(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＧＭ  Ａタンパク質に結合し、それを中和する単離タンパク質、特にモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ＲＧＭ  Ａの受容体及び／又は共受容体へのＲＧＭ  Ａの結合を阻害する能力を有する抗体。以下に限定されないが、多発性硬化症、哺乳動物の脳外傷、脊髄損傷、卒中、神経変性疾患及び統合失調症を含む疾患に罹患しているヒトにおいて、ＲＧＭ  Ａを検出するために及びＲＧＭ  Ａ活性を阻害するために有用である抗体又はその一部。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤ及び１ｘ１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数（両者とも表面プラズモン共鳴により測定）でヒトＲＧＭ  Ａから解離する、結合タンパク質。
【請求項２】
ヒトＲＧＭ  Ａに結合し、標準的インビトロアッセイで測定される場合に、ヒトＲＧＭ  Ａの神経突起伸長阻害活性を中和する、結合タンパク質。
【請求項３】
次のさらなる機能特性：
ラットＲＧＭ  Ａに対する結合、
ヒトＲＧＭ  Ｃに対する結合
ラットＲＧＭ  Ｃに対する結合
の少なくとも１つを有する、請求項１及び請求項２の一項の結合タンパク質。
【請求項４】
ＲＧＭの受容体の少なくとも１つに対するＲＧＭの結合能を調節する、請求項１から請求項３の一項の結合タンパク質。
【請求項５】
ヒトＲＧＭ  Ａの受容体結合ドメインと相互作用する、請求項４の結合タンパク質。
【請求項６】
次の相互作用：
ヒトＢＭＰ−４に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ａの結合
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ｃの結合
ヒトＢＭＰ−２に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合
の少なくとも１つを調節する、請求項４の結合タンパク質。
【請求項７】
ヒト化抗体である、請求項１から請求項６の一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
抗原結合ドメインを含む、請求項１から請求項７の一項に記載の結合タンパク質（該結合タンパク質は、ＲＧＭ分子のエピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、
ＧＴＴＰＤＹ（配列番号５９）、
ＦＱＡＴＨＤＰＬＴ（配列番号６２）、
ＡＲＲＮＥＹＹＧＳＳＦＦＤＹ（配列番号６５）、
ＬＱＧＹＩＰＰＲＴ（配列番号６８）及び
該配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。）。
【請求項９】
抗原結合ドメインを含む結合タンパク質（該結合タンパク質は、ＲＧＭ分子のエピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、
ＧＴＴＰＤＹ（配列番号５９）、
ＦＱＡＴＨＤＰＬＴ（配列番号６２）、
ＡＲＲＮＥＹＹＧＳＳＦＦＤＹ（配列番号６５）、
ＬＱＧＹＩＰＰＲＴ（配列番号６８）及び
該配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。）。
【請求項１０】
配列番号５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６、６７及び該配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲをさらに含む、請求項１から請求項９の一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＣＤＲが、
【表１】
2020018316.tif 000021
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項１０の何れか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
【表２】
2020018316.tif 000022
からなる可変ドメインＣＤＲセット
又は該３つのＣＤＲの少なくとも１つが、親配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列である可変ドメインセット
から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットが、
ＶＨ５Ｆ９セット及びＶＬ５Ｆ９セット及び
ＶＨ８Ｄ１セット及びＶＬ８Ｄ１セット
からなる群から選択される、請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項１から請求項１４の一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
ＶＨ３−４８セット（配列番号１５、１６及び１７）
ＶＨ３−３３セット（配列番号２１、２２及び２３）
ＶＨ３−２３セット（配列番号２４、２５及び２６）
（これらのセットのそれぞれは、
ＪＨ３（配列番号１８）、
ＪＨ４（配列番号１９）、
ＪＨ６（配列番号２０）
から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。）のセットからなる群から選択されるか；又は
Ａ１８セット：（配列番号２７、２８及び２９）
Ａ１７セット：（配列番号３１、３２及び３３）
（これらのセットのそれぞれは、ＪＫ２（配列番号２）から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。）のセットからなる群から選択される、
フレームワーク配列のセットを含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２及び４３から選択される少なくとも１つの重鎖可変ドメイン；及び／又は配列番号４４、４５及び４６から選択される少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から請求項１７の何れか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
２つの可変ドメインを含み、該２つの可変ドメインが、
配列番号３５及び４４；３６及び４４；３７及び４４；３８及び４４；３９及び４４；４０及び４４；４１及び４４；４２及び４４；４３及び４４；
配列番号３５及び４５；３６及び４５；３７及び４５；３８及び４５；３９及び４５；４０及び４５；４１及び４５；４２及び４５；４３及び４５；
配列番号３５及び４６；３６及び４６；３７及び４６；３８及び４６；３９及び４６；４０及び４６；４１及び４６；４２及び４６；４３及び４６
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８の結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
ＲＧＭエピトープと相互作用可能な残基；
ＣＤＲと相互作用可能な残基；
カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；
パラグルタミン酸（ｐａｒａｇｌｕｔａｍａｔｅ）形成が可能なＮ末端残基；及び
Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔにより定義された第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域中の残基
からなる群から選択される、請求項１５から請求項１９の何れか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
前記キーとなる残基が、
（重鎖配列位置）：１、５、３７、４８、４９、８８、９８
（軽鎖配列位置）：２、４、４１、５１
からなる群から選択される、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項１から請求項２１の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、ならびに該ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも７０アミノ酸残基を含む、請求項１５から請求項２２の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項２４】
配列番号４７、４８、４９、５０；
配列番号５１、５２、５３及び５４
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの（フレームワークが突然変異した）可変ドメインを含む、請求項１から請求項２３の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項２５】
２つの可変ドメインを含み、該２つの可変ドメインが、
配列番号４７及び４４；４７及び４５；４７及び４６；４７及び５１；４７及び５２；４７及び５３；４７及び５４；
配列番号４８及び４４；４８及び４５；４８及び４６；４８及び５１；４８及び５２；４８及び５３；４８及び５４；
配列番号４９及び４４；４９及び４５；４９及び４６；４９及び５１；４９及び５２；４９及び５３；４９及び５４；
配列番号５０及び４４；５０及び４５；５０及び４６；５０及び５１；５０及び５２；５０及び５３；５０及び５４
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４の結合タンパク質。
【請求項２６】
ＲＧＭ分子から選択される標的に結合することができる、請求項１から請求項２５の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項２７】
ヒトＲＧＭ  Ａに結合することができる、請求項１から請求項２６の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項２８】
次のさらなる機能特性：
ラットＲＧＭ  Ａに対する結合、
ヒトＲＧＭ  Ｃに対する結合、
ラットＲＧＭ  Ｃに対する結合
の少なくとも１つを有する、請求項２７の結合タンパク質。
【請求項２９】
ＲＧＭ分子から選択される標的の生物学的機能を調節することができる、請求項１から請求項２８の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項３０】
ＲＧＭの受容体の少なくとも１つへのＲＧＭの結合能を調節する、請求項２９の結合タンパク質。
【請求項３１】
次の相互作用：
ヒトＢＭＰ−４に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ｃの結合、
ヒトＢＭＰ−２に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合
の少なくとも１つを調節する、請求項３０の結合タンパク質。
【請求項３２】
ＲＧＭ生物活性を阻害することができる、請求項１から請求項３１の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項３３】
ＲＧＭ分子がＲＧＭ  Ａである、請求項３２の結合タンパク質。
【請求項３４】
ＲＧＭ  Ａが、ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚から選択される、請求項３３の結合タンパク質。
【請求項３５】
少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１及び少なくとも約１０７Ｍ−１ｓ−１（表面プラズモン共鳴により測定される場合）からなる群から選択される前記標的に対する会合速度定数（ｋｏｎ）を有する、請求項１から請求項３４の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項３６】
最大約１０−２ｓ−１；最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；及び最大約１０−６ｓ−１（表面プラズモン共鳴により測定される場合）からなる群から選択される前記標的に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有する、請求項１から請求項３５の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項３７】
最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ；及び最大１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的に対する解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１から請求項３６の何れか一項の結合タンパク質。
【請求項３８】
リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項１から請求項３７の何れか一項に記載の結合タンパク質を含む抗体コンストラクト。
【請求項３９】
前記結合タンパク質が、
免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
ＣＤＲグラフト抗体、
ヒト化抗体、
Ｆａｂ、
Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、
Ｆｖ、
ジスルフィド結合Ｆｖ、
ｓｃＦｖ、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多特異性抗体、
二重特異性抗体、
二重可変ドメイン免疫グロブリン及び
二特異性抗体
からなる群から選択される、請求項３８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４０】
前記結合タンパク質が、
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、
ヒトＩｇＥ定常ドメイン、
ヒトＩｇＤ定常ドメイン、
ヒトＩｇＡ１定常ドメイン
ヒトＩｇＡ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＹ定常ドメイン及び
対応する突然変異したドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項３８及び請求項３９の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４１】
配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項３８から請求項４０の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４２】
免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性剤からなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項３８から請求項４１の何れか一項に記載の抗体コンストラクトを含む抗体複合体。
【請求項４３】
前記作用物質が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生体発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である、請求項４２に記載の抗体複合体。
【請求項４４】
前記造影剤が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である、請求項４３に記載の抗体複合体。
【請求項４５】
前記作用物質が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性剤である、請求項４３に記載の抗体複合体。
【請求項４６】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを保持する、請求項３８から請求項４１の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４７】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを保持する、請求項４２から請求項４５の何れか一項に記載の抗体複合体。
【請求項４８】
結晶として存在する、請求項１から請求項３７の何れか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項４９】
結晶として存在する、請求項３８から請求項４１の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５０】
前記抗体コンストラクトが結晶として存在する、請求項４２から請求項４５の何れか一項に記載の抗体複合体。
【請求項５１】
前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項４８に記載の結合タンパク質。
【請求項５２】
前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項４９に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５３】
前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項５０に記載の抗体複合体。
【請求項５４】
可溶性形態の対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項４８に記載の結合タンパク質。
【請求項５５】
可溶性形態の対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項４９に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５６】
可溶性形態の対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項５０に記載の抗体複合体。
【請求項５７】
生物活性を保持する、請求項４８に記載の結合タンパク質。
【請求項５８】
生物活性を保持する、請求項４９に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５９】
生物活性を保持する、請求項５０に記載の抗体複合体。
【請求項６０】
請求項１から請求項３７の何れか一項の結合タンパク質アミノ酸配列をコードする単離核酸。
【請求項６１】
請求項３８から請求項４１の何れか一項の抗体コンストラクトアミノ酸配列をコードする単離核酸。
【請求項６２】
請求項４２から請求項４５の何れか一項の抗体複合体アミノ酸配列をコードする単離核酸。
【請求項６３】
請求項６０から請求項６２の何れか一項に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項６４】
ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐＨｙｂＥ及びｐＢＪからなる群から選択される、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６５】
請求項６３及び請求項６４の何れか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６６】
原核細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
Ｅ．コリである、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
真核細胞である、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項６９】
前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項６８に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及び酵母細胞から選択される、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
昆虫Ｓｆ９細胞である、請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
ＲＧＭに結合することができる結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で請求項６５から請求項７３の何れか一項の宿主細胞を培養することを含む、ＲＧＭに結合することができるタンパク質を産生させる方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法に従い産生される、タンパク質。
【請求項７６】
（ａ）処方物（該処方物は、請求項４８から請求項５０の何れか一項に記載の結晶化生成物タンパク質を含む。）及び成分と、
（ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体と、
を含む、結合タンパク質の放出のための組成物。
【請求項７７】
前記ポリマー性担体が、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリルレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン]、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、その混合物及びコポリマーからなる群の１以上から選択されるポリマーである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記成分が、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７９】
請求項７７及び請求項７８の何れか一項に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法。
【請求項８０】
請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項８１】
前記医薬的に許容可能な担体が、前記結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるために有用なアジュバントとして機能する、請求項８０の医薬組成物。
【請求項８２】
前記アジュバントがヒアルロニダーゼである、請求項８１の医薬組成物。
【請求項８３】
ＲＧＭ活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬剤をさらに含む、請求項８２の医薬組成物。
【請求項８４】
前記さらなる薬剤が、治療薬、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤；キナーゼ阻害剤；副刺激分子ブロッカー；接着分子ブロッカー；抗サイトカイン抗体又はその機能断片；メトトレキセート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能標識又はレポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ剤；筋弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋ブロッカー、抗菌剤、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫付与、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充剤、放射性医薬品、抗うつ剤、抗精神病薬、興奮剤、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン又は類似物質、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される、請求項８３の医薬組成物。
【請求項８５】
ヒトＲＧＭ  Ａ活性が低下するように、請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物とヒトＲＧＭ  Ａを接触させることを含む、ヒトＲＧＭ  Ａ活性を低下させるための方法。
【請求項８６】
ネオゲニン受容体へのｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に、請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体へのｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法。
【請求項８７】
骨形成タンパク質−２及び骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）へのｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に、請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−２及び骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）へのｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法。
【請求項８８】
請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、投与する段階を含む、ＲＧＭ  Ａ活性に関与する疾患に対して対象を治療する方法。
【請求項８９】
請求項１から請求項５９の何れか一項の生成物を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、該対象においてＲＧＭ  Ａ活性を低下させるための方法。
【請求項９０】
疾患が、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、脳損傷（外傷性脳損傷を含む。）、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、卒中、横断性脊髄炎；認知症、老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、運動亢進、そう病、パーキンソン病、スティール−リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血Ｉ、脳炎、急性混乱障害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障及びアルツハイマー病を含む群から選択される神経学的疾患を含む、請求項８９の方法。
【請求項９１】
請求項１から請求項５１の何れか１項で定義されるような結合タンパク質の単離ＣＤＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本願は、ＲＧＭ  Ａへの結合能を有し、ＲＧＭ  Ａ受容体及びその他のＲＧＭ  Ａ結合タンパク質へのＲＧＭタンパク質の結合を妨害し、従ってＲＧＭ  Ａの機能を中和する、ＲＧＭ  Ａ結合タンパク質、特にモノクローナル抗体及び特にそのＣＤＲグラフト、ヒト化形態を記載する。これらの抗体は、以下に限定されないが、多発性硬化症、哺乳動物の脳外傷、脊髄損傷、卒中、神経変性疾患及び統合失調症を含むいくつかの状況の治療において有用性があり得る。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）内での、損傷後又は炎症性攻撃後又は神経変性疾患後の軸索再生は、殆どの場合不可能であり、その転帰は、ＣＮＳにおける神経繊維の固有の再成長能と、病変又は損傷部位の微小環境に局在するＣＮＳ内の阻害性因子との間のバランスに依存し、この阻害性因子は、再成長、従って損傷を受けた繊維路の再生を積極的に妨害する。
【０００３】
インビトロならびインビボで成長円錐虚脱及び神経突起成長阻害を引き起こし、それにより結果的に軸索再成長を直接阻害することから、乏突起膠細胞及び病変瘢痕により生成されるＣＮＳミエリンは、損傷初期における軸索成長に対する最も重要な非許容構造であることが立証されている。ＣＮＳミエリン及び瘢痕組織における主要な阻害性因子であるＲＧＭタンパク質が同定されている（Ｍｏｎｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：３９２−３９５、２００２；Ｓｃｈｗａｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２：１５６１−８、２００５ａ；Ｓｃｈｗａｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１５６９−７６、２００５ｂ；Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６；概説としては：Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１７：２９−３４、２００７を参照。）。ＲＧＭタンパク質は、脳外傷又は虚血性傷害で死亡したヒトの損傷又は病変部位で上方制御され（Ｓｃｈｗａｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２：１５６１−８、２００５ａ）、脊髄損傷のあるラットの病変部位で上方制御される（Ｓｃｈｗａｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１５６９−７６、２００５ｂ；Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６、概説については：Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１７：２９−３４、２００７を参照。）。さらに、多発性硬化症患者及び健常者からの臨床試料を用いた最初のデータから、ＭＳに罹患している患者の脳脊髄液中でヒトＲＧＭ  Ａが上方制御されることが示唆される（データは示さず。）。
【０００４】
ＲＧＭ  Ａ特異的ポリクローナル抗体の再生促進能を評価するために、第９／１０胸椎レベルの脊髄のおよそ６０％が離断された脊髄損傷の中度から重度モデルにこの抗体を投与した。組織学的検査から、このような損傷により、皮質脊髄路の全ての背外側繊維が切断されたことが明らかになった。２週間にわたりポンプを介して局所的に投与されたＲＧＭ  Ａ−特異的ポリクローナル抗体により、損傷を受けた神経繊維の長距離の再生が誘導された（Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６）。
【０００５】
幾百もの神経繊維が病変部位を越えて伸長し、最長繊維は、病変部を１０ｍｍ超越えて再生したが、一方、対照の抗体処理動物では病変部より遠位で再生繊維は見られなかった。対照抗体処理した脊髄損傷ラットと比較して、抗ＲＧＭ  Ａ処置ラットの機能回復が顕著に向上し、それにより、ＲＧＭ  Ａが強力な神経再生阻害物質であり、軸索損傷又は神経繊維損傷を特徴とする指標において回復を刺激するための有益な標的であることが証明される（Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６；Ｋｙｏｔｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１８６：７４−８６、２００７）。さらに、機能を阻止するポリクローナル抗体でＲＧＭ  Ａタンパク質を中和することによって、脊髄損傷ラットでの損傷神経繊維の再成長が刺激されるだけでなく、それらのシナプス形成が促進され、それにより、損傷を受けた神経回路の再形成又は回復が可能になる（Ｋｙｏｔｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１８６：７４−８６、２００７）。
【０００６】
ｒｇｍ遺伝子ファミリーは、３つの異なる遺伝子を包含し、これらのうち２つ、即ちｒｇｍ  ａ及びｂは、ＲＧＭ  Ａ及びＲＧＭ  Ｂタンパク質が由来する哺乳動物ＣＮＳで発現され、一方、第三のメンバーであるｒｇｍ  ｃは、末梢で発現され（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６）、ここで、ＲＧＭ  Ｃは鉄代謝において重要な役割を果たす。ＲＧＭ  Ａは、インビトロで、ＲＧＭ受容体として同定されているネオゲニンに結合することにより神経突起伸長を阻害する（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．：６（８）、７５６−６２、２００４）。ネオゲニンは、最初にネトリン−結合タンパク質として記載された（Ｋｅｉｎｏ−Ｍａｓｕら、Ｃｅｌｌ、８７（２）：１７５−８５、１９９６）。ネオゲニン又はその近縁の受容体ＤＣＣ（結腸直腸癌で欠損）に対するネトリン−１の結合により、神経突起成長を阻害するのではなく、刺激することが報告されているので、これは重要な知見である（Ｂｒａｉｓｔｅｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：５７９２−８０１、２０００）。従って、ＲＧＭ  Ａを阻止することによって、ネオゲニンがその神経突起成長刺激性リガンド、ネトリンに結合できるようにすることにより、ＲＧＭ介在性の成長阻害が解除される。これらの観察に基づき、ＲＧＭ  Ａの中和は、ヒト脊髄損傷モデルでのネオゲニンの中和よりも優れていると評価され得る。ネオゲニンへのＲＧＭ  Ａの結合及び神経突起成長阻害の誘導の他に、骨形成タンパク質ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４へのＲＧＭ  Ａ又はＢの結合は、神経再生及び機能回復の成功に対して同様の障害となり得る（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｎｎｉｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９、２００２年、ｐ．３９２−３９５
【非特許文献２】Ｓｃｈｗａｂ他、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２、２００５年、ｐ．１５６１−８、
【非特許文献３】Ｓｃｈｗａｂ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、２００５年、ｐ．１５６９−７６
【非特許文献４】Ｈａｔａ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３、２００６年、ｐ．４７−５８
【非特許文献５】Ｍｕｅｌｌｅｒ他、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１、２００６年、ｐ．１５１３−２９
【非特許文献６】Ｙａｍａｓｈｉｔａ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１７、２００７年、ｐ．２９−３４
【非特許文献７】Ｋｙｏｔｏ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１８６、２００７年、ｐ．７４−８６
【非特許文献８】Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．：６（８）、２００４年、ｐ．７５６−６２
【非特許文献９】Ｋｅｉｎｏ−Ｍａｓｕ他、Ｃｅｌｌ、８７（２）、１９９６年、ｐ．１７５−８５
【非特許文献１０】Ｂｒａｉｓｔｅｄ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０、２０００年、ｐ．５７９２−８０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当技術分野で、ＲＧＭ  Ａに結合し得る改善された抗体、好ましくはＲＧＭ  Ａを遮断し、ＲＧＭ  Ａとその受容体及び／又は結合タンパク質、即ちネオゲニン及びＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４との間の相互作用を妨害するモノクローナル抗体が当技術分野で必要とされている。
【０００９】
本願は、（ａ）ＲＧＭ  Ａの受容体ネオゲニンへ及び骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）へのＲＧＭ  Ａの結合を選択的に阻害する、ＲＧＭ  Ａに対する中和モノクローナル抗体の生成及び（ｂ）骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）へのＲＧＭ  Ａの結合を選択的に阻害する、ＲＧＭ  Ａに対する中和モノクローナル抗体の生成を提供する。神経細胞がＲＧＭ  Ａ基質において移動及び伸長し易く、コラーゲンＩのような許容基質（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ではそうではない条件下で、本発明の中和モノクローナル抗体の１つは、ＲＧＭ  Ａの阻害的性質を転換すると思われるので、本発明の中和モノクローナル抗体は、損傷を受けたか又は障害された神経繊維の再成長及び再生する神経繊維の機能的シナプスの形成を刺激すると予想される。さらに、この抗体は、視神経損傷のインビボラットモデルで長距離再生を誘導することができ、これはまた、損傷を受け再生している神経繊維の再ミエリン形成も促進する。
【００１０】
従って、本発明の中和モノクローナル抗体は、損傷を受け、炎症を起こしたヒトＣＮＳにおいて、例えば多発性硬化症において、急性脊髄損傷、脳外傷後、又は例えばハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患において、障害されるか又は破壊されたニューロン結合の神経再生及び再成長を促進することが予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
ある態様によると、本発明は、１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤ及び１ｘ１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数（両者とも表面プラズモン共鳴により測定）でヒトＲＧＭ  Ａから解離する結合タンパク質を提供する。
【００１２】
別の態様によると、本発明は、ヒトＲＧＭ  Ａに結合し、例えば、下記実施例３で例示されるとおりのＮｔｅｒａ神経伸長アッセイのような標準的インビトロアッセイで測定される場合に、例えば上記の速度論的特性を示す結合タンパク質のような、ヒトＲＧＭ  Ａの神経突起伸長阻害活性を中和する、結合タンパク質に関する。
【００１３】
本発明はまた、次のさらなる機能特性の少なくとも１つ：
ラットＲＧＭ  Ａへの結合、
ヒトＲＧＭ  Ｃへの結合及び
ラットＲＧＭ  Ｃへの結合
を有する、上記で定義されるとおりの結合タンパク質にも関する。
【００１４】
特に、本明細書中に記載のような結合タンパク質は、その受容体の少なくとも１つへのＲＧＭの結合能を調節する。
【００１５】
このような結合タンパク質は、特に、ヒトＲＧＭ  Ａの受容体結合ドメインに結合する。ＲＧＭ  Ａに対して、Ｎ及びＣ末端受容体結合ドメインが同定されている。本発明の結合タンパク質の特定の実施形態は、例えば４７−１６８のようなＮ末端ｈＲＧＭ  Ａ断片とネオゲニン及びＢＭＰ−４のような受容体分子との間の結合の阻害により説明されるように、ＲＧＭ  ＡのＮ末端受容体結合ドメインに結合する。このＮ末端ｈＲＧＭ  Ａ断片の全長は、約３０から約１５０又は約３０から約１２２アミノ酸残基であり得る。非限定例として、本明細書中で記載のようなｈＲＧＭ  Ａの断片０（Ｎ末端残基４７−１６８に対応）又は何らかのより短い受容体結合断片を挙げ得る。
【００１６】
特に、この結合タンパク質は、次の相互作用の少なくとも１つ：
ヒトＢＭＰ−４へのヒトＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンへのｈＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンへのｈＲＧＭ  Ｃの結合、
ヒトＢＭＰ−２へのヒトＲＧＭ  Ａの結合、
を調節、好ましくは阻害する。
【００１７】
特定の実施形態によると、本明細書中で定義されるような結合タンパク質はヒト化抗体である。
【００１８】
