(57)【要約】【課題】本発明は、植物を生産している現場で簡便にトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を検査する方法を提供することを課題とする。また本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体を用いて免疫反応を行うイムノクロマトグラフィーを用いた検出方法において、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出する方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法により上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法。
【請求項２】
請求項１に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用である、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、請求項２に記載の抗体混合物。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体又は配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、請求項２又は３に記載の抗体混合物。
【請求項５】
検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出するための抽出液であって、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記抽出液。
【請求項６】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される、請求項５に記載の抽出液。
【請求項７】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））であり、その濃度が０．０１５〜１．５（ｗ／ｖ）％である、請求項６に記載の抽出液。
【請求項８】
前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、その濃度が０．００２〜０．１５（ｗ／ｖ）％である、請求項６に記載の抽出液。
【請求項９】
クエン酸ナトリウムの濃度が７.５〜１５０ｍＭである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抽出液。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の抽出液を使用することを特徴とする、検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する方法。
【請求項１１】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と請求項５〜９のいずれか１項に記載の抽出液とを含むことを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キット。
【請求項１２】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第１抗体混合物、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第２抗体混合物、及び膜担体を備え、
前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項１３】
前記第１抗体混合物及び第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列及びその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、請求項１２に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項１４】
前記第１抗体混合物及び前記第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、請求項１２に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項１５】
前記標識物質が金属コロイド粒子である、請求項１２に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項１６】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、請求項１５に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に関する。より詳細には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用抗体混合物、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出するための抽出液等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体は、昆虫、接触、土壌あるいは接ぎ木などを介して広く植物間に伝搬し増殖する。トマト黄化葉巻病は、ウイルスが原因の病気で、トマトなどによく発生する。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物を吸汁したタバココナジラミは、体内にウイルスを取り込み、他の株を吸汁した際にウイルスを次々に感染させる。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染すると株の上部の成長点付近の新葉が端部から黄淡色に変色し、やがて葉がカールしたように巻いた状態になる。
黄化葉巻病は、ウイルス病であり、感染すると薬剤による治療が出来ない病気である。黄化葉巻病を放置しておくと、発病した部分から先の成長が悪くなって実がならなくなるとともに、伝染源として本病を周囲に広げる恐れがある。黄化葉巻病に発病してからだと防除する方法がないため、感染しないように早期に予防対策を行なうことが重要である。
植物病原体を高感度に検出する方法としては、植物試料から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）やＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等のキットを用いて遺伝子を抽出し、抽出した核酸濃度を測定し、適量を用いて遺伝子検査法（ＰＣＲ）で判定することが行われている。
例えば特許文献１には、トマト黄化葉巻病の早期診断のために、その病原ウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出させる方法として、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法を開示しており、核酸増幅に検出によりトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染の有無を検討できること検出のためのキットなどが開示されている。しかしながら核酸増幅法を用いた検査方法、ＥＬＩＳＡ法による検査方法は、抽出操作や測定操作に機器が必要であり、測定機器を設置する施設が必要である。
