(57)【要約】【課題】  エレウテロシドB及びEをあわせて１質量％以上含むエゾウコギ抽出物の製造方法、AMP活性化タンパクキナーゼ（AMPK）発現量が高いエゾウコギ抽出物の製造方法、または流動性の高いエゾウコギ抽出物の製造方法を提供すること。【解決手段】  エゾウコギを水及び水−アルコール混合液のいずれかの第１抽出溶媒で抽出し第１抽出液と固形分とを回収する第１抽出工程、  固形分を水−アルコール混合液及び水のいずれかの第２抽出溶媒で抽出し第２抽出液を回収する第２抽出工程、及び  第１抽出液と第２抽出液とを混合する混合工程、を有し、  第２抽出溶媒は第１抽出溶媒が水であるときは水−アルコール混合液であり、第１抽出溶媒が水−アルコール混合液であるときは水である、エゾウコギ抽出物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エゾウコギを水及び水−アルコール混合液のいずれかの第１抽出溶媒で抽出して第１抽出液と固形分とを回収する第１抽出工程、
固形分を水−アルコール混合液及び水のいずれかの第２抽出溶媒で抽出して第２抽出液を回収する第２抽出工程、及び
第１抽出液と第２抽出液とを混合して混合液を得る混合工程、
を有し、
第２抽出溶媒は、第１抽出溶媒が水であるときは水−アルコール混合液であり、第１抽出溶媒が水−アルコール混合液であるときは水である、
エゾウコギ抽出物の製造方法。
【請求項２】
水−アルコール混合液におけるアルコールが、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール及び２−メチル−２−プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
水−アルコール混合液におけるアルコール濃度（ｖ／ｖ）が１０％〜９０％である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
水抽出の温度が２０℃〜１２０℃である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
水−アルコール混合液による抽出の温度が２０℃〜８５℃である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
混合工程において得られた混合液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程、
をさらに有する請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
混合工程において得られた混合液又は濃縮工程において得られた濃縮液を乾燥して粉末を得る粉末化工程、
をさらに有する請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
第１抽出溶媒が水であり、第２抽出溶媒が水−アルコール混合液である請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エゾウコギ抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エゾウコギはウコギ科の植物であり、北海道、サハリン、千島、朝鮮半島、中国北部、シベリアに分布していることが知られている。エゾウコギの根皮は五加皮として抗炎症、鎮痛作用が知られ、葉は茶として抗ストレス作用が知られ、その他にも滋養強壮作用などが知られている。
【０００３】
エゾウコギ中にはエレウテロシド（eleutheroside）A、エレウテロシドB（別名syringin）、エレウテロシドE(別名liriodendrin、syringaresinol di-O-β-D-glucoside)、クロロゲン酸（chlorogenic acid）などが含まれており、これらがエゾウコギの薬効を担うとされている。
【０００４】
