(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍効果と安全性面に優れる、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬の提供。【解決手段】次式：2020143114.tif 000092で示される抗腫瘍性化合物と抗ＨＥＲ３抗体とを、次式：-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-又は-L1-L2-LP-で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体−薬物コンジュゲート。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式で示されるリンカー及び薬物と、抗ＨＥＲ３抗体と、が結合した抗体−薬物コンジュゲート。
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-(NH-DX)又は-L１-L２-LＰ-(NH-DX)
（ここで、抗ＨＥＲ３抗体は、L１の末端において結合し、
n１は、０から６の整数を示し、
n２は、０から５の整数を示し、
L１は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n３-C(=O)-を示し、
ここで、n３は、２から８の整数を示し、
L２は、-NH-(CH2-CH2-O)n４-CH2-CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n４は、１から６の整数を示し
LＰは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
Lａは、-O-又は単結合を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１】
2020143114.tif 000088
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(NH-DX)は次式：
【化２】
2020143114.tif 000089
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。）
但し、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造と、抗ＨＥＲ３抗体と、が結合した抗体−薬物コンジュゲートを除く。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)；
（ここで、-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示し、-DGGFG-は、-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-のペンタペプチド残基を示す。）
【請求項２】
LＰのペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるペプチド残基である請求項１記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
LＰが、以下の群から選ばれるペプチド残基である請求項１又は２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
-GGF-、
-DGGF-、
-(D-)D-GGF-、
-EGGF-、
-GGFG-、
-SGGF-、
-KGGF-、
-DGGFG-、
-GGFGG-、
-DDGGFG-、
-KDGGFG-、
-GGFGGGF-；
（ここで『(D-)D』はＤ−アスパラギン酸を示す。）
【請求項４】
LＰが、４又は５個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である請求項１又は２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
LＰが、-GGFG-又は-DGGFG-である請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
LＰが、-GGFG-である請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
n３が２から５の整数であって、L２が単結合である請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
リンカーが、-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-である請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
n３が２から５の整数であって、L２が-NH-(CH2CH2-O)n４-CH2CH2-C(=O)-であり、n４が２又は４である請求項８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-が、４から７原子の鎖長を有する部分構造である請求項８又は９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-が、５又は６原子の鎖長を有する部分構造である請求項８又は９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-が、以下のいずれかである請求項１０又は１１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
【請求項１３】
-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-が、以下のいずれかである請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
【請求項１４】
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-(CH2)n２-C(=O)-(NH-DX)又は-L１-L２-LＰ-(NH-DX)で示される薬物−リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)；
（ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化３】
2020143114.tif 000090
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
-(NH-DX)は次式：
【化４】
2020143114.tif 000091
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示し、-DGGFG-は、-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-のペンタペプチド残基を示す。）
【請求項１５】
抗ＨＥＲ３抗体が、Ｕ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９のＣＤＲＨ１乃至Ｈ３及びＣＤＲＬ１乃至Ｌ３を重鎖及び軽鎖にそれぞれ含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
抗ＨＥＲ３抗体が、Ｕ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を重鎖及び軽鎖にそれぞれ含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号４２及び４４、５４及び５６、７０及び７２、９２及び９４、若しくは、９６及び９８で示されるアミノ酸配列を重鎖及び軽鎖にそれぞれ含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号５８３及び５８４で示されるアミノ酸配列を重鎖及び軽鎖にそれぞれ含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
抗ＨＥＲ３抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、請求項１８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である請求項１〜１９のいずれか一に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する医薬。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び／又は抗癌薬。
【請求項２４】
肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、又は陰茎癌に適用するための請求項２３に記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成物。
【請求項２６】
肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、又は陰茎癌に適用するための請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＥＲ３抗体と抗腫瘍性薬物とをリンカー構造部分を介して結合させた、
抗腫瘍薬として有用な抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞表面に発現し、かつ細胞に内在化できる抗原に結合する抗体（該抗原に結合した
該抗体も細胞に内在化できる）に、細胞毒性を有する薬物を結合させた抗体−薬物コンジ
ュゲート（Antibody-Drug Conjugate；ADC）は、癌細胞に選択的に薬物を送達できること
によって、癌細胞内に薬物を蓄積させ、癌細胞を死滅させることが期待できる（非特許文
献１〜３参照）。ADCとして例えば、抗CD33抗体にカリチアマイシンを結合させたMylotar
g（登録商標；ゲムツズマブオゾガマイシン）が急性骨髄性白血病の治療薬として認可さ
れている。また、抗CD30抗体にオーリスタチンＥを結合させたAdcetris（登録商標；ブレ
ンツキシマブベドティン）がホジキンリンパ腫と未分化大細胞リンパ腫の治療薬として最
近認可された（非特許文献４参照）。これまでに認可されたADCに含有される薬物は、DNA
又はチューブリンを標的としている。
【０００３】
抗腫瘍性の低分子化合物としてトポイソメラーゼＩを阻害して抗腫瘍作用を発現する化
合物であるカンプトテシン誘導体が知られている。その中で下式：
【０００４】
【化１】
2020143114.tif 000002
【０００５】
で示される抗腫瘍性化合物（エキサテカン、化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フル
オロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インド
リジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン）は、水溶性のカンプトテシン誘導体であ
る（特許文献１、２）。この化合物は、現在臨床で用いられているイリノテカンとは異な
り、抗腫瘍効果の発現には酵素による活性化を必要としない。また、イリノテカンの薬効
本体であるSN-38や、同じく臨床で用いられているトポテカンよりもトポイソメラーゼＩ
阻害活性が強く、in vitroで種々の癌細胞に対して、より強い殺細胞活性を有している。
特にP-glycoproteinの発現によってSN-38等に耐性を示す癌細胞に対しても効果を示した
。また、マウスのヒト腫瘍皮下移植モデルでも強い抗腫瘍効果を示し、臨床試験が行われ
たものの、上市には至っていない（非特許文献５〜１０参照）。エキサテカンがADCとし
て有効に作用するかについては明らかではなかった。
【０００６】
DE-310は、生分解性のカルボキシメチルデキストランポリアルコールポリマーにエキサ
テカンを、GGFGペプチドスペーサーを介して結合させた複合体である（特許文献３）。エ
キサテカンを高分子プロドラッグ化することによって、高い血中滞留性を保持させ、さら
に腫瘍新生血管の透過性の亢進と腫瘍組織滞留性を利用して、受動的に腫瘍部位への指向
性を高めたものである。DE-310は、酵素によるペプチドスペーサーの切断によって、活性
本体であるエキサテカン、及びグリシンがアミノ基に結合しているエキサテカンが持続的
に遊離され、その結果薬物動態が改善される。非臨床試験における種々の腫瘍の評価モデ
ルにおいて、DE-310は、ここに含まれるエキサテカンの総量がエキサテカン単剤の投与時
よりも減少しているのにも拘らず、単剤の投与時よりもより高い有効性を示した。DE-310
に関しては臨床試験が実施され、有効例も確認され、活性本体が正常組織よりも腫瘍に集
積することが確認されたとの報告がある一方、腫瘍へのDE-310及び活性本体の集積は正常
組織への集積と大差なく、ヒトでは受動的なターゲティングは見られなかったとの報告も
ある（非特許文献１１〜１４参照）。結果としてDE-310も上市には至らず、エキサテカン
がこの様なターゲティングを指向した薬物として有効に機能するかについては明らかでは
なかった。
【０００７】
DE-310の関連化合物として、-NH-(CH2)4-C(=O)-で示される構造部分を-GGFG-スペーサ
ーとエキサテカンの間に挿入し、-GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)-をスペーサー構造とする複合体
も知られているが（特許文献４）、同複合体の抗腫瘍効果については全く知られていない
。
【０００８】
ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３，ＥｒｂＢ３としても知られる）は、受容体蛋白
質チロシンキナーゼであり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、上皮増殖因子受容体としても知られる
）、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４（非特許文献１５〜１７参照）とともに受容体蛋白質チロシン
キナーゼのＥＧＦＲサブファミリーに属する。典型的な上皮増殖因子受容体と同様に、膜
貫通受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ド
メイン、膜貫通ドメイン、及びカルボキシル末端リン酸化ドメインからなる。これらのド
メインに加えてＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４は細胞内蛋白質チロシンキナーゼドメイン
（ＴＫＤ）を保持するが、ＨＥＲ３はこのドメインを欠損しており自己リン酸化能を持た
ない。
リガンドであるヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ，ＨＲＧ）は、ＨＥＲ３の細胞外ドメ
インに結合し、他のヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーメンバーとの二量体化
と細胞内ドメインのリン酸転移を促進することにより、受容体を介したシグナル経路を活
性化する。ＨＥＲファミリーメンバーとの二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナルポテンシャ
ルを増大させ、シグナルの多様化のみならずシグナルの増幅のための手段となる。例えば
、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーは、ＨＥＲファミリーのうちで最も重要な増殖シグ
ナルの一つを誘導する。ＨＥＲ３は乳癌、胃腸癌及び膵臓癌等、いくつかの種類の癌にお
いて過剰発現している。興味深いことに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３の発現と非浸潤性段階から
浸潤性段階への進行との間に相関が示されている（非特許文献１８〜２０参照）。したが
って、ＨＥＲ３を介したシグナルを阻害する物質が望まれている。抗ＨＥＲ３抗体及びそ
の免疫コンジュゲートが、特許文献５〜１０等でそれぞれ報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−５９０６１号公報
【特許文献２】特開平８−３３７５８４号公報
【特許文献３】国際公開第１９９７／４６２６０号
【特許文献４】国際公開第２０００／２５８２５号
【特許文献５】米国特許第５９６８５１１号公報
【特許文献６】米国特許第５４８０９６８号公報
【特許文献７】国際公開第２００３／０１３６０２号
【特許文献８】国際公開第２００７／０７７０２８号
【特許文献９】国際公開第２００８／１００６２４号
【特許文献１０】国際公開第２０１２／０１９０２４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
【非特許文献２】Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
【非特許文献３】Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
【非特許文献４】Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
【非特許文献５】Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
【非特許文献６】Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786.
【非特許文献７】Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
【非特許文献８】Joto, N. et al.. Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
【非特許文献９】Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
【非特許文献１０】De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
【非特許文献１１】Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al., (2003) 145-153.
【非特許文献１２】Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.
【非特許文献１３】Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
【非特許文献１４】Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
【非特許文献１５】Plowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 4905-4909.
【非特許文献１６】Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 9193-9197.
【非特許文献１７】Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 2900-2904.
【非特許文献１８】Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821.
【非特許文献１９】deFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498.
【非特許文献２０】Naidu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗体による腫瘍の治療においては、抗体が抗原を認識して腫瘍細胞に結合しても抗腫瘍
効果が十分でない場合が観察されることもあり、より効果の高い抗腫瘍抗体が必要とされ
る場合がある。また、抗腫瘍性の低分子化合物においては、抗腫瘍効果に優れていても副
作用や毒性面等、安全性上の問題を有するものが多く、安全性をより高めてより優れた治
療効果を獲得することが課題となっている。すなわち、本発明は、抗腫瘍効果と安全性面
に優れる、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬を獲得して提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、抗ＨＥＲ３抗体が腫瘍細胞を標的にできる抗体であること、すなわち、
腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、腫瘍細胞に内在化できる特性、
或は腫瘍細胞に対する殺細胞活性等を備えた抗体であることから、抗腫瘍性化合物である
エキサテカンを、リンカー構造部分を介して同抗体に結合させた抗体−薬物コンジュゲー
トに変換することによって、抗腫瘍性化合物を腫瘍細胞により確実に移動させて当該化合
物の抗腫瘍効果を腫瘍細胞で特異的に発揮させることができること、したがって抗腫瘍効
果の確実な発揮とともに抗ＨＥＲ３抗体の殺細胞効果の増強が期待できること、さらには
抗腫瘍性化合物の投与量を当該化合物の単体投与時よりも減少させることができること、
すなわちこれらによって通常細胞への抗腫瘍性化合物の影響を緩和させることができるの
でより高い安全性を達成できること、が可能と考えた。
このために本発明者らは特定の構造のリンカーを創出し、このリンカーを介して抗ＨＥ
Ｒ３抗体とエキサテカンとを結合させた抗体−薬物コンジュゲートを獲得することに成功
し、同コンジュゲートが優れた抗腫瘍効果を発揮することを見出して本発明を完成させた
のである。
【００１３】
すなわち本願発明は、
［１］次式
【化２】
2020143114.tif 000003
で示される抗腫瘍性化合物と抗ＨＥＲ３抗体とを次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-又は-L1-L2-LP-
で示される構造のリンカーを介して、抗ＨＥＲ３抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド
結合部分において形成させたチオエーテル結合によって結合させたことを特徴とする抗体
−薬物コンジュゲートに関するものである。
【００１４】
ここで、抗ＨＥＲ３抗体はL1の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ
基の窒素原子を結合部位として、-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基又はLPのＣ末端に
結合する。
式中、n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
ここで、n3は、２から８の整数を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化３】
2020143114.tif 000004
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上で
これを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
【００１５】
さらに本願発明は以下の各々に関するものでもある。
［２］LPのペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン
、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるペプチド残基で
ある［１］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［３］LPが、以下の群から選ばれるペプチド残基である［１］又は［２］に記載の抗体−
薬物コンジュゲート：
-GGF-、
-DGGF-、
-(D-)D-GGF-、
-EGGF-、
-GGFG-、
-SGGF-、
-KGGF-、
-DGGFG-、
-GGFGG-、
-DDGGFG-、
-KDGGFG-、及び
-GGFGGGF-；
ここで『(D-)D』はD-アスパラギン酸を示す。
［４］LPが、４又は５個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である［１］又は［２］に
記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［５］LPが、-GGFG-又は-DGGFG-である［１］から［４］のいずれかに記載の抗体−薬物
コンジュゲート。
［６］LPが、-GGFG-である［１］から［４］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲー
ト。
【００１６】
［７］n3が２から５の整数であって、L2が単結合である［１］から［６］のいずれかに記
載の抗体−薬物コンジュゲート。
［８］リンカーが、-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-である［１］から［７］の
いずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［９］n3が２から５の整数であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が
２又は４である［８］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１０］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、４から７原子の鎖長を有する部分構造であ
る［８］又は［９］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１１］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、５又は６原子の鎖長を有する部分構造であ
る［８］又は［９］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１２］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-である［１０］又は［１１］に記載の抗体−薬物コンジュゲー
ト。
［１３］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
である［１２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１４］リンカーが、-L1-L2-LP-である［１］から［５］のいずれかに記載の抗体−薬物
コンジュゲート。
［１５］LPが、-DGGFG-である［１４］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１６］n3が２から５の整数であって、L2が単結合である［１５］に記載の抗体−薬物コ
ンジュゲート。
【００１７】
［１７］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-又は-L1-L2-LP-に薬物を結合させた薬
物−リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［１］に
記載の抗体−薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
【００１８】
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化４】
2020143114.tif 000005
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上で
これを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
-(NH-DX)は次式：
【化５】
2020143114.tif 000006
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基、-DGGFG-は、-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly
-のペンタペプチド残基を示す。
【００１９】
［１８］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物−リンカー構
造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［１］に記載の抗体−薬
物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
【００２０】
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-、-(NH-DX)、-GGFG-、及び-DGGFG-は、上記の通りであ
る。
【００２１】
［１９］次式：
【化６】
2020143114.tif 000007
で示される抗腫瘍性化合物と抗ＨＥＲ３抗体とを次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
で示される構造のリンカーを介して、抗ＨＥＲ３抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド
結合部分において形成させたチオエーテル結合を介して結合させたことを特徴とする抗体
−薬物コンジュゲート。
ここで、抗ＨＥＲ３抗体はL1の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は-(CH2)n2-C(=O)
-部分のカルボニル基に結合する。
式中、n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
ここで、n3は、２から８の整数を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、-GGFG-のテトラペプチド残基を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化７】
2020143114.tif 000008
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上で
これを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
【００２２】
［２０］n1が３であり、n2が０であり、n3が２であり、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(
=O)-であって、n4が２であり、Laが単結合であるか、
n1が１であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-であるか、又
は
n1が２であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-である［１９
］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２１］n3が２又は５であって、L2が単結合である［１９］又は［２０］に記載の抗体−
薬物コンジュゲート。
［２２］n3が２又は５であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が２又
は４である［１９］又は［２０］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２３］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
である［１９］から［２２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【００２３】
［２４］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物−リンカー構
造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［１９］から[２３]のい
ずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；
【００２４】
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化８】
2020143114.tif 000009
で示される構造であり、このものの３位で抗ＨＥＲ３抗体と結合し、１位の窒素原子上で
これを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
-(NH-DX)は次式：
【化９】
2020143114.tif 000010
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示す。
【００２５】
［２５］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物−リンカー構
造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［１９］から［２３］の
いずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-、-(NH-DX)、及び-GGFG-は、上記の通りである。
【００２６】
［２６］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０
個の範囲である［１］から［２５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２７］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［１］から［２５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２８］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［１］から［２５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【００２７】
［２９］［１］から［２８］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又
はそれらの水和物を含有する医薬。
［３０］［１］から［２８］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又
はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［３１］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、
扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫
、又は陰茎癌に適用するための［３０］に記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［３２］［１］から［２８］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又
はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成物
。
［３３］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、
扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫
、又は陰茎癌に適用するための［３２］に記載の医薬組成物。
［３４］［１］から［２８］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又
はそれらの水和物を投与することを特徴とする腫瘍及び/又は癌の治療方法。
［３５］他の薬剤と組み合せて投与される、［２９］記載の医薬、［３０］もしくは［３
１］記載の抗腫瘍薬及び/若しくは抗癌薬、［３２］もしくは［３３］記載の医薬組成物
、又は［３４］記載の治療方法。
［３６］他の薬剤をも活性成分として含有する、［３２］又は［３３］記載の医薬組成物
。
【００２８】
［３５］次式で示される化合物：
(maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)又は(male
imid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-(NH-DX)
を抗ＨＥＲ３抗体又はその反応性誘導体と反応させ、該抗体のヒンジ部に存在するジスル
フィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させる方法によって薬物−リンカー部分
を該抗体に結合させることを特徴とする抗体−薬物コンジュゲートの製造方法。
【００２９】
式中、n3は、整数の２から８を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン
酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し
、
n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式：
【化１０】
2020143114.tif 000011
で示される、窒素原子が結合部位である基である。
-(NH-DX)は、次式
【化１１】
2020143114.tif 000012
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００３０】
［３６］薬物−リンカー部分を抗ＨＥＲ３抗体に結合させる方法が、該抗体を還元処理し
て反応性誘導体に変換する方法である［３５］に記載の製造方法。
【００３１】
［３７］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０
個の範囲である［３５］又は［３６］に記載の製造方法。
［３８］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［３５］又は［３６］に記載の製造方法。
［３９］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［３５］又は［３６］に記載の製造方法。
［４０］［３５］から［３９］のいずれかの製造方法によって得られる抗体−薬物コンジ
ュゲート。
【００３２】
［４１］抗ＨＥＲ３抗体を還元条件で処理した後に以下の化合物群から選ばれる化合物を
反応させることを特徴とする、該抗体のヒンジ部のジスルフィド結合部分においてチオエ
ーテル結合を形成させて得られる抗体−薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(
=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-
CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
【００３３】
ここで、(maleimid-N-yl)-は、次式：
【化１２】
2020143114.tif 000013
で示される、窒素原子が結合部位である基である。
-(NH-DX)は、次式
【化１３】
2020143114.tif 000014
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基、-DGGFG-は、-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly
-のペンタペプチド残基を示す。
【００３４】
［４２］抗ＨＥＲ３抗体を還元条件で処理した後に以下の化合物群から選ばれる化合物を
反応させることを特徴とする、該抗体のヒンジ部のジスルフィド結合部分においてチオエ
ーテル結合を形成させて得られる抗体−薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
ここで、(maleimid-N-yl)-、-(NH-DX)、及び-GGFG-は、上記の通りである。
【００３５】
［４３］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０
個の範囲である［４１］又は［４２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［４４］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［４１］又は［４２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［４５］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［４１］又は［４２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［４６］［４０］から［４５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、
又はそれらの水和物を含有する医薬。
［４７］［４０］から［４５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、
又はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［４８］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、
扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫
、又は陰茎癌に適用するための［４７］に記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［４９］［４０］から［４５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、
又はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成
物。
［５０］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、
扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫
、又は陰茎癌に適用するための［４９］に記載の医薬組成物。
［５１］［４０］から［４５］のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、
又はそれらの水和物を投与することを特徴とする腫瘍及び/又は癌の治療方法。
［５２］他の薬剤と組み合せて投与される、［４６］記載の医薬、［４７］もしくは［４
８］記載の抗腫瘍薬及び/若しくは抗癌薬、［４９］もしくは［５０］記載の医薬組成物
、又は［５１］記載の治療方法。
［５３］他の薬剤をも活性成分として含有する、［４９］又は［５０］記載の医薬組成物
。
【発明の効果】
【００３６】
特定の構造のリンカーを介して抗腫瘍性化合物エキサテカンを結合させた抗ＨＥＲ３抗
体−薬物コンジュゲートによって、優れた抗腫瘍効果及び安全性を達成することができる
。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号５８３）を示す。
【図２】抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖の全長アミノ酸配列（配列番号５８４）を示す。
【図３】Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲートの連続希釈液で処理したＨＣＣ１５６９の平均蛍光強度を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、ＫＤとＢｍａｘ値を算出した。
【図４】Ａ５４９細胞を２日間、Ｕ１−５９又は種々の抗体−薬物コンジュゲートと共に培養した。ＨＥＲ３又はリン酸化ＨＥＲ３をウェスタンブロッティングにより評価した。泳動コントロールとして、ｐａｎ−Ａｃｔｉｎを検出した。
【図５】Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート処理（３７℃，１時間）によるＨＣＣ１５６９細胞表面のＨＥＲ３発現低下の平均値を示す。
【図６】ヒト乳癌株（ＨＣＣ  １５６９）における、ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの抑制試験の結果を示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性となる発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を示す。
【図７】ヒト乳癌株（ＭＤＡ−ＭＢ  ４５３）における、ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの抑制試験の結果を示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性となる発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を示す。
【図８】ヒトメラノーマ株（Ａ３７５）における、ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの抑制試験の結果を示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性となる発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を示す。
【図９】ヒト大腸癌株（ＨＴ  ２９）における、ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの抑制試験の結果を示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性となる発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を示す。
【図１０】ヒト肺癌株（Ａ  ５４９）における、ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの抑制試験の結果を示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性となる発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を示す。
【図１１】抗体−薬物コンジュゲート（３）と抗体−薬物コンジュゲート（４）の細胞増殖・生存阻害率の比較結果を示す。左図は、１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存阻害率を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性を示す発光を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。右図は、無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を高ドラッグローディング（ＨＤＬ）と中ドラッグローディング（ＭＤＬ）で比較した。
【図１２】抗体−薬物コンジュゲート（１０）と抗体−薬物コンジュゲート（１１）の細胞増殖・生存阻害率の比較結果を示す。左図は、１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存阻害率を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性を示す発光を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。右図は、無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を高ドラッグローディング（ＨＤＬ）と中ドラッグローディング（ＭＤＬ）で比較した。
【図１３】抗体−薬物コンジュゲート（１３）と抗体−薬物コンジュゲート（１４）の細胞増殖・生存阻害率の比較結果を示す。左図は、１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存阻害率を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性を示す発光を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケートの平均±標準誤差を示す。右図は、無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュゲート処理による発光低下率を高ドラッグローディング（ＨＤＬ）と中ドラッグローディング（ＭＤＬ）で比較した。
【図１４】抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、又は（１３）を用いたヒト乳癌（ＨＣＣ１５６９）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図１５】抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、又は（１３）を用いたヒトメラノーマ（ＨＴ−１４４）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図１６】抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、又は（１３）を用いたヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は投与からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図１７】抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、又は（１３）を用いたヒト大腸癌株（ＨＴ−２９）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は投与からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図１８】抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、又は（１３）を用いたヒト肺癌株（Ａ５４９）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図１９】抗体−薬物コンジュゲート（１３）を用いたヒトトリプルネガティブ乳癌株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積及び初期マウス重量は記述的データ（平均及び標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２０】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒトルミナール乳癌株（ＭＣＦ−７）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２１】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒトメラノーマ株（ＷＭ−２６６−４）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２２】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト卵巣癌株（ＯＶＣＡＲ−８）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２３】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト膀胱癌株（ＳＷ−７８０）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２４】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト乳癌株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２５】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト乳癌株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２６】抗体−薬物コンジュゲート（１５）を用いたヒトヒト乳癌株（ＪＩＭＴ−１）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２７】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト肺癌株（ＰＣ９）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２８】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒトトリプルネガティブ乳癌株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図２９】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト頭頸部癌株（Ｆａｄｕ）抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【図３０】抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）を用いたヒト胃癌患者由来腫瘍片（ＮＩＢＩＯ−Ｇ０１６）を用いた抗腫瘍試験の結果を示す。縦軸は平均腫瘍体積を、横軸は細胞移植からの日数を示す。全ての値は平均±標準誤差で示される。初期腫瘍体積および初期マウス重量は記述的データ（平均および標準誤差）を用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いて解析された。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお
、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、こ
れによって本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３９】
本発明はＨＥＲ３結合蛋白質−薬物コンジュゲートを提供する。本発明のＨＥＲ３結合
タンパク質は、好適には、抗体様結合活性を有する足場タンパク質又は抗体、すなわち、
抗ＨＥＲ３抗体である。
【００４０】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、抗ＨＥＲ３抗体に、リンカー構造部
分を介して抗腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物であり、以下に詳細に説明する。
本発明の文脈内で、本明細書において使用される「足場タンパク質」という用語は、ア
ミノ酸の挿入、置換又は欠失が高度に許容される露出された表面を有するポリペプチド又
はタンパク質を意味する。本発明に従って使用することができる足場タンパク質の例は、
スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から
得られるプロテインＡ、ピエリス・ブラッシッカエ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ
）から得られるビリン結合タンパク質又はその他のリポカリン、アンキリン反復タンパク
質及びヒトフィブロネクチンである（Ｂｉｎｚ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｃｕｒｒ 
Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６， ４５９−６９中に概説されている。）。足場タ
ンパク質の操作は、安定に折り畳まれたタンパク質の構造的フレームワーク上に又は構造
的フレームワーク中に親和性機能を移植し、又は組み込むこととみなすことができる。親
和性機能とは、本発明に従うタンパク質結合親和性を意味する。足場は、結合特異性を付
与するアミノ酸配列から構造的に分離可能である。一般に、この様な人工的親和性試薬の
開発に適していると思われるタンパク質は、推論によって、又は最も一般的にはＨＥＲ３
（精製されたタンパク質又は細胞表面上にディスプレイされたタンパク質の何れか）に対
するパニング等の、インビトロでディスプレイされた人工的足場ライブラリーの結合剤に
対するコンビナトリアルタンパク質工学技術（これらの技術は、本分野において公知であ
る（Ｓｋｅｒｒａ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．， ２０００；Ｂｉｎｚ ａｎｄ Ｐｌｕｃ
ｋｔｈｕｎ， ２００５））によって取得され得る。さらに、抗体様結合活性を有する足
場タンパク質は、足場ドメインを含有するアクセプターポリペプチドに由来することがで
き、アクセプターポリペプチドを含有する足場ドメイン上にドナーポリペプチドの結合特
異性を付与するために、アクセプターポリペプチドには、ドナーポリペプチドの結合ドメ
インを移植することができる。前記挿入された結合ドメインは、例えば、抗体、特に、抗
ＨＥＲ３抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得る。挿入は、例えば、当業者に周知の
組み換え法の様々な形態による、ポリペプチド合成、コードするアミノ酸の核酸合成等、
当業者に公知の様々な方法によって達成することが可能である。
【００４１】
［抗体］
さらに、本明細書において使用される「抗体」又は「抗ＨＥＲ３抗体」という用語は、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ 
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１（１９８６），５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８），３２３−３２９；ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ
，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２），５９３−５９６）、キメ
ラ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８１（１９８４），６８５１−６８５５）、ヒト抗体と完全ヒト抗体、（Ｔｏｍ
ｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ
．１３３−１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，
Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ
Ａｓｐｅｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓ
ｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７、国際公
開第２００７／０７７０２８号等）、少なくとも２つの抗体から形成された多重特異的抗
体（例えば、二重特異的抗体）又はこれらの抗体断片を意味する。「抗体断片」という用
語は、上記抗体のあらゆる一部、好ましくはそれらの抗原結合領域又は可変領域を含む。
抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）2断片、Ｆｖ断片、ダイアボ
ディ（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．９０（１９９３），６４４４−６４４８）、一本鎖抗体分子（Ｐｌｕｃｋｔｈ
ｕｎ ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ， ＥＤＳ， Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），２６９−３１５）及びＨＥＲ３への所望の
結合能を示す限り他の断片が含まれる。
【００４２】
さらに、本明細書において使用される「抗体」又は「抗ＨＥＲ３抗体」という用語は、
抗体の加工されたサブドメインを含有する抗体様分子又は天然に存在する抗体変種を含み
得る。これらの抗体様分子は、ラクダ科の動物（ｃａｍｅｌｉｄ）等の天然の取得源から
得られた（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４，２７７−３０２）、又は、ヒト、ラクダ科の動
物若しくはその他の種から得たライブラリーのインビトロディスプレーを通じて得られた
（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，４８４−９０
）ＶＨのみ又はＶＬのみのドメイン等の単一ドメイン抗体であり得る。
【００４３】
本発明において、「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最低の抗体
断片である。これらの領域は、緊密に非共有会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽
鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが、ＶH−ＶL二量体の
表面上の抗原結合部位を規定するために相互作用するのは、この立体配置中である。一括
して、６つのＣＤＲが抗体への抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ド
メイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、一般に
、完全な結合部位より低い親和性であるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含
有する。「Ｆａｂ断片」は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由
来の１つ又はそれ以上のシステイン等、数個の残基が付加されている点で、「Ｆａｂ'断
片」と異なる。「Ｆ（ａｂ'）2断片」は、当初、ヒンジシステインをその間に有する「Ｆ
ａｂ'断片」の対として作製される。パパイン又はペプシン消化等、この様な抗体断片を
調製する方法は、当業者に公知である。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３の細胞
外ドメイン（ＥＣＤ）に対して誘導された抗ＨＥＲ３抗体である。
【００４５】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートに使用される抗ＨＥＲ３抗体は、いずれ
の種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、及びウサギを例示できる
。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが
好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっ
てもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
抗ＨＥＲ３抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる
特性、腫瘍細胞に結合できる特性、腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性、そして腫
瘍細胞に対する殺細胞活性等を備えており、抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介
