(57)【要約】      （修正有）【課題】インターロイキン１αに特異的に結合する完全なヒトモノクローナル抗体の提供。【解決手段】完全なヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）インターロイキン１αに対する非常に高い結合親和性を示す抗原結合可変領域と、（ｉｉ）Ｃ１ｑ結合を通じた補体系の活性化及びいくつかの異なるＦｃ受容体への結合のいずれにおいても有効な定常領域とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖に共有結合した重鎖を含み、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合することを特徴とする精製されたヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、それぞれ、２００８年５月３０日、２００８年１２月１０日及び２００９年５月１４日に提出された米国仮特許出願第６１／０５７，５８６号、第６１／１２１，３９１号、及び第６１／１７８，３５０号の優先権を主張する。
［連邦政府がスポンサーとなった研究に関する陳述］
適用なし
【０００２】
［技術分野］
本発明は、広くは、免疫学、炎症、癌、血管障害及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）に特異的に結合する抗体（Ａｂ）、及び、そのような抗体を用いることによってＩＬ−１αの発現異常に関連した疾病を治療、予防又は検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン１αは、炎症、免疫反応、腫瘍転移及び造血を含む多くの様々な機能において役割を果たす炎症性サイトカインである。インターロイキン１αに対するＩｇＧ自己抗体は、一般的な人口母集団において自然に生じており、アテローム性動脈硬化などの疾病において有益であると考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ｉ）ヒトインターロイキン１αに対して非常に高い結合親和性を示す抗原結合可変領域、並びに、（ｉｉ）Ｃ１ｑ結合を通じた補体系の活性化及びいくつかの異なるＦｃ受容体への結合のいずれにおいても有効な定常領域を含む完全なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発に基づいている。ここに記載されているヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体は、ヒトインターロイキン１αに対して特異的な可変領域を有するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の定常領域を、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の定常領域で置換することによって作成された。
【０００５】
従って、本発明は、軽鎖に共有結合で結合した重鎖を含むモノクローナル抗体である、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を特徴とする。重鎖は、配列番号：９のアミノ酸配列を含んでいてもよく、軽鎖は、配列番号：１１のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０００６】
インターロイキン１αに特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖をコードする第１核酸、及び、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第２核酸を含む単離された核酸のセットも本発明の範囲内である。第１核酸は、配列番号：９のアミノ酸配列をコードすることができ、第２核酸は、配列番号：１１のアミノ酸配列をコードすることができる。第１核酸は、配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、第２核酸は、配列番号：１２のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【０００７】
別の一態様において、本発明は、配列番号：９又は配列番号：１１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現ベクターを特徴とする。
【０００８】
本発明の他の特徴は、インターロイキン１αに特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖をコードする第１核酸、及び、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第２核酸を含む単離された核酸のセットを含む、単離された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞）である。重鎖は、配列番号：９のアミノ酸配列を含んでいてもよく、軽鎖は、配列番号：１１のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０００９】
本発明は、ヒトインターロイキン１αを発現する細胞を死滅させる方法をさらに特徴とする。この方法は、細胞を、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体に接触させるステップを含んでいてもよい。
【００１０】
基底膜マトリクスを経たヒト細胞の移動を阻害する方法も本発明に含まれる。この方法は、基底膜マトリクス及びヒト細胞を含む混合物に、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたモノクローナル抗体を加えるステップを含んでいてもよい。
【００１１】
ヒト内皮細胞の表面におけるインターロイキン１αによって誘導されるＩＣＡＭ−１及び／又はＥ−セレクチン発現の増加を阻害する方法も本発明に含まれる。この方法は、内皮細胞及びインターロイキン１αを含む混合物に、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたモノクローナル抗体を加えるステップを含んでいてもよい。
【００１２】
本発明は、以前に以下のステップ：最初に対象から末梢血単核細胞の第１サンプルを得るステップと；その第１サンプルを、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたモノクローナル抗体に接触させるステップと；及び、モノクローナル抗体に結合する第１サンプル中の細胞のパーセントを決定するステップとに供したヒト対象の炎症を追跡する方法をさらに含む。この方法は、以下のステップ：（ａ）２回目に対象から末梢血単核細胞の第２サンプルを得るステップと；（ｂ）前記第２サンプルを、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する精製されたモノクローナル抗体に接触させるステップと；（ｃ）モノクローナル抗体に結合する第２サンプル中の細胞のパーセントを決定するステップと；及び、（ｄ）モノクローナル抗体に結合する第１サンプル中の細胞のパーセントを、モノクローナル抗体に結合する第２サンプル中の細胞のパーセントと比較するステップと、を具えていてもよい。
【００１３】
前記方法において、精製されたモノクローナル抗体は、軽鎖に共有結合で結合した重鎖を含むヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であってもよい。例えば、重鎖は、配列番号：９のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１１のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明に含まれるその他の方法は、以下のステップ：（ａ）ヒト対象から得た生体サンプルを、分子量に従って分子を分離するフィルターを用いて、インターロイキン１αと複合化された完全なＩｇＧを含む第１画分と、１００Ｋｄａ未満の分子を含む第２画分とに濃縮するステップと；及び、（ｂ）第１画分中のインターロイキン１αの量を定量するステップと、を特徴とする。
【００１５】
しかし、本発明に含まれるその他の方法は、以下のステップ：（ａ）ヒト対象から得た血漿のサンプルを、分子量に従って分子を分離するフィルターを用いて、インターロイキン１αと複合化された完全なＩｇＧを含む第１画分と、１００Ｋｄａ未満の分子を含む第２画分とに濃縮するステップと；（ｂ）第１画分中のＩｇＧが、基質上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体に特異的に結合することを許容する条件下において、固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体を含む基質に前記第１画分を加えるステップと；（ｃ）前記基質を洗浄して、固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体に特異的に結合しない第１画分中の成分を除去するステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）において洗浄した基質を、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する抗体が基質に結合したあらゆるヒトインターロイキン１αに特異的に結合することを許容する条件下において、ヒトインターロイキン１αに特異的に結合する抗体に接触させるステップと；（ｅ）前記基質を洗浄して、基質に結合しないヒトインターロイキン１αに特異的に結合しているあらゆる抗体を除去するステップと；及び、（ｆ）ステップ（ｅ）の後に基質に結合したままのヒトインターロイキン１αに特異的に結合する抗体量を定量するステップとを特徴とする。
【００１６】
別段の定めがない限り、ここで用いられているすべての技術的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有している。一般的に理解される生物学的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、及び、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４において見つけることができる。
【００１７】
「特異的に結合する」という用語は、ここで用いられているように、ポリペプチド（抗体を含む）又はレセプタに言及する場合、タンパクの異種混合集団及びその他の生物製剤中におけるタンパク又はポリペプチド又はレセプタの存在の決定要因である結合反応を意味する。従って、指定された条件（例えば、抗体の場合における免疫測定条件）において、特定のリガンド又は抗体が、特定のその「ターゲット」に結合し、サンプル中に存在するその他のタンパク又は生体中においてそのリガンド若しくは抗体が接触する可能性があるその他のタンパクに有意な量で結合しない。通常、第２分子に「特異的に結合する」第１分子は、第２分子に対して約１０５リットル／モル超（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１及び１０１２以上）の平衡親和定数を有する。
【００１８】
「精製された」は、抗体などのタンパク分子に言及する場合、そのような分子に自然に付随する成分から分離されていることを意味する。典型的には、抗体又はタンパクが、非抗体タンパク又は前記抗体又は前記タンパクに自然に付随するその他の天然有機分子を含まずに、重量によって、少なくとも約１０％（例えば、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％及び１００％）であれば、精製されたものである。例えば、カラムクロマトグラフイー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ解析といったあらゆる適切な方法によって純度を測定することができる。化学的に合成されたタンパク又は天然に存在する細胞型以外の細胞型において生産されたその他の組み換えタンパクは、「精製された」ものである。
