(57)【要約】【課題】椎間板変性を処置または防止するための方法、阻害剤、使用およびシステムの提供。【解決手段】コンドロイチン、グルコサミン、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）およびＷＩＳＰ−２の組合せを含む組成物が開示される。患者における身体領域、好ましくは脊椎または関節から発する疼痛の低下に関する方法、使用およびシステムが記載される。処置または予防の方法が、変性椎間板疾患、椎間板損傷、疼痛、関節炎、または疑われる関節炎から選択される疾患または状態について記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．１質量％〜約２．０質量％のレベルで存在するコンドロイチン硫酸、
約１質量％〜約２５質量％のレベルで存在するグルコサミン塩酸塩、
組成物１ｍｇ当たり約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの濃度で存在する結合組織成長因子、
組成物１ｍｇ当たり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇの濃度で存在するトランスフォーミング成長因子ベータ１、
任意選択で約０質量％〜約２５質量％のレベルのデキストロース、
任意選択で約０質量％〜約０．５質量％のレベルのカルボキシメチルセルロース、および
質量に基づき全体を合せて組成物の残部に等しいレベルの、水と、任意選択で薬学的に許容される担体、緩衝剤および／またはジメチルスルホキシドとを含む水溶液
を含む組成物。
【請求項２】
コンドロイチン；グルコサミン；ならびに結合組織成長因子、ＷＩＳＰ−２、およびトランスフォーミング成長因子ベータ１から選択される因子；または薬学的に許容されるそれらの塩を含む組成物。
【請求項３】
結合組織成長因子およびトランスフォーミング成長因子ベータ１のいずれかもしくは両方、または薬学的に許容されるそれらの塩を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
水をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
デキストロースまたは薬学的に許容されるその塩をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物のｐＨを約６〜約７の間で安定化させるために十分な量で緩衝剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記コンドロイチンがコンドロイチン硫酸である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記コンドロイチン硫酸が前記組成物の約０．５質量％〜約２．０質量％のレベルで存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記コンドロイチン硫酸が前記組成物の約０．１質量％〜約０．５質量％のレベルで存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記グルコサミンがグルコサミン塩酸塩である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グルコサミン塩酸塩が、前記組成物の約５質量％〜約２０質量％のレベルで存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記グルコサミン塩酸塩が、前記組成物の約１質量％〜約５質量％のレベル、好ましくは約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
麻酔薬をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記麻酔薬がブピバカインである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記デキストロースが、前記組成物の約２５質量％までのレベルで、好ましくは約１質量％〜約２質量％のレベルで、より好ましくは約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１６】
前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５０ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１００ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約２００ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり約５０〜約５００ｎｇの間の濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１０ｎｇの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２３】
前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり約１〜約１００ｎｇの間の濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体をさらに含み、且つジメチルスルホキシドを含んでいてもよい、請求項４に記載の組成物。
【請求項２５】
前記薬学的に許容される担体がカルボキシメチルセルロースを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記薬学的に許容される担体がヒアルロン酸を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも１種のグリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体もしくは前駆体、好ましくはコンドロイチンおよび／もしくはグルコサミン、および結合組織成長因子、およびトランスフォーミング成長因子ベータ；または薬学的に許容されるそれらの塩を含む組成物。
【請求項２８】
患者における脊椎の椎間板から発する疼痛を低下させる方法であって、請求項１から２７のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を、前記椎間板中に注射することを含む方法。
【請求項２９】
前記椎間板が変性している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記椎間板が、以前に損傷している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
患者における変性椎間板疾患または椎間板損傷を処置する方法であって、請求項１から２７のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を、前記椎間板中に注射することを含む方法。
【請求項３２】
患者の身体領域における疼痛、関節炎、または疑われる関節炎を処置する方法であって、請求項１から２７のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を前記身体領域中に注射することを含む方法。
【請求項３３】
前記身体領域が脊椎である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記身体領域が関節である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記身体領域が膝である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記身体領域が肩である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記身体領域が手首である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記身体領域が肘である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月６日出願の米国出願第６２／２５２，２３４号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、脊椎の椎間板変性に関し、特に椎間板変性を処置または防止するための方法、阻害剤、使用およびシステムにさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
変性椎間板疾患（ＤＤＤ）は、低背部の疼痛発生の支配的な要因（約４０％）であり、世界中の身体障害の主要な原因であり、非常に大きい社会経済的負担および臨床的コストを社会に負わせる1,2。健常な椎骨間の椎間板（ＩＶＤ）は、同心円の線維輪（ＡＦ）により囲まれて薄い軟骨の終板により隣接する椎骨に付着した中枢プロテオグリカンに富む髄核（ＮＰ）で構成されている。ヒトでは、小児期にＮＰに存在する大きい、空胞のある脊索細胞（ＮＣ）が、初期の青春期までに、小さい軟骨細胞様細胞（ＣＬＣ）によって徐々に置き換えられる3-5。重要なこととして、ヒトではＮＣの損失とＤＤＤの発症の間に時間的に関係があり、その時期に、ＮＰの変性は、しばしば、弱まった椎間板機能、損なわれた荷重の支持、関連する疼痛および身体障害に至る3-5。現在のところ、変性した過程を改善できるかまたは修復を促進できる手段はない。事実、脊椎固定などの外科的手技は、隣接するセグメントの変性を加速する可能性がある6-8。したがって、侵襲が最少の再生療法の開発が、椎間板修復のための魅力的な代替法である9-15。
ヒトとは異なり、軟骨形成異常のないイヌ（ＮＣＤ）は、それらのＮＰ内にＮＣを保存して、ＤＤＤに対して比較的抵抗性である16,17。軟骨形成異常のないイヌ（ＮＣＤ）の髄核から得られた脊索細胞由来の馴化培地（ＮＣＣＭ）は、ＮＰ細胞に同化特性を付与する18,20。同様に、他の研究で、ＮＣＣＭによりインビトロで処理されたＮＰ細胞において、増大したプロテオグリカン合成および細胞増殖が示された21-24。ＮＣＣＭ処置における明白な有益な効果についての理由は、これまでのところ明らかでないが、しかしながら、および処置としてのＮＣＣＭは、それ自体、とりわけ混合物の不均一性を含む多くの不都合を有する。
それ故、椎間板変性のための改善された処置に対する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
一般的に、一態様において、約０．１質量％〜約２．０質量％のレベルで存在するコンドロイチン硫酸、約１質量％〜約２５質量％のレベルで存在するグルコサミン塩酸塩、組成物中約５０ｎｇ／ｍｇから組成物中約５００ｎｇ／ｍｇの濃度で存在する結合組織成長因子、組成物中約１０ｎｇ／ｍｇから組成物中約１００ｎｇ／ｍｇの濃度で存在するトランスフォーミング成長因子ベータ１、任意選択で約０質量％〜約２５質量％のレベルのデキストロース、任意選択で約０質量％〜約０．５質量％のレベルのカルボキシメチルセルロース、および質量に基づき全体を合せて組成物の残部に等しいレベルの、水と、任意選択で薬学的に許容される担体、緩衝剤および／または任意選択でジメチルスルホキシドとを含む水溶液を有する組成物が提供される。
一般的に、一態様において、コンドロイチン、グルコサミン、ならびに結合組織成長因子、ＷＩＳＰ−２、およびトランスフォーミング成長因子ベータ１から選択される因子または薬学的に許容されるそれらの塩を有する組成物が提供される。一態様において、コンドロイチン、グルコサミン、および結合組織成長因子およびトランスフォーミング成長因子ベータ１のいずれかもしくは両方；または薬学的に許容されるそれらの塩。実行は、以下の１種または複数を含むことができる。該組成物は水も有する。該組成物は、デキストロースまたは薬学的に許容されるそれらの塩も有する。該組成物は、組成物のｐＨを約６〜約７の間で安定させるのに十分な量で緩衝剤も含む。コンドロイチンはコンドロイチン硫酸である。コンドロイチン硫酸は、約０．５％〜約２．０％のレベルで存在する。コンドロイチン硫酸は約０．１％〜約０．５％のレベルで存在する。グルコサミンはグルコサミン塩酸塩である。グルコサミン塩酸塩は、約５％〜約２０％のレベルで存在する。グルコサミン塩酸塩は、約１質量％〜約５質量％のレベルで、好ましくは約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する。組成物は麻酔薬も有する。麻酔薬はブピバカインである。デキストロースは、約２５質量％までのレベルで存在する。デキストロースは、約１質量％〜約２質量％のレベルで存在する。デキストロースは、約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する。結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＣＴＧＦは、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＣＴＧＦは、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＣＴＧＦは、約５０〜約５００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＴＧＦβ１は、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＴＧＦβ１は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ＴＧＦβ１は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。組成物は、薬学的に許容される担体も含む。組成物は、ジメチルスルホキシドも有する。組成物はカルボキシメチルセルロースも含む。組成物はヒアルロン酸も有する。
【０００５】
一般的に、一態様において、少なくとも１種のグリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体もしくは前駆体、および結合組織成長因子、およびトランスフォーミング成長因子ベータ１；または薬学的に許容されるそれらの塩を有する組成物が提供される。実行は、以下の１種または複数を含むことができる。グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｙｃａｎ）はコンドロイチンである。グリコサミノグリカンはグルコサミンである。
一般的に、一態様において、患者における脊椎の椎間板から発する疼痛を低下させる方法であって、上に記載された組成物の１種の治療的有効量を、椎間板中または隣接する椎間板中に注射することを含む方法が提供される。実行は、以下の１つまたは複数を含むことができる。椎間板が変性している。椎間板が以前に損傷している。
一般的に、一態様において、患者における変性椎間板疾患（ＤＤＤ）または椎間板損傷を処置する方法であって、上に記載された組成物の１種の治療的有効量を、椎間板中または隣接する椎間板中に注射することを含む方法が提供される。
【０００６】
一般的に、一態様において、患者の身体領域における疼痛、関節炎、または疑われる関節炎を処置する方法であって、上に記載された組成物の１種の治療的有効量を、身体領域中に注射することを含む方法が提供される。実行は、以下の１つまたは複数を含むことができる；身体領域は脊椎である；身体領域は脚である；身体領域は関節である；身体領域は膝である；身体領域は肩である；身体領域は腕である；身体領域は肘である；または身体領域は手首である。
