(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療のための、粒子を含む組成物の使用、また、該組成物の作製方法を提供する。【解決手段】粒子を含む組成物に関し、該粒子は各々、ポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］等の少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチドと、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミンとの複合体を含む。また、該粒子は、それらの単峰性の径分布、及び特定範囲内のｚ平均径を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）前記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、前記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、前記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）前記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）前記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）前記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有する、
組成物。
【請求項２】
前記粒子の少なくとも９０％が３０ｎｍ〜１５０ｎｍの単峰性の径分布を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記粒子に含まれる前記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、前記粒子に含まれる前記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
３５ｍＶ〜５０ｍＶに含まれるゼータ電位を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記直鎖ポリアルキレンイミンが水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記直鎖ポリアルキレンイミンが直鎖ポリエチレンイミンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
粒子径の多分散指数が１．５未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
有機化合物、無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド、又はタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
１％〜１０％（重量／体積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）ｐＨ２〜４、及び／又は、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、
を有する水性組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）前記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、前記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、前記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）前記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）前記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）前記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有し、
前記組成物中の前記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する前記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５以上で前記粒子が形成される、
組成物。
【請求項１４】
該組成物の総容積１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇのポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］から複合体を作製することによって形成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１％〜１０％（重量／前記組成物の総容積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に添加することによって形成される、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の水性組成物を凍結乾燥することにより得られうる組成物。
【請求項１７】
医薬として使用される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記医薬が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを任意に含む注射用水性組成物である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療のために使用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞増殖障害が、癌又は雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
腫瘍内又は腫瘍周囲に注射するために使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
皮膚レベルで又は内臓若しくは組織に注射するために使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液を作製すること、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を形成すること、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて前記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に
注入によって混合チャンバーへ前記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成すること、
また、任意に、
（ｉｖ）得られた水性組成物を６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して濾過し、濾液を形成する、又は２２４８０ｍ／ｓ２以上で得られた水性組成物を遠心分離し、上清を形成すること、及び／又は、
（ｖ）得られた水性組成物、濾液、又は上清を凍結乾燥すること、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記方法が工程（ｉｖ）又は工程（ｖ）を含まず、前記組成物が水性組成物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が工程（ｖ）を含まず、前記組成物が水性組成物であり、前記工程（ｉｉｉ）が、混合チャンバーにおいて前記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することにより、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリリボヌクレオチド及びポリマーによって形成される粒子を含む医薬製剤、それらの製造、及びそれらの医薬としての使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌細胞の生育を阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導する領域で、腫瘍に対して免疫系を特異的に活性化するため、ウイルス二本鎖ＲＮＡを模する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成アナログの使用が模索されてきた。特に、二本鎖ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）又はｐＩＣと名付けられた）は、免疫系の活性化、ナチュラルキラー及び／又は樹状細胞媒介活性、及び／又は腫瘍遺伝子発現及び微小環境の変化に依存してもよく、又はそれらから独立し得るように、様々な癌（黒色腫、肝細胞腫（hepatoma）、結腸、胃及び口腔の癌腫、子宮頸癌、乳癌、卵巣癌、尿路腫瘍、肺及び前立腺の癌）及びそれらの転移に対して治療的関心のある様々な効果を有する一種のｄｓＲＮＡとされた（非特許文献１）。
【０００３】
残念ながら、これらの初期の前臨床の証拠は、不十分な細胞取り込み又は細胞質基質のＲＮアーゼによる分解等の様々な機構に起因したその低い安定性、乏しい均一性、予測不能な薬物動態、及び限定的な抗腫瘍効果が明らかとなっているネイキッドポリ（Ｉ：Ｃ）分子を用いた臨床研究では、十分に確認されていないか、又は確認されていない（非特許文献１）。実際、有効な治療的又は予防的な効果を達成するためには、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を使用の直前又は少し前に再度溶解することが必要な場合があり、製剤中、低濃度で利用可能な場合があり、及び／又は頻繁に投与される（例えば２時間毎）。
【０００４】
ここ数年、免疫調節性及び／又は治療特性を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の製剤化において著しい進歩があった。粉体として及び／又は標的化部分及び追加の化学リンカーを有する又は有しないポリマー系マイクロ粒子内に統合されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子を作製及び製剤化する様々な方法が開示されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献２、特許文献９、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子が、担体ポリマーと共に、またカチオン性脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子、リポソーム又は他の多孔質構造物内（非特許文献７、特許文献１０、特許文献１１）に封入されたポリリジン及びカルボキシメチルセルロース（特許文献１２）で安定化された経鼻投与に適合性のフォーマットで（特許文献５）、又は一本鎖ＲＮＡ及びプロタミンのようなカチオン性ペプチド（特許文献１３）と共に、製剤化されている。また代替的には、特定の細胞又は組織に対してポリ（Ｉ：Ｃ）分子を標的化することを支援し得る薬剤と共に又はその薬剤なしに、酸化鉄ナノ粒子等の固体粒子及び担体上にポリ（Ｉ：Ｃ）分子が固定化されている（非特許文献８、非特許文献９）。
【０００５】
いくつかの出版物は、他の成分及び遺伝子特異的（gene-specific）を伴う又はそれら
を伴わない、ポリマー、ポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又は二本鎖ＤＮＡによって形成される、マイクロメートル未満の範囲の様々な三元複合体又は四元複合体を更に開示する（非特許文献１０、特許文献１４、特許文献１５、非特許文献１１）。しかしながら、これらのアプローチは、癌細胞の選択的な殺傷ではなく、生存可能性を維持しながら、本質的に細胞へＤＮＡを投与する薬剤を提供することを目的としている。
【０００６】
キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリメタクリレート、
イミダゾール又はシクロデキストリンを含有するポリマー、ポリ（ベータ−アミノエステル）等のカチオン性ポリマー、及び関連するデンドリマーに基づくことが多い癌治療に対する薬物送達システムと共にポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む構造上複雑な抗癌性複合体を産生することによって、薬物としてポリ（Ｉ：Ｃ）分子の臨床開発を制限している落とし穴（pitfalls）、及びその規制要件とのコンプライアンシー（compliancy）を克服できる可能性がある。これらのポリマーシステム（ポリプレックス（Polyplex）とも呼ばれる）は、脂質ベースのシステム（リポプレックス（Lipoplex）とも呼ばれる）及び核酸の局所又は全身の送達に対して同様に使用されるハイブリッドシステム（リポポリプレックス（Lipopolyplex）とも呼ばれる）とは構造的また機能的に異なる（非特許文献１２、非特許文献１３）。ポリプレックスの中でも、ＰＥＩは、直鎖／分岐鎖の構造及びサイズ、化学結合、分解性、並びに誘導体化のレベルで変更可能であり（非特許文献１４）、細胞によるリポプレックス内部移行とは異なって、クラスリン媒介とカベオラ媒介との両方のエンドサイトーシスによって内部移行される（非特許文献１５）特定の目的のカチオン性ポリマーである。
【０００７】
ＰＥＩに会合したポリ（Ｉ：Ｃ）分子の作製及び投与を含むこの治療アプローチは、ＢＯ−１１０と呼ばれる薬剤によって文献に例示されている（非特許文献１６、非特許文献１７、特許文献１６）。［ｐＩＣ］ＰＥＩとしても同定されたこの複合体は、黒色腫及び他の腫瘍タイプ（神経膠腫又は癌腫等）のいくつかの癌細胞株におけるオートファジー及びアポトーシスの二重誘導に携わるのみならず、メラノサイト等の正常細胞の生存可能性に対して何らの影響もないか、限定的な影響を有する。ＢＯ−１１０は、重度の免疫無防備状態のマウスであっても、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍及び抗転移の活性を実証するための動物モデルにおいて黒色腫の生育を阻害する。さらに、類似する［ｐＩＣ］ＰＥＩ系薬剤は、正常な膵臓上皮細胞に影響することなく、膵管腺癌細胞におけるアポトーシスを賦活し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの［ｐＩＣ］ＰＥＩの投与は、腫瘍動物モデルにおいて腫瘍生育を阻害した（非特許文献１８）。ＢＯ−１１０投与の更なる効果は、子宮内膜症のモデルにおいて特性評価され、かかる薬剤が血管形成及び細胞増殖を減少させて、アポトーシスを増加させる（非特許文献１９）。
【０００８】
したがって、ＢＯ−１１０及び二本鎖ポリリボヌクレオチドを含む類似する［ｐＩＣ］ＰＥＩの薬剤は、種々の系統の正常細胞の生存可能性を維持しながら、腫瘍細胞における自律的かつ選択的なオートファジー及びアポトーシスの複合的な活性化により、広域スペクトルの作用を有する新規抗癌戦略である。しかしながら、依然として、担体と会合する場合、様々な前臨床モデルにおいて効力が実証された他の二本鎖ポリリボヌクレオチド系薬剤と同様に、種々の保存条件において安定で、均一に製造されサイズ分類される製剤においてＢＯ−１１０を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】中国特許第１０３５９９０７１号
【特許文献２】中国特許第１０２９８８３０３号
【特許文献３】国際公開第２００４０４５４９１号
【特許文献４】国際公開第２００８０５７６９６号
【特許文献５】国際公開第２０１３１６４３８０号
【特許文献６】国際公開第２０１５０６７６３２号
【特許文献７】国際公開第２０１４０５７４３２号
【特許文献８】国際公開第２０１４１６５２９６号
【特許文献９】国際公開第２０１５１７３８２４号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９１１７３０６号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１１００３８８３号
【特許文献１２】国際公開第２００５１０２２７８号
【特許文献１３】国際公開第２０１３０８７０８３号
【特許文献１４】国際公開第２０１３０４０５５２号
【特許文献１５】国際公開第２０１３０６３０１９号
【特許文献１６】国際公開第２０１１００３８８３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hafner A et al., 2013
【非特許文献２】Schaffert D et al., 2011
【非特許文献３】Kabilova T et al., 2014
【非特許文献４】Kubler K et al., 2011
【非特許文献５】Palchetti S et al., 2013
【非特許文献６】Saheki A et al., 2011
【非特許文献７】Chen L et al., 2013
【非特許文献８】McBain S et al., 2007
【非特許文献９】Cobaleda-Siles M et al., 2014
【非特許文献１０】Kurosaki T et al., 2009
【非特許文献１１】Tutin-Moeavin I et al., 2015
【非特許文献１２】Bilensoy E, 2010
【非特許文献１３】Germershaus O and Nultsch K, 2015
【非特許文献１４】Islam M et al., 2014
【非特許文献１５】Shabani M et al., 2010
【非特許文献１６】Pozuelo-Rubio M et al., 2014
【非特許文献１７】Tormo D et al., 2009
【非特許文献１８】Bhoopathi P et al., 2014
【非特許文献１９】Garcia-Pascual C and Gomez R, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
実際、従来技術は、癌の治療に対するポリ（Ｉ：Ｃ）含有組成物の産生を可能とする構造的及び生物物理学的な基準の最も有効な組み合わせに関する課題を解決するための適切な教示を提供していない。また、規制機関は、ヒトに使用される組成物に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）含有粒子の再現性、保存、並びにサイズ及び濃度の均一性に対する規格に厳密に準拠していることを要求する。したがって、患者のコンプライアンスを改善し、明確な安全域及び治療効果を有する二本鎖ポリリボヌクレオチド分子を投薬する頻度を減少させながら、薬物（特に癌に対する）として広範囲な前臨床及び臨床の開発を可能とするため、より高く、良好に制御された濃度でポリ（Ｉ：Ｃ）分子等の二本鎖ポリリボヌクレオチド分子を提供する薬剤、組成物、及び関連する方法がなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９５％又は少なくとも９０％は６００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下（例えば１４０ｎｍ〜２５０ｎｍ）の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、特にＩＳＯ２２４１２によって測定される２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有する、
組成物に関する。
【００１３】
好ましい実施の形態において、本発明は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有する、
組成物に関する。
【００１４】
本発明はまた、本明細書に開示される粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有し、
上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５以上で上記粒子が形成される、
組成物に関する。
【００１５】
また、本発明は、本明細書に開示される水性組成物の凍結乾燥によって得られうる組成物に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、医薬として使用される本明細書に開示される組成物に関する。さらに、本発明は、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療のために使用される、本明細書に開示される組成物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物を製造する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液を作製すること、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を形成すること、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって上記混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成すること、
また、任意に、
（ｉｖ）得られた水性組成物を６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して濾過し、濾液を形成する、又は２２４８０ｍ／ｓ２以上で得られた水性組成物を遠心分離し、上清を形成する、及び／又は、
（ｖ）得られた水性組成物、濾液、又は上清を凍結乾燥すること、
を含む、方法に関する。
【００１８】
また、好ましくは、本発明は、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］又はポリアデニル−ポリウリジル酸［ポリ（Ａ：Ｕ）］であり、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンが少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、上記ポリアルキレンイミンの重量平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５〜５．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％が６００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子が３０ｎｍ〜１５０ｎｍのｚ平均径を有する、
組成物に関する。
【００１９】
また、より好ましくは、本発明は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも６０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、ここで、上記ＰＥＩの重量平均分子量が１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５〜４．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％が５００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子が６０ｎｍ〜１３０ｎｍのｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記粒子が７５ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する、
組成物に関する。
【００２０】
ＢＯ−１１Ｘ製剤の形態のかかる組成物の作製に関する更なる実施形態、それらの特徴、それらの分析及びそれらの使用は、下記の詳細な説明及び実施例において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】４８時間の曝露後の黒色腫細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３における細胞死を分析することによる、濾過又は遠心分離の後の別々のＢＯ−１１１調剤の機能活性。（Ａ）実施例１における２−バイアル製造加工（processing）の記載に従い、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子をＰＥＩと会合させてＢＯ−１１１の複合体を形成し、得られた溶液を種々の細孔径を有するメンブレンを使用して濾過する（その後、細胞系アッセイに通過画分溶液を使用する）か、又は種々の速度で遠心分離する（その後、上清を細胞系アッセイに使用する）かのいずれかを行い、別々のＢＯ−１１１調剤を生成し、それらの各々が、より均質で、Ｚ平均（ｄ．ｎｍとして表される流体力学的径）として特定される更に小さいサイズのポリ（Ｉ：Ｃ）系複合体を含有する。質的に同様のデータを２４時間での細胞死を試験することによって作成した。細胞死に対するデータをＢＯ−１１１で処理しない試料と比較する。（Ｂ）対応する濾過していないＢＯ−１１１調剤（白色棒グラフ）と比較した、０．８μｍのフィルタを通して濾過することによって得られるＢＯ−１１１調剤の用量反応活性（影付きの棒グラフ）。より大きな複合体の沈降又は保持のため、（それぞれ）遠心分離又は濾過がポリ（Ｉ：Ｃ）の一部喪失を引き起こすことから、初期の調剤を適正濃度へと適宜希釈することによって細胞に対するかかる調剤の効果を正確に比較するため、別々の各ＢＯ−１１１調剤におけるポリ（Ｉ：Ｃ）の量を、２６０ｎｍの波長での分光光度分析によって定量化した。質的に同様のデータを１２時間、２４時間及び３６時間での細胞死を試験することによって作成した。文献に記載されるトリパンブルーアッセイによって細胞死を判定する。同じ実験の各条件に対する３回のデータを使用して標準偏差を計算する。
【図２】同じ細胞系アッセイ及び図１のＢＯ−１１１の濃度を使用して特定される、ＢＯ−１１１の機能活性に対するＰＥＩの特徴の効果。（Ａ）別々のＢＯ−１１１調剤を、種々の分子量を有する直鎖ポリマーを含有する市販のＪｅｔＰＥＩ調剤を使用して得た（キロダルトンで表す；ＮＴ：対照、処理していない細胞；かかるＪｅｔＰＥＩ調剤は、１．５未満の、特に１．１〜１．４に含まれる多分散性指数を有する単峰性の分布を示す）。（Ｂ）別々のＢＯ−１１１調剤を、μＬＰＥＩ×１５０ｎＭ／μｇポリ（Ｉ：Ｃ）×３ｎｍｏｌ（式中、１５０ｎＭはＰＥＩ中の窒素残留物の濃度を指し、３ｎｍｏｌはポリ（Ｉ：Ｃ）１μｇ当たりのアニオン性リン酸塩のナノモル数を指す）として計算される比率Ｎ／Ｐ（１．２〜５．３）を修正することにより得た。各組み合わせの薬理学的効果を黒色腫細胞及びメラノサイト（対照細胞；ＮＴ：対照、処理されていない細胞）の両方の細胞死パーセンテージの比較により判定する。「ファストピペッティング（fast pipetting）」法に代えて、シリンジを使用して、混合速度を増加させ（少なくとも視覚的に混合速度の増加を確認できる）ＰＥＩ溶液を含有するバイアルにポリ（Ｉ：Ｃ）溶液を素早く注入して、図１に記載されるのと同じポリ（Ｉ：Ｃ）調剤を（Ａ）及び（Ｂ）に記載される全てのＢＯ−１１１の調剤に使用した。同じ実験の各条件に由来する三回のデータを使用して標準偏差を計算する。
【図３】電気泳動によるＢＯ−１１１調剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）分子の分析。（Ａ）初期のポリ（Ｉ）分子又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子の標識化されていない調剤を、アガロースゲル０．８％（１時間の電気泳動）にて漸増量のＢＯ−１１１調剤と比較した。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の分子サイズをサイズマーカーと比較して特定する。（Ｂ）放射性同位体で標識化されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子を、写真フィルムに露光させたアガロースゲル１％（１時間の電気泳動）を使用して、非標識化ポリ（Ｉ：Ｃ）、及び同じ放射性同位体で標識化されたポリ（Ｉ：Ｃ）を含むＢＯ−１１１調剤と比較する。パネル（Ａ）では目視できない種々のＢＯ−１１１調剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、（それらのサイズ及び／又は電荷分布により）電場がアガロースゲルを横切って移動させることができないＪｅｔＰＥＩ形成粒子に会合されるため、アガロースゲルのウェル内で阻まれてパネル（Ｂ）に現われる。（Ｃ）非標識化ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を、アガロースゲル０．８％（１時間の電気泳動）中の比率Ｎ／Ｐ（１．２、３及び５．３；図２のようにこの値を計算する）を修正することにより得られた別々のＢＯ−１１１調剤と比較する。種々のＢＯ−１１１調剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）分子の安定性を評価するため、アガロースゲルにロードする前、各試料は非処理（Ｃ＋）であるか、又は特定の分解酵素（ＲＮＡｓｅ；Ｒｎａｓｅ  Ａ：３０分に亘って５μｇ／ｍＬ）で処理されるかのいずれかである。より高いＮ／Ｐ比（３以上）でＪｅｔＰＥＩと複合体化した場合、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、かかる酵素に非感受性のようであり、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のスメアはＮ／Ｐ比が３未満の場合に現れる（released）ようである。パネル（Ａ）及びパネル（Ｃ）では、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の分子サイズをサイズマーカーと比較して特定する。
