(57)【要約】【課題】心疾患を予防又は治療する作用を有する物質を提供すること。【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体、好ましくはリナクロチドを、経口投与などの方法により投与すると、心疾患を予防又は治療することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ心線維化を軽減させる作用を有するペプチド
からなる群から選択される１種又は２種以上のペプチドを含有することを特徴とする心疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
心疾患が、心線維化を伴う心疾患であることを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
ペプチドがリナクロチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
経口投与することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患を予防又は治療するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
心疾患は、心臓に何らかの障害が生じる病気の総称である。厚生労働省が公表している統計表によると、２０１７年の心疾患の死因順位は、がんに次いで第２位となっている。
【０００３】
多くの心疾患は、進行すると心不全に陥る。心不全に陥る過程において、左心室の拡大、収縮力の低下、心筋の線維化が生じ、この変化は左心室リモデリングと呼ばれている。左心室リモデリングの予防又は治療には、残存心筋の絶対的不足に対して心筋の再生を図り、かつ、心組織の線維化の抑制を図ることが重要である。従来、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンギオテンシンII受容体阻害剤（ＡＲＢ）等が治療に用いられてきた。また、抗線維化療法、中でもとりわけ、細胞外マトリックスを標的とした治療法の開発も注目されつつある。それにもかかわらず決定的な治療法はなく、慢性心不全のためにＱＯＬ（Quality of life）が著しく低下し、死亡する症例は多いため、新たな治療薬が模索されている。
【０００４】
本発明者は、特定のインドール酢酸アミド誘導体が、心疾患等のミトコンドリア機能障害に起因する疾患の治療に有効であることを報告している（特許文献１）。また、本発明者は、グアニル酸シクラーゼＣ受容体アゴニストであるリナクロチド（商品名：リンゼス［登録商標］）が、尿毒症の予防又は治療効果を有することを報告している（特許文献２）。しかしながら、リナクロチドが心疾患の予防又は治療効果を有することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１８−１２７４２９号公報
【特許文献２】特開２０１８−１２７４３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、心疾患を予防又は治療する作用を有する物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、以下に示す本件ペプチド類が心疾患の予防又は治療に有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ心線維化を軽減させる作用を有するペプチド；（以下、これらを総称して「本件ペプチド類」ということがある）
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ心線維化を軽減させる作用を有するペプチド
からなる群から選択される１種又は２種以上のペプチドを含有することを特徴とする心疾患の予防又は治療剤。
〔２〕心疾患が、心線維化を伴う心疾患であることを特徴とする上記〔１〕に記載の予防又は治療剤。
〔３〕ペプチドがリナクロチドであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の予防又は治療剤。
〔４〕経口投与することを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【０００９】
また本発明の実施の他の形態として、本件ペプチド類から選択される１種又は２種以上のペプチドを、心疾患の予防又は治療を必要とする対象に投与するステップを含む、心疾患を予防又は治療する方法；や、心疾患の予防又は治療剤として使用するための、本件ペプチド類から選択される１種又は２種以上のペプチド；や、心疾患の予防又は治療における使用のための、本件ペプチド類から選択される１種又は２種以上のペプチド；や、心疾患の予防又は治療剤を製造するための、本件ペプチド類から選択される１種又は２種以上のペプチドの使用；を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本件ペプチド類は、心線維化を軽減する作用等により、心疾患を予防又は治療する効果を有する。本件ペプチド類は、２０アミノ酸塩基長以下の比較的短いペプチドであるため、比較的簡便かつ安価に製造できる点でも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】４種類の群（対照群、０−ＣＫＤ群、１０−ＣＫＤ群、及び１００−ＣＫＤ群）のマウス心組織における線維レベルを、３種類の方法（シリウスレッド［sirius red］染色法［図中の「シリウスレッド」］、マッソントリクローム染色［Masson trichrome stain；ＭＴＳ］法［図中の「ＭＴＳ」］、及び抗コラーゲンI抗体を用いたＤＡＢ［3,3'-diaminobenzidine］染色法［図中の「コラーゲンI」］）により解析した結果を示す図である。図中の矢頭は、線維化した領域を示す。
