(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘパラン硫酸、特に、ＴＧＦβ１に結合するヘパラン硫酸の提供。【解決手段】ヘパラン硫酸ＨＳ１６。アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを有するかまたは配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、ヘパラン硫酸ＨＳ１６。（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがアミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを有するヘパリン結合ドメインを含み；（ｉｉ）固体支持体を、ヘパラン硫酸調製物を含む混合物と接触させ；（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、ヘパラン硫酸種を解離させ；（ｖ）解離したヘパラン硫酸種を収集する工程を含む方法によって得られる、ヘパラン硫酸ＨＳ１６。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項２】
単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項３】
アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項４】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
【表１】
2020143293.tif 000015
を含む二糖組成を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項５】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
【表２】
2020143293.tif 000016
を含む二糖組成を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項６】
（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがアミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを有するヘパリン結合ドメインを含み；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、固体支持体を、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸調製物を含む混合物と接触させ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸種を解離させ；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカン、好ましくは１またはそれより多いヘパラン硫酸種を収集する
工程を含む方法によって得られる、請求項１〜５のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項７】
ポリペプチドがＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）より選択されるアミノ酸配列を有するか、または該配列からなる、請求項６の方法。
【請求項８】
グリコサミノグリカンを含む混合物が、ブタ粘膜より得られるヘパラン硫酸調製物（ＨＳＰＭ）である、請求項６または７の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む組成物。
【請求項１０】
増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１をさらに含む、請求項９の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む化粧用組成物、医薬組成物または薬剤。
【請求項１２】
ＴＧＦβ１タンパク質および／または間葉系幹細胞をさらに含む、請求項１１の医薬組成物または薬剤。
【請求項１３】
医学的治療法において使用するための請求項１１または１２の医薬組成物または薬剤。
【請求項１４】
医学的治療法において使用するための請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項１５】
医学的治療法がin vivoの創傷治癒法を含む、請求項１４記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６
。
【請求項１６】
医学的治療法が、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を含む、請求項１４記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項１７】
疾患、状態または組織に対する傷害の治療のための薬剤製造における請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６の使用であって、方法が、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を含む、前記使用。
【請求項１８】
患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、療法的有効量のヘパラン硫酸ＨＳ１６を患者に投与し、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
組織の再生または修復が必要である、患者の体の創傷または位置にあるまたはそれを取り巻く組織にヘパラン硫酸ＨＳ１６を投与する工程を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
患者にＴＧＦβ１タンパク質を投与する工程をさらに含む、請求項１８または１９の方法。
【請求項２１】
患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、バイオマテリアルおよび請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む、生体
適合移植物または装具を、疾患、状態または傷害の部位のまたはそれを取り巻く組織内に、外科的に移植して、組織の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
バイオマテリアルおよび請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む、生体適合移植物または装具。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６で、バイオマテリアルをコーティングするか、または含浸する工程を含む、生体適合移植物または装具を形成する方法。
【請求項２４】
in vitroで、請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させて、幹細胞を培養する工程を含む、in vitroで幹細胞を培養する方法。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む培地。
【請求項２６】
ＴＧＦβ１をさらに含む、請求項２５の培地。
【請求項２７】
あらかじめ決定した量の請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６およびあらかじめ決定した量のＴＧＦβ１を含む、キットオブパーツ（kit of parts）。
【請求項２８】
医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６；および
（ｉｉ）ＴＧＦβ１タンパク質；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物。
【請求項２９】
増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１の安定性を増加させる方法であって、増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１を、請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
被験体に、請求項１〜８のいずれか一項記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を投与する工程を含む、美容法。
【請求項３１】
血液由来産物およびあらかじめ決定した量のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む調製物。
【請求項３２】
血小板調製物である、請求項３１の調製物。
【請求項３３】
生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料を、あらかじめ決定した量のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラン硫酸、そして排他的ではないが特に、ＴＧＦβ１に結合するヘパラン硫酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは、複雑で直鎖であり、非常に荷電した炭水化物であって、広範囲のタンパク質と相互作用してその機能を制御する；これらは通常、コアタンパク質に付着して合成される。ＧＡＧは、非硫酸化（ＨＡ）および硫酸化（ＣＳ、ＤＳ、ＫＳ、ヘパリンおよびＨＳ）に分類される。
【０００３】
ＧＡＧのうち、ヘパラン硫酸（ＨＳ）ファミリーは、ドメイン内の特定の配列に基づいて、ターゲティングされるタンパク質と相互作用する能力を有するため、特に興味深い。該ファミリー（ヘパリンおよびＨＳ）は、Ｎ−およびＯ−硫酸化の多様なパターンを伴う、反復ウロン酸−（１→４）−Ｄ−グルコサミン二糖サブユニットからなる。例えば、ヘパリンの抗凝固活性は、ユニークな五糖配置を伴う、グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化を要する（Lindahl U, Backstrom G, Hook M, Thunberg L, Fransson LA, Linker A.  ヘパリンにおけるアンチトロンビン結合部位の構造  Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:3198-202.）。ユニークな硫酸化パターンはまた、ＥＣＭタンパク質に関しても明らかで
あり；ＦＮに結合する強力なヘパリン結合変異体は、特に非常に荷電しており、７〜８のＮ−硫酸化二糖が必要であり、そして通常よりもより大きなドメインを伴う（＞１４残基）、（Falcone DJ, Salisbury BGJ.  フィブロネクチンは、低密度リポタンパク質−ヘパリン−コラーゲン複合体のマクロファージ取り込みを刺激する  Arteriosclerosis. 1988;8:263-73.；Mahalingam Y, Gallagher JT, Couchman JR.  フィブロネクチンのヘパリン結合（ＨｅｐＩＩ）ドメインへの細胞接着反応は、特定の特性を持つヘパラン硫酸を必要とする。 J Biol Chem. 2007;282:3221-30）。しかし、ＨＳは、非硫酸化ＮＡドメインによって分離された非常に硫酸化されたＮＳドメインを有することがこうした硫酸化ヘパリンとは異なり；こうした性質は、ヘパリンの副作用を伴わずに、タンパク質に選択的に結合するためのユニークな配置を提供する（Gandhi NS, Mancera RL.  グリコサミノグリカンの構造およびタンパク質とのその相互作用。Chem Biol Drug Des. 2008;72:455-82.）
。
【０００４】
ＨＳの二糖組成は、グリコシド結合を切断するフラボバクテリウム・ヘパリニウム（Flavobacterium heparinium）酵素、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩを用いて、一連の
酵素切断によって解明可能である（Venkataraman G, Shriver Z, Raman R, Sasisekharan
R.  複雑な多糖の配列決定。Science. 1999;286:537-42.；Desai UR, Wang HM, Linhardt RJ.  フラボバクテリウム・ヘパリヌム（Flavobacterium-heparinum）由来のヘパリン
・リアーゼに関する特異性研究  Biochemistry. 1993;32:8140-5.；Shriver Z, Sundaram
M, Venkataraman G, Fareed J, Linhardt R, Biemann K.ら  ヘパリナーゼによるヘパリンにおけるアンチトロンビンＩＩＩ結合部位の切断および低分子量ヘパリンの生成におけるその関与。Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:10365-70）。３つすべてのヘパリナーゼを組み合わせて用いると、ヘパリンまたはＨＳの９０％より高い脱重合が可能である（Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Tsegenidis T, Hjerpe A.  ヘパリンおよびヘ
パラン硫酸における二糖組成を決定するためのイオン対高性能液体クロマトグラフィ。J Chromatogr A. 1997;765:169-79.；Vynios DH, Karamanos NK, Tsiganos CP.  グリコサ
ミノグリカンの分析における進歩：結合組織の生理学的および病的状態の評価のための適用。 J Chromatogr B. 2002;781:21-38.）。生じる二糖混合物を、既知の二糖標準との比較によって、ＰＡＧＥ（Hampson IN, Gallagher JT.  ポリアクリルアミド−ゲル電気泳
動による放射標識グリコサミノグリカン・オリゴ糖の分離  Biochem J. 1984;221:697-705.）、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ（Skidmore M AA, Yates EおよびTurnbull JE.  ＨＰＬＣおよびＭＳ分離のための発色団、蛍光およびマスタグでのヘパラン硫酸糖の標識。Methods in Molecular biology. 2009;534:157-69.）、または高感度キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（Lamari F, Militsopoulou M, Gioldassi X, Karamanos NK.  キャピラリー電気泳動：プ
ロテオグリカン中のグリカン部分の単糖、二糖およびオリゴ糖構成要素分析のための優れた小型ツール。Fresenius J Anal Chem. 2001;371:157-67．；Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Hjerpe A.  ヘパリンおよびヘパラン硫酸二糖を性質決定する高性能キャ
ピラリー電気泳動法。Electrophoresis. 1996;17:391-5.；Sudhalter J, Folkman J, Svahn CM, Bergendal K, Damore PA.  ヘパリンによる酸性線維芽細胞増殖因子の増強における、サイズ、硫酸化、および抗凝固活性の重要性  J Biol Chem. 1989;264:6892-7.；Militsopoulou M, Lamari FN, Hjerpe A, Karamanos NK.  紫外およびレーザー誘導蛍光検出を用いたキャピラリーゾーン電気泳動による２−アミノアクリドン誘導体としての１２のヘパリンおよびヘパラン硫酸由来二糖の決定。Electrophoresis. 2002;23:1104-9）によ
って分析することも可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lindahl U, Backstrom G, Hook M, Thunberg L, Fransson LA, Linker A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:3198-202
【非特許文献２】Falcone DJ, Salisbury BGJ. Arteriosclerosis. 1988;8:263-73
【非特許文献３】Mahalingam Y, Gallagher JT, Couchman JR. J Biol Chem. 2007;282:3221-30
【非特許文献４】Gandhi NS, Mancera RL. Chem Biol Drug Des. 2008;72:455-82
【非特許文献５】Venkataraman G, Shriver Z, Raman R, Sasisekharan R. Science. 1999;286:537-42
【非特許文献６】Desai UR, Wang HM, Linhardt RJ. Biochemistry. 1993;32:8140-5
【非特許文献７】Shriver Z, Sundaram M, Venkataraman G, Fareed J, Linhardt R, Biemann Kら. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:10365-70
【非特許文献８】Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Tsegenidis T, Hjerpe A. J Chromatogr A. 1997;765:169-79
