(57)【要約】【課題】脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法を提供する。【手段】Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングした担体を含む脳障害の治療用材料等である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングした担体を含むことを特徴とする脳障害の治療用材料。
【請求項２】
前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｎ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有する請求項１記載の脳障害の治療用材料。
【請求項３】
前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、下記（１）〜（３）から選択されるタンパク質を含む融合タンパク質である請求項１または２記載の脳障害の治療用材料。
（１）Ｎ−カドヘリン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンと９０％以上同一であるタンパク質。
（２）Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンの細胞外ドメインと９０％以上同一であるタンパク質。
（３）Ｎ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含むタンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項１〜３のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項５】
前記担体が、多孔質体である請求項１〜４のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項６】
前記担体が、生体材料、または、生体適合性の高分子の担体である請求項１〜５のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項７】
前記担体が、生体材料の多孔質体である請求項１〜６のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項８】
前記生体材料が、タンパク質、または、多糖である請求項６または７記載の脳障害の治療用材料。
【請求項９】
前記生体材料が、ゼラチンまたはコラーゲンである請求項６〜８のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項１０】
前記担体が、ゼラチンスポンジである請求項１〜８のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
【請求項１１】
Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングした担体を含むことを特徴とする脳の神経細胞の再生用材料。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料を脳に移植することを特徴とする脳障害の治療方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞由来の神経系細胞を前記治療用材料と同時又は前記治療用材料を脳に移植した後に脳に移植することを特徴とする請求項１２記載の脳障害の治療方法。
【請求項１４】
請求項１１記載の脳の神経細胞の再生用材料を脳に移植することを特徴とする脳の神経細胞の再生方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞由来の神経系細胞を前記再生用材料と同時又は前記再生用材料を脳に移植した後に脳に移植することを特徴とする請求項１４記載の脳の神経細胞の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低酸素虚血のような新生児期の脳障害は、乳幼児の死亡及び生涯にわたる障害の第一要因である。しかしながら、損傷した脳の組織を修復する治療方法がないのが現状である。“脳室−脳室下帯（Ｖ−ＳＶＺ）”は、出生後の脊椎動物の脳における神経幹細胞（ＮＳＣ）ニッチであり、新生ニューロン（神経細胞）を継続的に供給している（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７（非特許文献１））。とりわけ、人間の新生児期のＶ−ＳＶＺは並外れたニューロン産生能力を有しており（Ｐａｒｅｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６（非特許文献２）；  Ｓａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（非特許文献３））、このことから、Ｖ−ＳＶＺが新生児期の脳障害後の内因性の神経の再生の源である可能性が高い。
【０００３】
齧歯動物では、新生ニューロンは、移動に様々な足場を使う。障害のある成体の脳では、Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンは、障害部に向かって血管に沿って移動する（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（非特許文献４））。血管を模倣した足場を障害のある成体の脳に移植すると、新生ニューロンの障害部に向かう移動が促進される（Ａｊｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（非特許文献５）；  Ｆｕｊｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７（非特許文献６））。成体の脳と比較すると、新生児期の脳ではＶ−ＳＶＺから障害部に向かって多くの新生ニューロンが移動する（Ｃｏｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（非特許文献７））。しかしながら、障害域に向かう新生ニューロンを誘導する新生児期の足場については、まだ十分に研究されていない。
【０００４】
放射状グリア（ＲＧ：ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ）は、細胞体は脳室帯に存在して細い突起を脳軟膜表面に伸ばす細胞であり、胎生期に神経幹細胞（ＮＳＣ：ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）として機能する（Ｒａｋｉｃ，１９７２（非特許文献８））。未発達な大脳皮質では、新生ニューロンが移動のための足場として放射状グリアを用いている（Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（非特許文献９））。この過程では、放射状グリア突起が、新生ニューロンと共に接着結合（ＡＪ：Ａｄｈｅｒｅｎｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）様の構造を形成し、大脳皮質層の形成のために新生ニューロンを適切に誘導する（Ｆｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（非特許文献１０）；  Ｒａｋｉｃ，１９７２（非特許文献８））。生後すぐに、放射状グリアはアストロサイト又は上衣細胞に転換する（Ｋｒｉｅｇｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，２００９（非特許文献１１））。従って、移動性の新生ニューロンが新生児期の脳障害の後にどのようにして誘導されるのかは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kaneko et al., 2017, J. Neurochem. 141, 835-847.
【非特許文献２】Paredes et al., 2016, Science 354, aaf7073.
【非特許文献３】Sanai et al., 2011, Nature 478, 382-386.
【非特許文献４】Yamashita et al., 2006, J. Neurosci. 26, 6627-6636.
【非特許文献５】Ajioka et al., 2015, Tissue Eng. Part A 21, 193-201.
【非特許文献６】Fujioka et al., 2017, EBioMedicine 16, 195-203.
【非特許文献７】Covey et al., 2010, Dev. Neurosci. 32, 488-498.
【非特許文献８】Rakic, 1972, J. Comp. Neurol. 145, 61-83.
【非特許文献９】Kawauchi et al., 2010, Neuron 67, 588-602.
【非特許文献１０】Franco et al., 2011, Neuron 69, 482-497.
【非特許文献１１】Kriegstein and Alvarez-Buylla, 2009, Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような知見はあるものの、脳障害を治療する方法がないのが現状であった。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のとおり放射状グリアは通常は生後すぐに消滅するが、本発明者らは、放射状グリア突起が、障害のある新生児期のマウスの脳において存続することができ、出生後の“脳室−脳室下帯（Ｖ−ＳＶＺ）”由来の新生ニューロンが障害部に移動するための足場となることを発見した。この放射状グリア突起の障害誘導による持続は、生後の限られた時間内に起こるものであり、ＲｈｏＡ活性を促進するＮ−カドヘリンを介した細胞間接着によって、新生ニューロンの方向性を有する跳躍運動を促進するものであった。そこで、本発明者らは、当該知見から鋭意検討し、障害のある新生児期の脳に、Ｎ−カドヘリンを含有する足場を移植すると、同様に、Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンの移動及び成熟が促進され、歩行挙動障害が機能改善され、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法に関する、以下の［１］〜［１５］である。
［１］Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングした担体を含むことを特徴とする脳障害の治療用材料。
［２］前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｎ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有する前記［１］記載の脳障害の治療用材料。
［３］前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、下記（１）〜（３）から選択されるタンパク質を含む融合タンパク質である前記［１］または［２］記載の脳障害の治療用材料。
（１）Ｎ−カドヘリン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンと９０％以上同一であるタンパク質。
（２）Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンの細胞外ドメインと９０％以上同一であるタンパク質。
（３）Ｎ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含むタンパク質。
［４］前記融合タンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である前記［１］〜［３］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［５］前記担体が、多孔質体である前記［１］〜［４］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［６］前記担体が、生体材料、または、生体適合性の高分子の担体である前記［１］〜［５］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［７］前記担体が、生体材料の多孔質体である前記［１］〜［６］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［８］前記生体材料が、タンパク質、または、多糖である前記［６］または［７］記載の脳障害の治療用材料。
［９］前記生体材料が、ゼラチンまたはコラーゲンである前記［６］〜［８］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［１０］前記担体が、ゼラチンスポンジである前記［１］〜［９］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料。
［１１］Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングした担体を含むことを特徴とする脳の神経細胞の再生用材料。
［１２］
前記［１］〜［１０］のいずれか一項記載の脳障害の治療用材料を脳に移植することを特徴とする脳障害の治療方法。
［１３］
多能性幹細胞由来の神経系細胞を前記治療用材料と同時又は前記治療用材料を脳に移植した後に脳に移植することを特徴とする前記［１２］記載の脳障害の治療方法。
［１４］
前記［１１］記載の脳の神経細胞の再生用材料を脳に移植することを特徴とする脳の神経細胞の再生方法。
［１５］
