(57)【要約】      （修正有）【課題】マイタンシノールのアミノ酸エステルの調製方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるマイタンシノールのアミノ酸エステルを調製する方法であって、マイタンシノールを乾燥剤の存在下でアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）と反応させることによって該化合物を調製する方法が開示される。該方法において、マイタンシノールと、アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物との反応完了後に求核試薬を反応混合物に加える、改善された方法もまた開示される。2020180150.tif 000061【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式：
【化１】
2020180150.tif 000036
（式中、Ｒ１は水素、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基、又はアミノ酸側鎖であり、但し、前記アミノ酸側鎖が反応性官能基を有する場合には前記反応性官能基は保護されていてもよく；
Ｒ２は水素又は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基である）で表される化合物を調製する方法であって、
マイタンシノールとＮ−カルボキシ無水物とを、塩基及び乾燥剤を追加して含ませた反応混合物において反応させ、それによって前記式（Ｉ）の化合物を形成するステップを含み、
前記Ｎ−カルボキシ無水物は次の式：
【化２】
2020180150.tif 000037
で表されるものである、方法。
【請求項２】
前記式（Ｉ）の化合物は次の式：
【化３】
2020180150.tif 000038
で表され、前記Ｎ−カルボキシ無水物は次の式：
【化４】
2020180150.tif 000039
で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応混合物はルイス酸をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ルイス酸は、亜鉛トリフレート、塩化亜鉛、臭化マグネシウム、マグネシウムトリフレート、銅トリフレート、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、及び塩化マグネシウムからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ルイス酸は亜鉛トリフレートである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
マイタンシノールと前記Ｎ−カルボキシ無水物の前記反応後の前記反応混合物を、炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は前記反応混合物を金属捕捉剤に接触させるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
次の式：
【化５】
2020180150.tif 000040
（式中、Ｒ１は水素、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基、又はアミノ酸側鎖であり、但し、前記アミノ酸側鎖が反応性官能基を有する場合には前記反応性官能基は保護されていてもよく；
Ｒ２は水素又は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基である）で表される化合物を調製する方法であって、
ａ）マイタンシノールとＮ−カルボキシ無水物とを、塩基を追加して含ませた反応混合物において反応させ、それによって前記式（Ｉ）の化合物を形成するステップを含み、前記Ｎ−カルボキシ無水物は次の式：
【化６】
2020180150.tif 000041
で表されるものであり、
ｂ）ステップａ）の反応混合物の未反応Ｎ−カルボキシ無水物を求核試薬と反応させるステップを含む、
方法。
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物は、次の式：
【化７】
2020180150.tif 000042
で表され、前記Ｎ−カルボキシ無水物は次の式：
【化８】
2020180150.tif 000043
で表される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）の前記反応混合物はルイス酸をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ルイス酸は、亜鉛トリフレート、塩化亜鉛、臭化マグネシウム、マグネシウムトリフレート、銅トリフレート、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、及び塩化マグネシウムからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ルイス酸は亜鉛トリフレートである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）の反応混合物は乾燥剤をさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記求核試薬は水又はアルコールである、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記求核試薬はアルコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はｔｅｒｔ−ブタノールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、ステップｂ）の後の反応混合物を、炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は前記反応混合物を金属捕捉剤に接触させるステップをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記式（Ｉ）の化合物を縮合剤の存在下で、式Ｒ３ＣＯＯＨを有するカルボン酸と反応
させるか、式Ｒ３ＣＯＸを有する活性カルボン酸と反応させて、次の式：
【化９】
2020180150.tif 000044
で表される化合物を形成するステップをさらに含み、
Ｒ３はアルキル基又は置換アルキル基であり、Ｘは脱離基である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘはハロゲン化物、アルコキシ基、アリールオキシ基、イミダゾール、ニトロ若しくは塩化物で置換されていてもよい−Ｓ−フェニル、又は−ＯＣＯＲであり、式中、Ｒは直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、環状Ｃ３〜Ｃ１０アルキル基、又はＣ１〜Ｃ１０アルケニル基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＯＸは反応性エステルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ３は−Ｙ−Ｓ−ＳＲ４であり、式中、ＹはＣ１〜Ｃ１０アルキレンであり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アリール、又はヘテロアリール（ピリジル）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
Ｙは−ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−であり、Ｒ４は−ＣＨ３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記式（ＩＩＩ）の化合物を還元剤と反応させて次の式：
【化１０】
2020180150.tif 000045
で表される化合物を形成するステップをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ３は−Ｌ−Ｅであり；Ｌは
【化１１】
2020180150.tif 000046
又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、又は
【化１２】
2020180150.tif 000047
であり；Ｅは
【化１３】
2020180150.tif 000048
又は
【化１４】
2020180150.tif 000049
又は
【化１５】
2020180150.tif 000050
又は
【化１６】
2020180150.tif 000051
であり、
Ｘ’はハロゲン化物であり；
ｎは２、３、４、５、又は６であり；
ｍは０又は１〜２０の整数であり；