上記に記載のような結合タンパク質は、抗原結合ドメインを有し得、この結合タンパク質はＲＧＭ分子のエピトープに結合することができ、この抗原結合ドメインは、
ＧＴＴＰＤＹ（配列番号５９）、
ＦＱＡＴＨＤＰＬＴ（配列番号６２）、
ＡＲＲＮＥＹＹＧＳＳＦＦＤＹ（配列番号６５）、
ＬＱＧＹＩＰＰＲＴ（配列番号６８）及び
該配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明は、抗原結合ドメインを含む結合タンパク質（該結合タンパク質は、ＲＧＭ分子のエピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、
ＧＴＴＰＤＹ（配列番号５９）、
ＦＱＡＴＨＤＰＬＴ（配列番号６２）、
ＡＲＲＮＥＹＹＧＳＳＦＦＤＹ（配列番号６５）、
ＬＱＧＹＩＰＰＲＴ（配列番号６８）及び
該配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性など、を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。）に関する。
【００１９】
例えば、この結合タンパク質は、前記のＣＤＲのうち２つ、例えば配列番号５９及び６２；又は配列番号６５及び６８などを含み得；これらのＣＤＲのうち少なくとも１つが修飾され得、前記の配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％同一など、を有する。
【００２０】
この結合タンパク質は、配列番号５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６、６７及び、この配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性など、を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲをさらに含み得る。
【００２１】
別の実施形態において、この少なくとも１つのＣＤＲが、
【００２２】
【表１】
2020018316.tif 000002
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合タンパク質が提供される。
【００２３】
特定の実施形態において、この結合タンパク質は、
【００２４】
【表２】
2020018316.tif 000003
からなる可変ドメインＣＤＲセット
又は表２の３つのＣＤＲの少なくとも１つが、親配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性など、を有する修飾ＣＤＲアミノ酸配列である可変ドメインセット
から選択される、少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【００２５】
特に、この上述の修飾のそれぞれは、１個又は複数のアミノ酸付加、欠失もしくは特に置換又はこれらの組み合わせによりもたらされ得る。
【００２６】
別の実施形態において、この結合タンパク質は、少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む。
【００２７】
特に、この少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットは、
ＶＨ５Ｆ９セット及びＶＬ５Ｆ９セット；及び
ＶＨ８Ｄ１セット及びＶＬ８Ｄ１セット
からなる群から選択される。
【００２８】
本発明による結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。
【００２９】
このヒトアクセプターフレームワークは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００３０】
本発明の結合タンパク質は、特に、セット：
（１）
ＶＨ３−４８セット（配列番号１５、１６及び１７）
ＶＨ３−３３セット（配列番号２１、２２及び２３）
ＶＨ３−２３セット（配列番号２４、２５及び２６）（これらのセットのそれぞれは、
ＪＨ３（配列番号１８）
ＪＨ４（配列番号１９）
ＪＨ６（配列番号２０）
から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。）
からなる群から選択されるか；又は
（２）
Ａ１８セット：（配列番号２７、２８及び２９）
Ａ１７セット：（配列番号３１、３２及び３３）（これらのセットのそれぞれは、ＪＫ２（配列番号２）から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。）
からなる群から選択される、フレームワーク配列の少なくとも１つのセットを含み得る。
【００３１】
特定の実施形態によると、先行する請求項の何れか一項に記載の結合タンパク質は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２及び４３から選択される少なくとも１つのＣＤＲグラフト重鎖可変ドメイン；及び／又は配列番号４４、４５及び４６から選択される少なくとも１つのＣＤＲグラフト軽鎖可変ドメインを含む。
【００３２】
とりわけ、本発明の結合タンパク質は、２つの可変ドメインの組み合わせを含み、この２つの可変ドメインは、
配列番号３５及び４４；３６及び４４；３７及び４４；３８及び４４；３９及び４４；４０及び４４；４１及び４４；４２及び４４；４３及び４４；
配列番号３５及び４５；３６及び４５；３７及び４５；３８及び４５；３９及び４５；４０及び４５；４１及び４５；４２及び４５；４３及び４５；
配列番号３５及び４６；３６及び４６；３７及び４６；３８及び４６；３９及び４６；４０及び４６；４１及び４６；４２及び４６；４３及び４６
から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、結合タンパク質のこのヒトアクセプターフレームワークは、キーとなる残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このキーとなる残基は、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
ＲＧＭエピトープと相互作用可能な残基；
ＣＤＲと相互作用可能な残基；
カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；
パラグルタミン酸（ｐａｒａｇｌｕｔａｍａｔｅ）形成が可能なＮ末端残基及び
Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔにより定義された第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域中の残基
からなる群から選択される。
【００３４】
特に、このキーとなる残基は、
（重鎖配列位置）：１、５、３７、４８、４９、８８、９８
（軽鎖配列位置）：２、４、４１、５１
からなる群から選択される。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変ドメインであるか又はこれを含む。
【００３６】
本発明の結合タンパク質の別の実施形態によると、このヒトアクセプターフレームワークは少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このフレームワークのアミノ酸配列は、このヒトアクセプターフレームワークの配列と、少なくとも６５％、例えば少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％、同一であり、このヒトアクセプターフレームワークと同一である、少なくとも７０アミノ酸残基、例えば少なくとも７５、８０又は８５残基、を含む。
【００３７】
特定の実施形態によると、本発明の結合タンパク質は、
配列番号４７、４８、４９、５０；（ＶＨドメイン）からなる群から選択される及び／又は配列番号５１、５２、５３及び５４（ＶＬドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのフレームワーク突然変異可変ドメインを含む。
【００３８】
特に、この結合タンパク質は、２つの、場合によってはフレームワークが突然変異した可変ドメインを含み、この２つの可変ドメインは、
配列番号４７及び４４；４７及び４５；４７及び４６；４７及び５１；４７及び５２；４７及び５３；４７及び５４；
配列番号４８及び４４；４８及び４５；４８及び４６；４８及び５１；４８及び５２；４８及び５３；４８及び５４；
配列番号４９及び４４；４９及び４５；４９及び４６；４９及び５１；４９及び５２；４９及び５３；４９及び５４；
配列番号５０及び４４；５０及び４５；５０及び４６；５０及び５１；５０及び５２；５０及び５３；５０及び５４
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３９】
本明細書中で記載されるような本発明の結合タンパク質は、ＲＧＭ分子から選択される少なくとも１つの標的に結合することができる。
【００４０】
特に、これらは、ヒトＲＧＭ  Ａ及び場合によっては少なくとも１つのさらなるヒト由来のＲＧＭ分子又はカニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚由来のものに結合し得る。
【００４１】
例えば、これらは、ラットＲＧＭ  Ａ、ヒトＲＧＭ  Ｃ及び／又はラットＲＧＭ  Ｃにさらに結合し得る。
【００４２】
特に、本発明の結合タンパク質は、上記で定義されるようなＲＧＭ分子から選択される標的の生物学的機能を調節することができ、特に中和又は阻害することができる。
【００４３】
特に、本発明の結合タンパク質は、ＲＧＭ受容体の少なくとも１つ、例えばネオゲニン及びＢＭＰ（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４など）に対するＲＧＭの結合能を調節、特に阻害する。
【００４４】
例えばこの結合タンパク質は、次の相互作用：
ヒトＢＭＰ−４に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ａの結合、
ヒトネオゲニンに対するｈＲＧＭ  Ｃの結合、
ヒトＢＭＰ−２に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合
の少なくとも１つを調節、特に抑制、及び好ましくは阻害する。
【００４５】
本明細書中で開示されるような、機能特性の様々な組み合わせを有し、結果として様々な機能プロファイルを示す結合タンパク質もまた本発明の範囲内である。このようなプロファイルの非限定例を下記で挙げる：
【００４６】
【表３】
2020018316.tif 000004
例えば、プロファイル１は、本発明により提供されるような抗体５Ｆ９及び本明細書中に記載のその誘導体に対応する。
【００４７】
例えば、プロファイル２は、本発明により提供されるような抗体８Ｄ１及び本明細書中に記載のようなその誘導体に対応する。
【００４８】
特に、本発明の結合タンパク質は、ＲＧＭ、特に、ＲＧＭ  Ａの少なくとも１つの生物活性を阻害することができ、このＲＧＭ  Ａは、ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚から選択される。
【００４９】
別の実施形態によると、本発明の結合タンパク質は、次の速度論的特性：
（ａ）少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１及び少なくとも約１０７Ｍ−１ｓ−１（表面プラズモン共鳴により測定される場合）からなる群から選択される前記の標的に対する会合速度定数（ｋｏｎ）；
（ｂ）最大約１０−２ｓ−１；最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；及び最大約１０−６ｓ−１（表面プラズモン共鳴により測定される場合）からなる群から選択される前記の標的に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）又は
（ｃ）最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ；及び最大１０−１３Ｍからなる群から選択される前記の標的に対する解離定数（ＫＤ）
の１以上を有する。
【００５０】
さらなる態様によると、本発明は、上記の結合タンパク質を含み、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、抗体コンストラクトを提供する。
【００５１】
本発明の抗体コンストラクト又は結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン免疫グロブリン及び二特異性抗体からなる群から選択され得る。
【００５２】
本発明による抗体コンストラクトにおいて、この結合タンパク質は、
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、
ヒトＩｇＥ定常ドメイン、
ヒトＩｇＤ定常ドメイン、
ヒトＩｇＡ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＡ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＹ定常ドメイン及び
対応する突然変異定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【００５３】
特に、本発明による抗体コンストラクトは、配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【００５４】
別の態様によると、本発明は、本明細書中に記載の抗体コンストラクトを含み、免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性剤（これらの作用物質のそれぞれは、前記の結合タンパク質に結合、例えば共有結合されている。）からなる群から選択される作用物質をさらに含む、抗体複合体を提供する。
【００５５】
例えば、この作用物質は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生体発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である。特に、この造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である。
【００５６】
例えば、この作用物質は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性剤である。
【００５７】
別の実施形態によると、本明細書中に記載のような本発明の結合タンパク質はヒトグリコシル化パターンを保持する。
【００５８】
さらに、本発明による、結合タンパク質、抗体コンストラクト及び抗体複合体は、好ましくは生物活性を保持する結晶として（結晶形態で）存在し得る。
【００５９】
特に、この結晶は、無担体医薬制御放出結晶である。この結晶形態の観点で、本結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体複合体は、対応する可溶性形態よりも、インビボで長い半減期を有し得る。
【００６０】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のような、結合タンパク質アミノ酸配列、抗体コンストラクトアミノ酸配列及び抗体複合体アミノ酸配列をコードする単離核酸を提供する。
【００６１】
本発明はまた、本明細書中に記載のような単離核酸を含むベクターにも関する。特に、本ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＪからなる群から選択される。
【００６２】
本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞にも関する。特に、この宿主細胞は、例えばＥ．コリのような原核細胞であるか又は真核細胞であり、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択され得る。特に、この真核細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。好ましくは、この宿主細胞は、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及び酵母細胞から選択される。この酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得、この昆虫細胞はＳｆ９細胞であり得る。
【００６３】
本発明はまた、ＲＧＭに結合可能である結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で本明細書中で定義されるような宿主細胞を培養することを含む、ＲＧＭに結合することができるタンパク質を産生させる方法も提供する。
【００６４】
本発明はまた、この方法に従い産生されるタンパク質にも関する。
【００６５】
本発明はまた、
（ａ）処方物（この処方物は、本明細書中で定義されるような結晶化生成物タンパク質を含む。）及び成分と、
（ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体と、
を含む、結合タンパク質の放出のための組成物も提供する。
【００６６】
このポリマー性担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリルレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン]、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、その混合物及びコポリマーからなる群の１以上から選択され得る。
【００６７】
この成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択され得る。
【００６８】
別の態様によると、本発明は、本明細書中で定義されるような組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。
【００６９】
別の態様によると、本発明は、生成物（特に、本明細書中で上述するような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）と医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
【００７０】
この医薬的に許容可能な担体は、本結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるために有用なアジュバントとして機能し得る。
【００７１】
例えばこのアジュバントはヒアルロニダーゼである。
【００７２】
別の実施形態によると、この調合薬は、ＲＧＭ活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬をさらに含む。例えば、この作用物質は、治療薬、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤；キナーゼ阻害剤；副刺激分子ブロッカー；接着分子ブロッカー；抗サイトカイン抗体又はその機能断片；メトトレキセート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能標識又はレポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ剤；筋弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋ブロッカー、抗菌剤、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫付与、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充剤、放射性医薬品、抗うつ剤、抗精神病薬、興奮剤、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン又は類似体、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも１つのヒトＲＧＭ  Ａ活性が低下させられるように、少なくとも１つの生成物（特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）とヒトＲＧＭ  Ａを接触させることを含む、ヒトＲＧＭ  Ａ活性を低下させるための方法にも関する。
【００７４】
本発明はまた、ネオゲニン受容体に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に本発明の生成物（特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体へのｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法にも関する。
【００７５】
本発明はまた、骨形成タンパク質−２及び／又は骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に、本発明の生成物（特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−２及び／又は骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法にも関する。
【００７６】
本発明はまた、本発明の生成物（特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて投与する段階を含む、ＲＧＭ  Ａ活性を伴う疾患に対して対象を治療するための方法にも関する。
【００７７】
本発明はまた、本発明の生成物（特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物）を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患に罹患している対象においてＲＧＭ  Ａ活性を低下させるための方法にも関する。
【００７８】
この疾患は、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、脳損傷（外傷性脳損傷を含む。）、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、卒中、横断性脊髄炎；認知症、老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、多動、そう病、パーキンソン病、スティール・リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血Ｉ、脳炎、急性混乱障害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障及びアルツハイマー病からなる群から選択される神経性疾患を含む。
【００７９】
本発明のさらなる特定の態様は以下に記載する。
【００８０】
ｈＲＧＭ  Ａタンパク質の少なくとも１つのエピトープと特異的に相互作用する単離結合タンパク質；
モノクローナル中和抗体又はその抗原結合断片である、前記単離タンパク質；
ＶＨ及びＶＬドメインを含む、前記抗原結合断片；
ｈＲＧＭ  Ａの、その受容体への結合能を低下させる、前記中和抗体；
ｈＲＧＭ  Ａ生物活性を阻害することができる、前記中和抗体；
ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚から選択されるＲＧＭ  Ａ受容体を認識する、前記抗体；
アミノ酸配列配列番号２と９０％相同性を有するＲＧＭ  Ａタンパク質を認識する、前記抗体；
ＲＧＭ  Ａタンパク質が、核酸配列配列番号１と９０％相同性を有する核酸によりコードされる、前記抗体；
配列番号９もしくは３４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）又は、このＶＨ領域の、ヒト化、場合によってはさらに突然変異した形態を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、前記抗体；
配列番号１０の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）又は、このＶＬ領域の、ヒト化、場合によってはさらに突然変異した形態を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、前記抗体；
ｈＲＧＭ  Ａに結合する、前記抗体（この抗体はグリコシル化されている。）；
マウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト、キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合断片又はキメラ抗体の抗原結合断片である、前記抗体又は抗原結合断片；
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片からなる群から選択される抗原結合断片である、前記抗体又は抗原結合断片；
ｈＲＧＭ  Ａの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する、前記モノクローナル抗体（このモノクローナル抗体は、本明細書中に記載のようなハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体である。）；
結合の結果、ｈＲＧＭ  Ａのその受容体との相互作用が不活性化される、前記モノクローナル抗体；
ｈＲＧＭ  Ａの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ細胞株；
ハイブリドーマが、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、前記ハイブリドーマ細胞株；
結合の結果、ｈＲＧＭ  Ａが不活性化される、前記モノクローナル抗体；
ｈＲＧＭ  Ａの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ細胞株；
ハイブリドーマが、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、前記ハイブリドーマ細胞株；
ａ）ｎＭ範囲以下の親和性で哺乳動物ＲＧＭ  Ａに結合すること；
ｂ）μｍ、ｎＭ以下の効率で神経突起伸長アッセイにおいてインビトロでＲＧＭ  Ａ活性と機能的に拮抗すること；
ｃ）視神経破壊モデルにおいて発芽をインビボで誘導すること；
ｄ）脊髄損傷モデルにおいて発芽をインビボで誘導すること；
ｅ）損傷を受けた神経繊維の再生的成長を促進することによりインビボの実験的脊髄損傷を軽減すること；又は
ｆ）シナプス形成を促進することによりインビボの実験的脊髄損傷を軽減すること
からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、前記モノクローナル中和抗体又はその抗原結合断片；
前記モノクローナル中和抗体又は抗原結合断片をコードする単離核酸；
前記単離核酸を含むベクター；
ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ；ｐＴＴ３；ｐＥＦＢＯＳ；ｐＢＶ；ｐＪＶ；ｐＨｙｂＥ及びｐＢＪからなる群から選択される、前記ベクター；
原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される形態である、前記ベクターにより形質転換される宿主細胞；
動物細胞がＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＣＯＳからなる群から選択される哺乳動物細胞である、宿主細胞；
真核細胞である、請求項２４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞；
ｈＲＧＭ  Ａに結合する結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養することを含む、ｈＲＧＭ  Ａに結合する結合タンパク質を産生させる方法；
前記モノクローナル抗体又は抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物；
ネオゲニン受容体に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に、前記抗体を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法；
骨形成タンパク質−２及び骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させることを必要とする対象に、前記抗体を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−２及び骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）に対するｈＲＧＭ  Ａ結合を減少させるための方法；
前記の抗体を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて投与する段階を含む、ＲＧＭ  Ａ活性を伴う疾患に対して対象を治療する方法；
前記の抗体を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、該対象においてＲＧＭ  Ａ活性を低下させるための方法；
配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２及び４３から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶＨ領域を含む、前記抗体；
配列番号４４、４５及び４６から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶＬ領域を含む、前記抗体；
ＶＨ又はＶＬ配列における１から５個の突然変異によりさらに修飾される、前記抗体；
突然変異が、フレームワーク復帰突然変異及びバーニア及びＶＨ／ＶＬ接触残基の突然変異から選択される、前記抗体；
同様に、本明細書中で開示されるような配列番号３４に対する何れの教示又は参照も配列番号９に対して適用される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、モノクローナル抗体がｈＲＧＭ  Ａに結合することを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、モノクローナル抗体が、ＨＥＫ２９３細胞で発現されるｈＲＧＭ  Ａに結合することを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、モノクローナル抗体が、ＨＥＫ２９３細胞で発現されるラットＲＧＭ  Ａに結合することを示す。
【図２】図２は、全長ＲＧＭ  Ａがネオゲニンに結合することを示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、全長、ｆｃ−連結ｈＲＧＭ  Ａのネオゲニンに対する結合を阻害する。
【図３】図３は、全長ＲＧＭ  ＡがＢＭＰ−４に結合することを示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ｆｃ−連結全長ｈＲＧＭ  Ａ断片（４７−４２２）のＢＭＰ−４に対する結合を阻害する。
【図４】図４は、ＲＧＭ  Ａ断片０がＢＭＰ−４に結合することを示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ｆｃ−連結ｈＲＧＭ  Ａ断片０（４７−１６８）のＢＭＰ−４に対する結合を阻害する。
【図５】図５は、全長ＲＧＭ  ＡがＢＭＰ−２に結合することを示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ｆｃ連結全長ｈＲＧＭ  Ａ断片（４７−４２２）のＢＭＰ−２に対する結合を阻害する。
【図６】図６は、Ｎｔｅｒａ細胞神経突起伸長アッセイでのＲＧＭ  Ａ断片のｍＡｂ  ５Ｆ９による中和を示す顕微鏡写真の組み合わせである。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ヒトＮｔｅｒａ凝集体を用いた神経突起伸長アッセイでのｆｃ−結合した強力なｈＲＧＭ  Ａ阻害物質断片の伸長阻害活性を中和する。Ａ．対照の培養、ラミニンにおける、Ｂ．ラミニン−ｈＲＧＭ  Ａ断片（４７−１６８）基質における、Ｃ．−Ｅ．０．１μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９（Ｃ）、１μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９（Ｄ．）、１０μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９（Ｅ．）存在下での、ラミニン−ｈＲＧＭ  Ａ断片（４７−１６８）基質における、Ｎｔｅｒａニューロンの成長。
【図７】図７は、ＮＴｅｒａ２アッセイ結果の定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ヒトＮｔｅｒａ凝集体を用いた神経突起伸長アッセイにおいて、ｆｃ−結合した強力なｈＲＧＭ  Ａ阻害物質断片（断片０、４７−１６８）の伸長阻害活性を用量依存的に中和する。
【図８Ａ】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙストライプアッセイの定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞の、全長ヒトＲＧＭ  Ａからなるストライプにより誘導される反発を中和する。ＭＡＢ  ５Ｆ９非存在下で（Ａ）又は低ＭＡＢ濃度ＳＨ−ＳＹ５Ｙ存在下で、ニューロンはＲＧＭ  Ａストライプを回避する傾向がある。この挙動は、ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度を上昇させることにより逆転させられる。（ＢからＤ）最大ＭＡＢ濃度（１０μｇ／ｍＬ）において（Ｅ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ＲＧＭ  Ａストライプに対して強い選択性を示す。
【図８Ｂ】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙストライプアッセイの定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞の、全長ヒトＲＧＭ  Ａからなるストライプにより誘導される反発を中和する。ＭＡＢ  ５Ｆ９非存在下で（Ａ）又は低ＭＡＢ濃度ＳＨ−ＳＹ５Ｙ存在下で、ニューロンはＲＧＭ  Ａストライプを回避する傾向がある。この挙動は、ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度を上昇させることにより逆転させられる。（ＢからＤ）最大ＭＡＢ濃度（１０μｇ／ｍＬ）において（Ｅ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ＲＧＭ  Ａストライプに対して強い選択性を示す。
【図８Ｃ】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙストライプアッセイの定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞の、全長ヒトＲＧＭ  Ａからなるストライプにより誘導される反発を中和する。ＭＡＢ  ５Ｆ９非存在下で（Ａ）又は低ＭＡＢ濃度ＳＨ−ＳＹ５Ｙ存在下で、ニューロンはＲＧＭ  Ａストライプを回避する傾向がある。この挙動は、ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度を上昇させることにより逆転させられる。（ＢからＤ）最大ＭＡＢ濃度（１０μｇ／ｍＬ）において（Ｅ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ＲＧＭ  Ａストライプに対して強い選択性を示す。
【図８Ｄ】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙストライプアッセイの定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞の、全長ヒトＲＧＭ  Ａからなるストライプにより誘導される反発を中和する。ＭＡＢ  ５Ｆ９非存在下で（Ａ）又は低ＭＡＢ濃度ＳＨ−ＳＹ５Ｙ存在下で、ニューロンはＲＧＭ  Ａストライプを回避する傾向がある。この挙動は、ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度を上昇させることにより逆転させられる。（ＢからＤ）最大ＭＡＢ濃度（１０μｇ／ｍＬ）において（Ｅ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ＲＧＭ  Ａストライプに対して強い選択性を示す。
【図８Ｅ】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙストライプアッセイの定量分析を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞の、全長ヒトＲＧＭ  Ａからなるストライプにより誘導される反発を中和する。ＭＡＢ  ５Ｆ９非存在下で（Ａ）又は低ＭＡＢ濃度ＳＨ−ＳＹ５Ｙ存在下で、ニューロンはＲＧＭ  Ａストライプを回避する傾向がある。この挙動は、ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度を上昇させることにより逆転させられる。（ＢからＤ）最大ＭＡＢ濃度（１０μｇ／ｍＬ）において（Ｅ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ＲＧＭ  Ａストライプに対して強い選択性を示す。
【図９】図９は、ｍＡＢ  ５Ｆ９及び８Ｄ１結合特性の定量分析をまとめる。ＭＡＢ５ＦｈＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン、ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２及びｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−４結合アッセイにおいて、９及び８Ｄ１を様々な濃度で評価する。
【図１０】図１０は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ化学走性アッセイにおける、ヒト化５Ｆ９抗体（ｈ５Ｆ９．２１、ｈ５Ｆ９．２３、ｈ５Ｆ９．２５）の、ｈＲＧＭ  Ａの化学反発活性に対する中和活性を示す。
【図１１】図１１は、視神経損傷の動物モデルにおける、５Ｆ９局所適用のインビボ神経再生活性を示す。ＭＡＢ  ５Ｆ９の局所適用により、ＲＧＭ  Ａが中和され、視神経破壊ラット動物モデルにおいて障害された視神経軸索の再生伸長が刺激される。５Ｆ９処理動物（Ａ）において、ラットＲＧＭ  Ａに結合しない対照ＭＡＢ８Ｄ１（Ｂ）とは対照的に、多くのＧＡＰ−４３陽性繊維が破壊部位を越えて伸長している。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、視神経損傷の動物モデルにおける５Ｆ９局所適用の定量分析を示す。（Ａ）５Ｆ９によって、再生ＧＡＰ−４３陽性繊維の数が顕著に増加したが、対照ＭＡＢ８Ｄ１では増加しなかった。５Ｆ９処置動物において、２００μｍ、４００μｍ及び６００μｍの距離で、有意に多くの繊維（ｐ＜０．０５）が観察され、１２００μｍでは、５Ｆ９処置動物でのみ繊維が見られ、対象動物では見られず、（Ｂ）５Ｆ９は、視神経損傷部位において、対照抗体８Ｄ１及びビヒクル対照ＰＢＳと比較して、ＧＡＰ−４３陽性面積を有意に増加させた。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、再生伸長面積（ＧＡＰ−４３陽性面積）を測定した。
【図１３】図１３は、視神経損傷の動物モデルにおける、５Ｆ９全身適用のインビボ神経再生活性を示す。それぞれ２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで、第０日及び第２１日に、５Ｆ９で動物を処置した。抗体又はビヒクルを腹腔内又は静脈内投与した。ラット視神経の合成画像。５Ｆ９処理動物において（Ａ）、多くのＧＡＰ−４３陽性繊維は、ＰＢＳ処置対照動物（Ｂ）とは対照的に、破壊部位を越えて伸長している。破壊部位は左端にあり、再生繊維は、ＧＡＰ−４３に対する抗体で染色される。５Ｆ９処理動物の視神経の上下縁で多くの繊維が観察されるが、ＰＢＳ動物では観察されない。
