(57)【要約】      （修正有）【課題】D-グルコース等の糖類から最低限度の特定の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成できる酵素反応系構築のための糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極の提供。特には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含めた酵素反応系を利用する糖類酸化方法、及び、糖類酸化酵素剤、糖類酸化酵素電極の提供。【解決手段】大腸菌由来の特定のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程を、含む糖類酸化方法、及び、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極。【選択図】図１
2020018221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類を分解する糖類酸化方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、前記2-ケト-D-グルコン酸を前記D-グリセルアルデヒドと前記ヒドロキシピルビン酸とに分解する工程を、含む糖類酸化方法。
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）の少なくとも１の工程を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素により前記ヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO2に分解する工程、
を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。
【請求項３】
以下の（Ｈ）及び（Ｉ）の少なくとも１の工程、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により前記2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、
を含む請求項１又は２に記載の糖類酸化方法。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む、糖類を分解するための糖類酸化酵素剤。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定した糖類酸化酵素電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極に関する。詳細には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を利用する糖類酸化方法、及び、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として利用する糖類酸化酵素電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素や微生物が持つエネルギー変換システムを利用したバイオ電池の開発が進められている。バイオプロセスを利用するバイオ電池は、緩和な条件かつ高い選択性を有し、燃料として糖やアルコール等の環境中に存在する多様な物質を利用できるという利点を有する。そのため、安全で環境負荷が小さいことから、携帯型機器や体内埋込型機器等の小型電子機器の電源等として更なる発展が期待されている。近年、バイオ電池の性能向上を目指し、安定性向上、電極素材の最適化、電極／酵素間の電子の移動の効率化等の観点から研究開発が進められている。
【０００３】
特に、燃料として糖類を用いるバイオ電池が着目されている。糖類は、極めて安定した物質であることから取扱いが容易であり、かつ生物由来であるため環境負荷が小さなクリーンなエネルギー源となり得る。そして、生命を維持する上で最も重要なエネルギー源であり、生体内の温和な条件下で多段階酸化を受けて二酸化炭素と水にまで分解され、最大限のエネルギー変換が行われる。この生体内でのエネルギー変換系は酵素の働きにより進行するが、これを如何にして生体外で模擬できるかがバイオ電池の開発における課題となり、様々な研究がなされてきている。特に、D-グルコース等の糖類から最大限かつ効率よく電気エネルギーを生成するためには、糖類から多電子を取り出す一連の多段階酸化反応に関与する酵素群が必要となり、種々の試みが報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１及び２を参照のこと）。
【０００４】
例えば、特許文献１には、2-ヒドロキシカルボン酸生成酵素、2-オキソ酸生成酵素、及び、2-オキソカルボキシリアーゼを含有する酵素電極が、糖類等のポリオールを分解することにより電子を取り出すことができることが報告されている。かかる酵素電極を利用するバイオセンサー及びバイオ電池を構築できること、更に、糖類としてD-グルコースをCO2まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から24電子を抽出する酵素反応系が示されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の酵素反応系は、実際の使用に適した酵素群が特定されていないことから、効率的に糖類の多段階酸化反応を進行できる酵素反応系を構築するためには多大な労力が要求される。例えば、特許文献１のように実際に使用に適した酵素が特定されてない場合には、細胞破砕液等の細胞抽出液を用いて酵素を供給することが必要となるが、細胞抽出液には目的外の酵素が大量に存在することから、様々な副反応が起こる可能性が高い。そのため、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点がある。
【０００６】
非特許文献１には、Gluconobacter属細菌から抽出したピロロキノリンキノン依存性酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ、2-グルコン酸デヒドロゲナーゼ）、Sulfolobus solfataricus由来のアルドラーゼ、及び、オオムギ由来のシュウ酸オキシダーゼを含む6酵素反応系を利用した酵素電極が報告されている。かかる酵素電極を利用したバイオ電池を構築できること、更に、D-グルコースをCO2まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から20電子を抽出する酵素反応系が示されている。
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載の酵素反応系は、特許文献１と同様に、実際の使用に適した酵素群が特定されていないことから、効率的に多段階酸化反応を進行できる酵素反応系を構築するためには多大な労力が要求される。また、細胞抽出液を用いるものであることから、特許文献１と同様に、様々な副反応が起こる可能性が高く、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点がある。
【０００８】
非特許文献２には、具体的に特定された組換え合成された12酵素による酵素反応系を利用した酵素電極が報告されている。かかる酵素反応系は、ポリリン酸グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ等が含まれ、ポリリン酸グルコキナーゼによるグルコースリン酸化、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ及び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼによるNADH生成、NADHからアノードへの電子移動、及び、非酸化型ペントースリン酸経路及び糖新生によるグルコース6-リン酸の再生から構成されている。かかる酵素電極を利用したバイオ電池は、D-グルコースをCO2まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から24電子を抽出できることが報告されている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献２の酵素反応系は、多種類の酵素群で構成されることから、当該酵素反応系を構築するために、それぞれの酵素を別個に調製する必要があり、コスト高の要因になるとの問題がある。
【００１０】
D-グルコースのCO2までの多段階酸化反応に関与する酵素反応系において、非特許文献１で示される酵素反応系のようなD-グルコース→D-グルコノラクトン→D-グルクロン酸→D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸へと分解する酵素反応系や、同じくグルコースを酸化して得られるD-グルコン酸を経由する酵素反応系の構築が検討されている。D-グルコースから、D-グルコノラクトン、D-グルコン酸を経て、2-ケト-D-グルコン酸へと酸化する酵素反応系に関与する酵素は多数報告されている。しかしながら、2-ケト-D-グルコン酸からD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応に関与する特定の酵素に関しては報告がないのが現状である。唯一、D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸を結合する種々の酵素（アルドラーゼ）が報告されている（例えば、非特許文献３を参照のこと）が、非特許文献３にも2-ケト-D-グルコン酸からD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する酵素に関しては報告がない。また、一般的に、酵素は特定の構造を有する基質に対してのみ特異的に作用する性質を有することから、立体選択的に特定の反応のみを触媒するといえる。非特許文献３においても、アルドラーゼに立体選択性があることが確認されていることからも、従来において2-ケト-D-グルコン酸に特異的に反応する酵素を見出すことは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2009-139257号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Shuai Xu及びShelley D. Minteer著、“Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO2”、ACS Catalysis、第２巻（2012年）、第１号、p91-94
【非特許文献２】ZhiguangZhu及び、Y.-H. Percival Zhang著、“In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose”、Metabolic Engineering、第39巻（2017年）、p110-116