ｑは０又は１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌは−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｎは５である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｌは
【化１７】
2020180150.tif 000052
である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ｎは４であり、ｍは３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ３は次
【化１８】
2020180150.tif 000053
【化１９】
2020180150.tif 000054
【化２０】
2020180150.tif 000055
【化２１】
2020180150.tif 000056
【化２２】
2020180150.tif 000057
【化２３】
2020180150.tif 000058
【化２４】
2020180150.tif 000059
及び
【化２５】
2020180150.tif 000060
の１つで表される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記縮合剤はカルボジイミド、ウロニウム、活性エステル、ホスホニウム、２−アルキル−１−アルキルカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、２−アルコキシ−１−アルコキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、又はクロロギ酸アルキルである、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記縮合剤はカルボジイミドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記縮合剤は塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１は天然のアミノ酸の側鎖であり、但し、前記側鎖が官能基を有する場合には前記官能基は保護されていてもよく；Ｒ２はメチルである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１はメチルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記塩基はトリアルキルアミン、金属アルコキシド、アルキル金属、アリール金属、金属水素化物、金属アミド、又はシリコン系アミドである、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記塩基はトリアルキルアミンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記トリアルキルアミンはジイソプロピルエチルアミンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記乾燥剤はモレキュラーシーブ、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、又は硫酸マグネシウムである、請求項１〜６及び１２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記乾燥剤は、モレキュラーシーブである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記乾燥剤は顆粒状ビーズ又は粉末の形態である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件への参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０１２年９月２６日出願の米国仮出願第６１／７０５，７３１号の出願日の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、マイタンシノイド及びその抗体複合体の合成において中間体を調製するための改善された方法である。
【背景技術】
【０００３】
マイタンシノイドは細胞傷害性の高い化合物であり、下に示すようなマイタンシノールや、マイタンシノールのＣ−３エステルがある（米国特許第４，１５１，０４２号）。
【０００４】
【化１】
2020180150.tif 000002
【０００５】
天然及び合成の、マイタンシノールのＣ−３エステルは２つの群に分類できる：（ａ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン又はＮ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体をもったＣ−３エステルである、マイタンシン（２）及びその類似体（例えばＤＭ１及びＤＭ４）（米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２６０，６０８号；第５，２０８，０２０号；及び、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１２：３４４１（１９８４））；（ｂ）単純なカルボン酸をもったＣ−３エステルであるアンサマイトシン（米国特許第４，２４８，８７０号；第４，２６５，８１４号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；及び第４，３３１，５９８号）。
【０００６】
マイタンシン（２）、その類似体、及び各アンサマイトシン種は、マイタンシノール（１）のエステル化によって調製できる、マイタンシノールのＣ３エステルである。米国特許第７，３０１，０１９号及び第７，５９８，３７５号は、下に示す通り、塩基の存在下、アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ、５）とともにマイタンシノール（１）をアシル化して、マイタンシノールのアミノ酸エステル（Ｍａｙ−ＡＡ、６）を形成する方法を記載する。
【０００７】
【化２】
2020180150.tif 000003
【０００８】
マイタンシノールのアミノ酸エステルは、カルボン酸に結合してマイタンシノイドをもたらすことができる貴重な中間体である。例えば下に示す通り、マイタンシノールと（４Ｓ）−３，４−ジメチル−２，５−オキサゾリジンジオン（５ａ）の反応は、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン（６ａ）を形成し、次に３−（メチルジチオ）プロピオン酸（７）に結合し、塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いてＤＭ１−ＳＭｅ（８）を形成することができる。
【０００９】
【化３】
2020180150.tif 000004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
マイタンシノールのアミノ酸エステルを形成するアシル化反応の大きな短所は、それが、余剰（Ｅｘｔｒａ）なＮ−メチル−アラニル成分（「余剰ＮＭＡ」（９）と称す）をＣ３側鎖に含む副生成物をも形成することである。Ｎ２’−デアセチル−マイタンシンがア
シル化されるとき、余剰ＮＭＡ（９）もまたアシル化され、余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅ（９ａ）を形成する。余剰ＮＭＡ（９）及び余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅ（９ａ）の構造を下に示す。
【００１１】
【化４】
2020180150.tif 000005
【００１２】
下に示す通り、還元によってＤＭ１（３）をＤＭ１−ＳＭｅ（８）から調製することができ、そうしてまた、余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅ（９ａ）を全て余剰ＮＭＡ−ＤＭ１（１０）に変換する。
【００１３】
【化５】
2020180150.tif 000006
【００１４】
余剰ＮＭＡ−ＤＭ１（１０）はＤＭ１（３）から除去することが困難であるが、これは、両者の化合物が似た極性を有し、精製したＤＭ１（３）のＨＰＬＣトレースにおいてピークのオーバーラップを見せることによる。ＤＭ１（３）とＤＭ４（４）は抗体複合体を調製するのに用いられており、そのいくつかは現在臨床治験にある。
【００１５】
したがって、かかるマイタンシノイドを調製する方法の収率と頑健性を改善し、その調製で用いる反応の間に形成される副生成物を最小にする必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
実施例１〜４に示す通り、現在、マイタンシノールとアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物との反応に乾燥剤を添加することがマイタンシノールのアミノ酸エステルの収率を実質的
