ａ）は反応粗生成物のＵＶピークを示す図である。（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す図である。
【図６】試験例２に係る質量分析法の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。
【００２３】
（実施の形態）
本実施の形態に係る核酸の標識方法は、反応ステップと、転移ステップと、標識ステップと、を含む。反応ステップでは、核酸プローブを標識対象の核酸にハイブリダイズさせる。標識対象の核酸は、２’−デオキシリボヌクレオチドが２本鎖を形成できる核酸であれば特に限定されず、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその修飾体である。好ましくは、標識対象の核酸はＲＮＡである。より具体的には、標識対象の核酸は、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等である。標識対象の核酸の塩基配列は、特に限定されず、任意の塩基配列からなる核酸を標識対象とすることができる。好ましくは、標識対象の核酸の塩基配列は、グアニン塩基、シトシン塩基又はアデニン塩基を少なくとも１つは含む。
【００２４】
標識対象の核酸の配列長は、特に限定されず、例えば、５〜１０００塩基、８〜５００塩基、１０〜３００塩基、１０〜２００塩基である。標識対象の核酸の配列長は、好ましくは、１０〜１５０塩基、１５〜１００塩基又は２０〜１００塩基である。
【００２５】
核酸プローブは、標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。核酸プローブには、標識対象の核酸における標識の標的となる標的塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入されている。
【００２６】
標的塩基がグアニンの場合、核酸プローブに導入される反応性塩基誘導体は、例えば構造式（１）に示すＳ−（２−（メチリデン）−１−フェニルブタン−１，３−ジオン）−６−チオグアニン（誘導体１）である。
【００２７】
【化１】
2020162476.tif 000003
【００２８】
標識対象の核酸のシトシンを選択的に標識する場合、核酸プローブに導入される反応性塩基誘導体は、例えば構造式（２）に示す（Ｅ）−３−（１−（ピリジン−２−イル）プロプ−２−エン−１−オン）−６−チオグアニン（誘導体２）である。
【００２９】
【化２】
2020162476.tif 000004
【００３０】
標識対象の核酸のアデニンを選択的に標識する場合、核酸プローブに導入される反応性塩基誘導体は、例えば構造式（３）に示す（Ｅ）−３−（１−（ピリジン−２−イル）プロプ−２−エン−１−オン）−４−チオチミン（誘導体３）である。
【００３１】
【化３】
2020162476.tif 000005
【００３２】
標識対象の核酸と核酸プローブとをハイブリダイズさせるには、例えば中性又はアルカリ性条件下の緩衝液内で標識対象の核酸と核酸プローブとを混合すればよい。核酸プローブが標識対象の核酸にハイブリダイズすると、近接効果によって、標識対象の核酸における標的塩基を含むヌクレオチド残基に、反応性塩基誘導体に含まれる転移基が転移する（転移ステップ）。
【００３３】
転移ステップは、３５〜４０℃、好ましくは３７℃で行えばよい。反応ステップ及び転移ステップにおける標識対象の核酸と核酸プローブとの反応時間は、合わせて５分〜６時間、１０分〜４時間又は１〜３時間、好ましくは２時間である。
【００３４】
転移基は反応性であれば特に限定されないが、好ましくは、α，β−不飽和カルボニル基を有する。標的塩基がグアニン塩基の場合、好ましくは、転移基はジケト転移基である。誘導体１を用いた場合、アルカリ性条件下では、ジケト転移基がグアニン−２−アミノ基に転移する。
【００３５】
【化４】
2020162476.tif 000006
【００３６】
なお、転移ステップにおける反応条件に応じて転移基を転移させる塩基の選択性を変えることができる。中性条件下では、誘導体１によって次のように転移基がシトシン−４−アミノ基に転移する。
【００３７】
【化５】
2020162476.tif 000007
【００３８】
標的塩基がシトシン塩基又はアデニン塩基の場合、好ましくは、転移基はピリジンケト転移基である。誘導体２の場合、次のように、転移基がシトシン−４−アミノ基に転移する。
【００３９】
【化６】
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【００４０】
また、誘導体３の場合、次のように、転移基がアデニン−６−アミノ基に転移する。
【００４１】
【化７】
2020162476.tif 000009
【００４２】
上記の誘導体１〜３は標識対象である核酸の塩基に転移基を転移させるが、標識対象の核酸の糖に転移基を移転させることもできる。この場合、核酸プローブに導入される反応性塩基誘導体として、例えば構造式（４）に示すＮ−（１−アセチル−４−ピリジル）−２−カルボキサミド−６−アミノプリン（誘導体４）を用いればよい。
【００４３】
【化８】
2020162476.tif 000010
【００４４】
誘導体４は、転移ステップを経て、標的塩基としてのウラシル塩基を含むヌクレオチド残基のリボースの２’位にアセチル基を転移させる。この結果、ウリジンのリボースの２’位のＯＨ基がアセチル化される。
【００４５】
【化９】
2020162476.tif 000011
【００４６】
上記の核酸プローブは、ＤＮＡ自動合成装置等を用いて公知の方法で合成できる。誘導体１を有する核酸プローブを合成する場合、例えば、６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む２’−デオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに、２−クロロメチレン−１−（ピリジン−２−イル）ブタン−１，３−ジオン（２−（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）−１−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔａｎｅ−１，３−ｄｉｏｎｅ）を緩衝液中で反応させればよい。
【００４７】
誘導体２を有する核酸プローブを合成する場合、例えば、６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む２’−デオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに、（Ｅ）−３−イオド−１−（ピリジン−２−イル）プロプ−２−エン−１−オン（（Ｅ）−３−ｉｏｄｏ−１−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐ−２−ｅｎ−１−ｏｎｅ）を緩衝液中で反応させればよい。
【００４８】
誘導体３を有する核酸プローブを合成する場合、例えば、４−チオチミジンを含む２’−デオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに、（Ｅ）−３−イオド−１−（ピリジン−２−イル）プロプ−２−エン−１−オンを緩衝液中で反応させればよい。
【００４９】