植物病原体のより簡便な検出方法として、抗体を用いた免疫学的検出方法が考えられるが、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）が分類されるジェミニウイルスに対するポリクローナル抗体は一般に力価、特異性共に低いとされ、免疫学的検出方法による高感度な検出は難しいとされてきた。非特許文献１には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の血清学的手法による検出技術を確立するために、大腸菌内で組換え発現させたウイルスのコートタンパク質（ＣＰ）を抗原としてウサギを免疫し作製した抗血清から精製した抗ＴＹＬＣＶ−ＣＰ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で検討したところ、純化ウイルス及びＴＹＬＣＶ罹病トマト葉磨砕液に対し特異的な陽性反応が認められたことが開示されている。
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法による検査方法についても測定操作に機器が必要であり、測定機器を設置する施設が必要である。
よって従前の方法では植物を生産している現場（農場等）で検査することは難しく、植物を生産している現場での検査を簡便に行なうことが可能な方法としてイムノクロマトグラフィーによる検出方法が求められていた。このような検出方法として非特許文献２には迅速免疫濾紙検定法（ｒａｐｉｄ  ｉｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ａｓｓａｙ、以下ＲＩＰＡと称する）によるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染の診断が開示されている。ＲＩＰＡの試験デバイスはガラスファイバーに抗体が固定されている単純な構造であり製造が容易ではあるものの、測定試料中の夾雑物等がそのまま展開し非特異的反応が起こりやすくなる、また夾雑物による目詰まりが発生しやすいという問題があった。また目詰まりを防ぐために測定試料を希釈する必要があること、また測定試料に標識抗体を添加してから展開するために測定試料が希釈されてしまうことなどから測定試料中のウイルス濃度が低いと測定できないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２１５５２０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】上田重文、石井貴明、花田薫、岩波徹「大腸菌発現蛋白質抗血清を用いたトマト黄化葉巻ウイルスの検出」２００３年、九州病害虫研究会報、４９号、４１-４４頁
【非特許文献２】大崎秀樹、野見山孝司、石川浩一「血清学的手法のトマト黄化葉巻病の診断への適用」２０１１年、近畿中国四国農業研究センター研究報告、第１０号ｐ．１３−２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物を生産している現場で簡便にトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を検査する方法を提供する。また本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体を用いて免疫反応を行うイムノクロマトグラフィーを用いた検出方法において、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法によって、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出することが出来ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法。
［２］前記［１］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用である、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物。
［３］配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、前記［２］に記載の抗体混合物。
［４］配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体又は配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、前記［２］又は［３］に記載の抗体混合物。
［５］検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出するための抽出液であって、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記抽出液。
［６］前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される、前記［５］に記載の抽出液。
［７］前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））であり、その濃度が０．０１５〜１．５（ｗ／ｖ）％である、前記［６］に記載の抽出液。
［８］前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、その濃度が０．００２〜０．１５（ｗ／ｖ）％である、前記［５］に記載の抽出液。
［９］クエン酸ナトリウムの濃度が７.５〜１５０ｍＭである、前記［５］〜［８］のいずれか１項に記載の抽出液。
［１０］前記［５］〜［９］のいずれか１項に記載の抽出液を使用することを特徴とする、検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する方法。
［１１］前記［２］〜［４］のいずれか１項に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と前記［５］〜［９］のいずれか１項に記載の抽出液とを含むことを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キット。
［１２］トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第１抗体混合物、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第２抗体混合物、及び膜担体を備え、
前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１３］前記第１抗体混合物及び第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列及びその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１４］前記第１抗体混合物及び前記第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１５］前記標識物質が金属コロイド粒子である、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１６］前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、前記［１５］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出する方法及びイムノクロマトキットを提供することができる。
