(57)【要約】      （修正有）【課題】種々の疾患（例：肥満症、脂質異常症、糖尿病、がん等）を引き起こす原因である炎症を阻害するための、マクロファージＭ１の活性化阻害方法の提供。【解決手段】ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤及び／又はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。前記PARP9阻害剤としては、PARP9特異的RNA干渉剤、PARP9に対する抗体又はその抗原結合性断片等が好ましく、PARP14活性化剤としてはPARP9に対する抗体又はその抗原結合性断片が好ましい。【選択図】図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージM1の活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
【請求項２】
PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項5または請求項6記載の組成物。
【請求項８】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項5〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項１０】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
マクロファージM1の活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
【請求項１４】
PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項13または14記載の組成物。
【請求項１６】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項13〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項17または請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項17〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項13または14記載の組成物。
【請求項２２】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項13〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
【請求項２６】
マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項25〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項25〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項25〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項25〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項25〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項25〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
初代マクロファージを、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、M1マクロファージの活性化を阻害する方法。
【請求項４４】
単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
【請求項４５】
単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤およびポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
【請求項４６】
a.  単球またはマクロファージの集団を提供する段階；および
b.  単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階
を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
【請求項４７】
マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項43〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項43〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項43〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項43〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項43、45〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項43、45〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項55〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項43、45〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項44〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
【請求項６５】
過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
過度または持続性の炎症の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項64または65記載の方法。
【請求項６７】
マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項64〜66のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって、該対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
【請求項６９】
対象において、接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項67または70記載の方法。
【請求項７２】
マクロファージ活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項64〜67、および71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、請求項68〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項72または73記載の方法。
【請求項７５】
単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項64〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項64〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項64〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項64〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項78〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項64〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項64〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項64〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、請求項64〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、請求項64〜67、71〜72、74〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項64、66〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象に、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項９３】
それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって：
a.  アテローム動脈硬化症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに
b.  該対象に、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
【請求項９４】
対象において、単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、請求項92または93記載の方法。
【請求項９５】
単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、請求項92〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項92〜97記載の方法。
【請求項１００】
PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項92〜99のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項101〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項92〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項92〜106のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
薬学的組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、請求項92〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
薬学的組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む、請求項92〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、ならびに炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、請求項92、94〜110のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
過度または持続性の炎症を有するまたは発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項92〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
前記薬学的組成物の投与のために対象を選択する段階をさらに含む、請求項93〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
アテローム動脈硬化症が、冠動脈、頸動脈、腸骨-大腿動脈、腎動脈または他の動脈において起こる、請求項89または111記載の方法。
【請求項１１６】
マクロファージ活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
【請求項１１７】
マクロファージ活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
【請求項１１８】
炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
【請求項１１９】
単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
【請求項１２０】
単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
【請求項１２１】
単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
【請求項１２２】
単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
【請求項１２３】
炎症促進性マクロファージの活性化がM1活性化を含む、請求項116〜122記載の方法または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119(e)条の下、2013年11月14日に提出された米国特許仮出願第61/904,241号の恩典を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は、マクロファージ活性化および炎症を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
生物における免疫系は、外来病原体を特定することおよび殺滅することによって感染から防御するように機能する。免疫系は、特別な細胞、タンパク質、組織、および器官から構成されている。それは、ウイルスから寄生蠕虫類にわたる病原体を検出し、それらを生物の正常な細胞および組織から識別する。しかし、時に免疫系は、正しく機能し損なって、これが病気に繋がる可能性がある。例えば、マクロファージ活性化の持続のような炎症応答の制御解除が起こって、炎症性疾患を誘発する可能性がある。炎症は、アテローム動脈硬化症、糖尿病などの代謝障害、自己免疫疾患、がん、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症を含む、様々な慢性疾患の病理発生に重大な役割を果たす。これらの慢性炎症性疾患は、世界中のほぼ5億人を冒し、それらは、我々の社会の大きな健康問題および経済的負担を表している。そのうえ、これらの疾患の多くは、体を衰弱させ、ますます我々の高齢化社会にありふれたものになりつつある。
【０００４】
主に自然免疫細胞および適応免疫細胞によって仲介される慢性軽度炎症は、肥満症と、脂質異常症および糖尿病を含む代謝障害との間の重要で過度なまたは持続的な連鎖として出現した。そのうえ、アテローム動脈硬化症は、慢性炎症性障害であると広く受け入れられている。動脈における慢性炎症過程は、急性心筋梗塞および脳卒中を含む組織虚血を招くアテローム動脈硬化性プラークの形成に繋がる。関節リウマチ（RA）および全身性エリテマトーデス（SLE）を含む自己免疫疾患は、身体の免疫応答が、それ自体の組織に向けられ、長期炎症およびその後の組織破壊を引き起こすことによって特徴づけられる。そして、炎症が、がんの発生、進行および転移において重大であることも周知である。免疫系が感染または損傷からホストを防御することおよび組織修復を促進することに従事しないこれらの炎症状況において、マクロファージ活性化は、様々な疾患の一因となるそのようなコントロール不能の持続性炎症に決定的に関与する。したがって、マクロファージの病理学的活性化をコントロールするための新しい方法が、有用である。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示の態様は、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）およびポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）が、非活性化、非極性化マクロファージ、およびそれらの前駆細胞である単球の調節因子であるという発見に基づく。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子（TNFα、IL-1βおよびiNOS）を誘導した一方で、抗炎症性M2のマーカー（Arg1およびMRC1）を減少させるが、これは、PARP14が、M1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2の極性化を促進することを示している。対照的に、siRNAのサイレンシング実験によって、PARP9がM1活性化を促進することが実証された。
【０００６】
したがって、PARP9および／またはPARP14の発現および／または活性を調節することは、単球またはマクロファージM1活性化および炎症の阻害を可能にする。例えば、望ましくない過度または持続性の炎症がその状態の発症、発生および／または進行の一因となることが公知であるかまたはその可能性が高い状態を、治療、予防および／または管理するための、ヒトにおいて見出される望ましくない過度または持続性の炎症の阻害である。
【０００７】
単球またはマクロファージの炎症促進性活性化（例えばM1活性化）の阻害方法を提供することが、本開示の目的である。
【０００８】
単球またはマクロファージM1の活性化の阻害方法を提供することが、本開示の目的である。
【０００９】
ヒトにおいて見出される望ましくない過度または持続性のマクロファージ活性化または炎症を阻害する方法を提供することも、本開示の目的である。
【００１０】
望ましくない過度または持続性のマクロファージ活性化または炎症が、状態の発症、発生および／または進行の一因となることが公知である、またはその可能性が高い該状態の治療および／または予防および／または管理の方法を提供することも、本開示の目的である。
【００１１】
ヒトにおける慢性アテローム動脈硬化症および／または他の慢性もしくは急性の動脈または静脈疾患の発生または臨床的合併症（例えば、冠動脈のステント内再狭窄、静脈グラフト不全、および血管炎）の治療および／または予防のための方法を提供することも、本開示の目的である。
【００１２】
したがって、一態様では、M1活性化などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００１３】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００１４】
一態様では、M1活性化などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法も、本明細書において提供される。
【００１５】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法も、本明細書において提供される。
【００１６】
一態様では、M1活性化などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００１７】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００１８】
一態様では、M1活性化などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００１９】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２０】
一態様では、M1活性化などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２１】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２２】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防する方法であって、対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２３】
一態様では、それを必要とする対象において過度または持続性のマクロファージ活性化または炎症を阻害する方法であって、対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２４】
一態様では、それを必要とする対象において過度または持続性のマクロファージ活性化または炎症を阻害する方法であって、対象に、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２５】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または動脈もしくは静脈疾患を治療するまたは予防する方法であって、（a）アテローム動脈硬化症および／または血管疾患を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに（b）対象に、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、アテローム動脈硬化症および／または動脈もしくは静脈疾患の治療または予防は、アテローム動脈硬化症および／または動脈もしくは静脈疾患の発生または臨床的合併症を治療するまたは予防することを含む。
【００２６】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または動脈もしくは静脈疾患の発生または臨床的合併症を治療するまたは予防する方法であって、（a）アテローム動脈硬化症および／または血管疾患を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに（b）対象に、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２７】
一態様では、それを必要とする対象において過度または持続性のマクロファージ活性化または炎症を阻害する方法であって、（a）過度または持続性の炎症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに（b）対象に、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【００２８】
任意の一方法の一態様では、アテローム動脈硬化症は、慢性であり、それは、アテローム動脈硬化症が、少なくとも過去3ヶ月間起こっていることを意味する。
【００２９】
任意の一方法の一態様では、血管疾患は、急性または慢性である。
【００３０】
任意の一方法の一態様では、血管疾患には、非限定的に、冠動脈アテローム動脈硬化症、頸動脈アテローム動脈硬化症、末梢動脈（または動脈）疾患、ステント内再狭窄、腎動脈疾患、糖尿病性血管障害、血管炎（例えば、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、バージャー病、川崎病）、大動脈瘤、脳血管疾患、移植動脈症、末梢動脈（または動脈）疾患のための静脈グラフトの狭細化または閉塞、冠動脈のための静脈グラフトの狭細化または閉塞、動静脈瘻／グラフトの狭細化または閉塞、組織工学による血管の狭細化または閉塞が含まれる。
【００３１】
任意の一方法の一態様では、血管疾患には、非限定的に、急性心筋梗塞（AMI）における血管合併症（すなわち、体内の血管に波及する合併症）、AMI後の心臓リモデリング／機能障害、心不全、脳卒中、脳卒中後の脳損傷、肢虚血および血管性勃起障害が含まれる。
【００３２】
任意の一方法の一態様では、マクロファージM1の活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む。
【００３３】
任意の一方法の一態様では、マクロファージ活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおけるM1などの炎症促進性極性化を阻害することを含む。
【００３４】
任意の一方法の一態様では、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化の阻害は、炎症促進性M1の遺伝子発現の抑制を含む。
【００３５】
任意の一方法の一態様では、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性極性化の阻害は、炎症促進性遺伝子発現の抑制を含む。単球／マクロファージの活性化は、M1以外の任意の形態の炎症促進性極性化によって判断することもできる。
【００３６】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む。
【００３７】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症の阻害は、単球および／またはマクロファージにおけるM1極性化などの炎症促進性極性化を阻害することを含む。
【００３８】
任意の一方法の一態様では、マクロファージ活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む。
【００３９】
任意の一方法の一態様では、対象において、接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が、阻害される。
【００４０】
任意の一方法の一態様では、対象において、接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性極性化（例えばM1）が、阻害される。
【００４１】
任意の一方法の一態様では、対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が、増加される。
【００４２】
任意の一方法の一態様では、抑制される炎症促進性M1遺伝子には、非限定的に、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン12（IL-12）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）が含まれる。
【００４３】
任意の一方法の一態様では、マクロファージ活性化の阻害は、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む。
【００４４】
任意の一方法の一態様では、抗炎症性M2のマーカーは、アルギナーゼ1（Arg1）、マンノース受容体Cタイプ1（MRC1）、IL-10、RHAMM（CD168）、レジスチン様-α（Retnla;Fizz1としても公知）およびキチナーゼ3様3（Chi3l3;Ym1としても公知）である。
【００４５】
任意の一方法の一態様では、単球またはマクロファージの集団は、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される。
【００４６】
任意の一方法の一態様では、組成物は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む。
【００４７】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9の発現を阻害する。
【００４８】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、小分子または核酸である。
【００４９】
任意の一方法の一態様では、核酸は、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである。
【００５０】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、PARP9核酸配列とハイブリダイズする。
【００５１】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、特異的にPARP9遺伝子に向けたsiRNAである。
【００５２】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤は、siRNA、ssRNA、dsRNA、shRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む。
【００５４】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤は、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤のヌクレオチド配列は、非限定的に、
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を含む。
【００５６】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9タンパク質の活性を阻害する。
【００５７】
一態様では、PARP9活性の阻害剤は、PARP9とPARP9結合パートナーとの相互作用を妨害する。一部の態様では、PARP9の結合パートナーには、STATおよびユビキチンリガーゼ（DTX3L）が含まれる。
【００５８】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に結合するアプタマーである。アプタマーは、特異的標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子である。
【００５９】
任意の一方法の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる。
【００６０】
任意の一方法の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【００６１】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。
【００６２】
任意の一方法の一態様では、組成物は、注射、輸液、または点滴注入によって投与される。
【００６３】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物は、注射、輸液、または点滴注入によって投与される。
【００６４】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む。
