(57)【要約】      （修正有）【課題】例えば、血管不安定性、血管新生、新血管形成、血管漏出、および浮腫によって特徴付けられる眼障害を処置するための、血管内皮プロテインチロシンホスファターゼ（ＶＥ−ＰＴＰまたはＶＥＰＴＰ）またはヒトプロテインチロシンホスファターゼ−ベータ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するヒト化モノクローナル抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１６年７月２０日に出願された米国仮出願第６２／３６４，３８１号、および２０１６年８月１９日に出願された米国仮出願第６２／３７７，０７２号（これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
非ヒト生物から生成されたモノクローナル抗体は、ヒトに投与されると、免疫応答を引き起こす可能性がある。これらの非ヒトモノクローナル抗体のセグメントは、標的特異性を保存しながら薬物免疫原性の可能性を低減させるために、ヒト化プロセスを介してヒト化配列と置き換えることができる。
【０００３】
参照による組み込み
本出願において引用される各々の特許、刊行物、および非特許文献は、各々が個々に参照により組み込まれたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物を提供する。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物を提供する。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明は、ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３４と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、ａ）配列番号２９と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３５と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、本発明は、ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３７と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ネズミＶＨ配列（切断ＶＨ０；配列番号４７）と、４つのヒト化バリアントの配列番号９（ＶＨ１）、配列番号１０（ＶＨ２）、配列番号１１（ＶＨ３）および配列番号１２（ＶＨ４）との配列アラインメントを示す。
【００１０】
【図２】図２は、ネズミＶＬ配列（切断ＶＬ０；配列番号４８）と、４つのヒト化ＶＬバリアントの配列番号２０（ＶＬ１）、配列番号２１（ＶＬ２）、配列番号２２（ＶＬ３）および配列番号２３（ＶＬ４）との配列アラインメントを示す。
【００１１】
【図３】図３は、ＨＰＴＰ−β細胞外ドメイン（ヒトＶＥ−ＰＴＰ／ＨＰＴＰ−β  ＥＣＤ）に対するモノクローナル抗体を生成するために使用されるハイブリドーマ技術をまとめている。
【００１２】
【図４】図４は、ヒト内皮細胞において内因性ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に結合したＲ１５Ｅ６の免疫沈降ウェスタンブロット（左パネル）およびフローサイトメトリー結果（右パネル）を示す。
【００１３】
【図５】図５は、ウェスタンブロットによる、組換え、６−Ｈｉｓタグ付きヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）、カニクイザルＰＴＰ−β、およびヒトＰＴＰ−η細胞外ドメインタンパク質に対するＲ１５Ｅ６の結合特異性を示す。
【００１４】
【図６】図６は、Ｔｉｅ２の濃度依存性リン酸化のウェスタンブロット（パネルＡ）および定量化（パネルＢ）およびＲ１５Ｅ６による増強した内皮細胞生存度（パネルＣ）を示す。
【００１５】
【図７】図７は、ウェスタンブロットによって決定した、マウス内皮細胞におけるＴｉｅ２（左上パネル）、マウスＶＥ−ＰＴＰ発現（左下パネル）、およびＡｋｔ（右パネル）に対する、ラット抗マウスＶＥ−ＰＴＰモノクローナル抗体１０９．１の効果を示す。
【００１６】
【図８】図８は、マウス内皮細胞における１時間のインキュベーション（パネルＡ）および３分のインキュベーション（パネルＢ）後の、マウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤに対するポリクローナル抗体によるＴｉｅ２活性化を示す。
【００１７】
【図９】図９は、マウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤポリクローナル抗体によるトロンビンおよびＶＥＧＦにより誘導された内皮細胞透過性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害を示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体１０９．１（パネルＡ）およびマウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤポリクローナル抗体（ＰＴＰ１−８）（パネルＢ）の静脈内投与による、ＶＥＧＦにより誘導された皮膚血管透過性のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害、ならびに対照ＩｇＧ（−）または抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体を注射したマウス（＋）の肺溶解物からのＴｉｅ２の免疫沈降（パネルＣ）を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、抗マウスＶＥ−ＰＴＰモノクローナル抗体１０９．１の眼内投与後の網膜新血管形成（パネルＡおよびＢ）および脈絡膜新血管形成（パネルＣ）に対する効果を示す。
【００２０】
【図１２】図１２は、抗マウスＶＥ−ＰＴＰモノクローナル抗体１０９．１の眼内投与後の網膜新血管形成（パネルＡおよびＢ）および脈絡膜新血管形成（パネルＣ）の平均面積の定量化を示す。
【００２１】
【図１３】図１３は、Ｒ１５Ｅ６の抗ヒトＶＥ−ＰＴＰ（抗ＨＰＴＰ−β）ヒト化バリアントの還元（パネルＡ）および非還元（パネルＢ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００２２】
【図１４】図１４は、Ｒ１５Ｅ６およびＨＣ０ＬＣ０のＨＣ１バリアントの、ＨＰＴＰ−βへの結合を示す。
【００２３】
【図１５】図１５は、Ｒ１５Ｅ６およびＨＣ０ＬＣ０のＨＣ２バリアントの、ＨＰＴＰ−βへの結合を示す。
【００２４】
【図１６】図１６は、Ｒ１５Ｅ６およびＨＣ０ＬＣ０のＨＣ３バリアントの、ＨＰＴＰ−βへの結合を示す。
【００２５】
【図１７】図１７は、Ｒ１５Ｅ６およびＨＣ０ＬＣ０のＨＣ４バリアントの、ＨＰＴＰ−βへの結合を示す。
【００２６】
【図１８】図１８は、ウェスタンブロットによって決定した、種々のヒト化抗体による、Ａｎｇ１の非存在下でのＴｉｅ２リン酸化（左パネル）およびＡｋｔ活性化（右パネル）を示す。
【００２７】
【図１９】図１９は、ウェスタンブロットによって決定した、ＨＣ２ＬＣ４およびＨＣ２ＬＣ１による、リガンドの非存在下での濃度依存性Ｔｉｅ２活性化（上パネル）およびＡｋｔ活性化（下パネル）を示す。
【００２８】
【図２０】図２０は、ウェスタンブロットによって決定した、ＨＣ２ＬＣ４およびＨＣ２ＬＣ１による、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の存在下でのＴｉｅ２リン酸化（左パネル）およびＡｋｔ活性化（右パネル）を示す。
【００２９】
【図２１】図２１は、ウェスタンブロットによって決定した、ＨＣ２ＬＣ１およびＨＣ２ＬＣ４による、Ａｎｇ１および／またはＡｎｇ２の存在下でのＴｉｅ２リン酸化（パネルＡ）、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）発現（パネルＢ）、およびＡｋｔ活性化（パネルＣ）を示す。
【００３０】
【図２２】図２２は、ウェスタンブロットによって決定した、単独での、および過剰の組換えヒトＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメインタンパク質（βＥＣＤ  ６ＨｉｓまたはβＥＣＤ  Ｆｃ）と共のＨＣ２ＬＣ１によるＡｋｔ活性化を示す。
【００３１】
【図２３】図２３は、非経口抗体（Ｒ１５Ｅ６）およびマウスＩｇＧ１対照と比較した、ＨＣ２ＬＣ１およびＨＣ０ＬＣ０による内皮細胞生存度の向上を示す。
【００３２】
【図２４】図２４は、マウスモデルにおける網膜剥離の処置のための抗マウスＶＥ−ＰＴＰ抗体／アフリベルセプト併用療法の有効性の向上を示す。
【００３３】
【図２５】図２５は、モノクローナル抗体１０９．１の皮下投与が、ビヒクルと比較してマウスにおける虚血性新血管形成を低減させたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、例えば、血管不安定性、血管新生、新血管形成、血管漏出、および浮腫によって特徴付けられる眼障害を処置するための、血管内皮プロテインチロシンホスファターゼ（ＶＥ−ＰＴＰまたはＶＥＰＴＰ）またはヒトプロテインチロシンホスファターゼ−ベータ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物は、Ｔｉｅ２タンパク質のリン酸化などのタンパク質リン酸化を促進することによって、Ｔｉｅ２シグナル伝達を活性化することができる。
【００３５】
ＶＥ−ＰＴＰは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）の受容体様ファミリーのメンバーである。ＶＥ−ＰＴＰは、細胞接着分子との構造的および機能的類似性を示す、主に血管内皮細胞において見出される膜貫通タンパク質である。ＶＥ−ＰＴＰは、例えば、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、イヌ、マウス、マーモセット、サル、およびヒトを含む種々の種において見出される。ＶＥ−ＰＴＰのヒトオルソログはＨＰＴＰ−βである。
【００３６】
Ｔｉｅ２（免疫グロブリンおよび上皮増殖因子相同ドメイン２を有するチロシンキナーゼ）は、発生の全体にわたって主に血管内皮細胞において発現される膜受容体チロシンキナーゼである。Ｔｉｅ２リン酸化の主要な調節因子は、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）である。Ａｎｇ１はＴｉｅ２のアゴニストであり、Ａｎｇ１のＴｉｅ２への結合は受容体リン酸化を促進する。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２の状況依存的なアンタゴニストまたはアゴニストにおいて作用する。Ａｎｇ１のＴｉｅ２への結合は、内因性Ｔｉｅ２受容体リン酸化のレベルを増加させ、高度に組織化された血管新生による血管安定化、内皮細胞間結合の締め付け（ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）（内皮細胞近接）、内皮生存能の増強、内皮炎症の低減および内皮機能の改善を誘導するように下流シグナル伝達を開始する。血管新生の間、Ａｎｇ２はＡｎｇ１−Ｔｉｅ２シグナル伝達の負の調節因子として作用する。
【００３７】
生理的条件下では、Ｔｉｅ２リン酸化の持続時間は、Ｔｉｅ２受容体からホスフェートを除去するＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）によって調節される。ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を阻害することによって、Ｔｉｅ２リン酸化のレベルが実質的に増加し、血管安定性を回復させる。ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤、例えば、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に結合する抗体は、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を阻害することによってＴｉｅ２下流シグナル伝達を活性化することができる。阻害剤によるＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の阻害は、本明細書に記載される眼障害を有する被験体における血管安定性をもたらすことができる。
【００３８】
本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の細胞外ドメイン（配列番号４５）に対して免疫反応性であり、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の第１のＦＮ３リピート（配列番号４６）に対して免疫反応性である、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７５８０によって産生されるネズミモノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６を含むことができる。ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、Ｒ１５Ｅ６と同じまたは実質的に同じ生物学的特性を有する抗体、Ｒ１５Ｅ６の抗体断片を含むことができ、断片は、重鎖および軽鎖可変領域のうちの一方または両方、Ｒ１５Ｅ６のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖの二量体または三量体、ならびにＲ１５Ｅ６に由来するダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、またはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物の断片は本明細書に記載される任意の生物活性についてアッセイされ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物の断片は、Ｔｉｅ２を活性化することができるか、または等効力（ｅｑｕｉｐｏｔｅｎｔ）のレベル、増加したレベル、もしくは減少したレベルにて対応するインタクトな抗体の生物活性を提供することができる。
【化１】
2020180156.tif 000002
【化２】
2020180156.tif 000003
【００３９】
本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、単独で、または他のアミノ酸配列と組み合わせて抗体、またはその抗体断片、バリアント、もしくは誘導体を含むことができる。阻害剤は、修飾、例えば、酵素的開裂、および翻訳後修飾を受けてもよい。
【００４０】
本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）のドミナントネガティブアイソフォームに結合することができる。一部の実施形態では、このドミナントネガティブアイソフォームは、内因性ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）と競合し得るホスファターゼ活性が欠損しているＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の形態に対応することができる。ドミナントネガティブＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の機能評価は、導入遺伝子の送達およびＴｉｅ２リン酸化に対する効果の決定により行うことができる。
【００４１】
本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、複数のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）結合部位を含むことができる。一部の実施形態では、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、２つのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）分子に同時に結合することができ、それによって２つのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）分子を近接させる。ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、３つのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）分子に同時に結合することができ、それによって３つのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）分子を近接させる。
【００４２】
本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、別の部分またはビヒクルに共有結合または非共有結合によってコンジュゲートされ得る。部分またはビヒクルは、例えば、阻害剤の分解を阻害し、半減期を増加させ、吸収を増加させ、毒性を低減させ、免疫原性を低減させ、および／または生物活性を増加させることができる。部分の非限定的な例には、免疫グロブリンのＦｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、およびデキストランなどのポリマー、脂質、ステロイドなどのコレステロール基、炭水化物、デンドリマー、オリゴ糖、ならびにペプチドが含まれる。
【００４３】
本発明の化合物は、Ｔｉｅ２活性を回復させるためにＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化し、例えば、Ａｋｔ／ＰＩ３−Ｋシグナル伝達、Ｒａｃ１シグナル伝達、ＭＡＰＫ／Ｒａｓシグナル伝達を含む、下流のシグナル伝達カスケードを開始するために使用され得る。一部の実施形態では、本発明の化合物はＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害することができる。Ｔｉｅ２の活性化は血管安定化をもたらすことができ、これは、例えば、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜灌流、眼新血管形成、眼血管漏出、眼の浮腫、眼内圧、高眼圧症、眼の炎症、緑内障、および眼出血を含む、糖尿病関連状態および眼の状態の処置に有益であり得る。化合物はまた、例えば、創傷治癒、不安定な血流、心臓線維症、勃起不全、心筋症、虚血性傷害、心臓肥大、間質性線維症、腎症、アルブミン尿症、糸球体硬化症、腎線維症、神経障害、およびニューロン炎症を含む、末梢動脈疾患の処置に有効であり得る。
【００４４】
抗体
抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）ポリペプチド配列および２つの同一の軽鎖（Ｌ）ポリペプチド配列からなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域を含む。軽鎖の各々は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖可変領域は重鎖可変領域と整列し、軽鎖定常領域は重鎖定常領域ＣＨ１と整列する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対合は単一の抗原結合部位を一緒に形成する。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結される。２つの重鎖は、重鎖アイソタイプに応じて、１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を含む。
【００４５】
任意の脊椎動物種由来の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパまたはラムダと指定することができる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、５つのクラスの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分類され得、各々は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと指定される重鎖を有する。アルファおよびガンマのクラスは、重鎖定常領域の配列および機能の差に基づいてサブクラスにさらに分けられる。ヒトによって発現されるＩｇＡおよびＩｇＧのサブクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれる。
【００４６】
可変（Ｖ）領域は、抗体間で配列が広範囲に異なり得るセグメントを含む。可変領域は抗原結合を媒介し、その抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変領域の範囲にわたって均一に分布していない。代わりに、可変領域は、各々９〜１２アミノ酸長である超可変領域と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域の各々は、主にｆ３シート構成を取り、３つの超可変領域によって接続される４つのフレームワーク領域を含み、これらは、ｆ３シート構造を接続するループ、および一部の場合、ｆ３シート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖における超可変領域はフレームワーク領域によって近接して一緒に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００４７】