して結合させて抗体−薬物コンジュゲートとすることができる。
抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内
への抗体の取り込みは、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内
に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Cell Death and Differentiati
on (2008) 15, 751-761）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細
胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Molecular Biology of the Cell Vol. 1
5, 5268-5282, December 2004）、又は（３）治療抗体に結合するイムノトキシンを用い
て、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというＭａｂ−ＺＡ
Ｐアッセイ（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：１６２−１６５，  Ｊａｎｕａｒｙ
２０００）を用いて確認できる。イムノトキシンとしては、ジフテテリア毒素の触媒領
域とプロテインＧとのリコンビナント複合蛋白質も使用可能である。
抗体の抗腫瘍活性は、in vitroでは、細胞の増殖の抑制活性で測定することで確認でき
る。例えば、抗体の標的蛋白質を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃
度で抗体を添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活
性を測定することができる。In vivoでは、例えば、標的蛋白質を高発現している腫瘍細
胞株を移植したヌードマウスに抗体を投与し、当該癌(腫瘍)細胞の変化を測定することに
よって、抗腫瘍活性を確認できる。
抗体−薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する化合物を結合させてあるので、抗体
自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。抗腫瘍性化合物の細胞障
害性を腫瘍細胞において特異的・選択的に発揮させる目的からは、抗体が内在化して腫瘍
細胞内に移行する性質のあることが重要であり、好ましい。
【００４６】
抗ＨＥＲ３抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチド
を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができ
る。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原
を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒ
ト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature(1975)256, p.495-497、Ken
net, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)）に従って
、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによっ
てハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させ
ることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製
し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上
記の遺伝子操作による抗原発現細胞、或は抗原を発現している細胞株、を動物に免疫する
方法を用いることによっても抗体を取得できる。
抗ＨＥＲ３抗体は、公知の手段によって取得することができる。
【００４７】
本発明で使用できる抗ＨＥＲ３抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有す
るものが望ましい。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗ＨＥＲ３抗体；
（ａ）ＨＥＲ３に特異的に結合する。
（ｂ）ＨＥＲ３と結合することによってＨＥＲ３発現細胞に内在化する活性を有する。
（２）ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）モノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活
性を有する上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗
体又はヒト若しくは完全ヒト（モノクローナル）抗体である上記（１）乃至（４）のいず
れかに記載の抗体。
（６）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２に記載のアミノ酸配
列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）乃至（５）のい
ずれかに記載の抗体。
（７）重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している上記（１）乃至（６）のいずれ
かに記載の抗体。
（８）配列番号７０に記載のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域及び配列番号７２に記
載のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含んでなる上記（７）に記載の抗体。
（９）上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含
有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得ら
れた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗
体。
【００４８】
以下に、本発明において使用される抗ＨＥＲ３抗体について説明する。
本明細書において、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本明細書において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ及びそのｃＲＮＡも含まれる。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれる。
本明細においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書において、「ＨＥＲ３」は、ＨＥＲ３蛋白質と同じ意味で用いている。
本明細書における「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ
ｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽
鎖にはそれぞれ３箇所のＣＤＲがあることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙ
ｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内
にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一
次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書においては、抗体のＣＤＲ
について、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２
、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１
、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結
合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハ
イブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又はＤＮＡを固
定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼ
ーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  
ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することによっ
て同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００４９】
１．ＨＥＲ３
ＨＥＲ３はヒト上皮増殖因子受容体３で、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ３とも呼ばれ、受容体蛋
白質チロシンキナーゼであり、ＨＥＲ１，ＨＥＲ２及びＨＥＲ４とともに受容体蛋白質チ
ロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する。ＨＥＲ３は膜貫通受容体
であり、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通
ドメイン、細胞内蛋白質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びカルボキシル末端リン
酸化ドメインを含む。ＨＥＲ３は乳癌、胃腸癌及び膵臓癌等、いくつかの種類の癌におい
て過剰発現している。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の発現と非浸潤性段階から浸潤性段階への進行
との間に相関が見られる。
本発明で用いるＨＥＲ３蛋白質は、ヒト、非ヒト哺乳動物（ラット、マウス等）のＨＥ
Ｒ３発現細胞から直接精製して使用するか、或は当該細胞の細胞膜画分を調製して使用す
ることができ、また、ＨＥＲ３をin vitroにて合成する、或は遺伝子操作によって宿主細
胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＨＥＲ３
ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエ
ネルギー物質を含む溶液中で合成する、或は他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形
質転換させることによってＨＥＲ３を発現させることによって、該蛋白質を得ることがで
きる。また、前記の遺伝子操作によるＨＥＲ３発現細胞、或はＨＥＲ３を発現している細
胞株をＨＥＲ３蛋白質として使用することも可能である。
ＨＥＲ３のＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開さ
れており、例えばＡＡＡ３５９７９（アミノ末端１９アミノ酸残基からなるシグナル配列
を含む前駆体）、Ｍ３４３０９（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能であ
る。
また、上記ＨＥＲ３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付
加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、当該蛋白質と同等の生物活性を有する蛋
白質もＨＥＲ３に含まれる。
【００５０】
２．抗ＨＥＲ３抗体の製造
本発明のＨＥＲ３に対する抗体は、この分野で通常実施される方法に従って、ＨＥＲ３
又はＨＥＲ３のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内
に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＨＥＲ３
の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＨＥＲ３を
動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種ＨＥＲ３に結合する抗体と
ヒトＨＥＲ３との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別で
きる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ
（１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．
Ｙ．（１９８０））に従って、ＨＥＲ３に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエロー
マ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得る
こともできる。
なお、抗原となるＨＥＲ３はＨＥＲ３遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に発現させ
ることによって得ることができる。
具体的には、ＨＥＲ３遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入し
て該遺伝子を発現させ、発現したＨＥＲ３を精製すればよい。
また、上記の遺伝子操作によるＨＥＲ３発現細胞、或はＨＥＲ３を発現している細胞株
をＨＥＲ３蛋白質として使用することも可能である。以下、具体的にＨＥＲ３に対する抗
体の取得方法を説明する。
【００５１】
（１）  抗原の調製
抗ＨＥＲ３抗体を作製するための抗原としてはＨＥＲ３又はその少なくとも６個の連続
した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、或はこれらに任意のアミノ酸配列や担体が
付加された誘導体を挙げることができる。
ＨＥＲ３は、ヒトの腫瘍組織或は腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また
、ＨＥＲ３をin vitroにて合成する、或は遺伝子操作によって宿主細胞に産生させること
によって得ることができる。
遺伝子操作では、具体的には、ＨＥＲ３のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ
後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、或は他
の原核生物又は真核生物の宿主細胞を形質転換してＨＥＲ３を発現させることによって、
抗原を得ることができる。
また、膜蛋白質であるＨＥＲ３の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合蛋白質
を適切な宿主・ベクター系において発現させることによって、分泌蛋白質として抗原を得
ることも可能である。
ＨＥＲ３のｃＤＮＡは例えば、ＨＥＲ３のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリ
ーを鋳型として、ＨＥＲ３  ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９  参照）を行う、いわゆるＰＣＲ法によ
って取得することができる。
ポリペプチドのイン・ビトロ（in vitro）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノス
ティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を挙げることができる
が、これに限定されない。
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を挙げることができる。目的の遺伝子を
これらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわ
ち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。
また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することが
できる配列を有するものが好ましい。
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞とし
ては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１
）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０；ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ
３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ
細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．  
ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９
８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されな
い。
上記の様にして得られる形質転換体は、この分野で通常実施される方法に従い培養する
ことができ、該培養によって細胞内又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗
生物質やＩＰＭＧを添加して用いることができる。
上記培養によって、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋
白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法によって分離・精製
することができる。
該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子
ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、これらの組合せ等を例示できる。
また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンタグを繋げることによって
、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。或は、発現させる組
換え蛋白質にＩｇＧのＦｃ領域を繋げることによって、プロテインＡカラムで効率的に精
製することができる。
上記方法を組合せることによって容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大
量に製造できる。
上記に述べた形質転換体自体を抗原として使用することも可能である。また、ＨＥＲ３
を発現する細胞株を抗原として使用することも可能である。
【００５２】
（２）  抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体の製造
ＨＥＲ３と特異的に結合する抗体の例としてＨＥＲ３と特異的に結合するモノクローナ
ル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記の様な作業工程が必要である。
すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、又は抗原発現細胞の調製、
（ｂ）抗原を動物に注射することによって免疫した後、血液を採取してその抗体価を検定
して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培
養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）この様にして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検
討、或は標識試薬としての特性の検定
等である。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法は
これに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもで
きる。
【００５３】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記した様な方法で調製したＨＥＲ３又はその一部を使用することがで
きる。
また、ＨＥＲ３発現組換え体細胞よって調製した膜画分、又はＨＥＲ３発現組換え体細
胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプ
チドを抗原として使用することもできる。
さらに、ＨＥＲ３発現細胞株を抗原として使用することもできる。
【００５４】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、或はカリミ
ョウバンの様な助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。この他に、抗原発現
細胞を免疫原として実験動物に免疫する方法もある。実験動物は公知のハイブリドーマ作
製法で用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラ
ット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生
細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫
動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統には特に制限はなく、マウスの場合には
、例えば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ
５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ
ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、例えば、Ｗｉｓ
ｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃ
ｈｅｒ等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア株式会社、日本チャ−ルス・リバー株式
会社等の実験動物飼育販売業者より入手することができる。
被免疫動物としては、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは
ＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下さ
せたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらのマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに
好ましくは６〜８週齢である。
ＨＥＲ３又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，
Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．
Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ
．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ
Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１
９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、例えば以下の通
りである。
すなわち、まず、抗原である膜蛋白質画分、又は抗原を発現させた細胞を動物の皮内又
は腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は
皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることが
できる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には
、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔
２〜４週間がさらに好ましい。
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には０．０５〜
５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは１〜４週間後、さらに
好ましくは１〜３週間後に行う。免疫原が細胞の場合には、１×１０6乃至１×１０7個の
細胞を使用する。
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等によって異なるが、一
般に、例えばマウスの場合には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さら
に好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。免疫原が細胞の場合には、１×１０6乃至
１×１０7個の細胞を使用する。
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後
に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。その際
に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば
、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げ
ることができるがこれらの方法に制限されない。本発明における抗体価の測定は、例えば
ＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載する様な手順によって行うことができる。
まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着さ
せ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミン（以下「ＢＳＡ」という）によって覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希
釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結
合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定
することによって、抗体価を算出する。
被免疫動物の脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば
、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｋｏｈ
ｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１；Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０；Ｗａ
ｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５）に従って行うことができる。
例えば、脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、
イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用
することができる。
【００５５】
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択し
て用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考
慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎ
ｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが
好ましい。
すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、
ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ
）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１
．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴ
Ｇ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２
）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例
えば、ＡＴＣＣ等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培
地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下
「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地）、イスコフ改変ダル
ベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕ
ｍ；ＩＭＤＭ）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞
融合の３乃至４日前に正常培地（例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の
素株式会社製））で継代培養し、融合当日に２×１０7以上の細胞数を確保しておく。
【００５６】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ
．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏ
ｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）
等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができ
る。
その様な方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産
生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を
用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下の通りである。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子
量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中
で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを
１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【００５７】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合によって得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用い
てハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマを
ＨＡＴ培地で培養することによって、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブ
リドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
【００５８】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース
法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ，  Ｂ．Ｍ
．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特にメチル
セルロース法等の三次元培養法が好適である。例えば、細胞融合によって形成されたハイ
ブリドーマ群をＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（Ｓ
ｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＃０３８０４）等のメチルセルロース
培地に懸濁して培養し、形成されたハイブリドーマコロニーを回収することでモノクロー
ンハイブリドーマの取得が可能である。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、
得られたハイブリドーマ培養上清中に安定して抗体価の認められたものを抗ＨＥＲ３モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００５９】
（ｇ）ハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製
この様にして選択されたハイブリドーマは、これを培養することによって、モノクロー
ナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法によ
って行うことができる。
以上の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に
凍結状態で保存することができる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養
される。
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、或はスピナー培養で行われる。この大量培
養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することによって、
本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、或はＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔
内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることによって、本発明のモ
ノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ；
プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
例えば、ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞
を不活性化した後、２０日後に１０6〜１０7個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清
を含まない培地中に浮遊（０．５ｍＬ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水
がたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法によって、培養液中に比べて約
１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法によって得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，
ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＨＥＲ３に対して高い抗原特異性を有する。
【００６０】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下の様
に行うことができる。
まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、
又はＲＩＡ法を挙げることができる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操
作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と
反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対
応する抗体を用いることによって、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同
定することが可能である。
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキッ
ト；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度（１
．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ）より算出する方法によって行うこ
とができる。
さらに、（２）の（ａ）乃至（ｈ）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナ
ル抗体を取得した場合においても、抗ＨＥＲ３抗体と同等の細胞傷害活性を有する抗体を
取得することが可能である。この様な抗体の一例として、抗ＨＥＲ３抗体と同一のエピト
ープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、抗
ＨＥＲ３抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル
抗体が抗ＨＥＲ３抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、抗
ＨＥＲ３抗体のＨＥＲ３に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合する（即ち、
該モノクローナル抗体が、抗ＨＥＲ３抗体とＨＥＲ３の結合を妨げる）ことを確認するこ
とによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクロー
ナル抗体が抗ＨＥＲ３抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピ
トープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体が抗ＨＥＲ３抗体と同
等の抗原結合能又は生物活性を有していることが強く期待される。
【００６１】
（３）  その他の抗体
本発明の抗体には、上記ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異
種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば
、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体等も
含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウ
ス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げるこ
とができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−
６８５５，（１９８４）参照）。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲ
の配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開
第９０／０７８６１号）を挙げることができる。
なお、本明細書中における「数個」とは、１乃至１０個、１乃至９個、１乃至８個、１
乃至７個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、又は１若しくは２個を意
味する。
【００６２】
本発明において、本発明の結合タンパク質のアミノ酸配列は、２０の一般的なアミノ酸
に限定されないことを理解すべきである（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ（２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ， Ｅｄｓ．
， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ．（１９
９１）（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。例えば、アミノ
酸には、２０の一般的なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）、α，α−二置換
されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸等の非天然アミノ
酸が含まれ得る。本発明の結合タンパク質に対する適切な成分でもあり得る非慣用アミノ
酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、
Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチ
ルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン
）が含まれる。
【００６３】
また、本明細書におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい。保存
的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である
。好適なアミノ酸グループは、以下の通りである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グル
タミン酸；塩基性グループ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリ
プトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システ
イン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次の通りである：
脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン
及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並び
に芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかるアミノ酸置
換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。本発
明の抗体の重鎖及び軽鎖においては、Ｎ末端のアミノ酸がグルタミン酸である場合、それ
は環化していること（ピログルタミンになっていること）がある。その様なピログルタミ
ンも、本発明においては、アミノ酸配列上、通常のグルタミンと区別されない。また、本
発明の抗体の重鎖及び軽鎖においては、システインがシステイニル（cysteinyl）化して
いることがある。その様なシステイニル（cysteinyl）化したものも、本発明においては
、アミノ酸配列上、通常のシステインと区別されない。
【００６４】
本発明の抗体としては、さらに、ＨＥＲ３に結合する、ヒト抗体を挙げることができる
。抗ＨＥＲ３ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を
意味する。抗ＨＥＲ３ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片
を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，
Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−
３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，ｐ．
６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ
．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９；Ｔ
ｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（
２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
【００６５】
この様なヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺
伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等を介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝
子座が導入された遺伝子組み換え動物として、ノックアウト動物及びトランスジェニック
動物の作製及びこれらの動物同士を掛け合わせることによって作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術によって、その様なヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードす
るｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターによって真核細胞を形質転換し、遺伝
子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することによって、この
抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ
等の哺乳動物細胞を用いることができる。
ヒト抗体作製については国際公開第２００７／０７７０２８号に詳細に記載されている
。国際公開第２００７／０７７０２８号の内容は、本発明の開示の一部を構成する。
【００６６】
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得
する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７
），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  
ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０
０２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）
も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させ
て、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いる
ことができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結
合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクタ
ーを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによってヒト抗体を取得することがで
きる（国際公開第９２／０１０４７号、同９２／２０７９１号、同９３／０６２１３号、
同９３／１１２３６号、同９３／１９１７２号、同９５／０１４３８号、同９５／１５３
８８号；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５；Ｎ
ａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１
１６）。
【００６７】
本発明の一つの側面はＨＥＲ３に結合する蛋白質に関する。本発明のある態様において
、本発明の単離されたＨＥＲ３結合タンパク質は、（ａ）配列番号２、６、１０、１４、
１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６
６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１
２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５
０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９
０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６又は２
３０に示されるアミノ酸配列に含まれるＣＤＨＲ１；（ｂ）配列番号２、６、１０、１４
、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、
６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１
１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１
５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１
９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６又は
２３０に示されるアミノ酸配列に含まれるＣＤＲＨ２；及び（ｃ）配列番号２、６、１０
、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、
６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０
８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４
６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８
６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２
６又は２３０に示されるアミノ酸配列に含まれるＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列、並
びに（ｄ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、
５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、
１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、
１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、
１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、
２２８又は２３２に示されるアミノ酸配列に含まれるＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号４、８
、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、
６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、
１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、
１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、
２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８又は２３２に示され
るアミノ酸配列に含まれるＣＤＲＬ２；及び（ｆ）配列番号４、８、１２、１６、２０、
２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８
２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２
８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６
８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０
８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８又は２３２に示されるアミノ酸配列に含ま
れるＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００６８】
本発明の単離されたＨＥＲ３結合蛋白質は、好適には（ａ）配列番号２３６、２５１、
２５２及び２５６からなる群から選択される一つで示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ
１；（ｂ）配列番号２５８、２７８、２８０及び２８２からなる群から選択される一つで
示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；及び（ｃ）配列番号２８３、２８５、３０９、
３１３及び３１５からなる群から選択される一つで示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ
３を含む重鎖アミノ酸配列、並びに（ｄ）配列番号３２０、３３４、３３７及び３４０か
らなる群から選択される一つで示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号
３４３、３５６、３５１及び３４４からなる群から選択される一つで示されるアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ２；及び（ｆ）配列番号３６０、３８１、３８５及び３８７からなる群
から選択される一つで示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を
含む。
【００６９】
本発明の別の形態において、本発明の単離されたＨＥＲ３結合タンパク質は、配列番号
２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、
５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、
１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、
１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、
１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、
２２２、２２６及び２３０からなる群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び／
又は配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、
５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６
、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８
、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８
、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８
及び２３２からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００７０】
本発明のさらに別の形態において、本発明の単離されたＨＥＲ３結合タンパク質は、好
適には、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、２
２及び２４、２６及び２８、３０及び３２、３６及び３８、４２及び４４、４６及び４８
、５０及び５２、５４及び５６、６０及び５８、６２及び６４、６６及び６８、７０及び
７２、７４及び７６、７８及び８２、８０及び８２、８４及び８６、８８及び９０、９２
及び９４、９６及び９８、１００及び１０２、１０４及び１０６、１０８及び１１０、１
１２及び１１４、１１６及び１１８、１２２及び１２４、１２６及び１２８、１３０及び
１３２、１３４及び１３６、１３８及び１４０、１４２及び１４４、１４６及び１４８、
１５０及び１５２、１５４及び１５６、１５８及び１６０、１６２及び１６４、１６６及
び１６８、１７０及び１７２、１７４及び１７６、１７８及び１８０、１８２及び１８４
、１８６及び１８８、１９０及び１９２、１９４及び１９６、１９８及び２００、２０２
及び２０４、２０６及び２０８、２１０及び２１２、２１４及び２１６、２１８及び２２
０、２２２及び２２４、２２６及び２２８、若しくは２３０及び２３２に示されている重
鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、又は、配列番号３４、４０、６
０、６２若しくは１２０に示されている重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５８若し
くは６４に示されている軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
本発明の単離されたＨＥＲ３結合タンパク質は、より好適には、配列番号４２、５４、
７０、９２又は９６で示される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び、配列番号４４、５６、
７２、９４又は９８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００７１】
配列番号２及び４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
を含む抗体を「Ｕ１−３９」、配列番号６及び８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及
び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４０」、配列番号１０及び１２に示さ
れる重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３８
」、配列番号１４及び１６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４１」、配列番号１８及び２０に示される重鎖可変領域アミ
ノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４２」、配列番号２２及び
２４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「
Ｕ１−４３」、配列番号２６及び２８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変
領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４４」、配列番号３０及び３２に示される重鎖可
変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４５」、配列番
号３６及び３８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含
む抗体を「Ｕ１−４７」、配列番号４２及び４４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及
び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４９」、配列番号４６及び４８に示さ
れる重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５０
」、配列番号５０及び５２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５１」、配列番号５４及び５６に示される重鎖可変領域アミ
ノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５３」、配列番号６０及び
５８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「
Ｕ１−５５」、配列番号６２及び６４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変
領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５７」、配列番号６６及び６８に示される重鎖可
変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５８」、配列番
号７０及び７２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含
む抗体を「Ｕ１−５９」、配列番号７４及び７６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及
び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５２」、配列番号７８及び８２に示さ
れる重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−６１
」、配列番号８０及び８２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−６１．１」、配列番号８４及び８６に示される重鎖可変領域
アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−６２」、配列番号８８
及び９０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体
を「Ｕ１−２」、配列番号９２及び９４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可
変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−７」、配列番号９６及び９８に示される重鎖可
変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−９」、配列番号
１００及び１０２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を
含む抗体を「Ｕ１−１０」、配列番号１０４及び１０６に示される重鎖可変領域アミノ酸
配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１２」、配列番号１０８及び１
１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「
Ｕ１−１３」、配列番号１１２及び１１４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖
可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１４」、配列番号１１６及び１１８に示され
る重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１５」
