(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＰＴＧ等の発現誘導剤を必要とせず、かつ蛍光を発した株を選択（ポジティブセレクション）することでインサートＤＮＡが導入されたベクターを含有する株をスクリーニング可能なベクターの提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。
（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
【請求項２】
発色団を有するタンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４〜２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項１又は２記載のベクター。
【請求項４】
配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のベクター。
【請求項５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えた、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法。
（ａ）請求項１〜４のいずれか記載のベクターにインサートＤＮＡをライゲーションして、インサートＤＮＡを含むベクターを作製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で作製したインサートＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程；
（ｃ）工程（ｂ）でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程；
【請求項６】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、請求項１〜４のいずれか記載のベクターと、請求項５又は６に記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は形質転換体のスクリーニングに用いることが可能なベクターや、かかるベクターを用いてインサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法や、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子クローニングは、遺伝子工学実験の基礎技術の一つである。生命科学に関する基礎研究やバイオテクノロジーの応用分野等の様々な場面で日常的に利用されている。制限酵素が発見されて以降、遺伝子クローニングは汎用性の高い手法として浸透し、さらに近年では、ＤＮＡ配列に依存しないシームレスクローニング（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法等）の発達により、自由なＤＮＡ配列の改変が可能になっている。その一方で、クローニングが成功したかどうかを判別するスクリーニング方法は、現在でも限定的である。
【０００３】
現在最も広く知られるスクリーニング方法は、「ブルー・ホワイトスクリーニング」である。β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：β−ｇａｌ）遺伝子の産物が無色の試薬である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｘ−ｇａｌ）を加水分解し、青い色素を生成する性質に基づく方法である。簡単に説明すると、まず、β−ｇａｌ遺伝子の内部にインサートＤＮＡ配列（目的ＤＮＡ配列）をライゲーションしたプラスミドベクターを作製する。そのプラスミドベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に形質転換し（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｘ−ｇａｌを含む寒天プレートに播種し一晩培養する。その後、形成された青色のコロニーはβ−ｇａｌ遺伝子がそのままの状態（インサートＤＮＡが入っていない、すなわちハズレ）を示し、白色のコロニーはβ−ｇａｌ遺伝子が破壊された状態（インサートＤＮＡが入っている、すなわちアタリ）を示すため、青色・白色で目的のコロニーをスクリーニングすることができる。
【０００４】
しかしこの方法には、以下のような問題点がある。まず、形質転換体が白と青の中間色を示す場合があることや、インサートＤＮＡが短い時にインサートＤＮＡを有するコロニーとインサートＤＮＡを有さないコロニーとの区別が難しいこと等により識別が難しく、信頼性がそもそも高いとはいえない。また、色素原基質としてＸ−ｇａｌを培地に添加することに加え、β−ｇａｌ遺伝子の発現を高める為にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）も培地に添加する。これらの試薬は、熱や光に弱く不活化しやすいため、使用する直前に個別の寒天プレートに逐一塗り広げる等する必要があり、作業が非常に煩雑である。さらに、プラスミドベクターの宿主株として、野生型ｌａｃＺの欠損に加えてＬａｃＺのωフラグメントのみをコードしているｌａｃＺΔＭ１５遺伝子を持つ変異株を用いなければならないという制限もあった。
【０００５】
上記「ブルー・ホワイトスクリーニング」に代わる技術も開発されている。例えば、プロモーター／オペレーター領域とＧＦＰ遺伝子の間にマルチクローニング部位を設けたベクター（非特許文献１参照）が開示されている。かかるベクターを用いれば、コロニーの緑色蛍光によってインサートの挿入の有無を判別することができる。さらに、ＧＦＰ遺伝子の上流及び下流にマルチクローニング部位を設けたベクター（非特許文献２参照）や、ＧＦＰのオープンリーディングフレームの上流にストップコドンを設けたベクター（特許文献１、非特許文献３参照）が開示されている。
【０００６】
また、「ブルー・ホワイトスクリーニング」方法のβ−ｇａｌ遺伝子の代わりにＧＦＰ遺伝子を用いて、目的ＤＮＡ配列挿入をＧＦＰ蛍光の有無によって確認する方法（特許文献２参照）が開示されている。この方法では、インサートＤＮＡが導入された場合には発現するＧＦＰの構造が変化することで緑色蛍光性が損なわれることを利用して、緑色蛍光を発しない株をインサートＤＮＡが導入された株として選択するというものであった。この方法は、ブルー・ホワイトスクリーニングと比較すると偽陽性が少ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５０１１９２号公報
【特許文献２】特開２００１−２０４４７４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Inouye,  S.  et  al.,  (1997).  Gene  189,  159−162.
【非特許文献２】Tang,  J.,  Liang,  S.,  Zhang,  J.,  Gao,  Z.,  and  Zhang,  S.   (2009) Analytical Biochemistry 388,173-174.