【００１９】
本発明の実施又は試験においては、ここに記載されているものに類似又は同等の方法及び材料を用いることができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。ここで言及されているすべての刊行物は、言及することによってその全体が組み込まれている。紛争の場合には、定義を含む本明細書が規定するであろう。さらに、以下に論じる特定の実施形態は例示的なものに過ぎず、限定するようには意図されていない。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、（ｉ）インターロイキン１αに対する非常に高い結合親和性を示す抗原結合可変領域、並びに、（ｉｉ）Ｃ１ｑ結合を通じた補体系の活性化及びいくつかの異なるＦｃ受容体への結合のいずれにおいても有効な定常領域を含む完全なヒトモノクローナル抗体に関する組成物及び方法を包含する。以下に記載されている好ましい実施形態は、これらの組成物及び方法の適用を説明する。それにかかわらず、これらの実施形態の説明から以下に提供する説明に基づいて本発明のその他の態様を作成及び／又は実行することができる。
【００２１】
従来の免疫学的手法及び分子生物学的手法を含む方法は、本明細書に記載されている。免疫学的手法（例えば、抗原抗体複合体の検出及び位置限定のための分析、免疫沈降、イムノブロッティングなど）は、当業界において一般的に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの方法論の論文に記載されている。分子生物学的手法は、分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１、及び、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの方法論の論文に詳細に記載されている。抗体手法は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｂｓ，Ｄｕｂｅｌ，Ｓ．，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００７に記載されている。細胞培養技術は、当業界において一般的に知られており、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｒ  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．，２０００、及び、ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｂｙ  Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｉａｎ  Ｆ  Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１９９４などの動物細胞培養の方法論の論文に詳細に記載されている。タンパク精製の方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｍ  Ｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０といったタンパク精製のガイドにおいて論じられている。
【００２２】
一態様においては、本発明は、（ｉ）ヒトインターロイキン１αに対する非常に高い結合親和性を示す抗原結合可変領域、並びに、（ｉｉ）Ｃ１ｑ結合を通じた補体系の活性化及びいくつかの異なるＦｃ受容体への結合のいずれにおいても有効な定常領域を含む完全なヒトモノクローナル抗体を特徴とする。ヒト抗体はＩｇＧ１であることが好ましい。抗体のＫａは、好ましくは少なくとも１×１０９Ｍ−１以上（例えば、９×１０１０Ｍ−１、８×１０１０Ｍ−１、７×１０１０Ｍ−１、６×１０１０Ｍ−１、５×１０１０Ｍ−１、４×１０１０Ｍ−１、３×１０１０Ｍ−１、２×１０１０Ｍ−１又は１×１０１０Ｍ−１よりも多い）である。
【００２３】
ヒトインターロイキン１αに対して特異的な免疫グロブリンを発現するＢリンパ球がヒトにおいて自然に生じるので、モノクローナル抗体を高める現在の好ましい方法は、まず対象からそのようなＢリンパ球を単離し、次いで、培養において連続的に複製できるように不死化させることである。ヒトインターロイキン１αに対して特異的な免疫グロブリンを発現する天然のＢリンパ球の大部分を欠損している対象を、１以上のヒトインターロイキン１α抗原を用いて免疫化させてそのようなＢリンパ球の数を増加させてもよい。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体分泌細胞（例えば、ヒト血漿細胞）を不死化することによって調製される。例えば、米国特許第４，６３４，６６４号を参照されたい。
【００２４】
１つの例示的方法においては、１以上（例えば、５、１０、２５、５０、１００又は１０００以上）のヒト対象（例えば、以前にヒトインターロイキン１αワクチンを接種されていない対象）を、血液中のそのようなヒトインターロイキン１α特異的抗体の存在について検査する。その後、所望の抗体を発現する対象を、Ｂリンパ球ドナーとして用いることができる。あり得る１つの方法においては、ヒトインターロイキン１α特異的抗体を発現するＢリンパ球を有するヒトドナーから末梢血を得る。その後、そのようなＢリンパ球を、例えば、細胞分類（例えば、蛍光活性化細胞選別「ＦＡＣＳ」；又は磁気ビーズ細胞選別）によって血液サンプルから分離することによって、ヒトインターロイキン１α特異的免疫グロブリンを発現するＢリンパ球を選択する。その後、ウイルス形質転換（例えば、ＥＢＶを用いて）によって、又は、公知技術によってヒト骨髄腫などの他の永久増殖細胞に融合させることによって、これらの細胞を不死化することができる。その後、限界希釈（例えば、ヒトインターロイキン１αに対して特異的な免疫グロブリンに対してポジティブなマイクロタイタープレート中のウェル内の細胞を選択して二次培養し、所望のクローン系を分離することができるまでプロセスを繰り返すこと）によって、ヒトインターロイキン１αに対して特異的な免疫グロブリンを発現するこの集団内のＢリンパ球を分離することができる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｂｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照されたい。ヒトインターロイキン１αに対して少なくともナノモル又はピコモルの結合親和性を有する免疫グロブリンを発現するクローン細胞株が好ましい。これらのクローン細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体を、脱塩、サイズ排除、イオン交換分離及び親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地又は体液（例えば腹水）から精製することができる。
【００２５】
不死化されたＢリンパ球をインビトロ培養に用いてモノクローナル抗体を直接的に生産してもよいが、いくつかの場合においては、異種起源の発現系を用いてモノクローナル抗体を生産することが望ましいこともある。例えば、米国特許出願第１１／７５４，８９９号に記載されている方法を参照されたい。例えば、ヒトインターロイキン１αに対して特異的なモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローンし、異種起源の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞及び大腸菌細胞）中の発現用の発現ベクター（例えば、プラスミドベースの発現ベクター）に導入してもよい。免疫グロブリンは、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）をＨ２Ｌ２配置で含んでいるので、それぞれをコードする遺伝子を別々に分離して、異なるベクターにおいて発現させてもよい。
【００２６】
一般的にはあまり好ましくないキメラモノクローナル抗体に由来した異なる部分（例えば、異なる動物種（例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域に結合したマウス免疫グロブリンの可変領域）を有する抗原結合分子である「ヒト化」モノクローナル抗体）を本発明において用いてもよい。当業界において知られている方法、Ｅ．Ｇ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４，１９８４；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２，１９８４によってそのようなキメラ抗体を調製することができる。同様に、当業界で知られている方法によって抗体をヒト化することができる。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナルの抗体を、米国特許第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号又は第５，５８５，０８９号に記載されているように商業的にヒト化することができる。
【００２７】
ここに記載されているモノクローナル抗体を、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリング(Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３，１９９２）、超可変領域のランダムな突然変異誘発（ＨＶＲ）、及び／又は、骨格残基（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３，１９９４；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５，１９９５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４，１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９，１９９５；及び、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６，１９９２）などの公知の方法によって、結合特異性を高める又は他の方法で変更するために親和性成熟してもよい。抗体のアミノ酸配列変異は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な変異を導入することによって作成していてもよい。さらに、モノクローナル抗体をコードする核酸配列への修飾を、ある発現系におけるモノクローナル抗体の生産を高めるように（例えばモノクローナル抗体のアミノ酸配列を変化させることなく）変更してもよい（例えば、イントロン除去及び／又は規定の発現系に対するコドン最適化）。ここに記載されているモノクローナル抗体は、その他のタンパク（例えば、他のモノクローナル抗体）又は非タンパク分子への接合によっても修飾することができる。例えば、モノクローナル抗体を、ポリエチレングリコール又はカーボンナノチューブなどの水溶性ポリマーに結合させてもよい（例えば、Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５，２００５を参照されたい）。米国特許出願第１１／７５４，８９９号を参照されたい。
【００２８】