に増加させるということが分かっている。また、実施例６〜８に示す通り、マイタンシノールとアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物との反応の後に続いて求核試薬を使う予備クエンチングステップを追加することが、余剰ＮＭＡなど望ましくない副生成物の形成を実質的に低減させるということも分かっている。これらの発見に基づいて、マイタンシノールのアミノ酸エステルを調製する改善された方法が本明細書に開示される。
【００１７】
本発明の第１の実施形態は、式（Ｉ）：
【００１８】
【化６】
2020180150.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基、又はアミノ酸側鎖であり、但し、アミノ酸側鎖が官能基を有する場合はその官能基は保護されていてもよく；Ｒ２は水素又は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキル基である）で表されるマイタンシノールのアミノ酸エステルを調製する方法である。
【００１９】
本方法はマイタンシノールとＮ−カルボキシ無水物とを、塩基及び乾燥剤を追加して含ませた反応混合物において反応させることを含む。Ｎ−カルボキシ無水物は次の式：
【００２０】
【化７】
2020180150.tif 000008
で表される。式（ＩＩ）の変数は全て式（Ｉ）において定義した通りである。
【００２１】
本発明の第２の実施形態は、式（Ｉ）で表されるマイタンシノールのアミノ酸エステルを調製する方法であって、ａ）マイタンシノールと、式（ＩＩ）で表されるＮ−カルボキシ無水物とを、塩基を追加して含ませた反応混合物において反応させることと；ｂ）ステップａ）で未反応であったＮ−カルボキシ無水物を求核試薬と反応させることと、を含む。式（Ｉ）及び（ＩＩ）の変数は全て本発明の第１の実施形態において定義した通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシンをカルボン酸と縮合剤でアシル化することを示す模式図である。
【図２】図２は、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシンをカルボン酸と縮合剤でアシル化することを示す模式図である。
【図３】図３は、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシンを活性化カルボン酸でアシル化することを示す模式図である。
【図４】図４は、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシンを活性化カルボン酸でアシル化することを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、マイタンシノールと、式（ＩＩ）で表されるＮ−カルボキシ無水物とから、式（Ｉ）で表されるアミノ酸エステルを調製する方法に関する。アミノ酸エステルは、さらにエステル化してＤＭ１、ＤＭ４等のマイタンシノイドを調製することができ、次いでマイタンシノイドの抗体複合体へとさらに生成させることができる。好ましくは、アミノ酸エステルは式（Ｉａ）で表され、Ｎ−カルボキシ無水物は式（ＩＩａ）で表される：
【００２４】
【化８】
2020180150.tif 000009
及び
【００２５】
【化９】
2020180150.tif 000010
式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）の変数は式（Ｉ）及び（ＩＩ）のところで記載した通りである。
【００２６】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、及び（ＩＩａ）の場合、好ましくは、Ｒ１は天然のアミノ酸の側鎖であり、但し、その側鎖が反応性官能基を有する場合にその官能基は保護されていてもよく；Ｒ２はメチルである。あるいは、Ｒ１はアルキルであり、Ｒ２はメチルである。より好ましくは、Ｒ１とＲ２の両方はメチルである。
【００２７】
本発明の第１の実施形態では、本方法はマイタンシノールと、式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）で表されるＮ−カルボキシ無水物とを、塩基及び乾燥剤を追加して含ませた反応混合物において反応させることを含む。
【００２８】
一好適実施形態では、反応混合物はルイス酸をさらに含む。好適ルイス酸は金属カチオンを含む。
【００２９】
別の好適実施形態では、まずマイタンシノールとＮ−カルボキシ無水物を反応させ、次いで反応混合物を炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は反応混合物を金属捕捉剤に接触させる。金属捕捉剤は当技術分野で既知のものを用いることができる（例えば“Ｔｈｅ  Ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｉｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｂｙ  Ａｕｂｒｅｙ  Ｍｅｎｄｏｃａ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ，２００８の第９章参照）。金属捕捉剤
の例としては、ポリマー系及びシリカ系金属捕捉剤（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＱｕａｄｒａＰｕｒｅ（商標）及びＱｕａｄｒａＳｉｌ（商標）、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅのＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭａｔｔｈｅｙのＳｍｏｐｅｘ（登録商標）、Ｂｉｏｔａｇｅの金属捕捉剤）、炭素系捕捉剤（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＱｕａｄｒａＰｕｒｅ（商標）Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
別の好適実施形態では、まずマイタンシノール及びＮ−カルボキシ無水物を反応させ、次いでルイス酸の金属カチオンを反応混合物から除去する。例えば、反応混合物を炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は反応混合物を金属捕捉剤に接触させるかすることによって、ルイス酸の金属カチオンを反応混合物から除去する。
【００３１】
第２の実施形態では、本方法は、ａ）マイタンシノールと、式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）で表されるＮ−カルボキシ無水物とを、塩基を追加して含ませた反応混合物において反応させることと；ｂ）ステップａ）で未反応であったＮ−カルボキシ無水物を求核試薬と反応させることと、を含む。
【００３２】
一好適実施形態では、ステップａ）の反応混合物はルイス酸をさらに含む。好適ルイス酸は金属カチオンを含む。
【００３３】
別の好適実施形態では、ステップｂ）の後の反応混合物を炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は金属捕捉剤に接触させる。
【００３４】
別の好適実施形態では、ステップｂ）を実施した後、即ち求核試薬を未反応Ｎ−カルボキシ無水物に反応させた後、ルイス酸の金属カチオンを反応混合物から除去する。例えば、反応混合物を炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液に接触させるか、又は反応混合物を金属捕捉剤に接触させることによって、ルイス酸の金属カチオンを反応混合物から除去する。
【００３５】
なおも別の好適実施形態では、ステップａ）の反応混合物は乾燥剤をさらに含む。
【００３６】
「塩基」という用語は、水素イオン（プロトン）を受け取ることができる物質、又は一対の価電子を与えることができる物質を指す。適例な塩基は、式（ＩＩ）で表されるＮ−カルボキシ無水物に対して非求核性・非反応性である。適切な塩基の例としては、トリアルキルアミン（例えば、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、及び１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン）、金属アルコキシド（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウム及びｔｅｒｔ−ブトキシドカリウム）、アルキル金属（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、メチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、リチウムジ−イソプロピルアミド、ペンチルナトリウム、及び２−フェニルイソプロピル−カリウム）、アリール金属（例えば、フェニルリチウム）、金属水素化物（例えば、水素化ナトリウム）、金属アミド（例えば、ナトリウムアミド、カリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド及びリチウムテトラメチルピペリジド）、及びシリコン系アミド（例えば、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド及びカリウムビス（トリメチルシリル）アミド）が挙げられる。好ましくは、塩基はトリアルキルアミンである。より好ましくは、塩基はジイソプロピルエチルアミンである。