多能性幹細胞由来の神経系細胞を前記再生用材料と同時又は前記再生用材料を脳に移植した後に脳に移植することを特徴とする前記［１４］記載の脳の神経細胞の再生方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】放射状グリアは、新生児期の脳障害後に、その突起を維持し、Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンの移動のための足場を提供する。（Ａ）実験スキーム。  （Ｂ）７ｄｐｉでのＧＦＰ（緑）及びネスチン（赤）を染色したＤｃｘ−ＥＧＦＰマウスの皮質の冠状断面。矢頭印は、ネスチン陽性突起と関連性がみられるＧＦＰ陽性新生ニューロンを指し示す（Ｂ１−Ｂ４）。  （Ｃ）野生型（ＷＴ）のマウスの皮質の冠状断面。ＥｍＧＦＰを発現するプラスミドをＶ−ＳＶＺにエレクトロポレーションし、ＧＦＰ（緑）、Ｄｃｘ（赤）、ネスチン（白）を染色した。  （Ｄ）Ｄｃｘ陽性（緑）新生ニューロン（アスタリスク）とネスチン陽性（白）放射状グリア突起（矢印）がＮ−カドヘリン（赤）を発現。  （Ｅ）アデノウイルスを感染させた、障害後の新生児期の放射状グリア突起。ＤｓＲｅｄ（赤）及びネスチン（白）を染色したＲ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの皮質の冠状断面。黄色及び白色の矢印はそれぞれ、Ｖ−ＳＶＺ及び脳梁（ＣＣ）に存在する放射状グリア突起を示す（Ｅ’）。  （Ｆ−Ｊ）放射状グリア突起にＤＮ−Ｎ−カドヘリン（Ｆ−Ｈ）又はＮ−カドヘリン−ＫＤ（Ｉ及びＪ）を発現させたことによる、新生ニューロンの放射状グリア突起への接着（Ｆ、Ｇ及びＩ）及び障害部に向かう移動（Ｆ、Ｈ及びＪ）に与える影響。ＧＦＰ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びネスチン（白）を染色したＲ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウスの皮質の冠状断面（Ｆ）。（Ｇ及びＩ）放射状グリア突起に沿う新生ニューロンの総量の比率（図Ｓ２Ｆは細胞体全体が接触する）。  （Ｋ及びＬ）新生ニューロン（Ｎ、緑）、コントロール（Ｋ）及びＤＮ−Ｎ−カドヘリン発現（Ｌ）放射状グリア突起（ＲＧＦ、赤）のＴＥＭ画像。赤矢印及び青矢頭印はＡＪ様電子密度構造および不規則な接着をそれぞれ示す。  （Ｍ）新生ニューロンと放射状グリア突起間の接着点における不規則な接触域の接触密度及び比率。スケールバーは、１０μｍ（Ｂ）、５０μｍ（Ｅ）、５μｍ（Ｃ、Ｄ及びＦ）、５００ｎｍ（Ｋ及びＬ）。  エラーバーは±標準誤差（±ＳＥＭ）を意味する。
【図２】Ｎ−カドヘリンは、放射状グリア突起に沿って移動する新生ニューロンのＲｈｏＡ活性と跳躍運動を促進する。  （Ａ）障害のある皮質切片中で、コントロールの放射状グリア突起とＤＮ−Ｎ−カドヘリンを発現するｔｄＴｏｍａｔｏ陽性突起（紫）に沿って移動するＧＦＰ陽性新生ニューロン（緑）の５ｄｐｉのタイムラプス画像。矢印及び矢頭印はそれぞれ、新生ニューロンの先導先端及び放射状グリア突起を示す。  （Ｂ−Ｇ）新生ニューロンの、移動速度（Ｂ）、放射状グリア突起接着フェーズに費やす時間の割合（Ｃ）、放射状グリア突起に接着していない新生ニューロンの割合（Ｄ）、ストライド長（Ｅ）、休息フェーズに費やす時間の割合（Ｆ）、及び、移動サイクル時間（Ｇ）。  （Ｈ及びＩ）  培養新生ニューロンのＲｈｏＡ活性（疑似カラー）のタイムラプスＦＲＥＴレシオメトリック画像（Ｈ）。拡大像を（Ｉ）に示す。  （Ｊ）ＲｈｏＡの活性化。  （Ｋ−Ｐ）  Ｎ−カドヘリン−Ｆｃストライプ上の、培養新生ニューロンの移動挙動。（Ｋ）ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性新生ニューロン（赤）のタイムラプス画像。新生ニューロンの、移動速度（Ｌ）、休息フェーズに費やす時間の割合（Ｍ）、ストライド長（Ｎ）、及び移動サイクル時間（Ｏ）。（Ｐ）Ｎ−カドヘリン−Ｆｃストライプの選好性。破線（Ｈ及びＫ）はストライプ境界を示す。  スケールバーは１０μｍ。エラーバーは±標準誤差（±ＳＥＭ）を示す。
【図３】Ｎ−カドヘリンを含有する足場は、新生児期の脳障害後のＶ−ＳＶＺ由来新生ニューロンの移動及び成熟を促進する。  （Ａ及びＢ）ＥｍＧＦＰ（緑）を染色したコントロール（Ａ）及びＤＮ−Ｎ−カドヘリン（Ｂ）群の皮質の冠状断面。これらは、８つに分かれたフィールド（縦方向に２つ及び横方向に４つのタイル）の複合図である。  （Ｃ）障害のある皮質におけるＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性細胞の数。  （Ｄ）コントロール及びＮ−カドヘリンスポンジ（Ｓｐ）に沿って移動する、培養新生ニューロンのタイムラプス画像。  （Ｅ）培養新生ニューロンの速度。  （Ｆ）実験スキーム。  （Ｇ）Ｎ−カドヘリンスポンジ（橙）内のＥｍＧＦＰ陽性（緑）Ｖ−ＳＶＺ由来Ｄｃｘ陽性（赤）新生ニューロン。  （Ｈ）Ｄｃｘ（赤）を染色した、スポンジ（黄緑）処理した野生型マウス（Ｐ２、Ｐ１４及び８ｗモデル）の皮質の冠状断面。矢印は、スポンジに沿ったＤｃｘ陽性細胞。  （Ｉ）スポンジ内のＤｃｘ陽性細胞の密度。  （Ｊ及びＪ’）ＥｍＧＦＰ（緑）とＮｅｕＮ（赤）を染色した、スポンジを移植したＰ３０野生型マウスの皮質の冠状断面。矢印はＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性ニューロン。  （Ｋ）障害のある皮質のＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性ニューロンの数（左）と分布（右）。  スケールバーは、５０μｍ（Ａ、Ｂ、Ｈ及びＪ）及び１０μｍ（Ｄ及びＧ）。エラーバーは±標準誤差（±ＳＥＭ）を意味する。
【図４】Ｎ−カドヘリンを含有する足場は、新生児期の脳障害後にＶ−ＳＶＺ由来のニューロン再生を促進することによって、機能回復を改善する。  （Ａ−Ｃ）Ｐ３０でのキャットウォーク解析。前足の、「最大接地面積」（Ａ）、「プリントエリア（足跡のプリント全体の面積）」（Ｂ）及び「ベースオブサポート（左右前肢間距離）」（Ｃ）。  （Ｄ）踏み外し（ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ）試験。Ｐ２、Ｐ１４、８ｗの障害モデルにおける左足の踏み外しの割合。  （Ｅ）実験スキーム。  （Ｆ）Ｖ−ＳＶＺ由来新生ニューロンを除外するための方略。  （Ｇ）障害のある皮質におけるＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性新生ニューロンのＰ３０での数。  （Ｈ）Ｎ−カドヘリンスポンジを移植したＡｄ−Ｃｒｅ；ＮＳＥ−ＤＴＡマウスのＦｏｏｔ−ｆａｕｌｔ試験。  エラーバーは±標準誤差（±ＳＥＭ）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の脳障害の治療用材料は、移動性の新生ニューロン、特にＶ−ＳＶＺ（脳室−脳室下帯）由来の新生ニューロンの障害部等の患部への移動及び成熟を促進することができる。本発明の脳障害の治療用材料を脳に移植することによって、脳障害、例えば、脳の障害によって損なわれた運動機能を改善することができる。
【００１３】
本発明の脳の神経細胞の再生用材料は、移動性の新生ニューロン、特にＶ−ＳＶＺ（脳室−脳室下帯）由来の新生ニューロンの障害部等の患部への移動及び成熟を促進し、神経細胞を増加させることができる。
【００１４】
以下、本発明の脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法について詳述する。
【００１５】
［脳障害の治療用材料及び脳の神経細胞の再生用材料］
本発明の脳障害の治療用材料及び脳の神経細胞の再生用材料は、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上（以下、「Ｎ−カドヘリン等」とも略称する）を、固定またはコーティングした担体であることを特徴とするものである。
【００１６】
カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれるＣａ２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する接着分子であり、Ｅ（上皮）型、Ｎ（神経）型、Ｐ（胎盤）型の３種が例として知られている。これらのカドヘリン分子は、７００〜７５０アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＮ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１６０〜２６７、２６８〜３８２、３８３〜４９７、４９８〜６０３、６０４〜７１４に相当する（数値は配列番号１に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＮ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１６０〜２６７、２６８〜３８２、３８３〜４９７、４９８〜６０３、６０４〜７１７に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。これらのＥＣドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）の相同性が高い。
【００１７】
Ｎ−カドヘリンは、カルシウム依存性細胞接着分子に属する１４０ｋＤ程度のタンパク質である。Ｎ−カドヘリンは同種のカドヘリンの相互作用およびカテニンを介したアクチン細胞骨格との結合により細胞接着において重要な役割を担っており、発生分化段階に関与している。Ｎ−カドヘリンは神経、心筋、骨格筋、血管内皮など様々な組織に発現する。Ｎ−カドヘリンは、網膜発生、体節形成および神経突起成長などの多くの発生プロセスにおいて、重要な分子シグナルを提供することにより、神経システム発生の重要な制御因子として機能していることが報告されている（Ｍｉｙａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４５；６３１−５、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００８：６５；３８０９−２１）。
【００１８】
Ｎ−カドヘリン及び前記融合タンパク質を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、Ｎ−カドヘリンを、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。
【００１９】
Ｎ−カドヘリン及び前記融合タンパク質に関し、そのリコンビナント・タンパク質を作製するための方法、及び当該分子をコードする遺伝子を取得する方法は、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、上記で挙げた参考書籍を参照することができるが、特にこれを限定しない。Ｎ−カドヘリン遺伝子は、既にヒト、マウス等の動物で単離・同定され、その塩基配列が、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能である（ＮＣＢＩアクセス番号：ヒトＮＭ＿００１７９２、マウスＮＭ＿Ｍ３１１３１、Ｍ２２５５６等）。そのため、当業者であれば、Ｎ−カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｎ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。また、Ｎ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡは、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／］等からも購入することができる。使用する遺伝子としては、治療対象と同種の動物由来のものが好ましい。しかし、異種動物由来のものを用いてもよい。
【００２０】
Ｎ−カドヘリン及び前記融合タンパク質のリコンビナント・タンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、ＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。また、転写・発現させる遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ  Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。
【００２１】
上記のリコンビナント・タンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、細胞外領域をコードする、ＥＣ１〜ＥＣ５ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定している（Ｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：１４７，１９９０）ため、少なくともＥＣ１を含み、それ以外のドメインの１個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。
【００２２】
前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質は、Ｎ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有することが好ましい。
【００２３】
また、前記Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、下記（１）〜（３）から選択されるタンパク質を含む融合タンパク質であることが好ましい。
（１）Ｎ−カドヘリン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンと８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上）同一であるタンパク質。
（２）Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン、又は、アミノ酸配列がＮ−カドヘリンの細胞外ドメインと８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上）同一であるタンパク質。
（３）Ｎ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含むタンパク質。
【００２４】
