(57)【要約】      （修正有）【課題】生理活性を持つボツリヌス神経毒素の調製方法及び経皮送達のための多層多相ナノ粒子の提供。【解決手段】動物由来成分を含まない発酵培地でボツリヌス菌を発酵させ、発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得、この上澄み液を透析してボツリヌス神経毒素を含む透析溶液を収集し、透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させ、その溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させて溶出液を収集する。また、上記のボツリヌス神経毒素及び／又はヒアルロン酸などの活性分子が含まれる、最内層の水相コア又は油相コア、水相層、油相層、及び最外層のクリーム層を含み、水相層と油相層は交互にカプセル化された、経皮送達のための多層多相ナノセル粒子も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法であって、
１）細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
２）細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
３）前記上澄み液を透析し、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
４）前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
５）ステップ３）および４）を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
６）前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は植物ペプトンを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも１つをさらに含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも１つから得られる、
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ２）において、前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ２）とステップ３）との間に、さらに、
細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ることと、
前記発酵培地を前記陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記上澄み液を混合することと、を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ５）は、さらに、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素の前記溶出液を透析することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素Ａである、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ボツリヌス神経毒素Ａの生物学的比活性は、マウスＬＤ５０を用いて測定して、１００〜４００ｕｎｉｔ／ｎｇである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ６）の後、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、前記溶出液への添加後の前記安定剤の濃度は、総体積に基づいて１０〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲である、
請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
前記安定剤において、
前記溶出液に添加された後の前記エチレングリコールの濃度は、５〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記グリセリンの濃度は、１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記プロピレングリコールの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％の範囲である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
最内層の水相コアまたは油相コアと、
複数の水相層と、
複数の油相層と、
最外層のクリーム層と、を含み、
前記複数の水相層のそれぞれおよび前記複数の油相層のそれぞれは、前記水相コアまたは前記油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成し、
前記水相コアおよび前記水相層には、生体分子を含み、
前記生体分子は、ボツリヌス神経毒素および／またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含み、
前記油相コアおよび前記油相層には、油溶性分子を含む、
多層多相ナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子であって、
前記ボツリヌス神経毒素の調製方法が、
１）細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
２）細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
３）前記上澄み液を透析し、かつ、前記生体分子を含む透析後の溶液を収集するステップと、
４）前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
５）ステップ３）および４）を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
６）前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
多層多相ナノ粒子。
【請求項１５】
前記多層多相ナノ粒子の平均サイズは１〜２００ナノメートルである、
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項１６】
前記水性コアまたは前記油相コアの平均サイズは１〜２００ナノメートルの範囲である、
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項１７】
前記最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含み、
前記水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも１つを含み、
前記油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、ステアリン酸グリセリル、Ｔｗｅｅｎ−６５、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｌａｂｒａｆａｃ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ  １３４９、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンＥ、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）およびポロキサマー、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸、ＰＥＧ−ポリ−Ｌ−ラクチド、ＰＥＧ誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも１つを含む、
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項１８】
前記ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの１つを含む、
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項１９】
前記複数の水相層の１つ以上は親水性分子を含み、および／または、前記複数の油相層の１つ以上は疎水性分子を含む、
請求項１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項２０】
前記親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Ｓｎａｐ−８オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、Ｎ−アセチルカルノシン、Ｌ−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンＣ、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−８、アセチルヘキサペプチド−１、Ｌ−トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド３、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−１、ヘキサペプチド−１、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−４、パルミトイルトリペプチド−１、パルミトイルテトラペプチド−７、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、ｓｉ−ＲＮＡ、幹細胞、および治療剤などのうちの少なくとも１つを含む、
請求項１９に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項２１】
前記疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンＥ、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンＡ、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも１つを含む、
請求項１９に記載の多層多相ナノ粒子。
【請求項２２】
前記治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、ＡｇＮＯ３をはじめとする銀イオン、ＺｎＯをはじめとするＺｎイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも１つを含む、
請求項２０または２１に記載の多層多相ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の調製および経皮送達の分野に関し、より具体的には、ボツリヌス神経毒素Ａの調製と、ボツリヌス神経毒素Ａを含有するナノカプセル化された生体分子および他の高分子量生体分子の経皮送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス毒素は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）によって産生される神経毒素であり、ボツリヌス菌は、植物、土壌、水、および動物の腸で一般的に見られるグラム陽性胞子形成嫌気性菌である。ボツリヌス菌の抗原性に応じて、７種類（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）に分類することができる。すべての血清型は、神経筋接合部での主要な神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を遮断することにより、筋肉を麻痺させて神経伝達を妨げる。今日、ボツリヌス神経毒素は、斜視、限局性ジストニア、片側顔面痙攣、さまざまな痙性ジスキネジア、頭痛、ポリープおよび多汗症など、さまざまな治療用途で重要な役割を果たし、かつその適用範囲は依然として急速に拡大している。ボツリヌス神経毒素は、顔、あご、首、胸全体の紋様、フリルおよびしわの修正、および多汗症とにきびなどのその他の皮膚科学的適用を含む、顔とボディ美容の用途でも一般的に使用される。２００２年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、一時的に眉間しわと見上げしわを減らすために、顔とボディ美容の用途向けにＢｏｔｏｘ（登録商標）（ボツリヌス神経毒素Ａがその有効成分であるボトックス）を承認した。
【０００３】
得られたボツリヌス神経毒素（ボツリヌス菌完全毒素、または完全ＢｏＮＴ−Ａとも呼ばれる）の活性は比較的低く、軽鎖と重鎖はジスルフィド結合で結合して、分子量約１５０ｋＤａ以上の活性を持つコア小分子ボツリヌス毒素（ＳＭ毒素または完全毒素またはヌード毒素）を形成する。図１は、ボツリヌス神経毒素の概略構造を示す。図１に示すとおり、ボツリヌス神経毒素ポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合で結合されたそれぞれ約１００ＫＤａの重（Ｈ）鎖と５０ＫＤａの軽（Ｌ）鎖を含む。ボツリヌス神経毒素Ａは、ニューロンのタンパク質の加水分解により可溶性のＮ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）を攻撃するために使用される、特異的な酵素活性を有し、ここで、酵素活性はＬ鎖によって付与される。Ｈ鎖は、受容体の結合とサイトゾルへの移行に必要である。完全ＢｏＮＴ−Ａは、非血球凝集素タンパク質および血球凝集素を含む他のタンパク質に結合して、より高い分子量（例えば、９６０ＫＤａ）のボツリヌス毒素複合体（ＢｏＮＴ−Ａとも呼ばれる）を形成する。１５０ＫＤａ完全ＢｏＮＴ−Ａ（毒性および治療効果がある）とは異なり、ボツリヌス毒素複合体に存在する関連タンパク質は非毒性であるため、薬理作用には必要ではない。
【０００４】
動物由来の成分を含む発酵培地でボツリヌス神経毒素を培養し、それらをヒトの治療に使用することは、当技術分野で知られている。しかしながら、動物由来の製品を使用すると、潜在的な汚染物質（例えば、動物由来の製品からのウイルス）が臨床使用のために調製されたボツリヌス毒素に入る可能性があり、それにより治療適用中のリスクが増加する可能性がある。
【０００５】
さらに、ＢｏＮＴ−Ａ（９６０ＫＤａ）と完全ＢｏＮＴ−Ａ（１５０ＫＤａ）の分子量が比較的大きいため、最も一般的な投与方法は臨床現場での注射器注射である。しかしながら、注射器注射は不便であり、使用時に痛みと不安を引き起こし、患者のコンプライアンスは低い。したがって、特に治療、皮膚病理学、および薬用化粧品の分野において、ボツリヌス神経毒素の便利かつ安全で痛みのない送達のための代替方法を開発する必要がある。例えば、注射器注射または機器を使用する他の侵襲的送達手順ではなく、手による経皮送達など、ボツリヌス神経毒素の局所適用を含む、高分子量タンパク質の非侵襲的送達方法を開発することが望ましい。
【０００６】
