(57)【要約】【課題】状態を治療するための、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を提供すること【解決手段】本発明は、新規クラスの癌幹細胞経路（ＣＳＣＰ）阻害剤の使用；治療抵抗性、再発性または転移性の癌を治療するためにそのような化合物の使用方法；そのような化合物を特定の投薬計画で用いて癌細胞を選択的に死滅させる方法；Ｓｔａｔ３経路を阻害することによって癌幹細胞を標的にする方法；異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する哺乳動物の状態または障害の治療で新規化合物の使用方法；ならびにそのような化合物およびそれらの中間体の調製方法、ならびに関連化合物の医薬組成物、ならびにこれらの化合物の具体的な投与方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、それぞれ２００７年９月１０日および２００７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／９７１，１４４号、６１／０１３，３７２号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、状態を治療するための、Ｓｔａｔ３経路阻害剤の使用に一般に関する。より具体的には、本発明は、癌幹細胞を標的にし、他の障害を治療するための、Ｓｔａｔ３経路阻害剤の使用に関する。さらにより具体的には、本発明は、癌幹細胞を標的にし、悪性疾患を治療するための、Ｓｔａｔ３を阻害するナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオンおよび関連化合物の使用に関する。本発明は、治療抵抗性、再発性または転移性の癌の治療、ならびに関連化合物およびその中間体の調製方法、ならびに関連化合物の医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
癌幹細胞（ＣＳＣ）
近年では、腫瘍形成のニューモデルが広く受け入れられ、そこでは、腫瘤全体の小さな画分だけが腫瘍内の腫瘍形成活性を担うと仮定されているが、古いモデルまたはクローン遺伝モデルは、すべての変異腫瘍細胞がそのような腫瘍形成活性に等しく寄与すると仮定している。ニューモデルに従うと、腫瘍形成性細胞のこの小さな画分は、幹細胞様特性を有する形質転換細胞であり、「癌幹細胞」（ＣＳＣ）と呼ばれる。ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋは、１９９０年代に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＣＳＣの存在をインビボで最初に証明した。彼らのデータは、免疫不全マウスに移植すると、ヒトＡＭＬ細胞の小さな亜集団だけがＡＭＬを転移させる能力を有し、他のＡＭＬ細胞は白血病を誘発することができないことを示した。後に、これらのＣＳＣは、原始造血幹細胞と同じ細胞マーカー、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−を有することが判明した［１］。それ以来、研究者は、脳、乳房、皮膚、前立腺その他の腫瘍を含む各種の腫瘍で、ＣＳＣを確定的に認めた。
【０００４】
腫瘍形成のＣＳＣモデルは、腫瘍移植を確立するために、数万または数十万の腫瘍細胞を実験動物に注入する必要がある理由を説明するであろう。ヒトＡＭＬでは、これらの細胞の頻度は、１０，０００分の１未満である［２］。所与の腫瘍細胞集団内で稀であるとしても、そのような細胞がほとんどすべての腫瘍型に存在するという証拠が増えている。しかし、癌細胞系は、組織培養で成長するように特に適応させた癌細胞の亜集団から選択されるので、癌細胞系の生物学的特性および機能的特性は、劇的な変化を経る可能性がある。したがって、すべての癌細胞系が、ＣＳＣを含むというわけではない。
【０００５】
癌幹細胞は、多くの類似した形質を正常幹細胞と共有する。例えば、ＣＳＣは、限られた分裂数とは対照的に、自己再生能力、すなわち、さらなる腫瘍形成性癌幹細胞を、一般的に他の分裂腫瘍細胞よりも遅い速度で生成する能力を有する。ＣＳＣは、複数の細胞型に分化する能力を有するが、そのことは、多くの腫瘍が宿主器官に固有の複数の細胞型を含むだけでなく、不均一性が腫瘍転移で通常保持されもするという、組織学的証拠を説明するであろう。ＣＳＣは、基本的に腫瘍形成、癌転移および癌再発を担うことが証明されている。ＣＳＣは、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、幹様癌細胞、高度腫瘍形成性細胞、腫瘍幹細胞、固形腫瘍幹細胞または超悪性細胞とも呼ばれる。
【０００６】
癌幹細胞の存在は、将来の癌治療および療法に、基本的な関連性を有する。これらの関連性は、疾患同定、選択的薬剤ターゲティング、癌の転移および再発の予防、および癌との闘いにおける新しい戦略の開発で現れる。
【０００７】
現在の癌治療の効力は、試験の初期の段階では、腫瘍縮みのサイズ、すなわち死滅する腫瘤の量でしばしば測定される。ＣＳＣは腫瘍の非常に小さな割合を形成し、それらのより分化した後代よりも著しく異なる生物特性を有するので、腫瘤の測定は、幹細胞に特異的に作用する薬剤を必ずしも選択できるわけではない。実際、癌幹細胞は、放射線療法（ＸＲＴ）に耐性であるようで、化学療法薬および対標的薬剤にも治療抵抗性である［３〜５］。正常な体細胞性幹細胞は本来化学療法剤に耐性である−それらは、薬剤を送り出す様々なポンプ（ＭＤＲなど）を有し、ＤＮＡ修復タンパク質を備える。さらに、それらは遅い速度の細胞ターンオーバーも有するが、化学療法剤は複製速度の速い細胞を標的にする。正常幹細胞の突然変異した対応物である癌幹細胞は、それらが薬剤療法および放射線治療を生き延びることを可能にする、類似した機構を有することもできる。言い換えると、従来の化学療法および放射線療法は、新規の高度に腫瘍形成性の癌幹細胞を再生することができない腫瘍の大部分を形成する、分化した細胞または分化中の細胞を死滅させる。他方、分化した細胞および分化中の細胞をもたらす癌幹細胞の集団は、手付かずの状態であることができ、疾患の再発を引き起こすことができよう。従来の抗癌療法のさらなる危険は、化学療法が、化学療法に耐性の癌幹細胞だけを残し、続いて起こる再発性の腫瘍も化学療法におそらく耐性であろうという可能性である。
【０００８】
生存癌幹細胞は腫瘍を再生息させ、再発を引き起こすことができるので、抗癌療法はＣＳＣに対する戦略を含むことが不可避である（図１を参照）。これは、タンポポの再成長を防止するためには、たとえその地上部を切断したとしても根部を除去することと同類である［６］。癌幹細胞を選択的に標的にすることによって、攻撃的で切除不能な腫瘍、および治療抵抗性もしくは再発性の癌を有する患者を治療すること、ならびに、腫瘍転移および再発を予防することが可能になる。癌幹細胞を標的にする特異的療法の開発は、癌患者（特に転移癌を有する患者）の生存および生活の質を改善し得る。この未開拓の可能性の錠を開ける鍵は、癌幹細胞の自己再生および生存にとって選択的に重要である経路の特定および検証である。残念ながら、癌または胚性もしくは成体幹細胞における自己再生での腫瘍形成の基礎をなす複数の経路が過去に解明されているものの、癌幹細胞の自己再生および生存についてはいかなる経路も特定、検証されていない。
【０００９】
癌幹細胞の特定および単離について、多くの研究がなされてきた。用いられる方法は、薬剤を排出するＣＳＣの能力を主に活用するか、癌幹細胞に関連する表面マーカーの発現に基づく。
【００１０】
例えば、ＣＳＣは多くの化学療法剤に耐性であるので、ＣＳＣが、ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ−１）などの薬剤流出ポンプ［７〜１１］、および他のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリー構成員［１２、１３］をほとんど遍在的に過剰発現することは、驚くべきことでない。したがって、当初、造血幹細胞および白血病幹細胞を富化するために用いられたサイドポピュレーション（ＳＰ）技術も、ＣＳＣの特定および単離のために採用された［１４］。最初にＧｏｏｄｅｌｌらによって記載されたこの技術は、ＣＳＣを濃縮した細胞集団を定義および単離するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などの蛍光色素の識別的ＡＢＣ輸送体依存性流出を利用する［１０、１５］。具体的には、ＳＰはベラパミルで薬剤流出をブロックすることによって明らかにされ、その時点では、もはや色素をＳＰから排出することができない。
【００１１】
研究者は、癌幹細胞と大部分の腫瘍とを区別する特異的マーカーの発見にも集中した。癌幹細胞による最も一般的に発現される表面マーカーには、ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＣＤ１６６が含まれる［１６〜２２］。これらの表面マーカー（複数可）の差次的発現に主に基づく腫瘍細胞の選別は、今日まで記載されている大部分の高度に腫瘍形成性のＣＳＣを説明してきた。したがって、これらの表面マーカーは、癌細胞系、および大半の腫瘍組織からの癌幹細胞の特定および単離のためによく検証される。
【００１２】
Ｓｔａｔ３経路。
【００１３】
多くの異なる遺伝子欠損が哺乳動物またはヒトの癌細胞にあり、多くのものが、癌の治癒に向けた探求で研究されてきた。例えば、ｐ５３腫瘍サプレッサーは、半分を超えるヒト癌で欠陥があるか、全く欠けていることがわかっている。ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサおよび転写アクチベータ（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））タンパク質ファミリーは、増殖、生存および他の生物学的過程を促進するために、サイトカイン／成長因子に応じて活性化される潜在性の転写因子である。それらの中で、Ｓｔａｔ３は、成長因子受容体チロシンキナーゼ、ＪａｎｕｓキナーゼまたはＳｒｃファミリーキナーゼなどによって媒介される、重要なチロシン残基のリン酸化によって活性化される。これらのキナーゼには、それらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ、Ａｂｌ、ＫＤＲ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｓｒｃ、およびＨｅｒ２が含まれる［２３］。チロシンリン酸化後、Ｓｔａｔ３はホモ二量体を形成し、核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内の特異的ＤＮＡ応答エレメントに結合し、遺伝子発現を誘導する［２４］。
【００１４】
正常な細胞では、Ｓｔａｔ３活性化は一時的で、厳しく制御されており、３０分〜数時間持続する。しかし、Ｓｔａｔ３は、すべての主要な癌腫ならびに一部の血液系腫瘍を含む、広範なヒト癌で異常に活動的であることがわかっている。Ｓｔａｔ３は、癌の進行において複数の役割を演ずる。強力な転写調節因子として、それは多くの重要な細胞機能に関与する遺伝子、例えばＢｃｌ−ｘｌ、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｖｅｇｆ、ＭＭＰ−２、およびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を標的にする［２５〜３０］。それは、腫瘍免疫監視機構および免疫細胞動員の重要な負の調節因子でもある［３１〜３３］。
【００１５】
アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、Ｓｔａｔ３のドミナントネガティブ型、および／またはチロシンキナーゼの遮断によってＳｔａｔ３シグナル伝達を切断することは、インビトロおよび／またはインビボである癌細胞系または腫瘍を阻害する［２４、２６、３４、３５］。しかし、これまで、Ｓｔａｔ３と癌幹細胞機能の間に、実験的にいかなる明白な関連付けもされていない。また、研究者は、癌幹細胞を含むことが見いだされている癌に関して潜在的治療用途を探究するための、有効なＳｔａｔ３経路阻害剤を見いだしていない。前に記載のように、癌幹細胞（ＣＳＣ）は、基本的に腫瘍形成、転移および再発の役割を担うことが最近証明されており、それらが腫瘤のどんなに小さい部分を構成しようとも、これらの細胞を有することが公知である腫瘍を標的にするいかなる治癒治療の設計においても考慮するべきである。
【００１６】
癌以外の疾患では、インターロイキン６（ＩＬ６）によるＳｔａｔ３の過度の活性化が、いくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患で証明されている［３６］。近年では、Ｓｔａｔ３経路は、ＴＨ１７  Ｔ細胞応答の生成におけるその必要不可欠な役割を通して、病的免疫応答を促進することも明らかにされている［３７］。さらに、ＩＬ６−Ｓｔａｔ３経路媒介性の炎症が、アテローム硬化、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、高血圧症、骨粗鬆症、２型糖尿病および認知症の共通の原因であることがわかっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、Ｓｔａｔ３が、広範囲の癌にわたって癌幹細胞（ＣＳＣ）の生存能力および自己再生能力の両方で重要な役割を演ずるとの本明細書で提供される実験的証拠において一部示される。したがって、本発明の第１の態様は、癌幹細胞を阻害する方法であって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を通して、癌幹細胞内のＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部、大部分、または実質的にすべて（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）を阻害するステップを含む方法を対象とする。本方法は、ＣＳＣの自己再生を阻害するか、ＣＳＣを死滅させる。本方法は、癌、特にＣＳＣを有し、異常な、例えば過活動のＳｔａｔ３経路活性を有する癌を治療するために、インビトロまたはインビボで実施することができる。これらの２つの基準は、慣習的知識によって満たすことができ、すなわち、患者の癌はＣＳＣおよび異常なＳｔａｔ３経路活性を有することが知られているタイプであるか、または、個々の患者から、例えば生検材料の検査を通して確認することができる。好ましい実施形態では、ＣＳＣは、異常なＳｔａｔ３経路活性を有することが知られているか、そうでなければ確認される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
癌幹細胞を阻害する方法であって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を通して、癌幹細胞の少なくとも一部のＳｔａｔ３経路活性を阻害するステップを含む方法。
（項目２）
前記癌幹細胞の自己再生を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記癌幹細胞を死滅させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
インビトロで実施される、項目１に記載の方法。
（項目５）
対象における癌を治療するためにインビボで実施される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記癌が癌幹細胞を有し、異常なＳｔａｔ３経路活性を有することが知られている、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記癌幹細胞が異常なＳｔａｔ３経路活性を有することが知られている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍、多発性骨髄腫および白血病からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選択される、項目８に記載の方法。（項目１０）
前記癌が転移性である、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記癌が、化学療法または放射線療法に治療抵抗性である、項目５に記載の方法。
（項目１２）
前記癌が化学療法に本質的に耐性である、項目５に記載の方法。
（項目１３）
前記癌が、最初の治療の後に前記対象で再発している、項目５に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が単離、精製または合成される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤およびＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｓｔａｔ３経路阻害剤の阻害機構が、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、およびその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
細胞において細胞Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する方法であって、前記細胞内の少なくとも望ましくないＳｔａｔ３経路活性が低減されるように、前記細胞に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、およびその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の有効量を投与するステップを含む方法。
（項目１９）
前記細胞が癌幹細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が癌細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
細胞死が前記細胞で誘導される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
インビトロで実施される、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
インビボで実施される、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
対象の異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を治療または予防する方法であって、少なくとも異常なＳｔａｔ３経路活性が低減されるように、前記対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
（項目２５）
異常なＳｔａｔ３経路活性は、リン酸化Ｓｔａｔ３の発現、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現により確認することができる、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記障害が癌である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記障害が、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
患者を治療する方法であって、
異常なＳｔａｔ３経路活性によって患者を特定するステップと、
前記患者に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の治療的有効量を投与するステップとを含む方法。
（項目３０）
異常なＳｔａｔ３経路活性によって前記患者を特定する前記ステップが、リン酸化Ｓｔａｔ３の発現、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現を検査するステップを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
異常なＳｔａｔ３経路活性によって前記患者を特定する前記ステップが、前記患者から採取される罹患組織または流体を検査するステップを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記罹患組織または流体が腫瘍の一部である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