エゾウコギの薬効の恩恵を受けるためエゾウコギエキスが市販されている。エゾウコギエキスは通常、原料のエゾウコギを水、エタノール又は含水エタノールで抽出した後、抽出された液を濃縮及び乾燥することによって粉末を製造されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２７７２８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エレウテロシドB及びEをあわせて１質量％以上含むエゾウコギ抽出物の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、AMP活性化タンパクキナーゼ（AMPK）発現量が高いエゾウコギ抽出物の製造方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、流動性の高いエゾウコギ抽出物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１抽出液と第２抽出液とを混合することによって上記課題が解決されることが見出された。かかる知見を基に、下記に代表される発明が提供される。
項１．
エゾウコギを水及び水−アルコール混合液のいずれかの第１抽出溶媒で抽出して第１抽出液と固形分とを回収する第１抽出工程、
固形分を水−アルコール混合液及び水のいずれかの第２抽出溶媒で抽出して第２抽出液を回収する第２抽出工程、及び
第１抽出液と第２抽出液とを混合して混合液を得る混合工程、
を有し、
第２抽出溶媒は、第１抽出溶媒が水であるときは水−アルコール混合液であり、第１抽出溶媒が水−アルコール混合液であるときは水である、
エゾウコギ抽出物の製造方法。
項２．
水−アルコール混合液におけるアルコールが、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール及び２−メチル−２−プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種である項１に記載の製造方法。
項３．
水−アルコール混合液におけるアルコール濃度（ｖ／ｖ）が１０％〜９０％である項１又は２に記載の製造方法。
項４．
水抽出の温度が２０℃〜１２０℃である項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
項５．
水−アルコール混合液による抽出の温度が２０℃〜８５℃である項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６．
混合工程において得られた混合液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程、
をさらに有する項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
項７．
混合工程において得られた混合液又は濃縮工程において得られた濃縮液を乾燥して粉末を得る粉末化工程、
をさらに有する項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
項８．
第１抽出溶媒が水であり、第２抽出溶媒が水−アルコール混合液である項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法では、第１抽出液と第２抽出液とを混合しているため、濃縮液の粉末化工程によって流動性の高い粉末が得られる。流動性が高いことにより、濃縮液の乾燥機内への付着が抑制され、粉末の生産性が向上し、また、粉末の加工特性も向上する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明では、エゾウコギを２段階で抽出し、１段階目で回収された抽出液と２段階目で回収された抽出液を混合して、エゾウコギ抽出物を得る。
より詳細には、エゾウコギを水及び水−アルコール混合液のいずれかの第１抽出溶媒で抽出して第１抽出液と固形分とを回収する第１抽出工程、
固形分を水−アルコール混合液及び水のいずれかの第２抽出溶媒で抽出して第２抽出液を回収する第２抽出工程、及び
第１抽出液と第２抽出液とを混合する混合工程、