誘導体４を有する核酸プローブを合成する場合、例えば、Ｎ−（１−アセチル−４−ピリジル）−２−カルボキサミド−６−アミノプリンを含む２’−デオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに、無水酢酸を緩衝液中で反応させればよい。なお、誘導体４の合成方法を下記実施例３に例示する。
【００５０】
核酸プローブの長さは、ＲＮＡとの間で形成される２本鎖が安定であれば、特に限定されない。核酸プローブの長さは、標識対象の核酸の長さよりも短くてもよい。核酸プローブの長さは、例えば、１０〜２０塩基、１２〜１８塩基又は１３〜１７塩基である。核酸プローブにおける反応性塩基誘導体が導入される位置は、例えば、１０〜２０塩基長のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端又は５’末端は好ましくなく、３’末端又は５’末端から５〜１０塩基又は６〜８塩基内側が好ましい。
【００５１】
標識ステップでは、ヌクレオチド残基に転移した転移基を放射性物質で標識する。放射性物質は、公知の任意のものが使用できる。放射性物質は、例えばトリチウムである。水中において標識対象の核酸をトリチウムホウ素化ナトリウムと反応させることで、上記転移基をトリチウムで標識できる。
【００５２】
例えば、標識対象の核酸に転移した、誘導体１に含まれる転移基は、次のようにトリチウムで標識できる。
【００５３】
【化１０】
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【００５４】
標識対象の核酸に転移した、誘導体２及び誘導体３に含まれる転移基は、次のようにトリチウムで標識できる。
【００５５】
【化１１】
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【００５６】
標識対象の核酸に転移した、誘導体４に含まれる転移基は、次のようにトリチウムで標識できる。
【００５７】
【化１２】
2020162476.tif 000014
【００５８】
トリチウムの他、放射性物質としては、１８Ｆ、１３１Ｉ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、８９Ｓｒ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ及び１１７ｍＳｎ等の放射性同位体が挙げられる。放射性同位体で標識するには、例えば、次に示すように、アルキンを有する転移基をヌクレオチド残基に転移させ、放射性同位体を有するアジド化合物（放射標識ユニット）を、クリック反応を介してアルキンと反応させればよい。アルキンとアジド化合物とのクリック反応は、アルキンとアジド化合物との［３＋２］型の付加環化反応（ヒュスゲン環化反応）である。ヒュスゲン環化反応によって、１，２，３−トリアゾール誘導体が得られる。Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応の条件は、適宜決定することができる。
【００５９】
【化１３】
2020162476.tif 000015
【００６０】
また、上記のクリック反応の他に、次に示すように、還元した転移基に、放射標識ユニットとしてのハロアセチルエステルによるエステル化−アミド化により１８Ｆ、１３１Ｉ及び７６Ｂｒ等の放射性同位体を導入することができる。エステル化の条件は適宜決定することができる。
【００６１】
【化１４】
2020162476.tif 000016
【００６２】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る核酸の標識方法によれば、標識対象の核酸における標識の標的となる標的塩基に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを標識対象の核酸にハイブリダイズさせ、転移基を標識対象の核酸に転移させる。このため、核酸プローブの塩基配列に応じて、合成済みの核酸又は天然から抽出される核酸の所望の位置を選択的に転移基で化学修飾できる。これにより、標識対象の核酸の末端以外の位置を標識できるため、例えば、ｓｉＲＮＡのように生体内で断片化されやすい核酸の動態を追跡するのに好適である。
【００６３】
さらに、本実施の形態に係る核酸の標識方法によれば、転移基を放射性物質で標識するため、高感度で検出可能に標識対象の核酸を標識できる。本実施の形態に係る転移基は、上述の金属錯体のような立体的に嵩高くないため、下記試験例２に示すように、核酸の機能を損なうことがない。
【００６４】
なお、標識対象の核酸として２本鎖の核酸を用いる場合、本実施の形態に係る核酸の標識方法は、上記反応ステップの前に、２本鎖の核酸を解離させるステップを含んでもよい。
【００６５】
また、本実施の形態に係る核酸の標識方法によって核酸の所望の位置を選択的に転移基で化学修飾できるため、当該標識方法によれば、同一の標識対象の核酸について異なる位置が標識された核酸を得ることができる。この場合、核酸の標識方法は、上記反応ステップ、転移ステップ及び標識ステップに加え、次の第１〜３のステップをさらに含む。
【００６６】
第１のステップでは、標識対象の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ標的塩基（塩基Ｘとする）とは標識対象の核酸における位置が異なる塩基（塩基Ｙとする）に相補的な位置に反応性塩基誘導体が導入された核酸プローブを、標識対象の核酸にハイブリダイズさせる。第２のステップでは、第１のステップで標識対象の核酸にハイブリダイズさせた核酸プローブにおける反応性塩基誘導体に含まれる転移基を、標識対象の核酸における塩基Ｙを含むヌクレオチド残基に転移させる。第３のステップでは、塩基Ｙを含むヌクレオチド残基に転移した転移基を、標識ステップにおける放射性物質とは異なる種類の放射性物質で標識する。
【００６７】
これにより、標識対象の核酸が生体内で分解されても、例えば、塩基Ｘを含む断片と塩基Ｙを含む断片とを識別可能に検出できる。こうすることで、標識対象の核酸から生じた複数の断片の動態を追跡することが可能になり、得られた情報を総合し標識対象の核酸の動態を解明することができる。
【００６８】
別の実施の形態では、核酸の調製方法が提供される。当該核酸の調製方法は、上記標識ステップで得られた、塩基Ｘを含むヌクレオチド残基が標識された第１の標的対象の核酸と、上記第３のステップで得られた、塩基Ｙを含むヌクレオチド残基が標識された第２の標的対象の核酸とを混合するステップを含む。当該核酸の調製方法で得られる、第１の標的対象の核酸と第２の標的対象の核酸とを含む核酸試料を生体に投与することで、標識対象の核酸の動態を詳細に解明することができる。なお、標的対象の核酸において標識される位置は、２箇所に限らず、３箇所以上であってもよい。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００７０】
（実施例１：１本鎖ＲＮＡ中のシトシンのトリチウム標識）
標識対象とする核酸としてのＲＮＡ０１は（Ｐ）ＲＲ／ＡＴＰ６ＡＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖である。ＲＮＡ０１の塩基配列を配列番号１に示す。ＲＮＡ０１の５’末端から４番目のＡから２０番目のＧまでに相補的な合成ＤＮＡを核酸プローブ０１とした。核酸プローブ０１の塩基配列を配列番号２に示す。核酸プローブ０１は、ＲＮＡ０１の５’末端から１３番目のＣに相補的な位置である５’末端から８番目に６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む。
【００７１】
