(57)【要約】【課題】タンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着することができる核酸吸着材を提供する。【解決手段】窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える、核酸吸着材。窒素原子を含むカチオン性基としては、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基）、４級アンモニウム基、イミノ基、アミジン基、グアニジノ基、イミダゾール基、４級イミダゾリウム基、ピリジル基、４級ピリジニウム基などが挙げられる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える、核酸吸着材。
【請求項２】
窒素原子を含むカチオン性基が、多価アミンに由来する官能基、及び／又は第４級アンモニウム基である、請求項１に記載の核酸吸着材。
【請求項３】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量が０．０１〜５ｍｅｑ／ｄｒｙ−ｇとなるように、セルロースナノファイバーが窒素原子を含むカチオン性基を有する、請求項１又は２に記載の核酸吸着材。
【請求項４】
セルロースナノファイバーが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの平均繊維径を有する、請求項１〜３の何れかに記載の核酸吸着材。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の核酸吸着材が充填された核酸吸着用カラム。
【請求項６】
セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入する工程を含む、請求項１〜４の何れかに記載の核酸吸着材を製造する方法。 
【請求項７】
請求項１〜４の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された液体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４の何れかに記載の核酸吸着材と、目的物質及び核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された目的物質を含有する液体の製造方法。
【請求項９】
目的物質がタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
目的物質が細胞生産物又は微生物生産物である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程と、核酸吸着材に吸着した核酸を核酸吸着材から離脱させる工程を含む核酸精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸吸着材、及びこの核酸吸着材を用いた核酸吸着方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養や微生物培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際、目的の有用物質を含む培養液中には、細胞や微生物、目的物質の他に、核酸や、培養液成分である糖、塩のような低分子化合物が含まれる。従って、目的物質以外の夾雑成分を除去して製品とする必要がある。
特に、核酸は培養液の粘度を上昇させるため、有用物質の分離及び精製の効率を低下させる原因となる。目的物質は、糖タンパク質を含むタンパク質である場合が多いため、タンパク質を除去せずに、核酸を選択的に除去する技術が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、タンパク質溶液から核酸又はエンドトキシンを除去するために低分子キトサンを用いることを開示している。
また、特許文献２は、タンパク質溶液から核酸又はエンドトキシンを除去するためにＮ-アルキル化したキトサンからなる二分子膜を固定化した担体を用いることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３-５６３００号
【特許文献２】特開２０１５-２３８２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着することができる核酸吸着材、及びタンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着できる核酸吸着方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、核酸を強く吸着し、また処理対象液の液性を調整することにより、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着できることを見出した。
【０００７】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の〔１〕〜〔１１〕を提供する。
〔１〕  窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える、核酸吸着材。
〔２〕  窒素原子を含むカチオン性基が、多価アミンに由来する官能基、及び／又は第４級アンモニウム基である、〔１〕に記載の核酸吸着材。
〔３〕  窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量が０．０１〜５ｍｅｑ／ｄｒｙ−ｇとなるように、セルロースナノファイバーが窒素原子を含むカチオン性基を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の核酸吸着材。
〔４〕  セルロースナノファイバーが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの平均繊維径を有する、〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の核酸吸着材。
〔５〕  〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材が充填された核酸吸着用カラム。
〔６〕  セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入する工程を含む、〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材を製造する方法。 
〔７〕  〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された液体の製造方法。
〔８〕  〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と、目的物質及び核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された目的物質を含有する液体の製造方法。
