(57)【要約】【課題】  量産性に優れ、高い生存率で多能性幹細胞を剥離し、単一細胞として回収可能な、多能性幹細胞の剥離方法を提供する。【解決手段】  基材上で培養された多能性幹細胞の剥離方法であって、基材が層厚×温度応答性成分の含有割合の積が１００ｎｍ以下の温度応答性高分子による層を有し、下記［１］〜［３］工程を経ることを特徴とする多能性幹細胞の剥離方法。［１］トリプシンを含有する細胞間結合乖離液と基材上で培養された多能性幹細胞を接触させる工程。［２］多能性幹細胞が基材に接着した状態のまま、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を除去する工程。［３］基材を冷却し、多能性幹細胞を基材から剥離する工程。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上で培養された多能性幹細胞の剥離方法であって、基材が層厚×温度応答性高分子成分の含有割合の積が１００ｎｍ以下の温度応答性高分子による層を有し、下記［１］〜［３］工程を経ることを特徴とする多能性幹細胞の剥離方法。
［１］トリプシンを含有する細胞間結合乖離液と基材上で培養された多能性幹細胞を接触させる工程。
［２］多能性幹細胞が基材に接着した状態のまま、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を除去する工程。
［３］基材を冷却し、多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【請求項２】
前記［１］工程におけるトリプシンを含有する細胞間結合乖離液と基材に接着した多能性幹細胞の接触時間が、１秒〜５分間であることを特徴とする、請求項１に記載の多能性幹細胞の剥離方法。
【請求項３】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の多能性幹細胞の剥離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量産性に優れ、高い生存率で多能性幹細胞を剥離し、単一細胞として回収可能な、多能性幹細胞の剥離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野における細胞ソースとして、大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療に応用するには、まず必要な数の多能性幹細胞を未分化状態で増殖させた後に、単一細胞として回収することが必須である。
【０００３】
従来、基材上で培養した多能性幹細胞を単一細胞として回収するには、トリプシン等の酵素で処理した後に、セルスクレーパーで基材を擦ることにより、基材から多能性幹細胞を剥離させていた。しかしながら、このような多能性幹細胞の剥離方法では、基材全体をセルスクレーパーで擦る必要があることから、大面積の基材を用いて大量の細胞を回収するのは困難であった。
【０００４】
セルスクレーパーを用いることなく細胞を剥離する別の方法として、温度応答性を有する基材を用いる方法が知られている。例えば、特許文献１では、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体を用い、温度変化により細胞を剥離せしめ、細胞シートを回収する方法が開示されている。しかしながら特許文献１に記載の方法では、細胞シートの回収を主目的としており、単一細胞の多能性幹細胞を得ることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１３１２７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、量産性に優れ、高い生存率で多能性幹細胞を剥離し、単一細胞として回収可能な、多能性幹細胞の剥離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が１００ｎｍ以下の温度応答性高分子による層を有する基材を用い、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液と多能性幹細胞を接触させる工程により上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、基材上で培養された多能性幹細胞の剥離方法であって、基材が層厚×温度応答性成分の含有割合の積が１００ｎｍ以下の温度応答性高分子による層を有し、下記［１］〜［３］工程を経ることを特徴とする多能性幹細胞の剥離方法。
［１］トリプシンを含有する細胞間結合乖離液と基材上で培養された多能性幹細胞を接触させる工程。
［２］多能性幹細胞が基材に接着した状態のまま、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を除去する工程。
［３］基材を冷却し、多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、量産性に優れ、多能性幹細胞を単一細胞として剥離可能な、多能性幹細胞の剥離方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【００１１】
本明細書において、「温度応答性高分子」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する高分子を示す。また、水分子の存在下で高分子の温度を低温から高温へ昇温していく場合に、ある温度を境に高分子の親水性／疎水性の程度がより疎水性に変化し、水溶性から水不溶性に変化する温度応答性高分子が存在し、この境界温度を「下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」という。一般に、温度応答性高分子がＬＣＳＴ未満の温度において水に溶解する場合、ＬＣＳＴ以上の温度では水に不溶となる。温度応答性高分子が水不溶性である場合には、ＬＣＳＴを有しないが、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する応答温度を有する。
【００１２】
本発明において、多能性幹細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば、肺性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を用いることができ、特に好ましくはｉＰＳ細胞である。また、多能性幹細胞の由来動物は特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物由来であることができる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれ、また実験動物であってもよく、コンパニオンアニマルであってもよい。本発明において、好ましくは霊長類由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【００１３】