前記融合タンパク質としては、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質であればよく、例えば、イムノグロブリン（免疫グロブリン）のＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナント・タンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合タンパク質は、ポリ乳酸やポリジオキサン等の合成高分子、コラーゲンなどの生体由来材料、アパタイト等のセラミック及びチタン合金やステンレス鋼等の金属などからなる生体材料への吸着に優れるため、本発明の実施において好適である。
【００２５】
イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Ｎａｇａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）、当該方法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。
【００２６】
なお、当該リコンビナント・タンパク質の作製法の一例として、既報告論文を挙げることができる（Ｙｕｅ  ＸＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１０；  ３１：５２８７−９６）。
【００２７】
また、ヒトのＮ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトのＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ  Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）や、マウスのＮ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、マウスのＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  マウス  Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ  Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）が市販されている。
【００２８】
前記担体としては、生体材料や生体適合性の高分子であることが好ましい。生体材料としては、特に限定されないが、タンパク質、多糖が挙げられる。タンパク質としては、ゼラチン、コラーゲン等が挙げられる。多糖としては、キトサン、キチン等が挙げられる。生体適合性の高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸等が挙げられる。また、担体として、インジェクタブルゲルに用いられる材料を用いてもよい。
【００２９】
また、前記担体の形状や性状は特に限定されないが、例えば、ファイバー、ゲル、及び、多孔質体が挙げられ、特に多孔質体が好ましい。前記多孔質体は、神経細胞が多孔質内を遊走することから、スポンジであることが好ましい。
【００３０】
前記担体の製造方法は特に限定されず、多孔質体の場合は、例えば、ゲル状の生体材料を凍結乾燥して得ることができる。ゼラチンスポンジの場合、ゼラチンを凍結乾燥して得ることができる。
【００３１】
なお、ゼラチンスポンジの作製法の一例として、本発明者らの既報告論文を挙げることができる（Ａｊｉｏｋａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ  ２１，１９３−２０１）。
【００３２】
多孔質体の大きさは特に限定されないが、脳障害領域に移植できる大きさが望ましい。
【００３３】
多孔質体の形状は特に限定されないが、神経細胞が遊走できる形状が望ましい。
【００３４】
Ｎ−カドヘリン等を担体に固定またはコーティングする方法は特に限定されず、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。接着性分子がタンパク質性やペプチド性の分子、又は糖鎖を含む高分子化合物等である場合、担体に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、担体が多孔質体の場合、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とする接着性分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、ゼラチンスポンジ等の多孔質体に接触させ、数時間から一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた多孔質体が得られる。好ましくは、蒸留水やＰＢＳ等で数回洗浄し、ＰＢＳ等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。
【００３５】
また、接着性分子に前もって人為的に抗原性分子が付加・融合させている場合は、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもでき、接着性分子を効率的に基材表面に修飾することができるため、より好ましい。この場合、特異抗体を前もって担体に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、接着性分子にＩｇＧのＦｃ領域タンパク質を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、担体に前もって修飾しておく抗体としては、ＩｇＧのＦｃ領域を特異的に認識するものを使用することができる。接着性分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、担体に前もって修飾することにより、使用することができる。
【００３６】
本発明の実施において、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる２種類以上を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々のタンパク質の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基き、修飾すればよい。
【００３７】
上記のＮ−カドヘリン等の溶液の濃度は、当該タンパク質の吸着量及び／又は親和性、さらには当該タンパク質の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ程度までの濃度範囲とし、好ましくは、０．１〜２００μｇ／ｍＬ程度、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは３〜２０μｇ／ｍＬである。
【００３８】
本発明の脳障害の治療用材料で治療する脳障害は特に限定されず、例えば、低酸素性脳症、低酸素性虚血性脳症、虚血性脳障害、物理的な傷害による脳障害等が挙げられる。
【００３９】
［脳障害の治療方法及び脳の神経細胞の再生方法］
本発明の脳障害の治療方法及び脳の神経細胞の再生方法は、本発明の上記材料を、脳に移植することを特徴とするものである。移植の方法は特に限定されないが、神経系の細胞、好ましくはＶ−ＳＶＺ（脳室−脳室下帯）由来の新生ニューロンが障害部等の患部に移動できるよう、例えば、新生ニューロンが存在する領域と患部とが繋がれるように本発明の上記材料を移植すればよい。また、本発明の上記材料を事前あるいは多能性幹細胞由来の神経系細胞などと同時に脳内に移植することによって、本発明の上記材料が移植された神経系細胞の足場となり神経系細胞の移動及び障害部等患部の再生を促進することもできる。このとき多能性幹細胞由来の神経系細胞などを上記材料よりも先に脳内に移植すると脳障害部に前記細胞を効率的に移動させることが難しくなるので好ましくない。前記多能性幹細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前記神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア細胞が挙げられる。
【００４０】
移植する上記材料の量は、障害部の大きさ等に合わせて有効量を移植すればよい。
【００４１】
上記材料の脳への移植は、公知慣用の外科的手段を用いればよく、例えば切開によって脳を露出させた後、患部に上記材料を移植すればよい。また、上記材料がインジェクタブルゲルのような注入可能な材料の場合には、患部に局所注入してもよい。
【００４２】
また、上記材料は、脳に移植する際に、清潔な状態で移植することが望ましい。
【００４３】
移植の対象は脳障害の患者であればよく、ヒトに限らず、ヒト以外の動物、例えば、ほ乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等であってもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。なお、以下において「％」とあるのは、特に断りのない限り、すべて質量基準である。
【００４５】
＜実験動物＞
生動物に関する実験は全て名古屋市立大学のガイドライン及び規則に従って実施し、名古屋市立大学学長の承認を得た。動物は、特定病原体除去施設内で、制御環境（２３±１℃、１２時間の明暗周期を８時丁度に変更）下でチップ状の床材を並べたケージ内で、水及び食べ物（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）へのアクセスは自由にして飼育した。野生型（ＷＴ）ＩＣＲ及びＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスは、日本ＳＬＣ社から購入した。次のトランスジェニックマウス系統を使用した。Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ストック番号７９１４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｎｅｕｒｏｇ２−ｄ４Ｖｅｎｕｓマウス（Kawaue et al., 2014, Dev. Growth Differ. 56, 293-304）、ＮＳＥ−ＤＴＡマウス（Imayoshi et al., 2008, Nat. Neurosci. 11, 1153-1161; Kobayakawa et al., 2007, Nature 450, 503-508）、及び、Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウス（Gong et al., 2003, Nature 425, 917-925）（ＭＭＲＲＣ＿０００２４４）。Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＮＳＥ−ＤＴＡ系統は、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ遺伝的背景がある。Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウス系統は、Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏリポーターマウス系統（同系接合体）と相互交配されている。遺伝子型は、マウスのテールカット（ｔａｉｌ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）でＰＣＲによって確認した。Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ系統における、アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ及びＡｄ−ＣＭＶ−ＤＮ−Ｎ−カドヘリン−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ）によるｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘカセットのＣｒｅ介在リコンビネーションは、恒久的なｔｄＴｏｍａｔｏの発現を普遍的に引き起こした。ＮＳＥ−ＤＴＡ系統における、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅによるｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘカセットのＣｒｅ介在リコンビネーションは、ＮＳＥ遺伝子プロモーターの制御のもと、恒久的なＤＴＡの発現を引き起こした。これはニューロンの子孫を除去する。マウスは各実験において、同齢に合わせた。離乳前に、同腹子をその母マウス又は仮親マウスと共に飼育した。離乳後、性別で分けて、集団で飼育した（１ケージ当たり７匹まで）。成体マウスを使用する実験では、８週齢の健康な雄マウスを使用した。他の動物実験では、健康な雄及び雌のマウスを両方使用した。同腹子を無作為に試験群にあてがった。
【００４６】
＜Ｖ−ＳＶＺ細胞の培養＞
新生児期のＶ−ＳＶＺを、ＷＴ  ＩＣＲ  Ｐ０−１の子マウスから切り出し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離させた。雄及び雌の子マウスを両方用いた。細胞は、４０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＬ−１５培地（ＧＩＢＣＯ）で二度洗った後、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩシステム（Ｌｏｎｚａ）を用いて２μｇのプラスミドＤＮＡを導入した。前記導入した細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光）でけん濁し、１５分、３７℃でインキュベートし、凝集させて後、凝集体をブロック（直径１５０〜２００μｍ）に切断し、５０％マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス）のＬ−１５培地と混合し、ディッシュ上に固定した。前記ディッシュを、加湿インキュベータで、３７℃、５％ＣＯ２で保存した。前記凝集体を含むゲルを、２％のＢ−２７上清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含む無血清のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ）で４８時間培養した。
