(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的に抗皮膚光老化効果を得るための手法の提供。【解決手段】米糠油を０．００２〜０．００８質量％含有する、抗皮膚光老化外用組成物。米糠油を０．００２〜０．００８質量％あるいは２５〜７５μｇ／ｍｌ含有する、皮膚における光によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）産生促進を抑制するための、外用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠油を０．００２〜０．００８質量％含有する、皮膚光老化抑制用外用組成物。
【請求項２】
米糠油を２５〜７５μｇ／ｍｌ含有する、皮膚光老化抑制用外用組成物。
【請求項３】
皮膚光老化が、シワ又はたるみである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
米糠油を０．００２〜０．００８質量％あるいは２５〜７５μｇ／ｍｌ含有する、皮膚における光によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）産生促進を抑制するための、外用組成物。
【請求項５】
化粧品組成物である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚光老化を抑制するための外用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特に美容分野において、抗皮膚老化効果を奏する外用組成物の需要はますます高まってきている。中でも皮膚のシワ又はたるみの抑制への関心は非常に高い。
【０００３】
皮膚においてシワやたるみが形成される一因として、光（紫外線、特にＵＶＡ）の皮膚照射が挙げられる。このような、光による皮膚の老化（皮膚光老化）には、真皮弾性繊維や膠原繊維の分解及び減少が関与している。そして、真皮構成成分の分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）が関与しており、特にＭＭＰ−１は、コラーゲンの３重螺旋構造を切断できる酵素の一つである。皮膚においてＭＭＰ−１が細胞外マトリックスを分解すると、皮膚構造が保持できなくなることで皮膚は大きく陥没し、深いシワの形成に至ると考えられる。またさらに、ＭＭＰ−１は、自然老化皮膚よりも光老化皮膚において活性がより高いという報告もある（非特許文献１）。よって、ＭＭＰ−１の誘導を抑制できる成分が、特に皮膚光老化の抑制に効果的であると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２４６４３６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chung JH, Seo JY, Choi HR, et al: Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo. J Invest Dermatol 117; 1218-1224: 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、効率的に皮膚光老化の抑制効果を得るための手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、米糠油を特定量含有する外用組成物が、皮膚における光によるＭＭＰ−１産生を抑制する効果を奏し得ることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
米糠油を０．００２〜０．００８質量％含有する、皮膚光老化抑制用外用組成物。
項２．
米糠油を２５〜７５μｇ／ｍｌ含有する、皮膚光老化抑制用外用組成物。
項３．
皮膚光老化が、シワ又はたるみである、項１又は２に記載の組成物。
項４．
米糠油を０．００２〜０．００８質量％あるいは２５〜７５μｇ／ｍｌ含有する、皮膚における光によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）産生促進を抑制するための、外用組成物。
項５．
化粧品組成物である、項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、優れた皮膚光老化抑制効果が奏される外用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】米糠油について、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に対する効果を評価した結果を示す。
【図２】米糠油について、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際のＭＭＰ−１の産生に対する効果を評価した結果を示す。
【図３】米糠油について、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際のＭＭＰ−１の産生に対する効果を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明に包含される皮膚光老化抑制用外用組成物は、米糠油を０．００２〜０．００８質量（ｗ／ｗ）％含有する。以下当該組成物を、本発明の外用組成物と呼ぶことがある。
【００１３】
米糠油としては、米糠から得られる油であれば特に制限はされない。米糠油の製造には、溶媒（例えばｎ−ヘキサン）により米糠から抽出する方法（溶媒抽出法）や、米糠を圧搾法により圧搾処理する方法（圧搾法）等を用いることができる。本発明には、溶媒抽出米糠油、及び圧搾米糠油のいずれも用いることができ、特に圧搾米糠油を用いることが好ましい。圧搾処理の方法は公知であり、例えば加熱焙煎処理され１００〜１１５℃程度になった米糠を低温連続圧搾機（例えば（株）テクノシグマ社より販売されているミラクルチャンバー）により圧搾する方法が挙げられる。本発明ではこれに限られず公知の圧搾方法を適用できる。圧搾の程度は、特に限定はされないが、圧搾後の脱脂米糠中の脂質が５〜１５重量％、好ましくは５〜１４重量％、より好ましくは５〜１２重量％となる程度である。