【図２】上記４種類の群のマウス心組織における６種類の線維化マーカー遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子［図２Ａ］、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子［図２Ｂ］、ＴＧＦＢ１遺伝子［図２Ｃ］、ＬＧＡＬＳ３遺伝子［図２Ｄ］、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子［図２Ｅ］、及びＮＰＰＡ遺伝子［図２Ｆ］）のｍＲＮＡの発現レベル（平均値±標準偏差）を解析した結果を示す図である。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図３】上記４種類の群のマウス血漿中の２種類の線維化マーカー（ガレクチン−３及びＳＴ２）濃度（平均値±標準偏差）を定量した結果を示す図である。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の心疾患の予防又は治療剤は、「心疾患を予防又は治療するための」という用途に特定された、本件ペプチド類から選択される１種又は２種以上のペプチドを含有する製剤（以下、「本件予防／治療剤」ということがある）であり、ここで、「心疾患を予防する」とは、心疾患発症を予防する；心疾患の重症度（ステージ）の進行を予防する；等を意味する。また、「心疾患を治療する」とは、心線維化を抑制若しくは軽減させる等の作用により、生体における心疾患の症状が改善する；生体における心疾患（例えば、心線維化）のマーカーの発現が減少する；などを意味する。本件予防／治療剤は、単独で医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（医薬組成物）として使用してもよい。また、本件予防／治療剤は、他の心疾患の予防又は治療剤と併用することもできる。
【００１３】
本件ペプチド類としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ血中尿毒症物質の濃度を低減させる作用を有するペプチドであれば特に制限されず、修飾されたアミノ酸及び／又は安定同位体標識されたアミノ酸を含むものであってもよい。かかるアミノ酸の修飾としては、例えば、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、及び／又はカルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）、糖鎖の付加、リン酸化等を挙げることができる。
【００１４】
本件ペプチド類としては、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１番目のシステイン（Ｃ）残基と、６番目のＣ残基とがジスルフィド結合し、２番目のＣ残基と、１０番目のＣ残基とがジスルフィド結合し、かつ５番目のＣ残基と、１３番目のＣ残基とがジスルフィド結合したペプチド、すなわち、下記の構造式で表わされるリナクロチド（Linaclotide）を好適に例示することができる。
【００１５】
【化１】
2020180087.tif 000002
【００１６】
本件ペプチド類の作製方法については特に制限なく、本件ペプチド類のアミノ酸配列情報を基に、公知のペプチド合成法に従って作製することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、及び液相合成法のいずれであってもよい。固相合成法を用いて本件ペプチド類を作製する場合、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの固相合成法を用い、本件ペプチド類を構成し得るペプチド又はアミノ酸と、残余部分とを縮合し、（生成物が保護基を有する場合は）保護基を脱離することにより目的とする本件ペプチド類を製造することができる。固相合成法のために、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）などの市販のペプチド合成機器を用いることができる。固相合成法において用いるレジンとしては、特に制限されず、例えば「Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＡＭ  Ｒｅｓｉｎ」、「Ｆｍｏｃ−ＡＡ−Ｗａｎｇ  Ｒｅｓｉｎ」、「ＡＡ−２−Ｃｌ−Ｔｒｔ  Ｒｅｓｉｎ」を挙げることができる。また、液相合成法を用いて本件ペプチド類を作製する場合、Ｎ−保護アミノ酸誘導体を一残基ずつ段階的に縮合していく方法により、本件ペプチド類を作製することができる。保護基の有無などによって、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、混合酸無水物法などの方法を用いることができる。また、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）試薬、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）などの縮合剤を用いる方法によっても、本件ペプチド類を作製することができる。また、本件ペプチド類として、リナクロチド（商品名：リンゼス［Linzess］）（アステラス社製）等の市販品を用いることもできる。
【００１７】
本明細書において、心疾患としては、具体的には、虚血性心疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞）、弁膜疾患、心筋症（例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症）、心筋炎、高血圧性心疾患、心不全、合併症による心疾患（例えば、術後再狭窄、不整脈、うっ血性心不全、心原性ショック、心室中隔穿孔、心破裂、肺うっ血、心負荷、左心室再構築）等を挙げることができる。また、心疾患としては、後述する本実施例において、腎機能障害に伴う心線維化の軽減作用が実証されているため、心線維化及び／又は腎機能障害を伴う心疾患を好適に例示することができる。
【００１８】