患者を治療する方法であって、
異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害と診断される患者を特定するステップと、
前記患者に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の治療的有効量を投与するステップとを含む方法。
（項目３４）
前記患者を特定するステップが、前記患者の障害を示す少なくとも１つのバイオマーカーについて検査するステップを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を診断するための少なくとも１つの作用物質、および
２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の治療的有効量
を含むキット。
（項目３６）
前記少なくとも１つの作用物質が、前記障害の存在を示す少なくとも１つのバイオマーカーについて検査する、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
異常なＳｔａｔ３経路活性を診断するための少なくとも１つの作用物質、および
２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の治療的有効量
を含むキット。
（項目３８）
前記少なくとも１つの作用物質が、リン酸化Ｓｔａｔ３の発現、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現を検査する、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
癌幹細胞を阻害する方法であって、癌幹細胞に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、およびその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物の有効量を投与するステップを含む方法。
（項目４０）
インビトロで実施される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
対象における癌を治療するためにインビボで実施される、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、黒色腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍、肉腫、髄芽細胞腫および白血病からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記癌が転移性である、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記癌が、化学療法または放射線療法に治療抵抗性である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記癌が化学療法に本質的に耐性である、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記癌が、最初の治療の後に前記対象で再発している、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
癌幹細胞を阻害することができる薬剤候補を特定する方法であって、Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する薬剤候補についてスクリーニングするステップを含む方法。
（項目４８）
前記薬剤候補が前記癌幹細胞で細胞死を誘導することができる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記薬剤候補が前記癌幹細胞の自己再生を阻害することができる、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記薬剤候補が、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤およびＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記薬剤候補がＳｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記薬剤候補がＳｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
前記薬剤候補がＳｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記薬剤候補がＳｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記薬剤候補がＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
標準の治療に治療抵抗性である対象における癌を治療する方法であって、前記対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
（項目５７）
前記標準の治療が、化学療法、放射線療法および手術からなる群から選択される治療を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記癌が化学療法に本質的に耐性である、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
対象における癌再発を治療または予防する方法であって、前記対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
（項目６０）
前記医薬組成物が、手術後の補助療法として投与される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
対象における癌転移を治療または予防する方法であって、前記対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
（項目６２）
前記医薬組成物が、手術後の補助療法として投与される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
対象における癌細胞を選択的に標的にする方法であって、対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物を、前記対象の血漿中の前記化合物の濃度が各投薬の後の２４時間を超える間臨界濃度を超えて維持されず、それによって、正常な細胞を実質的に残しながら癌細胞を選択的に死滅させるように投与するステップを含む方法。
（項目６４）
前記医薬組成物が、前記対象の血漿中の前記化合物濃度が、各投薬の後の１２、１６および２０時間からなる群から選択される持続時間を超える間臨界濃度を超えて維持されないように投与される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記臨界濃度が約１００μＭである、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記臨界濃度が約５０μＭである、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記臨界濃度が約３０μＭである、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
前記臨界濃度が約２０μＭである、項目６３に記載の方法。
（項目６９）
前記癌細胞が、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、多発性骨髄腫、転移性乳癌、白血病、リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌（網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、下垂体癌、直腸癌、唾液腺癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される癌の一部である、項目６３に記載の方法。
（項目７０）
前記癌細胞が、肺癌、乳癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選択される癌の一部である、項目６３に記載の方法。
（項目７１）
前記癌細胞が、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、多発性骨髄腫、転移性乳癌、白血病、リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌（網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、下垂体癌、直腸癌、唾液腺癌、鼻咽頭癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｘ  ｃａｎｃｅｒ）、白血病、黒色腫、口のエピサーモイド、ケラチノサイトおよび皮膚癌からなる群から選択される癌の一部である、項目６３に記載の方法。
（項目７２）
対象における癌を治療する方法であって、前記対象に、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
（項目７３）
前記癌が、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、多発性骨髄腫、転移性乳癌、白血病、リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌（網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、下垂体癌、直腸癌、唾液腺癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記癌が、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および転移性乳癌からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記癌が転移性である、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
前記対象が哺乳動物である、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記医薬組成物が、約１ｍｇ／ｍ２〜約５，０００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）または約１ｍｇ／ｍ２〜約５０，０００ｍｇ／ｍ２（ＰＯ）の薬量で投与される、項目５６〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記医薬組成物が、約２ｍｇ／ｍ２〜約３，０００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）または約１０ｍｇ／ｍ２〜約５０，０００ｍｇ／ｍ２（ＰＯ）の薬量で投与される、項目５６〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記医薬組成物が、経口的に、１日に４回（ＱＩＤ）以下で投与される、項目５６〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記医薬組成物が、前記対象の血漿中の前記化合物濃度が、各投薬の後の２４時間を超える間臨界濃度を超えて維持されないように投与される、項目５６〜６２、および７２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記医薬組成物が、前記対象の血漿中の前記化合物濃度が、各投薬の後の１２、１６および２０時間からなる群から選択される持続時間を超える間臨界濃度を超えて維持されないように投与される、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記臨界濃度が約１００μＭである、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記臨界濃度が約５０μＭである、項目８１に記載の方法。
（項目８５）
前記臨界濃度が約３０μＭである、項目８１に記載の方法。
（項目８６）
前記臨界濃度が約２０μＭである、項目８１に記載の方法。
（項目８７）
前記組成物が、単離、精製または合成される、項目５６〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物、ならびに
薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤
を含む医薬組成物。
（項目８９）
経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または静脈内、皮下もしくは筋肉内の注射に適する、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９０）
前記薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤が、静脈内送達のための脂質を含む、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９１）
前記脂質が、リン脂質、合成ホファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、天然のホファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド、ホファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、コレステロール、コレステロール硫酸、ならびにハプテンおよびＰＥＧを結合させた脂質からなる群から選択される、項目９０に記載の医薬組成物。
（項目９２）
前記脂質が、ナノエマルジョン、ミセル、乳剤、懸濁液、ナノ懸濁液、ニオソームまたはリポソームからなる群から選択される形態である、項目９０に記載の医薬組成物。
（項目９３）
前記薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤が、ミセル乳剤、懸濁液およびナノ粒子懸濁液からなる群から選択される形であり、静脈内送達のために静脈内で許容されるタンパク質をさらに含む、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９４）
前記静脈内で許容されるタンパク質がヒトアルブミンまたはその誘導体である、項目９３に記載の医薬組成物。
（項目９５）
前記薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤が、経口送達のためのワックス状物質を含む、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９６）
前記ワックス状物質が、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、ＰＥＧのモノ脂肪酸、ジ脂肪酸エステル、ＰＥＧ結合ビタミンＥ（ビタミンＥ  ＴＰＧ）およびＧｅｌｕｃｉｒｅからなる群から選択される、項目９５に記載の医薬組成物。
（項目９７）
前記Ｇｅｌｕｃｉｒｅが、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４３／０１、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ５０／０２、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ５０／１３、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ３７／０２、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ３３／０１、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４６／０７およびＧｅｌｕｃｉｒｅ  ３５／１０からなる群から選択される、項目９６に記載の医薬組成物。
（項目９８）
前記薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤が、Ｃａｐｒｙｏｌ、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ｈｐ、Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、トリアセチン、Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖ、エタノール、ポリビニルピロリジン、カルボキシメチルセルロース、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選択される、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９９）
前記薬学的に許容される賦形剤が界面活性剤と混合される、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目１００）
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ  ８０またはＴｗｅｅｎ  ２０である、項目９９に記載の医薬組成物。
（項目１０１）
経口投与のために製剤化される、項目９９〜１００に記載の医薬組成物。
（項目１０２）
式４−６
【化１２】
2020143135.tif 000002
（式中、Ｒ１はＨ、ＣｌまたはＦである）の化合物を調製する方法であって、
式４−４
【化１３】
2020143135.tif 000003
の化合物を、塩基および酸化剤の存在下の溶媒中で、ケトンと反応させるステップを含む方法。
（項目１０３）
前記酸化剤が、Ｏ２、Ｂｒ２およびＣＢｒＣｌ３からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記反応が開放空気容器内で実施される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記ケトンが式４−３
【化１４】
2020143135.tif 000004
の化合物である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０６）
式４−１
【化１５】
2020143135.tif 000005
の化合物を、溶媒と一緒にまたは溶媒無しで臭化物と反応させて、式４−２
【化１６】
2020143135.tif 000006
の化合物を生成するステップと、
その後、塩基の存在下の溶媒中で式４−２の化合物を反応させて、式４−３
【化１７】
2020143135.tif 000007
の化合物を生成するステップとをさらに含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
すべてのステップが同じ容器内で起こる、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサンおよびトルエンからなる群から選択され、前記塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンからなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０９）
リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルの式の化合物。
（項目１１０）
リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルの式の化合物。
（項目１１１）
化合物のリン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルを調製する方法であって、化合物の２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオンを、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドおよびカリウムビス（トリメチルシリル）アミドからなる群から選択される溶液と反応させ、続いて、ジメチルクロロホスフェートの溶液を加えるステップを含む方法。
（項目１１２）
