(57)【要約】【課題】ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二重特異的抗体の提供。【解決手段】２つの標的ヒトＣＤ３εおよびヒトＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体であって、ここで一方の抗体部分の可変ドメインは、互いに置き換えられ、上記抗体の結合は、ＡＰＲＩＬによって低下せずかつＢＡＦＦによって低下せず、上記抗体は、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を変化させず、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬなしのＮＦ−κＢ活性化を変化させず、治療剤として有用であることを特徴とする、二重特異的抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する新規な二重特異的抗体、それらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトＢ細胞成熟標的（ＢＣＭＡ；  ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても公知）は、分化した形質細胞で優先的に発現される腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーである［Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２；  Ｍａｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８］。ＢＣＭＡは、非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、これは、Ｂ細胞成熟、増殖および生存に関与する。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド：ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）（ＢＣＭＡに対する高親和性リガンド）およびＢ細胞活性化因子ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡに対する低親和性リガンド）（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ−１およびｚＴＮＦ４）に対するレセプターである。ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦは、構造類似性および重なり合うが別個のレセプター結合特異性を示す。負の調節因子ＴＡＣＩはまた、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＢＣＭＡおよび／もしくはＴＡＣＩへの、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの同等の結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化し、生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現およびアポトーシス促進因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）のダウンレギュレーションを増大させ、従って、アポトーシスを阻害し、生存を促進する。この組み合わされた作用は、Ｂ細胞分化、増殖、生存および抗体生成を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  （２０１１）  ２４４  （１）：  １１５−１３３において概説されるとおり）。ＢＣＭＡに対する抗体は、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９５）  １０９３−１１０６、ＷＯ２００１２４８１１、およびＷＯ２００１２４８１２に記載されている。リンパ腫および多発性骨髄腫の処置のための抗ＢＣＭＡ抗体の使用は、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６およびＷＯ２０１０１０４９４９で言及されている。
【０００３】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ＣＤ３標識ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）の不変のサブユニットとともに細胞表面で共発現される、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロダイマーのいずれかからなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）の下で記載されている。現在の技術水準で記載される抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８６）  １３７；  １０９７−１１００）である。ＳＰ３４は、霊長類およびヒト両方のＣＤ３と反応する。ＳＰ３４は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能である。現在の技術水準で記載されるさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照のこと）である。現在の技術水準で記載されるさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤのフェーズＩ／ＩＩ治験において使用される、Ａｎａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：  ８４４  （１９９２））である。ＳＰ３４は、ＳＰ−３４がＣＤ３のε鎖のみに存在するエピトープを認識する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ３０４７を参照のこと）のに対して、ＵＣＨＴ−１およびＢＣ−３は、ε鎖およびγ鎖の両方によって与えられるエピトープを認識するという点で、ＵＣＨＴ−１およびＢＣ−３とは異なる。抗体ＳＰ３４のものと同じ配列を有する抗体の配列は、ＷＯ２００８１１９５６５、ＷＯ２００８１１９５６６、ＷＯ２００８１１９５６７、ＷＯ２０１００３７８３６、ＷＯ２０１００３７８３７およびＷＯ２０１００３７８３８において言及されている。抗体ＳＰ３４のＶＨに９６％同一である配列は、ＵＳ８２３６３０８（ＷＯ２００７０４２２６１）に言及されている。ＳＰ３４のものと同じ配列を有するさらなる抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、配列番号７および８に示される。
【０００４】
多種多様な組換え二重特異的抗体様式は、例えば、例えば、ＩｇＧ抗体様式と単鎖ドメインとの融合によって、ここ最近開発された（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ，  ｍＡｂｓ
４：２，  （２０１２）  １−１６を参照のこと）。可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている二重特異的抗体は、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２に記載されている。
【０００５】
誤って対合した副生成物という問題を回避するアプローチ（「ノブが凹みに入り込む」（「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」）として公知である）は、ＣＨ３ドメインへ変異を導入して、接触界面を改変することによって、２つの異なる抗体重鎖の対合を強制することを目的とする。一方の鎖で、かさ高いアミノ酸を、短い側鎖を有するアミノ酸によって置き換えて、「凹み（ｈｏｌｅ）」を作った。逆に、大きな側鎖を有するアミノ酸を他方のＣＨ３ドメインに導入して、「ノブ（ｋｎｏｂ）」を作った。これらの２つの重鎖（および２つの同一の軽鎖（これらは、両方の重鎖にとって適切でなければならない））を共発現することによって、ホモダイマー形成（「凹み−凹み」もしくは「ノブ−ノブ」）に対して高収率のヘテロダイマー形成（「ノブ−凹み」）を観察した（Ｒｉｄｇｗａｙ
ＪＢ，  Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ヘテロダイマーのパーセンテージは、ファージディスプレイアプローチおよび上記ヘテロダイマーを安定化させるジスルフィド架橋の導入を使用して、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を再構築することによってさらに増大させることができた（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．Ｍ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６  （１９９８）  ６７７−６８１；  Ａτｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，
Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２７０  （１９９７）  ２６−３５）。上記ノブが凹みに入り込む技術に関する新たなアプローチは、例えば、ＥＰ  １８７０４５９Ａ１に記載されている。この様式は、非常に魅力的であるようだが、クリニックに向けた進歩を記載するデータは現在入手できていない。このストラテジーの１つの重大な制約は、２つの親抗体の軽鎖が誤って対合し、不活性分子を形成するのを防止するために同一でなければならないことである。従って、この技法は、第１の標的および第２の標的に対する２種の抗体から出発する、２つの標的に対する組換え二重特異的抗体を容易に開発するために適していない。なぜなら、これらの抗体の重鎖および／もしくは同一の軽鎖のいずれかが最適化されねばならないからである。Ｘｉｅ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８６  （２００５）  ９５−１０１は、ＦＣ部分のためにノブが凹みに入り込む技術と組み合わせてｓｃＦｖを使用する二重特異的抗体の様式に言及している。ＷＯ  ２０１２１１６９２７およびＷＯ  ２０１０／１４５７９２は、ＣＨ１およびＣＬドメインの交換に言及している。ＷＯ  ２００９／０８０２５４は、二重特異的抗体を生成するために凹み内のノブ（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）構築に言及している。
【０００６】
ＢＣＭＡに対する抗体は、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９５）  １０９３−１１０６、ＷＯ２００１２４８１１、ＷＯ２００１２４８１２、ＷＯ２０１０１０４９４９およびＷＯ２０１２１６３８０５に記載されている。ＢＣＭＡに対する抗体、ならびにリンパ腫および多発性骨髄腫の処置のためのそれらの使用は、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６およびＷＯ２０１０１０４９４９に言及されている。ＷＯ２０１３１５４７６０は、ＢＣＭＡ認識部分およびＴ細胞活性化部分を含むキメラ抗原レセプターに関する。
【０００７】
Ｒｙａｎ，  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ６  （２００７）  ３００９−３０１８は、形質細胞悪性疾患のためにＢＣＭＡを選択的に標的とすることに関する。抗体ＳＧ１（リガンドブロック活性を有する）は、裸の抗体として、もしくは抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）として、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株の細胞傷害性を促進し得る。ＳＧ１（阻害性ＢＣＭＡ抗体）は、インビトロで核因子−κＢのＡＰＲＩＬ依存性活性化を用量依存的方法でブロックする。ＳＧ１の細胞傷害性を、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合を増強するＦｃ変異ありおよびなしで、キメラ化の後に裸の抗体として評価した。Ｒｙａｎはまた、ＢＣＭＡへのＡＰＲＩＬ結合を有意には阻害しない抗体ＳＧ２に言及している。しかし、ＳＧ２は、ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞株に対する薬物結合体の細胞傷害性活性として測定したＳＧ１の２０倍高いＩＣ５０値を示した。Ｒｙａｎは、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化の阻害、ナチュラルキラー細胞媒介性ＡＤＣＣ活性による腫瘍細胞溶解の促進、およびＡＤＣによる細胞傷害性の誘導を含む複数の機構を通じて、ＢＣＭＡ抗体がＭＭ細胞株に対して作用し得ると結論づけている。
【０００８】
ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二重特異的抗体は、ＷＯ２００７１１７６００、ＷＯ２００９１３２０５８、ＷＯ２０１２０６６０５８、およびＷＯ２０１２１４３４９８で言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００１／２４８１１号
【特許文献２】国際公開第２００１／２４８１２号
【特許文献３】国際公開第２００２／０６６５１６号
【特許文献４】国際公開第２０１０／１０４９４９号
【特許文献５】国際公開第２００８／１１９５６５号
【特許文献６】国際公開第２００８／１１９５６６号
【特許文献７】国際公開第２００８／１１９５６７号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０３７８３６号
【特許文献９】国際公開第２０１０／０３７８３７号
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０３７８３８号
【特許文献１１】米国特許第８２３６３０８号明細書
【特許文献１２】国際公開第２００７／０４２２６１号
【特許文献１３】国際公開第２００９／０８０２５１号
【特許文献１４】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献１５】国際公開第１９９６／０２７０１１号
【特許文献１６】国際公開第２０１２／１１６９２７号
【特許文献１７】国際公開第２０１０／１４５７９２号
【特許文献１８】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献１９】国際公開第２００１／２４８１１号
【特許文献２０】国際公開第２０１２／１６３８０５号
【特許文献２１】国際公開第２０１３／１５４７６０号
【特許文献２２】国際公開第２００７／１１７６００号
【特許文献２３】国際公開第２００９／１３２０５８号
【特許文献２４】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／１４３４９８号
【特許文献２６】国際公開第２００７／１１７６００号
【特許文献２７】国際公開第２００９／１３２０５８号
【特許文献２８】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献２９】国際公開第２０１２／１４３４９８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  （２０１１）  ２４４  （１）：  １１５−１３３
【非特許文献２】Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９５）  １０９３−１１０６
【非特許文献３】Ｙａｎｇ  ＳＪ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８６）  １３７；  １０９７−１１００
【非特許文献４】Ａｎａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：  ８４４  （１９９２）
【非特許文献５】Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ３０４７
【非特許文献６】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ，  ｍＡｂｓ  ４：２，  （２０１２）  １−１６
【非特許文献７】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．Ｍ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６  （１９９８）  ６７７−６８１
【非特許文献８】Ａτｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２７０  （１９９７）  ２６−３５
【非特許文献９】Ｘｉｅ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８６  （２００５）  ９５−１０１
【非特許文献１０】Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９５）  １０９３−１１０６
【非特許文献１１】Ｒｙａｎ，  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ６  （２００７）  ３００９−３０１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、２つの標的ヒトＣＤ３ε（さらに「ＣＤ３」とも称される）およびヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン（さらに「ＢＣＭＡ」とも称される）に特異的に結合する二重特異的抗体を含み、該抗体は、濃度６．２５ｎＭでの該抗体の結合が、１４０ｎｇ／ｍｌ  マウスＡＰＲＩＬによって１０％超は低下せず、好ましくは、ＡＰＲＩＬなしのヒトＢＣＭＡへの該抗体の結合と比較して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて４５０ｎｍのＯＤとして測定して、１％超は低下しないことを特徴とする。好ましくは、上記二重特異的抗体は、濃度５０ｎＭでの該抗体の結合が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて４５０ｎｍのＯＤとして測定して、ＡＰＲＩＬなしのヒトＢＣＭＡへの該抗体の結合と比較して、１４０ｎｇ／ｍｌ
マウスＡＰＲＩＬによって１０％超は低下しないことを特徴とする。
【００１２】
好ましくは、本発明に従う抗体は、Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）への抗ＢＣＭＡ抗体の結合に関して１５ｎＭ以下というＥＣ５０値を示すことで特徴付けられる。
【００１３】
本発明は、２つの標的ヒトＣＤ３ε（さらに「ＣＤ３」とも称される）およびヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン（さらに「ＢＣＭＡ」とも称される）に特異的に結合する二重特異的抗体に関し、上記抗体は、
ｉ）上記二重特異的抗体は、抗ＣＤ３抗体のＦａｂフラグメントがそのＮ末端において抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂフラグメントのＣ末端へと化学的に結合した融合タンパク質である、および
ｉｉ）上記抗ＣＤ３抗体の可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えている、
ことを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、上記抗ＣＤ３抗体のＶＨドメインは、上記抗ＢＣＭＡ抗体のＣＨ１もしくはＣＬドメインに結合する。好ましくは、上記抗ＣＤ３抗体のＶＬドメインは、上記抗ＢＣＭＡ抗体のＣＨ１もしくはＣＬドメインに結合する。
【００１５】
好ましくは、上記二重特異的抗体は、抗ＣＤ３抗体の１以下のＦａｂフラグメント、抗ＢＣＭＡ抗体の２以下のＦａｂフラグメントおよび１以下のＦｃ部分（好ましくは、ヒトＦｃ部分）を含む。好ましくは、抗ＣＤ３抗体の１以下のＦａｂフラグメントおよび抗ＢＣＭＡ抗体の１以下のＦａｂフラグメントは、上記Ｆｃ部分に結合し、この結合は、ヒンジ領域への上記Ｆａｂフラグメント(複数可)のＣ末端結合を介して行われる。好ましくは、抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂフラグメントは、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体のＦａｂフラグメントのＮ末端もしくは上記Ｆｃ部分のヒンジ領域のいずれかへと結合する。好ましい二重特異的抗体は、図３に示される。
【００１６】
特に好ましいのは、以下に特定されるように、ＦａｂフラグメントおよびＦｃ部分のみを含むこれらの二重特異的抗体である：
Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（二重特異的様式３．１）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（二重特異的様式３．２）
Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（二重特異的様式３．３）
Ｆａｂ  ＣＤ３−  Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−  Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（二重特異的様式３．４）。
【００１７】
好ましくは、上記二重特異的抗体は、上記抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂフラグメントがそのＣ末端で上記抗ＢＣＭＡ抗体の第１のＦａｂフラグメントのＮ末端に化学的に結合したものを含む。好ましくは、上記第１の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨドメインは、上記第２の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＨ１もしくはＣＬドメインに結合する。好ましくは、上記第１の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＬドメインは、上記第２の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＨ１もしくはＣＬドメインに結合する。
【００１８】
好ましくは、上記二重特異的抗体は、Ｆｃ部分がそのＮ末端で上記抗ＣＤ３抗体のＣ末端に結合したものを含む。好ましくは、上記二重特異的抗体は、Ｆｃ部分がその第１のＮ末端で上記抗ＣＤ３抗体のＣ末端に結合したもの、および上記抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂフラグメントがそのＣ末端で上記Ｆｃ部分の第２のＮ末端に結合したものを含む。好ましくは、上記ＣＤ３抗体ＦａｂフラグメントのＣＬドメインは、上記Ｆｃ部分のヒンジ領域に結合する。好ましくは、上記ＢＣＭＡ抗体ＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインは、上記Ｆｃ部分のヒンジ領域に結合する。
【００１９】
上記Ｆａｂフラグメントは、現在の技術水準に従って適切なリンカーの使用によって一緒に化学的に結合する。好ましくは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーが使用される（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ  ＤＫ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９４  Ａｕｇ；７（８）：１０２７−３３およびＭａｃｋ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  Ｊｕｌｙ  １８，  １９９５  ｖｏｌ．  ９２  ｎｏ．  １５  ７０２１−７０２５）。
【００２０】
上記の本発明に従う抗体は、好ましくは、以下で言及する特徴によって、特に、上記抗体の結合が１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および好ましくは、ＢＡＦＦによって２０％超は低下しない、ならびにＡＰＲＩＬありおよびなしでＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、および好ましくは、ＢＡＦＦありおよびなしで２０％超は変化させないということに関して、特徴付けられる。
【００２１】
本発明は、２つの標的ヒトＣＤ３ε（さらに「ＣＤ３」とも称される）およびヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン（さらに「ＢＣＭＡ」とも称される）に特異的に結合する二重特異的抗体に関し、上記二重特異的抗体は、
ａ）上記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む；ならびに
ｂ）上記標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここで可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とし、そして
ｃ）ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて４０５ｎｍのＯＤとして測定して、ＡＰＲＩＬなしでのヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合と比較して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって２０％超は低下しない、
ｄ）上記抗体は、ＡＰＲＩＬのみと比較して、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、ならびに
ｅ）上記抗体は、上記抗体なしと比較して、ＡＰＲＩＬなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ことを特徴とする。
【００２２】
本発明に従う二重特異的抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分が由来するＢＣＭＡに特異的に結合する裸の抗体はまた、上記の特徴ｃ）〜ｅ）を示す。
【００２３】
好ましくは、上記抗体は、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が、上記ＥＬＩＳＡで測定して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって１５％超は低下しないという点でさらに特徴付けられる。好ましくは、上記抗体は、上記ＥＬＩＳＡで測定して、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および１０００ｎｇ／ｍｌによって２０％超は低下しない、という点でさらに特徴付けられる。好ましくは、上記抗体は、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が、上記ＥＬＩＳＡで測定して、１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって１５％超は低下しないという点でさらに特徴付けられる。
【００２４】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬなしでのＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。
【００２５】
本発明は、２つの標的ヒトＣＤ３ε（さらに「ＣＤ３」とも称される）およびヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン（さらに「ＢＣＭＡ」とも称される）に特異的に結合する二重特異的抗体に関し、上記二重特異的抗体は、
ａ）上記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む；ならびに
ｂ）上記標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここで可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる
ことを特徴とし、そして
ｃ）ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイで４０５ｎｍのＯＤとして測定して、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦそれぞれなしでのヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合と比較して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＡＦＦによって２０％超は低下しない、
ｄ）上記抗体は、ＡＰＲＩＬのみと比較して、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ｅ）上記抗体は、ＢＡＦＦのみと比較して、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、ならびに
ｆ）上記抗体は、上記抗体なしと比較して、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ことを特徴とする。
【００２６】
本発明に従う二重特異的抗体の上記抗ＢＣＭＡ抗体部分が由来する、ＢＣＭＡに特異的に結合する裸の抗体はまた、上記の特徴ｃ）〜ｆ）を示す。
【００２７】
好ましくは、ヒトＣＤ３に特異的に結合する上記抗体部分は、上記抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号１、２および３の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨ、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号４、５および６の軽鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＬを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＣＤ３に特異的に結合する上記抗体部分は、上記可変ドメインが配列番号７および８のものである（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３）ことを特徴とする。
【００２８】
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号３７〜４５、４７〜５５および５７〜６５の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨ、ならびに上記抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号６７〜７５、７７〜８５、および８７〜９５の軽鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分は、それぞれ、可変ドメインＶＨが配列番号１７〜２５の群より選択される、および上記可変ドメインＶＬが配列番号２７〜３５の群から選択されることを特徴とする。
【００２９】
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号３７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号５７のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号６７のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７７のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８７のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １３Ｃ２）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号３８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号５８のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号６８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７８のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８８のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １７Ａ５）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号３９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ２Ｈ、配列番号５９のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号６９のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７９のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８９のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５０のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６０のＣＤＲ３Ｈならびに配列番号７０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８０のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９０のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １３Ａ４）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６１のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７１のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９１のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １３Ｄ２）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６２のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８２のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９２のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １４Ｂ１１）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６３のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９３のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １４Ｅ１）ことを特徴とする。
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５４のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６４のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７４のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９４のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ２９Ｂ１１）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６５のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７５のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９５のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ２９Ｆ３）ことを特徴とする。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．１の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＣＤＲ  ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．２の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＣＤＲ  ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．３の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＣＤＲ
ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．４の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＣＤＲ  ＭＡＢからなることを特徴とする。
【００３１】
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号１７〜２５からなる群より選択されるＶＨを含むという点で、および／または配列番号２７〜３５からなる群より選択されるＶＬを含むことを特徴とする。
【００３２】
