(57)【要約】      （修正有）【課題】エリスロポエチン（ＥＰＯ）および、さらに好ましくはフィブロネクチン（ＦＮ）を含有する局所製剤、特に、ゲル製剤の提供。さらに、該ゲル製剤を調製するための方法の提供。【解決手段】ゲル、エリスロポエチン、および、フィブロネクチンを含有する医薬組成物であって、ここで前記フィブロネクチンは、創傷に適用されると前記エリスロポエチンの有益な作用を強化する量で組成物中に存在する医薬組成物。被験者における創傷を治療する方法であって、被験者にエリスロポエチンを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含み、組成物がゲルである方法。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル、
エリスロポエチン、および、
フィブロネクチンを含有する医薬組成物であって、ここで前記フィブロネクチンは、創傷に適用されると前記エリスロポエチンの有益な作用を強化する量で組成物中に存在する医薬組成物。
【請求項２】
エリスロポエチンを含む医薬組成物であって、ゲルとして処方される医薬組成物。
【請求項３】
被験者における創傷を治療する方法であって、前記被験者にエリスロポエチンを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含み、前記組成物がゲルである方法。
【請求項４】
被験者における創傷を治療する方法であって、前記被験者にアクアポリンの発現を誘導する治療有効量の組成物を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月４日に出願され、前記出願の内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／２１４，６１８号明細書に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびさらに好ましくはフィブロネクチン（ＦＮ）を含有する局所製剤、特にはゲル製剤に関する。本発明はさらに、このような製剤が適用されない治癒プロセスと比較して、例えば、熱傷からの創傷治癒を加速させるためのこれらの局所製剤の使用にも関する。前記製剤を調製する方法もまた、本発明の一部である。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ）によると、世界中で三億八千万人を超える人々が真性糖尿病（ＤＭ）に罹患している。ＣＤＣはさらに、これら個人の５％が糖尿病性皮膚潰瘍（ＤＳＵ）を発生するであろうこと、および１％は下肢切断術を必要とするようになると推定している。創傷のケアおよび管理における数多くの進歩にもかかわらず（Ｓｅｎ，２００９）、ＤＭにおける創傷治癒は、創傷治癒の細胞事象および生化学的事象の組織的なカスケードの全期が破壊されているために遅延する（Ｂｒｏｗｎ，１９９２（非特許文献１）、Ｓｈｕｋｌａ，１９９８（非特許文献２）、Ｍｕｓｔｏｅ，２００４（非特許文献３））。さらに、ＤＳＵの治癒は、損傷した血管形成、血流不足、増加した炎症、線維芽細胞の減少した増殖（Ｈｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，１９９９（非特許文献４））および角化細胞による減少した再上皮化（Ｍａｎｓｂｒｉｄｇｅ，１９９９（非特許文献５）、Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ，１９９８（非特許文献６）、Ｓｈｅｅｔｚ，２００２（非特許文献７））のために遅延する。
【０００４】
糖タンパク質ホルモンであるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球質量を調節し、貧血を治療するための承認薬である。ＥＰＯはさらに、皮膚における非造血性標的を有し、さらにこれらの標的が皮膚創傷の治癒に関与することが証明されている（Ｈａｍｅｄ，２０１４（非特許文献８））。以前に、実験的に誘導されたＤＭを有するラットおよびマウスにおける皮膚創傷の治癒が、（ａ）血管新生、再上皮化およびコラーゲン沈着を刺激すること、および（ｂ）炎症反応およびアポトーシスを抑制することによって皮膚創傷への組換えヒトＥＰＯの局所塗布後に加速されることが報告されている（Ｈａｍｅｄ，２０１０（非特許文献９））。ＥＰＯがＤＭにおける創傷治癒に及ぼす有益な作用は、フィブロネクチン（ＦＮ）によって補完される。ＦＮは一時的な創傷マトリックスの形成を促進し、創傷マトリックスの解離を防止する（Ｈａｍｅｄ，２０１１（非特許文献１０））。
【０００５】
アクアポリン（ＡＱＰ）は、機能が水およびグリセロールの輸送を可能にすることによって細胞内流体恒常性を調節することである内在性膜タンパク質である。ＡＱＰは、皮膚の基底層および腎臓の髄質集合管内の角化細胞の原形質膜内で発現する（Ａｇｒｅ，１９９８（非特許文献１１））。ＡＱＰのダウンレギュレートされた発現は、急性腎不全における尿濃縮能力の低下の原因である可能性があり、ＥＰＯはこのダウンレギュレーションを防止できる（Ｇｏｎｇ，２００４（非特許文献１２））。ＡＱＰ３は、創傷治癒中の細胞移動および増殖ならびに再上皮化を促進する（Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  ２００６（非特許文献１３）、Ｌｅｖｉｎ，２００６（非特許文献１４）、Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ，２００８（非特許文献１５））皮膚内で発現する（Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ，２００５（非特許文献１６））ＡＱＰである。皮膚創傷を治癒させる際の水分が果たす積極的な役割は、Ｗｉｎｔｅｒがブタの皮膚におけるかさぶたの形成および表在性創傷の上皮化率を調査し、湿潤創傷が乾燥創傷より迅速に治癒する（Ｗｉｎｔｅｒ，１９６２（非特許文献１７））ことを報告した１９６２年に最初に証明された。当然の結果として、足の皮膚の乾燥はＤＭを有する患者における足部潰瘍形成と相関する。糖尿病性創傷治癒においてＡＱＰ３が果たす特別な役割は、ＡＱＰ３がＤＭを有するラットにおける全層皮膚創傷の治癒中に再生する表皮においてはダウンレギュレートされる（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，２０１２（非特許文献１８））ことが見いだされた時点に推定された。研究は、ＥＰＯが進行性創傷の治癒を刺激するために使用できることを示した。このような観察所見は、さらに、（ａ）血管新生に関与するそれらの細胞の運動および増殖の損傷、（ｂ）線維芽細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の減少した生成、および（ｃ）角化細胞が皮膚創傷を再上皮化する失敗を包含する、ＤＭにおける損傷したＡＱＰ３発現と遅延した再上皮化との間の因果関係の存在をさらに示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Brown, et al., "Expression of vascular permeability factor (    vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound     healing." J Exp Med. 1992; 176: 1375-9
【非特許文献２】Shukla, et al., "Differential expression of proteins during     healing of cutaneous wounds in experimental normal and chronic models." BiochemBiophys Res Commun. 1998; 244:434-9
【非特許文献３】Mustoe, "Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis     on their pathogenesis and implications for therapy." Am J Surg2004, 187:65S-70S
【非特許文献４】Hehenberger, et al., "Impaired proliferation and increased L-lactate production of dermal fibroblasts in the GK-rat, a spontaneous model of non-insulin dependent diabetes mellitus." Wound Repair Regen 1999, 7:65-71）
【非特許文献５】Mansbridge, et al., "Growth factors secreted by fibroblasts: role in healing diabetic foot ulcers." Diabetes Obes Metab1999, 1:265-79、
【非特許文献６】Stadelmann, et al., "Physiology and healing dynamics of chro  nic cutaneous wounds." Am J Surg. 1998; 176:26S-38S
【非特許文献７】Sheetz & King, "Molecular understanding of hyperglycemia's a  dverse effects for diabetic complications." JAMA 2002, 288:2579-88
【非特許文献８】Hamed, et al., "Erythropoietin, a novel repurposed drug: An innovative treatment for wound healing in patients with diabetes mellitus." Wound Repair Regen. 2014 Jan-Feb; 22(l):23-33.
【非特許文献９】Hamed, et al., "Topical erythropoietin promotes wound repair in diabetic rats." J Invest Dermatol 2010; 130: 287-94.
【非特許文献１０】Hamed, et al., "Fibronectin potentiates topical erythropoietin-induced wound repair in diabetic mice." J Invest Dermatol2011; 6: 1365-74.
【非特許文献１１】Agre, et al. "The aquaporins, blueprints for cellular plumbing systems." J Biol Chem. 1998; 12;273(24): 14659-62.
【非特許文献１２】Gong, et al., "EPO and alpha-MSH prevent ischemia/reperfus ion-induced down-regulation of AQPs and sodium transporters in rat kidney."     Kidney Int. 2004; 66:683-695.
【非特許文献１３】Hara-Chikuma & Verkman, "Physiological roles of glycerol-t  ransporting aquaporins: the aquaglyceroporins." Cell MolLife Sci. 2006; 63(12): 1386-92.
【非特許文献１４】Levin & Verkman, "Aquaporin-3-dependent cell migration and proliferation during corneal re-epithelialization." Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47(10):4365-72.
【非特許文献１５】Hara-Chikuma & Verkman, "Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing." J Mol Med. 2008; 86:221-31
【非特許文献１６】Hara-Chikuma & Verkman, "Aquaporin-3 functions as a glycerol transporter in mammalian skin." Biol Cel 2005; 97:479-86.
【非特許文献１７】Winter, "Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of the young domestic pig." Nature.  1962; 20; 193:293-4.
【非特許文献１８】Sugimoto, et al., "Impaired Aquaporin 3 Expression in Reepithelializationof Cutaneous Wound Healing in the Diabetic Rat." BiolRes Nurs. 2012; 15(3): 347-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）および、さらに好ましくはフィブロネクチン（ＦＮ）を含有する局所製剤、特には、ゲル製剤は、このような製剤が塗布されない治癒プロセスと比較して、例えば、熱傷からの創傷治癒を加速させるために使用される。前記製剤を調製するための方法もまた提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびさらに好ましくはフィブロネクチン（ＦＮ）を含有する局所製剤、特にはゲル製剤に関する。一部の実施形態では、ゲル、エリスロポエチンおよびフィブロネクチンを含む医薬組成物について記載される。一部の態様では、フィブロネクチンは、組成物中に、創傷に適用されるとエリスロポエチンの有益な作用を強化する量で存在する。他の態様では、治療有効量のゲル、エリスロポエチンおよびフィブロネクチンを含む医薬組成物を局所塗布する工程を含む創傷を治療する方法であって、ここでフィブロネクチンは、創傷を治療するために創傷に塗布されるとエリスロポエチンの有益な作用を強化する量で組成物中に存在する方法が記載される。一部の実施形態では、創傷は、高血糖を有すると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である。他の実施形態では、創傷は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である。さらに他の実施形態では、創傷は、インスリン生成の欠損を有する、または、インスリン耐性であると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である。さらに別の実施形態では、創傷は、糖尿病性であると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である。特定の態様では、創傷は、ヒト被験者の創傷である。
【０００９】
詳細には、本発明の代表的な実施形態は以下の通りである。
（１）ゲル、エリスロポエチン、および、フィブロネクチンを含有する医薬組成物であって、ここで前記フィブロネクチンは、創傷に適用されると前記エリスロポエチンの有益な作用を強化する量で組成物中に存在する医薬組成物。
（２）創傷を治療する方法であって、前記創傷を治療するために前記創傷に治療有効量の上記（１）の製剤を局所塗布する工程を含む方法。
（３）前記創傷は、高血糖を有すると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である上記（１）の組成物。
（４）前記創傷は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である上記（１）の組成物。
（５）前記創傷は、インスリン産生の欠損を有すると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である上記（１）の組成物。
（６）前記創傷は、糖尿病性であると診断されている、または、疑われている被験者の創傷である、上記（１）の組成物。
（７）前記創傷は、ヒト被験者の創傷である請求項１に記載の組成物。
（８）前記エリスロポエチンは、５重量／重量％の濃度で存在する上記（１）の組成物。
（９）前記フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する上記（１）の組成物。
（１０）前記組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度の前記エリスロポエチン、０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度の前記フィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む上記（１）の組成物。
（１１）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベンを含む上記１０の組成物。
（１２）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベン、および、１００重量／重量％までの水を含む上記（１１）の組成物。
（１３）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸ゲルである上記（１）の組成物。
（１４）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸を含む上記（１）の組成物。
（１５）前記ゲルは、ヒドロゲルである上記（１）の組成物。
（１６）エリスロポエチンを含む医薬組成物であって、ゲルとして処方される医薬組成物。
（１７）前記組成物は、フィブロネクチンを含む上記（１６）の組成物。
（１８）前記エリスロポエチンは、５重量／重量％の濃度で存在する上記（１６）の組成物。
（１９）前記フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する上記（１７）の組成物。
（２０）前記組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度の前記エリスロポエチン、０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度の前記フィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む上記（１７）の組成物。
（２１）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベンを含む上記（２０）の組成物。
（２２）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベン、および、１００重量／重量％までの水を含む上記（２１）の組成物。
（２３）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸ゲルである上記（１６）の組成物。
（２４）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸を含む上記（１６）の組成物。
（２５）前記ゲルは、ヒドロゲルである上記（１６）の組成物。
（２６）被験者における創傷を治療する方法であって、前記被験者にエリスロポエチンを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含み、前記組成物がゲルである方法。
（２７）前記組成物は、フィブロネクチンを含む上記（２６）の方法。
（２８）前記エリスロポエチンは、５重量／重量％の濃度で存在する上記（２６）の方法。
（２９）前記フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する上記（２７）の方法。
（３０）前記組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度の前記エリスロポエチン、０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度の前記フィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む上記（２７）の方法。
（３１）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベンを含む上記（３０）の方法。
（３２）前記組成物は、５重量／重量％の前記グリセロール、１重量／重量％の前記カルボマー９４０、２重量／重量％の前記ベンジルアルコール、０．９重量／重量％の前記トリエタノールアミン、０．２重量／重量％の前記メチルパラベン、０．０５重量／重量％の前記プロピルパラベン、および、１００重量／重量％までの水を含む上記（３１）の方法。
（３３）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸ゲルである上記（２６）〜（３２）のいずれかの方法。
（３４）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸を含む上記（２６）〜（３２）のいずれかの方法。
（３５）前記ゲルは、ヒドロゲルである上記（３３）または（３４）の方法。
（３６）前記被験者は、高血糖を有すると診断されている、または、疑われている上記（２６）〜（３５）のいずれかの方法。
（３７）前記被験者は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている上記（２６）〜（３５）のいずれかの方法。
（３８）前記被験者は、インスリン産生の欠損を有すると診断されている、または、疑われている、上記（２６）〜（３５）のいずれかの方法。
（３９）前記被験者は、糖尿病性であると診断されている、または、疑われている上記（２６）〜（３５）のいずれかの方法。
（４０）前記被験者は、ヒト被験者である上記（２６）〜（３５）のいずれかの方法。
（４１）組成物は、複数回投与にわたり投与される上記（２６）〜（４０）のいずれかの方法。
（４２）前記組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、または、それ以上投与される上記（４１）の方法。
（４３）前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、または、２４週間にわたり提供される上記（４１）の方法。
（４４）前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、または、２４カ月間にわたり提供される上記（４１）の方法。
（４５）前記投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または、１４日間である上記（４１）の方法。
（４６）前記投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、または、８週間である上記（４１）の方法。
（４７）前記ゲルは、皮膚投与のために処方される、または、皮膚投与される上記（２６）〜（４６）のいずれかの方法。
（４８）前記創傷は、潰瘍である上記（２６）〜（４７）のいずれかの方法。
（４９）前記創傷は、糖尿病性潰瘍である上記（２６）〜（４８）のいずれかの方法。