核酸プローブ０１（５０μＭ）とピリジンケト転移基（（Ｅ）−３−ｉｏｄｏ−１−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐ−２−ｅｎ−１−ｏｎｅ、７５０μＭ）の炭酸緩衝溶液（２５ｍＭ、ｐＨ１０．０）を０℃にて調製し、同温度で３０分間反応させ反応性塩基誘導体を有する人工核酸０１を得た。
【００７２】
上記の反応液に１Ｍ  ＮａＣｌのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）を加え、超純水を加え全量を３倍に希釈した。この溶液を６５℃にて３分加熱した後、０℃で急冷した。この溶液に０℃にてＲＮＡ０１、ＮｉＣｌ２を加え、超純水を加えて次の最終濃度とした。当該溶液を３７℃で２時間インキュベーションした。これにより、転移基がＲＮＡ０１に転移した修飾ＲＮＡ０１を得た。
ＲＮＡ０１  ５μＭ
ＮｉＣｌ２  ７５μＭ
人工核酸０１  ７．５μＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝溶液  ５０ｍＭ（ｐＨ７．０）
ＮａＣｌ  １００ｍＭ
【００７３】
得られた反応液を濃縮し、炭酸緩衝溶液、ＮａＢＴ４及び超純水を加えて下記の最終濃度とした。
ＮａＢＴ４（３．８ｍＭ、３．７ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）
修飾ＲＮＡ０１（２５μＭ）
炭酸緩衝溶液（２５ｍＭ、ｐＨ１０．０）
【００７４】
この溶液を室温で３０分反応させ、１０％酢酸水溶液を加え反応液を中和した。反応粗生成物をＨＰＬＣ（Ｏｓａｋａ  ｓｏｄａ社製、４．６×２５０ｍｍ、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １．０ｍｌ／分、Ａ：ＴＥＡＡ、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、Ｂ−ｃｏｎｃ．１０−１５％／２０分、ｌｉｎｅａｒ−ｇｒａｄｉｅｎｔ、ＵＶ−ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２５４ｎｍ）で精製し、ＵＶピークを分取した。各ＵＶピークの１０μｌをシンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  ＭＶ）で１００倍希釈後、液体シンチレーションカウンタで放射能を測定した。分取したＨＰＬＣ溶液を凍結乾燥後、ＰＢＳ溶液とし冷凍保存した。
【００７５】
一方、（Ｐ）ＲＲ／ＡＴＰ６ＡＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であるＲＮＡ０２を標識対象とする核酸として、ＲＮＡ０１と同様にトリチウムで標識した。ＲＮＡ０２の塩基配列を配列番号３に示す。ＲＮＡ０２の５’末端から７番目のＡから２１番目のＡまでに相補的な合成ＤＮＡを核酸プローブ０２とした。核酸プローブ０２の塩基配列を配列番号４に示す。核酸プローブ０２は、ＲＮＡ０２の５’末端から１２番目のＣに相補的な位置である５’末端から１１番目に６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む。核酸プローブ０１と同様に、核酸プローブ０２とピリジンケト転移基（（Ｅ）−３−ｉｏｄｏ−１−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐ−２−ｅｎ−１−ｏｎｅ）とを反応させ、反応性塩基誘導体を有する人工核酸０２を得た。
【００７６】
ＲＮＡ０１と同様に、ＲＮＡ０２と人工核酸０２とから得られた、転移基がＲＮＡ０２に転移した修飾ＲＮＡ０２についてもＮａＢＴ４と反応させ、反応粗生成物をＨＰＬＣで精製し、分取した各ＵＶピークについて放射能を測定した。分取したＨＰＬＣ溶液を凍結乾燥後、ＰＢＳ溶液とし冷凍保存した。
【００７７】
（結果）
修飾ＲＮＡ０１の反応粗生成物に関するＵＶピークを図１（Ａ）に示す。図１（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す。ピーク４を単離精製したトリチウムラベル化ＲＮＡ０１（３Ｈ−ＲＮＡ０１）として得ることができた。
【００７８】
修飾ＲＮＡ０２の反応粗生成物に関するＵＶピークを図２（Ａ）に示す。図２（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す。ピーク２を単離精製したトリチウムラベル化ＲＮＡ０２（３Ｈ−ＲＮＡ０２）として得ることができた。
【００７９】
（試験例１：トリチウムラベル化ＲＮＡのマウス眼球内における動態測定）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）を１週間予備飼育後、セボフルランによる吸入麻酔下にて媒体（ＰＢＳ）のみ、３Ｈ−ＲＮＡ０１、３Ｈ−ＲＮＡ０２又は３Ｈ−ＲＮＡ０２と標識していないＲＮＡ０１とで調製したｓｉＲＮＡをマイクロシリンジ、３３Ｇ針を用いて硝子体内にある角膜輪部の強膜より投与した。投与した３Ｈ−ＲＮＡ０１、３Ｈ−ＲＮＡ０２及びｓｉＲＮＡの濃度はそれぞれ１００ｐｍｏｌ／ｅｙｅとした。投与後５分、１０分、３０分、１時間及び３時間で、頚椎脱臼により安楽死させたマウスの片眼球、又はレンズと硝子体とを含む部分及び網膜部分に分けて組織別に摘出した。各処理時間につきマウスを４匹使用した。片眼球及び組織別それぞれに０．５ｍｌのＳｏｌｖａｂｌｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を加えた後、５０℃にて終夜処理し、溶解させた。完全に溶解後、常温に戻し、１０ｍｌのＵｌｔｉｍａＧｏｌｄ  ＭＶを添加し、液体シンチレーションカウンタにより放射能を計測した。放射活性は臓器重量あたりのベクレルで算出した。
【００８０】
（結果）
図３は、３Ｈ−ＲＮＡ０１、３Ｈ−ＲＮＡ０２及びｓｉＲＮＡの、それぞれ５分後の放射線量を基準とする眼球における放射線量の減衰率を示す。１本鎖の３Ｈ−ＲＮＡ０１及び３Ｈ−ＲＮＡ０２よりも二本鎖であるｓｉＲＮＡのほうが眼球での滞留時間が長いことが示された。
【００８１】
図４は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスから摘出した組織別の放射活性の経時変化を示す。網膜部分及びレンズと硝子体とを含む部分それぞれの放射活性の経時変化を追跡することができた。網膜部分におけるｓｉＲＮＡの動態が、レンズと硝子体とを含む部分におけるｓｉＲＮＡの動態と異なることが示された。
【００８２】
（実施例２：合成ｍＲＮＡのシトシンのトリチウム標識）
アミノ酸配列が配列番号５に示されるペプチド（分子量：２８９７．４８７２、プロトン付加体：２８９８．２２３１）を非細胞翻訳系でコードする合成ｍＲＮＡを、標識対象とする核酸として、ＲＮＡ０１と同様にトリチウムで標識した。合成ｍＲＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。合成ｍＲＮＡの５’末端から８２番目のＡから９２番目のＡまでに相補的な合成ＤＮＡを核酸プローブ０３とした。核酸プローブ０３は、３’−ＯＭｅ化されたリボヌクレオチドからなる合成核酸である。核酸プローブ０３の塩基配列を配列番号７に示す。核酸プローブ０３のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳにおける理論値が３５９６．５９であって、観測値が３５９６．５３であった。核酸プローブ０３は、合成ｍＲＮＡの５’末端から８８番目のＣに相補的な位置である５’末端から７番目に６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む。核酸プローブ０１と同様に、核酸プローブ０３とピリジンケト転移基（（Ｅ）−３−ｉｏｄｏ−１−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐ−２−ｅｎ−１−ｏｎｅ）とを反応させ、反応性塩基誘導体を有する人工核酸０３を得た。人工核酸０３のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳにおける理論値が３７２７．６３であって、観測値が３７２７．７３であった。