【００１４】
また、米糠油は、市販品を用いることもできる。市販品としては、例えばつや姫こめ油、こめ油白絞油、コメーユ（以上、三和油脂）、ライストリエノール、ライステロールエステル、米サラダ油（以上、築野食品）、コメヌカ油、オリザオイル（以上、オリザ油化）などが挙げられる。
【００１５】
また、米糠油にはγ−オリザノールが含まれることが知られている。通常、米糠油には０．１〜３質量％程度のγ−オリザノールが含まれている。特に制限はされないが、本発明に用いる米糠油にはγ−オリザノールが０．１〜３質量％程度含まれることが好ましく、０．２〜２．５質量％程度含まれることがより好ましく、０．３〜２質量％程度含まれることがさらに好ましく、０．５〜１．５質量％程度含まれることがよりさらに好ましい。
【００１６】
また、上記の通り、本発明の外用組成物には、米糠油が０．００２〜０．００８質量％含有される。当該米糠油含有量範囲の上限又は下限は、０．００２５、０．００３、０．００３５、０．００４、０．００４５、０．００５、０．００５５、０．００６、０．００６５、０．００７、又は０．００７５質量％であってもよい。例えば米糠油含有量範囲は、０．００２５〜０．００７５質量％が好ましく、０．００３〜０．００７質量％がより好ましく、０．００３５〜０．００６５質量％がさらに好ましい。
【００１７】
また、本発明の外用組成物が液状（粘性を有するもの（例えばジェル状またはクリーム状のもも）も含む）である場合には、米糠油を２５〜７５μｇ／ｍｌ含有することが好ましく、３０〜７０μｇ／ｍｌ含有することがより好ましい。
【００１８】
本発明の外用組成物は、皮膚光老化の中でも、特に光による皮膚のシワ又はたるみに効果的であり、これらの抑制のために好ましく用いることができる。これは、本発明の外用組成物が、皮膚における光によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）産生促進を抑制する効果を好ましく有するからである。光の中でも、紫外線（特にＵＶＡ）の照射による皮膚光老化（特に、光による皮膚のシワ又はたるみ）を抑制するために好ましく用いることができる。
【００１９】
例えば、米糠油をそのまま本発明の外用組成物として用いることができるし、また、他成分を米糠油に加えて本発明の外用組成物として用いることができる。
【００２０】
他成分として、例えば、高分子、蛋白質及びその加水分解物、ムコ多糖類などを配合することができる。高分子としては、例えばカルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウムなどが例示できるが、これらに限定されるものでもない。カルボキシビニルポリマー、キサンタンガムが好ましく、特にカルボキシビニルポリマーが好ましい。これら高分子等は１種または２種以上を組み合わせて使用できる。高分子の配合量は特に限定しないが、０．００１〜２０％、好ましくは ０．００５〜１０％、特に好ましくは ０．０１〜５％である。蛋白質及びその加水分解物としては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、カゼイン、それらの加水分解物、加水分解物の塩、加水分解物のエステル、あるいは酵素処理されたものが挙げられるが、特にコラーゲンが好ましい。蛋白質及びその加水分解物の配合量は特に限定しないが、０．００１〜５％、好ましくは０．０１〜１％である。ムコ多糖としては、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ムコイチン硫酸、ヘパリンとその誘導体、及びそれらの塩類などが挙げられるが、特にコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びこれらのナトリウム塩が好ましい。ムコ多糖の配合量は特に限定しないが、 ０．０００５〜５％、好ましくは０．００１〜１％である。
【００２１】
また、この他にも、本発明の効果を損なわない範囲において、通常外用組成物に用いられる公知の成分を配合することもできる。このような成分としては、保湿剤、水溶性高分子、油成分、着色剤、酸化防止剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、清涼剤、香料、紫外線吸収・散乱剤、抗酸化剤、薬効成分などが例示できる。  
【００２２】
本発明の外用組成物は、特に皮膚に適用する組成物として用いることが好ましい。外用組成物としては、例えば医薬組成物、医薬部外品組成物、及び化粧品組成物が例示される。剤形としては、特に限定するものではないが、フェイスパック、ペースト、軟膏、クリーム、ジェル、ローション、乳液、美容液、化粧水、スプレー剤などが挙げられる。
【００２３】
本発明の外用組成物の適用対象は特に限定されないが、好ましくは抗皮膚光老化（特に光によるシワ又はたるみの抑制）を望むヒトである。
【００２４】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下、特に断らない限り、組成物における含有成分割合を示す％は質量％（ｗ／ｗ％）を表す。ＣＯ２濃度の％はｖ／ｖ％である。また、細胞、培地及び培地関連試薬については、全て市販品を購入して用いた（倉敷紡績株式会社又はシグマアルドリッチ）。
【００２６】
紫外線照射による活性酸素産生に対する効果の検討
米糠油について、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際に発生する活性酸素種（以下ＲＯＳ）の産生に対する効果を評価した。
【００２７】
＜使用材料＞
・５３歳女性由来ヒト皮膚線維芽細胞（以下ＨＤＦ５３）