（５０）前記創傷は、慢性糖尿病性潰瘍である上記（２６）〜（４９）のいずれかの方法。
（５１）前記創傷は、四肢の慢性糖尿病性潰瘍である上記（２６）〜（５０）のいずれかの方法。
（５２）前記創傷は、慢性糖尿病性足部潰瘍である上記（２６）〜（５１）のいずれかの方法。
（５３）被験者における創傷を治療する方法であって、前記被験者にアクアポリンの発現を誘導する治療有効量の組成物を投与する工程を含む方法。
（５４）前記アクアポリンは、アクアポリン−３である上記（５３）の方法。
（５５）前記組成物は、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸ゲルである上記（５３）〜（５４）のいずれかの方法。
（５６）前記ゲルは、フィブリン、コラーゲン、または、ヒアルロン酸を含む上記（５５）の方法。
（５７）前記ゲルは、ヒドロゲルである上記（５５）または（５６）の方法。
（５８）前記被験者は、高血糖を有すると診断されている、または、疑われている上記（５３）〜（５７）のいずれかの方法。
（５９）前記被験者は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている上記（５３）〜（５７）のいずれかの方法。
（６０）前記被験者は、インスリン産生の欠損を有すると診断されている、または、疑われている、上記（５３）〜（５７）のいずれかの方法。
（６１）前記被験者は、糖尿病性であると診断されている、または、疑われている上記（５３）〜（５７）のいずれかの方法。
（６２）前記被験者は、ヒト被験者である上記（５３）〜（５７）のいずれかの方法。
（６３）組成物は、複数回投与にわたり投与される上記（５３）〜（６２）のいずれかの方法。
（６４）前記組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、または、それ以上投与される上記（６３）の方法。
（６５）前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、または、２４週間にわたり提供される上記（６３）の方法。
（６６）前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、または、２４カ月間にわたり提供される上記（６３）の方法。
（６７）前記投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または、１４日間である上記（６３）の方法。
（６８）前記投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、または、８週間である上記（６３）の方法。
（６９）前記ゲルは、皮膚投与のために処方される、または、皮膚投与される上記（５３）〜（６８）のいずれかの方法。
（７０）前記創傷は、潰瘍である上記（５３）〜（６９）のいずれかの方法。
（７１）前記創傷は、糖尿病性潰瘍である上記（５３）〜（７０）のいずれかの方法。
（７２）前記創傷は、慢性糖尿病性潰瘍である上記（５３）〜（７１）のいずれかの方法。
（７３）前記創傷は、四肢の慢性糖尿病性潰瘍である上記（５３）〜（７２）のいずれかの方法。
（７４）前記創傷は、慢性糖尿病性足部潰瘍である上記（５３）〜（７３）のいずれかの方法。
（７５）擦傷のある皮膚表面を美容処置する方法であって、例えば、前記擦傷のある皮膚表面がかき傷、軟組織亀裂、座瘡などの結果である場合に、前記表面を美容的に処置するために十分量の上記（１）の組成物を前記擦傷のある皮膚表面に適用する工程による方法。
（７６）擦傷のある皮膚表面を治癒させる方法であって、例えば、前記擦傷のある皮膚表面がかき傷、軟組織亀裂、座瘡などの結果である場合に、前記擦傷のある皮膚表面を治癒させるために十分量の上記（１）の組成物を前記擦傷のある皮膚表面に適用する工程による方法。
【００１０】
ゲル製剤は、好ましくは、例えば、ベンジルアルコール、グリセロールもしくは他のアルコール、例えば粘度増強剤、ゲル化剤もしくは懸濁化剤として使用できるカルボマー９４０などのポリビニルカルボキシポリマーなどのポリマー（カルボマー９４０はペンタエリトリトールのエーテルと架橋結合されている）、メチルパラベン、プロピルパラベンなどのパラベン、トリエタノールアミンおよびゲルを製造するための当分野において公知である他の賦形剤ならびにそれらの任意の組み合わせを含む賦形剤の非限定的リストの少なくとも一つのメンバーを含有する。本発明のゲル製剤は、さらに水を含むはずである。
【００１１】
ゲル、エリスロポエチンおよびフィブロネクチンを含む医薬組成物の所定の態様では、エリスロポエチンは、組成物の５重量／重量％の濃度で存在する。他の態様では、フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する。さらに他の態様では、組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のエリスロポエチンおよび０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度のフィブロネクチンを含む。他の実施形態では、組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のエリスロポエチンおよび０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度のフィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む。さらにまた別の態様では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンを含む。特定の態様では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンおよび１００重量／重量％までの水を含む。一部の実施形態では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸ゲルである。他の実施形態では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸を含む。特定の実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。
【００１２】
所定の態様では、エリスロポエチンを含む医薬組成物であって、ゲルとして処方される組成物について記載される。特定の実施形態では、組成物は、フィブロネクチンを含む。さらに他の態様では、エリスロポエチンは、５重量／重量％の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する。他の態様では、組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のエリスロポエチンおよび０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度のフィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む。さらにまた他の態様では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンおよび１００重量／重量％までの水を含む。所定の実施形態では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸ゲルである。他の態様では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。
【００１３】
さらに、被験者における創傷を治療する方法であって、被験者にエリスロポエチンを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含み、組成物がゲルである方法も提供される。所定の実施形態では、組成物は、フィブロネクチンを含む。他の実施形態では、エリスロポエチンは、５重量／重量％の濃度で存在する。一部の他の実施形態では、フィブロネクチンは、３０重量／重量％の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のエリスロポエチン、０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の濃度のフィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の濃度のプロピルパラベンを含む。他の特定の実施形態では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンを含む。なおさらに他の実施形態では、組成物は、５重量／重量％のグリセロール、１重量／重量％のカルボマー９４０、２重量／重量％のベンジルアルコール、０．９重量／重量％のトリエタノールアミン、０．２重量／重量％のメチルパラベン、０．０５重量／重量％のプロピルパラベンおよび１００重量／重量％までの水を含む。さらに他の態様では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸ゲルである。さらに他の態様では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸を含む。特定の態様では、ゲルは、ヒドロゲルである。
【００１４】
一部の態様では、被験者における創傷を治療する方法であって、被験者にエリスロポエチンを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含み、組成物はゲルであり、被験者は高血糖を有すると診断されている、または、疑われている方法が提供される。他の態様では被験者は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている。別の態様では、被験者は、インスリン産生の欠陥を有すると診断されている、または、疑われている。さらにまた別の態様では、被験者は糖尿病性であると診断されている、または、疑われている。一部の実施形態では、被験者は、ヒト被験者である。他の実施形態では、組成物は、複数回投与にわたり提供される。特定の態様では、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、または、それ以上投与される。追加の態様では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３もしくは２４週間にわたり提供される。さらにまた別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３もしくは２４カ月間にわたり提供される。追加の実施形態では、投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日間である。さらに他の実施形態では、投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７もしくは８週間である。追加の実施形態では、ゲルは、皮膚投与のために処方される、または、皮膚投与される。さらに他の実施形態では、創傷は、潰瘍または熱傷である。一部の他の態様では、創傷は、糖尿病性潰瘍である。追加の実施形態では、創傷は、慢性糖尿病性潰瘍である。一部の実施形態では、創傷は、四肢の慢性糖尿病性潰瘍である。さらにまた別の態様では、創傷は、慢性糖尿病性足部潰瘍である。
【００１５】
さらに、被験者における創傷を治療する方法であって、被験者にアクアポリンの発現を誘導する治療有効量の組成物を投与する工程を含む方法も提供される。特定の実施形態では、アクアポリンは、アクアポリン−３である。一部の態様では、組成物は、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸ゲルである。さらに他の実施形態では、ゲルは、フィブリン、コラーゲンもしくはヒアルロン酸を含む。さらに他の実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。特定の実施形態では、被験者は、高血糖を有すると診断されている、または、疑われている。他の態様では、被験者は、インスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている。別の態様では、被験者は、インスリン産生の欠陥を有すると診断されている、または、疑われている。さらにまた別の態様では、被験者は糖尿病性であると診断されている、または、疑われている。一部の実施形態では、被験者は、ヒト被験者である。他の実施形態では、組成物は、複数回投与をかけて提供される。特定の態様では、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、または、それ以上投与される。追加の態様では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３もしくは２４週間にわたり提供される。さらにまた別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３もしくは２４カ月間にわたり提供される。追加の実施形態では、投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日間である。さらに他の実施形態では、投与間の時間間隔は、１、２、３、４、５、６、７もしくは８週間である。追加の実施形態では、ゲルは、皮膚投与のために処方される、または、皮膚投与される。さらに他の実施形態では、創傷は、潰瘍または熱傷である。一部の他の態様では、創傷は、糖尿病性潰瘍である。追加の実施形態では、創傷は、慢性糖尿病性潰瘍である。一部の実施形態では、創傷は、四肢の慢性糖尿病性潰瘍である。さらにまた別の態様では、創傷は、慢性糖尿病性足部潰瘍である。
【００１６】
一部の組成物もしくは方法では、エリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンは、マトリックス内に組み込まれる。所定の態様では、エリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンは、マトリックス内に組み込まれ、少なくとも一方は切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）である。他の態様では、マトリックスは、一種以上の切断可能なケモカイン、化学誘引物質、化学忌避剤、成長因子または一種以上の切断可能なサイトカインを組み込んでいる。例えば、ケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２およびＣＸ３ＣＬ１からなる群から選択されるケモカインの一つまたは任意の組み合わせであってよい。本明細書に開示した方法もしくは組成物とともに使用するためのサイトカインは、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、ミオカイン、腫瘍壊死因子もしくは炎症促進性サイトカインファミリーのメンバーを含む可能性がある。本明細書に記載した方法および組成物とともに使用するためのサイトカインの特定の例としては、ＧｃＭＡＦ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞増殖因子、ＩＬ１Ａ、インターフェロン、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、インターフェロンγ、インターフェロンI型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩＩＩ型、インターロイキン１β、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１６、インターロイキン２、インターロイキン２３、インターロイキン２３サブユニットα、インターロイキン３４、インターロイキン３５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン−１フェミリー、インターロイキン−１２サブユニットβ、インターロイキン−３６、白血病抑制因子、白血球促進因子、リンホトキシン、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファージ活性化因子、ミオネクチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、オプレルベキン、血小板因子４、プロメガポエチン、ＲＡＮＫＬ、間質細胞誘導因子１、腫瘍壊死因子αもしくは血管内皮増殖因子の一つ、または、任意の組み合わせが挙げられる。特に企図された増殖因子には、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦおよびＥＣＧＦが含まれる。さらに企���されるのは、低酸素症誘導性因子（例えば、ＨＩＦ−１αおよびβならびにＨＩＦ−２）、ホルモン（例えば、インスリン、増殖因子（ＧＨ）、ＣＲＨ、レプチン、プロラクチンおよびＴＳＨ）、血管新生因子（例えば、アンジオゲニンおよびアンジオポエチン）、凝固因子および抗凝固因子［例えば、第Ｉ因子、第ＸＩＩＩ因子、組織因子、カルシウム、ｖＷＦ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、フィブロネクチン、アンチトロンビン、ヘパリン、プラスミノーゲン、低分子量ヘパリン（Ｃｌｉｘａｎ）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン、プラスミノーゲンプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ΡΑＩ１）、プラスミノーゲンプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２（ＰＡＩ２）、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、α２−抗プラスミンおよびプロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター（ＺＰＩ）である。
【００１７】
一部の実施形態では、マトリックスはゲルである。さらに、他の実施形態では、マトリックスはヒドロゲルである。所定の例では、ヒドロゲルは、大量の水および生体液を溶解せずに吸収できる三次元親水性架橋結合ポリマー網目を意味する。ヒドロゲルは、物理的架橋結合（例えば、結晶領域、分子間相互作用および絡み合い）または化学的架橋結合（例えば、共有結合）の存在に起因して不溶性であるポリマーから構成されてよい。特定の実施形態では、ヒドロゲルは、フィブリンヒドロゲルもしくはフィブリンドメイン修飾ポリエチレングリコールヒドロゲルである。
【００１８】
一つの実施形態では、ヒドロゲルは、架橋剤と架橋しているフィブリンヒドロゲルである。所定の実施形態では、架橋フィブリンヒドロゲルは、被験者もしくは患者の体内への植込みにおいて、特に皮下植込みにおいて、それらを使用するために好適である化学的、物理的または機械的特性を有する。
【００１９】
限定するものではないが、ゲルは、任意の比率の架橋剤対フィブリン比を含む可能性がある。したがって、ゲルは、約０．１：１〜約１０：１の範囲内の架橋剤対フィブリン比を含む可能性がある。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、０．１：１〜５：１、０．１：１〜４：１、０．１：１〜２：１、０．１：１〜１．５：１、０．１：１〜１：１、０．１：１〜０．９：１、０．２〜０．８：１および／または０．２５〜０．７５：１の架橋剤対フィブリン比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２０：１〜０．５：１の架橋剤対フィブリン比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２５：１もしくは０．５：１の架橋剤対フィブリン比を含む。
【００２０】
ヒドロゲルは、広範囲の濃度のフィブリンを含むフィブリン溶液から製造することができる。したがって、ゲルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのフィブリン、またはそれらから引き出せる任意の範囲を含むフィブリン溶液から製造することができる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、約２００ｍｇ／ｍＬのフィブリンを含むフィブリン溶液から製造される。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ヒドロゲルは、約２５０ｍｇ／ｍＬのフィブリンを含むフィブリン溶液から製造される。本明細書に記載した態様のさらに一部の他の実施形態では、ヒドロゲルは、約３００ｍｇ／ｍＬのフィブリンを含むフィブリン溶液から製造される。
【００２１】
他の実施形態では、ヒドロゲルは、高分子を固定する三次元ポリマー網目構造を形成するためにゲル化および架橋された親水性モノマー溶液のフリーラジカル重合によって形成される。高分子は、例えば天然コラーゲンなどの組織の基質の構成成分を含む可能性がある。コラーゲンは、コラーゲン−ヒドロゲルを形成するポリマー網目構造内に散在している可能性がある。一部の実施形態では、コラーゲンヒドロゲルは、上皮細胞増殖を促進することができる。
【００２２】
架橋結合のための可溶性コラーゲンは、当分野で認識された技術によって調製することができる。さらに、架橋ヒドロゲルを形成するために、細胞付着および増殖を支持する他のタンパク質を使用することができる。細胞増殖を支持することが公知である追加のタンパク質の一つの例は、フィブロネクチンである。
【００２３】
本発明のヒドロゲルには、多糖類およびムコ多糖類もまた添加することができる。
【００２４】
モノマー溶液のフリーラジカル重合によって形成されるヒドロゲルポリマーは、水溶液をゲル化するためには網目の三次元ポリマー構造を形成するために架橋結合を必要とする。重合プロセスへのエチレングリコールジメタクリレートなどの架橋剤の添加は、結果として生じるヒドロゲルを変化させることができる。一般に、架橋剤の添加は、ヒドロゲルの剛性および機械的強度を増加させる傾向がある。天然コラーゲンの存在下での重合混合物への例えばエチレングリコールジメタクリレートおよびメチルメタクリレートなどの架橋剤の添加は、さらにヒドロゲルの物理的特性を変化させ、重合混合物へのこのような添加は天然コラーゲンと適合し、結果としてコラーゲン−ヒドロゲルを生じさせる。コラーゲン−ヒドロゲルを製造する際に申し分なく使用できる他の公知の架橋剤には、ジアクリレートおよびジメタクリレートまたは他の二価分子が含まれる。
【００２５】
限定されるものではないが、ゲルは、任意の比率の架橋剤対コラーゲンを含むことができる。したがって、ゲルは、約０．１：１〜約１０：１の範囲内の架橋剤対コラーゲン比を含む可能性がある。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、０．１：１〜５：１、０．１：１〜４：１、０．１：１〜２：１、０．１：１〜１．５：１、０．１：１〜１：１、０．１：１〜０．９：１、０．２〜０．８：１および／または０．２５〜０．７５：１の架橋剤対コラーゲン比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２０：１〜０．５：１の架橋剤対コラーゲン比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２５：１もしくは０．５：１の架橋剤対コラーゲン比を含む。
【００２６】