【図４】ゼータサイザーナノＺＳ技術によって動的光散乱を使用してシグナル強度を比較することにより特定される、２−バイアル生産プロセスを使用して得られる調剤におけるＢＯ−１１１の複合体の粒度分布。（Ａ）同じ生産プロセスの使用により得られた３つの異なるＢＯ−１１１バッチを使用して、粒径分布の比較を行った。（Ｂ）室温で３０分間撹拌しながらインキュベーションに曝す（又は曝さない、対照として示される試料）場合の別々のＢＯ−１１１調剤の比較。（Ｃ）５０℃で３０分間のインキュベーションに曝す（又は曝さない、対照として示される試料）場合の別々のＢＯ−１１１調剤の比較。（Ｄ）別々のＢＯ−１１１調剤、実施例１において提案される対照の製造品、及び３回のプロファイルによって評価した、混合速度の減少を使用するドロップ−バイ−ドロップ（drop-by-drop）アプローチによって得られた「緩速混合」試料の比較。ナノメートル単位の粒子径（ｄ．ｎｍ）を考慮することによって粒度を評価する。
【図５】ＢＯ−１１２によって例示される、ＢＯ−１１Ｘ化合物のＧＭＰ製造計画。（Ａ）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子と、市販のＪｅｔＰＥＩ調剤と、グルコースとを含む、ＧＭＰ準拠の薬学的調剤として、ＢＯ−１１２化合物を製造する主な工程を要約するフローチャート。（Ｂ）屈折率検出（ＲＩ）を使用して分析されるＢＯ−１１２、ＪｅｔＰＥＩ及びグルコースの試料に対する浸透クロマトグラム。ＢＯ−１１２シグナルは、グルコースシグナルと重複するのに対し、１３．７５ｍＬの保持容量での遊離ＪｅｔＰＥＩの特徴的なピークは消滅し、当初のＪｅｔＰＥＩが全てＢＯ−１１２に組み込まれたことを示唆する。（Ｃ）およそ１００ｎｍから７３ｎｍ、５４ｎｍ以下に及ぶＺ平均径（ｄ．ｎｍ）を有する粒子を得るための、低速（１００ｒｐｍ未満）又は高速（１００ｒｐｍ超、最高５５０ｒｐｍ）の注入速度（５５０ｒｐｍがＢＯ−１１２製造プロセス中に溶液を混合するための基準速度である）における、製造プロセス中の混合速度の増加によるＢＯ−１１２化合物分布の変化（機能性ＢＯ−１１２調剤は、３０ｎｍ〜１５０ｎｍの平均径を提示する；粒子径は、先の図におけるようにｄ．ｎｍの単位で定義する）。
【図６】種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の構造的分析。（Ａ）種々のポリ（Ｉ：Ｃ）調剤の分子サイズを、サイズマーカーを使用してアガロースゲルにおいて特定する。（Ｂ）ＢＯ−１１２複合体の粒度分布を、市販の３つのポリ（Ｉ：Ｃ）含有生成物（ポリ−ＩＣＬＣ、ＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ及びＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ、粒度は、先の図のようにｎｍ単位で定義する）と比較する。
【図７】ナノサイザー（Nanosizer）技術を使用してシグナル強度を比較することにより特定される−２０℃での保存後の粒度分布における変化を、ＢＯ−１１２（Ａ）、ポリ−ＩＣＬＣ（Ｂ）、ＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ（Ｃ）及びＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ（Ｄ）について判定する（粒子径は、先の図のようにｎｍ単位で定義する）。
【図８】２つの別々の癌細胞モデルにおける細胞生存率に対する種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の効果。ＢＯ−１１２を非処理細胞、及びポリ−ＩＣＬＣ、ＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ又はＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷで処理した細胞と比較し、各製剤を、黒色腫（Ａ）又は膵癌（Ｂ）の細胞モデルのいずれかにおいて複合体重量に従って決定した指定の濃度であるが、同様の含有量のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む濃度で試験する。２４時間後にクリスタルバイオレットアッセイ法を使用して細胞の生存率データを生成した。（Ｃ）治療的関心のあるシグナル伝達分子に対する種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の効果。ＢＯ−１１２、ポリ−ＩＣＬＣ（又は非処理、ＮＴ）に８時間、１６時間、及び２４時間曝したＳＫ−ＭＥＬ−１０３細胞におけるインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）の発現をＲＴ−ｑＰＣＲ法によって評価した。ＢＯ−１１２製剤及びポリ−ＩＣＬＣ製剤をポリ（Ｉ：Ｃ）分子の同様の含有量を提供する濃度で使用した。
【図９】癌細胞株に対するかかるＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の特異的な細胞毒性を実証する、正常、初代メラノサイト（調剤１番及び２番）及び４つの癌細胞株の生存率に対する、直鎖ＰＥＩのみ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、及び２つの異なるＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤（ＢＯ−１１０及びＢＯ−１１２）の効果。適用したポリ（Ｉ：Ｃ）のみ、ＢＯ−１１０及びＢＯ−１１２の処理の調剤中に使用されるポリ（Ｉ：Ｃ）の含有量は同一である（４０時間の処理当たり１μｇ／ｍＬ）。
【図１０】ヒト癌に対する動物モデルにおけるＢＯ−１１２の投与に対する効果。（Ａ）治療のスケジュールを示すタイムライン。０日目に、全てのマウスにＢ１６−Ｆ１０ネズミ科黒色腫細胞を皮下注射した。７日目に同様の平均サイズ（８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）の腫瘍を提示するマウスを５群に無作為化した後、２群、３群及び４群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）では、３つの異なる濃度で腫瘍組織への直接注射（ｉ．ｔ．治療）によってＢＯ−１１２製剤（二重円）で、又は残りの２群（Ｇ１及びＧ５）ではビヒクルのみで動物を治療した。７日目の同じ濃度のＢＯ−１１２製剤の腫瘍内投与に加えて、後の治療日（１０日目、１４日目、１７日目、２１日目及び２４日目）において、Ｇ１以外の全ての群は、抗ＰＤ−Ｌ１ネズミ科抗体（１５０μｇ／用量）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を受けた。生存を毎日モニターし、死亡したマウスを見つけた時、又は腫瘍量が最大許容サイズに達した時に死亡として採点した。最後の治療の後、最後のマウスが死亡して実験を終了した４５日目までモニタリングを継続した。（Ｂ）対照群Ｇ１及びＧ５をＢＯ−１１２製剤が指定の３つの濃度で投与された３群と比較する生存曲線。上記群を比較すると、対照群と試験群との間に統計学的な差（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）があり、Ｇ４はビヒクル又は抗ＰＤ−Ｌ１単独に対して最も強力な生存の増加を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９５％は６００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、特にＩＳＯ２２４１２に従って測定される２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有する、
組成物に関する。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有する、
組成物に関する。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に開示される粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２によって測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有し、
上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５以上で上記粒子が形成される、
組成物に関する。
【００２５】
上記複合体で構成されるか、又はそれによって形成される粒子は、更なる実施形態にお
いて、上記粒子がマンニトール又はグルコースのような賦形剤等の更なる成分を含んでもよいように、下記開示による追加の特徴を提示してもよく、又は癌を標的とする官能性又は他の部分及びリンカー等の更なる要素が存在しなくてもよい。粒子が上記組成物中に［すなわち、液体（水性）又は凍結乾燥された製剤中に］提供され分析される場合、例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍの特定の範囲に含まれる単峰性の粒度分布を有すると定義される場合、又は、組成物が一本鎖ポリリボヌクレオチド分子の欠如（低いハイパークロミック効果（hyperchromic effect）又はその不在によって確立される）を特徴とする場合等の更
なる好ましい実施形態において、追加の特徴を規定してもよい。規制上の承認に必要な国際的に確立されている基準及び／又は優良医薬品製造基準（Good Manufacturing Processes）に従って規定される他の特徴を以下に開示する。
【００２６】
本発明の組成物の好ましい実施形態では、上記組成物に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有する。さらに、複合体に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドは、それらの調剤プロセスによって及び／又は所望の使用に従って規定される特定の範囲の長さを提示してもよい。例えば、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％、５０％、６０％又は任意の他のより高い割合が少なくとも８５０塩基対を有してもよく、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％、６０％、７０％又は任意の他のより高い割合が４００塩基対〜５０００塩基対を有してもよい。上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドを規定し得る追加の範囲は、次のとおりである：
（ｉ）二本鎖ポリリボヌクレオチドの５％〜６０％（好ましくは１０％〜３０％）は４００未満の塩基対を有し、
（ｉｉ）二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％（又は１５％〜３０％であるが、好ましくは２０％〜３０％）は４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｉｉｉ）二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜７０％（好ましくは５０％〜６０％）は８５０塩基対〜５０００塩基対を有し、及び／又は、
（ｉｖ）二本鎖ポリリボヌクレオチドの０％〜１０％（好ましくは１％以下）は５０００超の塩基対を有する。
【００２７】
したがって、本発明の組成物の更に好ましい実施形態では、上記組成物に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記組成物に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有する。上記組成物に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記組成物に含まれる上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％は４００塩基対〜８５０塩基対を有することが、更により好ましい。上記組成物に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記組成物に含まれる上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜３０％は４００塩基対〜８５０塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの１０％〜３０％は４００未満の塩基対を有することが、より一層好ましい。
【００２８】
本発明の一実施形態では、二本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］分子又はポリアデニル−ポリウリジル酸［ポリ（Ａ：Ｕ）］分子であることが好ましい。二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］分子であることがより好ましい。上記二本鎖ポリリボヌクレオチド分子は、例えばポリ（Ｃ）及びポリ（Ｕ）とそれぞれ対になるポリ（Ｉ）及びポリ（Ａ）の鎖を含むことにより、二本鎖ポリリボヌクレオチドを形成し、ここで、各鎖は、最大５％の上記鎖の大多数のリボヌクレオチドとは異なるリボヌクレオチド、及び／又は最大５％の
ミスマッチ塩基対を含んでもよく、より好ましくは最大１％の上記鎖の大多数のリボヌクレオチドとは異なるリボヌクレオチド、及び／又は最大１％のミスマッチ塩基対を含んでもよい。また、選択されるポリリボヌクレオチド及び／又は上記複合体を生成するプロセスに応じて、複合体に含まれるポリリボヌクレオチドの画分は、一本鎖（すなわち、対にならなかった）ポリリボヌクレオチドを含んでもよい。
【００２９】
好ましい実施形態では、これらの粒子及び組成物中の遊離の一本鎖ポリリボヌクレオチドの含有量は、ハイパークロミシティー（又はハイパークロミック効果）に基づいて評価される。この二重構造が変性される場合、この効果は二本鎖ポリヌクレオチドの光学密度（吸光度）の増加に起因する。２つの一本鎖が熱、又は変性剤の添加、又はｐＨレベルを増加させることのいずれかによって分離されている場合、ポリヌクレオチドのＵＶ（紫外線）吸光度は増加される。したがって、ハイパークロミシティーを用いて、温度（又は別の条件）変化として粒子内のポリ（Ｉ：Ｃ）又はポリ（Ａ：Ｕ）の分子の構造を確認することにより、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子中のポリ（Ｉ）鎖とポリ（Ｃ）鎖との分離、又はポリ（Ａ：Ｕ）分子中のポリ（Ａ）鎖とポリ（Ｕ）鎖との分離をそれぞれ特定することができる。標準的な設備及びプロトコルを使用して２６０ｎｍの波長領域で光の吸光度を測定することにより特定される、粒子中の一本鎖ポリ（Ｉ）分子及びポリ（Ｃ）分子、又は一本鎖ポリ（Ａ）分子及びポリ（Ｕ）分子のかかる含有量は可能な限り低いことが好ましい。例えば、この効果は、分光光度計を使用し、欧州薬局方（２．２．２５；吸光光度法、紫外線及び可視光）に従って測定することができる。特に、本明細書に開示される組成物は、２０℃〜８０℃で２６０ｎｍでの吸光度の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満の増加を呈し、更に一層好ましくは２０℃〜８０℃で２６０ｎｍでの吸光度の１％未満の増加を呈する。代替的には、本明細書に開示される組成物は、室温と、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、及び９０℃とで０．２未満の透過率の増加を示す。この値を、室温で２６０ｎｍの吸光度（Ａ）又は透過率（１／Ａ）として測定することができ、その後、前述のより高温での吸光度又は透過率の各値により差を計算する。
【００３０】
本発明の組成物の好ましい実施形態では、ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物は、直鎖、分岐鎖及び／又は樹状であり、より好ましくは、上記ポリアルキレンイミンは直鎖ポリアルキレンイミンである。更に好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンは、ホモ−ポリアルキレンイミン又はヘテロ−ポリアルキレンイミンである。ポリカチオン性ホモ又はヘテロポリマーは、アミン基によって形成される反復単位と、少なくとも２つの炭素原子スペーサーとを含むことが好ましく、そのようにして直鎖若しくは分岐鎖、及び／又は樹状のホモ−ポリアルキレンイミン又はヘテロ−ポリアルキレンイミンのポリマーを含む。ポリアルキレンイミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン及びポリペンチレンイミンであり、これらのホモポリマーのうちのいずれかの混合重合体、又は任意の商業的に入手可能な誘導体、或いは開示される誘導体である。このポリアルキレンイミンポリマーは水溶性であることが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンは、水溶性で直鎖のホモ−ポリアルキレンイミン又はヘテロ−ポリアルキレンイミンである。更により一層好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンは、特に水溶性で直鎖のホモ−ポリアルキレンイミンを含み、より好ましくは、少なくとも７５％の直鎖ポリエチレンイミンを含み、より一層好ましくは９５％の直鎖ポリエチレンイミンを含む。本発明の組成物の更に一層好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩとしても知られる）である。したがって特に好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンは直鎖ポリエチレンイミンである。
【００３１】
本発明の組成物の別の好ましい実施形態では、上記ポリアルキレンイミンの重量平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、更に好ましくは１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａであり、１．５未満の分子量多分散性指数を有する。上記重量平均分子量及び上記多分散
性指数を、ＩＳＯ１６０１４：２０１２、好ましくはＩＳＯ１６０１４−２：２０１２によるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）に従って、上記ポリアルキレンイミンのポリアルキレンオキシド前駆体について特定した。多分散性指数は、Ｍｗ／Ｍｎ（重量平均分子量／数平均分子量）として計算され、１．５未満である。
【００３２】
本発明の組成物の別の好ましい実施形態では、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率は、２．５以上であり、より好ましくは２．５〜５．５であり、更により好ましくは２．５〜４．５であり、更に一層好ましくは２．５〜３．５である。この比率は、組成物内の粒子を形成し、所望の効果及び特性を有する組成物を提供する際、特に重要である。
【００３３】
したがって、上に言及されるように、本発明は本明細書に開示される粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩又はその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、ここで上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２に従って測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有し、
２．５以上、より好ましくは２．５〜５．５、更により好ましくは２．５〜４．５、更に一層好ましくは２．５〜３．５の上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率で上記粒子が形成される、組成物に関する。更に好ましい実施形態では、上記組成物は、上記組成物の総（すなわち最終）容積１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇのポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］から、より好ましくは上記組成物の総容積１ｍＬ当たり少なくとも２．０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することにより形成される。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、二本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］又はポリアデニル−ポリウリジル酸［ポリ（Ａ：Ｕ）］であり、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％が少なくとも８５０塩基対（ｂｐ）を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、ポリアルキレンイミンが少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、ここで、上記ポリアルキレンイミンの重量平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、上記組成物の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率（すなわち、上記粒子の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率）が２．５〜５．５である。
【００３４】
本発明のより望ましい特に好ましい実施形態では、二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、ここで、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも６０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の２０％〜３０％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１０％〜３０％が４００未満の塩基対を有し、ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンであり、ここで、上記ポリアルキレンイミンの重量平均分子量が１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満（例えば、組成物内で測定される０．１〜０．６）であり、上
記組成物の形成に使用される上記ポリ（Ｉ：Ｃ）のリンのモル数に対する上記ポリエチレンイミンの窒素のモル数の比率（すなわち、上記粒子の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率）が２．５〜４．５である。
【００３５】
本発明では、本発明の組成物に含まれる粒子のｚ平均径及び直径の多分散性指数は、上記粒子が等方性であり、球状であるという仮定に基づいて動的光散乱（ＤＬＳ）技術によって特定される。特に、ｚ平均径（ゼータ平均径）は、工業規格ＩＳＯ２２４１２：２００８に従って特定される上記粒子の輝度加重算術平均流体力学的径（intensity-weighted
arithmetic average hydrodynamic diameter）を指す。さらに、工業規格ＩＳＯ２２４
１２：２００８は、多分散性指数の形式の粒径（粒度）分布の基準を提供し、Ｄ５０％（それ未満に５０％の試料輝度（sample intensity）が含まれる最大粒径、中位径としても知られる）、Ｄ９０％（それ未満に９０％の試料輝度が含まれる最大粒径）、Ｄ９５％（それ未満に９５％の試料輝度が含まれる最大粒径）、及びＤ９９％（それ未満に９９％の試料輝度が含まれる最大粒径）として知られるパーセンタイル（Ｄ値）の計算を可能にする。したがって、ＩＳＯ２２４１２において提示される方法論に基づき、本発明の組成物に含まれる粒子の少なくとも９５％（Ｄ９５）又は好ましくは９０％（Ｄ９０）が６００ｎｍ以下、より好ましくは３００ｎｍ以下の直径を有し、上記粒子が２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ未満のｚ平均径を有することを確認することができる。
【００３６】
本発明の組成物の好ましい実施形態では、上記粒子は、特に上に示されるマイクロメートル未満の範囲に単峰性の径分布を有する。実際、一態様では、本発明の水性組成物は粒子を含み、ここで、上記粒子の少なくとも９０％が３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、上記粒子はＩＳＯ２２４１２に従って測定される１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有する。製造の終わり及び／又は投与の直前になおも存在する可能性のある（しかしながら、いずれの場合も欧州薬局方に指定される制限を下回る）、かかる値を上回るサイズ（例えば１０μｍ等を上回るようなマイクロメートル範囲）を有する粒子（又はそれらの凝集塊）を濾過（例えば０．８マイクロメートルフィルタを通して）により除去することができる。したがって、この組成物に含まれる全ての又は大多数の粒子は、実施例において示されるように、それらの作製の間に確立され、所望の用途及び／又は保存に応じて維持及び適合され得る組成物において単峰性の径分布を提示し得る。
【００３７】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記粒子の少なくとも９５％又は９０％は６００ｎｍ以下の直径（すなわち、それ未満に９５％又は９０％の試料輝度が含まれる最大粒子径＝Ｄ９５％又はＤ９０％＝６００ｎｍ）、より好ましくは５００ｎｍを超えない直径、更により好ましくは４００ｎｍを超えない直径、より一層好ましくは３００ｎｍを超えない直径を有する。かかる制限において、更に一層好ましくは上記粒子の少なくとも９９％が６００ｎｍ以下の直径を有し、より一層好ましくは上記粒子の少なくとも９９％が５００ｎｍ以下の直径を有し、更に好ましくは上記粒子の少なくとも９９％が４００ｎｍ以下の直径、更に好ましくは３００ｎｍを超えない直径を有する。一方、好ましい実施形態では、上記粒子は７５ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは８０ｎｍ〜１３０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有し、１４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくは１７０ｎｍ〜２４０ｎｍのＤ９０％を有する。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記粒子は１５０ｎｍ未満、より好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍ（更に好ましくは５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、７５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、又は６０ｎｍ〜１３０ｎｍ等）に含まれる範囲のｚ平均径を有する。本発明の水性組成物の上記粒子は３０ｎｍ〜１５０ｎｍの単峰性の径分布を有することがより好ましい。
【００３９】
したがって、最も特に好ましい実施形態では、（ｉ）本発明の組成物に含まれる粒子の少なくとも９９％は６００ｎｍ以下の直径を有し、それによって上記粒子は３０ｎｍ〜１５０ｎｍのｚ平均径を有し、（ｉｉ）本発明の組成物に含まれる粒子の少なくとも９９％は５００ｎｍ以下の直径を有し、それによって上記粒子は６０ｎｍ〜１３０ｎｍのｚ平均径を有し、７５ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、上記組成物を本明細書に開示される水性組成物の凍結乾燥によって得ることができる。したがって、本発明の組成物は水性組成物又は凍結乾燥組成物であってもよい。したがって、本発明の組成物（以下、ＢＯ−１１Ｘ製剤、ここでＢＯ−１１Ｘ製剤は、例えば、ＢＯ−１１１製剤及びＢＯ−１１２製剤を包含するように、Ｘは整数であってもよい）を固体（凍結乾燥された、又は他の高度に濃縮された形態の粒子として）、半固体（ゲルとして）、又は液体の形態で提供することができるが、液体組成物（水性組成物、又は注入若しくは吸入が可能な他の種類の粒子懸濁液等）として提供されることが好ましい。ＢＯ−１１Ｘ製剤をそのまま使用、輸送、及び保存することができ、又は具体的な使用、輸送、保存、他の化合物との投与、及び／又は更なる技術的要求に対する凍結乾燥形態を得るために使用することができる。凍結乾燥プロセス及び設備に関して、古典的な凍結乾燥（freeze-drying）、又はより最近の方法（電気凍結、超音
波制御、又は氷霧等）をＢＯ−１１Ｘ製剤の取り扱い及び製造に適合させてもよく、また、ｐＨ、風乾速度（drying air speed）、時間、湿度、圧又は温度等のパラメーターを変更することによって適合させてもよい。
【００４１】