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号１７のＶＨおよび配列番号２７のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １３Ｃ２）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号１８のＶＨおよび配列番号２８のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １７Ａ５）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号１９のＶＨおよび配列番号２９のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２０のＶＨおよび配列番号３０のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１３Ａ４）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２１のＶＨおよび配列番号３１のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１３Ｄ２）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２２のＶＨおよび配列番号３２のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １４Ｂ１１）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２３のＶＨおよび配列番号３３のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１４Ｅ１）ことを特徴とする。好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２４のＶＨおよび配列番号３４のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ２９Ｂ１１）ことを特徴とする。
好ましくは、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２５のＶＨおよび配列番号３５のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ
２９Ｆ３）ことを特徴とする。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態において、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号４６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号５６のＣＤＲ２Ｈ、配列番号６６のＣＤＲ３Ｈ、ならびに配列番号７６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号８６のＣＤＲ２Ｌ、配列番号９６のＣＤＲ３Ｌを含む（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １３Ａ７）ことを特徴とする。本発明のさらなる実施形態において、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのＦａｂフラグメントは、配列番号２６のＶＨおよび配列番号３６のＶＬを含む（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１３Ａ７）ことを特徴とする。抗体ＭＡＢ  １３Ａ７の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって２０％超、低下する。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．１の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１、および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＶＨＶＬ  ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．２の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１、および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＶＨＶＬ  ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．３の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１、２９Ｆ３、および１３Ａ７からなる群より選択される、ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＶＨＶＬ  ＭＡＢからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式３．４の１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１、および２９Ｆ３からなる群より選択される、ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３およびＶＨＶＬ  ＭＡＢからなることを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、本発明に従う二重特異的抗体は、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、上記抗体ＣＨ３ドメインの間の元の界面を含む界面で各々接触することを特徴とし；ここで上記界面は、上記二重特異的抗体の形成を促進するように変化し、ここで上記変化は、
ａ）上記二重特異的抗体内で他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、１つのアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の間隙に配置可能である一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内で突出部を生成するように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化する、ならびに
ｂ）上記二重特異的抗体内で第１のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、１つのアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有する１つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突出部が配置可能である第２のＣＨ３ドメインの界面内で間隙を生成するように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化する、
ことを特徴とする。
【００３６】
好ましくは、本発明に従う抗体は、より大きな側鎖体積を有する上記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されることを特徴とする。好ましくは、本発明に従う抗体は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択されることを特徴とする。好ましくは、本発明に従う抗体は、両方のＣＨ３ドメインが、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてシステイン（Ｃ）の導入によってさらに変化させられることを特徴とする。好ましくは、本発明に従う抗体は、両方の重鎖の定常重鎖ドメインＣＨ３のうちの一方が、定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換えられ；そして他方の定常重鎖ドメインＣＨ３が、定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換えられることを特徴とする。
【００３７】
好ましくは、上記抗体は、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が、上記ＥＬＩＳＡで測定して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＡＦＦによって１５％超は低下しないという点でさらに特徴付けられる。好ましくは、上記抗体は、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が、上記ＥＬＩＳＡで測定して、１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および１０００ｎｇ／ｍｌによって２０％超は低下しないという点でさらに特徴付けられる。好ましくは、上記抗体は、ヒトＢＣＭＡへの上記抗体の結合が、上記ＥＬＩＳＡで測定して、１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下しない、および１０００ｎｇ／ｍｌ  ＢＡＦＦによって１５％超は低下しないという点でさらに特徴付けられる。
【００３８】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。
【００３９】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡへのその結合が、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦそれぞれなしでのＮＣＩ−Ｈ９２９細胞への上記抗体の結合と比較して、濃度２．５μｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦそれぞれの存在下もしくは非存在下で、濃度１４０ｎＭ、好ましくは、５０ｎＭ、および好ましくは、５ｎＭにおいて上記抗体のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）への結合として測定して、ＡＰＲＩＬによって低下しない、および好ましくは、ＢＡＦＦによって２５％超は低下しない、好ましくは、２０％超は低下しない、好ましくは、１０％超は低下しないことを特徴とする。
【００４０】
好ましくは、本発明に従う抗体は、これがカニクイザルＢＣＭＡにも特異的に結合するという点でさらに特徴付けられる。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う二重特異的抗体の調製のための方法であり、上記方法は、
ａ）宿主細胞を、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換する工程であって、ここで可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、工程；
ｂ）上記宿主細胞を、上記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養する工程；ならびに
ｃ）上記抗体分子を上記培養物から回収する工程、
を包含する。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態は、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞であり、ここで可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる。
【００４３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、本発明に従う抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体を含む診断用組成物である。
【００４５】
本発明のさらに好ましい実施形態は、医薬としての使用のための本発明に従う抗体を含む薬学的組成物である。本発明のさらに好ましい実施形態は、形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む薬学的組成物である。本発明のさらに好ましい実施形態は、多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む薬学的組成物である。本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫ＭＭもしくはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害などの形質細胞障害の処置にのための本発明に従う抗体である。ＭＭは、骨髄区画中の異常な形質細胞のモノクローナルな増殖および蓄積によって特徴付けられるＢ細胞悪性疾患である。ＭＭはまた、同じＩｇＧ遺伝子再構成および体細胞超変異を有する循環クローン性Ｂ細胞を伴う。ＭＭは、低レベルの骨髄形質細胞およびモノクローン性のタンパク質によって特徴付けられる、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）といわれる無症候性の前悪性状態から生じる。ＭＭ細胞は、低速で増殖する。ＭＭは、多発性の構造的染色体変化（例えば、不均衡な転座）の進行性の発生から生じる。ＭＭは、悪性形質細胞および骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）の相互作用を伴う。活動性ＭＭの臨床徴候は、モノクローナル抗体スパイク、形質細胞が過密な骨髄、溶解性の骨病変および破骨細胞の過剰刺激から生じる骨破壊（Ｄｉｍｏｐｕｌｏｓ  ＆  Ｔｅｒｐｏｓ，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；  ２１  ｓｕｐｐｌ  ７：  ｖｉｉ１４３−１５０）が挙げられる。形質細胞に関わる、すなわち、ＢＣＭＡを発現する別のＢ細胞障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（狼瘡としても公知）である。ＳＬＥは、身体のいかなる部分にも影響を及ぼし得る全身性の自己免疫疾患であり、免疫系がその身体自体の細胞および組織を攻撃し、慢性的な炎症および組織損傷を生じることで表される。これは、抗体−免疫複合体が沈着し、さらなる免疫応答を引き起こすＩＩＩ型過敏性反応である（Ｉｎａｋｉ  ＆  Ｌｅｅ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０１０；  ６：  ３２６−３３７）。本発明のさらに好ましい実施形態は、全身性エリテマトーデスの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む薬学的組成物である。
【００４６】
ＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する二重特異的抗体に関して、本発明者らは、ＢＣＭＡに対するおよび活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合し得る二重特異的抗体（ＢＣＭＡ−ＴＣＢ）は、１）ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、多発性骨髄腫を有する患者に適切なＡＰＲＩＬ濃度によってＢＣＭＡへのその結合において２０％超は低下しない、２）好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、多発性骨髄腫を有する患者に適切なＢＡＦＦ濃度によってＢＣＭＡへのその結合において２０％超は低下せず、ＭＭ患者においてＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を根絶する上記ＢＣＭＡ−ＴＣＢの有効性が、血清中のもしくは腫瘍でのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの濃度によって負の影響を受けることを回避することを認識する（図１および図２、ならびに図１および図２に関する記載もまた参照のこと）。さらに、本発明者らは、ＢＣＭＡに対する、および活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合し得る二重特異的抗体（ＢＣＭＡ−ＴＣＢ）が、１）Ｈ９２９細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイにおいて、多発性骨髄腫を有する患者に適切であり得るＡＰＲＩＬ濃度によってＢＣＭＡへのその結合において２５％超は低下しない、２）好ましくは、Ｈ９２９細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイにおいて、多発性骨髄腫を有する患者に適切であり得るＡＰＲＩＬ濃度によってＢＣＭＡへのその結合において２５％超は低下せず、ＭＭ患者においてＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を根絶する上記ＢＣＭＡ−ＴＣＢの有効性が血清中もしくは腫瘍におけるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの濃度によって負の影響を受けることを回避することを認識する（図１および図２、ならびに図１および図２に関する記載もまた参照のこと）。
【００４７】
さらに、本発明者らは、ＢＣＭＡに対する、および活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合し得る二重特異的抗体（ＢＣＭＡ−ＴＣＢ）が、１）ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックも増大もさせない、２）好ましくは、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックも増大もさせない、および３）ＡＰＲＩＬなしおよび好ましくは、ＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を誘導せず、ＭＭ患者においてＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を根絶する上記ＢＣＭＡ−ＴＣＢの有効性が血清中もしくは腫瘍におけるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの濃度によって負の影響を受けることを避けることを認識する。さらに、上記ＢＣＭＡ−ＴＣＢは、ＡＰＲＩＬなしでの、および好ましくは、ＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を誘導しないので、ＢＣＭＡ陽性応答性腫瘍細胞の活性化および生存の増大は、上記ＢＣＭＡ−ＴＣＢが、どんな理由にせよ、例えば、ＣＤ３への結合によってではなく、腫瘍細胞のみへの結合によって、腫瘍細胞を死滅させない場合では起こらない。さらに、ＢＣＭＡ−ＴＣＢの有効性を低下させ得るレセプターインターナリゼーションもまた、起こらないと可能性がある。
【００４８】
抗体の有効性は、通常、腫瘍占有／ＴＣＢの濃度とともに増大するので、本発明に従うＢＣＭＡ抗体なしでのＢＣＭＡ−ＴＣＢでの結果は、有効性においてかなりの患者間変動があり得る（例えば、全般的に有効性があまりない、図１および図２もまた参照のこと）。さらに、高レベルの血清ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦを有する患者（例えば、多発性骨髄腫患者）において、本発明に従う抗体の用量を増大させることは、リガンド競合によって影響を受けない場合があるので、必ずしも必要とし得ない。対照的に、他のリガンドブロック／競合の抗ＢＣＭＡ抗体についての用量は、それらの患者において増大される必要があり得る。
【００４９】
本発明に従う抗体の別の利点は、少なくとも１週間に１回もしくは２回の投与を可能にする約１〜１２日の排泄半減期である。好ましくは、本発明に従う抗体は、１週間に１回もしくは２回、好ましくは、皮下投与を介して（例えば、好ましくは、０．２５〜２．５ｍｇ／ｍ2／週、好ましくは、２５ｍｇ／ｍ2／週までの用量範囲で）投与される。本発明に従う抗体の優れた細胞傷害性活性に起因して、Ｔ細胞二重特異的でない（すなわち、一方のアーム上でＣＤ３に結合しない）従来の単一特異的抗体もしくは従来の二重特異的抗体と比較して、本発明に従う抗体は、臨床的用量範囲の少なくとも同程度（もしくはさらにより低い）を投与することができる。本発明に従う抗体に関しては、臨床状況では（例えば、１〜１００ｍｇ／ｍ2／週の用量範囲で）皮下投与が好ましいことが想定される。
【００５０】
本発明によれば、ＯＤは、４０５ｎｍもしくは４５０ｎｍ（好ましくは、同じ相対的結果を伴う、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦなしでの比較）で測定され得る。本発明によれば、ＯＤは、ヒトもしくはマウスＡＰＩＬもしくはＢＡＦＦで、４５０ｎｍ（好ましくは、同じ相対的結果を伴う、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦなしでの比較）で測定され得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
２つの標的ヒトＣＤ３εおよびヒトＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、
ａ）該標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む；および
ｂ）該標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここでその可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくはその定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる
ことを特徴とし、そして
ｃ）ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて４０５ｎｍでのＯＤとして測定して、ＡＰＲＩＬなしでのヒトＢＣＭＡへの該抗体の結合と比較して、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって２０％超は低下しない、
ｄ）該抗体は、ＡＰＲＩＬのみと比較して、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、および
ｅ）該抗体は、該抗体なしと比較して、ＡＰＲＩＬなしのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
（項目２）
項目１に記載の、２つの標的ヒトＣＤ３εおよびヒトＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体であって、
ａ）該標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む；および
ｂ）該標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここでその可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくはその定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とし、そして
ｃ）ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて４０５ｎｍでのＯＤとして測定して、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦそれぞれなしでのヒトＢＣＭＡへの該抗体の結合と比較して、２０％超は、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって低下せず、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＡＦＦによって低下しない、
ｄ）該抗体は、ＡＰＲＩＬのみと比較して、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ｅ）該抗体は、ＢＡＦＦのみと比較して、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、および
ｆ）該抗体は、該抗体なしと比較して、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化させない、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
（項目３）
項目１または２に記載の二重特異的抗体であって、
ａ）該二重特異的抗体は、抗ＣＤ３抗体のＦａｂフラグメントがそのＮ末端において抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂフラグメントのＣ末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
ｂ）該抗ＣＤ３抗体のうちの可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
（項目４）
２つの標的ヒトＣＤ３εおよびヒトＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体であって、
ａ）該二重特異的抗体は、抗ＣＤ３抗体のＦａｂフラグメントがそのＮ末端において抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂフラグメントのＣ末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
ｂ）該抗ＣＤ３抗体の可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
（項目５）
項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号１、２および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、該抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨ、ならびに配列番号４、５および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、該抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
（項目６）
項目１〜５のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号７および８の可変ドメインを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号３７〜４５、４７〜５５、および５７〜６５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
（項目８）
項目１〜７のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号６７〜７５、７７〜８５、および８７〜９５の軽鎖ＣＤＲをそれぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
（項目９）
項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号３７〜４５、４７〜５５、および５７〜６５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨ、ならびに配列番号６７〜７５、７７〜８５、および８７〜９５の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインＶＨは、配列番号１７〜２５の群から選択されることを特徴とする、抗体。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインＶＬは、配列番号２７〜３５の群から選択されることを特徴とする、抗体。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の抗体であって、
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインＶＨは、配列番号１７〜２５の群から選択され、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインＶＬは、配列番号２７〜３５の群から選択される、という点でそれぞれ特徴付けられる、抗体。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか１項に記載の抗体であって、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインは、各々、該抗体のＣＨ３ドメインの間の元の界面を含む界面で接触することを特徴とし；ここで該界面は、前記二重特異的抗体の形成を促進するように変化し、該変化は、
ａ）該二重特異的抗体内で他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、１つのアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の間隙に配置可能である一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内での突出部を生成するように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化する、および
ｂ）該二重特異的抗体内で第１のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、１つのアミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有する１つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、該第１のＣＨ３ドメインの界面内の突出部がその内部に配置かのうである、該第２のＣＨ３ドメインの界面内の間隙を生成するように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化する、
ことを特徴とする、抗体。
（項目１４）
両方の重鎖の定常重鎖ドメインＣＨ３のうちの１つは、定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換えられる；および他方の定常重鎖ドメインＣＨ３は、定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換えられる、ことを特徴とする、項目１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１５）
項目１または１４に記載の二重特異的抗体であって、
ａ）該二重特異的抗体は、抗ＣＤ３抗体のＦａｂフラグメントがそのＮ末端において抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂフラグメントのＣ末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
ｂ）該抗ＣＤ３抗体の可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、
二重特異的抗体。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか１項に記載の二重特異的抗体を調製するための方法であって、該方法は、
ａ）宿主細胞を、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換する工程であって、ここでその可変ドメインＶＬおよびＶＨもしくはその定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられる、工程；
ｂ）該宿主細胞を、該抗体分子の合成を可能にする条件下で培養する工程；および
ｃ）該抗体分子を該培養物から回収する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞。
（項目１８）
項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１９）
医薬としての使用のための、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または項目８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
形質細胞障害の処置における医薬として使用するための、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または項目８に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
多発性骨髄腫の処置における医薬として使用するための、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または項目８に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
多発性骨髄腫ＭＭもしくはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害のような形質細胞障害の処置のための、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または項目８に記載の薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】プレートに結合したＢＣＭＡ細胞上でのＥＬＩＳＡによる、リガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体に対する非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体；またはリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ（ＴＣＢ含有）に対する非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ（ＴＣＢ含有）の優れた結合特性。このグラフで、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）は、プレートに結合したＢＣＭＡへの非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体もしくは非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ（ＴＣＢ含有）の結合を変化させない（実線）。対照的に、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの高濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）は、プレートに結合したＢＣＭＡへの、リガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体もしくはリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ（ＴＣＢ含有）の結合を低下させる（破線）。異なる特性を有する抗ＢＣＭＡ抗体もしくは抗ＢＣＭＡ（ＴＣＢ含有）の濃度は、好ましくは、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲に及ぶ濃度(複数可)である。なぜなら付加の循環ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦのレベルは、１ｎｇ／ｍＬ（健康で正常）〜１００ｎｇ／ｍＬ（ＭＭ，  血液）およびこれを超える（ＭＭ，骨髄中の腫瘍）範囲に及ぶからである。
【図２】ＬＤＨ放出アッセイにおける、リガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体に対する非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的抗体によって媒介されるＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の再指向Ｔ細胞傷害性の優れた効力。このグラフでは、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）は、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞に特異的な非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的抗体の死滅化効力を変化させない（実線）。対照的に、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの高濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）は、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞に特異的なリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的抗体の死滅化効力を低下させる（破線）。異なる特性を有する抗ＢＣＭＡ抗体を伴うＴ細胞二重特異的物質の濃度は、好ましくは、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲に及ぶ濃度(複数可)である。なぜなら、付加の循環ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦのレベルは、１ｎｇ／ｍＬ（健康で正常）〜１００ｎｇ／ｍＬ（ＭＭ，血液）およびこれを超える（ＭＭ，骨髄中の腫瘍）範囲に及ぶからである。
【図３】以下に特定されるとおりのＦａｂフラグメント（ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的）およびＦｃ部分のみを含む好ましい二重特異的抗体：（１）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（２）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（３）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（４）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ。好ましくは、上記Ｆａｂｓ  ＣＤ３は、ＬＣの誤った対合および副生成物を減少させるために、ＣＨ１−ＣＬ交差を含む。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡは、可撓性リンカーで互いに結合する。