超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基、例えば、軽鎖可変領域ではおよそ２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）の残基、重鎖可変領域ではおよそ１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）の残基、ならびに／または超可変ループ由来の残基を含むことができる。
【００４８】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する可能性がある起こり得る天然に存在し得る変異を除いて同一である。異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は単一のエピトープに対する。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、各々が他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有益である。
【００４９】
本明細書に使用されるモノクローナル抗体は、例えば、キメラ抗体であって、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方で、鎖の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体、ならびにそのような抗体の抗原結合性断片であってもよい。
【００５０】
抗体断片は、多量体抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含むことができる。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂコンジュゲートの二量体、および三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、ならびに線状抗体が含まれる。
【００５１】
エピトープの非限定的な例には、アミノ酸、糖、脂質、ホスホリル、およびスルホニル基が含まれる。エピトープは、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、コンフォメーション性であってもよいか、または線状であってもよい。
【００５２】
ヒト化モノクローナル抗体
ＶＥ−ＰＴＰを標的化する適切な抗体は様々な技術を使用して同定することができる。例えば、候補薬剤は、ＶＥ−ＰＴＰへの結合についてスクリーニングされてもよい。ＶＥ−ＰＴＰに結合する薬剤は、活性、例えば、Ｔｉｅ２のＶＥ−ＰＴＰ媒介性脱リン酸化の阻害についてスクリーニングされてもよい。一部の実施形態では、候補薬剤は、最初に活性についてｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングされる。
【００５３】
特定の阻害剤の同定に使用するために適したアッセイの選択は、スクリーニングされる候補薬剤の性質に依存する。例えば、候補がＦｃ部分を含む抗体またはペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）である場合、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、候補薬剤を、ＶＥ−ＰＴＰを発現する細胞に結合する能力に基づいて選択することが可能となる。細胞は内因的にＶＥ−ＰＴＰを発現することができるか、またはＶＥ−ＰＴＰを発現するように遺伝子操作されてもよい。アプタマーなどの他の候補薬剤について、他の技術が利用されてもよい。例えば、ＶＥ−ＰＴＰに特異的に結合するアプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の反復ラウンドを介して特定のアプタマーを選択する、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を使用して選択することができる。
【００５４】
ＶＥ−ＰＴＰ阻害剤は、ＶＥ−ＰＴＰ媒介性活性、例えば、Ｔｉｅ２脱リン酸化の阻害についてスクリーニングされてもよい。ウェスタンブロッティングに基づく１つの適切なアッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が、種々の濃度の候補薬剤の存在下または非存在下にて無血清培地中で培養され、細胞の溶解物が調製され、Ｔｉｅ２抗体により免疫沈降され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移される。次いで膜結合免疫沈降タンパク質を、Ｔｉｅ２リン酸化を定量化するために抗ホスホチロシン抗体により、その後全Ｔｉｅ２を定量化するためにＴｉｅ２抗体により連続的にウェスタンブロットする。Ｔｉｅ２リン酸化は、全Ｔｉｅ２シグナルに対する抗ホスホチロシンシグナルの比として表される。抗ホスホチロシンシグナルのレベルが大きいほど、候補薬剤によるＶＥ−ＰＴＰ阻害が大きくなることが示される。
【００５５】
ハイブリドーマ技術は、特定の抗原を標的化する多数のモノクローナル抗体を産生するための方法である。ハイブリドーマの発生は、マウス（ネズミ）またはウサギなどの哺乳動物宿主に、免疫応答を誘発する抗原を注射することによって開始する。抗原に応答して、宿主におけるＢリンパ球（Ｂ細胞）は抗原に結合する抗体を産生する。次いでＢ細胞は宿主から採取され、ハイブリドーマとして公知のハイブリッド細胞株を産生するために不死のＢ細胞がん細胞（骨髄腫細胞）と融合される。ハイブリドーマは、Ｂ細胞の抗体産生能力ならびに骨髄腫の増大した寿命および再現性の両方を保持する。ハイブリドーマは、遺伝的に同一のハイブリドーマからなる新たな培養物を産生するために１つの生存ハイブリドーマ細胞で開始する培養物中で増殖することができ、次に培養物につき１つの抗体（モノクローナル）または異なる抗体の混合物（ポリクローナル）を産生する。このプロセスに使用される骨髄腫細胞株は、組織培養物中で増殖する能力および抗体を合成することができないことのために選択される。培養後、一次スクリーニングプロセスが、最も高い特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを同定し、選択するために実施される。抗体スクリーニング技術の非限定的な例には、ＥＬＩＳＡおよび免疫細胞化学的スクリーニングが含まれる。次いでスクリーニングから同定されたリードのハイブリドーマが、反応性、結合親和性、特異性、および交差反応性について特徴付けられ得る。
【００５６】
一部の実施形態では、本開示の化合物のＨＰＴＰ−βに対する結合親和性（ＫＤ）は、約７０ｐＭ〜約７０ｎＭ、１ｎＭ〜約７０ｎＭ、または少なくとも約１ｎＭと同程度の強さである。一部の実施形態では、本開示の化合物のＨＰＴＰ−βに対する結合親和性（ＫＤ）は約４ｎＭ〜約７０ｎＭである。
【００５７】
他の組換え抗体操作技術は哺乳動物以外のウイルスまたは酵母の使用を含む。これらの技術は、所望の特異性を有する抗体が選択され得るわずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体ライブラリーを作製するために免疫グロブリン遺伝子セグメントの迅速クローニングに依存する。抗体ライブラリーは、標的抗原に対する特異性、種々の環境条件における安定性、治療有効性、および診断適用における検出可能性を増強するために使用され得る。
【００５８】
ヒト投与に関して、非ヒト種から生成されたモノクローナル抗体は、標的特異性を保存しながら免疫原性の可能性を低減させるためにヒト化プロセスによってさらに最適化され得る。ヒト化プロセスは、単離された抗体を産生する遺伝子の遺伝子配列へのヒトＤＮＡの組み込みを含む。次いで組換えＤＮＡはクローニングされ、新たにヒト化された抗体の大規模産生のために細胞内で発現される。
【００５９】
ヒト化抗体の例は修飾キメラ抗体である。キメラ抗体は上記のように生成される。キメラ抗体はさらに、可変領域内の非ヒト配列を相同ヒト配列と置換するためにＣＤＲの外側で変異される。ヒト化抗体の別の例は、非ヒトＣＤＲ配列が、対応するヒトＣＤＲ配列を置き換えるためにヒト抗体足場のヒト重鎖および軽鎖可変配列内に導入される、ＣＤＲ移植抗体である。
【００６０】
ヒト化抗体は、哺乳動物細胞、バイオリアクター、またはマウス、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびマーモセットなどのトランスジェニック動物において産生され得る。トランスジェニック動物は、動物のゲノム内に挿入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分を有することができる。
【００６１】
完全ヒトモノクローナル抗体は、その抗原結合残基が、選択を受けるヒト免疫グロブリン配列またはその断片に完全に由来する抗体に相当する。一部の実施形態では、この選択は、一連の可変抗体ドメインが、糸状ファージコートタンパク質上で発現され、標的抗原への結合について濃縮されるファージディスプレイ技術を使用して行うことができる。一部の実施形態では、この選択は、トランスジェニック動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギを使用して行うことができ、内因性免疫グロブリン遺伝子の全セットが、ヒト免疫グロブリン遺伝子の全セットと置き換えられる。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子の全セットは動物のゲノム内に導入され得、内因性抗体産生は、抗体の産生を不十分にする。
【００６２】
ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するヒト化モノクローナル抗体
本明細書に記載されるＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するネズミモノクローナル抗体のヒト化プロセスは、抗体構造と合わせたＣＤＲ移植技術と成熟ヒトＩｇＧ配列のデータベースの組み合わせを利用する。ヒトフレームワーク配列は、ＣＤＲ配列のためのアクセプターフレームワークとして使用された。これらのアクセプター配列は全て、ヒト供給源由来の成熟ヒトＩｇＧに由来し、ファージディスプレイに由来しなかった。
【００６３】
４つのヒト化バリアントが、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）の組換え細胞外ドメインに対して惹起されたネズミモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインのために設計された。設計は、相同性、Ｔ細胞エピトープ、重要な残基、および予測される構造を含む要因に基づいた。
【００６４】
本明細書に開示される配列はＩＭＧＴおよびＫａｂａｔからの抗体番号付けシステムを使用して同定された。これらの２つの番号付けシステムは、ネズミ抗体の異なる残基をＣＤＲに属するものと同定し、組み合わせたＩＭＧＴ／Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ配列を、ＣＤＲループコンフォメーションの最適な保持のために使用した。
【００６５】
重鎖配列
配列番号１は、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するネズミモノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６（ＶＨ０）のＶＨドメインであり、ネズミシグナルペプチド配列（下線）を含む。配列番号４７は、ネズミシグナルペプチド配列を含まないＲ１５Ｅ６のＶＨドメインの切断配列である。配列番号２は、Ｒ１５Ｅ６のネズミＶＨドメインに最も近いヒト生殖系列遺伝子Ｖ領域である、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＨＶ３−７３である。配列番号３および配列番号４は、それぞれＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＨＶ３−７２およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＨＶ３−４８であり、配列番号２と類似するさらなる生殖系列Ｖ領域である。配列番号１〜４のペプチド配列は表１に示される。
【表１】
2020180156.tif 000004
【００６６】
ヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用してネズミＶＨドメインとの比較のために検索し、候補ヒト可変ドメインを上位２００のＢＬＡＳＴ結果から選択した。同等のヒト可変ドメインを、フレームワーク相同性の組み合わせに基づいて４つの候補に減らし、フレームワーク残基および標準ループ構造を維持した。表２は、４つの選択されたアクセプターフレームワークである、配列番号５〜８を列挙する。配列番号５はＡＥＸ２９６００であり、配列番号６はＡＡＣ５１０２４であり、配列番号７はＡＥＸ２９２８９であり、配列番号８はＡＢＡ２６２０４である。
【表２】
2020180156.tif 000005
【００６７】
ネズミＶＨのＣＤＲをアクセプターフレームワーク（配列番号５〜８）に移植すると、これらの配列を表３に示されるヒト化バリアントに変換した。配列番号９はＶＨ１であり、配列番号１０はＶＨ２であり、配列番号１１はＶＨ３であり、配列番号１２はＶＨ４である。
【表３】
2020180156.tif 000006
【００６８】
図１は、４つのヒト化バリアントである、配列番号９（ＶＨ１）、配列番号１０（ＶＨ２）、配列番号１１（ＶＨ３）、および配列番号１２（ＶＨ４）とのネズミＶＨ配列（切断ＶＨ０；配列番号４７）の配列アラインメントを示す。ＶＨ／ＶＫ界面に重要な残基および標準ループ構造は保存された。
【００６９】
ネズミＶＨとのヒト化バリアントの相同パーセントは表４に示される。ヒト化バリアントの相同性のランク付けは、ＶＨ２＞ＶＨ１＞ＶＨ３＞ＶＨ４である。
【表４】
2020180156.tif 000007
【００７０】
軽鎖配列
以下の表５において、配列番号１３は、ネズミシグナルペプチド配列（下線）を含む、Ｒ１５Ｅ６のネズミＶＬドメイン（ＶＬ０）である。配列番号４８は、ネズミシグナルペプチド配列を有さないＲ１５Ｅ６のＶＬドメインの切断配列である。配列番号１４は、Ｒ１５Ｅ６のネズミＶＬドメインに最も近いヒト生殖系列遺伝子Ｖ領域である、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＫＶ１−１６である。配列番号１５はＩＧＫＶ４−１であり、ＩＧＫＶ１−１６と非常に類似している。
【表５】
2020180156.tif 000008
【００７１】
ヒトＩｇＫ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用してネズミＶＬドメインとの比較のために検索し、候補ヒト可変ドメインを上位２００のＢＬＡＳＴ結果から選択した。これらの同等のヒト可変ドメインを、フレームワーク相同性の組み合わせに基づいて４つの候補に減らし、フレームワーク残基および標準ループ構造を維持した。表６は、４つの選択されたアクセプターフレームワークを列挙する。配列番号１６はＡＦ２３４２５６＿１であり、配列番号１７はＡＡＤ０３７２２であり、配列番号１８はＡＡＹ３３３５２であり、配列番号１９はＡＡＺ０９１１３である。
【表６】
2020180156.tif 000009
【００７２】
ネズミＶＬのＣＤＲをこれらのアクセプターフレームワークに移植すると、これらの配列を表７に示されるヒト化バリアントに変換した。配列番号２０はＶＬ１であり、配列番号２１はＶＬ２であり、配列番号２２はＶＬ３であり、配列番号２３はＶＬ４である。
【表７】
2020180156.tif 000010
【００７３】
図２は、４つのヒト化ＶＬバリアントである、配列番号２０（ＶＬ１）、配列番号２１（ＶＬ２）、配列番号２２（ＶＬ３）、および配列番号２３（ＶＬ４）とのネズミＶＬ配列（切断ＶＬ０；配列番号４８）の配列アラインメントを示す。ＶＬ／ＶＫ界面に重要な残基および標準ループ構造は保存された。
【００７４】
ネズミＶＬとのヒト化バリアントの相同パーセントは表８に示される。ヒト化バリアントの相同性のランク付けは、ＶＬ３＞ＶＬ１＞ＶＬ２＞ＶＬ４である。
【表８】
2020180156.tif 000011
【００７５】
ヒト化抗体の設計：４つのＶＨおよび４つのＶＬ鎖の組み合わせ
マウス可変鎖を、インタクトな抗体タンパク質の発現のためのＩｇＧ４重鎖の文脈において上記したようにネズミＣＤＲ配列を適切なヒト抗体ドナー配列に移植することによってヒト化した。次いで全長ヒト化抗体のパネルを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株における発現のためにコドン最適化した。異なるヒトドナー配列を使用して各可変鎖のために設計した４つのバリアントは、発現のための１６個のヒト抗体のマトリクスを産生し、その重鎖および軽鎖の対合を表９に示す。ヒトＩｇＧ４定常ドメインに移植した完全マウス可変ドメイン（ＶＨ０−ＶＬ０）を有するキメラバリアントを、結合および機能アッセイにおける陽性対照として作製した。
【表９】
2020180156.tif 000012
【００７６】
Ｔ細胞エピトープスクリーニング
重鎖。
ＭＨＣクラスＩＩ分子の溝におけるペプチド配列の提示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および免疫原性応答をもたらす。この応答を低減させるために、治療用タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合の親和性を低減することによって、Ｔ細胞を活性化し得るＴ細胞エピトープの組み込みを回避するように設計され得る。
【００７７】
ネズミ抗体ＶＨおよびＶＬならびにヒト化バリアント配列を、ヒト化プロセスが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムを使用して高親和性を有するペプチド配列を取り出したことを決定するために、ＭＨＣ  ＩＩ結合ペプチドについてスクリーニングした。表１０はスクリーニングの結果を示し、太字は高親和性Ｔ細胞エピトープコアである（ＩＣ５０＜５０ｎＭ）。ヒト生殖系列配列ＩＣＨＶ３−７３、ＩＣＨＶ３−７２、およびＩＣＨＶ３−４８もまた、比較のために分析した。生殖系列配列に存在し、ヒト化バリアントにおいて一致する任意の潜在的Ｔ細胞エピトープをイタリック体で示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【表１０】
2020180156.tif 000013
【００７８】
軽鎖配列
表１１はスクリーニングの結果を示し、太字は高親和性Ｔ細胞エピトープコアである（ＩＣ５０＜５０ｎＭ）。ヒト生殖系列配列ＩＧＫＶ１−１６およびＩＧＫＶ４−１もまた、比較のために分析し、生殖系列配列に存在し、ヒト化バリアントにおいて一致する任意の潜在的Ｔ細胞エピトープをイタリック体で示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【表１１】
2020180156.tif 000014
【００７９】
ネズミＶＬ０は、軽鎖のＣＤＲ３／フレームワーク４領域内にＴ細胞エピトープを含有し、これはヒト化バリアントのうちの３つには存在しない。
【００８０】
翻訳後修飾
Ｆｖグリコシル化。
Ｎ−結合型グリコシル化モチーフはＮＸＳ／Ｔであり、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である。このモチーフはＲ１５Ｅ６  ＶＨまたはＶＬのネズミまたはヒト化バリアントには存在しなかった。
【００８１】
脱アミド。
アミノ酸モチーフＳＮＧ、ＥＮＮ、ＬＮＧ、およびＬＮＮは、アスパラギン酸を生じるようにアスパラギンの脱アミドを行う傾向があり得る。これらの４つのモチーフのいずれも、Ｒ１５Ｅ６ＶＨまたはＶＬのネズミまたはヒト化バリアントには存在しなかった。
【００８２】
シグナルペプチド。
ネズミ抗体シグナルペプチドは、ＣＨＯ細胞において、より高いレベルの発現を生じ得る。以下のシグナルペプチドがヒト化バリアントに組み込まれ得る。
重鎖シグナルペプチド（配列番号２４）：ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳ
軽鎖シグナルペプチド（配列番号２５）：ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣ
【００８３】
ＶＨドメインの各々は、安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有する、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成され得る。重鎖配列全体をコドン最適化することができ、ＤＮＡ配列を検証することができる。Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４定常ドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）は以下の通りである：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【００８４】
ＶＬドメインの各々は、ヒトＩｇＫアイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成され得る。次いで軽鎖配列全体をコドン最適化することができ、ＤＮＡ配列を検証することができる。ＩｇＫ定常ドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）は以下の通りである：
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００８５】