・ＨＤＦ５３用培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍ４６５５）に１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ＧｉｂｃｏＴＭ，  １５２４００６２）を添加して調製した。以下ＭＥＭ（＋）ともいう。
・ＰＢＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｄ８５３７）
・ＨＢＳＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｈ８２６４）
・ＤＣＦＨ−ＤＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
なお、ＤＣＦＨ−ＤＡプローブは細胞内に散在して、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し、非蛍光型  ２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＤＣＦＨ）になり、更にＲＯＳにより素早く酸化され、強く蛍光する２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＤＣＦ）に変化する。これにより、細胞内のＲＯＳ量を蛍光強度により測定することができる。
・Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，  ＭＫ４００）（以下ＷＳＴ−１）
なお、ＷＳＴ−１は、細胞生存能力を発色測定により定量するための試薬である。生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）のホルマザン色素への変換を基本としており、生細胞数が増加すれば、サンプル中のミトコンドリア脱水素酵素の全体の活性が増加することになり、この酵素活性の増加が、ホルマザン色素の生成増加を導くため、ホルマザン色素と培地中の代謝活性のある細胞の数とは直線的な相関を示すことになる。
【００２８】
＜実験操作＞
４８穴ウェルプレートにＨＤＦ５３を１．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、コンフルエントになるまで３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で３日間培養（使用培地：ＭＥＭ（＋））した。３日後、ＭＥＭ（＋）を除去してＨＢＳＳで１回洗浄し、新しいＨＢＳＳを各ウェルに２００μｌずつ添加した。上記のＨＤＦ５３に、ＵＶＡを４０００ｍＪ／ｃｍ２  照射した。ＨＢＳＳを吸引除去し、新しいＰＢＳで１回洗浄した。米糠油（三和油脂製「つや姫こめ油」又は築野食品製）を５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加した。各ウェルに  ５ｍＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡ  （Ｄｉ（Ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）  （６−Ｃａｒｂｏｘｙ−２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ））を３μｌずつ添加した（最終濃度３０μＭ）。３７℃、ＣＯ２５％インキュベーター内で３０分間培養した。培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。新しいＰＢＳを各ウェルに３００μｌずつ添加した。ＧＥＭＩＮＩ  ＸＰＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、Ｅｘ  ４８８ｎｍ／Ｅｍ  ５３０ｎｍの波長で蛍光強度を測定した。その後、ＰＢＳを吸引除去して１０倍希釈したＷＳＴ−１を含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加し、３７℃、ＣＯ２５％インキュベーター内で２時間培養した。ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。当該実験は、Ｎ＝３で実施した。また、米糠油を含まないＭＥＭ（＋）をコントロールとした。
【００２９】
測定した蛍光強度を図１に示す。ただし、図１に示す蛍光強度は、ＧＥＭＩＮＩ  ＸＰＳで測定した蛍光強度を、細胞生存率で割り補正した値である。細胞生存率は、ＷＳＴ−１を用いた検討において、ｘＭａｒｋで測定した各ウェルの吸光度を、ＵＶＡ未照射コントロールの吸光度の平均値で割ることにより、算出した。なお、ＵＶＡ未照射コントロールでの生存率を「１」とした。なお、図１において、＋はｐ＜０．１、＊はｐ＜０．０５（いずれもＴ−ｔｅｓｔによる）を示す。
【００３０】
紫外線照射によるＭＭＰ−１産生に対する効果の検討
米糠油について、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際のＭＭＰ−１の産生に対する効果を評価した。
【００３１】
＜使用材料＞
・５３歳女性由来ヒト皮膚線維芽細胞（以下ＨＤＦ５３）
・ＨＤＦ５３用培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍ４６５５）に１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ＧｉｂｃｏＴＭ，  １５２４００６２）を添加して調製した。以下ＭＥＭ（＋）ともいう。
・ＰＢＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｄ８５３７）
・ＨＢＳＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｈ８２６４）
・Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，  ＭＫ４００）（以下ＷＳＴ−１）
・Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−１    （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＤＹ９０１Ｂ）＊ＭＭＰ−１検出用ＥＬＩＳＡキット
・ＤｕｏＳｅｔ  Ａｎｃｉｌｌａｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ２    （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＤＹ００８）
【００３２】
＜実験操作＞
４８穴ウェルプレートにＨＤＦ５３を１．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、コンフルエントになるまで３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で３日間培養（使用培地：ＭＥＭ（＋））した。３日後、ＭＥＭ（＋）を除去してＨＢＳＳで１回洗浄し、新しいＨＢＳＳを各ウェルに２００μｌずつ添加した。上記のＨＤＦ５３に、ＵＶＡを８０００ｍＪ／ｃｍ２  照射した。ＨＢＳＳを吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。米糠油（三和油脂製「つや姫こめ油」又は築野食品製）を５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で７２時間培養した。７２時間後、培地を回収して１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収して使用するまで−３０℃で保管した。また、各ウェルの残った培地を吸引除去し、新しいＰＢＳで１回洗浄した。１０倍希釈したＷＳＴ−１を含むＭＥＭ（＋）を、各ウェルに３００μｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で２時間培養した。培養後、ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、遠心分離して得た培地上清中のＭＭＰ−１の濃度測定を、ＥＬＩＳＡキット付属のプロトコールに従って行った。ＥＬＩＳＡの測定において、吸光度はｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３３】
当該実験は、Ｎ＝３で実施した。また、米糠油を含まないＭＥＭ（＋）をコントロールとした。
【００３４】
測定したＭＭＰ−１の濃度を図２に示す。ただし、図２に示す濃度は、ＥＬＩＳＡの測定において、ｘＭａｒｋで測定した吸光度を、細胞生存率で割り補正した値である。細胞生存率は、ＷＳＴ−１を用いた検討において、ｘＭａｒｋで測定した各ウェルの吸光度を、ＵＶＡ未照射コントロールの吸光度の平均値で割ることにより、算出した。なお、ＵＶＡ未照射コントロールでの生存率を「１」とした。なお、図２において、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（いずれもＴ−ｔｅｓｔによる）を示す。
【００３５】
また、米糠油を５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を、２００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）に変更した検討の結果を図３に示す。この検討は、２４穴ウェルプレートにＨＤＦ５３を１．４６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種しておこなった。コンフルエントになるまで３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で３日間培養（使用培地：ＭＥＭ（＋））し、ＭＥＭ（＋）を除去してＰＢＳで１回洗浄し、新しいＰＢＳを各ウェルに３００μｌずつ添加した。上記のＨＤＦ５３に、ＵＶＡを６０００ｍＪ／ｃｍ２  照射した。ＰＢＳを吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。米糠油（三和油脂製「つや姫こめ油」又は築野食品製）を２００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに１ｍｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で７２時間培養した。７２時間後、培地を回収して１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収して使用するまで−３０℃で保管した。また、各ウェルの残った培地を吸引除去し、新しいＰＢＳで１回洗浄した。１０倍希釈したＷＳＴ−１を含むＭＥＭ（＋）を、各ウェルに１ｍｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で２時間培養した。その後は、米糠油を５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を用いた上記の検討と同様にして検討した。なお図３において、＋はＰ＜０．１を示す。
【００３６】
以上の結果から、米糠油を含有する組成物は、その含有量が増えるにつれ、光照射による線維芽細胞でのＲＯＳ産生をより強く抑制することが出来る（図１）ことがわかった。また、意外にも、光照射による線維芽細胞でのＭＭＰ−１産生については、米糠油含有量が５０μｇ／ｍｌ程度であれば効果的に抑制することができる一方、米糠油の含有量が増えるにつれ当該抑制効果は落ちてしまうこと、さらには、２００μｇ／ｍｌ程度以上含有される場合にはむしろ当該ＭＭＰ−１産生を促進してしまうおそれがあること（図２及び図３）、がわかった。 
【図１】
2020180072.tif 000002
【図２】
2020180072.tif 000003
【図３】
2020180072.tif 000004