(57)【要約】      （修正有）【課題】高親和性ＳＩＲＰα試薬の提供。【解決手段】高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを欠き、野生型ＳＩＲＰα配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記アミノ酸修飾は、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαポリペプチドの親和性を増加させる、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチド。【効果】ＳＩＲＰαとそのリガンドＣＤ４７との間の生理学的結合相互作用を遮断する高親和性ＳＩＲＰα試薬を含む、治療用量の薬学的組成物を投与することにより、哺乳動物における食作用を調節するための組成物および方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により付与された契約ＣＡ０８６０１７、ＨＬ０５８７７０、およびＣＡ１３９４９０の下での政府援助により成された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の代謝回転は、アポトーシスプログラム、またはそれらを除去されるようにマークする他の細胞変化の誘導から開始し、その後マクロファージ、樹枝状細胞等の食細胞によりマーカーが認識される。このプロセスは、不要な細胞の特異的および選択的除去を必要とする。健康な細胞と不要な／老化した／死にかけた細胞との区別は、「被食（ｅａｔ−ｍｅ）」シグナル、すなわち「自己改変（ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ）」と呼ばれるマーカーまたはリガンドにより示され、これは一方で食細胞上の受容体により認識され得る。健康な細胞は、食作用を活発に阻害する「貪食拒否（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ−ｍｅ）」シグナルを示すことができ、これらの信号は、死にかけた細胞においては下方制御され、または改変された構造で存在する。健康な細胞上の細胞表面タンパク質ＣＤ４７およびその食細胞受容体ＳＩＲＰαとの結合は、アポトーシスによる細胞排除およびＦｃＲ媒介食作用を含む複数の様式により媒介される飲み込みを止めることができる、重要な「貪食拒否（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ−ｍｅ）」シグナルを構成する。食細胞上のＳＩＲＰαのＣＤ４７媒介結合の遮断、またはノックアウトマウスにおけるＣＤ４７発現の喪失は、生細胞および非老化赤血球の除去をもたらし得る。代替として、ＳＩＲＰα認識の遮断もまた、通常は貪食されない標的の飲み込みを可能とする。
【０００３】
ＣＤ４７は、単一のＩｇ様ドメインおよび５つの膜貫通領域を有する広範に発現された膜貫通糖タンパク質であり、ＳＩＲＰαの細胞リガンドとして機能し、結合は、ＳＩＲＰαのＮＨ２末端Ｖ様ドメインにより媒介される。ＳＩＲＰαは、主として、マクロファージ、顆粒球、骨髄樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、および造血幹細胞を含むそれらの前駆体を含む骨髄性細胞上に発現する。ＣＤ４７結合を媒介するＳＩＲＰα上の構造決定基は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７９：７７４１−７７５０；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）  Ｊ．Ｂ．Ｃ．  ２８２：１４５６７−７５により議論されており、ＣＤ４７結合におけるＳＩＲＰαシス二量体化の役割は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ．Ｂ．Ｃ．  ２８５：３７９５３−６３により議論されている。
【０００４】
正常細胞の食作用を阻害するＣＤ４７の役割に一致して、その移動段階の直前またはその間にそれが一時的に造血幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞上で上方制御され、これらの細胞上のＣＤ４７のレベルが、それらがインビボで飲み込まれる確率を決定するという証拠が存在する。ＣＤ４７はまた、複数の癌において構造的に上方制御される。腫瘍細胞によるＣＤ４７の過剰発現は、細胞が食作用を回避するのを可能にすることにより、病原性を増加させ得る。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において高親和性ＳＩＲＰα試薬と呼ばれる、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドおよびその類似体が提供される。試薬は、天然ヒトＳＩＲＰαタンパク質の配列変異体であり、天然ＳＩＲＰαタンパク質とその受容体ＣＤ４７との間の相互作用を遮断するインビボおよびインビトロ法への実用性を有する。親和性の増加を提供するアミノ酸変化は、ｄ１ドメイン内に局在し、したがって、本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ヒトＳＩＲＰαのｄ１ドメインを含み、野生型配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸変化がｄ１ドメイン内に存在する。そのような高親和性ＳＩＲＰα試薬は、任意に、追加的アミノ酸配列、例えば抗体Ｆｃ配列；天然タンパク質またはその断片の残基１５０から３７４を制限なく含む、ｄ１ドメイン以外の野生型ヒトＳＩＲＰαタンパク質の一部（通常、断片はｄ１ドメインに隣接している）等を含む。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、単量体または多量体、すなわち二量体、三量体、四量体等であってもよい。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを欠き、野生型ヒトＳＩＲＰαに比べてｄ１ドメインに少なくとも１つのアミノ酸変化を含む、可溶性高親和性ＳＩＲＰα試薬を提供し、このアミノ酸変化は、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαポリペプチドの親和性を増加させる。高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、例えばグリコシル化、ペグ化等により、翻訳後に修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である。
【０００７】
本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた高親和性ＳＩＲＰα試薬の薬学的製剤を含む。そのような製剤は、単位用量、例えば個体における標的化食作用を増加させるのに効果的な用量として提供され得る。また、薬学的製剤は、使用のために再構成され得る高親和性ＳＩＲＰα試薬の凍結乾燥または他の調製物を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、例えばマクロファージまたは他の哺乳動物食細胞により細胞の標的化食作用を操作する方法が提供される。そのような方法において、ＣＤ４７を発現する細胞は、本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬と、内因性ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を遮断するのに効果的な用量で接触される。この相互作用を遮断することにより、通常は貪食されない標的の飲み込みが可能となる。接触は、例えば治療目的においてインビボで、および例えばスクリーニングアッセイ等のためにインビトロで行われてもよい。これらの目的のための高親和性ＳＩＲＰα試薬は、多量体または単量体であってもよい。単量体試薬は、食作用に標的化される細胞に選択的に結合する抗体と組み合わせた投与のための特定の用途が見出される。
【０００９】
関連した実施形態において、腫瘍細胞を、細胞表面上のＣＤ４７を遮断またはマスクするのに効果的な用量の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドと接触させ、通常は貪食されない標的の飲み込みを可能にすることにより、腫瘍細胞、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫等の固形腫瘍；白血病；リンパ腫等が食作用に標的化される。効果的な用量の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドの患者への投与は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を防止し、これによって食作用による腫瘍細胞の排除が増加する。これらの目的において、高親和性ＳＩＲＰα変異体を、食作用促進シグナルを提供する、食作用に標的化された細胞に結合した免疫グロブリンＦｃの存在下で投与することが有利となり得る。これらの態様において、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、１つ以上の追加的腫瘍細胞マーカーに対するモノクローナル抗体と組み合わされてもよく、この組成物は、単一薬剤の使用と比較して、食作用および腫瘍細胞の排除を向上させる上で相乗効果を有し得る。単量体高親和性ＳＩＲＰα試薬は、赤血球毒性が低いため、この目的に有利である。代替として、免疫グロブリンＦｃ領域を含むＳＩＲＰα融合コンストラクト、例えば食作用促進シグナルを提供するものが投与されてもよい。
【００１０】
他の実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、検出可能な標識を含む。そのような標識化試薬は、画像化目的においてインビトロまたはインビボで、例えば腫瘍の画像化において使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】高親和性ＳＩＲＰα変異体の指向進化。Ａ．可溶性高親和性ＳＩＲＰαによるＣＤ４７遮断の概略図。（左）基礎的状態において、癌細胞上のＣＤ４７発現が、マクロファージ上のＳＩＲＰαを活性化し、ＳＨＰ１および２チロシンホスファターゼによる阻害カスケードを開始し、癌細胞の食作用を防止する。（右）可溶性高親和性ＳＩＲＰαタンパク質は、ＣＤ４７に競合的に拮抗し、マクロファージ上のＳＩＲＰαとの結合を防止し、それにより食作用を脱阻害する。Ｂ．ＳＩＲＰα  ＶセットＩｇドメイン（ドメイン１、ｄ１）の酵母表面ディスプレイの概略図。酵母クローン（灰色の細胞）は、ＳＩＲＰα（色付きの突起）の異なる変異体を示す。挿入図は、Ａｇａ２との融合による酵母細胞表面へのＳＩＲＰαの連結、およびビオチン化ＣＤ４７による選択を示す。Ｃ．改質されたＳＩＲＰα変異体の配列およびＳＰＲ親和性測定の概要。変異残基の位置および野生型対立遺伝子１におけるその対応する配列を、表の最上部に示す。赤色の文字は、コンセンサス変異を示し、青い網掛けは、コンセンサスにおける接触残基を示す。野生型ＳＩＲＰαおよび高親和性変異体ＦＤ６結合固定ＣＤ４７の代表的なＳＰＲセンサグラムを、右側に示す。ＲＵ＝反応単位。Ｄ．ＦＤ６（橙色）およびＣＤ４７（青色）のリボン型表現を含む透明表面として描画される、ＦＤ６：ＣＤ４７複合体の結晶構造。Ｅ．野生型（赤紫色）および高親和性（緑色）ＳＩＲＰα：ＣＤ４７複合体の重ね合わせ。挿入図は、ＳＩＲＰα  Ｃ’Ｄループにおける変異接触残基（枝）およびＣＤ４７の結合界面（上部、空間充填；下部、枝）を示す。
【図２】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、インビトロでＣＤ４７を遮断し、食作用を刺激する。Ａ．野生型ＳＩＲＰα対立遺伝子１（ＷＴａ１、ピンク色）、抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２  Ｆａｂ断片（橙色）、または２種の高親和性ＳＩＲＰα変異体（ＦＤ６、ＣＶ１、緑色）を使用した、Ｒａｊｉリンパ腫に対するＣＤ４７拮抗作用の用量−反応曲線。細胞は、１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合ＷＴ  ＳＩＲＰα四量体と競合する、滴定濃度のＣＤ４７遮断剤で染色された。Ｂ．ビヒクル対照（ＰＢＳ）またはヒトＩｇＧ４に融合した高親和性ＳＩＲＰα変異（ＣＶ１−ｈＩｇＧ４）と共に、ＣＦＳＥ標識化Ｒａｊｉリンパ腫細胞およびＲＦＰ＋マクロファージを用いて行った、食作用アッセイの代表的画像。挿入図は、複数の癌細胞を取り込んだマクロファージを示す。スケールバー＝５０μｍ。Ｃ．フローサイトメトリーにより分析された食作用アッセイを示す代表的プロット。ヒトマクロファージを、ＧＦＰ＋ＤＬＤ−１細胞および示された処理と共に共培養した。ゲートを使用して、ＧＦＰ＋マクロファージ（赤色）を、全マクロファージ数（青色）のパーセンテージとして評価した。Ｄ．フローサイトメトリーにより評価されたドナー由来ヒトマクロファージによるＧＦＰ＋腫瘍細胞の食作用。全てのタンパク質処理は、１００ｎＭで使用した。ＧＦＰ＋マクロファージのパーセンテージは、各細胞株に対する各ドナーによる最大反応に正規化された。Ｅ．様々な濃度のＳＩＲＰα−Ｆｃ変異体またはアイソタイプ適合抗ＣＤ４７抗体（クローンＢ６Ｈ１２）での、ＧＦＰ＋ＤＬＤ−１細胞の食作用。Ｆ．非特異的アイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）、非遮断抗ＣＤ４７（２Ｄ３）、または抗ＥｐＣａｍ抗体での、ＧＦＰ＋ＤＬＤ−１細胞の食作用。全ての抗体は、２０μｇ／ｍＬで使用した。ＷＴ  ＳＩＲＰαまたは高親和性ＳＩＲＰα変異体ＦＤ６単量体を、１μＭで使用し、示されるように組み合わせた。Ｇ．単独（赤色）またはＷＴ  ＳＩＲＰα単量体（ピンク色）もしくは高親和性ＳＩＲＰα単量体（緑色）と組み合わせた様々な濃度のセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）での、ＧＦＰ＋ＤＬＤ−１細胞の食作用。全てのＳＩＲＰα変異体は、１００ｎＭで使用した。Ｈ．単独（赤色）またはＷＴ  ＳＩＲＰα単量体（ピンク色）もしくは高親和性ＳＩＲＰα単量体（緑色）の存在下での様々な濃度のリツキシマブ（抗ＣＤ２０）での、ＧＦＰ＋Ｒａｊｉ細胞の食作用。全てのＳＩＲＰα変異体は、１００ｎＭで使用した。Ｄ〜Ｈ  全てのヒトマクロファージ食作用アッセイは、最低３個体の独立した血液ドナーから得られたマクロファージを使用して行った。エラーバーは、標準偏差を示す。ｎｓ＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＴ  ＳＩＲＰα変異体（ｄ、ｇ、ｈ）、対Ｂ６Ｈ１２−ｈＩｇＧ４（ｅ）、または別段に指定。
【図３】高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質は、癌の単一薬剤として効果的である。Ａ．腹腔内にグラフトされ、周囲の腸ループの中に播種性腫瘍小結節を形成した、ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋ＤＬＤ−１細胞の代表的画像。Ｂ．ビヒクル対照（ＰＢＳ、赤色）または高親和性ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４融合タンパク質（ＣＶ１−ｈＩｇＧ４、青色）で処置された後の、ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋ＤＬＤ−１細胞でグラフトされたマウスの生存率。Ｃ．ｂにおいて処置された動物からの全血細胞の表面に結合したヒトＦｃの代表的分析。Ｄ．経時的なコホート当たり４匹の動物からの平均および標準偏差を示すｂにおける処置動物の血液分析。点線は、正常値の下限を示す。Ｅ．生物発光画像法により評価される、示された治療法による処置後のＮＳＧマウスの背部皮下組織におけるＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋６３９−Ｖ膀胱癌細胞の増殖。バーは、中央値を示し、点は、個々のマウスからの値を示す。Ｆ．グラフト後３７日目の各処置群からの６３９−Ｖグラフトマウスの代表的生物発光画像。Ｇ．グラフト後３８日目の６３９−Ｖグラフトマウスの腫瘍体積。バーは、中央値を示し、点は、個々のマウスからの値を示す。Ｈ．ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋６３９−Ｖ細胞でグラフトされたマウスの生存率。Ａ〜Ｈ．黒矢印は、毎日の処置の開始および終了を示している。ビヒクル対照処置対ＣＶ１−ｈＩｇＧ４において、ｎｓ＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】高親和性ＳＩＲＰα単量体は、インビボでモノクローナル抗体の有効性を向上させる。Ａ．生物発光画像法により評価される、ＰＢＳ（赤色）、ＣＶ１単量体（橙色）、リツキシマブ（緑色）、またはリツキシマブ＋ＣＶ１単量体（青色）による毎日の処置後のＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋Ｒａｊｉリンパ腫の腫瘍の増殖。バーは、中央値を示し、点は、個々のマウスからの値を示す。Ｂ．グラフト後２９日目のマウスの代表的生物発光画像。赤丸は、原発腫瘍の部位を示し、赤矢印は、腋窩リンパ節への転位の部位を示す。Ｃ．Ａからのマウスの平均腫瘍体積測定値。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｄ．Ａからのリンパ腫保有マウスの生存率。Ｅ．腫瘍体積測定により評価される、ＰＢＳ（赤色）、ＣＶ１単量体（橙色）、アレムツズマブ（緑色）、またはアレムツズマブ＋ＣＶ１単量体（青色）による週２回の処置後の、ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋Ｒａｊｉリンパ腫の腫瘍の増殖。バーは、中央値を示し、点は、個々のマウスからの値を示す。Ｆ．Ｅからのリンパ腫保有マウスの生存率。Ａ〜Ｆ  黒矢印は、処置の開始および終了を示している。全ての群対リツキシマブ＋ＣＶ１単量体、またはアレムツズマブ単体対アレムツズマブ＋ＣＶ１単量体において、ｎｓ＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】第一世代選択からのライブラリ設計および配列。Ａ．左：可能なアミノ酸変異体およびＳＩＲＰα内の無作為な位置の場所を含む、「接触残基」ライブラリの無作為な位置の表。右：非接触「コア残基」ライブラリの無作為な位置の場所および説明。ＳＩＲＰαは、緑色で描かれ、ＣＤ４７は、赤紫色で描かれ、無作為な位置は、空間充填側鎖として示されている。Ｂ．第一世代の選択後に得られたＳＩＲＰα変異体の配列の要約。変異残基の位置および野生型対立遺伝子１におけるその対応する配列を、表の最上部に示す。青の網掛けは、ＳＩＲＰα：ＣＤ４７界面において生じる「接触」変異を示す。イタリック体のフォントは、プールされたライブラリにおいて無作為化されていなかった位置での変異を示す（Ｇｌｕ４７およびＨｉｓ５６）。
【図６】第二世代選択のライブラリ設計。第二世代ライブラリの無作為な位置および可能なアミノ酸の表、ならびにＳＩＲＰαの構造内の可変残基の位置。ＳＩＲＰαは、緑色で描かれ、ＣＤ４７は、赤紫色で描かれ、無作為な位置は、空間充填側鎖として示されている。
【図７】ＦＤ６：ＣＤ４７複合体の代表的電子密度マップ。２ｍＦｏ−ＤＦｃ電子密度マップは、２．０σで輪郭化されている。モデルとなったアミノ酸残基は、枝として描かれ、ＦＤ６残基は黄色、およびＣＤ４７残基は緑色で示されている。ＣＤ４７のピログルタミン酸残基１は、対応する残基および密度の上にＰＣＡ１として示されている。
【図８】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、癌細胞上のＣＤ４７に強力に結合し、それを遮断する。Ａ．Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞に結合する、野生型ＳＩＲＰα対立遺伝子１単量体（ＷＴａ１単量体、ピンク色）、野生型ＳＩＲＰα対立遺伝子１四量体（ＷＴａ１四量体、栗色）、または高親和性ＳＩＲＰα変異体（ＦＤ６、ＦＡ４、緑色）の滴定曲線。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｂ．Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ４７遮断アッセイ。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合野生型ＳＩＲＰα四量体に競合して、ＣＤ４７拮抗薬を添加した。単量体としての第一世代ＳＩＲＰα変異体（１Ａ５単量体、ティール）、単量体としての第二世代ＳＩＲＰα変異体（ＦＤ６単量体、緑色）、ヒトＩｇＧ４とのＦｃ融合体としての第二世代ＳＩＲＰα変異体（ＦＤ６−ｈＩｇＧ４、青色）、および抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２（橙色）を用いて遮断を試験した。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｃ．野生型ＳＩＲＰα−Ｆｃタンパク質（ＷＴａ１−ｈＩｇＧ４、ピンク色；ＷＴａ２−ｈＩｇＧ４、紫色）、高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃタンパク質（ＦＤ−ｈＩｇＧ４、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４、緑色）、および抗ＣＤ４７抗体クローン  Ｂ６Ｈ１２（Ｂ６Ｈ１２−ｈＩｇＧ４、橙色）のＤＬＤ−１結腸癌細胞への結合。
【図９】高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ変異体は、インビトロでＤＬＤ−１結腸癌細胞の増殖を制限する。処置されたマウスの腹腔の生物発光画像法により測定された、ビヒクル（ＰＢＳ、赤色）または高親和性ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４融合タンパク質（ＣＶ１−ｈＩｇＧ４、青色）での処置後の腫瘍増殖曲線。点は、個々のマウスからの値を示し、線は、中央値を示す。＊＊二元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後試験により、ｐ＜０．０１。