バリアント鎖の各々は、ＤＮＡ配列決定分析によって検証することができる。次いでヒト化抗体の各々の一過性トランスフェクションおよび発現を追跡することができる。１つのキメラ抗体は、陽性対照として使用するために発現することができ、ネズミ可変ドメイン、ヒトＩｇ定常ドメインを有することができる。１６個のヒト化バリアントは、ヒト化可変ドメインおよびヒトＩｇ定常ドメインのみを有する。表１２は、ヒト化可変ドメインおよびヒトＩｇ定常ドメインを有する１６個のヒト化バリアントを生じる重鎖および軽鎖の対合を示す。
【表１２】
2020180156.tif 000015
【００８６】
表１３および表１４は、各ヒト化重鎖および軽鎖の完全アミノ酸配列を列挙する。
【表１３−１】
2020180156.tif 000016
【表１３−２】
2020180156.tif 000017
【表１４】
2020180156.tif 000018
【００８７】
標的配列は、本明細書に提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８１％の相同性、少なくとも約８２％の相同性、少なくとも約８３％の相同性、少なくとも約８４％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約８６％の相同性、少なくとも約８７％の相同性、少なくとも約８８％の相同性、少なくとも約８９％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９１％の相同性、少なくとも約９２％の相同性、少なくとも約９３％の相同性、少なくとも約９４％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも約９６％の相同性、少なくとも約９７％の相同性、少なくとも約９８％の相同性、少なくとも約９９％の相同性、少なくとも約９９．１％の相同性、少なくとも約９９．２％の相同性、少なくとも約９９．３％の相同性、少なくとも約９９．４％の相同性、少なくとも約９９．５％の相同性、少なくとも約９９．６％の相同性、少なくとも約９９．７％の相同性、少なくとも約９９．８％の相同性、少なくとも約９９．９％の相同性、少なくとも約９９．９１％の相同性、少なくとも約９９．９２％の相同性、少なくとも約９９．９３％の相同性、少なくとも約９９．９４％の相同性、少なくとも約９９．９５％の相同性、少なくとも約９９．９６％の相同性、少なくとも約９９．９７％の相同性、少なくとも約９９．９８％の相同性、または少なくとも約９９．９９％の相同性を有することができる。
【００８８】
ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の適切な方法もしくはアルゴリズムなどの、種々の方法およびソフトウェアプログラムが、２つまたはそれよりも多いペプチドまたは核酸の間の相同性を決定するために使用され得る。
【００８９】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、および／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであってもよい。医薬組成物は化合物の生物への投与を容易にする。医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、経口、非経口、眼科、および局所投与を含む種々の形態および経路によって、医薬組成物として治療有効量で投与され得る。
【００９０】
医薬組成物は、例えば、局所、経口、全身、硝子体内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）、結膜下、テノン嚢下、眼球後方、眼内、後強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）、眼周囲、網膜下、および脈絡膜上投与を含む任意の適切な形態または経路を介して眼に投与され得る。組成物は、前眼房、後眼房、硝子体腔（硝子体内）、網膜固有（ｒｅｔｉｎａ  ｐｒｏｐｅｒ）、および／または網膜下腔を含む眼の任意の部分に製剤を注射することによって投与され得る。組成物は非侵襲的方法によって送達され得る。製剤を投与する非侵襲的様式は無針注射デバイスを使用することを含んでもよい。複数の投与経路が医薬組成物の効率的な送達のために利用され得る。
【００９１】
医薬組成物は、例えば、血管内皮細胞などの内皮細胞、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ
ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｌｔｈｅｌｉｕｍ）（ＲＰＥ）などの網膜の細胞、角膜細胞、線維芽細胞、星状細胞、グリア細胞、周皮細胞、虹彩上皮細胞、神経起源の細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、外直筋の細胞などの眼を囲み、眼に付着した筋細胞、眼窩脂肪細胞、強膜および上強膜の細胞、小柱網の細胞、ならびに結合組織細胞を含む任意の適切な眼細胞を標的化することができる。
【００９２】
医薬組成物は、局所的に、例えば、器官への直接の化合物の注射を介して、任意選択でデポーもしくは持続放出製剤またはインプラントで投与され得る。医薬組成物は、急速放出製剤の形態、延長放出製剤の形態、または中間放出製剤の形態で提供され得る。急速放出形態は即時放出を提供することができる。延長放出製剤は制御放出または持続遅延放出を提供することができる。
【００９３】
投与のための医薬製剤は水溶性形態で活性化合物の水溶液を含むことができる。活性化合物の懸濁物は油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁物の粘度を増加させる物質を含有することができる。懸濁物はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【００９４】
本明細書に提供される処置または使用方法を実行する際に、本明細書に記載される化合物の治療有効量が、医薬組成物中で、処置される疾患または状態を有する被験体に投与される。一部の実施形態では、被験体はヒトなどの哺乳動物である。治療有効量は、疾患の重症度、被験体の年齢および関連する健康、使用される化合物の効力、および他の要因に依存して広範に変化し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、単独でまたは混合物の成分として１つもしくは複数の治療剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本開示のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ剤と共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）または共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）され得る。抗ＶＥＧＦ剤は、化合物、抗体、またはその抗体断片、バリアント、もしくは誘導体であってもよい。抗ＶＥＧＦ剤の非限定的な例には、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、およびアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、抗ＶＥＧＦ剤による処置の前、間、または後に使用され得る。
【００９６】
医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む１種または複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。製剤は、選択される投与経路に応じて修飾されてもよい。本明細書に記載される化合物を含む医薬組成物は、例えば、混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または圧縮プロセスによって製造され得る。
【００９７】
医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤および遊離塩基または薬学的に許容される塩形態として本明細書に記載される化合物を含むことができる。医薬組成物は、可溶化剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液、および防腐剤を含有することができる。
【００９８】
本明細書に記載される化合物を含む組成物を調製する方法は、化合物を１種または複数の不活性の薬学的に許容される賦形剤または担体と共に製剤化して、固体、半固体、または液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物には、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、およびカシェ剤が含まれる。液体組成物には、例えば、化合物が溶解される溶液、化合物を含むエマルション、または本明細書に開示される化合物を含むリポソーム、ミセル、もしくはナノ粒子を含有する溶液が含まれる。半固体組成物には、例えば、ゲル、懸濁物およびクリームが含まれる。組成物は、液体溶液もしくは懸濁物、使用前の液体中での溶解もしくは懸濁に適した固体形態であってもよいか、またはエマルションとしてでもよい。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および他の薬学的に許容される添加剤などの、少量の非毒性の補助物質を含有することができる。
【００９９】
本発明に使用するのに適した剤形の非限定的な例には、液体、粉末、ゲル、ナノ懸濁物、ナノ粒子、ミクロゲル（ｍｉｃｒｏｇｅｌ）、水性または油性懸濁物、エマルション、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１００】
本発明に使用するのに適した薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、結合剤、崩壊剤、付着防止剤（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）、静電防止剤、界面活性剤、酸化防止剤、コーティング剤、着色剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳化剤、抗菌剤、球形化剤（ｓｐｈｅｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１０１】
本発明の組成物は、例えば、即時放出形態または制御放出製剤であってもよい。即時放出製剤は、化合物が急速に作用することを可能にするように製剤化され得る。即時放出製剤の非限定的な例には、容易に溶解可能な製剤が含まれる。制御放出製剤は、活性剤の放出速度および放出プロファイルが生理学的および時間治療的要件と一致し得るように適合されているか、または代替として、プログラムされた速度で活性剤の放出をもたらすように製剤化されている医薬製剤であってもよい。制御放出製剤の非限定的な例には、顆粒、遅延放出顆粒、（例えば、合成または天然起源の）ヒドロゲル、他のゲル化剤（例えば、ゲル形成食物繊維）、マトリクスベースの製剤（例えば、少なくとも１種の活性成分が分散されたポリマー材料を含む製剤）、マトリクス内の顆粒、ポリマー混合物、および粒状塊が含まれる。
【０１０２】
一部の場合には、制御放出製剤は遅延放出形態である。遅延放出形態は化合物の作用を長期間遅延させるように製剤化され得る。遅延放出形態は、有効用量の１つまたは複数の化合物の放出を、例えば、約４、約８、約１２、約１６、または約２４時間遅延させるように製剤化され得る。
【０１０３】
制御放出製剤は持続放出形態であってもよい。持続放出形態は、例えば、化合物の作用を長期間にわたって持続するように製剤化され得る。持続放出形態は、約４、約８、約１２、約１６、または約２４時間にわたって本明細書に記載される有効用量のいずれかの化合物を提供する（例えば、生理学的に有効な血液プロファイルを提供する）ように製剤化され得る。
【０１０４】
開示される組成物は、任意選択で、薬学的に許容される防腐剤を含むことができる。
【０１０５】
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）；Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５年；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，  Ｌ．編、  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０年；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １９９９年）に見出すことができ、それらの各々はその全体が参照により組み込まれる。
【０１０６】
本明細書に記載される化合物は、便宜上、１つまたは複数の薬学的に許容される担体からなる医薬組成物に製剤化され得る。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版を参照のこと。それは、医薬組成物を調製する典型的な担体および従来の方法を開示している。そのような担体は、滅菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨにおける緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトおよび非ヒトへの組成物の投与のための担体であってもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、および麻酔薬などの１種または複数のさらなる活性成分を含むことができる。
【０１０７】
薬学的に許容される担体の非限定的な例には、生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液が含まれる。一部の実施形態では、溶液のｐＨは約５〜約８であってもよく、約７〜約７．５であってもよい。さらなる担体には、化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの持続放出調製物が含まれる。マトリクスは、成形物品、例えば、フィルム、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルの形態であってもよい。
【０１０８】
開示される方法は、医薬組成物の一部としてＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化する抗体を投与することに関する。局所投与に適した組成物が使用され得る。一部の実施形態では、本発明の組成物は、溶液、懸濁物、または両方に活性剤を含む液体を含むことができる。液体組成物はゲルを含むことができる。液体組成物は、例えば、水性であってもよい。組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化可能な水性組成物である。繰り返しとして、組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化可能な水溶液である。そのような組成物は、眼または眼の外側の涙液と接触するとゲル化を促進するのに有効な濃度でゲル化剤を含むことができる。水性組成物は、眼科用に適合可能な（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ｐＨおよび質量オスモル濃度を有することができる。組成物は、結膜下投与のための活性剤を含む眼科用デポー製剤を含むことができる。活性剤を含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容されるポリマーまたは脂質カプセル化剤に包埋され得る。デポー製剤は、全てまたは実質的に全ての活性物質を長期間にわたって放出するように適合され得る。ポリマーまたは脂質マトリクスは、存在する場合、全てまたは実質的に全ての活性剤の放出後、投与部位から輸送されるように十分に分解するように適合され得る。デポー製剤は、薬学的に許容されるポリマーおよび溶解または分散された活性剤を含む液体製剤であってもよい。注射の際に、ポリマーは、例えば、ゲル化または沈殿によって注射部位でデポーを形成する。組成物は、物品が活性剤を放出する場所である、眼と瞼との間または結膜嚢内などの眼の適切な位置に挿入され得る固体物品を含むことができる。このような様式での眼への移植に適した固体物品は、ポリマーを含んでもよく、生体内分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）であっても、生体内非分解性であってもよい。
【０１０９】
医薬製剤は、本明細書に開示される薬剤に加えて、さらなる担体、ならびに増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤を含むことができる。
【０１１０】
開示される組成物のｐＨは約３〜約１２の範囲であってもよい。組成物のｐＨは、例えば、約３〜約４、約４〜約５、約５〜約６、約６〜約７、約７〜約８、約８〜約９、約９〜約１０、約１０〜約１１、または約１１〜約１２のｐＨ単位であってもよい。組成物のｐＨは、例えば、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２のｐＨ単位であってもよい。組成物のｐＨは、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２のｐＨ単位であってもよい。組成物のｐＨは、例えば、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、または多くとも１２のｐＨ単位であってもよい。ｐＨが処方者によって所望される範囲外である場合、ｐＨは、十分な薬学的に許容される酸および塩基を使用することによって調整され得る。
【０１１１】
意図される投与様式に応じて、医薬組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、懸濁物、ローション、クリーム、またはゲルなどの、固体、半固体または液体剤形の形態、例えば、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形であってもよい。
【０１１２】
固体組成物について、非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムが含まれる。
【０１１３】
本開示の組成物との組み合わせに適した薬学的に活性な薬剤の非限定的な例には、抗感染剤、すなわち、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗コリン作用剤（ａｎｔｉ−ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）／抗痙攣薬（ａｎｔｉ−ｓｐａｓｍｏｔｉｃ）、抗糖尿病剤、降圧剤、抗新生物剤、心血管作動剤（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔ）、中枢神経系剤、凝固修飾剤、ホルモン、免疫学的薬剤、免疫抑制剤、および眼科用調製物が含まれる。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸塩およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤、および他のタンパク質と混合した治療有効量の化合物を含む。例示的な薬剤には、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンガーおよびハンクス溶液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールが含まれる。
【０１１５】
投与方法および処置方法
本明細書に記載される医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、組成物は、疾患または状態を既に患っている被験体に、疾患または状態の症状を治療するか、もしくは少なくとも部分的に停止させるか、または状態を治療し、治癒し、改善するか、もしくは好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）のに十分な量で投与され得る。組成物はまた、状態を発生させる、状態に罹る、または状態を悪化させる可能性を低下させるために投与され得る。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度および経過、以前の療法、被験体の健康状態、体重、および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に基づいて変化させてもよい。
【０１１６】
複数の治療剤は任意の順序でまたは同時に投与され得る。同時の場合、複数の治療剤が、単一の統一された形態で、または例えば、複数の別個の丸剤としての複数の形態で提供され得る。薬剤は一緒にまたは別々に、単一のパッケージまたは複数のパッケージに包装され得る。治療剤の１つまたは全ては複数回用量で与えられ得る。同時でない場合、複数回用量の間のタイミングは約１ヶ月程度まで変化させてもよい。
【０１１７】
本明細書に記載される治療剤は、疾患または状態の発生の前、間、または後に投与されてもよく、治療剤を含有する組成物を投与するタイミングは変化させてもよい。例えば、組成物は予防薬として使用されてもよく、疾患または状態の発生の可能性を低下させるために状態または疾患になる傾向を有する被験体に継続的に投与されてもよい。組成物は、症状の発症の間、または発症後可能な限り速やかに被験体に投与されてもよい。治療剤の投与は、症状の発症から最初の４８時間以内、症状の発症から最初の２４時間以内、症状の発症から最初の６時間以内、または症状の発症から３時間以内に開始され得る。最初の投与は、任意の実用的な経路を介して、例えば、本明細書に記載される任意の製剤を使用して本明細書に記載される任意の経路によって行われ得る。治療剤は、疾患または状態の発症が検出されたか、または疑われた後、実行可能な限り速やかに、および疾患の処置に必要な期間の間、例えば、約１ヶ月〜約３ヶ月などで投与されてもよい。処置の長さは、被験体ごとに変化させてもよい。