【図１４Ａ】図１４Ａは、視神経損傷の動物モデルにおける、５Ｆ９全身適用の定量分析を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、視神経損傷の動物モデルにおける、５Ｆ９全身適用の定量分析を示す。
【図１５】図１５は、視神経損傷の動物モデルにおける５Ｆ９全身適用のインビボ再ミエリン形成活性を示す。それぞれ２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで、第０日及び第２１日に、５Ｆ９で動物を処置した。抗体又はビヒクルを腹腔内又は静脈内投与した。ラット視神経の合成画像。ミエリンマーカーであるミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰに対する抗体を用いて、ミエリン形成を視覚化する。破壊部位は複合神経の中央部にあり、この領域は、ビヒクル処理対照動物（Ａ及びＢ）にはない。５Ｆ９処理動物（Ｃ及びＤ）において、多くのＭＢＰ陽性構造は、視神経の中央領域（破壊中心）で観察される。
【図１６】図１６は、視神経損傷の動物モデルでの、５Ｆ９の全身適用の再ミエリン形成における定量的影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
（詳細な記述）
本発明は、ＲＧＭ  Ａに結合する、ＲＧＭ  Ａ結合タンパク質、とりわけモノクローナルＲＧＭ  Ａ抗体、特にヒト化モノクローナルＲＧＭ  Ａ抗体、又はその抗原結合部分を記載する。本願の様々な態様は、抗体及び抗体断片及びその医薬組成物、ならびに、このような抗体及び断片を作製するために、核酸、組み換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトＲＧＭ  Ａを検出するために、インビボ又はインビトロの何れかでヒトＲＧＭ及び／又はヒトＲＧＭ  Ａ活性を中和するために、及び遺伝子発現を制御するために、本願の抗体を使用する方法も本発明に包含される。
【００８３】
１．一般的な定義
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の具体的な断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、１単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
【００８４】
一般に、本明細書中に記載の、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来法に従い、本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、行われる。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従い、当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、行われる。本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医学及び製薬化学と関連して使用される命名法及びそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成、化学分析、薬剤調合、処方及び送達ならびに患者の処置に対して標準的技術が使用される。
【００８５】
本発明がより容易に理解され得るように、選択した用語を下記で定義する。
【００８６】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸の何らかのポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語はポリペプチドという用語と交換可能に使用され、また、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブ又は人工タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体性又はポリマー性であり得る。
【００８７】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、誘導物のその起源又は源に基づいて、その生来の状態でそれに付随する天然に会合される成分と会合していないタンパク質又はポリペプチドであるか；同じ種由来のその他のタンパク質を実質的に含まないか；異なる種由来の細胞により発現されるか；又は天然では生じないものである。このようにして、化学的に合成されるか又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然会合成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然会合成分を実質的に含まないようにされているものでもあり得る。
【００８８】
「回収する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が、天然会合成分を実質的に含まないようにされるプロセスを指す。
【００８９】
「ヒトＲＧＭ  Ａ」（本明細書中でｈＲＧＭ  Ａと省略）は、本明細書中で使用される場合、４５０アミノ酸のグリコシルホスファチジル−イノシトール（ｇｐｉ）−アンカー付加糖タンパク質を指し、最初に、トポグラフィック投射（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）の進行中の、神経突起伸長消退物質又は神経突起伸長阻害物質として記載された（Ｓｔａｈｌら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５：７３５−４３、１９９０；Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｘｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｈｕｊｉｓａｗａ編、Ｊａｐａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、２１５−２２９、１９９７）。ｒｇｍ遺伝子ファミリーは、３種類の異なる遺伝子を包含し、それらのうち２つ、ｒｇｍ  ａ及びｂは哺乳動物ＣＮＳで発現され、一方第三のメンバーであるｒｇｍ  ｃは末梢で発現され（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６）、ここで、ｒｇｍ  ｃは鉄代謝において重要な役割を果たす。ヒトＲＧＭタンパク質は、４３％−５０％の配列同一性を有し、ヒト及びラットＲＧＭ  Ａのアミノ酸相同性は８９％である。ヒトＲＧＭタンパク質は、何らかのその他の公知のタンパク質と顕著な配列相同性はない。これらは、ＲＧＤ領域を含有するプロリンに富むタンパク質であり、フォン−ウィルブラント因子ドメインに対して構造的相同性を有し、未知のプロテアーゼによりＮ末端アミノ酸１６８で切断され、機能的活性タンパク質が生じる（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６）。
【００９０】
インビトロで、ＲＧＭ  Ａは、ＲＧＭ受容体として同定されているネオゲニンに結合することによりピコモル濃度で神経突起伸長を阻害する（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．：６（８）、７５６−６２、２００４）。ネオゲニンは、最初に、ネトリン−結合タンパク質として記載されたが（Ｋｅｉｎｏ−Ｍａｓｕら、Ｃｅｌｌ、８７（２）：１７５−８５、１９９６）、ネトリンに対するその親和性（Ｋｄ２ｎＭ）は、ＲＧＭ（Ｋｄ０．２ｎＭ）に対するものよりも小さい桁のものである（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．：６（８）、７５６−６２、２００４）。ネオゲニンに対する又はその近縁受容体ＤＣＣ（結腸直腸癌で欠失）に対するネトリン−１の結合が神経突起伸長を阻害するのではなく刺激することが報告されているので、これは重要な知見である（Ｂｒａｉｓｔｅｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：５７９２−８０１、２０００）。
【００９１】
ネオゲニンへのＲＧＭ  Ａの結合及び神経突起伸長阻害の誘導の他に、骨形成タンパク質ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４に対するＲＧＭ  Ａ又はＢの結合は、神経再生及び機能回復の成功に対する同様の障害となり得る（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１：１５１３−２９、２００６）。タンパク質の両クラス（ネオゲニン及びＢＭＰ）は、２つの完全に異なり独立するシグナル伝達回路を介して、ＲＧＭ  Ａの神経突起成長阻害性シグナルを変換することが報告されている。通常、これらのＢＭＰタンパク質の発現は、成体ＣＮＳの殆どの領域で比較的低いが、損傷及び傷害に応答して、一部のＢＭＰ（例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７）の発現及び蓄積が急激に上昇することが報告されている（Ｌａｉら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２６９１−９４、１９９７；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９４：１−１１、２００１；Ｈａｌｌ及びＭｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７６：１−８、２００４；Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８９：３３−４４、２００４）。さらに、多発性硬化症のモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて、マウス脊髄でＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７が上方制御された（Ａｒａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８６：１２５−３５、２００８）。ＢＭＰ−２は、細胞表面ＲＧＭ  Ａ、ＢＭＰ−受容体Ｉ及びＩＩに結合することによって及びＬＩＭ−キナーゼを直接活性化することによって、神経突起成長を阻害することが報告されており（Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、３６０：８６８−７３、２００７）、従って、ＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２相互作用を阻止することによって、ＣＮＳ損傷後の機能的回復がさらに促進されることが予想される。
【００９２】
上述のように、脊髄損傷ラット及び脳損傷のあるヒトは、損傷部位において細胞性ＲＧＭの大規模な蓄積を示し、脊髄病変部位でのラットにおけるＲＧＭ  Ａの染色パターンは、ヒトでの総ＲＧＭ  抗体染色と非常に類似しており、このことから、ヒトにおける総ＲＧＭ染色の殆どが、ＲＧＭ  Ｂ局在ではなくＲＧＭ  Ａ局在に関連するものであることが示唆される（Ｓｃｈｗａｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２：１５６１−８、２００５ａ；Ｓｃｈｗａｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１５６９−７６、２００５ｂ；Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６）。健康なヒト脳において、白質繊維、乏突起膠細胞、少数のニューロンの周核体、一部の血管平滑筋及び少数の内皮細胞で総ＲＧＭ染色（ＲＧＭ  Ａ及びＢ免疫反応性）が検出された。星状膠細胞の染色は観察されなかった。成人健常ヒト脳のＲＧＭ染色パターンは、成体ラット脊髄で観察される染色パターンと非常に類似している（Ｓｃｈｗａｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１５６９−７６、２００５ｂ；Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６）。
【００９３】
脳及び脊髄損傷での損傷部でのＲＧＭ  Ａの蓄積に基づき、及びその細胞性の神経突起成長阻害活性ゆえに、このタンパク質が神経突起成長阻害活性を発揮し、ヒトＲＧＭ  Ａの少なくとも１つのエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片によるその中和の結果、損傷を受けた神経繊維の再成長が向上し、神経繊維損傷及びＲＧＭ蓄積を特徴とする指標において機能的回復が促進されることが予想される。
【００９４】
別段の断りがない限り、「ＲＧＭ  Ａ」という用語はまた、その他の種、例えばマウス又はラットなどのげっ歯類から単離又は得られたＲＧＭ  Ａ分子、具体的には本明細書中で「ラットＲＧＭ  Ａ」と呼ばれるラット由来分子も包含する。
【００９５】
【表４】
2020018316.tif 000005
【００９６】
「生物活性」は、本明細書中で使用される場合、本明細書中で定義されるようなＲＧＭ  Ａの全ての生来の生物学的特性を指す。
【００９７】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、第二の化学種との抗体、タンパク質又はペプチドの相互作用に関して、相互作用が、その化学種において特定の構造（例えば、下記で定義されるような「抗原決定基」又は「エピトープ」）の存在に依存することを意味し；例えば、抗体は、一般的にタンパク質ではなく特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、エピトープＡ（又は遊離、非標識Ａ）を含有する分子が存在すると、標識された「Ａ」及びその抗体を含有する反応において、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
【００９８】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、広く、４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖から構成される何らかの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその何らかの機能的断片、突然変異体、変異体もしくは誘導体（これは、Ｉｇ分子の必須のエピトープ結合特性を保持する。）を指す。このような突然変異体、変異体もしくは誘導抗体形態は当技術分野で公知である。この非限定実施形態は下記で考察する。抗体は、それが、分子と特異的に反応することができ、それによりその抗体にその分子が結合する場合、分子に「結合可能」であると言われる。
【００９９】
「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、様々な抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物に対して、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を有する抗体分子の調製物を指すものとする。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソーム提示などのいくつかの新規技術ならびにハイブリドーマ由来抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）など、ハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマにより分泌される抗体）により例示される古典的方法により作製され得る。
【０１００】
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中で略してＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で略してＬＣＶＲ又はＶＬ）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存性が高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序で並んだ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、何らかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
【０１０１】
抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単純に「抗体部分」又は「抗体断片」）という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原（例えばｈＲＧＭ  Ａ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を発揮させ得ることが示されている。このような抗体実施形態はまた、２以上の異なる抗原に特異的に結合する、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１つの可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１（参照により本明細書中に組み込まれる。））及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組み換え法を用いて連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体のその他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上にあるこの２つのドメイン間での対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用して、これによりこれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作出する、二価の二特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。このような抗体結合部分は、当技術分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
【０１０２】
「抗体コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結される２以上のアミノ酸残基を含み、１以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常ドメインとは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、表２で示される。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、１以上のその他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を生成させるためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を生成させるための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を調製することができる。さらに、本明細書中に記載のように、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【０１０５】
「単離抗体」とは、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ｈＲＧＭ  Ａに特異的に結合する単離抗体は、ｈＲＧＭ  Ａ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、ｈＲＧＭ  Ａに特異的に結合する単離抗体は、その他の種由来のＲＧＭ  Ａ分子などのその他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体が含まれるものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発によるか又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
【０１０７】
「組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、宿主細胞に遺伝子移入された組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体（下記で詳述）、組み換え体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｙ  Ｈ．及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．及びＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．及びＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．及びＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかのその他の手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される抗体など、組み換え手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される、全てのヒト抗体を含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある種の実施形態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け、従って、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列由来であり、関連する一方で、インビボでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【０１０８】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を指す。キメラ抗体は、組み換え分子生物学技術を通じて作製され得るか又は物理的に一緒に結合され得る。
【０１０９】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、マウスＣＤＲの１以上（例えばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置換されている抗体を指す。
【０１１０】
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されており、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域又はその抗原結合部分におけるその他のアミノ酸残基よりもより可変性がある（即ち超可変性）アミノ酸残基に付番する系を指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置３１から３５の範囲であり、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５であり、ＣＤＲ３についてはアミノ酸位置９５から１０２の範囲である。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置２４から３４の範囲であり、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から５６であり、ＣＤＲ３についてはアミノ酸位置８９から９７である。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を与えるか又はコードする、抗体又は核酸配列を指す。ある実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を与えるか又はコードする、抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１以上を与えるか又はコードする、抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を与えるか又はコードする、ヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１以上の特異的位置で生じない、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）由来であり得るか又はそれらから得ることができる。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに３個のＣＤＲがあり、これらは、可変領域のそれぞれに対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原に結合し得る１つの可変領域で生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正しい境界は、系によって別に規定される。Ｋａｂａｔにより記載される系（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）及び（１９９１））は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能である明確な残基付番システムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する明確な残基境界ももたらす。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと呼ばれる得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、アミノ酸配列のレベルで非常に多様であるにもかかわらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内のある一定の部分（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）がほぼ同一のペプチド骨格構造をとることを見出した。これらの部分（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と名付けられた（ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖及び重鎖領域を表す。）。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ばれ得、これらは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義するその他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに正確には従わない可能性があるが、特定の残基又は残基群又はＣＤＲ全体でさえも抗原結合に重大な影響を与えないという予想又は実験的知見を考慮すると、それらが短くされ得るか又は長くされ得るかにかかわらず、それでもなお、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する。本明細書中で使用される方法は、これらのシステムの何れかに従い定義されるＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａで定義されるＣＤＲを使用する。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、両者とも参照により本明細書中に組み込まれる。）により定義されるような、特定のカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＣＤＲ構造を定義する、ＣＤＲ又はフレームワークにおける残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。各カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対する一組のペプチド骨格ねじれ角を指す。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるか又はそれが由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関して、「ドナー抗体」という用語は、１以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残存配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、相応して異なる解釈に従う。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３及び重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）もまた、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を各鎖において４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分けるが、ここで、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定のサブ領域を指定することなく、その他により指定される場合、フレームワーク領域は、１本の天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲ’を示す。本明細書中で使用される場合、ＦＲ（単数形）は４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲ（複数形）は、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２以上を表す。
【０１１６】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当技術分野で公知である。本発明のある実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、表３及び表４に記載の配列から選択される。ヒトフレームワーク配列ＦＲ１からＦＲ４に対する様々な組み合わせはこれらの表で述べる。
【０１１７】
【表６】
2020018316.tif 000007
2020018316.tif 000008
【０１１８】
【表７】
2020018316.tif 000009
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現に対して遺伝子再編成及び突然変異をもたらす成熟プロセスが行われていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態により提供される長所の１つは、生殖細胞系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種における個体の必須のアミノ酸配列構造の特徴を保存する可能性が高く、それゆえ、その種において治療用に使用される場合、外来の源由来のものとして認識される可能性が低いという認識によるものである。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、「キーとなる」残基という用語は、抗体の、特にヒト化抗体の、結合特異性及び／又は親和性においてより大きな影響がある可変領域内のある一定の残基を指す。キーとなる残基には、以下に限定されないが、次のもの：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位の何れかであり得る。）、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、ＣＤＲと相互作用可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基及び可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義と第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義との間で重複する領域における残基の１以上が含まれる。
【０１２１】
「ヒト化抗体」という用語は、一般に、非ヒト種（例えばマウス）由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗体を指すが、しかし、ここで、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒトに近く」になるように改変されている、即ち、ヒト生殖細胞系列の可変配列により類似するように改変されている。ヒト化抗体のあるタイプは、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するためにヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入される、ＣＤＲグラフト抗体である。
【０１２２】
特に、「ヒト化抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又はその変異体、誘導体、類似体又は断片である。本明細書中で使用される場合、ＣＤＲに関して「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ及び通常は２つの、可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、通常はヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はまた、重鎖の、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
【０１２３】
ヒト化抗体は、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ及び何らかのアイソタイプ（以下に限定されないが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。）を含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。
【０１２４】
ヒト化抗体の、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、その部位でＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに相当しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の、置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに対して突然変異誘発が行われ得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は大規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。本明細書中で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に現れるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に現れるアミノ酸がある。２種類のアミノ酸が同等の頻度で現れる場合、何れかをコンセンサス配列に含め得る。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、「バーニア」ゾーンは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により本明細書中に組み込まれる。）により記載されるように、ＣＤＲ構造を調整し得、抗原への適合を細かく調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの基礎をなす層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に影響を及ぼし得る。
【０１２６】
ＲＧＭのその受容体の１つへの「結合の阻害」という用語は、本明細書中で使用される場合、この受容体結合活性の、部分的（例えば、約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）又は完全な低下を包含する。この「結合の阻害」は、当技術分野で利用可能な何らかの適切な方法により、好ましくは、例えばＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイなど、本明細書中で例示されるような何らかの方法により、決定され得る。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、「中和」という用語は、結合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合するときの、標的タンパク質の生物活性の中和を指す。中和することは、この結合タンパク質の標的への結合の様々な手段の結果であり得る。例えば、中和することは、標的分子への受容体結合に影響を与えない標的の領域における結合タンパク質の結合により引き起こされ得る。あるいは、結合タンパク質の結合の結果、標的への受容体結合が阻止され得、この阻止により最終的に標的タンパク質活性が中和される。この様々な機能のそれぞれは、本発明に従い起こり得る。好ましくは、中和結合タンパク質は、ｈＲＧＭ  Ａへのその結合の結果、ｈＲＧＭ  Ａの生物活性が中和される中和抗体である。好ましくは、中和結合タンパク質は、ｈＲＧＭ  Ａに結合し、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上、ｈＲＧＭ  Ａの活性を生物学的に低下させる。当技術分野で周知のｈＲＧＭ  Ａ生物活性の１以上の指標を測定することにより、中和結合タンパク質によるｈＲＧＭ  Ａの生物活性の中和を評価することができる。例えば、ｈＲＧＭ  Ａの中和により、Ｎｔｅｒａ神経伸長アッセイにおいて阻害が逆転される（下記実施例３参照）。Ｎｔｅｒａ神経突起成長アッセイは、神経突起伸長の阻害を扱うものである。阻害性ＲＧＭ  Ａタンパク質又は断片の非存在下及び伸長刺激基質ラミニンの存在下で、ニューロンＮＴｅｒａ凝集は、伸長する神経突起の大規模で密集したネットワークを示す。ＲＧＭ  Ａ又はＲＧＭ  Ａ断片は神経突起伸長を阻害し、その結果、神経突起が短くなり、その数が減少する。機能阻止ＲＧＭ  Ａアンタゴニスト又はＭＡＢ（ＭＡＢ  ５Ｆ９など）は、分化したヒトＮＴｅｒａニューロンの凝集体による神経突起成長アッセイにおいてヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の強力なｆｃ−結合ｈＲＧＭ  Ａ軽鎖断片（アミノ酸４７−１６８）の神経突起伸長阻害活性を中和し、その結果、神経突起が長くなり、その数が顕著に増加した。
【０１２８】
「中和モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、その特異的抗原への結合がこの抗原に対する天然リガンドの結合と競合し、これを阻害し得る、抗体分子の調製物を指すものとする。本願の特定の実施形態において、本発明の中和抗体は、ネオゲニンに対する及び／又はＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４に対する結合に対してＲＧＭ  Ａと競合し得、ＲＧＭ  Ａ生物活性又は機能を妨害し得る。特に、本発明の中和抗体は、ＲＧＭ  Ａと結合し、ネオゲニンへ及び／又はＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４に対する結合を妨害し、ＲＧＭ  Ａ生物活性又は機能を妨害し得る。「活性」という用語には、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性（例えばＲＧＭ  Ａ抗原に結合する抗ｈＲＧＭ  Ａ抗体）及び／又は、抗体の中和能（例えば、ＲＧＭ  Ａに対するその結合がｈＲＧＭ  Ａの生物活性を阻害する抗ｈＲＧＭ  Ａ抗体（例えば下記実験セクションに記載のようなｈＲＧＭ  Ａ-ネオゲニン結合アッセイ、ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２結合アッセイ又はｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−４結合アッセイで測定される場合））などの活性が含まれる。