【図１０】高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ変異体は、マクロファージ浸潤をもたらし、赤血球指数に影響する。Ａ．ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスからの切開された明確な皮下組織塊。左＝白色光、右＝ＧＦＰ蛍光。点線の楕円は、２つの表在性腫瘍小結節を囲んだものであり、アスタリスクは、マクロファージに富む基質浸潤を示している。スケールバー＝５ｍｍ。Ｂ．浸潤マクロファージの存在を実証する、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスからの明確な皮下組織塊のヘマトキシリンおよびエオシン染色。腫瘍小結節は、それを取り囲む炎症性浸潤物と共に画像の左上に見られる。挿入図は、点線の四角で囲まれた領域内の代表的なマクロファージを示す。Ｃ．ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスからの明確な皮下組織塊内のマウスマクロファージマーカーＦ４／８０の免疫組織化学的染色。腫瘍小結節は、画像の右部分に見られ、染色された浸潤マクロファージは、左側に見られる。挿入図は、点線の四角で囲まれた領域内の代表的なマクロファージを示し、食作用プロセス中のマクロファージ（黒矢印）および腫瘍細胞の飲み込みの成功（赤矢印）の証拠が見られる。Ｄ．グラフト後３４日目のＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋６３９−Ｖ膀胱腫瘍を保有するマウスの血液分析。ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置は、赤血球指数の穏やかな減少をもたらした（黄色）。他の血統に対する毒性は観察されなかった。
【図１１】高親和性ＳＩＲＰα単量体による処置は、赤血球毒性をもたらさない。Ａ．示された治療法による処置の間中のヘマトクリット測定。Ｂ．示された治療法による処置の間中のマウスからのヘモグロビンレベル。Ｃ．示された治療法による処置の間中のマウスからの絶対赤血球数。Ａ〜Ｃ．ｎｓ＝有意ではない。黒矢印は、毎日の処置の開始および終了を示している。
【図１２】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、非ヒト霊長類において安全性を示す。カニクイザルを、高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ＦＤ６−ｈＩｇＧ４、赤色）、または用量漸増による一連の高親和性ＳＩＲＰα単量体（ＦＤ６単量体、青色）の単回静脈注射で処置した。点線は、上でｍｇ／ｋｇで示された容量での処置の日数を示す。ＦＤ６−ｈＩｇＧ４による処置後、赤血球に対する中程度の毒性がヘマトクリットの低下として観察され、ＦＤ６単量体治療では、赤血球の損失は観察されなかった。他の臓器系に対する毒性は観察されなかった。
【図１３】放射性標識化高親和性ＳＩＲＰα変異体は、癌に対する非侵襲的造影剤として効果的である。Ａ．ＮＳＧマウスに、ＤＬＤ−１ヒト結腸癌細胞を、右上部の脇腹に皮下グラフトした。腫瘍を保有するマウスに、Ｃｕ−６４標識化ＦＤ６単量体を注射し、ＰＥＴスキャンにより画像化した。赤い矢印は、腫瘍による取り込みを示し、黒い矢印は、腎臓による取り込みを示す。上のパネルは背側画像を、下のパネルは腫瘍を横切る断面図を示す。Ｍ２、Ｍ３は、２体の独立した動物からの画像を示す。Ｂ．経時的な動物からの信号の定量化。ＦＤ６は、少なくとも２４時間腫瘍内に存続する。Ｃ．腫瘍および正常組織内の放射性標識化ＦＤ６の存在を示す表。Ｔ：Ｎ＝示された組織に対する腫瘍内の取り込みの比。ＩＤ／ｇ＝組織のグラム当たりの注射用量。
【図１４】マクロファージの蛍光活性化細胞分類は、高親和性ＳＩＲＰα変異体が癌細胞の食作用を誘導することを実証している。初代ヒトマクロファージおよびＧＦＰ＋ＤＬＤ−１結腸癌細胞を、１００ｎＭ  ＣＶ１−ｈＩｇＧ４の存在下で共培養した。食作用は、ＧＦＰ＋となったＣＤ４５＋マクロファージのパーセンテージとして定量した。マクロファージ集団を、ＧＦＰ陰性（青色）、ＧＦＰ低（赤色）、またはＧＦＰ高（緑色）であるものに関して、フローサイトメトリーにより分類した。Ｂ  分類されたＧＦＰ高マクロファージは、明視野透過光下（上の画像）および蛍光下（下の画像；赤色＝ＣＤ４５、緑色＝ＧＦＰ）での顕微鏡法により可視化されるように、飲み込まれた腫瘍細胞を含有する。Ｃ  ＤＬＤ−１結腸癌細胞のＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色。Ｄ  飲み込まれた物質を有さない分類されたＧＦＰ陰性マクロファージ集団のＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色。Ｅ  飲み込まれた物質に関して濃縮された分類されたＧＦＰ低マクロファージ集団のＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色。Ｆ  飲み込まれた腫瘍細胞を含有する分類されたＧＦＰ高マクロファージ集団のＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色。Ｂ〜Ｆ  スケールバーは１００μｍを表す。
【図１５】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、Ｈｅｒ２＋乳癌に対するトラスツズマブとの相乗効果を有する。初代ヒトマクロファージを、ＧＦＰ＋ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞および示された処理と共に共培養した。食作用をフローサイトメトリーにより評価した。トラスツズマブへの高親和性ＳＩＲＰα単量体ＦＤ６またはＣＶ１の添加は、食作用を増強した。ｎｓ＝有意ではない、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照処理またはトラスツズマブと組み合わせた野生型ＳＩＲＰα処理。
【図１６】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、腫瘍に結合した抗体Ｆｃ鎖の存在下で最大の有効性を誘導する。Ａ  高親和性ＳＩＲＰα変異体を示す概略図。Ｂ  高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質が限定された凝集を伴って単一種（溶出体積＝１３．４４）として精製されることを示す、分析ゲル濾過。Ｃ  ＲＦＰ＋マウスマクロファージおよびＧＦＰ＋ヒトリンパ腫Ｒａｊｉ細胞を用いた食作用アッセイ。高親和性ＳＩＲＰα変異体ＣＶ１単量体または抗ＣＤ４７  Ｆａｂ断片によるＣＤ４７遮断は、食作用の僅かな増加をもたらし、一方高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃまたは無傷抗ＣＤ４７抗体による処置は、食作用の増大をもたらした。Ｄ  ＣＤ４７のオリゴマー化は食作用を誘導しない。初代ヒトマクロファージおよびＧＦＰ＋ＤＬＤ−１ヒト結腸癌細胞を用いて行った食作用アッセイ。食作用促進刺激を有さない高親和性ＳＩＲＰα二量体での処置は、実質的なレベルの食作用を誘導しない。
【図１７】高親和性ＳＩＲＰα変異体は、他の哺乳動物ＣＤ４７相同分子種に結合し、それを遮断する。Ａ．野生型対立遺伝子１ヒトＳＩＲＰαではなく、高親和性ＳＩＲＰα変異体ＦＤ６のマウスＣＴ２６結腸癌細胞に対する結合。Ｂ．高親和性ＳＩＲＰα変異体ＦＤ６−Ｆｃは、野生型マウスＳＩＲＰα四量体の、酵母の表面上に提示されたマウスＣＤ４７に対する結合を遮断する。Ｃ．高親和性ＳＩＲＰα変異体ＣＶ１は、酵母の表面上に提示されたマウスＣＤ４７に結合する。Ｄ．抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いたフローサイトメトリーにより検出された、１００ｎＭ野生型対立遺伝子２  ＳＩＲＰα−Ｆｃ、高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ、または抗ＣＤ４７抗体（クローンＢ６Ｈ１２および５Ｆ９）の、イヌＭＤＣＫ細胞に対する結合。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
以下の説明において、細胞培養の分野において従来使用されるいくつかの用語が使用される。明細書および特許請求の範囲、ならびにそのような用語に与えられる範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００１３】
ＳＩＲＰαとそのリガンドＣＤ４７との間の相互作用の「阻害剤」、「遮断剤」および「マスキング剤」という用語は、ＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の結合を防止する分子を指す。開発目的のために、結合は、実験条件下で、例えば結合パートナーとしての単離タンパク質を使用して、結合パートナーとしてのタンパク質の一部を使用して、結合パートナーとしてのタンパク質またはタンパク質の一部の酵母ディスプレイを使用して等行われてもよい。
【００１４】
生理学的に関連した目的のために、ＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の結合は、通常２つの細胞の間の事象であり、各細胞は、結合パートナーの１つを発現する。特に興味深いのは、マクロファージ等の食細胞上のＳＩＲＰαの発現；食作用の標的となり得る細胞、例えば腫瘍細胞、循環造血細胞等におけるＣＤ４７の発現等である。阻害剤は、受容体またはリガンド結合またはシグナリングに関するインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定され得る。
【００１５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すように同義的に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００１６】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物を指す。
【００１７】
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書において、処置に関して評価されている、および／または処置されている哺乳動物を指すように同義的に使用される。一実施形態において、哺乳動物は人間である。「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、癌を有する個体を制限なく包含する。対象は、人間であってもよいが、他の哺乳動物、特に人間の疾患の実験モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラット等も含む。
【００１８】
「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、本明細書において、細胞増殖に対する制御の顕著な喪失を特徴とする異常増殖表現型を示すように自立的な無秩序増殖を示す細胞を指すように同義的に使用される。本出願における検出、分析、または処置の対象となる細胞は、前癌（例えば良性）、悪性、前転移、転移、および非転移細胞を含む。事実上全ての組織の癌が知られている。「癌の負荷」という用語は、対象における癌細胞の量または癌体積を指す。したがって、癌の負荷の低減は、対象における癌細胞の数または癌体積の低減を指す。「癌細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、癌細胞である、または癌細胞のクローン等の癌細胞から得られる任意の細胞を指す。癌腫、肉腫、膠芽細胞腫、黒色腫等、リンパ腫、骨髄腫等の固形腫瘍、および白血病等の循環癌を含む、多くの種類の癌が当業者に知られている。癌の例は、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、および脳腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
癌の「病変」は、患者の健康を悪化させる全ての現象を含む。これは、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症または免疫反応の抑制または悪化、新生組織形成、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周囲または離れた組織または臓器、例えばリンパ節への浸潤等を制限なく含む。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「癌の再発」および「腫瘍の再発」という用語、ならびにそれらの文法的な変化形は、癌の診断後の新生物または癌細胞のさらなる増殖を指す。具体的には、再発は、さらなる癌細胞増殖が癌組織内で生じた場合に生じ得る。同様に、「腫瘍の拡大」は、腫瘍の細胞が局所的または離れた組織および臓器に広がった場合に生じ、したがって、腫瘍の拡大は、腫瘍転移を包含する。「腫瘍浸潤」は、腫瘍増殖が局所的に拡大し、正常な臓器機能の圧迫、破綻、または阻止により関連組織の機能を悪化させた場合に生じる。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「転移」という用語は、元の癌腫瘍の臓器と直接繋がっていない臓器または身体部分における癌腫瘍の増殖を指す。転移は、元の癌腫瘍の臓器と直接繋がっていない臓器または身体部分における検出不可能な量の癌細胞の存在である微小転移を含むように理解される。転移はまた、元の腫瘍部位からの癌細胞の出発、ならびに身体の他の部位への癌細胞の移動および／または浸潤等の、プロセスのいくつかのステップとして定義され得る。
【００２２】
患者に関する「試料」という用語は、血液および生物由来の他の液体試料、生検標本等の固形組織試料、または組織培養物もしくはそれから得られた細胞およびその後代を包含する。この定義はまた、その入手後に任意の手法で、例えば試薬による処理、洗浄、または癌細胞等のある特定の細胞集団の濃縮等により操作された試料を含む。この定義はまた、特定種類の分子、例えば核酸、ポリペプチド等が濃縮された試料を含む。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、また、外科的切除により得られた組織、生検により得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清等も含む。「生体試料」は、患者の癌細胞から得られた試料、例えば、患者の癌細胞から得られたポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む細胞溶解物または他の細胞抽出物）、ならびに患者からの癌細胞を含む試料を含む。患者からの癌細胞を含む生体試料はまた、非癌細胞を含んでもよい。
【００２３】
「診断」という用語は、本明細書において、分子または病状、疾患もしくは状態の特定、例えば、乳癌、前立腺癌、または他の種類の癌の分子サブタイプの特定を指すように使用される。
【００２４】
「予後」という用語は、本明細書において、卵巣癌等の腫瘍性疾患の再発、転移拡大、および薬物耐性を含む、癌を原因とし得る死亡または進行の可能性の予測を指すように使用される。「予測」という用語は、本明細書において、観察、経験、または科学的根拠に基づいて予想または推定する行為を指すように使用される。一例において、医者は、原発腫瘍の外科的除去および／またはある特定期間の化学療法の後に、患者が癌の再発なしに生存する可能性を予測することができる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「処置」、「処置する」等の用語は、ある効果を得る目的で薬剤を投与する、または手順を実行することを指す。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくはその疾患の症状の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。「処置」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、特に人間における腫瘍の処置を含み得、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象における、疾患または疾患の症状の発生を予防すること（例えば、原発疾患に関連し得る、またはそれにより引き起こされ得る疾患を含む）、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、および（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００２６】
処置することは、軽減、沈静、症状の消失もしくは疾患状態を患者により耐性とすること、悪化もしくは低下の速度を遅速化すること、または悪化の最終点をより非衰弱性とすること等の、任意の客観的または主観的パラメータを含む、癌の処置または改善または予防の成功の任意の指標を指し得る。症状の処置または改善は、医者による実験の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。したがって、「処置する」という用語は、癌または他の疾患に関連した症状または状態の発症を予防もしくは遅延する、軽減する、または阻止もしくは阻害するための、本発明の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、または予防を指す。
【００２７】
「〜と組み合わせた」、「併用療法」および「複合製品」は、ある特定の実施形態において、患者への第一の治療薬および本明細書に記載の化合物の同時投与を指す。組み合わせて投与される場合、各成分は、同時に投与されてもよく、または、異なる時点で逐次的に任意の順番で投与されてもよい。したがって、各成分は、所望の治療効果を提供するように、別個ではあるが時間的に十分近接して投与され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、処置は、本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬と細胞毒性薬との組み合わせを投与することにより達成される。細胞毒性薬の１つの例示的クラスは、化学療法薬である。例示的な化学療法薬は、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミゾール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ピロカルピン、プロクロルペラジン、リツキシマブ、サプロイン、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビノレルビンを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
他の実施形態において、本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬の投与は、患者のヘマトクリットを増加させる効果的用量の薬剤、例えばエリスロポエチン刺激剤（ＥＳＡ）と組み合わされる。そのような薬剤は、当該技術分野において知られており、例えば、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）ＮＦ／Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）ＮＦ（エポエチンアルファ）、Ｏｍｏｎｔｙｓ（登録商標）（ペギネサチド）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）等を含む。
【００３０】
他の併用療法は、細胞特異的抗体、例えば腫瘍細胞マーカーに選択的な抗体、放射線、手術、および／またはホルモン枯渇化との投与を含む（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１５０７４−９，１９９９）。血管形成阻害薬もまた、本発明の方法と組み合わせることができる。
【００３１】
いくつかの抗体が、現在癌の処置のために臨床的に使用されており、またいくつかは、様々な臨床開発段階にある。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のためのいくつかの抗原および対応するモノクローナル抗体が存在する。１つの標的抗原は、ＣＤ２０である。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原に対するキメラ非複合モノクローナル抗体である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞活性化、増殖、および分化において重要な機能的役割を有する。ＣＤ５２抗原は、慢性リンパ性白血病の処置に適応されるモノクローナル抗体アレムツズマブにより標的化される。ＣＤ２２は、いくつかの抗体により標的化され、最近、化学療法耐性有毛細胞白血病における毒素と組み合わせて有効性を示した。ＣＤ２０を標的化する２つの新たなモノクローナル抗体、トシツモマブおよびイブリツモマブが、食品医薬品局（ＦＤＡ）に登録されている。これらの抗体は、放射性同位体と複合化している。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）は、慢性リンパ性白血病の処置に使用され、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）は、急性骨髄性白血病の処置における使用が見出されており、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）は、非ホジキンリンパ腫の処置における使用が見出されており、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）は、結腸癌の処置における使用が見出されている。
【００３２】
固形腫瘍において使用されている本発明の方法において有用なモノクローナル抗体は、エドレコロマブおよびトラスツズマブ（ハーセプチン）を制限なく含む。エドレコロマブは、結腸および直腸癌において見られる１７−１Ａ抗原を標的化し、欧州ではそれらの適応症に対する使用が認可されている。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的化する。この抗原は、乳癌の２５％から３５％に見られる。セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）もまた、本発明の方法における使用の対象となる。抗体は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、結腸癌ならびに頭部および頚部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を含む固形腫瘍の処置において使用されている。
