(57)【要約】      （修正有）【課題】逆構造を有する磁性蛍光性ナノ集合体の提供。【解決手段】蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子とを含む、ナノ集合体およびナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマーを含み、但し、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せを含まない、ナノ集合体システム。蛍光性有機分子分子が下式2020143285.tif 000026であり、磁性ナノ粒子が、γーFe2O3およびFe3O4から選択される超常磁性ナノ粒子である。【選択図】図３
2020143285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ集合体システムであって、
蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと
前記蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む、ナノ集合体および
前記ナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマー
を含み、
但し、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せを含まない、
ナノ集合体システム。
【請求項２】
前記蛍光性有機分子が式Ｉ
【化１】
2020143285.tif 000023
の化合物であり、式中、
Ｌが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【化２】
2020143285.tif 000024
から選択されるスペーサーを表し、
Ｘが、Ｏ、ＣＨ２またはＮＲ８を表し、Ｒ８は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
Ｘ’がＯまたはＮＲ９を表し、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
ｎが、１、２、３および４から選択される整数を表し、
Ｒ１が−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が、それぞれメチル基を表す、
請求項１に記載のナノ集合体システム。
【請求項３】
前記磁性ナノ粒子が、γ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４からなる群より選択される超常磁性ナノ粒子である、請求項１または２に記載のナノ集合体システム。
【請求項４】
２０〜７００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項５】
前記蛍光性内部コアが、１×１０４〜１×１０７個の範囲の多数の有機蛍光性分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項６】
１×１０２〜１×１０６個の範囲の多数の磁性ナノ粒子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項７】
前記ポリマーがイオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項８】
前記ポリマーが式ＩＩ
【化３】
2020143285.tif 000025
のポリマーであり、式中、
ｍが、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し、
ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ独立して、０％〜１００％の範囲のｍの百分率を表し、ｘ＋ｙ＋ｚは１００％のｍに等しく、
Ｘが、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリール、−ＣＯ−アルキル、ポリ（エチレングリコール）、−ポリ（エチレングリコール）−ＯＭｅを表し、Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり、
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体から選択される反応基を表し、
Ｚが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを連結させている反応基の残基をさらに含み、
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、抗生物質、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項９】
前記ポリマーがポリ（アクリル酸）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを製造する工程であって、攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入することと、それに続く前記ポリマーの添加段階とを含む、工程。
【請求項１１】
生物活性基による前記ポリマーの官能基化のその後の段階をさらに含む、請求項１０に記載の工程。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを含む、薬剤。
【請求項１４】
生理的媒質から分子および／または生物学的標的を抽出し検出するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ集合体システムの使用。
【請求項１５】
１〜９のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆構造を有する磁性蛍光性ナノ集合体に関する。特に、本発明のナノ集合体は、有機蛍光性内部コアとその表面の超常磁性ナノ粒子とを含み、コア−シェル構造を生じる。本発明のナノ集合体は、その表面に吸着したポリマーをさらに含み得るものであり、前記ポリマーは任意選択で官能基化されている。本発明はさらに、本発明のナノ集合体を製造する工程に関する。本発明はこのほか、特にマルチモーダルイメージング、マルチモーダルイメージングによるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの診断、ｅｘ  ｖｉｖｏでの検知および／または抽出、ならびに／あるいは治療への本発明のナノ集合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルチモーダルナノ粒子（ＮＰ）は、タンパク質または核酸とサイズがほぼ同じである、体積に対する表面積の比が高いため相互作用が大きい、単一プラットフォーム内で活性単位が相補的に組み合わさる、高活性材料が局在化する、構造的に多様である、低分子に比して血中循環時間が長いなどの特性を有する点で有利である。
【０００３】
蛍光性と磁性とを併せもつバイモーダルナノ粒子の作製は、診断用のデュアルバイオイメージング、遠隔操作による薬物のベクトル化、温熱療法および生物学的実体の選択の可能性を秘めていることから、大いに注目を集めている。蛍光検出は感度が高いことを特徴とするが、磁性を扱うことは、深部組織のイメージングおよび遠隔操作による物質移動の可能性を開くものである。
【０００４】
これまでに作製されている一般的なシステムのほとんどは酸化鉄ナノ粒子（磁性）からなるものであり、有機または無機機能単位（蛍光性）でコーティングされ、比較的毒性が低いことで知られている。これに代わるドープ型またはコア−シェル構造体が発光ランタニドまたは量子ドットを用いて作製されているが、これらの後者の構造体は、周囲環境による発光消光から保護するために予めシリカまたはラテックスの基質に封入する必要がある（ＣｈｅｏｎおよびＬｅｅ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００８，４１，１６３０−１６４０；Ｌｅｅら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１２，４１，２５７５−２５８９；Ｆａｎら，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１２，６，１０６５−１０７３；Ｂｉｇａｌｌら，Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ，２０１２，７，２８２−２９６）。
【０００５】
これらのシステムではいずれも、磁性ナノ粒子が発光団の発光に有害な電子移動効果を及ぼすことが認められており、この効果は、発光団のペイロードが酸化鉄ナノ粒子のものに比して通常少ないことにより助長される。
【０００６】
さらに、これらのナノ粒子には以下のような欠点がある：
−特に生物学的媒質中において、蛍光性分子または磁性ナノ粒子の漏出または分解が起こり、組み合わさった蛍光性と磁性が失われ、性能が低下し、ノイズシグナルが出現する；
−蛍光性／磁性活性単位のペイロードが少なく、高用量の使用を余儀なくされる；
−個々の有機蛍光性分子の場合、光退色量が多くなる；
−生物学的周辺に対する蛍光感度が高く、発光消光または色ずれを起こす可能性がある；
−サイズの識別がしにくく、臓器および／または悪性細胞の非特異的標的化が生じる；
−生物学的媒質中での半減期が短い、特に血中循環時間が短いため、静脈内注射後材料が迅速に除去される；
−官能基化により生物学標的化および生物作用の点で強い付加価値がもたらされるが、ナノ粒子表面をさらに官能基化するのが困難である。
【０００７】
これらの問題点に対処するために、磁性ナノ粒子で取り囲まれた有機発光プラットフォーム（蛍光性）に基づくコア−シェル構造体がこれまで提案されたことがなかったのは驚くべきことである。
【０００８】
したがって、本発明は、磁性ナノ粒子で取り囲まれた無基質の有機蛍光性コアを含む、ナノ集合体に関する。得られる本発明のナノ集合体の逆構造は「ラズベリー様」の配置に似たものとなる（図１）（Ｆａｕｃｏｎら，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃ．，２０１３，１，３８７９−３８８６）。以降、このような逆構造を「ｆｌｕｏ＠ｍａｇ」ナノ集合体または「蛍光性磁性ナノ集合体」と呼ぶ。
【０００９】
本出願者は、このような逆構造により、埋め込まれた蛍光性分子が媒質のｐＨまたはイオンに非感受性となる高密度の発光コアが得られ、通常の光観察条件下で安定な蛍光シグナルが得られることを明らかにした。さらに、磁性ナノ粒子と蛍光性コアとが効果的に分離されていることから、有害な電子移動による磁性ナノ粒子からの発光消光が大幅に減少する。磁性ナノ粒子を付加した後に保持されるコアの蛍光は７０％を上回る。磁性ナノ粒子を外面に配置することにより、イオンまたは疎水性分子を寄せつけない静電障壁として作用する帯電シェル構造が生じる。その結果、個々のインタクトまたは変換蛍光性分子の分解／放出をもたらし得る疎水性媒質での溶解または酵素による作用から蛍光性分子が保護される。これが次には、蛍光性分子の強い相互作用による蛍光性コアの接着を強化することにより、溶媒和時の不安定化が起こる可能性が低下する。これに対し、磁性ナノ粒子が失われる可能性はあるが、個々のナノ粒子の磁気応答が最終的なバイモーダル集合体のものよりも小さくなるため、偽シグナルの点ではほとんど影響を及ぼすことはないものと思われる。
【００１０】
本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体は上記のような利点を多数示す。しかし、生物学的媒質中でのそのコロイド安定性を改善する必要がある。本明細書では、「コロイド安定性」は、ナノ集合体が長期間、好ましくは少なくとも数日間（通常、少なくとも３日間）、より好ましくは少なくとも１か月間、より一層好ましくは、生理的緩衝液中で少なくとも１か月間または精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水など）中で少なくとも６か月間、凝集せずに液体中に分散した状態を保持する能力を指す。このため、生理的水性条件中で本発明の逆構造ナノ集合体を安定化させることが必要である。
【００１１】
さらに、一実施形態では、好ましくは硝酸を用いて、希酸性条件下でｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を得て安定化させてもよい（のちの実験の節の製造工程を参照されたい）。このような酸性条件は、生物学的目的、特にｉｎ  ｖｉｖｏイメージングには最適なものではない。このため、本発明のナノ集合体を酸性媒質中で得る場合、それを水中および生理的条件下で安定化させる必要がある。
【００１２】
さらに、本発明のナノ集合体の生物学的適用が可能な範囲を広げるため、同ナノ集合体を生物活性分子により官能基化することは興味深い。ナノ集合体の官能基化によりナノ集合体の凝集が起こらないよう注意を払わなければならない。
【００１３】
本出願者は、本発明のナノ集合体の周囲にポリマー性の保護シェルを付加することにより、生理的条件下での安定化および官能基化が達成され得ることを明らかにした。
【００１４】
本出願者は特に、本発明のナノ集合体の表面にポリマーを吸着させて表面をコーティングすることにより、上記の期待される効果が達成され得ることを明らかにした（図２）。以降、ポリマーでコートされたこのようなｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体をｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体、「ポリマーコート蛍光性磁性ナノ集合体」または「ナノ集合体システム」と呼ぶ。
【００１５】
本発明のナノ集合体を修飾するのに用いるポリマーは、以下のような仕様を満たすものでなければならない：
−ポリマーとナノ集合体との間の相互作用は、全体としてｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体に対して強い接着を提供しなければならない。そのような目的には、ナノ集合体の正に帯電した表面との静電的相互作用が好ましい。さらに、ポリマーはナノ集合体と相互作用する部位を多数含むのが好ましい。
−ポリマーと磁性ナノ粒子との間の会合定数は、蛍光性コアと磁性ナノ粒子との間の会合定数よりも小さくなければならない、換言すれば、ポリマーは、蛍光性コアの表面に存在する磁性ナノ粒子に対する親和性がナノ集合体をコートするのに十分なものであると同時に、磁性シェルの一部がはがれない程度のものでなければならない。
−製造時および生物学的媒質中での使用時ともに、ポリマーの存在がナノ集合体の凝集を引き起こしてはならない。
−ポリマーは官能化可能なものでなければならず、好ましくは、ポリマーは、多数の官能基化可能パターンを示さなければならない。
−ポリマーは生体適合性を示すものでなければならない。
【００１６】
本出願者は、負に帯電した高分子電解質が上記の仕様を満たすことを明らかにした。本発明の特定の実施形態では、好ましいポリマーはポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）であり、好ましくは、ポリマーは官能基化ポリ（アクリル酸）である。
【００１７】
有利な点は、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーの平均サイズが、コートしていないｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体のものに比して妥当な範囲内で増大し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に適した寸法が維持されることである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、ナノ集合体システムであって、
蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと、
前記蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む、ナノ集合体；および
ナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマー
を含み；
但し、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せを含まない、
ナノ集合体システムに関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、蛍光性有機分子は式Ｉ
【化１】
2020143285.tif 000003
の化合物であり、式中、
Ｌは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【化２】
2020143285.tif 000004
から選択されるスペーサーを表し；
Ｘは、Ｏ、ＣＨ２またはＮＲ８を表し、Ｒ８は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し；
Ｘ’はＯまたはＮＲ９を表し、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し；
ｎは、１、２、３および４から選択される整数を表し；
Ｒ１は−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれメチル基を表す。
【００２０】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、磁性ナノ粒子は、γ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４からなる群より選択される超常磁性ナノ粒子である。
【００２１】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムは、２０〜７００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。
【００２２】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、蛍光性内部コアは、１×１０４〜１×１０７個の範囲の数の有機蛍光性分子を含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムは、１×１０２〜１×１０６個の範囲の数の磁性ナノ粒子を含む。
【００２４】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、ポリマーはイオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質である。
【００２５】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、ポリマーは式ＩＩ
【化３】
2020143285.tif 000005
のポリマーであり、式中、
ｍは、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し；
ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立して、ｍの百分率を表し、０％〜１００％の範囲であり、ｘ＋ｙ＋ｚはｍの１００％に等しく；
Ｘは、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリール、−ＣＯ−アルキル、ポリ（エチレングリコール）、−ポリ（エチレングリコール）−ＯＭｅを表し；Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、ここでは、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体から選択される反応基を表し；
Ｚは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、ここでは、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを結合させている反応基の残基をさらに含み；
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、抗生物質、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す。
【００２６】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムにおいて、ポリマーはポリ（アクリル酸）である。
【００２７】
本発明はこのほか、本発明によるナノ集合体システムを製造する工程であって、攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入することと、それに続くポリマー添加段階とを含む、工程に関する。
【００２８】
一実施形態では、本発明の工程は、その後に生物活性基によるポリマーの官能基化の段階をさらに含む。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のナノ集合体システムを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明はまた、本発明によるナノ集合体システムを含む薬剤にも関する。
【００３１】
本発明はまた、生理的媒質から分子および／または生物学的標的を抽出および検出するための本発明によるナノ集合体システムの使用に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、本発明によるナノ集合体システムを含むキットを提供する。
【００３３】
本発明はまた、バイモーダル磁気蛍光イメージングのための本発明のナノ集合体の使用にも関する。本発明はまた、細胞分取のための本発明のナノ集合体の使用にも関する。
【００３４】
（定義）
本発明では、以下に挙げる用語は次のような意味を有する。
【００３５】
「ナノ集合体」は、少なくとも１つの寸法が７００ｎｍ未満であり、ナノ粒子の隙間のない整列を特徴とするナノメートルサイズの構造体を指す。好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体は球状である。
【００３６】
「蛍光性」は、ＵＶから可視光線ないし近赤外線（最大９００ｎｍ）範囲にある１または２光子励起による光励起後に発光する特性を指す。
【００３７】
「磁性」は、外部から印加した磁場に反応して磁気双極子の向きが磁場の方向に揃う能力を指す。
【００３８】
「超常磁性」は、単一の磁気モノドメインよりも小さいナノ粒子にみられる磁気特性を指す。このようなナノ粒子は、外部から磁場を印加すると、飽和磁化と呼ばれる全体的な磁化が最大値に達するまで着実に配向を示す。磁場を除去すると、室温で磁気ヒステリシスを示さずに（磁気が残留せずに）緩和する。外部磁場が存在しない場合、超常磁性ナノ粒子は双極子配向（ネール緩和）およびナノ粒子の位置（ブラウン緩和）の熱変動による非恒久的な磁気モーメントを示す。
【００３９】
「流体力学的直径」は、ナノ粒子周囲の第一の溶媒和シェルの伸長を考慮に入れ、動的光散乱法により測定される、溶液中でのナノ粒子の直径を指す。
【００４０】
「高分子電解質」は、多数のイオン化可能な反復単位またはイオン性の反復単位を示し、金属酸化物材料、特に酸化鉄ナノ粒子の極性表面と静電気的に相互作用することができる水溶性高分子を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体」は、所望の生物学的標的化を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを包含する。
【００４２】
「アルキル」は、１〜５０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有し、飽和で直鎖状、分岐鎖状または環状の任意の炭化水素鎖を指す。適切なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル）、ブチル（ｉ−ブチル、ｓ−ブチルおよびｔ−ブチル）、ペンチルおよびその異性体（例えば、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル）ならびにヘキシルおよびその異性体（例えば、ｎ−ヘキシル、イソ−ヘキシル）が挙げられる。アルキル基は置換されていても、ヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００４３】
「アルケン」は、少なくとも１つの炭素間二重結合を有し、２〜５０個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子からなる直鎖状または分岐鎖状の任意の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は置換されていてもよい。アルケニル基の例には、エテニル、プロペン−２−イル、ブテン−２−イル、ブテン−３−イル、ペンテン−２−イルおよびその異性体、ヘキセン−２−イルおよびその異性体、ペンタジ−２，４−エニルなどがある。アルケニル基は、飽和または不飽和アリール基によって置換されていてもよい。
【００４４】
「アルキン」は、少なくとも１つの炭素間三重結合を有し、２〜５０個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子からなる直鎖状または分岐鎖状の任意の炭化水素鎖を指す。アルキニル基の非限定的な例には、エチニル、プロピン−２−イル、ブチン−２−イル、３−ブチン−３−イル、ペンチン−２−イルおよびその異性体、ヘキシン−２−イルおよびその異性体などがある。
【００４５】
「アリール」は、単環（すなわち、フェニル）または縮合した（例えば、ナフチル）もしくは共有結合した複数の芳香環を有し、典型的に、５〜２０個の原子；好ましくは少なくとも１つの環が芳香族である６〜１２個の原子を含む、芳香族炭化水素基を指す。芳香環は任意選択で、１〜２個の追加の環（シクロアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロアリールのいずれか）と縮合していてもよい。アリールの非限定的な例には、フェニル基、ビフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、テトラヒドロナフチル基、インダニル基、ビナフチル基、フルオレニル基およびアントラセニル基が挙げられる。
【００４６】
「アリールアルキル」は、例えばフェニル−メチル基などの、アリール基によって置換されたアルキル基を指す。
【００４７】
「活性化エステル」は、アルコキシ基が電子求引基であるエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、マレイミドエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルを指す。
【００４８】
「活性化カルボン酸」は、例えば酸無水物またはハロゲン化アシルを指す。
【００４９】
「スペーサー」は、ある分子の２つの部分を架橋する部分を指す。好ましくは、スペーサーは、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択され、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルである。
【００５０】
スペーサーが反応基と連結している場合、反応基はそれと反応性のある物質と反応し、それによりスペーサーが生物活性基と結合することになり得る。この場合、スペーサーには典型的に、反応基の残基、例えば、エステルのカルボニル基またはアジドとアルキンとの間のクリック反応により生じたトリアゾリル基を含む。このような残基は当業者によって知られているものである。「トリアゾリル基」は以下の部分：
【化４】
2020143285.tif 000006
を指す。例えば、生物活性基上に存在する反応基とスペーサー上に存在する反応基との間の結合から以下のような結合が生じ得る。
【表１】
2020143285.tif 000007
式中、Ｘはハロゲンを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（詳細な説明）
Ａ．ナノ集合体
Ａ．１．ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体：蛍光性コアおよび磁性ナノ粒子
本発明は蛍光性磁性ナノ集合体（ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体）に関する。特に、本発明のナノ集合体は、蛍光性コアであって、その表面に接している磁性ナノ粒子、好ましくは超常磁性ナノ粒子によって取り囲まれた蛍光性コア、好ましくは有機蛍光性コアを含む。
【００５２】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は、
蛍光性有機分子を含む蛍光性コアと、
前記蛍光性コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体は、
蛍光性有機分子を含む蛍光性コアと、
前記蛍光性コアの表面に接している超常磁性ナノ粒子と
を含む。
【００５４】
図１に本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の逆構造を示す。この構造を、コアが磁性を示し蛍光単位がそれをコートしている先行技術の従来の磁性蛍光性ナノ集合体と対比させて、「逆」構造と呼ぶ。
【００５５】
本発明のナノ集合体では、蛍光性コアと磁性ナノ粒子は共有結合によって結合していない。
【００５６】
蛍光性コア
一実施形態では、ナノ集合体の蛍光性コアは有機蛍光性コアである。好ましくは、蛍光性コアは「無基質」である、すなわち基質を含まず、基質は、例えばシリカ、油滴および油ベシクル、ポリマー（例えば、デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリスチレンなど）、液晶ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、ナノカプセル、ゼラチンナノ粒子、ナノラテックスであり得る。換言すれば、本発明の蛍光性コアは、蛍光性有機分子が封入された、または埋め込まれた基質ではない。
【００５７】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性内部コアは、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せではない。
【００５８】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性内部コアは量子ドットではない。
【００５９】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性内部コアはポリマー基質を含まない、好ましくは架橋ポリマー基質を含まない。
【００６０】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性内部コアは、それぞれミセルまたはポリマーソームを形成する自己集合非蛍光性分子または非蛍光性高分子を含まない。
【００６１】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性内部コアは、自己集合蛍光性高分子を含まない、好ましくは、ポリマードット（Ｐ−ドットとも呼ばれる）を形成する自己集合半導体ポリマー鎖を含まない。
【００６２】
一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは、蛍光性有機分子、好ましくは蛍光性有機低分子を含む。一実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは自己集合蛍光性有機分子を含む。別の実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは蛍光性有機分子、好ましくは蛍光性有機低分子からなる。
【００６３】
好ましくは、蛍光性コアは球状である。
【００６４】
蛍光性コアには、高密度の蛍光性分子を有し、固体状態での発光消光が少ないという利点がある。
【００６５】
蛍光性コアは、単純な製造工程により得られ得るものである。一実施形態では、１段階の核生成工程後に蛍光性コアが得られ得る。
【００６６】
一実施形態では、蛍光性コアの蛍光性有機分子は、Ｆａｕｃｏｎら，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃ，２０１３，１（２４），３８７９−３８８６に記載されているものである。
【００６７】
一実施形態では、蛍光性コアの蛍光性有機分子は式Ｉ：
【化５】
2020143285.tif 000008
の化合物であり、式中、
Ｌは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【化６】
2020143285.tif 000009
から選択されるスペーサーを表し；
Ｘは、Ｏ、ＣＨ２またはＮＲ８を表し、Ｒ８は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し；
Ｘ’はＯまたはＮＲ９を表し、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し；
ｎは、１、２、３および４から選択される整数を表し；
Ｒ１は−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれメチル基を表す。
【００６８】
一実施形態では、式Ｉの蛍光性コアの蛍光性有機分子は、式Ｉ’：
【化７】
2020143285.tif 000010
の化合物であり、式中、
ＸはＯまたはＣＨ２を表し；
ｎは、１、２、３および４から選択される整数を表し；
Ｒ１は−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれメチル基を表す。
【００６９】
本発明の特定の実施形態では、蛍光性コアの蛍光性有機分子は式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
【化８】
2020143285.tif 000011
の分子である。
【００７０】
一実施形態では、蛍光性コアの吸収波長は２００〜８００ｎｍ、好ましくは３００〜６５０ｎｍ、より好ましくは４００〜５００ｎｍの範囲である。
【００７１】
一実施形態では、蛍光性コアの発光波長は３００〜１０００ｎｍ、好ましくは４００〜８００ｎｍ、より好ましくは５００〜７００ｎｍ、より好ましくは５５０〜７００ｎｍの範囲である。
【００７２】
一実施形態では、蛍光性コアは、１×１０４〜１×１０７、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは１×１０５〜１×１０６個の範囲の数の有機蛍光性分子を含む。
【００７３】
一実施形態では、蛍光性有機分子は、磁性ナノ粒子と複合体を形成することができるイオン化可能な基、好ましくはアニオン基を含む。
【００７４】
一実施形態では、蛍光性コアは、例えば治療活性物質などの活性物質をさらに含む。別の実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは、蛍光性有機分子と、例えば治療活性物質などの活性物質とからなる。
【００７５】
磁性ナノ粒子
好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体の磁性ナノ粒子は超常磁性ナノ粒子である。超常磁性粒子は、外部から磁場を印加することによりその飽和磁化まで磁化され、磁界を除去すると、室温で残留磁化を全く示さない。
【００７６】
一実施形態では、磁性ナノ粒子は、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｕＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４を含む群から選択される。好ましくは、磁性ナノ粒子は、マグヘマイト酸化鉄であるγ−Ｆｅ２Ｏ３またはマグネタイトであるＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。一実施形態では、磁性ナノ粒子は、γ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４を含む群から選択される超常磁性ナノ粒子である。特定の実施形態では、磁性ナノ粒子は、マグヘマイト酸化鉄であるγ−Ｆｅ２Ｏ３のナノ粒子である。別の特定の実施形態では、磁性ナノ粒子は、マグネタイトであるＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。
【００７７】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は、１×１０２〜１×１０６、好ましくは１×１０３〜１×１０５、より好ましくは０．５×１０４〜５×１０４個の範囲の数の磁性ナノ粒子を含む。
【００７８】
好ましくは、磁性ナノ粒子は、超常磁性であり、蛍光性コアの表面と強く結合したときに遊離ナノ粒子に比して緩和特性が増強される点で有利である。
【００７９】
一実施形態では、磁性ナノ粒子は、２０〜１００ｅｍｕ／ｇ（２０〜１００（Ａ・ｍ２）／ｋｇ）、好ましくは１５〜８０ｅｍｕ／ｇ（１５〜８０（Ａ・ｍ２）／ｋｇ）、好ましくは２０〜５５ｅｍｕ／ｇ（２０〜５５（Ａ・ｍ２）／ｋｇ）の範囲の飽和磁化ＭＳ値を示す。
【００８０】
一実施形態では、遊離ナノ粒子と比較したとき、本発明のナノ集合体に含まれる磁性ナノ粒子は、臨床ＭＲＩ周波数におけるｒ２／ｒ１比が２より大きく、好ましくは４より大きく、より好ましくは６より大きい。
【００８１】
本発明のナノ集合体に存在する磁性ナノ粒子は、協調効果を発揮してＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）コントラストの重要な改善をもたらす点で有利である。一実施形態では、本発明のナノ集合体に存在する磁性ナノ粒子は、相加効果を発揮してＭＲＩコントラストの重要な改善をもたらす。したがって、本発明のナノ集合体は、鉄濃度が低くてもＭＲＩイメージングを可能にする。
【００８２】
ナノ集合体の特性