【０１２９】
ＲＧＭ  Ａの生物活性は、細胞移動を制御することとも言われ得る。細胞移動の具体例は神経突起成長であり、これはＲＧＭ  Ａタンパク質により妨害されるか又は阻害される。さらに、ＲＧＭタンパク質は、ＢＭＰ−タンパク質の活性を調節することが示されている。本明細書中で、公開されている例は、片側でＢＭＰ−経路におけるＲＧＭタンパク質の相乗増強活性及びＢＭＰ−経路におけるＲＧＭタンパク質の阻害活性（これは、鉄代謝、骨及び軟骨再生の制御に対して、及び再ミエリン形成及び再生のためにＣＮＳにおいて重要である。）を記載している。
【０１３０】
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合することができる何らかのポリペプチド決定基を含む。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群を含み、ある種の実施形態においては、特定の３次元構造的特徴及び／又は特定の電荷的特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある種の実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１３１】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いた、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度における変化の検出により、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７）を参照。
【０１３２】
「ｋｏｎ」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野において公知であるような抗体／抗原複合体を形成するための抗原への抗体の会合に対する会合速度定数を指すものとする。
【０１３３】
「ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野で公知であるような抗体／抗原複合体由来の抗体の解離に対する解離速度定数を指すものとする。
【０１３４】
「Ｋｄ」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野において公知であるような特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指すものとする。
【０１３５】
「標識された結合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、結合タンパク質の同定を可能にする標識が取り込まれたタンパク質を指す。好ましくは、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み又は目印を付したアビジン（例えば、光学的又は比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの連結である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のもの：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）；酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；及びガドリニウムキレート剤などの磁性試薬（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）が含まれる。
【０１３６】
「抗体複合体」という用語は、第二の化学部分（治療薬又は細胞毒性剤など）に化学的に連結される、抗体などの結合タンパク質を指す。本明細書中で、「作用物質（ａｇｅｎｔ）」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生物物質から調製される抽出物を表すために使用される。好ましくは、治療薬又は細胞毒性剤には、以下に限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン及びこれらの類似体又はホモログが含まれる。
【０１３７】
「結晶」及び「結晶化された」という用語は、本明細書中で使用される場合、結晶の形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態又は液晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）又は分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、当技術分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って配列される。結晶中で反復される基礎的単位又は構築ブロックは非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶学的対称性に合致する配置での非対称単位の反復により、結晶の「単位格子」がもたらされる。全ての三次元中での規則的な並進による単位格子の反復により結晶がもたらされる。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．及びＤｕｃｒｕｉｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ｐｐ．２０  １−１６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照。
【０１３８】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、２以上のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの何れか又はヌクレオチドの何れかの型の修飾形態）のポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの１本鎖及び２本鎖形態を含むが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」という用語は、その起源ゆえに、「単離ポリヌクレオチド」が、その「単離ポリヌクレオチド」が本来ともに見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部と会合していないか；天然にはそれが連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか；又はより大きな配列の一部として天然には存在しない、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源又はこれらのいくつかの組み合わせの）ポリヌクレオチドを意味する。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターのある種類は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが結合され得る環状２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、この場合、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書中で、「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクター形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１４１】
「操作可能に連結された」という用語は、記載された成分が、その意図する様式でそれらを機能させることができる関係にある併置状態を指す。コード配列に対して「操作可能に連結された」調節配列は、調節配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように結合される。「操作可能に連結された」配列は、関心のある遺伝子と連続する発現調節配列及び関心のある遺伝子を調節するように、トランスで又は離れて作用する発現調節配列の両方を含む。「発現調節配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、それらが結合されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を向上させる配列（即ちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を向上させる配列；及び必要に応じて、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。このような調節配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物では、このような調節配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ、真核生物では、一般に、このような調節配列には、プロモーター及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である成分を含むものとし、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。
【０１４２】
「形質転換」とは、本明細書中で定義される場合、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る何らかのプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて、天然又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞へ外来核酸配列を挿入するための何らかの公知の方法に依存し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、この方法には、以下に限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェション及び粒子衝突が含まれ得る。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが自己複製するプラスミドとして又は宿主染色体の一部としての何れかで複製することができる、安定して形質転換された細胞が含まれる。これらには、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、限られた時間、一過性発現する細胞も含まれる。
【０１４３】
「組み換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書中で使用される場合、外来ＤＮＡが導入されている細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫も指すことを理解されたい。突然変異又は環境的な影響の何れかのために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物の何れかの界から選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、以下に限定されないが、原核細胞株Ｅ．コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９及び真菌細胞サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
【０１４４】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して標準的技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従って、又は当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、実施され得る。一般に、先述の技術及び手順は、当技術分野で周知の従来の方法に従い、及び本明細書を通じて引用及び考察される様々な一般的及び具体的な参考文献中に記載のように、実施され得る。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））」（参照によりあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【０１４５】
当技術分野において公知であるように、及び本明細書において使用する場合、「トランスジェニック生物」とは、トランス遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、この場合、生物（又は生物の子孫）中に導入されたトランス遺伝子は、その生物中で天然には発現されないポリペプチドを発現する。「トランス遺伝子」とは、トランスジェニック生物の１以上の細胞種又は組織において、コードされた遺伝子産物の発現を支配する、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノム中に安定して及び操作可能に組み込まれるＤＮＡコンストラクトである。
【０１４６】
「制御する」又は「調節する」という用語は交換可能に使用され、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性（例えばｈＲＧＭ  Ａの生物活性）の変化又は変更を指す。調節は、関心のある分子のある種の活性又は機能の強さの向上又は低下であり得る。分子の典型的な活性及び機能には、以下に限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれる。
【０１４７】
同様に、「調節物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性又は機能（例えば、ｈＲＧＭ  Ａの生物活性）を変化又は変更させることが可能な化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを向上又は低下させ得る。本明細書中で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、関心のある分子と接触した際に、アゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを向上させる調節物質を指す。関心のある特定のアゴニストには、以下に限定されないが、ｈＲＧＭ  Ａポリペプチド又は、ｈＲＧＭ  Ａに結合する、ポリペプチド、核酸、炭水化物もしくは何らかのその他の分子が含まれ得る。「アンタゴニスト」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アンタゴニスト非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを低下させる調節物質を指す。代表的アンタゴニストには、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は低分子の有機分子が含まれる。ペプチボディは例えばＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【０１４８】
関心のある特定のアンタゴニストには、ｈＲＧＭ  Ａの生物活性又は免疫学的活性を阻止又は調節するものが含まれる。ｈＲＧＭ  Ａのアンタゴニストには、以下に限定されないが、ＲＧＭ  Ａ分子と相互作用するモノクローナル抗体のような、ｈＲＧＭ  Ａに結合する、タンパク質、核酸、炭水化物又は何らかのその他の分子が含まれ得る。ＲＧＭ  Ａとの相互作用の結果、その他のリガンド／細胞膜成分の結合及び中和が起こり得、複数の疾患に対する相加的又は相乗的機能に対して有用であり得ることに注意されたい。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又はその１以上の症候の、重症度及び／又は持続時間を低下（短縮）させるか又は改善するか、疾患の進行を予防するか、疾患の軽減を引き起こすか、疾患に付随する１以上の症候の再発、発現、発症もしくは進行を予防するか、疾患を検出するか、又は別の治療薬（例えば予防薬又は治療薬）の予防的もしくは治療的効果を促進もしくは向上させるのに十分である治療薬の量を指す。
【０１５０】
「試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、その最も広い意味で使用される。「生体試料」とは、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、生物由来の又は死亡した生物由来の物質のあらゆる量が含まれる。このような生物には、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及びその他の動物が含まれる。このような物質には、以下に限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節及び脾臓が含まれる。
【０１５１】
２．ｈＲＧＭ  Ａに結合するポリペプチド
本願の主要な実施形態は、ＲＧＭ  Ａタンパク質の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単離タンパク質又はポリペプチドを含む。ＲＧＭ  Ａタンパク質の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単離タンパク質又はポリペプチドは、ＲＧＭ  Ａの受容体ネオゲニンに対する及び／又は骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）に対するＲＧＭ  Ａの結合を阻害し得る。
【０１５２】
本願の最も好ましい実施形態は、ＲＧＭ  Ａ又はその抗原結合部分もしくは断片に結合する抗体を含む。
【０１５３】
好ましくは、本発明の抗ＲＧＭ  Ａ抗体は、例えば、当技術分野で公知であるか又は以下に記載のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイの何れか１つにより評価した場合、ＲＧＭ  Ａ活性を低下させるか又は中和する高い能力を示す。
【０１５４】
本願は、最も好ましくは、ＲＧＭ  Ａの受容体、ネオゲニンへの及び骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）へのＲＧＭ  Ａの結合を選択的に妨害する、ＲＧＭ  Ａに対する中和モノクローナル抗体及び、ＲＧＭ  Ａのその共受容体、骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）への結合を選択的に妨害する、ＲＧＭ  Ａに対する中和モノクローナル抗体の作製を含む。
【０１５５】
好ましくは、本願のモノクローナル中和抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するか又はそれ由来の、可変及び定常領域を有する抗体を指す（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、１９９１参照）。しかし、本願のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおける、及び特にＣＤＲ３における、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。
【０１５６】
様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。本願の最も好ましい中和抗体は、本明細書中で、ｍＡｂ５Ｆ９及びｍＡｂ８Ｄ１及びその機能的抗体断片を指し、解離速度が低く、中和能が高いＲＧＭ  Ａへの高親和性結合など、ｍＡｂ５Ｆ９及びｍＡｂ８Ｄ１と同等の特性を有するその他の抗体及び機能的抗体断片は、本発明の一部をなすものであるとする。免疫原性ＲＧＭ  Ａポリペプチド又はその断片に対する本願の抗ＲＧＭ  Ａ抗体の結合親和性及び解離速度は、当技術分野で公知の何らかの方法により決定され得る。例えば、結合親和性は、競合的ＥＬＩＳＡ、ｃＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ技術により測定することができる。解離速度もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ技術により測定することができる。結合親和性及び解離速度は、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いて表面プラズモン共鳴により測定される。
【０１５７】
本願の好ましいモノクローナル抗体の１つであるｍＡｂ５Ｆ９抗体は、配列番号９又は３４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び配列番号１０の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む配列と、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５８】
本願のＲＧＭ  Ａと相互作用する単離モノクローナル抗体が、抗体又はその抗原結合部分に１以上の炭水化物残基が含まれるグリコシル化結合タンパク質であり得ることも意図される。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基を酵素により添加し得る（グリコシル化として知られるプロセス）。共有結合されるオリゴ糖側鎖を有する、結果として得られるタンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られる。タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物によって産生されるグリコシル化酵素が異なり得（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）、利用可能な基質が異なり得る（ヌクレオチド糖）。このような因子のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系によって異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトとなるようにグリコシル残基を含む。
【０１５９】
本願の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＹ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。さらに、本抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れかを含み得る。好ましくは、本抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は１本鎖Ｆｖ断片であり得る。抗体エフェクターの機能を変化させるためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は当技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、例えば、抗体及び抗原−抗体複合体の、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び半減期／クリアランス速度などのいくつかの重要なエフェクターの機能を媒介する。場合によっては、これらのエフェクターの機能は、治療用抗体に対して好ましいが、その他の場合において、治療目的によっては、不要であり得るか又は有害でもあり得る。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な要素である。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクターの機能が変化するように、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
【０１６０】
３．抗ｈＲＧＭ  Ａ抗体の作製
３．１．一般原理
本願の抗体は、適切な宿主（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類を含む脊椎動物において及び鳥類、爬虫類及び魚類の卵において）の免疫付与により作製され得る。本願の抗体を作製するために、本発明の免疫原性ＲＧＭ  Ａポリペプチド又はその断片で宿主に免疫付与する。「免疫付与」という用語は、本明細書中で、免疫レパートリーが、天然の遺伝子改変されていない生物又はトランスジェニック生物（人工的人免疫レパートリーを提示するように修飾されたものを含む。）に存在するか否かにかかわらず、免疫レパートリーに対して抗原を提示するプロセスを指す。同様に、「免疫原性調製物」は、アジュバント又は抗原の免疫原性を促進するその他の添加物を含有する抗原の処方物である。
【０１６１】
当技術分野で公知の何らかの方法により、動物の免疫付与を行い得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０参照。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマなどの非ヒト動物を免疫付与するための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ及び米国特許第５，９９４，６１９号参照。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するために、ＲＧＭ  Ａ抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、完全又は不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着するようにポリペプチドを封鎖することによって急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか又は、これらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌させるために宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる２回以上のポリペプチドの投与が含まれる。
【０１６２】
動物宿主は、無傷細胞又は破壊細胞の細胞膜と会合している抗原で免疫付与され、本願の抗体は、本発明の免疫原性ポリペプチドへの結合により同定されることが企図される。抗原での動物宿主の免疫付与後、動物から抗体が得られ得る。採血するか又は動物を屠殺することにより、動物から抗体含有血清が得られる。この血清は動物から得られた状態のままで使用され得るか、又は免疫グロブリン分画が血清から回収され得るか、又は抗体が血清から精製され得る。このようにして得られた血清又は免疫グロブリンはポリクローナルであり、従って、異なる一連の特性を有する。
【０１６３】
３．２  ハイブリドーマ技術を用いた抗ＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多岐にわたる技術を用いて、モノクローナル抗体を調製し得る。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．１９８１）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で教示されるものを含むハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製し得る。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、何らかの真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが作製される方法ではない。
【０１６４】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製し、これについてスクリーニングするための方法は通常のものであり当技術分野で周知である。ある実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法ならびに、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生される抗体を提供するが、この場合、好ましくはハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫付与されたマウスから単離された脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで本発明のポリペプチドに結合可能である抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合の結果得られるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡潔に述べると、ＲＧＭ  Ａ抗原によりマウスに免疫付与することができる。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するために、抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、フロイントの完全又は不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着するようにポリペプチドを封鎖することによって急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか、又は、これらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌させるために宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる２回以上のポリペプチドの投与が含まれる。
【０１６５】
免疫反応が検出されたら、例えば、マウス血清中で抗原ＲＧＭ  Ａに対する特異的な抗体が検出されたら、マウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離する。次に、脾臓細胞を周知の技術により何らかの適切な骨髄腫細胞（例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈法によりクローニングする。次に、ＲＧＭ  Ａに結合可能である抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスに免疫付与することによって、通常高レベルの抗体を含有する腹水を産生させ得る。
【０１６６】
別の実施形態において、免疫付与動物から、抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、上出参照。好ましい実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合及び抗生物質選択後、ＲＧＭ  Ａ又はその一部又はＲＧＭ  Ａを発現する細胞を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素連結免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）（好ましくはＥＬＩＳＡ）を用いて行う。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、ＷＯ００／３７５０４（参照により本明細書中に組み込まれる。）で提供される。
【０１６７】
下記でさらに考察するように、抗ＲＧＭ  Ａ抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、さらに、ロバストなハイブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特徴についてスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、インビボで同系動物において、免疫系欠損動物（例えばヌードマウス）において、又はインビトロで細胞培養において、増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。
【０１６８】
好ましい実施形態において、上述のように、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種で産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が抗ＲＧＭ  Ａ抗体を発現するヒト細胞と融合させられているヒトハイブリドーマである。
【０１６９】
特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術により作製し得る。例えば、（Ｆａｂ断片を作製するための）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ペプシンなどの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製し得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０１７０】
３．３  ＳＬＡＭを用いた抗ＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体
本発明の別の態様において、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載のような、当技術分野で選択的リンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ、（ＳＬＡＭ））と呼ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から組み換え抗体を作製する。この方法において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する単一細胞（例えば上述の免疫付与動物の何れか１つ由来のリンパ球）をスクリーニンするが、ここで、抗原ＲＧＭ  Ａ、ＲＧＭ  Ａのサブユニット又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞に連結されており、ＲＧＭ  Ａに対する特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素−ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞から取り出し、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）の下で、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばＲＧＭ  Ａに対する抗体を発現する細胞を単離するために遺伝子移入された細胞を選び出すことにより、インビボ選択リンパ球由来の増幅された免疫グロブリン配列を遺伝子移入された宿主細胞をインビトロでさらに分析及び選択することができる。ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１及びＰＣＴ公開ＷＯ００／５６７７２に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などによって、増幅された免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。
【０１７１】
３．４  トランスジェニック動物を用いた抗ＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、ＲＧＭ  Ａ抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつか又は全てを含む非ヒト動物に免疫付与することによって抗体を作製する。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生欠損である、改変マウス系列である。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）及び米国特許第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号及び同第６，１３０，３６４号を参照。また、ＷＯ９１／１０７４１（１９９１年７月２５日公開）、ＷＯ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５（両方とも１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ９８／１６６５４（１９９８年４月２３日公開）、ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ９８／５０４３３（１９９８年１１月１２日公開）、ＷＯ９９／４５０３１（１９９９年９月１０日公開）、ＷＯ９９／５３０４９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ００／０９５６０（２０００年２月２４日公開）及びＷＯ００／０３７５０４（２０００年６月２９日公開）も参照。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原−特異的ヒトＭａｂを産生する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びｘ軽鎖遺伝子座の、メガベースの大きさの生殖細胞系列構造ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｇｒｅｅｎ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照（これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【０１７２】
３．５  組み換え抗体ライブラリを用いた抗ＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法を使用することもでき、この場合、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリをスクリーニングする。組み換え抗体ライブラリのこのようなスクリーニングのための方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、米国出願公開第２００３０１８６３７４及びＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１（これらのそれぞれの内容は参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載の方法が含まれる。
【０１７３】
組み換え抗体ライブラリは、ＲＧＭ  Ａ又はＲＧＭ  Ａの一部で免疫付与された対象由来であり得る。あるいは、組み換え抗体ライブラリは、未処理の対象、即ちＲＧＭ  Ａで免疫付与されていない対象由来であり得、例えば、ヒトＲＧＭ  Ａで免疫付与されていないヒト対象からのヒト抗体ライブラリなどである。ヒトＲＧＭ  Ａを含むペプチドを用いて組み換え抗体ライブラリをスクリーニングし、それによりＲＧＭ  Ａを認識する抗体を選択することによって、本発明の抗体を選択する。このようなスクリーニング及び選択を行うための方法は、先行する段落における参考文献に記載のものなど、当技術分野で周知である。特定のｋｏｆｆ速度定数でヒトＲＧＭ  Ａから解離するものなど、ＲＧＭ  Ａに対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴の当技術分野で公知の方法を使用して、所望のｋｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有するものなど、ＲＧＭ  Ａに対する特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、ｈＲＧＭ  Ａ活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準的方法を使用し得る。