ヒドロゲルは、広範囲の濃度のコラーゲンを含むコラーゲン溶液から製造することができる。したがって、ゲルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、または、それらから引き出せる任意の範囲を含むコラーゲン溶液から製造することができる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、約２００ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含むコラーゲン溶液から製造される。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ヒドロゲルは、約２５０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含むコラーゲン溶液から製造される。本明細書に記載した態様のさらに一部の他の実施形態では、ヒドロゲルは、約３００ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含むコラーゲン溶液から製造される。
【００２７】
合成「刺激応答性」ポリマーとして使用できるヒドロゲルは、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ポリ（ＮｉＰＡＡｍ））などの合成ポリマーをベースとしてよい。このようなヒドロゲルは、数多くの再生医療用途において使用されてきた（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮ．Ａ．Ｐｅｐｐａｓ，Ｐ．Ｂｕｒｅｓ，Ｗ．Ｌｅｏｂａｎｄｕｎｇ，ａｎｄ  Ｈ．Ｉｃｈｉｋａｗａ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０：２７−４６（２０００）を参照されたい）。
【００２８】
所定の態様では、ヒドロゲルは、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリアクリルアミドなどの様々なポリマーを用いて調製される。典型的なＰＶＡ系ヒドロゲルは、例えば、それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２３１，６０５号明細書、同第５，３４６，９３５号明細書、同第５，９８１，８２６号明細書、同第４，６６３，３５８号明細書、および、同第４，９８８，７６１号明細書に開示されている。所定の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ヒドロゲルは、水溶液中で高度の膨潤を提供する。様々なＰＥＧ系ヒドロゲルは、例えば、それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５１４，３７９号明細書；同第６，３６２，２７６号明細書および同第６，５４１，０１５号明細書に開示されている。参照により本明細書に組み込まれた国際公開第２００６１２５０８２号パンフレットは、前駆ヒドロゲル溶液中の前固化ヒドロゲル粒子を含有するヒドロゲル製剤を提供する。
【００２９】
限定するものではないが、ゲルは、任意の比率の架橋剤対ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む可能性がある。したがって、ゲルは、約０．１：１〜約１０：１の範囲内の架橋剤対ＰＥＧ比を含むことができる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、０．１：１〜５：１、０．１：１〜４：１、０．１：１〜２：１、０．１：１〜１．５：１、０．１：１〜１：１、０．１：１〜０．９：１、０．２〜０．８：１および／または、０．２５〜０．７５：１の架橋剤対ＰＥＧ比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２０：１〜０．５：１の架橋剤対ＰＥＧ比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２５：１もしくは０．５：１の架橋剤対ＰＥＧ比を含む。
【００３０】
ヒドロゲルは、広範囲の濃度のＰＥＧを含むＰＥＧ溶液から製造することができる。したがって、ゲルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ、またはそれらから引き出せる任意の範囲を含むＰＥＧ溶液から製造することができる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、約２００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧを含むＰＥＧ溶液から製造される。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ヒドロゲルは、約２５０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧを含むＰＥＧ溶液から製造される。本明細書に記載した態様のさらに一部の他の実施形態では、ヒドロゲルは、約３００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧを含むＰＥＧ溶液から製造される。
【００３１】
また別の実施形態では、ヒドロゲルは、架橋剤と架橋しているヒアルロン酸ヒドロゲルである。所定の実施形態では、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、特定の皮下植込みにおいて、被験者もしくは患者の体内への植込みにおいてそれらを使用するために好適である化学的、物理的または機械的特性を有する。他の実施形態では、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、被験者もしくは患者の皮膚創傷の治療において、特に皮膚適用において、それらを使用するために好適である化学的、物理的または機械的特性を有する。
【００３２】
限定するものではないが、ゲルは、任意の比率の架橋剤対ヒアルロン酸を含む可能性がある。したがって、ゲルは、約０．１：１〜約１０：１の範囲内の架橋剤対ヒアルロン酸比を含む可能性がある。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、０．１：１〜５：１、０．１：１〜４：１、０．１：１〜２：１、０．１：１〜１．５：１、０．１：１〜１：１、０．１：１〜０．９：１、０．２〜０．８：１、および／または、０．２５〜０．７５：１の架橋剤対ヒアルロン酸比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２０：１〜０．５：１の架橋剤対ヒアルロン酸比を含む。一部の実施形態では、ゲルは、０．２５：１もしくは０．５：１の架橋剤対ヒアルロン酸比を含む。
【００３３】
ヒドロゲルは、広範囲の濃度のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸溶液から製造することができる。したがって、ゲルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、または、それらから引き出せる任意の範囲を含むヒアルロン酸溶液から製造することができる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ゲルは、約２００ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含むヒアルロン酸溶液から製造される。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、ヒドロゲルは、約２５０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含むヒアルロン酸溶液から製造される。本明細書に記載した態様のさらに一部の他の実施形態では、ヒドロゲルは、約３００ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含むヒアルロン酸溶液から製造される。
【００３４】
本明細書で使用するように、「一つの」は、一つ以上を意味することができる。特許請求の範囲で使用するように、用語「〜を含む」と結び付けて使用した場合、用語「一つの」は、一つもしくは一つ以上を意味することができる。
【００３５】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、他の選択だけ、または相互排他的であることを意味することを明示的に指示していない限り「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、他の選択だけおよび「および／または」を意味する用語の定義を指示する。本明細書で使用する「もう一つの」は、少なくとも第２もしくは第３以上を意味することができる。
【００３６】
本出願を通して、用語「約」は、数値が前記数値を決定するために使用される装置、前記方法についての固有の誤差変動または試験被検者間に存在する変動を含むことを意味するために使用される。
【００３７】
本発明の他の目的、特徴および長所は、下記に詳述する説明から明白になるであろう。しかし、詳述した説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾がこの詳細な説明から当業者に明白になるであろうから、例示する目的でのみ提供されると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
下記の図面は本願の明細書の一部を形成し、本発明の所定の態様を詳細に明示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示した特定の実施形態の詳細な説明と結び付けてこれらの図面の１枚以上を参照することにより、より明確に理解することができる。
【図１】局所的ＥＰＯは、用量依存様式で、糖尿病性創傷の再生皮膚における創傷閉    鎖を促進し、血流量を増加させる。ＦＮによって強化された作用。非糖尿病性および糖尿病性ブタの再生皮膚内での創傷閉鎖率および血流量は、様々な治療後の第０日、第２日、第４日、第７日、第９日、第１１日および第１４日に決定した。（Ａ）糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の創傷閉鎖率。（Ｂ）糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、低用量ＥＰＯ治療および高用量ＥＰＯ治療熱傷創の創傷閉鎖率。（Ｃ）非糖尿病性（左）ブタおよび糖尿病性ブタの第０日、第２日、第４日、第７日、第９日、第１１日および第１４日（右）におけるビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の代表的な写真画像およびレーザードップラースキャン。（Ｄ）非糖尿病性（左）および糖尿病性ブタの第０日、第２日、第４日、第７日、第９日、第１１日および第１４日（右）における同一のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の代表的セットの写真画像およびレーザードップラースキャン。レーザードップラースキャン内の白丸は、第０日の熱傷創部を表す。濃紺色は非血管形成領域を表し、黄色および赤色は血管形成領域を表し、赤色領域は黄色領域よりも高度に血管形成している領域を描出している。各治療群におけるサンプルサイズは、サンプル数が６例であった低用量ＥＰＯ治療熱傷創群を除いて１２例であった。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１であり、ボンフェローニ補正を伴う二元配置によるＡＮＯＶＡ（分散分析）の結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である。†ｐ＜０．０５であり、ボンフェローニ補正を伴う二元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがった（ａ）ＥＰＯ治療もしくはＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創およびＦＮ治療熱傷創と（ｂ）高用量ＥＰＯ治療熱傷創および低用量ＥＰＯ治療熱傷創間の有意差である。
【図２】局所ＦＮは、非糖尿病性の再生皮膚内での創傷閉鎖率および血流量には影響  を及ぼさない。非糖尿病性ブタの再生皮膚内での創傷閉鎖率および血流量は、様々な治療後の第０日、第４日、第９日および第１４日に決定した。（Ａ）非糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の創傷閉鎖率。（Ｂ）第０日、第４日、第９日および第１４日の非糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＦＮ治療熱傷創、ＥＰＯ治療熱傷創およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の代表的なセットの写真画像（左）およびレーザードップラースキャン（右）。レーザードップラースキャン内の白丸は、第０日の熱傷創部を表す。濃紺色は非血管形成領域を表し、黄色および赤色は血管形成領域を表し、赤色領域は黄色領域よりも高度に血管形成している領域を描出している。二頭の非糖尿病性ブタにおける各治療群のサンプルサイズは１２例であった。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１であり、ボンフェローニ補正を伴う二元配置によるＡＮＯＶＡ（分散分析）の結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である。†ｐ＜０．０５であり、スチューデントの両側ｔ検定の結果にしたがった、ＥＰＯ／ＦＮ治療とＥＰＯ治療熱傷創間の有意差である。
【図３】局所ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内での微小血管密度（ＭＶＤ）およ    びｅＮＯＳ発現を増加させ、これらの作用はＦＮによって強化される。（Ａ）１４日間の治療後に収集した、非糖尿病性ブタ（上のパネル）および糖尿病性ブタ（下のパネル）のビヒクル治療熱傷創、ＦＮ治療熱傷創、ＥＰＯ治療熱傷創およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内での毛細血管の血管内皮細胞によるＣＤ３１発現についての免疫組織学的染色を示している顕微鏡写真の代表的なセット。再生皮膚内のＭＶＤは、各創傷部位における光学顕微鏡下での五カ所の無作為顕微鏡視野（倍率×２００）における毛細血管の数を計数することによって決定した。（Ｂ）非糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＭＶＤ。（Ｃ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＭＶＤ。（ＤおよびＥ）非糖尿病性ブタ（Ｄ）および糖尿病性ブタ（Ｅ）のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚から第１４日に収集され、この後それらから調製された溶解物中で測定された組織内でのｅＮＯＳ発現の代表的なウェスタンブロット。α−アクチンを使用してタンパク質負荷を正規化し、ブロットは個別ゲル上で同時に分析したサンプルから引き出した。各治療群のサンプルサイズは１２例であり、データは各治療群について二回ずつの測定の平均値±ＳＤ（ＢおよびＣ）として表示した。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である（ＢおよびＣ）。†ｐ＜０．０５であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがった、ＥＰＯ／ＦＮ治療とＥＰＯ治療熱傷創間の有意差である（Ｃ）。スケールバー：２００μｍ（Ａ）。
【図４】局所的ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内のヒドロキシプロリン（ＨＰ）    およびヒアルロン酸（ＨＡ）合成の量を増加させ、この作用はＦＮによって強化される。（Ａ）１４日間の治療後に収集した、非糖尿病性ブタ（上のパネル）および糖尿病性ブタ（下のパネル）のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内でのマッソン三色染色法によるＨＰの量についての免疫組織学的染色を示している顕微鏡写真の代表的なセット。（Ｂ）第１４日の非糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＨＰ含量。（Ｃ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＨＰ含量。（Ｄ）非糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＨＡ含量。（Ｅ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内のＨＡ含量。（ＦおよびＧ）非糖尿病性ブタ（Ｆ）および糖尿病性ブタ（Ｇ）のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚から第１４日に収集され、この後それらから調製された溶解物中で測定された組織内でのＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルの代表的なウェスタンブロット。α−アクチンを使用してタンパク質負荷を正規化し、ブロットは個別ゲル上で同時にランして分析したサンプルから引き出した。各治療群のサンプルサイズは１２例であり、データはＨＰ（ＢおよびＣ）またはＨＡ（ＤおよびＥ）量の二回ずつの測定の平均値±ＳＤとして表示した。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である。†ｐ＜０．０５であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがった、ＥＰＯ／ＦＮ治療（Ｃ）とＥＰＯ治療熱傷創（Ｅ）間の有意差である。スケールバー：２００μｍ（Ａ）。
【図５】ＡＱＰ３発現は、創傷のない糖尿病性皮膚では減少する。非糖尿病性ブタ（Ａ）および糖尿病性ブタ（Ｂ）の創傷のない皮膚内でのＡＱＰ３についての免疫組織学的染色の顕微鏡写真の代表的セット。スケールバー：（左）５０μｍ；（右）２００μｍ（ＡおよびＢ）。非糖尿病性ブタ（Ｃ）および糖尿病性ブタ（Ｄ）の創傷のない皮膚内でのＡＱＰ３についての免疫組織学的染色の顕微鏡写真の代表的セット。スケールバー：２００μｍ（ＣおよびＤ）。（Ｅ）糖尿病性ブタのＤＭ誘導３０日後の創傷のない皮膚内および非糖尿病性ブタの創傷のない皮膚内のＡＱＰ３発現の代表的なウェスタンブロット。数値は、ＡＱＰ３タンパク質発現の三回ずつの測定の平均値±標準偏差および創傷のない非糖尿病性皮膚内の数値（１００％）のパーセンテージとして表示した。（Ｇ）α−アクチンを使用してタンパク質負荷を正規化し、ブロットは個別ゲル上で同時にランしたサンプルから引き出した。（Ｆ）全ＲＮＡは二頭の糖尿病性ブタおよび二頭の非糖尿病性ブタの熱傷創組織由来の、第１４日に収集した再生皮膚のサンプルから調製した創傷のない皮膚溶解物から単離した。ＡＱＰ３  ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって定量した。数値は、ＡＱＰ３  ｍＲＮＡ発現の三回ずつの測定の平均値±ＳＤおよび創傷のない非糖尿病性皮膚内の発現（１００％）のパーセンテージとして表示した。＊＊ｐ＜０．０１であり、スチューデントの両側ｔ検定の結果にしたがった、健常ブタおよび糖尿病性ブタ間の有意差である。
【図６】局所ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内でのＡＱＰ３発現を増加させ、この作用はＦＮによって強化される。（ＡおよびＢ）１４日間の治療後に収集した、非糖尿病性ブタ（Ａ）および糖尿病性ブタ（Ｂ）のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚内でのＡＱＰ３についての免疫組織学的染色を示している顕微鏡写真の代表的なセット。スケールバー：（ＡまたはＢ；左）５０μｍ；（ＡまたはＢ；右）２００μｍ。（ＣおよびＤ）ビヒクル含有、ＦＮ含有、ＥＰＯ含有およびＥＰＯ／ＦＮ含有ゲルを用いた、（Ｃ）二頭の非糖尿病性ブタおよび二頭の糖尿病性ブタの熱傷創の１４日間の治療後のＡＱＰ３タンパク質発現の代表的なウェスタンブロット。数値は、非糖尿病性ブタのビヒクル治療熱傷創（１００％）におけるＡＱＰ３タンパク質発現の三回ずつの測定の平均値±ＳＤとして表示した。非糖尿病性ブタ（Ｅ）および糖尿病性ブタ（Ｆ）由来の熱傷創の１４日間の治療後の再生皮膚の溶解物中でのＡＱＰ３タンパク質発現の代表的なウェスタンブロット。α−アクチンを使用してタンパク質負荷を正規化し、ブロットは個別ゲル上で同時にランしたサンプルから引き出した（ＧおよびＨ）。全ＲＮＡは、非糖尿病性ブタ（Ｇ）および糖尿病性ブタ（Ｈ）のビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚の溶解物から単離した。ＡＱＰ３  ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって定量した。数値は、ＡＱＰ３  ｍＲＮＡ発現の三回ずつの測定の平均値±ＳＤおよび創傷のない非糖尿病性皮膚内の発現（１００％）のパーセンテージとして表示した。＊＊ｐ＜０．０１であり、ボンフェローニ補正を伴う二元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である。†ｐ＜０．０５であり、スチューデントの両側ｔ検定の結果にしたがった、ＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創とＥＰＯ治療熱傷創間の有意差である。
【図７】ＡＱＰ３タンパク質発現は、糖尿病性創傷の再生皮膚内の血管新生の程度な    らびにヒドロキシプロリン（ＨＰ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）の量と正相関する。ＡＱＰ３タンパク質の発現は、非糖尿病性ブタの熱傷創においては、（ａ）微小血管密度（ＭＶＤ）（ｒ＝０．６１）、（ｂ）ＨＰの量（ｒ＝０．７９）および（ｃ）ＨＡの量（ｒ＝０．８８）と有意に相関する。ＡＱＰ３タンパク質の発現は、さらに糖尿病性ブタの熱傷創においても、（ａ）ＭＶＤ（ｒ＝Ｘ）、（ｂ）ＨＰ量（ｒ＝０．６０）および（ｃ）ＨＡ量（ｒ＝０．９３）と有意に相関する。各点は、六例の創傷におけるＡＱＰ３タンパク質発現、ＭＶＤならびにＨＰおよびＨＡの量の平均値を表す。