【非特許文献３】Banerjee,  S.,  Kumar,  J.,  Apte-Deshpande,  A.,  and  Padmanabhan,  S.  (2010).  Microb.  Cell  Fact.  9,  30.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記非特許文献１に記載の方法では、コロニーの色の判別が難しいという問題や、ＩＰＴＧを必要とするという問題があった。さらに、上記特許文献１及び非特許文献３に記載の方法では、ＧＦＰ蛍光が出現することでクローニングの成否を判定するが、ＧＦＰだけではなく、挿入したインサートＤＮＡ断片も同時に翻訳されて発現するため、その毒性等で生育を阻害することが起こりうる。
【００１０】
また、上記特許文献２に記載の方法では、基本的にはＩＰＴＧ等の発現誘導剤を必要とすることからコストがかかる上、作業の煩雑さは根本的に変わっていない。しかも、突然変異が生じる等の何らかの要因でＧＦＰ蛍光が消失する場合もあり、偽陽性が生じる可能性も残されていた。そこで、本発明の課題は、ＩＰＴＧ等の発現誘導剤を必要とせず、かつ蛍光を発した株を選択（ポジティブセレクション）することでインサートＤＮＡが導入されたベクターを含有する株をスクリーニング可能なベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細胞性粘菌のミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）遺伝子に着目し、ｍｌｃＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと共にリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ：ＲＢＳ）をコードするポリヌクレオチドとＧＦＰ遺伝子コードするポリヌクレオチドを、汎用されているｐＵＣベクターに組み込んで大腸菌を形質転換したところ、形質転換体において緑色蛍光を発することを確認した。さらに、ｍｌｃＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドの中でも、３’末端から少なくとも１０ｂｐ（停止コドンは含まず）の領域を含むことで緑色蛍光の発色が確認できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。
（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
［２］発色団を有するタンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする上記［１］記載のベクター。
［３］リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４〜２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のベクター。
［４］配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のベクター。
［５］以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えた、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法。
（ａ）上記［１］〜［４］のいずれか記載のベクターにインサートＤＮＡをライゲーションして、インサートＤＮＡを含むベクターを作製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で作製したインサートＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程；
（ｃ）工程（ｂ）でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程；
［６］宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする上記［５］記載の方法。
［７］インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、上記［１］〜［４］のいずれか記載のベクターと、上記［５］又は［６］に記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＩＰＴＧを用いず、かつ蛍光の有無によって組換えコンストラクトをスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」の作製工程において、ｍｌｃＲ遺伝子とフォワードプライマー、リバースプライマーの位置関係を示した図である。
【図２】プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」のマップを示す図である。
【図３】実施例１において、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」及び「ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩暗黒環境下にて培養し、青色ＬＥＤ照射下で撮影した写真である。
【図４】実施例１において、緑色蛍光を発することが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩暗黒環境下にて培養後、培養液を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図５】実施例１において、赤色蛍光を発することが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩暗黒環境下にて培養後、培養液を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図６】実施例２において、（ａ）はｍｌｃＲの欠損部位を表す図であり、（ｂ）は欠損ｍｌｃＲ−ＧＦＰ形質転換体を培養し、ＧＦＰの蛍光強度（Ｚ  ｓｃｏｒｅ）を蛍光顕微鏡で観察して計算した結果を示す図である。
【図７】実施例３において、ＧＦＰ発現の有無における菌の生育速度及びプラスミドベクター収量を比較した結果を示す図である。（ａ）における横軸は時間、縦軸は生育開始時の細胞濃度を１とした場合の相対細胞濃度を示す。（ｂ）における縦軸はプラスミドベクターの収量を示す。
【図８】実施例４において、連結した３つのＤＮＡ断片の概念図である。
【図９】実施例４において、３つのＤＮＡ断片を連結して作製したプラスミドベクターを大腸菌に形質転換して、緑色蛍光を有するコロニーを選択した後、コロニーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を行った結果を示す図である。図中、矢印は約１５００ｂｐの位置を示す。
【図１０】実施例５において、インサートＤＮＡを含むプラスミドベクターを大腸菌に形質転換して、緑色蛍光を有するコロニーを選択した後、コロニーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を行ってインサートＤＮＡの有無を確認した結果を示す図である。横軸は緑色蛍光（ＧＦＰ）が観察されなかったコロニーの割合、縦軸は緑色蛍光（ＧＦＰ）が観察されなかったコロニーのうち、インサートＤＮＡを有していたものの割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明におけるベクターは、（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター（以下、「本件ベクター」ともいう）であればよく、かかるベクターを用いれば、ＩＰＴＧを用いず、かつ蛍光の有無によって組換えコンストラクトをスクリーニングすることが可能となる。
【００１６】
本件ベクターにおけるミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）は、アクチン上を動くモータータンパク質であるミオシンＩＩの構成要素である。かかるミオシン調節軽鎖は、細胞分裂、細胞の運動、細胞の形態変化等の機能に関与していることが知られている。