この点に関して、本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の記載で述べるかまたは図面で例示する構造物の詳細および構成要素の配列に対するその適用に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態でも可能であり、種々の仕方で実行および実施できる。本明細書で用いられる言い回しおよび用語法は、説明の目的のためであり、限定するとみなされるべきではないことも理解されるべきである。
図面には、本発明の実施形態が例として例示されている。記載および図面は例示の目的のため、および理解の助けとしてだけであり、本発明の定義の限定として意図されるものではないことがはっきり理解されるべきである。
本明細書では、実施形態を、添付図を参照して例としてのみ記載することにする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】ラットの尾部椎間板における針穿刺損傷が、線維軟骨のマトリックスの発達ならびに脊索（ＮＣ）および髄核（ＮＰ）中の幹細胞の損失に至ることを示す図である。（ａ）Ｘ線透視画像ガイド下のラット尾部椎間板ＮＰにおける針穿刺損傷。（ｂ）ラットＮＰにおける損傷後１０週間の期間における線維軟骨のマトリックスの発達を示す組織学的分析（Ｈ＆Ｅ）およびサフラニンＯ染色。ＥＣＭタンパク質、アグリカンおよびコラーゲン２の損失を時間依存性様式で示す免疫組織化学（健常から損傷後１０週間まで、スケールバー５０μｍ）。
【図１−２】ラットの尾部椎間板における針穿刺損傷が、線維軟骨のマトリックスの発達ならびに脊索（ＮＣ）および髄核（ＮＰ）中の幹細胞の損失に至ることを示す図である。（ｃ）炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）、炎症メディエーター、Ｃｏｘ２およびＥＣＭタンパク質（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ１、ＡＤＡＭＴＳ４）の発現における変化を、損傷後ラットのＮＰ組織溶解物における時間依存性様式で示すウェスタンブロット。（ｄ）ホスホ−ｐ４２／４４（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、全ｐ４２／４４、ホスホ−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）およびラット尾部の損傷椎間板ＮＰから得られた組織溶解物中の合計ｐ３８ＭＡＰＫのウェスタンブロット。
【図１−３】ラットの尾部椎間板における針穿刺損傷が、線維軟骨のマトリックスの発達ならびに脊索（ＮＣ）および髄核（ＮＰ）中の幹細胞の損失に至ることを示す図である。（ｅ）ラット尾部の損傷椎間板から得られたＮＰ中のＮＣマーカー（ブラキウリ、ガレクチン３）および幹細胞マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）の１０週間の期間にわたる損失を示すウェスタンブロット分析。β−アクチンはウェスタンブロットにおけるローディング対照として使用した。ラット尾部の損傷椎間板ＮＰにおける（ｆ）核ブラキウリ（ｇ）ガレクチン３（膜／細胞質）および核Ｏｃｔ４発現の減少を健常対照椎間板ＮＰと比較して検証する免疫蛍光（スケールバー１０μｍ）。
【図２−１】ＩＬ−１βがＤＤＤにおけるＮＰ−ＥＣＭ分解において役割を演じることを示す図である。（ａ）ＩＬ−１β単独または（ｂ）ＩＬ−１βとＴＮＦαの組合せを用いる処置におけるＥＣＭ遺伝子の差次的発現を、無処置の対照（ＮＴＣ）とＥＣＭ遺伝子アレイで比較して描いたＶｏｌｃａｎｏプロット（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。
【図２−２】ＩＬ−１βがＤＤＤにおけるＮＰ−ＥＣＭ分解において役割を演じることを示す図である。（ｃ）ＩＬ−１β単独、またはＴＮＦαとの組合せで２４時間処置された健常ラットのＮＰ細胞におけるＥＣＭ遺伝子の有意な差次的発現（ｐ＜０．０５）を示す代表的ヒストグラム。
【図２−３】ＩＬ−１βがＤＤＤにおけるＮＰ−ＥＣＭ分解において役割を演じることを示す図である。（ｄ）健常ラットのＩＶＤ−ＮＰから得られたＮＰ細胞中において、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαは、コラーゲン２を低下させたが、マトリックスのメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３）および炎症メディエーター、Ｃｏｘ−２の発現を誘発したことを示すウェスタンブロット。（ｅ）ＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせて５〜６０分間処置された健常ラットのＮＰ細胞におけるホスホ−ｃＲａｆ（Ｓｅｒ２５９）、ホスホ−ｐ４２／４４（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、全ｐ４２／４４、ホスホ−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）および合計−ｐ３８ＭＡＰＫのウェスタンブロット。ｐ４２／４４（Ｕ０１２６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（ＳＢ２０３５８０）、ＮＦκＢ（ＢＡＹ−１１−７０８２）、ＰＩ３Ｋ（Ｗｏｒｔａｍａｎｉｎ）、Ｊａｋ１およびＳＴＡＴ３（ＷＰ１０６６）を標的とする特異的阻害剤の存在下において（ｆ）ＩＬ−１β単独、（ｇ）ＩＬ−１βおよびＴＮＦαとの組合せで処置された健常ラットのＮＰ細胞から得られた細胞溶解物中のＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２のウェスタンブロット。（ｈ）ヒトの変性椎間板ＮＰ細胞においてＳＢ２０３５８０、ＢＡＹ−１１−７０８２、Ｊａｋ１およびＳＴＡＴ３（ＷＰ１０６６）阻害剤の存在下でサイトカインに誘発されたＣｏｘ２の発現の減少を示すウェスタンブロット。
【図３−１】ラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰにおいて、ＮＣＣＭがタンパク同化および抗異化特性を変性ＮＰに付与することを示す図である。（ａ）正常で豊かな大きい脊索細胞、プロテオグリカンに富むＥＣＭから小さいＮＰ細胞によって置き換えられて脊索細胞が大きく欠けてものに変化したことを示すサフラニンＯ染色。対照として使用したタンパク質を含まないハイブリドーマ培地またはＮＣＣＭで処置されたラット尾部の損傷椎間板のパラフィン包埋切片におけるアグリカン、コラーゲン２、ブラキウリおよびＯｃｔ４の免疫組織化学（スケールバー５０μｍ）。（ｂ）ラット尾部の損傷椎間板ＮＰおよび健常対照から得られた組織溶解物中におけるコラーゲン２および幹細胞マーカーＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのウェスタンブロット。
【図３−２】ラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰにおいて、ＮＣＣＭがタンパク同化および抗異化特性を変性ＮＰに付与することを示す図である。（ｃ）質量分析法を使用するＮＣＣＭタンパク質を同定するための方法論の略図。（ｄ）ＮＣＣＭで同定されたＥＣＭタンパク質の分布を示す円グラフ。
【図３−３】ラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰにおいて、ＮＣＣＭがタンパク同化および抗異化特性を変性ＮＰに付与することを示す図である。（ｅ）ラットＮＰ（健常および損傷椎間板）およびヒトの変性椎間板ＮＰのパラフィン包埋切片中のＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の発現を示す免疫組織化学。
【図４−１】ＤＤＤのインビトロモデルにおけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１のタンパク同化効果を示す図である。（ａ）ラット尾部（健常／損傷）の椎間板から得られたＮＰ細胞におけるＭＴＴアッセイを使用して決定されたＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１単独または組み合わせた処置の細胞生存能力（７２時間）に対する効果（**ｐ＝０．０４９、*ｐ≦０．０２）。（ｂ）ウシの変性椎間板ＮＰ、*ｐ＜０．０１および（ｃ）ヒト（Ｈ１〜Ｈ４）変性椎間板ＮＰ（*ｐ＜０．００５）。各バーは、３連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．（ｎ＝９）を表す。
【図４−２】ＤＤＤのインビトロモデルにおけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１のタンパク同化効果を示す図である。（ｄ）ラットのＮＰ細胞（健常／損傷椎間板）における細胞増殖アッセイ（７２時間）、*ｐ＜０．００１、**ｐ＜０．０１および（ｅ）比色分析抗ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡを使用して決定された、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１単独または組み合わせて処置されたヒト（Ｈ１、Ｈ２）の変性椎間板ＮＰ  *ｐ＜０．００１。ｐ値は、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１単独または組み合わせた処置について、無処置の対照（ＮＴＣ）に関して、対応のあるスチューデントｔ検定を使用して決定された。（ｆ）リアルタイムＰＣＲ分析により明らかにした、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１を用いるヒトの変性椎間板ＮＰ細胞の処置におけるコラーゲン２、ＨＡＰＬＮ１、バーシカンおよびトロンボスポンジンｌの増大した発現を示すヒストグラム。ヒストグラムにおける各バーは、２連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝６，*ｐ＜０．００１）。（ｇ）ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１を用いる処置に対するヒトの変性椎間板ＮＰ細胞において増大したコラーゲン２発現を検証するウェスタンブロット。
【図５−１】ＤＤＤのインビトロモデルにおけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の抗異化の効果を示す図である。（ａ）ラットの損傷ＩＶＤに由来するＮＰ細胞におけるカスパーゼ３／７活性を示すヒストグラム（*ｐ＝０．００８、**ｐ＝０．０５）。（ｂ、ｃ）炎症誘発性サイトカイン、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα単独でまたはＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の存在下で処置されたヒトの変性椎間板ＮＰ（*ｐ＜０．０５）。
【図５−２】ＤＤＤのインビトロモデルにおけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の抗異化の効果を示す図である。炎症誘発性サイトカイン、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα単独またはＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の存在下で処置された（ｄ）ラットの損傷ＩＶＤ、（ｅ、ｆ）ヒトの変性椎間板ＮＰに由来するＮＰ細胞におけるカスパーゼ９活性を示すヒストグラム（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５）。カスパーゼアッセイ中の各バーは、４連で行われた２回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を示す（ｎ＝８）。ｐ値は、対応のあるスチューデントｔ検定を使用して決定された。ＩＬ−１βとＴＮＦαの組合せは無処置の対照（ＮＴＣ）に関するが、成長因子（ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１）を含有する群についてのｐ値は、ＩＬ−１βとＴＮＦαの組合せのみを含有する群に関する。
【図５−３】ＤＤＤのインビトロモデルにおけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の抗異化の効果を示す図である。（ｇ）ＩＬ−１β単独で、（ｈ）ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを組み合わせて、およびＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１の存在下で処置されたラット健常ＩＶＤのＮＰ細胞中におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２のウェスタンブロット分析。ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の存在下でＩＬ−１βおよびＴＮＦαにより処置されたヒトの変性椎間板ＮＰ細胞中における（ｉ）Ｃｏｘ２  ｍＲＮＡ、（ｊ）ＭＭＰ−１３  ｍＲＮＡの減少した発現レベルの、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαのみの処置との比較を示すヒストグラム。ヒストグラム中における各バーは、２連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝６、*ｐ＜０．００１）。
【図６−１】ＤＤＤの前臨床のインビボにおける齧歯動物の椎間板損傷モデルにおけるＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の再生可能性の評価を示す図である。（ａ）リン酸緩衝生理食塩水（対照として使用したＰＢＳ）、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１またはＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せで処置されたラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰのパラフィン包埋切片におけるＥＣＭタンパク質、アグリカンおよびコラーゲン２の代表的サフラニン−Ｏおよび免疫組織化学染色（スケールバー５０μｍ）。（ｂ）ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１またはＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せで処置されたラット尾部の損傷椎間板から得られたＮＰ組織溶解物中におけるＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２の減少した発現、ならびにＮＣマーカー、ブラキウリおよび幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４の回復を示すウェスタンブロット。