最小限の副作用で対象に投与することができる高い力価のヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体を確かなものにするために、本発明のモノクローナル抗体組成物は、（あらゆる添加剤を除いて）少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９重量％純粋であることが好ましい。本発明のモノクローナル抗体組成物は、１種類のモノクローナル抗体（すなわち、単一のクローンＢリンパ球株から作られるもの）のみを含んでいてもよいし、又は、２種類以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類以上）の異なるモノクローナル抗体の混合物を含んでいてもよい。ヒトインターロイキン１αモノクローナル抗体に加えて、本発明の抗体組成物は、ヒトインターロイキン１α以外の抗原に特異的に結合するその他のモノクローナル抗体を含んでいてもよい。
【００２９】
ヒトインターロイキン１αモノクローナル抗体を、細胞毒素又は検出可能なラベルなどの他の分子に結合させて、機能を変化又は強化してもよい。ヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体を１つ以上の細胞毒素に結合させて、インターロイキン１αを発現する細胞をより効果的に死滅させてもよい。本発明で使用される細胞毒素は、ヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体に結合させることができるあらゆる細胞毒性薬（例えば、細胞と接触した後にその細胞を殺すことができる分子）であってもよい。細胞毒素の例は、限定されるものではないが、放射性核種（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、２０１Ｔｌ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５７Ｃｕ、２１３Ｂｉ及び２１１Ａｔ）、結合した放射性核種及び化学療法剤を含む。さらに、細胞毒素の例は、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレザト（ＭＴＸ）、フルダラビンなど）、抗微小管薬剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、タキサン（パクリタキセル及びドセタセルなど）など）、アルキル化薬（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）など）、白金薬剤（例えば、シスプラチン（ｃＤＤＰとも呼ばれる）、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３など）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、抗生物質（例えば、マイトマイシンＣ）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシド、テニポシド及びカンプトテシン）、又は、（リシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、サポリン、アメリカヤマゴボウウィルスタンパク、臭化エチジウム、グルココルチコイド、炭疽毒素などの）その他の細胞毒性薬を含む。例えば、米国特許第５，９３２，１８８号を参照されたい。
【００３０】
検出可能なラベルにヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体を結合させることもできる。本発明において有用な検出可能なラベルは、ビオチン又はストレプトアビジン、磁気ビーズ、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパクなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ又は７２Ａｓ）、放射性イメージングのための金属などの放射線不透過性物質、磁気共鳴画像のための常磁性薬剤、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるその他のもの）、コロイド金若しくは有色ガラスなどの比色定量ラベル、又は、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズを含む。そのようなラベルを検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、写真フィルム又はシンチレーション計数器を用いて放射標識を検出してもよい。蛍光マーカーを用いてもよく、放射された光束を光検出器を用いて検出することによって、蛍光マーカーを検出することができる。酵素ラベルは、一般的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生じた反応生成物を検出することによって検出される。比色定量ラベルは、単純に有色ラベルを視覚化することによって検出される。
【００３１】
本発明は、ヒトインターロイキン１αに対して特異的なヒトモノクローナル抗体をコードする完全な核酸分子を包含する。同じ核酸分子がヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードしてもよいが、重鎖をコードする１つの核酸と、軽鎖をコードするもう１つの核酸との２つの異なる核酸分子を用いてもよい。ヒトインターロイキン１αに対して特異的な３つのＩｇＧ１モノクローナル抗体のアミノ酸配列を与える。配列番号１、３、５、７、９及び１１を参照されたい。また、これらのアミノ酸配列をコードする例示的核酸分子を記載する。配列番号２、４、６、８、１０及び１２を参照されたい。２つの記載されているＩｇＧ１モノクローナル抗体又は本発明に含まれるその他のモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするその他のあらゆる適切な核酸を用いてもよい。
【００３２】
モノクローナル抗体の生産のために、本発明の核酸分子は、そのような核酸分子が作用可能な状態で転写制御配列及び翻訳制御配列などの発現制御配列に連結される方向で発現ベクター中に組み込まれていてもよい。発現ベクターの例は、プラスミドに由来するベクター、並びに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクターを含む。軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、単一のベクターに組み込まれていてもよいし、又は、異なるベクターに組み込まれていてもよい。本発明のベクターは、プロモータ及び／若しくはエンハンサなどの調節配列（米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号及び米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい）、選択マーカ、又は、親和性タグ（精製を容易にするためのもの）若しくは検出可能なラベルをコードする配列を含んでいてもよい。
【００３３】
モノクローナル抗体の生産のために、本発明のベクターを、例えば、バクテリアなどの原核細胞、又は、好ましくは哺乳動物、植物又は酵母などの真核細胞といった適切な宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞中に異種起源のポリヌクレオチドを導入する方法の例は、ウイルスベクターの使用、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、アグロバクテリウム媒介性トランスフォーメーション、遺伝子銃トランスフォーメーション、及び、核内へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションを含む。現在のところ、哺乳動物細胞株は、ベクターからのモノクローナル抗体の発現に好ましい。哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞株）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞を含む。本発明のモノクローナル抗体は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物において発現されてもよい。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；第５，７５６，６８７号；第５，７５０，１７２号；第５，７４１，９５７号；第６，０４６，０３７号；及び第５，９５９，１７７号を参照されたい。
【００３４】
本発明は、細胞をヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体と接触させてその細胞に結合したモノクローナル抗体を検出することによって、サンプル中のヒトインターロイキン１αを発現する細胞を検出する方法を提供する。本発明は、細胞をヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体と接触させることによってヒトインターロイキン１αを発現する細胞を死滅させる方法をも提供する。そのような死滅は、補体媒介性障害、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害、又は、細胞毒素の抗体媒介性送達によって達成することができる。ここに記載されている抗体は、その他の方法にも有用であることが示されている。例えば、ＭＡＢｐ１は、インターロイキン１αによって誘導される内皮細胞におけるＩＣＡＭ１及びＥ−セレクチン発現を減少させている。ＭＡＢｐ１は、生体サンプル中のインターロイキン１αの検出及び定量のための免疫測定に用いられることが示されている。
【００３５】
実施例１−抗ヒトインターロイキン１αＩｇＧ１及びκ鎖のクローニング
可変領域重鎖（Ｖ−ＨＣ）及び可変領域軽鎖（Ｖ−ＬＣ）の配列は、米国特許第５，９５９，０８５号で提供されているアミノ酸配列情報を用いて合成される遺伝子であった。ＡＴＧ開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｌ部位を導入し、３’末端にＮｈｅｌ部位を導入して、Ｖ−ＨＣをＰＣＲ増幅させた。ヒト生殖細胞ＩｇＧ１定常領域（エキソン及びイントロンを含む）を、最初の２個のアミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒをコードする５’トリプレットをＮｈｅｌ部位に組み換えて、３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入して、ＰＣＲ増幅させた。ヒト生殖細胞ＩｇＧ１定常領域アミノ酸配列は、Ｋ１７１Ｑ及びＶ２６１Ｌ交換を除いて、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０１８５７に対応していた。Ｖ−ＨＣ配列と定常ＩｇＧ１−ＨＣ配列とをＮｈｅｌ部位を用いて結合し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１部位を用いてｐｃＤＮＡ３中にクローンした。
【００３６】
＞ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１−ＨＣ
