(57)【要約】【課題】皮膚由来ステロイドホルモンを調製又は定量する方法の提供。【解決手段】被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを分離することを含む、ステロイドホルモンの調製方法。該調製したステロイドホルモンを定量することを含む、皮膚表上脂質中ステロイドホルモンの定量方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを分離することを含む、ステロイドホルモンの調製方法。
【請求項２】
前記分離が、前記皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを溶媒抽出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ステロイドホルモンが、アンドロゲン、プロゲステロン、エストロゲン、及び糖質コルチコイドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で調製したステロイドホルモンを定量することを含む、皮膚表上脂質中ステロイドホルモンの定量方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法により、被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の皮膚特性の解析方法。
【請求項６】
前記皮膚表上脂質中ステロイドホルモン量に基づいて前記被験体の皮膚特性を評価することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記皮膚表上脂質中ステロイドホルモン量の変化に基づいて前記被験体の皮膚特性を評価することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記ステロイドホルモンがアンドロゲンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ステロイドホルモンがプロゲステロンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイドホルモンがエストロゲンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記ステロイドホルモンが糖質コルチコイドであり、前記被験体の皮膚特性が、角層水分量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
請求項４記載の方法により、被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の血中ステロイドホルモン量の解析方法。
【請求項１３】
前記皮膚表上脂質中のステロイドホルモン量の変化に基づいて前記被験体の血中ステロイドホルモン量の変化を解析することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ステロイドホルモンが、アンドロゲン及びプロゲステロンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１２又は１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイドホルモンを調製又は定量する方法、ならびに当該方法を利用した皮膚特性又は血中ステロイドホルモンの解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンは、全身の様々な臓器の機能維持に重要な内分泌因子である。ステロイドホルモンには、コルチゾール等の糖質コルチコイド、アルドステロン等の鉱質コルチコイド、男性ホルモンであるアンドロゲン、女性ホルモンであるエストロゲン、及びプロゲステロンなどの種類がある。
【０００３】
ステロイドホルモンが、皮膚において表皮、皮脂腺、真皮、毛といった様々な部位の生理機能に影響を与えていることが報告されている。閉経後の女性において、血中エストロゲン濃度の低下に伴い、皮膚のコラーゲン線維やエラスチン線維が減少し、その結果しわやたるみといった皮膚の老化が誘導される（非特許文献１、２）。また、閉経後女性の皮膚にエストロゲンを塗布すると、コラーゲン線維が増加してしわが改善するだけでなく、保湿性も改善し、かつ皮脂分泌も抑制されることが報告されている（非特許文献３〜５）。黄体ホルモンであるプロゲステロンを閉経前及び閉経後の女性に皮膚に塗布すると、皮膚の弾性が改善することが報告されている（非特許文献６）。男性ホルモンであるアンドロゲンは、毛の生育と深く関与している。眉毛、まつ毛を除く全身の毛の生育がアンドロゲンに依存していることが報告されている（非特許文献７）。テストステロンが腋毛や陰毛などといった体毛の生育を亢進する一方で、ジヒドロテストステロンが頭部の毛の生育を抑制することも報告されている（非特許文献８）。さらに、ジヒドロテストステロンは男性型脱毛症と密接に関与しており、このホルモンを産生する酵素５α−ｒｅｄｕｃｔａｓｅの阻害剤は男性型脱毛症の改善薬として実際の臨床に応用されている（非特許文献９）。糖質コルチコイドであるコルチゾールは、ストレスの指標として利用されている。また、ストレスを付加した動物で皮膚のバリア機能のリカバリー率は減少するが、糖質コルチコイド受容体のアンタゴニストを投与するとリカバリー率が回復することが報告されており（非特許文献１０）、ストレスによるヒトや動物の皮膚機能への影響に糖質コルチコイドが関与していることが推測される。
【０００４】
従来、皮膚のステロイドホルモンを解析する場合、皮膚の生検サンプルのステロイドホルモンを測定する方法が一般に用いられている（非特許文献１１）。しかしこの方法は、侵襲性が高いため被験者の負担が大きい。特許文献１〜２には、テープストリッピングにより採取した角層サンプルを溶媒抽出し、ＬＣ−ＭＳ分析することによる、より低侵襲なエストロゲンの定量方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−０８５９４６号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６３９４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.，２００５，５３：５５５−５６８
【非特許文献２】Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.，２００６，１５：８３−９４
【非特許文献３】Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，２００１，３９：４３−５５
【非特許文献４】Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，１９９５，２２：１５１−１５４
【非特許文献５】Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，１９９４，１９：２１１−２２３
【非特許文献６】Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.，２００５，１５３：６２６−６３４
【非特許文献７】Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｔｈｅｒ.，２００８，２１：３１４−３２８
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ.，２００２，１９８：８９−９５
【非特許文献９】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.，２００２，１２：３８−４９
【非特許文献１０】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ.，２００６，２９１：Ｒ１６５７−Ｒ１６６２