【図４】多発性骨髄腫細胞株でのＢＣＭＡ発現。フローサイトメトリーによって検出される場合の、Ｈ９２９細胞への抗ＢＣＭＡ抗体の漸増濃度（０．３〜１０μｇ／ｍＬ）の結合の際のメジアン蛍光強度の増大。
【図５】ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞での抗ＢＣＭＡ抗体の結合。抗ＢＣＭＡ抗体濃度（０．２〜４０μｇ／ｍＬ）の関数でプロットした抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧクローンについての平均蛍光強度；（Ａ）Ｈ９２９細胞に対してクローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｂ）ＭＫＮ４５細胞に対してクローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｃ）Ｈ９２９細胞に対してクローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１、（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞に対してクローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１。
【図６】競合ＥＬＩＳＡ。マウスＡＰＲＩＬ（１．５６〜１００ｎＭ）の濃度範囲の存在下での固定化ヒトＢＣＭＡに結合する、５００ｎＭもしくは１０００ｎＭの飽和濃度での７個の選択した抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローン（１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１９、１３Ａ４、１３Ｄ２、２９Ｂ１１、１３Ａ７）のＥＬＩＳＡ結果が示される。非競合の場合、シグナルは、上記濃度範囲にわたって上記アッセイの変動内で一定のままであり、マウスＡＰＲＩＬの存在下でのシグナルは、マウスＡＰＲＩＬが添加されなかったコントロールウェルに由来するシグナルに匹敵する。競合の場合、シグナルの濃度依存性低下が測定される。
【図７】ＦＡＣＳによる結合の競合。フローサイトメトリーによって検出されるΔ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との競合。Ｈ９２９細胞に対する抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１４Ｂ１１の濃度（１μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、および４０μｇ／ｍＬ）の関数で検出した、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されるΔ−ＡＰＲＩＬ（ＦＩＴＣシグナル）の相対的メジアン蛍光強度。アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの結合の際のメジアン蛍光強度を、１に設定した；他のシグナルを、これに対して正規化した。抗ＢＣＭＡ抗体の存在下でのＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞へのＡＰＲＩＬ結合の検出を、抗ＨＡ蛍光色素結合体化抗体によって測定した。
【図８】ＦＡＣＳによる結合の競合。フローサイトメトリーによって検出される抗ＢＣＭＡ抗体とΔ−ＡＰＲＩＬとの競合。Δ−ＡＰＲＩＬ  １０００ｎｇ／ｍＬの非存在下もしくは存在下で検出される、ＲＰＭＩ細胞に対して抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４、１３Ｃ７、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１７Ａ５、８３Ａ１０に関して４０μｇ／ｍＬの濃度で使用される抗ＢＣＭＡ抗体の相対的メジアン蛍光強度（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）。Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下での抗ＢＣＭＡ抗体の結合の際のメジアン蛍光強度を１に設定した；Δ−ＡＰＲＩＬの存在下での上記抗ＢＣＭＡ抗体に対するそれぞれの他のシグナルを、それに対して正規化した。Δ−ＡＰＲＩＬの存在下でのＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ細胞への抗ＢＣＭＡ抗体結合の検出を、抗ヒトＦｃ蛍光色素結合体化抗体によって測定した。
【図９】フローサイトメトリーによって検出される同時インキュベーション後の抗ＢＣＭＡ抗体とΔ−ＡＰＲＩＬとの競合。（Ａ）２．５μｇ／ｍＬ  Δ−ＡＰＲＩＬの存在下もしくは非存在下での濃度２０μｇ／ｍＬでの抗ＢＣＭＡ抗体クローン１４Ｂ１１、１３Ｄ２、１３Ａ４、１７Ａ５および８３Ａ１０の平均蛍光強度および相対的蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）、（Ｂ）２．５μｇ／ｍＬ  Δ−ＡＰＲＩＬおよび抗ＢＣＭＡ抗体クローン８３Ａ１０（２０μｇ／ｍＬ）の濃度でのΔ−ＡＰＲＩＬ（ＦＩＴＣシグナル）の平均蛍光強度および相対的蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）を測定した。ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃ抗体でのΔ−ＡＰＲＩＬの存在下での抗ＢＣＭＡ抗体の検出を、Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下による、抗ＢＣＭＡ抗体クローンのシグナルに対して正規化した。Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体化抗ＨＡ抗体による、抗ＢＣＭＡ抗体クローンの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの検出は、アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬシグナルに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（発明の詳細な説明）
用語「ＢＣＭＡ」とは、本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡ；  ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ，  ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても公知であり、分化した形質細胞で優先的に発現される腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーであるヒトＢ細胞成熟標的に関する。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔによれば、アミノ酸１〜５４（もしくは５〜５１）からなる。用語「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」とは、本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体に関する。
【００５３】
用語「ＣＤ３εもしくはＣＤ３」とは、本明細書で使用される場合、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）の下で記載されるヒトＣＤ３εに関する。用語「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」とは、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。好ましくは、上記抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、それぞれ配列番号１、２および３の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨ、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として、それぞれ配列番号４、５および６の軽鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＬを含む。好ましくは、上記抗体は、配列番号７（ＶＨ）および配列番号８（ＶＬ）の可変ドメインを含む。用語「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」とは、本明細書で使用される場合、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に関する。
【００５４】
「ＣＤ３もしくはＢＣＭＡに特異的に結合する」とは、抗体がＣＤ３もしくはＢＣＭＡを標的とすることについて治療剤として有用であるように十分な親和性を有して、ＣＤ３もしくはＢＣＭＡ（標的）に結合し得る抗体をいう。いくつかの実施形態において、関連しない非ＣＤ３もしくは非ＢＣＭＡタンパク質への抗ＣＤ３もしくはＢＣＭＡ抗体の結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素結合イムノソルベント（ＥＬＩＳＡ）もしくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、ＣＤ３もしくはＢＣＭＡへの上記抗体の結合より約１０倍、好ましくは、＞１００倍弱い。好ましくは、ＣＤ３もしくはＢＣＭＡに結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）  １０−８Ｍ以下、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍを有する。好ましくは、上記抗ＣＤ３および／もしくは抗ＢＣＭＡ抗体は、種々の種（好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの中で）に由来するＣＤ３および／もしくはＢＣＭＡの中で保存されているＣＤ３および／もしくはＢＣＭＡのエピトープに結合する。「ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異的抗体」もしくは「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合に関するそれぞれの定義に言及する。ＢＣＭＡ（もしくはＢＣＭＡおよびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。従って、ＥＬＩＳＡでは、このような関連しない標的についてのＯＤ値は、特定のアッセイの検出限界の値以下（好ましくは、＞０．３ｎｇ／ｍＬ）、またはプレートに結合したＢＣＭＡがないもしくはトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞を伴うコントロールサンプルのＯＤ値以下である。
【００５５】
用語「ＡＰＲＩＬ」とは、本明細書で使用される場合、組換え短縮型マウスＡＰＲＩＬ（アミノ酸１０６〜２４１；ＮＰ＿０７６００６）に関する。ＡＰＲＩＬは、Ｒｙａｎ，
２００７  （Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように生成され得る。
【００５６】
用語「ＢＡＦＦ」とは、本明細書で使用される場合、組換え短縮型ヒトＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９Ｙ２７５（ＴＮ１３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ）に関し、これは、Ｇｏｒｄｏｎ，
２００３  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  ４２  （２０）：  ５９７７−５９８３）に記載されるように生成され得る。好ましくは、Ｈｉｓタグ化ＢＡＦＦが、本発明に従って使用される。好ましくは、上記Ｈｉｓタグ化ＢＡＦＦは、ＢＡＦＦ残基８２〜２８５をコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、そのあとにトロンビン切断部位を有する融合物を作り、上記ベクターを発現させ、その回収されたタンパク質をトロンビンで切断することによって生成される。
【００５７】
抗ＢＣＭＡ抗体は、ＡＰＲＩＬおよび／もしくはＢＡＦＦの存在下および非存在下で、プレートに結合したＢＣＭＡを使用してヒトＢＣＭＡへの結合に関してＥＬＩＳＡによって分析される。このアッセイに関して、プレートに結合したＢＣＭＡの量、好ましくは、１．５μｇ／ｍＬ、および好ましくは、１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲に及ぶ抗ＢＣＭＡ抗体の濃度(複数可)が使用される。ＢＣＭＡへの結合が本発明に従って阻害されないＢＣＭＡ抗体は、「ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＢＣＭＡへのＡＰＲＩＬおよび／もしくはＢＡＦＦの結合を阻害しない」抗ＢＣＭＡ抗体である。
【００５８】
用語「ＮＦ−κＢ」は、本明細書で使用される場合、組換えＮＦ−κＢ  ｐ５０（受託番号Ｐ１９８３８）に関する。
【００５９】
ＮＦ−κＢ活性は、ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞（ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）の抽出物のＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡによって測定される。ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞（未処理、または０．１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、１００ｎｇ／ｍＬ  熱処理ＨＴ−短縮型ＢＡＦＦ、１００ｎｇ／ｍＬ  短縮型ＢＡＦＦ、０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  アイソタイプコントロール、ならびに０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体ありもしくはなし、で処理）を、２０分間インキュベートする。ＮＦ−κＢ活性を、ＮＦ−κＢコンセンサス配列（ＵＳ６１５００９０）に結合したｐ６５由来の化学発光シグナルを検出する機能的ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。
【００６０】
ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超はブロックしない、およびＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は低下させない、およびＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は増大させない抗体は、本発明に従う抗体なしでのＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦ−κＢ活性化（コントロール群）と比較して、２０％超は「ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を変化させない」とみなされる；２０％は、実験間の平均標準変動性（ｍｅａｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を表す。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。
【００６１】
ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超はブロックしない、およびＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は低下させない、およびＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は増大させない抗体は、本発明に従う抗体なしでのＢＡＦＦ誘導性ＮＦ−κＢ活性化（コントロール群）と比較して、２０％超は「ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を変化させない」とみなされる；２０％は、実験間の平均標準変動性を表す。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。
【００６２】
ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超はブロックしない、およびＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は低下させない、およびＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を２０％超は増大させない抗体は、本発明に従う抗体なしでのＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦ−κＢ活性化（コントロール群）と比較して、２０％超は「ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を変化させない」とみなされる；２０％は、実験間の平均標準変動性を表す。好ましくは、本発明に従う抗体は、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦなしでのＮＦ−κＢ活性化を１５％超は変化させない。
【００６３】
本発明に従う抗体が大過剰（好ましくは、最大５００ｎＭもしくは１０００ｎＭ）で使用される場合はまた、上記抗体の結合は、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＲＩＬによって、および好ましくは、ＢＡＦＦによって２０％超は低下しない、ならびにＡＰＲＩＬありおよびなしでＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を２０％超は変化せず、ならびに好ましくは、ＢＡＦＦありおよびなしで２０％超は変化しない。
【００６４】
用語「標的」は、本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡもしくはＣＤ３のいずれかを意味する。用語「第１の標的および第２の標的」とは、第１の標的としてのＣＤ３および第２の標的としてのＢＣＭＡを意味するか、または第１の標的としてのＢＣＭＡおよび第２の標的としてのＣＤ３を意味するかのいずれかである。
【００６５】
用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体をいう。抗体は、２対の「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）（このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対は、本明細書でＬＣ／ＨＣとも省略される）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲもしくはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。上記重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、ならびに必要に応じて重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラスＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。上記可変ドメインＶＨおよびＶＬは、より保存された、フレーム領域（ＦＲ）といわれる領域が散在した超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）ともいわれる）へとさらに細分類され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、標的への抗体の結合には直接関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。
【００６６】
用語「抗体」は、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および遺伝子操作された抗体（改変もしくは変異抗体）を含む。特に好ましいのは、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であり、特に、組換えヒト抗体もしくはヒト化抗体が好ましい。
【００６７】
用語「二重特異的抗体」および「本発明に従う抗体」とは、本明細書で使用される場合、２対の重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）のうちの一方がＣＤ３に特異的に結合し、他方がＢＣＭＡに特異的に結合する抗体をいう。
【００６８】
ギリシャ文字によって示される哺乳動物抗体重鎖には、５つのタイプがある：  α、δ、ε、γ、およびμ（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖のタイプは、抗体のクラスを定義する；これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ
ＲＡ，  Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ  （２００２）．  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成において異なっている；αおよびγは、約４５０アミノ酸を含む一方で、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域、定常領域および可変領域を有する。上記定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列に）から構成される定常領域、ならびに付加された可撓性のためにヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ  Ｊ，  Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４  （２００４）  ８９−９９）；重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．
５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。上記重鎖の可変領域は、種々のＢ細胞によって生成される抗体において異なるが、単一のＢ細胞もしくはＢ細胞クローンによって生成される全ての抗体に関して同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸長であり、単一の抗体ドメインから構成される。
【００６９】
哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）といわれる軽鎖の２タイプのみが存在する。軽鎖は、２つの連続ドメインを有する：１つの定常ドメインＣＬおよび１つの可変ドメインＶＬ。軽鎖のおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。好ましくは、上記軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖であり、上記定常ドメインＣＬは、好ましくは、カッパ（Ｋ）軽鎖に由来する（定常ドメインＣＫ）。
【００７０】
用語「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書で使用される場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物をいう。
【００７１】
本発明に従う「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧもしくはＩｇＥ）の、もしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であり得、それによって、本発明に従う二価の二重特異的抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）の、好ましくは、同じアロタイプの（例えば、白色人種の）Ｆｃ部分を有する。
【００７２】
「抗体のＦａｂフラグメント」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合する抗体上のフラグメントである。それは、上記重鎖（ＣＨ１およびＶＨ）および上記軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々のうちの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。本発明によれば、Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖のドメインは、化学的に一緒に結合していないので、ｓｃＦｖ（１本鎖可変フラグメント）はない。
【００７３】
「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知かつ抗体のパパイン切断に基づいて定義される用語である。本発明に従う抗体は、Ｆｃ部分として、好ましくは、ヒト起源のＦｃ部分、および好ましくは、ヒト定常領域の全ての他の部分を含む。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化およびＦｃレセプター結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、ある特定の条件に依存する一方で、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分における規定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、当該分野の水準において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，  ＴＪ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２７  （１９８１）  ２５５５−２５６０；  Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，  Ｒ．，
ａｎｄ  Ｃｅｂｒａ，  Ｊ．Ｊ．，  ＭｏＩ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６  （１９７９）  ９０７−９１７；  Ｂｕｒｔｏｎ，  Ｄ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８８  （１９８０）  ３３８−３４４；  Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏＩ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７  （２０００）  ９９５−１００４；  Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，  Ｅ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４  （２０００）  ４１７８−４１８４；  Ｈｅｚａｒｅｈ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．  ７５  （２００１）  １２１６１−１２１６８；  Ｍｏｒｇａｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６  （１９９５）  ３１９−３２４；およびＥＰ  ０  ３０７  ４３４に記載される。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う（以下を参照のこと））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は、通常は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化を示すのに対して、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑを結合せず、そしてＣ３を活性化しない。好ましくは、上記Ｆｃ部分は、ヒトＦｃ部分である。好ましくは、上記Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分である。
【００７４】
好ましくは、本発明に従う抗体は、Ｆｃ部分として、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ改変体を含む。上記Ｆｃ改変体は、Ｐｒｏ３２９の位置においてアミノ酸置換を、および少なくとも１個のさらなるアミノ酸置換を含み、ここで上記残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされ、上記抗体は、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＡおよび／もしくはＦｃγＲＩに対して低下した親和性を示し、上記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％へと低下する。具体的実施形態において、本発明に従う抗体における野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９は、グリシンもしくはアルギニン、または上記Ｆｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ  ８７およびＴｉｐ  １１０との間で形成されるＦｃ／Ｆｃγレセプター界面内のプロリンサンドイッチを破壊するために十分な大きさのアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，  ２６７−２７３  （２０  Ｊｕｌｙ  ２０００））。本発明のさらなる局面において、上記Ｆｃ改変体における上記少なくとも１個のさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、もしくはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態において、上記少なくとも１個のさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ改変体は、ＷＯ２０１２１３０８３１に詳細に記載される。
【００７５】
用語「キメラ抗体」とは、１つの供給源もしくは種由来の可変領域、すなわち、結合領域、および異なる供給源もしくは種に由来する定常領域の少なくとも一部を含み、通常は、組換えＤＮＡ技法によって調製される抗体をいう。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性（特に、Ｃ１ｑ結合および／もしくはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して）を生じるために、定常領域が元の抗体のものから改変されているかもしくは変化させられているものである。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチされた抗体」ともいわれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で周知の従来の組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法を要する。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１  （１９８４）  ６８５１−６８５５；米国特許第５，２０２，２３８号および同第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【００７６】
用語「ヒト化抗体」とは、フレームワークもしくは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体をいう。好ましい実施形態において、マウスＣＤＲは、「ヒト化抗体」を調製するためにヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフト化される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２  （１９８８）  ３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ
３１４  （１９８５）  ２６８−２７０を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上記に示される標的を認識する配列を表すものに対応する。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が本発明に従う特性（特に、Ｃ１ｑ結合および／もしくはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して）を生じるために、元の抗体のものからさらに改変されているかもしくは変化させられているものである。
【００７７】
用語「ヒト抗体」とは、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、当該分野の水準で周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ
Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５
（２００１）  ３６８−３７４）。ヒト抗体はまた、免疫の際に、内因性免疫グロブリン生成の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーもしくは選択物を生成し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）で生成され得る。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、標的チャレンジの際に、ヒト抗体の生成をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０  （１９９３）  ２５５１−２５５５；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２  （  １９９３）  ２５５−２５８；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，
Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９３）  ３３−４０を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーで生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，
Ｈ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７
（１９９２）  ３８１−３８８；  Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２  （１９９１）  ５８１−５９７）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．  ７７  （１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７  （１９９１）  ８６−９５）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及されたように、用語「ヒト抗体」はまた、本明細書で使用される場合、本発明に従う特性（特に、Ｃ１ｑ結合および／もしくはＦｃＲ結合に関して）を例えば「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部分の変化もしくは変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４および／もしくはＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異へ）によって生成するために、定常領域において改変されているこのような抗体を包含する。
【００７８】
用語「組換えヒト抗体」とは、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製されたか、発現されたか、作られたかもしくは単離された全てのヒト抗体（例えば、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、または宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたヒト免疫グロブリン遺伝子もしくは抗体に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体）を含むことが意図される。このような組換えヒト抗体は、再構成形態で可変領域および定常領域を有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、インビボでの体細胞超変異に供されてきた。従って、上記組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来しかつ関連する一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性のある配列である。
【００７９】