好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは式（Ｉａ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はγ−Ｆｅ２Ｏ３またはＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。特定の実施形態では、蛍光性コアは式（Ｉａ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はγ−Ｆｅ２Ｏ３のナノ粒子である。別の特定の実施形態では、蛍光性コアは式（Ｉａ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体の蛍光性コアは式（Ｉｂ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はγ−Ｆｅ２Ｏ３またはＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。特定の実施形態では、蛍光性コアは式（Ｉｂ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はγ−Ｆｅ２Ｏ３のナノ粒子である。別の特定の実施形態では、蛍光性コアは式（Ｉｂ）の蛍光性有機分子を含み、磁性ナノ粒子はＦｅ３Ｏ４のナノ粒子である。
【００８４】
本発明のナノ集合体に含まれる蛍光性有機分子および磁性ナノ粒子は、内部フィルター効果による発光消光を避けるため、蛍光性コアの発光波長が磁性ナノ粒子の吸収波長に比して赤色シフトしている点で有利である。
【００８５】
一実施形態では、蛍光性有機分子は、ストークスシフトが４５００ｃｍ−１よりも大きい。
【００８６】
本発明の一実施形態では、ナノ集合体の流体力学的直径は、２０〜８００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは８０〜２００ｎｍの範囲である。一実施形態では、本発明のナノ集合体は、２０〜７００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。
【００８７】
特定の実施形態では、ナノ集合体が式（Ｉａ）および／または（Ｉｂ）の蛍光性有機分子とγ−Ｆｅ２Ｏ３の磁性ナノ粒子とを含む場合、流体力学的直径は８０〜２００ｎｍの範囲内にあるのが好ましい。
【００８８】
一実施形態では、本発明のナノ集合体を酸性媒質中で保管する。この場合、アニオン対イオンが、ナノ集合体の凝集を防ぐ静電反発力によりナノ集合体の安定化を可能にする。
【００８９】
別の実施形態では、本発明のナノ集合体を塩基性媒質中で保管する。この場合、カチオン対イオンが、ナノ集合体の凝集を防ぐ静電反発力によりナノ集合体の安定化を可能にする。
【００９０】
Ａ．２．ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体システム：蛍光性コア、磁性ナノ粒子およびポリマー
本発明はさらに、ポリマーのコーティングをさらに含む、磁性蛍光性ナノ集合体を含むナノ集合体システム（ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体）に関する。特に、本発明のナノ集合体システムは、一部または全体が蛍光性コアの表面に接している磁性ナノ粒子、好ましくは超常磁性ナノ粒子により取り囲まれ、さらにポリマーにより連続的または不連続的にコートされた蛍光性コア、好ましくは有機蛍光性コアを含む。ポリマーはナノ集合体の表面に吸着している。ポリマーは、ナノ集合体と共有結合によって結合していない。
【００９１】
したがって、一実施形態では、本発明のナノ集合体は少なくとも１つのポリマーをさらに含む。一実施形態では、ポリマーはイオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質である。
【００９２】
ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体およびその構成要素に関する上記の実施形態はすべて、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体に適用可能である。
【００９３】
ポリマーは、酸性媒質中でｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を安定化させるのに使用する対イオンの代わりになり、ひいては中性媒質中でのナノ集合体の安定化を可能にする点で有利である。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は中性媒質中で安定であるため、それを生物学的媒質中で使用することができる点で有利である。
【００９４】
一実施形態では、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は、３〜１２の範囲のｐＨで安定である。
【００９５】
一実施形態では、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は、０〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲のＮａＣｌのイオン強度、好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの範囲のＮａＣｌのイオン強度で安定である。
【００９６】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は、
蛍光性有機分子を含む蛍光性コアと、
蛍光性コアの表面に接している磁性ナノ粒子と、
少なくとも１つのポリマーと
を含む。
【００９７】
１つの好ましい実施形態では、本発明のナノ集合体システムは、
蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと、
蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む、ナノ集合体；および
ナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマー
を含む。
【００９８】
一実施形態では、本発明のナノ集合体システムは、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せのいずれも含まない。
【００９９】
ポリマーは、表面に磁性ナノ粒子を有する蛍光性コアを含むナノ集合体の表面に接しているのが好ましい。図２に本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の構造を示す。
【０１００】
一実施形態では、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体は、その表面に少なくとも１つのポリマーをさらに含み、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体となる。
【０１０１】
本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は、親水性であり、酸性およびアルカリ性の媒質中でコロイド的に安定であり、照射下で光安定性であり、明白な細胞毒性をもたず、構成要素の蛍光性コアおよび磁性ナノ粒子に近いか、これより優れた磁気特性および蛍光特性を示し、その構成要素の蛍光性および磁性ナノの粒子または分子に脱凝集しない点で有利である。
【０１０２】
ポリマー保護シェルを加えることにより、集合体単独の流体力学的直径の増大が最小限（すなわち、約４０ｎｍ）に抑えられることが明らかになった。一実施形態では、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は、５０〜８００ｎｍ、好ましくは７０〜６００ｎｍ、より好ましくは９０〜３００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。一実施形態では、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は１５０〜４００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。
【０１０３】
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体は、凍結乾燥させてから保管してもよい。凍結乾燥後の再分散は容易に達成され得る。一実施形態では、凍結乾燥後の再分散を水、緩衝液、アルコール性溶媒から選択される溶媒中で実施する。
【０１０４】
本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体には、溶媒に入れても凝集しないという利点がある。一実施形態では、溶媒はアルコール性溶媒、好ましくはエタノールまたはメタノールであり得る。
【０１０５】
本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体には、細胞内に移行するが、核内には侵入しないという利点がある。
【０１０６】
ポリマー
一実施形態では、本発明のナノ集合体を連続的または非連続的にコートするのに使用するポリマーは、イオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質である。
【０１０７】
一実施形態では、ポリマーは、本発明のナノ集合体の磁性粒子と相互作用することができるアニオン性機能を含む。
【０１０８】
一実施形態では、ポリマーは架橋されていない。
【０１０９】
一実施形態では、ポリマーは「官能基化可能なポリマー」および／または「官能基化ポリマー」である。
【０１１０】
一実施形態では、ポリマーは「官能基化可能なポリマー」である、すなわち、ポリマーは少なくとも１つの反応基を含む。本明細書では、「反応基」は、別の化学基と反応して共有結合および／または静電結合を形成することができる基、すなわち、適切な反応条件下で共有結合反応性および／またはイオン反応性であり、一般に別の物質に対する結合点を示す基を指す。反応基は、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合および／または静電結合を形成することが可能なポリマー上の部分である。反応基としては一般に、求核体、求電子体、求ジエン体、求双極子体、カチオンおよび光活性基が挙げられる。
【０１１１】
本発明のナノ集合体に使用するポリマー上に反応基が存在する場合、ナノ集合体を官能基化することが可能である。
【０１１２】
一実施形態では、ポリマーは、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体を含む群から選択される少なくとも１つの反応基を含む。
【０１１３】
一実施形態では、ポリマーは、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電した金属錯体を含む群から選択される少なくとも１つの反応基を含む。
【０１１４】
一実施形態では、ポリマーは、マレイミドである少なくとも１つの反応基を含む。一実施形態では、ポリマーは、イソチオシアナートである少なくとも１つの反応基を含む。一実施形態では、ポリマーは、活性化エステル、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、少なくとも１つの反応基を含む。
【０１１５】
一実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つの反応基によって置換された少なくとも１つの側鎖を含む。
【０１１６】
別の実施形態では、ポリマーは「官能基化ポリマー」である、すなわち、ポリマーは少なくとも１つの生物活性基を含む。生物活性基は、生物学的標的の認識により、ポリマーでコートされたナノ集合体の標的化を可能にし得る。生物活性基はまた、ポリマーでコートされたナノ集合体に生物活性を付与し得る。
【０１１７】
一実施形態では、以下のような生物活性基が、その対応する生物学的標的の認識を可能にし得る：
【表２】
2020143285.tif 000012
【０１１８】
一実施形態では、生物活性基は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、基質、ビオチン、アビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される。
【０１１９】
一実施形態では、生物活性基は、アミノ酸、ペプチド（例えば、ＲＧＤペプチドなど）、タンパク質（例えば、（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質など）、抗体（例えば、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ、免疫グロブリンＩｇＥ、ハーセプチンなど）、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または上皮成長因子阻害剤など）、抗生物質（例えば、β−ラクタムまたはグリコペプチドなど）基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される。
【０１２０】
一実施形態では、生物活性基は、ビオチン、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）、免疫グロブリン（ＩｇＥ）、オリゴヌクレオチド、チロシンキナーゼ阻害剤、ハーセプチン、アプタマー、ＲＧＤペプチド、上皮成長因子阻害剤、β−ラクタム、グリコペプチドおよび（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質から選択される。
【０１２１】
一実施形態では、生物活性基は親和性タンパク質である。「親和性タンパク質」という用語は、相補的なタンパク質または抗原と選択的に結合する能力を有する、すなわち抗体模倣物である人工タンパク質を指す。特定の実施形態では、親和性タンパク質は約７ｋＤａのものである。好ましくは、親和性タンパク質はジスルフィド結合を含まない。特定の実施形態では、親和性タンパク質は、高温、高圧および強酸性条件に耐えることができる。
【０１２２】
生物活性基はまた、ポリマーコートナノ集合体に免疫逃避性（ｆｕｒｔｉｖｉｔｙ）を付与し得る。このようにして、単核食細胞系（細網内皮系（ＲＥＳ））による血流からのナノ集合体の排除が損なわれ、体内循環時間が長くなる。この場合、生物活性基は、ＰＥＧ部分を含むか、この中に存在するのが好ましい。特定の実施形態では、ポリマーはＰＡＡ−ＰＥＧポリマーである。
【０１２３】
一実施形態では、生物活性基は直接ポリマー上に存在する。あるいは、反応基との反応を介して生物活性基をポリマー上に導入する。特に、ペプチドカップリングまたはクリックケミストリーにより生物活性基をポリマー上に導入し得る。例えば、ＰＡＡのカルボキシル単位とのペプチドカップリングにより、アミン誘導体化ビオチン基をＰＡＡポリマー上に導入し得る。
【０１２４】
任意選択で、ポリマーと生物活性基との間にスペーサーが存在してもよい。
【０１２５】
一実施形態では、生物活性基はポリマーの側鎖上に存在する。別の実施形態では、生物活性基はポリマーの一端または両端に存在する。
【０１２６】
生物活性基によるポリマーの官能基化は、前記生物活性基の生物学的特性の喪失が全く生じないように実施するのが有利である。
【０１２７】
一実施形態では、ポリマー、特に「官能基化可能なポリマー」は、１〜１０ｋＤａ、好ましくは１〜５ｋＤａの範囲の分子量を有する。「官能基化ポリマー」は、官能基化に使用する生物活性基の性質に応じて１０ｋＤａを超える分子量を有し得る。
【０１２８】
合計ｍ個のモノマーを含み、前記モノマーのｘ％がモノマーＡであり、前記モノマーのｙ％がモノマーＢであり、前記モノマーのｚ％がモノマーＣであるコポリマーによく用いられる命名法は、Ｐ［Ａｘ−ｃｏ−Ｂｙ−ｃｏ−Ｃｚ］ｍである。コポリマーの一端を具体的に示す場合、それらをＰ［Ａｘ−ｃｏ−Ｂｙ−ｃｏ−Ｃｚ］ｍのいずれかの側に、つまりＲ１−Ｐ［Ａｘ−ｃｏ−Ｂｙ−ｃｏ−Ｃｚ］ｍ−Ｒ２の形で示し得る。以降、この命名法を用いる。
【０１２９】
特定の実施形態では、ポリマーは式ＩＩ：
【化９】
2020143285.tif 000013
のポリ（アクリル酸）またはその誘導体であり、式中、
ｍは、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し；
ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立して、ｍの百分率を表し、０％〜１００％の範囲であり、ｘ＋ｙ＋ｚはｍの１００％に等しく；
Ｘは、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリール、−ＣＯ−アルキル、ポリ（エチレングリコール）、−ポリ（エチレングリコール）−ＯＭｅを表し；Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、ここでは、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体から選択される反応基を表し；
Ｚは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、ここでは、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを結合させている反応基の残基をさらに含み；
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド（例えば、ＲＧＤペプチドなど）、タンパク質（例えば、（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質など）、抗体（例えば、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ、免疫グロブリンＩｇＥ、ハーセプチン）、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または上皮成長因子阻害剤など）、抗生物質（例えば、β−ラクタムまたはグリコペプチド）基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す。
【０１３０】
特定の実施形態では、ポリマーは式ＩＩ’：
【化１０】
2020143285.tif 000014
のポリ（アクリル酸）またはその誘導体であり、式中、
ｍは、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し；
ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立して、ｍの百分率を表し、０％〜１００％の範囲であり、ｘ＋ｙ＋ｚはｍの１００％に等しく；
Ｘは、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリールを表し；Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、ここでは、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電した金属錯体から選択される反応基を表し；