したがって、最も好ましい一実施形態では、本発明の組成物は粒子を含み、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］又はポリアデニル−ポリウリジル酸［ポリ（Ａ：Ｕ）］であり、ここで、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％は４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンは少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、ここで、上記ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、多分散性指数は１．５未満あり、上記組成物の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率（すなわち、上記粒子の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率）は２．５〜５．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％は６００ｎｍ以下の直径を有し、好ましくは上記粒子の少なくとも９５％は４００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は３０ｎｍ〜１５０ｎｍのｚ平均径を有する。
【００４２】
別の最も好ましい実施形態では、本発明の組成物は粒子を含む水性組成物であり、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、ここで、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも６０％は少なくとも８５０塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも７０％は４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の２０％〜４５％は４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、ここで、上
記ＰＥＩの重量平均分子量は１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａであり、多分散性指数は１．５未満であり、上記組成物の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率（すなわち、上記粒子の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率）は２．５〜４．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％は５００ｎｍ以下の直径を有し、好ましくは上記粒子の少なくとも９５％又は９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は６０ｎｍ〜１３０ｎｍのｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記粒子は７５ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する。
【００４３】
ＢＯ−１１Ｘ製剤は、本発明の好ましい実施形態では、好ましい最終形態（液体又は凍結乾燥形態等）、使用、輸送、保存、他の化合物との投与、及び／又は更なる技術的要件に最も適した薬学的に許容可能な担体、賦形剤、有機溶媒、及び／又はアジュバント［グリセロール、エタノール、グルコース又はマンニトール、好ましくはグルコース又はマンニトール、より好ましくは１％〜１０％（重量／容積）の濃度］を更に含む組成物［すなわち、上記組成物は、１％〜１０％（重量／上記組成物の総容積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に添加することによって形成される］として提供され得る。より好ましい実施形態では、上記組成物は、有機化合物、無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド、又はタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を更に含む。
【００４４】
一態様では、本発明の水性組成物は、ＩＳＯ１３０９９による、３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ〜５０ｍＶ、又は３８ｍＶ〜４５ｍＶ、より一層好ましくは４０ｍＶ〜４５ｍＶのゼータ電位を有する。
【００４５】
本発明の組成物の別の実施形態では、上記組成物は、
（ｉ）２〜４のｐＨ、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、
（ｉｉｉ）水に対して言及される、上記水性組成物が水中５％（重量／容積）のＤ−グルコースを含む場合の２０℃、５８９ｎｍの波長における、＋１５００度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１〜＋３７５０度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１の比旋光度、及び／又は、
（ｉｖ）３０ｍＶ以上（例えば、３５ｍＶ〜５０ｍＶに含まれる）のゼータ電位、
を有する水性組成物である。
【００４６】
本発明の更に好ましい実施形態では、上記組成物は、
（ｉ）２〜４のｐＨ、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、及び／又は、（ｉｉｉ）３０ｍＶ以上（例えば、３５ｍＶ〜５０ｍＶに含まれる）のゼータ電位、
を有する水性組成物である。
【００４７】
特に好ましい一実施形態では、上記組成物は、
（ｉ）２〜４のｐＨ、及び／又は、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、
を有する、グルコース又はマンニトールを含む水性組成物である。
【００４８】
本発明の更なる好ましい一実施形態では、上記組成物は、
（ｉ）２．７〜３．４のｐＨ、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、及び／又は、（ｉｉｉ）３５ｍＶ〜５０ｍＶ又は３８ｍＶ〜４５ｍＶ、更に好ましくは４０ｍＶ〜４５ｍＶに含まれるゼータ電位、
を有する、グルコースを含む水性組成物である。
【００４９】
代替的な更なる好ましい実施形態では、上記組成物は、
（ｉ）２．７〜３．４のｐＨ、
（ｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度、及び／又は、（ｉｉｉ）３５ｍＶ〜５０ｍＶ又は３８ｍＶ〜４５ｍＶ、更に好ましくは４０ｍＶ〜４５ｍＶに含まれるゼータ電位、
を有する、マンニトールを含む水性組成物である。
【００５０】
本発明について、本明細書に報告されるモル浸透圧濃度値は、厳密には浸透圧値であるが、水（本発明の水性組成物が作製される溶媒）の密度が２０℃で１．００ｇ／ｍＬに近似することから、これらの用語は同じ意味で使用される。本発明の目的について、室温は２０℃〜２５℃の温度を指す。
【００５１】
本発明では、ゼータ電位はＩＳＯ１３０９９、好ましくは１３０９９−２：２０１２に従って測定される。
【００５２】
また、本明細書に開示されるように、本発明は、医薬として使用される組成物に関する。したがって、また同様に、本発明は、医薬の製造のための本明細書に開示される組成物の使用に関する。この使用は、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子及びそれを含む粒子が高度に安定な形態であり、高濃度の液体（水性）の又は凍結乾燥された組成物として上記組成物を提供することにより達成され得る。例えば、上記組成物は、上記組成物の総（すなわち最終）容積１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍｌ、最大２．０ｍｇ以上のポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］又はポリアデニル−ポリウリジル酸［ポリ（Ａ：Ｕ）］を用いて複合体を作製することによって形成される。
【００５３】
これらの組成物は、例えば、腫瘍内又は、皮膚若しくはかかる腫瘍及び癌細胞を含む内臓若しくは組織への腫瘍周囲への注射による、特に癌細胞への直接投与に適合される。本発明の好ましい実施形態では、上記医薬は注射可能である。本発明のより好ましい実施形態では、上記医薬は、任意に薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む、注射用水性組成物である。この注射用水性組成物をそのまま提供してもよく、又は（所与の容量の溶液に添加されるポリ（Ｉ：Ｃ）分子又はポリ（Ａ：Ｕ）分子の各重量に関して粒子を調製する際に確立される、作製される組成物の総容積１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇ以上のポリ（Ｉ：Ｃ）又はポリ（Ａ：Ｕ）の各濃度に）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子若しくはポリ（Ａ：Ｕ）分子の濃縮調剤を希釈した後に、又は本発明の組成物の総容積を構成するように凍結乾燥組成物を希釈した後に提供してもよい。これは、上記組成物が、水性組成物の総容積当たりの複合体を作製するのに使用されたポリ（Ｉ：Ｃ）又はポリ（Ａ：Ｕ）の重量に関して決定される前述の濃度で提供されることを意味するが、適切な場合、特に長期保存及び／又は腫瘍内投与については濃縮されてもよい。特に、かかる高濃度の二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む（すなわち、総水性組成物１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇ、最大０．７ｍｇ、好ましくは０．９ｍｇ、より好ましくは２．０ｍｇ以上のポリ（Ｉ：Ｃ）を直鎖ＰＥＩと複合体化することによって形成される複合体を含む粒子から作製される）ＢＯ−１１Ｘ製剤は、医薬としての投与及び使用に最も適切である。腫瘍及び癌細胞が存在する、１以上の小さな又は限定された場所における腫瘍内又は腫瘍周辺への（また、実際の接近可能性及び／又は医療者（practitioner）によって評価される腫瘤のサイズに応じた）かかる組成物の注射は、より強力及び／又はちょうどよいタイミングで治療効果を提供し得る。
【００５４】
さらに、本発明は、ヒト細胞又は動物細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療のために使用される本明細書に開示される組成物に更に関する。かかる治療は、本発明の組成物と、別の癌特異的薬物（例えば癌抗原を標的とする抗体又は癌ワクチン）等の別の
治療的処置又は標準治療（放射線療法又は化学療法等）との併用適用を含んでもよい。併用適用は、相加的な治療効果だけでなく、同様の治療的利益を達成するのに必要な他の薬物の投与量を減らす、副作用を低減する、又は腫瘍及び癌細胞に対して長期間継続する及び／又は相乗的な効果を提供するといった他の価値のある効果を提供する場合がある。したがって、同様に、本発明はまた、ヒト細胞又は動物細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に対する医薬の製造に対する、本明細書に開示される組成物の使用に関する。本発明について、生育異常は制御されていない細胞の分裂及び／又は分化を特徴とする。
【００５５】
より好ましい実施形態では、上記細胞増殖障害は、癌又は雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害である。本発明において言及される癌は、基底細胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腹膜の癌；絨毛癌；結合組織の癌；消化器系癌（食道、胃、結腸、直腸、又は他の消化器の癌を含む）；眼癌；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌（hepatic carcinoma）；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌（kidney）、副
腎癌又は腎癌（renal）；白血病；肝臓癌（liver cancer）；肺癌（例えば、小細胞肺癌
、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば唇、喉頭、舌、口又は咽頭の癌）；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；呼吸器系の癌；唾液腺癌；皮膚癌；扁平上皮癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮、子宮内膜、子宮頸部、外陰部、卵巣、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫（ＮＨＬ；低悪性度／濾胞状、小リンパ球性、中悪性度／濾胞状、中悪性度びまん性、高悪性度免疫芽球性、高悪性度リンパ芽球性、高悪性度小型非切れ込み核細胞性、又は巨大腫瘤病変ＮＨＬ等の特定の種類を含む）；マントル細胞リンパ腫及びエイズ関連リンパ腫；慢性リンパ性白血病；急性リンパ芽球性白血病；毛様細胞白血病；慢性骨髄芽球白血病；同様に他の癌腫及び肉腫；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、また同様に、母斑症又は浮腫と関連する（脳腫瘍と関連するもの等）血管増殖異常の１以上であることが好ましい。より好ましくは、上記癌は、膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；消化器系癌（食道、胃、結腸、直腸、又は他の消化器癌を含む）；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌；肝細胞腫；腎臓癌、副腎癌又は腎癌；白血病；肝臓癌；肺癌；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；膵癌；前立腺癌；呼吸器系の癌；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮、子宮内膜、子宮頸部、外陰部、卵巣、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；リンパ腫又は白血病の１以上から選択される。更に好ましくは、上記癌は、癌腫、神経膠腫、黒色腫又は肉腫の１以上、より一層好ましくは、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、乳癌又は膵癌、或いは黒色腫又は膵癌から選択される。
【００５６】
本発明で言及される雌性哺乳動物の生殖器は、包括的に、膣と卵管との間に位置する雌性哺乳動物の性器である。本発明の上記生殖器は子宮、卵管（子宮卵管境界を含む）、卵巣、子宮頸部及び膣、好ましくは子宮、卵管及び子宮頸部、より好ましくは哺乳動物の子宮である。したがって、本発明の婦人科障害は、膣と卵管との間に位置する雌性哺乳動物の生殖器系、好ましくは子宮、卵管及び子宮頸部の少なくとも１個の細胞を冒す疾患である。本発明では、婦人科障害は、哺乳動物の子宮の組織における少なくとも１個の細胞を冒す疾患がより好ましい。最も好ましい実施形態では、婦人科障害は、子宮内膜症又は子宮筋腫から選択される。
【００５７】
本発明では、哺乳動物は、好ましくはヒト亜科（hominine：ホミニン）、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ、又はシカである。さらに、上記哺乳動物は、好ましくはヒト、イヌ、雌ウシ、ウマ、又はラクダ、更に好ましくはヒト又はイヌ、最も好ましくはヒトである。
【００５８】
したがって、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、好ましくは、薬物の製造に適用され得る要件等の規制上及び工業上の要件と適合するプロセスの適用によって得ることができる（黒色腫又は
癌腫等の癌の治療等に対する）医学的関心のある効果を提供する、成分の組み合わせ及び他の物理化学的な特徴を提示することができる。特に、ＢＯ−１１Ｘ産生段階は、欧州（具体的には添付１３）、米国、日本及び／又は他の国々で施行されている優良医薬品製造基準の要件、及び／又は治験薬概要書（ＩＭＰＤ）の承認に対する要件の厳密な遵守において行われる。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、無菌、純度、安定性及び生物学的安全性（エンドトキシン、ウイルス、細菌、化学物質、金属、又はヒトにおける使用に不適合な他の汚染物質がない、又は実質的にそれらを含まない）に対する試験に合格しなくてはならない。例えば、エンドトキシンレベルは、公式に承認された検出キットを使用して１．０ＥＵ／ｍｇ以下又は１μｇ／ｍＬ以下でなくてはならない。
【００５９】
ＢＯ−１１Ｘ製剤を更に特徴づけるかかる成分及び特徴（組成又は該製剤に含まれる粒子としての）は、以下の１以上とすることができる：
（ｉ）任意の更なる有機化合物（溶媒等）、無機化合物、核酸、アプタマー、（例えばそれらの製作中に）粒子自体に含まれる医学的関心のあるペプチド又はタンパク質を含む若しくはそれを含まない、又は、その後、これらの粒子を含む組成物に添加される、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む組成物、
（ｉｉ）特に１７ｋＤａ〜２３ｋＤａ、より好ましくは１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａの重量平均分子量を有するポリアルキレンイミン（直鎖ＰＥＩ等）によって形成される粒子；
（ｉｉｉ）上記組成物の総（すなわち最終）容積１ｍＬ当たり少なくとも０．５ｍｇ（例えば、０．５ｍｇ／ｍｌから最大０．７ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍＬ以上）の濃度の二本鎖ポリリボヌクレオチドを使用して複合体を作製することにより形成される粒子を含む組成物；
（ｉｖ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率（すなわち、上記粒子の形成に使用される上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率）２．５以上、より好ましくは２．５〜５．５、より一層好ましくは２．５〜４．５、更に好ましくは２．５〜３．５で形成される、ポリアルキレンイミンと二本鎖ポリリボヌクレオチドとを含む粒子；
（ｖ）本明細書に定義され、ＩＳＯ２２４１２に従って測定される、好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは１５０ｎｍ未満、より一層好ましくは１５０ｎｍ〜３０ｎｍ（１５０ｎｍ〜５０ｎｍ、１５０ｎｍ〜７５ｎｍ、１００ｎｍ〜５０ｎｍ、１５０ｎｍ〜１００ｎｍ、又は６０ｎｍ〜１３０ｎｍ等）に含まれる範囲のＺ平均径を伴う単峰性の径分布を有する粒子；
（ｖｉ）Ｄ値  Ｄ５０％（それ未満に５０％の試料輝度が含まれる最大粒径、中位径としても知られる）７５ｎｍ〜１５０ｎｍ、及びＤ９０％（それ未満に９０％の試料輝度が含まれる最大粒径）１４０ｎｍ〜２５０ｎｍによって表される、ＩＳＯ２２４１２による径分布から特定される、単峰性の径分布を有する粒子；
（ｖｉｉ）粒子の少なくとも９５％は６００ｎｍの直径、好ましくは５００ｎｍの直径、より好ましくは４００ｎｍの直径、更に一層好ましくは３００ｎｍの直径を有する。粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有することが更により好ましい；
（ｖｉｉｉ）２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇに含まれるモル浸透圧濃度を提示する組成物、好ましくは２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇに含まれるモル浸透圧濃度を提示する、５％（重量／容積）のグルコースを含む水性組成物；
（ｉｘ）２．７〜３．４に含まれるｐＨを提示する組成物；
（ｘ）水に対して言及される、２０℃、５８９ｎｍの波長における＋１５００度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１〜＋３７５０度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１の比旋光度を提示する水中５％（重量／容積）のＤ−グルコースを含む水性組成物、及び／又は、
（ｘｉ）本明細書に定義され、ＩＳＯ１３０９９に従って測定される、３０ｍＶ以上、例えば３８ｍＶ、好ましくは３５ｍＶ〜５０ｍＶに含まれる、又はより好ましくは約４０ｍＶ〜４５ｍＶ（例えば４３ｍＶ）に含まれるゼータ電位を提示する組成物。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明は、特に医薬として使用される、粒子を含む組成物であって、該粒子が、二本鎖ポリヌクレオチドと水溶性でポリカチオン性のホモポリマー又はヘテロポリマーとの複合体を含み、上記粒子が６００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下の直径を有していることにより規定される単峰性の径分布、及び２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ平均径を特徴とする、組成物に関するものであり得る。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、二本鎖ポリリボヌクレオチドは、実施例に指定されるように、それら自体が０．４Ｋｂ未満、０．４Ｋｂ〜０．８５Ｋｂ、０．８５Ｋｂ〜５．０Ｋｂ、及び５．０Ｋｂ超のサイズに対する特定の範囲の割合を有し、またポリ（Ｉ：Ｃ）分子の水溶液（グルコース又はマンニトール等の賦形剤を既に含有するか、それを含有しない）を生成するための手段を提供し、ＢＯ−１１Ｘ製剤を生産するため、ポリアルキレンイミン（ポリエチレンイミン等）の水溶液との混合に対して適切な特徴を有する、ポリイノシン酸［ポリ（Ｉ）］分子とポリシチジル酸［ポリ（Ｃ）］の一本鎖分子とのアニーリングから生じるＢＯ−１１Ｘ製剤に存在するポリ（Ｉ：Ｃ）分子である。これら２つの水溶液を混合することによりもたらされるポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤を、その後バッチ調剤として維持し（好ましくは、なおも水溶液として、又は凍結乾燥形態で）、又は各々が使い捨てバイアル、シリンジ、若しくは保存用、かかるアリコートの使い捨て用、及び／又は凍結乾燥用の他の適切な容器に含まれるアリコートに直接調製してもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤（液体又は凍結乾燥の形態）を室温、又は０℃未満若しくは−２０℃未満の温度で保存してもよい。
【００６２】
かかる好ましい実施形態では、更なる化合物（１以上の抗体、ホルモン、ペプチド、賦形剤、担体、酵素活性の阻害剤、化学療法剤、抗生物質、安定剤、標識剤、有機溶媒、防腐剤、担体、又は他の薬物等）を（粒子の正確な形成又はＢＯ−１１Ｘ製剤について上に列挙される任意の他の特徴を変更しない場合）それらの混合の前、又はＢＯ−１１Ｘ製剤が２つの水溶液（二本鎖ポリリボヌクレオチドとポリアルキレンイミンと）の混合によって産生された後のいずれかに、２つの各水溶液に添加してもよい。結果的にＢＯ−１１Ｘ成分と同時に投与されるかかる追加の成分は、バイオアベイラビリティー、効能、薬物動態学的／薬力学的なプロファイル、安定性、代謝、又は当初のＢＯ−１１Ｘ製剤若しくは追加の成分（例えば薬学的関心のある別の化合物）の各々を単独で投与する、又は当初のＢＯ−１１Ｘ製剤若しくは追加の成分の各々を別々に投与する場合には観察されない、薬学的関心のある他の特性の改善を組成物にもたらすことができる。
【００６３】
更なる好ましい主な実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、（例えば、任意に薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む注射用水性組成物として）製剤化され、外因性の病原体（細菌又はウイルス等）と関係する疾患を提示する、又はヒト若しくは動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害、例えば癌（すなわち、腫瘍原性の形質転換、転移、毒性化合物を伴う）、若しくは雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害によりに起因する変更を提示する健康状態にある臓器又は組織への二本鎖ポリリボヌクレオチドの送達のため投与される医薬組成物等の医薬として使用される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ヒト又は動物に本発明の組成物を投与することを含む疾患の治療法に関する。更なる好ましい実施形態では、本発明は、本発明の組成物をヒト又は動物に投与することを含む、本明細書に定義される、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療方法に関する。
【００６４】
ＢＯ−１１Ｘ製剤は、（直接的又は間接的に）腫瘍細胞の死を誘導する、又は腫瘍細胞
の生育を抑制する、治療の領域において、癌の生育、生存、転移、上皮間葉転換、免疫学的回避又は再発を軽減、改善、又は阻止する方法のために使用されることが好ましい。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、癌腫、神経膠腫、黒色腫又は肉腫等の固形腫瘍を治療する方法のために使用されることがより好ましい。特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、全身、又は腫瘤の縁、周辺の上皮細胞、リンパ管若しくは血管（例えば、腫瘍内又は腫瘍周囲への注射）、又は雌性哺乳動物の生殖器の異常に生育している細胞等において腫瘍内に直接に又は腫瘍に近い場所のいずれかに投与される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、製造方法に従って産生され、その後、ＢＯ−１１１製剤又はＢＯ−１１２製剤として実施例に記載されるように構造的及び機能的に明らかな製剤である。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、特許文献１６に記載される、ＢＯ−１１０について特性評価された、生物学的活性、すなわち、改善された程度にかかわらず、癌細胞における又は好ましくはヒト起源の癌細胞に由来する細胞株におけるオートファジーの誘導と併せて、ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化又はＮＯＸＡ発現レベルを更に示す場合がある。ＢＯ−１１Ｘ製剤を検証するための細胞株の例は、ヒトのＳＫ−Ｍｅｌ−１９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞、及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞、並びにネズミ科Ｂ１６細胞であり、上記黒色腫細胞株は、ＢＯ−１１Ｘ製剤に曝されるとインターフェロンベータ等の分子の発現増加を提示する。さらに、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、免疫系の細胞と同様に、通常癌治療において二次的な毒性部位を提示する、メラノサイト又は他の皮膚細胞等の対照として使用される正常な細胞に対して毒性を提示しない。また、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、癌細胞のオートファジー及びアポトーシス（又はこの製剤がかかる細胞において誘導し得る治療的関心のある任意の他の効果）に続いて、特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤が、同じ適応症に対する別の薬物又は他の治療の同時又は連続する投与を伴って又はそれを伴わずに、（例えば、腫瘤の縁、周辺の上皮細胞、リンパ管若しくは血管に、又は直接腫瘤内にＢＯ−１１Ｘを投与する腫瘍周囲又は腫瘍内への注射によって）癌細胞又は腫瘍に局所的に投与される場合に、腫瘍特異的な免疫学的応答の誘導因子として作用し得る癌細胞抗原の放出を誘導する。
【００６６】
また、本発明は、本明細書に開示される組成物の製造方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製すること、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製すること、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成すること、
また、任意に、
（ｉｖ）６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して得られた水性組成物を濾過し、濾液を形成する、又は得られた水性組成物を２２４８０ｍ／ｓ２以上で遠心分離して上清を形成すること、
及び／又は、
（ｖ）得られた水性組成物、濾液又は上清を凍結乾燥すること、
を含む、方法に関する。
【００６７】
したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される組成物の製造方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
（ｉｖ）任意に得られた水性組成物を凍結乾燥することと、
を含む、方法に関し得る。