を有し、第２抽出溶媒は、第１抽出溶媒が水であるときは水−アルコール混合液であり、第１抽出溶媒が水−アルコール混合液であるときは水である、エゾウコギ抽出物の製造方法である。
【００１０】
第１抽出工程
第１抽出工程では、エゾウコギを第１抽出溶媒で抽出して第１抽出液と固形分とに分離して両者を回収する。
エゾウコギは北海道、サハリン、千島、朝鮮半島、中国北部、シベリアに分布し、ウコギ科に属する植物である。根部にサポニンのエレウテロシド（eleutheroside）A、クマリン配糖体としてのエレウテロシドB（別名syringin）、エレウテロシドE(別名liriodendrin、syringaresinol di-O-β-D-glucoside)、クロロゲン酸（chlorogenic acid）などを含むことが知られている。本発明では、公知のエゾウコギを広く使用できる。例えば、エゾウコギの産地は上記の分布地域のいずれであってもよく、入手容易性の点では中国産が好ましい。
【００１１】
抽出に供されるエゾウコギの部位は、地上部（葉、茎、幹）、根部、全体等のいずれであってもよいが、抽出物中のエレウテロシド含量が高くなる点で根部が好ましい。抽出に供されるエゾウコギの大きさ及び形状は抽出条件等を考慮して適宜設定できるが、抽出効率の低下抑制と取り扱い性向上の観点から０．５ｍｍ〜５０ｍｍが好ましく、０．５ｍｍ〜２０ｍｍがより好ましく、１ｍｍ〜１５ｍｍがより好ましい。また、抽出に供されるエゾウコギは生木、半乾燥物、乾燥物等でよいが、乾燥物は抽出効率が比較的高いため好ましい。
【００１２】
第１抽出溶媒は、水及び水−アルコール混合液のいずれかである。水−アルコール混合液は水とアルコールとからなり、含水アルコールと称されることもある。アルコールとしては、エタノール、メタノール、プロパノール（例；１−プロパノール、２−プロパノール）、ブタノール（例；１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール）などの低級アルコールが挙げられ、１種単独で又は２種以上を組み合わせることができる。これらの中でも食品安全性の高いエタノールが好ましい。第１抽出溶媒は水又は水−上記列挙したアルコール混合液が好ましく、水又は水−エタノール混合液がより好ましく、得られる粉末が高流動性となる点で水が特に好ましい。水−アルコール混合液におけるアルコールの容積比率（ｖ／ｖ）は、例えば１０％〜９０％とでき、好ましくは２０％〜８０％であり、高エレウテロシド含量と高粉末流動性の点からより好ましくは３０％〜７０％、さらに好ましくは４０％〜６０％である。
【００１３】
抽出に使用される第１抽出溶媒は、エゾウコギ１ｋｇに対して、例えば０．５Ｌ〜１００Ｌとできる。抽出効率及び抽出後の濃縮を考慮すると１Ｌ〜２０Ｌが好ましく、２．５Ｌ〜１０Ｌがより好ましい。
【００１４】
抽出温度は特に限定されないが、室温（１５℃〜２５℃）から溶媒の沸点程度とすればよく、加圧条件化で抽出するときは室温から沸点より２０℃程度高い温度までとすればよい。抽出溶媒が水の場合、抽出温度は例えば２０℃〜１２０℃とでき、抽出効率が向上する点で６０℃〜１００℃が好ましく、７０℃〜９５℃がより好ましい。抽出溶媒が水−アルコール混合液の場合、抽出温度は例えば２０℃〜アルコールの沸点とできる。抽出溶媒が水−エタノール混合液の場合、抽出温度は例えば２０℃〜８５℃とでき、４０℃〜８０℃が好ましく、５０℃〜７５℃がより好ましい。
【００１５】
抽出時間は特に限定されず、抽出温度、撹拌等の抽出時の条件に基づき適宜決定することができる。例えば、１分〜４８時間とできるが、抽出時間を長くしても抽出量の増加が少なくなるため、１０分〜２４時間、３０分〜１２時間、３０分〜６時間、３０分〜２時間、３０分〜９０分等とすることができる。
【００１６】
抽出時の圧力条件は加圧、減圧、常圧のいずれでもよいが、経済性の点から常圧が好ましい。
【００１７】
第１抽出溶媒で抽出した後は、公知の方法で固液分離できる。固液分離の方法は特に限定されないが、エゾウコギのサイズに応じた孔径、篩い目等を有する濾材で濾過する方法が簡便である。濾過は、自然濾過、加圧濾過、減圧濾過、遠心濾過のいずれでもよい。固液分離によって得られた液体が第１抽出液であり、固体が固形分（エゾウコギ残渣）である。固形分は第２抽出工程に供されて再度抽出される。
