(57)【要約】【課題】本発明は、高強度、生分解性、および自己修復特性を示し、細胞の増殖を阻害しないことから再生医療用の足場材料などとして利用可能なヒドロゲルを提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るヒドロゲルは、ポリロタキサンと水溶性多糖類を含み、前記ポリロタキサンが、両末端に封鎖基を有する直鎖状分子が環状分子を貫通している構造を有するものであり、前記環状分子と前記水溶性多糖類が可逆的共有結合により架橋されていることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を含み、
前記ポリロタキサンが、両末端に封鎖基を有する直鎖状分子が環状分子を貫通している構造を有するものであり、
前記環状分子と前記鎖状水溶性多糖類が可逆的共有結合により架橋されていることを特徴とするヒドロゲル。
【請求項２】
前記直鎖状分子がポリエチレングリコールである請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項３】
前記環状分子が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される１以上である請求項１または２に記載のヒドロゲル。
【請求項４】
前記可逆的共有結合が、アルデヒド基とアミノ基により形成されるアゾメチン基、ボロン酸基とｃｉｓ−ジオール基とのボロン酸エステル結合、ジスルフィド結合、アルデヒド基と水酸基とのアセタール結合、およびケトン基と水酸基とのケタール結合から選択される１以上である請求項１〜３のいずれかに記載のヒドロゲル。
【請求項５】
前記鎖状水溶性多糖類が水溶性キトサン誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載のヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高強度、生分解性、および自己修復特性を示し、細胞の増殖を阻害しないことから再生医療用の足場材料などとして利用可能なヒドロゲルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、三次元状の網目構造を持つ高分子が水を含んで膨潤した物質の総称であり、その高い含水率と優れた生体適合性から、再生医療用の足場材料をはじめとする生体材料としてこれまでに多くの応用が検討されてきた。例えば、タンパク質であるコラーゲンが再生医療用の足場材料として検討されている。
【０００３】
また、再生医療用の足場材料として、ヒドロゲル内で細胞を培養した後に自由自在にゲルの形を工作することができ、場合によっては一旦切断したヒドロゲルを再び接着できる自己修復特性を有すれば、埋植部位において最適形状の足場部位を調製できるため、臨床応用的にも望ましい。そこで本発明者らは、グリコールキトサンのアミノ基と酸化デキストランのアルデヒド基の間でアゾメチン基を形成させて架橋し、自己修復特性を有するヒドロゲルを開発した（非特許文献１）。アゾメチン基は容易に加水分解されるため、かかるヒドロゲルは生分解性も示す。
【０００４】
しかし、従来のヒドロゲルは非常に脆いために、例えば血管や軟骨など高負荷がかかる部位に使用する足場材料としては不十分であった。
【０００５】
ところで、近年、両末端に封鎖基を有する直鎖状分子が環状分子を貫通しているという構造を有するポリロタキサンという高分子が開発されている。ポリロタキサンは、環状分子が直鎖状分子に沿って移動可能であり、負荷された変形応力を内部で吸収可能であるため、優れた耐傷付き性を示す塗料成分などとして、車のバンパーやゴルフボールなどに適用されている（特許文献１，２）。
【０００６】
しかし上記のポリロタキサンは架橋されていない。また、有機溶媒への溶解性を高めるべく、環状分子にカプロラクタム基、および当該カプロラクタム基が開環したヒドロキシペンチル基が導入されているため、ヒドロゲルとして利用できず、生体への適用もできない。
【０００７】
ポリロタキサンを架橋することも検討されてはいるが、主に工業用途が志向されているため、架橋剤として塩化シアヌルやヘキサメチレンジシアネート等、反応性の高さから生体に有害な試薬が用いられている（非特許文献２〜４）。ヒドロキシプロピル基を介した架橋や（非特許文献５）、三次元的構造を有するポリロタキサンゲル（非特許文献６）も検討されているが、不可逆的な共有結合により架橋された高分子は生分解性を示さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１５−４５０２８号公報
【特許文献２】特開２０１８−１０２６９４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１６／１７１１８７号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｋ  Ｓｕｎｇ  Ｃｈｏ  ＆  Ｔｏｏｒｕ  Ｏｙａ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．，２０１８，２９（２），ｐｐ．１４５−１５９