【非特許文献９】Vynios DH, Karamanos NK, Tsiganos CP. J Chromatogr B. 2002;781:21-38
【非特許文献１０】Hampson IN, Gallagher JT. Biochem J. 1984;221:697-705
【非特許文献１１】Skidmore M AA, Yates EおよびTurnbull JE. Methods in Molecular biology. 2009;534:157-69
【非特許文献１２】Lamari F, Militsopoulou M, Gioldassi X, Karamanos NK. Fresenius J Anal Chem. 2001;371:157-6
【非特許文献１３】Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Hjerpe A. Electrophoresis. 1996;17:391-5
【非特許文献１４】Sudhalter J, Folkman J, Svahn CM, Bergendal K, Damore PA. J Biol Chem. 1989;264:6892-7
【非特許文献１５】Militsopoulou M, Lamari FN, Hjerpe A, Karamanos NK. Electrophoresis. 2002;23:1104-9
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヘパラン硫酸種およびヘパラン硫酸種を含むかまたは該種からなるヘパラン硫酸調製物に関する。ヘパラン硫酸種は、ＨＳ１６と呼ばれる。ＨＳ１６は、構造的にそして機能的に関連する単離ヘパラン硫酸の新規クラスを指す。
【０００７】
ＨＳ１６は、ＴＧＦβ１に結合し、ＴＧＦβ１の熱安定性を増進し、そしてＴＧＦβ１シグナル伝達を増強し、そしてしたがって、間葉系幹細胞の軟骨形成分化を増強することが見出されてきている。
【０００８】
本発明の１つの側面において、ヘパラン硫酸ＨＳ１６を提供する。ＨＳ１６は、単離された型または実質的に精製された型で提供されることも可能である。これは、ヘパラン硫酸構成要素が少なくとも８０％のＨＳ１６、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、ＨＳ１６の１つである組成物を提供する工程を含むことも可能である。
【０００９】
好ましい態様において、ＨＳ１６は、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。ペプチドは、この配列の一端または両端に１またはそれより多いさらなるアミノ酸を有することも可能である。例えば、ペプチドは、この配列の一端または両端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多いアミノ酸のいずれかを有することも可能である。
【００１０】
他の態様において、ポリペプチドはＴＧＦβ１タンパク質である。いくつかの態様において、ＨＳ１６は、配列番号１のアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなるペプチド、あるいはＴＧＦβ１タンパク質に、１００μＭ未満、より好ましくは５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭまたは１ｎＭの１未満のＫＤで、結合する。
【００１１】
本明細書に記載する本発明者らの方法論にしたがって、ＨＳ１６を、得るか、同定するか、単離するかまたは濃縮することも可能であり、該方法は以下の工程：
（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨのアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを含み；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペプチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集する
工程を含むことも可能である。
【００１２】
場合によって、方法は、サイズ分画工程を、例えば工程（ｉｖ）または（ｖ）の後にさらに含むことも可能である。サイズ分画を用いて、選択した閾値、例えばｄｐ４、ｄｐ６、ｄｐ８、ｄｐ１０、ｄｐ１２、ｄｐ１４、ｄｐ１６、ｄｐ１８、ｄｐ２０、ｄｐ２２、またはｄｐ２４の１つより小さいヘパラン硫酸鎖を除去することも可能である。
【００１３】
本発明者の方法論において、混合物は、商業的に入手可能な供給源から得られるグリコサミノグリカンを含むことも可能である。１つの適切な供給源は、ヘパラン硫酸分画、例えば商業的に入手可能なヘパラン硫酸である。１つの適切なヘパラン硫酸分画は、ブタ腸粘膜からのヘパリン単離中に得られることが可能であり、別のものは、ブタ粘膜由来のヘパラン硫酸［ＨＳＰＭ］（例えばCelsus Laboratories Inc.のもの−ときに「Ｃｅｌｓｕｓ  ＨＳ」と称される）である。
【００１４】
ヘパラン硫酸の他の適切な供給源には、任意の哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）由来の、特に腎臓、肺または腸粘膜由来のヘパラン硫酸が含まれる。いくつかの態様において、ヘ
パラン硫酸は、ブタまたはウシ腸粘膜、腎臓または肺由来である。
【００１５】
本発明の別の側面において、上記の側面の任意の１つに記載のＨＳ１６およびＴＧＦβ１タンパク質を含む組成物を提供する。
本発明の１つの側面において、上述の側面にしたがった、ＨＳ１６を含む医薬組成物または薬剤を提供する。医薬組成物または薬剤は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含むことも可能である。
【００１６】
いくつかの態様において、医薬組成物は、治療法において使用するためのものであり、該方法は、組織、例えば結合組織（軟骨、骨、腱、靱帯、皮膚、角膜）または骨折の修復および／または再生を含む。いくつかの態様において、医薬組成物または薬剤は、ＴＧＦβ１タンパク質をさらに含むことも可能である。いくつかの態様において、医薬組成物または薬剤は、間葉系幹細胞をさらに含むことも可能である。
【００１７】
本発明の別の側面において、医学的治療法において使用するためのＨＳ１６を提供する。医学的治療法は、in vivoでの創傷治癒、組織の修復および／または再生、例えば結合
組織（軟骨、骨、腱、靱帯、皮膚、角膜）の修復および／または再生の方法を含むことも可能である。こうした修復および／または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。
【００１８】
本発明の関連する側面において、医学的治療法において使用するための薬剤の製造におけるＨＳ１６の使用を提供する。いくつかの態様において、医学的治療法は、上述のような組織の修復および／または再生を含む。
【００１９】
本発明のさらなる側面において、バイオマテリアルおよびＨＳ１６を含む、生体適合移植物または装具を提供する。いくつかの態様において、移植物または装具はＨＳ１６でコーティングされている。いくつかの態様において、移植物または装具はＨＳ１６で含浸されている。移植物または装具は、ＴＧＦβ１タンパク質で、および／または間葉系幹細胞で、さらにコーティングまたは含浸されていることも可能である。
【００２０】
本発明の別の側面において、生体適合移植物または装具を形成する方法であって、バイオマテリアルをＨＳ１６でコーティングまたは含浸する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ＴＧＦβ１タンパク質および間葉系幹細胞の一方または両方でバイオマテリアルをコーティングまたは含浸する工程をさらに含む。
【００２１】
いくつかの側面において、方法は、患者に、ＨＳ１６および間葉系幹細胞を投与する工程を含むことも可能である。こうした方法において、ＨＳ１６、ＴＧＦβ１タンパク質および間葉系幹細胞の少なくとも２つを、ＨＳ１６、ＴＧＦβ１タンパク質および間葉系幹細胞の少なくとも２つ、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む医薬組成物中で配合することも可能である。
【００２２】
好ましくは、ＨＳ１６、ＴＧＦβ１タンパク質および間葉系幹細胞をそれぞれ、療法的有効量で提供する。いくつかの態様において、方法は、ＨＳ１６、および／またはＴＧＦβ１タンパク質および／または間葉系幹細胞、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む医薬組成物として、療法的有効量のＨＳ１６、および／またはＴＧＦβ１タンパク質および／または間葉系幹細胞を配合する工程をさらに含み、ここで医薬組成物を患者に投与する。
【００２３】
本発明の別の側面において、患者を治療する方法であって、バイオマテリアルおよびＨＳ１６を含む生体適合移植物または装具を、患者組織内または骨折部位周囲に外科的に移
植する工程を含む前記方法を提供する。
【００２４】
いくつかの態様において、移植物または装具は、ＨＳ１６でコーティングされる。いくつかの態様において、移植物または装具は、ＨＳ１６で含浸される。いくつかの態様において、移植物または装具は、ＴＧＦβ１タンパク質および間葉系幹細胞の一方または両方でさらに含浸される。
【００２５】
本発明のさらなる側面において、ＨＳ１６を含む培地を提供する。
本発明の別の側面において、in vitroの細胞培養におけるＨＳ１６の使用を提供する。本発明の関連する側面において、in vitroの結合組織増殖におけるＨＳ１６の使用を提供する。本発明の別の関連する側面において、in vitroで結合組織を増殖させるための方法であって、外因性に添加されたＨＳ１６と接触させて間葉系幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらにさらなる側面において、治療が必要なヒトまたは動物患者における、組織、例えば結合組織の修復、置換または再生のための方法であって：
（ｉ）間葉系幹細胞が組織を形成するために十分な期間、該細胞を、ＨＳ１６と接触させて、in vitroで培養し；
（ｉｉ）前記組織を収集し；
（ｉｉｉ）傷害または疾患の部位で、前記組織を患者の体内に移植して、患者において、組織を修復、置換または再生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２７】
組織は、結合組織、例えば骨、軟骨、腱、皮膚または脂肪であることも可能である。いくつかの態様において、方法は、培養中の間葉系幹細胞を外因性ＴＧＦβ１タンパク質と接触させる工程をさらに含む。
【００２８】
本発明の別の側面において、ＨＳ１６の存在下で間葉系幹細胞のin vitro培養によって得られる組織を提供する。いくつかの態様において、組織は、ＨＳ１６およびＴＧＦβ１タンパク質の存在下で、間葉系幹細胞のin vitro培養によって得られる。
【００２９】
本発明のさらなる側面において、幹細胞、例えば間葉系幹細胞を培養する方法であって、ＨＳ１６と接触させて幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
本発明のいくつかの側面において、in vitroで幹細胞を培養する方法であって、ヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させて、in vitroで幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。ＨＳ１６は、好ましくは外因性であり、そして単離され、そして補充物として、例えば培地の一部として、培養に添加される。
【００３０】
本発明のさらにさらなる側面において、キットオブパーツ（kit of parts）であって、あらかじめ決定した量のＨＳ１６およびあらかじめ決定した量のＴＧＦβ１を含む、前記キットを提供する。該キットは、あらかじめ決定した量のＨＳ１６を含有する第一の容器およびあらかじめ決定した量のＴＧＦβ１を含有する第二の容器を含むことも可能である。キットは、あらかじめ決定した量の間葉系幹細胞をさらに含むことも可能である。キットは、医学的治療法において使用するために提供されることも可能である。医学的治療法は、in vivoの創傷治癒、組織、例えば結合組織（例えば、軟骨、骨、腱、靱帯、皮膚、
角膜）の修復および／または再生の方法を含むことも可能である。修復および／または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。キットは、医学的治療法を提供するため、ＨＳ１６、ＴＧＦβ１タンパク質および／または間葉系幹細胞を別個に、連続してまたは同時に投与するための使用説明書とともに提供されることも可能である。
【００３１】
本発明のさらなる側面において、医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）ＨＳ１６；および
（ｉｉ）ＴＧＦβ１；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物を提供する。医学的治療法は、in vivoの創傷治癒、
結合組織の修復および／または再生の方法を含むことも可能である。修復および／または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。産物は、場合によって、共投与のための組み合わせ調製物として配合されることも可能である。
【００３２】
本明細書に示すように、ＨＳ１６は、ＴＧＦβ１を安定化し、そしてそれによってその作用を延長する特性を有する。ＨＳ１６は、培地中でＴＧＦβ１が分解されることを防止する。これは、通常、ＴＧＦβ１調製物の貯蔵およびＴＧＦβ１含有培地の調製に有用に適用されうる。
【００３３】
こうしたものとして、本発明の１つの側面において、増殖因子および単離ＨＳ１６を含む組成物を提供する。増殖因子は、タンパク質増殖因子であることも可能であり、そして好ましくはＴＧＦβ１である。組成物は、単離ＴＧＦβ１および単離ＨＳ１６を含むことも可能である。いくつかの態様において、組成物は培地であることも可能である。他の態様において、組成物は、ＴＧＦβ１を含有する医薬組成物または薬剤であることも可能である。
【００３４】
組成物は、容器中にＴＧＦβ１および単離ＨＳ１６を含むＴＧＦβ１調製物であることも可能である。適切な容器は、瓶、バイアル、チューブまたはシリンジであることも可能である。
【００３５】
増殖因子の安定性を増加させる方法であって、増殖因子を単離ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法もまた提供する。
増殖因子の安定性を、半減期、すなわち所定の組成物中の増殖因子の半分が分解され、そして／またはその活性を失うために掛かる時間の量に関して、測定することも可能である。増殖因子は、好ましくは、タンパク質増殖因子、より好ましくはＴＧＦβ１である。ＨＳ１６は、ＴＧＦβ１半減期を維持し、そして延長するよう作用する。該方法は、単離ＨＳ１６を増殖因子（例えばＴＧＦβ１）とin vitroで、例えば増殖因子（例えばＴＧＦβ１）組成物の調製、その保存または輸送の一部として、接触させる工程を含むことも可能である。あるいは、該方法は、例えば、増殖因子（例えばＴＧＦβ１）［組織中に天然に存在するかまたは組織に外因性に添加されたもの］が存在する組織に、単離ＨＳ１６を投与することによって、in vivoで、単離ＨＳ１６を増殖因子（例えばＴＧＦβ１）と接
触させる工程を含むことも可能である。該方法はまた、外因性増殖因子（例えばＴＧＦβ１）を組織に添加する工程を含むことも可能である。
【００３６】
単離ＨＳ１６を含有する所定の組成物または組織（または単離ＨＳ１６が添加されているもの）におけるＴＧＦβ１の安定性を、ＨＳ１６を含有しない（または単離ＨＳ１６が添加されていない）匹敵する組成物に対して比較することも可能である。上述の組成物および方法において、ＨＳ１６は本明細書に記載するように精製されていることも可能である。ＴＧＦβ１は、単離され、そして／または精製され、単離されずまたは部分的に単離され、例えば細胞外マトリックス材料の一部として、あるいは細胞組成物中に存在することも可能である。単離または精製ＴＧＦβ１は、組換えＴＧＦβ１であることも可能である。組換えＴＧＦβ１は、多くの商業的製造者から商業的に入手可能である。
【００３７】
いくつかの側面において、ＨＳ１６は、血液由来産物の産生中の保存剤および／または保存料として用いる。いくつかの態様において、血液由来産物には、血小板、血小板産物、血小板溶解物、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）が含まれる。血液由来産物は、血液または血清から単離され、そして場合によって血液および／または血清の他の構成要素から濃縮されるかまたは分配されることも可能である。
【００３８】
いくつかの側面において、血液由来産物（単数または複数）の調製物であって、血液由来産物およびあらかじめ決定した量のＨＳ１６を含む前記調製物を提供する。ＨＳ１６は、好ましくは単離されたまたは精製された型であり、そして好ましくは、血液由来産物（単数または複数）に対して外因性であり、血液由来産物（単数または複数）に添加される。調製物は、ＨＳ１６が添加されている、血小板調製物、例えば血小板、血小板産物、血小板溶解物または血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）であることも可能である。
【００３９】
