(57)【要約】【課題】  エガセラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができ、もって２型糖尿病や本細菌に起因する各種感染症の予防や治療に寄与しうる、菌数抑制剤および菌数抑制用食品組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  １−ケストースを有効成分とするエガセラ属細菌の菌数抑制剤。本発明によれば、エガセラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができ、もって２型糖尿病や菌血症等の本細菌に起因する各種感染症の予防または治療に寄与することができる。また、本発明によれば、安全性も高く、様々な食品や医薬品等に容易に配合することないし日常的に簡便に摂取することができるエガセラ属細菌の菌数抑制剤を得ることができる。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ケストースを有効成分とする、エガセラ属細菌の菌数抑制剤。
【請求項２】
２型糖尿病ならびにエガセラ属細菌による菌血症、副鼻腔炎、化膿性筋炎、皮膚膿瘍、脊椎椎間板炎および肝膿瘍から選択される疾患の予防または治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の菌数抑制剤。
【請求項３】
１−ケストースを有効成分とする、エガセラ属細菌の菌数抑制用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−ケストースを有効成分とする、エガセラ属細菌の菌数を抑制する剤および食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エガセラ属細菌（Eggerthella）のエガセラ・レンタ（Eggerthella lentha）は、非芽胞形成性の嫌気性グラム陽性細菌であり、コリオバクテリウム綱に属する。当該細菌は健康なヒトにおける腸内細菌叢の構成細菌であるが、その一方で、近年、消化管を感染源とする複数微生物による感染症に関与することや、重篤な播種性の疾患に関与することが報告されている（非特許文献１；第６２６頁左欄第１−２段落）。エガセラ・レンタに起因する感染症として、具体的には、菌血症（非特許文献２）や副鼻腔炎（非特許文献３）、化膿性筋炎（非特許文献４）、皮膚膿瘍（非特許文献５）、脊椎椎間板炎（非特許文献６）、肝膿瘍（非特許文献７）が報告されている（非特許文献１；第６３１頁左欄第２段落、非特許文献８；第４７５頁左欄第２段落）。
【０００３】
また、２型糖尿病患者の血漿中では、ヒスチジンの代謝産物であるイミダゾールプロピオン酸濃度が上昇していること、イミダゾールプロピオン酸は耐糖能およびインスリンシグナル伝達を弱めること、エガセラ・レンタはイミダゾールプロピオン酸を生成する酵素を持っており、かつ、糖尿病患者の糞便において、耐糖能が正常な者と比較して菌数が多いことが示されている（非特許文献９：第９４９頁左欄第２段落および図２Ｄ，Ｅなど）。すなわち、エガセラ・レンタは、生体内でイミダゾールプロピオン酸を生成することにより２型糖尿病の発症ないし悪化に関与することが示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】B.J. Gardiner, A.Y. Tai, D. Kotsanas, M.J. Francis, S.A. Roberts, S.A. Ballard, et al. Clinical and microbiological characteristics of Eggerthella lenta bacteremia. J Clin Microbiol 53 (2015) 626-35
【非特許文献２】Gardiner BJ, Korman TM, Junckerstorff RK. 2014. Eggerthella lenta bacteremia complicated by spondylodiscitis, psoas abscess and meningitis. J Clin Microbiol 52:1278-1280. doi:10.1128/JCM.03158-13.
【非特許文献３】Moon T, Lin RY, Jahn AF. 1986. Fatal frontal sinusitis due to Neisseria sicca and Eubacterium lentum. J Otolaryngol 15:193-195.
【非特許文献４】Palomino-Nicas J, Gonzalez E, Arroyo A, Canas E, Hernanz W, Pachon J. 1996. Pyomyositis due to Eubacterium lentum and Streptococcus constellatus from a periodontal source. Clin Infect Dis 22:176-178. doi:10.1093/clinids/22.1.176.