【図６−２】ＤＤＤの前臨床のインビボにおける齧歯動物の椎間板損傷モデルにおけるＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の再生可能性の評価を示す図である。（ｃ）炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）の存在下における進行性椎間板変性およびＩＶＤ−ＮＰの再生のために可能性のある治療剤（ＣＴＧＦ／ＴＧＦβ１）による介入の効果の機構を示す提案されたモデル。
【図７】（ａ）ヒトの変性椎間板、ウシの変性椎間板、軟骨形成異常のないイヌのおよび健常ラットの椎間板から得られた髄核のパラフィン包埋切片におけるブラキウリおよびＯｃｔ４タンパク質のサフラニンＯ染色および免疫組織化学分析を示す図である（スケールバー１０μｍ）。矢印は、ＣＬＣ、軟骨細胞様細胞およびＮＣ、脊索細胞を表す。（ｂ）ＮＣの損失を示すヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および線維軟骨のマトリックスの発達を示すサフラニン−Ｏ（ＳａｆＯ）染色を用いる、時間依存性様式（健常から損傷後損傷後１０週間まで）におけるラットの椎間板のＮＰ中の組織学的変化。
【図８】サイズ排除クロマトグラフィー後に集められたタンパク質を含有する分画（ＰＦ）の生物活性の評価を示す図である。ＮＣＣＭまたは対照培地（血清、フェノールレッドおよびタンパク質を含まないハイブリドーマ培地）の存在下で、ＮＣＣＭ、細胞毒性薬のエトポシド（３００μΜ、陽性対照として使用した）で処置されたウシＮＰ細胞における（ａ）細胞生存能力、（ｂ）カスパーゼ３／７活性を示すヒストグラム。各バーは、３連で行われた２回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝６）。（ｃ）対照培地（血清を含まず、フェノールレッドを含まないハイブリドーマ培地）中でエトポシドによりまたはタンパク質を含有する分画（ＰＦ）の存在下で処置されたウシＮＰ細胞におけるカスパーゼ３／７の活性を示すヒストグラム。各バーは、３連で行われた２回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝６）。これらの実験のために、タンパク質を含有する分画（ＰＦ）を、対照培地（血清を含まない、フェノールレッドを含まないハイブリドーマ培地）と混合して（１：１）、無処置の対照（即ち溶離緩衝液＋対照培地（１：１））と比較した。
【図９】ＮＣＣＭの質量分析法で観察されたＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１に対するペプチドのシグネチャーのピークを示す図である。
【図１０−１】（ａ）ＣＴＧＦ、（ｂ）ＷＩＳＰ−２および（ｃ）ＴＧＦβ１処置単独または（ｄ）ＣＴＧＦとＷＩＳＰ−２、およびＴＧＦβ１との組合せの、健常ラットＩＶＤから得られたＮＰ細胞におけるＭＴＴアッセイを使用して決定された細胞生存能力に対する用量（１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）および時間依存性（２４時間〜９６時間）効果を示す図である。各バーは、４連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝１２）。
【図１０−２】（ａ）ＣＴＧＦ、（ｂ）ＷＩＳＰ−２および（ｃ）ＴＧＦβ１処置単独または（ｄ）ＣＴＧＦとＷＩＳＰ−２、およびＴＧＦβ１との組合せの、健常ラットＩＶＤから得られたＮＰ細胞におけるＭＴＴアッセイを使用して決定された細胞生存能力に対する用量（１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）および時間依存性（２４時間〜９６時間）効果を示す図である。各バーは、４連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝１２）。
【図１１】（ａ）ラットの（健常／損傷）椎間板から得られたＮＰ細胞、*ｐ≦０．０２。（ｂ）ウシの変性椎間板、*ｐ＜０．０１および（ｃ）ヒト（Ｈ１〜Ｈ４）の変性ＮＰ細胞（*ｐ＜０．００５，**ｐ＝０．０２）でＭＴＴアッセイを使用して決定された、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１単独または組み合わせた処置の４８時間処置の細胞生存能力に対する効果を示す図である。各バーは、３連で行われた３回の独立の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝９）。
【図１２ａ】ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１単独およびＤＲＳ（グルコサミン塩酸塩およびコンドロイチン硫酸を含む溶液）と組み合わせた、ＤＤＤの前臨床のインビボ齧歯動物椎間板損傷モデルにおける再生可能性の評価を示す図である。（ａ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照として使用した）によりラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰのパラフィン包埋切片におけるＥＣＭタンパク質、アグリカンおよびコラーゲン２のサフラニン−Ｏおよび免疫組織化学染色（スケールバー５０μｍ）、（ｂ）ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せ、ＤＲＳ、ＣＴＧＦと組み合わされたＤＲＳまたはＤＲＳ、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の組合せで処置されたラット尾部の損傷椎間板から得られたＮＰ組織溶解物におけるＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２の減少した発現、および幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４の回復を示すウェスタンブロットを示す。
【図１２ｂ】ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１単独およびＤＲＳ（グルコサミン塩酸塩およびコンドロイチン硫酸を含む溶液）と組み合わせた、ＤＤＤの前臨床のインビボ齧歯動物椎間板損傷モデルにおける再生可能性の評価を示す図である。（ａ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照として使用した）によりラット尾部の損傷ＩＶＤ−ＮＰのパラフィン包埋切片におけるＥＣＭタンパク質、アグリカンおよびコラーゲン２のサフラニン−Ｏおよび免疫組織化学染色（スケールバー５０μｍ）、（ｂ）ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せ、ＤＲＳ、ＣＴＧＦと組み合わされたＤＲＳまたはＤＲＳ、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の組合せで処置されたラット尾部の損傷椎間板から得られたＮＰ組織溶解物におけるＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２の減少した発現、および幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４の回復を示すウェスタンブロットを示す。
【図１３】ラット尾部の椎間板損傷モデルにおける損傷後２０週間のＰＢＳ注射と比較して、ＴＧＦβ１＋ＣＴＧＦ＋ＤＲＳの効果を示す図である。ＰＢＳを注射された椎間板は、線維輪の摩損／裂け目、椎間板高さの損失およびＮＰ細胞型の変性した変化を含む線維軟骨の変性した変化を示す。ＴＧＦβ１＋ＣＴＧＦ＋ＤＲＳが注射された椎間板（ｃ）は、豊かな細胞外マトリックス、脊索と思われる細胞、保たれた椎間板高さおよび健常線維輪が保存された殆ど正常に見える表現型を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の実施で使用するのに適当な方法、使用、システムおよび装置の実施形態を、図面を参照することにより説明する。
本開示の一態様において、水溶液で以下の構成要素、または薬学的に許容されるそれらの塩；コンドロイチン（好ましくはコンドロイチン硫酸）、グルコサミン（好ましくはグルコサミン塩酸塩）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）の一方または両方を含み、任意選択でデキストロース、カルボキシメチルセルロース、ジメチルスルホキシド、および／またはヒアルロン酸をさらに含む組成物が提供される。
本開示のいくつかの態様において、処置は、対象に治療的有効量を投与すること、好ましくは、治療の必要がある部位に直接注射することを含む。
【０００９】
本明細書において使用する「治療的有効量」とは、投薬時に、および所望の治療結果を達成するために必要な期間に有効な量を指す。開示された組成物の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性、および体重、および個体で所望の応答を引き出す組成物の能力などの要因に従って変化し得る。治療的有効量は、任意の毒性のまたは有害な効果に、治療的に有益な効果がまさる量でもある。
本明細書に記載された治療的に有効な組成物は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、９５、または１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、または約１〜約１００ｎｇ／ｍＬの範囲内のＴＧＦβ１を含むことが適当である。本明細書に記載された治療的に有効な組成物は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｎｇ／ｍＬのＣＴＧＦ、または約５０〜約５００ｎｇ／ｍＬの範囲内のＣＴＧＦを含むことが適当である。治療効果は、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、好ましくは５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦＢ１を利用する実験；および少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬのＣＴＧＦを利用する実験で見られた。
【００１０】
本明細書に記載された組成物で使用される化合物は、無機酸または有機酸に由来する薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。薬学的に許容される塩（複数可）は当技術分野において周知である。明確にするために、本明細書において使用する用語「薬学的に許容される塩」は、無機酸および無機塩基および有機酸および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性の酸または塩基から調製される塩を一般的に指す。適当な薬学的に許容される塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される金属塩またはリシン、Ν，Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインから作製される有機塩が含まれる。適当な非毒性酸には、無機酸および有機酸、例えば、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、硫酸、酒石酸、およびｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。特定の非毒性酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、およびメタンスルホン酸が含まれる。したがって、特定の塩の例には、塩酸塩およびメシレート塩が含まれる。その他も当技術分野において周知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th ed.(Mack Publishing, Easton Pa.: 1990)およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed.(Mack Publishing, Easton Pa.: 1995)を参照されたい。本明細書に記載された組成物で使用される化合物の酸付加塩、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩、および両性イオン塩の調製および使用は、それらが、妥当な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび下等動物の組織と、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等なしに接触して使用されるのに適当であれば、薬学的に許容されると考えられてもよく、合理的な利益／リスク比で釣り合い、それらの意図される使用にとって効果的である。
【００１１】
一実施形態において、ＣＴＧＦおよびＴＧＦ−ベータ１の少なくとも１種およびＥＣＭの構成要素を含む組成物が提供される。一実施形態において、少なくとも１種のＥＣＭ構成要素は、グリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体または前駆体を含む。一実施形態において、グリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体または前駆体は、コンドロイチンを含む。一実施形態において、グリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体または前駆体は、グルコサミンを含む。一実施形態において、組成物は、コンドロイチンおよびグルコサミンを含む。一実施形態において、組成物は、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、コンドロイチンおよびグルコサミンを含む。
一実施形態において、組成物は、少なくとも１種の糖をさらに含む。一実施形態において、糖はセルロース誘導体である。一実施形態において、糖はカルボキシメチルセルロースである。一実施形態において、糖はデキストロースである。
一実施形態において、組成物はさらなる成長因子を含むこともある。一実施形態において、さらなる成長因子はＷＩＳＰ−２である。
【００１２】
一態様において、コンドロイチン、グルコサミン、ＣＴＧＦ、およびＴＧＦ−βΙまたは薬学的に許容されるそれらの塩を含む組成物が提供される。組成物は、適当に水およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含み、ＤＭＳＯは、全組成物に基づいて、１５質量％まで、１０質量％まで、または好ましくは約５質量％未満である。一実施形態において、組成物は生理食塩水である。一実施形態において、組成物は、デキストロースまたは薬学的に許容されるその塩をさらに含む。
一実施形態において、組成物は、組成物を所望のｐＨで安定化するために十分な量で緩衝剤をさらに含む。一実施形態において、組成物は、約６〜約７の間のｐＨで安定化される。
一実施形態において、組成物は、コンドロイチン、好ましくはコンドロイチン硫酸を含む。
一実施形態において、コンドロイチン、好ましくはコンドロイチン硫酸は、全組成物に基づいて、約０．１質量％〜約２．０質量％、一実施形態において、約０．１質量％〜約１．０質量％、別の実施形態において、０．５質量％〜約２質量％のレベルで存在する。
【００１３】
一実施形態において、グルコサミン、好ましくはグルコサミン塩酸塩は、全組成物に基づいて、約１質量％〜約２５質量％、一実施形態において約１質量％〜約１０質量％、別の実施形態において約５質量％〜約２５質量％のレベルで存在する。