【００３３】
癌治療に加えて、本発明のＳＩＲＰα試薬は、モノクローナル抗体が細胞の枯渇を目的として投与される他の治療において、例えば枯渇免疫細胞による炎症性疾患の処置において有用である。そのような目的のために、本発明のＳＩＲＰα試薬は、治療抗体、例えば、炎症性疾患および自己免疫状態におけるＢ細胞の枯渇のためのリツキシマブ、多発性硬化症のためのアレムツズマブ、免疫抑制のためのＯＫＴ３、骨髄移植の調整のためのその他の抗体等と組み合わせて投与される。
【００３４】
癌治療薬剤、ＥＳＡまたは腫瘍に対する抗体の、本発明の薬学的組成物との「併用投与」は、薬物、ＥＳＡまたは抗体と本発明の組成物の両方が治療効果を有するような時点での、高親和性ＳＩＲＰα試薬との投与を意味する。そのような併用投与は、本発明の化合物の投与と比較して、薬物、ＥＳＡまたは抗体の同時（すなわち同じ時点）、前、または後の投与を含み得る。当業者は、本発明の特定の薬物および組成物の投与の適切なタイミング、順序および用量を容易に決定する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「無病生存率」という語句は、そのような腫瘍再発および／または拡大の欠如、および患者の寿命に対する癌の影響に関する診断後の患者の運命を指す。「全生存率」という語句は、患者の死因が癌の影響に直接起因しない可能性にもかかわらず、診断後の患者の運命を指す。「無病生存率の可能性」、「再発のリスク」という語句およびそれらの変化形は、癌の診断後の患者における腫瘍再発または拡大の確率を指し、この確率は、本発明の方法に従い決定される。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「相関する」または「〜と相関する」という用語、および同様の用語は、２つの事象の発生の間の統計的関連を指し、事象は、数、データセット等を含む。例えば、事象が数を含む場合、正の相関（本明細書において「直接的相関」とも呼ばれる）は、一方が増加すると、他方も同様に増加することを意味する。負の相関（本明細書において「逆相関」とも呼ばれる）は、一方が増加すると、他方は減少することを意味する。
【００３７】
「用量単位」は、処置されるべき特定の個体に対する単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果（複数を含む）を生成するように計算される所定量の活性化合物（複数を含む）を含有し得る。単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物（複数を含む）の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果（複数を含む）、ならびに（ｂ）そのような活性化合物（複数を含む）を調合する技術分野の本質的な限界によって決定付けられ得る。
【００３８】
「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に安全で、非毒性で望ましい薬学的組成物を調製する上で有用である賦形剤を意味し、獣医学的用途および人間の薬学的用途に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物の場合、気体であってもよい。
【００３９】
「薬学的に許容される塩およびエステル」は、薬学的に許容され、所望の薬学的特性を有する塩およびエステルを意味する。そのような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩を含む。好適な無機塩は、アルカリ金属、例えばナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムで形成されるものを含む。好適な有機塩は、アミン塩基のような有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミン等で形成されるものを含む。そのような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）ならびに有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカンおよびアレーンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸）で形成される酸付加塩を含む。薬学的に許容されるエステルは、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ、およびホスホンオキシ基から形成されるエステル、例えばＣ１−６アルキルエステルを含む。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩もしくはエステル、またはジ−塩もしくはエステルであってもよく、同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合、そのような基のいくつかまたは全てが塩化またはエステル化されてもよい。本明細書において命名される化合物は、非塩化もしくは非エステル化形態、または塩化および／もしくはエステル化形態で存在してもよく、そのような化合物の命名は、元の（非塩化および非エステル化）化合物とその薬学的に許容される塩およびエステルの両方を含むように意図される。また、本発明において命名されるある特定の化合物は、２つ以上の立体異性体形態で存在してもよく、そのような化合物の命名は、全ての単一立体異性体およびそのような立体異性体の全ての混合物（ラセミ体またはその他に関わらず）を含むように意図される。
【００４０】
「薬学的に許容される」、「生理学的に耐性である」という用語およびそれらの文法的な変化形は、組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合、同義的に使用され、材料が、組成物の投与が許容されない程度までの望ましくない生理学的効果を生成せずに、人間に、または人間に対して投与され得ることを表す。
【００４１】
「治療上効果的な量」は、疾患の処置のために対象に投与された場合、その疾患の処置を達成するのに十分な量を意味する。
【００４２】
実施形態の詳細な説明
一般に高親和性ＳＩＲＰα試薬と呼ぶことができる高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドおよびその類似体が提供される。試薬は、天然ヒトＳＩＲＰαタンパク質の変異体である。一実施形態において、本発明は、可溶性ＳＩＲＰα変異体ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを欠き、野生型ＳＩＲＰα配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、アミノ酸変化は、例えばオフ速度を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、またはそれ以上低下させることにより、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαポリペプチドの親和性を増加させる。
【００４３】
本発明によれば、アミノ酸変化は、当該技術分野において知られている、または後に発見される、任意の天然に存在する、または人工のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、追加、挿入等を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、既存のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを含む。関連した実施形態において、アミノ酸変化は、１つ以上の既存のアミノ酸を、天然に存在しないアミノ酸で置き換えること、または１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を挿入することを含む。アミノ酸変化は、天然配列に比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上のアミノ酸残基においてなされてもよい。１つ以上のアミノ酸変化は、ＳＩＲＰαの特性を改変する、例えば、安定性、結合活性および／または特異性等に影響する。
【００４４】
本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ＳＩＲＰαのｄ１ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、このドメインは、配列番号１に記載され、天然ヒト全長ヒトタンパク質の残基３１から１４９に対応する。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ｄ１ドメインの全てまたは一部からなってもよく、またｄ１ドメインの外のＳＩＲＰαからの１つ以上のアミノ酸をさらに含んでもよく、または、免疫グロブリンＦｃ領域配列を制限なく含むＳＩＲＰα以外のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４５】
高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、少なくとも約１００アミノ酸の長さ、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００アミノ酸の長さから、膜貫通ドメインにおける野生型タンパク質の全長まで、すなわち約３４３アミノ酸の長さまでであってもよく、任意に異種ポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃに融合していてもよい。
【００４６】
別の実施形態において、ｄ１ドメイン内の、本明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸変化を含むより短いペプチドの使用が見出され、そのようなペプチドは、通常は、１０アミノ酸以下の長さ、１５アミノ酸以下の長さ、２０以下、２５以下、３０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、４５アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、５５アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、６５アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、７５アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、８５アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、９５アミノ酸以下、１００アミノ酸以下の本明細書に記載の配列からのアミノ酸の連続的広がりを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドにおけるアミノ酸変化は、残基（番号付けは、配列番号１として記載のｄ１ドメインの野生型配列により定義される）Ｌ４、Ｖ６、Ｖ２７、Ｉ３６、Ｆ３９、Ｌ４８、Ｉ４９、Ｙ５０、Ｆ５７、Ｖ６０、Ｍ７２、Ｆ７４、Ｉ７６、Ｖ９２、Ｆ９４およびＦ１０３を制限なく含む、ＳＩＲＰαの疎水性コア残基のセット内のアミノ酸の１つ以上でなされる。代替の実施形態において、アミノ酸変化は、例えばＣＶ１に対して示されるように、野生型対立遺伝子２配列においてなされる。
【００４８】
他の実施形態において、アミノ酸変化は、Ａ２９、Ｌ３０、Ｉ３１、Ｐ３２、Ｖ３３、Ｇ３４、Ｐ３５、Ｑ５２、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｓ６６、Ｔ６７、Ｋ６８、Ｒ６９、Ｆ７４、Ｋ９３、Ｋ９６、Ｇ９７、Ｓ９８、およびＤ１００（配列番号１）を制限なく含む、ＣＤ４７と相互作用する接触残基のセット内のアミノ酸の１つ以上でなされる。
【００４９】
他の実施形態において、アミノ酸変化は、上で定義された組み合わされた接触残基のセットおよび疎水性コア残基のセット内の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、および１４個以下のアミノ酸でなされる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、残基Ｌ４、Ｖ６、Ａ２１、Ｖ２７、Ｉ３１、Ｅ４７、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｓ６６、Ｖ６３、Ｋ６８、Ｖ９２、Ｆ９４、およびＦ１０３、またはそれらの組み合わせを制限なく含むセット内のアミノ酸の１つ以上で、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、および１５個以下の残基でなされる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、（１）Ｌ４Ｖ；Ｌ４Ｉ；（２）Ｖ６Ｉ；Ｖ６Ｌ；（３）Ａ２１Ｖ；（４）Ｖ２７Ｉ；Ｖ２７Ｌ；（５）Ｉ３１Ｔ；Ｉ３１Ｓ；Ｉ３１Ｆ；（６）Ｅ４７Ｖ；Ｅ４７Ｌ；（７）Ｋ５３Ｒ；（８）Ｅ５４Ｑ；（９）Ｈ５６Ｐ；Ｈ５６Ｒ；（１０）Ｓ６６Ｔ；Ｓ６６Ｇ；（１１）Ｋ６８Ｒ；（１２）Ｖ９２Ｉ；（１３）Ｆ９４Ｌ；Ｆ９４Ｖ；（１４）Ｖ６３Ｉ；および（１５）Ｆ１０３Ｖから選択される少なくとも１つのアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、残基の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個全てにおける、上記（１）から（１５）までから選択される修飾、ならびにそれらの組み合わせおよび保存的均等物を含む。
【００５２】
アミノ酸変化のセットは、上記の組み合わせ、例えば以下を含み得る。
・  Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；およびＦ１０３Ｖ、
・  Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・  Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１ＳまたはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・  Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・  Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｆ９４ＬまたはＦ９４Ｖ；およびＦ１０３Ｖ、
・  Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・  Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ、またはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６Ｔ、またはＳ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・  Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；およびＳ６６Ｔ、
・  Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｖ６３Ｉ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；およびＶ９２Ｉ、
・  Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・  Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；およびＶ９２Ｉ。
【００５３】
いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、以下のアミノ酸変化のセットを含む。
・  例えば（配列番号３）に示されるような｛Ｖ２７Ｉ；Ｋ５３Ｒ；Ｓ６６Ｔ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｆ１０３Ｖ｝；
・  例えば（配列番号４）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ２７Ｌ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ｝；
・  例えば（配列番号５）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；Ｆ９４Ｌ｝；
・  例えば（配列番号６）に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｓ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ９４Ｌ｝；
・  例えば（配列番号７）に示されるような｛Ｌ４Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｒ；Ｓ６６Ｇ；Ｆ９４Ｖ；Ｆ１０３Ｖ｝；
・  例えば（配列番号８）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｒ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ９４Ｌ｝；または
・  例えば（配列番号９）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｌ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ１０３Ｖ｝
・  例えば配列番号３７に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ｝、
・  例えば配列番号３８に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｖ６３Ｉ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ｝、
・  例えば配列番号３９に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ１０３Ｖ｝、
・  例えば配列番号１０に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；Ｖ９２Ｉ｝。
【００５４】
本発明の目的のために、本発明の試薬は、通常はシグナル配列と膜貫通ドメイン、または結合活性を保時するその断片との間に存在する、認識可能な親和性、例えば高い親和性でＣＤ４７に結合するのに十分なＳＩＲＰαの一部を含む。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、通常、上述のような修飾アミノ酸残基を有するＳＩＲＰαの少なくともｄ１ドメイン（配列番号１）を含む。高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、野生型ＳＩＲＰαｄ１ポリペプチド（配列番号１）またはその対立遺伝子変異体、すなわち野生型対立遺伝子２の少なくともアミノ酸１〜３、７〜２０、３２〜４６、６９〜９１、９５〜１０２を含んでもよい。高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、さらに、天然タンパク質の残基１５０から３７４（配列番号２として記載）を制限なく含む、または、配列番号２に記載の配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも２０個の連続アミノ酸、少なくとも５０個の連続アミノ酸、少なくとも１００個の連続アミノ酸、少なくとも１２５個の連続アミノ酸、少なくとも２５０個の連続アミノ酸、もしくはそれ以上を制限なく含む、ｄ１ドメイン以外の天然ヒトＳＩＲＰαタンパク質の一部を含んでもよい。
【００５５】
本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬は、さらに修飾されてもよく、例えば、様々な目的のために、広範な他のオリゴペプチドまたはタンパク質に連結されてもよい。例として、例えばプレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、グリコシル化、ペグ化等により翻訳後に修飾されてもよい。そのような修飾はまた、グリコシル化の変更、例えば、その合成および処理中に、またはさらなる処理ステップにおいて、ポリペプチドのグリコシル化パターンを変更することにより、例えば、ポリペプチドを、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素等のグリコシル化に影響する酵素に暴露することにより作製されたものを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＳＩＲＰα変異体は、リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有するＳＩＲＰα変異体を含む。
【００５６】
一実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ＣＤ４７に対して少なくとも約１×１０−８Ｍの動力学的ＫＤを有する。別の実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ＣＤ４７に対して少なくとも約１×１０−９Ｍの動力学的ＫＤを有する。さらに別の実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ＣＤ４７に対して少なくとも約１×１０−１０Ｍの動力学的ＫＤを有する。本明細書に記載の様々な実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、配列番号１および２に例示されるように、天然ヒトＳＩＲＰαポリペプチドの動力学的ＫＤよりも少なくとも約５倍大きい、ＣＤ４７に対する動力学的ＫＤを示す。いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、天然ＳＩＲＰαポリペプチドの動力学的ＫＤよりも少なくとも約１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍大きい、ＣＤ４７に対する動力学的ＫＤを有する。
【００５７】
