(57)【要約】【課題】精度よく癌を検出する技術を提供する。【解決手段】便又は体液から選択される生体試料中の、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  １（ＣＤＯ１）遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することを含み、前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、前記シトシン残基のメチル化が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
便又は体液から選択される生体試料中の、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  １（ＣＤＯ１）遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することを含み、
前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、
前記シトシン残基のメチル化が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法。
【請求項２】
前記シトシン残基のメチル化の検出が、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行われる、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
便試料中の、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することと、
前記便試料中の便潜血を検出することと、を含み、
前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、
前記シトシン残基のメチル化が検出されること、又は、前記便潜血が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法。
【請求項４】
前記シトシン残基のメチル化の検出が、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行われる、請求項３に記載の癌の検出方法。
【請求項５】
亜硫酸水素塩と、
ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基を識別するプライマーと、
デジタルＰＣＲ用試薬と、
を含む、癌の検出用キット。
【請求項６】
便潜血検出試薬を更に含む、請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、日本における死亡率第２位の癌であり、食の欧米化に伴い急激に増加している。しかしながら、大腸癌は、リンパ節転移のないステージＩ／ＩＩの段階で発見できれば、手術により９０％以上が治癒することも分かっている。したがって、ステージＩ／ＩＩの大腸癌を高い頻度で検出できる検査法が望まれている。
【０００３】
大腸内視鏡はそのような検査法の一つであるが、患者にとって苦痛が大きく、中には穿孔等の重篤な合併法に至る例もある。また、日本人全員に大腸内視鏡検査を行うことは現実問題として無理である。そこで、非侵襲的な便検査で高感度に癌を検出する方法が強く求められている。
【０００４】
現在、大腸癌のスクリーニング検査として便潜血検査（ＦＩＴ）が行われている。しかしながら、便潜血検査で陽性となるのは大腸癌患者の７４％にとどまる（例えば、非特許文献１を参照。）。このため、大腸癌の発見が遅れてしまう場合がある。
【０００５】
ところで、癌組織では、癌抑制遺伝子プロモーターＤＮＡのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化が生じることが知られており、これを癌の検出に応用することが検討されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Imperiale T. F., Multitarget stool DNA testing for colorectal-cancer screening, N Engl J Med., 370 (14), 1287-1297, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、癌抑制遺伝子プロモーターＤＮＡのメチル化を検出する方法では、癌組織によってメチル化がみられない場合がある。このため、メチル化を検出する癌抑制遺伝子プロモーターを複数種類組み合わせて感度をあげる必要があり、検査コストが非常に高くなってしまう。
【０００８】
また、癌の検査には、比較的低侵襲で採取できる生体試料を利用できることが好ましい。しかしながら、このような生体試料は癌由来ＤＮＡを極微量しか含まない。このため、従来、このような生体試料を用いて、癌抑制遺伝子プロモーターＤＮＡのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することは不可能であった。
【０００９】
このような状況のもと、本発明は、精度よく癌を検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］便又は体液から選択される生体試料中の、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  １（ＣＤＯ１）遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することを含み、前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、前記シトシン残基のメチル化が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法。
［２］前記シトシン残基のメチル化の検出が、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行われる、［１］に記載の癌の検出方法。
［３］便試料中の、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することと、前記便試料中の便潜血を検出することと、を含み、前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、前記シトシン残基のメチル化が検出されること、又は、前記便潜血が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法。
［４］前記シトシン残基のメチル化の検出が、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行われる、［３］に記載の癌の検出方法。