一実施形態において、組成物は、麻酔薬、適当にはブピバカインをさらに含む。
一実施形態において、組成物は、造影剤、一実施形態において、非イオン性造影剤をさらに含む。
一実施形態において、デキストロースは、全組成物に基づいて≦約２５質量％のレベルで存在する。一実施形態において、デキストロースは存在しない。一実施形態において、デキストロースは、全組成物に基づいて≦約５質量％のレベルで存在する。別の実施形態において、デキストロースは、全組成物に基づいて約１質量％〜約２質量％の間のレベルで存在する。
ＣＴＧＦは、組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５０ｎｇ、一実施形態においては、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、別の実施形態において、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、および一実施形態においては約５０〜約５００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で組成物中に存在することが適当である。
ＴＧＦβ１は、組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１ｎｇ、一実施形態においては少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、別の実施形態においては少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、および別の実施形態においては約１〜約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で組成物中に存在することが適当である。
【００１４】
一実施形態において、
約０．１質量％〜約２．０質量％のレベルで存在するコンドロイチン硫酸、
約１質量％〜約２５質量％のレベルで存在するグルコサミン塩酸塩、
組成物１ｍｇ当たり約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの濃度で存在する結合組織成長因子、
組成物１ｍｇ当たり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇの濃度で存在するトランスフォーミング成長因子ベータ１、
任意選択で約０質量％〜約２５質量％のレベルでデキストロース、
任意選択で約０質量％〜約０．５質量％のレベルでカルボキシメチルセルロース、および
質量に基づき全体を合せて組成物の残部に等しいレベルの、水と、任意選択で薬学的に許容される担体、緩衝剤および／またはジメチルスルホキシドとを含む水溶液
を含む、からなる、または本質的にそれらからなる組成物が提供される。
実施例で例示されるように、本明細書に記載された組成物は、椎間板変性または損傷のための治療で適当に使用することができる。
【００１５】
一実施形態において、患者における脊椎の椎間板から発する疼痛を低下させる方法であって、本明細書に記載された組成物の治療的有効量を椎間板中に注射することを含む方法が提供される。椎間板は変性椎間板および／または以前に損傷した椎間板であってもよい。
一実施形態において、本明細書に記載された組成物の治療的有効量を椎間板中に注射することを含む、患者におけるＤＤＤまたは椎間板損傷を処置する方法が提供される。
一実施形態においては、処置のタイミングは限定されないが、一実施形態においては、処置は損傷後約１０週間以内に実施され、他の実施形態において、損傷後４週間以内、損傷後２週間以内、または損傷後９６時間以内に実施される。
一実施形態において、患者の身体領域における疼痛、関節炎、または疑われる関節炎を処置する方法であって、本明細書に記載された組成物の治療的有効量を該身体領域に注射することを含む方法が提供される。身体領域は限定されないが、脊椎または関節であってもよい。本明細書に記載された方法に従って処置され得る適当な他の身体領域は肩、手首または肘である。
【００１６】
必要に応じて、処置は、隣接する身体領域、例えば脊椎の隣接する椎間板などの処置を含む予防的または防止的処置を含むことができることは理解されるであろう。
本明細書に記載された実施形態の他の変形も、本発明の範囲から逸脱することなく実施され得ることが、当業者によって認識されるであろう。それ故、他の改変も可能である。
変性した椎骨間椎間板の異化状態を変えることにより、健常な髄核を回復させる能力を有する、脊索細胞により分泌される因子（ＴＧＦβ１およびＣＴＧＦ）が本発明で同定される。ヒトを含む複数の種において、変性椎間板内におけるＴＧＦβ１およびＣＴＧＦの両方の損失は、椎間板変性の発達および進行と関連することも示される。実施例で、ＤＤＤのための新規な分子的再生療法でＴＧＦβ１とＣＴＧＦの組合せを使用する有用性が示される（例えば、図４（ｅ）、５（ｉ）、および５（ｊ）を参照されたい）。その上、ＴＧＦβ１およびＣＴＧＦを、米国特許第８，０４８，８６５号で以前に同定された治療剤および他の薬剤と組み合わせることには追加の有用性がある。一実施形態において、これらの薬剤は、コンドロイチン、グルコサミン、およびデキストロースを含む。一実施形態において、これらの薬剤は、カルボキシメチルセルロースおよび／またはヒアルロン酸などの担体を含む。一実施形態において、組成物中に存在するカルボキシメチルセルロースの量は、約０．５質量％未満である。適当な薬学的に許容される担体の選択は、とりわけ、所望の投薬形態、影響されるべき身体領域、および投与経路に依存する。
本開示は、ある程度特定された典型的形態で記載および例示されているが、記載および例示は、例のためにだけ行われたことに注意する。構造の詳細ならびに部分およびステップの組合せおよび配列において、多くの変化が為され得る。したがって、そのような変化は、その範囲が請求項によって規定される本発明に含まれることが意図されている。
【実施例】
【００１７】
ＮＣＣＭの生物活性の分画中に存在するタンパク質を、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して同定した。ＮＣＣＭ中で同定されたＴＧＦβ１、ＣＴＧＦおよびＷｎｔ誘発性可溶タンパク質−２（ＷＩＳＰ２）の再生可能性を、インビトロ（ラット、ウシおよびヒトのＮＰ細胞）およびＤＤＤの前臨床齧歯動物モデルを使用して評価した。
【００１８】
ＤＤＤの前臨床モデルの開発
ＤＤＤの十分に特徴づけされた動物モデルの欠点は、可能性のある治療剤の比較分析および正確なアセスメントに対して大きい難題を課すことである。その上、治療剤に対する応答が、種の間の組織学的および表現型の差によって影響されると思われる25、2６。ヒトＤＤＤを模倣して、治療剤の評価のために適当な動物モデルを探して、ヒトの変性椎間板ＮＰの組織学的特性を、ウシ、ＮＣＤイヌおよびウィスターラットのＩＶＤと比較した。ヒトおよびウシの変性したＩＶＤ（図７ａ）から得られたＮＰ中の線維軟骨のマトリックスを示す強いサフラニン−Ｏ染色を観察した。対照的に、健常な脊索細胞に富む軟骨形成異常のない（ＮＣＤ）イヌおよび若い健常なウィスターラットは、サフラニン−Ｏ染色が微弱な、高度に細胞のＮＣに富む（＞９０％）ＮＰ（図７ａ）を有する。ＮＰの間の細胞の表現型における差を、ＮＣに特異的なマーカーであるブラキウリ、および幹細胞の公知のマーカーであるＯｃｔ４4、5に対する免疫組織化学を使用して検証した。免疫組織化学分析により、ヒトまたはウシの変性椎間板ＮＰにおけるブラキウリまたはＯｃｔ４の検出可能な発現は明らかにならなかった（図７ａ）。しかしながら、ブラキウリおよびＯｃｔ４の強い核発現が、健常な若いＮＣＤのイヌのおよびウィスターラットの椎間板で観察されて、これらのＮＰ内におけるＮＣおよび幹細胞の存在が確認された（図７ａ）。
【００１９】
治療剤の評価のためのプラットホームを確立するために、ＤＤＤの前臨床齧歯動物モデルを採用した。画像ガイド下で針穿刺の損傷を１２週齢の健常ウィスターラットの尾の（尾部）の椎間板につくった（ｎ＝２１、１匹の動物当たり４個の椎間板）。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および細胞の表現型における変化を、時間依存性様式で（７２時間〜１０週間、図１ａ〜ｇ）決定した。組織学的分析により、２〜１０週間から増大したサフラニン−Ｏの染色強度と一緒にＮＣが徐々に失われる（＞７０％）ことが明らかになり、損傷後のＮＰにおけるＥＣＭの改造が示された（図１ｂ、図７ｂ）。アグリカンおよびコラーゲン２の減少した発現も損傷後１０週間の終わりまでに観察された（図１ｂ）。注目すべきは、ＮＰにおいて損傷後７２時間で早くも、針穿刺損傷が、炎症誘発性サイトカイン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）の発現を増大させた（図１ｃ）。しかしながら、ＩＬ−１β（約１７ｋＤａ）の活性形態は１０週間まで観察されず、炎症メディエーター、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）およびＥＣＭ分解酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現における突然の増大と一致した（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３、図１ｃ）。興味深いことに、メタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ１）の組織阻害剤、ＭＭＰの天然阻害剤の損失が、損傷後１０週間の終わりに観察され、ＭＭＰ（図１ｃ）の発現と一致した。アグリカン分解に関与する主要な酵素の１種である、トロンボスポンジン１型モチーフ４を有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ４）の発現における有意な増大が、損傷後１週間で観察された（図１ｃ）。それに加えて、針穿刺損傷も、ｐ４２／４４（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）のリン酸化を誘発して、椎間板変性におけるそれらの役割を示唆した（図１ｄ）。平行して、ウェスタンブロットおよび共焦点顕微鏡を使用する免疫蛍光が、損傷椎間板ＮＰで、損傷後１０週間に、ＮＣマーカー（ブラキウリおよびガレクチン３）および幹細胞マーカー（Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ）の損失を示した（図１ｅ〜ｇ）。これらの発見は、健常なホメオスタシスに調節される環境から炎症誘発性の異化状態へのＮＰ環境における偏移を、変性椎間板におけるＮＣおよび幹細胞の両者の損失と共に明確に示す。
ＤＤＤにおけるＥＣＭのターンオーバーの調節
【００２０】
健常なＮＰで見られる親水性でプロテオグリカンに富むＥＣＭとは異なり、変性椎間板の微小環境は、異化であり、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）に富み、ラットの尾部椎間板損傷モデルで示されるようなホメオスタシスの不全を反映する。ＥＣＭのターンオーバーに対するＩＬ−１βおよびＴＮＦαの効果を決定するために、ラットのＮＰ細胞をＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせて２４時間処置して、ＥＣＭおよび細胞接着分子の遺伝子アレイ（８４種の遺伝子を含む）を使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。ラットのＮＰ細胞のＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせた処置は、健常マトリックス遺伝子（ＨＡＰＬＮ１、ＣＴＧＦ、トロンボスポンジン１および２）の下方制御およびマトリックス分解酵素、ＭＭＰ（ＭＭＰ−３／９／１１／１３）の上方制御を含む２２種のｍＲＮＡ転写物の発現において、無処置の対照と比較して、有意な変化を示した（ｐ＜０．０５）（ＮＴＣ、図２ａ〜ｃ、表１）。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
ウェスタンブロットが、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαで処置されたラットのＮＰ細胞におけるＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の発現レベルにおける著しい上昇を検証する（図２ｄ）。それに加えて、ラットのＮＰ細胞におけるＣｏｘ２では増大するが、減少したコラーゲン２の発現も、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα処置に対する応答で観察された（図２ｄ）。
【００２３】
注目すべきは、ＩＬ−１βまたはそのＴＮＦαとの組合せは、ｃ−Ｒａｆ（Ｓ２５９）、ｐ４２／４４（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）のリン酸化レベルを増大させたが、それらの合計タンパク質含有率にはいかなる有意な変化もなかった（図２ｄ、ｅ）。ＩＬ−１βおよびＴＮＦαは両方共、ラットのＮＰ細胞中でｐ４２／４４ＭＡＰＫの特異的阻害剤であるＵ０１２６の存在下で、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３またはＣｏｘ２の発現を誘発できなかった（図２ｆ、ｇ）。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下で、ＳＢ２０３５８０は、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の発現を低下させたが、Ｃｏｘ２がＩＬ−１βで処置されたラットのＮＰ細胞中で観察された（図２ｆ）。これらの観察は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの下流におけるｐ４２／４４およびｐ３８ＭＡＰＫの活性化が、椎間板変性中におけるＥＣＭタンパク質の調節において重要であることを示唆するインビボデータを支持する（図１ｄ）。得られた結果も、ＮＰ細胞中におけるＩＬ−１βおよびＴＮＦαに誘発されたＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２の発現における核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）、ヤヌス活性化キナーゼ１（ＪＡＫ１）、およびシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）の関与を示唆する。ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２タンパク質の低下した発現が、ＢＡＹ−１１−７０８２（ＮＦκＢ阻害剤）、ＪＡＫ１またはＳＴＡＴ３特異的阻害剤の存在下で、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαにより処置されたラットのＮＰ細胞中で示された（図２ｆ、ｇ）。対照的に、ウォルトマンニン（Ｗｏｒｔａｍａｎｉｎ）（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の存在はＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の発現だけを低下させた（図２ｆ、ｇ）。同様に、ヒトの変性椎間板から得られたＮＰ細胞では、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαが、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ１またはＳＴＡＴ３という阻害剤の存在下で、Ｃｏｘ２を誘発できなかった（図２ｈ）。これらの発見は、進行性椎間板変性におけるｐ３８ＭＡＰＫ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ１およびＳＴＡＴ３タンパク質の重要性を示唆する。
ＮＣＣＭは、ＥＣＭのターンオーバーを促進して、インビボにおける炎症を低下させる
【００２４】
本発明者らは、脊索細胞に由来する馴化培地（ＮＣＣＭ）が、抗アポトーシス効果を示して、インビトロで、アグリカンおよびコラーゲン２のｍＲＮＡレベルにおける上方制御を誘発したことを以前に示した19、20。しかしながら、前臨床のＤＤＤのインビボモデルにおけるＮＣＣＭの再生可能性は、評価されたことがなかった。ＮＣＤイヌから得られたＮＣに富むＮＰを、フェノールレッドを含まず血清を含まないハイブリドーマ培地および以前記載されたプロトコルに従って収穫されて馴化培地に入れることにより、ＮＣＣＭを集めた18-20。濃縮されたＮＣＣＭまたは対照培地（約８μＬ／椎間板）を、Ｘ線透視の撮像を使用して、損傷した（４週損傷後）ラット尾部の椎間板ＮＰに注射した。損傷後１０週間に、組織学的分析は、ＮＣＣＭを注射されたラット尾部の損傷椎間板で、中程度にサフラニン−Ｏで染色されたＮＣに富むＮＰを明らかにした（図３ａ）。対照的に、対照培地を注射されたラット尾部の損傷椎間板は、低い細胞充実性を示し、線維軟骨の形態を示す、サフラニン−Ｏで強く染色された線維軟骨のマトリックスを示した（図３ａ）。免疫組織化学およびウェスタンブロットにより、ＮＣＣＭを注射されたラット尾部の損傷椎間板におけるアグリカン、コラーゲン２、ブラキウリ、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの回復が、擬似対照との比較で明らかになった（図３ａ、ｂ）。これらの結果は、ＮＣＣＭ内の可溶性因子がＤＤＤのための再生可能性を有することをインビボで示す。
質量分析法を使用するＮＣＣＭ中の可溶性因子の同定
ＮＣにより分泌された可溶性因子を同定するために、５０ｋＤａおよび３ｋＤａフィルターを順に使用し、それに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分画して、ＮＣＣＭを濃縮した（図３ｃ）。タンパク質を含有する分画の中で、５分画（５０ＰＦ４、５０ＰＦ５、５０ＰＦ６、３ＰＦ４および３ＰＦ５）だけが、エトポシドに誘発されるカスパーゼ３／７活性をウシＮＰ細胞で低下させた（図８ａ〜ｃ）。これらの生物活性分画の質量分光分析が、イヌのタンパク質データベースに対応する３０３種の非冗長タンパク質の同定を導いた（図３ｃ）。
【００２５】
これらのタンパク質の約３１％が、分泌性ペプチドシグナル配列を有し、ＥＣＭ内で報告されている（図３ｄ）。成長因子およびそれらのモジュレーターは、ＴＧＦβ１、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、Ｗｎｔ誘発性可溶タンパク質−２（ＷＩＳＰ−２）、コーディン、スクレロスチン、軟骨中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）およびＣＤ１０９を含むと確認されている（図９）。免疫組織化学分析により、ＮＣ細胞の細胞質においておよび健常ラットの尾部椎間板ＮＰ中のＥＣＭにおいて、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１の中程度ないし強い免疫染色が示された。しかしながら、損傷したラットの尾部椎間板およびヒトの変性椎間板ＮＰは、ＥＣＭ内におけるＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１の検出可能な発現を示さなかった（図３ｅ）。これらの発見は、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１の損失はＤＤＤの発達と関連することを示唆した。
ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１は、インビトロで、同化および抗異化の効果をＮＰ細胞に付与する
【００２６】
ラットの尾部椎間板ＮＰ細胞（健常／変性）をＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１で処置して、細胞生存能力に対するそれらの効果を用量および時間依存性様式で評価した（２４時間〜９６時間、図１０ａ〜ｄ）。細胞生存能力は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）に基づく比色分析アッセイを使用して決定した。ＣＴＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）単独または組み合わせた処置は、ラットの尾部椎間板（健常／損傷）およびウシ椎間板に由来するＮＰ細胞の生存能力を４８時間〜７２時間で増大させた（図４ａ、ｂ、図１１ａ、ｂ）。注目すべきは、ＣＴＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せを用いる処置は、ヒトの変性椎間板ＮＰ細胞において、増大した細胞生存能力を≧３５％だけ増大させた（図４ｃ、図１１ｃ）。しかしながら、ＷＩＳＰ−２を用いる処置では、ＮＰ細胞（ラットおよびヒト）の生存能力における有意な変化は観察されなかった（図４ａ〜ｃ、図１０ｂ、５ａ〜ｃ）。このことは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み込みを使用する細胞増殖アッセイでさらに確認された。ＴＧＦβ１を単独で用いる処置で、ＤＮＡ合成における有意な増大がラット尾部（健常／損傷）およびヒトの変性椎間板ＮＰ細胞で観察された（図４ｄ、ｅ）。コラーゲン２、ヒアルロナンおよびプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、バーシカンおよびトロンボスポンジンｌ（ＴＨＢＳ１）の増大したｍＲＮＡレベルも、ヒトの変性椎間板ＮＰ細胞において、ＴＧＦβ１単独でまたはＣＴＧＦと組み合わせた処置で観察された（図４ｆ）。ウェスタンブロットにより、ＴＧＦβ１単独でまたはＣＴＧＦと組み合わせた処置で２４時間以内に、コラーゲン２発現における増大が検証され（図４ｇ）、これらの成長因子のタンパク同化の役割が支持された。
【００２７】
炎症に誘発されたカスパーゼ活性およびＭＭＰの発現を抑制するＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の可能性を評価した。ラットおよびヒトの両方の変性椎間板ＮＰ細胞を、ＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせて、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１の存在下において４８時間処置した。その結果、ＴＧＦβ１単独の存在下において、変性椎間板ＮＰ細胞（ラット／ヒト）におけるサイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）に誘発されるカスパーゼ３／７活性の有意な減少が明らかになった（図５ａ−ｃ）。対照的に、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαが誘発したカスパーゼ９活性における有意な低下が、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１のいずれかの存在下で、ヒトの変性椎間板ＮＰ細胞で観察された（図５ｅ、ｆ）。ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２またはＴＧＦβ１を用いる処置は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαで処置されたラット尾部のＮＰ細胞におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２タンパク質の発現を低下させた（図５ｇ、ｈ）。同様に、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαで処置されたヒトの変性椎間板ＮＰ細胞は、ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せの存在下で、Ｃｏｘ２およびＭＭＰ−１３ｍＲＮＡレベルのより低いレベルを示して、これらの成長因子の抗異化の効果を示した（図５ｉ、ｊ）。
ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１を用いる処置は、変性椎間板髄核をインビボで再生させる
【００２８】
したがって、これまで、結果は、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の抗異化作用およびタンパク同化促進の役割を、インビトロで示唆した。ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の再生可能性を齧歯動物モデルで試験するために、画像ガイド下の尾部椎間板損傷（ｎ＝３０、４個の椎間板／動物）を、２回の独立の実験で実施した。損傷後４週間で、動物を５群に無作為に分けて（ｎ＝６動物／群）、ＣＴＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＴＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）とＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）の組合せまたはビヒクル対照としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１×、ｐＨ＝７．２）の椎間板内注射を与えた。ＰＢＳ（１×、ｐＨ＝７．２）を注射された椎間板の組織学的分析は、ＮＰ内に線維軟骨のマトリックスおよび強いサフラニン−Ｏ染色を有する細胞を殆ど示さなかった（図６ａ）。しかしながら、損傷したラットの尾部椎間板でＣＴＧＦまたはＴＧＦβ１単独または組み合わせて処置されたものは、損傷後１０週間に、健常な椎間板を示し、ＮＣに富んでいた（図６ａ）。免疫組織化学分析により、健常ＮＰの回復が確認され、損傷椎間板ＮＰでビヒクル対照を注射されたものと比較してアグリカンおよびコラーゲンＩＩの強い発現を示した（図６ａ、ｂ）。ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せを用いる処置は、ＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２タンパク質を抑制して、ラット尾部の損傷椎間板ＮＰ中におけるブラキウリおよびＯｃｔ４の発現を回復させた（図６ｂ）。
【００２９】
ＤＤＤは、ＩＶＤの構造的完全性の損失、およびＮＰ  ＥＣＭの発達不良により特徴づけられる多元的な過程であり、しばしば、椎間板の疼痛および移動性の制限に至る27-31。健常なＩＶＤのＮＰでは、親水性のＥＣＭが、脊椎の生体力学的性質を維持することにおいて重要な役割を演じる。例は、ＤＤＤの齧歯動物モデルにおけるＮＰ−ＥＣＭの悪化は炎症ならびに脊索および幹細胞の損失と関連して、それらが共同してヒトの変性椎間板で観察されるのと同様な線維軟骨のＮＰの発達をもたらすことを示す。これらの発見は、ＤＤＤにおける炎症誘発性サイトカインの発現（ＴＮＦαおよびＩＬ−１β）とマトリックス分解酵素（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３、ＡＤＡＭＴＳ４）の間の関係を直接示す。これらの炎症誘発性サイトカインによる処置により、椎間板変性進行性中のＥＣＭ分解およびターンオーバーの調節における炎症についての有意な役割がインビトロで確立された。それ故、変性椎間板ＮＰにおける炎症を標的にすることは、ＤＤＤの処置のためのキーであり得る。インターロイキン１受容体のアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ならびにＴＮＦαおよびその主要な下流の標的、ＮＦκＢを標的とする合成ペプチドおよび阻害剤を含む数種の単剤戦略を設計して、ＤＤＤにおける炎症を標的として試験した32-39。支持の中で、ＮＦκＢまたはＭＡＰＫ（ｐ４２／４４およびｐ３８ＭＡＰＫ）、Ｊａｋ１およびＳＴＡＴ３の阻害が、ＮＰ細胞中のＩＬ−１βおよびＴＮＦαの下流におけるＣｏｘ２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の発現を低下させることができることも示された。しかしながら、これらの特異的阻害剤の治療剤としての作用は、抗異化の活性に限定される。これらの薬剤は、健常なＮＰ  ＥＣＭの新たな合成を触媒するかまたは変性するＩＶＤにおけるＮＰ細胞生存能力および増殖を促進するいかなるタンパク同化応答も示すことができない。
【００３０】
本発明者らは、ＮＣＣＭ中のＴＧＦβ１、ＣＴＧＦおよびＷＩＳＰ−２を同定して、それらの再生可能性を示した。ＴＧＦβ１は、脊椎の胚形成期ならびに出生後の発達におけるＩＶＤおよび軟骨の発達において決定的役割を果たす40。終板の軟骨細胞および内部線維輪細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達の損失は、マトリックス組織の損失、およびＴＧＦβ１欠損マウスの脊椎における異常な成長プレート形態をもたらす40。データは、ヒトおよび損傷したラットの両方の尾部椎間板中の変性した、線維軟骨のＮＰにおける低下したＴＧＦβ１発現も示した。変性椎間板ＮＰにおけるＴＧＦβ１の損失は、健常なＮＣに富む髄核の維持のためのＴＧＦβシグナル伝達の重要性を示す。健常なウサギのＮＰ中におけるＴＧＦβ１の過剰発現は、プロテオグリカン合成において、対照のアデノウイルスベクターまたは生理食塩水を注射されたＩＶＤと比較して有意な増大を示した41。
【００３１】
別の治療剤、ＮＣＣＭ中で同定されたＣＴＧＦは、アミノ末端の分泌性ペプチドとそれに続く、インスリン様成長因子結合タンパク質と相同性の配列を有する４個の保存ドメイン、フォンウィルブラント因子Ｃ（ＶＷＣ）ドメイン、１型トロンボスポンジンの反復（ＴＳＲ）およびシステイン節モチーフを含有するカルボキシ末端ドメインを有するマトリックス細胞タンパク質である。ＣＴＧＦは、椎骨間椎間板の微小環境の重要な構成成分であり、数種の成長因子およびインテグリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含むマトリックスタンパク質と相互作用する。実施例で示したように、ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せによる処置は、ＩＬ−１βに誘発されたＣｏｘ２およびマトリックス分解酵素（ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３）の発現を、ＤＤＤのインビトロおよびインビボ両方のモデルで有意に低下させて、これらの可能性のある治療剤の組み合わされた作用を示した（図６ｃ）。
ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ単独ならびにＤＲＳ組成物と組み合わせた再生可能性