人体の皮膚には、厚さ２０μｍから数百μｍ（例えば、一部の面領域では約２５０μｍ）の角質層（ＳＣ）、表皮（ＥＤ）、および真皮などの三層構造の様々な組織および細胞層を含む。一般的に、人体の皮膚は、外皮細胞から内皮細胞までの明確なネットワーク構造を備えた三層の精緻な多層（油相−水相）ｎシステムとみることができる。したがって、外皮細胞から内皮細胞への精緻かつ非常に厚い障害物を通過させての、特に高分子量の生体分子の送達は非常に困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の開示されたボツリヌス神経毒素Ａの調製方法およびナノカプセル化形態でのその経皮送達は、上記の問題の１つまたは複数ならびに当技術分野の他の問題に対処することを意図している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、複数の態様を含み、そのうちの１つの態様は、生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法を提供する。該方法は、
１）細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
２）細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
３）上澄み液を透析し、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
４）ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
５）ステップ３）および４）を繰り返し、ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
６）陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得したボツリヌス神経毒素を含む溶出液を収集するステップと、を含む。
【０００９】
背景技術で説明したとおり、ボツリヌス神経毒素複合体は、比較的大きな分子量（例えば、９６０ＫＤａ）を持つ。高分子量のタンパク質を使用する場合、経皮送達を促進しないため、通常は注射の形を採用する。より大きな分子量（例えば、９６０ＫＤａ）のボツリヌス神経毒素複合体とは異なり、本発明の方法に従って得られた低分子量のボツリヌス神経毒素Ａは、多くの利点を有し得る。例えば、約１５０ＫＤａの分子量を有するボツリヌス神経毒素Ａは、ボツリヌス神経毒素複合体と比較して２０％未満の重量のみを有する。したがって、ボツリヌス神経毒素Ａは、抗原性および免疫原性を著しく低下させる可能性がある。得られたボツリヌス神経毒素Ａは、より大きな分子量の複合体よりも臨床使用に対して安全であり得る。さらに、得られたボツリヌス神経毒素Ａはサイズが小さいため、拡散速度が高くなる可能性があり、様々な適用（例えば、限局および局所適用）で皮膚バリアを簡単に通過でき、注射器注射などの侵襲的な送達方法を回避する。
【００１０】
本発明によって他の非毒性タンパク質の解離から生成されたボツリヌス神経毒素Ａは、１５０ＫＤａのより小さな分子量を有し得る。解離したボツリヌス神経毒素Ａは正に帯電し（ボツリヌス神経毒素複合体は負に帯電している）、それに応じて、本発明は、連続透析、陰イオン交換、および陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するボツリヌス神経毒素Ａの精製方法を提供する。例えば、残りの核酸不純物、その他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Ａから解離した非毒性タンパク質のすべてを、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を連続して使用することで、実質的に除去し、それにより、低分子量の正に帯電したボツリヌス神経毒素Ａの精製が達成される（従来技術には１５０ＫＤａのボツリヌス神経毒素Ａの調製方法もあるが、本発明の方法は技術的に異なる）。
【００１１】
さらに、従来技術において、ボツリヌス神経毒素は、動物由来の成分を含む発酵培地で培養され、かつ、それがヒトの治療に使用される。しかしながら、本発明のチームは、動物由来の製品を使用すると、潜在的な汚染物質（例えば、動物由来の製品からのウイルス）が臨床使用のために調製されたボツリヌス毒素に入る可能性があり、それにより治療適用中のリスクが増加する可能性があることを研究で発見した。本発明は、発酵培地に動物由来の成分を使用せず、それにより、動物源による調製物の潜在的な汚染を回避し、したがって、本発明の方法により得られるボツリヌス神経毒素はより安全である。
【００１２】
好ましくは、動物由来の成分を含まない発酵培地は、植物ペプトンを含む。
【００１３】
好ましくは、動物由来の成分を含まない発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも１つをさらに含む。
【００１４】
好ましくは、植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも１つから得られる。
【００１５】
好ましくは、ステップ２）において、ボツリヌス菌を含む発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる。
【００１６】
本発明は、収穫時に酸性スラッジ形成を行って発酵培地を酸性化することにより、標的タンパク質とするボツリヌス神経毒素Ａの抽出を開始することをさらに含むことができる。
【００１７】
好ましくは、ステップ２）とステップ３）との間に、さらに、
細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ること、
発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られたボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を混合すること、を含む。
【００１８】
好ましくは、ステップ５）は、さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素を含む溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素の溶出液を透析することを含む。
【００１９】
好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａである。
【００２０】
好ましくは、ボツリヌス神経毒素Ａの生物学的比活性は、マウスＬＤ５０を用いて測定して、１００〜４００  ｕｎｉｔ／ｎｇである。
【００２１】
好ましくは、ステップ６）の後、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素を含む溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む。
【００２２】
高分子量ボツリヌス神経毒素と比較した低分子量ボツリヌス神経毒素の生物活性の安定性は比較的低いため、本発明は、保存中の安定剤製剤を最適化し、本発明は、広範な研究の後、安定剤としての既存の単一エチレングリコールと比較して、エチレングリコール＋グリセリン＋プロピレングリコールの組み合わせを使用すると、効果の著しい改善が見られた。
【００２３】
好ましくは、安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、溶出液への添加後の安定剤の濃度は、総体積に基づいて１０〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲である。
【００２４】
好ましくは、安定剤において、
溶出液に添加された後のエチレングリコールの濃度は、５〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
溶出液に添加された後のグリセリンの濃度は、１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
溶出液に添加された後のプロピレングリコールの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％の範囲である。
【００２５】
本発明の別の態様は、多層多相ナノ粒子（ナノセル顆粒またはナノ粒子と略される）を提供する。該ナノ粒子は、最内層の水相コアまたは油相コア、複数の水相層、複数の油相層、および最外層のクリーム層を含み、複数の水相層のそれぞれおよび複数の油相層のそれぞれは、水相コアまたは油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成する。水相コアおよび水相層には、生体分子を含み、生体分子は、ボツリヌス神経毒素および／またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含む。油相コアおよび油相層には、油溶性分子を含む。
【００２６】
本発明の多層多相ナノ粒子は、図５Ａ／Ｂに示すとおり、水相と油相が交互にカプセル化された構造を有する（本発明の層の数は、出願人の先の出願の数よりも多く、図８Ｆに示すとおり、本発明の実施例では８層を含む製品の調製が成功した）。該構造は、３次元の微細な多層（油相−水相）ｎシステムなど、多層の人間の皮膚構造と人間の細胞構造をシミュレートする多層ナノセル構造（すなわち、水相、油相が積み重ねられる）である。このような多層多相ナノ粒子は、内皮細胞への活性成分の輸送および送達を促進することができる。例えば、皮膚または細胞構造の水層にある場合、水層中の水溶性活性物質が溶解され、該水層から除去された残りのナノ粒子は油相層に浸透し続け、その時点で油相層中の油溶性活性物質（選択的に添加または非添加）が溶解され、このように層ごとに深層まで浸透することができ、高分子物質が経皮送達しにくいという技術的問題が解決される。また、各水相または油相層には、内層と同じまたは異なる活性成分分子が含まれる可能性がある。異なる治療法、薬用化粧品、およびその他の用途向けに異なる活性成分を含む２層以上を備えた多機能ナノセルが製造される。
【００２７】
好ましくは、多層多相ナノ粒子の平均サイズは１〜２００ナノメートルである。
【００２８】
好ましくは、水性または油相コアの平均サイズは１〜２００ナノメートルの範囲である。
【００２９】
好ましくは、最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含む。
【００３０】
水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも１つを含み、
油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、ステアリン酸グリセリル、Ｔｗｅｅｎ−６５、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｌａｂｒａｆａｃ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ  １３４９、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンＥ、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）およびポロキサマー、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸、ＰＥＧ−ポリ−Ｌ−ラクチド、ＰＥＧ誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも１つを含む。
【００３１】
好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの１つを含む。
【００３２】
好ましくは、複数の水相層の１つ以上は親水性分子を含み、および／または複数の油相層の１つ以上は疎水性分子を含む。
【００３３】
好ましくは、親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Ｓｎａｐ−８オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、Ｎ−アセチルカルノシン、Ｌ−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンＣ、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−８、アセチルヘキサペプチド−１、Ｌ−トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド３、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−１、ヘキサペプチド−１、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−４、パルミトイルトリペプチド−１、パルミトイルテトラペプチド−７、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、ｓｉ−ＲＮＡ、幹細胞および治療剤などのうちの少なくとも１つを含む。
【００３４】
好ましくは、疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンＥ、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンＡ、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも１つを含む。
【００３５】
好ましくは、治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、ＡｇＮＯ３をはじめとする銀イオン、ＺｎＯをはじめとするＺｎイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも１つを含む。
【００３６】
本発明の他の態様は、説明、特許請求の範囲および図面を参照して当業者によって理解され得る。
【００３７】
本発明の実施形態における技術的解決手段をより明確に説明するために、実施形態を説明するための図面を以下に簡単に説明する。以下の説明の図面は本発明の実施形態の一部を示すに過ぎず、かつ、当業者は、発明の努力を必要とせずにこれらの図面から他の派生図面を導き出すことができることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１はボツリヌス神経毒素の構造概略図である。
【図２】図２は本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Ａを調製するための例示的な方法のフローチャートである。
【図３】図３は本発明の様々な実施形態によるマスター細胞バンクから収集された血清型Ａ  ＤＮＡサンプルおよび異なる血清型プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の結果である。
【図４】図４は本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Ａを調製するための例示的な方法における様々な精製方法ステップによるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）結果である。