「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、本明細書で使用される場合、上記標的への上記抗体の結合に直接関与する軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、この配列は、広く保存されており、３つの「超可変領域」（もしくは相補性決定領域、ＣＤＲ）によって繋がれている。上記フレームワーク領域は、βシートコンホメーションをとり、ＣＤＲは、上記βシート構造を繋ぐループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造が保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすので、本発明のさらなる目的を提供する。
【００８０】
用語「超可変領域」もしくは「抗体の標的結合部分」は、本明細書で使用される場合、標的結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。上記超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」もしくは「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されるとおりの超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖のＣＤＲは、このようなフレームワークのアミノ酸によって分離されている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、標的結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１）の標準的な定義に従って決定される。
【００８１】
重鎖ドメインＣＨ３が置き換えられる定常重鎖ドメインＣＨ１は、任意のＩｇクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）、もしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであり得る。重鎖ドメインＣＨ３が置き換えられる定常軽鎖ドメインＣＬは、ラムダ（λ）もしくはカッパ（κ）タイプ、好ましくは、カッパ（κ）タイプのものであり得る。
【００８２】
用語「標的」もしくは「標的分子」とは、本明細書で使用される場合、交換可能に使用され、ヒトＢＣＭＡおよびヒトＣＤ３εをいう。
【００８３】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合し得る任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、もしくはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、ある特定の実施形態においては、特定の三次元構造特徴および／もしくは特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。
【００８４】
一般に、上記第１の標的に特異的に結合する上記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクター、ならびに上記第２の標的に特異的に結合する上記抗体の軽鎖および重鎖をコードするさらなる２つのベクターが存在する。上記２つのベクターのうちの一方は、それぞれの軽鎖をコードし、上記２つのベクターのうちの他方は、それぞれの重鎖をコードする。しかし、本発明に従う二重特異的抗体の調製のための代替法において、上記第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第１のベクター、ならびに上記第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第２のベクターが、宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【００８５】
用語「核酸もしくは核酸分子」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、１本鎖であっても２本鎖であってもよいが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【００８６】
本明細書で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、全てのこのような名称は、子孫を含む。従って、語句「形質転換体」および「形質転換した細胞」は、移入の回数を考慮せずに、初代被験体細胞およびこれから由来する培養物を含む。全ての子孫が、故意のもしくは不注意の変異に起因して、ＤＮＡ含有量において正確に同一でなくてもよいこともまた、理解される。本来形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同じ機能もしくは生物学的活性を有する改変子孫が含まれる。別個の名称が意図される場合、それは状況から明らかである。
【００８７】
用語「形質転換」とは、本明細書で使用される場合、宿主細胞へとベクター／核酸を移入するプロセスをいう。強力な（ｆｏｒｍｉｄａｂｌｅ）細胞壁バリアのない細胞が宿主細胞として使用される場合、例えば、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｈ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２  （１９７８）  ５４６ｆｆによって記載されるとおりのリン酸カルシウム沈殿法によって、トランスフェクションが行われる。しかし、核注入によるもしくはプロトプラスト融合によるなどの、細胞へとＤＮＡを導入するための他の方法もまた、使用され得る。原核生物細胞もしくは実質的細胞壁構築物を含む細胞が使用される場合、例えば、トランスフェクションの１方法は、Ｃｏｈｅｎ  ＳＮ，  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  １９７２，  ６９  （８）：  ２１１０−２１１４によって記載されるとおりの塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【００８８】
形質転換を使用する抗体の組換え生成は、当該分野の水準で周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｓ．  Ｃ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １７  （１９９９）  １８３−２０２；  Ｇｅｉｓｓｅ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ８  （１９９６）  ２７１−２８２；  Ｋａｕｆｍａｎ，  ＲＪ．，  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６  （２０００）  １５１−１６１；  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｒ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４８  （１９９８）  ８７０−８８０の総説記事、ならびにＵＳ６３３１４１５およびＵＳ４８１６５６７に記載される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡへと転写されるプロセスおよび／またはその転写されたｍＲＮＡ（転写物ともいわれる）がその後ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスをいう。上記転写物およびコードされるポリペプチドは、まとめて遺伝子産物といわれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００９０】
「ベクター」は、核酸分子、特に、自己複製し、宿主細胞の中におよび／もしくは宿主細胞間に挿入される核酸分子を移入する核酸分子である。この用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを細胞へと主に挿入する（例えば、染色体組み込み）ように機能するベクター、ＤＮＡもしくはＲＮＡを複製するように主に機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡを転写および／もしくは翻訳するように機能する発現ベクターを含む。記載されるように上記機能のうちの１つより多くを提供するベクターもまた含まれる。
【００９１】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞へと導入される場合に、転写され得、ポリペプチドへと翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現生成物を得るために機能し得る発現ベクターから構成される適切な宿主細胞をいう。
【００９２】
本発明に従う二重特異的抗体は、好ましくは、組換え手段によって生成される。このような方法は、当該分野の水準で周知であり、原核生物細胞および真核生物細胞におけるタンパク質発現、上記抗体ポリペプチドのその後の単離および通常は、薬学的に受容可能な純度への精製を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖もしくはこれらのフラグメントをコードする核酸は、標準的な方法によって発現ベクターへと挿入される。発現は、適切な原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、もしくはＥ．ｃｏｌｉ細胞）において行われ、抗体は、上記細胞（上清もしくは溶解後の細胞）から回収される。上記二重特異的抗体は、全細胞、細胞溶解物、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、他の細胞成分もしくは他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質を、標準的な技法（アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィーおよび他の当該分野で周知のものが挙げられる）によって排除するために行われる。Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）を参照のこと。
【００９３】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，  Ｌ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２  （２０００）  １０９−１２３；およびＢａｒｎｅｓ，  Ｌ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ７３  （２００１）  ２６１−２７０によって記載される。一過性の発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ３０  （２００２）  Ｅ９によって記載される。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６  （１９８９）  ３８３３−３８３７；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  （１９９２）  ４２８５−４２８９；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４  （１９９７）  ７７−８７によって記載される。好ましい一過性の発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，  Ｅ．−  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｋ．，によってＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０  （１９９９）  ７１−８３の中で、およびＳｃｈｌａｅｇｅｒ，  Ｅ．−Ｊ．，  による  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９４  （１９９６）  １９１−１９９中に記載される。
【００９４】
原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。
【００９５】
核酸は、これが別の核酸配列と機能的関係にあるように配置される場合に「作動可能に結合」される。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に結合される；プロモーターもしくはエンハンサーは、これが配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に結合されている；またはリボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に結合されている。一般に、「作動可能に結合」されたとは、結合されているＤＮＡ配列が連続している、および分泌リーダーの場合には、連続しかつリーディングフレームの中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。結合は、便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００９６】
二重特異的抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、もしくはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として働き得る。いったん単離されたら、上記ＤＮＡは、発現ベクターへと挿入され得、これは次いで、免疫グロブリンタンパク質を別段生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、もしくは骨髄腫細胞などの宿主細胞へとトランスフェクトされ、上記宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。
【００９７】
上記二重特異的抗体のアミノ酸配列改変体（もしくは変異体）は、上記抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって、調製される。しかし、このような改変は、非常に限られた範囲でのみ、例えば、上記のように行われ得る。例えば、上記改変は、ＩｇＧアイソタイプおよび標的結合などの上述の抗体特徴を変化させないが、組換え生成物の収量、タンパク質安定性を改善し得るか、または精製を容易にし得る。
【００９８】
Ｔ細胞二重特異的（ＴＣＢ）結合因子は、細胞を死滅させるにあたって、非常に高濃度／腫瘍細胞レセプター占有依存性効力を有する（例えば、ピコモル濃度未満もしくは低ピコモル濃度範囲でのインビトロ細胞死滅化アッセイでのＥＣ５０；  Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ
ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２）。Ｔ細胞二重特異的結合因子（ＴＣＢ）は、従来の単一特異的抗体より遙かに低い用量で与えられる。例えば、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ１９ｘＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の処置のために５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか０．３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）、または非ホジキンリンパ腫の処置のために６０μｇ／ｍ２／日の連続静脈内用量で与えられ、これらの用量での血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍｌの範囲にある（Ｋｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１２；  Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１）。ＴＣＢの低用量は、患者において高い有効性を発揮し得るので、本発明に従う抗体に関しては、皮下投与が可能であり、臨床状況において（好ましくは、０．２５〜２．５ｍｇ／ｍ２／週の用量範囲において）好ましいと予見される。これらの低い濃度／用量／レセプター占有においてすら、ＴＣＢは、かなりの有害事象を引き起こし得る（Ｋｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１２）。従って、腫瘍細胞占有／適用範囲を制御することは重要である。高くかつ変動性のレベルの血清ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦを有する患者（例えば、多発性骨髄腫患者、Ｍｏｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４；  Ｂｌｏｏｄ  １０３（８）：  ３１４８−３１５７）において、腫瘍細胞に結合したＴＣＢの数、応答する（ｒｅｓｐ．）腫瘍細胞占有は、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦによってかなり影響を受け得る。しかし、本発明の上記抗体、腫瘍細胞占有、それぞれ、有効性／安全性を使用することによって、本発明に従う抗体の用量を増大させる必要はない可能性がある。なぜなら、上記抗体は、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦリガンド競合によって影響を受け得ないからである。本発明に従う抗体の別の利点は、Ｆｃ部分の包含に基づき、このことは、排泄半減期を約１２日間へと増大させ、患者によって運ばれるポンプを用いて静脈内におよび連続して与えられる必要があるＦｃ部分なしのＴＣＢ（例えば、ブリナツモマブ）と比較すると、１週間に少なくとも１回もしくは２回の投与を可能にする。
【００９９】
【表１】
2020180158.tif 000002
【０１００】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の趣旨から逸脱することなく、示される手順において改変が行われ得ることは、理解される。
【０１０１】
（材料および一般的方法）
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１）。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされかつ参照される（Ｅｄｅｌｍａｎ，  Ｇ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６３  （１９６９）  ７８−８５；  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  （１９９１））。
【０１０２】
（組換えＤＮＡ技法）
標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９に記載されるようにＤＮＡを操作するために使用した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下に示される：  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２。
【０１０３】
（遺伝子合成）
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製する。６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメント（これは、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している）を、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブリし、その後、示される制限部位（例えば、ＫｐｎＩ／ＳａｄもしくはＡｓｃＩ／ＰａｃＩ）を介してｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターへとクローニングする。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。遺伝子合成フラグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の所定の仕様に従って注文する。
【０１０４】
（ＤＮＡ配列決定）
ＤＮＡ配列を、二重鎖配列決定法によって決定した。
【０１０５】
（ＤＮＡおよびタンパク質配列分析ならびに配列データ管理）
ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のソフトウェアパッケージバージョン１０．２およびＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴｌ  Ａｄｖａｎｃｅスイートバージョン８．０を、配列作製、マッピング、分析、註釈および図解のために使用する。
【０１０６】
（発現ベクター）
ａ）一過性発現（例えば、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡもしくはＨＥＫ２９３−Ｆにおいて）のための発現プラスミドの記載される抗体改変体の発現のために、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターでのｃＤＮＡ組織化もしくはＣＭＶプロモーターでのゲノム組織化のいずれかに基づく細胞を適用する。抗体発現カセットの他に、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、およびＥ．ｃｏｌｉにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。抗体遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−５’末端における特有の制限部位(複数可)−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
−続いて、ｃＤＮＡ組織化の場合には、イントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−ｃＤＮＡもしくは免疫グロブリンエキソン−イントロン組織化を含むゲノム組織化のいずれかとしてのヒト抗体鎖（野生型もしくはドメイン交換を有する）
−ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、ならびに
−３’末端における特有の制限部位(複数可)。
【０１０７】
以下に記載されるとおりの記載される抗体鎖を含む融合遺伝子を、ＰＣＲおよび／もしくは遺伝子合成によって生成し、公知の組換え法およびそれに応じた核酸セグメントを例えば、それぞれのベクター中の特有の制限部位を使用して繋ぐことによる技法でアセンブリする。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証する。一過性トランスフェクションのために、多量のプラスミドを、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ，  Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製によって調製する。
【０１０８】
ｂ）抗体および抗原発現ベクターの生成。
重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターの中に予め挿入されたヒトＩｇＧ１定常重鎖もしくはヒト（ｈｕｍ）ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現を、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーター、続いて、５’  ＵＴＲ、イントロンおよびκＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターによって駆動した。転写を、ＣＤＳの３’末端において合成ポリＡシグナル配列によって終了させる。全てのベクターは、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有する。さらに、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞におけるエピソームプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０１０９】
ファージディスプレイ選択作戦のために、および選択された抗体の結合特性を特徴付けるために使用されてきた抗原を、Ｃ末端タグをコードする予め挿入されたＤＮＡ配列を有する哺乳動物抗原発現ベクターから発現した。Ａｖｉタグは、それぞれの抗原のインビボもしくはインビトロでのビオチン化のために使用されてきた。上記抗原の精製およびホモダイマー化もしくはヘテロダイマー化のために、ヒト（ｈｕｍ）ＩｇＧ１  Ｆｃ野生型（Ｆｃ  ｗｔ）もしくはＦｃ  ｋｎｏｂを、抗原発現カセットのＣ末端に融合した。上記抗原発現を、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーター、続いて、５’  ＵＴＲ、イントロンおよびκＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターによって駆動した。転写を、ＣＤＳの３’末端において合成ポリＡシグナル配列によって終了させた。全てのベクターは、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有する。さらに、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞におけるエピソームプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０１１０】
（細胞培養技法）
標準的な細胞培養技法を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２０００），  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｄａｓｓｏ，
Ｍ．，  Ｈａｒｆｏｒｄ，  Ｊ．Ｂ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，
Ｊ．  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，  Ｋ．Ｍ．  （ｅｄｓ．），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．に記載されるように使用する。
【０１１１】
（ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現）
二重特異的抗体を、以下に記載されるように、接着して増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞においてもしくは懸濁物中で増殖するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞において、それぞれの発現プラスミドの一過性の共トランスフェクションによって発現させる。
【０１１２】
ａ）ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系における一過性トランスフェクション
二重特異的抗体を、接着して増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（１０％  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（ウシ胎仔血清，  Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および２５０μｇ／ｍｌ  ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地，  Ｇｉｂｃｏ）中で培養したエプスタイン・バーウイルス核標的を発現するヒト胚性腎細胞株２９３；アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ−  １０８５２，  Ｌｏｔ．  ９５９  ２１８）中で、それぞれの発現プラスミド（例えば、重鎖および改変重鎖、ならびにその対応する軽鎖および改変軽鎖ををコードする）の一過性共トランスフェクションによって発現させる。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥＴＭ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、ＦｕＧＥＮＥＴＭ試薬（μｌ）  対  ＤＮＡ（μｇ）が４：１（３：１〜６：１の範囲）の比で使用する。
【０１１３】
タンパク質を、１：２〜２：１の範囲に及ぶ１：１（等モル）の（改変型および野生型）それぞれ軽鎖および重鎖コードプラスミドのモル比を使用して、それぞれのプラスミドから発現させる。細胞に、３日目に、Ｌ−グルタミン  ４ｍＭ，  グルコース［Ｓｉｇｍａ］およびＮＡＡ［Ｇｉｂｃｏ］を供給する。二重特異的抗体含有細胞培養上清を、トランスフェクション後５日目〜１１日目に、遠心分離によって回収し、−２００Ｃで貯蔵した。例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的情報は、以下に与えられる：  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ７５  （２００１）  １９７−２０３。
【０１１４】
ｂ）ＨＥＫ２９３−Ｆ系における一過性トランスフェクション
二重特異的抗体を、ＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従って、それぞれのプラスミド（例えば、重鎖および改変重鎖、ならびにその対応する軽鎖および改変軽鎖をコードする）の一過性トランスフェクションによって生成する。簡潔には、振盪フラスコ中もしくは撹拌発酵器中のいずれかで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、懸濁物中で増殖するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、上記４つの発現プラスミドおよび２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）もしくはフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物でトランスフェクトした。２Ｌ  振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に関しては、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、６００ｍＬ中、密度１．０×１０６細胞／ｍＬで播種し、１２０ｒｐｍ，  ８％  ＣＯ２でインキュベートする。その翌日、上記細胞を、細胞密度  約１．５×１０６細胞／ｍＬにおいて、Ａ）２０ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、重鎖もしくは改変重鎖それぞれおよびその対応する軽鎖を等モル比でコードする６００μｇ  総プラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍＬ）、ならびにＢ）２０ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ＋１．２ｍＬ  ２９３フェクチンもしくはフェクチン（２μｌ／ｍＬ）の約４２ｍＬ  ミックスでトランスフェクトする。グルコース消費に従って、グルコース溶液を、発酵の過程の間に添加する。分泌された抗体を含む上清を、５〜１０日後に回収し、抗体は、上記上清から直接精製するか、または上記上清を、凍結および保存するかのいずれかである。
【０１１５】
（タンパク質決定）
精製された抗体および派生物のタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９５，  ４，  ２４１１−１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定する。
【０１１６】
（上清中の抗体濃度決定）
細胞培養上清中の抗体および派生物の濃度を、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）での免疫沈降によって概算する。６０μＬ  プロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ−ＮＰ４０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）中で３回洗浄する。その後、１〜１５ｍＬ  細胞培養上清を、ＴＢＳ−ＮＰ４０で予め平衡化したプロテインＡアガロースビーズにアプライする。室温で１時間インキュベートした後、上記ビーズを、０．５ｍＬ  ＴＢＳ−ＮＰ４０で１回、０．５ｍＬ  ２×リン酸緩衝食塩水（２×ＰＢＳ，  Ｒｏｃｈｅ）で２回、および０．５ｍＬ  １００ｍＭ  クエン酸Ｎａ  ｐＨ５，０で短時間４回、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ−フィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ］上で洗浄する。結合した抗体を、３５μｌ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって溶離する。そのサンプルの半分を、それぞれ、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤と混合するか、もしくは還元しないままにし、１０分間、７０℃で加熱する。最終的に、５〜３０μｌを、４−１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライし（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＭＯＰＳ緩衝液で、および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤泳動緩衝液添加剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＳ緩衝液で）、クーマシーブルーで染色する。
【０１１７】
細胞培養上清中の抗体および派生物の濃度は、アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーによって定量的に測定される。簡潔には、プロテインＡに結合する抗体および派生物を含む細胞培養上清を、２００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム，
ｐＨ７．４中のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｏｒｏｓ  Ａ／２０カラムにアプライし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  クエン酸，ｐＨ２．５を用いてマトリクスから溶離する。その溶離したタンパク質を、ＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量する。精製された標準的ＩｇＧ１抗体は、標準物質として働いた。
【０１１８】
あるいは、細胞培養上清中の抗体および派生物の濃度は、サンドイッチ−ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによって測定される。簡潔には、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ  Ａ−９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、０．１μｇ／ｍＬの１００μＬ／ウェル  ビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子  Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で１時間室温において、または代わりに一晩４℃で被覆し、その後、２００μＬ／ウェル  ＰＢＳ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳＴ，  Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄する。それぞれの抗体を含む細胞培養上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中の段階希釈物１００μＬ／ウェルを、上記ウェルに添加し、室温においてマイクロタイタープレート振盪機上で１〜２時間インキュベートする。上記ウェルを、２００μＬ／ウェル  ＰＢＳＴで３回洗浄し、結合した抗体を、検出抗体として０．１μｇ／ｍＬの１００μｌ  Ｆ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）で１〜２時間、室温においてマイクロタイタープレート振盪機上で検出する。結合していない検出抗体を、２００μＬ／ウェル  ＰＢＳＴで３回洗い流し、結合した検出抗体を、１００μＬ  ＡＢＴＳ／ウェルの添加によって検出する。吸光度の決定は、４０５ｎｍの測定波長（基準波長４９２ｎｍ）においてＴｅｃａｎ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで行う。
【０１１９】
（タンパク質精製）
タンパク質を、標準プロトコルを参照して、濾過した細胞培養上清から精製する。簡潔には、抗体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳで洗浄する。抗体の溶離を、ｐＨ２．８で行い、続いて、そのサンプルを直ぐに中和する。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ中もしくは２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってモノマー抗体から分離する。モノマー抗体画分をプールし、必要な場合には、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を使用して濃縮し、−２０℃で凍結および貯蔵する。上記サンプルの一部をその後のタンパク質分析および分析による特徴付け（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーもしくは質量分析による）のために提供する。
