(57)【要約】【課題】身体の固有の組織修復機構を誘発する、組織傷害の部位への微量元素（例えば、銅）の局所的送達を提供すること。【解決手段】本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つの事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位への骨髄間葉系幹細胞の移動を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において幹細胞の分化を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において組織再生を誘導することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銅などの微量元素の送達による組織の修復及び再生の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、生きている機能性組織を生成して、加齢、疾患、損傷、又は先天性欠損によって失われた組織又は器官の機能を修復又は交換するプロセスを伴う重要な治療手法である。生物系は、身体の器官に傷害が生じると、確実に救済されるための、組織傷害シグナル伝達系を介して具現化されている自己修復機構を備えている。組織が傷害を受けると、傷害を身体の固有の修復機構に伝達するために傷害部位から直ちに開始される、ケモカイン及びサイトカインシグナル伝達などの様々な種類のシグナルが生じる。この伝達は、血管輸送系などの一連の伝達系により媒介される。いったん、傷害シグナルが修復機構により感知されると、幹細胞、サイトカイン、増殖因子及び／又はケモカインを伴う修復材料が動員され、その後、傷害部位へ誘導される。したがって、手入れの行き届いた血管及び／又はリンパ輸送系は、傷害部位と修復機構との間の伝達を確実にするのみならず、修復材料を傷害部位へ送達するために不可欠な導管としても機能している。組織傷害の程度及び循環系に放出されるホーミング（homing）因子の量は、修復材料の輸送に対する誘導物質（navigator）として作用する。傷害部位までホーミングした後、幹細胞又は前駆細
胞は、「標的」細胞に分化することとなる。修復機構により活性化された複数の制御因子、サイトカイン、増殖因子、及びケモカインは、細胞分化、組織再生及び再生組織の現存組織との統合を促進するための親和的な環境を生成する。したがって、これらの一連のシグナル伝達及び自己修復又は自己再生機構と呼ばれるものは、「組織傷害シグナル伝達系」である。例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，１，７を参照のこと。この系は、十分に接合された網状組織を必要とし、シグナル生成、シグナル伝達、シグナル受信、修復材料動員、傷害特異的（injury-directed）輸送、ホ
ーミング、分化及び再生プロセスのうちいずれかに対する損傷は、傷害器官の自己修復を抑制させると考えられる。例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，１，７を参照すること。一部の器官（肝臓、骨、骨格筋、及び膵臓など）は、傷害を受けたときに強い自己再生能力を示す。しかし、加齢及び慢性的な傷害状態においては、自己修復能力は、組織傷害シグナル伝達系の機能不全によって減少する。
【０００３】
心筋梗塞（ＭＩ）は、不適切な血液供給による心筋の酸素の供給と需要との間の不均衡によってもたらされる、一種の虚血性心疾患（ＩＨＤ）である。ＭＩの主な原因は、責任血管により供給された領域にほとんど潅流をもたらさない、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は冠動脈血栓である。心臓への血流障害が持続すると、閉塞した冠動脈の領域の心臓細胞は死滅し、心機能は障害を受け、その場所にコラーゲン瘢痕を形成する。これらにより、潜在的に生命を脅かす不整脈の危険に患者を曝すことになり、悲惨な結果を伴って破裂する場合がある心室瘤の形成をもたらす場合がある。
【０００４】
心臓の収縮の際に、心ポンプは、好気性代謝により生成される大量のエネルギーを消費して、循環を維持し、心臓組織への十分な血液供給は、心機能を維持するために必須である。例えば、Ｅｓｓｏｐ，２００７，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５８４，７１５〜７２６；Ｄｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９３，Ｈ５２６〜５３３を参照すること。心筋虚血は、心機能不全の主な原因である。心筋に対する局所冠動脈の破損の有害な影響は、閉塞した冠動脈の領域に虚血傷害を開始させるのみならず、人体の固有の組織修復機構により動員される、自己再生のための材料が、虚血域にホーミングする経路を遮断することである。血液供給の回復を促進するための解決策は、心筋の再生において重要である。
【０００５】
虚血状態下では、血液供給の減少に対する初期及び一次分子応答は、低酸素誘導因子の蓄積である。低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、及びＨＩＦ−３）は、低酸素への転写応答において主要な役割を果たす。ＨＩＦは、独自の酸素依存性αサブユニット及び共通の構造的に発現されるβサブユニットを含む、ヘテロ二量体である。ヒト及び哺乳動物には３つのＨＩＦαがある。低酸素シグナル伝達は、酸素恒常性及び細胞生存を維持するのに必要不可欠な役割を果たす。低酸素誘導性転写因子ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２は、酸素欠乏に応答して代謝適応、酸素送達、及び生存を制御する遺伝子発現を調節することによって、低酸素に対する細胞応答の中心的な媒介物質である。
【０００６】
ＨＩＦ−１転写因子は、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１β又はＡＲＮＴ（アリール炭化水素核内移行体）を含む。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ，９２，５５１０〜５５１４を参照すること。ＨＩＦ−１αの蓄積は、ＨＩＦ−１の活性化の律速段階である。それ故に、ＨＩＦ−１αの主な制御は、翻訳後のレベルにおけるものである。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ，９０，４３０４〜４３０８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，９５，７９８７〜７９９２を参照すること。ＨＩＦ−１αの発現レベルは、ＨＩＦ−１αがユビキチンプロテアソーム経路により分解されるので、正常酸素圧状態下で大部分の細胞の種類において検出不能である。このプロセスにおいて、ＨＩＦ−１αの２つの保存プロリン残基（Ｐｒｏ４０２及びＰｒｏ５６４）の一方又は両方は、プロリンヒドロキシル化の反応を触媒するプロリルヒドロキシラーゼドメイン含有タンパク質（ＰＨＤ）のメンバーにより認識される。例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，９５，７９８７〜７９９２；Ｊａａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，４６８〜４７２；Ｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，４６４〜４６８を参照すること。ヒドロキシル化ＨＩＦ−１αは、サイトゾルにおいてプロテアソームによる分解のためのＨＩＦ−１αサブユニットを標的にするユビキチンリガーセ複合体の構成成分である、フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質（ｐＶＨＬ）により認識される。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，３９９，２７１〜２７５；Ｍａｓｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ，２０，５１９７〜５２０６；Ｏｈｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２，４２３〜４２７；Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９，４２９８〜４３０９を参照すること。低酸素状態下では、ＨＩＦ−１αは、分解経路から逃れ、蓄積し、核内に移行し、そこでＨＩＦ−１βと二量体化し、補助因子と相互作用して、ＨＩＦ−１転写複合体を組み立てて、傷害に対する応答に関与する複数の遺伝子の上方制御をもたらす。例えば、Ｓｈｏｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ），８５，１３０９〜１３１５；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ，３，１７７〜１８５を参照すること。これらのうち、ＨＩＦにより制御される遺伝子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、アンジオポイエチン１（ＡＮＧＰＴ１）及び２（ＡＮＧＰＴ２）、並びに血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦＢ）などの脈管形成に関与するものである。例えば、Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，８６，２３６〜２４２を参照すること。急性虚血状態では、ＨＩＦ−１誘導性血管新生が、有意に増強される。ＨＩＦ−１の活性化は、血管新生に重要な役割を果たし、虚血性組織適応を低酸素状態に調和させる。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４２，６２６〜６３３を参照すること。
【０００７】
しかし、慢性虚血状態では、傷害を受けた心筋は、一般に、毛細血管密度の減少及び血管新生の増強ではなく、むしろ抑圧によって特徴づけられる。ＨＩＦ−１αレベルが、慢性虚血性心筋症の患者から試料採取した虚血心筋において一貫して増加していても、急性虚血発作下で、蓄積されたＨＩＦ−１αにより活性化された防御作用は機能しない。しかし、その後のＶＥＧＦなどの遺伝子の発現は、抑圧された。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４２，６２６〜３３；Ｍｏｓｌｅｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２２，１００４〜１０１６を参照すること。
本明細書において参照されている全ての出版物、特許及び特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，１，７
【非特許文献２】Ｅｓｓｏｐ，２００７，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５８４，７１５〜７２６
【非特許文献３】Ｄｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９３，Ｈ５２６〜５３３
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ，９０，４３０４〜４３０８
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，９５，７９８７〜７９９２
【非特許文献６】Ｊａａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，４６８〜４７２
【非特許文献７】Ｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，４６４〜４６８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つの事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位への骨髄間葉系幹細胞の移動を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において幹細胞の分化を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において組織再生を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において損傷を逆転させることを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位における神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境の再構築を含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害シグナルを回復及び／又は増強させることを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害シグナルのシグナル伝達及び／又は受信を含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位への修復材料の動員を回復及び／又は増強させることを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、修復材料の傷害特異的輸送及び／又はホーミングを回復及び／又は増強させることを含む。いくつかの態様において、修復材料は、幹細胞などの細胞、サイトカイン、増殖因子、及び／又はケモカインを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位における幹細胞又は前駆細胞の分化及び組織再生を回復及び／又は増強させることを含む。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、損なわれた組織修復系を有する。
【００１０】
別の態様では、組織傷害を有する個体の組織の傷害部位への幹細胞（間葉系幹細胞、例えば骨髄間葉系幹細胞など）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、損なわれた組織修復系を有する。
【００１１】
別の態様では、組織傷害を有する個体に組織修復を誘導する方法であって、ａ）有効量の微量元素を傷害部位に送達することと、ｂ）有効量の幹細胞（骨髄間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞など）を個体に投与することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、損なわれた組織修復系を有する。
【００１２】
別の態様では、損なわれた組織修復系を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【００１３】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、個体は慢性組織傷害を有する。いくつかの実施形態において、個体は少なくとも６０歳である。いくつかの実施形態において、個体は、骨髄間葉系幹細胞が欠乏している。
【００１４】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【００１５】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡により送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。
【００１６】
上記に記述された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【００１７】
本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法を提供する。別の態様では、組織傷害を有する個体において傷害部位に向けて血管増殖を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【００１８】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、微量元素は、注入により送達され、注入（例えば、カテーテルを介した注入）の際に注入部位に濃縮された状態で留まる。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素を含有する埋込剤（例えば、微量元素で被覆された埋込剤、例えば、ステント、プレース（place）、
及び膜からなる群から選択される埋込剤）によって送達される。
【００１９】
上記に記述された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞誘導因子を個体に投与することを更に含む。
【００２０】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、個体は損なわれた組織修復系を有する。いくつかの実施形態において、損なわれた組織修復系を有する個体は、慢性組織傷害又は急性組織傷害を有する個体である。いくつかの実施形態において、損なわれた組織修復系を有する個体は、少なくとも６０歳の個体である。いくつかの実施形態において、損なわれた組織修復系を有する個体は、幹細胞が欠乏している個体である。
【００２１】
上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。上記に記載された方法のうちいずれかによるいくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【００２２】
本明細書に記載されている方法に有用なキット及び製造品もまた提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つの事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む、方法。
（項目２）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、前記傷害部位への骨髄間葉系幹細胞の移動を誘導することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、前記傷害部位において幹細胞の分化を誘導することを含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、前記傷害部位において組織再生を誘導することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導することを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、前記傷害部位において損傷を逆転させることを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記組織修復の少なくとも１つの事象は、前記傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境の再構築を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
組織傷害を有する個体の組織の傷害部位への幹細胞の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を該傷害部位に送達することを含む、方法。
（項目９）
組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、
ａ）有効量の微量元素を傷害部位に送達することと、
ｂ）有効量の幹細胞を該個体に投与することと、
を含む、方法。
（項目１０）
組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素及び有効量の幹細胞の誘導因子を傷害部位に送達することを含む、方法。
（項目１１）
前記個体は、損なわれた組織修復系を有する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
損なわれた組織修復系を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む、方法。
（項目１３）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、慢性組織傷害を有する個体である、項目１１又は１２に記載の方法。
（項目１４）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、少なくとも６０歳の個体である、項目１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、幹細胞が欠乏している個体である、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記微量元素は銅である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記微量元素は、微小気泡によって送達される、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記微量元素を含む前記微小気泡は、静脈内投与され、前記微量元素は、前記傷害部位における前記微小気泡の部位特異的破裂によって放出される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記微小気泡の前記部位特異的破裂は、超音波によるものである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記微量元素は、前記傷害部位への前記微量元素の直接的な投与によって送達される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記組織は、心臓、肝臓、脳、又は骨格筋である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む、方法。
（項目２４）
組織傷害を有する個体の傷害部位に向けて血管増殖を誘導する方法であって、有効量の微量元素を該傷害部位に直接送達することを含む、方法。
（項目２５）
前記微量元素は、注入により送達され、注入の際に注入部位に濃縮された状態で留まる、項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２６）
前記注入は、カテーテルを介したものである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記微量元素は、該微量元素を含有する埋込剤によって送達される、項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２８）
前記埋込剤は、前記微量元素で被覆されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記埋込剤は、ステント、プレート、及び膜からなる群から選択される、項目２７又は２８に記載の方法。
（項目３０）
前記方法は、有効量の幹細胞を前記個体に投与することを更に含む、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記方法は、有効量の幹細胞の誘導因子を前記個体に投与することを更に含む、項目２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記個体は、損なわれた組織修復系を有する、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、慢性組織傷害又は急性組織傷害を有する個体である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、少なくとも６０歳の個体である、項目３２又は３３に記載の方法。
（項目３５）
損なわれた組織修復系を有する前記個体は、幹細胞が欠乏している個体である、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記微量元素は銅である、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
前記組織は、心臓、肝臓、脳、又は骨格筋である、項目２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ａ〜Ｄは、ニュージーランドウサギモデルにおける慢性心筋梗塞のＣｕ−ＭＢ治療の結果を示す図である。図１Ａは、心筋梗塞域の減少を示す図である。図１Ｂは、心筋梗塞域の減少を示す図である。図１Ｃは、左心室駆出率の改善を示す図である。図１Ｄは、梗塞域における毛細血管密度の増加を示す図である。
【００２４】
【図２】急性心筋梗塞状態下での大部分の梗塞域におけるＢＭＳＣホーミングを示す図である。
【００２５】
【図３】梗塞域におけるＢＭＳＣホーミングを示すが、非梗塞域にはＢＭＳＣホーミングを示さない図である。
【００２６】
【図４】急性心筋梗塞域における強いＢＭＳＣホーミングシグナルを示す図である。
【００２７】
【図５】慢性心筋梗塞状態下ではＢＭＳＣホーミングシグナルが検出されないことを示す図である。
【００２８】
【図６】心筋梗塞を伴わないと、Ｃｕ−ＭＢ治療単独では、ＢＭＳＣホーミングを動員できないことを示す図である。
【００２９】
【図７】慢性心筋梗塞のＣｕ−ＭＢ治療後の、ＢＭＳＣホーミングシグナルの再発生を示す図である。
【００３０】
【図８】慢性心筋梗塞のＣｕ−ＭＢ治療後の、ＢＭＳＣホーミングの再発生を示す図である。
【００３１】
【図９】急性心筋梗塞群、慢性心筋梗塞群、及びＣｕ−ＭＢ治療慢性心筋梗塞群のホーミングシグナルの定量化を示す図である。
【００３２】
【図１０】急性心筋梗塞後１か月以内にＡＭＤ３１００で処理した後の、ＢＭＳＣホーミングシグナルの有意な減少を示す図である。
【００３３】
【図１１】急性心筋梗塞において、ＡＭＤ３１００で処理したＢＭＳＣにはＢＭＳＣホーミングシグナルがないことを示す図である。
【００３４】
【図１２】急性心筋梗塞のホーミングシグナル及び急性心筋梗塞におけるＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣのホーミングシグナルの定量化を示す図である。
【００３５】
【図１３】Ｃｕ−ＭＢ治療慢性心筋梗塞群において、ＢＭＳＣをＡＭＤ３１００で処理した後ではＢＭＳＣホーミングシグナルがないことを示す図である。
【００３６】
【図１４】急性心筋梗塞において、ＢＭＳＣをＡＭＤ３１００で処理した後ではＢＭＳＣホーミングシグナルがないこと及びＣｕ−ＭＢ治療慢性心筋梗塞群において、ＢＭＳＣをＡＭＤ３１００で処理した後ではＢＭＳＣホーミングシグナルがないことを示す図である。
【００３７】
【図１５】慢性心筋梗塞群、Ｃｕ−ＭＢ治療慢性心筋梗塞群、及びＡＭＤ３１００処理Ｃｕ−ＭＢ治療慢性心筋梗塞群のＢＭＳＣホーミングシグナルの定量化を示す図である。
【００３８】
【図１６Ａ】Ｃｕ−ＭＢによる治療後のアカゲザルの左心室駆出率の心エコー法により検出された変化を示す図である
【００３９】
【図１６Ｂ】Ｃｕ−ＭＢによる治療後のアカゲザルの左心室駆出率のＭＲＩにより検出された変化を示す図である。
【００４０】
【図１７】Ｃｕ−ＭＢによる治療後のアカゲザルの左心室収縮終期容積の心エコー法により検出された変化を示す図である。
【００４１】
【図１８Ａ】Ｃｕ−ＭＢ治療後のアカゲザルの侵襲的心臓血行動態測定により検出された最大ｄＰ／ｄｔを示す図であり、最大ｄＰ／ｄｔの増加は、心臓収縮機能の増大を反映している。
【００４２】
【図１８Ｂ】Ｃｕ−ＭＢ治療後のアカゲザルの侵襲的心臓血行動態測定により検出された最小ｄＰ／ｄｔを示す図であり、最小ｄＰ／ｄｔの絶対値の増加は、心臓拡張機能の増強を反映している。
【００４３】
【図１９】Ｃｕ−ＭＢ治療後のアカゲザルの侵襲的心血行動態測定により検出された左心室圧（ＬＶＤＰ）を示す図であり、ＬＶＤＰの増加は、心臓収縮機能の増大を反映している。
【００４４】
【図２０】Ｃｕ−ＭＢによる治療後のアカゲザルの梗塞サイズにおける、ＭＲＩにより検出された変化を示す図である。
【００４５】
【図２１】梗塞域の境界におけるＣＤ３１標識毛細血管密度を示す図である。
【００４６】
【図２２】アカゲザルの梗塞域におけるＣＤ３１標識毛細血管密度を示す図である。
【００４７】
【図２３】銅アルブミン超音波造影微小気泡標的化療法（ultrasound  contrast  microbubble  targeted  therapy）によりアカゲザルが治療された後の梗塞域における増殖性細胞のＫｉ６７標識化を示す図である。
【００４８】
【図２４】梗塞域におけるＨＩＦ−１αタンパク質レベルの増加を示し、免疫組織化学的染色は、心筋細胞の細胞質及び核、並びに内皮細胞の細胞質にＨＩＦ−１α発現を示している図である。
【００４９】
【図２５】様々な群の様々な心臓域にＨＩＦ−１αタンパク質の発現を示すウエスタンブロットを示す図である。
【００５０】
【図２６】様々な群の梗塞域にＨＩＦ−１αタンパク質の発現を示すウエスタンブロットを示す図である。
【００５１】
【図２７】様々な群の様々な心臓域における心臓ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５２】
【図２８】様々な群の梗塞域における心臓ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５３】
【図２９】様々な群の様々な心臓域における心臓ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５４】
【図３０】様々な群の梗塞域における心臓ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５５】
【図３１】様々な群の様々な心臓域における心臓ＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５６】
【図３２】様々な群の梗塞域における心臓ＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの変化を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【００５７】
【図３３】様々な治療群における離れた非梗塞域及び梗塞域における銅含有量を示す図である。
【００５８】
【図３４】ＨＩＦ−１活性の低下を誘導する銅喪失の機構を示す図である。
【００５９】
【図３５】銅ナノ材料の治療の１４日後の脳虚血ラットにおける神経機能スコアの定量分析を示す図である。
【００６０】
【図３６】脳梗塞のサイズの変化（図３６Ａ）及び様々な群における脳梗塞のサイズの比較（図３６Ｂ）を示すＴＴＣ染色を示す図である。
【００６１】
【図３７】全脳及び脳萎縮の巨視的観察（図３７Ａ）及び治療の１４日後の様々な群の脳梗塞ラットにおける脳萎縮の比較（図３７Ｂ）を示す図である。
【００６２】
【図３８】脳の正常域、梗塞中心及び梗塞域の境界におけるヘマトキシリン及びエオジン染色を示す図である。
【００６３】
【図３９】血管新生検出域を示し、四角形は虚血の境界域を示す図である。
【００６４】
【図４０】虚血の境界域におけるＣＤ３１標識細胞を示す免疫組織化学分析を示す図である。
【００６５】
【図４１】未治療群と比較して銅化合物治療群における治療の７日後の神経機能の改善を示す、アカゲザルの脳梗塞の神経機能傷害スコアの定量分析を示す図である。
【００６６】
【図４２】１％のＦＢＳを有するＥＢＭ−２に培養した単離ラット冠動脈リングの血管新生に対する、様々な濃度の硫化銅の効果を示す図である。
【００６７】
【図４３】血管新生の銅による促進に対する銅キレート剤ＴＥＰＡの効果を示す図である。
【００６８】
【図４４】単離ラット冠動脈リングにおけるＶＥＧＦタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す図である。図４４Ａは、ＶＥＧＦタンパク質レベルに対する様々な濃度の銅の効果を示す図である。図４４Ｂは、ＶＥＧＦタンパク質レベルに対するＴＥＰＡの効果を示す図である。
【００６９】
【図４５】血管新生の銅による促進に対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果を示す図である。
【００７０】
【図４６】単離ラット冠動脈リングにおけるＶＥＧＦタンパク質レベルに対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果を示す図である。
【００７１】
【図４７】銅微小気泡の注入後の血中銅濃度における有意な増加を示す図である。
【００７２】
【図４８】超音波を用いずに銅微小気泡により治療した群と比較した、超音波媒介銅微小気泡治療群における、心臓銅濃度の血中銅濃度に対する比の有意な増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
ＨＩＦ−１転写活性は、微量元素の銅の関与を必要とすることが以前に示された。例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，０４，６５７〜６６６；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７５，１７４〜１８２；Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１２，Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，３４２，５６１〜５６７を参照すること。細胞からの銅の喪失は、標的遺伝子のＨＲＥ配列へのかつＨＩＦ−１転写複合体の構成要素であるＰ３００へのＨＩＦ−１α結合を低減させ、ＨＩＦ−１により制御されるＶＥＧＦ及び他の遺伝子の発現を抑制したが、ＨＩＦ−１αの産生及び安定化は影響を受けなかった。重要なことに、銅濃度は、慢性心疾患により死亡した人々の心臓では低かった。心筋から離れる銅の動員は、蔓延性虚血によって誘発されることが知られていた。例えば、Ｃｈｅｖｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９０，１１０２〜１１０６を参照すること。銅の喪失は、心機能不全の程度と深く相関していた。
【００７４】
したがって、心筋の銅の劇的な流出は、蔓延性心筋虚血と共に、蓄積ＨＩＦ−１α転写活性の低下の主な原因であると考えられる。したがって、ＨＩＦ−１タンパク質レベルが上昇する条件下であっても、ＨＩＦ−１制御遺伝子の上方制御は、心臓の銅の喪失によって生じなかった。したがって傷害部位への銅の効果的な送達により、ＨＩＦ−１転写活性が回復し、虚血性心筋梗塞を実際に逆転させることが予測される。銅などの微量元素は、ＨＩＦ−１転写活性を活性化するために組織の傷害部位に送達されると、組織修復及び自己再生の誘導に特に効果的であると考えられる。
【００７５】
したがって、本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つの事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法を提供する。これは、組織傷害部位への銅などの微量元素の送達が、組織修復をもたらす一連の事象から構成される身体の固有の組織修復機構を誘発するという、本発明者たちの洞察に基づいている。微小気泡を介する傷害部位への銅の局所送達は、個体の組織が骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）を自発的に動員する固有の能力を別の状況によって失った後であっても、傷害部位へのＢＭＳＣの移動（すなわち、ホーミング）を誘導すると考えられる。傷害部位への銅の局所送達はまた、例えば、傷害部位において幹細胞の分化を誘導すること、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導すること、傷害部位において組織再生を誘導すること、傷害部位において損傷を逆転させること、並びに傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築することを含む、組織修復をもたらす他の一連の事象も誘発すると考えられる。銅及び他の微量元素は、組織修復において中心的な役割を有し、本開示は、組織損傷を伴う疾患の効果的な治療のための新たな治療機会をもたらすと考えられる。
【００７６】
別の態様において、本発明は、組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法を提供する。これは、銅などの微量元素が、組織の傷害部位に直接送達されると、組織修復を誘導するのに特に効果的であるという、本発明者たちの洞察に基づいている。例えば、傷害部位に存在する微量元素が、血管の増殖を傷害部位に向かって誘引し、それ故に、傷害部位における微小血管の環境の再生、ひいては組織の再生を促進できると考えられる。組織修復及び血管形成に対する銅（又は他の微量元素）の効果は、局所傷害部位における銅（又は他の微量元素）の特定の濃度に応じて左右されることが更に考えられる。傷害部位への銅（又は他の微量元素）の直接的な送達により、局所傷害部位における所望の銅濃度のより良好な制御を行うことができ、それ故に、より正確な介入及び治療が可能となる。
【００７７】