、配列番号１２２及び１２４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミ
ノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２０」、配列番号１２６及び１２８に示される重鎖可変領
域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２１」、配列番号１
３０及び１３２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含
む抗体を「Ｕ１−２２」、配列番号１３４及び１３６に示される重鎖可変領域アミノ酸配
列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２３」、配列番号１３８及び１４
０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ
１−２４」、配列番号１４２及び１４４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可
変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２５」、配列番号１４６及び１４８に示される
重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２６」、
配列番号１５０及び１５２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２７」、配列番号１５４及び１５６に示される重鎖可変領域
アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−２８」、配列番号１５
８及び１６０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む
抗体を「Ｕ１−３１」、配列番号１６２及び１６４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列
及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３２」、配列番号１６６及び１６８
に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１
−３５」、配列番号１７０及び１７２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変
領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３６」、配列番号１７４及び１７６に示される重
鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３７」、配
列番号１７８及び１８０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸
配列を含む抗体を「Ｕ１−３４」、配列番号１８２及び１８４に示される重鎖可変領域ア
ミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１」、配列番号１８６及
び１８８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体
を「Ｕ１−３」、配列番号１９０及び１９２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽
鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４」、配列番号１９４及び１９６に示され
る重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５」、
配列番号１９８及び２００に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−６」、配列番号２０２及び２０４に示される重鎖可変領域ア
ミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−８」、配列番号２０６及
び２０８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体
を「Ｕ１−１１」、配列番号２１０及び２１２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び
軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１６」、配列番号２１４及び２１６に示
される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１
７」、配列番号２１８及び２２０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域
アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１８」、配列番号２２２及び２２４に示される重鎖可
変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３３」、配列番
号２２６及び２２８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
を含む抗体を「Ｕ１−２９」、配列番号２３０及び２３２に示される重鎖可変領域アミノ
酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−３０」、配列番号３４に示さ
れる重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４６」、配列番号４０に示される重
鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−４８」、配列番号６０及び５８に示される
重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５５．１
」、配列番号１２０に示されている重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体を「Ｕ１−１９
」、配列番号６２及び６４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ
酸配列を含む抗体を「Ｕ１−５７．１」と呼ぶ。これらの抗体については実施例に詳しく
記載されている。
本発明の単離されたＨＥＲ３結合タンパク質は、より一層好適には、配列番号４２及び
４４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、配列番号５４
及び５６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、配列番号
７０及び７２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、配列
番号９２及び９４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、
又は、配列番号９６及び９８に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び軽鎖可変領域アミ
ノ酸配列を含み、さらにより一層好適には、かかるＨＥＲ３結合タンパク質は抗ＨＥＲ３
抗体であるＵ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９である。
【００７２】
【化１４】
2020143114.tif 000015
2020143114.tif 000016
2020143114.tif 000017
2020143114.tif 000018
2020143114.tif 000019
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2020143114.tif 000021
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2020143114.tif 000023
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2020143114.tif 000025
2020143114.tif 000026
2020143114.tif 000027
2020143114.tif 000028
2020143114.tif 000029
2020143114.tif 000030
2020143114.tif 000031
2020143114.tif 000032
2020143114.tif 000033
2020143114.tif 000034
2020143114.tif 000035
2020143114.tif 000036
2020143114.tif 000037
2020143114.tif 000038
2020143114.tif 000039
2020143114.tif 000040
2020143114.tif 000041
2020143114.tif 000042
2020143114.tif 000043
【００７３】
【化１５】
2020143114.tif 000044
2020143114.tif 000045
2020143114.tif 000046
2020143114.tif 000047
2020143114.tif 000048
【００７４】
新たに作製されたモノクローナル抗体が、Ｕ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１
−７又はＵ１−９抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該抗体が
Ｕ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９抗体と同一のエピトープに
結合すると判定することができる。また、Ｕ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−
７又はＵ１−９抗体のＨＥＲ３に対する結合に対して該抗体が競合する（すなわち、該抗
体がＵ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９抗体とＨＥＲ３の結合
を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定され
ていなくても、該抗体がＵ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−９抗
体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であること
が確認された場合、該抗体がＵ１−４９、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、Ｕ１−７又はＵ１−
９抗体と同等の生物活性を有していることが強く期待される。
【００７５】
本発明によれば、本発明のＨＥＲ３結合タンパク質は、ＨＥＲ３の細胞外部分中の少な
くとも１つのエピトープと相互作用する。エピトープは、好ましくは、アミノ末端ドメイ
ンであるドメインＬ１（アミノ酸１９から１８４）、システインに富む２つのドメインで
あるドメインＳ１（アミノ酸１８５から３２７）及びＳ２（アミノ酸５００から６３２）
、システインに富む２つのドメインに隣接しているドメインＬ２（３２８から４９９）又
はＨＥＲ３ドメインの組み合わせの中に位置する。エピトープは、Ｌ１及びＳ１の一部に
よって構成されるエピトープ等（但し、これに限定されない。）のドメインの組み合わせ
中にも位置し得る。さらに、本発明の結合タンパク質は、ＨＥＲ３へのその結合がＨＥＲ
３によって媒介されるシグナル伝達を低下させることをさらに特徴とする。本発明に従っ
て、ＨＥＲ３によって媒介されるシグナル伝達の低下は、例えば、細胞表面からＨＥＲ３
分子を少なくとも部分的に消失させるＨＥＲ３の下方制御によって、又は実質的に不活性
な形態（すなわち、安定化されていない形態に比べて、より低いシグナル伝達を示す形態
）の、細胞表面上のＨＥＲ３の安定化によって引き起こされ得る。或は、ＨＥＲ３によっ
て媒介されるシグナル伝達の低下は、ＨＥＲ３への、リガンド又はＨＥＲファミリーの別
のメンバーの結合、ＨＥＲ−２へのＧＲＢ２の結合若しくはＳＨＣへのＧＲＢ２の結合に
影響を与える（例えば、減少又は阻害する）ことによって、受容体チロシンリン酸化、Ａ
ＫＴリン酸化、ＰＹＫ２チロシンリン酸化若しくはＥＲＫ２リン酸化を阻害することによ
って、又は腫瘍の浸潤性を減少させることによっても引き起こされ得る。或は、ＨＥＲ３
によって媒介されるシグナル伝達の低下は、他のＨＥＲファミリーのメンバーとのＨＥＲ
３含有二量体の形成に影響を与える（例えば、減少又は阻害する）ことによっても引き起
こされ得る。とりわけ、１つの例は、ＨＥＲ３−ＥＧＦＲタンパク質複合体の形成を減少
又は阻害することであり得る。
【００７６】
さらに、本発明において、配列番号１乃至２３２のいずれか一つに示されているアミノ
酸配列中の僅かな変動は、本発明によって包含されるものと想定されるが、但し、アミノ
酸配列中の変動は、配列番号１乃至２３２のいずれか一つに示されている配列の少なくと
も７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
及び最も好ましくは９９％を維持する。変動は、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤ
Ｒ外）、ＣＤＲ内、又はフレームワーク領域及びＣＤＲ内に生じ得る。配列番号１から２
３２に示されているアミノ酸配列中の好ましい変動、すなわち、１乃至数個のアミノ酸の
欠失、挿入及び／又は置換は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的及び機能的ド
メインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを、公共の配列データベース又は
独自の配列データベースと比較することによって同定することが可能である。公知の構造
及び／又は機能の他の結合タンパク質中に生じる配列モチーフ又は予測されるタンパク質
立体構造ドメインを同定するために、コンピュータ化された比較法を使用することが可能
である。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法は公知で
ある。例えばＢｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３， １６４（１９９１）
；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ， ｅｄｓ．， Ｇ
ａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（１９９１ ））；
及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）を参照
されたい（これらは全て、参照により本明細書中に組み込まれる。）。したがって、当業
者であれば、本発明に従って構造及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列
モチーフ及び構造的立体構造を認めることができる。その様なアミノ酸配列中の変動を有
する重鎖及び軽鎖を組み合わせて得られる抗体の中から、元の抗体（親抗体）と同等の又
は親抗体より優れた抗体を選択することが可能である。本発明のＨＥＲ３結合蛋白質、抗
ＨＥＲ３抗体等は、前述の様にアミノ酸配列中に変動が生じても、ＨＥＲ３結合活性を保
持する。
本発明において「相同性」は「同一性」と同義である。二種類のアミノ酸配列間の相同
性は、Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  
Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，  Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，
Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「
Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔ
ｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」
，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）のデフォルトパラ
メーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈ
ｍは、例えば、インターネットでwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastにアクセスすることによっ
ても使用することができる。
【００７７】
以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、公知の方法等
によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
本発明の抗ＨＥＲ３抗体には、ＭＥＨＤ−７９４５Ａ（又はｄｏｌｉｇｏｔｕｚｕｍａ
ｂ）、ＲＧ−７１１６、ＭＭ−１１１、ＭＭ−１２１（又はｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）
、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ−７１６、ｈｕＨＥＲ３−８、ｔｒｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎ
ｔｉ−ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３  ｚｙｂｏｄｙ、ＧＳＫ−２８４９３３０、ＲＥＧＮ−１４
００、ＫＴＮ−３３７９、ＡＶ−２０３、ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｒｏｂｏｄ
ｙ  （ＥｒｂＢ３）、ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ、ＭＰ−ＥＶ−２０、ＺＷ−９、Ｄｉｍ
ｅｒｃｅｐｔTM、ａｎｔｉ−Ｅｒｂ３  ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ（ＳＬ−１７５又はＳＬ−１
７６）、ＳＹＭ−０１３、それらの改変体、活性断片、修飾体等も含まれる。
【００７８】
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができ
る。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱
変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用い
てＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することがで
きる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており
（Ｌｏｒｉ  Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）
、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指
標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いこ
とを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限ら
ないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗
体を選抜する必要がある。
【００７９】
本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又
は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学
的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合への糖鎖付加、Ｎ末又はＣ
末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）された
もの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末にメチオニン残基が付加し
たもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標
識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の
意味に含まれる。この様な本発明の抗体の修飾物は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善
、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
【００８０】
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコー
ス化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修
飾の調節技術としては、国際公開第１９９９／５４３４２号、同２０００／６１７３９号
、同２００２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本
発明の抗体には当該糖鎖修飾が調節された抗体も含まれる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な
宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては
、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする
遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖
配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり
、また別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることが
できる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇ
ｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ
−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ
葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）
を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞
をin vitroで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によ
って収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬とし
ての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形
質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又
は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によ
って得られる抗体も含まれる。
【００８１】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失
することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，
７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン
、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基が
アミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗
体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用等）には
影響を及ぼさない。したがって、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該
抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２のアミノ酸が欠失し
た欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残
基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保
たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限
定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からな
る群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか２種を組み合わせた
ものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種
類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双
方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
本発明の全長抗体（本発明においては、単に「抗体」とも記載される）の範囲には、それ
らの欠失体、１種又は２種以上のそれらの欠失体を含む混合物等も含まれる。また、本発
明の「抗体」には、Ｎ末端がグルタミンの場合にそれが環化してピログルタミンになって
いる重鎖又は軽鎖、及び／又は、システインの一部がシステイニル（cysteinyl）化して
いる重鎖又は軽鎖を含むものも含まれる。
【００８２】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、
ＩｇＧ又はＩｇＭ型、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１
及びＩｇＭ２型等を挙げることができるがそれらに限定されるものではなく、より好適に
はＩｇＧ又はＩｇＭ型のものであり、最適にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である。
【００８３】
抗体の生物活性としては、一般的には抗原結合活性、抗原と結合することによって該抗
原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する
活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び抗
体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有す
る機能は、ＨＥＲ３に対する結合活性であり、好ましくはＨＥＲ３と結合することによっ
てＨＥＲ３発現細胞に内在化する活性である。さらに、本発明の抗体は、細胞内在化活性
に加えて、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性を併せ持っていてもよい。
【００８４】
ある観点において、例えば、治療候補物としてＨＥＲ３に対する抗体を作製することに
関して、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、補体を固定し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関
与できることが望ましい場合があり得る。マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇ
Ｇ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３及びヒトＩｇＡ等（
但し、これらに限定されない。）、補体の固定及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への関
与が可能な抗体のイソタイプが多数存在する。作製される抗体は、この様なイソタイプを
最初から有する必要はなく、むしろ、作製された抗体は、あらゆるイソタイプを有するこ
とができること、並びに、本分野において周知である慣用の分子生物学的技術を用いて、
適切な発現ベクター中に分子クローニングされた定常領域遺伝子又はｃＤＮＡへ、分子ク
ローニングされたＶ領域遺伝子又はｃＤＮＡを付加し、次いで、本分野で公知の技術を用
いて宿主細胞中で抗体を発現させることによって抗体をイソタイプ交換できることが理解
される。イソタイプ交換された抗体は、天然に存在する変種に比べて優れたＣＤＣを有す
る様に分子的に加工され（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６
６，２５７１−２５７５）、本分野で公知の技術を用いて、宿主細胞中で組換え的に発現
されたＦｃ領域も有し得る。この様な技術には、とりわけ、直接的な組換え技術（例えば
、米国特許第４，８１６，３９７号を参照。）、細胞−細胞融合技術（例えば、米国特許
第５，９１６，７７１号及び米国特許第６，２０７，４１８号）の使用が含まれる。細胞
−細胞融合技術では、何れかの所望のイソタイプを有する重鎖を保有する骨髄腫又は他の
細胞株（ＣＨＯ等）が調製され、さらに軽鎖を保有する別の骨髄腫又は他の細胞株（ＣＨ
Ｏ等）が調製される。その後、この様な細胞を融合し、完全な状態の抗体を発現する細胞
株を単離することができる。例として、（抗体の特異性及び抗体の親和性の幾つかを規定
する）同じ可変領域を有しながら、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３イソタイ
プを作製するために、ＨＥＲ３抗原への所望の結合を有するヒト抗ＨＥＲ３ＩｇＧ４抗体
を容易にイソタイプ交換させ得る。その後、この様な分子は、補体を固定し、ＣＤＣへ関
与することが可能であり得る。
【００８５】
さらに、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、単球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のエフ
ェクター細胞上のＦｃ受容体へ結合することができ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に
関与することも望ましい場合があり得る。マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウス
ＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ３等（但し、これらに限定されない。）、上記の
ことが可能な抗体のイソタイプが多数存在する。作製される抗体は、この様なイソタイプ
を最初から有する必要はなく、むしろ、作製された抗体は、あらゆるイソタイプを有する
ことができること、並びに、本分野において周知である慣用の分子生物学的技術を用いて
、適切な発現ベクター中に分子クローニングされた定常領域遺伝子又はｃＤＮＡへ、分子
クローニングされたＶ領域遺伝子又はｃＤＮＡを付加した後、本分野で公知の技術を用い
て抗体を宿主細胞中で発現させることによって、抗体のイソタイプ交換を実施できること
が理解される。イソタイプ交換された抗体は、天然に存在する変種に比べて優れたＡＤＣ
Ｃを有する様に分子的に加工され（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．
，２７６，６５９１−６６０４）、本分野で公知の技術を用いて、宿主細胞中で組換え的
に発現されたＦｃ領域も有し得る。この様な技術には、とりわけ、直接的な組換え技術（
例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照。）、細胞−細胞融合技術（例えば、米
国特許第５，９１６，７７１号及び米国特許第６，２０７，４１８号を参照。）の使用が
含まれる。細胞−細胞融合技術では、何れかの所望のイソタイプを有する重鎖を保有する
骨髄腫又は他の細胞株（ＣＨＯ等）が調製され、及び軽鎖を保有する別の骨髄腫又は他の
細胞株（ＣＨＯ等）が調製される。その後、この様な細胞を融合し、完全な状態の抗体を
発現する細胞株を単離することができる。例として、（抗体の特異性及び抗体の親和性の
幾つかを規定する）同じ可変領域を有しながら、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３イソタイ
プを作製するために、ＨＥＲ３抗原への所望の結合を有するヒト抗ＨＥＲ３ＩｇＧ４抗体
を容易にイソタイプ交換させ得る。次いで、この様な分子は、エフェクター細胞上のＦｃ
γＲへ結合し、ＡＤＣＣに関与することが可能であり得る。
【００８６】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質
で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、
フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電
点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒ
ａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ
，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉ
ｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８
８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用
いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プ
ロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとし
て、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ファルマシア社）等
を挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも
可能である。
【００８７】
［抗腫瘍性化合物］
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートに結合される抗腫瘍性化合物について述
べる。本発明で使用される抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって
、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗
腫瘍性化合物は、リンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分
が遊離して抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍
性化合物が未修飾の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。
本発明で使用される抗腫瘍性化合物として、カンプトテシン誘導体であるエキサテカン
（(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H
-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン；次
式：）
【００８８】
【化１６】
2020143114.tif 000049
【００８９】
を好適に使用することができる。このエキサテカンは、優れた抗腫瘍活性を有しているも
のの、抗腫瘍薬として市販されるには至っていない。同化合物は、公知の方法で容易に取
得でき、１位のアミノ基をリンカー構造への結合部位として好適に使用することができる
。また、エキサテカンはリンカーの一部が結合した状態で腫瘍細胞内で遊離される場合も
あるが、この様な構造であっても優れた抗腫瘍効果が発揮される優れた化合物である。
エキサテカンはカンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えばpH3程度）
ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例
えばpH10程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られてい
る。この様な閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入した薬物コンジュ
ゲートであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれの状態のものも本発明の範囲に包
含されることはいうまでもない。
【００９０】
他の抗腫瘍性化合物として例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン
Ｃ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセ
ート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘
導体、その他のカンプトテシン若しくはその誘導体（特開平6-87746号公報に記載された
抗腫瘍剤）等を挙げることができる。
【００９１】
抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗体１分子への薬物の結合数は、その有効性、安
全性に影響する重要因子である。抗体−薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一
定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが
、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られる
のが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数とし
て特定され、表記される。本発明でも原則として断りのない限り、すなわち、異なる薬物
結合数をもつ抗体−薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定の薬物結合数をもつ抗体−
薬物コンジュゲートを示す場合を除き、薬物の結合数は平均値を意味する。
抗体分子へのエキサテカンの結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの薬物平
均結合数として、１から１０個程度のエキサテカンを結合させることができるが、好まし
くは２から８個であり、より好ましくは３から８個である。なお、当業者であれば本願の
実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、エキサ
テカンの結合数をコントロールした抗体−薬物コンジュゲートを取得することができる。
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは抗体１分子への薬物の結合数が多くなった場合で
も、凝集、不溶性、フラグメンテーション等は生じ難い。
【００９２】
［リンカー構造］
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗腫瘍性化合物を抗ＨＥＲ３
抗体に結合させるリンカー構造について述べる。当該リンカーは、次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-又は-L1-L2-LP-
の構造を有しており、抗体はL1の末端（L2が結合するのとは反対側の末端）で結合し、抗
腫瘍性化合物は-La-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基又はLPのＣ末端で結合する。
n1は、０から６の整数を示すが、好ましくは１から５の整数であり、より好ましくは１
から３である。
【００９３】
１．L1
L1は、
-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-
の構造で示される。
ここで、n3は、２から８の整数であり、『-(Succinimid-3-yl-N)-』は、次式：
【００９４】
【化１７】
2020143114.tif 000050
【００９５】
で示される構造を有する。この部分構造における３位が抗ＨＥＲ３抗体への結合部位であ
る。この３位での該抗体との結合は、チオエーテルを形成して結合することが特徴である
。この構造部分の１位の窒素原子は、この構造が含まれるリンカー内に存在するメチレン
の炭素原子と結合する。すなわち、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2-は次式で示
される構造である（ここで、「抗体−Ｓ−」は抗体由来である。）。
【００９６】
【化１８】
2020143114.tif 000051
【００９７】
式中、n3は、２から８の整数であるが、好ましくは２から５である。
【００９８】
L1の具体例としては、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる。
【００９９】
２．L2
L2は、
-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-
で示される構造であるが、L2は存在しなくともよく、この場合L2は単結合となる。特に本
発明の薬物−リンカー構造においてはLPが薬物に直接結合する場合があるが、その場合に
はこのL2は、単結合であることが特に好ましい。n4は、１から６の整数であり、好ましく
は２から４である。L2は末端のアミノ基でL1に結合し、反対の末端のカルボニル基でLPと
結合する。
【０１００】
L2の具体例としては、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる。
【０１０１】
３．LP
LPは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、２から７個
のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。LPは、Ｎ末端
においてL2に結合し、Ｃ末端においてリンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-部分の
アミノ基に結合する。
【０１０２】
LPを構成するアミノ酸は特に限定されることはないが、例えば、L-又はD-アミノ酸であ
り、好ましくはL-アミノ酸である。また、α−アミノ酸の他、β−アラニン、ε−アミノ
カプロン酸、γ−アミノ酪酸等の構造のアミノ酸であってもよく、さらには例えばＮ−メ
チル化されたアミノ酸等の非天然型のアミノ酸であってもよい。
LPのアミノ酸配列は、特に限定されないが、構成するアミノ酸として、フェニルアラニ
ン（Phe；F）、チロシン（Tyr；Y）、ロイシン（Leu；L）、グリシン（Gly；G）、アラニ
ン（Ala；A）、バリン（Val；V）、リシン（Lys；K）、シトルリン（Cit）、セリン（Ser
；S）、グルタミン酸（Glu；E）、アスパラギン酸（Asp；D）等を挙げることができる。
これらのうちで好ましくは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン
、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸を挙げることができる。アミノ酸の種類によっ
て、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。アミノ酸の数は、２から７個
でよい。
【０１０３】
LPの具体例として、
-GGF-、
-DGGF-、
-(D-)D-GGF-、
-EGGF-、
-GGFG-、
-SGGF-、
-KGGF-、
-DGGFG-、
-GGFGG-、
-DDGGFG-、
-KDGGFG-、
-GGFGGGF-
を挙げることができる。上記の『(D-)D』はD-アスパラギン酸を意味する。本発明の抗体
−薬物コンジュゲートの特に好ましいLPとして、-GGFG-及び-DGGFG-ペプチド残基を挙げ
ることができる。さらに、本発明の薬物−リンカー構造においてLPが薬物に直接結合する
場合があるが、その場合に好ましいLPとして、-DGGFG-のペンタペプチド残基を挙げるこ
とができる。
【０１０４】
４．La-(CH2)n2-C(=O)-
La-(CH2)n2-C(=O)-におけるLaは、-O-の構造であるか、又は単結合である。n2は、０か
ら５の整数であるが、好ましくは０から３であり、より好ましくは０又は１である。
La-(CH2)n2-C(=O)-としては以下の構造のものを挙げることができる。
-O-CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2-C(=O)-、
-CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-。
これらのうちでは、
-O-CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2-C(=O)-
である場合か、Laが単結合でn2が０である場合が好ましい。
【０１０５】
リンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-で示される構造の具体例として、
-NH-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
等を挙げることができる。
【０１０６】
これらのうちでより好ましくは、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-
である。
【０１０７】
リンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-は、鎖長として４から７原子の鎖長である
ものが好ましいが、さらに好ましくは５又は６原子の鎖長を有するものである。
【０１０８】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞内に移動した後にはリンカ
ー部分が切断され、NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)で示される構造の薬物誘導体
が遊離して抗腫瘍作用を発現すると考えられる。本発明の抗体−薬物コンジュゲートから
遊離されて抗腫瘍効果を発現する抗腫瘍性誘導体としては、先に挙げたリンカーの-NH-(C
H2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-で示される構造の末端がアミノ基となった構造部分を有する抗
腫瘍性誘導体を挙げることができるが、特に好ましいものは次のものである。
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
なお、NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)の場合は同分子内にあるアミナール構造が不安定
であるため、さらに自己分解して
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
が遊離されることが確認された。これらの化合物は本発明の抗体−薬物コンジュゲートの
製造中間体としても好適に用いることができる。
また、本発明の薬物−リンカー構造においてLPが薬物に直接結合する場合がある。この
場合において、LPのＣ末端がグリシンであるときには、遊離される抗腫瘍性薬物はエキサ
テカン自体であるか又はエキサテカンのアミノ基にグリシンが結合した化合物である。
【０１０９】
薬物をエキサテカンとする本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいては、下記の構造
の薬物−リンカー構造部分
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)、又は
-L1-L2-LP-(NH-DX)
を抗体に結合させたものが好ましい。これらの薬物−リンカー構造部分は、１抗体あたり
の平均結合数として、１から１０を結合させればよいが、好ましくは２から８であり、よ
り好ましくは３から８である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-O-CH2CH2-C
(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
これらのうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
さらに、好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
特に、好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
【０１１０】
本願の抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗ＨＥＲ３抗体と薬物とを結合するリンカ
ー構造は、これまで述べたリンカー各部において示した好ましい構造のものを結合するこ
とで好ましいリンカーを構築することができる。この様なリンカー構造として以下の構造
のものを好適に使用することができる。なお構造の左端が抗体との結合部位であり、右端
が薬物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-。
これらのうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-。
さらに、好ましくは、次のものを挙げることができる。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-。
特に、好ましくは、次のものを挙げることができる。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-。
【０１１１】
［製造方法］
次に、本願発明の抗体−薬物コンジュゲート或はその製造中間体の代表的な製造方法に
ついて説明する。なお、以下において、化合物を、各反応式中に示される番号で示す。す
なわち、『式（１）の化合物』、『化合物（１）』等と称する。またこれ以外の番号の化
合物についても同様に記載する。
【０１１２】
１．製造方法１
式（１）で示される、チオエーテルを介して抗体と薬物−リンカー構造が結合している
抗体−薬物コンジュゲートは、例えば下記の方法によって製造することができる。
【０１１３】
【化１９】
2020143114.tif 000052
【０１１４】
[式中、ABは、スルフヒドリル基を有する抗体を示し、L1'は、L1で示されるリンカー構造
において、リンカー末端がマレイミジル基（次式）：
【０１１５】
【化２０】
2020143114.tif 000053
【０１１６】
に変換された構造である（ここで、窒素原子が結合部位である。）。具体的には、-(Succ
inimid-3-yl-N)-(CH2)n2-C(=O)-で示されるL1の構造において、当該-(Succinimid-3-yl-N
)-部分がマレイミジル基となった構造のリンカーを示す。また、-(NH-DX)は次式：
【０１１７】
【化２１】
2020143114.tif 000054
【０１１８】
で示される構造であり、エキサテカンの１位のアミノ基の水素原子１個が除かれて生成す
る基を示す。］
【０１１９】
なお、上記の反応式において、式（１）の化合物では、薬物からリンカー末端までの構
造部分１個が１個の抗体に対して結合した構造として解釈され得る。しかしながら、これ
は説明のための便宜的な記載であって、実際には当該構造部分が抗体分子１個に対して複
数個が結合している場合が多い。この状況は以下の製造方法の説明においても同様である
。
【０１２０】
すなわち、後述する方法によって入手しうる化合物（２）と、スルフヒドリル基を有す
る抗体（３ａ）を反応させることによって、抗体−薬物コンジュゲート（１）を製造する
ことができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、当業者周知の方法で得ることができる（He
rmanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press(199
6)）。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬を抗体のアミノ基に作用させる；Ｎ−サクシンイミジ
ル  Ｓ−アセチルチオアルカノエート類を抗体のアミノ基に作用させた後、ヒドロキシル
アミンを作用させる；Ｎ−サクシンイミジル  ３−（ピリジルジチオ）プロピオネートを
作用させた後、還元剤を作用させる；ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ)等の還元剤を抗体に作用
させて抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元してスルフヒドリル基を生成させる；等
の方法を挙げることができるがこれらに限定されることはない。
具体的には、還元剤としてＴＣＥＰを、抗体内ヒンジ部ジスルフィド１個当たりに対し
て０．３乃至３モル当量用い、キレート剤を含む緩衝液中で、抗体と反応させることで、
抗体内ヒンジ部ジスルフィドが部分的若しくは完全に還元された抗体を得ることができる
。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリア
ミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等を挙げることができる。これ等を１ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で
用いればよい。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
溶液等を用いることができる。具体的には、抗体は４℃乃至３７℃で１乃至４時間ＴＣＥ
Ｐと反応させることで部分的若しくは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（
３ａ）を得ることができる。
ここでスルフヒドリル基を薬物−リンカー部分に付加させる反応を実施することでチオ
エーテル結合によって薬物−リンカー部分を結合させることができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）１個あたり、２乃至２０モル当量の化合物（２
）を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗体−薬物コンジュゲート
（１）を製造することができる。具体的には、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を
含む緩衝液に、化合物（２）を溶解させた溶液を加えて反応させればよい。ここで、緩衝
液としては、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム等を用いればよ
い。反応時のｐＨは５乃至９であり、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよい。化合
物（２）を溶解させる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（
ＮＭＰ）等の有機溶媒を用いることができる。
化合物（２）を溶解させた有機溶媒溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を
含む緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃
、より好適には１０乃至２５℃であり、反応時間は、０．５乃至２時間である。反応は、
未反応の化合物（２）の反応性をチオール含有試薬によって失活させることによって終了
できる。チオール含有試薬は例えば、システイン又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ
ＡＣ）である。より具体的には、ＮＡＣを、用いた化合物（２）に対して、１乃至２モル
当量加え、室温で１０乃至３０分インキュベートすることにより反応を終了できる。
製造した抗体−薬物コンジュゲート（１）は、以下の共通操作によって濃縮、バッファ
ー交換、精製、抗体濃度、及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体−
薬物コンジュゲート（１）の同定を行うことができる。
【０１２１】
共通操作Ａ：抗体又は抗体−薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（５０，０００  ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）の容器内に抗体又は抗体−薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａ
ｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心
操作（２０００Ｇ乃至３８００Ｇで５乃至２０分間遠心）にて、抗体又は抗体−薬物コン
ジュゲート溶液を濃縮した。
【０１２２】
共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った
。ここで、２８０ｎｍ吸光係数は、抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein 
Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって推定することができ、抗体ごとに異なる２
８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1乃至１．８ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1）を用いた。Ｕ
１−５９の場合、そのアミノ酸配列に従って、１．７６８ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1の２８０ｎｍ
吸光係数を推定値として用いた。
【０１２３】
共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５担体を使用したＮＡＰ−２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７
−０８５２−０２，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）及びエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ，５ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０；本明細書でＰ
ＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラム一本につ
き、抗体水溶液２．５ｍＬをのせた後、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた
画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用
いて抗体濃度の測定を行った後に、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて１０ｍｇ／ｍＬに抗
体濃度を調整した。
【０１２４】
共通操作Ｄ：抗体−薬物コンジュゲートの精製
Ｓｏｒｂｉｔｏｌ（５％）を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ５．５；本明細書でＡＢ
Ｓと称する。）にてＮＡＰ−２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラムに、抗
体−薬物コンジュゲート反応水溶液（約２．５ｍＬ）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液
で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びＮＡＰ−２５カラムにの
せ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計２乃至３回繰り返すことで、未結合の薬物
リンカーや低分子化合物（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ
）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ジメチルスルホキシド）を除いた抗体−
薬物コンジュゲートを得た。
【０１２５】
共通操作Ｅ：抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平
均結合数の測定（１）
抗体−薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、抗体−薬物コンジュゲート水溶液
の２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長におけるＵＶ吸光度を測定した後に下記の計算を行
うことで、算出することができる。
ある波長における全吸光度は系内に存在する全ての吸収化学種の吸光度の和に等しい［
吸光度の加成性］ことから、抗体と薬物のコンジュゲーション前後において、抗体及び薬
物のモル吸光係数に変化がないと仮定すると、抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃
度及び薬物濃度は、下記の関係式で示される。
Ａ280＝ＡD,280＋ＡA,280＝εD,280ＣD＋εA,280ＣA  式（１）
Ａ370＝ＡD,370＋ＡA,370＝εD,370ＣD＋εA,370ＣA  式（２）
ここで、Ａ280は２８０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し
、Ａ370は３７０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、ＡA,280
は２８０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡA,370は３７０ｎｍにおける抗体の吸光度
を示し、ＡD,280は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、ＡD,370は
３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、εA,280は２８０ｎｍにおけ
る抗体のモル吸光係数を示し、εA,370は３７０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し
、εD,280は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、εD,370は
３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、ＣAは抗体−薬物コン