【非特許文献１１】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ.，２０１２，３６２：１９−２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ステロイドホルモンを調製又は定量する方法、ならびに当該方法を利用した皮膚特性又は血中ステロイドホルモンの解析方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、被験体から採取した皮膚表上脂質からステロイドホルモンを分離し、これを解析に用いることができることを見出した。また本発明者は、該皮膚表上脂質由来ステロイドホルモンの量が、被験体の皮膚特性を表す指標となることを見出した。さらに本発明者は、該皮膚表上脂質由来ステロイドホルモンの量が、血中ステロイドホルモンの量と相関しているため、皮膚表上脂質由来ステロイドホルモンの量を基準に、血中ステロイドホルモン量を解析することができることを見出した。
【０００９】
本発明は、被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを分離することを含む、ステロイドホルモンの調製方法を提供する。
また本発明は、前記調製方法で調製したステロイドホルモンを定量することを含む、皮膚表上脂質中ステロイドホルモンの定量方法を提供する。
さらに本発明は、前記定量方法により、被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の皮膚特性の解析方法を提供する。
さらに本発明は、前記定量方法により、被被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の血中ステロイドホルモン量の解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、被験体のステロイドホルモンを簡便かつ非侵襲的に調製及び定量することができる。本発明により調製される皮膚表上脂質中のステロイドホルモンの量は、皮膚特性や血中ステロイドホルモン量と相関する。したがって、本発明によれば、被験体の皮膚表上脂質中のステロイドホルモンの量に基づいて、該被験体の皮膚特性や血中ステロイドホルモン量の解析が可能になる。さらに本発明によれば、従来血中ステロイドホルモン量が指標として用いられていた生体の生理機能又は疾患の状態の評価を、血中ステロイドホルモンの代わりに皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを用いることで、より簡便かつ非侵襲的に実施することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＳＳＬ中ステロイドホルモン濃度と血中ステロイドホルモン濃度との相関。Ｒは相関係数。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１３】
本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
【００１４】
本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、被験体から採取した皮膚表上脂質中のステロイドホルモンを分離することを含む、ステロイドホルモンの調製方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法で調製されるステロイドホルモンの例としては、アンドロゲン、プロゲステロン、エストロゲン、及び糖質コルチコイドが挙げられる。アンドロゲンの例としては、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、テストステロン（Ｔ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、及びアンドロステンジオン（Ａ−ｄｉｏｎｅ）が挙げられる。エストロゲンの例としては、エストロン（Ｅ１）及びエストラジオール（Ｅ２）が挙げられる。糖質コルチコイドの例としては、コルチゾール（Ｆ）が挙げられる。本発明の方法では、上記に挙げた各種ステロイドホルモンからなる群より選択されるいずれか１種又は２種以上が調製されればよい。好ましい一実施形態において、本発明の方法で調製されるステロイドホルモンはアンドロゲンを含み、より好ましくはＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅからなる群より選択されるいずれか１種又は２種以上を含み、さらに好ましくはＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の方法で調製されるステロイドホルモンは、プロゲステロン（Ｐ４）を含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の方法で調製されるステロイドホルモンはエストロゲンを含み、より好ましくはＥ１又はＥ２を含み、さらに好ましくはＥ１及びＥ２を含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の方法で調製されるステロイドホルモンは、糖質コルチコイドを含み、より好ましくはコルチゾール（Ｆ）を含む。
【００１７】
本発明の方法における被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。好ましくは、該被験体は、自身のステロイドホルモンの解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物である。
【００１８】
一実施形態において、本発明の方法は、被験体のＳＳＬを採取することをさらに含んでいてもよい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、アトピー、ニキビ、炎症、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられ、好ましくは顔部の皮膚が挙げられるが、特に限定されない。
【００１９】
被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材が水溶性の高い溶媒や水分を含んでいると、ＳＳＬの吸着が阻害されるため好ましくない。また、ＳＳＬ吸収性素材は、ステロイドホルモンの測定の妨害となるような脂溶性物質を含んでいないことが好ましい。あるいは、ＳＳＬ吸収性素材に対して該脂溶性物質を除去するための前処理を行ってもよい。該前処理の例としては、クロロホルム／メタノール溶液等の有機溶媒への浸漬などが挙げられる。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
【００２０】
被験体から採取されたＳＳＬは、直ちに後述するステロイドホルモンの分離に用いられてもよいが、ステロイドホルモンの分離まで保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、冷蔵保存又は氷点下で低温保存してもよいが、常温保存してもよい。例えば、ＳＳＬを含むＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材を、常温、冷蔵又は低温保存することができる。
【００２１】
ＳＳＬ中のステロイドホルモンは、採取されたＳＳＬから溶媒抽出により分離することができる。好ましくは、上述したＳＳＬを含むＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材から、該ＳＳＬ中のステロイドホルモンを溶媒抽出することができる。例えば、該ＳＳＬを含むＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材（例えばあぶら取りフィルムやテープ）を、必要に応じて適当な大きさに裁断した後、エーテル類、アルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒に浸漬し、ステロイドホルモンを抽出する。該抽出に用いられる有機溶媒は、エーテル類が好ましく、メチルブチルエーテルがより好ましい。得られた抽出物を、さらに精製することが好ましい。精製の手段としては、カラム精製、有機溶媒による洗浄などが挙げられる。例えば、得られた抽出物から溶媒を除去した後、ヘキサン、アセトニトリル等で洗浄することができる。