図１２（ａ）は、上で記載された齧歯動物のＤＤＤの椎間板損傷モデルにおける、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１単独ならびにＤＲＳと組み合わせた（「方法」に基づいて調製したグルコサミン塩酸塩およびコンドロイチン硫酸を含む組成物）再生可能性のインビボにおける評価を示す。該図は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照として使用した）を用いたＥＣＭタンパク質、アグリカンおよびコラーゲン２のサフラニン−Ｏおよび免疫組織化学染色を示す。この評価は、ＤＲＳ＋ＣＴＧＦ＋ＴＧＦβ１が、健常対照との比較に基づいて特に効果的な処置であることを示した。図１２（ｂ）は、ラット尾部の損傷椎間板を、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＣＴＧＦとＴＧＦβ１の組合せ、ＤＲＳ、ＣＴＧＦと組み合わせたＤＲＳまたはＤＲＳ、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の組合せで処置されたものから得られたＮＰ組織溶解物におけるＭＭＰ−１３およびＣｏｘ２の減少した発現、および幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４の回復を示すウェスタンブロットを提供する。
【００３２】
図１３は、ＤＤＤのラットの尾部損傷モデルにおける２０週間を通したさらなる評価を示す。３通りの異なる条件が存在する。（ａ）はラットの尾部椎間板（ＩＶＤ）のサフラニン−Ｏ染色された矢状方向の切片であり、健常髄核、線維輪および脊椎の終板を絵で示す（赤い矢印）；（ｂ）針穿刺損傷により誘発されたＳａｆ−Ｏ染色された変性椎間板。
椎間板は、通常の方法に従って損傷し、続いて４週間後にＰＢＳ緩衝生理食塩水を注射され、注射後１６週間（損傷後２０週間）に収穫された。損傷対照に対する結果は、高さの損失、組織形態、脊索細胞の損失および線維軟骨性の細胞外マトリックスの発達が明瞭な、大きく変性した表現型を示す。（ｃ）損傷後４週間を除いて同一の実験で、生理食塩水ではなくＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、およびＤＲＳを含む組成物を注射した。この処置された椎間板は、殆ど正常な表現型および椎間板高さの維持、健常な脊椎の終板および保たれた細胞充実性および健常なマトリックスを有する形態を明らかにする。
【００３３】
（方法）
脊索細胞由来の馴化培地（ＮＣＣＭ）を、前に記載された軟骨形成異常のないイヌのＩＶＤから得られた脊索細胞（ｎｏｔｃｏｈｏｒｄａｌ  ｃｅｌｌ）に富む髄核（ＮＰ）から集めた18。全ての動物（ｎ＝１２）は、認可された動物施設との共同で得て、全ての実行は、トロント  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（トロント、オンタリオ州、カナダ）の動物飼育方針および倫理承認委員会に従った。全ての軟骨形成異常のないイヌは、８〜１４カ月の月齢であり、他の目的のために採用時に失格するかまたは安楽死させることになっていた。１ｍｌ／１５Ｋｇ体重の組み合わされた用量でキシラジン１００ｍｇ／ｍＬ（Ｘｙｌｏｍａｘ−Ｂｉｍｅｄａ−ＮＨＣ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｒｏｏｍｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ、Ｔａｌｌａｇｈｔ、ダブリン、アイルランド）と混合されたアセプロマジン（１０ｍｇ／ｍＬ、Ａｔｒａｖｅｔ−Ａｅｒｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｔ．  Ｌａｕｒｅｎｔ、ケベック州、カナダ）の組合せを使用して、深い鎮静を達成した。深い鎮静が起こったら、安楽死を、静脈内ナトリウムペントバルビタール（ＣＤＭＶ）（Ｓｔ．Ｈｙａｃｉｎｔｈｅ、ケベック州、カナダ）を３０ｍＬ／ｋｇ体重の用量で使用して遂行した。安楽死の２時間以内に、腰部の脊椎を取り出して、髄核を無菌条件下で単離した18。核の肉質（ｐｕｌｐｏｓｉ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）で洗浄して、２〜３のＮＰを、低酸素条件下（３．５％Ｏ2、および５％ＣＯ2、ＮｕＡｉｒｅ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒｓ）３７℃の６ウェルプレート中の、１００単位のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＣＤハイブリドーマ培地（タンパク質およびフェノールレッドを含まない、カタログ番号＃１１２７９−０２３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）中の組織培養挿入物内に１０μｍフィルターを用いて入れた。この後ＮＣＣＭと称する馴化培地を２４時間〜４８時間後に収集して、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、０．２μｍのシリンジ先端フィルターを通して濾過し、−８０℃でさらなる使用まで貯蔵した。
【００３４】
ＮＣＣＭを室温（ＲＴ）で解凍し、５０ｋＤａおよび３ｋＤａの遠心限外濾過タンパク質濃縮装置（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国）をメーカーの使用説明書に従って使用して、順次濃縮した。濃縮されたそれぞれのＮＣＣＭ試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２ＨＲ  １０／３０急速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の泳動緩衝液でサイズ排除により分画した。３０分画（約１ｍｌ）を集めて、タンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度により測定してさらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。連続するタンパク質含有分画を対でプールして、ウシの尾部椎間板のＮＰ細胞におけるエトポシド（細胞毒性薬）に誘発されたカスパーゼ３／７の活性に対するそれらの効果を、下で記載するように評価した。生物活性の分画は、エトポシドによる処置でウシＮＰ細胞中のカスパーゼ３／７活性における減少を示すタンパク質分画と定義した。これらの生物活性の分画は、後でタンパク質の同定のために質量分析法を使用して分析した。
【００３５】
生物活性の分画をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元して、遊離のシステイン残基をヨードアセトアミドでアルキル化し、改変されたウシトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）で終夜消化した。トリプシンによって生じたペプチドを脱塩して、積分エミッターを備える、ＲＳＬＣ  ２μｍＣ１８充填材（ＥＡＳＹ−スプレー、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）を含有する５０ｃｍ×７５μｍＩＤのカラムに搭載した。該ペプチドを、９０分で０．１％ギ酸中０％から３５％へのアセトニトリルの勾配でＥａｓｙ−Ｓｐｒａｙ  ｎＬＣ  １０００クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｏｄｅｎｓｅデンマーク）を使用するＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、ＳａｎＪｏｓｅ、カリフォルニア州）中に溶離した。質量分析計をデータ依存性様式で操作して、１ＭＳそれに続いて１０ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。７０，０００ＦＷＨＭの分割、１×１０6イオンの標的および１２０ｍｓの最大走査時間でＭＳを得た。ＭＳ／ＭＳ走査は、１７，５００ＦＷＨＭの分割、１×１０6イオンの標的および１２０ｍｓの最大走査時間で２７％の相対衝突エネルギーを使用して得た。１５秒の動的排除時間をＭＳ／ＭＳ走査のために使用した。粗データファイルをＸＣａｌｉｂｕｒ  ２．２（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で得て、Ｓｅｑｕｅｓｔ検索エンジン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ＵｎｉＰｒｏｔのイヌのデータベース  ２８，４６０件のエントリーがあった８月１２日、２０１４バージョンをＸ！−タンデム（Ｂｅａｖｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、マニトバ州）と共に使用して加工処理した。加工処理されたデータをスキャフォールド３．２（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン州）にインポートした。ペプチドは、スキャフォールドスコアが、逆ＵｎｉＰｒｏｔのイヌのデータベースに対する検索により決定されたように、０．１％の偽発見率（ＦＤＲ）を超えれば、同定されたと考えられた。
６頭の３歳の雄の子牛からウシ尾部の椎間板ＮＰを得た。ヒトの変性椎間板の髄核細胞は、椎間板切除または固定手術をＴｏｒｏｎｔｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、トロントで受ける患者（ｎ＝４）から得られた（インフォームドコンセントを得て）。
【００３６】
１２週齢の雌ウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、米国）を、ＤＤＤの前臨床齧歯動物モデルを開発するために使用して、ＮＣＣＭ、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の治療可能性をこれらの前臨床齧歯動物モデルで評価した。実験は、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施して、実験計画案はＴｏｒｏｎｔｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、トロント、オンタリオ州、カナダの倫理承認委員会により承認された。外科的手技は以下のとおりであった；麻酔はイソフルオラン（５Ｌ／分プラス１Ｌ／分Ｏ2）を使用して達成し、３Ｌ／分を維持した。深く麻酔がかかったら、動物を、ノーズコーン吸入を備える定位の手技装置（モデル９００、Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  カリフォルニア州、米国）上に固定した。動物実験のために、尾部を剃毛して、イソプロパノールを用いて滅菌様式で準備した。Ｘ線透視を使用して針の侵入を可視化して針がＮＰの中心に侵入することを確実にした。椎間板損傷のために、２６ゲージ（Ｇ）、３５°斜角、０．７５インチ高の針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）がマウントされたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用した。針を、選択された尾部ＩＶＤに完全に通して進めて、椎間板の両側で線維輪を含む全厚に侵入させた。針の位置の確認は、Ｘ線透視を使用して行い、位置に２分間維持し、半分引き出してＮＰの中心に置き、そこに１分間放置して、次に１分間かけてゆっくりと完全に引き出した。次に、動物を定位装置から取り外して、温めたケージ中で快復させた。研究期間、即ち７２時間〜１０週間の終わりに、ＣＯ2を使用して動物を人道的に安楽死させ、各脊椎の腰部／尾の運動セグメントを無菌的に解剖した。ＩＶＤは、組織学的分析のためにホルマリンで固定するか、または髄核（健常／損傷）を収穫し、ウェスタンブロットのためにＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解するかのいずれかを行った。
【００３７】
ＮＣＣＭ、ＣＴＧＦまたはＴＧＦβ１の再生可能性を決定するために、１２週齢のラットの動物１匹当たり４個のＩＶＤを、上で記載された２６Ｇ針を使用して損傷した。損傷後４週間に、動物を６群に無作為化して、ＮＣＣＭ、ＣＴＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）またはＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかの椎間板内の注射（約８μＬ）を、局所麻酔下で与えた。ＮＣＣＭを注射された動物に対して、対照群は、ハイブリドーマ培養培地だけの椎間板内の注射（約８μＬ）を受けた動物からなり、一方、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１×、ｐＨ＝７．２）は、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１を注射された動物群のための対照として役立った。６週間後に、損傷椎間板および対照椎間板からＮＰを収穫し、組織学的分析のためにホルマリンで固定するかまたはウェスタンブロットのためにＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解させるかのいずれかを行った。この実験の各々を独立に繰り返して再現性を確実にした。
【００３８】
ホスホ−ｐ４２／ｐ４４（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ホスホ−ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ホスホ−ｃＲａｆ（Ｓｅｒ３３８）、合計ｐ４２／ｐ４４、ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質に対するウサギポリクローナル／モノクローナル抗体を含む細胞シグナル伝達技法のＳａｍｐｌｅｒキットを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌｔｄ．（オンタリオ州、カナダ）から得た。コラーゲン２（ａｂ３４７１２）、ＭＭＰ−１３（ａｂ３９０１２）、Ｃｏｘ２（ａｂ１５１９１）、Ｏｃｔ４（ａｂ１８９７６）、Ｎａｎｏｇ（ａｂ１０６４６５）、ＣＴＧＦ（ａｂ６９９５）、ＳＴＡＴ３（ａｂ７９６６）に対するウサギポリクローナル抗体、ＭＭＰ−３（ａｂ５２９１５）に対するウサギモノクローナルおよびガレクチン３（ａｂ２７８５）およびβ−アクチン（ａｂ６２７６）に対するマウスモノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．（トロント、カナダ）から購入した。ヤギポリクローナルブラキウリ抗体（ｓｃ−１７７４３）およびアグリカン（ｓｃ−２５６７４）、ＴＩＭＰ−１（ｓｃ−５５３８）、ＡＤＡＭＴＳ−４（ｓｃ−２５５８２）、ＴＮＦα（ｓｃ−８３０１）、ＴＧＦβ１（ｓｃ−１４６）に対するウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナルＷＩＳＰ２（ｓｃ−５１４０７０）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、米国）から得た。ｐ４２／４４（Ｕ０１２６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（ＳＢ２０３５８０）、ＮＦκＢ（ＢＡＹ−１１−７０８２）、ＰＩ３Ｋ（Ｗｏｒｔａｍａｎｉｎ）を標的とする特異的阻害剤、ＪＡＫ１阻害剤およびＳＴＡＴ３阻害剤は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（オンタリオ州、カナダ）から購入した。ヒト組み換えＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ２およびＴＧＦβ１タンパク質は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（ケベック州、カナダ）から購入した。