【００４７】
＜脳障害＞
生後２日目（Ｐ２）、Ｐ４、Ｐ１４及び８週齢のマウスに、公知の方法（Ajioka et al., 2015, Tissue Eng. Part A 21, 193-201）で、凍結大脳皮質障害を作製した。簡潔には、マウスをイソフルランの自然吸入によって深麻酔し、頭皮切開で頭頂骨を露出させた。Ｐ２及びＰ４、Ｐ１４、及び８週齢のマウスそれぞれにおいて、液体窒素で冷却した金属のプローブ（直径１．５ｍｍ）を、３０、６０及び１２０秒間、右の頭蓋骨に定位的に置いた（ブレグマの０．５ｍｍ前と１．２ｍｍ横）。頭皮をすぐに縫合し、マウスを飼育ケージに戻した。この工程は、再現性よく、深さ５００−６００μｍの障害を生じさせた。
【００４８】
Ｐ５マウスに低酸素虚血障害を誘発させた。術中、マウスはイソフルランの自然吸入によって深麻酔であった。解剖顕微鏡下で右の総頚動脈を焼灼した後、１時間の回復時間後に、プラスチック製の箱の中で、３７℃で湿気のある環境で全身低酸素（酸素／窒素、８／９２％）を２０分間行った。この工程後に、マウスを飼育ケージに戻した。
【００４９】
＜アデノウイルスベクターとＲＮＡｉ構成＞
ｐＥＮＴＲ４−ＤＮ−Ｎ−カドヘリン−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅを作製するために、ｐＬＶ−ＣＭＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ由来のＩＲＥＳ−Ｃｒｅフラグメント（Robel et al., 2011, J. Neurosci. 31, 12471-12482）とｐＣＡＧ−ＭＣＳ２−ＤＮ−Ｎ−カドヘリン由来のＤＮ−Ｎ−カドヘリンフラグメント（Nuriya and Huganir, 2006, J. Neurochem. 97, 652-661）をＰＣＲで増幅し、ｐＥＮＴＲ４−Ｈ１（理研製）のそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩサイトにインサートした。アデノウイルスベクターを用いたＮ−カドヘリンノックダウン（ＫＤ）実験のために、マウスのＮ−カドヘリン遺伝子の標的配列を、ＥｍＧＦＰを含む改変Ｂｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にインサートした。コントロールとして、ｌａｃＺ標的配列を公知の方法（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）で用いた。ｐＥＮＴＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−ｌａｃＺ及び−Ｎ−カドヘリンを生成するために、ｐＥＮＴＲ−ＥｍＧＦＰ−ＲｆＡプラスミドにおけるＥｍＧＦＰをエンコードするフラグメントを、ＢｓｐＭＩサイト間に移動させ、ＰＣＲで増幅させたｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）由来のｔｄＴｏｍａｔｏフラグメントを挿入した。Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を次のアデノウイルスベクターを生成するために用いた。ｐＡｄ−ＣＭＶ−ＤＮ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ、ｐＡｄ−ＣＭＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、及び、ｐＡｄ−ＣＭＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−ｌａｃＺ。取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、これらのベクターをＨＥＫ２９３Ａ細胞に導入し、アデノウイルスの粒子を産生した。アデノウイルスの粒子は、超遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＰ１００ＷＸ、日立）で、２５，０００ｇで２時間、４℃、次いで３０，０００ｇで３時間、４℃、塩化セシウム密度勾配遠心して濃縮した。Ａｄ−ＣＭＶ−ＤＮ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅのコントロールとして、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いた。
【００５０】
エレクトロポレーションを用いたＮ−カドヘリンノックダウン実験のために、ＤＮＡカセット（ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−ｌａｃＺ）を、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、改変ｐＣＡＧＧＳベクターに複製した。他のノックダウン実験（ＦＡＫ−ＫＤ及びＬ１−ＣＡＭ−ＫＤ）のために、マウスのＦＡＫ又はＬ１−ＣＡＭ遺伝子の標的配列を改変Ｂｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ発現ベクターに挿入した。そのＤＮＡカセットを、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、改変ｐＣＡＧＧＳベクターに複製した。全てのプラスミドは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製し、その配列はＤＮＡシークエンシングで確認した。
【００５１】
＜アデノウイルスベクターの注入＞
放射状グリア細胞は脳室表面に存在し、軟膜表面に向かって長い放射状の突起を伸ばすことから、リポーターマウスの皮質表面への少量のＡｄ−Ｃｒｅの注入によって、突起を介して逆行性感染が引き起こされる。よって、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−介在リコンビネーションは、新生児期の脳内において放射状グリア細胞の特異的かつ継続的なラベリングをもたらす（Merkle et al., 2007, Science 317, 381-384）。放射状グリア細胞を、Ｐ０  Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｄｃｘ−ＥＧＦＰ、Ｄｃｘ−ＥＧＦＰ、又は、Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを用いて、公知の方法（Merkle et al., 2007, Science 317, 381-384.）をいくつか改変した方法によって、ラベルした。簡潔には、Ｐ０マウスに、低体温法（５分）又はイソフルランの自発吸引によって麻酔をかけ、頭蓋支持器によって定位装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のプラットフォームに配置した。頭皮切開で頭頂骨を露出させた後、次の定位座標；ブレグマから前方＋０．５ｍｍ、側方＋１．０ｍｍ、及び、頭蓋骨表面から深さ＋０．３ｍｍ；を用いて、２０ｎＬのアデノウイルスの懸濁液を大脳皮質の表面に真上から注入した。注入には、斜角の引張加工したガラスマイクロピペット（Ｗｉｒｅ  Ｔｒｏｌｌ  ５μｌ、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。注入後、頭皮をすぐに縫合し、母親のもとに戻し、授乳が再開されるまで監視した。ニューロンの成熟を調べるために、６０ｎＬのアデノウイルスの懸濁液を、次の定位座標；ブレグマから前方＋０．８ｍｍ、＋０．５ｍｍ、＋０．２ｍｍ、側方＋１．０ｍｍ、及び、頭蓋骨表面から深さ＋０．３ｍｍ；を用いて、上記のようにＰ０マウスに注入し、障害域の範囲を超えて、皮質内の放射状グリア細胞をラベルした。Ｖ−ＳＶＺ細胞をラベルするために、１μＬのアデノウイルスの懸濁液（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ）を、次の定位座標；ラムダ縫合から前方＋１．８ｍｍ、側方＋１．１ｍｍ、及び、頭蓋骨表面から深さ＋２．０ｍｍ；を用いて、上記のようにＰ０  ＮＳＥ−ＤＴＡ又はＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの側脳室に注入した。ラベル効率は、次のものであった。コントロール（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ）はＰ２でネスチン陽性突起の９７．７±０．５％（ｎ＝マウス３匹）；ＤＮ−Ｎ−カドヘリンはＰ２で９８．０±０．６％（ｎ＝マウス３匹）；ｐ＞０．０５、独立ｔ検定；コントロール（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ）はＰ９で９９．２±０．２％（ｎ＝マウス４匹）；ＤＮ−Ｎ−カドヘリンはＰ９で９９．０±０．２％（ｎ＝マウス３匹）；ｐ＞０．０５、独立ｔ検定；コントロール（Ａｄ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−ｌａｃＺ）はＰ９でネスチン陽性突起の９８．７±０．４％（ｎ＝マウス４匹）；  Ｎ−カドヘリン−ＫＤはＰ９で９７．９±  ０．４％（ｎ＝マウス４匹）；ｐ＞０．０５、独立ｔ検定。
【００５２】
＜生後のエレクトロポレーション＞
Ｐ０  ＩＣＲ、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ、及び、ＮＳＥ−ＤＴＡマウスのＶ−ＳＶＺ細胞を、公知の方法（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）をいくつか改変した方法でラベルした。簡潔には、マウスに、低体温法（５分）又はイソフルランの自発吸引によって麻酔をかけ、頭蓋支持器によって定位注入装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のプラットフォームに固定した。ＥｍＧＦＰ発現ｐＣＡＧＧＳプラスミド（子ネズミあたり７．５μｇ／μＬ）及び０．０１％ファストグリーンを含む溶液を右半球の側脳室（ラムダ縫合の前方１．８ｍｍ、側方１．２５ｍｍ、及び、深さ２．０ｍｍ）に注入し、エレクトロポレーター（ＣＵＹ−２１ＳＣ、ネッパジーン）と鉗子型電極（ＣＵＹ６５０Ｐ７）を用いて電子パルス（７０Ｖ、５０ｍｓｅｃ、４回）によってＶ−ＳＶＺ細胞に導入した。Ｖ−ＳＶＺラベルした子ネズミに、無作為に凍結大脳皮質障害及びスポンジ移植を施した。マウスに同日（Ｐ０）にアデノウイルス注入とエレクトロポレーションの両方を実施した場合は、アデノウイルスを先に注入し、その後、少なくとも８時間後にエレクトロポレーションを実施した。ｐＣＡＧＧＳ−ＥｍＧＦＰエレクトロポレーションによるＶ−ＳＶＺ細胞のラベル効率は、Ｐ２での試験群（コントロール、Ｖ−ＳＶＺ細胞の６．３±１．２％、ｎ＝マウス３匹；障害、Ｖ−ＳＶＺ細胞の６．３±１．７％、ｎ＝マウス３匹；ｐ＞０．０５、独立ｔ試験）又はＰ３０での試験群（Ａｄ−Ｃｒｅ；コントロール、２．７±０．１％、ｎ＝マウス３匹；Ａｄ−Ｃｒｅ；ＮＳＥ−ＤＴＡ、２．５±０．０％、  ｎ＝マウス３匹；ｐ＞０．０５、独立ｔ試験）で統計的な違いはなかった。ｐＣＡＧＧＳ−ＥｍＧＦＰエレクトロポレーションによるＤＣＸ陽性細胞のラベル効率（ＧＦＰ・ＤＣＸ二重陽性／ＤＣＸ陽性細胞）は、Ｐ９での障害のある皮質において、ＤＣＸ陽性細胞の４．０±０．７％（ｎ＝マウス５匹）であった。ノックダウン試験（Ｎ−カドヘリン−ＫＤ、ＦＡＫ−ＫＤ及びＬ１−ＣＡＭ−ＫＤ）のために、０．０１％ファストグリーンを含有するプラスミド溶液（子マウス当たり７．５μｇ／μＬ）を、右半球の側脳室（ラムダ縫合の前方１．８ｍｍ、側方１．２５ｍｍ、及び、深さ２．０ｍｍ）に注入し、エレクトロポレーター（ＣＵＹ−２１ＳＣ）と鉗子型電極（ＣＵＹ６５０Ｐ７）を用いて背腹方向に電子パルス（７０Ｖ、５０ｍｓｅｃ、４回）を発生させた。
【００５３】
＜免疫ブロット法＞
免疫ブロット分析は、公知の方法（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）で行った。ｍｉＲＮＡｓ（Ｎ−カドヘリン、ＦＡＫ、及び、Ｌ１−ＣＡＭ）のノックダウン効率を確認するために、ｃＤＮＡ（Ｎ−カドヘリン、ＦＡＫ、及び、Ｌ１−ＣＡＭ）を発現するプラスミド、及び、ｍｉＲＮＡを、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共導入した。ｐＣＡＧ−ＭＣＳ２−ＨＡ−Ｎ−カドヘリン（Nuriya and Huganir, 2006, J. Neurochem. 97, 652-661）は提供されたものを用いた。ｐＥＧＦＰＣ１−マウス  ＦＡＫ（Itoh et al., 2010, Cytoskeleton (Hoboken) 67, 297-308.）は提供されたものを用いた。ｐＣＭＶ６−マウス  Ｌ１−ＣＡＭは、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。導入から４８時間後に、細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、０．０１％  ＳＤＳ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン）に溶解した。ニューレグリン−１α／１β／２の発現を確認するために、皮質組織をＷＴ  ＩＣＲ  Ｐ６（障害後４日）マウスから切り離し、溶解バッファーでホモジナイズした。その溶解物を手短に超音波処理し、遠心分離できれいにした。タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。その膜を、５％スキムミルクを含む０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩中インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ）と共に室温で１時間インキュベートした。シグナルは、冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ３０００ｍｉｎｉ、富士フィルム）を用いて、増強ルミナール系化学発光ウエスタンブロッティング試薬（ＧＥヘルスケア）で検出及び測定した。一次抗体は次のものを用いた。ラット抗ＨＡ抗体（１：１，０００、Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗Ｌ１−ＣＡＭ抗体（１：１，０００、Ａｂｃａｍ）、ラット抗ＧＦＰ抗体（１：１，０００、ナカライテスク）、ウサギ抗ニューレグリン−１α／１β／２抗体（１：１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び、マウス抗アクチン抗体（１：１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。シグナル発現強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて算出した。