【非特許文献２】Ｙａｓｕｓｈｉ  Ｏｋｕｍｕｒａ  ＆  Ｋｏｈｚｏ  Ｉｔｏ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００１，１３（７），ｐｐ．４８５−４８７
【非特許文献３】Ｋｏｈｚｏ  Ｉｔｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３９（６），ｐｐ．４８９−４９９（２００７）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｍａｃｒｏ  Ｌｅｔｔ．，２０１７，６，ｐｐ．１４０９−１４１３
【非特許文献５】Ｃｈｉｋａｒａ  Ｋａｔｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２０１３，２５，ｐｐ．４６３６−４６４０
【非特許文献６】Ｔａｋｕｙａ  Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２０１７，５５，ｐｐ．１１５６−１１６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、再生医療用の足場材料などとして利用されるヒドロゲルは検討されているが、高強度、生分解性、および自己修復特性を示し、細胞の増殖を阻害しないヒドロゲルは未だ開発されていない。
そこで本発明は、高強度、生分解性、および自己修復特性を示し、細胞の増殖を阻害しないことから再生医療用の足場材料などとして利用可能なヒドロゲルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を可逆的な共有結合で架橋すれば、高強度であるにもかかわらず生分解性を示すのみならず自己修復特性も有し、細胞の増殖を阻害しないことを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【００１２】
［１］  ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を含み、
前記ポリロタキサンが、両末端に封鎖基を有する直鎖状分子が環状分子を貫通している構造を有するものであり、
前記環状分子と前記鎖状水溶性多糖類が可逆的共有結合により架橋されていることを特徴とするヒドロゲル。
［２］  前記直鎖状分子がポリエチレングリコールである上記［１］に記載のヒドロゲル。
［３］  前記環状分子が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される１以上である上記［１］または［２］に記載のヒドロゲル。
［４］  前記可逆的共有結合が、アルデヒド基とアミノ基により形成されるアゾメチン基、ボロン酸基とｃｉｓ−ジオール基とのボロン酸エステル結合、ジスルフィド結合、アルデヒド基と水酸基とのアセタール結合、およびケトン基と水酸基とのケタール結合から選択される１以上である上記［１］〜［３］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［５］  前記鎖状水溶性多糖類が水溶性キトサン誘導体である上記［１］〜［４］のいずれかに記載のヒドロゲル。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るヒドロゲルは、高分子鎖間の可逆的共有結合の形成と解離によって、自己修復特性を有する。また、２種の高分子が可逆的な共有結合で架橋されており、生分解性を示すにもかかわらず、ポリロタキサンの導入により高強度を示す。更に、本発明者らの実験的知見によれば、本発明に係るヒドロゲルを培地として用いて細胞を増殖させることも可能である。よって本発明に係るヒドロゲルは、再生医療用の足場材料などとして非常に利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、（１）ポリロタキサン水溶液の写真、（２）グリコールキトサン水溶液の写真、および（３）本発明に係るヒドロゲルの写真である。
【図２】図２は、酸化デキストリン−グリコールキトサンゲルのＳＥＭ写真（Ａ）と、本発明に係るヒドロゲルのＳＥＭ写真（Ｂ〜Ｄ）である。
【図３】図３は、本発明に係るヒドロゲルの水分取り込み量（１）と含水率（２）の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、酸化デキストリン−グリコールキトサンゲルと本発明に係るヒドロゲルの圧縮応力−歪み測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、酸化デキストリン−グリコールキトサンゲルと本発明に係るヒドロゲルの周期的圧縮試験結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明に係るヒドロゲルの引張応力−歪み測定の結果を示すグラフ（１）と写真（２）である。