ＣＤ４７への結合は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面上に提示された；溶液中等のＣＤ４７に結合するＳＩＲＰα試薬の能力により決定され得る。本発明のＳＩＲＰα変異体のＣＤ４７に対する結合活性は、リガンド、例えばＣＤ４７、またはＳＩＲＰα変異体を、ビーズ、基板、細胞等に固定することにより分析され得る。適切な緩衝液に試薬を添加することができ、結合パートナーを所与の温度である期間インキュベートすることができる。洗浄して未結合物質を除去した後、結合したタンパク質を、例えばＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液等で放出させ、分析することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明のＳＩＲＰα変異体は、例えば、第２のポリペプチドとフレームで融合された融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、例えば、融合タンパク質が循環から急速に排除されないように、融合タンパク質のサイズを増加させることができる。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域の一部または全てである。他の実施形態において、第２のポリペプチドは、例えば、増加したサイズ、多量体化ドメイン、および／またはＩｇ分子との追加的な結合もしくは相互作用を提供する、実質的にＦｃに類似した任意の好適なポリペプチドである。これらの融合タンパク質は、精製、多量体化を促進し、インビボで増加した半減期を示すことができる。また、ジスルフィド結合多量体構造を有する融合タンパク質が、単量体ＳＩＲＰα以外の分子に結合およびそれを中性化する上で、より効率的となり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα結合ドメイン、すなわちＣＤ４７に対する高い親和性を提供するために本明細書に記載のように修飾されたＳＩＲＰαｄ１ドメインは、多量体タンパク質として提供され、すなわち、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＳＩＲＰα結合ドメインは、例えば融合タンパク質として；ジスルフィド結合により；アビジン、ストレプトアビジン等に結合するビオチンを介して、共有結合的または非共有結合的に連結している。そのような多量体高親和性ＳＩＲＰα結合タンパク質は、ＣＤ４７を発現する細胞の食作用を増加させるための単一薬剤として、または他の結合物質、例えば細胞特異的モノクローナル抗体の組み合わせとして有用である。
【００６０】
いくつかのそのような実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα結合ドメインは、免疫グロブリン配列に融合または別様に連結して、キメラタンパク質を形成する。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメイン（複数を含む）であるが、必然的ではない。そのようなキメラにおける免疫グロブリン部分は、任意の種、通常は人間から得ることができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭを含む。免疫グロブリン部分は、１つ以上のドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３等を含んでもよい。
【００６１】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結した配列から構築されたキメラが、当該技術分野において知られている。そのような融合において、コードされたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保時し得る。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、または、重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域のすぐＮ末端側に形成される。融合が形成される正確な部位は重要ではなく、特定の部位が周知であり、ＳＩＲＰαポリペプチド−免疫グロブリンキメラの生物活性、分泌または結合特性を最適化するために選択され得る。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰαポリペプチド−免疫グロブリンキメラは、単量体、またはヘテロもしくはホモ多量体として、特に二量体または四量体として組み立てられる。
【００６２】
免疫グロブリン軽鎖の存在は必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖が含まれてもよく、ＳＩＲＰαポリペプチド−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に会合しているか、またはＳＩＲＰαポリペプチドに直接融合している。重鎖および軽鎖定常領域の両方を提供するために、単鎖コンストラクトが使用されてもよい。
【００６３】
他の融合タンパク質コンストラクトにおいて、第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易化するペプチド等のマーカー配列である。例えば、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、中でも例えばｐＱＥベクター内に提供されたタグ等（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１）であってもよく、その多くは市販されている。例えばＧｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４，１９８９に記載のように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに相当する。Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７，１９８４。ポリペプチドの取り扱いを容易化するためのペプチド部分の追加は、当該技術分野においてよく知られており、日常的な技術である。
【００６４】
別の実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα結合ドメインは、単量体タンパク質として提供され、これは、単離されたｄ１ドメイン、またはＳＩＲＰαもしくはキメラ配列に融合したｄ１ドメインであってもよい。単量体ＳＩＲＰα結合ドメインは、例えば、細胞特異的結合物質、例えば抗体、特に本明細書に記載の腫瘍細胞特異的抗体と組み合わされた場合、ＣＤ４７を発現する細胞の食作用を増加させるためのアジュバントとして有用である。単量体ＳＩＲＰα結合ドメインはまた、ＳＩＲＰαを発現し、本発明のＳＩＲＰα試薬による遮断に反応する、マクロファージ、樹枝状細胞、好中球、顆粒球等のいくつかの免疫細胞による食作用および他の免疫機能、例えばＡＤＣＣ、抗原提示のための抗原の取り込み等を増加させるためのアジュバントとして有用である。単量体高親和性ＳＩＲＰα結合ドメインはまた、例えば検出可能な標識に複合化した場合、造影剤として有用である。
【００６５】
いくつかの他の実施形態において、本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬は、タンパク質分解に対するその耐性を改善するために、または溶解特性を最適化するために、またはそれらを治療薬剤としてより好適とするためにさらに修飾された試薬を含む。例えば、本発明の変異体は、さらに、天然に存在するＬアミノ酸以外、例えばＤアミノ酸、または天然に存在しない合成アミノ酸の残基を含有する類似体を含む。Ｄアミノ酸は、アミノ酸残基の一部または全てにおいて置換されていてもよい。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態において、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、１つ以上の画像化部分、すなわち検出可能な標識に結合または複合化される。本明細書において使用される場合、「細胞毒性部分」は、細胞に近接した、または細胞により吸収された場合に、細胞増殖を阻害する、または細胞死を促進する部分を指す。これに関して好適な細胞毒性部分は、放射性同位体（放射性核種）、化学毒性薬剤、例えば分化誘導剤および微小化学毒性薬、毒素タンパク、およびそれらの誘導体を含む。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「画像化部分」または検出可能な標識は、可視化技術、例えばＸ線造影法、ポジトロン放出型断層撮影法、磁気共鳴画像化法、直接的または間接的な目視検査等において腫瘍と周囲の健康組織との間のコントラストを増加させるために使用され得る部分を指す。したがって、好適な画像化部分は、Ｘ線造影部分、例えば重金属および放射線放出部分、ポジトロン放出部分、磁気共鳴コントラスト部分、ならびに光学的に視認可能な部分（例えば、蛍光または可視スペクトル染料、視認可能な粒子等）を含む。治療部分であるものと、画像化部分であるものとの間には、ある程度の重複が存在することが、当業者に認識される。
【００６８】
一般に、治療または画像化薬剤は、薬物動態学的安定性、および患者に対する全体的毒性の低減の必要性を適切に考慮して、任意の好適な技術により高親和性ＳＩＲＰα試薬部分に複合化され得る。薬剤とＳＩＲＰαとの間の直接的反応は、それぞれが互いに反応し得る官能基を有する場合可能である。例えば、アミノまたはスルフヒドリル基等の求核基は、無水物もしくは酸ハライド等のカルボニル含有基と、または、良好な脱離基（例えばハライド）を含有するアルキル基と反応可能となり得る。代替として、好適な化学的リンカー基が使用されてもよい。リンカー基は、結合能力への干渉を回避するためのスペーサとして機能し得る。
【００６９】
ホモおよびヘテロ官能性の両方の（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩのカタログに記載のもの等）様々な二官能性または多官能性試薬が、リンカー基として使用可能であることが、当業者に明らかである。例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を介して、結合が達成されてもよい。そのような方法を説明した多くの参考文献がある。代替として、ＳＩＲＰαは、非共有結合対、例えばストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンの使用により、細胞毒性または画像化部分に連結される。これらの実施形態において、対の一方の要素は、ＳＩＲＰαに共有結合し、結合対の他方の要素は、細胞毒性または画像化部分に共有結合している。２つ以上の細胞毒性および／または画像化部分に結合することが望ましくなり得る。高親和性ＳＩＲＰα試薬を多重誘導体化することにより、いくつかの戦略を同時に実行することができ、抗体をいくつかの可視化技術の造影剤として有用とすることができ、または、治療抗体を可視化技術による追跡のために標識化することができる。
【００７０】
担体は、直接的またはリンカー基を介した共有結合、および非共有結合的会合を含む様々な様式で薬剤を保時することができる。好適な共有結合担体は、アルブミン等のタンパク質、ペプチド、およびアミノデキストラン等の多糖類を含み、そのそれぞれは、部分の結合のための複数の部位を有する。また、担体は、非共有結合的会合、例えば非共有結合またはカプセル化により薬剤を保持し得る。
【００７１】
放射性各種薬剤に特異的な担体およびリンカーは、放射性ハロゲン化小分子およびキレート化合物を含む。放射性核種キレートは、金属または金属酸化物放射線各種の結合のためのドナー原子として窒素および硫黄原子を含有するものを含む、キレート化合物から形成され得る。
【００７２】
本発明における画像化部分としての使用のためのＸ線造影部分は、比較的大きな原子、例えば金、イリジウム、テクネチウム、バリウム、タリウム、ヨウ素、およびそれらの同位体等との化合物およびキレートを含む。より毒性の低いＸ線造影部分、例えばヨウ素またはヨウ素同位体が、本発明の組成物および方法において使用されることが好ましい。そのような部分は、許容され得る化学リンカーまたはキレート担体を介して、高親和性ＳＩＲＰα試薬抗体部分に複合化され得る。本明細書における使用のためのポジトロン放出部分は、１８Ｆを含み、これは、高親和性ＳＩＲＰα試薬とのフッ素化反応により容易に複合化され得る。
【００７３】
磁気共鳴コントラスト部分は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）イオンのキレートを含む。その非常に強い磁気モーメントにより、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、および鉄（ＩＩＩ）イオンが特に好ましい。
【００７４】
画像化部分としての使用のための光学的に視認可能な部分は、蛍光染料または可視スペクトル染料、視認可能な粒子、および他の視認可能な標識部分を含む。フルオレセイン、クマリン、ローダミン、ボディピーテキサスレッド、およびシアニン染料等の蛍光染料は、十分な励起エネルギーが視覚的に検査されるべき部位に提供され得る場合有用である。内視鏡可視化手順が、そのような標識の使用により適合し得る。許容され得る染料は、ＦＤＡに認可された非毒性の食用染料および色素を含むが、内服投与に認可されている薬学的に許容される染料が好ましい。
【００７５】
特定の患者に与えられるべき画像化複合体組成物の効果的な量は、様々な因子に依存し、そのいくつかは患者毎に異なる。有能な臨床医学者は、腫瘍の可視化を促進するのに効果的な量を決定することができる。用量は、腫瘍の処置、投与経路、治療薬の性質、治療薬に対する腫瘍の感受性等に依存する。通常の技術を使用して、有能な臨床医学者は、日常的な臨床試験の間に、特定の治療薬または画像化組成物の用量を最適化することができる。
【００７６】
典型的な用量は、対象の体重１キログラム当たり、０．００１から１００ミリグラムであってもよい。患者の体重１キログラム当たり０．１から１０ｍｇまでの範囲の比較的多量の用量が、比較的非毒性の画像化部分を用いて複合体を画像化するために使用され得る。使用される量は、画像化方法の感度、および画像化部分の相対的毒性に依存する。
【００７７】
本発明のＳＩＲＰα変異体は、当該技術分野において知られている、または後に発見される任意の好適な手段により生成され得、例えば、真核細胞または原核細胞から生成され得る、インビトロで生成され得る、等である。タンパク質が原核細胞により生成される場合、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元等によりさらに処理されてもよく、またさらに当該技術分野において知られている方法を使用してリフォールディングされてもよい。
【００７８】
ポリペプチドは、当該技術分野において知られている従来の方法を使用して、細胞不含翻訳系により、または人工的なインビトロ合成により調製され得る。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動化合成装置が利用可能である。合成装置を使用することにより、天然に存在するアミノ酸を、非天然アミノ酸と置換することができる。具体的な配列および調製様式は、利便性、経済性、必要な純度等により決定される。
【００７９】
ポリペプチドはまた、組み換え合成の従来の方法に従い単離および精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製されてもよく、溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技術を使用して精製され得る。大部分において、使用される組成物は、生成物の調製およびその精製の方法に関連した不純物に対して、少なくとも２０重量％、より通常は少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、治療目的においては、通常は少なくとも約９９．５重量％の所望の生成物を含む。通常、パーセンテージは、全タンパク質に依存する。
【００８０】
当業者に周知である方法を使用して、コード配列、ならびに適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えを含む。代替として、対象となるポリペプチドをコードすることができるＲＮＡは、商業的に合成され得る。当業者は、本発明のポリペプチドのいずれかのための好適なコード配列を提供するために、周知のコドン使用表および合成方法を容易に利用することができる。核酸は、実質的な純度で単離および獲得され得る。通常、ＤＮＡまたはＲＮＡとしての核酸は、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まないで、一般に少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％の純度で得られ、典型的には「組み換え」であり、例えば通常は天然に存在する染色体上に関連していない１つ以上のヌクレオチドが隣接している。本発明の核酸は、直鎖状分子として、または環状分子内に提供され得、また、自己複製分子（ベクター）内、または複製配列を有さない分子内に提供され得る。核酸の発現は、それら自身により、または当該技術分野において知られている他の調節配列により調節され得る。本発明の核酸は、当該技術分野において利用可能な様々な技術を使用して、好適な宿主細胞内に導入され得る。
【００８１】
本発明によれば、ＳＩＲＰα変異体は、治療用途、例えば人間の治療に好適な薬学的組成物中に提供され得る。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、本発明の１種以上の治療物質またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくは溶媒和物を含む。いくつかの他の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、別の治療薬剤、例えば別の抗腫瘍薬剤と組み合わせて、本発明の１種以上の治療物質を含む。
【００８２】
本発明の治療物質は、しばしば、活性治療薬剤および他の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物として投与される。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存する。組成物はまた、所望の製剤に依存して、動物または人間に対する投与用の薬学的組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含んでもよい。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、薬学的組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤等を含んでもよい。
【００８３】
さらなる他のいくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物はまた、粗大な徐々に代謝される巨大分子、例えばタンパク質；多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロース等）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）を含んでもよい。
【００８４】
使用方法
ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を阻害し、それにより腫瘍細胞のインビボ食作用を増加させることにより、原発性または転移性癌としてのリンパ腫、白血病、癌腫、黒色腫、膠芽細胞腫、肉腫、骨髄腫等を制限なく含む癌を処置、低減または予防するための方法が提供される。そのような方法は、処置を必要とする対象に、試薬と化学療法薬、腫瘍特異的抗体、またはＥＳＡとの組み合わせを制限なく含む、治療上効果的な量または効果的な用量の本発明の高親和性ＳＩＲＰα試薬を投与することを含む。
【００８５】
例えば癌の処置のための本発明の治療物質の効果的用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者が人間であるかまたは動物であるか、投与される他の医薬品、および治療が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者は人間であるが、人間以外の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ等のペット用動物、ウサギ、マウス、ラット等の実験動物等もまた処置され得る。標的用量は、安全性および有効性を最適化するために滴定され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、治療用量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、より通常では０．０１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ（ホストの体重）の範囲であってもよい。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ（体重）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的処置計画は、２週間に１回、または１月に１回、または３ヶ月から６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数の機会で投与される。単回投薬の間の間隔は、１週間、１ヶ月または１年であってもよい。間隔はまた、患者における治療物質の血中レベルを測定することにより示されるように、不定期的であってもよい。代替として、本発明の治療物質は、徐放製剤として投与されてもよく、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に依存して変動する。
【００８７】
予防用途においては、長期間にわたり比較的低頻度の間隔で、比較的低い用量が投与され得る。一部の患者は、その生涯にわたり処置を受け続ける。他の治療用途においては、疾患の進行が低減または停止されるまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、時折、比較的短期間で比較的高い用量が必要である。その後、患者に予防計画が実施され得る。
【００８８】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、リンパ腫、白血病、癌腫、黒色腫、膠芽細胞腫、肉腫、骨髄腫等を含む癌の腫瘍増殖、腫瘍転移または腫瘍浸潤Ｉを処置、低減または防止することを含む。予防用途においては、薬学的組成物または医薬品は、疾患に罹患しやすい、または別様にそのリスクがある患者に、疾患の生化学的、組織学的、および／または行動的症状、その合併症ならびに疾患の発達の間現れる中間的病理学的表現型を含む、疾患のリスクを排除もしくは低減する、重症度を低下させる、またはその発症を遅延させるのに十分な量で投与される。