したがって、本出願は、いくつかの実施形態において、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つの事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織内の傷害部位への幹細胞（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば骨髄間葉細胞（ＢＭＳＣ）など）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体に組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素及び有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）又は幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）の誘導因子を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、損なわれた組織修復系を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位に向けて血管増殖を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【００８３】
本明細書に記載されている方法に有用なキット及び製造品もまた提供される。
【００８４】
本明細書に記載されている本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「からなる」こと及び／又は「から実質的になる」ことを含むことが理解される。
【００８５】
「約」に関して、本明細書の値又はパラメーターは、その値又はパラメーター自体を対象にする変動を含む（含みかつ記載している）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００８６】
本明細書に使用される用語「約Ｘ〜Ｙ」は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００８７】
明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に明白に示される場合を除いて、複数の対象を含む。
【００８８】
当業者には明らかなように、評価される、選択される、及び／又は治療を受ける個体は、そのような活動を必要とする個体である。
【００８９】
組織修復の１つ以上の事象を誘導する方法
本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６つ又はそれ以上のうちいずれかを含む）の事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【００９０】
本明細書に記載されている「個体」は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル及び他の非ヒト霊長類、並びにヒトなどの哺乳動物、サカナなどの脊椎動物、ニワトリなどの鳥類を指す。哺乳動物には、家畜、競技用の動物、齧歯類、及び愛玩動物を挙げることができる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【００９１】
いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、複能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、又は様々な組織由来幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない幹細胞の、傷害部位への移動を誘導することを含む。いくつかの態様において、組織由来幹細胞は、脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞、又は臍帯組織由来幹細胞である。他の実施形態において、本明細書に開示されている幹細胞は、成人の幹細胞である。特定の態様において、成人の幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、胎盤の間葉系幹細胞、脂肪組織、肺、骨髄、血液、臍帯のウォートンジェリー（Wharton's  jelly  of  the  umbilical  cord）、又は歯（歯髄及び歯周靭帯の血管周囲ニッチなど）、内皮幹細胞、神経幹細胞、成人嗅幹細胞、神経堤幹細胞、又は生殖系幹細胞（例えば、精巣の幹細胞）である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において幹細胞の分化を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において組織再生を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位において損傷を逆転させることを含む。いくつかの実施形態において、組織修復の少なくとも１つの事象は、傷害部位における神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境の再構築を含む。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【００９３】
本明細書に記載されている組織傷害を有する個体には、心筋傷害、脳傷害、脊髄傷害、筋肉傷害、骨格傷害、急性尿細管壊死、膀胱傷害、肺傷害、肝障害、腎臓傷害、骨傷害、皮膚傷害、ヘルニア修復、血管吻合、アテローム性動脈硬化巣、血管腫及び鈍的又は穿通性外傷性傷害のうち１つ以上を有する個体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織の傷害部位への幹細胞の移動（すなわち、ホーミング）を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、複能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、又は組織由来幹細胞である。いくつかの態様において、組織由来幹細胞は、脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞、又は臍帯組織由来幹細胞である。他の実施形態において、幹細胞は、成人の幹細胞である。特定の態様において、成人の幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、胎盤の間葉系幹細胞、脂肪組織、肺、骨髄、血液、臍帯のウォートンジェリー、又は歯（歯髄及び歯周靭帯の血管周囲ニッチなど）、内皮幹細胞、神経幹細胞、成人嗅幹細胞、神経堤幹細胞、又は生殖系幹細胞（例えば、精巣の幹細胞）である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、組織傷害を有する個体の器官又は組織区画から別の器官又は組織区画の傷害部位にインビボで移動する。例えば、ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＵＣＢ）、臍帯間質（ウォートンジェリー）、胎盤、及び脂肪組織（ＡＴ）から移動することができる。他の実施形態では、ＭＳＣを器官又は組織区画から単離すること、豊富化すること及び／又はインビトロで処理することができ、その後、組織又は器官の傷害部位への移動のためにインビボで使用することができる。
【００９７】
他の実施形態において、本明細書において使用される細胞移動アッセイには、インビボにおけるバイオマーカー、バイオルミネッセンス、蛍光発光、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）／ＣＴ、及び磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）が挙げられる。インビボのアッセイを、他の方法により、例えば、組織切片におけるＩＨＣによって検証及び確証することができる。
【００９８】
幹細胞移動をアッセイするインビボの非侵襲的画像化技術には、Ｘ線、ラマン分光法、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、又は超音波（ＵＳ）様式を使用して可視化することができるＭＳＣに装填された金デキストラン被覆粒子の画像化が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体適合性ナノ粒子構造物、トレーサー、又は超常磁性粒子が、ＭＳＣなどの幹細胞に装填され、Ｘ線、ＣＴ、ＵＳ、ＰＥＴ、又はＭＲＩにより細胞を可視化できる特性を有する。いくつかの実施形態では、幹細胞の移動は、腸管穿孔モデル（cecal  ligation  and  puncture）（ＣＬＰ）などの技術を使用してアッセイすることができる。例えば、ＧＦＰキメラマウスにＣＬＰを実施することによって、腹部敗血症の設定におけるＢＭＳＣの挙動を観察することが可能になる。ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー及び免疫組織化学を使用して、末梢血、肺、肝臓、皮膚創傷、及び傷害の原発部位へのＢＭＳＣの移動を追跡することができる。ＢＭＳＣの挙動を、傷害の時点、並びにサイトカイン及びケモカインの局所レベル（ＲＴ−ＰＣＲの使用）及び全身レベルと相関させることができる。幹細胞の移動の追跡により、組織傷害後の局所及び遠方の器官及び組織の修復及び再生におけるＢＭＳＣの寄与を解明することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、幹細胞の移動は、個体に投与された標識細胞を使用してモニターすることができる。同位体標識化及び染色などの手法を使用して、幹細胞を標識する。いくつかの実施形態において、標識化手法には、Ｙ染色体がトラッカー（tracker
）となり得るように、雄動物の幹細胞を雌に注入すること、Ａ種の特定の遺伝子が細胞トラッカーとなり得るように、Ａ種の幹細胞をＢ種に注入すること、幹細胞を、色素により又はトラッカーへの特定の酵素反応により追跡することができるように、幹細胞をｐＫＨ２６、ＢｒｄＵ又は他の色素により標識することが挙げられる。
【０１００】
インビボにおける最も一般的な追跡手法は、同位体標識化である。細胞を標識する同位体により幹細胞を追跡することができる。しかし、安全性の問題及び放射能半減期を考慮する必要があることに留意することは価値がある。幹細胞の他のインビボ追跡手法には、ＤＩＤなどの細胞色素による細胞染色、二光子励起蛍光顕微鏡検査法による身体表面細胞のライブイメージング（live  imaging）、二光子励起蛍光顕微鏡検査法によるトランス
ジェニック動物の特定の身体表面細胞のライブイメージング、ＳＰＩＯによる細胞の標識化及びＭＲＩによるトラッカーの追跡などが挙げられる。幹細胞を複数の蛍光色素で標識した後、幹細胞を動物に注入することができる。検査点に達すると、標的器官を凍結し、薄切りにして、共焦点レーザー走査顕微鏡検査法により直接観察することができる。この追跡手法は、それほど多くの標識細胞を必要としないので（１０６細胞／ウサギ）、自己細胞を、天然状態の器官及び細胞においてトラッカーとして使用することができる。
【０１０１】
幹細胞の標識化は、例えば、ｐＫＨ２６のような単独のトラッカーにより達成することができる。ｐｋＨ２６は、脂溶性色素であり、それによる標識化によって、細胞膜に浸透しないので、生きている細胞の追跡に適している。本明細書に記述されている追跡プロセスは、２つ又は３つの色素による多重標識化である。一つの選択される標識化手法は、核トラッカー（ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ）及び膜トラッカーによるものである。核トラッカーは、細胞の核を確認し、同時に膜トラッカーｐＫＨ２６に反響する。別の手法は、２つの膜トラッカー、例えば、Ｄｉｏ（３）及びｐＫＨ２６による多重標識化である。これらのトラッカーは、類似した機構によって細胞を標識するが、異なる励起及び発光波長を有する。したがって、ホーミングシグナルは、２つの異なる蛍光シグナルを含み、これらの２つは、ＢＭＳＣが同時にホーミングすることを証明している。この追跡方法では、異なる波長の重複シグナル（赤色及び緑色シグナルなど）のみが、ホーミングシグナルとみなされる。
【０１０２】
多くの種類の動物組織は、自己蛍光性であり、天然の組織における最も一般的な自己蛍光は、緑色蛍光である。心臓は、蛍光性が比較的少ないが、観察を干渉するのに十分な蛍光性である。切片の切り口は、常に最も強い蛍光性である。妨害に対処するために、緑色及び赤色の重複シグナルのみが追跡シグナルとして認識されると考えられる。赤色蛍光は、その特異性のためＩＯＤ値による統計分析により適している（赤色蛍光シグナルにおける明らかに不正確性を除く）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、傷害部位において幹細胞の分化を誘導し、かつ／又は組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。特定の態様において、幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、腸細胞、骨細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、筋細胞（骨格筋及び平滑筋）、並びに心筋細胞が挙げられる間葉細胞型に分化することができる。他の態様において、幹細胞は、ベータ細胞、肝細胞、及びニューロンが挙げられる非中胚葉由来の細胞に分化することができる。
【０１０４】
当該技術に既知のアッセイを使用して、幹細胞分化のプロセスを解明すること及び分化した幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）の表現型を解明することができ、骨芽細胞にはアルカリホスファターゼ及びアリザリンレッドＳ染色、脂肪細胞にはオイルレッドＯ染色、並びに軟骨形成にはアルシアンブルー染色が挙げられる。ＭＳＣなどの幹細胞の様々な細胞型への分化もまた、遺伝子発現プロファイリングによりアッセイすることができる。例えば、転写プロファイリングは、骨形成分化（ＦＨＬ２、ＩＴＧＡ５、Ｆｇｆ１８）、軟骨形成（ＦＯＸＯ１Ａ）、及び腱形成（tenogenesis）（Ｓｍａｄ８）に関与する特
定の遺伝子を特定している。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、大規模拡大により大きな細胞数を生じることができる。いくつかの実施形態では、個体の傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、本方法は、傷害部位において細胞繁殖を誘導する。いくつかの実施形態において、本方法は、傷害部位において血管新生を誘導する。いくつかの実施形態において、本方法は、傷害部位において血管の成熟を誘導する。いくつかの実施形態において、本方法は、上記に記載された効果のうち２つ以上をもたらす。
【０１０５】
本明細書に開示されている組織再生を、例えば、組織の一部が損傷を受けているか又は除去されている生物体においてアッセイすることができる。次に、微量元素が、本明細書に記載されている幹細胞を伴って又は伴わないで生物体に投与され、組織再生率が決定される。組織再生率を、生物体が対照の投与を受けるとき又は治療されないときに観察される組織再生率と比較することができる。組織再生アッセイの際に決定することができる他のパラメーターには、疼痛又は疼痛マーカーなどの症状又は転帰、炎症の徴候又は症状、再生の最終程度及び再生の質が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本明細書の組織再生アッセイは、１つ以上の心臓機能マーカー、１つ以上の腎機能マーカー、及び１つ以上の肝機能マーカーなどの１つ以上の器官機能パラメーターの評価を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、心臓再生及び修復の分析における以下のパラメーターのうち１つ以上を使用して、本明細書に記載されている方法を評価することができる。（１）再構成された組織の量又は心筋質量及び冠血管系の量、（２）回復した筋細胞及び血管の数及びサイズ、（３）新たに形成された筋細胞及び血管の周囲心筋への統合、並びに（４）再生された心筋構造の発生源。１つの態様では、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を実施して、瘢痕域、左室機能全体、局所機能（壁運動及び肥厚）、並びに局所心室潅流について調査することができる。別の態様では、ＭＲＩを使用して、血管機能を改善する新たな血管、組織又は細胞の存在を検出及び／又は確認する。更に別の態様では、組織病理学を実施して、瘢痕域を決定することができ、ｃ−キット陽性心臓幹細胞の特定及び定量化を決定することができる。組織病理学はまた、新たな血管及び心筋細胞の分布、サイズ及び密度についてのデータを提供する。組織病理学は、組織及び細胞レベルでの修復プロセスの考証を可能にする。例えば、試験を実施して、梗塞切片内の微小血管密度（ｖＷＦ陽性血管／ｍｍ２）、ＢｒｄＵ陽性細胞及びｃ−キット陽性細胞を評価する。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）を使用した微小血管密度の定量化は、梗塞区域に作り出された新たな血管の量の決定を可能にする。ＢｒｄＵ陽性細胞は、心臓細胞を含む細胞の繁殖を表す。ｃ−キット陽性細胞試験は、選択された梗塞切片内の幹細胞の量を示す。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織における組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１０８】
本明細書に記載されている適切なシグナル伝達分子には、ＨＩＦ−１、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１αとも呼ばれる）、ＭＭＰ、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ１０６、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−セレクチン、インテグリン−ベータ１及びＣＤ４９ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ（インテグリンａ１、２、３、４、６）などのインテグリン、並びにＶＣＡＭ及びＩＣＡＭなどのインテグリンリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸は、幹細胞ホーミングの最も重要な機構の１つである。ＳＤＦ−１（間質細胞由来因子１又はＣＸＣＬ１２）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属し、一種の小分子分泌タンパク質である。ＳＤＦ−１の発現は、ＨＩＦ−１（低酸素誘導因子−１）により制御される。ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１β／ＡＲＮＴ（アリール炭化水素核内移行体、ＡＲＮＴ）から構成される。ＨＩＦ−１βは、細胞質において安定しているので、ＨＩＦ−１αの発現及び蓄積は、ＨＩＦ−１の活性に対して既定である。酸素正常状態下では、ＨＩＦ−１αタンパク質は、ユビキチンプロテアソーム系により迅速に合成及び分解される。プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）は、ＨＩＦ−１αをヒドロキシル化し、ヒドロキシル化されたＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１αタンパク質分解を標的にするユビキチンタンパク質リガーゼを構成する、フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制タンパク質（ｐＶＨＬ）により認識される。傷害を受けると、害を被った領域は低酸素になり、これによりＰＨＤの活性が阻害され、ＨＩＦ−１αの蓄積及び核への移行を可能にし、そこでＨＩＦ−１βとの二量体化によりＨＩＦ−１を形成し、他の因子と組み合わされて、標的遺伝子転写を開始する。傷害を受けた組織は、高レベルのＳＤＦ−１を発現し、それを循環系に放出し、傷害領域から循環系の遠端までの濃度勾配を構築する。このようにして、勾配は、ＢＭＳＣが挙げられるＣＸＣＲ４発現幹細胞を、傷害組織に誘引する。
【０１１０】
心臓が慢性低酸素症であるとき、冠動脈の血液は、心筋の需要を満たすことができない。そのため、慢性虚血は、心筋線維症を誘導し、微小動脈を減少させ、血液循環に害を及ぼし、最終的に虚血性心梗塞となる。慢性虚血下では、ＨＩＦ−１の活性は制限され、ＨＩＦ−１により制御される血管新生因子の発現の阻害がもたらされる。それ故に、血液供給が回復せず、梗塞が発症すると考えられる。
【０１１１】
通常、傷害を受けた組織におけるＨＩＦ−１の活性は一時的に制限される。動物実験及び臨床試験は両方とも、心虚血下では、傷害組織におけるＨＩＦ−１αが、傷害の直後に蓄積するが、その後、徐々に減少することを証明している。ＨＩＦ−１の活性は、含有量よりも更に早く低下し、一過性の増加の後にＶＥＧＦ及びＳＤＦ−１のようなＨＩＦ−１制御因子の発現の低下をもたらす。ＨＩＦ−１の制御に起因して、ＳＤＦ−１の発現は、心梗塞後１及び２日目にピークとなる。次に、徐々に減少し、約１か月でベースラインに低減する。ＳＤＦ−１が幹細胞ホーミング動員剤（mobilizer）の１つであるので、ＳＤ
Ｆ−１の減少は、幹細胞ホーミングの後退、更には消滅をもたらす。
【０１１２】
重要なことに、急性虚血状態下で活性化されるＨＩＦ−１αにより誘導される防御作用は、蔓延性虚血状態と異なって作用する。長期の虚血状態下では、ＨＩＦタンパク質レベルは虚血心筋において増加するが、ＨＩＦ（ＶＥＧＦなど）により制御される遺伝子は抑制される。これにより、脈管再建が減少し、再生に障害をもたらす。銅の欠乏は、標的遺伝子のＨＲＥ配列及びＨＩＦ−１転写複合体の構成要素であるＰ３００へのＨＩＦ−１αの結合を低減させる。更に、銅は、蔓延性虚血の直後に心筋から血液へ実質的に動員される。冠血流におけるこの銅の動員は、短時間ではなく蔓延性の心虚血の後に感度良く流動する。心筋銅の損失は、心機能喪失の程度と相関する。したがって、ＨＩＦタンパク質レベルが上昇する状態でも、ＨＩＦ制御遺伝子の上方制御は、心筋銅の喪失によって生じない。銅などの微量元素は、ＨＩＦ−１αの合成、安定化、サイトゾルから核への移行、標的遺伝子のＨＲＥ配列への結合、及びＨＩＦ−１転写複合体の形成が挙げられる、ＨＩＦ−１の活性化をもたらすことができる。本明細書に記載されている方法は、ＨＩＦ−１αなどの１つ以上のシグナル伝達分子の誘導に有用である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、個体において組織の傷害部位の損傷を逆転させる方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１１４】
組織損傷の逆転は、任意の適切な方法により、例えば、正常組織の恒常性及び／若しくは持続的な組織損傷の細胞マーカーを検出すること（例えば、免疫組織化学により若しくはＤＮＡ及び転写レベルを測定することにより）、損傷域若しくは損傷量を測定すること、又は任意の臨床的に適切な指標を評価することによってアッセイすることができる。例えば、梗塞組織の心臓組織損傷の逆転は、筋細胞、線維芽細胞の数などの細胞数若しくは瘢痕の量の定量化により、又はＬＶＥＤＰ、ＬＶＤＰ、最大ｄｐ／ｄｔ、最小ｄｐ／ｄｔ、ＬＶ重量、心腔容積、及び拡張期壁応力が挙げられる心臓機能の拍出量若しくは構造的局面によって測定することができる。一般に、本明細書に開示されている方法は、そのような臨床評価のいずれか又はその任意の組み合わせに有意な（例えば、少なくとも２倍の）変化をもたらす場合に、損傷を受けた組織の損傷を逆転させると言われる。いくつかの実施形態において、本方法は、組織の傷害部位において線維症を逆転させる。線維症は、損傷を受けた組織に創傷治癒過程の一部として生じ得る線維組織の異常な蓄積である。そのような組織損傷は、物理的な傷害、炎症、感染、毒素への曝露、及び他の原因によってもたらされる場合がある。例えば、肝臓（肝）線維症は、慢性肝障害への創傷治癒応答の一部として生じる。線維症は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール依存症、住血吸虫病、ウイルス性肝炎、胆管閉塞症、毒素への曝露、及び代謝障害の合併症として生じる。この瘢痕組織の形成は、身体が傷害組織を被包する試みの表れと考えられる。肝臓線維症は、正常な肝臓と定性的に区別され得る細胞外マトリックスの蓄積によって特徴づけられる。未検査のまま放置されると、肝線維症は、（被包化小結節の存在により定義される）硬変症、肝不全、及び死亡に進行する。Ｌｉ及びＦｒｉｅｄｍａｎ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１４：６１８〜６３３，１９９９）により要約されているように、肝臓線維症の実際の提案された治療戦略には、根本原因（例えば、毒素若しくは感染性病原体）の除去、（例えば、コルチコステロイド、ＩＬ−１受容体アンタゴニス若しくは他の作用物質の使用による）炎症の抑制、例えば、ガンマインターフェロン若しくは抗酸化剤の使用による）星細胞活性化の下方制御、マトリックス分解の促進、又は星細胞のアポトーシスの促進が挙げられる。
【０１１５】
線維性組織は、高血圧症、高血圧性心疾患、アテローム性動脈硬化症、及び心筋梗塞の結果として、心臓及び血管に蓄積する。高血圧又は高血圧症は、様々な因子によってもたらされる可能性があり、多くの場合、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）をもたらし、心停止及び心筋梗塞に進行する。同様に、アテローム性動脈硬化症及び他の虚血性心疾患もまた、多くの場合に心停止をもたらす。これらの心血管疾患は、全て細胞外マトリックスの蓄積又は線維性堆積物を示し、これは血管系の硬化及び心臓組織自体の硬化をもたらす。この線維性材料の堆積は、高血圧性及び／又は硬化性の状態によって誘導される損傷に応答しているが、この応答の影響はまた、血管及び心臓の硬化、並びに心室の拡大という悪影響ももたらす。場合によっては、心血管疾患における心臓線維症の増加は、心臓の組織足場を介して心筋細胞に伝達されたシグナルを破損又は変更し、更に、効率的な心機能の破損をもたらし、心停止及び心筋梗塞を促進する。
【０１１６】
本開示によると、組織損傷の際に異なって制御される遺伝子の発現プロファイルを使用して、本明細書に開示されている治療方法における組織損傷の逆転を評価することができる。例えば、マイクロアレイに基づいた、遺伝子発現の分析は、線維症の特徴である細胞外コラーゲンの蓄積及び拡散に変化をもたらす選択された刺激に付されるヒト細胞（線維芽細胞及び心筋細胞など）の分析に基づくことができる。刺激は、組織特異的線維症プロセスにおける刺激を模倣するように選択することができる。次に、線維症（例えば、肝臓線維症、肺線維症、心臓組織線維症、糖尿病性腎障害及び腎臓線維症）に関連する遺伝子発現ファイルを使用して、線維症及び組織への線維性損傷の逆転をアッセイすることができる。他の実施形態では、線維症の逆転（例えば、線維症を少なくとも部分的に逆転させることが知られている治療による）に関連する遺伝子発現ファイルを使用して、線維症及び組織への線維性損傷の逆転をアッセイすることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織の傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１１８】
微小環境は、構造性と炎症性の両方の細胞、サイトカイン、タンパク質及び増殖因子による入り組んだ網状組織である。心臓線維性疾患又は状態の場合では、心臓は、心筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞、並びに常在性心筋細胞前駆体及びサイトカイン分泌細胞などの常在性構造細胞を含む。これらの細胞は、線維症の病理発生の際に線維化因子と相互作用する。特定の態様において、線維芽細胞及び筋線維芽細胞は、非可逆的な瘢痕をもたらす過剰量のコラーゲン及びマトリックス材料を分泌するので、線維性環境の作成に重要な役割を果たす。細胞間接着分子及び細胞外マトリックスリガンドは、線維性微小環境における重要な因子であり、線維症及び線維芽細胞分化を促進する。いくつかの実施形態では、接着媒介シグナル伝達が組織微小環境においてアッセイされる。例えば、細胞分化及び移動は、周囲マトリックスの硬化などの微小環境からの機械的な合図に応答して生じる。１つの態様では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の組織又は培養マトリックスの弾性をアッセイし、調節して、傷害組織への幹細胞のホーミング、傷害部位における幹細胞の分化、組織修復、及び／又は組織損傷の逆転を促進させる。１つの実施形態において、軟質マトリックスは、ニューロン様細胞へのＭＳＣの分化をもたらし、一方、硬質マトリックスは、筋原性へのＭＳＣの分化をもたらす。１つの態様では、傷害部位の細胞外マトリックス及びその構成要素をアッセイして、微小環境が幹細胞の部位への移動、傷害部位における幹細胞の分化、組織修復及び／又は組織損傷の逆転を促進するかどうかを示す。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、天然環境の文脈における細胞の変化を測定して、本明細書に開示されている治療方法の有効性及び／又は毒性を示す。いくつかの態様では、供与体組織又は器官（骨髄など）及び傷害部位の幹細胞微小環境をアッセイするか、かつ／又は調節して、幹細胞の部位への移動、傷害部位における幹細胞の分化、組織修復、及び／又は組織損傷の逆転を促進させる。局所組織微小環境を、タンパク質染色（ＩＨＣ及びＩＦ）、並びに色素産生及び蛍光ＩＳＨの両方によるＲＮＡ染色によりアッセイすることができる。例えば、低酸素微小環境は、低酸素マーカー染色、内皮細胞マーカー染色、微小血管密度分析、及び近接分析によって示すことができる。組織微小環境は、Ｂｅｎｂｒｏｏｋ，２００６，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ，３（２）：１４３〜１４８に開示されているように、器官培養又は器官型培養を使用して研究することもできる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６つ又はそれ以上のうちいずれかを含む）の事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、組織修復の少なくとも２つの事象が、傷害部位への骨髄間葉系幹細胞などの幹細胞の移動を誘導すること、傷害部位において幹細胞の分化を誘導すること、傷害部位において組織再生を誘導すること、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導すること、傷害部位において損傷を逆転させること、並びに傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築することからなる群から選択される方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＸＣなど）の移動を誘導し、かつ傷害部位において幹細胞の分化を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＸＣなど）の移動を誘導し、かつ傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＸＣなど）の移動を誘導し、傷害部位において幹細胞の分化を誘導し、かつ傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１２２】
直接的な送達による組織修復及び血管増殖を誘導する方法
本出願は、１つの態様において、組織傷害を有する個体において組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体において、注入部位にＶＥＧＦの発現を増加させることなく組織修復を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位に向けて血管増殖を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位に向けて、注入部位にＶＥＧＦの発現を増加させることなく血管増殖を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１２６】
組織内の血管の形成及び増殖は、血管新生及び／又は脈管形成により生じる場合がある。１つの態様において、血管は、血液の輸送を支持するために完全に機能的な毛細血管様構造を含む。いくつかの実施形態において、血管新生には、既に存在している血管からの新たな血管の増殖を伴うプロセスが挙げられ、既存のものから出芽することにより新たな血管を形成する出芽血管新生又は既存のものを分割すること（splitting  off）により新たな血管を形成する分割血管新生（挿入成長）である。いくつかの実施形態において、脈管形成には、既に存在するものがない場合の新たな血管の形成などの、内皮幹細胞の増殖による新たな血管の新しい生成を伴うプロセスが挙げられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、血管の形成及び増殖は、アンジオポイエチン（Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２など）、エフリン（Ｅｐｈ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃなど）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２など）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（ＣＣＬ−２としても知られている）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、及びＴＧＦ−β４など）、エンドスタチン、バソヒビン、ケモカイン、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１など）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２及びＭＰＰ−９など）、インテグリン、カドヘリン、プラスミノーゲン活性化因子、並びにプラスミノーゲン活性化因子阻害剤などの、プロセスを直接制御する増殖因子及び他のタンパク質からのシグナルを必要とする。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、血管増殖は、無傷の動物における毛細血管の発生のために必要とされる内皮細胞繁殖を測定することによって、アッセイされる。いくつかの実施形態において、内皮繁殖の傷害部位への微量元素の直接的な送達の作用を、直接的な細胞計数、ＤＮＡ合成、及び／又は代謝活性によってアッセイすることができる。例えば、内皮細胞を傷害部位から単離し、微量元素で処理した後の繁殖率をアッセイすることができる。他の実施形態において、傷害部位における内皮細胞の繁殖は、細胞を標識し、細胞数、ＤＮＡ合成及び／又は代謝活性を測定することによって、その場でモニターすることができる。他の実施形態において、標識された内皮細胞を対象に投与し、傷害部位における標識内皮細胞の繁殖をその場でモニターすることができる。いくつかの実施形態において、内皮細胞は、放射性同位体、蛍光部分、又は特異的に検出することができるマーカー、例えば、抗体により標識される。特定の実施形態において、細胞は［３Ｈ］チミジン又はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）により標識される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、血管増殖は、内皮細胞の移動を測定することによりアッセイされ、内皮細胞は、出芽血管新生の際に基底膜を分解し、例えば血管新生促進増殖因子により確立された化学勾配に沿って移動する。特定の実施形態では、傷害部位の内皮細胞を標識し、細胞移動をインビボでモニターする。他の態様では、標識された内皮細胞を対象に投与し、傷害部位への移動をインビボでモニターする。他の態様では、傷害部位の内皮細胞を単離し、それらの移動特性を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ、アンダーアガロース（under-agarose）アッセイ、創傷治癒アッセイ、Ｔｅｆｌｏｎフェンスアッセ
イ、ファゴキネティックトラックアッセイ（phagokinetic  track  assay）及び同様のアッセイが挙げられる、多数のインビトロアッセイによってアッセイすることができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、血管増殖は、血流を導く内腔付き管を形成する、すなわち管形成する内皮細胞を測定することによってアッセイされる。いくつかの実施形態において、血管増殖は、冠動脈リングアッセイによってアッセイされる。血管増殖をアッセイする冠動脈リングアッセイは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｐｐｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ
ｒｉｎｇ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（２０１４）４４〜４９に開示されており、その開示は、全体が参照により本明細書に援用されている。冠動脈リングからの出芽微小血管は、常在マクロファージ、周皮細胞、及び線維芽細胞と、無傷の動物における血管新生を模倣する通常の順番で密接に相互作用する。いくつかの態様において、内皮細胞は、継代により予め選択されず、したがって無傷の動物と同様の静止状態にある。血管新生機能（マトリックス分解、移動、繁殖、管形成など）を組み込んだ他の血管新生アッセイには、胚様体アッセイ、マウス中足骨アッセイ及び同様のアッセイが挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、インビボアッセイを使用して、微量元素が傷害部位に直接送達された後の血管増殖を測定する。これらのアッセイには、角膜血管新生アッセイ、ヒヨコ絨毛尿膜アッセイ、及びＭａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、角膜は、無血管でもあり透明でもある身体の唯一の組織であり、血管新生の観察にとって理想的である。１つの態様において、血管新生促進分子（例えば、本明細書に開示されている微量元素）を含有するペレット剤又はスポンジ剤を、外科的に作り出された間質ポケットに埋め込むことができる。角膜縁末梢血管系からの新たな血管の内殖を毎日モニターすることができ、血管新生率の決定を可能にする。Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイでは、本明細書に開示されている微量元素を含有するＭａｔｒｉｇｅｌを対象の傷害部位又は傷害部位の近くに埋め込むことができ、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグは、血管の可視化のため後に取り出される。いくつかの実施形態において、内皮細胞は、１つ以上のマーカーにより標識され、傷害部位におけるその繁殖、移動、管形成、血管形成及び／又は血管増殖は、インビボにおいて、例えば適切な画像化技術を使用してアッセイされる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織の傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動（すなわち、ホーミング）を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、傷害部位において幹細胞の分化を誘導し、かつ／又は組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、個体の傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、個体の組織の傷害部位において損傷を逆転させる方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の組織の傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体において組織修復の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６つ又はそれ以上のうちいずれかを含む）の事象を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含み、組織修復の少なくとも２つの事象が、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導すること、傷害部位において幹細胞の分化を誘導すること、傷害部位において組織再生を誘導すること、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導すること、傷害部位において損傷を逆転させること、並びに傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築することからなる群から選択される方法が提供される。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導し、傷害部位において幹細胞の分化を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導し、傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導し、傷害部位において幹細胞の分化を誘導し、傷害部位において組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。
【０１３９】
幹細胞又は誘導因子を伴う併用療法
本出願は、別の態様において、組織傷害を有する個体に組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、ａ）有効量の微量元素を傷害部位に送達することと、ｂ）有効量の幹細胞（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）など）又は幹細胞の誘導因子を個体に投与することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞誘導因子を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、微量元素は、微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、複能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、又は組織由来幹細胞である。いくつかの実施形態において、組織由来幹細胞は、脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞、又は臍帯組織由来幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、成人の幹細胞の誘導因子である。いくつかの実施形態において、成人の幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、胎盤の間葉系幹細胞、脂肪組織、肺、骨髄、血液、臍帯のウォートンジェリー、又は歯（歯髄及び歯周靭帯の血管周囲ニッチなど）、内皮幹細胞、神経幹細胞、成人嗅幹細胞、神経堤幹細胞、又は生殖系幹細胞（例えば、精巣の幹細胞）である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている幹細胞の誘導因子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、複能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、又は脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞若しくは臍帯組織由来幹細胞などの組織由来幹細胞の誘導因子である。いくつかの実施形態において、幹細胞の誘導因子は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、胎盤の間葉系幹細胞、脂肪組織、肺、骨髄、血液、臍帯のウォートンジェリー、又は歯（歯髄及び歯周靭帯の血管周囲ニッチなど）、内皮幹細胞、神経幹細胞、成人嗅幹細胞、神経堤幹細胞、又は生殖系幹細胞（例えば、精巣の幹細胞）などの成人の幹細胞の誘導因子である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本開示の間葉系幹細胞の誘導因子は、組織において、例えば、骨髄において間葉系幹細胞の形成を誘導する作用物質である。特定の態様において、間葉系幹細胞の誘導因子は、未分化幹細胞又は多能性幹細胞から間葉系幹細胞の形成を誘導する。いつくかの態様において、幹細胞は、胚幹細胞又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。幹細胞は、インビボ、インビトロ、又はエキソビボであることができる。他の態様において、幹細胞は、ヒト胚幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞である。
【０１４３】
いくつかの態様において、本開示の間葉系幹細胞の誘導因子は、ＢＭＰタンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、アクチビンＡ、ＢＭＰ４アンタゴニスト、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｔｓｇ、ＢＭＰ可溶性受容体、ＢＭＰＲＩＡ、ＢＭＰＲＩＢ、ＢＭＰアンタゴニストのように作用又は機能する小分子、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、レチノイン酸シグナル伝達経路の阻害剤、パンレチノイン酸受容体拮抗物質、レチノイン酸拮抗物質、レチノイン酸受容体拮抗物質、レチノイン酸Ｘ受容体拮抗物質、Ｗｎｔ−３ａ、ｄｉｃｋｋｏｐｆ相同体１（ＤＫＫ１）、及びＢｉｏ又はＣＨＩＲ９９０２１などＷｎｔ−３ａのように作用又は機能する小分子からなる群から選択される。１つの態様において、間葉系幹細胞の誘導因子には、本明細書に開示されている誘導因子の１つ以上が含まれる。１つの態様において、間葉系幹細胞の誘導因子は、血液中の間葉系幹細胞を増加させる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、かつ幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）が投与されている個体において組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、幹細胞が個体に投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位へ幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の分化を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、幹細胞が個体に投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の誘導因子を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、かつ幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の誘導因子が投与されている個体において組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、幹細胞の誘導因子が個体に投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位において幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の分化を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、幹細胞の誘導因子が個体に投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１４６】
本明細書に記載されている方法は、傷害部位への幹細胞のホーミングを誘導するのに概ね適しており、これには、内在性幹細胞の傷害部位への移動、外来性幹細胞の傷害部位への移動、又はその両方を挙げることができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本明細書において使用される幹細胞は修飾されて、そのホーミング応答が増強される。１つの実施形態において、幹細胞は、血管を介して、かつ／又は局所移動を介して傷害部位に移動する。例えば、幹細胞（ＭＳＣなど）を、化学的、酵素的及び／又は遺伝子的に修飾して、移動及びホーミング応答を増強することができる。１つの態様において、細胞ローリングリガンドであるシアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ）部分は、ビオチン−ストレプトアビジン化学修飾を介して、幹細胞の表面に共有結合する。いくつかの実施形態において、ＳＬｅＸ改変ＭＳＣは、Ｐセレクチンが被覆されている基質においてインビトロでローリング応答を示す。Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９，２１０５〜２１０９。他の適切な化学、酵素及び／又は遺伝子修飾を使用して、幹細胞の傷害組織部位への移動及びホーミングを増強できることが理解されるべきである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、細胞の表現型が異なる多数の異なる組織からのものである。これらの差は、細胞が単離された天然の微小環境の差に部分的に起因する場合がある。幹細胞の供給源の他に、培養方法は、ホーミングの潜在性が挙げられる幹細胞の特徴に大きな影響を及ぼす。特定の実施形態において、新たに単離された幹細胞は、培養された対応物より良好にホーミングする。１つの態様において、ＳＤＦ−１αを認識するＣＸＣＲ４ケモカイン受容体は、ＢＭＳＣにおいて高く発現するが、培養すると失われる。いくつかの実施形態において、幹細胞は、サイトカイン（ＨＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６など）と共にかつ／又は低酸素条件下で培養され、ＣＸＣＲ４発現が再び確立される。他の実施形態において、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）シグナル伝達は、細胞移動を制御する本明細書に開示されている方法を使用して制御される。ＭＳＣにおけるＭＭＰの発現は、低酸素などの因子により影響を受け、培養集密を増大させる。更に、炎症性サイトカインのＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αも、ＭＳＣのホーミングに影響を与えるＭＭＰ（ＭＭＰ）の上方制御により、移動を亢進させる。
【０１４９】
組織修復を、例えば、損傷域又は損傷量によって評価することができる。患者の損傷組織の修復は、任意の臨床的に適切な基準を使用して評価することができる。例えば、梗塞組織の修復は、筋細胞、線維芽細胞の数などの細胞数若しくは瘢痕の量の定量化により、又はＬＶＥＤＰ、ＬＶＤＰ、最大ｄｐ／ｄｔ、最小ｄｐ／ｄｔ、ＬＶ重量、心腔容積及び拡張期壁応力が挙げられる心臓機能の拍出量若しくは構造的局面に関する機能アッセイによって測定することができる。一般に、本明細書に開示されている方法は、そのような臨床評価のいずれか又はその任意の組み合わせに有意な（例えば、少なくとも２倍の）変化をもたらす場合に、損傷組織を修復すると言われる。
【０１５０】
任意の適切な（複数の）方法を実施して、組織修復をアッセイすることができる。例えば、方法を実施して、組織治癒を評価すること、修復された組織の機能性を評価すること、及び組織における細胞増殖を評価することができる。組織治癒の程度を決定するため、組織学及び細胞染色を実施して、接種した細胞の増殖及び／又は組織学的外観の改善を検出することができる。場合によっては、組織の部分を収集し、例えば、中性緩衝ホルマリンなどの固定剤で処理することができる。そのような組織の部分を脱水し、パラフィンに包埋し、組織学的分析のためにミクロトームにより切片にすることができる。切片をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、次に、形態学及び細胞性についての顕微鏡評価のためにガラススライドに載せることができる。場合によっては、生理学的試験を実施して、本明細書に提供されている方法及び材料によって、処理後の組織の移動性及び機能性を評価することができる。例えば、インビトロにおいて機械的アッセイを実施して、修復された腱組織又は修復された関節の屈曲動作（work  of  flexion）（ＷＯＦ）又は
屈曲角を測定することができる。インビボアッセイには、器官の機能的評価、症状の評価又は画像化技術を挙げることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている治療方法を投与する前、投与している間、又は投与した後の組織及び／又は器官の機能を、以下の方法のうち任意の１つ以上により評価することができる。フローサイトメトリー、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ、蛍光体標識化、ハイブリッド形成、核酸増幅、又はウエスタンブロットなどの方法による、組織機能の改善を示す少なくとも１つのバイオマーカーの生化学的分析；免疫蛍光又はフローサイトメトリーによるアネキシンＶ染色、カスパーゼ活性の検出、低酸素アッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ、細胞ＤＮＡ標識化、Ｈ２Ｏ２に応答する桿状細胞の数、遺伝子発現のｑＰＣＲ評価及びＨ＆Ｅ染色による壊死域の測定を含む、細胞アポトーシスアッセイ、壊死アッセイ及び細胞生存度アッセイなどの細胞機能性アッセイ；損傷又は梗塞域における線維芽細胞の数の測定、コラーゲン堆積の測定及び瘢痕形成に関連する他のマトリックスタンパク質のレベルの測定を含む、瘢痕形成アッセイ；損傷域への幹細胞又は前駆細胞の移動；並びに他の任意の臨床的に関連する器官の機能検査。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、心臓機能を以下のパラメーターのうち任意の１つ以上により評価することができる。筋細胞の構造及び細胞融合、例えば、筋細胞のサイズの度数分布、短縮のピーク、短縮及び再伸長の速度、並びに細胞融合（Ｘ染色体の数）の評価；ＬＶＥＤＰ、ＬＶＤＰ、＋ｄｐ／ｄＴ、ＬＶ重量、心腔容積、拡張期壁応力を含む心臓機能の拍出量又は構造的局面及びＭＩ治療対象とＭＩ未治療対象との比較；再生された心筋の組成、未治療対象と比べた治療対象における梗塞域のＢｒｄＵ陽性細胞の評価及び未治療対象と比べた治療対象における梗塞域のミオシン陽性細胞の評価、などの心筋再生；梗塞のサイズ、線維化の量及び心筋細胞肥大などの心臓構造。特定の実施形態において、本明細書に開示されている方法は、心機能の１つ以上の指標を測定することを更に含み、心機能の前記指標は、胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）、心係数（ＣＩ）、短縮率％（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮性（ｄＰ／ｄｔ）、対照と比較した、心房若しくは心室機能の減少、ポンピング効率の増加、ポンピング効率の損失率の減少、血行動態機能の喪失の減少又は心筋症に関連した合併症の減少である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている治療方法を投与する前、投与している間、又は投与した後の脳機能を、神経学的試験により若しくは電気生理学的に、例えば減少したシグナル・ノイズ比により、又は生化学的に、例えば、中枢若しくは末梢神経系の器官機能、組織機能及び／又は細胞機能を示す少なくとも１つのバイオマーカーの分析により、評価することができる。電気生理学的手法の例には、脳波記録法（ＥＥＧ）、心電図検査法（ＥＫＧ）、筋電図検査法（ＥＭＧ）、事象関連電位（ＥＲＰ）、誘発電位（ＥＰ）、脳磁気図検査法（ＭＥＧ）及び神経伝導検査法（ＮＣＳ）が挙げられる。他の実施形態では、脳機能を以下の方法又はパラメーターのうち任意の１つ以上により評価することができる。ウェクスラー簡易知能スケール（Wechsler  Abbreviated  Scale  of  Intelligence）及びウェクスラー成人知能スケールＩＩＩ（Wechsler  Adult  Intelligent  Scale-III）などの一般的な知的機能；ウェクスラー記憶スケールＩＩＩ（Wechsler
Memory  Scale-III）の数唱、空間処理下位検査（Digit  Span,  Spatial  span  subtests）などの基本的な注意；ウェクスラー成人知能スケールＩＩＩの数唱、文字数字整列及び算数下位検査（Digit  Span,  Letter  Number  Sequencing  and  Arithmetic  subtests）などの複雑性注意（作業記憶）；ウィスコンシンカード分類検査（Wisconsin  Card  Sorting  Test）、トレイルメイキングテストＢ（Trail  Making  Test  B）、スト
ループテスト（Stroop  Test）、ロンドン塔課題（Tower  of  London  Test）、ギャン
ブリング課題（Gambling  Test）、前頭葉性行動スケール（Frontal  System  Behavior
Scale）及び前頭葉機能のアイオワスケール（Iowa  Scales  of  Frontal  Lobe  Function）などの実行機能；ウェクスラー記憶スケールＩＩＩ、Ｒｅｙの聴覚言語性学習検査（Rey  Auditory,  Verbal  Learning  Test）、カリフォルニア言語性学習検査ＩＩ（California  Verbal,  Learning  Test-II）、短期視覚記憶検査改訂版（Brief  Visual  Memory  Test  Revised）などの記憶（視覚及び言語性）；ミネソタ多面人格テスト２（Minnesota  Multiphasic  Personality  Inventory-2）、情動ストループテスト（Affective  Stroop  Test）、前頭葉性行動スケール及び前頭葉機能のアイオワスケールなどの情
動制御；ＤＡＮＶＡ（非言語的行動の診断分析（Diagnostic  Analysis  of  Nonverbal
Behavior））などの感情刺激の解釈；ウェクスラー成人知能スケールＩＩＩ、トレイルメイキングテストＢ及び符号数字モダリティー検査（Symbol  Digit  Modalities  Test
）の処理速度指標（Processing  Speed  index）（符号検索コード化（Symbol  Search,
Coding））などの処理速度；ボストン呼称検査（Boston  Naming  Test）、言語流暢性検査（Controlled  Oral  Word  Association  Test）、意味流暢性検査（Semantic  Word  Fluency  Test）及び多言語失語症検査（Multilingual  Aphasia  Examination）などの言語；レイ複雑図形検査（Rey-Osterrieth  Complex  Figure  Test）、ウェクスラー
成人知能スケールＩＩＩのブロック設計及びオブジェクト組立下位検査（Block  Design,
and  Object  Assembly  subtests）の視覚構成検査；並びにＷＡＩＳ−ＩＩＩの行列
推理（Matrix  Reasoning）及び線方向判断テスト（Judgment  of  Line  Orientation  Test）などの視覚空間検査。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている治療方法を投与する前、投与している間、又は投与した後の骨格筋の健康が試験される。いくつかの実施形態において、骨格筋の健康には、筋痛、筋損傷、運動に対する代謝変化及び細胞骨格再構築が挙げられる。骨格筋機能は、筋力、筋持久性、訓練適応性、関節の運動を可能にする筋肉の正常状態、又は健康な哺乳動物の骨格筋の標準的な生理学的代謝及び機能であり得る。筋力（特定の運動において生じる最大力）、筋持久力（一連の頻度及び力で実施することができる収縮の最大数）、並びに筋仕事率（仕事量／時間、筋肉により生じる最大作用）が挙げられる骨格筋の機能変数を測定することができる。包括的ではないが、典型的な筋肉特異的機能には、筋芽細胞分化、筋芽細胞決定、筋肉発生、筋肉収縮、筋節変化、筋芽細胞融合、体性筋発生、及び筋形成が挙げられる。
【０１５５】
特定の実施形態では、患者の骨格筋線維症が評価される。患者から筋組織の生検を得て、生検を、線維性組織の存在を検出するのに感度が良い組織化学的染色又は免疫組織化学的染色により評価することを含む多数の方法が、骨格筋線維症の状態を決定するために利用可能である。組織化学的染色の例には、例えば、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）、三色染色法、並びにＡＴＰアーゼ（例えば、ｐＨ４．３、４．６５及び１０．４）が挙げられる。免疫組織化学的染色において筋線維の標識化に使用できる代表的な抗体には、例えば、ミオシン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びジストロフィンが挙げられる。あるいは、線維症が患者の骨格筋に蔓延している程度を決定する機能的方法を用いることができる。機能的方法は、患者に一連の検査及び身体測定のうち１つ以上を受けさせることを伴う。典型的には、そのような検査及び測定には、神経強度試験、筋力、平衡、歩行、姿勢、感覚協調性の評価、並びに肺機能検査、例えば、肺活量及び強制呼気量が挙げられ、これらの全ては、当該技術に既知の方法によって実施することができる。いくつかの実施形態では、組織修復を、本明細書に記載されている１つ以上のシグナル伝達分子の（複数の）発現レベルに基づいて評価することができる。組織修復の指標として適したバイオマーカーには、ｐ５３、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５ａ、ＡＴＭ、リン酸化Ｈ２ＡＸヒストン、ＩＬ−６、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＦＮ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−６、唾液ベータアミラーゼ、シトルリン化（citrulinated）タンパク質、Ｓ１００Ｂ、ＳＰ−Ｄ、ＢＰＩ、ＴＳＰ、ＣＡ１５−３、ＣＤＢＢ、ＣＫＭＢ、ＣＫＭＭ、ＦＡＢＰ２、ＧＦＡＰ、ＮＳＥ、ＣＤ５、ＣＤ−１６ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ１７７、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｆｌｔ−３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＦＧ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＳＤＦ−１αなどの、ＤＮＡ損傷バイオマーカー、抗炎症反応バイオマーカー、組織損傷バイオマーカー、組織損傷修復バイオマーカー又は血液学的代用マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている微量元素は、組織損傷の修復及び／又は組織再生に関与する１つ以上の因子（例えば、転写因子）の制御因子である。銅制御因子には、Ｃｔｒ１、Ｃｔｒ３、ＤＭＴ１、Ａｔｏｘ１、ＡＴＰ７Ａ／７Ｂ、Ｃｏｘ１７、ＣＣＳ、Ｓｃｏ１／２、Ｃｏｘ１１、グルタミン酸作動性Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、銅代謝遺伝子ＭＵＲＲ１ドメイン（ＣＯＭＭＤ１）、Ｘ−連結アポトーシスインヒビター（ＸＩＡＰ）、ホモシステイン（Ｈｃｙ）、シトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＩＩ（ＣＯＸ  ＩＩ）、シトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＩ（ＣＯＸ  Ｉ）、ＦＧＦ−１、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン（ＡＮＧ１又はＡＮＧ２など）、フィブロネクチン、コラゲナーゼ、ＭＭＰ−ＴＩＭＰ、エラスチン、ＰＤＧＦ及びｅＮＯＳなどのＣｕ恒常性タンパク質；シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＣＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、メタロチオネイン（ＭＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ドーパミン−β−モノオキシゲナーゼ（ＤＢＨ）、ペプチジルグリシン−α−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）、チロシナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ヘファエスチン（Hephaestin）及び軟骨基質糖タンパク質などの細胞内Ｃｕ結合タンパク質；セルロプラスミン（ＣＰ）、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、アルブミン（ＡＬＢ）、トランスクプレイン（Transcuprein）、アミンオキシダーゼ、血液凝固因子Ｖ及びＶＩＩＩ、フェロキシダーゼＩＩ、細胞外スーパーオキシドジムスターゼ、並びに細胞外メタロチオネインなどの細胞外Ｃｕ結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。銅制御因子は、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ｉｎ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈａｒｍｔｈｅｒａ．２０１４．１１．０１４（２０１４）に開示されており、参照により本明細書に援用されている。特定の態様において、微量元素は、ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ、及びＣＯＭＭＤ１のうち１つ以上の転写活性、並びにこれらの転写因子により制御されるシグナル伝達ネットワークを制御する。
【０１５７】
いくつかの態様おいて、本明細書に開示されている微量元素により制御される１つ以上の因子のレベル及び／又は活性は、本明細書に開示されている治療組成物又は予防組成物による治療の後に個体において分析される。特定の態様では、ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ、及びＣＯＭＭＤ１のうち１つ以上のレベル及び／又は活性が決定され、次に、治療組成物又は予防組成物への個体の応答と相関される。いくつかの態様において、応答は、正常組織の恒常性及び／若しくは持続的な組織損傷の細胞マーカーを測定すること（例えば、免疫組織化学により若しくはＤＮＡ及び転写レベルを測定することにより）、損傷域若しくは損傷量を測定すること、又は任意の臨床的に適切な指標を評価することによって検出される。したがって、特定の態様では、１つ以上の微量元素制御因子（ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ及びＣＯＭＭＤ１など）のレベル及び／又は活性を、本明細書に開示されている治療レジメン又は予防レジメンへの個体の応答の終点バイオマーカーとして使用することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている微量元素により制御される１つ以上の因子を使用して、本明細書に開示されている組成物又は治療方法若しくは予防方法への応答を分析及び予測することができる。例えば、ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ
１、ＣＣＳ、及びＣＯＭＭＤ１のうち１つ以上のレベル及び／又は活性は、個体が本明細書に開示されている治療組成物又は予防組成物に肯定的に応答する可能性を示すことができ、治療組成物又は予防組成物を個体に投与することができる。逆に、ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ、及びＣＯＭＭＤ１のうち１つ以上のレベル及び／又は活性は、個体が治療又は予防組成物に応答しないか又は陰性に応答する可能性を示し、代替的な治療過程を処方することができる。陰性応答は、有効な応答がないか又は毒性の副作用があるかのいずれか一方であるとして定義することができる。治療処置又は予防処置への応答は、以下の個体群のいずれかにおける対象の遺伝子型が決定される、バックグラウンド研究において予測することができる。治療レジメンに好ましく応答する個体群、治療レジメンに有意に応答しない個体群、及び治療レジメンに不利に応答する（例えば、１つ以上の副作用を示す）個体群。これらの個体群は、例として提供され、他の個体群及び下位個体群を分析することができる。これらの分析結果に基づいて、対象の遺伝子型を決定して、治療レジメンに好ましく応答するか、治療レジメンに有意に応答しないか、又は治療レジメンに不利に応答するかを予測する。したがって、特定の態様では、ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ及びＣＯＭＭＤ１のうち１つ以上のレベル及び／又は活性を、本明細書に開示されている治療レジメン又は予防レジメンへの個体の応答指標として使用することができる。応答指標は、治療レジメン又は予防レジメンを投与する前、投与している間、及び／又は投与した後に評価することができる。例えば、１つ以上の応答指標を、連続投与の用量の合間に評価して、連続治療が対象の役に立っている可能性があるか又は代替的な治療が必要であるかを評価することができる。
【０１５９】
本明細書に記載されている予後検査もまた、臨床試験に適用可能である。１つ以上の応答指標（ＨＩＦ−１、ＳＰ１、ＭＴ、Ａｔｏｘ  １、ＣＣＳ及びＣＯＭＭＤ１など）は、本明細書に記載されている方法を使用して特定することができる。したがって、微量元素組成物の臨床試験への潜在的な実験参加者を選別して、組成物に好ましく応答する可能性が最も高い個体を特定し、副作用を経験する可能性のある個体を除外することができる。このようにして、研究において陽性に応答する可能性の少ない個体を含める結果として測定値を低下させることなく、不要な安全性の問題の危険性を被ることなく、治療の有効性を、微量元素組成物に陽性に応答する個体において測定することができる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、幹細胞又は幹細胞の誘導因子は、全身的に投与される。いくつかの実施形態において、幹細胞又は幹細胞の誘導因子は、傷害部位に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、幹細胞又は幹細胞の誘導因子は、傷害部位以外の部位に局所的に投与される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、幹細胞（又は幹細胞の誘導因子）及び微量元素は同時に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている幹細胞（又は幹細胞の誘導因子）及び微量元素は、任意の好適な順番で順次投与される。
【０１６２】
特定の実施形態において、幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）は、他の幹細胞（ＢＭＳＣではない幹細胞など）、筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、又は筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞及び／若しくは心筋細胞の前駆体と共に投与される。
【０１６３】