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＭＦＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＡＶＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＩＬＦＬＱＭＤＳＬＲＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＫＶＶＩＰＡＰＬＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＦＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＱＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＬＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：１）
【００３７】
＞ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１−ＨＣ
ａｔｇｇａｇｔｔｃｇｇｇｃｔｇａｇｔｔｇｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇａｇｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔｇｃｇｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃｇｇｔｔｔｔａｃｃｔｔｔｔｃｔａｔｇｔｔｔｇｇｔｇｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃａａｇｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｔｔａｃｇａｃｇｇｇｔｃｃａａｃａａａｔａｔｔａｃｇｃｔｇａｇａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃａｇａｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇａｇａｔａａｔｔｃｃａａｇａａｔａｔｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇａｃａｇｔｃｔｇａｇａｃｔｇｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｃｃｃｔａａｇｇｔｇｇｔｃａｔｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇｇｃａｃａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｇａｃｃｔｔｔｔｃｔａｇｃｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｃａａｇａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｇｇｇｃａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｃｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔａｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃｃａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｔｔａａｇｔｃｃｇｇｇａａａａｔａａ（配列番号：２）
【００３８】
ＡＴＧ開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｌ部位を導入し、３’末端にＢｓｉＷＩ部位を導入して、Ｖ−ＬＣをＰＣＲ増幅させた。付加されたＡｒｇ及び第１アミノ酸Ｔｈｒをコードする５’ＢｓｉＷＩ部位を導入し、３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入して、ヒト定常カッパＬＣ配列をＰＣＲ増幅させた。ヒト定数カッパＬＣアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０１８３４に対応していた。ＢｓｉＷＩ部位を用いてＶ−ＨＣ配列と定常カッパＬＣ配列とを結合し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位を用いてｐｃＤＮＡ３中にクローンした。
【００３９】
＞ヒトインターロイキン１α−Ｋ−ＬＣ
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＳＦＬＬＳＦＧＧＧＴＫＶＥＨＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号：３］
【００４０】
＞ヒトインターロイキン１α−Ｋ−ＬＣ
ａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｃｇｔｇｃｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｔｇｇａｔｃｔａｇｇｔｇｃｇａｃａｔｔｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｃａｇｃｔｃａｇｔｇｔｃａｇｃｃｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃａａｔｃａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｃｔｃｔｃａｇｇｇａａｔｃｔｃｔａｇｔｔｇｇｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｔｇｇａａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｔｇａａｇｃｃｔｃｃａａｃｃｔｇｇａｇａｃｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔｃｔｃｇｃｔｔｃａｇｃｇｇｃｔｃａｇｇｃｔｃａｇｇｃａｇｔｇａｔｔｔｔａｃｔｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｃｃａｇａｇｇａｔｔｔｃｇｃｔａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇａｃｃｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｔｔｃｇｇｇｇｇａｇｇｃａｃａａａｇｇｔｇｇａｇｃａｃｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｔｔｃａｃｃｇｇｔｇａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔａｇ［配列番号：４］
【００４１】
実施例２−ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１及びκ鎖の生成
ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α／ＩｇＧ１重鎖をコードする完全な配列を遺伝子合成した。Ｖ−ＨＣ配列は、米国特許第５，９５９，０８５号に記載されているアミノ酸配列に対応していた。ヒト定常ＩｇＧ１−ＨＣ配列は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０１８５７に対応していた。このヌクレオチド配列は、ＣＨＯ細胞における発現に最適化されたコドンであった。Ｋｏｚａｃ配列（ｇｃｃａｃｃ）を開始ＡＴＧの上流に加えた。
【００４２】
＞ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１−ＨＣ
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＭＦＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＡＶＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＩＬＦＬＱＭＤＳＬＲＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＫＶＶＩＰＡＰＬＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＦＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ［配列番号：５］
【００４３】
＞ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１−ＨＣ
ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｇｔｔｃｔｔｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇａｇｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｔｇｃｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｔｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｇａｇａｔｃｔｃｔｇｃｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｃａｃｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｇｇｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃａａａｇｇａｃｔｃｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｃａｇｃｔｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｃｇｇｇｔｃｔａａｃａａａｔａｔｔａｃｇｃｔｇａｇｔｃｔｇｔｃａａｇｇｇｔａｇｇｔｔｔａｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｇａｔａａｔｔｃｃａａａａａｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃａａａｔｇｇａｃｔｃｔｃｔｇａｇｇｃｔｇｇａａｇａｔａｃｔｇｃａｇｔｃｔａｃｔａｔｔｇｔｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｃａａａｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｔｔｔｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃｃｔｃｃａａａｔｃｔａｃｔｔｃｔｇｇａｇｇｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇａｔｇｔｃｔｃｇｔｇａａａｇａｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｇｔｇａｇｃｔｇｇａａｃａｇｃｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｔａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｔｃｃｃｇｃａｇｔｇｃｔｇｃａａｔｃｔａｇｃｇｇｇｃｔｇｔａｃｔｃｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｇｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｃｔｃｇｇａａｃｔｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｔｇｔｃａａｔｃａｔａａａｃｃｃｔｃｔａａｔａｃｃａａａｇｔｃｇａｔａａｇａａｇｇｔｃｇａａｃｃｔａａａｔｃｔｔｇｃｇａｔａａａａｃｃｃａｔａｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｃｇａａｃｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｃｃｃｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｃｃａａａｇａｔａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃｔｔｇｔｇｔｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａａｇａｔｃｃａｇａａｇｔｃａａａｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｔｇｔｇｇａｃｇｇｇｇｔｃｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃａａａｇａｃｃａａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃａｇｔａｔａａｔａｇｃａｃａｔａｔａｇｇｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｇａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｔｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａａｇａａｔａｔａａｇｔｇｔａａａｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃａａｔｃｇａａａａｇａｃａａｔｃｔｃｔａａａｇｃｃａａｇｇｇｇｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｔｃａｇｇｔｃｔａｔａｃａｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｇｇｇａｔｇａａｃｔｇａｃｃａａｇａａｔｃａｇｇｔｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｃｔｔｇｔｇａａｇｇｇｔｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇａｃａａｃｃａｇａａａａｔａａｃｔａｃａａａａｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃｔｃｔａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｔａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｔｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃａｃｔｇｃａｃａａｔｃａｔｔａｔａｃａｃａａａａｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃａｇｇａａａｇｔａａ［配列番号：６］
【００４４】
ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α／κ軽鎖をコードする完全な配列を遺伝子合成した。Ｖ−ＬＣ配列は、米国特許第５，９５９，０８５号に記載されているアミノ酸配列に対応していた。ヒト定常カッパＬＣ配列は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０１８３４に対応していた。このヌクレオチド配列は、ＣＨＯ細胞の発現に最適化されたコドンであった。Ｋｏｚａｃ配列（ｇｃｃａｃｃ）をＡＴＧの上流に加えた。
【００４５】
＞ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α−Ｋ−ＬＣ
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＳＦＬＬＳＦＧＧＧＴＫＶＥＨＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号：７］
【００４６】
＞ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α−Ｋ−ＬＣ
ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｇａｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔｇｇｔｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｔｇｔｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃｃｔｃｃｔｃｃｇｔａｔｃｔｇｃａｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｃａｃａａｔｃａｃｔｔｇｔａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｇａｔｃｔｃｔａｇｔｔｇｇｃｔｃｇｃａｔｇｇｔａｃｃａａｃａａａａｇｃｃａｇｇｔａａｇｇｃｔｃｃｇａａａｃｔｇｃｔｃａｔｔｔａｃｇａａｇｃｔａｇｔａａｃｃｔｃｇａａａｃａｇｇｃｇｔｇｃｃａａｇｃｃｇｇｔｔｔａｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｔｔｃｃｇｇｔｔｃｔｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｃａｃｔａｔｔｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃａａｃｃｔｇａｇｇａｔｔｔｔｇｃｃａｃａｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａａａｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇｃｔｃｔｃｃｔｔｔｇｇｔｇｇｇｇｇａａｃｔａａｇｇｔｇｇａｇｃａｃａｃａｇｔｇｇｃｃｇｃｃｃｃｃａｇｃｇｔｃｔｔｔａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａｇｃｇａｔｇａａｃａｇｃｔｇａａｇｔｃａｇｇｇａｃｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃａａｔａａｔｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｇｃｇａｇｇｃｔａａｇｇｔｃｃａａｔｇｇａａａｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａｇａｇｃｇｇｔａａｃｔｃｔｃａｇｇａｇｔｃｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａａｇａｃａｇｃａａｇｇａｔａｇｃａｃｃｔａｔｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔｃｔａａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇａｇｇｔｇａｃｔｃａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｔａｇｃｃｃｔｇｔｇａｃａａａａｔｃｔｔｔｃａａｔａｇｇｇｇａｇａａｔｇｃｔｇａ［配列番号：８］
【００４７】
実施例３−ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α（ＩｇＧ１／ｋサブタイプ）の発現
ＮＡＴＨＭＡＢ−インターロイキン１αを一時的トランスフェクション方法を用いて発現させ、精製した。細胞培養上澄み又はＧタンパク質親和性精製された抗体を、以下に記載されているさらなる分析に供した。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、製造社のプロトコルに従ってｊｅｔＰＥＩ試剤（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いて一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に１０ｃｍのディッシュ上に細胞を撒き（１０ｃｍのディッシュ当たりに３×１０６細胞）、トランスフェクション時に約５０％の密度に達するようにした。ディッシュ当たり５μｇのｐｃＤＮＡ３−抗ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧ１−Ｈｃ及び２倍モル過剰量のｐｃＤＮＡ３−抗ヒトインターロイキン１α−Ｋａｐｐａをトランスフェクションに用いた。回収後に、媒体を、２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（１ディッシュ当たり１０ｍｌ）に変更し、５〜６日間抗体を回収した。上澄みを回収し、ろ過し、ｐＨ７．５〜８に調整して、さらなる使用まで４℃で保存した。
【００４８】
上澄み（２５０ｍｌ）の一部を、回転ホイール上で４℃においてＧタンパクセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に３時間インキュベートした。その後、Ｇタンパクセファロースを重力流カラムにロードし、ＰＢＳで洗浄した。１００ｍＭのグリシン／１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００μｌのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を用い、その後の１０％グリセロールを含むＰＢＳによる透析によって、１ｍｌの画分中に抗体を溶出させた。ＢＣＡタンパク検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて各画分の総タンパク濃度を測定した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって重鎖及び軽鎖の正確なサイズ並びに組み立てられた天然抗体の正確なサイズを確認した。
【００４９】
ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α精製抗体及び生成ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリトンＸ−１００細胞溶解物を含む上澄みを用いて、１２５Ｉ−インターロイキン１αを用いた放射免疫定量法（ＲＩＡ）における抗原結合について試験を行った。タンパクＧへの吸着によって結合を定量した。すべてのサンプルは、溶出液中において最も高い活性で１２５Ｉ−ヒトインターロイキン１αに結合した。０．０１２％濃度（ＲＩＡにおいて最大半量の活性）の精製されたＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１αの１２５Ｉ−ヒトインターロイキン１αに対する結合を、親和係数の測定に用いた。これらの条件下におけるＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１αのＫａは、３．０３×１０１０Ｍ−１であった。逆算によって、精製された溶出液中の活性抗ヒトインターロイキン１α−ＩｇＧの濃度が推定的に約３０μｇ／ｍｌであることが明らかになった。
【００５０】
