(57)【要約】      （修正有）【課題】全コーヒー果実抽出物を含む年齢関連性神経変性疾患軽減用組成物の製造方法の提供。【解決手段】（ａ）新たに採集した全コーヒー果実を用意し、任意選択で水分含量が２０％以下になるように前記全コーヒー果実を乾燥させるステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の乾燥させた全コーヒー果実を、水、メタノール、エタノール及びアセトンから選択される溶媒による抽出に供するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の抽出物を回収するステップとを含む方法により、前記全コーヒー果実抽出物を得ることを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
全コーヒー果実抽出物を含む年齢関連性神経変性疾患軽減用組成物の製造方法であって、
（ａ）新たに採集した全コーヒー果実を用意し、任意選択で水分含量が２０％以下になるように前記全コーヒー果実を乾燥させるステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の乾燥させた全コーヒー果実を、水、メタノール、エタノール及びアセトンから選択される溶媒による抽出に供するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の抽出物を回収するステップと
を含む方法により、前記全コーヒー果実抽出物を得ることを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）における前記抽出が、約５０〜約１００℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）における前記抽出が、約０．５〜約５時間行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）における前記抽出において、固体と液体との比が、約１：２０〜約１：５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）における前記抽出が、約２５〜約３０％エタノールによって、固体と液体との比が約１：１０〜約１：５で、約７０〜約８０℃で約３．５〜約４時間実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記全コーヒー果実抽出物が、クロロゲン酸（ＣＡ）及びプロシアニジンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、ｐ−ＣＲＥＢ及びＢＤＮＦの発現レベルの増加、並びにｐ−ｅＩＦ２α、ＢＡＣＥ−１、Ａβ、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ−２の発現レベル低下用である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、アルツハイマー病におけるＡβ沈着減少用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記年齢関連性神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性痴呆症及びハンチントン舞踏病からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記年齢関連性神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が前記全コーヒー果実抽出物を約５０〜約４００ｍｇ／ｋｇ含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が前記全コーヒー果実抽出物を約２００ｍｇ／ｋｇ含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、全コーヒー果実を抽出する方法、当該方法から得られる抽出物、及び当該抽出物を使用する年齢関連性神経変性疾患を軽減する方法を提供する。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]  コーヒー果実は、主にアフリカ及び中東で生産される。報告では、アフリカ及びアジアにおいて、コーヒー果実の果皮及び果肉は、ワインへの発酵又は噛むための食物として直接使用されることが報告に示されている。イエメンにおいて、コーヒー果実の果皮は、現地の人々が「キシル」と呼ぶ飲料を作るために、香辛料と混合され、煮つめられる（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｉ．、２０００年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｏｎ  Ａ．  Ｐｒｉｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。他方、全コーヒー果実抽出物を９０日間給餌したラットにおける毒物学試験の結果は、最も高い非観察効果レベル（ＮＯＥＬ）が３４４６ｍｇ／ｋｇ  ｂｗ／日（雄ラット）及び４０８７ｍｇ／ｋｇ  ｂｗ／日（雌ラット）であることを実証している（Ｈｅｉｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４８、２５１７〜２５２５頁）。上記の文献は、全コーヒー果実が食用に安全であり、したがって食物として調製できることを証明する。