上記にしたがって、生物学的材料、好ましくはＴＧＦβ１を含む生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料をあらかじめ決定した量のＨＳ１６に接触させる工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、生物学的材料は、細胞材料、組織、血液由来産物、細胞、または幹細胞より選択されることも可能である。
【００４０】
本発明の別の側面において、幹細胞の単離および／またはプロセシング中に使用するためのＨＳ１６を提供する。いくつかの態様において、幹細胞の培養および／または拡大中に使用するための試薬として、ＨＳ１６を提供する。したがって、幹細胞を単離するか、プロセシングするか、培養するかまたは拡大する方法であって、幹細胞をあらかじめ決定した量のＨＳ１６と接触させる工程を含む前記方法を提供することも可能である。幹細胞は場合によってＴＧＦβ１を発現することも可能である。
【００４１】
場合によって、本発明の側面および態様には、Mantonら（Journal of Cellular Physiology 209:219-229(2006)）に記載されるようなＨＳは含まれない。
図面の簡単な説明
本発明の原理を例示する態様および実験は、ここで、付随する図に関連して論じられるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂ。ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合することを示すチャート。（Ａ）ＴＧＦ−β１がヘパリンに結合する能力を決定するＧＡＧ結合プレートアッセイの結果を示すチャート。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。（Ｂ）多様な濃度（５０〜８００ｎＭ）の注入ＴＧＦ−β１に対する結合反応の変化を示すＳＰＲセンソグラム。注入タンパク質の関数として、結合反応（ＲＵ）をプロットすることによって標準曲線を用意した。ヘパリンに対するＴＧＦ−β１結合のＫｄは〜０．４７５μＭと概算された。
【図１−２】図１Ａおよび１Ｂ。ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合することを示すチャート。（Ａ）ＴＧＦ−β１がヘパリンに結合する能力を決定するＧＡＧ結合プレートアッセイの結果を示すチャート。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。（Ｂ）多様な濃度（５０〜８００ｎＭ）の注入ＴＧＦ−β１に対する結合反応の変化を示すＳＰＲセンソグラム。注入タンパク質の関数として、結合反応（ＲＵ）をプロットすることによって標準曲線を用意した。ヘパリンに対するＴＧＦ−β１結合のＫｄは〜０．４７５μＭと概算された。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄ。ヘパリン結合は、ＴＧＦ−β１活性を増強する。（Ａ）ヘパリン（２５μＭ）を伴う（ＴＧＦ−β１＋Ｈｅｐ）または伴わない（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β１（２．５μＭ）およびＤＴＴ（１０ｍＭ）のＤＳＦから得られる融解曲線の一次導関数を示すチャート。各グラフのピークで、各条件下でのＴＧＦ−β１の融解温度を取った。（Ｂ）相対タンパク質レベルを示すウェスタンブロットおよびチャート：細胞を、多様な量（０、１０または４０μｇ／ｍｌ）のヘパリン（Ｈｅｐ）と室温で１０分間プレインキュベーションした、ＴＧＦ−β１（１または５ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして６時間後に溶解した。リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）およびＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ２／３およびアクチン・レベルをウェスタンブロッティングによって決定し、そしてアクチンに比較して濃度測定によって定量化した。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｄ。ヘパリン結合は、ＴＧＦ−β１活性を増強する。（Ｃ）軟骨形成培地（培地）またはヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む軟骨形成培地（培地＋Ｈｅｐ）中で、３日間培養した軟骨形成微量ペレットにおけるＳＯＸ９およびＣＯＭＰの定量的ＰＣＲの結果を示すチャート。エラーバーは標準誤差を示し、ｎ＝３である。（Ｄ）ＤＭＳＯまたはＳＢ４３１５４２（１０μＭ）で処理した後、ｑＰＣＲによって測定した際の、第３日の軟骨形成微量ペレットにおけるＳＯＸ９およびＣＯＭＰ発現の阻害を示すチャート。エラーバーは標準誤差を示し、ｎ＝３である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃ。ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリンの長さの要件。（Ａ）５または１０μｇのヘパリン（Ｈｅｐ）またはサイズ分画されたヘパリン（ｄｐ４〜２４）のいずれかと注入前にプレインキュベーションした際の、２００ｎＭのＴＧＦ−β１の結合反応の変化を示す代表的なＳＰＲセンソグラム。多様なＧＡＧがヘパリン・コーティングチップに対するＴＧＦ−β１結合に関して競合する能力を示す代表的な棒グラフ。２００ｎＭ  ＴＧＦ−β１単独に対してデータを規準化した。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｃ。ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリンの長さの要件。（Ｂ）ＴＧＦ−β１が多様なヘパリン断片（ｄｐ１４〜２４）または未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）に結合する能力を決定する、ＧＡＧ結合プレートアッセイの結果を示すチャート。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝３。（Ｃ）ウェスタンブロット：細胞を、多様なヘパリン断片（ｄｐ１４〜２４）または未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）と室温で１０分間プレインキュベーションした、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして６時間で溶解した。リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）およびＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ２／３およびアクチン・レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃ。ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリン硫酸化要件。（Ａ）注入前に、５または１０μｇのヘパリン（Ｈｅｐ）、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（２−Ｏ−脱）、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（６−Ｏ−脱）またはＮ−脱硫酸化ヘパリン（Ｎ−脱）のいずれかとプレインキュベーションした際の、２００ｎＭのＴＧＦ−β１の結合反応の変化を示す代表的なＳＰＲセンソグラム。多様なＧＡＧが、ヘパリン・コーティングチップに対するＴＧＦ−β１結合に関して競合する能力を示す、代表的な棒グラフ。２００ｎＭ  ＴＧＦ−β１単独に対してデータを規準化した。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｃ。ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリン硫酸化要件。（Ｂ）ＴＧＦ−β１が、選択的に脱硫酸化された（２−Ｏ−脱、６−Ｏ−脱またはＮ−脱）または完全に硫酸化されているヘパリン（Ｈｅｐ）に結合する能力を決定する、ＧＡＧ結合プレートアッセイを示すチャート。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。（Ｃ）ウェスタンブロット：細胞を、多様な選択的に脱硫酸化された（２−Ｏ−脱、６−Ｏ−脱またはＮ−脱）または完全に硫酸化されているヘパリン（Ｈｅｐ）と室温で１０分間プレインキュベーションした、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして６時間で溶解した。リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）およびＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ２／３およびアクチン・レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ＴＧＦ−β１ヘパリン結合部位の同定。（Ａ）ＴＧＦ−β１アミノ酸配列、ならびに保護および標識戦略によって同定されたリジンの位置［配列番号３］。ＴＧＦ−β１の以前公表されたヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を下線で示す。高信頼度（＊）および中程度の信頼度（＾）で同定されたリジンを示す。（Ｂ）ＴＧＦ−β１の予測される３次元構造上にマッピングされた、同定されたリジンの位置（ＰＤＢ：１ＫＬＣ［５１］）。上列、リボンダイヤグラム。下列、対応する分子表面。左列および右列、水平軸周囲のＴＧＦ−β１の１８０°回転。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｆ。アフィニティ選択されたＴＧＦ−β１結合性ＨＳ（ＨＳ１６陽性）の単離。（Ａ）商業的に入手可能なＨＳＰＭからＴＧＦ−β１結合性ＨＳ集団の単離に用いたペプチドを示す成熟ＴＧＦ−β１のアミノ酸配列［配列番号３］。（Ｂ）３Ｈ−ヘパリンに結合するペプチドの能力を決定する、３Ｈ−ヘパリン結合アッセイの結果を示すチャート。ペプチドをニトロセルロース膜上に吸着させ、そして次いで、３Ｈ−ヘパリンへの結合を可能にした。ペプチドに結合しているヘパリンの量をシンチレーションカウンターで定量化した。ＰＢＳは陰性対照として働いた。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝２。（Ｃ）ＴＧＦ−β１ペプチドでのアフィニティ選択後に得られるＨＳ分画のクロマトグラム。ペプチドに結合しないＨＳ（ＨＳ１６陰性）が最初に溶出し、一方、ペプチドに結合するＨＳ（ＨＳ１６陽性）は、１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出する。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｆ。アフィニティ選択されたＴＧＦ−β１結合性ＨＳ（ＨＳ１６陽性）の単離。（Ｄ）商業的に入手可能なＨＳＰＭからＴＧＦ−β１結合性ＨＳ集団を単離するために用いたペプチド（Ｐ４）およびやはり試験した３つの他のペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を示す、成熟ＴＧＦ−β１のアミノ酸配列。（Ｅ）ＰＢＳおよびＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４の各々へのＨＳＰＭの相対結合を示すチャート。（Ｆ）ＨＳ１６のクロマトグラフィ単離を例示するダイヤグラム。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃ。ＨＳ１６陽性の特徴付け。（Ａ）ＨＳ１６陽性（上部）、ＨＳ１６陰性（中央）およびＨＳＰＭ（下部）のプロトンＮＭＲスペクトル。矢印は、３つの糖の間のスペクトル相違を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｃ。ＨＳ１６陽性の特徴付け。（Ｂ）ＨＳ１６陽性、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭのサイズ排除クロマトグラム。ヘパリンサイズ標準（ｄｐ８、１２、２０および２６）の溶出時間をグラフ上に示す。（Ｃ）ヘパリン・リアーゼで消化したＨＳ１６陽性、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭの二糖組成を示すチャート。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｈ。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する。（Ａ）注入前に５または１０μｇのＨＳ１６陽性、ＨＳ１６陰性またはＨＳＰＭのいずれかとプレインキュベーションした際の、２００ｎＭのＴＧＦ−β１の結合反応の変化を示す、代表的なＳＰＲセンソグラム。多様なＧＡＧが、ヘパリン・コーティングチップに対するＴＧＦ−β１結合に関して競合する能力を示す、代表的な棒グラフ。２００ｎＭ  ＴＧＦ−β１単独に対してデータを規準化した。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｈ。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する。（Ｂ）ゲル電気泳動の提示：単独でまたは示すＧＡＧとともにインキュベーションしたＴＧＦ−β１のプラスミン消化。試料を１．５時間消化し、４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして銀染色によって視覚化した。（Ｃ）ウェスタンブロット：細胞を、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｈｅｐ）、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性と室温で１０分間プレインキュベーションした、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして６時間で溶解した。リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）およびＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ２／３およびアクチン・レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｈ。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する。注入前に、５または１０μｇの（Ｄ）ＨＳＰＭ、（Ｅ）ＨＳ１６陽性、（Ｆ）ＨＳ１６陰性、または（Ｇ）ヘパリン（Ｈｅｐ）のいずれかとプレインキュベーションした際の、２００ｎＭのＴＧＦ−β１の結合反応の変化を示す代表的なＳＰＲセンソグラム。
【図８−４】図８Ａ〜８Ｈ。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する。注入前に、５または１０μｇの（Ｄ）ＨＳＰＭ、（Ｅ）ＨＳ１６陽性、（Ｆ）ＨＳ１６陰性、または（Ｇ）ヘパリン（Ｈｅｐ）のいずれかとプレインキュベーションした際の、２００ｎＭのＴＧＦ−β１の結合反応の変化を示す代表的なＳＰＲセンソグラム。
【図８−５】図８Ａ〜８Ｈ。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する。（Ｈ）棒グラフは、多様なＧＡＧが、ヘパリン・コーティング表面に対するＴＧＦ−β１結合に関して競合する能力を示す。明確にするために、いかなるＧＡＧも伴わない（すなわち０μｇ）ＴＧＦ−β１の結合反応は、ヘパリンに関してのみ示される。データを２００ｎＭ  ＴＧＦ−β１単独に対して規準化した。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。
【図９】ヘパリン／ＨＳとＴＧＦ−β１の相互作用に関する模式的モデル。Ｌｙｏｎら（２）によって提唱されるモデルにしたがって、ヘパリン／ＨＳ鎖（実線）は、いずれかの単量体上のＫ２６残基を通じてＴＧＦ−β１と相互作用する。このモデルは、２つのタンパク質単量体の界面間の溝に導かれる、ヘパリン／ＨＳ鎖を伴う。Ｋ１３の位置は、ＴＧＦ−β１への結合に必要な、こうした空間的配向を採用するように、糖鎖を補助するであろう。Ｋｈａｎら（５７）によって最近公表されたヘパリン構造と、予測されるＴＧＦ−β１構造を比較すると、また、いずれかの単量体上のＫ２６残基間の距離を架橋するには、ｄｐ２２ヘパリン断片が十分であることもまた示唆される。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃ。ＨＳ１６陽性はＬＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強する。（Ａ）ウェスタンブロット:細胞を、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｈｅｐ）、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性と室温で１０分間プレインキュベーションした、ＬＴＧＦ−β１（３．３ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして６時間で溶解した。リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）およびＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ２／３およびアクチン・レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。（Ｂ）ヘパリン／ＨＳとＬＴＧＦ−β１の相互作用に関する模式的モデル。図９と同じヘパリン結合モデルをＬＴＧＦ−β１構造（ＰＤＢ：３ＲＪＲ（６０））に適用すると、Ｋ１３残基は、ヘパリン／ＨＳ鎖（赤線）が潜在関連ペプチド（ＬＡＰ、ベージュに色づけ）の成熟ＴＧＦ−β１への結合に干渉するように、その配向を補助することも可能である。（Ｃ）ＬＡＰがどのようにＴＧＦ−β１ホモ二量体周囲に巻き付くかを示すＬＴＧＦ−β１のリボンダイヤグラム。