【図８】ＨｇＣｌ２によるＡＱＰ３阻害は、糖尿病性創傷の創傷閉鎖率、血管新生の程度ならびにヒドロキシプロリン（ＨＰ）量およびヒアルロン酸（ＨＡ）量に局所的ＥＰＯが及ぼす作用を減少させる。糖尿病性ブタの再生皮膚内での創傷閉鎖率および血流量は、ビヒクル含有、高用量ＥＰＯ含有およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２含有ゲルを用いた１４日間の治療後に決定した。（Ａ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療熱傷創の創傷閉鎖率。（Ｂ）糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療熱傷創の１４日間の治療後の写真画像（上のパネル）およびレーザードップラースキャン（下のパネル）の代表的なセット。濃紺色は非血管形成領域を表し、黄色および赤色は血管形成領域を表し、赤色領域は黄色領域よりも高度に血管形成している領域を表している。糖尿病性ブタの一頭における各治療群における熱傷創（ｎ＝６）を評価して比較した。（Ｃ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＦＮ治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創の再生皮膚から第１４日に収集され、この後それらから調製された溶解物中で測定された組織内でのｅＮＯＳ、ＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルの代表的なウェスタンブロット。α−アクチンを使用してタンパク質負荷を正規化し、ブロットは個別ゲル上で同時にランしたサンプルから引き出した。（Ｄ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＥＰ    Ｏ治療およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療熱傷創の再生皮膚のＭＶＤ。（Ｅ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療熱傷創の再生皮膚のＨＰ含量。（Ｆ）糖尿病性ブタのビヒクル治療、ＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療熱傷創の再生皮膚のＨＡ含量。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１であり、ボンフェローニ補正を伴う二元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である（Ａ）。＊＊ｐ＜０．０１であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがったビヒクル治療熱傷創と他の治療間の有意差である（Ｄ〜Ｆ）。†ｐ＜０．０５であり、スチューデントの両側ｔ検定の結果にしたがった、ＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療とＥＰＯ治療熱傷創間の有意差である（Ｄ〜Ｆ）。
【図９】高グルコースはヒト皮膚に由来する角化細胞および線維芽細胞内でのＡＱＰ    ３発現をダウンレギュレートする；ＥＰＯによって遮断された作用。（Ａ）低グルコース（正常）および高グルコース培地中のＨＥＫＣの増殖にＥＰＯが及ぼす作用。（Ｂ）低グルコース（正常、ＮＧ）および高グルコース（ＨＧ）培地中のＮＨＢＣの増殖にＥＰＯが及ぼす作用（ＣおよびＤ）。ＮＧもしくはＨＧいずれかの培地中の５日間培養後のＥＰＯ治療ＨＥＫＣおよびＮＨＢＣから調製した溶解物中のＡＱＰ３発現レベルの代表的なウェスタンブロット。α−アクチンを使用して個別ゲル上でのランを正規化した（ＥおよびＦ）。ＨＥＫＣ（Ｅ）およびＮＨＢＣ（Ｆ）中のＡＱＰ３発現レベルについての免疫組織学的染色の顕微鏡写真の代表的なセット。スケールバー：５００μｍ。＊＊ｐ＜０．０１であり、チューキーの事後検定を伴う一元配置によるＡＮＯＶＡの結果にしたがった有意差である。
【図１０】ＥＰＯ／ＦＮ治療を用いた数週間にわたる慢性糖尿病性足部潰瘍の長さおよび幅における減少を示す折れ線グラフ。
【図１１】ＥＰＯ／ＦＮ治療を用いた数週間にわたる慢性糖尿病性足部潰瘍の潰瘍領域における減少を示す折れ線グラフ。
【図１２】ＥＰＯ／ＦＮ治療を用いた数週間にわたる慢性糖尿病性足部潰瘍の創傷閉鎖の代表的な写真。
【図１３】数週間のＥＰＯ／ＦＮ治療の前後の慢性糖尿病性足部潰瘍の代表的な写真。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．本発明
この技術背景とは反対に、本発明者は、ＤＳＵの治癒にＥＰＯが及ぼす治療上有益な作用が一部には、ＥＰＯが皮膚内でのＡＱＰ３発現を刺激する能力に起因すると推測した。この仮説は、実験によって誘発した１型ＤＭおよび中間層皮膚熱傷を備えるブタにおいて試験された。糖尿病性ブタにおける熱傷の局所的ＥＰＯ治療は、血管新生およびＥＣＭ産生を刺激することによるＡＱＰ３依存性機序を通してそれらの治癒を促進することが見いだされた。追加の証拠は、ＦＮが糖尿病性ブタにおける熱傷の治癒にＥＰＯが及ぼす促進作用を強化できることを示唆している。さらに、糖尿病性足部創傷を本発明によって治療できることも示唆されている。ヒトの治療もまた企図されている。
【００４０】
したがって、本発明は、一部には、本明細書の上記および他の個所で記載された製剤および創傷の治療に関する。本発明はさらに、一部には、ゲル、エリスロポエチンおよびフィブロネクチンを含有する医薬組成物であって、ここでフィブロネクチンは、創傷に塗布されるとエリスロポエチンの有益な作用を強化する量で組成物中に存在する医薬組成物に関する。
【００４１】
創傷、例えば、熱傷もしくは糖尿病性足部創傷を治療するため、および／または、治癒を促進するために、治療有効量の例えば本明細書の上記および他の個所で記載したような製剤を局所塗布する工程を含む創傷を治療する方法。
【００４２】
任意の特定の理論に限定されなくても、治癒は、血管新生を活性化する、コラーゲンおよびヒアルロン酸合成ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を誘発する、および角化細胞による再上皮化を刺激するＡＱＰ３依存性機序によって作動すると考えられる。製剤中へのフィブロネクチンの添加は、熱傷の治癒にＥＰＯが及ぼす促進作用を強化することができる。
【００４３】
ＩＩ．定義
したがって、本発明の一つの態様によると、それを必要とする被験者における創傷治癒および結合組織の再建を促進する方法が提供される。一部の実施形態では、被験者は、糖尿病を有すると診断されている、または、疑われている。他の実施形態では、被験者は、高血糖もしくはインスリン耐性を有すると診断されている、または、疑われている。
【００４４】
本明細書で使用する語句「結合組織」は、この中で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および詳細にはコラーゲンが主要部分を形成する動物組織を意味しており、組織は他の身体組織および身体部分を支持してそれらを相互に結合させるために機能する。典型的な例は、皮膚および内臓である。
【００４５】
本明細書で使用する語句「結合組織の再建」は、損傷もしくは非健常組織にとっての美観、構造、機能および生理機能の回復を意味する。この再建は、再生治癒をもたらす。さらに、結合組織の再建とは、健常組織内のコラーゲン産生の増加を意味する。典型的な実施形態では、再建は、組織劣化の停止をもたらす。他の典型的な実施形態では、結合組織の再建は、線維症を回避する。
【００４６】
本明細書で使用する語句「損傷もしくは非健常組織」は、健常機能性組織からの逸脱を意味する。皮膚の場合には、皮膚は、健常な皮膚より弱く、低弾性であり、より損傷しやすい傾向がある。非健常もしくは損傷皮膚の構造は、健常な皮膚の構造より劣っている（例えば、真皮および上皮が含有する細胞およびコラーゲンが少ない）。非健常皮膚を治療するための一つの目的は、皮膚の一層の劣化を減少させ、機能を正常もしくは正常に近いレベルに回復させることである。
【００４７】
本明細書で使用する語句「健常組織」は、強力で弾性があり、平滑およびふっくらしている皮膚を意味する。健常な皮膚を治療する一つの目的は、過度の太陽光および微生物感染を含む老化もしくは環境ストレスによって誘発される皮膚の劣化を予防することである。
【００４８】
結合組織に関連した用語「促進する（工程）」は、組織再生を可能にする様式で、例えば、線維芽細胞および角化細胞などの皮膚細胞によるコラーゲンの産生を増加させるプロセスを意味する。したがって本発明の一部の実施形態では、「促進する（工程）」は、組織再生の少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％の増加または組織変性における少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％の停止を意味する。当業者であれば、組織再生の促進を評価するために様々な方法およびアッセイを使用することができ、同様に組織変性の停止を評価するために様々な方法およびアッセイを使用できることを理解するであろう。
【００４９】
本明細書で使用する用語「創傷」は、様々な方法（例えば、糖尿病性潰瘍、長期間の床上安静からの床ずれ、外傷によって誘発された創傷、外科手技中もしくは外科手技後に受けた創傷など）のいずれか一つで開始され、様々な特徴を備える皮膚および皮下組織ならびに内臓への損傷を広汎に意味する。例としては、打撲傷、擦傷、熱傷創、日焼け傷、切開創傷、切除創傷、外科創傷、壊死性筋膜炎、潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、アフタ性潰瘍、褥瘡、瘢痕、円形脱毛症、皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ベルロック皮膚炎、おむつ皮膚炎、汗疱状皮膚炎、乾癬、湿疹、紅斑、いぼ、肛門いぼ、血管腫、サクランボ色血管腫、足部白癬、異常なほくろ、基底細胞癌、ベートマン紫斑、水疱性類天疱瘡、カンジダ症、耳輪軟骨皮膚炎、クラーク母斑、口唇ヘルペス、コンジローム、嚢胞、ダリエ病、皮膚線維腫、円板状エリテマトーデス、貨幣状湿疹、アトピー性湿疹、異汗性湿疹、手湿疹、多形性結節性紅斑、フォーダイス状態、項部息肉性毛嚢炎、毛嚢炎、環状肉芽種、グレーバー病、あせも、単純ヘルペス、帯状疱疹（帯状ヘルペス）、化膿性汗腺炎、汗腺膿瘍、じんましん、多汗症、魚鱗病、膿痂疹、毛孔性角化症、ケロイド、角化棘細胞腫、扁平苔癬、扁平苔癬様角化症、慢性単純性苔癬、硬化性苔癬、リンパ腫様丘疹症、皮膚狼瘡、ライム病、腺状苔癬、粘液様嚢胞、菌状息肉腫、伝染性軟属腫、あざ、爪真菌症、糖尿病性リポイド類壊死、貨幣状皮膚炎、爪甲層状分裂症、爪糸状菌症、苔癬状粃糠疹、バラ色粃糖疹、毛孔性紅色粃糠疹、足底疣贅、ツタウルシ、ウルシ、汗疱、偽鬚髯毛嚢炎、肛門そう痒症および白色粃糠疹が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
創傷は、典型的には、創傷の深さに依存して四つのグレード、（ｉ）グレードＩ：上皮に限定される創傷、（ｉｉ）グレードＩＩ：真皮に及ぶ創傷、（ｉｉｉ）グレードＩＩＩ：皮下組織内に伸びる創傷、および、（ｉｖ）グレードＩＶ（もしくは全層性創傷）、骨が露出している創傷（例えば、大転子もしくは仙骨などの骨圧点）の一つに分類される。
【００５１】
本明細書で使用する用語「中間層創傷」は、グレードＩ〜ＩＩＩを含む創傷を意味するが、中間層創傷の例としては、熱傷創、褥瘡、静脈うっ滞潰瘍および糖尿病性潰瘍が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「深創傷」は、グレードＩＩＩおよびグレードＩＶ創傷の両方を含むことが意図されている。
【００５３】
本明細書で使用する用語「慢性創傷」は、３０日間以内で治癒しなかった創傷を意味する。
【００５４】
創傷に関連する用語「治癒する（工程）」は、瘢痕形成によるなどの創傷を修復するプロセスを意味する（典型的な実施形態では、治癒する（工程）には線維組織形成が欠けている）。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の一部の実施形態の組成物は、治癒プロセスを促進する、すなわち加速する。
【００５６】
語句「皮膚創傷の治癒プロセスを誘発もしくは加速する（工程）」は、創傷収縮の肉芽組織の形成の誘導および／または上皮形成（すなわち、上皮内の新規な細胞の生成）の誘導のいずれかを意味する。創傷治癒は、便宜的には創傷部の減少によって測定される。
【００５７】
一部の態様では、深創傷および慢性創傷を含む全創傷タイプの治療が企図されている。
【００５８】
本明細書で使用する用語「治療する（工程）」は、例えば潅流を増強することなどによって、虚血状態の有害作用を予防する、治癒する、逆転する、減衰する、緩和する、最小限に抑える、抑制する、または、停止させることを意味する。当業者であれば、状態の発生を評価するために様々な方法およびアッセイを使用することができ、同様に状態の軽減、寛解もしくは回帰を評価するために様々な方法およびアッセイを使用できることを理解するであろう。
【００５９】
治療は、例えば下記の実施例の項で記載したモデルなどの日常的実験によって評価することができる。例えば潅流および生存率ならびに組織学的基準および機能的基準などの結果判定法は、皮膚創傷を治療する際の最高治療価値を有する多数の細胞中での最適効率に取り組むために、様々なパラメーターを変動させることの効率を評価するために使用することができる。罹患組織における潅流を決定するために定量できる当分野において公知の追加のパラメーターは、血管造影法およびＭＲＩならびに罹患組織内での組織壊死の程度、組織潰瘍化および手足の指および／または手足の切断術などの臨床パラメーターである。
【００６０】
創傷治癒の状況では、「促進する（工程）」は、それらの治療を可能にする方法で、創傷治癒を許容もしくは支援する能力を意味する。したがって本発明の一部の実施形態では、「促進する（工程）」は、治癒を達成するために要する時間の少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％の軽減または創傷閉鎖率における少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％の増加を意味する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「被験者」は、任意の段階および／または程度で、組織損傷を経験する、もしくは経験する可能性がある、または創傷もしくは虚血に苦しむ任意の年齢にある男性もしくは女性である任意の哺乳動物（例えば、人間または家畜）を意味する。
【００６２】
上記のように、本発明のこの態様による方法は、指示した用量のＥＰＯおよびＦＮを被験者に局所投与することによって達成される。
【００６３】
本明細書で使用する用語「エリスロポエチン」（ＥＰＯ）は、哺乳動物（例えば、ヒト）エリスロポエチンタンパク質（ポリペプチドと互換的に使用される）もしくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７９０に規定されたミメティックなどのそれらのミメティックを意味する。エリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術もしくは固相テクノロジーを使用して合成することができる。エリスロポエチンは、さらに市販でも入手できる（例えば、Ｃｙｔｏｌａｂ／Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｅｈｏｖｏｔ  Ｉｓｒａｅｌ，Ａｒｅｎｅｓｐ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ；およびＥｐｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｒｏｃｈｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）。エリスロポエチンは、全糖タンパク質として、または結合糖が欠けているタンパク質サブユニットのみとして使用することができる。本実施形態のエリスロポエチンは臨床用途のために使用されるので、好ましくは無菌性である、または可能性のある汚染因子（例えば、フィルターなどによって、細菌もしくは細菌成分）から精製することができる。
【００６４】
本明細書で使用する用語「フィブロネクチン」（ＦＮ）は、哺乳動物（例えば、ヒト）フィブロネクチンタンパク質（ポリペプチドと互換的に使用される）もしくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２０１７に規定されたミメティックなどのそれらのミメティックを意味する。フィブロネクチンは、組換えＤＮＡ技術もしくは固相テクノロジーを使用して合成することができる。フィブロネクチンは、さらに市販で入手できる（例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ）。本発明のフィブロネクチンは臨床用途のために使用されるので、好ましくは無菌性である、または可能性のある汚染因子（例えば、フィルターなどによって、細菌もしくは細菌成分）から精製することができる。
【００６５】
ミメティック組成物が使用される場合は、ＦＮおよびＥＰＯの用量は例えばモル値（ｍｏｌａｒ  ｖａｌｕｅ）にしたがうなどによって較正すべきであることは理解されるであろう。このような較正は、当業者にとっては日常的計算である。
【００６６】
本発明の医薬組成物もしくは化粧品組成物は、（例えば、下記の実施例１でさらに提供するような）共製剤または二つの別個の組成物中にエリスロポエチンおよびフィブロネクチンを含むことができる。
【００６７】
本明細書で使用する語句「局所投与する（工程）」は、本発明の組成物を身体の表面、すなわち皮膚、頭皮、毛髪、爪などの上に、好ましくは損傷組織（例えば、皮膚）の表面上、創傷もしくは創傷の表面または糖尿病性潰瘍上に適用もしくは塗布する工程を意味する。共処方されない場合、エリスロポエチンおよびフィブロネクチンの投与は、同時または連続的に実施することができる。
【００６８】
本発明の教示にしたがって塗布されたエリスロポエチンおよびフィブロネクチンの用量が変動する可能性があることは理解されるであろう。したがって、エリスロポエチンは、治療対象の組織損傷もしくは創傷の重症度に依存して組織１ｃｍ２当たり１０〜３０μｇの用量で投与することができる。一つの実施形態では、エリスロポエチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり１５〜２５μｇである。別の実施形態では、エリスロポエチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり約２０μｇである。フィブロネクチンは、治療対象の組織損傷もしくは創傷の重症度に依存して組織１ｃｍ２当たり１００〜３００μｇの用量で投与することができる。一つの実施形態では、フィブロネクチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり１５０〜２５０μｇである。別の実施形態では、フィブロネクチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり約２００μｇである。
【００６９】
特定の実施形態では、投与されるエリスロポエチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり０．１〜１０μｇである。他の実施形態では、投与されるフィブロネクチンの用量は、組織１ｃｍ２当たり１０〜１００μｇである。所定の態様では、エリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンの用量は、化粧品において使用するために適合させられる。例えば、エリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンの用量は、擦傷のある皮膚を治療するために適合させることができる。したがって、本発明の製剤は、さらにまた美容的に、および／または少数の非限定的な例を挙げるとかき傷、軟組織亀裂、座瘡などの結果として範囲の狭い小さな創傷を伴う皮膚状態を治療するための範囲の狭い創傷治癒のためにも使用することができる。したがって、本発明は、例えば、擦傷のある皮膚表面がかき傷、軟組織亀裂、座瘡などの結果である場合に、表面を美容的に治療するために十分量の本発明の組成物を擦傷のある皮膚表面に塗布することによる、一部には擦傷のある皮膚表面を美容のために治療する方法に関する。
【００７０】
本発明は、例えば、擦傷のある皮膚表面がかき傷、軟組織亀裂、座瘡などの結果である場合に、擦傷のある皮膚表面を治癒させるために十分量の本発明の組成物を擦傷のある皮膚表面に塗布することによる、擦傷のある皮膚表面を治癒させる方法に関する。
【００７１】
実施形態のエリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンを含む組成物は、被験者自体または医薬組成物もしくは化粧組成物に投与することができる。一部の態様では、実施形態のエリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチンは、マトリックス内で処方される。特定の態様では、マトリックスは、ゲルである。他の特定の実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。
【００７２】
本明細書で使用する用語「医薬組成物もしくは化粧組成物」は、例えば生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載した有効成分の調製物を意味する。組成物の目的は、被験者への有効成分（例えば、ＥＰＯおよびＦＮ）の投与を促進することである。
【００７３】
本明細書で使用する用語「有効成分」は、意図される生物学的作用（すなわち、創傷治癒、結合組織の再建および虚血症の治療を促進する）の責任を負うエリスロポエチンおよびフィブロネクチン組成物を意味する。
【００７４】
以下では、互換的に使用できる語句「生理学的に許容される担体」および「医薬上許容される担体」は、被験者に有意な刺激を誘発しない、および投与された有効成分の生物学的活性および特性を無効にしない担体もしくは希釈剤を意味する。アジュバントは、これらの語句の下に含まれる。
【００７５】
本明細書では、用語「賦形剤」は、本発明の有効成分の投与をさらに促進するために組成物（医薬組成物もしくは化粧組成物）に添加される不活性物質を意味する。
【００７６】
薬物を調製および投与するための技術は、参照により本明細書に組み込まれる‘‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，’’Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（ペンシルベニア州イーストン）、最新版の中に見いだすことができる。
【００７７】
組成物は、単位剤形として処方することができる。このような形態では、本製剤は、例えば単回投与用などの適切な量の有効成分を含有する単位用量に細分される。単位剤形は、包装が別個の量の製剤を含有する包装された製剤、例えば接着ガーゼ包帯、非接着ガーゼ包帯、ティッシュ、赤ちゃん用ウェットティッシュ、ガーゼ、パッドおよび生理用ナプキンであってよい。
【００７８】
本発明の教示にしたがった単位剤形は、約１０〜３０μｇの用量のエリスロポエチン、約１００〜３００μｇの用量のフィブロネクチンまたは約１０〜３０μｇの用量のエリスロポエチンおよび約１００〜３００μｇの用量のフィブロネクチンの両方を含む。一つの実施形態では、単位剤形は、約１５〜２５μｇの用量のエリスロポエチン、約１５０〜２５０μｇの用量のフィブロネクチンまたは約１５〜２５μｇの用量のエリスロポエチンおよび約１５０〜２５０μｇの用量のフィブロネクチンの両方を含む。また別の実施形態では、単位剤形は、約２０μｇの用量のエリスロポエチン、約２００μｇの用量のフィブロネクチンまたは約２０μｇの用量のエリスロポエチンおよび約２００μｇの用量のフィブロネクチンの両方を含む。追加して、本発明の教示にしたがった単位剤形は、約０．１〜１０μｇの用量のエリスロポエチン、約１０〜１００μｇの用量のフィブロネクチンまたは約０．１〜１０μｇの用量のエリスロポエチンおよび約１０〜１００μｇの用量のフィブロネクチンの両方を含む。
【００７９】
製剤の単位用量中の活性化合物の量は、特定の用途にしたがって変化させられてよい、または調整されてよい。