【０１７４】
ある態様において、本発明は、ヒトＲＧＭ  Ａに結合する、単離抗体又はその抗原結合部分に関する。好ましくは、本抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。
【０１７５】
例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製し得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担うファージ粒子の表面で機能的抗体ドメインを提示する。特に、このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用され得る。抗原により、例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉される抗原を用いて、関心のある抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択するか又は同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の何れかに組み換え融合される、Ｆａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインとともにファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３及び同第５，９６９，１０８号（これらはそれぞれ、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されるのものが含まれる。
【０１７６】
上記参考文献に記載のように、例えば下記で詳述するように、ヒト抗体又は何らかのその他の所望の抗原結合断片を含み、何らかの所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む。）において発現される全抗体を生成させるために、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、使用することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換え作製するための技術を使用することもできる。１本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが含まれる。
【０１７７】
ファージディスプレイによる組み換え抗体ライブラリのスクリーニングの代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当技術分野で公知のその他の方法を、本発明の２重特異性抗体の同定に適用することができる。代替的な発現系の１つのタイプは、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓによるＰＣＴ公開ＷＯ９８／３１７００及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｗ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載のような、組み換え抗体ライブラリがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されるものである。この系において、その３’末端にプロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質を有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチド又はタンパク質との間で、共有結合融合が生じる。このようにして、コードされるペプチド又はタンパク質、例えば抗体又はその一部の特性（二重特異性抗原への、抗体又はその一部の結合など）に基づき、ｍＲＮＡの複合混合物（例えばコンビナトリアルライブラリ）から、特異的ｍＲＮＡを濃縮することができる。このようなライブラリのスクリーニングから回収される抗体又はその一部をコードする核酸配列は、上記のような組み換え手段によって発現させることができ（例えば哺乳動物宿主細胞において）、さらに、上述のような、元来選択された配列へと突然変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによるか又は組み換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によるかの何れかで、さらなる親和性成熟に供することができる。
【０１７８】
別のアプローチにおいて、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することもできる。酵母ディスプレイ法において、酵母細胞壁に抗体ドメインを繋ぎ止め、酵母の表面上にそれらを提示するために遺伝学的方法を使用する。特に、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために、このような酵母を使用することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号（参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されるものが含まれる。
【０１７９】
４．本発明の特定の組み換えＲＧＭ  Ａ抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知の多くの技術の何れかにより作製され得る。例えば、宿主細胞からの発現であり、この場合、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは標準的技術により宿主細胞に遺伝子移入される。「遺伝子移入（トランスフェクション）」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多岐にわたる技術を包含するものとする（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン遺伝子移入など）。原核又は真核宿主細胞の何れかにおいて本発明の抗体を発現することが可能ではあるが、真核細胞（及び特に哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、正しく折り畳まれ免疫学的活性のある抗体を構築して分泌する可能性が高いので、真核細胞での抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞中での発現が最も好ましい。
【０１８０】
本発明の組み換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載のような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞での抗体の発現を可能にするか又はより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたり宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。標準的タンパク質精製法を用いて培地から抗体を回収することができる。
【０１８１】
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を生成させるために宿主細胞を使用することもできる。上記手順における変化が本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖の何れかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞に遺伝子移入することが望ましいものであり得る。関心のある抗原への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖の何れか又は両方をコードするＤＮＡのいくつか又は全てを除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる。このような短縮ＤＮＡ分子から発現される分子もまた本発明の抗体に包含される。さらに、標準的化学架橋法により第二の抗体へ本発明の抗体を架橋することによって、１本の重鎖及び１本の軽鎖が本発明の抗体であり、その他の重鎖及び軽鎖が、関心のある抗原以外の抗原に特異的である、二官能性抗体を作製し得る。
【０１８２】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましい系において、リン酸カルシウムが介在する遺伝子移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組み換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、遺伝子の高レベル転写を推進するために、それぞれＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに操作可能に連結される。組み換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子も有し、これにより、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターが遺伝子移入されているＣＨＯ細胞の選択が可能になる。抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために、選択された形質転換宿主細胞を培養し、無傷の抗体を培地から回収する。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に遺伝子移入し、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的分子生物学技術を使用する。またさらに、本発明は、本発明の組み換え抗体が合成されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の組み換え抗体を合成する方法を提供する。この方法はさらに、培地から組み換え抗体を単離することを含む。
【０１８３】
４．１  抗ＲＧＭ  Ａ抗体
表５は、本発明の好ましい抗ｈＲＧＭ  Ａ抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列のリストである。
【０１８４】
【表８】
2020018316.tif 000010
2020018316.tif 000011
【０１８５】
先述の単離抗ＲＧＭ  Ａ抗体ＣＤＲ配列は、本発明に従い単離される、ＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む、ＲＧＭ  Ａ結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。好ましいＲＧＭ  Ａ結合を有し及び／又はｈＲＧＭ  Ａに関して活性を中和する本発明のＣＤＲを作製し、選択するために、以下に限定されないが、本明細書中に具体的に記載されるものを含む、本発明の結合タンパク質を作製し、ＲＧＭ  Ａ結合及び／又はこれらの結合タンパク質の特性の中和を評価するための、当技術分野で公知の標準的方法を使用することができる。
【０１８６】
４．２  抗ＲＧＭ  Ａキメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の領域によって由来する動物種が異なる分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び４，８１６，３９７号（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を使用することができる。
【０１８７】
ある実施形態において、本発明のキメラ抗体は、本明細書中に記載されるマウスモノクローナル抗ヒトＲＧＭ  Ａ抗体の重鎖定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域で置換することにより、作製される。
【０１８８】
４．３  抗ＲＧＭ  Ａ  ＣＤＲグラフト抗体
本発明のＣＤＲグラフト抗体は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上が、例えば本発明のマウス抗体などの非ヒトのＣＤＲ配列で置換される、ヒト抗体からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。何らかのヒト抗体からのフレームワーク配列は、ＣＤＲグラフトのための鋳型となり得る。しかし、このようなフレームワーク上への直鎖置換により、抗原に対する結合親和性をある程度喪失することが多い。ヒト抗体が元のマウス抗体に対して相同であるほど、マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることにより、親和性を低下させ得るＣＤＲでのゆがみの導入の可能性は低くなる。従って、ＣＤＲを除いたマウス可変フレームワークを置換するために選択されるヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％配列同一性があることが好ましい。より好ましくは、ＣＤＲを除いたヒト及びマウス可変領域は少なくとも７０％の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、ＣＤＲを除いたヒト及びマウス可変領域は少なくとも７５％の配列同一性を有する。最も好ましくは、ＣＤＲを除いたヒト及びマウス可変領域は少なくとも８０％の配列同一性を有する。ＣＤＲグラフト抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；米国特許第５，２２５，５３９号）。具体的な実施形態において、本発明は、表６に記載のようなＶＨ及び／又はＶＬ鎖を有するＣＤＲグラフト抗体を提供する。
【０１８９】
【表９】
2020018316.tif 000012
2020018316.tif 000013
【０１９０】
４．４  抗ＲＧＭ  Ａヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｅｇｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；Ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈ−ｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ  ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）（それぞれ全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示される。免疫原性を低下させるか又は、当技術分野で公知のような、結合、親和性、会合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期又は何らかのその他の適切な特性を低下、促進又は変化させるために、このようなインポート（取り込まれる）配列を使用することができる。
【０１９１】
ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び抗原結合及び特定の位置での通常はないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照）。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を示し、提示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの提示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス及びインポート配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的に及び最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する。抗体は、以下に限定されないが、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９，２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；同��４，８１６，５６７号（それぞれ、全体的に、そこで引用される参考文献を含め、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載のものなど、当技術分野で公知の様々な技術を用いて、ヒト化され得る。
【０１９２】
５．本発明の抗体のさらなる実施形態
５．１  融合抗体及び免疫接着
本願はまた、別のポリペプチドに連結された本願のＲＧＭ  Ａ抗体の全て又は一部を含むように作製され得る融合抗体又は免疫接着も記載する。ある実施形態において、ＲＧＭ  Ａ抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。その他の実施形態において、本願のＲＧＭ  Ａ抗体のＶＨドメインは第一のポリペプチドに連結され、一方、この抗体のＶＬドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成できるように、第一のポリペプチドに結合する第二のポリペプチドに連結される。その他の実施形態において、ＶＨドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに相互作用できるようにするリンカーによってＶＬドメインから分離される（下記１本鎖抗体参照）。次に、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を関心のあるポリペプチドと連結する。この融合抗体は、ＲＧＭ  Ａを発現する細胞又は組織にポリペプチドを導くために有用である。関心のあるポリペプチドは、毒素などの治療薬であり得るか、又は、ホースラディッシュペルオキシダーゼなど、容易に視覚化され得る酵素などの診断薬であり得る。さらに、融合抗体は、２つ（以上）の１本鎖抗体が互いに連結されるように作製され得る。これは、１つのポリペプチド鎖上で二価又は多価抗体を作製したい場合に又は二特異性抗体を作製したい場合に、有用である。
【０１９３】
ある実施形態は、本願の抗体又は抗体部分が誘導体化されるか又は別の機能分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結される、標識された結合タンパク質を提供する。例えば、別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体又は抗体部分の会合を媒介することができる、１以上のその他の分子部分へ、例えば、核酸、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出可能試薬、細胞毒性剤、医薬品及び／又はタンパク質又はペプチドへ、本願の抗体又は抗体部分を機能的に連結することにより（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）、本願の標識された結合タンパク質を誘導体化することができる。
【０１９４】
本願の抗体又は抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能試薬には、蛍光化合物が含まれる。代表的な蛍光性の検出可能試薬には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどが含まれる。抗体はまた、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素でも誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合、検出可能な反応産物を生成させるために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによりこれが検出される。例えば、検出可能試薬ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加により、検出可能である有色の反応産物が生じる。核酸、ビオチンで抗体を誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出することもできる。
【０１９５】
５．２  １本鎖抗体
本願は、本発明の免疫原性ＲＧＭ  Ａに結合する１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖを作製するために、ＶＨ−及びＶをコードするＤＮＡは、ＶＬ及びＶＨ領域がフレキシブルリンカーにより連結された連続した１本鎖タンパク質としてＶＨ及びＶＬ配列が発現され得るように、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ−４−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡに操作可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、３０  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４  ８：５５２−５５４参照）。１本鎖抗体は、１つのＶＨ及びＶＬのみが使用される場合、一価であり得、２つのＶＨ及びＶＬが使用される場合、二価であり、又は３以上のＶＨ及びＶＬが使用される場合、多価である。リンカーを介して連結されるこれらのｓｃＦｖ断片のうち２つは、「ダイアボディ」と呼ばれ、この形態もまた本発明により包含される。
【０１９６】
５．３  二特異性抗体
本願は、１つの特異性が本願の免疫原性ＲＧＭ  Ａポリペプチドに対するものである、二特異性抗体又はその抗原結合断片をさらに含む。例えば、１つの結合ドメインを通じて本発明の免疫原性ＲＧＭ  Ａポリペプチドに及び第二の結合ドメインを通じて第二の分子に特異的に結合する二特異性抗体が作製され得る。さらに、本発明の免疫原性ポリペプチドへ及びミエリン介在性の成長円錐崩壊を減弱させること及び神経突起伸長及び発芽の阻害に関与する別の分子へ特異的に結合する、複数のＶＨ及びＶＬを含有する１本鎖抗体が作製され得る。このような二特異性抗体は、例えば、Ｆａｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）及びＷｒｉｇｈｔ及びＨａｒｒｉｓ、２０（上出）など、周知の技術を用いて作製され得る。
【０１９７】
ある実施形態において、二特異性抗体は、本発明の抗体由来の可変領域の１以上を用いて調製される。別の実施形態において、二特異性抗体は、前記の抗体からの１以上のＣＤＲ領域を用いて調製される。
【０１９８】
５．４  誘導体化及び標識化抗体
本願の抗体又は抗原結合断片は、誘導体化されるか又は別の分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結される。一般に、本抗体又は抗原結合断片は、本発明の免疫原性ポリペプチドへの結合が誘導体化又は標識により有害な影響を受けないように誘導体化される。
【０１９９】
例えば、１以上のその他の分子部分へ、例えば、別の分子（例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体又は抗体結合断片の会合を媒介することができる、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出試薬、細胞毒性薬、医薬品及び／又はタンパク質又はペプチドへ、本願の抗体又は抗体部分を（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）機能的に連結することができる。またさらに、本抗体又はその抗原結合部分は、１以上のその他のもしくは異なるタンパク質又はペプチドと本抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：１０４７−１０５８）が含まれる。全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の一部を調製することができる。さらに、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【０２００】
誘導体化抗体は、（同じタイプの、又は例えば二特異性抗体を作製するために、異なるタイプの）２以上の抗体を架橋することにより作製され得る。適切な架橋剤には、適切なスペーサーにより分離される２つの異なる反応性がある基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）又はホモ官能性（例えばスベリン酸ジスクシニミジル）が含まれる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから入手可能である。
【０２０１】
誘導体化抗体はまた標識化抗体でもあり得る。例えば、本発明の抗体又は抗体部分が誘導体化され得る検出試薬は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン、ランタニド蛍光体などを含む蛍光化合物である。抗体はまた、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出に有用である酵素でも標識され得る。検出可能な酵素で標識される実施形態において、本抗体は、検出可能な反応産物を生成させるために酵素が使用するさらなる試薬を添加することにより検出される。例えば、過酸化水素及びジアミノベンジジンとホースラディッシュペルオキシダーゼなど。抗体は、ビオチンで標識し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出することもできる。抗体は、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ：タグ）。ＲＧＭ  Ａ抗体又はその抗原断片はまた、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。この放射性標識は、診断及び治療目的の両方に対して使用することができる。放射性標識ＲＧＭ  Ａ抗体は、診断的に、例えば対象でのＲＧＭ  Ａ受容体レベルを決定するために使用され得る。さらに、放射性標識ＲＧＭ  Ａ抗体は、脊髄損傷を治療するために治療的に使用され得る。
【０２０２】
ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次の放射性同位体又は放射性ヌクレオチド、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍが含まれる。ＲＧＭ  Ａ抗体又はその抗原断片はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基又は炭水化物基などの化学基によって誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を向上させるために、例えば、血清半減期を延長させるために又は組織結合を増加させるために、有用であり得る。また、ポリペプチドに対する標識には、核酸、例えばＰＣＲによる検出又は遺伝子発現の促進のためのＤＮＡ又はＲＧＭ  Ａを有する細胞又は、組織での遺伝子発現を抑制するためのｓｉＲＮＡが含まれ得る。
【０２０３】
ＲＧＭ  Ａ抗体のクラス及びサブクラスは、当技術分野で公知の何らかの方法により決定され得る。一般に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに対して特異的である抗体を用いて決定され得る。このような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットならびにその他の技術により決定され得る。あるいは、クラス及びサブクラスは、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインの全て又は一部の配列決定を行い、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、抗体のクラス及びサブクラスを決定することにより、決定され得る。
【０２０４】
５．５  二重可変ドメイン免疫グロブリン
二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質又は免疫グロブリンは、本明細書中で使用される場合、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、例えば２価及び４価など、多価結合タンパク質である。「多価結合タンパク質」という用語は、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を示すために本願で使用される。多価結合タンパク質は、好ましくは、２以上の抗原結合部位を有するように改変され、通常は天然抗体ではない。「多特異的結合タンパク質」という用語は、２以上の関連又は非関連標的に結合可能な結合タンパク質を指す。このようなＤＶＤは、単一特異的、即ち１つの抗原に結合可能であるか、又は多特異的、即ち２以上の抗原に結合可能である。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ  Ｉｇを指す。ＤＶＤ  Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、抗原結合部位ごとに抗原結合に関与する全部で６つのＣＤＲがある重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ結合タンパク質及びＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願１１／５０７，０５０で開示されている（参照により本明細書中に組み込まれる。）。本発明は、ＲＧＭ  Ａに結合可能な結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質を含むものとする。好ましくは、ＤＶＤ結合タンパク質は、ＲＧＭ  Ａ及び第二の標的に結合可能である。第二の標的は、抗炎症性ＭＡＢ活性（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦα／β、ＩＦＮ−β、γ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＰＦ−４、血小板塩基性タンパク質（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＢＰ）、ＮＡＰ−２、β−ＴＧ、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ２／３、ＲＡＮＴＥＳ、リンホタクチン）から、輸送介在タンパク質（インスリン受容体、トランスフェリン受容体、トロンビン受容体、レプチン受容体、ＬＤＬ受容体）から、その他の神経再生ＭＡＢ（ＮｇＲ、Ｌｉｎｇｏ、ｐ７５、ＣＳＰＧ（例えばＮＧ−２、ニューロカン、ブレビカン、バーシカン、アグリカン）ヒアルロン酸、ｍＡＧ、テナシン、ＮＩ−３５、ＮＩ−２５０、ＩＭＰ、パールカン、ニューロカン、ホスファカン、ｎｏｇｏ−Ａ、ＯＭＧＰ、Ｓｅｍａ４Ｄ、Ｓｅｍａ３Ａ、エフリンＢ３、エフリンＡ２、エフリンＡ５、ＭＡＧ、ＥｐｈＡ４、プレキシンＢ１、ＴＲＯＹ、ｗｎｔｓ、ｒｙｋ  ｒｅｃ．、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）から、神経保護性ＭＡＢ活性（ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｓｅｍａ３）から、抗アミロイドβＭＡＢ（例えば、ｍ２６６、３Ｄ６（バピネオズマブ）、抗球状体ＭＡＢ  ７Ｃ６）から、ＣＮＳ局在受容体及び輸送体（セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ＤＡＴ、Ａｓｃ−１、ＧｌｙＴ１）からなる群から選択される。
【０２０５】
５．６  二重特異的抗体
本願はまた、「二重特異性抗体」技術も記載する。二重特異性抗体は、アゴニスト、アンタゴニスト又は、様々な組み合わせでのその両方、として作用し得る。二重特異性抗体は、ＷＯ２００８０８２６５１で例示されるように、ＶＨ鎖が第一の抗原に結合し、ＶＬ鎖が別の抗原に結合する抗体である。
【０２０６】
５．７  結晶化抗体
本願の別の実施形態は、結晶化結合タンパク質を提供する。「結晶化」という用語は、本明細書中で使用される場合、結晶の形態で存在する、抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は物質の固体状態の一形態であり、非晶質固体状態又は液晶状態などのその他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば抗体などのタンパク質）又は分子集合体（例えば抗原／抗体複合体）の、規則的な反復三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、当技術分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って配列される。結晶中で反復される基礎的単位又は構築ブロックは非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶学的対称性に合致する配置での非対称単位の反復により、結晶の「単位格子」がもたらされる。全ての三次元中での規則的な並進による単位格子の反復により結晶がもたらされる。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．及びＤｕｃｒｕｉｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ｐｐ．２０  １−１６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照。
【０２０７】
好ましくは、本願は、本明細書中で開示されるような全ＲＧＭ  Ａ抗体及びその断片の結晶及び、このような結晶を含む製剤及び組成物を記載する。ある実施形態において、結晶化結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性形態よりもインビボでの半減期が長い。別の実施形態において、本結合タンパク質は、結晶化後、生物活性を保持する。
【０２０８】
本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従い、及び参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開ＷＯ０２／０７２６３６で開示されるように、作製され得る。
【０２０９】
５．８  グリコシル化抗体
本発明の別の実施形態は、抗体又はその抗原結合部分が１以上の炭水化物残基を含むグリコシル化結合タンパク質を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基が酵素により添加され得るが、これは、グリコシル化として知られるプロセスである。結果として得られる、オリゴ糖側鎖が共有結合されているタンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られる。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインにおいて１以上の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインの炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に重要な影響を及ぼし、抗体の抗原結合又は半減期における影響は極僅かである（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５）、ｐｐ．１１−１６）。一方、可変ドメインでのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に影響を及ぼし得る。可変でのグリコシル化は、おそらく立体障害のために、抗体結合親和性に負の影響を及ぼし得るか（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１−１３６７）、又は結果として、抗原に対する親和性を向上させ得る（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：２７１７−２７２３）。
【０２１０】
本発明のある態様は、結合タンパク質のＯ−又はＮ−結合グリコシル化部位が突然変異を受けているグリコシル化部位突然変異体を作製することに関する。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような突然変異体を作製することができる。生物活性を保持するが結合活性が向上又は低下したグリコシル化部位突然変異体は、本発明の別の目的である。
【０２１１】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（即ちこの抗体はグリコシル化を欠く。）。例えば抗原に対する抗体の親和性を向上させるために、グリコシル化を変化させることができる。例えば抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を変化させることにより、このような糖修飾を行うことができる。例えば、結果として１以上の可変領域グリコシル化部位が除去され、それによりその部位のグリコシル化が除去される、１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を向上させ得る。このようなアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号（これらのそれぞれが、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）でさらに詳しく記載されている。
【０２１２】
さらに又はあるいは、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体又は分岐ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変化している本発明の修飾抗体を作製することができる。このような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能が向上することが明らかになっている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現させることにより、このような糖修飾を行うことができる。グリコシル化機構が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生させるために、宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１ならびに欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号及びＷＯ９９／５４３４２８０号（これらのそれぞれは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照。
【０２１３】
タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物によってグリコシル化酵素が異なり得（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）、利用可能な基質が異なり得る（ヌクレオチド糖）。このような因子のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系によって異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。
【０２１４】