ジュゲートにおける抗体濃度を示し、ＣDは抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物濃度
を示す。
ここで、εA,280、εA,370、εD,280、εD,370は、事前に用意した値（計算推定値又は
化合物のＵＶ測定から得られた実測値）が用いられる。例えば、εA,280は、抗体のアミ
ノ酸配列から、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって
推定することができる。εA,370は、通常、ゼロである。Ｕ１−５９の場合、そのアミノ
酸配列に従って、εA,280は推定値として２５９４００を用いた。εD,280及びεD,370は
、用いるコンジュゲート前駆体をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定すること
で、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝ モル濃度×モル吸光係数×セル光路長）によ
って、得ることができる。抗体−薬物コンジュゲート水溶液のＡ280及びＡ370を測定し、
これらの値を式（１）及び（２）に代入して連立方程式を解くことによって、ＣA及びＣD
を求めることができる。さらにＣDをＣAで除することで１抗体あたりの薬物平均結合数が
求めることができる。
本発明においては、以上に説明した、１抗体あたりの薬物平均結合数の求め方を「ＵＶ
法」と呼ぶ。
【０１２６】
共通操作Ｆ：抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測
定（２）
抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、前述の共通
操作Ｅに加え、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によっ
ても求めることができる。
［Ｆ−１．ＨＰＬＣ分析用サンプルの調製（抗体−薬物コンジュゲートの還元）］
抗体−薬物コンジュゲート溶液（約１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）をジチオトレイトール（
ＤＴＴ）水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合する。混合物を３７℃で３０分インキュ
ベートすることで、抗体−薬物コンジュゲートのＬ鎖及びＨ鎖間のジスルフィド結合を切
断したサンプルを、ＨＰＬＣ分析に用いる。
［Ｆ−２．ＨＰＬＣ分析］
ＨＰＬＣ分析を、下記の測定条件にて行う。
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ（２．１×５０ｍｍ、８μｍ、１０００Å；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ ＰＬ１９１２−１８０２）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．０４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
移動相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：２９％−３６％（０分−１２．５分）、３６％−４２％（１
２．５−１５分）、４２％−２９％（１５分―１５．１分）、２９％−２９％（１５．１
分―２５分）
サンプル注入量：１５μＬ
［Ｆ−３．データ解析］
〔Ｆ−３−１〕  薬物の結合していない抗体のＬ鎖（Ｌ0）及びＨ鎖（Ｈ0）に対して、薬
物の結合したＬ鎖（薬物が一つ結合したＬ鎖：Ｌ1）及びＨ鎖（薬物が１個結合したＨ鎖
：Ｈ1、薬物が２個結合したＨ鎖：Ｈ2、薬物が３個結合したＨ鎖：Ｈ3）は、結合した薬
物の数に比例して疎水性が増して保持時間が大きくなることから、Ｌ0、Ｌ1、Ｈ0、Ｈ1、
Ｈ2、Ｈ3の順に溶出される。Ｌ0及びＨ0との保持時間比較により検出ピークをＬ0、Ｌ1、
Ｈ0、Ｈ1、Ｈ2、Ｈ3のいずれかに割り当てることができる。
〔Ｆ−３−２〕  薬物リンカーにＵＶ吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、
Ｌ鎖、Ｈ鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を
行う。
【０１２７】
【数１】
2020143114.tif 000055
【０１２８】
【数２】
2020143114.tif 000056
【０１２９】
ここで、各抗体におけるＬ鎖及びＨ鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、既知の計算方
法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって、各抗体のＬ鎖及びＨ鎖のア
ミノ酸配列から推定される値を用いることができる。Ｕ１−５９の場合、そのアミノ酸配
列に従って、Ｌ鎖のモル吸光係数として３４６９０を、Ｈ鎖のモル吸光係数として９５０
００を推定値として用いた。また、薬物リンカーのモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、各薬
物リンカーをメルカプトエタノール又はＮ−アセチルシステインで反応させ、マレイミド
基をサクシニイミドチオエーテルに変換した化合物の実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）
を用いた。
〔Ｆ−３−３〕  ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って
計算する。
【０１３０】
【数３】
2020143114.tif 000057
【０１３１】
〔Ｆ−３−４〕  抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数
を、下式に従って計算する。
薬物平均結合数＝（Ｌ0ピーク面積比ｘ０＋Ｌ0ピーク面積比ｘ１＋Ｈ0ピーク面積比ｘ
０＋Ｈ1ピーク面積比ｘ１＋Ｈ2ピーク面積比ｘ２＋Ｈ3ピーク面積比ｘ３）／１００ｘ２
【０１３２】
以下に製造方法1において使用される製造中間体化合物について述べる。製造方法１に
おける式（２）で示される化合物は次式：
【０１３３】
(maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)又は
(maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-(NH-DX)
で示される化合物である。
式中、
n3は、整数の２から８を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン
酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し
、
n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式：
【化２２】
2020143114.tif 000058
【０１３４】
で示される、マレイミジル基（2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl基）で、窒素原子
が結合部位となっている基であり、
-(NH-DX)は、次式：
【化２３】
2020143114.tif 000059
【０１３５】
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【０１３６】
LPのペプチド残基としては、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリ
ン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるアミノ酸残基
であるものが製造中間体として好ましい。この様なペプチド残基LPのうち、４又は５個の
アミノ酸で構成されるペプチド残基であるものが製造中間体として好ましい。より具体的
には、LPが-GGFG-のテトラペプチド残基又は-DGGFG-のペンタペプチドであるものが製造
中間体として好ましいが、さらに好ましくは-GGFG-である。
【０１３７】
また、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-としては、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2
CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-であるものが
製造中間体として好ましく、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2で
あるものがより好ましい。
n3としては、整数の２から８であるものが製造中間体として好ましい。
L2は、単結合であるか、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であってn4が整数の２から４
のものが製造中間体として好ましい。
【０１３８】
さらに、n3が、整数の２から５であり、L2が単結合であり、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-
が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH
2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-であるものが製造中間体として好ましい。そして、こ
れらのうちでより好ましくは、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH
2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物である。さらに、n3が、整数
の２又は５であるものが好ましい。
【０１３９】
また、n3が、整数の２から５であり、L2が-NH-(CH2-CH2-O)n4-CH2-CH2-C(=O)-であって
、n4が整数の２から４であり、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH
2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH
2-であるものが製造中間体として好ましい。より好ましくは、n4が整数の２又は４の化合
物である。さらに、-NH-(CH2)n1-La-が、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2
CH2-O-CH2-であるものが好ましい。
【０１４０】
この様な本発明化合物の製造に有用な中間体として好ましいものとしては以下のものを
例示することができる：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
【０１４１】
上記の製造中間体化合物の群から選ばれる薬物−リンカー化合物を、抗Ｈｅｒ３抗体又
はその反応性誘導体と反応させることによって抗Ｈｅｒ３抗体のヒンジ部に存在するジス
ルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させて本発明の抗Ｈｅｒ３抗体−薬物
コンジュゲートを製造することができる。この場合、抗Ｈｅｒ３抗体の反応性誘導体を使
用することが好ましく、特に抗Ｈｅｒ３抗体を還元処理して得られる反応性誘導体が好ま
しい。
【０１４２】
以下のものが製造中間体としてより好ましい化合物である。
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(
=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
【０１４３】
また、上記の中間体化合物群の中では次式：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
で示される中間体がさらに好ましい化合物である。
特に好ましくは次式：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
で示される化合物である。
【０１４４】
２．製造方法２
先の製造方法で使用した中間体である式（２）で示される化合物又はそれらの薬理上許
容される塩は、例えば下記の方法によって製造することができる。
【０１４５】
【化２４】
2020143114.tif 000060
【０１４６】
［式中、L1’はL1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、P1、P2及びP3は保護
基を示す。］
【０１４７】
カルボン酸（５）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩
基存在下、NH2-DX［エキサテカンを示す；化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオ
ロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリ
ジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン］（４）又はその薬理上許容される塩と反応
させることによって化合物（６）を製造することができる。
この反応は、ペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよい。活性エステ
ルには各種のものがあるが、例えばｐ−ニトロフェノール等のフェノール類、Ｎ−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール或はＮ−ヒドロキシスクシンイミド等とカルボン酸（５）をＮ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド或は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・塩酸塩等の縮合剤を用いて反応させれば製造できる。また、活性
エステルは、カルボン酸（５）とペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート等との
反応；カルボン酸（５）と１−ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスファイトとの反応；カルボン酸（５）とシアノホスホン酸ジエチルとの
反応（塩入法）；カルボン酸（５）とトリフェニルホスフィン及び２，２’−ジピリジル
ジスルフィドとの反応（向山法）；カルボン酸（５）と４−（４，６−ジメトキシ−１，
３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴＭＭ）
の様なトリアジン誘導体との反応；等によっても製造することができる。また、カルボン
酸（５）を塩基存在下に塩化チオニル、オキザリルクロリド等の酸ハロゲン化物で処理す
ることによって製造できる酸ハライド法等によって反応を行うこともできる。
上記の様に得たカルボン酸（５）の活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物
を化合物（４）と適当な塩基存在下に不活性な溶媒中で−７８℃〜１５０℃の反応温度で
反応させることによって化合物（６）を製造することができる。なお、「不活性な溶媒」
とはその溶媒が採用された反応において実施される目的とされた反応を阻害することのな
い溶媒を意味する。
【０１４８】
上記の各工程に用いる具体的な塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム
、ナトリウムエトキシド、カリウムブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
素化ナトリウム、水素化カリウム等の、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩、ア
ルコキシド、水酸化物、又は水素化物；ｎ−ブチルリチウム等のアルキルリチウム、リチ
ウムジイソプロピルアミド等のジアルキルアミノリチウムに代表される有機金属塩基；リ
チウムビス（トリメチルシリル）アミド等のビスシリルアミンの有機金属塩基；又は、ピ
リジン、２，６−ルチジン、コリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン
、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロ［５．４．０］
ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）等の有機塩基等を挙げることができる。
【０１４９】
本反応に用いる不活性な溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等
のハロゲン化炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキ
サン等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジン−２−オン等
のアミド系溶媒；を挙げることができ、これらに加えて場合によってはジメチルスルホキ
シド、スルホラン等のスルホキシド系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系
溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系の溶媒等を使用することも可能である。
さらにはこれ等を混合して使用することもできる。
【０１５０】
化合物（６）の末端アミノ基の保護基P1としては、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
基や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等、ペプ
チド合成に通常用いられているアミノ基の保護基を用いることができる。他のアミノ基の
保護基としては、アセチル基等のアルカノイル基；メトキシカルボニル基、エトキシカル
ボニル基等のアルコキシカルボニル基；パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラ
（又はオルト）ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアリールメトキシカルボニル基；
ベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；ベンゾイル基等のアロイル基
；２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、オルトニトロベンゼンスルホニル基等のアリ
ールスルホニル基；を挙げることができる。保護基P1は、アミノ基を保護する化合物の性
質等に応じて選択すればよい。
得られた化合物（６）の末端アミノ基の保護基P1を脱保護させることによって化合物（
７）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれ
ばよい。
Ｎ末端をP2で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に誘
導し、得られた化合物（７）に反応させることによって、化合物（９）を製造することが
できる。ペプチドカルボン酸（８）と化合物（７）のペプチド結合を形成する反応条件や
試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使
用すればよい。保護基P2は、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用す
ればよく、アミノ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すればよい。また、ペプチド
合成に通常用いられている様に、ペプチドカルボン酸（８）を構成するアミノ酸又はペプ
チドを順次反応と脱保護を繰り返し、伸長させて化合物（９）を製造することもできる。
得られた化合物（９）のアミノ基の保護基P2を脱保護させることによって化合物（１０
）を製造することができる。この保護基は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
カルボン酸（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、
得られた化合物（１０）に反応させることによって、化合物（２）を製造することができ
る。カルボン酸（１１）と化合物（１０）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、及
び塩基、不活性溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよ
い。
【０１５１】
化合物（９）は例えば下記の方法でも製造することができる。
Ｎ末端をP2で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に誘
導し、塩基存在下、カルボキシ基をP3で保護したアミン化合物（１２）と反応させること
によって化合物（１３）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（８）と化合物（
１２）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（
６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
化合物（１３）のアミノ基の保護基P2としては、通常用いられる保護基であれば特に制
限はない。具体的には水酸基の保護基としては、メトキシメチル基等のアルコキシメチル
基；ベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基
；アセチル基等のアルカノイル基；ベンゾイル基等のアロイル基；ｔｅｒｔ−ブチルジフ
ェニルシリル基等のシリル基；等を挙げることができる。カルボキシ基は、メチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基、アリル基、又はベンジル基等のアリールメ
チル基とのエステル等として保護することができる。アミノ基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキ
シカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルキルオキシカル
ボニル基；アリルオキシカルボニル基、又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
、ベンジルオキシカルボニル基、パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラ（又は
オルト）ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアリールメトキシカルボニル基；のほか
、アセチル基等のアルカノイル基；ベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチ
ル基；ベンゾイル基等のアロイル基；又は２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、オル
トニトロベンゼンスルホニル基等のアリールスルホニル基；等を挙げることができる。
カルボキシ基の保護基P3としては、有機合成化学、中でもペプチド合成においてカルボ
キシ基の保護基として通常用いられている保護基を使用すればよく、具体的にはメチル基
、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル等のアルキルエステル、アリルエステル、ベンジルエステ
ル等であり上記の保護基から適宜選択して使用すればよい。
この場合に、アミノ基の保護基とカルボキシ基の保護基が異なる方法又は条件で除去で
きることが好ましい。例えばP2がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基であり、P3がベン
ジル基である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基は
アミノ基とカルボキシ基を保護する化合物の性質等に応じて上述したものから選択すれば
よく、それらの保護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい
。
得られた化合物（１３）のカルボキシ基の保護基P3を脱保護させることによって化合物
（１４）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択
すればよい。
得られた化合物（１４）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導
し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（９）を製造することが
できる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条
件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して
使用すればよい。
【０１５２】
化合物（２）は例えば下記の方法でも製造することができる。
化合物（１３）のアミノ基の保護基P2を脱保護させることによって化合物（１５）を製
造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、塩基存在下、得られた化合物（１５）と反応させることによって化合物（１６）を
製造することができる。ペプチドカルボン酸（１１）と化合物（１５）のアミド結合を形
成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものか
ら適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（１６）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることによって化合物（
１７）を製造することができる。この脱保護は、化合物（１４）の製造におけるカルボキ
シ基の脱保護と同様に行うことができる。
化合物（１７）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（２）を製造することができる。
この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬
、塩基、及び不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すれ
ばよい。
【０１５３】
３．製造方法３
中間体の式（２）で示される化合物は下記の方法によっても製造することもできる。
【０１５４】
【化２５】
2020143114.tif 000061
【０１５５】
［式中、L1’はL1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、P4は保護基を示す］
【０１５６】
化合物（１１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存在下、Ｃ末端をP4で
保護したペプチドカルボン酸（１８）と反応させることによって化合物（１９）を製造す
ることができる。ペプチドカルボン酸（１８）と化合物（１１）のペプチド結合を形成す
る反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適
宜選択して使用すればよい。化合物（１８）のカルボキシ基の保護基P4は先に述べた保護
基から適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（１９）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることによって化合物（
２０）を製造することができる。この脱保護は、化合物（１４）の製造におけるカルボキ
シ基の脱保護と同様に行うことができる。
得られた化合物（２０）を活性エステル、又は混合酸無水物等に誘導し、化合物（７）
に反応させることによって、化合物（２）を製造することができる。この反応はペプチド
合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、塩基、及び不活性
な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１５７】
４．製造方法４
以下に、製造方法２に記載の製造中間体（１０）のうち、n1=1、Ｌa=Oとなった化合物
（１０ｂ）の製造方法について詳述する。式（１０ｂ）で示される化合物、その塩又はそ
れらの溶媒和物は、例えば下記の方法で製造することができる。
【０１５８】
【化２６】
2020143114.tif 000062
【０１５９】
［式中、LPは前記と同じものを示し、Lはアシル基であって、アセチル基等のアルカノイ
ル基若しくはベンゾイル基等のアロイル基であるか、又は水素原子等を示し、Ｘ及びＹは
１から３個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを、P5及びP7はアミノ基の保護基を、P6は
カルボキシ基の保護基を示す］
【０１６０】
式（２１）で示される化合物は、特開２００２−６０３５１号公報に記載される手法や
文献（J. Org. Chem., 51巻，3196頁，1986年）記載の方法、又はその方法を応用して必
要に応じて保護基の除去や官能基変換を行うことによって製造することができる。この他
、末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護されたオリゴペプチドの酸アミ
ドをアルデヒド又はケトンと処理することによって得ることができる。
化合物（２１）を、不活性な溶媒中、酸又は塩基存在下で冷却下から室温での温度条件
で水酸基を有する化合物（２２）と反応させることによって、化合物（２３）を製造する
ことができる。
ここで使用できる酸としては例えば、フッ化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ
酸等の無機酸；酢酸、クエン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸
；テトラフルオロボレート、塩化亜鉛、塩化スズ、塩化アルミニウム、塩化鉄等のルイス
酸；等を挙げることができる。これらのうちではスルホン酸類が好ましく、特にパラトル
エンスルホン酸が好ましい。さらに塩基としては、既に述べられた塩基の中から適宜選択
して使用すればよく、特にカリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシ
ド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属水酸化物
；水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；リチウム  ジイソプロ
ピルアミド等のジアルキルアミノリチウムに代表される有機金属塩基；リチウム  ビス（
トリメチルシリル）アミド等のビスシリルアミンの有機金属塩基等が好ましい。
反応に用いる溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル系
溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；等が用いられる。上記の溶媒は水
との混合物としてもよい。
また、P5として示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられ
る基であれば特に制限はない。代表的なものとして製造方法２で記載したアミノ基の保護
基を挙げることができるが、本反応中においてP5として示されるアミノ基の保護基が切断
される場合がある。その場合には、必要に応じて適当なアミノ基の保護試薬と適宜反応さ
せて再度保護基を導入すればよい。
化合物（２４）は、化合物（２３）の保護基P6を除去することによって製造することが
できる。ここで、P6として示されるカルボキシ基の保護基としては、製造方法２に代表的
なものが記載されており、ここから適宜選択することができる。化合物（２３）において
、アミノ基の保護基P5とカルボキシ基の保護基P6が異なる方法又は条件で除去できる保護
基であることが望ましい。例えば、P5が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基であ
り、P6がベンジル基である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それ
らの保護基は、アミノ基及びカルボキシ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すれば
よく、それらの保護基の除去に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい
。
カルボン酸（２４）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、
塩基存在下、化合物（４）又はその薬理上許容される塩と反応させることによって化合物
（２５）を製造し、得られた化合物（２５）の保護基P5を除去することによって化合物（
２６）を製造することができる。化合物（４）とカルボン酸（２４）との反応及び保護基
P6を除去する反応では、製造方法２で述べた試薬や反応条件と同様なものを用いればよい
。
化合物（２６）と末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護されたオリゴ
ペプチド（２７）を反応させることによって化合物（９ｂ）を製造し、得られた化合物（
９ｂ）の保護基P7を除去することによって化合物（１０ｂ）を製造することができる。P7
として示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられる基であれ
ば特に制限はなく、代表的なものとして製造方法２で記載したアミノ基の保護基を挙げる
ことができ、その除去に際しても保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。化合物（
２６）と化合物（２７）との反応では、ペプチド合成に通常使用される反応試薬や条件を
準用すればよい。上記の方法で製造した化合物（１０ｂ）は、上述の製造方法に従って本
発明化合物（１）に導くことができる。
【０１６１】
５．製造方法５
中間体の式で示される化合物（２）は下記の方法によっても製造することもできる。
【０１６２】
【化２７】
2020143114.tif 000063
【０１６３】
［式中、、L1’はL1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、LPは-Lp1-Lp2-か
らなる構造を、P3、P8、P9、P10、P11、及びP12は保護基を示す。］
【０１６４】
LPは、Lp1及びLp2を結合させて形成されるため、LPのＮ末端の親水性アミノ酸はLp1由
来となるので、Lp1はＮ末端が親水性アミノ酸であるものを採用すればよい。なお、親水
性アミノ酸は複数個であってよい。また、Lp2に親水性アミノ酸があるものを採用すれば
、その位置に応じて、LPのＮ末端又はＮ末端とそれ以外の位置に複数個の親水性アミノ酸
を含むLPを製造することができる。
【０１６５】
Ｎ末端をP2で保護したペプチド又はアミノ酸（２８）を活性エステル、混合酸無水物等
に誘導し、得られた化合物（７）に反応させることにより、化合物（２９）を製造するこ
とができる。ペプチド又はアミノ酸（２８）と化合物（７）のアミド結合を形成する反応
条件や試薬、塩基、及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用
すればよい。アミノ基の保護基P8は、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択し
て使用すればよく、その化合物の性質等に応じて選択すればよい。また、ペプチド合成に
通常用いられている様に、ペプチド又はアミノ酸（２８）を構成するアミノ酸又はペプチ
ドを順次反応と脱保護を繰り返し、伸長させて化合物（２９）を製造することもできる。
得られた化合物（２９）のアミノ基の保護基P8を脱保護させることにより化合物（２３
）を製造することができる。脱保護にはその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい
。
Ｎ末端をP8で、側鎖のカルボキシ基水酸基、又はアミノ基をP9で保護したアミノ酸又は
ペプチド（３１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、得られた化合物（３０）に
反応させることにより、化合物（３２）を製造することができる。アミノ酸又はペプチド
（３１）と化合物（３０）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、
化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。保護基P8及びP9とし
ては、化合物（６）のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の保護基で述べたものから適宜
選択して使用すればよい。ただし、この場合に、アミノ基の保護基P9と側鎖の官能基の保
護基P10が異なる方法又は条件で除去できる必要がある。例えばP9が９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル基であり、P10がカルボキシ基の保護基であればｔｅｒｔ−ブチル
基等、水酸基の保護基であればメトキシメチル基等、アミノ基の保護基であればｔｅｒｔ
−ブチルオキシカルボニル基等である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることがで
きる。側鎖の官能基の保護基P10は酸性条件に付すことによって脱保護可能な保護基が好
ましいが、これに限定されることはなく、保護する化合物のアミノ基、カルボキシ基又は
水酸基の性質等に応じて上述したものから選択すればよい。また、それらの保護基の切断
に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。なお、ペプチド合成に通常
用いられている様に、化合物（３２）は構成するアミノ酸又はペプチドを順次反応、脱保
護を繰り返し、伸長させて製造することもできる。
得られた化合物（３２）の末端アミノ基の保護基P9を脱保護させることにより化合物（
３３）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択す
ればよい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、得られた化合物（３３）に反応させることにより、化合物（３４）を製造すること
ができる。ここでカルボン酸誘導体（１１）はL1’のリンカー末端がマレイミジル基を有
する構造の化合物である。
カルボン酸誘導体（１１）と化合物（３３）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬
、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（３４）のペプチド部分のアミノ酸側鎖のカルボキシ基又は水酸基、ア
ミノ基の保護基P10を脱保護させることにより化合物（２）を製造することができる。そ
の保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
【０１６６】
化合物（２９）は例えば下記の方法でも製造することができる。
Ｎ末端をP8で保護したペプチド又はアミノ酸（２８）を活性エステル、混合酸無水物等
に誘導し、塩基存在下、末端のカルボキシ基をP3で保護したアミン化合物（１２）と反応
させることにより化合物（３５）を製造することができる。ペプチド又はアミノ酸（２８
）と化合物（１２）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び溶媒は、化合
物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。化合物（３５）のアミノ
基の保護基P8は化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよい。カ
ルボキシ基の保護基P3としては、有機合成化学、中でもペプチド合成においてカルボキシ
基の保護基として通常用いられている保護基を使用すればよく、具体的にはメチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル等のアルキルエステル、アリルエステル、ベンジルエステル等
、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよい。この場合に、ア
ミノ基の保護基P8とカルボキシ基の保護基P3が異なる方法又は条件で除去できる必要があ
る。例えばP8がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基であり、P3がベンジル基である組み
合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基はアミノ基とカルボ
キシ基を保護する化合物の性質等に応じて上述したものから選択すればよく、それらの保
護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
得られた化合物（３５）のカルボキシ基の保護基P3を脱保護させることにより化合物（
３６）を製造することができる。脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
得られた化合物（３６）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導
し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることにより化合物（２９）を製造することが
できる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条
件や試薬、塩基及び溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すれば
よい。
【０１６７】
化合物（３２）は例えば下記の方法でも製造することができる。
化合物（３５）のアミノ基の保護基P8を脱保護させることにより化合物（３７）を製造
することができる。脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
アミノ酸又はペプチド（３１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等
に誘導し、塩基存在下、得られた化合物（３７）と反応させることにより化合物（３８）
を製造することができる。アミノ酸又はペプチド（３１）と化合物（３７）のアミド結合
を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜
選択して使用すればよい。ここで、アミノ酸又はペプチド（３１）の保護基P9、P10と化
合物（３７）の保護基P3がそれぞれ異なる方法又は条件で除去できる必要がある。例えば
P9が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基であり、P10がｔｅｒｔ−ブチルオキシ
カルボニル基やｔｅｒｔ−ブチル基、又はメトキシメチル基、P3がベンジル基等である組
み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。また、上述した様に側鎖の官能基
の保護基P10は酸性条件に付すことによって脱保護可能な保護基が好ましいが、これに限
定されることはなく、保護する化合物のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の性質等に応
じて上述したものから選択すればよく、それらの保護基の切断に際してもその保護基に応
じた試薬や条件を選択すればよい。
得られた化合物（３８）のカルボキシ基の保護基P3を脱保護させることにより化合物（
３９）を製造することができる。脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
化合物（３９）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（４）と反応させることにより化合物（３２）を製造することができる。
この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬
、塩基及び溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１６８】
化合物（３４）は例えば下記の方法でも製造することができる。
化合物（３８）のアミノ基の保護基P9を脱保護させることにより化合物（４０）を製造
することができる。脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、塩基存在下、得られた化合物（４０）と反応させることにより化合物（４１）を製
造することができる。カルボン酸誘導体（１１）と化合物（４０）のアミド結合を形成す
る反応条件や試薬、及び塩基、溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択し
て使用すればよい。
得られた化合物（４１）のカルボキシ基の保護基P3を脱保護させることにより化合物（
４２）を製造することができる。脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
化合物（４２）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（４）と反応させることにより化合物（３４）を製造することができる。
この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬
、塩基及び溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１６９】
化合物（３４）は例えば下記の方法でも製造することができる。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、塩基存在下、カルボキシ基をP11で、側鎖のカルボキシ基、水酸基又はアミノ基をP
10で保護したアミノ酸又はペプチド（４３）と反応させることにより化合物（４４）を製
造することができる。カルボン酸誘導体（１１）と化合物（４３）のアミド結合を形成す
る反応条件や試薬、及び塩基、溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択し
て使用すればよい。ここで化合物（４４）の保護基P10及びP11としては、化合物（６）の
カルボキシ基、水酸基、又はアミノ基の保護基で述べたものから適宜選択して使用すれば
よい。ただし、この場合に、カルボキシ基の保護基P11と側鎖の官能基の保護基P10が異な
る方法又は条件で除去できる必要がある。例えばP11がベンジル基であり、P10がカルボキ
シ基の保護基であればｔｅｒｔ−ブチル基等、水酸基の保護基であればメトキシメチル基
等、アミノ基の保護基であればｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基等である組み合わせ
等を代表的なものとして挙げることができる。側鎖の官能基の保護基P10は酸性条件に付
すことによって脱保護可能な保護基が好ましいが、これに限定されることはなく、保護す
る化合物のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の性質等に応じて上述したものから選択す
ればよく、それらの保護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
得られた化合物（４４）のカルボキシ基の保護基P11を脱保護させることにより化合物
（４５）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択
すればよい。
化合物（４５）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（３０）と反応させることにより化合物（３４）を製造することができる
。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試
薬、塩基及び溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
また、化合物（４５）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し
、塩基存在下、カルボキシ基をP12で保護したアミノ酸又はペプチド（４６）と反応させ
ることにより化合物（４７）を製造することができる。この反応はペプチド合成に通常用
いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、塩基及び溶媒は化合物（６）の
合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。ここで化合物（４７）の保護基P10
及びP12としては、化合物（６）のカルボキシ基、水酸基又はアミノ基の保護基で述べた
ものから適宜選択して使用すればよい。ただし、この場合に、カルボキシ基の保護基P12
と側鎖の官能基の保護基P10が異なる方法又は条件で除去できる必要がある。例えばP12が
ベンジル基であり、P10がカルボキシ基の保護基であればｔｅｒｔ−ブチル基等、水酸基
の保護基であればメトキシメチル基等、アミノ基の保護基であればｔｅｒｔ−ブチルオキ
シカルボニル基等である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。側鎖の
官能基の保護基P10は酸性条件に付すことによって脱保護可能な保護基が好ましいが、こ
れに限定されることはなく、保護する化合物のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の性質
等に応じて上述したものから選択すればよく、それらの保護基の切断に際してもその保護
基に応じた試薬や条件を選択すればよい。また、化合物（４７）は構成するアミノ酸又は
ペプチドを順次反応、脱保護を繰り返し、伸長させて製造することもできる。
得られた化合物（４７）のカルボキシ基の保護基P12を脱保護させることにより化合物
（４８）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
化合物（４８）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（７）と反応させることにより化合物（３４）を製造することができる。
この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬
、塩基及び溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
化合物（４７）は例えば下記の方法でも製造することができる。
アミノ酸又はペプチド（４６）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等
に誘導し、塩基存在下、Ｎ末端をP9で、側鎖のカルボキシ基、水酸基又はアミノ基をP10
で保護したアミノ酸又はペプチド（３１）と反応させることによりペプチド（４９）を製
造することができる。アミノ酸又はペプチド（４６）とアミノ酸又はペプチド（３１）の
ペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べた
ものから適宜選択して使用すればよい。ここでアミノ酸又はペプチド（４６）のカルボキ
シ基の保護基P12と、アミノ酸又はペプチド（３１）の保護基P9及びP10としては、上述の
通りであるが、互いに異なる方法又は条件で除去できる必要がある。例えばP9が９−フル
オレニルメチルオキシカルボニル基であり、P10がカルボキシ基の保護基であればｔｅｒ
ｔ−ブチル基等、水酸基の保護基であればメトキシメチル基等、アミノ基の保護基であれ
ばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基等であり、P12がベンジル基である組み合わせ等
を代表的なものとして挙げることができる。側鎖の官能基の保護基P10は酸性条件に付す
ことによって脱保護可能な保護基が好ましいが、これに限定されることはなく、保護する
化合物のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の性質等に応じて上述したものから選択すれ
ばよく、それらの保護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよ
い。
得られたペプチド（４９）のＮ末端の保護基P9を脱保護させることによりペプチド（５
０）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、塩基存在下、得られたペプチド（５０）と反応させることにより化合物（４７）を
製造することができる。カルボン酸誘導体（１１）とペプチド（５０）のアミド結合を形
成する反応条件や試薬、及び塩基、溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選
択して使用すればよい。
【０１７０】
６．製造方法６
製造中間体（２）のうち、リンカーが、-L1-L2-LP-で示される構造であり、当該LPは、
そのＮ末端が親水性アミノ酸であるペプチド残基であって、当該Ｎ末端に存在する親水性
アミノ酸がグリシン以外の親水性アミノ酸であるペプチド残基であるものは下記の方法に
よっても製造することができる。
【０１７１】
【化２８】
2020143114.tif 000064
【０１７２】
［式中、は、L1’は、L1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、LPは-Lp1-Lp2
-からなる構造を、P8、P9、P10、及びP12は保護基を示す。］
【０１７３】
LPは、Lp1及びLp2を結合させて形成されるため、LPのＮ末端の親水性アミノ酸はLp1由
来となるので、Lp1はＮ末端が親水性アミノ酸であるものを採用すればよい。なお、親水
性アミノ酸は複数個であってよい。また、Lp2に親水性アミノ酸があるものを採用すれば
、その位置に応じて、LPのＮ末端又はＮ末端とそれ以外の位置に複数個の親水性アミノ酸
を含むLPを製造することができる。
製造方法５に記載のＮ末端をP8で保護したペプチド又はアミノ酸（２８）を活性エステ
ル、混合酸無水物等に誘導し、化合物（４）及びその塩に反応させることにより、化合物
（５１）を製造することができる。ペプチド又はアミノ酸（２８）と化合物（４）のペプ
チド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたもの
から適宜選択して使用すればよい。保護基P8は、化合物（６）の保護基で述べたものから
適宜選択して使用すればよく、アミノ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すればよ
い。また、ペプチド合成に通常用いられている様に、ペプチド又はアミノ酸（２８）を構
成するアミノ酸又はペプチドを順次反応と脱保護を繰り返し、伸長させて化合物（５１）
を製造することもできる。
得られた化合物（５１）のアミノ基の保護基P8を脱保護させることにより化合物（５２
）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
製造方法４に記載の、Ｎ末端をP9で、側鎖のカルボキシ基、水酸基、又はアミノ基をP1
0で保護したアミノ酸又はペプチド（３１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、
得られた化合物（５２）に反応させることにより、化合物（５３）を製造することができ
る。アミノ酸又はペプチド（３１）と化合物（５２）のペプチド結合を形成する反応条件
や試薬、及び塩基、溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すれ
ばよい。保護基P9及びP10としては、製造方法５に記載した通りである。また、ペプチド
合成に通常用いられている様に、化合物（５３）は構成するアミノ酸又はペプチドを順次
反応、脱保護を繰り返し、伸長させて製造することもできる。
得られた化合物（５３）のアミノ基の保護基P9を脱保護させることにより化合物（５４
）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すれば
よい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、得られた化合物（５４）に反応させることにより、化合物（５５）を製造すること
ができる。カルボン酸誘導体（１１）と化合物（５４）のペプチド結合を形成する反応条
件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すれ
ばよい。
得られた化合物（５５）のカルボキシ基又は水酸基、アミノ基の保護基P10を脱保護さ
せることにより化合物（２）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じ
た試薬や条件を選択すればよい。
【０１７４】
化合物（５３）は例えば下記の方法でも製造することができる。
製造方法５に記載のペプチド（４９）のカルボキシ基の保護基P12を脱保護させること
によりペプチド（５６）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試
薬や条件を選択すればよい。
得られたペプチド（５６）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、化合物（４）又はその塩に反応させることにより、化合物（５３）を製造すること
ができる。化合物（５６）と化合物（４）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩
基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１７５】
化合物（５５）は例えば下記の方法でも製造することができる。
製造方法５に記載の化合物（４８）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存
在下、化合物（４）と反応させることにより、又は製造方法５に記載のアミノ酸又はペプ
チド（４５）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存在下、上述の化合物（５
２）と反応させることにより、化合物（５５）を製造することができる。それぞれのペプ
チド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたもの
から適宜選択して使用すればよい。
【０１７６】
７．製造方法７
式（２）で示される製造中間体のうち、リンカーが、-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n
2-C(=O)-で示される構造であり、当該LPは、そのＮ末端が親水性アミノ酸であるペプチド
残基であって、Ｎ末端に存在する当該親水性アミノ酸がグリシン以外の親水性アミノ酸で
ある場合は、例えば下記の方法によっても製造することができる。
【０１７７】
【化２９】
2020143114.tif 000065
【０１７８】
［式中、L1’は、L1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、LPは-Lp1-Lp2-か
らなる構造を、P9、P13は、保護基を示す。］
【０１７９】
式（２）で示される製造中間体には、リンカーが、-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-
C(=O)-で示される構造と、-L1-L2-LP-で示される構造の二つの態様がある。
リンカーが、-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-で示される構造の化合物（２）
は以下の様に製造することができる。
化合物（５７）は製造方法５に記載の化合物（３２）と同様に合成することができるが
、化合物（３２）と異なり、そのアミノ基の保護基P9と側鎖の官能基の保護基P13を異な
る方法又は条件で除去できることは必要ではない。側鎖の官能基はカルボキシ基又は水酸
基であり、そのアミノ基の保護基P9と側鎖のカルボキシ基又は水酸基の保護基P13を同時
に脱保護させることもできる。例えばP9がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基であり、
P13がｔｅｒｔ−ブチル基やトリチル基、或はP3がベンジルオキシカルボニル基であり、P
13がベンジル基等である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それら
の保護基は、保護する化合物のアミノ基、カルボキシ基又は水酸基の性質等に応じて化合
物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよく、それらの保護基の切断
に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。化合物（５７）は、上記の
性質を満たす保護されたアミノ酸又はペプチドを用いれば、製造方法５と同様に合成する
ことができる。
化合物（５７）の保護基P9、P13を順次又は同時に脱保護させることにより化合物（５
１）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
化合物（５８）は、LPの親水性側鎖の官能基は特に保護されていないが、塩基存在下、
活性エステル、混合酸無水物等に誘導した化合物（１１）と反応させることにより、化合
物（２）を製造することができる。それぞれのペプチド結合を形成する反応条件や試薬、
塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
リンカーが、-L1-L2-LP-で示される構造の化合物（２）は以下の様に製造することがで
きる。
化合物（５９）も製造方法６に記載の化合物（５３）と同様に合成することができるが
、化合物（５３）と異なり、そのアミノ基の保護基P3と側鎖の官能基の保護基P8を異なる
方法又は条件で除去できることは必要ではない。側鎖の官能基はカルボキシ基又は水酸基
であり、そのアミノ基の保護基P9と側鎖のカルボキシ基又は水酸基の保護基P13を同時に
脱保護させることもできる。例えばP9がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基であり、P1
3がｔｅｒｔ−ブチル基やトリチル基、或はP3がベンジルオキシカルボニル基であり、P13
がベンジル基等である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの
保護基は、保護する化合物のアミノ基、カルボキシ基、又は水酸基の性質等に応じて化合
物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよく、それらの保護基の切断
に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。化合物（５９）は、上記の
性質を満たす保護されたアミノ酸又はペプチドを用いれば、製造方法６と同様に合成する