【００１７】
上記ミオシン調節軽鎖の由来としては、細胞性粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、真正粘菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）、襟鞭毛虫、海綿、線虫等の環形動物、ショウジョウバエ等の昆虫、ホヤ等の尾索動物、ギボシムシ等の半索動物、ウニ等の棘皮動物、ナメクジウオ等の頭索動物、ゼブラフィッシュ等の魚類、アフリカツメガエル等の両生類、ニワトリ等の鳥類、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を挙げることができ、細胞性粘菌を好適に挙げることができる。
【００１８】
ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドは、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。細胞性粘菌由来のミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１９】
ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの部分配列とは、ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドの一部が欠損した配列を意味する。かかるミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの部分配列としては、
配列番号２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４７４〜４８３番目の１０塩基）や、
配列番号３に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４６４〜４８３番目の２０塩基）や、
配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５９〜４８３番目の２５塩基）や、
配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５４〜４８３番目の３０塩基）や、
配列番号６に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４４４〜４８３番目の４０塩基）や、
配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４３９〜４８３番目の４５塩基）や、
配列番号８に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４２４〜４８３番目の６０塩基）や、
配列番号９に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４１０〜４８３番目の７４塩基）や、
配列番号１０に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の３７４〜４８３番目の１１０塩基）や、
配列番号１１に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２４９〜４８３番目の２３５塩基）や、
配列番号１２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２１９〜４８３番目の２６５塩基）や、
配列番号１３に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の１２９〜４８３番目の３５５塩基）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含む」とは、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列、すなわち配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチド中の３’末端側の１０塩基を含んでいればよいことを意味する。具体的には、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドでもよく、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチド中の３’末端側の１０塩基を含んでいる限り、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）中の５’末端側の任意の塩基が欠損した部分配列をコードするポリヌクレオチドでもよい。
【００２１】
本明細書において、「少なくとも９０％以上の配列同一性」とは、配列同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を意味する。
【００２２】
「上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有する塩基配列」とは、換言すると、「上記（１）記載のポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチド」であり、かつ、上記（１）記載のポリヌクレオチドと同等の機能を有する塩基配列である。ここで、「１若しくは数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの長さに応じて適宜調整できるが、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、さらにより好ましくは１〜５個の範囲内、特に好ましくは１〜３個の範囲内、最も好ましくは１〜２個の範囲内の数のポリヌクレオチドが欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチドを意味する。これらポリヌクレオチドの変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。
【００２３】
本件ベクターにおけるリボソーム結合サイト（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ：ＲＢＳ）をコードするポリヌクレオチドとは、原核生物のｍＲＮＡにおいて翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＵＵ、ＣＵＧ）の約３〜９塩基上流に位置するプリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富むポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡにリボソームを動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによってタンパク質合成を開始させるサイトである。リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドとしては、シャイン・ダガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づいて設計することができる。具体的には、プリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富む４〜９塩基からなるポリヌクレオチドを挙げることができ、ＧＧＡＧ、ＡＧＧＡ、ＧＧＡＧＧ、ＡＧＧＡＧ、ＧＧＡＧＧＴ、ＡＧＧＧＡＧ、ＧＡＧＧＡＧ、ＡＧＧＡＧＧ、ＡＧＧＡＧＧＴ、ＡＧＡＧＧＡＧＡ等を挙げることができる。
【００２４】
リボソーム結合サイトとして機能する任意のプリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富む配列の活性は、任意の好適な方法を使用して試験することができる。例えば、発現は、国際公開第２００４／０４６３２１号パンフレットの実施例１に記載のとおり、ｍＲＮＡによりコードされるレポータータンパク質の活性を計測することにより計測することができる。
【００２５】