【０００３】
[0003]  コーヒー果実は、高レベルのフェノール抗酸化物質を含有する。しかしながら、伝統的なコーヒー加工では、収穫後の速い腐敗により産生されるマイコトキシンによる汚染を回避するために、果皮及び果肉は直ちに取り除く若しくは廃棄される又は肥料として使用される。事実、果皮及び果肉は、栄養分及び抗酸化物質に富んでいる（Ｎａｐｏｌｉｔａｎａ  Ａ．ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５５．１０４９９〜１０５０４頁）。文献は、コーヒー果実の水抽出物が、ポリフェノールの８５％より多くを含有し、抽出物１００ｇそれぞれが、６００，０００〜１，５００，０００単位の活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）を含むことを証明する（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５．１４１〜１４６頁）。コーヒー果実は、免疫調整における潜在性を有し、腫瘍成長を阻害することも証明された（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８．１８７〜１９０頁；Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５．１４１〜１４６頁）。
【０００４】
[0004]  加齢は、学習記憶の衰えを通常伴い、学習記憶の衰えは、酸化的ストレス、ニューロン細胞損傷及び神経栄養因子変性などの因子に起因し得る。神経栄養因子は、構造的に関連するタンパク質で構成されるファミリーであり、末梢並びに中枢神経系のニューロンの生存、分化、発生及び機能を調整することができる。それらは、ニューロンシグナル変換及び機能を調整するためにシナプスにとっても重要である（Ｈｕａｎｇら、２００１年）。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、脳内で最も大量に存在する神経栄養因子である。研究者は、小グリア細胞が、ニューロン保護の機序として、損傷を受けた脳領域において大量のＢＤＮＦ及びグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を分泌することを証明した（Ｉｍａｉら、２００７年；Ｓｕｚｕｋｉら、２００１年）。ＢＤＮＦは、神経伝達物質を調整し、ニューロンの成長、分化及び再形成の過程、例えば、海馬により制御される記憶及び学習に関与する。ＢＤＮＦのタンパク質濃縮は、ニューロン活性により調整される。ニューロン活性が増加すると、それによりｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ｃＡＭＰ−ＣＲＥＢ）のシグナル変換経路が活性化され、ＣＲＥＢは、ＢＤＮＦの発現レベルを増強させる重要な転写因子である（Ｌｏｎｚｅら、２００２年）。真核性開始因子２（ｅＩＦ２α）のαサブユニットは、真核性生物の翻訳開始過程における重要なサブユニットであり、リン酸化されると翻訳の開始を阻害し、全体のタンパク質合成を減少させ、シナプスの再形成及びニューロンの安定化に影響を及ぼす。ｐ−ｅＩＦ２αはまた、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）を増加させ、ＣＲＥＢの阻害物質として機能し、その結果その後の転写が阻害される。加えて、遺伝子特異的翻訳により、ｐ−ｅＩＦ２αは、ＢＡＣＥ−１の合成を増加させ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をアミロイド形成の経路に送り、したがってニューロン変性を協力して引き起こすことができる。
【０００５】
[0005]  過剰な炎症は、アミロイドβ（Ａβ）の沈着を誘導することになり、Ａβは炎症反応を同時に活性化し、したがって悪循環を形成する。ＮＬＲＰ３は、ＮＬＲファミリーのメンバーであり、外来微生物の浸潤を検出し炎症反応を活性化する複合体である。ＮＬＲＰ３は、カスパーゼ−１を活性化することによってサイトカインプロインターロイキン１ベータ（プロ−ＩＬ−１β）を活性なＩＬ−１βに転換して、外来物質に対して防御する。他方、ニューロン細胞における過度のＩＬ−１βは、ＣＯＸ−２の産生を誘導し、全体の炎症反応を悪化させることになる。最終的に、ニューロン炎症を引き起こし、ニューロンをアポトーシスさせる場合がある。
【０００６】
[0006]  アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳内のＡβプラークの沈着により特徴付けられる最も一般的な年齢関連性ニューロン変性疾患である。Ａβの凝集は、大量の過酸化物を産生し、酸化的ストレス及び炎症をもたらし、神経栄養因子の変性を促進する。最終的に、それは自食又はアポトーシス経路によりニューロン細胞の死を引き起こし、学習及び記憶能力の欠如を引き起こす場合がある（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、２０１１年）。