【００８０】
本発明の組成物（例えば、医薬組成物もしくは化粧組成物）は、局所的様式で、例えば、患者の組織領域（例えば、創傷）への組成物の直接的な投与によって適用することができる。組成物の好適な投与経路は、例えば、局所（例えば、皮膚、毛髪、爪、頭皮などの角質組織へ）および粘膜（例えば、口腔、膣、眼）投与を含む可能性がある。
【００８１】
本発明の組成物は、さらに有効成分（例えば、ＥＰＯおよびＦＮ）および生理学上許容される担体を含む組成物を注射する工程によって適用することもできる。局所投与のためには、組成物は創傷に、および／または創傷皮膚を取り囲む健常皮膚または両方に注射することができる。
【００８２】
本発明の組成物は、当分野において周知のプロセスによって、例えば、従来型の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、研和、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【００８３】
有効成分は、さらに使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェン非含有水溶液を用いて構成するための粉末形にあってもよい。
【００８４】
したがって、本発明にしたがって使用するための組成物は、有効成分の製剤への加工処理を促進する賦形剤および助剤を含む一種以上の生理学上許容される担体を使用して従来型方法で処方することができる。適正な製剤は、選択される投与アプローチに依存する。
【００８５】
治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供した詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内に明確に含まれる。
【００８６】
本発明の方法に使用された任意の製剤については、（治療）有効量もしくは用量は、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから推定することができる。さらに、用量は、所望の濃度もしくは力価を達成するために組織培養系または動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用すると、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００８７】
本明細書に記載した有効成分の毒性および治療有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養または実験動物における標準医薬手法によって決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の用量を調整する際に使用できる。用量は、使用された剤形および利用された投与経路に依存して変動する可能性がある。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態に照らして個々の医師が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５），‘‘Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，’’、第一章、１頁を参照されたい）。
【００８８】
状態（例えば、組織損傷、創傷もしくは虚血の面積、深さおよび程度）の重症度および組織の応答性に依存して、投与する工程は、単回投与であってよい、または数日間から数週間持続する治療の経過に伴って、または治癒が成立するか皮膚状態の減少が達成されるまで複数回の投与であってよい。好ましくは、本発明の組成物は、少なくとも一日一回投与される。
【００８９】
投与すべき組成物の量は、当然ながら、治療される被験者、苦痛の重症度、投与方法、処方医師の判断などに依存するであろう。
【００９０】
本発明の組成物は、所望であれば、有効成分を含有する一つ以上の単位剤形を含有していてよいＦＤＡ承認キットなどのパックもしくはディスペンサー器具で提示されてよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔もしくはプラスチック箔を含む可能性がある。パックもしくはディスペンサー器具には投与のための取扱説明書が添付されてよい。パックもしくはディスペンサー器具には、さらに医薬品の製造、使用もしくは販売を規制する行政機関によって規定された書式での通知であって、ヒトもしくは獣医用投与のための組成物の形態の当局による承認を反映している通知が添付されてよい。このような通知は、例えば、処方薬または承認製品インサートについて米国食品医薬品局によって承認されたラベル表示を含む可能性がある。医薬上許容される担体中で処方された本発明の製剤を含む組成物は、適切な容器中に配置し、上記で詳細に説明したように指示した状態の治療についてラベル表示して調製されてよい。
【００９１】
本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｖｏで利用されるので、組成物は好ましくは高純度で実質的に潜在的に有害な汚染物質を含まない、例えば、少なくとも国家食品（ＮＦ）等級、一般には少なくとも分析等級および好ましくは少なくとも医薬品等級である。所定の化合物が使用前に合成されなければならない限り、このような合成もしくはこの後の精製は、好ましくは、合成もしくは精製手順中に使用されている可能性があるあらゆる潜在的汚染毒性物質を実質的に含んでいない製品を生じさせなければならない。
【００９２】
追加の因子は、本発明の組成物もしくはゲル（すなわち、本明細書で上記したエリスロポエチンおよびフィブロネクチン）に組み込むことができる。これらには、細胞外マトリックス成分（例えば、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン）、成長因子（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦおよびＥＣＧＦ）、低酸素症誘導性因子（例えば、ＨＩＦ−１αおよびβおよびＨＩＦ−２）、ホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン（ＧＨ）、ＣＲＨ、レプチン、プロラクチンおよびＴＳＨ）、血管新生因子（例えば、アンジオゲニンおよびアンジオポエチン）、凝固および抗凝固因子［例えば、第Ｉ因子、第ΧＩＩＩ因子、組織因子、カルシウム、ｖＷＦ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、フィブロネクチン、アンチトロンビン、ヘパリン、プラスミノーゲン、低分子量ヘパリン（Ｃｌｉｘａｎ）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ΡＡＩ２）、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、α２−抗プラスミンおよびプロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）］、サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−γ）、ケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１もしくはＣＣＬ２）、酵素（例えば、エンドグリコシダーゼ、エキソグリコシダーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、ヒドラーゼ、コンドロイチナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、ヒアルロニダーゼ、ケラタナーゼ、へパラナーゼ、ヘパラナーゼスプライス変異、コラゲナーゼ、トリプシン、カタラーゼ）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリンおよびモノアミン）、神経ペプチド（例えば、サブスタンスＰ）、ビタミン類（例えば、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸、カルシウム塩、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＢ１〜６、ビタミンＫ、ビタミンＡおよびビタミンＰＰ）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、マルトースおよびフルクトースを含む単糖／二糖／多糖）、イオン、キレート剤（例えば、Ｆｅキレート剤、Ｃａキレート剤）、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ、クエルセチン（Ｑｕａｒｃｅｔｉｎ）、スーパーオキシドスカベンジャー、スーパーオキシドジスムターゼ）、Ｈ２Ｏ２スカベンジャー、フリーラジカルスカベンジャー、Ｆｅスカベンジャー）、脂肪酸（例えば、トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、遊離脂肪酸および非遊離脂肪酸、脂肪族アルコール、リノール酸、オレイン酸およびリポ酸）、抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよびテトラサイクリン）、鎮痛剤、麻酔薬、抗菌剤、抗酵母剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、プロバイオティクス剤、抗原虫薬、痒み止め薬、抗皮膚炎薬、制吐薬、抗炎症薬、抗角化症薬、制汗剤、抗乾癬薬、抗脂漏薬、抗ヒスタミン剤、アミノ酸（例えば、必須および非必須（Ａ〜Ｚ）、詳細にはグルタミンおよびアルギニン）、塩類（例えば、ピルビン酸（ｐｒｕｒｉｖａｔ  ｓａｌｔ）および硫酸塩）、硫酸エステル（例えば、硫酸カルシウム）、ステロイド（例えば、アンドロゲン、エストロゲン、黄体ホルモン、グルココルチコイドおよび鉱質コルチコイド）、カテコールアミン（例えば、エピネフリンおよびノルエピネフリン）、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、プリンおよびピリミジン）、プロスタグランジン（例えば、プロスタグランジンＥ２）、ロイコトリエン、エリスロポエチン（例えば、トロンボポエチン）、プロテオグリカン（例えば、硫酸ヘパラン、硫酸ケラタン）、ヒドロキシアパタイト［例えば、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）］、ハプトグロビン（Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−２およびＨｐ１−２）、スーパーオキシドジスムターゼ（例えば、ＳＯＤ１／２／３）、一酸化窒素、一酸化窒素供与体（例えば、ニトロプルシド、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）、グルタチオンペルオキシダーゼ、水和化合物（例えば、バソプレッシン）、細胞（例えば、血小板）、細胞培地（例えば、Ｍ１９９、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｓ）、血清（例えば、ヒト血清、ウシ胎仔血清、ウシ胎児血清）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム）、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、消毒剤、ハーブ、果実抽出物、野菜抽出物（例えば、キャベツ、キュウリ）、花抽出物、植物抽出物、フラビノイド（例えば、ザクロジュース）、スパイス、葉（例えば、緑茶、カモミール）、ポリフェノール（例えば、赤ワイン）、ハチミツ、レクチン、微粒子、ナノ粒子（リポソーム）、ミセル、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３、例えば、沈降炭酸カルシウム、重質／粉末状炭酸カルシウム、Ａｌｂａｃａｒ、ＰＣＣ、ＧＣＣ）、カルサイト、石灰岩、粉砕大理石、粉砕石灰岩、石灰、チョーク（例えば、白亜、シャンパンチョーク、フレンチチョーク）およびＢＨ４（テトラヒドロビオブテリン）などの補因子が含まれるがそれらに限定されない。
【００９３】
組成物は、さらに、水素、アルキル基、アリール基、ハロ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシル基、カルボキシル基、カルボアミド基、スルホンアミド基、アミノアシル基、アミド基、アミン基、ニトロ基、有機セレニウム化合物、炭化水素および環状炭化水素を含有する成分、物質、要素および材料もまた含有する可能性がある。
【００９４】
組成物は、例えば、過酸化ベンゾール、血管収縮薬、血管拡張薬、サリチル酸、レチノイン酸、アゼライン酸、乳酸、グリコール酸、ピルビン酸（ｐｙｒｅｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、タンニン、ベンジリデンカンファー（ｂｅｎｚｌｉｄｅｎｅｃａｍｐｈｏｒ）およびそれらの誘導体、αヒドロキシリス、界面活性剤などの物質と結合することができる。
【００９５】
本発明の一部の実施形態の組成物は、それらの生物学的活性を維持してそれらの半減期を延長しながら、有効成分（すなわち、本発明のＥＰＯおよび／またはＦＮ組成物）の安定性（例えば、プロテアーゼ活性に対して）および／または溶解度（例えば、血液、消化液などの生体液内）を維持するポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ、ＳＥ−ＰＥＧ）にバイオコンジュゲートさせることができる。
【００９６】
本明細書に開示した医薬上有効量の物質に加えて、本発明のこの態様の組成物もまた、皮膚学上許容される担体をさらに含む。
【００９７】
語句「皮膚学上許容される担体」は、皮膚、すなわち角質組織上への局所塗布のために好適である、優れた審美的特性を有する、本発明の活性物質および任意の他の成分と適合する、および、哺乳動物において使用するために安全で非毒性である担体を意味する。
【００９８】
有効成分（例えば、本発明のエリスロポエチンおよび／またはフィブロネクチン）の経皮吸収を強化するために、組成物にジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン、アルコール、アセトン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールを含むがそれらに限定されない多数の作用物質の一つ以上を添加することができる。
【００９９】
本発明の組成物において利用される担体は、広汎な形態にあってよい。これらには、水中油型、油中水型、水中油中水型および水中シリコーン中油型エマルジョン、クリーム、軟膏、水溶液、ローション、石鹸、ペースト、エマルジョン、ゲル、スプレーまたはエーロゾルを含むがそれらに限定されないエマルジョン担体が含まれる。当業者であれば理解できるように、特定の成分は、組成物中の成分の水溶性／分散性に依存して、主として水相もしくは油／シリコーン相のいずれかに分散するであろう。
【０１００】
本発明によるエマルジョンは、一般に、本明細書に開示した医薬有効量の作用物質および脂質もしくは油を含有している。脂質および油は、動物、植物もしくは石油に由来してよく、天然または合成（すなわち、人工）であってよい。好適な乳化剤の例は、例えば、それぞれが本明細書に全体として参照により組み込まれる、１９７３年８月２８日にＤｉｃｋｅｒｔらへ発行された米国特許第３，７５５，５６０号明細書；１９８３年１２月２０日にＤｉｘｏｎらへ発行された米国特許第４，４２１，７６９号明細書：およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ、北米版、３１７−３２４頁（１９８６）に記載されている。
【０１０１】
エマルジョンは、さらに角質組織上に塗布後の泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、高分子量シリコーンおよびこのような使用のために当分野において周知である他の物質が含まれる。
【０１０２】
好適なエマルジョンは、所望の製品形態に依存して、広範囲の粘度を有することができる。
【０１０３】
水中油型エマルジョンを含む好適な担体の例については、それぞれが全体として参照により完全に組み込まれる１９９１年１２月１７日に発行されたＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌへの米国特許第５，０７３，３７１号明細書および１９９１年１２月１７日に発行されたＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌへの米国特許第５，０７３，３７２号明細書に記載されている。構造化剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、親水性界面活性剤および水を含有する特に好ましい水中油型エマルジョンについては、以下で詳細に記載する。
【０１０４】
好ましい水中油型エマルジョンは、結晶ゲル網目構造の形成を支援するための構造化剤を含む。理論によって限定されなくても、構造化剤は、組成物の安定性に寄与する組成物に流動学的特性を提供することを支援すると考えられる。構造化剤は、さらに乳化剤もしくは界面活性剤として機能することができる。
【０１０５】
本明細書では広範囲のアニオン性界面活性剤もまた有用である。例えば、参照によりこの全体として本明細書に完全に組み込まれる、１９７５年１２月３０日に発行されたＬａｕｇｈｌｉｎらへの米国特許第３，９２９，６７８号明細書を参照されたい。さらに、両性および両性イオン性界面活性剤もまた本明細書では有用である。
【０１０６】
本発明の組成物は、下記に記載するような液剤、ローション剤、スプレー剤、クリーム剤、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル剤、油剤、洗浄液などを含む皮膚適用のために製薬業によって利用された様々な形態のいずれかで処方することができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、治療された皮膚領域上に残留するために十分な粘性で処方することができ、容易に蒸発しない、および／または水で容易に洗い流すことができないが、石鹸、クレンザーおよび／またはシャンプーを用いると除去できる。
【０１０８】
このような特性を有する組成物を調製するための方法は、当業者には周知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０（上記）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第六版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９５）の中で詳述されている。
【０１０９】
ローション剤およびクリーム剤を含むがそれらに限定されない本発明の局所組成物は、皮膚学上許容される皮膚軟化剤を含む可能性がある。本明細書で使用する用語「皮膚軟化剤」は、皮膚の乾燥の予防もしくは緩和ならびに保護のために有用な物質を意味する。多種多様な好適な皮膚軟化剤は公知であり、本明細書で使用できる。例えば、皮膚軟化剤として好適な物質の数多くの例を含有しており、参照により本明細書に完全に組み込まれるＳａｇａｒｉｎ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第二版、第一巻、３２４３頁（１９７２）を参照されたい。好ましい皮膚軟化剤は、グリセリンである。
【０１１０】
本発明によるローション剤およびクリーム剤は、一般には液剤担体系および一種以上の皮膚軟化剤を含む。
【０１１１】
本発明の局所塗布される組成物は、さらに、例えば、香料および皮膚栄養因子を備える組成物を濃縮するために添加される追加の成分をさらに含む可能性がある。
【０１１２】
着実な医学的判断の範囲内で毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを誘発することなくヒト角質組織上に使用するために好適な成分が選択される。さらに、このような任意選択的成分は、それらが本発明の活性化合物の利点を許容できないほど変化させないことを前提に有用である。
【０１１３】
Ｔｈｅ  ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第二版（１９９２）は、本発明の組成物において使用するために好適である、スキンケア産業において一般に使用される広範囲の非限定的な化粧用成分について記載している。これらの成分クラスの例としては、研磨剤、吸収剤、審美的成分、例えば香料、顔料、カラーリング剤／着色剤、精油、皮膚温感剤、収斂剤など（例えば、丁子油、メントール、カンファー、ユーカリ油、オイゲノール、乳酸メンチル、ウィッチヘーゼル蒸留液）、抗座瘡剤、凝固防止剤、消泡剤、抗菌物質（例えば、ヨードプロピルカルバミン酸ブチル）、酸化防止剤、結合剤、生物学的添加物、緩衝剤、増量剤、キレート剤、化学的添加物、着色剤、化粧用収斂剤、化粧用殺生物剤、変性剤、薬物用収斂剤、外用鎮痛剤、フィルム形成剤もしくはフィルム材料、例えば、フィルム形成特性および組成物の直接性を援助するためのポリマー（例えば、エイコセンとビニルピロリドンとのコポリマー）、乳白剤、ｐＨ調整剤、噴射剤、還元剤、封鎖剤、皮膚コンディショニング剤（例えば、混合型および密封型を含む湿潤剤）、皮膚平滑剤および／または治癒剤（例えば、パンテノールおよび／または誘導体（例えば、エチルパンテノール）、アロエ・ベラ、パントテン酸および誘導体、アラントイン、ビサボロールおよびグリチルリジン酸（ｇｌｙｃｙｆｆｈｉｚｉｎａｔｅ）二ナトリウム）、皮膚治療剤、増粘剤ならびにビタミン類およびそれらの誘導体が挙げられる。
【０１１４】
本発明の組成物は、皮膚に直接塗布することができる。または、本発明の組成物は、例えば徐放性様式で皮膚内に組成物を放出する経皮パッチなどの、当分野において公知である様々な経皮薬物送達系による通常の皮膚塗布によって送達することができる。当分野において公知の他の薬物送達系には、加圧エアロゾルボトル、イオントフォレーシスもしくはソノフォレーシスが含まれる。イオントフォレーシスは、皮膚透過性を増加させて経皮送達を促進するために使用される。米国特許第５，６６７，４８７号明細書および同第５，６５８，２４７号明細書は、皮膚を越えた治療薬の超音波−イオン導入法媒介性輸送のために好適なイオン音波装置を開示している。または、もしくは加えて、リポソームもしくはミセルもまた送達ビヒクルとして使用することができる。
【０１１５】
創傷および虚血は頭皮に関与する可能性があるので、本発明の組成物にはさらに、頭皮および毛髪上で使用するために好適である皮膚軟化剤、界面活性剤および／またはコンディショナーが含まれる。
【０１１６】
皮膚軟化剤には、炭化水素油およびワックス、例えば鉱油、石油など、植物油および動物油および脂肪、例えばオリーブ油、ヤシ油、ヒマシ油、コーン油、大豆油など、ならびに、ラノリンおよび誘導体、例えばラノリン、ラノリン油、ラノリンワックス、ラノリンアルコールなどが含まれるがそれらに限定されない。他の皮膚軟化剤には、例えばミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、パルミチン酸などの１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸のエステル、例えばミリスチン酸メチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸プロピル、イソステアリン酸プロピル、パルミチン酸プロピルなどが含まれる。他の皮膚軟化剤には、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、イソステアリン酸、パルミチン酸などを含む、１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸が含まれる。皮膚軟化剤には、さらに、例えばセチル、ミリスチル、ラウリル、イソステアリル、ステアリルなどの１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールが含まれる。