ことができる。
化合物（５９）の保護基P9、P13を順次又は同時に脱保護させることにより化合物（５
３）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
化合物（６０）は、LPの親水性側鎖の官能基は特に保護されていないが、塩基存在下、
活性エステル、混合酸無水物等に誘導した化合物（１１）と反応させることにより、化合
物（２）を製造することができる。それぞれのペプチド結合を形成する反応条件や試薬、
塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１８０】
８．製造方法８
製造方法５に示される化合物（４３）のうち、リンカー-LP-が、-Lp1-Gly-Gly-Phe-Gly
-からなる構造を有する場合は下記の方法によっても製造することができる。
【０１８１】
【化３０】
2020143114.tif 000066
【０１８２】
[式中、P9、P10は、保護基を示す。]
【０１８３】
製造方法５に記載のアミノ酸又はペプチド（３１）を活性エステル、混合酸無水物、又
は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−
Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０
，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベン
ゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イ
ル］グリシンアミド（国際公開第１９９７／４６２６０号に記載された医薬化合物のフリ
ー体）（６１）又はその塩と反応させることにより化合物（６２）を製造することができ
る。アミノ酸又はぺプチド（３１）と化合物（６１）のペプチド結合を形成する反応条件
や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すれば
よい。Ｎ末端の保護基P3、側鎖の官能基の保護基P10としては、製造方法５にて上述の通
りである。なお、側鎖の官能基の保護基P10はなくてもよく、Ｎ末端のみを保護したアミ
ノ酸又はペプチド（３１）を用いて反応を行い、化合物（６２）を得ることができる。
【０１８４】
９．製造方法９
式（２）で示される化合物のうち、リンカーが、-L1-L2-LP-で示される構造であり、当
該LPは、そのＣ末端が２又は３以上のグリシンからなるオリゴペプチドであって薬物に結
合し、かつ当該ペプチド残基のＮ末端が親水性アミノ酸である場合はグリシンであるペプ
チド残基である場合は、例えば下記の方法でも製造できる。
【０１８５】
【化３１】
2020143114.tif 000067
【０１８６】
［式中、L1’は、L1の末端がマレイミジル基に変換された構造であり、LPはLp1-Lp2から
なる構造を、P12及びP14は、保護基を示す。］
【０１８７】
LPは，Lp1及びLp2を結合させて形成されるので、これらに含まれるLPのＣ末端を構成す
るためグリシンの数は、LPが有するＣ末端のグリシンの数、さらに反応時にこれらを使用
する反復回数を考慮して設計すればよい。
ペプチド（６３）はそのＣ末端が２又は３以上のグリシンからなるオリゴペプチドであ
り、かつ当該ペプチド残基のＮ末端が親水性アミノ酸となる場合にはグリシンであるペプ
チド残基であって、当該Ｎ末端はP14で保護されている。ペプチド（６３）はぺプチド合
成に通常用いられている様に、その構成するアミノ酸又はペプチドを順次縮合反応と脱保
護を繰り返して合成できる。
ペプチド（６３）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、化合物（４）又はその塩
と反応させることにより、化合物（６４）を製造することができる。ペプチド（６３）と
化合物（４）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）
の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。保護基P14は、化合物（６）の合
成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
また、化合物（６４）は、Ｎ末端をP14で保護したアミノ酸又はペプチド（６５）を活
性エステル、混合酸無水物等に誘導し、製造方法６に記載の化合物（５２）に反応させる
ことによっても製造することができる。アミノ酸又はペプチド（６５）と化合物（５２）
のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べ
たものから適宜選択して使用すればよい。保護基P14は、化合物（６）の合成で述べたも
のから適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（６４）のアミノ基の保護基P14を脱保護させることにより化合物（６
６）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘
導し、得られた化合物（６６）に反応させることにより、化合物（２）を製造することが
できる。カルボン酸誘導体（１１）と化合物（６６）のアミド結合を形成する反応条件や
試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよ
い。
化合物（２）は下記の方法でも製造することができる。
化合物（６７）はLp1のＮ末端のグリシンがL2と結合し、製造方法５に記載の化合物（
４５）と同様に合成することができる。製造方法５に記載したアミノ酸又はぺプチド（４
６）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、化合物（６７）に
反応させることにより、化合物（６８）を製造することができる。ここで、ここで、アミ
ノ酸又はペプチド（４６）は、グリシンか又はそのＣ末端が２又は３以上のグリシンから
なるオリゴペプチドであり、そのＣ末端がP12で保護されている。アミノ酸又はペプチド
（４６）と化合物（６７）のアミド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化
合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
化合物（６８）は、化合物（１１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、Ｃ末端
をP12で保護したペプチド（６９）に反応させることによっても製造することもできる。
ここで、ペプチド（６９）はそのＣ末端が２又は３以上のグリシンからなるオリゴペプチ
ドであり、かつＮ末端が親水性アミノ酸となる場合においてはグリシンとなるペプチド残
基である。ペプチド（６９）はぺプチド合成に通常用いられている様に、その構成するア
ミノ酸又はペプチドを順次縮合反応と脱保護を繰り返して合成できる。ペプチド（６９）
と化合物（１１）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（
６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。保護基P12は、酸条件で脱保
護可能な保護基が好ましいが、これに限定されることはなく、化合物（６）の合成で述べ
たものから適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（６８）のカルボキシ基の保護基P12を脱保護させることにより化合物
（７０）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択
すればよい。
化合物（７０）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、化合物（４）又はその塩に
反応させることにより、化合物（２）を製造することができる。化合物（７０）と化合物
（４）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶媒は、化合物（６）の合成
で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
他に化合物（２）は下記の方法でも製造することができる。
製造方法６に記載の化合物（５２）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存
在下、化合物（６７）に反応させることにより、化合物（２）を製造することができる。
化合物（６７）と化合物（５２）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基及び溶
媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１８８】
なお、製造方法１から製造方法９の中間体の化合物はいずれも塩及び/又は水和物とな
ってもよい。
【０１８９】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶等の精製操作
を行うことにより、水分を吸収し、或は吸着水が付着する等して、水和物になる場合があ
り、その様な水を含む化合物又は塩も本発明に包含される。
また、本発明には、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含され
る。本発明の抗体−薬物コンジュゲートを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然
割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（2H）、トリチウム（3H）、ヨ
ウ素-125（125I）又は炭素-14（14C）等を挙げることができる。また、本発明化合物は、
例えば、トリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）、炭素-14（14C）、銅-64（64Cu）、ジ
ルコニウム-89（89Zr）、イオジン-124（124I）、フルオリン-18（18F）、インジウム-11
1（111I）、炭素-11（11C）又はイオジン-131（131I）の様な放射性同位体で放射性標識
され得る。放射性標識された化合物は、治療又は予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試
薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体−薬物コ
ンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包
含される。
【０１９０】
［医薬］
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、癌細胞に対して細胞傷害活性を示す
ことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び／又は予防剤として使用することがで
きる。
すなわち本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、癌治療の主要な治療法であ
る化学療法のための薬剤として選択して使用することができ、その結果として、癌細胞の
成長を遅らせ、増殖を抑え、さらには癌細胞を破壊することができる。これ等によって、
癌患者において、癌による症状からの解放や、ＱＯＬの改善を達成でき、癌患者の生命を
保って治療効果が達成される。癌細胞の破壊には至らない場合であっても、癌細胞の増殖
の抑制やコントロールによって癌患者においてより高いＱＯＬを達成しつつより長期の生
存を達成させることができる。
このような薬物療法においての薬物単独での使用の他、アジュバント療法において他の
療法と組み合わせる薬剤としても使用でき、外科手術や、放射線療法、ホルモン療法等と
組み合わせることができる。さらにはネオアジュバント療法における薬物療法の薬剤とし
て使用することもできる。
以上のような治療的使用の他、微細な転移癌細胞の増殖を押さえ、さらには破壊する効
果も期待することができる。特に原発性の癌細胞においてＨＥＲ３の発現が確認されたと
きに本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを投与することよって癌転移の抑制や
、予防効果を期待することができる。例えば、転移過程で体液中にある癌細胞を抑制し破
壊する効果や、いずれかの組織に着床した直後の微細な癌細胞に対する抑制、破壊等の効
果が期待できる。したがって、特に外科的な癌の除去後においての癌転移の抑制、予防効
果が期待できる。
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、患者に対しては全身療法として投与
する他、癌組織に局所的に投与して治療効果を期待することができる。
抗体ー薬物コンジュゲート（１）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用及び抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（２）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用を、in vivoではＵ
１−５９より強い抗乳癌作用及び抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（３）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巣癌、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用を、in v
ivoではＵ１−５９より強い抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用、抗胃癌作用、及び
抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（４）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（５）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（６）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗メラノーマ作用を、in vivoではＵ１−５９より強い
抗乳癌作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（７）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（８）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗メラノーマ作用を、in vivoではＵ１−５９より強い
抗乳癌作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（９）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in v
itroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巣癌、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用をを示し
た。
抗体ー薬物コンジュゲート（１０）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in
vitroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用を、in vivoでは
Ｕ１−５９より強い抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用、抗胃癌作用、及び抗メラノ
ーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（１１）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in
vitroで抗乳癌作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（１２）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in
vitroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巣癌、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用をを示
した。
抗体ー薬物コンジュゲート（１３）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in
vitroで抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及び抗メラノーマ作用を、in vivoでは
Ｕ１−５９より強い抗乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）作用、抗肺癌作用、抗大腸
癌作用、抗胃癌作用、抗膵臓癌作用、及び抗メラノーマ作用を示した。
抗体ー薬物コンジュゲート（１４）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、in
vitroで抗乳癌作用を示した。
抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）は、優れた抗腫瘍活性、安全性及び物性を有し、
in vivoで抗乳癌（ルミナル乳癌及びトリプルネガティブ乳癌を含む）作用、抗メラノー
マ作用、抗卵巣癌作用、抗膀胱癌作用、抗肺癌作用、抗頭頸部癌作用及び抗胃癌作用を、
単独で又はトラスツズマブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ若しくはペルツ
ズマブとの併用で、示した。
【０１９１】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートが適用される癌の種類としては、例えば
、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、
転移性乳癌、ルミナール乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸
癌、頭頸部癌、食道癌、扁平上皮癌、腹膜癌、多形グリア芽細胞腫、肝臓癌、肝細胞癌、
結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状
腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、又は陰茎癌等を挙げることができる。特に乳癌の中のトリプル
ネガティブ乳癌（ＨＥＲ２、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ受容体、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ受容体を
非発現）は、現行治療に化学療法しかなく、予後不良と言われている。トリプルネガティ
ブ乳癌にてＨＥＲ３発現についてはほとんど報告されていないが、もしＨＥＲ３発現がト
リプルネガティブ乳癌患者で認められるならば、本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュ
ゲートは、治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。但し、治療対象となる
癌細胞において抗体−薬物コンジュゲート中の抗体が認識できるタンパクを発現している
癌細胞であればこれらには限定されることはない。
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、治療対象となる癌細胞において、抗
体−薬物コンジュゲート中の抗体が認識できるＨＥＲ３蛋白を発現している癌細胞が治療
対象となる。本明細書において、「ＨＥＲ３蛋白を発現している癌」とは、その細胞表面
にＨＥＲ３蛋白を有する細胞を含む癌、又は血液中にＨＥＲ３蛋白を分泌する癌である。
ＨＥＲ３蛋白はさまざまなヒトの腫瘍において過剰発現しており、腫瘍（原発、転移）検
体におけるＨＥＲ３蛋白の過剰発現を評価する免疫組織化学染色法（ＩＨＣ）やＨＥＲ３
遺伝子の増幅を評価する蛍光in situハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、また血液
検体におけるＨＥＲ３蛋白の過剰発現を評価する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等、
この分野で通常実施される方法を用いて評価することができる。
また、本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、その抗ＨＥＲ３抗体が癌細胞
表面で発現しているＨＥＲ３蛋白を認識し、さらに内在化することによって抗腫瘍効果が
発現されることから、本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートの治療対象は「ＨＥ
Ｒ３蛋白を発現している癌」に限定されることはなく、例えば白血病、悪性リンパ腫、形
質細胞種、骨髄腫、又は肉腫も治療対象とすることができる。
【０１９２】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与するこ
とができるが、より好ましくはヒトである。
【０１９３】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用され
る物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加
物その他から適宜選択して適用することができる。
【０１９４】
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を
含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、１種
以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体）を含む。ここで液体には、例えば、水及
び油（石油、動物起源、植物起源又は合成起源の油）が含まれる。油は、例えば、ラッカ
セイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であってよい。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与さ
れる場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、並びにデキストロース水溶液及
びグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され
得る。適切な薬学的賦形剤は、この分野で公知のものから適宜選択することができる。上
記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤を含み
得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。その処方は、
投与の態様に対応する。
【０１９５】
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを投
与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮
下の経路を挙げることができるが、これらに限定されることはない。投与は、例えば、注
入又はボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記リガ
ンド薬物結合体の投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路で
ある。
【０１９６】
代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的
組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物
は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶
化剤及び注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み
得る。一般に、上記成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェ等に密封して
シールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末又は無水の濃縮物として、別個に、又は単位剤形
中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される形態
の場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水又は食塩水を含む注入ボトルで投薬さ
れ得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルは
、例えば、上記成分が投与前に混合され得る様に、提供され得る。
【０１９７】
本発明の医薬組成物には有効成分として本願の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートの
みを含んでもよいし、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以
外の他の薬剤（例えば癌治療剤）を含んでもよい。本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジ
ュゲートは、他の癌治療剤と共に投与することもでき、これによって抗癌効果を増強させ
ることができる。この様な目的で使用される他の抗癌剤等の薬剤は、例えば、投与した後
に本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを有効成分として含む医薬組成物を投与
するか、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを有効成分として含む医薬組成物を投与し
た後に投与するか、抗体−薬物コンジュゲートと同時に、別々に（個別に）、或は連続し
て個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。本発明の抗
ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを本発明においては、抗体−薬物コンジュゲートと他
の薬剤を単一の製剤として同時に投与される場合、および、別々の製剤として同時に、連
続して、又は投与間隔を変えて投与される場合のいずれも、「抗体−薬物コンジュゲート
及び他の薬剤を含む医薬組成物」の意味に包含される。この様な癌治療剤として、５−Ｆ
Ｕ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ（Ｔ−ＤＭ
１）、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ｐｅｒｔｕ
ｚｕｍａｂ、ａｂｒａｘａｎｅ、ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓ
ｐｌａｔｉｎ、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃ
ａｎ（ＣＰＴ−１１）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ｐｅｍｅｔｒｅｘ
ｅｄ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ、ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ，ｖｅｍｕ
ｒａｆｅｎｉｂ又は国際公開第２００３／０３８０４３号パンフレットに記載の薬剤、さ
らにＬＨ−ＲＨアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォ
スフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマター
ゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）等を挙げることができ
るが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。これらの癌治療剤を、そ
の標的に基づき、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ等
の抗ＦＧＥＲ剤、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔ−ＤＭ１、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ等の抗Ｈ
ＥＲ２剤、ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１等の抗ＨＥＲ３剤、ｉｎ
ｆｌｉｘｉｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂ等の抗ＶＥＧＦ剤等と分類することができる。
さらに、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ等の抗ＥＧＦＲ抗体、ｔｒａｓｔ
ｕｚｕｍａｂ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ等の抗ＨＥＲ２抗体、ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ、ＭＭ
−１２１、ＭＭ−１１１等の抗ＨＥＲ３抗体、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍ
ａｂ等の抗ＶＥＧＦ抗体等と分類することができる。本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コン
ジュゲートは、ｉ）胃癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌等の治療において抗ＨＥＲ２剤
又は抗ＨＥＲ２抗体と組み合わせて投与すると、又は、ｉｉ）肺癌、頭頸部癌、胃癌、乳
癌、トリプルネガティブ乳癌等の治療において抗ＥＧＦＲ剤又は抗ＥＧＦＲ抗体と組み合
わせて投与すると、優れた治療効果を奏する。また、他の薬剤は１又は２以上であり、他
の薬剤は抗癌剤であっても、併用剤に起因する副作用を軽減するための薬剤でもよい。
【０１９８】
本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート及び他の薬剤を含む医薬組成
物」は、「抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤を組み合わせて投与される医
薬組成物」と同義である。本発明において、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の
薬剤を「組み合わせて投与される」とは、ある一定期間において、被投与対象の体内に、
抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤剤が取り込まれることを意味する。抗Ｈ
ＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤が単一製剤中に含まれた製剤が投与されても
よく、またそれぞれが別々に製剤化され、別々に投与されても良い。別々に製剤化される
場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる
時間に、又は、異なる日に、投与されても良い。抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと
他の薬剤が、それぞれ異なる時間又は日に投与される場合、その投与の順番は特に限定さ
れない。通常、それぞれの製剤は、それぞれの投与方法に従って投与されるため、それら
の投与は、同一回数となる場合もあり、異なる回数となる場合もある。また、それぞれが
別々に製剤化される場合、各製剤の投与方法（投与経路）は同じであってもよく、異なる
投与方法（投与経路）で投与されてもよい。また、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート
と他の薬剤が同時に体内に存在する必要は無く、ある一定期間（例えば一ヶ月間、好まし
くは１週間、さらに好ましくは数日間、さらにより好ましくは１日間）の間に体内に取り
込まれていればよく、いずれかの投与時にもう一方の有効成分が体内から消失していても
よい。
「抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤を組み合わせて投与される医薬組成
物」の投与形態としては、例えば、１）抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤
を含む単一の製剤の投与、２）抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤とを別々
に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、３）抗ＨＥＲ３抗体−薬
物コンジュゲートと他の薬剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での
時間差をおいての投与、４）抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートと他の薬剤を別々に製
剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、５）抗ＨＥＲ３抗体−薬物
コンジュゲートと他の薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路で
の時間差をおいての投与などを挙げることができる。「抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲ
ートと他の薬剤を組み合わせて投与される医薬組成物」の投与量、投与間隔、投与形態、
製剤等は、本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートを含有する医薬組成物のそれら
に準ずるが、それらに限定されるものではない。
かかる医薬組成物は、それが２種の異なる製剤にされた場合には、それらを含むキット
であってもよい。
本発明において、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートおよび他の薬剤の「組合せ」と
は、抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートおよび他剤を「組み合わせて投与される」こと
を意味する。
【０１９９】
この様な医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤
或は液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野
において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤において
も同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤
化することができる。
【０２００】
医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含
まれる抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの抗原に対す
る親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋ
ｄ値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、
抗体−薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体−薬物コンジュゲートと抗
原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体−薬物コン
ジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇを
１回或は１〜１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
【実施例】
【０２０１】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない
。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源か
ら容易に入手可能である。
【０２０２】
参考例１  Ｕ１−５９の作製
Ｕ１−５９は、国際公開２００７／０７７０２８号に記載の方法に基づいて作製した。
【０２０３】
実施例１  抗体−薬物コンジュゲート（１）
【化３２】
2020143114.tif 000068
【０２０４】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  （４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９
−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘ
キサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ
［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）カーバメート
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（０．２３７ｇ、１．１３ｍｍ
ｏＬ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１
３０ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（０．２１６ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）を加えて１時間撹拌した。その
反応溶液をエキサテカンのメシル酸塩（０．５００ｇ、０．９４ｍｍｏＬ）、及びトリエ
チルアミン（０．１５７ｍＬ、１．１３ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド溶液（１０ｍＬ）に滴下し、室温にて一日撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ−ル＝
８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．５９５ｇ、定量的）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６６（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８９−１．８２（２Ｈ，ｍ），２．１２−２．２１（３Ｈ，
ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．１７（２Ｈ
，ｓ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８
Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５９−５．５５（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ
），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：６２１（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２０５】
工程２：４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキ
シ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ
−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−
ｂ］キノリン−１−イル］ブタンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程１で得た化合物（０．３８８ｇ、０．６１ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（９ｍ
Ｌ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（９ｍＬ）を加えて４時間撹拌した。溶媒を減圧留去
し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホル
ム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物
（０．３４３ｇ、定量的）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），
１．７９−１．９２（４Ｈ，ｍ），２．１０−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．８０−２．８６（２Ｈ，ｍ），３．
１５−３．２０（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２６（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５４−５．６１（１Ｈ，ｍ）
，６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７２（３Ｈ，ｂｒｓ），７．８２
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５２１（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２０６】
工程３：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシンアミド
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリ
シン（０．０８１ｇ、０．１９ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（０．０２１ｇ、０．１９ｍｏＬＬ）、及び１−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０３６ｇ、０．１９ｍｍｏＬ
）を加えて３．５時間撹拌した。その反応溶液を上記工程２で得た化合物（０．０８０ｇ
、０．１５ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１．５ｍＬ）に滴下
し、室温にて４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ−ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて
精製し、標記化合物（０．１０６ｇ、７３％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．７１（２Ｈ，ｍ），１．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈ
ｚ），２．１５−２．１９（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７７（１Ｈ，ｄｄ
，Ｊ＝１２．７，８．８Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．１，４．７Ｈｚ），
３．０８−３．１１（２Ｈ，ｍ），３．１６−３．１９（２Ｈ，ｍ），３．５４（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．５７−３．７７（４Ｈ，ｍ），４．４６−４．４８（１Ｈ，
ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈ
ｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ）
，７．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．１７−７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３１
（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１
．０Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２
Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ
）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２０７】
工程４：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９
−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３
，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，
４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソ
ブチル）グリシンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程３で得た化合物（１．９７ｇ、２．１０ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（７ｍＬ
）に溶解した。トリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し
、トルエンを加えて共沸し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ク
ロロホルム〜クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］
にて精製し、標記化合物（１．９７ｇ、９９％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．７１−１．７３（２Ｈ，ｍ），１．８２−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．１２−２
．２０（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９
．４Ｈｚ），３．０３−３．０９（３Ｈ，ｍ），３．１８−３．１９（２Ｈ，ｍ），３．
５８−３．６０（２Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．６９（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝１６．８，５．９Ｈｚ），４．５０−４．５６（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，
ｓ），５．５５−５．６０（１Ｈ，ｍ），７．１７−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３２（
１Ｈ，ｓ），７．７８−７．８１（２Ｈ，ｍ），７．９５−７．９７（３Ｈ，ｍ），８．
３３−８．３５（２Ｈ，ｍ），８．４８−８．５１（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：８３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２０８】
工程５：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４
−オキソブチル）グリシンアミド
上記工程４で得た化合物（３３７ｍｇ，０．３５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（１．２ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（４４．３ｍＬ，０．３１８ｍｍｏＬ
）、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（１１９．７ｍｇ，０．３８８ｍｍ
ｏＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ
）］にて精製し、標記化合物（２７８．０ｍｇ，７６％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ
），１．１２−１．２２（２Ｈ，ｍ），１．４０−１．５１（４Ｈ，ｍ），１．６６−１
．７６（２Ｈ，ｍ），１．８０−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０５−２．２１（６Ｈ，ｍ
），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．０，９．８Ｈｚ），２．
９８−３．２１（５Ｈ，ｍ），３．５５−３．７７（８Ｈ，ｍ），４．４１−４．４８（
１Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８
．９Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７
．１Ｈｚ），５．５４−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ
，ｓ），７．２０−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７０（１Ｈ，ｔ
，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．０３（１Ｈ，ｔ，
Ｊ＝５．８Ｈｚ），８．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
７．９Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１０３２（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２０９】
工程６：抗体−薬物コンジュゲート（１）
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ及
びＣを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調
製した。本溶液（１．００ｍＬ）を２．０ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに
１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０３０７ｍＬ；抗体一分子に
対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフ
ィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃水浴で10分間インキュベ
ートした後に、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０
．０５８６ｍＬ）と上記工程５で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（
０．０６１５ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃水浴にて４０分間イ
ンキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１２３ｍＬ）を加え、さらに室温
でチューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて２０分間撹拌
し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ（緩衝液としてＡＢＳを使用）を
用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（ドラッグリンカーのモル吸光係数として
、εD,280＝７２８０εD,370＝２３４００を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：１．２９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７．７４ｍｇ（７７％），共通操作Ｅにて
測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．９。
【０２１０】
実施例２  抗体−薬物コンジュゲート（２）
【化３３】
2020143114.tif 000069
【０２１１】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例１工程５で得た化合物を用いて、実施例１
工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２２６．８ｍｇ（９１％），共通操作Ｅに
て測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．９。
【０２１２】
実施例３  抗体−薬物コンジュゲート（３）
【化３４】
2020143114.tif 000070
【０２１３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例１工程５で得た化合物を用いて、実施例１
工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１６．９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２１９．７ｍｇ（８８％），共通操作Ｅに
て測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．９。
【０２１４】
実施例４  抗体−薬物コンジュゲート（４）
【化３５】
2020143114.tif 000071
【０２１５】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４）
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ及
び共通操作Ｃを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体
濃度に調製した。本溶液（１．００ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ
、ここに１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１８７ｍＬ；抗体
一分子に対して２．８当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔ
ｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０１７０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内
であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部
のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、上記工程５で得た化合物を１
０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０３１４ｍＬ；抗体一分子に対して４．７当
量）を室温で加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた
。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０
．０１２３ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）を加え、さらに室温で２０分間イン
キュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ（緩衝液としてＡＢＳを使用）を
用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、共
通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（ドラッグリンカーのモル吸光係数として
、εD,280＝５０００、εD,370＝１９０００を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：１．０２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．１ｍｇ（６１％），共通操作Ｅにて測
定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：２．９；共通操作Ｆ（ドラッグリン
カーのモル吸光係数として、εD,280＝５０００を使用）にて測定された抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：３．２。
【０２１６】
実施例５  抗体−薬物コンジュゲート（５）
【化３６】
2020143114.tif 000072
【０２１７】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  （５Ｓ，１４Ｓ）−５−ベンジル−１−｛［（１Ｓ，９Ｓ）
−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２
，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３
’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−１４−
｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−１，４，７，１０
，１３−ペンタオキソ−３，６，９，１２−テトラアザヘキサデカン−１６−オエート
氷冷下、グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチ
ル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，
１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：
６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］グリシンアミド（国際公開第
１９９７／４６２６０号に記載された医薬化合物のフリー体；０．２５０ｇ，０．３３２
ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５７．２ｍｇ，０．４９７ｍｍｏＬ）、及
びＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−アスパラギン酸４
−ｔｅｒｔ−ブチル（０．２０５ｇ，０．４９７ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（１０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１２３
ｇ，０．４９７ｍｍｏＬ）を加え、室温にて２日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られ
た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ
ール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．２７８ｇ，７３％）を淡黄色固
体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ
），１．３５（９Ｈ，ｓ），１．７９−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０３−２．２５（２
Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．４０−２．５１（２Ｈ，ｍ），２．６４−２．８
２（２Ｈ，ｍ），２．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，４．６Ｈｚ），３．１６（２Ｈ
，ｂｒｓ），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．７，５．７Ｈｚ），３．６３−３．８０
（４Ｈ，ｍ），４．１６−４．３４（３Ｈ，ｍ），４．３６−４．５０（２Ｈ，ｍ），５
．２３（２Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ），５．４３（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１６．５Ｈｚ），５．５１−５．６２（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），７．１
０−７．２５（５Ｈ，ｍ），７．２６−７．３３（３Ｈ，ｍ），７．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ
＝７．３Ｈｚ），７．６５−７．７２（３Ｈ，ｍ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０
Ｈｚ），７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ
），８．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），
８．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１１４７（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２１８】
工程２：ｔｅｒｔ−ブチル  （５Ｓ，１４Ｓ）−１４−アミノ−５−ベンジル−１−｛［
（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３
−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄ
ｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］ア
ミノ｝−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−３，６，９，１２−テトラアザヘキサ
デカン−１６−オエート
上記工程１で得た化合物（０．２７９ｇ，０．２４２ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２．００ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．２４０ｍＬ，２．４２ｍｍｏＬ）
を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラム
クロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）］に