本発明の多能性幹細胞の剥離方法における［１］工程は、多能性幹細胞と細胞間結合乖離液を接触させる。多能性幹細胞と細胞間結合乖離液を接触させることによって、多能性幹細胞の細胞−細胞間結合を乖離させ、多能性幹細胞を単一細胞とすることができる。また、［１］工程によって、未分化細胞の基材からの剥離を促進することができる。［１］工程を行わない場合、単一細胞で多能性幹細胞を剥離することができない。
【００１４】
前記［１］工程では、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を用いる。ここで、本発明において「トリプシン」とは、膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素の「ＥＣ．３．４．２１．４」、又は該タンパク質分解酵素と同等の特性を有する分解酵素を示す。市販品としては例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＳＥＬＥＣＴ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥＸＰＲＥＳ（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）等を挙げることができる。本発明において「細胞間結合乖離液」とは、細胞同士が互いに細胞膜貫通型タンパク質等を介して形成する結合（細胞間結合）を乖離させる作用を有する溶液を示す。細胞間結合乖離液はトリプシン、トリプシンと同様のタンパク質分解作用を有する酵素の他、キレート剤等を含有していてもよい。
トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を用いることにより、単一細胞で多能性幹細胞を剥離することができる。トリプシンを含有しない場合、単一細胞で多能性幹細胞を剥離することができない。単一細胞で多能性幹細胞を剥離し、さらに細胞の生存率を高めるのに好適であることから、トリプシンの含有量が０．０１〜２．５ｗｔ％が好ましく、０．１〜１ｗｔ％がさらに好ましく、０．２〜０．５ｗｔ％が特に好ましく、０．２５〜０．３５ｗｔ％が最も好ましい。
【００１５】
前記細胞間結合乖離液としてはまた、細胞を単一細胞とするのに好適であることから、５×１０−１０〜５×１０−１ｍｏｌ／Ｌのキレート剤をさらに含有することが好ましく、５×１０−６〜１×１０−１ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましく、５×１０−４〜５×１０−２ｍｏｌ／Ｌが特に好ましく、１×１０−３〜５×１０−２ｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。
【００１６】
前記キレート剤としては、キレート剤であること以外に特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、１，３−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，３−ジアミノ−２−プロパノール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、イミノ二酢酸、エチドロン酸、クエン酸、ムギネ酸、ビピリジン、ポルフィリン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル、サイクレン、１８−クラウン−６、デフェロキサミン、ドータオクトレオテート、ニコチアナミン、ジメルカプロール、シデロホア等を挙げることができる。細胞を単一細胞とするのに好適であり、また、細胞の生存率を高めるのに好適であることから、１〜４価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、２価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤がさらに好ましく、カルシウムイオンとキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。
【００１７】
前記［１］工程の多能性幹細胞と細胞間結合乖離液との接触時間としては、多能性幹細胞を単一細胞とし、また、細胞の生存率を高めるのに好適であることから、１秒〜３０分間が好ましく、１０秒〜１０分間がさらに好ましく、１分〜５分間が特に好ましく、２分〜４分間が最も好ましい。
【００１８】
前記［１］工程における細胞間結合乖離液の温度としては特に限定はないが、トリプシンを活性化させるのに好適であることから、１０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３５〜４０℃が特に好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００１９】
前記［１］工程の後、多能性幹細胞は基材に接着した状態である。前記［１］工程の後に多能性幹細胞が基材に接着した状態であることにより、多能性幹細胞の生存率を高めることができる。［１］工程の途中で多能性幹細胞が基材から剥離する場合、多能性幹細胞の生存率が低下する原因となる。
【００２０】
本発明の多能性幹細胞の剥離方法における［２］工程では、多能性幹細胞が基材に接着した状態のまま、多能性幹細胞を洗浄し、トリプシンを除去する。多能性幹細胞を洗浄し、トリプシンを除去する方法としては特に限定はないが、例えば、多能性幹細胞と接触させた細胞間結合乖離液を吸引除去した後、リン酸緩衝生理食塩水と多能性幹細胞を接触させ、次いでリン酸緩衝生理食塩水を除去することにより多能性幹細胞を洗浄することができる。多能性幹細胞の生存率を高めるため、本発明の多能性幹細胞の剥離方法における［２］工程の後、多能性幹細胞は基材に接着した状態である。［２］工程の途中で多能性幹細胞が基材から剥離する場合、多能性幹細胞の生存率が低下する原因となる。
【００２１】
前記［２］工程の後、必要に応じて細胞間結合乖離液の除去や培地への置換を行ってもよい。培地としては特に制限はないが、多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに好適であることから、例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２−メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることが好ましく、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地がさらに好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地が特に好ましい。
【００２２】