【０００７】
[0007]  Ａβ沈着の過剰な蓄積は、酸化的ストレス、炎症反応及びＢＤＮＦの変性を誘導し、それによってＡＤなどの年齢関連性神経変性疾患を引き起こす可能性がある。全コーヒー果実抽出物の広い用途機能にもかかわらず、Ａβ沈着及びＡＤに対する効果に関しては依然として未知である。
【０００８】
[0008]  本発明において、神経変性疾患に対する全コーヒー果実抽出物の効果及びアルツハイマー病に対する潜在的な予防効力が確認された。これらの結果は、全コーヒー果実抽出物が様々な神経変性障害に対して潜在的な治療用途を有し、将来的に抗加齢の健康食品を開発するための参考を提供し得ることを示す。
［発明の概要］
【０００９】
[0009]  本発明において、全コーヒー果実抽出物が、脳内でのＡβの発現及び沈着を低下させ、ＡＤに関連する因子を調整する能力があることが判明する。したがって、本開示は、全コーヒー果実抽出物を生産する新規方法、当該方法により生産される全コーヒー果実抽出物、並びに当該方法により生産した全コーヒー果実抽出物を使用してアルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性痴呆症及びハンチントン舞踏病等の年齢関連性神経変性疾患を軽減する方法を提供する。
【００１０】
[0010]  好ましい実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、水、メタノール、エタノール及びアセトンから選択される溶媒により抽出される。一実施形態において、溶媒は、エタノール、好ましくは約１０〜約５０％エタノール、より好ましくは約２０〜約４０％エタノール、なおより好ましくは約２５〜約３０％エタノールである。
【００１１】
[0011]  好ましい実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、約５０〜約１００℃の温度で抽出される。一実施形態において、温度は、好ましくは約６０〜約９０℃、より好ましくは約７０〜約８０℃である。
【００１２】
[0012]  好ましい実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、約０．５〜約５時間抽出される。一実施形態において、抽出は、好ましくは約３〜約５時間、より好ましくは約３．５〜約４時間行う。
【００１３】
[0013]  好ましい実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、固体と液体との比が約１：２０〜約１：５で抽出される。一実施形態において、比は、約１：２０、約１：１０及び約１：５から選択され、約１：１０〜約１：５が好ましい比である。
【００１４】
[0014]  本開示は、上記の方法で生産される全コーヒー果実抽出物にも関する。好ましい実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、５−Ｏ−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）、クロロゲン酸（ＣＡ）及びプロシアニジンを含む。一実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、ＣＡ及びプロシアニジンを含む。
【００１５】
[0015]  本発明は、年齢関連性神経変性疾患を軽減する方法であって、治療有効量の上述の全コーヒー果実抽出物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法に更に関する。一実施形態において、全コーヒー果実抽出物の治療有効量は、約５０〜約４００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態において、対象においてＡβ、ｐ−ｅＩＦ２α、ＢＡＣＥ−１、ｐ−ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ−２が調節される。一実施形態において、ｐ−ｅＩＦ２α、ＢＡＣＥ−１、Ａβ、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ−２は下方制御され、ｐ−ＣＲＥＢ及びＢＤＮＦは上方制御される。一実施形態において、アルツハイマー病におけるＡβ沈着が減少する。一実施形態において、年齢関連性神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性痴呆症及びハンチントン舞踏病から選択される。一実施形態において、年齢関連性神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
【００１６】
[0016]  本発明は、以下の節で詳述される。本発明の他の特徴付け、目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求項において容易に見ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
[0017]  図１Ａ及び１Ｂは、異なるチュー（ｃｈｅｗ）で１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するｐ−ｅＩＦ２αの発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0018]  図２Ａ及び２Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するＢＡＣＥ−１の発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0019]  図３Ａ及び図３Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬並びに全脳それぞれにおけるＡβの領域沈着のパーセンテージを示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0020]  図４Ａ及び４Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるＣＲＥＢに対するｐ−ＣＲＥＢの発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0021]  図５Ａ及び５Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するＢＤＮＦの発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0022]  図６Ａ及び６Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するＮＬＲＰ３の発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0023]  図７Ａ及び７Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するカスパーゼ−１ｐ２０の発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0024]  図８Ａ及び８Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するＩＬ−１βの発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0025]  図９Ａ及び９Ｂは、異なるチューで１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの海馬及び皮質それぞれにおけるβ−アクチンに対するＣＯＸ−２の発現レベルの比を示す（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）。
[0026]  図１０は、標準チュー（Ａ）及び本発明の全コーヒー果実抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）（Ｂ）で１２週間給餌した後の３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの脳におけるＡβ沈着のレベルに対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色の結果を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
[0027]  本明細書において別段の規定がない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的な用語は、当分野の技術者により一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明白であるべきだが、どんな潜在的曖昧性が生じた場合も、本明細書において提供される定義が、どんな辞書又は外部定義よりも優先する。
【００１９】
[0028]  本開示により利用される通り、以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００２０】
[0029]  本明細書では用語「全コーヒー果実」とは、コーヒーの木（コーヒー種）の果実全体のことを指し、外果皮及び外側の中果皮（即ち、果肉）は、内側の中果皮（即ち粘質物）及び内果皮（即ち、殻）を囲み、これは次に種子（即ち、豆）を囲む。したがって、全コーヒー果実という用語は、果実の種子を含み得る又は含み得ない全コーヒー果実のことを特に指す。
【００２１】