【非特許文献５】Lattuada E, Zorzi A, Lanzafame M, Antolini D, Fontana R, Vento S, Concia E. 2005. Cutaneous abscess due to Eubacterium lentum in injection drug user: a case report and review of the literature. J Infect 51:E71-E72. doi:10.1016/j.jinf.2004.08.026.
【非特許文献６】Bok CW, Ng YS. 2009. Eggerthella lenta as a cause of anaerobic spondylodiscitis. Singapore Med J 50:e393-e396.
【非特許文献７】Elias RM, Khoo SY, Pupaibool J, Nienaber JS, Cummins NW. 2012. Multiple pyogenic liver abscesses caused by Eggerthella lenta treated with ertapenem: a case report. Case Rep Med 2012:718130. doi:10.1155/2012/718130.
【非特許文献８】Venugopal AA, Szpunar S, Johnson LB. Risk and prognostic factors among patients with bacteremia due to Eggerthella lenta. Anaerobe. 2012;18(4):475-478.
【非特許文献９】Koh et al., Microbially Produced Imidazole Propionate Impairs Insulin Signaling through mTORC1. Cell 175, 947-961, November 1, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、生体内のエガセラ属細菌の菌数を抑制できれば、２型糖尿病や本細菌に起因する各種感染症の予防や治療に貢献できると考えた。すなわち、本発明は、エガセラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができ、もって２型糖尿病や本細菌に起因する各種感染症の予防や治療に寄与しうる、菌数抑制剤および菌数抑制用食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、１−ケストースが、腸内のエガセラ属細菌の菌数を顕著に抑制することを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
【０００７】
（１）本発明に係るエガセラ属細菌の菌数抑制剤は、１−ケストースを有効成分とする。
【０００８】
（２）本発明に係る菌数抑制剤は、２型糖尿病ならびにエガセラ属細菌による菌血症、副鼻腔炎、化膿性筋炎、皮膚膿瘍、脊椎椎間板炎および肝膿瘍から選択される疾患の予防または治療に好適に用いることができる。
【０００９】
（３）本発明に係るエガセラ属細菌の菌数抑制用食品組成物は、１−ケストースを有効成分とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体におけるエガセラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができる。また、本発明によれば、エガセラ属細菌の菌数を抑制することにより、当該細菌の代謝精製物あるいは当該細菌への感染に起因する各種疾患の予防や治療に寄与することができる。
【００１１】
また、本発明が有効成分とする１−ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれているオリゴ糖の一種であり、古来より食経験を有する物質であることや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は極めて高い（食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．１２、第９頁、２０１４年）。したがって、本発明によれば、安全性への懸念を全く生じさせずにエガセラ属細菌の菌数を抑制することができる。
【００１２】
特に、エガセラ属感染症の治療には、従来、各種の抗生物質が用いられているが、抗生物質の多用は耐性細菌の出現リスクを伴う（非特許文献１；第６３３頁右欄第２段落など）。この点、１−ケストースは上述のとおり食品成分に用いられる物質であるため、耐性細菌の出現を全く懸念することなく、エガセラ属細菌の菌数を抑制することができる。
【００１３】
また、１−ケストースは、水溶性が高く、砂糖に似た良好な甘味質を有するため、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合することができる。したがって、本発明によれば、安全性が高く、そのまま、あるいは様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合して日常的に簡便に摂取することができる、エガセラ属細菌の菌数抑制剤および菌数抑制用食品組成物を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係るエガセラ属細菌の菌数抑制剤および菌数抑制用食品組成物（以下、まとめて「本発明の剤等」という場合がある。）について詳細に説明する。