【００５４】
＜免疫組織染色＞
免疫組織染色は、公知の方法（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）で実施した。簡潔には、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ）で経心腔的灌流することによって脳を固定し、４℃で一晩中、同じ固定液でポストフィックスした。浮遊の６０μｍ厚の冠状断面を、ｖｉｂｒａｔｏｍｅセクショニングシステム（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を用いて作製した。当該断面を、ブロッキング溶液（１０％正常ロバ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び０．２％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で室温で４０分、一次抗体と共に４℃で一晩、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識第二抗体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で２時間インキュベートした。抗ネスチン抗体のために、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ニワトリＩｇＹ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）を用いた。スポンジ移植試験において（図３Ｊ，３Ｋ及び４Ｇ）、２００μｍ厚の冠状断面を、ブロッキング溶液（１０％正常ロバ血清及び０．５％トリトンＸ−１００のＰＢＳ）中でインキュベートする前に、１００％メタノールで３０分、−３０℃、アセトンで３０分、−３０℃、０．３％Ｈ２Ｏ２のメタノールで２時間、室温、及び、５０％メタノールで１５分、室温で処理した。シグナル増幅は、ビオチン標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）とＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行い、ＴＳＡ蛍光システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてシグナルを可視化した。Ｍａｓｈ１染色のために、断面をアセトンで６０秒、氷上で処理した。抗ＤｓＲｅｄ抗体を、抗Ｐａｘ６、抗ＥｒｂＢ４、抗Ｏｌｉｇ２抗体と併せて二重染色するために、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂフラグメント  ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。抗ＮｅｕＮ抗体を、抗パルブアルブミン（ＰＶ）、抗カルレチニン（ＣＲ）、抗ＧＡＤ６７抗体と併せて二重染色するために、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂフラグメント  ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。次の一次抗体を用いた。ウサギ抗Ｄｃｘ（１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、モルモット抗Ｄｃｘ（１：３，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヤギ抗Ｄｃｘ抗体（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗ＧＦＰ（１：５００、Ｎａｃａｌａｉ）、ニワトリ抗ネスチン（１：１，０００、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１：１，０００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウス抗ＮｅｕＮ抗体（１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＣＲ（１：３，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＰＶ（１：２，０００、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗Ｍａｓｈ１（１：１００、ＢＤ）、ウサギ抗Ｔｂｒ２（１：２００、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗Ｐａｘ６（１：１００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、マウス抗Ｎ−カドヘリン（１：２００、ＢＤ）、マウス抗グリア線維性酸性蛋白（ＧＦＡＰ）（１：５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗Ｏｌｉｇ２（１：２００、ＩＢＬ）、マウス抗ＧＡＤ６７（１：８００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＥｒｂＢ４（１：３００、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＦＡＫ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び、マウス抗Ｌ１−ＣＡＭ（１：１，０００、Ａｂｃａｍ）。モルモット抗Ｄｌｘ２抗体（１：３，０００）（Kuwajima et al., 2006, J. Neurosci. 26, 5383-5392）は提供された。核染色のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：３，０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
【００５５】
ニューロン前駆体、放射状グリア突起、成熟ニューロン、及び、放射状グリア突起、スポンジ、又は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）線維と関連がある移動性新生ニューロンの画像は、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）と２０×及び４０×の対物レンズを用いて、１μｍ間隔でスキャンすることによって取得した。図３（Ａ及びＢ）において、８つに分かれたフィールド（縦方向に２つ及び横方向に４つのタイル）の複合画像は、２０×の対物レンズで、ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）のタイル−スキャン機能を用いて取得した。Ｄｃｘ陽性、ＣＲ陽性、ＰＶ陽性、ＧＡＤ６７陽性、又は、ＮｅｕＮ陽性ニューロンを特徴づけるため、１μｍ間隔でスキャンすることによって、皮質内におけるシグナルの共局在を確認した。Ｖ−ＳＶＺ内のＥｍＧＦＰ陽性細胞、及び、障害のある皮質内の新生ニューロンの量を測定するために、Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒシステム（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、立体解析学的に細胞を数えた。アデノウイルスの注入及びエレクトロポレーション後に、マウスに凍結大脳皮質障害及びスポンジ移植を無作為に施した。ニューロン前駆体及び移動性新生ニューロンの解析のために、６番目ごとに６０μｍ厚の冠状断面内の細胞の実際の数を数え、その後、数えた細胞の総和を６倍にして総量を見積もった。放射状グリア突起の長さ及び形態を調べるために、３つの連続する６０μｍ厚の冠状断面を解析した。新生ニューロン及び放射状グリア突起との関係性を調べるために、先の研究（Shikanai et al., 2011, Commun. Integr. Biol. 4, 326-330）に従って、「関連性」を「新生ニューロンと放射状グリア突起との間が２μｍ未満」と定義した。成熟ニューロンの解析のために、障害のある感覚及び運動皮質における全てのＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性細胞（Ｍ２／Ｍ１／Ｓ１ＨＬ／Ｓ１ＦＬ／ＭＰｔＡ／ＬＰｔＡ／Ｓ１Ｔｒ）（Paxinos et al., 2007, J. Comp. Neurol. 145, 61-83.）を解析した。２番目ごとに６０μｍ厚の冠状断面内の細胞の実際の数を数え、その後、数えた細胞の総和を２倍にして総量を見積もった。スポンジ移植試験（図３Ｋ及び４Ｇ）において、２００μｍ厚の冠状断面を、障害域にスポンジを保存するために用いた。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性放射状グリア細胞の形態を、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて再現及び定量した。
【００５６】
＜透過型電子顕微鏡＞
コントロール又はＤＮ−Ｎ−カドヘリン発現アデノウイルスを感染させたＰ９マウスの脳を、２．５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）及び２％ＰＦＡの０．１Ｍ  ＰＢ（ｐＨ７．４）で経心腔的灌流によって固定した。摘出した脳組織を、ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で２００μｍの冠状断面に切断した。断面を２％ＯｓＯ４の同じバッファーで２時間、４℃で処理した。その後、脳組織を段階的なエタノール濃度で脱水し、プロピレンオキサイド中に置いて、確実に重合させるため、７２時間、６０℃でＤｕｒｃｕｐａｎ樹脂に埋め込んだ。半薄断面（１．５μｍ厚）を連続して切り出して１％トルイジンブルーで染色し、その後、目的の断面を光学顕微鏡で確認した。その後、高分解能顕微鏡（ＵＣ６、Ｌｅｉｃａ）とダイアモンドナイフを用いて、超極薄断面（６０−７０ｎｍ）を半薄断面から切り出し、２％酢酸ウラニルの蒸留水で１５分、及び、改変したＳａｔｏの鉛溶液で５分、染色した。断面を透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１４００ｐｌｕｓ、ＪＥＯＬ）で解析した。ＡＪ様電子密度の吸着構造及び不規則な接着の長さは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）定量した。新生ニューロンは、その暗い細胞質と、多くの遊離型リボソームと高電子密度核によって認識し、放射状グリア細胞は、その低電子密度の核、及び、明るい細胞質とグリコーゲン果粒及び多くの中間径フィラメントによって認識した。解析した細胞の数は次のとおりであった。コントロールでは２匹のマウスから２１細胞、ＤＮ−Ｎ−カドヘリンでは、２匹のマウスから１７細胞。
【００５７】
＜障害のある脳切片のタイムラプスイメージング＞
タイムラプスイメージングのために、Ｐ０のＲ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウスへアデノウイルスベクターを注入し、新生児期の障害後４−５日後に、脳切片を作製した。簡潔には、ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を用いて、脳を冠状切片（２００μｍ厚）に切り出した。切片はｓｔａｇｅ−ｔｏｐ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置き、イメージング中は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；  １ｍＬ／ｍｉｎ；  １２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び２０ｍＭ  グルコースを含有；  ｐＨ７．４；  ３８℃で保存；９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で通気）での連続還流下で保存した。ガリウム砒素リン検出器を備える共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて、６〜１６時間、１０分毎に、Ｚ−ｓｔａｃｋ画像（３−５μｍステップサイズで、４つのｚセクション）を保存した。移動性新生ニューロンと放射状グリア突起との接着時間は、移動プロセス時間における突起接着時間の比率として評価した。保存した画像中における放射状グリア突起に沿った新生ニューロンの、スピード、ストライド長、休息フェーズ、及び、移動サイクルを測定するために、皮質中の単極又は双極形の新生ニューロンをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｍａｎｕａｌ  ｔｒａｃｋｉｎｇプラグイン）を用いてトレースした。突起伸長の速度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した。少なくとも６０分間連続的に追跡できた新生ニューロンの全てを当該解析に用いた。移動サイクルの評価のために、跳躍運動の少なくとも１サイクルを連続的に追跡できた新生ニューロンの全てを用いた。「休息」フェーズの細胞を、その細胞体が１２μｍ／ｈよりも遅く移動する細胞と定義した。図２Ａにおいて、数字は最初のフレームからの時間（分）を示している。
【００５８】
＜Ｎ−カドヘリン−Ｆｃスポンジの作製＞