また本発明の抽出液によれば抽出液によりトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の高感度抽出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】５種類の組換えコートタンパク質（ＣＰ）の領域
【図２】イムノクロマトグラフィー用テストストリップの側面模式構成図
【図３】イムノクロマトグラフィー用テストストリップのテストライン（Ｂ１）及びコントロールライン（Ｂ２）の位置
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、検体からクエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に関する。
【００１１】
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）]
植物ウイルスは、基本的に遺伝子本体である核酸成分と、その周りを取り囲んで核酸を保護するタンパク質のみから構成されている。植物ウイルスに含まれる核酸成分は、ウイルス種によって決まっており、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）はＤＮＡを持つウイルスで、ベゴモウイルス属ジェミニウイルス科に属する。このウイルスの形は、双子のように２個結合した球形ウイルスである。
植物ウイルスは、自らが増殖できる植物に感染すると、ウイルス核酸を自分のタンパク質合成のための鋳型にさせ、植物に優先的にウイルスに必要なウイルスタンパク質、特にコートタンパク質（ＣＰ）を大量に合成させる。一方で、植物に合成させたウイルス複製酵素によってウイルス核酸を次々と作らせる。こうして感染植物体内で複製されたウイルス核酸とコートタンパク質（ＣＰ）が、植物細胞内で集合してウイルス粒子が形成される。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）は分子量３０ｋＤａの外被タンパク質である。このコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の働きは、内部の特に複製酵素遺伝子核酸を外界から守るばかりでなく、種々の機能を担っており、病徴決定機能、遠距離以降機能、非伝播機能などをあわせ持っている。また、植物ウイルスの大きな特徴としてコートタンパク質（ＣＰ）は１種類だけである。
【００１２】
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物]
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体を含む抗体混合物であり、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用である。
【００１３】
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物は、好ましくは、（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む。
【００１４】
本発明の抗体混合物は、より好ましくは、上記（i）〜（v）のうち４種を含み、さらに好ましくは（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含むか又は、(i)配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む。
【００１５】
本発明の抗体混合物は、なお好ましくは、上記（i）〜（v）のすべてを含む、すなわち、（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む。
【００１６】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、例えば、トマト黄化葉巻ウイルス体から抽出したコートタンパク質（ＣＰ）、またはクローニングされたコートタンパク質（ＣＰ）の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製した組換えコートタンパク質（ＣＰ）、又はコートタンパク質（ＣＰ）の一部を構成するペプチドを免疫用抗原として、常法に従って得ることができる。
ポリクローナル抗体の場合は、前記免疫用抗原でウサギやマウスなどの動物を免疫した抗血清から得ることができる。モノクローナル抗体の場合は、マウスなどに免疫した後、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地で選択した後に増殖させて、コートタンパク質（ＣＰ）を利用して、例えば、抗コートタンパク質（ＣＰ）抗体産生株をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１７】
本発明の抗体混合物は、１種以上のモノクローナル抗体及び/又は１種以上のポリクローナル抗体の混合物として調製することもできる。
【００１８】
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体フラグメントおよび改変抗体も含まれる。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の抗体混合物は、必要に応じて標識化される。標識化は常法により行うことができる。標識化に利用する標識物質としては金属コロイド粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、これらの混合物（例えば、金と白金の混合物、金と銀の混合物、パラジウムと白金の混合物）のコロイド粒子）等の有色粒子が挙げられる。金属コロイド粒子の中でも、利用し易い等の理由から、金コロイド粒子が好ましい。
【００２０】
[検体]
本発明において「検体」とは、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染が疑われる植物体の一部、例えば葉、葉柄、茎、花、花弁等から採取した検体であって、被検出対象である別の植物病原体を含む植物体、或いは、植物病原体を含まない植物体を含む可能性がある検体をいう。
【００２１】
[抽出液]
本発明は、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出するための抽出液であって、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記抽出液に関する。
本発明において、抽出液とは、検体から植物病原体あるいは少なくともその一部を抽出する溶液をいう。本発明において「少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する」とはコートタンパク質（ＣＰ）それ自体のみならずコートタンパク質（ＣＰ）を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）あるいはコートタンパク質を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の少なくともその一部を抽出することも含む。