【００６５】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症は、非限定的に、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフトの閉塞または狭細化、動静脈（AV）瘻および／またはグラフトの閉塞または狭細化、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、炎症性腸疾患、および心臓弁疾患（例えば、大動脈弁石灰化、大動脈弁狭窄）からなる群より選択される状態において見出される。
【００６６】
任意の一方法の一態様では、自己免疫性または自己炎症性疾患は、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される。
【００６７】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む。
【００６８】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む。
【００６９】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物の投与のための対象を選択することをさらに含む。
【００７０】
一態様では、マクロファージM1の活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物も、本明細書において提供される。
【００７１】
一態様では、M1極性化などのマクロファージ活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物も、本明細書において提供される。
【００７２】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物も、本明細書において提供される。
【００７３】
一態様では、M1極性化などのマクロファージ活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物も、本明細書において提供される。
【００７４】
任意の一組成物の一態様では、組成物は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む。
【００７５】
任意の一組成物の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9の発現を阻害する。
【００７６】
任意の一組成物の一態様では、PARP9阻害剤は、小分子または核酸である。
【００７７】
任意の一組成物の一態様では、核酸は、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである。
【００７８】
任意の一組成物の一態様では、RNA干渉剤は、PARP9核酸配列とハイブリダイズする。
【００７９】
任意の一組成物の一態様では、RNA干渉剤は、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む。
【００８０】
任意の一組成物の一態様では、RNA干渉剤は、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
任意の一組成物の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9タンパク質の活性を阻害する。
【００８２】
任意の一組成物の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【００８３】
任意の一組成物の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる。
【００８４】
任意の一組成物の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】マクロファージ極性化における全プロテオームのハイスループットスクリーニングのために使用された細胞培養プロトコールを示す。10ng/mLインターフェロンガンマ（IFNγ）を最大72時間補充して、初代または細胞系マクロファージを炎症促進表現型（M1）に向けて極性化させた。10ng/mLインターロイキン4（IL4）を抗炎症性表現型（M2）のために使用した。M0は、刺激なしにマクロファージを培養することと定義した。
【図１Ｂ】M0（未刺激）、M1（IFNγ刺激）およびM2（IL-4刺激）条件でマウスRAW264.7細胞およびヒトTHP-1細胞から定量されたタンパク質（2種以上のペプチド）のベン（Venn）図を示す。RAW264.7細胞においてタンパク質5137種を、THP1において5635種を特定した。RAW264.7におけるタンパク質2688種およびTHP1における3991種は、M0、M1およびM2条件の全てに共通して存在した。
【図１Ｃ】RAW264.7実験（i、ii）およびTHP-1実験（iii、iv）についてM0（薄灰色のトレース）対M1（濃灰色のトレース）またはM2（黒色のトレース）条件についてのlog10規準化タンパク質プロファイルの重ね合わせを示す。破線は、確立された有意性閾値+0.13を示す（i、iii、v、vii）。RAW264.7実験（v、vi）およびTHP-1実験（vii、viii）からの、存在度がM1閾値（i）を超えるタンパク質を抽出したプロファイル。M1において閾値を超えて増加したが、M2条件で減少したタンパク質について抽出したタンパク質プロファイル；RAW264.7（ix）およびTHP1（x）。
【図２Ａ】1）M0、M1およびM2条件の全てに共通であるタンパク質を選択し、2）M1で有意に増加し（＞0.13）、M2で減少する（＜0）タンパク質を選択し、3）マウス（RAW264.7）およびヒト（THP-1）マクロファージ細胞系で共通であるタンパク質を選択することを含む、フィルタリング戦略によって、PARP14がマクロファージ極性化の可能な制御因子として呼び出されたことを示す。RAW264.7の極性化M0、M1およびM2実験において特定されたPARP14ペプチドについてのMS2スペクトルを示す。主bおよびyイオンを示す。挿入図は、TMTレポーターイオンチャネルおよびそれらの対応する時点を含む。小文字は、TMT標識アミノ酸を示す。
【図２Ｂ】1）M0、M1およびM2条件の全てに共通であるタンパク質を選択し、2）M1で有意に増加し（＞0.13）、M2で減少する（＜0）タンパク質を選択し、3）マウス（RAW264.7）およびヒト（THP-1）マクロファージ細胞系で共通であるタンパク質を選択することを含む、フィルタリング戦略によって、PARP14がマクロファージ極性化の可能な制御因子として呼び出されたことを示す。マウスRAW264.7細胞およびヒトTHP-1細胞におけるM0、M1およびM2データセットからのPARP14およびPARP9についてのタンデム質量タグ付け由来の相対タンパク質存在度プロファイルを示す。PARP14は、両方の細胞系で、M1において増加し、M2において減少したが、M0において有意には変化しなかった。RAW264.7およびTHP-1の両方で、「マクロPARP」として、PARPドメインと結合したマクロドメイン1〜3個をPARP14と共有することが知られているPARP9も、M1において増加し、M2において減少した。
【図２Ｃ】1）M0、M1およびM2条件の全てに共通であるタンパク質を選択し、2）M1で有意に増加し（＞0.13）、M2で減少する（＜0）タンパク質を選択し、3）マウス（RAW264.7）およびヒト（THP-1）マクロファージ細胞系で共通であるタンパク質を選択することを含む、フィルタリング戦略によって、PARP14がマクロファージ極性化の可能な制御因子として呼び出されたことを示す。刺激の24時間後のマクロファージ極性化におけるPARP9およびPARP14のmRNA発現パターンを示す（n＝3）。（*および**は、それぞれANOVAによるp＜0.05およびp＜0.01を示す）。プロテオミクスのデータに類似して、PARP14およびPARP9は、THP-1でのM1刺激（IFNγの24時間補充）において有意に増加し、M2刺激（IL4を24時間補充）において減少した。
【図２Ｄ】1）M0、M1およびM2条件の全てに共通であるタンパク質を選択し、2）M1で有意に増加し（＞0.13）、M2で減少する（＜0）タンパク質を選択し、3）マウス（RAW264.7）およびヒト（THP-1）マクロファージ細胞系で共通であるタンパク質を選択することを含む、フィルタリング戦略によって、PARP14がマクロファージ極性化の可能な制御因子として呼び出されたことを示す。PARP9およびPARP14タンパク質の発現がウエスタンブロッティングによって確認されたことを示す。プロテオミクスおよびmRNAに一致して、刺激開始の24時間後に、PARP9およびPARP14の両方がM1において増加し、M2において減少した。
【図３Ａ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。マウスマクロファージ細胞系RAW264.7において、低分子干渉RNA（siRNA）によるPARP14遺伝子のサイレンシングが、TNFα（TNF）およびiNOS（NOS2）などのM1マーカー遺伝子の有意な上昇ならびにM2マーカー遺伝子MRC1（Mrc1）の有意な減少を誘導したことを示す。
【図３Ｂ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。同様に、ヒトマクロファージ細胞系THP-1において、PARP14遺伝子のサイレンシングが、TNFα（TNF）およびIL-1β（IL1B）などのM1マーカー遺伝子の有意な上昇ならびにM2マーカー遺伝子MRC1（Mrc1）の有意な減少を誘導したことを示す。
【図３Ｃ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。THP-1細胞（n＝3）において、上清中へのM1マーカーおよび炎症性サイトカイン（TNFα、IL-1β）の放出が、PARP14をサイレンシングすることによって有意に促進されたことを示す。
【図３Ｄ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。培養ヒトCD14+末梢血単核細胞（PBMC）において、TNFα遺伝子の有意な増加およびMRC1遺伝子の減少が、PARP14のサイレンシングによって誘導されたことを示す。各点は、それぞれのドナーのそれぞれの遺伝子における4つ組の平均を示す（合計でドナー3人）。
【図３Ｅ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。PARP14のサイレンシングが、PARP9の有意な増加を誘導したことを示す。逆に、PARP14遺伝子は、PARP9のサイレンシングにより増加する傾向であった。
【図３Ｆ】PARP14（図3A〜3D）およびPARP9（図3F）のサイレンシングが、マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系および初代マクロファージの極性化に及ぼす効果ならびにPARP14およびPARP9の可能な相互作用（図3D）を示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。PARP14のサイレンシングと対照的に、PARP9のサイレンシングが、TNFα（TNF）、IL-1β（IL1B）およびCCL2（CCL2）などのM1マーカー遺伝子の有意な減少、ならびにMRC1（Mrc1）遺伝子の増加を誘導したことを示す（THP-1、N＝3）。
【図４Ａ】PARP14（図4A、4B）およびPARP9（図4C）のサイレンシングが、マクロファージ極性化におけるSTAT1、STAT6およびSTAT3介在性細胞シグナル伝達経路に及ぼす効果を示す。*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。PARP14のサイレンシングが、M1環境（10ng/mL IFNγを30分間）でSTAT1のリン酸化の増加を誘導した一方で、総STAT1に有意な変化を誘導しなかったことを示す。他方、それは、M2（10ng/mL IL4を30分間）においてSTAT6のリン酸化の顕著な低下を誘導した（THP-1、N＝3）。
【図４Ｂ】PARP14（図4A、4B）およびPARP9（図4C）のサイレンシングが、マクロファージ極性化におけるSTAT1、STAT6およびSTAT3介在性細胞シグナル伝達経路に及ぼす効果を示す。*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。同様に、ホスホ-STAT6および総STAT6のELISAによって、M2におけるSTAT6のリン酸化の有意な減少が量的に示されたことを示す。
【図４Ｃ】PARP14（図4A、4B）およびPARP9（図4C）のサイレンシングが、マクロファージ極性化におけるSTAT1、STAT6およびSTAT3介在性細胞シグナル伝達経路に及ぼす効果を示す。*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。PARP14のサイレンシングと対照的に、PARP9のサイレンシングによって、M1ではSTAT1のリン酸化における低下が誘導されたが、総STAT1に有意な変化はなく、M2ではSTAT6のリン酸化に有意な変化がなかったことが示された（THP-1、N＝3）。
【図４Ｄ】PARP14（図4A、4B）およびPARP9（図4C）のサイレンシングが、マクロファージ極性化におけるSTAT1、STAT6およびSTAT3介在性細胞シグナル伝達経路に及ぼす効果を示す。*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。STAT3のリン酸化が、PARP9またはPARP14のどちらのサイレンシングによっても影響されなかったことを示す。
【図５Ａ】PARP14欠損マウスから単離された腹腔マクロファージを含む初代マクロファージ（図5A〜5C）および骨髄マクロファージ（図5D）が、炎症特性（M1）を悪化しやすく、抗炎症特性（M2）を弱めやすいことを示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。PARP+/+マウス（N＝3）よりもPARP14-/-マウスにおいて、M1刺激におけるM1マーカー遺伝子（（iNOS（Nos2）およびTNFα（TNF））が、有意に高く、M2刺激におけるM2マーカー遺伝子（MRC1（Mrc1）およびArg1（Arg1））が有意に低いことを示す。
【図５Ｂ】PARP14欠損マウスから単離された腹腔マクロファージを含む初代マクロファージ（図5A〜5C）および骨髄マクロファージ（図5D）が、炎症特性（M1）を悪化しやすく、抗炎症特性（M2）を弱めやすいことを示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。ウエスタンブロッティングのデンシトメトリーで、PARP14+/+マウスよりもPARP14-/-マウスにおいて、総STAT1（tSTAT1）に対するリン酸化STAT1の比が有意に高く、総STAT6に対するリン酸化STAT6（pSTAT6）の比（pSTAT1/tSTAT6）が有意に低かったことが明らかとなったことを示す。グラフ中の各点は、それぞれのドナー（合計でドナー3人）における2つ組の試料の平均を表す。
【図５Ｃ】PARP14欠損マウスから単離された腹腔マクロファージを含む初代マクロファージ（図5A〜5C）および骨髄マクロファージ（図5D）が、炎症特性（M1）を悪化しやすく、抗炎症特性（M2）を弱めやすいことを示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。腹腔マクロファージによるTNFαおよび一酸化窒素の分泌が、PARP14+/+マウスと比べてPARP14-/-マウスにおいて有意に高かったことを示す。
【図５Ｄ】PARP14欠損マウスから単離された腹腔マクロファージを含む初代マクロファージ（図5A〜5C）および骨髄マクロファージ（図5D）が、炎症特性（M1）を悪化しやすく、抗炎症特性（M2）を弱めやすいことを示す；*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。同様に、骨髄マクロファージにおいて、PARP14-/-においてM1刺激でM1マーカー遺伝子（iNOS（Nos2）およびTNFα（TNF））が有意に高く、M2マーカー遺伝子（MRC1（Mrc1）が低かったことを示す。別のM2マーカー遺伝子Arg1（Arg1）は、PARP14-/-マウスにおいて低めの傾向にあったが、有意ではなかった。グラフ中の各点は、それぞれのドナーにおける4つ組の試料の平均を表す（合計でドナー5人）。
【図６】PARP14-/-マウスにおけるワイヤー介在性血管傷害の2週間後の新生内膜肥厚がPARP14+/+マウスよりも高度であったことを示す。中膜面積に対する新生内膜面積の比は、PARP14-/-マウス（n＝5）において有意に高かった。スケールバーは100μmを示す。
【図７Ａ】マクロファージ極性化におけるマスター制御因子の候補を特定するためのクラスタリング戦略を示す。M1において増加し、M2において減少し、M0において有意な変化を示さないと判定されたタンパク質の階層的クラスタリングを説明するヒートマップである。RAW264.7細胞についてタンパク質n＝490種およびTHP-1細胞についてタンパク質n＝414種。各行は、タンパク質の遺伝子IDに対応する。
【図７Ｂ−１】マクロファージ極性化におけるマスター制御因子の候補を特定するためのクラスタリング戦略を示す。RAW264.7およびTHP-1データセットの両方で特定された、図7Aからのタンパク質38種の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。各行は、タンパク質の遺伝子IDに対応する。
【図７Ｂ−２】詳細は図7B-1に記載の通り。
【図８】心血管疾患とのそれらの関連を予測するネットワーク解析を示す。左欄：ランダムな期待値と比較した、インタラクトームにおけるPARP14-PARP9の第1近傍（first neighbor）と、心血管および代謝疾患モジュールとの近接性の有意性をp値によって示す。モジュールを結ぶ線の太さは、報告されたp値の有意性を表す。右欄：PARP9およびPARP14モジュールと冠動脈疾患（CAD）モジュールとの間の全ての最短経路。全ゲノム関連研究（GWAS）解析からのCAD疾患遺伝子であるPLEKHO2（プレクストリン相同ドメイン含有ファミリーOメンバー2）、LIPA、SH2B3、FN1（フィブロネクチン1）、HLA-DQB1（主要組織適合複合体クラスII、DQベータ1）およびABCA1（ヒト輸送体サブファミリーABCAメンバー1）は、他の疾患遺伝子と比較してPARP14近傍と最大の相互作用を有する。
【図９】図9AおよびBは、PARP14およびPARP9のインビトロおよびインビボ発現を示す。図9Aは、ウエスタンブロットによって視覚化されたPARP14およびPARP9タンパク質の発現を示す。β-アクチンに対して規準化されたPARP14およびPARP9の相対タンパク質存在度を定量した（グラフ、n＝3）。図9Bは、高脂肪食を給餌されたApoe-/-マウスの大動脈からのアテローム動脈硬化性プラークにおけるPARP14およびPARP9の発現を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図１０Ａ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。M1（THP-1、n＝3）において、PARP14のサイレンシングが、PARP9遺伝子発現を有意に増加させたことを示す。
【図１０Ｂ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。免疫共沈（IP）アッセイで、PARP9とPARP14との複合体が明らかとなったことを示す。
【図１０Ｃ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。PARP9が、PARP14によるSTAT1αのADP-リボシル化を阻害することを示す（タンパク質リボシル化アッセイ）。PARP14の自己リボシル化も示す。
【図１０Ｄ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。ヒトSTAT1αのC末端アミノ酸配列を示す。下線付きのアミノ酸は、リボシル化ペプチドを示し；リボシル化部位は枠内である。STAT1は、Y701でリン酸化されることが公知である。
【図１０Ｅ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。2種のモノ-ADP-リボシル化ペプチドおよびそれらの対応する未修飾形態についてのMS/MSスペクトルを示す。矢印は、ADP-リボース断片を指す。*、リボシル化部位；m、酸化Met。灰色の丸は、バックグラウンドイオンを示す。
【図１０Ｆ】PARP9およびPARP14の潜在的相互作用を示す。PARP9によるPARP14介在性STAT1αリボシル化の阻害の、MS1に基づく定量を示す。AUC、曲線下面積。*および**は、それぞれスチューデントのt検定によるp＜0.05およびp＜0.01を示す。
【図１１Ａ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。PARP14-/-マウスおよびPARP14+/+マウス由来の培養腹腔マクロファージを示す。M1およびM2の遺伝子発現プロファイルを示す（n＝3）。
【図１１Ｂ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。PARP14-/-マウスおよびPARP14+/+マウス由来の培養腹腔マクロファージを示す。培地中への炎症因子の分泌を示す（n＝3）。
【図１１Ｃ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。PARP14-/-マウスおよびPARP14+/+マウス由来の培養腹腔マクロファージを示す。リン酸化STAT1およびSTAT6のウエスタンブロットおよび対応するデンシトメトリー定量を示す。各データ点は、ドナー（n＝3）1人あたりの3つ組試料の平均である。
【図１１Ｄ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。PARP14-/-マウスおよびPARP14+/+マウスからの骨髄由来マクロファージからのM1およびM2の遺伝子発現データを示す。各データ点は、ドナー（n＝5）1人あたりの4つ組試料の平均である。
【図１１Ｅ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。PARP14-/-マウスおよびPARP+/+マウスの機械的に傷害した大腿動脈における病変形成の定量を示す。Mac3の染色は、マクロファージの蓄積を表す（n＝5）。
【図１１Ｆ】PARP14の欠失が、マクロファージ活性化およびインビボ動脈病変形成を増強することを示す。新生内膜のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）に続く遺伝子発現解析を示す（n＝4）。
【図１２】ヒトプラークマクロファージにおけるPARP9およびPARP14の発現を示すプロットのセットである。安定／不安定プラークにおけるPARP14+またはPARP9+マクロファージの蔓延性。
【図１３Ａ】CD14+マクロファージの単一細胞遺伝子発現解析を示す（n＝3）。PARP14およびPARP9に関する本明細書記載の新規な知見を組み入れている、マクロファージ極性化のモデルを示す。ドナー3人の合同および各ドナーにおける、M0細胞と比較したM1細胞における不均一性を示す。
【図１３Ｂ】CD14+マクロファージの単一細胞遺伝子発現解析を示す（n＝3）。PARP14およびPARP9に関する本明細書記載の新規な知見を組み入れている、マクロファージ極性化のモデルを示す。群1と群2との間のマクロファージの機能に関連する遺伝子の比較を示す。群1および群2は、全てのドナー／条件からの細胞の類似性マップから得ることができ、その類似性マップは、3つの亜集団；IFNγで刺激されたM1細胞（1）、未刺激のM0細胞（2）および混合集団（3）を明らかにしている（データは示さず）。M1（1）内にさらなる2つの亜集団（群1および2）がある。
【図１３Ｃ】CD14+マクロファージの単一細胞遺伝子発現解析を示す（n＝3）。PARP14およびPARP9に関する本明細書記載の新規な知見を組み入れている、マクロファージ極性化のモデルを示す。PARP9/14、STAT、JAKおよびIRF遺伝子の遺伝子類似性マップである。
【図１３Ｄ】CD14+マクロファージの単一細胞遺伝子発現解析を示す（n＝3）。作業仮説の模式図である。
【図１３Ｅ】CD14+マクロファージの単一細胞遺伝子発現解析を示す（n＝3）。標的発見研究の模式的ワークフローである。医薬品開発への包括的検証に向けた包括的スクリーニングからの完全統合型の標的発見研究。
【図１４−１】RAW264.7細胞およびTHP-1細胞におけるクラスター化データセットの概要を示す。RAW264.7細胞およびTHP-1細胞のモデルに基づくクラスター。y軸：規準化相対存在度の合計；x軸：TMT分析のために収集された刺激後の時点。各プロットにおける破線は、閾値y=0.16（すなわち合計を規準化後の無変化）を示す。
【図１４−２】詳細は図14-1に記載の通り。
【図１４−３】詳細は図14-1に記載の通り。
【図１４−４】詳細は図14-1に記載の通り。
【図１４−５】詳細は図14-1に記載の通り。
【図１４−６】詳細は図14-1に記載の通り。
【図１５−１】心血管障害および代謝障害の疾患モジュールを示す。X軸は、各疾患において所与の遺伝子が一緒にクラスターを形成する確率を示す（矢印）。
【図１５−２】詳細は図15-1に記載の通り。
【図１６−１】M0、M1およびM2のRAW264.7細胞で特定された、PARP14およびPARP9ペプチドについてのMS/MSスペクトル例のセットである。主bおよびyイオンを示す。挿入図は、TMTレポーターイオンチャネルおよびそれらの対応する時点を含む。小文字は、TMT標識アミノ酸を示す。
【図１６−２】詳細は図16-1に記載の通り。
【図１６−３】詳細は図16-1に記載の通り。
【図１７−１】各条件M0、M1およびM2でのRAW264.7細胞およびTHP-1細胞におけるPARP14およびPARP9の定量に使用された全てのPSMの規準化log比についての中央値を相対エラーバー付きで示す。
【図１７−２】詳細は図17-1に記載の通り。
【図１７−３】詳細は図17-1に記載の通り。
【図１８】細胞生存度／増殖／アポトーシスアッセイを示す。PARP14およびPARP9のサイレンシングは、マウス骨髄由来マクロファージの生存度、増殖およびアポトーシスに有意な効果を及ぼさなかった（n＝3）。
【図１９】STAT3リン酸化のウエスタンブロット検出を示す。PARP14またはPARP9のサイレンシングは、THP-1細胞におけるSTAT3のリン酸化（pSTAT3）に効果を及ぼさなかった。総STAT3（tSTAT3）。
【図２０Ａ−１】平滑筋細胞および内皮細胞におけるPARP9/14の機能を示す。PARP14欠損は、SMCにおけるTNFαおよびiNOSの発現を促進した一方で、SMC関連遺伝子を変化させなかった。傷害した大腿動脈内膜において、SMα-アクチン陽性面積は類似していた。PARP9のサイレンシングは、ECにおけるICAM1発現を抑制した一方で、他の遺伝子では有意な変化が起こらなかった。
【図２０Ａ−２】詳細は図20A-1に記載の通り。
【図２０Ａ−３】詳細は図20A-1に記載の通り。
【図２０Ｂ】平滑筋細胞および内皮細胞におけるPARP9/14の機能を示す。PARP14欠損は、SMCにおけるTNFαおよびiNOSの発現を促進した一方で、SMC関連遺伝子を変化させなかった。傷害した大腿動脈内膜において、SMα-アクチン陽性面積は類似していた。PARP9のサイレンシングは、ECにおけるICAM1発現を抑制した一方で、他の遺伝子では有意な変化が起こらなかった。
【図２１】PARP9/14に加えてマクロファージ極性化に重要な役割を果たすCD14陽性PBMCおよび遺伝子の類似性マップのセットである。M0およびM1条件の両方における全てのドナー（ドナー1〜3）からの試料の類似性マップ。PARP9/14は、M0条件と比較してM1条件において、STAT1、STAT6、STAT2、JAK1、JAK2、JAK3、IRF1およびIRF5と密接に関連している。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
定義
便宜上、本出願全体（明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む）に採用される特定の用語が、ここに集められる。特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。したがって、特定の遺伝子もしくはタンパク質の発現または細胞機能によって計測される炎症促進性シグネチャーを有する単球またはマクロファージの任意のサブセットは、PARP9またはPARP14調節の標的であることができる。
【００８７】
本明細書において使用される用語「含んでいる（comprising）」または「含む（comprises）」は、本発明に不可欠な方法およびそのそれぞれの構成要素を参照して使用されるが、それでも不可欠であろうとなかろうと未特定の要素の包含を許容する。「含んでいる」の使用は、限定よりもむしろ包含を示す。
【００８８】
一態様では、本明細書において使用される用語「マクロファージM1の活性化」は、非活性化マクロファージまたは単球が、TH-1およびTH-17細胞の抗原特異的炎症応答を前向きに推進することを助ける大量のTNF、IL-12、およびIL-23を産生するように、非活性化マクロファージまたは単球の機能的活性を変化させる過程を表す。一部の態様では、「マクロファージM1の活性化」は、マクロファージが、活性化M1マクロファージサブタイプに典型的な以下の特徴：高い抗原提示能；オプソニン受容体［例えばFcgRIII(CD16)］；高いインターロイキン-12（IL-12）産生；高いIL-23産生；低いIL-10産生、高い炎症促進性サイトカイン（IL-1、TNFおよびIL-6）産生、結果としての極性化I型応答の活性化；L-アルギニンからの一酸化窒素（NO）、活性酸素種（ROS）などの毒性中間体の高産生；ならびにCXCL1、2、3、5、8、9および10ならびにCCL2、3、4、5、11、17および22などの炎症性ケモカインの産生の、少なくとも1つを獲得することを招く非活性化マクロファージの変態を表す。しかし、本明細書記載のアプローチは、このM1極性化モデルに限定されないことに留意すべきである。したがって、特定の遺伝子もしくはタンパク質の発現または細胞機能によって計測される、炎症促進性シグネチャーを有する単球またはマクロファージの任意のサブセットは、PARP9またはPARP14調節の標的であることができる。一態様では、本明細書記載の方法および組成物は、M1極性化マクロファージ集団のサブセットまたは亜集団に適用可能であることができる。