様々なタンパク質グリコシル化の結果、タンパク質の特徴が異なり得ることは当業者にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主で産生され、酵母内在性経路を使用してグリコシル化される治療用タンパク質の効率は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現される同じタンパク質の効率と比較して低下している可能性がある。このような糖タンパク質はまた、ヒトにおいて免疫原性があり得、投与後のインビボでの半減期が短い可能性がある。ヒト及びその他の動物における特異的受容体は、特異的グリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の急速なクリアランスを促進し得る。その他の有害な影響には、タンパク質折り畳み、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、その他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルギー誘発性の変化が含まれ得る。従って、実施者は、グリコシル化の特異的組成及びパターン、例えば、ヒト細胞又は意図される対象動物の種特異的細胞において産生されるものと同一であるか又は少なくとも類似のグリコシル化組成及びパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。
【０２１５】
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種グリコシル化酵素を発現させるために宿主細胞を遺伝子改変することにより達成され得る。当技術分野で公知の技術を用いて、実施者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製し得る。例えば、酵母株は、これらの酵母株において産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示すように非天然のグリコシル化酵素を発現させるために遺伝子改変されている（米国特許出願公開２００４００１８５９０及び２００２０１３７１３４及びＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１００５８４Ａ２）。
【０２１６】
さらに、当業者にとって当然のことながら、ライブラリのメンバー宿主細胞が変異型グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現させるために遺伝子操作された宿主細胞のライブラリを用いて、関心のあるタンパク質を発現させ得る。次に、実行者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を選択し、単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性の向上又は変化を示す。
【０２１７】
５．９  抗イディオタイプ抗体
結合タンパク質に加えて、本発明はまた、本発明のこのような結合タンパク質に対して特異的な抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体にも関する。抗Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域と会合するユニークな決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、結合タンパク質又はそのＣＤＲ含有領域を用いて動物に免疫付与することにより調製することができる。免疫付与動物は、免疫付与抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに対して反応し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体はまた、また別の動物において免疫反応を誘導するために、「免疫原」としても使用され得、その動物はいわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する。
【０２１８】
６．本抗体の使用
ヒトＲＧＭ  Ａに結合するそれらの能力を考えると、酵素免疫測定吸着法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学などの従来の免疫アッセイを用いて、（例えば、血清又は血漿などの生体試料中で）ヒトＲＧＭ  Ａを検出するために、本願の中和抗体又はその一部を使用することができる。本願は、本発明の抗体又は抗体部分と生体試料を接触させ、ヒトＲＧＭ  Ａに結合する抗体（又は抗体部分）又は未結合抗体（又は抗体部分）の何れかを検出し、それにより生体試料中のヒトＲＧＭ  Ａを検出することを含む、生体試料中のヒトＲＧＭ  Ａを検出するための方法を提供する。本抗体は、結合又は未結合抗体の検出を促進するために検出可能物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；適切な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍが含まれる。
【０２１９】
本願の抗体及び抗体部分は、好ましくは、インビトロ及びインビボの両方でヒトＲＧＭ  Ａ活性を中和することができる。従って、本発明のこのような抗体及び抗体部分は、その受容体ネオゲニンへの、ＢＭＰ−２及び又はＢＭＰ−４への、ＲＧＭ  Ａ結合を阻害し、従って、結果として生じる活性を阻害するために使用され得る。
【０２２０】
別の実施形態において、本願は、対象において、有利には、ＲＧＭ  Ａの結果として生じる活性が有害である疾病又は疾患に罹患する対象から、ＲＭＧ  Ａ活性を低下させるための方法を提供する。本願は、本願のモノクローナル抗体の使用を通じて、ネオゲニン及び／又はＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４へのＲＧＭ  Ａ結合を阻止することによって、このような疾病又は疾患に罹患している対象においてＲＭＧ  Ａ活性を低下させるための方法を提供する。治療目的で、本願の抗体、特に本明細書中で開示されるヒト化抗体をヒト対象に投与することができる。さらに、獣医学の目的で、又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が結合し得るＲＧＭ  Ａを発現する非ヒト哺乳動物に本願の抗体を投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効率を評価するために有用であり得る（例えば、投与量及び投与のタイムコースの試験）。本明細書中で使用される場合、「ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患」という用語は、疾患に罹患している対象におけるＲＧＭ  Ａの存在又はその結果として生じる活性が、その疾患の病態生理に関与する因子又はその疾患の悪化に寄与する因子の何れかであることが示されているか又は予想される、疾病及びその他の疾患を含むものとする。従って、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患は、ＲＧＭ  Ａ活性の低下が疾患の症候及び／又は進行を緩和すると予想される疾患である。本発明の抗体で治療され得る疾患の非限定例には、本発明の抗体の医薬組成物に関係する下記セクションで考察される疾患が含まれる。
【０２２１】
神経変性又は神経再生プロセスの阻害（その結果、麻痺が起こる。）が付随する神経性疾患を含む様々な疾患に関連する病理において、ＲＧＭ  Ａが重要な役割を果たすことが認識されている。これには、認知症、老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、運動亢進、そう病、パーキンソン病、スティール−リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血Ｉ、脳炎、フリードライヒ失調症、急性混乱障害、緑内障、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、脳損傷（外傷性脳損傷を含む。）、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、卒中、横断性脊髄炎が含まれる。
【０２２２】
また、既に考察したように、上述のパートナーの何れか１つの間のＤＶＤ免疫グロブリン又は二重特異性抗体が有用であり得る。上述のようなこのような抗体製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、多発性硬化症、末梢神経損傷、統合失調症、うつ、不安ならびに何らかの可塑性及び神経突起成長及び上記で引用した神経毒性関連疾患の治療に対して有用であり得る。
【０２２３】
本願の抗体はまた、細胞内標的タンパク質を標的とすることを含むために膜を横断する移動を可能にするペプチドとも組み合わせられ得る。このようなペプチド配列には、以下に限定されないが、ｔａｔ、アンテナペディア、ポリ−アルギニン、一部の抗菌ペプチドが含まれ得る。このようなペプチドは、細胞原形質膜、また上皮及び内皮膜（血管脳関門、腸粘膜、髄膜などを含む。）をも含む、膜を通じた移動を可能にし得る。
【０２２４】
本願の抗体又は抗体部分はまた、先行する段落で考察されるようなＲＧＭ  Ａ活性が関与する疾患の治療に有用な１以上のさらなる小分子治療薬とともに投与することもできる。本願の抗体又はその抗原結合部分を単独で又はさらなる作用物質、例えば治療薬と組み合わせて使用することができ、このさらなる作用物質は、その意図する目的に対して熟練者により選択されることを理解されたい。例えば、さらなる作用物質は、本発明の抗体により治療される疾病又は状態を治療するのに有用であると当技術分野で認識されている治療薬であり得る。さらなる作用物質はまた、治療用組成物に対して有益な性質を与える作用物質、例えば組成物の粘度に影響を与える作用物質でもあり得る。
【０２２５】
７．医薬組成物
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、以下に限定されないが、疾患の診断、検出又は監視における、疾患又はその１以上の症候の予防、治療、管理又は改善における、及び／又は研究における、使用のためのものである。具体的な実施形態において、組成物は１以上の本発明の抗体を含む。別の実施形態において、本医薬組成物は、１以上の本発明の抗体と、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患を治療するための本発明の抗体以外の１以上の予防薬又は治療薬と、を含む。好ましくは、疾患又はその１以上の症候の予防、治療、管理又は改善に有用であることが知られているか又はそれにおいて使用されてきたか又は現在使用されている予防薬又は治療薬である。これらの実施形態によると、本組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
【０２２６】
本発明の抗体及び抗体部分は、対象への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。通常、本医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である、何らかの及び全ての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せの１以上が含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容可能な担体には、抗体又は抗体部分の貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤などの補助物質の少量がさらに含まれ得る。
【０２２７】
１以上の本発明の抗体又は本発明の１以上の抗体の組み合わせ及び、疾患又はその１以上の症候の予防、管理、治療又は改善に有用な予防薬又は治療薬を投与するために、様々な送達系が知られており、使用することができる（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中での封入、抗体又は抗体断片を発現可能な組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウイルス又はその他のベクターなどの一部としての核酸の構築物など）。本発明の予防薬又は治療薬を投与する方法には、以下に限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻内及び口腔経路）が含まれる。さらに、例えば、吸入器又はネブライザーの使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺内投与を使用し得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において、参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照。ある実施形態において、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を用いて、本発明の抗体、併用療法又は本発明の組成物を投与する。具体的な実施形態において、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、肺内又は皮下により本発明の予防薬又は治療薬を投与する。何らかの従来経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び小腸粘膜など）を通じた吸収により、予防薬又は治療薬を投与し得、その他の生物学的活性物質とともに投与し得る。投与は全身性又は局所性であり得る。
【０２２８】
具体的な実施形態において、治療の必要がある領域に局所的に本発明の予防薬又は治療薬を投与することは望ましいものであり得；これは、例えば、限定するものではないが、局所点滴により、注射により、又は移植手段により（この移植片は、膜及びマトリクスを含む多孔性又無孔性材料、例えば、サイラスティック膜、ポリマー、繊維状マトリクス（例えばＴｉｓｓｅｅｌ（Ｒ））又はコラーゲンマトリクスなど、である。）、達成され得る。ある実施形態において、本発明の１以上の抗体の有効量アンタゴニストは、疾患又はその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、対象の病変部に局所的に投与される。別の実施形態において、本発明の１以上の抗体の有効量は、疾患又は１以上のその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、本発明の抗体以外の１以上の治療薬（例えば１以上の予防薬又は治療薬）の有効量と組み合わせて、病変部に局所的に投与される。
【０２２９】
別の実施形態において、制御放出又は持続放出系で予防薬又は治療薬を送達することができる。ある実施形態において、制御放出又は持続放出を行うためにポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態において、本発明の治療薬の制御放出又は持続放出を行うためにポリマー性材料を使用することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；また、Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；同第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；及びＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３も参照）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例には、以下に限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）コポリマー、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態において、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性で、溶出不純物不含であり、保管時に安定であり、滅菌されており、生体分解性である。さらに別の実施形態において、制御放出系又は持続放出系は、予防又は治療標的に近接して置かれ得、従って、必要とされるのは全身的用量のうち僅かである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０２３０】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）により概説で考察されている。本発明の１以上の治療薬を含む持続放出製剤を調製するために、当業者にとって公知の何らかの技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４及びＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。
【０２３１】
具体的な実施形態において、本発明の組成物が、予防薬又は治療薬をコードする核酸である場合、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、細胞内に入るようにそれを投与することによって、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）又は直接注入によって又は微粒子衝突の使用によって（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくは遺伝子移入剤でのコーティングによって又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結してそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）、そのコードされる予防薬又は治療薬の発現を促進するためにインビボで核酸が投与され得る。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組み換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、以下に限定されないが、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれる。具体的な実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は局所投与に適している医薬組成物としての通常の手順に従い処方される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び局所麻酔薬（例えば、注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなど）も含み得る。
【０２３３】
本発明の組成物が局所投与されるべき場合、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ジェル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン又はその他の当業者にとって周知の形態で本組成物を処方することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５）参照。噴霧用ではない局所投与形態の場合、局所塗布に適合し、好ましくは水よりも動的粘性が高い担体又は１以上の賦形剤を含む半固体状又は固体形態の粘度が通常は使用される。適切な製剤には、以下に限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれ、必要に応じて、それらは滅菌されるか又は例えば浸透圧などの様々な特性に影響を与えるための補助物質（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。その他の適切な局所投与形態には、好ましくは、固体又は液体不活性担体と組み合わせて、活性成分が加圧揮発剤（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄ  ｖｏｌａｔｉｌｅ）（例えばフレオンなどのガス噴射剤）との混合物中又は搾り出しボトル中に封入される、噴霧用エアロゾル製剤が含まれる。モイスチャライザー又は保湿剤も必要に応じて医薬組成物及び投与形態に添加され得る。このようなさらなる成分の例は当技術分野で周知である。
【０２３４】
本発明の方法が組成物の鼻内投与を含む場合、エアロゾル形態、スプレー、ミストで又は滴剤の形態で組成物を処方することができる。特に、本発明に従う使用のための予防薬又は治療薬は、都合よく、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体）を使用して、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達させ得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するための値を与えることにより決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ又はｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）での使用のためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチンからなる。）は、本化合物と、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有するように処方され得る。
【０２３５】
本発明の方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル、カシェ剤、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で組成物を経口用に処方することができる。結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容可能な賦形剤とともに従来の手段により錠剤又はカプセルを調製することができる。当技術分野で周知の方法により錠剤を被覆し得る。経口投与用の液体製剤は、以下に限定されないが、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとり得るか、又はそれらは、使用前に水又はその他の適切なビヒクルで構成するための乾燥品として与えられ得る。懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別された植物油）；及び保存料（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの医薬的に許容可能な添加物とともに、従来の手段により、このような液体製剤を調製し得る。本製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、色素及び甘味料も含有し得る。経口投与のための製剤は、予防薬又は治療薬の、徐放、制御放出又は持続放出のために適切に処方され得る。
【０２３６】
本発明の方法は、例えば、エアロゾル化剤とともに処方される組成物の吸入器又はネブライザーの使用による、肺内投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。具体的な実施形態において、本発明の抗体、併用療法及び／又は本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。
【０２３７】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射又は連続点滴による）非経口投与のために処方される組成物の投与を含み得る。注射用の製剤は、保存料を添加された単位投与形態（例えば、アンプル又は複数回使用容器中）で与えられ得る。本組成物は、懸濁液、溶液又は油中エマルジョン又は水性ビヒクルなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調剤に必要な薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）も含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌発熱物質不含水）での構成のための粉末形態であり得る。本発明の方法は、さらに、デポー製剤として処方される組成物の投与を含み得る。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）により又は筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば、本組成物は、適切なポリマー性又は疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として（例えば難溶性の塩として）、処方され得る。
【０２３８】
本発明の方法は、中性又は塩形態として処方される組成物の投与を包含する。医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のものなどの陰イオンとともに形成されるもの及び、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどの陽イオンとともに形成されるものが含まれる。
【０２３９】
一般に、組成物の成分は、個別に又は単位投与形態で一緒に混合されて、例えば、活性物質の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水不含濃縮物として、供給される。投与方法が点滴である場合、滅菌された医薬グレードの水又は食塩水を含有する点滴瓶とともに組成物を調剤することができる。投与方法が注射によるものである場合、注射のための滅菌水又は食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。
【０２４０】
特に、本発明はまた、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１以上が、薬物の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中に封入されることも提供する。ある実施形態において、予防薬又は治療薬の１以上又は本発明の医薬組成物は、密封容器中で乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は水不含の濃縮物として供給され、対象への投与のために、（例えば水又は食塩水で）適切な濃度に再構成され得る。好ましくは、予防薬又は治療薬の１以上又は本発明の医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの単位投与量で、密封容器中で乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥された予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、その元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきであり、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、再構成後、１週間以内、好ましくは５日間以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与すべきである。代替的な実施形態において、予防薬又は治療薬の１以上又は本発明の医薬組成物は、薬物の量及び濃度を表示する密封容器中で液体形態で供給される。好ましくは、投与される組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬで密封容器中で供給される。液体形態はその元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきである。
【０２４１】
本発明の抗体及び抗体部分は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。好ましくは、この抗体又は抗体部分は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射用の溶液として調製される。注射用の溶液は、フリントガラス又は茶褐色のバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジ中で、液体又は凍結乾燥製剤の形態の何れかから構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ、最適には５−１０ｍＭ）であり得る。その他の適切な緩衝液には、以下に限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが含まれる。塩化ナトリウムは、０−３００ｍＭの濃度（液体投与形態の場合、最適には１５０ｍＭ）で溶液の毒性を変化させるために使用することができる。凍結乾燥製剤の場合、凍結保護剤、基本的には０−１０％スクロース（最適には０．５−１．０％）が含まれ得る。その他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥投与形態の場合、充填剤、基本的には１−１０％マンニトール（最適には２−４％）が含まれ得る。安定化剤は、基本的には１−５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適には５−１０ｍＭ）を液体及び凍結乾燥投与形態の両方で使用することができる。その他の適切な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれ、０−０．０５％ポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、以下に限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。非経口投与のための注射用の溶液として調製される本発明の抗体及び抗体部分を含む医薬組成物は、治療用タンパク質（例えば抗体）の吸収又は分散を促進するために使用されるものなど、アジュバントとして有用な物質をさらに含み得る。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（Ｒ）（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射用溶液にヒアルロニダーゼを添加することにより、非経口投与、特に皮下投与後のヒトバイオアベイラビリティーが向上する。これによりまた、疼痛及び不快感を軽減し、注入部位の反応の発生を最小限にしながら、注射部位の体積を大きくする（即ち１ｍＬ超）ことも可能となる（ＷＯ０４／０７８１４０及び米国特許出願公開ＵＳ２００６１０４９６８（参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。）。
【０２４２】
本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体投与形態、例えば溶液（例えば、注射用及び点滴用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び坐薬などが含まれる。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液の形態、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物など、である。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、本抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、本抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０２４３】
治療用組成物は、通常、製造及び保管の条件下で無菌であり安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高薬物濃度に適した秩序構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、活性化合物（即ち抗体又は抗体部分）を、必要とされる量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の１以上の組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさらなる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより、維持され得る。組成物中で吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことにより、注射用組成物を持続的に吸収させるようにすることができる。
【０２４４】
本発明の抗体及び抗体部分は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路／方法は、皮下注射、静脈内注射又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に依存して変化する。ある種の実施形態において、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物が急速に放出されないようにする担体を用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法が特許取得されているか、又は当業者にとって一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８参照。
【０２４５】
ある種の実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の抗体又は抗体部分を経口投与し得る。この化合物（及び必要に応じてその他の成分）を、硬殻又は軟殻のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤になるように圧縮するか又は対象の食餌に直接混合することもできる。治療剤の経口投与の場合、賦形剤とともにこの化合物を配合し、経口摂取錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラートなどの形態で使用し得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不活性化を阻止する物質で被覆するか、又はこの化合物をこれらと一緒に投与することが必要であり得る。
【０２４６】
補助的な活性物質を組成物中に配合することもできる。ある種の実施形態において、ＲＧＭ  Ａ活性が有害である疾患を治療するのに有用である１以上のさらなる治療薬とともに、本発明の抗体又は抗体部分を共処方（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）及び／又は同時投与する。例えば、本発明の抗ＲＧＭ  Ａ抗体又はその抗体部分を、その他の標的に結合する１以上のさらなる抗体（例えばサイトカインに結合するか又は細胞表面分子に結合する抗体）とともに共処方（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）及び／又は同時投与し得る。さらに、本発明の１以上の抗体は、先行する治療薬の２以上と組み合わせて使用され得る。このような併用療法は、有利に、投与される治療薬のより低い投与量を使用し得、従って、様々な単剤療法に付随する毒性又は合併症の可能性を回避する。
【０２４７】
ある種の実施形態において、ＲＧＭ  Ａに対する抗体又はその断片は、当技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、以下に限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号及び公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５０４４（これらは、あらゆる目的に対して参照により本明細書により組み込まれる。）に記載されている。
【０２４８】
具体的な実施形態において、遺伝子治療により、疾患又はその１以上の症候を治療、予防、管理又は改善するために、本発明の抗体又は本発明の別の予防薬又は治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が投与される。遺伝子治療は、発現されるか又は発現可能な核酸の対象への投与により行われる治療を指す。本発明のこの実施形態において、この核酸は、それらのコードされる抗体又は予防もしくは治療効果を媒介する本発明の予防薬もしくは治療薬を生成させる。
【０２４９】
本発明に従い、当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法の何れかを使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、米国特許出願公開ＵＳ２００５００４２６６４  Ａ１（参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されている。
【０２５０】
ＲＧＭ  Ａは、本明細書中上記で定義されるような様々な疾患に関連する病理において重要な役割を果たす。ＲＧＭ  Ａ及びＲＧＭタンパク質は、外傷性脳損傷に罹患しているヒトの損傷部位において（Ｓｃｈｗａｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２：１５６１−８、２００５ａ）、卒中で障害を受けたヒト脳の梗塞周辺部及びコア領域において（Ｓｃｈｗａｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２：１５６１−８、２００５ａ）、パーキンソン病に罹患している患者の黒質において（Ｂｏｓｓｅｒｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１９：９１−１０７、２００８）、上方制御されることが記載されている。従って、ＲＧＭ  Ａ抗体は、脳卒中、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病及びヒト神経系のその他の神経変性疾患の併用療法に対する適切な作用物質である。卒中患者において、最初の３時間内の最新の治療は、血塊の溶解のための組織プラスミノーゲン活性化因子の送達（Ｌｉａｎｇら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：１４２９−３３、２００８）からなり、このような治療は、原理的に、異なる治療アプローチをもたらし、さらなる治療枠を広げる、ＲＧＭ  Ａ抗体送達と組み合わせられ得る。アルツハイマー病において、ＲＧＭ  Ａ抗体との薬物の併用は、承認済みの認知促進薬、ドネペジル、メマンチンと可能であり、このようなアプローチにより進行性の神経病態の進行が顕著に抑制され得る。インスリンの鼻腔内送達は、注意及び記憶においてプラス方向の効果があり（Ｈａｎｓｏｎ及びＦｒｅｙ、ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：Ｓ５、２００８）、ＲＧＭ  Ａ抗体に対する可能な投与経路であり、これにより、血液−脳関門を迂回する。パーキンソン病（ＰＤ）患者において、最新の治療は、主に、レボドパなどのドーパミン作用薬、ドーパミンプロドラッグ（Ｋｈｏｒ及びＨｓｕ、Ｃｕｒｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：２３４−４３、２００７）、ロピニロール、非エルゴリン系ドーパミンアゴニスト（Ｊｏｓｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５５  Ｓｕｐｐｌ．５：６０−６３、２００８）、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤ラサギリン及びセレグリン（Ｅｌｍｅｒ及びＢｅｒｔｏｎｉ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．９：２７５９−７２、２００８）に基づく。早期及び軽度ＰＤでのそれらの有益な効果にかかわらず、これらの薬物の中で、脳の黒質及び関連皮質下及び皮質領域での進行性の変性を阻止できるものはなく、従って、再生刺激性ＲＧＭ  Ａ抗体との併用療法は、疾患経過を遅延させ得る。
【０２５１】