【００１８】
第２抽出工程
第２抽出工程では、第１抽出工程で回収された固形分を第２抽出溶媒で抽出して第２抽出液を回収する。第１抽出工程で回収された固形分はそのまま第２抽出工程に供されてもよいし、さらに小さいサイズに加工されてから供されてもよいし、乾燥されてから供されてもよい。
【００１９】
第２抽出溶媒は、水及び水−アルコール混合液のいずれかであって、第１抽出溶媒が水であるときは水−アルコール混合液であり、第１抽出溶媒が水−アルコール混合液であるときは水である。好ましくは第１抽出溶媒が水であり、第２抽出溶媒が水−アルコール混合液である。水−アルコール混合液におけるアルコールとしては、エタノール、メタノール、プロパノール（例；１−プロパノール、２−プロパノール）、ブタノール（例；１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール）などの低級アルコールが挙げられ、１種単独で又は２種以上を組み合わせることができる。これらの中でも食品安全性の高いエタノールが好ましい。第２抽出溶媒が水−アルコール混合液である場合、水−上記列挙したアルコール混合液が好ましく、水−エタノール混合液がより好ましい。水−アルコール混合液におけるアルコールの容積比率（ｖ／ｖ）は、例えば１０％〜９０％とでき、好ましくは２０％〜８０％とでき、高エレウテロシド含量と高粉末流動性の点からより好ましくは３０％〜７０％、高収量の点からさらに好ましくは３０％〜６０％である。
【００２０】
抽出に使用される第２抽出溶媒は、第１抽出工程に供された原料エゾウコギ１ｋｇに対して、例えば１Ｌ〜１０Ｌとできる。抽出効率及び抽出後の濃縮を考慮すると１Ｌ〜７Ｌが好ましく、１．５Ｌ〜５Ｌがより好ましい。
【００２１】
抽出温度は特に限定されないが、室温（１５℃〜２５℃）から溶媒の沸点程度とすればよく、加圧条件化で抽出するときは室温から沸点より２０℃程度高い温度までとすればよい。抽出溶媒が水の場合、抽出温度は例えば２０℃〜１２０℃とでき、抽出効率が向上する点で６０℃〜１００℃が好ましく、７０℃〜９５℃がより好ましい。抽出溶媒が水−アルコール混合液の場合、抽出温度は例えば２０℃〜アルコールの沸点とできる。抽出溶媒が水−エタノール混合液の場合、抽出温度は例えば２０℃〜８５℃とでき、４０℃〜８０℃が好ましく、５０℃〜７５℃がより好ましい。
【００２２】
抽出時間は特に限定されず、抽出温度、撹拌等の抽出時の条件に基づき適宜決定することができる。例えば、１０分〜４８時間とできるが、抽出時間を長くしても抽出量の増加が少なくなるため、２０分〜２４時間、３０分〜１２時間、３０分〜６時間、３０分〜２時間、３０分〜９０分等とすることができる。
【００２３】
抽出時の圧力条件は加圧、減圧、常圧のいずれでもよいが、経済性の点から常圧が好ましい。
【００２４】
第２抽出溶媒で抽出した後は、公知の固液分離法により固形分（残渣）と第２抽出液とに分離し、第２抽出液を回収することが取り扱い性の点から好ましいが、抽出後の残渣を含む第２抽出液をそのまま第１抽出液と混合してから固液分離して固形分を分離してもよい。固液分離の方法については第１抽出工程の固液分離の方法と同様である。
【００２５】
第２抽出工程で得られた固形分をさらに抽出してもよいが、その抽出による抽出量の増加が多くないこと、並びに以降の濃縮又は粉末化時に多くの抽出液を処理することを考慮すると、さらなる抽出はしなくともよい。さらなる抽出を行う場合の抽出溶媒は水でも水−アルコールの混合液でもよいが水−アルコールの混合液が好ましい。さらなる抽出における抽出溶媒に関するその他の事項、抽出条件、固液分離等は第１抽出工程に準じて行えばよい。得られた抽出液は第１抽出液及び第２抽出液と混合できる。
【００２６】
混合工程