【０１２０】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って使用する。特に、１０％もしくは４−１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  Ｂｉｓ−ＴＲＩＳプレキャストゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤泳動緩衝液添加剤を含む）もしくはＭＯＰＳ（非還元ゲル）泳動緩衝液を使用する。
【０１２１】
（分析用サイズ排除クロマトグラフィー）
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行う。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４，  ｐＨ７．５中の、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、または２×ＰＢＳ中の、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍ上のスーパーデックス２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライする。溶離したタンパク質を、ＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量する。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１を、標準物質として働いた。
【０１２２】
（質量分析）
クロスオーバー抗体の全脱グリコシル化質量を決定し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認する。簡潔には、１００μｇの精製抗体を、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４，  ｐＨ７中、３７℃で１２〜２４時間、タンパク質濃度最大２ｍｇ／ｍｌで、５０ｍｉｌ  Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ，  ＰｒｏＺｙｍｅ）で脱グリコシル化する。その後、セファデックスＧ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨＰＬＣによって脱塩する。それぞれの重鎖および軽鎖の質量を、脱グリコシル化および還元後にＥＳＩ−ＭＳによって決定する。簡潔には、１１５μｌ中の５０μｇ  抗体を、６０μｌ  ＩＭ  ＴＣＥＰおよび５０μｌ  ８Ｍ  グアニジン塩酸塩とともにインキュベートし、その後脱塩する。総質量ならびに還元重鎖および軽鎖の質量を、ＮａｎｏＭａｔｅ（登録商標）源を装備したＱ−Ｓｔａｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＭＳシステムでＥＳＩ−ＭＳによって検出する。
【実施例】
【０１２３】
（実施例１−抗ＢＣＭＡ抗体の生成）
（実施例１Ａ。抗原およびツール試薬の生成）
（実施例１Ａ１。組換え可溶性ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン）
ａ）組換え可溶性ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン（「ＢＣＭＡ  ＥＣＤ」）を、Ｒｙａｎ，  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように生成する。簡潔には、上記ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ；アミノ酸５〜５１；ＮＰ＿００１１８３）を、ＢａｍＨ１部位（太字下線）を組みこんだ順方向プライマー
【化１】
2020180158.tif 000003
（配列番号１１）、および終止コドン（斜体）およびＮｏｔＩ部位（太字下線）を組みこんだ逆方向プライマー
【化２】
2020180158.tif 000004
（配列番号１２）で、ＰＣＲテンプレートとしてＩＭＡＧＥクローン６８７１９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して増幅する。そのＰＣＲ生成物を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の上流にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターにクローニングし、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株へと形質転換し、その誘導されたタンパク質を、４℃においてＡＥＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。その細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビターおよびリゾチームを含む１：１５  ｗ／ｖのＢ−ＰＥＲ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解する。その抽出物に、１〜２μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を補充し、さらに２０分間撹拌し、ｐＨ７．５に調節する。その可溶性融合タンパク質を、３１，０００×ｇで２０分間の遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ）後に集め、Ｂ−ＰＥＲ緩衝液で予め平衡化したグルタチオンセファロース４  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せる。上記カラムを、４カラム体積（ＣＶ）のＢ−ＰＥＲ緩衝液、各々３ＣＶの洗浄緩衝液１および２（Ｐｉｅｒｃｅ）で洗浄し、続いて、５ＣＶの５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌで最後のカラム洗浄を行う。ＧＳＴタグ化ＢＣＭＡを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の２０ｍｍｏｌ／Ｌ  還元型グルタチオンで溶離し、３５００  ＭＷＣＯ
ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析する。ＧＳＴタグ除去のために、ＢＣＭＡ：ＧＳＴを、グルタチオンセファロースに結合させながら５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ中のトロンビンで処理する。次いで、放出されたトロンビンは、ベンズアミジンセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉される。ＧＳＴ切断ＢＣＭＡは、上記カラムから３〜５ＣＶの５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌで溶離され、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析される。トロンビン除去を、色素生成性基質Ｓ−２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，  ＤｉａＰｈａｒｍａ）を使用してトロンビン活性に関して画分を分析することによって確認する。タンパク質濃度を、Ａ２８０によって決定する。全ての精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、およびＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析する。
【０１２４】
ＢＣＭＡ  ＥＣＤのビオチン化改変体（「ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ｂｉｏｔ」）を、以下の改変を伴う同じ手順を使用して、上記のように生成する。Ａｖｉ−ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅によって上記の第１のＰＣＲ生成物の３’末端の下流に、インフレームで付加する。この新たな第２のＰＣＲ生成物は、次いで、ｐＧＥＸ４Ｔ１発現ベクターにサブクローニングされ、次いで、上記Ａｖｉタグのインビボビオチン化のために、ＢｉｒＡ酵素を発現するためのベクターと一緒に細菌中に共形質転換される。残りの生成および精製工程は、ＢＣＭＡ−ＥＣＤに関して上記に示されるように行われる。
【０１２５】
ｂ）ファージディスプレイ選択のための抗原として使用したヒト、カニクイザルおよびマウスのＢＣＭＡの細胞外ドメインを、Ｎ末端モノマーＦｃ融合物として、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞において一過性に発現し、レセプター鎖を有するＦｃ部分（Ｆｃ  ｋｎｏｂ鎖）のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列においてＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現によってインビボで部位特異的ビオチン化した。ヒト、カニクイザルおよびマウスのＢＣＭＡの細胞外ドメインは、それぞれ、メチオニン４〜アスパラギン５３、メチオニン４〜アスパラギン５２、およびアラニン２〜スレオニン４９を含んだ。これらを、ヒトＩｇＧ１のヒンジにＮ末端融合し、ノブが凹みに入り込む技術によって融合していないヒトＩｇＧ１
Ｆｃ部分（凹鎖（ｈｏｌｅ  ｃｈａｉｎ））とのヘテロダイマー化を可能にした。
【０１２６】
（実施例１Ａ２。組換え短縮型マウスＡＰＲＩＬ）
ａ）組換え短縮型マウスＡＰＲＩＬを、Ｒｙａｎ，  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように生成する。簡潔には、マウスＡＰＲＩＬ（残基１０６〜２４１；  ＮＰ＿０７６００６）を、ＩＭＡＧＥクローン５２９０９６５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅し、ＣＯＯＨ末端において、遺伝子特異的順方向プライマー
【化３】
2020180158.tif 000005
に融合した細菌発現ベクターへとクローニングし、逆方向プライマー    
【化４】
2020180158.tif 000006
を、増幅のために使用する。順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれの中のＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ部位（太字下線）を、得られたＰＣＲフラグメントを、ＣＯＯＨ末端においてチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ．ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）に融合した細菌発現ベクターへとクローニングするために使用する。この構築物を、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子に変異を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株Ｋ−１２へと形質転換し、Ａ６００が約０．６になるまで２５℃で培養し、１ｍｍｏｌ／Ｌ  イソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導し、次いで、２５℃で一晩培養する。上記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを再懸濁し、４℃において完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビターを含む１：１０  ｗ／ｖのＢ−ＰＥＲ溶解緩衝液中で撹拌する。次いで、その混合物を、５×ストック緩衝液で終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％  グリセロール、および１０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール（ｐＨ８〜９）へと希釈する。上記サンプルに、リゾチーム、ＤＮａｓｅ  Ｉ、および２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を補充し、３０分間撹拌し、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡへと調節し、２０分間撹拌し、次いで、遠心分離して、細胞デブリを除去する。そのサンプルを、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２へと調節し、３０分間撹拌し、その後、Ｎｉ−ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せる。上記カラムを、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中１０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールの３〜５ＣＶ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）中０．５％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の２〜３ＣＶ、次いで、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中７０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールの５〜１０ＣＶで順次洗浄する。短縮型ＡＰＲＩＬを、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％  グリセロール（ｐＨ８．０）中、７０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールの直線勾配で溶離する。プールしたタンパク質画分を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−Ａｒｇ、５％  グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むＰＢＳ緩衝液に対して透析する。タンパク質濃度を、分光光度法で決定する［ε２８０（１％）＝０．９４］。
【０１２７】
ｂ）ファージディスプレイ選択およびＥＬＩＳＡのツール（競合物）として使用した組換え短縮型マウスＡＰＲＩＬを、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞においてＮ末端モノマーＦｃ−融合物として一過性に発現した。マウスＡＰＲＩＬは、ヒスチジン１０６〜ロイシン２４１を含んだ。これを、Ｎ末端においてヒトＩｇＧ１のヒンジに融合し、ノブが凹みに入り込む技術によって融合していないヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分（凹鎖）とのヘテロダイマー化を可能にした。
【０１２８】
（実施例１Ａ３。組換え短縮型ヒトＢＡＦＦ）
組換え短縮型ヒトを、Ｇｏｒｄｏｎ，  ２００３（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  ４２
（２０）：  ５９７７−５９８３）に記載されるように生成する。簡潔には、ＢＡＦＦ残基８２〜２８５をコードするＤＮＡフラグメントを、Ｎ末端においてＨｉｓタグ、および後ろにトロンビン切断部位を含むｐＢｒ３２２ベクターへとクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、そのあとにトロンビン切断部位を有する融合物を作る。ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株を、３７℃において、５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリンを含むＬＢ培地中で対数期中期まで培養し、次いで、１６℃へと冷却し、その後、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導する。細胞を、さらなる増殖の１２時間後に遠心分離によって回収し、−８０℃で保存する。上記細胞ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ８．０、および５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に再懸濁し、氷上で超音波処理する。遠心分離後、その上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に載せる。上記カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  イミダゾールで洗浄し、次いで、２５０ｍＭ  イミダゾールを有する同じ緩衝液中での段階勾配で溶離する。ＢＡＦＦ含有画分をプールし、トロンビンを添加し、そのサンプルを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ８．０、および５ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して４℃において一晩透析する。タンパク質を、ｍｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで、最終的に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中のＳ−２００サイズ排除カラムでさらに精製する。
【０１２９】
（実施例１Ｂ。ヒトＢＣＭＡを表面に発現する組換え細胞）
ヒトＢＣＭＡを表面に発現する組換え細胞（「ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞」）を、Ｒｙａｎ，  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように生成する。簡潔には、全長ヒトＢＣＭＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字下線）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む順方向プライマー
【化５】
2020180158.tif 000007
（配列番号１５）ならびに３’終止コドンおよびＸｂａＩ制限部位（太字下線）を含む逆方向プライマー
【化６】
2020180158.tif 000008
（配列番号１６）を使用して、ＩＭＡＧＥクローン６８７１９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＣＲテンプレートとして使用して増幅する。その増幅生成物を、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、およびネオマイシン耐性遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングし、直線状にし、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞へとトランスフェクトする。これらの細胞は、ヒトＢＣＭＡを表面に発現するものを選択し、高発現安定クローンを、蛍光活性化セルソーティング分析によって選択する。
【０１３０】
（実施例１Ｃ。ＢＣＭＡを表面に発現するヒト骨髄腫細胞株）
ａ）細胞起源および培養条件。  ヒトＭＭ細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９を、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得る（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０６８）。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を、１０％  ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で増殖させる。Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１９６）ヒトＢリンパ球骨髄腫細胞株を、ＲＰＭＩ  ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン、１％  ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中で培養する。ＲＰＭＩ  ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）、ヒトＢリンパ球骨髄腫細胞株を、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン中で培養する。。ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）、ヒト胃腺癌細胞株を、１０％  ＦＣＳおよび１％  グルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養する。ＭＭ細胞株でのＢＣＭＡ発現を、蛍光色素結合体化抗ヒトＢＣＭＡ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーによって確認する。
【０１３１】
ｂ）ＢＣＭＡ発現を、フローサイトメトリーによって、３種のヒト骨髄腫細胞株（Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびＵ２６６Ｂ１）で評価した。簡潔には、細胞を採取し、洗浄し、生存率を計数し、９６ウェル丸底プレートの１ウェルあたり５００００細胞で再懸濁し、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，  ＃ａｂ５４８３４，  マウスＩｇＧ１）とともに３０分間、４℃においてインキュベートした（インターナリゼーションを妨げるため）。マウスＩｇＧ１をアイソタイプコントロール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＃５５４１２１）として使用した。次いで、細胞を遠心分離（５分間、３５０×ｇで）し、２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化抗マウス二次抗体とともに３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇで）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスで分析した。図４は、Ｈ９２９細胞への漸増濃度の上記抗ＢＣＭＡ抗体の結合の際のメジアン蛍光強度の増大を示す。Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびＵ２６６Ｂ１骨髄腫細胞株の膜表面のＢＣＭＡレセプター数の定量を、ＱＦＩＫＩＴ分析（Ｄａｋｏ，  ＃Ｋ００７８，  製造業者の指示に従う）によって評価した。
【０１３２】
【表２】
2020180158.tif 000009
【０１３３】
（実施例１Ｄ。免疫による抗ＢＣＭＡ抗体の獲得）
抗ＢＣＭＡ抗体を、Ｒｙａｎ，  ２００７  （Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６
（１１）：  ３００９−１８）に記載されるように、ＢＣＭＡ  ＥＣＤでのラットの免疫によって生成する。簡潔には、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン結合体化ＢＣＭＡ  ＥＣＤ（アミノ酸５〜５４；  ＮＰ＿００１１８３）で皮下免疫する。キーホールリンペットヘモシアニン結合体化を、Ｉｍｊｅｃｔ  ｍｃＫＬＨＶ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、リジン残基で行う。ヒトとマウスとの間のＢＣＭＡタンパク質の配列相同性が高いことに起因して、ラットは、抗体生成に好ましい。Ｂ細胞を、免疫した脾臓から回収し、標準的なポリエチレングリコール融合プロトコル（Ｇｏｄｉｎｇ  １９９６；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を使用して、Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８骨髄腫細胞に融合する。ハイブリドーマを、８０％  イスコフ改変ダルベッコ培地（１０％  ｆｅｔａｌ  ｃｌｏｎｅ  Ｉ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１０％  クローニングファクターを補充し、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１×ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン、およびチミジンもまた含む）中で培養する。ＥＬＩＳＡ試験を行って、ＢＣＭＡへのハイブリドーマ培養上清の結合を検出する。陽性ＢＣＭＡ結合ハイブリドーマを、ＢＣＭＡトランスフェクト体（ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞）への細胞ベースの結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。選択したハイブリドーマは、２ラウンドの限界希釈クローニングを受け、精製のためのさらに増殖させられる。さらに、これらの同じ選択されたハイブリドーマ由来の抗体を、標準的な方法によってヒト定常領域を有するキメラ抗体へと変換する。簡潔には、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ハイブリドーマ由来のｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、次いで、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域をそれぞれコードするｃＤＮＡとインフレームで結合させる。これらのｃＤＮＡを、哺乳動物一過性発現ベクターにクローニングし、プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉで生成し、トランスフェクションのために精製する。ＨＥＫ２９３細胞を、ａｒｅ  標準的なトランスフェクション法（リン酸カルシウムベースのトランスフェクション）によってトランスフェクトし、７日間後、ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、続いて、モノマー抗体画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって単離する。
【０１３４】
（実施例１Ｅ。インビトロでの組換えライブラリーからの抗ＢＣＭＡ抗体獲得）
（実施例１Ｅ１。包括的Ｆａｂライブラリーの構築）
Ｆａｂ様式での包括的抗体ライブラリーを、以下のＶドメイン対合を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築する：ＤＰ４７−３ライブラリーについてはＶｋ３＿２０  κ軽鎖とＶＨ３＿２３  重鎖、およびＤＰ８８−３ライブラリーについてはＶｋ１＿１７κ軽鎖とＶＨ１＿６９重鎖。両方のライブラリーを、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）および重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）の中で無作為化し、重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  （ＳＯＥ）
ＰＣＲ）によって１ライブラリーあたり３つのフラグメントからアセンブリする。フラグメント１は、無作為化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、フラグメント２は、Ｌ３からＨ３にわたる中央の定常フラグメントであるのに対して、フラグメント３は、無作為化Ｈ３および抗体遺伝子の３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを、ＤＰ４７−３ライブラリーについてのライブラリーフラグメントを生成するために使用する：フラグメント１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、フラグメント２（ＭＳ６３−ＭＳ６４）、フラグメント３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ＷＯ２０１２０２００３８の表１を参照のこと。以下のプライマーの組み合わせを、ＤＰ８８−３ライブラリーについてのライブラリーフラグメントを生成するために使用する：フラグメント１（ＬＭＢ３−ＲＪＨ＿ＬＩＢ３）、フラグメント２（ＲＪＨ３１−ＲＪＨ３２）およびフラグメント３（ＬＩＢ８８＿２−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ＷＯ２０１２０２００３８の表３および表４を参照のこと。
【０１３５】
ライブラリーフラグメントの生成のためのＰＣＲプロトコルは、以下を含む：９４℃での最初の変性を５分間；９４℃で１分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間を２５サイクル；ならびに７２℃で１０分間の末端伸長。アセンブリＰＣＲのために、等モル比の上記３種のフラグメントを、テンプレートとして使用する。上記アセンブリＰＣＲプロトコルは、以下を含む：９４℃での最初の変性を３分間；ならびに９４℃で３０秒、５８℃で１分、および７２℃で２分を５サイクル。この段階では、フラグメント１〜３の外側の配列に相補的なプライマーが追加され、さらに２０サイクルが行われ、その後、７２℃で１０分間の末端伸長が行われる。全長無作為化Ｆａｂ構築物の十分量のアセンブリ後に、上記Ｆａｂ構築物を、同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒に、ＤＰ４７−３ライブラリーについてはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ、およびＤＰ８８−３ライブラリーについてはＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化する。ＤＰ４７−３ライブラリーについては、２２．８μｇのＦａｂライブラリーを、１６．２μｇのファージミドベクターとライゲーションする。ＤＰ８８−３ライブラリーについては、３０．６μｇのＦａｂライブラリーを、３０．６μｇのファージミドベクターとライゲーションする。
【０１３６】
精製したライゲーションを、最終的なＤＰ４７−３ライブラリーおよびＤＰ８８−３ライブラリーを得るために、それぞれ、ＤＰ４７−３ライブラリーについては６８の形質転換、およびＤＰ８８−３ライブラリーについては６４の形質転換のために使用する。Ｆａｂライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して、抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンの選択のために使用する。
【０１３７】
（実施例１Ｅ２。抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンの選択）
ａ）選択を、ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチンに対して行う。抗原を、発現の際にインビボでビオチン化する。以下のプロトコルに従って、溶液中で選択を行う：（ｉ）０．５時間にわたる総体積１ｍｌ中でのライブラリーＤＰ８８−３の約１０１２  ファージミド粒子および１００ｎＭ  ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチンの結合；（ｉｉ）１０分間にわたる５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加による、ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチンおよび結合したファージの捕捉；（ｉｉｉ）５×１ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５×１ｍｌ  ＰＢＳを使用してのビーズの洗浄；（ｉｖ）１０分間にわたる１ｍＬ  １００ｍＭ  ＴＥＡ（トリエチルアミン）の添加によるファージ粒子の溶離および５００μＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和；ならびに（ｖ）対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での感染およびその後の選択ラウンドで使用される予定のその後のファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０１３８】
１００ｎＭの一定ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチン濃度を使用して、３ラウンドにわたる選択を行う。第２ラウンド目において、抗原：ファージ複合体の捕捉を、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートロアビジンプレートで行う。特異的結合因子を、以下のように用いてＥＬＩＳＡによって同定する：１００μｌの１００ｎＭ  ＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチンを、ニュートロアビジンプレートの各ウェルに被覆する。
【０１３９】
Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、結合しているＦａｂを、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用することによって、それらのＦｌａｇタグによって検出する。いったん同定されたら、抗ＢＣＭＡ  ＥＣＤクローンを、０．５リットル培養体積において細菌で発現させ、アフィニティー精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器を使用してＳＰＲ分析によってさらに特徴付ける。
【０１４０】
ｂ）抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂを、ファージディスプレイによって、種々のＶドメインファミリーに由来するＶＬおよびＶＨ対合からなる合成Ｆａｂライブラリーから樹立した。クローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１４Ｅ１、２９Ｂ１１、および２９Ｆ３を、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３サブライブラリーから、クローン１３Ａ４をＶｋ２Ｄ＿２８／  ＶＨ５＿１サブライブラリーから、およびクローン１３Ａ７をＶｋ２Ｄ＿２８／ＶＨ３＿２３サブライブラリーから、それぞれ生成した（表３）。これらのライブラリーは、もっぱら、ヒトフレームワークと、ＶＬドメイン（３つの異なる長さ）およびＶＨドメイン（６つの異なる長さ）のＣＤＲ３における配列多様性とに基づく。
【０１４１】
【表３】
2020180158.tif 000010
【０１４２】
選択ラウンド（バイオパニング）を、以下のパターンに従って溶液中で行った：１．抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを除去するために、１０μｇ／ｍｌの非関連ヒトＩｇＧで被覆したイムノチューブ中の１ライブラリープールあたり約１０１２  ファージミド粒子の予備清浄（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）、２．総体積２ｍｌ中のＦｃ結合因子のさらなる除去のための、１００ｎＭ  非関連非ビオチン化Ｆｃ  ノブが凹みに入り込む構築物の存在下での０．５時間にわたる非Ｆｃ結合ファージミド粒子と１００ｎＭ  ビオチン化ＢＣＭＡとのインキュベーション、３．振盪機上で２０分間、パニング反応物を、ニュートロアビジンもしくはストレプトアビジンを予め被覆したマイクロタイタープレートの１６ウェルの中に分割および移すことによる、ビオチン化ＢＣＭＡおよび特異的に結合するファージの捕捉、４．プレート洗浄機を使用して、それぞれのウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で１０〜３０回およびＰＢＳで１０〜３０回洗浄、５．天然のリガンドの結合部位を認識し、従って、ＡＰＲＩＬ−非競合ファージ抗体を選択するＦａｂクローンを置き換えるために、２３０ｎＭ  マウスＡＰＲＩＬを添加することによる任意選択の競合洗浄工程、６．５〜１０分間にわたって１ウェルあたり１２５μｌ  １００ｍＭ  ＴＥＡ（トリエチルアミン）を添加することによるファージ粒子の溶離、および等体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４を添加することによる中和、７．溶離したファージ粒子での対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３での感染、３０℃で一晩振盪機上でのインキュベーションおよび次の選択ラウンドに使用される予定のファージミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０１４３】
一定抗原濃度１００ｎＭを使用して、３〜５ラウンドにわたって選択を行った。ヒトＢＣＭＡのみを抗原として使用する選択作戦とは別に、交差反応性抗体を選択するためにカニクイザルもしくはマウスＢＣＭＡもヒトＢＣＭＡと代わる代わるの様式で使用するさらなる選択作戦を行った。さらに、ストレプトアビジンプレートベースの捕捉の代わりとして、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７  ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを、パニング反応物に添加することによって行い、続いて、上記の条件の下でそれぞれの磁石を使用して洗浄工程を行った。
