(57)【要約】【課題】水中における色素の発光強度および経時での吸光度の低下抑制、および光照射による退色の抑制により蛍光標識剤として好適に使用できる色素組成物を提供すること。【解決手段】色素と、水溶性樹脂と、水とを含んでなる色素組成物であって、水溶性樹脂が、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、およびアルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）を含有することを特徴とする蛍光標識剤用色素組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素と、水溶性樹脂と、水とを含む蛍光標識剤用色素組成物であって、水溶性樹脂が、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、およびアルキル基を有
する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）を含有することを特徴とする蛍光標識剤用
色素組成物。
【請求項２】
水溶性樹脂の質量平均分子量が１０,０００〜１００,０００であることを特徴とする請求項１記載の蛍光標識剤用色素組成物。
【請求項３】
色素が、フタロシアニン系色素を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光標識剤用色素組成物。
【請求項４】
フタロシアニン系色素が、フタロシアニン基本骨格の６員環上の少なくとも１箇所に原子数３以上の置換基を有し、かつ、２価〜４価の中心金属を有するフタロシアニン系色素を含有することを特徴とする請求項３記載の蛍光標識剤用色素組成物。
【請求項５】
色素が、シアニン系色素を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光標識剤用色素組成物。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の蛍光標識剤用色素組成物を含むことを特徴とする蛍光標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素組成物およびそれを用いた蛍光標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や細胞、組織などを可視化するバイオイメージング法は、生体内分子・細胞機能の解明や創薬の研究等、生物学、医学の研究領域で幅広く活用されている。中でも蛍光色素を用いたバイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、高感度観察が可能なイメージング法である。さらに、近年では、蛍光色素を用いたバイオイメージング法は非侵襲的に診断可能なイメージング法として注目されており、患者への負担が少ない画像診断や手術中のリアルタイム診断など臨床現場における応用が期待されている。
【０００３】
バイオイメージングに用いられる蛍光色素としては、可視光領域に蛍光を発するものが広く使用されているが、この波長領域は細胞や組織の自家蛍光や、吸収・散乱が高いため、深部の観察が困難であった。そこで、より影響を受けにくい７００ｎｍ以上の近赤外領域に蛍光を発する蛍光色素を用いた検討が行われている（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
現在、バイオイメージングに用いられる近赤外蛍光色素としては、インドシアニングリーンなどのシアニン系色素が一般的に知られている。しかしながら、シアニン系色素は水溶液中での蛍光量子収率は数％と極めて低く、また、励起光による退色の懸念がある。
【０００５】
一般的に、バイオイメージングに用いられる蛍光色素は、生体親和性を考慮して水溶性であるが、近赤外領域での蛍光を有する分子構造とするためには、共役系の増大などが必要であるため、分子量は増加傾向となり、そのため、色素間に働く疎水性相互作用が強まり、会合や凝集が生じ易くなる。そして、蛍光量子収率の低下を招く。さらに、近赤外領域では、そのエネルギーレベルが水分子の振動エネルギーに近いことから、周囲に存在する水分子へのエネルギー移動が生じて、蛍光量子収率は低下する。
【０００６】
上記の蛍光色素の欠点を克服するため、様々な技術が提案されている。特許文献１では、ポリマー骨格に蛍光色素を共有結合することで発光強度を向上させる蛍光プローブが提案されている。しかしポリマー骨格へ共有結合にて連結することから製造プロセスやコスト面で手間がかかるといった問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−９５２７３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２０１２  Ａｐｒ７（４），ｅ３６２６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、水中における色素の発光強度および経時での吸光度の低下抑制、および光照射による退色の抑制により蛍光標識剤として好適に使用できる色素組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（A）およびアルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（B）を含有することを特徴とする水溶性樹脂を用いることで、水中における色素の蛍光強度、経時での安定性、および光照射に対する安定性を向上させ得ることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、蛍光色素と水溶性樹脂と、水とを含む蛍光標識剤用色素組成物であって、水溶性樹脂が、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、およびアルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）を含有することを特徴とする蛍光標識剤用色素組成物に関する。
【００１２】
さらに、水溶性樹脂の質量平均分子量が１００００〜１０００００であることを特徴とする上記の近赤外蛍光標識剤用色素組成物に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、蛍光色素が、フタロシアニン系色素を含有する上記の蛍光標識剤用色素組成物に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、フタロシアニン系色素が、フタロシアニン基本骨格の６員環上の少なくとも１箇所に原子数３以上の置換基を融資、かつ、２価〜４価の中心金属を有するフタロシアニン系色素を含有することを特徴とする上記の蛍光標識剤用色素組成物に関する。原子数３以上の置換基を有し、かつ３価または４価の中心金属を有するフタロシアニン系色素を含有する上記蛍光標識剤用色素組成物に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、蛍光色素が、シアニン系色素を含有することを特徴とする上記蛍光標識剤用色素組成物に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、上記の蛍光標識剤用色素組成物を含むことを特徴とする蛍光標識剤に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、高い蛍光強度、経時での安定性、および光照射に対する安定性を有する色素組成物を用いた蛍光標識剤を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試験例１における蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】試験例２における蛍光スペクトルを示す図である。
【図３】試験例３における蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】試験例４における蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】試験例１および試験例３における蛍光スペクトルを示す図である。
【図６】試験例２および試験例４における蛍光スペクトルを示す図である。
【図７】色素組成物の安定性評価における吸収スペクトルを示す図である。
【図８】色素組成物の安定性評価における吸収スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態に関わる蛍光標識剤用色素組成物は、色素と、水溶性樹脂と、水とを含む。そして、水溶性樹脂は、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（A
）、およびアルキル基を有する樹合成不飽和単量体由来の構成単位（B）を有することを
特徴としている。
【００２１】
本発明では、このように、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、および、アルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）を含有する水溶性樹脂を用いることで、色素からの蛍光強度が増加し、なおかつ、経時での安定な蛍光発光および光照射に対する色素の劣化抑制が可能な色素組成物が得られる。
【００２２】
（水溶性樹脂について）
まず、本発明の水溶性樹脂の構成成分であるイオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、およびアルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）について説明する。
【００２３】
なお、本願では、「（メタ）アクリロイル」、「（メタ）アクリル」、「（メタ）アクリル酸」、「（メタ）アクリレート」、及び「（メタ）アクリロイルオキシ」と表記した場合には、特に説明がない限り、それぞれ、「アクリロイル及び／又はメタクリロイル」、「アクリル及び／又はメタクリル」、「アクリル酸及び／又はメタクリル酸」、「アクリレート及び／又はメタクリレート」、及び「アクリロイルオキシ及び／又はメタクリロイルオキシ」を表すものとする。
【００２４】
イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）におけるイオン性官能
基としては、カチオン性基、および、アニオン性基からなる群より選ばれる少なくとも１種のイオン性官能基を表す。カチオン性基としては、３級アミノ基、および、４級アンモニウム塩基が挙げられ、アニオン性基としては、カルボキシル基、スルホ基、および、リン酸基が挙げられる。
【００２５】
イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体は、１種でもよく、２種以上であってもよい。
【００２６】