【０１１７】
乳化剤／界面活性剤は、好ましくは毛髪上に使用するために本発明の組成物を処方する場合に利用される。
【０１１８】
界面活性剤の例としては、親水性酸化アルキレン、酸化ポリエチレン、酸化プロピレン、酸化ブチレン、酸化ポリエチレンもしくはポリエチレングリコールとの縮合のために利用できる遊離反応性水素を有する疎水性アルキル、アルケンもしくはアルキル芳香族官能基の酸化ポリオキシアルキレン縮合生成物が挙げられるがそれらに限定されない。特に効果的であるのは、オクチルフェノールとＲｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙによって商標名ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）  １００シリーズ製品の下で販売される約７〜約１３モルの酸化エチレンとの縮合生成物である。
【０１１９】
例えば香料、安定剤、色素、抗微生物剤、抗菌剤、抗凝集剤、紫外線吸収剤などの他の成分もまた、実施形態の組成物中に含まれる。
【０１２０】
エトキシル化モノクアットと一緒に少なくとも一つの第四級アンモニウム部分を有するシリコーン化合物などの酸加水分解に対して安定性であるコンディショナー剤は、さらにまた実施形態の組成物を安定化および任意選択的に増粘するために利用される。
【０１２１】
本発明の組成物を乳白化するために使用できる材料には、脂肪酸エステル、乳白化ポリマー、例えばＭｏｒｔｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．からのＯＰＡＣＩＦＩＥＲ  ６５３（商標）のようなスチレンポリマー、および、脂肪族アルコールが含まれる。下記のセチルアルコール；ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ベヘニルアルコール、および、アラキジルアルコールは、脂肪族アルコールの非限定的リストである。透明ではない本発明のコンディショニング組成物は、さらにＬｅｘａｍｉｎｅ  Ｓ−１３、塩化ジセチルアンモニウムおよびセテアレス−２０を含む可能性がある。
【０１２２】
特定の実施形態では、エリスロポエチンおよびフィブロネクチン製剤は、約１０〜３０μｇ／ｍＬのエリスロポエチンおよび約１００〜３００μｇ／ｍＬのフィブロネクチン、約０．２０％のメチルパラベン、約９％のラウレスおよびイソパラフィンおよびポリアクリルアミド、約１２％の脱イオン水ならびに１００％までのリン酸緩衝液を含んでいる。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、エリスロポエチンおよびフィブロネクチン製剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（５重量／重量％）、フィブロネクチン（ＦＮ）（３０重量／重量％）、グリセロール（５重量／重量％）、ｃａｒｂｏｍｅｒ  ９４０（１重量／重量％）、ベンジルアルコール（ＢＡ）（２重量／重量％）、トリエタノールアミン（０．９重量／重量％）、メチルパラベン（０．２重量／重量％）、プロピルパラベン（ＰＰ）（０．０５重量／重量％）および水（１００重量／重量％まで）を含む。
【０１２４】
さらに他の実施形態では、エリスロポエチンおよびフィブロネクチン製剤もしくは組成物は、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のエリスロポエチン、０．０１重量／重量％〜５０重量／重量％の任意の数値の濃度のフィブロネクチン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のグリセロール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のカルボマー９４０、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のベンジルアルコール、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のトリエタノールアミン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のメチルパラベン、０．０１重量／重量％〜３０重量／重量％の任意の数値の濃度のプロピルパラベンおよび０．０１重量／重量％〜１００重量／重量％の任意の数値の濃度の水を含む。
【０１２５】
したがって、本発明の実施形態は、血管新生および創傷治癒のための局所組成物を含む。
【０１２６】
本発明の組成物が例えば光線療法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（オハイオ州ビーチウッド）による創傷ケア用のＤｅｒｍａｎｗａｎｄ（商標））および超音波療法（例えば、米国特許第６，９６０，１７３号明細書を参照されたい）などであるがそれらに限定されない他の現在実践されている療法と組み合わせて使用できることは理解されるであろう。
【０１２７】
本出願から発達して特許権の存続期間中には、多数の関連エリスロポエチンおよびフィブロネクチン組成物が開発され、用語「エリスロポエチンおよびフィブロネクチン組成物」の範囲はこのような新規なテクノロジー全てを先験的に含むことが意図されることは予測される。
【０１２８】
本明細書で使用する用語「約」は、±１０％を意味する。
【０１２９】
エリスロポエチンおよびフィブロネクチンの組成物および製剤は、どちらの内容も全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４／０１５４２０５（Ａｌ）号明細書（「治療および美容用途のためのエリスロポエチンおよびフィブロネクチン組成物」）および米国特許出願第２０１０／０３１０６２６（Ａｌ）号明細書（「骨再生のためのエリスロポエチンおよびフィブロネクチン組成物」）に記載されている。
【実施例】
【０１３０】
ＩＩＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証するために含まれる。当業者であれば、下記に示す実施例に開示した技術は、本発明の実践において明確に機能するために実践のために好ましい様式を構成すると見なすことができる本発明者によって見いだされた技術を表すと理解すべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らせば、本明細書に開示した、およびさらに本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様もしくは類似の結果を得るために特定の実施形態において多数の変化を加えられることを理解すべきである。
【０１３１】
実施例１
四頭のブタ、ＤＭを備える二頭のブタおよび二頭のコントロールブタが１４日間の試験期間を完了した。二頭の糖尿病性ブタは二頭のコントロールブタよりも有意に高い血糖およびグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）レベルならびに低い体重を有していた。ビヒクル含有、ＦＮ含有、ＥＰＯ含有およびＥＰＯ／ＦＮ含有ゲルを用いた熱傷の局所治療は、（ａ）糖尿病性ブタにおける赤血球数、白血球数もしくは血小板数ならびに上昇した血糖レベルおよび（ｂ）コントロールおよび糖尿病性ブタにおける血中ヘモグロビンおよびＨｂＡｌｃレベルを変化させなかった（表１）。
【０１３２】
【表１】
2020180137.tif 000003
【０１３３】
局所的ＥＰＯは、用量依存法で創傷閉鎖を促進して糖尿病性創傷の再生皮膚中への血流量を増加させる。
この作用は、ＦＮによって強化される。ＥＰＯ治療、ＦＮ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷は、ビヒクル治療糖尿病性創傷より速く閉鎖した。創傷閉鎖率における最も有意な差は、第４日以降のビヒクル治療とＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷との間で検出された。第４日以降では、ＥＰＯ／ＦＮ治療創傷の創傷閉鎖率はＦＮ治療およびＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率より有意に速かった。第９日以降では、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率はＦＮ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率より速かった（図１Ａ）。
【０１３４】
ビヒクル治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率は、ビヒクル治療健常創傷の創傷閉鎖率より有意に緩徐であった。ＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率は、用量依存性であった。高用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率は、低用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率より有意に速かった。さらに、低用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率は、ビヒクル治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率より有意に速かった（図１Ｂ）。
【０１３５】
ビヒクル治療糖尿病性創傷における血流量は、第２日以降のビヒクル治療非糖尿病性創傷における血流量より少なかった。さらにまた、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷における血流量はＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷の血流量と有意には相違しなかった、および、ビヒクル治療およびＦＮ治療糖尿病性創傷における血流量より有意に高かったこともまた見いだされた（図１Ｃ；右側のパネル）。高用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷における血流量は、第４日以降のビヒクル治療糖尿病性創傷における血流量および第７日以降の低用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷における血流量より有意に高かった。低用量ＥＰＯ治療糖尿病性創傷における血流量は、第９日以降のビヒクル治療糖尿病性創傷における血流量より有意に高かった（図１Ｄ；右側のパネル）。
【０１３６】
局所ＦＮは、非糖尿病性創傷の再生皮膚内での創傷閉鎖率および血流量には影響を及ぼさない。
健常ブタのビヒクル治療およびＦＮ治療創傷の創傷閉鎖率および血流量は、極めて類似であった。第４日以降、ＥＰＯ治療非糖尿病性創傷の創傷閉鎖率および血流量は、ビヒクル治療およびＦＮ治療非糖尿病性創傷の創傷閉鎖率および血流量より有意に高かった。興味深いことに、創傷閉鎖率および血流量における最も有意な差は、第４日〜第１１日の期間にわたる健常ブタにおけるＥＰＯ／ＦＮ治療創傷およびビヒクル治療間、およびＦＮ治療およびＥＰＯ治療創傷間で検出された（図２Ａ＆２Ｂ）。
【０１３７】
局所ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内での微小血管密度（ＭＶＤ）およびｅＮＯＳ発現レベルを増加させ、ＦＮはこれらの作用を強化する。
ビヒクル治療糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルは、１４日後のビヒクル治療非糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルより低かった（図３Ａ〜Ｅ）。１４間にわたる局所ＦＮ治療は、糖尿病性および非糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルに作用を及ぼさなかった（図３Ｂ〜Ｅ）。他方、１４日間にわたる局所ＥＰＯ治療は、糖尿病性および非糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルを有意に増加させる（図３Ｂ〜Ｅ）。ＥＰＯ治療非糖尿病性創傷においては、ＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルはＥＰＯ治療非糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルとは有意に相違しなかった（図３Ｂ＆３Ｄ）。これとは対照的に、ＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷のＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルは、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷におけるＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルより有意に高かった（図３Ｃ＆３Ｅ）。
【０１３８】
局所ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内でのコラーゲン沈着および（ＨＡ）合成を増加させ、ＦＮはこの作用を強化する。
ビヒクル治療糖尿病性創傷におけるヒドロキシプロピン（ＨＰ）およびＨＡの量ならびに二種のＨＡシンターゼであるＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現レベルは、１４日後のビヒクル治療非糖尿病性創傷におけるより低かった（図４Ａ〜Ｇ）。１４間にわたる局所ＦＮ治療は、糖尿病性および非糖尿病性創傷におけるＨＰおよびＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現レベルを変化させなかった（図４Ｂ〜Ｇ）。他方、１４日間にわたる局所ＥＰＯ治療は、糖尿病性および非糖尿病性創傷におけるＨＰおよびＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現レベルを有意に増加させた（図４Ｂ〜Ｇ）。ＥＰＯ／ＦＮ治療非糖尿病性および糖尿病性創傷におけるＨＰ量は、それぞれＥＰＯ治療非糖尿病性および糖尿病性創傷におけるＨＰ量よりも有意に高かった（図４Ａ〜Ｃ）。ＥＰＯ／ＦＮ治療非糖尿病性創傷のＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルは、ＥＰＯ治療非糖尿病性創傷のＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルと極めて類似であった（図４Ｄ＆４Ｆ）。これとは対照的に、ＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷内のＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２Ｓ発現レベルは、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷におけるＨＡ量ならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルより有意に高かった（図４Ｅ＆４Ｇ）。
【０１３９】
ＡＱＰ３発現は、創傷のない糖尿病性皮膚では減少する。
創傷のない糖尿病性ブタの皮膚内のＡＱＰ３発現レベルは、創傷のない健常ブタの皮膚におけるより低かった（図５Ａ〜Ｄ）。創傷のない糖尿病性ブタの皮膚内のＡＱＰ３プロテイン発現レベルは、創傷のない健常ブタの皮膚におけるより有意に低かった（ｐ＜０．０１）（図５Ｅ＆Ｇ）。この結果は、さらにＡＱＰ３  ｍＲＮＡ発現レベルにおいても反映されている。創傷のない糖尿病性皮膚内のＡＱＰ３  ｍＲＮＡ発現レベルは、創傷のない健常ブタの皮膚におけるＡＱＰ３  ｍＲＮＡ発現レベルより有意に低かった（ｐ＜０．０１）（図５Ｆ）。
【０１４０】
局所ＥＰＯは、糖尿病性創傷の再生皮膚内でのＡＱＰ３発現を刺激し、ＦＮはこの作用を強化する。
１４日後、ビヒクル治療糖尿病性創傷におけるＡＱＰ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル治療非糖尿病性創傷におけるＡＱＰ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現レベルより有意に低かった（図６Ａ〜Ｈ）。糖尿病性およびコントロールブタでは、（ａ）ＥＰＯ治療創傷におけるＡＱＰ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現はビヒクル治療およびＦＮ治療創傷のＡＱＰ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現より有意に高く、（ｂ）ＥＰＯ／ＦＮ治療創傷はＥＰＯ治療創傷のＡＱＰ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現より有意に高く、および（ｃ）ビヒクル治療およびＦＮ治療創傷は相互に相違しなかった（図６Ａ〜６Ｈ）。
【０１４１】
ＡＱＰ３タンパク質発現は、糖尿病性熱傷創の再生皮膚内の血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡの量と正相関する。
ピアソンの相関関係を使用して、健常ブタおよび糖尿病性ブタの熱傷創内のＡＱＰ３タンパク質発現レベル、血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡ量間の相関関係を調査した。糖尿病性ブタおよび健常ブタにおいて、ＡＱＰ３タンパク質発現レベルは、血管新生の程度（図７Ａ＆７Ｂ）、ＨＰ量（図７Ｃ＆７Ｄ）およびＨＡ量（図７Ｅ＆７ｆ）と正相関していた。興味深いことに、これらの相関は、糖尿病性ブタの熱傷創の再生皮膚内では健常ブタの熱傷創の再生皮膚内で見いだされる相関よりも有意に強度であった。
【０１４２】
ＡＱＰ３阻害は、糖尿病性熱傷創における創傷閉鎖率、血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡ量に局所的ＥＰＯが及ぼす作用を減少させる。
ＡＱＰ３活性がＨｇＣｌ２によって遮断されると、ＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療糖尿病性創傷の創傷閉鎖率が有意に減少した（図８Ａ）。創傷閉鎖率におけるこの減少には、減少した血流量（図８Ｂ）、低いｅＮＯＳ発現レベル（図８Ｃ）、低いＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベル（図８Ｃ）、血管新生の低い程度（図８Ｄ）、減少したＨＰ量（図８Ｅ）および減少したＨＡ量（図８Ｆ）が付随した。さらに、ＥＰＯ／ＨｇＣｌ２治療糖尿病性創傷における創傷閉鎖率、ｅＮＯＳ、ＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現レベル、ＨＰおよびＨＡの量は、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷におけるより有意に低かった。
【０１４３】
高グルコースはヒト皮膚に由来する角化細胞および線維芽細胞内でのＡＱＰ３発現をダウンレギュレートするが、この作用はＥＰＯによって遮断される。
５日間にわたり高グルコース（ＨＧ）レベルに曝露させたＨＥＫＣおよびＮＨＦＣの増殖率は、正常グルコース（ＮＧ）レベルに曝露させられた細胞の増殖率より低かった（図９Ａ＆９Ｂ）。ＨＧ曝露細胞内でのＡＱＰ３発現レベルは、ＮＧ曝露細胞におけるＡＱＰ３発現レベルより相当に低かった（図９Ｃ＆９Ｄ）。ＥＰＯ治療は、５日間にわたりＨＧにおいてインキュベートした細胞の正常ＡＱＰ３発現レベルおよび増殖率を回復させた。
【０１４４】
方法
１型ＤＭのブタモデル。
本試験は、Ｌａｈａｖ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（イスラエル国Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｌａｈａｖ）から購入された四頭の体重６０ｋｇの健常雌性ブタ（Ｓｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）を含んでいた。ブタは、ブタにおける皮膚創傷治癒がヒトの皮膚創傷治癒と類似であるために、この調査のための実験動物として選択された（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，２００１）。ブタは、一定の温度範囲（２４±２℃）および相対湿度（５５±１０％）で１２時間の人工明暗周期を備える室内の囲い内に一頭ずつ収容した。ブタを試験前の１週間にわたり順化させ、標準実験動物用飼料および水を自由に摂取させた。ブタの維持管理および福祉は、（ａ）‘‘Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ’’、第七版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ（米国ワシントンＤＣ）に描出されている動物の福祉および人道的な動物治療に関するガイドラインならびに（ｂ）実験および他の科学的目的についての動物の使用に関するイスラエル国の法令にしたがったＴｅｃｈｎｉｏｎガイドラインを順守していた。
【０１４５】
ＤＭの誘導、熱傷創の作製、創傷治療、ドレッシングの交換およびデータ収集は、固定化せずに意識のあるブタの創傷の清浄化、治療および包帯貼付が極めて困難であるために、全身麻酔下で実施した。全身麻酔は、プロポフォールの静脈内投与（５ｍｇ／ｋｇ）を使用して誘導し、次に気管内挿管後に２：１の酸素／一酸化窒素混合液中の５％のイソフルランを使用して維持した。二頭のブタにおける調査中の血液採取およびＤＭ誘導中の流体の注入のために、静脈内カテーテルを四頭のブタにおける全身麻酔下で右頸静脈内に永久的に配置した。麻酔をかけたブタの心拍数および血中酸素飽和度は、非侵襲性耳酸素測定法を使用して監視し、ブタの体温はデジタル式直腸体温計を使用して監視した。全手技後、ブタは手術台上で麻酔から回復するに任せ、抜管し、次にブタの囲いに戻した。実験最終日である第１４日に、ブタはデータおよび検体収集のために麻酔を施し、次にＫＣｌ（２ｍｍｏｌ／ｋｇ；４０ｍＬ）および過量のイソフルラン（５％）の静脈内注射によって人道的に殺めた。
【０１４６】