幹細胞（又は幹細胞の誘導因子）及び本明細書に記載されている微量元素が哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されると、いくつかの態様における細胞の存在及び／又は生物学的活性は、多数の既知の方法のいずれかによってモニターされる。他の実施形態において、細胞は、インビボにおいて対象の組織から移動し、組織損傷部位へ行く途中の細胞の存在及び／又は生物学的活性がモニター及び／又は制御される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、微量元素は傷害部位に直接送達される。例えば、いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体に組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、ａ）有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することと、ｂ）有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）又は幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）の誘導因子を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、複能性幹細胞、又は組織由来幹細胞である。いくつかの態様において、組織由来幹細胞は、脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞、又は臍帯組織由来幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞の誘導因子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、複能性幹細胞、又は脂肪組織由来幹細胞、心臓組織由来幹細胞若しくは臍帯組織由来幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない組織由来幹細胞の誘導因子である。他の実施形態において、幹細胞の誘導因子は、成人の幹細胞の誘導因子である。特定の態様において、成人の幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、胎盤の間葉系幹細胞、脂肪組織、肺、骨髄、血液、臍帯のウォートンジェリー、又は歯（歯髄及び歯周靭帯の血管周囲ニッチなど）、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅成体（olfactory  adult）幹細胞、神経堤幹細胞、又は生殖系幹細胞（例えば、精巣の幹細胞）である。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の骨髄間葉系幹細胞の誘導因子を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、かつ幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）が投与されている個体において組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含み、幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）が個体に投与される方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有する個体の傷害部位へ幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の分化を誘導する方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に直接送達することを含み、幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）が個体に投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の骨髄間葉系幹細胞の誘導因子を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、微量元素は銅である。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。
【０１６６】
本明細書に記載されている方法は、組織修復の全ての態様に概ね適用可能であるが、併用療法を以下の任意の１つ以上の目的のために使用できることが理解されるべきである。傷害部位への骨髄間葉系幹細胞の移動を誘導するため、傷害部位において幹細胞の分化を誘導するため、傷害部位において組織再生を誘導するため、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導するため、傷害部位において損傷を逆転させるため、かつ傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築するため。
【０１６７】
更に、本明細書に記載されている方法は、併用療法に焦点を合わせているが、組織修復に関する考察は、本出願の他のセクション（例えば、直ぐ下のセクション）にも等しく当てはまることが理解されるべきである。
【０１６８】
損なわれた組織修復系を有する個体を治療する方法
本出願は、別の態様において、損なわれた組織修復系を有する個体において組織修復を誘導する（又は組織の機能を改善する）方法であって、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、個体は、約３０歳、約３５歳、約４０歳、約４５歳、約５０歳、約５５歳、約６０歳、約６５歳、約７０歳、約７５歳、約８０歳、約８５歳、又は約９０歳を超える。他の実施形態において、個体は約３０歳よりも若い。いくつかの実施形態において、個体は、少なくとも約６０歳（例えば、少なくとも約６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、８０歳以上、８５歳以上、９０歳以上のうちいずれか）である。いくつかの実施形態において、個体は、慢性組織傷害を有し、すなわち、少なくとも約６、７、８、９，１０、１１、１２、１８、又は２４か月のいずれかの間、組織傷害を有している。いくつかの実施形態において、個体は、幹細胞が欠乏している。いくつかの実施形態において、個体は、欠損した組織修復系を有する。いくつかの実施形態において、個体は、上記に記載された特徴のうち２つ以上を有する。いくつかの態様において、個体は、以下の症状又は状態のうち１つ以上を患っている。記憶喪失、低運動能力又は運動能力減少（体力（force  ability）、速度耐久力、柔軟性、及び関節可動性が挙げられるが、これらに限定されない）、感覚減退、筋力低下、聴力喪失、及び慢性緊張。
【０１７０】
生物系が傷害を受けると、一連の自己修復系が活性化される。異なる器官は、異なる自己修復能力を有し、肝臓及び筋肉の方が心臓及び神経系より良好な修復を誘発し、若年者の方が高齢者より良好に修復する。しかし、全ての生物組織が自己修復系を有する。例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２０１２，２８：７１９〜４１、Ｇａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ，１９８４，９（５）：６８３〜９２、Ｐｏｒｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３３１（６０２０）：１０７８〜８０、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７（９）：４１９４〜９、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９，４（２）：１５５〜６９、Ｋａｊｓｔｕｒａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１２，１２６（１５）：１８６９〜８１、Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，４（１２）：９６６〜７７、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ，１９８８，８７（１）：６７〜７４、及びＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１２，１１０（６）：８０７〜１６を参照すること。最も重要な構成要素の１つは、幹細胞ホーミングである。幹細胞ホーミングは、標的組織に向かう移動であり、内在性又は外来性幹細胞は、複雑であるが組織化された状況下で生存する。ホーミングは、幹細胞が傷害部位を保護するために必須である。
【０１７１】
短期間の心虚血下では、傷害組織は、（骨髄間葉系幹細胞、すなわちＢＭＳＣを含む）様々な種類の幹細胞のホーミングを開始させる。幹細胞は、ホーミングした後に組織を修復及び保護する。ＢＭＳＣを例に挙げると、ホーミングしたＢＭＳＣは、増殖し、心筋に分化するか、又はパラクリンを介して傷害を修復することができると考えられる。いくつかの症例は、幹細胞のホーミングの遮断が、心臓の治療前の保護を減少させることを示している。Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，２００８，７７（３）：４６３〜７０。急性傷害と比較して、慢性疾患を有する組織は修復能力をより緊急に必要とする。しかし、これらの自己修復能力は、減少しているか、又は更には失われている。心虚血と同様に、慢性虚血は心臓梗塞をもたらす。心機能及び血液供給は両方とも一貫して減少し、疾患の悪化、最終的には心不全をもたらす。疾患の進行は、組織構造及び生理学的機能の劣化を伴う。慢性虚血性の心臓は、構造的及び機能的修復を必要とすることが明かである。それにもかかわらず虚血が長引くと、幹細胞の自発的なホーミングは減少し、心臓は自己修復能力を失う。
【０１７２】
心臓が虚血下にあると、銅が心臓から流出する。Ｃｈｅｖｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９３，９０（３）：１１０２〜６；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００７，２０４（３）：６５７〜６。銅は、核内のＦＩＨ−１（ＨＩＦ−１を阻害する因子）を阻害するので、ＨＩＦ−１の転写活性にとって不可欠なものである。銅を欠いていると、ＨＩＦ−１は、機能的な転写複合体を形成することができず、ホーミング関連ケモカインＳＤＦ−１などの、ＨＩＦ−１制御遺伝子の発現を開始する能力を失う。Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００９，７５（１）：１７４〜８２、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００９，１６（１０）：１３０４〜１４、Ｃｅｒａｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００４，１０（８）：８５８〜６４、Ｃｅｒａｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，２００５，１５（２）：５７〜６３。１つの態様において、本開示は、幹細胞ホーミングの減少が慢性心虚血の際の銅流出に起因することを示して、幹細胞ホーミングを銅流出と関連づけている。１つの態様において、銅の補充は心不全を逆転させる。Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００７，２０４（３）：６５７〜６、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００８，４５（１）：１０６〜１７。別の態様において、心臓への銅の補充は、虚血性心臓への幹細胞ホーミングを取り戻し、このようにして、銅はＨＩＦ−１活性を上昇させ、このようにして、ＳＤＦ−１の発現を促進させる。
【０１７３】
傷害組織への銅補充を目的として、一態様では、Ｃｕ−アルブミン微小気泡が設計かつ使用される。気泡を配置して超音波を照射した後、銅は、気泡から心臓の標的域に放出されてもよく、虚血領域における銅濃度は、増加する。本開示において示したように、Ｃｕ−アルブミン微小気泡により心臓を治療することで、慢性心虚血が原因の症状を緩和できる（図１）。梗塞サイズは、減少し（図１Ａ、図１Ｂ）、ＥＦ（駆出率）は、増加し（図１Ｃ）、血管密度もまた増加した（図１Ｄ）。
【０１７４】
組織修復を評価する方法は、上記のセクションに記載されており、簡潔さのため、単に繰り返すことはしない。
【０１７５】
上記のセクションに記載された方法又は併用療法のいずれかを、損なわれた組織修復系を有する個体に概ね適用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体に組織修復を誘導する方法であって、ａ）有効量の微量元素を傷害部位に送達することと、ｂ）有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）又は幹細胞の誘導因子を個体に投与することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織の傷害部位への幹細胞（ＭＳＣ、例えば、ＢＭＳＣなど）の移動を誘導する方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量の幹細胞（ＭＳＣ、例えばＢＭＳＣなど）又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織において、傷害部位に幹細胞の分化を誘導し、傷害部位に組織再生を誘導し、損なわれた組織修復系を有する方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量のＢＭＳＣなどの幹細胞又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織の傷害部位に組織再生を誘導する方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量のＢＭＳＣなどの幹細胞又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織に組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導する方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量のＢＭＳＣなどの幹細胞又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織の傷害部位において損傷を逆転させる方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量のＢＭＳＣなどの幹細胞又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する個体の組織の傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築する方法であって、有効量の微量元素を、場合により、有効量のＢＭＳＣなどの幹細胞又は幹細胞の誘導因子の投与と組み合わせて、傷害部位に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、組織傷害を有し、損なわれた組織修復系を有する、個体において組織修復の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６つ又はそれ以上のいずれかを含む）の事象を誘導する方法であって、ＢＭＳＣ又は幹細胞の誘導体などの有効量の幹細胞の投与と任意選択的に組み合わせて、有効量の微量元素を傷害部位に送達することを含み、組織修復の少なくとも２つの事象は、傷害部位への幹細胞の移動を誘導すること、傷害部位において幹細胞の分化を誘導すること、傷害部位において組織再生を誘導すること、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導すること、傷害部位において損傷を逆転させること、並びに傷害部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築することからなる群から選択される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素及び／又はその錯体は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
予防の方法及び予防的使用
【０１８２】
有効量の微量元素を個体に投与することを含む、個体において組織傷害を予防する方法もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、組織は、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、皮膚、消化管、生殖器、骨、又は骨格筋である。いくつかの実施形態において、組織は心臓である。いくつかの実施形態において、微量元素は微小気泡によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素を含む微小気泡は、静脈内投与され、微量元素は、傷害部位における微小気泡の部位特異的破裂によって放出される。いくつかの実施形態において、微小気泡の部位特異的破裂は、超音波によるものである。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅、鉄、亜鉛、及びセレニウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（ＣｕＳＯ４など）である。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合する分子と錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、微量元素に結合するいずれの分子とも錯体を形成しない。
【０１８３】
組織傷害が予防されるべき部位に微量元素を直接注入することによって、個体において組織傷害を予防する方法も本明細書に提供されている。
【０１８４】
本明細書において使用されるとき、「予防する」には、疾患に罹患しやすくなっているが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発症又は再発に対して予防を提供することが挙げられる。いくつかの実施形態において、提供される細胞及び組成物を使用して、組織傷害などの疾患の発生を遅延させるか、又は疾患の進行を緩徐させる。
【０１８５】
疾患の予防又は治療では、適切な投与量又は投与経路は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、細胞が予防又は治療の目的で投与されているか、以前の療法、対象の病歴及び対象の組成物及び／若しくは細胞への応答、並びに担当医の判断によって左右される。微量元素組成物及び細胞は、いくつかの実施形態において、対象に、一度に又は一連の治療にわたって適切に投与される。
【０１８６】
いくつかの態様において、組織損傷は、潜在的な有糸分裂細胞の枯渇（例えば、幹細胞の枯渇）、低酸素及び他の影響により引き起こされる血管傷害、Ｊｕｎ及びＥＧＲ１などの即初期遺伝子の誘導、インターロイキン及びＴＮＦなどの前炎症（性）のサイトカインの誘導、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＢＦＧＦなどの炎症性サイトカインの誘導及び二次サイトカインカスケードの誘導を含む、正常な宿主修復応答、炎症反応の影響、並びに／又は炎症細胞、間質機能性細胞及び線維芽細胞などの複数の細胞型の相互作用の影響によって引き起こされる。他の態様において、正常な組織の損傷は、放射線及び化学療法薬などの細胞毒性物への曝露の結果として生じる。放射線は、放射線への偶発的、環境的、職業的、診断的、及び治療的な曝露によるものであり得る。組織損傷は、放射線療法、化学療法、及び放射線療法と化学療法の組み合わせなどの癌治療の一般的な副作用でもある。いくつかの態様において、本開示は、組織損傷を治療及び予防する組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている微量元素組成物及び／又は細胞は、対象に組織損傷を引き起こすこととなるか、又は引き起こす可能性のある治療の前、治療の間、及び／又は治療の後に投与され、この投与により、癌放射線療法及び化学療法などの治療に関連する組織損傷を予防又は低減することができる。
【０１８７】
いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物又は方法は、個体の組織が幹細胞を自発的に動員する固有の能力を別の方法で失った後であっても、組織部位への幹細胞の移動（例えば、ホーミング）を誘導することにより、組織の損傷を予防するか、又は組織の損傷域、体積、若しくは持続期間を低減させる。他の態様において、本開示の組成物及び／又は細胞の投与は、例えば、組織部位において幹細胞の分化を誘導すること、組織部位において組織再生を誘導すること、組織再生を誘発するシグナル伝達分子を誘導すること、追加の損傷が行われる前に初期傷害の部位の損傷を逆転させること、並びに／又は組織部位において神経原線維細胞及び神経分泌細胞の微小環境を再構築すること、を含む、組織損傷に対する抵抗性の増強をもたらす一連の他の事象を誘発する。
【０１８８】
例えば、心筋虚血又は心筋梗塞は、機能的な心臓組織を非可逆的に喪失させ、ポンプ機能の劣化及び死亡の可能性をもたらし得る。冠血管の閉塞は、依存性毛細血管系（dependent  capillary  system）への血液供給の中断をもたらす。栄養素及び酸素がないと、心筋細胞は死滅し、壊死を起こす。周囲組織の炎症は、炎症細胞の侵入及び細胞片の食作用を伴って生じる。線維状瘢痕化が生じ、収縮力に対する心臓のこの部分の以前の働きが失われる。介入がない場合、心筋が組織喪失を補償する唯一の方法は、残りの心筋細胞を肥大化（細胞内の細胞タンパク質及び収縮要素の蓄積）させることである。内分泌性、代謝性（アルコール）又は感染性（ウイルス性心筋炎）作用物質及び癌治療剤もまた、細胞死をもたらし、結果的に心筋機能を低下させる。いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物又は方法は、心臓組織の損傷を予防するか、又は心臓組織の損傷域、体積、若しくは持続期間を低減させる。１つの態様において、本明細書に開示されている微量元素組成物は、心臓組織への間葉系幹細胞（例えば、ＢＭＳＣ）の移動（例えば、ホーミング）及び／又は保持を誘導する。１つの態様において、心筋虚血又は心筋梗塞の場合では、心筋は、心筋細胞への幹細胞の分化により組織の喪失を補償し、それによって心肥大、更には心臓組織の損傷を回避又は低減することができる。
微量元素の送達
【０１８９】
本明細書において使用される「微量元素」は、植物、動物及び／又は土壌中に少量で見出される化学元素を指し、植物及び動物を含む生物体により使用され、その生理機能にとって必須又は有益である。「微量金属」、「微量元素」及び「微量化合物」は、交換可能に使用される。多くの場合、目的の微量元素は、錯体イオンとして存在することとなるが、微量元素を本開示による細胞、組織、又は生物体に導入することによってもたらされる様々なイオン種が挙げられる。これらの用語のそれぞれは、本開示による細胞、組織又は生物体における使用によってもたらされる反応生成物を含む。適切な微量元素には、Ｂ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｂｒ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｒｂ、Ｃｅ、Ａｇ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｆ、Ｔｅ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｂｉ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｒｅ、Ｗ、Ｔａ、及びＨｆが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、微量元素は、Ａｌ、Ｃｄ、Ｒｂ、Ｚｒ、Ｃｏ、Ｓｎ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｆ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ｍｏ、Ｇｅ、Ｖ、Ｂｒ、Ｉ、Ｂａ、Ａｇ、Ｔｉ、Ｓｅ、Ｃｕ、及びＺｎからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、微量元素は、銅（例えば、ＣｕＳＯ４又はＣｕＣｌ２の形態）である。いくつかの実施形態において、微量元素は塩形態である。他の実施形態において、微量元素は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、又は単糖、二糖若しくは多糖と化合物又は錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、１つ以上のポリマーと化合物又は錯体を形成する。他の実施形態において、微量元素は、小分子有機金属化合物などの有機金属化合物である。１つの実施形態において、本明細書に開示されている微量元素は、ＨＩＦ−１の転写活性を制御する。１つの態様において、銅などの微量元素は、ＨＩＦ−１転写活性の誘導因子である。本明細書に開示されているＨＩＦ−１転写活性の誘導因子は、微量元素を含む１種以上の金属元素を含むことができる。
【０１９０】
微量元素は、いくつかの実施形態において、微小気泡により送達することができる。薬物担体としても機能する超音波造影剤の使用は、米国特許第５，５８０，５７５号にガス充填リポソームに関して記載されている。薬物を含有するリポソームのある量が、患者の循環系に投与され、リポソームの存在が目的の領域において検出されるまで、診断レベルの超音波エネルギーを使用してモニターされる。次に、リポソームが破裂して薬物を治療目的で局所放出するのに十分な超音波エネルギーが、領域に適用される。診断用トランスデューサー要素の中央に位置する治療用トランスデューサー要素から診断用及び治療用の超音波を同時に適用するトランスデューサーによって適用される超音波エネルギーは、米国特許第５，５５８，０８２号に記載されている。
【０１９１】
身体の領域への薬物の送達を制御するガス充填マイクロカプセル（又は本明細書において使用される微小気泡）の使用は、米国特許第５，１９０，７６６号にも記載されており、薬物担体の音響共振周波数は、薬物が放出される領域において測定され、次に領域は、薬物の放出を制御するのに適した音波により照射される。標的領域において薬物放出を画像化及び誘発する別個の超音波トランスデューサーが記載されている。ＣＮ  １０２３０２５０７  Ｂは、微量元素の方向制御放出用組成物、並びに調製方法及び適用を開示し、微小気泡を含む組成物が含まれている。
【０１９２】
本明細書において使用される例示的な微小気泡には、例えば、安定化微小気泡、超音波処理されたアルブミン、ガス充填微小球、ガス充填リポソーム、及びガス形成エマルションが挙げられる。様々な方法が、これらの製造のために開発されている。これらの方法は、通常、噴霧乾燥、エマルション、又は界面重合の技術を伴う。典型的には、固定されているか又は任意に可変であるかのいずれか一方である壁厚がある様々な直径を有する微小気泡集団がもたらされる。例えば、１つの方法論により生成される超音波造影剤は、直径に関係なくそれぞれ同じ厚さのシェル壁を有する微小球を含有してもよい。あるいは、異なる生成方法は、同じ直径を有する微小気泡間でも可変である壁厚を持つ微小気泡集団をもたらし得る。微小気泡は、以下の薬学的方法のいずれかによって調製することができる。超音波音響振動、凍結乾燥、噴霧乾燥法、「リビング」／制御ラジカル重合、沈殿重合、懸濁重合、エマルション重合、シード重合、分散重合及び沈殿重合不均一重合系、イオン架橋、イオン乳化ゲル、イオン沈下及び化学架橋、エマルション化学架橋、二重乳化共架橋、熱架橋、コアセルヴェーション、乳化溶媒蒸発又はこれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている微小気泡は、治療剤の担体であり、薬物が内部に装填されている。次に、微小気泡は、静脈内注射され、全身を循環することができる。薬物含有微小気泡を破裂させるのに十分なエネルギーの超音波信号が、薬物の送達が望ましい領域に適用される。超音波付加（insonating）ビームは、微小気泡を破壊し、それによって装填物を放出させる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている微小気泡は、脆弱性が制御され、すなわち、所定の強度以上の音響エネルギーに曝露された場合にのみ破裂する。すなわち、この音響強度閾値を下回ると、実質的に全ての微小気泡が無傷のまま残り、一方、音響強度閾値を上回ると、微小気泡が破裂する。未破裂状態では、気泡作用物質が大きな血液プールにおいて依然として超音波により見ることができ、音波検査者は、超音波強度を増加して、作用物質の破裂及び薬物の同時送達を開始する前に、目的の領域にスキャナートランスデューサーを位置決めし、焦点を合わせることができる。このように、超音波付加信号の強度を制御することによって、作用物質を表したり、消したりすることができる。
【０１９４】
１つの実施形態では、微小気泡を、エマルション溶媒蒸発プロセスによって生成することができる。最初に、２つの溶液が調製される。１つは、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、又はグロブリンなどの両親媒性バイオポリマーであり得る適切な界面活性材料を含有する水溶液である。粘度増強剤を追加的に含めてもよい。これは、エマルション系の外側連続相になる。第２のものは、２種の非水混和合性有機液体の混合物中に壁形成ポリマーを溶解することによって作製される。有機液体の一方は、ポリマーに対して比較的揮発性の溶媒であり、他方は、ポリマーに対して比較的非揮発性の非溶媒である。比較的非揮発性の非溶媒は、典型的には、デカン、ウンデカン、シクロヘキサン、シクロオクタンなどのＣ６〜Ｃ２０炭化水素である。比較的揮発性の溶媒は、典型的には酢酸イソプロピルなどのＣ５〜Ｃ７エステルである。他のポリマー溶媒、例えば、塩化メチレンを、一緒になる非溶媒と混和できる限り使用することができる。典型的には、約０．５〜１０パーセントのポリマーの濃度を有する有機ポリマー溶液の約３部を、約１〜２０パーセントの濃度の生体材料を有するバイオ材料水溶液の１部に加える。壁形成ポリマーを、ポリマーの機械的特性を定義する弾性係数及び引張弾性係数によって選択してもよい。薬物担持微小気泡超音波造影剤の作成に有用な好ましいポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、エプシロン−カプロラクトン、デルタ−バレロラクトンなどのラクチドとラクトンのコポリマー、ポリアミド、ポリヒドロキシブチレート、ポリジオキサノン、ポリ−ベータ−アミノケトン、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリグルタミン及びポリアスパラギン酸又はそのエステルなどのポリアミノ酸、並びにこれらの任意の好適な組み合わせなどの生分解性ポリマーである。ポリマー溶液（内側有機相）を、水溶液（外側相）に加え、撹拌して、エマルションを形成する。様々な装置、例えば、コロイドミル、ローター／ステーターホモジナイザー、高圧ホモジナイザー及び超音波ホモジナイザーを使用して、エマルションを生成することができる。乳化工程は、内側相液滴が所望のサイズ範囲になるまで実施される。微小気泡のサイズを決定することとなるのが、この液滴のサイズである。
【０１９５】
微量元素（例えば、銅）を、多数の手法によって微小気泡作用物質の中に組み込むことができると考えられる。例えば、１つの方法では、薬物を、微小気泡を作成する際に有機ポリマー溶液に溶解するか、ないしは別の方法で組み込む。あるいは、一連の二次工程によって、薬物を微小気泡に組み込むことができ、ここでは最終生成物を、薬物を含有する溶液により再構成し、懸濁微小気泡を薬物含有溶液で溢水させ、得られた生成物を、典型的には凍結乾燥により乾燥する。最後に、薬物を化学的手段により微小気泡の表面に固着することができる。好ましい組み込み方法は、超音波付加により破裂したとき、必要に応じて血液又は他の体液中の活性剤の溶解を容易にする、薬物担持微小気泡を生成する。薬物を微小気泡の壁構造に組み込むか、又は表面へ付着させるこれらの方法もまた有用であり得る。この場合、壁の機械的特性は、微小気泡の破裂が極小壁破片をもたらすと考えられ、それが、その後、局所部位に薬物を運ぶと考えられることが考慮される。中空微小気泡を使用する超音波誘発性薬物送達に関する追加的な開示は、米国特許第６，８９６，６５９号に見出すことができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、微量元素は、銅を含むペプチド系ナノ粒子によって送達される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているペプチド系ナノ粒子は、自己組織化ペプチド（例えば、芳香族ジペプチド）を含む。ペプチドをヒドロゲルナノ粒子などのナノ粒子の中に組み付け、これを、例えば、治療及び診断用途における生体活性剤の送達用の担体として、効率的に利用することができる。いくつかの態様では、親水性及び疎水性の生体活性物質、小薬物分子、磁気又は金ナノ粒子などの画像化剤、並びにペプチド、タンパク質、ｓｉＲＮＡ及びＤＮＡなど高分子量生体分子を、本開示によるペプチド系ナノ粒子を介して送達することができる。いくつかの態様では、安定性、効率性及び／又は生物学的利用可能性を改善するためにナノ粒子を生体分子又は合成分子により修飾する。特定の実施形態において、ナノ粒子の平均直径は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ又は１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、改善された標的化及び延長されたインビボ安定性、並びに／又は他の機能性を有する超微細構造を含む。ペプチド系ナノ粒子の追加的な開示は、ＷＯ  ２０１４１３２２６２  Ａ１において見出すことができる。
【０１９７】
微量元素を含有するビヒクル（ナノ粒子など）を、標的化（例えば、抗原抗体結合などの特定の化学相互作用）することができ、又は傷害部位に送達することができる。いくつかの態様において、組織の治療は、非標的化送達を伴ってもよく、例えば、ナノ粒子材料で組織を浸すこと、ピペット若しくはマイクロピペットを使用して、ナノ粒子材料を組織に適用すること、ナノ粒子材料を組織に注入すること、ナノ粒子材料を組織に塗布すること、又はナノ粒子を、１つ以上のポリマー及び／若しくは１つ以上のタンパク質、若しくはこれらの組み合わせなどの他の成分と組み合わせることを伴ってもよい。例には、アルブミン、フィブリノゲン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キトサン、塩基性線維芽細胞増殖因子、又は血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、又はインスリン様増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、微量元素を含有するナノ粒子と一緒に使用される１つ以上の他の化学実体又は部分。これらの種は、補完的又は追加的な治療有効性若しくは診断有効性を有し得る。ナノ粒子を、これらの他の構成要素に化学的に結合させることができ、又はこれらとの簡単な混合物として送達することができる。例えば、ナノ粒子を抗体に結合させることができる。修復の方法は、１種のナノ粒子のみが関与してもよく、又は２種以上のナノ粒子が関与してもよい。ナノ粒子は、１種以上の微量元素を含有することができる。
【０１９８】
１つの態様において、受動的標的化又は送達は、ナノ粒子（又は微小球）を介した傷害部位への放出又は送達を誘導する物理的効果によって実現することができる。例えば、磁気アルブミン微小球は、微量元素及び磁気物質の両方をアルブミンシェル付微小球の中へ包むことによって合成することができる。身体に注入した後、磁気アルブミン微小球を、外部磁場力によって傷害部位に導くことができる。微量元素の標的への持続性放出を達成して、治療効果を増加し、毒性副作用を回避することができる。別の態様において、積極的な標的化又は送達は、標的器官又は組織細胞を自動的に認識する能力を有する合成ビヒクルによって達成することができる。例えば、抗原抗体反応は、アルブミン微小球自動認識を媒介した。そのような微小球の表面は、微量元素の標的送達のために特定の細胞と結合する能力を有する特定の抗体又はポリペプチドを、備えることができる。微小球に加えて、リポソーム及びナノ粒子媒介消極的（passive）標的送達、並びに受容体又はポリペ
プチド構造誘導性積極的（positive）標的送達を使用して、微量元素を有効濃度に達成するように輸送することもできる。いくつかの実施形態において、微量元素は、傷害部位への微量元素の直接的な投与によって送達される。他の適切な方法には、インビトロ、エキソビボ、又はインビボの投与方法が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書に開示されている微量元素組成物は、組織傷害の部位へ経口投与される。いくつかの実施形態において、微量元素又は微量元素を含有する化合物（例えば、銅イオン、銅原子、又はキレート銅）は、消化管から吸収される。１つの態様において、吸収された微量元素は、傷害部位を（能動的標的化又は受動的標的化により）標的にし、傷害部位において局所的に放出されて、組織修復に有効な局所濃度の微量元素を提供する。いくつかの実施形態において、経口送達される微量元素は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、又は単糖、二糖、若しくは多糖との化合物又は錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、１つ以上のポリマーと化合物又は錯体を形成する。他の実施形態において、微量元素は、小分子有機金属化合物などの有機金属化合物に存在する。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、微量元素は、被覆埋込剤、ステント若しくはプレート、又は微量元素含浸埋込剤を使用して、傷害部位に送達される。１つの実施形態において、微量元素は、微量元素が結合した血管内ステントからの微量元素の緩徐放出によって傷害部位に送達される。他の実施形態において、微量元素は、積極的標的化リポソーム又は受容体−供与体複合体により、傷害部位に送達される。いくつかの態様において、微量元素は、理学療法、超音波、イオン導入法、超音波浸透促進、電気穿孔、及び／又はスポンジ適用を使用して、傷害部位に送達される。傷害部位への組成物及び／又は細胞の適用は、（例えば、皮膚を介して）局所的であり得るか、体表面の内側にある傷害組織のいずれかの位置であり得るか、又はその両方であり得る。例えば、微量元素は、イオン導入法により、血管、内皮細胞層、又は他の内側組織を介して傷害部位に送達されて、組織修復に有効な局所濃度の微量元素を提供することができる。