【００１５】
本発明において、「エガセラ属細菌」は、エガセラ属に属する微生物をいう。係る微生物としては、例えば、エガセラ・レンタ（Eggerthella lentha）やエガセラ・シネンシス（Eggerthella sinensis）、エガセラ・ブラキ(Eggerthella brachy)、エガセラ・ホンコンジェンシス(Eggerthella hongkongensis)、エガセラ・インフィルムム(Eggerthella infirmum)、エガセラ・ミヌタム(Eggerthella minutum)、エガセラ・ノダタム(Eggerthella nodatum)、エガセラ・サフェヌム(Eggerthella saphenum)、エガセラ・スルシ(Eggerthella sulci)、エガセラ・テヌエ(Eggerthella tenue)などを挙げることができる。
【００１６】
本発明の剤等は、１−ケストースを有効成分とする。１−ケストースは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。
【００１７】
１−ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８−２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β−フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１−ケストース含有反応液を得る。この１−ケストース含有反応液を、特開２０００−２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１−ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１−ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１−ケストース溶液を濃縮した後、特公平６−７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１−ケストースを結晶として得ることができる。
【００１８】
また、１−ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１−ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１−ケストースとして、１−ケストースを含有するオリゴ糖などの１−ケストース含有組成物を用いてもよい。１−ケストース含有組成物を用いる場合、１−ケストースの純度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、１−ケストースの「純度」とは、糖の総質量を１００とした場合の、１−ケストースの質量％をいう。
【００１９】
本発明の剤等は、ヒトまたは動物に経口摂取させることにより使用することができるほか、有効成分を経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法で使用してもよい。
【００２０】
本発明の菌数抑制剤の形態としては、有効成分である１−ケストースのみからなるもののほか、医薬品や食品添加剤、サプリメントなどの形態を挙げることができる。医薬品や食品添加剤、サプリメントの形態とする場合、その剤型としては、例えば、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型を挙げることができる。
【００２１】
上記各剤型の医薬品や食品添加剤、サプリメントは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、散剤であれば、１−ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１−ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１−ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０（ｖ／ｖ）％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させ、湿潤粉末を得る。この湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒した後、顆粒４７０ｇに対してショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合する。これを、ロータリー打錠機（６Ｂ−２、菊水製作所）に供して打錠することにより、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１−ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。
【００２２】
また、本発明の菌数抑制用食品組成物の形態としては、有効成分である１−ケストースのみからなるもののほか、菓子や飲料、加工食品、健康食品、乳幼児食品などの通常の飲食物の形態を挙げることができる。飲食物の形態とする場合は、通常の製造過程で、有効成分を添加して製造することができる。１−ケストースの甘味度は３０で、その味質・物性・加工性はショ糖に近いことから、各種飲食物の製造過程において、砂糖の一部または全部を１−ケストースに置き換えるなどして、砂糖と同様に扱って各種飲食物を製造することができる。
【００２３】