マウス又はヒトインターロイキン１αで処理を行うと高いレベルのインターロイキン２を生成するマウスＥＬ４−６．１亜系統を用いた生物的分析において、ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１αの中和活性を試験した（Ｚｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：３６６２−３６６８，１９８５）。示されている濃度のＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α（溶出液）を、９６ウェル培養プレート（平底）内において、最終体積が１００μｌ／ウェルの様々な濃度の組み換えのヒトインターロイキン１α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。各ポイントを培地（ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ）中において３回反復して実行した。０．２μｇ／ｍｌのイオノマイシンを含む培地中のＥＬ４−６．１細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）の懸濁液１００μｌを各ウェルに加えた。５％ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で２４時間のインキューベートした後に、細胞が含まれていない上澄みを回収し、市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、インターロイキン２濃度について分析した。その結果は、ＮＡＴＨＭＡＢ−インターロイキン１αが、ヒトインターロイキン１αで誘導されたＥＬ−４細胞によるインターロイキン２の分泌を有効に中和することができることを示した。
【００５１】
膜結合ヒトインターロイキン１αの中和について試験を行うために、上記されている同じＥＬ−４細胞ベースの分析を以下のように変更して用いた。様々な濃度のＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α（溶出液）を、様々な数のヒト活性化単球と共にインキュベートした。単球を調製するために、フィコール・パック遠心分離機を用いて、軟膜からＰＢＭＣを分離した。ＲＰＭＩ中において単球を３７℃で１．５時間にわたってプラスチックディッシュ上に付着させた。付着していないリンパ球を洗い流してほぼ純粋な単球培地を作った。Ｇｌｎ、Ｐｙｒ及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中において、単球を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）と共に、５％ＣＯ２炭酸インキュベータ内において３７℃で２４時間培養した。細胞を、ＰＢＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを用いて分離し、慎重にプレートからこすり落とし、ファルコンチューブ内に移した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＰＦＡ中に再懸濁し、２０℃において１０分間固定した。細胞を、グリシンバッファ（１５０ｍＭのグリシン、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで培養液で洗浄し、数をカウントした。その結果は、ＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１αが、膜結合ヒトインターロイキン１αで誘導されたＥＬ−４細胞によるインターロイキン２分泌を有効に中和することを示した。上述されているものと類似の試験において、マウスインターロイキン１αの中和についてＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１αを試験した。示されている量のＮＡＴＨＭＡＢ−ヒトインターロイキン１α上澄みを、組み換えヒト（ｈ）又はマウス（ｍ）インターロイキン１α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートした。抗体を含む上澄みは、ヒトインターロイキン１αを中和したが、マウスインターロイキン１αを中和しなかった。
【００５２】
実施例４−抗体による癌細胞の死滅
標準的フィコールパック調製によって軟膜から分離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＲＰＭＩ−１６４０ＣＭ又は組み換えヒトインターロイキン２（３０ナノグラム／ｍｌ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＲＰＭＩ−１６４０−ＣＭのいずれかにおいて、３７℃及び５％ＣＯ２中で一晩培養し、作動細胞（Ｅ）として用いた。ＴＨＰ１細胞をターゲット（Ｔ）として用いた。９６ウェルプレートにおいて各ポイントを３回反復して分析を実行した。１×１０４個のターゲットを様々な濃度のＭＡＢｐ１と共に１５分間インキュベートした後に、１×１０４個のターゲットに２５：１及び５０：１のＥＴ比で作動細胞を加え、さらに４時間培養した。７５μｌの分析体積を、新しい９６ウェルプレートに移し、ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造社のプロトコルに従って細胞毒性を分析した。
％特異的細胞溶解＝（平均試験放出−抗体を含まない平均自然放出）×１００／（ターゲットからの平均最大放出−ターゲットからの平均自然放出）
Ａ．処理していないＰＢＭＣを作動細胞として用いた。
Ｂ．組み換えヒトインターロイキン２で処理したＰＢＭＣを作動細胞として用いた。
いずれの場合においても、ＭＡＢｐ１の濃度（１．２５〜２０μｇ／ｍｌ）を増加させることは、両方のＥＴ比においてターゲット細胞殺傷の増大（約９０％まで）をもたらした。
【００５３】
実施例５−ヒト抗ヒトインターロイキン１α特異的モノクローナル抗体配列
ヒトインターロイキン１α（ＭＡＢｐ１）に対して特異的なもう１つのヒト抗−ヒトインターロイキン１αＩｇＧ１／κ軽鎖をコードする完全な配列を合成して上記のように発現させた。重鎖及び軽鎖をコードする核酸中に、開始ＡＴＧの上流にＫｏｚａｃ配列（ｇｃｃａｃｃ）を加えた。
【００５４】
重鎖
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＭＦＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＡＶＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＩＬＦＬＱＭＤＳＬＲＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＫＶＶＩＰＡＰＬＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＦＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ［配列番号：９］
ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｇｔｔｃｔｔｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇａｇｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｔｇｃｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｔｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｇａｇａｔｃｔｃｔｇｃｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｃａｃｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｇｇｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃａａａｇｇａｃｔｃｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｃａｇｃｔｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｃｇｇｇｔｃｔａａｃａａａｔａｔｔａｃｇｃｔｇａｇｔｃｔｇｔｃａａｇｇｇｔａｇｇｔｔｔａｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｇａｔａａｔｔｃｃａａａａａｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃａａａｔｇｇａｃｔｃｔｃｔｇａｇｇｃｔｇｇａａｇａｔａｃｔｇｃａｇｔｃｔａｃｔａｔｔｇｔｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｃａａａｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｔｔｔｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃｃｔｃｃａａａｔｃｔａｃｔｔｃｔｇｇａｇｇｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇａｔｇｔｃｔｃｇｔｇａａａｇａｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｇｔｇａｇｃｔｇｇａａｃａｇｃｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｔａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｔｃｃｃｇｃａｇｔｇｃｔｇｃａａｔｃｔａｇｃｇｇｇｃｔｇｔａｃｔｃｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｇｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｃｔｃｇｇａａｃｔｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｔｇｔｃａａｔｃａｔａａａｃｃｃｔｃｔａａｔａｃｃａａａｇｔｃｇａｔａａｇａｇｇｇｔｃｇａａｃｃｔａａａｔｃｔｔｇｃｇａｔａａａａｃｃｃａｔａｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｃｇａａｃｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｃｃｃｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｃｃａａａｇａｔａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃｔｔｇｔｇｔｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａａｇａｔｃｃａｇａａｇｔｃａａａｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｔｇｔｇｇａｃｇｇｇｇｔｃｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃａａａｇａｃｃａａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃａｇｔａｔａａｔａｇｃａｃａｔａｔａｇｇｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｇａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｔｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａａｇａａｔａｔａａｇｔｇｔａａａｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃａａｔｃｇａａａａｇａｃａａｔｃｔｃｔａａａｇｃｃａａｇｇｇｇｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｔｃａｇｇｔｃｔａｔａｃａｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｇｇｇａｇｇａａａｔｇａｃｃａａｇａａｔｃａｇｇｔｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｃｔｔｇｔｇａａｇｇｇｔｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇａｃａａｃｃａｇａａａａｔａａｃｔａｃａａａａｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃｔｃｔａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｔａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｔｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃａｃｔｇｃａｃａａｔｃａｔｔａｔａｃａｃａａａａｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃａｇｇａａａｇｔａａ［配列番号：１０］
