(57)【要約】【課題】  免疫学的測定に使用可能で、感度、耐久性及び視認性に優れ、かつ、特別な装置や作業工程の追加を必要とせずに高感度な判定を可能とする標識物質を提供する。【解決手段】  標識物質は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００を有する。樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０と金属粒子２０とを備え、（Ａ）樹脂−金属複合体１００の平均粒子径が３００ｎｍを超える、又は（Ｂ）金属粒子２０の平均粒子径が２０ｎｍを超え７０ｎｍ未満の範囲内である、のいずれかの構成を備えており、金属粒子２０が、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子を含んでいる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、
以下の（Ａ）、（Ｂ）のいずれかの構成：
（Ａ）前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３００ｎｍを超える；
又は、
（Ｂ）前記金属粒子の平均粒子径が２０ｎｍを超え７０ｎｍ未満の範囲内である；
を備えているとともに、
前記金属粒子が、前記樹脂粒子内に埋包された部位及び前記樹脂粒子外に露出した部位を有する金属粒子を含んでいることを特徴とする標識物質。
【請求項２】
前記金属粒子が、さらに前記樹脂粒子に完全に内包された金属粒子を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の標識物質。
【請求項３】
前記金属粒子の担持量が樹脂−金属複合体の重量に対して５ｗｔ％〜７０ｗｔ％の範囲内であることを特徴とする、請求項１または２に記載の標識物質。
【請求項４】
前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項５】
前記樹脂粒子が、含窒素ポリマー粒子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項６】
前記（Ａ）のとき、前記金属粒子の平均粒子径が１ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項７】
前記（Ａ）のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３００ｎｍを超え１０００ｎｍ以下の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項８】
前記金属粒子が、金粒子である請求項７に記載の標識物質。
【請求項９】
前記（Ｂ）のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項１０】
前記金属粒子が、金粒子である請求項９に記載の標識物質。
【請求項１１】
前記樹脂−金属複合体を水に分散したことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項１２】
前記樹脂−金属複合体の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の標識物質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標識物質を用いることを特徴とする、免疫学的測定法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標識物質を備えた免疫学的測定用試薬。
【請求項１５】
試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法であって、
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標識物質で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II)：前記判定部にて、工程(I)において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III)：前記標識物質における前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とするアナライトの測定方法。
【請求項１６】
ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットであって、
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標識物質で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キット。
【請求項１７】
試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマト用テストストリップであって、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標識物質で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的測定に使用可能で、感度、耐久性及び視認性に優れた標識物質及びこれを利用した免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、無数の化学物質が存在することから、生体内の特定の微量成分を定性的、定量的に分析することは、極めて重要な技術である。医療、製薬、健康食品、バイオテクノロジー、環境等の分野において、生体内の特定の箇所（化学物質）にのみ作用する薬品及び食品、生体の僅かな変化を検出する分析装置及び診断薬等は、上記技術とともに発展してきた。
【０００３】
上記分析技術の一つに、イムノアッセイがある。これは、免疫学的測定法とも呼ばれ、免疫反応の一つである、抗原−抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。抗原−抗体間反応は感度や反応の選択性が高いため、上記分野で広く用いられている。イムノアッセイは、その測定原理により、様々な測定法がある。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。なお、イムノアッセイの他には、物理・化学的測定法、生物学的測定法等がある。
【０００４】
イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体または複合体の濃度変化）から、抗原または抗体を定性的または定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原または複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。
そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。
【０００５】
ところで、標識物質として着色した微粒子を用いた場合、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することができるため、より簡便な測定ができることが期待される。このような着色した微粒子としては、金属及び金属酸化物のコロイド状粒子、色素で着色したラテックス粒子等が挙げられる（特許文献１、特許文献４等）。
しかし、上記コロイド状粒子は、粒子径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の鮮明な濃い色調のものを得難い、つまり視認性が不十分であるという問題がある。
また、上記着色したラテックス粒子は、色素による着色の効果が低く、目視判定性が不十分であるという問題がある。なお、この問題を解消するために色素の着色量を増やそうとすると、色素がラテックスの表面を覆い、ラテックス粒子本来の表面状態が損なわれるため、抗原又は抗体を結合させるのが困難になるという問題があった。また、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まったり、ラテックス粒子が非特異凝集を起こしたりして、色素の着色量を増やすことにより濃く着色することが、必ずしも、性能の向上に結び付かない、という問題もあった。
【０００６】
上記標識物質の視認性を向上させるために、標識物質が結合した抗体（標識抗体）と抗原が反応し複合体を形成した後に、これらの標識物質に対しさらに他の金属を修飾させることで標識物質の検出感度を増幅させるイムノクロマトグラフ方法が開示されている（特許文献２及び５）。しかし、この方法では、金属銀を修飾させるために特別な装置が必要である。そのため、操作が煩雑であり、安定した増幅が難しい。また、特別な装置が必要である等、測定コストがかかることから、適用可能な用途及び使用環境は限定されると考えられる。
【０００７】
また、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子とからなる着色ラテックスが開示されている（特許文献３）。ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ一方、金ナノ粒子自身が抗原又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
【０００８】
上記着色ラテックスは、スチレン−アクリル酸共重合体ラテックス及び金ナノ粒子の前駆体であるＨＡｕＣｌの分散液にガンマ線を照射することで、上記ラテックスの表面に金ナノ粒子を結合させたものである。しかし、上記着色ラテックスは、金ナノ粒子がラテックスの表面のみに結合されることから、表面プラズモン吸収が発現する金粒子の担持量に制限があるうえに、金ナノ粒子が脱離しやすい。その結果、免疫学的測定用試薬としての視認性や感度が十分でない恐れがある。また、ガンマ線等の電磁放射線を照射するため、ラテックスにダメージを与える恐れがある。さらに、特許文献３の明細書中には、上記ラテックス径や金ナノ粒子径の好ましい範囲を開示しているが、実施例においてこれらの好ましい範囲で検証されているか明らかでなく、好ましい範囲の規定の根拠がない。
【０００９】
また、特許文献４では、金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子が開示され、顕微鏡検査法及びイムノアッセイ法に利用可能な試薬への適用が示唆されている。
【００１０】
しかし、上記金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子は、ポリマーラテックス粒子の材質や粒径の開示がない。さらに、イムノアッセイ法に利用可能な試薬としての効果について検証がない。そのため、金属金及びポリマーラテックス粒子における試薬としての効果は不明である。
【００１１】
以上より、金ナノ粒子が結合または被覆されたラテックス粒子は、免疫学的測定用の試薬として期待されるものであるが、従来の技術では、耐久性や視認性が十分でなかった。また、視認性が高いものでも、適用可能な用途及び使用環境は限定されるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平５−１０９５０号公報
【特許文献２】特開２０１１−１１７９０６号公報
【特許文献３】特開２００９−１６８４９５号公報
【特許文献４】特開平３−２０６９５９号公報
【特許文献５】特開２００９−１９２２７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、免疫学的測定に使用可能で、感度、耐久性及び視認性に優れ、かつ、特別な装置や作業工程の追加を必要とせずに高感度な判定を可能とする標識物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の構造を有する樹脂−金属複合体を利用することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明の標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、以下の（Ａ）、（Ｂ）のいずれかの構成：