Ｚは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、ここでは、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを結合させている反応基の残基をさらに含み；
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す。
【０１３１】
ｘ＋ｙ＋ｚはｍの１００％に等しく、ｘ、ｙまたはｚのうちの少なくとも１つはｍの０％と等しくなり得る。一実施形態では、式ＩＩのポリマーは式ＩＩ’’：
【化１１】
2020143285.tif 000015
のものであり、式中、
ｍ、ＸおよびＹは、式ＩＩで定義される通りであり；
ｘ、ｙ、ｚ’およびｚ’’はそれぞれ独立して、ｍの百分率を表し、０％〜１００％の範囲であり、ｘ＋ｙ＋ｚ’＋ｚ’’はｍの１００％に等しく；
Ｚ’およびＺ’’はそれぞれ独立して、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、ここでは、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを結合させている反応基の残基をさらに含み；
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、抗生物質、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す。
【０１３２】
一実施形態では、Ｚ’およびＺ’’のうちの一方は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、Ｌ２は単結合であり、Ｒ１０はポリ（エチレングリコール）鎖である。
【０１３３】
一実施形態では、Ｚ’およびＺ’’のうちの一方は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、Ｌ２はポリ（エチレングリコール）鎖であり、Ｒ１０はポリ（エチレングリコール）鎖とは異なる生物活性基である。
【０１３４】
一実施形態では、Ｚ’は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、Ｌ２は単結合であり、Ｒ１０はポリ（エチレングリコール）基であり；Ｚ’’は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、Ｌ２はポリ（エチレングリコール）鎖であり、Ｒ１０はポリ（エチレングリコール）鎖とは異なる生物活性基である。
【０１３５】
一実施形態では、ポリマーは、ランダムコポリマー、交互コポリマーまたはブロックコポリマーである。別の実施形態では、リガンドは統計コポリマーである。別の実施形態では、前記リガンドはランダムコポリマーまたはブロックコポリマーである。
【０１３６】
Ｂ．本発明のナノ集合体を製造する工程
一実施形態では、古典的な巨視的手段を用いて本発明のナノ集合体の製造を実施する。別の実施形態では、マイクロ流体手段を用いて本発明のナノ集合体の製造を実施する。
【０１３７】
Ｂ．１．ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の製造
本発明はさらに、本発明のナノ集合体を製造する工程に関する。特に、本発明は、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を製造する工程に関する。
【０１３８】
一実施形態では、本発明の工程は、攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入することを含む。
【０１３９】
一実施形態では、蛍光性有機分子の溶液は、溶液の総重量に対して０．００５〜１重量％の範囲、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｗ）の量の蛍光性有機分子を含む。
【０１４０】
一実施形態では、蛍光性有機分子の溶液の溶媒は有機溶媒、好ましくは水混和性の有機溶媒、好ましくはＴＨＦである。
【０１４１】
一実施形態では、磁性ナノ粒子の分散液は、溶液の総重量に対して０．００１〜０．１重量％の範囲、好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００４〜０．０５％、より好ましくは０．００４〜０．０１％の量の磁性ナノ粒子を含む。
【０１４２】
一実施形態では、磁性ナノ粒子の分散液の溶媒は水性溶媒、好ましくは水である。
【０１４３】
好ましくは、製造工程での攪拌をボルテックスミキサーにより実施する。
【０１４４】
Ｂ．２．ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の製造
本発明はさらに、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体を製造する工程に関する。
【０１４５】
一実施形態では、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体を製造する工程は、上記のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の製造工程と、それに続くポリマーの溶液の添加段階とを含む。
【０１４６】
一実施形態では、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体を製造する工程は、
攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入してｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を形成することと、
ポリマーを添加すること
とを含む。
【０１４７】
一実施形態では、ポリマーを固体の形態で、好ましくは粉末の形態で添加する。別の実施形態では、ポリマーを溶液、好ましくは水溶液で添加する。
【０１４８】
好ましい実施形態では、この工程は、続くｐＨ調整段階、好ましくは６〜１２の範囲のｐＨ、好ましくは約ｐＨ８に調整する段階をさらに含む。好ましくは、塩基の滴加によりｐＨ調整を実施し、前記塩基は、好ましくは水酸化アンモニウムであり、好ましくは、塩基は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化アンモニウムである。
【０１４９】
好ましい実施形態では、この工程は、続く透析段階、好ましくは続くＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に対する透析段階をさらに含む。このような透析により、ｐＨを約７に到達させることが可能となり得る。
【０１５０】
この工程は凍結乾燥段階をさらに含み得る。凍結乾燥させたナノ集合体は、長期間にわたる保管が容易である。
【０１５１】
Ｂ．３．ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の官能基化
一実施形態では、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の形成に使用するポリマーは、官能基化ポリマーである。この場合、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の形成により、官能基化されたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体が生じる。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の形成に使用するポリマーは、官能基化可能なポリマーである。この場合、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体を形成した後、ポリマーの反応基と、適切な反応基を含む生物活性物質とを反応させることにより、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体の官能基化を実施し得る。例えば、ポリマーがカルボキシル官能基を含む場合、ナノ集合体は、形成後、アミン官能基を含む生物活性物質とアミド結合形成を介して反応することにより官能基化され得る。
【０１５３】
Ｃ．本発明のナノ集合体の使用
本発明はさらに、本発明のナノ集合体の使用に関する。
【０１５４】
イメージング
一実施形態では、本発明のナノ集合体をイメージング、好ましくは医用イメージングに使用し得る。好ましくは、本発明のナノ集合体をバイモーダルイメージング、すなわち蛍光イメージングと磁気共鳴イメージングに使用する。
【０１５５】
一実施形態では、本発明のナノ集合体を用いるイメージングをｉｎ  ｖｉｖｏで実施し得る。別の実施形態では、本発明のナノ集合体を用いるイメージングをｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施し得る。別の実施形態では、本発明のナノ集合体を用いるイメージングをｅｘ  ｖｉｖｏで実施し得る。
【０１５６】
本発明はさらに、それを必要とする患者に本発明によるナノ集合体を投与することと、蛍光シグナルおよび磁気シグナルを記録することとを含む、医用イメージングの方法に関する。
【０１５７】
一実施形態では、本発明のナノ集合体を診断目的で使用し得る。
【０１５８】
一実施形態では、本発明のナノ集合体を、目的とする物質の生体内分布をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価するのに使用し得る。
【０１５９】
本発明はこのほか、本発明のナノ集合体の相関顕微鏡法および／または電子顕微鏡法での使用に関する。
【０１６０】
治療
一実施形態では、本発明のナノ集合体を治療に使用することができる。
【０１６１】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は治療活性物質を含み得る。この場合、ナノ集合体は、前記活性物質の送達手段として作用し得る。
【０１６２】
本発明のナノ集合体の磁気特性を用いて高熱を発生させ得る。したがって、本発明のナノ集合体を温熱療法による疾患の治療に使用し得る。特に、温熱療法を用いて腫瘍を破壊し得る。外部交流磁場の下で本発明のナノ集合体が高熱を誘導する能力を試験した。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体の水溶液に交流磁場を印加したところ、有意な温度上昇が得られた。中皮細胞の存在下でも有意な温度上昇がみられた。
【０１６３】
ポリマー保護シェルを有するナノ集合体の場合、標的化剤および／または薬学的活性物質によりポリマーを官能基化し得る。
【０１６４】
本発明は、任意選択で薬学的活性物質により官能基化された本発明によるナノ集合体を少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物に関する。
【０１６５】
本発明はまた、本発明によるナノ集合体を含み、前記ナノ集合体が任意選択で薬学的活性物質により官能基化されている、薬剤に関する。
【０１６６】
本発明はまた、薬剤、好ましくは癌または病原体による感染症の治療および／または予防のための薬剤の製造への本発明によるナノ集合体の使用に関する。一実施形態では、本発明は、薬剤、好ましくは癌の治療および／または予防のための薬剤の製造への本発明によるナノ集合体の使用に関する。
【０１６７】
一実施形態では、「病原体による感染症」は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）または肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を原因とする感染症を指す。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は、癌または病原体による感染症の治療および／または予防に使用するものである。一実施形態では、本発明のナノ集合体は、癌の治療および／または予防に使用するものである。
【０１６９】
一実施形態では、本発明のナノ集合体、好ましくは本発明の官能基化されたナノ集合体を活性な治療物質として使用する。
【０１７０】
細胞分取
本発明はさらに、本発明のナノ集合体の磁気特性および／または蛍光特性を用いる細胞分取への本発明のナノ集合体の使用に関する。
【０１７１】
特に、蛍光特性をフローサイトメトリーによる細胞分取に用い得る。フローサイトメトリー法は当業者に公知である。例えば、フローサイトメトリー法はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）であり得る。
【０１７２】
本発明のナノ集合体の磁気特性はまた、磁気細胞分離にも用いることができる。
【０１７３】
一実施形態では、本発明のナノ集合体を蛍光細胞分取に使用する。別の実施形態では、本発明のナノ集合体を磁気細胞分離に使用する。一実施形態では、本発明のナノ集合体を蛍光細胞分取および磁気細胞分離に使用する。
【０１７４】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの検知および／または抽出
本発明はさらに、本発明のナノ集合体のｅｘ  ｖｉｖｏ検知への使用に関する。
【０１７５】
特に、本発明のナノ集合体を生理的媒質中の化合物および／または生物学的標的の検出に使用し得る。本発明のナノ集合体はまた、生理的媒質からの化合物および／または生物学的標的の抽出にも使用することができる。一実施形態では、本発明のナノ集合体を生理的媒質からの分子および／または生物学的標的の抽出および検出に使用する。
【０１７６】
一実施形態では、生物学的標的は、病原体、タンパク質、抗体、ウイルスおよび生体異物から選択され、好ましくは病原体である。本明細書では、「病原体」は、その宿主に疾患を引き起こす微生物、例えばウイルス、細菌、プリオン、真菌または原生動物などを指す。
【０１７７】
一実施形態では、生理的媒質は、血漿、血清、血液、尿およびリンパ液から選択され、好ましくは血液である。
【０１７８】
ｅｘ  ｖｉｖｏ検知のためには、検出対象の化合物および／または生物学的標的との相互作用を可能にする生物活性基でナノ集合体のポリマーを官能基化するのが好ましい。
【０１７９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ検知は、本発明のナノ集合体と分析対象の生理的媒質とを接触させることにより実施され得る。次いで、ナノ集合体を官能基化している生物活性基が検出対象の化合物および／または生物学的標的と相互作用する。このような相互作用により、ナノ集合体と標的との凝集物が形成され得る。次いで、本発明のナノ集合体の磁気特性を利用して、磁場を印加することによりトラッピングを実施し得る。次いで、残った媒質を洗浄により除去し得る。磁気を解除した後、蛍光により検出を実施し得る。
【０１８０】
キット
本発明はさらに、本発明によるナノ集合体を含むキットに関する。キットは、１つまたは複数の追加の構成要素、例えば再分散溶液など（例えば：緩衝液、血清、培養細胞培地）をさらに含み得る。一実施形態では、キットは校正標準物質をさらに含む。
【０１８１】
一実施形態では、本発明のナノ集合体は、表面、例えばチップ、マイクロプレートウェルまたはその他の固体もしくは半固体基質などに結合してキット中に存在し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体およびその製造工程の略図である。
【図２】本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体およびその製造工程の略図である。
【図３】合成後のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体のＴＥＭ画像である。差込み画像：２０ｎｍスケールバーを付した拡大画像。
【図４】ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（ＤＨ＝１５０ｎｍ；黒い点で表示）およびＰＡＡでコートし分散させた酸化鉄ナノ粒子（ｍａｇ＠ＰＡＡ：ＤＨ＝７ｎｍ；白い四角で表示）の横緩和度Ｒ２の発展を周波数の関数として表した図である。縦棒は測定誤差を表す。
【図５】ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（ＤＨ＝１５０ｎｍ；黒い点で表示）およびＰＡＡでコートし分散させたγ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子（ｍａｇ＠ＰＡＡ：ＤＨ＝７ｎｍ；白い四角で表示）の縦緩和度Ｒ１の発展を周波数の関数として表した図である。縦棒は測定誤差を表す。
【図６】水中での蛍光性有機ナノ粒子（ｆｌｕｏ吸収）およびγ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子（γ−Ｆｅ２Ｏ３吸収）のＵＶ−可視吸収スペクトルならびにｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ発光）の蛍光性有機ナノ粒子（ｆｌｕｏ発光）の発光スペクトル（λｅｘｃ＝４５０ｎｍ）を示す図である。
【図７】ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体とインキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。ａ）は、濃度３μＭの蛍光性分子とインキュベートし、染色剤は加えなかったもの（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＞５１０ｎｍ）、ｂ）は、濃度１μＭの蛍光性分子とインキュベートし、核染色剤（ヘキスト３３３４２）で後処理したもの（λｅｘｃ＝４０５ｎｍ、λｅｍ＞５１０ｎｍ）である。（対物レンズ×６３、ＮＡ１．４）。
【図８】ＨＥＫ細胞に内部移行したナノ粒子のＴＥＭ画像である（７０ｎｍの薄切片）。ａ）は全体像である。ｂ）は拡大像である。ｃ）およびｄ）はｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体を捕捉するエンドソームである。
【図９】マウス肝臓のＴ２＊強調ＭＲ画像である。ａ）は注射前、ｂ）は注射から２５分後、ｃ）は注射から２３０分後である。白い丸は水の磁気共鳴ファントムに相当する。
【図１０】マウス脾臓のＴ２＊強調ＭＲ画像である。ａ）は注射前、ｂ）は注射から２５分後である白い丸は水の磁気共鳴ファントムに相当する。
【図１１】本発明のｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体を静脈内注射した後のマウス肝組織のＴＥＭ画像である。
【図１２】７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＣ）、ＡＣによるｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡの表面官能基化により得られたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ−ＡＣナノ集合体およびＡＣによるｍａｇ＠ＰＡＡの表面官能基化により得られたｍａｇ＠ＰＡＡ−ＡＣの水中での発光スペクトル（λｅｘｃ＝３５０ｎｍ）および蛍光減衰（λｅｍ＝３４０ｎｍ、λｅｍ＝４４０ｎｍ）を比較した図である。