【００５５】
軽鎖
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＳＦＬＬＳＦＧＧＧＴＫＶＥＨＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号：１１］
ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｇａｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔｇｇｔｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｔｇｔｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃｃｔｃｃｔｃｃｇｔａｔｃｔｇｃａｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｃａｃａａｔｃａｃｔｔｇｔａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｇａｔｃｔｃｔａｇｔｔｇｇｃｔｃｇｃａｔｇｇｔａｃｃａａｃａａａａｇｃｃａｇｇｔａａｇｇｃｔｃｃｇａａａｃｔｇｃｔｃａｔｔｔａｃｇａａｇｃｔａｇｔａａｃｃｔｃｇａａａｃａｇｇｃｇｔｇｃｃａａｇｃｃｇｇｔｔｔａｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｔｔｃｃｇｇｔｔｃｔｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｃａｃｔａｔｔｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃａａｃｃｔｇａｇｇａｔｔｔｔｇｃｃａｃａｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａａａｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇｃｔｃｔｃｃｔｔｔｇｇｔｇｇａｇｇａａｃｔａａｇｇｔｇｇａｇｃａｃａａｇｃｇｇａｃａｇｔｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔａｇｃｇｔｃｔｔｔａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃａａｇｃｇａｔｇａａｃａｇｃｔｇａａｇｔｃａｇｇｇａｃｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃａａｔａａｔｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｇｃｇａｇｇｃｔａａｇｇｔｃｃａａｔｇｇａａａｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａｇａｇｃｇｇｔａａｃｔｃｔｃａｇｇａｇｔｃｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａａｇａｃａｇｃａａｇｇａｔａｇｃａｃｃｔａｔｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔｃｔａａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇａｇｇｔｇａｃｔｃａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｔａｇｃｃｃｔｇｔｇａｃａａａａｔｃｔｔｔｃａａｔａｇｇｇｇａｇａａｔｇｃｔｇａ［配列番号：１２］
【００５６】
実施例６−ＭＡＢｐ１結合親和性
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、精製ＭＡＢｐ１の結合親和性を決定した。ヒト抗体捕捉キット及びアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、ＣＭ５センサチップのフローセル上に共有結合で固定化した。典型的には８０００−１４０００ＲＵの固定化レベルが達成されるであろう。マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）捕捉抗体の固定化の後に、ＨＢＳ−ＥＰ泳動バッファ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた３回のスタートアップサイクル及びＭＡＢｐ１を用いた２回のスタートアップサイクルを実行して、ＣＭ５表面を安定化し、共有結合しないあらゆる抗体を除去した。分析のために、ＭＡＢｐ１抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ泳動バッファ中で１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、ＣＭ５センサチップの１個のフローセル上に７００ＲＵまで固定化した。担体を含まないヒトＩＬ−１Ａサイトカイン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃３４−８０１９）を、ＨＢＳ−ＥＰ泳動バッファ中によって、１００ｎＭから０．０５ｎＭの試験範囲にひと続きに希釈した。流速は３０μｌ／分であった。各サイトカイン希釈物の溶出データを１５分間記録した。各サイクル後に、３ＭのＭｇＣｌ２の単独注射を３０μｌ／分の流速で２５秒間行って、ＣＭ５表面を再生した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及びＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いてデータを一致させた。ＭＡＢｐ１に対するＫＤは、２．０×１０−１０Ｍ未満であることがわかった。
【００５７】
実施例７−ＭＡＢｐ１は基底膜マトリクス腫瘍細胞侵入を阻害する
マトリゲル（ＢＤ）、基底膜マトリクスを４℃において一晩解凍し、血清を含まない冷却された細胞培養液で希釈した（５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）。１００μｌの希釈されたマトリゲルを、２４ウェルのトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ）の上部室に入れ、ゲル化のために３７℃で少なくとも４〜５時間培養した。腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴＨＰ−１）を、トリプシン／ＥＤＴＡによって組織培養フラスコから回収し、培養液で洗浄し、１％ＦＢＳを含む媒体中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ゲル化したマトリゲルを暖めた無血清培養液で穏やかに洗浄し、各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。トランスウェルの下部室を６００μｌの培養液で満たし、そのプレートを３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。マトリゲルに侵入しなかった細胞を各トランスウェル上から綿球で穏やかにこすり落とした。次いで、トランスウェルを２４ウェルプレートから取り除き、侵入した細胞を７０％エタノール又はメタノールで固定した後に、トランスウェルをクリスタルバイオレットで染色した。侵入した細胞を光学顕微鏡下でカウントした。マトリゲルに侵入する細胞の割合は、ＭＡＢｐ１の存在下において有意に阻害された。
【００５８】
実施例８−ＭＡＢｐ１は内皮細胞におけるＩＣＡＭ１発現の増加をブロックする
低血清増殖サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が加えられたＭ−２００溶媒１ｍＬ中のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、１ウェル当たり５×１０５個で２４ウェルプレートに撒いた。細胞を３〜４時間定着させた。溶媒を吸引し、１ウェル当たり１ｍｌのフレッシュなＭ−２００を加えた。ＭＡＢｐ１を４．２６μｇ／ｍｌで細胞に直接的に加え、室温で１５分間共培養し、次いで、組み換えヒトＩＬ−１α（組み換えヒトインターロイキン１α、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を４０ｐｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。ポジティブコントロールウェルにはＩＬ−１αのみを加えた。ＩＬ−１α非存在下又はＭＡＢｐ１非存在下のＨＵＶＥＣ細胞をネガティブコントロールとした。３７℃及び５％ＣＯ２での１７〜２０時間のインキューベーションの後に、細胞を、ＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ試剤（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いた２０分間の非酵素的処理によってプレートから離し、次いで、標準的流動細胞計測法プロトコルを用いてＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）発現について直ちに分析した。染色バッファは、２％の熱不活性化されたウシ胎児血清が加えられたダルベッコＰＢＳで構成されていた。ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＨＡ５８）又はＰＥ結合マウスＩｇＧ１ｋアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ、＃１２−４７１４）を製造社の説明書に従って用いて、１００マイクロリットルの染色体積で、暗闇において室温で２０分間ＨＵＶＥＣ細胞を染色した。続いて、染色バッファ中における２回の洗浄を行い、次に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でサンプルを得た。いくつかの独立した試験（ｎ＝５）において、ＨＵＶＥＣ細胞表面の組み換えヒトインターロイキン１αによって誘導されるＩＣＡＭ−１接着分子のアップレギュレーションは、ＭＡＢｐ１によって促進されていないＨＵＶＥＣ細胞によって示されたベースラインレベルまで中和された。