（Ａ）前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３００ｎｍを超える；
又は、
（Ｂ）前記金属粒子の平均粒子径が２０ｎｍを超え７０ｎｍ未満の範囲内である；
を備えていることを特徴とする。
【００１６】
本発明の標識物質は、前記（Ａ）のとき、前記金属粒子の平均粒子径が１ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内であってもよい。
【００１７】
本発明の標識物質は、前記（Ａ）のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３００ｎｍを超え１０００ｎｍ以下の範囲内であってもよい。この場合、前記金属粒子が、金粒子であってもよい。
【００１８】
本発明の標識物質は、前記（Ｂ）のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲内であってもよい。この場合、前記金属粒子が、金粒子であってもよい。
【００１９】
本発明の標識物質は、前記樹脂−金属複合体を水に分散したものであってもよい。
【００２０】
本発明の標識物質は、前記樹脂−金属複合体の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものであってもよい。
【００２１】
本発明の免疫学的測定法は、上記いずれかの標識物質を用いることを特徴とする。
【００２２】
本発明の免疫学的測定用試薬は、上記いずれかの標識物質を備えている。
【００２３】
本発明のアナライトの測定方法は、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法である。
本発明のアナライトの測定方法は、メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いる。
そして、本発明のアナライトの測定方法は、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II)：前記判定部にて、工程(I)において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III)：前記標識物質における前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
【００２４】
本発明のアナライト測定用キットは、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットである。
本発明のアナライト測定用キットは、メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むものである。
【００２５】
本発明のラテラルフロー型クロマト用テストストリップは、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマト用テストストリップである。
本発明のラテラルフロー型クロマト用テストストリップは、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えている。そのため、樹脂粒子への局在型表面プラズモン吸収を発現する金属粒子の担持量が多い。従って、本発明の標識物質は、耐久性及び視認性に優れ、特別な装置や作業工程の追加を必要とせずに高感度な判定が可能になる優れた材料として、例えばＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の免疫学的測定に好ましく適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施の形態に係る標識物質を構成する樹脂−金属複合体の断面の構造を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いたアナライトの測定方法の概要を示す説明図である。
【図３】実施例１で得られた樹脂−金複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図４】実施例９で得られた樹脂−金複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図５】実施例９で得られた樹脂−金複合体の断面の走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）写真である。
【図６】実施例１０で得られた樹脂−金複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図７】実施例１０で得られた樹脂−金複合体の断面の走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２９】
［第１の実施の形態］
本発明の第１の実施の形態に係る標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３００ｎｍを超えるものである。図１は、本実施の形態に係る標識物質を構成する樹脂−金属複合体の断面模式図である。樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０と、金属粒子２０と、を備えている。樹脂−金属複合体１００を有する本実施の形態の標識物質は、例えば免疫学的測定用試薬又はその材料として好ましく用いることができる。
【００３０】
樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散または固定化されている。また、樹脂−金属複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において二次元的または三次元的に分布し、かつ前記三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されている。
【００３１】
ここで、金属粒子２０には、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子（以下、「内包金属粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子（以下、「一部露出金属粒子４０」）ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子（以下、「表面吸着金属粒子５０」ともいう。）が存在する。
【００３２】
樹脂−金属複合体１００を標識物質として使用する場合、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０上に、抗体または抗原を固定化して使用する。その際、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０には、前記抗体または抗原が固定化される一方で、内包金属粒子３０には、固定化されない。しかし、内包金属粒子３０を含む金属粒子２０の全てが局在型表面プラズモン吸収を発現することから、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０のみならず、内包金属粒子３０も、標識物質の視認性向上に寄与する。さらに、一部露出金属粒子４０及び内包金属粒子３０は、表面吸着金属粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等の物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、樹脂−金属複合体１００を使用した標識物質としての耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
【００３３】
内包金属粒子３０は、その表面の全てが、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
【００３４】
また、樹脂−金属複合体１００への金属粒子２０（内包金属粒子３０、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０の合計）の担持量は、樹脂‐金属複合体１００の重量に対して、５ｗｔ％〜７０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、樹脂−金属複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属粒子２０の担持量が５ｗｔ％未満では抗体または抗原の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の担持量は、より好ましくは、１５ｗｔ％〜７０ｗｔ％である。
【００３５】
また、金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることが好ましい。この範囲であれば、金属粒子２０上への抗体または抗原の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。金属粒子２０の２０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることがより好ましく、耐久性の観点から、表面吸着金属粒子５０が２０ｗｔ％以下であることがさらに好ましい。
【００３６】
また、免疫学的測定において優れた検出感度を得るためには、金属粒子２０の６０ｗｔ％〜１００ｗｔ％、好ましくは、７５〜１００ｗｔ％が、より好ましくは、８５〜１００ｗｔ％が、表層部６０に、より好ましくは、樹脂粒子１０の表面から深さ方向に粒子半径の４０％の範囲に、存在することがよい。また、表層部６０に存在する金属粒子２０の５ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０であることが、金属粒子２０上への抗体または抗原の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高いため、好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９５ｗｔ％が内包金属粒子３０であることがよい。
【００３７】
ここで、前記「表層部」とは、樹脂−金属複合体１００の最も外側の位置（つまり、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出端部）を基準にして、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、前記「二次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向に分布していることを意味する。前記「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分布していることを意味する。金属粒子２０が「三次元的に分布」している方が、金属粒子２０が、樹脂粒子１０から脱離しにくい点及び金属粒子２０の担持量が多くなる点から、好ましい。
【００３８】
また、本実施の形態において、樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、３００ｎｍを超えるものである。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径が３００ｎｍ以下では、標識物質として視認性や感度が低下する傾向がある。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、好ましくは、３００ｎｍを超え１０００ｎｍ以下であり、より好ましくは、３４０ｎｍ以上６５０ｎｍ未満である。ここで、樹脂−金属複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、または遠心沈降法により測定することができる。
【００３９】