【００８９】
本発明の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、ＣＤ４７を発現する細胞、特にＣＤ４７を発現する癌細胞の数の増加または低下を測定することにより疾患治療の経過を監視するために、インビトロおよびインビボで使用され得、疾患の改善を目標とした特定の治療計画が効果的であるかどうかが決定され得る。そのような目的において、ＳＩＲＰαポリペプチドは、検出可能に標識化され得る。
【００９０】
本発明の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、結合アッセイにおいてインビトロで使用されてもよく、それらは、液相で使用され得、または固相担体に結合され得る。さらに、これらの免疫測定法におけるポリペプチドは、様々な手法で検出可能に標識化され得る。本発明の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドを使用し得るアッセイの種類の例は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、組織化学、直接または間接的形式の競合的または非競合的免疫測定法等である。高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドを使用したＣＤ４７の検出は、生理学的試料に対する組織化学的アッセイを含む、順方向、逆方向、または同時モードで行われるアッセイで行われ得る。当業者は、他のアッセイ形式を知っているか、または不必要な実験を行うことなく容易に確認することができる。
【００９１】
高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、多くの異なる担体に結合することができ、ＣＤ４７発現細胞の存在を検出するために使用され得る。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的において、可溶性または不溶性となり得る。当業者は、タンパク質に結合するための他の好適な担体を知っているか、または日常的な実験を用いてそれらを確認することができる。
【００９２】
当業者に知られた多くの異なる標識および標識化方法がある。本発明において使用され得る標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、および生物発光化合部を含む。当業者は、本発明のポリペプチドに結合するための他の好適な標識を知っているか、または日常的な実験を用いてそのようにそれらを確認することができる。さらに、本発明のポリペプチドに対するこれらの標識の結合は、当業者には一般的な標準的技術を使用して行うことができる。
【００９３】
ＣＤ４７は、生物学的流体および組織内に存在する場合、本発明の高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドにより検出され得る。検出可能な量のＣＤ４７を含有する任意の試料が使用され得る。試料は、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清等の液体であってもよく、または、組織、便等の固体もしくは半固体であってもよく、または代替として、組織学的診断において一般に使用されるもの等の固形組織であってもよい。
【００９４】
より高い感度をもたらし得る別の標識化技術は、ポリペプチドを低分子量ハプテンに結合させることからなる。これらのハプテンは、次いで、第２の反応を用いて特異的に検出され得る。例えば、アビジンと反応するビオチン等のハプテン、または特定の抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェノール、ピリドキサール、もしくはフルオレセインを使用することが一般的である。
【００９５】
高親和性ＳＩＲＰα試薬の画像化複合体は、一連の２回以上の投与で対象に投与され得る。画像化複合体組成物は、可視化技術の前の適切な時点で投与され得る。例えば、直接的目視検査の１時間前以内の投与が適切となり得、または、ＭＲＩ走査の１２時間前以内の投与が適切となり得る。しかしながら、画像化化合物は最終的には患者の系から排出され得るため、投与と可視化との間で過度に長い時間を経過させないように注意を払うべきである。
【００９６】
癌の処置のための組成物は、非経口、局所的、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内の手段により投与され得る。典型的な投与経路は、静脈内または腫瘍内であるが、他の経路も同等に効果的となり得る。
【００９７】
典型的には、組成物は、溶液または懸濁液としての注射製剤として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に好適な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、乳化されてもよく、または、上述のような向上したアジュバント効果のために、リポソームもしくはマイクロ粒子、例えばポリ乳酸、ポリグリコリド、もしくはコポリマー等の中にカプセル化されてもよい。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，１９００およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の徐放またはパルス放出を可能とするような様式で製剤化され得る、蓄積注射製剤またはインプラント調製物の形態で投与され得る。薬学的組成物は、一般に、無菌の実質的に等張性のものとして、および米国食品医薬品局の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の全てに完全に適合するように製剤化される。
【００９８】
本明細書に記載の高親和性ＳＩＲＰα試薬の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的である用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対し致死的である用量）を決定することにより決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、人間における使用には毒性ではない用量範囲を策定する上で使用され得る。本明細書に記載のタンパク質の用量は、好ましくは、毒性が僅かである、または毒性がない効果的用量を含む血中濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。厳密な製剤、投与経路および用量は、個々の医者により、患者の状態に照らして選択され得る。
【００９９】
また、本発明の組成物（例えば高親和性ＳＩＲＰα試薬およびその製剤）ならびに取扱説明書を含むキットも、本発明の範囲内である。キットは、さらに、少なくとも１種の追加的試薬、例えば、化学治療薬、抗腫瘍抗体、ＥＳＡ等を含有し得る。キットは、典型的には、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上に、もしくはキットと共に供給される、または別様にキットに付随する任意の書面または記録資料を含む。
【０１００】
ここで、本発明が十分に説明されているが、当業者には、本発明の精神または範囲から逸脱せずに、様々な変更および修正を行うことができることが明らかとなる。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラーおよび偏差が計上されるはずである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【０１０２】
本明細書において引用される全ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
本発明は、本発明者により本発明の実践に好ましい様式を含むことが発見または提示された具体的実施形態に関して説明されている。当業者には、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱せずに、例示された具体的実施形態に数々の修正および変更が行われてもよいことが理解される。例えば、コドンの冗長性により、タンパク質配列に影響を与えずに、基本となるＤＮＡ配列に変更を行うことができる。さらに、生物学的な機能的均等性の考慮により、種類または量において生物学的作用に影響を与えずに、タンパク質構造に変更が行われ得る。すべてのそのような修正は、添付される特許請求の範囲内であるよう意図されている。
【０１０４】
タンパク質発現および精製：  ヒトＣＤ４７のＩｇＳＦ  ドメイン（残基１９〜１３５）およびヒトＳＩＲＰαの第１のＩｇＳＦ  ドメインの変異体（残基３１〜１４８）を、Ｃ末端８×ヒスチジンタグを有するｐＡｃＧＰ６７にクローニングし、組み換えバキュロウイルスを使用してＨｉ５細胞に発現させた。ＣＤ４７  ＩｇＳＦ  ドメイン上の遊離システインをグリシンに変異させた。タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム上でのゲル濾過により、ＨＢＳに精製した（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）。ビオチン化タンパク質を生成するために、Ｃ末端ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）−ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥタグを添加し、過剰のビオチン（１００μｍ）を有するＢｉｒＡリガーゼでタンパク質を共発現させた。結晶化のために、ＳＩＲＰα変異体ＦＤ６を、Ｎ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを有する大腸菌ペリプラズム内で発現させ、これを３Ｃプロテアーゼでの処置により除去した。ＣＤ４７  ＩｇＳＦ  ドメインを、キフネンシンの存在下でＨｉ５細胞中でＥｎｄｏＦで共発現させ、グリコシル化を除去した。
【０１０５】
ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ２  Ｆｃ鎖への融合としての、ＳＩＲＰα変異体タンパク質の発現のために、ＳＩＲＰα変異体をｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ２およびｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ２ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）内に、ＩＬ２シグナル配列とのフレーム内でクローニングした。ＳＩＲＰα変異体融合タンパク質を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるトランスフェクション後に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で発現させた。９６時間のタンパク質発現後に上清を回収し、ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。
【０１０６】
ＦＤ６：ＣＤ４７複合体の結晶化および構造決定：  大腸菌由来ＦＤ６および脱グリコシル化昆虫由来ＣＤ４７を、１：１の比で混合し、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢで処置し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム上でＨＢＡにゲル濾過した。複合体を２２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、シッティングドロップにおける蒸気拡散により、０．１μＬのタンパク質を等しい体積の２．０Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ＭトリスｐＨ７．３を添加することによって結晶化させた。回折試験は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで行われた。結晶構造を、ＰＨＡＳＥＲによる分子置換で解き、ＰＨＥＮＩＸおよびＣＯＯＴを使用して精密化した。
【０１０７】
表面プラズモン共鳴：  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器において、２５℃でＳＰＲ実験を行った。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ビオチン化ＣＤ４７を約１５０ＲＵの表面密度で捕捉した。非関連ビオチン化タンパク質を、一致するＲＵを有するＳＡセンサチップの参照表面として、実験表面に固定した。流通緩衝液［１×ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］中の非ビオチン化ＳＩＲＰα変異体の一連の希釈物を、５０μＬ／分の速度でチップ上に流動させた。２Ｍ  ＭｇＣｌ２の３回の３０秒注入を使用して、ＣＤ４７を再生した。１：１ラングミュア結合モデルを用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用してデータを分析した。
【０１０８】
癌細胞系統および培養条件：  Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）およびＤＬＤ−１細胞（ＡＴＣＣ）を、ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を懸濁液中に維持し、一方ＤＬＤ−１細胞を接着性単一層として維持した。両方の細胞系統を、コンフルエンスに達するまで、３〜４日の通常の間隔で継代した。ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋細胞系統を作製するために、ＪｕｒｋａｔおよびＤＬＤ−１細胞を、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｐｕｒｏ  ＨＩＶ系レンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から得られたルシフェラーゼ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）−ｅＧＦＰ発現レンチウイルスで形質導入した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩフローサイトメーターを使用して、細胞をＧＦＰ＋細胞に関して分類し、親系統と同じ様式で培養物中に維持した。
【０１０９】
ヒト癌細胞に結合するＳＩＲＰα変異体の評価：  ＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、滴定濃度のビオチン化ＳＩＲＰα変異体と共に、氷上で３０分間インキュベートした。４：１モル比のビオチン化野生型ＳＩＲＰαおよびストレプトアビジンを氷上で１５分間インキュベートすることにより、野生型ＳＩＲＰα四量体を事前に形成した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中で洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に複合化した５０ｎＭのストレプトアビジンと共に、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、次いで、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーによりＳＩＲＰα変異体結合に関して分析した。野生型ＳＩＲＰαからＣＤ４７への遮断を評価するために、５０ｎＭの野生型ＳＩＲＰα四量体を、滴定濃度のＣＤ４７遮断剤と共に、氷上で３０分間インキュベートした。抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、遮断の陽性対照として使用した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して分析した。最大ＳＩＲＰα変異体結合は、各変異体に対して測定された最大平均蛍光強度のパーセンテージを表す。
【０１１０】
マクロファージ誘導体化および培養：  ヒトマクロファージの誘導体化のために、白血球減少系チャンバを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから、匿名のドナーから得た。遠心分離により、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配で末梢血単核細胞を得た。ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＣＤ１４＋単球を精製した。ＩＭＤＭ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＡＢヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中での７日間の培養により、単球をマクロファージに分化させ、その時点でそれらを食作用アッセイに使用した。
【０１１１】
Ｃ５７Ｂｌ／Ｋａ  Ｒｏｓａ２６−ｍＲＦＰ１形質転換マウスから骨髄を単離し、１０μｇ／ｍＬマウスＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ＋１％ＧｌｕｔａＭａｘ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で培養することにより、マウスマクロファージを得た。７日間の分化後、マクロファージを回収し、食作用アッセイに使用した。
【０１１２】
インビトロ食作用アッセイ：  インビトロ食作用アッセイは、マウスおよびヒトマクロファージを使用して行った。フローサイトメトリーによる評価のために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、ウェル当たり約５０，０００マクロファージを添加した。２００，０００ＧＦＰ＋腫瘍細胞を、血清不含培地中で、抗体またはＳＩＲＰα変異体治療薬と共に３０分間プレインキュベートし、次いでマクロファージを添加した。オプソニン化のために、抗ＣＤ４７クローン２Ｄ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびセツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を、説明されるように使用した。マクロファージおよび標的細胞を、５％二酸化炭素を含有する加湿した３７℃インキュベータ内で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、プレートから除去し、フローサイトメトリー用に調製した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色により、死細胞を分析から除外した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合化抗ヒトＣＤ１４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により、ヒトマクロファージを同定した。高スループットサンプラーを有するＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して、試料を分析した。ＧＦＰ＋マクロファージにより表現される腫瘍細胞を貪食しているマクロファージのパーセンテージを、ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．４（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して決定した。
【０１１３】
インビトロでの食作用の可視化のために、５０，０００マクロファージを２４ウェルプレートに播種した。腫瘍細胞を、５μＭ  ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造者のプロトコルに従い標識化した。２００，０００ＣＦＳＥ＋腫瘍を、抗体またはＳＩＲＰα変異体処置で、血清不含培地中で３０分間処置し、マクロファージに添加し、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを広範囲に洗浄し、残留標的細胞を除去した。その後、倒立型蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００  Ｂ）を使用して、ウェルを可視化した。食作用指標は、マクロファージ当たりの標的細胞の数に１００を乗じてスコア化した。
【０１１４】
結果。異種移植免疫不全マウスを処置するインビボ実験は、高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ試薬による処置が、腫瘍増殖を遮断したことを示している。ルシフェラーゼ発現ＨＬ６０白血病細胞が移植されたマウスは、可溶性ＳＩＲＰ試薬で処置された。ルシフェラーゼ−ＨＬ６０細胞から放出される放射輝度により測定される全身腫瘍組織量は、バックグラウンドレベルまで降下したが、これは腫瘍細胞の排除を示しており、一方、ＩｇＧ対照処置マウスにおいては、放射輝度が増加し、腫瘍増殖の増加を反映している。結果は、ｈｕ５Ｆ９抗ＣＤ４７ａｂに関して観察される結果と同等であった。これらのデータは、高親和性可溶性ＳＩＲＰα試薬が、ＨＬ６０細胞上のＣＤ４７に結合し、細胞の食作用および排除を可能とすることにより、「貪食拒否（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ−ｍｅ）シグナル」の効果的な遮断において抗ＣＤ４７抗体と同等であることを示している。
【０１１５】
実施例２
高親和性ＳＩＲＰαは、癌細胞のマクロファージ食作用の閾値を低下させる
免疫系を回避する腫瘍の能力は、癌の新たな特徴であり、癌細胞に対する免疫反応を誘導する新たな治療戦略が、実験および臨床の場において有望である。マクロファージは一般に腫瘍に浸潤し、最近の研究では、ＣＤ４７が、マクロファージ媒介破壊を回避するために多くの種類の癌において高度に発現する抗食作用的「貪食拒否（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ）シグナル」として特定されている。マクロファージ上の阻害受容体であるＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合を遮断する抗体は、癌細胞の食作用を大きく増加させ、抗腫瘍免疫治療による操作に対する興味深い新たな軸を特定している。指向進化およびタンパク質改質を使用して、ＳＩＲＰαの結合ドメインを修飾したが、その野生型親和性は、ＣＤ４７の高親和性競合的拮抗剤として治療上有用となるには弱すぎる。