【図７】図７は、本発明に係るヒドロゲルを切断した断片を接触させて自己修復させた写真（１）と接触面の拡大写真（２）である。
【図８】図８は、自己修復させた本発明に係るヒドロゲルの動的粘弾性測定の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、自己修復前後における本発明に係るヒドロゲルの引張試験結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、酸化デキストリン−グリコールキトサンゲルと本発明に係るヒドロゲルの内部におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の蛍光標識写真である。
【図１１】図１１は、酸化デキストリン−グリコールキトサンゲルと本発明に係るヒドロゲルの内部における蛍光標識したヒト臍帯静脈内皮細胞の蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るヒドロゲルは、ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を含み、これらが架橋された構造を有する。
【００１６】
ポリロタキサンは、両末端に封鎖基を有する直鎖状分子が環状分子を貫通している構造を有する高分子であり、環状分子が直鎖状分子に沿って移動可能であり、負荷された変形応力を内部で吸収可能であるため、優れた耐傷付き性を示す塗料成分などとして利用されている。本発明に係るヒドロゲルの高い強度は、ポリロタキサンにより発揮されると考えられる。
【００１７】
ポリロタキサンを構成する直鎖状分子は、親水性または両親媒性であり、環状分子を貫通できる程度に嵩高くないものであれば特に制限されず、例えばポリエーテル、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリアミド、ポリウレタンが挙げられ、ポリエーテルが好ましい。ポリエーテルとしては、Ｈ−［−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＲ3Ｒ4−］−ＯＨ（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈまたはメチル基を示す）で表されるポリアルキレングリコールが好ましく、環状分子の貫通に対する立体障害の少ないポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびエチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体がより好ましい。
【００１８】
直鎖状分子の分子量は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば１，０００Ｄａ以上、１００，０００Ｄａ以下が好ましい。分子量が１，０００Ｄａ以上であれば、ヒドロゲルの強度をより確実に確保することができ、１００，０００Ｄａ以下であれば、その水溶液の粘度が過剰に高くならず、ヒドロゲルの作製がより容易になる。当該分子量としては、１０，０００Ｄａ以上がより好ましく、２０，０００Ｄａ以上がより更に好ましく、また、５０，０００Ｄａ以下がより好ましく、４０，０００Ｄａ以下がより更に好ましい。
【００１９】
ポリロタキサンを構成する環状分子は、直鎖状分子が貫通できる内腔を有するものであれば特に制限されない。例えば、シクロデキストリンやシクロフラクタンなどが挙げられる。シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンが挙げられ、内径の点からα−シクロデキストリンが好ましい。シクロフラクタンとしては、例えば、環状オリゴマー中に６〜８個のフルクトース部分を有するＣＦ６、ＣＦ７、ＣＦ８などが挙げられる。
【００２０】
環状分子は、シクロデキストリンやシクロフラクタンなどの誘導体であってもよい。１分子のポリロタキサンあたり１分子の環状分子が直鎖状分子に貫通していることも考えられるが、環状分子の内腔と直鎖状分子との親和性に応じて２分子以上の環状分子が貫通している可能性がある。ポリロタキサンは鎖状水溶性多糖類と架橋する必要があるため、１分子のポリロタキサンあたり１分子以上の環状分子が架橋のための官能基を有している必要がある。架橋のための官能基としては、アゾメチン基のためのアルデヒド基またはアミノ基、ボロン酸エステル結合のためのボロン酸基またはｃｉｓ−ジオール基、ジスルフィド結合のためのスルフヒドリル基、アセタール結合のためのアルデヒド基または水酸基、ケタール結合のためのケトン基または水酸基が挙げられる。なお、これら架橋のための官能基は、例えばＣ1-4アルカンジイル基やフェニレン基などのリンカー基により環状分子に結合していてもよい。但し、シクロデキストリンやシクロフラクタンのように、ｃｉｓ−ジオール基や水酸基を元々有している場合がある。
【００２１】