【００６８】
また、別の好ましい一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される組成物の製造方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
（ｉｖ）６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して得られた水性組成物を濾過し、濾液を形成する、又は得られた水性組成物を２２４８０ｍ／ｓ２以上で遠心分離して上清を形成することと、
（ｖ）任意に得られた濾液又は上清を凍結乾燥することと、
を含む、方法に関し得る。
【００６９】
本発明の方法は、凍結乾燥の最終工程を含まないことがより好ましい。本発明の方法において、上記二本鎖ポリリボヌクレオチド、上記ポリアルキレンイミン、及び上記薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントは、本明細に開示される通りである。５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を別々に通して濾過することにより、好ましくは３００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を別々に通して濾過することにより、より好ましくは２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を通して濾過することにより、各溶液の滅菌を行って滅菌溶液を形成する。得られた濾液の混合を、大規模な渦の対流輸送、その後の純粋な拡散輸送による濃度差の排除により行う。混合チャンバーは、上記溶液の混合を開始する、フラスコ、リアクタ、又はミキサー等の任意のチャンバー又は容器であってもよい。上記混合チャンバーは、０．１ｍＬ〜２０ｍＬ、更に好ましくは０．２ｍＬ〜１０ｍＬ、より一層好ましくは０．５ｍＬ〜８ｍＬの固定容積を有することがより好ましい。混合は、添加により、任意には１ｍＬ／分〜２０００ｍＬ／分、より一層好ましくは１０ｍＬ／分〜１０００ｍＬ／分、更に好ましくは２０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分の速度の注入によって行われることがより好ましい。濾液を形成する又は収集するための得られた水溶液の最適な濾過は、その後、６００ｎｍ以下、好ましくは５００ｎｍを超えない、より好ましくは４００ｎｍを超えない、更により好ましくは３００ｎｍを超えない細孔径を有するフィルタを通して行われてもよい。
代替的には、その後、上清を形成する又は収集するために得られた水性組成物の任意の遠心分離が、２２４８０ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで５０００ｒｐｍ）、好ましくは２７２０２ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで５５００ｒｐｍ）、より好ましくは３２３７２ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで６０００ｒｐｍ）、更により好ましくは４４０６２ｍ／ｓ２（半径０．０８２ｍを有するローターで７０００ｒｐｍ）で行われてもよい。特に好ましい一実施形態は、本発明の組成物が本発明の方法の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程によって達成されない場合、すなわち、上記水性組成物に含まれる粒子の９５％未満が６００ｎｍ以下の直径を有するような速度で添加が行われる場合、及び／又は上記粒子が２００ｎｍ超のｚ平均粒径を有する場合、より好ましくは上記粒子が単峰性の径分布を有しない場合、工程（ｉｖ）は必須である。これは、添加が１ｍＬ／分〜２０ｍＬ／分の速度で、特に０．５ｍＬ〜２０ｍＬの反応チャンバーにおいて行われる場合にあたり得る。最後に、得られた水性組成物、濾液、又は上清を凍結乾燥に供して、微粒子固体として本発明の組成物を得てもよい。
【００７０】
したがって、本発明の方法のより一層特に好ましい一実施形態では、上記方法は、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に２０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は２０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
ここで、上記混合チャンバーが０．２ｍＬ〜１０ｍＬの容積を有し、
（ｉｖ）得られた水性組成物を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して濾過して濾液を形成する、又は得られた水性組成物を３２３７２ｍ／ｓ２以上（半径０．０８２ｍを有するローター上６０００ｒｐｍ）で遠心分離して上清を形成することと、
（ｖ）任意に得られた濾液又は上清を凍結乾燥することと、
を含む。
【００７１】
本発明の方法の別の更により一層特に好ましい実施形態では、上記方法は、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更み、
（ｉｉ）各溶液を２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に３０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は３０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
ここで、上記混合チャンバーが０．５ｍＬ〜８ｍＬの容積を有し、
（ｉｖ）任意に得られた水性組成物を凍結乾燥することと、
を含む。
【００７２】
更なる実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、得られた粒子が、本質的に透明なコロイド溶液としての外観と共に、特に直径及び単峰性の径分布に関して、上に規定される特徴を提示するように、二本鎖ポリリボヌクレオチド（又はその塩若しくはその溶媒和物）を含む第１の水溶液と、ポリアルキレンイミン（又はその塩若しくはその溶媒和物）を含む第２の水溶液との２つの水溶液を混合することを含む製造プロセスに従ってもたらされる。
【００７３】
実施例に更に詳細に記載されるように、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、二本鎖ポリリボヌクレオチドと水溶性ポリカチオン性ホモ若しくはヘテロポリマーによって形成される粒子を含む医薬組成物を濾過及び／又は遠心分離により、目視可能な凝集塊のないバルク用途又は使い捨ての液体組成物としてＢＯ−１１Ｘ製剤を提供することができる。上記組成物を製造するかかる方法は、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくは溶媒和物の水溶液を、任意にいずれかの溶液に存在する、薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントと共に、作製することと、
（ｉｉ）上記溶液を混合することと、
（ｉｉｉ）得られた混合物を、６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに通して濾過する、又は２２４８０ｍ／ｓ２超で遠心分離することと、
を含む。
【００７４】
特に上記組成物が使用の直前に製造されることを必要とする場合、又は医薬組成物においてより一般的な、長期保存用及び／又は各々が使い捨て用の複数の容器（例えば滅菌バイアル又はシリンジ）の形態で製造され、最も均一なサイズ、ポリ（Ｉ：Ｃ）含有量、安定性、溶解度及び最後に、投与された場合に生物学的作用を有する粒子を含んでいる場合、組成物の使用、保存、輸送、包装、及び／又は投与の所望の方法と同様に、組成物の実際の成分（二本鎖ポリリボヌクレオチド、ポリアルキレンイミン、及び任意の更なる成分）に対して、この方法を更に適合させてもよい。
【００７５】
この領域において、上記混合工程（ｉｉ）及び濾過工程（ｉｉｉ）は、濾過及び／又は混合の順番、混合の方法、混合速度、及び／又は混合される溶液の量のレベルで適合され得る。更に好ましい実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤の製造方法は、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液を、任意にいずれかの溶液に存在する、薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントと共に、作製することと、
（ｉｉ）各溶液を別々に濾過することによって滅菌することと、
（ｉｉｉ）該組成物の保存、凍結乾燥、及び／又は使用のため、容器内の上記溶液を、流速１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分で５０ｒｐｍ超の注入速度にて、最初にいずれかの溶液を添加し、その後他の溶液を添加することによって混合することと、
（ｉｖ）容器を密閉することと、
を含む。
【００７６】
組み合わせ
本発明による組成物は、相加的又は更には相乗的効果を提供しない場合、適合性であることが知られている他の化合物又は治療を含む組み合わせで使用することができる。例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、種々の抗癌薬、抗体、放射線療法若しくは化学療法と組み合わせて（Le U et al., 2008；Le U et al., 2009；Taura M et al., 2010；Matijevic T et al., 2011；Levitzki A, 2012;Yoshino H and Kashiwakura I, 2013；非特許文献１）、又は種々の長さのポリ（Ｉ：Ｃ）分子（Zhou Y et al., 2013）と組み合わせて使用す
ることができる。また、癌抗原又は細胞溶解物によるワクチン接種（Ammi R et al., 2015）、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断する薬剤（Nagato T and Celis E, 2014）、ＴＬ
Ｒ９アゴニストＣｐＧ  ＯＤＮ等の他のＴＬＲアゴニスト（Zhang Y et al., 2014）、ジクロロ酢酸（Ohashi T et al., 2013）、ＩＬ２７（Chiba Y et al., 2013）、ソラフェ
ニブ等のキナーゼ阻害剤（Ho V et al.,2015）、ＮＳ１等のアポトーシス促進性タンパク質（Gupta S et al. 2016）、ゾレドロン酸（非特許文献７）、又は全トランス型レチノ
イン酸（Szabo A et al., 2012）等の他の薬剤と合わせた場合において、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、アジュバント又は相乗的に作用する薬剤として使用されてきた。ＢＯ−１１Ｘ製剤の他の使用は、前脂肪細胞に対して、分化及び脂肪細胞における分化を阻害する（Yu L
et al., 2016）、間葉系幹細胞に対して免疫抑制性の効果を増強する（Cho K. et al., 2016；Vega-Letter A et al., 2016）、又はＮＫ細胞の活性化（Perrot I et al., 2010
）等の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを少なくとも使用して、最近実証された特定細胞型に対するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の活性を考慮して明らかになる場合がある。
【００７７】
いくつかの態様では、本発明は有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤と、有効量の１以上の免疫調節剤、特に免疫チェックポイント分子（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７ＲＰ１、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＣＤ２８、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、又はＯＸ−４０等）を標的とする薬剤とを含む医薬組成物に関し、上記化合物はチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）として一般に命名される。
【００７８】
したがって、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び別の治療剤又は治療（放射線療法、化学療法、凍結療法、腫瘍アブレーション又は光線力学療法を含む）の適用を含む併用療法及び投薬計画に有用な組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の抗癌薬、好ましくは免疫調節剤とを投与することを含む、被験体における癌の生育、転移、潰瘍形成、免疫回避又は再発を治療する、改善する、又は予防する方法に関し、ここで、上記投与は同時（別々の製剤として、又は合剤の状況で）又は順次（任意の順、又は連続する投与サイクルで）ある。いくつかの態様では、本発明は癌を治療する方法であって、有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤と、有効量の１以上の免疫調節剤とを、それを必要とする被検体に投与することを含み、特に、上記被験体が１以上の免疫調節剤による癌療法を受けている、方法に関する。
【００７９】
様々な実施形態では、免疫調節剤は、モノクローナル抗体及び他の抗体フォーマットを含む抗体、又は免疫応答を制御する細胞表面タンパク質に結合してＣＰＩとして作用する任意の他の薬学的に利用可能な薬剤であることが好ましい。このＣＰＩは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２、及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断する、減少する、及び／又は阻害することができる。代替的には、このＣＰＩは、ＣＴＬＡ−４、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２及び／又はＰＰＰ２Ｒ５Ａ等の他の免疫チェックポイント分子の活性を遮断する、減少する及び／又は減少を阻害する、及び／又は阻害することができる。更なる選択肢として、ＣＰＩは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又は１以上の４−１ＢＢリガンド及びＴＲＡＦ２とＣＤ１３７（４−１ＢＢ）との結合を増加及び／又は賦活する。
【００８０】
様々な実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤の投与を含む癌の治療に対する併用療法及び投薬計画を含む方法は、ＢＯ−１１Ｘ製剤を免疫調節薬剤、好ましくはＣＰＩ等の他の治療用化合物の１つとは異なる経路によって投与する具体的な投与方法に関して更に定義され得る。この方法は、腫瘍内又は腫瘍周囲への注射（腫瘍内、腫瘤の縁、周辺の上皮細胞中、リンパ管又は血管）により、又は癌細胞若しくは癌細胞を含む臓器内への直接の若しくはそれに隣接した（例えば、間接的ではなく、例えば血流による）ＢＯ−１１Ｘ製剤の投
与、及びＣＰＩ若しくは他の免疫賦活剤の全身投与を可能とする他の手段によってＢＯ−１１Ｘ製剤を投与することを含んでもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤の腫瘍内又は腫瘍周囲への注射は、皮膚のレベルで、すなわち、皮膚に対して（例えば、黒色腫の治療のため、又はワクチンとの組み合わせと関連して）、又は内臓若しくは組織のレベルで、すなわち該内臓若しくは組織内に対して（例えば、肝臓癌を治療するための肝臓内への注射、又は膀胱癌に対する小胞内への投与によって）行われてもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤のかかる局所投与は、好ましくは免疫賦活剤の投与の後に行われるか、又は（好ましくは）その後に免疫賦活剤の投与が続く。
【００８１】
相加効果及び使用
更なる実施形態では、本発明は、病原体又は望ましくない生物学的因子に対する免疫応答を増加させるため、特に、免疫調節剤としてそれ自体が作用する可能性がある抗腫瘍免疫応答を増強するためのＢＯ−１１Ｘ製剤の投与を含む医薬としての使用及び方法を提供する。かかる効果を、関連する細胞型及び亜集団（例えば樹状細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）、及び／又は免疫学的バイオマーカー（例えば、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、及びそれらの受容体）のレベルで腫瘍部位及び腫瘍微小環境への（又は、血流、他の体液、及び組織において）腫瘍関連免疫応答を測定することによりモニターすることができる。
【００８２】
医薬組成物
また、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の薬学的に許容可能なそのアジュバント、希釈剤、担体、又は賦形剤とを混合することによって、ＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２（及び／又は他のＢＯ−１１Ｘ製剤）の医薬組成物を作製する方法を提供する。かかる成分を具体的な医学的適応症（例えば、固形癌又は血液癌）、及び／又は例えば注射による（腫瘍周囲、腫瘍内、肝臓内、膵臓内、又は皮下注射）、吸入による、若しくは経口の投与手段に対して適合させることができる。
【００８３】
ＢＯ−１１Ｘ製剤に基づく併用治療は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び他の化合物に対して同一又は異なった投与経路を含んでもよい。特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、他の免疫賦活性ＲＮＡ剤に対するように、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路阻害剤のようなＣＰＩとして作用する治療的抗体（Bald T et al., 2014）、又は活性化Ｔ細胞（Amos SM et al., 2011）の全身
投与に先立って免疫系を活性化し得る腫瘍内又は腫瘍周囲への注射によって投与することができる。代替的にはＢＯ−１１Ｘ製剤を、抗癌ワクチン接種の効果を増強するためのＣｐＧ分子若しくはレシキモド（Sajadian A et al., 2014）又は樹状細胞（Fujimura T et
al., 2006）等のＴＬＲアゴニスト又はリガンドである他の治療用化合物と共に投与することができる（together with）。
【００８４】
免疫調節剤
ＢＯ−１１Ｘ製剤を１以上の免疫調節剤と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、共刺激分子又は共阻害分子（例えば、非限定的に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞等の１以上の免疫細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４７、ＣＤ６９、ＣＤ２６、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３に関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによってＣＤ４及び／又はＣＤ８のＴ細胞を調節する薬剤である。他の実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ３０に関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによってＮＫ細胞を調節する薬剤である。他の実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ４５、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＴＥＮ及びＣＤ３１に関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによって腫瘍間質バイオマーカー及び腫瘍内皮バイオマーカーを調節する薬剤である。
【００８５】
免疫調節剤は、有機化合物又は無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質の形態の更なる化合物、より詳しくは体液中又は細胞表面上の関連する標的と結合する抗体として提供される。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル；インタクト又はトランケート（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ）；二重特異性又は多重特異性；それらの異種形態、同種形態、同系形態、又は改変形態（例えば、キメラ抗体又はヒト化抗体）であってもよい。免疫調節剤がモノクローナル抗体である場合、非ヒト哺乳動物由来モノクローナル抗体、組換えキメラモノクローナル抗体、組換えヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体であってもよい。
【００８６】
免疫調節剤として作用する抗体は、Ｆｃ受容体と相互作用して免疫応答を活性化し、免疫細胞又は他の細胞の枯渇及び／又は細胞死をもたらす、１以上の抗原を結合可能であって（例えば、二重特異性又は多重特異性の抗体）、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ）のＦｃ領域を提示可能な、ジスルフィド結合によって相互接続した４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）等の必要な生物学的活性を発揮するのに通常必要とされる構造上の要素を更に含んでもよい。重鎖は各々、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が間に入る相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各可変領域（ＶＨ又はＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で示される３つのＣＤＲを含む。また、各可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で示される４つのフレームワークサブ領域を含む。抗体の用語は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、及びそれらの各サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む全種類の抗体を含む。またいくつかの実施形態では、抗体は、抗体フラグメント及び抗原結合フラグメントを指す。
【００８７】
本明細書に記載される方法を実施するのに適した抗体は、様々な抗体フォーマット、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性、多重特異性であってもよく、限定されないが、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリ及び／又は上のいずれかの結合フラグメントによって産生されたフラグメントを含むヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を挙げることができる。また、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、本明細書に記載される少なくとも２つの標的に対する、少なくとも２つの抗原又は標的結合部位を含む分子を指す。本明細書に記載される免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。さらに、本明細書に記載される本発明を実施するのに適した抗体（例えば、単一特異性、二重特異性、及び／又は多重特異性）は、文献に開示される代替的なフォーマットのいずれか、例えば、Ｄｉａｂｏｄｙ；Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ；ラクダ抗体、Ｉｍｍｕｎｏｂｏｄｙ；Ｔｒｉｏｍａｂ、Ｐｅｐｂｏｄｙ、Ｖａｃｃｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｆｃａｂ、ＵｎｉＢｏｄｙ、又はＤｕｏＢｏｄｙ（Storz U 2011）で提供されてもよい。
【００８８】
ＰＤ−１（ＣＤ２７９又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる）は、受容体Ｂ７ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１はヒトＰＤ−１配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５００９を参照されたい）及び任意の天然起源の対立遺伝子、スプライス変異体、及びそれらのプロセシング形態（Keir M et al.,
2008；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１５１１６）を指す。ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバ
ーでもある、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる）及びＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３又はＢ７−ＤＣとしても知られる）を結合する。実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、任意の天然起源の対立遺伝子、スプライス変異体、及びそれらのプロセシング形態と共に、ヒトＰＤ−Ｌ１（例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２３３５１６を参照されたい）を指し、ＰＤ−Ｌ２はヒトＰＤ−Ｌ２（例えばＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２５２３９）を指す。
【００８９】
様々な実施形態では、免疫調節剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２の１以上を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤はＰＤ−１阻害剤である。様々な実施形態では、免疫調節剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２の１以上に対して特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的には、ニボルマブ、（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＫ−３４７５、ＢＭＳ  ９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ等の抗体である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、例えば進行した固形腫瘍の治療に対して、ＢＭＳ−９３６５５９及びＭＥＤＩ４７３６の１つ以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫の治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にベムラフェニブと）及びＭＥＤＩ４７３６（任意にダブラフェニブ及びトラメチニブの１つ以上と）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＮＳＣＬＣの治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にエルロチニブと）及びＭＥＤＩ４７３６（任意にトレメリムマブと）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＲＣＣの治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａと（任意にベバシズマブ及びスニチニブの１以上と）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形又は血液の悪性疾患の治療に対してＭＰＤＬ３２８０Ａと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対してＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にベバシズマブ、化学療法及びコビメチニブの１以上と）；ＭＥＤＩ４７３６（任意にトレメリムマブと）及びＭＳＢ００１０７１８Ｃの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、進行した癌の治療に対して、ＡＭＰ−２２４と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、進行した固形腫瘍の治療に対して、ニボルマブと（任意に腸腰（iliolumbar）（抗ＫＩＲ）と）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、去勢抵抗性前立腺癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ及びＲＣＣの治療に対して、ニボルマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、結腸癌の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、胃癌、頭頸部癌、ＴＮＢＣ及び尿路上皮癌の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、胃癌、膵癌、小細胞肺癌及びＴＮＢＣの治療に対して、ニボルマブと（任意にイピリムマブと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、膠芽腫の治療に対して、ニボルマブと（任意にイピリムマブと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、肝細胞癌（hepatocellular cancer）の治療に対して、ニボルマブと併用される。いくつか