【０１１８】
本明細書に記載される医薬組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形であってもよい。単位剤形において、製剤は、適切な量の１つまたは複数の化合物を含有する単位用量に分割される。単位投薬量は個別の量の製剤を含有するパッケージの形態であってもよい。非限定的な例は、包装された注射剤、バイアル、またはアンプルである。水性懸濁組成物は単回用量の再閉鎖できない容器に包装され得る。複数回用量の再閉鎖可能な容器は、例えば、防腐剤と組み合わせて、または防腐剤を有さずに使用され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル、または防腐剤を有する複数回用量の容器で提示され得る。
【０１１９】
本明細書に提供される医薬組成物は、他の療法、例えば、化学療法、放射線、外科手術、抗炎症剤、および選択されたビタミンと併用して投与されてもよい。他の薬剤は、医薬組成物の前、後、または同時に投与されてもよい。
【０１２０】
投薬
ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体は、被験体の体重に基づいて、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されてもよい。
【０１２１】
ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体は所望の任意の間隔で投与されてもよい。化合物の投与は、化合物を投与するヒトまたは化合物を受容する被験体のいずれかに合わせるために不規則な投薬スケジュールを有してもよい。例えば、化合物は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に６回、週に６回、週に７回、週に８回、週に９回または週に１０回投与されてもよい。毎日の投薬の間の間隔は、例えば、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、５時間毎、６時間毎、７時間毎、８時間毎、９時間毎、１０時間毎、１１時間毎、または１２時間毎の任意の時間間隔であってもよい。ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の投与についての投薬スケジュールには、１日１回、週３回、週２回、週１回、月３回、月２回、月１回、隔月１回、年１回、年２回、年３回、または年４回が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体は隔週で投与されてもよい。
【０１２２】
さらに、投与されるＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の量は各用量において同じ量であってもよく、または投薬量は用量間で変化させてもよい。例えば、第１の量は午前に投薬され、第２の量は晩に投与される。投与のための投薬量は、抗ＶＥＧＦ投与のスケジュールに応じて変化させてもよい。
【０１２３】
抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体は、例えば、処置の開始時、処置の間の任意の時点または抗ＶＥＧＦ剤による処置が終了した後の任意の時点に、任意の組み合わせで任意の抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせて投与されてもよい。さらに、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤の投薬量は処置の間に調整されてもよい。また、抗ＶＥＧＦ剤の量も処置の間に調整されてもよい。
【０１２４】
ＶＥＧＦ調節剤のさらなる非限定的な例には、非炎症剤（ｎｏｎ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）、例えば、デキサメタゾン、フルオシノロン、およびトリアムシノロンが含まれる。さらに、開示される方法は、抗ＶＥＧＦ剤を送達するインプラントを含んでもよい。例えば、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は、本明細書に記載される疾患または状態を患っている被験体にインプラントが提供される前、間、または後のいずれかに共投与されてもよい。
【０１２５】
抗ＶＥＧＦ処置は、例えば、毎月、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、または毎年投与されてもよく、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は処置の間に任意の頻度で投与される。
【０１２６】
本明細書に開示される疾患または状態を処置する方法も本明細書に開示される。この方法は、
ａ）治療有効量のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤、および
ｂ）治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤
を被験体に投与するステップを含み、
ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤および抗ＶＥＧＦ剤の投与は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、投与者によって所望される任意の様式で行われてもよい。
【０１２７】
ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）結合剤または抗ＶＥＧＦ剤は必要または簡便な任意の量で投与されてもよい。例えば、本明細書に記載される化合物は、任意の投与経路によって被験体に対して１用量当たり、約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約１．５ｍｇ、０．１ｍｇ〜約１．５ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇ、または約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．１１ｍｇ、約０．１２ｍｇ、約０．１３ｍｇ、約０．１４ｍｇ、約０．１５ｍｇ、約０．１６ｍｇ、約０．１７ｍｇ、約０．１８ｍｇ、約０．１９ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．２１ｍｇ、約０．２２ｍｇ、約０．２３ｍｇ、約０．２４ｍｇ、約０．２５ｍｇ、約０．２６ｍｇ、約０．２７ｍｇ、約０．２８ｍｇ、約０．２９ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．３１ｍｇ、約０．３２ｍｇ、約０．３３ｍｇ、約０．３４ｍｇ、約０．３５ｍｇ、約０．３６ｍｇ、約０．３７ｍｇ、約０．３８ｍｇ、約０．３９ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．４１ｍｇ、約０．４２ｍｇ、約０．４３ｍｇ、約０．４４ｍｇ、約０．４５ｍｇ、約０．４６ｍｇ、約０．４７ｍｇ、約０．４８ｍｇ、約０．４９ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．５１ｍｇ、約０．５２ｍｇ、約０．５３ｍｇ、約０．５４ｍｇ、約０．５５ｍｇ、約０．５６ｍｇ、約０．５７ｍｇ、約０．５８ｍｇ、約０．５９ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．６１ｍｇ、約０．６２ｍｇ、約０．６３ｍｇ、約０．６４ｍｇ、約０．６５ｍｇ、約０．６６ｍｇ、約０．６７ｍｇ、約０．６８ｍｇ、約０．６９ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．７１ｍｇ、約０．７２ｍｇ、約０．７３ｍｇ、約０．７４ｍｇ、約０．７５ｍｇ、約０．７６ｍｇ、約０．７７ｍｇ、約０．７８ｍｇ、約０．７９ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．８１ｍｇ、約０．８２ｍｇ、約０．８３ｍｇ、約０．８４ｍｇ、約０．８５ｍｇ、約０．８６ｍｇ、約０．８７ｍｇ、約０．８８ｍｇ、約０．８９ｍｇ、約０．９ｍｇ、約０．９１ｍｇ、約０．９２ｍｇ、約０．９３ｍｇ、約０．９４ｍｇ、約０．９５ｍｇ、約０．９６ｍｇ、約０．９７ｍｇ、約０．９８ｍｇ、約０．９９ｍｇ、約１ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、または約３００ｍｇの量で投与されてもよい。
【０１２８】
眼内送達
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体に本発明の組成物を眼内送達するための方法が本明細書に開示される。送達方法は、眼細胞に組成物を直接送達するための侵襲的方法を含むことができる。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は網膜下注射によって送達される。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は硝子体内または皮下注射によって送達される。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は腔内注射によって送達される。一部の実施形態では、組成物は、抗体送達の効率を増加させるために、複数の投与経路、例えば、網膜下および／または硝子体内によって送達される。一部の実施形態では、網膜下および／または硝子体内注射の前に硝子体切除術が先行する。
【０１２９】
眼内注射は、送達の効率を改善し、および／または周囲組織への損傷を最小化もしくは回避するために任意の時間間隔にわたって実施され得る。眼内注射のための時間間隔は、例えば、約１分〜約６０分、約１分〜約５分、約５分〜約１０分、約１０分〜約１５分、約１５分〜約２０分、約２０分〜約２５分、約２５分〜約３０分、約３０分〜約３５分、約３５分〜約４０分、約４０分〜約４５分、約４５分〜約５０分、約５０分〜約５５分、または約５５分〜約６０分であってもよい。
【０１３０】
眼内注射は任意の速度で実施され得る。眼内注射の速度は、例えば、約１μＬ／分〜約２００μＬ／分、約１μＬ／分〜約１０μＬ／分、約１０μＬ／分〜約２０μＬ／分、約２０μＬ／分〜約３０μＬ／分、約３０μＬ／分〜約４０μＬ／分、約４０μＬ／分〜約５０μＬ／分、約５０μＬ／分〜約６０μＬ／分、約６０μＬ／分〜約７０μＬ／分、約７０μＬ／分〜約８０μＬ／分、約８０μＬ／分〜約９０μＬ／分、約９０μＬ／分〜約１００μＬ／分、約１００μＬ／分〜約１１０μＬ／分、約１１０μＬ／分〜約１２０μＬ／分、約１２０μＬ／分〜約１３０μＬ／分、約１３０μＬ／分〜約１４０μＬ／分、約１４０μＬ／分〜約１５０μＬ／分、約１５０μＬ／分〜約１６０μＬ／分、約１６０μＬ／分〜約１７０μＬ／分、約１７０μＬ／分〜約１８０μＬ／分、約１８０μＬ／分〜約１９０μＬ／分、または約１９０μＬ／分〜約２００μＬ／分であってもよい。
【０１３１】
キット
本開示はさらに本開示の組成物を含有するキットに関する。キットは、
Ａ）ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化する抗体を含む組成物、および
Ｂ）組成物を被験体に送達するための担体
を含むことができる。
【０１３２】
キットは、処置される被験体のために処方される投薬レジメンに適合するように修飾されてもよい。以下は、眼内注射によって本開示の組成物を受容する被験体に使用するためのキットの非限定的な例である：
Ａ）水性組成物であって、
ａ）ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）細胞外ドメインを標的化する抗体、および
ｂ）担体系であって、
ｉ）張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、および
ｉｉ）水
を含み、
張度剤は、再構成された製剤が張度剤の体積に対して約０．５質量％〜約１０質量％を構成するような量で存在する、担体系
を含有する、水性組成物、ならびに
Ｂ）水性組成物を送達するための成分。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明のキットは、
Ａ）抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体を送達するための組成物、および
Ｂ）抗ＶＥＧＦ剤を送達するための組成物
を含む。
キットは、処置される被験体のために処方される投薬レジメンに適合するように修飾されてもよい。以下は、開示される化合物を含む静脈内に送達される組成物および硝子体内に投与される抗ＶＥＧＦ剤を受容する患者に使用するためのキットの非限定的な例である。この例は、３ヶ月間１日２回の開示された化合物の投薬、および１２週目にラニビズマブの注射を提供する。
Ａ．各パッケージが４個のバイアルを含む、３個のパッケージ。各バイアルは、開示された化合物５ｍｇを７日間毎日２回注射するのに十分な量のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤を含む；および
Ｂ．ラニビズマブ０．５ｍｇを提供する１２週目の終わりに注射するためのラニビズマブのバイアル。
キットは要素の任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、本明細書に開示される抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体が経口で提供される場合、十分な用量の開示される化合物を有する単一の容器がキットと共に供給されてもよい。
キットはまた、送達される組成物を使用し、処分するための書面による指示を提供してもよい。指示は、処方される投薬レジメンを反映するようにキットごとに変更されてもよい。指示は、本明細書に記載される任意の療法、化合物、賦形剤、または投与方法を記載していてもよい。
【０１３４】
開示される組成物は、例えば、担体系の体積に基づいて約１．５質量％〜約９０質量％を構成してもよい。張度剤の非限定的な例には、デキストロース、マンニトール、およびグリセリンが含まれる。処方者は１つより多い張度剤を利用することができる。
【０１３５】
キットは、シリンジ、フィルター針、延長管状材料、カニューレ、および網膜下注射器などの投与のためのデバイスをさらに含んでもよい。投与経路の非限定的な例には、眼内、非経口、および局所が含まれる。眼内投与経路には、例えば、硝子体内、腔内、結膜下、テノン嚢下、眼球後方、眼内、後強膜近傍、眼周囲、網膜下、および脈絡膜上が含まれ得る。送達は、例えば、シリンジ、針、注入ポンプ、または注射器によってでもよい。シリンジおよび注射器は、例えば、単回用量、複数回用量、固定用量、または可変用量であってもよい。注射器の非限定的な例には、ペン型注射器、自動注射器、および電気パッチ注射器（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐａｔｃｈ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）システムが含まれる。
【０１３６】
キットは、被験体への本発明の組成物の投与に適した成分を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は単位剤形としてキットに存在する。したがって、処方者は、より高い濃度の化合物を有する送達デバイスを提供し、送達体積を調整して、溶液全体における量よりも少ない量の化合物を提供することができる。
【０１３７】
本明細書に記載される任意のキットに一組の指示が含まれてもよい。指示は、投薬量、投薬のタイミング、キットが乾燥組成物を含有する場合の組成物の再構成、ならびに送達ビヒクルおよび未使用組成物の処分方法に関連し得る。指示は、本明細書に記載される任意の療法、化合物、賦形剤、または投与方法を記載していてもよい。
【０１３８】
方法
本発明は、眼の疾患または状態、例えば、眼の浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、血管漏出、加齢性黄斑変性（湿潤型）、加齢性黄斑変性（乾燥型）、脈絡膜新血管形成、糖尿病性網膜症、眼虚血、ブドウ膜炎、網膜静脈閉塞（中心または分枝）、眼外傷、手術誘発性浮腫、手術誘発性新血管形成、類嚢胞黄斑浮腫、眼虚血、およびブドウ膜炎を処置または予防するための組成物および方法を提供する。これらの疾患または状態は、進行性であるか、非進行性であるかに関わらず、急性疾患もしくは状態、または慢性疾患もしくは状態の結果に関わらず、眼血管系の変化によって特徴付けられ得る。これらの疾患は、血漿中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルの増加によって特徴付けられ得る。
【０１３９】
本開示は、それを必要とする被験体における眼新血管形成を処置する方法であって、治療有効量のＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）標的化抗体を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤は漏出および新血管形成に対して血管系を安定化する。
【０１４１】
臨床症状の改善は、例えば、倒像眼底検査、眼底撮影法（ｆｕｎｄｕｓ  ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、フルオレセイン血管障害、網膜電図記録、外眼検査（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｙｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）、細隙灯生体顕微鏡検査、圧平眼圧測定（ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｔｏｎｏｍｅｔｒｙ）、角膜厚測定（ｐａｃｈｙｍｅｔｒｙ）、光干渉断層撮影、またはオートリフラクション（ａｕｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｏｎ）によってモニターされ得る。一部の実施形態では、開示される方法は、抗ＶＥＧＦ剤を含む組成物を含む、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の投与に関する。
【０１４２】
一部の実施形態では、本開示の方法は、漏出に対して血管系を安定させることができる、１つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤とのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の共投与を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、本開示の方法は、新血管形成に対して血管系を安定させることができる、１つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤との抗ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の共投与を対象とする。
【０１４４】
一部の実施形態では、抗ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体は、漏出および新血管形成に対して血管系を安定させることができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、少なくとも１つの視覚障害がある眼を有するヒト被験体は、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体により処置される。臨床症状の改善は、例えば、倒像眼底検査、眼底撮影法、フルオレセイン血管障害、網膜電図記録、外眼検査、細隙灯生体顕微鏡検査、圧平眼圧測定、角膜厚測定、光干渉断層撮影およびオートリフラクションによってモニターされ得る。本明細書に記載されるように、投薬は投与者によって決定される任意の頻度で行うことができる。抗ＶＥＧＦ剤処置の中断後、その後の用量は、例えば、毎週または毎月、例えば、応答に応じて約２〜８週または約１〜１２ヶ月離した頻度で投与されてもよい。
【０１４６】
糖尿病の直接的または間接的な結果である疾患には、とりわけ、糖尿病性黄斑浮腫および糖尿病性網膜症が含まれる。糖尿病患者の眼の血管系は時間をわたって不安定になり、非増殖網膜症、黄斑浮腫、および増殖網膜症などの状態をもたらす。鮮明かつ真っすぐな視覚が生じる眼の部分である黄斑の中心に体液（ｆｌｕｉｄ）が漏出すると、体液および関連タンパク質の蓄積が黄斑の上または下に沈着し始める。この沈着は被験体の中心視を徐々に歪ませる腫脹を生じる。この状態が黄斑浮腫である。発生する可能性がある別の状態は、眼の黄斑部の外側に微細動脈瘤などの血管変化が観察され得る非増殖網膜症である。
【０１４７】
これらの状態は、増加した新血管形成によって特徴付けられる糖尿病性増殖網膜症と関連する可能性がある。新たな血管は脆く、出血しやすい。その結果は、網膜の瘢痕および新たな血管の過剰形成に起因する、眼を通る光路の閉塞または完全な遮断である。糖尿病性黄斑浮腫を有する被験体は、多くの場合、糖尿病性網膜症の非増殖期を患うが、被験体は、多くの場合、増殖期の開始時に黄斑浮腫を発現し始めるだけである。
【０１４８】