〔９〕  目的物質がタンパク質である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  目的物質が細胞生産物又は微生物生産物である、〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程と、核酸吸着材に吸着した核酸を核酸吸着材から離脱させる工程を含む核酸精製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の核酸吸着材は、ＤＮＡなどの核酸を強く吸着する。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える本発明の核酸吸着材は、同様の官能基を有するセルロース粒子に比べて、格段に核酸吸着容量が高い。
【０００９】
また、処理対象である核酸含有液の液性を調整することにより、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着することができる。微生物培養や細胞培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際の有用物質は、糖タンパク質を含むタンパク質である場合が多い。従って、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着する本発明の核酸吸着材を用いれば、有用物質の回収率を低下させずに核酸を吸着除去することができる。
また、核酸は酸性を示すことから、酸性タンパク質との分離が特に難しいが、本発明の核酸吸着材は、酸性タンパク質を吸着しない条件で核酸を強く吸着することができる。
【００１０】
また、遺伝子治療薬や研究ツールなどとして有用な核酸は、簡単に大量精製する技術が求められている。即ち、タンパク質などの生体由来成分から核酸を分離精製する技術が求められている。この点、本発明の核酸吸着材は、タンパク質を吸着せずに核酸を特異的に吸着でき、さらに核酸を吸着した核酸吸着材に所定の液性を有する溶出液を接触させることにより、吸着した核酸を高い溶出率で溶出させ回収することができる。従って、核酸精製にも有用である。
【００１１】
また、本発明の核酸吸着材は、幅広いｐＨ範囲で核酸を吸着することができるため、広範囲の核酸含有液を処理対象にすることができる。
【００１２】
また、セルロースは医薬品や食品の賦形剤などとして汎用されており、また、セルロースナノファイバーは化粧品成分として用いられていることから分かるように、セルロースナノファイバーは安全性が確立されている。従って、本発明の核酸吸着材は、安全性が高く、医薬品などの生産工程で好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エチレンジアミン固定化セルロースナノファイバーのプラスミド吸着容量を示す図である。
【図２】エチレンジアミン固定化セルロースナノファイバーのプラスミド吸着能に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】エチレンジアミン固定化セルロースナノファイバーのＤＮＡ吸着能に及ぼすイオン強度の影響を示す図である。
【図４】エチレンジアミン固定化セルロースナノファイバー及びポリアリルアミン固定化セルロースナノファイバーが、タンパク質とＤＮＡを含む処理対象液中のＤＮＡを選択的に吸着し、さらに溶出液中にＤＮＡを溶出したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）核酸吸着材
本発明の核酸吸着材は、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える核酸吸着材である。
【００１５】
セルロースナノファイバー
「セルロースナノファイバー」とは、ナノメートルオーダーの平均繊維径を有する繊維状のセルロースをいう。
平均繊維径は、１ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であればよい。また、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、又は３０ｎｍ以上で、１０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、又は５０ｎｍ以下とすることができ、また、これらの組み合わせとすることができる。例えば、３ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、又は１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲が挙げられる。
また、セルロースナノファイバーは、繊維径について高い均一性を有することが好ましい。セルロースナノファイバーの繊維径分布の標準偏差は、１００ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、又は２０ｎｍ以下が好ましい。
【００１６】
セルロースナノファイバーの平均繊維長は、例えば、５μｍ以上、１０μｍ以上、５０μｍ以上、１００μｍ以上、２００μｍ以上、３００μｍ以上、５００μｍ以上、又は１０００μｍ以上とすることができ、１０００００μｍ以下、１００００μｍ以下、３０００μｍ以下、２５００μｍ以下、２０００μｍ以下、１５００μｍ以下、又は１２００μｍ以下とすることができ、また、これらの組み合わせとすることができる。例えば、１０μｍ〜３０００μｍ、１００μｍ〜２５００μｍ、２００μｍ〜２０００μｍ、３００μｍ〜１５００μｍ、又は５００μｍ〜１２００μｍが挙げられる。
【００１７】
セルロースナノファイバーの平均アスペクト比は、例えば、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、５０００以上、１００００以上、又は２００００以上で、１０００００以下、８００００以下、５００００以下、４００００以下、又は３５０００以下とすることができ、また、それらの組み合わせとすることができる。例えば、２０００〜１０００００、３０００〜８００００、５０００〜５００００、１００００〜４００００、又は２００００〜３５０００が挙げられる。
「平均アスペクト比」とは、平均繊維径に対する平均繊維長の比（平均繊維長／平均繊維径）をいう。
【００１８】
平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、電子顕微鏡を用いて少なくとも２０本のランダムに選択されたセルロースナノファイバーの寸法を測定した結果から算出した値である。
【００１９】
平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入する前のセルロースナノファイバーの平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比を意味する。窒素原子を含むカチオン性基を導入した後のセルロースナノファイバーの平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、窒素原子を含むカチオン性基導入前のセルロースナノファイバーと同程度であるが、セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入することにより、セルロースナノファイバーが膨潤し得るため、例えば、窒素原子を含むカチオン性基導入後のセルロースナノファイバーの平均繊維径は、セルロースナノファイバーの平均繊維径よりも大きくなり得る。
【００２０】