【００８３】
合成ｍＲＮＡヘの転移基の転移反応は、合成ｍＲＮＡと人工核酸０３とをｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液中、３７℃、７５μＭ  ＮｉＣｌ２共存下で１時間インキュベーションすることで行った。次に、ＮａＢＴ４存在下で還元した後、遠心濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ社製）により低分子の夾雑物を除去し、反応粗生成物をＨＰＬＣで精製した。ここで、ＨＰＬＣの溶出条件を、Ａ：ＴＥＡＡ、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、Ｂ−ｃｏｎｃ．１０−２０％／２０分、ｌｉｎｅａｒ−ｇｒａｄｉｅｎｔに変更した。分取した各ＵＶピークについて放射能を測定した。分取したＨＰＬＣ溶液を凍結乾燥後、ＰＢＳ溶液とし冷凍保存した。
【００８４】
（結果）
反応粗生成物に関するＵＶピークを図５（Ａ）に示す。図５（Ｂ）は各ＵＶピークの放射能の大きさを示す。ピーク２を単離精製したトリチウムラベル化ＲＮＡ０３（３Ｈ−ＲＮＡ０３）として得ることができた。
【００８５】
（試験例２：非放射性ラベル化ＲＮＡの翻訳に対する影響の検討）
ＮａＢＴ４の代わりにＮａＢＨ４を用いる点を除いて上記トリチウムラベル化ＲＮＡ０３と同様に調製した非放射性ラベル化ＲＮＡ０３について、Ｐｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｕｒｅ  Ｆｌｅｘ  ２．０、ジーンフロンティア社製）を用いて翻訳反応を３７℃で１時間行った。反応液について、Ａｎｔｉ−Ｔ７−ｔａｇ  ａｇａｒｏｓｅビーズを用いたアフィニティクロマトグラフィを行い、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ）で分子量を測定した。
【００８６】
（結果）
図６は質量分析法で得られたスペクトルを示す。合成されるペプチドの精密分子量は２８９８．２２であるところ、非放射性ラベル化ＲＮＡ０３は、未修飾のｍＲＮＡと同じペプチドを産生したことが示された。なお、合成ｍＲＮＡの５’末端から８６番目のＡから９２番目のＡに相補的であって、合成ｍＲＮＡの５’末端から８６番目のＣに相補的な位置である５’末端から５番目に６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む人工核酸を用いた非放射性ラベル化ｍＲＮＡでも未修飾のｍＲＮＡと同じペプチドを産生したことを確認した。同様に、合成ｍＲＮＡの５’末端から７０番目のＡから８３番目のＣに相補的であって、合成ｍＲＮＡの５’末端から８２番目のＣに相補的な位置である５’末端から１２番目に６−チオ−２’−デオキシグアノシンを含む人工核酸を用いた非放射性ラベル化ｍＲＮＡでも未修飾のｍＲＮＡと同じペプチドを産生したことを確認した。本試験例により、ピリジン誘導体によるシトシン４位アミノ基の修飾は翻訳に影響を与えないことが示された。
【００８７】
（実施例３：誘導体４の合成）
２’−デオキシグアノシンから誘導体４の前駆体を次に示すステップａ〜Ｊで合成した。
【００８８】
【化１５】
2020162476.tif 000017
【００８９】
以下、各ステップについて説明する。
（ステップａ）３’，５’−Ｄｉ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｉｓｏｎｅ（２−１）の合成
アルゴン気流下、室温にて、２’−デオキシグアノシン（２０ｇ，７０．１ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（４００ｍｌ）懸濁液に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（４２．２ｇ，２８０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（３０ｇ，４４１ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。２０時間後、２００ｍｌの氷水を加えて撹拌を続け、１時間後、析出物を濾取し減圧下乾燥した。これを再結晶（メタノール）にて精製し、２−１（２８ｇ，８０％）を白色結晶として得た。
【００９０】
２−１：Ｃ２２Ｈ４１Ｎ５Ｏ４Ｓｉ２（ＭＷ＝４９５．７７）
ｗｈｉｔｅ  ｓｏｌｉｄ，ｍｐ＞３００℃
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ４９６．２７７０［Ｍ＋Ｈ］＋
ｆｏｕｎｄ  ４９６．２７９４
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９２８，１６６９，１５５５
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）
δ（ｐｐｍ）：
１０．５７（１Ｈ，ｓ）
７．８６（１Ｈ，ｓ）
６．４４（２Ｈ，ｓ）
６．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
４．４８（１Ｈ，ｍ）
３．８０（１Ｈ，ｍ）
３．６６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２２．７，１１．０，５．１Ｈｚ）
２．６３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．３，６．６，６．６Ｈｚ）
２．２３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．２，５．９，３．３Ｈｚ）
０．８８（９Ｈ，ｓ）
０．８６（９Ｈ，ｓ）
０．０９（６Ｈ，ｓ）
０．０３３（３Ｈ，ｓ）
０．０２８（３Ｈ，ｓ）
【００９１】
（ステップｂ）２−ａｍｉｎｏ−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−６−ｙｌ−２，４，６−ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（２−２）の合成
無水アセトニトリルで共沸した２−１（１．０ｇ，２．０２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）懸濁液に、アルゴン気流下、０℃にてトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（１．２ｇ，３．９６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（２５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５６０μｌ，４．０２ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。２７時間後、反応液を水、飽和食塩水にて洗浄、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→５：１）にて精製し、２−２（１．３６ｇ，８９％）を白色泡状物質として得た。