樹脂粒子１０は、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗原または抗体の固定化が容易な金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるアニオン性金属イオンを化学吸着しやすいため、好ましい。本実施の形態では、含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する為、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０または一部露出金属粒子４０となる。また、アクリル酸重合体のように、カルボン酸等はカチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅などの金属粒子の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすく、銀、ニッケル、銅などの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記金、パラジウムなどの金属との合金を作ることも可能である。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子２０の大部分は、表面吸着金属粒子５０となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子５０は、樹脂粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子１０から金属粒子２０が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。これらの中でも、好ましくは、ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−３−ビニルピリジン、ポリ−４−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。
【００４０】
金属粒子２０は、例えば、銀、ニッケル、銅、金、パラジウム等が適用できる。好ましくは、視認性に優れ、抗原または抗体の固定化が容易な金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。より好ましくは、保存安定性がよい金である。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。ここで、例えば金合金としては、金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上含有する合金を意味する。
【００４１】
また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の平均粒子径は、例えば１〜８０ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や８０ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモンが発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。第１の実施の形態における金属粒子２０の平均粒子径は、金属粒子２０が金粒子である場合は、好ましくは、２０ｎｍ以上７０ｎｍ未満であり、より好ましくは、２２ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。
【００４２】
［第２の実施の形態］
本発明の第２の実施の形態の標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、前記金属粒子の平均粒子径が２０ｎｍを超え７０ｎｍ未満の範囲内である。本実施の形態に係る標識物質を構成する樹脂−金属複合体は、金属粒子の平均粒子径の範囲、及び樹脂−金属複合体の平均粒子径の範囲が異なる以外は、第１の実施の形態（図１）の樹脂−金属複合体１００と同様である。以下、図１も参照しながら、第１の実施の形態との相違点を中心に説明する。
【００４３】
第２の実施の形態で使用する樹脂−金属複合体１００において、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の平均粒子径は、例えば２０ｎｍを超え７０ｎｍ未満である。金属粒子２０の平均粒子径が、２０ｎｍ以下では、感度が低下する傾向があり、７０ｎｍ以上では、視認性が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、より好ましくは、２２ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。
【００４４】
また、樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、例えば１００〜１０００ｎｍであることが好ましい。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径が１００ｎｍ未満では、例えば、金属粒子２０として金粒子を使用する場合に、金粒子の担持量が少なくなる傾向があるため、同サイズの金粒子より着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、好ましくは、１００ｎｍ以上７００ｎｍ未満であり、より好ましくは、３４０ｎｍ以上６５０ｎｍ未満である。ここで、樹脂−金属複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、または遠心沈降法により測定することができる。
【００４５】
第２の実施の形態に係る標識物質に使用される樹脂−金属複合体１００において、上記以外の構成は第１の実施の形態で使用される樹脂−金属複合体１００と同様であるため説明を省略する。
【００４６】
［樹脂−金属複合体の製造方法］
上記第１及び第２の実施の形態の標識物質に使用される樹脂−金属複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子１０の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。さらに、金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させ、樹脂−金属複合体１００を得る。
【００４７】
また、例えば、金属粒子２０として、金粒子を使用する場合、金属イオンを含有する溶液としては、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ4）水溶液等が挙げられる。また、金属イオンの代わりに金属錯体を用いても良い。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
【００４８】
また、還元剤は、公知の物を用いることができる。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、ロッシェル塩等が挙げられる。このうち、水素化ホウ素ナトリウム又は、ジメチルアミンボラン、クエン酸が好ましい。還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整することが出来る。ｐＨ調整にはホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリにより調整することが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子の粒径をコントロールすることが出来る。
【００４９】
また、前記金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させる際、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加しても良いし、還元剤を前記金属イオン吸着樹脂粒子に添加しても良いが、内包金属粒子３０及び一部露出金属粒子４０の生成しやすさの観点から、前者が好ましい。
【００５０】
また、樹脂−金属複合体１００の、水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４（ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を添加してもよい。
さらにホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することが出来る。
【００５１】
以上の構成を有する樹脂−金属複合体１００は、特に、金属粒子２０の表面に抗原または抗体を吸着させることにより、標識物質として、例えばＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、特に、低濃度域（高感度領域）での目視判定性に優れた標識物質として好ましく適用できる。また、標識物質の形態に特に限定はないが、例えば、樹脂−金属複合体１００を水もしくは、ｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用できる。
【００５２】
上記金属粒子２０の表面に抗原または抗体を吸着させる方法としては特に限定せず、公知の物理吸着及び化学吸着による方法を用いることができる。例えば、抗原または抗体を含む緩衝液中に樹脂−金属複合体１００を浸漬させ、インキュベートする等の物理吸着や、抗原又は抗体にＳＨ基を導入し、樹脂−金属複合体１００と反応させてＡｕ−ＳＨ結合を形成する等の化学吸着が挙げられる。なかでも、金属粒子２０と抗原または抗体との結合が強固となることから化学吸着が好ましい。
【００５３】
次に、樹脂−金属複合体１００を標識物質として使用したアナライトの測定方法、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ及びアナライト検出・定量キットについて説明する。
【００５４】
［ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ］
まず、図２を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ（テストストリップ）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
【００５５】
テストストリップ２００は、メンブレン１１０を備えている。メンブレン１１０には、試料の展開方向において順に、試料添加部１２０、判定部１３０及び吸液部１４０が設けられている。
【００５６】
＜メンブレン＞
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（アナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
【００５７】
テストストリップ２００は、操作をより簡便にするため、メンブレン１１０を支持する支持体を備えていることが好ましい。支持体としては、例えばプラスチック等を用いることができる。
【００５８】
＜試料添加部＞
テストストリップ２００は、アナライト１６０を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。
【００５９】
＜判定部＞
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。
【００６０】
また、判定部１３０は、標識抗体１５０とアナライト１６０とを含む複合体１７０が、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１に接触するような構成である限り特に限定されない。例えば、メンブレン１１０に、直接、捕捉リガンド１３１が固定されていてもよいし、あるいは、メンブレン１１０に固定されたセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッドに捕捉リガンド１３１が固定されていてもよい。