抗酸化剤、ラジカルスカベンジャー、フェニトインなどの抗けいれん薬又は貧血薬エリスロポエチンである、何らかの神経保護剤は、プロ再生ＲＧＭ  Ａ抗体との組み合わせ療法に適切であり、それにより、通常は非常に短い神経保護剤の治療的処置の枠が広がる。
【０２５２】
本発明の抗体及び抗体部分は、このような疾患に罹患しているヒトを治療するために使用され得る。
【０２５３】
本発明の抗体又はその抗原結合部分を、単独で、又はさらなる作用物質、例えば治療薬（このさらなる作用物質は、その意図する目的に対して熟練者により選択される。）と組み合わせて使用され得ることを理解されたい。例えば、さらなる作用物質は、本発明の抗体により治療されている疾病又は状態を治療するために有用であると当技術分野で認識されている治療薬であり得る。さらなる作用物質はまた、治療組成物に有利な属性を与える作用物質、例えば、組成物の粘性をもたらす作用物質、でもあり得る。本発明内に含まれるべき組み合わせは、それらの用途に有用な組み合わせであることをさらに理解されたい。下記で述べられる作用物質は、説明を目的とするものであり、限定を意図するものではない。本発明の一部であるこれらの組み合わせは、本発明の抗体及び下記リストから選択される少なくとも１つのさらなる作用物質であり得る。この組み合わせには、また、この組み合わせが、形成される組成物がその所望の機能を果たし得るようなものである場合、複数のさらなる作用物質、例えば２又は３のさらなる作用物質も含まれ得る。
【０２５４】
本発明の抗体又は抗体部分が組み合わせられ得る多発性硬化症に対する治療薬の非限定例には、次のもの：コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキセート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（ＡＶＯＮＥＸ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロン−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；インターフェロンα−ｎ３）（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉｍｏｍｔｏ）、インターフェロン−α（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ／Ｊ＆Ｊ）、インターフェロンβ１Ａ−ＩＦ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ペグインターフェロンα２ｂ（Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１；ＣＯＰＡＸＯＮＥ；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラドリビン；その他のヒトサイトカイン又は成長因子及びそれらの受容体、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦに対する抗体又はアンタゴニストが含まれる。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０又はそれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせられ得る。本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬などの作用物質、ＴＮＦα又はＩＬ−１（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）などの炎症性サイトカインによるシグナル伝達を阻止する作用物質、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体（例えば可溶性ｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）及び抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）とも組み合わせられ得る。
【０２５５】
抗体又はその抗原結合部分が組み合わせられ得る多発性硬化症に対する治療薬の好ましい例には、インターフェロン−β、例えば、ＩＦＮβ１ａ及びＩＦＮβ１ｂ；コパクソン、コルチコステロイド、カスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ−１の阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤及びＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体が含まれる。
【０２５６】
本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、アレムツズマブ、ドロナビノール、ユニメド、ダクリズマブ、ミトキサントロン、キサリプロデン塩酸塩、ファムプリジン、グラチラマー酢酸塩、ナタリズマブ、シンナビドール、ａ−イムノカインＮＮＳＯ３、ＡＢＲ−２１５０６２、ＡｎｅｒｇｉＸ．ＭＳ、ケモカイン受容体アンタゴニスト、ＢＢＲ−２７７８、カラグアリン（ｃａｌａｇｕａｌｉｎｅ）、ＣＰＩ−１１８９、ＬＥＭ（リポソーム封入ミトキサントロン）、ＴＨＣ．ＣＢＤ（カンナビノイドアゴニスト）ＭＢＰ−８２９８、メソプラン（ＰＤＥ４阻害剤）、ＭＮＡ−７１５、抗ＩＬ−６受容体抗体、ニューロバックス、パーフェニドン・アロトラップ１２５８（ＲＤＰ−１２５８）、ｓＴＮＦ−Ｒ１、タランパネル、テリフルノミド、ＴＧＦ−β２、チプリモチド、ＶＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、ＴＲ−１４０３５、ＶＬＡ４  Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ、Ａｎｔｅｇｒａｎ−ＥＬＡＮ／Ｂｉｏｇｅｎ）、インターフェロンγアンタゴニスト、ＩＬ−４アゴニストなどの作用物質とも組み合わせられ得る。
【０２５７】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な投薬で、必要な期間、所望の治療結果を達成するための、有効な量を指す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者により決定され得、個体の、疾病ステ―ジ、年齢、性別及び体重、その個体において所望の反応を誘発するための抗体又は抗体部分の能力などの因子に従い変動し得る。治療的有効量はまた、治療上の有益な効果が抗体又は抗体部分の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものでもある。「予防的有効量」とは、必要な投薬で、必要な期間、所望の予防結果を達成するための、有効な量を指す。通常、予防的用量は、対象において、疾患の前又は早期の段階で使用されるので、予防的有効量は治療的有効量より少量となろう。
【０２５８】
最適の所望の反応（例えば治療又は予防的反応）をもたらすために投薬計画を調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与し得、何回かの分割用量をある時間にわたり投与し得るか、又は、治療状況の要件により指示されるように、用量を均等に減少させ得るか又は増加させ得る。投与を容易にするために及び投与量を均一にするために、投与単位形態で非経口組成物を処方することは特に有利である。投与単位形態は、本明細書中で使用される場合、治療しようとする哺乳動物対象に対する単一の投与量として適切な物理的に分離された単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体とともに所望の治療効果を発揮するために計算される活性化合物の所定の量を含有する。本発明の投与単位形態に対する規定は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成しようとする特定の治療又は予防効果及び（ｂ）個体における感受性の治療に対するこのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限により決定され、これらに直接依存する。
【０２５９】
本発明の抗体又は抗体部分の治療的又は予防的有効量に対する代表的な非限定範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、緩和しようとする状態の種類及び重症度により変動し得ることに注意されたい。あらゆる特定の対象に対して、個々のニーズ及び本組成物の投与を行うか又は投与を監督する者の専門的判断に従い、ある時間にわたり具体的投薬計画を調整すべきであり、本明細書中で述べられる投与範囲は単なる例示であり、主張される組成物の範囲又は実施を限定するものではないことをさらに理解されたい。
【０２６０】
当業者にとって当然のことながら、本明細書中に記載される本発明の方法のその他の適切な変更及び適応は明らかであり、本発明の範囲及び本明細書中で開示される実施形態から逸脱することなく、適切な同等物を用いて為し得る。本発明を詳細に説明してきたが、次の実施例（単なる説明のために含まれるものであり、本発明を限定するものではない。）を参照することにより本発明がより明確に理解されよう。
【実施例】
【０２６１】
方法
次の方法は、実験セクションで使用される実験手順を詳述する。
【０２６２】
（ｉ）直接結合ＥＬＩＳＡプレートを炭酸緩衝液中の２μｇ／ｍＬの濃度のｈＲＧＭ  Ａ（Ｒ＆Ｄ）で被覆した。次に、２％ブロッキング溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で室温にて１時間、ウェルをブロッキング処理した。プレート中、上から下へ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中でビオチン化抗体を１：５の希釈係数で連続希釈し、室温にて１時間温置した。検出試薬は、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰの１：１０，０００希釈液であった。ＴＭＢ試薬で検出を行い、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎＭでＯＤを読み取った。
【０２６３】
（ｉｉ）ＦＡＣＳ分析。ｈＲＧＭ  Ａを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞又はラットＲＧＭ  Ａを過剰発現するＢＡＦ３細胞の安定した遺伝子移入体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中で４℃にて１５分間超、未標識５Ｆ９又は８Ｄ１ＭＡＢで染色した。マウス抗ラットＩｇＧ  ＰＥ抗体により検出を行った。
【０２６４】
（ｉｉｉ）ｈＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイにおいてＭＡＢ  ５Ｆ９を評価するための固相ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｈｉｓタグ付加ヒトネオゲニンタンパク質の細胞外ドメイン（保存溶液濃度：３０μｇ／ｍＬ）の２．５μｇ／ｍＬの濃度で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂ．Ｆ９６  ＮＵＮＣ、４３９４５４）を３７℃で１時間被覆した。温置後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる３回の別個の洗浄段階で未結合ネオゲニンを除去した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）ブロッキング溶液２００μＬ／ウェルを添加することにより、ネオゲニン被覆プレートのブロッキング処理を行った。３７℃で１時間温置後、ブロッキング溶液を除去し、抗体あり又はなしで、ヒトｆｃタグと結合されたＲＧＭ  Ａ断片又は全長タンパク質を添加した。ある実験においては、抗体をｆｃ−結合ｈＲＧＭ  Ａタンパク質とともに室温にて１時間予備温置した。抗体あり又はなしで、ネオゲニン被覆プレートをｈＲＧＭ  Ａとともに３７℃で１時間温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）での３回の洗浄段階後、ビオチン標識抗ヒトｆｃ抗体（１ｍｇ／ｍＬ、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で１：２００希釈）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：７０９−０６５−１４９とともに、３７℃で１時間、プレートを温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）を用いて、３回の洗浄段階により、未結合抗体を除去した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体の結合を視覚化するために、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで１：５０００希釈されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．＃１１０８９１５３００１）からなる複合体を添加し、続いて３７℃で１時間温置した。ペルオキシダーゼ基質（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ＃３４０２１）を添加する前に、３回の続く洗浄段階（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％））で未結合ペルオキシダーゼ複合体を除去した。ウェルへの基質添加から１−３０分後、２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により、基質反応を停止させた。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析（ＯＤ測定）した。
【０２６５】
（ｉｖ）ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−４結合アッセイにおいてＭＡＢ  ５Ｆ９を評価するための固相ＥＬＩＳＡアッセイ
組み換えヒトＢＭＰ−４タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３１４−ＢＰ、Ｌｏｔ＃ＢＥＭ３１６０６１）２．５μｇ／ｍＬの濃度を含有する溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂ．Ｆ９６  ＮＵＮＣ、４３９４５４）を３７℃で１時間被覆した。温置後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる３回の個別の洗浄段階で未結合ＢＭＰ−４を除去した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）ブロッキング溶液２００μＬ／ウェルを添加することによって、ＢＭＰ−４被覆プレートのブロッキング処理を行った。３７℃で１時間温置後、ブロッキング溶液を除去し、抗体あり又はなしで、ヒトｆｃタグと結合したＲＧＭ  Ａ断片又は全長タンパク質を添加した。ある実験においては、抗体をｆｃ−結合ｈＲＧＭ  Ａタンパク質とともに室温で１時間、予備温置した。抗体あり又はなしで、ｈＲＧＭ  ＡとともにＢＭＰ−４被覆プレートを３７℃で１時間温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）での３回の洗浄段階後、ビオチン標識抗ヒトｆｃ抗体（１ｍｇ／ｍＬ、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で１：２００希釈）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：７０９−０６５−１４９とともにプレートを３７℃で１時間温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）での３回の洗浄段階により未結合抗体を除去した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体の結合を視覚化するために、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで１：５０００希釈されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．＃１１０８９１５３００１）からなる複合体を添加し、続いて３７℃で１時間、温置した。ペルオキシダーゼ基質（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ＃３４０２１）を添加する前に、３連続洗浄段階（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％））で未結合ペルオキシダーゼ複合体を除去した。ウェルへの基質添加から１−３０分後、２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により、基質反応を停止させた。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析（ＯＤ測定）した。
【０２６６】
（ｖ）ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２結合アッセイにおいてＭＡＢ  ５Ｆ９を評価するための固相ＥＬＩＳＡアッセイ
組み換えヒトＢＭＰ−２タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３５５−ＢＭ、Ｌｏｔ＃ＭＳＡ０４）２．５μｇ／ｍＬの濃度を含有する溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂ．Ｆ９６  ＮＵＮＣ、４３９４５４）を３７℃で１時間被覆した。温置後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる３回の個別の洗浄段階で未結合ＢＭＰ−２を除去した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）ブロッキング溶液２００μＬ／ウェルを添加することによって、ＢＭＰ−２被覆プレートのブロッキング処理を行った。３７℃で１時間温置後、ブロッキング溶液を除去し、抗体あり又はなしで、ヒトｆｃタグと結合させられたＲＧＭ  Ａ断片又は全長タンパク質を添加した。ある実験においては、抗体をｆｃ−結合ｈＲＧＭ  Ａタンパク質とともに室温で１時間、予備温置した。抗体あり又はなしで、ｈＲＧＭ  ＡとともにＢＭＰ−２被覆プレートを３７℃で１時間、温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）での３回の洗浄段階後、ビオチン標識抗ヒトｆｃ抗体（１ｍｇ／ｍＬ、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で１：２００希釈）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：７０９−０６５−１４９とともにプレートを３７℃で１時間温置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）での３回の洗浄段階により未結合抗体を除去した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体の結合を視覚化するために、０．６％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで１：５０００希釈されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．＃１１０８９１５３００１）からなる複合体を添加し、続いて３７℃で１時間、温置した。ペルオキシダーゼ基質（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ＃３４０２１）を添加する前に、３連続洗浄段階（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％））で未結合ペルオキシダーゼ複合体を除去した。ウェルへの基質添加から１−３０分後、２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により、基質反応を停止させた。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析（ＯＤ測定）した。
【０２６７】
（ｖｉ）Ｎｔｅｒａ−２細胞培養
Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＭＳＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）からヒトＮｔｅｒａ−２細胞を得た。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋａｎｓａｓ、ＵＳＡ）及び５％ウマ血清（ＨＳ；Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＤＭＥＭ培地中で未分化Ｎｔｅｒａ−２細胞の凍結ストックを凍結融解した。細胞が８０％の密集度に到達するまで、培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で細胞を増殖させた。
【０２６８】
神経分化のために、分化用培地（１０％ＦＢＳ、５％ＨＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、レチノイン酸１０μｍを含有するＤＭＥＭ培地）中、２．５ｘ１０６個の細胞／１７５ｃｍ２の密度でＮｔｅｒａ−２細胞を播種した。細胞を３週間分化させ、週に２回培地を交換した。
【０２６９】
分化後、トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥離させ、１：６の割合で分割した。４８時間後、軽く叩くことによって下層の細胞から神経細胞を分離させた。新しい培地中で凝集させるために、取り外した細胞を新しい振盪培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に移した。Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、滑らかな水平振盪条件下、３７℃で２４時間、分化させたＮｔｅｒａ−２細胞を凝集させた。２４ウェルプレートにおいてカバースリップ１枚あたりおよそ２０−３０個の凝集体の密度でＮｔｅｒａ−２凝集物を播種した。ポリリジンで予め被覆したカバースリップをラミニン（２０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及び１０μｇ／ｍＬの濃度の組み換えｆｃ−連結ヒトＲＧＭ  Ａ断片＃７８６（アミノ酸４７−１６８）で被覆した。播種後、５Ｆ９ＭＡＢ（３種類の異なる濃度（０．１μｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ；１０μｇ／ｍＬ）で培地に添加）で培養物を処理し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７℃で２４時間さらに温置した。次に、凝集体を４％パラホルムアルデヒド中で固定（２時間、室温）し、ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加により透過処理（２０分、室温）した。蛍光染色のために、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで培養物を室温で１時間ブロッキング処理した。ブロッキング処理後、β−チューブリンアイソタイプ３に対するマウスモノクローナル抗体（クローンＳＤＬ３Ｄ１０、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ８６６０）とともに室温で２時間、Ｎｔｅｒａ細胞を温置した。３回の個別の洗浄段階（各５−１５分）により未結合抗体を除去し、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ及び０．５μｇ／ｍＬビスベンズイミド中で１：３５０倍希釈したＣｙ−３結合ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｔ６２５９７）とともにＮｔｅｒａ細胞を温置した。１時間の温置後、未結合二次抗体を除去するために培養物を３回洗浄した。蛍光顕微鏡のために、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｃｈｉｎｇ）中にカバースリップを包埋した。
【０２７０】
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００蛍光顕微鏡を用いてＮｔｅｒａ−２凝集体の画像を収集し、社内の画像収集及び分析システムを用いて、培養物の伸長を自動的に分析した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４．５により伸長の自動分析を行い、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４によりデータの統計分析を行った。ヒトＲＧＭ  Ａ断片＃７８６の非存在下で増殖させた対照培養物に対して伸長を正規化した。
【０２７１】
（ｖｉｉ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２２６６）は、転移性脳腫瘍由来のヒト神経芽細胞腫細胞である。５０％アール平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃２４０１０−０４３）及び５０％Ｆ１２（Ｈａｍ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃３１７６５−０２７）からなる培地中でこれらの細胞を増殖させた。熱不活性化１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃａｔ．＃１２１０７−１０００Ｍ）、１％ＮＥＡＡ（ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ｍ１７４５）及び１％ペニシリン（１０．０００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０．０００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃１５１４０−１２２）をこの培地にさらに添加した。神経分化及び及び神経突起の成長を刺激するために、数日間にわたり１０μｍレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ｒ２６２５−０５０ＭＧ））を添加した培地中でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養した。分化させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を組織培養フラスコ中で増殖させ、慎重にトリプシン処理することにより取り外し、ＲＧＭ  Ａタンパク質又はその断片及びコラーゲンＩのストライプパターンで被覆したガラス製カバースリップ上に置いた。
【０２７２】
（ｖｉｉｉ）ストライプのあるガラス製カバースリップの調製
以前に記載されたもの（Ｋｎｏｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１２１６−１２２４、２００７）とは少々異なる方法でガラス製カバースリップ上でのストライプアッセイの改変法を実施したが、これを下記で要約する。
【０２７３】
精製タンパク質からなるストライプの生成のための滅菌シリコン基盤を、基盤の粗い面を上に向けて、ペトリ皿の表面上に押し付けた。エタノールで洗浄した汚染のないカバースリップをこの基盤上に置き、基盤の角をカバースリップの裏面にインクボールペンでマークする。カバースリップがペトリ皿の底部に向くように、カバースリップを載せた基盤を慎重に裏返した。ＲＧＭ  Ａストライプを可視化するために、Ｆｃ−結合全長阻害性ＲＧＭ  Ａ又はＦｃ−断片又はその組み換えヒトＲＧＭ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．＃２４５９  ＲＭ）をＦＩＴＣ標識抗マウス抗体（Ｆａｂ特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ｆ−４０１８）１０μＬと混合した。ハミルトンシリンジを用いて、注入口を通じてＲＧＭ  Ａ−ＦＩＴＣ抗体溶液５０μＬを慎重に注入する。過剰な液が排出口を通じて基盤から流出したが、これはＫｌｅｅｎｅｘ布で除去する。３７℃で２時間、マトリクス−カバースリップを温置した後、第一のコーティング溶液（ＲＧＭ  Ａ含有）をＰＢＳ１００μＬで洗い流した。次の段階で、ＲＧＭ  Ａストライプ付きのカバースリップを２４ウェルプレートに移し、ＲＧＭ  Ａストライプの間の空いている部分を埋めるために、５００μＬコラーゲンＩ（ラット尾部コラーゲンＩ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ．＃３５４２３６）で被覆し、３７℃で２時間温置した。最後に、カバースリップ上にＲＧＭ  Ａ及びコラーゲンＩの交互のストライプのパターンが生じた。温置後、ＰＢＳによる３回の個別の洗浄段階で未結合コラーゲンＩを洗い流し、分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をカバースリップ上に置いた。ヒトＲＧＭ  Ａに対するモノクローナル抗体の存在下又は非存在下で、パターン化基質上でのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の温置を３７℃で２０−２４時間続けた。
【０２７４】
免疫蛍光分析のために、室温で２時間又は４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、室温で１０−２０分間、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳとともに温置することにより透過処理した。６０分間にわたる３％ＢＳＡでのブロッキング処理後、一次抗体（モノクローナル抗−β−チューブリンアイソタイプ３クローンＳＤＬ  ３Ｄ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ｔ８６６０）とともに細胞を室温で２時間温置し、数回の洗浄段階後、０．１％ＢＳＡ入りのＰＢＳ中で希釈した二次抗体（Ｃｙ−３ロバ抗マウス  ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｔ：６２５９７）とともに１時間温置した。ビスベンズイミドＨ３３２５８（Ｒｉｅｄｅｌ−Ｄｅ−Ｈａｅｎ、Ｃａｔ．＃Ａ−０２０７）を用いて核を対比染色した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．：Ｃａｔ．＃０１０００１）中に細胞を最終的に包埋した。Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて細胞を分析した。
【０２７５】
（ｉｘ）組み換え抗ＲＧＭ  Ａ抗体の構築及び発現
細菌における相同組み換えにより、２つのヒンジ領域アミノ酸突然変異を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有するｐＨｙｂＥ発現ベクターに、ラット抗ヒトＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体５Ｆ９及び８Ｄ１の重鎖可変領域のｃＤＮＡ断片をコードするＤＮＡをクローニングした。これらの突然変異は、位置２３４及び２３５でのロイシンからアラニンへの変化である（ＥＵ付番、Ｌｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７）。ヒトκ定常領域を含有するｐＨｙｂＥベクターに、５Ｆ９及び８Ｄ１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をクローニングした。代表的なｐＨｙｂ−Ｅベクターには、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ及びｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ、非−ａ（米国特許出願第６１／０２１，２８２号参照）が含まれる。ｐＨｙｂＥ発現プラスミドに結合されたキメラ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの同時遺伝子移入により、２９３Ｅ細胞において全長抗体を一時的に発現させた。プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより、組み換え抗体を含有する細胞上清を精製し、酸性緩衝液の添加により、結合した抗体を溶出させた。抗体を中和し、ＰＢＳに対して透析した。次に、実施例１に記載されるようなＥＬＩＳＡ及び実施例７に記載されるような競合的ＥＬＩＳＡにより、精製抗ヒトＲＧＭＡモノクローナル抗体を、ＲＧＭ  Ａへのそれらの結合能について試験した。
【０２７６】
（実施例１）
抗ヒトＲＧＭ  Ａモノクローナル抗体の作製
次のようにして抗ヒトＲＧＭ  Ａラットモノクローナル抗体を得た。
【０２７７】
（実施例１Ａ）
ヒトＲＧＭ  Ａ抗原でのラットの免疫付与
第１日に、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合した組み換え精製ヒトＲＧＭ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃２４５９−ＲＭロットＭＲＨ０２５１１Ａ）２５μｇを４匹の６−８週齢Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに皮下注射した。第２１、４２及び６３日に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合した組み換え精製ヒトＲＧＭ  Ａ２５μｇを同じ４匹のＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに皮下注射した。第１４４日又は第１６５日に、ラットに１０μｇ組み換え精製ヒトＲＧＭ  Ａを静脈内注射した。
【０２７８】
（実施例１Ｂ）
ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマを作製するために、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５に記載の確立された方法に従い、実施例１．２．Ａに記載の免疫付与ラットから得られる脾臓細胞をＳＰ２／Ｏ−細胞と２：１の比率で融合させた。
【０２７９】
１．５ｘ１０５個の脾臓細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート中のアザセリン及びヒポキサンチンを含有する選択培地に融合生成物を入れた。融合から７−１０日後、肉眼で見えるハイブリドーマコロニーを観察した。ヒトＲＧＭ  Ａに対する抗体の存在について、直接的ＥＬＩＳＡ（実施例２参照）により、ハイブリドーマコロニーを含有する各ウェルからの上清を試験した。ヒト及び／又はラットＲＧＭ  Ａを発現する安定的遺伝子移入ＨＥＫ２９３細胞に対するＦＡＣＳにおいてＥＬＩＳＡ陽性細胞株を試験した。続いて、ラットＲＧＭ  Ａとの交差反応性及びＨｕＲＧＭ  Ａ４７−１６８融合タンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合について、直接的ＥＬＩＳＡにおいて、これらのラットハイブリドーマ細胞株を試験した。
【０２８０】
【表１０】
2020018316.tif 000014
【０２８１】
（実施例２）
ｍＡＢ５Ｆ９及び８Ｄ１の直接的ＥＬＩＳＡ結合
図１Ａで示されるように、ＭＡＢ５Ｆ９及び８Ｄ１は、上記セクション（ｉ）で記載されるように同様の力価でｈＲＧＭ  Ａに結合する。ＭＡＢ  ５Ｆ９もまたＥＬＩＳＡでラットＲＧＭ  Ａに結合することが示されたが、一方で、８Ｄ１はラットＲＧＭ  Ａに結合することはできない（データ示さず。）。図１Ｂは、ＭＡＢ５Ｆ９及び８Ｄ１が、ＦＡＣＳにおいてｈＲＧＭ  Ａを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に結合することを示す。図１Ｃは、５Ｆ９（８Ｄ１ではない。）が、ＦＡＣＳにおいて、ラットＲＧＭ  Ａを過剰発現するＢＡＦ３細胞に結合可能であることを示す。セクション（ｉｉ）に記載のようにＦＡＣＳを行った。
【０２８２】
競合的ｈＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイにおけるＭＡＢ  ５Ｆ９結合を評価するために、固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＥＬＩＳＡプレートを調製し、本願のセクション（ｉｉｉ）に記載のように使用した。３７℃で１時間、５Ｆ９抗体とともに０．５μｇ／ｍＬの濃度でｈＲＧＭ  Ａを添加した。次の濃度：１．２５μｇ／ｍＬ；０．６３μｇ／ｍＬ；０．３２μｇ／ｍＬ；０．１６μｇ／ｍＬ；０．０８μｇ／ｍＬ；０．０４μｇ／ｍＬ；０．０２μｇ／ｍＬ；０．０１μｇ／ｍＬでＭＡＢ  ５Ｆ９を使用した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ｈＲＧＭ  Ａの結合を視覚化した。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析した（ＯＤ測定）。図２で示されるように、高い方から３つの抗体濃度は、用量依存的にネオゲニンへの全長ヒトＲＧＭ  Ａの結合を阻害した。
【０２８３】
競合的ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−４結合アッセイにおいてＭＡＢ  ５Ｆ９を評価するためにも固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＥＬＩＳＡプレートを調製し、本願のセクション（ｉｖ）に記載のように使用した。５Ｆ９抗体とともに０．５μｇ／ｍＬの濃度で３７℃で１時間、ｈＲＧＭ  Ａを添加した。次の濃度：１．２５μｇ／ｍＬ；０．６３μｇ／ｍＬ；０．３２μｇ／ｍＬ；０．１６μｇ／ｍＬ；０．０８μｇ／ｍＬ；０．０４μｇ／ｍＬ；０．０２μｇ／ｍＬ；０．０１μｇ／ｍＬでＭＡＢ  ５Ｆ９を使用した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ｈＲＧＭ  Ａの結合を視覚化した。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析した（ＯＤ測定）。図３で示されるように、高い方から４種類の抗体濃度は、用量依存的にＢＭＰ−４への全長ヒトＲＧＭ  Ａの結合を阻害した。
【０２８４】