【００３９】
組織を１０％ホルマリンで固定して、１０％ＥＤＴＡ溶液中で脱カルシウムした。脱カルシウムされた椎間板を、最初に正中矢状方向の平面で縦に裂き、パラフィンに包埋して、組織学的評価のために厚さ５μｍの切片を得た。ヘマエトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびサフラニン−Ｏ染色を実施して、これらの組織切片の一般的形態およびプロテオグリカン含有率を前に記載した16ようにアセスメントした。免疫組織化学／免疫蛍光（ＩＦ）のために、ヒトの変性椎間板ＮＰ、ウシＮＰ、健常イヌ（ＮＣＤ）およびラット（健常／損傷）椎間板のパラフィン包埋切片（５μｍ）をキシレン中で脱パラフィンして、勾配アルコールで水和し、続いてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中で抗原を回収した。切片をメタノール中の過酸化水素（０．３％ｖ／ｖ）と１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、続いて非特異的結合を除外するために１０％血清でブロックした。その後、スライドをウサギまたはヤギのいずれかのポリクローナル／マウスモノクローナル一次抗体と終夜（Ｏ／Ｎ）４℃でインキュベートした。タンパク質発現は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキットからのそれぞれの二次抗体（ウサギ／ヤギ／マウス）および色原体としてのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して検出した。陰性対照では、一次抗体を、イソ型を合わせたＩｇＧによって置き換えた。明視野切片を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＯＭＦ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＴＭＤＴ）で利用できるＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ、Ａｐｅｒｉｏ  Ｗｈｏｌｅ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して、顕微鏡検査により評価した。画像を、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（バージョン１０）を使用して分析した。免疫蛍光のためには、一次抗体を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（４８８／５６８ｎｍ）で標識されたそれぞれの二次抗体（ウサギ／ヤギ／マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、米国）を使用して検出した。切片をＤＡＰＩで対比染色して、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）の封入剤を使用してマウントした。全ての画像は、ＡＯＭＦ、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＴＭＤＴ）で利用できるＦｌｕｏｖｉｅｗ  １０００倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  １Ｘ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して得た。画像を、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  １０００（バージョン３．１）ソフトウェアを使用して分析した。
【００４０】
安楽死の後、健常ラットの腰部／尾の脊椎ＩＶＤ、損傷尾部椎間板およびウシの尾のＩＶＤのＮＰを無菌的に取り出して、髄核（ＮＰ）を別に取り出し、本発明者らにより確立された方法16に従って酵素で消化した。同様に、ヒトの変性椎間板ＮＰを、プロナーゼを使用して（０．４％、３７℃で１時間）酵素的に消化し、続いてコラゲナーゼＩＩで処置した（０．０１５％、Ｏ／Ｎ、３７℃）。翌日、細胞を７０μｍの細胞ストレーナーで濾過して、３．５％Ｏ2、５％ＣＯ2の低酸素インキュベーター（ＮｕＡｉｒｅ、ミネソタ州、米国）内で、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を補完されたアドバンストダルベッコ改変イーグル培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＡＤＭＥＭ）中で培養した。処置のために、低酸素条件下の種々の時点について、血清を含まないＡＤＭＥＭ中で細胞を培養するか（無処置の対照）またはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍＬ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα、５０ｎｇ／ｍＬ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ、１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔ誘発性可溶タンパク質２（ＷＩＳＰ２、１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）またはトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１、５〜２０ｎｇ／ｍＬ）で処置するかのいずれかを行った。
【００４１】
等量の全細胞またはＲＩＰＡ溶解緩衝液を使用して調製した組織溶解物を、前に記載したように18、19ウェスタンブロットにかけた。全溶解物（３０μｇ）を１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で還元条件下に分離して、次にタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州）上に電気泳動転写した。Ｔｒｉｓで緩衝された生理食塩水（ＴＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックした後、ブロットを、ウサギまたはヤギポリクローナル／マウスモノクローナル一次抗体と４℃で終夜インキュベートした。膜をＴｗｅｅｎ（０．１％）トリス緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）で３回洗浄して、次にメーカーの提案によるようにＴＢＳ（ｐＨ＝７．２、１×）中２％脱脂乳で希釈したそれぞれのＨＲＰ−コンジュゲート抗ｌｇＧ二次抗体（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州）と２時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。ブロットをＴＴＢＳで１５分間３回洗浄して、タンパク質のバンドを、増強化学発光法（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州）によりコダックのＨｙｐｅｒｆｉｌｍで検出した。
【００４２】
成長因子による処置の効果を細胞生存能力および増殖アッセイで評価するために、髄核細胞（ラット、ウシおよびヒト）を９６ウェル平底プレートに入れた。ラットのＮＰ細胞を、ＣＴＧＦ、ＷＩＳＰ−２およびＴＧＦβ１によって用量（１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）および時間依存性様式（２４時間〜９６時間）で処置して、生存能力に基づくこれらの成長因子のアセスメントのための最適用量および時間を決定した。細胞生存能力は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を、以前に記載したように44使用して決定した。ヒトおよびラットのＮＰ細胞（健常／損傷）に対するＣＴＧＦまたはＴＧＦβ１による処置の効果を決定するために、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡ（比色分析）アッセイ（カタログ番号ａｂ１２６５５６、Ａｂｃａｍ）を、メーカーの使用説明書に従って使用した。簡単に述べれば、ＮＰ細胞をＣＴＧＦまたはＴＧＦβ１単独または組み合わせて４８時間処置した後、各ウェルにＢｒｄＵ試薬を添加してＯ／Ｎ置いた。増殖する細胞のＤＮＡに組み込まれたＢｒｄＵを、抗ＢｒｄＵ抗体を使用して決定し、メーカーの使用説明書に従ってＥＬＩＳＡにより定量した。
【００４３】
炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）による処置の結果としてＮＰ細胞（ラットおよびヒト）で誘発されたアポトーシスを、カスパーゼ３／７およびカスパーゼ９に特異的なＬｕｍｉ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して決定した。簡単に述べれば、ＮＰ細胞をプレートで培養して、ＩＬ−１β単独もしくはＴＮＦαのみと組み合わせて、またはＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の存在下のいずれかで４８時間処置して、それに続いてカスパーゼ３／７およびカスパーゼ９のための特異的試薬をメーカーの使用説明書に従って添加した。細胞をさらに４時間３７℃でインキュベートして、プレートをマルチウェルルミネッセンスプレートリーダーで読み取った。
健常なおよび処置された（ＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせて）ラットのＮＰ細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ抽出キット（カタログ番号７４１３４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して定量した。ｃＤＮＡを調製するために、全ＲＮＡ（約４００ｎｇ）を、ＲＴ2  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（カタログ番号３３０４０１、Ｑｉａｇｅｎ）を、メーカーの使用説明書に従って使用して逆転写した。ラットのＮＰ細胞中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）遺伝子に対するＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせた効果を評価するために、ＲＴ2Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  ＰＣＲＡｒｒａｙ  Ｒａｔ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ＆  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＰＡＲＮ−０１３Ｚ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴの３８４ウェルの急速ブロック機で実施されたリアルタイムＰＣＲを使用する３回の独立の実験で、無処置の対照（ＮＴＣ）と比較した。ΔΔＣｔ値、制御の変化およびｐ値の計算を含むデータ分析を、オンライン（ｈｔｔｐｓ；／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃａ）で利用できるソフトウェアを使用して実施した。ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＣＴＧＦ＋ＴＧＦβ１で処置されたヒトの変性椎間板ＮＰ細胞（Ｈ１／Ｈ２）から全ＲＮＡを単離して、それらのコラーゲン２、ＨＡＰＬＮ１、バーシカンおよびトロンボスポンジン１に対する効果を、遺伝子特異的プライマーを使用して評価した。同様に、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ１の存在下でＩＬ−１β単独またはＴＮＦαと組み合わせて処置されたヒトＮＰ細胞からＲＮＡを単離して、それらのＣｏｘ２およびＭＭＰ−１３発現に対する効果を、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。
【００４４】
全てのデータは、平均±ＳＤで表した。試験と無処置の対照における有意差は、対応のあるスチューデントｔ検定を使用して決定した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。全ての検定について、ｐ＜０．０５を統計的に有意と定義した。
典型的組成物の調製
３０ｍｌの１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を入れたチューブに、０．０４８ｇのカルボキシメチルセルロース（カタログ番号４１９２７３、Ｓｉｇｍａ）を散布により添加した。このチューブをアルミニウム箔中に包んで２〜３時間室温で振り動かした。次に、０．３８４ｇのデキストロース（カタログ番号Ｄ８０６６、Ｓｉｇｍａ）を加えた。次に、０．３８４ｇのグルコサミン塩酸塩（カタログ番号Ｇ１５１４、Ｓｉｇｍａ）を加えた。次に、７２ｍｇのコンドロイチン硫酸（カタログ番号Ｃ４３８４、Ｓｉｇｍａ）を加えて、１ｍｌの滅菌プラスチックチップを使用して、材料の任意の塊を分散および溶解させた。次に、このチューブを、全部が溶解されるまで振り動かした。ｐＨを、１．０ＮのＮａＯＨでｐＨ７．４に調整して、「ＤＲＳ貯蔵溶液」を形成した。
【００４５】
「ＤＲＳ作業溶液」を作製するために、バイオセーフティーキャビネット中で、ＤＲＳ貯蔵溶液の１：１０希釈を１×ＰＢＳで行い、０．２２μｍのシリンジフィルターを通して濾過して４℃で貯蔵した。
「ＣＴＧＦ貯蔵溶液」を作製するために、ＣＴＧＦをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（カタログ番号１２０−１９）から購入した。２０μｇの凍結乾燥されたＣＴＧＦを遠心分離して１ｍｌの滅菌脱イオン水で溶解した。
ＤＲＳ中で「ＣＴＧＦ作業溶液」を作製するために、５μｌのＣＴＧＦ貯蔵溶液を９９５μｌのＤＲＳ作業溶液に加えて、１００ｎｇ／ｍｌのＣＴＧＦを生じさせた。
【００４６】
「ＴＧＦ−ベータ１貯蔵溶液」を作製するために、ＴＧＦ−ベータ１をＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した（カタログ番号１００−２１）。１０μｇの凍結乾燥されたＴＧＦ−ベータ１を遠心分離して１ｍｌの滅菌１０ｍＭクエン酸（ｐＨ約３．０）で溶解した。
提示した図において最も大きい効果を有した「ＤＲＳ中のＣＴＧＦ＋ＴＧＦ−ベータ１作業溶液」を作製するためには、１μｌのＴＧＦ−ベータ１貯蔵溶液、５μｌのＣＴＧＦ貯蔵溶液、および９９４μｌのＤＲＳ貯蔵溶液を混合して、４本のチューブに２５０μｌを各々分注した。