【図５Ａ】図５Ａは本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化生体分子を調製するための例示的な方法のフローチャートである。
【図５Ｂ】図５Ｂは本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化生体分子を調製するための別の例示的な方法のフローチャートである。
【図６】図６は本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化ボツリヌス神経毒素を調製するための例示的な方法で使用してボツリヌス神経毒素がカプセル化されたナノセルの粒径および分布図である。
【図７】図７は本発明の様々な実施形態によるボツリヌス神経毒素がカプセル化されたナノセルが塗布される患者の皮膚領域の比較図である。
【図８】図８は本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化生体分子を調製するための例示的な方法を使用して高分子量ヒアルロン酸がカプセル化されたナノセルの粒径および分布図である。
【図９】図９は本発明の様々な実施形態による高分子量ヒアルロン酸がカプセル化されたナノセルが塗布される患者の皮膚領域の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書は、本発明の原理および実装に関して説明するが、実施形態の説明は、本発明の方法および方法の中核概念の理解を助けることのみを意図している。同時に、当業者は、本発明の思想に従って特定の実施形態および適用範囲を修正することができる。結論として、明細書の内容は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明は、本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Ａを調製する方法を提供する。ボツリヌス神経毒素Ａは、ボツリヌス菌Ａ型Ｈａｌｌ株の発酵によって生成され、さらに発酵培地から抽出および精製される。図２は、本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Ａを調製するための例示的な方法のフローチャートを示す。
【００４１】
図２において、例示的な方法は、細胞接種および発酵を含むことができ、この時間中、細菌であるボツリヌス菌は制御された方法で培養され、ボツリヌス神経毒素Ａを生成することができる（例えば、図２のＳ２０１において）。該方法は、収穫時に酸性スラッジ形成を行って発酵培地を酸性化し、それにより標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Ａの抽出を開始することをさらに含むことができる（例えば、図２のＳ２０３において）。発酵培地を酸性化して沈殿物（酸性スラッジ）を形成した後、例示的な方法は、核酸不純物および他のタンパク質不純物を除去するためのフラッシュ抽出および透析をさらに含むことができる（例えば、図２のＳ２０５において）。残りの核酸不純物および他の関連する非毒性タンパク質をさらに除去して低分子量の高純度ボツリヌス神経毒素Ａを得るために、例示的な方法は、透析およびクロマトグラフィーを使用した逐次精製をさらに含むことができる（例えば、図２のＳ２０７〜Ｓ２１１において）。例えば、例示的な方法は、透析、陰イオン交換クロマトグラフィープロセス、および陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを含む反復可能な精製サイクルをさらに含むことができる。精製プロセスが完了すると、得られたボツリヌス神経毒素Ａをさらにろ過し、かつ長期保存を実現するためにそれを低温（例、≦−７０℃）で保存することができる（例えば、図２のＳ２１３において）。
【００４２】
標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Ａが、制御された方法で生成、抽出、および精製されるように、図２による例示的なステップのそれぞれを異なる方法を使用して監視することができる。再び図２を参照すると、例えば、高濃度の酸を加えることで形成された沈殿物（スラッジ）と硫酸アンモニウムを含む沈殿物をそれぞれ計量することにより、Ｓ２０３での酸性スラッジの形成およびＳ２０５でのフラッシュ抽出および透析を監視することができる。あるいは、蛍光アッセイを実行して、酸性スラッジの形成を監視することができる。例えば、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ核酸定量試薬として使用される超高感度蛍光色素は、水溶液中のＤＮＡ、例えばタンパク質を含む水溶液中のＤＮＡ不純物を定量する。したがって、核酸の蛍光強度の減少を測定することにより、タンパク質含有溶液中の核酸不純物の除去を監視することができる。いくつかの任意の実施形態では、蛍光アッセイを使用して、図２の１つまたは複数のステップ（例えば、Ｓ２０３およびＳ２０５）で核酸不純物の除去を監視することができる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、図２の実質的にすべての例示的なステップでボツリヌス神経毒素Ａの純度を監視するために使用することができる。あるいは、ＵＶ分光法も、タンパク質の濃度を監視し、タンパク質溶液中の核酸不純物を測定するために使用することができる。例えば、２７８ｎｍの波長でのＵＶ吸光度を、タンパク質濃度を測定および決定するために使用することができる。さらに、タンパク質溶液中の核酸不純物を測定するように２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸光度比（Ａ２６０／Ａ２８０比）を測定することができる。さらに、例えば、核酸不純物の濃度が特に低い場合に、ボツリヌス神経毒素Ａを含む溶液中の核酸不純物を決定するように、ｑＰＣＲ方法で測定することを含むことができる。本発明の一実施形態では、最終製品からのクロストリジウムＤＮＡ不純物の除去を確実にするために、精製ボツリヌス神経毒素Ａサンプル中の残留ボツリヌス菌Ａ型ゲノムＤＮＡを検出するようにＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲアッセイを実施することができる。
【００４４】
図２の例示的なステップを監視するために、１つまたは複数の方法を組み合わせることができることに留意されたい。例えば、本発明はこれを限定することを意図しないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＵＶ分光法を組み合わせて、抽出および精製プロセスを監視することができる。また、本発明はこれを限定することを意図しないが、ボツリヌス神経毒素Ａの生成および精製を監視する際に他の方法を含めることができることにさらに留意されたい。
【００４５】
細胞接種および発酵（Ｓ２０１）では、低分子量ボツリヌス神経毒素Ａの調製には、作動細胞バンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，  ＷＣＢ）の調製、調製されたＷＣＢの接種および発酵を含むことができる。本発明の一実施形態では、ＷＣＢは高圧蒸気処理された発酵培地で解凍することができ、解凍プロセスは周囲温度または３７℃で実施することができる。続いて、解凍したＷＣＢは、高圧蒸気処理された発酵培地に接種することができる。一実施形態では、接種プロセスは、約３３℃から４０℃の範囲の温度で約４時間から２０時間実施することができる。例えば、接種プロセスは３７℃で１２時間実施することができる。
【００４６】
本発明のいくつかの任意の実施形態では、ＷＣＢ中の細菌であるボツリヌス菌が利用可能なマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を特徴付けて、細菌であるボツリヌス菌の様々な特性を検証することができる。特徴付けプロセスは、接種および発酵プロセスの前に実施することができ、かつ、発酵プロセスに動物由来の成分が含まれる場合、ボツリヌス菌の特徴的な特性には、同一性、生物学的純度、安定性、形態、ＤＮＡ配列決定、およびウイルス検出を含むことができる。例えば、細菌の表現型または遺伝子型の特徴を決定することにより、同一性の特徴づけを達成することができる。生物学的活性は、血漿汚染を測定することにより決定することができる。所望の標的産物の所望の産生として定義される安定性は、細胞の性質、培養方法などによって決定することができる。生存能力は、限定された条件下での保存中に生成を維持する能力として定義することができる。本発明はこれを限定することを意図しないが、ＭＣＢの他のいくつかの特徴的な特性を識別および測定することができることに留意されたい。
【００４７】
本発明の一実施形態では、細胞の接種および発酵中に、好ましくは、動物由来の成分が実質的に使用されず、それにより、動物源による調製物の潜在的な汚染が回避される。一般的なブリスター培地、および接種と発酵プロセス用の動物由来の他の成分（例えば、ウシおよびブタ出発材料を使用するＮＺ−Ａｍｉｎｅおよびグリセリン）の代替物として、本発明の一実施形態には、実質的に非動物由来の発酵培地を含むことができる。本発明の別の実施形態は、植物ペプトンベースの発酵培地を任意に含むことができる。
【００４８】
例えば、大豆、ジャガイモ、および／または米を含むがこれらに限定されない植物ベースのタンパク質製品を発酵培地に含めることができる。さらに、自己分解酵母スラッジ、酵母抽出物、およびグルコースも発酵培地に含めることができる。本発明の一実施形態では、非動物由来の発酵培地は、培地の総体積に対して、重量（ｗ／ｖ）で５％の大豆粉、２％の酵母抽出物、および２％の自己分解酵母スラッジを含むことができる。任意に、非動物由来の発酵培地は、３％の大豆粉、２％のジャガイモ粉、２％の酵母抽出物、および１％の自己分解酵母スラッジを含むことができる。任意に、非動物由来の発酵培地は、３％の大豆粉、１％の酵母抽出物、２％の自己分解酵母スラッジ、および１％のグルコースを含むことができる。非動物由来の発酵培地は、ｐＨ調整のためにデキストロースおよび水酸化ナトリウム（例えば、約１０％〜５０％水溶液）をさらに含むことができる。一実施形態では、発酵培地中のデキストロースの濃度は、１リットル当たり５グラム（５ｇ／Ｌ）であってもよい。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、本発明に記載される成分の割合は、総体積に対する重量割合を指す。
【００４９】
調製された非動物由来の発酵培地は、適切なｐＨに調整することができる。一実施形態では、発酵培地のｐＨは、ｐＨ６．５からｐＨ８．５の範囲であり得る。例えば、発酵培地のｐＨはｐＨ７．０からｐＨ７．５の範囲であり得る。いくつかの任意の実施形態では、発酵培地のｐＨをｐＨ７．２に調整することができ、かつ、水酸化ナトリウムを追加することによりｐＨ調整を実現することができ、例えば、０．３ｍＬの５０％水酸化ナトリウムを１Ｌの発酵培地に追加することによりｐＨ調整を実現する。
【００５０】
図２のステップＳ２０１をさらに参照し、接種溶液中の作動細胞は、ボツリヌス菌が嫌気性環境で成長および拡大できるように、より大量の発酵培地に移すことができる。発酵プロセスの期間は、約３３℃から４０℃の範囲の温度で７０時間から１２０時間であり得る。本発明の一実施形態では、発酵プロセスは、３５℃から３９℃の範囲の温度で約９６時間であり得る。各バッチの様々な例によると、９Ｌの非動物由来の発酵培地は、２０億（１０９）以上のマウスＬＤ５０ユニットのボツリヌス神経毒素Ａを生成することができ、ここで、各マウスＬＤ５０ユニットは、マウスＬＤ５０アッセイで約２．５〜１０ピコグラムに対応するボツリヌス神経毒素Ａの致死量として定義することができ、その生物学的活性は１００〜４００ＬＤ５０  ｕｎｉｔ／ｎｇである。
【００５１】
図２のステップＳ２０３を参照し、本発明の様々な実施形態によれば、細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を収穫時に沈殿させて、酸性スラッジ形成を実現することができる。一実施形態では、細胞破片を除去するために、ボツリヌス菌を含む発酵培地に高濃度の酸を加えることができる。例えば、ｐＨが少なくとも３時間３．５まで低下するまで、３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を発酵培地に加えて実質的にすべての細胞が沈殿して沈殿物を形成できるようにすることができる。
【００５２】
本発明の一実施形態では、発酵培地を酸性化することによって形成された沈殿物は、ｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸緩衝液で所定の時間抽出するために遠心分離によって収集し、再懸濁することができる。同時に、ボツリヌス神経毒素Ａ、核酸不純物、およびその他のタンパク質不純物を含む遠心分離によって得られた上澄み液を収集することができる。いくつかの任意の実施形態では、ボツリヌス神経毒素Ａの大部分または実質的にすべてを上澄み液に抽出できるように、遠心分離および再懸濁プロセスを繰り返すことができる。
【００５３】
例えば、酸性化発酵培地は、上澄み液を沈殿物から分離できるように、１回目の遠心分離を実行することができる。残りの沈殿物は、抽出のために１００ｍＭクエン酸緩衝液に１時間再懸濁し、続いて、２回目の遠心分離を実行することができる。その後、２回目の遠心分離によって得られた上澄み液を沈殿物から分離することができ、ここで、上澄み液を１回目の遠心分離によって得られた上澄み液と混合することができ、かつ、沈殿物に対する３回目の再懸濁を実行することができる。さらに沈殿させるために、硫酸アンモニウムを混合した上澄み液に加えることができる。本発明の一実施形態では、混合した上澄み液の沈殿プロセスは、２〜８℃で約４〜２０時間実施することができる。前記実施形態によれば、各酸沈殿サイクルの核酸不純物の除去を監視するように、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイとＵＶ吸光度アッセイからのＡ２６０／Ａ２８０比を実行することができる。
【００５４】