カチオン性基を有する重合性不飽和単量体としては、具体的には、  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチル（メタ）アクリレートなどのＮ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクレート；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドなどのＮ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミドのような３級アミノ基含有重合性不飽和単量体；
（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルオクチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルオクチルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルドデシルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルドデシルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルヘキサデシルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルオクチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルオクチルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルドデシルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルドデシルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジエチルヘキサデシルアンモニウムブロマイド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルオクチルアンモニムクロライド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルオクチルアンモニムブロマイド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルドデシルアンモニムクロライド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルドデシルアンモニムブロマイド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルヘキサデシルアンモニムクロライド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルヘキサデシルアンモニムブロマイド、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルエチルアンモニウムエチルスルフェー卜、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート、（メタ）アクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、（メタ）アクリロイルアミノプロピルジメチルエチルアンモニウムエチルスルフェー卜、（メタ）アクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネートのような４級アンモニウム塩基含有重合性不飽和単量体；
【００２７】
中でも、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の３級アミノ基含有重合性不飽和単量体、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルジメチルエチルアンモニウムエチルスルフェー卜等の４級アンモニウム塩基含有重合性不飽和単量体が好ましく、その中でも４級アンモニウム塩基含有重合性不飽和単量体が更に好ましい。その中でも、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドが最も好ましい。
【００２８】
４級アンモニウム塩基含有樹脂は３級アミノ基含有重合性不飽和モノマーを重合した後、塩化メチルなどのハロゲン化アルキル、ベンジルクロライドなどのベンジルハライド、エピクロロヒドリン、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などのアルキル化剤を用いて４級化反応により合成してもよいし、モノマーの状態で４級化したものを重合して合成してもよい。中でも、モノマーの状態で４級化したものを重合して得られる４級アンモニウム塩基含有樹脂が好ましい。
【００２９】
アニオン性基を有する重合性不飽和単量体としては、具体的に、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、ナジック酸、メチルナジック酸、ハイミック酸、アンゲリカ酸、テトラヒドロフタル酸、ソルビン酸又はメサコン酸などの炭素数３〜１０のα，β−不飽和カルボン酸；
２−アクリロイルオキシエチルコハク酸、２−アクリロイルオキシエチルフタル酸、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸又は２−メタクリロイルオキシエチルフタル酸などのカルボン酸基含有重合性不飽和単量体；
ビニルスルホン酸及びその塩類、アリルスルホン酸及びその塩類、メタリルスルホン酸及びその塩類、スチレンスルホン酸及びその塩類、α−メチルスチレンスルホン酸及びその塩類、メタリルオキシベンゼンスルホン酸及びその塩類、アリルオキシベンゼンスルホン酸及びその塩類、アクリルアミド−ｔ−ブチルスルホン酸及びその塩類、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸及びその塩類、シクロブテン−３−スルホン酸及びその塩類、イソプレンスルホン酸及びその塩類、１，３−ブタジエン−１−スルホン酸及びその塩類、１−メチル−１，３−ブタジエン−２−スルホン酸及びその塩類、１−メチル−１，３−ブタジエン−４−スルホン酸及びその塩類、アクリル酸エチルスルホン酸及びその塩類、アクリル酸プロピルスルホン酸及びその塩類、アクリル酸ブチルスルホン酸及びその塩類、メタクリル酸エチルスルホン酸及びその塩類、メタクリル酸プロピルスルホン酸及びその塩類、メタクリル酸ブチルスルホン酸及びその塩類、メタクリル酸フェニレンスルホン酸及びその塩類、メタクリル酸ナフタレンスルホン酸及びその塩類、アリル酸エチルスルホン酸及びその塩類、アリル酸ブチルスルホン酸及びその塩類、４−ペンテン酸エチルスルホン酸及びその塩類、４−ペンテン酸プロピルスルホン酸及びその塩類、４−ペンテン酸ブチルスルホン酸及びその塩類、４−ペンテン酸フェニレンスルホン酸及びその塩類、４−ペンテン酸ナフタレンスルホン酸及びその塩類等のようなスルホ基含有重合性不飽和単量体；
ビニルホスホン酸、ビニルホスフェート、アシッドホスホキシエチル（メタ）アクリレート等のリン酸基含有重合性不飽和単量体が挙げられる。
【００３０】
中でも、工業上の入手性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、２−メタクリロイロキシエチルコハク酸、２−アクリロイロキシエチル-コハク酸、２−アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−メタクロイロキシエチルアシッドホスフェート、２−アクリロイルオキシエチルアシッドフォスフェート、および、ビニルスルホン酸、アクリルアミドt-ブチルスルホン酸が好ましい。
【００３１】
本発明の色素組成物は、含有する水溶性樹脂を形成するためのイオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（A）におけるアクリル酸や、前記した別途導入されるアニオン性官能基を有する単量体をイオン化することで、色素との親和性を向上することができる。このために、色素組成物中の水溶性樹脂が中性又はアルカリ性に調整されたものであることが好ましく、７〜１０のｐＨ範囲とするのが好ましい。この際に使用されるｐＨ調整剤（中和剤）としては、下記のものが挙げられる。例えば、アンモニア水、ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン等の各種有機アミン、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物等の無機アルカリ剤、有機酸や鉱酸等を使用することができる。ｐＨ調製剤として好ましくは、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム、エタノールアミン、トリイソプロパノールアミンが挙げられる。水溶性樹脂は、pH調製剤を用いて中和、水性化することで、水性液媒体中に分散又は溶解されたものが好ましい。
【００３２】
次に、アルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（B）について説明する。
アルキル基としては、置換基を有してもよい、直鎖、分岐、または、環状のいずれでも良い。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、アミル基、イソアミル基、ヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、デシル基、ドデシル基、ステアリル基、などの直鎖および分岐アルキル基、シクロヘキシル基、などの環状アルキル基が挙げられる。
【００３３】
具体的なアルキル基を有する重合性不飽和単量体としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｓ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、イソアミル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、イソヘプチル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレートウンデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、トリデシル（メタ）アクリレート、テトラデシル（メタ）アクリレート、ペンタデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ヘプタデシル（メタ）アクリレート、オクタデシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレートなどの直鎖、および分岐アルキル（メタ）アクリレート；シクロヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘプチル（メタ）アクリレートなどの環状アルキル（メタ）アクリレートが挙げられる。これらの（メタ）アクリル系単量体は１種又は２種以上使用できる。
【００３４】
アルキル基を有する重合性不飽和単量体のうち、炭素数５〜２０、特に１０〜１８の直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を有する（メタ）アクリレートが好ましい。