【００６１】
＜吸液部＞
吸液部１４０は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。
【００６２】
テストストリップ２００は、必要に応じて、さらに、反応部、コントロール部等の任意の部位を含んでいてもよい。
【００６３】
＜反応部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００には、メンブレン１１０に、標識抗体１５０を含む反応部が形成されていてもよい。反応部は、試料が流れる方向において、判定部１３０よりも上流側に設けることができる。なお、図２における試料添加部１２０を反応部として利用してもよい。テストストリップ２００が反応部を有する場合、アナライト１６０を含む試料を、反応部又は試料添加部１２０に供すると、反応部において、試料に含まれるアナライト１６０と標識抗体１５０とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部又は試料添加部１２０に供することで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成させることができるので、いわゆる１ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。
【００６４】
反応部は、アナライト１６０と特異的に結合する標識抗体１５０を含む限り特に限定されないが、メンブレン１１０に、直接、標識抗体１５０が塗布されてなるものであってもよい。あるいは、反応部は、例えばセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッド（コンジュゲートパッド）に標識抗体１５０を含浸したものを、メンブレン１１０に固定してなるものであってもよい。
【００６５】
＜コントロール部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
【００６６】
［アナライトの測定方法］
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト１６０の測定方法について説明する。
【００６７】
本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、試料中に含まれるアナライト１６０を検出又は定量するアナライト１６０の測定方法である。実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、メンブレン１１０、及び当該メンブレン１１０にアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００を用い、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程(II)：判定部１３０にて、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体を、捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程(III)：樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
【００６８】
工程(I)：
工程(I)は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００の試料添加部１２０又は反応部（図示省略）に試料を供し、当該反応部においてアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよいし、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。
【００６９】
工程(I)で形成された複合体１７０は、テストストリップ２００上で展開して移動し、判定部１３０に至る。
【００７０】
工程(II)：
工程(II)は、テストストリップ２００の判定部１３０において、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。
【００７１】
なお、捕捉リガンド１３１は、標識抗体１５０には特異的に結合しないために、アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０が判定部１３０に到達した場合、当該アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０は、判定部１３０を通過する。ここで、テストストリップ２００に、標識抗体１５０に特異的に結合する別の捕捉リガンドが固定されたコントロール部（図示省略）が形成されている場合、判定部１３０を通過した標識抗体１５０は、展開を続け、コントロール部で当該別の捕捉リガンドと結合する。その結果、アナライト１６０と複合体１７０を形成していない標識抗体１５０は、コントロール部で捕捉される。
【００７２】
工程(II)の後、必要に応じて工程(III)の前に、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の生化学検査で汎用される緩衝液で、テストストリップ２００を洗浄する洗浄工程を実施してもよい。洗浄工程によって、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部に捕捉されなかった標識抗体１５０（アナライト１６０と結合しておらず、複合体１７０を形成していない標識抗体１５０）を除去することができる。
【００７３】
洗浄工程を実施することで、工程(III)において、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部における樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴による発色を測定する際に、バックグラウンドの発色強度を低減させることができ、シグナル／バックグラウンド比を高め、一層、検出感度や定量性を向上させることができる。
【００７４】
工程(III)：
工程(III)は、樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(II)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する。
【００７５】
なお、テストストリップ２００にコントロール部が形成されている場合、工程(II)によって、コントロール部にて、標識抗体１５０が別の捕捉リガンドによって捕捉され複合体が形成される。そのため、工程(III)では、テストストリップ２００において、判定部１３０だけでなく、コントロール部においても局在型表面プラズモン共鳴による発色を生じさせることができる。このように、判定部１３０とともにコントロール部においても発色強度を測定することで、テストストリップ２００に供した試料が正常に展開して、反応部及び判定部１３０に到達したか否かを確認できる。
【００７６】
＜試料及びアナライト＞
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト１６０として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト１６０がインフルエンザウィルスＮＰ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等のリガンドとアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
【００７７】
また、前記試料は、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。
【００７８】
前記アナライト１６０としては、例えば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）、核酸（一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）又は核酸を有する物質、糖（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）又は糖鎖を有する物質、脂質などその他の分子が挙げられ、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１に特異的に結合するものである限り特に限定されないが、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウィルス、ヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられる。これらの中でも非イオン性界面活性剤により可溶化される抗原が好ましく、ウィルスの核タンパク質のように自己集合体を形成する抗原がより好ましい。
【００７９】
＜標識抗体＞
標識抗体１５０は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)〜(III)において、標識抗体１５０から樹脂−金属複合体１００が脱離しない程度に、抗体に樹脂−金属複合体１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体に樹脂−金属複合体１００が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と樹脂−金属複合体１００とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
【００８０】
また、本実施の形態において、「抗体」としては、特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。
【００８１】
＜標識抗体の好ましい作製方法＞
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）樹脂−金属複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ； 
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。
【００８２】
［工程Ａ］
工程Ａでは、樹脂−金属複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状の樹脂−金属複合体１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。第１のｐＨ条件は、樹脂−金属複合体１００における金属粒子２０の金属種によって異なる。
【００８３】
樹脂−金属複合体１００の金属粒子２０が金粒子（金合金粒子を含む；以下同様である）である場合には、第１のｐＨ条件は、抗体との結合は、樹脂−金属複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま樹脂−金属複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜７の範囲内の条件が好ましく、さらに酸性条件、例えばｐＨ２．５〜５．５の範囲内がより好ましい。金属粒子２０が金粒子である場合、樹脂−金属複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ７を超えると樹脂−金属複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
【００８４】
また、樹脂−金属複合体１００の金属粒子２０が金以外の粒子、例えばパラジウム粒子、またはそれらの合金等である場合には、第１のｐＨ条件は、抗体との結合は、樹脂−金属複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま樹脂−金属複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜１０の範囲内の条件が好ましく、さらに例えばｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。金属粒子２０が金以外の粒子である場合、樹脂−金属複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると樹脂−金属複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