【００３７】
「乾燥剤」という用語は水分を溶液から除去することができる剤を指す。適切な乾燥剤の例としては、モレキュラーシーブ、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、及び硫酸マグネシウムが挙げられるがこれらに限定されない。乾燥剤の物理的形態としては、顆粒状ビーズ又は粉末が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、乾燥剤
はモレキュラーシーブである。あるいは、乾燥剤は硫酸ナトリウムである。
【００３８】
「ルイス酸」という用語は、酸性物質であって、それ自体の原子の１つで安定な基を完成させるに当たって他の分子の孤立電子対を使うことのできる物質を指す。本開示の方法で用いられる適例なルイス酸としては、亜鉛トリフレート、塩化亜鉛、臭化マグネシウム、マグネシウムトリフレート、銅トリフレート、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、及び塩化マグネシウムが挙げられる。好ましくは、ルイス酸は亜鉛トリフレートである。
【００３９】
「求核試薬」という用語は、式（ＩＩ）で表されるＮ−カルボキシ無水物の正電荷中心と反応してＮ−カルボキシ無水物を分解する反応物を指す。適切な求核試薬の例としては、水、アルコール（メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はｔｅｒｔ−ブタノール）、及び一級又は二級アミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン等）が挙げられる。好ましくは、求核試薬はアルコールである。あるいは、求核試薬は水である。
【００４０】
式（Ｉ）で表されるマイタンシノールのアミノ酸エステルを調製するための適例な反応条件は下に記載する。具体的な条件は実施例で記載する。
【００４１】
Ｎ−カルボキシ無水物に対しては等モル量のマイタンシノールを用いることができるけれども、より一般的にはＮ−カルボキシ無水物を過剰に用いる。マイタンシノール対Ｎ−カルボキシ無水物の適例なモル比は、１：１〜１：１０、より一般的には１：２〜１：７又は１：１〜１：４の範囲である。一好適実施形態では、マイタンシノール対Ｎ−カルボキシ無水物のモル比は約１：５である。
【００４２】
本開示の方法では、ルイス酸を用いてもよい。その場合、典型的には、マイタンシノールに対して過剰に、例えば２０倍まで過剰に用いる。より一般的にはマイタンシノール対ルイス酸のモル比は１：５〜１：８、より好ましくは１：７の範囲である。より少ない量のルイス酸を用いることもできる。
【００４３】
反応溶媒から溶存水を除去するのに十分な量の乾燥剤を用いる。乾燥剤の量は決定的に重要なものではないが、但し、反応溶液を実質的に無水物にするものとする。乾燥剤は、反応容器の中に直接用いるか、又は容器中で焼結ガラス容器など半透性バリアに入れて用いることができる。
【００４４】
反応に要する時間は、高圧液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー等、但しこれらに限定されない技術を用いて、当業者に容易にモニターできる。典型的な反応は２４時間撹拌した後完了するが、反応温度や反応物の濃度など種々の要因によって、反応の実施はより遅くもより速くもなり得る。
【００４５】
反応は、−２０℃〜８０℃の間、好ましくは−１０℃〜６０℃の間、より好ましくは−１０℃〜４０℃の間、最も好ましくは０℃〜３５℃の間で実施できる。
【００４６】
適切な溶媒は当業者に容易に決定でき、無水ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）等の極性非プロトン性溶媒、ヘキサン、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン、ジオキサン等）、ジクロロメタン、又はその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
ルイス酸が反応混合物中に存在する場合、マイタンシノールとＮ−カルボキシ無水物の反応の後の反応混合物は、好ましくは、炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液か、金属捕捉剤と接触させる。好ましくは、反応混合物は、炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液か金属
捕捉剤と接触させる前に、求核試薬と反応させて過剰なＮ−カルボキシ無水物を分解する。
【００４８】
金属カチオンを含むルイス酸が反応混合物中に存在する場合、反応のワークアップ（ｗｏｒｋ−ｕｐ）の一部として、好ましくは金属カチオンを反応混合物から除去する。金属カチオンの除去は、反応混合物を炭酸水素又は炭酸を含有する水溶液か金属捕捉剤と接触させることによって達成することができる。好ましくは、金属カチオンの除去の前にＮ−カルボキシ無水物を求核試薬と反応させる。
【００４９】
ステップｂ）における求核試薬の量は、当業者に容易に決定できる。好ましくは、十分な量の求核試薬を用いて、未反応のＮ−カルボキシ無水物を分解する。これは、典型的には等モル量の求核試薬であるが、過剰な量の求核試薬を用いることもできる。典型的な反応は１時間撹拌した後完了するが、温度など種々の要因によって、反応の実施はより遅くもより速くもなり得る。
【００５０】
また、本発明の範囲内にはマイタンシノールのアミノ酸エステルをアシル化する方法も入る。本方法は、式（Ｉ）又は式（Ｉａ）で表されるマイタンシノールのアミノ酸エステルを上に記載した通りに調製したものを、式「Ｒ３ＣＯＯＨ」を有するカルボン酸に縮合剤の存在下で反応させるか、又は式「Ｒ３ＣＯＸ」を有する活性カルボン酸に反応させて、次の式の１つで表される化合物をそれぞれ形成することを含む：
【００５１】
【化１０】
2020180150.tif 000011
及び
【００５２】
【化１１】
2020180150.tif 000012
【００５３】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）において、Ｒ１及びＲ２は式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、及び（ＩＩａ）において定義した通りであり；Ｒ３はアルキル基又は置換アルキル基であり；Ｒ３ＣＯＸのＸは脱離基である。好ましくは、Ｘは、ハロゲン化物、アルコキシ
基、アリールオキシ基、イミダゾール、又は、フェニルがニトロ若しくは塩化物で置換されていてもよい−Ｓ−フェニル、又は、Ｒが直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、環状Ｃ３〜Ｃ１０アルキル基、若しくはＣ１〜Ｃ１０アルケニル基である−ＯＣＯＲである。一実施形態では、上に記載の式「Ｒ３ＣＯＸ」において−ＣＯＸは反応性エステル、例えば、置換されていてもよいＮ−サクシニミドエステルである。反応性エステルの例としては、Ｎ−サクシニミジル、Ｎ−スルホサクシニミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニル、及び３−カルボキシ−４−ニトロフェニルエステルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
好ましくは、Ｒ３は−Ｙ−Ｓ−ＳＲ４であり、ＹはＣ１〜Ｃ１０アルキレンであり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アリール、又はヘテロアリールである。別の代替形態では、Ｙは−ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−であり、Ｒ４はメチルである。
【００５５】
別の実施形態では、Ｒ３は−Ｌ−Ｅであり；Ｌは
【００５６】
【化１２】
2020180150.tif 000013
又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−又は
【００５７】
【化１３】
2020180150.tif 000014
であり；Ｅは
【００５８】
【化１４】
2020180150.tif 000015
又は
【００５９】
【化１５】
2020180150.tif 000016
又は
【００６０】
【化１６】
2020180150.tif 000017
又は
【００６１】
【化１７】
2020180150.tif 000018
であり；Ｘ’はハロゲン化物であり；ｎは１、２、３、４、５、又は６であり；ｍは０又は１〜２０の整数であり；ｑは０又は１である。あるいは、Ｌは−（ＣＨ２）ｎ−であり；ｎは上に定義した通りであるか又はｎは５である。別の代替形態では、Ｌは