【００２２】
以上の手順で調製されたＳＳＬ由来のステロイドホルモンは、各種解析に使用することができる。ＳＳＬ由来のステロイドホルモンの解析は、一般的なステロイドホルモンの解析の手順に従って行うことができる。好ましい実施形態において、上記手順で調製されたＳＳＬ由来のステロイドホルモンは定量される。
【００２３】
好ましくは、ＳＳＬ由来のステロイドホルモンの定量は、ＬＣ−ＭＳ測定により行われる。該ＬＣ−ＭＳとしては、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳなどを用いることができ、好ましくはＬＣ−ＭＳ／ＭＳが用いられる。
【００２４】
ＬＣ−ＭＳによるステロイドホルモンの測定を行う場合、検出感度を向上させるため、適宜、ステロイドホルモンに置換基を導入し、ステロイドホルモンの誘導体を得ることが好ましい。ステロイドホルモンの誘導体化は、特許第４６３４９１３号（「ステロイドの測定方法」）、及び特許文献１〜２に記載されている方法に従って行うことができる。
【００２５】
アンドロゲン（例えばＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ又はＡ−ｄｉｏｎｅ）、プロゲステロン（Ｐ４）、又は糖質コルチコイド（例えばＦ）の検出感度を向上させる場合、好ましくは、これらをエステル誘導体に変換する。例えば、塩基（例えば水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等）及び不活性有機溶媒（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド、等）の存在下で、ステロイドホルモンをピコリン酸等のピリジルカルボニル化合物と反応させることで、エステル誘導体を得ることができる。
【００２６】
あるいは、アンドロゲンの検出感度を向上させる場合、これをアシル化試薬でアシル誘導体、好ましくはピコリノイル誘導体に変換することができる。または２−フルオロ−１−メチルピリジンによりアンドロゲンのピリジニウム誘導体を得てもよい。
【００２７】
あるいは、プロゲステロンの検出感度を向上させる場合、プロゲステロンの３位及び２０位のカルボニルにケトン誘導化試薬のＯ−エチルヒドロキシルアンモニウムクロライド、ジラール試薬Ｔ又はジラール試薬Ｐを反応させて、プロゲステロンのイミノ誘導体を得ることができる。
【００２８】
エストロゲン（例えばＥ１又はＥ２）の検出感度を向上させる場合、好ましくは、これらをフルオロピリジンエーテル誘導体に変換する。例えば、塩基及び不活性有機溶媒（例えば上述したもの）の存在下で、エストロゲンをペンタハロゲン化ベンジル基又はペンタハロゲン化ベンゾイル基と反応させてペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体を得ることができる。得られたペンタハロゲン化ベンジル又はベンゾイル誘導体に、さらに２−（１−低級アルキルヒドラジノ）ピリジンを導入してもよい。あるいは、上述したアンドロゲンのエステル誘導体化反応と同様の手順で、得られたペンタハロゲン化ベンジル又はベンゾイル誘導体を、フザリン酸等のピリジルカルボニル化合物と反応させることで、エステル誘導体を得てもよい。
【００２９】
得られた誘導体を含む反応液を有機溶媒抽出することにより、目的のステロイドホルモン誘導体の粗精製物を得ることができる。さらに、得られた粗精製物をカラム精製することにより、ＬＣ−ＭＳ測定でのバックグラウンドを大幅に低減させ、ステロイドホルモンの検出精度を向上させることができる。カラム精製には、ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＳＩ（ジーエルサイエンス）等の順相カラムを使用することができる。
【００３０】
ＬＣ−ＭＳによるＳＳＬ由来ステロイドホルモンの測定は、一般的なＬＣ−ＭＳの測定手順に従って行うことができる。得られた測定値から、内部標準、検量線などに基づいて検出したステロイドホルモン量を算出することができ、又は、採取したＳＳＬ中のステロイドホルモン量を定量することができる。ＳＳＬ中のステロイドホルモン量を定量する場合、例えば、採取されたＳＳＬの質量当たりのステロイドホルモン量を定量してもよく、又は、該ＳＳＬ中の皮脂成分であるトリグリセリド及び遊離脂肪酸量を測定し、該トリグリセリド＋遊離脂肪酸当たりのステロイドホルモン量を定量することもできる。
【００３１】
後述の実施例に示すとおり、本発明者は、ＳＳＬ中のステロイドホルモン量が、皮膚特性との相関性を有することを見出した。これは、被験体のＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて該被験体の皮膚特性を解析することができることを表す。したがって、本発明はまた、被験体から採取したＳＳＬ中ステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の皮膚特性の解析方法を提供する。
【００３２】
本発明で解析される皮膚特性としては、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）、メラニン量（又はメラニンインデックス、ＭＩ）、紅班量（又はエリスマインデックス、ＥＩ）、皮膚ｐＨ等が挙げられる。皮膚特性が解析される皮膚は、部位は特に限定されないが、好ましくは顔、より好ましくは額又は頬の皮膚である。皮脂量としては、カジュアル皮脂量、回復皮脂量（皮脂を除去後、所定時間内に排泄される皮脂の量、例えば洗顔から所定時間後の皮脂量）などが挙げられる。皮脂量の計測には、市販の皮脂測定装置（例えば、Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ＳＭ８１５；Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いることができる。Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ＳＭ８１５では、測定プローブ先端に取り付けた半透明のテープに皮脂を付着させ、皮脂吸着によるテープの光透過度の増加を測定することで、皮脂量を測定する。角層水分量は、例えば皮膚の静電容量に基づいて計測することができる。角層水分量の測定には、市販の測定装置（例えば、ｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ８２５；Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いることができる。ＴＥＷＬは、Ｆｉｃｋの法則に従って、皮膚表面から蒸発する水分の濃度勾配に基づいて計算することができる。例えば２つのセンサーを通過する水分の温度差、湿度差を測定し、それらの値からＴＥＷＬを算出する。この原理によるＴＥＷＬ測定装置が市販されている（例えば、ＴＥＷＡ  ｍｅｔｅｒ  ＴＭ３００；Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）。あるいは、皮膚表面にあてた密閉式のプローブ内に空気や窒素ガスを還流させ、回収したガスの含有水分量からＴＥＷＬを計算することができる。皮膚のメラニン量は、メラニンへの吸収率が異なる波長の光を皮膚に照射し、それらの光の皮膚への吸収量を測定することで、求めることができる。皮膚の紅班量は、皮膚のヘモグロビンによる光吸収に基づいて測定することができる。ヘモグロビンへの吸収率が異なる波長の光を皮膚に照射し、それらの光の皮膚への吸収量を測定することで、紅班量を測定することができる。メラニン量及び紅班量は、市販の測定装置（例えば、Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ  ＭＸ１８；Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて測定することができる。皮膚ｐＨは、市販のｐＨメーター（例えば、Ｓｋｉｎ−ｐＨ−Ｍｅｔｅｒ  ＰＨ９０５；Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）により計測することができる。
