(57)【要約】【課題】ヒトの臨床病態に即したＮＡＳＨのモデル動物を作成し、こうしたモデル動物を利用する方法を提供する。【解決手段】５０％超の脂質含量の食餌を与えて飼育されたｐ６２遺伝子欠失マウスをＮＡＳＨモデル動物として同定し、ＮＡＳＨモデル動物を用いて、治療又は予防処置についてスクリーニングを行う方法を提供することによる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防のための処置のスクリーニング方法であって、
５０％超の脂質含量の食餌を与えて飼育されたｐ６２遺伝子欠失非ヒト動物において、治療又は予防のための候補処置を行い、
候補処置を行っていない対照非ヒト動物と比較することで、候補処置の治療又は予防効果を決定する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
候補処置が、候補薬剤の投与であり、非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防薬をスクリーニングする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
候補処置が、運動負荷である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
５０％超の脂質含量の食餌を与えて、８週経過後において、候補処置が行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非アルコール性脂肪肝炎の病態モデルマウスの製造方法であって、
ｐ６２遺伝子を欠失されたマウスにおいて、５０％超の脂質含量の食餌を与えて飼育し、
８週の時点で、体重４２ｇ以上、
１２週の時点で、体重４８ｇ以上、又は
１６週の時点で、体重５０ｇ以上、
であるマウスを、病態モデルマウスとして選別する、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防の分野に関し、非アルコール性脂肪肝炎治療又は予防処置のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）は、飲酒習慣がないにもかかわらず、単純性脂肪肝から発症し、肝硬変や肝がんへ進行する致死的な慢性肝疾患である。ＮＡＳＨは、単純性脂肪肝を基礎として、炎症と線維化により特徴づけられている。単純性脂肪肝からＮＡＳＨへの進展機序はいまだ未解明であるが、ＮＡＳＨは、メタボリック症候群の一表現型であると考えられている（Tilg H. et al., Hepatology 2010, 52:1836-46）。
【０００３】
ＮＡＳＨに対して、現在までのところ、運動療法や減量以外に有効な治療法や治療薬は確立されていない。また、ＮＡＳＨを高精度で判定することができる病態マーカーも開発されておらず、確定診断には肝生検が必須であることから、侵襲性の低い診断方法も切望されている。治療薬や病態マーカーの開発の遅れは、ＮＡＳＨの進展機序が明らかにされていないことに起因するものである。ＮＡＳＨの進展機序の解明には、適当なＮＡＳＨの非ヒトモデル動物を確立する必要である。ＮＡＳＨの研究に用いられる非ヒトモデル動物の作成方法としては、メラノコルチン４型受容体を欠失するＭＣ４Ｒノックアウトマウスに高脂肪食を負荷させる方法（特許文献１：特開２０１７−６０２２）や、コリン不含Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）試料を与えて飼育する方法（特許文献２：特開２０１５−１８６４８４）などが知られている。こうした方法で得られたＮＡＳＨモデルマウスは、メタボリック症候群の１表現型として緩やかに病態が進行するＮＡＳＨを適切に表現できていない。
【０００４】
線維芽細胞の一種と考えられている肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓の線維化や癌化に寄与することが知られている。ｐ６２が星細胞を負に制御しており、ｐ６２の欠失がＨＳＣの活性を増強し、炎症、線維化、及び肝がん進行を増強すること、さらにｐ６２が、ＶＤＲとＲＸＲのヘテロ二量化に作用することが開示されている（非特許文献１：Cancer Cell 30, 595-609)。この文献において、ｐ６２欠失マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷した対象において、ＮＡＳＨ様の表現型が観察されたことが示された。しかしながら、この文献は、あくまでｐ６２欠失マウスに、肝がん誘発物質であるジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）を注射して、肝がんの誘発を観察するための対照として開示しているにすぎない。