本発明において、エステルエーテル型非イオン界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（ＣＡＳ登録番号９００５−６６−７：Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（ＣＡＳ登録番号９００５−６７−８：Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＣＡＳ登録番号９００５−６５−６：Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＣＡＳ登録番号９００５−７０−３：Ｔｗｅｅｎ８５（登録商標））等が挙げられる。
本発明において、硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、デシル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
本発明の抽出液は好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される界面活性剤を含む。
本発明の抽出液は好ましくは界面活性剤として、０．０１５〜１．５（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは０．１５〜０．４（ｗ／ｖ）％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含む。また本発明の抽出液は界面活性剤として、０．００２〜０．１５（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは０．００７〜０．０１５（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。
なお本発明において界面活性剤は水に難溶性のタンパク質を可溶化し、検体から効率的に抽出するために抽出液に添加される。
また本発明の抽出液は好ましくは７.５〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
本発明の抽出液には、その他の成分として塩類が含まれていても良く、そのような塩類としては、塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含まれるもののほか、水酸化ナトリウムなどのｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
本発明の抽出液のｐＨは、ｐＨ６．５からｐＨ７．５が好ましく、ｐＨ７．０からｐＨ７．２がより好ましい。
【００２２】
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抽出方法]
本発明は、前述の抽出液を使用することを特徴とする、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法を提供する。本発明において「少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する」とはコートタンパク質（ＣＰ）それ自体のみならずコートタンパク質（ＣＰ）を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）あるいはコートタンパク質を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の少なくともその一部を抽出することも含む。
本発明の検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法は、上記抽出液を使用することを特徴とする。本発明の検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法は、上記抽出液を使用すること以外は常法に従って行うことが出来、従来用いられている磨砕、粉砕、乳化、攪拌、振とう、又は煮沸法など適宜の方法を単独又は組み合わせて用いることができる。
例えば検体であるトマトの数枚の葉を凍結乾燥させ、粉末状にしたものに対して抽出液を添加し、磨砕することにより行うことが出来る。一般に植物サンプルの磨砕作業は、乳鉢が広く用いられてきたが、チューブとセットになったディスポーザブルホモジナイザー、ソフトチューブ内にスリット加工されている簡易磨砕容器、ナイロンメッシュを含むポリエチレン製袋等の容器に、抽出液を添加して砕くことによっても行うことができる。
【００２３】
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キット]
本発明はトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と前述の抽出液とを含むことを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットに関する。
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットは、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と上記抽出液を含むことを特徴とする。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットに含まれる抗体混合物は１種又は複数であっても良い。本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットにおいて抗体混合物は、支持体である固相に固定化された第１抗体混合物と標識物質で標識された第２抗体混合物として含まれることが好ましい。本発明の食物アレルゲン検出用キットにはその他、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の標準品、検出用試薬、希釈用緩衝液などを含むことができる。
【００２４】
[イムノクロマトグラフィー]
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用い、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用の試験器具（イムノクロマトグラフィー試験デバイス）を構築することができる。即ち、本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第１抗体混合物、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第２抗体混合物、及び膜担体を備え、前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイスに関する。
【００２５】
本発明のイムノクロマトグラフィー試験デバイスにおいて、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されることを意味する。「保持」とは、担体の中又は表面を移動可能に配置されることを意味する。以下、一例として図２及び図３（具体例であるテストストリップ）を参照して、試験デバイスの構成を説明する。第１抗体混合物は捕捉抗体であり、担体（Ｂ）に固定されて検出部（Ｂ１）を構成する。「検出部」とは、抗原抗体反応によって形成される、検体中の抗原と第２抗体混合物の複合体を捕捉し、抗原の存在を検出する部位をいう。
【００２６】