【非特許文献３】Veronique de Berardinis他著、“Expanding the reaction space of aldolases using hydroxypyruvate as a nucleophilic substrate”、Green Chemistry、第19巻（2017年）、第2号、p519-526
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明は上記従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、D-グルコース等の糖類から最低限度の特定の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成できる酵素反応系の構築を目的とし、かかる酵素反応系構築のための糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極の提供を目的とする。特には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含めた酵素反応系による糖類酸化方法、及び、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒とする糖類酸化酵素電極の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、発明者は上記課題を達成するべく、鋭意研究を行った結果、特定のアルドースが2-ケト-D-グルコン酸を分解してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解できることを見出した。かかる2-ケト-D-グルコン酸の分解反応を利用することで糖類の多段階酸化反応を触媒する酵素反応系を構築でき、糖類から効率的に電気エネルギーを生成することができることを見出した。本発明者は、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
上記課題を解決するため、下記〔１〕〜〔５〕の構成の発明を提供する。
【００１６】
〔１〕糖類を分解する糖類酸化方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程を、含む糖類酸化方法。
【００１７】
上記〔１〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による糖類酸化方法を提供することができる。従来において、D-グルコース等の酸化分解産物である2-ケト-D-グルコン酸を分解する酵素が特定されていなかった。そのため、D-グルコース等の糖類からCO2への多段階酸化反応を触媒する酵素反応系の構築には、多種類の酵素群を用いるか、細胞破砕液等の細胞抽出液を用いる必要があった。多種類の酵素群を用いる場合には、それぞれの酵素を別個調製する必要があり、コスト高の要因になるとの問題があり、また、細胞抽出液を用いる場合には、細胞抽出液には目的外の酵素が大量に存在することから、様々な副反応が起こる可能性が高く、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点があった。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応系の構築が可能となる。これにより、D-グルコース１分子から24電子を取り出す酵素反応系を構築することが可能となる。2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を用いることで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【００１８】
〔２〕以下の（Ａ）〜（Ｇ）の少なくとも１の工程を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO2に分解する工程、
を含む上記〔１〕の糖類酸化方法。
【００１９】
上記〔２〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO2への多段階酸化反応において、当該工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。
【００２０】
〔３〕以下の（Ｈ）及び（Ｉ）の少なくとも１の工程、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により前記2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、
を含む上記〔１〕又は〔２〕の糖類酸化方法。
【００２１】
上記〔３〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO2への多段階酸化反応において、当該工程の上流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。
【００２２】
〔４〕以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む、糖類を分解するための糖類酸化酵素剤。
【００２３】
上記〔４〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤を提供することができる。従来において構築された糖類の多段酸化反応を触媒する酵素反応系は、コスト高を招くことや酵素反応系の反応効率の点で問題がある。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素剤を提供することが可能となる。本構成の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【００２４】
〔５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定した糖類酸化酵素電極。
【００２５】
上記〔５〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極材上に固定した糖類酸化酵素電極を提供することができる。従来において構築された糖類の多段酸化反応を触媒する酵素反応系は、コスト高を招くことや酵素反応系の反応効率の点で問題がある。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素電極を提供することが可能となる。本構成の糖類酸化酵素電極は2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本実施形態の糖類酸化方法の一例を示すブロック図であり、D-グルコースからCO2への多段階酸化反応による分解経路を示す。
【図２】2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析を行った実施例３の結果を示すグラフであり、D-グリセルアルデヒドの検出結果を示す。
【図３】2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析を行った実施例３の結果を示すグラフであり、ヒドロキシピルビン酸の検出結果を示す。
【図４】酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４において検討を行った2-ケト-D-グルコン酸（2KG）の多段階酸化反応による分解経路を示すブロック図。
【図５】酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４において検討を行った2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸（KDG）の多段階酸化反応による分解経路を示すブロック図。
【図６】酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４の結果を示すグラフであり、No.4の結果を示す。
【図７】酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４の結果を示すグラフであり、No.5の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（糖類酸化方法）
本発明の実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を利用するものである。
【００２８】
本実施形態の糖類酸化方法で利用される2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、上記した通り、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する。当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、国際生化学・分子生物学連合による酵素番号（EC番号）においてEC 4.1.2.53に属する2-ケト-3-デオキシ-L-ラムノン酸アルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）として（2-ケト-3-デオキシ-L-ラムノン酸 ⇔ ピルビン酸 + (S)-ラクトアルデヒド）の反応を触媒することが知られている酵素であり、補因子としてMgイオンが要求される酵素である。
【００２９】
本実施形態の糖類酸化方法の対象となる糖類は、2-ケト-D-グルコン酸自体及び他の酵素又は酵素群の作用により2-ケト-D-グルコン酸を生成するものである限り特に制限ない。例えば、2-ケト-D-グルコン酸は、D-グルコースからの多段階酸化反応により、D-グルコノラクトン、D-グルコン酸を経て生成することから、D-グルコースも本実施形態の糖類酸化方法の好適な対象となる。また、糖類には、D-マンノース及びD-フルクトース等の六炭糖の単糖類が含まれる。更に、これらの単糖類が脱水縮合した二糖類やそれ以上の単糖類が脱水縮合した多糖類も含まれる。二糖類としては、マルトースやスクロース、セルビオース、ラクトース等が例示され、多糖類としては、デンプン、グルコマンナン、セルロース等が例示されるがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるもの、及び、その改変体を包含する。好ましくは、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、2-ケト-D-グルコン酸に作用しD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するものである。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも一定割合の配列同一性を有するアミノ酸配列
【００３１】