【００８９】
本明細書において使用される用語「マクロファージ（M1）活性化を阻害する」は、マクロファージが、本明細書記載の活性化M1マクロファージサブタイプに典型的な表現型の特徴を獲得することを停止、阻止または低下させることを意味する。ある態様では、阻害することは、PARP9阻害剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP9阻害剤と接触またはそれで処理された細胞集団において、マクロファージM1の特徴の少なくとも5％の低下である。PARP9阻害剤で処理された細胞集団におけるPARP9発現のパーセンテージは、PARP9阻害剤が添加されていない比較可能な対照処理集団よりも少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれより低いことが好ましい。
【００９０】
本明細書において使用される、本明細書記載の方法における用語「M1マクロファージ極性化」または「炎症促進性M1の極性化」は、活性化M2マクロファージサブタイプに典型的な発生中の表現型特徴に向けてではなく、本明細書記載の活性化M1マクロファージサブタイプに典型的な発生中の表現型特徴に向けた非活性化マクロファージまたは単球の移行を表す。
【００９１】
ある態様では、活性化M2マクロファージサブタイプに典型的な表現型特徴には、非限定的に、IL-2およびIL-23の低産生；IL-10の高産生、高レベルのスカベンジャー、マンノース、およびガラクトース型受容体；IL-1-RA、IL-1β、およびカスパーゼ1の高産生；デコイIL-1タイプII受容体の高発現、ならびにCCL17、CCL22およびCCL24などの炎症性サイトカインの産生が含まれた。
【００９２】
本明細書において使用される用語「炎症促進性M1の極性化を阻害する」は、マクロファージが本明細書記載の活性化M1マクロファージサブタイプに典型的な発生中の表現型特徴に向けて移行することを停止、阻止または低下させることを意味する。ある態様では、阻害することは、PARP9阻害剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP9阻害剤と接触またはそれで処理された細胞集団において、マクロファージM1の特徴の少なくとも5％の低下を招く。PARP9阻害剤で処理された細胞集団におけるPARP9発現のパーセンテージは、PARP9阻害剤が添加されていない細胞の比較可能な対照処理集団よりも少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれより低いことが好ましい。
【００９３】
一態様では、本明細書において使用される用語「非活性化マクロファージ」は、当技術分野において公知でありおよびまた本明細書記載のM1およびM2マクロファージサブタイプに典型的な表現型特徴を獲得していないマクロファージを表す。
【００９４】
本明細書において使用される語句「慢性炎症を伴う疾患」は、任意の医学的状態であって、慢性炎症が、該医学的状態の部分として観察される、かつ／または慢性炎症が、該医学的状態の開始および／もしくは進行に寄与する要因であることが指し示されている医学的状態を表す。一態様では、炎症は、マクロファージだけでなく、非限定的に、Tリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞、マスト細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞、および線維芽細胞を含む様々な他の細胞型によっても仲介または加速される。一態様では、慢性炎症は、医学的状態の診断症状である。
【００９５】
本明細書において使用される用語「慢性炎症」は、主として新しい結合組織形成によって特色づけられる長期および持続性の炎症を表し；それは、急性型または長期低度型の継続であり得る。一態様では、「慢性炎症」は、「過度または持続性の炎症」を意味する。
【００９６】
一態様では、本明細書において使用される用語「過度または持続性の炎症」は、急性感染または傷害に対する防御に十分な免疫防御メカニズムをホストに提供するという恒常性状態を上回った継続中の炎症応答を表す。別の態様では、本明細書において使用される用語「過度または持続性の炎症」は、応答の結果として許容されないレベルの組織損傷を引き起こしている継続中の炎症応答であって、急性感染または傷害に対する防御に関係しない炎症応答を表す。
【００９７】
本明細書において使用される用語「PARP9の阻害剤」またはPARP9阻害剤」は、PARP9発現を阻害する、またはPARP9活性を阻害する任意の薬剤を表す。
【００９８】
「PARP9発現を阻害する」によって、PARP9阻害剤と接触された、またはそれで処理された細胞集団において、PARP9阻害剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP9の発現量が、少なくとも5％低いことが意味される。PARP9阻害剤で処理された細胞集団におけるPARP9の発現パーセンテージは、PARP9阻害剤が添加されていない比較可能な対照処理集団よりも少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれより低いことが好ましい。
【００９９】
「PARP9活性を阻害する」によって、PARP9阻害剤と接触された、またはそれで処理された細胞集団において、PARP9阻害剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP9の機能的活性の量が、少なくとも5％低いことが意味される。PARP9阻害剤で処理された集団におけるPARP9活性のパーセンテージは、PARP9阻害剤が添加されていない比較可能な対照処理／接触細胞集団よりも少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれより低いことが好ましい。最小でも、PARP9活性は、PARP9の発現量を、当技術分野において標準的な技法を用いてタンパク質またはmRNAレベルで決定することによってアッセイすることができる。あるいは、または加えて、PARP9活性は、PARP9阻害剤を用いた処理、または接触後に、IL-1β、TNFα、IL-6を含む炎症因子の発現をmRNAまたはタンパク質レベルで測定することによって、アッセイすることができる。あるいは、または加えて、PARP9活性のレベルは、その標的タンパク質のADP-リボシル化によってアッセイすることができる。
【０１００】
本明細書において使用される用語「PARP14の活性化剤」または「PARP14活性化剤」は、PARP14の発現またはPARP14タンパク質の活性を増加させる任意の薬剤を表す。
【０１０１】
本明細書において使用される語句「PARP14の活性化または促進」は、PARP14の発現またはPARP14タンパク質の活性を増加させることを意味する。
【０１０２】
「PARP14の発現を増加させる」によって、PARP14活性化剤と接触またはそれで処理された細胞集団において、PARP14活性化剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP14の発現量が、少なくとも5％高いことが意味される。PARP14活性化剤で処理された細胞集団におけるPARP14の発現パーセンテージは、PARP14活性化剤が添加されていない比較可能な対照細胞集団よりも少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれより高いことが好ましい。
【０１０３】
「PARP14活性を増加させる」によって、PARP14活性化剤と接触またはそれで処理された細胞集団において、PARP14活性化剤が存在しない比較可能な対照細胞集団よりも、PARP14の機能的活性が、少なくとも5％高いことが意味される。PARP14活性化剤で処理された集団におけるPARP14の活性パーセンテージは、PARP14活性化剤が添加されていない比較可能な対照処理／接触細胞集団よりも少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれより高いことが好ましい。最小でも、PARP14活性は、PARP14の発現量を、当技術分野において標準的な技法を用いてタンパク質またはmRNAレベルで決定することによってアッセイすることができる。あるいは、または加えて、PARP14活性は、PARP14活性化剤を用いた処理または接触後に、ケモカインCCL17、CCL22およびCCL24；サイトカインIL-2、IL-23IL-10、IL-1-RA、IL-1β、IL-6、カスパーゼ1、ならびに他の炎症促進性分子の発現をmRNAまたはタンパク質レベルで測定することによってアッセイすることができる。あるいは、または加えて、PARP14の活性レベルは、その標的タンパク質のADP-リボシル化によってアッセイすることができる。
【０１０４】
用語「薬剤」は、普通は存在しない、または細胞、組織もしくは対象に投与されるレベルで存在しない任意の実体を表す。薬剤は：化学物質；小分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；アプタマー；抗体；またはその機能的断片を含む群より選択することができる。核酸配列は、RNAまたはDNAであることができ、1本鎖または2本鎖であることができ：関心対象のタンパク質をコードする核酸；オリゴヌクレオチド；および核酸類似体；例えばペプチド-核酸（PNA）、偽相補的（pseudo-complementary）PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）などを含む群より選択することができる。そのような核酸配列には、非限定的に、例えば転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えば非限定的にRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（mRNAi）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどとして作用する、タンパク質をコードする核酸配列が含まれる。タンパク質および／もしくはペプチドまたはそれらの断片は、任意の関心対象のタンパク質、例えば、非限定的に；突然変異型タンパク質；治療用タンパク質；切断型タンパク質であることができ、その際、該タンパク質は、通常は不在である、または細胞中により低いレベルで発現される。タンパク質は、また、突然変異型タンパク質、遺伝子操作タンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディーボディー（midibody）、トリボディー（tribody）、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変タンパク質およびそれらの断片を含む群より選択することができる。薬剤は、それが細胞と接触し、その効果を誘導する培地に適用することができる。あるいは、薬剤をコードする核酸配列が細胞内に導入され、それが転写され、細胞内での核酸および／またはタンパク質の環境刺激の産生を招く結果として、薬剤は、細胞内であることができる。一部の態様では、薬剤は、非限定的に合成および天然の非タンパク質性実体を含む、任意の化学物質、実体または部分である。特定の態様では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、マクロライド、レプトマイシンおよび関連天然産物またはそれらの類似体を含む、非置換または置換のアルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分を含んだ。薬剤は、所望の活性および／もしくは性質を有することが公知であることができ、または多種多様な化合物のライブラリーより選択されることができる。
【０１０５】
本明細書において使用される用語「小分子」は、1000ダルトン未満の低分子量有機化合物または化学物質である。一態様では、低分子は、10-9メートルの規模のサイズを有する。
【０１０６】
組成物、担体、希釈剤および試薬を表す、本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」およびその文法的変形は、互換的に使用され、材料が、悪心、めまい、胃の不調などの望ましくない生理学的作用の産生なしに哺乳動物にまたは哺乳動物上に投与可能であることを表す。各担体は、また、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容され」なければならない。中に溶解または分散された活性成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、製剤に基づき限定される必要はない。薬学的製剤は、本発明の化合物を、1種または複数種の薬学的に許容される成分と組み合わせて含有する。担体は、固体、半固体または液体の希釈剤、クリームまたはカプセルの形態であることができる。典型的には、そのような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射用として調製されるが、使用前に液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製することができる。調製物は、リポソーム組成物として乳化または提示されることもできる。薬学的に許容され、活性成分と適合性であり、本明細書記載の治療方法における使用に適した量の賦形剤と、活性成分は、混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。加えて、所望であれば、組成物は、活性成分の有効性を増強する湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などといった少量の補助物質を含有することができる。本発明の治療用組成物は、その中に成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成された酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成された）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩は、また、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどといった有機塩基由来であることができる。生理学的に耐容される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水以外に物質を含有しない、または生理学的pH値のリン酸ナトリウムなどの緩衝剤、生理食塩水、もしくはリン酸緩衝食塩水のようにその両方を含有する、無菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、1種を超える緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有することができる。液体組成物は、また、水に加えて、および水を除く、液相を含有することができる。そのような追加的な液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油乳剤である。特定の障害または状態の処置に有効な、本発明において使用される活性薬剤の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技法によって決定することができる。語句「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、1つの器官、または身体の一部から別の器官または身体の一部に対象薬剤を運搬または輸送することに関与する、液体または固体の増量剤、希釈��、賦形剤、溶媒または封入物質などの薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、そう望まれない限り、それと一緒に混合される薬剤に対する免疫応答の生成を促進しない。
【０１０７】
本明細書において使用される「投与される」は、所望の部位での阻害剤または活性化剤の少なくとも部分的な局在を招く方法または経路による、対象へのPARP9阻害剤またはPARP14活性化剤の配置を表す。PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤は、対象における有効な処置を招く任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は、対象における所望の位置への送達を招き、その位置に組成物の少なくとも一部が送達され、すなわち、少なくともPARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤は、ある期間、所望の部位において活性である。阻害剤および／または活性化剤が活性である期間は、対象に投与後のインビボ半減期に依存し、数時間、例えば24時間という短期間から、数日まで、数年という長期間までであることができる。投与様式には、注射、輸液、点滴注入、または経口摂取が含まれる。「注射」には、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射および輸液が含まれる。他の態様では、投与は、また、例えば噴霧を用いた、エアロゾル吸入が含まれる。他の態様では、投与は、全身性または局所性であることができる。
【０１０８】
用語「有効量」は、処置されようとする病状のための処置を提供するために十分な投薬量を意味する。これは、患者、疾患および行われようとする処置に応じて変動する。
【０１０９】
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、意図される目的を達成するために十分な量を表す。例えば、組成物の有効量は、マクロファージおよび単球の炎症促進性M1の極性化を阻害するPARP9阻害剤を含む。障害、疾患、または医学的状態を処置または回復するための有効量は、障害、疾患、または医学的状態の症状の低下または完全な除去を招くために十分な量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤の投与を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的などの要因に応じて変動する。各個別の場合における有効量は、当技術分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
【０１１０】
一態様では、用語「治療すること」または「治療」は、対象の臨床症状を安定化または改善することを意味する。別の態様では、「治療すること」または「治療」は、そのような状態に関連する少なくとも1つの症状を軽減もしくは緩和すること、または本明細書記載の状態の症状の回復を引き起こす点で、そのような状態の進行もしくは予期される進行を減速もしくは後退させることも意味する。
【０１１１】
本明細書において使用される用語「予防する」または「予防」は、有害作用および本明細書記載の医学的状態に関連する少なくとも症状の発生の開始を停止、妨害、および／または減速することを表す。
【０１１２】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送する能力のある核酸分子を表す。ベクターの1種は、追加的な核酸セグメントを中にライゲートすることができる環状2本鎖DNAループを表す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加的な核酸セグメントをウイルスゲノム内にライゲートすることができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入されるホスト細胞において自己複製する能力がある（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、ホスト細胞内に導入されるとホスト細胞のゲノム中に組み込まれることによって、ホストゲノムと一緒に複製される。そのうえ、特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指令する能力がある。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」、またはより簡単には「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えDNA技法において有用な発現ベクターは、多くの場合に、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるので、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に使用することができる。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。一態様では、本発明の1種または複数種のsiRNA分子を細胞に送達するために、レンチウイルスが使用される。
【０１１３】
発現ベクター内での「機能的に連結される」は、関心対象のヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが標的細胞内に導入される場合は標的細胞において）、制御配列に連結されることを意味することが意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。制御配列には、多種類のホスト細胞においてヌクレオチド配列の構成性発現を指令する制御配列および特定のホスト細胞だけにヌクレオチド配列の発現を指令する制御配列が含まれる（例えば、組織特異的制御配列）。さらに、RNA干渉剤は、特定の間隔で、または特定の期間にわたり本発明のsiRNAの合成を指令するための制御配列を含むベクターによって送達され得る。発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望のsiRNAの発現レベルなどの要因に依存できることは、当業者によって理解される。
【０１１４】
本発明の発現ベクターを標的細胞に導入することによって、本発明のsiRNA分子を産生させることができる。一態様では、DNAテンプレート、例えば突然変異型アレルに対するsiRNA分子をコードするDNAテンプレートは、RNAポリメラーゼIII（Pol III）のコントロール下で発現ベクターにライゲートされ、標的細胞に送達され得る。Pol IIIは、3'末端がチミジン4〜5個のストレッチ内での終止によって定義される、低分子非コード転写物の合成を指令する。したがって、DNAテンプレートは、RNAiをもたらすsiRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方をインビボで合成するために使用され得る（Sui, et al. (2002) PNAS 99(8):5515）。
【０１１５】
本明細書記載の方法により使用することができる「抗体」には、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合性断片、および免疫グロブリンの抗原結合性ドメインを含む抗原結合性タンパク質が含まれる。免疫グロブリンの抗原結合性断片には、例えば、Fab、Fab'、F（ab'）2、scFvおよびdAbsが含まれる。結合特異性を保持するが、例えば、二重特異性、多価（2つを超える結合部位）、および小型のサイズ（例えば、結合ドメイン単独）を含む、望ましくあり得る他の特徴を有する、改変された抗体形態が開発されている。1本鎖抗体は、派生元の抗体全体の定常ドメインの一部または全てを欠如する。したがって、それらは、抗体全体の使用に関連する問題の一部を克服することができる。例えば、1本鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生物学的分子との間の特定の望ましくない相互作用を有さない傾向にある。追加的に、1本鎖抗体は、抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも大きな透過性を有することができ、標的抗原結合部位に1本鎖抗体をより効率的に局在および結合させる。さらに、比較的小さなサイズの1本鎖抗体は、それらがレシピエントにおいて望まれない免疫応答を誘発する可能性を抗体全体よりも低くする。第1のペプチドリンカーによって共有結合された1つのVHおよび1つのVLドメインを各1本鎖が有する複数の1本鎖抗体を、少なくとも1つまたは複数のペプチドリンカーによって共有結合させて、単一特異性または多特異性であることができる多価1本鎖抗体を形成させることができる。多価1本鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片および可変重鎖断片を含み、ペプチドリンカーによって少なくとも1つの他の鎖に連結されている。ペプチドリンカーは、少なくともアミノ酸15個の残基から成り立っている。リンカーのアミノ酸残基の最大数は、およそ100である。2つの1本鎖抗体を組み合わせて、二価二量体としても公知の二重特異抵抗体を形成させることができる。二重特異性抗体は、2つの鎖および2つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であることができる。二重特異性抗体の各鎖は、VLドメインによって結合されたVHドメインを含む。これらのドメインは、同じ鎖上でのドメイン間の対形成を阻止するために十分に短いリンカーで結合されているので、異なる鎖上での相補性ドメイン間の対形成を推進して、2つの抗原結合部位を再創出する。3種の1本鎖抗体を組み合わせて、三価三量体としても公知のトリアボディー（triabody）を形成させることができる。トリアボディーは、VLまたはVHドメインのアミノ酸末端がVLまたはVHドメインのカルボキシル末端に直接融合されて、すなわち、いかなるリンカー配列もなしに、構築される。トリアボディーは、ポリペプチドが頭から尾の方式で環状に配列された3つのFv頭部を有する。トリアボディーの可能なコンフォメーションは、3つの結合部位が相互に角度120°で一平面の状態で配置された平面状である。トリアボディーは、単一特異性、二重特異性または三重特異性であることができる。したがって、本明細書記載の方法に有用な抗体には、非限定的に、抗原と特異的に結合する天然抗体、（Fab'）2などの二価断片、Fabなどの一価断片、1本鎖抗体、1本鎖Fv（scFv）、単一ドメイン抗体、多価1本鎖抗体、二重特異抵抗体、トリアボディーなどが含まれる。
【０１１６】
抗体は、当業者に公知の方法によってポリペプチドまたはポリペプチドの一部に対して作製することもできる。抗体は、ウサギまたはマウスなどの動物において、遺伝子産物またはその断片を免疫処置することによって容易に作製される。免疫処置されたマウスは、ハイブリドーマの製造用のB細胞源を提供するために特に有用であり、次いでハイブリドーマが培養されて大量のモノクローナル抗体が産生される。抗体の製造方法は、例えば、Harlow et al., 1988に詳細に説明されている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を、本明細書記載の方法に使用することができるものの、特定のタンパク質に対して増加した特異性を必要とする条件では、モノクローナル抗体が使用されることが好ましい。
【０１１７】
詳細な説明
特に説明しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, Jones & Bartlett Publishingによって出版, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.によって出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.によって出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出され得る。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。
【０１１８】
特に述べない限り、本発明は、当業者に公知の標準的な手順、例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982)；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005)、Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)、Methods in Molecular biology, Vol.180, Transgenesis Techniques by Alan R. Clark editor, second edition, 2002, Humana Press、およびMethods in Meolcular Biology, Vo. 203, 2003, Transgenic Mouse, Marten H. Hofker and Jan van Deursen編における標準的な手順を用いて行われた。
【０１１９】
本発明は、本明細書記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変動し得ることを理解すべきである。本明細書において使用される用語法は、特定の態様のみを記載することを目的とし、本発明の範囲を限定することが意図されず、本発明の範囲は、特許請求の範囲だけにより定義される。
【０１２０】
操作実施例以外で、または特に示した場合、本明細書において使用された成分の量または反応条件を表現する全ての数字は、全ての場合で用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用されたときの用語「約」は、±1％を意味する。
【０１２１】
特定された全ての特許および刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得る、そのような刊行物中に記載された方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、単に、本出願の出願日前にそれらが開示されているために提供される。この点に関し、先行発明の効力またはその他の理由により、本発明者らがそのような開示に先行する権利を与えられないという承認であると何ら解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する全ての記載または内容に関する表示は全て、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【０１２２】