前記反応から得られる粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、飽和ＮＨ４ＣＬおよび水で洗浄し、ＭｇＳＯ２で乾燥させ、その後前記生成物をカラムクロマトグラフィーに通すことによって、前記粗生成物を精製するステップをさらに含む、項目１１１に記載の方法。（項目１１３）
化合物のリン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルを調製する方法であって、化合物のリン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルをトリメチルシリルブロミドと反応させるステップを含む方法。
（項目１１４）
セミプレップＨＰＬＣによって、前記反応から得られる粗生成物を精製するステップをさらに含む、項目１１３に記載の方法。
【００１８】
ＣＳＣおよび異常なＳｔａｔ３経路活性の両方を有することが現在知られている癌には、それらに限定されないが、以下のものが含まれる：乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍、多発性骨髄腫および白血病。転移性乳癌など、これらの癌の転移性形態の多くも、ＣＳＣおよび異常なＳｔａｔ３経路活性の両方を有することがわかっている。１つの特徴では、本発明の方法は、この群から選択される癌を治療するために実施することができる。一実施形態では、本発明の方法は、以下から選択される癌を治療するために実施することができる：肺癌、乳癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および前立腺癌。
【００１９】
さらに、ＣＳＣは、腫瘍形成、癌転移および癌再発の役割を基本的に担うことが証明されているので、本発明の方法は、転移性であるか、化学療法もしくは放射線療法に治療抵抗性であるか、化学療法に本質的に耐性であるか、または、最初の治療の後に対象で再発した癌を治療するために実施することができる。一実施形態では、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を単離、精製し、または合成し、それは、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤およびＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択することができる。阻害の機構は、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することからなる群から選択することができる。
【００２０】
一実施形態では、阻害剤は、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、その鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体およびその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物である（以下「本発明の化合物」と称す）。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、細胞において細胞Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞の少なくとも望ましくないＳｔａｔ３経路活性が、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低減されるように、細胞に、本発明の化合物の有効量を投与するステップを含む。一実施形態では、細胞はＣＳＣであるか、そうでなければ癌性である。本方法は、細胞死を誘導すること、または細胞の自己再生を阻害することができる。本方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、対象の異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を治療または予防する方法であって、少なくとも異常なＳｔａｔ３経路活性が低減されるように、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。１つの特徴では、異常なＳｔａｔ３経路活性は、リン酸化Ｓｔａｔ３、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現により確認することができる。障害は、癌であってよい。一実施形態では、癌は、異常なＳｔａｔ３経路活性を有することが知られており、癌の例には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫。障害は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが知られている非癌性の状態であってもよく、一実施形態では、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症からなる群から選択される。
【００２３】
第４の態様では、本発明は、患者を治療する方法であって、異常なＳｔａｔ３経路活性によって患者を特定するステップと、患者に本発明の化合物の治療的有効量を投与するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、異常なＳｔａｔ３経路活性によって患者を特定するステップは、リン酸化Ｓｔａｔ３、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現の検査を含む。異常なＳｔａｔ３経路活性によって患者を特定するステップは、患者から採取される、腫瘍の一部であってよい罹患組織または流体の検査を含むことができる。
【００２４】
第５の態様では、本発明は、患者を治療する方法であって、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害と診断される患者を特定するステップと、患者に本発明の化合物の治療的有効量を投与するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、患者を特定するステップは、患者の障害を示す少なくとも１つのバイオマーカーについて検査することを含む。
【００２５】
第６の態様では、本発明は、障害の存在を示すバイオマーカーについて検査することができる、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を診断するための少なくとも１つの作用物質、および本発明の化合物の治療的有効量を含むキットを提供する。
【００２６】
第７の態様では、本発明は、異常なＳｔａｔ３経路活性を診断するための少なくとも１つの作用物質、および本発明の化合物の治療的有効量を含むキットを提供する。一実施形態では、作用物質は、リン酸化Ｓｔａｔ３、またはＳｔａｔ３リン酸化の代用の上流もしくは下流側の調節因子の発現を検査する。
【００２７】
第８の態様では、本発明は、１つまたは複数の癌幹細胞を阻害する方法を提供する。本方法は、癌幹細胞に本発明の化合物の有効量を投与するステップを含む。本方法は、対象の癌を治療するために、インビトロまたはインビボで実施することができる。一実施形態では、癌は、ＣＳＣを有することが知られており、癌の例には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍、肉腫、髄芽細胞腫および白血病。一実施形態では、癌は転移性である。別の実施形態では、癌は、化学療法または放射線療法に治療抵抗性である。例えば、癌は、化学療法に本質的に耐性であってよい。さらに別の実施形態では、癌は、最初の治療の後に対象で再発している。
【００２８】
第９の態様では、本発明は、癌幹細胞を阻害することができる薬剤候補を特定する方法であって、Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する薬剤候補についてスクリーニングするステップを含む方法を提供する。一実施形態では、薬剤候補は、癌幹細胞で細胞死を誘導することができ、別の実施形態では、ＣＳＣの自己再生を阻害することができる。様々な実施形態では、薬剤候補は、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤、またはＧカルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤である。薬剤候補は、以下から選択される能力を有することができる：Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害すること。
【００２９】
第１０の態様では、本発明は、標準の治療に治療抵抗性の癌について対象を治療する方法であって、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。標準の治療は、例えば、化学療法、放射線療法および／または手術であってよい。一実施形態では、癌は、化学療法に本質的に耐性である。
【００３０】
第１１の態様では、本発明は、対象の癌再発を治療または予防する方法であって、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、手術後の補助療法として投与される。
【００３１】
第１２の態様では、本発明は、対象の癌転移を治療または予防する方法であって、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、手術後の補助療法として投与される。
【００３２】
第１３の態様では、本発明は、例えば、悪性疾患を治療するために、対象の癌細胞を選択的に標的にする方法であって、対象の血漿中の化合物の濃度が各投薬の後の２４時間を超える間重要な濃度を超えて維持されず、それによって、正常な細胞を実質的に残しながら癌細胞を選択的に死滅させるように、本発明の化合物を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。あるいは、本発明の方法に従い、化合物の血漿中濃度は、各投薬の後のある時点、例えば、１２、１６、２０または２４時間後に、重要な濃度を超えない。一実施形態では、医薬組成物は、対象の血漿中の化合物濃度が、例えば、連続的に、各投薬の後の１２、１６および２０時間からなる群から選択される持続時間を超える間重要な濃度を超えて維持されないように投与される。様々な実施形態では、重要な濃度は、約１００μＭ、約５０μＭ、約３０μＭまたは約２０μＭである。一実施形態では、癌細胞は、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、多発性骨髄腫、転移性乳癌、白血病、リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌（網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、下垂体癌、直腸癌、唾液腺癌、鼻咽頭癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｘ  ｃａｎｃｅｒ）、白血病、黒色腫、口のエピサーモイド（ｅｐｉｔｈｅｒｍｏｉｄ）、ケラチノサイトおよび皮膚癌からなる群、またはそのサブグループのいずれかから選択される癌の一部である。別の実施形態では、癌細胞は、肺癌、乳癌（転移型を含む）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選択される癌の一部である。
【００３３】
第１４の態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、本発明の前の態様に関して記載される癌に類似する癌を治療するために適用することができる。１つの特徴では、治療の対象は、哺乳動物、例えばヒトである。
【００３４】
第１５の態様では、本発明は、本発明の化合物、すなわち、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される化合物、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。１つの特徴では、組成物は、経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または静脈内、皮下もしくは筋肉内の注射に適する。
【００３５】
第１６の態様では、本発明は、本発明の化合物のいくつかを調製する方法も提供する。本方法により、式４−６
【００３６】
【化１】
2020143135.tif 000008
の化合物（式中、Ｒ１はＨ、ＣｌまたはＦである）は、式４−４
【００３７】
【化２】
2020143135.tif 000009
の化合物を、塩基および酸化剤の存在下の溶媒中で、ケトンと反応させるステップにより調製する。酸化剤は、例えば、Ｏ２、Ｂｒ２またはＣＢｒＣｌ３であってよい。一実施形態では、反応は、開放空気容器内で実施される。１つの特徴では、本方法のすべてのステップが、１つのポット内で、すなわち同じ容器内で行われる。様々な例示的な実施形態では、溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサンまたはトルエンであってよく、塩基は、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンであってよい。
【００３８】
上記の方法の一実施形態では、ケトンは、式４−３
【００３９】
【化３】
2020143135.tif 000010
の化合物である。
【００４０】
上記の方法は、式４−１
【００４１】
【化４】
2020143135.tif 000011
の化合物を、溶媒と一緒にまたは溶媒無しで臭化物と反応させて、式４−２
【００４２】
【化５】
2020143135.tif 000012
の化合物を生成するステップと、
その後、塩基の存在下の溶媒中で式４−２の化合物を反応させて、式４−３
【００４３】
【化６】
2020143135.tif 000013
の化合物を生成するステップとをさらに含むことができる。
【００４４】
第１７の態様では、本発明は、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルという式の化合物を提供する。
【００４５】
第１８の態様では、本発明は、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルという式の化合物を提供する。
【００４６】
第１９の態様では、本発明は、化合物であるリン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルを調製する方法であって、化合物である２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオンを、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドおよびカリウムビス（トリメチルシリル）アミドからなる群から選択される溶液と反応させ、続いて、ジメチルクロロホスフェートの溶液を加えるステップを含む方法を提供する。本方法は、生成物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、飽和ＮＨ４ＣＬおよび水でそれを洗浄し、ＭｇＳＯ２でそれを乾燥させ、その後生成物をカラムクロマトグラフィーに通すことによって、反応物から得られる粗生成物を精製するステップをさらに含むことができる。
【００４７】
第２０の態様では、本発明は、化合物であるリン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルを調製する方法であって、化合物であるリン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルをトリメチルシリルブロミドと反応させるステップを含む方法を提供する。本方法は、半プレップＨＰＬＣによって、反応物から得られる粗生成物を精製するステップをさらに含むことができる。
【００４８】
本発明の他の態様および実施形態は、示されるか、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】癌幹細胞特異的療法および従来の癌療法の違いを示す図である。
【図２】癌におけるＳｔａｔ３経路を示す図である。
【図３】図３Ａは、Ｓｔａｔ３が、Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション細胞において構成的に活性であることを示す図である。図３Ｂは、Ｓｔａｔ３が、ＣＤ１３３＋細胞において構成的に活性であることを示す図である。
【図４】癌幹細胞において、Ｓｔａｔ３のノックダウンがアポトーシスを誘導することを示す図である。
【図５】癌幹細胞において、Ｓｔａｔ３のノックダウンが、癌幹細胞の球体形成性を阻害することを示す図である。
【図６】化合物４０１が、Ｓｔａｔ３の転写活性化活性を阻害することを示す図である。
【図７】図７Ａは、化合物４０１が、核抽出物においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。図７Ｂは、化合物４０１、４１６および４１８が、核抽出物においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。
【図８】図８Ａは、化合物４０１が、異種移植腫瘍組織においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。図８Ｂは、化合物４０１が、異種移植腫瘍組織において、Ｓｔａｔ３下流エフェクターの発現レベルを阻害することを示す図である。
【図９Ａ】Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーションのソーティングおよび分析を示す図である。
【図９Ｂ】Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーションが、非サイドポピュレーションと同じ程度に化合物４０１に対して感受性であることを示す図である。
【図１０】図１０Ａは、化合物４０１が、Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション細胞に対してアポトーシス性であることを示す図である。図１０Ｂは、化合物４０１が、ＣＤ１３３＋細胞に対してアポトーシス性であることを示す図である。
【図１１】化合物４０１が、ＣＤ４４高の球体形成を遮断することを示す図である。
【図１２】インビボの化合物４０１による処置が、異種移植された腫瘍細胞の球体形成性を減少させることを示す図である。
【図１３】化合物４０１が、癌細胞においてアポトーシスを誘導することを示す図である。
【図１４】化合物４０１が、ヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表し、腫瘍のリバウンドをなくす点で標準的化学療法とは異なった挙動を示すことを示す図である。
【図１５】化合物４０１が、ヒト頭頸部癌異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表すことを示す図である。
【図１６】化合物４０１が、ヒト乳癌異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表すことを示す図である。
【図１７】化合物４０１が、ヒト前立腺癌異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表すことを示す図である。
【図１８】化合物４０１が、ヒト胃癌異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表すことを示す図である。
【図１９】化合物４０１が、ヒト肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を表すことを示す図である。
【図２０】化合物４０１が、ＩＳＭＳモデルにおいて転移を阻害することを示す図である。
【図２１】化合物４０１の、ラットにおける薬物動態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数形を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００５１】
本明細書で用いるように、用語「単離された」または「精製された」は、その天然の状態で通常それに付随する成分を、実質的にまたは基本的に含まない物質を指す。純度および均一性は、一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。
【００５２】