ここで、「１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする核酸分子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。例えば、このような改変は、配列番号２で示すアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも一定割合の配列同一性を有するものとできる。
【００３２】
また、「少なくとも一定割合の配列同一性」とは、好ましくは70、75、80、又は85％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95、96、97、98、又は99％以上の配列同一性を保持することを意味する。
【００３３】
アミノ酸配列の改変に際しては、当業者は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の理化学的物性を保持する改変を容易に予測することができる。具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。また、その後の精製、固相への固定等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にヒスチジンタグ（His-tag）、FLAGタグ（FLAG-tag）等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、酵素活性の消失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００３４】
本実施形態の糖類酸化方法で利用される2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、そのアミノ酸配列及び理化学的物性が確認されたことから、自然界をスクリーニングすることにより取得することができる。しかしながら、公知の遺伝子工学的技術を用いて、本発明の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を取得し、得られた核酸分子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質を採取することによって取得することが好ましい。2-ケト-D-グルコン酸を分解する活性の確認方法については下記で詳述する。
【００３５】
改変体についても、自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。若しくは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子に対して公知の方法で改変を施すことによっても取得できる。
【００３６】
例えば、改変の基礎とする配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に対して、下記で詳述するように改変を施し、得られた改変型核酸分子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３７】
ここで、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するすべての2ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードするものを包含する。つまり、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素及びその改変体をコードする全ての核酸分子である。
【００３８】
好ましくは、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子、及び、その改変体を包含する。特に好ましくは、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列からなる核酸分子である。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有する塩基配列
（ｆ）配列番号１に示す塩基配列と少なくとも一定割合の配列同一性を有する塩基配列
【００３９】
ここで、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子にはDNA及びRNAの双方が含まれ、DNAである場合には、一本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４０】
ここで、「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となる核酸分子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。配列番号１に示す塩基配列の３'、又は５'末端にタグペプチドをコードする塩基配列が付加したものや、エキソヌクレアーゼを作用させることによって塩基配列が欠失したものが好適に例示される。また、このような改変は、配列番号１で示す塩基配列に対して、塩基レベルで少なくとも一定割合の配列同一性を有するものとできる。
【００４１】
また、「少なくとも一定割合の配列同一性」とは、好ましくは70、75、80、又は85％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95、96、97、98、又は99％以上の配列同一性を保持することを意味する。
【００４２】
更に、コードされるタンパク質が2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を保持している限り、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子と相補的な核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子も本発明に含まれる。
【００４３】
ここで、ストリンジェントな条件とは、塩基配列において、60 ％以上、好ましくは70 ％、より好ましくは80 ％以上、特に好ましくは90 ％、95 ％以上の同一性を有するDNA同士が優先的にハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの反応や洗浄の際の塩濃度及び温度を適宜変化させることによって調製することができる。例えば、Sambrook他著、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、New York等に記載のサザンハイブリダイゼーションのための条件等が挙げられる。
【００４４】
より具体的には、50 ％（v/v） ホルムアミド、5×SSC中で、42 ℃にて16時間のハイブリダイゼーションが例示される。ここで、1×SSCは、0.15 M NaCl、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0である。また、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を0.1〜1.0 ％（v/v）、変性非特異的DNAを0〜200 μl含んでいてよい。そして、洗浄条件としては、2×SSC、0.1 ％ SDS中の5 ℃にて5分間の洗浄、及び0.1×SSC、0.1 ％ SDS中の65 ℃にて30分間〜4時間の洗浄が例示される。また、これらと同等の条件も当業者は容易に理解できるであろう。
【００４５】
2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、本明細書において、その塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。
【００４６】
例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列、好ましくは配列番号１に示す塩基配列を基にして作製したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を調製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸分子が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。このようなプローブとしては、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列に基づき、この塩基配列の連続する10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。そして、プローブは必要に応じて適当な標識が付されていてよく、このような標識として放射線同位体、蛍光色素等が例示される。
【００４７】
また、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列、好ましくは配列番号１に示す塩基配列を基にして作製したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を調製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸分子が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいてプライマーの設計を行う。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、所望の増幅領域を挟んで設計され、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４８】
ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則にしたがって特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸分子を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件等多くの因子に依存して決定される。
【００４９】
また、塩基配列情報に基づいて、常法のホスホアミダイト（phosphoramidite）法等の核酸合成法により合成することによっても取得することができる。
【００５０】
また、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の改変体をコードする核酸分子は、公知の変異導入技術を利用して取得することができる。具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に変異部位を挿入することによって行うことができる。変異部位を挿入する方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の変異型タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、PCR法等を利用して変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法等の公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。