【０１４４】
特異的結合因子を、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサを使用して、Ｆａｂ含有細菌培養上清の表面プラズモン共鳴スクリーニングによって同定した。簡潔には、対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞を溶離したファージ粒子に感染させた後、単一コロニー形成単位（ｃｆｕ）をまき、９６深型ウェルプレート中で１ｍｌ  発現培養物を接種するために拾い上げた。８．０００〜１０．０００  ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  ＃  １０９−００５−００６）で誘導体化したＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＭチップ上で、垂直配向で上清からＦａｂを捕捉した。引き続いて、ヒト、カニクイザルおよびマウスＢＣＭＡ、ならびに非関連Ｆｃ  ノブが凹みに入り込む構築物を、水平配向で分析物として注入した。ＢＣＭＡへの有意な結合応答を示し、抗原のＦｃ部分を結合しなかったクローンを、０．５リットル培養体積において細菌で発現させ、アフィニティー精製し、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサでワンショットキネティクス（ｏｎｅ−ｓｈｏｔ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ）プロトコルを使用して、ＳＰＲ分析によって動力学的に特徴付けた。
【０１４５】
（実施例１Ｆ。ＢＣＭＡ結合アッセイ：表面プラズモン共鳴）
ａ）固定化ＢＣＭＡへのＢＣＭＡ抗体の結合親和性を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で表面プラズモン共鳴測定を行う。レセプターＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ−ＥＣＤ）を、製造業者によって提供されるアミンカップリングプロトコルを使用して、４００共鳴単位のレベルでセンサチップにカップリングする。代替のＢＣＭＡ−ＥＣＤ−ビオチンを、これもまた４００共鳴単位のレベルで、製造業者によって提供される上記プロトコルを使用して、ストレプトアビジン−センサチップにカップリングする。全ての実験において、フローセル１を、参照セルとして使用する。センサグラムを、濃度０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲に及ぶＦａｂ溶液について記録する。非線形回帰分析を使用して、製造業者のソフトウェアを使用して動力学定数および結合定数を同時に計算する。≦１００ｎＭのＢＣＭＡ−ＥＣＤへの一価の結合親和性を有するＦａｂクローンを、標準的な方法によってＩｇＧに変換する。簡潔には、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域をそれぞれコードするｃＤＮＡとインフレームで結合する。これらのｃＤＮＡを、哺乳動物一過性発現ベクターへとクローニングし、プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成し、トランスフェクションのために精製する。ＨＥＫ２９３細胞を、標準的なトランスフェクション法（リン酸カルシウムベースのトランスフェクション）によってトランスフェクトし、７日後に、ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、続いて、モノマー抗体画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって単離する。
【０１４６】
ｂ）抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンのアフィニティー（ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、２５℃において、ニュートロアビジン捕捉によってＮＬＣチップに固定化したビオチン化ヒト、カニクイザルおよびマウスのＢＣＭＡで、表面プラズモン共鳴によって測定した（表４）。非関連ビオチン化Ｆｃ  ノブが凹みに入り込む構築物を、陰性コントロールとして類似の様式で固定化した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  ホスフェート、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０μｇ／ｍｌへと希釈し、次いで、垂直配向で、４０μｌ／分において３００秒にわたって注入した。分析物の注入：ワンショットキネティクス測定のために、注入方向を水平配向に変更し、精製Ｆａｂの連続２倍希釈物（種々の濃度範囲）をチャンネル１〜５を通し、会合時間２００秒もしくは３００秒、および解離時間３００秒を用いて、４０μｌ／分で同時に注入した。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルにそって注入して、基準のための「インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）」ブランクを提供した。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアの単純な１対１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合型モデルを使用して、会合センサグラムおよび解離センサグラムを同時に適合させることによって計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比  ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。流速１００μｌ／分で接触時間１８秒にわたって１０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ
ｐＨ１．５を使用して水平配向で再生を行った。
【０１４７】
【表４】
2020180158.tif 000011
【０１４８】
ｃ）以下のとおりの、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による組換えＢＣＭＡへの抗ＢＣＭＡ抗体の結合の評価。全てのＳＰＲ実験を、２５℃において、ランニング緩衝液としてのＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において行った。抗ＢＣＭＡ抗体と組換えＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）（ヒト、カニクイザルおよびマウス）との間の相互作用のアビディティを決定した。ビオチン化組換えヒト、カニクイザルおよびマウスＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、指示（Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってＳＡチップに直接カップリングした。固定化レベルは、２００〜７００  ＲＵの範囲に及んだ。上記抗ＢＣＭＡ抗体を、２倍濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）において、流速３０μＬ／分で、１２０秒間にわたってフローセルに通過させた。１８０秒間、解離をモニターした。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られる応答を差し引くことによって、較正した。ここで、上記抗ＢＣＭＡ抗体を、標準的なアミンカップリングキットに記載されるように予め活性化し、脱活性化した空の表面に流した。みかけの動力学的定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ，  Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出して、比較目的の相互作用が二価であるが、数値積分によって１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ型結合の速度式を適合させた。
【０１４９】
抗ＢＣＭＡ抗体と組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性もまた、決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ５．０において、標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣＭ５チップに直接カップリングした。固定化レベルは、約６５００  ＲＵであった。抗ＢＣＭＡ抗体を、９０秒間、２５ｎＭで捕捉した。組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、４倍濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）において、流速３０μＬ／分で、１２０秒かけてフローセルを通過させた。１２０秒間、解離をモニターした。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られる応答を差し引くことによって、較正した。ここで、組換えＢＣＭＡを、固定化した抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上に抗ＢＣＭＡ抗体ではなくＨＢＳ−ＥＰを注入した。動力学的定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ，  Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出して、数値積分によって１：１
Ｌａｎｇｍｕｉｒ型結合の速度式を適合させた（表５）。組換えカニクイザルＢＣＭＡ
Ｆｃ（ｋｉｈ）およびマウスＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への８３Ａ１０  抗ＢＣＭＡ抗体の結合もまた、測定した（表６）。
【０１５０】
【表５】
2020180158.tif 000012
【０１５１】
【表６】
2020180158.tif 000013
【０１５２】
（実施例１Ｇ。ＢＣＭＡシグナル伝達アッセイ：ＮＦ−κＢ活性化）
ａ）Ｒｙａｎ，  ２００７  （Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を洗浄し、処理前に、０．２５％  ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中で２４時間インキュベートする。次いで、上記細胞を、処理しないか、または０．１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  熱処理ＨＴ短縮型ＡＰＲＩＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  短縮型ＡＰＲＩＬ、０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  アイソタイプコントロール、もしくは０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  抗ＢＣＭＡ抗体で、２０分間処理する。リガンドブロックを評価するために、２０分間、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体で予備処理した細胞を、１μｇ／ｍＬの短縮型ＡＰＲＩＬで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％  ＮＰ４０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）  化学発光アッセイキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を使用してＮＦ−κＢ活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行う。
【０１５３】
ｂ）簡潔には、Ｈ９２９細胞を、細胞インキュベーター中で、２４時間、３７℃において０．２５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で飢餓にさせる。飢餓時間（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）の最後に、細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、４×１０６細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの３０μｌを、丸底９６ウェルプレートへと１ウェルあたりでさらにアリコートに分け、抗ＢＣＭＡ抗体（１５μｇ／ｍｌもしくは５０μｇ／ｍｌ）もしくはアイソタイプコントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）とともに２０分間、細胞インキュベーター中で予備インキュベートした。次いで、細胞に、４０分間、３７℃でヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化した１μｇ／ｍｌ  組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬを補充した。熱不活化Δ−ＡＰＲＩＬ  （ＨＩ  ＡＰＲＩＬ）を上記アッセイで使用して、Δ−ＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦκＢシグナルの特異性を確認した（熱不活化を、６０℃で１時間のΔ−ＡＰＲＩＬの処理により行った）。インキュベーション時間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、溶解し、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃  ４０４１０）の製造業者のプロトコルに従って処理した。タンパク質抽出物を、ＮＦ−κＢ活性について、ＴｒａｎｓＡｍ（Ｃ）  ＮＦκＢ  ｐ６５  Ｃｈｅｍｉ  Ａｓｓａｙキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃４００９７）を使用して製造業者の指示に従って分析した。発光シグナルを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５ルミノメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。
【０１５４】
（実施例１Ｈ。ＢＣＭＡへの結合において、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦによって影響を受けず、ＢＣＭＡ細胞内ドメインによるシグナル伝達を促進もブロックもしない抗体を選択するための抗ＢＣＭＡ抗体のスクリーニング）
本発明は、１）ヒトＢＣＭＡに結合する、２）ＢＣＭＡへの結合は、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦによって影響を受けない、３）ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化を＞２０％、好ましくは、＞１５％ブロックも低下もさせない、または＞２０％、好ましくは、＞１５％  増大させない、４）ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を、＞２０％、好ましくは、＞１５％ブロックも低下もさせない、または＞２０％、好ましくは、＞１５％増大させない、５）ＡＰＲＩＬもＢＡＦＦもなしでＮＦ−κＢ活性化をそれ自体で誘導させない、抗ヒトＢＣＭＡ抗体の生成に関する。表１０は、所望の新たな特性：非リガンド結合／ブロック、非リガンド競合を有するＢＣＭＡ抗体の選択のためのスクリーニングパラダイムを示す。ＢＣＭＡへの結合がＡＰＲＩＬによってもＢＡＦＦによってもブロックされない抗体を選択する。
【０１５５】
（実施例１Ｈ１。ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞、プレートに結合したＢＣＭＡもしくはＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株上のＢＣＭＡへの結合（フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ））
ａ）固定化アプローチおよび／もしくは上記の組換えインビトロライブラリーのスクリーニングのいずれかに由来する抗ＢＣＭＡ抗体を、フローサイトメトリーによって、ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡへの結合について分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率をトリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２×１０６  細胞／ｍｌへと調節する。この細胞懸濁物のうちの９０μｌを、丸底９６ウェルプレートへと１ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。１０μｌの上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールを、終濃度０．１ｐＭ〜２００ｎＭを得るように、その細胞を含むウェルに添加する。全ての構築物およびコントロールＩｇＧを同じ容量モル濃度で使用する。３０分間、４℃でインキュベートした後、上記細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分間、４℃で１２μｌ／ウェル  蛍光色素結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；  作業溶液：  １：２０）とともにインキュベートする。次いで、細胞を、染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  １２０μｌ／ウェルで洗浄し、３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化する。第２の洗浄工程を、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μｌ／ウェルを使用して行う。上記サンプルを、２００μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、取得および分析する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、抗ＢＣＭＡ抗体濃度の関数としてプロットして、結合曲線を得て最大結合の５０％に達する有効抗体濃度（ＥＣ５０）を計算する。細胞上のＢＣＭＡに結合する抗ＢＣＭＡ抗体は、このアッセイから判定されるように、次のスクリーニング工程、すなわち、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦに対する競合ＢＣＭＡ結合アッセイのために選択される（以下の工程（実施例１Ｈ２））。
【０１５６】
ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡへの結合を示す抗体の特性は、Ｒｙａｎ
ｅｔ  ａｌ．  （２００７）によって記載されるとおりのＥＬＩＳＡ法を使用して確認する。簡潔には、イムノソーブ（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ）９６ウェルプレートを、１．５μｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＢＣＭＡ−ＥＣＤで被覆し、ＰＢＳ＋１％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％  血清アルブミンでブロックする。ＢＣＭＡ被覆プレートを、ハイブリドーマ培養上清とともに２時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ラットＩｇＧとともにインキュベートする。二次抗体とのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン基質とともにインキュベートし、等体積の１ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させる。
【０１５７】
ｂ）抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体（クローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１）を、フローサイトメトリーによって、ＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞上のヒトＢＣＭＡへの結合について分析した。ＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現しないヒト胃腺癌細胞株）を、陰性コントロールとして使用した。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。次いで、生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２×１０６  細胞／ｍｌに調節する。この細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりでさらにアリコートに分け、３０μｌの上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールとともに、３０分間４℃でインキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体（およびアイソタイプコントロール）を力価測定し、０．１〜４０μｇ／ｍｌの間の終濃度範囲で分析した。次いで、細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分間４℃で、蛍光色素結合体化ＰＥ結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ
Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；  １０９−１１６−１７０）とともにインキュベートした。次いで、細胞を、染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌ  ＢＤ固定緩衝液（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して分析した。図５は、抗ＢＣＭＡ抗体濃度の関数でプロットした抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧクローンの平均蛍光強度を示す；（Ａ）Ｈ９２９細胞に対してクローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｂ）ＭＫＮ４５細胞に対してクローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｃ）Ｈ９２９細胞に対してクローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１、（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞に対してクローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１。Ｈ９２９細胞へのクローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０の結合に関するＥＣ５０値（最大結合の５０％に達するために必要とされる抗体濃度を示す）を、表７にまとめる。
【０１５８】
【表７】
2020180158.tif 000014
【０１５９】
（実施例１Ｈ２。ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬは、ヒトＢＣＭＡへのＢＣＭＡ抗体結合を変化させない（フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ））
ａ）上記の工程（実施例１Ｈ１）から選択された抗ＢＣＭＡ抗体を、次いで、フローサイトメトリーによって、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下もしくは非存在下で、ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡへの結合について分析する。生きているＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２×１０６  細胞／ｍｌに調節する。この細胞懸濁物のうちの９０μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。１０μｌの上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールを、その細胞含有ウェルに添加して、終濃度０．１ｐＭ〜２００ｎＭを得る。全ての構築物およびコントロールＩｇＧを、同じ容量モル濃度で使用する。３０分間３７℃でインキュベートした後、１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦそれぞれの存在下および非存在下で、上記細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分間４℃で１２μｌ／ウェル  蛍光色素結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；作業溶液：  １：２０）とともにインキュベートする。次いで、細胞を、染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  １２０μｌ／ウェルで洗浄し、３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化する。第２の洗浄工程を、ＦＡＣＳ染色緩衝液  １５０μｌ／ウェルを使用して行う。上記サンプルを、２００μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬＳＲ
ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、取得および分析する。その平均蛍光強度を抗ＢＣＭＡ抗体濃度の関数としてプロットして、その結合曲線を得て最大結合の５０％に達するための有効抗体濃度（ＥＣ５０）を計算する。１つの結合曲線は、ＡＰＲＩＬの存在下で、もうひとつはその非存在下で行われ、同じことをＢＡＦＦの存在下および非存在下で行う。ＢＣＭＡへの結合が、１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬによって影響を受けず、同様に１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＢＡＦＦによっても影響を受けないそれらの抗体を、以下の次の工程のために選択する。ＢＣＭＡへの結合に関してリガンドＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦと競合しない抗体の代表的結合曲線、ならびにＢＣＭＡへの結合に関してこれらのリガンドと競合する抗体の代表的結合曲線を、図１に示す。
【０１６０】
１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下で、ＨＥＫ２９３−ＢＣＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡへの結合を示す抗体の特性を、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）によって記載されるとおりのＥＬＩＳＡ法を使用して確認する。簡潔には、イムノソーブ９６ウェルプレートを、１．５μｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＢＣＭＡ−ＥＣＤで被覆し、ＰＢＳ＋１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％  血清アルブミンでブロックする。ＢＣＭＡ被覆プレートを、ハイブリドーマ培養上清とともに２時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ラットＩｇＧとともにインキュベートする。二次抗体とのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン基質とともにインキュベートし、等体積の１ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させる。プレートベースのリガンドブロックについては、プレートを、上記のように１μｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＢＣＭＡ−ＥＣＤで被覆する。被覆したプレートを、精製抗体とともに特定の濃度で予めインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、３μｇ／ｍＬの組換えヒトＭｅｇａＡＰＲＩＬ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）もしくは組換えヒトＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともにインキュベートする。ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの結合を、ペルオキシダーゼ結合体化抗ＦＬＡＧ、続いて、上記のように３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンでの発色を使用して検出する。
【０１６１】
ｂ）ＥＬＩＳＡによる非ＡＰＲＩＬ競合抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂもしくは抗体の同定。固定化ヒトＢＣＭＡへのＦａｂの結合を、マウスＡＰＲＩＬの漸増濃度の存在下で評価した。２５ｎＭ  ビオチン化ヒトＢＣＭＡ（１００μｌ／ウェル）を、ニュートロアビジンプレート上に被覆し、振盪機上で、１時間室温でインキュベートした。５００ｎＭもしくは１０００ｎＭの精製Ｆａｂを添加して、上記被覆ヒトＢＣＭＡを１時間室温で飽和させた。上記プレートを、３回ＰＢＳで洗浄し、マウスＡＰＲＩＬを、ＰＢＳ緩衝液中での２倍段階希釈（０〜１００ｎＭの範囲に及ぶ）を使用して、８種の種々の濃度で添加し、振盪機上で３０分間インキュベートした。上記プレートを３回ＰＢＳで洗浄し、抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体（１：４０００）を１時間添加した。再び、上記プレートを３回ＰＢＳで洗浄し、１００μｌ／ウェル  ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによって発色させた。５０μｌ／ウェル  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、そのＯＤを、ＯＤ４５０−６５０の最終的な読み取りのために４５０ｎｍで読み取った（６５０ｎｍの参照）。選択したＦａｂの結果を、図６に示す。５０ｎＭ（１０００ｎｇ／ｍＬ）もしくは６．２５ｎＭ（１４０ｎｇ／ｍＬ）のｍｕＡＰＲＩＬ（マウスＡＰＲＩＬ）の非存在下  対  存在下での抗ＢＣＭＡクローンで測定したＯＤ値の低下（％）を、表８にまとめる。
【０１６２】
【表８】
2020180158.tif 000015
【０１６３】
ｃ）フローサイトメトリーによって検出されるΔ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との間の結果としての競合の評価を、抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１３Ｃ２、１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１）の漸増濃度の存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの結合を定量することによって、Ｈ９２９細胞に対して行った。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１×１０６  細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりでさらにアリコートに分け、３０μｌの上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールとともに３０分間４℃でインキュベートする。全て抗ＢＣＭＡ抗体（およびアイソタイプコントロール）を力価測定し、終濃度１μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌで分析する。次いで、細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化した１μｇ／ｍｌ  組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬとともにさらに３０分間４℃でインキュベートする。次いで、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ緩衝液で１回細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＃Ｈ７４１１）とともに３０分間４℃でインキュベートする。インキュベーション時間の最後に、細胞を、１２０μｌ／ウェル
ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌ  ＢＤ固定緩衝液／ウェル（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、８０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析する。図７は、Ｈ９２９細胞での抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４、１３Ｄ２、１４Ｅ１、１３Ａ７、１４Ｂ１１の漸増濃度の関数で検出されるΔ−ＡＰＲＩＬの相対的メジアン蛍光強度（ＦＩＴＣシグナル）を示す。アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの結合の際のメジアン蛍光強度を、１に設定した；他のシグナルを、それに対して正規化した。
【０１６４】
ｄ）フローサイトメトリーによって検出される抗ＢＣＭＡ抗体とΔ−ＡＰＲＩＬとの競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との間の結果としての競合の評価を、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下もしくは非存在下で抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１３Ａ４、１３Ｃ２、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１７Ａ５、８３Ａ１０）の結合を定量することによって、ＲＰＭＩ細胞に対して行った。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１×１０６  細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりでさらにアリコートに分け、３０μｌの上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールとともに２０分間４℃でインキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体およびアイソタイプコントロールを、終濃度４０μｇ／ｍｌで分析した。次いで、細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化した１μｇ／ｍｌ  組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬとともにさらに４０分間４℃でインキュベートした。次いで、細胞を、１回１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体化抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，  ＃１０９−６０６−００８）とともに３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌ  ＢＤ固定緩衝液／ウェル（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５５４６５５）を使用して４℃で２０分間固定し、８０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。図８は、１０００ｎｇ／ｍＬのΔ−ＡＰＲＩＬの非存在下もしくは存在下で検出されるＲＰＭＩ細胞上での抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４、１３Ｃ７、１３Ｄ２、１４Ｂ１１、１７Ａ５、８３Ａ１０の相対的メジアン蛍光強度（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）を示す。Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下での抗ＢＣＭＡ抗体の結合の際のメジアン蛍光強度を１に設定した；Δ−ＡＰＲＩＬの存在下での抗ＢＣＭＡ抗体に関する他のシグナルを、それに対して正規化した。
【０１６５】