本開示は、マクロファージおよび単球の活性化を阻害するための、PARP9および／またはPARP14の発現および／または活性を阻害する方法、ならびに炎症を抑制するためのそれらの使用に関する。
【０１２３】
本開示の態様は、マクロファージ活性化を制御するタンパク質群の特定に基づく。ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）は、M1マクロファージの極性化に典型的な遺伝子の発現を促進する一方で、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PAPP14）は、反対の効果を発揮する。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子（TNF-α、IL-1βおよびiNOS）を誘導する一方で、抗炎症性M2のマーカー（Arg1およびMRC1）を減少させ、PARP14がM1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2極性化を促進することを示している。対照的に、siRNAのサイレンシング実験によって、PARP9がM1活性化を促進することが実証された。これは、PARP9およびPARP14が、代謝障害、アテローム硬化性血管疾患、自己免疫疾患およびがんにおける病理学的マクロファージ活性化に密接に関連したマクロファージ極性化の主要制御因子であることを実証する最初の報告である。したがって、PARP9およびPARP14は、非活性化、非極性化マクロファージおよびそれらの前駆細胞である単球の調節因子である。
【０１２４】
炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物質などの有害な刺激に対する血管組織の複合型生物学的応答の一部分である。急性炎症の古典的徴候は、疼痛、熱、発赤、腫脹、および機能喪失である。炎症は、傷害性刺激を除去し、治癒過程を開始するための生物による防御の試みである。炎症が感染によって引き起こされる場合であっても、炎症は感染の同義語ではない。感染は微生物によって引き起こされるものの、炎症は、病原体に対する生物の応答の1つである。しかし、炎症は、常同性応答であり、したがって、各病原体に特異的な適応免疫と比較して、自然免疫のメカニズムとして見なされる。
【０１２５】
炎症は、急性または慢性のいずれかとして分類することができる。急性炎症は、有害刺激に対する身体の初期応答であり、血液から傷害組織内への血漿および白血球（特に顆粒球）の移動増加によって達成される。生化学的事象のカスケードは、炎症応答を広げ、成熟させ、局所血管系、免疫系、および傷害組織内の様々な細胞に波及する。炎症応答は傷害性刺激を除去して治癒過程を開始するために、有害刺激周囲に特定量の組織破壊を伴った。しかし、組織の進行性破壊は、生物の生存を損なうであろう。慢性炎症は、また、例えば枯草熱、歯周炎、アテローム動脈硬化症、関節リウマチ、およびさらにはがん（例えば胆嚢がん）などの多数の疾患に繋がる可能性がある。炎症が、通常、身体によって密接に制御されるのは、その理由からである。
【０１２６】
慢性炎症としても公知の長期炎症は、炎症部位に存在する細胞型における進行性の移行に繋がり、炎症過程から組織の破壊および治癒が同時に起こることによって特徴づけられる。慢性炎症は、応答の結果として、過度で許容されないレベルの組織損傷に繋がる可能性があり、急性感染または傷害に対する防御に関係しない。多くの場合、これらの組織リモデリングは、生物の正常な生理学的機能を妨害し、アテローム動脈硬化症および関節リウマチなどの障害に繋がるので、望ましくない。
【０１２７】
マクロファージ活性化は、炎症を伴うアテローム動脈硬化症、代謝障害および他の重大な疾患の発生に寄与することが、公知である。炎症促進性（M1）マクロファージが優位で、抗炎症性（M2）マクロファージを欠如する微小環境は、疾患状態を仲介する過度の炎症に繋がる。したがって、PARP9および／またはPARP14を調節することによる病理学的マクロファージ活性化の抑制は、望ましくない慢性炎症が結びつけられている多種多様な疾患の魅力的な治療選択肢として役立つことができる。例えば、望ましくない過度または持続性の炎症が、その状態の発症、発生および／または進行の一因となることが公知であるかまたはその可能性が高い状態を、治療、予防および／または管理するための、ヒトにおいて見出される望ましくない過度または持続性の炎症の阻害である。
【０１２８】
したがって、一態様では、M1などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１２９】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。PARP9がM1活性化を促進し、PARP14がM1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、かつ抗炎症性M2の極性化を促進することが示されている。非活性化マクロファージおよびそれらの前駆細胞である単球においてPARP9を阻害することによって、接触された細胞を活性化から阻害することが可能である。または活性化単球またはマクロファージにおいてPARP9を阻害することによって、それらの炎症促進性特性を低下させることが可能である。同様に、非活性化マクロファージおよびそれらの前駆細胞である単球においてPARP14を活性化または促進することによって、これらの細胞におけるM1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2極性化を促進することが可能である。または活性化単球もしくはマクロファージにおけるPARP14を活性化することによって、それらの炎症促進性特性を低下させることが可能である。さらに、非活性化または活性化マクロファージおよびそれらの前駆細胞である単球において、PARP9を阻害することおよびPARP14を活性化または促進することの組み合わせは、また、これらの細胞におけるM1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、かつ／または抗炎症性M2極性化を促進することができる。
【０１３０】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法も、本明細書において提供される。
【０１３１】
一態様では、M1などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法も、本明細書において提供される。
【０１３２】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３３】
一態様では、M1などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３４】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３５】
一態様では、M1などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３６】
一態様では、マクロファージM1の活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３７】
一態様では、M1などの炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３８】
様々な疾患に及ぼすマクロファージ活性化の重大な影響にかかわらず、その根底にあるメカニズムは不明なままである。アテローム動脈硬化症などの炎症性疾患は、古典的活性化（M1）マクロファージが優位な微小環境において全盛を極め得る一方で、代わりに活性化M2マクロファージは、抗炎症性環境を促進し得る。IFNγ（M1）またはIL-4（M2）で刺激されたヒトおよびマウスマクロファージ細胞系の全プロテオームスクリーニングによって、2種のアデノシン二リン酸（ADP）-リボシル化酵素であるPARP9/ARTD9およびPARP14/ARTD8を、マクロファージ活性化の主要制御因子についての候補として特定した。インタラクトーム分析は、PARP9およびPARP14を冠動脈疾患と密接に関連づけた。PARP14のサイレンシングは、見たところSTAT1およびSTAT6経路を調節することを介して、ヒトおよびマウスマクロファージ細胞系ならびに初代マクロファージにおいて、M1傾斜を促進したが、M2傾斜を抑制した。しかし、PARP9のサイレンシングは、STAT1リン酸化およびM1極性化を抑制した。免疫共沈によって、PARP14およびPARP9が、相互に物理的に相互作用し得ることが示された。ADP-リボシル化アッセイによって、PARP9が、PARP14によって誘導されるリボシル化を障害し得ることが示された。質量分析によって、PARP14が、STAT1?における少なくとも2つの部位をADP-リボシル化することができ、それをPARP9が抑制したことが実証された。インビボで、PARP14-/-マウスの機械的に傷害された動脈は、病変形成、マクロファージ蓄積、およびM1関連遺伝子の発現を加速した。ヒトプラークにおいてPARP9の免疫活性を示すのは、「安定」よりも「不安定」な形態的特徴を有するマクロファージの方が多かった。これらの知見は、PARP14およびPARP9が、マクロファージ活性化のメカニズムを相互に制御することを示しており、新しい心血管疾患療法の可能性、および転帰にマクロファージ活性が影響する障害に対する処置の可能性をもたらしている。
【０１３９】
ヒトにおいて見出される状態の発症、発生および／または進行に、望ましくない過度または持続性の炎症が寄与することが公知または結びつけられている状態を、治療および／または予防および／または管理したいという欲求がある。そのような状態の非包括的な例には、非限定的に、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト不全、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患が含まれる。
【０１４０】
したがって、一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防するおよび／または管理する方法であって、対象からの単球および／またはマクロファージを、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤からなる組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４１】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防するおよび／または管理する方法であって、対象からの単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法も、本明細書において提供される。
【０１４２】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防するおよび／または管理する方法であって、対象からの単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４３】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防するおよび／または管理する方法であって、対象からの単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４４】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するおよび／または予防するおよび／または管理する方法であって、（a）対象から単球もしくはマクロファージの集団または両細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４５】
一態様では、それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４６】
一態様では、それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４７】
一態様では、それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって、（a）アテローム動脈硬化症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに（b）PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１４８】
本発明者らは、様々な炎症性疾患の新規な治療標的として、マクロファージの病理学的活性化を調節するためのマクロファージ極性化の主要制御因子を探究した。タンデム質量タグ付け戦略（TMT）を用いて、M1刺激因子としてのインターフェロンガンマ（IFNγ）またはM1誘導因子としてのインターロイキン4（IL-4）のいずれかに応答した、それぞれマウスおよびヒトマクロファージ細胞系であるRAW264.7およびTHP-1のプロテオームにおける変化を定量した。マウスからのタンパク質5816種およびヒト細胞系における4723種を定量した。これらのデータのクラスター解析によって、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ9（PARP9）、PARP14およびDTX3Lを、マクロファージ極性化のマスター制御因子の候補として特定した。ネットワーク解析によって、PARP9-PARP14ネットワークが冠動脈疾患遺伝子モジュールと密接に関連づけられた。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子（TNF-α、IL-1βおよびiNOS）を誘導し、一方で抗炎症性M2のマーカー（Arg1およびMRC1）を減少させた。これは、PARP14が、STAT1のリン酸化を誘導し、かつSTAT6のリン酸化を低下させながら、M1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、かつ抗炎症性M2極性化を促進することを示しており、それらがシグナル伝達メカニズムに果たす役割を示している。追加的に、PARP14欠損マウス由来の初代マクロファージにおいて、M1遺伝子は劇的に増加したが（40倍超）、一方でM2マーカーは極度に減少した（1/30未満）。対照的に、siRNAサイレンシング実験によって、PARP9が、STAT6活性化を抑制しながら、STAT1リン酸化を介したM1活性化を促進することが実証された。
【０１４９】
任意の一方法の一態様では、マクロファージM1の活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む。
【０１５０】
任意の一方法の一態様では、マクロファージ活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおけるM1などの炎症促進性極性化を阻害することを含む。
【０１５１】
任意の一方法の一態様では、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化の阻害は、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む。
【０１５２】
任意の一方法の一態様では、単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性極性化の阻害は、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む。
【０１５３】
任意の一方法の一態様では、対象における過度または持続性の炎症の阻害は、対象における単球および／またはマクロファージにおける炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む。目的は、単球および／またはマクロファージのM1極性化を抑制することである。同時に、または別々に、単球および／またはマクロファージのM2極性化を促進することである。この戦略を用いて、炎症促進性M1マクロファージが優位で、抗炎症性M2マクロファージを欠如している、慢性炎症に典型的な微小環境を、正反対の微小環境である、抗炎症性M2マクロファージが優位で、炎症促進性M1マクロファージを相対的に欠如する微小環境に移行させることができる。
【０１５４】
任意の一方法の一態様では、対象における過度または持続性の炎症の阻害は、対象における単球および／またはマクロファージでのM1などの炎症促進性マクロファージの極性化を阻害することを含む。目的は、単球および／またはマクロファージの極性化（例えばM1）を抑制することである。同時にまたは別々に、単球および／またはマクロファージの非極性化／抗炎症性極性化（例えばM2）を促進することである。この戦略を用いて、炎症促進性マクロファージが優位で抗炎症性マクロファージが欠乏した、慢性炎症において典型的な微小環境を、正反対の微小環境である、抗炎症性マクロファージが優位で、炎症促進性マクロファージを相対的に欠如する微小環境に移行させることができる。
【０１５５】
任意の一方法の一態様では、マクロファージM1の活性化の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む。
【０１５６】
任意の一方法の一態様では、炎症促進性マクロファージの活性化（例えばM1）の阻害は、単球および／またはマクロファージにおける抗炎症性極性化（例えばM2）のマーカーの発現を増加させることを含む。
【０１５７】
接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が、対象において阻害される任意の一方法の一態様では、炎症因子（IL-1γ、TNFα、IL-6）の発現が、そのような接触前の発現と比較して減少される。
【０１５８】
接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性極性化が、対象において阻害される任意の一方法の一態様では、M1マクロファージに典型的な炎症因子（IL-1γ、TNFα、IL-6）の発現が、そのような接触前の発言と比較して減少される。
【０１５９】
任意の一方法の一態様では、対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される。
【０１６０】
任意の一方法の一態様では、対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性マクロファージマーカーの発現が増加される。
【０１６１】
任意の一方法の一態様では、抑制される炎症促進性M1遺伝子は、非限定的に、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）、IL-6、および誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）からなる群より選択される。
【０１６２】
任意の一方法の一態様では、抑制される炎症促進性遺伝子は、非限定的に、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）、IL-6、および誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）からなる群より選択される。
【０１６３】
任意の一方法の一態様では、マクロファージM1の活性化の阻害は、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む。
【０１６４】
任意の一方法の一態様では、マクロファージの炎症促進性活性化（例えばM1）の阻害は、抗炎症性マクロファージ（例えばM2）のマーカーの発現を増加させることを含む。
【０１６５】
任意の一方法の一態様では、抗炎症性M2のマーカーには、非限定的に、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）が含まれる。
【０１６６】
任意の一方法の一態様では、単球またはマクロファージの集団は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤とエクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される。
【０１６７】
一態様では、単球または非活性化マクロファージは、エクスビボまたはインビトロで接触される。特定の一態様では、接触されようとする細胞は、骨髄系列の細胞である。骨髄系列の細胞は、単球を生じ、それが今度はマクロファージを生じる。一態様では、組成物は、PARP9の発現を阻害する。
【０１６８】
ある態様では、単球または非活性化マクロファージは、骨髄系列由来の細胞に特徴的な、以下の細胞表面マーカーの少なくとも1つを有する：CD68、F4/80（EMR1）およびCD11b。
【０１６９】
任意の一方法の一態様では、アテローム動脈硬化症は、慢性である、すなわち、アテローム動脈硬化症が少なくとも過去3ヶ月間起こっている。
【０１７０】
任意の一方法の一態様では、血管疾患は、急性または慢性である。
【０１７１】
血管疾患には、冠動脈疾患または末梢動脈疾患などの、対象の循環系を冒す任意の状態が含まれる。これは、対象の動脈、静脈およびリンパ管の疾患から、循環を冒す血液障害に及ぶ。
【０１７２】
任意の一方法の一態様では、血管疾患には、非限定的に、冠動脈アテローム動脈硬化症、頸動脈アテローム動脈硬化症、末梢動脈（または動脈）疾患、ステント内再狭窄、腎動脈疾患、糖尿病性血管障害、血管炎（例えば、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、バージャー病、川崎病）、大動脈瘤、脳血管疾患、移植動脈症、末梢動脈（または動脈）疾患のための静脈グラフトの狭細化または閉塞、冠動脈のための静脈グラフト狭細化または閉塞、動静脈瘻／グラフトのための狭細化または閉塞、組織工学による血管の狭細化または閉塞が含まれる。本明細書記載の任意の一方法の一部の態様では、血管疾患には、急性心筋梗塞（AMI）後の心室リモデリングおよび脳卒中後の脳損傷などといった、その合併症が含まれる。
【０１７３】
任意の一方法の一態様では、組成物は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む。任意の一方法の一態様では、脂質封入製剤は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤が、主として単球および非活性化マクロファージへ向けられるように製剤化される。
【０１７４】
したがって、任意の一方法の一態様では、脂質は、単球およびマクロファージ中への送達のためにPARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を封入する。一態様では、本明細書記載のPARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤は、陽イオン性ポリマー、例えば、PEI、ポリアミンであるスペルミジンおよびスペルミン、または陽イオン性ペプチド、例えばプロタミンおよびポリリシンと縮合され、脂質粒子中に封入される。リポソームは、段階的に集合された多層を含むことができる。
【０１７５】
脂質材料は、リポソームを産生するために当技術分野において周知であり、日常的に利用される。脂質には、スフィンゴミエリンなどの相対的に硬い種類、または不飽和アシル鎖を有するリン脂質などの液体タイプが含まれ得る。「リン脂質」は、リポソームを形成する能力のある任意の1種のリン脂質またはリン脂質の組み合わせを表す。卵、ダイズもしくは他の植物源から得られたもの、または部分もしくは完全合成のもの、または多様な脂質鎖長および不飽和度のものを含むホスファチジルコリン（PC）が、本発明における使用に適している。非限定的に、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、水素化ダイズホスファチジルコリン（HSPC）、ダイズホスファチジルコリン（ダイズPC）、卵ホスファチジルコリン（卵PC）、水素化卵ホスファチジルコリン（HEPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）およびジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）を含む、合成、半合成および天然産物のホスファチジルコリンが、本発明における使用に適したホスファチジルコリンである。これらのリン脂質の全てが、市販されている。さらに、ホスファチジルグリセロール（PG）およびリン酸（PA）も、本発明における使用に適したリン脂質であり、それらには、非限定的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジラウリルホスファチジルグリセロール（DLPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）ジミリストイルホスファチジン酸（DMPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）、ジラウリルホスファチジン酸（DLPA）、およびジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）が含まれる。ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）は、多くの場合に製剤中に使用される負荷電脂質である。
【０１７６】
他の適切なリン脂質には、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアロイル、およびパルミチン酸鎖を含むホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジン酸が含まれる。脂質膜を安定化するために、コレステロールなどの追加的な脂質成分を追加してもよい。本発明によりリポソームを産生させるための脂質には、コレステロール（CH）とさらに組み合わせたホスファチジルエタノールアミン（PE）およびホスファチジルコリン（PC）が含まれ得る。例えば、本発明のリポソームを産生させるための脂質およびコレステロールの組み合わせは、PE:PC:Cholのモル比3:1:1を含む。さらに、リン脂質を含有するポリエチレングリコール（PEG）の組み入れも、本発明によって企図されている。
【０１７７】
加えて、細胞内皮システム中へのリポソームの取込みを阻止し、関心対象の組織内へのリポソームの取込みを増強するために、リポソームの外表面は、長期循環性の物質で修飾され得る。長期循環性の物質としての親水性ポリマーを用いたリポソームの修飾は、血中でのリポソームの半減期を延長できることが公知である。
【０１７８】
本明細書記載の核酸セグメントを封入しているリポソームは、当業者に公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、本発明のリポソーム調製物は、逆相蒸発（REV）法（米国特許第4,235,871号を参照されたい）、注入手順、または界面活性剤希釈によって産生させることができる。リポソームを産生させるためのこれらおよび他の方法の総説は、1 LIPOSOMES, (Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, 1983)に見出され得る。Szokaら、9 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 467 (1980)も参照されたい。
【０１７９】
任意の一方法の一態様では、脂質封入製剤は、リポソームである脂質粒子を含む。任意の一方法の一態様では、脂質封入製剤は、ミセルである脂質粒子を含む。
【０１８０】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9の発現を阻害する。
【０１８１】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、小分子または核酸である。
【０１８２】
任意の一方法の一態様では、核酸は、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクター、またはPARP9と結合するアプタマーである。
【０１８３】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤は、1本鎖（ssRNA）、2本鎖RNA（dsRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である。
【０１８４】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、PARP9核酸配列とハイブリダイズする。
【０１８５】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む。
【０１８６】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤は、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
【０１８７】
任意の一方法の一態様では、PARP9特異的RNA干渉剤のヌクレオチド配列は、非限定的に、
2020143123.tif 000004
を含む。
【０１８８】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9タンパク質の活性を阻害する。一部の態様では、PARP9阻害剤は、PARP9による転写制御を妨害または阻害する。一部の態様では、PARP9阻害剤は、PARP9による複数のADP-リボース部位の付加によるタンパク質の翻訳後修飾の触媒を妨害もしくは阻害し、かつ／またはIFN-ガンマ応答性遺伝子の発現誘導を直接もしくは間接的に妨害もしくは阻害する。
【０１８９】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【０１９０】
任意の一方法の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる。
【０１９１】