本発明の剤等をヒトや動物に対して用いる場合の有効成分の摂取量（投与量）としては、例えば、１日あたり０．０４ｇ／ｋｇ体重以上を挙げることができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。
【００２４】
本発明において、エガセラ属細菌の「菌数を抑制する」とは、生体のいずれかの細胞ないし組織・器官における当該細菌の細胞数の増加を抑制することをいう。
【００２５】
例えば、腸におけるエガセラ属細菌の菌数は、糞便あるいは盲腸内容物（以下、「糞便等」という。）中の当該細菌の菌数と相関していると考えられるため、糞便等の中の当該細菌の菌数を計測することにより、腸においてエガセラ属細菌の菌数が抑制されたか否かを確認することができる。具体的には、例えば、本発明の剤等の摂取前後の糞便等、または、摂取した個体からの糞便等と摂取していない個体からの糞便等とを試料として、エガセラ属細菌に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行って１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）コピー数を計測する。当該細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数と当該細菌の菌数とは相関関係にあるため、１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は、菌数の指標とすることができる。よって、当該細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を計測した結果、摂取後の試料における１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が摂取前よりも小さければ、あるいは、摂取した個体からの試料における１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が摂取していない個体よりも小さければ、本発明の剤等によりエガセラ属細菌の菌数が抑制されたと判断することができる。
【００２６】
エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的なプライマーは、公知の塩基配列に基づいて設計することができる。例えば、後述する実施例１（３）に示すエガセラ属の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列（配列番号１）に基づいて設計することができる。また、エガセラ・レンタの基準株（ＶＰＩ  ０２５５、ＤＳＭ  ２２４３、ＡＴＣＣ  ２５５５９、ＪＣＭ  ９９７９）の全ゲノム塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＰ００１７２６．１から入手可能である（Saunders E et. al., Stand Genomic Sci. 2009 Sep 28;1(2):174-82. doi: 10.4056/sigs.33592.）。当該全ゲノム塩基配列情報においては、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号２）も開示されており、これに基づいて、エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的なプライマーを設計することができる。
【００２７】
また、後述する実施例１（３）に示すように、本発明の剤等の摂取前後の糞便等、または、摂取した個体からの糞便等と摂取していない個体からの糞便等とを試料として、次世代シークエンサーにより試料中の細菌由来１６Ｓ ｒＤＮＡの網羅的解析を行い、エガセラ属の配列（配列番号１）と相同性の高い配列データの存在比率を算出する。当該存在比率は、エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数、すなわち当該細菌の菌数と相関関係にあるといえる。よって、摂取後の試料における当該配列データの存在比率が摂取前よりも小さければ、あるいは、摂取した個体の試料における当該配列データの存在比率が摂取していない個体のものよりも小さければ、本発明の剤等によりエガセラ属細菌の菌数が抑制されたと判断することができる。
【００２８】
上述のとおり、２型糖尿病患者の糞便すなわち腸内には、耐糖能正常者と比較してエガセラ・レンタが多く存在すること、エガセラ・レンタはウロカニン酸からイミダゾールプロピオン酸を生成すること、イミダゾールプロピオン酸は耐糖能およびインスリンシグナル伝達を弱めることが報告されている（非特許文献９）。よって、腸内のエガセラ属細菌の菌数を抑制できれば、２型糖尿病に罹患可能性のある者あるいは２型糖尿病患者におけるイミダゾールプロピオン酸の濃度を抑制できることから、２型糖尿病の予防または治療に寄与できると考えられる。したがって、本発明の剤等は、２型糖尿病を予防または治療する用途に用いることができる。
【００２９】