【０２００】
１つの態様において、本明細書に開示されている微量元素組成物及び／又は細胞を傷害部位に送達するためのアプリケーターが本明細書に開示されている。アプリケーターは、本明細書に開示されている様々な組成物を送達するのに適した任意の装置であり得る。アプリケーターは、噴霧、滴下、塗布、噴射、蒸気化、霧化、若しくは注入によって組成物を体表面に接触させるように構成することができ、又はそのような方法の任意の組み合わせによって組成物及び／若しくは細胞を適用するように構成することができる。傷害部位への組成物及び／又は細胞の適用は、局所的であってもよく、体表面の内側にある傷害組織におけるいくつかの位置に対してであってもよく、又はその両方であってもよく、アプリケーターをそれに応じて構成することができる。いくつかの実施形態において、アプリケーターは、流体である組成物を傷害部位に送達するように構成されている。流体を滴下、蒸気化、霧化、又は噴霧化（例えば、平坦又は丸形流）するノズルは、当該技術において周知である。アプリケーターは、組成物を体表面に、例えば、ブラシ、ローラー、又はローラーボールにより「塗布」するように構成され得る。組成物を傷害部位に注入するアプリケーターには、ナノ又はマイクロ注入針などの針が挙げられる。アプリケーターは、組成物をイオン導入法、超音波浸透促進、電気穿孔、スポンジ適用、又は任意の他の適切なプロセスによって適用するように構成され得る。好ましくは、アプリケーターは、傷害部位の場所への組成物の送達が、治療的に許容される誤差の範囲内で空間的に正確であるように構成される。
【０２０１】
いくつかの態様において、本明細書に開示されている微量元素組成物は、組織傷害の部位へ経口投与される。いくつかの実施形態において、微量元素又は微量元素を含有する化合物（例えば、銅イオン、銅原子又はキレート銅）は、消化管から吸収される。１つの態様において、吸収された微量元素は、傷害部位を（能動的標的化又は受動的標的化により）標的にして、組織修復に有効な局所濃度の微量元素を提供する。いくつかの実施形態において、経口送達される微量元素は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、又は単糖、二糖、若しくは多糖と化合物又は錯体を形成する。いくつかの実施形態において、微量元素は、１つ以上のポリマーと化合物又は錯体を形成する。他の実施形態において、微量元素は、小分子有機金属化合物などの有機金属化合物に存在する。
【０２０２】
治療のためにインビボで使用されるとき、微量元素組成物及び／又は細胞は、有効量（すなわち、所望の治療及び／又は予防効果を有する量）で対象に投与される。用量及び投与量レジメンは、対象の傷害の程度、使用される特定の微量元素組成物及び／又は細胞の特徴、例えば、治療指数、対象、並びに対象の病歴よって左右される。
【０２０３】
有効量は、医師及び臨床医が良く知っている方法により前臨床治験及び臨床治験中に決定することができる。本方法に有用な微量元素組成物及び／又は細胞の有効量を、それを必要とする哺乳動物に、薬学的化合物を全身的又は局所的に投与する多数の周知の方法のうちいずれかによって投与することができる。
傷害部位への微量元素の直接的な送達
【０２０４】
１つの態様において、微量元素は、傷害を受けた組織への直接的な注入によるか、又は傷害部位に物理的に接触して配置されている被覆埋込剤によるかのいずれか一方で、傷害部位に直接送達される。このことは、微量元素が送達部位に長時間留まることを可能にし、傷害部位が最高濃度になる微量元素の勾配を生成する。そのような微量元素の勾配は、傷害部位に向かう血管の増殖を可能にし、そのようにして傷害部位における微小血管環境の再生、ひいては、組織の再生を促進する。１つの実施形態において、本明細書に開示されている微量元素は、ＨＩＦ−１の転写活性を制御する。１つの態様において、銅などの微量元素は、ＨＩＦ−１転写活性の誘導因子である。本明細書に開示されているＨＩＦ−１転写活性の誘導因子には、微量元素を含む１種以上の金属元素を含み得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、傷害部位への微量元素の直接的な送達は、全身投与に関連する有害な副作用を回避又は低減させる。特定の態様において、傷害部位での直接的な送達は、薬物若しくは作用物質に関連する全身毒性及び／又はサイトカインストームなどの全身性炎症反応の誘導を回避する。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、微量元素は、被覆埋込剤、ステント若しくはプレート、又は微量元素含浸埋込剤を使用して傷害部位に送達される。いくつかの態様において、傷害部位への直接的な送達は、血管又は組織内の治療部位への局在的送達を含む。適切な送達系には、同時に膨張して動脈内腔内に治療空間を隔離する近位及び遠位バルーンを有する二重バルーン送達系が挙げられるが、これに限定されない。この場合、カテーテルが２つのバルーンの間に伸びて、治療剤を局所送達する。他のバルーンに基づいた局在的送達系には、多孔性バルーン系、ヒドロゲル被覆バルーン、及び内臓式金属ステントを有する多孔性バルーンが挙げられる。他の系には、局所的に配置された薬剤装填被覆金属ステント及び薬剤充填ポリマーステントが挙げられる。Ｗｉｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｉｅｓ，Ｔｒｅｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，ｖｏｌ．３（１９９３）。
【０２０７】
１つの態様において、傷害部位における微量元素の持続的な送達により、傷害を受けた組織へ比較的少量の作用物質を長期間にわたって投与することができる。１つの実施形態において、長期間の治療により、高用量の作用物質による急性治療によって得ることができない結果を、少ない低減された中毒量で得ることができる。１つの態様において、傷害部位での微量元素の持続的な送達により、作用物質を約１２時間、約１日、約２日、約１週、約２週、約１か月、約２か月、約６か月、約９か月、約１年、約１年半又は約２年より長く放出する。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている持続性送達組成物には、微量元素を含有する長期作用注入可能物質（例えば、油系注入薬、注入用懸濁剤、注入用微小球及び注入用インサイチュー系）、デポ型注入用の作用物質及びポリマー、市販のデポ型注入薬、並びに注入用持続放出送達系が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書に開示されている持続性送達組成物は、ポリマーマトリックスを含み、作用物質がポリマーマトリックスの拡散及び／又は分解により放出される。したがって、作用物質の放出パターンは、原則としてポリマーマトリックスによって、並びに装填率及び製造方法によって決定される。いくつかの実施形態において、持続性放出調合剤は、生分解性ポリマーを使用する。この場合、持続性放出調合剤は、対象から調合剤を外科的に取り出す必要がない。典型的には、そのような調合剤は、ゆっくりと分解し、患者の体内に吸収され、最終的に他の可溶性代謝廃棄物と一緒に処分される。
【０２０９】
１つの態様では、ポリマー注入用デポ剤系を使用して、微量元素含有インサイチュー形成埋込剤を傷害部位に送達する。インサイチュー形成埋込剤系は、典型的に生分解性産物から作成され、シリンジにより体内に注入され、いったん注入されると凝結して、固体の生分解性埋込剤を形成することができる。いくつかの実施形態において、埋込剤は、熱可塑性ペースト、インサイチュー架橋ポリマー、インサイチューポリマー沈殿、熱誘導性ゲル化又はインサイチュー凝固有機ゲルにより形成される。熱可塑性ペーストのデポ剤形成の機構は、溶融形態で体内に注入された後、体温に冷却されると半固体を形成するというものである。架橋ポリマー網状組織は、様々な方法によりインサイチューで得ることができ、固体ポリマー系又はゲルを形成する。インサイチュー架橋系についての方法には、熱若しくは光子の吸収によって通常開始されるフリーラジカル反応、又は小カチオンとポリマーアニオンとの間のイオン相互作用が挙げられる。インサイチュー形成は、溶液からポリマー沈殿を引き起こすことによってなされ得る。水不溶性かつ生分解性ポリマーは、生体適合有機溶媒において可溶化され、それに薬物が添加され、混合した後に溶液又は懸濁液が形成される。この製剤が体内に注入されると、水混和性有機溶媒が消散し、水が有機相に浸透する。このことは、ポリマーの相分離及び沈殿をもたらして、注入部位にデポ剤を形成する。熱誘導性ゲル化系は、熱可逆性ゾル／ゲル転移を示し、下限臨界溶液温度によって特徴づけられる。これらは、室温で液体であり、下限臨界溶液温度以上でゲルを生成する。インサイチュー凝固有機ゲルは、水不溶性両親媒性脂質を含み、これは水中で膨張し、様々な種類のリオトロピック液晶を形成する。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている持続性放出組成物は、微量元素の制御送達のための生分解性ポリマーを含む。適切な生分解性ポリマーには、典型的には、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリグリコネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（ジオキサノン）、及びポリアルキルシアノアクリレートが挙げられる。いくつかの実施形態において、持続性放出組成物は、ＰＬＧＡ微小球、ＰＣＬ微小球、ポリ無水物微小球、ポリオルトエステル微小球、及びポリアルキルシアノアクリレート微小球などの注射用生分解性微小球を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、直接的な送達は、銅（又は他の微量元素）を含有するナノ粒子材料を傷害部位に注入することによって実施される。いくつかの態様において、本明細書に開示されているナノ粒子材料は、約１〜約５，０００ナノメートルの直径を有する粒子を含む。いくつかの態様において、ナノ粒子の直径は幅広く変わることができ、最大直径（例えば、球の直径、プレートの幅、ロッドの長さなど）は、１〜１，０００ｎｍまでのいずれかの範囲であり、最小直径（例えば、ロッドの直径、プレートの厚さなど）は、０．１〜１００ｎｍまでのいずれかの範囲である。
【０２１２】
ナノ粒子は、任意の形状又は形態を有することができる。例えば、これらは、金コロイド又は銀コロイドなどの金属コロイドであり得る。ナノ粒子は、ナノ球及びナノチューブ構造の両方において利用可能であるフラーレンであり得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ナノシェルなどコア／シェル構造を有してもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、球体、平板又は曲板、及び円形、環状、多角形、不整形などを含む任意の断面であり得る直線状又は湾曲状の細長い粒子（例えば、細長円筒、管、多角形の断面を有する円柱形状、リボン状粒子など）、並びに他の規則的又は不規則的な形状であり得る。
【０２１３】
微量元素を含有するナノ粒子材料を、標的化（例えば、抗原抗体結合などの特定の化学相互作用）することができ、又は傷害部位に直接送達することができる。いくつかの態様において、組織表面の治療は、非標的化送達によって、例えば、ナノ粒子材料に組織を浸すこと、ピペット又はマイクロピペットを使用して、ナノ粒子材料を組織に適用すること、ナノ粒子材料を組織に注入すること、ナノ粒子材料を組織に塗布すること、又はナノ粒子を１つ以上のポリマー及び／若しくは１つ以上のタンパク質、若しくはこれらの組み合わせなどの他の成分と組み合わせることによって達成することができる。例には、アルブミン、フィブリノゲン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キトサン、塩基性線維芽細胞増殖因子若しくは血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、又はインスリン様増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、微量元素を含有するナノ粒子と一緒に使用される１つ以上の他の化学実体又は部分。これらの種は、優遇的又は追加的な治療有効性又は診断有効性を有し得る。ナノ粒子を、これらの他の構成要素に化学的に結合させることができ、又はこれらとの簡単な混合物として送達することができる。例えば、ナノ粒子を抗体に結合させることができる。修復の方法は、１種のナノ粒子のみが関与してもよく、又は２種以上のナノ粒子が関与してもよい。ナノ粒子は、１種以上の微量元素を含有することができる。
【０２１４】
ナノ粒子を形成することができるポリマーには、天然及び合成、生分解性又は非生分解性、ホモポリマー又はコポリマー、熱可塑性又は非熱可塑性などのポリマーが挙げられる。ナノ粒子の形成に適したポリマーは、例えば、以下から選択することができる。ポリアクリル酸を含むポリカルボン酸ポリマー及びコポリマー；アセタールポリマー及びコポリマー；アクリレート及びメタクリレートポリマー及びコポリマー（例えば、ｎ−ブチルメタクリレート）；酢酸セルロース、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、セロファン、レーヨン、レーヨントリアセテート（rayon  triacetate）を
含むセルロースポリマー及びコポリマー、並びにカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロースなどのセルロースエーテル；ポリオキシメチレンポリマー及びコポリマー；ポリマーブロックイミド、ポリアミドイミド、ポリエステルイミド及びポリエーテルイミドなどのポリイミドポリマー及びコポリマー；ポリスルホン及びポリエーテルスルホンを含むポリスルホンポリマー及びコポリマー；ポリカプロラクタム及びポリアクリルアミドを含むポリアミドポリマー及びコポリマー；アルキド樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、アリル樹脂及びエポキシド樹脂を含む樹脂；ポリカーボネート；ポリアクリロニトリル；ポリビニルピロリドン（架橋及び他のもの）；ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニルなどのポリビニルハロゲン化物、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテル、ポリスチレン、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー、スチレン−エチレン−ブチレンコポリマー（例えば、ポリスチレン−ポリエチレン／ブチレン−ポリスチレン（ＳＥＢＳ）コポリマー）、スチレン−イソプレンコポリマー（例えば、ポリスチレン−ポリイソプレン−ポリスチレン）、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、アクリロニトリル−ブタンジエン−スチレンコポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー及びスチレン−イソブチレンコポリマー（例えば、ＳＩＢＳなどのポリイソブチレン−ポリスチレンブロックコポリマー）、ポリビニルケトン、ポリビニルカルバゾール、並びにポリ酢酸ビニルなどのポリビニルエステルを含む、ビニルモノマーのポリマー及びコポリマー；ポリベンゾイミダゾール；イオノマー；ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリアルキルオキシドポリマー及びコポリマー；グリコサミノグリカン；ポリエチレンテレフタレートを含むポリエステル、並びにラクチド、イプシロン−カプロラクトン、（グリコール酸を含む）グリコリド、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート（及びそのアルキル誘導体）のポリマー及びコポリマーなどの脂肪族ポリエステル；ポリフェニレンエーテルなどのポリアリールエーテル、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトンを含むポリエーテルポリマー及びコポリマー；ポリフェニレンスルフィド；ポリイソシアネート；ポリオレフィンポリマー及びコポリマー；ポリオレフィンエラストマー（例えば、サントプレーン）、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（テトラフルオロエチレン−ｃｏ−ヘキサフルオロプロペン）（ＦＥＰ）、変性エチレン−テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦフッ素化ポリマーＥ）及びポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む及びコポリマー；シリコーンポリマー及びコポリマー；ポリウレタン；ｐ−キシレンポリマー；ポリイミノカーボネート；ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸コポリマーなどのコポリ（エーテル−エステル）；ポリホスファジン；ポリアルキレンオキサレート；ポリオキサアミド及びポリオキサエステル（アミン及び／又はアミド基を含有するものを含む）；ポリオルトエステル；フィブリン、フィブリノゲン、コラーゲン、エラスチン、キトサン、ゼラチン、デンプン、ヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを含む、ポリペプチド、タンパク質、多糖及び脂肪酸（及びそのエステル）などのバイオポリマー；並びに上記のブレンド及び更なるコポリマー。
【０２１５】
他の実施形態において、ナノ粒子は、例えば、とりわけ以下から選択される１種以上の金属から形成することができる。銀、金、白金、パラジウム、イリジウム、オスミウム、ロジウム、チタン、タングステン及びルテニウムなどの実質的に純粋な金属、並びにコバルト−クロム合金、ニッケル−チタン合金、鉄−クロム合金、コバルト−クロム−鉄合金及びニッケル−クロム合金などの金属合金。いくつかの他の態様において、ナノ粒子は、本明細書に開示されている微量元素から形成することができ、同じ又は異なる微量元素を傷害部位に直接送達するために使用することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、例えば、以下から選択される１種以上の適切な非金属無機材料から形成することができる。リン酸カルシウムセラミック（例えば、ヒドロキシアパタイト）；ガラスセラミックと呼ばれる場合があるリン酸カルシウムガラス（例えば、バイオガラス）；非遷移金属酸化物（例えば、周期表１３、１４及び１５族の金属の酸化物、例えば、酸化アルミニウムが挙げられる）、並びに遷移金属酸化物（例えば、周期表３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２族の金属の酸化物、例えば、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウム、イリジウムなどの酸化物が挙げられる）が挙げられる金属酸化物；純粋な及びドープした（doped）炭素（例えば、フラーレン、カーボンナノファイバー、単層（single-wall）、いわゆる「数層（few-wall）」及び多層（multi-wall）カーボンナノチューブ）、炭化ケイ素及び窒化炭素などの炭素系材料；シリカ；ケイ酸アルミニウムが挙げられる合成又は天然ケイ酸塩、様々な機能化ＰＯＳＳ及び重合ＰＯＳＳが挙げられる多面体オリゴマーシルセキオキサン（silsequioxane）（ＰＯＳＳ）などのモノマーケイ酸塩、並びにモ
ンモリロナイト、ヘクトライト、ヒドロタルサイト、バーミキュライト及びラポナイトなどの粘土及び雲母（場合により、挟まれているか、かつ／又は薄片状になっていることもある）が挙げられる層状ケイ酸塩。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているナノ粒子材料は、１種以上のポリマー、１種以上の金属若しくは合金、及び／又は１種以上の適切な非金属無機材料を含む。
【０２１８】
特定の実施形態において、様々な種類の銅含有化合物を、傷害部位への直接的な局在的送達に使用することができる。適切な銅イオン含有溶液の例は、塩化銅（Ｉ）、塩化銅（ＩＩ）、酢酸銅及び硫酸銅の溶液である。他の実施形態では、塩化亜鉛、酢酸亜鉛及び硫酸亜鉛の溶液などの、適切な亜鉛含有溶液が使用される。他の実施形態において、銅又は亜鉛は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、単糖、二糖、若しくは多糖、１種以上のポリマー又は小分子と化合物又は錯体を形成し、化合物又は錯体は、傷害部位における直接的な局在的送達に使用される。いくつかの実施形態では、微量元素を含有する有機金属化合物が、傷害部位における直接的な局在的送達に使用される。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、傷害部位への直接的な局在的送達に使用される銅組成物における銅イオンの濃度は、約５μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約２０μＭ、約２０μＭ〜約４０μＭ、約４０μＭ〜約６０μＭ、約６０μＭ〜約８０μＭ、約８０μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約２００μＭ、約２００μＭ〜約４００μＭ、約４００μＭ〜約６００μＭ、約６００μＭ〜約８００μＭ、約８００μＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ又は約４０ｍＭ〜約６０ｍＭである。亜鉛イオンの適切な濃度は、上記に記載された銅組成物の濃度と同じオーダーとなる。微量元素の濃度は、医師及び臨床医が良く知っている方法により前臨床治験及び臨床治験中に決定することができる。
【０２２０】
別の実施形態において、微量元素は、例えば、直接的な経皮穿孔により、介入カテーテルにより、又は脊椎内注射により、傷害部位に注入される。いくつかの実施形態において、微量元素は、被覆埋込剤、ステント若しくはプレート、又は微量元素含浸埋込剤を使用して、傷害部位に直接送達される。１つの実施形態において、微量元素は、微量元素が結合した血管内ステントからの微量元素の緩徐放出によって、傷害部位に直接送達される。１つの態様において、本明細書に開示されている微量元素組成物及び／又は細胞を傷害部位に直接送達するアプリケーターが、本明細書に開示されている。
組織傷害及び関連する疾患
【０２２１】
本明細書に記載されている「組織傷害」は、例えば、心血管、肝臓、脳、骨格筋などが挙げられる組織の傷害を指す。いくつかの実施形態において、組織傷害は心血管虚血である。いくつかの実施形態において、組織傷害は肝臓線維症である。いくつかの実施形態において、組織傷害は脳卒中である。いくつかの実施形態において、組織傷害は下肢虚血である。いくつかの実施形態において、組織傷害は、糖尿病、糖尿病性足部潰瘍、壊死性腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、再狭窄（血管形成術後又はステント留置術後）、切開創傷、切除創傷、外科手術、偶発的外傷、褥瘡、うっ血性潰瘍、腱断裂、声帯の音声外傷（vocal  fold  phonotrauma）、中耳炎又は膵炎に関連する。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、組織傷害は糖尿病に関連する。いくつかの態様において、組織傷害は糖尿病性足に関連する。糖尿病性足は、典型的には、持続的な日和見感染及び不十分な創傷治癒と組み合わされた、糖尿病の血管系及び神経系の両方の合併症によって引き起こされる。１つの態様において、組織傷害は、糖尿病性足部潰瘍である。他の態様において、組織傷害は、糖尿病性皮膚潰瘍である。
【０２２３】
したがって、本明細書に記載されている方法は、組織傷害に関与する多くの疾患に概ね適用可能である。これらには、心筋梗塞、心筋症、動脈瘤、アンギナ、大動脈弁狭窄症、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中隔肥大症（ＡＳＨ）、アテローム性動脈硬化症、心房細動及び粗動、細菌性心内膜炎、バーロー症候群（僧帽弁逸脱）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心肥大症、心炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄症、先天性心疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、アイゼンメンジャー症候群、塞栓症、心内膜炎、肢端紅痛症、細動、線維筋性異形成、心ブロック、心雑音、高血圧症、低血圧症、突発性乳児動脈石灰化（idiopathic  infantile  arterial  calcification）、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎（infantile  polyarteritis））、代謝症候群、微小血管性狭心症、心筋炎、発作性心房頻拍（ＰＡＴ）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症虚血肢、静脈炎、肺動脈弁狭窄症（肺動脈弁狭窄）、レイノー病、腎動脈狭窄症、腎血管性高血圧症、リウマチ性心疾患、糖尿病性脈管障害、心房中隔欠損症、無症候性虚血、シンドロームＸ、頻拍症、高安動脈炎、ファロー四徴症、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、静脈瘤、血管炎、心室中隔欠損症、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、心内膜床欠損症、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心疾患、僧帽弁の疾患、僧帽弁狭窄症、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾患、虚血性心疾患（急性及び亜急性）、狭心症、急性肺性心、肺塞栓症、慢性肺性心、脊柱後側弯性（kyphoscoliotic）心疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、心内膜線維弾性症、房室ブロック、不整脈、心筋変性、脳血管性疾患、動脈、細動脈及び毛細血管の疾患又は静脈及びリンパ管の疾患、後天性脳傷害、外傷性脳傷害、卒中（虚血性、脳内出血、くも膜下出血が挙げられる）、無酸素性傷害、代謝障害、感染に起因する脳炎及び脳傷害が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において組織傷害を伴う疾患には、全身性サルコドーシス、皮膚の疾患又は状態、Ｌｏｆｇｒｅｎ症候群、肺の疾患又は状態、心臓の疾患又は状態、眼の疾患又は状態、肝臓の疾患又は状態、骨格筋の疾患又は状態、及び腎臓の疾患又は状態が挙げられる。したがって本出願は、本明細書に記載されている方法を使用して、これらの疾患のうちいずれかを治療することも含む。
キット、組成物及び製造品
【０２２４】
別の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞及び／又は本明細書に開示されている微量元素、並びに、例えば、薬学的に許容される担体と混合することによって薬学的に許容される形態に調製することができる治療用細胞組成物、並びにアプリケーターを、使用説明書を伴って含むキットが、本明細書において提供される。キットは、残りのキット内容物から分離している容器を含むことができる。特定の実施形態において、組成物及びキットは、ＢＭＳＣ、微量元素、幹細胞の誘導因子、及び本明細書に開示されている追加の治療剤のうち１つ以上を含むことができる。
【０２２５】
特定の実施形態において、キットは、ＢＭＳＣ、微量元素、幹細胞の誘導因子、及び／又は追加の治療剤の、個体への送達を促進する１つ以上の構成要素を含む。例えば、特定の実施形態において、キットは、個体へのＢＭＳＣ及び／又は微量元素及び／又は幹細胞の誘導因子の病巣内送達を促進する構成要素を含む。そのような実施形態において、キットは、例えば、個体への細胞の送達に適したシリンジ及び針などを含むことができる。そのような実施形態において、幹細胞又は微量元素又は幹細胞の誘導因子は、バッグ又は１つ以上のバイアルの中のキットに含まれていてもよい。特定の他の実施形態において、キットは、個体への幹細胞又は微量元素又は幹細胞の誘導因子の静脈内送達又は動脈内送達を促進する構成要素を含む。そのような実施形態では、幹細胞又は微量元素又は幹細胞の誘導因子を、例えば、ボトル又はバッグ（例えば、細胞を含む最大約１．５Ｌの溶液を含有することができる血液バッグ又は同様のバッグ）内に含有することができ、キットは、幹細胞又は微量元素又は幹細胞の誘導因子を個体に送達するのに適した管系及び針を追加的に含む。
【０２２６】
加えて、キットは、個体の疼痛又は炎症を低減する１種以上の化合物（例えば、鎮痛薬、ステロイド系又は非ステロイド系抗炎症化合物などを含んでもよい。キットは、抗細菌若しくは抗ウイルス化合物（例えば、１種以上の抗生物質）、個体の不安を低減する化合物、個体の免疫反応を低減する化合物（例えば、サイクロスポリンＡ）及び／又は抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、クロルフェニラミン（chlorepheniramine）、
レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジンなど）を含むこともできる。
【０２２７】
加えて、キットは、使い捨て器具、例えば、滅菌ワイプ、使い捨て紙製品、グローブなどを含むことができ、これらは、送達を受ける個体の準備を促進し、又は幹細胞及び／若しくは微量元素及び／若しくは幹細胞の誘導因子の投与の結果として個体が感染する可能性を低減させる。
【０２２８】
以下の非限定的な実施例は、本発明の組成物及び方法を更に説明する。当業者は、いくつかの実施形態が本発明の範囲及び趣旨の範囲内で可能であることを認識することとなる。ここで、本発明は、下記の非限定的な実施例を参照してより詳細に記載されることとなる。以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然のことながら、本発明の範囲をいかようにも制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２２９】
実施例１：慢性虚血性心臓におけるＢＭＳＣホーミングを改善するための超音波媒介Ｃｕ−アルブミン微小気泡の使用
【０２３０】
銅の補充を方向づけるために、この実験は、Ｃｕ−アルブミン微小気泡を使用した。超音波を位置決めし照射すると、銅は、気泡から心臓の標的域に放出され、虚血領域において銅濃度が増加した。パイロット実験は、心臓へ方向づけられた銅の補充が慢性心虚血の症状を軽減したことを示した。更に、ビトロＢＭＳＣ培養方法が十分に確立されており、ＢＭＳＣは、典型的なホーミング幹細胞であるので、細胞を追跡するのに適している。ニュージーランド白ウサギは、心臓研究の分野において好ましいモデル動物の１つである。同様に、ホーミング自己由来ＢＭＳＣの追跡にとって理想的である。ＢＭＳＣを培養及び標識し、心筋梗塞のウサギに注射した。Ｃｕ−アルブミン微小気泡の治療により、慢性虚血性心臓へのＢＭＳＣの再ホーミング（re-homing）を、標識蛍光によって観察した。加
えて、特定の遮断薬のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸のＡＭＤ３１００をこの実験に使用して、心虚血及び微小気泡治療の際のＢＭＳＣホーミングの機構を研究し、心梗塞の病理を詳述し、心梗塞の新たな治療の理論的基礎を提供した。
【０２３１】
方法：
【０２３２】
１．実験的ＭＩ（心筋梗塞）及びＣｕ−アルブミン微小気泡による治療
【０２３３】
（１）成体雄ニュージーランド白ウサギを手術前に１２時間絶食させ、手術室を、手術の前に紫外線放射により一晩滅菌した。（２）ウサギを３ｍＬ／ｋｇの抱水クローラルの腹腔内投与により麻酔を掛け、次に手術台に仰臥位で配置した。電極取付部位の胸部及び肢部を覆っている体毛を剃った。手術域をポビドン−イオジンで連続して３回擦った。リドカインを、切開部位の周りの皮下域に注射した。（３）電極を肢部に取り付け、ＥＣＧ（心電図）を手術の前後３０分間記録した。（４）ウサギを胸骨正中切開に付した。皮膚を切断し、皮下組織及び筋肉組織を解剖した。その後、胸骨を後退させ、胸膜を解剖し、胸膜腔を開けて、心膜を露出させた。（５）心膜を穏やかに切開した後、心臓を露出させ、左回旋枝（ＬＣ）を結紮した。結紮部位は、ＬＣのレベル７５であった（ＬＣの心外膜末端をレベル０と定義し、ＬＣの起点をレベル１００と定義した）。心臓の状態及び呼吸を、結紮が完了するまでモニターした。（６）心室前壁の色変化、左心室壁運動の変化、並びにＥＣＧの電極ＩＩ、ＩＩＩ及びａＶＦにより記録されたＳＴ部分を含む変化を、２分毎にモニターして、結紮が確実に成功するようにした。（７）律動異常又は異常呼吸が特定されたら、結紮を開放し、必要であれば心肺蘇生を施すことができるように、心臓状態を１０分間、集中的にモニターした。心臓の血流（cardiac  hemodynamic）及びバイタルサインが安定すると、胸部を閉じた。胸膜が手術中に損傷を受けた場合、胸部を直ぐに閉じて、空気抽出により気胸を防止した。（８）切開部位を滅菌的に清浄した後、ウサギを回復させた。ウサギには、感染を回避させるために、４０００００単位のペニシリンを３日間与えた。（９）生存したウサギを、急性（＜手術後１か月）、慢性（手術後６か月）、慢性及び微小気泡（手術後６か月及びＣｕ−アルブミン微小気泡で治療）の３つの群に分けた。Ｃｕ−アルブミン微小気泡は、実験的ＭＩ手術の６か月後に耳静脈から静脈内投与した。微小気泡（５ｍＬ／ウサギ／治療）を、Ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（周波数：１．３ＭＨｚ、エネルギー：９０〜１００％、メカニカルインデックス：１．１〜１．２、放射時間：２０分／治療（５秒間の放射−５秒間の間隔））により左心室において超音波放射した。全てのウサギを３回治療し、治療を１回に２〜３日間投与し、１匹のウサギへの３回の治療は、全て１週間以内に実施した。
【０２３４】
２．ウサギＢＭＳＣの単離及び培養
【０２３５】
（１）成体雄ニュージーランド白ウサギを手術前に１２時間絶食させ、手術室を、手術の前に紫外線放射により一晩滅菌した。（２）ウサギを３ｍＬ／ｋｇの抱水クローラルの腹腔内投与により麻酔を掛け、次に手術台に仰臥位で配置した。吸引部位の肢部を覆っている体毛を剃った。手術域をポビドン−イオジンで連続して３回擦り、続いて７５％アルコールにより擦って、脱ヨウ素化した。吸引部位を露出させ、周囲域を手術タオル（operation  towel）で覆った。（３）（複数の）骨生検用針及び（複数の）シリンジを滅菌的にヘパリン処理した。（４）供与体ウサギの一方又は両方の大腿骨を、ヘパリン処理済の針及びフリンジを使用して吸引し、１〜２ｍＬの骨髄吸引液を１回の吸引で採取した。（５）吸引液を、４〜５ｍＬのダルベッコー修飾イーグル培地（Ｌ−ＤＭＥＭ）を含有する１５ｍＬの管に直ぐに移した。管を穏やかに振とうし、試料をＤＭＥＭとブレンドして、凝固を防止した。（６）ブレンドを、別の１５ｍＬの円錐管中の等量の１．０７７ｇ／ｍＬパーコール溶液に重ねて層状にした。溶液を、単離する前に室温で保持するべきであり、ブレンドは、溶液に穏やかに重ねて層状にするべきである。（７）次にブレンド溶液を４００×ｇにより室温で１５分間遠心分離した。（８）勾配界面で白血球層（単核細胞）を収集し、ＤＭＥＭで２回すすぎ、３００×ｇで遠心分離した。細胞を、１２％のＦＢＳを補充したＬ−ＤＭＥＭに３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で接種した。（９）最初の培地交換を接種の３日後に実施した。その後、培養培地を２日又は３日毎に交換した。培地交換は、培地の半分又は全体を交換するように実施することができると考えられる。培地中のＦＢＳの濃度を、細胞の状態に応じて調節した。非接着細胞を、培地交換に伴って廃棄した。８０〜９０％の集密で、ＭＳＣを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで消化し、継代させた。細胞を培養して、８〜１０×１０６の数にした。
【０２３６】
３．ウサギＢＭＳＣの標識化
【０２３７】