【００９２】
２−２：Ｃ３７Ｈ６３Ｎ５Ｏ６ＳＳｉ２（ＭＷ＝７６２．１７）
ｗｈｉｔｅ  ｐｏｗｄｅｒ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ７６２．４１１０［Ｍ＋Ｈ］＋
ｆｏｕｎｄ  ７６２．４１４７
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９５５，１６３４，１５７４
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１５８．６，１５５．７，１５５．３，１５４．３，１５１．０，１４０．１，１３１．６，１２３．９，１１６．９，８８．０，８４．０，７２．２，６３．０，４１．１，３４．５，２９．９，２６．１，２５．９，２４．８０，２４．７６，２３．７，１８．６，１８．２，−４．５
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
７．９７（１Ｈ，ｓ）
７．２０（２Ｈ，ｓ）
６．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，６．６Ｈｚ）
４．８６（２Ｈ，ｓ）
４．５７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．１，３．１，５．９Ｈｚ）
４．３１（２Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）
３．９７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．４，３．６，３．６Ｈｚ）
３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１１．２Ｈｚ）
３．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，１１．２Ｈｚ）
２．９１（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
２．５６（１Ｈ，ｍ）
２．３４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６，６．１，１３．１Ｈｚ）
１．２８−１．２５（１８Ｈ，ｍ）
０．９１（９Ｈ，ｓ）
０．８９（９Ｈ，ｓ）
０．１０（６Ｈ，ｓ）
０．０７（３Ｈ，ｓ）
０．０６（３Ｈ，ｓ）
【００９３】
（ステップｃ）９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−２−ｉｏｄｏ−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−６−ｙｌ−２，４，６−ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（２−３）の合成
２−２（１．１ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（８５ｍｌ）懸濁液に、アルゴン気流下、室温にてヨウ化銅（３２２ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）、ヨウ素（７３２ｍｇ，５．７７ｍｍｏｌ）、ジヨードメタン（７００μｌ，７．２２ｍｍｏｌ）、亜硝酸イソアミル（９７０μｌ，７．２２ｍｍｏｌ）を加え、７５℃にて攪拌した。４５分後、反応液を室温に戻したのち減圧下溶媒留去した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（関東化学６０Ｎ，ヘキサン＝酢酸エチル＝１０：１）にて精製し、２−３（０．８７４ｍｇ，６９％）を白色泡状物質として得た。
【００９４】
２−３：Ｃ３７Ｈ６１ＩＮ４Ｏ６ＳＳｉ２（ＭＷ＝８７３．０５）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ８９５．２７８７［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ８９５．２７９２
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９２６
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１５４．６，１５４．３，１５３．４，１５１．０，１４３．５，１３１．４，１２４．０，１２３．３，１１５．７，８８．４，８５．１，７２．０，６２．８，４１．５，３４．５，３０．０，２６．１，２５．９，２５．０，２４．９，２３．７１，２３．７０，１８．６，１８．２，−４．５，−４．６，−５．２，−５．３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
８．２５（１Ｈ，ｓ）
７．２０（２Ｈ，ｓ）
６．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ）
４．５９（１Ｈ，ｍ）
４．２４（２Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）
３．９８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．４，３．４，３．４Ｈｚ）
３．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，１１．０Ｈｚ）
３．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，１１．３Ｈｚ）
２．９１（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
２．５８（１Ｈ，ｍ）
２．４１（１Ｈ，ｍ）
１．１９−１．２７（１８Ｈ，ｍ）
０．８９（９Ｈ，ｓ）
０．８８（９Ｈ，ｓ）
０．０９（６Ｈ，ｓ）
０．０６（３Ｈ，ｓ）
０．０６（３Ｈ，ｓ）
【００９５】
（ステップｄ）６−ａｍｉｎｏ−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−２−ｉｏｄｏ−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ（２−４）の合成
２−３（１．０ｇ，１．１４５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１３ｍｌ）溶液に、アンモニア２８％水溶液（７．０ｍｌ，８６７３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて撹拌した。６９時間後、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、酢酸エチルにより抽出した。これを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→５：２）にて精製し、２−４（６１９ｍｇ，８９％）を白色泡状物質として得た。
【００９６】