菌血症は、微生物が血流中に存在する状態として定義される（Herbert M. Transitory bacteremia. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology. 1954;7:609-615.）。菌血症は無症状な一時的な状態である場合もあるが、敗血症などの重篤な状態に進展する場合がある。エガセラ・レンタによる菌血症は、敗血症に進行し（非特許文献２；第１２７８頁第１行目など）、褥瘡性潰瘍、出血や消化管閉塞、消化管穿孔、憩室や膵臓、卵管ないし卵巣における膿瘍といった症状を呈することや、発症した場合には死亡率が２０−３６％と高いことが報告されている（非特許文献８；第４７７頁右欄４．Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ第１−２段落）。腸内のエガセラ属細菌の菌数を抑制できれば、環境中に排泄される菌数や腸から血流に侵入する菌数を抑制できることから、エガセラ属細菌による菌血症の予防または治療に寄与できると考えられる。したがって、本発明の剤等は、菌血症を予防または治療する用途に用いることができる。
【００３０】
また、上述のとおり、エガセラ・レンタは、副鼻腔炎（非特許文献３）、化膿性筋炎（非特許文献４）、皮膚膿瘍（非特許文献５）、脊椎椎間板炎（非特許文献６）および肝膿瘍（非特許文献７）を引き起こす細菌として報告されている（非特許文献１；第６３１頁左欄第２段落、非特許文献８；第４７５頁左欄第２段落）。腸内のエガセラ属細菌の菌数を抑制できれば、これらの感染症の予防または治療に寄与できると考えられる。したがって、本発明の剤等は、副鼻腔炎、化膿性筋炎、皮膚膿瘍、脊椎椎間板炎および肝膿瘍から選択される疾患を予防または治療する用途に用いることができる。
【００３１】
以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。また、本実施例においては、「１−ケストース」として、純度９８質量％以上で１−ケストースを含有する組成物（物産フードサイエンス社）を用いた。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞生体外でのエガセラ属細菌の菌数抑制作用の検討
（１）糞便含有微生物の培養
既報〈Ｅ  Ｏｌａｎｏ−Ｍａｒｔｉｎら、Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ、第８３巻、第２４７−２５５頁、２０００年〉に従って下記の組成の嫌気緩衝液および基本培地を調製した。また、１−ケストース水溶液（終濃度０．５％（ｗ／ｖ）を調製した。嫌気緩衝液、基本培地、１−ケストース水溶液、滅菌水および硝子瓶は窒素ガスで浄化した後、オートクレーブ滅菌を行った。
《嫌気緩衝液の組成／１Ｌあたり》（最終ｐＨ：ｐＨ７．０）
ペプトン１ｇ、塩化ナトリウム８．５ｇ、システイン塩酸塩０．５ｇ。
《基本培地の組成／１Ｌあたり》（最終ｐＨ：ｐＨ７．０）
ペプトン２ｇ、酵母抽出物２ｇ、塩化ナトリウム０．１ｇ、リン酸水素二カリウム０．０４ｇ、リン酸二水素カリウム０．０４ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．０１ｇ、塩化カルシウム二水和物０．０１ｇ、炭酸水素ナトリウム２ｇ、システイン塩酸塩０．５ｇ、胆汁酸塩０．５ｇ、ヘミン０．００５ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ２ｍＬ、フィロキノン１０μＬ、レザズリンナトリウム。
【００３３】
７名の健常者（平均年齢２５．６歳、標準偏差±６．４歳、体格指数（Body Mass Index）範囲２２〜２５）から糞便を採取し、検体１〜７とした。なお、当該健常者は、糞便採取時から以前８週間以上抗生剤を摂取しておらず、糞便採取時から以前２週間以上プレバイオティクスを摂取していない。検体は速やかに嫌気ジャー（アネロパック、三菱ガス化学）に入れ、採取から２時間以内に下記の処理を行った。
【００３４】
各検体から適量を取って培養前検体とし、−８０℃にて凍結保存した。また、残りの各検体を９ｍＬの嫌気緩衝液に入れて１０倍（ｗ／ｖ）に希釈した後、窒素ガスを満たした環境下で２倍濃度の基本培地４０ｍＬを入れた硝子瓶に移した。このうち５ｍＬを、同様の嫌気環境下の硝子瓶にて、等量の１−ケストース水溶液または滅菌水と混合した。これを３７℃で４８時間静置培養した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離を行い、沈殿物を回収して、これを培養後検体とし、−８０℃にて凍結保存した。
【００３５】
（２）総ＤＮＡの抽出
〈Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＰＬｏｓＯＮＥ、第９巻、第８号、ｅ１０５５９２、２０１４年８月：参考文献１〉に記載の方法に従って、本実施例１（１）の培養前検体および培養後検体から総ＤＮＡを抽出した。具体的には、まず、４Ｍのグアニジンチオシアネート、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）および４０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液に、氷上で融解した培養前検体または培養後検体１００ｍｇを懸濁し、FastPrep FP100A(MP Biomedicals)を用いてジルコニアビーズで粉砕して懸濁液を得た。Magtration System 12GC（Precision System Science）およびGC series MagDEA DNA 200（Precision System Science）を用いて、この懸濁液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの濃度を分光測光器ND-1000（NanDrop Technologies）を用いて測定し、１０ｎｇ／μＬとなるように調製して、これを糞便由来総ＤＮＡとした。
【００３６】
（３）糞便中の細菌由来ＤＮＡの網羅的解析