本明細書で用いるように、用語「癌幹細胞」および「ＣＳＣ」は、互換性である。ＣＳＣは哺乳動物性であり、好ましい実施形態では、これらのＣＳＣはヒト起源であるが、それらはそれに限定されるものではない。癌幹細胞は、（１）多大な増殖能力を有し、（２）増殖能力または発達能力が低下した１種類または複数種類の分化した後代を生成する非対称性の細胞分裂が可能であり、そして（３）自己再生または自己維持のための対称性の細胞分裂が可能である、固形腫瘍由来の細胞の集団と定義され、機能的に特徴づけられる。ＣＳＣを特徴づけるための他の一般的な手法は、形態学ならびに、細胞表面マーカー、転写プロフィールおよび薬剤応答の調査を含む。ＣＳＣは、研究文献において、腫瘍／癌開始細胞、癌幹様細胞、幹様癌細胞、高度腫瘍形成性細胞、腫瘍幹細胞、固形腫瘍幹細胞、薬剤耐久細胞（ｄｒｕｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｅｌｌ）（ＤＳＣ）、薬剤抵抗性細胞（ＤＲＣ）または超悪性細胞とも呼ばれる。
【００５３】
本明細書で用いるように、用語「自己再生」は、それらの数を補充または増加させるために、新しい腫瘍形成性の癌幹細胞を生成する、癌幹細胞の能力を指す。
【００５４】
本明細書で用いるように、用語「癌」および「癌性」は、細胞集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、記載する。本明細書で用いるように、「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍に由来する細胞の全集団を指す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および各種の頭頸部癌が含まれる。
【００５５】
「腫瘍」は、本明細書で用いるように、良性（非癌性）または、前癌性病変を含む悪性（癌性）の、過剰の細胞成長もしくは増殖から生じる任意の組織塊を指す。
【００５６】
「転移」は、本明細書で用いるように、癌が体の原発部位から他の領域に広がるか移って新しい場所に類似した癌性の病巣が発達する過程を指す。「転移性」または「転移する」細胞は、隣接細胞との接着性接触を失い、血流またはリンパを通して疾患の原発部位から移動して、近隣の体構造に侵入する細胞である。
【００５７】
本明細書で用いるように、用語「対象」は、それらに限定されないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯動物などを含む、特定の治療のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。一般に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書で互換的に用いられる。
【００５８】
本明細書で用いる、「治療する」または「治療」または「治療すること」または「軽減する」または「軽減すること」などの用語は、１）診断された病的状態または障害の症状を治癒させ、遅くし、軽くし、および／または診断された病的状態または障害の進行を停止させる治療措置、ならびに、２）標的の病的状態または障害の発達を予防するか遅くする、予防的または防止的措置の両方を指す。したがって、治療が必要な者には、障害をすでに有する者、障害を起こしやすい者、および、障害が予防されるべき者が含まれる。患者が以下の１つまたは複数を示す場合、対象は本発明の方法によって首尾よく「治療される」：癌細胞の数の減少またはその完全な非存在；腫瘍サイズの縮小；軟組織および骨への癌の広がりを含む周辺器官への癌細胞の浸入の阻害または癌細胞の浸入の非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍増殖の阻害または非存在；特定の癌に関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の低下；ならびに、生活の質の向上。
【００５９】
本明細書で用いるように、用語「阻害する」、「阻害すること」およびそれらの文法上の同等物は、生物活性との関連で用いられる場合、生物活性の下方制御を指し、それは、タンパク質の生成または分子のリン酸化などの標的にした機能を低下または除去することができる。特定の実施形態では、阻害は、標的にした活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の低下を指すことができる。障害または疾患との関連で用いられる場合、本用語は、症状の発生の予防、症状の軽減、または、疾患、状態もしくは障害の緩和の成功を指す。
【００６０】
本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤」は、１つの器官または体の一部から別の器官または体の一部への、対象の医薬用薬剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材などの、薬学的に許容される物質、組成物または媒体を意味する。各担体は、その製剤の他の成分と適合するという意味において「許容される」ものでなければならず、患者に有害であってはならない。薬学的に許容される担体の役目を果たすことができる物質の一部の例には、以下のものが含まれる：乳糖、グルコースおよびショ糖などの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性の食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに、医薬製剤で使用される他の無毒性適合物質。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、防腐剤および抗酸化剤が、組成物に存在してもよい。
【００６１】
本発明の化合物は塩を形成することができ、それらも本発明の範囲内である。本明細書で本発明の化合物への言及は、特に明記しない限り、その塩への言及を含むものと理解される。本明細書で使用されるように、用語「塩（複数可）」は、無機および／または有機の酸および塩基と形成される、酸性および／または塩基性の塩を表す。さらに、本発明の化合物が、それらに限定されないがピリジンまたはイミダゾールなどの塩基性の部分、および、それらに限定されないがカルボン酸などの酸性部分の両方を含む場合、双性イオン（「内塩」）を形成することができ、それらは本明細書で用いる用語「塩（複数可）」の範囲に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、無毒性で、生理的に許容される）塩が好ましいが、他の塩も、例えば、調製中に使用することができる単離または精製ステップで有用である。本発明の化合物の塩は、例えば、化合物Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩを、酸または塩基のある量（例えば同等量）と、塩がその中で沈殿するような媒体中で反応させて形成するかまたは水性媒体中で反応させ、その後凍結乾燥することによって形成させることができる。
【００６２】
本発明の化合物の溶媒和物も、本明細書で企図される。本発明の化合物の溶媒和物には、例えば水和物が含まれる。
【００６３】
最近の研究により、腫瘍を再生する独占的な能力を有する、癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在が発見された。これらのＣＳＣは、ほとんどすべての腫瘍型に存在し、連続的悪性増殖、癌転移、再発および癌薬剤耐性と機能的に関連する。ＣＳＣおよびそれらのより分化した後代は、著しく異なる生物特性を有するようである。従来の癌薬剤スクリーニングは腫瘤の量の測定に依存し、したがって、それらは、ＣＳＣに特異的に作用する薬剤を必ずしも選択することができるわけではない。実際、ＣＳＣは、標準の化学療法および放射線療法に耐性であること、標準の抗癌治療の後に増殖し、結果として癌の治療抵抗性および再発をもたらすことが証明された。これらの細胞を単離する方法には、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を流出させるそれらの能力の特定、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、その他などのこれらの細胞が発現する表面マーカーによる特定、およびそれらの腫瘍形成特性による富化が含まれるが、これらに限定されない。癌幹細胞を腫瘍形成に関連付ける、増えつつある証拠は、癌幹細胞を標的にする膨大な治療の機会を告げている。
【００６４】
この未開拓の可能性の錠を開ける鍵は、ＣＳＣの自己再生および生存にとって選択的に重要である経路の特定および検証である。癌および胚性幹細胞もしくは成体幹細胞での腫瘍形成の基礎をなす複数の経路が過去に解明されているが、ＣＳＣの自己再生および生存についてはいかなる経路も特定、検証されていない。
【００６５】
本発明は、Ｓｔａｔ３経路活性がＣＳＣの生存および自己再生の両方に重要であるという証拠を提供する（実施例１）。本発明は、Ｓｔａｔ３経路活性の有効な阻害剤である化合物をさらに提供する（実施例２）。本発明は、これらのＳｔａｔ３阻害剤がＣＳＣ自己再生を阻害し、ＣＳＣにアポトーシス性であることを示す、インビトロおよびインビボの両方のデータも提供する（実施例３）。本発明は、これらの化合物が広範囲の癌細胞をインビトロで選択的に死滅させることができ（実施例４）、同様に広範囲の癌をインビボで阻害することができること（実施例５）も示す。さらに、本発明は転移癌に対するＳｔａｔ３阻害剤の効力を実験的に確認する（実施例６）。さらに、本発明は、これらの化合物が、インビボにおける癌細胞の選択的殺滅のための所望のＰＫ曝露を達成することができることを、実験的に確認する（実施例７）。
【００６６】
本明細書で提供されるデータは、ＣＳＣ研究の最近の進展と組み合わせて、本発明が、ＣＳＣを阻害すること、または、具体的にはＣＳＣを有する癌、もしくは一般には癌を治療することを目的とする、一群の方法を提供することを可能にする。また、細胞のＳｔａｔ３経路活性を阻害すること、または、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する癌性および非癌性の障害を治療することを対象とする方法も、本明細書で提供される。本発明は、関連する方法（例えば、製造および薬剤候補スクリーニング）、材料、組成物およびキットも提供する。
【００６７】
Ｓｔａｔ３経路を下方制御するかブロックすることがＣＳＣの自己再生および生存の両方を阻害する（実施例１）との知見により、本発明は、ＣＳＣ内の少なくとも一部のＳｔａｔ３経路活性がＳｔａｔ３経路阻害剤によって阻害される、癌幹細胞を阻害する方法を提供する。一実施形態では、Ｓｔａｔ３経路活性のほとんど、すなわち５０％超が阻害される。別の実施形態では、実質的にすべてのＳｔａｔ３経路活性が阻害される。本方法は、ＣＳＣが腫瘍形成性のＣＳＣ細胞に分裂することによってその数を補充することができないように、ＣＳＣの自己再生を防止することができる。または、本方法は、ＣＳＣで細胞死を誘導することができる。
【００６８】
この方法は、対象の癌を治療するために用いることができる。ＣＳＣおよび異常な（例えば、過活動のもしくは構成的に活性な）Ｓｔａｔ３経路活性を有することが公知である癌は、そのような治療にふさわしい候補であり、例には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫。一実施形態では、本方法は、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌および／または胃癌を治療するために用いられる。別の実施形態では、本方法は、多発性骨髄腫、脳腫瘍および肉腫を治療するために用いられる。
【００６９】
さらに、ＣＳＣは、腫瘍形成、癌転移および癌再発の役割を基本的に担うことが証明されているので、ＣＳＣの阻害を目的とする本発明の任意の方法を、転移性であるか、化学療法もしくは放射線療法に治療抵抗性であるか、または、最初の治療の後に対象で再発した癌を治療するために実施することができる。
【００７０】
一実施形態では、阻害剤は、単離、精製または合成され、また、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤およびＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択することができる。阻害剤は、天然生成物からも単離または精製することができる。
【００７１】
阻害機構は、Ｓｔａｔ３経路の任意のステップを標的にするように選択することができる。例えば、阻害剤は、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、および／またはＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することができる。あるいは、Ｓｔａｔ３経路阻害剤は、Ｓｔａｔ３経路の１つまたは複数の上流または下流側成分を阻害することができる。
【００７２】
Ｓｔａｔ３経路は、ＩＬ−６などのサイトカインに反応して、または、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ、Ａｂｌ、ＫＤＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＳｒｃおよびＨｅｒ２などの一連のチロシンキナーゼによって活性化することができる。Ｓｔａｔ３の下流側エフェクターには、それらに限定されないが、Ｂｃｌ−ｘｌ、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｖｅｇｆ、ＭＭＰ−２およびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が含まれる（図２）。表１に示すように、Ｓｔａｔ３経路は、多種多様のヒト疾患で異常に活動的であることがわかっている。調べた既存の臨床試料から、乳癌および肺癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、多発性骨髄腫の半数超で、および頭頸部癌の９５％超で、Ｓｔａｔ３経路が持続的活性で存在することが示された。活性化Ｓｔａｔ３は、いくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患でも証明されている。さらに、インターロイキン６などのサイトカイン媒介性の炎症は、アテローム硬化［３８］、末梢血管疾患［３９、４０］、冠状動脈疾患［３９、４０］、高血圧症［４１］、骨粗鬆症［４２］、２型糖尿病［３９］および認知症［４３］の一般的な原因であり、ｇｐ１３０−Ｊａｋ−ＳｔａｔはＩＬ−６によって活性化される主な経路であるので、Ｓｔａｔ３経路の阻害は、これらの疾患も予防し得る。
【００７３】
【表１】
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一実施形態では、本発明によるＳｔａｔ３阻害剤は、以下の通りである：２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステル、リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル、その鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体およびその塩もしくは溶媒和物（「本発明の化合物」）（実施例２）。本発明は、本発明の化合物がＣＳＣ自己再生を阻害し、ＣＳＣでアポトーシスを誘導することを示す、インビトロおよびインビボデータの両方も提供する（実施例３）。
【００７４】
Ｓｔａｔ３経路の下方制御がＣＳＣを阻害する証拠を提供し、本発明は、癌幹細胞を阻害することができる薬剤候補を特定する方法を提供する。本方法は、Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する薬剤候補についてスクリーニングするステップを含む。様々な実施形態では、薬剤候補は、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤、またはＧカルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤である。
【００７５】
一実施形態では、薬剤候補は、ＣＳＣで細胞死を誘導すること、または少なくともその自己再生を阻害することができる。経路の様々なフェーズを、薬剤候補のスクリーニングについての標的にすることができる。例えば、本方法の様々な実施形態は、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害するか、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害するか、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害するか、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害するか、またはＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害する薬剤候補についてスクリーニングすることができる。
【００７６】
下の実施例２が示すように、本発明の化合物は、インビトロでＳｔａｔ３転写活性およびＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害する。実施例２は、本発明の化合物が、Ｓｔａｔ３の下流側エフェクター（例えば、サイクリンＤ１およびサバイビン）の発現およびＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性の両方をインビボで阻害することをさらに示す。
【００７７】
したがって、別の態様では、本発明は、本発明の化合物の有効量が投与される、細胞Ｓｔａｔ３経路活性を阻害する方法を提供する。別の態様では、本発明の化合物は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害または状態を治療または予防するための医薬組成物を製剤化するために用いることができる。１種の障害の中のサブタイプであってよい障害に罹患している患者が、患者の細胞の少なくとも一部に、必ずしもそうではないが障害の病状に寄与することができる、異常なＳｔａｔ３経路活性を一般に有する場合、本明細書で、障害は異常なＳｔａｔ３経路活性に「関連する」とみなされる。異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが公知である障害の一部には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症。異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが公知である障害の一部は癌であり、例には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：様々な種類の乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫。
【００７８】
本発明のこの態様に関係し、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を診断するための１つまたは複数の作用物質、および、本発明の化合物または別の有効なＳｔａｔ３経路阻害剤の治療的有効量を含むキットが提供される。診断剤は、疑われる障害によって任意の適する試薬であってよく、例には、血液試料を引き抜き、生検材料をとり、生体分子（例えば、抗原もしくは抗体）についてスクリーニングし、または、試料から遺伝情報を抽出するために必要な作用物質を含めることができる。作用物質には、溶媒、洗浄剤、抗凝血物質、抗原、抗体、酵素、ＰＣＲプライマー、その他を含めることができる。
【００７９】
異常なＳｔａｔ３活性に関連することが公知である障害と患者が診断されるにせよされないにせよ、医師は、患者からとられる生検試料中に異常なＳｔａｔ３活性があるかどうか見分けるために、検査を常に命令することができる。したがって、異常なＳｔａｔ３経路活性を診断するための１つまたは複数の作用物質、および、本発明の化合物または別の有効なＳｔａｔ３経路阻害剤の治療的有効量を含むキットが提供される。１つの特徴では、異常なＳｔａｔ３経路活性は、そのような活性の任意の証拠、例えば、リン酸化Ｓｔａｔ３の発現（レベル、持続時間など）または代わりのＳｔａｔ３リン酸化の上流もしくは下流側の調節因子の発現（レベル、持続時間など）を調べるための、任意の適する分析的手段を通して特定することができる。前に記載したキットに類似して、診断剤は、検査が診る異常なＳｔａｔ３経路活性の証拠によって、任意の適する試薬であってよい。