セルロースナノファイバーを製造するための原料繊維の由来は特に制限されない。原料繊維としては、高等植物由来のセルロース繊維、動物由来のセルロース繊維、藻類由来のセルロース繊維、細菌由来のセルロース繊維、化学的に合成されたセルロース繊維、及びそれらの誘導体などが挙げられる。高等植物由来のセルロース繊維としては、針葉樹や広葉樹由来の木材パルプ等の木材繊維；コットンリンター、ボンバックス綿、カポック等の種子毛繊維；麻、コウゾ、ミツマタ等の靭皮繊維；マニラ麻、サイザル麻、ニュージーランド麻等の葉脈繊維；竹繊維；サトウキビ繊維などが挙げられる。動物由来のセルロース繊維としては、ホヤセルロースなどが挙げられる。藻類由来のセルロース繊維としては、バロニアセルロースなどが挙げられる。細菌由来のセルロース繊維としては、酢酸菌により製造されるセルロースなどが挙げられる。化学的に合成されたセルロース繊維としては、メチルセルロースやエチルセルロースのようなアルキルセルロースなどが挙げられる。
誘導体としては、官能基が導入されたセルロース繊維が挙げられる。即ち、本発明において、「セルロース」という用語は、そのような官能基を有するものを包含する。導入し得る官能基については後述する。
【００２１】
原料繊維からセルロースナノファイバーを製造する方法としては、原料繊維をリファイナー、ホモジナイザー、媒体撹拌ミル、石臼、グラインダー等の破砕装置を用いてミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法（特開２０１１-０２６７６０）、原料繊維と機能性粒子とを混合し、加圧条件化で混練することによりセルロースナノファイバーを製造する方法（特開２００７-２６２５９４）、原料繊維を湿式で離解した後、予備的に解繊し、蒸煮処理し、破砕装置を用いてミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法であって、酵素を併用する方法（特開２００８-０７５２１４）、原料繊維を湿式で離解した後、予備的に解繊し、超音波処理によりミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法であって、酵素を併用する方法（特開２００８-１６９４９７）が挙げられる。
また、セルロースナノファイバーは、例えば、セルロースのイオン液体溶液やセルロースの有機溶媒溶液から紡糸することによっても製造できる（特開２０１５-００４１５１）。
【００２２】
セルロースナノファイバーの市販品としては、ダイセルファインケム株式会社製のセリッシュ（登録商標）やＫｅｌｃｏ社製のＣｅｌｌｕｌｏｎ（登録商標）が挙げられる。セリッシュとしては、ろか名人、ＰＣ１１０Ｔ、ＰＣ１１０Ａ、ＰＣ１１０Ｂ、ＰＣ１１０Ｓ、ＫＹ１００Ｓ、ＫＹ１００Ｇが挙げられる。
【００２３】
窒素原子を含むカチオン性基
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本来的に窒素原子を含むカチオン性基を有するものであってもよく、窒素原子を含むカチオン性基をセルロースナノファイバーに導入したものであっても良い。
【００２４】
窒素原子を含むカチオン性基としては、例えば、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基）、４級アンモニウム基、イミノ基、アミジン基、グアニジノ基、イミダゾール基、４級イミダゾリウム基、ピリジル基、４級ピリジニウム基などが挙げられる。アミノ基は、アンモニアから水素原子１つを除去した官能基（−ＮＨ２）、第１級アミンから水素原子１つを除去した官能基（−ＮＨＲ）、第２級アミンから水素原子１つを除去した官能基（−ＮＲＲ´）の何れであってもよい。
窒素原子を含むカチオン性基は非環状であってもよく、環状であってもよい。
【００２５】
窒素原子を含むカチオン性基は、例えば、セルロースの水酸基に導入することができる。窒素原子を含むカチオン性基を導入する方法としては、セルロースの水酸基を活性化剤で活性化し、次いで、窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させる方法が挙げられる。窒素原子を含むカチオン性基がそれ自体反応性基を有する場合は、活性化剤での前処理は必ずしも要さない。
【００２６】
活性化剤としては、例えば、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）、メタクリル酸グリジシル、アクリル酸グリシジル、ジグリシジルエーテル、エピブロモヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなエポキシ基供与体、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、２−フルオロ−１−メチルピリジニウム、クロロアセチルクロリド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ｍ−キシレンジイソシアネート、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどが挙げられる。
活性化剤としては、エポキシ基供与体が好ましく、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）がより好ましい。
活性化剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００２７】
窒素原子を含むカチオン性基の供与体である、窒素原子を含むカチオン性化合物としては、アンモニア、アミジン、１価アミン、多価アミン、第４級アンモニウム塩、第４級イミダゾリウム塩、第４級ピリジニウム塩などが挙げられる。
１価アミンとしては、脂肪族アミン類、特にアルキルアミン（メチルアミン、エチルアミンのような第１級アミン；ジメチルアミン、ジエチルアミンのような第２級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような第３級アミン）；芳香族アミン類（アニリン、トルイジンのような第１級アミンなど）；複素環式アミン類（ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールのような第２級アミン；ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン（コリジン）、２，６−ルチジン、キノリン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリンのような第３級アミンなど）；アルカノールアミン又はアミノアルコール（モノメタノールアミン、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール、トリス(ヒドロキシメチルアミノ)メタンのような第１級アミン；ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ−エチルエタノールアミンのような第２級アミン；トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｎ−ジメチルアミノエタノール、Ｎ−ジエチルアミノエタノールのような第３級アミン）などが挙げられる。
【００２８】