【００３３】
本発明の皮膚特性の解析方法の一実施形態において、定量されるステロイドホルモンはアンドロゲンであり、解析される皮膚特性は、皮脂量、角層水分量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）、紅班量（ＥＩ）及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である。該アンドロゲンは、好ましくはＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅからなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅである。
【００３４】
本発明の皮膚特性の解析方法の一実施形態において、定量されるステロイドホルモンはプロゲステロン（Ｐ４）であり、解析される皮膚特性は、皮脂量、角層水分量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）、紅班量（ＥＩ）及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００３５】
本発明の皮膚特性の解析方法の一実施形態において、定量されるステロイドホルモンはエストロゲンであり、解析される皮膚特性は、皮脂量、角層水分量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）、紅班量（ＥＩ）及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である。該エストロゲンは、好ましくはＥ１及びＥ２からなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはＥ１及びＥ２である。
【００３６】
本発明の皮膚特性の解析方法の一実施形態において、定量されるステロイドホルモンは糖質コルチコイドであり、解析される皮膚特性は、角層水分量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である。該糖質コルチコイドは、好ましくはコルチゾール（Ｆ）である。
【００３７】
一実施形態において、本発明の皮膚特性の解析方法では、定量されたＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて被験体の皮膚特性が評価される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のアンドロゲン量が高い場合、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は高いと判断され、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断される。また、該ＳＳＬ中のアンドロゲン量が低い場合、被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は低いと判断され、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のＰ４量が高い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は低いと判断される。また、該ＳＳＬ中のＰ４量が低い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は高いと判断される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のエストロゲン量が高い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は低いと判断される。また、該ＳＳＬ中のエストロゲン量が低い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）は高いと判断される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中の糖質コルチコイド量が高い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断され、一方、該ＳＳＬ中の糖質コルチコイド量が低い場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断される。
【００３８】
被験体のＳＳＬ中ステロイドホルモン量が高い又は低いとの判断は、例えば、予め定めた閾値等に基づいて行うことができる。例えば、集団から測定したＳＳＬ中ステロイドホルモン量の統計値に基づいて閾値を設定することができる。あるいは、同じ被験者から以前に測定したＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて閾値を設定することができる。あるいは、後述するようにＳＳＬ中ステロイドホルモン量は血中ステロイドホルモン量と相関するので、標準的な血中ステロイドホルモン量に基づいて閾値を算出することが可能である。ただし、本発明の方法における該閾値の設定や、ＳＳＬ中ホルモン量の判断の手法は、これらに限定されない。
【００３９】
別の一実施形態において、本発明の皮膚特性の解析方法では、ＳＳＬ中ステロイドホルモン量の変化を測定し、該ホルモン量の変化に基づいて被験体の皮膚特性が評価される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のアンドロゲン量が増加した場合、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の増加が判断又は予測され、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下が判断又は予測される。また、該ＳＳＬ中のアンドロゲン量が減少した場合、被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の低下が判断又は予測され、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加が判断又は予測される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のＰ４量が増加した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加が判断又は予測され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の低下が判断又は予測される。また、該ＳＳＬ中のＰ４量が減少した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下が判断又は予測され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の増加が判断又は予測される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中のエストロゲン量が増加した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加が判断又は予測され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の低下が判断又は予測される。また、該ＳＳＬ中のエストロゲン量が減少した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下が判断又は予測され、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量（ＭＩ）及び紅班量（ＥＩ）の増加が判断又は予測される。