この文献には、ＮＡＳＨ様のマウスを、病態モデルとして使用することについては何ら記載も示唆もされていない。また、ｐ６２欠失マウスでは、過食・肥満、耐糖能異常・インスリン抵抗性、内臓脂肪蓄積、単純性脂肪肝をきたすことが報告されている（非特許文献２：Hepatol Res 39:490-500, 2009、非特許文献３：J Neurosci 33; 14767-14777, 2013、非特許文献４：Cell Metabolism 2006, vol. 3, 211-222)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−６０２２号公報
【特許文献２】特開２０１５−１８６４８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Cell 30, 595-609
【非特許文献２】Hepatol Res 39:490-500, 2009
【非特許文献３】J Neurosci 33; 14767-14777, 2013
【非特許文献４】Cell Metabolism 2006, vol. 3, 211-222
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒトの臨床病態に即したＮＡＳＨのモデル動物を作成し、こうしたＮＡＳＨモデル動物を利用する方法、さらにはこうしたＮＡＳＨモデル動物を製造する方法が必要とされていた。
【０００８】
本発明者らは、ＮＡＳＨモデルの確立するために鋭意研究を行ったところ、ｐ６２ノックアウトマウスにおいて、高脂肪食を摂取させることにより、ヒトの臨床病態に即したＮＡＳＨモデルを確立できたことを見い出し、本発明に至った。
【０００９】
そこで、本発明は、以下に関する：
［１］  非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防のための処置のスクリーニング方法であって、
５０％超の脂質含量の食餌を与えて飼育されたｐ６２遺伝子欠失非ヒト動物において、治療又は予防のための候補処置を行い、
候補処置を行っていない対照非ヒト動物と比較することで、候補処置の治療又は予防効果を決定する、
を含む、前記方法。
［２］  候補処置が、候補薬剤の投与であり、非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防薬をスクリーニングする、項目１に記載の方法。
［３］  候補処置が、運動負荷である、項目１に記載の方法。
［４］  前記非ヒト動物がマウスである、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［５］  ５０％超の脂質含量の食餌を与えて、８週経過後のマウスにおいて、候補処置が行われる、項目４に記載の方法。
［６］  非アルコール性脂肪肝炎の病態モデルマウスの製造方法であって、
ｐ６２遺伝子を欠失されたマウスにおいて、５０％超の脂質含量の食餌を与えて、飼育し、
８週の時点で、体重４２ｇ以上、
１２週の時点で、体重４８ｇ以上、又は
１６週の時点で、体重５０ｇ以上、
であるマウスを、病態モデルマウスとして選別する、
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で確立されたＮＡＳＨモデルは、ヒトの臨床病態に即している。具体的に、脂肪滴の蓄積の後に、炎症及び線維化が生じている。したがって、本発明のＮＡＳＨモデルは、ヒト病態と近く、当該ＮＡＳＨモデルを用いたスクリーニング方法は、より正確に治療又は予防処置をスクリーニングすることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、高脂肪食（ＨＦ）及び標準食（ＮＣ）を摂餌後の、体重の変化を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、野生型（ｐ６２+/+）マウス及びｐ６２ノックアウトマウス（ｐ６２-/-）において、高脂肪食（ＨＦＤ）摂餌後の肝臓組織のヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色後撮影した写真を示す。図２Ｂは、図２Ａの写真中の脂肪面積をスコア化して示したグラフである。図２Ｃは、図２Ａの写真における炎症活性をスコア化して示したグラフである。
【図３】図３Ａは、野生型（ｐ６２+/+）マウス及びｐ６２ノックアウトマウス（ｐ６２-/-）において、高脂肪食（ＨＦＤ）摂餌後の肝臓組織のシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ）染色後撮影した写真を示す。図３Ｂは、図３Ａの写真中において線維化をスコア化して示したグラフである。