【００６２】
【化１８】
2020180150.tif 000019
であり、ｎ及びｍは上に記載の通り；あるいは、ｎは４でｍは３である。
【００６３】
なおも別の代替形態では、Ｒ３は次の式：
【００６４】
【００６５】
【化１９】
2020180150.tif 000020
【００６６】
【化２０】
2020180150.tif 000021
【００６７】
【化２１】
2020180150.tif 000022
【００６８】
【化２２】
2020180150.tif 000023
【００６９】
【化２３】
2020180150.tif 000024
【００７０】
【化２４】
2020180150.tif 000025
【００７１】
【化２５】
2020180150.tif 000026
及び
【００７２】
【化２６】
2020180150.tif 000027
より選択される。
【００７３】
「縮合剤」という用語は、カルボン酸のヒドロキシル基と反応してそれを脱離基に変換し、アミン又はヒドロキシル基に置き換えることができる試薬を指す。適切な縮合剤の例としては、カルボジイミド（塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、ウロニウム、活性エステル、ホスホニウム、２−アルキル−１−アルキルカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（２−イソブトキシ−１−イソブトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、２−アルコキシ−１−アルコキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、又はクロロギ酸アルキル（クロロギ酸イソブチル）が挙げられる。好ましくは、縮合剤はカルボジイミドである。より好ましくは、塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドである。
【００７４】
「脱離基」という用語は、アミン等、求核試薬に容易に置き換わることのできる、荷電成分又は非荷電成分の基を指す。当技術分野で周知のかかる脱離基としては、ハロゲン化物、エステル、アルコキシ、ヒドロキシル、アルコキシ、トシレート、トリフレート、メ
シレート、ニトリル、アジド、イミダゾール、カルバミン酸、ジスルフィド、チオエステル、チオエーテル（即ち、−Ｓ−フェニルが置換されていてもよい）、及びジアゾニウム化合物が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、脱離基は、ハロゲン化物、アルコキシ基、アリールオキシ基、イミダゾール、又は、−ＮＯ２若しくはクロロで置換されていてもよい−Ｓ−フェニル、又は、Ｒが直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、環状Ｃ３〜Ｃ１０アルキル基、若しくはＣ１〜Ｃ１０アルケニル基である−ＯＣＯＲである。別の好適実施形態では、脱離基は、反応性エステル中の置換され得る成分（例えば、−ＣＯＸ）である。反応性エステルとしては、Ｎ−サクシニミジル、Ｎ−スルホサクシニミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニル、及び３−カルボキシ−４−ニトロフェニルエステルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７５】
本発明はまた、マイタンシノールのＣ３エステルを用いてその誘導体を調製する方法を含む。本方法は、上で調製した式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）で表されるマイタンシノールのＣ３エステルを還元剤と反応させて、次の式の１つで表される化合物を形成するステップを含む：
【００７６】
【化２７】
2020180150.tif 000028
及び
【００７７】
【化２８】
2020180150.tif 000029
【００７８】
式（ＩＶ）及び（ＩＶａ）において、Ｒ１及びＲ２は式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、及び（ＩＩａ）において定義した通りであり；Ｙは式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）において定義した通りである。
【００７９】
「還元剤」という用語は、ジスルフィド結合を硫化水素基に変換する、還元酸化反応の要素又は化合物を指す。適切な還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、（
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）、及びＮａＢＨ４が挙げられる。
【００８０】
Ｒ３が−ＬＥである場合の式（ＩＩＩ）若しくは（ＩＩＩａ）の化合物、又は式（ＩＶ）若しくは（ＩＶａ）の化合物は、抗体又は修飾抗体と反応して抗体−マイタンシノイド複合体を形成することができる。例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、第５，２０８，０２０号、及び第７，８１１，８７２号を参照のこと。あるいは、式（ＩＶ）又は（ＩＶａ）の化合物は二官能性クロスリンカーと反応してリンカー化合物を形成することが可能であり、このリンカー化合物は、抗体と反応して抗体−マイタンシノイド複合体を形成することのできる反応性基を保持する。例えば、米国特許第６，４４１，１６３号、米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９（Ａ１）号、及び米国特許出願公開第２００８／０１４５３７４号を参照のこと。
【００８１】
「アルキル」とは、本明細書で使用される場合、直鎖、分岐、又は環状アルキルを指す。
【００８２】
「直鎖又は分岐アルキル」とは、本明細書で使用される場合、炭素原子が１〜２０の飽和直鎖又は分岐鎖一価炭化水素ラジカルを指す。アルキルの例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、１−ヘプチル、１−オクチル等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、アルキルは１〜１０の炭素原子を有する。より好ましくは、アルキルは１〜４の炭素原子を有する。
【００８３】
「アルキレン」とは、本明細書で使用される場合、直鎖、分岐、又は環状アルキレンを指す。
【００８４】
「直鎖又は分岐アルキレン」とは、本明細書で使用される場合、炭素原子が１〜２０の飽和直鎖又は分岐鎖二価炭化水素ラジカルを指す。アルキルの例としては、メチレン、エチレン、１−プロピレン、２−プロピレン、１−ブチレン、２−メチル−１−プロピレン、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２−、２−ブチレン、２−メチル−２−プロピレン、１−ペンチレン、２−ペンチレン、３−ペンチレン、２−メチル−２−ブチレン、３−メチル−２−ブチレン、３−メチル−１−ブチレン、２−メチル−１−ブチレン、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２−、１−ヘキシル、２−ヘキシレン、３−ヘキシレン、２−メチル−２−ペンチレン、３−メチル−２−ペンチレン、４−メチル−２−ペンチレン、３−メチル−３−ペンチレン、２−メチル−３−ペンチレン、２，３−ジメチル−２−ブチレン、３，３−ジメチル−２−ブチレン、１−ヘプチレン、１−オクチレン等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、アルキレンは１〜１０の炭素原子を有する。より好ましくは、アルキレンは１〜４の炭素原子を有する。
【００８５】
「直鎖又は分岐アルケニル」とは、少なくとも１つの不飽和部位、即ち炭素−炭素二重結合をもった、炭素原子が２〜２０の直鎖又は分岐鎖一価炭化水素ラジカルを指し、アルケニルラジカルには、「シス」及び「トランス」配位、又は「Ｅ」及び「Ｚ」配位を有するラジカルも含める。例としては、エチレニル又はビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、アルケニルは２〜１０の炭素原子を有する。より好ましくは、アルケニルは２〜４の炭素原子を有
する。
【００８６】
「環状アルキル」とは一価の飽和炭素環ラジカルを指す。好ましくは、環状アルキルは三〜十員の単環ラジカルである。より好ましくは、環状アルキルはシクロヘキシルである。
【００８７】