【００３５】
イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、および、アルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）の割合としては、単量体（Ａ）／単量体（Ｂ）＝１／９〜９／１であることが好ましく、単量体（Ａ）／単量体（Ｂ）＝１／４〜４／１であることがさらに好ましい。単量体（Ａ）／単量体（Ｂ）の比率が１／９より少ないと共重合体の親水性が低くなり、水への溶解性が低下する傾向がある。また、単量体（Ａ）／単量体（Ｂ）の比率が９／１より多いと、樹脂の親水基が増加することで色素との親和性が低下することによって、蛍光強度が低下する傾向がある。
また、水溶性樹脂中、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）の含有率は、１０〜８０質量％が好ましく、２０〜５０質量％がより好ましい。水溶性樹脂中、アルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）の含有率は、１０〜９０質量％が好ましく、２０〜８０質量％がより好ましい。
【００３６】
水溶性樹脂を調製するにあたり、他に使用することができる重合性不飽和単量体としては、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体、および、アルキル基を有する重合性不飽和単量体と重合可能な不飽和単量体であれば特に限定されず、用途に応じて適宜選択することができる。例えば、
【００３７】
トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、オクタフルオロペンチル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、又はテトラフルオロプロピル（メタ）アクリレート等のフルオロアルキル（メタ）アクリレート類；テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、又は３−メチル−３−オキセタニル（メタ）アクリレート等の複素環を有する（メタ）アクリレート類；
【００３８】
ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、パラクミルフェノキシエチル（メタ）アクリレート、パラクミルフェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、又はノニルフェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等の芳香族環を有する（メタ）アクリレート類；
【００３９】
2-ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、3-ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、4-ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４-ヒドロキシビニルベンゼン、２−ヒドロキシ-3-フェノキシプロピルアクリレートまたはこれらモノマーのカプロラクトン付加物（不可モル数は１〜５）等の水酸基を有する（メタ）アクリレート類；
【００４０】
メトキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ラウロキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ステアロキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、フェノキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、フェノキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル(メタ)アクリレート、ラウロキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ノニルフェノキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ノニルフェノキシポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ノニルフェノキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、フェノキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、ｎ −ブトキシエチル(メタ)アクリレート、ｎ −ブトキシジエチレングリコール(メタ)アクリレート、２ −メトキシエチル(メタ)アクリレート、２ −エトキシエチル(メタ)アクリレート等のエーテル基を有する（メタ）アクリレート類；
【００４１】
３−（アクリロイルオキシメチル）３−メチルオキセタン、３−（メタクリロイルオキシメチル）３−メチルオキセタン、３−（アクリロイルオキシメチル）３−エチルオキセタン、３−（メタクリロイルオキシメチル）３−エチルオキセタン、３−（アクリロイルオキシメチル）３−ブチルオキセタン、３−（メタクリロイルオキシメチル）３−ブチルオキセタン、３−（アクリロイルオキシメチル）３−ヘキシルオキセタン及び３−（メタクリロイルオキシメチル）３−ヘキシルオキセタン等のオキセタニル基を有する（メタ）アクリレート類；
【００４２】
スチレン、α−メチルスチレン、酢酸ビニル、（メタ）アクリル酸ビニル、又は（メタ）アクリル酸アリル等のビニル類；
【００４３】
（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド、又はアクリロイルモルホリン等のＮ置換型（メタ）アクリルアミド類；
（メタ）アクリロニトリル等のニトリル類；
【００４４】
エチルビニルエーテル、ｎ−プロピルビニルエーテル、イソプロピルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、又はイソブチルビニルエーテル等のエーテル基を有するビニルエーテル類；などが挙げられる。
【００４５】
その他の重合性単量体としては、色素との親和性の観点から、芳香族環を有する（メタ）アクリレート類およびビニル類が好ましい。
【００４６】
水溶性樹脂の重量平均分子量（ポリスチレン換算）は、１０，０００〜１００，０００であることが好ましく、１０，０００〜３０，０００であることがより好ましい。本明細書において重量平均分子量とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により測定されたポリスチレン換算分子量を示す。
【００４７】
水溶性樹脂は、公知の方法、例えば、アクリルの溶液重合で合成することができる。重合時には、水溶性溶剤に溶解しており、水性媒体中に分散または溶解させるためには、以下の方法がある。
（１）１つ目の方法としては、水と共沸する水溶性溶剤中で重合し、その後、水を加えて、溶剤を水と共沸させ、脱溶剤し、最終的には溶媒は完全に水のみとする。
（２）２つ目の方法としては、最終的に、色素組成物に含まれる水溶性溶剤を合成溶媒として重合する。その後、合成溶媒は取り除くことをせず、そのまま分散処理を行う。
【００４８】
一つ目の方法の合成溶媒としては、水と共沸するものであれば良いが、水溶性樹脂に対し溶解性の高いものが良く、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノールがあり、さらに好ましくは１−ブタノールがある。
二つ目の方法の合成溶媒としては、最終的に色素組成物に含まれる水溶性溶剤であれば良いが、水溶性樹脂に対し溶解性の高いものが良く、好ましくはグリコールエーテル類、ジオール類、さらに好ましくは（ポリ）アルキレングリコールモノアルキルエーテル、炭素数３〜６のアルカンジオール類が良い。
【００４９】
具体的には、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノプロピルエーテル、トリエチレングリコールモノプロピルエーテルが挙げられる。より好ましくは、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテルである。
【００５０】
つまり、本実施形態に関わる蛍光標識剤用色素組成物の中には、水溶性樹脂を合成した際の水溶性溶剤を含むことも可能である。
【００５１】
水溶性樹脂の重合開始剤としては、重合時に使用する溶剤に溶解する重合開始剤であれば特に限定はない。通常の過酸化物またはアゾ化合物、例えば、過酸化ベンゾイル、アゾイソブチルバレノニトリル、アゾビスイソブチロニトリル、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、ｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔ−ブチルペルオクトエート、クメンヒドロキシペルオキシドなどが用いられ、重合温度は、好ましくは５０〜１４０℃、さらに好ましくは７０〜１４０℃である。
【００５２】
水溶性樹脂は重合後、並びに、水性媒体中に分散溶解させた後に、精製することで系中に残留するモノマー、重合開始剤、および溶剤種を除去し精製することも可能である。また、イオン交換樹脂とスラリー洗浄することや、樹脂を溶解可能な溶剤に希釈後に、樹脂に対して貧溶媒中に添加し、沈殿物を得ることで精製することが可能である。好ましい精製方法としては、重合後の水溶性樹脂を加温条件で減圧することによりモノマー成分を除去し、その後、水中で樹脂を析出した後真空乾燥を行った後に、ｐＨ調製剤を加え水中に溶解することで水溶性樹脂を得ることが、細胞などの蛍光標識剤として使用する上では好ましい。
【００５３】
（色素）
本発明における色素とは、光照射によって可視光領域から近赤外領域にかけて蛍光発光が可能な色素である。例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロリン系色素分子、ピロメセン系色素分子、フタロシアニン系色素分子、さらに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製） 系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製） 系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ （登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子や蛍光タンパク質などに分類することができる。
【００５４】
フタロシアニン系色素分子の具体例としては、下記一般式（１）に示す構造を有し得る。
【００５５】
一般式（１）
【化１】
2020177014.tif 000003
【００５６】
一般式（１）中、