混合工程では、第１抽出工程で回収された第１抽出液と第２抽出工程で回収された第２抽出液とを混合して混合液を得る。混合の方法は特に制限されないが、第１抽出液の全量を第２抽出液の全量と一度に混合してもよいし、第１抽出液に第２抽出液の一部を数回に分けて添加してもよいし、第２抽出液に第１抽出液の一部を数回に分けて添加してもよいし、第１抽出液の一部と第２抽出液の一部を混合しこれを複数回繰り返してもよい。混合時の温度は常温（１５℃〜２５℃）が好ましく、圧力は加圧条件又は減圧条件でも可能であるが常圧が好ましい。
第２抽出工程後にさらなる抽出を行った場合はその抽出で得られた抽出液を、本混合工程においてさらに混合すればよい。
【００２７】
混合工程によって得られた混合液はそのまま粉末化工程に供されてもよいが、粉末化効率を向上させる観点から、濃縮工程を経て濃縮液とされてから粉末化工程に供されることが好ましい。
【００２８】
濃縮工程
濃縮工程では、混合工程で得られた第１抽出液と第２抽出液とを含む混合液を濃縮することで濃縮液を得る。濃縮方法は特に制限されず、減圧濃縮などの公知の方法により公知の条件で所望の程度まで濃縮することができる。本工程によって得られた濃縮液を液状のエゾウコギ抽出物としてもよいし、粉末化工程に供して粉末状のエゾウコギ抽出物としてもよい。濃縮率等の濃縮の程度は、最終のエゾウコギ抽出物の形態等を考慮して適宜決めればよい。
【００２９】
粉末化工程
粉末化工程では、濃縮工程によって得られた濃縮液又は混合工程によって得られた混合液を粉末化処理することで粉末状のエゾウコギ抽出物を得る。粉末化処理は、噴霧乾燥（スプレードライ）、ドラム乾燥等の公知の方法により公知の条件で行うことができる。粉末化の方法としては粒径の安定性及び高い流動性の観点から噴霧乾燥が好ましい。噴霧乾燥処理において、被処理物の温度が例えば３０℃〜６０℃、好ましくは４０℃〜５０℃となる温度条件で行うことができる。
【００３０】
本発明の製造方法で得られるエゾウコギ抽出物は液状と粉末状とを問わず、AMPK発現を促進する作用が高い。このAMPK発現を促進する作用によって、糖尿病、低血糖、低酸素状態、虚血、熱ショックなどの症状を予防又は改善できる。このため、本発明の製造方法で得られるエゾウコギ抽出物を摂取することによってこれらの症状を予防又は改善できる。
本発明の製造方法で得られる粉末状のエゾウコギ抽出物は流動性が高い。このため、貯蔵安定性が高く、加工が容易であり、液体への溶解が容易である。また、濃縮液の乾燥機内への付着が抑制され、粉末の生産性が向上し、また、粉末の加工特性も向上する。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例等によって本発明の一実施態様を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。また、水とエタノールの混合物（含水エタノール）中のエタノール濃度は容積％（v/v）である。なお、以下の例で使用された材料、装置等は次のとおりである。
エゾウコギ乾燥物：5mm〜12mmサイズに裁断された中国産エゾウコギ根部の乾燥物
濾紙：No.5A（東洋濾紙株式会社）
噴霧乾燥装置：CNK-P-SDD-O型（ダルトン社）
FBS：ウシ胎児血清（シグマアルドリッチ社）
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液：ペニシリン及びストレプトマイシンを各10,000μ／ｍｌ含有（ナカライテスク社）
DMEM培地：ダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク社）
培養培地：FBSを10％（v/v）濃度で含み、且つ、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液が１％(v/v)で添加されたDMEM培地
分化誘導剤：ウマ血清（シグマアルドリッチ社）
分化誘導培地：FBSを10％（v/v）濃度で含み、且つ、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液が１％(v/v)で添加され、且つ、分化誘導剤としてウマ血清を２％（v/v）で含んだDMEM培地