【図１１】ＴＧＦ−β１合成のプロセスを示すダイヤグラム。ＴＧＦ−β１は、シグナルペプチド（Ｓ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）およびＴＧＦ−β１自体を含有する３９０アミノ酸プレプロタンパク質として合成される。翻訳後、シグナルペプチドが切断され、ジスルフィド結合が２つの単量体の間に形成され、そして次いで、ＬＡＰがＴＧＦ−β１から切断される。ＬＡＰおよびＴＧＦ−β１は、次いで、非共有的に再会合して、小分子潜在複合体（ＳＬＣ）としてもまた知られる、潜在ＴＧＦ−β１（ＬＴＧＦ−β１）を形成する。ジスルフィド結合を黄色に着色する。
【図１２】ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性組成の比較。ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性、およびＨＳＰＭのＢＭＰ−２結合分画であるＨＳ３陽性の間の組成相違を示す棒グラフ。ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陽性組成をＨＰＬＣによって決定し、これはまれなＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ二糖を検出することが不可能であり、一方、ＨＳ３陽性組成は、キャピラリー電気泳動によって決定された。エラーバーは誤差区間を示し、これは、信頼性限界を９５に設定した、スチューデントのｔ分布を用いて決定された。ＨＳ３陽性に関するデータは［Murali, S.ら，骨修復のためのアフィニティ選択ヘパラン硫酸。Biomaterials, 2013, 34(22):p.5594-5605］から引用し、そして比較のために用いた。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅ。ＢＭＰ−２へのＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性結合の比較。注入前に、５または１０μｇの（Ａ）ＨＳＰＭ、（Ｂ）ＨＳ３陽性、（Ｃ）ＨＳ１６陽性または（Ｄ）ヘパリン（Ｈｅｐ）のいずれかとプレインキュベーションした際の、２５ｎＭのＢＭＰ−２の結合反応の変化を示す、代表的なＳＰＲセンソグラム。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｅ。ＢＭＰ−２へのＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性結合の比較。注入前に、５または１０μｇの（Ａ）ＨＳＰＭ、（Ｂ）ＨＳ３陽性、（Ｃ）ＨＳ１６陽性または（Ｄ）ヘパリン（Ｈｅｐ）のいずれかとプレインキュベーションした際の、２５ｎＭのＢＭＰ−２の結合反応の変化を示す、代表的なＳＰＲセンソグラム。
【図１３−３】図１３Ａ〜１３Ｅ。ＢＭＰ−２へのＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性結合の比較。（Ｅ）棒グラフは、多様なＧＡＧがヘパリン・コーティング表面に対するＢＭＰ−２結合に関して競合する能力を示す。明確にするために、いかなるＧＡＧも伴わない（すなわち０μｇ）ＢＭＰ−２の結合反応は、ヘパリンに関してのみ示される。データを２５ｎＭ  ＢＭＰ−２単独に対して規準化した。エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３。
【図１４】ＨＳ１６陽性のＢＭＰ−２増強能。ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性が、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のＢＭＰ−２駆動発現を増強する能力を示す、棒グラフ。エラーバーは、ＳＤを示す、ｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】分化するｈＭＳＣにおける湿重量変化。長期に渡る、ＴＧＦ−β１で処理した（ＴＧＦ−β１）またはＴＧＦ−β１で処理しない（対照）、軟骨形成分化したペレットの重量変化を示すグラフ。エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。＊＊＊対照に比較したＰ＜０．００１。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｅ。分化するｈＭＳＣにおける軟骨形成遺伝子発現。長期に渡る、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１で処理した（ＴＧＦ−β１）または処理しない（対照）（Ａ）ＳＯＸ９、（Ｂ）ＣＯＭＰ、（Ｃ）アグリカン、（Ｄ）コラーゲン２α１型、および（Ｅ）コラーゲン１０α１型ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ。コラーゲン２α１型ｍＲＮＡは、対照ペレットにおいては検出されなかった。エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。対照に比較した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６−２】図１６Ａ〜１６Ｅ。分化するｈＭＳＣにおける軟骨形成遺伝子発現。長期に渡る、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１で処理した（ＴＧＦ−β１）または処理しない（対照）（Ａ）ＳＯＸ９、（Ｂ）ＣＯＭＰ、（Ｃ）アグリカン、（Ｄ）コラーゲン２α１型、および（Ｅ）コラーゲン１０α１型ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ。コラーゲン２α１型ｍＲＮＡは、対照ペレットにおいては検出されなかった。エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。対照に比較した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６−３】図１６Ａ〜１６Ｅ。分化するｈＭＳＣにおける軟骨形成遺伝子発現。長期に渡る、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１で処理した（ＴＧＦ−β１）または処理しない（対照）（Ａ）ＳＯＸ９、（Ｂ）ＣＯＭＰ、（Ｃ）アグリカン、（Ｄ）コラーゲン２α１型、および（Ｅ）コラーゲン１０α１型ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ。コラーゲン２α１型ｍＲＮＡは、対照ペレットにおいては検出されなかった。エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。対照に比較した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂ。初期軟骨形成遺伝子発現に対するヘパリンの影響。示す処理を伴う、軟骨形成培地における分化３日後の、ｈＭＳＣにおける（Ａ）ＳＯＸ９および（Ｂ）ＣＯＭＰ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフ。対照−対照；５  Ｈｅｐ−５μｇ／ｍＬヘパリン；１０  Ｈｅｐ−１０μｇ／ｍＬヘパリン；１  ＴＧＦ−β１−１  ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１；１０  ＴＧＦ−β１−１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１。エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。対照に比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜。１  ＴＧＦ−β１に比較して、＃Ｐ＜０．００５、＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｄ。ｈＭＳＣの軟骨形成遺伝子発現に対する、単離ＨＳ分画の影響。１または１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１（それぞれ１  ＴＧＦ−β１および１０  ＴＧＦ−β１）および１０μｇ／ｍＬの示すＧＡＧを含む軟骨形成培地中で２１日間培養したペレットにおける、（Ａ）ＳＯＸ９、（Ｂ）ＣＯＭＰ、（Ｃ）アグリカンおよび（Ｄ）コラーゲン１０α１型ｍＲＮＡ発現レベルを示すスキャッタープロット。コラーゲン２α１型ｍＲＮＡは、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１で処理したペレットにおいてのみ検出された。中央の線は平均を示し、一方、エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。１  ＴＧＦ−β１に比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。１  ＴＧＦ−β１＋ＨＳ１６陽性データセット中に外れ値があることに注目されたい。
【図１８−２】図１８Ａ〜１８Ｄ。ｈＭＳＣの軟骨形成遺伝子発現に対する、単離ＨＳ分画の影響。１または１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１（それぞれ１  ＴＧＦ−β１および１０  ＴＧＦ−β１）および１０μｇ／ｍＬの示すＧＡＧを含む軟骨形成培地中で２１日間培養したペレットにおける、（Ａ）ＳＯＸ９、（Ｂ）ＣＯＭＰ、（Ｃ）アグリカンおよび（Ｄ）コラーゲン１０α１型ｍＲＮＡ発現レベルを示すスキャッタープロット。コラーゲン２α１型ｍＲＮＡは、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１で処理したペレットにおいてのみ検出された。中央の線は平均を示し、一方、エラーバーはＳＤを示す、ｎ＝３。１  ＴＧＦ−β１に比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。１  ＴＧＦ−β１＋ＨＳ１６陽性データセット中に外れ値があることに注目されたい。
【図１９】成熟ヒト［配列番号３］およびウサギＴＧＦ−β１［配列番号４］の配列整列。成熟ヒトＴＧＦ−β１の予測されるヘパリン結合ドメイン中のアミノ酸残基を下線で示し、そして「保護および標識」技術によって同定されるリジン（Ｋ）を太字で示す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂ。処置群の巨視的スコア。各処置群に関するＩＣＲＳＩスコアのスキャッタープロット。（Ａ）中央の線は平均スコアを示し、エラーバーはＳＥを示す。（Ｂ）線は平均スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明者らは、ＴＧＦβ１のヘパリン結合ドメインを解明するため、配列に基づくアフィニティクロマトグラフィプラットホームを用いた。これは、ＴＧＦβ１結合性ヘパラン硫酸（ＨＳ）分画の濃縮を可能にした。
【００４４】
用語「硫酸」（sulphate）、「硫酸化された」（sulphated）、および「硫酸化」（sulphation）は、それぞれ、「sulfate」、「sulfated」、および「sulfation」と交換可能
に用いられる。
【００４５】
ＨＳ１６
本発明は、ＨＳ１６と呼ばれるヘパラン硫酸分子のクラスに関する。ＨＳ１６分子は、ＴＧＦβ１のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドに結合する、１またはそれより多いグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含有する化合物の混合物を濃縮する方法によって得られうる。特に、ＨＳ１６分子は、アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを含むかまたは該配列からなる、ＴＧＦβ１のヘパラン結合ドメインに結合する、ヘパラン硫酸に関して濃縮することによって得られうる。濃縮プロセスを用いて、ＨＳ１６を単離することも可能である。
【００４６】
本発明はまた、ＨＳ１６が濃縮された化合物の混合物、およびこうした混合物を用いる方法にも関する。
本明細書記載の方法論によって得られうることに加えて、ＨＳ１６はまた、機能的にそして構造的に定義されることも可能である。
【００４７】
機能的には、ＨＳ１６は、アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）を有するかまたは該配列からなるペプチドに結合することが可能である。該ペプチドは、ペプチドの一端または両端に、１またはそれより多いさらなるアミノ酸を含有することも可能であり、またはいくつかの場合、短いアミノ酸リンカー配列（例えば長さ約１〜５アミノ酸）および／またはビオチンなどのタグに付着していることも可能である。
【００４８】
好ましくは、ＨＳ１６は、１００μＭ未満、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたは１００ｐＭの１つ未満のＫＤで、ペプチドに結合する。
【００４９】
好ましくは、ＨＳ１６はまた、１００μＭ未満、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたは１００ｐＭの１つ未満のＫＤで、ＴＧＦβ１タンパク質に結合する。
【００５０】
ＨＳ１６およびＴＧＦβ１タンパク質の間の結合は、以下のアッセイ法によって決定可能である。
ＧＡＧを各ウェル中に固定し、そして次いで、製造者の指示にしたがって、ＴＧＦ−β１に曝露する。簡潔には、３つ組ウェルをまず、標準アッセイ緩衝液（ＳＡＢ：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）中の５μｇ／ｍｌのヘパリン、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性でプレコーティングし、そして次いで、室温で一晩インキュベーションする。プレートを次に、ＳＡＢで３回、注意深く洗浄し、２５０μｌのブロッキング溶液（０．４％ｗ／ｖ魚皮ゼラチン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ中）でブロッキングし、そして３７℃で１時間インキュベーションする。次いで、ＴＧＦ−β１を１００、２００、または４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ブロッキング溶液中に溶解した。プレートをＳＡＢで３回洗浄し、そしてタンパク質の各希釈物（２００μｌ）を３つ組ウェルに分配し、そして３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＡＢでリンスし、そしてブロッキング溶液中、２００μｌの７５０ｎｇ／ｍｌモノクローナルマウス抗ＴＧＦ−β１抗体（ＭＡＢ２４０１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、ＳＡＢで洗浄し、そしてブロッキング溶液中、２００μｌの１μｇ/ｍｌポリクローナルヤ
ギ抗マウスビオチン化抗体（ａｂ６７８８、Ａｂｃａｍ）を添加した。再び、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、ＳＡＢで洗浄し、そしてブロッキング溶液中、２００μｌの２２０ｎｇ／ｍｌ  ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ  ＡＰ（Sigma-Aldrich）を添加し
、３７℃で３０分間インキュベーションし、そして次いでＳＡＢでリンスする。最後に、２００μｌの現像試薬（ＳｉｇｍａＦＡＳＴ  ｐ−ニトロフェニルリン酸、Sigma-Aldrich）を添加し、３７℃で４０分間インキュベーションし、そして１時間以内に４０５ｎｍ
で読み取る。
【００５１】
このアッセイにおいて、吸光度を測定することによって、結合を決定することも可能であり、そして添加されるヘパラン硫酸の非存在下でのＴＧＦβ１タンパク質、またはＴＧＦβ１タンパク質に結合しないヘパラン硫酸が添加されているＴＧＦβ１タンパク質などの対照に比較して決定することも可能である。
【００５２】
表面プラズモン共鳴（実験結果を参照されたい）によって、例えばヘパリン、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性を用いた競合アッセイにおいて、ＴＧＦβ１とＨＳ１６のユニークな相互作用を分析することも可能である。
【００５３】
ＨＳ１６の結合は、好ましくは、非特異的結合とは対照的に特異的であり、そしてＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを含むペプチド、例えば配列番号１との、またはＴＧＦβ１タンパク質との、高アフィニティ結合相互作用を示すヘパラン硫酸の選択を伴う方法によって、ＨＳ１６が他のヘパラン硫酸および／またはＧＡＧから選択可能である背景において、特異的である。