[0030]  本明細書では用語「全コーヒー果実抽出物」とは、当業者に公知の任意の全コーヒー果実抽出過程の産物のことを指す。どの全コーヒー果実抽出物も、本明細書における使用に適していると考えられる。例えば、全コーヒー果実抽出物は、水性及び／又はアルコール性溶媒で調製して、１つ以上の望ましい成分に富んだ溶液を得る（及び／又は１つ以上の望ましくない成分を除去した材料を得る）ことができる。こうして調製された抽出物は、クロマトグラフィー方法（例えば、イオン交換、サイズ排除又は濾過）を使用して、又は全コーヒー果実の成分若しくは賦香剤を添加して、更に精製及び／又は特定の成分において濃縮され得る。所望の成分に応じて、抽出物はまた、コーヒーチェリーの選択された部分（例えば、コーヒーチェリーの豆、全コーヒー果実の果肉、粘質物及び／又は果皮の少なくとも１つ以上）から調製され得ることが更に認識されるべきである。好ましい一実施形態において、全コーヒー果実抽出物は、本明細書に開示される方法により調製される。別の好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法により調製される全コーヒー果実抽出物は、製品名、アンソクロロギン（Ａｎｔｈｏｃｈｌｏｒｏｇｉｎ）のものである。
【００２２】
[0031]  本明細書では用語「軽減する」とは、罹患しやすい対象の症状の発症を遅延させ、又は疾患の出現を減少させ、罹患しやすい対象の症状を減少及び／若しくは改善し、又は特定の致死的障害若しくは状態を持つ対象の生存率を増加させることを指す。
【００２３】
[0032]  本明細書では用語「年齢関連性神経変性疾患」とは、加齢につれて進行する、例えば、脳機能及び認知が加齢に伴って下落する神経変性疾患のことを指す。例えば、このような疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性痴呆症及びハンチントン舞踏病がある。
【００２４】
[0033]  本明細書では用語「対象」は、動物、特に哺乳動物を意味する。好ましい一実施形態において、用語「対象」は、ヒトを意味する。
【００２５】
[0034]  本明細書では用語「治療有効量」とは、単独で、又は年齢関連性神経変性疾患を処置するための他の処置／医薬と組み合わせて使用される、治療効力を示す活性成分の量のことを指す。
【００２６】
[0035]  文脈により必要とされない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。
【００２７】
[0036]  本発明の発明者らは、全コーヒー果実抽出物が、ｐ−ＣＲＥＢ及びＢＤＮＦの発現を増強させ、ｐ−ｅＩＦ２α、ＢＡＣＥ−１、Ａβ、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ−２の発現を低下させ得ることを見いだした。これらのパラメータは、年齢関連性神経変性疾患に関連し得るので、したがって本発明は、年齢関連性神経変性疾患に対する新規の治療を提供することができる。好ましい実施形態において、年齢関連性神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
【００２８】
[0037]  酵素に関するデータに加えて、マウスの脳においてＡβの沈着の減少を示すｉｎ  ｓｉｔｕデータが、Ａβ沈着に関連する疾患における全コーヒー果実抽出物の効力を更に証明する。一実施形態において、Ａβ沈着に関連する疾患は、アルツハイマー病である。
【００２９】
[0038]  次に本発明について一般に記述したように、同じことが、本発明の全コーヒー果実抽出物を生産する典型的なプロトコール、及び、年齢関連性神経変性疾患の軽減における全コーヒー果実抽出物の使用を提供する以下の例を参照することによって一層容易に理解され得る。例は、例示的な目的のためだけに提供され、決して本発明の範囲を限定するものではない。使用される数（例えば、量、温度、等）に関する精度を確実にするための取り組みが行われたが、いくつかの実験誤差及び偏差を、当然ながら考慮に入れるべきである。
【実施例】
【００３０】
実施例１：全コーヒー果実抽出物の調製
[0039]  コーヒー（コーヒー・アラビカ［Ｃｏｆｆｅｅ  Ａｒａｂｉｃａ］）豆原料は、タイナン、ピントン、ファーリエン並びにタイトウの農業者のコーヒー園又は農業生産及び売買群から得た。コーヒー果実（新鮮な果実）を、表面微生物を減少させるために、受領後に殺菌した。次いで、コーヒー果実を、貯蔵技術により研究室に搬送した。到着直後に、コーヒー果実を寒風又は凍結乾燥に供し、それにより新鮮な果実を乾燥させて水分含量を２０％以下にした。乾燥後、コーヒー果実を保存したか、又は抽出のために挽いて粉末にした。
【００３１】
[0040]  抽出の間、全コーヒー果実粉末を、抽出用エタノールに溶解した。抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、存在し得る活性成分を分析した。結果から、抽出物が５−ＣＱＡ、ＣＡ及びプロシアニジンを含むことが明らかになる。抽出物を凍結乾燥させ、アンソクロロギンと命名される茶色から深茶色の粉末を得た。抽出物の生物活性に対する評価の前に、乾燥産物をトウモロコシ油に溶解し、チューにおいて所望の濃度に調整した。
【００３２】
実施例２：飼料の実験的設計及び組成物