好ましい一実施形態において、被験体から採取したＳＳＬ中の糖質コルチコイド量が増加した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下が判断又は予測され、一方、該ＳＳＬ中の糖質コルチコイド量が減少した場合、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加が判断又は予測される。
【００４０】
被験体のＳＳＬ中ステロイドホルモン量の増加又は減少の判断は、同じ被験者から以前に測定したＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて行うことができる。ただし、本発明の方法におけるＳＳＬ中ホルモン量の変化を評価する手法は、これに限定されない。
【００４１】
また、後述の実施例に示すとおり、本発明者は、ＳＳＬ中ステロイドホルモン量が、血中ステロイドホルモン量と相関性を有することを見出した。これは、被験体のＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて該被験体の血中ステロイドホルモン量を推定することができることを表す。したがって、本発明はまた、被験体から採取したＳＳＬ中ステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の血中ステロイドホルモン量の解析方法を提供する。好ましい実施形態において、本方法で解析されるステロイドホルモンは、アンドロゲン（ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅ）及びプロゲステロン（Ｐ４）からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００４２】
一実施形態において、本発明の血中ステロイドホルモン量の解析方法では、被験体から採取したＳＳＬ中のステロイドホルモン量に基づいて、該被験体の血中ステロイドホルモン量を解析する。好ましくは、本発明の血中ステロイドホルモン量の解析方法では、ＳＳＬ中のステロイドホルモン量から血中ステロイドホルモン量を予測する予測計算式に基づいて、被験体のＳＳＬ中のステロイドホルモン量から該被験体の血中ステロイドホルモン量を推定する。該予測計算式は、集団から採取したＳＳＬ中のステロイドホルモン量と血中ステロイドホルモン量の値に基づいて、予め作成しておくことができる。さらに、得られた被験体の血中ステロイドホルモン量に基づいて、該被験体の血中ステロイドホルモン量の変化の方向（増加や減少）又はその程度（増加率、減少率など）を解析することができる。血中ステロイドホルモン量は、生体の様々な生理機能や疾患の指標として使用されており、血中ステロイドホルモン量は、該生理機能や疾患の状態を評価するための有用な指標である。本方法によれば、採血の必要なく非侵襲的に被験体の血中ステロイドホルモン量を解析できるので、より被験体に負担をかけることなく、その生理機能や疾患の状態を調べることができる。
【００４３】
例えば、血中テストステロン量は、男性型更年期障害、アジソン病、下垂体機能低下症、肝硬変、緊張性筋ジストロフィー、前立腺癌、クッシング症候群、ターナー症候群、甲状腺機能亢進症、先天性副腎皮質過形成、多嚢胞性卵巣症候群、多発性多毛症、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍等の診断指標に使用されている。また、テストステロン及びＤＨＴは、体毛や頭部の毛の生育（非特許文献８参照）を制御し、さらにＤＨＴは男性脱毛症と密接に関与している（非特許文献９参照）。血中プロゲステロン量は、アジソン病、体機能不全、下垂体機能低下症、下垂体腫瘍、胎盤機能不全、排卵障害、無月経、卵巣機能低下症、流産、クッシング症候群、先天性副腎皮質過形成、副腎癌、副腎性器症候群、睾丸間質細胞腫等の診断指標、又は月経周期や妊娠の把握に使用されている。したがって、本発明により測定されるＳＳＬ中ステロイドホルモン量は、上述した生体の生理機能や疾患の状態を評価するための有用な指標となる可能性がある。
【００４４】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４５】
〔１〕被験体から採取した皮膚表上脂質（ＳＳＬ）中のステロイドホルモンを分離することを含む、ステロイドホルモンの調製方法。
〔２〕好ましくは、前記分離が、前記ＳＳＬ中のステロイドホルモンを溶媒抽出することを含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記ステロイドホルモンが、アンドロゲン、プロゲステロン、エストロゲン、及び糖質コルチコイドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
好ましくは、該アンドロゲンが、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、テストステロン（Ｔ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、及びアンドロステンジオン（Ａ−ｄｉｏｎｅ）からなる群より選択される少なくとも１種であり、
好ましくは、該エストロゲンがエストロン（Ｅ１）及びエストラジオール（Ｅ２）からなる群より選択される少なくとも１種であり、
好ましくは、該糖質コルチコイドがコルチゾール（Ｆ）である、
〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記溶媒が、好ましくは有機溶媒であり、より好ましくはエーテル類である、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記被験体のＳＳＬを採取することをさらに含む、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４６】
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法で調製したステロイドホルモンを定量することを含む、ＳＳＬ中ステロイドホルモンの定量方法。
〔７〕好ましくは、前記定量がＬＣ−ＭＳ測定により行われる、〔６〕記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ＬＣ−ＭＳ測定の前に、前記ステロイドホルモンの誘導体を調製することをさらに含む、〔７〕記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記ステロイドホルモンがアンドロゲン、プロゲステロン、又は糖質コルチコイドであり、前記誘導体がエステル誘導体である、〔８〕記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記ステロイドホルモンがエストロゲンであり、前記誘導体がペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体である、〔８〕記載の方法。
〔１１〕好ましくは、前記ペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体のフルオロピリジンエーテル誘導体又はエステル誘導体を調製することをさらに含む、〔１０〕記載の方法。
【００４７】