環状分子は、架橋のための官能基以外の官能基を有していてもよい。かかる官能基としては、例えば、水溶性を向上させるヒドロキシ−Ｃ1-4アルキル基が挙げられる。即ち、本開示においてシクロデキストリンおよびシクロフラクタンなどの誘導体とは、鎖状水溶性多糖類との架橋のための官能基および／または水溶性向上のための官能基が導入されたシクロデキストリンおよびシクロフラクタンなどを意味する。
【００２２】
ポリロタキサンにおいて封鎖基は直鎖状分子の両末端に存在し、直鎖状分子からの環状分子の脱落を抑制する役割を有する。封鎖基は、環状分子の脱落を十分に抑制できる程度に嵩高い基であれば特に制限されないが、例えば、アダマンチル基やＣ6-12芳香族炭化水素基が挙げられる。Ｃ6-12芳香族炭化水素基としてはフェニル基やナフチル基が挙げられ、ニトロ基などの置換基を有していてもよい。
【００２３】
ポリロタキサンは、常法により製造できる。例えば、環状分子の内腔と直鎖状分子の少なくとも一部との親和性により、環状分子と直鎖状分子を含む溶液中、加熱するなどして環状分子に直鎖状分子を貫通させることができる。例えば、シクロデキストリンの内腔は親水性が低下しており、ポリアルキレングリコールのアルキレン基と親和性を示す。この際、直鎖状分子の両末端には封鎖基を結合させるための反応性官能基を導入しておいてもよい。次いで、直鎖状分子の両末端の反応性官能基と封鎖基の反応性官能基を反応させて、直鎖状分子の両末端を封鎖する。例えば、直鎖状分子の末端を酸化してカルボキシ基に変換しておき、封鎖基にアミノ基を導入しておき、ＢＯＰ試薬を用いれば、シクロデキストリンには複数の水酸基が存在しても、カルボキシ基とアミノ基との反応を優先的に進行せしめ、直鎖状分子の末端に封鎖基を選択的に結合させることが可能である。
【００２４】
鎖状水溶性多糖類は、単糖類が鎖状に重合した構造を有する水溶性の高分子をいう。鎖状の多糖類としては、直鎖状多糖類でも分岐鎖状多糖類でもよいが、直鎖状多糖類が好ましい。鎖状水溶性多糖類としては、例えば、アミロース、キチン、キトサン、アガロース、寒天、デキストラン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デンプン、イヌリン、セルロースが挙げられる。鎖状水溶性多糖類としては、ポリロタキサンと可逆的に共有結合させるための反応性官能基を元々有するものや、当該反応性官能基が導入されたものを用いることが好ましい。かかる反応性官能基としては、例えば、アゾメチン基のためのアルデヒド基またはアミノ基、ボロン酸エステル結合のためのボロン酸基またはｃｉｓ−ジオール基、ジスルフィド結合のためのスルフヒドリル基、アセタール結合のためのアルデヒド基または水酸基、ケタール結合のためのケトン基または水酸基が挙げられる。なお、かかる反応性官能基は、例えばＣ1-4アルカンジイル基やフェニレン基などのリンカー基により環状分子に結合していてもよい。
【００２５】
鎖状多糖類の中には、水溶性でないものがある。そのような場合には、多糖類を構成する単糖類の水酸基を、水溶性を向上させるヒドロキシ−Ｃ1-4アルキル基で修飾することにより水溶性にすることが好ましい。即ち、本開示において鎖状多糖類の誘導体とは、ポリロタキサンとの架橋のための官能基および／または水溶性向上のための官能基が導入された鎖状多糖類を意味する。
【００２６】
鎖状水溶性多糖類の分子量は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば１０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以下が好ましい。分子量が１０ｋＤａ以上であれば、ヒドロゲルの強度をより確実に確保することができ、１００ｋＤａ以下であれば、その水溶液の粘度が過剰に高くならず、ヒドロゲルの作製がより容易になる。当該分子量としては、２０ｋＤａ以上がより好ましく、また、７０ｋＤａ以下がより好ましく、５０ｋＤａ以下がより更に好ましい。
【００２７】
本発明のハイドロゲルにおいては、ポリロタキサンの環状分子と鎖状水溶性多糖類が可逆的に共有結合することにより、ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類が架橋されている。本開示において可逆的共有結合とは、水の存在下、室温などの温和な条件にて切断と形成が平衡状態になる可逆的な共有結合をいう。例えばエステル結合も、水の存在下、加熱により切断可能ではあるが、切断後の水酸基とカルボキシ基は再結合形成されないため可逆的共有結合には含まれない。可逆的共有結合は、水素結合や静電結合などの非共有結合に比べて強固である一方で、切断に極めて高いエネルギーが必要な非可逆的共有結合に比べて生分解性が高い。
【００２８】