【００５４】
本発明記載のＨＳ１６は、好ましくは、ＴＧＦβ１の熱安定性を増進させ、そして間葉系幹細胞のＴＧＦβ１シグナル伝達および軟骨形成分化を増強する。ＨＳ１６は、ＴＧＦβ１の安定化、および／またはＴＧＦβ１の分解の防止および／またはＴＧＦβ１の持続延長が望ましい、任意の適用に使用を見出す。例えばＨＳ１６は、血小板製品においてＴＧＦβ１を安定化させることに使用を見出す。
【００５５】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完全に消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後のＨＳ１６の二糖組成を以下に示す：
【００５６】
【表１】
2020143293.tif 000002
【００５７】
本発明記載のＨＳ１６には、ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完全に消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供することによって測定した際、ＨＳ１６保持種（ＨＳ１６＋）に関する上記の各二糖に関して示した規準化パーセント値の±１０％（より好ましくは±９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％の１つ）以内の二糖組成を有するヘパラン硫酸が含まれる。
【００５８】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完全に消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供することによって測定した際、ＨＳ１６の二糖組成は、以下のいずれか１つに記載の二糖組成を有することも可能である：
【００５９】
【表２−１】
2020143293.tif 000003
【００６０】
または
【００６１】
【表２−２】
2020143293.tif 000004
【００６２】
または
【００６３】
【表２−３】
2020143293.tif 000005
【００６４】
または
【００６５】
【表２−４】
2020143293.tif 000006
【００６６】
または
【００６７】
【表２−５】
2020143293.tif 000007
【００６８】
または
【００６９】
【表２−６】
2020143293.tif 000008
【００７０】
好ましい態様において、列挙する８つの二糖の総重量パーセントは１００％（場合によって±３．０％以下、または±２．０％以下、±１．０％以下、±０．５％以下）である。
【００７１】
いくつかの態様において、ΔＵＡ，２ＳＧｌｃＮＡｃ，６Ｓの規準化重量パーセントは上記プロファイルにおけるものとは異なる。例えば、ＨＳ１６は、ΔＵＡ，２ＳＧｌｃＮＡｃ，６Ｓを除いて、上述のような規準化重量パーセントで二糖を有することも可能であり、ΔＵＡ，２ＳＧｌｃＮＡｃ，６Ｓは異なる規準化重量パーセントで存在してもよいし、または存在しなくてもよい。
【００７２】
いくつかの態様において、ＨＳ１６は、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６ＳおよびΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃに関する上記規準化重量パーセントを参照することによって定義される。
【００７３】
ＨＳ調製物のヘパリン・リアーゼ酵素消化を、以下のように行うことも可能である：ＨＳ調製物（１ｍｇ）を各々、５００μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ酢酸カルシウムを含有する１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、そして各２．５ｍＵの３つの酵素を添加する；試料チューブを穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）試料を３７℃で一晩（２４時間）インキュベーションし；さらに各２．５ｍＵの３つの酵素を試料に添加し、試料チューブを穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）、３７℃でさらに４８時間インキュベーションし；加熱（１００℃、５分間）によって消化を停止し、そして次いで凍結乾燥し；消化物を５００μＬの水に再懸濁し、そしてアリコット（５０μＬ）を分析のため採取する。
【００７４】
特に、ＨＳ１６を以下のように消化することも可能である：ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性試料を、水（１１００μｌ）中に溶解し、そして濾過し（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＲＣ１５、０．２μｍシリンジフィルター装置、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、＃１７７６１）、いかなる粒子状物質も除去する。さらなるクリーンアップ工程として、濾過した溶液を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１時間、１５℃）によって２０００ＭＷＣＯ膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、＃ＶＳ０２Ｈ９１、２０００ＭＷＣＯ  ＨＹ膜、２ｍＬ限外濾過スピンカラム）に通過させる。残余物を水（３ｘ１ｍｌ）で洗浄し、フィルターから回収して、そして凍結乾燥する。精製ＨＳ試料を水に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、そしてアリコット（２ｘ〜１ｍｌ）の各凍結乾燥試料を分析のために採取する。Brickmanら（Brickman, Y. G., Ford, M. D., Gallagher, J. T., Nurcombe, V., Bartlett, P. F．，およびTurnbull, J. E.（1998） J Biol Chem 273, 4350-4359）の方法に基づくが、ある程度の修飾を伴い、ヘパリン・リアーゼ酵素（ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、Ibex Technologies）を
連続添加することによって、ＨＳ試料を二糖およびオリゴ糖に消化する。乾燥ＨＳ試料を消化緩衝液（５００μｌ；５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）中に再溶解し、そしてヘパリン・リアーゼＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を各試料に添加する。回転ホイール（９ｒｐｍ）上で穏やかに混合しながら試料をインキュベーションする（３７℃、２時間）。ヘパリン・リアーゼＩＩＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を消化物に添加し、そしてさらに１時間（上述のように）インキュベーションする。ヘパリン・リアーゼＩＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を添加し、そして消化物を上述のように１８時間インキュベーションする。最後に、３つのヘパリン・リアーゼすべてのアリコット（５μｌ；５ｍＩＵ）を同時に添加し、そして消化物をさらに２４時間インキュベーションする。加熱（１００℃、５分間）によって酵素消化を終結させる。すべての３つのＨＳ試料を２つ組で消化する。
【００７５】
いくつかの態様において、ＨＳ１６鎖は、約１２〜２６の糖単位（重合度、ｄｐ）を含む。いくつかの態様において、ｄｐ数は、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、または少なくとも２６の１つであることも可能である。場合によって、２６未満であることも可能である。
【００７６】
ＨＳ１６にサイズ分画法を適用することによって、望ましい範囲のサイズ（ｄｐ）を有するＨＳ１６鎖の組成物を調製することも可能である。
ＨＳ１６を同定するため、本発明者らは、ヘパリン結合ドメインを有する特定のポリペプチドへの結合を示すグリコサミノグリカン分子を濃縮する工程を伴う方法を用いた。次いで、単離ＧＡＧ混合物および／または分子を同定し、そしてこれらが、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質を発現している細胞および組織の増殖および分化を調節する能力に関して試験することも可能である。これによって、in vitroおよびin vivoの両方
で、細胞および組織の増殖および分化に対する特定のＧＡＧ糖配列の影響の制御された分析が可能になる。この方法論は、本明細書に援用されるＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００４６９（ＷＯ２０１０／０３０２４４）に記載される。本発明者らは、ＴＧＦβ１に高い結合を有するＧＡＧを単離し、そして特徴付けるために、この方法論をＴＧＦβ１に適用した。
【００７７】
したがって、ＨＳ１６を同定するため、本発明者らは、ヘパリン／ヘパラン結合ドメインを有するタンパク質に結合することが可能なグリコサミノグリカンを単離する方法であって：
（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含み；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペプチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集する
工程を含む、前記方法を提供した。
【００７８】
本発明者らはまた、これらが細胞または組織の増殖または分化を調節する能力によって同定される、単離グリコサミノグリカンも提供した。これを行うため、本発明者らは、細胞および／または組織の増殖および／または分化を刺激するかまたは阻害することが可能なグリコサミノグリカンを同定する方法であって：
（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含み；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペ
プチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集し；
（ｖｉ）ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するタンパク質が存在する細胞または組織に、収集したグリコサミノグリカンを添加し；
（ｖｉｉ）細胞の増殖、細胞の分化、１またはそれより多いタンパク質マーカーの発現の１またはそれより多くを測定する
工程を含む、前記方法を提供した。
【００７９】
本発明者らは、これらの方法を用いて、ＴＧＦＢ１に結合可能なＧＡＧ（これらをＨＳ１６と呼ぶ）を同定し、本発明者らの方法論で用いたポリペプチドは、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）のヘパリン結合ドメインを含んだ。
【００８０】
本発明者らの方法論において、ＧＡＧを含む混合物は、合成グリコサミノグリカンを含有することも可能である。しかし、細胞または組織から得られるＧＡＧが好ましい。ＧＡＧを含む混合物は、好ましくはＨＳＰＭのようなヘパラン硫酸調製物である。好ましい態様において、ＧＡＧはヘパラン硫酸である。
【００８１】
ヘパラン硫酸またはＧＡＧ構成要素を、当業者に周知の一連のルーチンの分離工程（例えば陰イオン交換クロマトグラフィ）によって、組織または細胞試料または抽出物から抽出することも可能である。
【００８２】
ＧＡＧ混合物は、異なるタイプのグリコサミノグリカンの混合物を含有し、これには、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸が含まれることも可能である。好ましくは、固体支持体と接触するＧＡＧ混合物では、ヘパラン硫酸が濃縮されている。ＧＡＧ混合物に対してカラムクロマトグラフィ、例えば弱、中程度または強陰イオン交換クロマトグラフィ、ならびに強陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）を行い、適切な分画を選択することによって、ヘパラン硫酸濃縮ＧＡＧ分画を得ることも可能である。
【００８３】
ＧＡＧを同定するため、例えばＧＡＧ組成または配列を決定するため、あるいはＧＡＧの構造特性を決定するため、収集したＧＡＧをさらなる分析に供することも可能である。ＧＡＧ構造は典型的には非常に複雑であり、そして現在利用可能な分析技術を考慮すると、ＧＡＧ配列構造の正確な決定は、大部分の場合、不可能である。
【００８４】
しかし、収集したＧＡＧ分子を部分的または完全糖消化（例えば亜硝酸によって化学的に、またはリアーゼ、例えばヘパリナーゼＩＩＩを用いて酵素的に）に供して、ＧＡＧの特徴的でありそしてかつ診断的である糖断片を得ることも可能である。特に、二糖（または四糖）を生じる消化を用いて、得られる各二糖の割合を測定することも可能であり、これは、ＧＡＧの特徴的な二糖「フィンガープリント」を提供するであろう。
【００８５】
また、ＧＡＧの硫酸化のパターンを決定し、そしてこれを用いてＧＡＧ構造を決定することも可能である。例えば、ヘパラン硫酸に関して、アミノ糖での、そしてＣ２、Ｃ３およびＣ６位での硫酸化のパターンを用いて、ヘパラン硫酸を特徴付けることも可能である。
【００８６】
二糖分析、四糖分析および硫酸化分析を、他の分析技術、例えば各々、ＧＡＧに関するユニークなスペクトルを提供可能であるＨＰＬＣ、質量分析、およびＮＭＲと組み合わせ
て用いることも可能である。組み合わせると、これらの技術は、ＧＡＧの定義構造特性を提供することも可能である。
【００８７】
例えば、全体のＨＳ調製物、例えばＨＳＰＭ（ここからＨＳ１６が得られていることも可能である）およびＨＳ１６を比較した、ＨＳ１６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図７に示す。本発明記載のＨＳ１６は、図７のＨＳ１６スペクトルに対応する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを有することも可能である。
【００８８】
ＧＡＧおよびヘパリン結合ドメインの間の高アフィニティ結合相互作用は、ＧＡＧが高アフィニティ結合相互作用に寄与する特定の糖配列を含有するであろうことを示す。さらなる工程は、ＧＡＧの完全または部分的糖配列、あるいは結合相互作用に関与するＧＡＧの重要な部分の決定を含むことも可能である。
【００８９】
ＧＡＧ−ポリペプチド（例えばＨＳ−ポリペプチド）複合体を、グリコサミノグリカン鎖を溶解する剤、例えばリアーゼでの処理に供することも可能である。リアーゼ処理は、ポリペプチドとの結合相互作用に関与しない、結合したＧＡＧの部分を切断することも可能である。ポリペプチドとの結合相互作用に関与するＧＡＧの部分をリアーゼ作用から保護することも可能である。リアーゼを除去した後、例えば洗浄工程後、ポリペプチドに結合したままであるＧＡＧ分子は、ポリペプチドの特異的結合パートナー（「ＧＡＧリガンド」）に相当する。より短いＧＡＧ分子はより低い複雑性を有するため、解離およびＧＡＧリガンド収集後、ＧＡＧリガンドのより高い度合いの構造的特徴付けが予期されうる。例えば、任意の糖配列（すなわち、ＧＡＧリガンド中に含有される単糖の一次（直鎖）配列）、硫酸化パターン、二糖および／または四糖消化分析、ＮＭＲスペクトル、質量分析スペクトルおよびＨＰＬＣスペクトルの任意の組み合わせが、ＧＡＧリガンドの高レベルの構造特性を提供することも可能である。
【００９０】
本明細書において、用語「濃縮する」、「濃縮」、「濃縮された」等は、混合物の相対組成が、１またはそれより多くのこうした実体によって提供される混合物の分画が増加する一方、１またはそれより多くの異なる実体によって提供される混合物の分画が減少するように、改変される（またはされている）プロセス（または状態）を記載する。濃縮によって単離されるＧＡＧは、純粋である、すなわち実質的に１つのタイプのＧＡＧしか含有しないことも可能であるし、またはＧＡＧの異なるタイプの混合物であり続けることも可能であり、該混合物は、出発混合物に比較して、ヘパリン結合ドメインに結合する特定のＧＡＧのより高い比率を有する。
【００９１】
ＨＳ１６は、好ましくは、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質が発現されるかまたは含有される細胞または組織と接触させた際に、機能的影響を示す。機能的影響は、影響を調節するかまたは増強することも可能である。
【００９２】
機能的影響は、特定のタイプの細胞の増殖または１つの細胞タイプの別のものへの分化、あるいは１またはそれより多いタンパク質マーカーの発現を促進する（刺激する）ことであることも可能である。例えば、ＨＳ１６は、幹細胞の特殊化細胞タイプへの分化を促進することも可能である（例えば間葉系幹細胞の結合組織への分化）。
【００９３】
本明細書において、用語「調節効果」は、第一の実体が第二の実体に有する効果であって、単数または複数の別のプロセスにおける第二の実体の正常な機能が、第一の実体の存在によって修飾される、前記効果を意味すると理解される。調節効果は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれであることも可能である。
【００９４】
調節効果は増強効果であることも可能である。用語「増強効果」は、強度を増加させる