多価アミンとしては、エチレンジアミン、テトラメチルエチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンのような脂肪族ジアミン；４，４′−ジアミノ−３，３′ジメチルジシクロヘキシルメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ジアミノヘキサン、ジアミンシクロヘキサン、イソホロンジアミンのような脂環族ジアミン；フェニレンジアミン、ジアミノナフタレン、キシリレンジアミンのような芳香族ジアミン；ピペラジンのような複素環式ジアミン；ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンペンタミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、トリス（３−アミノプロピル）アミン、グアニジンのような３価以上の脂肪族アミン；メラミンのような３価以上の芳香族アミンなどが挙げられる。
また、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、アミノ酸(中でも、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、トリプトファンのような塩基性アミノ酸)、アミノ酸の重合体（中でも、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリトリプトファンのような塩基性アミノ酸の重合体）、ポリクレアチニンなどのアミノ基を有するポリマーも挙げられる。ポリマーは、直鎖状、分岐状の何れであってもよい。ポリマーの数平均分子量は、例えば、５０以上、１００以上、又は１５０以上であってよく、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、５，０００以下、２，０００以下、又は１，０００以下であってよい。ポリマーの数平均分子量としては、例えば、５０〜１，０００，０００、５０〜１００，０００、５０〜１０，０００、５０〜５，０００、５０〜２，０００、５０〜１，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１００，０００、１００〜１０，０００、１００〜５，０００、１００〜２，０００、１００〜１，０００、１５０〜１，０００，０００、１５０〜１００，０００、１５０〜１０，０００、１５０〜５，０００、１５０〜２，０００、１５０〜１，０００が挙げられる。
【００２９】
第４級アンモニウム塩としては、グリシジルトリメチルアンモニウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。また、例えば、上記例示した第３級アミンのアルキル化により第４級化した四級アミンも使用できる。
第４級イミダゾリウム塩としては、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウム塩、１−メチル−ベンゾイミダゾリウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。
第４級ピリジニウム塩としては、ブチルピリジニウム塩、ドデシルピリジニウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。
【００３０】
窒素原子を含むカチオン性化合物としては、多価アミン、１価アミン、第４級アンモニウム塩が好ましく、多価アミン、第４級アンモニウム塩がより好ましく、エチレンジアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンがさらにより好ましい。
窒素原子を含むカチオン性化合物は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
２種以上のカチオン性化合物を使用する場合、各カチオン性化合物を導入したセルロースナノファイバーを混合して使用してもよく、或いは、２種以上のカチオン性化合物を導入したセルロースナノファイバーを使用してもよい。
【００３１】
また、セルロースナノファイバーを窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させた後に、さらに修飾を施すことによってカチオン性を高めることができる。カチオン性を高めるためにアミノ基を第４級化させる化合物としては、例えば、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）、ヨードメタン、ヨードエタンなどが挙げられる。カチオン性を高めるために窒素原子を含むカチオン性基を追加して導入する方法としては、導入したカチオン性基を活性化剤で活性化し、次いで、既に導入したカチオン性基と同じ又はこれとは異なる、窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させる方法が挙げられる。活性化剤、窒素原子を含むカチオン性化合物としては上記例示したものを使用できる。
カチオン性を高めるために反応させる化合物は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３２】
セルロースナノファイバー又は活性化セルロースナノファイバーと窒素原子を含むカチオン性化合物との反応は、例えば、約１０〜１００℃で、約０．１〜２４時間行えばよい。
溶媒としては、通常、水を用いればよいが、メタノール、エタノール、２−プロパノール、エチレングリコールモノメチルエーテル（２−メトキシエタノール）のようなアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒も用いることができる。溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３３】
上記のようにして得られる、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、窒素原子を含むカチオン性化合物がセルロースナノファイバーに結合したもの、又は窒素原子を含むカチオン性化合物が橋架け剤を介してセルロースナノファイバーに結合したものであってよい。
【００３４】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの特性
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーにおける、窒素原子を含むカチオン性基の含有量は、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量（Anion Exchange Capacity；ＡＥＣ）が、例えば０．０１ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、より好ましくは０．４ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、さらに好ましくは０．９ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上となる量であればよい。この範囲であれば、核酸を十分に吸着することができる。
また、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量（ＡＥＣ）が、例えば５ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下、好ましくは３ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下、より好ましくは１．２ ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下となる量であればよい。この範囲であれば、処理対象試料中に酸性物質（例えば、酸性タンパク質）などのマイナスチャージを有する物質が存在する場合にそのマイナスチャージを有する物質の非特定的吸着を抑えつつ、核酸を効率よく吸着することができる。