「アリール」とは、１つの水素原子を親芳香族環系の単一炭素原子から除去することによって誘導される、炭素原子が６〜１８の一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。アリールには、飽和・部分的不飽和環に縮合した芳香族環、又は、芳香族炭素環若しくは芳香族複素環を含む二環式ラジカルも含める。典型的なアリール基としては、ベンゼン（フェニル）、置換ベンゼン（例えば、パラニトロフェニル、オルトニトロフェニル、及びジニトロフェニル）、ナフタレン、アントラセン、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等、これらから誘導されるラジカルが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、アリールは、置換されていてもよいフェニル（例えば、フェニル、フェノール、又は保護フェノール）である。
【００８８】
「ヘテロアリール」とは、五員環又は六員環の一価芳香族ラジカルを指し、窒素、酸素、及びイオウより互いに独立して選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含有する、５〜１８の原子の縮合環系（そのうちの少なくとも１つは芳香族）を含む。ヘテロアリール基の例としては、ピリジニル（例えば、２−ヒドロキシピリジニル）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば、４−ヒドロキシピリミジニル）、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルがある。
【００８９】
アルキル基に適切な置換基は、本開示の反応に大きく干渉しないものである。本開示の反応に干渉する置換基は当技術分野に周知の、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９に記載の方法に従って保護することができる。適例な置換基としては、アリール（例えば、フェニル、フェノール、及び保護フェノール）、ヘテロアリール（例えば、インドリル及びイミダゾリル）ハロゲン、グアニジウム［-ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２］、−
ＯＲ１００、ＮＲ１０１Ｒ１０２、−ＮＯ２、−ＮＲ１０１ＣＯＲ１０２、−ＳＲ１００、−ＳＯＲ１０１で表されるスルホキシド、−ＳＯ２Ｒ１０１で表されるスルホン、硫酸−ＳＯ３Ｒ１００、スルホン酸−ＯＳＯ３Ｒ１００、−ＳＯ２ＮＲ１０１Ｒ１０２で表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ１０１、−ＯＣＯＲ１０１、−ＯＣＯＮＲ１０１Ｒ１０２が挙げられ；Ｒ１０１及びＲ１０２はそれぞれ互いに独立して、Ｈ、直鎖、分岐、若しくは環状アルキル、１〜１０の炭素原子を有するアルケニル又はアルキニルより選択される。
【００９０】
「ハロゲン化物」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉを指す。
【００９１】
「アミノ酸」という用語は、ＮＨ２−Ｃ（Ｒａａ’Ｒａａ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで表される天然のアミノ酸又は非天然のアミノ酸を指し、Ｒａａ及びＲａａ’はそれぞれ互いに独立して、Ｈ、置換されていてもよい直鎖、分岐、若しくは環状アルキル、１〜１０の炭素原子を有するアルケニル若しくはアルキニル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシ
クリルである。「アミノ酸」という用語はまた、−ＮＨ−Ｃ（Ｒａａ’Ｒａａ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−等、１つの水素原子がアミノ酸のアミン及び／又はカルボキシ末端から除去される場合の対応残基を指す。下の具体的な実施例は例示的に過ぎず、本開示の他の部分をいかようにも限定しないと解釈されるものとする。さらに工夫をしなくても、当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限活用することができると確信する。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、下に提示するいかなる技法も、特許請求する発明の範囲をいかようにも制限するものではない。
【実施例】
【００９２】
材料と方法
下に与えるプロセスパラメーターは、当業者の特定の必要性に合うように当業者が適応させ採用することができる。
【００９３】
全ての反応は、アルゴン下、磁気撹拌によって実施した。テトラヒドロフラン及びジメチルホルムアミドをＡｌｄｒｉｃｈから無水物溶媒として購入した。マイタンシノールを（Ｗｉｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９：４３９２−４４０８（２００６））に記載の通り生成させた。Ｎ−メチル−アラニン，（４Ｓ）−３，４−ジメチル−２，５−オキサゾリジンジオンのＮ−カルボキシ無水物を（Ａｋｓｓｉｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍａｒｏｃａｉｎ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｑｕｅ，１：４４−４７（２００２））に記載の通りに調製した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）のスペクトル（１Ｈ  ４００ＭＨｚ、１３Ｃ  １００ＭＨｚ）をＢｒｕｋｅｒ  ＡＤＶＡＮＣＥ（商標）シリーズＮＭＲで得た。ＨＰＬＣ／ＭＳデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣにＢｒｕｋｅｒ  ＥＳＱＵＩＲＥ（商標）３０００イオントラップ質量分析計を併せ用いて得た。ＨＰＬＣ法１を用いてＤＭ１を分析した。他の分析には全てＨＰＬＣ法２を用いた。
【００９４】
分析ＨＰＬＣ法１：
ＵＶ検出器又は同等機器を備えた水（Ｗａｔｅｒ）ＨＰＬＣシステム
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ  ２５０×４．６ｍｍ；５μｍ（品番＝ＡＱ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ）
流量：１ｍＬ／分（グラジエント）
移動相：Ａ＝水１リッター中８５％Ｈ３ＰＯ４１ｍｌ；Ｂ＝アセトニトリル／テトラヒドロフラン  ３０：７０（ｖ／ｖ）（注：ＬＣ／ＭＳ分析で移動相Ａ中に、Ｈ３ＰＯ４の代わりに０．１％ＴＦＡを用いた）
グラジエント表：
【００９５】
【表１】
2020180150.tif 000030
ラン時間：６０分＋ポストタイム：１０分
ＵＶ検出：２５２ｎｍ
注入量＝アセトニトリル中約１ｍｇ／ｍｌのＤＭ１が５μＬ
カラム温度＝１５℃（他に記載していない場合）
試料温度＝２〜８℃
【００９６】
分析ＨＰＬＣ／ＭＳ法２：
カラム：１５０×４．６ｍｍ  Ｃ８、粒子サイズ  ５ミクロン、Ｚｏｒｂａｘ品番９９３９６７−９０６
溶媒：Ａ脱イオン水＋０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：アセトニトリル
流量  １．０ｍＬ／分
温度：室温
注入量：１５μＬ
グラジエント
【００９７】
【表２】
2020180150.tif 000031
ＨＰＬＣトレース中データを０〜２５分表示した。
【００９８】
分析ＨＰＬＣ法２のための試料調製：
所与の混合物のアリコート（２０μＬ）をオートサンプラーバイアル中アセトニトリル（１．５ｍＬ）に加えた。バイアルにキャップをし、振盪し、次いで１５℃のオートサンプラー中に置いた。各ＨＰＬＣランごとに注入量（１５μＬ）を分析した。
【００９９】
実施例１  乾燥剤として４Ａモレキュラーシーブを加えたＤＭ１−ＳＭｅの調製
マイタンシノール（５０．１ｍｇ、０．０８８８ｍｍｏｌ）、（４Ｓ）−３，４−ジメチル−２，５−オキサゾリジンジオン（３０．２ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ、２．６当量）、亜鉛トリフレート（１３３ｍｇ、０．３６６ｍｏｌ）及び、真空下２５０℃で予備乾燥し、次いで室温で冷却した４Ａモレキュラーシーブ（０．５０ｇ）を、１０ｍｌフラスコに加えた。内容物を無水ジメチルホルムアミド（０．７５ｍＬ）中に取り、ジイソプロピルエチルアミン（６２μＬ、０．３５７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。粗混合物の資料をＨＰＬＣによって分析したところ、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン生成物が総ＨＰＬＣ面積の８０％を占めた。反応混合物を、１：１の飽和ＮａＨＣＯ３：飽和ＮａＣｌ（１．２ｍＬ）と酢酸エチル（３ｍＬ）で希釈し、混合し、次いでセライトでろ過し、次いでリン酸カリウム緩衝液（１ｍＬ、４００ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させると、黄色い固体が形成された。この固体に、３−メチルジチオプロパン酸（２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン（３ｍＬ）を加えた。２時間撹拌した後、混合物を酢酸エチル（８ｍＬ）で希釈し、１．０Ｍ  ｐＨ６．５リン酸カリウム緩衝液（２ｍＬ）で洗い、水溶液を酢酸エチル（２×８ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮し、シリカクロマトグラフィー、９５：５のジクロロメタン：メタノールで精製すると、５１ｍｇ（７０％）のＤＭ１−ＳＭｅが得られた。