【実施例】
【０１８３】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【０１８４】
材料
化学試薬および溶媒はすべて、商業的供給源（Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａｃｒｏｓ社、ＳＤＳ社）から購入し、受け取ったものをそのまま使用した。分光計測にはＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した分光グレードの溶媒を使用した。
【０１８５】
略語
【表３】
2020143285.tif 000016
【０１８６】
第Ａ部−磁性−蛍光性ナノ集合体
Ａ．１．合成手順
Ａ．１．１．蛍光性有機分子
Ｆａｕｃｏｎら，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃ．，２０１３，１，３８７９−３８８６に記載されている通りに蛍光性分子（Ｉａ）および（Ｉｂ）を得た。
【０１８７】
分光測光グレードのＴＨＦを用いて蛍光性分子（Ｉａ）および（Ｉｂ）のストック溶液を０．０５〜１重量％の範囲の濃度で調製した。
【０１８８】
Ａ．１．２．磁性ナノ粒子
硝酸安定化磁性ナノ粒子。Ｍａｓｓａｒｔら（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．，１９８１，１７，１２４７−１２４８）により記載されている手順に従ってマグヘマイトγ−Ｆｅ３Ｏ３ナノ粒子を調製した。簡潔に述べれば、Ｆｅ（ＩＩ）塩とＦｅ（ＩＩＩ）塩を希塩酸中で混合した。濃アンモニアを添加して媒質を急速にアルカリ化することにより、マグネタイトＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の共沈殿が可能になり、これを分離した。γ−Ｆｅ３Ｏ４を硝酸で酸性化した後、硝酸第二鉄で８０℃にて化学的に酸化させてγ−Ｆｅ３Ｏ３ナノ粒子を得た。硝酸イオンはコロイド分散液の正に帯電した表面（ζ＝＋２５ｍＶ）の対イオンを安定化させる作用があるため、磁気デカンテーションの後、赤色沈殿を硝酸（ｐＨ＝１．２）に分散させた。
【０１８９】
マグネタイトナノ粒子。Ｓａｎｔｏｙｏら（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１１，２３，１３７９−１３８６）を改変して合成を実施した。鉄塩の溶液を２種類：ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ中１ｍｏｌ／Ｌ（１０ｍＬ）およびＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ中２ｍｏｌ／Ｌ（２．５ｍＬ）を調製した。窒素を用いて２時間、十分に脱酸素した後、両溶液を混合し、アルゴン雰囲気下で激しく攪拌しながら７０℃まで加熱した。次いで、水酸化テトラプロピルアンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）の溶液を０．７ｍＬ／分の速度で注入し、さらに２０分間、激しく攪拌し続けた。得られたナノ粒子を磁気デカンテーションにより２回洗浄し、ｐＨが中性になるまでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に対して透析した。酸性媒質で安定なマグネタイト分散液を得るため、ナノ粒子を２Ｍ  ＨＮＯ３中で１５分間、超音波処理した後、磁気デカンテーションにより０．１ＭのＨＮＯ３によって１回洗浄した。ナノ粒子を数日間攪拌した後、コロイド分散液が得られ、最終的にはこれを０．２μｍでろ過し、これより大きいナノ物体を除去した。先の透析段階の後、アミンを１滴加えて、中性水で安定なマグネタイトナノ粒子Ｆｅ３Ｏ４の分散液を得、最終的にはこれを０．２μｍでろ過し、これより大きいナノ物体を除去した。
【０１９０】
Ａ．１．３．ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の形成
蛍光性分子をＴＨＦ（５０μＬ）に溶かした０．１重量％ストック溶液を、ボルテックスミキサーを用いて攪拌しているマグヘマイトナノ粒子の０．００６重量％溶液（２．５ｍＬ）に注入した。磁性ナノ粒子の硝酸溶液を用いた場合、蛍光性分子と酸化鉄ナノ粒子とを含みｆｌｕｏ＠ｍａｇと称されるハイブリッドナノ粒子の形成が即時に起こる。
【０１９１】
Ａ．２．物理化学的特徴付け
Ａ．２．１．ナノ集合体の特徴付け
方法。６３３ｎｍで作動する４ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅレーザーと１７５°の角度で後方散乱光を収集する光電子増倍検出器とを備えたナノ粒子サイズ分析機であるＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  ＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ）によりナノ集合体の流体力学的直径およびサイズ分布を決定した。ナノ集合体の水溶液を用いて２０℃で測定を実施した。各試料について、コレログラムの自動調整を伴う多重取得モードで強度測定を実施し、３回の取得の測定値の平均値を求めた。各コレログラムをキュムラントアルゴリズムに当てはめることにより、ナノ粒子の平均サイズおよび分布幅を求めた。
【０１９２】
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  ＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いて表面電位ζの測定を実施した。試料をプラスチック製のセルに入れた。既定の操作手順に従い、各試料について測定を数回実施した。
【０１９３】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＦ２０００−ＦＥＧ）によりナノ集合体の形態を調べた。裸のγ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子を希硝酸に分散させて調製したｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子については、穴開カーボン被覆金グリッド（３００メッシュ）にナノ集合体の溶液を載せ、それ以外の化合物についてはすべて、穴開カーボン被覆銅グリッド（３００メッシュ）にナノ集合体の溶液を載せた。
【０１９４】
結果。ＤＬＳおよびＴＥＭによるｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の測定では一定して、極めて狭いサイズ分布の平均直径９０〜１００ｎｍが得られた。ナノ集合体のコロイド懸濁液は、ゼータ電位測定法で測定した場合に負に帯電した表面（ζ＝−３３ｍＶ）により、希硝酸中で数か月間にわたって安定であった。ＴＥＭイメージングでは、γ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子と有機ナノスフェアとの接点でラズベリー様集合体が明らかとなり、これは水溶液中での相分離による蛍光性分子の自己凝集が原因であった。
【０１９５】
２．２．光物理的測定
方法。Ｖａｒｉａｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃａｒｙ  ５Ｅ分光光度計に積分球ＤＲＡ２５００を用いてＵＶ−可視吸収スペクトルを記録した。Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ社の蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ２）を用いて補正発光スペクトルを得た。ＥｔＯＨ中のクマリン５４０Ａ（φｆ＝０．３８）から溶液中での蛍光量子収率φｆを求めた。Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社の装置（二次元レーザーダイオードアレイおよび２つのＬＢＯ結晶によって励起される２つのＹＡＧレーザー（Ｍｉｌｌｅｎｎｉａ社）によって励起されるチタンサファイアＴｓｕｎａｍｉレーザー）によって生じる４５０ｎｍのフェムト秒レーザー励起を用いた時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）により、モノクロメータ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＭＣＰ  Ｒ３８０９Ｕ光電子増倍管）を用いて５８０ｎｍにおける蛍光強度減衰を測定した。光音響結晶により４ＭＨｚの繰り返し率で９００ｎｍにおける光パルスを選択した後、４５０ｎｍで２倍にした。
【０１９６】
【表４】
2020143285.tif 000017
【０１９７】
結果。得られたｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の定常状態発光スペクトルは、エネルギー（浅色シフト５ｎｍ）および強度（φｆ＝０．０１）の点で蛍光ナノスフェアと極めて類似しているように見えた。このような強い類似性は、コアに含まれ境界面から隔離された蛍光性分子が主として寄与していることに起因する。境界面では、水と蛍光性分子との間の振動カップリングにより蛍光ナノスフェアの部分的発光消光が起こった。ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体では、このような消光は、周辺部の蛍光性分子から接している酸化鉄ナノ粒子まで電子が移動することにより生じ、その範囲はわずか数ナノメートルであり、コア内部の蛍光性分子には全く影響を及ぼさない。実際、時間分解蛍光の測定により蛍光減衰の短縮が観察された。寿命定数は蛍光ナノスフェアの方が長く、１．４９ナノ秒と評価され、ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体ではこれが０．０８ナノ秒に減少した。以上の結果は、採用した逆構造が、強力な発光消光体として知られる酸化鉄ナノ粒子から蛍光性分子を隔離するものであることを強調している。
【０１９８】
２．３．磁気測定
方法。Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ社のＭＰＭＳ−５Ｓ  ＳＱＵＩＤ磁力計を温度２９８Ｋおよび磁場範囲０〜２Ｔで作動させて、ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子のコロイド懸濁液（［Ｆｅ］約６．５×１０５ｍｏｌ／Ｌ）に関する温度依存性磁化実験の結果を収集した。磁気双極子間相互作用を回避するために十分に試料を希釈した。ＺＦＣ試料で２９８Ｋにてヒステリシスループを実施した。
【０１９９】
結果。３００Ｋで印加した磁場の関数として表した磁化曲線は、超常磁性ナノ粒子に典型的な極めて低い保磁力を示す。ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の飽和磁化値ＭＳは２２ｅｍｕ／ｇ（２２（Ａ・ｍ２）／ｋｇ）であることがわかった。ＭＳ値がバルクマグヘマイト（７５〜８０ｅｍｕ／ｇ（７５〜８０（Ａ・ｍ２）／ｋｇ））に比して減少したのは、蛍光性分子が表面に化学吸着したことにより生じた表面異方性の増大に起因するものであり得る。元素分析から求めた鉄の質量を考慮に入れて磁化曲線をフィットさせると、７．２９ｎｍ（幅δ＝０．２５）にピークのあるサイズ分布が得られ、最初のナノ粒子の平均直径（ＤＨ＝８．１ｎｍ）とまずまず一致する。このような値は、γ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子が吸着させても依然としてその超常磁性挙動を保持することをどちらかと言うと示す。
【０２００】
第Ｂ部−ポリマーナノ集合体システム
ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を適切な高分子電解質（すなわち、ポリマー）でコートすることにより、水性媒質中で凝集も解離も起こらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に適した安定なナノ集合体のコロイド溶液が得られる。次いで、それを凍結乾燥させると、構造的および機能的特性を全く失わずに様々な化学的性質およびイオン強度の媒質に再分散させることができる長期間保管用の微粉末が得られる。
【０２０１】
Ｂ．１．合成手順
以下のプロトコルは、ポリマーとしてＰＡＡ高分子電解質（Ｍｗ＝１．８〜２．２ｋＤａ）を用いることにより蛍光性磁性ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体を安定化させる工程を説明するものである。目的とする様々な媒質中で生物学的に使用する安定化されたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体の凍結乾燥を説明する。
【０２０２】
Ｂ．１．１．ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体の合成
マグヘマイトナノ粒子を用いた合成。蛍光性化合物（Ｉｂ）をＴＨＦに溶解した溶液（５０μＬ、０．１重量％）をマグヘマイトナノ粒子の硝酸溶液（２．５ｍＬ、０．００６重量％、ｐＨ＝１．２）に激しく攪拌しながら加えた。数秒後、磁性蛍光性ナノ集合体（Ｉｂ）−ｆｌｕｏ＠マグヘマイトが形成された。ポリ（アクリル酸）（２．１ｋＤａ、５ｍｇ）を粉末で加え、ｐＨ＝９に達するまで攪拌下で水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）を滴加した。得られた半透明の溶液をさらに３０分間攪拌し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒメンブレン（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いて、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の溶液の最終ｐＨの値が７に達するまで２４時間にわたってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して透析した。
【０２０３】
マグネタイトナノ粒子を用いた合成。化合物（Ｉｂ）をＴＨＦに溶解した溶液（５０μＬ、０．１重量％）をマグネタイトナノ粒子の水溶液（２．５ｍＬ、０．００６重量％）に激しく攪拌しながら加えた。数時間後（通常、２時間後）、磁性蛍光性ナノ集合体（Ｉｂ）−ｆｌｕｏ＠マグネタイトが形成された。ポリアクリル酸（２．１ｋＤａ、５ｍｇ）を粉末で加えた後、ｐＨ＝９に達するまで攪拌下で水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）を滴加した。得られた半透明の溶液をさらに３０分間攪拌し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ膜（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いて、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（２）の溶液の最終ｐＨの値が７に達するまで２４時間にわたってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して透析した。最後にこのナノ集合体の懸濁液を４℃で保管した。
【０２０４】
Ｂ．１．２．凍結乾燥
得られたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体を固体状態で長期間にわたって保管するため、様々な体積（１ｍＬ〜３ｍＬ）のナノ粒子溶液を液体の高さが１ｃｍを超えないようにガラス製バイアルに入れた。液体窒素を用いて溶液を凍結させた。９時間〜１２時間にわたって凍結乾燥を実施して暗赤色の粉末を得、これを窒素雰囲気下で−１８℃にて保管した。
【０２０５】
Ｂ．１．３．再分散手順
凍結乾燥試料に十分な溶媒（水、生理的媒質、エタノールなどのアルコール性溶媒）を加えることにより、ナノ集合体の再分散が容易に実施された。ナノ集合体は再分散時に凝集を起こさないため、超音波処理を一切必要としなかった。再分散溶媒を加える量に応じて０．６〜３×１０−３ｍｏｌ／Ｌの範囲、さらには０．６〜７×１０−３ｍｏｌ／Ｌの範囲の鉄濃度を得ることができた。
【０２０６】
Ｂ．２．物理化学的特徴付け
サイズ、表面電位、組成、光物理的特性および緩和特性に関するｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の特徴付けについて記載する。ＤＬＳ、ＴＥＭおよびＵＶ−可視吸収測定（積分球ＤＲＡ２５００を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃａｒｙ  ５Ｅ分光光度計を用いてＵＶ−可視吸収スペクトルを記録した）により、時間および溶媒の性質の関数としてコロイド懸濁液の安定性を調べた。質量分析および磁気沈降の両方により組成（コア内の蛍光性分子およびシェルの磁性ナノ粒子の数）を明らかにした。
【０２０７】
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）のＤＬＳおよびＴＥＭ測定では、平均直径が１２０〜１５０ｎｍであることがわかった。ＤＬＳ測定を水中で実施すると一般に、第一水和圏により直径がわずかに大きくなる。ナノ集合体は水中で、室温では５か月間にわたって安定であり、４℃ではほぼ１年にわたって安定である。サイズ分布は、ＤＬＳおよびＵＶ−可視吸収測定によって示されるように、凍結乾燥後および様々な媒質（水、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、エタノール）に再分散させた後もほとんど変化せず、同時に実施したＤＬＳおよびＴＥＭによる分析とも一致する。超音波によりナノ集合体が解離しないことから、ＰＡＡコーティングによって確保されるｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の接着もまた超音波によって証明される。組成を決定することが可能な質量分析法による分析および磁気沈降ではデータの収束がみられ、具体的には、コアは約１０５個の有機分子からなり（単一ナノ粒子光吸収測定値を含めたこれまでの結果と一致する）、約１０４個のマグヘマイトナノ粒子のシェルに取り囲まれていた。緩和度の測定から、磁性シェルの中に集合する隣り合う酸化鉄ナノ粒子の間に大きな協調効果があることがわかる。ナノ集合体に観察されたｒ２／ｒ１比の３倍の増大は、コントラストの高いＴ２強調ＭＲＩを可能にするものである。最後に、定常状態および時間分解蛍光測定は、マグヘマイトナノ粒子シェルが果たす保護的役割から予想されるように、蛍光シグナルが周囲媒質による影響を受けないことを示している。
【０２０８】
Ｂ．２．１．サイズの特徴付け