糖尿病性網膜症は、就業年齢のアメリカ人における視力喪失の最も一般的な原因である。重度の視力喪失は網膜新血管形成を悪化させる牽引性網膜剥離に起因して発生するが、中等度の視力喪失の最も一般的な原因は糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である。
【０１４９】
ＶＥＧＦは低酸素調節遺伝子であり、ＶＥＧＦレベルは低酸素または虚血性網膜において増加する。ほとんどの状況下で、Ａｎｇ２はＴｉｅ２に結合するが、リン酸化を刺激せず、Ｔｉｅ２アンタゴニストとして作用する。眼において、Ａｎｇ２は新血管形成部位において上方調節され、ＶＥＧＦについての許容因子として作用する。網膜におけるＶＥＧＦの増加した発現は網膜または脈絡毛細管板の表在または中間の毛細血管床からの新血管形成の発芽を刺激しないが、Ａｎｇ２の構成的発現が発生する深部毛細血管床からの発芽を刺激する。網膜の表面におけるＶＥＧＦおよびＡｎｇ２の共発現は表在の網膜毛細血管からの新血管形成の発芽を引き起こす。
【０１５０】
既存の血管から新たな血管を生じるプロセスである血管新生は、胎生発育、月経、創傷治癒、および腫瘍成長を含む、広範囲の生理学的および病理学的事象に必須である。全てではないにしても、ほとんどの腫瘍は成長および増殖するために血管新生を必要とする。ＶＥＧＦは、血管透過性および毛細血管の数を増加させることによる血管新生における主要な因子であり得る。
【０１５１】
ＶＥＧＦは、内皮細胞に主に見出され、脈管形成、血管新生、および血管の透過化において機能を有するタンパク質である。ＶＥＧＦの発現は、低酸素症、活性化がん遺伝子、およびサイトカインによって誘導される。ＶＥＧＦ活性化は、正常なヒト細胞および組織における血管新生をもたらし得るが、腫瘍における血管新生ももたらし得、腫瘍の進行および成長を可能にする。ＶＥＧＦの阻害は腫瘍成長を阻害することができ、腫瘍退縮をもたらす。様々な網膜症は、ＶＥＧＦのレベルの増加に関連し、眼における虚血は酸素の欠乏に起因してＶＥＧＦ産生の誘導をもたらす。ＶＥＧＦのこの増加は、網膜における血管の過剰増殖を引き起こし得、失明をもたらし得る。開示された抗ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体は、眼の血管系を安定させるように作用することができ、罹患した網膜に存在するＶＥＧＦおよび他の炎症性作用物質によって引き起こされる刺激に対抗することができる。一部の実施形態では、被験体への抗ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗体の投与は、被験体への抗ＶＥＧＦ薬の投与が中止された後、疾患の逆転のレベルを維持することができる。
【０１５２】
黄斑変性は、網膜の中心における黄斑部の細胞および組織変性に起因する視力の漸進的な喪失または障害によって特徴付けられる。黄斑変性は、多くの場合、非滲出性（乾燥型）または滲出性（湿潤型）の２つの型のうちの１つとして特徴付けられる。両方の型は両側性で進行性であるが、各々の型は異なる病理学的プロセスを反映し得る。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の湿潤型は、脈絡膜新血管形成の最も一般的な型であり、高齢者における失明の主な原因である。ＡＭＤは、６０歳を超える何百万人ものアメリカ人が罹患し、高齢者の間での新たな失明の主な原因である。
【０１５３】
脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）は多種多様の網膜疾患に関連する問題であるが、最も一般的には加齢性黄斑変性に関連している。ＣＮＶＭでは、脈絡膜（網膜直下の血管が豊富な組織層）に由来する異常血管が網膜層を通って成長する。これらの新たな血管は非常に脆く、容易に破れ、血液および体液を網膜の層内に溜める。
【０１５４】
糖尿病（真性糖尿病）は、膵臓がインスリンを産生または使用できないことによって引き起こされる代謝性疾患である。最も一般的な糖尿病の型は、１型糖尿病（多くの場合、若年発症型糖尿病と称される）および２型糖尿病（多くの場合、成人発症型糖尿病と称される）である。１型糖尿病は、インスリン産生細胞の喪失に起因して身体がインスリンを産生することができないことによって生じ、現在、ヒトにインスリンを注射することを必要とする。２型糖尿病は一般に、細胞がインスリンを適切に使用することができない状態である、インスリン耐性から生じる。糖尿病は、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を含む眼の状態または疾患を含む、多数の他の状態と相関し得る。
【０１５５】
糖尿病性網膜症は、眼の後方（網膜）における光感受性組織の血管に対する損傷から生じる糖尿病の合併症である。最初、糖尿病性網膜症は、症状を全く引き起こさないか、または軽度の視力の問題しか引き起こさない可能性がある。最終的に、糖尿病性網膜症は失明に至る可能性がある。糖尿病性網膜症は１型糖尿病または２型糖尿病を有するいずれのヒトにも発生し得る。
【０１５６】
非増殖網膜症の最も初期の段階では、微細動脈瘤が網膜の非常に小さな血管に発生する。疾患が進行するにつれて、これらの血管の多くが損傷されるか、または遮断され、網膜のこれらの領域が、栄養物のための新たな血管を成長させるために、局部組織にシグナルを送る。この段階は増殖網膜症と呼ばれる。新たな血管は、網膜に沿って、および眼の内側を満たす透明な硝子体ゲルの表面に沿って成長する。血管は薄く、脆い壁を有し、時宜にかなった処置をしないと、新たな血管は血液、例えば、全血またはその一部の構成成分を漏出し得、重度の視力喪失および失明さえも生じ得る。また、鮮明かつ真っすぐな視覚視覚が生じる眼の部分である黄斑の中心に体液が漏出し得る。体液および関連タンパク質が黄斑の腫脹の上または下に沈着し始めると、被験体の中心視が歪められる。この状態は黄斑浮腫と呼ばれ、糖尿病性網膜症のどの段階でも発生し得るが、疾患が進行するにつれて発生する可能性が高くなる。
【０１５７】
ブドウ膜炎は、ブドウ膜が炎症を起こした状態である。眼は内側が中空であり、中心腔を囲む組織の３つの異なる層を有する。最も外側は強膜（眼の白い被膜）であり、最も内側は網膜である。強膜と網膜との間の中間層はブドウ膜と呼ばれる。ブドウ膜は、眼に栄養を与える多くの血管を含有する。ブドウ膜炎の合併症には、緑内障、白内障、および新たな血管の形成（新血管形成）が含まれる。
【０１５８】
眼外傷は、眼に対するあらゆる種類の物理的または化学的損傷である。眼外傷は誰もが罹患する可能性があり、主要な症状には、罹患した眼における充血（ｒｅｄｎｅｓｓ）または疼痛が含まれる。この症状は、非常に小さな発射物が外傷を引き起こす場合には、発生しない傾向がある。
【０１５９】
手術により誘発される浮腫は、網膜または眼の他の部分に対する手術後の眼組織における腫脹の発生である。類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）はこの現象の一例である。ＣＭＥは、白内障の手術を受けたことのあるヒトだけでなく、糖尿病、網膜色素変性症、ＡＭＤ、または眼の慢性炎症を引き起こす状態のヒトにも発生し得る。ＣＭＥの主な症状は、霧視または中心視力の低下である。
【０１６０】
眼虚血症候群（ＯＩＳ）は、慢性血管不全から生じる徴候および症状を包含する。この状態は、総頸動脈または内頸動脈の閉塞または狭窄に起因する眼の低潅流によって引き起こされる。ＯＩＳは一般に、高血圧または糖尿病などの全身性疾患を示すことが多い５０〜８０歳の被験体が罹患する。ＯＩＳの主な症状は、眼窩痛、視力喪失、視野の変化、非対称白内障、および光に対する緩慢な反応である。
【０１６１】
網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）は、糖尿病性網膜症後の最も一般的な網膜血管疾患である。有効に閉塞された網膜静脈ドレナージの領域に依存して、状態は、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、半側網膜静脈閉塞症（ＨＲＶＯ）、または網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）として広範に分類される。ＲＶＯの発現は、網膜血管の蛇行、網膜出血（斑状および火炎状）、綿花状白斑、視神経乳頭腫脹および黄斑浮腫からなる眼底所見のいずれかの組み合わせを伴う、様々な無痛性の視力喪失を伴う。ＣＲＶＯにおいて、網膜出血は眼底の４四分円部分全てに見出され得るが、出血はＨＲＶＯにおいて上側または下側眼底半球のいずれかに制限される。ＢＲＶＯにおいて、出血は、閉塞した分枝網膜静脈によって排出される領域に主に局在する。視力喪失は黄斑浮腫または虚血に続発して発生する。
【０１６２】
本開示の組成物は眼血管系を安定化させるように作用し、一部の実施形態では、本開示の薬剤は、ＶＥＧＦおよび罹患した網膜に存在し得る他の炎症性作用物質によって引き起こされる刺激に対抗することができる。一部の実施形態では、被験体への本開示の抗体の投与は被験体への抗ＶＥＧＦ薬の投与が中止された後に、疾患の逆転のレベルを維持するために使用され得る。
【０１６３】
被験体の処置
一部の実施形態では、本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体における本開示の組成物の単回投与は、眼新血管形成の長期の抑制に十分なレベルでのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤の持続的な眼内発現をもたらす。
【０１６４】
例えば、宿主眼細胞において産生されるＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤のレベルは、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬまたは少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬであってもよい。宿主眼細胞において産生されるＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）阻害剤のレベルは、多くとも１００ｐｇ／ｍＬ、多くとも２００ｐｇ／ｍＬ、多くとも３００ｐｇ／ｍＬ、多くとも４００ｐｇ／ｍＬ、多くとも５００ｐｇ／ｍＬ、多くとも６００ｐｇ／ｍＬ、多くとも７００ｐｇ／ｍＬ、多くとも８００ｐｇ／ｍＬ、多くとも９００ｐｇ／ｍＬ、多くとも１０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも２０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも３０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも４０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも５０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも６０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも７０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも８０００ｐｇ／ｍＬ、多くとも９０００ｐｇ／ｍＬ、または多くとも１０，０００ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【０１６５】
タンパク質レベルは、本開示の医薬組成物を投与してから、少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約１４、少なくとも約２１、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３２５、少なくとも約３５０、または少なくとも約３６５日後に測定され得る。タンパク質レベルは、本開示の医薬組成物を投与してから、多くとも約０．１、多くとも約０．２、多くとも約０．３、多くとも約０．４、多くとも約０．５、多くとも約０．６、多くとも約０．７、多くとも約０．８、多くとも約０．９、多くとも約１、多くとも約２、多くとも約３、多くとも約４、多くとも約５、多くとも約６、多くとも約７、多くとも約１４、多くとも約２１、多くとも約３０、多くとも約５０、多くとも約７５、多くとも約１００、多くとも約１２５、多くとも約１５０、多くとも約１７５、多くとも約２００、多くとも約２２５、多くとも約２５０、多くとも約２７５、多くとも約３００、多くとも約３２５、多くとも約３５０、または多くとも約３６５日後に測定され得る。
【０１６６】
中心窩厚（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｆｏｖｅａｌ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体における中心窩厚（ＣＦＴ）を減少させる方法も本明細書に開示される。方法は、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）標的化抗体を眼に投与するステップを含み、抗体の投与は任意の様式で行われてもよい。
【０１６７】
中心窩厚の減少のレベルは、例えば、約５０μｍ〜約１０００μｍであってもよい。中心窩厚の減少のレベルは、例えば、約５０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約７５０μｍ、約１５０μｍ〜約５００μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、約２００μｍ〜約１０００μｍ、約２５０μｍ〜約６５０μｍ、または約４００μｍ〜約７００μｍであってもよい。
【０１６８】
視力
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体の視力を上昇させる方法が、本明細書にさらに開示される。
【０１６９】
視力は、視覚の鋭さ（ａｃｕｔｅｎｅｓｓ）または鮮やかさ（ｃｌｅａｒｎｅｓｓ）であり、眼内の網膜焦点の鮮明さおよび脳の解釈部分（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｖｅ  ｆａｃｕｌｔｙ）の感度に依存する。視力は視覚処理システムの空間分解能の尺度である。視力は、設定距離からの図表上の特徴、典型的には数字または文字を識別することを被験体に要求することによって試験される。図表の特徴は白色の背景に対して黒色の記号として表される。被験体の眼と試験図表との間の距離は、水晶体が焦点を合わせようとする仕方で無限遠に近づくのに十分な距離に設定される。２０フィート、または６メートルが、視覚的遠近法から本質的に無限遠である。本開示では、視力の改善は、図表から読み取ることができる文字の数の増加によって評価された。
【０１７０】
視力を測定するための１つの非限定的な試験は、ＥＳＶ−３０００  ＥＴＤＲＳ試験デバイスおよび自己較正試験照明の使用である。ＥＳＶ−３０００デバイスはＬＥＤ光源技術を組み込んでいる。自動較正回路はＬＥＤ光源を常時モニターし、試験輝度を８５ｃｄ／ｍ２または３ｃｄ／ｍ２に較正する。
【０１７１】
大型ＥＴＤＲＳ試験（最大で２０／２００）が４メートルで実施される臨床試験用に設計されているが、デバイスは、非研究環境、すなわち、眼疾患モニタリングが行われる病院または診療所において使用され得る。ＥＴＤＲＳを適切に評価するために、試験は、標準化された照明条件下、例えば、８５ｃｄ／ｍ２の明所視試験レベルで行われるべきである。視力のスコア付けは、モニターによって選択される任意の様式において達成され得る。ベースライン評価を提供した後、試験被験体が識別できる文字の数の増加または減少は、処置の間の視力の上昇または低下の尺度となる。
【０１７２】
本明細書に開示される眼の疾患または状態を有する被験体における視力を上昇させる方法が、本明細書に開示される。この方法は、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）標的化抗体を、眼の疾患または状態を有する被験体に投与するステップを含み、抗体の投与は本明細書に記載される任意の様式で行われ得る。処置された眼によって認識される文字の数の増加は、例えば、約１〜約３０文字、約５〜約２５文字、約５〜約２０文字、約５〜約１５文字、約５〜約１０文字、約１０〜約２５文字、約１５〜約２５文字、または約２０〜約２５文字であり得る。視力の上昇は、約１文字、約５文字、約１０文字、約１５文字、約２０文字、または約２５文字であり得る。
【実施例】
【０１７３】
（実施例１：ハイブリドーマ技術を使用したＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の生成。）
【０１７４】
ハイブリドーマ技術を使用して、図３の概略図に示されるように、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）またはマウスＶＥ−ＰＴＰのＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するモノクローナル抗体を生成した。マウスをヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）ＥＣＤタンパク質によりチャレンジして、標的タンパク質に対する抗体を生成した。次いでＢ細胞を脾臓およびリンパ節から採取し、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞株を産生した。融合細胞を、抗原曝露マウスに由来する遺伝子を有する骨髄腫細胞のみが成長することができる培地中で培養した。単一の骨髄腫細胞に由来するコロニーを限界希釈によって生成した。次いでハイブリドーマコロニーによって産生された抗体を、ＥＬＩＳＡによってヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）ＥＣＤへの結合についてスクリーニングした。１つのハイブリドーマであるＲ１５Ｅ６をさらなる分析のために選択した。Ｒ１５Ｅ６抗体は、図４における免疫沈降（ＩＰ）ウェスタンブロット（左パネル）およびフローサイトメトリー（右パネル）によって示されるように、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）由来の内因性ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に結合した。ビーズ対照（抗体を含まないプロテインＡ／Ｇビーズ；ＢＣ）またはＶＥＧＦＲ２もしくはＴｉｅ２（Ｒ２／Ｔ２）へのＲ１５Ｅ６の結合は観察されなかった。
【０１７５】
（実施例２：Ｒ１５Ｅ６によるＨＵＶＥＣにおけるＴｉｅ２活性化。）
【０１７６】
Ｒ１５Ｅ６は、図６のパネルＡおよびＢに示されるＩＰ実験によって実証されるように、濃度依存的にＴｉｅ２を活性化した。抗体はまた、パネルＣに示されるように、ＨＵＶＥＣにおいて濃度依存的に血清飢餓内皮細胞の生存度を向上させた。
【０１７７】
（実施例３：ネズミモノクローナルおよびポリクローナル抗マウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤ抗体を用いたＴｉｅ２活性化および細胞透過性実験。）
【０１７８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＥ−ＰＴＰ抗体の治療効果を特徴付けるために、Ｔｉｅ２活性化および細胞透過性実験を、抗マウスＶＥ−ＰＴＰ抗体を使用して実施した。マウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を、細胞外ドメインのＮ末端８ＦＮ３リピートのＶＥ−ＰＴＰ−Ｆｃ融合タンパク質でラットを免疫化することによって生成した。免疫化、ハイブリドーマ融合、およびスクリーニングは、上記のように実施した。実施例３では、マウスＶＥ−ＰＴＰの細胞外フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）様ドメイン１〜８に対するモノクローナル抗体１０９．１（ｍＡｂ  １０９．１）およびポリクローナル抗体（ｐＡｂ）をさらなる分析のために選択した。
【０１７９】
図７は、ウェスタンブロットによって決定した、マウス内皮細胞（ｂＥｎｄ）におけるＴｉｅ２活性化（左上パネル）、マウスＶＥ−ＰＴＰタンパク質発現（左下パネル）、およびＡｋｔ（右パネル）に対するｍＡｂ  １０９．１の効果を示す。ｍＡｂ  １０９．１による処理は、Ｔｉｅ２リン酸化（ｐＴｙｒ；左上パネル）によって示されるように、Ｔｉｅ２の活性化をもたらした。Ａｋｔは、抗体の濃度の増加に伴うリン酸化の増加の非存在によって確認されるように、試験したマウス内皮細胞において構成的に活性化された（右パネル）。
【０１８０】
マウスｐＡｂ  １−８を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験もまた、内皮細胞におけるＴｉｅ２（Ｔｉｅ−２）活性化および下流シグナル伝達を増強した。培養したマウス内皮（ｂＥｎｄ．５）細胞をｐＡｂ１−８または免疫前（対照）抗体により１時間処理し、続いてＴｉｅ２について免疫沈降させ、その後、抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）およびＴｉｅ２に対する抗体で免疫ブロットした。同一のタンパク質含量を有する細胞溶解物のアリコートをＶＥ−ＰＴＰおよびＴｉｅ２について直接免疫ブロットした（下パネル）。図８は、ｐＡｂが、マウスＶＥ−ＰＴＰに対するポリクローナル抗体または免疫前抗体により１時間（パネルＡ）または３分間（パネルＢ）処理したｂＥｎｄ．５細胞においてＴｉｅ２活性化を急速に誘導した免疫沈降実験を示す。
【０１８１】