本発明の様々な実施形態による図２のステップＳ２０５を参照し、上記上澄み液への高濃度の硫酸アンモニウムの添加は、上澄み液中のタンパク質の溶解度の低減をもたらし得る。硫酸アンモニウムの濃度が十分に高い場合、タンパク質が溶液から沈殿する可能性がある。一実施形態では、沈殿物を遠心分離によって収集し、かつ、ｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。次に、再懸濁した沈殿物をさらに処理して、核酸不純物および他のタンパク質不純物を実質的に除去することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁した沈殿物を陰イオン交換体と混合して、標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Ａをさらに抽出することができ、ここで、陰イオン交換体は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーを含むことができる。いくつかの任意の実施形態によれば、ボツリヌス神経毒素Ａに対する効率的な抽出を達成するように、陰イオン交換体の上記抽出プロセスを繰り返すことができる。例えば、５０ｍＭのｐＨ５．５のクエン酸緩衝液中の再懸濁溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーと１：１の比率で混合し、かつ、１時間振盪する（１回目の抽出）。上澄み液を収集するために得られたスラリー混合物を遠心分離して、同時に沈殿物をｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。再懸濁した溶液は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーと１：１の比率で混合し、かつ、１時間振盪する（２回目の抽出）。１回目と２回目の遠心分離後の上澄み液をすべて混合し、かつ、硫酸アンモニウムを加えてさらに沈殿させる。本発明の一実施形態では、混合した上澄み液の沈殿プロセスは、２〜８℃で約４〜２０時間実施することができる。
【００５５】
上記のように、非血球凝集素タンパク質と血球凝集素などの他の非毒性タンパク質に関連するボツリヌス神経毒素とを含むボツリヌス神経毒素複合体は、比較的大きな分子量（たとえば９６０ＫＤａ）を持ち、かつ、負に帯電している。従来技術では、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体が、ボツリヌス神経毒素複合体を精製するために主に使用される。本発明の様々な実施形態では、他の非毒性タンパク質からの解離によって生成されたボツリヌス神経毒素Ａは、１５０ｋＤａという著しく小さい分子量を有し得る。さらに、解離したボツリヌス神経毒素Ａは正に帯電している。それに応じて、本発明は、連続透析、陰イオン交換、および陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するボツリヌス神経毒素Ａの精製方法を提供する。例えば、残りの核酸不純物、その他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Ａから解離した非毒性タンパク質のすべてを、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を連続して使用することで実質的に除去し、それにより、低分子量の正に帯電したボツリヌス神経毒素Ａの精製が達成される。前記実施形態によれば、上記の精製プロセスのそれぞれを監視するために異なる方法を使用することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法とＵＶ分光法の両方が、核酸不純物およびその他のタンパク質不純物の除去を検出するために使用することができる。
【００５６】
本発明の一実施形態による図２のステップＳ２０７を参照し、アニオン樹脂抽出および透析によってステップＳ２０５から得られた硫酸アンモニウム含有沈殿物を処理することができる。例えば、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、かつ、ｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。再懸濁した溶液をさらに透析することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、ｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液において２℃〜８℃で約４〜２０時間透析することができる。その後、透析チューブから収集した透析後の生成物を陰イオン交換クロマトグラフィー用のＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムに装填し、それにより、負に帯電した核酸不純物とその他のタンパク質不純物を大幅に除去することができる。
【００５７】
本発明の一実施形態では、透析チューブから収集された透析後の生成物の重量を測定し、次いでＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムに装填することができる。さらに、ＵＶ分光法を使用して核酸不純物の除去を監視することができる。例えば、０．６未満のＡ２６０／Ａ２８０比を有する収集製品を混合することができ、特に小さなＡ２６０／Ａ２８０比は、より低い濃度の核酸不純物を示すことができる。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後に得られた結合生成物を秤量し、装填前の透析後の生成物と比較して、不純物の除去を制御可能な方法で操作および監視することができるようにする。
【００５８】
本発明の一実施形態および図２のステップＳ２０９によれば、陰イオン交換クロマトグラフィープロセスをさらに繰り返して、核酸不純物および他のタンパク質不純物を効率的に除去することができる。例えば、１回目の透析と陰イオン交換クロマトグラフィープロセスの後、０．６未満のＡ２６０／Ａ２８０比を有する生成物を混合し、かつ、硫酸アンモニウムを加えることでさらに沈殿させ、このプロセスを２℃〜８℃で約４〜２０時間実行することができる。その後、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁することができる。７．９の高いｐＨにより、ボツリヌス神経毒素Ａを非毒性タンパク質から解離することができ、これは低分子量ボツリヌス神経毒素Ａの精製を促進することができ、続いて解離した非毒性タンパク質を除去する。再懸濁した溶液をさらに透析することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸緩衝液において２℃〜８℃で約４〜２０時間透析することができる。続いて、透析チューブから収集された透析生成物をさらに２回目のクロマトグラフィー処理のためにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムに装填することができ、それにより実質的にすべての残留核酸不純物とほとんどのタンパク質不純物を除去することができる。
【００５９】
本発明の前記実施形態による２回目の透析および陰イオン交換クロマトグラフィーの完了により、得られた結合生成物を陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに処理することができ、それにより正に帯電したボツリヌス神経毒素Ａを精製することができる。例えば、得られた生成物を硫酸アンモニウムと一緒に加えてさらに沈殿させることができ、このプロセスは２℃〜８℃で約４〜２０時間実行することができる。遠心分離によって沈殿物を収集することができ、３回目の透析のためにｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液において２℃〜８℃で約４〜２０時間透析することができる。その後、透析チューブから収集された透析後の生成物は、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスのためにさらに処理することができる。本発明の一実施形態では、ＳｕｐｅｒｌｏｏｐおよびＰ−５０ポンプを使用する予め充填されたＳＰ陽イオン交換カラムは、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを実施することができる。
【００６０】
本発明の一実施形態では、３回目の透析後に得られた生成物を秤量し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィー用のＳＰ陽イオン交換カラムに装填することができる。さらに、純度を監視し、ボツリヌス神経毒素Ａの溶出曲線を確立するために、それぞれ２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、２７８ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍなどの波長での陽イオン交換クロマトグラフィー後に収集された生成物のＵＶ吸光度を測定することができる。さらに、陽イオン交換クロマトグラフィープロセス後に得られた混合生成物を秤量し、装填前の透析生成物と比較し、それにより不純物の除去を制御可能な方法で操作および監視することができる。ボツリヌス神経毒素Ａの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりさらに測定することができる。
【００６１】
いくつかの任意の実施形態では、逐次透析およびクロマトグラフィーを使用して高分子量のボツリヌス神経毒素Ａ複合体を精製することもできる。例えば、９６０ＫＤａ  ＢｏＮＴ−Ａは、例えば図２に従って、透析とそれに続くイオン交換クロマトグラフィーによって調製することができる。特に、９６０ＫＤａ  ＢｏＮＴ−Ａ複合体を調製するために、透析→陰イオン交換クロマトグラフィー→透析→陰イオン交換クロマトグラフィー→透析→陽イオン交換クロマトグラフィーのステップを含む連続精製プロセスを実施することができる。高分子量のＢｏＮＴ−Ａ複合体を得るために、ｐＨ７．９のリン酸緩衝液を使用する必要がないことに留意されたい。
【００６２】
陽イオン交換クロマトグラフィープロセス後に収集された高純度ボツリヌス神経毒素Ａを含む混合生成物は、長期使用のために保存することができる。本発明の一実施形態では、１５％のエチレングリコール、３％のグリセリン、および２％のプロピレングリコールを混合生成物に加え、混合物を−７０℃以下の温度で保存することができる。任意に、生成物を−８０℃で保存することができる。
【００６３】
ＢｏＮＴ−Ａおよび完全ＢｏＮＴ−Ａ分子は両方とも、ｐＨ、他のタンパク質の存在、イオン強度、光、温度などの局所的な微小環境要因に応じて大きな酵素活性を持つ大きなタンパク質化合物である。いくつかの任意の実施形態では、安定した毒素および長期保存の目的で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または組換えヒトアルブミン（ＲＨＡ）を毒素溶液に添加することができる。
【００６４】
完全ＢｏＮＴ−Ａを他の関連タンパク質から分離した後、特に保存または後で使用するために希釈した場合、同じ保存条件下でＢｏＮＴ−Ａ複合体よりも不安定になる可能性がある。一実施形態では、エチレングリコール、グリセリン（グリセロール）、およびプロピレングリコールのうちの１つ以上を安定剤として使用して、低分子量のＢｏＮＴ−Ａ複合体および完全なＢｏＮＴ−Ａを安定化することができる。いくつかの任意の実施形態では、エチレングリコール、グリセリン（グリセロール）、およびプロピレングリコールのうちの１つ以上を含む安定剤は、１０％〜３０％の総濃度、例えば２０％〜２５％の総濃度を有し得る。一実施形態では、安定剤は、エチレングリコール（５〜２０重量％）、グリセリン（１〜１０重量％）、およびプロピレングリコール（１〜５重量％）を含むことができる。別の実施形態では、安定剤は、１０％エチレングリコール、３％グリセリン、および２％プロピレングリコールを含むことができる。
【００６５】
本発明はまた、多層多相ナノカプセル化生体分子を調製する方法を提供する。いくつかの任意の実施形態では、カプセル化生体分子は、広範囲の分子量を有し得る。例えば、カプセル化生体分子は、ＢｏＮＴ−Ａ複合体（９６０ＫＤａ）およびヒアルロン酸（≦１５００ＫＤａ）など、１０００ＫＤａに近いまたはそれを超える高分子量を有する１つ以上の生体分子を含むことができる。別の実施形態では、カプセル化生体分子は、完全ＢｏＮＴ−Ａ（１５０ＫＤａ）を含む中分子量の１つ以上の生体分子、そして、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ビタミン分子（例、ビタミンＣおよび／またはビタミンＤ）、Ｓｎａｐ−８オクタペプチド、ジペプチド、アラントイン、ニコチンアミド、アロエベラ、コエンザイムＱ１０、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−４、パルミトイルトリペプチド−１、パルミトイルテトラペプチド−７、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー（核酸アプタマー）、ｓｉ−ＲＮＡ、幹細胞とマトリックス、幹細胞、アプタマー、幹細胞液、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＡＧＦ、ＢＧＦなどの様々な細胞増殖因子、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオールなどの多くの治療剤、銀イオン（ＡｇＮＯ３など）、Ｚｎイオン（ＺｎＯなど）、および植物抽出物などの低分子を含むことができるが、本発明はこれに限定することを意図しない。
【００６６】
図５Ａは本発明の様々な実施形態による多層多相ナノカプセル化生体分子を調製するための例示的な方法のフローチャートである。
【００６７】
図５ＡのＳ５０１によれば、まず、水相層に囲まれた油相コア（水中油（Ｏ／Ｗ）構造とも呼ばれる）を含むナノセル１Ａを形成することができ、ここで、水溶性化合物と油溶性化合物とはそれぞれ水相と油相とに溶解することができる。水中油型ナノセル１Ａは、親水性頭部と疎水性尾部などの２つの異なる分子領域を持つ両親媒性物質の存在下でミセルを形成することで実現することができ、ここで、疎水性コアは油相を表し、親水性シェルは水相を表すことができる。
【００６８】
本発明において、用語「水相」および「親水性相」は互換的に使用され、用語「油相」および「疎水性相」は互換的に使用されることに留意されたい。
【００６９】
本発明の一実施形態では、複数の水溶性化合物は、カプセル化構造内の１つ以上の水層に溶解することができ、様々な油溶性化合物は、カプセル化構造内の１つ以上の油相層に溶解することができる。例えば、水溶性生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸など）は、カプセル化構造内の１つ以上の水層に溶解することができるが、いくつかの任意の実施形態では、タンパク質は油相層に含まれる疎水性部分を有し得る。別の実施形態では、１つ以上の水相層を水溶性生体分子で溶解することができ、１つ以上の油相層を油溶性化合物で溶解することができ、それにより、２種類以上の分子を含むナノセルを形成し、２つ以上のタイプの分子は、疎水性分子および親水性分子の少なくとも１つであってもよい。
【００７０】
一実施形態では、磁気的または機械的撹拌によって撹拌を達成することができる。かつ、撹拌速度は、３００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ、例えば、５００ｒｐｍ〜２０００ｒｐｍに設定することができる。いくつかの実施形態では、攪拌速度は約８００ｒｐｍに設定することができる。
【００７１】