【００５１】
特には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子（DNA）、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子（DNA）を鋳型として、所望の改変を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、改変体の調製において、PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の変異が挿入できるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００５２】
また、目的とする改変を有するアミノ酸配列が定めれば、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホアミダイト法等の核酸合成技術を利用して、改変体を化学的に合成することができる。或いは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする塩基配列からなる核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に対してエキソヌクレアーゼを作用させることによって取得することができる。
【００５３】
そして、得られた核酸分子用いて、当業者に公知の遺伝子組換え技術により2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を製造することができる。
【００５４】
具体的には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクターとしては、外来DNAを組み込め、かつ宿主細胞内で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（pEX系、pUC系、及びpBR系等）、ファージベクター（λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００５５】
ベクターには、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。したがって、核酸分子の機能発現に必要な他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく公知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性等の遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００５６】
ベクターへの2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法等を用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、DNAリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（Takara-bio社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００５７】
形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Sf９細胞等の昆虫細胞、CHO細胞、COS-7細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００５８】
続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を製造する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００５９】
2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を含む組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００６０】
形質転換体の培養物から、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDS-PAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の公知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合、所望の酵素をヒスチジンタグ（His Tag）等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、所望の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。
【００６１】
また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、アミノ酸配列が公知であることから、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することもできる。
【００６２】
精製されたタンパク質が、本実施形態の糖類酸化方法で利用に適した2-ケト-D-グルコン酸分解酵素であるか否かの確認は、その理化学的物性や配列の分析によって行うことができる。理化学的物性の分析による場合、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を測定することにより確認することができる。
【００６３】
2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する分解活性の測定は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法の何れも利用して行うことができる。好ましくは、D-グリセルアルデヒド又はヒドロキシピルビン酸の生成を測定することによって行うことができる。例えば、生成したD-グリセルアルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナーゼに作用させ、かかるアルデヒドデヒドロゲナーゼによるD-グリセルアルデヒドの脱水素反応に基づく、電子受容体の還元反応を追跡することにより行うことができる。電子受容体としては、ジクロロインドフェノール（以下、「DCIP」と称する場合がある）及びフェナジンメトサルフェイト（以下、「PMS」と称する場合がある）等を用いることができる。例えば、DCIPの還元反応の追跡は、DCIPの吸収波長である600nmでの吸光度変化を測定することにより行うことができ、吸光度の減少度によりDCIPの還元反応を追跡することができる。また、PMSの還元反応の追跡は、還元型PMSによるニトロテトラゾリウムブルー（以下、「NTB」と称する場合がある）の還元により生成するホルマザンの吸収波長である570nmでの吸光度変化を測定することにより行うことができる。吸光度変化の測定は公知の手法により行うことができ、例えば、マイクロプレートリーダー等を利用することができる。
【００６４】
また、精製したタンパク質の確認を配列分析によって行う場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法等を利用することができる。
【００６５】
本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素による反応を含めることができる。本実施形態の糖類酸化方法は、図１に例示するD-グルコースからCO2への多段階酸化反応を行う酵素反応系の一部又は全部を含んで構成することができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO2まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を含んで構成してもよい。これにより、2-ケト-D-グルコン酸一分子から16電子を取り出すことができる。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する反応工程を含んで構成することができ、更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する反応工程や、他の単糖類からD-グルコースに変換する反応工程等を含んで構成することもできる。
【００６６】
ここで、図１に示すD-グルコースからCO2への多段階酸化反応は、8種類の酵素群により触媒される酵素反応系で構成され、D-グルコース一分子から24電子を取り出す酵素反応系である。
【００６７】
詳細には、図１の酵素反応系には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系である、
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO2に分解する工程、が含まれる。本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加えて、上記工程の任意の少なくとも１の工程を含むことができ、また、上記工程の全てを含むこともできる。
【００６８】
更に、図１の酵素反応系には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側の酵素反応系である、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、及び、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、が含まれる。本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加えて、上記工程の任意の少なくとも１の工程を含むことができ、また、上記工程の全てを含むこともできる。
【００６９】
更に、本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の任意又は全部の工程のみ、若しくは、双方の任意又は全部の工程、を含むものであってもよい。
【００７０】