担体には、タンパク質を結合でき、且つ検体中の成分、抗原−第２抗体混合物の複合体などを展開できる材質のものが用いられる。好ましくは、担体は膜状（膜担体）である。膜担体の材質としてポリエチレン、ナイロン類、セルロース類を挙げることができる。より好ましくはニトロセルロース膜を使用する。担体上には、検出部に加えて、検体が適切に展開されたことを確認するための対照部（Ｂ２）を備えることが好ましい。対照部には、第２抗体混合物に結合可能な物質が固定されている。好ましくは、検出部と対照部は、担体上に、展開方向を横断する方向で線状に設置されることができる（それぞれ「テストライン」及び「コントロールライン」とも称される）。担体上の検出部及び対照部の位置関係は特に限定されないが、一般には、検出部よりも下流側に対照部が形成される。
【００２７】
第１抗体混合物及び第２抗体混合物に結合可能な物質の固定方法は、担体の種類に応じて、常法に従って行うことができる。例えば、適切に希釈した抗体溶液を、抗体塗布機を用いて塗布し、乾燥することで固定することができる。検出部に固定される捕捉抗体の量は、好ましくはテストストリップ１枚当たり０．４〜３μgであり、より好ましくは１〜２μgである。
【００２８】
第２抗体混合物は、標識物質で標識された抗体、即ち「標識抗体」であり、検出部とは離れた位置において担体に保持されている。典型的には、標識抗体を保持する担体は、捕捉抗体を固定化する担体とは別の部材である。第２抗体混合物（標識抗体）を保持している標識抗体保持部材（Ｃ）は、検出部よりも上流側に配置される。標識抗体保持部材は、乾燥状態で標識抗体を保持し、液体で浸潤すると標識抗体を放出する。標識抗体保持部材の材質としては、グラスファイバー、セルロースファイバー、ポリエステルなどが挙げられる。標識抗体保持部材に標識抗体を保持させる方法は常法に従って行うことができることができる。例えば適量の標識抗体を含む緩衝液に標識抗体保持部材を含浸させ、又は適量の標識抗体を含む緩衝液を標識抗体保持部材に滴下した後、乾燥させることにより行うことができる。保持させる標識抗体の量は好ましくはテストストリップ１枚当たり抗体量として５〜２０ｎgであり、より好ましくは５〜１０ｎgである。
【００２９】
検体添加部材は、標識抗体保持部材の上流側に配置され、好ましくは、検体添加部材中の少なくとも下流側領域の下面が、標識抗体保持部材中の上流側の領域の上面と接触している。標識抗体保持部材の一部が、検体添加部材の下面と担体の上流側の領域の上面との間に挟み込まれていることが好ましい。好ましくは、担体の下流に配置される吸収部材（Ｅ）が備えられる。吸収部材は、その上流側領域の下面が、担体の検出部よりも下流側に存在する領域の上面と接触するよう配置される。
【００３０】
本発明の試験デバイスでは、必要に応じて前処理した液体状の検体を検体添加部材（Ｄ）に滴下すると、標識抗体保持部材に浸潤し、検体と標識抗体との混合物が担体に移動し、担体中で検出部に向けて展開する。検体にトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）（抗原）が含まれる場合、当該抗原と標識抗体とが免疫複合体を形成する。そして、検出部において抗原抗体反応によって、当該複合体が捕捉抗体に捕捉され、集積して発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の抗原の有無を判定することが可能となる。担体が対照部を備える場合には、検体中の抗原と複合体を形成せずに残留する標識抗体が検出部を素通りし、下流の対照部に固定された、標識抗体に結合可能な物質に捕捉され、集積して発色する。
【実施例】
【００３１】
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
＜製造例（イムノクロマトグラフィーの作製）＞
１. 組換えタンパク質（トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ））の作製
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：ＴＹＬＣＶ−ＣＰ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ: ＮＰ６５８９９２．１）のアミノ酸配列全長（（ｆ）：１−２５８ａａ、配列番号１）及び全長を５分割（（ａ）：１−６０ａａ、配列番号２、（ｂ）：５１−１１０ａａ、配列番号３、（ｃ）：１０１−１６０ａａ、配列番号４、（ｄ）：１５１−２１０ａａ、配列番号５、（ｅ）：２０１−２５８ａａ、配列番号６）し、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現させるため、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア社）に挿入した。これらのプラスミドを大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換させて導入し、コロニーを単離させた。この大腸菌をＩＰＴＧで発現誘導させて、大量発現しタグ精製した。
組換えコートタンパク質（ＣＰ）の領域範囲を図１に示した。
【００３３】
２．トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体の作製
得られた組換えコートタンパク質全長（ｆ）を免疫抗原とし、３匹のウサギを４回免疫した。抗血清の力価が上昇したことを確認し、各ウサギの血液を回収した。血液から分離した血清から、ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社）を用い抗体を精製し、３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを得た。
【００３４】
３.トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体混合物のコートタンパク質（ＣＰ）上の結合領域の確認
（１）（ａ）から（ｆ）の組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｗａｋｏ社）でアガロースゲル電気泳動し、ウエスタンブロッド機（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）でニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）に転写させた。
（２）トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の全長（組換えタンパク質（ｆ））で免疫した動物から得た３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを（ａ）〜（ｆ）の組換えタンパク質に反応させ、ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）とケミドック（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用し、抗原抗体反応で確認を行なった。
ウエスタンブロットの結果を表１に示した。なお表中、陽性（＋）判定は抗原抗体反応が確認できたもの、陰性（−）判定は抗原抗体反応が確認できなかったものを示す。
【００３５】
【表１】
2020180834.tif 000002
この結果より、ポリクローナル抗体Ａは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に含まれる範囲に結合する抗体を含み、ポリクローナル抗体Ｂは（ａ）、（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）に含まれる範囲に結合する抗体を含み、ポリクローナル抗体Ｃは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に含まれる範囲に結合する抗体を含むことが明らかとなった。