【００５９】
実施例９−ＭＡＢｐ１は内皮細胞におけるｅ−セレクチン発現の増大をブロックする
ＩＣＡＭ−１誘導に対するその効果と同様に、ＨＵＶＥＣ細胞に対するＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）の誘導のＭＡＢｐ１によって媒介される中和も観察された。ＨＵＶＥＣ細胞が、可溶性組み換えヒトインターロイキン１αによってではなく、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞（ＧＰＩ−ＩＬ１Ａ細胞）の表面にグリコシル−ホスファチジルイノシトールによって固定された膜性ＩＬ−１ａによって促進される場合、この効果が最も顕著であった。この試験において、６ウェルプレート中のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエント培養液を、単独で、１０μｇ／ｍｌのＭＡＢｐ１の存在下で、又は、１０μｇ／ｍｌのＤ５アイソタイプコントロール抗体の存在下で、Ｍ−２００媒体中の５×１０６個のＧＰＩ−ＩＬ１Ａ  ＤＧ４４細胞と共に一晩共培養した。１７〜２０時間後に、ＨＵＶＥＣ単層を、ダルベッコＰＢＳで広く洗浄し、次に、ＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ試剤（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いた２０分間の非酵素的処理によって離し、、次いで、標準的流動細胞計測法プロトコルを用いてＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）発現について直ちに分析した。染色バッファは、２％熱不活性化ウシ胎児血清が加えられたダルベッコＰＢＳで構成されていた。ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ６２Ｅモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＰ２Ｈ３）又はＰＥ結合マウスＩｇＧ１ｋアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ、クローンＰ３）を製造社の説明書に従って用いて、１００マイクロリットルの染色体積で、暗闇において室温で２０分間ＨＵＶＥＣ細胞を染色した。続いて、染色バッファ中で２回の洗濯を行い、次に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でサンプルを得た。膜性ＧＰＩ−ＩＬ−１ａによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞表面においてアップレギュレートされるＥ−セレクチン発現は、ＭＡＢｐ１によって、促進されていないＨＵＶＥＣ細胞によって示されるベースラインレベルまで中和された。
【００６０】
実施例１０−ＭＡＢｐ１効力（組み換えヒトインターロイキン１Ａの中和）に関するＭＲＣ−５生物試験
ＡＴＣＣコレクション（ＣＣＬ−１７１）から胎児ヒト肺繊維芽細胞に由来するＭＲＣ−５細胞株を得た。ＭＲＣ−５細胞からのＩＬ−１Ａによって誘導されるＩＬ−６の放出を測定することによって、ＭＡＢｐ１のＩＬ−１中和能力を分析した。ＭＲＣ−５細胞を、１００マイクロリットルのＤＭＥＭ完全培地中に１ウェル当たり５×１０３で９６ウェルプレートに撒いた。加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で細胞を一晩培養した。続いて、コンフルエントのＭＲＣ−５細胞を、単独で又は増大させた濃度のＭＡＢｐ１の存在下で、２０ｐｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−１Ａ（組み換えヒトインターロイキン１Ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にさらに２４時間培養した。ネガティブコントロール細胞は、組み換えヒトインターロイキン１Ａによって刺激されなかった。２４時間後に上澄みを回収し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−６放出について分析した。ＩＣ５０、又は、最大のＩＬ−６放出の５０％を阻害するのに必要なＭＡＢｐ１の濃度は、０．００１〜０．０１μｇ／ｍＬの範囲内であった。
【００６１】
実施例１１−ＭＡＢｐ１はＩＬ−１ａ＋細胞を識別する
１００マイクロリットルのナトリウムヘパリン抗凝結全血をポリスチレンＦＡＣＳチューブに等分した。サンプルを、２ｍｌの熱不活性化ウシ胎児血清を加えた１ｍｇのヒトＩｇＧ（精製されたプロテインＡ）と共に室温において１５分間インキュベートすることによって、Ｆｃ受容体をブロックした。その後、サンプル：アレクサ−４８８でラベルされた１ｍｇのＭＡＢｐ１、ＦＩＴＣでラベルされた１ｍｇのモノクローナル抗膜ヒトＩＬ１Ａ抗体（ＦＡＢ２００Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は、１ｍｇのマウスアイソタイプコントロール（ＩＣ００２Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかに一次抗体を加えた。一次抗体を、暗闇の室温において３０分間サンプルと共にインキュベートした。その後、サンプル赤血球を室温において１５分間溶解させ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ溶液）、３００×ｇで５分間遠心分離して吸引した。サンプルペレットを、２％熱不活性化胎児血清を含む１ｍｌのハンクス液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄した。サンプルを０．３ｍｌのＨＢＳＳ＋２％ＦＢＳ中に再懸濁し、データをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで得て、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。ＭＡＢｐ１を用いたヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析は、ＰＢＭＣの０．２％のみがインターロイキン１αに対してポジティブであることを示した。
【００６２】
実施例１２−感染及び炎症を検出及び追跡するためのＭＡＢｐ１
ＭＡＢｐ１を用いたヒトＰＢＭＣの（実施例１１のような）フローサイトメトリー分析は、ＩＬ−１α＋に対してポジティブなＰＢＭＣのパーセントが、通常のコントロールと比較して、無症状感染を有する対象において３．６倍に増加したことを示した。同様に、炎症を起こした親知らずを有する対象において、ＩＬ−１α＋に対してポジティブなＰＢＭＣのパーセントが増加した。ＩＬ−１α＋ＰＢＭＣの数における実質的減少は、親知らずの除去の１４日後から４５日後までみられた。
【００６３】
実施例１３−インターロイキン１αの検知及び／又は定量のための免疫分析
ヒト対象の血漿中には一般に非常に低いレベルのＩＬ−１αが存在する。多くの場合においてこれらのレベルは従来的免疫分析の検出閾を外れているので、改善された感度を有するＥＬＩＳＡが開発された。このＥＬＩＳＡにおいては、抗体がサンプル中のインターロイキン１αに結合することを許容する条件下で、試験される生体サンプル（例えばヒト血漿）に外因性の抗インターロイキン１α抗体（例えばＭＡＢｐ１）を加えることができる。ヒト血漿サンプル中のインターロイキン１αのほとんどすべてが内因性抗インターロイキン１α抗体に既に結合して存在することがわかっているので、多くの場合においては後のステップを省略することができる。その後、ヒトインターロイキン１α抗体複合体を含むサンプルを、約１００ｋＤａの分子量遮断装置を有するフィルター（Ａｍｉｃｏｎ遠心装置）に適用することによって、サンプル中の分子量遮断未満の分子からヒトインターロイキン１α抗体複合体を分離した。ある試験においてはこれによって濃度が５０倍になった。その後、処理されたサンプル（及びその希釈物）を、抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  製品コード＃９０４２−０１）でコーティングされたマイクロタイタープレートのウェル中に加えた。サンプル中のヒトインターロイキン１α抗体複合体に結合するための時間を与えた後に、ウェルを洗浄して結合しない成分を除去した。その後、ラベルされた抗ヒトインターロイキン１α二次抗体（０．２μｇ／ｍｌのビオチン結合モノクローナルマウス抗ヒトＩＬ−１Ａ抗体、クローンＣＲＭ６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ＃１３−７０１７）をそのウェルに加えた。ウェル中のインターロイキン１αに結合するための時間を与えた後に、プレートを洗浄し、試験したサンプル中のインターロイキン１αの濃度の指標として、各ウェル中のラベルされた抗ヒトインターロイキン１αの量を定量した。
【００６４】
その他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前記説明は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するように意図されておらず、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によって定められることは理解されるであろう。その他の態様、長所及び変更は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【配列表】
2020143127000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月8日(2020.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１αに特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、軽鎖に共有結合した重鎖を含み、前記重鎖が配列番号９の２０乃至４７１位のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１１の２３−２３６位のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖をコードする第１の核酸配列、および、請求項１に記載のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第２の核酸配列を含む核酸のセット。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸のセットにおいて、前記核酸のセットが、少なくとも１つの発現ベクター中に含まれていることを特徴とする核酸のセット。
【請求項４】
請求項２または３に記載の核酸のセットを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞において、前記宿主細胞が、哺乳類宿主細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
療法に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、薬学的に許容できる担体および請求項１に記載のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
医薬の製造における、薬学的に許容できる担体および請求項１に記載のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む医薬組成物の使用。