公知の方法（Ajioka et al., 2015, Tissue Eng. Part A 21, 193-201）を改変して、ゼラチン（ＧＥ）スポンジを作製した。５０μＬの３％  ＧＥ  ｂｅＭａｔｒｉｘ  ゼラチンＬＳ−Ｈ（新田ゼラチン）を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、−２０℃で凍結させた。その後、凍結したＧＥサンプルを４００ｒｐｍで遠心分離（ＶＣ−９６Ｗ、タイテック）しながら２５℃で凍結乾燥した。その後、凍結乾燥したＧＥサンプルを、２５ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（和光）の９０％アセトンで、室温で一晩、架橋した。再蒸留水で５回洗った後、ＧＥスポンジをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ）で３時間インキュベートした。その後、ＧＥスポンジをブロック（１．２×１．２×１．２ｍｍ３）に切断し、１０μｇ／ｍＬのＮ−カドヘリン−Ｆｃ（ＩｇＧ−ＦｃにマウスＮ−カドヘリンの細胞外ドメインが結合）又はＦｃ溶液（Yue et al., 2010, Biomaterials 31, 5287-5296）で、４℃、２４時間で結合させた。
【００５９】
＜Ｎ−カドヘリンＰＥＴ線維の作製＞
直径２４μｍのＰＥＴ線維（Inoue et al., 2009, J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 20, 721-736.）を東レ社から入手した。ＰＥＴ線維をＮ−カドヘリン−Ｆｃ（ＩｇＧ−ＦｃにマウスＮ−カドヘリンの細胞外ドメインが結合）又はＦｃ溶液（Yue et al., 2010, Biomaterials 31, 5287-5296）で、１時間、３７℃で被覆し、その後、ＰＢＳで５回濯いだ。
【００６０】
＜Ｎ−カドヘリンスポンジ又は線維の移植＞
Ｎ−カドヘリン−Ｆｃスポンジ又はコントロールのＦｃ−スポンジ、又は、Ｎ−カドヘリンＦｃ−ＰＥＴ線維又はコントロールのＦｃ−ＰＥＴ線維を、公知の方法（Ajioka et al., 2015, Tissue Eng. Part A 21, 193-201）で移植した。簡潔には、凍結障害の導入後３日目又は１０日目に、イソフルランの自然吸入によってマウスに麻酔した。障害のある頭頂骨を露出させるために、以前の切れ目を切断して、ピンセットで開いた。Ｎ−カドヘリン−Ｆｃ又はＦｃスポンジ（１．２×１．２×１．２ｍｍ３）を、ピンセットで、穴の中に置いた。ＰＥＴ線維の移植では、約１．２×１．２×１．２ｍｍ３のＮ−カドヘリン−Ｆｃ又はコントロールのＦｃ線維（長さ１．２ｍｍ）の密度の線維を、ピンセットで穴に埋め込んだ。移植後は、スポンジを頭頂骨で覆い、頭皮を閉じた。移植後、マウスは回復のために暖かいヒーターの上に置かれた。
【００６１】
＜Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養＞
ストライプアッセイによって、コントロールのＦｃストライプとＮ−カドヘリン−Ｆｃストライプの間の境界と交差する単一の新生ニューロンの移動挙動を解析することができた。第一ストライプのために、１０μｇ／ｍＬ  Ｎ−カドヘリン−Ｆｃと、３μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）のＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）とを混ぜ合わせた。第二（コントロール）ストライプのために、１０μｇ／ｍＬ  Ｆｃと、３μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）のＨＢＳＳとを混ぜ合わせた。両方のストライプ溶液を３０分間、４℃で穏やかに攪拌しながらプレインキュベーションした後、１００μＬの第一ストライプ溶液を、ガラス底３５ｍｍのペトリ皿に置かれたシリコンマトリックス（幅５０μｍ）に注入した。３７℃で３０分インキュベートした後、皿とマトリックスを５００μＬのＨＢＳＳで濯ぎ、マトリックスを慎重に取り除いた。その皿を、１００μＬの第二ストライプ溶液で被覆した。３７℃で３０分インキュベートした後、皿をＨＢＳＳで３回洗浄した。新生児期のＶ−ＳＶＺを、ＷＴ  ＩＣＲ  Ｐ０−１の子マウスから切り出し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離させた。細胞を、４０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＬ−１５培地（ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄し、その後、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩシステム（Ｌｏｎｚａ）を用いて２μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＧＧＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｉＲ−Ｎ−カドヘリン又は  −ＬａｃＺ  ｍｉＲＮＡ）を導入した。前記導入した細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光）でけん濁し、凝集させた後、凝集体をブロック（直径１５０〜２００μｍ）に切断し、５０％マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス）のＬ−１５培地と混合し、ストライプ上に固定した。
【００６２】
Ｎ−カドヘリン−Ｆｃスポンジ又はＮ−カドヘリン−Ｆｃ線維と共に神経培養するために、Ｖ−ＳＶＺ細胞の凝集体を、５０％マトリゲル中の、Ｎ−カドヘリン−Ｆｃスポンジ又はコントロールのＦｃスポンジ、又は、Ｎ−カドヘリン−Ｆｃ線維又はコントロールのＦｃ線維の隣に置いた。前記ディッシュを、加湿インキュベータで、３７℃、５％ＣＯ２で保存した。前記凝集体を含むゲルを、２％のＢ−２７上清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含む無血清のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ）で４８時間培養した。
【００６３】
タイムラプスビデオ録画を、２０×の乾燥対物レンズを用いて、Ｃｏｌｉｂｒｉ発光ダイオード光システムを備える倒立型光学顕微鏡（Ａｘｉｏ−Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて得た。画像は２４時間で３分ごと（図３Ｄ、３Ｅ）又は５分ごと（図２Ｋ−２Ｐ）に自動的に得た。移動速度はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。少なくとも６０分間連続的に追跡できたであろう新生ニューロンの全てを当該解析に用いた。移動サイクルの評価のために、跳躍運動の少なくとも１サイクルを連続的に追跡できたであろう新生ニューロンの全てを用いた。「休息」フェーズの細胞を、その細胞体が１２μｍ／ｈよりも遅く移動する細胞と定義した。図２Ｋ，３Ｄにおいて、数字は最初のフレームからの時間（分）を示している。
【００６４】
＜免疫細胞化学＞
カバーガラス上の培養ニューロンをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で濯ぎ、室温で３０分間、４％ＰＦＡの０．１Ｍ  ＰＢで固定した。ブロッキング溶液（１０％正常ロバ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び０．２％トリトンＸ−１００のＰＢＳ）中で４０分間プレインキュベートした後、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次の一次抗体を用いた。ウサギ抗Ｄｃｘ（１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１：１，０００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及び、マウス抗Ｎ−カドヘリン（１：２００、ＢＤ）。マウス抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体（１：１，０００）（Seki and Arai, 1991, Neurosci. Res. 12, 503-513）は東京医科大学石龍徳博士より提供された。核染色のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：３，０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。多重ラベルした培養細胞を、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で解析し、定量のために、各カバーガラスから４０×対物レンズ下で、３つよりも多くランダムフィールドを選択した。ＰＳＡ−ＮＣＡＭ・ｔｄＴｏｍａｔｏ二重陽性新生ニューロンの細胞体を追跡し、Ｎ−カドヘリンの発現強度をＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて算出した。各定量では、少なくとも３回の独立した試験を実施した。
【００６５】
＜ＦＲＥＴイメージング＞
培養した移動性新生ニューロンにおけるＲｈｏＡ活性のＦＲＥＴイメージングを、公知の方法（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）で実施した。ＲｈｏＡ用のＦＲＥＴプローブ（Ｒａｉｃｈｕ−１２９８Ｘ）（Yoshizaki et al., 2003, J. Cell Biol. 162, 223-232）を、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩシステムを用いたエレクトロポレーションによって、培養Ｖ−ＳＶＺ由来新生ニューロンに導入した。ＦＲＥＴプローブを発現する新生ニューロンのタイムラプスイメージングは、４０×の水浸対物レンズで、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。ＦＲＥＴ比（ＦＲＥＴ／ＣＦＰ強度）を算出し、最終的な画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアのｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅ機能（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて生成した。ＲｈｏＡ活性の基準値は、先導シャフト（ｌｅａｄｉｎｇ  ｓｈａｆｔ）における基礎活性を平均化し、各細胞の平均を１．０と定義することによって算出した。目的の円領域（ＲＯＩ）にある近い方の先導突起のＲｈｏＡ活性の程度（＝ＲｈｏＡｐｒｏｘ）は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアのＲｅｇｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ機能を用いて測定し、各フレームにおける活性の基準値に基準を合わせた（ＲｈｏＡ活性＝ＲｈｏＡｐｒｏｘ−１）。プローブを発現する二極性新生ニューロンの全てを、各実験で解析した。独立した３つの試験を実施した。図２Ｈ及び２Ｉにおいて、数字は最初のフレームからの時間（分）を示している。
【００６６】
＜行動試験＞
マウスに、定量的神経学的行動試験をＰ３０で実施した。試験群では、体重に統計学的な差異はなかった。持ち上げられた六角格子状のワイヤ上での歩行挙動を解析した（Ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ試験）。当該試験は、正確に四肢を配置することに関連した運動機能を評価するものであり、足底からの感覚のフィードバックも組み込まれている（Barth et al., 1990, Behav. Brain Res. 39, 73-95）。Ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ試験は、２３±１℃で実施した。簡潔には、マウスを、持ち上げられた４０ｍｍ幅の六角格子状のワイヤに置き、自由に歩き回らせた。四肢のいずれか１つが格子の穴に落ちて、マウスが滑る又は落下した場合に、ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔとして踏み外しを記録した。５分間、各肢のｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔの数を別々に数えて、その後、障害側（左側）の前肢及び後肢の踏み外しと四肢の踏み外しの合計の比率をパーセンテージで算出した。試験は２回行い、数値を平均化した。
【００６７】
歩行解析を、自動歩行解析システムであるＮｏｌｄｕｓ  ＣａｔＷａｌｋ  ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、説明書に従って実施した。簡潔には、２３℃±１℃の暗い環境で、マウスに、緑色の光源で照らしたガラスの通路を歩かせた。マウスの足底がガラス面に接地したとき、接地により圧力のかかった地点以外が完全に内面に反射する。ガラス上の各足の接触点が照らされ、これを高速度ビデオカメラで録画した。各試験において録画された足跡を、ＣａｔＷａｌｋ  ＸＴ  １０．５ソフトウェアを用いて解析し、一連のパラメータを生成した。各解析には、各マウスごとに少なくとも３回の成功した連続性の歩行の録画を用い、その平均を記録した。
【００６８】
＜実験計画＞
マウス、細胞、及び、実験の繰り返しの数は、各図の説明に記載してある。Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒシステムを用いた、Ｖ−ＳＶＺ内のＥｍＧＦＰ陽性細胞、及び、障害のある皮質中の新生ニューロンの数の立体学的測定を除き、ランダム化のための特別な方策は実施しておらず、盲検化を用いていない。サンプルサイズの見積には、統計学的計算を用いていない。実験においてサンプルサイズは、公知の研究（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532; Fujioka et al., 2017, EBioMedicine 16, 195-203）に従って決定した。解析には、凍結障害により作製された大脳皮質障害の深さが５００−６００μｍの動物を採用した。