図１に示す酵素反応系において、D-グルコースは、グルコース-1-酸化酵素の作用により、D-グルコノラクトンに分解され、かかるD-グルコノラクトンが非酵素的に加水分解されることでD-グルコン酸に分解される。グルコース-1-酸化酵素としては、D-グルコース + NAD(P)+ ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + NAD(P)Hの反応を触媒することが報告されているNAD(P)+依存性グルコース1-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）、D-グルコース + O2 ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + H2O2（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているグルコースオキシダーゼ（EC 1.1.3.4）、及び、D-グルコース + ユビキノン ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + ユビキノール（Caイオン、Mgイオン、PQQを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.2）、D-グルコース + キノン ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + キノール（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているFAD依存性グルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.9）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。
【００７１】
D-グルコン酸は、D-グルコン酸-2-酸化酵素の作用により、2-ケト-D-グルコン酸に分解される。D-グルコン酸-2-酸化酵素としては、D-グルコン酸 + NADP+ ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + NADPHの反応を触媒することが報告されているNADP+依存性グルコン酸 2-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.215）、D-グルコース + O2 ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + H2O2（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているFAD依存性ピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.10）、D-グルコン酸 + 受容体 ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + 還元型受容体（FADを補因子として要求）の反応を触媒するFAD依存性グルコン酸 2-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.3）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。
【００７２】
2-ケト-D-グルコン酸は、上記した2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の作用により、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解される。
【００７３】
D-グリセルアルデヒドは、アルデヒド酸化酵素の作用によりD-グリセリン酸に分解され、生成したD-グリセリン酸はD-2-ヒドロキシ酸酸化酵素の作用によりヒドロキシピルビン酸に分解される。アルデヒド酸化酵素としては、アルデヒド類 + NAD+ ⇔ カルボン酸類 + NADHの反応を触媒することが報告されているNAD+依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3）、アルデヒド+ NADP+ ⇔ カルボン酸類 + NADPHの反応を触媒することが報告されているNADP+依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.4）、アルデヒド類 + H2O + O2⇔ カルボン酸類+ H2O2（FAD、鉄-硫黄、Moカチオンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているアルデヒドオキシダーゼ（EC 1.2.3.1）、アルデヒド類 + キノン+ H2O ⇔ カルボン酸類 + キノール（ヘム及びピロロキノリンキノンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.5.2）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Sphingomonas wittichii由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用することができる。D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素としては、(R)-乳酸+ NAD+ ⇔ ピルビン酸 + NADHの反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.28）、(R)-乳酸 + 2ヘリシトクロムc ⇔ ピルビン酸 + 2フェロシトクロムc + 2H+（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.3.1）、(R)-2-ヒドロキシ酸 + キノン ⇔ オキソ酸 + キノール（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-2-ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.10）、(R)-乳酸 + 受容体 ⇔ ピルビン酸 + 還元型受容体（FAD及びZnイオンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.6）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Escherichia coli由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼを利用することができる。
【００７４】
ヒドロキシピルビン酸は、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素との組み合わせの作用により、グリコール酸に分解される。ヒドロキシピルビン酸酸化酵素として、ピルビン酸 + リン酸+ O2 ⇔ アセチルリン酸 + CO2 + H2O2（FAD及びチアミン二リン酸を補因子として要求）を触媒することが報告されているピルビン酸オキシダーゼ（EC 1.2.3.3）、ピルビン酸 + ユビキノン + H2O ⇔ 酢酸 + CO２ + ユビキノール（FADを補因子として要求する）の反応を触媒することが報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.5.1）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素としては、2-オキソ酸 ⇔ アルデヒド + CO2（チアミン二リン酸を補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているピルビン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.1）、及び、ヒドロキシピルビン酸 → グリコールアルデヒド+ CO2の反応を触媒することが報告されているヒドロキシピルビン酸デヒドロゲナーゼ（EC 4.1.1.40）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素を利用することができる。アルデヒド酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。
【００７５】
グリコール酸は、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素の作用によりグリオキシル酸に分解される。D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。
【００７６】
グリオキシル酸は、アルデヒド酸化酵素の作用によりシュウ酸に分解される。アルデヒド酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。
【００７７】
シュウ酸は、シュウ酸脱炭酸酵素の作用によりギ酸に分解される。シュウ酸脱炭酸酵素としては、シュウ酸 ⇔ ギ酸 + CO2（Mnイオンを補因子として要求）を触媒することが報告されているシュウ酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.2）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Bacillus subtilis由来のシュウ酸脱炭酸酵素を利用することができる。
【００７８】
ギ酸は、ギ酸酸化酵素の作用によりCO2に分解される。ギ酸酸化酵素としては、ギ酸 + NAD+ ⇔ CO2 + NADH（フラビン、鉄-硫黄、Mo カチオン）の反応を触媒することが報告されているギ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.17.1.9）、及び、ギ酸オキシダーゼ等を例示することができるが、これらに限定するものではない。
【００７９】
これらの酵素は、市販品を利用してもよいし、上記した遺伝子組み換え技術を利用して人工的に合成したものを用いても良い。上記した酵素群や同等の機能を有する酵素群のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸分子の塩基配列情報は公知であり、GenBank、EMBI、DDBJ等の遺伝子配列データベースから取得することができる。
【００８０】
本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって糖類を酸化する方法を提供することができる。本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応系の構築が可能となる。これにより、D-グルコース１分子から24電子を取り出す酵素反応系を構築することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素において、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を用いることで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【００８１】
本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO2への多段階酸化反応において、当該工程の上流側及び下流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。
【００８２】
（糖類酸化酵素剤）
本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含んで構成することができる。