【００８５】
工程Ａは、第１のｐＨ条件に調整した結合用緩衝液（Binding  Buffer）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量の樹脂−金属複合体１００を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
【００８６】
次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。
【００８７】
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、樹脂−金属複合体１００における金属粒子２０の金属種によって異なる。
【００８８】
樹脂−金属複合体１００の金属粒子２０が金粒子である場合には、第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜９の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、さらに酸性条件、例えばｐＨ２〜６の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。
【００８９】
また、樹脂−金属複合体１００の金属粒子２０が金以外の粒子である場合には、第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜１０の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。
【００９０】
工程Ｂは、第２のｐＨ条件に調整したブロック用緩衝液（Blocking  Buffer）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体１５０に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能な蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体１５０が均一分散した分散液が得られる。
【００９１】
以上のようにして、標識抗体１５０の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理などを実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
【００９２】
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８〜９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
【００９３】
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。
【００９４】
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
【００９５】
［アナライト検出・定量キット］
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばラテラルフロー型クロマト用テストストリップ２００を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０の検出又は定量するためのキットである。
【００９６】
本実施の形態のキットは、
メンブレン１１０と
メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部１３０を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップ２００と、
アナライト１６０に特異的に結合する抗体を樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のキットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。
【００９７】
本発明に係るキットを使用するにあたっては、試料中のアナライト１６０と検出試薬中の標識抗体１５０とを接触させて工程(I)を実施した後、テストストリップ２００の反応部又は試料添加部１２０に試料を供して、工程(II)、工程(III)を順次実施してもよい。あるいは、テストストリップ２００の判定部１３０よりも上流側に、検出試薬を塗布して、適宜乾燥させて反応部を形成した後、形成された反応部あるいは該反応部よりも上流側の位置（例えば、試料添加部１２０）に試料を添加して、工程(I)〜(III)を順次実施してもよい。
【実施例】
【００９８】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。
【００９９】
＜樹脂−金属複合体の吸光度測定＞
樹脂−金属複合体の吸光度は、光学用白板ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した樹脂−金属複合体分散液（分散媒：水）を入れ、瞬間マルチ測光システム（大塚電子社製、ＭＣＰＤ−３７００）を用いて、金の場合５７０ｎｍの吸光度を測定した。金の場合５７０ｎｍでの吸光度が０．９以上を○（良好）、０．５〜０．９未満を△（可）、０．５未満を×（不可）とした。
【０１００】
＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間熱処理を行った。熱処理前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
【０１０１】
固形分濃度（ｗｔ％）＝［乾燥後の重量（ｇ）／  乾燥前の重量（ｇ）］×  １００
【０１０２】
また、上記熱処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間加熱処理を行い、加熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［５００℃加熱処理後の重量（ｇ）／５００℃加熱処理前の重量（ｇ）］×１００
【０１０３】
＜樹脂粒子及び樹脂−金属複合体の平均粒子径の測定＞
ディスク遠心式粒度分布測定装置（CPS  Disc  Centrifuge  DC24000  UHR、CPS  instruments,  Inc.社製）を用いて測定した。測定は、樹脂−金属複合体を水に分散させた状態で行った。
【０１０４】
＜イムノクロマトグラフによる評価＞
各実施例等で作製した樹脂−金属複合体標識抗体分散液を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って樹脂−金属複合体分散液の性能を評価した。
（評価方法）
評価は、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーン（アドテック社製）を用い、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）の２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）を用いた（ＡＰＣ希釈前のウィルスの濃度は５０００ＦＦＵ／ｍｌ）。
（評価手順）
９６ウェルプレートの各ウェルに、樹脂−金属複合体標識抗体分散液を３μｌずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μｌを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μｌ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。発色レベルは金コロイド判定用色見本（アドテック社製）を用いて判定した。
【０１０５】
＜金属粒子の平均粒子径の測定＞
金属粒子の平均粒子径の測定は、樹脂−金属複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作製した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ−９０００）により観測した画像から、金属粒子の面積平均径を測定した。
【０１０６】
［実施例１］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、２．００ｇ）を８０ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、９．９０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．１００ｇ）を加え、窒素気流下において２５０ｒｐｍ、６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、９．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．１００ｇ）を５分かけて滴下し、２５０ｒｐｍ、６０℃で６時間撹拌することで、平均粒子径０．４５μｍの樹脂粒子を得た。この樹脂粒子を遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１０７】
＜樹脂−金属複合体の合成＞
前記樹脂粒子分散液（３．０５ｇ）に３０ｍＭ塩化金酸水溶液（８０ｇ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、５５ｇの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。この金イオン吸着樹脂粒子分散液４５ｇを１０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４５０ｍｌ）に８分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径０．６μｍの樹脂−金複合体を得た。この樹脂−金複合体を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１２０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、３７ｇの純水に再度分散させ、限外濾過膜により精製することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．２０であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は２２．０ｎｍ、金の担持量は４９．４ｗｔ％であった。作製した樹脂−金複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図３に示した。
【０１０８】
［実施例２］
実施例１で得た樹脂粒子分散液（３．０５ｇ）に１０ｍＭの塩化金酸水溶液（５６ｇ）を加えた他は、実施例１と同様の方法で、金イオン吸着樹脂粒子分散液、平均粒子径０．６μｍの樹脂−金複合体及び１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は１．０４であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は７．６１ｎｍ、金の担持量は３６．８ｗｔ％であった。
【０１０９】
［実施例３］
＜樹脂粒子の合成＞
２−ＶＰ（９．９０ｇ）及びＤＶＢ（０．１００ｇ）を４５０ｇの純水に加え、窒素気流下において２５０ｒｐｍ、６０℃で３０分間撹拌した。３０分撹拌した後、９．００ｇの純水に溶解したＡＩＢＡ（０．１００ｇ）を５分かけて滴下し、２５０ｒｐｍで６時間撹拌することで平均粒子径０．１０μｍの樹脂粒子を得た。この樹脂粒子を遠心分離（９０００ｒｐｍ、２０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