（１）およそ８〜１０×１０６に増殖すると、ＢＭＳＣを採取し、Ｌ−ＤＭＥＭ（血清なし）で２回洗浄し、後者は、細胞の充填に４００×ｇでの遠心分離を必要とした。（２）収集したＢＭＳＣを、製造者の取扱説明書に従ってｐｋＨ２６でまず標識した。簡潔には、ＤＭＥＭを充填細胞から最大限除去した。次に、（２つの部分に等しく分けた）細胞を希釈Ｃの１つの部分に１×１０７細胞／２ｍＬの濃度で懸濁した。色素を、希釈Ｃの他方の部分にブレンドし、細胞懸濁液に加えた（色素の濃度：５μＬ／１×１０７細胞）。その後、十分なブレンドを行い、インキュベーションを、そのプロセスで１又は２回穏やかに振とうしながら、室温で５分間実施した。次に、等量の血清をブレンドに加え、１分間インキュベーションを行って、標識化を停止させた。次に、細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ（血清あり）により、室温において４００×ｇで１０分間遠心分離しながら洗浄した。その後、細胞をＤＭＥＭで２又は３回洗浄し、１０％のＦＢＳを補充したＬ−ＤＭＥＭに３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で一晩接種した。標識化に成功した細胞は、目視により観察するとピンク色から赤色であった。（３）次に、培地を交換した後、死滅細胞を廃棄し、ｐＫＨ２６標識ＢＭＳＣを共焦点レーザー走査顕微鏡検査方法により試験した。細胞の標識率は、９０％を超えたときだけ適格であるとみなされ、そうでなければステップ（２）を繰り返した。（４）標識化プロセスの前に、Ｄｉｏ（３）及びＨｏｅｃｈｓｔの作用液を調製した。Ｄｉｏ（３）を蒸留水で希釈して、１μｇ／μＬの濃度にし、滅菌濾過し、−２０℃で保存した。Ｈｏｅｃｈｓｔをジメチルスルホキシドで希釈して、１μｇ／μＬの濃度にし、−２０℃で保存した。（５）赤色蛍光（ｐＫＨ２６）試験の後、Ｄｉｏ（３）（１０μｇ／１０ｍＬ）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１０μｇ／１０ｍＬ）を、適格にｐＫＨ２６標識されたＢＭＳＣの培地に加え、細胞を一晩インキュベートした。（６）強い赤色及び緑色、並びに弱い青色の蛍光シグナルが、最終的に成功した標識化とみなされた。（７）次に、標識された細胞を画像化し、赤色、緑色蛍光の標識化率の分析を行った。青色蛍光シグナルは核として観察され、標識化率は、無作為２００×視野中の赤色又は緑色蛍光細胞の数／青色蛍光細胞の数として算出された。（８）ＡＭＤ３１００治療群では、滅菌ＡＭＤ３１００（最終濃度：１×１０７ｎｇ／ｍＬ）を標識細胞に加え、一晩インキュベートした。インキュベーションが終わった後、細胞を消化し、洗浄し、使用前に１〜２ｍＬのＬ−ＤＭＥＭ（血清なし）に懸濁した。もう一方の群では、標識化が成功した細胞を消化し、洗浄し、使用前に１〜２ｍＬのＬ−ＤＭＥＭ（血清なし）に懸濁した。調製したＢＭＳＣを、耳静脈を介して同じ供与体ウサギに注射した。
【０２３８】
４．心梗塞の際及びＣｕ−アルブミン微小気泡で治療した後での、ウサギＢＭＳＣのホーミングの追跡
【０２３９】
４．１  急性心梗塞、慢性心虚血及びＣｕ−アルブミン微小気泡で治療した慢性心虚血中のウサギＢＭＳＣのホーミングの追跡
【０２４０】
（１）急性（≦ＭＩ手術後１か月後、ｎ＝３）、慢性（ＭＩ手術６か月後、ｎ＝３）、慢性及び微小気泡（ＭＩ手術６か月後及びＣｕ−アルブミン微小気泡で治療、ｎ＝５）。（２）ＢＭＳＣを単離し、ＭＩ手術の１か月前（急性群）又は４〜５か月後（他の慢性群並びに慢性及び微小気泡群）に培養し、使用前にｐＫＨ２６、Ｄｉｏ（３）、及びＨｏｅｃｈｓｔで標識した。（３）調製したＢＭＳＣ（１〜９×１０６細胞／ウサギ）を、ＭＩ手術の２週間後（急性）又は６か月後（慢性）に、耳静脈を介して供与体ウサギに注射した。心臓を細胞注射の２４時間後に採取した。慢性及び微小気泡群では、微小気泡治療を、ＭＩ手術の６か月後に実施した。調製したＢＭＳＣを、３つの治療後に供与体ウサギに注射した。心臓を細胞注射の２４時間後に採取した。採取したそれぞれの心臓を、長軸に沿って心尖部から底部まで類似した厚さで４つの部分に分けた。次に、全ての部分を凍結して、同様に長軸に沿って心尖部から底部まで薄切りにし（５切片／部分）、共焦点レーザー走査顕微鏡検査法を使用して観察した。ホーミングの画像をＮｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００／ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓを使用して撮影した。その後、切片を病理分析のために固定し、調製した。（４）画像をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．０により分析した。それぞれの画像の赤色蛍光のＩＯＤ値及び蛍光域（画素）を算出した。心臓毎のＩＯＤ値の合計及び蛍光域の合計を算出した。統計は、ＩＯＤ（又は蛍光域）の合計／蛍光切片の数として処理された。
【０２４１】
４．２  Ｃｕ−アルブミン微小気泡により誘導されたＢＭＳＣホーミングの機構
【０２４２】
（１）ウサギを３つの群に分けた。慢性（ＭＩ手術６か月後、ｎ＝３）、慢性及び微小気泡（ＭＩ手術６か月後及びＣｕ−アルブミン微小気泡で治療、ｎ＝５）、慢性及び微小気泡＋ＡＭＤ３１００（ＭＩ手術６か月後、銅−微小気泡で治療、及びＡＭＤ３１００で治療したＢＭＳＣ、ｎ＝３）。（２）ＢＭＳＣを単離し、ＭＩ手術の４〜５か月後に培養し、使用前にｐＫＨ２６、Ｄｉｏ（３）及びＨｏｅｃｈｓｔで標識した。（３）調製したＢＭＳＣを、微小気泡治療を伴う（慢性及び微小気泡）か、又は伴わない（慢性）ＭＩ手術の６か月後に、供与体ウサギに耳静脈を介して注射した。心臓を細胞注射の２４時間後に採取した。慢性及び微小気泡＋ＡＭＤ３１００群では、微小気泡治療を、ＭＩ手術の６か月後に実施した。蛍光標識及びＡＭＤ３１００処理したＢＭＳＣを、３つの治療後に供与体ウサギに注射した。心臓を細胞注射の２４時間後に採取した。採取した心臓を凍結し、薄切りにした。切片を共焦点レーザー走査顕微鏡検査法、画像化系：Ｎｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００／ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓを使用して、観察及び記録した。その後、切片を病理分析のために固定し、調製した。（４）画像をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．０により分析した。それぞれの画像の赤色蛍光のＩＯＤ値及び蛍光域（画素）を算出した。それぞれの心臓毎のＩＯＤ値の合計及び蛍光域の合計を算出した。統計は、ＩＯＤ（又は蛍光域）の合計／蛍光切片の数として処理された。
【０２４３】
５．病理分析
【０２４４】
抱水クローラルの過剰投与量を静脈内注射して、ウサギを殺処分した。次に心臓を採取し、ＮＳ（生理食塩水）を使用して洗浄した。その後、生理食塩水を十分に除去し、心臓を凍結して薄切りにした。共焦点で観察した切片を乾燥し、４％ホルムアルデヒド溶液に固定した。次に切片を脱水し、ＨＥで染色した。（１）キシレンにより切片を脱ろうし、切片を減少勾配濃度のアルコールで洗浄し、最後に水で洗浄する。キシレン（Ｉ）５分→キシレン（ＩＩ）５分→１００％アルコール２分→９５％アルコール１分→８０％アルコール１分→７５％アルコール１分→蒸留水２分。（２）切片をヘマトキシリンで５分間染色し、続いて蒸留水で洗浄する。（３）蒸留水で洗浄し、１％酸性アルコールで３０秒間洗浄する。（４）水道水に１５分間又は温水（約５０℃）に５分間浸ける。（５）切片をアルコール可溶性エオジンで２分間染色する。（６）切片の脱水、透明性及び被包。９５％アルコール（Ｉ）１分→９５％アルコール（ＩＩ）１分→１００％アルコール（Ｉ）１分→１００％アルコール（ＩＩ）１分→キシレン（Ｉ）１分→キシレン（ＩＩ）１分→中性樹脂による被包。
【０２４５】
６．統計分析
【０２４６】
ＳＰＳＳ１４．０（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）をデータの分析に使用した。ＩＯＤ値及び蛍光域は中央値で表した。群間の差は順位和（α＝０．０５）により検査した。標識化率は、
【数１】
2020143158.tif 000002
として表した。群間の差は、独立したサンプルのｔ検定（Independent-Samples  t-tests）により検査した。Ｐ値が＜０．０５の場合、統計的有意性があると推定した。
【０２４７】
結果：
【０２４８】
ＭＩ手術の間に、心室前壁の色変化、（左心室壁、側壁及び心尖部を伴う）心筋運動の減速、並びに電極ＩＩ、ＩＩＩ及びａＶＦにより記録された上昇又は下降ＳＴセグメントを観察した。
【０２４９】
骨髄吸引液を採取し、密度勾配遠心分離により単離した。白血球層（単核細胞）を収集し、培養し、継代させた。非接着細胞を、培地交換に伴って廃棄し、接着細胞を増殖させ、このようにしてＢＭＳＣを豊富化させた。接着細胞は、接種の３〜５日後にクローン増殖を発生させた。多面細胞及び紡錘細胞の両方がコロニーにおいて観察された。多面細胞は、接種の第１週以内は優勢であったが、徐々に紡錘細胞に代わっていった。コロニーが大きく高密度になったとき（通常、接種の１〜２週間後に生じる）、細胞を継代させることができる。継代させた後、紡錘細胞は、優勢な細胞になった。
【０２５０】
蛍光標識化は、細胞がおよそ８〜１０×１０６に増殖したときに実施した。ｐＫＨ２６標識化のプロセスには消化及び遠心分離が必要とされるので、ｐＫＨ２６標識化は、通常一部の細胞に細胞死をもたらした。したがって、Ｄｉｏ（３）及びＨｏｅｃｈｓｔ標識化をｐＫＨ２６の後に実施して、ｐＫＨ２６標識化を成功させ、生きている細胞を接着させ、生存させた。Ｄｉｏ（３）及びＨｏｅｃｈｓｔを、適格にｐＫＨ２６標識されたＢＭＳＣの培地に加え、細胞を一晩インキュベートした。標識化率がの場合のみ、細胞の標識化が成功し、追跡実験に適しているとみなされた。
【０２５１】
ｐＫＨ２６及びＤｉｏ（３）は両方とも脂溶性色素であり、その標識化のメカニズムは、膜への蛍光体の挿入である。これらの２つの色素の標識化シグナルは類似している。標識された細胞は、膜において均一な赤色又は緑色の点として見られる。観察は、１つの細胞において、一部は強力なｐＫＨ２６シグナルで標識されるが、一部は強力なＤｉｏ（３）シグナルで標識され得ることを示した。Ｄｉｏ（３）又はｐＫＨ２６のいずれによっても標識することができない細胞はほとんどなかった。
【０２５２】
心筋梗塞及びＣｕ−アルブミン微小気泡治療の際のＢＭＳＣホーミングから観察される結果によって、梗塞域は、通常、心臓の第１、第２及び第３の部分の範囲内であった。梗塞域は、心尖部及び大部分の左心室壁を伴い、実験的ＭＩがＬＣの結紮によって得られた。採取した心臓を、長軸に沿って心尖部から底部まで４つの部分に分けた。全ての心臓の第１及び第２の部分が梗塞域を含有し（１８／１８）、大部分の心臓の第３の部分が梗塞域を含有し（１２／１８）、いくつかの心臓の第４の部分が、梗塞域の小さい部分を含有した（３／１８）。
【０２５３】
急性心梗塞では、ホーミングシグナルは大量にあり、梗塞域の中及び周囲において強力であった。ＭＩ手術の１か月後、成功裏に確立された実験ＭＩ手術ウサギは、急性心梗塞モデルであると考慮された（急性、ｎ＝３）。急性梗塞の際に、動物は、自発的な自己修復を開始し、梗塞域に散乱する強力なＢＭＳＣホーミングシグナルを観察することができた（図２〜４）。この実験では、重なり合う緑色と赤色の蛍光シグナルをホーミングシグナルとして観察し、これらは、非梗塞域ではなく、梗塞域の中及び周囲において見られた（図２〜４）。図２は、急性梗塞の際に、ＢＭＳＣのホーミングシグナルが梗塞域の大きな部分において観察されたことを示す。Ａ〜Ｃは、左心室の相互作用の範囲内の同じ視野で撮影された。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。黄色点線が、梗塞域（上側）と非梗塞域（下側）に区域を分けている。画像は、４０×視野で撮影され、ルーラ＝５００μｍである。図３は、ホーミングシグナルが梗塞域にのみ見られたことを示している。Ａ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉは、同じ心臓のものであり、Ａ〜Ｃ及びＤ〜Ｆは、梗塞域（第２の部分）内の同じ視野の画像であり、Ｇ〜Ｉは、非梗塞域内の画像である。Ｄ〜Ｆは、Ａ〜Ｃ内の青色で線を引いた領域である。黄色点線が、梗塞域（左側）と非梗塞域（右側）に区域を分けている。Ｇ〜Ｉは、非梗塞域の画像である。重なり合う赤色及び緑色シグナルが梗塞域内に見られ、梗塞域の縁又は梗塞域から遠く離れたところには、ほとんど見出すことができなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｉは、４０×視野で撮影され、ルーラ＝５００μｍであり、Ｄ〜Ｆは、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍ（Ｄ〜Ｅ）又は２００μｍ（Ｆ）である。図４は、急性梗塞の際に、ＢＭＳＣの強力なホーミングシグナルが観察されたことを示している。ＭＩ手術後１か月以内に、強力なホーミングシグナルが梗塞域に観察された。上から下へ、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分の画像である。蛍光シグナルが、梗塞域（第１及び第２の部分、Ａ〜Ｆ）に見られ、非梗塞域（第３及び第４の部分、Ｇ〜Ｌ）においてシグナルは見られなかった。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍであった。
【０２５４】
この実験の結果は、ＢＭＳＣのホーミングが、心臓が慢性虚血下にあるときに消滅するが、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療がＢＭＳＣの再ホーミングを開始したことを実証している。ＭＩ手術の６か月後、確立に成功した実験動物は、慢性心虚血であるとみなされた（慢性、ｎ＝３）。これらの動物の自発的な自己修復並びにＢＭＳＣホーミングは、大きく減少したか、又は更には消滅した。重なり合う緑色及び赤色シグナル（ＢＭＳＣのホーミングシグナル）は、梗塞域と非梗塞域の両方において見出すことができなかった（図５）。図５は、ＢＭＳＣのホーミングシグナルが慢性心虚血の際に消滅したことを示している。ＭＩ手術の６か月後、心臓を薄切りにし、画像化した。シグナルは、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分において観察することができなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影された。ルーラ＝１００μｍである。
【０２５５】
心梗塞域に方向づけられた銅補充を、超音波位置決め及びＣｕ−アルブミン微小気泡の照射によって行った。Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療は、非梗塞心臓にＢＭＳＣホーミングを開始させない（図６）。図６は、梗塞がないと、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療がＢＭＳＣホーミングを開始させなかったことを示している。上から下へ、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）、及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分の画像である。蛍光シグナルを、いずれの域（第１及び第２の部分、Ａ〜Ｆ）においても見出すことができなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍであった。６か月の心虚血を罹患しているウサギをＣｕ−アルブミン微小気泡治療で治療すると、ＢＭＳＣの再ホーミングが生じた（図７）。Ｍｉ手術の６か月後、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療は、梗塞域へのＢＭＳＣの再ホーミングを開始した。上から下へ、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）、及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分の画像である。蛍光シグナルが、梗塞域（第１、第２、及び第３の部分、Ａ〜Ｉ）に見られ、非梗塞域（第４の部分、Ｊ〜Ｌ）においてシグナルは見られなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍであった。存在量、強度及び可視領域は、急性梗塞の際のホーミングシグナルと比較してかなり小さいが、微小気泡治療により開始されるホーミングシグナルは、治療を受けていない慢性梗塞の動物と比較して、明確に上昇している。（図８〜９）。図８は、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療が、梗塞域へのＢＭＳＣの再ホーミングを開始したことを示す。急性梗塞の際に、ＢＭＳＣの大量のホーミングシグナルが、梗塞域において観察された（Ａ〜Ｃ、ａ）。ホーミングシグナルは、慢性心虚血心臓では消滅した（Ｄ〜Ｆ、ｄ）。Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療の後、消滅したホーミングシグナルは、心梗塞域において再び現れた（Ｇ〜Ｉ、ｇ）。画像は、全て第２の部分の切片のものである。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ）又は２００μｍ（ａ、ｄ、ｇ）である。図９は、急性群、慢性群、並びに慢性及び微小気泡群の蛍光シグナルの統計分析を示す。上側はＩＯＤ値の分析であり、下側は蛍光域の分析である。群間の差は順位和により検査した。短い線は中央値を表し、＊及び＃は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０２５６】
この実験の結果は、Ｃｕ−アルブミン微小気泡により刺激されたＢＭＳＣの再ホーミングが、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸に依存していることを実証した。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸は、幹細胞ホーミングの重要な機構の１つである。ＳＤＦ−１は、傷害を受けた組織によって表され、ＢＭＳＣホーミングを含む様々な幹細胞を誘引する。幹細胞の表面に発現する特異的受容体のＣＸＣＲ４は、ＳＤＦ−１に応答し、細胞のホーミングを開始させる。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４を特異的に遮断するために、ＣＸＣＲ４の遮断薬であるＡＭＤ３１００を選択して、細胞を処理した。
【０２５７】
この実験の結果は、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが、心梗塞域にホーミングできなかったことを実証している。細胞をｐＫＨ２６、Ｄｉｏ（３）及びＨｏｅｃｈｓｔで標識し、ＡＭＤ３１００と共に一晩インキュベートし、その後、採取し、ウサギに注射した。大量で強力なホーミングシグナルは、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが急性梗塞ウサギに注射された場合には観察されなかった。ホーミングシグナルの存在量及び可視領域は、両方とも、非ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣを受けた急性梗塞ウサギと比較して顕著に収縮し（図１０〜１２）、ＡＭＤ３１００がＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４依存性ホーミングを阻害したことを実証している。図１０は、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが、急性心筋梗塞にホーミングできなかったことを示している。ＭＩ手術後１か月以内に、梗塞域へのＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣのホーミング能力は、明らかに減少した（第１、第２及び第３の部分、Ａ〜Ｉ）。上から下へ、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）、及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分画像である。蛍光シグナルは、いずれの部分にもほとんどなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍであった。図１１は、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが、急性心筋梗塞にホーミングできなかったことを示している。上側から下側へ、画像は、急性群（Ａ〜Ｃ、ａ）及び急性＋ＡＭＤ３１００群（Ｄ〜Ｆ、ｄ）（全て、第２の部分）のものである。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ）又は２００μｍ（ａ、ｄ）であった。図１２は、急性群、急性＋ＡＭＤ３１００群の蛍光シグナルの統計分析を示す。上はＩＯＤ値の分析であり、下は蛍光域の分析である。群間の差は順位和により検査した。短い線は中央値を表し、＊及び＃は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０２５８】
この実験の結果は、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが、慢性心虚血域にホーミングできなかったことを示している。ＭＩ手術の６か月後、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療は、梗塞域へのＢＭＳＣの再ホーミングを開始した。しかし、追跡細胞がＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣであったとき、ホーミングシグナルは、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療慢性虚血域において観察することができなかった。細胞がＡＭＤ３１００で処理された場合、Ｃｕ−アルブミン微小気泡により刺激されたホーミングシグナルは、慢性虚血を６か月間患い、Ｃｕ−アルブミン微小気泡治療を受けた梗塞ウサギにおいて見出すことができなかった。上から下へ、第１（Ａ〜Ｃ）、第２（Ｄ〜Ｆ）、第３（Ｇ〜Ｉ）、及び第４（Ｊ〜Ｌ）の部分画像である。第１から第３（Ａ〜Ｉ）の部分は、梗塞域を含有するが、いずれの部分においてもホーミングシグナルはほとんど見られなかった。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍであった。図１４は、ＡＭＤ３１００処理ＢＭＳＣが、急性心筋梗塞又は慢性心虚血域にホーミングできなかったことを示している。上から下へ、画像は、急性群（Ａ〜Ｃ、ａ）、慢性群（Ｄ〜Ｆ、ｄ）、慢性及び微小気泡群（Ｇ〜Ｉ、ｇ）、並びに慢性及び微小気泡性＋ＡＭＤ３１００群（Ｊ〜Ｌ、ｊ）の（全て、第２の部分）のものである。左から右へ、緑色及び赤色シグナルのＨＥの結果が示されている。画像は、１００×視野で撮影され、ルーラ＝１００μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ、Ｊ〜Ｌ）又は２００μｍ（ａ、ｄ、ｇ、ｊ）であった。図１５は、慢性群、慢性及び微小気泡群、並びに慢性及び微小気泡＋ＡＭＤ３１００群の蛍光シグナルの統計分析を示す。上はＩＯＤ値の分析であり、下は蛍光域の分析である。群間の差は順位和により検査した。短い線は中央値を表し、＊及び＃は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０２５９】
心筋梗塞のモデルとして、ニュージーランド白ウサギは、安価であり、給餌及び輸送に都合よく、ＭＩ手術の際に機械式呼吸が不可欠ではなく、冠動脈の結紮が容易である。冠動脈の結紮は、大部分がＬＡＤ（左前下行枝）又は以前の文献におけるＬＣによってなされた。この実験において、結果は、ＬＡＤの結紮が安定した心筋梗塞モデルを確立できなかったことを示した。インクの潅流によって、ウサギのＬＡＤは、ラット及びブタよりも特に短いことが観察された。最大で左心室の心室壁の１／３に達し、著しく限定された範囲−左心室の１０％〜１５％に血液を供給する。しかし、ＬＣは比較的長くて大きく、心尖部に到達し（場合によっては、心尖部を一巡して右側冠動脈に達し）、左心室の大部分の範囲に血液を供給する。
【０２６０】
ＬＣの結紮は、ＬＡＤの結紮より成功し安定したモデルを提供した。心エコー図及び血行動態測定の結果は、ＬＡＤ結紮を有するウサギの心機能が明白に変化せず、ＬＣ結紮では劇的に変化したことを示している。病理分析は、ＬＣ結紮ウサギの梗塞域がＬＡＤ結紮ウサギよりも明白に大きいことも証明した。そのうえ、ＬＣは心筋の表面まで延びているので、認識及び手術することが容易である。
【０２６１】
超音波微小気泡は、一種の好ましい超音波造影剤及び標的薬物担体である。微小気泡は、頑健に制御される超音波照射により照射される前、輸送の際、安定している。そのため、微小気泡上の薬物を、標的組織における破壊のために方向づけることができた。そのうえ、微小気泡の破壊及び超音波照射により、薬物は細胞に進入することができる。超音波微小気泡は、操作が容易であり、動物に対してほとんど損傷を起こさず、銅補充を適時に位置決めすることも期待される。したがって、この実験では、超音波媒介Ｃｕ−アルブミン微小気泡を選択して、銅を心筋に補充した。
【０２６２】
幹細胞ホーミングは、全身が関与する系統的反応である。系統的観察は、単なるタンパク質検査より説得力がある。そのため、この実験は、ＡＭＤ３１００処理を介したＣｕ−アルブミン微小気泡刺激ＢＭＳＣホーミングの機構を研究し、刺激ホーミングがＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸依存性であり、機構が、ＣｕがＨＩＦ−１活性を上昇させ、ＨＩＦ−１がＳＤＦ−１の発現を刺激し、ＳＤＦ−１が幹細胞ホーミングを誘引する、というものであり得ることを示唆している、と例証した。
【０２６３】
心虚血は、低酸素症をもたらし、これにより、ＨＩＦ−１αが分解を逃れて、サイトゾルに蓄積することを可能にする。核内に輸送されると、ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１βと二量体化してＨＩＦ−１を形成する。しかし、核内では、ＨＩＦ−１αは、カルボキシル末端内のＮ８０３アスパラギン残基に対するＨＩＦ−１を阻害する因子（ＦＩＨ−１）であるアスパラギニルヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化され、ＨＩＦ−１αが共活性化因子のＣＢＰ／ｐ３００と相互作用し、機能的転写複合体を形成することを阻害する。銅は、ＦＩＨ−１の活性を抑制するので、ＨＩＦ−１が他の因子と組み合わされて機能的転写複合体を形成することを促進する。ＨＩＦ−１は、機能的複合体を形成することができず、銅が系において不十分であるときに、下流遺伝子の発現を開始する。いずれにしても、ＨＩＦ−１αを蓄積する心虚血は、心臓からの銅流出を引き起こし、ＨＩＦ−１転写活性の抑制をもたらし、ホーミングケモカイン（例えば、ＳＤＦ−１）が挙げられるＨＩＦ−１制御遺伝子の発現を阻害する。したがって、心虚血時間の長期化に伴い、ＢＭＳＣのホーミングが減少して、更には消滅する。
【０２６４】
この実験の結果は、急性心梗塞の際に、ＢＭＳＣが梗塞域にホーミングしなかったことを示している。虚血時間が６か月に延びると、ＢＭＳＣのホーミングは消滅した。Ｃｕ−アルブミン微小気泡により銅の補充を心臓に方向づけると、ＢＭＳＣの再ホーミングが観察された。結論としては、Ｃｕ−アルブミン微小気泡は、慢性心虚血の際にＢＭＳＣのホーミングを刺激し、刺激を受けたホーミングプロセスは、ＨＩＦ−１−ＳＤＦ−１依存性である。
【０２６５】
実施例２：アカゲザルの虚血性心筋梗塞モデルにおける銅超音波造影微小気泡標的化療法
【０２６６】
この実験は、アカゲザルにおいて実施された。虚血性心筋梗塞モデルを、冠動脈結紮手術により確立した。手術の４週間後、虚血性心組織をコラーゲン線維に完全に取り替えて、梗塞組織にした。次に、治療有効性の評価のために、超音波誘導銅微小気泡標的化療法を実施して、心筋梗塞を治療した。アカゲザルは、類似した内部構造、電気活性、冠動脈分布、冠側副血行、胸腔内配置及び付着を有する、ヒトに似ている高次心臓を有する。したがって、心筋梗塞のアカゲザルモデルは、ヒトにおける心筋後続状態の良好な代用物を提供すると考えられる。
【０２６７】
１．１  アカゲザルの虚血性心筋梗塞モデルの確立
【０２６８】
手術処置の前に、全ての対象は、５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．２ｍｇ／ｋｇのミダゾラムの筋肉内注射を受けて、鎮静作用を誘導した。電極取付部位の胸部及び肢部を覆っている体毛を、手術及び良好なＥＣＧ記録のために十分に剃った。標準両極及び単極肢誘導を記録した。頻拍（１分あたり２００回を超える拍動）、不整脈及び基線を明白に逸脱しているＳＴセグメントなどの異常なＥＣＧを示す動物は、この研究から除外した。
【０２６９】
心電図検査法、カフ血圧、パルスオキシメトリ及びカプノグラフィーが挙げられる標準的非侵襲性測定によって常時モニターし（Ｄａｓｈ３０００、ＧＥ，ＵＳＡ）、静脈カテーテルを設置した。手術を受けた全てのサルには、フェンタニル（１０μｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．２ｍｇ／ｋｇ）、プロポフォール（１ｍｇ／ｋｇ）及びベクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入により麻酔が掛けられた後、最初に挿管した。補助呼吸を、圧力制御換気により実施して、４．７ｋＰａ〜５．３ｋＰａ（３５ｍｍＨｇ〜４０ｍｍＨｇ）の呼気終末ＣＯ２を得た。吸息圧は、１２〜２０ｃｍＨ２Ｏの範囲内に設定し、呼吸数は、４０／分であり、吸気／呼気の比は１：２であった。
【０２７０】
手術処置の際に麻酔状態を維持するために、２ｍＬのフェンタニル（０．１ｍｇ）及び１０ｍＬのプロポフォール（１００ｍｇ）を食塩水により２０ｍＬに希釈した。混合物を、シリンジポンプにより５〜１０ｍＬ／時間の速度で連続的に注入した。ポンプ速度を、麻酔状態及び手術の継続時間に応じて調整した。動脈カニューレ挿入法は、留置針を伴い、手術中に侵襲性血圧をモニターする圧力モニタリング管系を連結して、大腿動脈の中に穿刺するものであった。通常は、大腿動脈脈動を、上前腸骨棘と恥骨結合との間の中間点で触診することができる。手術域を、無菌的に分離した。分離は、４枚の使い捨て滅菌シートを用いて行う。
【０２７１】
手術域を、左側第４肋間腔の線の僅か内側を切断し、胸骨柄の左側から外側に向けて４〜５ｃｍの横切開を行った。組織の切断及び凝固の両方に使用することができるので、単極ジアテルミーが推奨される。皮下組織及び筋肉面を胸膜まで解剖し、胸膜腔に進入し、次に鉗子を開くことにより、切開を広げた。綿棒を挿入し、胸膜腔を掃引し、肺を空孔から押し出し、次に、肋間腔切開を広げて、胸部を開き、心膜を露出させた。
【０２７２】
心臓を、左側第４肋間開胸切開（４〜５ｃｍ）を介して露出させ、心尖部及び左心耳を特定した。ＬＡＤの心外膜末端をレベル０と定義し、左心耳下のＬＡＤの起点をレベル１００と定義した。結紮を特定の位置において実施した。加えて、数匹のサルにおいて、対角動脈の分枝部位が結紮部位の上方にある場合、主な対角枝もＬＡＤ動脈の結紮部位に並行に結紮した。
【０２７３】
動脈は、１分間閉塞し、続いて５分間再潅流し、この閉塞−再潅流は、最終的な結紮の前に３回繰り返した。最後の結紮の後、左心室壁運動の変化、心室前壁の色変化、並びに心電図及び血圧における変化をモニターして、確実に結紮を成功させる必要がある。永久的な結紮の後、メチレンブルー（１ｍＬ）を１．０ｍＬのシリンジにより左心耳に急速静注した。メチレンブルーの充満欠損は、結紮の完了、並びに虚血域の予測を示している。
【０２７４】
胸部を閉じる前に、心臓状態を４５分間集中的にモニターした。ドブタミン（３〜５μｇ・ｋｇ−１・ｍｍ−１）を注入して、心機能を支持し、必要な場合は除細動器（ＨＥＡＲＴＳＴＡＲＴ  ＸＬ，Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用した。心膜を閉じる際に心臓の損傷を避けるように、注意を払う必要がある。ヒアルロン酸ナトリウムを、癒着防止治療のために心膜腔（pericardial  chamber）に注入するべきである。心膜及び胸膜を４−０ポリエチレン縫合糸で閉じた。肋間切開を絹縫合糸で閉じた。気胸症を避けるため、肋間を閉じる際に肺の損傷を避けるように、注意を払う必要がある。空気を胸膜腔から排出できるように、肋間切開を閉じる際に、肺を再膨張させる。肋間切開を閉じた後、食塩水を皮下腔に滴下し、肺を再び膨張させて、胸部切開が密接に閉じられていることを確実にする。筋肉及び皮膚切開を＃２−０絹縫合糸で層状に閉じ、滅菌的に清浄した。自発呼吸が回復した後、気管内挿入管を引き抜いた。切開を滅菌ガーゼ及び包帯で覆った。トラマドール（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して、疼痛を取り除いた。包帯の交換を１日おきに実施し、縫合糸を手術の１週間後に取り外した。
【０２７５】
１．２  ＥＣＧモニタリング
【０２７６】
１２誘導ＥＣＧ（ＭＡＣ８０００，ＧＥ，ＵＳＡ）を、手術の前、直後（手術の全ての処置の約２時間後）、手術の４及び８週間後の時点において、２５ｍｍ／秒の紙送り速度（paper  velocity）及び１０ｍｍ／ｍＶの振幅の小児用電極の使用によりそれぞれのサ
ルの仰臥位で記録した。サルの胸壁は、十分な幅がないので、小児用電極であっても、同時に６個の胸部誘導ができなかった。したがって、６個の胸部誘導を２つの群にわけ、Ｖ１、Ｖ３及びＶ５が一方の群において記録し、Ｖ２、Ｖ４及びＶ６が他方の群において記録した。
【０２７７】
１．３  心エコー法
【０２７８】
断層心エコー法による測定を、３つの連続心周期を伴う標準的な心尖部の２個及び４個の腔像で実施した。フレーム率は、７０ｆｐｓ〜１００ｐｆｓに保った。全てのサルを、手術前、手術の４及び８週間後の時点において、１０．３ＭＨｚのトランスデューサー（Ｐ１０−４，Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＡＣＵＳＯＮ  Ａｎｔａｒｅｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｒｍａｎ）により左側位で経胸壁心エコー法による評価に付した。
【０２７９】
左心室の駆出率（ＥＦ）を、シンプソン一面法（Simpson's  single-plane  method）
により評価した。左心室拡張終期容積（ＬＶＥＤＶ）及び収縮終期容積（ＬＶＥＳＶ）を直接記録し、ＥＦ＝（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ×１００％とした。左心室の一回拍出量を、ＳＶ＝ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶとして算出した。
【０２８０】
１．４  心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
【０２８１】
全てのサルは、１０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．２ｍｇ／ｋｇのミダゾラムの筋肉注射により麻酔し、挿管して呼吸を補助し、医療用３．０−Ｔスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で仰臥位で治療の前後に、心臓専用のフェーズドアレイコイル及びＥＣＧトリガを使用して観察した。シーケンストリガ用ＥＣＧは、ＭＲ実験の最も重要な基礎の１つである。機能的試験（シネＭＲＩ）は、息止め、短軸、定常状態自由歳差シーケンスを使用して実施した（左室全体を対象。息止めごとに１スライス。ＴＲ／ＴＥ、心拍間隔／最小。スライス厚、１０ｍｍ。セグメント当たりの画像数、８）。ガドペンテト酸ジメグルミンで増強した取得を以下のように行った。心室短軸に沿って、この造影剤の１回目通過時に５０心拍数に対して、交互切れ目つき飽和分割化（interleaved  notched  saturation  segmented）グラジエント−エコー−エコー−プラナーハイブリッドパルスシーケンスを使用し
て取得を行い（心拍ごとに５つの画像による血流スキャン。間隔時間、１６０ミリ秒。５ｍＬ／秒にて送達される左側０．１ｍｍｏｌ／ｋｇの静脈内ボーラス）、続いて左室短軸に沿った反転回復準備済み（inversion-recovery  prepared）グラジエント−エコーシーケンス（息止めごとに１スライス、早期相及び遅延相それぞれに対して５スライス）を、早期及び遅延増強造影用にそれぞれ２回目の０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのボーラス投与後２分及び１０分後に実施して取得を行った（正常心筋をゼロ位にする反転時間は、早期及び遅延増強造影用にそれぞれ２００及び２５０ｍｓに固定された）。追加画像（４房室又は長軸）は、必要な場合に得た。総観察時間は、約３０分であった。
【０２８２】
ＭＲＩ画像解析：解析の際、画像は、コンピュータモニタ上に一般的に認められているソフトウェア、Ｓｙｎｇｏ  Ａｒｇｕｓにより表示され、このソフトウェアは、同じスライス中の心周期の異なる位相の画像が同じ行に表示され、また異なるスライスの心周期の同じ位相の画像が整列する点において便利であった。心臓ＭＲＩで最も一般的に使用されるシンプソン則の手法を用いて、一連の動的なシネＭＲＩ画像を解析することにより、心室容積の正確な評価を行い得る。乳頭筋が含まれるそれぞれのスライスの心筋の心内膜境界及び心外膜境界を画定するために手動でトレースされた輪郭から、拡張終期容積及び収縮終期容積、駆出率、一回拍出量を含む、心室容積及び全体の機能パラメーターを、Ｓｙｎｇｏ  Ａｒｇｕｓソフトウェアにより、シンプソン則を使用して自動的に決定し得る。
【０２８３】
梗塞サイズ：ランダム化かつ匿名化された画像は、心臓解析ソフトウェアを使用して解析された。梗塞サイズを推定するために、心内膜境界及び心外膜境界は、手動調整を伴ってＬＧＥ画像において自動的に分割され、続いてセグメントの埋め込み断片を使用して梗塞組織の自動描写を行う。必要な個所には手動修正を実施した。左室重量の百分率として表現される梗塞サイズは、（シネデータから）梗塞容量／左室容量として計算された。造影増強磁気共鳴画像法により決定された慢性梗塞サイズ測定結果には、再現性が見られた。