本件ベクターにおける発色団とは、タンパク質が色をもつために必要とされる原子団を意味し、具体的には、不飽和結合系に作用して共役系を延長したり電荷の偏りを偏重させる原子団である。かかる発色団を有するタンパク質としては、蛍光タンパク質、色素タンパク質、発光タンパク質を挙げることができ、蛍光タンパク質を好適に挙げることができる。
【００２６】
蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＥＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、ｍＣｈｅｒｒｙ等が挙げられ、これらの改変体等を利用してもよい。改変体としては、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰ、ｍＦｒｕｉｔｓ、ｍＲｕｂｙ等が挙げられる。
【００２７】
色素タンパク質としては、色素と結合しているタンパク質であればよく、ヘモグロビン、チトクロム、ミオグロビン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等のヘムタンパク質や、ヘモシアニン、フェリチン等の金属錯化合物や、フィコエリトリン、フィコシアニン等のフィコ色素タンパク質等を挙げることができる。
【００２８】
発光タンパク質としては、ルシフェリン等を挙げることができる。
【００２９】
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間には、任意の塩基配列からなるスペーサー配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、４〜２０塩基、好ましくは５〜１１塩基、より好ましくは６〜１０塩基からなるポリヌクレオチドであり、かかる配列により、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける開始コドンが、翻訳制御機能を発揮できる適切な距離で配置されることなる。スペーサー配列の塩基としては特に制限されず、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのいずれの塩基でもよい。
【００３０】
本明細書における、
（ａ）本件ベクターにインサートＤＮＡをライゲーションして、インサートＤＮＡを含むベクターを作製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で作製したインサートＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程；
（ｃ）工程（ｂ）でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程；
の工程（ａ）〜（ｃ）を備えた、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法（以下、「本件スクリーニング方法」ともいう）におけるインサートＤＮＡとは、ベクターに連結するＤＮＡであれば特に制限されず、目的とするタンパク質遺伝子の全長又は一部を含むＤＮＡや、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー、デゴイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等の機能性核酸を発現しうるＤＮＡを挙げることができ、生体由来のＤＮＡでも、人工的に合成されたＤＮＡでもよい。また、かかるインサートＤＮＡは、宿主細胞において発現が最適化されるように改変されたＤＮＡであってもよい。
【００３１】
本件スクリーニング方法におけるベクターとしては、原核生物内でインサートＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現できるベクターであれば良く、プラスミドベクター、フォスミド、コスミド、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等を挙げることができ、プラスミドベクターであることが好ましい。プラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ４等の大腸菌で複製可能なプラスミドベクターや、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌で複製可能なプラスミドベクターを挙げることができる。
【００３２】
また、上記ベクターには、プロモーター、複製開始点、オペレーター、薬剤耐性遺伝子、マルチクローニング部位、異化活性化タンパク質結合サイト（Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでもよい。
【００３３】
上記プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰ  ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔ１プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３４】
上記複製開始点としては、用いる宿主細胞に合わせて適宜選択すればよく、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＢＲ３２２由来の複製開始点を挙げることができる。
【００３５】
上記オペレーターとしては、用いる宿主細胞に合わせて適宜選択すればよく、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｌａｃオペレーターを挙げることができる。
【００３６】
上記薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００３７】
本件ベクターにインサートＤＮＡをライゲーションする場合において、インサートＤＮＡをライゲーションする位置は、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
ポジティブセレクションによりスクリーニングを行う場合には、インサートＤＮＡをライゲーションする位置として、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチド、及び発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド」からなる塩基配列以外の位置、好ましくは「発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端の下流」を選択することができる。
【００３９】
一方、ネガティブセレクションスクリーニングを行う場合には、インサートＤＮＡをライゲーションする位置として、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチド、及び発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列」中のいずれかの位置や、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチ」と「リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチド」との間、「リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチド」と「発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド」との間の位置を選択することができる。また、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチド、及び発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列」の全部又は一部配列とインサートＤＮＡが置換するようにインサートＤＮＡを本件ベクターにライゲーションしてもよい。
【００４０】
インサートＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する方法は特に制限されず、カルシウムリン酸法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を挙げることができる。
【００４１】