＜樹脂−金属複合体の合成＞
樹脂粒子分散液（５．０ｇ）に３０ｍＭの塩化金酸水溶液（１９８ｇ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、１．５ｇの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。この金イオン吸着樹脂粒子分散液（１．５ｇ）を１０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（６５ｍｌ）に２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径０．２２μｍの樹脂−金複合体を得た。この樹脂−金複合体に１０ｗｔ％の分散剤（ＢＹＫ１９４）６００μｌを加え１時間撹拌した後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿させ、上澄みを除去した。その後、適量の純水を加え再度分散させ、限外濾過膜により精製し、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は１．１２であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は２２．６ｎｍ、金の担持量は３７．０ｗｔ％であった。
【０１１０】
[比較例１]
＜イムノクロマトの評価＞
着色ラテックス（メルクミリポア社製、着色Ｅｓｔａｐｏｒ機能性粒子、Ｋ１０３０、平均粒子径；３９２ｎｍ、５７０ｎｍでの吸光度は０．８３、４００ｎｍでの吸光度は１．１１）１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して着色ラテックスに抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して着色ラテックスをブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して着色ラテックス標識抗体を作製した。
作製した着色ラテックス標識抗体を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って着色ラテックスの性能を評価した。
（評価方法）
評価は、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーン（アドテック社製）を用い、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）の２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）を用いた（ＡＰＣ希釈前のウィルスの濃度は５０００ＦＦＵ／ｍｌ）。
（評価手順）
９６ウェルプレートの各ウェルに、着色ラテックス標識抗体を３μｌずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μｌを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μｌ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を以下に示した。
【０１１１】
【表１Ａ】
2020177035.tif 000003
【０１１２】
上記表１Ａから、着色ラテックス標識抗体は、１６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１１３】
以上の実施例及び比較例の吸光度の結果をまとめて表１Ｂに示した。
【０１１４】
【表１Ｂ】
2020177035.tif 000004
【０１１５】
［比較例２］
〈金コロイドの合成〉
５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに１ｍＭ 塩化金酸水溶液を２５０ｍｌ入れ、加熱還流装置を用い、激しく攪拌しながら沸騰させ、沸騰後３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液を２５ｍｌ添加し、溶液が淡黄色から濃紅色に変化することを確認した。攪拌しながら１０分間加熱を続けた後、室温で３０分程度攪拌放冷をおこなった。孔径２μｍのメンブランフィルターを用いて溶液をろ過し、三角フラスコに移し冷暗所で保存した。作製した粒子の平均粒径は１２．３ｎｍであった。
【０１１６】
＜イムノクロマトの評価＞
得られた金コロイド１ｍｌ（ＯＤ＝１０）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して金コロイドに抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して金コロイド表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して金コロイド標識抗体を作製した。
作製した金コロイド標識抗体を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って金コロイドの性能を評価した。
（評価方法）
評価は、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーン（アドテック社製）を用い、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）の２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）を用いた（ＡＰＣ希釈前のウィルスの濃度は５０００ＦＦＵ／ｍｌ）。
（評価手順）
９６ウェルプレートの各ウェルに、金コロイド標識抗体を３μｌずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μｌを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μｌ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を以下に示した。
【０１１７】
【表２】
2020177035.tif 000005
【０１１８】
上記表２から、金コロイド標識抗体は、３２倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１１９】
［比較例３］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（５．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３８９．５ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、５０．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径２００ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１２０】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１２１】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、２０℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）と５２８ｍＭのホウ酸水溶液（１０ｍｌ）の混合溶液を４分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径２５０ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．６９であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は７５．０ｎｍ、金の担持量は５２．３ｗｔ％であった。
【０１２２】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１２３】
【表３】
2020177035.tif 000006
【０１２４】
上記表３から、樹脂−金複合体標識抗体は、１６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１２５】
［実施例４］
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を０．５分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径５００ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１２６】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１２７】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、２０℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径５１０ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．０１であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は４６．３ｎｍ、金の担持量は５４．２ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１２８】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１２９】
【表４】
2020177035.tif 000007
【０１３０】
上記表４から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１３１】
［実施例５］
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（０．５０ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を０．５分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径６１３ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１３２】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１３３】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径６２５ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９８であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２５．０ｎｍ、金の担持量は５５．３ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１３４】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１３５】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１３６】
【表５】
2020177035.tif 000008
【０１３７】
上記表５から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１３８】
［実施例６］