効果を意味すると理解される。本発明の好ましい態様において、用語「増強効果」は、第一の実体が第二の実体に対して有する効果であって、単数または複数の別のプロセスにおける第二の実体の強度を増加させる、前記効果を意味すると理解される。本発明のさらなる好ましい態様において、増強効果は、ヘパリン結合因子に対する単離ＧＡＧの効果を意味すると理解され、前記効果は、前記ヘパリン結合因子の強度を増加させる。
【００９５】
本明細書において、「接触」プロセスは、２またはそれより多い別個の実体を緊密な物理的近傍に置くことを伴う。「接触」プロセスは、２またはそれより多い別個の実体を、分子レベルでこれらの２またはそれより多い別個の実体の部分が相互作用することを可能にするために十分な時間、および条件下で、緊密な物理的近傍に置くことを伴う。好ましくは、本明細書において、「接触」プロセスは、１またはそれより多いＧＡＧおよびヘパリン結合因子のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドを所持する化合物混合物を緊密な近傍に置くことを伴う。「接触」プロセスの例には、混合、溶解、膨張、洗浄が含まれる。好ましい態様において、ＧＡＧ混合物およびポリペプチドの「接触」は、共有的であることも可能であるが、好ましくは非共有的に、互いに高アフィニティを示すＧＡＧおよびポリペプチドの間で複合体が形成されるために十分である。
【００９６】
ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを有する、選択されるタンパク質の全長またはほぼ全長一次アミノ酸配列を含むことも可能である。より長いポリペプチドではフォールディングが生じて、ＧＡＧ混合物からヘパリン結合ドメインのマスキングを導く可能性があるため、ポリペプチドは短いことが好ましい。好ましくは、ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含むかまたは該ドメインからなるアミノ酸配列を有し、そして場合によって、ペプチドのＮおよびＣ末端の一方または各々に、１またはそれより多いアミノ酸を含むことも可能である。これらのさらなるアミノ酸は、固体支持体にポリペプチドを付着させるために必要な、ポリペプチドへのリンカーまたは付着分子（例えばタグ、例えばビオチン）の付加を可能にしうる。
【００９７】
本発明者らの方法論の好ましい態様において、ヘパリン結合ドメイン中のアミノ酸の数に加えて、ポリペプチドは、１〜２０以下の、より好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜５のさらなるアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のいずれかを、ポリペプチドのＣおよび／またはＮ末端の一方または両方に含有する。いくつかの態様において、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つを構成する。固体支持体の表面にポリペプチドを接着させるため、ポリペプチドは、好ましくは、分子タグを含むよう修飾され、そして固体支持体表面は、該分子タグに対して高アフィニティを有する対応する分子プローブを取り込むように修飾され、すなわち分子タグおよびプローブは結合対を形成する。タグおよび／またはプローブは：抗体、細胞受容体、リガンド、ビオチン、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはプローブが結合するかまたは別の方式で特異性を持って会合するように設計または設定されることも可能な任意の他の構造のいずれか１つより選択されることも可能である。タグおよびプローブとして使用するために適した好ましい結合対は、ビオチンおよびアビジンである。
【００９８】
ポリペプチドは、関心対象のタンパク質に由来し、本発明の場合はＴＧＦβ１である。「に由来する」によって、ポリペプチドが、関心対象のタンパク質中に存在するヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するため、該ポリペプチドが選ばれ、選択されまたは調製されることを意味する。ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、例えば、ＧＡＧ結合に対するヘパリン結合ドメイン配列の変化の影響を調べるため、関心対象のタンパク質
に現れる形から修飾されていることも可能である。
【００９９】
本明細書において、タンパク質はＴＧＦＢ１である。好ましいヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）である。
当業者によって、特定のポリペプチドのアミノ酸配列の小さな変動は、その部分の生得的な機能が維持されることを可能にしうることが理解される。ペプチド内の特定のアミノ酸残基の、等比体積のおよび／または等電子数の他のアミノ酸残基での置換が、未置換ペプチドの特定の特性を維持するかまたは改善するかいずれかでありうることもまた理解される。これらの変動もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸アラニンは、ときに、ペプチドの１またはそれより多くの特性を維持しながら、アミノ酸グリシンに置換可能である（そしてその逆も可能である）。用語「等比体積」は、２つの実体間の空間的類似性を指す。中程度に上昇した温度で等比体積である部分の２つの例は、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチル基である。用語「等電子数」は、２つの実体間の電子類似性を指し、この１例は、２つの実体が同じまたは類似のｐＫａの官能性を所持する場合である。
【０１００】
ヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドは、合成または組換えであることも可能である。
固体支持体は、分子が、直接または間接的に、共有または比共有結合のいずれかを通じて付着可能である表面を有する任意の支持体であることも可能である。固体支持体には、表面に付着するプローブに物理的支持を提供することが可能な任意の支持材料が含まれることも可能である。これはマトリックス支持体であることも可能である。材料は、一般的に、表面へのプローブの付着に関連する条件、およびアッセイ実行中に遭遇するいかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングにも耐えることが可能である。材料は、天然存在、合成、または天然存在材料の修飾であることも可能である。固体支持体は、プラスチック材料（ポリマー、例えばポリ（塩化ビニル）、シクロ−オレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはテフロン（登録商標））、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル））等であることも可能であり、これら自体を用いるかまたは他の材料と組み合わせて用いることも可能である。さらなる剛性材料を考慮することも可能であり、例えばシリカを含むガラス、そしてさらに、例えばバイオガラスとして入手可能なガラスが含まれる。使用可能な他の材料には、多孔性材料、例えば制御孔ガラスビーズが含まれる。例えば表面上に取り込まれた、１またはそれより多い官能基、例えばアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基を有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の材料もまた意図される。
【０１０１】
好ましい固体支持体には、カラム表面上に固定されるポリペプチドを有するカラムが含まれる。表面は、カラムの壁であることも可能であり、そして／またはカラムの中央空間にパッケージングされたビーズによって提供されることも可能である。
【０１０２】
ポリペプチドを固体支持体上に固定することも可能である。固定法の例には：吸着、共有結合、捕捉および膜拘束が含まれる。本発明の好ましい態様において、ポリペプチドおよびマトリックスの間の相互作用は、実質的に永続性である。本発明のさらなる好ましい態様において、ペプチドおよびマトリックスの間の相互作用は、適切には、イオン交換クロマトグラフィに対して不活性である。好ましい配置において、ポリペプチドは、固体支持体表面に付着される。当業者は、化学的にそして／または物理的に２つの実体を互いに付着させるため、選択される非常に多様なオプションを有することが理解される。これらのオプションは、すべて、本発明の範囲内に含まれる。好ましい配置において、ポリペプチドは、ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を通じて、固体支持体に吸着される。
この配置の代表的な例では、ビオチン分子が、ポリペプチドに共有結合し、ビオチン−ポリペプチドコンジュゲートがストレプトアビジンに結合すると、ストレプトアビジンは次に、固体支持体に共有結合している。別の配置において、スペーサーまたはリンカー部分を用いて、ビオチン分子とポリペプチドを、そして／またはストレプトアビジンとマトリックスを連結することも可能である。
【０１０３】
ＧＡＧ混合物と固体支持体を接触させることによって、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体が形成可能となる。固体支持体から混合物の残りを除去することによって、例えば固体支持体を洗浄して、非結合物質を溶出させることによって、これらを混合物の残りから分配する。カラムを固体支持体として用いる場合、ＧＡＧ混合物の非結合構成要素をカラムから溶出し、カラムに結合したＧＡＧポリペプチド複合体を残すことも可能である。
【０１０４】
特定のオリゴ糖は、非特異的方式でポリペプチドと相互作用する可能性もあることが理解される。特定の態様において、非特異的方式でポリペプチドと相互作用するオリゴ糖は、ヘパリン結合因子の影響を調節する１またはそれより多いＧＡＧが濃縮された化合物の混合物に含まれるか、または該混合物から排除されることも可能である。非特異的相互作用の例は、適切なサイズおよび／または形状の分子のポケット内の一時的な拘束である。さらに、これらのオリゴ糖は、ペプチトとまったく相互作用を示さないオリゴ糖よりもより緩慢に溶出する可能性もあることが理解される。さらに、非特異的に結合する化合物は、溶出させるために、特異的方式で（例えばイオン性相互作用を通じて）結合する化合物に関するものと同じ外部刺激の投入は必要としない可能性もあることが理解される。本発明者の方法論は、オリゴ糖の混合物を：ポリペプチドと高アフィニティ様式で結合するもの；ポリペプチと低アフィニティ様式で結合するもの；およびポリペプチドと結合しない、その混合物の構成要素に分離することが可能である。これらの指摘は、各ＧＡＧ−ペプチド対に関して、操作的に定義される。
【０１０５】
ＧＡＧおよびポリペプチドの結合が起こる、固体支持体表面に存在する条件（例えば塩濃度）を変化させることによって、ヘパリン結合ドメインに対して最高のアフィニティおよび／または特異性を有するＧＡＧを選択することも可能である。したがって、関心対象のタンパク質および／または関心対象のタンパク質のヘパリン結合ドメインに対して高い結合アフィニティを有するＧＡＧを得ることも可能である。結合アフィニティ（Ｋｄ）を：１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満の１つから選択することも可能である。
【０１０６】
記載する方法によって得られるＨＳ１６は、in vitroおよび／またはin vivoのある範
囲の適用に有用である可能性もある。in vitroの細胞または組織培養、あるいはin vivo
の細胞または組織のいずれかにおいて、細胞または組織成長および／または増殖および／または分化の刺激または阻害に使用するために、ＨＳ１６を提供することも可能である。
【０１０７】
ＨＳ１６をこうしたプロセスのための配合物として提供することも可能である。例えば、ＨＳ１６を含む培地を提供することも可能である。
ＨＳ１６の存在下で、in vitroの細胞または組織培養から得られる細胞または組織を収集し、そして治療が必要なヒトまたは動物患者内に移植することも可能である。したがって、細胞および／または組織の移植法であって：
（ａ）in vitroで、ＨＳ１６と接触させて、細胞および／または組織を培養し；
（ｂ）細胞および／または組織を収集し；
（ｃ）治療が必要なヒトまたは動物被験体内に細胞および／または組織を移植する
工程を含む、前記方法を提供することも可能である。
【０１０８】
ＨＳ１６と接触させる部分（ａ）において、細胞または組織の成長、増殖または分化を
可能にするために十分な期間、細胞を培養することも可能である。例えば、期間を：少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間または少なくとも４０日間から選択することも可能である。
【０１０９】
別の態様において、ＨＳ１６を、傷害または疾患の防止または治療を含む、医学的治療法で使用するために配合することも可能である。ＨＳ１６および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアーまたはアジュバントを含む医薬組成物または薬剤を提供することも可能である。こうした医薬組成物または薬剤を、傷害または疾患の防止または治療のために提供することも可能である。傷害または疾患の防止または治療のための薬剤製造におけるＨＳ１６の使用もまた提供する。場合によって、本発明記載の医薬組成物および薬剤はまた、ＧＡＧが結合するヘパリン結合ドメインを有する関心対象のタンパク質（すなわちＴＧＦβ１）も含有することも可能である。さらなる態様において、医薬組成物および薬剤は、幹細胞、例えば間葉系幹細胞をさらに含むことも可能である。
【０１１０】
傷害または疾患の防止または治療は、細胞または組織、例えば皮膚を含む結合組織（例えば骨、軟骨、筋肉、脂肪、腱、靱帯）の強化、修復、再生または置換を含むことも可能である。組織の修復のため、新規組織の成長、増殖および／または分化を刺激して、傷害の修復を達成するか、あるいは疾患状態を治癒させるかまたは軽減する（例えば症状の緩和を提供する）ために、ＨＳ１６を含む医薬組成物または薬剤を、傷害または疾患の部位に直接投与することも可能である。医薬組成物または薬剤において、幹細胞を組み合わせることによって、組織の修復または再生を改善することも可能である。
【０１１１】
いくつかの使用は、皮膚の修復または若返りの一部として、皮膚にＨＳ１６の適用を伴うことも可能である。これは、皮膚バリアの修復および／または若返り、ならびに／あるいは皮膚の外見の改善を伴う、療法的および／または美容的適用であることも可能である。例えば、火傷または他の瘢痕の外見を修復するか、若返らせるか、そして／または改善するために、ＨＳ１６を皮膚に適用することも可能である。
【０１１２】
組織の置換のため、患者の傷害または疾患部位での移植用の細胞および／または組織を生成するために、細胞および／または組織のin vitro培養中に、ＨＳ１６を細胞および／または組織と接触させることも可能である。細胞または組織の移植を用いて、傷害または疾患組織の置換によって、患者において、傷害または疾患組織の修復を達成することも可能である。これは、傷害／疾患組織の切除、ならびにＨＳ１６と接触させて細胞および／または組織を培養することによって調製された新規組織の移植を伴うことも可能である。
【０１１３】
本発明記載の医薬組成物および化粧用組成物および薬剤は、したがって：
（ａ）ＨＳ１６；
（ｂ）幹細胞と組み合わせたＨＳ１６；
（ｃ）ＨＳ１６によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えばＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ）を含有するタンパク質と組み合わせたＨＳ１６；
（ｄ）幹細胞およびＨＳ１６によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えばＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ）を含有するタンパク質と組み合わせたＨＳ１６；
（ｅ）ＨＳ１６と接触させた細胞または組織の培養から得られる組織または細胞
の１つを含むことも可能である。
【０１１４】
ＨＳ１６を体性組織、特に結合組織の修復または再生に用いることも可能である。したがって、ＨＳ１６を用いて、結合組織における／への広範囲の疾患および傷害を防止または治療することも可能である。
【０１１５】
組織の修復、再生または置換におけるＨＳ１６の使用は、創傷治癒、例えば創傷治癒の
加速、瘢痕または骨組織の治癒および組織移植における使用を伴うことも可能である。
いくつかの側面において、本発明は、ＨＳ１６の投与を含む、美容的治療に関する。「美容的」は、本明細書において、非療法的である。美容的治療を用いて、皮膚の外見および／またはテクスチャーを改善することも可能である。
【０１１６】
いくつかの側面において、本発明は、ＨＳ１６の投与を含む美容的治療法に関する。本明細書において、用語「美容的方法」には、ＥＰＣ第５３条（ｃ）にしたがって、ヒトまたは動物の体に実施する、手術または療法、あるいは診断法による、ヒトまたは動物の体の治療のための方法は含まれない。美容的方法において、被験体はＨＳ１６の療法的投与を必要としない。
【０１１７】
本発明はまた、ＨＳ１６を含む化粧用組成物も提供する。該組成物を用いて、皮膚の外見を改善することも可能である。化粧用組成物は、以下に記載するように、医薬組成物と類似に配合することも可能である。美容的に有効な量のＨＳ１６を被験体に投与することも可能である。これは、美容的利益を誘導するために有効なＨＳ１６の量である。これは、適切な施術者の健全な判断内にあり、施術者は、活性化合物または活性化合物を含有する組成物の適切な投薬量は、被験者間で多様でありうることを認識するであろう。