【０２８４】
１．５  銅超音波微小気泡治療
【０２８５】
手術処置の前に、全ての対象は、５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．２ｍｇ／ｋｇのミダゾラムの筋肉内注射を受けて、鎮静作用を誘導した。電極取付部位の胸部及び肢部を覆っている体毛を、微小気泡治療及び良好なＥＣＧ記録のために十分に剃った。静脈カテーテルを設置した。心筋梗塞の超音波誘導療法を実施した。銅微小気泡を、肢の後側を通る小伏在静脈を介して確立された静脈内進入路を介して、３日毎に注入した。それぞれの銅微小気泡治療の際に、超音波を心臓の梗塞域に向けることができるように、超音波プローブ（Ｖｉｖｉｄ  ７，Ｍ３Ｓ，ＧＥ）を胸部の前胸部に配置した。メカニカルインデックスを１．２に設定した。それぞれの注入の後、循環系を介して心室に到達した銅微小気泡を、超音波出力誘発により破裂させた。同時に、超音波プローブを、心臓の心尖部と僧帽弁との間の短軸に沿って前後に若干動かした。それぞれ注入された銅微小気泡が破裂した後、それぞれの治療の用量（２ｍＬ／ｋｇ）が終了するまで、次の注入が後に続いた。治療を３日に１度実施した。治療の前及びそれぞれのサルが８回の治療を受けた２週間後、心機能及び構造を評価して、治療効果を評価した。
【０２８６】
１．６  侵襲性血行動態測定
【０２８７】
侵襲性圧・容積法は、左心室性能の圧力測定を可能にし、他の利用可能な心機能測定に対する利点を提供する。心エコー法による検知と組み合わせて、心機能を包括的に測定した。この手順は、実験の最終採取の前に限って実施した。
【０２８８】
Ｐｏｗｅｌａｂ（１６チャンネル、ＡＤｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．）レコーダーを、３Ｆカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）に接続した。圧力を製造者の推奨に従って較正した。
【０２８９】
麻酔剤の筋肉注射により麻酔を掛けた。連続的で安定した鎮静作用のために、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）をミダゾラム（０．２ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて使用する。サルの頸部を清浄し、覆っている体毛を剃った。次に動物を手術台に仰臥位で載せた。静脈内進入路を、２５ゲージ静脈留置針により小伏在静脈を介して確立した。食塩水により２０ｍＬの最終体積に希釈した１０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び２０ｍｇ／ｋｇのプロポフォールで麻酔を維持した。混合物を、シリンジポンプにより１ｍＬ（ｋｇ・時間）−１の速度で連続的に注入した。血行動態指数の収集の際に妥当な結果を得るために、薬物を正確に使用し、最適化に注意しながら、麻酔の維持に注意を払う必要がある。僅かに規格外の用量でも、心臓機能に顕著な影響を与える場合がある。
【０２９０】
３〜４ｃｍの長さの外科的切開を頸部の左側部分に行い、皮下組織及び筋肉面を、顔面皮膚と頸部皮膚（cutaneous  facii  and  cutaneous  colli）との間で解剖した。気管
と胸鎖乳突筋（sternomastoideus）との間の顔面を解剖して、頸動脈を触診し、頸動脈鞘の場所を見つけ出した。右頸動脈の外科的解剖及びカニューレ挿入は、左心室への最も直接的で適時の信頼できる進入路を提供し、頸動脈のＣＴ走査及び３Ｄ再構築によって確認される。
【０２９１】
総頸動脈を、２ｃｍの長さの鈍的切開を使用して分離した。必要であれば動脈遠位を結紮して、血液の喪失を低減させた。近位血管を、０手術用絹縫合糸で制御し、近位を血管鉗子で閉塞した。露出した動脈を２％リドカインに浸けて、血管を拡張させ、進入を促進させた。
【０２９２】
頚動脈管を小血管切開により開き、３Ｆ  Ｍｉｌｌａｒカテーテルを動脈内に入れ、次に、血管鉗子を取り外した。
【０２９３】
カテーテルを左頸動脈に沿って、左心室まで徐々に進めた。次に、近位血管制御を締めた。
【０２９４】
カテーテルシャフトの位置を設定し、正確な測定及び記録のため、超音波補助検出下において、左心室の軸に沿って回転させて尖端を最適に配置した。数字の８又は不規則なループを示す、左心室腔の外側にある近位コンダクタンス電極セグメントは、大動脈測定値を示し、これらの近位セグメントにより検出された容積は、除外する必要がある。あるいは、カテーテルを左心室の中に更に進める必要がある。カテーテルの尖端が心尖部と向かい合っていること、及びコンダクタンスカテーテルが、安定した直進位置を心室腔のおよそ中間に保って、壁への接触を回避することを確実にする必要がある。必要であれば、カテーテルの位置を調整して、規則的な圧・容積ループを得る必要がある。
【０２９５】
一定時間の安定化の後、ドブタミンを、１０μｇ・ｋｇ−１／ｍｍ−１の出発用量、続く３０，５０、７０μｇ・ｋｇ−１／ｍｍ−１の増加用量で注入ポンプにより、それぞれの段階において３分間注入した。ドブタミンによる刺激下の心臓性能を、機器により連続的かつ同時に記録した。全てのサルの、ドブタミン注入前の心拍数と定義される基礎心拍数（ＨＲ）及び基礎心拍数の１１０％、１２０％、１３０％、１４０％での＋ｄＰ／ｄｔ最大、−ｄＰ／ｄｔ最小、ＬＶＤＰを収集し、分析した。
【０２９６】
１．７  組織病理学的検査
【０２９７】
サルを、塩化カリウム（１０％、１０ｍＬ）の静脈注射により殺処分し、完全な剖検を実施した。採取した心臓を洗浄し、可視病巣について肉眼で検査し、１０％ホルムアルデヒド溶液に固定した。次に、心臓を、長軸に沿って心尖部から底部まで６つのブロックに切断した。それぞれのブロックの厚さを０．５ｃｍに定めた。それぞれの切片の表面が、切開の際に平坦及び均一であること及び切片がラベルの付いた結紮糸により標識されることを確実にする。薄切片を顕微鏡検査のために切断し、マッソン及びＨ／Ｅで染色した。
【０２９８】
抗体：マウス抗ヒトＨＩＦ−１αモノクローナル抗体：ａｂ１６０６６、Ａｂｃａｍ；マウス抗ヒトＶＥＧＦＡモノクローナル：ｓｃ−５７４９６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；ウサギ抗ヒトＶＥＧＦＲ１モノクローナル抗体：１３０３−１２、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ；マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体：Ｍａｉｘｉｎ  ｂｉｏ−ｔｅｃｈ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｕｚｈｏｕ。ＨＩＦ−１αの抗原賦活化（antigen  retrieval）は、ｐＨが９．０であるＥＤＴＡによる高圧加熱誘導性抗原賦活化であり、一方、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１は、ｐＨが６．０であるクエン酸緩衝溶液によるマイクロ波加熱誘導性抗原賦活化であり、ＣＤ３１は、ＥＤＴＡによるマイクロ波加熱誘導性抗原賦活化である。ＨＩＦ−１αの作用濃縮は、１：８００であり、ＶＥＧＦは１：１００であり、ＶＥＧＦＲ１は１：１００であった。免疫組織化学検出の過程では、ＰＢＳを最初の抗体の陰性対照とし、正確なタンパク質発現が特定されたスライドを陽性対照とした。Ｋｉ−６７標識を共焦点により免疫蛍光検査した。
【０２９９】
毛細血管密度：最初に、最大毛細血管分布視野を１００倍光学顕微鏡で決定し、次に、５つの無作為化視野を２００倍光学顕微鏡により集め、毛細血管密度を測定した。毛細血管は、それぞれの内腔の直径が８つの赤血球の直径の合計を下回るものと定義した。測定は、２人の別々の技術者によって実施された。
【０３００】
タンパク質発現半定量分析：Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．０画像分析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｍｅｔｉｃｓ）を使用して、タンパク質半定量発現を分析した。免疫組織化学スライドを観察し、光学顕微鏡下で撮影された。異なる群のスライドを２人の独立した技術者が評価し、２人の技術者の間に有意な差はなかった。それぞれのスライドの、境界域及び梗塞からの遠隔域の５つの無作為化視野を４００倍光学顕微鏡下で撮影した。
【０３０１】
１．８  ウエスタンブロット
【０３０２】
組織調製：心臓を胸部から取り出した。左心室壁を注意深く検査し、梗塞域、境界域、及び遠隔域を分けた。梗塞域は、淡い外観として非梗塞域と区別することができる。境界域は、梗塞域の内側１ｍｍから外側３ｍｍの区域として定義される。試料をウエスタンブロット分析のために液体窒素に貯蔵した。
【０３０３】
ウエスタンブロット：液体窒素内のそれぞれの組織を粉砕し、１％完全ＥＤＴＡ無含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，ＤＥ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，ＣＮ）において、氷上で４０分間溶解させて、タンパク質抽出物を得た。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，２３２２７，ＵＳＡ）により決定した。それぞれの等量のタンパク質（３０μｇ）を５×ＳＤＳ試料緩衝液に可溶化し、１０％ＳＤＳと８％ポリアクリルアミドゲルに分けた。次に、タンパク質を、フッ化ポリビニリデン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に電気泳動的に移動させた。膜を、５％の脱脂粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩／Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０）において１時間遮断し、供給者の推奨に従ってブロッキング溶液中の、抗ＨＩＦ−１α（Ａｂｃａｍ，ａｂ１１３６４２、ＵＳＡ）、抗ＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ５７４９６、ＵＳＡ）及び抗ＶＥＦＧＲ−１（Ａｂｃａｍ，ａｂ３２１５２，ＵＳＡ）などの対応する一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、膜を適切な二次抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。標的タンパク質を、化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）の使用により可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの使用によりデンシトメトリーで分析した。
【０３０４】
１．９  ＨＩＦ−１標的遺伝子のｍＲＮＡレベル
【０３０５】
虚血心筋におけるＨＩＦ−１転写活性を定義するため、ＨＩＦ−１標的遺伝子ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰｃＲにより検査した。
【０３０６】
全ＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６−０２６，ＵＳＡ）の使用により単離した。１μｇの全ＲＮＡを、プロトコールに従い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ，ＲＲ０３７Ａ，Ｊａｐａｎ）を３７℃で１５分間、続いて８５℃で５秒間及び４℃で５分間使用して逆転写した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩ（ＴａＫａＲａ，ＲＲ８２０Ａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１のｃＤＮＡフラグメントを増幅するために、試料を、９５℃で３０秒間、続いてそれぞれ以下の温度変動：９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を有する３５サイクルによって変性する、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して処理した。増殖曲線の対数線形相の結果を分析し、相対的定量化を２−ΔＣＴ法の使用により実施した。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１の遺伝子発現レベルは、それぞれの試料においてアクチンと比べて表す。それぞれの試料において少なくとも３回の反復を重ねた。プライマー配列を表１に示す。
【表１】
2020143158.tif 000003
【０３０７】
１．１０  心臓におけるＣｕ濃度
【０３０８】
組織試料を、新たに凍結し、凍結乾燥する前に−８０℃で保存した。凍結乾燥し、硝酸で組織を蒸解した後、蒸解物は、無色又は明黄色の明澄であり、眼に見える沈殿物又は残留物はなかった。超純水をそれぞれの容器に加えて、続く銅の分析のため、ＨＮＯ３を２％に希釈した。銅濃度は、表２に示されているプログラムを使用してグラファイト炉原子吸光分光法（ＩＣＥ３５００，Ｔｈｅｒｍｏ）により決定した。
【表２】
2020143158.tif 000004
【０３０９】
１．１１  統計分析
【０３１０】
全てのデータを平均±ＳＤで表した。それぞれのパラメーターの変動を、Ｌｅｖｅｎｅ検定及び変動係数（ＣＶ）の均一性の使用により４つの群の間で比較した。ＳＰＳＳ  １４．０統計パッケージ（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用し、Ｐ値が＜０．０５の場合、有意な差があると推定した。
【０３１１】
２．結果
【０３１２】
２．１  心機能及び心予備力
【０３１３】
心エコー法による検査は、銅微小気泡治療の後、左心室駆出率が有意に増加したことを示した。しかし、未治療群及び微小気泡群では、左心室駆出率は、やがて減少した（図１６Ａ）。また、心機能のこの回復は、ＭＲＩ実験により確認された（図１６Ｂ）。更なる調査により、左心室駆出率の改善は、左心室の収縮終期容積の有意な減少（ｐ＜０．０５）をもたらしたことが見出された。左心室のそれぞれの収縮の後、残留血液は、銅微小気泡治療群では顕著に低減され、このことは、左心室の収縮機能が有意に改善した（ｐ＜０．０５）ことを意味する（図１７）。
【０３１４】
侵襲性血行動態測定を、薬物ストレス条件下で実施した。ドブタミン用量の増加に応答して心拍数が上昇すると、心予備力パラメーターを基本比率の１００％〜１４０％の心拍数上昇であると評価した。ｄＰ／ｄｔ最大、ｄＰ／ｄｔ最小及び左心室発生圧（ＬＶＤＰ）の絶対値の増加に伴って、心予備性能が改善された。侵襲性血行動態測定は、未治療及び微小気泡治療群と比較して、最大ｄＰ／ｄｔ（図１８Ａ）、最小ｄＰ／ｄｔ（図１８Ｂ）及びＬＶＰＤ（図１９）が銅微小気泡治療群において有意に改善した（ｐ＜０．０５）ことを示した。
【０３１５】
２．２  梗塞サイズ
【０３１６】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により測定された心筋の梗塞容積に対する治療の効果を、治療開始前と、治療に続く２週間の観察後とに推定した。比較解析からは、銅−アルブミン超音波造影微小気泡（Ｃｕ＋ＭＢ）治療群における梗塞サイズが、治療前の梗塞サイズと比較して明白に低減されたことが示された（図２０）。しかし、未治療群及び微小気泡のみ（ＭＢ）治療群では、梗塞サイズは、有意な変化を示さなかった。その結果から、虚血心の回復における梗塞サイズの低減に対する銅−アルブミン超音波造影微小気泡（ＣＡＵＣＭ）治療の治療的効果が確認された。
【０３１７】
２．３  免疫組織化学
【０３１８】
毛細血管密度：ＣＤ３１は、内皮細胞のマーカーであった。境界域及び梗塞域において、免疫組織化学検査は、多数のＣＤ３１標識毛細血管が銅微小気泡群に存在し（図２１及び図２２）、未治療及び微小気泡群よりかなり多い（ｐ＜０．０５）ことを示した。毛細血管密度の統計図は、ＣＤ３１標識毛細血管密度が銅装填微小気泡治療の後で境界域及び梗塞域において有意に増加したことを示した。＊＊はｐ＜０．０１を意味する。局所血流が有意に改善した。
【０３１９】
Ｋｉ−６７陽性細胞は、共焦点による細胞繁殖活性の代表であった。データは、銅装填微小気泡治療後に、多数の繁殖細胞が梗塞域に現れたことを示した。梗塞域のＨＩＦ−１αは、免疫組織化学によって検出された。データは、ＨＩＦ−１αが主に常在心筋細胞及び内皮細胞のサイトゾル及び核に位置することを示した。ＨＩＦ−１αのレベルは、梗塞域において明白に発現上昇した（図２４）。図２４は、ＨＩＦ−１αが心筋細胞及び内皮細胞のサイトゾル（矢印）及び核（矢じり）に存在することを示した。ＨＩＦ−１αの発現は、梗塞域において上昇した。
【０３２０】
ＨＩＦ−１αのタンパク質レベルは、ウエスタンブロット法により示されているように、他の区域と比較して梗塞域において有意に増加した。図２５は、それぞれの群の異なる部分におけるＨＩＦ−１αのタンパク質レベルを示し、図２６は、それぞれの群の梗塞心筋におけるＨＩＦ−１αの発現を示す。
【０３２１】
ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１は、ＨＩＦ−１制御遺伝子である。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで試験して、ＨＩＦ−１の転写活性を明らかにした。図２７及び図２９に示されているように、これらの２つの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、未治療及びＭＢ群において著しく低減したが、Ｃｕ治療群では有意に増加した（図２８、図３０）。このことは、慢性低酸素症がＨＩＦ−１の転写活性の抑制をもたらし、これをＣｕ治療によって回復できることを示している。
【０３２２】
心筋におけるＣｕ濃度を、ＡＡＳにより決定した。図３３に示されているように、Ｃｕ濃度は虚血心筋のＣｕ治療の後で増加している。
【０３２３】
虚血発作に心筋が応答するＨＩＦ−１α蓄積の機構は、ＰＨＤの調節を伴う。ＰＨＤ酵素活性は、酸素、還元鉄、及び２−オキソグルタル酸を必要とする。加えて、これらの酵素は、電子輸送鎖並びにミトコンドリア代謝及び機能の妨害により生成される活性酸素種が挙げられる、多くの代謝変化よって影響を受ける酸素利用性に敏感である。したがって、ＰＨＤタンパク質は、酸素センサーとして作用し、ＨＩＦ−１転写活性の変化に関連する。したがって、虚血心筋における酸素不足は、ＰＨＤ機能を損ない、このことは、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１応答性遺伝子産物の蓄積の増加を伴う。急性心筋虚血は、ＨＩＦ−１αの蓄積及び血管新生に関与しているＨＩＦ−１制御遺伝子発現の増加をもたらす。初期研究は、急性虚血の病理学的証拠を有する、冠動脈バイパス術を受けた患者の心室生検標本において、ＨＩＦ−１α及びＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ、並びにタンパク質の増加を見出した。動物モデル研究において、全身性虚血が広範囲のＨＩＦ−１αの上昇及び心臓発作をもたらしたことも見出した。
【０３２４】
ランゲンドルフ構成により順行的に潅流させた単離ラットの心臓を使用する初期研究は、短時間ではなく蔓延性の心虚血の直後に冠血流中の実質的な銅の動員の直接的な証拠を生成した。単離ラットの心臓のランゲンドルフ潅流では、銅のレベルは、虚血の３５分後の最初の再潅流の冠血流割合（ＣＦＦ）（０．１５ｍＬ）の虚血前値より８〜９倍高かった。続くＣＦＦのレベルは減少し、虚血前の値に達し、銅が冠血流の再開のバーストと思われることを示している。虚血の１８分後、再潅流の最初のＣＦＦにおける銅レベルは、虚血前値の僅か１５％であった。最初のＣＦＦにおける銅の喪失は、心機能喪失の程度と十分に相関する。虚血の１８分後、心機能は約５０％であり、損傷は可逆的であるとみなされたが、３５分後では、機能喪失は８０％を超え、非可逆的であるとみなされた。したがって、心臓における長時間の虚血後の銅の喪失は、虚血性毒性を直接もたらすと考えられる。
【０３２５】
心筋虚血におけるホモシステインレベルの増加が長い間知られており、心筋の病理における危険因子であるとみなされてきた。血中銅及びホモシステインは、心血管疾患を有する患者において同時に上昇したことが観察されている。心臓からの銅流出はホモシステインと関連すると推測することが妥当である。銅とホモシステインとの間の相互作用を示す数連の証拠が存在する。第１には、高ホモシステイン血症が、高濃度の血中銅、並びにセルロプラスミンと関連することが、常に観察されている。第２には、銅及びホモシステイン錯体がインビントロで特定されている。第３には、銅補充が、ホモシステイン曝露の状態で銅依存性酵素活性を回復させる。これらの観察は、まとめて、銅とホモシステインとの間の相互作用が心臓銅流出の原因であり得ることを示唆している。
【０３２６】
銅は、プロリルヒドロキシラーゼの阻害を伴う機構によりＨＩＦ−１αを安定化することができる。しかし、この銅の作用は、コバルト及びニッケルなどの他の遷移金属と同じであり、ＨＩＦ−１活性化にとって必須ではないが、細胞が過剰量のこれらの遷移金属に曝露されたときＨＩＦ−１活性を増大させる。本発明者たちの研究は、銅がＨＩＦ−１転写活性に必要であることを示している。培養細胞における銅キレート化は、低酸素応答性要素（ＨＲＥ）へのＩＧＦ−１誘導性ＨＩＦ−１結合及びＶＥＧＦ発現を遮断する。この阻害効果は、培養物への過剰量の銅の添加によって軽減することができる。加えて、本発明者たちは、この銅作用が、Ｃｕ，Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＣＣＳ）の銅シャペロンに依存し、ＣＣＳ遺伝子サイレンシングは、ＩＧＦ−１誘導性ＨＩＦ−１  ＨＲＤ結合及びＶＥＧＦ発現を遮断し、銅キレート化の効果を模倣することを見出した。更に、ＣＣＳは、ＨＩＦ−１αと直接相互作用し、このことは免疫沈降アッセイによって明白となった。
【０３２７】
ＨＩＦ−１α合成、安定化、サイトゾルから核への転位、標的遺伝子のＨＲＥ配列への結合及びＨＩＦ−１転写複合体の形成が挙げられる、ＨＩＦ−１の活性化に潜在的に銅を必要とする多数の部位が存在する。本発明者たちは、ヒト肝細胞癌ＨｐｅＧ２細胞のＨＩＦ−１転写活性の制御における銅の作用機構を特定した。銅キレート剤であるテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）又はｓｉＲＮＡを標的とするＣＣＳによるＨｅｐＧ２細胞の処理は、ＨＩＦ−１の低酸素誘導活性化を抑制した。過剰量の銅の添加は、ＴＥＰＡによる抑制を軽減したが、ＣＣＳ遺伝子サイレンシングでは軽減しなかった。このＣＣＳ遺伝子サイレンシングの結果は、ＴＥＰＡの非特異的キレート化の起こり得る交絡効果を除外している。したがって、このデータは、銅がＨＩＦ−１の活性化に必要であるが、作用はＣＣＳ依存性であることを示している。銅の欠乏は、ＨＩＦ−１αの産生又は安定性に影響を与えなかったが、標的遺伝子のＨＲＥ配列及びＨＩＦ−１転写複合体の構成要素であるｐ３００へのＨＩＦ−１αの結合を低減させた。銅は、ＦＩＨ−１を阻害して、ＨＩＦ−１転写複合体の形成を確実にする可能性がある。したがって、銅は、ＨＲＥへのＨＩＦ−１α結合の制御によるＨＩＦ−１活性化及びＨＩＦ−１転写複合体の形成にとって必要であると結論づけられた。したがって、銅の欠乏は、ＦＩＨ−１抑圧によりＨＩＦ−１転写活性を抑制する。
【０３２８】
概念の実証として、本発明者たちは、銅の食餌補給を、肥大型心筋症のマウスに使用した研究を行った。このマウスに、上行大動脈狭窄により圧負荷を掛け、心肥大を処置の４週間後に発生させた。生理学的に適切なレベルの銅を有する食餌補給を、心肥大が発生した後に開始した。銅補給の４週間後、既に確立されていた肥大型心筋症が逆転し、この逆転は、圧負荷の連続的存在下で生じたことが見出された。持続的な圧負荷により、心筋の血管新生の抑制を伴って、心臓の銅のレベル及びＶＥＧＦのレベルを減少させた。銅補給は、心臓の銅を補充し、ＶＥＧＦを増加させ、血管新生を促進させた。
【０３２９】
ＨＩＦ−１は、構造的に発現したＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）及びＨＩＦ−１β（又はＨＩＦ−２β）から構成され、これは、好気条件下での２つの工程（サイトゾル及び核）のヒドロキシル化調節に付される。サイトゾルでは、ＨＩＦ−１βは、Ｏ２を基質として使用する３つの主なプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）によるプロリルヒドロキシル化に付される。ヒドロキシル化ＨＩＦ−１βは、フォン・ヒッペル・リンダウタンパク質（ｐＶＨＬ）に結合し、これはユビキチン化及びプロテアソーム分解のためにＨＩＦ−１βを標的にする。核では、ＨＩＦ−１βは、補助因子ＳＲＣ１、ＣＢＰ及びｐ３００と相互作用する。これは、アスパラギンヒドロキシラーゼにより又はＨＩＦ−１を阻害する因子（ＦＩＨ−１）により阻害される。ＦＩＨ−１もまたＯ２依存性酵素である。低酸素状態では、ＰＨＤ及びＦＩＨ−１は阻害され、プロテアソーム分解からのＨＩＦ−１βの逃避及びＨＩＦ−１転写複合体形成の促進、それ故に転写因子の活性化をもたらす。Ｃｏ及びＮｉは、ＰＨＤを阻害することが示されており、それ故に低酸素状態を模倣し、ＨＩＦ−１β活性化をもたらす。過剰量のＣｕもまたＰＨＤを阻害し、Ｃｏ及びＮｉと同じ効果をＨＩＦ−１βに対して引き起こす。しかし、Ｃｕは、ＨＩＦ−１とＨＲＥとの間の相互作用に必要であり、ＦＩＨ−１の生理学的阻害剤として作用して、確実にＨＩＦ−１複合体転写複合体を形成させる。したがって、Ｃｕ欠乏は、ＨＩＦ−１活性を阻害する（図３４）。
【０３３０】
心筋虚血は、ＨＩＦ−１αの蓄積及び銅の枯渇をもたらす。銅がＨＩＦ転写複合体形成に必要であり、ＨＩＦと標的遺伝子におけるＨＲＥ配列との相互作用に必要であるので、この条件下において、ＨＩＦαの蓄積をＨＩＦ転写活性に変換することができない。したがって、ＨＩＦの蓄積が虚血性心筋において生じるが、銅の欠乏は、血管新生に関わる遺伝子のＨＩＦ制御発現を遮断し、心筋の血管新生の抑制をもたらす。このことは、心筋梗塞をもたらし、更に心不全へと進行させる。
【０３３１】
したがって、本研究は、心筋梗塞治療のために局所性虚血域の銅含有量を増加させるために破裂する超音波誘引性（ultrasound  triggering）銅微小気泡による、銅の標的化送達によって実施された。結果は、ＨＩＦの転写活性が梗塞域において増加し、毛細血管密度も有意に増加したことを示した。更に、心エコー法検査は、銅微小気泡治療後、心機能が改善したことを示した。加えて、心予備力が銅治療群において対応して増大した。この実験の結果は、この超音波誘導銅微小気泡の破裂が心筋梗塞の治療のために銅を送達する新規戦略であるという強力な証拠を提供した。
【０３３２】
実施例３  ラットの虚血性脳傷害の銅含有生物材料による治療
【０３３３】
脳虚血の治療のための新たな方法を探求するために、本実施例は、虚血ラットモデルを治療するために銅ナノ材料を利用して、血管新生に対する治療効果を検査した。
【０３３４】
１．実験方法
【０３３５】
１．１  ラット虚血モデルの確立
【０３３６】
健康な雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、体重２７０±１５ｇ）を一定温度及び湿度並びに１２時間の交互明暗サイクルを有する室内で育てた。ラットを、１２時間の術前絶食及び飲料水の自由供給により処置した。
【０３３７】
１．２  技術的手法
【０３３８】
ラットを以下の５つの群に無作為に分けた。偽群、ＩＲ群、ＩＲ＋Ｃｕ群、ＩＲ＋ＮＭ群、ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭ群。脳虚血ラットに、外科手術の７日後にそれぞれ同じ量のＣｕ、ＮＭ、Ｃｕ−ＮＭ材料１０ｍｕ（Ｌ）を定位固定心室に注射し、神経機能スコア及びＴＴＣ染色を１４日間実施した。次に、脳組織を、免疫組織化学検出のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０３３９】
１．３  中大脳動脈閉塞及び再潅流モデル（ＭＣＡＯ）の調製工程
【０３４０】
気管カニューレ及び人工呼吸器を用いることなく、１０％抱水クローラル（０．３５ｍＬ／１００ｇ）腹腔内注射により麻酔を掛けた。ラットの四肢が動かず、呼吸数が３０〜６０回であり、眼が閉じたままである場合に、ラットの麻酔が成功したと考えた。以下の手順は、改善された縫合糸による中大脳動脈閉塞モデルを製造するための縫合閉塞方法である、Ｋｏｉｚｕｍｉ及びＬｏｎｇａ方法（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｌｏｎｇａ  ＥＺ，１９８９）に従って実施した。従来の方法は、０．２０〜０．２５ｍｍの直径有し、その先端が炎熱により丸められている４−０ナイロンモノフィラメント縫合糸により実施された。先端が十分に大きくないので、血管を完全に遮断することができず、逆流をもたらした。０．３２ｍｍの直径及びシリカゲルで覆われた５ｍｍの先端を有する改変縫合糸には、１８ｍｍごとに目印が付けられた。先端においてシリコーンで被覆された縫合糸の外側を、漏れが発生することなく、血管の内壁に適応して擦り付けることができる。したがって、逆流の割合が低減されるので、モデルの成功率を上昇させることができる。
【０３４１】
麻酔後、ラットを手術台に載せた。直腸温を、外科的処置の際に加熱パッドを用いて３７．０℃に維持した。頸部体毛を剃り、手術域をポビドンヨードで消毒し、７５％エチルアルコールで脱ヨウ素化し、滅菌手術用ドレープを準備した。組織用ハサミ（tissue  scissors）により前正中線にそって頸部皮膚を３ｃｍの長さで切り取った後、頸筋及び甲状腺を、総頸動脈（ＣＣＡ）を露出するまで血管鉗子により思い切って引き離し、次に頸動脈に沿って上向きに全動脈（total  artery）を引き離して、外頸動脈（ＥＣＡ）、内頸
動脈（ＩＣＡ）を露出した。ＥＣＡの遠端を結紮して、頸動脈血流を一時的な挟みにより遮断し、小さい切開をＣＣＡに作った。縫合糸を、小さい切開を通ってＣＣＡに挿入し、次に、ＣＣＡにそってゆっくりと穏やかに進めて、一時的な挟みにより誘導される妨害物に達するまで遮断した。次に、一時的な挟みを開放し、縫合糸を直ぐに内頸動脈内に押し込んだ。縫合糸を進める際に抵抗が感じられる場合、縫合糸の尖端は前大脳動脈に進入し、縫合糸の側壁は中大脳動脈を閉塞しており、縫合糸を停止して、縫合糸が翼突口蓋動脈に進入することを避けるべきである。翼突口蓋動脈は、ＩＣＡの頭蓋外枝（external  cranium  branch）である。縫合糸は、翼突口蓋動脈に挿入される場合、１０ｍｍの深さで
進むべきではない。縫合糸を引き抜き、方向を正確に制御すれば、再びＩＣＡに挿入することができると考えられる。次の手順は、筋肉を縫合し、皮膚切開のヨウ素消毒が続き、ラットを３３℃の加湿チャンバーにおいて滅菌包帯で覆って麻酔からの回復を促進した。ＭＣＡＯの９０分後、麻酔を再び施し、縫合糸を引き抜いて血液を再潅流させた。抵抗を感じたときに縫合糸の引出を止めた。抵抗は、縫合糸の先端が総頸動脈の股部（crotch）に到達したことを実証しており、次に皮膚の外側にある縫合糸を切断する。体温及び生理食塩水補給の維持が必要である。４０００００単位のペニシリンを筋肉内注射して、感染を予防した。
【０３４２】
１．４  術後脳傷害の評価
【０３４３】
神経学的重症度スコア：理想的なＭＣＡＯラットは、意識が回復した後に様々な程度の神経学的機能不全を示した。前肢片麻痺が主な症状であり、頭部を身体の反対側に移動させ、よじ登ると、旋回又は落下し、モデルを持ち上げると、身体の片側への屈曲及び後肢の屈曲も生じた。観察の際に生存率を計数した。
【０３４４】
神経学的機能不全スコアは、ラットが覚醒した後に実施した。１８ポイントのスコア付け基準をこの実験に使用した（表３）。ＭＮＳＳスコア付けシステム（合計１８ポイント）を以下のように分けた。１．運動（スコア６）：尾が持ち上げられているときの、反対側の前肢の屈曲度の観察。２．感情（スコア２）：深い感覚及び浅い感覚。３．平均台検査（スコア６）：虚血後の神経学的欠損に適応する平衡状態の観察。４．反射（スコア４）：耳介、角膜、瘢痕、及び痙攣などの反射が挙げられる。「０」は正常を示し、「１８」は最も重症であることを示す。軽度の傷害：１〜６、中程度の傷害：７〜１２、重度の障害；１３〜１８。明かな神経学的機能不全を有さなかった虚血及び再潅流の後では、ラットを、再潅流の２４時間後に研究から除外した。
【表３】
2020143158.tif 000005
【０３４５】
梗塞域の測定：ミトコンドリアのスクシノデヒドロゲナーゼとのＴＴＣ（２、３、５回の塩素化、トリフェニルテトラゾリウム）反応を使用して、細胞の活性を検出した。ＴＴＣ染色は、虚血性傷害脳切片を白色に染色した。ＴＴＣ染色（２％）は、３７℃の条件下で照明を用いることなく実施した。脳試料を異なる時間に採取し（群あたり１８個）、予め−２０℃で保存した組織切片成形型に入れた。脳を、１０分間凍結した後、切片型において嗅球から後頭葉まで、切片１個あたり２ｍｍの厚さで６個の切片に切断した。次に、切片を２％ＴＴＣに浸け、３７℃のインキュベーターに３０分間入れ、次に１０％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。
【０３４６】
ＴＴＣ染色は、脳組織切片のどの部分が低酸素症を患ったかを示した。このため、脳傷害のＴＴＣ標識スコアは、脳虚血サイズの検出に広く使用されてきた。それぞれの切片画像をデジタルカメラ（Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ  ４００デジタルカメラ，Ｃａｎｏｎ  Ｃｏｒｐ）で集め、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで処理して、脳傷害の面積を算出した。同時に、本発明者たちは、変更した式を使用して、脳傷害の実際の体積に対する脳水腫の影響によってもたらされた偏差を除外した。修正（％）＝［反対側脳半球面積−（傷害脳半球面積−脳損傷面積）］／反対側脳半球面積｝×１００％。
【０３４７】
脳萎縮指数の決定：この実験は、慢性期における脳梗塞の変化を研究するために実施し、脳梗塞域は、１０日間で異なる萎縮度を示し、１４日間で最も明白であった。脳萎縮度の計算は、脳梗塞域の計算と類似している。脳梗塞半球の脳萎縮指数（％）＝｛（脳半球体積−反対側脳半球梗塞体積）／反対側脳半球体積｝×１００％。
【０３４８】
１．５  銅生物材料の調製
【０３４９】
この例は、（ヒスチジン、アルギニン及びグリシンから構成される）Ｃｕ２＋結合部位を有する短ペプチド材料を設計した。短ペプチドをＣｕ２＋と組み合わせて、ナノファイバーナノ生物材料から構成される安定したヒドロゲル試料（８０μＭのＣｕＳＯ４を含有するＣｕ−ＮＭ）を形成することができる。Ｃｕ−ＮＭは、傷害組織及び器官の特定に場所においてＣｕ２＋をゆっくりと放出し、かつ、銅の生物学的機能を有効に利用し、同時に正常な組織及び器官への銅イオンの副作用を除外することによって虚血性傷害組織器官の再生を促進する、機能を有する。
【０３５０】
１．６  定位固定技術による銅−ナノメートル材料の静脈内注射
【０３５１】
ラットの側脳室の場所：冠状面解剖マップ（coronal  plane  anatomy  map）は、ラットの側脳室が十字縫合の０．８ｍｍ後方、正中線の１．５ｍｍ側方、４〜４．５ｍｍの深さに位置するラットの側脳室を示した。この場所は、医薬の最適な注射部位である。
【０３５２】
脳虚血／再潅流の７日後、１０％抱水クローラル（３．５ｍＬ／ｋｇ）の腹腔内注射によりラットに麻酔を施した。麻酔を施し、頭頂領域の体毛を剃った後に、ラットを定位固定装置に固定した。一般的な滅菌化及び無菌タオルで覆った後、正中線に沿って皮膚に１ｃｍの切開を行って、十字縫合を露出した。脳組織を損傷することなく、頭蓋骨の正中線の側方１．５ｍｍ、十字縫合の０．８ｍｍ後方に、小さな穴をドリルで開けた。１０μＬのＣｕ−ＮＭ材料をシリンジで抜き取り、これを針の先端の位置に合わせるように固定及び調節した。次に、シリンジの針の先端を小さな穴に挿入し、脳組織の中に入れ、４．５ｍｍの深さで停止した。Ｃｕ−ＮＭ材料を注入し、注入が完了した５分後、シリンジを抜き出し、小さな穴を骨ろうで密閉した。皮膚切開を縫合した。一方、１０μＬのＣｕをＣｕ治療群に注入し、１０μＬのナノメートル材料を材料群に注入し、偽群及び対照群は治療しなかった。神経学的機能スコア及びＴＴＣ染色を実施して、脳の梗塞体積及び萎縮度を、治療後１４日目に測定した。
【０３５３】
１．７  病理の検出
【０３５４】
Ｃｕ、ＮＭ、Ｃｕ−ＮＭを、脳虚血／再潅流モデルを構築した後１週間以内に脳室に注入した。脳組織を治療後１週間以内に採取した（各群あたり５匹のラット）。麻酔を施した後、本発明者たちは、心臓を０．９％食塩水及び４％パラホルムアルデヒドで潅流させ、次に脳組織を素早く取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。脳の切片を視交差冠状切片のレベルで選択し、次に以下のように染色した。
【０３５５】