ＤＭは、以前に記載されたプロトコール（Ｈａｒａ，２００８）にしたがってブタ二頭において誘導した。手短には、ブタは一晩絶食させ、次にストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）の投与前１時間にわたり０．９％のＮａＣｌ（１０ｍＬ／ｋｇ／時）を静脈内投与することで水和させた。ＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇ）を０．９％のＮａＣｌ中に溶解させ、１分間かけて植込み静脈内カニューレを通して静脈内投与した。血糖レベルは、グルコメーターを使用してＳＴＺ投与後６時間にわたり１５分毎にチェックした（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＦＲＥＥＤＯＭ  Ｌｉｔｅ，Ａｂｂｏｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州アラメダ）。膵β細胞の急性ＳＴＺ誘導性損傷によって誘発される可能性がある重症低血糖を回避するために、グルコース（水１００ｍＬ中に溶解させた５０ｇ）をＳＴＺ投与後初期２時間中に継続的もしくは間欠的いずれかで静脈内注入した。血糖値は、試験期間中に血糖計によって少なくとも毎日二回チェックした。ＤＭの誘導は、血糖値がＳＴＺ投与の６時間後に３００ｍｇ／ｄＬ以上であり、１４日間の試験期間の継続中に持続した場合に成功であると見なされた。３００〜４００ｍｇ／ｄＬの糖尿病性ブタの絶食時血糖値を維持するために、長時間作用型インスリン（２４ＩＵ  Ｌａｎｔｕｓ；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国ミズーリ州カンザスシティー）を静脈内注射した。
【０１４７】
中間層皮膚熱傷創の作製
ＤＭは、中間層皮膚熱傷創が麻酔下で作製される前の一カ月間維持された。麻酔を施したら、ＶＥＥＴ脱毛クリーム（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ  ｐｌｃ（英国バークシャー州スラウ）を使用して、各ブタの脊柱の両側上の背面皮膚の剛毛を除去した。次に無菌技術を使用して、皮膚を水で浄化して組織を乾燥させ、この後にブタの清浄な背面皮膚上に１２ｃｍ２の環状中間層皮膚熱傷創を作製した。熱傷創は、以前に記載された方法（Ｄａｖｉｓ，１９９０）を使用して作製した。手短には、それぞれが約２．２５ｃｍの径および重量３５８ｇを備える四本の真ちゅう製の円筒形棒を２分間にわたり温水（９２℃）中に配置した。４群の六カ所の中間層熱傷創は、追加の圧力を加えずに２０秒間にわたり麻酔を施した各ブタの背面皮膚上に棒を垂直に配置することによって作製した。二頭の糖尿病性ブタにおいて、六カ所の中間層熱傷創の一つの追加群を作製した。皮膚に加熱した棒を適用する前に、水滴が蒸発することから皮膚上の蒸気による熱傷創の作製を防止するために、棒を拭いて乾かした。
【０１４８】
局所創傷治療のためのＥＰＯ製剤
局所創傷治療のための六種のゲルは、米合衆国薬局方に規定の勧告にしたがってＲｅｍｅｄｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて調製された：（ａ）有効成分を全く含有していなかったゲル（ビヒクルゲル）、（ｂ）２，０００ＩＵ／ｇのＥＰＯ（高用量ＥＰＯ）を含有していたゲル、（ｃ）５００ＩＵ／ｇのＥＰＯ（低用量ＥＰＯ）を含有していたゲル、（ｄ）３００μｇ／ｇのＦＮを含有していたゲル、（ｅ）２，０００ＩＵ／ｇのＥＰＯおよび３００μｇ／ｇのＦＮを含有していたゲル、ならびに（ｆ）０．１ｍＭのＨｇＣｌ２および２，０００ＩＵ／ｇのＥＰＯを含有していたゲル。組換えヒトＥＰＯは、注射液（ＥＰＲＥＸ（登録商標）、４０，０００ＩＵ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｃｉｌａｇ  Ｂｕｃｋｓ（英国））として購入された。ＦＮは、ｌｍｇ／ｍＬ溶液（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州ビルリカ））として購入された。ＨｇＣｌ２（０．ｌｍＭ）は、創傷内の皮膚ＡＱＰ３活性を遮断するために２，０００ＩＵ／ｇのＥＰＯを含有し、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））から購入されたゲル内に組み込まれた（陰性コントロール）。ゲルの安定性試験の結果は、ＥＰＯおよびＦＮが、ＥＬＩＳＡによって決定されたように、４℃で少なくとも３カ月間にわたりゲル内で安定性であることを確証した。
【０１４９】
【表２】
2020180137.tif 000004
【０１５０】
製剤の調製方法
製剤は、下記のように調製した。
１．メチルパラベン（ＭＰ）およびプロピルパラベン（ＰＰ）をガラス製ビーカー内に測り入れ、グリセロールおよびベンジルアルコール（ＢＡ）中に溶解させた。
２．１／３バッチサイズのＷＦＩを加え、加熱プレートおよび上方ミキサーを使用して６０℃で３０分間撹拌した。
３．混合物を撹拌しながら３０℃へ冷却した。
４．加熱せずに撹拌しながら必要量のカルボマー９４０をゆっくりと加えた。
５．混合物にＥＰＯを加え、１０分間混合した。
６．混合物にＦＮを加え、１０分間混合した。
７．十分量のトリエタノールアミンを添加することによってｐＨを６．５±０．３に調整した。
８．必要な重量を得るために十分量のＷＦＩを加えた。
９．室温で３０分間混合した。
【０１５１】
【表３】
2020180137.tif 000005
【０１５２】
調製方法
調製すべき総量のために必要とされる各成分の量。各成分は正確に計量した。メチルパラベンおよびプロピルパラベンの総量をグリセリンおよびベンジルアルコールと混合した。混合物に約４０ｇの水を加え、混合液を３０分間にわたり６０℃までしっかりと混合した。Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９４０ｐを迅速に撹拌した混合物上に緩徐にまき散らし、３０℃でしっかりと混合した。次に混合物へＥＰＯの全部を加えて１０分間にわたりしっかりと混合した。次に混合物へＦＮを加え、１０分間にわたりしっかりと混合した。混合物に十分なトリエタノールアミンを加え、次に所望の粘度が得られるまで混合し、この後に混合物中にＣａｒｂｏｐｏｌ  ９４０ｐの塊が全くないことを確認した。総量が１００ｇになるまで十分な水を加え、混合物をしっかりと混合した。次にゲルを各１ｇのエッペンドルフバイアル中に充填した。バイアルには次にバッチ番号、調製日および保管条件をラベル表示した。３０ｇのゲルのサンプルは、安定性および微生物学試験のために採取し、次のように配分した。ａ．Ｅｌｉｓａ試験のために４℃で２０ｇ、ｂ．微生物学試験のために４℃で１０ｇ。
【０１５３】
様々な局所ＥＰＯ製剤を用いた創傷の治療
六カ所の中間層熱傷創の各群を下記の局所ゲル：ビヒクル含有ゲル、高用量ＥＰＯ含有ゲル、ＦＮ含有ゲルおよびＥＰＯ／ＦＮ含有ゲルの一つで治療するように無作為割り付けした。一頭の糖尿病性ブタにおける熱傷創の追加の群は、ＥＰＯ／ＨｇＣｌ２含有ゲルで治療し、二頭目の糖尿病性ブタにおける熱傷創の追加の群は、低用量ＥＰＯ含有ゲル（低用量ＥＰＯ）を用いて治療した。ゲル（３ｇ）は、１４日間の試験期間の２日毎に各創傷に局所塗布した。摩擦による塗布後のゲルの除去を防止し、治療間の熱傷創を保護するために、治療創傷は非接着性ガーゼパッドを用いて被覆し、これらはＴｅｎｓｏｐｌａｓｔ弾性接着性包帯法（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ（英国ロンドン）によって安定化した。術後鎮痛薬および抗生物質は、これらの薬物が治癒プロセスに影響を及ぼし、それによってデータの解釈を混乱させる可能性があるので、投与しなかった。
【０１５４】
試験パラメーター
各ブタの体重は、１４日間の試験期間の開始時および終了時ならびに試験期間中に計量した。各治療日に、各創傷は１２メガピクセルのデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｔｙｌｅｓ  Ｔｏｕｇｈ（日本国東京））を使用して写真撮影し、血液サンプルは、赤血球数、白血球数および血小板数ならびに血漿ヘモグロビンおよびＨｂＡｌｃレベルを決定するために採取した。ビヒクル治療および治療創傷の再生皮膚および糖尿病性ブタおよび非糖尿病性ブタの非損傷皮膚の無作為選択領域からのパンチ生検は、６ｍｍのサーキュラーブレードを使用して第２日、第７日および第１４日に採取した。各生検材料のサンプルは、ＭＶＤの組織学的決定のための１０％の中性緩衝ホルマリン中で直ちに固定し（詳細については下記を参照されたい）、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲを使用するタンパク質レベルの決定（詳細については下記を参照されたい）のために液体窒素中に貯蔵した。
【０１５５】
創傷閉鎖率の決定
創傷閉鎖率は、熱傷創内の再上皮化組織の領域から計算した。閉鎖率を計算するために、各熱傷創の領域は、三つの領域：（ａ）やけどした皮膚が熱傷の作成後に剛性外皮となる痂皮領域、（ｂ）痂皮を剥離できるが上皮細胞を有していない赤色領域および（ｃ）痂皮を剥離できて新規な上皮細胞を含有する白色領域に分類した。創傷閉鎖率は、創傷を治療して包帯を交換した第２日、第４日、第７日、第９日、第１１日および第１４日に白色領域を測定することによって計算した。このために、各創傷の上方に透明紙を配置し、白色領域の形状を紙上に描出した。透明紙は次に、創傷内の白色領域を測定するために１ｍｍ２の方眼紙上に載せた。白色率のサイズにおける時間依存性変化は、次の式を使用して計算した。
【０１５６】
白色領域（創傷閉鎖）率（％）＝第Ｘ日の白色領域／第０日の白色領域×１００
【０１５７】
白色領域の全測定値は、治療様式について遮蔽された三人の検査官によって作製された。
【０１５８】
熱傷創内の血流量の決定
創傷内の血流量は、１４日間の試験期間の開始時および終了時ならびに試験期間中に、レーザードップラー潅流イメージングシステム（ＰｅｒｉＳｃａｎ  ＰＩＭ２  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｉｍｅｄ（スウェーデン国ストックホルム））によって非侵襲的に測定した。創傷の走査は、下記の設定で実施した：レーザー波長−６７０ｎｍ（可視赤色光）、熱傷創からの距離−２５ｃｍ、走査解像率−２５６×６４ピクセル、および走査時間−１８０秒間。走査装置のプローブは、機器のマニュアルで推奨されたように、非有効領域からのレーザー光線の反射を防止するために皮膚への垂直からわずかにずれた角度で配置した。各熱傷創について、組織潅流と正比例して増減するレーザードップラー潅流指数である潅流パラメーターは、移動する赤血球からレーザー光線の反射から計算した。関心領域（ＲＯＩ）内の潅流は、紺青色が最低潅流速度を描出し、赤色は最高潅流速度を描出する６色のスケール上で血液潅流イメージングについてのＰＩＭＳｏｆｔソフトウエア（Ｌｉｓｃａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＡＢ、スウェーデン国リンチェピング）を使用して測定した。各熱傷創について、ＲＯＩは、初期熱傷創の周囲に描かれた１２ｃｍ２の円であり、創傷内の血流量は、ＲＯＩ内の全色の平均値である。
【０１５９】
熱傷創組織の再生皮膚内での血管新生の程度の決定
ＣＤ３１は、血管内皮細胞により発現し、組織内の内皮細胞および新規に形成された毛細管の存在を証明するためのマーカーとして広く使用されている接着分子である。このマーカーを使用して、回復期創傷のＭＶＤおよび再生皮膚内の血管新生の程度を決定した。このために、第２日、第７日および第１４日に収集した創傷のホルマリン維持サンプルパンチ生検の厚さ５μｍの切片を調製し、ＣＤ３１染色のためにスライドグラス上に載せた。手短には、検体は、キシレンを使用して脱パラフィン化したパラフィンブロック内に包埋し、二重脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）中の一連の段階的なプロパノール溶液（１００〜０％）中で再水和させ、それらを次に５分間にわたりＴｒｉｓ緩衝食塩液（ＴＢＳ、ｐＨ７．５）中に浸漬した。ＴＢＳを用いた処置後、切片内の内因性ペルオキシダーゼは、スライドを２０分間にわたり３％の過酸化水素／メタノール溶液中に浸漬することによって遮断した。スライドは次にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）ですすぎ洗い、マイクロ波加熱によって抗原を曝露させるために１０分間にわたり９０℃で１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に浸漬した。スライドは、抗原による非特異的染色を排除するために３０分間にわたり１：５０の正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）を用いて最初に遮断し、ＰＢＳ中ですすぎ洗い、次に暗所で１：１００のＣＤ３１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）を用いて４℃の暗所で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後に、スライドをＰＢＳ中ですすぎ洗いし、マイヤーのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて１０秒間対比染色し、この後に組織切片を識別するために１％の酢酸を適用し、水道水を流しながらすすぎ洗いした。スライドをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００直立顕微鏡により撮影し、切片の画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）画像分析ソフトウエア（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州メルビル）によって捕捉して分析した。各創傷部位での再生皮膚内での毛細管の数は、治療様式について遮蔽された三人の検査官によって五カ所の無作為顕微鏡視野（倍率×２００）内で計数された。
【０１６０】
熱傷創組織の再生皮膚内でのＡＱＰ３の検出
ＡＱＰ３は、創傷のない健常ブタおよび糖尿病性ブタの皮膚内で、ＤＭ誘導の１カ月後および熱傷創の作製１日前、ならびに１４日間の試験期間中の創傷の再生皮膚内で免疫組織化学検査および免疫蛍光検査によって検出された。ＡＱＰ３免疫組織化学検査のためには、１４日間の試験期間中の再生皮膚から第２日、第７日および第１４日に創傷のない非糖尿病性および糖尿性ブタの皮膚から収集した検体からの厚さ５μｍの切片を調製し、ＣＤ３１染色について記載した方法と同一の方法でスライドグラス上に載せた。切片は最初に３０分間にわたり１：５０のヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）を用いて遮断し、１：２００のウサギポリクローナルＡＱＰ３一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）とともに４℃の暗所で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、スライドをＰＢＳ中ですすぎ洗いし、１：４００のビオチン化ＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）とともに室温の暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、切片はＰＢＳで穏やかに洗浄し、室温の暗所で３０分間にわたりストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ）とともにインキュベートした。抗原検出は、カラー信号の発生が観察されるまで、基質としてＳ−（２−アミノエチル）−１−システイン（ＡＥＣ／ＲＥＤ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、米国カリフォルニア州カマリロ）を使用して促進された。次にスライドはＰＢＳを用いて直ちにすすぎ洗いし、１０秒間にわたりマイヤーのヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて対比染色し、この後に組織切片を識別するためにＰＢＳ中の１％酢酸を適用した。切片を水道水ですすぎ洗いし、５分間にわたり一連の段階的エタノール中で脱水させ、この後にＩｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ピッツバーグ）を用いて載せた。切片の画像は、以前に記載されたようにＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）画像分析ソフトウエアによって分析した。
【０１６１】
創傷のない健常および糖尿病性ブタ皮膚内および創傷の再生皮膚内での免疫蛍光検査によるＡＱＰ３の存在を確証するために、また別のセットの脱パラフィン化パラフィン切片を４℃で一晩、１：１００のウサギポリクローナルＡＱＰ３抗体（サンタクルーズ）とともにインキュベートした。インキュベーション後、スライドを水道水で穏やかに洗浄し、室温の暗所で３０分間にわたり１：２００のローダミン抱合ＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、次に３０分間にわたり核染色ＴＯＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて対比染色した。ＴＯＰＲＯ−３のインキュベーションの終了時に、スライドはＰＢＳ中で穏やかに洗浄した後に共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ１０２４、米国カリフォルニア州）下で検査した。切片の画像は、以前に記載されたようにＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）画像分析ソフトウエアによって分析した。
【０１６２】
熱傷創組織の再生皮膚内でのコラーゲンの検出
再生皮膚内でのコラーゲンの量は、ＣＤ３１およびＡＱＰ３免疫染色のために調製された厚さ５μｍの切片の一部のマッソンの三重染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の第２日、第７日および第１４日に収集した検体中で決定した。この方法を使用すると、コラーゲン繊維は青色に染まり、核は黒色に染まり、細胞質および筋繊維は赤色に染まった。切片の画像は、以前に記載されたようにＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）画像分析ソフトウエアによって分析した。
【０１６３】
熱傷創組織の再生皮膚内でのコラーゲン量の決定
ヒドロキシプロリン（ＨＰ）はＩ型コラーゲンのアミノ酸構成成分であり、コラーゲンのためのマーカーとして使用されることが多い。したがって、第２日、第７日および第１４日に健常ブタおよび糖尿病性ブタから収集した皮膚検体内のＨＰの量は、熱傷創の再生皮膚内でのコラーゲンの量の指標として使用した。このために、１００ｍｇの皮膚サンプルは、組織ホモジナイザー（ＨＧ−３００；ＭＲＣ、イスラエル国ホロン）を使用して完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）を含有しているＰＢＳ中で均質化した。ホモジネートは、最初に４℃で５分間にわたり１，５００ｇで遠心分離した。上清を収集し、Ｗｈａｔｍａｎのグレード５４０濾紙（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に通して濾過し、ＨＣｌ中で加水分解し、次に脱イオン水で希釈した。希釈溶液のアリコート（２μＬ）を最初にクロラミン−Ｔ溶液と混合し、この後に以前に記載されたプロトコールを使用してｐ−ジメチル−アミノ−ベンズアルデヒドを添加した（Ｈａｍｅｄ，２００９）。結果として生じた溶液のアリコート（１５０μＬ）を次にマイクロタイタープレートに移し、各サンプルの吸光度を５５７ｎｍで蛍光マイクロプレートリ−ラー内で測定した。結果は、健常ブタのビヒクル治療熱傷創（１００％）におけるＨＰの量の三回ずつの測定の平均パーセンテージとして表示した。
【０１６４】
熱傷創組織の再生皮膚内でのＨＡの量の決定
ＨＡは皮膚の強度および水和に結び付いているので、熱創傷組織の再生皮膚内でのＨＡ量は、製造業者のプロトコールにしたがってヒアルロナンＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して第２日、第７日および第１４日に非糖尿病性および糖尿病性ブタから収集した検体中で決定した。手短には、熱傷創の再生皮膚内でのＨＡ量を決定するために調製した同一希釈液のアリコート（１５０μＬ）をマイクロタイタープレートに移した。各サンプルの吸光度は、次に５７０ｎｍに設定した波長補正を用いて４５０ｎｍで蛍光マクロプレートリーダー内で測定した。結果は、健常ブタのビヒクル治療熱傷創（１００％）におけるＨＡの量の三回ずつの測定の平均パーセンテージとして表示した。
【０１６５】
ウェスタンブロット分析による熱傷創組織の再生皮膚内でのＡＱＰ３、ｅＮＯＳならびにＨＡＳ１およびＨＡＳ２発現レベルの決定
再生皮膚内でのＡＱＰ３発現は皮膚の水和と結び付いているので、ＡＱＰ３が細胞への水進入を促進するために、ＥＰＯが熱傷創床内のＡＱＰ３および細胞水和に及ぼす作用を調査した。ＨＡは皮膚の強度および水和と結び付いているので、ＨＡが皮膚の水分に含まれる重要な分子であり、ＨＡＳ１およびＨＡＳ２によって合成されるために、ＥＰＯがＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現に及ぼす作用を調査した。血管新生は再生皮膚内で発生するので、ｅＮＯＳが血管構造内の主要ＮＯＳアイソフォームであり、発現レベルは血管新生の程度を指示するために、ＥＰＯがｅＮＯＳ発現に及ぼす作用を調査した。ＡＱＰ３、ｅＮＯＳ、ＨＡＳ１およびＨＡＳ２の発現レベルは、第１４日に健常および糖尿病性ブタから収集した熱傷創組織の再生皮膚内で決定した。手短には、サンプルは、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＰＢＳ中で最初に均質化し、次にＲＩＰＡバッファー中で溶解させた。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して、溶解液の４０μｇのタンパク質サンプル中のタンパク質を分離した。分離したタンパク質は次に、最初に４℃の暗所で１：１００のポリクローナルＡＱＰ３抗体、１：１５０のモノクローナルｅＮＯＳ抗体、１：１００のモノクローナルＨＡＳ１抗体および１：１００のモノクローナルＨＡＳ２抗体（全部がＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズから購入された）とともに一晩インキュベートし、次に室温の暗所で３０分間にわたり、ホースラディッスペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、欧州）とともにインキュベートしたニトロセルロース膜に移した。α−アクチン（サンタクルーズ）を使用して、タンパク質負荷を正規化した。タンパク質発現レベルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｔａｒ  ＨＲＰ化学発光検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を使用してデンシトメトリーによって検出した。結果は、健常ブタのビヒクル治療熱傷創（１００％）における平均タンパク質レベルの二回ずつの示度のパーセンテージとして表示した。
【０１６６】