【０１１８】
別の側面において、本発明は、ＨＳ１６を含む生物学的足場を提供する。いくつかの態様において、本発明の生物学的足場を、整形外科、血管、装具、皮膚および角膜適用に用いることも可能である。本発明が提供する生物学的足場には、長期放出薬剤送達デバイス、生体弁、生体弁膜（tissue valve leaflets）、薬剤溶出ステント、血管移植片、創傷
治癒または皮膚移植片、および整形外科装具、例えば骨、靱帯、腱、および軟骨が含まれる。
【０１１９】
本発明の別の側面において、組織の修復または再生において使用するためのキットであって、（ｉ）あらかじめ決定した量のＨＳ１６、および（ｉｉ）あらかじめ決定した量のＴＧＦβ１を含む、前記キットを提供する。
【０１２０】
ＨＳ１６を薬学的に許容されうる塩として被験体に投与することも可能である。例えば、本発明の濃縮された混合物の化合物の塩基塩には、限定されるわけではないが、薬学的に許容されうる陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムで形成されるものが含まれる。本発明には、その範囲内に、陽イオン性塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩が含まれる。
【０１２１】
カルボン酸基を所持する本発明の化合物を、投与可能なプロドラッグの形で送達することも可能であることが認識され、ここで、酸部分はエステル化される（−ＣＯ２Ｒ’の形を有する）。用語「プロドラッグ」は、特に、−ＯＲ’基から−ＯＨ基、またはカルボン酸陰イオンへの、in vivoでの変換に関する。したがって、本発明のプロドラッグは、細
胞への薬剤吸着および／または薬剤送達を増進するよう作用することも可能である。プロドラッグのin vivo変換は、細胞性酵素、例えばリパーゼおよびエステラーゼによって、
または化学的切断、例えばin vivoエステル加水分解によって促進されることも可能であ
る。
【０１２２】
本発明の側面にしたがった薬剤ならびに医薬組成物および化粧用組成物は、限定されるわけではないが、疾患または傷害の部位での注射を含む、多様な経路による投与のために配合されることも可能である。薬剤および組成物を液体または固体型で配合することも可能である。液体配合物は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与のために配合されることも可能である。
【０１２３】
投与は「療法的有効量」であることも可能であり、これは個体への利益を示すために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療しようとする障害または疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences，第２０版，２０００，pub. Lippincott, Williams & Wilkinsに見出されうる。
【０１２４】
幹細胞
ＨＳ１６と接触させる細胞には、幹細胞が含まれる。
ＨＳ１６を、幹細胞の増殖および／または分化、ならびに／あるいは幹細胞の系譜拘束に用いることも可能である。
【０１２５】
本明細書において培養し、そして記載する幹細胞は、任意の種類の幹細胞であることも可能である。これらは、全能性、多能性または多分化能であってもよい。これらは、任意の組織に由来する胚性または成体幹細胞であることも可能であり、そして造血幹細胞、神経幹細胞または間葉系幹細胞であることも可能である。好ましくはこれらは成体幹細胞である。
【０１２６】
本明細書において、幹細胞によって、分裂し（すなわち自己再生し）、そして全能性、多能性または多分化能を維持し、そして特殊化細胞を生じさせる能力を有する、任意の細胞タイプを意味する。
【０１２７】
本発明において培養する幹細胞は、存在する培養から得られるかまたは由来するか、あるいは任意の成体、胚性または胎児性組織から直接得られてもよく、こうした組織には、血液、骨髄、皮膚、上皮または臍帯（通常廃棄される組織）が含まれる。
【０１２８】
幹細胞の多分化能は適切なアッセイを使用することによって決定可能である。こうしたアッセイは、１またはそれより多い多能性マーカー、例えばアルカリホスファターゼ活性、ＲＵＮＸ２、オステリックス、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、Ｘ、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロプロテイン２（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（ＣＯＬ２Ａ１）およびＳＯＸ９を検出する工程を含むことも可能である。
【０１２９】
いくつかの好ましい態様において、幹細胞は、例えば結合組織および／または骨細胞、例えば軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞および脂肪細胞に分化することが可能な、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。
【０１３０】
間葉系幹細胞は、最小限に侵襲性である技術によって、骨髄から容易に得ることが可能であり、そしてこれを培養中で拡大して、所望の系譜への分化を可能にすることも可能である。特定の増殖因子の適用によって、分化を誘導することも可能である。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーメンバータンパク質、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、間葉系幹細胞の軟骨形成および骨形成分化の重要な因子である。
【０１３１】
選択的マーカー、例えばＳＴＲＯ−１を用いて、骨髄再増殖に関する潜在能力を示すＣＤ３４＋分画から、間葉系幹細胞を単離し、そして検出することも可能である。これらの細胞表面マーカーは、間葉系幹細胞の細胞表面上でのみ見出され、そしてこれは、細胞の多分化能の指標である。
【０１３２】
適切な間葉系幹細胞は、骨髄吸引物から収集される骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）（例えば、Ｗｅｘｌｅｒら  成体骨髄は、ヒト間葉系「幹」細胞の豊富な供給源であるが、臍帯および可動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）成体血液はそうではない  HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121 (2):368-374，２００３年４月）または臍帯のワルトンゼリー（例えばＴａら  ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞の長期拡大および多能性マーカーアレイの分析  Stem Cells Dev.  ２００９年７月２０日（Ｅｐｕｂ））か
ら得られるかまたはこれに由来することも可能である。
【０１３３】
当該技術分野において周知であるように、適切な分化因子を適用することによって、多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の分化によって、間葉系幹細胞を得ることも可能である。
【０１３４】
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靱帯、および脂肪の構成要素を生成する能力を持つ、多能性前駆細胞である。これらの原始的前駆細胞は、出生後に存在し、そして幹細胞特性を示し、すなわち出現率が低く、そして広範な再生潜在能力を持つ。これらの特性とその発生可塑性が組み合わさり、損傷を受けた組織を置換する潜在的な使用に多大な関心が生じてきている。本質的には、これらの幹細胞を培養して、その数を拡大し、次いで、傷害部位に移植するか、または足場中／上に植え付けた後、適切な組織構築物を生成することも可能である。
【０１３５】
したがって、骨格、筋肉、腱、靱帯および血液修復／再生のための代替アプローチは、特定の組織増殖因子の賢明な選択とともに、再生を支持し、そしてガイドする、伝導性または誘導性足場と組み合わせた、適切な前駆細胞（例えば間葉系幹細胞、軟骨細胞）の選択、拡大および調節である。
【０１３６】
任意の動物またはヒト、例えば非ヒト動物、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目（Rodentia）の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトから幹細胞が得られうる。好ましくはこれらはヒトである。場合によってこれらは非ヒトである。場合によってこれらは非胚性幹細胞である。場合によってこれらは全能性ではない。
【０１３７】
本発明のさらにさらなる側面において、本発明の方法のいずれかによって生成された幹細胞または他の体細胞を含む医薬組成物、あるいはその断片または産物を提供する。医薬組成物は、医学的治療法において有用でありうる。適切な医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含むことも可能である。
【０１３８】
本発明の別の側面において、本発明の任意の方法によって生成される幹細胞または他の細胞を、医学的治療法において使用することも可能であり、好ましくは、医学的治療法であって、治療が必要な個体に、療法的に有効な量の前記薬剤または医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１３９】
本発明記載の培養法および技術を通じて得られる幹細胞および他の細胞を用いて、医学的治療法において使用するための別の細胞タイプに分化させることも可能である。したがって、分化した細胞タイプは、分化することが続いて許可された、記載するような培養法および技術によって得られる幹細胞に由来し、そして幹細胞の産物として見なすことも可能である。場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤とともに、こうした分化した細胞を含む医薬組成物を提供することも可能である。こうした医薬組成物は、医学的治療法において有用でありうる。
【０１４０】
間葉系幹細胞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、元来、骨髄から単離され、そして全部で１０４〜１０５の骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）のうちのわずか１つとして存在する（Friedensteinら  1966）。これらの細胞は、ＣＦＵ−Ｆ（コロニー形成単位線維芽細胞）集団をダビングする（ｄｕｂｂｅｄ）、単細胞前駆体に由来するコロニーを産生することが可能である。ＭＳＣは、現在、脂肪組織（GimbleおよびGuilak 2003；Zukら 2001）、臍帯血（Biebackら 2004；Ericesら 2000；Goodwinら 2001；Koglerら 2004；Wagnerら 2005）および筋肉（Jiangら 2002）を含む、多くの他の組織において同定されてきている。
【０１４１】
多分化能ヒト間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の最小限の基準が、細胞療法に関する国際会議によって示されてきている（Dominiciら Cytotherapy(2006) Vol.8, No.4, 315-317）。
彼らは、ヒトＭＳＣを定義するために、３つの基準:プラスチックへの接着、特定の表面
抗原発現および多分化能分化潜在能力を提唱する。特に、彼らは、「まず、ＭＳＣは、組織培養フラスコを用いた標準培養条件下で維持された際、プラスチック接着性であるはずである。第二に、≧９５％のＭＳＣ集団は、フローサイトメトリーによって測定された際、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現していなければならない。さらに、これらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現を欠いていなければならない（≦２％陽性）。第三に、細胞は、標準的なin vitro分化条件下で、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化可能でなければならない」と述べた。
【０１４２】
Ｄｏｍｉｎｉｃｉらはまた、ＭＳＣを最もユニークに同定する生物学的特性は、標準的in vitro組織培養分化条件を用いて、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞への三系譜間葉系分化の能力であると述べた。彼らは、アリザリンレッドまたはフォンコッサ染色での染色によって、骨芽細胞への分化を立証可能であり、脂肪細胞分化は、オイルレッドＯでの染色によって最も容易に立証可能であり、そして軟骨芽細胞分化は、アルシアンブルーまたはコラーゲンＩＩ型に関する免疫組織化学染色によって立証可能であることを確認した。Dominiciらは、こうしたアッセイのためのキットが商業的に入手可能であり、そして分化の立証は、すべての研究者にとって容易であるはずであると述べる。
【０１４３】
Dominiciらはまた、将来、ヒトＭＳＣを定義するためにやはり使用可能な新規表面マーカーが同定されうることも認識する。現在、３つのこうしたマーカー：ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１が知られる。
【０１４４】
Riderらは、ＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングされていない細胞に比較して、Ｃ
Ｄ９０およびＣＤ１０５の発現を増進したことを報告し、そしてＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングされていない細胞に比較して、脂肪、骨および軟骨への多系譜分化を容易に経ることを立証し、間葉系幹細胞の濃縮のためのアルファ−１インテグリン（ＣＤ４９ａ）選択の使用を支持し、そして骨髄単核幹細胞の異種プールから最も多分化能である細胞を選択するための戦略を提供した（Riderら J. Mol. Hist(2007)38:449-458）。Rider
らはまた、ＣＦＵ−Ｆ細胞がＣＤ４９ａの発現と関連し、ＣＤ４９ａ発現ＣＦＵ−Ｆ細胞がまたＳＴＲＯ−１も同時発現し、そしてＣＤ４９ａを用いて、ヒトに加えてラットおよびマウスからＭＳＣを単離することも可能であり、該分子が濃縮のための保存されたマーカーでありうることを示すことも報告した。
【０１４５】
Gangらは、未分化多能性ヒト胚性幹細胞および胚盤胞段階胚への卵割に関するマーカーとして一般的に用いられる段階特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−４がまた、成体ヒト間葉系幹細胞集団を同定し、そしてＭＳＣを単離するために使用可能であることを報告する（Gangら， Blood 2007;109:1743-1751）。Gangらはまた、クローン原性間質細胞（ＣＦＵ−Ｆ）
、いわゆるＳＴＲＯ−１＋明の濃縮における表面マーカーＳＴＲＯ−１に結合するモノクローナル抗体の使用も記載する。
【０１４６】
グリコサミノグリカン
本明細書において、用語「グリコサミノグリカン」および「ＧＡＧ」は交換可能に用いられ、そしてオリゴ糖を含む分子の大きなコレクションを指すと理解され、ここで１またはそれより多いこれらの結合した糖は、アミノ置換基、またはその誘導体を所持する。ＧＡＧの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
【０１４７】
本明細書において、用語「ＧＡＧ」はまた、ＧＡＧコンジュゲートである分子を含むよう拡大する。ＧＡＧコンジュゲートの例は、プロテオグリコサミノグリカン（ＰＧＡＧ、プロテオグリカン）であり、ここでペプチド構成要素はオリゴ糖構成要素に共有結合する。
【０１４８】
好ましい態様において、ＧＡＧはヘパラン硫酸である。
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、プロテオグリカンの非常に多様な下位群に相当し、そしてタンパク質主鎖に共有結合したヘパラン硫酸グリコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は３つの主要な型：パールカンとして知られる分泌型、グリピカンとして知られる形質膜に係留された型、およびシンデカンとして知られる膜貫通型で存在する。これらは、哺乳動物細胞表面および大部分の細胞外マトリックスの普遍的な構成要素である。アグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質があり、この際、ＨＳ鎖は、より一般的に見られないコアに付着している可能性もある。
【０１４９】
本発明の好ましい態様は、コアタンパク質から単離されたＨＳ鎖に関する。ＨＳ鎖は、コアタンパク質から、例えばノイラミニダーゼ処理によって容易に分離され、そして単離されることも可能である。
【０１５０】