形成後、凍結乾燥−再分散工程後および超音波処理実施後にｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）のサイズ特徴付け（ＤＬＳおよびＴＥＭ測定）を実施した。再分散後、凍結乾燥前の最初の溶液よりも濃度の高い溶液でも、ＤＬＳにより凝集は観察されない。さらに、超音波処理後にナノ集合体の解離は全く観察されない。
【０２０９】
ＴＥＭにより特徴付けを実施する集合体を穴開カーボングリッドに載せ、室温で乾燥させた。ＭＯ−Ｊｅｏｌ  ＭＥＴ１２３０を電圧８０ｋＶで作動させて観察（図３）を実施した。
【０２１０】
Ｂ．２．２．コロイド安定性
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の安定性を、時間の関数としてｐＨおよびイオン強度の異なる様々な溶液で調べた。
【０２１１】
合成の直後および数か月後に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に分散させたナノ集合体のＤＬＳおよびＴＥＭ測定を実施した。その結果は、ナノ集合体構造の安定性が高いことを示している（ＴＥＭ−図３）。
【０２１２】
ＵＶ−可視光吸収分析を時間の関数として４５０ｎｍでも同様に実施し、コロイド安定性を追跡した。不安定なナノ粒子の分散液の場合、通常、沈降が観察されると吸光度が低下する。１１日後の吸光度の低下が２％未満であることから、ナノ集合体を水に入れても、またはＨＢＳＳもしくはＰＢＳ緩衝液に再分散させても、そのコロイドとしての性質が極めて安定であることを証明している。
【０２１３】
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体の流体力学的直径の分布の測定を、様々な媒質を用いて、室温で様々な保管期間でも同様に実施し、コロイド安定性を評価した。予め凍結乾燥させたナノ集合体を純水またはＰＢＳと１０％ウシ血清とからなる生理的媒質に再分散させたところ、流体力学的直径の分布に有意な変化はみられなかった。ウシ血清のみ（１００％）からなる媒質にナノ集合体を分散させた場合、ナノ集合体表面へのタンパク質の非特異的吸着により平均直径のわずかな増大が観察される。２４時間後、流体力学的直径がわずかに増大したにもかかわらず、なおもデカンテーション、沈殿ともにさらに観察されることはなかった。したがって、ナノ集合体は高濃度の血清（最大１００％）中でも独特の安定性を示す。
【０２１４】
ナノ集合体は、−３１ｍＶ未満の有意な表面電位ζにより、ナノ集合体間で効率的な静電反発力が生じることから、広範囲にわたるｐＨ（３〜１２）で安定である。その結果、０．３ｍｏｌ／Ｌまでの様々なイオン強度の媒質中でも凝集は全く観察されず、このことは、通常イオン強度が高い媒質を扱う生物学的適用に有益である。
【０２１５】
Ｂ．２．３．組成の決定
有機性コア表面の酸化鉄ＮＰの量を決定する試験を質量分析および磁気沈降それぞれにより実施した。ＩＣＰ−ＡＥＳ測定（誘導結合プラズマ−原子発光分析）によるナノ集合体の鉄含有量の滴定も同様に実施してもよい。
【０２１６】
Ｄｏｕｓｓｉｎｅａｕら，Ｒａｐｉ．Ｃｏｍｍｕｎ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１，２５，６１７−６２３に記載されている方法に従って質量分析実験を実施した。蛍光ナノスフェアおよびｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）のモル質量分布を記録した。蛍光性有機ナノスフェアからｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）に移行する際の重量の顕著な増大（つまり、８６ＭＤａ）は主として、ナノ集合体１個当たり約２×１０４個と評価される酸化鉄ナノ粒子の量と相関させることができる。これらの測定からまた、有機性コア１個当たりの蛍光性分子の量が確認され、その値は約１０５個である。
【０２１７】
磁気デカンテーション実験を実施して、５５２ｎｍおよび４４６ｎｍでの正規化吸光度の時間発展を分析した。希硝酸（ｐＨ＝１．２）に分散させたマグヘマイトナノ粒子の溶液および水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の溶液を用いて磁気沈降を実施した。
【０２１８】
単一マグヘマイトナノ粒子分散液およびｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）分散液の磁気沈降の測定値を比較すると、後者がより強い沈降性を示し、後者の磁気含有量が高いことと一致する。吸光度減衰のモデリングにより、ナノ集合体の磁性シェルが約１０４個のマグヘマイトナノ粒子を含むことが示され、質量分析によって得られたデータと一致した。
【０２１９】
Ｂ．２．４．緩和度測定
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の希釈溶液の緩和度測定（１Ｈ  ＮＭＲのＴ１縦緩和およびＴ２横緩和時間）を実施した。
【０２２０】
試料の希釈溶液（ν＝２００ＭＨｚおよび３００ＭＨｚ）を用いて、Ｔ１については１０ｋＨｚ≦ν≦２１２ＭＨｚ、Ｔ２については１５ＭＨｚ≦ν≦６０ＭＨｚの範囲の様々な周波数νにおける１ＨのＴ１縦緩和およびＴ２横緩和時間の測定を室温で実施した。４．７Ｔの磁場を印加し、Ｔｅｃｍａｇ  Ａｐｏｌｌｏ分光計を２００ＭＨｚで稼働させて、様々な濃度のナノ集合体の水溶液についてプロトンのＴ１およびＴ２緩和時間の測定を室温（３００Ｋ）で実施した。縦緩和および横緩和で観察された速度はともに、ナノ粒子濃度に対する線形従属を示した。Ｔ１およびＴ２を測定する反転回復シーケンスおよびスピンエコー（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｍｅｉｂｏｏｍ  Ｇｉｌｌ）シーケンスを用いて、ナノ粒子濃度に対する１／Ｔ１および１／Ｔ２曲線のプロットの傾きから縦ｒ１および横ｒ２緩和度を算出した。図４および５はそれぞれ、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）およびＰＡＡでコートし分散させた酸化鉄ナノ粒子の横緩和度および縦緩和度を周波数の関数として表したものである。
【０２２１】
分散させた酸化鉄ナノ粒子よりもｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）のほうが横緩和度ｒ２の値が高い。縦緩和度ｒ１は逆の傾向で変化する。Ｔ２強調ＭＲＩに関してナノ集合体がＴ２の値が高くｒ２／ｒ１比の増大が大きいことは、ナノ集合体表面の酸化鉄ナノ粒子の間に極めて明確な相加効果があることを示している。参照物質の単離鉄ナノ粒子にはこのような相加性はない。
【０２２２】
Ｂ．２．５．光物理的特性
様々な媒質に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の定常状態の吸収および発光測定（図６）、時間分解蛍光測定および広視野蛍光顕微鏡観察を実施して、その発光強度およびスペクトル範囲の特徴を明らかにした。
【０２２３】
【表５】
2020143285.tif 000018
【０２２４】
安定化していないｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子と比較して、ＰＡＡコーティングの存在が発光特性に及ぼす有意な影響は観察されなかった。蛍光シグナルも周囲の溶液の性質に対して非感受性であった。これにより、特に予想されない限り、蛍光強度も色も変化させる必要なく、生物学的媒質中のナノ粒子を正確に検出することが可能になる。蛍光性コアの吸収帯でｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡを励起させれば効率的な蛍光シグナルが検出される。コアの発光強度が純粋な蛍光ナノスフェアに比してわずかに低下するのが観察されたが、発光がマグヘマイトナノ粒子の吸収帯に比して赤色シフトすることにより、有害なマグヘマイトナノ粒子による発光再吸収が回避される（図６）。この効果は、電子がコアからマグヘマイトナノ粒子の鉄（ＩＩＩ）イオンに移動することによるものである。実際、文献に通常報告され、周囲の各蛍光単位が酸化鉄ナノ粒子と直接接している通常の構造またはドープ構造では、このような発光消光ははるかに強い。
【０２２５】
Ｂ．３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
ナノ集合体の取込みおよびその細胞毒性作用を検討するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究用によく知られたモデル細胞として２種類の異なるヒト細胞株（ＨＥＫ２９３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を用いる。蛍光顕微鏡観察およびＴＥＭイメージングを実施して、細胞内でのナノ集合体の蛍光特性および配置の特徴を明らかにする。
【０２２６】
主な結果。ナノ集合体の細胞内取込みは６〜８時間以内に起こる。細胞毒性ＭＴＴ試験から、Ｆｅ濃度をｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ実験に使用するもの同じ１５μｍｏｌ／Ｌにして細胞培養しても、細胞生存能は阻害されないことがわかる。生細胞の蛍光顕微鏡イメージングでは、細胞内に可動性のオレンジ色の明るいスポットがみられ、内部移行したナノ粒子の有意な凝集は全く認められない。蛍光性有機ナノスフェアとの比較実験から、ＰＡＡコーティングにより高い構造剛性がもたらされるため、ナノ集合体が細胞内で解離することはないことがわかる。以上の結果は、ナノ集合体の構造が無傷であることおよび酸化鉄ナノ粒子が有機コア周囲に環状に配置していることを示す細胞の二次元ＴＥＭイメージングによって裏付けられる。
【０２２７】
Ｂ．３．１．手順
細胞のインキュベーション。細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、Ｉｂｉｄｉ社の８ウェルプレート上で少なくとも２４時間、３７．７℃でインキュベートした。７２時間にわたる実験に５０００個の細胞をインキュベートした。ＭＤＡ細胞は、１０％のウシ胎仔血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で増殖させた。ＨＥＫ細胞は、１０％のウシ胎仔血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（高グルコース、グルタミン添加）で増殖させた。
【０２２８】
ナノ集合体の内部移行。水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ粒子（１）の溶液（１０〜２０μＬ）を蛍光性分子および鉄の最終濃度が約１×１０−６ｍｏｌ／Ｌおよび２×１０−５ｍｏｌ／Ｌになるように細胞培地に加えることにより、内部移行を実施した。ナノ集合体が確実に効率的に細胞内に取り込まれるように懸濁液を６時間インキュベートしたが、わずか３時間後には既に細胞内取込みを観察することができた。
【０２２９】
Ｂ．３．２．細胞生存率
ＭＴＴ試験：５０００個の細胞を適切な培地（２００μＬ）で２４時間増殖させた。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の溶液と様々な時間の間インキュベートした。ＭＴＴ試験を用いることにより細胞生存率を評価した。ＭＴＴの溶液（２０μＬ；５ｍｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、さらに２時間〜２時間３０分インキュベートした。上清溶液を除去し、ＤＭＳＯ（２００μＬ）を加えて、着色した酸化産物を溶解させた。５７０ｎｍでの吸光度を読み取って参照細胞と比較することにより、インキュベートした細胞の生存率がわかる。
【０２３０】
ＭＴＴ試験から、鉄含有量がすべてのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験によく用いられる濃度である１５μｍｏｌ／Ｌであるナノ集合体溶液に関して細胞毒性はほとんと認められない（細胞生存率が９５％を上回る）ことがわかる。鉄の濃度が極めて高い（３００μｍｏｌ／Ｌ）場合、ＨＥＫ細胞のみが有意な死亡率を示し、このことは、過剰の鉄（３００〜５００μｇ／ｍＬ）によって引き起こされる酸化ストレスの増大と一致する。
【０２３１】
Ｂ．３．３．内部移行したナノ集合体の生細胞での蛍光顕微鏡観察
反転モードで作動するＬＳＭ（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  Ｓｉ、油浸対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏ、×６０、１．４、λｅｘｃ＝４８８ｎｍ）を用いて共焦点モードで、または倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ、油浸対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏ、×６０、１．４、λｅｘｃ＝４８２ｎｍ）を用いて広視野モードで蛍光顕微鏡観察を実施した。
【０２３２】
内部移行したナノ集合体（１）は、細胞内で有意な凝集を受けることなく、図７ａのスポットとして明確に識別することができる。核内にはスポットは全く識別されず、ナノ集合体が細胞質内に留まり、核内に侵入しないことを示している（図７ｂ）。
【０２３３】
内部移行したナノ集合体のＴＥＭイメージング：
−４５〜５０℃の寒天溶液にＨＥＫ細胞を加える；
−０．１Ｍリン酸塩溶液および３％グルタルアルデヒドを用いて寒天ゲルの小片を４℃で２時間固定する；
−リン酸塩緩衝液およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で洗浄する；
−四酸化オスミウムのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水溶液（１％）を用いて１時間、後染色し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水を用いて繰り返し洗浄する；
−エタノール浴を用いて、エタノールの濃度を漸増させながら（３０％、５０％、７０％、８５％、９５％、１００％）１時間脱水する；
−１００％エタノール浴を用いて脱水する（２時間および４℃で一晩）；
−エタノールを酸化プロピレンに入れ換える；
−ＥＰＯＮ樹脂に包埋する；
−５５℃で１日および７２℃で６０時間、重合させる；
−薄切後、酢酸ウラニルで３０分間染色し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水を用いて洗浄する。
【０２３４】
ＴＥＭイメージング（図８）から、細胞取込み後、コントラストの付いた酸化鉄ナノ粒子が細胞エンドソーム内に包埋されているのがわかる。注目すべきことは、マグヘマイトナノ粒子が、ナノ集合体の球状のコア−シェル構造を思わせる円盤様の配置に従って構築されている点である。生細胞内に強い蛍光が検出されることから、これらのＴＥＭ画像は、接着性のＰＡＡコーティングのおかげで磁性シェルが有機コアから解離することなく、ナノ集合体が内部移行後もその完全性を維持することを示している。
【０２３５】
Ｂ．４．ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
一連の５匹のマウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ磁気共鳴イメージングを実施した。マウスを安楽死させた後、摘出した臓器をスライスし、組織の自家蛍光を最小限に抑えるため、１光子および２光子励起を用いて蛍光顕微鏡観察を実施した。ナノ集合体のイメージングの空間解像度を高めるため、肝臓の超薄スライス（厚さ７０ｎｍ）を用いて透過型電子顕微鏡測定（ＴＥＭ）を実施した。
【０２３６】
Ｂ．４．１．小型げっ歯類を用いた磁気共鳴イメージング
手順。５匹の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（５週齢）にＭＲＩ分光計ＢｉｏＳｐｅｃｔ  ４，７Ｔ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いてＴ２強調ＭＲＩ実験を実施した。シーケンス（Ｔ２＊モード）のエコー時間ＴＥおよび繰返し時間ＴＲをそれぞれ５ｍｓおよび３００ｍｓに設定した。この分析を実施するにあたっては、Ｆｅ濃度１３μｍｏｌ／ｋｇマウスを選択した。
【０２３７】
１分間の心拍数が３０回になる濃度のイソフルランガスを用いてマウスを麻酔した。ナノ集合体を注射する前に、参照として肝臓の画像を記録した。ＨＢＳＳ緩衝液を用いたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の懸濁液（２５０μＬ、Ｆｅ濃度１．３μｍｏｌ／ｍＬ）をマウス尾静脈に注射した。２０〜３０分後、ＭＲＩを実施した。ＥＮＨは脾臓が平均−１３％、肝臓が平均−４９％であった。
【０２３８】
結果。ナノ集合体表面の酸化鉄ナノ粒子間の磁気協調作用を観察するため、ＭＲＩイメージングを実施した。図９および１０に示されるように、個々の酸化鉄ナノ粒子によく用いられる濃度（文献の平均濃度：４０〜７０μｍｏｌ  Ｆｅ／ｋｇ）よりも低い鉄濃度（１３μｍｏｌ  Ｆｅ／ｋｇ）を用いたＴ２＊イメージングにより、ネガティブコントラストが得られた。注射から３時間５０分後、コントラストの発展は観察されなかった。
【０２３９】
Ｔ２強調ＭＲＩ実験は、１５０ｎｍサイズのナノ粒子に対するマクロファージ動員によるナノ集合体の除去の大部分に関与する主要臓器（脾臓および肝臓）に着目するものである。肝臓および脾臓では、注射から２０〜２５分後にＴ２＊コントラストの明らかな減少が観察される。この観察結果は、ナノ集合体が効率的に取り込まれたことを示している。観察結果はまた、用いるＦｅ濃度が低くても、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体がＭＲＩ造影剤としての役割を効率的に果たすことも示している。この結果は、ｒ１縦緩和度とｒ２横緩和度のｒ２／ｒ１比が高いことと関係があるものと考えられる（項目Ｂ．２．４．を参照されたい）。
【０２４０】
Ｂ．４．２．スライス組織の蛍光顕微鏡観察
組織薄切手順。注射から２４時間後、マウスを屠殺した。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）の生体内分布を評価するため、ｅｘ  ｖｉｖｏ分析用に５種類の臓器（肝臓、脾臓、腎臓、肺および心臓）を採取した。臓器を、４℃の亜鉛含有固定液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、フランス）に４８時間、次いで４℃の４重量％パラホルムアルデヒド−２０重量％スクロース溶液に２４時間、連続して浸漬させた。最後に、液体窒素の蒸気を用いてＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ社）の中で凍結させた。亜鉛含有固定液は、固定工程で蛍光性分子が弱まるのを防ぐ。凍結させた臓器は使用するまで−８０℃で３０日間保管した。クリオトームクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｃｕｔ  ２０３０）を用いて、−２０℃で厚さ１０μｍの切片に切断した。切片を直ちにスーパーフロストガラススライドに載せ、２時間乾燥させた後、Ｐｒｏｌｏｎｇ（細胞核染色剤のＤＡＰＩを含有する、または含有しないもの）で処理し、上部カバースリットで保護して、顕微鏡イメージングを可能にした。切片を観察する前に少なくとも７２時間、４℃で放置した。