ＢＭＰ−４への断片０（４７−１６８）ｈＲＧＭ  ＡのＭＡＢ  ５Ｆ９結合阻害を評価するためにも固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ヒト組み換えＢＭＰ−４タンパク質の２．５μｇ／ｍＬの濃度で、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間被覆した。５Ｆ９抗体とともに０．５μｇ／ｍＬの濃度で３７℃で１時間、ｈＲＧＭ  Ａ軽鎖（断片０、４７−１６８）を添加した。次の濃度：１．２５μｇ／ｍＬ；０．６３μｇ／ｍＬ；０．３２μｇ／ｍＬ；０．１６μｇ／ｍＬ；０．０８μｇ／ｍＬ；０．０４μｇ／ｍＬ；０．０２μｇ／ｍＬ；０．０１μｇ／ｍＬでＭＡＢ  ５Ｆ９を使用した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ｈＲＧＭ  Ａの結合を視覚化した。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析した（ＯＤ測定）。図４は、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ及び０．３２μｇ／ｍＬの抗体濃度が用量依存的にＢＭＰ−４に対するヒトＲＧＭ  Ａ軽鎖の結合を阻害することを示す。競合的ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２結合アッセイでのＭＡＢ  ５Ｆ９結合を評価するためにも固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＥＬＩＳＡプレートを調製し、本願のセクション（ｖ）に記載のように使用した。５Ｆ９抗体とともに０．５μｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で１時間、全長ｈＲＧＭ  Ａを添加した。次の濃度：５μｇ／ｍＬ；２．５μｇ／ｍＬ；１．２５μｇ／ｍＬ；０．６３μｇ／ｍＬ；０．３２μｇ／ｍＬ；０．１６μｇ／ｍＬでＭＡＢ  ５Ｆ９を使用した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ｈＲＧＭ  Ａの結合を視覚化した。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析した（ＯＤ測定）。図５は、抗体濃度５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬがＢＭＰ−２に対する全長ヒトＲＧＭ  Ａの結合を阻害することを示す。
【０２８５】
ｈＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン、ｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−２及びｈＲＧＭ  Ａ−ＢＭＰ−４結合アッセイにおいてＭＡＢ５Ｆ９及び８Ｄ１を評価するためにも固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した（図９）。記載のように、Ｈｉｓ−タグ付加ヒトネオゲニンタンパク質の細胞外ドメイン２．５μｇ／ｍＬ濃度又は２．５μｇ／ｍＬ  Ｂｍｐ−２又はＢＭＰ−４でＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間被覆した。抗体とともに０．５μｇ／ｍＬの濃度で全長ｆｃ−結合ｈＲＧＭ  Ａを３７℃で１時間添加した。次の濃度：５μｇ／ｍＬ；２．５μｇ／ｍＬ；１．２５μｇ／ｍＬ；０．６３μｇ／ｍＬ；０．３２μｇ／ｍＬ；０．１６μｇ／ｍＬ；０．０８μｇ／ｍＬでＭＡＢ  ５Ｆ９及び８Ｄ１を使用した。ビオチン標識抗ｆｃ抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ｈＲＧＭ  Ａの結合を視覚化した。Ａｎｔｈｏｓ光度計を用いて４５０ｎｍの波長でプレートを分析した（ＯＤ測定）。図９で示されるように、ラットモノクローナル抗体８Ｄ１は、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４に対するヒトＲＧＭ  Ａの結合を阻害又は減少させるが、ネオゲニンへのその結合を阻害することはできない。
【０２８６】
（実施例３）
分化したヒトＮＴｅｒａニューロンの凝集を用いた神経突起伸長アッセイにおけるｍＡＢ  ５Ｆ９活性
Ｎｔｅｒａ細胞を得て、本願の方法セクション（ｖｉ）に記載のように培養した。ｍＡＢ  ５Ｆ９は、分化したヒトＮＴｅｒａニューロンの凝集による神経突起伸長アッセイにおけるヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の強力なｆｃ−結合軽鎖（アミノ酸４７−１６８）の神経突起伸長阻害活性を中和した。図６で示されるように、阻害性ＲＧＭ  Ａタンパク質又は断片の非存在下及び伸長刺激性基質ラミニンの存在下でニューロンのＮＴｅｒａ凝集体は、伸長する神経突起の広範囲の密集したネットワークを示す（Ａ）。また図６で示されるように、ｈＲＧＭ  Ａ軽鎖が存在すると、ＮＴｅｒａ神経突起の数、密度及び長さが劇的に低下し、このことから、ｈＲＧＭ  Ａ断片の強力な阻害活性が証明される。凝集したままである少数の神経突起は短く、堅く束ねられている（Ｂ）。図６のＣ−Ｅ部は、培養に添加されたＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度漸増により、用量依存的にｈＲＧＭ  Ａ軽鎖断片の神経突起伸長阻害活性が中和されたか又は抑制されたことを示す。ＭＡＢの濃度漸増につれて、ＲＧＭ  Ａ阻害剤（Ｃ：０．１μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９；Ｄ：１μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９；Ｅ：１０μｇ／ｍＬ  ＭＡＢ  ５Ｆ９）が存在するにもかかわらず、Ｎｔｅｒａニューロン凝集体の伸長が完全に維持される。
【０２８７】
ヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の強力なｆｃ−結合軽鎖阻害性断片（アミノ酸４７−１６８）を試験するために、ヒトＮＴｅｒａ凝集体による神経突起成長アッセイにおけるＭＡＢ  ５Ｆ９の中和活性の定量分析を行った。ビスベンズイミドで凝集体を染色することによって、培養物の伸長を自動的に分析し、続いて写真撮影を行った。この染色は伸長する神経突起ではなく凝集体のみをマークした。しかし、伸長する神経突起は、β３−チューブリンに対する抗体及び蛍光物質標識二次抗体で染色された。神経突起伸長指標を計算することによって（指標は、凝集体及びその突起のβ３チューブリン染色面積から細胞体の面積を差し引くことにより計算）、神経突起伸長を自動的に測定した。次に、Ｌｉｎｇｏｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０３：１８１−１８９、２００７に記載のように、細胞体の面積でこの因子を割った。図７は、ＭＡＢ  ５Ｆ９が用量依存的に（０．１−１０．０μｇ）ヒトＮｔｅｒａ凝集体による神経突起伸長アッセイでのｆｃ−結合、強力ｈＲＧＭ  Ａ阻害剤断片（断片０、４７−１６８；１０μｇ）の伸長阻害活性を中和したことを示す。
【０２８８】
（実施例４）
ｈＲＧＭ  Ａ／コラーゲンＩストライプにおけるｍＡｂ  ５Ｆ９活性
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養し、本願のセクション（ｖｉｉ）に記載のように使用した。ＲＧＭ  Ａ及びコラーゲンＩによるストライプ付きガラス製カバースリップを本願のセクション（ｖｉｉｉ）に記載のように調製した。文献に記載のプロトコール（Ｋｎｏｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１２１６−１２２４、２００７）に従い、本実験のために、ｈＲＧＭ  Ａ／コラーゲンＩ及びコラーゲンＩの交互のストライプ付きのカーペットを作製した。５Ｆ９ＭＡＢ非存在下で（Ａ）、ニューロンのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はコラーゲンＩストライプに対する明らかな選択性を示し、この細胞の９０％がｈＲＧＭ  ＡよりもコラーゲンＩストライプを選択する。ＭＡＢ  ５Ｆ９の濃度漸増につれて、ニューロンＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、コラーゲンＩストライプよりもｈＲＧＭ  Ａストライプを選択するようになる（Ｂ−Ｅ）。使用した最大ＭＡＢ濃度において（Ｅ））、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロンは、コラーゲンＩストライプと比較して、ｈＲＧＭ  Ａストライプに対する強い選択性を示す（図８参照）。これは、５Ｆ９ＭＡＢが、誘因性の活性においてＲＧＭ  Ａの阻害性の性質を変換したので、５Ｆ９ＭＡＢのユニークな特徴として解釈され得る。５Ｆ９の漸増濃度の存在下で、神経細胞は、ＲＧＭ  Ａ基質へ移動し、そこで伸長する傾向があり、コラーゲンＩのような許容基質では成長しない。このようなユニークな特性はモノクローナル抗体に対して以前記載されたことはない。
【０２８９】
（実施例５）
ＣＤＲ−グラフト抗体の構築
当技術分野で周知の標準的方法を適用することにより、モノクローナル抗体５Ｆ９のＶＨ及びＶＬ鎖のＣＤＲ配列（上記表５参照）が様々なヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列に移植される。本発明のモノクローナル抗体５Ｆ９のＶＨ及びＶＬ配列との配列ＶＨ及びＶＬアラインメントに基づき、次の既知のヒト配列を選択する：
ａ）（上記表３に従う）重鎖アクセプター配列を構築するための、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−３３及びＶＨ３−２３ならびに連結配列ｈＪＨ３、ｈＪＨ４及びｈＪＨ６；
ｂ）（上記表４に従う）軽鎖アクセプター配列を構築するための、Ａ１７及びＡ１８ならびにｈＪＫ２。
【０２９０】
５Ｆ９の対応するＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲを前記のアクセプター配列に移植することにより、次のＣＤＲグラフト、ヒト化、修飾ＶＨ及びＶＬ配列を調製した（上記表６も参照）：ＶＨ５Ｆ９．１−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．２−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．３−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．４−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．５−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．６−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．７−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．８−ＧＬ；ＶＬ  ５Ｆ９．１−ＧＬ、ＶＬ  ５Ｆ９．２−ＧＬ及びＶＬ  ５Ｆ９．３−ＧＬ。
【０２９１】
（実施例６）
ＣＤＲグラフト抗体におけるフレームワーク復帰突然変異の構築
ヒト化抗体フレームワーク復帰突然変異を生成させるために、可変ドメインのデノボ合成によって及び／又は、突然変異誘発性プライマー及びＰＣＲ及び当技術分野で周知の方法を用いて、実施例５に従い調製されるようなＣＤＲグラフト抗体配列に突然変異を導入する。次のようにＣＤＲグラフトのそれぞれに対して、復帰突然変異及びその他の突然変異の様々な組み合わせを構築する。
【０２９２】
重鎖ＶＨ５Ｆ９．１−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．２−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．３−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：
Ｖ３７→Ｉ、Ｖ４８→Ｉ、Ｓ４９→Ｇ及び／又はＲ９８→Ｋ。
【０２９３】
重鎖ＶＨ５Ｆ９．４−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．５−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．６−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：
Ｖ３７→Ｉ、Ｖ４８→Ｉ、Ａ４９→Ｇ、Ｒ９８→Ｋ。
【０２９４】
重鎖ＶＨ５Ｆ９．７−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．８−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．９−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：
Ｖ３７→Ｉ、Ｖ４８→Ｉ、Ｓ４９→Ｇ。
【０２９５】
さらなる突然変異には、次のものが含まれる：
重鎖ＶＨ５Ｆ９．１−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．２−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．３−ＧＬに対して：Ｄ８８→Ａ、
重鎖ＶＨ５Ｆ９．４−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．５−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．６−ＧＬに対して：
Ｑ１→Ｅ及び
重鎖ＶＨ５Ｆ９．７−ＧＬ、ＶＨ５Ｆ９．８−ＧＬ及びＶＨ５Ｆ９．９−ＧＬに対して：
Ｌ５→Ｖ。
【０２９６】
軽鎖ＶＬ  ５Ｆ９．１−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：Ｉ２→Ｖ、Ｍ４→Ｌ、Ｙ４１→Ｆ。
【０２９７】
軽鎖ＶＬ  ５Ｆ９．２−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：Ｍ４→Ｌ、Ｒ５１→Ｌ。
【０２９８】
軽鎖ＶＬ  ５Ｆ９．３−ＧＬに対して、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基のうち１以上を次のように復帰突然変異させる：Ｍ４→Ｌ、Ｙ４１→Ｆ。
【０２９９】
（実施例７）
組み換えヒト化抗ＲＧＭ  Ａ抗体の構築及び発現
上記セクションｉｘに記載のように、全長ヒト化抗体を一時的に産生させるために、フレームワーク復帰突然変異を含有する重鎖及び軽鎖を有するｐＨｙｂＥ発現ベクターを２９３−６Ｅ細胞に同時遺伝子移入した。可変ドメインのデノボ合成によって及び／又は、突然変異誘発性プライマー及びＰＣＲ及び当技術分野で周知の方法を用いて、実施例５に従い調製されるようなＣＤＲグラフト抗体配列に突然変異を導入した。ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を表８で開示する。
【０３００】
具体的に、重鎖に対して：
ＶＨ５Ｆ９．１、ＶＨ５Ｆ９．５及びＶＨ５Ｆ９．９は、Ｑ１→Ｅ突然変異があるＶＨ５Ｆ９．４−ＧＬを含有する。
【０３０１】
ＶＨ５Ｆ９．２、ＶＨ５Ｆ９．６、ＶＨ５Ｆ９．１０、ＶＨ５Ｆ９．１９、ＶＨ５Ｆ９．２０、ＶＨ５Ｆ９．２１及びＶＨ５Ｆ９．２２は、Ｑ１→Ｅ突然変異及び次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｖ３７→Ｉ、Ｖ４８→Ｉ、Ａ４９→Ｇ、Ｔ９８→ＫがあるＶＨ５Ｆ９．４−ＧＬを含有する。
【０３０２】
ＶＨ５Ｆ９．３、ＶＨ５Ｆ９．７及びＶＨ５Ｆ９．１１は、Ｌ５→Ｖ突然変異があるＶＨ５Ｆ９．７−ＧＬを含有する。ＶＨ５Ｆ９．４、ＶＨ５Ｆ９．８、ＶＨ５Ｆ９．１２、ＶＨ５Ｆ９．２３、ＶＨ５Ｆ９．２４、ＶＨ５Ｆ９．２５及びＶＨ５Ｆ９．２６は、Ｌ５→Ｖ突然変異及び次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｖ３７→Ｉ、Ｖ４８→Ｉ、Ｓ４９→ＧがあるＶＨ５Ｆ９．７−ＧＬを含有する。
【０３０３】
軽鎖に対して：
ＶＬ５Ｆ９．１、ＶＬ５Ｆ９．２、ＶＬ５Ｆ９．３及びＶＬ５Ｆ９．４はＶＬ５Ｆ９．１−ＧＬと同一である。
【０３０４】
ＶＬ５Ｆ９．５、ＶＬ５Ｆ９．６、ＶＬ５Ｆ９．７及びＶＬ５Ｆ９．８はＶＬ５Ｆ９．２−ＧＬと同一である。
【０３０５】
ＶＬ５Ｆ９．９、ＶＬ５Ｆ９．１０、ＶＬ５Ｆ９．１１及びＶＬ５Ｆ９．１２はＶＬ５Ｆ９．３−ＧＬと同一である。
【０３０６】
ＶＬ５Ｆ９．１９及びＶＬ５Ｆ９．２３は、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｍ４→Ｌ、Ｒ５１→ＬがあるＶＬ５Ｆ９．２−ＧＬを含有する。ＶＬ５Ｆ９．２０及びＶＬ５Ｆ９．２４は、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｍ４→ＬがあるＶＬ５Ｆ９．２−ＧＬを含有する。
【０３０７】
ＶＬ５Ｆ９．２１及びＶＬ５Ｆ９．２５は、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｍ４→Ｌ、Ｙ４１→ＦがあるＶＬ５Ｆ９．３−ＧＬを含有する。ＶＬ５Ｆ９．２２及びＶＬ５Ｆ９．２６は、次のバーニア及びＶＨ／ＶＬ接続残基復帰突然変異：Ｍ４→ＬがあるＶＬ５Ｆ９．３−ＧＬを含有する。
【０３０８】
【表１１】
2020018316.tif 000015
2020018316.tif 000016
2020018316.tif 000017
2020018316.tif 000018
【０３０９】
（実施例８）
競合ＥＬＩＳＡを用いたヒト化５Ｆ９抗体の特性評価
０．２Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４中の０．２５μｇ／ｍＬ  ｈＲＧＭ  Ａの５０μＬ／ウェルにより、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３６９）を被覆し、洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中２％脱脂粉乳２００μＬ／ウェルにより室温で１時間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液での洗浄後、ＥＬＩＳＡ緩衝液５０μＬ／ウェル中の、ビオチン化キメラ５Ｆ９（０．１μｇ／ｍＬ最終濃度）及び５０μｇ／ｍＬ最終濃度から始まり５倍連続希釈した未標識競合試験抗体の混合物をデュプリケートで添加した。室温で１時間プレートを温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中のＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）の１：１０，０００希釈液１００μＬ／ウェルを用いて、結合した抗体を検出した。室温で１時間温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ緩衝液（Ｚｙｍｅｄ）１００μＬ／ウェルを添加することにより発色を行った。室温で１５分間温置した後、１Ｎ塩酸５０μＬ／ウェルを添加することによって発色を停止させた。４９０ｎｍで吸収を読み取った。
【０３１０】
表９は、コンピュータソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて得られたヒト化５Ｆ９抗体のＩＣ５０値を示す。
【０３１１】
【表１２】
2020018316.tif 000019
【０３１２】
（実施例９）
ＢＩＡＣＯＲＥ技術を用いたキメラ及びヒト化抗体の親和性決定
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）は、会合、解離速度定数の速度論的測定により抗体の親和性を決定する。２５℃での連続的なＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）での表面プラズモン共鳴に基づく測定により、組み換え精製ヒトＲＧＭ  Ａに対する抗体の結合を調べた。化学物質は全て、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。２５μｇ／ｍＬで製造者の説明書及び手順に従い、標準的アミンカップリングキットを用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧおよそ５０００ＲＵ、（Ｆｃγ）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で希釈した断片特異的ポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をＣＭ５研究グレードバイオセンサーチップの全域に直接固定化した。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロッキング処理した。フローセル２及び４の修飾カルボキシメチルデキストラン面を反応面として使用した。フローセル１及び３のヤギ抗ヒトＩｇＧなしの未修飾カルボキシメチルデキストランを参照面として使用した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ特異的反応面全域での捕捉のために、ＨＥＰＥＳ−緩衝塩中で精製抗体を希釈した。５μＬ／分の流速で、リガンドとして捕捉しようとするヒト抗体（２５μｇ／ｍＬ）を反応基盤全体に注入した。２５μＬ／分の連続流速下で、会合及び解離速度定数、ｋｏｎ（単位  Ｍ−１ｓ−１）及びｋｏｆｆ（単位ｓ−１）を調べた。速度定数は、０．３９から５０ｎＭの範囲の１０種類の異なる抗原濃度で速度論的結合測定を行うことにより得た。速度論的分析に対して、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０ソフトウェアを使用して、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルから得られた反応速度式を同様に全８回の注入の会合及び解離相に（グローバルフィット分析を用いて）フィットさせた。次に、ヒト化抗体と組み換え精製ヒトＲＧＭ  Ａとの間の反応の平衡解離定数（単位  Ｍ）を次の式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎによって、反応速度定数から計算した。
【０３１３】
【表１３】
2020018316.tif 000020
【０３１４】
（実施例１０）
ヒト化５Ｆ９抗体は、神経ＳＨ−ＳＹ５Ｙ化学走性アッセイにおいてヒトＲＧＭ  Ａの化学反発活性を中和する。
【０３１５】
化学走性アッセイは、化学誘引又は化学反発活性を発揮することができる拡散性因子に反応した細胞の化学走性の挙動を測定する。ＲＧＭ  Ａは、膜結合（接触に依存した反発）及び可溶性の拡散形態（化学反発性）の両方で作用するタンパク質として記載されており、従って、ｈＲＧＭ  Ａ化学走性アッセイにおいて評価されてきた。この目的のために、ＲＧＭ受容体ネオゲニンを保持するＲＧＭ  Ａ−感受性のヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙを使用した（Ｓｃｈａｆｆａｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１０７：４１８−４３１、２００８）。１０％ウシ胎仔血清及び１％非必須アミノ酸（ＭＥＭ−ＮＥＡＡ）を添加したアール平衡塩溶液／Ｆ１２（ＥＢＳＳ／Ｆ１２）培地中でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を増殖させた。神経突起伸長の誘導のために、１０μｍレチノイン酸（ＲＡ）を添加した培地中で細胞を培養した。５−６時間後、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５１１８５、ＨＴＳ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）に入れるために数えた。細胞縣濁物５００μＬ（１ｘ１０５個の細胞に対応）を各ウェルの内側の円部分に添加した。この内側の円部分は、各ウェルのより大きい外側の円部分と、８μｍ孔径のＰＥＴ膜により分離されている。培地＋／−ＲＧＭ  Ａ＋／−抗体６００μＬをピペットで外側の円部分に入れ、マルチウェルボイデンチャンバー中で細胞を３７℃で一晩培養した。温置後、培地を吸引除去し、固定剤（２％パラホルムアルデヒド）に置き換えた。室温で２時間固定を続け、ＰＢＳで数回洗浄段階を行った後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いて透過処理を行った（１５分、ＲＴ）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ファロイジン１：１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１２３７９）及びビスベンズイミド（Ｈ３３２４５６）１：１００の溶液中で暗所にて１時間これらを温置することにより、細胞の染色を行った。ＰＢＳで２回洗浄段階を行った後、培養物にＰＢＳを満たし、パラフィルムで密封し、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）での分析のために暗所で保存した。
【０３１６】
ｈＲＧＭ  Ａの非存在下で、細胞は、膜孔を通じて移動し、固定及び染色後に数えることができる。数えられるのは、膜の底部に接着した細胞のみであるが、これは、これらの細胞がＰＥＴ膜を通じて移動したからである。固定手順前に、膜の上側にある細胞を慎重に剥がした。この化学走性アッセイから、ｈＲＧＭ  Ａが存在した場合、膜を通じて移動するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の数が８０％超、顕著に減少したことが証明された。ラットモノクローナル５Ｆ９、キメラヒト−ラット５Ｆ９及びヒト化５Ｆ９は、膜の底部で見られる細胞の数の増加で明らかであるように、１０μｇ／ｍＬでｈＲＧＭ  Ａの化学反発活性を部分的又は完全に中和した（アイソタイプ対照ラットモノクローナル抗体（ｐ２１）は中和しなかった。）（図１０）。
【０３１７】
（実施例１１）
５Ｆ９は、視神経損傷のラットモデルにおいて、破壊された損傷視神経軸索の再生を誘導する。
【０３１８】
視神経破壊（又は視神経損傷）モデルは、視神経繊維の再生を刺激し、網膜ガングリオン細胞の大規模な細胞死を減少させる様々な物質を試験するための動物モデルを提供する。
【０３１９】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｄ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ及び雄Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、この実験を行った。不断給餌給水で１２：１２時間の明／暗周期で１つのケージ中でこれらの動物を維持した。最小限の前方固定術（Ａａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ）により常に左眼でのみ視神経破壊を行う。これは、視神経損傷の最小侵襲法であり、ヒト前方固定視覚術法（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｖｉｓｕａｌ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）に従い、発明者らにより開発された。手術手順前及び手術手順中、セボフルラン（Ａｂｂｏｔｔ  ＧｍｂＨ  Ｃｏ．＆  ＫＧ、Ｄｅｌｋｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて吸入麻酔により動物に麻酔をかけ、顎クランプ及び四肢に対する粘着テープを用いて手術台に固定する。動物を加温パッドに載せることによって体温低下を防ぐ。ラット視神経の前部破壊術のために、左眼を慎重に靭帯及び結合組織から外す。第一段階として、眼の外角の隣接組織を顕微鏡下で切断する（２−３ｍｍ）。次に、眼の筋肉及び涙腺を側面に寄せるために（従ってそれを取っておく。）鉗子を用いることによって、視神経を露出させる。次の段階で、視神経を露出させるために微小鋏を用いてることにより髄膜を縦方向に開いた。
【０３２０】
この結果、眼の可動性が高まり、眼の外旋が可能となり、その左視神経に触れることができるようになる。２０−３０秒間にわたり一定の最大圧力を与えるために鉗子を用いて、眼のおよそ１−３ｍｍ後で視神経に損傷を与える。眼への血管供給に障害を与えないように特別な注意を払う。
【０３２１】
抗体及び緩衝溶液の局所投与
視神経の破壊損傷後、５Ｆ９抗体（ｎ＝１０匹）、８Ｄ１対照抗体（ｎ＝１０匹）により又はビヒクル対照ＰＢＳ（ｎ＝１０匹）により、雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを局所的に処置した。異なる処置群に対して盲検で実験を行った。局所抗体投与のために、小さなゲルフォーム片（長さ：２．５ｍｍ、幅：２．５ｍｍ、高さ：２．５ｍｍ）を１０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液２０μＬ又はＰＢＳ２０μＬに浸し、視神経病変部位のすぐ隣に置いた。最小侵襲手術及び抗体適用後、動物が動き始めるまで、体温を調節するために加温装置上に載せた清潔なケージ中のペーパータオルの上に動物を置いた。細菌感染及び強膜の乾燥を防ぐために抗生物質（Ｇｅｎｔａｍｙｔｒｅｘ、Ｄｒ．Ｍａｎｎ  Ｐｈａｒｍａ）を含有する軟膏を眼に塗布した。術後すぐ及び次いで３日間にわたり１日２回、術後の疼痛治療のために、カルプロフェン（Ｒｉｍａｄｙｌ、５ｍｇ／ｋｇ、Ｐｆｉｚｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）をｉ．ｐ．投与した。全動物が生存し、麻酔及び手術から回復したことを確認するために、術後すぐから数時間定期的に及び翌日、動物を観察し、調整した。手術及び抗体／ビヒクル適用から５週間後、ナルコレンの過剰用量（４０−６０ｍｇ／ｋｇ）で動物を麻酔し、心臓への４％パラホルムアルデヒド溶液の注入により潅流した。視神経を摘出し、組織の適正な固定を確実にするために、室温で１時間、４％パラホルムアルデヒド溶液に移した。後固定後、３０％スクロース溶液（４℃）中でラット視神経を一晩保存した。翌日、視神経をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋに包埋し、凍結し、クライオスタットを用いて１６μｍの厚さの縦断面の切片を作製した。
【０３２２】
免疫染色のために、冷（−２０℃）アセトンで視神経切片を固定し（１０分間）、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、Ｆｌｕｋａ  ９３３１２）で３ｘ洗浄（５分間）し、ブロッキング処理し、５％ウシ血清アルブミン及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（３０分）を含有するＴＢＳで室温にて透過処理した。ＴＢＳでの２回の個別の洗浄段階（５分間）により、残留ＢＳＡ及び界面活性剤を除去した。５％ＢＳＡ／ＴＢＳ溶液中で１：１００希釈したポリクローナルウサギ抗ＧＡＰ−４３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ７５６２）とともに切片を室温で１時間温置した。ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄段階後、細胞核を視覚化するために、ビスベンズイミド（Ｈ３３２５８、５０μｇ／ｍＬ）の１：１００希釈物を含有する、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ中で１：１０００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ１１０３４）とともに切片を室温で１時間温置した。包埋する前に、染色した切片をＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ（各段階５分間）及び蒸留水で３回洗浄した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇに切片を包埋し、カバースリップで覆い、顕微鏡での記録のために暗所で保管した。
【０３２３】
Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡画像を用いて、染色した縦断面切片の画像（図１１）をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて保存した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｄｏｂｅ）を用いて各神経の単一像を分析のために載せた。視神経の合成画像を用いて、２種類の異なる方法で定量分析を行った。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて病変部位のＧＡＰ−４３陽性面積を測定した。（図１２Ｂ）。この最初の定量分析とは独立して、４ヶ所の異なる領域：破壊部位から０−２００μｍ、２００−４００μｍ、４００−６００μｍ及び６００−１２００μｍの領域で単一再生繊維（ＧＡＰ−４３陽性）を数えた。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析及びデータの統計評価を行った（図１２Ａ）。
【０３２４】
抗体及び緩衝溶液の全身投与
全身抗体送達のために、５Ｆ９抗体（ｎ＝１０匹）又はビヒクル対照ＰＢＳ（ｎ＝１０匹）により、雄Ｗｉｓｔａｒラットを全身的（腹腔内（ｉｐ）又は静脈内（ｉｖ））に処置した。動物に２回注射し、神経破壊誘導後すぐ、第０日に、及び破壊後第２１日に注射を行った。与えられた抗体の用量は、第０日に２ｍｇ／ｋｇ及び第２１日に１０ｍｇ／ｋｇであった。破壊損傷から５週間後に動物を屠殺し、上述のように、組織摘出、切片作製、染色及び定量分析を行った。前回のように、２群の異なる治療群に対して盲検で実験を行った。ラット視神経の合成画像を図１３で示す。５Ｆ９処置動物（Ａ）において、ＰＢＳで処置した対照動物（Ｂ）と対照的に、破壊部位を越えて多くのＧＡＰ−４３陽性繊維が伸長している。破壊部位は、左端にあり、再生繊維はＧＡＰ−４３に対する抗体で染色される。５Ｆ９処置動物の視神経の上下縁部で多くの繊維が観察されるが、ＰＢＳ動物では観察されない。
【０３２５】
５Ｆ９により、再生ＧＡＰ−４３陽性繊維の数が顕著に増加したが、ビヒクル対照ＰＢＳでは増加しなかった。５Ｆ９で処置した動物において、３００μｍから１８００μｍの距離で、ビヒクル処置動物によりも、顕著に多くの繊維（ｐ＜０．００１）が見出された。それぞれ２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの５Ｆ９で第０日及び第２１日に動物を処置した。抗体又はビヒクルを腹腔内又は静脈内投与した。データは、１群あたり９匹の動物の分析からのものである。動物あたり３枚連続のクライオスタット切片を分析した（図１４Ａ）。
【０３２６】
第二の実験において、視神経損傷後、５Ｆ９抗体（ｎ＝１０匹）、８Ｄ１対照抗体（ｎ＝１０匹）により又はビヒクル対照ＰＢＳ（ｎ＝１０匹）により、雄Ｗｉｓｔａｒラットを全身的（ｉｖ）に処置した。ｉｖで投与される抗体２ｍｇ／ｋｇをラットに週に１回注射し、視神経破壊後すぐに注射を開始した。全てのラットは、４回の注射を受け、破壊損傷から５週間後に動物を安楽死させた。実験を盲検で行い、前に記載したように組織処理及び定量分析を行った。５Ｆ９により再生ＧＡＰ−４３陽性繊維の数が顕著に増加したが、ビヒクル対照ＰＢＳでは増加しなかった。２００μｍから１４００μｍの距離で、ビヒクル又は対照抗体処置動物よりも、５Ｆ９処置動物において有意に多くの繊維が見られた（ｐ＜０．００１）。第０日から開始して４週間にわたり、５Ｆ９（投与あたり２ｍｇ／ｋｇ）により、対照抗体８Ｄ１（投与あたり２ｍｇ／ｋｇ）により又はＰＢＳにより、週に１回動物をｉｖ処置した（図１４Ｂ）。
【０３２７】
（実施例１１）
視神経損傷のラットモデルにおいて、５Ｆ９は、破壊され、障害を受けた視神経軸索の再ミエリン形成を誘導する。
【０３２８】
乏突起膠細胞及びミエリンに対するマーカーは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）である。異なる治療群で再ミエリン形成に差異が生じるか否かという問題に答えるために、ＭＢＰに対する抗体を使用した。再ミエリン形成の過程を視覚化するために、全身的処置を行った動物の視神経切片を冷（−２０℃）アセトン（１０分間）で固定し、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、Ｆｌｕｋａ  ９３３１２）で３回（５分間）洗浄し、ブロッキング処理し、５％ウシ血清アルブミン及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＴＢＳで室温にて透過処理（３０分間）した。ＴＢＳでの２回の個別の洗浄段階（各５分間）により、残留ＢＳＡ及び界面活性剤を除去した。５％ＢＳＡ／ＴＢＳ溶液中で１：５０希釈したポリクローナルウサギ抗ＭＡＢ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４０４）で切片を４℃で３時間又は一晩温置した。ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄段階後、細胞核を視覚化するために、ビスベンズイミド（Ｈ３３２５８、５０μｇ／ｍＬ）の１：１００希釈液を含有する、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ中で１：１０００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ１１０３４）とともに切片を室温で１時間温置した。包埋する前に、染色した切片をＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎで３回（各段階５分間）及び蒸留水で洗浄した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇに切片を包埋し、カバースリップで覆い、顕微鏡での記録のために暗所で保存した。
【０３２９】
Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて、染色した縦断面切片の画像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて保存した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｄｏｂｅ）を用いて各神経の単一像を分析のために載せた。視神経の合成画像を用いて、２種類の異なる方法で定量分析を行った。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて病変部位のＭＢＰ陽性面積を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析及びデータの統計評価を行った。
【０３３０】
それぞれ２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの５Ｆ９で第０日及び第２１日に動物を処置した。抗体又はビヒクルを腹腔内又は静脈内投与した。
【０３３１】
ラット視神経の合成画像
ミエリンマーカーであるミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰに対する抗体を用いて、ミエリン形成を視覚化する。破壊部位は混成神経（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｎｅｒｖｅ）の中央部に位置し、この領域はビヒクル処置対照動物（Ａ及びＢ）にはない。５Ｆ９処置動物（Ｃ及びＤ）において、視神経の中央部領域（破壊の中央部）で多くのＭＢＰ−陽性構造が観察される（図１５）。
【０３３２】
ミエリンマーカーであるミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰに対する抗体を用いて、ミエリン形成を視覚化する。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いてＭＢＰ面積を測定した。Ｍ１及びＭ２は、２回の独立した測定であり、Ｍは平均測定ＭＰＢ陽性面積である。５Ｆ９により、視神経破壊部位のＭＢＰ面積は有意に（ビヒクル対照に対してｐ＜０．００１）３．５倍、増加する（図１６）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2020018316.tif 000036
【図９】
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【図１０】
2020018316.tif 000038
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤ及び１ｘ１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数（両者とも表面プラズモン共鳴により測定）でヒトＲＧＭ  Ａから解離する、結合タンパク質。