〔１２〕〔６〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法により、被験体から採取したＳＳＬ中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の皮膚特性の解析方法。
〔１３〕好ましくは、前記ＳＳＬ中ステロイドホルモン量に基づいて前記被験体の皮膚特性を評価することをさらに含む、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記ＳＳＬ中ステロイドホルモン量の変化に基づいて前記被験体の皮膚特性を評価することをさらに含む、〔１２〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記ステロイドホルモンがアンドロゲンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕好ましくは以下をさらに含む、〔１５〕記載の方法：
前記アンドロゲン量が高い場合、前記被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は高いと判断し、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断すること；
前記アンドロゲン量が低い場合、前記被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は低いと判断し、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断すること；
前記アンドロゲン量が増加した場合、前記被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の増加を判断又は予測し、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下を判断又は予測すること；あるいは、
前記アンドロゲン量が減少した場合、前記被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の低下を判断又は予測し、一方、該被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加を判断又は予測すること。
〔１７〕好ましくは、前記ステロイドホルモンがプロゲステロンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕好ましくは以下をさらに含む、〔１７〕記載の方法：
前記プロゲステロン量が高い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は低いと判断すること；
前記プロゲステロン量が低い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は高いと判断すること；
前記プロゲステロン量が増加した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加を判断又は予測し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の低下を判断又は予測すること；あるいは、
前記プロゲステロン量が減少した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下を判断又は予測し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の増加を判断又は予測すること。
〔１９〕好ましくは、前記ステロイドホルモンがエストロゲンであり、前記被験体の皮膚特性が、皮脂量、角層水分量、経皮水分蒸散量、メラニン量、紅班量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２０〕好ましくは以下をさらに含む、〔１９〕記載の方法：
前記エストロゲン量が高い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は低いと判断すること；
前記エストロゲン量が低い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量は高いと判断すること；
前記エストロゲン量が増加した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加を判断又は予測し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の低下を判断又は予測すること；あるいは、
前記エストロゲン量が減少した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下を判断又は予測し、一方、該被験体の皮脂量、ＴＥＷＬ、メラニン量及び紅班量の増加を判断又は予測すること。
〔２１〕好ましくは、前記ステロイドホルモンが糖質コルチコイドであり、前記被験体の皮膚特性が、角層水分量及び皮膚ｐＨからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２２〕好ましくは以下をさらに含む、〔２１〕記載の方法：
前記糖質コルチコイド量が高い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは低いと判断すること；
前記糖質コルチコイド量が低い場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨは高いと判断すること；
前記糖質コルチコイド量が増加した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの低下を判断又は予測すること；あるいは、
前記糖質コルチコイド量が減少した場合、前記被験体の角層水分量及び皮膚ｐＨの増加を判断又は予測すること。
【００４８】
〔２３〕〔６〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法により、被験体から採取したＳＳＬ中のステロイドホルモンを定量することを含む、被験体の血中ステロイドホルモン量の解析方法。
〔２４〕好ましくは、前記ＳＳＬ中のステロイドホルモン量の変化に基づいて前記被験体の血中ステロイドホルモン量の変化を解析することをさらに含む、〔２３〕記載の方法。
〔２５〕好ましくは、前記ステロイドホルモンが、アンドロゲン及びプロゲステロンからなる群より選択される少なくとも１種である、〔２３〕又は〔２４〕記載の方法。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５０】
以下の実施例において、ステロイドホルモンを下記の略号で表す。
ＤＨＥＡ；デヒドロエピアンドロステロン
Ｔ；テストステロン
ＤＨＴ；ジヒドロテストステロン
Ａ−ｄｉｏｎｅ；アンドロステンジオン
Ｐ４；プロゲステロン
Ｆ；コルチゾール
Ｅ１；エストロン
Ｅ２；エストラジオール
【００５１】
試験例１  ＳＳＬ中ステロイドホルモンの定量
（１）被験者
健常男性及び健常女性（２０〜５９歳、ＢＭＩ：１８．５以上５．０未満）８０名を被験者とした。被験者は、予め皮膚科医により皮膚に異常が無いことを確認した。
【００５２】
（２）ＳＳＬの採取
ステロイドホルモン測定の妨害となるような脂溶性物質をあらかじめ除去するため、あぶら取りフィルム（３Ｍ社）をクロロホルム/メタノール溶液に浸漬した。浸漬後のあぶら取りフィルムは十分に乾燥させた。該あぶら取りフィルムを用いて、各被験者の全顔からＳＳＬを回収し、精密天びんで質量を測定し、ＳＳＬの質量（ＳＳＬ回収後のあぶら取りフィルムの質量−ＳＳＬ回収前のあぶら取りフィルムの質量）を求めた。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、−８０℃で保存した。
【００５３】
（３）ＳＳＬからのステロイドホルモンの抽出