可逆的共有結合は、生分解性を示す限り特に制限されないが、例えば、アルデヒド基とアミノ基により形成されるアゾメチン基、ボロン酸基とｃｉｓ−ジオールとのボロン酸エステル結合、スルフヒドリル基（チオール基）同士のジスルフィド結合、アルデヒド基と水酸基とのアセタール結合、およびケトン基と水酸基とのケタール結合が挙げられる。これらはポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を含む水溶液を２０℃以上、７０℃以下程度の温度条件で形成可能であり、また、解離も可能である。
【００２９】
本発明に係るヒドロゲルは、上記可逆的共有結合を常法で形成してポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類を架橋することにより、容易に製造できる。例えば、ポリロタキサンの水溶液と鎖状水溶性多糖類の水溶液を混合すればよい。
【００３０】
上記溶液の濃度は、適宜調整すればよい。例えば、上記可逆的共有結合を形成するためのポリロタキサンの反応性官能基と鎖状水溶性多糖類の反応性官能基の数が１対１の場合に、最も高強度のヒドロゲルが形成されると考えられる。よって、例えばポリロタキサンの反応性官能基の数に対する鎖状水溶性多糖類の反応性官能基の数の比を０．２以上、５以下程度に調整することが好ましい。しかし、反応性官能基を有さないポリロタキサンまたは鎖状水溶性多糖類に反応性官能基を導入した場合には、反応性官能基の数を特定できない場合がある。そのような場合などには、反応液におけるポリロタキサンおよび／または鎖状水溶性多糖類の濃度を０．５質量％以上、１５質量％以下程度に調整すればよい。なお、各水溶液の溶媒としては、緩衝液を用いてもよい。
【００３１】
本発明に係るヒドロゲルの形成のためには、ポリロタキサンの水溶液と鎖状水溶性多糖類の水溶液を混合するのみでもよいが、混合溶液を加熱することが好ましい。加熱温度は可逆的共有結合の種類などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、３０℃以上、７０℃以下程度とすることができる。
【００３２】
ポリロタキサンと鎖状水溶性多糖類は、架橋されることにより不溶化する。よって、ヒドロゲルの形成後、水などにより洗浄してもよい。
【００３３】
本発明のヒドロゲルは、高強度、生分解性、および自己修復特性を示すのみならず、その製造に毒性の高い試薬などが必要ないことから細胞の増殖を阻害しない。よって、再生医療用の足場材料など非常に有用である。例えば、ポリロタキサンの水溶液および／または鎖状水溶性多糖類の水溶液に、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞などの再生医療用細胞などを添加してヒドロゲルを作製する。次いで、細胞を含むヒドロゲルをその細胞の増殖に適した条件でインキュベートすることにより、ヒドロゲル内でも細胞を増殖させることができる。また、本発明のヒドロゲルは自己修復性も示すため、例えば細かく切断して生体内で所望の形状に埋設することにより、ヒドロゲル同士が接着し、また、本発明者らの実験的知見によればその界面においても細胞は増殖可能である。よって、本発明のヒドロゲルは、再生医療の一層の発展に寄与し得るものである。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００３５】
実施例１：  ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルの調製
（１）ＰＥＧ−カルボン酸を用いたポリロタキサンの合成
【化１】
2020180228.tif 000002
ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，数平均分子量：３５，０００）（１０．０ｇ）を２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）（１００ｍｇ）および臭化ナトリウム（１００ｍｇ）を含む蒸留水（１００ｍＬ）に溶解した。この溶液に次亜塩素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌することにより、ＰＥＧの末端を酸化した。エタノール（１０ｍＬ）を添加することにより過剰の次亜塩素酸ナトリウムを分解して反応を停止させ、続いて塩酸を加えて反応液のｐＨを２未満に調整した後、１００ｍＬの塩化メチレンで３回抽出した。抽出した塩化メチレン層を減圧乾燥し、残渣を熱エタノール（２５０ｍＬ）に溶解し、続いて冷凍庫で一晩沈殿させた。
調製したＰＥＧ−ＣＯＯＨ（３．０ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に溶解し、さらにα−シクロデキストリン（１２．０ｇ）を溶解した。得られた混合物を７０℃で３時間加熱し、溶液を冷蔵庫で一晩保持して、白色ペースト状の擬ポリロタキサンを得た。