【０１００】
実施例２  実施例１の１０倍拡大
実施例１の反応を１０倍大きい規模で行い、４９０ｍｇ（６８％）のＤＭ１−ＳＭｅを得た。
【０１０１】
実施例３  乾燥剤の添加のないＤＭ１−ＳＭｅの調製
２５ｍＬフラスコの無水ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中にマイタンシノール（１．０ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を溶解させ、氷／水浴中冷却した。２分後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．９２ｇ、７．０７ｍｍｏｌ）及び亜鉛トリフレート（３．８ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を磁気撹拌しながら加え、次いで（４Ｓ）−３，４−ジメチル−２，５−オキサゾリジンジオン（０．９１３ｇ、７．０７ｍｍｏｌ）を手早く加え、混合物を２４時間撹拌した。粗混合物の試料をＨＰＬＣによって分析したところ、Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン生成物が総ＨＰＬＣ面積の６５％を占めた。反応混合物を、１：１の飽和ＮａＨＣＯ３：飽和ＮａＣｌ（２５ｍＬ）と酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、混合し、次いでセライトでろ過し、飽和ＮａＣｌで洗った。有機層を無水物硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させた。残渣をジクロロメタン（３０ｍＬ）中に取り、３−メチルジチオプロパン酸（１．１ｇ、７．０ｍｍｏｌ）及び塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（１．３４ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を手早く加え、反応物をアルゴン下室温で２時間撹拌した。混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、１．０Ｍリン酸カリウム緩衝液（３０ｍＬ）、ｐＨ６．５、で洗い、水溶液を酢酸エチル（２×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮し、シリカクロマトグラフィー、９５：５のジクロロメタン：メタノールで精製すると、６９８ｍｇ（５０％）のＤＭ１−ＳＭｅが得られた。
【０１０２】
実施例４  実施例３の繰り返し
実施例３の反応を同じ規模で繰り返し、７３５ｍｇ（５３％）のＤＭ１−ＳＭｅを得た。
【０１０３】
実施例５  粗Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン保存液
２５ｍＬフラスコの無水ジメチルホルムアミド（７ｍＬ）中にマイタンシノール（０．５ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を溶解させ、氷／水浴中冷却した。２分後、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）及び亜鉛トリフレート（１．９ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を磁気撹拌しながら加え、次いで（４Ｓ）−３，４−ジメチル−２，５−オキサゾリジンジオン（４．５２ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を手早く加え、混合物を２４時間撹拌した。この保存液のアリコート（各０．５ｍＬ）を次の実験で用いるため、各アリコートを約０．１３ｍｍｏｌのマイタンシノールから作製した。
【０１０４】
実施例６  Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン抽出とそれに続くプロピオン酸（対照）への結合
【０１０５】
【化２９】
2020180150.tif 000032
Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン保存液（０．５０ｍＬ）を酢酸エチル（１．５ｍＬ）及び１：１の飽和ＮａＣｌ：ＮａＨＣＯ３（０．７５ｍＬ）を含有する６ｍＬ容量バイアルに加え、手早くキャップをし、混合した。有機層を保持し、無水Ｎａ２ＳＯ４（１２０ｍｇ）上で乾燥した。有機層（１．０ｍＬ）を取り、プロピオン酸（２０．０μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）。溶液を、次いで、塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（４０ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）を含有するバイアルへ移した。反応を２．５時間進行させ、その後それをＨＰＬＣによって分析した。
【０１０６】
下に示す通り、前述の反応の副生成物であるＭａｙ−ＮＭＡ２から次の副生成物も生成した。
【０１０７】
【化３０】
2020180150.tif 000033
【０１０８】
１７：１６でＨＰＬＣパーセント面積の比率は３．０：７１．７であった。１６のＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）７０６（Ｍ＋Ｎａ＋）７２８；１７のＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）８１３。
【０１０９】
実施例７  実施例６の実験を繰り返した
１７：１６で、ＨＰＬＣパーセント面積の比率は３．０：７０．９であった。
【０１１０】
実施例８  Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン抽出とそれに続くメタノール予備クエン
チに次のプロピオン酸への結合（過剰５ａを破壊する予備クエンチ）
Ｎ２’−デアセチル−マイタンシン保存液（０．５０ｍＬ）を６ｍＬ容量バイアルに加え、それにメタノール（７５μＬ、１．８ｍｍｏｌ）を加え、バイアルにキャップをし、内容物を１時間磁気撹拌した。次いで酢酸エチル（１．５ｍＬ）及び１：１の飽和ＮａＣｌ：ＮａＨＣＯ３（０．７５ｍＬ）を加え、バイアルにキャップをし、混合した。有機層を保持し、無水Ｎａ２ＳＯ４（１２０ｍｇ）上で乾燥した。有機層（１．０ｍＬ）を取り、プロピオン酸（２０．０μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで溶液を、塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（４０ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）を含有するバイアルに移した。反応を２．５時間進行させ、その後それをＨＰＬＣによって分析した。１７に対するＨＰＬＣのピークはほとんど検出できず、積分はできなかった。反応を繰り返しが、再度１７はほとんど検出できず、積分はできなかった。したがって、予備クエンチング法は、望ましさがより低くない化合物１５及び１７を生成させる。
【０１１１】
実施例９  余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅ（９ａ）の合成
【０１１２】
【化３１】
2020180150.tif 000034
マイタンシノール（１．２ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬフラスコへ秤量し、ジメチルホルムアミド（１２ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（６ｍＬ）の混合物に溶解させた。フラスコを氷／水浴中冷却した。５分後、ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）、亜鉛トリフルオロメタンスルホン酸（４．５ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）、及び２，５−オキサゾリジンジオン、３，４−ジメチル（４Ｓ）（１．１ｇ、８．５ｍｍｏｌ）を逐次加えた。１７時間撹拌した後、反応物を１：１の飽和水性ＮａＣｌ：飽和水性ＮａＨＣＯ３（１４ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を保持し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。乾燥剤を除去し、溶媒の約２／３を減圧回転蒸発に