別の実施形態では、油相と水相の重量比（油相：水相）は、１：９９〜４０：６０、例えば５：９５〜２０：８０に設定することができる。さらに、一実施形態では、油相中の界面活性剤と油の重量比（界面活性剤：油）は、１０：１〜１：１０、例えば３：１〜１：３である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、油および界面活性剤は、油相を形成するために、ミセル形成剤として使用することができ、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−６５、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｌａｂｒａｆａｃ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ  １３４９、大豆油、茶油、オクタン酸グリセリル、レシチン卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）、ポロキサマー、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸、ＰＥＧ−ポリ−Ｌ−プロパノイド  エステル、オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ−８０）などのうちの１つ以上を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、混合プロセスは、室温（２５℃）または室温未満（例えば、４℃〜２５℃）で実施することができる。別の実施形態では、混合プロセスは、高温（例えば、約４０℃）で実施することができる。例えば、油相または水相の溶解を促進するために加熱が必要な場合、高温は約６０℃〜７０℃の範囲であってもよいが、例えば９０℃以下である。５０℃〜７０℃のより高い温度と比較して、低い製造温度（例えば、４℃〜２５℃または４℃〜４０℃）を使用した穏やかな調製プロセスは、特により高い温度がカプセル化生体分子活性の損失または保持をもたらし得る場合、開示された方法にさらなる利点を提供することができる。
【００７４】
前記実施形態によれば、水中油構造を有する調製されたナノセル１Ａは、図５ＡのＳ５０３に従ってナノセル２Ａを形成するために、反対の極性の相溶液、すなわち油相層にさらにカプセル化されてもよい。形成されたナノセル２Ａは、水相層に連続的にカプセル化され、シェルの別の油相層として少なくとも油相コアを含む多層構造があってもよい。前記実施形態によれば、油相層のそれぞれは、同じまたは異なる疎水性活性成分を含むことができ、かつ、水相コアは、追加の親水性活性成分を含むことができる。
【００７５】
図５ＡによるＳ５０５の一実施形態では、上記カプセル化ステップを繰り返して、１つ以上のタイプの活性成分を含む追加のカプセル化層を新たに形成された水相シェルに封入し、安定なナノセル３Ａを形成する。
【００７６】
本発明の一実施形態では、ヒト皮膚構造およびヒト細胞構造の複数の層を模倣することができる多層ナノ細胞構造を形成するために、上記カプセル化ステップを複数回繰り返すことができる。この多層多相ナノセル構造は、内皮細胞への活性成分の輸送および送達を促進することができる。本発明の別の実施形態による各カプセル化ステップでは、新たに形成された水相および油相カプセル化層は、内層のものと同じ活性成分分子を含むことができる。あるいは、新たに形成されたカプセル化層は、異なる活性成分を含むことができ、異なる治療、薬用化粧品、および他の適用のための異なる活性成分を含む２つ以上の層を有する多機能ナノセルを生成する。
【００７７】
いくつかの任意の実施形態では、形成された内部油相コアから外部水相シェルの方向に沿った油−水−油層を有する多層構造のナノセル３Ａは、図５ＡのＳ５０７によるナノセル４Ａを得るために、油相でさらに再カプセル化されてもよい。別の実施形態では、形成された内部油相コアから外部油相シェルの方向に沿った油−水−油−水−油層を有する多層構造のナノセル４Ａは、図５ＡのＳ５０９によるナノセル５Ａを得るために、油相でさらに再カプセル化されてもよい。
【００７８】
本発明の前記実施形態によれば、形成されたナノセルの層の数は限定されないことに留意されたい。すなわち、親水性相の層の数および疎水性相の層の数は、異なる適用に従って決定することができ、本発明はこれを限定することを意図しない。さらに、活性成分の極性および層の極性との適合性に応じて、１つ以上の種類の活性成分を１つ以上の異なる相層に溶解することができる。
【００７９】
図５ＡのＳ５１１による本発明の一実施形態では、安定なエッセンスの形のナノセル６Ａを生成するために調製されたナノセル５Ａをさらにクリームでカプセル化することができ、ここでナノセル６Ａの平均粒子サイズは、１〜２００ｎｍの間、一般的には１〜１００ｎｍの間、時には５０ｎｍ未満、時には３０ｎｍ未満である。一実施形態では、ナノセル６Ａの平均粒径は３０ｎｍ未満である。別の実施形態では、ナノセル６Ａの平均粒径は、２０ｎｍ未満、または１０ｎｍ未満、さらには１ｎｍに近いことができる。
【００８０】
本発明の一実施形態では、生成されたナノセルは、１つ以上のクリーム層にカプセル化することができる。クリーム層の追加により、経皮送達、治療および薬用化粧品用途におけるナノセルの特性を改善することができる。さらに、生成されたナノセルのクリーム層は、ユーザーエクスペリエンスを向上させることもできる。
【００８１】
図５Ｂは、本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化生体分子を調製するための別の例示的な方法のフロー図を示す。図５ＢのＳ５０２によれば、まずナノセル１Ｂを形成することができ、それは、油相層で囲まれた水相コア（油中水（Ｗ／Ｏ）構造とも呼ばれる）を含み、ここで、水溶性化合物および油溶性化合物は、それぞれ水相および油相に溶解することができる。油中水構造を有するナノセル１Ｂは、界面活性剤の存在下で水相溶液を撹拌された油相に加えることにより調製することができる。一実施形態では、ボツリヌス神経毒素および／またはヒアルロン酸などの生体分子を水相コアに溶解することができ、ここで、コアは油相層にカプセル化することができる。いくつかの任意の実施形態では、いくつかのタンパク質は、油相層に含まれる疎水性部分も有し得る。
【００８２】
前記実施形態によれば、油中水構造を有する調製されたナノセル１Ｂは、図５ＢのＳ５０４によるナノセル２Ｂを形成するために、その反対の極性の相溶液、すなわち水相層にカプセル化されてもよい。形成されたナノセル２Ｂは、油相層に連続的にカプセル化され、外側シェルの別の水相層として少なくとも水相コアを含む多層構造があってもよい。さらに、ナノセルの外側シェルの極性に応じて、外側シェルとは異なる極性の追加層を適用することができる。図５ＢのＳ５０８によれば、例えば、追加の水相層を形成して、内部水コアから外部水シェルの方向に沿った水−油−水−油−水の多層構造を有するナノセル４Ｂを生形成することができる。いくつかの実施形態では、図５ＢのＳ５１０によるナノセル５Ｂを形成するために上記カプセル化をさらに繰り返すことができ、それは、内部水コアから外部油シェルの方向に沿った水−油−水−油−水−油の多層構造を有する。
【００８３】
図５ＢのＳ５１２による本発明の一実施形態では、安定なエッセンスの形のナノセル６Ｂを生成するために調製されたナノセル５Ｂをさらにクリームでカプセル化することができ、ここでナノセル６Ｂの平均粒子サイズは、１〜２００ｎｍの間、一般的には１〜１００ｎｍの間、時には５０ｎｍ未満、時には３０ｎｍ未満である。一実施形態では、ナノセル６Ｂの平均粒径は３０ｎｍ未満である。別の実施形態では、ナノセル６Ｂの平均粒径は、２０ｎｍ未満、または１０ｎｍ未満、さらには１ｎｍに近いことができる。
【００８４】
以下で詳細に説明するクリーム層の追加は、図５のＳ５１１による多層多相ナノセル５Ａの親水性外側シェルおよび図５ＢのＳ５１２によるナノセル５Ｂの疎水性外側シェルと適合性がある。それは、形成されたナノカプセル化構造の外側シェルとしてクリーム層を追加する製造プロセスを大幅に簡素化することができ、これらの構造は、その特定の用途に応じて異なる層分布を持つことができる。他方、クリーム層の追加は、形成されたナノカプセル化構造をエッセンスの形で安定化し、それによりユーザーエクスペリエンスを向上させることができる。
【００８５】
同様に、実施形態は、様々な多層多相ナノセルラー粒子を含む。例示的なナノ粒子は、油相層によってカプセル化されて油中水構造を形成する生体分子を含む最内層の水相コア、複数の水相層、複数の油相層、および最外層のクリーム層を含むことができる。生体分子には、ボツリヌス神経毒素および／またはヒアルロン酸を含む。複数の水相層のそれぞれと複数の油相層のそれぞれは、油中水構造を交互に囲む。例えば、ナノ粒子は、１ナノメートルから２０ナノメートルの範囲など、平均サイズが５０ナノメートル未満の多層多相ナノ粒子である。
【００８６】
様々な実施形態では、クリーム層は、開示されたナノ粒子の最外層であり得る。例えば、最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含むことができる。一実施形態では、水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、プロピレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも１つを含む。油相混合物鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、ステアリン酸グリセリル、Ｔｗｅｅｎ−６５、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｌａｂｒａｆａｃ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ  １３４９、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンＥ、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）、ポロキサマー、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸、ＰＥＧ−ポリ−Ｌ−プロパノイド、ＰＥＧ誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸（Ｓｐａｎ−８０）などのうちの少なくとも１つを含む。
【００８７】
（実施例）
説明される実施例は、本発明の前記実施例のいくつかを説明するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。
【００８８】
（実施例１：非動物由来の発酵培地を使用したボツリヌス神経毒素Ａの調製）
実施例１は、図２に示す上記ステップの少なくとも一部を含む。以下の詳細な説明によれば、上流プロセスについて、実施例１は、動物由来のものを含まない発酵培地を使用して作動細胞に接種および発酵するステップを含む。
【００８９】
下流プロセスについて、実施例１は、発酵培地を酸性化することによる酸性スラッジの形成、その後の抽出および透析を含む。ボツリヌス神経毒素Ａの精製を達成するために、実施例１は、繰り返して実行した透析プロセスおよび連続クロマトグラフィープロセスのステップも含み、異なる方法を使用してこれらのステップを監視する。
【００９０】
接種および発酵用の作動細胞バンク（ＷＣＢ）はマスターセルバンク（ＭＣＢ）に由来し、ここで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検出方法を使用して、ＭＣＢは血清型特異的プライマーでＡ型ボツリヌス菌として明確に同定され、Ｂ、Ｅまたは破傷風配列は存在しなかった。具体的には、表１にリストされたタイプＡ、Ｂ、およびＥの神経毒素のボツリヌス菌構造遺伝子のＤＮＡ配列を使用して３対のプライマーを合成した。発酵培地でのＭＣＢ株の２４時間培養物から分離されたＭＣＢ細胞のゲノムＤＮＡを、さらにＰＰＹＧ（培地５００ｍＬあたり、植物ペプトン２５ｇ、酵母抽出物１５ｇ、自己分解酵母スラッジ５ｇ、グルコース５ｇ）を培地で継代し、さらに２４時間増殖させた後、ＤＮＡを分離した。ミニスピンカラムの形のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用してＤＮＡを分離した。
【００９１】
図３は、本発明の様々な実施例によるマスター細胞バンクから収集された血清型Ａ  ＤＮＡサンプルおよび異なる血清型プライマーを使用したＰＣＲ増幅の結果である。図３に示すとおり、血清型ＡのＰＣＲ増幅産物（９８３  ｂｐ）は、タイプＡプライマーを使用して生成された（図３のレーン１）が、血清型ＢおよびＣプライマーを使用した場合は増幅産物は生成されなかった（図３のレーン２および３）。図３のレーンＭに示す断片サイズは、λＤＮＡ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ１７４  ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）との比較によって決定された。さらに、血清型特異的（神経毒素）配列データのＢｌａｓｔ分析は、各サンプルが対応する血清型特異的プライマーの存在下でのみ正しいサイズの増幅産物を生成し、かつ、血清型Ａ増幅産物の配列がボツリヌス菌Ａ型Ｈａｌｌ株と一致したことを示した。
【００９２】
【表１】
2020189825.tif 000002
【００９３】
ＭＣＢ細胞株の検証後、ＷＣＢ細胞株はＭＣＢ細胞株に由来し、かつ１０ｍＬの高圧蒸気処理された非動物由来の発酵培地に３７℃で少なくとも一晩接種した。非動物由来の発酵培地の主要成分を表２に示す。接種が完了した後、接種物５ｍＬを使用して９Ｌの非動物由来の発酵培地に接種し、ここで、接種は３５℃〜３９℃の範囲の温度で９６時間行われた。
【００９４】
【表２】
2020189825.tif 000003
【００９５】
発酵後の酸性スラッジの形成プロセスについて、３．５の目標ｐＨに到達するまで、収穫時に３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を発酵液に添加し、最低３時間作動細胞を沈殿させて沈殿物を形成した。沈殿物を遠心分離によって収集し、１回目の酸沈殿抽出（１回目の酸沈殿）のために、ｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁溶液をさらに遠心分離した。得られた上澄み液をデカントして保存し、同時に残りの沈殿物を２回目の酸沈殿抽出（２回目の酸沈殿）のために１００ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁溶液に対して３回目の遠心分離を行い、得られた上澄み液をデカントして保存した。１回目および２回目の酸沈殿から得られた２つの上澄み液を混合し、次いで硫酸アンモニウムを加えて冷蔵温度で一晩さらに沈殿させた。
【００９６】