AMPK抗体及びACC抗体含有液：AMPK and Acc Antibody Sampler Kit#9957（Cell Signaling Technology社）
【００３２】
実施例１（水抽出、５０％含水エタノール抽出）
（水抽出）
２．５ｋｇのエゾウコギ乾燥物に１１．２５Ｌの水を加え９０℃まで加熱した。水温が９０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、９．７Ｌの濾液（第１抽出液）と濾紙上に残った４．１ｋｇの残渣（固形分）とを得た。
（含水エタノール抽出）
残渣を乾燥させることなく含水エタノール抽出に用いた。残渣に１０Ｌの５０％含水エタノールを加え、液温が６０℃になるまで加熱した。液温が６０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、１０．３Ｌの濾液（第２抽出液）を得た。
（混合及び噴霧乾燥）
第１抽出液全量と第２抽出液全量とを混合し、混合液を回転式減圧濃縮装置（ロータリーエバポレーター）でBrix値が４０％になるまで濃縮した。濃縮液を噴霧乾燥装置で粉末化（熱風温度１４０℃、アトマイザー回転数１５，０００ｒｐｍ、流速５０ｍL/分、試料温度４０℃）し、１０１ｇの粉末を得た。
【００３３】
実施例２（水抽出、３０％含水エタノール抽出）
エタノール濃度を３０％に変更したことを除き、実施例１と同じ手順で、１０３ｇの粉末を得た。
【００３４】
実施例３（水抽出、７０％含水エタノール抽出）
エタノール濃度を７０％に変更したことを除き、実施例１と同じ手順で、５２ｇの粉末を得た。
【００３５】
実施例４（水抽出、１０％含水エタノール抽出）
エタノール濃度を１０％に変更したことを除き、実施例１と同じ手順で、１０４ｇの粉末を得た。
【００３６】
実施例５（５０％含水エタノール抽出、水抽出）
（含水エタノール抽出）
エゾウコギ乾燥物を、含水エタノール、水の順で抽出した。２．５ｋｇのエゾウコギ乾燥物に１１．２５Ｌの含水エタノール（エタノール濃度５０％）を加え６０℃まで加熱した。液温が６０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、９．８Ｌの濾液（第１抽出液）と濾紙上に残った３．８ｋｇの残渣（固形分）とを得た。
（水抽出）
残渣を乾燥させることなく水抽出に用いた。残渣全量に１０Ｌの水を加え、液温が９０℃になるまで加熱した。液温が９０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、１０．１Ｌの濾液（第２抽出液）を得た。
（混合及び噴霧乾燥）
実施例１における第１抽出液と第２抽出液を、各々、本例の第１抽出液と第２抽出液に変更したことを除き、実施例１における混合及び噴霧乾燥手順と同じ手順で、９５ｇの粉末を得た。
【００３７】
比較例１（水抽出、水抽出）
実施例１と同じ手順で第１抽出液と残渣（固形分）とを回収した。
次に、残渣を乾燥させることなく全量を水抽出に供した。残渣に水を加えて全量を１０Ｌとし、水温が９０℃になるまで加熱した。水温が９０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、１０．３Ｌの濾液（第２抽出液）を回収した。
第１抽出液全量と第２抽出液全量とを混合し、混合液を、実施例１と同じ手順で粉末化し、１０５ｇの粉末を得た。
【００３８】
比較例２（５０％エタノール抽出、５０％エタノール抽出）
（含水エタノール抽出）
２．５ｋｇのエゾウコギ乾燥物に１１．２５Ｌの含水エタノール（エタノール濃度５０％）を加え６０℃まで加熱した。液温が６０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、９．８Ｌの濾液（第１抽出液）と濾紙上に残った３．８ｋｇの残渣とを回収した。
（含水エタノール抽出）
残渣を乾燥させることなく全量を含水エタノール抽出に用いた。残渣に１０Ｌの含水エタノール（エタノール濃度５０％）を加え、液温が６０℃になるまで加熱した。液温が６０℃に到達してから６０分間その温度を維持した後、濾紙で濾過し、１０．０Ｌの濾液（第２抽出液）を得た。