て精製し、標記化合物（０．２６５ｇ，定量的）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
），１．３９（９Ｈ，ｓ），１．８１−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．０７−２．２８（２
Ｈ，ｍ），２．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．８，８．０Ｈｚ），２．４３（３Ｈ，ｓ）
，２．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．８，４．９Ｈｚ），２．７５−２．８２（１Ｈ，ｍ
），３．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．９，４．５Ｈｚ），３．１６−３．２５（２Ｈ，
ｍ），３．５０−３．６１（２Ｈ，ｍ），３．６５−３．８１（５Ｈ，ｍ），４．４０−
４．５１（１Ｈ，ｍ），５．２７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２４．１，１９．０Ｈｚ），５．４
３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２１．３，１６．２Ｈｚ），５．５６−５．６５（１Ｈ，ｍ），６
．５５（１Ｈ，ｓ），７．１５−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．８
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２６−８．３９（２Ｈ，ｍ），８．４４（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝８．２Ｈｚ）．
【０２１９】
工程３：ｔｅｒｔ−ブチル  （５Ｓ，１４Ｓ）−５−ベンジル−１４−｛［６−（２，５
−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］アミノ｝−
１−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１
０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベ
ンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−
イル］アミノ｝−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−３，６，９，１２−テトラア
ザヘキサデカン−１６−オエート
上記工程２で得た化合物（０．１００ｇ，０．１０８ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２．００ｍＬ）溶液に、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（
４０．０ｍｇ，０．１３０ｍｍｏＬ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去し
、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム
：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（８０．０ｍｇ，６６％）を
淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
），１．１３−１．２３（２Ｈ，ｍ），１．３７（９Ｈ，ｓ），１．４２−１．５４（４
Ｈ，ｍ），１．８０−１．９６（２Ｈ，ｍ），２．０８−２．２５（４Ｈ，ｍ），２．３
５−３．７６（１５Ｈ，ｍ），２．４３（３Ｈ，ｓ），４．３９−４．４９（１Ｈ，ｍ）
，４．５５−４．６７（１Ｈ，ｍ），５．２１−５．３４（２Ｈ，ｍ），５．４３（２Ｈ
，ｄｄ，Ｊ＝２１．１，１６．４Ｈｚ），５．５６−５．６４（１Ｈ，ｍ），６．５５（
１Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），７．１６−７．２６（５Ｈ，ｍ）
，７．３３（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），８．０４−８．１
８（３Ｈ，ｍ），８．３０−８．３７（１Ｈ，ｍ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈ
ｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１１１８（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２２０】
工程４：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］−Ｌ−α−アスパルチルグリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ
−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，
１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ
［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル
］グリシンアミド
氷冷下、上記工程３で得た化合物（７０．０ｍｇ，６２．６μｍｏＬ）にトリフルオロ
酢酸（４．００ｍＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物
（５５．０ｍｇ，８３％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．１４−１．２４（２Ｈ，ｍ），１．４１−１．５３（４Ｈ，ｍ），１．７９−１
．９５（２Ｈ，ｍ），２．０８−２．２８（４Ｈ，ｍ），２．３７−２．６０（２Ｈ，ｍ
），２．４２（３Ｈ，ｓ），２．６３−２．８２（２Ｈ，ｍ），２．９９（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝１４．１，５．１Ｈｚ），３．１２−３．２５（２Ｈ，ｍ），３．２９−３．４４（
１Ｈ，ｍ），３．５２−３．８０（６Ｈ，ｍ），４．３８−４．４８（１Ｈ，ｍ），４．
５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，７．４Ｈｚ），５．２７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２４．３
，１８．８Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２１．５，１６．４Ｈｚ），５．５７−
５．６２（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｓ），７．１５−７．
２６（５Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），
７．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．３４（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈ
ｚ），１２．２６（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０６２（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２２１】
工程５：抗体−薬物コンジュゲート（５）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び上記工程４で得た化合物を用いて、実施例１工程
６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１．３６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．１６ｍｇ（８２％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝７６２０、εD,370＝２３７００を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．０。
【０２２２】
実施例６  抗体−薬物コンジュゲート（６）
【化３７】
2020143114.tif 000073
【０２２３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（６）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例５工程４で得た化合物を用いて、実施例１
工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１１．５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２２４．２ｍｇ（９０％），共通操作Ｅ（
ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝７６２０、εD,370＝２３７００を使
用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．６。
【０２２４】
実施例７  抗体−薬物コンジュゲート（７）
【化３８】
2020143114.tif 000074
【０２２５】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｓ，１２Ｓ）−１２−ベンジル−２１−｛［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−３
−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４，７，１０，
１３，１６，２１−ヘキサオキソ−５，８，１１，１４，１７−ペンタアザヘニコサン−
１−ノエート
（２Ｓ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ
）カルボニル］アミノ｝−４−オキソブタン酸（０．６２５ｇ、１．５２ｍｍｏＬ）をジ
クロロメタン（１０．０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１７５ｇ
、１．５２ｍｏＬ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイ
ミド塩酸塩（０．２９１ｇ、１．５２ｍｍｏＬ）を加えて１時間撹拌した。その反応溶液
を実施例1工程４で得た化合物（１．００ｇ、１．０１ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド溶液（１０．０ｍＬ）に滴下し、室温にて２０時間撹拌した。溶媒を減
圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロ
ロホルム：メタノ−ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．８７３ｇ、７
０％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．３７（９Ｈ，ｓ），１．６８−１．７８（２Ｈ，ｍ），１．８１−１．９３（２
Ｈ，ｍ），２．１０−２．２３（４Ｈ，ｍ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．６８−２．８
５（３Ｈ，ｍ），２．９９−３．２２（５Ｈ，ｍ），３．５８−３．８１（６Ｈ，ｍ），
４．１９−４．３６（３Ｈ，ｍ），４．３８−４．５２（２Ｈ，ｍ），５．１７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，
ｓ），５．５４−５．６２（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．１５−７．３４（
８Ｈ，ｍ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６６−７．７５（４Ｈ，ｍ）
，７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），
８．０１−８．０６（１Ｈ，ｍ），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．１７−
８．２２（１Ｈ，ｍ），８．２５−８．３０（１Ｈ，ｍ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１２３２（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２２６】
工程２：ｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｓ，１２Ｓ）−１２−ベンジル−３−｛［６−（２，５
−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］アミノ｝−
２１−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−
１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−
ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１
−イル］アミノ｝−４，７，１０，１３，１６，２１−ヘキサオキソ−５，８，１１，１
４，１７−ペンタアザヘニコサン−１−ノエート
上記工程１で得た化合物（０．８００ｇ、０．６４９ｍｍｏＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（３．００ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．６４３ｍＬ、６．４９ｍｍｏＬ
）を加え１時間撹拌した。溶媒を減圧乾固し、得られた残留物をＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（１０ｍＬ）に溶解した。６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（０．
３００ｇ、０．９７４ｍｍｏＬ）を加え、２０時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られ
た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ
−ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．２２４ｇ、２９％）を淡黄色固
体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ
），１．１５−１．２２（２Ｈ，ｍ），１．３５（９Ｈ，ｓ），１．４４−１．４７（４
Ｈ，ｍ），１．７１−１．７３（２Ｈ，ｍ），１．８０−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０
８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．１３−２．２０（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，
ｓ），２．６７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１１．１，４．８Ｈｚ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１３．６，９．４Ｈｚ），２．９９−３．１７（６Ｈ，ｍ），３．３１−３．３６（２
Ｈ，ｍ），３．５７−３．７６（６Ｈ，ｍ），４．４５−４．４７（１Ｈ，ｍ），４．５
７−４．６０（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２５（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５−５．６０（１Ｈ，ｍ），
６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．１５−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．
３１（１Ｈ，ｓ），７．７０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１０．９Ｈｚ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０９−８．１２（３Ｈ，
ｍ），８．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），８．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）
．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１２０３（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２２７】
工程３：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］−Ｌ−α−アスパラチルグリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ
−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル
−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ
−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−
１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシナミド
上記工程２で得た化合物（０．２２４ｇ、０．１８６ｍｍｏＬ）を実施例１の工程２と
同様に反応させ、標記化合物（２１．２ｍｇ、１０％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
），１．１３−１．２１（２Ｈ，ｍ），１．４２−１．４５（６Ｈ，ｍ），１．７０−１
．７２（２Ｈ，ｍ），１．８５−１．８８（２Ｈ，ｍ），２．０６−２．２０（６Ｈ，ｍ
），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．６３−２．６７（１Ｈ，ｍ），２．７８−２．８１（１
Ｈ，ｍ），３．０４−３．１２（６Ｈ，ｍ），３．６３−３．７０（６Ｈ，ｍ），４．４
６−４．５２（２Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５−５．５８（１Ｈ，ｍ），
６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．１８−７．２３（６Ｈ，ｍ），７．
３０（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１０．９Ｈｚ），７．９９−８．０２（１Ｈ，ｍ），８．１０−８．１１（３Ｈ，ｍ），
８．２７−８．３０（１Ｈ，ｍ），８．４７−８．５０（１Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１１４７（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２２８】
工程４：抗体−薬物コンジュゲート（７）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び上記工程３で得た化合物を用いて、実施例１工程
６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１．３９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．３４ｍｇ（８３％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝７６７０、εD,370＝２４８００を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．７。
【０２２９】
実施例８  抗体−薬物コンジュゲート（８）
【化３９】
2020143114.tif 000075
【０２３０】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（８）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例７工程３で得た化合物を用いて、実施例１
工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１１．２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２２８．５ｍｇ（９１％），共通操作Ｅ（
ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝７６７０、εD,370＝２４８００を使
用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．７。
【０２３１】
実施例９  抗体−薬物コンジュゲート（９）
【０２３２】
【化４０】
2020143114.tif 000076
【０２３３】
工程１：Ｎ−｛３−［２−（２−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ
−ピロール−１−イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グ
リシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−
５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０
，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，
７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グ
リシンアミド
実施例１の工程４で得た化合物（１００ｍｇ，０．１１９ｍｍｏＬ）を、６−マレイミ
ドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−（２−（２−（３−マレインイミドプ
ロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸Ｎ−スクシンイミジル（５０．７ｍｇ，
０．１１９ｍｍｏＬ）を用いて、実施例１の工程５と同様に反応させ、標記化合物（６６
．５ｍｇ，４８％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．６５−１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０７−２
．１９（４Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．３３−２．３６（２
Ｈ，ｍ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．８Ｈｚ）
，２．９６−３．１８（９Ｈ，ｍ），３．４２−３．４４（４Ｈ，ｍ），３．５３−３．
７６（１０Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８．６，４．７Ｈｚ），５．１４（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．３８（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．５２−５
．５８（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．９８（２Ｈ，ｓ），７．１２−７．１
７（１Ｈ，ｍ），７．１８−７．２５（４Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｓ），７．６９（
１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），７．９８−８
．０３（２Ｈ，ｍ），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ
＝５．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９
．０Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１１４９（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２３４】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（９）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び上記工程１で得た化合物を用いて、実施例１工程
６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：２．０８ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１８．７ｍｇ（９４％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝４９６４、εD,370＝１８９８２を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６。
【０２３５】
実施例１０  抗体−薬物コンジュゲート（１０）
【化４１】
2020143114.tif 000077
【０２３６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１０）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例９工程１で得た化合物を用いて、実施例１
工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１９．７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２３６．４ｍｇ（９５％），共通操作Ｅ（
ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝４９６４、εD,370＝１８９８２を使
用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．２；共通操作Ｆ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝４９６４を使用）にて測定された抗体
一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．４。
【０２３７】
実施例１１  抗体−薬物コンジュゲート（１１）
【０２３８】
【化４２】
2020143114.tif 000078
【０２３９】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１１）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例９工程１で得た化合物を用いて、実施例４
工程１と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：０．８８ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．２８ｍｇ（５３％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝４９６４、εD,370＝１８９８２を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．０；共通操作Ｆ（ドラ
ッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝４９６４を使用）にて測定された抗体一
分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．３。
【０２４０】
実施例１２  抗体−薬物コンジュゲート（１２）
【化４３】
2020143114.tif 000079
【０２４１】
工程１：（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝ア
ミノ）メチルアセテート
Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルグリシルグリシン（４．３３ｇ，１２．２ｍ
ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）、及びトルエン（４０．０ｍＬ）からなる
混合物に、ピリジン（１．１６ｍＬ，１４．７ｍｍｏｌ）及び四酢酸鉛（６．８４ｇ，１
４．７ｍｍｏｌ）を加え、５時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、不溶物を
セライト濾過によって除き、濾液の溶媒を減圧下濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル
に溶解し、水及び飽和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒
を減圧下で留去した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサ
ン：酢酸エチル＝９：１（ｖ／ｖ）〜酢酸エチル］にて精製し、標記化合物（３．００ｇ
，６７％）を無色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：２．０７（３Ｈ，ｓ），３．９０（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．４６（２Ｈ，ｄ，
Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｂｒｓ）
，６．９６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４１（２Ｈ
，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．７７（２Ｈ，ｄ
，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
【０２４２】
工程２：ベンジル  ［（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］
グリシル｝アミノ）メトキシ］アセテート
上記工程１で得た化合物（３．６８ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）及びベンジルグリコレート
（４．９９ｇ，３０．０ｍｍｏＬ）のテトラヒドロフラン（４０．０ｍＬ）溶液に、カリ
ウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド（２．２４ｇ，２０．０ｍｍｏＬ）を０℃で加え、室温にて
１５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、水を０℃で加え、酢酸エチル、クロロホルム
で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得
られた残留物をジオキサン（４０．０ｍＬ）、水（１０．０ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナ
トリウム（１．０１ｇ，１２．０ｍｍｏＬ）、クロロギ酸９−フルオレニルメチル（２．
５９ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸
エチルで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去
し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝１
００：０（ｖ／ｖ）〜０：１００］にて精製し、無色油状の標記化合物（１．８８ｇ、４
０％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：３．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），
４．２４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．
８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１５−５．２７（１Ｈ，ｍ），５．１９（２Ｈ
，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３１−７．３９（７Ｈ，ｍ），７．４３（２Ｈ
，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７９（２Ｈ，ｄ
，Ｊ＝７．４Ｈｚ）．
【０２４３】
工程３：［（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝
アミノ）メトキシ］酢酸
上記工程２で得た化合物（１．８８ｇ、３．９６ｍｍｏＬ）をエタノール（４０．０ｍ
Ｌ）、酢酸エチル（２０．０ｍＬ）に溶解した。パラジウム炭素触媒（３７６ｍｇ）を加
え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。不溶物をセライト濾過によって除き、濾液の
溶媒を減圧留去し、標記化合物（１．５２ｇ、定量的）を無色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：３．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ
），３．９７（２Ｈ，ｓ），４．１８−４．３２（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６．７Ｈｚ），７．２９−７．４６（４Ｈ，ｍ），７．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈ
ｚ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
，８．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）．
【０２４４】
工程４：９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（２−｛［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−
エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，
９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４
’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエ
トキシ）メチル］アミノ｝−２−オキソエチル）カーバメート
氷冷下、エキサテカンのメシル酸塩（０．２８３ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（６１．４ｍｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、及び上記工程３で得た化
合物（０．２０５ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０
ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９２．９μＬ，０．５３３ｍｍｏ
Ｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１４３ｇ，０．６９３ｍｍｏ
Ｌ）を加え、室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（
ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物（０．３５２ｇ，８２％）を淡茶色
固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），１．７３−１．８７（２Ｈ，ｍ），２．０６−２．２０（２Ｈ，ｍ），２．３４（３
Ｈ，ｓ），３．０１−３．２３（２Ｈ，ｍ），３．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），
３．９８（２Ｈ，ｓ），４．１３−４．２５（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６
．７Ｈｚ），５．０９−５．２２（２Ｈ，ｍ），５．３２−５．４２（２Ｈ，ｍ），５．
５０−５．５９（１Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｓ），７．２４−７．３０（３Ｈ，ｍ）
，７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７
．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．
８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．７７
（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８０２（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２４５】
工程５：Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ
−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−
１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ
］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程４で得た化合物（０．８８１ｇ，１．１０ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（１１．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（１．１ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌
した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の精製
は行わずに次の反応に用いた。
【０２４６】
工程６：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシルグリシル
−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ
−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５
−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリ
ジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリ
シンアミド
氷冷下、上記工程５で得た混合物（０．４３９ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（０．１０１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）、及びＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イル
メトキシ）カルボニル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（特開２００２−６０
３５１号公報に記載された化合物；０．４４０ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（５０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（０．１８１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）を加え、室温で４日間撹拌した。溶媒を減圧留去
し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホル
ム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．２６９ｇ，５８％）
を淡橙色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０６３（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２４７】
工程７：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−
９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，
３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’
，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキ
ソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程６で得た化合物（０．２６９ｇ，０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（４．００ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．２５１ｍＬ，２．５３ｍｍｏＬ）
を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本
混合物は、これ以上の精製は行わずに次の反応に用いた。
【０２４８】
工程８：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，
９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキ
ソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラ
ノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−
２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程７で得た化合物（０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１
０．０ｍＬ）溶液に、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（０．１５６ｇ，
０．５０６ｍｍｏＬ）を加え、室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝
９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．１００ｇ，３８％）を淡黄色固体とし
て得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：０．８３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
），１．０９−１．２１（２Ｈ，ｍ），１．３３−１．４７（４Ｈ，ｍ），１．７５−１
．９０（２Ｈ，ｍ），２．００−２．２３（４Ｈ，ｍ），２．３６（３Ｈ，ｓ），２．６
９−２．８１（１Ｈ，ｍ），２．９４−３．０３（１Ｈ，ｍ），３．０６−３．２２（２
Ｈ，ｍ），３．２３−３．７４（６Ｈ，ｍ），３．９８（２Ｈ，ｓ），４．３９−４．５
０（１Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１７（２Ｈ，ｓ），５．
３９（２Ｈ，ｓ），５．５３−５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５０（１Ｈ，ｓ），６．９６
（２Ｈ，ｓ），７．１１−７．２４（５Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｓ），７．７５（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０３（１Ｈ
，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ
，Ｊ＝６．５Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ
＝６．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０３４（Ｍ＋Ｈ）+．
【０２４９】
工程９：抗体−薬物コンジュゲート（１２）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び上記工程８で得た化合物を用いて、実施例１工程
６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：２．１１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１９．０ｍｇ（９５％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：４．９。
【０２５０】
実施例１３  抗体−薬物コンジュゲート（１３）
【化４４】
2020143114.tif 000080
【０２５１】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１３）
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例１２工程８で得た化合物を用いて、実施例
１工程６と同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：２２．２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２４４．２ｍｇ（９８％），共通操作Ｅ（
ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を使
用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．２；共通操作Ｆ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８を使用）にて測定された抗体
一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．０。
【０２５２】
実施例１４  抗体−薬物コンジュゲート（１４）
【化４５】
2020143114.tif 000081
【０２５３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１４）
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ及
び共通操作Ｃを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体
濃度に調製した。本溶液（１．００ｍＬ）を２．０ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ
、ここに１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１６０ｍＬ；抗体
一分子に対して２．４当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔ
ｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０１５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内
であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部
のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で10分間インキュベ
ートした後に、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０
．０２０９ｍＬ）と実施例１２工程８で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド
溶液（０．０３１５ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）を加え、１５℃水浴にて６０
分間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００５０ｍＬ）を加え、さら
に室温でチューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて２０分
間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
実施例１工程６と同様の精製操作及び特性評価により、下記の特性値を得た。
抗体濃度：１．４６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．７６ｍｇ（８８％），共通操作Ｅ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を使用
）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：２．５；共通操作Ｆ（ドラ
ッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８を使用）にて測定された抗体一
分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：２．９。
【０２５４】
実施例１５  抗体−薬物コンジュゲート（１５）
【化４６】
2020143114.tif 000082
【０２５５】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１５）
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂお
よび共通操作Ｃを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗
体濃度に調製した。本溶液（１００ｍＬ）をポリカーボネート製の２５０ｍL三角フラス
コ容器に入れ、マグネティックスターラー撹拌下、室温にて１Ｍリン酸水素二カリウム水
溶液（１．７０ｍＬ）を加えた後、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（４．０１０ｍＬ；抗体一
分子に対して６．０当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認
した後に、撹拌を停止し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、抗体内ヒンジ
部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃に冷却後、撹拌下、実施
例１２工程８で得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（６．６８４ｍＬ；抗体一分子に
対して１０．０当量）をゆっくり滴下して加えた。１５℃にて、最初の３０分間撹拌し、
次の１時間は撹拌を停止させてインキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次
に、撹拌下、１００ｍＭ  ＮＡＣ水溶液（０．８６２ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９
当量）を加え、さらに室温下２０分間インキュベートし、未反応の薬物リンカーの反応性
を停止させた。
精製：撹拌下、上記溶液に２０％酢酸水（約０．６ｍＬ）とＡＢＳ（１００ｍＬ）をゆ
っくり加え、本溶液のｐＨを５．５±０．１にした。この溶液を精密ろ過（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ  Ｃｏ．  Ｍｉｌｌｅｘ―ＨＶフィルター、０．４５μｍ、ＰＶＤＦ膜）を行い白
濁物を除いた。この溶液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｘ
Ｌ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、Ｂｉｏｍａｘ  ５０ＫＤａ）、チューブポンプ（米国コールパー
マー社マスターフレックスポンプ  ｍｏｄｅｌ  ７７５２１−４０、ポンプヘッド  ｍｏ
ｄｅｌ  ７５１８−００）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレックスチュ
ーブ  Ｌ／Ｓ１６）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を行った。すなわち
、反応液に精製緩衝液としてＡＢＳを滴下しながら（計１６００ｍＬ）、限外ろ過精製を
行うことで、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに緩衝液をＡ
ＢＳへ置換し、さらに濃縮まで行った。得られた精製溶液に対して、精密ろ過（０．２２
μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．  Ｍｉｌｌｅｘ―ＧＶフィルター、ＰＶＤＦ膜）を行
い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を３７．５ｍＬ得た。
抗体濃度：２６．５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９９３．０ｍｇ（９０％），共通操作Ｅ（
ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を使
用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．３；共通操作Ｆ（ド
ラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８を使用）にて測定された抗体
一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．３。
【０２５６】
実施例１６ａ  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）
【化４７】
2020143114.tif 000083
【０２５７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂお
よび共通操作Ｃを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗
体濃度に調製した。本溶液（１５ｍＬ）をポリエチレンテレフタラート製の５０ｍL容器
に入れ、マグネティックスターラー撹拌下、室温にて１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（
０．２５５ｍＬ）を加えた後、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（０．６０１ｍＬ；抗体一分子
に対して６．０当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した
後に、３７℃で２時間インキュベートすることにより、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結
合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃に冷却後、撹拌下、実施
例１２工程８で得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（１．００２ｍＬ；抗体一分子に
対して１０．０当量）をゆっくり滴下し加えた。１５℃にて、３０分間撹拌し、薬物リン
カーを抗体へ結合させた。次に、撹拌下、１００ｍＭ  ＮＡＣ水溶液（０．１２９ｍＬ；
抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、さらに室温下２０分間インキュベートし、未
反応の薬物リンカーの反応性を停止させた。実施例１工程６と同様の精製操作及び特性評
価により、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．３６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１４０ｍｇ（５９．５ｍＬ）（９４％），
共通操作Ｅ（ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２
０２１７を使用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．４；共
通操作Ｆ（ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８を使用）にて測
定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．７。
【０２５８】
実施例１６ｂ  抗体−薬物コンジュゲート（１６ｂ）
【化４８】
2020143114.tif 000084
【０２５９】
抗体の還元：参考例１にて作製したＵ１−５９を、製造方法１に記載した共通操作Ｂお
よび共通操作Ｃを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗
体濃度に調製した。本溶液（９００ｍＬ）をポリカーボネート製の２０００ｍL三角フラ
スコ容器に入れ、マグネティックスターラー撹拌下、室温にて１Ｍリン酸水素二カリウム
水溶液（１５．３ｍＬ）を加えた後、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（３６．１ｍＬ；抗体一
分子に対して６．０当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認
した後に、撹拌を停止し、３７℃で２時間インキュベートすることにより、抗体内ヒンジ
部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃に冷却後、撹拌下、実施
例１２工程８で得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（６０．１６ｍＬ；抗体一分子に
対して１０．０当量）をゆっくり滴下し加えた。１５℃にて３０分間撹拌し、薬物リンカ
ーを抗体へ結合させた。次に、撹拌下、１００ｍＭ  ＮＡＣ水溶液（７．７６ｍＬ；抗体
一分子に対して１２．９当量）を加え、さらに室温下２０分間インキュベートし、未反応
の薬物リンカーの反応性を停止させた。
精製：撹拌下、上記溶液に２０％酢酸水（約５ｍＬ）とＡＢＳ（１０００ｍＬ）をゆっ
くり加え、本溶液のｐＨを５．５±０．１にした。この溶液を精密ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ  Ｃｏ．  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、０．４５μｍ、ＰＶＤＦ膜）を行い白濁物を除いた。
この溶液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  ｍｉｎｉ  ｃ
ａｓｅｔｔｅ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０ＫＤａ、０．１ｍ2）、チューブポンプ（米国コ
ールパーマー社マスターフレックスポンプ  ｍｏｄｅｌ  ７５２８−２０、ポンプヘッド
ｍｏｄｅｌ  ７７８００−６２）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレッ
クスチューブ  Ｌ／Ｓ２４及び２５）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を
行った。すなわち、反応液に精製緩衝液としてＡＢＳを滴下しながら（計１６Ｌ）、限外
ろ過精製を行うことで、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに
緩衝液をＡＢＳへ置換し、さらに濃縮まで行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有す
る溶液を約５００ｍL得た。
抗体濃度：１９．６６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９８３０ｍｇ（１０９％），共通操作Ｅ
（ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を
使用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．５。
【０２６０】
実施例１６ｃ  抗体−薬物コンジュゲート（１６ｃ）
【化４９】
2020143114.tif 000085
【０２６１】
参考例１にて作製したＵ１−５９及び実施例１２工程８で得た化合物を用いて、実施例
１６ｂと同様の方法により、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１６．２１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９７２６ｍｇ（６００ｍＬ、１０８％）
，共通操作Ｅ（ドラッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝
２０２１７を使用）にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．５。
【０２６２】
実施例１６ｄ  抗体−薬物コンジュゲート（１６ｄ）
【化５０】
2020143114.tif 000086
【０２６３】
実施例１６ａ、１６ｂ及び１６ｃで作製した抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、（
１６ｂ）及び（１６ｃ）を混合し（計約１８ｇ）、さらに、実施例１６ｂと同様の限外ろ
過精製を行った（１１ＬのＡＢＳを使用）。得られた精製溶液に対して、精密ろ過（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、０．４５μｍ及び０．２２μｍ、ＰＶＤＦ
膜）を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を７４５ｍL得た。さらにＡ
ＢＳ  １１０ｍＬを加えることで、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を８５
５ｍL得た。
抗体濃度：２０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１７．１ｇ（９４％），共通操作Ｅ（ドラ
ッグリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８、εD,370＝２０２１７を使用）
にて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．５；共通操作Ｆ（ドラッ