本件スクリーニング方法における宿主細胞としては真正細菌又は枯草菌、すなわち原核生物であればよく、真正細菌としては、大腸菌等のグラム陰性細菌や枯草菌等のグラム陽性細菌を挙げることができ、大腸菌を好適に挙げることができる。
【００４２】
宿主細胞における発色の有無の確認は、目視観察や顕微鏡観察を挙げることができる。観察の際には、用いる蛍光団を有するタンパク質における蛍光団の特徴に合わせた特定の波長の光を照射したうえで観察したり、オレンジフィルター等のフィルターを通して観察してもよい。また、蛍光タンパク質の発色を観察する場合には、蛍光顕微鏡を用いてもよい。
【００４３】
本発明におけるキットとしては、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、上記のいずれか記載の本件ベクターと、上記本件スクリーニング方法に記載の方法を実施するための説明書を含むキット（以下、「本件キット」ともいう）であればよい。
【００４４】
本件キットには、本件ベクター及び上記説明書の他に、例えば、滅菌水、生理食塩水、界面活性剤、緩衝剤、保存剤、形質転換用試薬等を必要に応じて含んでいてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。なお、大腸菌の培養、プラスミドベクターの作製、蛍光顕微鏡観察、大腸菌の増殖測定については以下の手順によって行った。
【００４６】
［大腸菌の培養］
大腸菌はＫ−１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）を用いた。ＬＢ培地は市販のＬＢ培地（日本ジェネティクス社）を用いた。ＬＢ寒天培地は、市販寒天（和光純薬工業社）を上記ＬＢ培地に追添加し作製した。培養は、３７℃にて暗黒環境下で行なった。
【００４７】
［プラスミドベクターの作製］
（１）ＧＦＰ発現プラスミドベクター「ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」の作製
ｍＥＧＦＰ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、単に「ＧＦＰ」ともいう）遺伝子が挿入されていたプラスミドベクターＧＦＰ−ｐＵＣ１９ｋａｎ（ファスマック社）を鋳型に、以下のプライマーを使ってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ｍＥＧＦＰ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー  配列番号１４
ＧＦＰ＿ＦＯＲ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧ
リバースプライマー    配列番号１５
ＧＦＰ＿ＲＥＶ：ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡ
【００４８】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＸｂａＩ（「５’−ＴＣＴＡＧＡ−３’」）及びＢａｍＨＩ（「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」）で処理し、ｐＵＣ１９ベクター（タカラバイオ社）に挿入し、プラスミドベクター「ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を作製した。なお、上記フォワードプライマーＧＦＰ＿ＦＯＲには、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩサイト及びＧＦＰの開始コドン（下線：ＡＴＧ）が含まれ、上記リバースプライマーＧＦＰ＿ＲＥＶには、ＢａｍＨＩサイト及び停止コドン（下線：ＣＴＡ）が含まれる。
【００４９】
（２）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」の作製
（２−１）ｍｌｃＲ遺伝子の増幅
発明者らが公知の手法に基づいて作製した細胞性粘菌ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、耐熱性ＤＮＡ複製酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、ＰＣＲでｍｌｃＲ遺伝子を増幅した。このときＰＣＲは増幅効率を高めるために２種類のリバースプライマーを用いて２段階で行った。１回目のＰＣＲは、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ、ＢｇｌII切断サイトを含むフォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ−ＦＷ  ５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣ−３’と、３’末端側にＲＢＳ及びスペーサーの一部の配列の相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１７：ｍｌｃＲ−ＲＶ１  ５’−ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧ−３’）を設計して用いた。２回目のＰＣＲは、上記フォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ−ＦＷ）と、３’末端側にＲＢＳ、スペーサーの全配列及びＢａｍＨＩ切断サイトの相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１８：ｍｌｃＲ−ＲＶ２  ５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’）を設計して用いた。ｍｌｃＲ遺伝子と上記フォワードプライマー、リバースプライマーの位置関係を示した図を図１に示す。
【００５０】
（２−２）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクターの作製
上記で得られたｍｌｃＲ遺伝子の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、分離及び精製後、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素消化し、同様にＢｇｌＩＩで消化した上記プラスミドベクター「ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」とライゲーションを行い、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を作製した。さらに、大腸菌Ｋ−１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）に上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養して形質転換を行なった。得られた形質転換体をさらにアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、市販のプラスミドベクター精製キット：ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ（日本ジェネティクス社）によりプラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を精製した。
【００５１】
なお、配列番号１７に示すｍｌｃＲ−ＲＶ１の３〜８番目の６塩基、及び配列番号１８に示すｍｌｃＲ−ＲＶ２の１２〜１７番目の６塩基はＲＢＳ（リボソーム結合サイト）の相補配列、配列番号１７に示すｍｌｃＲ−ＲＶ１の１〜２番目の塩基はスペーサー配列の一部の相補配列、配列番号１８に示すｍｌｃＲ−ＲＶ２の３〜１１番目の塩基はスペーサー配列の相補配列である。
【００５２】