ＨＥ染色：試験片を１０％中性ホルマリンで固定し、脱水し、パラフィン処理し、パラフィンに包埋した。スライド及びカバーガラスを硝酸に一晩浸け、水道水及び蒸留水で清浄にし、次に、無水アルコールで拭き取り、無塵の場所に位置付けた。３７℃で乾燥した後、スライドをポリリシン錠剤で処理した。包埋ルーチンパラフィンは、一連の切片において４μｍであり、その後、６０℃のオーブンで乾燥させた。従来のＨ＆Ｅ染色の簡潔な工程は以下のとおりであった。（１）パラフィン水和よりパラフィンに包埋された組織切片（４μｍ）を取り出した。（２）組織切片をＨａｒｒｉｓヘマトキシリンに５分間散在させ、水で１分間洗浄した。（３）組織切片を７５％塩酸エタノールで３０秒間差異化し、水で１分間洗浄した。（４）組織切片をアンモニアで３０秒間処理し、水で１分間洗浄した。（５）組織切片を酸エオシンエタノールで１２分間染色した。（６）組織切片を水で素早く洗浄した。（７）組織切片を脱水して、切片を透明にした。（８）切片を中性ゴムで固定した。次に、脳梗塞域の病理変化を観察し、反対側の脳組織と比較した。
【０３５６】
免疫組織化学：血管新生を検出するために実施した。検出域には、梗塞区域、梗塞周囲域及び反対側の正常な脳組織が含まれた。ＣＤ３１で血管を標識した後、本発明者たちは、銅ナノ材料による介入の後、脳虚血における血管新生を検査した。免疫組織化学の簡潔な工程：（１）パラフィンに包埋された組織切片（４μｍ）からパラフィンろうを取り除いた。（２）３％Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）で内在性ペルオキシダーゼを停止させた。（３）１０％ウサギ血清により室温で３０分間遮断した。（４）ヤギ抗ラットＣＤ３１第一ポリクローナル抗体（１：２０００）において、４℃で一晩インキュベートした。（５）洗浄後、切片をヤギ抗ラットＣＤ３１第二ポリクローナル抗体（１：２０００）において、１時間インキュベートした。（６）複合酵素中、ホースラデッシュペルオキシダーゼ−アビジン（１：２００）においてインキュベートした。（７）ジアミノビフェニルアンモニア（ＤＡＢ）で染色した。
【０３５７】
１．８  統計処理
【０３５８】
データを、全ての結果における測定指標が平均±標準偏差（Ｘ±ＳＤ）であり、２つの群をｔ検定により比較する、ＳＰＳＳ１４．０（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）ソフトウェアにより統計的に分析した。複数の群を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ＬＳＤ検定及び変動により比較した。等分散性は推定せず、これは、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ法により修正することができる。検査レベルは、α＝０．０５であり、有意な統計差は、Ｐ＜０．０５である。
【０３５９】
２．実験結果
【０３６０】
２．１  術後観察、モデル形成の成功率及び生存率
【０３６１】
縫合糸を、内頸動脈を通って挿入し、９０分後に抜き出して、脳虚血／再潅流モデルを生成した。ラットが麻酔状態から回復したとき、身体の反対側への頭部の回転、反対側の前肢の脱力、反対方向への旋回又は落下、尾を持ち上げたときの反対側の前肢の下垂を含む症状を示した。３００個のＭＣＡＯモデルのうち、２１０個のモデルが成功し（成功率７０％）、３０個のモデルが不成功であり（１０％）、６０匹のラットが死亡した（２０％）（表４）。
【表４】
2020143158.tif 000006
【０３６２】
原因分析：２２匹のラットには、肢機能欠損が見られず、８匹のラットは軽度の麻痺症状を示し、２４〜４８時間後に回復した。考えられる原因は、縫合糸の不十分な深さであり、これは縫合糸の側壁と血管の内壁との間の間隙を出現させ、中大脳動脈への血流をもたらした。第２の原因は、縫合糸が皮膚切開の閉鎖の際に引き出されたことであり、このことが、不十分な閉塞をもたらした。第３は、血管の変形が、短時間の神経学的機能回復を伴って、虚血性傷害に対してより良好な抵抗性に寄与した。ＴＴＣ染色は、ＭＣＡＯ後に、いくつかの小さな梗塞のみがこの種類のラットの基底核領域に出現することを実証した。不成功モデルは、実験から除外される。
【０３６３】
第４に、くも膜下出血であり、縫合糸の過剰な深さ、縫合糸の過大な進行力のため、縫合糸が血管に穴を開けて、くも膜下出血を引き起こした。剖検によって、１８匹のラット（死亡ラット全体の３０％）が、くも膜下出血によって死亡した。重篤な脳梗塞：縫合糸の過剰な深さが、重篤な脳虚血及び梗塞を引き起こした。ＴＴＣ染色は、２４匹のラット（死亡ラット全体の４０％）が、大脳半球全体に浮腫を有する重篤な脳浮腫で死亡した。気管（weasand）及び迷走神経が手術の際に損傷を受けた：迷走神経の傷害が気道に多量
の分泌液をもたらして、ことのこが呼吸性低酸素をもたらした。１０匹のラット（死亡ラット全体の１６．７％）が、この原因によって死亡した。
【０３６４】
原因不明の死亡：ラットにおける原因不明の死亡は、手術後の飼育の過程において現れた。本発明者たちは、死亡後の解剖又はＴＴＣ染色によって有意な死因を見出さなかった。この群に８匹のラットが存在し、全ての死亡の１３．３％を占めた。
【０３６５】
２．２  神経欠損スコア
【０３６６】
脳虚血の１４日後、神経機能スコアは、偽群が正常であり、対照群（ＩＲ）、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ、ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭの全てが、様々な程度の神経機能傷害を１４日間示したことを示した（表５）。しかし、ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭ群の１４日間の神経機能スコアは、ＩＲ群、ＩＲ＋Ｃｕ及びＩＲ＋ＮＭより有意に低く（Ｐ＜０．０５）、（ＩＲ）、ＩＲ＋Ｃｕ及びＩＲ＋ＮＭ群間に有意な差はなかった（図３５）。
【表５】
2020143158.tif 000007
＃、Ｐ＜０．０５対ＩＲ、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ
【０３６７】
２．３  脳梗塞体積の分析
【０３６８】
脳虚血の１４日後、ＴＴＣ染色を実施して、脳梗塞の体積を検査した（図３６Ａ）。結果は、偽群に梗塞はなかったが、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ、ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭの全てが様々な程度の梗塞を呈したことを示した（表６）。ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭ群の脳梗塞の体積は、ＩＲ群、ＩＲ＋Ｃｕ及びＩＲ＋ＮＭ群より有意に低く（Ｐ＜０．０５）、（ＩＲ）、ＩＲ＋Ｃｕ及びＩＲ＋ＮＭ群間に有意な差はなかった（図３６Ｂ）。
【表６】
2020143158.tif 000008
＊、Ｐ＜０．０５対ＩＲ、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ
【０３６９】
２．４  脳萎縮指数の分析
【０３７０】
脳虚血の後、局所脳組織は、液状壊死及び炎症性細胞湿潤を経験し、壊死組織は、徐々に吸収され、最終的に虚血性脳萎縮が生じた。結果は、脳梗塞の１４日後に脳が明白に萎縮し、Ｃｕ−ＮＭで治療したラットの脳萎縮指数（９．９３±１．８９％）がＩＲ群（２４．２２±３．３９）、ＩＲ＋ＣＵ＋ＮＭ（２２．１８±２．９３）、ＩＲ群（２２．１１±３．５２）よりも有意に低いことを示し（表７）、脳組織により多くの毛細血管が存在した（図３７）。（ＩＲ）、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ群間で有意な差はない。図３７Ａは、脳組織が脳梗塞の１４日後に明白に収縮していることを示す。ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭ群の脳は、僅かに収縮し、より多くの目に見える毛細血管が現れた。図３７Ｂにおいて、脳萎縮の定量比較は、ＩＲ＋Ｃｕ−ＮＭ群が、ＩＲ群、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ群より有意に低かった（Ｐ＜０．０５）ことを示している。
【表７】
2020143158.tif 000009
＃、Ｐ＜０．０５対ＩＲ、ＩＲ＋Ｃｕ、ＩＲ＋ＮＭ
【０３７１】
２．５  脳梗塞後の組織病理学形態の変化
【０３７２】
脳組織をＨＥ染色で処理し、顕微鏡検査法により観察した。ニューロン数は多く、核は、正常な脳組織において明白であった。ニューロンは、梗塞域において有意に減少し、細胞の配置は散在的及び不規則であった。梗塞域において、広範囲の細胞壊死、部分的な細胞自己融解、不鮮明な構造、核の消滅が生じ、ニューロンの周りの神経線維により多くの遊離気泡（free  bubble）が存在した。
【０３７３】
２．６  血管新生の検出
【０３７４】
血管新生は、血管の数を観察するための血管内皮細胞マーカーＣＤ３１による免疫組織化学染色によって検出した。脳虚血の周囲域（虚血性境界区域、ＩＢＺ）を主に観察した。図３９は、血管新生検出域を示し、小さい四角はＩＢＺを示している。次に、１平方ミリメートルあたりの血管数を、血管計数により算出した。結果によると、多数の新たな血管が、ＩＲ−Ｃｕ−ＮＭ群の脳梗塞周辺に存在し、この群の血管は、他の群より明らかに多かった（図４０）。
【０３７５】
脳梗塞は、虚血性脳卒中（脳虚血、ＣＩ）とも呼ばれ、血管狭窄又は閉塞によって引き起こされる、脳への血液供給の障害から生じ、脳組織の対応する部分の虚血、無酸素及び壊死、脳卒中全体の約８０％を占める脳軟化症（soften  disease）をもたらす。現在の
ところ、超早期血栓溶解治療が、限りなく早く虚血性組織の血流を回復する、ＣＩの唯一の効果的な治療であった。しかし、血栓溶解の治療時間範囲は、厳密に限定されている（＜３時間）。一部の患者の血栓溶解療法の時間範囲を４．５時間まで延長することができるが、血栓溶解患者の５％未満が安全で効果的な治療を受けることができる。時間範囲外の血栓溶解治療は、虚血／再潅流（ＩＲ）の重篤な虚血／再潅流傷害をもたらし、出血性変化の危険性を増大させ、疾病を更に悪化させる。ここで、更に様々な種類の神経保護薬が動物モデルにおいて効果的であることが証明されているが、臨床用途に対する効果についてはほとんど確認されなかった。
【０３７６】
虚血性脳損傷は、組織損傷シグナルとして、自己組織再生及び修復機構を開始させた。しかし、傷害の慢性期において、組織傷害シグナルの欠如により、身体の自己修復能力及び再生能力を有意に減少又は喪失させ、内因性再生は、傷害のある脳機能から回復することを制限された。そのため、本発明者たちは、外因性介在手段により固有の組織再生及び組織修復系を活性化させた。外因性治療は、固有の組織再生能力を活性化させ、神経の血管新生及び再生を促進した。神経と血管再生の組み合わせは、神経学的機能の回復を促進した。
【０３７７】
血管新生は、脳虚血後の神経機能の回復に重要な役割を果たす。新生児末梢神経は、主に、梗塞域、すなわち、虚血及び半暗帯（虚血性半影、ＩＰ）に位置していた。副行循環による影響を受けて、虚血及び半暗帯の峡部は、特定の補償的血流をもたらした。死を伴う虚血性半暗は、何も治療を受けていない細胞内に生じることとなる。したがって、外因性介入は、虚血性半暗帯に血管新生を促進して、虚血域の周囲に増殖している毛細血管を刺激し、副行循環の形成を刺激することによって、損傷を受けた神経細胞を救出した。最後に、虚血域の血管新生が生じ、神経機能回復をもたらした。
【０３７８】
銅は、低酸素誘導因子１（低酸素誘導性因子１、ＨＩＦ−１）の活性を制御する重要な部分である。銅は、転写複合体ＨＩＦ−１を介してＨＩＦ−１を活性化し、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン−１及び他の因子を促進して、血管新生を促進することができる。虚血性心筋組織における銅の補充は、微小循環の血液供給を効果的に回復させることができ、最終的に、心筋組織の再生及びニューロン機能の再生を達成することができる。
【０３７９】
過剰量の銅が酸化ストレスを引き起こし、身体に重篤な副作用を生じる場合があるので、銅の制御送達系は、銅を臨床において使用するための理想的なツールである。理想的な銅装填体は、銅が豊富であり、特定の病変部位に長時間留まるべきである。銅系の徐放によって、固有の組織再生が活性化されて、神経機能の改善を促進させる。そして、第二銅は、良好な生体適合性を有するべきでり、拒絶反応を有するべきではない。この例は、銅イオンをナノ材料（ナノ生体材料、ＮＭ）と一緒に組み合わせた。この新たな種類の銅ナノ材料（Ｃｕ−ＮＭ）は、非常に良好な生物学的適合性を有し、虚血域への銅イオンの徐放による銅の効果的な吸収を促進し、それによって、虚血域に血管新生を促進し、損傷を受けた脳組織微小循環の改善により血液供給を増加させて、疾患組織を修復し、損傷を受けた脳機能を回復することができる。
【０３８０】
この治療は、虚血／再潅流の７日後に銅ナノメートル材料をラットの脳室に注入することによって実施した。
【０３８１】
梗塞体積及び脳萎縮の両方が１４日間で有意に減少した。神経機能は明白に改善された。Ｃｕ−ＮＭ材料は、脳梗塞及び末梢血管再生を促進し、このことは、ニューロン機能の回復に役立つと考えられる。脳虚血性傷害の１日後では、脳梗塞のサイズ及び神経機能スコアは、最も重篤であり、その後、梗塞サイズは徐々に縮小し、ラットの機能不全も徐々に改善された。梗塞サイズは、１４日目までほとんど変化がなかった。虚血／再潅流傷害が持続すると、固有の修復系が抑制された。しかし、この治療は、身体の固有の修復機構を活性化して、梗塞域に動員されている幹細胞を動員し、最終的に成熟細胞になり、壊死細胞と交換される。この例は、銅補充により動かされる組織固有の修復機能の強力な証拠を提供した。
【０３８２】
銅は、ＨＩＦ−１制御によるＶＥＧＦなどの様々な血管増殖因子の発現を制御した。これらの因子は、血管新生に関与していた。結果は、毛細血管密度が脳梗塞域の周辺で有意に増加したことを示した。ＶＥＧＦは単独で新たな血管形成を促進することができるが、血管を成熟させるには、様々な因子の関与も必要である。銅は、新たな血管形成を誘導するのみならず、新たな血管の成熟も促進した。これらの複数の効果は、単一のＶＥＧＦよりも効果的であった。この例は、銅が梗塞末梢血管の再生を促進し、ニューロン機能の回復を改善したことを示した。
【０３８３】
この例は、銅治療が脳萎縮を明白に低減させたことを示した。脳梗塞の後、ニューロン及びグリア細胞の壊死及び萎縮が梗塞域において生じたが、銅治療が脳萎縮を部分的に逆転させることができた。研究は、梗塞脳が脳損傷の後で再生する能力を有したことを示した。中枢神経系において、神経細胞の再生は２つの特定の区域において生じ、上衣下帯（脳室下帯、ＳＶＺ）及び粒子域の海馬歯状回（顆粒細胞下帯、ＳＧＺ）である。生理学的条件下では、神経細胞は、ＳＶＺ域から始まり、神経細胞のアポトーシスを補足するために、吻側移動流（吻側移動性流、ＲＭＳ）に沿って嗅球へ移動した。しかし、脳虚血の条件下では、ＳＶＺ域の神経再生が有意に増加し、新たな神経細胞は、伝統的なＲＭＳ移動経路を傷害域に変え、周囲組織の回復を増大させた。これらの研究は、中枢神経系が、神経細胞の繁殖及び病変域への細胞ホーミングにより、傷害に応答することを示した。このように、銅は、神経再生を促進する原因であり得る。神経再生は、血管再生に依存しているので、両方の効果がニューロン機能の回復を促進した。銅は、様々な血管増殖因子の発現を促進することができ、これらの因子もまた神経再生のために重要な役割を果たす。インビボ及びインビトロ研究は、ＶＥＧＦが細胞繁殖マーカーＢｒｄＵの発現をマウス脳虚血ＳＶＺ域において増加させ、このことは、ＶＥＧＦがいくつかの神経栄養因子を介して神経再生の役割を果たすことを示すことを確認した。
【０３８４】
実施例４  銅材料によるアカゲザル脳梗塞の治療
【０３８５】
この例は、９匹のアカゲザルを使用した。４匹は、未治療群であり、５匹は銅治療群であった。
【０３８６】
１．アカゲザル脳梗塞モデルの確立
【０３８７】
断食を、手術の８時間前に実施し、全ての対象は、１０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．２ｍｇ／ｋｇのミダゾラムの筋肉内注射を受けて、鎮静作用が誘発された。麻酔後、動物を手術台に載せた。電極取付部位及び陰極プレートの吸熱ナイフ部位における脳、四肢を覆う体毛を良好なＥＣＧ記録及び操作のために徹底的に剃毛した。皮膚を剃毛した後に静脈のギャラリー（gallery）を確立し、モニターを接続した。心拍数、血圧、酸素飽和度
、二酸化炭素分圧及び温度を含む、標準的な非侵襲性測定を手術の際に実施した。次に、対象は、気管カニューレ３．５〜４．５のために、ベクロニウム臭化物の筋肉内注射を受け、気管カテーテルは、喉頭鏡を用いて気管に挿入された。食道ではなく気管にあることを確実にするため、気管カニューレの場所を確認しなければならない。人工呼吸器のパラメーターを調整し、圧力制御型を採用し、Ｐ＝１２〜２０ｍｍＨｇ、４０／分の呼吸数、１０〜１５ｍＬ／ｋｇの一回呼吸量、３０〜４０ｍｍＨｇの二酸化炭素圧とした。麻酔状態を、イソフルラン（０％〜１．５％）の吸引、フェンタニル（２μｇ／ｋｇ）、ベクロニウム臭化物（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の静脈マイクロ注入により維持した。順調であれば、動物を手術台に載せ、頭部を固定器上に１５°上方に向けて、右前頭側頭部を露出させた。手術領域をヨードフォールで滅菌し、無菌タオルで覆った。前頭側頭部の開頭術を右頬骨弓から開始して、正中線で止めた。
【０３８８】
手術手順は、皮膚、皮下組織及び側頭筋を切断し、前頭側頭頭蓋を露出することを含む。研磨孔開け用ドリル（abrasive  drilling）は、前頭側頭頭蓋を穿孔して、小さな穴を開け、骨鉗子により３×５ｃｍの骨窓を形成した。頭蓋内膜を切開し、側頭に固定して、側頭葉を露出させた。脳組織をコットンフリークス（cotton  fleexe）で覆って、脳組織の傷害を低減させた。前頭葉及び鞍域の底部を脳ベラにより慎重に露出させた。視神経が見えたら、くも膜を剥離器により分離するべきであり、脳脊髄液を放出させて、脳組織の圧力を減少させた。脳組織が沈下すると、前側頭葉を自動開創器により押しのけるべきであり、手術用の空間を空けた。内頸動脈が近端から遠端まで露出すると、中大脳動脈（ＭＣＡ）及び前大脳動脈（ＡＣＡ）を含む動脈の２つの枝がＩＣＡの股部に見られる。ＭＣＡを近端から遠端まで分離して、ＭＣＡの最初の区分（Ｍ１区分）を露出させた。ＭＣＡの開始区分を６−０縫合糸で結紮し、長さが５ｍｍのＭ１区分を、対極（twin  pole）により電気凝固させた。電気凝固区分を切断して、ＭＣＡの血液循環を遮断した。手術領域を生理食塩水で洗浄し、硬膜、筋肉及び皮膚を縫合した。創傷を滅菌し、滅菌包帯を使用して覆った。
【０３８９】
術後処置は、麻酔後、電気毛布で体温を維持することと、気道を阻害しないよう保つことと、嚥下反射が回復したとき気管カテーテルを引き抜くことと、を含んだ。動物が横転するか又は起立できるまで、飼育室に戻した。１００ｍｇのトラマドールを使用して、筋肉内注射により疼痛を緩和し、２ｍｇのグラニセトロンを使用して、同じ注射により悪心・嘔吐を予防した。動物を術後毎日１〜２回観察して、手術した領域に症状又は他の異常が生じていないかどうかを確かめた。
【０３９０】
２．アカゲザル脳梗塞モデルの神経機能スコア
【０３９１】
神経機能スコアは、意識、筋肉及び神経反射、平衡などの多くの局面におけるアカゲザルの脳神経機能を包括的に評価するために、主に、非ヒト霊長類脳卒中評価スケール（非ヒト霊長類脳卒中スケール、ＮＨＰＳＳ）（表８）及び改訂サル脳卒中評価スケール（サル脳卒中の改変神経学的評価スケール、ｍＮＳＳ）（表９）を採用した。神経機能スコアが高いほど、神経機能が悪化していることを表した。
【表８】
2020143158.tif 000010
【表９−１】
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【表９−２】
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合計：６０スコア
【０３９２】
３．神経学的スコアの結果
【０３９３】
脳梗塞は、脳虚血の７日後に形成され、銅ナノ材料を届ける注射により治療され、術後神経学的評価を実施した。銅錯体群におけるニューロン機能不全は、有意に減少した（Ｐ＜０．０５）ことが見出された。経時的に、ニューロン機能の回復がより有意に現れた。結果は、銅錯体が、アカゲザル脳梗塞後にニューロン機能回復を効果的に促進できること及び神経機能を改善できることを示した（図４１、表されているスコアが低いほど、損傷が軽く、神経機能が良好である）。図４１は、アカゲザル脳梗塞モデルにおける神経機能不全の程度についての評価である。未治療群と比較して、結果は、銅錯体による治療が神経機能を有意に改善したことを示した。
【０３９４】
実施例５：単離ラット冠動脈リングにおける血管新生の銅による促進
【０３９５】
本実施例は、ＶＥＧＦが血管新生に必須であるが、銅の血管新生促進効果が、ＶＥＧＦの生成の増大によって作用しないことを実証している。器官系レベルにおける血管新生の銅の刺激は、ＶＥＧＦ依存性であるが、培養物中の血管内皮細胞繁殖の銅の刺激は、ＶＥＧＦから独立している。本実施例では、単離ラット冠動脈リングを使用した。胸部大動脈をスプラーグドーリーラット（８〜１０週齢）から分離し、培養するために１．０ｍｍ厚の血管リングの切片にした。最終濃度の５、２５、５０又は１００μＭの硫化銅を培養物に加え、８日間維持した。銅キレート剤であるテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を最終濃度２５μＭで、いくつかの培養物に加えて、銅の作用を遮断した。抗ＶＥＧＦ抗体を使用して、血管新生の銅による促進におけるＶＥＧＦの役割を決定した。得られたデータは、培養物中で５μＭの銅が、血管形成を刺激したこと、効果がＴＥＰＡにより遮断されたことを示した。５０μＭを超える濃度の銅は、血管新生促進効果を喪失していた。しかし、５μＭの銅によりＶＥＧＦの産生は増加しなかった。また、５０μＭを超える濃度によりＶＥＧＦの産生を有意に増加した。一方、抗ＶＥＧＦ抗体による治療は、５μＭの銅の血管新生促進効果を完全に遮断した。
【０３９６】
１．方法
【０３９７】
１．１  単離ラット冠動脈リング及び治療条件
【０３９８】
胸部大動脈を８〜１０週齢の雄スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット（２９２〜３０７ｇ）から取り出し、氷冷無血清内皮細胞用基礎培地−２（ＥＢＭ−２、Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＡＧ）を含有する培養皿に直ぐに移した。大動脈周囲線維脂肪組織を、微細顕微解剖鉗子及び虹彩切除ハサミにより、大動脈壁を損傷しないように特別に注意を払いながら、注意深く取り出した。１ミリメートルの長さの冠動脈リングを切片にして、ＥＢＭ−２による５回連続洗浄で十分にすすいだ。
【０３９９】
１．２  血管新生のアッセイ
【０４００】
４８ウエル組織培養等級プレートを、１００μＬのマトリゲル（ＧＦＲ，ＢＤ）で被覆し、３７℃、５％  ＣＯ２で４５分間ゲル化させた。冠動脈リングをマトリゲル被覆ウエルにいれ、更に１００μＬのマトリゲルで被覆し、３７℃、５％  ＣＯ２で４５分間再びゲル化させた。次に培養物に、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する２５０μＬのＥＢＭ−２を加えた。硫化銅溶液を、５、２５、５０又は１００μＭの銅元素の最終濃度で培養物に加えた。増殖培地を、２日毎に取り除いて交換した。冠動脈リングを８日目に撮影した。
【０４０１】
１．３  画像分析
【０４０２】
血管新生萌出（angiogenic  sprouting）の面積を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアプロ
グラム（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の使用により計算した。微小血管密度は正方画素で報告される。
【０４０３】
１．４  ＶＥＧＦのウエスタンブロッティング分析
【０４０４】
１％完全エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）無含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ，ＤＥ）を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ，ＣＮ）において、マトリゲルを有するラットの冠動脈リングを氷上で３０分間溶解した後、タンパク質抽出物を得た。タンパク質の均等装填は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）の使用により予め定量化することによって確実にした。総溶解産物中の適切な量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルにより分解し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ，ＵＳＡ）に移動させた。膜を、５％脱脂粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水／Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｎ  ２０）で１時間遮断し、遮断緩衝液で希釈した一次マウス抗体ＶＥＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びマウス抗ベータアクチン抗体（ＺＳＧＢ−ＢＩＯ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，ＣＮ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、膜を、ＴＢＳＴで希釈したホースラデッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（ＺＳＧＢ−ＢＩＯ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，ＣＮ）と共に室温で１時間インキュベートした。標的タンパク質を、化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）の使用により可視化した。
【０４０５】
１．５  ＶＥＧＦの中和
【０４０６】
冠動脈リングを、４８ウエルプレートにおいて、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を最終濃度の２ｎｇ／ｍＬで含有する２５０μＬのＥＢＭ−２（１％ＦＢＳ）培地中で培養した。処理及び血管新生アッセイは、上記と同じであった。
【０４０７】
１．６  統計分析
【０４０８】
データは、３つの独立した実験から得て、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。図４２及び図４４Ａに提示された結果を、最初に分散の一方向分析により分析し、複数の群を比較するダネットＴ３検定により更に分析した。２×２要因分析を、図４３及び図４４Ｂ及び図４５に提示されたデータに適用した。有意な相互作用が検出された後、主作用の有意性を更に決定した。有意性のレベルをＰ＜．０５とみなした。
【０４０９】
２．結果
【０４１０】
２．１  単離ラット冠動脈リングの血管新生に対する銅の効果
【０４１１】
図４２は１％のＦＢＳを有するＥＢＭ−２に培養した単離ラット冠動脈リングの血管新生に対する、様々な濃度の硫化銅の効果を示す。硫化銅を、０（対照）、５、２５、５０又は１００μＭの銅元素最終濃度で培養物に直接加え、８日間維持した。定量データを３つの別々の実験から得た。それぞれは、処理ごとに３つの試料を含有し、データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で提示した。＊対照群と有意に異なる（Ｐ＜．０５）（バー＝５００μｍ）。
【０４１２】
５μＭの銅が血管新生に対して最強の促進効果を有することが観察された。このレベルを超える濃度は、血管新生促進効果を示さないのみならず、５０μＭを超える濃度では有意な阻害効果も示した。培地、ＦＢＳ（１％）及び添加された銅の寄与を含む銅の最終濃度は、０．５、２５、５０又は１００μＭの銅が添加された培養物において、それぞれ、２６．９、３４４．４、１６１４．４、３２０１．９又は６４１６．９μｇ／Ｌであった。したがって、様々な濃度の添加銅で８日間培養した後の冠動脈リングにおける銅濃度は、それぞれ、５．９、２６、６３、１０６又は１６２μｇ／ｇ組織であり、これは培養物における銅濃度に比例している。
【０４１３】
銅キレート剤であるテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を単独で対照として又は最終濃度２５μＭの銅と同時に、培養物に８日間加えた。図４３に示されているように、この処理によって、ＴＥＰＡそれ自体が血管新生の阻害を引き起こし、５μＭの銅の血管新生促進効果を完全に抑制した。１％ＦＢＳを有するＥＢＭ−２において培養した単離ラット冠動脈リングを、５μＭの硫化銅、２５μＭのＴＥＰＡ又は両方で８日間処理した。定量データを３つの別々の実験から得た。それぞれは、処理ごとに３つの試料を含み、データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で提示した。＊対照群と有意に異なる（Ｐ＜．０５）（バー＝５００μｍ）。
【０４１４】
２．２  単離冠動脈リングにおけるＶＥＧＦ産生に対する銅の効果
【０４１５】
図４４に提示されている結果は、培養物中の５μＭでは、銅は単離血管組織におけるＶＥＧＦの産生を増加させなかったが、血管新生の抑制を引き起こした５０μＭを超える濃度では、銅はＶＥＧＦの産生を有意に増加させたことを示している。ＴＥＰＡは、最終濃度の２５μＭでは、培養物中の５μＭの銅を用いて又は用いないで処理された単離ラット冠動脈リング組織におけるＶＥＧＦレベルを有意に減少させた（図４４）。図４４は、単離ラット冠動脈リングにおけるＶＥＧＦタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す。図４４Ａは、ＶＥＧＦタンパク質レベルに対する様々な濃度の銅の効果を示す。処理プロトコールは、図４２に提示されたものと同じであった。図４４Ｂは、ＶＥＧＦタンパク質レベルに対するＴＥＰＡの効果を示す。処理プロトコールは、図４３に提示されたものと同じであった。全ての定量データは、３つの独立した実験かれ得て、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示した。＊対照群と有意に異なる（Ｐ＜．０５）。
【０４１６】
２．３  銅による血管新生の促進に対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果
【０４１７】
図４５に提示されている結果は、培養物中の最終濃度２ｎｇ／ｍＬの抗ＶＥＧＦ抗体が、単独で血管新生を有意に抑制し、５μＭの銅との組み合わせが、銅の血管新生促進効果を完全に遮断したことを示す。図４５は、血管新生の銅による促進に対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果を示す。１％ＦＢＳを有するＥＢＭ−２において培養した単離ラット冠動脈リングを、５μＭの硫化銅、２ｎｇ／ｍＬの抗ＶＥＧＦ抗体、又は両方で８日間処理した。定量データは、３つの独立した実験かれ得られ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示した。＊対照群と有意に異なる（Ｐ＜．０５）（バー＝５００μｍ）。
【０４１８】
しかし、抗ＶＥＧＦ抗体単独又は５μＭ銅との組み合わせのいずれも、ＶＥＧＦの産生に影響を及ぼさなかった（図４６）。図４６は、単離ラット冠動脈リングにおけるＶＥＧＦタンパク質レベルに対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果を示す。図４５に記載されたものと同じ処理プロトコールを適用した。全ての定量データは、３つの独立した実験かれ得られ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示した。＊対照群と有意に異なる（Ｐ＜．０５）。
【０４１９】
実施例６  肝障害のための亜鉛補充治療
【０４２０】
肝星細胞は、アルコール、ウイルス及び化学物質の持続的な刺激後に大量のコラーゲンを分泌した。肝臓線維症及び損傷は、細胞外マトリックスの過剰堆積によって発生した。線維症を逆転させる亜鉛の特異的な機能に起因して、この例は、標的化亜鉛補充療法を利用して、肝組織固有自己修復を活性化させ、肝臓の傷害部位へホーミングする幹細胞（例えば、骨髄間葉系幹細胞）を動員し、肝細胞に分化させ、傷害組織を再生させる。標的化亜鉛補充は、超音波媒介亜鉛装填微小気泡破裂により、亜鉛を、傷害を受けた肝組織に送達することによって達成される。標的化亜鉛補充治療の後、肝臓線維症は逆転され、肝臓機能が回復する。
【０４２１】
この実験は、肝臓線維症及び脂肪肝の疾患に対する超音波媒介亜鉛装填微小気泡破裂の治療効果を評価するために実施した。肝臓線維症のＷｉｓｔｅｒラットモデルを、肝臓線維症の症状が生じるまで、１日おきにチアセトアミド（thiacetamide）（ＴＡＡ）１００ｍｇ／ｋｇを注射することによって誘導した。次に、モデルを、治療群と未治療群の２つの群に分けた。治療群では、超音波媒介亜鉛装填微小気泡破裂治療を３日毎に実施した。治療した後、血液試料を、肝障害関連マーカーである、血中脂肪、肝臓脂質、コラーゲン、抗酸化酵素の活性及び脂質過酸化代謝産物の検査のために収集した。肝障害状態は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の検出によって判断した。ＴＮＦ−α及びＩＬ−βが肝障害後に分泌される。すると、これにより肝臓の損傷が加速する。このように、ＴＮＦ−α及びＩＬ−βのレベルは、肝障害の程度を評価するための指標である。加えて、肝臓線維症の逆転もまた、肝組織切片及び生検によって評価することができる。
【０４２２】
この実験は、薬物性肝障害に対する超音波媒介亜鉛装填微小気泡破裂の治療効果を評価するために実施される。肝障害のスプラーグドーリーラットモデルは、肝障害の症状が生じるまで、四塩化炭素（ＣＣＬ４）１ｍＬ／ｋｇ（４０％）を１日おきに挿管供給することによって誘導される。次に、モデルを、治療群と未治療群の２つの群に分ける。治療群では、超音波媒介亜鉛装填微小気泡破裂治療が３日毎に実施される。治療後、血液試料は、肝障害関連マーカーである血中脂肪、肝臓脂質、コラーゲン、抗酸化酵素の活性及び脂質過酸化代謝産物の検査のために収集される。肝障害状態は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の検出によって判断される。ＴＮＦ−α及びＩＬ−βが肝障害後に分泌される。すると、これにより肝臓の損傷が加速する。このように、ＴＮＦ−α及びＩＬ−βのレベルは、肝障害の程度を評価するための指標である。加えて、肝臓線維症の逆転もまた、肝組織切片及び生検によって評価することができる。
【０４２３】
実施例７  超音波媒介銅−アルブミン微小気泡を使用した心臓の銅含有量の標的化補充
【０４２４】
１．方法
【０４２５】
１．１  銅超音波微小気泡治療
【０４２６】
心筋梗塞の超音波誘導療法を正常なマウスに対して実施した。尾静脈を介して銅微小気泡を注入した。それぞれの銅微小気泡治療の際に、超音波を心臓の梗塞域に向けることができるように、超音波プローブ（Ｖｉｖｉｄ  ７，ｉ１３Ｌ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）を胸部の前胸部に配置した。メカニカルインデックスを１．２に設定した。それぞれの注入の後、循環系を介して心室に到達した銅微小気泡を、超音波出力誘発により破裂させた。同時に、超音波プローブを、心臓の心尖部と僧帽弁との間の短軸に沿って前後に若干動かした。それぞれ注入させた銅微小気泡が破裂した後、それぞれの治療の用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）が完全に投与されるまで、次の注入が後に続いた。注入後、血液試料を収集し、心臓を採取した。
【０４２７】
１．２．Ｃｕ濃度の判定
【０４２８】
試料を、新たに凍結し、凍結乾燥する前に−８０℃で保存した。凍結乾燥し、硝酸で組織を蒸解した後、蒸解物は、無色又は明黄色の明澄であり、眼に見える沈殿物又は残留物はなかった。超純水をそれぞれの容器に加えて、続く銅の分析のため、ＨＮＯ３を２％に希釈した。銅濃度は、表１０に示されているプログラムを使用してグラファイト炉原子吸光分光法（ＩＣＥ３５００，Ｔｈｅｒｍｏ）により決定した。
【表１０】
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【０４２９】
２．結果
【０４３０】
銅微小気泡の注入後、血中銅の濃度が有意に増加した（図４７）。加えて、超音波プローブが出力を放出すると、銅微小気泡は破裂した。超音波により誘発される音響穿孔により、細胞膜及び毛細血管において一過性の穴の形成が更に導かれ、これにより心臓組織への銅の取り込みが、超音波を媒介させずに銅微小気泡を用いた治療群（Ｃｕ＋ＭＢ）と比較すると、超音波媒介銅微小気泡治療群（Ｃｕ＋ＭＢ超音波）において大幅に促進された（図４８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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