の実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群及び非ホジキンリンパ腫の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、悪性神経膠腫の治療に対して、ピディリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫の治療に対して、ニボルマブ（任意に、イピリムマブ、並びに複数のクラス１ペプチド及びモンタニド（montanide
）ＩＳＡ  ５１  ＶＧの１以上；並びに任意にイピリムマブと連続して）及びペンブロリズマブの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫及びＮＳＣＬＣの治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＮＳＣＬＣの治療に対して、ニボルマブ（任意にゲムシタビン／
シスプラチン、ペメトレキセド／シスプラチン、カルボプラチン／パクリタキセル、ベバシズマブ、エルロチニブ及びイピリムマブの１以上と）及びペンブロリズマブの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は膵癌の治療に対してピディリズマブと（任意にゲムシタビンと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、前立腺癌の治療に対して、ピディリズマブと（任意にシプリューセル−Ｔ（sipleucel-T）及びシクロホスファミドの１以上と）併用される。いくつかの実施形態では、
ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＲＣＣの治療に対して、ニボルマブ（任意にスニチニブ、パゾパニブ及びイピリムマブの１以上と）、ペンブロリズマブ（任意にパゾパニブと）及びピディリズマブ（任意に樹状細胞／ＲＣＣ融合細胞ワクチンと）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対して、抗ＬＡＧ３（ＢＭＳ−９８６０１６、任意にニボルマブと）、ニボルマブ（任意にインターロイキン−２１と）及びＡＭＰ−５５４の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対してペンブロリズマブと併用される。
【００９１】
様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７又はＣＤ１３７Ｌの１以上を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７又はＣＤ１３７Ｌの１以上に特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的には、ウレルマブ（urelumab）（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体としても知られる）等の抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、固形腫瘍、及び／又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫、及び／又は頭頸部癌、及び／又は多発性骨髄腫の治療に対して、ウレルマブと（任意にニボルマブ、リリルマブ（lirilumab）及びウレルマブの１以上と
）併用する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的には、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、ヤーボイ（Yervoy）、ＢＭＳ）及び／又はトレメリムマブ（Pfizer）等の抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、黒色腫、前立腺癌及び肺癌の１以上の治療に対してイピリムマブと（任意にバビツキシマブと）併用する。
【００９２】
様々な実施形態では、免疫調節剤はＣＤ２０を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤はＣＤ２０特異的抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的な例として、オファツムマブ、オビヌツズマブ（GAZYVA）、ＡＭＥ−１３３ｖ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、及びベルツズマブ等の抗体である。
【００９３】
ＢＯ−１１Ｘ製剤の検証
ＢＯ−１１Ｘ製剤（本発明による、また実施例においてＢＯ−１１１及びＢＯ−１１２により例示される）の治療的効力の前臨床での検証を細胞系アッセイにおいて、また最も興味深いことには、ＢＯ−１１Ｘ製剤を単独で又は候補の若しくは承認された抗癌薬と組み合わせて使用し、治療効果を効果的に達成する最も適切な条件を確立するために種々の実験基準を試験し、比較することができる、動物モデルにおいて行うことができる。これらの基準は、効力、安全性及び／又は臨床用途の観点から、ＢＯ−１１Ｘ製剤の（単独の、又は候補若しくは承認された抗癌薬と相乗的な）治療的使用に対してどれがより良好な条件かを識別する範囲でいずれかの化合物の用量、投与経路、投与の順番及び／又は頻度を含む。
【００９４】
種々の投薬量のＢＯ−１１Ｘ製剤の効果、投与の数及び／又は部位（特に、１以上の部位に注射することによる）、投与経路、頻度、及び／又は投与の時間点を、関連するエンドポイント及び単独で又は他の薬物と組み合わせた試験化合物に曝される細胞又は（好ましくは）動物から得られた生体試料において測定される、生理学的パラメーターに関連づけることができる。かかるパラメーターの非限定的な一覧は、腫瘍サイズの退縮、腫瘍成長及び／又は腫瘍細胞の増殖の阻止、アポトーシス、腫瘍血管新生又は転移の減少、一般的な抗癌薬に対する耐性の克服（或いは、治療集団におけるかかる薬物に対する応答の改
善）、正常な組織及び機能に対する腫瘍に関連する有害事象の減少、免疫応答及び／又は特定の活性及び特徴を有する免疫細胞の調節、その増加（又は減少）が一般的に癌治療効果、特に動物モデル、場合によっては癌患者の生存と関連していると文献において知られている、生体材料中のバイオマーカー若しくは特定の細胞集団の同定（例えば、癌細胞の調製物、腫瘍生検材料、又は体液に存在する）を含む。可能な場合は常に、かかるエンドポイントは、特定の投与経路及び／又は医薬製剤を使用して、各試験化合物の投与、又は所与の用量及び／又は投薬計画における化合物の組み合わせ試験の後に、中間及び最終の時点で測定される。
【００９５】
ＢＯ−１１Ｘ製剤の治療的な抗癌効力を、単独で、又は標準治療である従来の治療（放射線療法、化学療法、細胞キナーゼ阻害剤等）若しくは新規の機構及び／又は新規の候補抗癌薬を含む治療と組み合わせて試験することができる。実際に、ＢＯ−１１Ｘ製剤と組み合わせて試験され得る新規な抗癌化合物のカテゴリーは、除かれる散在性腫瘍細胞を標的とする全身の抗腫瘍免疫の提供によって、腫瘍微小環境内で抗腫瘍免疫応答を改善するものである。このアプローチは、動物モデル及び患者において成功することが証明されており、放射線療法又は化学療法等の従来の治療法の成果を改善することができる（例えば、Galluzzi L et al., 2014；Vacchelli E et al., 2013；Van der Jeught K et al., 2015を参照されたい）。
【００９６】
この成長している新たな制癌薬のパネルは、癌細胞が免疫による検出及び人体による破壊から逃れる機構を標的とする。他の癌療法（例えば腫瘍細胞特異性）と比較した場合、癌特異的免疫療法は、一連の利点を提供する場合がある。実際に、癌免疫療法の一連の分子標的の同定は、腫瘍の可塑性、不均質性、耐性又は微小環境に関して、腫瘍に対する免疫応答に適切な共同刺激（又は共抑制）効果を提供することができる機構及び化合物を明らかにすることにおいて大きな進歩をもたらしている。
【００９７】
各々が異なる分子標的及び／又は機構に作用する癌の受動的な又は積極的な免疫療法の非限定的な一覧は、腫瘍を標的とする又は他の免疫調節性のモノクローナル抗体、腫瘍崩壊ウイルス、免疫賦活サイトカイン、養子細胞移入及び他の細胞療法、ＤＮＡ又はペプチドに基づくワクチン、免疫抑制性代謝の阻害剤、又はパターン認識受容体のアゴニストを含む。これらの機構のうち、抗体又は他の化合物がアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性（免疫応答又は免疫応答からの癌の回避におけるそれらの役割に応じて）のいずれかを有する分子標的として、腫瘍発生に対するチェックポイントである、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ３８、ＯＸ−４０、ＣＤ２６、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３等の一連の細胞膜タンパク質が挙げられ、それらに対する種々のアゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体は、商業的に入手可能であるか、又は、それらの特異性及び／又はヒト抗原若しくは（動物モデルを扱う場合は）対応する齧歯類抗原に対する抗癌効果のレベルを特性評価するための科学的リポジトリ（repository）において入手可能である。
【００９８】
これらの共刺激分子又は共阻害分子を標的とする薬剤（例えば抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体に基づく治療法）に対する印象的な患者の反応にもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤に対する臨床的な反応は、多くの（too many）癌患者において所望の治療効果を達成するには、まだ不完全であるか、又は非効率的である。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＣＤ１３７抗体等の化合物との適切な組み合わせにおけるＢＯ−１１Ｘ製剤は、それら２つの抗癌剤の１つの単独投与の効果と比較した場合、おそらくは予測され得る付加的効果を超えて、腫瘍の生育及び転移の減少を増強する（又はかかる減少を提示する被験体の数を増加する）可能性がある。
【００９９】
好ましくはヒト起源の初代癌細胞又は樹立された癌細胞株を含む単離された又は混合さ
れた細胞培養物に基づくいくつかの細胞系モデルの１つにおいて、ＢＯ−１１Ｘ製剤の治療効果を評価することができる。ＢＯ−１１Ｘ製剤を検証するための癌細胞株の例は、黒色腫（ヒトのＳＫ−Ｍｅｌ−１９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞及びＵＡＣＣ６２細胞；ネズミ科Ｂ１６細胞）、癌腫（マウスＨｅｐａ１−６細胞；ラットＦＡＯ細胞）、乳癌（ヒトのＢＴ４８３細胞、ＨＣＣ１１４３細胞、ＨＣＣ１９３７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びＢＴ５４９細胞）、膵癌（ヒトのＭｉａＰａＣａ２細胞、ＩＭＩＭ−ＰＣ２細胞、Ｐａｎｃ１細胞、Ｐａｎｃ０２０３細胞、Ｐａｎｃ３．２７細胞又はＢｘＰｃ３細胞）、又はＡＴＣＣ、他の公的若しくは学術的なリポジトリ、又は商業的な提供者を通して入手可能な他の関連する細胞株のように癌の種類に従って定義することができる。ＢＯ−１１Ｘ製剤の抗癌効果は、増殖、死、バイオマーカーの発現のレベルで、及び／又はより生理学的な条件において確認されるＢＯ−１１Ｘ製剤の関連する可能性のある効果を示すシグナル伝達分子（ケモカイン又はインターフェロンベータ等）の放出の阻止を有するのに必要な期間、頻度、及び／又は用量で評価され得る。
【０１００】
その後、ＢＯ−１１Ｘ製剤の効果を、ＢＯ−１１２等の例示的な製剤の投与による抗腫瘍反応が単独療法及び併用治療（例えば、抗ＰＤ−１抗体等のＣＰＩと共に）の両方について、投与後、より短期間又はより長期間の間、異なるプロトコルで判断される腫瘍動物モデルにおいて評価することができる。その研究は、注入された細胞の増殖に起因する腫瘍の発生の所与の時間において、すなわち癌細胞の注入後の特定の日数の後、若しくは（好ましくは）所望の腫瘍サイズ（例えば、８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３の平均サイズ）を提示する動物において、又は腫瘍の消滅の後に（腫瘍再発に対する各薬物又は薬物の組み合わせの任意の効果の評価のため）、ＢＯ−１１２及び／又は抗ＰＤ−１抗体を投与することによって追及されてもよい。また、その研究は、文献において、特定の腫瘍に対して及び／又は所与の動物モデルにおいて薬物の有効性に対する基準として指定される、化学療法薬又は他の抗癌薬等の陰性対照（例えばビヒクル単独）、又は陽性対照のいずれかである対照化合物を含む場合がある。また、動物モデル及び動物細胞におけるこれらの活性の確認は、獣医学に使用されるＢＯ−１１Ｘ製剤の開発をもたらし得る。
【０１０１】
動物モデルは、典型的には、癌が、（不死化細胞株又は患者によって得られる癌生検材料に由来する）ヒト癌細胞移植及び生着、又は動物におけるマウス腫瘍細胞の誘導（又は移入）のいずれかの結果として生じるマウスモデルである。細胞は、異なる種類の腫瘍（例えば、肺癌腫、黒色腫、リンパ腫）を起源としてもよく、研究の間、腫瘍の検出、並びにそのサイズ及び／又は組成の分析を単純化するため、マウス脇腹に皮下注射されてもよい。その後、マウスを、結果の統計学的分析を可能とする各サイズの群（例えば、各対照群又は治療群に対して３匹、５匹、１０匹、１２匹、１５匹、２０匹以上の動物）へと無作為化することによって処理する。
【０１０２】
ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤、及び抗ＰＤ−１抗体等のチェックポイント阻害剤が、癌の動物モデルにおいて改善し得る特徴は（特に、量、順番又は他の投与基準に関して適切に組み合わされる場合）、ＢＯ−１１２及び／又は抗ＰＤ−１抗体による治療の終了後の治療後の動物の生存及び／又は腫瘍消失、腫瘍再発の減少、毒性及び／又は抵抗の効果の限定若しくは遅延、並びに腫瘍接種の再チャレンジに対する反応を含んでもよい。
【０１０３】
ＢＯ−１１２及び抗ＰＤ−１抗体として上に構造的及び機能的に識別される例示的なＢＯ−１１Ｘ製剤を（単独で又は組み合わせて、単回又は複数回の用量で）、腫瘍細胞に関して異なる場所に、及び／又は異なる量で投与することができる。典型的には、ＢＯ−１１２及びマウスＰＤ−１に対して特異的なモノクローナル抗体（例えば、BioLegend製の
クローンＲＭＰ１−１４、又は他の提供元によって入手可能な同様のもの）を皮下、血管内、腹腔内、腫瘍周囲、又は腫瘍内に（モデル及び腫瘍分子及び病理学的特徴に応じて）
、動物の重量に関して決定された濃度（例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇ）、注射容量中の濃度（例えば、０．０１ｍＬ〜０．５ｍＬ）、及び／又は各投薬中の含有量（例えば、１用量当たり０．０１μｇ〜２５０μｇ）で注射する。特に、固定された抗ＰＤ−１抗体用量と併用される種々の濃度のＢＯ−１１２の用量反応（又はその逆）は、他の化合物との併用による、投与されるいずれかの化合物の量の著しい減少の結果としての任意の有利な効果（例えば、影響されない、又は更に改善された効能及び／又は安全性のプロファイル；異なる、治療していない場所の腫瘍におけるアブスコパル効果）を判定することを可能とし得る。
【０１０４】
ＢＯ−１１２を１サイクルで注射してもよく、又は所与の日数（１日、２日、３日、５日、７日以上）によって分けられる複数のサイクル（例えば、２回、３回又は４回以上）で注射してもよい。代替的にはＢＯ−１１２が抗ＰＤ−１の抗体と同時投与される場合、ＢＯ−１１２を、ここでも、１又は複数の（所与の日数によって分けられた）サイクルで、抗体（又は単一の注射用調剤において）の直前（又は直後）に投与してもよい。更に代替的には、２つの薬剤は、任意の連続する順番であるが、変更可能な期間（例えば、１時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日以上）によって分かれて、製剤化又は投与されてもよい。特に、ＢＯ−１１２が抗ＰＤ−１抗体の後に投与される場合、後の投与（単独、又は抗ＰＤ−１抗体と更に組み合わせた）は、抗ＰＤ−１抗体が腫瘍細胞に対して有効ではない動物において抗腫瘍レスキュー効果を提供して、任意の特異的な腫瘍耐性又は回避機構を克服する可能性がある。治療の終わりに、腫瘍の完全な退縮があった全て動物に癌細胞の更なる皮下注射よる再チャレンジをして又はそれなしで腫瘍細胞が再出現するか、及びどのように再出現するかをモニターするため、全ての生存する動物を、連続して１週間、２週間、３週間以上に亘って治療せずに放置してもよい。
【０１０５】
腫瘍及び／又は正常細胞の分子的特徴（ＮＫ細胞の総数及び／又は特定の亜集団、腫瘍浸潤リンパ球、脾細胞、放射性標識化前駆体の組み込み、及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）等の抗腫瘍局所性又は全身性免疫応答に関与し得る他の細胞を含む）を特定するため、ＢＯ−１１２の単独、又は上に列挙される抗ＰＤ−１抗体との併用の効果を、動物を屠殺せずに（例えば、腫瘍サイズの測定、まだ生存しているマウスの割合、体重又は行動基準によって）研究の間に報告される中間的な結果として、又は動物を屠殺した後（又はすでに死亡したマウスにおいて）に判断することができる。並行して、関連するバイオマーカーの存在／不在を、関連するＲＮＡのＰＣＲ増幅によって、又はサイトカイン若しくはケモカイン等の組織中若しくは血中に循環している細胞表面上のタンパク質レベルで標準的な免疫学的アッセイ及びキットを使用して特定することができる。
【０１０６】
この全体的な表現型分析を、フローサイトメトリーによって検出され、文献に記載される、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＴＥＮ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４７、ＣＤ６９、ＣＤ２６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ４５、及びＣＤ３１等の細胞表面マーカーを発現する細胞数の任意の統計学的及び／又は治療的に関連する変化を検出するため、腫瘍、血液、脾臓、リンパ節又は他の関連する組織及び場所から単離された細胞を使用して行うことができる。また、かかる細胞を腫瘍抗原特異的免疫応答、関連する転写因子、サイトカイン又はケモカイン（例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ、ＴＮＦアルファ、ＨＩＦ１ａ、ＨＩＦ２ａ、ｐ５３）の発現のレベルで、又は他の細胞系アッセイを使用して評価することができる。
【０１０７】
さらに、いずれかの免疫不全で完全に免疫応答性の動物モデルにおける臓器及び皮膚の肉眼検査及び顕微鏡による病理学的分析は、研究化合物の効能（単独で又は組み合わせて）、又は臓器の炎症及び壊死等のそれらの毒性に関する兆候を更に提供することができる。同様の研究で作成される定量的データを、どの治療（特に、抗腫瘍）効果がＢＯ−１１Ｘ製剤の単独又は別の抗癌剤との併用による投与によって提供されるかを評価する領域において、適切な統計学的検定の使用により、複合の試験に対する補正を伴って及び補正を伴わずに、種々の実験群間で比較することができる。
【０１０８】
治療法及び患者の選択
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の免疫調節剤とを投与することによる投与を含む、癌の生育、生存、転移、上皮間葉転換、免疫回避又は再発を治療、減少、改善、又は予防する方法に関する。癌は腫瘍学的疾患であってもよい。癌は、癌の転移によって生じ得る潜伏腫瘍であってもよい。また、潜伏腫瘍は、腫瘍の外科的摘出から取り残される場合もある。癌の再発は、例えば、腫瘍再成長、肺転移、又は肝転移であってもよい。
【０１０９】
様々な実施形態では、癌は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腹膜の癌；絨毛癌；結合組織癌；消化器系癌（食道、胃、結腸、直腸、又は他の消化器の癌を含む）；眼癌；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌、副腎癌又は腎癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、喉頭、舌、口及び咽頭）；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；呼吸器系の癌；唾液腺癌；皮膚癌；扁平上皮癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮、子宮内膜、子宮頸部、外陰部、卵巣、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ；低悪性度／濾胞状、小リンパ球性、中悪性度／濾胞状、中悪性度びまん性、高悪性度免疫芽球性、高悪性度リンパ芽球性、高悪性度小型非切れ込み核細胞性、又は巨大腫瘤病変ＮＨＬ等の特定の種類を含む）を含むリンパ腫、マントル細胞リンパ腫及びエイズ関連リンパ腫；慢性リンパ球性白血病；急性リンパ芽球性白血病；毛様細胞性白血病；慢性の骨髄芽球白血病；同様に他の癌腫及び肉腫；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、また同様に、母斑症又は浮腫と関連する（脳腫瘍と関連するもの等）血管増殖異常の１以上である。
【０１１０】
様々な実施形態では、癌は胆道癌である。いくつかの実施形態では、胆道癌は、膵癌、胆嚢癌、胆管癌及びファーター乳頭部の癌から選択される。様々な実施形態では、癌は肝臓癌である。様々な実施形態では、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態では、胆道癌は胆管細胞癌及び／又は腺癌である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤は、様々なステージ（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶ）の癌を治療するために使用される。非限定的な例として、全体的なステージ分類を使用すれば、ステージＩの癌は身体の一部に局在され、ステージＩＩの癌は局所的に進行しており、ステージＩＩＩの癌も同様である。癌がステージＩＩ又はステージＩＩＩとして指定されるかどうかは、癌の具体的な種類に依存し得る。非限定的な一例では、ホジキン病のステージＩＩは、横隔膜の片方のみに冒されたリンパ節を示すのに対し、ステージＩＩＩは横隔膜の上及び下に冒されたリンパ節を示す。したがって、ステージＩＩ及びステージＩＩＩの具体的な基準は、診断により異なる。ステージＩＶの癌は、他の臓器又は全身に転移又は広がっていることが多い。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（及び／又は免疫調節剤）は、患者が経験する可能性のある治療の副作用を軽減する。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の免疫調節剤の併用療法は、（例えば単剤療法と比較して）より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／
又は１以上の免疫抑制剤を可能とする場合があり、それによりいずれかの薬剤の治療濃度域を増加する。いくつかの実施形態では、用量の低下は、効能を失うことなく（又は最小限の喪失で）１以上の副作用を軽減する。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を使用して、難治性癌（treatment-refractory cancer）を有する被
験体を治療する。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を使用して、１以上の免疫調節剤、特にＢＯ−１１Ｘ製剤と実際に併用されるものに対して不応性である被験体を治療する。
【０１１３】
例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＫ−３４７５、ＢＭＳ−９３６５５９、イブルチニブを含む、ＰＤ−１剤及び／又はＰＤ−Ｌ１剤及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に対して不応性である、及び／又はＭＰＤＬ３２８０Ａ不応性患者である。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は抗ＣＴＬＡ−４剤に不応性、例えば、イピリムマブ（ヤーボイ）不応性患者（例えば、黒色腫患者）である。いくつかの実施形態では、被験体はＢＯ−１１Ｘ製剤に対して不応性である。したがって、様々な実施形態では、本発明はＢＯ−１１Ｘ製剤又は１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む様々な治療法に対して非反応性の患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１１４】
様々な実施形態では、「患者」及び「被験体」の用語は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態では、被験体及び／又は動物は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長動物（サル（例えばヒヒ）、又はチンパンジー等）である。
【０１１５】
様々な実施形態では、本発明の方法はヒト被験体の治療に有用である。いくつかの実施形態では、ヒトは小児である。他の実施形態では、ヒトは成人である。他の実施形態では、ヒトは高齢者である。他の実施形態では、ヒトは患者又は被験者と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、ヒトは女性である。いくつかの実施形態では、ヒトは男性である。
【０１１６】
治療レジメン及び併用療法
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び免疫調節剤（また任意に１以上の追加の治療剤）による特定の癌の治療レジメンに備える。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２を、第１に任意に低酸素症の軽減又は除去によって腫瘍血管新生を正常化するため患者に投与する。ＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２のかかる第１の投与は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞）及び／又はＮＫ細胞腫瘍を賦活及び／又は増加し、及び／又は免疫抑制細胞（例えば骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））の腫瘍への補充を阻害及び／又は減少し得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療法は、Ｍ１マクロファージを支援するように、腫瘍部位におけるＭ２マクロファージに対するＭ１マクロファージの比率を変更し得る。特に、例えば抗血管新生分子と異なり、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、いくつかの実施形態では、長期間継続する（すなわち、一時的よりも大きな）血管の正常化を誘導する。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤の血管正常化は、１日、又は２日、又は３日、又は４日、又は５日、又は６日、又は７日、又は１４日、又は２１日を超えて継続し得る。したがって、いくつかの実施形態では、この長期間継続するＢＯ−１１Ｘ製剤の血管正常化は、１以上の免疫調節剤に対して反応性となる可能性がより高い持続性で寛容な腫瘍微小環境を可能とする。すなわち、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、免疫調節剤療法を増強する。
【０１１７】
代替的には、ＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２は１以上の免疫調節剤による治療の後に患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、１以上の共阻害分子を標的とし、免疫抑制を減少させるか、又は排除する。この好都合な状況では、すなわち抑制の除去により、ＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２を、免疫系を賦活するために投与する。或いは、免疫調節剤は、１以上の共刺激分子を最初に標的とし、次に、例えば相乗的にこの効果を支持するためにＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１１又はＢＯ−１１２を投与する。