１回目と２回目の酸沈殿中に、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ、および２６０ｎｍと２８０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０比）での吸光度測定に使用されるＵＶスペクトルを使用して、核酸不純物を監視し、各沈殿および抽出ステップは、制御可能な方法で操作および監視される。表３に、抽出溶液に含まれる核酸不純物の定量化を示す。例えば、サンプルＩＤ１「酸性沈殿抽出物＃１」には、１回目の酸沈殿（３５９．３μｇ／ｍｇタンパク質）後の核酸不純物濃度がリストされ、サンプルＩＤ２「混合した酸沈殿抽出物＃１および＃２」には、２回目の酸沈殿後の混合した上澄み液の核酸不純物濃度（５１４．０μｇ／ｍｇタンパク質）がリストされる。表４に、実施例１における各抽出および精製ステップ後に測定されたＵＶ  Ａ２６０／Ａ２８０比をさらに示す。例えば、サンプルＩＤ１「酸性沈殿抽出物＃１」には、１回目の酸沈殿後のＡ２６０／Ａ２８０比が１．５４であったことがリストされ、かつサンプルＩＤ２「混合した酸沈殿抽出物＃１および＃２」には、２回目の酸沈殿後に混合した上澄み液中の核酸不純物の濃度（５１４．０μｇ／ｍｇタンパク質）がリストされる。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
後続のフラッシュ抽出および透析ステップについて、硫酸アンモニウムを、さらなる沈殿のために、１回目および２回目の酸沈殿から得られた混合した上澄み液に加えた。沈殿物を遠心分離により収集し、かつ新たに調製されたｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁した。表３および４に示すように、サンプルＩＤ３「硫酸アンモニウム沈殿後に再懸濁された抽出物」は、硫酸アンモニウムの添加および遠心分離後の抽出溶液中の核酸不純物の濃度とＡ２６０／Ａ２８０比がリストされる。抽出物をさらにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーと１：１の比率で混合し、１時間揺動した（１回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリー）。１回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリーの上澄み液をデカントして保存し、同時に残りの沈殿物を新たに調製されたｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液でさらに再懸濁し、かつ１：１の比率でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーを加えて１時間揺動した（２回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリー）。その後、第二スラリー混合物を遠心分離し、得られた上澄み液をデカントして保存した。１回目および２回目の酸沈殿により得られた２つの上澄み液を混合し、続いて硫酸アンモニウムを加えて、冷蔵温度で一晩さらに沈殿させた。
【００９９】
【表４】
2020189825.tif 000005
【０１００】
表３および表４に示すように、核酸不純物の濃度は、各抽出ステップ中に監視される。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーを添加すると、核酸不純物が大幅に除去されることが分かった。たとえば、表３に示すように、サンプルＩＤ４「１回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリー」は、サンプルＩＤ３「硫酸アンモニウムの沈殿後に再懸濁された抽出」と比較して、核酸不純物濃度の大幅な減少を示した。さらに、例えば、サンプルＩＤ４「１回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリー」中の１８９．１μｇ／ｍｇタンパク質の核酸不純物濃度とサンプルＩＤ５「２回目のＤＥＡＥ  Ａ５０スラリー」中の９１．４μｇ／ｍｇタンパク質の核酸不純物濃度を比較することにより、繰り返し添加できる抽出用ＤＥＡＥ  Ａ５０ビーズスラリーが残りの核酸不純物を効果的に除去したことがわかる。
【０１０１】
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイは、酸性スラッジ形成ステップ、およびＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０ビーズスラリーを使用したフラッシュ抽出を含む、抽出および精製プロセスの初期段階で使用されることに注意されたい。上記ステップで核酸不純物を実質的に除去した後、比較的高濃度のタンパク質がＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイに干渉を引き起こす可能性がある。したがって、ＵＶ分光法によるＡ２６０／Ａ２８０比の測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる後続の抽出および精製プロセスの監視を含む、他の方法を使用する。
【０１０２】
フラッシュ抽出は、ＤＥＡＥ  Ａ５０ビーズスラリーを繰り返し添加することにより達成され、得られた生成物は透析および連続クロマトグラフィーで処理され、残留核酸不純物、他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Ａから解離した非毒性タンパク質を除去し、これにより、高純度で低分子量のボツリヌス神経毒素Ａが生成される。
【０１０３】
具体的には、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、かつｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液に再懸濁した。その後、再懸濁した溶液を透析チューブに移し、ｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液中の核酸不純物をさらに除去した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した（１回目の透析）。１回目の透析後に得られた生成物をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムに装填し、１回目の陰イオン交換クロマトグラフィー（１回目の陰イオン交換）を実施した。図４は、ボツリヌス神経毒素Ａに従って精製された連続クロマトグラフィープロセスの各ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。例えば、図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ非還元および還元条件下でクロマトグラフィープロセスをモニタリングする各ステップに含まれるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図４Ａおよび４Ｂのレーン１「１回目のＡ−５０の混合」は、１回目の陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後の混合したサンプルに存在するタンパク質バンドを表す。１回目の透析および陰イオン交換プロセスは、負に帯電した残留核酸不純物およびその他のタンパク質不純物を本質的に除去した。１回目の陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａ２６０／Ａ２８０比が０．６未満）の後に収集された生成物は、２回目の透析のために混合し、続いて別の陰イオン交換クロマトグラフィープロセスを実施した。例えば、表４に示すとおり、サンプルＩＤ８「１回目のＤＥＡＥ  Ａ−５０の混合」のＡ２６０／Ａ２８０比は０．４８であった。
【０１０４】
１回目の透析と１回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのプロセスが完了すると、沈殿のために硫酸アンモニウムを混合した生成物に加えた。得られた沈殿物を遠心分離によって収集し、ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁した。ｐＨ７．９の弱アルカリ性条件下では、低分子量のボツリヌス神経毒素Ａは、非毒性タンパク質を含むボツリヌス神経毒素複合体から解離する可能性がある。再懸濁した溶液を、ｐＨ７．９の５０ｍＭクエン酸緩衝液透析チューブに移した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した（２回目の透析）。２回目の透析後に得られた生成物をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムに装填し、２回目の陰イオン交換クロマトグラフィー（２回目の陰イオン交換）を実施した。図４に示すとおり、２回目の陰イオン交換前のサンプル（レーン３）と２回目の陰イオン交換後の混合サンプル（レーン４）を比較することにより、ｐＨ７．９のクエン酸緩衝液を使用して、ボツリヌス神経毒素Ａを非毒性タンパク質（２回目の陰イオン交換クロマトグラフィーで実質的に除去された）から効果的に解離されたことがわかる。同様に、２回目の陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後に収集されたＡ２６０／Ａ２８０比が０．６未満の生成物を混合した。例えば、表４に示すとおり、サンプルＩＤ１０「２回目のＤＥＡＥ  Ａ−５０の混合」のＡ２６０／Ａ２８０比は０．４７であった。
【０１０５】
上記の繰り返し可能な透析−陰イオン交換サイクルは、陰イオン交換クロマトグラフィープロセスの単一ステップと比較して、製品中のすべての核酸不純物およびタンパク質不純物のほとんどを実質的に除去した。例えば、図４に示すとおり、１回目の陰イオン交換プロセスから収集された生成物を示すレーン１（１回目のＡ−５０の混合）を、２回目の陰イオン交換プロセスから収集された生成物を示すレーン３（２回目のＡ−５０の混合）と比較した。繰り返し可能な陰イオン交換プロセスの後、大量のタンパク質不純物が除去された。
【０１０６】
ボツリヌス神経毒素Ａは、加工条件下で正電荷を持つ低分子量タンパク質であるため、本明細書に記載の実施例には、高純度のボツリヌス神経毒素Ａを得るための陽イオン交換クロマトグラフィープロセスも含まれる。具体的には、２回目の透析と２回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのプロセスが完了すると、混合した生成物に硫酸アンモニウムを加えて沈殿させた。得られた沈殿物を遠心分離によって収集し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁した溶液を透析チューブに移し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液中に残っている非毒性タンパク質をさらに除去した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した（３回目の透析）。ＳｕｐｅｒｌｏｏｐおよびＰ−５０ポンプを使用して、３回目の透析後に得られた生成物を陽イオン交換クロマトグラフィー用の事前充填されたＳＰカラムに装填した。図４に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスの後、混合した生成物は分子量１５０ＫＤａの透明なタンパク質バンドを示した（例えば、図４Ａのレーン６参照）。さらに、得られたボツリヌス神経毒素Ａは、１００ＫＤａの重鎖と５０ＫＤａの軽鎖を含む（例えば、図４Ｂのレーン６参照）。上記のＳＰカラムの陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを使用して、低分子量ボツリヌス神経毒素Ａが効率的に精製されたことがわかる。
【０１０７】
より大きな分子量（例えば、９６０ＫＤａ）のボツリヌス神経毒素複合体とは異なり、本発明の前記実施例に従って生成された低分子量ボツリヌス神経毒素Ａは、様々な利点を有し得る。例えば、約１５０ＫＤａの分子量を有するボツリヌス神経毒素Ａは、ボツリヌス神経毒素複合体と比較して２０％未満の重量を有する。したがって、ボツリヌス神経毒素Ａは、抗原性および免疫原性を著しく低減させる可能性がある。得られたボツリヌス神経毒素Ａは、より大きな分子量の複合体よりも臨床使用にとって安全である可能性がある。さらに、生成されたボツリヌス神経毒素Ａはサイズが小さいため、拡散速度が速くなる可能性があり、これにより、様々な適用（例えば、限局および局所適用）で皮膚バリアを簡単に通過でき、注射器注射などの侵襲的な送達方法を回避する。
【０１０８】
さらに、本発明の様々なバッチの様々な実施例に従って生成されたボツリヌス神経毒素Ａは、１００〜４００  ｕｎｉｔ／ｎｇ、一般に２００ＬＤ５０  ｕｎｉｔ／ｎｇより高く、ほとんどの場合３００ＬＤ５０  ｕｎｉｔ／ｎｇを超える生体分子活性を有し得る。生成されたボツリヌス神経毒素Ａの活性は、２０  ＬＤ５０／ｎｇの生体分子活性を有するボツリヌス神経毒素複合体と比較して１５倍以上の効力を達成することができる。臨床使用中に同じ治療効果を達成するために、生成に必要なボツリヌス神経毒素Ａの量は、より大きな分子量のボツリヌス神経毒素複合体の量の１５分の１であり、患者への毒性は著しく低減された。
【０１０９】
より重要なことに、本発明の前記実施例によれば、低分子量のボツリヌス神経毒素Ａの調製は、動物由来の成分（例えば、動物源からの調理済みの肉培地またはグリセリン）を含まなくてもよい。このようにして、調製プロセス中の安全性を大幅に改善することができ、調製されたボツリヌス神経毒素Ａ製品に対する動物由来の潜在的な汚染を回避することができる。
【０１１０】
さらに、本発明の前記実施例によれば、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体を使用する２つのクロマトグラフィープロセスおよび陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を使用するクロマトグラフィープロセスを含むボツリヌス神経毒素Ａの調製は、調製プロセスの効率を改善することができる。例えば、９Ｌの発酵培地を使用することにより、約１０〜５０ｍｇ（例えば、完全毒素ＢｏＮＴ−Ａ）のボツリヌス神経毒素Ａを生成することができる。調製プロセスを簡単にスケールアップして、大量のボツリヌス神経毒素Ａを生成することができる。
【０１１１】
実施例１は、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。前記実施例のいくつかによれば、実施例１に開示された方法はまた、高分子量（例えば、９６０ＫＤａ）のＢｏＮＴ−Ａ複合体を調製するために使用でき、例えば透析およびクロマトグラフィープロセス中にｐＨ値が７以下の緩衝液を使用して精製中に修飾することができる。
【０１１２】
（実施例２：多層多相ナノカプセル化ボツリヌス神経毒素Ａの調製および経皮送達）
実施例２は、ボツリヌス神経毒素Ａの多相多相ナノカプセル化の調製方法を説明する。該実施例では、ナノカプセル化を調製するために、低分子量（例えば、１５０ＫＤａ）の完全ＢｏＮＴ−Ａが使用されたことに留意されたい。あるいは、高分子量のＢｏＮＴ−Ａ複合体を使用してナノカプセル化を調製することもでき、本発明はこれに限定することを意図しない。
【０１１３】
（毒素ナノセル１の調製）