【図４】図４は、本発明のＮＡＳＨモデルマウスにおいて、高脂肪食（ＨＦＤ）摂餌後の運動負荷群（ＥＸＥ）と休息群（ＲＥＳＴ）における、体重（Ａ）、肝臓重量（Ｂ）、肝臓重量／／体重比（Ｃ）、ＷＡＴ重量（Ｄ）、及びＷＡＴ／体重比の変動を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、本発明のＮＡＳＨモデルマウスにおいて、標準食群（ＮＣ）、高脂肪食（ＨＦＤ）摂餌後の休息群（ＲＥＳＴ）、及び運動負荷群（ＥＸＥ）における、肝臓組織のヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色及びシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ）染色後の撮影写真に関する。図５Ｂは、図５Ａの写真における、脂肪面積をスコア化して示したグラフである。図５Ｃは、図５Ａの写真における炎症活性をスコア化して示したグラフである。図５Ｄは、図５Ａの写真における線維化スコアを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を発症するモデル非ヒト動物（以下、本発明のＮＡＳＨモデルともいう）、ＮＡＳＨモデルを用いたＮＡＳＨの治療又は予防のための処置のスクリーニング方法、さらにはこうしたＮＡＳＨモデルの製造方法に関する。
【００１３】
本発明のモデル動物を作製するために使用される非ヒト動物（以下、本発明で用いられる非ヒト動物ともいう）は、実験動物として一般的に使用される非ヒト動物であれば特に制限されないが、好ましくは非ヒト脊椎動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくはげっ歯類である。本発明で用いられる非ヒト動物としては、具体的には、マウス、ラット、ラビット、イヌ、ニワトリ、サル等を例示することができる。本発明で用いられる非ヒト動物は、好ましくはマウス、ラット、モルモット、またはハムスターであり、特に好ましくはマウスまたはラットであり、さらにより好ましくはマウスである。
【００１４】
ｐ６２は、転写因子Ｎｒｆ２の下流に位置し、新規酸化ストレスタンパクとしてマウスマクロファージにおいて見いだされている。ｐ６２は、オートファジー形成因子であるＬＣ３／Ａｔｇ８と相互作用し、選択的オートファジーを制御する。ｐ６２遺伝子をノックアウトされたマウスでは、過食、肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性、内臓脂肪蓄積、単純性脂肪肝のうちの少なくとも１の表現型を示す。
【００１５】
本発明において「ｐ６２欠失」は、非ヒト動物の全体又は組織の一部において、ｐ６２遺伝子の発現が抑制されていることをいう。一例として、ｐ６２の遺伝子ノックアウト、ｐ６２遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム等を用いる遺伝子ノックダウンが挙げられる。ｐ６２遺伝子を欠失させる手法について、当業者であれば従来公知の方法を適用して行うことができる。標準食で飼育されたｐ６２欠失マウスは、過食・肥満、耐糖能異常・インスリン抵抗性、内臓脂肪蓄積、単純性脂肪肝をきたすことが報告されている。これらの症状は、炎症や線維化を伴わない点でＮＡＳＨとは異なっているが、基礎となる単純性脂肪肝を発症していることから、ｐ６２欠失マウス自体が、ヒトにおけるメタボリック症候群の病徴を的確に表していると考えられる。
【００１６】
本発明のモデル動物は、ｐ６２欠失非ヒト動物において、脂質含量の高い食餌を与えて飼育することにより、作製することができる。脂質含量の高い食餌は、高脂肪食と呼ばれ、通常、脂肪をエネルギー比率にて５０％以上含む食餌であり、より好ましくは脂肪をエネルギー比率にて６０％以上含む食餌をいう。高脂肪食は、通常の標準食餌に対して、牛脂、ブタ油、乳脂肪、コーン油、ダイズ油など脂肪が添加されており、肥満を引き起こす食餌として、試料メーカーから販売されている。高脂肪食は、任意の時期から与えることができるが、ｐ６２欠失マウスの場合、一例として５週齢から高脂肪食を与えることができ、通常、水とともに自由に摂食させる。
【００１７】
摂取期間は、ＮＡＳＨの病徴である、脂肪の蓄積と、炎症と線維化が観察されるまで任意の期間を用いることができる。ｐ６２欠失マウスの場合、一例として、６週間以上、８週間以上、１０週間以上、１２週以上、１６週間以上の高脂肪食の摂取により、ＮＡＳＨの病徴がみられる。スクリーニングに用いる場合には、高脂肪食をあまりに長く摂取すると、ＮＡＳＨの病態が進行してしまい、治療又は予防のための処置によって、治療又は予防効果の判定が難しくなることもある。したがって、治療又は予防の効果を鋭敏に判定する観点から、３０週以内、好ましくは２０週以内の期間、高脂肪食が与えられうる。高脂肪食は、連続して与えられてもよいし、休止期間を経て与えられてもよい。