【００３６】
４.トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体混合物の検出限界の検討
（ｆ）の組換えタンパク質をＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に固相化し、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の全長（組換えタンパク質（ｆ））に対する３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを反応させ、マイクロプレートリーダー（日立社）で抗体限界値の測定確認を行なった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の組換え抗原によるコートタンパク質（ＣＰ）抗体混合物の検出限界値を表２に示した。なお、陽性（＋）判定は０．０５０以上、陰性（−）判定は０〜０．０５０未満とした。
【００３７】
【表２】
2020180834.tif 000003
この結果より、ポリクローナル抗体Ａ、ポリクローナル抗体Ｂ、ポリクローナル抗体Ｃのいずれも蛋白質濃度１０ｎｇ/ｍｌまで検出可能であることが明らかとなった。
【００３８】
５．トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトの試験デバイスの作製
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａを使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含む試験デバイスを製造した。本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を図２に示した。
（１）プラスチック製粘着シート（Ａ）に不溶性メンブレン（Ｂ）を貼り、次いで、コンジュゲートパッド（Ｃ）、サンプルパッド（Ｄ）の順に貼り合わせて配置装着し、反対側の端には吸収パッド（Ｅ）を貼り合わせて配置装着した。
（２）コンジュゲートパッドには、金コロイドにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａを感作したコンジュゲート（標識抗体）が含浸されており、不溶性メンブレンには、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａ（固定抗体）を（塗布濃度３．５ｍｇ／ｍＬ、塗布量５０μｌ／分、１０ｍｍ／秒）、およびコントロール試薬（塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量５０μｌ／分、１０ｍｍ／秒）を流れ方向に対して垂直になるように、ライン上に固定化した。
（３）各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置した。
（４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの塗布ラインの位置は、図３に示した通りであり、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体からなるラインをテストライン（Ｂ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（Ｂ２）とした。
（５）更に、５ｍｍ幅に、イムノクロマトカッター（ニップンエンジニアリング社）で切断しイムノクロマトグラフィー用テストストリップを得た。
【００３９】
＜試験例１（従来の植物ウイルス検出用抽出液の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）と、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉を、表４に示す各緩衝液で抽出させ、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）各抽出液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。
結果を表４に示す。
【００４０】
【表３】
2020180834.tif 000004
【００４１】
【表４】
2020180834.tif 000005
*文献中にはＴｒｉｓ・ＨＣｌの濃度とｐＨが記載されていなかったため、試験は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．４)で行なった。
【００４２】
本結果によれば、カンキツ類における植物ウイルスの一種である温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例１ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で偽陽性となった。
植物ウイルスの一種であるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例２では、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で、偽陽性反応が見られた。
カンキツ類における植物ウイルスの一種である温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例３ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した感染葉での反応が弱かった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の抗血清を使用したＥＬＩＳＡによるウイルス診断についての文献に記載された抽出液を用いた参考例１ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差が見られなかった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用の市販のＥＬＩＳＡキットの抽出液を用いた参考例２では、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した感染葉での反応が弱かった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用ｒａｐｉｄ ｉｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｓｓａｙが開示されている文献に記載された抽出液を用いた参考例３ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で、偽陽性反応が見られた。
【００４３】
＜試験例２（抽出液における緩衝液の種類の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）と、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉を、各緩衝液で抽出させ、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む各緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、上記表３の判定基準に従って評価した。