生体分子（例：完全ＢｏＮＴ−Ａ）を含む活性成分をナノサイズのセルまたはエマルジョンにカプセル化して、毒素ナノセルを形成することができる。毒素ナノセル１（例えば、図５ＡのＳ５０１または図５ＢのＳ５０２）を調製するために、７３ｍｇのＴｗｅｅｎ−８０を、完全ＢｏＮＴ−Ａ生体分子を含む１０ｇの撹拌された水性毒素作動溶液に加え、前記完全ＢｏＮＴ−Ａ生体分子の効力は、１グラムあたり１０００ユニット（ＬＤ５０）（１０００  ｕｎｉｔ／ｇ）である。毒素作動溶液は、完全ＢｏＮＴ−Ａストック溶液をリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８、１０％エチレングリコール、３％グリセリン、２％プロピレングリコールを含む）で室温で連続希釈することで調製された。Ｔｗｅｅｎ−８０と水性毒素作動溶液の混合物を、透明な溶液が形成されるまで約１５分間撹拌した。得られた毒素ナノセル１を含む透明な溶液を、粒子サイズ分析器（Ｍａｌｖｅｒｎ  ＰａｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位について測定した。図６Ａおよび表５は、毒素ナノセル１の粒径強度分布および毒素ナノセル１の粒径体積分布を示す。平均強度の粒子サイズは９．７９ｎｍ（ｚ平均値）であったことがわかる。さらに、毒素ナノセル１の粒子サイズ体積分布は、６．９６ｎｍ（１０％累積体積）から１４．９０  ｎｍ（９０％累積体積）であった。
【０１１４】
水中油構造を有する上記毒素ナノセル１の調製は、例示のみを目的とすることに留意されたい。あるいは、図５ＢのＳ５０２によれば、完全ＢｏＮＴ−Ａは、油相層によって囲まれた水相コアに含まれてもよく、本発明はそれに限定されるものではない。完全ＢｏＮＴ−Ａがナノセル１Ｂの構造、すなわち、ナノセルの水相コアに含まれる場合、それに応じて、次の繰り返し可能なカプセル化ステップを調整して、新しく形成された各外層の極性がカプセル化プロセス前の現在の外層の極性と異なることを確認することもできる。
【０１１５】
（毒素ナノセル２の調製）
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（１０ｇ）を別の容器でのＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油（２０ｇ）に加え、かつ約４０℃で完全に混合して室温に冷却させた。その後、０．５ｇの上記プロセスで調製された毒素ナノセル１を上記混合物に加え、かつ毒素ナノセル２を含む透明な溶液が形成されるまで約１５分間撹拌を続けた。粒子サイズ分析器で溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位について測定した。図６Ｂおよび表５に示すとおり、毒素ナノセル２の平均強度粒子サイズは１２．８２ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は８．２７ｎｍ〜２５．３０ｎｍであった。
【０１１６】
（毒素ナノセル３の調製）
毒素ナノセル３を調製するために、上記プロセスから得られた５ｇの毒素ナノセル２を４５ｇの毒素作動溶液に加えた（１０００ｕｎｉｔ／ｇの効力）。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、室温（例えば、２５℃）で約１５分間、約１０００ｒｐｍでさらに撹拌した。毒素ナノセル３を含む得られた溶液（ナノ粒子またはナノエマルジョンとも呼ばれる）の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図６Ｃおよび表５に示すとおり、毒素ナノセル３の平均強度粒子サイズは１６．２１ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１１．４０ｎｍ〜２５．４０ｎｍであった。
【０１１７】
（毒素ナノセル４の調製）
毒素ナノセル４の調製は、上記毒素ナノセル２の調製と同様である。具体的には、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油（２０ｇ）およびカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（１０ｇ）を約４０℃の容器で完全に混合し、室温まで冷却させた。混合物を撹拌しながら上記プロセスで調製された毒素ナノセル３（０．５ｇ）を加えた。毒素ナノセル４を含む透明な溶液が形成されるまで、混合物を約１５分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図６Ｄおよび表５に示すとおり、毒素ナノセル４の平均強度粒子サイズは２０．００ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１３．８０ｎｍ〜３１．９０ｎｍであった。
【０１１８】
（毒素ナノセル５の調製）
毒素ナノセル５の調製は、上記毒素ナノセル３の調製と同様である。具体的には、上記プロセスから得られた５ｇの毒素ナノセル４を４５ｇの毒素作動溶液に加えた（１０００ｕｎｉｔ／ｇの効力）。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、約１０００ｒｐｍで、室温で約１５分間さらに撹拌した。毒素ナノセル５を含む得られた明るい青色の透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図６Ｅおよび表５に示すとおり、毒素ナノセル５の平均強度粒子サイズは２４．５３ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１７．３０ｎｍ〜３７．７０ｎｍであった。
【０１１９】
（毒素ナノセル６の調製）
まず、表６にリストされた成分に従ってクリーム１を調製した。具体的には、「容器１の相１」としてリストされた成分と「容器２の相２」としてリストされた成分を調製し、約７０℃に加熱し、かつ容器内のすべての成分が溶解されるまで別々に撹拌した。その後、約７０℃で約１５分間撹拌しながら、容器２内の溶解した成分を容器１に移した。混合成分をさらに室温まで冷却させてクリーム１を形成した。
【０１２０】
【表５】
2020189825.tif 000006
【０１２１】
形成されたクリーム１が約５０℃に冷却されたとき、１グラムのクリーム１を、室温で別の容器内で上記プロセスによって調製された撹拌毒素ナノセル５に加えた。毒素ナノセル６（ナノ毒素生成物とも呼ばれる）が形成されるまで、混合物を約１５分間撹拌し続けた。次に、形成された明るい青色の毒素ナノセル６の粒子サイズとゼータ電位を測定した。図６Ｆおよび表５に示すとおり、毒素ナノセル６の平均強度粒子サイズは２５．８４ｎｍ（ｚ平均値）であり、かつ粒子サイズ体積分布は１６．３０ｎｍ〜５３．１０ｎｍであり、全体の粒子サイズは１１０ｎｍ未満であった。
【０１２２】
【表６】
2020189825.tif 000007
【０１２３】
（毒素ナノセル６の熱安定性）
上記プロセスに従って調製された毒素ナノセル６の安定性は、様々な保存条件、例えば１８０日間でさらに試験され、前記保存条件には、凍結融解サイクル、冷凍条件（例えば、−２０℃）、冷蔵条件（例えば、２〜８℃）、および室温（例えば、２５℃）が含まれる。表７に、各凍結融解サイクル中の毒素ナノセル６の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。さらに、表８に、様々な熱条件下での毒素ナノセル６の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。調製された毒素ナノセル６は、６か月の試験期間中に異なる熱条件で保存される期間に（複数の凍結融解サイクル、２℃〜８℃の冷蔵保存条件、冷凍保存条件（例：−２０℃）、室温（２５℃など））、良好な安定性と小さな寸法変化を示す。毒素ナノセル６は、生物活性の損失を避けるために、上記の様々な保存温度条件を比較することにより、低温（例：−２０℃）で保存された。
【０１２４】
【表７】
2020189825.tif 000008
【０１２５】
【表８】
2020189825.tif 000009
【０１２６】
（毒素ナノセル６を使用した治療および薬用化粧品の適用）
調製された毒素ナノセル６は、エッセンスの形で調製され、かつ治療および薬用化粧品の適用で患者の顔面領域で試験された。具体的には、毒素ナノセル６の塗布前の各患者の顔面領域をカラー画像で記録した。その後、上記プロセスで調製された毒素ナノセル６を含む約０．２ｍＬのエッセンスを、交差したカラスの顔面領域の片側に１回だけ塗布した。その後、それらを連続して観察し、かつそれぞれ１週間、２週間、４週間に記録した。図７は、本発明の様々な実施例に従って調製されたナノカプセル化ボツリヌス神経毒素Ａを塗布した患者の顔面領域の比較を示す。２週間後、毒素ナノセル６を使用して局所的に塗布された顔のしわの緩和と減少がはっきりと観察され、かつ、効果が引き続き顕著であることがわかる。さらに、毒素ナノセル６を使用して顔面領域を１回だけ塗布しても、４週間後に皮膚の引き締めとしわの開きが観察された。
【０１２７】
（実施例３：多層多相ナノカプセル化ヒアルロン酸の調製と経皮送達）
本発明の前記実施例によれば、ナノカプセル化生体分子を調製する例示的な方法は、１５００ＫＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）を含む複数の高分子量生体分子を調製するために使用することができる。実施例３は、ナノカプセル化ＨＡを調製する方法、および治療および薬用化粧品適用におけるその経皮送達を説明する。
【０１２８】
（ＨＡナノセル１の調製）
前述実施例、例えば図５Ａおよび５Ｂに従って、ＨＡ生体分子でカプセル化されたナノセルを形成し、かつ各調製プロセス中のＨＡナノセルのサイズ分布を監視した。特に、ＨＡナノセル１を調製するために、１８０ｍｇのＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油液（融解のために約４０℃に加熱する）に、容器での０．１％ＨＡ（および２０ｐｐｍの銅トリペプチド−１、１０ｐｐｍのパルミトイルペンタペプチド−４、および１０ｐｐｍのヘキサペプチドアクイリン）を含む１０ｇの水溶液を加えて撹拌しながら完全に混合させた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約３０分間維持した。ＨＡナノセル１を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を、粒子サイズアナライザーを使用して測定した。図８Ａおよび表９に示すとおり、形成されたＨＡナノセル１の平均強度粒子サイズは９．９１ｎｍ（ｚ平均値）であった。さらに、粒子サイズ体積分布は７．０４ｎｍ（１０％の累積体積）から１５．３０ｎｍ（９０％の累積体積）であった。
【０１２９】
水中油構造を有する上記ＨＡナノセル１の調製は、例示目的のみであることに留意されたい。あるいは、図５ＢのＳ５０２に従って、油相層によってカプセル化された水相コアにＨＡを含めることができ、本発明は限定することを意図していない。ＨＡがナノセル１Ｂの構造、すなわち、ナノセルの水相コアに含まれる場合、それに応じて、次の繰り返し可能なカプセル化ステップを調整することにより、新しく形成された各外層の極性がカプセル化プロセス前の現在の外層の極性と異なることを確認することもできる。
【０１３０】
（ＨＡナノセル２の調製）
別の容器で、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（１０ｇ）をＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（２０ｇ）に加え、かつ約４０℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製された０．５ｇのＨＡナノセル１を混合物に加え、かつ、透明な溶液が形成されるまで約３０分間撹拌し続けた。ＨＡナノセル２を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図８Ｂおよび表９に示すとおり、形成されたＨＡナノセル２の平均強度粒子サイズは１２．９０ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は８．４７ｎｍから２３．７０ｎｍであった。
【０１３１】
（ＨＡナノセル３の調製）
上記プロセスで調製された５グラム（５ｇ）のＨＡナノセル２を、約４０℃で、約８００ｒｐｍの撹拌速度で、０．１％ＨＡ（および２０ｐｐｍの銅トリペプチド−１、１０ｐｐｍのパルミトイルペンタペプチド−４、および１０ｐｐｍのヘキサペプチドアクイリン）を含む４５ｇの水溶液に加えた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約３０分間維持した。ＨＡナノセル１を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図８Ｃおよび表９に示すとおり、ＨＡナノセル３の平均強度粒子サイズは１８．７０ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１２．５０ｎｍから２９．９０ｎｍであった。
【０１３２】
（ＨＡナノセル４の調製）
ＨＡナノセル４の調製は、上記ＨＡナノセル２の調製と同様である。特に、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（１０ｇ）をＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（２０ｇ）に加えて約４０℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製されたＨＡナノセル３（０．５ｇ）を混合物に加えた。ＨＡナノセル４を含む透明な溶液が形成されるまで約３０分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図８Ｄおよび表９に示すとおり、ＨＡナノセル４の平均強度粒子サイズは２１．９５ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１６．１０ｎｍから３３．４０ｎｍであった。
【０１３３】
（ＨＡナノセル５の調製）
ＨＡナノセル５の調製は、上記ＨＡナノセル３の調製と同様である。特に、上記プロセスで調製されたＨＡナノセル４（５ｇ）を、約４０℃で、約８００ｒｐｍの撹拌速度で、０．１％ＨＡ（および２０ｐｐｍの銅トリペプチド−１、１０ｐｐｍのパルミトイルペンタペプチド−４、および１０ｐｐｍのヘキサペプチドアクイリン）を含む４５ｇの水溶液に加えた。混合物を、ＨＡナノセル５を含む明るい青色の溶液が得られるまで約３０分間撹拌し続けた。得られた明るい青色の溶液の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図８Ｅおよび表９に示すとおり、ＨＡナノセル５の平均強度粒子サイズは２７．６５ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１７．００ｎｍから５２．８０ｎｍであった。
【０１３４】
（ＨＡナノセル６の調製）
実施例２に記載された完全ＢｏＮＴ−Ａを含む毒素ナノセル６の調製プロセスと同様に、まず、表５にリストされた成分に従ってクリーム１を調製した。さらに、調製したクリーム１を約５０℃に冷却させ、１グラムのクリーム１を、４０℃の別の容器で上記プロセスによって調製された撹拌したＨＡナノセル５に加えた。ＨＡナノセル６（ＨＡナノ製品とも呼ばれる）が形成されるまで、混合物を約３０分間撹拌し続けた。その後、形成されたＨＡナノセル６の粒子サイズとゼータ（Ｚｅｔａ）電位を測定した。図８Ｆおよび表９に示すとおり、ＨＡナノセル６の平均強度粒子サイズは２９．７２ｎｍ（ｚ平均値）であり、粒子サイズ体積分布は１８．００ｎｍから６１．１０ｎｍであり、全体の粒子サイズは１３０ｎｍ未満であった。