[0041]  老化促進マウスＰ８（ＳＡＭＰ８）を、アルツハイマー病の軽減を評価する動物モデルに使用した。このマウスモデルは、年齢関連性記憶欠損を有することにより特徴付けられる。全コーヒー果実抽出物が、学習及び記憶容量を改善する効力を有するか、並びに関連する分子機序に対する効果を有するかどうか調査した。３ヵ月齢ＳＡＭＰ８を、３０（Ｗ）×２０（Ｄ）×１０（Ｈ）ｃｍの透明なプラスチックケージ内で育てた。温度を２２±２℃で保ち、相対湿度を６５±５％で保ち、部屋は明期を自動的に制御し、７：００〜１９：００が暗期及び１９：００〜７：００が明期であった。試験前に、動物を３〜５日間適応させた。実験開始時に、マウスを、標準的な食事（２０％カゼイン、５％トウモロコシ油、１％ビタミン混合物［ＡＩＮ９３−Ｇ］、５％ミネラル混合物［ＡＩＮ９３−Ｇ］、２％セルロース粉末及び２．５％コリン）を摂取する対照群と、追加の２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物を摂取する実験群とに分けた。上記２００ｍｇ／ｋｇは、ヒト１日用量であり、投与のためにマウス用量に転換された。飼料及び水は、自由に摂取させた。実験を通じて、食物摂取量及び体重を記録した。１２週間の給餌後にマウスを屠殺し、脳サンプルを、アミロイドβ（Ａβ）、リン酸真核生物開始因子２α（ｐ−ｅＩＦ２α）、ベータ−部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素−１（ＢＡＣＥ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びリン酸ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ｐ−ＣＲＥＢ）に対する分析に供した。炎症マーカーＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ２のレベルも測定した。
【００３３】
実施例３：ウェスタンブロット分析
[0042]  脳組織サンプルを均質化した。観察すべき標的タンパク質の分子量に従って、異なる濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電気泳動のために調製した。サンプルを１００℃で加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルに順次ロードした。標的タンパク質が所望の位置に流れ得るように、分離を６５Ｖ  １００分間及び１００Ｖ  ８０分間行った。電気泳動後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＰＶＤＦ膜をカセット中に置いて、標的タンパク質を移した。移動は、４℃冷蔵室内で行った。
【００３４】
[0043]  移動の完了後に、ＰＶＤＦ膜を、標的タンパク質の分子量に従って切り、小さい箱の中に置いて１時間ブロッキングした。次いで膜を振盪機上で、洗浄緩衝液で数回洗浄した。洗浄後に、一次抗体溶液を添加して、４℃冷蔵室内で、振盪機上で膜を浸漬し、８〜１６時間のインキュベーション後に回収した。二次抗体溶液を次いで添加して、膜をシェーカー上で、室温で１時間浸漬した。ＰＶＤＦ膜を、次いで増強化学発光（ＥＣＬ）基質とインキュベートし、化学発光画像化システム内に置いて画像の写真を撮像した。
【００３５】
[0044]  この例における各実験群のデータを、ＳＰＳＳソフトウェアによって分析した。結果を、平均±標準誤差で表す。各群間のタンパク質発現の差異を、一元配置分散分析法（一元配置ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。Ｐ＜０．０５が、有意差を表す。
【００３６】
実施例３．１：Ａβ関連因子ｐ−ｅＩＦ２αの発現レベルの分析
[0045]  図１Ａ及び図１Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図１Ａ）及び皮質（図１Ｂ）におけるβ−アクチンに対するｐ−ｅＩＦ２αの発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００３７】
実施例３．２：Ａβ調節因子ＢＡＣＥ−１の発現レベルの分析
[0046]  図２Ａ及び図２Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図２Ａ）及び皮質（図２Ｂ）におけるβ−アクチンに対するＢＡＣＥ−１の発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００３８】
実施例３．３：脳におけるＡβの沈着の分析
[0047]  図３Ａ及び図３Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図３Ａ）及び全脳（図３Ｂ）においてＡβの領域沈着のパーセンテージは低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００３９】
実施例３．４：神経栄養因子ｐ−ＣＲＥＢの発現レベルの分析
[0048]  図４Ａ及び図４Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図４Ａ）及び皮質（図４Ｂ）におけるＣＲＥＢに対するｐ−ＣＲＥＢの発現レベルの比は増加する。増加は、統計的有意性に達する。
【００４０】
実施例３．５：神経栄養因子ＢＤＮＦの発現レベルの分析