ここで、上記のｍｌｃＲ−ＲＶ１及びｍｌｃＲ−ＲＶ２プライマーを使うことによって配列番号１に示すｍｌｃＲをコードするポリヌクレオチドの４８０位に塩基置換（本来アデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ））が生じる。そこで、生じた塩基置換を修正（グアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に修正）するために、フォワードプライマー：ｍｌｃＲ−ｒｅｐａｉｒ−ＦＷ（配列番号１９：５’−ＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴ−３’）及びリバースプライマー：ｍｌｃＲ−ｒｅｐａｉｒ−ＲＶ（配列番号２０：５’−ＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧ−３’）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより増幅した。増幅産物を大腸菌Ｋ−１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）に導入してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養して形質転換を行なった。得られた形質転換体をさらにアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、上記と同様の方法でプラスミドベクターを精製し、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を得た。得られたプラスミドベクターのマップを図２に示す。図２中、ＣＡＰはｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、Ｐｌａｃはｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｌａｃＯはｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒを示す。
【００５３】
（３）ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクター「ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｐＵＣ１９」の作製
ｍｌｃＲなしのコントロールとして、上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」をテンプレートとして、ｍｌｃＲをコードするポリヌクレオチドの３’末端のさらに３’側（下流）のグアニン（Ｇ）を含むフォワードプライマー：ＲＢＳ−ＦＷ（配列番号２１：５’−ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣ−３’）と上記リバースプライマー：ＧＦＰ＿ＲＥＶ（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより増幅後、制限酵素（ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）処理したｐＵＣ１９に挿入して、プラスミドベクター「ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｐＵＣ１９」を作製した。
【００５４】
（４）欠損ｍｌｃＲ−ＧＦＰキメラ遺伝子の作製
上記（２）で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を鋳型に、ｍｌｃＲ遺伝子の全長４８３ｂｐにおける３’末端（停止コドンは含まず）から１０、２０、２５、３０、４０、４５、６０、７４，１１０、２３５、２６５、３５５ｂｐの部分塩基配列をＰＣＲによって増幅し、ｍｌｃＲ遺伝子の５’末端側から所定の領域を欠損させた欠損ｍｌｃＲ−ＧＦＰキメラ遺伝子断片（それぞれ順にｍｌｃＲ_Ｒ１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２０、ｍｌｃＲ_Ｒ２５、ｍｌｃＲ_Ｒ３０、ｍｌｃＲ_Ｒ４０、ｍｌｃＲ_Ｒ４５、ｍｌｃＲ_Ｒ６０、ｍｌｃＲ_Ｒ７４、ｍｌｃＲ_Ｒ１１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２３５、ｍｌｃＲ_Ｒ２６５、ｍｌｃＲ_Ｒ３５５断片）を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは、増幅産物の５’末端側にＸｂａＩ切断サイト、３’側にＢａｍＨＩ切断サイトを含むように設計した。
【００５５】
得られたそれぞれのｍｌｃＲの部分塩基配列をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その後同じＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＵＣ１９とライゲーションすることで、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」における配列番号１に示すｍｌｃＲの全長（ｆｕｌｌ）を、ｍｌｃＲの５’末端から所定の領域を欠損させた部分塩基配列（配列番号２〜１３）に置き換えたプラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿１０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿６０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿７４−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿１１０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２３５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２６５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３５５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を作製した。
【００５６】
（５）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、及びｍＲｕｂｙ３発現プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｍＲｕｂｙ−ｐＵＣ１９」の作製
上記ｍＥＧＦＰ遺伝子の代わりにｍＲｕｂｙ３遺伝子（Bajar,  B.T.  et  al.,  2016.  Improving  brightness  and  photostability  of  green  and  red  fluorescent  proteins  for  live  cell  imaging  and  FRET  reporting.  Sci  Rep,  6,  p.20889.）を用いた以外は、上記と同様の用法を行って、「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｍＲｕｂｙ−ｐＵＣ１９」を作製した。
【００５７】
［蛍光顕微鏡観察］
カバーガラス（２４×６０ｍｍ：松浪硝子工業社）に大腸菌培養液を５μＬ滴下し、その上に１．５％アガロース片（８×８×１ｍｍ）を被せ、さらにカバーガラス（１８×１８ｍｍ：松浪硝子工業社）を被せ、励起光源として水銀ランプが搭載された倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、観察を行なった。ｍＥＧＦＰ又はｍＲｕｂｙ３の蛍光のＺ  ｓｃｏｒｅは、以下のように計算した。なお、大腸菌の蛍光値は、大腸菌内の任意の１箇所を代表値として用いた。背景蛍光は、カバーガラス上で大腸菌が観察されない任意箇所を用いた。
【００５８】
Ｚ  ｓｃｏｒｅ＝(大腸菌の蛍光値−１０箇所の背景蛍光の平均値)／(１０箇所の背景蛍光の標準偏差)
【００５９】
［大腸菌の増殖測定］
分光光度計（島津製作所）を用いて、６００ｎｍでの吸光度を測定し求めた。
【００６０】
［実施例１］形質転換体の観察