調製した擬ポリロタキサンの分散液を凍結乾燥機で乾燥させた。別途、アダマンタンアミン（０．１６ｇ）を脱水ＤＭＦ（８０ｍＬ）に室温で溶解し、得られた擬ポリロタキサン（１４．０ｇ）を加え、すぐによく振り混ぜた。引き続き、脱水ＤＭＦ（１０ｍＬ）にＢＯＰ試薬（０．４８ｇ）を溶解した溶液を加えた。さらに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ）を脱水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、得られたスラリー状の混合物を３時間攪拌し、４℃で一晩反応させた後、ＤＭＦ／メタノール＝１／１で２回遠心分離して洗浄した。さらにメタノールで２回洗浄した。得られた固体をＤＭＳＯに溶解した溶液（８０ｍＬ）を水（８００ｍＬ）に加えて沈殿させ、遠心分離する洗浄操作を繰り返した。次いで、凍結乾燥させて、ポリロタキサンを白色固体として得た。
【００３６】
（２）ポリロタキサンアルデヒド（ＰＲＸ−ＡＬＤ）の合成
【化２】
2020180228.tif 000003
ポリロタキサン（１．０ｇ）およびデスマーチンペルヨージナン（ＤＭＰ）（０．６９６ｇ）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解した。次いで、室温で２４時間撹拌し、反応混合物をアセトン（２００ｍＬ）に滴下し、１時間撹拌した後に、冷凍庫で２時間静置した。この溶液を蒸留水中で３日間透析し、沈殿物を回収し、凍結乾燥してＰＲＸ−ＡＬＤを白色固体として得た。
【００３７】
（３）ヒドロキシプロピル化ポリロタキサンアルデヒド（ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ）の合成
【化３】
2020180228.tif 000004
ポリロタキサンアルデヒド（１．０ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液にプロピレンオキシド（１１．４ｍＬ）をゆっくり加え、室温で２４時間反応させた。反応液を塩酸で中和した後、溶液を蒸留水に対して３日間透析し、次いで凍結乾燥して、水溶性のＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤを白色固体として得た。
【００３８】
（４）ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルの調製
【化４】
2020180228.tif 000005
ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤを蒸留水に溶解し、５質量％、７．５質量％および１０質量％の水溶液をそれぞれ調製した。別途、グリコールキトサン（ＧＣ）（和光純薬社製）を蒸留水に溶解し、５質量％水溶液を調製した。使用したＧＣを1Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、重合度は２００以上、アセチル化率は９．１３±０．８９％であった。
ヒドロゲルを調製するために、５質量％のＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液を５質量％のＧＣ水溶液と１：１（容量比）の比率で混合した。混合物を１０秒間静かに撹拌し、３７℃に維持した。結果を図１に示す。図１中、（１）はＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液の写真、（２）はグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液の写真、（３）は混合物の写真である。
図１に示す結果の通り、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液とＧＣ水溶液はゾル状であったのに対し、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液とＧＣ水溶液の混合物はチューブを反転しても流動せず、ゲル化していることが確認された。
【００３９】
試験例１：  動的粘弾性測定
各水溶液を１：１の容量比で混合し、レオメーターを用いて１０ｒａｄ／ｓの振動周波数で３７℃にて時間掃引試験を行った。具体的には、各水溶液を混合した直後にサンプルを試験プレート上に置き、１分後に測定を開始し、貯蔵弾性率Ｇ'と損失弾性率Ｇ”を求め、Ｇ'＝Ｇ”となるゲル化時間を求めた。結果を表１に示す。表１中、ＨＰ−ＰＲＸx−ＡＬＤ／ＧＣゲルと命名されたゲルの「ｘ」は、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液の濃度を示す。
【００４０】
【表１】
2020180228.tif 000006
【００４１】
表１に示す結果の通り、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液の濃度が高いほど速やかにゲル化することが明らかになった。その理由としては、グリコールキトサンのアミノ基とＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤのアルデヒド基とから可逆的共有結合であるアゾメチン基が形成される反応は平衡反応であり、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液の濃度が高いほどアルデヒド基濃度も高くなり、平衡が結合解離よりも結合形成側に傾くことによりアゾメチン基が多く形成され、ゲル化が進行したと考えられる。