ｅ）フローサイトメトリーによって検出される、同時インキュベーション後の抗ＢＣＭＡ抗体とΔ−ＡＰＲＩＬとの競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との間の結果としての競合の評価を、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下もしくは非存在下で、抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１４Ｂ１１、１３Ｄ２、１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０）の結合を定量することによって、Ｈ２９２細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）に対して行った。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１×１０６  細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートにウェルあたりさらにアリコートに分け、上記抗ＢＣＭＡ抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールの３０μｌおよびヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化したΔ−ＡＰＲＩＬの３０μｌとともに４０分間４℃でインキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体およびアイソタイプコントロールを終濃度２０μｇ／ｍｌで；Δ−ＡＰＲＩＬを終濃度２．５μｇ／ｍｌで分析した。次いで、細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄した。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体化抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，  ＃１０９−６０６−００８）およびＦＩＴＣ結合体化抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＃Ｈ７４１１）とともに３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌ  ＢＤ固定緩衝液／ウェル（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、８０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して分析した。図９Ａは、上記抗ＢＣＭＡ抗体クローンの平均蛍光強度および相対的蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）を示し、図９Ｂは、Δ−ＡＰＲＩＬ（ＦＩＴＣシグナル）および上記抗ＢＣＭＡ抗体クローンの平均蛍光強度および相対的蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）を示す。Δ−ＡＰＲＩＬとＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃ抗体との存在下での抗ＢＣＭＡ抗体の検出を、Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下での抗ＢＣＭＡ抗体クローンのシグナルに対して正規化した。抗ＢＣＭＡ抗体クローンとＡｌｅｘａ．Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体化抗ＨＡ抗体との存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの検出を、アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬシグナルに対して正規化した。蛍光色素結合体化抗ヒトＦｃ抗体で検出されたとおりの、Δ−ＡＰＲＩＬ（２．５μｇ／ｍＬ）の存在下での抗ＢＣＭＡ抗体（２０μｇ／ｍＬ）  クローン１４Ｂ１１、１３Ｄ２、１３Ａ４、１７Ａ５および８３Ａ１０の結合の低下を表９にまとめる。
【０１６６】
【表９】
2020180158.tif 000016
【０１６７】
（実施例１Ｈ３。ＢＣＭＡ抗体は、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックも増大もしない）
ａ）上記の工程（実施例１Ｈ２）において非競合として選択された抗体（すなわち、それらのＢＣＭＡ結合曲線が、１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在によって影響を受けない、および１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＢＡＦＦの存在によっても影響を受けない）を、次いで、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、およびＢＣＭＡ媒介性ＮＦ−κＢ活性化に対する効果に関して工程（実施例１Ｈ３）で試験する。ＡＰＲＩＬはＢＣＭＡに対する高親和性リガンドであるので、ＡＰＲＩＬシグナル伝達に対する抗ＢＣＭＡ抗体のブロック特性もしくはアゴニスト特性を、最初に試験する。Ｒｙａｎ  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように、抗ＢＣＭＡ抗体がＡＰＲＩＬ下流シグナル伝達をブロックするかもしくは増大させるかを確認するために、ＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を洗浄し、無血清ＲＰＭＩ中で２４時間、処理前にインキュベートする。次いで、上記細胞は未処理であるか、または０．１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（陽性コントロールとして使用）、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  熱処理ＨＴ短縮型ＡＰＲＩＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  短縮型ＡＰＲＩＬ、０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  アイソタイプコントロール、あるいは０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  抗ＢＣＭＡ抗体で、２０分間処理する。ＡＰＲＩＬブロックを評価するために、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体もしくはそれぞれのアイソタイプコントロール抗体で２０分間予備処理した細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬの短縮型ＡＰＲＩＬで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％  ＮＰκ０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）化学発光アッセイキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を使用してＮＦ−κＢ活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行う。
【０１６８】
ＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５に由来する化学発光シグナルを検出する機能的ＥＬＩＳＡを使用してアッセイされるので、ＡＰＲＩＬ媒介性下流シグナル伝達およびＮＦ−κＢ活性化を変化させない（すなわち、ＡＰＲＩＬのみで処理したＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞由来の核抽出物中でＥＬＩＳＡによって検出されるその平均発光シグナルは、ＡＰＲＩＬおよび抗ＢＣＭＡ抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ９２９
ＭＭ細胞からの核抽出物のものに対して類似であり、有意に低下も増大もさせない）抗ＢＣＭＡ抗体は、以下の次の工程のために選択される。
【０１６９】
ｂ）抗ＢＣＭＡ抗体の結合がＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦｋＢ活性化（ＢＣＭＡの下流にある公知のシグナル伝達経路）を妨害するかどうかを評価した。簡潔には、Ｈ９２９細胞を、０．２５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で２４時間３７℃において細胞インキュベーター中で飢餓状態にした。飢餓時間の最後に、細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で４×１０６  細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの３０μｌを、丸底９６ウェルプレートにウェルあたりさらにアリコートに分け、抗ＢＣＭＡ抗体（１５μｇ／ｍｌもしくは５０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）とともに２０分間、細胞インキュベーター中で予めインキュベートした。次いで、細胞に、マウスヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化した１μｇ／ｍｌ  組換えΔ−ＡＰＲＩＬを４０分間３７℃で補充した。熱不活化Δ−ＡＰＲＩＬ（ＨＩ  ＡＰＲＩＬ）をアッセイにおいて使用して、Δ−ＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦｋＢシグナルの特異性を確認した（熱不活化を、６０℃で１時間でのΔ−ＡＰＲＩＬの処理によって行った）。インキュベーション時間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、溶解し、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃  ４０４１０）の製造業者のプロトコルに従って処理した。タンパク質抽出物を、ＴｒａｎｓＡｍ（Ｃ）  ＮｆｋＢ  ｐ６５  Ｃｈｅｍｉ  Ａｓｓａｙキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃４００９７）を使用して、製造業者の指示に従ってＮＦ−ｋＢ活性について分析した。発光シグナルを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５ルミノメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。上記のように処理したＨ９２９細胞を使用して得られる相対的発光シグナル強度を測定した。アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの結合の際に得られた発光シグナルを、１に設定した；他のシグナルを、これに対して正規化した。
【０１７０】
（実施例１Ｈ４。ＢＣＭＡ抗体は、ＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックも増大もさせない）
次いで、上記の工程（実施例１Ｈ３）においてＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックしないおよび増大させないとして選択された抗体を、次に、ＢＡＦＦ媒介性ＮＦ−κＢ活性化に対する効果に関して工程（実施例１Ｈ３）で試験する。Ｒｙａｎ  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  ６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように、ＢＣＭＡ抗体が、ＮＦ−κＢ活性化をもたらすＢＡＦＦ下流シグナル伝達をブロックもしくは増大させるかどうかを確認するために、ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞（ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）を洗浄し、Ｒｙａｎ  ２００７（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；
６  （１１）：  ３００９−１８）に記載されるように、無血清ＲＰＭＩ培地中で２４時間、処理前にインキュベートする。次いで、細胞は、処理しないか、または０．１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  熱処理ＨＴ短縮型ＢＡＦＦ、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬ  短縮型ＢＡＦＦ、０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  アイソタイプコントロール、もしくは０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  抗ＢＣＭＡ抗体とともに２０分間処理する。ＢＡＦＦブロックを評価するために、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体もしくはそれぞれのアイソタイプコントロール抗体で２０分間予備処理した細胞を、１μｇ／ｍＬの短縮型ＢＡＦＦで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％  ＮＰ４0、１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）化学発光アッセイキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を使用してＮＦ−κＢ活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行う。ＢＡＦＦ媒介性下流シグナル伝達およびＮＦ−κＢ活性化を変化させない（すなわち、ＢＡＦＦのみで処理したＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞由来の核抽出物における、ＥＬＩＳＡによって検出されるＮＦ−κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５由来の平均発光シグナルは、ＢＡＦＦおよび抗ＢＣＭＡ抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞由来の核抽出物のものに類似であり、有意に低下も増大もしない）抗ＢＣＭＡ抗体を、以下の次の工程のために選択する。
【０１７１】
（実施例１Ｈ５。ＢＣＭＡ抗体は、ＮＦ−κＢ活性化をそれ自体で誘導しない）
ａ）次いで、上記の工程（実施例１Ｈ４）においてＢＡＦＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化をブロックしないおよび増大させないとして選択された抗体を、次に、ＮＦ−κＢ活性化を媒介するそれらの内因性のアゴニスト効果について工程（実施例１Ｈ５）で試験する。ＢＣＭＡ抗体がアゴニスト的であり、それら自体で下流シグナル伝達を誘導するかどうかを確認するために、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を洗浄し、無血清ＲＰＭＩ培地中で２４時間、処理前にインキュベートする。次いで、上記細胞は、未処理であるか、０．１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  アイソタイプコントロールもしくは０．１ｐＭ〜２００ｎＭ  抗ＢＣＭＡ抗体で２０分間処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％  ＮＰ０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、ＮＦ−κＢ活性についてＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）化学発光アッセイキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を使用して分析し、発光シグナル読み取りを、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行う。下流のシグナル伝達およびＮＦ−κＢ活性化を誘導しない（すなわち、抗ＢＣＭＡ抗体のみで処理されたＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞に由来する核抽出物中でＥＬＩＳＡによって検出されるＮＦ−κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５由来の平均発光シグナルは、アイソタイプコントロール抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞に由来する核抽出物のものに類似であり、有意に増大させない）抗ＢＣＭＡ抗体を、さらなる生成ならびにインビトロおよびインビボでの特徴付けのために最終的に選択する。それらは、非リガンドブロック、非競合および非シグナル伝達の抗ＢＣＭＡ抗体を表す（表１０を参照）。
【０１７２】
ｂ）ＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞への抗ＢＣＭＡ抗体の結合がＮＦｋＢ活性化（ＢＣＭＡの下流にある公知のシグナル伝達経路）を誘導するかどうかを評価した。簡潔には、Ｈ９２９細胞を、０．２５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で２４時間３７℃において細胞インキュベーター中で飢餓状態にした。飢餓時間の最後に、細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。生細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で４×１０６  細胞／ｍｌに調節した。この細胞懸濁物のうちの３０μｌを、丸底９６ウェルプレートにウェルあたりさらにアリコートに分け、１００ｎＭもしくは３５０ｎＭ（１４μｇ／ｍｌもしくは５０μｇ／ｍｌ）の抗ＢＣＭＡ抗体３０μｌとともに２０分間、３７℃でインキュベートした。陰性コントロールとして、細胞は未処理のままにしたか、またはその対応するＩｇＧアイソタイプコントロール抗体１００ｎＭ（１４μｇ／ｍｌ）とともに２０分間、３７℃でインキュベートした。陽性コントロールとして、細胞を、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｅｕｒｏｐｅ，  ＃７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ化した１μｇ／ｍｌ  組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬとともに、２０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、溶解し、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃  ４０４１０）の製造業者のプロトコルに従って処理した。タンパク質抽出物を、ＴｒａｎｓＡｍ（Ｃ）  ＮＦｋＢ  ｐ６５  Ｃｈｅｍｉ  Ａｓｓａｙキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，  ＃４００９７）を使用して、製造業者の指示に従ってＮＦｋＢ活性について分析した。発光シグナルを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５ルミノメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。上記のように処理したＨ９２９細胞から得られた相対的発光シグナル強度を測定した。上記アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−ＡＰＲＩＬの結合の際に得られた発光シグナルを、１に設定した；他のシグナルをこれに対して正規化した。
【０１７３】
【表１０】
2020180158.tif 000017
【０１７４】
（実施例２−リガンド（ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）結合をブロックせず、ＢＣＭＡ細胞内ドメインを介するシグナル伝達を促進もブロックもせず、ＢＣＭＡへのその結合が１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬによっても、１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＢＡＦＦによっても影響を受けない、治療用抗ＢＣＭＡ抗体の生成）
上記の工程（実施例１Ｈ５）後に選択した抗体が、組換え抗体ライブラリーからのインビトロ選択に由来する場合、それらは、既に非結合体化ヒトＩｇＧ１抗体である。免疫に由来する、上記の工程（実施例１Ｈ５）後に選択したそれらの抗体は、ラット−ヒトキメラ様式にあり、次いで、好ましくは、それらが治療に適用され得るように、ヒト化される。その場合、標準的な抗体ヒト化方法は、それらのラット可変領域の相補性決定領域をヒト抗体可変領域フレームワークに移すことによって適用される。さらなる変異は、必要であれば、キメラ親抗体と比較して、ＢＣＭＡへの結合を回復させるために、上記可変領域に導入される。
【０１７５】
抗体の生成のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は、抗体の重鎖の発現用、およびもう一方は、抗体の軽鎖の発現用）を、それぞれ１：１の比で共トランスフェクトする。細胞を、１０％  ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培養培地を使用して、Ｔフラスコ中の接着性単層培養物として増殖させ、それらが５０〜８０％の間でコンフルエントになったときにトランスフェクトする。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションのために、ＦＣＳ（最終１０％  Ｖ／Ｖで）、２５０μｇ／ｍｌ  ネオマイシンを補充した１４ｍｌ  ＤＭＥＭ培養培地中でのトランスフェクションの２４時間前に、８００万個の細胞を播種し、３７℃において５％  ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中に一晩おく。トランスフェクトされる予定の各Ｔ７５フラスコに関しては、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２および水の溶液を、軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターとの間で等しく分割した４７μｇ  総プラスミドベクターＤＮＡと、２３５μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を混合し、最終体積４６９μｌになるように水を添加することによって調製する。この溶液に、ｐＨ７．０５の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液を４６９μｌ添加し、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置する。その懸濁物を、２％  ＦＣＳを補充した１２ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ７５に添加する。上記細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベートし、次いで、上記培地を、１２ｍｌ  ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳに交換する。馴化培養培地を、トランスフェクションの５〜７日間後に５分間、１２００ｒｐｍでの遠心分離し、続いて、１０分間、４０００ｒｐｍでの２回目の遠心分離を行って回収し、４℃で維持する。
【０１７６】
その分泌された抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いて、カチオン交換クロマトグラフィーおよびスーパーデックス（登録商標）２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での最後のサイズ排除クロマトグラフィー工程（上記緩衝液をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）に交換し、純粋なモノマーＩｇＧ１画分を集める）によって精製する。抗体濃度を、分光光度計を使用して２８０ｎｍの吸光度から概算する。上記抗体を、２５ｍＭ  リン酸カリウム、１２５ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン溶液（ｐＨ６．７）中に処方した。
【０１７７】
（実施例３−抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の生成）
（実施例３Ａ。抗ＣＤ３抗体の生成）
ＶＨ領域およびＶＬ領域の以下のタンパク質配列を、ＷＯ２００７／０４２２６１に記載されるようにヒトおよびカニクイザル交叉反応性ＣＤ３ε抗体を生成するために使用する。
【０１７８】
Ｈ２Ｃ＿ＶＨ  （配列番号７）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１７９】
Ｈ２Ｃ＿ＶＬ  （配列番号８）
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＳＧＹＹＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＫＦＬＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＲＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０１８０】
簡潔には、上記の配列をコードするオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによって一緒に結合して、抗ＣＤ３抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列をそれぞれコードするｃＤＮＡを合成する。
【０１８１】
（実施例３Ｂ。Ｆｃを有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的１＋１様式の生成）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的因子を、工程（実施例１Ｈ５）の後に選択されるヒトもしくはヒト化抗ＢＣＭＡ抗体のために生成する。実施例２に記載されるように、その対応する抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体の完全重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ、ならびに実施例３Ａに記載される抗ＣＤ３  ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用する。各二重特異的抗体のために、４種のタンパク質鎖が必要とされ、その対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上記の抗ＣＤ３抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ含む。誤って対合した重鎖を有する、例えば、抗ＣＤ３抗体の２つの重鎖を有する副生成物の形成を最小限にするために、変異したヘテロダイマーＦｃ領域が使用され、これは、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２に記載されるように、「ノブが凹みに入り込む変異」および操作されたジスルフィド結合を有する。誤って対合した軽鎖を有する、例えば、抗ＢＣＭＡ抗体の２つの軽鎖を有する副生成物の形成を最小限にするために、ＣＨ１×定常κクロスオーバーが、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２に記載される方法論を使用して、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖に適用される。
【０１８２】
簡潔には、各二重特異的抗体は、以下をそれぞれコードする４種の哺乳動物発現ベクターの同時共トランスフェクションによって生成される：ａ）その対応するＢＣＭＡ抗体の完全軽鎖ｃＤＮＡ、ｂ）ヘテロダイマー抗体を生成するためにＦｃ領域中に「凹変異」（以下の詳細を参照のこと）を有するその対応するＢＣＭＡ抗体の完全重鎖ｃＤＮＡ、ｃ）標準の分子生物学的方法（例えば、スプライス−オーバーラップ−伸長ＰＣＲ）によって生成され、（Ｎ末端からＣ末端の順に）分泌リーダーペプチド、上記の抗ＣＤ３抗体のＶＬおよびＩｇＧ１抗体のヒトＣＨ１ドメインから作られる融合タンパク質をコードする融合ｃＤＮＡ、ならびにｄ）ヘテロダイマー抗体を生成するために、標準の分子生物学的方法（例えば、スプライス−オーバーラップ−伸長ＰＣＲ）によって生成され、（Ｎ末端からＣ末端の順に）分泌リーダーペプチド、上記の抗ＣＤ３抗体のＶＨ、ヒト軽鎖ｃＤＮＡの定常κドメイン、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、およびＦｃ領域中に「ｋｎｏｂ変異」（以下の詳細を参照のこと）を含むヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）から作られる融合タンパク質をコードする融合ｃＤＮＡ。ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１抗体の生成のために上記の方法を使用する哺乳動物細胞の共トランスフェクション、ならびに抗体生成および精製（実施例２を参照のこと）。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域中の「ノブが凹みに入り込む変異」は、以下からなる：Ｔ３６６Ｗ（「ノブ（ｋｎｏｂ）変異」として公知）；ならびにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（まとめて、「凹変異」として公知）。さらに、ジスルフィドを含ませて、安定性および収量、ならびにイオン架橋を形成しヘテロダイマー化収量を増加させる追加の残基を増加させることができる（ＥＰ  １８７０４５９Ａ１）。
【０１８３】
（実施例４−ＢＣＭＡおよびＣＤ３への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の同時結合（表面プラズモン共鳴））
実施例３で生成された二重特異的抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体のＢＣＭＡおよびＣＤ３への結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）  Ｔ１００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）と、ランニング緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ３ｍＭ  ＥＤＴＡ，
０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０，  Ｂｉａｃｏｒｅ）としてＨＢＳ−ＥＰを使用して分析する。このシステムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。それは、リガンド／分析物結合の連続リアルタイムモニタリングを可能とし、従って、種々のアッセイ状況において会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡定数（ＫＤ）の決定を可能にする。ＳＰＲ技術は、金被覆バイオセンサチップの表面の近傍の屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと、溶液中の注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面上での質量変化を示す。分子が上記表面の固定化リガンドに結合すれば、質量は増加し、解離すれば、質量は減少する。
【０１８４】
捕捉抗Ｈｉｓタグ抗体を、ＣＭ５バイオセンサチップの表面に、アミンカップリング化学を使用して固定化する。フローセルを、０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび０．１Ｍ  ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物で流速５μｌ／分において活性化し、抗ヒトＩｇＧ抗体を、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中、１０μｇ／ｍｌで注入する。このことから、約１２０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を生じた。参照コントロールフローセルを、同じように、ただし捕捉抗体の代わりに、ビヒクル緩衝液のみで処理する。表面を、１Ｍ  エタノールアミン／ＨＣｌ  ｐＨ８．５の注入でブロックする。上記抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中に希釈し、流速５μｌ／分で注入する。接触時間（会合相）は、上記抗体に関して、ＢＣＭＡ−ＥＣＤ結合については１〜１００ｎＭの間、およびＣＤ３相互作用については１〜２００ｎＭの間の濃度で、１分間である。ＢＣＭＡ−ＥＣＤを３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭの漸増濃度で、ＣＤ３を０．２１ｎＭ、０．６２ｎＭ、１．８５ｎＭ、５．６ｎＭ、１６．７ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭの濃度で、注入する。接触時間（会合相）は３分であり、解離時間（ランニング緩衝液での洗浄）は、両方の分子に関して流速３０μｌ／分で５分である。全ての相互作用を、２５℃（標準温度）で行う。３Ｍ  塩化マグネシウムの再生溶液を、６０秒間、５μｌ／分の流速で注入して、各結合サイクル後にいかなる非共有結合タンパク質をも除去する。シグナルを、１シグナル／秒の速度で検出する。サンプルを、漸増濃度で注入する。接触時間に対してプロットしたシグナルの速度（すなわち、共鳴単位）を示すＳＰＲグラフを決定する。
【０１８５】
（実施例５−ＭＭ細胞上のＢＣＭＡもしくはＴ細胞上のＣＤ３への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合（フローサイトメトリー））
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞上で発現されるヒトＢＣＭＡもしくはヒト白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ）上で発現されるヒトＣＤ３へのそれらの結合特性に関して分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、トリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２×１０６  細胞／ｍｌに調節する。この細胞懸濁物のうちの９０μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。上記Ｔ細胞二重特異的抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールのうちの１０μｌを、上記細胞含有ウェルに添加して、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの終濃度を得る。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体およびコントロールＩｇＧを、同じ容量モル濃度で使用する。３０分間、４℃でのインキュベーションの後に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェル  ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分間４℃で、１２μｌ／ウェル  蛍光色素結合体化抗Ｈｉｓ抗体（Ｌｕｃｅｒｎａ）とともに、Ｔ細胞二重特異的抗体の検出のためにインキュベートする。次いで、細胞を、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液の添加および３５０×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄する。第２の洗浄工程を、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液で行う。上記サンプルを、２００μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液中で再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得および分析する。ＭＭ細胞およびＴ細胞への上記抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合を評価し、その平均蛍光強度を、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞もしくはＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のいずれかに対してゲーティングをかけて決定し、ヒストグラムもしくはドットプロットでプロットする。
【０１８６】
（実施例６−抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合の際のＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー））