【００３５】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本発明の効果を妨げない範囲で、窒素原子を含むカチオン性基以外のカチオン性基を有することができる。窒素原子を含むカチオン性基以外のカチオン性基の含有量は、陰イオン交換容量（ＡＥＣ）として、５ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下とすればよい。窒素原子を含むカチオン性基以外の陰イオン交換基は含まないことができる。この範囲であれば、処理対象試料中に酸性物質（例えば、酸性タンパク質）などのマイナスチャージを有する物質が存在する場合にそのマイナスチャージを有する物質の非特定的吸着を抑えつつ、核酸を効率よく吸着することができる。
【００３６】
また、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本発明の効果を妨げない範囲で、カチオン性基以外の官能基を有することができる。カチオン性基以外の官能基としては、アルキル基、アルコキシ基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、硫酸基、ホルミル基、アセチル基、水素、ハロゲン原子などが挙げられる。
【００３７】
本発明において、イオン交換容量は、ｐＨ滴定法で測定した値であり、具体的には、実施例に記載の方法で測定した値である。
【００３８】
本発明の窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーのカラム法による核酸吸着容量は、１ｍＬカラム当り１ｍｇ以上、３ｍｇ以上、１０ｍg以上、４０ｍg以上、又は５０ｍg以上であり得る。また、カラム法による核酸吸着容量の上限値は１ｍＬカラム当り３００ｍg程度であり得る。
【００３９】
核酸吸着材
本発明の対象となる核酸の種類は限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。また、プラスミドのように環状核酸であってもよく、直鎖状核酸であってもよい。また、１本鎖、２本鎖、多重鎖の何れの核酸も対象にすることができる。さらに、リン酸化、アデニル化、アジド化、コレステロール化、ヘキシニル化、ビオチン化、チオール化、フルオロ化、ヘキサンジオール化、蛍光色素の結合などの化学修飾を施した核酸も対象にすることができる。核酸のサイズも限定されず、数塩基又は数塩基対程度のオリゴヌクレオチドから、１０，０００塩基又は１０，０００塩基対程度のポリヌクレオチドまで対象にすることができる。
【００４０】
本発明の核酸吸着材は、核酸を吸着して除去する際は核酸除去材として用いることができ、核酸を吸着して精製する際は核酸精製材として用いることもできる。
【００４１】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、単独で、或いは他の構成要素と組み合わせて、核酸吸着材として利用できる。即ち、本発明の核酸吸着材は、アミノ基を有するセルロースナノファイバーからなるものであってもよく、さらに他の構成要素を備えるものであってもよい。他の構成要素は、所望の核酸吸着能が得られる限り、特に制限されない。
【００４２】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、未加工の状態では、通常、繊維状であるが、膜状、柱状などの任意の形態に加工して用いることができる。成形は、例えば、製紙プロセスによって行うことができる。
また、本発明の核酸吸着材は、カラムに充填して用いることができる。本発明の核酸吸着材が充填されたカラムは、核酸吸着用、核酸除去用、又は核酸精製用のカラムとして用いることができる。
【００４３】
本発明の核酸吸着材は、必要に応じて、核酸フリー化して利用することができる。核酸フリー化は常法により行うことができる。例えば、洗浄液を用いて本発明の核酸吸着材を１回または複数回洗浄することにより行うことができる。洗浄液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム エタノール溶液、イオン強度２以上の緩衝液などが挙げられる。洗浄後、遠心や濾過等の固液分離手段により、本発明の核酸吸着材と洗浄液とを分離すればよい。
【００４４】
（２）核酸吸着方法
本発明の核酸吸着材と、核酸吸着対象材料とを接触させることにより、核酸吸着対象材料中の核酸が核酸吸着材に吸着する。
【００４５】
核酸吸着対象材料は、液体状の材料であればよい。液体状は流動状を含む。また、加熱又は加温により液体状とした材料であってもよい。核酸吸着対象材料は、核酸だけを含むものであってよく、核酸以外に１種以上の成分を含むものであってもよい。また、核酸やその他の成分が水やその他の溶媒に溶解又は懸濁したものであってもよい。
【００４６】
核酸吸着対象材料としては、例えば、細胞培養液、微生物培養液、それらからタンパク質や核酸などを精製する途中の画分液などが挙げられる。
【００４７】
本発明の核酸吸着材と接触させる際の核酸吸着対象材料のｐＨは、窒素原子を含むカチオン性基の種類や、核酸吸着対象材料のｐＨ安定性などにより異なるが、例えば、２〜１０、特に、３以上、４以上、５以上、又は６以上とすることができ、また、９以下、８以下、又は７以下とすることができる。
【００４８】
また、本発明の核酸吸着材と接触させる際の核酸吸着対象材料のイオン強度は、窒素原子を含むカチオン性基の種類や、核酸吸着対象材料のイオン強度安定性などにより異なるが、０．０５以上、又は０．１以上とすることができる。イオン強度が低すぎると、核酸選択性が低下し、例えば、タンパク質も吸着し易くなるが、この範囲であれば良好な核酸選択性が得られる。また、核酸吸着対象材料のイオン強度は、１以下、又は０．４以下とすることができる。イオン強度が高すぎると、アミノ基と反応するイオンの濃度も高くなり、核酸吸着能が低下する場合があるが、この範囲であれば高い核酸吸着能が得られる。
【００４９】
本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料との接触は、例えば、バッチ法により行うことができる。「バッチ法」は、適当な容器内で本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを混合することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる手法である。バッチ法は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。接触時間は、核酸吸着対象材料の種類などにより異なるが、例えば、約５分間〜１２０時間、約３０分間〜２４時間、約１〜１２時間、又は約２〜４時間とすることができる。また、接触時の温度は、核酸吸着対象材料の種類などにより異なるが、例えば、約５〜８０℃、約１５〜６５℃、又は約２５〜５０℃とすることができる。
【００５０】