【００４２】
試験例２：  ゲルの拡大観察
さらに、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤの各水溶液を５質量％のグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液と１：１の容量比で混合して、直径１０ｍｍ×厚さ５ｍｍの円筒形ヒドロゲルを作製し、−５０℃で凍結乾燥した。乾燥したヒドロゲルを中央に沿って破砕してヒドロゲルの断面を露出させ、蒸着により断面をＰｔで被覆し、ＳＥＭで観察した。また、比較のために、５質量％の酸化デキストリン（Ｏｄｅｘ）と５質量％のグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液を使って作製したゲルも同様に観察した。ＳＥＭ写真を図２に示す。図２中、（Ａ）はＯｄｅｘ/ＧＣヒドロゲルのＳＥＭ写真であり、（Ｂ）はＨＰ−ＰＲＸ5−ＡＬＤ／ＧＣヒドロゲルのＳＥＭ写真であり、（Ｃ）はＨＰ−ＰＲＸ7.5−ＡＬＤ／ＧＣヒドロゲルのＳＥＭ写真であり、（Ｄ）はＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤ／ＧＣヒドロゲルのＳＥＭ写真であり、各ＳＥＭ写真中のスケールは１００μｍを示す。
図２に示すＳＥＭ写真の通り、ＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣヒドロゲルを構成する高分子の主鎖間には、矢印で示す非常に細い構造が観察された。かかる構造は、ゲル製造の反応条件から、酸化シクロデキストリンのアルデヒド基とグリコールキトサンのアミノ基との間で形成された架橋鎖であり、移動可能なものであると考えられる。
【００４３】
試験例３：  膨潤プロファイルと生分解挙動の解析
乾燥したＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベーションし、所定時間でＰＢＳから取り出し、過剰のＰＢＳを濾紙で穏やかに吸い取った後に秤量した。含水率は、以下の式により算出した。
含水率（％）＝［（ｍｔ−ｍｏ）／ｍｏ］×１００
［式中、ｍｔは膨潤したヒドロゲルの質量を示し、ｍｏは乾燥したゲルの質量を示す。］
測定は３回行い、平均値と標準偏差を求めた。乾燥したＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルからの水分取り込み量（Ｗａｔｅｒ  ｕｐｔａｋｅ）を図３（１）に、膨潤平衡後におけるＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルからの含水率（Ｗｅｉｇｈｔ  ｒａｔｉｏ）の変化を図３（２）に示す。
図３（１）に示す結果の通り、グリコールキトサン（ＧＣ）に対するＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤの割合が大きいほど膨潤平衡時の水分含量が少ないことが明らかになった。その理由としては、ゲルの架橋点である可逆的共有結合が多いことが考えられる。また、図３（２）に示す結果の通り、ＧＣに対するＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤの割合が大きいほど膨潤平衡後の重量減少が遅くなることが明らかになった。その理由としては、ゲルの架橋点である可逆的共有結合が多くなることで、可逆的結合が解離した後にも再結合する確立が高くなり、分解後に生じると考えられるＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣの断片が水媒体中に溶解・拡散し難くなったことが考えられる。
【００４４】
試験例４：  機械的試験
（１）圧縮応力−歪み測定
自動記録万能試験装置の下板に直径１０ｍｍ×高さ５ｍｍの円柱状ゲル試料をセットし、ロードセルに接続した上板を使って１ｍｍ／ｍｉｎの歪率で圧縮した。結果を図４に示す。
図４に示す結果の通り、従来の自己修復ゲルであるＯｄｅｘ/ＧＣゲルは圧縮により崩壊したのに対して、本発明に係るＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ／ＧＣゲルは崩壊しなかった。
【００４５】
（２）周期的圧縮試験
１０質量％のＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤ水溶液を５質量％のグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液と１：１の容量比で混合して作製したＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤ／ＧＣゲルの円柱状試料を、０〜５５％の圧縮歪みで１０ｍｍ／ｍｉｎの一定速度で１０サイクル圧縮し、応力を測定した。結果を図５に示す。