【００８３】
本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素を含めることができる。本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、図１に例示するD-グルコースからCO2への多段階酸化反応系を構成する酵素の一部又は全部をも含んで構成することができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO2まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素の一部又は全部を含んでいてもよい。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を含んでいても良い。更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する酵素反応系や、他の単糖類からD-グルコースに変換する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を含んでいてもよい。このとき、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素のみ、若しくは、双方の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素、を含むものであってもよい。
【００８４】
例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加え、D-グルコース-1-酸化酵素、D-グルコン酸-2-酸化酵素、アルデヒド酸化酵素、D-２-ヒドロキシ酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素、シュウ酸脱水炭酸酵素、ギ酸酸化酵素の一部又は全部を含めることができる。
【００８５】
本実施形態の糖類酸化酵素剤は、液体形態の液剤、固形形態の錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の任意の剤形に形成することができる。更に、例えば、賦形剤、緩衝化剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤等の添加剤を有効成分である酵素の活性を損なわない限りにおいて含ませることができる。固形形態に製剤化する際には、例えば、酵素溶液に適当な賦形剤等の添加剤を配合し、噴霧乾燥処理又は凍結乾燥処理を施すことで固形形態の剤形に製剤化することができる。
【００８６】
賦形剤としては、水や精製水、生理食塩水等の適当な水性媒体、結晶セルロース、トレハロース、デキストリン、微粒酸化ケイ素、ステアリン酸カルシウム等の適当な固形媒体を利用できる。緩衝化剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を利用できる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチルやパラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等が利用できる。安定化剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ポリソルベート80、ポビドン、デキストラン40等が利用できる。界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、ラウリル硫酸ナトリウム等が利用できる。しかしながら、これらに限定するものではなく、有効成分である酵素の活性を損なわない限り、公知の添加物を必要に応じて含ませることができる。
【００８７】
また、本実施形態の糖類酸化酵素剤は、用時調製用として、例えば、有効成分である酵素を錠剤や粉末等の固体形態や濃縮形態として、用時調製時の溶解や希釈用の水や精製水、生理食塩水等の適当な水性溶媒と組み合わせることができる。
【００８８】
本実施形態の糖類酸化酵素剤のpHは、緩衝化剤等を用いて、例えば、酵素の機能上及び製剤学的に許容される範囲内であれば特に限定されないが、好ましくは4.0〜9.5、特に好ましくは、4.8〜8.5となる範囲に調整される。
【００８９】
本実施形態の糖類酸化酵素剤において、補因子を要求する酵素は、補因子を含むホロ酵素の状態で酵素剤に含めることが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で含め、補因子を同一製剤内に独立して、又は、別個の製剤として含めるように構成してもよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質、例えば、Mgイオン等の金属イオン等に関しても同一製剤内に独立して、又は、別個の製剤として含めるように構成してもよい。
【００９０】
本実施形態の糖類酸化酵素剤によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤を提供することができる。本実施形態の糖類酸化酵素剤によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素剤を提供することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含むことから、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【００９１】
（糖類酸化酵素電極）
本実施形態の糖類酸化酵素電極は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定している。
【００９２】
本実施形態の糖類酸化酵素電極は、電極触媒に固定された2-ケト-D-グルコン酸分解酵素が2-ケト-D-グルコン酸に作用し、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する。
【００９３】
本実施形態の糖類酸化酵素電極は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素を電極触媒として含めることができる。本実施形態の糖類酸化酵素電極は、例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、図１に例示するD-グルコースからCO2への多段階酸化反応系を構成する酵素の一部又は全部をも電極触媒として含んで構成することができる。これにより、電極上でD-グルコース等からの多段階酸化反応が進行し、各段階の触媒反応によって発生する電子を電極に取り出すことができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO2まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素の一部又は全部を電極触媒として含んでいてもよい。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を電極触媒として含んでいても良い。更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する酵素反応系や、他の単糖類からD-グルコースに変換する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を電極触媒として含んでいてもよい。このとき、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素のみ、若しくは、双方の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素、を電極触媒として含むものであってもよい。
【００９４】
詳細には、D-グルコース-1-酸化酵素、D-グルコン酸-2-酸化酵素、アルデヒド酸化酵素、D-２-ヒドロキシ酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素、シュウ酸脱水炭酸酵素、ギ酸酸化酵素の一部又は全部を電極触媒として含めることができる。
【００９５】
電極材としては、外部回路に接続可能で電子を伝達できる導電性の基材であれば特に制限はない。例えば、カーボンクロス、カーボンフェルト、カーボンペーパー、グラファイト、グラッシーカーボン等のカーボン電極材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等、従来公知の材質の導電性の物質を使用することができる。特には、広い電位窓を有し安定した電極性能を発揮し得るカーボン電極材が好ましい。また、カーボン電極材は多孔性材料でもあることから電極表面積も広く、これを有効に利用することにより高効率の酵素電極を構築できる。そして、これらの基材を単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。更に大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。
【００９６】
また、これを単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。また、導電性向上のため、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラック、活性炭粉末等の導電性カーボン微粒子を基材に塗布してもよい。その際に、PVDF等のバインダーを使用してもよい。電極材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。
【００９７】
電極材上への酵素の固定は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ架橋試薬で架橋固定する架橋法をも利用できる。更には、アルギン酸、カラギーナン等の多糖類、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、光架橋性ポリマー等の網目構造をもつポリマー、透析膜等の半透性膜内に封入して固定する包括法等をも利用することができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。また、電極材上に形成した親水性ポリマー樹脂層に、酵素溶液、任意には電子メディエーターや補酵素等の電極触媒として機能を発現するために必要な物質を染み込ませる等の手段により固定するように構成してもよい。電極材上への2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の固定化量は、糖類酸化酵素電極の使用目的等に応じて適宜変更することができる。
【００９８】