【００８０】
下の実施例３が示すように、少なくともＳｔａｔ３経路阻害剤である本発明の化合物は、癌幹細胞を死滅させる。また、実施例３は、本発明の化合物が、ＣＳＣ自己再生の良好な阻害の指標であるＣＳＣ球体形成を、インビトロおよびインビボの両方で阻害することも証明する。
【００８１】
したがって、一態様では、本発明は、本発明の化合物の有効量が細胞に投与される、癌幹細胞を阻害する方法を提供する。ＣＳＣを有することが公知である癌はそのような治療の良好な候補であり、例には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：様々な種類の乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍、肉腫、髄芽細胞腫および白血病。
【００８２】
さらに、ＣＳＣは、腫瘍形成、癌転移および癌再発の役割を基本的に担うことが証明されているので、ＣＳＣの阻害を目的とする本発明の任意の方法を、転移性であるか、化学療法もしくは放射線療法に治療抵抗性であるか、または、最初の治療の後に対象で再発した癌を治療するために実施することができる。下の実施例６は、本発明の化合物の抗転移効力をインビボで具体的に試験し、データは、原発腫瘍病巣の数および自然発生肝転移のかなりの減少を示す。
【００８３】
下の実施例４では、本発明の化合物は、広範囲の癌細胞でアポトーシスを引き起こすだけでなく、低毒性治療薬の開発に重要であるその細胞傷害性における選択性を示すことが示される。本明細書で用いる選択的な細胞傷害性は、時にはある条件下で、正常な細胞を実質的に残しながら癌細胞を死滅させる化合物の能力を指す。通常、正常な細胞は、健康な、非腫瘍形成性の細胞を指す。薬剤候補のための選択的細胞傷害性をもたらす条件は、細胞傷害性の根底にある機構についての知識を必要とするので、予測するのが困難である。例えば、有糸分裂中の微小管形成を標的にする抗癌剤の毒性を低下させることは、細胞の代謝過程をブロックする薬剤と非常に異なる、研究すべき因子を提示する。選択的な細胞傷害性を生むための適する条件は、薬剤が、正常な細胞に十分に許容されつつも、癌細胞を効果的に死滅させるのに十分毒性がある必要性のバランスをとる必要がある。例えば、より低い濃度を用いる場合、それは、しばしば、癌細胞を死滅させるために長期注入が必要であることを意味する。
【００８４】
実施例４に示すデータを含む本発明の実施例で生成されるデータから、罹患細胞がある期間を超えて連続的に化合物の重要な濃度に曝露されない場合に、本発明の化合物の選択的細胞傷害性を達成することができることは明らかである。対象の癌細胞を選択的に死滅させることを目的とする方法においては、対象の血漿中の化合物の濃度が各投薬の後の２４時間を超える間重要な濃度を超えて維持されないように、本発明の化合物を有する医薬組成物を対象に投与する。この方法は、本明細書で記載される癌の群のいずれかを含むすべての癌を治療するために、および、Ｓｔａｔ３関連の障害を治療するために用いることができるが、その例示的なリストはすでに上で提供されており、ここで繰り返さない。あるいは、持続時間は、各投薬の後１２、１６および２０時間にさらに制限されてもよい。各化合物の重要な濃度は、異なることができる。本発明の様々な実施形態では、重要な濃度は、約１００μＭ、約５０μＭ、約３０μＭまたは約２０μＭである。
【００８５】
本方法の一実施形態では、治療される癌は、以下の群から選択される：肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、多発性骨髄腫、転移性乳癌、転移性前立腺癌、白血病、リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌（網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、下垂体癌、直腸癌、唾液腺癌および鼻咽頭癌。
【００８６】
一態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、本発明の化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与する方法を提供する。癌は転移性であってよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってよい。
【００８７】
本明細書に記載される対象を治療する方法のいずれについても、本発明は、化合物の有効な投薬量範囲、投薬頻度および血漿中濃度を提供する。様々な実施形態では、医薬組成物は、以下の投薬量で投与される：（ａ）約１ｍｇ／ｍ２〜約５，０００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）または約１ｍｇ／ｍ２〜約５０，０００ｍｇ／ｍ２（ＰＯ）；（ｂ）約２ｍｇ／ｍ２〜約３，０００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）または約１０ｍｇ／ｍ２〜約５０，０００ｍｇ／ｍ２（ＰＯ）。様々な実施形態では、本発明の化合物は、隔日（Ｑ２Ｄ）、毎日（ＱＤ）または１日に２回（ＢＩＤ）投与することができる。一実施形態では、医薬組成物は、経口的に、１日に４回（ＱＩＤ）以下で投与される。
【００８８】
一特徴では、医薬組成物は、対象の血漿中の化合物濃度が、各投薬の後の２４時間（または１２、１６および２０時間）を超えて、重要な濃度を超えて維持されないように対象に投与される。本発明の代替実施形態によると、非選択的毒性を回避する投薬計画として、化合物の血漿中濃度は、各投薬の後のある時点、例えば、１２、１６、２０または２４時間後に、重要な濃度を超えない。本発明の様々な実施形態では、重要な濃度は、約１００μＭ、約５０μＭ、約３０μＭまたは約２０μＭである。組成物は、ある場合には、単離、精製または合成される。
【００８９】
別の態様では、本発明は、本発明の化合物、および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。１つの特徴では、組成物は、経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または静脈内、皮下もしくは筋肉内の注射に適する。
【００９０】
本発明の製剤には、経口、鼻、局所（口内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適するものが含まれる。製剤は単位剤形で都合よく提供することができ、また薬剤学の分野で周知である任意の方法で調製することができる。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される哺乳動物および特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生成する化合物の量である。一般に、この量は、１００％のうち、例えば、有効成分約１％〜約９９％、約５％〜約７０％、約１０％〜約３０％の範囲である。
【００９１】
経口投与に適する本発明の治療用の組成物または製剤は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味をつけた基剤、通常ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを用いる）、粉末、粒剤の形態、または、水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水の液体乳剤として、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香剤（不活性の基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムを用いる）として、および／または洗口剤などとしての形態であってよく、それぞれは有効成分として本発明の化合物の所定量を含む。本発明の化合物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【００９２】
経口投与のための本発明の固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、粒剤など）では、本発明の化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つまたは複数の薬学的に許容される担体、および／または以下のいずれかと混合される：デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアラビアゴムなどの結合剤；グリセロールなどの湿潤剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、炭酸ナトリウムおよびデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解遅延剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレートおよびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体などの湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収材；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物などの滑沢剤；ならびに着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。類似した種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル内の充填剤として使用することもできる。
【００９３】
本発明の化合物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシルが含まれる。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で通常用いられる不活性の希釈剤、例えば水もしくは他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（より詳細には、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、キャスターおよびゴマの油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物を含むことができる。さらに、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを、化合物を可溶化するために用いることができる。
【００９４】
不活性希釈剤のほかに、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、香料および防腐剤などのアジュバントを含むこともできる。懸濁液は、本発明の１つまたは複数の化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステルなどの懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴム、およびそれらの混合物を含むことができる。
【００９５】
直腸投与または膣投与のための本発明の医薬組成物の製剤は、坐薬として提供することができ、それは、本発明の１つまたは複数の化合物を、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む、１つまたは複数の適する非刺激性の賦形剤または担体と混合することによって調製することができ、それは、室温で固体であるが体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解し、本発明の活性薬剤を放出する。膣投与に適する本発明の製剤には、適当であることが当技術分野で公知である担体などを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤も含まれる。
【００９６】
本発明による組成物の局所投与または経皮投与のための剤形には、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性化合物は、薬学的に許容される担体、および、任意の防腐剤、緩衝剤、または必要とされるかもしれない噴射剤と、無菌条件下で混合することができる。
【００９７】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の化合物に加えて、賦形剤を、例えば動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含むことができる。
【００９８】
粉末および噴霧剤は、本発明の化合物に加えて、賦形剤を、例えば乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。噴霧剤は、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロハイドロカーボンおよび揮発性の非置換の炭化水素、例えばブタンおよびプロパンをさらに含むことができる。
【００９９】
眼用製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本発明の適用範囲内であることが企図される。
【０１００】
非経口投与に適する本発明の医薬組成物は、本発明による１つまたは複数の化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張性の水溶液もしくは非水性の溶液、分散物、懸濁液または乳剤、または、使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散物に再構成することができる無菌粉末と一緒に含み、それらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、製剤を予定のレシピエントの血液で等張性にする溶質または懸濁剤もしくは増粘剤を含むことができる。
【０１０１】
場合によっては、本発明による組成物の効果を長くするために、皮下注射または筋肉内注射からの体によるその吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性の劣る結晶性または非晶質の物質の液体懸濁液を用いて達成することができる。次に、薬剤の吸収速度はその溶解速度に依存し、次に、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存することができる。あるいは、非経口的に投与される組成物の遅延型吸収は、化合物を油媒体に溶解または懸濁することによって達成される。デポ注入のための１つの戦略は、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体の使用を含み、そこでは、媒体は室温で流体であり、体温で固化する。
【０１０２】
本発明の医薬化合物は、単独で、または他の薬剤と組み合せて、または、本明細書で記載される他の抗癌療法と組み合せて、および、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と一緒に投与することができる。
【０１０３】
一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤は、静脈内送達のための脂質を含む。脂質は、リン脂質、合成ホファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、天然のホファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、スフィンゴミエリン、セラミド、ホファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、コレステロール、コレステロール硫酸、ならびにハプテンおよびＰＥＧを結合させた脂質であってよい。脂質は、ナノエマルジョン、ミセル、乳剤、懸濁液、ナノ懸濁液、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）またはリポソームの形であってよい。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤は、ミセル乳剤、懸濁液またはナノ粒子懸濁液の形であり、それは、静脈内送達のために、静脈内で許容されるタンパク質、例えばヒトアルブミンまたはその誘導体をさらに含む。
【０１０４】
一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤は、経口送達のためにワックス状物質を含む。ワックス状物質は、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、ＰＥＧのモノ脂肪酸エステル、ジ脂肪酸エステル、ＰＥＧ結合ビタミンＥ（ビタミンＥ  ＴＰＧ）および／またはＧｅｌｕｃｉｒｅであってよい。Ｇｅｌｕｃｉｒｅは、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４３／０１、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ
５０／０２、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ５０／１３、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ３７／０２、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ３３／０１、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４６／０７およびＧｅｌｕｃｉｒｅ  ３５／１０から選択することができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤は、Ｃａｐｒｙｏｌ、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ｈｐ、Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、トリアセチン、Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖ、エタノール、ポリビニルピロリジン、カルボキシメチルセルロース、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０から選択される。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、例えば、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４は、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＴｗｅｅｎ  ２０であってよい界面活性剤と混合される。医薬組成物のこれらの実施形態は、経口投与のためにさらに製剤化することができる。
【０１０５】
本発明の化合物は、市販の出発物質および、有機化学分野の技術者に周知である方法を用いて合成することができる。実施例８〜１０で、本発明は、請求されるいくつかの化合物の生産方法を提供する。
【０１０６】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤は、Ｓｔａｔ３に対して阻害活性を示す、任意の低分子量薬剤を指す。タンパク質、ペプチドおよび炭水化物などのより大きな分子量の医薬と比較して、小分子は、細胞膜および脳血液関門をより容易に透過することができる。これらの分子は、より安価な方法開発コストおよび製造コストをもたらす傾向がある。
【０１０７】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、ＲＮＡｉ療法は、悪いタンパク質、したがって疾患をもたらす遺伝子をサイレンシングすることによる、疾患の治療におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の直接使用である。ＲＮＡｉは、生細胞中のある遺伝子活性を抑制する天然に存在する過程である。それは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの短いＲＮＡ二重鎖中間体を通して二本鎖ＲＮＡが細胞内で誘発する、広く保存された真核生物の機能である。一連のプロセシングステップを通して、ｓｉＲＮＡの２つの鎖のうちの１つはタンパク質と複合体を形成して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導性のサイレンシング複合体）を形成する。ＲＩＳＣは、ワトソン−クリックの塩基対合によって相補的ＲＮＡ配列を認識し、その後、それを切断する。ＲＮＡｉには、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡその他も含まれる。