【０１１６】
我々は、野生型ＳＩＲＰαに比べ約５０，０００倍の親和性の増加を伴ってＣＤ４７に結合する、ＳＩＲＰα変異体を作製した。多量体高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質として生成された場合、変異体は、インビトロで食作用を誘導し、インビボでヒト腫瘍の増殖を低減するための単一薬剤として機能する。単一ドメイン高親和性ＳＩＲＰα単量体は、それ自身では最大食作用を誘導するのに十分ではないが、併用療法において与えられると、確立された治療モノクローナル抗体の有効性を大きく向上させる。ＣＤ４７は、腫瘍細胞が免疫系を回避するために使用する波及メカニズムであるため、本研究において生成された分子は、単剤療法および他の標的生物製剤へのアジュバントの両方として、数多くの癌患者に有益である。
【０１１７】
理想的なＣＤ４７拮抗剤を生成するために、タンパク質改質を使用して、ＣＤ４７に対する可溶性ＳＩＲＰαの親和性を改善した（図１Ａ）。我々は、酵母表面ディスプレイのために、Ａｇａ２ｐに複合化したＳＩＲＰαのＮ末端ＶセットＩｇドメインの変異ライブラリを作製した（図１Ｂ）。選択試薬としてＣＤ４７  ＩｇＳＦドメインを使用して、我々は、２つの「世代」のインビトロ進化を行った。第１世代は、２つのクラスのＳＩＲＰα残基、すなわちＣＤ４７に接触するもの、または疎水性コア内に存在するものへの無作為化を含むプールされた変異ライブラリからの５ラウンドの選択を伴った（図５Ａ）。得られた第１世代のＳＩＲＰα変異体は、表面プラズモン共鳴により測定されるように、野生型ＳＩＲＰαよりも２０〜１００倍高い親和性でＣＤ４７に結合した。さらに高い親和性の変異体を得るために、我々は、第１世代の選択物において変異した１３残基の完全適用を達成したライブラリを構築することにより、第２世代の指向進化を実行した。さらなる５ラウンドの選択の後、我々は、解離定数（ＫＤ）が３４．０ｐＭまで低く、減衰半減期（ｔ１／２）が４４分まで長い（野生型ＳＩＲＰαに対する０．３〜０．５μＭのＫＤ  および１．８秒のｔ１／２と比較して）、ＣＤ４７に結合した変異体を得た（図１Ｃ）。興味深いことに、高親和性ＳＩＲＰα変異体の配列は、変異のコンセンサスセットに収束した。我々がこれらの９つの保存的置換を主要な野生型ＳＩＲＰα対立遺伝子（対立遺伝子２）にグラフトすると、得られる変異体（ＣＶ１、コンセンサス変異体１と呼ばれる）は、１１．１ｐＭの親和性でＣＤ４７に結合した（図１Ｃ）。
【０１１８】
ＣＶ１配列は、野生型対立遺伝子に比べ、以下のアミノ酸変化を有する：Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；Ｖ９２Ｉ。ＣＶ１は、例えば、以下のようにｄ１ドメインアミノ酸配列を含んでもよい：
（配列番号１０）ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤ  ＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴ  ＡＴＬＲＣＴＩＴＳＬ  ＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲ  ＧＡＧＰＧＲＶＬＩＹ  ＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶ  ＴＴＶＳＤＴＴＫＲＮ  ＮＭＤＦＳＩＲＩＧＮ  ＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹ  ＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤ  ＤＶＥＦＫＳＧＡＧＴ  ＥＬＳＶＲＡＫＰＳ
【０１１９】
高親和性ＳＩＲＰα変異体が野生型タンパク質と同様のＣＤ４７結合構造を保持するかを理解するために、我々は、高親和性変異体ＦＤ６とＣＤ４７  ＩｇＳＦ  ドメインとの間の複合体の結晶構造を決定した（図１Ｄ）。ＦＤ６：ＣＤ４７複合体は、僅か０．６１３Åの標準偏差で野生型ＳＩＲＰα：ＣＤ４７複合体と重なり、これは、高度な構造類似性を示し、野生型相互作用の構造を保存する我々の取り組みの正当性を実証している（図１Ｅ）。ＦＤ６および野生型ＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する重複した結合様式は、それらが、同じＣＤ４７エピトープに対して競合し、それにより最大の潜在的拮抗作用を提供することを示している。顕著な違いとして、ＦＤ６のＣ’Ｄループは、コンセンサス配列に存在する４つの接触変異のうち３つを含有する（図１Ｅ）。我々は、これらの変異がＣ’Ｄループを安定化し、これがＡｒｇ５３の正電荷をＣＤ４７上のグルタミン酸のクラスタ内に位置付けると推測している（図１Ｅ）。ＦＤ６とＣＤ４７との間の結合界面の残りは、野生型ＳＩＲＰα：ＣＤ４７界面と極めて類似しており、最も顕著な例外は、Ｉｌｅ３１からＰｈｅへの変異である。これらの構造的試験は、高親和性ＳＩＲＰα変異体が有効なＣＤ４７拮抗剤として作用し得ることを示している。
【０１２０】
高親和性ＳＩＲＰα変異体の機能的特性を試験するために、我々は、まず、癌細胞の表面上のＣＤ４７に結合し拮抗するその能力を検査した。我々は、増加したＣＤ４７親和性を有するＳＩＲＰα変異体が、細胞表面ＣＤ４７に結合し（図８ａ、ｃ）、遮断する（図２ａおよび図８ｂ）上で、より大きな効力を示すことを発見した。単一ドメイン単量体として、ＦＤ６およびＣＶ１変異体は両方とも、野生型ＳＩＲＰαと比べて強力な拮抗作用を示した。重要なことに、両方の高親和性変異体は、インビトロおよびインビボにおいて治療有効性を示す十分特性決定されたＣＤ４７拮抗剤である抗ＣＤ４７抗体クローンＢ６Ｈ１２から生成されたＦａｂ断片より強力なＣＤ４７拮抗剤であった（図８ａ）。
【０１２１】
次に、我々は、ＣＤ４７遮断剤の存在下でマクロファージおよび腫瘍細胞を共培養することにより、インビトロで食作用を増加させる高親和性ＳＩＲＰα変異体の能力を評価した。ヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）のＦｃ断片への融合タンパク質として、高親和性ＳＩＲＰα変異体は、顕微鏡法により可視化されるように、癌細胞の食作用の劇的な増加をもたらした（図２ｂ）。食作用の定量的測定値を得るために、初代ヒトマクロファージおよびＧＦＰ＋腫瘍細胞を、ＣＤ４７遮断剤と共培養し、次いでフローサイトメトリーにより分析した（図２ｃ）。固形および血液悪性腫瘍の両方を発現する複数癌細胞系統を使用して、我々は、飽和濃度の高親和性ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４変異体による処置が、野生型ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４対照と比べて、食作用の劇的な増加をもたらすことを発見した（図２ｄ）。高親和性ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４変異体およびアイソタイプ適合抗ＣＤ４７抗体は、飽和濃度において同等レベルの食作用をもたらしたが（図２ｄ）、高親和性ＳＩＲＰα変異体は、用量反応曲線を生成するために滴定されると明確な利点を示した（図２ｅ）。ＦＤ６−ｈＩｇＧ４およびＣＶ１−ｈＩｇＧ４の高い親和性は、ＥＣ５０の減少に対応していたが、これは、食作用のより強力な誘導を示している。
【０１２２】
興味深いことに、飽和濃度の高親和性ＳＩＲＰα単量体による処置後には、食作用の実質的な増加は観察されなかった（図２ｄ）が、これは、ＣＤ４７の遮断だけでは、最大の食作用を誘導するのに不十分であることを示唆している。結果として、我々は、高親和性ＳＩＲＰα単量体による処置が、腫瘍特異的モノクローナル抗体の存在下で食作用の閾値を低下させるという仮説を立てた。この仮説を調査するために、我々は、ＤＬＤ−１細胞、すなわちヒト結腸癌細胞株を標的化する抗体を使用して食作用アッセイを行った。高親和性ＳＩＲＰα単量体が、単独または非特異的アイソタイプ対照抗体と組み合わせて添加されると、基礎レベルの食作用が観察された（図２ｆ）。
【０１２３】
ＣＤ４７に結合するがＳＩＲＰαとの相互作用を遮断しない抗ＣＤ４７クローン２Ｄ３、または抗ＥｐＣａｍ抗体による処置は、中程度のレベルの食作用をもたらした。しかしながら、両方の抗体処置に高親和性ＳＩＲＰα単量体ＦＤ６を添加すると、マクロファージは、食作用の顕著な増加を示した（図２ｆ）。したがって、ＣＤ４７の遮断は、他の活性化刺激、例えば抗体Ｆｃの存在下で、マクロファージ食作用の閾値を低下させる。
【０１２４】
この原理の臨床的意義を実証するために、我々は、現在癌治療薬として使用されている確立されたモノクローナル抗体の有効性を向上させる、高親和性ＳＩＲＰα単量体の能力を調査した。まず、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブで処置されたＤＬＤ−１結腸癌細胞を使用して、食作用アッセイを行った。単独、野生型ＳＩＲＰα単量体と組み合わせた、または高親和性ＳＩＲＰα単量体と組み合わせた滴定濃度のセツキシマブに応じた食作用を評価した。単独または野生型ＳＩＲＰα単量体と組み合わせたセツキシマブの両方と比べ、セツキシマブおよび高親和性ＳＩＲＰα単量体の組み合わせは、セツキシマブの最大の有効性および効力の両方の大幅な増加をもたらした（図２ｇ）。滴定濃度の抗ＣＤ２０抗体リツキシマブで処置されたＲａｊｉリンパ腫細胞を用いて食作用を評価した際にも同様の効果が観察された（図２ｈ）。この場合も、高親和性ＳＩＲＰα単量体は、リツキシマブの最大の有効性および効力の両方を増加させた。臨床の場において、モノクローナル抗体は、しばしば、限定された反応を達成するのみであり、処置後にぶり返すことが一般的である。高親和性ＳＩＲＰα単量体は、腫瘍特異的抗体に対する普遍的アジュバントとして作用することにより、これらの問題に対する解決策を提供する。
【０１２５】
次に、我々は、マウス腫瘍モデルを使用して、高親和性ＳＩＲＰα変異体のインビボでの有効性を評価した。進行期のヒト結腸癌の侵攻性モデルとして、ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋ＤＬＤ−１細胞を、ＮＳＧマウスの腹腔にグラフトした（図３ａ）。生物発光画像法によりグラフトを確認した後、単剤療法としてビヒクル対照または高親和性ＳＩＲＰα変異体ＣＶ１−ｈＩｇＧ４による毎日の処置を開始した。全フラックスの生物発光監視により、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４による処置の最初の週の間の腫瘍増殖速度の中程度の減少が明らかであり（図９）、これは、経時的に大幅な生存率の利点をもたらした（図３ｂ）、赤血球喪失は、抗マウスＣＤ４７抗体による処置後に観察される主要な副作用であることから、我々は、同様の疾患に対して、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスの血液を検査した。フローサイトメトリーにより、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４は、血液中の全ての細胞に結合し（図３ｃ）、ヘマトクリットの中程度の減少をもたらした（図３ｄ）ことが明らかとなった。しかしながら、以前に観察されたように、長期的処置は、さらなる毒性を引き起こさなかった。
【０１２６】
ＣＶ１−ｈＩｇＧ４は、単一薬剤として抗腫瘍有効性を示したため、我々は、次に、現在標的生物製剤が存在しない癌の種類であるヒト膀胱癌のモデルにおけるその有効性を評価した。ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋６３９−Ｖ膀胱癌細胞を、ＮＳＧマウスの背側皮下組織に注射した。生物発光画像法によりグラフトを確認し、マウスをビヒクル対照またはＣＶ１−ｈＩｇＧ４による毎日の処置の群に無作為化した。ＣＶ１−ｈＩｇＧ４による処置は、生物発光画像法により評価されるように、腫瘍増殖速度を実質的に低減した（図３ｅ、ｆ）。第１の対照処置マウスの死亡直前に腫瘍体積を評価したが、この時点で全ての対照マウスにおいて大きな腫瘍が測定可能であり、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスにおいては、識別可能な腫瘍は確認されなかった（図３ｇ）。したがって、全ての対照マウスが死亡した時に処置を中止した後であっても、生存率における著しい利点が観察された（図３ｈ）。
【０１２７】
以前に観察されたように、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４による処置は、赤血球指数の減少をもたらした（図１０ａ）。ＣＶ１−ｈＩｇＧ４処置マウスはまた、腫瘍グラフト部位の周囲に明確な間質組織を発達させた。この組織の組織病理学的検査では、マクロファージを含有する広範囲の炎症性浸潤物に埋没した微小な腫瘍小結節が明らかであった（図１０ｂ、ｃ）。
【０１２８】
次に、我々は、高親和性ＳＩＲＰα単量体のインビボでのアジュバント効果を調査した。ヒトリンパ腫の局在化モデルにおいて、ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋Ｒａｊｉ細胞を、ＮＳＧマウスの脇腹に皮下グラフトした。生物発光画像法によりグラフトを確認した後、マウスを、ビヒクル、ＣＶ１単量体単独、リツキシマブ単独、またはリツキシマブおよびＣＶ１単量体の組み合わせによる毎日の処置の３週間のコースの群に無作為化したＣＶ１単量体またはリツキシマブ単独による処置は、腫瘍増殖を低減しただけであり、一方併用療法による処置は、大半のマウスにおいて  腫瘍を劇的に根絶した（図４ａ、ｂ、ｃ）。処置期間中、顕著な赤血球減少は観察されなかった。（図１１ａ、ｂ、ｃ）。各治療の効果は、生存率曲線におけるそれぞれの傾向に変換された（図４ｄ）。意外なことに、高親和性ＳＩＲＰα単量体を腫瘍特異的モノクローナル抗体と組み合わせる相乗効果は、処置が中止された後であっても、大半の動物において長期持続的治癒をもたらした（図４ｄ）。
【０１２９】
高親和性ＳＩＲＰα変異体の開発は、タンパク質レベルでの分子工学から始まって、精製された免疫エフェクター細胞を使用したインビトロ検証、および最終的には動物モデルにおける治療評価に至るまでの、集学的な合理的薬物設計への取り組みである。以前の研究は、癌に対する免疫介入としてＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を標的化することの価値を実証したが、我々はここで、治療薬として最適な特性を示す極めて有効で強力なＣＤ４７拮抗剤を生成するために、この系をさらに操作した。
【０１３０】
我々のインビトロおよびインビボでの所見は、癌に対するマクロファージの活性、および免疫調節治療に対するその反応への新たな洞察を提供する。高親和性ＳＩＲＰα単量体において観察されたように、ＣＤ４７単独の遮断は、最大の食作用を誘導するのに不十分である。同様に、ＣＤ４７がマクロファージ上のＳＩＲＰαを介して自由に阻害シグナルを伝達する場合、モノクローナル抗体はその最大の有効性を達成しない。しかしながら、マクロファージは、表面結合抗体Ｆｃの存在下でＣＤ４７が高親和性ＳＩＲＰα単量体により遮断されると、強固に刺激される。高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質および抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７遮断成分および食作用促進抗体Ｆｃを単一分子に組み合わせ、したがってそれらは単一薬剤としての有効性を示すが、標的外毒性のより高い可能性を有する。一方、高親和性ＳＩＲＰα単量体と別個の抗腫瘍モノクローナル抗体、例えばリツキシマブとの組み合わせは、特に抗腫瘍反応を向上させる。この戦略は、明確な利益、具体的には識別可能な毒性の欠如を提供するが、最大反応の達成は、臨床的に認可されたモノクローナル抗体の利用可能性および有効性に依存する。
【０１３１】
最近の報告は、野生型ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質がヒト白血病を処置するために使用され得ることを示唆した。しかしながら、我々の研究は、野生型ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の弱い親和性が、そのような治療の可能性を制限することを示している。他の者により観察された効果は、マクロファージが内毒素およびインターフェロン−γにより事前活性化された場合にのみ食作用が現れるため、ＣＤ４７拮抗作用とは対照的に、主としてＦｃの食作用促進効果により媒介されると考えられる。インビボにおいて、野生型ヒトＳＩＲＰαとマウスＣＤ４７との間の交差反応性の欠如は、人間における処置および毒性を不十分にモデル化し、身体の全ての細胞上のＣＤ４７発現に起因して大きな「抗原シンク」が存在する。
【０１３２】
高親和性ＳＩＲＰα試薬は、さらなる改質が可能な新規クラスの抗腫瘍生物製剤を構成する。修飾は、有効性、特異性、組織浸透度、クリアランス、および毒性を改変するように設計され得る。さらに、多くの腫瘍はＣＤ４７を過剰発現し、発現レベルは、低い患者予後と相関するため、高親和性ＳＩＲＰα変異体は、癌用の非侵襲性造影剤として適合され得る。ＣＤ４７は、免疫系を回避するために腫瘍細胞により一般的に使用され、したがって、高親和性ＳＩＲＰα変異体は、様々な人間の癌に対する有益な治療薬となり得る。高親和性ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質は、単一薬剤としての有効性を示し、したがって、現在標的療法が存在しない癌の治療薬として特に有用となり得る。さらに、高親和性ＳＩＲＰα単量体は、従来のモノクローナル抗体治療に対する普遍的アジュバントとして使用され得る。全体として、本研究は、悪性細胞に対するマクロファージ反応の我々の知識を深め、高親和性ＳＩＲＰα試薬の癌の免疫ベース治療薬としての使用を支持する。
【０１３３】
方法
タンパク質発現および精製。  Ｃ１５Ｇ変異およびＣ末端８ヒスチジンタグを有するＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン（残基１〜１１７）を、バキュロウイルスを使用してイラクサギンウワバ（Ｈｉ−５）細胞から分泌させ、Ｎｉ−ＮＴＡおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムを有するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。結晶学のためのグリカン最小化ＣＤ４７を生成するために、キフネンシンの存在下でＣＤ４７をエンドグリコシダーゼ−Ｈ（ｅｎｄｏＨ）と共発現させた。ＭＢＰタグおよびＣ末端８ヒスチジンタグの後にライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を含有する修飾ｐＭａｌ−ｐ２Ｘ発現ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、単量体ＳＩＲＰα変異体（残基１〜１１８）をＢＬ−２１（ＤＥ３）大腸菌のペリプラズム内にＭＢＰ融合体として発現させた。細胞を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで０．８のＯＤ６００で誘導し、振盪と共に２２℃で２４時間インキュベートした。浸透圧衝撃によりペリプラズムタンパク質を得、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）クロマトグラフィーを使用してＭＢＰ融合タンパク質を精製した。溶出したタンパク質は、３Ｃプロテアーゼにより４℃で１２時間分解させてＭＢＰを除去し、追加的なＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーステップにより、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ７５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。インビトロ食作用アッセイおよびインビボ実験のために、以前に説明されたようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を使用して内毒素を除去し、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用して内毒素除去を確認した。ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合体は、ＳＩＲＰα変異体をＩＬ−２シグナル配列および改質されたＳｅｒ２２８  Ｐｒｏ変異を有する修飾ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にクローニングすることにより生成した。タンパク質は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における一時的トランスフェクションにより発現させ、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。キメラ抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２−ｈＩｇＧ４は、ＣＨＯ細胞（Ｌｏｎｚａ）における好適な発現により、組み換え生成した。
【０１３４】
ビオチン化ＣＤ４７およびＳＩＲＰαを得るために、カルボキシ末端ビオチン受容体ペプチドタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）でタンパク質を発現させ、上述のように精製した。精製されたタンパク質をＢｉｒＡリガーゼでインビトロでビオチン化し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーにより反応混合物から再精製した。
【０１３５】
Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ断片の調製。  Ｂ６Ｈ１２抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０、２５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＥＤＴＡに脱塩し、４ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。次いで、抗体を、抗体１ｍＬ当たり２５０μＬの固定フィシン樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、３７℃で５時間回転させながらインキュベートした。反応混合物をｍｏｎｏＱカラムに通過させ（Ｂ６Ｈ１２  Ｆａｂは通過物に存在した）、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−２０カラムを用いたゲル濾過により、分解された断片を精製した。
【０１３６】
酵母ディスプレイおよびＳＩＲＰα変異体のライブラリ生成。  以前に説明されたように、ｐＣＴ３０２ベクターを使用して、Ａｇａ２へのＣ末端融合体として、ＳＩＲＰαのＮ末端Ｖセットドメイン（残基１〜１１８）を、Ｓ．セレビシエ株ＥＢＹ１００の表面上に提示した。縮重コドンを有する以下のプライマーセットを使用して、プールされた第１世代のライブラリを、それぞれＳＩＲＰαのＣＤ４７−接触残基および疎水性「コア」残基を無作為化する２つの別個のアセンブリＰＣＲ反応により生成した：接触残基ＰＣＲプライマーセット、無作為化Ｓｅｒ２９＝ＲＳＴ、Ｌｅｕ３０＝ＮＴＴ、Ｉｌｅ３１＝ＮＴＴ、Ｐｒｏ３２＝ＣＮＴ、Ｖａｌ３３＝ＮＴＴ、Ｇｌｙ３４＝ＲＳＴ、Ｐｒｏ３５＝ＣＮＴ、Ｇｌｎ５２＝ＳＡＷ、Ｌｙｓ５３＝ＡＲＧ、Ｇｌｕ５４＝ＳＡＷ、Ｓｅｒ６６＝ＲＳＴ、Ｔｈｒ６７＝ＲＳＴ、Ｌｙｓ６８＝ＡＲＧ、Ａｒｇ６９＝ＡＲＧ、Ｐｈｅ７４＝ＮＴＴ、Ｌｙｓ９３＝ＡＮＧ、Ｌｙｓ９６＝ＡＮＧ、Ｇｌｙ９７＝ＲＳＴ、Ｓｅｒ９８＝ＲＳＴ、およびＡｓｐ１００＝ＲＡＳ：
（配列番号１１）５’ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴ３’；（配列番号１２）５’ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＴＡＣＧＧＡ３’；（配列番号１３）５’ＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＲＳＴＮＴＴＮＴＴＣＮＴＮＴＴＲＳＴＣＮＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡ３’；（配列番号１４）５’ＡＴＴＧＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴ３’；（配列番号１５）５’ＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＳＡＷＡＲＧＳＡＷＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧ３’；（配列番号１６）５’ＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＮＧＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＹＴＣＹＴＡＳＹＡＳＹＣＴＣＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣ３’；（配列番号１７）５’ＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧ３’；（配列番号１８）５’ＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＣＴＣＣＧＴＷＴＹＡＧＧＡＳＹＡＳＹＣＮＴＣＣＧＧＡＡＣＮＴＣＡＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡ  ＧＧＴＧＣＣ３’；（配列番号１９）５’ＡＣＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡ  ＡＡＣＣＣＴＣＴ３’
【０１３７】
「コア」残基ＰＣＲプライマー、無作為化Ｌｅｕ４、Ｖａｌ６、Ｖａｌ２７、Ｉｌｅ３６、Ｐｈｅ３８、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４９、Ｔｙｒ５０、Ｐｈｅ５７、Ｖａｌ６０、Ｍｅｔ７２、Ｐｈｅ７４、Ｉｌｅ７６、Ｖ９２、Ｐｈｅ９４、およびＰｈｅ１０３からＮＴＴ：
（配列番号２０）５’ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＮＴＴＣＡＧＮＴＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴ  ＧＧＡＧＡＧ３’；（配列番号２１）５’ＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＮＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡ  ＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣ３’；（配列番号２２）５’ＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＮＴＴＣＡＧＴＧＧ  ＮＴＴＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡ３’；（配列番号２３）５’ＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＮＡＡＮＡＡ  ＮＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣ３’；（配列番号２４）５’ＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＮＴＴＣＣＣＣ  ＧＧＮＴＴＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣ３’；（配列番号２５）５’ＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧ  ＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＴＡＡＮＧＧＡＡＡＮＧＴＣＡＡＮＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡ３’；（配列番号２６）５’ＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＮＴＴＡＡＧＮＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧ３’，（配列番号２７）５’ＡＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＮＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣ３’。
ＰＣＲ産物を、ｐＣＴ３０２ベクターとの相同性を含有するプライマーでさらに増幅し、線形化ｐＣＴ３０２ベクターＤＮＡと組み合わせ、ＥＢＹ１００酵母に共電気穿孔した。得られたライブラリは、４．０・１０８  の形質転換体を含有した。
【０１３８】
第２世代のライブラリを、第１世代のライブラリと同一に生成および形質転換したが、以下のプライマー、無作為化Ｌｅｕ４＝ＮＴＴ、Ｖａｌ６＝ＮＴＴ、Ｖａｌ２７＝ＮＴＴ、Ｉｌｅ３１＝ＷＹＴ、Ｇｌｕ４７＝ＳＷＡ、Ｌｙｓ５３＝ＡＲＧ、Ｇｌｕ５４＝ＳＡＫ、Ｈｉｓ５６＝ＣＮＴ、Ｓｅｒ６６＝ＲＳＴ、Ｌｙｓ６８＝ＡＲＧ、Ｖａｌ９２＝ＮＴＴ、Ｐｈｅ９４＝ＮＴＴ、Ｐｈｅ１０３＝ＮＴＴを用いてアセンブルした：
（配列番号２８）５’ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＮＴＴＣＡＧＮＴＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＣ３’；（配列番号２９）５’ＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＴＡＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡ３’；（配列番号３０）５’ＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＮＴＴＡＣＣＴＣＣＣＴＧＷＹＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧ３’；（配列番号３１）５’ＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧ３’；（配列番号３２）５’ＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＳＷＡＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＲＧＳＡＫＧＧＣＣＮＴＴＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧ３；（配列番号３３）５’ＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＹＴＴＧＴＡＳＹＣＴＣＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣ３’；（配列番号３４）５’ＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣ  ＧＧＣＡＣ３’；（配列番号３５）５’ＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡＡＮＣＴＴＡＡＮＡＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣ  ＴＧＣＴＧ３’、（配列番号３６）５’ＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＮＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡ  ＡＣＣＣＴＣＴ３’。得られたライブラリは、２×１０８の形質転換体を含有した。
【０１３９】
第１世代のライブラリの選択。  形質転換された酵母を、ＳＤＣＡＡ液体培地中で３０℃で増殖させ、ＳＧＣＡＡ液体培地中で２０℃で誘導した。全ての選択ステップは、４℃で行った。第１ラウンドの選択において、ライブラリ形質転換体の数の１０倍の範囲を表す４×１０９の誘導酵母を、５ｍＬ  ＰＢＥ（０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡが添加されたリン酸緩衝生理食塩水）中に懸濁させた。酵母を、ビオチン化ＣＤ４７で事前にコーティングされた５００μＬの常磁性ストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と混合し、混合物を回転させながら１時間インキュベートした。５，０００ｇで５分間の遠心分離により、酵母をペレット化し、１０ｍＬ  ＰＢＥで２回洗浄した。磁気標識化酵母を、５ｍＬのＰＢＥに懸濁させ、製造者の指示に従い（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＬＳ  ＭＡＣＳカラムで分離した。溶出した酵母をペレット化し、ＳＤＣＡＡ培地に再懸濁させ、次のラウンドの選択のために増殖させた。第１のラウンドと同様に、以下の修正と共に４つの追加的な選択ラウンドを行った：１×１０８の酵母を、ＦＩＴＣ標識化抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、または、１μｍから１００ｎＭの連続低下濃度のビオチン化ＣＤ４７タンパク質を含有する、５００μＬのＰＢＥに再懸濁させた。１時間のインキュベーション後、酵母をＰＢＥで洗浄し、ＣＤ４７による選択のために、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（独自に生成）で１５分間標識化した。酵母をさらに２回ＰＢＥで洗浄し、５０μＬの適切な抗フルオロフォアマイクロビーズ（抗ＦＩＴＣ、抗ＰＥ、または抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で１５分間、磁気標識化した。酵母を１回洗浄し、３ｍＬのＰＢＥに再懸濁させ、第１ラウンドと同様にＬＳカラムで分離した。
【０１４０】
第２世代のライブラリの選択。  第２世代のライブラリの最初の２ラウンドの選択においては、第１世代の選択のラウンド２から５の場合と同様に、単量体ビオチン化ＣＤ４７で酵母を選択した。リガンド枯渇を避けるためにより大量の染料体積（１０ｍＬ  ＰＢＥ）を使用して、第１ラウンドは、２０ｎＭのビオチン化ＣＤ４７で選択し、第２ラウンドは、１ｎＭのビオチン化ＣＤ４７で選択した。全ての後続の選択ラウンドにおいては、動力学的選択を行った。簡潔に説明すると、２０ｎＭビオチン化ＣＤ４７で１時間酵母を染色し、ＰＢＥで洗浄し、次いで１μＭの非ビオチン化ＣＤ４７を含有する５００μＬのＰＢＥ中に懸濁させた。細胞を２５℃で９０分間（ラウンド３）または３００分間（ラウンド４および５）インキュベートし、その後それらを氷冷ＰＢＥで洗浄し、蛍光標識ストレプトアビジンで染色した。ラウンド１から４においては、第１世代ライブラリに関して説明したように、ＭＡＣＳを使用して酵母を分離した。第５ラウンドの選択においては、ＦＩＴＣ標識化抗ｃ−Ｍｙｃおよびストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で酵母を共標識化し、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選択した。
【０１４１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて２５℃で実験を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、タンパク質濃度を２８０ｎＭの吸光度により定量化した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ビオチン化ＣＤ４７  （Ｒｍａｘ〜１５０ＲＵ）を捕捉した。非関連ビオチン化タンパク質を、基準表面のＲＵ値と一致するＲＵ値で固定し、非特異的結合を制御した。ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のＳＩＲＰα変異体の連続希釈液により、測定を行った。ＣＤ４７表面を、２Ｍ  ＭｇＣｌ２の３回の６０秒注入により再生した。１：１ラングミュア結合モデルを用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用して、全てのデータを分析した。
【０１４２】
ＦＤ６：ＣＤ４７複合体の結晶化および構造決定。  グリカン最小化ＣＤ４７および大腸菌由来ＦＤ６を、１：１の比で混合し、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢで分解し、そのＣ末端８×ヒスチジンタグを除去した。分解したＦＤ６：ＣＤ４７複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムを用いてＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）へのゲル濾過により精製し、２２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。等体積の２．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１ＭトリスｐＨ７．３への０．１μＬタンパク質の添加により結晶を得、パラフィン油中で凍結防止した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  （Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）において、ビームライン８−２で回折試験を行った。異方性１．９Åデータセットを得て、ＨＫＬ−３０００で処理した。ＦＤ６：ＣＤ４７複合体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ受託コード２ＪＪＳからのＣＤ４７およびＳＩＲＰαの個々のモデルとの分子置換により解いた。ＰＨＥＮＩＸを用いて精密化を行い、ＣＯＯＴでモデル調整を行った。溶媒補正には、バルク溶媒平滑化（ｂｕｌｋ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）を使用した。最初の精密化は、剛体、座標、および実空間精密化と共に、個別の原子転移パラメータ精密化を使用した。その後の精密化の繰り返しにおいて、ＴＬＳ精密化を追加した。
【０１４３】
細胞系統およびＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋形質導入。  ＤＬＤ−１細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）、および６３９−Ｖ細胞（ＤＳＭＺ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋系統を、ｅＧＦＰ−ルシフェラーゼ２（ｐｇｌ４）融合タンパク質を発現するように改質されたｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１  ｐｕｒｏ  ＨＩＶ系レンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した形質導入により生成した。ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのＧＦＰ発現の選別により、安定な系統を形成した。
【０１４４】
細胞ベースＣＤ４７結合アッセイ。  様々な濃度のビオチン化ＳＩＲＰα単量体、ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４融合タンパク質、または抗ＣＤ４７抗体を、示されたように癌細胞と共にインキュベートした。ビオチン化単量体の結合は、２次染色試薬として１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合化ストレプトアビジンを使用して検出し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ４融合タンパク質または抗ＣＤ４７抗体の結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、高スループットサンプラー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有するＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ上で分析した。データは、各クラスの試薬の最大結合に正規化された平均傾向強度を表し、点は、Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、Ｓ字用量反応曲線にフィッティングされた。
【０１４５】
細胞ベースＣＤ４７遮断アッセイ。  ビオチン化ＷＴａ１ｄ１  ＳＩＲＰαを、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合化ストレプトアビジンと共にインキュベートし、ＷＴａ１ｄ１  ＳＩＲＰα四量体を形成した。１００ｎＭ  ＷＴａ１ｄ１  ＳＩＲＰα四量体を、滴定濃度のＣＤ４７拮抗剤と組み合わせ、５０，０００ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋Ｒａｊｉ細胞に同時に添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、次いで洗浄して未結合四量体を除去した。試料をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で染色して死細胞を除外し、高スループットサンプラーを有するＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して蛍光を分析した。データは、最大四量体結合に正規化されたＦｌｏｗＪｏ  ｖ９．４．１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析された幾何平均蛍光強度を表し、Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、Ｓ字用量反応曲線にフィッティングされた。
【０１４６】
マクロファージ誘導体化および食作用アッセイ。  白血球減少系（ＬＲＳ）チャンバを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから、匿名のドナーから得て、末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で密度勾配遠心分離により濃縮した。単球をＡｕｔｏＭＡＣＳ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して精製し、１０％ＡＢ−ヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＩＭＤＭ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での７〜１０日間の培養により、マクロファージに分化させた。５０，０００マクロファージの１００，０００ＧＦＰ＋腫瘍細胞との２時間の共培養により食作用アッセイを行い、次いで、高スループットサンプラーを有するＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。処置に使用された抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ４７クローン２Ｄ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＥｐＣａｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、およびリツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含んでいた。マクロファージは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４５、または抗ＣＤ２０６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用したフローサイトメトリーにより同定した。死細胞は、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）での染色により、分析から除外された。食作用は、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ９．４．１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して、ＧＦＰ＋マクロファージのパーセンテージとして評価し、各細胞系統に対するそれぞれの独立したドナーによる最大反応に正規化された。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後試験により決定し、示される場合には、データは、Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、Ｓ字用量反応曲線にフィッティングされた。