そして、2種類以上の酵素群の固定に際して、好ましくは、固定を行う酵素群を予め混合して固定してもよく、また、何れかの酵素を先に固定した後、順次他の酵素を固定してもよい。好ましくは、酵素は、局在することなく電極材に均一に分散して固定することが好ましい。酵素の固定比率は、均等であっても、任意の比率であってよい。例えば、グルコースの多段階反応において律速段階となる反応を触媒する酵素の固定比率を大きくすることが好ましく、また、後段の反応を触媒する酵素の固定比率を大きくしてもよい。
【００９９】
補因子を要求する酵素の固定に際しては、補因子を含むホロ酵素の状態で固定することが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で固定し、補因子を別の層として、又は、使用に際して適当な緩衝液に補因子を溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質、例えばMgイオンの金属イオン等を、別の層として、又は、使用に際して適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。
【０１００】
また、必要に応じて、酵素反応と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエーターを電極材に固定することができる。電子メディエーターの固定は、酵素と混合して固定してもよいし、酵素の固定の前、若しくは後に固定してもよい。
【０１０１】
電子メディエーターは、酵素等の生体触媒の反応に応じて酸化又は還元される低分子の酸化還元物質であり、生体触媒と電極材間の電子移動を媒介する。したがって、電子メディエーターは、酵素等の生体触媒と電子を授受することができる共に、電極材とも電子を授受することができる物質である限り何れも使用することができる。そして、電子メディエーターは、一重結合と二重結合が交互に並んだπ共役系化合物であることが好ましい。例えば、電子メディエーターは、特に限定されるものではないが、例えば、5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンメトスルファート：PMS）、5-エチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンエトスルファート：PES）等、のフェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェリシアン化カリウム等のフェリシアン化物、フェロセンやジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン系化合物、ナフトキノン、アントラキノン、ハイロドキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物、シトクロム系化合物、ベンジルビオロゲンやメチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物、ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール系化合物等が挙げられる。フェナジン系化合物の1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（以下、「mPMS」と称する場合がある）が特に好ましく例示できる。
【０１０２】
本実施形態の糖類酸化酵素電極は、D-グルコース等の糖類を燃料とするバイオ電池のアノード側電極として、また、D-グルコース等の糖類を測定するためのバイオセンサーの作用極として利用することができる。
【０１０３】
本実施形態の糖類酸化酵素電極をバイオセンサーの作用極として利用する場合には、本実施形態の糖類酸化酵素電極を作用電極とし、及びその対向電極（対極）を設けて構成することができる。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。例えば、対極として白金電極、参照電極としてAg/AgCl電極を用いて構成することができる。
【０１０４】
本実施形態の糖類酸化酵素電極をバイオ電池のアノード側電極として利用する場合に、バイオ電池は、酸化反応を行うアノード側電極と還元反応を行うカソード側電極を含み、アノード側電極とカソード側電極が隔膜を挟んで対向するように配置され、アノード側電極とカソード側電極は外部回路によって接続される。燃料をアノード側電極側に供給することにより、本実施形態の糖類酸化酵素電極により燃料を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。そして、この電子は、直接、又は酵素反応と電極間の電子伝達を仲介するための電子メディエーターを通してアノード側電極に受け渡たされる。そして、アノード側電極から外部回路を通ってカソード側電極に電子が受け渡されることによって電流が発生する。一方、アノード側電極側で発生したプロトンが隔膜を通って、カソード側電極側に移動し、外部回路を通してアノード側から移動してきた電子と反応し水を生成するように構成される。カソード側電極側は、酸素や過酸化水素等の酸化剤を還元して電子を伝達することのできる触媒を固定して構成されることが好ましく、アノード側電極側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。また、カソード側電極としては、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ等のマルチ銅酵素等の酵素が固定された電極を使用することもできる。
【０１０５】
隔膜は、プロトン等を透過できるイオン伝導性を有すると共に、プロトン等のイオン以外の負極側の構成成分及び正極側の構成成分を透過させないという性質を有する限り、その素材及び形状等に制限はない。例えば、セルロース膜等を利用することができ、また、固体電解質膜を利用することができる。固体電解質膜としては、スルホン基、リン酸基、ホスホン基、及びホスフィン基等の強酸基、カルボキシル基等の弱酸基、及び極性基を有する有機高分子等のイオン交換機能を有する固体膜等が例示されるが、これらに限定するものではない。具体的にはセルロース膜、及びテトラフルオロエチレンとパーフルオロ〔２−（フルオロスルフォニルエトキシ）プロピルビニルエーテル〕：tetrafluoroethyleneとperfluoro[2-(fluorosulfonylethoxy)propylvinyl ether]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のパーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜を利用することができる。
【０１０６】
燃料は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の基質である2-ケト-D-グルコン酸の他、酵素等による分解反応により2-ケト-D-グルコン酸に分解されるD-グルコース等の糖類等も燃料として好適に利用することができる。燃料は、好ましくは、適当な溶媒に溶解させた燃料溶液として供給されるが、ゲル等の形態で供給してもよい。溶媒は、水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝液成分としては、例えば、リン酸カリウム等のリン酸塩、イミダゾール、炭酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタン スルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパン スルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。燃料溶液中の糖類の量については、燃料の形態、電極系の種類や容量、発電方式等に応じて適宜変更することができる。
【０１０７】
燃料溶液は、バイオ電池内部にアノード側として配置された本実施形態の糖類酸化酵素電極に供給される。燃料溶液の供給は、燃料溶液を本実施形態の糖類酸化酵素電極に供給できる限り、その形態に制限はない。
【０１０８】
本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群が補因子を要求し、当該酵素が補因子を含まないアポ酵素の形態で固定した場合には、補因子を燃料溶液に含めて供給する他、補因子を別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群の触媒活性の発現のために必要な物質、例えば、Mgイオン等の金属イオン等を、別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。更に、必要に応じて、電子メディエーターを等の酵素の触媒反応と電極反応と共役させるために必要な物質を供給することができる。電子メディエーターの供給形態も特に制限はなく、本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群がその触媒機能の発現し得るように適宜供給される。
【０１０９】
本実施形態の糖類酸化酵素電極によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極材上に固定した糖類酸化酵素電極を提供することができる。本実施形態の糖類酸化酵素電極によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素電極を提供することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素電極は2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。
【実施例】
【０１１０】
以下、実施例により、本願発明を更に詳細に説明する。しかしながら、本願発明は以下の実施例に限定されるものではなく、様々な実施形態が可能であることは明確に理解されるべきである。
【０１１１】
実施例１．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の取得
本実施例では、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討を行った。上記〔先行技術〕の項で説明した非特許文献３に、様々な酵素がD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルピン酸とを結合する活性を有すると報告している。しかしながら、先行技術においては、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルピン酸に分解する酵素の報告例はないことから、かかる反応を触媒できる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討を行った。
【０１１２】
2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討するため、下記の表１及び表２に示すNo.1〜No.7の酵素を候補酵素として選択した。なお、配列には、下線で示した遺伝子挿入サイトとHis tagコード配列が含まれている。