Ｔｉｅ２活性化の血管安定化効果と一致して、ＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤ抗体は、図９に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮単層のトロンビンおよびＶＥＧＦにより誘導される透過性を低減させた。２５０ｋＤのＦＩＴＣ−デキストランについての傍細胞透過性を、トランスウェルフィルター中で成長させた培養ＨＵＶＥＣ単層について決定した。透過性はトロンビン（パネルＡ）またはＶＥＧＦ（パネルＢ）のいずれかにより誘導した。ＰＢＳ処理細胞の透過性は１００％に設定した。ＶＥ−ＰＴＰ標的化のために、細胞を抗ＶＥ−ＰＴＰ  ｐＡｂにより処理した。対照として、細胞を免疫前抗体（対照Ａｂ）により処理した。データは２つの独立した実験を表す。
【０１８２】
Ｔｉｅ２活性化の血管安定化効果と一致して、ＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤ抗体もまた、図１０に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＥＧＦにより誘導される皮膚血管透過性を遮断した。モノクローナルおよびポリクローナルＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤ抗体、ｍＡｂ  １０９．１（パネルＡ）およびｐＡｂ  ＰＴＰ  １−８（パネルＢ）の両方は、Ｍｉｌｅｓアッセイによって実証されるように、ＶＥＧＦにより誘導される皮膚血管透過性を阻害した。Ｍｉｌｅｓアッセイは、血管漏出および新血管形成の特性である、血管透過性のｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして使用され得る。Ｍｉｌｅｓアッセイを開始する３０分前に、１００μｇの対照ＩｇＧまたは抗マウスＶＥ−ＰＴＰ抗体をマウスに静脈内注射した。次いでエバンスブルーをマウスに静脈内注射し、その後、１０分後にＶＥＧＦ（縞模様の棒）またはＰＢＳ（中実の黒色の棒）を皮内注射した。３０分後、マウスを屠殺し、染料を皮膚試料から抽出し、定量化した。データセットを正規性および等分散について調べた。値は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。パネルＣに示すように、透過性の遮断は、ｐＡｂ  ＰＴＰ１−８により処置したマウスの肺組織において実証されるように、Ｔｉｅ２リン酸化と相関する。
【０１８３】
（実施例４：マウスにおける網膜および脈絡膜新血管形成に対するマウスＶＥ−ＰＴＰ
ＥＣＤモノクローナル抗体の効果。）
【０１８４】
増殖性糖尿病性網膜症の態様を模倣する虚血性網膜症モデルにおいて、ＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ  １０９．１）は、図１１（パネルＡ）に示し、図１２（パネルＡ）において定量化したように、抗体の投与後、網膜新血管形成を有意に低減させた。Ｐ１２にて、虚血性網膜症を有するマウスに、０．１、０．５、もしくは２μｇのｍＡｂ  １０９．１または２μｇのＩｇＧアイソタイプ対照（各々についてｎ≧１２）を硝子体内注射により投与した。Ｐ１７にて、広範なＧＳＡ染色された網膜新血管形成を、対照のＩｇＧを注射した眼において観察し、有意に少ない網膜新血管形成を、２μｇの抗ＶＥ−ＰＴＰを注射した眼において観察した。＊Ｐ＜０．００１。
【０１８５】
同様に、湿潤型加齢性黄斑浮腫の異なる態様（網膜血管腫増殖および脈絡膜新血管形成）を模倣する２つのモデルにおいて、ＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ
１０９．１）の単回の２μｇの硝子体内投与は、両方の網膜新血管形成を有意に低減させた（図１１のパネルＢおよび図１２のパネルＢにおいて定量化した）。Ｐ１５にて、６匹のＲｈｏ−ＶＥＧＦトランスジェニックマウスに、一方の眼に０．５または２μｇのｍＡｂ  １０９．１を硝子体内注射し、他方の眼に対応する用量の対照ＩｇＧを与えた。Ｐ２１にて、有意に少ないＧＳＡ染色された網膜下新血管形成を、対照ＩｇＧにより処置した眼においてよりも、０．５または２μｇのｍＡｂ  １０９．１により処置した眼において観察した。＊ＩｇＧ対照の他方の眼との比較について独立ｔ検定によりＰ＝０．０１。スケールバー：１００μｍ。
【０１８６】
２μｇのｍＡｂ  １０９．１の硝子体内注射により、対照ＩｇＧと比較して、ブルッフ膜破裂部位における脈絡膜新血管形成の面積が有意に低減した（図１１のパネルＣおよび図１２のパネルＣにおいて定量化した）。＊Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正を伴う一元ＡＮＯＶＡによりＰ＜０．００１。スケールバー：１００μｍ。
【０１８７】
ｍＡｂ  １０９．１の皮下投与もまた、虚血性網膜症マウスモデルにおいて虚血性新血管形成を低減させた。網膜新血管形成の平均面積は、図２５に示すように、ビヒクルと比較して約３０％低減した。虚血性網膜症を有するマウスに、２ｍｇ／ｋｇのｑ．ｏ．ｄ（１日おき）×３の皮下注射を投与した。
【０１８８】
（実施例５：マウスにおける網膜剥離に対する抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせたマウスＶＥ−ＰＴＰ  ＥＣＤモノクローナル抗体の効果。）
【０１８９】
本明細書に開示される抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体を使用した併用療法の効果を評価するために、Ｔｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦマウスモデルを使用した。Ｔｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦトランスジェニックマウスは、重度の網膜下新血管形成および血管漏出を発生し、ヒトＶＥＧＦの誘導性網膜過剰発現によって媒介される滲出性網膜剥離をもたらす。図２４は、ダブルアスタリスクによって示されるように、マウスにおける網膜剥離を阻止するためのいずれかの療法単独と比較して、抗マウスＶＥ−ＰＴＰ抗体（ｍＡｂ  １０９．１）およびアフリベルセプトの組み合わせの増強した有効性を示す。ラットＩｇＧを対照として使用した。
【０１９０】
（実施例６：ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に対するＲ１５Ｅ６由来のヒト化抗体の生成および精製。）
【０１９１】
Ｒ１５Ｅ６は重鎖および軽鎖を含有する１５０ｋＤａの抗体である。抗体の１６個の異なるヒト化変種を、表１２に示すように、重鎖配列と軽鎖配列の異なる組み合わせを使用して合成した。
【０１９２】
実施例１に記載されるＲ１５Ｅ６ヒト化バリアントを、ｐＶｉｔｒｏ  ＤＨＦＲ３哺乳動物発現ベクターにクローニングした。中規模の一過性トランスフェクション発現分析を実施してＣＨＯ細胞からの発現収量を決定した。懸濁物に適応したＣＨＯ細胞を、５００ｍＬの通気フラスコ中の８ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＬ／Ｌのヒポキサンチン／チミジンを補充したＰｒｏ  ＣＨＯ４無血清培地中で、３７℃、１５０ｒｐｍにて８５％ＣＯ２で２．０〜３．０×１０５細胞／ｍＬにて培養した。各構築物のマキシプレップ（Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ）を、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ｐｃ５００キットを使用して、製造業者の指示に従って調製した。ベクターＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ（商標）分光光度計を使用して定量化した。
【０１９３】
１．０×１０６細胞／ｍＬの最終密度にて１００ｍＬの細胞を、５００ｍＬの通気フラスコ中の８ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＬ／Ｌのヒポキサンチン／チミジンを補充したＰｒｏ  ＣＨＯ５無血清培地中で、１．２５μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした培養物を、３７℃、１５０ｒｐｍにて８５％ＣＯ２で８〜１１日間インキュベートし、その後、４，０００ｒｐｍ、４℃にて４０分間、遠心分離により採取した。
【０１９４】
遠心分離後、培地を、０．８μｍの酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。各バッチを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムを使用して精製した。発現したヒト化抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを全てのヒト化抗体精製のために使用した。全ての精製は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ所内の洗浄および溶出緩衝液を使用して実施した。タンパク質をカラムに充填した後、あらゆる結合した抗体を、グリシン／トリス緩衝液（ｐＨ３）を使用して溶出した。溶出した１ｍＬ画分の全てを１００μＬのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）により中和した。溶出ピークに対応する溶出画分を、ＰＢＳ中での一晩の透析のために選択した。透析後、抗体の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ（商標）分光光度計により測定した。
【０１９５】
（実施例７：ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に対するヒト化抗体の評価。）
【０１９６】
ヒト化抗体の試料を還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３）によって分析して、重鎖および軽鎖の存在ならびに抗体の純度を決定した。マウス／ヒトキメラ抗体、ＨＣ０ＬＣ０は、ネズミ重鎖および軽鎖可変領域のヒトＦｃ領域との融合によってＲ１５Ｅ６に由来した。両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、レーン１：ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２予め染色したタンパク質標準物；レーン２：ＨＣ０ＬＣ０  ＃１；レーン３：ＨＣ１ＬＣ１  ＃２；レーン４：ＨＣ１ＬＣ２  ＃１；レーン５：ＨＣ１ＬＣ３  ＃１；レーン６：ＨＣ１ＬＣ３  ＃２；レーン７：ＨＣ１ＬＣ４  ＃１；レーン８：ＨＣ２ＬＣ１  ＃１；レーン９：ＨＣ２ＬＣ２  ＃１；レーン１０：ＨＣ２ＬＣ３  ＃１；レーン１１：ＨＣ２ＬＣ３  ＃２；レーン１２：ＨＣ２ＬＣ４  ＃１；レーン１３：ＨＣ３ＬＣ１  ＃１；レーン１４：ＨＣ３ＬＣ２  ＃１；レーン１５：ＨＣ３ＬＣ３  ＃１；レーン１６：ＨＣ３ＬＣ４  ＃１；レーン１７：ＨＣ４ＬＣ１  ＃１；レーン１８：ＨＣ４ＬＣ１  ＃２；レーン１９：ＨＣ４ＬＣ２  ＃１；レーン２０：ＨＣ４ＬＣ３  ＃１；レーン２１：ＨＣ４ＬＣ３  ＃２；レーン２２：ＨＣ４ＬＣ４  ＃１；レーン２３：ＨＣ４ＬＣ４  ＃２；およびレーン２４：ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２予め染色したタンパク質標準物。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により、全ての分析試料の高純度が示された。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、重鎖および軽鎖は目に見え、重鎖については５０ｋＤａ、軽鎖については２５ｋＤａの推定分子量である。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、遊離重鎖も遊離軽鎖も、それぞれおよそ５０ｋＤａまたは２５ｋＤａにて観察されなかった。ゲルは、全てのＨＣ４バリアントならびにＨＣ１ＬＣ３、ＨＣ２ＬＣ３およびＨＣ３ＬＣ３バリアントについて低量のタンパク質を示す。
【０１９７】
精製したＲ１５Ｅ６を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ（商標）分光光度計を使用して、２８０ｎｍでのＩｇＧについての標準基準として１３．７の吸光係数を使用して定量化した。表１６はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果をまとめている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致して、重鎖の４個のバリアントの全ては抗体をほとんどまたは全く発現しなかった。
【表１５】
2020180156.tif 000019
【０１９８】
（実施例８：ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）、カニクイザルＶＥ−ＰＴＰ（ｃｙｎｏ  ＰＴＰ−β）、およびヒトＨＰＴＰ−ηに対するＲ１５Ｅ６およびヒト化バリアントの選択性。）
【０１９９】
ハイブリドーマ由来の抗体を含有する組織培養上清を、標的ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ヒトベータ１／２ＥＣＤ）、ｃｙｎｏ  ＶＥ−ＰＴＰ（Ｃｙｎｏベータ）、およびヒトＨＰＴＰ−η（ヒトエータ）に対して試験して、ＥＬＩＳＡによって結合親和性を決定した。
【０２００】
ヒトＨＰＴＰ−β、ｃｙｎｏ  ＰＴＰβ、およびヒトＨＰＴＰ−ηを独立に産生し、ＨＥＫ２９３細胞を使用して精製した。ＨＥＫ２９３細胞を振盪フラスコ中に播種して２４時間置いた後、種特異的ＶＥ−ＰＴＰまたはＨＰＴＰ−ηを発現するプラスミドをトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を、無血清の化学的に定義された培地を使用して成長させた。種特異的ＶＥ−ＰＴＰまたはＨＰＴＰ−η構築物についてのＤＮＡを、ＨＥＫ２９３の３０ｍＬの懸濁物に一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を計数して、細胞の生存度を評価し、生存細胞数を決定した。一過性トランスフェクションプロセスの間中、さらなる読み取りを行った。一過性トランスフェクションの５日目に細胞培養物を採取した。一過性トランスフェクションから採取した馴化培地上清を遠心分離によって清澄化した。上清を、０．２μｍのメンブレンフィルターを使用して濾過した。次いでタンパク質を抗Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製後、タンパク質のＰＢＳ（ｐＨ７．４）への緩衝液交換を実施した。次いで、ＳＤＳ−ゲルキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）分析を実施し、タンパク質を精製した。ＤＮＡプラスミド挿入物のアミノ酸配列、ＤＮＡプラスミド挿入物、および対応する野生型配列を以下の表１５に示す。タンパク質配列のシグナルペプチドには下線が引かれている。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【表１６−１０】
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【０２０１】
ＨＰＴＰ−β、ｃｙｎｏ  ＰＴＰ−β、およびＨＰＴＰ−ηタンパク質を、コーティング緩衝液（ｐＨ９．４）中のＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。各タンパク質を、５０ｍＭの炭酸塩−重炭酸塩中の１μｇ／ｍＬのタンパク質ストックとして調製した。コーティングしたタンパク質を、滅菌透明ポリスチレン平底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの体積にてアリコートに分けた。プレートを４℃にて一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、プレートを２００μＬ／ウェルの１×ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）により３回洗浄した。免疫化タンパク質はヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）であった。次いでプレートを、ＰＢＳ−Ｔ中の５％ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳２００μＬ／ウェルによりブロックし、室温にて１時間インキュベートした。
【０２０２】
一次抗体試料を、ＰＢＳ中の５％ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳１μｇ／ウェルを使用して、ヒト化バリアントおよび陰性対照である、抗ｈＣＤ２０−ｈＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐについて調製した。試料を３連で試験した。Ｆａｂ抗体断片をＩｇＧ抗体として処理した。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、１００μＬの一次抗体調製物を各ウェルに添加した。次いでプレートを室温にて１時間インキュベートした。
【０２０３】
ペルオキシダーゼがコンジュゲートし、アフィニティー精製されたロバ抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体を、ＰＢＳ中のブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳中で１：２，０００希釈にて希釈することによって二次抗体試料を調製した。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、１００μＬの二次抗体調製物を各ウェルに添加した。次いでプレートを室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。
【０２０４】
次いで７５μｇの１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡを各ウェルに添加し、プレートを室温にて５分間発色させた。５分後、５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに添加して反応を停止させた。次いでプレートを４５０ｎｍの吸光度波長にてプレートリーダーにより分析した。
【０２０５】
図５は、種特異的ＶＥ−ＰＴＰおよびＨＰＴＰ−ηに対してスクリーニングしたＲ１５Ｅ６のウェスタンブロットを示す。Ｒ１５Ｅ６はヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β；レーン１および４）に対して高度に選択的であった。ヒトＰＴＰ−ηまたはｃｙｎｏ  ＶＥ−ＰＴＰ（ｃｙｎｏ  ＰＴＰ−β）への有意な結合は観察されなかった。示された組換えヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質（６−Ｈｉｓ）を、Ｒ１５Ｅ６および市販の６−Ｈｉｓ抗体を用いて逐次的にプローブした。市販の６−Ｈｉｓ抗体は全てのタンパク質標的への結合を示し、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に対して不十分な選択性を示した。
【０２０６】
各ヒト化バリアントを、ＥＬＩＳＡを使用して、抗原、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に対する親和性について測定した。１００ｍｇ／ウェルのＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）抗原を、４℃にて一晩、コーティング緩衝液（０．５ｍＭのＮａ２ＣＯ３の添加によ
ってｐＨを９．６にした０．５ｍＭのＮａＨＣＯ３）中の９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定した。次いでコーティング緩衝液を除去し、２００μＬ／ウェルのブロック溶液（３％ｗ／ｖセミスキムミルク（ｓｅｍｉ−ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋ）粉末、ＰＢＳ）を添加し、室温にて２時間撹拌した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０）により４回洗浄した。１００μＬ／ウェルを、ＰＢＳ−ＴＢ（０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ）中で１０，０００ｎｇ／ｍＬから９．７６５ｎｇ／ｍＬまで連続希釈した精製したＲ１５Ｅ６バリアントに添加した。室温にて２時間撹拌した後、プレートをＰＢＳ−Ｔにより４回洗浄した。次いで１：６０，０００ＰＢＳの比にて１００μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＨＲＰ（Ｆｃ特異的）を添加し、プレートを室温にて撹拌しながらさらに１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔにより６回洗浄し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を添加し、３７℃にて１０分間インキュベートした。１ウェル当たり５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加し、プレートを４５０ｎｍにてＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーにより直ちに読み取った。ＥＬＩＳＡの結果を図１４〜１７に示す。ＨＣ１、ＨＣ２およびＨＣ３バリアントは一般に、キメラＨＣ０ＬＣ０抗体と比較して同様の結合特性を示した。ＨＣ４バリアントの結合は、ＨＣ０ＬＣ０と比較して他の重鎖バリアントとの結合よりはるかに低かった（図１７）。