任意の一方法の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【０１９２】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。
【０１９３】
任意の一方法の一態様では、組成物は、注射、輸液、または点滴注入によって投与される。
【０１９４】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物は、注射、輸液、または点滴注入によって投与される。
【０１９５】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物は、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む。
【０１９６】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症は、非限定的に、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患を含む状態において見出される。
【０１９７】
任意の一方法の一態様では、自己免疫性または自己炎症性疾患は、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される。
【０１９８】
任意の一方法の一態様では、本方法は、アテローム動脈硬化症を有するまたはアテローム動脈硬化症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む。アテローム動脈硬化症を発生させるためのリスク因子は、当技術分野において周知である。例示的なリスク因子は、糖尿病、脂質異常症（高LDL、低HDL）、高血圧、喫煙習慣、肥満症、および男性である。医師は容易に、対象のリスクを判断し、対象においてアテローム動脈硬化症が最終的に発生することを予防すべきかどうかを決定することができる。
【０１９９】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む。そのような対象は、慢性炎症が結びつけられている任意の医学的状態を有すると診断された対象であろう。例えば、非限定的に、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患などの医学的状態である。熟練の臨床家は、医学的状態を診断し、対象が、炎症が結びつけられている医学的状態を有する場合、処置方法のために対象を選択することができるであろう。
【０２００】
任意の一方法の一態様では、過度または持続性の炎症が結びつけられている任意の医学的状態に繋がる可能性もある過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む。過度または持続性の炎症が結びつけられている医学的状態を発生させることに関するリスク因子は、当技術分野において周知である。例えば、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血について過体重；および心臓リモデリングについて急性心筋梗塞；およびアテローム動脈硬化症について高い血中LDLもしくはTGまたは低HDLである。対象が慢性炎症と結びつけられている任意のまたは1つの医学的状態に繋がる可能性もある過度または持続性の炎症を発生させる少なくとも1つのリスク因子を有する場合、熟練の臨床家は、対象における関連するリスク因子の存在を判断し、かつ治療または予防方法のために対象を選択することができよう。
【０２０１】
任意の一方法の一態様では、薬学的組成物の投与のために対象を選択する段階をさらに含む。
【０２０２】
本明細書記載の方法を、予防法として使用できることも企図されている。
【０２０３】
PARP9阻害剤
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【０２０４】
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤には、非限定的に、DR2313、3-アミノベンズアミド、4-HQN、NU1025、PJ34ヒドロクロリド、およびアデノシン5'-ピロホスフェートとの3-カルバモイル-1-D-リボフラノシルピリジニウムヒドロキシド5'-エステルならびに誘導体が含まれる。
【０２０５】
PARP9と特異的に結合する抗体は、PARP9のインビボまたはエクスビボまたはインビトロ阻害のために使用することができる。PARP9に対する抗体は、市販されており、周知の方法を用いて当業者によって作製されることができる。所与の抗体、さらに言えば任意のPARP9阻害剤のPARP9阻害活性は、当技術分野において公知または本明細書記載の方法を用いて判断することができる。疑いが生じないように、PARP9を阻害する抗体は、PARP9に結合し、PARP9による転写制御を妨害もしくは阻害し、かつ／またはPARP9による複数のADP-リボース部位の付加によるタンパク質の翻訳後修飾の触媒を妨害もしくは阻害し、かつ／またはIFN-ガンマ応答性遺伝子の発現誘導を直接もしくは間接的に妨害もしくは阻害する。
【０２０６】
PARP9の抗体阻害剤は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性誘導体または断片を含むことができる。周知の抗原結合性断片には、例えば、単一ドメイン抗体（dAb；本質的に単一のVLまたはVH抗体ドメインからなる）、1本鎖Fv断片（scFv）を含むFv断片、Fab断片、およびF（ab'）2断片が含まれる。そのような抗体分子の構築のための方法は、当技術分野において周知である。
【０２０７】
PARP9発現の核酸阻害剤
選択された標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチは、RNA干渉剤の使用を経由する。RNA干渉（RNAi）は、選択的分解のために、標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的化する低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖を使用する。遺伝子発現のsiRNA依存性転写後サイレンシングは、siRNAによってガイドされる部位で標的メッセンジャーRNA分子を切断する段階を伴う。「RNA干渉（RNAi）」は、標的遺伝子と同一または高度に類似の配列のRNAの発現または導入が、その標的化された遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を招き（Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225参照）、それによって標的遺伝子の発現を阻害する、進化的に保存された過程である。一態様では、RNAは、2本鎖RNA（dsRNA）である。本過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。自然界では、RNAiは、siRNAと名付けられた、長鎖dsRNAの2本鎖断片への前進型切断を促進するdsRNA特異的エンドヌクレアーゼDicerによって開始される。siRNAは、標的mRNAを認識および切断するタンパク質複合体（「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と名付けられた）内に組み入れられる。RNAiは、また、核酸分子、例えば、合成siRNAまたはRNA干渉剤を導入することによっても開始されて、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングすることができる。本明細書において使用される「標的遺伝子の発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比較して、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルにおける任意の減少を含む。減少は、RNA干渉剤によって標的化されていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％以上である。
【０２０８】
本明細書において使用される用語「RNA干渉剤」および「RNA干渉」は、RNA干渉剤が、siRNA、miRNA、shRNAまたは他の2本鎖RNA分子を含むかどうかにかかわらず、2本鎖RNAによって仲介される遺伝子サイレンシングの形態を包含することが意図される。本明細書において「小型干渉RNA」とも呼ばれる「低分子干渉RNA」（siRNA）は、標的遺伝子の発現を、例えばRNAiによって、阻害するように機能するRNA薬剤として定義される。siRNAは、化学合成され得、インビトロ転写によって産生され得、またはホスト細胞内で産生され得る。一態様では、siRNAは、約15〜約40ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチド長、より好ましくは約19、20、21、22、または23ヌクレオチド長の2本鎖RNA（dsRNA）分子であり、各鎖上に、約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長を有する3'および／または5'オーバーハングを含み得る。オーバーハングの長さは、2本の鎖の間で独立しており、すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、2番目の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA（mRNA）の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を経由してRNA干渉を促進する能力がある。
【０２０９】
siRNAには、また、低分子ヘアピン型（ステムループとも呼ばれる）RNA（shRNA）も含まれる。一態様では、これらのshRNAは、短い（例えば、約19〜約25ヌクレオチド）アンチセンス鎖に続く、約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から成り立っている。あるいは、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造に先行し得、アンチセンス鎖は後続し得る。これらのshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含まれ得、例えばpol III U6プロモーター、または別のプロモーターから発現され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるStewart, et al. (2003） RNA Apr；9(4):493-501を参照されたい）。RNA干渉剤の標的遺伝子または標的配列は、細胞性遺伝子またはゲノム配列、例えばPARP9配列であり得る。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同であり得る。これに関連して使用される用語「相同な」は、標的のRNA干渉をもたらすために、標的mRNA、またはその断片に実質的に同一、十分に相補的、または類似であると定義される。ネイティブなRNA分子に加えて、標的配列の発現を阻害または妨害するために適したRNAには、RNA誘導体および類似体が含まれる。好ましくは、siRNAは、その標的と同一である。siRNAは、好ましくは1つだけの配列を標的化する。siRNAなどの各RNA干渉剤は、例えば発現プロファイリングによって潜在的なオフターゲット効果についてスクリーニングされることができる。そのような方法は、当業者に公知であり、例えば、Jacksonら、Nature Biotechnology 6:635-637, 2003に記載されている。発現プロファイリングに加えて、配列データベース中から類似の配列について潜在的標的配列もスクリーニングして、オフターゲット効果を有し得る潜在的配列が特定され得る。例えば、Jacksonらによると、配列が同一な15個またはおそらくわずか11個の連続ヌクレオチドが、標的化されていない転写物のサイレンシングを指令するために十分である。したがって、BLASTなどの任意の公知の配列比較法による配列同一性解析を用いて、潜在的オフターゲットサイレンシングを回避するために、提案されたsiRNAを最初にスクリーニングしてもよい。siRNA配列は、RISC内へのsiRNAのアンチセンス（ガイド）鎖の取込みを最大化することによって、RISCが分解のためにヒトGGT mRNAを標的化する能力を最大化するように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'末端での結合の自由エネルギーが最も低い配列についてスキャンすることによって果たすことができる。より低い自由エネルギーは、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'末端の巻き戻し増強に繋がることによって、アンチセンス鎖が、RISCによって取り込まれ、ヒトPARP9 mRNAの配列特異的切断を指令することを確実にする。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、例えば、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し、リボース糖分子が別の糖分子に置換された分子または類似の機能を果たす分子も含む。そのうえ、ホスホロチオエート結合などの、ヌクレオチド残基間の非天然結合を使用することができる。RNA鎖は、フルオロフォアなどのレポーター基の反応性官能基で誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の1つまたは複数の末端、典型的にはセンス鎖の3'末端で修飾される。例えば、3'末端での2'-ヒドロキシルは、多様な基で容易に選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体などの修飾糖質部位を有するヌクレオチドを組み入れている。RNA塩基も修飾され得る。標的配列の発現を阻害または妨害するために有用な任意の修飾塩基が、使用され得る。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み入れることができる。塩基は、また、アルキル化され得、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み入れることができる。阻害を成功裡に生じる非天然塩基も組み入れることができる。最も好ましいsiRNA修飾には、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンまたはロックド核酸（LAN）ヌクレオチド、およびホスホジエステル結合または様々な数のホスホロチオエート結合のいずれかを含むRNA二重鎖が含まれる。そのような改変は、当業者に公知であり、例えば、Braaschら、Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子への有用な修飾の大部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド技法のために確立された化学反応を用いて導入することができる。好ましくは、修飾は、最小の2'-O-メチル修飾を伴い、好ましくはそのような修飾を除外する。修飾は、また、好ましくはsiRNAの遊離5'-ヒドロキシル基の修飾を除外する。本明細書における例は、PARP9 mRNAを効果的に標的化するshRNA分子などのRNA干渉剤の具体例を提供するものである。
【０２１０】
任意の一方法の一態様では、RNA干渉剤は、薬学的に許容される担体で送達または投与される。一態様では、RNA干渉剤は、脂質中に封入され、送達または投与のために製剤化される。一態様では、記載のRNA干渉剤を含む脂質封入製剤は、薬学的に許容される担体で送達または投与される。リポソームなどの追加的な担体物質は、薬学的に許容される担体に添加することができる。別の態様では、RNA干渉剤は、薬学的に許容される担体中の低分子ヘアピンRNA（shRNA）をコードするベクターによって、個体の器官中の細胞に送達される。shRNAは、転写後に細胞によって、例えばPARP9を、標的化する能力があるsiRNAに変換される。
【０２１１】
任意の一方法の一態様では、PARP9の阻害剤としてのsiRNA、ssRNA、dsRNAまたはshRNAは、
2020143123.tif 000005
を含む。
【０２１２】
任意の一方法の一態様では、ベクターは、テトラサイクリン誘導性ベクターなどの制御可能なベクターである。例えば、pTet-Onベクター（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）を使用してWangら、Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106に記載されている方法を用いることができる。一態様では、本明細書記載の方法に使用されるRNA干渉剤は、ベクターを使用せずに、静脈内注射、例えば水力学的注射後に、インビボで細胞によって能動的に取り込まれるが、これは、RNA干渉剤の効率的なインビボ送達を例証している。siRNAを送達するための一方法は、標的器官の血液供給血管のカテーテル挿入である。例えば、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターによる送達などの、本発明の方法に使用されるRNA干渉剤、例えばsiRNAまたはshRNAの送達のための他の戦略も、採用され得る。そのようなベクターは、例えば、Xiao-Feng Qinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188に記載のように使用することができる。他の送達方法には、RNA干渉剤を塩基性ペプチド、例えばTATペプチドの断片とコンジュゲーションまたは混合することによって塩基性ペプチドを用いる、陽イオン性脂質と混合する、または粒子に製剤化する、本発明のRNA干渉剤、例えばsiRNAまたはshRNAの送達が含まれる。RNA干渉剤、例えばPARP9 mRNAを標的化するsiRNAは、単独で、または他のRNA干渉剤、例えばsiRNA、例えば他の細胞性遺伝子に対するsiRNAと組み合わせて送達され得る。PARP9 siRNAは、また、酸化ストレスに関連する疾患または障害、特に呼吸器疾患を、より著しくは喘息を、治療または予防するために使用される他の医薬品と組み合わせて投与され得る。shRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に公知のいくつかの技法を用いて得ることができる。例えば、siRNA分子は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来型DNA/RNA合成装置を使用するなどして、当技術分野において公知の方法を用いて化学合成または組換え産生することができる（例えば、Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. et al . (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017;およびTuschl, T. et al . (1999) Genes & Development 13:3191-3197参照)。あるいは、非限定的に、Proligo（Hamburg, Germany）、Dharmacon Research（Lafayette, CO, USA）、Pierce Chemical（Perbio Scienceの一部門、Rockford, IL, USA）、Glen Research（Sterling, VA, USA）、ChemGenes（Ashland, MA, USA）、およびCruachem（Glasgow, UK）を含むいくつかの商業的RNA合成供給業者が利用可能である。このように、siRNA分子は、合成が過度に困難ではなく、RNAiに適切な品質で容易に提供される。加えて、dsRNAは、プラスミドベクター、レトロウイルスおよびレンチウイルスによってコードされるステムループ構造として発現することができる（Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, C.P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508; Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell 9:1327-1333; Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501）。これらのベクターは、一般的に、dsRNAの上流にpolIIIプロモーターを有し、別々におよび／またはヘアピン構造としてセンスおよびアンチセンスRNA鎖を発現することができる。細胞内で、Dicerは、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を有効なsiRNAにプロセシングする。本発明のsiRNA分子の標的化領域は、開始コドンの約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチド下流から開始する、所与の標的遺伝子配列、例えばPARP9コード配列より選択することができる。ヌクレオチド配列は、5'または3' UTRおよび開始コドン近くの領域を含み得る。本発明のsiRNA分子を設計する一方法は、23個のヌクレオチド配列モチーフAA(N19)TT（SEQ. ID. NO. 63）（式中、Nは任意のヌクレオチドであることができる）を特定する段階および少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％または75％のG/C含量を有するヒットを選択する段階を含む。配列の「TT」部分は随意である。あるいは、そのような配列が見つからないならば、モチーフNA(N21)（式中、Nは任意のヌクレオチドであることができる）を用いて検索を延長してもよい。この状況では、センスsiRNAの3'末端が、TTに変換されて、センスおよびアンチセンスの3'オーバーハングの配列組成に対して対称な二重鎖の発生を可能にし得る。次に、アンチセンスsiRNA分子は、ヌクレオチド23個の配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21の相補物として合成され得る。対称な3'TTオーバーハングの使用は、低分子干渉リボヌクレオタンパク質粒子（siRNP）が、ほぼ等しい比のセンスおよびアンチセンス標的RNA切断性siRNPを有して形成されることを確実にするために有利であり得る（Elbashir et al., (2001)前記およびElbashir et al., 2001、前記）。非限定的に、NCBI、BLAST、DerwentおよびGenSeqを含む配列データベースの解析、ならびにOLIGOENGINE（登録商標）などの商業的に利用可能なオリゴ合成会社も使用してESTライブラリーに対するsiRNA配列を選択して、遺伝子が1つだけ標的化されることを確実にしてもよい。
【０２１３】
RNA干渉剤の送達
RNA干渉剤、例えばsiRNA、またはRNA干渉剤を含むベクターを、標的細胞、例えばマクロファージ、リンパ球または他の所望の標的細胞に、取込みのために送達する方法には、RNA干渉剤、例えばsiRNAを含有する組成物の注射、または細胞、例えばマクロファージを、RNA干渉剤、例えばsiRNAを含む組成物と直接接触させることが含まれる。別の態様では、RNA干渉剤、例えばsiRNAは、静脈、動脈、細静脈または細動脈などの任意の血管に直接、例えば水力学的注射またはカテーテル挿入を介して注射され得る。投与は、単回注射または2回以上の注射により行われ得る。RNA干渉剤は、薬学的に許容される担体中に入れて送達される。1種または複数種のRNA干渉剤を、同時に使用してもよい。好ましい一態様では、ヒトPARP9を標的化する1種のみのsiRNAが使用される。一態様では、特異的細胞は、RNA干渉の非特異的標的化によって引き起こされるRNA干渉の潜在的副作用を限定しながら、RNA干渉で標的化される。該方法は、例えば、細胞標的化部位と、RNA干渉を細胞内に効果的に送達するために使用されるRNA干渉結合性部位とを含む、複合体または融合分子を使用することができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合されるとsiRNAと結合し、抗体によって認識される抗原を発現している細胞内にsiRNAを選択的に送達し、抗原を発現している細胞だけに遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。siRNAまたはRNA干渉誘導分子結合性部位は、タンパク質もしくは核酸結合性ドメインまたはタンパク質の断片であり、結合性部位は、標的化部位の一部に融合される。標的化部位の位置は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中間であることができる。ウイルス介在性送達メカニズムもまた、siRNAを細胞にインビトロおよびインビボで、Xia, H.ら、(2002) Nat Biotechnol 20(10):1006)に記載のように送達するために採用することができる。shRNAのプラスミドまたはウイルス介在性送達メカニズムは、また、shRNAを細胞にインビトロおよびインビボで、Rubinson, D.A.ら（(2003) Nat. Genet. 33:401-406）およびStewart、S.A.ら（(2003) RNA 9:493-501）に記載のように送達するために採用され得る。RNA干渉剤、例えば、siRNAまたはshRNAは、以下の活動：細胞、例えばリンパ球または他の細胞によるRNA干渉剤、例えばsiRNAの取込みを増強する、1本鎖のアニーリングを阻害する、1本鎖を安定化する、またはさもなければ標的細胞への送達を容易にする、および標的遺伝子、例えばPARP9の阻害を増加させる、の1つまたは複数を行う構成要素と共に導入することができる。特定のRNA干渉剤の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング（PTGS）をもたらすことによって、標的遺伝子の発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害に繋がるために必要な量である。
【０２１４】
一態様では、PARP9の発現の阻害剤は、小分子および核酸より選択される。代替的におよび好ましくは、PARP9の発現の阻害剤は、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクター、またはPARP9に特異的に結合するアプタマーである。特定の一態様では、RNA干渉剤は、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44の1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
【０２１５】
一態様では、薬物溶出性ステントまたは生体吸収性足場を、PARP9阻害剤を送達するために使用することができる。一態様では、冠動脈、頸動脈、または末梢動脈（腎動脈および四肢動脈を含む）用のバルーンを使用して、PARP9阻害剤を送達することができる。一態様では、静脈グラフトをPARP9阻害剤（例えばsiRNAまたはアンチセンスオリゴ）と共にインキュベートして、その後動脈に移植することができる。一態様では、薬物でコーティングされた縫合糸を使用して、PARP9阻害剤を送達することができる。
【０２１６】
PARP14の活性化剤
理論に縛られることを望むわけではないが、PARP9のサイレンシングがPARP14 mRNAを増加させる傾向にあることが発見された（例えば、図10A参照）。したがって、PARP9阻害剤である化合物を、PARP14活性化剤としても使用することができる。
【０２１７】
任意の一方法の一態様では、PARP14活性化剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
【０２１８】
PARP9阻害剤の送達のために使用される方法は、また、PAPR14活性化剤の送達のために使用することができる。
【０２１９】
製剤および適用
投与経路には、非限定的に、エアロゾル、直接注射、皮内、経皮（例えば、徐放ポリマー中に入れて）、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、局所、経口、経粘膜、口腔、直腸、膣、経皮、鼻腔内および非経口経路が含まれる。「非経口」は、非限定的に、眼窩内、輸液、動脈内、関節包内、心臓内、皮内、肝内、器官内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む、一般的に注射に関連する投与経路を表す。任意の他の治療的に効果的な投与経路、例えば、輸液またはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚裏層を経由した吸収を使用することができ、または治療用タンパク質もしくはペプチドをコードするDNA分子が、例えばそのタンパク質もしくはペプチドを発現させてインビボで治療レベルで分泌させるベクターを介して、患者に投与される遺伝子療法によることができる。様々な態様では、投与は、例えば噴霧を用いてエアロゾル投与を介して肺への吸入を行うことができる。投与は、また、全身または局所であることができる。
【０２２０】
一部の態様では、本明細書記載の組成物は、全身送達用に適応した製剤として投与することができる。一部の態様では、本明細書記載の組成物は、特定の器官、例えば非限定的に、肝臓、脾臓、骨髄、および皮膚への送達用に適応した製剤として投与することができる。
【０２２１】
他の態様では、本明細書記載の組成物は、例えばリポソームまたはナノ粒子中への封入を介して、送達後の遅延または持続放出のために製剤化することができる。
【０２２２】
薬剤の製剤化に採用される正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重症度にも依存し、医療従事者の判断および各患者の事情に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿してもよい。
【０２２３】