【０１１３】
【表１】
2020018221.tif 000003
【０１１４】
【表２】
2020018221.tif 000004
【０１１５】
各候補酵素をコードする核酸分子にHis tagコード配列を目的とする組換えタンパク質のN末端にHis tagが融合するように融合させ（Genscript社）、発現ベクターpET22b(+)（Novagen社）に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングした。なお、No.5の酵素は、His tagコード配列を目的とする組換えタンパク質のC末端にHis tagが融合するように融合させたと共に、遺伝子挿入サイトがNdeI-HindIIIであった。クローニング後、組換えベクターにより、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.1 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。
【０１１６】
培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。
【０１１７】
水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行い、これを酵素サンプルとし、以下の実施例での実験に用いた。
【０１１８】
実施例２．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性の測定
本実施例では、実施例１で取得した酵素サンプルについて、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性を確認した。
【０１１９】
（方法）
実施例１で取得した酵素サンプルNo.1〜No.7について、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性を確認した。酵素活性の測定は、アルデヒドデヒドロゲナーゼによる色素還元を指標とした評価系を用いた。かかる評価系は、2-ケト-D-グルコン酸が分解されるとヒドロキシピルビン酸とD-グリセルアルデヒドが生成するが、生成したD-グリセルアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより酸化され、続いて、色素が還元されることを利用するものである。色素としてはジクロロインドフェノール（DCIP、和光純薬591-03541）、アルデヒドデヒドロゲナーゼとしてはSphingomonas wittichii由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下「SwALDH」と称する）を用いた。
【０１２０】
なお、SwALDHは、SwALDHをコードする核酸分子（配列番号１０：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを酵素活性測定のためのアルデヒドデヒドロゲナーゼとして用いた。
【０１２１】
酵素反応は、酵素反応溶液（2 mM 2-ケト-D-グルコン酸、10mM MgCl2、1μM SwALDH、50μM DCIPを含む100 mM HEPES pH 7.0）に適量の酵素サンプルNo.1〜No.7を加えて室温で行った。DCIPの還元は、600 nmの吸光度を測定することにより行った。
【０１２２】
（結果）
その結果、No.4の酵素が0.0015 dA/分の吸光度を示した以外、他の酵素に関してはDCIPの還元は認められなかった。したがって、No.4の酵素のみが2-ケト-D-グルコン酸に対して分解活性を有することが判明した。
【０１２３】
実施例３．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析
本実施例では、実施例２にて2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性が確認された酵素サンプルについて、当該酵素反応により生成した酵素反応物の解析を行った。
【０１２４】
（方法）
実施例１で取得し、実施例２にて2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性が確認された酵素サンプルNo.4について、当該酵素反応により生成した酵素反応物の解析を行った。酵素反応物の解析は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて行い、HPLC装置には日立ハイテクノロジーズ社製クロムマスターを用いた。反応生成物であるD-グリセルアルデヒドの検出は、TSKgel SCX（東ソー、0007158）カラムを使用して、移動相0.04 % リン酸水溶液、流速1 ml/分、カラム温度20℃の条件下、RI検出器にて行った。もう一つの反応生成物であるヒドロキシピルビン酸の検出は、TSKgel DEAE-2SW（東ソー、0007168）カラムを使用して、移動相10 mM リン酸ナトリウム水溶液（pH 7.1）、流速1 ml/分、カラム温度30℃の条件下、UV検出器にて行った。D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸の標準品として、シグマアルドリッチ社製のD-(+)-グリセルアルデヒド（49800）及びシグマアルドリッチ社製のβ-ヒドロキシピルビン酸ナトリウム（06367）を使用し、それぞれの溶出時間である8.1分及び9.1分を求めた。
【０１２５】
酵素反応は、酵素反応溶液（2 mM 2-ケト-D-グルコン酸、10mM MgCl2を含む100 mM HEPES pH 7.0）に適量の酵素サンプルNo.4を加えて室温で行い、反応後の酵素反応液10μlをHPLCに注入した。
【０１２６】
（結果）
結果を図２及び図３に示す。図２は、D-グリセルアルデヒドの検出結果を示し、図３はヒドロキシピルビン酸の検出結果を示す。その結果、酵素サンプルNo.4は、2-ケト-D-グルコン酸を分解し、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解することが確認された。
【０１２７】
実施例４．酵素反応による電子抽出量の比較
本実施例では、2種類の糖類からの多段階酵素反応系を構築し、両酵素反応系からの電子抽出量を比較した。
【０１２８】
（方法）
酵素反応による電子抽出を確認するために、フェリシアン化カリウムを電子受容体とした多段階酵素反応を行った。このとき、電子抽出量の比較のために、出発物質として、2-ケト-D-グルコン酸（以下、「2KG」と略する場合がある）、及び、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸（以下、「KDG」と略する場合がある）。酵素としては、No.4の酵素又はNo.5の酵素、実施例２で用いたSwALDH、Escherichia coli由来のD-乳酸脱水素酵素（以下、「EcDLD」と略する場合がある）、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素(以下、「ZmPDC」と略する場合がある）、及び、Bacillus subtilis由来シュウ酸脱炭酸酵素(以下「BsODC」と略する場合がある）を用いた。
【０１２９】
なお、No.4の酵素及びNo.5の酵素は、上記実施例１に記載の通りに調製した酵素サンプルNo.4及びNo.5を用いた。SwALDHは、上記実施例２に記載の通りに調製したものを用いた。
【０１３０】
EcDLDは、以下の通り調製した。EcDLDをコードする核酸分子（配列番号１１：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、20℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。
【０１３１】
ZmPDCは、以下の通り調製した。ZmPDCをコードする核酸分子（配列番号１２：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。
【０１３２】
BsODCは、以下の通り調製した。BsODCをコードする核酸分子（配列番号１３：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mM、MnCl2を終濃度5 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、37℃で4時間培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。
【０１３３】
図４及び図５に、2KG及びKDGのそれぞれが受ける反応経路を示し、図４は2KG、図５はKDGの反応経路である。かかる経路に基づくと、2KGでは一分子当たり16電子、KDGでは一分子当たり12電子が、それぞれ抽出されることになる。
【０１３４】
酵素反応は、酵素反応溶液（100 mMリン酸緩衝液 pH 7.0中、0.5 mM 2-ケト-D-グルコン酸又は2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸、10mM フェリシアン化カリウム（和光純薬：167-03722）、1 mMチアミン2リン酸（以下、「ThDP」と略する場合がある、シグマアルドリッチ：C8754）、5 mM MgCl2（和光純薬：135-00165）を含む）に適量の上記した酵素群を加えて37℃の条件下で行い、経時的にプレートリーダーにて420 nmでの吸光度を測定した。なお、コントロールとして、酵素の代わりにウシ血清アルブミン（BSA）を添加したものについても同様に実験を行った。
【０１３５】
（結果）
結果を、図６及び図７に示し、図６はNO.4の酵素の結果、図７はNo.5の酵素の結果である。図中、縦軸は、反応開始時の吸光度を1.0と定義して算出される変化率である。その結果、No.4の酵素は、KDGも分解できるため（データは図示せず）、図４及び図５の何れもの反応経路が進行する。その結果、KDGに比べて、2KGからの方が、多くの電子を抽出できることが示された。一方、No.5の酵素はKDGを分解できることは知られているが、実施例１で確認した通り2KGは分解できない。その結果、KDGからはNo.4の酵素と同じ量の電子の抽出が認められたが、2KGからはほとんど電子の抽出が認められなかった。これらの結果より、2KGからNo.4の酵素を用いて電子を抽出することが効率的であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、糖類酸化酵素電極に関するものであり、糖類の酸化反応、特には、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築が要求されるあらゆる分野、例えば、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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