２−４：Ｃ２２Ｈ４０ＩＮ５Ｏ３Ｓｉ２（ＭＷ＝６０５．６７）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ６２８．１６０７［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ６２８．１６１４
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９５６，１６４９，１５８９
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１５５．２，１５０．０，１３９．５，１２０．１，１１９．８，８８．１，８４．７，７２．０，６２．９，４１．３，２６．１，２５．９，１８．６，１８．２，−４．５，−４．６，−５．２，−５．３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
７．９９（１Ｈ，ｓ）
６．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ）
５．６１（２Ｈ，ｓ）
４．６１（１Ｈ，ｍ）
３．９６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．８，３．８，３．８Ｈｚ）
３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５，１１．１Ｈｚ）
３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，１１．３Ｈｚ）
２．６３（１Ｈ，ｍ）
２．３８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．１，６．３，１３．３Ｈｚ）
０．９０（９Ｈ，ｓ）
０．９０（９Ｈ，ｓ）
０．０９（６Ｈ，ｓ）
０．０８（６Ｈ，ｓ）
【００９７】
（ステップｅ）６−ａｍｉｎｏ−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ（２−５）の合成
２−４（７００ｍｇ，１．１５６ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）溶液に、アルゴン気流下、室温にてトリブチルチンシアニド（５４８ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）を加え、２０分間脱気した。その後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１６０ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃にて加熱撹拌した。１時間後、反応液を室温に戻したのち、酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム水で洗浄、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン→ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）にて精製し、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：２）にて精製し、２−５（５７２ｍｇ，９８％）を白色泡状物質として得た。
【００９８】
２−５：Ｃ２３Ｈ４０Ｎ６Ｏ３Ｓｉ２（ＭＷ＝５０４．７８）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ５２７．２５９３［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ５２７．２５９６
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９２９，２８５６，１６５６，１５９４
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
８．２６（１Ｈ，ｓ）
６．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，６．３Ｈｚ）
５．６９（２Ｈ，ｓ）
４．６２（１Ｈ，ｍ）
４．００（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，３．７，３．７Ｈｚ）
３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１１．３Ｈｚ）
３．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１１．３Ｈｚ）
２．６５（１Ｈ，ｍ）
２．４４（１Ｈ，ｍ）
０．９１（９Ｈ，ｓ）
０．８９（９Ｈ，ｓ）
０．１０（３Ｈ，ｓ）
０．１０（３Ｈ，ｓ）
０．０７（３Ｈ，ｓ）
０．０７（３Ｈ，ｓ）
【００９９】
（ステップｆ）６−ａｍｉｎｏ−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２−６）の合成
２−５（５４０ｍｇ，１．０７ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２６ｍｌ）溶液に、アルゴン気流下、室温にて、０．５Ｎナトリウムメトキシド−メタノール溶液（１．０ｍｌ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌した。２８時間後、反応液をダウエックス５０（Ｈ＋）で中和し、セライト濾過したのち、濾液を減圧下溶媒留去した。残渣をメタノールに溶解させ、室温にて撹拌しながら水（６．５ｍｌ）をゆっくり加えたのち１０％塩酸水（５９０μｌ）を加えた。２０分後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、減圧下溶媒留去した。残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルにより抽出し、これを減圧下溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：２）にて精製し、２−６（４２０ｍｇ，７３％，ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ）を白色泡状物質として得た。
【０１００】
２−６：Ｃ２４Ｈ４３Ｎ５Ｏ５Ｓｉ２（ＭＷ＝５３７．８１）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ５６０．２６９５［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ５６０．２７２４
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９５３，２９２８，２８５６，１７３９，１６４６，１５９１
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１６４．７，１５５．６，１５０．６，１４９．７，１４１．５，
１２１．１，８８．２，８４．４，７１．９，６２．９，５３．５，４２．０，２６．１，２５．９，１８．６，１８．２，−４．５，−４．７，−５．２，−５．４
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
８．２８（１Ｈ，ｓ）
６．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ）
５．７３（２Ｈ，ｓ）
４．６２（１Ｈ，ｍ）
４．００（３Ｈ，ｓ）