【００６９】
＜定量及び統計学的解析＞
全てのデータは±標準誤差（±ＳＥＭ）を示す。２つの群を、両側検定で対応ある又は独立のｔ検定、ウィルコクソンの符号順位検定、及び、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて比較した。複数群の比較は、一元配置分散分析の後に、テューキーの多重比較検定又はダネットの検定を実施するか、又は、クラスカル・ウォリス検定の後に、スティール−ドゥワスの多重比較検定又はスティール検定を実施した。正常性の評価には、シャピロ−ウィルク検定を用いた。０．０５未満のＰ値は、統計学的に重要であると見做した。使用した統計学的検定及び統計学的パラメータは下記のとおりである。図１Ｇ及び１Ｉ、（Ｇ）ｎ＝それぞれマウス３匹；独立ｔ検定、＊ｐ＜０．０５；（Ｉ）ｎ＝それぞれマウス４匹；独立ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図１Ｈ及び１Ｊ、（Ｈ）コントロール、ｎ＝マウス４匹；  ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス５匹；  対応のある及び独立のｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５；（Ｊ）コントロール、ｎ＝マウス４匹；Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝マウス４匹；対応のある及び独立のｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１．  図１Ｍ、コントロール、ｎ＝２１細胞；  ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝１７細胞；  独立ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｂ、２Ｅ、及び２Ｆ、コントロール、ｎ＝８匹のマウスから４２細胞；ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝１２匹のマウスから６０細胞；マン・ホイットニーのＵ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｃ、コントロール、ｎ＝８匹のマウスから６３細胞；ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝１２匹のマウスから１０７細胞；マン・ホイットニーのＵ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｄ、コントロール、ｎ＝８匹のマウスから６３細胞；  ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝１２匹のマウスから１０７細胞；  フィッシャーの正確確率検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｇ、コントロール、ｎ＝８匹のマウスから３９細胞；ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝１０匹のマウスから３７細胞；マン・ホイットニーのＵ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｊ、ｎ＝９細胞、３回の独立した試験、対象のあるｔ検定、＊ｐ＜０．０５．  図２Ｌ、コントロール、ｎ＝１５細胞（５回の独立した試験）；  Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝２７細胞  （６回の独立した試験）、対象のあるｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｍ；コントロール、ｎ＝１５細胞（５回の独立した試験）；Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝２７細胞（６回の独立した試験）、対象のあるｔ検定及びウィルコクソンの符号順位検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｎ、コントロール、ｎ＝１６細胞  （５回の独立した試験）；  Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝２６細胞（６回の独立した試験）、ウィルコクソンの符号順位検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｏ、コントロール、ｎ＝１６細胞（５回の独立した試験）；Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝２３細胞（５回の独立した試験）、ウィルコクソンの符号順位検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図２Ｐ、コントロール、ｎ＝２７細胞（５回の独立した試験）；  Ｎ−ｃａｄ−ＫＤ、ｎ＝１８細胞（４回の独立した試験）、カイ二乗検定とイエッツの連続修正．  ＊ｐ＜０．０５．  図３Ｃ、コントロール、ｎ＝マウス６匹；  ＤＮ−Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス７匹；  独立ｔ検定、＊ｐ＜０．０５．  図３Ｅ、コントロール−非接着、ｎ＝１４細胞；  コントロール−接着、ｎ＝１９細胞；  Ｎ−ｃａｄ−非接着、ｎ＝１９細胞；  Ｎ−ｃａｄ−接着、ｎ＝２８細胞；３回の独立した試験；独立ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図３Ｉ、Ｐ２（３ｄｐｉ）、コントロール、ｎ＝マウス７匹、Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス７匹；Ｐ１４（３ｄｐｉ）、コントロール、ｎ＝マウス６匹、Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス５匹；  ８ｗ（３ｄｐｉ）、コントロール、ｎ＝マウス７匹、Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス７匹；  Ｐ２（１０ｄｐｉ）、コントロール、ｎ＝マウス４匹、Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス５匹；  独立ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５；  コントロール、Ｐ２（３ｄｐｉ）ｖｓＰ１４（３ｄｐｉ）又は８ｗ（３ｄｐｉ）、一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定、＃＃＃ｐ＜０．００５；  Ｎ−ｃａｄ、（Ｐ２［３ｄｐｉ］ｖｓＰ１４［３  ｄｐｉ］、８ｗ［３ｄｐｉ］、又はＰ２［１０ｄｐｉ］、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００５）、（Ｐ１４［３ｄｐｉ］ｖｓ８ｗ［３ｄｐｉ］、§§ｐ＜０．０１）；一元配置分散分析後にテューキー検定．  図３Ｋ、コントロール、ｎ＝マウス１０匹；  Ｎ−ｃａｄ、ｎ＝マウス８匹；  左側、独立ｔ検定；  右側、カイ二乗検定、＊ｐ＜０．０５．  図４Ａ-４Ｃ、ｎ＝マウス１０匹；一元配置分散分析後にテューキー検定（（Ａ）の右側（クラスカル・ウォリス検定の後に、スティール−ドゥワス検定）を除く）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図４Ｄ、Ｐ２モデル、コントロール、ｎ＝マウス１１匹；  障害、ｎ＝マウス１０匹；  障害＋コントロール−ｓｐ、ｎ＝マウス１３匹；  障害＋Ｎ−ｃａｄ−ｓｐ、ｎ＝マウス１４匹、クラスカル・ウォリス検定の後に、スティール−ドゥワス検定；  Ｐ１４及び８ｗモデル、ｎ＝各マウス７匹、一元配置分散分析後にテューキー検定．  ＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５．  図４Ｇ、コントロール、ｎ＝５；  ＮＳＥ−ＤＴＡ、ｎ＝４；  独立ｔ検定、＊ｐ＜０．０５．  図４Ｈ、コントロール、ｎ＝マウス１１匹；  ＮＳＥ−ＤＴＡ、ｎ＝マウス７匹；独立ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００５。用いた統計学的試験、標準誤差（±ＳＥＭ）及びＰ値を含む全ての統計学的データは、本文中、図の説明、及び図中に示す。エラーバーの値は、±標準誤差（±ＳＥＭ）を示す。同腹子を無作為に試験群に割り当てた。
【００７０】
（結果）
＜新生児期の放射状グリア細胞は、脳障害後にその突起を持続する＞
凍結大脳皮質障害を生後２日目（Ｐ２）に実施し、放射状グリア突起の消失のダイナミクスを解析した。反対側（非障害側）では、ネスチン陽性放射状グリア突起の密度が徐々に低下し、従来の知見（Kriegstein and Alvarez-Buylla, 2009, Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184）と一致した。一方、同側（障害側）の皮質における放射状グリア突起の密度は、障害後（ｄｐｉ）７日目で最も高く、その後は減少したが、全ての時点で逆側よりも有意に高かった。また、放射状グリア突起は、非障害脳よりも、障害脳の方が長かった。これらの結果は、新生児期の脳障害が、放射状グリア突起の持続を促進することを示唆している。
【００７１】
後期に生じた障害が放射状グリア突起に与える影響を調べるために、Ｐ４、Ｐ１４、及び、８週齢（８ｗ、成体）のマウスに凍結大脳皮質障害を作製し、７日後に放射状グリア突起を解析した。ネスチン陽性突起はＰ４モデルで維持されたが、Ｐ４モデルにおける突起密度はＰ２モデルと比べて有意に低かった。Ｐ１４及び８ｗ障害モデルでは、はっきりとしたネスチン陽性放射状グリア突起は観察されなかった。これらの結果は、放射状グリア突起が、障害後に維持されるという潜在力を新生児期の期間にのみ有することを示唆している。培養脳切片のタイムラプスイメージングによって、退縮した放射状グリア突起は、障害への応答で再成長し得ることがわかった。一貫して、Ｐ１４及び８ｗモデルにおいて、障害脳におけるこれらの突起は、非障害脳の突起と比べて有意に長かった。放射状グリア突起は、低酸素及び虚血性障害後の新生児期のマウスの脳にも見られた。まとめると、これらの結果は、新生児期の脳には、障害後に放射状グリア突起を持続させる潜在力があることを示している。
【００７２】
＜新生児期の放射状グリア細胞は、脳障害後にＶ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンための移動性の足場を与える。＞
Ｐ２で凍結障害を作製し、障害後のニューロン新生をＰ９で調査した（図１Ａ）。典型的な移動性新生ニューロンの形態を持ったダブルコルチン（Ｄｃｘ陽性）細胞の多くは、障害部の周囲に現れた（図１Ｂ）。少なくとも一部はＶ−ＳＶＺ由来である（図１Ｃ）これらの新生ニューロンは、ネスチン陽性突起と関係していることが観察された（図１Ｂ−１Ｄ）。放射状グリア突起を特異的に標識するために、Ｃｒｅをエンコードするアデノウイルス（Ａｄ−Ｃｒｅ）を、Ｐ０のＲ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウス（Merkle et al., 2007, Science 317, 381-384）の大脳皮質表面に注入した（図１Ａ、１Ｅ）。ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光発光は、放射状グリア細胞マーカーであるＰａｘ６、ネスチン、及び、ＥｒｂＢ４を発現する、突起を持つ細胞をはっきりと標識した（Schmid et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4251-4256）。これらの細胞の細胞体は、アストロサイト及び希突起膠細胞と同様に、Ｖ−ＳＶＺ及び脳梁（ＣＣ）で観察された（図１Ｅ’）。Ｄｃｘ−ＥＧＦＰ陽性新生ニューロンの５５．５％±３．１％が（障害部に向かって）放射状に移動し、これらの移動性新生ニューロンの９６．０％±０．３％には、ｔｄＴｏｍａｔｏ・ネスチン二重陽性の放射状グリア突起との関連が見られた。特に、Ｄｃｘ−ＥＧＦＰ陽性新生ニューロンの３４．８％±４．７％は、細胞体全体が放射状グリア突起に沿っていた（図１Ｆ、１Ｇ）。これらの結果は、新生児期の脳障害後に放射状に障害部に向かって移動するＶ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンは、放射状グリア突起と関連することを示唆している。
【００７３】