【０２０７】
各バリアントの試料を、結合親和性を決定するためにＢｉａｃｏｒｅ分析によってさらに評価した。抗体結合実験を２５℃にてＢｉａｃｏｒｅ  ３０００（商標）により実施した。アッセイ緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）。再生緩衝液：１０ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ１．７５）。コンジュゲーション緩衝液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）。リガンドを捕捉するために使用した流量は５μＬ／分であった。動態分析のための流量は５０μＬ／分であった。ＣＭ５チップのフローセル１および２を最大量のヤギ抗ヒトＩｇＧによりコーティングした。およそ１５０ＲＵの試験抗体を、示したようにフローセル２、３、および４上で捕捉した。抗原をチップの上に流した。抗体への抗原の結合をリアルタイムでモニターした。ＫＤを、観察したｋｏｎおよびｋｏｆｆ値から決定した。
【０２０８】
探索分析（ｓｃｏｕｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を、示したように単一の検体濃度を使用して実施した。これらの濃度では、たとえリガンド結合が弱くても結合を観察することができる。フローセル１の応答を、基準を差し引くために使用した。
【０２０９】
完全な動態分析を、以下に示した検体の濃度範囲：５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、および０ｎＭで２倍連続希釈した対照抗体について実施した
【０２１０】
表１７は、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイによって決定した、結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、最大結合能力（Ｒｍａｘ）、結合定数（ＫＡ）、および解離定数（ＫＤ）を含む、ＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）ＥＣＤへの各ヒト化抗体の結合の結合動態パラメータを示す。Ｒｍａｘを相対応答（ＲＵ）として測定した。ヒト化候補の全ては、マウス／ヒトキメラ抗体、ＨＣ０ＬＣ０と同様の結合親和性を示した。
【表１７】
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【０２１１】
表１８は、ＥＬＩＳＡによって決定した、親抗体（Ｒ１５Ｅ６）および不活性対照（ＩｇＧ４）と比較したヒト化抗体の結合選択性を示す。０．２未満またはそれと等しい値は、結合がないことを示す。ヒト化抗体候補、親Ｒ１５Ｅ６、およびマウス／ヒトキメラ抗体（ＨＣ０：ＬＣ０）の全ては、ヒトＰＴＰ−ηおよびｃｙｎｏ  ＰＴＰ−βへの有意な結合がないことによって示されるように、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）に対して高い選択性を示した。
【表１８】
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【０２１２】
ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）を標的化するために使用したヒト化抗体は、自己リン酸化によりＴｉｅ２活性を回復させ、例えば、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路におけるタンパク質を含む、下流エフェクターを開始することができる。ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）への抗体の結合を評価することに加えて、これらのエフェクタータンパク質を活性化する抗体の能力を測定した。図１８は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化バリアントによる、Ｔｉｅ２リガンド（例えば、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２）の非存在下でのＴｉｅ２（左パネル）およびＡｋｔ（右パネル）の活性化を示す。ヒト化バリアントの活性は、親ネズミ抗体Ｒ１５Ｅ６およびキメラ抗体ＨＣ０ＬＣ０の活性と同様であった。ヒトＩｇＧ４を対照として使用した。全ての抗体を５０ｎＭにて試験した。各ブロットの上パネルは、Ｔｉｅ２またはＡｋｔ活性化を示す、Ｔｉｅ２またはＡｋｔのいずれかのリン酸化を示す。Ｔｉｅ２およびＡｋｔは、対照抗体で処理した試料よりも、ヒト化抗体で処理した試料においてより高いリン酸化を示し、ヒト化抗体が、リガンドの非存在下でさえＴｉｅ２およびＡｋｔを活性化するのに有効であったことを示した。
【０２１３】
図１９は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体、ＨＣ２ＬＣ４およびＨＣ１ＬＣ１による、Ｔｉｅ２リガンド（例えば、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２）の非存在下でのＴｉｅ２（上パネル）およびＡｋｔ（下パネル）の濃度依存性活性化を示す。Ｔｉｅ２およびＡｋｔシグナル伝達活性をヒト化バリアントの低ナノモル濃度にて観察した。各ブロットの上パネルは、Ｔｉｅ２またはＡｋｔ活性化を示す、Ｔｉｅ２またはＡｋｔのいずれかのリン酸化を示す。Ｔｉｅ２およびＡｋｔは、対照抗体で処理した試料において示されたものよりも、ヒト化抗体で処理した試料においてより高いリン酸化を示した。この結果は、ヒト化抗体が、Ａｎｇ１の非存在下でさえＴｉｅ２およびＡｋｔを活性化するのに有効であったことを示す。
【０２１４】
図２０は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体候補、ＨＣ２ＬＣ４およびＨＣ１ＬＣ１による、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の存在下でのＴｉｅ２（左パネル）およびＡｋｔ（右パネル）の活性化を示す。ＨＣ２ＬＣ４およびＨＣ１ＬＣ１は、Ａｎｇ２の存在下でＴｉｅ２およびＡｋｔの両方を活性化し、それぞれＴｉｅ２およびＡｋｔのリン酸化の増加によって示されるように、Ａｎｇ１媒介性Ｔｉｅ２およびＡｋｔ活性化を増強した。全ての抗体を１０ｎＭにて試験した。
【０２１５】
図２１は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体候補、ＨＣ２ＬＣ１およびＨＣ２ＬＣ４による、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２の存在下でのＴｉｅ２（パネルＡ）、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）発現（パネルＢ）、およびＡｋｔ（パネルＣ）の活性化を示す。ＨＣ２ＬＣ１およびＨＣ２ＬＣ４は、Ａｎｇ１単独、Ａｎｇ２単独の存在下、ならびにＡｎｇ１およびＡｎｇ２の両方の存在下でＴｉｅ２を活性化した。抗体を１５分間プレインキュベートし、次いで６００ｎｇ／ｍＬの濃度にて１０分間、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２によって刺激した。全ての抗体を１０ｎＭにて試験した。
【０２１６】
図２２は、ヒト化抗体候補、ＨＣ２ＬＣ１を使用したＨＵＶＥＣにおけるＡｋｔの活性化を示す。最初の３つのブロットの上パネルは、漸増濃度のＨＣ２ＬＣ１にて、Ａｋｔ活性化を示す、Ａｋｔのリン酸化を示す。結合親和性試験と一致して、ＨＣ２ＬＣ１は抗体のナノモル濃度にてＡｋｔを活性化した。ＨＣ２ＬＣ１によるＡｋｔ活性化は、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）細胞外ドメイン（βＥＣＤ  ６ＨｉｓおよびβＥＣＤ  Ｆｃ）との抗体のプレインキュベーションによってブロックされた。この結果は、ＨＣ２ＬＣ１媒介性Ａｋｔ活性化が、ヒトＶＥ−ＰＴＰ（ＨＰＴＰ−β）細胞外ドメインへのＨＣ２ＬＣ１結合を介して生じることを示す。
【０２１７】
図２３は、親抗体、Ｒ１５Ｅ６、およびｍＩｇＧ１対照と比較して、ヒト化抗体候補ＨＣ２ＬＣ１およびＨＣ０ＬＣ０を使用した、血清飢餓ＨＵＶＥＣにおける向上した生存度を示す。
【０２１８】
実施形態
実施形態１．配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物。
【０２１９】
実施形態２．配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも８５％同一である、実施形態１の化合物。
【０２２０】
実施形態３．配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９０％同一である、実施形態１〜２のいずれか１つの化合物。
【０２２１】
実施形態４．配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９５％同一である、実施形態１〜３のいずれか１つの化合物。
【０２２２】
実施形態５．配列が、配列番号９と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２２３】
実施形態６．配列が配列番号９である、実施形態１〜５のいずれか１つの化合物。
【０２２４】
実施形態７．配列が、配列番号１０と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２２５】
実施形態８．配列が配列番号１０である、実施形態１〜４および７のいずれか１つの化合物。
【０２２６】
実施形態９．配列が、配列番号１１と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２２７】
実施形態１０．配列が配列番号１１である、実施形態１〜４および９のいずれか１つの化合物。
【０２２８】
実施形態１１．配列が、配列番号１２と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２２９】
実施形態１２．配列が配列番号１２である、実施形態１〜４および１１のいずれか１つの化合物。
【０２３０】
実施形態１３．配列が、配列番号２９と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２３１】
実施形態１４．配列が配列番号２９である、実施形態１の化合物。
【０２３２】
実施形態１５．配列が、配列番号３０と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２３３】
実施形態１６．配列が配列番号３０である、実施形態１の化合物。
【０２３４】
実施形態１７．配列が、配列番号３１と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２３５】
実施形態１８．配列が配列番号３１である、実施形態１の化合物。
【０２３６】
実施形態１９．配列が、配列番号３２と少なくとも８０％同一である、実施形態１の化合物。
【０２３７】
実施形態２０．配列が配列番号３２である、実施形態１の化合物。
【０２３８】
実施形態２１．チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態１〜２０のいずれか１つの化合物。
【０２３９】
実施形態２２．ＨＰＴＰ−βを阻害する、実施形態１〜２１のいずれか１つの化合物。
【０２４０】
実施形態２３．ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、実施形態１〜２２のいずれか１つの化合物。
【０２４１】
実施形態２４．Ｔｉｅ２を活性化する、実施形態１〜２３のいずれか１つの化合物。
【０２４２】
実施形態２５．Ａｋｔを活性化する、実施形態１〜２４のいずれか１つの化合物。
【０２４３】
実施形態２６．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、実施形態１〜２５のいずれか１つの化合物。
【０２４４】
実施形態２７．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、実施形態１〜２６のいずれか１つの化合物。
【０２４５】
実施形態２８．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、実施形態１〜２７のいずれか１つの化合物。
【０２４６】
実施形態２９．配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物。
【０２４７】
実施形態３０．配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８５％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２４８】
実施形態３１．配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一である、実施形態２９〜３０のいずれか１つの化合物。
【０２４９】
実施形態３２．配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９５％同一である、実施形態２９〜３１のいずれか１つの化合物。
【０２５０】
実施形態３３．配列が、配列番号２０と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２５１】
実施形態３４．配列が配列番号２０である、実施形態２９〜３３のいずれか１つの化合物。
【０２５２】
実施形態３５．配列が、配列番号２１と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２５３】
実施形態３６．配列が配列番号２１である、実施形態２９〜３２および３５のいずれか１つの化合物。
【０２５４】
実施形態３７．配列が、配列番号２２と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２５５】
実施形態３８．配列が配列番号２２である、実施形態２９〜３２および３７のいずれか１つの化合物。
【０２５６】
実施形態３９．配列が、配列番号２３と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２５７】
実施形態４０．配列が配列番号２３である、実施形態２９〜３２および３９のいずれか１つの化合物。
【０２５８】
実施形態４１．配列が、配列番号３４と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２５９】
実施形態４２．配列が配列番号３４である、実施形態２９の化合物。
【０２６０】
実施形態４３．配列が、配列番号３５と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２６１】
実施形態４４．配列が配列番号３５である、実施形態２９の化合物。
【０２６２】
実施形態４５．配列が、配列番号３６と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２６３】
実施形態４６．配列が配列番号３６である、実施形態２９の化合物。
【０２６４】
実施形態４７．配列が、配列番号３７と少なくとも８０％同一である、実施形態２９の化合物。
【０２６５】
実施形態４８．配列が配列番号３７である、実施形態２９の化合物。
【０２６６】
実施形態４９．チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態２９〜４８のいずれか１つの化合物。
【０２６７】
実施形態５０．ＨＰＴＰ−βを阻害する、実施形態２９〜４９のいずれか１つの化合物。
【０２６８】
実施形態５１．ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、実施形態２９〜５０のいずれか１つの化合物。
【０２６９】
実施形態５２．Ｔｉｅ２を活性化する、実施形態２９〜５１のいずれか１つの化合物。
【０２７０】
実施形態５３．Ａｋｔを活性化する、実施形態２９〜５２のいずれか１つの化合物。
【０２７１】
実施形態５４．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、実施形態２９〜５３のいずれか１つの化合物。
【０２７２】
実施形態５５．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、実施形態２９〜５４のいずれか１つの化合物。
【０２７３】
実施形態５６．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、実施形態２９〜５５のいずれか１つの化合物。
【０２７４】
実施形態５７．ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３４と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
【０２７５】
実施形態５８．重鎖が配列番号３０と少なくとも８５％同一であり、軽鎖が配列番号３４と少なくとも８５％同一である、実施形態５７の化合物。
【０２７６】
実施形態５９．重鎖が配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、軽鎖が配列番号３４と少なくとも９０％同一である、実施形態５７〜５８のいずれか１つの化合物。
【０２７７】
実施形態６０．重鎖が配列番号３０と少なくとも９５％同一であり、軽鎖が配列番号３４と少なくとも９５％同一である、実施形態５７〜５９のいずれか１つの化合物。
【０２７８】
実施形態６１．重鎖が配列番号３０であり、軽鎖が配列番号３４である、実施形態５７〜６０のいずれか１つの化合物。
【０２７９】
実施形態６２．チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態５７〜６１のいずれか１つの化合物。
【０２８０】
実施形態６３．ＨＰＴＰ−βを阻害する、実施形態５７〜６２のいずれか１つの化合物。
【０２８１】
実施形態６４．ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、実施形態５７〜６３のいずれか１つの化合物。
【０２８２】
実施形態６５．Ｔｉｅ２を活性化する、実施形態５７〜６４のいずれか１つの化合物。
【０２８３】
実施形態６６．Ａｋｔを活性化する、実施形態５７〜６５のいずれか１つの化合物。
【０２８４】
実施形態６７．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、実施形態５７〜６６のいずれか１つの化合物。
【０２８５】
実施形態６８．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、実施形態５７〜６７のいずれか１つの化合物。
【０２８６】
実施形態６９．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、実施形態５７〜６８のいずれか１つの化合物。
【０２８７】
実施形態７０．ａ）配列番号２９と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３５と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
【０２８８】
実施形態７１．重鎖が配列番号２９と少なくとも８５％同一であり、軽鎖が配列番号３５と少なくとも８５％同一である、実施形態７０の化合物。
【０２８９】
実施形態７２．重鎖が配列番号２９と少なくとも９０％同一であり、軽鎖が配列番号３５と少なくとも９０％同一である、実施形態７０〜７１のいずれか１つの化合物。
【０２９０】
実施形態７３．重鎖が配列番号２９と少なくとも９５％同一であり、軽鎖が配列番号３５と少なくとも９５％同一である、実施形態７０〜７２のいずれか１つの化合物。
【０２９１】
実施形態７４．重鎖が配列番号２９であり、軽鎖が配列番号３５である、実施形態７０〜７３のいずれか１つの化合物。
【０２９２】
実施形態７５．チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態７０〜７４のいずれか１つの化合物。
【０２９３】
実施形態７６．ＨＰＴＰ−βを阻害する、実施形態７０〜７５のいずれか１つの化合物。
【０２９４】
実施形態７７．ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、実施形態７０〜７６のいずれか１つの化合物。
【０２９５】
実施形態７８．Ｔｉｅ２を活性化する、実施形態７０〜７７のいずれか１つの化合物。
【０２９６】
実施形態７９．Ａｋｔを活性化する、実施形態７０〜７８のいずれか１つの化合物。
【０２９７】
実施形態８０．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、実施形態７０〜７９のいずれか１つの化合物。
【０２９８】
実施形態８１．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、実施形態７０〜８０のいずれか１つの化合物。
【０２９９】
実施形態８２．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、実施形態７０〜８１のいずれか１つの化合物。
【０３００】
実施形態８３．ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、ｂ）配列番号３７と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
【０３０１】