（混合及び噴霧乾燥）
実施例１における第１抽出液と第２抽出液を、各々、本例の第１抽出液と第２抽出液に変更したことを除き、実施例１における混合及び噴霧乾燥手順と同じ手順で、３９ｇの粉末を得た。
【００３９】
比較例３（１００％エタノール抽出、１００％エタノール抽出）
含水エタノールをエタノールに変更したことを除き、比較例２と同じ手順を行ったが、噴霧乾燥装置に供給した濃縮液が当該装置の内壁に付着したため、３ｇの粉末しか得られなかった。
【００４０】
粉末の評価
実施例及び比較例で得られた粉末（以下、サンプル粉末と称することがある）についてエレウテロシドＢ及びＥの含量、ＡＭＰＫ発現量、水分含量及び流動性を評価した。
【００４１】
＜エレウテロシドの定量＞
サンプル粉末中に含まれるエレウテロシドＢ及びＥの含量を高速液体クロマトグラフ（HPLC）法により測定した。すなわち、各々の粉末１．００ｇを精密に量り取り、含水メタノール（メタノール濃度５０％；（特級  和光純薬工業）に溶解し２５０ｍLに定容した。この溶液をメンブレンフィルター（GLCTD-PTFE2545；島津ジーエルシー社；孔径0.45μｍ）で濾過した後、下記のHPLC条件で分析を行った。粉末中のエレウテロシド含量のため、市販の試薬であるエレウテロシドＢ及びエレウテロシドＥ（ChromaDex社）を用いて検量線を作成し、次に、この検量線に基づいて粉末中のエレウテロシド含量を定量した。
【００４２】
（ＨＰＬＣ条件）
装  置： LC-20Aシステム（島津製作所）
カラム：LiChrospher 100 RT-18  5μm  （直径4.6mm×長さ250mm；メルク社）
カラム温度：30℃
移動相：移動相A：  0.5％（ｖ／ｖ）リン酸水溶液
移動相B：  アセトニトリル
検  出：220nm（エレウテロシドＢ）；205nm（エレウテロシドＥ）
流  量：1.0 mL/min
溶  出：溶出条件は下記の通り。カッコ内は（移動相A：移動相B）の容積比率。
０  ｍｉｎ（９：１）〜５ｍｉｎ（９：１）
５  ｍｉｎ（９：１）〜２７ｍｉｎ（８：２）
２７  ｍｉｎ（８：２）〜３５  ｍｉｎ（５：５）
３５  ｍｉｎ（９：１）〜４５  ｍｉｎ（９：１）
【００４３】
＜ＡＭＰＫ発現量の測定＞
（細胞培養）
12ウェルプレートの各ウェルに培養培地を加え、マウス由来C2C12骨格筋細胞を各ウェルに播種し、37℃、5％ CO2の環境のインキュベーター内で培養した。C2C12細胞がコンフルエントになった後、培養培地を分化誘導培地に交換し、実施例又は比較例で製造された粉末をこの培地に0.5mg/mlで溶解し、細胞の分化誘導を行った。分化誘導から培養5日目に細胞を回収した。加えて、粉末を含まない分化誘導培地で同様に分化誘導した細胞を対照とした。5日間培養後、細胞を集めて破砕し、得られた細胞破砕液を試料とし、試料中のAMPK量を下記のウエスタンブロッティング法で測定した。尚、各群３試料を測定し、統計処理を行った。
【００４４】
（ウエスタンブロッティング）
回収した各サンプルに、800μLのドデシル硫酸ナトリウム緩衝液（100mM トリス−塩酸（pH.6.8）、2％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、20％ グリセリン、12％ β-メルカプトエタノール）を加え、95℃で10分間煮沸した。得られたサンプルをSDS-PAGEで電気泳動を行い、電気泳動終了後トランスファー装置を用いて、ゲル上のタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（PVDF膜）に転写した。得られた膜を1次抗体（AMPK抗体）希釈液に浸漬し、４℃で一晩放置した。当該希釈液は、ウシ血清アルブミンを5％(w/v)で溶解したTBST（Tween 20（0.05M）及び塩化ナトリウム（0.15M）を含むトリス−塩酸緩衝液（pH 7.6））でAMPK抗体及びACC抗体含有液を1,000倍（容量比）希釈した液である。次いで、PVDF膜をTBSTで10分間の洗浄を3度行った後、抗マウスIgG-ワサビ由来パーオキシダーゼ抗体（2次抗体）希釈液に浸し、室温で1時間振盪した。その後、PVDF膜をTBSTで洗浄（10分間×3回）した後、検出試薬（Luminata Forte Western HRP Subluminate Luminata；ミリポア社）をTBS（塩化ナトリウム（0.138M）及び塩化カリウム（0.0027M）を含むトリス−塩酸緩衝液（pH 7.6））で5倍希釈した発色液をPVDF膜に1分間浸透させ、画像解析装置（LAS4000；GEヘルスケア社）を用いてPVDF膜に表れたバンドを画像解析することによりAMPK発現量を測定した。