本件予防／治療剤は、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の添加剤をさらに含むものであってもよい。かかる添加剤としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００１９】
本件予防／治療剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射（例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射）、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができ、経口投与が好ましい。
【００２０】
本件予防／治療剤における本件ペプチド類の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定され、例えば、０．０１０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜２００（ｍｇ／ｋｇ体重／日）の投与量の範囲である。後述する本実施例において、モデルマウスを用いた実験により、１０〜１００（μｇ／ｋｇ体重／日）のリナクロチドの投与量が具体的に示されている。かかる投与量は、マウスにおけるヒト等価用量（ＨＥＤ）１２．３（資料「Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」参照）を基に、ヒトへの投与量に換算した場合、０．８１〜８．１（μｇ／ｋｇ体重／日）である。このため、本件予防／治療剤における本件ペプチド類の投与量としては、０．０５０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜２０（ｍｇ／ｋｇ体重／日）が好ましく、０．１０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜２．０（ｍｇ／ｋｇ体重／日）がより好ましく、０．２０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜１００（μｇ／ｋｇ体重／日）がさらに好ましく、０．３０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜５０（μｇ／ｋｇ体重／日）がさらにより好ましく、０．６０（μｇ／ｋｇ体重／日）〜２０（μｇ／ｋｇ体重／日）が最も好ましい。なお、本件予防／治療剤は、一日あたり単回又は複数回（例えば、２〜４回）に分けて投与してもよい。
【００２１】
本件予防／治療剤としては、本件ペプチド類以外にも、心疾患を予防又は治療する作用を有する成分を含むものであってもよいが、本件ペプチド類単独でも心疾患を予防及び／又は治療する作用を発揮するため、本件ペプチド類以外の、心疾患を予防又は治療する作用を有する成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、植物由来の抽出物、ポリマー）を含まないものであってもよい。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．方法
［アデニン誘発性ＣＫＤマウスの作製］
Ｃ５７ＢＬ／６（７週齢、オス、日本クレア社製）を、１週間馴化させ、各ケージの体重に、ばらつきが無いようグルーピングした。ＣＫＤ群（ｎ＝２３）には、８週齢時から０．２％アデニン飼料（日本クレア社製）を６週間給与し、対照群（ｎ＝８）には通常飼料（ＣＥ−２）を給与した。脱水による死亡を防ぐため、通常の給水に加え、外付けの給水ボトルもセットした。飼育は中央棟の飼育マニュアルに則り、４〜５匹／ケージ、飼育温度２４℃、１２時間の明暗サイクル、不断給餌、自由飲水とした。
【００２４】
［リナクロチド液の調製］
１５ｍＬチューブに、リナクロチド（Cat＃：L465880、Toronto Research Chemicals社製）５ｍｇを加え、５ｍＬの生理食塩水で溶解し、１ｍｇ／ｍＬのリナクロチドのストック液を調製し、−２０℃で保存した。リナクロチドのストック液を、１００μＬ投与したときのリナクロチド投与量が、１０（μｇ／ｋｇ体重／日）、又は１００（μｇ／ｋｇ体重／日）となるように生理的水溶液で調整し、マウスへ投与するリナクロチド液を得た。
【００２５】
［アデニン誘発性ＣＫＤマウスへのリナクロチド投与試験］
ＣＫＤ群におけるアデニン誘発性ＣＫＤマウスの飲水量及び体重を測定し、３種類の群（０−ＣＫＤ群［ｎ＝６］、１０−ＣＫＤ群［ｎ＝８］、及び１００−ＣＫＤ群［ｎ＝９］）に分け、それぞれ３種類の液（生理的水溶液、１０［μｇ／ｋｇ体重／日］のリナクロチド液、及び１００［μｇ／ｋｇ体重／日］のリナクロチド液）１００μＬを、１ｍＬシリンジを装着したマウス用経口ゾンデ（ディスポーザブルフィーディングニードル、ＦＧ７２０２、先玉径２．０ｍｍ、サイズ１．１８×５０ｍｍ）を用いて２週間継続的に投与した。
【００２６】
［組織学的解析］
上記４種類の群（対照群、０−ＣＫＤ群、１０−ＣＫＤ群、及び１００−ＣＫＤ群）のマウスから心臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋した心組織をスライスして心組織切片を作製し、３種類の染色法（線維性コラーゲンを染色するシリウスレッド染色法、膠原線維を染色するＭＴＳ法、及び抗コラーゲンI抗体（ab15098、abcam社製）を用いたＤＡＢ染色法）を用いて心臓における線維化レベルを解析した（図１参照）。
【００２７】
［線維化マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現解析］