図５に示す結果の通り、本発明ゲルに対して圧縮を１０回繰り返しても同様の応力−歪み特性を保持しており、高い圧縮耐性を示すことが証明された。
【００４６】
（３）引張応力−歪み測定
１０質量％のＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤの水溶液を５質量％のグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液と１：１（容量比）の比率で混合し、ＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤ／ＧＣゲルの幅１０ｍｍ×高さ１０ｍｍ×厚さ１ｍｍの正方形試験片を作製した。当該試験片を自動記録万能試験装置のクランプ間で器具上に保持し、引張応力を１ｍｍ／ｍｉｎの歪み速度で負荷した。図６（１）として引張応力−歪み曲線を示し、図６（２）として試験時の写真を示す。
図６に示す結果の通り、本発明ゲルは、約６００％も伸長することが示された。
【００４７】
試験例５：  自己修復特性評価
１０質量％のＨＰ−ＰＲＸ−ＡＬＤの水溶液を５質量％のグリコールキトサン（ＧＣ）水溶液と１：１（容量比）の比率で混合して作製したＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤ／ＧＣゲルを複数の断片に完全に切断し、切断した断片を室温で３０分間物理的に接触させ、ゲル間の断面を顕微鏡で拡大観察した。試験の際の写真を図７に示す。
図７に示す結果の通り、本発明ゲルは互いに接触させたのみで接着し、ゲル間の境界は経時的に消失した。この様に、本発明ゲルは高い自己修復特性を有していた。
【００４８】
また、本発明ゲルの自己修復プロセスを定性的にモニターするために、動的粘弾性解析を実施した。具体的には、ゲルに対して１．０Ｈｚの一定周波数で歪みを１％から８００％まで連続的に負荷する操作を２回繰り返し、貯蔵弾性率Ｇ'と損失弾性率Ｇ”を測定した。結果を図８に示す。
図８に示す結果の通り、動的粘弾性解析の結果、歪み変化に応じて本発明ゲルは可逆的にゾルゲル変化したことから、力学的にも自己修復されることが証明された。
【００４９】
切断前の本発明ゲルと自己修復後の本発明ゲルに対して引張試験を行い、自己修復前後の破断歪みと応力を測定した。結果を図９に示す。
図９に示す結果の通り、自己修復前の本発明ゲルの破断歪みは約６４０％、破断強度は約８ｋＰａであったのに対し、自己修復後はそれぞれ約５８０％、４．５ｋＰａであり、破断歪みは９０％程度保持されていた。
【００５０】
試験例６：  ゲル内での血管内皮細胞の増殖評価
１×１０7／ｍＬのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を懸濁したＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤの１０質量％水溶液を調製した。この懸濁液と、ＧＣの５質量％水溶液とを混合し、棒状の型にピペットで入れ、棒状ヒドロゲルを作製した。棒状ヒドロゲルの両側を切断し、各端部の位置を入れ替えて新たな界面に付着させた後、自己修復するまで３７℃でインキュベートした。対照として、動的化学架橋ヒドロゲルである酸化デキストラン（Ｏｄｅｘ）とＧＣを混合して得られたＯｄｅｘ／ＧＣゲルを調製し、同様に処理した。
次いで、各ヒドロゲルを４チャンバープレートの内側に置き、内皮細胞基礎培地を加え、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で５日間培養した。その間、培地を一日おきに交換した。培養開始から１、３、および５日間後、ＣＤ３１膜タンパク質の免疫染色を行った。ＣＤ３１については、試料を４％ｗ／ｖのパラホルムアルデヒド中で３０分間固定した後、０．１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に３０分間曝して細胞膜を透過させた。透過処理の際に、１０質量％ウシ血清を含むＤＰＢＳ中、試料を３７℃で１時間ブロックし、１／１００に希釈したヒト抗ＣＤ３１抗体水溶液中でインキュベートした。ゲルの自己修復領域の蛍光画像を図１０に、ＨＵＶＥＣの蛍光強度を図１１に示す。
図１０，１１に示す結果の通り、従来の自己修復ゲルであるＯｄｅｘ／ＧＣゲルの場合には、細胞の数はかえって減少する傾向が認められた。
それに対して、本発明に係るＨＰ−ＰＲＸ10−ＡＬＤ／ＧＣゲルの場合には、細胞が経時的に有意に増殖していた。
かかる結果の通り、本発明ゲルによって、細胞増殖をより促進できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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