【０１３５】
【表９】
2020189825.tif 000010
【０１３６】
（ＨＡナノセル６の熱安定性）
【表１０】
2020189825.tif 000011
【０１３７】
【表１１】
2020189825.tif 000012
【０１３８】
同様に、上記プロセスに従って調製されたＨＡナノセル６の安定性は、様々な保存条件、例えば１８０日間でさらに試験され、前記保存条件には、凍結融解サイクル、冷蔵条件（例えば、２〜８℃）、室温（例えば、２５℃）および高温（例えば、４０℃）が含まれる。表１０に、各凍結融解サイクル中のＨＡナノセル６の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。さらに、表１１に、様々な熱条件下でのＨＡナノセル６の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。調製されたＨＡナノセル６は、６か月の試験期間中に異なる熱条件で保存される期間に（複数の凍結融解サイクル、冷蔵保存条件（例えば、２〜８℃）、室温（例えば、２５℃）および高温（例えば、４０℃））、良好な安定性と小さな寸法変化を示す。上記の様々な保存熱条件を比較することにより、ＨＡナノセル６を室温で保存され、ＨＡの生物活性の依存に十分である。
【０１３９】
（ＨＡナノセル６を使用した治療および薬用化粧品の適用）
調製されたＨＡナノセル６はエッセンスの形態であり、かつ治療および薬用化粧品適用（例えば、創傷治癒ならびにたるみおよび肌荒れ修復）で患者の異なる皮膚領域で試験される。
【０１４０】
創傷治癒のために、ＨＡナノセル６の塗布前の各患者の皮膚領域をカラー画像で記録した。その後、上記プロセスで調製されたＨＡナノセル６を含む約１ｍＬのエッセンスを、１日２回、新たに損傷した皮膚領域（もはや出血しない）に塗布した。観察は順番に行われ、それぞれ１日間、３日間、５日間記録された。図９のケース５〜７は、本発明の様々な実施例による創傷治癒のために調製されたナノカプセル化ＨＡを塗布した患者の皮膚領域の比較を示す。新たに損傷した皮膚領域については、ナノカプセル化ＨＡを含むエッセンスを１週間塗布した後、創傷領域は完全に治癒し、皮膚はきれいになり、瘢痕はなかった。
【０１４１】
たるみと肌荒れの修復については、ナノカプセル化ＨＡを含むエッセンスによる皮膚領域の治療は、創傷修復用途の治療と同様である。観察は、それぞれ１週間、２週間、３週間で連続して行われ、記録された。図９のケース８−９は、本発明の様々な実施例に従って、たるみと肌荒れの修復のために調製されたナノカプセル化ＨＡを塗布した患者の皮膚領域の比較を示す。３週間の治療後に、肌の引き締めと目に見える肌の色／色合いの増白およびしわの減少が観察されたことがわかる。
【０１４２】
本発明の前記実施例と実施例によれば、ナノカプセル化生体分子（例えば、ＢｏＮＴ−Ａ毒素ナノセルおよびＨＡナノセル）を調製するための開示された方法は、安定で生理活性を持つナノ粒子を生成することができ、それは、様々な適用で示されるように臨床的改善を示した。この改善は、コアカプセル化、または多層ナノ粒子の間、またはナノ粒子の表面に固定された活性成分（ＢｏＮＴ−ＡまたはＨＡ）の皮下細胞への迅速かつ効率的な送達によってもたらされた。
【０１４３】
ナノカプセル化生体分子を調製するための開示された方法は、ミセル形成プロセスと複数のカプセル化プロセスを組み合わせてシステムプログラムとすることができる。各親水性活性成分は、カプセル化プロセスのために親水性相に溶解することができ、各疎水性活性成分は、カプセル化プロセスのために疎水性相に溶解することができる。したがって、異なる極性および溶解度を有する様々な活性成分を、経皮バリア送達タスクのために単一の多層ナノ粒子内にカプセル化することができ、その結果、複数の機能を達成するために異なる活性成分を運ぶ多層ナノ粒子が得られ、単一のタイプの成分のみを含むナノ粒子よりも、非常に幅広い用途がある。
【０１４４】
本発明の原理および実施は、本発明の特定の実施例に関して説明されるが、実施例の前記説明は、本発明の方法および方法の中核思想の理解を助けることのみを意図している。同時に、当業者は、本発明の思想に従って特定の実施例および適用範囲を修正することができる。結論として、明細書の内容は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４５】
［付記］
［付記１］
生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法であって、
１）細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
２）細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
３）前記上澄み液を透析し、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
４）前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
５）ステップ３）および４）を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
６）前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
ことを特徴とする、方法。
【０１４６】
［付記２］
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は植物ペプトンを含む、
付記１に記載の方法。
【０１４７】
［付記３］
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも１つをさらに含む、
付記２に記載の方法。
【０１４８】
［付記４］
前記植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも１つから得られる、
付記２に記載の方法。
【０１４９】
［付記５］
ステップ２）において、前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる、
付記１に記載の方法。
【０１５０】
［付記６］
ステップ２）とステップ３）との間に、さらに、
細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ることと、
前記発酵培地を前記陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記上澄み液を混合することと、を含む、
付記１に記載の方法。
【０１５１】
［付記７］
ステップ５）は、さらに、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素の前記溶出液を透析することを含む、
付記１に記載の方法。
【０１５２】
［付記８］
前記ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素Ａである、
付記１に記載の方法。
【０１５３】
［付記９］
前記ボツリヌス神経毒素Ａの生物学的比活性は、マウスＬＤ５０を用いて測定して、１００〜４００ｕｎｉｔ／ｎｇである、
付記８に記載の方法。
【０１５４】
［付記１０］
ステップ６）の後、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む、
付記１に記載の方法。
【０１５５】
［付記１１］
前記安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、前記溶出液への添加後の前記安定剤の濃度は、総体積に基づいて１０〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲である、
付記１０に記載の方法
【０１５６】
［付記１２］
前記安定剤において、
前記溶出液に添加された後の前記エチレングリコールの濃度は、５〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記グリセリンの濃度は、１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記プロピレングリコールの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％の範囲である、
付記１１に記載の方法。
【０１５７】
［付記１３］
最内層の水相コアまたは油相コアと、
複数の水相層と、
複数の油相層と、
最外層のクリーム層と、を含み、
前記複数の水相層のそれぞれおよび前記複数の油相層のそれぞれは、前記水相コアまたは前記油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成し、
前記水相コアおよび前記水相層には、生体分子を含み、
前記生体分子は、ボツリヌス神経毒素および／またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含み、
前記油相コアおよび前記油相層には、油溶性分子を含む、
多層多相ナノ粒子。
【０１５８】
［付記１４］
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子であって、
前記ボツリヌス神経毒素の調製方法が、
１）細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
２）細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
３）前記上澄み液を透析し、かつ、前記生体分子を含む透析後の溶液を収集するステップと、
４）前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
５）ステップ３）および４）を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
６）前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
多層多相ナノ粒子。
【０１５９】
［付記１５］
前記多層多相ナノ粒子の平均サイズは１〜２００ナノメートルである、
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６０】
［付記１６］
前記水性コアまたは前記油相コアの平均サイズは１〜２００ナノメートルの範囲である、
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６１】
［付記１７］
前記最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含み、
前記水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも１つを含み、
前記油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、ステアリン酸グリセリル、Ｔｗｅｅｎ−６５、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｌａｂｒａｆａｃ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ  １３４９、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンＥ、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）およびポロキサマー、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸、ＰＥＧ−ポリ−Ｌ−ラクチド、ＰＥＧ誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも１つを含む、
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６２】
［付記１８］
前記ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの１つを含む、
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６３】
［付記１９］
前記複数の水相層の１つ以上は親水性分子を含み、および／または、前記複数の油相層の１つ以上は疎水性分子を含む、
付記１３に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６４】
［付記２０］
前記親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Ｓｎａｐ−８オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、Ｎ−アセチルカルノシン、Ｌ−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンＣ、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−８、アセチルヘキサペプチド−１、Ｌ−トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド３、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−１、ヘキサペプチド−１、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−４、パルミトイルトリペプチド−１、パルミトイルテトラペプチド−７、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、ｓｉ−ＲＮＡ、幹細胞、および治療剤などのうちの少なくとも１つを含む、
付記１９に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６５】
［付記２１］
前記疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンＥ、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンＡ、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも１つを含む、
付記１９に記載の多層多相ナノ粒子。
【０１６６】
［付記２２］
前記治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、ＡｇＮＯ３をはじめとする銀イオン、ＺｎＯをはじめとするＺｎイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも１つを含む、
付記２０または２１に記載の多層多相ナノ粒子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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