【０２４１】
計測。反転モードで作動する２種類のＬＳＭを用いて共焦点モードで蛍光顕微鏡観察を実施した：
−１光子蛍光イメージング：励起源であるＡｒ＋およびＨｅ−Ｎｅレーザーを備えたＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  Ｓｉ（油浸対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏ、×６０、１．４、λｅｘｃ＝４８８ｎｍを使用）−ＩＲＳＵＮ社／ナントとの共同研究；
−２光子蛍光イメージング：波長可変Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザー（Ｍａｉ  Ｔａｉ、７１０〜９２０ｎｍ）およびマルチスペクトルイメージングが可能な３２チャンネルＱＵＡＳＡＲ  ＧａＡｓｐ検出器を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０。画像はすべて、８３０ｎｍで励起させ、２種類の検出チャンネル（４５０（±３５）ｎｍの青を中心とするチャンネルと６５４（±１０４）ｎｍの赤を中心とするチャンネル）を用いて取得した−ＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ／ベルギーとの共同研究。
【０２４２】
結果。蛍光顕微鏡イメージングでは、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体がスライス組織内の明るい発光スポットとして明確に識別され、細胞核への侵入は全くみられなかった。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体は２光子励起に効率的に応答し、組織透過ウィンドウでのより高い局在解像度およびＮＩＲ研究を可能にするものであった。除去過程と同じく、非官能基化ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体のほとんどが肝臓に蓄積し、程度は少ないにせよ脾臓にも蓄積した。より小さいナノ粒子（数ｎｍサイズ）の除去に関与する腎臓には、ごく少数のナノ集合体がみられたのに対し、肺および心臓には全くみられなかった。
【０２４３】
特に、肝臓または脾臓のような色素の多い組織には強い自家蛍光がみられるにもかかわらず、１光子または２光子励起下でもナノ集合体の発光が明確に識別された。ナノ集合体は、５２０ｎｍを中心とする自家蛍光に比して適切に赤方シフトした５８０ｎｍを中心とする蛍光シグナルを発する小さい極めて明るいスポットとして局在するように思われる。スポットの寸法は、光散乱を考慮に入れると単一のナノ集合体の寸法に近く、ナノ集合体がｉｎ  ｖｉｖｏで凝集も解離もしないことが示唆される。蛍光顕微鏡イメージングから、ナノ集合体が肝細胞の細胞核に侵入しないことがわかる。ナノ集合体は、組織自家蛍光と対比させる通常の観察条件下でも有意な退色を全く示さず、標的化剤で適切に官能基化すれば、ナノ集合体の正確な局在化が可能になるはずである。
【０２４４】
Ｂ．４．３．スライス組織の透過型電子顕微鏡観察
手順および試薬
カコジル酸ナトリウム緩衝液０．２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝７．４（１年以上保管−５００ｍＬ）。カコジル酸ナトリウム三水和物（２１．４ｇ）、塩化カルシウム二水和物（２５ｍｇ）および塩化マグネシウム六水和物（５０ｍｇ）を蒸留水（４５０ｍＬ）に溶解した。磁気攪拌下で０．５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を加えることにより混合物のｐＨを調整した。最後に蒸留水を加えて全量を５００ｍＬに調整した。
【０２４５】
組織固定。組織の構造を保存するため、組織を最初にグルタルアルデヒド（２．５重量％／体積）で２時間固定した。次いで、組織をカコジル酸緩衝液で１０分間洗浄し、２％四酸化オスミウムで１時間、後固定した。組織をカコジル酸緩衝液に２回、それぞれ５分間浸して洗浄した。
【０２４６】
脱水。組織脱水を以下の通りに実施した：５０％エタノールで１０分間、７０％エタノールで１０分間、９０％エタノールで１５分間、１００％エタノールを２回交換してそれぞれ１５分間、酸化プロピレンを３回交換してそれぞれ１５分間。
【０２４７】
樹脂包埋。樹脂：酸化プロピレンの１：２混合物を３０分間、樹脂：酸化プロピレンの１：１混合物を３０分間および樹脂：酸化プロピレンの２：１混合物を３０分間、連続で用いて樹脂浸透を実施した。試料をすべて新鮮な樹脂に周囲温度で一晩または４℃で１〜２日間入れた。６０℃のオーブンで４８時間、重合を実施した。
【０２４８】
試料（ブロック）薄切。ブロックはすべて、ダイヤモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ社）を搭載したクリオウルトラミクロトーム（モデルＲｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓ）を用いて厚さ７０ｎｍの切片に切断した。切片を穴開カーボンコート銅グリッド（Ｄｅｌｔａ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｅｓ社）の色の濃い側に載せた。
【０２４９】
後染色。グリッドを酢酸ウラニルの５０％エタノール飽和溶液に室温で２５分間浮かべ、蒸留水で手短に２回洗浄した。グリッドをクエン酸鉛の液滴の上に１０分間置き、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで２回洗浄し、最後に蒸留水で２回洗浄した。
【０２５０】
結果。これまでに、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩおよび蛍光組織蛍光顕微鏡実験により、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体が肝マクロファージによって取り込まれることを示す証拠が明らかになった。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体のイメージングの空間解像度をさらに高めるため、肝臓の超薄スライス（厚さ７０ｎｍ）を用いて透過型電子顕微鏡測定を実施した。ＴＥＭイメージングでは、ナノ集合体の「ラズベリー」様構造が完全な状態で維持されている（図１１）ことから、静脈内注射によりマウスに投与したナノ集合体の完全性が明確に示された。この重要な観察結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射後も磁性シェルと蛍光性コアとの間の高い接着性を証明し、正確でマルチモーダルな横断的診断が可能であること示している。
【０２５１】
第Ｃ部−官能基化ナノ集合体
Ｃ．１．葉酸による官能基化
ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体は、ナノ粒子の細胞内移行の速度を増大させる葉酸（ＦＡ）などの生物学的に活性な分子でコートし得る。酸化鉄ナノ粒子の外層に対して錯体を形成するカルボキシル単位があることから葉酸を選択した。
【０２５２】
ＦＡによるバイモーダルｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の錯体化は実現可能であるが、ただし、得られたナノ集合体ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡは暗所で４℃にて保管する。得られた構造ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡを用いて実施した定常状態および時間分解蛍光測定では、ＦＡがナノ集合体の表面に強固にグラフトされることが確認された。
【０２５３】
合成手順。蛍光化合物（Ｉｂ）をＴＨＦに溶解した溶液（５０μＬ、０．１重量％）をマグヘマイトナノ粒子の硝酸溶液（２．５ｍＬ、０．００６重量％、ｐＨ＝１．２）に激しく攪拌しながら加えた。数秒後、磁性蛍光性ｆｌｕｏ＠ｍａｇが形成された。混合物に葉酸（５当量超、１ｍｇ）を加えた後、ｐＨ＝８に達するまで磁気攪拌下で水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）を滴加した。得られた半透明の溶液をさらに３０分間攪拌し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒメンブレン（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して３〜４時間にわたって透析し、過剰な葉酸を除去した。ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子が凝集し始めると、クエン酸三ナトリウム塩（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）の存在下で透析を数時間実施した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して最後の透析段階を実施して、過剰なクエン酸イオンを除去した。得られた官能基化ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡナノ集合体は、時間の経過とともに葉酸単位が脱錯体するのを避けるため、４℃で保管した。
【０２５４】
光物理的特徴付け。定常状態および時間分解蛍光測定を用いてｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子上でのＦＡの錯体形成を検出することができた。電子が励起状態のＦＡから酸化鉄ナノ粒子に迅速に移動したことにより、ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子との錯体形成後に強い発光のｆｌｕｏ＠ｍａｇが青色蛍光のＦＡを消光するのが観察された。これに対し、葉酸を単に酸化鉄γ−Ｆｅ２Ｏ３の懸濁液と混合した場合、一部のみの錯体化により、有意な青色発光消光は検出されなかった。したがって、これらの結果から、単離マグヘマイトナノ粒子に関して酸化鉄ナノ粒子の全体の協調的錯体形成挙動が示された。しかし、ＰＡＡがｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ粒子を強固にコートするのと比較すると、ＦＡでは時間の経過とともに脱錯体が起こる。したがって、強い青色シグナルが検出されれば錯体を形成していないＦＡがあることを示し、このことを利用して、生細胞を７２時間インキュベートした後に葉酸が放出されることを示した。以上の結果は、ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体およびｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体を適切に官能基化すれば、薬物カーゴとして使用できる可能性を開くものである。
【０２５５】
生細胞の蛍光顕微鏡イメージング。ＨＥＫ細胞を葉酸コートｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体（ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡ）とインキュベートし、広視野蛍光顕微鏡により観察した。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡは効率的にＨＥＫ細胞に内部移行した。インキュベーションから７２時間後ではｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＦＡに葉酸の脱錯体による青色の発光がみられたのに対し、わずか２０時間後ではそのような発光はみられなかった。オレンジ色の代わりに緑色の発光がみられたのは、確実に強固に接着させることがわかっているＰＡＡコーティングがなかったことから、ｆｌｕｏ＠ｍａｇナノ集合体の分解過程に関連した。
【０２５６】
Ｃ．２．アミノクマリンによる官能基化
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体（１）に抗生物質としての役割を果たすアミノクマリンなどの生物学的に活性な分子を共有結合によりグラフトすることが可能である。アミノクマリンは、アミド結合形成を介してｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ表面と共有結合させることができアミノ官能基を示す。
【０２５７】
ナノ集合体（１）の表面にアミド結合形成を介して蛍光プローブの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＣ）を共有結合させた。得られた構造体ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ−ＡＣを用いて定常状態および時間分解蛍光測定を実施したところ、ナノ集合体の表面に強固なＡＣグラフトが確認され、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡのほうがｆｌｕｏ＠ｍａｇよりも生物学的に活性な分子の表面結合安定性が優れていることが明らかになった。このような官能基化は、今後さらに複雑な活性生体分子をグラフトする先駆けとなるものである。
【０２５８】
合成手順。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ集合体の溶液（Ｆｅ  ０．７μｍｏｌ、ＰＡＡ  １μｍｏｌ未満、２．５ｍＬ）に希硝酸（ｐＨ＝１．２）をｐＨ＝４に達するまで加えた。ボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら混合物にＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１０当量、１．４ｍｇ、１０μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０当量、１．１ｍｇ、１０μｍｏｌ）を加えた。ナノ集合体をさらに２時間攪拌した後、水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）をｐＨ＝９に達するまで加えた。次いで、ナノ粒子分散液に７−アミノ−４−メチルクマリン（４０当量、７．０ｍｇ、４０μｍｏｌ）を加え、得られた溶液をさらに１６時間攪拌した。得られた半透明の溶液を、透析浴に青色蛍光発光が観察されなくなるまで７２時間にわたって、  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒメンブレン（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して透析した。官能基化ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ−ＡＣナノ集合体を４℃で保管した。
【０２５９】
光物理的特徴付け。４４１ｎｍの蛍光シグナルを示す７−アミノ−４−メチルクマリンの表面グラフトを特徴付けるため、定常状態および時間分解蛍光実験もまた実施した（図１２）。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体の表面に固定化されたＡＣには、ＡＣ単独の水溶液に比して強い発光消光が検出された（蛍光シグナルの減少および蛍光減衰）。この消光作用は、ＡＣの発光スペクトルと蛍光性コアの吸収スペクトルとの間でスペクトルが重なっていることにより、励起状態のＡＣから蛍光性有機コアにエネルギーが効率的に移動したことによるものと考えられた。ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡ−ＡＣの蛍光減衰に観察された迅速な構成成分は、ＡＣが酸化鉄ナノ粒子に極めて接近していること、その結果ＡＣが共有結合していることに起因する（図１２ｂ）。実際、水に分散させたｍａｇ＠ＰＡＡナノ粒子の表面にＡＣを固定化した場合、このような消光作用は全く観察されなかった。効率的なエネルギー移動にはエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離が１０ｎｍより短くなければならないことから、この実験は、ＡＣとｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ＰＡＡナノ集合体との共有結合が達成されたことを明確に示している。最終的には、２週間の期間にわたって、共有結合したＡＣの漏出は全く検出されなかった。この実験は、標的化されたバイオイメージングおよび薬物送達のための生物学的に活性な目的タンパク質のバイオコンジュゲーションに向けた第一歩となるものである。
【０２６０】
Ｃ．３．マレイミドによる官能基化
ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーのバイオコンジュゲーションには、生物学的実体と効率的かつ特異的に反応することがわかっている反応基の導入が必要である。マレイミド誘導体は、タンパク質および抗体中の存在量がアミノ基に比して少ないチオール基と特異的に反応するため、特に興味深いものである。マレイミド誘導体の導入は、ポリマーシェルとマレイミド単位との間に共有アミド結合を生じさせるペプチドカップリングを介して進行する。マレイミドのグラフトは、蛍光測定で、得られた発光スペクトルの最大発光波長がカップリング前よりもわずかに浅色シフトする（Δλｍａｘ≒−１０ｎｍ）ことにより明らかになった。
【０２６１】
マレイミド誘導体。マレイミド誘導体の合成はＲｉｃｈｔｅｒら（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，１６７０８−１６７１５）に基づくものである。以下のマレイミド誘導体をｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーナノ集合体（１）とカップリングさせた：
【化１２】
2020143285.tif 000019
式中、ｘの範囲は１〜１０、好ましくは３〜５の範囲である。
【０２６２】
マレイミド官能基化ナノ集合体。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーの溶液（Ｆｅ  ４μｍｏｌｅ、１０ｍＬ）に希硝酸（ｐＨ＝１．２）をｐＨ＝４に達するまで加えた。ボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら混合物にＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（４．２ｍｇ、４０μｍｏｌ、１０当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、４０μｍｏｌ、１０当量）を加えた。ナノ集合体をさらに１時間攪拌した後、水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）をｐＨ＝９に達するまで加えた。