［５］亜硫酸水素塩と、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基を識別するプライマーと、デジタルＰＣＲ用試薬と、を含む、癌の検出用キット。
［６］便潜血検出試薬を更に含む、［５］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、精度よく癌を検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例１の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［癌の検出方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、便又は体液から選択される生体試料中の、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することを含み、前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、前記シトシン残基のメチル化が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法を提供する。
【００１４】
本実施形態の検出方法において、体液としては、例えば、血液、尿、腹膜洗浄液、胆汁等が挙げられる。
【００１５】
実施例において後述するように、本実施形態の検出方法により、高い精度で癌を検出することができる。また、発明者らは、メチル化を検出する対象遺伝子として、ＣＤＯ１遺伝子を選択することにより、非常に精度よく癌を検出することができることを明らかにした。
【００１６】
本実施形態の検出方法において、特に便以外の生体試料を検査対象とした場合、検出できる癌は大腸癌には限られず、頭頸部癌、食道癌、胃癌、小腸癌、膵臓癌、胆管癌、胆嚢癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌等を検出することができる。
【００１７】
ＣｐＧアイランドとは、シトシンの次にグアニンが現れる２塩基配列（ジヌクレオチド）であるＣｐＧの出現頻度が、ゲノム中の他の領域と比べて高い領域のことである。ＣｐＧの「ｐ」の文字は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表している。哺乳類の遺伝子のうち４０％近くが、プロモーター内部又は近傍にＣｐＧアイランドを含んでいると考えられている。
【００１８】
便や体液等の生体試料中には、癌組織に由来するＣＤＯ１遺伝子の断片が含まれている。本実施形態の検出方法では、このＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出する。
【００１９】
ここで、プロモーター領域とは、厳密にプロモーター領域に限定されず、プロモーター領域及びその近傍を含む。より具体的には、「ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランド」は、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域及び第１エクソンに存在するＣｐＧアイランドであってもよい。ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドを含む領域の塩基配列を配列番号１に示す。
【００２０】
シトシン残基のメチル化の検出は、ＤＮＡ断片のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理とＰＣＲ法を組み合わせた方法により好適に行うことができる。バイサルファイト処理により、シトシン残基は脱アミノ化されてウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンはそのまま残る。そこで、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型とし、シトシン残基を識別するプライマーを用いたＰＣＲ法を行うことにより、シトシン残基のメチル化を検出することができる。
【００２１】
ＤＮＡ断片のバイサルファイト処理は、市販のキット（例えば、商品名「ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ（ＴＭ）  Ｋｉｔ」、ザイモリサーチ社）等を用いて実施することができる。配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片において、ＣｐＧ配列のシトシン残基が全てメチル化されていたと仮定した場合に、このＤＮＡ断片のバイサルファイト処理により得られるＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２に示す。また、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の相補鎖において、ＣｐＧ配列のシトシン残基が全てメチル化されていたと仮定した場合に、このＤＮＡ断片のバイサルファイト処理により得られるＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３に示す。
【００２２】
デジタルＰＣＲ法としては、鋳型ＤＮＡが１区画に１個又は０個存在するように鋳型を分割して行うＰＣＲ法であれば特に限定なく用いることができる。デジタルＰＣＲ法における１区画は、１ウェルであってもよいし、液滴１つであってもよい。デジタルＰＣＲ法としては、例えば、ドロップレットデジタルＰＣＲ法（バイオラッド社）等を利用することができる。
【００２３】
デジタルＰＣＲの結果、１以上の区画においてシトシン残基のメチル化を検出することができた場合には、シトシン残基のメチル化が検出されたと判断する。
【００２４】
シトシン残基のメチル化の検出は、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行うことが好ましい。これにより、癌の検出率が更に向上する。
【００２５】
ネステッドＰＣＲとは、標準的なＰＣＲの変法であり、増幅産物の特異性及び収率を高めることができる方法である。ネステッドＰＣＲでは、２対のＰＣＲプライマーを使用する。１つめのプライマーセット（アウタープライマーセット）は、標的領域の両側に位置させる。また、２つめのプライマーセット（インナープライマーセット）は、標的領域に位置させる。
【００２６】
そして、まず、アウタープライマーセットを用いたＰＣＲ（以下、「ネステッドアウターＰＣＲ」という場合がある。）を行い、続いて、インナープライマーセットを用いたＰＣＲ（以下、「ネステッドインナーＰＣＲ」という場合がある。）を行う。アウタープライマーセットを用いたＰＣＲにより、隣接領域を含めて標的領域を増幅する。続いて、インナープライマーセットを用いたＰＣＲにより標的領域を増幅する。