【００４５】
（ＡＭＰＫ発現量の評価）
画像解析により測定されたAMPK発現量をt検定による統計処理にかけた。対照群の発現量に対する有意差に基づき次のように評価した。
p＜0.01    「＋＋＋」
p＜0.05    「＋＋」
p＜0.1     「＋」
p＞0.1     「−」
【００４６】
＜水分含量及び流動性の測定及び評価＞
実施例及び比較例で製造された粉末の10ｇ（但し、比較例３の粉末は全量が10ｇに満たないため1ｇ）を、各々、50mL容ビーカーに入れた。全ビーカーを同一チャンバー内で同時に、シリカゲル存在下、20時間減圧乾燥することで、ビーカー内の粉末を同一条件で乾燥させた。得られた粉末の水分含量と安息角を下記に従って測定した。
【００４７】
（水分含量の測定）
はかり瓶をあらかじめ１０５℃、３０分間乾燥した後、防湿庫に入れ２時間以上室温で静置させる。はかり瓶の質量を精密に量り、各々の粉末約4ｇ（比較例３の粉末のみ約1ｇ）をはかり瓶に取り、質量を精密に量る。はかり瓶及び粉末を乾燥器に入れ１０５℃で４時間、乾燥させる。乾燥後、防湿庫にいれ２時間以上室温で静置させた後、はかり瓶及び粉末の質量を精密に量る。乾燥前後の減少質量を粉末の水分含量とした。
【００４８】
（流動性の評価）
注入法により粉末の安息角を測定した。乾燥された粉末から各々5ｇを取り、嵩密度測定器（JIS K-6720；筒井理化学機器社製）のホッパーに供給した。ホッパーの弁を開けて粉末を落下させた。落下によって形成された粉末の山（略円錐形）の側面を縦に均等に４つの部位に分け、各部位の側面の傾斜角を測定し、平均値を安息角（°）とした。
【００４９】
【表１】
2020189800.tif 000002
【００５０】
実施例１〜５で得られた第１抽出液と第２抽出液との混合液を用いて噴霧乾燥処理を実施すると、安息角が50°以下の流動性の高い粉末を得ることができた。また、これらの粉末はエレウテロシド含量が１％（ｗ／ｗ）を超えており、一般的なエゾウコギ粉末製品の規格を満たすものであった。さらに、実施例１〜５で得られた粉末は比較例２の粉末と水分含量が同程度であるが、その粉末の収量は比較例２の粉末の収量より高かった。通常、粉末の水分含量が高いと粉末収量が低下するので、本発明の製造方法では水分含量が同程度でより高い粉末収率を達成できることが確認された。
比較例１の水、水抽出で得られた混合液を用いて噴霧乾燥処理を実施し、得られた粉末によるAMPK発現量が低かった。
比較例２の50％含水エタノール、50％エタノール抽出で得られた混合液を用いて噴霧乾燥処理を実施すると、エレウテロシドB及びEの含有量が高い固形物が得られた。しかし、噴霧乾燥機内に固形物又は濃縮液の付着が見られ、流動性の低い粉末を低収量でしか得られず、粉末生産性が低いものであった。
比較例３の100％エタノール、100％エタノール抽出で得られた混合液を用いて噴霧乾燥処理を実施すると、エレウテロシドB及びEの含有量が非常に高い固形物が得られた。しかし、噴霧乾燥機内に非常に多くの固形物又は濃縮液の付着が見られ、粉末をほとんど得ることができなかった。
本発明の製造法は、第１抽出液と第２抽出液を混合することにより、十分なAMPK発現量及びエレウテロシド含量を保持しつつ、流動性に優れた粉末を収率よく製造できる。つまり、十分な薬効を有しつつ加工特性に優れた粉末を効率よく製造できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明はエゾウコギ抽出物の製造方法に利用できる。