上記参考文献１に記載の方法に従い、本実施例１（１）の培養前後の糞便に含まれる細菌の種類と存在比率の網羅的解析を行った。すなわち、まず、本実施例１（２）の糞便来総ＤＮＡを鋳型として、下記配列番号３および４のユニバーサルプライマーを用いてＤｕａｌ−ｉｎｄｅｘ法（Ｈｉｓａｄａ Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７巻、第７号、第９１９‐３４頁、２０１５年６月）によりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、細菌由来の１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３−Ｖ４領域を増幅した。
フォワードプライマー（３４１ｆ）：ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号３）
リバースプライマー（Ｒ８０６）：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（配列番号４）
【００３７】
続いて、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（Illumina）によりＰＣＲ増幅産物の塩基配列をペアエンド法により解読した。得られた塩基配列データはデータの質（クオリティ）が低いものおよびキメラ配列由来のものを排除した。決定した塩基配列についてデータベースによる検索を行い、同一性が９７％以上で検出される分類群を１菌種（属）として同定した。エガセラ属として同定された配列（１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列）を配列番号１に示す。存在比率は、総リード数に占める各群のリード数の割合を百分率として算出した。なお、クオリティのチェックは参考文献１に、キメラ配列のチェックは〈Robert C. Edgarら、BIOINFORMATICS、第２７巻、１６号、第２１９４−２２００頁、２０１１年６月〉に、データベースによる検索は〈Ｈｉｓａｄａ Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７巻、第７号、第９１９‐３４頁、２０１５年６月〉に、それぞれ記載の方法に準じて行った。この網羅的解析におけるエガセラ属の結果を表１に示す。なお、表１において、存在比率の値は、検体１〜７における平均値である。
【表１】
2020143020.tif 000002
【００３８】
表１に示すように、１−ケストース存在下で培養した場合、エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、培養前検体では０．３０％であったのに対して、培養後検体では０．０７％であり、培養前と比較して１／４．２倍と顕著に減少した。これに対して、１−ケストース非存在下で培養した場合、培養後検体では１．６０％であり、培養前と比較して５．３倍と顕著に増加した。この結果から、１−ケストースの存在下では、糞便中のエガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率が減少することが明らかになった。すなわち、１−ケストースは、生体外においてエガセラ属細菌の菌数を抑制する効果を有することが明らかになった。
【００３９】
＜実施例２＞生体内でのエガセラ属細菌の菌数抑制作用の検討
健常者（２３〜６２歳、男性、体重６０．０〜９８．６ｋｇ）３８名を、ケストース群２０名、プラセボ群１８名の２つの群に分けた。ケストース群には１−ケストースを、プラセボ群にはマルトースを、試験期間中、毎日経口摂取させた。なお、試験期間中、被検者には、１−ケストースまたはマルトースのいずれを摂取しているのか不明な状態とした。試験期間は１２週間、１−ケストースまたはマルトースの１日の摂取量は１０ｇ（約０．１７〜０．１０ｇ／ｋｇ体重／日）とした。試験期間の開始時および終了時に糞便を採取し、−８０℃にて凍結保存した。
【００４０】
採取した糞便から、実施例１（２）に記載の方法により総ＤＮＡを抽出した。続いて、実施例１（３）に記載の方法により糞便中の細菌由来ＤＮＡの網羅的解析を行った。この網羅的解析におけるエガセラ属の結果を表２に示す。なお、表２において、存在比率の値は、各群１８名または２０名における平均値である。また、括弧内に、各群における数値範囲を示す。
【表２】
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【００４１】
表２に示すように、プラセボ群では、エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は試験開始時に０．１００％であったのに対して試験終了時には０．１７９％であり、増加していた。これに対して、ケストース群では、エガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は試験開始時に０．０８９％であったのに対して試験終了時には０．０６７％であり、減少していた。この結果から、１−ケストースの摂取により、糞便中のエガセラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率が減少することが明らかになった。すなわち、１−ケストースは、生体内においてエガセラ属細菌の菌数を抑制する効果を有することが明らかになった。
【配列表】
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