【００２７】
例えば、インナープライマーセットを、シトシン残基を識別するプライマーセットにすることにより、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせを実施することができる。
【００２８】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、便試料中の、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出することと、前記便試料中の便潜血を検出することと、を含み、前記シトシン残基のメチル化の検出が、デジタルＰＣＲ法により行われ、前記シトシン残基のメチル化が検出されること、又は、前記便潜血が検出されることが、前記生体試料が癌患者由来のものであることを示す、癌の検出方法を提供する。
【００２９】
第２実施形態の検出方法は、第１実施形態の検出方法と比較すると、生体試料が便試料に特定されている点、便潜血検査との組み合わせで癌を検出する点において主に異なる。
【００３０】
実施例において後述するように、第２実施形態の検出方法により、大腸癌患者をほぼ１００％の陽性率で検出することができる。便に含まれるＤＮＡのうち、９９％以上は食物由来のＤＮＡや腸内細菌由来のＤＮＡである。更に、便中には、ＰＣＲ反応を阻害する物質が多く含まれている。このため、便を用いて癌抑制遺伝子プロモーターＤＮＡのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出し、大腸癌を検出することができることは予想外であった。
【００３１】
第２実施形態の検出方法においても、前記シトシン残基のメチル化の検出は、ネステッドＰＣＲ法とデジタルＰＣＲ法との組み合わせにより行うことが好ましい。これにより、癌の検出率が更に向上する。
【００３２】
［キット］
１実施形態において、本発明は、亜硫酸水素塩と、ＣＤＯ１遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基を識別するプライマーと、デジタルＰＣＲ用試薬と、を含む、癌の検出用キットを提供する。
【００３３】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した第１実施形態の癌の検出方法を好適に実施することができる。
【００３４】
デジタルＰＣＲ用試薬としては、ＰＣＲ反応液を微小区画に分割する試薬又は容器等が挙げられる。当該試薬としては、例えばオイルが挙げられる。また、容器としては、ウェルアレイ等が挙げられる。
【００３５】
本実施形態のキットは、便潜血検出試薬を更に含んでいてもよい。このようなキットは、上述した第２実施形態の癌の検出方法を実施するのに好適である。
【実施例】
【００３６】
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３７】
［実験例１］
癌患者及び健常者の便試料について、（１）便潜血検査、（２）ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のネステッドＰＣＲ法による検出、（３）ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによる検出を行った。
【００３８】
便潜血検査は、市販のキット（商品名「採便容器Ａ１日法（ロット番号：ＮＩ２２）」、株式会社エスアールエル社）を用いて行った。
【００３９】
また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のネステッドＰＣＲ法は、次のようにして行った。まず、市販のキット（商品名「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を使用して、便試料１８０〜２２０ｍｇからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出はキットのプロトコールにしたがって行い、試料の完全なホモジナイズにビーズ（商品名「ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒグリーンビーズ」、ロシュ社）とホモジナイザー（商品名「ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ」、ロシュ社）を用いた。
【００４０】
続いて、抽出したＤＮＡ  ２μｇを市販のキット（商品名「ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ（ＴＭ）  Ｋｉｔ」、ザイモリサーチ社）を用いてバイサルファイト処理した。続いて、バイサルファイト処理後のＤＮＡの１／１０量を鋳型として、配列番号４に塩基配列を示すプライマー及び配列番号５に塩基配列を示すプライマーを用いたネステッドアウターＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応では、ポリメラーゼとして、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。また、サーマルサイクラーとして、ＭｙＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（バイオラッド社）を用いた。
【００４１】
ネステッドアウターＰＣＲの温度プログラムは次の通りであった。まず、９４℃５分の後、９４℃１分、アニーリング温度１分、７２℃１分を反復した。アニーリング温度は６６℃から開始し２℃ずつ下げていった。各アニーリング温度で２サイクル行い、最終アニーリング温度は５６℃で３２サイクル行った。最終伸長反応は７２℃１０分行った。
【００４２】
続いて、ネステッドアウターＰＣＲ後のＰＣＲ産物を市販のキット（商品名「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて精製した。続いて、ＰＣＲ産物の１／３０量を鋳型として、配列番号６に塩基配列を示すプライマー、配列番号７に塩基配列を示すプライマー及び配列番号８に塩基配列を示すＴａｑＭａｎプローブを用いて、ネステッドインナーＰＣＲを、定量的ＰＣＲを用いて行った。ＰＣＲ反応の温度プログラムは、９５℃３分の後、９５℃２０秒、アニーリング温度６０℃３０秒、７２℃３０秒を４０サイクル反復した。ＰＣＲ反応は、市販の装置（商品名「ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」、バイオラッド社）を用いて行った。
【００４３】