Ｒ１〜Ｒ１６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、−ＣＯＯＭ１、−ＳＯ３Ｍ１、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい複素環基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいアルキルチオ基、もしくは置換基を有してもよいアリールチオ基である。Ｒ１〜Ｒ１６は、隣接する基同士が互いに連結して環を形成してもよい。Ｍ１は、水素原子、またはアルカリ金属を表す。Ｒ１〜Ｒ１６の内の少なくとも一つは、原子数３以上の基であることが好ましい。つまり、本フタロシアニン系色素は、フタロシアニンを構成するイソインドールユニットの４〜７位のうちの少なくとも１箇所に原子数３以上の置換基を有することが好ましい。Ｍは、２価〜４価の金属原子を表し、３価または４価であることが好ましい。
【００５７】
Ｚは、水酸基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１７Ｒ１８、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１９、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｒ２０、または−ＯＳｉＲ２１Ｒ２２Ｒ２３を表す。Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルコキシ基、または置換基を有してもよいアリールオキシ基を表す。Ｒ１９は、水素原子、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ２０は、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ２１〜Ｒ２３は、それぞれ独立に、置換基を有してもよいアルキル基、または置換基を有してもよいアリール基を表す。ｎは０〜２の整数を表し、Ｍが２価の金属原子である場合は０、Ｍが３価の金属原子である場合は１、Ｍが４価の金属原子である場合は２である。）
【００５８】
アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２−エチルヘキシル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は１〜３０の範囲内であることが好ましく、１〜２０の範囲内であることがより好ましい。
【００５９】
上記アルキル基における置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、カルボキシル基等の他、後述するアリール基、シクロアルキル基、および複素環基が挙げられる。また本開示においては、骨格構造の一部がエステル結合（−ＣＯＯ−）やエーテル結合（−Ｏ−）で置換されている場合、その置換部分も「置換基」として含めるものとする。
【００６０】
したがって、置換アルキル基としては、上記の置換基で置換されたアルキル基を意味する。アルキル基は１つまたは２つ以上の置換基で置換され得る。例えば、ハロゲン原子で置換されたアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、−（ＣＦ２）４ＣＦ３、−（ＣＦ２）５ＣＦ３、−（ＣＦ２）６ＣＦ３、−（ＣＦ２）７ＣＦ３、−（ＣＦ２）８ＣＦ３、トリクロロメチル基、２，２−ジブロモエチル基等を挙げることができる。
【００６１】
エステル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−(ＣＨ２)５−ＣＯＯ−（ＣＨ２）１１−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−(
ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３) ２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましく、２〜２０の範囲内であることがより好ましい。
【００６２】
エーテル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３−、−ＣＨ２−ＣＨ−（ＯＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましく、２〜２０の範囲内であることがより好ましい。
【００６３】
エステル結合（−ＣＯＯ−）およびエーテル結合（−Ｏ−）で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３を挙げることができる。エステル結合およびエーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、３〜３０の範囲内であることが好ましく、３〜２０の範囲内であることがより好ましい。
【００６４】
シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロへキシル基、２，５−ジメチルシクロペンチル基、４−ｔｅｒｔ−プチルシクロヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキル基の炭素数は５〜１２の範囲内であることが好ましい。置換シクロアルキル基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。
【００６５】
アルケニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。本開示においては複数の二重結合を有するものもアルケニル基に含めるものとする。具体例としては、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソプロペニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、１，３−ブタジエニル基等を挙げることができる。アルケニル基の炭素数は２〜１８の範囲内であることが好ましい。置換アルケニル基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。
【００６６】
アリール基としては、単環または縮合多環のアリール基が挙げられる。具体例としては、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−ビフェニル基、ｍ−ビフェニル基、２−アントリル基、９−アントリル基、２−フェナントリル基、３−フェナントリル基、９−フェナントリル基、２−フルオレニル基、３−フルオレニル基、９−フルオレニル基、１−ピレニル基、２−ピレニル基、３−ペリレニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、４−メチルビフェニル基、ターフェニル基、４−メチル−１−ナフチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ナフチル基、４−ナフチル−１−ナフチル基、６−フェニル−２−ナフチル基、１０−フェニル−９−アントリル基、スピロフルオレニル基、２−ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６〜１８の範囲内であることが好ましい。置換アリール基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。
【００６７】
アルコキシ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−３−ペンチルオキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２−エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシ基の炭素数は１〜１０の範囲内であることが好ましく、１〜７の範囲内であることがより好ましい。
【００６８】
置換アルコキシ基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。置換アルコキシ基の具体例としては、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ基、２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロポキシ基、２−エトキシエトキシ基、２−ブトキシエトキシ基、２−ニトロプロポキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００６９】
アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ−メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６〜１２のアリールオキシ基が好ましい。
【００７０】
置換アリールオキシ基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。置換アリールオキシ基の具体例としては、ｐ−ニトロフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、２，４−ジクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２−メチル−４−クロロフェノキシ基等が挙げられる。
【００７１】
アルキルチオ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキルチオ基が挙げられる。具体例としては、上述したアルコキシ基における酸素原子を硫黄原子に置き換えたものが挙げられる。
アルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ブチルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、デシルチオ基、ドデシルチオ基、オクタデシルチオ基、メトキシエチルチオ基、アミノエチルチオ基、ベンジルアミノエチルチオ基、メチルカルボニルアミノエチルチオ基、フェニルカルボニルアミノエチルチオ基などが挙げられる。アルキルチオ基の炭素数は１〜６の範囲内であることが好ましい。
【００７２】
置換アルキルチオ基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。置換アルキルチオ基の具体例としては、上述した置換アルコキシ基における酸素原子を硫黄原子に置き換えたものが挙げられる。
【００７３】
アリールチオ基としては、単環または縮合多環のアリールチオ基が挙げられる。具体例としては、上述したアリールオキシ基における酸素原子を硫黄原子に置き換えたものが挙げられる。アリールチオ基としては、フェニルチオ基、１−ナフチルチオ基、２−ナフチルチオ基、９−アンスリルチオ基、クロロフェニルチオ基、トリフルオロメチルフェニルチオ基、シアノフェニルチオ基、ニトロフェニルチオ基、２−アミノフェニルチオ基、２−ヒドロキシフェニルチオ基などが挙げられる。その中でも単環のアリールチオ基が好ましい。また、炭素数６〜１２のアリールチオ基が好ましい。