【００１８】
ｐ６２欠失マウスに高脂肪食を与えた場合、Ｎａｓｈ病態を表している観点から、８週の時点で、体重４２ｇ以上、１２週の時点で、体重４８ｇ以上、又は１６週の時点で、体重５０ｇ以上の個体をスクリーニングに使用することができ、また、ばらつきを抑える観点から７５ｇ以下、より好ましくは６０ｇ以下の個体をスクリーニングに使用することができる。
【００１９】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、単純性脂肪肝を基礎として、炎症及び線維化をきたす疾患であり、肝硬変及び肝がんへ進行しうる致死的な疾患である。本発明において用いられたｐ６２欠失マウスは、高脂肪食ではなく標準食餌を与えられた場合に、肥満、耐糖能異常、及び単純性脂肪肝を発症しており、ｐ６２欠失マウスに高脂肪食を負荷することでＮＡＳＨを誘導できることから、ヒトにおけるＮＡＳＨの病態に近い。
【００２０】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防のための処置のスクリーニング方法は、下記の工程：
５０％超の脂質含量の食餌を与えて飼育されたＮＡＳＨモデルにおいて、治療又は予防のための候補処置を行い、
候補処置を行っていない対照マウスと比較することで、候補処置の治療又は予防効果を決定する
を含む。本発明で用いるＮＡＳＨモデルは、ヒトにおけるＮＡＳＨの病態と近いことから、より適切な治療又は予防処置をスクリーニングすることが可能となる。対照マウスとの比較は、ＮＡＳＨを示す任意の病態又は病態マーカーの比較が行われうる。
【００２１】
ＮＡＳＨを示す病態としては、マウスの体重、肝臓重量、白色脂肪組織重量、体重に対する肝臓重量の比、体重に対する白色脂肪組織重量の比を用いて比較してもよいし、肝臓の生検による比較が行われてもよい。生検によるＮＡＳＨの病態比較は、本技術分野に周知の方法により行われる。一例として、生検において、脂肪蓄積、炎症、及び線維化からなる群から選ばれる少なくとも１をスコア化して比較を行うことができる。
【００２２】
候補処置は、単回であってもよいし、複数回一定の期間にわたってなされてもよい。候補処置が一定の期間にわたる場合には、ＮＡＳＨモデルに対し、５０％超の脂質含量の食餌を継続して与えられてもよいし、他の食餌、例えば脂質含量を低下させた食餌や標準食餌に切り替えて与えられてもよい。候補処置としては、候補薬剤の投与が行われうる。候補薬剤としては、有機化合物ライブラリー、天然物ライブラリー、無機化合物ライブラリー、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、抗体、細胞抽出物（微生物、植物、動物の抽出物）ライブラリーなどが挙げられる。さらには、既存の薬物ライブラリーを用いてもよい。既存の薬物ライブラリーを用いる場合、既存の抗酸化剤、糖尿病治療薬、脂質代謝異常治療薬、肝庇護剤、抗炎症薬などを単独で、又は組み合わせて、候補薬剤又は処置として投与することができる。
【００２３】
既存の抗酸化剤としては、非限定的に、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、カテキン、フラボノイドなどが与えられうる。糖尿病治療薬としては、ビグアナイド系薬剤、チアゾリジン系薬剤、ＤＰＰ４阻害薬、スルホニル尿素薬、αグルコシダーゼ阻害薬、ＳＧＬＴ-２阻害薬などが挙げられる。脂質代謝異常治療薬としては、フィブラート系薬剤、スタチン系薬剤、小腸コレステロールトランスポータ阻害薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、ＭＴＰ阻害薬、選択的ＰＰＡＲαモジュレーター、ニコチン酸誘導体などが挙げられる。肝庇護剤としては、ウルソデオキシコール酸、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン、タウリン、チオプロニン、プロトポルフィリン二ナトリウム、ポリエンホスファチジルコリンなどが挙げられる。抗炎症薬としては、ＮＳＡＩＤｓ、例えばサリチル酸系、アントラニル酸系、プロピオン酸系、アリール酢酸系、オキシカム系、コキシブ系の抗炎症薬が挙げられる。
【００２４】