【０１１８】
さらに、本明細書に記載されるように、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、例えば同時投与、治療レジメン又は合剤の状況で追加の治療剤と組み合わせてもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、任意に追加的な治療剤と共に、連続して投与してもよい。本明細書で使用される「連続して（連続）」の用語は、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤とを、約６０分超の時間をあけて投与することを意味する。例えば、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の連続投与との間の時間は、約６０分超、約２時間超、約５時間超、約１０時間超、約１日超、約２日超、約３日超、又は約１週超あけてもよい。最適な投与回数は、投与される追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の代謝、排泄の速度及び／又は薬力学的活性に依存する場合がある。追加の治療剤又は本発明の薬剤のいずれかを最初に投与してもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、任意に追加の治療剤と共に、同時に投与してもよい。本明細書で使用される「同時に（同時）」の用語は、追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下、約５分以下、又は約１分以下等の約６０分以下の時間をあけて投与することを意味する。追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の投与は、単一の製剤（例えば、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤とを含む製剤）又は別々の製剤（例えば、追加の治療剤を含む第１の製剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を含む第２の製剤）の同時投与によってもよい。
【０１２１】
また、同時投与は、投与される追加の治療剤を同じ投与経路によって被験体に投与されることを必要としない。むしろ、各治療剤を任意の適切な経路によって、例えば、非経口的に又は経口的（non-parenterally）に投与してもよい。
【０１２２】
かかる組み合わせは、より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤で相乗効果及び／又は相加効果及び／又は強力な効果をもたらす可能性がある。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤が１以上の免疫調節剤と併用される場合、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は単剤療法のときよりも低くなることがある。いくつかの実施形態では、例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤を免疫調節剤と併用すると、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は治療量以下の用量であり、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤と併用すると、免疫調節剤の有効量は単剤療法のときよりも低くなることがある。いくつかの実施形態では、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤と併用すると、免疫調節剤の有効量は治療量以下の用量である。様々な実施形態では、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤及び追加の治療剤と併用すると、該追加の治療剤の有効量は治療量以下の用量である。「治療量以下の用量又は量」の用語は、薬理学的に活性な物質の用量又は量が、治療効果を達成するために単独の物質として投与されるその物質の用量又は量を下回ることを意味する。かかる物質の治療量以下の用量は、治療される被験体及び疾患の状態、被験体の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の方法等に応じて変化し得るが、当業者によって容易に決定することができる。一実施形態では、化学療法剤の治療量以下の用量又は量は、化学療法剤に関する米国食品医薬品局承認のラベル情報に提供されるもの等の化学療法剤の承認された全用量の９０％未満である。他の実施形態では、化学療法剤の
治療量以下の用量又は量は、承認された全用量の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は更には１０％未満であり、例えば、２０％〜９０％、３０％〜８０％、４０％〜７０％、又は本明細書において提供される値に含まれる別の範囲である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤の有効量は、同じ癌に対する単剤療法及び／又は同じ癌に対するＢＯ−１１Ｘ製剤以外の薬剤との併用療法で使用される有効量よりも少ない。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は、同じ癌若しくは臨床状態に対する単剤療法、及び／又は同じ癌若しくは臨床状態に対する薬剤（免疫調節剤等）との併用療法で使用される有効量よりも少ない。
【０１２４】
様々な実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を１以上の免疫調節剤（例えば、１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個の免疫調節剤）及び任意に１以上の追加の治療剤（例えば１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個の追加の治療剤）と併用する。かかる組み合わせは、より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤及び／又は１以上の追加の治療剤で相乗効果及び／又は相加効果及び／又は強力な効果をもたらす可能性がある。同時投与は同時であってもよく、又は連続してもよい。さらに、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を含む医薬組成物は、追加の治療剤を含んでもよい（例えば、合剤による）。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される２以上の任意の薬剤を合剤化してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、１以上の追加の治療剤により治療を受けている患者に投与してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤は、１以上の追加の治療剤による患者の現在の治療に取って代わる場合がある。
【０１２５】
アジュバントケア（adjuvant care）とも呼ばれるアジュバント療法は、一次、主要、
又は初回の治療に加えて与えられる治療である。非限定的な例として、アジュバント療法は、通常、全ての検出可能な疾患が除去されたが、潜在性疾患による再発の統計学的リスクが残る場合の手術の後に与えられる追加的な治療であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤を癌の治療におけるアジュバント療法として使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療剤を切除に先立ってネオアジュバント療法として適用する。或る特定の実施形態では、ネオアジュバント療法は、任意の手術に先立って腫瘍を縮小及び／又はダウングレード（downgrade）する治療法を指す。いく
つかの実施形態では、ネオアジュバント療法は、本明細書に記載される治療剤を手術又は腫瘍の切除を可能とする他の手技に先立って癌患者に投与することを意味する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療剤は、本開示の追加の治療剤のいずれかを含むが、これらに限定されない、第一選択療法による最初の治療後の維持療法として有用である。
【０１２７】
様々な実施形態では、本発明は、治療的有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、本明細書に記載される１以上の追加の治療剤とを同時に又は連続して投与することを含む、被験体において癌又は腫瘍を治療する治療レジメン又は方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、治療的有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、限定されないが化学療法剤を含む、本明細書に記載される１以上の抗癌剤とを同時に又は連続して投与することを含む、被験体において癌又は腫瘍を治療する治療レジメン又は方法を提供する。本発明の方法において使用される好適な化学療法剤として、本明細書に記載されるものが挙げられ得る。或る特定の実施形態では、化学療法剤は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ゲムシタビン、パクリタキセル、及びシスプラチンの１以上である。一例として、いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、１以上の一般的な癌治療レジメン（非限定的な実例として、ＦＯＬ
ＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＩＦＬ、ＦＬ（Ｍａｙｏ）、ＱＵＡＳＡＲ、Ｍａｃｈｏｖｅｒスケジュール、ＣＡＦ、ＣＭＦ、ＥＣＦ、及びＦＥＣ）と組み合わせることを提供する。
【０１２８】
様々な実施形態では、追加の治療剤は抗過剰増殖剤である。抗過剰増殖剤として、限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、シスプラチン、ＶＰ１６、エンジイン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブチル、ブスルファン、ロムスチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ＢＣＮＵ、又はカンプトテシンが挙げられる。
【０１２９】
さらに、追加の治療剤は放射線の使用を更に含んでもよい。さらに、上記治療法は光線力学療法の使用を更に含んでもよい。
【０１３０】
塩、医薬組成物及び用量
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される薬剤と、薬学的に許容可能なエステル、プロドラッグ、塩、溶媒和物、鏡像異性体、立体異性体、活性代謝産物、共結晶、及びそれらの他の生理学的に機能性の誘導体とを提供する。
【０１３１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される薬剤と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを提供する。上記医薬組成物は、所望の使用及び投与経路に適切な任意の好適な形態であってもよい。薬学的賦形剤は、石油、動物、野菜、又は合成に由来するもの等、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等を含む、水及び油等の液体であってもよい。薬学的賦形剤は、例えば、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素等であってもよい。一実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、被験体に投与される際に無菌である。本明細書に記載される任意の薬剤を静脈内投与する場合、水は有用な賦形剤である。また、生理食塩水溶液、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液も、液体賦形剤、具体的には注射用溶液として採用され得る。また、好適な薬学的賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。好適な薬学的賦形剤の他の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Allen, Loyd V., Jr編；２２版、２
０１２）に記載される。
【０１３２】
さらに、本発明の医薬組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び分散剤等のアジュバントを含んでもよい。さらに、助剤、安定化剤、増粘剤、滑剤、及び着色剤を含んでもよい。微生物の活動の阻止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含むことによって保証され得る。また、上記医薬組成物は、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含んでもよい。
【０１３３】
また必要な場合、上記医薬組成物は可溶化剤を含んでもよい。また、上記薬剤を好適なビヒクル又は当該技術分野で既知の送達デバイスにより送達してもよい。投与用の組成物は、注射部位における痛みを軽減するため、例えば、リドカイン等の局所麻酔を含んでもよい。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、液滴、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体を含むカプセル剤、粉末、徐放剤、坐剤、エマルジョン、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適した任意の他の形態をとることができる。したがって、本明細書に記載される組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、カプレット、ボトル、アンプル、サッシェ、シリンジ、カートリッジ、ネブライザー、又は他の容器に含まれ
てもよい。一実施形態では、医薬組成物はカプセル剤の形態である。別の実施形態では、医薬組成物は錠剤の形態である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、記載される薬剤及び組成物のいずれかの投与は、経口、静脈内、及び非経口のいずれか一つである。様々な実施形態では、投与経路として、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外麻酔、舌下、鼻腔内、脳内、肝臓内、膵臓内、小胞内、膣内、経皮的、直腸に、吸入により、又は局所的に、例えば耳、鼻、眼若しくは皮膚が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は経口で又は非経口注射によってなされる。投与の様式は、医療者の判断にゆだねてもよく、その部位の医学的状態及び／又は（例えば、化学療法、放射線療法、又は抗体、ワクチン、及び他の癌を標的とする薬物との併用である）併用治療（concurrent treatment）に一部依存する。様々な実施形態では、投与は、血流への本明細書に記載される任意の薬剤の放出をもたらす。
【０１３６】
本明細書に記載される任意の薬剤及び／又は医薬組成物を経口投与してもよい。また、かかる薬剤及び／又は医薬組成物を、任意の他の簡便な経路により、例えば、静脈内の点滴又はボーラス注入、上皮又は粘膜−皮膚の内側（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜等）を通る吸収により投与してもよく、追加の治療剤と共に投与してもよい。投与は全身であってもよく、又は局所であってもよい。様々な送達システム、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセル等への封入が知られ、それらを使用することができる。具体的な実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書に記載される薬剤及び／又は本明細書に記載される医薬組成物を、ヒトに対する経口投与に適合された組成物として慣例の手順に従って製剤化する。経口投与用の固体剤形として、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、及び顆粒が挙げられる。かかる剤形では、不活性な薬学的に許容可能な、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム等の賦形剤又は担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸、微結晶性セルロース、及びＢａｋｅｒｓ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｕｇａｒ等のフィラー又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、ｃ）グリセロール等の湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショ又はタピオカデンプン、アルギン酸、或る特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム、クロスポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、クロスカルメロースナトリウム（架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）等の架橋ポリマー、デンプングリコール酸ナトリウム等の崩壊剤、ｅ）パラフィン等の溶液遅延剤（solution retarding agent）、ｆ）第四級アンモニウム剤等の吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等の湿潤剤、ｈ）カオリン、ベントナイト粘土等の吸収性剤、並びにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル等の滑沢剤等、並びにかかる賦形剤の混合物の少なくとも１つと活性薬剤とを混合する。当業者は、経口剤形において特定の賦形剤が２以上の機能を有し得ることを認識する。また、経口剤形、例えばカプセル剤又は錠剤の場合には、該剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【０１３８】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性薬剤に加えて、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒等の当該技術分野で一般的に使用される不活性な希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエ
チレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含んでもよい。非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、肝臓内、膵臓内、腹腔内、皮下、及び関節内の注射及び点滴）に適した剤形として、例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン等が挙げられる。また上記の剤形は、使用の直前に無菌の注射用媒質に溶解又は懸濁され得る無菌の固体組成物（例えば凍結乾燥組成物）の形態で製造されてもよい。上記剤形は、例えば、当該技術分野で知られている懸濁剤、又は分散剤を含んでもよい。非経口注射用の本発明の医薬組成物は、使用の直前に無菌注射用の溶液又は分散液への再構成用の無菌粉末と同様に、薬学的に許容可能な無菌の水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。好適な水性又は非水性の担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油等）、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１３９】
本明細書に記載される任意の薬剤及び／又は本明細書に記載される任意の医薬組成物を、制御放出手段若しくは徐放性手段によって、又は当業者に知られている送達デバイスによって投与することができる。かかる剤形は、変動する割合の所望の放出プロファイルを提供するため、例えばヒドロプロピルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、Ｅｕｄｒａｇｉｔ、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、浸透システム、多層コーティング剤、マイクロ粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はそれらの組み合わせを使用して、１以上の有効成分の制御放出又は徐放を提供するのに有用な場合がある。好適な制御放出又は徐放性の製剤は、本明細書に記載される薬剤の有効成分による使用に対して容易に選択され得る。したがって、本発明は、限定されないが、制御放出又は徐放に対して適合される、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ（gelcap）、及びカプレット等の経口投与に適した単回の単位剤形を提供する。
【０１４０】
本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物を含む製剤は、簡便には、単位剤形で提示され、薬学の分野で既知の任意の方法によって調製され得る。かかる方法は、一般に、治療剤を、１以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。典型的には、製剤は、治療剤を液体担体、微粒子固体担体、又はそれらの両方と均一かつ密接に会合させた後、必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形へと成形することによって作製される（例えば、湿式又は乾式の造粒、パウダーブレンド等の後、当該技術分野で知られている従来の方法を使用して打錠する）。
【０１４１】
本発明に従って投与される本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物の実際の用量は、特定の薬剤、特定の剤形、及び投与様式により変化し得ることが理解される。ＢＯ−１１Ｘ製剤の作用を変え得る多くの因子（例えば、体重、性別、食餌、投与の時間、投与経路、排泄の速度、被験体の状態、薬物の組み合わせ、遺伝学的傾向、及び反応感受性）が当業者によって考慮され得る。投与は、継続的に、又は最大耐用量内で１以上の個別の投薬で実行され得る。所与の一連の状態に対して最適な投与速度は、従来の投与量試験（dosage administration test）を使用して、当業者によって確認され得る。
【０１４２】
本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物の個々の用量を、例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤中約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子［例えば、ここで、上記個々のＢＯ−１１Ｘ製剤は約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することにより形成される］を含み、それらの間の全ての値及び範囲を包含する、単位剤形（例えば錠剤又はカプセル剤）で投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物を、ＢＯ−１１Ｘ製剤中約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子の量で毎日、又は約０．１
ｍｇ〜約１０ｍｇで毎日［例えば、ここで、上記個々の毎日のＢＯ−１１Ｘ製剤は約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することにより形成される］（それらの間の全ての値及び範囲を包含する）投与する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤及び／又は医薬組成物の好適な投薬量は、被験体の体重１ｋｇ当たり、ＢＯ−１１Ｘ製剤中約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲のポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．００３ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、より好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．００５ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、より一層好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり［例えば、ここで、投与される上記個々のＢＯ−１１Ｘ製剤は、約０．００５ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することによって形成される］、被験体の体重１ｋｇ当たり、好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たり約０．００３ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）であり、より好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）であり、それらの間の全ての値及び範囲を包含する。他の実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤及び／又は追加の治療剤の好適な投薬量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲、又は体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある。
【０１４４】
本発明の或る特定の実施形態によれば、本明細書に記載される薬剤及び／又は医薬組成物を、例えば、１日２回以上、約１日に１回、約２日に１回、約３日に１回、約１週間に１回、約２週間に１回、約１ヶ月に１回、約２ヶ月に１回、約３ヶ月に１回、約６ヶ月に１回、又は約１年に１回、投与してもよい。
【０１４５】
キット
また本発明は、本明細書に記載される薬剤及び／又は医薬組成物の投与を単純化することができるキットを提供する。キットは、本明細書に記載される薬剤を少なくとも１つ含む材料又は構成要素の集合である。キットにおいて構成される構成要素の正確な性質はその意図される目的に依存する。一実施形態では、キットはヒト被験体を治療する目的で構成される。
【０１４６】
使用に関する指示書がキットに備えられてもよい。使用に関する指示書は、典型的には、例えば癌、糖尿病又は肥満を治療するといった所望の成果に影響を及ぼすキットの構成要素の使用に採用される技術を説明する明瞭な表現を含む。また任意に、上記キットは、希釈剤、バッファー、薬学的に許容可能な担体、シリンジ、カテーテル、アプリケータ、フィルタ、針（マイクロニードル）、ピペッティング若しくは計量の器具、テーピング材料等の他の有用な構成要素、又は当業者に容易に認識され得る有用な他の装備を備える。
【０１４７】
キットに集合された材料及び構成要素は、それらの操作性及び実用性を維持する任意の簡便で好適な方法で医療者の備品に対して提供され得る。例えば、上記構成要素を、室温、冷蔵又は冷凍の温度で提供することができる。上記構成要素は、典型的には好適な包装材料に含まれる。様々な実施形態では、上記包装材料は、好ましくは無菌の汚染物質を含まない環境を提供するためによく知られている方法によって構築される。上記包装材料は、内容物及び／又はキットの目的及び／又はキットの構成要素を示す外部ラベルを有してもよい。
【０１４８】
本発明はその具体的な実施形態に関して記載されるが、更なる修飾が可能であって、本出願が、概して、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野の既知の慣習又は慣行に含まれる本開示からの解離を含む、本発明のいかなる変化、使用、又は適合も包含するこ
とを意図し、前に述べられ、添付の特許請求の範囲の通りの本質的な特徴に応用され得ることが理解されるであろう。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：別々のｊｅｔＰＥＩ系ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤（ＢＯ−１１１製剤）の抗癌効果に対する複合体サイズの効果
材料及び方法
ＢＯ−１１１製剤（２−バイアルプロセス）