本明細書において本発明の好ましい実施形態を記載したが、それらに対する変形は、本発明の精神または添付の特許請求の範囲を逸脱することなく行うことができることが、当業者により理解されるであろう。以下の参考文献リスト中の文献を含む本明細書で開示された全ての文献は、参照により組み込まれる。
【００４７】
参考文献
2020143106.tif 000003
2020143106.tif 000004
2020143106.tif 000005
2020143106.tif 000006
2020143106.tif 000007
【図１−１】
2020143106.tif 000008
【図１−２】
2020143106.tif 000009
【図１−３】
2020143106.tif 000010
【図２−１】
2020143106.tif 000011
【図２−２】
2020143106.tif 000012
【図２−３】
2020143106.tif 000013
【図３−１】
2020143106.tif 000014
【図３−２】
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【図３−３】
2020143106.tif 000016
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２ａ】
2020143106.tif 000030
【図１２ｂ】
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【図１３】
2020143106.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板（ＩＶＤ）注射に適した剤形の医薬組成物であって、
少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素と、
（ａ）前記組成物中の唯一の成長因子としての結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、又は
（ｂ）前記組成物中の唯一の成長因子としてのトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、又は
（ｃ）前記組成物中の２つのみの成長因子としてのＣＴＧＦ及びＴＧＦ−β１、
とを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１種のＥＣＭ構成要素が、コンドロイチン又はその医薬的に許容できる塩、グルコサミン又はその医薬的に許容できる塩、或いはその組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コンドロイチン又はその医薬的に許容できる塩が、コンドロイチン硫酸である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記コンドロイチン硫酸が、前記組成物の０．１質量％〜２．０質量％、０．５質量％〜２．０質量％又は０．１質量％〜０．５質量％の量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルコサミン又はその医薬的に許容される塩が、グルコサミン塩酸塩である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルコサミン塩酸塩が、前記組成物の１質量％〜２５質量％、５質量％〜２０質量％、１質量％〜５質量％又は１．０質量％〜１．５質量％の量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＣＴＧＦが、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも５０ｎｇ、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも１００ｎｇ、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも２００ｎｇ、又は前記組成物１ｍＬあたり５０ｎｇ〜５００ｎｇの濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＴＧＦ−β１が、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも１ｎｇ、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも５ｎｇ、前記組成物１ｍＬあたり少なくとも１０ｎｇ、前記組成物１ｍＬあたり１ｎｇ〜１００ｎｇ、又は前記組成物１ｍＬあたり１０ｎｇ〜１００ｎｇの濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１種の医薬的に許容できる担体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
水を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
デキストロース又はその医薬的に許容できる塩を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記デキストロース又はその医薬的に許容できる塩が、前記組成物の最大で２５質量％の量、前記組成物の１質量％〜２質量％の量、又は前記組成物の１質量％〜１．５質量％の量で存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＣＭＣが、前記組成物の最大で０．５質量％の量で存在する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
緩衝剤を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記緩衝剤は、前記組成物のｐＨを６〜７．４に安定化させるのに十分な量で存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
変性した椎間板の髄核（ＮＰ）細胞の増殖及び／又は生存能力を高める、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
患者における前記ＩＶＤから発する疼痛を低減するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＩＶＤが変性しているか、或いは、以前に損傷している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
患者における変性ＩＶＤ疾患又はＩＶＤ損傷を処置するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＩＶＤは、変性しているか、或いは損傷している、前記組成物。
【請求項２１】
患者の前記ＩＶＤにおける疼痛、関節炎又は疑いのある関節炎を処置するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
患者における変性ＩＶＤの再生に用いるための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
患者の変性又は損傷したＩＶＤにおけるＩＶＤの高さの損失の進行を抑制するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物であって、変性又は損傷したＩＶＤは、変性していないＩＶＤ又は損傷していないＩＶＤに比べて椎間板の高さを失っている、前記組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
「ＴＧＦ−ベータ１貯蔵溶液」を作製するために、ＴＧＦ−ベータ１をＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した（カタログ番号１００−２１）。１０μｇの凍結乾燥されたＴＧＦ−ベータ１を遠心分離して１ｍｌの滅菌１０ｍＭクエン酸（ｐＨ約３．０）で溶解した。
提示した図において最も大きい効果を有した「ＤＲＳ中のＣＴＧＦ＋ＴＧＦ−ベータ１作業溶液」を作製するためには、１μｌのＴＧＦ−ベータ１貯蔵溶液、５μｌのＣＴＧＦ貯蔵溶液、および９９４μｌのＤＲＳ貯蔵溶液を混合して、４本のチューブに２５０μｌを各々分注した。
本明細書において本発明の好ましい実施形態を記載したが、それらに対する変形は、本発明の精神または添付の特許請求の範囲を逸脱することなく行うことができることが、当業者により理解されるであろう。以下の参考文献リスト中の文献を含む本明細書で開示された全ての文献は、参照により組み込まれる。
なお、本発明としては、以下の態様も好ましい。
〔１〕  約０．１質量％〜約２．０質量％のレベルで存在するコンドロイチン硫酸、
約１質量％〜約２５質量％のレベルで存在するグルコサミン塩酸塩、
組成物１ｍｇ当たり約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの濃度で存在する結合組織成長因子、
組成物１ｍｇ当たり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇの濃度で存在するトランスフォーミング成長因子ベータ１、
任意選択で約０質量％〜約２５質量％のレベルのデキストロース、
任意選択で約０質量％〜約０．５質量％のレベルのカルボキシメチルセルロース、および
質量に基づき全体を合せて組成物の残部に等しいレベルの、水と、任意選択で薬学的に許容される担体、緩衝剤および／またはジメチルスルホキシドとを含む水溶液
を含む組成物。
〔２〕  コンドロイチン；グルコサミン；ならびに結合組織成長因子、ＷＩＳＰ−２、およびトランスフォーミング成長因子ベータ１から選択される因子；または薬学的に許容されるそれらの塩を含む組成物。
〔３〕  結合組織成長因子およびトランスフォーミング成長因子ベータ１のいずれかもしくは両方、または薬学的に許容されるそれらの塩を含む、〔２〕に記載の組成物。
〔４〕  水をさらに含む、〔３〕に記載の組成物。
〔５〕  デキストロースまたは薬学的に許容されるその塩をさらに含む、〔４〕に記載の組成物。
〔６〕  前記組成物のｐＨを約６〜約７の間で安定化させるために十分な量で緩衝剤をさらに含む、〔４〕に記載の組成物。
〔７〕  前記コンドロイチンがコンドロイチン硫酸である、〔４〕に記載の組成物。
〔８〕  前記コンドロイチン硫酸が前記組成物の約０．５質量％〜約２．０質量％のレベルで存在する、〔７〕に記載の組成物。
〔９〕  前記コンドロイチン硫酸が前記組成物の約０．１質量％〜約０．５質量％のレベルで存在する、〔７〕に記載の組成物。
〔１０〕  前記グルコサミンがグルコサミン塩酸塩である、〔４〕に記載の組成物。
〔１１〕  前記グルコサミン塩酸塩が、前記組成物の約５質量％〜約２０質量％のレベルで存在する、〔１０〕に記載の組成物。
〔１２〕  前記グルコサミン塩酸塩が、前記組成物の約１質量％〜約５質量％のレベル、好ましくは約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する、〔１０〕に記載の組成物。
〔１３〕  麻酔薬をさらに含む、〔４〕に記載の組成物。
〔１４〕  前記麻酔薬がブピバカインである、〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕  前記デキストロースが、前記組成物の約２５質量％までのレベルで、好ましくは約１質量％〜約２質量％のレベルで、より好ましくは約１．０質量％〜約１．５質量％のレベルで存在する、〔５〕に記載の組成物。
〔１６〕  前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５０ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔１７〕  前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１００ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔１８〕  前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約２００ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔１９〕  前記結合組織成長因子が、前記組成物１ｍＬ当たり約５０〜約５００ｎｇの間の濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔２０〕  前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔２１〕  前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔２２〕  前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり少なくとも約１０ｎｇの濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔２３〕  前記トランスフォーミング成長因子ベータ１が、前記組成物１ｍＬ当たり約１〜約１００ｎｇの間の濃度で存在する、〔４〕に記載の組成物。
〔２４〕  薬学的に許容される担体をさらに含み、且つジメチルスルホキシドを含んでいてもよい、〔４〕に記載の組成物。
〔２５〕  前記薬学的に許容される担体がカルボキシメチルセルロースを含む、〔２４〕に記載の組成物。
〔２６〕  前記薬学的に許容される担体がヒアルロン酸を含む、〔２４〕に記載の組成物。
〔２７〕  少なくとも１種のグリコサミノグリカンまたはそれらの誘導体もしくは前駆体、好ましくはコンドロイチンおよび／もしくはグルコサミン、および結合組織成長因子、およびトランスフォーミング成長因子ベータ；または薬学的に許容されるそれらの塩を含む組成物。
〔２８〕  患者における脊椎の椎間板から発する疼痛を低下させる方法であって、〔１〕から〔２７〕のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を、前記椎間板中に注射することを含む方法。
〔２９〕  前記椎間板が変性している、〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕  前記椎間板が、以前に損傷している、〔２８〕に記載の方法。
〔３１〕  患者における変性椎間板疾患または椎間板損傷を処置する方法であって、〔１〕から〔２７〕のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を、前記椎間板中に注射することを含む方法。
〔３２〕  患者の身体領域における疼痛、関節炎、または疑われる関節炎を処置する方法であって、〔１〕から〔２７〕のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を前記身体領域中に注射することを含む方法。
〔３３〕  前記身体領域が脊椎である、〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕  前記身体領域が関節である、〔３２〕に記載の方法。
〔３５〕  前記身体領域が膝である、〔３２〕に記載の方法。
〔３６〕  前記身体領域が肩である、〔３２〕に記載の方法。
〔３７〕  前記身体領域が手首である、〔３２〕に記載の方法。
〔３８〕  前記身体領域が肘である、〔３２〕に記載の方法。
【外国語明細書】
2020143106000001.pdf