【０２６３】
次いで、ナノ粒子分散液に本明細書で先に示したマレイミドトリフルオロ酢酸塩誘導体（１３．５ｍｇ、４０μｍｏｌ、４０当量）を加え、得られた溶液をさらに１６時間攪拌した。得られた半透明の溶液を、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒメンブレン（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して２４時間にわたって透析した。官能基化ナノ集合体を４℃で保管した。
【０２６４】
非特異的相互作用を防ぐため、上記反応の最後の段階でマレイミド誘導体と市販のアミノＰＥＧ（１０〜３０００、Ｄａ、好ましくは約１５００Ｄａ）との混合物（１／１）をカップリングさせることも可能である。
【０２６５】
Ｃ．４．ビオチンによる官能基化
ストレプトアビジンと結合した生物学的に関心のある様々な実体と複合体を形成させるのに使用される非常に一般的なビオチンとの共有的コンジュゲーションにより、ｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーを官能基化した。ビオチンとストレプトアビジンは安定度定数の極めて高い（Ｋｄ＝１０８）アフィニティー複合体を形成することから、以下の結果は、ビオチンで官能基化したｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマーを用いて、ストレプトアビジンとコンジュゲートした生物学的実体を容易に認識することが可能であることを示している。
【０２６６】
手順。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に分散させたｆｌｕｏ＠ｍａｇ＠ポリマー集合体（１）の溶液（Ｆｅ  ２μｍｏｌｅ、５ｍＬ）に希硝酸（ｐＨ＝１．２）をｐＨ＝４に達するまで加えた。ボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら混合物にＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．８ｍｇ、２０μｍｏｌ、１０当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．４ｍｇ、２０μｍｏｌ、１０当量）を加えた。ナノ集合体をさらに１時間攪拌した後、水酸化アンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌ）をｐＨ＝９に達するまで加えた。次いで、ナノ粒子分散液にビオチン−Ｘ−カダベリン（１ｍｇ、２μｍｏｌ、１当量）を加え、得られた溶液をさらに１６時間攪拌した。得られた半透明の溶液を、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒメンブレン（標準グレード再生セルロース；カットオフ：８〜１０ｋＤａ）を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（６００ｍＬ）に対して２４時間にわたって透析した。ビオチン官能基化ナノ集合体を４℃で保管した。
【０２６７】
非特異的相互作用を防ぐため、上記反応の最後の段階でビオチン−Ｘ−カダベリンと市販のアミノＰＥＧ（１０〜３０００Ｄａ、好ましくは約１５００Ｄａ）（１／１）との混合物をカップリングさせてもよい。
【０２６８】
検出、抽出および定量化。周知のビオチン／ストレプトアビジン結合を実施することにより、生物学的に官能基化されたナノ集合体が検知剤としての役割を果たす可能性を試験した。ビオチン官能基化ナノ集合体を凍結乾燥させた後、適切な緩衝液に再分散させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８とコンジュゲートしたストレプトアビジンを加えた。室温で１時間攪拌した後、透析を実施して過剰な蛍光ストレプトアビジンを除去した。
【０２６９】
透析した溶液の蛍光発光測定では、ストレプトアビジンと結合したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に典型的な５２５ｎｍ付近の幅の狭い発光シグナルが、コアに特徴的な幅の広い赤色蛍光（６００ｎｍ超）とともに示された。このシグナルは、蛍光性ストレプトアビジンと、ナノ集合体に結合したビオチンとの結合を明確に証明するものであった。ビオチンとストレプトアビジンとの結合時にフルオロフォアであるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の発光が変化しなかったと仮定すると、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に由来する蛍光シグナル強度の測定からビオチンの量は約１００であると推定することができた。
【０２７０】
本願はさらに以下の発明をも含む。
（１）
ナノ集合体システムであって、
蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと
前記蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む、ナノ集合体および
前記ナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマー
を含み、
但し、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せを含まない、
ナノ集合体システム。
（２）
前記蛍光性有機分子が式Ｉ
【化１３】
2020143285.tif 000020
の化合物であり、式中、
Ｌが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【化１４】
2020143285.tif 000021
から選択されるスペーサーを表し、
Ｘが、Ｏ、ＣＨ２またはＮＲ８を表し、Ｒ８は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
Ｘ’がＯまたはＮＲ９を表し、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
ｎが、１、２、３および４から選択される整数を表し、
Ｒ１が−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が、それぞれメチル基を表す、
（１）に記載のナノ集合体システム。
（３）
前記磁性ナノ粒子が、γ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４からなる群より選択される超常磁性ナノ粒子である、（１）または（２）に記載のナノ集合体システム。
（４）
２０〜７００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（５）
前記蛍光性内部コアが、１×１０４〜１×１０７個の範囲の多数の有機蛍光性分子を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（６）
１×１０２〜１×１０６個の範囲の多数の磁性ナノ粒子を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（７）
前記ポリマーがイオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質である、（１）〜（６）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（８）
前記ポリマーが式ＩＩ
【化１５】
2020143285.tif 000022
のポリマーであり、式中、
ｍが、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し、
ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ独立して、０％〜１００％の範囲のｍの百分率を表し、ｘ＋ｙ＋ｚは１００％のｍに等しく、
Ｘが、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリール、−ＣＯ−アルキル、ポリ（エチレングリコール）、−ポリ（エチレングリコール）−ＯＭｅを表し、Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり、
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体から選択される反応基を表し、
Ｚが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを連結させている反応基の残基をさらに含み、
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、抗生物質、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す、
（１）〜（７）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（９）
前記ポリマーがポリ（アクリル酸）である、（１）〜（８）のいずれかに記載のナノ集合体システム。
（１０）
（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ集合体システムを製造する工程であって、攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入することと、それに続く前記ポリマーの添加段階とを含む、工程。
（１１）
生物活性基による前記ポリマーの官能基化のその後の段階をさらに含む、（１０）に記載の工程。
（１２）
（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ集合体システムを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
（１３）
（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ集合体システムを含む、薬剤。
（１４）
生理的媒質から分子および／または生物学的標的を抽出し検出するための、（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ集合体システムの使用。
（１５）
（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ集合体システムを含む、キット。
【図１】
2020143285.tif 000027
【図２】
2020143285.tif 000028
【図３】
2020143285.tif 000029
【図４】
2020143285.tif 000030
【図５】
2020143285.tif 000031
【図６】
2020143285.tif 000032
【図７】
2020143285.tif 000033
【図８】
2020143285.tif 000034
【図９】
2020143285.tif 000035
【図１０】
2020143285.tif 000036
【図１１】
2020143285.tif 000037
【図１２】
2020143285.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月30日(2020.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ集合体システムであって、
蛍光性有機分子を含む有機蛍光性内部コアと
前記蛍光性内部コアの表面に接している磁性ナノ粒子と
を含む、ナノ集合体および
前記ナノ集合体の表面に吸着した少なくとも１つのポリマー
を含み、
前記蛍光性有機分子が式Ｉ
【化１】
2020143285.tif 000039
の化合物であり、式中、
Ｌが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【化２】
2020143285.tif 000040
から選択されるスペーサーを表し、
Ｘが、Ｏ、ＣＨ２またはＮＲ８を表し、Ｒ８は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
Ｘ’がＯまたはＮＲ９を表し、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアルケンを表し、
ｎが、１、２、３および４から選択される整数を表し、
Ｒ１が−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がそれぞれ独立して、アルキルおよびエステルまたはポリ（エチレングリコール）から選択される任意選択で官能基化された基を表し、好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が、それぞれメチル基を表し、
前記磁性ナノ粒子が、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｕＦｅ２Ｏ４、およびＮｉＦｅ２Ｏ４からなる群より選択されるものであり、
前記ポリマーが、イオン性ポリマー、好ましくは高分子電解質であり、
但し、シリカ、官能基化シリカ、ドープシリカ、グラフトシリカまたはその組合せを含まない、
ナノ集合体システム。
【請求項２】
前記磁性ナノ粒子が、γ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４からなる群より選択される超常磁性ナノ粒子である、請求項１に記載のナノ集合体システム。
【請求項３】
２０〜７００ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項４】
前記蛍光性内部コアが、１×１０４〜１×１０７個の範囲の数の有機蛍光性分子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項５】
１×１０２〜１×１０６個の範囲の数の磁性ナノ粒子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項６】
前記ポリマーが式ＩＩ
【化３】
2020143285.tif 000041
のポリマーであり、式中、
ｍが、２０〜１５０の範囲の正の整数を表し、
ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ独立してｍの百分率を表し、０％〜１００％の範囲であり、ｘ＋ｙ＋ｚはｍの１００％に等しく、
Ｘが、−ＣＯＯＨ、アルキル、アリール、−ＣＯ−アルキル、ポリ（エチレングリコール）、−ポリ（エチレングリコール）−ＯＭｅを表し、Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ１−Ｒ８、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ１−Ｒ８）を表し、
Ｌ１は、１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり、
Ｒ８は、Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルケン、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、チオシアナート、イソチオシアナート、イソシアナート、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアナート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、スルファート、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバマート、イミン、アセチレン、オレフィン、ポリエン、アルキルアクリラート、オキセタン、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、正に帯電したまたは中性の金属錯体から選択される反応基を表し、
Ｚが、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｌ２−Ｒ１０、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）または−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ（−Ｌ２−Ｒ１０）を表し、
Ｌ２は、単結合または１〜１５０個の鎖原子を有するアルキル、アルケン、アリール、アリールアルキル、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリ（プロピレングリコール）連結基から選択されるスペーサーを表し、前記連結基は任意選択で、１つまたは複数の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−またはその組合せにより中断または終結されていてよく、Ｒ９はＨまたはアルキルであり；任意選択で、Ｌ２とＲ１０とを連結させている反応基の残基をさらに含み、
Ｒ１０は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、親和性タンパク質、酵素、多糖、デキストラン、ベンジルグアニン、脂質、脂質集合体、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、アプタマー、リガンド、抗生物質、基質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、合成ポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリマー微粒子、ナノ粒子、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、放射性同位元素の大環状複合体およびその組合せから選択される生物活性基を表す、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項７】
前記ポリマーがポリ（アクリル酸）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ集合体システム。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを製造する工程であって、攪拌下で磁性ナノ粒子の分散液に蛍光性有機分子の溶液を注入することと、それに続く前記ポリマーの添加工程とを含む、プロセス。
【請求項９】
生物活性基による前記ポリマーの官能基化である、その後の工程をさらに含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを含む、薬剤。
【請求項１２】
生理的媒質から分子および／または生物学的標的を抽出および検出するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システムの使用。
【請求項１３】
１〜７のいずれか１項に記載のナノ集合体システムを含む、キット。