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、４−ビニルピリジン（４−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３８ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１３９】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１４０】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径４４８ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９９であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２４．０ｎｍ、金の担持量は５５．７ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１４１】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１４２】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１４３】
【表６】
2020177035.tif 000009
【０１４４】
上記表６から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１４５】
［実施例７］
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、３−ビニルピリジン（３−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４２９ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１４６】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１４７】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径４３６ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．０３であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２４．３ｎｍ、金の担持量は５５．５ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１４８】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１４９】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１５０】
【表７】
2020177035.tif 000010
【０１５１】
上記表７から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１５２】
［実施例８］
２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ、１０．３ｇ）、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート（０．２ｇ）とポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、２．０ｇ）を８５ｇの純水に溶解した後、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで７０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、２．００ｇの純水に溶解したペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、０．１０ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、７０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３３８ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１５３】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１５４】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径３４５ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９６であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２４．６ｎｍ、金の担持量は４８．５ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１５５】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１５６】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１５７】
【表８】
2020177035.tif 000011
【０１５８】
上記表８から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１５９】
［実施例９］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（３．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４９．５０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．５０ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．２５０ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３７０ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１６０】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１６１】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、２０℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径３９３ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９２であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は１４．９ｎｍ、金の担持量は５５．８ｗｔ％であった。得られた樹脂−金複合体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図４に、その断面の走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）写真を図５に、それぞれ示した。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１６２】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１６３】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１６４】
【表９】
2020177035.tif 000012
【０１６５】
上記表９から、樹脂−金複合体標識抗体は、６４倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１６６】
［実施例１０］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（２．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３８０ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【０１６７】
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【０１６８】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、２０℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径３９９ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９６であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２５．０ｎｍ、金の担持量は５３．２ｗｔ％であった。得られた樹脂−金複合体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図６に、その断面の走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）写真を図７に、それぞれ示した。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【０１６９】
〈イムノクロマトの評価〉
得られた樹脂―金複合体分散液１ｍｌ（０．１ｗｔ％）にインフルエンザ抗体を１００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って回収し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
【０１７０】
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
【０１７１】
【表１０】
2020177035.tif 000013
【０１７２】
上記表１０から、樹脂−金複合体標識抗体は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【０１７３】
実施例９の図５と実施例１０の図７の断面画像を比較すると、金粒子の６０〜１００％、好ましくは７５〜１００％が、樹脂粒子の表面から深さ方向に粒子半径の５０％の範囲内に存在している実施例１０の方がイムノクロマトの検出感度に優れていた。
【０１７４】
［標識抗体の作製に関する試験例］
【０１７５】
［作製例１］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、２．００ｇ）を８０ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、９．９０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．１００ｇ）を加え、窒素気流下において２５０ｒｐｍ、６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、９．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．１００ｇ）を５分かけて滴下し、２５０ｒｐｍ、６０℃で６時間撹拌することで、平均粒子径０．３６μｍの樹脂粒子Ａ−１を得た。前記Ａ−１を遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、２．１ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−１を得た。
【０１７６】
＜樹脂−金複合体の合成＞