上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ｍｌｃＲ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）、及びコントロールとして上記プラスミドベクター「ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）をＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩暗黒環境下にて培養し、青色ＬＥＤ照射下で撮影した写真を図３に示す。図３中、左上がＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、右下がｍｌｃＲ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株である。
【００６１】
さらに、ＬＢ培地を加えたカルチャーチューブに、上記で緑色蛍光を発することが確認されたコロニーを加えて一晩暗黒環境下にて培養後、大腸菌培養液を上述の蛍光顕微鏡観察方法によって観察した結果を図４に示す。
【００６２】
図３、図４より、ｍｌｃＲ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株では、ＬＢ培地で培養するだけで恒常的に緑色蛍光を発することが確認された。したがって、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドの上流にｍｌｃＲ遺伝子及びＲＢＳをコードするポリヌクレオチドを配置するだけで、ＧＦＰを恒常的に発現させることが可能であることが明らかとなった。
【００６３】
なお、上記における「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」の代わりに上記「ｍｌｃＲ４８０Ｇ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」で大腸菌を形質転換した場合も、同様に恒常的に緑色蛍光を発することが確認された（図示なし）。すなわち、ｍｌｃＲをコードする塩基配列の一部が変異した配列であっても、恒常的に緑色蛍光を発することに影響はないことが確認された。
【００６４】
さらに、上記における「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」の代わりに「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｍＲｕｂｙ−ｐＵＣ１９」で大腸菌を形質転換した以外は、上記と同様の方法で蛍光顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。図５に示すように、ｍＲｕｂｙ３をコードするポリヌクレオチドの上流にｍｌｃＲ遺伝子及びＲＢＳをコードするポリヌクレオチドを配置するだけで、恒常的に赤色蛍光を発することが可能であることが明らかとなった。
【００６５】
［実施例２］欠損ｍｌｃＲ−ＧＦＰ形質転換体の蛍光強度
ｍｌｃＲ全長の塩基配列の代わりに、ｍｌｃＲの５’末端から所定の領域を欠損させた部分塩基配列に置き換えたそれぞれのプラスミドベクターを用い、実施例１と同様の方法で大腸菌Ｋ−１２由来株のＨＳＴ０８に形質転換して培養し、ＧＦＰの蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示す。図６中、（ａ）はｍｌｃＲの欠損部位を表す図であり、（ｂ）はそれぞれのプラスミドベクターで形質転換した株のＧＦＰ蛍光強度（Ｚ  ｓｃｏｒｅ）を示す図である。また、図６中「ｍｌｃＲ＿１０」、「ｍｌｃＲ＿２０」「ｍｌｃＲ＿２５」「ｍｌｃＲ＿３０」「ｍｌｃＲ＿４０」「ｍｌｃＲ＿４５」「ｍｌｃＲ＿６０」「ｍｌｃＲ＿７４」「ｍｌｃＲ＿１１０」「ｍｌｃＲ＿２３５」「ｍｌｃＲ＿２６５」「ｍｌｃＲ＿３５５」、「ｍｌｃＲ＿ｆｕｌｌ」はそれぞれ上記で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿１０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿２０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿６０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿７４−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿１１０−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２３５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２６５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３５５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。さらに、ＧＦＰはプラスミドベクターＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、ＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒはプラスミドベクター「ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。
【００６６】
図６（ｂ）に示すように、ｍｌｃＲ遺伝子の５’末端側の一部を欠損してもＧＦＰの蛍光が観察された。特に、蛍光強度に関して、ｍｌｃＲ遺伝子の３’末端から１０塩基の部分塩基配列を用いた場合、コントロールのＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒと比較して２７倍ものＺ  ｓｃｏｒｅを有していた。また、ｍｌｃＲ遺伝子の３’末端から４０塩基、２３５塩基、２６５塩基の部分配列を用いた場合、部分塩基配列にも関わらずｍｌｃＲ遺伝子全長を用いた場合と同様のＺ  ｓｃｏｒｅを有し、ｍｌｃＲ遺伝子の３’末端から２５塩基の部分塩基配列を用いた場合には、ｍｌｃＲ遺伝子全長を用いた場合の約２倍ものＺ  ｓｃｏｒｅを有していた。また、図６（ｂ）に示すように、「ＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒ」や「ＧＦＰ」ではほとんど蛍光が見られなかった。かかる結果より、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の少なくとも４７４〜４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドにより、リボソーム結合サイトの下流にある遺伝子を高発現させることが可能であることが明らかとなった。
【００６７】
［実施例３］ＧＦＰの発現による生育とプラスミドベクター収量への影響
ＧＦＰを発現させることよるクローニングへの悪影響がないか調べた。まず、ＧＦＰ発現の有無における菌の生育速度を比較した。培養はＬＢ培地で行った。その結果、ＧＦＰ蛍光なしの株（ｐＵＣ１９株：プラスミドベクター「ｐＵＣ１９」で形質転換した株）の生育とＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の生育は同程度であった（図７（ａ））。図７（ａ）中、横軸は培養時間、縦軸は培養開始時を１とした場合の相対細胞密度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を吸光度測定した結果である。また、それぞれの株から公知の手法でプラスミドベクターを精製し、プラスミドベクターの収量を比較した。プラスミドベクターの収量は、分光光度計（島津製作所社）を用いて、２６０ｎｍでの吸光度を測定し求めた。その結果、ＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の方が平均的にＧＦＰ蛍光なしのｐＵＣ１９株に対して収量が約２倍であった（図７（ｂ））。上記結果から、ＧＦＰ発現によるクローニングに対する悪影響は観察されず、かつプラスミドベクターの収量が多いことが明らかとなった。
【００６８】
［実施例４］蛍光の有無よる、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体の判断−１