本手順は、株式会社あすか製薬メディカルに委託して実施した。あぶら取りフィルム をハサミで細かく切断し試験管に入れ、内部標準（ＤＨＥＡ−13Ｃ3（ＩＳＯＳｃｉｅｎｃｅｓ）４００ｐｇ、Ｔ−13Ｃ3（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）６００ｐｇ、ＤＨＴ−13Ｃ3（ＩＳＯＳｃｉｅｎｃｅｓ）２００ｐｇ、Ａ−ｄｉｏｎｅ−13Ｃ3（ＩＳＯＳｃｉｅｎｃｅｓ）４００ｐｇ、Ｐ４−13Ｃ3（林純薬工業株式会社）４００ｐｇ、Ｆ−ｄ４（ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）２０００ｎｇ、Ｅ１−13Ｃ4（林純薬工業株式会社）１００ｐｇ、及びＥ２−13Ｃ4（林純薬工業株式会社））１０ｐｇを添加した後、４ｍＬのメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でステロイドホルモンを抽出した。抽出後、ＭＴＢＥを留去し、得られた残留物に２ｍＬのヘキサンと０．５ｍＬのアセトニトリルを加えて振盪し、アセトニトリル層を分取し留去した。残留物を１ｍＬのメタノールに溶解し、ＳＳＬ由来ステロイドホルモンを含むサンプル溶液を得た。得られたサンプル溶液は、それぞれＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４及びＦの測定用と、Ｅ１及びＥ２の測定用に２等分した。
【００５４】
（４）ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４及びＦの定量
本測定は、特許第４６３４９１３号（「ステロイドの測定方法」）に記載される方法に従って実施した。（３）で得られたＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４及びＦの測定用のサンプル溶液に１ｍＬの精製水を加えて希釈し、Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸカートリッジ（ウォーターズ）に負荷した。カートリッジを１ｍＬの精製水、１ｍＬの精製水／メタノール／酢酸水溶液（５５：４５：１，ｖ／ｖ／ｖ）、及び１ｍＬの精製水／ピリジン水溶液（１００：１，ｖ／ｖ）で順次洗浄後、１ｍＬのメタノール／ピリジン溶液（１００：１，ｖ／ｖ）でサンプルを溶出し、得られた溶出物から溶離液を留去した。残留物に０．０５ｍＬのピコリン酸エステル誘導体化試薬（４０ｍｇのピコリン酸（東京化成工業）、８０ｍｇの２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（ＭＮＢＡ、東京化成工業）及び２０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含むアセトニトリル溶液１ｍＬ）、及び０．０１ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、富士フィルム和光純薬株式会社）を加え、ステロイドのピコリン酸エステル誘導体化反応を室温で３０分間行った。反応液を０．５ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン／酢酸溶液（１５：３５：１，ｖ／ｖ／ｖ）で希釈後、ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＳＩカートリッジ（ジーエルサイエンス）に負荷した。カートリッジを１ｍＬのヘキサン及び２ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン溶液（３：７，ｖ／ｖ）で順次洗浄後、２．５ｍＬのアセトン／ヘキサン溶液（７：３，ｖ／ｖ）でサンプルを溶出した。
得られた溶出物から溶離液を留去し、残留物を０．１ｍＬの精製水／アセトニトリル水溶液（３：２，ｖ／ｖ）に溶解した。得られた溶液を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ［質量分析計：ＡＰＩ４０００、ＵＨＰＬＣ：Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ、分析カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（１．７μｍ，２．１×１５０ｍｍ）、カラム温度：５０℃、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相：０．１％ギ酸水溶液−アセトニトリルグラジエント分析］によりＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４及びＦを測定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定値から、それぞれの内部標準に基づく検量線に従って、ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４、及びＦの量をそれぞれ定量した。得られた値を（２）で測定したＳＳＬの質量で除した値を、ＳＳＬ中のＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４及びＦの量として取得した。
【００５５】
（５）Ｅ１及びＥ２の定量
本測定は、特許第６０４１１２５号（「エストロゲンの超高感度測定法」）に記載される方法に従って実施した。（３）で得られたＥ１及びＥ２の測定用のサンプル溶液に１ｍＬの精製水を加えて希釈し、Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸカートリッジ（ウォーターズ）に負荷した。カートリッジを１ｍＬの精製水／酢酸水溶液（１００：１，ｖ／ｖ）、１ｍＬの精製水／アセトニトリル水溶液（７：３，ｖ／ｖ）、１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、３ｍＬのメタノール、１ｍＬの精製水／酢酸水溶液（１００：１，ｖ／ｖ）、及び１ｍＬのメタノール／精製水／ピリジン水溶液（６０：４０：１，ｖ／ｖ／ｖ）で順次洗浄後、１ｍＬのメタノール／精製水／ピリジン水溶液（９０：１０：１，ｖ／ｖ／ｖ）でサンプルを溶出し、得られた溶出物から溶離液を留去した。残留物にペンタフルオロピリジン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）０．０５ｍＬ、アセトニトリル０．１ｍＬ及びＴＥＡ０．０２ｍＬを加え、ステロイドのテトラフルオロピリジンエーテル誘導体化反応を室温で２０分間行った。
反応物から液体を留去し、得られた残留物（Ｅ１−Ｔｆｐｙ及びＥ２−Ｔｆｐｙを含む）に２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン（ＨＭＰ０．０５ｍｇ、あすか製薬メディカル）、トリフルオロ酢酸（富士フィルム和光純薬株式会社）０．０１ｍＬ及びアセトニトリル０．１４ｍＬを加え、室温で１時間反応させ残留物中のＥ１−ＴｆｐｙをＨＭＰ誘導体化した。得られた反応物から液体を留去し、残留物を０．５ｍＬのメタノールに溶解、さらに０．５ｍＬの精製水で希釈し、Ｏａｓｉｓ  ＷＣＸカートリッジ（ウォーターズ）に負荷した。カートリッジを１ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液、２ｍＬの精製水及び１ｍＬの精製水／アセトニトリル水溶液（３：２，ｖ／ｖ）で順次洗浄後、１ｍＬのメタノールでＥ２−Ｔｆｐｙ画分を溶出した。Ｅ２−Ｔｆｐｙ溶出後のカートリッジを２ｍｌのアセトニトリル、０．５ｍＬの精製水及び１ｍＬのメタノール／精製水／ギ酸水溶液（６５：３５：２，ｖ／ｖ／ｖ）水溶液で洗浄後、１ｍＬのメタノール／ギ酸溶液（５０：１，ｖ／ｖ）でＥ１誘導体（Ｅ１−ＴｆｐｙＨＭＰ）画分を溶出した。それぞれの画分から溶離液を留去した。