実施形態８４．重鎖が配列番号３０と少なくとも８５％同一であり、軽鎖が配列番号３７と少なくとも８５％同一である、実施形態８３の化合物。
【０３０２】
実施形態８５．重鎖が配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、軽鎖が配列番号３７と少なくとも９０％同一である、実施形態８３〜８４のいずれか１つの化合物。
【０３０３】
実施形態８６．重鎖が配列番号３０と少なくとも９５％同一であり、軽鎖が配列番号３７と少なくとも９５％同一である、実施形態８３〜８５のいずれか１つの化合物。
【０３０４】
実施形態８７．重鎖が配列番号３０であり、軽鎖が配列番号３７である、実施形態８３〜８６のいずれか１つの化合物。
【０３０５】
実施形態８８．チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態８３〜８７のいずれか１つの化合物。
【０３０６】
実施形態８９．ＨＰＴＰ−βを阻害する、実施形態８３〜８８のいずれか１つの化合物。
【０３０７】
実施形態９０．ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、実施形態８３〜８９のいずれか１つの化合物。
【０３０８】
実施形態９１．Ｔｉｅ２を活性化する、実施形態８３〜９０のいずれか１つの化合物。
【０３０９】
実施形態９２．Ａｋｔを活性化する、実施形態８３〜９１のいずれか１つの化合物。
【０３１０】
実施形態９３．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、実施形態８３〜９２のいずれか１つの化合物。
【０３１１】
実施形態９４．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、実施形態８３〜９３のいずれか１つの化合物。
【０３１２】
実施形態９５．ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、実施形態８３〜９４のいずれか１つの化合物。
【０３１３】
実施形態９６．それを必要とする被験体において状態を処置する方法であって、治療有効量の実施形態１〜９５のいずれか１つの化合物を被験体に投与するステップを含む、方法。
【０３１４】
実施形態９７．状態が眼の状態である、実施形態９６の方法。
【０３１５】
実施形態９８．状態が糖尿病性網膜症である、実施形態９６または９７の方法。
【０３１６】
実施形態９９．状態が新血管形成である、実施形態９６〜９７のいずれか１つの方法。
【０３１７】
実施形態１００．状態が血管漏出である、実施形態９６〜９７のいずれか１つの方法。
【０３１８】
実施形態１０１．状態が眼内圧上昇である、実施形態９６〜９７のいずれか１つの方法。
【０３１９】
実施形態１０２．状態が眼の浮腫である、実施形態９６〜９７のいずれか１つの方法。
【０３２０】
実施形態１０３．状態が糖尿病性黄斑浮腫である、実施形態９６または９７の方法。
【０３２１】
実施形態１０４．状態が高眼圧症である、実施形態９６または９７のいずれか１つの方法。
【０３２２】
実施形態１０５．状態が眼の炎症である、実施形態９６または９７の方法。
【０３２３】
実施形態１０６．投与が被験体の眼に対するものである、実施形態９６〜１０５のいずれか１つの方法。
【０３２４】
実施形態１０７．投与が硝子体内である、実施形態９６〜１０６のいずれか１つの方法。
【０３２５】
実施形態１０８．投与が皮下である、実施形態９６〜１０５のいずれか１つの方法。
【０３２６】
実施形態１０９．投与が局所である、実施形態９６〜１０６のいずれか１つの方法。
【０３２７】
実施形態１１０．被験体がヒトである、実施形態９６〜１０９のいずれか１つの方法。
【０３２８】
実施形態１１１．化合物の治療有効量が、約０．２５ｍｇ〜約２００ｍｇである、実施形態９６〜１１０のいずれか１つの方法。
【０３２９】
実施形態１１２．化合物の治療有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、実施形態９６〜１１０のいずれか１つの方法。
【０３３０】
実施形態１１３．化合物の治療有効量が、約１ｍｇ〜約５０ｍｇである、実施形態９６〜１１０のいずれか１つの方法。
【０３３１】
実施形態１１４．化合物の治療有効量が、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇである、実施形態９６〜１１０のいずれか１つの方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物。
(項目２)
前記配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも８５％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目３)
前記配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目４)
前記配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９５％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目５)
前記配列が、配列番号９と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目６)
前記配列が配列番号９である、項目１に記載の化合物。
(項目７)
前記配列が、配列番号１０と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目８)
前記配列が配列番号１０である、項目１に記載の化合物。
(項目９)
前記配列が、配列番号１１と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目１０)
前記配列が配列番号１１である、項目１に記載の化合物。
(項目１１)
前記配列が、配列番号１２と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目１２)
前記配列が配列番号１２である、項目１に記載の化合物。
(項目１３)
前記配列が、配列番号２９と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目１４)
前記配列が配列番号２９である、項目１に記載の化合物。
(項目１５)
前記配列が、配列番号３０と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目１６)
前記配列が配列番号３０である、項目１に記載の化合物。
(項目１７)
前記配列が、配列番号３１と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目１８)
前記配列が配列番号３１である、項目１に記載の化合物。
(項目１９)
前記配列が、配列番号３２と少なくとも８０％同一である、項目１に記載の化合物。
(項目２０)
前記配列が配列番号３２である、項目１に記載の化合物。
(項目２１)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目１に記載の化合物。
(項目２２)
ＨＰＴＰ−βを阻害する、項目１に記載の化合物。
(項目２３)
ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、項目１に記載の化合物。
(項目２４)
Ｔｉｅ２を活性化する、項目１に記載の化合物。
(項目２５)
Ａｋｔを活性化する、項目１に記載の化合物。
(項目２６)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、項目１に記載の化合物。
(項目２７)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、項目１に記載の化合物。
(項目２８)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、項目１に記載の化合物。
(項目２９)
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８０％同一である配列を含む化合物。
(項目３０)
前記配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８５％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３１)
前記配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３２)
前記配列が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９５％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３３)
前記配列が、配列番号２０と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３４)
前記配列が配列番号２０である、項目２９に記載の化合物。
(項目３５)
前記配列が、配列番号２１と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３６)
前記配列が配列番号２１である、項目２９に記載の化合物。
(項目３７)
前記配列が、配列番号２２と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目３８)
前記配列が配列番号２２である、項目２９に記載の化合物。
(項目３９)
前記配列が、配列番号２３と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目４０)
前記配列が配列番号２３である、項目２９に記載の化合物。
(項目４１)
前記配列が、配列番号３４と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目４２)
前記配列が配列番号３４である、項目２９に記載の化合物。
(項目４３)
前記配列が、配列番号３５と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目４４)
前記配列が配列番号３５である、項目２９に記載の化合物。
(項目４５)
前記配列が、配列番号３６と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目４６)
前記配列が配列番号３６である、項目２９に記載の化合物。
(項目４７)
前記配列が、配列番号３７と少なくとも８０％同一である、項目２９に記載の化合物。
(項目４８)
前記配列が配列番号３７である、項目２９に記載の化合物。
(項目４９)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目２９に記載の化合物。
(項目５０)
ＨＰＴＰ−βを阻害する、項目２９に記載の化合物。
(項目５１)
ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、項目２９に記載の化合物。
(項目５２)
Ｔｉｅ２を活性化する、項目２９に記載の化合物。
(項目５３)
Ａｋｔを活性化する、項目２９に記載の化合物。
(項目５４)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、項目２９に記載の化合物。
(項目５５)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、項目２９に記載の化合物。
(項目５６)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、項目２９に記載の化合物。
(項目５７)
ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号３４と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目５８)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも８５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３４と少なくとも８５％同一である、項目５７に記載の化合物。
(項目５９)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖が配列番号３４と少なくとも９０％同一である、項目５７に記載の化合物。
(項目６０)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３４と少なくとも９５％同一である、項目５７に記載の化合物。
(項目６１)
前記重鎖が配列番号３０であり、前記軽鎖が配列番号３４である、項目５７に記載の化合物。
(項目６２)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目５７に記載の化合物。
(項目６３)
ＨＰＴＰ−βを阻害する、項目５７に記載の化合物。
(項目６４)
ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、項目５７に記載の化合物。
(項目６５)
Ｔｉｅ２を活性化する、項目５７に記載の化合物。
(項目６６)
Ａｋｔを活性化する、項目５７に記載の化合物。
(項目６７)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、項目５７に記載の化合物。
(項目６８)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、項目５７に記載の化合物。
(項目６９)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、項目５７に記載の化合物。
(項目７０)
ａ）配列番号２９と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号３５と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目７１)
前記重鎖が配列番号２９と少なくとも８５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３５と少なくとも８５％同一である、項目７０に記載の化合物。
(項目７２)
前記重鎖が配列番号２９と少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖が配列番号３５と少なくとも９０％同一である、項目７０に記載の化合物。
(項目７３)
前記重鎖が配列番号２９と少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３５と少なくとも９５％同一である、項目７０に記載の化合物。
(項目７４)
前記重鎖が配列番号２９であり、前記軽鎖が配列番号３５である、項目７０に記載の化合物。
(項目７５)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目７０に記載の化合物。
(項目７６)
ＨＰＴＰ−βを阻害する、項目７０に記載の化合物。
(項目７７)
ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、項目７０に記載の化合物。
(項目７８)
Ｔｉｅ２を活性化する、項目７０に記載の化合物。
(項目７９)
Ａｋｔを活性化する、項目７０に記載の化合物。
(項目８０)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、項目７０に記載の化合物。
(項目８１)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、項目７０に記載の化合物。
(項目８２)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、項目７０に記載の化合物。
(項目８３)
ａ）配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号３７と少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目８４)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも８５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３７と少なくとも８５％同一である、項目８３に記載の化合物。
(項目８５)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖が配列番号３７と少なくとも９０％同一である、項目８３に記載の化合物。
(項目８６)
前記重鎖が配列番号３０と少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖が配列番号３７と少なくとも９５％同一である、項目８３に記載の化合物。
(項目８７)
前記重鎖が配列番号３０であり、前記軽鎖が配列番号３７である、項目８３に記載の化合物。
(項目８８)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目８３に記載の化合物。
(項目８９)
ＨＰＴＰ−βを阻害する、項目８３に記載の化合物。
(項目９０)
ＶＥ−ＰＴＰを阻害する、項目８３に記載の化合物。
(項目９１)
Ｔｉｅ２を活性化する、項目８３に記載の化合物。
(項目９２)
Ａｋｔを活性化する、項目８３に記載の化合物。
(項目９３)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに結合する、項目８３に記載の化合物。
(項目９４)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインの最初のＦＮ３リピートに結合する、項目８３に記載の化合物。
(項目９５)
ＨＰＴＰ−βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性（ＫＤ）が約７０ｐＭ〜約７０ｎＭである、項目８３に記載の化合物。
(項目９６)
状態の処置を必要とする被験体において状態を処置する方法であって、治療有効量の項目１〜９５のいずれか一項に記載の化合物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目９７)
前記状態が眼の状態である、項目９６に記載の方法。
(項目９８)
前記状態が糖尿病性網膜症である、項目９６に記載の方法。
(項目９９)
前記状態が新血管形成である、項目９６に記載の方法。
(項目１００)
前記状態が血管漏出である、項目９６に記載の方法。
(項目１０１)
前記状態が眼内圧上昇である、項目９６に記載の方法。
(項目１０２)
前記状態が眼の浮腫である、項目９６に記載の方法。
(項目１０３)
前記状態が糖尿病性黄斑浮腫である、項目９６に記載の方法。
(項目１０４)
前記状態が高眼圧症である、項目９６に記載の方法。
(項目１０５)
前記状態が眼の炎症である、項目９６に記載の方法。
(項目１０６)
前記投与が前記被験体の眼に対するものである、項目９６に記載の方法。
(項目１０７)
前記投与が硝子体内である、項目９６に記載の方法。
(項目１０８)
前記投与が皮下である、項目９６に記載の方法。
(項目１０９)
前記投与が局所である、項目９６に記載の方法。
(項目１１０)
前記被験体がヒトである、項目９６に記載の方法。
(項目１１１)
前記化合物の前記治療有効量が、約０．２５ｍｇ〜約２００ｍｇである、項目９６に記載の方法。
(項目１１２)
前記化合物の前記治療有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、項目９６に記載の方法。
(項目１１３)
前記化合物の前記治療有効量が、約１ｍｇ〜約５０ｍｇである、項目９６に記載の方法。
(項目１１４)
前記化合物の前記治療有効量が、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇである、項目９６に記載の方法。
【図１】
2020180156.tif 000032
【図２】
2020180156.tif 000033
【図３】
2020180156.tif 000034
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020180156.tif 000038
【図８】
2020180156.tif 000039
【図９】
2020180156.tif 000040
【図１０】
2020180156.tif 000041
【図１１】
2020180156.tif 000042
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020180156.tif 000045
【図１５】
2020180156.tif 000046
【図１６】
2020180156.tif 000047
【図１７】
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【図１８】
2020180156.tif 000049
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020180156.tif 000053
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2020180156000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月14日(2020.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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