二本鎖ポリイノシン−ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］分子］を生成するため使用した一本鎖ポリイノシン酸［ポリ（Ｉ）］分子及びポリシチジル酸［ポリ（Ｃ）］分子をTide Group、Carbogen、又はInvivogen等の商業上の提供者から得た。供給元及びバッチに
応じて、ポリ（Ｃ）分子に対する粒度分布は次のように定義される：４００塩基未満、２０％〜８２％（例えば、３３％、４３％又は５０％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；４００塩基〜８５０塩基、１５％〜４０％（例えば、２７％、３０％又は３７％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；８５０塩基〜５０００塩基、３％〜５０％（例えば、１３％、３０％又は３４％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；５０００塩基超、１％以下（通常は存在しない）。供給元及びバッチに応じて、ポリ（Ｉ）分子に対する粒度分布は次のように定義される：４００塩基未満、８０％〜９５％（例えば、８６％及び９１％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；４００塩基〜８５０塩基、５％〜２０％（例えば、８％又は１２％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；８５０塩基〜５０００塩基、０％〜５％（例えば、１％以下を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；５０００塩基超、１％以下（通常は存在しない）。また、ポリ（Ｉ）及びポリ（Ｃ）の粉体又は溶液に適用するＢＯ−１１１製剤を製造するための判定基準は、最大吸光度（ポリ（Ｉ）及びポリ（Ｃ）に対してそれぞれ２４８±１ｎｍ及び２６８±１ｎｍの波長において）、エンドトキシン含有量（１０ＥＵ／ｍｇ以下）、ｐＨ（６．０〜８．０）及び沈降係数（４Ｓ以上）を含む。
【０１５０】
バッチポリ（Ｉ）調剤は、撹拌し続けながら６リットルフラスコの１倍ＰＢＳ（２．４Ｌ）中５０℃で粉体ポリ（Ｉ）（１．０当量、２３．９９ｇ）を溶解することにより得られた。バッチポリ（Ｃ）調剤は、同じ方法、及び同じ濃度で別々に粉体のポリ（Ｃ）を使用して得られた。開始溶液の品質を更に改善するため、３００ｋＤａカットオフ又は５００ｋＤａカットオフを有するメンブレンを（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２カセット、Millipore
）使用して、濾過の追加工程を実行してもよい。これらの濾過工程の浸透物（permeates
）は濃縮され、３０ｋＤａのメンブレン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２カセット、Millipore）
上でモノマー等の小型の不純物を含まない。各溶液に対して得られた被保持物（retentate）を濃縮バッファー溶液（１０倍ＰＢＳ等）と混合する。両方の溶液について、後のア
ニーリング工程のため１：１の化学量論をもとに濃度を計算するため、光学密度を特定し、結果的にアニーリング工程前に総容積を調整する。５５℃〜６２℃で３０分間に亘りポリ（Ｉ）溶液をポリ（Ｃ）溶液分子と混合し、撹拌する。得られた溶液を、一本鎖分子をアニーリングし、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を生成するためおよそ３時間かけてゆっくりと室温まで冷却し、最終的にＧ３ガラスポアフィルタ（細孔径およそ１５μｍ〜４０μｍ）により濾過した。
【０１５１】
このアニーリングプロセスによって、異なる二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のプールを含む溶液を生成し、その後、これをクロマトグラフィーのＧＰＣカラム上に適用する。４０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の７００ｍｌのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５Ｆのスラリーを充填した直径５ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔガラスカラムを用いて、クロマトグラフィーを行った。スラリーをゆっくりと沈殿させた後、流速を１０ｍＬ／分から６０ｍＬ／分に増加させて４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝６．９）で洗浄した。カラ
ムを、２つのフィードポンプ、ＵＶ検出器、サンプリングバルブ及びコンピューターからなる分取ＨＰＬＣ装置に設置した。アニーリングによる反応混合物をカラムに装填し、４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（フロー＝５０ｍＬ／分、ｐＨ＝６．９）で溶出した。ＵＶシグナルが１００ｍＶ〜１２５０ｍＶである場合に標的画分を得て、４回の希釈の脱塩サイクルを使用する更なる処理、及び接線流装置（ＴＦＦ、MilliporeのＰｅｌｌ
ｉｃｏｎ  ２、再生セルロース、各々０．１ｍ２の３本のメンブレンカセットを備える、３００ｋＤａカットオフ）を使用する濃縮のために貯蔵した。貯蔵したクロマトグラフィー画分を含む第１のガラスビンにインレット及びアウトレットを接続した。最終被保持物及び洗浄溶液をメンブレンにより濾過し、透明で無色の溶液を得て、イソプロパノールを使用してこれを脱塩し、凍結乾燥し（freeze-dried）、室温で凍結乾燥（およそ５日間に亘り１ｍｂａｒにて）した（lyophilized）。
【０１５２】
種々の市販のｉｎ  ｖｉｖｏ−ＪｅｔＰＥＩ［８．３ｋＤａ〜２２．５ｋＤａに含まれる平均分子量を有し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ：ＳＯＰ  ＧＰＣ−００４４）によってＰＥＯＸ（ポリエチレンオキシド、ＰＥＩの前駆体）の多分散性指数から決定される多分散性指数１．５未満、及び０．２μｍフィルタによる滅菌濾過］をＰｏｌｙＰｌｕｓ（カタログ番号２０１−５０Ｇ）から得た。２−バイアルプロセスは、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含むバイアル１の内容物を（溶液をファストピペッティングする場合は１．０ｍＬ以下、又は、シリンジを使用する場合は最大５．５ｍＬの容量）、ＰＥＩ溶液を含むバイアル２（溶液をファストピペッティングする場合は１．０ｍＬ以下、又は、シリンジを使用する場合は最大５．５ｍＬの容量）と混合することを含む。代替的には、バイアル１の内容物をシリンジ（１０ｍＬ）及び針（Ｇ２０−０．９μｍ）で吸引し、素早くバイアル２中の液体の表面に対して注射する。その後、得られたＢＯ−１１１調剤を１μｍ〜５μｍの範囲の細孔径を有するメンブレンを通して濾過し、より大きく目視できる粒子の排除を確実にする。最終のＢＯ−１１１調剤において５％（重量／容積）の濃度に達するように、グルコース（又はマンニトール）をバイアル１に賦形剤として含ませた［すなわち、上記組成物は、更にグルコース（又はマンニトール）を５％（重量／上記組成物の総容積）の濃度で添加することによって形成される］。機能的又は物理化学的な特徴を損なわず、高濃度のマンニトールを投与することに起因する、可能性のある望ましくない副作用を回避しながら、ＢＯ−１１１の許容可能なモル浸透圧濃度（３０２ｍＯｓｍ／Ｋｇ）を促進する賦形剤として、グルコースを広範囲に使用した。
【０１５３】
別のＢＯ−１１１調剤は、種々の細孔径のセルロースアセテートメンブレン（Ｍｉｎｉｓａｒｔ（商標）ＮＭＬ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ；Sartorius）に当初のＢＯ
−１１１溶液を製造業者の指示書に従って１回又は２回濾過することにより産生された。代替的には、遠心分離機５４１５Ｄ／５４１５Ｒ（Eppendorf）用の固定角ローターＦＡ
−４５−２４−１１を使用して、当初のＢＯ−１１１調剤を指定の速度で１５分間遠心分離した。メンブレン濾過の通過画分及び遠心分離の上清をそれぞれ、ＵＶによって特定される０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）濃度で４℃にて使用まで保存した。その後、各実験の前にポリ（Ｉ：Ｃ）濃度を再度計算し、各条件に対して同じ用量の試料を調製した。
【０１５４】
アガロースゲル、及び非標識化又は［３２Ｐ］標識化されたポリ（Ｉ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）の調剤を使用して、ＢＯ−１１１調剤に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子のサイズを特定した。簡潔には、１μｇのポリ（Ｉ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＢＳ）をアガロースゲルにロードし、ＴＢＥバッファー中８０ボルトで１時間、電気泳動を行った。当初のポリ（Ｃ）及びポリ（Ｉ）の分子の粒度分布に応じて、ＢＯ−１１１調剤に存在するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の粒度分布は次の通りであると特定された：４００塩基未満、７％〜５７％（例えば、１５％又は２１％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；４００塩基〜８５０塩基、２０％〜４５％（例えば、２５％又は２７％を提示する調剤を使用して行
った詳細な試験による）；８５０塩基〜５０００塩基、２０％〜７０％（例えば、５２％又は５３％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；５０００塩基超、０％〜９％（例えば、１％又は０％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）。
【０１５５】
分析技術
別々のＢＯ−１１１調剤（０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ、ポリ（Ｉ：Ｃ）濃度１．０μｇ／ｍＬで細胞系及び他のアッセイのため希釈される）におけるＪｅｔＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）粒子のゼータ平均（ｚ平均）径及び多分散性指数に対する値を、上記粒子が球形であるという仮定に基づき、製造業者の指示に従ってＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用し、ＩＳＯ２２４１２に従って決定した。一般に、動的光散乱（ナノサイザー技術）はｖ７．１１ソフトウェアを使用して適用される。
【０１５６】
ＢＯ−１１１調剤の機能的特性評価
ＢＯ−１１０複合体の特性を記載する文献に従って（非特許文献１６；非特許文献１７；特許文献１６）、種々のＢＯ−１１１調剤をヒト黒色腫細胞、ヒト膵細胞又はヒトメラノサイトを使用して試験した。簡潔には、細胞の生存率アッセイを処理の少なくとも１２時間前に付着細胞に対して行った。指定の時間及び処理濃度での細胞死のパーセンテージを、貯蔵され、０．４％トリパンブルー溶液（米国ニューヨーク州グランドアイランドのGibco Laboratories）で染色され、光学顕微鏡下で採点された（１つの処理当たり最低１００個〜５００個の細胞を計数した）浮遊細胞及び付着細胞に対する標準的なトリパンブルー排除アッセイによって推定した。各調剤を１２時間〜４８時間に含まれる期間について、０．１μｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬに含まれた種々の調剤におけるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の濃度で試験した。
【０１５７】
結果
文献（非特許文献１６；非特許文献１７；特許文献１６）に記載されるＢＯ−１１０複合体を作製する既存のプロセスは実験室規模で確立され、より大きな前臨床の規模で試験された後、臨床評価され得る材料の生成に対する要件に関していくつかの重要な制限、すなわち、濃度の制限（０．０５ｍｇ／ｍＬを超えない）及び、アップスケーリング可能性の制限、また同時に、製造プロセスをＧＭＰ準拠にすることを有する。特に、この製造プロセスによって、関連する前臨床モデル及び薬物毒物学アッセイにおけるそれらの生物学的効果及び医学的使用を正確に評価するため、別の調剤との間で可能な限り均一な物理化学的特徴（無菌、粒度分布、安定性、目視可能な及び目視可能でない（sub-visible）粒
子の欠如、並びに少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度等）を有するポリ（Ｉ：Ｃ）含有粒子を含む製剤のバッチを産生することが可能であるものとする。
【０１５８】
これらの目的に達する最初の工程は、ＪｅｔＰＥＩ溶液に対して一滴ずつ（drop-by-drop）ポリ（Ｉ：Ｃ）溶液を添加し（逆に、当初のＢＯ−１１０調剤におけるように；特許文献１６）、室温で混合物をインキュベートする工程を代替するものである。潜在的に重要であるがまだ評価されていない製造の課題を解決するための因子として混合の速度を確認した。この領域において、凍結乾燥され、バイアルに包装される溶液のバルク混合のアプローチを、各々が所望量のＪｅｔＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む２つのバイアルをもたらすアプローチで代替することによって、ＢＯ−１１１と名付けられた新たな種類のポリ（Ｉ：Ｃ）−ＰＥＩ製剤が確立された。２つのバイアルの内容物を、同様の容量の２つの溶液を注入することにより（又はファストピペッティング等の液体を迅速混合する他の手段により）迅速混合する。得られた溶液は後のアッセイ及び使用と適合する容量を有する（例えば、１．２ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＯ−１１１調剤、２つの溶液の混合から得られ、各々が０．６ｍＬの容量を有する）。
【０１５９】
混合物に使用したシリンジ及び針は、速い混合及びＢＯ−１１１調剤において、限定的
な目視可能な粒子を含む（又は存在しない）、粒子の急速な形成を促進するのに十分な乱流を生成する。ＢＯ−１１１調剤の活性、再現性、安定性及び／又は均質性のレベルの更なる増加を提供するため、例えば、塩を抽出すること、生産残渣を排除すること、大きな細孔径（例えば１μｍ〜５μｍの範囲）を有するフィルタにより溶液を濾過すること、２つの溶液をファストピペッティング又はボルテックスすること、シリンジのサイズ／直径を選択すること、ＪｅｔＰＥＩ溶液にポリ（Ｉ：Ｃ）溶液を素早く添加すること（この逆でない）、又はグルコース若しくはマンニトールのような化合物を賦形剤として使用して調剤を凍結乾燥することによって、ＢＯ−１１１製造プロセスの具体的な技術的細目を適合させてもよい。
【０１６０】
しかしながら、かかる細目を、単回又は即時の使用に対する小さな容量から、担体としてのＪｅｔＰＥＩに基づき、薬物毒物学的又は他の前臨床評価の間、高用量を試験するのに必要な、十分な高濃度（少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ）かつ均一な濃度でポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する、ＧＭＰに準拠した医薬製剤のより大規模な作製に移すことは殆ど不可能である。さらに、特に、より大きく完全に制御されていない直径（サイズ）の範囲を有するＢＯ−１１１粒子を含有する混濁溶液でない透明な溶液の形成に関し、投与直前にＢＯ−１１１の成分を混合する工程は専門家に良質な最終材料をもたらす。
【０１６１】
この状況において、次の工程の目的は、ＢＯ−１１１粒子の混合物の直径を正規化する種々の手段及び効果を評価することであった。２−バイアルのファストピペッティングプロセスによって得られた当初のＢＯ−１１１調剤を使用して、高速での（例えば５０００ｒｐｍ超）遠心分離及び濾過（例えば１μｍ〜５μｍの範囲又はマイクロモル未満の範囲の細孔径による）等の一般的な技術を使用することによって溶液中のＢＯ−１１１複合体等の溶質の濃度及び／又はサイズが変更される、代替の調剤を作製及び比較した。
【０１６２】
この当初の分析は、いずれかの技術を適用することによって、得られたＢＯ−１１１調剤が平均ＢＯ−１１１粒子径の減少を提示するのみならず、驚いたことに、ＢＯ−１１１複合体の減少した平均直径に比例して癌細胞に対するかかる調剤の細胞毒性の増加も提示することを示した（図１Ａ）。また、かかる抗癌効果の増加は、より大きなマイクロモル未満の細孔径によって当初のＢＯ−１１１溶液を濾過することにより得られるＢＯ−１１１通過画分溶液が、特により低いＢＯ−１１１濃度でＢＯ−１１１複合体の既に重要な抗癌効果の増加を提示する（図１Ｂ）ことを示す用量反応研究において確認された。細胞毒性における同様の増加もまた、０．８μｍの細孔径を有するフィルタによって濾過されるＢＯ−１１０調剤を使用して確認される。
【０１６３】
評価可能な更なる基準は、ＪｅｔＰＥＩの特徴及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子に対する比率に関するものである。構造レベルでは、平均分子量の範囲に含まれる直鎖ＰＥＩを含むＪｅｔＰＥＩ調剤を２−バイアルプロセスを使用して試験した。かかるＢＯ−１１１調剤の細胞毒性の比較（図２Ａ）は、より高分子量（例えば１７ｋＤａ〜２３ｋＤａ）の直鎖ＰＥＩは、より低分子量（例えば８．３ｋＤａ）の直鎖ＰＥＩを含むものよりも有効な抗癌性ＢＯ−１１１調剤を提供することを示した。
【０１６４】
所望の抗癌特性を有するＢＯ−１１１を製造するのに適した直鎖ＰＥＩサイズの範囲を規定することに加えて、ＰＥＩのアミンとポリ（Ｉ：Ｃ）分子のアニオン性リン酸塩との種々の濃度比率の効果をＢＯ−１１１の製造の状況において試験した。ＪｅｔＰＥＩとポリ（Ｉ：Ｃ）分子との間のイオンバランスは、種々のレベルの細胞成分との相互作用（例えば、有効な細胞移入のための）を提示する複合体を提供する可能性がある。このバランスはＮ／Ｐ比率として計算され、ポリリボヌクレオチドリン酸塩当たりのＪｅｔＰＥＩの窒素残基の数を規定し、ｉｎ  ｖｉｖｏポリリボヌクレオチド送達実験に対して、値は６〜８であることが推奨される（８を超える、すなわち二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子１μｇ当
たり０．１６μＬのＪｅｔＰＥＩの毒性の問題を回避する）。かかる比率Ｎ／Ｐを１．８から５．２に増加させる場合、別のＢＯ−１１１調剤は、黒色腫細胞と正常なメラノサイトとの両方に対して用量反応性の細胞毒性効果を示した。実際に、中間範囲（およそ３の比率Ｎ／Ｐ）でのみ、黒色腫細胞に対する細胞毒性は正常なメラノサイトに対するものより十分に優れ、非処理細胞と比較した場合、後者の細胞の生存可能性は、この特定のＢＯ−１１１調剤によってわずかに影響されるにすぎない（図２Ｂ）。
【０１６５】
また、ＢＯ−１１１調剤を標識化又は非標識化ポリ（Ｉ：Ｃ）バッチを使用してポリ（Ｉ：Ｃ）分子の含有量について分析した。当初のポリ（Ｉ：Ｃ）バッチ調剤は、それらの製造及びそれらのアニーリングの結果、最長５キロベース（又はそれよりも長い）の長さの粒度分布を有する二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含み、かかる二本鎖の少なくとも４０％又は５０％は０．８５Ｋｂを超えるサイズを有し、かかる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％は０．４Ｋｂ〜５Ｋｂに含まれるサイズを有する（代表的な調剤では、４００塩基対（ｂｐ）未満：２１％、４００ｂｐ〜８５０ｂｐ：２７％、８５０ｂｐ〜５０００ｂｐ：５２％）。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子が２−バイアルプロセスを使用するＢＯ−１１１調剤に含まれる複合体中のＪｅｔＰＥＩに会合される場合、非標識化又は標識化ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤によるアガロースゲル分析によって示されるように（図３Ａ及び図３Ｂ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の全体がＪｅｔＰＥＩと会合する。また、電気泳動によって、より高いＮ／Ｐ比率（３以上；図３Ｃ）で観察され得ることから、３未満のＮ／Ｐ比率のＢＯ−１１１調剤において、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は完全にはＪｅｔＰＥＩに会合していないと特定される。したがって、適切な製造プロセスは、複合体化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）分子又はＪｅｔＰＥＩを除去するための特定の手順を追加せずに、生物学的に機能性のＢＯ−１１１調剤中への広い粒度分布を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子を効率的に組み込むことを可能とする。
【０１６６】
また、製造プロセスが繰り返されるか修正される場合、又はＢＯ−１１１調剤をそれらの安定性に関して試験する場合に、マイクロメートル未満の範囲の粒子の粒度分布を確立するための技術を使用して構造的なＢＯ−１１１特徴を評価した。別のＢＯ−１１１調剤が、常に単峰性の粒度分布を提示し、大半がおよそ１００ｎｍ、最も頻繁には５０ｎｍ〜９０ｎｍ（８５ｎｍ〜９０ｎｍの平均径（ｄ．ｎｍ））に集中する直径を有し、粒子の大多数が１００ｎｍ未満又は２００ｎｍ未満のサイズを有するが、４００ｎｍを超えず、しかしながら通常、更には３００ｎｍを超えない（図４Ａ）のであれば、この製造プロセスの再現性が実証される。この参照ＢＯ−１１１調剤が温度又はインキュベーション時間の変化に曝される場合、径分布は変化する場合があるが、それでも単峰性の１００ｎｍ〜１５０ｎｍ（１０５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均径（ｄ．ｎｍ））をピークとし、粒子の大多数がなおも３００ｎｍ未満であって６００ｎｍを超えない直径を有する（図４Ｂ及び図４Ｃ）。対応するＢＯ−１１１調剤は、図１及び図２について記載されるように試験した場合、同様の細胞毒性レベルをなおも提示し、この混合手順が医薬開発に対する要求と一致した製剤を提供することができることを実証する。しかしながら、混合速度の減少又は濾過手順を導入しないこと等のプロセスの修正は、ＢＯ−１１１複合体の粒度分布を変更する可能性があり、二峰性となって、制御が不十分でより高い平均径（ｄ．ｎｍ）を有し、大多数の粒子は５００ｎｍを超える（図４Ｄ）。
【０１６７】
これらの実験は、ＢＯ−１１０と名付けられた複合体の製造及び製剤化のプロセスが、それらの使用に先立って小規模での成分の素早い管理された混合を適用することによって改善可能であり、ＢＯ−１１１と名付けられたより均一で濃縮された、有効なポリ（Ｉ：Ｃ）系調剤をもたらすことを示す。しかしながら、医学的使用の直前に確立される手順とは別に、最も高い安定性及び効能の特徴に関して完全にＧＭＰに準拠した調剤を提示する調剤を作製するため、更なる改善が必要である。特に、「ファストピペッティング」法又は２−バイアルプロセスの他の変形は、なおも２００ｎｍを超える直径（最大１μｍ〜数
マイクロメートル）を有する相当量の粒子を提供する可能性がある。所望の無菌の濃縮されたＢＯ−１１１調剤（より小さく、より狭く分布したおよそ１００ｎｍの均一な直径の機能的複合体を提示する）を提供するために必要とされ得る追加の（またおそらくは部分的にのみ効率的な）濾過工程は、メンブレンフィルタに保持される大量の材料を喪失する結果を有する場合がある。したがって、たとえ当初のアプローチが、ＢＯ−１１１複合体の直径とその治療的活性との逆相関を伴う小規模なＢＯ−１１１調剤の確立を可能としても、狭く制御された粒度分布を有するポリ（Ｉ：Ｃ）系複合体を含むＧＭＰに準拠した安定な医薬製剤のバルク製造に都合がよく、その後、制御された匹敵する特徴［上記製剤のポリ（Ｉ：Ｃ）含有量、複合体の安定性及び生物学的活性等］を各々が有するいくつかのバイアルを産生するのに使用され得るように、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子とＪｅｔＰＥＩ溶液とを確立し、混合するためには、更なる技術的な改善が必要である。
【０１６８】
実施例２：ＧＭＰ条件下でのＢＯ−１１Ｘ調剤の生産に対する１−バイアルプロセス（ＢＯ−１１２製剤）
材料及び方法
ＢＯ−１１２調剤の製造（１−バイアルプロセス）
濃度、分子粒度分布を有する溶液として、実施例１に記載されるプロトコルに従って、ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤を生産した。しかしながら、１つのバッチでは、ポリ（Ｉ：Ｃ）それ自体を次の例示的プロセスによって得た：ポリ（Ｃ）溶液を、これをポリ（Ｉ）溶液と混合する前に６１℃〜６６℃で１．５時間に亘って加熱し、５５℃〜５８℃で７０分間撹拌し、その後、該混合物を冷却して０．２μｍのメンブレンにより濾過した。クロマトグラフィー及び／又は濾過工程に適用可能ないくつかの条件、凍結工程の不在又は存在を、バッファー及びアニーリング時間と共に、更なる溶液粘度の減少又は複合体の沈澱に対して適合させた。マンニトール又はグルコースのいずれかを最終製剤における賦形剤として使用する。ＪｅｔＰＥＩを含有する溶液１は、濃縮した液体調剤中のＪｅｔＰＥＩを使用すること、又はＪｅｔＰＥＩ（１７ｋＤａ〜２３ｋＤａに含まれる分子量を有する）の固体バルク調剤を１５０ｍＭに達するように或る量の注射用滅菌水に可溶化し、均質な溶液を得るために混合することのいずれかによって得られる。最終のバイアル中の５．６２ｍＭまでの最終希釈の前に１１．２５ｍＭの濃度に達するように、更なる稀釈工程を行う。溶液２はポリ（Ｉ：Ｃ）分子と、ＪｅｔＰＥＩと混合した後に５％グルコース（重量／上記組成物の総容積）及び上記組成物の総容積１ｍＬ当たり０．５ｍｇ〜０．７ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）を添加することによって形成される溶液を提供する量のグルコース一水和物とを含有し、それによって、上記ＪｅｔＰＥＩとの上記ポリ（Ｉ：Ｃ）複合体が、１つのバイアル当たり溶液中に１０８〜１０１０の粒子を有するＢＯ−１１２組成物をもたらす。
【０１６９】
溶液１及び溶液２を、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗのポンプ（速度３０ｒｐｍ）を使用して、０．２μｍのフィルタ（滅菌グレードフィルタ（ＡＳＴＭ  Ｆ−８３８−０５ガイドラインによる）として十分確認されているＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２  １５０  ０．２μｍ）による二重濾過を使用して個別に滅菌する。２つの溶液の自動化混合は、次の連続するプロセスを使用して、各バイアルにおいて行われる：（ｉ）５．９５ｇ〜６．０５ｇ（６ｍＬ；密度：１ｇ／ｍＬ）を投薬するためＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプを使用して、溶液１をバイアルに添加し、（ｉｉ）６．０８ｇ〜６．４０ｇ（６ｍＬ）を投薬するため、５５０ｒｐｍの速度でＦｌｅｘｉｃｏｎポンプを使用してＧ２０−０．９μｍ針に接続された内径１．８ｍｍのチューブを使用して、溶液２を溶液１上に添加する。結果は、Ｔピースミキサーの使用により改善される場合がある。静電相互作用により製造プロセスの終わりに（又はその保存中に）目視検査によってなおも存在し得る粒子（例えば、１μｍ〜１００μｍ以上の範囲のサイズ）が凝集した場合には、それによって生物学的特性も組成物内の粒子の単峰性の径分布も変更することなく、製品を使用に先立って（例えばその注入の前に）０．８μｍフィルタで濾過してもよい。例えば、０．８μｍの排除サイズを有するＭｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルタ（Sartorious）にＢＯ−１１２製剤
を通して濾過してもよい。バイアルを無菌の発熱物質を含まないゴム栓で密閉してアルミニウムカプセルで圧着し、個別にラベルを付した。
【０１７０】
商業的に入手可能なポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤
ポリ−ＩＣＬＣは、ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されるポリ（Ｉ：Ｃ）調剤である（Ewel C et al., 1992；特許文献１２）。ＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ（
カタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｉｃｌｖ）及びＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｉｃｗｌｖ）、及び対応する高分子量（ＨＭＷ；カタログ名ｔｌｒｌ−ｐｉｃ）及び低分子量（ＬＭＷ；カタログ名ｔｌｒｌ−ｐｉｃｗ）を有するポリ（Ｉ：Ｃ）調剤はInvivogenから入手可能である。
【０１７１】
分析試験
ＢＯ−１１２の直径及び分布の分析を標準的な動的光散乱設備を使用し、実施例１に従って行った。
【０１７２】
結果