グリンカーのモル吸光係数として、εD,280＝５１７８を使用）にて測定された抗体一分
子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．８。
【０２６４】
試験例１  Ｕ１−５９と比較した抗体−薬物コンジュゲートのＨＥＲ３への結合親和性
方法：
ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１５６９（ＣＲＬ−２３３０）をＲＰＭＩ１６４
０メディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入、１０％ウシ血清アルブミン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ製）と２ｍＭのＬ−ｇｕｌｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む）
にて培養した。細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）ＳＯＬＵＴＩＯＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ，ＳＣＲ００５）又はＥＤＴＡ（５ｍＭ、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  
ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，１３７ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２．７ｍＭ  ｐ
ｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，１．４７ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｄｉｈｙｄ
ｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０．５ｍＭ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））にて培養プレートから剥がし、トリパンブルー処理により生細
胞数を測定した。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔ
ｉｎｇ（ＦＡＣＳ）バッファー（３％  ＦＢＳ及び０．００４％  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉ
ｄｅを含むＰＢＳ）に懸濁した同数の細胞を９６穴Ｕ底プレートに播種し、遠心分離によ
り細胞を沈殿させ、１００μＬの氷冷した抗体又は抗体−薬物コンジュゲート希釈液、又
はＦＡＣＳバッファーに懸濁した。
抗体又は抗体−薬物コンジュゲートはＦＡＣＳバッファーにて１／３で段階希釈を行い
３０μｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ（２００ｎＭ〜０．０３ｎＭ）に調整した。一次抗体を添
加しないＦＡＣＳバッファーにて処理した細胞をコントロール群とした。
抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとして、Ｕ１−５９、抗体−薬物コンジュゲート（
３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０）、抗体−薬物コンジュゲート（１３）を評価し
た。
各細胞を一次抗体希釈液で氷上にて４５分間反応させた後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄
した。さらに１００μＬのＦＡＣＳバッファー、又は二次抗体を１／１００で希釈した（
ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）−ｃｏｕｐｌｅｄ  ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ，Ｄｉａｎｏｖａ  ＃７０９−１１６−１４９）反応液を添加した。暗闇氷上
で４５分間処理した後に、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー又は７−Ａ
ｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（７ＡＡＤ，Ｓｉｇｍａ，＃Ａ９４００，１．１μ
ｇ／ｍＬ）を添加したＦＡＣＳバッファーで死細胞を排除した。
生細胞における蛍光シグナルは、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ
（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ  Ｉ
ｎｃ，ｓｅｒｉａｌ  ｎｕｍｂｅｒ  １４２４）及びＣＦｌｏｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃ
Ｆｌｏｗ  ｓａｍｐｌｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０．２６４．１３）を用いて評価した
。
ＰＥ及び７−ＡＡＤ由来シグナル補正のため、Ｕ１−５９（３０μｇ／ｍＬ）とＰＥ標
識二次抗体又は７−ＡＡＤで染色した細胞の蛍光シグナルを評価した。
細胞でのＵ１−５９特異的な蛍光シグナルを定量するため、二次抗体又は７−ＡＡＤの
みを処理した細胞のＦＬ−２シグナルを差し引いた値を使用した。平衡的な結合親和性（
ＫＤ）及び最大結合強度（Ｂｍａｘ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（
バージョン  ５．０４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ））にて計算した。
【０２６５】
結果を図３及び表１に示す。図３及び表１は、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲー
トの連続希釈液で処理したＨＣＣ１５６９の平均蛍光強度を示す。平衡結合親和性ＫＤ及
び最大結合強度ＢｍａｘはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより計算した。
【０２６６】
【表１】
2020143114.tif 000087
【０２６７】
ＨＣＣ−１５６９に対する抗体−薬物コンジュゲート（３）又は抗体−薬物コンジュゲ
ート（１０）の平均結合親和性ＫＤは、非コンジュゲートである抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１−５
９と同程度のＫＤを示した。さらに抗体−薬物コンジュゲート（１３）の平均結合親和性
ＫＤは、非コンジュゲートである抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１−５９と同程度のＫＤ（２．７ｎＭ
と１．６ｎＭ）を示した。異なる抗体−薬物コンジュゲートのＫＤ値から、抗体−薬物コ
ンジュゲーション・プロセスは、Ｕ１−５９の結合親和性を有意に損なわないことを示唆
した。
【０２６８】
試験例２  抗ＨＥＲ３抗体―薬物コンジュゲートによるＨＥＲ３シグナルの阻害
方法：
Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ由来のヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＣＲＳ−３００
１１４）をトリプシン処理にて剥がし、６穴ウェルに５０，０００個の生細胞を３ｍＬの
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２１３３１−０２０）＋１０％  ＦＢＳ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０２７０−１０６）に播種した。細胞を３日培養した後に、
２ｍＬの新鮮なメディウムに交換した。
抗体及び抗体−薬物コンジュゲートを最終濃度１０μｇ／ｍＬになる様に、６ウェルの
各２ｍＬ培地に直接添加した（１μｇ／μＬの抗体又は抗体−薬物コンジュゲートのスト
ック溶液２０μＬを添加）。
抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとして、Ｕ１−５９、抗体−薬物コンジュゲート（
３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０）、抗体−薬物コンジュゲート（１３）を使用し
、非処理群をコントロールとした。
細胞を２日間培養し、ＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの氷冷バッファー（５０ｍＭ  
４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ，１ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ
（ＥＤＴＡ），１２．５％  ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１
０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｅｔｒａｂａｓｉｃにｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ，＃１１６９７  ４９８  ００１），
１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｖａｎａｄａｔｅ
，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ−ｍｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ−ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭ
ＳＦ），１０μｇ／ｍＬ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ａ１１５３）を添加）にて
、４℃で３０分処理を行い、可溶化（ｌｙｓｉｓ）した。ライセートを１３０００ｒｐｍ
、４℃で２０分間洗浄し、上清をＢｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｂ６９
１６，ＢＳＡ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｗａｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ，＃２３２０９）による、タンパク質濃度測定に使用した。タンパク質量１２０μｇ
を一サンプルとして、４倍濃度のＬＤＳバッファ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、最終濃度１
６６．６７ｍＭのＤＴＴを含む）を添加し、最終的に水で４０μＬとした。サンプルを７
０度１０分煮沸し、ＮｕＰａｇｅ  Ｍｉｎｉ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ（４％−１２％
，１．５ｍｍ厚、１０  ｓｌｏｔｓ／ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに添加し
た。タンパク質スタンダードとして、７．５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）ｓｈａｒｐ  
ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐ／Ｎ  ５７３１８）を添加した。サンプルは１
７５ボルトでＮｕＰａｇｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ００
０５，Ｌｏｔ  １３５６６２９を含む１ｘＭＯＰＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を内部チャンバーに加えて、７０分間泳動した。ゲル電気泳動によ
り分離したタンパク質は、１０％  ｍｅｔｈａｎｏｌとＮｕＰａｇｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄ
ａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００５，Ｌｏｔ  １３５６６２９，１：１０００
ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を含むＮｕＰａｇｅ転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用
いて、０．４５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅのニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。タンパク質は
３０Ｖ定圧で８０分転写した。
転写膜を切断し、１００ｋＤａ以上及び３０−１００ｋＤａの分画に分け、０．１％  
Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて２回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＩ−ＣＯＲ，＃９２７−４００００）にて室温一時間で振とうさせる
ことで、ブロッキングを行なった。ブロッキング後、転写膜は一次抗体を希釈した溶液（
Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとＰＢＳを等量混合した）の処理
を４℃一晩行なった。
一次抗体として、抗ＨＥＲ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣ−８１４５５，１：５
００希釈）、抗リン酸化ＨＥＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，＃４７９１  １：１０００）そして、泳動コントロールとして抗ａｃｔｉｎ抗体（
Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，＃ＭＳ１２９５，ｄｉｌｕｔｉｏｎ  １：３３３３）を使用した
。
転写膜は０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにより３回洗浄（各５分）され、二次
抗体を含む希釈液（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとＰＢＳを等
量混合した）により暗室にて室温で１時間反応させた。
二次抗体として、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤ（Ｌｉ−
ＣＯＲ，＃９２６−６８０７０，ｄｉｌｕｔｉｏｎ  １：２５０００）又はｇｏａｔ  ａ
ｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＣＷ（Ｌｉ−ＣＯＲ，＃９２６−３２２１
１，１：１００００希釈）を使用した。転写膜は０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢ
Ｓにより各６分間、３回洗浄され、Ｌｉ−ＣＯＲ／Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  
ｉｍａｇｅｒによりシグナルを検出した。
【０２６９】
結果を図４に示す。Ａ５４９細胞を２日間、Ｕ１−５９又は異なる抗体−薬物コンジュ
ゲートと共に培養した。ＨＥＲ３又はリン酸化ＨＥＲ３をウェスタンブロッティングによ
り評価した。泳動コントロールとして、ｐａｎ−Ａｃｔｉｎを検出した。
【０２７０】
Ａ５４９をＵ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート１０μｇ／ｍＬと共に２日間培養
した結果、非処理細胞に比べて、ＨＥＲ３のリン酸化は低下した。このＨＥＲ３リン酸化
の低下はＵ１−５９及び抗体−薬物コンジュゲートで同程度であり、複数の薬物コンジュ
ゲート操作によりＵ１−５９由来のＨＥＲ３シグナル阻害機能は損なわれなかったことを
示唆した。
Ａ５４９をＵ１−５９及び抗体−薬物コンジュゲートで２日間処理した場合、非処理細
胞に比べて、ＨＥＲ３の発現低下も観察された。発現低下の度合いはＵ１−５９及び抗体
−薬物コンジュゲートで同程度であり、これはＵ１−５９介在性の内在化（内在化の試験
例を参照）及びＵ１−５９誘導性ＨＥＲダウンレギュレーション（シグナル阻害の試験例
を参照）は、複数の薬物コンジュゲート操作により損なわれなかったことを示唆している
。
【０２７１】
試験例３  Ｕ１−５９及び抗体−薬物コンジュゲートによる細胞表面ＨＥＲ３の発現低下
方法：
Ｕ１−５９及び抗体−薬物コンジュゲートによるＨＥＲ３の内在化は、Ｆｌｏｗ  ｃｙ
ｔｏｍｅｔｒｙにより評価した。７０，０００個の生細胞ＨＣＣ１５６９（ＡＴＣＣ由来
）を、０．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃３１８７０−０２５）
（１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０２７０−１０６又はＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，＃  １５０５−Ｐ１３１３０４）と２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，＃２５０３０−０２４）と含む）に懸濁し、２４ウェルプレートの各ウェルに播
種した。細胞は４日間培養し、内在化試験開始前に０．５ｍＬの新鮮な培地に交換した。
５μｇの抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを、２４ウェルプレートの各ウェル０．５ｍ
Ｌに添加し最終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。細胞を３７℃で抗体又は抗体−薬物コンジ
ュゲートの存在下で１時間培養した。抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとして、Ｕ１−
５９、抗体−薬物コンジュゲート（３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０）、又は抗体
−薬物コンジュゲート（１３）を使用した。ポジティブコントロール、またネガティブコ
ントロールとしての細胞は、一部の操作を未処理とした。
Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析のため、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、ＡＣＣＵＴＡ
ＳＥ（登録商標）ＳＯＬＵＴＩＯＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＣＲ００５）又はＰＢＳに
溶解した５ｍＭ  ＥＤＴＡ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で細胞を剥がした。２００μＬの氷
冷ＦＡＣＳバッファー（３％  ＦＢＳと０．００４％  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅを含む
ＰＢＳ）に懸濁した後、９６穴Ｕ底プレートの各ウェルに添加し、氷上に置いた。細胞を
ＦＡＣＳバッファーで１度洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳバッファーに希釈したＵ１−５
９（１０μｇ／ｍＬ）又はＦＡＣＳバッファーのみを各サンプルに加えた。細胞を氷上で
振とうさせながら４５分間処理した後にＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１００μＬのＰＥ
標識二次抗体ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｄｉａｎｏｖａ，７０９−１１
６−１４９）を１：１００でＦＡＣＳバッファーに溶解したもの、又はＦＡＣＳバッファ
ーのみを各ウェルに添加した。細胞を氷上で振とうさせながら４５分間暗室処理した。細
胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー又は死細胞を染める７ＡＡＤ（Ｓ
ｉｇｍａ，Ａ９４００，１．１μｇから１．２５μｇ／ｍＬ）を含むＦＡＣＳバッファー
で処理した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにより生細胞の蛍光シ
グナルを測定し、ＰＥ及び７−ＡＡＤのシグナルを補正するために、Ｕ１−５９（１０μ
ｇ／ｍＬ）とＰＥ標識二次抗体又は７−ＡＡＤのみで染色した細胞を使用した。
ＨＥＲ３特異的なシグナル定量のために、二次抗体又は７−ＡＡＤのみで染色した値を
、一次抗体と二次抗体、さらには７−ＡＡＤで染色したＦＬ−２値より差し引いた。
Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート処理しなかった（内在化させなかった）細胞
のＦＬ−２シグナルを最大値として、３７℃処理したＵ１−５９又は抗体−薬物コンジュ
ゲートによる細胞表面ＨＥＲ３の低下（内在化）を計算した。
ポジティブコントロール（３７℃の処理はせず）及びネガティブコントロール（一次抗
体添加せず）は、２〜３のウェルから算出される平均値として、各処理群のウェルの内在
化を定量化した。
【０２７２】
結果を図５に示す。図には、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート処理（３７℃，
１時間）によるＨＣＣ１５６９細胞表面のＨＥＲ発現低下の平均値を示した。細胞におけ
るＨＥＲ３発現の最大値は、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲートを添加しない群と
した。バックグラントの値として二次抗体のみ又は７−ＡＡＤ処理のみの群とした。Ｕ１
−５９又は各抗体−薬物コンジュゲートを１時間処理したものを処理群とした。Ｕ１−５
９及び抗体−薬物コンジュゲートによりＦＬ−２の値はほぼ同じであった。
【０２７３】
ＨＣＣ−１５６９をＵ１−５９又は各抗体−薬物コンジュゲートで処理することにより
生じた蛍光が低下したことは、ＨＥＲ３発現の低下を示している。Ｕ１−５９によるＨＥ
Ｒ３の発現低下が約５０％であることと比較して、各抗体−薬物コンジュゲートによるＨ
ＥＲ３発現低下も同等かそれ以上の値を示していることから、ＨＥＲ３を内在化させる抗
体の機能は抗体への薬物コンジュゲート操作により損なわれたかったことを示唆している
。
【０２７４】
試験例４  ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる、ヒト癌細胞株におけるin vitro増
殖・生存シグナルの抑制
方法：
ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの阻害活性は、１０％  
ＦＢＳ存在下で測定した。細胞の増殖及び成長は、非処理及び抗体−薬物コンジュゲート
処理群のａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）活性を測定すること
で評価した。接着性の癌細胞株（ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１５６９（ＣＲＬ
−２３３０）、ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＬＢ−２２）及
びＰｒｏＱｉｎａｓｅ由来のヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＣＰＱ−５７））は２Ｄ培養
系で、浮遊性の（接着性ではない）癌細胞株（ＡＴＣＣ由来のヒトメラノーマ細胞株Ａ３
７５（ＣＲＬ−１６１９）及びＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ由来のヒト肺癌細胞
株Ａ５４９（ＣＲＳ−３００１１４））は３Ｄ培養系で培養した。
接着細胞の処理
癌細胞株は低密度で（ＨＴ−２９は５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３は８００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＨＣＣ−１５６９は１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）
で１００μＬの各メディウムに懸濁し、９６マイクロウェルオプティカルボトムプレート
（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ，＃１６５３０６、白壁透明底）に播
種した。ＨＣＣ−１５６９及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３に関しては、１０％  ＦＢＳ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，  １０２７０−１０６）及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，  ２５０３０−０２４）を含むＲＰＭＩ１６４０メディウム（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，  ３１８７０−０２５）で、ＨＴ−２９に関しては１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，  １０２７０−１０６）及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，  ２５０３０−０２４）を含むＭｃ  Ｃｏｙ’ｓ  ５Ａ  メディウム（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ２６６００−０２３）で培養した。各プレートの縁のウェルは、１
００μＬ  ｍｅｄｉｕｍで満たした。
細胞を３日間培養し、抗体−薬物コンジュゲート処理前に９５μＬの新鮮な培地に交換
した。
抗体−薬物コンジュゲート（３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０）、そして抗体−薬
物コンジュゲート（１３）を使用し、通常の細胞増殖を測定するために無処理群をコント
ロールとして置いた。
２０倍濃度に濃縮した抗体−薬物コンジュゲート５μＬを、９６ウェルプレートの各ウ
ェルに入っている９５μＬの培養メディウム（１０％  ＦＢＳ）に添加することで最終濃
度とした。コントロールのウェルには５μＬの培地のみを添加した。１サンプルあたりＴ
ｒｉｐｌｉｃａｔｅで実施した。
細胞の増殖・生存を５０％低下させる抗体−薬物コンジュゲートの濃度を算出するため
、抗体−薬物コンジュゲートの濃度は、４倍希釈で作成し（１０μｇ／ｍＬから０．１５
ｎｇ／ｍＬ、又は４０μｇ／ｍＬ〜０．１５ｎｇ／ｍＬ）、細胞を処理して、無処理群と
ＡＴＰ活性を比較した。抗体−薬物コンジュゲートを加えた後、ＨＴ−２９に関しては５
日間、ＨＣＣ−１５６９とＭＤＡ−ＭＢ−４５３に関しては７日間の培養で評価した。抗
体−薬物コンジュゲートの活性を評価するため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標
）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを利用した。こ
れは、代謝活性のある生細胞をＡＴＰ活性を基準に測定し、最終的に生細胞数を見積もる
方法で、キットとしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｃｅｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７３）を使用した。
１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔを９６穴ウェル
プレートの各ウェルに加え、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａ
ｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｐｒｏｇｒａｍ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，測定時間０．５
ｓ）で測定する前に２５分から６５分間暗室室温で保存した。細胞は播種せずに培養液の
みを含むウェルを、ブランクとして測定した。ＡＴＰ活性の低下を測定するため、各条件
３ウェルずつの平均発光値を算出した（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０）。
細胞非依存的なシグナルを除去するために、ブランク平均発光値を、抗体−薬物コンジュ
ゲート処理した細胞の平均発光値から差し引いた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２
０１０）。発光低下率（％）は、無処理群の細胞と比較することで算出し（Ｍｉｃｒｏｓ
ｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０）、この値を細胞増殖・生存阻害率（％）として解釈した
。
浮遊細胞の処理
Ａ３７５とＡ５４９は他の細胞株よりも増殖速度が速いため、非接着の３Ｄ培養系にて
増殖測定を実施した。
癌細胞株は低密度で（Ａ３７５は５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、Ａ５４９は１５００ｃ
ｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で７５μＬの各メディウムに懸濁し、９６丸底ウェル非接着３Ｄ培
養プレート（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ；Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔ
ｅ  Ｃｏ，  Ｌｔｄ．；ｏｒｄｅｒ  ｎｏ．  ＭＳ−９０９６Ｕ）に播種した。Ａ３７５
に関しては、１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０２７０−１０６）及び２ｍＭ
ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２５０３０−０２４）を含むＤＭＥＭメ
ディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４１９６５−０３９）で、Ａ５４９に関しては１０％
ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０２７０−１０６）及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎ
ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２５０３０−０２４）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２メディウム（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２１３３１−０２０）で培養した。各プレートの縁のウェルは、
１５０μＬ  ｍｅｄｉｕｍで満たした。細胞を３日間培養し、抗体−薬物コンジュゲート
添加前に６７．５又は７５μＬの新鮮な培地を添加して、最終用量を１４２．５μＬ又は
１５０μＬとした。抗体−薬物コンジュゲート（３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０
）、又は抗体−薬物コンジュゲート（１３）を使用し、通常の細胞増殖を測定するために
無処理群をコントロールとして置いた。
２０倍濃度に濃縮した抗体−薬物コンジュゲート７．５又は８μＬを、９６ウェルプレ
ートの各ウェルに入っている１４２．５又は１５０μＬの培養メディウム（１０％  ＦＢ
Ｓ）に添加することで最終濃度とし、最終用量は１５０μＬ又は１５８μＬとした。コン
トロールにはメディウムのみを７．５又は８μＬを添加した。１サンプルあたりＴｒｉｐ
ｌｉｃａｔｅで実施した。
細胞の増殖・生存を５０％低下させる抗体−薬物コンジュゲートの濃度を算出するため
、抗体−薬物コンジュゲートの濃度は、４倍希釈で作成し（１０μｇ／ｍＬから０．１５
ｎｇ／ｍＬ、又は４０μｇ／ｍＬ〜０．１５ｎｇ／ｍＬ）、細胞を処理し、無処理群とＡ
ＴＰ活性を比較した。抗体−薬物コンジュゲートを加えた後、７日間の培養で評価した。
抗体−薬物コンジュゲートの活性を評価するため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商
標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを利用した。
これは、代謝活性のある生細胞をＡＴＰ活性を基準に測定し、最終的に生細胞数を見積も
る方法で、キットとしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｔ  Ｃｅｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７３）を使用した。
測定前に５０μＬのメディウムを各ウェルから除去し、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅ
ｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔを９６穴ウェルプレートの各ウェルに加え、Ｗａ
ｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（プログ
ラム：ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，測定時間０．５秒）で測定する前に３０分から５５分
間暗室室温で保存した。測定前に各ウェルの１８０μＬを採取し、測定可能な９６マイク
ロウェルオプティカルボトム白色プレートに移し変えた。細胞は播種せずに培養液のみを
含むウェルを、ブランクとして測定した。細胞の増殖・生存を５０％阻害する抗体−薬物
コンジュゲートの濃度算出方法に関しては、接着細胞の評価法に記載した。
【０２７５】
ヒト乳癌株ＨＣＣ１５６９及びＭＤＡ−ＭＢ４５３での結果をそれぞれ図６及び図７に
示す。また、ヒトメラノーマ株Ａ３７５の結果を図８に、ヒト大腸癌株ＨＴ２９の結果を
図９に、ヒト肺癌株Ａ５４９の結果を図１０に示す。Ａ：１０％  ＦＢＳ存在下での抗体
−薬物コンジュゲート由来の細胞増殖・生存を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性とな
る発光値を示し、横軸は各抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。データはトリプリケ
ートの平均±標準誤差を示す。Ｂ：無処理群を１００％とした場合の抗体−薬物コンジュ
ゲート処理による発光低下率を示す。
【０２７６】
１０％  ＦＢＳ存在下で、三種類の抗体−薬物コンジュゲートを様々なヒト癌細胞株に
添加して、２Ｄ又は３Ｄでのin vitro増殖を評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登
録商標）によるＡＴＰ活性の測定から、無処理及び抗体−薬物コンジュゲートによる細胞
の増殖・成長阻害率を算出した。ＡＴＰ活性の評価から、抗体−薬物コンジュゲートは２
種類の乳癌細胞株（ＨＣＣ−１５６９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）及び一種類のヒトメラノ
ーマ株Ａ３７５の細胞増殖・生存を強く阻害した。
抗体−薬物コンジュゲートを添加し７日間培養（１０％ＦＢＳ存在下）することで、Ｈ
ＣＣ１５６９では５５から７５％、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３では６０−８３％、Ａ３７５で
は６０から７０％ＡＴＰ活性が低下した。ヒト乳癌株及びヒトメラノーマ株と比較して、
ヒト大腸癌株ＨＴ−２９とヒト肺癌株Ａ５４９では抗体−薬物コンジュゲートによる細胞
増殖・生存の阻害活性は強くなかった。ＨＣＣ−１５６９及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３にお
いて、抗体−薬物コンジュゲート（１０）が強い阻害活性を示し、抗体−薬物コンジュゲ
ート（３）の阻害活性ともin vitroでは大差なかった。対して、双方のヒト乳癌株では、
抗体−薬物コンジュゲート（１３）は低い活性を示し、抗体−薬物コンジュゲート（３）
や抗体−薬物コンジュゲート（１０）が１ｎＭ以下で阻害できる細胞増殖・生存の５０％
阻害を達成するには、抗体−薬物コンジュゲート（１３）は１５ｎＭの濃度を必要とした
。ヒト乳癌株に対してヒトメラノーマ株では、抗体−薬物コンジュゲート（１３）の活性
は、抗体−薬物コンジュゲート（３）や抗体−薬物コンジュゲート（１０）と同等であっ
た。
全ての抗体−薬物コンジュゲートは６１から６８％程の最大阻害率を支援し、ＡＴＰ活
性５０％阻害に抗体−薬物コンジュゲートは１から４ｎＭの濃度で達成した。
上記に加えて、抗体−薬物コンジュゲート（１３）によるヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ
−８への細胞増殖・生存阻害活性もin vitroにて確認している（データ示さず）。
【０２７７】
試験例５  ヒト癌細胞株のin vitro細胞増殖・生存における抗体−薬物コンジュゲートの
ドラッグロード数（高、中）による阻害率の比較
方法：
異なるドラッグローディング数を持つ抗体−薬物コンジュゲートのin vitroの細胞増殖
・生存の阻害活性を評価した。高ドラッグローディングとは５から７個、中ドラッグロー
ディングとは約３個の薬剤が抗体にコンジュゲートされている状態を示す。１抗体にコン
ジュゲートされた薬剤の平均個数をＵＶ法（本発明の他の部分に記載）によって測定した
。
【０２７８】
１個の抗体にコンジュゲートされた薬剤の平均個数：
高ドラッグローディング  〈ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ〉
抗体−薬物コンジュゲート（３）：  ４．９個
抗体−薬物コンジュゲート（１０）：  ６．２個
抗体−薬物コンジュゲート（１３）：  ６．２個
中ドラッグローディング〈ＭＤＬ：Ｍｉｄｄｌｅ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ〉
抗体−薬物コンジュゲート（４）：  ２．９個
抗体−薬物コンジュゲート（１１）：  ３．０個
抗体−薬物コンジュゲート（１４）：  ２．５個
【０２７９】
ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートによる増殖・生存シグナルの阻害活性は、１０％  
ＦＢＳ存在下で測定した。細胞の増殖及び成長は、非処理及び抗体−薬物コンジュゲート
処理群のａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）活性を測定すること
で評価した。癌細胞株は低密度で（ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３
（ＣＬＢ−２２））は７５０ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で１００μＬの各メディウムに懸濁
し、９６マイクロウェルオプティカルボトム白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ，＃１６５３０６）に播種した。１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，１０２７０−１０６）及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
２５０３０−０２４）を含むＲＰＭＩ１６４０メディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，３１
８７０−０２５）で培養した。各プレートの縁のウェルは、１００μＬ  ｍｅｄｉｕｍで
満たした。
細胞を３日間培養し、抗体−薬物コンジュゲート添加前に９５μＬの新鮮な培地に交換
した。抗体−薬物コンジュゲート（３）、抗体−薬物コンジュゲート（１０）、抗体−薬
物コンジュゲート（１３）、抗体−薬物コンジュゲート（４）、抗体−薬物コンジュゲー
ト（１１）、又は抗体−薬物コンジュゲート（１４）を使用し、通常の細胞増殖を測定す
るために無処理群をコントロールとして置いた。
２０倍濃度に濃縮した抗体−薬物コンジュゲート５μＬを、９６ウェルプレートの各ウ
ェルに入っている９５μＬの培養メディウム（１０％  ＦＢＳ）に添加することで最終濃
度とした。コントロールのウェルには５μｌメディウムのみを添加した。１サンプルあた
りＴｒｉｐｌｉｃａｔｅで実施した。細胞の増殖・生存を５０％低下させる抗体−薬物コ
ンジュゲートの濃度を算出するため、抗体−薬物コンジュゲートの濃度は、４倍希釈で作
成し（１０μｇ／ｍＬから０．１５ｎｇ／ｍＬ）、細胞を処理し、無処理群とＡＴＰ活性
を比較した。抗体−薬物コンジュゲートを加えた後、７日間の培養で評価した。抗体−薬
物コンジュゲートの活性を評価するため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを利用した。これは、
代謝活性のある生細胞をＡＴＰ活性を基準に測定し、最終的に生細胞数を見積もる方法で
、キットとしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅ
ｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７３）を使用した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇ
ｌｏ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔを９６穴ウェルプレートの各ウェルに加え、Ｗａｌｌａ
ｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（プログラム：
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、測定時間：０．５秒）で測定する前に、２５分から５５分間
暗室室温で保存した。細胞は播種せずに培養液のみを含むウェルを、ブランクとして測定
した。ＡＴＰ活性の低下を測定するため、各条件３ウェルずつの平均発光値を算出した（
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０）。細胞非依存的なシグナルを除去するため
に、ブランク平均発光値を、抗体−薬物コンジュゲート処理した細胞の平均発光値から差
し引いた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０）。発光低下率（％）は、無処理
群の細胞と比較することで算出し（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０）、この
値を細胞増殖・生存阻害率（％）として解釈した。
【０２８０】
結果を図１１〜１３に示す。図１１は、抗体−薬物コンジュゲート（３）と抗体−薬物
コンジュゲート（４）の比較、図１２は、抗体−薬物コンジュゲート（１０）と抗体−薬
物コンジュゲート（１１）の比較、図１３は、抗体−薬物コンジュゲート（１３）と抗体
−薬物コンジュゲート（１４）の比較の結果を示す。各図において、左図は、３回実施し
た試験の１回における、１０％  ＦＢＳ存在下での抗体−薬物コンジュゲート由来の細胞
増殖・生存阻害率を示す。縦軸は各サンプルのＡＴＰ活性を示す発光を示し、横軸は各抗
体−薬物コンジュゲートの濃度を示す。右図は、無処理群を１００％とした場合の抗体−
薬物コンジュゲート処理による発光低下率を高ドラッグローディング（ＨＤＬ）と中ドラ
ッグローディング（ＭＤＬ）で比較した。
【０２８１】
高ドラッグロード及び中ドラッグロードの抗体−薬物コンジュゲートは、ＭＤＡ−ＭＢ
−４５３への処理及び７日間の培養により、細胞増殖・生存を阻害した。既に高ドラッグ
ロードの結果で示しているが、中ドラッグロードの抗体−薬物コンジュゲート（１１）が
、抗体−薬物コンジュゲート（４）と同じ程の高い活性を示した。ドラッグロード数での
比較では、高ドラッグロード数の抗体−薬物コンジュゲートが、中ドラッグロードのもの
より高いＡＴＰ低下を示した。高ドラッグロード数の、抗体−薬物コンジュゲート（３）
は６８％、抗体−薬物コンジュゲート（１０）は７６％、抗体−薬物コンジュゲート（１
３）は５６％の阻害率を１０μｇ／ｍＬの濃度にて示したが、同濃度において中ドラッグ
ロード数の抗体−薬物コンジュゲート（４）は４４％、抗体−薬物コンジュゲート（１１
）は４７％、抗体−薬物コンジュゲート（１４）は２７％の阻害率しか示さなかった。癌
細胞の増殖・生存の５０％阻害濃度から、高ドラッグロード数の抗体−薬物コンジュゲー
トが、中ドラッグロード数の抗体−薬物コンジュゲートよりも優れていた。高ドラッグロ
ード数の抗体−薬物コンジュゲート（３）又は抗体−薬物コンジュゲート（１０）がＡＴ
Ｐ活性値を５０％低下させるために１５ｎｇ／ｍＬ（１ｎＭ）の抗体−薬物コンジュゲー
トを必要とし、抗体−ドラッグコンジュゲート（１３）は少なくとも試験した最高濃度で
５０％低下させたが、中ドラッグロード数の抗体−薬物コンジュゲートは評価濃度範囲内
１０００ｎｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）以下では、これに相当するＡＴＰ活性低下は観察されな
かった。In vitroの高ドラッグロード数と中ドラッグロード数の比較から、in vivoでも
抗体−薬物コンジュゲートの癌細胞の増殖に対する阻害活性は、高ドラッグロード数が優
れていることが示唆された。
【０２８２】
試験例６  抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、（１３）はヒト乳癌抗腫瘍in v
ivo試験において抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１５から２０ｇの５週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスを使用した。
マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温及び湿度が一定に保たれた。
無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動を記録した。ＡＴＣＣ由来
のヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１５６９（ＣＲＬ−２３３０）５×１０6個を、５０μＬのＰＢ
ＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃Ｈ２１−００２，  Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＢＤ
＃３５４２３０）を１対１で混合した調整液に懸濁し、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの右
体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。
体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。腫
瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（ｍａｕａｌ  ｃａｌｉｐｅｒ，ＯＭＣ  
Ｆｏｎｔａｎａ）で１週間に２回測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下
に示す通り（以下の試験例においても同様）。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１９で腫瘍径が約１５０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて７０匹の動物
を無作為に７群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０
）、（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２８３】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１０）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０２８４】
全てのデータは、±ＳＥＭの平均値として示し、腫瘍径及び体重はＭｅａｎ±ＳＥＭに
て評価した。全てのデータ解析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００９を用いた（
以下の試験例においても同様）。
【０２８５】
結果を図１４に示す。許容される最大腫瘍径を超えた為に、ＰＢＳ投与群は、移植後５
３日目に安楽死させた。全ての抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較
して、ヒト乳癌細胞株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、処置群で観
察されなかった。
【０２８６】
試験例７  抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、（１３）はヒトメラノーマ抗腫
瘍試験において抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が２２から２６ｇで５から６週齢の雌性ＮＭＲＩヌードマウスを使用した
。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温及び湿度が一定に保たれた
。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒトメラノーマ細胞株ＨＴ−１４４（ＨＴＢ−６３）５×１０6個を、
５０μＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃Ｈ２１−００２，Ｍａｔｒｉ
ｇｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３０）を１対１で混合した調整液に懸濁し、ＮＭＲＩヌードマ
ウスの右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。
体重、腫瘍径の測定と、腫瘍体積の測定、算出は試験例６記載の方法により行った。
Ｄａｙ２２で腫瘍径が約１５０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて８０匹の動物
を無作為に８群への群分けを実施した。同日、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート
（３）、（１０）、（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２８７】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：Ｕ１−５９、２５ｍｇ／ｋｇで、週２回皮下注射。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１０）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０２８８】
結果を図１５に示す。許容される最大腫瘍径を超えた為に、ＰＢＳ及びＵ１−５９投与
群は、それぞれ移植後４８日目、５２日目に安楽死させた。全ての抗体−薬物コンジュゲ
ートの投与において、対照群及びＵ１−５９投与群と比較して、ヒトメラノーマ細胞株の
腫瘍増殖抑制を観察した。
【０２８９】
試験例８  抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、（１３）はヒト乳癌株抗腫瘍試
験において抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１７−から２５．５ｇで１６週齢の雌性ＳＣＩＤヌードマウスを使用し
た。マウスは換気ケージで室温及び湿度が一定に保たれた。
ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＬＢ−２２）の固形腫瘍は、
継代１回目（Ｂａｔｃｈ  １０８９）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３を３匹のマウスに移植（１
匹に対して２箇所、右体側部と左体側部）して１３から１７週後に腫瘍片を回収し、凍結
保存した。継代２回目は継代１回目の腫瘍片（２×２×２ｍｍ）をさらに皮下移植（１０
匹、１匹に対して２箇所で右体側部と左体側部）して増殖させて７週間腫瘍を形成させた
。ここで形成した腫瘍を腫瘍片（２×２×２ｍｍ、継代２回目）にして、ＳＣＩＤヌード
マウスの右体側部に移植した。
体重は体重計により計測した。腫瘍の長径（ｌｅｎｇｔｈ）及び直径（ｄｉａｍｅｔｅ
ｒ）を電子式デジタルキャリパー（Ｐｒｏ−Ｍａｘ  １５０  ｍｍ  ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ
ｃａｌｉｐｅｒｓ、Ｆｒｅｄ  Ｖ．  Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ）で測定し、腫
瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示す通り。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝π／６×長径（ｍｍ）×［直径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ４０で腫瘍径が約１４３ｍｍ3になったところで、７２匹の動物を無作為に８群
への群分けを実施した。同日、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０
）、（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２９０】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：Ｕ１−５９、２５ｍｇ／ｋｇで、週２回皮下注射。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１０）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０２９１】
結果を図１６に示す。全ての抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群及びＵ
１−５９投与群と比較して、ヒト乳癌細胞株の腫瘍増殖抑制を観察した。また、マウスの
体重減少は、処置群で観察されなかった。また、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４又はＪＩ
ＭＴ１−ＰＲ１０（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ耐性、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ耐性、Ｔ−ＤＭ
１耐性）を用いた抗腫瘍試験において、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はｉｎ  ｖ
ｉｖｏ抗腫瘍効果を示した。
【０２９２】
試験例９  抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、（１３）はヒト大腸癌株抗腫瘍
試験において抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１５から２０ｇで５から６週齢の雌性ＮＭＲＩヌードマウスを使用した
。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温及び湿度が一定に保たれた
。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動を記録した。
ＰｒｏＱｉｎａｓｅ由来のヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＣＰＱ−５７）４×１０6個
を、ＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃Ｈ２１−００２，Ｍａｔｒｉｇｅｌ
：ＢＤ  ＃３５４２３０）を１対１で混合した調整液に懸濁し、ＮＭＲＩヌードマウスの
右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。
体重、腫瘍径の測定と、腫瘍体積の測定、算出は試験例６記載の方法により行った。
Ｄａｙ８で腫瘍径が約１５０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて７０匹の動物を
無作為に７群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）
、（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２９３】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１０）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０２９４】
結果を図１７に示す。許容される最大腫瘍径を超えた、又は潰瘍形成の為に、ＰＢＳ投
与群（１０匹中６匹）、抗体―薬物コンジュゲート（３）の３ｍｇ／ｋｇ（１０匹中３匹
）、１０ｍｇ／ｋｇ（１０匹中４匹）、抗体―薬物コンジュゲート（１０）の３ｍｇ／ｋ
ｇ（１０匹中２匹）、１０ｍｇ／ｋｇ（１０匹中２匹）、抗体―薬物コンジュゲート（１
３）の３ｍｇ／ｋｇ（１０匹中２匹）を、移植後５０日目に安楽死させた。全ての抗体−
薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較して、ヒト大腸癌細胞株の腫瘍増殖抑
制を観察した。また抗体−薬物コンジュゲート（１３）は、抗体−薬物コンジュゲート（
３）や抗体−薬物コンジュゲート（１０）よりも強い抗腫瘍活性を示した。またマウスの
体重減少は、処置群で観察されなかった。
【０２９５】
試験例１０  抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０）、（１３）はヒト肺癌株抗腫瘍
試験において抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が２４から２８ｇで５から６週齢の雌性ＣＤ１ヌードマウスを使用した。
マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温及び湿度が一定に保たれた。
無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動を記録した。
Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ由来のヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＣＲＳ−３００
１１４）５×１０6個を、２００μＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃
Ｈ２１−００２，Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３０）を１対１で混合した調整液
に懸濁し、ＣＤ１ヌードマウスの右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。
体重、腫瘍径の測定と、腫瘍体積の測定、算出は試験例６記載の方法により行った。
Ｄａｙ３８で腫瘍径が約２００ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて７０匹の動物
を無作為に７群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（３）、（１０
）、（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２９６】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１０）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、３又は１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０２９７】
結果を図１８に示す。全ての抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較
して、ヒト肺癌細胞株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、処置群で観
察されなかった。
【０２９８】
試験例１１  抗体−薬物コンジュゲート（１３）はヒトトリプルネガティブ乳癌株抗腫瘍
試験においてin vivoで抗腫瘍効果を示した
トリプルネガティブ乳癌とは、ホルモン受容体（エストロゲンレセプター及びプロゲス
テロンレセプター）を発現せず、またＨＥＲ２を発現しない乳癌を指す。これらの受容体
が発現していないことから、ホルモン治療（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ等）や抗ＨＥＲ２治療（
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、Ｐｅｒｔｕｚ
ｕｍａｂ）が利用できないため生存率が低い乳癌であり、現在でも臨床試験で多くの治療
剤が試されている。ヒトトリプルネガティブ乳癌株であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８にてＨＥ
Ｒ３の発現が確認されたため（データ示さず）、抗体−薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
を評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温及び
湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動を
記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＣＲＬ−２
３２２）５×１０6個を、２００μＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃
１００１０−０２３，Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３４）を１対１で混合した調
整液に懸濁し、ヌードマウスの右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植し移植した。体
重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏｙ
ｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示す通り。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ２０で腫瘍径が約１７０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて１８匹の動物
を無作為に３群への群分けを実施した。同日、Ｕ１−５９又は抗体−薬物コンジュゲート
（１３）及び対照群としてＰＢＳを下記の用量で尾静脈内投与した。
【０２９９】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：Ｕ１−５９、１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１３）、１０ｍｇ／ｋｇで、週１回静注。
【０３００】
結果を図１９に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群及びＵ１−５
９投与群と比較して、ヒトトリプルネガティブ乳癌株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマ
ウスの体重減少は、いずれの処置群でも観察されなかった。
【０３０１】
試験例１２  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒトルミナール乳癌株抗腫瘍試験に
おいてin vivo抗腫瘍効果を示した
ヒトルミナール乳癌とは、ホルモン受容体（エストロゲンレセプター）を発現し、ＨＥ
Ｒ２を発現しない乳癌を指す。これらの受容体が発現していないことから、抗ＨＥＲ２治
療（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、Ｐｅｒｔ
ｕｚｕｍａｂ）が利用できないため生存率が低い乳癌であり、現在でも臨床試験で多くの
治療剤が試されている。ヒトルミナール乳癌株であるＭＣＦ−７にてＨＥＲ３の発現が確
認されたため（データ示さず）、抗体−薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性を評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＡｔｈｙｍｉｃヌードマウスＮｕｄｅ
−Ｆｏｘｎ１nu（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケ
ージに最大４匹）で室温および湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置
きに測定し、毎日動物の行動を記録した。
ヒトルミナール乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＣＲＱ−＃３２７）５×１０6個を、２００μ
ＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃１００１０−０２３，Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３４）を１対１で混合した調整液に懸濁し、ヌードマウスの右体
側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄ
ｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１１で腫瘍径が約２５０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて２０匹の動物
を無作為に２群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）およ
び対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３０２】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
【０３０３】
結果を図２０に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較して、
ヒトルミナール乳癌株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、いずれの処
置群で観察されなかった。
【０３０４】
試験例１３  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒトメラノーマ株抗腫瘍試験におい
てin vivo抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＣＲＬ−１６７６）３×１０
6個を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ＃３５４２３４）に混合・懸濁し、ヌードマウスの右
体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅ
ｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１９で腫瘍径が約２２０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて８匹の動物を
無作為に２群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、およ
び対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３０５】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
【０３０６】
結果を図２１に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較してヒ
トメラノーマ株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で
観察されなかった。また他のヒトメラノーマ株Ｃ３２の抗腫瘍試験においても、抗体−薬
物コンジュゲート（１６ａ）はｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示した。
【０３０７】
試験例１４  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト卵巣癌株抗腫瘍試験においてin
vivo抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−８（ＨＴＢ−１６１）５×１０6個を、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ＃３５４２３４）に混合・懸濁し、ヌードマウスの右体側部に
、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｐ
Ｂ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ２１で腫瘍径が約１４０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて８匹の動物を
無作為に２群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、およ
び対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３０８】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
【０３０９】
結果を図２２に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較して、
ヒト卵巣癌株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で観
察されなかった。
【０３１０】
試験例１５  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト膀胱癌株抗腫瘍試験においてin
vivo抗腫瘍効果を示した
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト膀胱癌細胞株ＳＷ−７８０（ＣＲＬ−２１６９）８×１０6個を、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ＃３５４２３４）に混合・懸濁し、ヌードマウスの右体側部に
、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｐ
Ｂ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ７で腫瘍径が約１９０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて１０匹の動物を
無作為に２群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、およ
び対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３１１】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
【０３１２】
結果を図２３に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較して、
ヒト膀胱癌株の腫瘍増殖抑制を観察した。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で観
察されなかった。
【０３１３】
試験例１６  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト乳癌株抗腫瘍試験においてＨＥ
Ｒ３依存的なin vivo抗腫瘍効果を示した
ヒト乳癌株であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３はＨＥＲ３を発現しており、試験例８で記載さ
れているように抗体−薬物コンジュゲート（１３）に対して感受性である。しかしこの薬
効がＨＥＲ３を介したものかは証明できていなかった為、Ｕ１−５９を事前投与すること
でＨＥＲ３をカバーし、薬効が低下するか否かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＬＢ−２２）１×１０7個を
、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ＃３５４２３４）に混合・懸濁し、ヌードマウスの右体側部
に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  
ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１１で腫瘍径が約１３０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて１６匹の動物
を無作為に４群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、Ｕ
１−５９および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３１４】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：Ｕ１−５９、３０ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、３ｍｇ／ｋｇ、単回静注。
投与群：Ｕ１−５９を投与（単回静注）した３０分後に、抗体−薬物コンジュゲート（
１６ａ）、３ｍｇ／ｋｇで単回静注。
【０３１５】
結果を図２４に示す。抗体−薬物コンジュゲートの投与において、対照群と比較して、
ヒト乳癌株の腫瘍増殖抑制を観察したが、この腫瘍抑制効果はＵ１−５９の事前投与によ
り減弱した。以上のことから、抗体−薬物コンジュゲートによる腫瘍抑制効果はＨＥＲ３
を介している薬効であることが証明された。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で
観察されなかった。
【０３１６】
試験例１７  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト乳癌株抗腫瘍試験において、ト
ラスツズマブとのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍併用効果を示した
ヒトＨＥＲ２陽性乳癌の治療薬にはトラスツズマブが承認されている。しかしトラスツ
ズマブ耐性が知られており、耐性機構の一つにＰＩＫ３ＣＡの変異〈Ｈ１０４７Ｒ，  Ｈ
４２０Ｒ〉が関与していることが報告されている。本試験では、トラスツズマブ耐性であ
る乳癌株に対して、トラスツズマブと抗体−薬物コンジュゲートの併用に効果があるか否
かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＬＢ−２２，  ＰＩＫ３ＣＡ
Ｈ１０４７Ｒ変異）１×１０7個を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃１００１
０−０２３，Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３４）に混合・懸濁し、ヌードマウス
の右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏ
ｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１１で腫瘍径が約１３０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて１６匹の動物
を無作為に４群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、ト
ラスツズマブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３１７】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回静注。
投与群：トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍｇ／ｋｇで、単回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、３ｍｇ／ｋｇ、単回静注。
投与群：トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）を投与（単回静注）した３０分後に、抗体−薬
物コンジュゲート（１６ａ）、３ｍｇ／ｋｇで単回静注。
【０３１８】
結果を図２５に示す。トラスツズマブと抗体−薬物コンジュゲート投与において、各単
剤と比較して、ヒト乳癌株（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）における抗腫瘍併用効果を観
察した。以上から、抗体−薬物コンジュゲートの薬効ははトラスツズマブとの併用により
増強することが示された。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で観察されなかった
。また他のヒト乳癌株（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）のＨＣＣ１９５４の抗腫瘍試験に
おいても、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はトラスツズマブとのｉｎ  ｖｉｖｏ抗
腫瘍併用効果を示した。
【０３１９】
試験例１８  抗体−薬物コンジュゲート（１５）はヒト乳癌株抗腫瘍試験において、トラ
スツズマブとのin vivo抗腫瘍併用効果を示した
ヒトＨＥＲ２陽性乳癌の治療薬にはトラスツズマブが承認されている。しかしトラスツ
ズマブ耐性が知られており、耐性機構の一つにＰＩＫ３ＣＡの変異〈Ｈ１０４７Ｒ，  Ｈ
４２０Ｒ〉が関与していることが報告されている。本試験では、トラスツズマブ耐性であ
る乳癌株に対して、トラスツズマブと抗体−薬物コンジュゲートの併用に効果があるか否
かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１（ＡＣＣ−５８９  ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ４２
０Ｒ変異）５×１０6個を、ＰＢＳ（ＰＡＡ  ＃１００１０−０２３）に懸濁し、ヌード
マウスの右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ
Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１０で腫瘍径が約２００ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて２４匹の動物
を無作為に４群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１５）、トラ
スツズマブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３２０】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。  投与群：ト
ラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｍｇ／ｋｇで、週一回静注。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１５）、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回静注。
投与群：トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）を投与（週１回静注）した３０分後に、抗体−
薬物コンジュゲート（１５）、１０ｍｇ／ｋｇで週１回静注。
【０３２１】
結果を図２６に示す。トラスツズマブと抗体−薬物コンジュゲート投与において、各単
剤と比較して、ヒト乳癌株（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ４２０Ｒ）における抗腫瘍併用効果を観察
した。以上から、抗体−薬物コンジュゲートの薬効はトラスツズマブとの併用により増強
することが示された。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で観察されなかった。
【０３２２】
試験例１９  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト肺癌株抗腫瘍試験において、ゲ
フィチニブとのin vivo抗腫瘍併用効果を示した
ヒト肺癌の治療薬にはゲフィチニブが承認されている。本試験では、ゲフィチニブと抗
体−薬物コンジュゲートの併用に効果があるか否かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト肺癌細胞株ＰＣ−９（ＲＣＢ０４４６）３×１０6個を、ＰＢＳ（
ＰＡＡ  ＃１００１０−０２３）に懸濁し、ヌードマウスの右体側部に、２９Ｇ針を用い
て、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）に
より計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ１４で腫瘍径が約２７０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて１６匹の動物
を無作為に４群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、ゲ
フィチニブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与した。
【０３２３】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、週１回静注。
投与群：ゲフィチニブ（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、６ｍｇ／ｋｇで、日１回経口投
与。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回静注。
投与群：ゲフィチニブ（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）を投与（日１回経口投与）した３
０分後に、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで週１回静注。
【０３２４】
結果を図２７に示す。ゲフィチニブと抗体−薬物コンジュゲート投与において、各単剤
と比較して、ヒト肺癌株における抗腫瘍併用効果を観察した。以上から、抗体−薬物コン
ジュゲートの薬効はゲフィチニブとの併用により増強することが示された。またマウスの
体重減少は、いずれの処置群で観察されなかった。
【０３２５】
試験例２０  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒトトリプルネガティブ乳癌株抗腫
瘍試験において、セツキシマブおよびパニツムマブとのin vivo抗腫瘍併用効果を示した
ヒトトリプルネガティブ乳癌に対して、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブやパニツム
マブの臨床試験が実施されている。本試験では、セツキシマブやパニツムマブと抗体−薬
物コンジュゲートの併用に効果があるか否かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＣＲＬ−２
３２２）５×１０6個を、２００μＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＰＢＳ：ＰＡＡ  ＃
１００１０−０２３，Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＢＤ  ＃３５４２３４）を１対１で混合した調
整液に懸濁し、ヌードマウスの右体側部に、２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体
重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ２１で腫瘍径が約１６０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて３０匹の動物
を無作為に６群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、セ
ツキシマブ、パニツムマブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与
した。
【０３２６】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、１０ｍｇ／ｋ
ｇで、単回投与。
投与群：パニツムマブ（ＡＭＧＥＮ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回投与。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を投与（単回投
与）した３０分後に、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで単回投与
。
投与群：パニツムマブ（ＡＭＧＥＮ）を投与（単回投与）した３０分後に、抗体−薬物
コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで単回投与。
【０３２７】
結果を図２８に示す。セツキシマブ（Ａ）またはパニツムマブ（Ｂ）と抗体−薬物コン
ジュゲート投与において、各単剤と比較して、ヒトトリプルネガティブ乳癌株における抗
腫瘍併用効果を観察した。以上から、抗体−薬物コンジュゲートの薬効はセツキシマブま
たはパニツムマブとの併用により増強することが示された。またマウスの体重減少は、い
ずれの処置群で観察されなかった。また他のヒトトリプルネガティブ乳癌株MDA-MB-231を
用いても、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はセツキシマブまたはパニツムマブとの
併用により抗腫瘍併用効果を示した。
【０３２８】
試験例２１  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）はヒト頭頸部癌株抗腫瘍試験において
、セツキシマブおよびパニツムマブとのin vivo抗腫瘍併用効果を示した
ヒト頭頸部癌に対して抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブは承認されており、またパニ
ツムマブの臨床試験が実施されている。本試験では、セツキシマブやパニツムマブと抗体
−薬物コンジュゲートの併用に効果があるか否かを評価した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
ＡＴＣＣ由来のヒト頭頸部癌細胞株Ｆａｄｕ（ＨＴＢ−４３）４×１０6個を、２００
μＬのＰＢＳ（ＰＡＡ  ＃１００１０−０２３）に懸濁し、ヌードマウスの右体側部に、
２９Ｇ針を用いて、皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＰＢ
６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ６で腫瘍径が約３３０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて３０匹の動物を
無作為に６群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、セツ
キシマブ、パニツムマブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与し
た。
【０３２９】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、５ｍｇ／ｋｇ
で、単回投与。
投与群：パニツムマブ（ＡＭＧＥＮ）、５ｍｇ／ｋｇで、単回投与。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を投与（単回投
与）した３０分後に、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで単回投与
。
投与群：パニツムマブ（ＡＭＧＥＮ）を投与（単回投与）した３０分後に、抗体−薬物
コンジュゲート（１６ａ）１０ｍｇ／ｋｇで単回投与。
【０３３０】
結果を図２９に示す。セツキシマブ（Ａ）またはパニツムマブ（Ｂ）と抗体−薬物コン
ジュゲート投与において、各単剤と比較して、ヒト頭頸部癌株における抗腫瘍併用効果を
観察した。以上から、抗体−薬物コンジュゲートの薬効はセツキシマブまたはパニツムマ
ブとの併用により増強することが示された。またマウスの体重減少は、いずれの処置群で
観察されなかった。
【０３３１】
試験例２２  抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）は胃癌患者腫瘍の移植抗腫瘍試験にお
いて、セツキシマブおよびペルツツマブとのin vivo抗腫瘍併用効果を示した
ヒト胃癌に対して抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ、および抗ＨＥＲ２抗体のペルツ
ツマブの臨床試験が実施されている。本試験では、セツキシマブとペルツツマブと抗体−
薬物コンジュゲートの併用に効果があるか否かを評価した。また通常のヒト癌株を用いた
評価系でなく、患者由来の腫瘍をマウスに移植して抗腫瘍試験を行なうことで、患者の間
質を含んだ臨床に近い状態で評価を実施した。
馴化後の体重が１５から２０ｇで５−６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１［ｎｕ］
／ＣｒｌＣｒｌｊ〔Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ〕ヌードマウス（日本チャールス・
リバー社）を使用した。マウスは換気ケージ（ＩＶＣ、各ケージに最大４匹）で室温およ
び湿度が一定に保たれた。無作為化後にマウス体重を１日置きに測定し、毎日動物の行動
を記録した。
独立行政法人・医薬基盤研究所由来の胃癌患者由来腫瘍ＮＩＢＩＯ−Ｇ０１６を、ヌー
ドマウスの右体側部に皮下移植した。体重は体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｐ
Ｂ６０２−Ｌ）により計測した。
腫瘍の長径および短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ−１５ＣＸ、Ｍｉｔｓｕｔｏ
ｙｏ  Ｃｏｒｐ）で測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示すとおり
。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
Ｄａｙ５６で腫瘍径が約２２０ｍｍ3になったところで、腫瘍径を用いて３０匹の動物
を無作為に６群への群分けを実施した。同日、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、セ
ツキシマブ、ペルツツマブ、両剤の併用、および対照群としてＰＢＳを下記の用量で投与
した。
【０３３２】
投与群：ＰＢＳを、抗体−薬物コンジュゲートと同容量で、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、１０ｍｇ／ｋ
ｇで、単回投与
投与群：ペルツツマブ（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｍｇ／ｋｇで、単回投与。
投与群：抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与。
投与群：セツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を投与（単回投
与）した３０分後に、抗体−薬物コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで単回投与
。
投与群：ペルツツマブ（Ｒｏｃｈｅ）を投与（単回投与）した３０分後に、抗体−薬物
コンジュゲート（１６ａ）、１０ｍｇ／ｋｇで単回投与。
【０３３３】
結果を図３０に示す。セツキシマブ（Ａ）またはペルツツマブ（Ｂ）と抗体−薬物コン
ジュゲート投与において、各単剤と比較して、胃癌患者由来腫瘍モデルにおける抗腫瘍併
用効果を観察した。以上から、抗体−薬物コンジュゲートの薬効はセツキシマブまたはパ
ニツムマブとの併用により増強することが癌患者由来の腫瘍モデルにおいて示された。ま
たマウスの体重減少は、いずれの処置群で観察されなかった。また、ヒト膵臓癌細胞株Ｂ
ｘＰＣ３を用いた抗腫瘍試験においても、抗体−薬物コンジュゲート（１３）は、ＰＢＳ
投与の対象群もしくはＵ１−５９投与群と比較して強い抗腫瘍効果を示した。また、トラ
スツズマブおよびペルツツマブの併用への耐性又はトラスツズマブ・エムタンシンへの耐
性を獲得したＨＥＲ２陽性乳癌細胞株ＪＩＭＴ１を用いたin vivo抗腫瘍モデルでも、そ
の抗体−薬物コンジュゲートは強い抗腫瘍効果を示した。
【０３３４】
試験例２３  抗体−薬物コンジュゲートの非ヒト動物における安全性
本発明の抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート及びそれを含む医薬組成物は、疾患の治
療又は予防剤として安全性に優れている。例えば、抗体−薬物コンジュゲート（５）、（
１０）又は（１３）を３０ｍｇ／ｋｇまで、交差種であるラットに週１回の間隔で計２回
投与して最終投与後７日まで観察した結果、いずれの抗体−薬物コンジュゲートについて
も重篤な毒性所見は認められなかった。また、抗体−薬物コンジュゲート（５）、（１０
）又は（１３）を３０ｍｇ／ｋｇまで、交差種であるサルに単回投与して７日間観察した
結果、いずれの抗体−薬物コンジュゲートについても顕著な毒性所見は認められなかった
。
また、サルに複数回投与〈３週間間隔〉して観察した結果、いずれの抗体−薬物コンジ
ュゲートにおいても顕著な毒性所見は認められなかった。このように、本発明の抗体−薬
物コンジュゲートは、疾患の治療又は予防のための医薬組成物として優れた安全性を具備
している。
【配列表フリーテキスト】
【０３３５】
配列番号１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４６重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号３４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４６重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５．１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードす
る塩基配列
配列番号６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５．１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７．１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードす
る塩基配列
配列番号６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７．１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードす
る塩基配列
配列番号８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードす
る塩基配列
配列番号８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号８６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号８８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号９０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号９２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号９４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号９６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基
配列
配列番号９８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１００：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１０２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１０４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１０６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１０８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１３４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号１８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１８６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１８８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１９０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１９２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１９４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１９６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号１９８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２００：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２０２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩
基配列
配列番号２０４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２０６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２０８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする
塩基配列
配列番号２３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３３：プライマー
配列番号２３４：プライマー
配列番号２３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−７軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−８軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２８５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２８６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２８７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２８８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−９軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２８９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２９０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２９１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２９２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２９３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２９４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１０軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２９５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２９６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２９７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２９８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２９９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３００：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３０１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３０２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３０３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３０４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３０５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３０６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３０７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３０８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３０９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１４軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１６軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３３３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３３４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１７軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１８軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−１９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２０軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２４軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３８５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３８６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３８７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２６軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３８８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３８９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３９０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３９１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３９２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３９３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２７軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３９４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３９５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３９６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３９７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３９８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３９９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２８軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４００：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４０１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４０２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４０３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４０４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４０５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−２９軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４０６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４０７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４０８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４０９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３０軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４３３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４３４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３４軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３６軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３７軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３８軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−３９軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４０軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４８５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４８６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４８７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４８８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４８９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４９０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４９１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４９２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４９３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４９４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号４９５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４４軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号４９６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４９７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４９８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４９９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５００：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５０１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５０２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４６重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５０３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４６重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５０４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４６重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５０５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５０６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５０７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５０８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５０９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５１０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４７軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５１１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５１２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５１３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５１４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５１５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５１６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５１７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５１８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５１９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−４９軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５２０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５２１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５２２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５２３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５２４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５２５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５０軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５２６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５２７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５２８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５２９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５３０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５３１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５３２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５３３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５３４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５３５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５３６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５３７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５３８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５３９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５４０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５４１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５４２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５４３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５３軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５４４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５．１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５４５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５．１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５４６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５．１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５４７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５４８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５４９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５５軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５５０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７．１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５５１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７．１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５５２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７．１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５５３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５５４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５５５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５７重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５５６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５５７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５５８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５５９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５６０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５６１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５８軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５６２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５６３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５６４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５６５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５６６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５６７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５６８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５６９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５７０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５７１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５７２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５７３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１．１軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５７４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５７５：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５７６：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６１重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５７７：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号５７８：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号５７９：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号５８０：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号５８１：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５８２：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−６２軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５８３：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９重鎖の全長アミノ酸配列
配列番号５８４：抗ＨＥＲ３ヒト抗体Ｕ１−５９軽鎖の全長アミノ酸配列             
【図１】
2020143114.tif 000093
【図２】
2020143114.tif 000094
【図３】
2020143114.tif 000095
【図４】
2020143114.tif 000096
【図５】
2020143114.tif 000097
【図６】
2020143114.tif 000098
【図７】
2020143114.tif 000099
【図８】
2020143114.tif 000100
【図９】
2020143114.tif 000101
【図１０】
2020143114.tif 000102
【図１１】
2020143114.tif 000103
【図１２】
2020143114.tif 000104
【図１３】
2020143114.tif 000105
【図１４】
2020143114.tif 000106
【図１５】
2020143114.tif 000107
【図１６】
2020143114.tif 000108
【図１７】
2020143114.tif 000109
【図１８】
2020143114.tif 000110
【図１９】
2020143114.tif 000111
【図２０】
2020143114.tif 000112
【図２１】
2020143114.tif 000113
【図２２】
2020143114.tif 000114
【図２３】
2020143114.tif 000115
【図２４】
2020143114.tif 000116
【図２５】
2020143114.tif 000117
【図２６】
2020143114.tif 000118
【図２７】
2020143114.tif 000119
【図２８】
2020143114.tif 000120
【図２９】
2020143114.tif 000121
【図３０】
2020143114.tif 000122
【配列表】
2020143114000001.app