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下もしくは非存在下、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ６９または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を評価することによって、Ｔ細胞活性化を誘導するそれらの能力を分析する。簡潔には、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して細胞生存率を確認する。生存ＭＭ細胞を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で０．２×１０６  細胞／ｍＬに調節し、１ウェルあたりこの細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートの中にピペットで移す。Ｔ細胞二重特異的構築物のうちの５０μｌを、ＭＭ細胞含有ウェルに添加して、終濃度１ｎＭを得る。上記９６ウェルプレートを確保しておき、さらなる操作のときまで、３７℃、５％  ＣＯ２で維持する。
【０１８７】
ＰＢＭＣを、クエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ  ｔｕｂｅｓ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、密度勾配遠心分離法を使用して新鮮な血液から単離する。次いで、全ヒトＴ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造業者の指示に従って単離する。次いで、ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で２×１０６  細胞／ｍｌに調節する。この細胞懸濁物のうちの５０μｌを、既にＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞を含むアッセイプレート中の１ウェルあたりに添加して、最終Ｅ：Ｔ比  ５：１を得る。Ｔ細胞二重特異的構築物がＢＣＭＡ発現ＭＭ腫瘍標的細胞の存在下でのみＴ細胞を活性化し得るかどうかを試験するために、エフェクター細胞あり、しかしＭＭ腫瘍標的細胞はなしで、それぞれの二重特異的分子の０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の終濃度(複数可)を含むウェルもまた、含める。３７℃、５％  ＣＯ２で５日間のインキュベーション後、細胞を、遠心分離（５分間、３５０×ｇ）によってペレット化し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄する。ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９もしくはＣＤ２５に対する選択した蛍光色素結合体化抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での上記エフェクター細胞の表面染色を、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で製造業者のプロトコルに従って遮光して４℃で３０分間行う。細胞を、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、２００μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを補完したＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得および分析する。ＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの発現を、ヒストグラムもしくはドットブロットで表されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団に対してゲーティングをかけた平均蛍光強度を測定することによって決定する。
【０１８８】
（実施例７−抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合の際のＴ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈））
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下もしくは非存在下で、ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して生存率について調べる。生存ＭＭ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で０．２×１０６  細胞／ｍｌに調節し、この細胞懸濁物のうちの１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたりピペットで移す。Ｔ細胞二重特異的構築物のうちの５０μｌを、ＭＭ細胞含有ウェルに添加して、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の終濃度(複数可)を得る。上記ウェルプレートを確保しておき、３７℃、５％  ＣＯ２で維持する。
【０１８９】
ＰＢＭＣを、クエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒｔａｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ  ｔｕｂｅｓ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、密度勾配遠心分離法を使用して新鮮な血液から単離する。次いで、全ヒトＴ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造業者の指示に従って単離する。次いで、上記全Ｔ細胞を、血清なしの予め加温したＲＰＭＩ（３７℃）中で１ｍｌあたり１００万個の細胞に調節し、遮光して、１μＭ  ＣＦＳＥで室温において６分間染色する。次いで、染色体積を、１０％  ＦＣＳおよび１％  ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地を添加することによって倍量にして、ＣＦＳＥ染色を停止する。室温でさらに２０分間のインキュベーションの後、上記細胞を、予め加温した血清含有培地で３回洗浄して、残留ＣＦＳＥを除去する。次いで、ＣＦＳＥ染色した全Ｔ細胞（エフェクター）を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で２×１０６  細胞／ｍＬへと調節する。この細胞懸濁物のうちの５０μｌを、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞を既に含むアッセイプレート中の１ウェルあたりに添加して、最終Ｅ：Ｔ比  ５：１を得る。Ｔ細胞二重特異的構築物がＢＣＭＡ発現ＭＭ腫瘍標的細胞の存在下でのみＴ細胞を活性化し得るかどうかを試験するために、エフェクター細胞ありだが、ＭＭ腫瘍標的細胞なしの１ｎＭの上記Ｔ細胞二重特異的抗体を含むウェルもまた、含める。３７℃、５％  ＣＯ２で５日間のインキュベーションの後に、遠心分離（５分間、３５０×ｇ）によって細胞をペレット化し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄する。ヒトＣＤ４、ＣＤ８もしくはＣＤ２５に対する選択した蛍光色素結合体化抗体（ＢＤ）での上記エフェクター細胞の表面染色を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で製造業者のプロトコルに従って、遮光して４℃で３０分間行う。細胞を、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、２００μｌ／ウェル
ＦＡＣＳ染色緩衝液中で再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ）を補完したＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用して取得および分析する。非増殖細胞のパーセンテージを、ウェルがＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞およびＣＦＳＥ染色Ｔ細胞を含むが、Ｔ細胞二重特異的抗体なしの群において一番右の非希釈ＣＦＳＥピークでゲーティングをかけることによって決定し、他の実験群（ウェル）のものと比較する。増殖細胞のパーセンテージを、最も右のピーク（観察可能であれば）を除く全てのその希釈ＣＦＳＥピークをゲーティング、することによって測定する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖レベルを、その集団で最初にゲーティングをかけ、次にＣＦＳＥ希釈ピークをさらに調べることによって決定する。
【０１９０】
（実施例８−抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合の際の活性化したＴ細胞からのサイトカイン生成）
（実施例８Ａ。インターフェロン−γ生成）
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体もまた、ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下もしくは非存在下でＴ細胞によってインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）生成を誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して生存率について調べる。１ウェルあたり約２０，０００個の生細胞を丸底９６ウェルプレートにまき、それぞれの抗体希釈物を添加して、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の終濃度(複数可)を得る。同じ容量モル濃度に調節した抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧおよび抗ＣＤ３  ＩｇＧを、コントロールとして使用する。ヒト全Ｔエフェクター細胞を添加して、最終Ｅ：Ｔ比  ５：１を得る。３７℃、５％  ＣＯ２で２０時間のインキュベーションの後、上清中のヒトＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡによって、製造業者の指示（ヒトＩＦＮ−γ
ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って測定する。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体およびＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下でのＴ細胞によって生成されたＩＦＮ−γのレベルを測定し、ヒストグラムにプロットし、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の存在下であるが、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞なしでのＴ細胞によって生成されたものと比較する。
【０１９１】
（実施例８Ｂ。サイトカイン放出アッセイ（ＣＢＡ分析））
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下もしくは非存在下でＴ細胞媒介性サイトカイン生成を誘導するそれらの能力について分析する。ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離法を使用し、クエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ  ｔｕｂｅｓ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して新鮮な血液から単離し、最終細胞濃度３０万個の細胞／ウェルを、丸底９６ウェルプレートにまく。次いで、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９
ＭＭ細胞を添加して、最終Ｅ：Ｔ比  １０：１を得、同様に、Ｔ細胞二重特異的構築物およびＩｇＧコントロールを添加して、３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間にわたって、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の終濃度(複数可)を得る。翌日、上記細胞を、５分間、３５０×ｇで遠心分離し、その上清を、新たな深型ウェルの９６ウェルプレートへとさらなる分析のために移す。ＣＢＡ分析を、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターのための製造業者の指示に従って、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−１０、ヒトＴＮＦ−α、およびヒトＩＦＮ−γを含むＨｕｍａｎ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行う。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体およびＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在下でＴ細胞によって生成されるサイトカインのレベルを測定し、ヒストグラムにプロットし、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の存在下であるが、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞なしでＴ細胞によって生成されるものと比較する。
【０１９２】
（実施例９−Ｔ細胞上のＣＤ３およびＭＭ細胞上のＢＣＭＡへの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３
Ｔ細胞二重特異的抗体の架橋の際のＭＭ細胞のＴ細胞による再指向された細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ））
実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合による上記構築物の架橋の際に、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ヒトＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液で回収し、１０％  ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中で洗浄および再懸濁する。約３０，０００個の細胞／ウェルを、丸底９６ウェルプレートにまき、上記構築物の各々の希釈物を、所望の終濃度；０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の終濃度のために添加する（三連で）。適切な比較のために、全Ｔ細胞二重特異的構築物およびコントロールを、同じ容量モル濃度に調節する。ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）をウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比  ５：１を得る。ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される場合、最終Ｅ：Ｔ比  １０：１が使用される。ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）は、１μｇ／ｍｌの濃度でヒトＴ細胞活性化の陽性コントロールとして使用される。陰性コントロール群は、エフェクターもしくは標的細胞のみによって表される。正規化のために、ＮＣＩ−Ｈ９２９
ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、標的細胞と終濃度１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とをインキュベートし細胞死を誘導することによって決定する。最小溶解（＝０％）は、標的細胞と、エフェクター細胞のみとを、すなわち、いかなるＴ細胞二重特異的抗体もなしで共インキュベートすることによって表す。３７℃、５％  ＣＯ２での２０時間のインキュベーションの後、次いで、アポトーシス／壊死ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、製造業者の指示に従って測定する。ＬＤＨ放出のパーセンテージを、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の濃度に対してプロットする。そのＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、ＬＤＨ放出の５０％を生じるＴ細胞二重特異的抗体濃度として決定する。
【０１９３】
（実施例１０−ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の死滅化能力に対する非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体  対  リガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的因子の比較
ある特定の組織学的悪性疾患（例えば、多発性骨髄腫）において、循環するＢＣＭＡ−リガンドＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのレベルは、上昇し得る（Ｍｏｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４；  Ｂｌｏｏｄ  １０３（８）：  ３１４８−３１５７）。従って、本発明者らは、血清中の高レベルのリガンドが腫瘍細胞上のＢＣＭＡへの抗ＢＣＭＡ抗体の結合を妨害し得ることを認識している。健康なドナーとの比較において、ＭＭ患者における循環するＡＰＲＩＬ（ＢＣＭＡに対する高親和性リガンド）のレベルは、約１０ｎｇ／ｍＬに対して約１００ｎｇ／ｍＬである。ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡに対する低親和性リガンド）に関しては、そのレベルは、健康なドナーの約３ｎｇ／ｍＬと比較して、１〜１０００ｎｇ／ｍＬで変動し得る。上記腫瘍細胞の近くでは、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ濃度は、血清中で測定されるよりさらにかなり高い可能性がある。ある特定の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）では、循環するＡＰＲＩＬのレベルも同様に高く、約８５ｎｇ／ｍＬである（Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６４：  １０６５−１０６７）。
【０１９４】
非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体を含む、実施例３で生成した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体をまた、高濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）のＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下での細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合による上記構築物の架橋の際に、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力について、同じ様式のリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体を含む抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体と比較して分析する。
【０１９５】
図１に示されるように、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦは、プレートに結合したＢＣＭＡへの非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体の結合を変化させない（実線）。対照的に、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する高濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦは、プレートに結合したＢＣＭＡへのリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体の結合を低下させる（破線）。
【０１９６】
図２に示されるように、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦは、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞に対して特異的な非リガンドブロック／非競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的抗体の死滅化効力を変化させない（実線）。対照的に、多発性骨髄腫患者の血中および骨髄中で見出されるレベルを代表する高濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦは、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞に対して特異的なリガンドブロック／競合抗ＢＣＭＡ抗体を含むＴ細胞二重特異的抗体の死滅化効力を低下させる（破線）。
【０１９７】
（実施例１０Ａ。１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下での非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体での、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合特性（フローサイトメトリー））
実施例３で生成した非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体を、フローサイトメトリーによって、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下で、ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞上で発現されるヒトＢＣＭＡへのそれらの結合特性について分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、トリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２×１０６  細胞／ｍｌに調節する。この細胞懸濁物のうちの９０μｌを、丸底９６ウェルプレートにウェルあたりさらにアリコートに分ける。上記Ｔ細胞二重特異的抗体もしくは対応するＩｇＧコントロールのうちの１０μｌを上記細胞含有ウェルに添加して、好ましくは、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲に及ぶ終濃度を得る。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体およびコントロールＩｇＧを、同じ容量モル濃度で使用する。
３０分間４℃でのインキュベーションの後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェルのＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分間４℃で、１２μｌ／ウェル  蛍光色素結合体化抗Ｈｉｓ抗体（Ｌｕｃｅｒｎａ）とともにＴ細胞二重特異的抗体の検出のためにインキュベートする。次いで、細胞を、１２０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液の添加および３５０×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄する。第２の洗浄工程を、１５０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液で行う。上記サンプルを２００μｌ／ウェル  ＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得および分析する。ＭＭ細胞およびＴ細胞への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合を評価し、その平均蛍光強度を、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞でゲーティングをかけて決定し、ヒストグラムもしくはドットプロットでプロットする。次いで、ＭＭ細胞への、非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合（例えば、ＭＦＩ）を、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下でリガンド結合／ブロック、競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の結合と比較する。
【０１９８】
（実施例１０Ｂ。１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下での非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の死滅化特性：ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞のＴ細胞による再指向された細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ））
実施例３で生成した非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体を、漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）のＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下もしくは非存在下で、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合による上記構築物の架橋の際に、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ヒトＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、１０％  ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中で洗浄および再懸濁する。約３０，０００  細胞／ウェルを、丸底９６ウェルプレートにまき、上記Ｔ細胞二重特異的抗体のそれぞれの希釈物を、好ましくは、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度になるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴ細胞二重特異的抗体およびコントロールを、同じ容量モル濃度に調節する。漸増濃度（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ヒト組換えＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦを、上記細胞培養物に添加する。ＡＰＲＩＬの添加もＢＡＦＦの添加もないウェルをまた、コントロールとしてプレートに含める。次いで、ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）を、ウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比  ５：１を得る。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、最終Ｅ：Ｔ比  １０：１を使用する。ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）を、濃度１μｇ／ｍｌでヒトＴ細胞活性化の陽性コントロールとして使用する。陰性コントロール群は、エフェクターもしくは標的細胞のみによって表される。正規化のために、ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、細胞死を含め、終濃度１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００との標的細胞のインキュベーションによって決定する。最小溶解（＝０％）を、エフェクター細胞とのみ、すなわち、いかなる構築物も抗体もなしで共インキュベートした標的細胞によって表される。３７℃、５％  ＣＯ２での２０時間のインキュベーションの後、次いで、アポトーシス／壊死ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、製造業者の指示に従って測定する。ＬＤＨ放出のパーセンテージを、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の濃度(複数可)の存在下で、好ましくは、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの濃度範囲で、ＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの濃度に対してプロットする。次いで、そのＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定する。次いで、非リガンド結合／ブロック、非競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体のＩＣ５０値を、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦの存在下で、リガンド結合／ブロック、競合抗ＢＣＭＡ抗体を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体のものと比較する。
【０１９９】
（実施例１１−Ｖｋ＊ＭＹＣ  多発性骨髄腫マウスモデルにおける抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の治療有効性の評価）
マウス交叉反応性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体を、Ｃｈｅｓｉ，  ２０１２（Ｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；  Ｂｌｏｏｄ  １２０：  ３７６−３８５）に記載されるように、Ｖｋ＊ＭＹＣ  多発性骨髄腫になりやすいマウスにおいて多発性骨髄腫を防止するそれらの能力について試験する。多発性骨髄腫は、骨髄中の形質細胞の制御されない増大を伴う血液悪性疾患である。ＢＣＭＡは、悪性形質細胞上で強く発現されるので、本発明者らは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的因子が多発性骨髄腫の処置に効果的であると仮定する。上記Ｖｋ＊ＭＹＣ  多発性骨髄腫マウスモデルは、ヒト骨髄腫をよく表し、クリニックにおいて使用される薬物応答の予測となり；抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の前臨床的概念実証を試験するための優れたツールの代表である。簡潔には、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ａｒｉｚｏｎａでの学術的協同研究から得られたＶｋ＊ＭＹＣマウスを、ヒトＣＤ３εトランスジェニック（ｈｕＣＤ３ε  Ｔｇ）マウスと交配する。ｈｕＣＤ３ε  Ｔｇ×Ｖｋ＊ＭＹＣマウス由来のＴ細胞は、ヒトＣＤ３εおよびマウスＣＤ３εの両方をその細胞表面に発現するので、上記マウスは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的因子に応答性である。Ｖｋ＊ＭＹＣマウスは、約３０週齢で開始する単クローン性高ガンマグロブリン血症を一律に発症し、これは、ヒト骨髄腫の代表的な臨床徴候（例えば、貧血、骨粗鬆症および腎疾患）を伴って、時間を経てゆっくりと進行する。マウスの尾の掠り傷を付けて定期的に採血し、血液をＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に集め、室温で凝固させ、次いで、１０分間、２，３００ｇで遠心分離する。血清を生理食塩緩衝液中で１：２希釈し、プレキャストＱｕｉｃｋＧｅｌｓ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して製造業者の指示に従ってＱｕｉｃｋＧｅｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ装置で分析する。ガンマグロブリン（ｇａｍｍａ）／アルブミン比および血清画分を、デンシトメトリー分析によって測定する。
【０２００】
治療研究のために、Ｖｋ＊ＭＹＣマウスを登録し、種々の処置群に無作為化する（ｎ＝５〜８／群）：例えば、１）コントロールＩｇＧ；２）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体；５００μｇ／ｋｇ／週もしくは１０μｇ／マウス／週を尾静脈から静脈内投与する；３）標準ケアとして使用される１日目、４日目、８日目、１１日目にボルテゾミブ  １ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．。好ましくは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の用量(複数可)は、複数であり得、２００〜１０００μｇ／ｋｇ／週の範囲に及び得る。各群において、少なくとも３歳の（＞１歳）Ｖｋ＊ＭＹＣマウスは、０．３〜２．０の間のガンマグロブリン／アルブミン比（デンシトメトリーによって測定される場合、約１０〜７０ｇ／ｌの間の顕著なＭスパイクに対応する）を有する。血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥＰ）を、０日目と処置後１４日目に行って、クリニックで行われるように、腫瘍応答のマーカーとしてのＭスパイクにおける処置媒介性低下を測定する。いくつかの治療研究では、Ｍスパイク  約１０〜７０ｇ／ｌおよび５％を超える骨髄形質細胞増加症を有する移植Ｖｋ＊ＭＹＣマウスを登録し、種々の処置群に割り当てる。Ｍスパイクを低下させる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の有効性を、評価する。
【０２０１】
（実施例１２−全身性エリテマトーデスの、ＮＺＢ／Ｗ狼瘡になりやすいマウスモデルにおける治療有効性の評価）
マウス交叉反応性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体を、ＮＺＢ／Ｗ  ｐｒｏｎｅマウス（十分に特徴付けられたモデル（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４（９）：  ４７８９−４８００））において全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を防止するそれらの能力について試験する。自己反応性形質細胞がＳＬＥにおいて重要な役割を果たし、自己反応性形質細胞の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的因子での枯渇が、ＳＬＥ患者に有益であり得ることを示唆する証拠が蓄積しつつある。簡潔には、ＮＺＢおよびＮＺＷマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ｈｕＣＤ３ε  Ｔｇマウスと交配する。次いで、ＮＺＢ×ｈｕＣＤ３ε  ＴｇマウスおよびＮＺＷ×ｈｕＣＤ３ε  Ｔｇマウスを、互いと交配し、雌性ｈｕＣＤ３ε
Ｔｇ×ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスを、将来的な研究のために選択する。マウスを、Ａｌｂｕｓｔｉｘ試薬ストリップ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）で隔週にタンパク尿について半定量的に試験し、タンパク質濃度（０〜≧２０ｇ／ｌまで）に従って０〜４までのスケールでスコア付けする。７〜８ヶ月齢のｈｕＣＤ３ε  Ｔｇ×ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１雌性マウスを、治療研究に登録し、種々の処置群に無作為化する（ｎ＝１６／群）：  例えば、１）コントロールＩｇＧ；２）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体；  ５００μｇ／ｋｇ／週もしくは１０μｇ／マウス／週が尾静脈を介して静脈内投与される；３）標準ケアとして使用される抗ＢＡＦＦ  ２０ｍｇ／ｋｇ／週。好ましくは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異的抗体の用量(複数可)は、複数であり得、２００〜１０００μｇ／ｋｇ／週の範囲に及び得る。上記治療研究の開始時のベースラインタンパク質レベルは、３０〜３００ｍｇ／ｄＬである。
【０２０２】
ＳＬＥの代表的な臨床エンドポイントは、タンパク尿、腎疾患および糸球体腎炎、糸球体の細胞充実性およびサイズの増大などの徴候、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）陽性沈着物、ＥＬＩＳＡによって測定される場合、ｄｓＤＮＡ、総ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの血清中の自己抗体の出現からなる。
【図１】
2020180158.tif 000018
【図２】
2020180158.tif 000019
【図３】
2020180158.tif 000020
【図４】
2020180158.tif 000021
【図５】
2020180158.tif 000022
【図６】
2020180158.tif 000023
【図７】
2020180158.tif 000024
【図８】
2020180158.tif 000025
【図９】
2020180158.tif 000026
【配列表】
2020180158000001.app
【外国語明細書】
2020180158000001.pdf