効力試験は、本明細書記載の方法を用いた処置の経過の間に行うことができる。特定の病気に関連するいくつかの症状の重症度の測定値が、処置の開始前に、および次に処置の開始後の後期の特定期間に、記録される。例えば、関節リウマチなどの自己免疫疾患を処置する場合、関節痛の重症度を、1〜10の数でスコア付けすることができ、その際、スコア1は軽度の不快を、スコア10は、動きの有無にかかわらず持続的な耐えられない疼痛を表し；患部関節の可動域も、関節が動くことができる角度として測定することができる。関節痛および可動域は、処置の前後に記録される。処置後の関節痛の重症度および可動域が、処置前と比較される。疼痛スコアの減少および／または関節の運動角度の増加は、処置が罹患関節における炎症の低下に有効であることにより、疼痛を減少させ関節運動を改善していることを示す。
【０２２４】
あるいは、処置の効力は、処置の開始前および開始後の対象におけるIL-12high、IL-23highおよびIL-10lowM1マクロファージサブタイプおよびIL-12lowおよびIL-10highM2マクロファージサブタイプの集団の分布を測定することによって決定することができる。マクロファージの集団は、末梢血試料から、本明細書開示のM1およびM2マクロファージサブタイプに特徴的なマーカーを使用するFACS分析によって決定することができる。
【０２２５】
当業者は、非限定的に、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要な投薬量およびタイミングに影響し得ることを認識している。用量レベルは、また、リスク因子の数、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性に依存することができる。そのうえ、治療的に有効な用量を用いた対象の処置は、単回処置または一連の処置を含むことができる。本明細書記載の組成物についての有効投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法論を用いて、または当技術分野において公知もしくは本明細書記載の適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づき行うことができる。本明細書記載の所与の組成物についての好ましい投薬量は、当業者によって多様な手段により容易に決定可能である。
【０２２６】
本発明の一部の態様を、以下の番号付き項目に挙げる。
[1] マクロファージM1の活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
[2] PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目1の組成物。
[3] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目1または2の組成物。
[4] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目1〜3のいずれかの組成物。
[5] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目4の組成物。
[6] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目5の組成物。
[7] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目5または項目6の組成物。
[8] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目5〜7のいずれかの組成物。
[9] PARP9阻害剤がPARP9タンパク質の活性を阻害する、項目1または2の組成物。
[10] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目9の組成物。
[11] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目1〜10のいずれかの組成物。
[12] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目11の組成物。
[13] マクロファージM1の活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
[14] PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目13の組成物。
[15] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目13または14の組成物。
[16] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目13〜15のいずれかの組成物。
[17] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目16の組成物。
[18] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目17の組成物。
[19] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目17または項目18の組成物。
[20] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目17〜19のいずれかの組成物。
[21] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目13または14の組成物。
[22] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目21の組成物。
[23] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目13〜22のいずれかの組成物。
[24] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目23の組成物。
[25] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[26] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目25の方法。
[27] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目26の方法。
[28] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、項目27の方法。
[29] マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目25〜28のいずれかの方法。
[30] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、項目29の方法。
[31] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目25〜30のいずれかの方法。
[32] 組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目25〜31のいずれかの方法。
[33] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目25〜32のいずれかの方法。
[34] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目25〜33のいずれかの方法。
[35] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目34の方法。
[36] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目35の方法。
[37] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目36の方法。
[38] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目34〜37のいずれかの方法。
[39] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目25〜32のいずれかの方法。
[40] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目39の方法。
[41] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目25〜40のいずれかの方法。
[42] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目41の方法。
[43] 初代マクロファージを、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、M1マクロファージの活性化を阻害する方法。
[44] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[45] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤およびポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[46] a.  単球またはマクロファージの集団を提供する段階；および
b.  単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階
を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[47] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目43〜46のいずれかの方法。
[48] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目43〜47のいずれかの方法。
[49] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、項目48の方法。
[50] マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目43〜49のいずれかの方法。
[51] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、項目50の方法。
[52] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目43〜51のいずれかの方法。
[53] 組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目43〜52のいずれかの方法。
[54] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目43、45〜53のいずれかの方法。
[55] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目43、45〜54のいずれかの方法。
[56] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目55の方法。
[57] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目56の方法。
[58] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目57の方法。
[59] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目55〜58のいずれかの方法。
[60] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目43、45〜53のいずれかの方法。
[61] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目60の方法。
[62] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目44〜61のいずれかの方法。
[63] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目62の方法。
[64] それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[65] 過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む、項目64の方法。
[66] 過度または持続性の炎症の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目64または65の方法。
[67] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目64〜66のいずれかの方法。
[68] それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって、該対象からの単球および／またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[69] 対象において、接触された単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、項目68の方法。
[70] 単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目69の方法。
[71] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、項目67または70の方法。
[72] マクロファージ活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目64〜67、および71のいずれかの方法。
[73] 対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、項目68〜71のいずれかの方法。
[74] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、項目72または73の方法。
[75] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目64〜74のいずれかの方法。
[76] 組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目64〜75のいずれかの方法。
[77] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目64〜76のいずれかの方法。
[78] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目64〜77のいずれかの方法。
[79] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目78の方法。
[80] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目79の方法。
[81] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目80の方法。
[82] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目78〜81のいずれかの方法。
[83] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目64〜76のいずれかの方法。
[84] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目83の方法。
[85] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目64〜84のいずれかの方法。
[86] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目85の方法。
[87] PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、項目64〜86のいずれかの方法。
[88] 組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、項目64〜87のいずれかの方法。
[89] 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、項目64〜67、71〜72、74〜88のいずれかの方法。
[90] 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、項目89の方法。
[91] 過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項目64、66〜90のいずれかの方法。
[92] それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象に、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。
[93] それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および／または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって：
（a）アテローム動脈硬化症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階；ならびに
（b）該対象に、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
[94] 対象において、単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、項目92または93の方法。
[95] 単球および／またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目94の方法。
[96] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン1β（IL-1β）および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、項目95の方法。
[97] 対象における単球および／またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、項目92〜96のいずれかの方法。
[98] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、項目97の方法。
[99] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目92〜97の方法。
[100] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目92〜99のいずれかの方法。
[101] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目100の方法。
[102] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目101の方法。
[103] RNA干渉剤が、GENBANK（商標）アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目102の方法。
[104] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目101〜103のいずれかの方法。
[105] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目92〜97のいずれかの方法。
[106] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目105の方法。
[107] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および／またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目92〜106のいずれかの方法。
[108] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目107の方法。
[109] 薬学的組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、項目92〜108のいずれかの方法。
[110] 薬学的組成物が、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む、項目92〜109のいずれかの方法。
[111] 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および／またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、ならびに炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、項目92、94〜110のいずれかの方法。
[112] 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、項目111の方法。
[113] 過度または持続性の炎症を有するまたは発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項目92〜112のいずれかの方法。
[114] 前記薬学的組成物の投与のために対象を選択する段階をさらに含む、項目93〜113のいずれかの方法。
[115] アテローム動脈硬化症が、冠動脈、頸動脈、腸骨-大腿動脈、腎動脈または他の動脈において起こる、項目89または111の方法。
[116] マクロファージ活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
[117] マクロファージ活性化の阻害における使用のための、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤および／またはポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー14（PARP14）の活性化剤を含む、組成物。
[118] 炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、（a）単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階；ならびに（b）単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[119] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[120] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および／またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[121] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[122] 単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[123] 炎症促進性マクロファージの活性化がM1活性化を含む、項目116〜122の方法または組成物。
【０２２７】
本発明は、限定的であると解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例証される。本出願にわたり引用された全ての参考文献の内容、ならびに図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２８】
当業者は、本明細書記載の発明の具体的な態様に対する多くの等価物を認識している、またはせいぜい日常的な実験を用いて確認することができる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【実施例】
【０２２９】
以下の実施例は、本発明の一部の態様および局面を例証するものである。様々な改変、追加、置換などを、本発明の精神または範囲を変えずに行うことができることは、関連技術分野の専門家に明らかであり、そのような改変および変動は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内に包含される。以下の実施例は、決して本発明を限定するものではない。
【０２３０】
実施例1：
本発明者らは、病理学的マクロファージ活性化を調節するためのマクロファージ極性化の主要制御因子を、様々な炎症性疾患の新規な治療標的として探究した。タンデム質量タグ付け戦略（TMT）を用いて、M1刺激因子としてのインターフェロンガンマ（IFNγ）またはM1誘導因子としてのインターロイキン4（IL-4）のいずれかに応答した、それぞれマウスおよびヒトマクロファージ細胞系であるRAW264.7およびTHP-1のプロテオームにおける変化を定量した。本発明者らは、マウス細胞系からのタンパク質5816種およびヒト細胞系における4723種を定量した。これらのデータのクラスター解析によって、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ9（PARP9）、PARP14およびDTX3Lが、マクロファージ極性化のマスター制御因子の候補として特定された。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子（TNF-α、IL-1βおよびiNOS）を誘導した一方で、抗炎症性M2のマーカー（Arg1およびMRC1）を減少させ、このことは、PARP14が、M1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2の極性化を促進することを示しており、STAT1のリン酸化を誘導し、STAT6のリン酸化を減少させ、このことは、シグナル伝達メカニズムに果たすそれらの役割を示している。追加的に、PARP14欠損マウス由来の初代マクロファージにおいて、M1遺伝子は、劇的に増加し（40倍を超える）、一方でM2マーカーは猛烈に減少した（1/30未満）。対照的に、siRNAのサイレンシング実験によって、PARP9がSTAT1リン酸化を介してM1活性化を促進し、STAT6活性化を抑制することが実証された。免疫沈降アッセイによって、PARP9、PARP14およびDTX3L（deltex 3-様、E3ユビキチンリガーゼ）が直接相互作用を有することが示された。
【０２３１】
実施例2：PARP9およびPARP14は、マクロファージ活性化の新規な制御因子である
アテローム動脈硬化症は、米国および他の先進国における死因の第1位である急性心筋梗塞を引き起こす（1）。医学の進歩にかかわらず、虚血性心疾患の世界的負担は、増加の一途である（2）。マクロファージ活性化は、アテローム動脈硬化症を含む多数の障害の病理発生に関与する（3〜6）。脂質異常症および糖尿病などの代謝障害は、循環している単球の血管壁内への動員を促進し、そこで単球はマクロファージに分化する。炎症促進性微小環境は、さらに、マクロファージ活性化を誘導する。本発明者ら自身のものを含む前臨床的証拠は、活性化マクロファージが、アテローム動脈硬化症の発生に関与するだけでなく、アテローム動脈硬化性プラークの完全性を低下させることによって、その血栓合併症もトリガーすると提唱した（7）。臨床的証拠の蓄積は、また、血管炎症と心血管事象とを関連づけた（8）。マクロファージ活性化は、2型糖尿病などの様々な他の疾患の病理発生に主要な役割を果たすように見える（9、10）。したがって、マクロファージ活性化に関連するいくつかの経路は、実証されたように、炎症性疾患の共通メカニズムに寄与し得る（11、12）。心血管疾患では、スタチンによるコレステロール低下などの強力な治療法にかかわらず、実質的な残余リスクが残っており（7、13、14）、そのことが、マクロファージ活性化に対する新規な解決策のための活発な探索を推進している。
【０２３２】
マクロファージ活性化のための複雑でからみ合ったメカニズムを精査するには、明確な機構モデルを必要とする。厳密な二分法が特にヒトには当てはまらない場合があるものの、M1/M2極性化の概念は、マクロファージの不均一性のための枠組みを提供する（15〜22）。長く、消耗させる包括的プロテオーム解析およびバイオインフォマティクス解析を単純化するための出発点として、本研究は、刺激と応答との間に明らかな関係をもつ、この確立されたインビトロ構成概念を使用する。マウスおよびヒトのデータセットの両方で、ADP-リボシルトランスフェラーゼジフテリア毒素様8（ARTD8）としても公知のポリADP-リボースポリメラーゼ14（PARP14）およびPARP9/ARTD9は、マクロファージ極性化における主要な分子の候補としての見込みを示した。NADからのADP-リボース部位をタンパク質アクセプターに転移するPARPの触媒ドメインの存在が、PARPファミリータンパク質を特徴づけている（23）。最もよく特徴づけられたメンバーであるPARP1/ARTD1は、ポリ-ADP-リボシル化酵素を代表する。さらに最近の証拠は、また、モノ-ADP-リボシル化を重要な制御メカニズムとして実証している（24）。PARP14/ARTD8は、細胞内モノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼである。以前の報告によって、PARP14が、B細胞におけるシグナル伝達性転写因子および転写活性化因子6（STAT6）と相互作用することによってIL-4誘導型転写を増強すること（25）、およびTヘルパーリンパ球におけるヒストンデアセチラーゼ2（HDAC2）およびHDAC3のADP-リボシル化（26）が、この過程を仲介することが明らかとなった。PARP9/ARTD9の分子機能に関して存在する情報は、より少ない。PARP9は、触媒活性を欠如する場合があり（27）、B細胞リンパ腫においてIFNγ-STAT1シグナル伝達を仲介する（28）。しかし、マクロファージにおけるPARP14またはPARP9の役割は、未知のままである。
【０２３３】