上記４種類の群のマウスから心臓を採取し、ホモジナイズ処理した後、Trizol reagent(Invitrogen社製）にて全ＲＮＡを抽出・精製し、Oligo(dT）プライマーを用いて、Transcriptor first strand cDNAsynthesis kit（Roche社製）によりｃＤＮＡを調製した。６種類の線維化マーカー（I型コラーゲンα１鎖、III型コラーゲンα１鎖、形質転換増殖因子［transforming growth factor；ＴＧＦ］−β１、ガレクチン［Galectin］−３、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＬ１［interleukin 1 receptor like 1］、及びナトリウム利尿ペプチド［Natriuretic peptides］Ａ）をコードする遺伝子（それぞれ、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、ＴＧＦＢ１遺伝子、ＬＧＡＬＳ３遺伝子、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子、及びＮＰＰＡ遺伝子）のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを検出するために、Fast start universal probe master（Roche社製）を用いた定量ＰＣＲを以下の１）〜２）に示した条件で行い、検出した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
【００２８】
１）９５℃、１０分を１サイクル（ポリメラーゼの活性化）
２）９５℃、１５秒と６０℃、１分の往復を４０サイクル（フォワードプライマー及びリバースプライマーによるｃＤＮＡの増幅）
【００２９】
上記６種類の線維化マーカーをコードする遺伝子のｃＤＮＡを増幅し、検出するためのプライマー・プローブセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）として、TaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセット（Applied  Biosystems社製）を用いた（表１参照）。
【００３０】
【表１】
2020180087.tif 000003
【００３１】
Baselineソフトウェア(Applied  Biosystems社製)を用いてＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（デルタデルタＣｔ法）によりＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準とした上記６種類の線維化マーカーをコードする遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記６種類の線維化マーカーをコードする遺伝子のｃＤＮＡの相対量、すなわち上記６種類の線維化マーカーをコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを算出した（図２参照）。
【００３２】
［線維化マーカーの発現解析］
上記４種類の群のマウスから血液検体を採取し、定法にしたがって血漿を調製した後、Mouse Galectin 3 ELISA  Kit（ab203369）（アブカム社製）を用いて血漿中のガレクチン−３の濃度を定量し、Mouse ST2/IL-1 R4 Quantikine ELISA Kit（R＆D systems社製）を用いて血漿中のＳＴ２の濃度を定量した。
【００３３】
［統計解析］
統計解析は、Dunnett’s multiple comparisons test（図中の「＊」）により評価した。
【００３４】
２．結果
シリウスレッド染色法及びＭＴＳ法を行った結果、対照群のマウス心組織においては、線維性コラーゲン及び膠原線維はほとんど検出されなかったのに対して、０−ＣＫＤ群のマウス心組織においては、線維性コラーゲン及び膠原線維が検出されることを確認した（図１参照）。一方、１０−ＣＫＤ群及び１００−ＣＫＤ群のマウス心組織においては、これら線維性コラーゲン及び膠原線維が顕著に減少することが示された（図１参照）。さらに、抗コラーゲンI抗体を用いたＤＡＢ染色法を行った結果、０−ＣＫＤ群のマウス心組織において、コラーゲンIで検出される領域が、１０−ＣＫＤ群及び１００−ＣＫＤ群のマウス心組織においては、有意に減少することが示された（図１参照）。
【００３５】
上記組織学的解析結果を裏付けるために、遺伝子レベルでの解析を行った。心組織中の６種類の線維化マーカー遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、ＴＧＦＢ１遺伝子、ＬＧＡＬＳ３遺伝子、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子、及びＮＰＰＡ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果、０−ＣＫＤ群のマウス心組織において、上昇した上記６種類の線維化マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、１０−ＣＫＤ群及び１００−ＣＫＤ群のマウス心組織においては、減少することが示された（図２参照）。また、血液中の２種類の線維化マーカー（ガレクチン−３及びＳＴ２）の濃度を解析した結果、０−ＣＫＤ群のマウス血液中において、上昇した上記２種類の線維化マーカーの濃度は、１０−ＣＫＤ群及び１００−ＣＫＤ群のマウス血液中においては、減少することが示された（図３参照）。
【００３６】
以上の結果は、リナクロチドは心線維化を軽減する作用を有し、心疾患の予防又は改善に有効であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、心疾患の予防又は治療に資するものである。
【図１】
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【図２】
2020180087.tif 000005
【図３】
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【配列表】
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