また、本発明の核酸吸着材と核酸吸着去対象材料との接触は、例えば、流動的分離法により行うことができる。「流動的分離法」とは、本発明の核酸吸着材に核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる手法である。具体的には、例えば、本発明の核酸吸着材をカラムに充填し、このカラムに核酸含有液を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。また、例えば、本発明の核酸吸着材がフィルター状に成形されている場合は、このフィルターに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。膜としては、メンブランフィルター、中空糸膜、チューブラー膜などの形態が挙げられる。また、本発明の核酸吸着材が柱状などに成形されている場合は、この柱状物などに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。柱状物は、例えば、微小な孔を有する連続した多孔体としてモノリスクロマトグラフィーに供することができる。また、ろ紙上に本発明の核酸吸着材を載せ、そこに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。
【００５１】
本発明の核酸吸着材に核酸を吸着させた後に混合物から本発明の核酸吸着材を、ろ過又は遠心分離などにより分離することができる。
【００５２】
本発明の核酸吸着材と、核酸吸着対象材料とを接触させることにより、核酸吸着対象材料中の核酸が核酸吸着材に吸着し、核酸が除去された材料が得られる。このように、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる工程を含む核酸吸着方法は、核酸除去方法とすることができる。核酸除去方法は、さらに、核酸が除去された材料と核酸を吸着した核酸吸着材を分離する工程、例えば、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料との混合物から、核酸が除去された材料を回収する工程を含むことができる。核酸除去方法は、換言すれば、核酸が除去された材料の製造方法である。
【００５３】
この核酸除去方法により、処理後の核酸除去対象材料中の核酸濃度又は含有量を、処理前と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、又は１％以下に低下させることができる。
【００５４】
核酸が除去されたこと及びその程度は、処理後の核酸対象材料中の核酸を、例えば、必要に応じてＰＣＲなどの核酸増幅法で増幅した後、蛍光インターカレーター、蛍光プローブ、又は電気泳動により検出することで確認できる。
【００５５】
また、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる工程と、核酸吸着材に吸着した核酸を核酸吸着材から離脱させる工程を含む方法は、核酸精製方法とすることができる。
核酸を変性させずに核酸吸着材から離脱させるには、核酸を吸着した核酸吸着材を、イオン強度１〜２程度及び／又はｐＨ ９程度の緩衝液と接触させたり、このような緩衝液を通液すればよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）核酸吸着材の製造
エチレンジアミン（ＥＤＡ）固定化セルロースナノファイバー
５００ｍＬセパラブルフラスコに、２０ ｗｅｔ−ｇの湿潤状態のセルロースナノファイバー（セリッシュろか名人；ダイセルファインケム株式会社製）と、５％（ｗ／ｗ） 水酸化ナトリウム水溶液（５ｇの水酸化ナトリウム（特級；ナカライテスク製）を９５ｍＬ水に溶解したもの）を入れ、３０℃水浴中で１時間撹拌した。次いで、セパラブルフラスコに１６０ｍＬのクロロメチルオキシラン（特級；和光純薬工業株式会社製）を加え、さらに３０℃水浴中で２時間撹拌した。撹拌速度は一定とした。反応物を濾布（東レシルク, メッシュサイズ ２０μｍ, 東レ株式会社製）上で吸引ろ過し、固形分（ろ過残渣）としてエポキシ活性化セルロースナノファイバーを得た。得られたエポキシ活性化セルロースナノファイバーと、３０％(ｖ／ｖ) エチレンジアミン（ＥＤＡ）水溶液（３０ｍＬ ＥＤＡ（和光純薬工業株式会社製）と７０ｍＬ水の混合液）をセパラブルフラスコに入れ、４５℃の水浴中で４時間攪拌した。反応物を東レシルク上で超純水を用いて洗浄液のｐＨが中性付近になるまで十分に洗浄し、固形分（ろ過残渣）としてＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを得た（ＥＤＡ-ＣＮＦ-１）。
【００５７】
また、水酸化ナトリウム水溶液の濃度を１０％（ｗ／ｗ）にした他は、ＥＤＡ-ＣＮＦ-１の製造と同様にしてＥＤＡ-ＣＮＦ-２を製造した。
【００５８】
反応容器にイオン交換水(ＤＷ)約４ｋｇ、４８ｗ／ｗ％水酸化ナトリウム水溶液約２ｋｇを仕込んだ。セリッシュろ過名人(ダイセルファインケム株式会社製)１ｋｇを追加し、室温で1時間撹拌した。クロロメチルオキシランを約２ｋｇ追加し室温で、終夜撹拌した。固形分を濾取し、ＤＷで十分に洗浄した後、反応容器に戻した。ＤＷ 約４ｋｇを仕込んだ後、エチレンジアミン約０．５ ｋｇを加え終夜撹拌した。固形分を濾取し、ＤＷで十分に洗浄し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを得た（ＥＤＡ−ＣＮＦ−３）。
【００５９】
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロースナノファイバー
３０％ＥＤＡ水溶液に代えて３０％（ｗ／ｗ）ポリアリルアミン水溶液（平均分子量１，６００）；ニットーボーメディカル株式会社製）を１００ｍＬ添加した他は、ＥＤＡ-ＣＮＦ-１の製造と同様にしてポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロースナノファイバー（ＰＡＡ-ＣＮＦ）を製造した。
【００６０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）固定化セルロース粒子
５００ｍｌ四ツ口フラスコに、１５ｇのセルロース粒子（ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＧＨ−２５；ＪＮＣ株式会社製）と、２０％（ｗ/ｗ）水酸化カリウム水溶液（４２．４ｇの水酸化カリウム（一級；和光純薬工業株式会社製）を１６９．６ｍｌの水に溶解させたもの）を入れ、３０℃水浴中で１時間撹拌した。次いで、四ツ口フラスコに１１３ｍｌのクロロメチルオキシラン（特級；和光純薬工業株式会社製）を加え、４０℃水浴中で２時間撹拌した。反応物をろ布（ＴＦ−３０１Ｂ；通気度 １０．２ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃ；東レ株式会社製）上で吸引濾過し、固形分（ろ過残渣）としてエポキシ活性化セルロース粒子（Ｅｐ−ＭＣＣ）を得た。
得られたＥｐ−ＭＣＣを５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、１３２．４ｍｌの水に分散させた。その後、５０％（ｗ/ｗ）ポリエチレンイミン水溶液（２５．４ｍｌポリエチレンイミン（平均分子量１８００；和光純薬工業株式会社製）と２５．４ｍｌ水の混合液）を滴下し、５０℃の水浴中で２時間撹拌した。反応物をろ布上で吸引濾過し、超純水を用いて洗浄した。得られた固形分（ろ過残渣）を５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、水２００ｍｌ中で室温で１時間撹拌した。ろ布上で吸引濾過して超純水及びメタノールで洗浄を行い、ポリエチレンイミン固定化セルロース粒子（ＰＥＩ-ビーズ）を得た。