本研究は、マクロファージ介在性炎症性疾患についての治療標的を発見することを目標にした。マクロファージ活性化に関与する新規なメカニズムについての臨床的に関連する証拠を提供するために、本発明者らは、プロテオミクス、システム生物学、および細胞分子生物学を伴う集学的アプローチを採った。本発明者らの多重スケールモデリングは、マウスおよびヒト細胞系ならびに初代マクロファージを利用し、それにPARP14欠損（PARP14-/-）マウスおよびヒト試料におけるインビボ立証研究が続いた。本発明者らのデータによって、マクロファージ活性化についての新規なメカニズムが実証され、マクロファージ活性が転帰に影響する心血管疾患および様々な他の障害のための新しい治療法の潜在性がもたらされる。
【０２３４】
材料および方法
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）
高分解能／正確度LTQ-Orbitrap Elite（Thermo Scientific）でTMTペプチド試料を分析し、Q Exactive（Thermo Scientific）で、インビトロでリボシル化されたペプチドを分析した。両方の質量分析装置にNanospray FLEXイオン源を前置し、Easy-nLC1000 HPLCポンプ（Thermo Scientific）を連結しておく。ペプチドを、2カラム設定：Acclaim PepMap RSLC C18トラップカラム、75um×20cm（Q Exactiveでは50um×15cm）；およびAcclaim PepMap RSLC C18分析カラム、75um×250mm（Thermo Scientific）に供した。TMT分析のために、250nl/minで90分間かけて10〜30％溶媒B（アセトニトリル／0.1％ギ酸）の分析勾配をかけ、続いて95％溶媒Bを5分間流した。溶媒Aは0.1％ギ酸であった。リボシル化ペプチドについて、250nl/minで30分間かけて5〜28％溶媒Bの勾配をかけ、続いて95％溶媒Bを5分間流した。全ての試薬はHPLC等級であった。ペプチド配列解析（MS/MS）のために、LTQ-Orbitrapを分解能120Kに設定し、上位20種の前駆イオン（スキャン範囲380〜2000m/z内）を、高エネルギー衝突誘起解離（HCD、衝突エネルギー40％、選択幅3m/z、動的排除可能、開始m/zを120m/zに固定、および分解能を30Kに設定）に供した。上位10種前駆体選択法で、Q Exactiveを分解能140Kに設定した（スキャン範囲380〜1500m/z）。MS/MSのために、HCDを段階式規準化衝突エネルギー25±10％、選択幅1.6m/z、動的排除可能に設定し、分解能を17.5Kに設定した。MS/MSスキャンにおいて、m6ピーク348.1によってリボシル化ペプチド候補をスクリーニングした（39、40）。観測された前駆体からADP-リボース（541.06Da）の質量を差し引くことによって未修飾形態を計算した。修飾および未修飾m/z値ならびに対応する保持時間枠を包含リストに提出し、Q Exactiveのデータ独立獲得モジュールを用いて解析した（R＝35K）。
【０２３５】
SEQUEST検索アルゴリズムを使用し、Proteome Discoverer（PD）パッケージ（バージョン1.3, Thermo Scientific）（41）を介し、MS1検索空間内の許容枠10ppm、およびHCDについて断片許容枠0.02Daを使用して、MS/MSデータをマウスまたはヒトUniProtデータベース（2012年3月27日にダウンロード）に対して問い合わせた。メチオニン酸化を可変修飾として設定し、システイン残基のカルバミドメチル化および6-plex TMTタグ（Thermo Scientific）を固定修飾に設定した。ペプチドの偽発見率（FDR）を、PDによって提供されるパーコレーターを使用して計算し：マウスまたはヒトの逆デコイデータベースに対して検索したときのMS/MSスペクトルのヒット数に基づき、FDRを決定した（42、43）。ペプチドを1％ FDRに基づきフィルタリングした。所与のタンパク質群に割り当てられ、いかなる他のタンパク質群にも存在しないペプチドを、独特であると見なした。その結果、各タンパク質群は、単一のマスタータンパク質（PD Grouping feature）によって代表される。TMTレポーター比の定量のために、2種以上の独特なペプチドを有するマスタータンパク質を使用した（表2）。リボシル化スペクトルに手作業で注釈を付けた（39、40）。
【０２３６】
プロテオミクスのデータマイニングおよびフィルタリング
タンパク質の存在度の中央値をゼロ時間に基準化し、対数空間に変換した。M1において増加するが、M2において減少するタンパク質を抽出するために、利用可能なM0データセットを活用した単純なフィルタリング論理を適用した。本研究において、M0は、本システムにおける生物学的雑音に関するベースライン対照として役立つ；すなわち、ベースラインの端部を越えるM1およびM2タンパク質のトレースは、真のM1またはM2特異的応答の可能性が高い。その存在度が、INFγの補充（すなわち0時間）後のベースラインに勝ったタンパク質のプロファイルで、全時間のM1データセットに関する全般閾値を制定した。このカットオフ値（相対存在度のlog10が+0.13）は、RAW264.7およびTHP-1の両方のM1データセットについて使用された、まさにその値であった。そのうえ、M1フィルタリング段階から抽出されたタンパク質を、M0データセットだけでなく、M2データセットとも相互参照した。M2データセットでは、時点にかかわらず、タンパク質がM1と逆のプロファイルを有すると予想された。したがって、候補タンパク質の最終リストは、M1およびM2の存在度が、それらのベースライン対照からそれぞれ増加および減少したプロファイルを有した。
【０２３７】
プロテオミクスデータのクラスタリング
有限混合モデルに基づくRにモデルベースのアルゴリズム（44）を使用して、クラスタリングを行った。このように、本アルゴリズムは、マクロファージ極性化実験のために獲得されたデータなどの、時系列データ解析にうまく適用することができる（43）。このアプローチでは、各時系列（タンパク質プロファイル）yi［i＝1,2,...,N］（Nは、TMTチャネルの数である）は、線によって結合された単一の実体であると見なされる。クラスタリングは、従来の有限混合モデルについて各時系列yiをクラスターに割り当てることによって達成される。教師なしモデルベースクラスタリングは、プロファイルを特定のクラスターに割り当てるために期待値最大化アルゴリズム（EM）を使用する。MCLUSTは、データセット内の変動性を最大化することによって、ベイズ情報量基準（Bayesian Information Criteria）（BIC）を使用してデータセットを最良に分割するクラスター数を決定するという利点を有する。最終的に、合計の規準化によって、2時点のセットの間のより強力な共分散（およびしたがって依存性）が可能になる（45）。クラスタリングを行った後に、プロファイルがM1において増加し、M2において減少したが、M0において基礎レベルに維持されたタンパク質を特定する目的で、RAW264.7およびTHP-1細胞の両方について3つ全てのデータセット（M0、M1およびM2）で共通のタンパク質に焦点を合わせた。M1におけるゼロ時間に対する任意の時点でのタンパク質の相対存在度の増加を探しながら全てのクラスターを点検し、続いてプロファイルが減少した、およびベースライン内に残ったタンパク質について、それぞれM2およびM0クラスターを相互参照した。これらの3つの基準を満たしたタンパク質を、RAW264.7およびTHP-1細胞のデータセットについてのヒートマップに示す（図7B）。最終的に、関心対象のタンパク質のリストをさらに狭めるために、両方の種に共通であったタンパク質に、同一のUniprotタンパク質IDによって決定される優先順位を付けた（図7B）。行に沿って得られたZスコアに従ってタンパク質発現レベルを配列するためだけに、ヒートマップを使用した（すなわちz＝（x-平均）/sd）。ユークリッド距離および平均連結法を用いてタンパク質を水平方向に階層的にクラスタリングさせた。このデータ行列では、各列は、TMT時点分析の0、8、12、24、48、72時間を表し、各行は、タンパク質の遺伝子IDに対応する。
【０２３８】
PARP14-PARP9のネットワーク解析
心血管疾患および代謝性疾患としてのPARP14およびPARP9の候補資格をさらに研究するための並行アプローチとして、潜在的PARP14/PARP9インタラクトームがその関連する血管疾患ネットワーク／モジュールに近接するという前提で、インシリコまたはネットワークに基づく予測法を使用した。
【０２３９】
PARP14/PARP9隣接物の影響を評価するために、HumanNet相互作用データベースを使用した（46）。次に、ランダムウォーク方法論（31）を使用して、機能的データベースから疾患モジュールを構築したが、その際、ゲノムワイド関連研究（GWAS）、ならびに心筋症、冠動脈心疾患、心不全、高コレステロール血症、高血圧、代謝的特性、骨粗鬆症、心血管リスク因子および突然の心停止に関するOMIMおよびMalaCardsデータベースから抽出された遺伝子-疾患関連を使用した。機能的データベースにおける第1近傍によってPARP9-PARP14モジュールを決定した。さらに、第1近傍を、遺伝子発現に基づきマクロファージにおいて発現される隣接物に限定した。この選択に基づき、PARP9について55個の第1近傍を、PARP14について149個の第1近傍を考慮し、PARP9-PARP14モジュールとしてまとめてそれらに注釈を付けた。さらに、上記疾患モジュールと共に最短経路のトポロジー尺度を用いて第1近傍の近接性を測定した。各疾患モジュールについて、PARP9-PARP14モジュールへの最短経路距離を計算し、これらの距離を、同じモジュールサイズのランダム距離分布と比較した（Wilcoxon検定および多重検定のためのBenjamini-Hochberg補正）。最終的に、モジュールサイズをランダムウォークからの上位35種の遺伝子に減少させることによってランダム距離を再計算することによって、モジュールサイズが冠動脈心疾患および骨粗鬆症のモジュールについてのp値の有意性に影響しないことを検証した。
【０２４０】
細胞培養
本研究において、マウスおよびヒトの10ng/mlインターフェロンガンマ（IFNγ）および10ng/mlインターロイキン4（IL-4）（R&D systems）を、それぞれM1およびM2刺激として使用した。
【０２４１】
細胞系
マウス単球／マクロファージ細胞系RAW264.7をAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD）から入手し、加湿5％CO2中でペニシリンおよびストレプトマイシン（Corning）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Sigma）を含有する10％ウシ胎児血清（FBS, Life Technologies）中で37℃で維持した。M1およびM2刺激（それぞれ10ng/ml IFNγおよび10ng/ml IL-4）の前に、細胞を0.1％ FBS含有培地で24時間飢餓状態にした。THP-1もATCCから購入し、加湿5％CO2中でペニシリンおよびストレプトマイシンを有する10％FBS中のRoswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培地中にて37℃で維持した。THP-1単球をPMA（200ng/ml, Sigma）で48時間処理することによって、マクロファージ様状態を得た。マイコプラズマ汚染試験を日常的に行った（1ヶ月に1回）。
【０２４２】
初代細胞
マウス腹腔マクロファージ。4％チオグリコレート（Fisher Scientific）2.5〜3mlの腹腔内注射の4日後に腹腔マクロファージを得、10％FBSを含有するRPMIを用いて細胞5×105個を24ウェルプレート（Corning）上で培養した。非接着性細胞を16時間後に捨てた。PBSで洗浄後、細胞をM1またはM2刺激（それぞれ10ng/ml IFNγおよび10ng/ml IL-4）を加えながら回収まで24時間インキュベーションした。
【０２４３】
マウス骨髄マクロファージ。骨髄由来マクロファージ（BMDM）を単離し、以前に記載されたように分化させた（47）。簡潔には、PARP14-/-雄性10〜12週齢マウスまたは年齢および性別が一致する対照野生型マウス（C57BL/6マウス、Jackson Laboratory）の大腿骨から無菌条件で全骨髄細胞を回収し、加湿5％CO2中において10％FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Corning）を補充されたRPMI1640（Lonza）中でM-CSF（50ng/ml）（Peprotech）存在下にて37℃で培養した。7日培養後に、細胞をM1またはM2刺激（それぞれ10ng/ml IFNγおよび10ng/ml IL-4）を加えながら24時間インキュベーションし、その後回収した。
【０２４４】
CD14+ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の単離
リンパ球分離培地（LSM、MP Biomedicals）を使用して末梢血単核細胞（PBMC）をバフィーコートから単離した。PBMCの単離後、抗CD14抗体（Dynabeads FlowComp human CD14, Invitrogen）と組み合わせたDynabeadsによって、製造業者の説明書通りにCD14+細胞を単離した。簡潔には、磁石を使用してCD14+ dynabeads結合細胞（CD14+細胞）を単離した。細胞からDynabeadsを放出後、ビーズ不在のCD14+ PBMC（細胞5×105個）を、5％ CO2中において、10％ FBSを補充したRPMI 0.5mlを有する24ウェルディッシュプレート中にて37℃で培養した。
【０２４５】
免疫組織化学／免疫蛍光
試料を7μmに薄切りし、凍結切片をアセトン中で固定した。4％の適切な血清中でブロッキング後、切片を一次抗体（Mac3（1:200, M3/84, BD Pharmingen）、PARP14（1:50, HPA01206 Sigma-Aldrich）、PARP9（1:100, ab53796, Abcam）、およびヒトCD68（1:200, M0876, Dako））と共に、続いてビオチン標識二次抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）およびストレプトアビジン結合型Alexa Fluor 488抗体（Life Technologies）と共にインキュベーションした。アビジン／ビオチンブロッキング（Vector Laboratories）後の免疫蛍光二重標識のために、第2の一次抗体に続いて、ビオチン標識二次抗体およびストレプトアビジン結合型Alexa Fluor 594抗体（Life Technologies）を4℃で一晩適用した。切片をPBS中で洗浄し、DAPI（Vector Laboratories）含有封入剤中に包埋した。最初のビオチン標識二次抗体のインキュベーション後の組織切片に対する明視野免疫組織化学分析のために、切片をストレプトアビジン標識HRP溶液（Dako）に続いてAEC溶液と共にインキュベーションした。Eclipse 80i顕微鏡（Nikon, Melville, NY, USA）または共焦点顕微鏡A1（Nikon）を使用してスライドを検鏡した。全ての画像をElements 3.20ソフトウェア（Nikon）で処理した。
【０２４６】
ヒト組織およびPARP14/PARP9陽性マクロファージの計数
アテローム硬化性頸動脈（n＝10）を、Brigham and Women's Hospitalで動脈内膜切除術を受けている患者からIRBプロトコール#1999P001348（PL）に従って収集した。全ての試料は「廃棄された材料」と見なされるので、インフォームドコンセントは不必要であった。試料は、それぞれ、マクロファージが多い（「不安定」、n＝5）プラークおよびマクロファージが多くない（「安定」、n＝5）プラークなどの2群を有する。試料をOCTコンパウンド中に包埋し、使用まで-80℃で保存した。各試料の3つの異なる視野で（n＝5）、CD68陽性細胞を有する細胞200個（核）がPARP14および／またはPARP9（1試料あたり細胞600個）を発現するかどうかを評価した。免疫蛍光の定量は、群の割り当て（不安定プラーク対安定プラーク）に関して知らされなかった試験者によって行われた。
【０２４７】
動物手技、PARP14欠損（PARP14-/-）マウス、ワイヤー誘導血管傷害、および新生内膜肥厚の評価
PARP14欠損（PARP14-/-）雄性マウス（25、48）および齢が一致する野生型（PARP14+/+）雄性マウスを血管傷害に供した。以前に記載されたように（49）、10週齢マウスについて顕微鏡観察下（Leica M80）で大腿動脈中にストレートスプリングワイヤー（直径0.38mm, C-SF-15-15, Cook）を挿入することによって経管的動脈傷害を誘導した。傷害の2週間後に、動脈試料を収集するために、過量のペントバルビタールの腹腔内投与によってマウスを安楽死させ、次に左心室を経由して一定圧力で0.9％ NaCl溶液を灌流した（50）。収集された組織をO.C.T.コンパウンド（Tissue-Tek）中に包埋し、次に液体窒素中で凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。Beth Israel Deaconess Medical Centerの施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）は、全ての手技を承認した（プロトコール#017-2010）。内膜および中膜面積ならびに傷害大腿動脈のそれらの比を、各動物（n＝5）において間隔100μmで3つの異なるレベルの少なくとも3つの切片を、Elements 3.20ソフトウェア（Nikon）を使用して手作業でトレースすることによって測定した。群の割り当て（PARP14+/+対PARP14-/-）を知らされなかった試験者が、組織検査および免疫組織化学検査の定量を行った。無作為化法は使用しなかった。
【０２４８】
PARP14のRNA干渉およびPARP14
以前に記載されたようにRNAサイレンシングを行った（51）。簡潔には、20nmol/lのPARP14に対するsiRNA（ヒト細胞についてL-023583、マウス細胞についてL-160447）およびPARP9に対するsiRNA（ヒト細胞についてL-014734、マウス細胞についてL-05024901）（全てONTARGETplus SMART-pool, Thermo Scientific）または非標的化siRNA（スクランブル対照siRNA, ON-TARGET Non-Targeting Pool, Thermo Scientific）を、製造業者の説明書に従ってSilenceMag（BOCA Scientific, Boca Raton, FL）を使用してマクロファージ内に導入した。siRNAプールの標的配列は以下の通りであった。
【０２４９】
ヒトPARP14：
2020143123.tif 000006
【０２５０】
ヒトPARP9：
2020143123.tif 000007
【０２５１】
マウスPARP14：
2020143123.tif 000008
【０２５２】
マウスPARP9：
2020143123.tif 000009
【０２５３】
対照スクランブル：
2020143123.tif 000010
【０２５４】
細胞増殖（MTS）、細胞生存度、およびアポトーシス
細胞増殖、生存度、およびアポトーシスを、製造業者の説明書に従って、それぞれCellTiter 96 AQueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay Kit（MTS）、Cell Titer Blueアッセイ、およびApo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit（Promega）により判定した。
【０２５５】
RNAの調製およびリアルタイムPCR
TriZol（Life Technologies）を使用して、細胞培養物から総RNAを単離し、QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を使用して逆転写を行った。TaqManに基づくリアルタイムPCR反応（Life Technologies）によってmRNAの発現を決定した。以下のTaqManプローブを使用した：Hs99999902_m1（ヒトRPLP0）、Mm00725448_s1（マウスRPLP0）、Hs00981511_m1（ヒトPARP14）、Mm00520984_m1（マウスPARP14）、Hs00967084_m1（ヒトPARP9）、Mm00518778_m1（マウスPARP9）、Hs00174128_m1（ヒトTNF）、Mm00443258_m1（マウスTNF）、Hs00174097_m1（ヒトIL-1β）、Mm01336189_m1（マウス1L1β）Mm00475988_m1（マウスARG1）、Hs00267207_m1（ヒトMRC1）、Mm00485148_m1（マウスMRC1）、Mm00440502_m1（マウスNOS2）およびHs00234140_m1（ヒトCCL2）。発現レベルをRPLP0に対して規準化した。デルタ-デルタCt法を用いて結果を計算し、任意の単位として提示した。
【０２５６】
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）およびRNAの増幅
Leica LMD6500マイクロダイセクションシステムでLCMを行った。以下のLCMパラメーターを使用して新生内膜を切断した：出力50mW；パルス幅2ms；およびスポットサイズ20Hm。製造業者のプロトコールに従って、PicoPure RNA Isoaltion Kitを用いてRNAを単離し、続いてRiboAmp HS Plus RNA Amplification Kit（共にArcturus, Mountain View, CA, USA）を用いてRNAを増幅した。Fluidigm PCRシステムを用いてPCRアレイを行った。
【０２５７】
ウエスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含有するRIPA緩衝液を用いて細胞を溶解させた。ビシンコニン酸（BCA）法（Thermo Scientific）を用いてタンパク質濃度を測定した。総タンパク質を8〜10％ SDS-PAGEによって分離し、iBlotウエスタンブロットシステム（Life Technologies）を用いて移行させた。ヒトおよびマウスPARP14に対する一次抗体（1：250, HPA01206 Sigma-Aldrich）、ヒトおよびマウスPARP9に対する一次抗体（1:250, ab53796, Abcam）、ヒトおよびマウスSTAT1に対する一次抗体（1:1000, #9172, cell signaling）、リン酸化STAT1に対する一次抗体（1:1000, #9167, cell signaling）、ヒトおよびマウスSTAT6に対する一次抗体（1:2000, #9362, cell signaling）、マウスリン酸化STAT6に対する一次抗体（1:1000, ab54461, Abcam）、ヒトリン酸化STAT6に対する一次抗体（1:2000, #9361, cell signaling）、ならびにヒトおよびマウスβ-アクチンに対する一次抗体（1:5000; Novus）を使用した。Pierce ECLウエスタンブロット基質試薬（Thermo Scientific）およびImageQuant LAS 4000（GE Healthcare）を用いてタンパク質の発現を検出した。
【０２５８】
ELISA
刺激後に培地中に放出されたTNFαおよびIL-1βの量を、製造業者の説明書に従ってELISAキット（Duoset Kit, R&D）により測定した。未刺激のマクロファージの培地を陰性対照として使用した。特異的モノクローナル捕捉抗体で予備コーティングされていたELISAウェルプレートに標準、対照、または試料溶液を添加した。室温で3時間静かに振盪後、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗TNFαポリクローナル抗体を溶液に添加し、室温で1時間インキュベーションした。過酸化水素および色素原を含有する基質溶液を添加し、20分間反応させた。プレートリーダーによって450nmでサイトカインレベルを判定し、標準溶液の存在度により規準化した。
【０２５９】
硝酸塩の定量
iNOS濃度を模倣している、マクロファージの細胞培養培地中の一酸化窒素を定量するために、Greiss試薬キット（G-7921, Life technologies）を使用した。
【０２６０】
免疫共沈
免疫沈降（IP）溶解緩衝液（Thermo Scientific）中で細胞を溶解させた。タンパク質100μgをPARP14抗体（5μg, Invitrogen）およびDynabeadsストレプトアビジン（Life Technologies）と共に4℃で一晩回転させることによってインキュベーションし、続いてPBS/Tween 20（0.02％）で3回洗浄し、各洗浄の後に磁石を使用してビーズを収集した。沈降したタンパク質試料の5％をSDS-PAGEに供した。Pierce ECLウエスタンブロット基質試薬およびImageQuant LAS 4000を用いてタンパク質の発現を検出した。
【０２６１】
リボシル化アッセイ
組換えヒトPARP14およびPARP9（BPS Bioscience Inc.）タンパク質およびBSA（Sigma-Aldrich）を、終濃度5ng/μlの組換えヒトSTAT1α（OriGene Technologies, Inc.）または終濃度5ng/μlのSTAT6タンパク質（Sino Biological Inc.）と共に、100μM β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（NAD; Sigma-Aldrich）または6-ビオチン-17-NAD（Trevigen, Inc.）の存在下で、50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4）中で、室温で1時間インキュベーションした。トリプシン消化後のLC-MS/MSまたはSDS-PAGE後のストレプトアビジン-HRP（Abcam）を使用したウエスタンブロットによって、STAT1αおよびSTAT6のリボシル化を検出した。未修飾ペプチドに対して修飾ペプチドのモノアイソトピックピークの抽出イオンクロマトグラム（XIC）の曲線下面積（AUC）を計算することによって、リボシル化STAT1αペプチドの相対存在度の定量を完了した。比をAUC mod./（AUC mod. + AUC unmod）として報告した。
【０２６２】
単一細胞遺伝子発現分析
ドナー2人由来のCD14+ PBMCの単一細胞分析のために、製造業者の説明書に従ってC1システム（Fluidigm）を用いて細胞捕獲および標的予備増幅を行った。BioMark 96.96 Dynamic Arrayプラットフォーム（Fluidgm）を用いて定量リアルタイムPCRを行った（37）。バフィーコートからCD14+ PBMCを単離後、細胞を10日間培養した。M0状態の細胞を10日目に回収し、10ng/ml IFNγと共に24時間インキュベーション後の11日目にM1細胞を回収した。C1チップによる細胞捕捉率は、ドナー1のM0において89.6％（86/96）およびM1において83.3％（84/96）であり、ドナー2のM0において96.9％（93/96）およびM1において89.6％（86/96）であり、ドナー3のM0において93.8％（90/96）および84.3％（81/96）であった。RPLP0/GAPDH遺伝子発現を使用することによって、各細胞における標的遺伝子のデルタ-デルタCt値を計算した。各遺伝子についてのデルタ-デルタCTスコアを細胞対遺伝子の行列として記憶させた。各細胞に、1からn（nは総細胞数）の範囲の数的IDを割り当てた。ハウスキーピング遺伝子（GAPDHおよびRPLP0）に対して規準化された直接遺伝子測定から、デルタ-デルタCTスコアが得られる。
【０２６３】
単一細胞分析に関する品質管理として、全ての細胞にわたる遺伝子読出しの平均を最初にM0およびM1条件の両方においてドナー1および2（D1およびD2）について広く比較し、両方の規準化因子（GAPDHおよびRPLP0）を考慮した。全ての条件の間のPearson相関を測定し、順序類似性行列として表した。ここで、D2 M1を除き、規準化因子は安定に見えた。追加的に、D2 M1は、他の条件とも一致しないように見え、D1 M1と別個の分離した枝を形成することが全体的に見出された。したがって、分析からD2を除外した。M0条件の細胞が同期化されたかどうか、すなわちそれらが均一な集団として存在することを理解するために、同じ分析を行い、細胞間の全ての対比較についてPearson相関スコアを考慮した。M1期の亜集団について観察するために、同じ手順を行った。試料にわたる遺伝子的相関を観察するために、細胞-遺伝子行列を転置し、全ての細胞観察にわたり各遺伝子についてPearson類似性スコアを計算した。
【０２６４】
統計解析
データを平均±SDとして示す。ここで、「n」は、独立した実験の数または動物／試料の数を示す。0.05未満のP値を有する検定を統計的に有意と見なした。スチューデントのt検定を用いて群の対比較を行った（GraphPad prism 5, Prism Software Inc.（La Jolla、CA））。F検定から分散が有意に異なったと示された場合、Welch補正を行って、独立t検定を行った。Grubbs検定によって排除基準を設定した。試料サイズを予備決定するために統計的方法を用いなかった。実験を無作為化しなかった。
【０２６５】
結果
全体的プロテオミクスによって、マクロファージ極性化における主要分子の候補としてPARP9およびPARP14が特定された
インビトロプロトコールは、マウスRAW264.7細胞およびヒトTHP-1細胞の極性化の評価（図1A）と、上流の制御因子を特定するための定量プロテオミクスの適用とを可能にした。RAW264.7細胞およびTHP-1細胞におけるそれぞれ5137および5635種のタンパク質を、以下の3条件にわたり定量した：M0（未刺激または未極性化マクロファージ）、M1（IFNγ）およびM2（IL-4）（図1B）。3条件にわたるタンパク質強度の概要から、各M1およびM2条件についてのタンパク質の発現レベルの分布が、RAW264.7細胞およびTHP-1細胞の両方においてM0の強度を超えたことが明らかとなった（図1C）。