細胞間接着の調節に関与するタンパク質であるＮ−カドヘリンは、胎生期の大脳皮質における放射状グリアで誘導される新生ニューロンの移動に関与している（Kawauchi et al., 2010, Neuron 67, 588-602）。本発明者らは、新生児期の放射状グリア突起及び障害後の移動性新生ニューロンの両方において、Ｎ−カドヘリンが発現することを観察した（図１Ｄ）。放射状グリアのＮ−カドヘリンの機能を不活性化するために、放射状グリア突起に、Ｎ−カドヘリンの不活性体（dominant negative form）（ＤＮ−Ｎ−カドヘリン）とＣｒｅをエンコードするアデノウイルスベクターをＰ０で感染させた（図１Ａ及び１Ｆ）。放射状グリア内で発現されたＤＮ−Ｎ−カドヘリンは、７ｄｐｉでは、放射状グリアの形態及び密度に影響を与えなかった。しかしながら、ＤＮ−Ｎ−カドヘリンを発現した放射状グリア突起と関連する新生ニューロンの比率は、比較対象群と比べて、有意に低かった（図１Ｆ、１Ｇ）。さらに、コントロールのマウスと比べて、新生ニューロンの密度は、ＤＮ−Ｎ−カドヘリン−ウイルス感染領域において有意に減少し、非感染領域では増加した（図１Ｈ）。このことは、新生ニューロンは、その移動のために、ＤＮ−Ｎ−カドヘリンが無い放射状グリア突起を好むことを示唆している。アデノウイルスのノックダウン（ＫＤ）ベクターを用いて放射状グリアのＮ−カドヘリン発現を特異的に下方制御したときもまた、放射状グリア突起と関連する新生ニューロンの比率、及び、新生ニューロンの密度は減少した（図１ｌ及び１Ｊ）。これらの結果は、放射状グリアのＮ−カドヘリンは、障害後の放射状グリア突起が関連した新生ニューロンの移動に関与していることを示している。胎生期における放射状グリア突起に関連した新生ニューロンの移動に関与するＦＡＫ及びＬ１−ＣＡＭをノックダウン（Tonosaki et al., 2014, PLoS ONE 9, e86186; Valiente et al., 2011, J. Neurosci. 31, 11678-11691）したところ、新生ニューロンと放射状グリア突起との関係に影響を与えなかった。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析によって、新生ニューロンと放射状グリア突起とが直接的に接着することが明らかとなり、ＡＪ様の電子密度構造があちこちに観察された（図１Ｋ−１Ｋ”、赤矢印）。放射状グリアにおけるＤＮ−Ｎ−カドヘリン発現によって、そのような構造の密度は減少し、新生ニューロンの細胞膜と放射状グリアの細胞膜とが並走しない不規則な接着の比率が増加した（図１Ｌ−１Ｍ、青矢印）。これらの観察結果は、放射状グリアにおけるＮ−カドヘリンは、新生児期の脳において、放射状グリア突起と移動性新生ニューロンとの適切な細胞接着を形成することに関与することを示唆している。これらの結果は、新生児期の放射状グリアは、脳障害後に障害部に向かって移動するＶ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンと関連していることを示している。
【００７４】
＜Ｎ−カドヘリンは、放射状グリア突起に沿って移動する新生ニューロンのＲｈｏＡ活性化および跳躍運動を促進する＞
新生ニューロンが障害部に向かって移動するための足場として放射状グリア突起を用いるかどうかを調べるために、Ｒ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｄｃｘ−ＥＧＦＰマウスの培養脳切片において、新生ニューロンを４−５ｄｐｉでライブイメージングで観察した。Ｄｃｘ−ＥＧＦＰ陽性の新生ニューロンは、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性の放射状グリア突起に沿って、その先導突起を伸ばし、その細胞体を跳躍挙動で障害部の方向に移動させた（図２Ａ及び２Ａ’）。ＤＮ−Ｎ−カドヘリンを発現する放射状グリアに沿って移動する新生ニューロンは、移動速度が有意に遅く（図２Ａ及び２Ｂ）、頻繁に放射状グリア突起から離れた（図２Ａ、２Ａ’及び２Ｃ）。組織学的解析（図１Ｇ、１ｌ）と一致して、突起に接していない新生ニューロンの比率は、ＤＮ−Ｎ−カドヘリン群において、有意に上昇した（図２Ｄ）。これらの結果は、放射状グリアのＮ−カドヘリンは、放射状グリア突起に沿って障害部に向かう新生ニューロンの効率的かつ連続的な移動に関与していることを示唆している。
【００７５】
新生ニューロンの移動速度は、細胞体のストライド長、細胞体のストライド頻度、及び、休止の長さ（休息フェーズ）によって決定される（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）。放射状グリアにおけるＤＮ−Ｎ−カドヘリンの発現によって、細胞体のストライド長は有意に減少し、休息フェーズの期間及び新生ニューロンの移動における１移動周期時間は増加した（図２Ｅ−２Ｇ）。これらの結果から、障害のある新生児期の脳における放射状グリア突起を足場にしたニューロンの移動は、Ｎ−カドヘリンを介してニューロンの細胞体ストライド長及びニューロンの跳躍運動の頻度を増加させることを示唆している。
【００７６】
移動性新生ニューロンの細胞体の近位に位置する腫脹部位におけるＲｈｏＡシグナリングはその跳躍運動を促進することが知られていることから（Ota et al., 2014, Nat. Commun. 5, 4532）、本発明者らは次に、Ｎ−カドヘリン−Ｆｃをコーティングしたストライプアッセイにおいて蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）イメージングを用いて、そのＲｈｏＡ活性を観察した。移動性新生ニューロンの腫脹部位におけるＲｈｏＡ活性は、Ｎ−カドヘリンを含有する足場上に移動した際に有意に増加した（図２Ｈ−２Ｊ）。
【００７７】
Ｎ−カドヘリンは、様々なシグナル分子と相互作用することができる。次に、新生ニューロンのＮ−カドヘリンもまた、Ｎ−カドヘリンを含有する足場上への新生ニューロンの移動に関与するかどうか調べるために、Ｎ−カドヘリンノックダウンプラスミドを培養新生ニューロンに導入し、その移動挙動をストライプアッセイで解析した（図２Ｋ−２Ｐ）。新生ニューロンがＮ−カドヘリン−Ｆｃストライプに入ると、新生ニューロンの移動速度が有意に増加した（図２Ｋ及び２Ｌ）。移動速度の増加は、細胞体のストライド長の増加及び各移動サイクルにおける休息フェーズにかかる時間の減少の両方に起因すると考えられる（図２Ｋ−２Ｏ）。このことは、放射状グリアにおけるＤＮ−Ｎ−カドヘリン発現の影響（図２Ａ−２Ｇ）と一致していた。新生ニューロンがＮ−カドヘリン−Ｆｃストライプの境界に到達すると、コントロールの細胞のほとんどはその先導突起の方向を変え、Ｎ−カドヘリン−Ｆｃをコーティングした領域に残存した。この挙動を示した細胞の割合は、Ｎ−カドヘリンノックダウンによって有意に減少した（図２Ｋ及び２Ｐ）。このことは、新生ニューロンのＮ−カドヘリンは、Ｎ−カドヘリンを含有する足場上への方向性を持った新生ニューロンの移動を持続するのに役立つことを示唆している。これらの結果は、Ｎ−カドヘリンが、放射状グリア突起に沿って移動する新生ニューロンのＲｈｏＡ活性化及び跳躍運動を促進することを示している。
【００７８】
＜Ｎ−カドヘリンを含有する足場は、新生児期の脳障害後にＶ−ＳＶＺ由来のニューロンの移動及び再生を増加させることによって、神経学的機能の回復を促進する＞
新生児期のＶ−ＳＶＺは、新しく産生された成熟ニューロンを生理的条件において大脳皮質に供給し（Le Magueresse et al., 2011, J. Neurosci. 31, 16731-16747）、脳障害後には障害のある線条体及び皮質に供給する（Yang et al., 2007, Ann. Neurol. 61, 199-208; Yang et al., 2008, J. Comp. Neurol. 511, 19-33）。大脳皮質の凍結障害によって、神経前駆細胞の数は増加した。障害後に、Ｄｌｘ２・Ｄｃｘ二重陽性であってＴｂｒ２・Ｄｃｘ二重陽性ではない新生ニューロンの数は増加した。このことは、ＧＡＢＡ作動性の新生ニューロンは、障害のある皮質に補充されることを示唆している。さらに、新生児期の凍結大脳皮質障害によって、ＥｍＧＦＰ・ＮｅｕＮ二重陽性の成熟ニューロンの数が有意に増加し、そのほとんどがＧＡＤ６７陽性であり、Ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ（ＰＶ）陽性又はＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ（ＣＲ）陽性はそれほど多くはなかった。このことは、これらがＶ−ＳＶＺ由来の皮質介在ニューロンであることを示している。これらのニューロンの６０％よりも多くは、皮質層ＩＶ−ＶＩに存在した。皮質内のＶ−ＳＶＺ由来の成熟ニューロンの数は、新生児期の放射状グリアにおいてＤＮ−Ｎ−カドヘリンを発現することによって有意に減少した（図３Ａ−３Ｃ）。このことは、放射状グリア突起が、障害後の新生児期の皮質における、Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンの移動及び成熟に寄与することを示している。
【００７９】
次に、Ｎ−カドヘリンを含有する人工足場が、脳障害後のＶ−ＳＶＺ由来のニューロンの移動を促進するかどうかを試験するために、Ｆｃ又はＮ−カドヘリン−Ｆｃを結合したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）線維及びゼラチンスポンジ（それぞれコントロール又はＮ−カドヘリン線維／スポンジ）を開発した。Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンの移動速度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮ−カドヘリン線維及びスポンジと接触させた時に増加した（図３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ）。そこで、本発明者らは、Ｎ−カドヘリン線維又はスポンジを、障害のある皮質に移植した（図３Ｆ）。コントロール繊維とＮ−カドヘリン線維とでは、Ｄｃｘ陽性の新生ニューロンの密度に大きな違いはなかったが、Ｎ−カドヘリンスポンジで処理したマウスでは、スポンジ内の新生ニューロンの密度が増加した（図３Ｇ−３Ｉ）。このことは、当該試験条件においては、Ｎ−カドヘリンスポンジがｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｎ−カドヘリン線維よりも、新生ニューロンの移動をより効率的にサポートすることを示唆している。
【００８０】
Ｎ−カドヘリンスポンジが、放射状グリアが欠乏する高齢の脳において新生ニューロンの移動を促進するかどうかを調べるために、本発明者らは、Ｐ１４又は８ｗで凍結大脳皮質障害を作製し、Ｎ−カドヘリンスポンジを移植した（図３Ｆ）。コントロールのスポンジの群では、障害部に到達した新生ニューロンの数は、Ｐ２と比べてＰ１４及び８ｗモデルでは有意に少なく、このことは、放射状グリア突起が、新生ニューロンが障害部に向かって移動するための重要な足場であるという考えを支持するものであった（図３Ｈ及び３Ｉ）。Ｎ−カドヘリンスポンジにおける新生ニューロンの絶対数は、Ｐ２モデルが最も高く、また、加齢と共に減少したが（図３Ｈ及び３Ｉ）、新生ニューロンの移動の促進に与えるＮ−カドヘリンスポンジの影響は、高齢の脳においてより明白であった。
【００８１】
さらに、Ｐ２の障害モデルに１０ｄｐｉでＮ−カドヘリンスポンジを移植し、３ｄｐｉの移植群と、スポンジ内の新生ニューロンの数を比較した（図３Ｆ）。４ｄｐｔで、脳内の新生ニューロンの密度は、Ｐ５で移植した方がＰ１２で移植した方よりも高くなった（図３Ｉ）。このことは、早期のスポンジの移植が、新生児期の脳障害後の新生ニューロンの補充において、もっとも有益な効果があることを示唆している。
【００８２】
Ｎ−カドヘリンスポンジ移植によるニューロンの再生への影響を調べるために、Ｖ−ＳＶＺ細胞をエレクトロポレーションによって標識し、その結果を２８ｄｐｉで解析した（図３Ｆ、３Ｊ及び３Ｋ）。障害部内及びその周囲のＶ−ＳＶＺ由来のＮｅｕＮ陽性成熟ニューロンの数は、Ｎ−カドヘリンスポンジで処理したマウスの方が、コントロールのスポンジで処理したマウスよりも有意に多かった（図３Ｊ及び３Ｋ）。さらに、皮層の上層におけるＶ−ＳＶＺ由来のＮｅｕＮ陽性のニューロンの比率は、Ｎ−カドヘリンスポンジの移植によって有意に増加した（図３Ｋ）。これらの結果は、Ｎ−カドヘリンを含有する足場が、新生児期の脳障害後のＶ−ＳＶＺ由来のニューロンの再生を促進することを示唆している。
【００８３】
最後に、Ｎ−カドヘリンスポンジ移植が機能回復に与える影響を２８ｄｐｉで調べた。自然な歩行挙動を解析するために、キャットウォーク解析を使用した。脳障害は、前肢の接地面積（「最大接地面積」及び「プリントエリア（足跡のプリント全体の面積）」）の減少と、左右前肢間の幅（「ベースオブサポート」）の増加を引き起こした（図４Ａ−４Ｃ）。コントロールのスポンジの移植は、これらの歩行挙動を悪化させなかった（図４Ａ−４Ｃ）。このことは、スポンジ移植が悪影響を何も与えないことを示唆している。注目すべきことに、Ｎ−カドヘリンスポンジの移植によって、これらの歩行パラメータの不良が改善された（図４Ａ−４Ｃ）。このことは、Ｎ−カドヘリンスポンジが、新生児期の脳障害後のニューロンの再生に加えて、機能回復も促進することを示唆している。
【００８４】
次に、ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ試験（Barth et al., 1990, Behav. Brain Res. 39, 73-95）を行った。凍結大脳皮質障害は、Ｐ２障害モデルにおいて、２８ｄｐｉで、踏み外し（foot-fault）率の左右非対称性を引き起こした。これは、Ｎ−カドヘリンスポンジの移植で回復したが、コントロールのスポンジでは回復しなかった（図４Ｄ）。また、Ｎ−カドヘリンスポンジの移植によって、Ｐ１４モデルでは神経学的スコアが明らかに改善したが、８ｗモデルでは改善しなかった（図４Ｄ）。従って、成体の脳であってもＮ−カドヘリンスポンジによって新生ニューロンの移動は促進され得るが、機能回復が得られる日齢はより限定されるようである。
【００８５】
さらに、Ｖ−ＳＶＺ由来の内因性のニューロンの再生が機能回復に寄与することを調べるために、Ｐ０の神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）−ジフテリアトキシンフラグメントＡ（ＤＴＡ）マウス（Imayoshi et al., 2008, Nat. Neurosci. 11, 1153-1161; Kobayakawa et al., 2007, Nature 450, 503-508）の脳室内にＡｄ−Ｃｒｅを注入し、ニューロン系の子孫が除去された（図４Ｅ−４Ｇ）。Ｎ−カドヘリンスポンジ移植による踏み外し率の改善は、当該Ａｄ−Ｃｒｅ感染ＮＳＥ−ＤＴＡマウスでは見られなかった（図４Ｈ）。これらの結果は、Ｎ−カドヘリンを含有する足場による新生児期の脳障害後の機能回復の促進は、Ｖ−ＳＶＺ由来の新生ニューロンの再生が寄与することを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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