【０１０８】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、アンチセンス療法は、遺伝的障害または感染症に対する治療形態である。特定の遺伝子の遺伝子配列が特定の疾患を引き起こすことが公知である場合、その遺伝子によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それを不活性化して、効果的にその遺伝子を「オフ」にする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学類似体）の鎖を合成することが可能である。これは、ｍＲＮＡ翻訳されるためにはｍＲＮＡが一本鎖でなければならないからである。この合成された核酸は「アンチセンス」オリゴヌクレオチドと呼ばれるが、その理由は、その塩基配列が、「センス」配列と呼ばれる遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的であるからである（したがって、ｍＲＮＡのセンスセグメント「５’−ＡＡＧＧＵＣ−３’」は、アンチセンスｍＲＮＡセグメント「３’−ＵＵＣＣＡＧ−５’」によってブロックされるであろう）。
【０１０９】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、ペプチド模倣物物質は、ペプチドを模倣するように設計される小タンパク質様鎖である。一般的に、それらは、分子の特性を変化させるために、既存のペプチドの修飾から生じる。例えば、それらは、分子の安定性または生物活性を変えるための修飾から生成することができる。これは、既存のペプチドからの薬剤様化合物の開発で、役割を果たすことができる。これらの修飾は、天然に存在しないペプチドの変化（例えば変化させられた骨格および非天然アミノ酸の組込み）を含む。
【０１１０】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、Ｇ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチド阻害剤は、細胞中のそれらのＲＮＡ切断活性とは無関係にタンパク質を阻害するように設計された、触媒性のＤＮＡ分子（ＤＮＡザイム）である。
【０１１１】
材料および方法
生物検定
本発明の化合物は、上記のプロトコルに従って試験することができる。表２は、プロトコルに記載される化合物のリストを示す。
【０１１２】
【表２】
2020143135.tif 000015
細胞培養：Ｈｅｌａ、ＤＵ１４５、Ｈ１２９９、ＤＬＤ１、ＳＷ４８０、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＬＮ１８、ＨＣＴ１１６、ＨｅｐＧ２、Ｐａｃａ２、Ｐａｎｃ１、ＬＮｃａｐ、ＦａＤｕ、ＨＴ２９およびＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）および５％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテルシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｃｉｎ）  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で維持した。
【０１１３】
Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション：サイドポピュレーション（ＳＰ）および非ＳＰ画分を特定、単離するために、トリプシンおよびＥＤＴＡを含む培養皿からＳＷ４８０細胞を取り出し、遠心分離によってペレットにし、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）に３７℃で再懸濁した。次に、細胞を、５μｇ／ｍＬの濃度のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。標識細胞を、単独で、または５０μＭベラパミル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と一緒に、３７℃で１２０分間インキュベートした。染色の後、細胞を、２％ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓの平衡化食塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、４０μｍメッシュフィルターに通し、フローサイトメトリー分析まで４℃に維持した。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を３５０ｎｍで励起させ、その蛍光を、４５０ＤＦ１０（４５０／２０ｎｍバンドパスフィルター）および６７５ＬＰ（６７５ｎｍロングパスエッジフィルター）の光学フィルターを用いて、２波長で測定した。前方散乱光および側方散乱光のゲーティングはストリンジェントではなく、デブリだけが除外された［１５］。
【０１１４】
表面マーカーによるＣＳＣ単離：表面マーカー（複数可）、例えばＣＤ４４またはＣＤ１３３の差次的発現に主に基づく腫瘍細胞の選別は、今日まで記載されている大部分の高度の腫瘍形成性のＣＳＣを説明してきた。ＣＤ１３３の単離は、わずかな修正を加えたＲｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら［２０］の方法に基づく。ＣＤ１３３＋細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁気ナノ粒子に基づく分離によって単離した。簡潔には、１０７個の細胞／ｍＬを、ＦＡＣＳに基づく細胞選別のためにＣＤ１３３／１（ＡＣ１３３）−ＰＥで標識、または、磁場に基づく分離のためにＣＤ１３３／１（ＡＣ１３３）−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で標識したが、標識のためには、製造業者の推奨に従ってＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ビオチン選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた。非特異的標識を、供給されたＦｃＲブロッキング試薬でブロックし、抗体インキュベーション（１：１１）を、氷上の２％ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で１５分間実行した。５回の洗浄をＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）単離のために行い、細胞を５分間の４００×ｇでペレットにし、２×１０７／ｍＬに再懸濁した後、ＦＡＣＳによって選別した。
【０１１５】
ＣＤ４４高細胞を、わずかな修正を加えたＰｏｎｔｉらに記載の方法に従ってＦＡＣＳによって単離した［８５］。簡潔には、増殖培地での３７℃で３０分間の細胞のトリプシン処理および回収の後、細胞を４００×ｇでペレットにし、２％ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。次に、細胞を、氷上でＣＤ４４−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の１：１００の希釈溶液と１５分間インキュベートした。あるいは、陰性選択のために、ＣＤ２４−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（１：１００）を利用した。３回洗浄の後、細胞を２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、４０μＭメッシュに通した後に選別した。
【０１１６】
スフィアアッセイ：細胞集団の自己再生能力を測定する信頼できる方法は、血清または接着物が存在しない場合に球体として培養される能力である。球体形成を可能にするために、ＣＤ４４高  ＦａＤｕまたはＨｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション癌幹細胞を、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ補助剤、２０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ、４μｇ／ｍｌインスリンおよび０．４％ＢＳＡ）が入った超低接着プレート中で培養した。一般的に、培養の１０〜１４日後に球体形成を鏡検によって評価し、細胞数＞５０の球体を記録した。
【０１１７】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載される通りにリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて、ＨｅＬａ細胞をＳｔａｔ３−ルシフェラーゼ（Ｓｔａｔ３−Ｌｕｃ）レポーターベクター（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ州）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの後、０．５％ＦＢＳを含む培地で細胞を２４時間維持した。次に、細胞を指示された化合物で３０分間処理し、その後、培地に２５ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を加えた。ＯＳＭの添加の６時間後、細胞を収集し、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記載されるように、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系を用いて、ホタルおよびｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのレベルを測定した。
【０１１８】
アポトーシスの分析：化合物によって処理した細胞または処理しなかった細胞を、アネキシンＶ染色のための処理の５時間後に収集した。収集した細胞をＰＢＳで洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有緩衝剤に再懸濁し、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の指示に従って染色した。アネキシンＶ陽性の細胞を、フローサイトメトリーによって判定した。
【０１１９】
ＳＴＡＴ３  ＤＮＡ結合アッセイ：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、製造業者（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によって記載される通りに実施した。簡潔には、製造業者（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって記載される通りにＮｕｃＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出キットを用いて、核抽出物をＨｅＬａ細胞から作製した。５μｇの核抽出物を、指示された化合物の指示された用量と３０分間プレインキュベートし、その後、ＩＲ７００標識コンセンサスＳｔａｔ３オリゴヌクレオチドと１５分間インキュベートした。次に、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて直ちに走査した。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のために、５μｇの核抽出物を、指示された化合物の指示された濃度と３０分間プレインキュベートし、その後、ビオチン化オリゴ（５’−ビオチン−ＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＴＣ−３’配列番号１）を加えた。次に、Ｓｔａｔ３−ＤＮＡ複合体を、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で捕捉した。次に、結合した複合体をＳｔａｔ３ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と、続いて抗ウサギＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）とインキュベートした。次に、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によって結合抗体を可視化し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１２０】
細胞生存度判定：３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）分析のために、ウェルにつき１０，０００個の細胞で、細胞を９６ウェルプレートにまいた。プレートにまいてから２４時間後、化合物を指示された用量で細胞に加えた。化合物添加から２２時間後、ＭＴＴを各ウェルに加え（０．５ｍｇ／ｍｌ、最終濃度）、プレートを３７℃でさらに２時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、ホルマザン生成物を１００μｌのイソプロピルアルコールに可溶化した。マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの吸光度を５７０ｎｍで測定した。
【０１２１】
免疫蛍光：指示された時間指示された化合物で処理した細胞は、それぞれアネキシンＶ、切断されたカスパーゼ３またはｓｔａｔ３の検出のために、４％ホルムアルデヒドまたは冷メタノールのいずれかで固定した。カバーガラスを空気乾燥させ、室温で１０分間、ＰＢＳ中に再水和させた。次に、湿気のあるチャンバ内で、室温で１０分間、試料をブロック緩衝剤（ＰＢＳ、５％ＦＢＳ）中でインキュベートした。４℃で一晩、細胞を一次抗体とインキュベートした。洗浄の後、室温で１時間、細胞をＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体の１：５００の希釈溶液とインキュベートした。落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）およびＳＰＯＴモザイクＣＣＤカメラを備えたニコンＴＥ２００顕微鏡で、画像を取得した。ポリクローナル抗切断カスパーゼ３抗体（１：１００）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡから得た。アネキシンＶ−ＦＩＴＣは、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ポリクローナル抗Ｓｔａｔ３抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから得た。
【０１２２】
ＴＰＩＶ（登録商標）技術による遺伝子ノックダウン：ＴＰＩＶ（登録商標）（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）技術（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、細菌を先ずトランスフェクトし、次にその細菌を哺乳動物の対象に取り込ませるために用いることができるプラスミドを提供する。細菌溶解の後、ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドによってコードされ、細菌によってプロセシングされるｄｓＲＮＡは、哺乳動物の細胞の細胞質に放出されて標的とする遺伝子ノックダウンをもたらす。ＴＰＩＶ（登録商標）技術は、共同所有される２００８年６月３０日に出願のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０８／６８８６６に記載され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、以下のプライマーを用いて、Ｓｔａｔ３に対して有効なｓｉＲＮＡ配列をコードするＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドを、Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入したＳｔａｔ３プラスミドのＰＣＲクローニングによって構築した：
ＴＰＩＶ−Ｓｔａｔ３（３００ｂｐ挿入断片）
【０１２３】
【化７】
2020143135.tif 000016
対照プラスミドは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入したｐＧＬ２プラスミドを用いて構築する。
【０１２４】
ＴＰＩＶ−ＧＬ２（３００ｂｐ挿入断片）
【０１２５】
【化８】
2020143135.tif 000017
化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹＳｅ細菌（５０〜１００μｌ）を、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、対照プラスミドまたは１００ｎｇのＳｔａｔ３標的ＴＰＩＶ（登録商標）のプラスミドで形質転換した。次に、単一のコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＢＨＩ培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。翌日、一晩培養物のそれぞれの５ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＢＨＩ培地で１：４０に希釈し、さらなる２〜４時間（ＯＤ６００＝０．５まで）増殖させた。次に、各培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）で２〜４時間処理して、細菌によってカクテルｓｉＲＮＡにプロセシングされるであろう長い二本鎖ＲＮＡの転写を誘導した。ＩＰＴＧ誘導の後、各培養物中の細菌総数を、ＯＤ６００値（１ｍｌ培養物につき８×１０８個の細菌数は、ＯＤ６００＝１を有する）を測ることによって計算した。次に、細胞処理のための細菌数を、細胞集密度および適当な反応容量で必要とされた感染多重度（ＭＯＩ；細菌数対細胞数が２０：１〜２０００：１の試行範囲）に従って計算した。経験則として、１０００：１のＭＯＩについて３×１０８／ｍｌになるように反応容量を選択するべきである。次に、必要とされた細菌培養物の容量を、４℃で１０分間、２５００ｇで遠心分離し、細菌感染させる細胞のために用いた無血清培地と、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧとでペレットを１回洗浄し、細菌感染（バクトフェクション（ｂａｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ））に必要とされた密度で同じ培地に再懸濁した。
【０１２６】
同時に、癌細胞または癌幹細胞を単離した。バクトフェクションの３０分前に、細胞培地を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ｍｌの新しい無血清培地で置換した。次に、上で調製した細菌を、３７℃で２時間、所望のＭＯＩで細胞に加えた。
【０１２７】
感染期間の後、無血清細胞培地を用いて細胞を３回洗浄した。次に、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む２ｍｌの新しい完全細胞培地で２時間インキュベートして、あらゆる残存細胞外細菌を死滅させた。アンピシリンおよびゲンタマイシンによる処理の後、細胞を、１０μｇ／ｍｌのオフロキサシンを含む３ｍｌの新しい完全ＲＰＭＩ  １６４０培地でインキュベートして、あらゆる細胞内細菌を死滅させた。次に、標的遺伝子のサイレンシングの程度および生じた表現型を調査するために、細胞を様々な時間に収集または分析した。
【０１２８】