[0049]  図５Ａ及び図５Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図５Ａ）及び皮質（図５Ｂ）におけるβ−アクチンに対するＢＤＮＦの発現レベルの比は増加する。増加は、統計的有意性に達する。
【００４１】
実施例３．６：炎症関連因子ＮＬＲＰ３の発現レベルの分析
[0050]  図６Ａ及び図６Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図６Ａ）及び皮質（図６Ｂ）におけるβ−アクチンに対するＮＬＲＰ３の発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００４２】
実施例３．７：炎症関連因子カスパーゼ−１の発現レベルの分析
[0051]  図７Ａ及び図７Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図７Ａ）及び皮質（図７Ｂ）におけるβ−アクチンに対するカスパーゼ−１ｐ２０の発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００４３】
実施例３．８：炎症関連因子ＩＬ−１βの発現レベルの分析
[0052]  図８Ａ及び図８Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図８Ａ）及び皮質（図８Ｂ）におけるβ−アクチンに対するＩＬ−１βの発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００４４】
実施例３．９：炎症関連因子ＣＯＸ−２の発現レベルの分析
[0053]  図９Ａ及び図９Ｂに示すように、異なるチュー（ａ：対照、ｂ：２００ｍｇ／ｋｇ全コーヒー果実抽出物）で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスにおいて、マウス脳の海馬（図９Ａ）及び皮質（図９Ｂ）におけるβ−アクチンに対するＣＯＸ−２の発現レベルの比は低下する。低下は、統計的有意性に達する。
【００４５】
実施例４：Ａβに対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色
[0054]  マウスを屠殺した後、脳組織を得、１０％ホルマリンに直ちに浸漬してパラフィン包埋し、組織をスライスした（３〜５μｍ／薄片）。ＩＨＣ染色を実行する前に、薄片をキシレン中に置いて脱ろうし、エタノールで処理してキシレンを取り除いた。薄片を、トリロジーに浸漬し、１２１℃で１５分間加熱して抗原性を復元し、続いてＩＨＣ染色した。第１に、ヤギ血清−ＰＢＳ溶液を添加してブロッキングした。ブロッキング後に、希釈したモノクローナル抗Ａβ抗体を添加し、４℃で終夜インキュベートした。次の日、スーパーエンハンサー溶液を添加して暗所において室温で反応させ、続いてポリ−ＨＲＰ試薬と暗所において室温で反応させた。ＤＡＢを１．５分間使用して発色させ、次いでヘマトキシリンを使用して対比染色した。完了後に、薄片を光学顕微鏡に置いて、Ａβ沈着の量に相当する茶色がかった物質の密度を観察した。
【００４６】
[0055]  結果を、異なる食事で１２週間給餌した３ヵ月齢雄ＳＡＭＰ８マウスの脳におけるＡβの沈着のレベルを表す図１０に示す。図１０Ａは、マウスを標準チューで給餌した対照群の結果である。図１０Ｂは、マウスを、本発明の全コーヒー果実抽出物２００ｍｇ／ｋｇを更に添加したチューで給餌した実験群の結果である。図１０における結果は、図１０ＡにおけるＡβ沈着のレベルが図１０Ｂにおけるそれより明白に強いことをはっきりと実証している。この結果は、本発明の全コーヒー果実抽出物２００ｍｇ／ｋｇで給餌したマウスが、ＳＡＭＰ８マウスの脳において著しく減少したＡβ沈着の量を有することを示す。したがって、Ａβ沈着に関連する疾患又は症状は、本発明の全コーヒー果実抽出物で給餌したＳＡＭＰ８マウスにおいて軽減され得る。
【００４７】
[0056]  年齢関連性神経変性疾患は、酸化的ストレス、ニューロン細胞損傷又は神経栄養因子レベルの低下によって引き起こされ得る。上記にて実証した例から、本発明の全コーヒー果実抽出物を摂ることにより、神経栄養因子ｐ−ＣＲＥＢ及びＢＤＮＦのレベルが増加し、Ａβを調節するｐ−ｅＩＦ２α及びＢＡＣＥ−１が低下したことが意外にも見いだされた。最終的に、Ａβの沈着の低下が観察された。更に、炎症因子ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β及びＣＯＸ−２の発現レベルが低下した。したがって、クロロゲン酸（ＣＡ）及びプロシアニジンを含み得る本発明の全コーヒー果実抽出物は、年齢関連性神経変性疾患を軽減するのに有用であり得る。
【００４８】
[0057]  当業者であれば、上記した例証となる実施例に記載された本発明の多数の改変及びバリエーションを思い付くと予測される。結果として、添付の特許請求の範囲に記載された限定のみが本発明に課せられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【外国語明細書】
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