候補処置として、運動負荷を用いることができる。運動負荷は、ＮＡＳＨの治療に有用であることが既に知られていることから、運動負荷によるＮＡＳＨモデルの病態改善を、スクリーニング方法の陽性対照として用いることができる。候補処置を行っていない対照マウスと比較して運動負荷ＮＡＳＨモデルにおいて変動する各種病態マーカーを、候補処置をスクリーニングするために用いることができる。運動負荷は、具体的に、トラッドミルを用いた強制運動が挙げられる。
【００２５】
スクリーニングにおいて使用しうる病態マーカーとして、ＮＡＳＨの改善により変動するマーカーであれば任意のマーカーを使用しうる。一例として血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）などを使用しうる。また、肝臓の組織における、炎症性マーカー、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−β１など、又は線維化マーカー、例えばα１プロコラーゲン、α−ＳＭＡなどの遺伝子発現が挙げられうる。これらのマーカーが、候補処置を行っていない対照と比較して、候補処置を行ったＮＡＳＨモデルにおいて有意に変動した場合に、候補処置を、ＮＡＳＨ治療又は予防のために有効な処置として選択するこができる。
【実施例】
【００２６】
実施例１：ＮＡＳＨモデルマウスの作成
＜実験動物＞
全ての動物実験は，筑波大学実験委員会の承諾を得て、筑波大学動物実験取扱規定、動物の愛護および管理に関する法律（法律第６８号）、実験動物の飼育および保管ならびに苦痛の軽減に関する基準（環境省告示第８８号）に準拠して行った。
マウスは湿度３０〜７０％、２０〜２３℃の周囲温度、水および食餌は自由摂取下で飼育し、４週齢で母親から離乳させた。全てのマウスは、筑波大学実験動物資源センターの環境制御されたクリーンルーム内で特定の病原体のない条件下で飼育した。標準飼料および６０％高脂肪食はオリエンタル酵母より購入して使用した。ｐ６２遺伝子欠失マウス（ｐ６２−ＫＯマウス）を既報の通り作製し（非特許文献２：Hepatol Res 39:490-500, 2009及び非特許文献３：J Neurosci 33; 14767-14777, 2013）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと１０代以上交配させ、正常な生育と繁殖を確認した。野生型（ＷＴ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入し、筑波大学動物資源センターで飼育した。全ての実験において雄性マウスを使用した。
【００２７】
＜高脂肪食摂餌＞
６０％高脂肪食は、ＷＴおよびｐ６２−ＫＯマウスに５週齢から自由摂餌させた。また、対照群として標準食を同様にＷＴおよびｐ６２−ＫＯマウスに５週齢から自由摂餌させ、経時的に体重を測定した（図１）。高脂肪食を摂餌後、４、８、１２、１６週間後（それぞれ９、１３、１７、２１週齢）に、イソルフラン（和光純薬）を用いて安楽死させ、肝臓組織および血漿を採取した。試料は液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。標準食摂餌マウス（９週齢）を対照とし、同様に試料を採取した。
【００２８】
＜病理学的解析＞
前述のマウスから肝臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、パラフィンにて包埋した。薄切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色とＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を行い、病理標本を作製した。ＨＥ染色で、肝臓の脂肪沈着と炎症性細胞の浸潤、Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色で肝臓の線維化の評価を行った（図２A:HE染色、図3A：Sirius Red染色）。包埋および染色は、筑波大学医学医療系組織標本作製部門に依頼した。脂肪性肝炎の組織学的評価を定量的に行うためにＳＡＦスコア（脂肪化：Ｓ０−Ｓ３、炎症活動性：Ａ０−Ａ４、線維化：Ｆ０−Ｆ４）にてスコア化した（図２Ｂ：脂肪化、図２Ｃ：炎症、図３Ｂ：線維化）。ｐ６２ＫＯマウスでは、高脂肪食を摂餌後、４週で脂肪滴が観察され始め、８週で脂肪性肝炎を発症し、同様に８週で線維化がみられた。野生型マウスでは、高脂肪食を摂餌後の脂肪の蓄積が、ｐ６２ＫＯマウスに比べて遅く、炎症及び線維化の発生も遅く、炎症スコア及び線維化スコアは低かった。ｐ６２ＫＯマウスでは、脂肪面積は、摂取後８週でプラトーに達する一方で、炎症及び線維化は、１２週及び１６週にかけて増大した。特に線維化は、ｐ６２ＫＯマウスにおいて炎症と同時期に線維化が出現し、経時的に憎悪した。高脂肪食摂食群では、ＮＡＳＨの病態である単純性脂肪肝を基礎とし、炎症及び線維化がみられた。