結果を表５に示す。また、表６に高感度に検出することができたクエン酸ナトリウムについての使用濃度による結果を示した。
【００４４】
【表５】
2020180834.tif 000006
本結果によれば、クエン酸ナトリウム液を使用してトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を検出した場合、高感度に検出が可能であった。更に、本結果によれば、至適ｐＨを使用することで、より高感度に検出することが可能であった。
また、トリス系緩衝液は反応せず、反応した場合は偽陽性発色であった。
【００４５】
さらにクエン酸ナトリウムの濃度を１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲で変化させた以外は試験例２の方法に従って同様の検討を行った。結果を表６に示す。
【表６】
2020180834.tif 000007
本結果によれば、１０〜１００ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムを使用してトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を検出した場合に偽陽性がなく高感度に検出可能であった。
またクエン酸ナトリウムの濃度が５００ｍＭ、１０００ｍＭである場合には測定不能であったが、これは高濃度のナトリウムを含有する緩衝液により金コロイド標識抗体が凝集反応を起こし、展開の途中で目詰まりしたためと考えられる。
【００４６】
＜試験例３（抽出液における界面活性剤の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）から、更に高感度にウイルスを抽出させるため、クエン酸ナトリウム緩衝液に各界面活性剤を添加し、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）各界面活性剤を添加した５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。  結果を表７に示す。  また、表８に高感度に検出することができた界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＤＳ）についての使用濃度による結果を示した。
【００４７】
【表７】
2020180834.tif 000008
【００４８】
【表８】
2020180834.tif 000009
本結果によれば、至適濃度を使用することで、高感度に検出が可能であった。
また、ＳＤＳの濃度が２％（ｗ／ｖ），５％（ｗ／ｖ），１０％（ｗ／ｖ）である場合において測定不能であったが、これは溶液の粘性が強くなり、目詰まりを起こし、展開出来なくなったためと考えられる。
【００４９】
＜試験例４（抗体混合物の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）から、更に高感度にウイルスを検出するため、使用する抗体混合物をトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトは、標識抗体、固定抗体として使用する抗体混合物が異なる以外は製造例に従って作製した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉の乾燥葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬを複合体の抗体を用いて作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。
【００５０】
結果を表９に示す。なお使用した各ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ法でトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の組換えコートタンパク質を用いて抗体活性を比較した場合、差は見られなかった。
【００５１】
【表９】
2020180834.tif 000010
【００５２】
本結果によれば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の５つの結合領域にそれぞれに結合する抗体を含むポリクローナル抗体Ａを使用した場合、高感度に検出が可能であった。また、（ｃ）に結合する抗体を含まないポリクローナル抗体Ｂと（ｅ）に結合する抗体を含まないポリクローナル抗体Ｃを合わせると、結合領域を補うことで検出感度を上げることが可能であった。
【００５３】
＜試験例５（検体の部位および交差反応の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花等）を検体とし、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。また、トマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）に感染している植物体に対する反応を検討した。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトは、製造例に従って作製した。なお検体は植物体（葉、茎、花）を採取し、そのままの状態で使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花）、及び、トマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）に感染した植物体（葉、茎）、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）とトマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）の両方に感染した植物体（葉、茎）、ウイルスに感染していない植物体（葉、茎）を採取したままの状態で、滅菌バサミで切断し５０ｍｇずつを秤量したものを添加し磨砕してサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬを複合体の抗体を用いて作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後イムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。結果を表１０に示す。
【００５４】
【表１０】
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【００５５】
本結果によれば、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花）であれば検出が可能であり、別のウイルスに同時感染した植物体であっても検出が可能であった。
また、ウイルス感染のない植物体との偽陽性反応や、別のウイルスに感染した植物体の誤判定の反応は見られなかった。
【符号の説明】
【００５６】
（Ａ）プラスチック製粘着シート
（Ｂ）不溶性メンブレン（担体）
（Ｃ）コンジュゲートパッド（標識抗体保持部材）
（Ｄ）サンプルパッド（検体添加部材）
（Ｅ）吸収パッド（吸収部材）
（Ｂ１）テストライン（検出部）
（Ｂ２）コントロールライン（対照部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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