ＢＯ−１１Ｘ調剤の定義は、（実施例１において示されるように、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、３００ｎｍを超えない、更には２００ｎｍを超えないピークのｚ平均径によって定義される）小さく、分布の狭い粒子径の範囲を有する複合体を生成するため、ＰＥＩのようなポリマーを含有する溶液と、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する溶液とを適切に混合することにより得られる医薬組成物に当てはまる。ＢＯ−１１１調剤が更なる使用の直前に手動で行なわれる混合工程（すなわち「２−バイアルプロセス」）から生じる場合、ＧＭＰ関連及び他の工業上の要件（例えばプロセスの自動化に対する）を、要求される薬学的規格に準拠し、注入される準備ができているＢＯ−１１Ｘ製剤を提供する「１−バイアルプロセス」を確立するため考慮に入れた。この領域では、２つの溶液が別々に作製され（また１以上の賦形剤を含むポリ（Ｉ：Ｃ）溶液の場合に）、混合の速度及び時間が各バイアルについて管理され、維持される自動化システムで混合される前に濾過によって滅菌される。
【０１７３】
図５Ａは、ＢＯ−１１２製剤と名付けられる第１型のＢＯ−１１Ｘ調剤を生成するかかるプロセスの概要を提供し、該プロセスにおいては、原体（すなわち、ポリ（Ｉ）及びポリ（Ｃ）の一本鎖分子のアニーリングによって生成される二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子）を担体（すなわちＪｅｔＰＥＩ）の機能を有するポリマーを含有する溶液とは別々に濾過によって滅菌される溶液中で、グルコースのような賦形剤と最初に混合する。その後、これらの２つのバルク調剤を各バイアルに適切に混合し、薬物毒物学の研究及び臨床応用に必要な多数の構造的及び機能的に匹敵する医薬製剤を生成する。
【０１７４】
このアプローチは実施例１に記載される知見を利用し、より一層均一な特徴を有するＢＯ−１１２調剤を提供するように自動化され得る。この混合手順は、単にＢＯ−１１２調剤に含まれる複合体に利用可能なグルコース、ＪｅｔＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子の全てを組み込むことを可能とするのみならず（図５Ｂ）、３０ｎｍ〜１５０ｎｍの間でＺ平均を調節することができるように、ＢＯ−１１２調剤に含まれる複合体の平均径及び単峰性の径分布の調節を可能とする（図５Ｃ）。得られたＢＯ−１１２製剤は、単峰性の径分布を有し、最終溶液がバルク溶液の１と２とを混合した後に５μｍを通して濾過されなくても目視可能な粒子を含まないＢＯ−１１２複合体を提示する。混合条件を、特に、５０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの混合速度及び／又はポリ（Ｉ：Ｃ）又はＪｅｔＰＥＩ溶液のいずれかに対する１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分のフロー速度の修飾によって、適合させてもよい。
【０１７５】
一般に、ＢＯ−１１Ｘ調剤（特に、ＢＯ−１１２調剤において）は次の主な特徴：無色
で、目視可能な粒子はなく、モル浸透圧濃度は２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇに含まれ、ｐＨは２．７〜３．４に含まれ、＋１５００〜＋３７５０の旋光度、３０ｍＶ以上のゼータ電位、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、しかしながら好ましくは６０ｎｍ〜１３０ｎｍのＺ平均径（ｎｍ）を有する粒子の単峰性の径分布を提示し、０．８５Ｋｂを超えるサイズを有するかかる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％又は５０％において、また、かかる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％において０．４Ｋｂ〜５Ｋｂに含まれるサイズを有する、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む。溶液１及び溶液２の両方に対する種々のフロー速度と組み合わせてＴピースミキサーを使用することにより、粒子の径分布等の特徴を修飾してもよい。かかる速度が２０ｍＬ／分を上回る（例えば３０ｍＬ／分）場合、得られたＢＯ−１１２調剤の濁度は、この値周辺のＺ平均粒径及び径分布の減少と並行して減少されるのに対し、おそらくはフローレジム（flow regime）の変
化により、単峰性を維持する。
【０１７６】
例示的なＢＯ−１１２調剤は、ＢＯ−１１１に類似する組成（６．９２４ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、５．６２５ｍＭのＪｅｔＰＥＩ、５％グルコースで形成される）を提示するが、各バイアルは、Ｚ平均径４５＋／−５ｎｍ〜８１＋／−５ｎｍ（例えば７３＋／−５ｎｍ）を有し、少なくとも５０％の粒子が８５＋／−２０ｎｍより小さく、３８ｍＶのゼータ電位及びｐＨ３．１の粒子を含む。−２０℃の凍結／融解サイクル、又は室温での広範囲な曝露の後に維持されるこれらの構造特性を別のバッチにおいて修飾することができ、値の特定範囲内の判定基準を維持する（例えば、ＢＯ−１１２製剤は、１００＋／−５０ｎｍ（例えば８９ｎｍ）のＺ平均径を提示することができ、約４０ｍＶ〜４５ｍＶ（例えば４３ｍＶ）に含まれる電位ｚを伴う）。これらの値は、凍結保存後に修飾されてもよいが、値はこれらの範囲内にとどまる。
【０１７７】
かかる再現性及び判定基準のうちの少なくともいくつかは、抗癌活性が知られている他のポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤のものと比較することができる。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子サイズのレベルでは、市販のＬｙｏｖｅｃ−ＨＭＷ及びＬｙｏｖｅｃ−ＬＭＷに含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、実際に使用される（actually makes use of）ＢＯ−１１Ｘの製造プロセ
スのものとは明らかに異なるサイズ範囲を包含する（ＨＭＷはほぼ完全に０．８５ｋｂを上回り、ＬＭＷはほぼ完全に０．８５ｋｂを下回る；図６Ａ）。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のこのサイズ差は、異なる製造プロセス及び／又は複合体においてポリ（Ｉ：Ｃ）分子と会合される担体に依存し得る。ポリ−ＩＣＬＣ（ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースを含む）及びＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ／ＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ（製造業者によれば、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬のジ−テトラデシルホスホリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルメタンアミニウムクロリド、すなわちＤＴＣＰＴＡ、及び中性脂質の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、すなわちＤｉＰＰＥを含む）に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）系複合体内の複合体のＺ平均値を、ＢＯ−１１２製剤のものと比較して、これらの市販の製剤が、少なくとも二峰性分布を伴うＬｙｏｖｅｃ−ＬＭＷについて、はるかに大きい（大多数が２００ｎｍより大きい）複合体を含むことを示す（図６Ｂ）。
【０１７８】
この分析が凍結／融解サイクルの後に行なわれる場合、これらの市販の調剤もまた、ＢＯ−１１２については観察されない可変性を伴い、より安定していないものに見える（図７Ａ〜図７Ｄ）。実際、ＢＯ−１１２製剤は、ＢＯ−１１１製剤のように、１００＋／−５０ｎｍ（例えば８２．５ｎｍ）の４００ｎｍを超えないＺ平均径（ｄ．ｎｍ）を有する場合（図４及び図６Ｂを参照されたい）、ＬｙｏＶｅｃ系及びポリ−ＩＣＬＣの製剤は、３００ｎｍよりかなり高いＺ平均値を有することから、商業的に入手可能なポリ（Ｉ：Ｃ）は、組成物において不均質であるか、又は機能的な特性評価に乏しく、そのサイズが凍結／融解サイクル中に修飾される、大きな粒子を含むかのいずれかの調剤として提供される。
【０１７９】
また、ポリ（Ｉ）鎖とポリ（Ｃ）鎖との間の分離を判定する温度（又は他の条件の）変化の結果として、ＢＯ−１１２製剤、特に粒子内の二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の安定性を評価するため、ハイパークロミシティーを使用することができる。ＢＯ−１１２製剤は、０．２未満又は０．１未満の２６０ｎｍでの透過率の差を有する、非常に低いハイパークロマティック効果を示した。また、種々の時間に対する−２０℃での凍結ＢＯ−１１Ｘバイアルの安定性を評価し、確認した。
【０１８０】
投与前のＢＯ−１１２製剤の濾過、凍結乾燥及び凍結は、本来のＢＯ−１１２製剤に関して、組成物内の粒子に対する細胞毒性の特性、安定性又は構造上の特徴に対する本質的な変化を促進しない。例えば、組成物は、２５０ｎｍ未満のＤ９０％、４０ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位、３０ｎｍ〜１５０ｎｍのＺ平均を有する流体力学的径、賦形剤としてのグルコースの使用との適合性、０．１〜０．６に含まれる多分散値、及びヨーロッパ薬局方による他の該当する基準を維持する）。
【０１８１】
したがって、ＢＯ−１１２調剤等のＢＯ−１１Ｘ調剤は、他の担体及び製作方法に基づく市販のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤については観察されない、２００ｎｍ未満（１００ｎｍ未満でない場合）のＺ平均直径（ｄ．ｎｍ）を有するポリ（Ｉ：Ｃ）−ＪｅｔＰＥＩ複合体によって形成される粒子に対する高レベルの安定性及び再現性を提示する製剤である。
【０１８２】
実施例３：細胞系モデルにおけるＢＯ−１１Ｘ調剤の機能的特性評価
材料及び方法
ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤
ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を実施例２に記載される通り得た。
【０１８３】
細胞生存率の分析
実施例１及び本明細書に引用される文献に記載される通り、０．３μｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬ（０．８５μｇ／ｍＬが最も関連する基準値である）の範囲のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する濃度でポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を使用し、１２時間〜４８時間に含まれる期間に亘って細胞を曝して、ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１０３及びヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ０２．０３を使用した。
【０１８４】
ＢＯ−１１２の細胞死誘導活性（death-inducing activity）を、正常なメラノサイト
、並びに黒色腫及び膠芽腫に由来する細胞株で試験し、単離した成分、すなわちポリ（Ｉ：Ｃ）分子及び直鎖ＰＥＩ（ＪｅｔＰＥＩ；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）と比較した。正常なメラノサイトを無症候性ドナーの包皮から単離した。黒色腫細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３、及びＵＡＣＣ６２（それぞれ、ｐ５３、ＮＲＡＳ、及びＢＲＡＦに突然変異を有する）をＡＴＣＣ又はメモリアルスローンケタリング癌センター（Memorial Sloan Kettering Cancer Centre）（米国）の樹立されたコレクションから得て、細胞株認証のためショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリング（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（商標）１０  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。細胞を９６ウェルプレートに播種した（６０００細胞／ウェル）。０．５μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）のみ、ＢＯ−１１０又はＢＯ−１１２の製剤による２４時間又は４０時間の処理で１つの実験当たり３回。
【０１８５】
結果
実施例１及び実施例２は、ＢＯ−１１Ｘ製剤の当初の開発及び特性評価に関する実験データを示し、ＢＯ−１１０と比較して、癌細胞に対するＢＯ−１１Ｘ製剤の増加した細胞毒性を導く。これらのデータを、ＢＯ−１１Ｘの製造プロセス及び得られたポリ（Ｉ：Ｃ）含有調剤と、文献に開示されるプロセス及び調剤とを比較することにより、更に統合することができる。
【０１８６】
実施例２は、市販のＬｙｏｖｅｃ−ＨＭＷ及びＬｙｏｖｅｃ−ＬＭＷが実質的に異なる分布を有することを示した。しかしながら、対応するポリ（Ｉ：Ｃ）ＨＭＷ及びＬＭＷ調剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）分子の種々のサイズが、ＢＯ−１１Ｘ製造プロセス、並びにポリ（Ｉ：Ｃ）ＨＭＷ及びＬＭＷを使用して生成された複合体の活性に、どの程度まで影響し得るかを評価することができる。ＢＯ−１１２製剤の細胞毒性活性を市販の製剤と比較する場合、後者は、少なくとも２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（図８Ａ及び図８Ｂ）において癌細胞の殺傷にそれほど有効でないように見える。ＢＯ−１１Ｘの細胞毒性活性を、種々の臨床上の癌の指標を代表する種々のタイプの癌細胞株において測定して、どの癌の適応症がＢＯ−１１Ｘによってより効率的に治療されるかを評価することができる。また、これらの効果は、癌細胞に対する細胞応答を変化させるとともに改善する可能性があることが知られているタンパク質の発現及び／又は分泌を測定することによって検討され得る。例えば、ＢＯ−１１２製剤は、ポリ−ＩＣＬＣより一層効率的に、少なくとも２４時間の期間に亘って黒色腫細胞株においてインターフェロン−β発現を誘導する（図８Ｃ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏでの証拠を、ＢＯ−１１Ｘ製剤を投与することによってどのタイプの癌がより効率的に治療され得るかを評価するためのみならず、ＢＯ−１１Ｘ製剤と組み合わせて投与される場合に（例えば、投薬量、頻度及び／又はこの他のアプローチによる治療期間を減少することによって）、どの他の癌の治療（ワクチン、アジュバント、抗体、化学療法薬、放射線療法、免疫療法、又はキナーゼ等の酵素活性の阻害剤等）がより効果的な方法で作用し得るかを評価するためにも使用することができる。
【０１８７】
実際、ＢＯ−１１Ｘ製剤による正常な初代細胞に対してではなく、癌細胞株に対するかかる細胞毒性効果の特異性（実験室スケールのＢＯ−１１０製剤について先に記載される；非特許文献１７）を、適切な化合物及び細胞対照と活性を比較することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した（図９）。直鎖ＰＥＩＬもポリ（Ｉ：Ｃ）分子単独も、腫瘍細胞（黒色腫又は神経膠腫）の生存可能性に顕著に影響しなかった。直鎖ＰＥＩとポリ（Ｉ：Ｃ）分子が複合体化される場合に限り、正常なメラノサイトの生存可能性に影響することなく、腫瘍細胞の顕著な殺傷が観察される。同様の細胞系アプローチを、濾過、凍結乾燥、及び／又は凍結に曝されたＢＯ−１１Ｘ、特にＢＯ−１１２製剤を検証するため使用し、細胞毒性効果は、かかる処理の後にＢＯ−１１２調剤において定性的に及び定量的に維持されることを確認した。種々のＢＯ−１１Ｘ製剤の生産及び比較、種々の投与レジメン、及び／又は癌等の疾患に関連する状態を含む種々の前臨床モデルを使用して、臨床開発を導くためのこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータのより深く掘り下げた分析を行うことができる。
【０１８８】
実施例４：動物モデルにおけるＢＯ−１１Ｘ調剤の機能的特性評価
材料及び方法
ＢＯ−１１Ｘ製剤及び他の化合物
実施例２に記載される通りＢＯ−１１２製剤を得て、５％グルコースＰＢＳ溶液（ビヒクル；参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、フランス国Lonza）で、それぞれ０．０５ｍｇ／Ｋｇ
、０．５ｍｇ／Ｋｇ及び２．５ｍｇ／Ｋｇの動物の体重１キログラム当たりの投薬量に従って、３つの異なる濃度に希釈した。
【０１８９】
ネズミ科抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩｎＶｉｖｏＰｌｕｓ、クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を免疫療法化合物との組み合わせとして選択した。マウスに対する毎日の注射では、抗ＰＤ−１抗体を１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にビヒクルで希釈した。
【０１９０】
結果
ＢＯ−１１２製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗癌の効力を、マウス黒色腫細胞を移植した免疫応答性マウス系統においてｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。マウスをＰＢＳ溶液、又はネズミ
科抗ＰＤ−Ｌ１抗体（好ましくは静脈内で投与される）と組み合わせて、３つの異なる濃度（好ましくは腫瘍内に投与される０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇ）のＢＯ−１１２製剤のいずれかで治療し、３週間に亘り、ビヒクル単独と比較した（図１０Ａ）。ビヒクルと組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ビヒクル単独と比較した場合、顕著には生存を増加しなかった。抗ＰＤ−Ｌ１（また、おそらくはかかる抗体から独立して）で試験した３つ全てのＢＯ−１１２製剤の組み合わせは、ビヒクル又は抗ＰＤ−Ｌ１単独と比較してマウスの生存を著しく増加した。さらに、生存は、より低用量のＢＯ−１１２製剤と比較して、２．５ｍｇ／ｋｇのＢＯ−１１２製剤＋抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせで著しく増加した。これらの結果は、これらの群において測定された腫瘍サイズと相関した。
【０１９１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、重要で検証された抗癌薬であり、癌細胞に対する有効な免疫応答の媒介物質である。本発明者らの実験は、ＢＯ−１１Ｘ複合体を他の抗癌剤と組み合わせて使用できること、及びＢＯ−１１Ｘ化合物と、抗ＰＤ１等の他の抗癌剤との組み合わせが抗癌剤単独に対してより優れた効力を有し、生存及び抗腫瘍の効能の著しい増加をもたらすことを実証する。さらに、生存における改善は、上記組み合わせに対するＢＯ−１１Ｘ製剤の用量の増加と相関し、生存における追加の利益がＢＯ−１１Ｘ製剤によって媒介されることを支持する。
【０１９２】
したがって、ＢＯ−１１Ｘ製剤（単独で、又は同じ若しくは異なる経路を使用して投与され得る抗体、免疫療法又は化学療法等の他の抗癌剤と組み合わせて）を黒色腫及び他の癌適応症、特に、膵癌、子宮内膜癌、卵巣癌、結腸直腸癌等の腫瘍周囲又は腫瘍内への注射を可能とするものの治療に使用することができる。この領域では、樹状細胞の活性を増強するＰＤ−１又はＣＤ１３７及びポリ（Ｉ：Ｃ）を標的とする免疫調節性モノクローナル抗体の併用効果について示されたように（Sanchez-Paulete AR et al., 2015）、特定
の生物学的経路及び作用機構の同定は、最も適切な投薬量、投薬計画、他の薬物又は治療法との組み合わせ、及びＢＯ−１１Ｘ製剤に対する適応症を導く可能性がある。この目的のため、Duewell P et al., 2015は、本発明の組成物を試験するため使用され得る疾患の代替的な動物モデルを開示する。
【０１９３】
いかにしてかかる治療が、更なる薬物又はワクチンの同時投与により又はそれによらずに、マウス黒色腫モデル等の関連するモデルにおけるマウス生存を改善するのかを評価するため、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子（０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、又は５ｍｇ／ｋｇ等）に関する濃度範囲に亘る腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与についてｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行うことにより、腫瘍成長（局所及び／又は遠位の場所での）及び抗腫瘍免疫応答に対するＢＯ１１Ｘの治療効果を測定することができる。同時に、ＢＯ−１１Ｘ治療によって誘導された特定の生物学的活性に関する用量反応研究を、アポトーシス誘導（カスパーゼに関連する発光（Caspase-related Glow））、体液中のケモカイン／サイトカインの分泌（例えばＩＬ−６及びＩＰ−１０の分泌）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の活性化及び／又は増殖（例えば、適切な細胞型に対するＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ６９の上方制御と関連する）のレベルでのヒト又は動物の試料を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏと並行して評価することができる。これらの研究は、いくつかの免疫活性又は免疫調節性活性（例えばヒト末梢血単核細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞）を行ってから、疾患に直接関与するか、又は間接的に関与する細胞（例えば腫瘍細胞、上皮細胞、内皮又は上皮細胞）を使用して行われ得る。ＢＯ−１１Ｘ治療に対する疾患段階及び／又は患者集団を階級化するため、これらの研究を、ＢＯ−１１Ｘに対する応答（又は応答の欠如）を予測するためのバイオマーカーとして使用され得る分子の同定に対して更に関連付けることができる。
【０１９４】
参照文献
【表１】
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2020143088.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月29日(2020.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のために用いられる、粒子を含む水性組成物であって、
（ａ）粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、
（ｉ）前記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］であり、
前記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％は少なくとも８５０塩基対を有し、
前記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％は４００〜５０００の塩基対を有し、
２０〜４５％の間の前記二本鎖ポリリボヌクレオチドが４００〜８５０の塩基対を有し、
（ｉｉ）前記ポリアルキレンイミンは少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、
前記ポリアルキレンイミンは、平均分子量が１７〜２３ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、かつ
前記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する前記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が好ましくは２．５〜３．５であり、
（ｂ）前記粒子はＩＳＯ２２４１２：２００８によって測定される３０〜１５０ｎｍのｚ平均径を有し、
（ｃ）前記粒子の少なくとも９９％は６００ｎｍ未満の径分布を有し、
（ｄ）前記水性組成物は２〜４のｐＨを有し、２００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有し、
（ｅ）前記組成物は３５〜５０ｍＶのゼータ電位を有する、
組成物。
【請求項２】
前記水性組成物が２．７〜３．４のｐＨを有し、＋１５００度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１〜＋３７５０度．ｍＬ．ｇ−１．ｄｍ−１の比旋光度、３０ｍＶ以上のゼータ電位、２６０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を提示する、５％（重量／容積）のグルコースをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する前記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が約３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記癌が、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶの癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
癌の生育、生存、転移、上皮間葉転換、免疫学的回避又は再発を軽減、改善、又は阻止するために使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記癌の再発が、腫瘍再成長、肺転移、又は肝転移である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腫瘍内又は腫瘍周囲に注射される、又は皮膚レベルで又は内臓若しくは組織に注射される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
抗癌薬、放射線療法、化学療法、凍結療法、腫瘍アブレーション、光線力学療法、又は免疫調節剤と組み合わせて用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗癌剤は、腫瘍を標的とする又は他の免疫調節性のモノクローナル抗体、腫瘍崩壊ウイルス、免疫賦活サイトカイン、養子細胞移入及び他の細胞療法、ＤＮＡ又はペプチドに基づくワクチン、免疫抑制性代謝の阻害剤、及びパターン認識受容体のアゴニストから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体の標的が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ３８、ＯＸ−４０、ＣＤ２６、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３から選択される、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物と前記抗癌剤とは同時、又は、
任意の順、又は連続する投与サイクルで、順次に、投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記癌が、膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、又は他の胃腸癌を含む消化器の癌；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌（hepatic carcinoma）；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌（kidney）、副腎癌又は腎癌（renal）；白血病；肝臓癌（liver cancer）；肺癌；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；膵癌；前立腺癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、外陰部癌、卵巣癌、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；リンパ腫及び白血病から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記癌が、癌腫、神経膠腫、黒色腫及び肉腫から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、及び抗ＣＤ１３７抗体から選択される免疫調節剤による副作用を低減する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記癌が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＣＤ１３７抗体から選択される免疫調節剤に耐性を示す、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組成物。