３．９８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．４，３．４，３．４Ｈｚ）
３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７，１１．３Ｈｚ）
３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１１．３Ｈｚ）
２．５８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．５，６．５，６．５Ｈｚ）
２．４８（１Ｈ，ｍ）
０．９０（９Ｈ，ｓ）
０．９０（９Ｈ，ｓ）
０．０９（６Ｈ，ｓ）
０．０８（６Ｈ，ｓ）
【０１０１】
（ステップｇ）６−（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）−５−［（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２−７）の合成
アルゴン気流下、２−６（５０ｍｇ，０．０９３０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（４７０μｌ）溶液に無水安息香酸（１０５ｍｇ，０．４６４１ｍｍｏｌ）を加え５０℃で撹拌した。８６時間後反応液をクロロホルムで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）にて精製し、２−７（２６．７ｍｇ，４５％）を白色泡状物質として得た。
【０１０２】
２−７：Ｃ３１Ｈ４７Ｎ５Ｏ６Ｓｉ２（ＭＷ＝６４１．９２）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ６６４．２９５７［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ６６４．２９３９
ＩＲ（ｃｍ−１）：２９２８，２８５７，１７４０，１６９７，１６０５，１５７５，１２５２
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１６４．９，１６４．１，１５２．５，１４９．８，１４９．６，１４４．１，１３３．３，１３３．１，１２９．０，１２８．８，１２８．２，１２７．５，１２５．３，８８．４，８４．７，７２．１，６３．０，５３．７，４２．０，２６．１，２５．９，１８．６，１８．２，−４．５，−４．７，−５．２，−５．３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
９．０１（１Ｈ，ｓ）
８．５１（１Ｈ，ｓ）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）
７．５９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
７．５０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）
６．６４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）
４．６３（１Ｈ，ｍ）
４．１０（１Ｈ，ｍ）
４．０４（３Ｈ，ｓ）
３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８，１１．１Ｈｚ）
３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１１．３Ｈｚ）
２．６２（１Ｈ，ｍ）
２．５１（１Ｈ，ｍ）
０．９１（９Ｈ，ｓ）
０．８９（９Ｈ，ｓ）
０．１０（６Ｈ，ｓ）
０．０７（６Ｈ，ｓ）
【０１０３】
（ステップｈ）６−（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２−８）の合成
アルゴン気流下、０℃にて、２−７（１７９ｍｇ，０．２７８９ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１ｍｌ）溶液にトリエチルアミン（１７０μｌ，１．２２０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（２００μｌ，１．２２７ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。９時間後、反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１→４５：１）で精製し、２−８（１０８．４ｍｇ，９４％）を白色粉末として得た。
【０１０４】
２−８：Ｃ１９Ｈ１９Ｎ５Ｏ６（ＭＷ＝４１３．３９）
ｗｈｉｔｅ  ｐｏｗｄｅｒ
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ４３６．１２２８［Ｍ＋Ｎａ］＋
ｆｏｕｎｄ  ４３６．１２４８
ＩＲ（ｃｍ−１）：３３５０，２９３２，１７３０，１６０８，１５２１，１２６１
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）
δ（ｐｐｍ）：１６５．７，１６３．５，１５２．２，１５０．６，１４９．１，１４５．１，１３３．０，１３２．６，１２８．６，１２８．５，１２７．１，８８．２，８３．７，７０．７，６１．５，５２．８
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
δ（ｐｐｍ）：
８．７９（１Ｈ，ｓ）
８．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）
７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
７．５５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，７．５Ｈｚ）
６．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）
４．６４（１Ｈ，ｍ）
４．０７（１Ｈ，ｍ）
４．０１（３Ｈ，ｓ）
３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，１２．２Ｈｚ）
３．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１２．２Ｈｚ）
２．８６（１Ｈ，ｍ）
２．５３（１Ｈ，ｍ）
【０１０５】
（ステップｉ）６−（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２−９）の合成
無水ピリジンで共沸した２−８（３０ｍｇ，０．０７２５７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（６００μｌ）溶液に、アルゴン気流下、ジメトキシトリチルクロリド（４９ｍｇ，０．１４４６ｍｍｏｌ）を加え室温で撹拌した。７５分後メタノール（１ｍｌ）を加えてさらに１０分間撹拌し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：１）で精製し、２−９（４９．５ｍｇ，９５％）を白色粉末として得た。
【０１０６】
２−９：Ｃ４０Ｈ３７Ｎ５Ｏ８（ＭＷ＝７１５．７６）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ７１６．２７［Ｍ＋Ｈ］＋
ｆｏｕｎｄ  ７１６．９８５９
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