また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基がメチル化された陽性コントロールとして、ヒト結腸腺癌細胞株であるＤＬＤ１細胞から抽出したゲノムＤＮＡを使用し、上記と同様の反応を行った。また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基がメチル化されていない陰性コントロールとして、ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞から抽出したゲノムＤＮＡを使用し、上記と同様の反応を行った。
【００４４】
そして、定量ＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）１０サイクル時における蛍光シグナルが０．０３５以上であった症例をＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化が陽性であったと判定し、０．０３５未満の症例を陰性であったと判定した。
【００４５】
また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによる検出は、次のようにして行った。
【００４６】
まず、ネステッドアウターＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製までは、上述したネステッドＰＣＲ法と同様にして行った。続いて、精製した、ネステッドアウターＰＣＲのＰＣＲ産物の１／３０量を鋳型として配列番号６に塩基配列を示すプライマー及び配列番号７に塩基配列を示すプライマーを用いたデジタルＰＣＲ法を行った。デジタルＰＣＲ法は、市販の装置（ＱＸ２００（ＴＭ）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（ＴＭ）  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、バイオラッド社）及び専用のソフトウエアを使用して行った。
【００４７】
デジタルＰＣＲの温度プログラムは次の通りであった。まず、９５℃１０分の後、９４℃３０秒、アニーリング温度１分を４５サイクル反復した。アニーリング温度は６２℃が最適であった。続いて、デジタルＰＣＲにより得られた増幅断片のコピー数を、専用のソフト解析ツールを用いてカウントした。また、内因性コントロールとしてβ−アクチン遺伝子をｄｕｐｌｅｘ反応させ同時に検出した。
【００４８】
表１は、実験結果をまとめたものである。また、図１は、表１に示す結果に基づいて大腸癌の陽性率を算出した結果を示すグラフである。
【００４９】
表１中、「ＣＣ」は癌患者由来試料であることを示し、「Ｂ」は健常者由来試料であることを示す。また、「便潜血」は便潜血試験の結果であることを示し、「＋」は便潜血陽性であったことを示し、「−」は便潜血陰性であったことを示す。また、「ＣＤＯ１  ＱＭＳＰ」はネステッドＰＣＲ法によるシトシン残基のメチル化の検出結果であることを示し、「＋」はメチル化が検出されたことを示し、「−」はメチル化が検出されなかったことを示す。
【００５０】
また、「ＣＤＯ１  Ｄｉｇｉｔａｌ」は、ネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによるシトシン残基のメチル化の検出結果であることを示し、「＋」はメチル化が検出されたことを示し、「−」はメチル化が検出されなかったことを示す。また、カッコ内の数字は、デジタルＰＣＲ法により定量された、シトシン残基がメチル化された鋳型ＤＮＡのコピー数（個／μＬ）を示す。
【００５１】
また、「ＦＩＴ＋ＣＤＯ１  ＱＭＳＰ」は、便潜血試験の結果と、ネステッドＰＣＲ法によるシトシン残基のメチル化の検出結果を組み合わせた結果であることを示し、便潜血試験の結果と、メチル化の検出結果のいずれかが陽性であった場合を「＋」と示し、いずれも陰性であった場合を「−」と示す。
【００５２】
また、「ＦＩＴ＋ＣＤＯ１  Ｄｉｇｉｔａｌ」は、便潜血試験の結果と、ネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによるシトシン残基のメチル化の検出結果を組み合わせた結果であることを示し、便潜血試験の結果と、メチル化の検出結果のいずれかが陽性であった場合を「＋」と示し、いずれも陰性であった場合を「−」と示す。
【００５３】
また、図１中、「便」は、便潜血検査の結果であることを示す。また、「ＣＤＯ１  ＱＭＳＰ」は、ネステッドＰＣＲ法によるシトシン残基のメチル化の検出結果であることを示す。また、「ＣＤＯ１  Ｄｉｇｉｔａｌ」はネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによるシトシン残基のメチル化の検出結果であることを示す。
【００５４】
また、「ＦＩＴ＋ＣＤＯ１  ＱＭＳＰ」は、便潜血試験の結果と、ネステッドＰＣＲ法によるシトシン残基のメチル化の検出結果のいずれかが陽性であった場合に癌であると判断した結果であることを示す。また、「ＦＩＴ＋ＣＤＯ１  Ｄｉｇｉｔａｌ」は、便潜血試験の結果と、ネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによるシトシン残基のメチル化の検出結果のいずれかが陽性であった場合に癌であると判断した結果であることを示す。
【００５５】
【表１】
2020018260.tif 000002
【００５６】
その結果、便潜血検査のみでは、陽性率は８３．３％にとどまり、癌患者であるにもかかわらず、便潜血陰性である患者が存在することが明らかとなった。
【００５７】
また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のネステッドＰＣＲ法による検出のみでは、陽性率が２５．０％にとどまることが明らかとなった。
【００５８】
また、ＣＤＯ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化のデジタルＰＣＲ法による検出のみでは、陽性率が７２．９％であったことが明らかとなった。
【００５９】
また、便潜血試験又はネステッドＰＣＲ法によるシトシン残基のメチル化の検出のいずれかが陽性であった場合に癌であると判断すると、陽性率が８７．５％に上昇したことが明らかとなった。
【００６０】
また、便潜血試験と、ネステッドＰＣＲ法及びデジタルＰＣＲ法の組み合わせによるシトシン残基のメチル化の検出のいずれかが陽性であった場合に癌であると判断すると、陽性率が１００％に上昇したことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、精度よく癌を検出する技術を提供することができる。
【図１】
2020018260.tif 000003
【配列表】
2020018260000001.app