【００２９】
＜血液生化学検査＞
肝障害を評価するために血清ＡＳＴ及びＡＬＴを、脂質代謝を評価するために血清トリグリセリド（ＴＧ）、コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ、  ＨＤＬ−Ｃ）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を測定する。
【００３０】
＜定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）＞
肝組織からＲＮＡを抽出し、Prime Script RT reagent Kit (タカラバイオ社)を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得る。Fast SYBR Green Master Mix（Applied biosystems）、ＣＦＸ３８４ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲシステム（Bio-Rad社）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行う。グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準とし、肝組織の炎症性サイトカインとして、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β  （ＩＬ−１β）を、肝線維造成因子としてトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、α１-プロコラーゲン（α１-ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）のｍＲＮＡ量を測定する。
【００３１】
実施例２：治療又は予防処置によるＮＡＳＨの改善
＜運動負荷＞
運動による肝病態変化を探索するため、５週齢のｐ６２−ＫＯマウスに６０％高脂肪食を自由摂餌させ、同時に運動負荷を開始した。運動負荷は１２週間（１７週齢まで）にわたり、８００ｍ／日（１０ｍ／分：５分間、１２ｍ／分：５分間、１４ｍ／分：５分間、１６ｍ／分：５分間、１８ｍ／分：３０分間；合計：５０分間）、週５回行った。運動機器は、ラット・マウス兼用型トレッドミルＭＫ−６８０（室町機械株式会社）を使用した。高脂肪食摂餌開始時、及び摂餌後４週、８週及び１１週目で体重を測定した（図４Ａ）。１２週間の運動負荷終了後、マウスの体重を測定し、マウスはイソルフランを用いて安楽死させた。マウスの肝臓及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）および血漿を採取し、肝臓重量及び白色脂肪組織の重量を測定した（図４Ｂ：肝臓重量、図４Ｃ：肝臓／体重比、図４Ｄ：白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量、図４Ｅ：白色脂肪組織（ＷＡＴ）／体重比）。試料は液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【００３２】
得られた肝臓組織について、上述の病理学的解析と同様の手法を行い、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色とＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を行った（図５Ａ）。ｐ６２ノックアウトマウスに標準食を与えた群（p62-/-NC）、ｐ６２ノックアウトマウスに高脂肪食を与え運動負荷をかけなかった群（HFD 12ｗｋ  REST）、及びｐ６２ノックアウトマウスに高脂肪食を与え運動負荷をかけた群（EXＥ）それぞれにおいて、ＳＡＦスコア（脂肪化：Ｓ０−Ｓ３、炎症活動性：Ａ０−Ａ４、線維化：Ｆ０−Ｆ４）にてスコア化した（図５Ｂ：脂肪化、図５Ｃ：炎症、図５Ｄ：線維化）。運動群（EXE）では、脂肪蓄積量はほぼ変化がなかったものの、炎症及び線維化スコアが減少した。
＜統計解析＞
全てのデータは、平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示した。有意差検定には統計解析ソフトを用いて一元配置分散分析を用い、Ｐ  ＜０．０５を有意水準とした。
【図１】
2020152699.tif 000003
【図２】
2020152699.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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