【００６１】
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロース粒子
ＰＥＩ固定化セルロース粒子の製造と同様にして、Ｅｐ−ＭＣＣを得た。得られたＥｐ−ＭＣＣを５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、１００ ｍｌの水に分散させた。その後、３０％（ｗ/ｗ）ポリアリルアミン水溶液（５０ｍｌ（平均分子量１，６００）；ニットーボーメディカル社））を滴下し、その後は、ＰＥＩ固定化セルロース粒子の製造と同様にし、ポリアリルアミン固定化セルロース粒子（ＰＡＡ-ビーズ）を得た。
【００６２】
（２）各種の核酸吸着材のＤＮＡ吸着容量の評価
ＥＤＡ-ＣＮＦ-１、ＥＤＡ-ＣＮＦ-２、ＰＡＡ-ＣＮＦ、ＰＡＡ-ビーズ、及びＰＥＩ-ビーズを、それぞれ、カラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、５０μg／ｍＬ ＤＮＡ水溶液（サケ精巣由来、分子量３×１０５）の５０〜２０００ｍＬを、流速０．１ｍＬ／分で通液しながら、５ｍＬずつ分取して回収した。分取した溶出液に含まれるＤＮＡ濃度をＤＡＰＩを用いた蛍光測定により定量し、ＤＮＡ吸着容量は以下の式により算出した。
ＤＮＡ吸着容量
＝カラムに通液したＤＮＡの総量（５０（μｇ／ｍＬ）×通液量（ｍＬ））−カラムから溶出したＤＮＡの総量（分取した各溶出液のＤＮＡ量（溶出液のＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）×５ｍＬ）の合計）
【００６３】
各吸着材の陰イオン交換容量（ＡＥＣ）とＤＮＡ吸着容量（ｍｇ／ｍＬ カラム）を表１に示す。
【表１】
2020152702.tif 000003
アミノ化セルロースナノファイバーは、陰イオン交換容量（ＡＥＣ）、即ちアミノ基の導入量がアミノ化セルロース粒子と同程度であるにも拘らず、アミノ化セルロース粒子に比べて、核酸吸着容量が桁違いに高いことが分かる。
【００６４】
（陰イオン交換容量の測定方法）
陰イオン交換容量（Anion Exchange Capacity；ＡＥＣ）は、塩酸を用いた逆滴定法により測定した。手順を以下に示す。
【００６５】
アミノ化セルロースナノファイバー、及びアミノ化セルロース粒子を、それぞれ２４時間以上室温で減圧乾燥し、約０．５ｇをスクリュー管に精密秤量した。ファクター既知の０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸２０ｍｌを加え、ローラー上で２時間撹拌した。ろ紙を用いて濾過し、ろ液を１０ｍｌ別のスクリュー管に取った。ファクター既知の０．０５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液でフェノールフタレインを指示薬として滴定を行った。
以下の式によりＡＥＣを算出した。
ＡＥＣ（ｍＥｑ／ｄｒｙ・ｇ）
＝（０．１×ｆＨＣｌ×２０−０．０５×ｆＮａＯＨ×Ｖ×２０／１０）÷Ｗ
ｆＨＣｌ  ：  使用した塩酸のファクター
ｆＮａＯＨ  ：  使用した水酸化ナトリウムのファクター
Ｖ  ：  滴定量（ｍｌ）
Ｗ  ：  粒子の乾燥重量（ｄｒｙ・ｇ）
【００６６】
（３）プラスミド吸着容量の評価
９，０００塩基対のサイズのプラスミド（終濃度：０．０１〜１００，０００ｐｐｂ）とＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-３）（終濃度：１％）を試験管中で混合し、２５℃３００ｒｐｍの条件で１．５時間振盪した。その後、混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。
【００６７】
ろ液に含まれるプラスミドをＰＣＲで検出した。ＰＣＲは、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ及び２×ＧＣバッファー（Ｉ）を用いたＰＣＲ反応液１０μＬにより行った。ＰＣＲプライマーとしては、
フォワードプライマー：（５’−ＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号１）
リバースプライマー  ：（５’−ＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号２）
を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃５分、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）を３０サイクル、７２℃５分とした。
ＰＣＲ反応液を１％アガロース電気泳動に供し、色素（Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ）により可視化した。結果を図１に示す。図１において、Ｍは分子量マーカーを示す。
【００６８】
プラスミド濃度１００，０００ｐｐｂ（１００ｐｐｍ）以下の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを使用しないコントロールに比べて、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへのプラスミド吸着量が多かった。また、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、濃度１０，０００ｐｐｂ（１０ｐｐｍ）以下のプラスミドを完全に吸着した。混合液中のＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー濃度は１％であるから、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー１重量部に対して１／１，０００重量部までのプラスミドを吸着できることが分かる。
【００６９】
（４）プラスミド吸着能に及ぼすｐＨの影響の評価
９，０００塩基対のサイズのプラスミド（終濃度：１０，０００ｐｐｂ）とＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-３）（終濃度：１％）を試験管中で混合し、２５℃３００ｒｐｍの条件で１．５時間振盪した。その後、混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。混合液として、ｐＨを２.０〜１１．０に変化させたものを調製した。
【００７０】
ろ液に含まれる核酸をＰＣＲで検出した。ＰＣＲの条件は「（３）ＤＮＡ吸着容量の評価」の項目に記載した方法と同じである。結果を図２に示す。図２において、Ｍは分子量マーカーを示す。
【００７１】
ｐＨ３．０〜９．０の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを使用しないコントロールに比べて、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへのプラスミド吸着量が多かった。特に、ｐＨ４．０〜９．０の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーはプラスミドを強く吸着した。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーによる核酸吸着の最適なｐＨは４．０〜９．０であることが分かる。