Ｅ２−Ｔｆｐｙ画分の残留物に０．０５ｍＬのフザリン酸エステル誘導体化試薬（アセトニトリル溶液１ｍＬに４０ｍｇのフザリン酸（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、８０ｍｇのＭＮＢＡ及び２０ｍｇのＤＭＡＰを溶解）及び０．０１ｍＬのＴＥＡを加え、Ｅ２−Ｔｆｐｙのフザリン酸エステル誘導体化反応を室温で３０分間行った。反応液を０．５ｍＬのヘキサン／酢酸溶液（５０：１，ｖ／ｖ）で希釈後、ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＳＩカートリッジに負荷した。カートリッジを１ｍＬのヘキサン及び２ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン溶液（３：１７，ｖ／ｖ）で順次洗浄後、２.５ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン溶液（９：１１，ｖ／ｖ）でＥ２誘導体（Ｅ２−ＴｆｐｙＦＵ）を溶出し、溶出物から溶離液を留去した。
Ｅ１−ＴｆｐｙＨＭＰを含む残留物は、０．１ｍＬのアセトニトリル／精製水水溶液（７：３，ｖ／ｖ）に溶解した。Ｅ２−ＴｆｐｙＦＵを含む残留物は、０．１ｍＬのアセトニトリル／精製水水溶液（４：１，ｖ／ｖ）に溶解した。得られた溶液を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりＥ１及びＥ２を測定した。Ｅ１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定は［質量分析計：ＡＰＩ５０００、ＵＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ、１次元目分析カラム：Ｃｏｒｔｅｘ  Ｃ１８（１．６μｍ，２．１×５０ｍｍ）、２次元目分析カラム：Ｌｕｎａ  Ｏｍｅｇａ  ＰＳ  Ｃ１８（１．６μｍ，２．１×５０ｍｍ）、カラム温度：６０℃、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、１次元目移動相：０．１％ギ酸水溶液−メタノールグラジエント分析、２次元目移動相：２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリルグラジエント分析］の条件で実施した。Ｅ２のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定は［質量分析計：ＡＰＩ５０００、ＵＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ、１次元目分析カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｃｏｒｅ  ＰＦＰ（２．７μｍ，２．１×５０ｍｍ）、２次元目分析カラム：Ｃｏｒｔｅｘ  Ｃ１８（１．６μｍ，２．１×１５０ｍｍ）、カラム温度：６０℃、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、１次元目移動相：０．１％ギ酸水溶液−アセトニトリルグラジエント分析、２次元目移動相：０．１％ギ酸水溶液−アセトニトリルグラジエント分析で実施］の条件で実施した。得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定値から、それぞれの内部標準に基づく検量線に従って、Ｅ１及びＥ２の量をそれぞれ定量した。得られた値を（２）で測定したＳＳＬの質量で除した値を、ＳＳＬ中のＥ１及びＥ２の量として取得した。
【００５６】
（６）結果
ＳＳＬを採取した全被験者で、８種のステロイドホルモン（ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４、Ｆ、Ｅ１及びＥ２）の全てを検出及び定量することができた。各ステロイドホルモンの量の全被験者間での平均値と標準偏差を表１に示す。表１の結果より、Ｅ１とＥ２の量は少ないものの、ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４、ＦはＳＳＬ中に豊富に存在していることが明らかとなった。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
試験例２  ＳＳＬ中ステロイドホルモン量と皮膚特性との関連
試験例１の被験者集団において、ＳＳＬ採取と同日に皮膚特性についての各種測定を実施した。皮膚特性の測定では、最初に、Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ＳＭ８１５（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて洗顔４時間以上経過した額と頬のカジュアル皮脂量を測定した。その後、洗顔を実施し、馴化を２０分間実施した後に、頬部において、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ  ＴＭ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）で経皮水分蒸散量を、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）で角層水分量を、Ｓｋｉｎ−ｐＨ−Ｍｅｔｅｒ  ＰＨ９０５（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）で皮膚ｐＨを、Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ  ＭＸ１８（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）でメラニンインデックス及びエリスマインデックスを、それぞれ測定した。さらに洗顔６０分後に、Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ＳＭ８１５を用いて額と頬部の回復皮脂量を測定した。得られた各種皮膚特性値と試験例１で測定したＳＳＬ中の各種ステロイドホルモン量との相関をピアソンの相関解析により解析した。結果を表２に示す。
【００５９】
表２の結果より、ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、Ａ−ｄｉｏｎｅ、Ｐ４、Ｆと各種皮膚特性の間には、統計学的に有意な相関性が複数確認された。アンドロゲン（ＤＨＥＡ、Ｔ、ＤＨＴ、及びＡ−ｄｉｏｎｅ）は主に皮脂量、経皮水分蒸散量、メラニンインデックス及びエリスマインデックスと正相関を示し、一方、角層水分量及びｐＨと負相関を示した。プロゲステロン（Ｐ４）は、角層水分量及びｐＨと正相関を示し、一方、皮脂量、経皮水分蒸散量、メラニンインデックス及びエリスマインデックスと負相関を示した。コルチゾール（Ｆ）は、角層水分量及びｐＨと負相関を示した。エストロゲン（Ｅ１及びＥ２）は、角層水分量及びｐＨと正相関を示し、皮脂量、経皮水分蒸散量、メラニンインデックス及びエリスマインデックスと負相関を示した。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
試験例３  ＳＳＬ中ステロイドホルモン量と血中ステロイドホルモン量との関連
試験例１の被験者集団から、ＳＳＬ採取と同日に腕より血液３ｍＬを採取した。採取した血液から遠心分離機により血清を分離し、解析まで−８０℃で保存した。得られた血清サンプルから、Ｔ及びＰ４の血中濃度を、ＥＬＩＳＡによる測定キット（Ｃａｙｍａｎ）を用いて添付のプロトコルに従い定量した。Ｔ及びＰ４について、血中濃度と、試験例１で測定したＳＳＬ中濃度との間の相関性を解析した。Ｔ及びＰ４の血中及びＳＳＬ中濃度をプロットした結果を図１に示す。Ｔ及びＰ４について、ＳＳＬ中濃度と血中濃度との間に統計的に有意な正の相関がみられた。
【図１】
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