ＡＱＰ３  ｍＲＮＡレベルを定量するためのリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＥＰＯがＡＱＰ３発現に及ぼす作用がＥＰＯがＡＱＰ３遺伝子に及ぼす作用に起因するかどうかを調査した。糖尿病性ブタおよび健常ブタの熱傷創組織からの再生皮膚のサンプルは、第１４日に収集してＰＢＳ中で均質化した。全ＲＮＡは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用してホモジネートから抽出した。各サンプルについて、およそ２μＬのＲＮＡをどちらもＡＢｇｅｎｅ（英国）から購入された絶対ＱＰＣＲ  Ｍｉｘｅｓ逆転写試薬およびＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ逆転写酵素キットを使用して三回ずつ逆転写させた。再生皮膚サンプル中のＡＱＰ３遺伝子発現の定量は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００サイクラ−（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、オーストラリア国シドニー）内でＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージン）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって実施した。標準曲線に基づく方法を使用して、ＰＣＲ効率およびアッセイ内変動を評価した。熱サイクル条件は、１サイクル（９５℃で１０分間）、この後に４０サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で３０秒間）、この後に１サイクル（９５℃で１分間、５５℃で３０秒間および９５℃で３０秒間）であった。２−ΔΔＣＴ方法を使用して非糖尿病性および糖尿病性創傷から収集した治療、ビヒクル治療および未治療組織サンプル中でのＡＱＰ３遺伝子発現における相対変化を分析した。これらの結果は、内因性参照遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＧＡＰＤＨ）に正規化した後のコントロール下の変化率（％）として表示した。
【０１６７】
細胞培養
どちらも新生仔陰茎包皮（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ワシントン州カークランド）に由来した一次ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫＣ）および一次ヒト線維芽細胞（ＮＨＦＣ）は、ＡＱＰ３を発現する。二種の細胞タイプを個別に、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２μｇ／ｍＬのアムホテリシンが補給されたＣＳＣ培地（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で１型コラーゲンコーティングフラスコ上で繁殖させた。ＡＱＰ３はそれらの増殖のために必須であると考えられるので、それらがＮＧ濃度（５ｍｍｏｌ／ｍＬのＤ−グルコース）およびＨＧ濃度（３０ｍｍｏｌ／ｍＬのＤ−グルコース）およびＥＰＯ（１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で増殖する能力を決定した。このために、細胞を最初に採取し、１０％のＦＢＳを含むＣＳＣ培地を含有していた１型コラーゲンコーティングの２４ウエルプレートのウエル（約１００，０００ｃｅｌｌ／ウエル）に移し、次に５％のＣＯ２および３７℃に設定した加湿インキュベーター内で５日間にわたりＥＰＯ（１００ＩＵ／ｍＬ）を含む、または含まないＨＧ濃度に曝露させた。５日後、ＨＥＫＣおよびＮＨＦＣの増殖は、製造業者のプロトコールにしたがってＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。アッセイを三回繰り返し、結果はコントロールの非治療細胞の増殖率（１００％）の平均パーセント±標準偏差（ＳＤ）として表示した。以前に記載したように、ウェスタンブロット分析を使用してＡＱＰ３発現レベルを決定するために、二種の細胞タイプのタンパク質抽出物を調製した。免疫蛍光アッセイを使用して、接着性ＨＥＫＣおよびＮＨＦＣ内のＡＱＰ３を局在化した。このために、細胞は最初の２％パラホルムアルデヒド中で固定し、次に１：１００のウサギポリクローナルＡＱＰ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともに４℃で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞はＰＢＳ中で穏やかに洗浄し、この後に１：２００のローダミン抱合ＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに室温の暗所で３０分間インキュベートした。細胞の核は、次に３０分間にわたりＴＯＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて対比染色した。ＴＯＰＲＯ−３を用いた対比染色後、細胞をＰＢＳ中で穏やかに洗浄し、次に共焦点顕微鏡下で検査した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ  １０２４、米国カリフォルニア州）。染色細胞の画像は、以前に記載されたようにＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）画像分析ソフトウエアによって分析した。
【０１６８】
統計学
全統計学的分析は、コンピューター化統計プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、米国カリフォルニア州）を使用して実施し、全データは、平均値もしくはパーセンテージ±ＳＤとして提示した。統計学的有意性は、５％に設定した。スチューデントの両側ｔ検定を使用して、健常および糖尿病性ブタの試験パラメーターを比較し、Ｉ型誤差を制御するためのボンフェローニの補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して多重比較を実施した。ピアソンの補正係数を使用してＡＱＰ３タンパク質発現と（ａ）ＭＶＤによって提示された血管新生、（ｂ）ＨＰ量によって提示されたコラーゲン含量、および（ｃ）熱傷創組織の再生皮膚内でのＨＡ量との関係を決定した。群間の創傷閉鎖率は、チューキーの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較におけるＩ型誤差についてのコントロールに対するボンフェローニの補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して比較および分析した。健常および糖尿病性ブタ由来のデータは、スチューデントの両側ｔ検定を使用して比較した。
【０１６９】
考察
ＤＳＵの治癒は、損傷した血管新生、減少した皮膚細胞活性および増加した炎症反応のために遅延する。結果として、慢性創傷が発生し、重症例では、四肢欠損が発生することがある。以前には、局所ＥＰＯが（ａ）血管新生の刺激、（ｂ）増加したコラーゲン沈着、（ｃ）炎症反応の抑制、および（ｄ）創傷床内の減少した細胞アポトーシス（１０，１１）（Ｈａｍｅｄ，２０１０；２０１１）を含む数種の機序を通して糖尿病性のマウスおよびラットの全層皮膚創傷の治癒を加速させると報告されている。現在では、それによって局所ＥＰＯが糖尿病性皮膚創傷の治癒を加速させる新規な機序が見いだされている；局所塗布されたＥＰＯは健常および糖尿病性ブタの創傷床内のＡＱＰ３発現を増加させる。
【０１７０】
局所ＥＰＯ治療後の糖尿病性ブタの熱傷創内のＡＱＰ３発現レベルが上昇することは、血管新生ならびにＨＰおよびＨＡ量に及ぼすＥＰＯの正味性作用を反映しており、加速された創傷閉鎖を生じさせる。本発明者は創傷のない糖尿病性ブタの皮膚内ではＡＱＰ３発現が減少することを見いだしたので、低レベルの細胞ＡＱＰ３は、少なくとも一部には、ＤＳＵの非治癒を実証すると仮定された。さらに、（ａ）ＡＱＰ３発現レベルはＨＧ治療角化細胞および線維芽細胞内ではＮＧ治療角化細胞および線維芽細胞内よりも低い、および（ｂ）ＨＧ治療角化細胞および線維芽細胞が増殖する能力はＮＧ治療角化細胞および線維芽細胞の増殖能力よりも低いこともまた見いだされた。興味深いことに、ＥＰＯによる治療はＨＧが角化細胞および線維芽細胞に及ぼすこの負の作用を遮断することができた。これらの観察所見は、ＨＧレベルが皮膚細胞内のＡＱＰ３発現を損傷させ、ＤＭを備えるブタの皮膚内での本発明者の実験結果についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの裏付けを提供することを暗示している。これらは、可能性のある説明的機序として提供される；本発明者は、このような理論によって拘束されることを意図していない。
【０１７１】
ＡＱＰ３発現レベルには糖尿病性皮膚創傷における創傷閉鎖率が結び付いていることが見いだされた。増え続ける一連の証拠は、ＤＳＵの再生皮膚内でのＡＱＰ３欠損症が上皮細胞の移動および増殖を損傷させ、結果として再上皮形成の減少および創傷治癒の遅延を生じさせることを示唆した（Ｌｅｖｉｎ，２００６；Ｓｉｇｏｍｏｔｏ，２０１２）。角膜上皮細胞の移動、増殖および再上皮化はＡＱＰ３によって刺激されることは報告されている（Ｌｅｖｉｎ，２００６）。さらにＡＱＰのダウンレギュレートされた発現は、急性腎不全における尿濃縮能力の低下の原因である可能性があり、ＥＰＯはこのダウンレギュレーションを防止できることもまた報告されている（Ｇｏｎｇ，２００４）。したがって、ＤＳＵにおけるＥＰＯによる局所ＡＱＰ３発現が創傷治癒を加速できると推測されてきた。この試験の結果は、糖尿病性ブタの皮膚内の熱傷害の局所ＥＰＯ治療が血管新生を刺激することによるＡＱＰ３依存性機序を通してそれらの治癒およびＥＣＭ産生を加速するという本発明者の仮説を支持する証拠を提供する。この試験の結果は、さらにＥＰＯによる非治癒性潰瘍におけるＡＱＰ３発現を刺激することが細胞水和を増加させ、創傷の含水レベルを上昇させることによって治癒をさらに加速するという証拠もまた提供する。細胞の水和を増加させて含水レベルを上昇させることは、様々な細胞タイプとＥＣＭ成分との相互作用を促進する。このような相互作用は、適正な細胞運動、移動および分化ならびに最終的に無傷皮膚の回復を生じさせる。
【０１７２】
創傷床内の血管新生、例えばコラーゲンおよびＨＡなどのＥＣＭ成分の合成および適正な細胞水和は、正常創傷治癒のために不可欠である。ＥＰＯは内皮細胞増殖ならびに血管新生サイトカインおよび例えば内皮細胞および角化細の血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、およびインスリン様成長胞由来因子１などの成長因子の分泌を刺激して新規血管の創傷床内への萌芽を誘発する（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ，１９９０）。この研究調査では、創傷の局所ＥＰＯ治療がレーザードップラー走査によって測定される糖尿病性熱傷創の再生皮膚内での血流量を実質的に増加させることが見いだされた。この作用は、糖尿病性熱傷創の再生皮膚内でのＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルが測定された場合に、ＥＰＯ治療糖尿病性熱傷創の再生皮膚内でのＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルがビヒクル治療糖尿病性熱傷創の再生皮膚内でのＭＶＤおよびｅＮＯＳ発現レベルより高かった場合に確証された。局所ＥＰＯ治療はさらに、糖尿病性熱傷創における有意に増加したＨＰおよびＨＡ量を生じさせた。Ｖｅｄｒｅｎｎｅは、ＥＣＭと、細胞とＥＣＭとの付着、血管新生、皮膚創傷治癒および常在皮膚線維芽細胞の代謝回転を調節する分子の合成との密接な関係の存在について報告した（Ｖｅｄｒｅｎｎｅ，２０１２）。細胞の水和および湿潤環境は、創傷治癒中の線維芽細胞の代謝回転、血管新生および角化細胞による再上皮化を促進するために極めて重要である。このため、局所的ＡＱＰ３タンパク質発現および／または活性化を防止もしくは制限する任意の因子もしくは事象は、細胞水和のレベルを減少させて創傷治癒を損傷させる可能性がある。コラーゲンおよびＨＡはＥＣＭにおける多数の機能を有しており、それらの一つは、細胞の運動および移動を支持し、皮膚層内のＥＣＭが圧縮に抵抗することを可能にする、細胞の形状および分化を維持するための組織骨格となることである。
【０１７３】
ＨＡは、極めて親水性の分子であり、この特性はＨＡが水を誘引して結合するために組織水和を調節することを可能にする。ＡＱＰ３発現レベルは、糖尿病性ブタの創傷のない皮膚では減少することが見いだされた。さらに、減少した血管新生ならびに低いＨＰおよびＨＡ量に加えて、糖尿病性ブタにおけるビヒクル治療熱傷創の再生皮膚内でのＡＱＰ３発現レベルは、健常ブタにおけるビヒクル治療熱傷創の再生皮膚内でのＡＱＰ３発現レベルより低いこともまた見いだされた。さらに、局所ＥＰＯ治療は糖尿病性創傷内の血管新生ならびにＨＰおよびＨＡ量を有意に増加させ、これらの増加にはＡＱＰ３発現レベルにおける有意な増加が付随することもまた見いだされた。さらにまた、糖尿病性ブタの熱傷創内のＨｇＣｌ２によるＡＱＰ３の阻害はＥＰＯの積極的な作用に拮抗することもまた見いだされたが、この結果は、ＡＱＰ３のＥＰＯ媒介性刺激がＤＭにおける創傷治癒を刺激できることを示唆している。さらに、ＡＱＰ３発現レベルが健常および糖尿病性ブタのＥＰＯ治療熱傷創における血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡ量と相関することもまた見いだされた。さらに、これらの相関が糖尿病性ブタのＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創における方が健常ブタのＥＰＯ治療およびＥＰＯ／ＦＮ治療熱傷創における相関より強力であることもまた見いだされた。（ａ）ＥＰＯが糖尿病性ブタの創傷の再生皮膚内でのＡＱＰ３発現にプラスの効果を及ぼし、および（ｂ）局所治療の前後の創傷組織内のＡＱＰ３発現レベルと血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡ量との相関が強力であるので、ＡＱＰ３依存性機序を通して治癒のＥＰＯ誘導性加速が媒介されると結論付けることができる。この（これらの）機序が活性化されると、創傷治癒プロセスの重要な事象、つまり血管新生、コラーゲンおよびＨＡ合成ならびに再上皮化は刺激され、創傷閉鎖率は加速される。
【０１７４】
糖尿病性ラットの皮膚全層創傷の治癒中の再生皮膚内での減少したＡＱＰ３発現は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１２によって報告された。Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  ａｎｄ  Ｖｅｒｋｍａｎもまた、ＡＱＰ３ノックアウトマウスにおいては野生型マウスにおけるよりも角質層の含水量および弾性が低いこと、および創傷治癒およびＥＣＭ生合成が緩徐であることも報告した（Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ，２００８ａ）。興味深いことに、ヒト皮膚内のＡＱＰ３発現は、例えばアトピー性湿疹および皮膚癌などの一部の皮膚疾患（Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ，２００８ｂ）および皮膚熱傷創（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，２０１５）においては増加する。これらの観察所見は、ＡＱＰ３が表皮生物学において重要な役割を果たしており、ＡＱＰ３が刺激されると損傷後の皮膚回復が促進されることを示唆している。
【０１７５】
さらに、糖尿病性創傷の緩徐な創傷閉鎖率には減少した血管新生ならびに創傷床内の低いＨＰおよびＨＡ量が結び付いていることも見いだされた。さらにＨＧ治療ＨＥＫＣおよびＮＨＢＣが増殖する減少した能力には細胞内の減少したＡＱＰ３発現レベルが結び付いていることも見いだされた。これらの観察所見は、減少したＡＱＰ３発現レベルがＨＧ濃度に起因し、ＤＭにおける角化細胞および線維芽細胞の減少した増殖の基礎であることを示唆している。細胞増殖およびＡＱＰ３発現に及ぼすＨＧ濃度の有害作用はＥＰＯによって防止されることもまた見いだされたので、この証拠は、ＥＰＯがＨＧ濃度の作用の一部を組織から免れさせるＡＱＰ３依存性機序を通して糖尿病性創傷の治癒を促進することを示唆している。
【０１７６】
また別の興味深い観察所見は、ＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷内のＡＱＰ３発現レベルは、ＥＰＯ治療糖尿病性創傷内のＡＱＰ３発現レベルより四倍高いことであった。ＥＰＯ／ＦＮ治療糖尿病性創傷におけるＡＱＰ３発現レベルにおけるこの実質的な増加には、迅速な創傷閉鎖率ならびに上昇した血流量および創傷組織内のＭＶＤならびにＨＰおよびＨＡ量における二倍の増加が結び付いている。ＦＮおよびフィブリンは、マクロファージ、線維芽細胞および血管新生を支持する暫定的マトリックスの二つの極めて重要な構成成分である（Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ，１９９８）。暫定的マトリックスおよび肉芽組織の適正な形成は、再上皮化および創傷閉鎖を可能にする（Ｍａｒｔｉｎ，１９９７）。ＤＭでは、ＦＮの欠損症および／またはプロテアーゼによるＦＮの分解は、暫定的マトリックスの崩壊をもたらし、再上皮化は発生しない、または遅延する。以前に、糖尿病性マウスの局所ＥＰＯ／ＦＮ治療皮膚創傷の治癒は糖尿病性マウスの局所ＥＰＯ治療皮膚創傷の治癒よりも速いと報告されている（Ｈａｍｅｄ，２０１１）。ＦＮは、創傷治癒の増殖期中の肉芽組織の形成において重要な機能を有する。そこで、本発明者は、外因性ＦＮが糖尿病性創傷における正常な暫定的マトリックスを回復できると推測した。ＦＮ単独は、健常ブタの熱傷創内での創傷閉鎖率、血流量、血管新生の程度ならびにＨＰおよびＨＡ量に影響を全く及ぼさないことが見いだされた。さらに、健常ブタ内では内因性ＦＮが正常レベルで存在して変性しないために、外因性ＦＮは健常ブタの熱傷創の治癒へのＥＰＯの加速作用を強化しないことが見いだされた。内因性ＦＮはＤＳＵ内では分解されるので、ＦＮをＥＰＯ含有ゲルに組み込むことが望ましいが、これはＦＮがＥＰＯ含有ゲルの有益な作用を強化するためである。
【０１７７】
そこで本発明者は、糖尿病性創傷への局所ＥＰＯ塗布が再上皮化および創傷閉鎖率を加速することを証明したので、そこで糖尿病性ブタにおける観察所見に基づいて、局所ＥＰＯの塗布が皮膚ＡＱＰ３発現レベルを上昇させることによってＤＳＵの治癒を刺激するために治療上有益な可能性があると推測される。
【０１７８】
実施例２−ヒトにおける慢性糖尿病性潰瘍の治療
ヒト患者における慢性糖尿病性潰瘍を治療するための有効性を決定するために、実施例１の処方を試験した。真性糖尿病、高血圧および高脂血症を有すると診断された７７歳の男性患者が右内側足背上の糖尿病性潰瘍を示した。病変はおよそ９．６ｃｍ２であった（図１３の「治療前」パネルを参照されたい）。
【０１７９】
患者のパラメーター
性別：男性
年齢：７７歳
民族：北アフリカ
喫煙：喫煙歴なし
病歴：真性糖尿病、高血圧、高脂血症
身長：    １７６ｃｍ
体重：    ９６ｋｇ
ＢＭＩ：  ３０．９９ｋｇ・ｍ−２
ＡＢＩ    ０．７６（軽度閉塞）
ヘモグロビン  １２．３  ｇ／ｄＬ
ＨＣＴ        ３６．５  ％
ＲＢＣ        ４．１３  １０＾８／μｌ
血小板数      １６９    １０＾３／μｌ
グルコース    １５９    ｇ／ｄＬ
併用薬（継続中）
アムロジピン        ２０１５年以降
メトホルミン        ２０１５年以降
プラバスタチン      ２０１５年以降
カルチア            ２０１５年以降
Ｅｎａｌａｄｅｘ    ２０１２年以降
【０１８０】
糖尿病性足部潰瘍
場所：          背部内側位置
面積：          ９．６ｃｍ２
履歴：          ２カ月超改善なし
Ｗａｇｎｅｒ型：Ｉ
好気性細菌（緑膿菌）
【０１８１】
創傷は、第１日に組成物の塗布前に穏やかに創傷清拭した。実施例１の組成物は、治療当日の潰瘍の面積によって、創傷の０．２５ｇ／ｃｍ２の用量で週に５日間にわたり創傷に局所適用した。治療はほぼ８週間（５５日間）継続し、医師が診断した創傷の完全閉鎖まで実施例１の組成物の３６回の局所塗布を含んでいた。治療は、患者の自宅で訪問看護師によって提供された。患者は潰瘍の判定、検査および評価のために週一回外来診療部門を訪れた。図１３（「治療後」パネル）は、８週間の治療後の完全に閉鎖した創傷の写真である。
【０１８２】
８週間にわたる実施例１の組成物を用いた治療は、特筆すべき全身性作用を有していなかった。すなわち、血液パラメーターもしくは血圧の有意な変化を誘発しなかった。パラメーターの一部を下記の表３に表示した。
【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
有害作用
３週間の治療後には高肉芽形成（ｈｙｐｅｒ  ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）が観察された。これは小さな有害作用と見なされた。このために治療は３日間休止され、３日間の一日一回の薬物投与は省略された。３日間の間隔の後に高肉芽形成作用が減少したので、治療を継続した。治療経過の終了時まで、それ以上の高肉芽形成の徴候は観察されなかった。
【０１８５】
結論
ＲＭＤ−Ｇ１による患者Ｋの治療は安全および効率的であった。８週間の治療中に慢性糖尿病性創傷の完全な閉鎖が観察された。
【０１８６】
本明細書に開示および要求した方法の全部は、本開示を踏まえると過度の実験を行わずに実行および達成することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者には、これらの方法および本明細書に記載した方法の工程もしくは一連の工程に本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに変化を加えられることは明白であろう。より詳細には、化学的および生理学的にどちらも関連する所定の作用物質は、本明細書に記載した作用物質と置換することができ、それでも同一もしくは類似の結果が達成されることは明白であろう。当業者には明白である全てのこのような類似の代替物および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の中に含まれると見なされている。
【０１８７】
参考文献
下記の参考文献は、それらが本明細書に規定したものを補足する典型的な手技的もしくは他の詳細を提供する程度まで、特には参照により本明細書に組み込まれる。
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【図１Ａ】
2020180137.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2020180137.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020180137.tif 000035
【図６Ｅ】
2020180137.tif 000036
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
2020180137.tif 000040
【図７Ｂ】
2020180137.tif 000041
【図７Ｃ】
2020180137.tif 000042
【図７Ｄ】
2020180137.tif 000043
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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