前記Ｂ−１（１９．０９ｇ）に３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１０６．６ｇ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、４０ｇの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−１を調製した。前記Ｃ−１（２０ｇ）を３．３ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（６００ｍｌ）に４分かけて滴下した後、８℃で１時間撹拌し、さらに室温で５時間撹拌することで、平均粒子径０．３８μｍの樹脂−金複合体Ｄ−１を得た。前記Ｄ−１を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１２０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、適量の純水を加えて再度分散させ、限外濾過膜により精製することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液Ｅ−１を得た。Ｅ−１中の樹脂−金複合体Ｆ−１の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．０であった。また、Ｆ−１における金粒子の平均粒子径は２２．０ｎｍ、金の担持量は４９．１ｗｔ％であった。
【０１７７】
［試薬等］
試験例、参考試験例では以下の試薬等を使用した。
抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（７．１５ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）：アドテック株式会社製
結合用緩衝液ａ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒３に調整した。
結合用緩衝液ｂ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒４に調整した。
結合用緩衝液ｃ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒５に調整した。
結合用緩衝液ｄ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液  ｐＨ≒６．５
結合用緩衝液ｅ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＮａＣｌでｐＨ≒７．５に調整した。
結合用緩衝液ｆ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＮａＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。
結合用緩衝液ｇ：５０ｍＭ  ２−モルフォリノエタンスルホン酸溶液  ｐＨ≒３．８
ブロック用緩衝液ａ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒５に調整した。
ブロック用緩衝液ｂ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒７に調整した。
ブロック用緩衝液ｃ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。  
ブロック用緩衝液ｄ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒９．５に調整した。
洗浄用緩衝液：５ｍＭトリス溶液をＨＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。
保存用緩衝液：洗浄用緩衝液に、スクロースを１０重量％濃度になるように添加した。
インフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）：インフルエンザＡ型ウィルス不活化抗原（アドテック株式会社製）を、検体処理液（アドテック株式会社製）を用いて１００倍希釈して調製した。ＡＰＣの抗原濃度は、５０００ＦＦＵ／ｍｌに相当する。
陰性コントロール：検体処理液（アドテック株式会社製）
ＡｕＮＣＰビーズ：作製例１で得た樹脂−金複合体（１重量％；平均粒子径３８０ｎｍ）
【０１７８】
［試験例１］
【０１７９】
（結合工程）
マイクロチューブ［アイビス（登録商標；アズワン社製）２ｍＬ］に、樹脂−金属複合体としてＡｕＮＣＰビーズ０．１ｍＬを投入し、結合用緩衝液ａ０．９ｍＬを添加した。転倒混和によって十分に混合した後、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体１００μｇを添加し、室温で３時間かけて転倒撹拌を行い、樹脂−金属複合体で標識した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を含む標識抗体含有液Ａ−１を得た。
【０１８０】
（ブロック工程）
次に、標識抗体含有液Ａ−１を氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣にブロック用緩衝液ａ１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行い、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体含有液Ｂ−１を得た。
【０１８１】
（洗浄処理）
次に、標識抗体含有液Ｂ−１を氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に洗浄用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。
【０１８２】
（保存処理）
次に、氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液Ｃ−１を得た。
【０１８３】
［試験例２］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｂを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−２，Ｂ−２、Ｃ−２を得た。
【０１８４】
［試験例３］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｃを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−３，Ｂ−３，Ｃ−３を得た。
【０１８５】
［試験例４］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｄを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−４，Ｂ−４、Ｃ−４を得た。
【０１８６】
［参考試験例１］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｅを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
【０１８７】
［参考試験例２］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｆを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
【０１８８】
［試験例５］
試験例１のブロック工程でブロック用緩衝液ａの代わりにブロック用緩衝液ｂを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ｂ−５、Ｃ−５を得た。
【０１８９】
［試験例６］
試験例１のブロック工程でブロック用緩衝液ａの代わりにブロック用緩衝液ｃを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ｂ−６、Ｃ−６を得た。
【０１９０】
［参考試験例３］
試験例１のブロック工程でブロック用緩衝液ａの代わりにブロック用緩衝液ｄを用いたところ、結合工程後の標識抗体は良好な分散性を示したが、ブロック工程後に標識抗体が凝集してしまい、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
【０１９１】
［試験例７］
試験例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｇを用いる以外は試験例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−７，Ｂ−７、Ｃ−７を得た。
【０１９２】
＜評価方法＞
評価は、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーン（アドテック社製）を用い、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを比較した。発色レベルは金コロイド判定用色見本（アドテック社製）を用いて判定した。スクリーニング評価において、抗原はインフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）を用いた。性能評価において、抗原はＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍希釈）を用いた。
【０１９３】
＜スクリーニング評価＞
９６ウェルプレートの７ウェルに、試験例１〜７で得られた標識抗体含有液Ｃ−１〜７を３μＬずつ入れ、それぞれにＡＰＣ１００μＬを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μＬずつ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表１１に示した。なお、表１１における数値が大きい程、発色レベルが高い（発色が強い）ことを意味する。
【０１９４】
【表１１】
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【０１９５】
表１１から、試験例１で得られた抗体標識含有液Ｃ−１は、最も強い発色を示し、優れた標識性能を有することが確認された。
【０１９６】
＜性能評価＞
９６ウェルプレートの１２ウェルに、試験例１で得られた標識抗体含有液Ｃ−１を３μＬずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍希釈、それぞれＡＰＣ×１〜ＡＰＣ×１０２４と表す）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μＬを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μＬ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表１２に示した。なお、表１２における数値が大きい程、発色レベルが高い（発色が強い）ことを意味する。
【０１９７】
【表１２】
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【０１９８】
表１２から、試験例１で得られた標識抗体含有液Ｃ−１は、２５６倍希釈の抗原に対しても良好な発色を示し、優れた標識性能を有することが確認された。
【０１９９】
以上、本発明の実施の形態を例示の目的で詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態に制約されることはない。
【０２００】
本国際出願は、２０１４年７月１日に出願された日本国特願２０１４−１３６３５６号及び２０１４年７月１日に出願された日本国特願２０１４−１３６３５７号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の全内容をここに援用する。
【符号の説明】
【０２０１】
１０…樹脂粒子、２０…金属粒子、３０…内包金属粒子、４０…一部露出金属粒子、５０…表面吸着金属粒子、６０…表層部、１００…樹脂−金属複合体、１１０…メンブレン、１２０…試料添加部、１３０…判定部、１３１…捕捉リガンド、１４０…吸液部、１５０…標識抗体、１６０…アナライト、１７０…複合体、２００…テストストリップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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