８．９６（１Ｈ，ｓ）
８．３７（１Ｈ，ｓ）
８．０４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，８．６Ｈｚ）
７．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
７．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１６．３Ｈｚ）
７．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
７．３−７．２（３Ｈ，ｍ）
６．８１（４Ｈ，ｍ）
６．６７（１Ｈ，ｍ）
４．７３（１Ｈ，ｍ）
４．１５（１Ｈ，ｍ）
４．０４（３Ｈ，ｓ）
３．７８（６Ｈ，ｓ）
３．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５，１０．３Ｈｚ）
３．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６５，１０．４Ｈｚ）
２．７８（１Ｈ，ｍ）
２．６８（１Ｈ，ｍ）
４．６２（１Ｈ，ｍ）
【０１０７】
（ステップｊ）６−（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）−９−｛（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−［２−ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｙｌ］−５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ｝−９Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２−１０）の合成
トルエン、無水アセトニトリルで共沸した２−９（１３８ｍｇ，０．１９２８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２．８ｍｌ）懸濁液にアルゴン気流下、０℃にてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２００μｌ，１．１４９ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１３０μｌ，０．５８２８ｍｍｏｌ）を加え０℃で撹拌した。７５分後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３３μｌ，０．７６６ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（８７μｌ，０．３８８５ｍｍｏｌ）を追加し、さらに２５分後反応液をクロロホルムで希釈した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで洗浄後溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２→１：１→２：３）で精製した。残渣をジクロロメタンに溶解し、−７８℃に冷却したヘキサンに加えて再沈殿を行い、上澄みを取り除いて真空乾燥を行うことにより２−１０（１２０ｍｇ，６８％）を白色泡状物質として得た。
【０１０８】
２−１０：Ｃ４９Ｈ５４Ｎ７Ｏ９Ｐ（ＭＷ＝９１５．９８）
ｗｈｉｔｅ  ｆｏａｍ
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
ｃａｌｃｄ．  ９１６．３８［Ｍ＋Ｈ］＋
ｆｏｕｎｄ  ９１５．９４９７
３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：１４９．１
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）：
８．９５（１Ｈ，ｓ）
８．０２（１Ｈ，ｓ）
７．５９（２Ｈ，ｍ）
７．５３（２Ｈ，ｍ）
７．３７（２Ｈ，ｍ）
７．３０−７．１５（８Ｈ，ｍ）
６．７８（４Ｈ，ｍ）
６．６６（１Ｈ，ｍ）
４．７９（１Ｈ，ｍ）
４．２８（１Ｈ，ｍ）
４．２３−４．０７（２Ｈ，ｍ）
４．０４（３Ｈ，ｓ）
３．７７（６Ｈ，ｓ）
３．５５−３．４２（４Ｈ，ｍ）
２．６３（１Ｈ，ｍ）
２．４４（１Ｈ，ｍ）
【０１０９】
（固相合成による２’−デオキシリボオリゴヌクレオチドへの導入）
２−１０の無水アセトニトリル溶液を調製し、ＤＮＡ自動合成装置に装てんし、装置に標準化された方法で２’−デオキシリボオリゴヌクレオチドに導入した。この合成された核酸プローブが固定化されたＣＰＧ担体に無水メタノール、４−アミノピリジンを加え５５℃で一晩加温することでＣＰＧ担体からの切り出し、及び塩基の脱保護、アミンの導入を行った。メタノールにアルゴンガスを吹き付け溶媒留去し、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液を加えメンブレンフィルターを用いてろ過し不溶物を除去した後ＨＰＬＣａで精製した。続いて５％酢酸水中にて室温で３０分静置し、５’末端のジメトキシトリチル基の脱保護を行い、再度ＨＰＬＣｂにて精製することで誘導体４を得た。
【０１１０】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ）
ｃａｌｃｄ．  ４８５５．１２９６［Ｍ−Ｈ］−
ｆｏｕｎｄ  ４８５６．０４５．
【０１１１】
ＨＰＬＣａの条件
ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８，ｔｙｐｅ  ＭＧ，４．６×２５０ｍｍ；Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０，Ｂ：ＣＨ３ＣＮ：Ｂ：１０％  ｔｏ  ４０％／２０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ；Ｃｏｌｕｍｎ  ｏｖｅｎ  ３５℃；Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １ｍｌ／ｍｉｎ；ＵＶ：２５４ｎｍ
【０１１２】
ＨＰＬＣｂの条件
ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８，ｔｙｐｅ  ＭＧ，４．６×２５０ｍｍ；Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０，Ｂ：ＣＨ３ＣＮ：Ｂ：１０％  ｔｏ  １５％／２０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ；Ｃｏｌｕｍｎ  ｏｖｅｎ  ３５℃；Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １ｍｌ／ｍｉｎ；ＵＶ：２５４ｎｍ
【０１１３】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、合成済みの核酸、特には核酸医薬リード又は天然から抽出される核酸の末端以外の位置を高感度に標識するのに好適である。
【図１】
2020162476.tif 000018
【図２】
2020162476.tif 000019
【図３】
2020162476.tif 000020
【図４】
2020162476.tif 000021
【図５】
2020162476.tif 000022
【図６】
2020162476.tif 000023
【配列表】
2020162476000001.app