【００７４】
置換アリールチオ基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。置換アリールチオ基の具体例としては、上述した置換アリールオキシ基における酸素原子を硫黄原子に置き換えたものが挙げられる。
【００７５】
複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数は、４〜１２であることが好ましい。環員数は、５〜１３であることが好ましい。
【００７６】
【化２】
2020177014.tif 000004
【００７７】
置換複素環基の置換基としては、アルキル基について上述したものと同じ置換基が挙げられる。置換複素環基の具体例としては、３−メチルピリジル基、Ｎ−メチルピペリジル基、Ｎ−メチルピロリル基等が挙げられる。
【００７８】
Ｍ１のアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム等が挙げられる。
【００７９】
中心金属であるＭの例としては、Ｍｇ、Ｚｎ、Ａｌ、およびＳｉが挙げられる。
【００８０】
ローダミン系色素分子の具体例としては、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ） 、テキサスレッド（ＴｅｘａｓＲｅｄ）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＬＤ７００ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１５などが挙げられる。
【００８１】
スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ６８０−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｂｉｓ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｂｉｓ、２−（４−（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（４−（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，２，３，５，６，７−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−９−ｙｌ）−４−（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，３，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ−９（５Ｈ）−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、などが挙げられる。
【００８２】
シアニン系色素分子の具体例としては、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３ｅｉｔｉ−ｉｎｄｏｌｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｃｈｌｏｒｏ−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、 −Ｅｔｈｙｌ−２−［５−（３−ｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−３−ｉｕｍｉｏｄｉｄｅ、などが挙げられる。
【００８３】
芳香族炭化水素系色素分子の具体例としては、Ｎ,Ｎ−Ｂｉｓ−（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４：９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４，９，１０−ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３,４,９,１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉcａｃｉｄ、２，１０−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ、２，１０−Ｂｉｓ（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ,３，３'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ
、１７−ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２−ｃｄｅ−］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−５−１０−Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ,５，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−５,１０−ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２−ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−１６,１７−ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ,４，４'，４''，４'''−[[２，９−ｂｉｓ[２，６−ｂｉｓ(１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]−１, ３, ９, −ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、４，４'，４''，４'''−［［２，９−ｂｉｓ［２，６−ｂｉｓ（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−１, ３, ９,１０−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−］、などが挙げられる。
【００８４】
オキサジン系色素分子の具体例としては、Ｃｒｅｓｙｌｖｉｏｌｅｔ、Ｏｘａｚｉｎｅ１７０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＮｉｌｅＢｌｕｅなどが挙げられる。
【００８５】
カルボピロリン系色素分子の具体例としては、ＣＡＲＢＯＰＹＲＯＮＩＮ１４９などが挙げられる。
【００８６】
ジピロメテン（ピロメセン）系色素分子の具体例としては、ＰＹＲＲＯＭＥＴＨＥＮＥ６５０などが挙げられる。
【００８７】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０など（以上インビトロジェン社製）が挙げられる。
【００８８】
ＢＯＤＩＰＹ系色素分子（主にジピロメテン骨格を有する）の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹＴＲ、ＢＯＤＩＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）などが挙げられる。
【００８９】
Ｃｙ系色素分子の具体例としては、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（以上ＧＥヘルスケア社製）やインドシアニングリーンなどが挙げられる。
【００９０】
ＤＹ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＤＹ−５９０、Ｄ
Ｙ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３４（以上ＤＹＯＭＩＣＳ社製）などが挙げられる。
【００９１】
ＨｉＬｙｔｅ系色素分子の具体例としては、ＨｉＬｙｔｅ５９４、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒＴＲ（以上アナスペック社製）などが挙げられる。
【００９２】
ＤｙＬｉｇｈｔ系色素分子（主にローダミン骨格を有する） の具体例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３（以上サーモサイエンティフィック社製） などが挙げられる。
【００９３】
ＡＴＴＯ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６５５など（以上ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）が挙げられる。
【００９４】
ＭＦＰ系色素分子の具体例としては、ＭＦＰ５９０、ＭＦＰ６３１（以上Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）などが挙げられる。
【００９５】
その他色素としては、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＡＰＣ−ＸＬ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ６３７（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）、等が挙げられる。
【００９６】
蛍光タンパク質の例としては、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＥＧＦＰなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
上記色素の中でも、色素が光を吸収して、近赤外領域である７００ｎｍ以上に蛍光極大波長を持つ近赤外蛍光色素が好ましい。
【００９８】
そのような近赤外蛍光色素としては、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スクアリリウム系色素、ローダミン系色素およびＢＯＤＩＰＹ系色素などを好適に用いることができる。その中でも、フタロシアニン系色素が好ましい。これらの色素は一種類のみを使用してもよく、二種類以上を混合して使用してもよい。
【００９９】
特に好ましいフタロシアニン系色素の具体例として下記のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）
【化３】
2020177014.tif 000005
【０１０１】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）
【化４】
2020177014.tif 000006
【０１０２】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−３）
【化５】
2020177014.tif 000007
【０１０３】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−４）
【化６】
2020177014.tif 000008
【０１０４】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−５）