【０１４７】
食作用の生細胞画像化。  ＲＦＰ＋マウスマクロファージを生成し、以前に説明したように、生細胞画像化アッセイにおいて評価した。簡潔に説明すると、骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／Ｋａ  Ｒｏｓａ２６  ｍＲＦＰ１形質転換マウスから単離し、１０ｎｇ／ｍＬマウスＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）中で分化させた。５００，０００Ｒａｊｉ細胞を０．５?Ｍ  ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化し、５０，０００ＲＦＰ＋マクロファージと共培養し、３７℃および５％二酸化炭素に平衡化されたＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ  ＩＭＱ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像化した。
【０１４８】
マウス。Ｎｏｄ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、全てのインビボ実験に使用した。約６〜１０週齢でマウスに腫瘍をグラフトし、８〜１５のマウスの年齢および性別一致コホートで実験を行った。マウスは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒのケアの下、バリア施設内に維持し、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより認可されたプロトコルに従い取り扱った。
【０１４９】
腫瘍モデル。  ヒト結腸癌をモデル化するために、１・１０５ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋ＤＬＤ−１細胞を、ＮＳＧマウスの腹腔内に注入した。腫瘍小結節を、ＤＦＣ５００カメラ（Ｌｅｉｃａ）を備えるＭ２０５ＦＡ蛍光解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）上で可視化した。２５％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１．２５・１０５ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋６３９−Ｖ細胞をＮＳＧマウスの背側皮下組織内にグラフトすることにより、膀胱癌をモデル化した。ヒトリンパ腫の局在化モデルにおいて、１・１０６ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋Ｒａｊｉ細胞を、下脇腹に皮下グラフトした。全てのモデルにおいて、処置は、グラフトの確認後に開始し、示されたように継続した。全ての処置において、２００μｇのＳＩＲＰα変異体または抗体を、毎日のスケジュールで腹腔内注射により投与した。生物発光画像法により腫瘍増殖を監視し、腫瘍寸法を測定して、楕円の式（π／６・長さ・幅２）に従って体積を計算した。統計的有意性は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験またはＫｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＤｕｎｎの事後試験により適宜決定した。生存率は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ試験により分析した。
【０１５０】
血液学的分析。  後眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）から血液を採取し、二カリウム−ＥＤＴＡ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に収集した。ＨｅｍａＴｒｕｅ分析機（Ｈｅｓｋａ）を使用して、血液学的パラメータを評価した。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後試験により決定した。マウス全血に対するＳＩＲＰα−Ｆｃ変異体の結合は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したフローサイトメトリーにより決定した。
【０１５１】
生物発光画像法。  麻酔されたマウスに、無菌ＰＢＳ中１６．６７ｍｇ／ｍＬで再構成した２００μＬのＤ−ルシフェリン（蛍）カリウム塩（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を注射した。生物発光画像法は、２０分にわたりＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い、最大放射輝度を記録した。ピーク全フラックス値は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して対象解剖領域から評価し、分析に使用した。
【０１５２】
タンパク質配列。  本明細書に記載の実施例において使用されたタンパク質の中には、以下が含まれる：
ヒトＩｇＧ４のＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域、ならびに高親和性ＳＩＲＰα  ＦＤ６のｄ１ドメインを含む、ＦＤ６−ｈＩｇＧ４（ＦＤ６は下線付き、ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐは太字）：
（配列番号４０）
ＥＥＥＶＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＩＳＥＴＴＲＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＡＡＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ４のＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域、ならびに高親和性ＳＩＲＰαＣＶ１のｄ１  ドメインを含む、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４（ＣＶ−１は下線付き、ヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐは太字）。ＣＶ１アミノ酸置換は、ヒト野生型対立遺伝子２上に「構築」されていることに留意されたい：
（配列番号４１）
ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＡＴＬＲＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＶＳＤＴＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＤＶＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＡＡＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ２のＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域、ならびに高親和性ＳＩＲＰα  ＦＤ６のｄ１ドメインを含む、ＦＤ６−ｈＩｇＧ２（ＦＤ６は下線付き、ヒトＩｇＧ２は太字）：
（配列番号４２）
ＥＥＥＶＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＩＳＥＴＴＲＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＡＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ２のＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域、ならびに高親和性ＳＩＲＰα  ＣＶ−１のｄ１ドメインを含む、ＣＶ１−ｈＩｇＧ２（ＣＶ−１は下線付き、ヒトＩｇＧ２は太字）：
（配列番号４３）
ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＡＴＬＲＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＶＳＤＴＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＤＶＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＡＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＧＣＮ４ロイジン（ｌｅｕｚｉｎｅ）ジッパー融合体：
ＧＣＮ４に融合したＦＤ６のｄ１ドメインを含み、ロイシンジッパー機能を使用して二量体化する、ＦＤ６−ジッパー（ＦＤ６は下線付き、ＧＣＮ４ロイシンジッパーは太字）：
（配列番号４４）
ＥＥＥＶＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＩＳＥＴＴＲＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＡＡＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＡＡＳＧＡＤ
コンカタマーコンストラクト：
ＦＤ６コンカタマー（ＦＤ６は下線付き、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー、ＦＤ６は下線付き）
（配列番号４５）
ＥＥＥＶＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＩＳＥＴＴＲＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＥＥＶＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＩＳＥＴＴＲＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ
【０１５３】
選択された配列の表
【表１】
2020143104.tif 000002
【０１５４】
例示的な実施形態
１．  高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを欠き、野生型ＳＩＲＰα配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記アミノ酸修飾は、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαポリペプチドの親和性を増加させる、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチド。
２．  前記高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、ＣＤ４７に対し少なくとも１×１０−９ＭのＫＤを有する、実施形態１に記載のポリペプチド。
３．  前記高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、ＣＤ４７に対し少なくとも１×１０−１０ＭのＫＤを有する、実施形態１に記載のポリペプチド。
４．  前記ポリペプチドは、ＳＩＲＰαのｄ１ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。
５．  前記ＳＩＲＰα  ｄ１ドメインの全てまたは一部からなる、実施形態４に記載のポリペプチド。
６．  ｄ１ドメインの外のＳＩＲＰαからのアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のポリペプチド。
７．  アミノ酸修飾は、ＳＩＲＰαの疎水性コア残基のセット内のアミノ酸の１つ以上でなされる、実施形態４に記載のポリペプチド。
８．  前記疎水性コア残基のセットは、配列番号１に比べて、Ｌ４、Ｖ６、Ｖ２７、Ｉ３６、Ｆ３９、Ｌ４８、Ｉ４９、Ｙ５０、Ｆ５７、Ｖ６０、Ｍ７２、Ｆ７４、Ｉ７６、Ｖ９２、Ｆ９４およびＦ１０３を含む、実施形態７に記載のポリペプチド。
９．  アミノ酸修飾は、ＣＤ４７と相互作用する接触残基のセット内のアミノ酸の１つ以上でなされる、実施形態４に記載のポリペプチド。
１０．  前記接触残基のセットは、配列番号１に比べて、Ａ２９、Ｌ３０、Ｉ３１、Ｐ３２、Ｖ３３、Ｇ３４、Ｐ３５、Ｑ５２、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｓ６６、Ｔ６７、Ｋ６８、Ｒ６９、Ｆ７４、Ｋ９３、Ｋ９６、Ｇ９７、Ｓ９８、およびＤ１００を含む、実施形態９に記載のポリペプチド。
１１．  アミノ酸残基は、組み合わされた接触残基のセットおよび疎水性コア残基のセット内の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、および１４個以下のアミノ酸で修飾される、実施形態４に記載のポリペプチド。
１２．  アミノ酸修飾は、残基Ｌ４、Ｖ６、Ａ２１、Ｖ２７、Ｉ３１、Ｅ４７、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｓ６６、Ｋ６８、Ｖ９２、Ｆ９４、およびＦ１０３、またはそれらの組み合わせを制限なく含むセット内のアミノ酸の１つ以上でなされる、実施形態４に記載のポリペプチド。
１３．  （１）Ｌ４Ｖ；Ｌ４Ｉ；（２）Ｖ６Ｉ；Ｖ６Ｌ；（３）Ａ２１Ｖ；（４）Ｖ２７Ｉ；Ｖ２７Ｌ；（５）Ｉ３１Ｔ；Ｉ３１Ｓ；Ｉ３１Ｆ；（６）Ｅ４７Ｖ；Ｅ４７Ｌ；（７）Ｋ５３Ｒ；（８）Ｅ５４Ｑ；（９）Ｈ５６Ｐ；Ｈ５６Ｒ；（１０）Ｓ６６Ｔ；Ｓ６６Ｇ；（１１）Ｋ６８Ｒ；（１２）Ｖ９２Ｉ；（１３）Ｆ９４Ｌ；Ｆ９４Ｖ；（１４）Ｖ６３Ｉ；および（１５）Ｆ１０３Ｖから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、実施形態１２に記載のポリペプチド。
１４．  ・Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；およびＦ１０３Ｖ、
・Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１ＳまたはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｆ９４ＬまたはＦ９４Ｖ；およびＦ１０３Ｖ、
・Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｖ２７ＩまたはＶ２７Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７ＶまたはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６ＴまたはＳ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ９４ＬまたはＦ９４Ｖ、
・Ｌ４ＶまたはＬ４Ｉ；Ｖ６ＩまたはＶ６Ｌ；Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、またはＩ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ、またはＥ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６ＰまたはＨ５６Ｒ；Ｓ６６Ｔ、またはＳ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；およびＳ６６Ｔ、
・Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｖ６３Ｉ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；およびＶ９２Ｉ、
・Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；およびＦ１０３Ｖ、
・Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；およびＶ９２Ｉ
から選択されるアミノ酸修飾を含む、実施形態１３に記載のポリペプチド。
１５．  ・（配列番号３）に示されるような｛Ｖ２７Ｉ；Ｋ５３Ｒ；Ｓ６６Ｔ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｆ１０３Ｖ｝；
・（配列番号４）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ２７Ｌ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ｝；
・（配列番号５）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；Ｆ９４Ｌ｝；
・（配列番号６）に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｓ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ９４Ｌ｝；
・（配列番号７）に示されるような｛Ｌ４Ｉ；Ａ２１Ｖ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｒ；Ｓ６６Ｇ；Ｆ９４Ｖ；Ｆ１０３Ｖ｝；
・（配列番号８）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｒ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ９４Ｌ｝；または
・（配列番号９）に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｌ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ１０３Ｖ
・例えば配列番号３７に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｌ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ｝、
・例えば配列番号３８に示されるような｛Ｌ４Ｖ；Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｖ６３Ｉ；Ｓ６６Ｔ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ｝、
・例えば配列番号３９に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｔ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｇ；Ｋ６８Ｒ；Ｖ９２Ｉ；Ｆ１０３Ｖ｝、
・例えば配列番号１０に示されるような｛Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ｉ３１Ｆ；Ｅ４７Ｖ；Ｋ５３Ｒ；Ｅ５４Ｑ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｔ；Ｖ９２Ｉ｝
から選択されるアミノ酸修飾を含む、実施形態１３に記載のポリペプチド．
１６．  免疫グロブリンＦｃ配列に融合した、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
１７．  前記高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、多量体である、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
１８．  前記高親和性ＳＩＲＰαポリペプチドは、単量体である、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
１９．  実施形態１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む治療製剤。
２０．  検出可能な標識をさらに含む、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
２１．  ＣＤ４７を発現する細胞の食作用を調節する方法であって、前記細胞を実施形態１９の製剤と接触させることを含む方法。
２２．  前記細胞を腫瘍特異的抗体と接触させることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．  前記接触させることは、インビトロである、実施形態２１に記載の方法。
２４．  前記接触させることは、インビボである、実施形態２１に記載の方法。
２５．  ＣＤ４７を発現する前記細胞は、癌細胞である、実施形態１８に記載の方法。
２６．  腫瘍を画像化する方法であって、がん細胞を実施形態２０に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【図１】
2020143104.tif 000003
【図２】
2020143104.tif 000004
【図３】
2020143104.tif 000005
【図４】
2020143104.tif 000006
【図５】
2020143104.tif 000007
【図６】
2020143104.tif 000008
【図７】
2020143104.tif 000009
【図８】
2020143104.tif 000010
【図９】
2020143104.tif 000011
【図１０】
2020143104.tif 000012
【図１１】
2020143104.tif 000013
【図１２】
2020143104.tif 000014
【図１３】
2020143104.tif 000015
【図１４】
2020143104.tif 000016
【図１５】
2020143104.tif 000017
【図１６】
2020143104.tif 000018
【図１７】
2020143104.tif 000019
【配列表】
2020143104000001.app