前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２−Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）等を挙げることができる。多能性幹細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
【００２３】
また、細胞の生存率を高めるのに好適であることから、必要に応じてＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加してもよい。特にヒトの多能性幹細胞を用いる場合であって、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ−２７６３２）、１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの多能性幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、１×１０−６〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、３×１０−６〜２×１０−５ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましく、８×１０−６〜１．２×１０−５ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。  
本発明の多能性幹細胞の剥離方法における［３］工程では、基材を冷却し、多能性幹細胞を基材から剥離する。細胞の生存率を高めるのに好適であるため、０〜３０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが好ましく、２〜２５℃の温度で１秒〜６０分間冷却することがさらに好ましく、２〜２０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが特に好ましく、２〜１０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが最も好ましい。
【００２４】
本発明の多能性幹細胞の剥離方法では、温度応答性高分子による層を有する基材を用いる。基材が温度応答性高分子による層を有することにより、前記［３］工程において、基材を冷却することで多能性幹細胞を剥離することができる。温度応答性高分子による層を有しない場合、［３］工程で多能性幹細胞を剥離することができない。
【００２５】
本発明において、前記温度応答性高分子による層の層厚×温度応答性成分の含有割合の積は、１００ｎｍ以下である。温度応答性高分子による層の層厚×温度応答性成分の含有割合の積が１００ｎｍ以下であることにより、多能性幹細胞を基材に強固に接着させることができ、前記［１］及び［２］工程において細胞が剥離するのを抑制することができる。温度応答性高分子による層の層厚×温度応答性成分の含有割合の積が１００ｎｍを超える場合、前記［１］及び［２］工程において細胞が剥離しやすく、細胞の生存率が低下する原因となる。前記［１］及び［２］工程において細胞が剥離するのを抑制し、細胞の生存率を高めるのに好適であることから、層厚×温度応答性成分の積が５０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、４０ｎｍ以下が特に好ましく、２０ｎｍ以下が最も好ましい。ここで、本発明において温度応答性高分子による層の「層厚」とは、温度応答性高分子による層の最も基材側の界面から最も表面側の界面までの基材面外方向の長さを示し、層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作成した培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。また、本発明において「温度応答性成分の含有割合」とは、温度応答性高分子に含まれる温度応答性の単量体単位の重量割合を示す。
【００２６】
また、前記［３］工程において多能性幹細胞を短時間で剥離し、細胞へのダメージを低減させるのに好適であることから、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が５ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ以上がさらに好ましく、２０ｎｍ以上が特に好ましく、３０ｎｍ以上が最も好ましい。
【００２７】
前記温度応答性高分子による層を有する基材としては、水に対する応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を表面に有する基材を挙げることができ、剥離後の多能性幹細胞の生存率を高めるのに好適であることから、応答温度が０℃〜５０℃の範囲にあることが好ましく、５℃〜３５℃がさらに好ましく、１０℃〜２５℃が特に好ましく、１５℃〜２５℃が最も好ましい。
【００２８】
前記温度応答性高分子を構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ  アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−  ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテルを挙げることができ、応答温度を０〜５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。
【００２９】
前記温度応答性高分子による層の形成方法としては特に制限はないが、温度応答性高分子を基材に強固に固定化するのに好適であることから、温度応答性高分子の単量体単位を基材上で電子線重合する方法、熱又は光反応性の温度応答性高分子を用いて熱または光により基材に固定化する方法、温度応答性高分子の単量体単位とその他の単量体単位との共重合体を用いる方法を好適に用いることができる。
【００３０】
前記温度応答性高分子の単量体単位とその他の単量体単位との共重合体を用いる方法においては、共重合体を強固に基材に固定化させるのに好適であることから、少なくとも水に不溶の高分子の単量体単位を含むことが好ましい。また、温度応答性高分子の応答温度の制御に好適であることから、共重合体の構造としてはブロック共重合体であることが好ましい。
【００３１】
前記水に不溶の高分子の単量体単位としては特に制限はないが、例えば、スチレン、２−ヒドロキシフェニルアクリレート、２−ヒドロキシフェニルメタクリレート、３−ヒドロキシフェニルアクリレート、３−ヒドロキシフェニルメタクリレート、４−ヒドロキシフェニルアクリレート、４−ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−デシルアクリレート、ｎ−デシルメタクリレート、ｎ−ドデシルアクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−テトラデシルアクリレート、ｎ−テトラデシルメタクリレートを挙げることができる。
【００３２】