【化７】
2020177014.tif 000009
【０１０５】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−６）
【化８】
2020177014.tif 000010
【０１０６】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−７）
【化９】
2020177014.tif 000011
【０１０７】
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−８）
【化１０】
2020177014.tif 000012
【０１０８】
（蛍光標識剤用色素組成物の構成割合）
本発明における色素組成物は、上記の色素と、上記の水溶性樹脂と、水とを含む。そして色素は、水溶性樹脂を含む水溶液中で可溶化もしくは分散された状態で存在する。色素の濃度は特に限定されないが、例えば、細胞を扱う場合、細胞の機能障害や増殖阻害などへの影響を考量すると、色素の濃度は低い方が好ましく、色素の濃度は１００μＭ以下であることが好ましい。ただし、色素の濃度が低過ぎると、蛍光を認識することが難しいため、１μＭ以上であることが好ましい。また同様に、水溶性樹脂の濃度も低い方が好ましく、水溶性樹脂の量は、色素に対して５００倍質量部以下が好ましく、２００倍質量部以下がより好ましく、１００倍質量部以下がさらに好ましい。ただし、水溶性樹脂の量が少な過ぎると、蛍光色素の会合や凝集が生じる恐れがあるため、色素に対して１０倍質量部以上の量であることが好ましい。
【０１０９】
（蛍光標識剤用色素組成物の作製方法）
本発明における色素組成物の作製方法は、特に限定されないが、例えば、色素と水溶性樹脂を有機溶媒中に溶解した後、有機溶媒を留去し、水に再溶解させる方法、あるいは色素と水溶性樹脂を有機溶媒に溶解した溶液に水を注入し、有機溶媒を留去する方法などを挙げることができる。
【０１１０】
前者の方法では、有機溶媒の留去が容易であり、色素と水溶性樹脂の濃度も比較的容易に見積もることができるといった利点がある。有機溶媒の留去には、エバポレーターなどによる減圧留去装置が好適に用いられる。溶媒留去時の温度は、１５℃から有機溶媒の沸点温度の範囲で任意に設定することができる。水に再溶解させるときは、プロペラ撹拌機、タービン撹拌機、ボルテックスミキサー、撹拌子を用いたマグネティックスターラーによる撹拌、あるいは超音波照射装置による分散などが好適に用いられる。また、コロイドミルなどを併用してもよい。
【０１１１】
後者の方法では、樹脂由来のミセル粒子を均一に調製し易いといった利点がある。有機溶媒に溶解した溶液に水を注入するとき、溶液は撹拌あるいは超音波照射した状態とし、水を短時間で注入することが好ましい。撹拌は上記と同様の装置で行うことができる。水注入時の温度は、１５℃から有機溶媒の沸点より５℃低い温度の範囲で任意に設定することができる。有機溶媒の留去は、撹拌あるいは超音波照射した状態で常圧の下に留去する方法、あるいはエバポレーターなどにより減圧留去する方法が好ましい。溶媒留去時の温度は、１５℃から有機溶媒の沸点温度の範囲で任意に設定することができる。
【０１１２】
上記の作製方法で使用される有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類、ヘキサン、シクロへキサン、およびヘプタンなどの炭化水素類、アセトンおよびメチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテルおよびテトラヒドロフランなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、およびトリクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼンおよびトルエンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチルおよび酢酸ブチルなどのエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびＮ−メチル−２−ピロリドンなどの非プロトン性極性溶媒類、あるいはピリジン誘導体を挙げることができる。これらの溶媒は、単独で使用してもよく、混合して使用してもよい。
また、上記方法にて作製した組成物を透析にかけることで、有機溶媒を完全に除去してもよい。
【０１１３】
上記の作製方法で使用される水としては、イオン交換水、蒸留水、あるいは超純水を挙げることができる。細胞を扱う場合は、生理条件に近づけるために水に塩を加えた生理食塩水、さらにリン酸緩衝剤を加えたリン酸緩衝生理食塩水などを好適に用いることができる。
【０１１４】
（蛍光標識剤）
本発明の蛍光標識剤の用途は特に限定されないが、例えば、タンパク質や生体内の低分子化合物を蛍光ラベルすることで、生体内での挙動を可視化することが挙げられる。
この用途の場合、近赤外蛍光色素と水溶性樹脂からなる粒子に、ターゲット分子に結合する物質を修飾することが好ましい。ターゲット分子に結合する物質としては、ターゲット分子と特異的に結合する一次抗体、その一次抗体に結合する二次抗体、アビジン、ビオチン、あるいは糖鎖などが挙げられる。
【実施例】
【０１１５】
＜色素の合成例＞
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）の合成例］
３−ニトロフタロニトリル１０部および２，４−ジメチル−３−ペンタノール７．４部をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７０部に溶解し、この溶液に、別途調製したｔ−ブトキシナトリウム６．１部およびＤＭＦ４０部を含む溶液を、０℃以下の温度で滴下した。更に、８０％酢酸４．８部および塩酸１７．５部を加えた。更に、水７０部を滴下して生じた結晶を濾別し、得られた結晶を水で洗浄した後に乾燥して、３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を得た。キノリン６８部および無水塩化アルミニウム２．２部の溶液にアンモニアガスを導入し、上記で得られた３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を加えた。１８０℃に加熱して２時間反応した。これを室温（２５℃）まで冷却し結晶を析出させた。生じた結晶を濾別し、結晶を４７％メタノール水溶液で洗浄した後に乾燥して、アルミニウムフタロシアニン中間体１０．３部を得た。このアルミニウムフタロシアン中間体１部を、２−ブタノン１０部中で、トリフェニルシラノール０．２５部およびトリエチルアミン０．１４部と４５℃で２時間反応させた。生じた析出物を濾別し、得られた濾液にアセトンを２０部加え、さらにイオン交換水１５部を滴下することにより、結晶を析出させた。析出した結晶を濾別し、６６％アセトン水溶液１５部で洗浄した後に乾燥して、０．７部のフタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）を得た。フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）の構造は上記に示した通りである。
【０１１６】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）の合成例］
濃硫酸９．２部、２５％発煙硫酸５．５部の混合溶液にフタロシアニン色素化合物（D−１）を１部加え、５０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を冷却後、８０部の氷に反応液を添加し、析出した沈澱を濾別した。さらに、テトラヒドロフラン５０部に濾別した固体を懸濁させ、再度沈澱を濾別して、テトラヒドロフラン５０部で洗浄後、乾燥して、０．５部の粗製物を得た。粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー(アセトニトリル/水＝４/１)で精製した。０．４部のフタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）を得た。フタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）の構造は上記に示した通りである。
【０１１７】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−３）の合成例］
スルホラン１２０部、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）１４部に４−（２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロピル）オキシ−１，３−ジイミノイソインドリン１０部および四塩化珪素５部を加え、１６０〜１７０℃で８時間加熱撹拌後、冷却し、３５％塩酸８０部と水１５００部の混合溶液に注入撹拌し、８０℃で２時間加熱撹拌した。その後、析出した沈澱を濾別して、メタノール：水（質量比４：１）混合溶液で洗浄後、乾燥して、粗製シリコンフタロシアニン中間体１０部を得た。
この粗製シリコンフタロシアニン中間体を濃硫酸２５０部に溶解した後、氷水２０００部に注入し、析出した沈澱を濾別して、水洗後、乾燥して、シリコンフタロシアニン中間体９部を得た。この中間体５部をピリジン１００部、トリ−ｎ−ブチルアミン２５部に撹拌溶解した後、冷却しながらクロロジフェニルホスフィン１０部を加え、１１０℃で２時間加熱撹拌した後、冷却し、氷水１０００部中に注入した。析出した沈澱を濾別し、水洗後、乾燥して、フタロシアニン色素化合物（Ｄ−３）４部を得た。
【０１１８】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−４）の合成例］
脱水ＴＨＦを３０部と３−ニトロフタロニトリルを２．６部、ジエチレングリコールモノメチルエーテルを４．５部入れ、テトラヒドロフラン１５部にｔ−ブトキシナトリウムを１．６部懸濁させた懸濁液を系内を１０℃以下に保持した上で、滴下ロートにて添加し、その後室温まで昇温し３時間反応させた。エバポレーターにより反応液中のテトラヒドロフランを除去し、メタノールでカラム精製を行い、中間体である、フタロニトリルの３位にジエチレングリコール鎖が置換した化合物を２．２部 (収率７７％)で得た。
次に、フタロニトリルの３位にジエチレングリコール鎖が置換した化合物を２．２部、ジアザビシクロウンデセンを０．８６部、塩化マグネシウムを０．１２部、１-ペンタノールを１６部入れ、６時間加熱還流した。冷却後、メタノールおよび酢酸エチルでカラム精製を行い、粘性のフタロシアニン色素化合物（Ｄ−４）０．７部を得た。
【０１１９】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−５）の合成例］