生前評価：各動物の健康状態の検査も、毎日行った。体重は、３日ごとに検査した。食べ物および水は、施設の動物飼育手順に従って、毎日供給した。２０％を超える死亡率をもたらす処理、および、または、２０％を超える体重の減少は、有毒とみなした。結果を、平均腫瘍容積（ｍｍ３）±ＳＥで表す。０．０５未満のＰ値は、統計学的に関連があるとみなす。
【０１２９】
動物飼育：４〜５週齢の雄または雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、試験開始前の少なくとも１週間、動物飼育施設に順応させた。利用した実験手順のすべては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＳｏｃｉｅｔｙおよびＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓによって概説され、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されてもいるガイドラインに一致していた。動物は、制御された温度（６８°Ｆ〜７２°Ｆ）、光（１２時間明暗周期）および湿度（４５〜５５％）の部屋内の、床が木材チップのケージに、４匹の群で収容した。実験の間、動物には、水および食物を自由摂取させた。
【０１３０】
脾臓内ヌードマウスモデル系（ＩＳＭＳモデル）：雌のヌードマウスに麻酔をかけ、無菌条件の下で、左側腹部を切開して脾臓を露出させた。０．１ｍｌ  ＰＢＳ中の１００万個のヒト結腸癌ＨＴ２９細胞を、２７ゲージ針を用いて脾被膜下に注入した。脾臓を腹膜腔に戻して、切開を閉じた。処置は、移植の翌日に開始され、試験日までであった。処置計画は、腹腔内を介する５ｑｄ／週である。死にかけているとき、または注射の３０日後に、マウスを犠牲にした。脾臓および肝臓を取り出して検査し、腫瘍病巣数を記録した。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１）
抗癌幹細胞標的としてのＳｔａｔ３の同定
ＣＳＣにおいて、Ｓｔａｔ３のノックダウンはアポトーシスを誘導する。癌幹細胞がＳｔａｔ３を発現するかどうか、そしてＳｔａｔ３が構成的に活性であるかどうかを決定するために、本発明者らは免疫蛍光顕微鏡法を実施し、免疫蛍光顕微鏡法は稀有な細胞集団の分析を可能にするだけでなく、タンパク質の局在についての、そして染色と表現型（すなわちアポトーシス）とを関連付ける能力についてのさらなる情報もまた提供する。ＳＷ４８０結腸癌細胞からＦＡＣＳにより単離されたＮＳＰ細胞およびＳＰ細胞中のｐ−Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３の免疫蛍光検出の後に、本発明者らは、Ｓｔａｔ３が実際にＳＰ細胞中に存在し、核において適度に富化されていると判定した（図３Ａ）。さらに、本発明者らは、ｐ−Ｓｔａｔ３の染色がＮＳＰ細胞よりもＳＰ細胞中で増加していることを観察し、ＳＰ細胞が、生存のためにＳｔａｔ３により強く頼ることができることが示唆された。
【０１３２】
Ｓｔａｔ３の状態を、ＦａＤｕヒト頭頸部癌細胞およびＬＮ１８ヒトグリア芽腫細胞から単離されたＣＤ１３３＋細胞においてさらに評価した。図３Ｂに示すように、Ｓｔａｔ３は、これらの細胞においてもまた構成的に活性である。総合的に、これらのデータは、標的としてのＳｔａｔ３が癌幹細胞にとって特に重要であることを示唆する。
【０１３３】
次に本発明者らは、ＴＰＩＶ（登録商標）を使用して、ＣＳＣにおけるＳｔａｔ３のノックダウンの効果を試験した。免疫蛍光分析により、新鮮に単離されたＣＳＣ（ＳＰ）において感染から２４時間以内にＳｔａｔ３の有意な減少が達成され得たことが明らかになり（図４Ａ）、Ｓｔａｔ３標的化ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドにより処理された細胞の大部分が感染２４時間以内にアポトーシスとなり、一方、対照ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドは、対照の未感染の細胞を上回るレベルまでアポトーシスを誘導しなかったことが見出された（図４Ｂ）。これらのデータは、癌幹細胞が生存のためにＳｔａｔ３に依存していることを実証する。
【０１３４】
ＣＳＣにおけるＳｔａｔ３のノックダウンは、ＣＳＣの球体形成性を阻害する。ＣＤ４４高／ＣＤ２４低ＦａＤｕまたはＨｏｅｓｃｈｓｔのサイドポピュレーション癌幹細胞をＦＡＣＳにより単離し、超低接着プレートにおいて、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ添加物、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、４μｇ／ｍＬのインスリンおよび０．４％のＢＳＡ）中で培養し、球体を形成させた。一次球体を回収し、トリプシンで分散させ、９６ウェルの超低接着プレートに分注し、その後ＴＰＩＶ（登録商標）処理した。細菌を、ＭＯＩが１０００で投与し、２時間後抗生物質カクテル（ｐｅｎｓｔｒｅｐ、ゲンタマイシン、オフロキサシン（ｏｆｌａｘａｃｉｎ））を加えた。球体形成を、培養１０〜１４日後に評価した。代表的な球体の画像を、トリパンブルーの添加前（図５、左上のパネル）または後に記録し、死細胞を同定した（図５、左下のパネル）。相対的球体形成性を、図５の右のパネルに示した。データは、癌幹細胞におけるＳｔａｔ３のノックダウンが、球体形成性を阻害したことを明らかに示し、Ｓｔａｔ３が、癌幹細胞のカギとなる自己再生因子であることを実証している。
【０１３５】
（実施例２）
Ｓｔａｔ３経路の活性を阻害する化合物の同定
Ｓｔａｔ３の転写活性の阻害。化合物を、細胞においてＳｔａｔ３の転写活性化活性を阻害するそれらの能力に関して、Ｓｔａｔ３−ルシフェラーゼ（Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ）レポーター構築体を使用して試験した。Ｓｔａｔ３−ｌｕｃを形質移入した細胞を、血清低減培地で培養し、その後表示の化合物を３０分間加えた。その後、細胞を、２５ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を用いて６時間刺激し、続いてＳｔａｔ３−ｌｕｃレポーター活性を検出した。細胞を化合物４０１と共にインキュベートすると、ＯＳＭ刺激性Ｓｔａｔ３レポーターの活性が阻害された（図６、左のパネル）。Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路の阻害剤として公知であるＡＧ４９０は、Ｓｔａｔ３の阻害に関する陽性対照に挙げられる。遺伝毒性作用の対照として挙げられるエトポシドは、Ｓｔａｔ３をほとんど、または全く阻害しないことが示された。本発明の化合物としてのナフトキノンの代わりにナフタレンである化合物１００１は、非常に高い濃度であってもＯＳＭ刺激性Ｓｔａｔ３レポーターの活性を阻害しなかった（図６、右のパネル）。
【０１３６】
さらなる化合物を、Ｓｔａｔ３ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験し、結果を表３に要約する。
【０１３７】
【表３】
2020143135.tif 000018
Ｓｔａｔ３  ＤＮＡ結合活性の阻害。チロシン７０５残基のリン酸化により検出されるような、構成的に活性化されたＳｔａｔ３を含有する、ＨｅＬａ細胞由来の核抽出物を、Ｓｔａｔ３  ＥＭＳＡの実施に使用し、Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合活性をモニターした。核抽出物を、表示の化合物と共にインキュベートし、その後ＩＲ７００標識Ｓｔａｔ３コンセンサスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。Ｓｔａｔ３とオリゴヌクレオチドの結合を、ゲル電気泳動およびＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線走査装置を使用した検出によりモニターした。Ｓｔａｔ３の低下したバンドを、抗Ｓｔａｔ３抗体によるスーパーシフト（図７Ａ、左のパネル）およびＳｔａｔ３ペプチドによる用量依存性阻害（図７Ａ、中央のパネル）によって同定し確認した。Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合の用量依存性阻害を、標識プローブと化合物４０１とのインキュベーションの後で観察した（図７Ａ、右のパネル）。
【０１３８】
ＥＭＳＡアッセイにおいてさらなる化合物を試験した。図７Ｂに示すように、化合物４０１、４１６および４１８は、Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害できる。
【０１３９】
異種移植腫瘍組織におけるＳｔａｔ３下流エフェクターの阻害。化合物４０１またはビヒクルの対照により処理し、４時間後に収穫した異種移植されたＰａｃａ２腫瘍から、抽出物を調製した。サンプルを、ウェスタンブロットおよびＥＭＳＡにより分析し、Ｓｔａｔ３下流エフェクターの発現レベルおよびＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を評価した。化合物４０１により処理したサンプル（Ｔ）は、対照（Ｖ）よりもＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性が減少することが示された（図８Ａ）。さらに、化合物４０１による処理は、Ｓｔａｔ３の下流エフェクターである、サイクリンＤ１およびサバイビン（図８Ｂ）の発現レベルの減少をもたらした。
【０１４０】
（実施例３）
癌幹細胞を標的とする化合物の同定
癌幹細胞に対してアポトーシス性である化合物の同定。癌幹細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔを活発に排出させることが実証されているので、ＳＷ４８０細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色し、サイドポピュレーション（図９Ａに示した、左のパネルのゲートエリア）を識別し、癌幹細胞を富化した。このサイドポピュレーションは、癌幹細胞が富化されていることを確認するために、一連の対照ＳＷ４８０細胞を、まずＡＢＣ輸送体の阻害剤であるベラパミルを用いて処理し、その後Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色した。図９Ａの右のパネルに示すように、ベラパミル処理により、サイドポピュレーションの欠損がもたらされる。
【０１４１】
Ｈｏｅｃｈｓｔのサイドポピュレーションに対する化合物４０１のＩＣ５０をＭＴＴアッセイにおいて評価し、非サイドポピュレーションに対するＩＣ５０と比較した。結果は、サイドポピュレーションは非サイドポピュレーションと同程度に、化合物４０１に対して感受性であることを示す（図９Ｂ、右のパネル）。しかしサイドポピュレーションは非サイドポピュレーションより、ドキソルビシンに対して非常に抵抗性であり（図９Ｂ、左のパネル）、さきの出版物と一致する［７、８６］。これらのデータは、化合物４０１が癌幹細胞を死滅させることを示唆する。
【０１４２】
Ｈｏｅｃｈｓｔのサイドポピュレーション細胞を、化合物４０１を用いて処理し、細胞死の様式をアネキシンＶ（アポトーシスの早期マーカー）染色により評価した。結果は、死にかけている細胞がアネキシンＶ陽性であり（図１０Ａ）、化合物４０１が癌幹細胞に対してアポトーシス性であることを実証している。
【０１４３】
または、本発明者らは、ＣＤ１３３（共通の癌幹細胞表面マーカーの１つ）抗体磁気ビーズプルダウンを実施し、癌幹細胞を富化した。その後、ＣＤ１３３＋細胞を、化合物４０１を用いて処理し、続いて切断カスパーゼ３（アポトーシスの顕著な特徴）に対する抗体を用いて染色した。図１０Ｂに示すように、化合物４０１による処理後、ＣＤ１３３＋細胞の多くは切断カスパーゼ３陽性になり、化合物４０１が癌幹細胞に対してアポトーシス性であることを裏付ける。
【０１４４】
さらに、本発明者らは、癌幹細胞に対するいくつかの他の化合物の活性を試験した。簡潔に言うと、新鮮に単離したＣＳＣ（ＳＷ４８０  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ＳＰ細胞またはＣＤ４４高ＦａＤｕ細胞）を、化合物の用量範囲（３０〜０．１１７μＭ）に４８時間曝露し、その後細胞の生存をＭＴＴアッセイにより調べた。ＩＣ５０を、生存細胞のパーセントをプロットすることによって推定した。表４および表５に示すように、本発明の化合物は、癌幹細胞を標的にできる。
【０１４５】
【表４】
2020143135.tif 000019
【０１４６】
【表５】
2020143135.tif 000020
インビトロでＣＳＣの球体形成性を阻害する化合物の特定。癌幹細胞の顕著な特徴の１つは、それらの自己再生能力である［８７］。細胞集団の自己再生能力を測定する信頼性のある方法は、血清および接着物が存在しない状態で、球体として培養される能力である［８８］。他の対標的薬および化学療法剤に対する化合物４０１の能力を比較するために、ＦＡＣＳにより単離されたＣＤ４４高ＣＳＣを球体として７２時間成長させ、その後一連の治療薬にチャレンジした。被験薬剤の中で、化合物４０１のみが球体の増殖の防止に有効であった（図１１）。球体は、同様のアッセイにおいて細胞死に関するそれらのＩＣ５０濃度のおよそ１０倍で用いてもドキソルビシンおよびドセタキセルに抵抗性であることは留意されたい。Ｔａｒｃｅｖａ、ＳｕｔｅｎｔおよびＧｌｅｅｖｅｃを、報告されたそれらの治療濃度のおよそ３倍で加えた。このことは、癌幹細胞は、従来の化学療法薬および対標的薬に対して抵抗性であるが、化合物４０１はそれらの成長の阻害に非常に有効であることを実証する。
【０１４７】
インビボでＣＳＣの球体形成性を阻害する化合物の特定。６週齢の雌の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）より入手した。マウスに、０．２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中の６×１０６のＦａＤｕまたはＰａｃａ２癌細胞を、脇に皮下注入した。異種移植片が約２００ｍｍ３のサイズに達した後で、Ｐａｃａ２異種移植片腫瘍を担持する動物に、ビヒクル、ゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ、週に２回）または化合物４０１（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、犠牲にする前の１週間、ｉｐにより投与し、ＦａＤｕ異種移植片腫瘍を担持する動物に、ビヒクル、カルボプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ）または化合物４０１（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを犠牲にする前の２週間ｉｐを介して毎日投与した。その後Ｐａｃａ２およびＦａＤｕ細胞それぞれに関して腫瘍を回収した。動物を犠牲にし、腫瘍を無菌除去した後で、単一細胞懸濁液を得た。簡潔に言うと、腫瘍を滅菌の外科用メスを用いて０．１ｍｍ３の断片に刻み、その後１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ＨＢＳＳにおいて１５〜３０分、一定の撹拌を行いながら消化した。４０μｍのメッシュのフィルターを通した後で、細胞懸濁液を１ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ上に層にし、１４４０×ｇで３０分間遠心分離した後で界面層を回収することによって、ＲＢＣ、死細胞および細胞のデブリを除去した。その後、生細胞を数え、球体形成のそれらの能力を測定するために使用した。細胞を、超低接着性９６ウェルプレートに、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ補充物、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、４μｇ／ｍＬのインスリンおよび０．４％のＢＳＡ）中に１００細胞／ウェルの密度で分配した。新鮮な培地を３日ごとに加え、球体の形成を培養１０〜１４日後に決定した。＞５０細胞の球体を数えた。実験の終わりにトリパンブルーを加え、死細胞を特定した。図１２に示すように、標準的化学療法剤のゲムシタビン（上のパネル）およびカルボプラチン（下のパネル）は癌幹細胞を増加させたことが、球体形成性の増加から明らかである。対照的に、球体形成性の減少により明らかなように、化合物４０１による処理は、癌幹細胞を減少させた。
【０１４８】
（実施例４）
広範囲の癌細胞を選択的に死滅させる化合物の特定
インビトロで広範囲の癌細胞に対してアポトーシス誘導性である化合物の特定。９６ウェルプレートに播種し、表示の化合物で処理した細胞を、化合物処理の後でＭＴＴ分析に２４時間の時点で供し、細胞生存率を決定した。複数の細胞系にわたって計算したＩＣ５０値を、下記の表６に要約する。データは、これらの化合物が広範囲な癌細胞に対して強力な活性を有することを実証している。
【０１４９】
【表６】
2020143135.tif 000021
さらに、ＤＵ１４５細胞をまずＤＭＳＯまたは表示濃度の化合物４０１を用いて処理し、続いてアネキシンＶを用いて染色し、その後処理後５時間でフローサイトメトリにより分析した。結果は、４０１による処理がアネキシンＶ染色の用量依存的増加をもたらし（図１３）、化合物４０１がこれらの癌細胞に対してアポトーシス誘導性であることを実証している。
【０１５０】
化合物の選択性の例。事実上すべての癌細胞に死をもたらすアッセイ条件のもとで、正常な細胞は、実質的に生存し続ける。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、化合物４０１に対して比較的抵抗性であり、化合物４０１と共に２４時間インキュベートした後の、ＭＴＴアッセイによるＩＣ５０は１４μＭであった。このＩＣ５０は、さまざまな癌細胞系においてみられるＩＣ５０より６〜１１６倍高く、癌細胞と比較して妥当な治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を示す。
【０１５１】
ＰＭＢＣと類似の方式で、化合物４０１を用いて処理した場合、ＣＤ３４＋骨髄造血幹細胞は残った。表７に示すように、ＣＤ３４＋骨髄単核細胞を化合物４０１と共に６時間インキュベートすると、骨髄赤血球系列および骨髄細胞系列の双方に関してＩＣ５０は３０μＭを超え、一方ＤＵ１４５前立腺癌細胞およびＨＴ２９結腸癌細胞は、同様の条件下でＩＣ５０が０．５μＭ未満であった。これらのデータは、インビトロのデータによれば化合物４０１の広い治療域（５０倍を超える）を示唆する。
【０１５２】
【表７】
2020143135.tif 000022
（実施例５）
インビボの抗腫瘍効力
膵臓癌異種移植モデル。Ｐａｃａ−２細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種した（４×１０６細胞／マウス）。腫瘍がおよそ４５０ｍｍ３に達した場合に、動物を、５マウス／群の２群にランダムに分けた。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照のいずれかを用いて腹腔内に毎日処置した。化合物４０１は、１．５％の脂質およびＨ２Ｏ中に５ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計１４用量を与え、処置後観察にした。腫瘍を、処置期間中を通して測定し、処置後さらに２２日間モニターした。図１４の左のパネルに示すように、化合物４０１は、腫瘍の成長を強力に阻害した。腫瘍の成長阻害は、６０日目において６４％であると計算され、統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）。より重要なことには、腫瘍体積は、処置後２２日の期間静止していた。
【０１５３】
同様の実験において、ｐａｎｃ−１ヒト膵臓癌細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（２×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。腫瘍がおよそ６０ｍｍ３に達した場合に、動物を、５マウス／群の２群にランダムに分けた。マウスを、標準投与計画でゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ、３日に一度）またはビヒクル対照で、計６用量のゲムシタビンまたはビヒクル対照を腹腔内（ｉｐ）処置した。腫瘍を、処置期間中を通して測定し、処置後さらに１９日間モニターした。図１４の右のパネルに示すように、単剤療法としてのゲムシタビンを用いた処置は、腫瘍成長を阻害し、腫瘍の成長阻害は、４１日目において４７．５％であった。処置を停止した後で、ゲムシタビン処置群における腫瘍は、すぐに対照群における腫瘍より大きくなった。