よって除去した。次いで、Ｎ−メチル−Ｎ−［（２−メチルジチオ）−１−オキソプロピル］−Ｌ−アラニン（１．０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、続いて塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（０．８８９ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン（１０ｍＬ）を加えて混合物に溶解させた。４時間後、反応物を塩化メチレン（７０ｍＬ）及び１：４の飽和水性ＮａＣｌ：飽和水性ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を保持し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減圧回転蒸発によって除去した。得られた濃い油をアセトニトリル（３ｍＬ）中に溶解させ、物質の約１／２をｗａｔｅｒｓ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ８カラム（１９×１５０ｍｍミクロン、５ミクロン粒子サイズ）でＨＰＬＣによって精製した。カラムの溶出を、０．２％ギ酸を含有する脱イオン水で、アセトニトリルグラジエント（１８分で３０％〜６０％アセトニトリル）にて行った。カラムに９５％アセトニトリルを５分間流し、次いでランとランの間に３０％アセトニトリルで６分間再平衡化した。注入量の範囲は１００〜８００ｕＬである。未反応マイタンシノールを８．５分で溶出し、余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅのイソマーで所望でないものを１３．８分で溶出し、余剰ＮＭＡ−ＤＭ１−ＳＭｅのイソマーで所望のものを１５．１分で溶出した。何回かのランから得た所望の生成物断片を合わせ、溶媒を減圧回転蒸発によって除去した。残渣をできるだけ少ない量の酢酸エチルに取り、細かい不純物をＫｒｏｍａｓｉｌシアノカラム（２５０ｍｍ×２１ｍｍ、１０ミクロン粒子サイズ）でＨＰＬＣによって除去した。カラムを６７：９：２４のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの定組成移動相により２１ｍＬ／分でランにかけた。所望の生成物は２２．６分で溶出し、不純物は１２．６分で溶出した。何回かのランから得た生成物画分を合わせ、溶媒を減圧回転蒸発によって除去すると、生成物９５ｍｇ（収率１０％）が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ）δ＝７．２６，６．８１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｄｄ，Ｊ＝９．１，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５２−５．４０（ｍ，１Ｈ），５．２７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５−４．６９（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．７（ｂｓ，１），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０３−２．９０（ｍ，３Ｈ），２．８７（ｓ，３Ｈ），２．８２−２．６４（ｍ，５Ｈ），２．６３−２．５０（ｍ，１Ｈ），２．４５−２．３０（ｍ，３Ｈ），２．１５（ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ，１Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．５７（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，４Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．７９（ｓ，３Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ１７０．８６，１７０．５０，１７０．３５，１６８．６９，１５６．１９，１５２．３５，１４２．２，１４０．９０，１３９．２９，１３３．２７，１２８．０５，１２５．１，１２２．０７，１１９．１５，１１３．３１，８８．７２，８０．９６，７８．５１，７４．２３，６６．１９，６０．６６，６０．１３，５６．８１，５６．７１，５４．９７，４７．９０，４６．７２，３８．９９，３６．４１，３５．６８，３３．１９，３２．５４，３０．９０，３０．０２，２３．０１，１５．６２，１４．７５，１４．５９，１３．５４，１２．３５．
ＨＲＭＳ  計算値  Ｃ４０Ｈ５７ＣｌＮ４Ｏ１１Ｓ２（Ｍ＋Ｎａ＋）  ｍ／ｚ＝８９１．３０５２；測定値  ８９１．３０４９。
【０１１３】
実施例１０  余剰ＮＭＡ−ＤＭ１（１０）の合成
【０１１４】
【化３２】
2020180150.tif 000035
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル）−マイタンシン（９５ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）を２：１のジメトキシエタン：１００ｍＭカリウムリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５に溶解させ、そこにジチオスレイトール（１１０ｍｇ、ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、溶液を、２：１の酢酸エチル：塩化メチレン（５ｍＬ）と飽和水性ＮａＣｌ（１ｍＬ）の混合物で抽出した。有機層を保持し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。乾燥剤を減圧ろ過によって除去し、溶媒を減圧回転蒸発によって除去した。残渣を、できるだけ少ない量の１：１の酢酸エチル：塩化メチレンに取り、Ｋｒｏｍａｓｉｌシアノカラム（２５０ｍｍ×２１ｍｍ、１０ミクロン粒子サイズ）でＨＰＬＣによって精製した。カラムを６４：１９：１７のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの定組成移動相により２１ｍＬ／分でランにかけた。所望の生成物を１６分で溶出した。何回かのランから得た生成物断片を合わせ、溶媒を減圧回転蒸発によって除去すると、生成物６２ｍｇ（収率６９％）が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．８１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），
６．６７（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２６（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２８−５．２２（ｍ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｂｓ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８５（ｓ，３Ｈ），２．８４−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｓ，３Ｈ），２．７６（ｓ，１Ｈ），２．６８−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｄｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．６２−１．５９（ｍ，１Ｈ），１．４９−１．４０（ｍ，，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２７−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ１７０．３７，１７０．３０，１７０．２５，１６８．５３，１５６．０７，１５２．１６，１４２．３１，１４０．７４，１３９．１６，１３３．１２，１２７．０９，１２５．３２，１２１．９２，１１９．９２，１１３．１５，８８．５７，８０．８３，７８．３７，７４．０８，６７．０１，５９．９７，５８．６６，５６．５６，５３．５４，４９．１７，４６．５８，３８．８６，３７．３３，３６．２５，３５．５３，３２．３９，３０．８１，２９．８０，２１．０２，１９．８７，１５．４７，１４．８０，１３．４，１２．２２．
ＨＲＭＳ  計算値  Ｃ３９Ｈ５５ＣｌＮ４Ｏ１１Ｓ  （Ｍ＋Ｎａ＋）  ｍ／ｚ＝８４５．３１７４；測定値  ８４５．３１６６。
【図１】
2020180150.tif 000062
【図２】
2020180150.tif 000063
【図３】
2020180150.tif 000064
【図４】
2020180150.tif 000065
【外国語明細書】
2020180150000001.pdf