ｐＵＣ１９、上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」、又はｍＲｕｂｙ３−ｐＵＣ５７（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により３つのＤＮＡ断片を増幅した。まず、ｐＵＣ１９ベクターを増幅するために、ｐＵＣ１９を鋳型として、フォワードプライマー：ｌｉｎｅａｒ＿ＦＯＲ（５’−ＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴ−３’：配列番号２２)、及びリバースプライマー:ｌｉｎｅａｒ＿ＲＥＶ（５‘−ＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣ−３’：配列番号２３)を用いて増幅した。また、ｍｌｃＲの３’末端から２５ｂｐ（ｍｌｃＲ２５）、ＲＢＳ、スペーサー及びＧＦＰ遺伝子（停止コドンを含む）からなる断片を増幅するために「ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を鋳型として、フォワードプライマー：ｍｌｃＲ２５-ＧＦＰ＿ＦＷ（５’−ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＣＧＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡ−３’：配列番号２４)、及びリバースプライマー:ｍｌｃＲ２５−ＧＦＰ＿ＲＶ（５’−ＣＴＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣ−３’：配列番号２５)を用いて増幅した。さらに、インサートＤＮＡとしてのｍＲｕｂｙ３遺伝子断片を増幅するためにｍＲｕｂｙ３−ｐＵＣ５７を鋳型として、フォワードプライマー：ｍＲｕｂｙ＿ＦＷ（５’−ＴＴＧＴＡＴＡＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＧＡ−３’：配列番号２６)、及びリバースプライマー:ｍＲｕｂｙ＿ＲＶ（５’−ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣ−３’：配列番号２７)を用いて増幅した。また、市販のシームレスクローニングキット：Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、１）上記ｐＵＣ１９ベクター断片と、２）上記ｍｌｃＲの３’末端から２５ｂｐ（ｍｌｃＲ２５）、ＲＢＳ、スペーサー及びＧＦＰ遺伝子（停止コドンを含む）からなる断片と、３）上記ｍＲｕｂｙ遺伝子断片の１）〜３）の３つを連結させた。上記３つのＤＮＡ断片の概念図を図８に示す。図８中、ＧＯＩはインサートＤＮＡ（ｇｅｎｅ−ｏｆ−ｉｎｔｅｒｅｓｔ：７１４ｂｐのｍＲｕｂｙ遺伝子断片）を表す。
【００６９】
上記で作製したベクターを大腸菌に形質転換して、緑色蛍光を有するコロニーを８個選択してコロニーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を行った結果を図９に示す。図９から明らかなように、緑色蛍光を示したすべてのコロニーにおいて、７１４ｂｐのインサートＤＮＡ（ｍＲｕｂｙ遺伝子断片）が導入されていることが確認された。よって、本発明のベクターを用いれば、緑色蛍光を示すコロニーを選択（ポジティブセレクション）することによってインサートＤＮＡを含む大腸菌を選択可能であること、換言すれば、蛍光の有無によって、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断できることが確認された。なお、コロニーはすべて緑色蛍光であったことから、インサートＤＮＡであるｍＲｕｂｙ３は、遺伝子としては存在しているものの発現していないと考えられる。また、ｍｌｃＲ２５の５’末端側からＧＦＰの３’末端側までが７６０ｂｐ、ｍＲｕｂｙ遺伝子が７１４ｂｐのため、増幅産物は合わせて約１５００ｂｐになる。
【００７０】
上記実施例の結果より、一般的な培地以外に必要な試薬はなく、大腸菌が生来持っている遺伝子発現方法を活用し、大腸菌コロニーの蛍光を観察するだけで、安価で簡便にクローニングが成功したかどうか判別することができる。さらに、従来はＧＦＰ蛍光の”消失”によってインサートＤＮＡを選択する「ネガティブスクリーニング」しかできなかったが、逆に蛍光を”発する”ことでクローニングが成功したかどうか判定する「ポジティブスクリーニング」も可能な技術である。さらに、ネガティブセレクション方法では、培地組成の影響等、何らかの要因でＧＦＰ蛍光が消失する場合もあり、偽陽性が生じる可能性も残されていたが、上記ポジティブスクリーニングではそのような偽陽性の可能性をは除することができる。
【００７１】
［実施例５］蛍光の有無よる、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体の判断−２
上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ｐＵＣ１９」を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理してＧＦＰ遺伝子（５’−ＸｂａＩ−ｍｌｃＲ＿２５−ＲＢＳ−Ｓｐａｃｅｒ−ＧＦＰ−ＢａｍＨＩ−３’）を切断した。また、配列番号２８に示す細胞性粘菌α−チューブリン遺伝子の５’側に制限酵素ＸｂａＩサイト及びＢｇｌＩＩサイト（５’−ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴ−３’：配列番号２９）、３’側にＢａｍＨＩサイト（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’：配列番号３０）をＰＣＲ法によって付加してインサートＤＮＡを調製した。つぎに、上記インサートＤＮＡを上記ＧＦＰ遺伝子を切断したプラスミドベクターとライゲーションし、大腸菌に形質転換して上記ＬＢ培地で３７℃にて培養した。コントロールとしてライゲーションの際に反応液に上記インサートＤＮＡなしで行ったプラスミドベクターを大腸菌に形質転換し、同様に培養した。培養後、それぞれ青色ＬＥＤ照射下で観察を行うと共に上記実施例４と同様にコロニーＰＣＲ及びアガロース電気泳動によりインサートＤＮＡの有無を確認した。結果を図１０に示す。図１０において、横軸はＧＦＰ蛍光が観察されなかったコロニーの割合、すなわちランダムにコロニーを選択する場合に目的とするインサートＤＮＡが入ったコロニーを選択できる理論的な確率であり、縦軸はＧＦＰの蛍光が観察されなかったコロニーのうち、インサートＤＮＡが入っていたものの割合を示す。
【００７２】
図１０に示すように、ＧＦＰ蛍光が観察されなかったコロニーにおいて９０％以上の確率でインサートＤＮＡが入っていた。したがって、本発明のベクターを用いれば、緑色蛍光を失ったコロニーを選択（ネガティブセレクション）することによってインサートＤＮＡを含む大腸菌を選択可能であること、換言すれば、蛍光の有無によって、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断できることが確認された。特に、たとえ緑色蛍光を失ったコロニーが少ない場合であっても、目的とするインサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体を選べることができるという点は、遺伝子クローニンを行うに当たって有用である。具体的には、図１０の矢印で示す位置のように、緑色蛍光を失ったコロニーがわずか６％しかない場合であっても、９０％以上の確率でインサートＤＮＡを含む大腸菌を選択できる。さらに、通常、蛍光観察に紫外線照射が用いられるが、この場合には紫外線照射により形質転換体のＤＮＡが損傷する可能性や、作業者の手に紫外線が照射される可能性が生じる。本発明のベクターを用いれば蛍光強度が強く、紫外線を用いずにＬＥＤ照射でも十分に蛍光観察ができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
遺伝子クローニングを行う際のクローニングの成否確認を行う方法として利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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