前記共重合体における温度応答性高分子の構成単位比率は、多能性幹細胞の冷却剥離性を高める観点から、５ｍｏｌ％以上が好ましく、２０ｍｏｌ％以上がさらに好ましく、３０ｍｏｌ％以上が特に好ましく、４０ｍｏｌ％以上が最も好ましい。また、共重合体を基材へ強固に固定化するのに好適であることから、温度応答性高分子の構成単位比率が９５ｍｏｌ％以下であることが好ましく、９０ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましく、８５ｍｏｌ％以下であることが特に好ましく、８０ｍｏｌ％以下であることが最も好ましい。
【００３３】
前記温度応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、温度応答性高分子による層の強度を高めるのに好適であることから、数平均分子量で１０００〜１００万であることが好ましく、２０００〜５０万であることがさらに好ましく、５０００〜３０万であることが特に好ましく、１万〜２０万であることが最も好ましい。
【００３４】
本発明における基材の材質は、特に限定されるものではないが、通常細胞培養に用いられるガラス、ポリスチレン等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、セラミックス、金属類などを用いることができる。培養操作の容易性から、基材の材質がガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンの内少なくとも１種類を含むことが好ましく、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラートの内少なくとも１種類を含むことがさらに好ましく、可撓性を高めるのに好適であることからポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラートが特に好ましい。
【００３５】
本発明における基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ−ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカー製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロー２−イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
【００３７】
［実施例１］
基材としてポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）に温度応答性高分子による層が形成されたものを用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を用いた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（培地に対して２．５μＬ／ｍＬ）を添加し培養した。
【００３８】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、細胞はコロニー状で基材に存在していることを確認した。
【００３９】
培地を除去してリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水に０．５×ＴｒｙｐＬＥ  ＳＥＬＥＣＴ、エチレンジアミン四酢酸を５×１０−３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、３７℃で３分間処理した。細胞間結合乖離液を吸引除去してリン酸緩衝生理食塩水を加え、リン酸緩衝生理食塩水を吸引除去することで、細胞を基材に接着させたまま洗浄した後、Ｙ−２７６３２を添加した培地をディッシュ内に加えた。１５℃で１０分間冷却を行うことで細胞を剥離させた。細胞の生存率は９６．５％であった。
【００４０】
なお、温度応答性高分子の合成及びコーティングは以下の方法で行った。
【００４１】
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００４２】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
【００４３】
ポリスチレンディッシュ上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．５ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
【００４４】
温度応答性高分子の応答温度は３２℃、構成単位比率はｎ−ブチルメタクリレート４ｍｏｌ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド９６ｍｏｌ％、分子量はＭｎ７万であった。ポリスチレンディッシュ上への温度応答性高分子の被覆の膜厚は２５ｎｍであった。
【００４５】
［実施例２］
実施例１において下記方法で作製した基材を用い、１５℃で１０分間冷却を行った後に基材を２０回叩いて振動を与える操作を行い、その他は実施例１と同様にして細胞を剥離した。細胞の生存率は９２．３％であった。
【００４６】
ポリスチレンディッシュ上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．１ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。ポリスチレンディッシュ上への温度応答性高分子の被覆の膜厚は５ｎｍであった。
【００４７】
［比較例１］
実施例１において温度応答性高分子による層を形成せず、ポリスチレンディッシュをそのまま使用し、その他は実施例１と同様にして行った。細胞は基材から剥離せず、回収できなかった。
【００４８】
［比較例２］
実施例１において下記方法で作製した基材を用い、その他は実施例１と同様にして細胞を剥離した。多能性幹細胞と細胞間結合乖離液を接触させている間にほぼ全ての細胞が基材から剥離してしまい、生存率は０％であった。
【００４９】
ポリスチレンディッシュ上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の２ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。ポリスチレンディッシュ上への温度応答性高分子の被覆の膜厚は１２０ｎｍであった。
【００５０】
［比較例３］
実施例１において多能性幹細胞と細胞間結合乖離液を接触させる操作を行わず、その他は実施例１と同様にして行った。細胞は基材から一部しか剥離せず、また、剥離した細胞は複数の細胞の塊であり、単一細胞を回収することはできなかった。
【００５１】
［比較例４］
実施例１において多能性幹細胞と接触させた細胞間結合乖離液を吸引除去せず、トリプシンが残存したまま冷却剥離操作を行い、細胞を基材から剥離した。細胞は剥離したが、大部分の細胞が死滅し、生存率は２９．５％であった。