３−ニトロフタロニトリル１０部および２，４−ジメチル−３−ペンタノール７．４部をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７０部に溶解し、この溶液に、別途調製したｔ−ブトキシナトリウム６．１部およびＤＭＦ４０部を含む溶液を、０℃以下の温度で滴下した。更に、８０％酢酸４．８部、塩酸１７．５部を加えた。更に、水７０部を滴下して生じた結晶を濾別し、得られた結晶を水で洗浄した後に乾燥して、３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を得た。
キノリン６８部及び無水塩化アルミニウム２．２部の溶液にアンモニアガスを導入し、上記で得られた３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を加えた。１８０℃に加熱して２時間反応した。これを室温（２５℃）まで冷却し結晶を析出させた。生じた結晶を濾別し、結晶を４７％メタノール水溶液で洗浄した後に乾燥して、アルミニウムフタロシアニン中間体１０．３部を得た。
このアルミニウムフタロシアン中間体１部を、２−ブタノン１０部中で、ジメチルフェニルクロロシラン０．２３部およびトリエチルアミン０．１４部と４５℃で２時間反応させた。生じた析出物を濾別し、得られた濾液にアセトンを２０部加え、さらにイオン交換水１５部を滴下することにより、結晶が析出した。析出した結晶を濾別し、６６％アセトン水溶液１５部で洗浄した後に乾燥して、フタロシアニン色素化合物（Ｄ−５）０．７部を得た。
【０１２０】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−６）の合成例］
ｏ−ジクロロベンゼン５０部、トリ−ｎ−ブチルアミン２５部に、４−（２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロピル）オキシ−１，３−ジイミノイソインドリン８部および四塩化珪素６部を加え、１６０〜１７０℃で７時間加熱撹拌後、冷却し、メタノール１０００部で希釈後、析出した沈澱を濾別して、メタノール：水（質量比３：１）混合溶液で洗浄後、乾燥して、粗製アルミニウムフタロシアニン中間体５．５部を得た。
この粗製アルミニウムフタロシアニン中間体を濃硫酸３００部に溶解した後、氷水６０００部に注入し、析出した沈澱を濾別して、水洗後、乾燥して、アルミニウムフタロシアニン中間体４．３部を得た。この中間体４部をピリジン８０部、トリ−ｎ−ブチルアミン２０部に撹拌溶解した後、冷却しながらクロロジフェニルホスフィン５部を加え、１１０℃で２時間加熱撹拌した後、冷却し、氷水１０００部に注入した。析出した沈澱を濾別し、水洗後、乾燥して、フタロシアニン色素化合物（Ｄ−６）３．５部を得た。
【０１２１】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−７）の合成例］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−３）で得られたシリコンフタロシアニン中間体１部を、２−ブタノン１０部中で、トリフェニルクロロシラン０．５部およびトリエチルアミン０．３部と４５℃で５時間反応させた。生じた析出物を濾別し、得られた濾液にアセトンを２０部加え、さらにイオン交換水１５部を滴下することにより、結晶が析出した。析出した結晶を濾別し、６６％アセトン水溶液１５部で洗浄した後に乾燥して、フタロシアニン色素化合物（Ｄ−７）０．８部を得た。
【０１２２】
［フタロシアニン色素化合物（Ｄ−８）の合成例］
３−ニトロフタロニトリル２０部をジメチルアセトアミド１５０部に溶解させ、エタノール８部を添加した。そこに、ナトリウムエトキシド１２部をジメチルアセトアミド５０部に懸濁させた液を氷浴中で滴下ロートにて添加し８０℃で4時間反応させた。水７００部を加え、析出物をろ過によりフタロシアニン化合物（Ｄ−７）の原料となる３−エトキシフタロニトリルを１４部得た。
次に、窒素雰囲気下５０℃で、無水塩化アルミニウム １．３部をキノリン４０部に溶解させた後、アンモニアガスを１．５時間バブリングさせた。その後、３−エトキシフタロニトリルを5部加え、１８０℃６時間反応させた。反応液にメタノール２００部と水８５部、３５％塩酸６０部 を添加し、1時間攪拌後析出物をろ過して、クロロアルミニウムフタロシアニン中間体を５部得た。
クロロアルミニウムフタロシアニン中間体３．５部をN―メチルピロリドン５０部に溶解させた後、水酸化カリウム０．５４部を加え、５０℃で２時間反応させた。水１０００部を加え、1時間攪拌後析出物をろ過して、ヒドロキシアルミニウムフタロシアニン中間体を３部得た。
ヒドロキシアルミニウムフタロシアニン中間体２部をピリジン２５部に溶解させた後、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン１．１部加え、室温で一晩反応させた。エバポレーターでピリジンを除去した後、固形物をエタノール３０部に半溶解させ、水80部を加え、析出物をろ過、乾燥して、中間体である３−アミノプロピルジメチルエトキシシリルアルミフタロシアニン化合物０．８部を得た。
３−アミノプロピルジメチルエトキシシリルルアルミフタロシアニン中間体０．５部をＮＭＰに溶解させた後、無水コハク酸０．０１２部を加え、９０℃で４時間反応させた。ＭＳ分析より、目的物の生成と、原料ピークの消失を確認した。水５０部と食塩を２０部加え、１．５時間攪拌させた後、遠心分離機(３０００rpm,５分)より固体を沈降させ濾別し、乾燥させ、フタロシアニン色素化合物（Ｄ−８）０．４部を得た。
【０１２３】
［インドシアニングリーン（ＩＣＧ）］
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、市販のインドシアニングリーンを使用した。構造を以下に示す。
【０１２４】
【化１１】
2020177014.tif 000013
【０１２５】
＜水溶性樹脂の合成例＞
［水溶性樹脂（Ｐ−１）］
ガス導入管、温度計、コンデンサー、攪拌機を備えた反応容器に、トリエチレングリコールモノメチルエーテル９３．４部を仕込み、窒素ガスで置換した。反応容器内を１１０℃に加熱して、ラウリルメタクリレート３５．０部、スチレン３５．０部、アクリル酸３０．０部、およびＶ−６０１（和光純薬製）６．０部の混合物を２時間かけて滴下し、重合反応を行った。滴下終了後、さらに１１０℃で３時間反応させた後、Ｖ−６０１（和光純薬製）０．６部を添加し、さらに１１０℃で１時間反応を続けて、水溶性樹脂１の溶液を得た。水溶性樹脂１の重量平均分子量は約１６０００であった。その後、８０℃で減圧撹拌を３時間行うことで、残留モノマーを留去した。その後、室温まで冷却した後、ジメチルアミノエタノール３７．１部添加し中和した。これは、アクリル酸を１００％中和する量である。さらに、水を２００部添加し、水性化した。これを１ｇサンプリングして、１８０℃２０分加熱乾燥して不揮発分を測定し、先に水性化した樹脂溶液の不揮発分が２４％になるように水を加え水溶性樹脂（Ｐ−１）の水溶液を得た。
【０１２６】
［水溶性樹脂（Ｐ−２）］
ガス導入管、温度計、コンデンサー、攪拌機を備えた反応容器に、１−ブタノール９７部を仕込み、窒素ガスで置換した。反応容器内を１１０℃に加熱して、ラウリルメタクリレート３５．０部、スチレン３５．０部、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド３０．０部、およびＶ−６０１（和光純薬製）３．３部の混合物を２時間かけて滴下し、重合反応を行った。滴下終了後、さらに１１０℃で３時間反応させた後、Ｖ−６０１（和光純薬製）０．６部を添加し、さらに１１０℃で１時間反応を続けて、水溶性樹脂２の溶液を得た。水溶性樹脂２の重量平均分子量は約２４０００であった。次に、この反応容器に分離管を取り付けた後、イオン交換水９７部を添加し、１―ブタノールと共沸させることで、反応系内から１−ブタノールを除去した。続いて、これを１ｇサンプリングして、１８０℃２０分加熱乾燥して不揮発分を測定し、合計のイオン交換水が２４１部になるように残りのイオン交換水を添加して、不揮発分３０％水溶性樹脂（Ｐ−２）の水溶液を得た。
【０１２７】
［水溶性樹脂（Ｐ−３）］
水溶性樹脂（Ｐ−１）と同様に合成し、残留モノマーを留去した後、水中へ樹脂溶液を加え、白色樹脂を析出し、室温下で真空乾燥を行った。その後、中和剤としてアンモニア水７．０８部を加え、添加し中和した。これは、アクリル酸を１００％中和する量である。さらに、水を添加し、水性化した。これを１ｇサンプリングして、１８０℃２０分加熱乾燥して不揮発分を測定し、先に水性化した樹脂溶液の不揮発分が２４％になるように水を加え水溶性樹脂（Ｐ−３）の水溶液を得た。
【０１２８】
［水溶性樹脂（Ｐ−４）］
水溶性樹脂（Ｐ−３）と同様に合成し、中和剤をアンモニア水から炭酸水素ナトリウム３４．９６部へ変更する以外は同様な条件で中和し、水性化した。これを１ｇサンプリングして、１８０℃２０分加熱乾燥して不揮発分を測定し、先に水性化した樹脂溶液の不揮発分が２４％になるように水を加え水溶性樹脂（Ｐ−４）の水溶液を得た。
【０１２９】
＜色素組成物の作製＞
［実施例１］
蛍光色素としてフタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）１部、水溶性樹脂（Ｐ−１）１００部をメタノール２００００部に溶解した。得られたメタノール溶液を室温（２５℃）で撹拌下、超純水２５０００部を滴下した。フラスコに移して、エバポレーターにてメタノールを減圧留去し、真空乾燥を１２時間行って、フラスコ底面にフタロシアニン化合物（Ｄ−１）と水溶性樹脂の混合物の薄膜を形成させた。そのフラスコにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１００００部を添加し、６０℃超音波処理を行った。その後、０．２０μｍナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、フタロシアニン化合物（Ｄ−１）が水溶性樹脂に可溶化された色素組成物１を得た。このミセルの体積平均粒子径（以下、特に断りのない限り、単に「平均粒子径」と略記する）は、動的光散乱式ナノトラック粒度分布計（日機装社製、ＵＰＡ−ＥＸ１５０）を用いて測定したところ、６５ｎｍであった。
【０１３０】
［実施例２］
水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作成し、色素組成物２を得た。ミセルの平均粒子径は、５５ｎｍであった。
【０１３１】
［実施例３］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）に変更した以外は、実施例１と同様に作製し、色素組成物３を得た。ミセルの平均粒子径は、５８ｎｍであった。
【０１３２】
［実施例４］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物４を得た。ミセルの平均粒子径は、６５ｎｍであった。
【０１３３】
［実施例５］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をインドシアニングリーンに変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物５を得た。ミセルの平均粒子径は、５９ｎｍであった。
【０１３４】