【０１５４】
異種移植されたＰａｃａ−２ヒト膵臓癌モデルにおいて、化合物４０１処置期間または処置後の期間に腫瘍のリバウンドは観察されず、このことは、化合物４０１の癌幹細胞標的化の作用機序と一致する。対照的に、現在の標準的化学療法のゲムシタビンを用いて処置したヒト膵臓異種移植腫瘍は、初めは応答したが、継続治療中にリバウンドするか、または投薬を停止後対照腫瘍よりも大きくなった。腫瘍のリバウンドが起こらなかったことが、化合物４０１が標準的化学療法に対して差違をなすものであり、劇的にかつ根本的に癌治療を改善する可能性を提示する。
【０１５５】
頭頸部癌異種移植モデル。ＦａＤｕヒト頭頸部癌細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（６×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した場合に、動物を、２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照を用いて毎日（連続５日、その後２日は投与休み）腹腔内（ｉｐ）処置した。化合物４０１は、２％の脂質、０．１％のコレステロールおよびＨ２Ｏ中に５ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計１５用量の化合物４０１またはビヒクル対照を与えた。腫瘍を、処置期間中を通して測定した。図１５に示すように、この非常に侵襲性の頭頸部異種移植モデルにおいて、単剤療法として化合物４０１を腹腔内に投薬された動物は、腫瘍の成長を強力に阻害した。化合物４０１の腫瘍の成長阻害は７５％であると計算され、ｐ値は０．００７であった。ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１の腹腔内投与による、体重の有意な変化はなかった。
【０１５６】
乳癌異種移植モデル。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（８×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達した場合に、動物を、２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照を用いて毎日（連続５日、その後２日は投与休み）経口（ｐｏ）処置した。化合物４０１は、８％のｇｅｌｕｃｉｒｅおよび２０％ビタミンＥ中に２０ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計１５用量の化合物４０１またはビヒクル対照を与えた。腫瘍を、処置期間中を通して測定した。表１６に示すように、単剤療法としての２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１の経口投薬は、腫瘍の成長を強力に阻害した。化合物４０１の最適な腫瘍の成長阻害は６６％であると計算され、ｐ値は０．００６８であった。ビヒクルまたは２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１のｐｏ投与による、体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、化合物４０１をヒト乳癌のこのモデルにおいて有効である投与計画において、安全に投薬できることを示唆する。
【０１５７】
前立腺癌異種移植モデル。ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（８×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した場合に、動物を、２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照を用いて、毎日腹腔内（ｉｐ）処置した。化合物４０１は、２％の脂質、０．１％コレステロールおよびＨ２Ｏ中に５ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計３０用量の化合物４０１またはビヒクル対照を与えた。腫瘍を、処理期間中を通して測定した。表１７に示すように、単剤療法としての２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１のｉｐ投薬は、腫瘍の成長を阻害した。化合物４０１の最適な腫瘍の成長阻害は５５％であると計算され、ｐ値は０．０１５であった。ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１のｉｐ投与による、体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、化合物４０１を、ヒト前立腺癌のこのモデルにおいて有効である投与計画において、安全に投薬できることを示唆する。
【０１５８】
胃癌異種移植モデル。ＭＫＮ−４５ヒト胃癌細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（８×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。腫瘍がおよそ１８０ｍｍ３に達した場合に、動物に、２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照を毎日経口（ｐｏ）投与した。化合物４０１は、８％のｇｅｌｕｃｉｒｅおよび２０％ビタミンＥ中に２０ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計２０用量の化合物４０１またはビヒクル対照を与えた。腫瘍を、処置期間中を通して測定した。表１８に示すように、単剤療法として２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１を用いた経口投薬は、腫瘍の成長を阻害した。化合物４０１の最適な腫瘍の成長阻害は７０％であると計算され、ｐ値は０．０１であった。ビヒクルまたは２００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１の経口投与による、体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、化合物４０１を、ヒト胃癌のこのモデルにおいて有効である投与計画において、安全に投薬できることを示唆する。
【０１５９】
肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）異種移植モデル。ＨｅｐＧ２ヒト肝癌（ｌｉｖｅｒ
ｃａｎｃｅｒ）細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの皮下に接種し（８×１０６細胞／マウス）、触知可能な腫瘍を形成させた。この研究において、腫瘍がおよそ７００ｍｍ３に達した場合に投薬を始めた。動物を、１０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１またはビヒクル対照を用いて毎日静脈内（ｉｖ）処置した。化合物４０１は、１．５％のアルブミン中に２ｍｇ／ｍｌで調合した。動物に、計１０用量の化合物４０１またはビヒクル対照を与えた。腫瘍を、処置期間中を通して測定した。表１９に示すように、腫瘍成長の非常に後期のステージにおいて処置を開始しても、単剤療法として１０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１を用いたｉｖ処置は、腫瘍の成長をさらに強力に阻害した。化合物４０１の最適な腫瘍の成長阻害は５２．３％であると計算され、ｐ値は０．０５であった。ビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１のｉｖ投与による、体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、化合物４０１をヒト肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）のこのモデルにおいて有効である投与計画において、安全に投薬できることを示唆する。
【０１６０】
（実施例６）
抗転移効力
化合物４０１を、ＩＳＭＳモデルにおいて転移を阻害するその能力に関して、さらに試験した。脾臓内ヌードマウスモデル系（ＩＳＭＳモデル）は、この技術により肝臓に実験的転移を起こすことができるので、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の悪性挙動の研究に適している。このモデルにおいて、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１００万個のＨＴ２９細胞を、ヌードマウスの脾被膜下に注入した。脾臓を、腹膜腔内に元に戻し、切開部を閉じた。瀕死の場合または注入３０日後にマウスを犠牲にした。脾臓および肝臓を取り出し、試験し、腫瘍病巣の数を記録した。マウスを、２つの群に分け、対照群（ｎ＝４）にビヒクルを与え、他の群には２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１を与えた（ｎ＝４）。薬剤を、ｉ．ｓ．注入の２日目から始めて３０日目まで、ｉｐ．を介して５日／週投与した。一次腫瘍および転移肝腫瘍の数を顕微鏡によって評価した。代表的写真を、図２０に示す。ビヒクルを用いた対照群において、脾臓に一次腫瘍の重大な負荷があった（図２０、左上のパネル）。重度の自然発生の肝転移を観察した（図２０、右上のパネル）。化合物４０１による処置は、一次腫瘍病巣の数および自然発生肝転移をかなり減少させた（図２０、下のパネル）。
【０１６１】
（実施例７）
薬物動態および毒性プロファイル
ラットにおいて、化合物４０１の薬物動態分析を実施した。薬物動態評価のために、雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（９ラット／群）に、強制経口投与を介して投薬した。投与容量は、対照品（無菌水中の９％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４および１８％のビタミンＥ  ＴＰＧＳ）、あるいは対照品中の１０または３０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物４０１を含有する調製物を与えた群それぞれに対して１０ｍｌ／ｋｇであった。血液サンプルを、３動物／性別／予備投与ならびに初回投薬後およそ２、４、６、８、１０および２４時間の時点から採取した。血漿を、遠心分離することにより収穫し、−７５°Ｃ±１５°Ｃを維持するように設定された冷凍庫において、分析まで保存した。この研究の生物分析部分は、バリデートされたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して実施した。定量の下限（ＬＬＯＱ）は１０．０ｎｇ／ｍＬであった。図２１に示すように、薬物動態データは、化合物４０１が、８時間まで７μＭの限界濃度を達成し、維持したことを示す。
【０１６２】
これらの用量において、２８日間連続投薬したラットに毒性作用は観察されなかった。このことは、臨床観察、実験室試験、肉眼的および組織学的所見を含んだ。総合的に、これらのデータは、化合物４０１が、選択的抗癌活性に関して所望のＰＫ曝露を達成できることを実証した。
【０１６３】
（実施例８）
スキーム１
【０１６４】
【化９】
2020143135.tif 000023
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＲＴ：室温
２−アセチル−４Ｈ，９Ｈ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン（式４−６の化合物であり、式中、Ｒ１＝Ｒ７＝ＨおよびＲ３＝−ＣＨ３である）の調製
アイスバスにおいて激しく撹拌している、１８．８ｇ（２２ｍｌ、０．２６８ｍｏｌ）の３−ブテン−２−オン（スキーム１の式４−１）の２００ｍｌのペンタン溶液に、５０ｍｌのペンタン中の３９．０ｇの（１２．５４ｍｌ、０．２４４モル）の臭素を、３０分以内にゆっくりと加えた。アイスバスにおいてさらに５分撹拌後、混合物を蒸発させ、大部分のペンタンを除去した。ステップ１の少量の３，４−ジブロモ−２−ブタノン残留物（４−２）を４００ｍｌのＴＨＦに溶解し、その後アイスバスにおいて冷却した。アイスバスにおいて激しく撹拌している溶液に、５０ｍｌのＴＨＦ中の３７．２ｇ（３６．５ｍｌ、０．２４４ｍｏｌ）のＤＢＵを、３０分以内にゆっくりと加えた。大量の塩の沈殿が発生した。混合物を直接次のステップの反応に使用した。３−ブロモ−３−ブテン−２−オン（４−３）の反応混合物に、３８．５ｇ（０．２２０ｍｏｌ）の２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（４−４）を加えた。得られた混合物を、室温のウォーターバスにおいて激しく撹拌した。その後、４４．６ｇ（４３．８ｍｌ、０．２９３ｍｏｌ）のＤＢＵを、混合物に３０分以内にゆっくりと加えた。反応混合物の温度は反応から発生する熱によって上昇し、ウォーターバスに氷を加えることによって３５℃より低く調節した。空気下、室温下で、さらに３時間激しく撹拌した後で、１，８００ｍｌの水を混合物に加えた。得られた混合物を０℃に冷却し、その後ろ過した。ろ過した固体を、５００ｍｌの水、５００ｍｌの５％水性重炭酸ナトリウム、５００ｍｌの１％酢酸および２５０ｍｌの氷冷アセトンで連続して洗浄した。洗浄した固体を、２００ｍｌのギ酸中で再結晶させ、１２ｇの生成物を得、化合物４−６または３−２（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ３＝ＣＨ３、Ｒ７＝Ｈ）の全収率は２２．８％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）δ  ２．６７（ｓ，３Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ−３），７．７９−７．８４（ｍ，２Ｈ），８．２２−８．２８（ｍ，２Ｈ）。
【０１６５】
（実施例９）
スキーム２
化合物のリン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルの調製
【０１６６】
【化１０】
2020143135.tif 000024
ＢＢＩ６００２（２４０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の５０ＴＨＦ溶液に、−７８℃において、リチウムｂｉｓ（トリメチルシリル）アミド溶液（ＴＨＦ中１．０Ｍ、１．２ｍＬ）を加えた。この温度で１時間撹拌後、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。ジメチルクロロホスフェート（２１７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の、５ｍＬＴＨＦ溶液を、その後この混合物に−７８℃において加えた。得られた混合物を撹拌し、室温にゆっくりと温めた。周囲温度で１時間撹拌後、溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮＨ４Ｃｌおよび水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒の蒸発により、粗反応混合物が得られ、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色い固体としてリン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ８．２０−８．２８（ｍ，２Ｈ），７，７８−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），５．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），５．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ）；ＭＳｍ／ｚ３４７．２０（Ｍ−Ｈ）。
【０１６７】
（実施例１０）
スキーム３
化合物のリン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステルの調製
【０１６８】
【化１１】
2020143135.tif 000025
リン酸１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニルエステルジメチルエステル（４０ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）の、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液に、室温においてトリメチルシリルブロミド（７１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温において３時間撹拌し、その後真空下で濃縮した。残留物を、半分取ＨＰＬＣにより精製し、黄色い固体としての生成物、リン酸モノ−［１−（４，９−ジオキソ−３ａ，４，９，９ａ−テトラヒドロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−２−イル）−ビニル］エステルを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８−８．０２（ｍ，２Ｈ），７，５７−７．６２（ｍ，２Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），５．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），５．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）；ＭＳｍ／ｚ３１９．２０（Ｍ−Ｈ）。
【０１６９】
本明細書に引用されているすべての参考文献は、各個々の出版物または特許または特許出願が、あたかもすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのような同じ程度で、適用法により認められる範囲で、そしてすべての目的のためにそれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた出版物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲内において、本明細書は、このような矛盾材料のいずれにも優先する、そして／または勝るよう意図されている。
【０１７０】
本明細書および特許請求の範囲に使用される成分、反応条件、分析結果などの量を表すすべての数字は、「約」という用語によりすべての場合に修飾されていると理解するべきである。したがって、反することを特に明記しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において記載される数値パラメーターは、本発明により得られることを追求される所望の特性に依存して変動可能な近似値である。少なくとも、特許請求の範囲と同等の原理の適用を限定するつもりはないが、各数値パラメーターは、有効数字および普通の丸め法の数字を考慮して解釈されるべきである。
【０１７１】
当業者には明らかなように、本発明の改良および変形は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく実行可能である。本明細書に記載の特定の実施形態は単に例の目的で提示しており、決して限定することを意味するものではない。本明細書および実施例は単なる例示として考えるべきであり、本発明の真の範囲および精神は下記の特許請求の範囲により示されることを意味する。
【０１７２】
【数１】
2020143135.tif 000026
【０１７３】
【数２】
2020143135.tif 000027
【０１７４】
【数３】
2020143135.tif 000028
【０１７５】
【数４】
2020143135.tif 000029
【０１７６】
【数５】
2020143135.tif 000030
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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