【０２６６】
タンパク質の存在度に基づく制御因子の1クラスを探究するために、以下の基準を使用した：1）M1における早期誘導（24時間以内）に続く、その後の時点まで持続性のレベル（最大72時間）、2）M2における発現減少、および3）M0における有意な変化なし。そのような挙動を有するタンパク質についてのデータセットをマイニングするためにデータフィルタリングおよびモデルに基づくクラスタリングを採用した。M0データセットは、データフィルタリングを大きく促進し、それがベースラインのノイズの差し引きを可能にした（図1C）。ベースライン閾値0.13（約1.24倍に増加）に勝るM1タンパク質の存在度が抽出され、一方でM2では減少している（図1C）。モデルに基づくクラスター解析によって、それぞれRAW264.7データセットおよびTHP-1データセットについてクラスター15個および20個が生成した（図14）。存在度がM0に対してM1において増加したが、M2において減少したタンパク質についてマイニングされたクラスターによって、RAW264.7データセットにおけるタンパク質490種およびTHP-1データセットにおけるタンパク質414種がこれらの基準を満たしていることが明らかとなった（図7A）。ヒトおよびマウスデータセットの間で共通のタンパクの検証によって、候補タンパク質38種の短縮されたリストが誘起された（図7B）。興味深いことに、両方のデータセットから、PARP9およびPARP14が特定された。
【０２６７】
ネットワーク解析は、PARP9およびPARP14を冠動脈疾患と関連づけた
PARP9およびPARP14の潜在的な臨床影響を予測するために、ネットワークに基づく解析を適用して、包括的相互作用ネットワーク（「インタラクトーム」）におけるこれらの遺伝子の影響を理解した（図8）。分子相互作用ネットワークアプローチに関する最近の進歩を活用して、様々な疾患モジュールに対するPARP14およびPARP9の機能の潜在的相互依存について知識を探索した。増え続ける証拠は、疾患遺伝子がインタラクトーム上にランダムに分布するのではなく、むしろ類似の生物学的モジュールまたは経路において一緒に働くことを示している（29、30）。そのうえ、同じ表現型に連結した遺伝子産物（例えばタンパク質）は、互いに相互作用し、同じネットワーク近傍域にクラスター化する可能性が高い（30）。これらの観察に基づき、PARP9またはPARP14が疾患のネットワーク近傍域に影響するならば、その直近傍は、ランダムな期待と比較して疾患モジュールに近接するはずであると仮定した（29、30）。異なる起源、例えば全ゲノム関連研究（GWAS）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）およびMalaCardsからの疾患遺伝子を用いて、ランダムウォーク法で心血管疾患および代謝性疾患のための疾患モジュールとして遺伝子セットを定義した（31）（図15）。次に、心血管障害および代謝障害の疾患モジュールへのPARP9-PARP14ネットワークの直近傍の平均最短距離を測定した。主として、インタラクトームは、タンパク質間の物理的または機能的関連のセットを説明し、細胞または組織特異性を提供しない。したがって、この場合、公的データベースにおけるマクロファージでの直近傍の発現を検査し、発現されなかったものを除去した。このPARP9-PARP14ネットワークが、他の心血管疾患および代謝性疾患と比較して冠動脈疾患モジュールに有意に大きく近接していたことが見出された（図8）。この結果は、動脈疾患の病理発生または臨床的合併症の発症に及ぼすPARP9および／またはPARP14の潜在的な主影響を示している。
【０２６８】
インビトロ検証：PARP9は炎症促進性分子であり、PARP14は抗炎症性分子である
PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化および動脈疾患を制御するという新規な仮説を検定するため、およびマクロファージM1/M2極性化におけるこれらのタンパク質の関与を検討するために、包括的なインビトロおよびインビボアプローチを使用した。プロテオミクスデータに一致して（図2B、16および17）、PARP9およびPARP14のmRNAレベルはM1において増加し、M2において減少した（図2C）。タンパク質レベルで、PARP14は、M1刺激に対してPARP9よりも早く増加した（図9A）。マウス（図9B）およびヒト（データは示さず）アテローム硬化性病変は、PARP14およびPARP9タンパク質を示したが、これはさらに、これらのPARP制御異常が動脈疾患の一因になるという仮説を支持している。
【０２６９】
マクロファージ極性化に果たすPARP14およびPARP9の因果的役割を探るために、マクロファージ極性化に関連する遺伝子産物（例えば、M1応答についてTNFα、iNOS、IL-1β、およびCCL2/MCP-1；M2についてMRC1およびArg1）の発現レベルは、低分子干渉RNA（siRNA）を用いたこれらのPARPのサイレンシングの下流の効果を測定した。PARP14のサイレンシングは、M1刺激因子IFNγによるTNFαおよびiNOSの誘導を有意に増強し、マウスRAW264.7細胞におけるIL-4に対するM2マーカーMRC1の応答を抑制した（図3A）。ヒトTHP-1細胞において、PARP14のサイレンシングは、また、M1条件においてTNFαおよびIL-1βのmRNA発現レベルを増加させ、M2条件においてMRC1 mRNAを減少させた（図3B）。PARP14をサイレンシングされたTHP-1細胞の上清中のTNFαおよびIL-1βタンパク質のレベルが増加したこと（図3C）は、これらのデータを支援した。さらに、CD14+末梢血単核細胞（PBMC）由来のヒト初代マクロファージにおけるPARP14のサイレンシングは、類似の効果を発揮した（図3D）。対照的に、PARP9のサイレンシングは、THP-1細胞におけるTNFα、IL-1βおよびCCL2/MCP-1のmRNAレベルを減少させたが、一方でMRC1は有意な変化を示さなかった（図3F）。これらの知見は、PARP14が抗炎症性分子であり、PARP9が炎症促進性分子であることを示している。PARP14およびPARP9は、マウス初代マクロファージの生存度、増殖、およびアポトーシスに有意な効果を示さなかった（図18）。
【０２７０】
PARP9およびPARP14は、マクロファージにおけるSTAT1およびSTAT6のインビトロ活性化を制御する
M1およびM2マクロファージにおけるPARP14およびPARP9の発現パターンが類似であったものの（図2B〜2C）、それらのそれぞれのsiRNA実験は、反対の結果をもたらした（図3A〜3D、3F）。IFNγシグナル伝達は、炎症促進性STAT1の活性化（リン酸化）を伴い、一方で、IL-4経路は、抗炎症性STAT6のリン酸化を使用する（32、33）。PARP14のサイレンシングは、M1マクロファージにおけるIFNγ誘導型STAT1リン酸化を加速し、かつM2マクロファージにおけるIL-4促進型STAT6リン酸化を抑制した（図4A）。対照的に、PARP9のサイレンシングは、M1マクロファージにおけるSTAT1のリン酸化を減少させた（図4C）。したがって、PARP14は、IFNγ-STAT1軸を調節することによってM1極性化を抑制し、IL-4-STAT6-M2経路を促進し得る。対照的に、PARP9は、IFNγ-STAT1シグナル伝達を活性化してM1極性化を誘導し得る。証拠は、様々な状況での免疫応答におけるSTAT3の関与を示している（34）が、PARP14またはPARP9のサイレンシングは、STAT3のリン酸化に有意な効果を生じなかった（図19）。
【０２７１】
PARP9およびPARP14は相互に相互作用する
上に実証された結果から、PARP14およびPARP9の間の制御相互関係の仮説が生まれた。実際に、PARP14のサイレンシングは、PARP9 mRNAの発現を有意に増加させ、一方で、PARP9のサイレンシングはPARP14 mRNAを増加させる傾向であった（図10A）。以前の報告は、Bリンパ球において、IL-4がPARP14の触媒活性を促進し、HDAC2、HDAC3、およびp100のリボシル化、ならびにSTAT6の活性化に繋がることによって、IL-4応答性遺伝子プロモーターへのその結合を促進することを示している（25、26、35、36）。THP-1細胞における免疫共沈アッセイが、PARP9およびPARP14によって形成された複合体を示したので（図10B）、これらの2つの分子がマクロファージにおいて相互に物理的に相互作用し得る。組換えPARP14タンパク質は、PARP14自体、PARP9、およびSTAT1αのADP-リボシル化を誘導した（図10C）。PARP9は、STAT1αをADPリボシル化しなかったが、このことは、PARP9が触媒活性を欠如することを示している以前の報告を立証する（27）。興味深いことに、PARP9の補充は、STAT1αのリボシル化を抑制した（図10C）。PARP1などの他のPARPファミリーメンバーの大部分がポリ-ADP-リボシル化酵素である一方で、PARP14は、モノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼである（24）。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）で、STAT1αのGlu657およびGlu705がPARP14によってモノ-ADP-リボシル化されたことが決定された（図10Dおよび10E）。Glu657およびGlu705は、STAT1αの機能的に重要なリン酸化部位であるTyr701に隣接する（図10Dおよび10E）。LC-MS/MSで、さらに、組換えPARP9がSTAT1αのGlu657およびGlu705でのPARP14誘導型モノADP-リボシル化を阻害したことが明らかになった（図10F）。まとめると、これらの結果は、PARP9が抑制する過程である、PARP14が炎症促進性STAT1αをモノ-ADPリボシル化し得るマクロファージ活性化についての潜在的メカニズムを示している。
【０２７２】
インビボPARP14欠乏は、マクロファージ活性化および動脈病変の発生を増強する
PARP14-/-マウスは、さらに、PARP14が動脈病変形成およびマクロファージ活性化に関与するというインビボ証拠を提供した。PARP14-/-またはPARP14+/+マウス腹腔マクロファージは、マクロファージの表現型および血管病変の形成の検査を可能にした。培養マクロファージにおけるインビトロsiRNA実験に一致して、データは、PARP14+/+細胞と比較してPARP14-/-マクロファージにおいて、炎症促進性M1の極性化に関連する因子の顕著に高いmRNAおよびタンパク質レベルならびに低いM2分子を示した（図11Aおよび11B）。PARP14欠乏は、また、腹腔マクロファージにおけるM1条件で誘導されたSTAT1のリン酸化を増強し、M2でのSTAT6リン酸化を減少させた（図11C）。PARP14-/-骨髄細胞由来初代マクロファージは、M1およびM2遺伝子について類似の結果を示した（図11D）。
【０２７３】
血管疾患におけるPARP14の機能をさらに見通すために、インビトロM1/M2モデルの他に、ワイヤー介在性機械的傷害後のPARP14-/-マウスの大腿動脈における病変形成を検査した。PARP14欠乏は、新生内膜形成を加速し（図11E）、かつMac3の免疫染色によって示されるようにマクロファージ蓄積を増加させた（図11E）。傷害大腿動脈の内膜のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションに続くリアルタイムPCRによって、PARP14+/+マウスと比較したPARP14-/-マウスにおけるM1分子TNFαおよびiNOSの高い発現レベルならびに低いM2マーカーArg1が実証された（図11F）。
【０２７４】
平滑筋および内皮細胞に果たすPARP9およびPARP14の可能な役割
マクロファージ介在性疾患についての新規な治療標的を発見する目標で、不偏プロテオミクスおよびバイオインフォマティクスによって、PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化の潜在的制御因子として特定された。初代平滑筋細胞および内皮細胞と比較して、PARP9およびPARP14の両方のmRNA発現は、初代培養マクロファージの方が高かった（図20A）。したがって、本研究は、マクロファージの生物学に果たすこれらのPARPファミリーメンバーの役割に焦点を当てている。それにもかかわらず、他の血管細胞型におけるPARP9およびPARP14の可能な機能を検討した。マウス大動脈から単離された初代平滑筋細胞（SMC）において、IFNγは、TNFαおよびiNOSの発現増加によって測定される炎症応答を誘導し、SMC分化マーカー遺伝子SM α-アクチン、SM22α、およびミオシン重鎖（SM-MHC）の発現を抑制した（図20A）。IFNγによるTNFαおよびiNOSの誘導は、PARP14+/+マウス由来SMCよりもPARP14-/- SMCにおいて増強された。PARP14欠乏は、SM α-アクチン、SM22αおよびSM-MHCのインビトロ発現において有意な変化を生じなかった。PARP14+/+およびPARP14-/-マウスの機械的に傷害された大腿動脈の内膜において、SM α-アクチンに対して免疫反応性の内膜細胞の絶対面積および％面積は、異ならなかった（n＝4）（図20A）。これらの結果は、PARP14欠乏が内膜SMCのインビボ蓄積に効果を示さなかったことを示している。培養内皮細胞（EC）において、IFNγは、ICAM-1、VCAM-1、およびTNFαの発現を誘導したが、PECAM-1を変化させなかった（図20B）。PARP9のサイレンシングは、IFNγによるICAM-1誘導を部分的に抑制したが、VCAM-1、TNFα、またはPECAM-1に効果を生じなかった。PARP14のサイレンシングは、IFNγに対するこれらの分子の応答に変化を引き起こさなかった。これらの結果は、PARP9およびPARP14が、SMCおよびECの活性化に少なくともインビトロで幾分かの役割を果たし得ることを示している。しかし、理論に縛られることを望むわけではなく、動脈疾患へのSMCまたはEC由来PARP9およびPARP14の相対的寄与は、マクロファージにおいて発現されるPARPファミリーメンバーと比較して実質的でない場合がある。
【０２７５】
「不安定」ヒトアテローム動脈硬化性プラークは、より多くのPARP9発現マクロファージを含んでいた
動脈疾患に果たすPARP14およびPARP9の潜在的役割についての追加的なインビボ証拠を探すために、血管内膜摘除術によって外科的に除去されたヒト頸動脈アテローム動脈硬化性プラークを検査した。免疫蛍光染色で、重複するCD68陽性シグナルによって示されるように、PARP14およびPARP9シグナルがプラークマクロファージに主に局在化したことが明らかになった（データを示さず）。マクロファージに乏しい「安定」プラークと比較して、マクロファージが豊富な「不安定」プラークにおいて、より多くのマクロファージが、炎症促進性分子PARP9に対して免疫反応性であったが、一方で、PARP14陽性マクロファージにおいて有意差はなかった（図12、データは示さず）。ヒトプラークにおける一部のマクロファージは、PARP14およびPARP9を同時発現したものの、他の細胞は、PARP14またはPARP9のいずれかの一方のみについて陽性染色された（データは示さず）。これらの一連のインビボ証拠は、動脈病変におけるマクロファージが不均一であることを示しており、これは、個別細胞における多種多様なレベルの炎症促進性活性化を反映し得る。
【０２７６】
M1条件における初代ヒトマクロファージの単一細胞分析は、PARP9およびPARP14をIFNγシグナル伝達の他の主要構成要素と連結した
ヒトプラークにおけるPARP9およびPARP14の発現パターンの多様性は、PBMC由来ヒトCD14陽性マクロファージの単一細胞遺伝子発現プロファイリング（BioMark, Fluidigm）（37）を用いたマクロファージ亜集団の追加的な判定を引き起こした。検査細胞数は、それぞれドナー1のM0において86個であり、M1では84個であり、ドナー2のM0では93個であり、M1では86個であり、ドナー3のM0では90個であり、M1では81個であった。具体的には、検査で、M0細胞が群全体としてM1の遺伝子発現を増加させるかどうか、または個別の細胞がIFNγに対して異なる応答をするかを検討した。さらなる分析で、3人の異なるドナー（n＝3）由来のM0およびM1マクロファージにおける標的遺伝子63種の発現パターンが強調された。各細胞にわたる距離を、それらの遺伝子発現類似性に基づき評価した（マンハッタン距離）（National Institute of Standards and TechnologyでのDictionary of Algorithms and Data Structuresのworld-wide web）。距離を距離行列として記憶させ、距離に基づくグラフとして表現した。ドナー3人における2条件（M0/M1）のチップ全6個を組み合わせることによって、M0細胞（淡灰色）およびM1細胞（濃灰色）は、明らか分離される。しかし、M0表現型に食い込むM1の「跡（trail）」がある。逆に、M0細胞はM1空間と混ざらない。各ドナーにおける同じ分析がドナー-ドナー変動を示すものの、ドナー3人にわたり類似のパターンが観察された（図13A）。これらの結果は、「M1極性化」マクロファージが不均一であることを示している。同様に、全ての条件／ドナーの全細胞の遺伝子63種の発現レベルによるPearson相関（38）でも、CD14+ PBMCの不均一性が明らかとなった。細胞類似性行列（データは示さず）は、IFNγで刺激されたM1細胞（1）、未刺激のM0細胞（2）およびこれらの混合集団（3）の別個の分布だけでなく、各集団内の亜集団も示す。具体的に、IFNγで刺激されたM1細胞に少なくとも2つの亜集団があり（データは示さず）、マクロファージの機能に関係する遺伝子を検討した。PARP9およびPARP14の両方は、群1よりも群2の方が有意に高かった。興味深いことに、プロテアーゼMMP9ならびにCD36、TLR2およびTLR4などのパターン認識受容体は、群2の方が高かったので、群2においてマクロファージがさらに活性化され、PARP9およびPARP14がそのような活性化マクロファージにおいて役割を果たし得ると示している（図13B）。全ての細胞にわたる遺伝子の相関行列（データは示さず）は、PARP9およびPARP14が、IFNγシグナル伝達に関与することが公知であるJAK、STATおよびIRF遺伝子などの遺伝子と密接に関連することを示している。この相関は、これらの遺伝子において高度に特異的であり、このアッセイで検査された他の遺伝子に及ばない。そのうえ、PARP9およびPARP14のクラスター内関連は、JAK3を除くSTAT1、2、6、JAK1、2およびIRF1、5などのこれらのIFNγ経路遺伝子と密接に相関関係にあることが見出された（図13C）。関心がもたれることに、これらの相関は、M0（未刺激）と比較してM1（IFNγ刺激）において明らかに増強されている（図21）。
【０２７７】
考察
本研究は、PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化を制御することを示している。本報告で実証された具体的な新規の知見には：1）PARP9がマウスおよびヒトのマクロファージの活性化を促進し；2）PARP14がマウスおよびヒトのマクロファージの活性化を抑制し；3）PARP9およびPARP14が物理的および機能的相互作用をもつと考えられ；4）PARP9およびPARP14がマクロファージにおけるIFNγシグナル伝達の構成要素と密接に相互作用し；5）PARP14のインビボ欠乏が、マウスにおけるマクロファージ活性化および動脈病変発生を加速し；6）PBMC由来ヒトM1マクロファージが、細胞のサブセットを含み；ならびに7）PARP9およびPARP14インタラクトームが、冠動脈疾患モジュールに有意に近接する（ネットワーク解析）ことが含まれる。集学的アプローチは、マルチスケールのインビトロおよびインビボ研究を用いてPARP9およびPARP14の役割についての明白な証拠を立証することを目標とした。
【０２７８】
本研究は、包括的スクリーニングのための典型的なM1およびM2刺激因子の例としてそれぞれIFNγおよびIL-4を選択した。マウスおよびヒトのマクロファージ細胞系をこの樹立されたモデルで使用して、初代マクロファージの、特に、ヒト循環単球から得られたマクロファージのドナー変動を回避した。細胞系における単純モデルの使用は、さもなければ疲労させる大域プロテオーム解析から信頼でき再現性の富むデータを得ることを助ける。そのうえ、PARP9およびPARP14の機能性に関する主要な結果が初代マクロファージにおいて検証された。さらに、ヒト初代マクロファージの単一細胞分析で、PARP9、PARP14、およびIFNγ経路関連分子（例えばJAK1、JAK2、STAT1、STAT6）の間の密接な関連が明らかとなったが、これは、これらのPARPファミリーメンバーがM1マクロファージ極性化の過程に決定的に寄与していることを示しており、さらに、細胞系におけるプロテオミクスによって最初に導かれた主要な結果が、臨床的に移転可能であることを示している。
【０２７９】
蓄積し続けるインビトロの証拠によってこのモデルが樹立された。しかし、特にヒト病変における、そのインビトロの重要性は、不完全に理解されているままである。したがって、ヒト動脈病変およびマウスモデルにおけるインビトロの知見を検証して、臨床的に移転可能な証拠を提供した。ヒトおよびマウスアテローム動脈硬化性プラークのマクロファージは、PARP9およびPARP14を発現する。ヒトにおいて、より「不安定」なプラークのマクロファージの方が、より大量の炎症促進性PARP9を含んでいた。4つのマクロファージ亜集団がヒト病変において特定された：PARP9+/PARP14+；PARP9+/PARP14-；PARP9-/PARP14+；およびPARP9-/PARP14+。興味深いことに、単一細胞遺伝子発現分析で、さらに、ヒト初代マクロファージにおいて「M1極性化」細胞が不均一なままであったこと、およびM1内の亜集団が異なる機能を有し得ることが明らかとなった。単一細胞遺伝子プロファイリングに関するバイオインフォマティック解析によって、M1マクロファージにおいてPARP9およびPARP14が、IFNγシグナル伝達経路の公知の構成要素と密接に関連することも実証されたが、これは、炎症促進性マクロファージの活性化に果たすこれらのPARPファミリーメンバーの役割に関する新規な知見をさらに裏付けている。
【０２８０】
PARP14がインビトロM1/M2パラダイムを超えて抗動脈硬化的な役割を果たす証拠を探るために、PARP14について遺伝的に改変されたマウス系統を使用した。PARP14の遺伝的欠失は、実際に、機械的に傷害された動脈の内膜におけるマクロファージ活性化および蓄積を促進し、インビボの概念証明をもたらした。加えて、ECおよびSMCの活性化に果たすPARP9またはPARP14の可能な役割をさらに探った。
【０２８１】
本明細書記載の研究で、さらに、PARPファミリーの比較的研究されていないメンバーであるPARP9およびPARP14についての新たな生物学的性質が明らかとなった。独立した2連の証拠であるADP-リボシル化アッセイおよびLC-MS/MSは、PARP14がSTAT1を、おそらくその主要リン酸化部位近くの部位でADP-リボシル化する能力を有し得ると示した。興味深いことに、PARP9は、この過程を阻害し得る。IFNγがPARP9よりも早くPARP14タンパク質を誘導することに留意すべきである。この相互作用は、PARP9およびPARP14が、両方ともM1条件で増加し、M2において減少するものの、なぜマクロファージ極性化に逆の効果を発揮するかを部分的に説明し得る。
【０２８２】
（表１）各TMTチャネルへのタイムポイント割り当て
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【０２８３】
（表２）定量されたプロテオームの概要
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【０２８４】
（表３）
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【０２８５】
実施例2についての参考文献：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
2020143123.tif 000071
【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２０Ａ−３】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月16日(2020.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤の脂質封入製剤を含む、M1マクロファージの活性化を阻害するための薬学的組成物であって、該阻害剤がPARP9の小分子阻害剤であり、かつM1マクロファージの活性化の阻害が炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、薬学的組成物。
【請求項２】
小分子が、DR2313、3-アミノベンズアミド、4-HQN、NU1025、PJ34ヒドロクロリド、アデノシン5'-ピロホスフェートとの3-カルバモイル-1-D-リボフラノシルピリジニウムヒドロキシド5'-エステル、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
小分子が、PARP9の発現または活性を阻害する、請求項1または2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
M1マクロファージの活性化を阻害するための医薬の製造における、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤の脂質封入製剤の使用であって、該阻害剤がPARP9の小分子阻害剤であり、M1マクロファージの活性化の阻害が炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、使用。
【請求項５】
小分子が、DR2313、3-アミノベンズアミド、4-HQN、NU1025、PJ34ヒドロクロリド、アデノシン5'-ピロホスフェートとの3-カルバモイル-1-D-リボフラノシルピリジニウムヒドロキシド5'-エステル、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
小分子が、PARP9の発現または活性を阻害する、請求項4または5記載の使用。
【請求項７】
M1マクロファージの活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項7記載の使用。
【請求項９】
M1マクロファージの活性化の阻害が、抗炎症性M2マーカーの発現を増大することを含む、請求項4または7記載の使用。
【請求項１０】
抗炎症性M2マーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）、またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
a.  単球またはマクロファージの集団を提供する段階；および
b.  単球またはマクロファージの集団を、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー9（PARP9）の阻害剤を含む組成物の有効量とエクスビボまたはインビトロ接触させる段階であって、該阻害剤がPARP9の小分子阻害剤である、段階
を含む、M1マクロファージの活性化を阻害するエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１２】
小分子が、DR2313、3-アミノベンズアミド、4-HQN、NU1025、PJ34ヒドロクロリド、アデノシン5'-ピロホスフェートとの3-カルバモイル-1-D-リボフラノシルピリジニウムヒドロキシド5'-エステル、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項11記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１３】
小分子が、PARP9の発現または活性を阻害する、請求項11または12記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１４】
M1マクロファージの活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項11記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１５】
M1マクロファージの活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項11または14記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１６】
抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）からなる群より選択される、請求項15記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１７】
マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2マーカーの発現を増大することを含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１８】
抗炎症性M2マーカーが、アルギナーゼ1（Arg1）、またはマンノース受容体Cタイプ1（MRC1）である、請求項17記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項１９】
組成物が、PARP9の阻害剤の脂質封入製剤を含む、請求項11〜18のいずれか一項に記載のエクスビボまたはインビトロの方法。
【請求項２０】
PARP9の阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、またはPARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項11〜19のいずれか一項に記載のエクスビボまたはインビトロの方法。