［実施例６］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をインドシアニングリーンに変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物６を得た。ミセルの平均粒子径は、６３ｎｍであった。
【０１３５】
［実施例７］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−３）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物７を得た。ミセルの平均粒子径は、５８ｎｍであった。
【０１３６】
［実施例８］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−４）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物８を得た。ミセルの平均粒子径は、５３ｎｍであった。
【０１３７】
［実施例９］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−５）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物９を得た。ミセルの平均粒子径は、４８ｎｍであった。
【０１３８】
［実施例１０］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−６）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物１０を得た。ミセルの平均粒子径は、５０ｎｍであった。
【０１３９】
［実施例１１］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−７）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物１１を得た。ミセルの平均粒子径は、４６ｎｍであった。
【０１４０】
［実施例１２］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−８）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−２）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物１２を得た。ミセルの平均粒子径は、４３ｎｍであった。
【０１４１】
［実施例１３］
水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−３）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物１３を得た。ミセルの平均粒子径は、６３ｎｍであった。
【０１４２】
［実施例１４］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−１）をフタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）に変更し、水溶性樹脂を（Ｐ−１）を水溶性樹脂（Ｐ−４）に変更した以外は実施例１と同様に作製し、色素組成物１４を得た。ミセルの平均粒子径は、４５ｎｍであった。
【０１４３】
［比較例１］
水溶性樹脂として、ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）・ＰＰＯ（ポリプロピレンオキシド）ブロック共重合体（プルロニックＦ１２７、シグマアルドリッチ社製、ＰＥＯ分子量８８００、ＰＰＯ分子量３７７０）を用いた以外は、実施例１と同様に作製し、色素組成物１５を得た。
【０１４４】
［比較例２］
水溶性樹脂として、ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）・ＰＰＯ（ポリプロピレンオキシド）ブロック共重合体（プルロニックＦ６８、シグマアルドリッチ社製、ＰＥＯ分子量６６９０、ＰＰＯ分子量１６８０）を用いた以外は、実施例１と同様に作製し、色素組成物１６を得た。
【０１４５】
［比較例３］
インドシアニングリーンを色素濃度０．０５％になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し調整した色素水溶液を色素組成物１７として作成した。
【０１４６】
［比較例４］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−２）を色素濃度０．０５％になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し調整した色素水溶液を色素組成物１８として作成した。
【０１４７】
［比較例５］
フタロシアニン色素化合物（Ｄ−４）を色素濃度０．０５％になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し調整した色素水溶液を色素組成物１９として作成した。
今回作成した、色素組成物１〜１９を、表１に示した。
【０１４８】
【表１】
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【０１４９】
＜蛍光強度の評価＞
［試験例１］
実施例１で作製した色素組成物について蛍光スペクトル測定を行った。なお、蛍光スペクトルは、色素組成物１の吸収スペクトルの最も長波長側の極大吸収波長を励起波長とし、室温条件で日本分光社製ＦＰ−６５００を用い測定した。励起波長は７２２ｎｍである。結果を図１に示す。
［試験例２］
試験例１の実施例１で作成した色素組成物を実施例５で作成した色素組成物５に変更し、同様に試験を実施した。励起波長は７９８ｎｍである。結果を図２に示す。
［試験例３］
試験例１の実施例１で作成した色素組成物を比較例１で作成した色素組成物１５に変更し、同様に試験を実施した。励起波長は７２２ｎｍである。結果を図３に示す。
［試験例４］
試験例１の実施例１で作成した色素組成物を比較例３で作成した色素組成物１７に変更し、同様に試験を実施した。励起波長は７９８ｎｍである。結果を図４に示す。
【０１５０】
図５に、試験例１、および試験例３の蛍光スペクトルを比較したものを示す。試験例１、および試験例３のスペクトルを比較すると、本発明の特徴である水溶性樹脂を用いることによって他の水溶性樹脂に比べ蛍光強度が向上した。
【０１５１】
図６に、試験例２、および試験例４の蛍光スペクトルを比較したものを示す。試験例２、および試験例４のスペクトルを比較すると、本発明の特徴である水溶性樹脂を用いることで、インドシアニングリーンを単にＰＢＳに溶解した場合に比べ蛍光強度が向上した。
【０１５２】
＜色素組成物の安定性の評価＞
［試験例５］
実施例１で作成した色素組成物１を３５℃で経時保管した後の吸収スペクトルの変化を測定した。色素組成物を調製してからの日数に対して、最も長波長領域に現れる吸収スペクトルの極大波長の吸光度の変化の関係を図４に示す。吸収スペクトルは日立ハイテクサイエンス社製ＵＶ−４１００を用い測定した。
［試験例６〜１４］
試験例５で調製した色素組成物１を表１に示す色素組成物２〜６、１５〜１８に変更し、同様に評価を行った。結果を図７に示す。
【０１５３】
これらの結果より、色素組成物１〜６は溶液調製後、２１日経過時においても、初期の吸光度の７０％以上であることが示された。一方、色素組成物１５〜１８においては、初期の吸光度に対して経時での吸光度が大幅に低下しており、この結果からも本発明の色素組成物１〜６は安定性が高いことが示された。
【０１５４】
＜色素組成物の光安定性の評価＞
［試験例１５］
実施例１で作成した色素組成物１を色素の吸収極大波長に相当する７２４ｎｍを励起波長とし、蛍光分光光度計（日本分光社製ＦＰ―６５００、励起波長のスリット幅２０ｎｍ）で一定時間照射した際の吸収極大波長の変化を測定した。照射時間に対して、吸収スペクトルの極大波長の吸光度の変化の関係を図８に示す。
【０１５５】
［試験例１６、１７］
試験例１５で調製した色素組成物１をそれぞれ色素組成物５（励起波長を７９８ｎｍ）、および色素組成物１７（励起波長を７９８ｎｍ）に変更し、同様に評価を行った。評価結果を図８に示す。
【０１５６】
試験例１５および試験例１６で作成した色素組成物は、いずれも吸光度の変化が小さいことが示された。一方、本発明の樹脂を用いない試験例１７の色素組成物１７では、光照射に伴い、吸光度の低下を確認するに至った。以上の結果から、本発明の水溶性樹脂を色素組成物に用いることで大幅な光安定性の実現が可能となることが示された。
【０１５７】
［実施例１５〜１８、比較例６、７］
＜蛍光標識剤としての評価＞
（細胞培養と蛍光顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種（５×１０3ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）し、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2含有Ａｉｒ、加湿環境）内で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、表２に示す色素組成物を超純水で１００倍希釈したものを添加し、インキュベーター内に２４時間静置した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。色素にインドシアニングリーンを用いる場合は、７７５±２５ｎｍの励起光のカットフィルターおよび８４５±２７．５ｎｍのモニター光のカットフィルターを、それ以外の色素を用いる場合は７１０±３７．５ｎｍの励起光のカットフィルターおよび８１０±４５ｎｍのモニター光のカットフィルターを設置した蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＺ−Ｘ８００）を用いて、細胞の暗視野像と蛍光像を観察した。それらの結果を表２に示す。実施例１５〜実施例１８の色素組成物では蛍光ラベルされた細胞を明瞭に確認することができたが、比較例６および比較例７では不明瞭であった。実用レベルは、◎および○である。
【０１５８】
（判定基準）
◎：非常に明瞭
○：明瞭
×：不明瞭
【０１５９】
これらの結果より、色素組成物１３および色素組成物１４では非常に明瞭な視認性を示すことを見出した。要因としては、水溶性樹脂（Ｐ−３）および水溶性樹脂（Ｐ−４）を使用することで、細胞に対する悪影響（細胞毒性）が抑制されたことからも色素組成物１および色素組成物５を用いた場合に比べより明瞭な観察が可能となった。一方、色素組成物１５および色素組成物１７を用いた場合は、希釈により蛍光強度が低下してしまい、細胞の視認性が不明瞭または蛍光が未検出になったと考えられる。
【０１６０】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明によれば、水中における色素の蛍光強度および安定性を向上させることができる。そのため、本発明は蛍光イメージング等に利用する事ができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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