【００７２】
（５）ＤＮＡ吸着能に及ぼすイオン強度の影響の評価
ＢＳＡ（Bovine serum albumin；ウシ血清アルブミン）とＤＮＡ（サケ精巣由来、分子量３×１０５）との混合液（ＢＳＡ 1mg/ml、ＤＮＡ ５０μｇ／ｍＬ）４ｍＬとＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-２）０．２ ｗｅｔ-ｇを混合し、２５℃の下、２００ｒｐｍで２時間撹拌した。混合液のイオン強度は、リン酸緩衝液濃度を調整することで、０．０５又は０．２とした。また、混合液のｐＨを５〜９に変化させたものを調製した。混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。
【００７３】
ろ液に含まれるＤＮＡをＤＡＰＩを用いた蛍光測定により定量し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを用いない場合のＤＮＡ量を基準値として、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへの吸着率（％）を算出した。
また、ろ液に含まれるＢＳＡをＢＣＡキットを用いたＵＶ−Ｖｉｓ測定により定量し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを用いない場合のＢＳＡ量を基準値として、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへの吸着率（％）を算出した。
【００７４】
結果を図３に示す。
イオン強度０．２の場合、ｐＨ５〜９の全範囲で、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーはＤＮＡを完全に吸着し、ＢＳＡを全く吸着しなかった。
一方、イオン強度０．０５の場合、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、ｐＨ５〜９の全範囲でＤＮＡを完全に吸着したが、ｐＨ６〜７外の範囲でＢＳＡも吸着した。ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、ｐＨ６〜７の範囲で核酸を選択的に吸着した。
【００７５】
ＢＳＡは酸性タンパク質（ｐＩ＝４．７）であり、酸性を示す核酸との分離が特に難しいタンパク質である。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、イオン強度を調整することで、酸性タンパク質の共存下でも、核酸を選択的に吸着できることが分かる。
【００７６】
（６）ＤＮＡの吸着・溶出条件の検討
ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-２）をカラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、ＢＳＡとＤＮＡ（サケ精巣由来、分子量３×１０５）との混合液 ６０ｍＬ（ＢＳＡ １０００μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ５０μｇ／ｍＬ）をアプライした。ＢＳＡとＤＮＡの混合液は、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．２に調製した。
まず、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．２に調製した溶出液を通液した。次いで、トリスバッファーを用いてｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液を通液した。流速は０．１ｍＬ／分とした。溶離液中のＤＮＡは、ＤＡＰＩを用いた励起波長３４０ｎｍ、蛍光は波長４３０ｎｍでの蛍光測定により検出し、ＢＳＡは、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）を用いた５６０ｎｍでのＵＶ-Ｖｉｓにより検出した。
【００７７】
結果を図４（Ａ）に示す。
ＤＮＡとＢＳＡの混液をアプライした後、ほとんどＢＳＡは吸着せず、ｐＨ＝７．０、イオン強度０．２の溶出液の通液により、ＢＳＡの９９％以上が溶出した。この間、プラスミドは９９％以上が吸着したままであった。また、ｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液の通液によりプラスミドの８０％以上が溶出した。
【００７８】
また、ＰＡＡ固定化セルロースナノファイバー（ＰＡＡ-ＣＮＦ）をカラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、ＢＳＡとＤＮＡの混合液（ＢＳＡ １０００μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ５０μｇ／ｍＬ）をアプライした。ＢＳＡとＤＮＡの混合液は、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．４に調製した。
まず、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．４に調製した溶出液を通液した。次いで、トリスバッファーを用いてｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液を通液した。流速は０．１ｍＬ／分とした。
【００７９】
結果を図４（Ｂ）に示す。ＤＮＡとＢＳＡの混液をアプライした後、ＢＳＡはほとんど吸着せず、ｐＨ＝７．０、イオン強度０．４の溶出液の通液により、ＢＳＡの９７％が溶出した。この間、ＤＮＡは９９％以上が吸着したままであった。また、ｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液の通液によりＤＮＡの２６％が溶出した。
【００８０】
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、ｐＨやイオン強度を選択することで、核酸を強く吸着し、またタンパク質と精度良く分離できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の核酸吸着材は、核酸を強く吸着し、またタンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着することができる。従って、微生物培養や細胞培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際、有用物質を吸着せずに、培養液中の核酸を吸着し除去することができる。また、遺伝子治療薬や研究ツールとしての核酸などの製造において、核酸を吸着して精製することができる。
【図１】
2020152702.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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