「ヘパラン硫酸」（「ヘパラン硫酸」または「ＨＳ」）は、最初に、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のタンデム反復からなる多糖として、ゴルジ体において合成される。新生多糖は続いて、一連の工程で修飾されうる：ＧｌｃＮＡｃのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、ＧｌｃＡのイズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＣ５エピマー化、ＩｄｏＡおよびＧｌｃＡのＣ２でのＯ−硫酸化、Ｎ−スルホグルコサミン（ＧｌｃＮＳ）のＣ６でのＯ−硫酸化、そしてＧｌｃＮＳのＣ３での時折のＯ−硫酸化。ＨＳのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、２−Ｏ−、６−Ｏ−および３−Ｏ−硫酸化は、それぞれ、ＨＳ  Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳＮＤＳＴ）、ＨＳ  ２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ２ＳＴ）、ＨＳ  ６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ６ＳＴ）およびＨＳ  ３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼの特異的作用によって仲介される。修飾の各段階で、潜在的な基質の一部のみが修飾され、かなりの配列多様性が生じる。ＨＳのこの構造の複雑さのために配列を決定し、そしてＨＳ構造および機能の間の関連を理解することが困難になってきた。
【０１５１】
ヘパラン硫酸側鎖は、（１→４）グリコシド結合を通じて連結された、交互に配置されたＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸およびＤ−グルコサミンからなる。グルコサミンは、しばしば、Ｎ−アセチル化またはＮ−硫酸化され、そしてウロン酸およびグルコサミンはどちらも、さらにＯ−硫酸化されていることも可能である。特定の結合パートナーに対する特定のＨＳＰＧの特異性は、グルコサミンおよびウロン酸に付着した、カルボキシル、アセチルおよび硫酸基の特定のパターンによって生成される。ヘパリンとは対照的
に、ヘパラン硫酸は、より少ないＮおよびＯ−硫酸基およびより多いＮ−アセチル基を含有する。ヘパラン硫酸側鎖は、四糖連結（−グルクロノシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→４）−キシロシル−β−１−Ｏ−（セリン））領域を通じて、コアタンパク質のセリン残基に連結される。
【０１５２】
ヘパラン硫酸鎖およびコアタンパク質はどちらも、生物学的活性に最終的に影響しうる、一連の修飾を経ることも可能である。ＨＳの複雑性は、核酸のものを凌ぐと見なされてきている（Lindahlら， 1998, J. Biol. Chem. 273, 24979；SugaharaおよびKitagawa, 2000, Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 518）。ＨＳ種の変動は、Ｎ−アセチル化グルコサミンを含有する二糖の非硫酸化領域によって分離される、糖残基の非ランダムな非常に硫酸化された配列の合成から生じる。Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−スルホグルコサミンへの最初の変換は、グルクロン酸からイズロン酸へのエピマー化およびグルコサミンまたはイズロン酸に対するＯ−硫酸化の複雑なパターンを含む、他の修飾のためのフォーカスを生じる。さらに、非修飾低硫酸化Ｎ−アセチル化配列内で、ヘキサウロン酸残基はグルクロン酸として残り、一方、非常に硫酸化されたＮ−硫酸化領域において、Ｃ−５エピマーイズロン酸が優勢である。これは、任意の所定の鎖において可能である潜在的な二糖変異体の数を限定するが、各々の存在比を限定しない。成熟鎖において、高硫酸化領域が低硫酸化ドメインに分離されるように、大部分の修飾は、Ｎ−硫酸化ドメイン、またはそれに直接隣接して起こる（本明細書にその全体が援用される、Brickmanら（1998）， J. Biol. Chem. 273(8), 4350-4359）。
【０１５３】
非常に可変性であるヘパラン硫酸鎖が、多数の細胞外リガンドの作用の調節に重要な役割を果たすと仮定され、こうした役割には、自己分泌、接触分泌およびパラ分泌フィードバックループの複雑な組み合わせを通じた、細胞への増殖および接着因子の制御および提示が含まれ、こうして細胞内シグナル伝達を制御し、そしてそれによって幹細胞分化を制御する。例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンは、遺伝子的に記載されている（Albertsら（1989）Garland Publishing, Inc,ニューヨークおよびロンドン，ｐｐ．８０４
および８０５）が、単一供給源から単離されたヘパラン硫酸グリコサミノグリカン種は、生物学的活性が多様でありうる。Brickmanら， 1998, Glycobiology 8, 463に示されるように、神経上皮細胞から得られるヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの２つの別個のプールは、分裂促進状態に応じて、ＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかを特異的に活性化しうる。同様に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）がＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかと相互作用する能力が、ＷＯ  ９６／２３００３に記載される。この特許出願によると、ＦＧＦ−１と相互作用しうるそれぞれのＨＳは、約１１日〜約１３日胚のネズミ細胞から得ることが可能であり、一方、ＦＧＦ−２と相互作用可能なＨＳは、約８日〜約１０日胚で得られうる。
【０１５４】
上述のように、ＨＳ構造は非常に複雑であり、そしてＨＳ間で多様である。実際、ＨＳ構造における変動は、各ＨＳが細胞増殖を促進しそして細胞分化を導く際に異なる活性に向かうように寄与する際に、重要な役割を果たすと見なされる。構造の複雑さは、核酸を凌ぐと見なされ、そしてＨＳ構造は、現在では特定のそしてユニークな硫酸化パターンを有する反復二糖単位の配列として特徴付けられうるが、ＨＳ配列構造を決定するために、核酸配列決定に関して入手可能なものと同等な標準的な配列決定技術は利用可能ではない。定義的なＨＳ配列構造を決定するための単純な方法がないため、ＨＳ分子はいくつかの分析技術によって、当業者により、積極的に同定され、そして構造的に特徴付けられている。これらには、二糖分析、四糖分析、ＨＰＬＣおよび分子量決定の１つまたは組み合わせが含まれる。これらの分析技術は、当業者に周知であり、そして用いられている。
【０１５５】
ＨＳから二糖および四糖を産生するための２つの技術には、亜硝酸消化およびリアーゼ消化が含まれる。これらの消化技術を実行する１つの方法の説明は、純粋に例として以下
に提供され、こうした説明は本発明の範囲を限定しない。
【０１５６】
亜硝酸消化
亜硝酸に基づくヘパラン硫酸の脱重合は、完了した際には、炭水化物鎖の個々の二糖への最終的な分解を導く。
【０１５７】
例えば、亜硝酸は、２５０μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４および０．５Ｍ  Ｂａ（ＮＯ２）２を別個に氷上で１５分間冷却することによって調製可能である。冷却後、Ｂａ（ＮＯ２）２をＨ２ＳＯ４と併せ、そしてボルテックスした後、遠心分離して、硫酸バリウム沈殿物を除去する。１２５μｌのＨＮＯ２を、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁したＧＡＧ試料に添加し、そしてボルテックスした後、時々混合しながら、２５℃で１５分間インキュベーションする。インキュベーション後、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を試料に添加して、ｐＨ６にする。次に、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の１００μｌの０．２５Ｍ  ＮａＢＨ４を試料に添加し、そして混合物を５０℃に２０分間加熱する。次いで、混合物を２５℃に冷却して、そして酸性化氷酢酸を添加して、試料をｐＨ３にする。次いで、混合物を１０Ｍ  ＮａＯＨで中和し、そして凍結乾燥によって体積を減少させる。最終試料をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２カラムに流して、二糖および四糖を分離して、分解の度合いを検証する。
【０１５８】
リアーゼ消化
ヘパリナーゼＩＩＩは、グルクロニド結合で糖鎖を切断する。一連のヘパリナーゼ酵素（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）は、各々、特定の硫酸化認識部位で、特定のヘパラン硫酸配列を脱重合することによって、各々、相対的に特異的な活性を示す。ヘパリナーゼＩは、ＨＳ鎖に沿ってＮＳ領域でＨＳ鎖を切断する。これは、硫酸化ドメインの破壊を導く。ヘパリナーゼＩＩＩは、ＮＡドメインでＨＳを脱重合し、炭水化物鎖の個々の硫酸化ドメインへの分離を生じる。ヘパリナーゼＩＩは、主に、ＨＳ鎖のＮＡ／ＮＳ「肩」ドメインにおいて切断し、このドメインは多様な硫酸化パターンが見られる箇所である。注：ヘパリンポリマーの反復二糖主鎖は、アミノ酸グルコサミンに連結されたウロン酸である。「ＮＳ」は、Ｃ２、Ｃ６およびＣ３の他の基の硫酸化を可能にする、アミノ基上の硫酸基を所持するアミノ糖を意味する。「ＮＡ」は、アミノ基が硫酸化されておらず、そしてアセチル化されたままであることを示す。
【０１５９】
例えば、ヘパリナーゼＩＩＩを用いたＮＡ領域における脱重合のため、酵素および凍結乾燥ＨＳ試料の両方を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび４ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中で調製する。純粋に例として、１μｇのＨＳあたりヘパリナーゼＩＩＩを５ｍＵ添加し、そして３７℃で１６時間インキュベーションした後、７０℃で５分間加熱することによって、反応を停止することも可能である。
【０１６０】
二糖および四糖をカラムクロマトグラフィ、例えばＨＰＬＣによって溶出させることも可能である。あるいは、これらを、キャピラリー電気泳動によって分析することも可能である。
【０１６１】
軟骨および結合組織形成
本発明の別の側面において、軟骨組織形成（軟骨形成）を促進する方法であって、ＨＳ１６を軟骨前駆細胞または軟骨幹細胞に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１６２】
骨または軟骨前駆体または幹細胞を、ＨＳ１６と、場合によって外因性に添加されるＴＧＦβ１タンパク質の存在下で、接触させることによって、骨形成または軟骨組織の形成を刺激するかまたは阻害する方法を、in vitroで行うことも可能である。前駆細胞または幹細胞は間葉系幹細胞であることも可能である。組織形成が促進される場合、形成される
組織を収集し、そしてヒトまたは動物患者内への移植に用いることも可能である。
【０１６３】
したがって、本発明の１つの側面において、結合組織を提供し、ここで、ＨＳ１６（すなわち外因性ＨＳ１６）の存在下、および場合によってＴＧＦβ１（すなわち外因性ＴＧＦβ１）の存在下で、間葉系幹細胞のin vitro培養によって、結合組織が得られる。結合組織は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯または腱であることも可能である。
【０１６４】
ＨＳ１６を用いた疾患の防止または治療は、組織、特に結合組織、例えば骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯または腱の修復、再生または置換を伴うことも可能である。
これらの組織の１つの悪化を有する患者において、悪化部位へのＨＳ１６の投与を用いて、その部位の組織の成長、増殖および／または分化を刺激することも可能である。例えば、投与部位にまたはその近傍に存在する間葉系幹細胞の刺激は、好ましくはＴＧＦβ１もまたその部位に存在した場合に、間葉系幹細胞の増殖および適切な結合組織への分化を導き、それによって損傷を受けた組織の置換／再生ならびに傷害の治療を提供することも可能である。
【０１６５】
あるいは、ＨＳ１６と接触した間葉系幹細胞のin vitro培養から得られる結合組織を収集して、そして傷害または疾患の部位に移植して、損傷を受けたまたは悪化した組織を置換することも可能である。損傷を受けたまたは悪化した組織を、場合によって、まず、傷害または疾患部位から切除することも可能である。
【０１６６】
したがって、ＨＳ１６は、治療を必要とする患者に、場合によってＴＧＦβ１および／または幹細胞と組み合わせて、ＨＳ１６を直接適用することによって達成される、組織修復、再生および／または置換を含む、in vivoでの創傷治癒（例えば瘢痕組織または骨折
の治癒）に有用である。ＨＳ１６はまた、組織修復、再生および／または置換が必要な患者への移植に適した組織のin vitro生成にも有用である。
【０１６７】
軟骨組織の修復および／または再生
いくつかの側面において、本発明は、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷あるいは軟骨組織の喪失または変性を治療するかまたは防止するための、ＨＳ１６の療法的使用（ヒトおよび／または獣医学的）に関する。
【０１６８】
いくつかの態様において、本明細書に記載するようなＨＳ１６投与によって治療されるべき疾患または状態は、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷および軟骨組織の喪失または変性の１つまたはそれより多くに関連する疾患または状態であることも可能である。軟骨分解、損傷または喪失は、軟骨の厚さまたは体積の減少を伴う可能性もある。
【０１６９】
関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷および／または軟骨組織の喪失または変性は、疾患プロセス、生理学的プロセスの結果として、そして／または傷害または外傷の結果として、起こることも可能である。例えば、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷および／または軟骨組織の喪失または変性は、傷害または外傷の結果として始まり、そしてこれらのプロセスの１またはそれより多くが、次いで、疾患および／または生理学的プロセスを通じて進行することも可能である。
【０１７０】
疾患または状態は、関節炎、場合によって外傷または傷害が誘導する関節炎、年齢関連関節炎または非年齢関連関節炎であることも可能である。関節炎は変形性関節症であることも可能である。変形性関節症は、関節の疼痛および関節機能の減少（例えば硬直および／または可動範囲の減少）の臨床的症候群である。症状には、関節疼痛、硬直および関節を動かす際の問題が含まれる。該疾患は、局所的軟骨喪失、骨のリモデリングおよび／または炎症によって、病理学的に特徴付け可能である。関節炎によって最も一般的に影響を
受ける関節は、膝関節、股関節および手足の関節であるが、他の関節もまた影響を受ける可能性もある。
【０１７１】
本発明の方法にしたがって治療されるべき被験体は、これらのプロセスがまだ始まっていない場合であっても、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷および軟骨組織の喪失または変性の１つまたはそれより多くに感受性であることも可能である。被験体は、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷および軟骨組織の喪失または変性の１またはそれより多くと関連する疾患または状態を有する結果として感受性であることも可能である。
【０１７２】
軟骨は、傷害または外傷、または機械的摩耗および裂傷などの物理的プロセス、ならびに／あるいは疾患および生理学的プロセスなどの生物学的プロセスの結果として損傷を受けるかまたは分解することも可能である。物理的プロセスおよび生物学的プロセスが相互作用して、軟骨の喪失、変性、分解または損傷をもたらす。例えば、傷害または外傷または機械的摩耗および裂傷は、軟骨損傷を開始し、そして例えば炎症を通じて生物学的プロセスと結びつき、軟骨の喪失、変性、分解または損傷を達成し、そして加速させる。
【０１７３】
傷害または外傷は、落下またはスポーツ関連障害または外傷の結果であることも可能である。機械的摩耗および裂傷は、肥満および／または反復動作と関連することも可能である。例えば、機械的摩耗および裂傷は、特定の活動の結果として起こることも可能であるし、または特定の職業に関連することも可能である。
【０１７４】
軟骨の喪失、変性、分解または損傷を生じる生物学的プロセスのエフェクターには、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、炎症仲介因子に反応して上方制御される軟骨分解酵素、アグリカナーゼ、コラゲナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＭＭＰ３およびＭＭＰ１３が含まれる。軟骨細胞の異化活性増加は、生物学的プロセスと関連して、軟骨の喪失、変性、分解または損傷を生じる。軟骨細胞の代謝活性は、例えばＳＯＸ−９、ＣＯＬＩＩ、アグリカン、ＣＯＬ１およびＴＳＧ−６などの軟骨遺伝子発現の分析によって、または放射標識の取り込みによって、アッセイ可能である。
【０１７５】
軟骨の喪失、変性、分解、損傷または維持は、長期に渡る軟骨の画像化および／または軟骨の測定によって、決定することも可能である。軟骨の画像化および／または測定は、関心対象の部位、例えば傷害または外傷の部位、あるいは関節炎関節であることも可能である。
【０１７６】
軟骨の喪失、変性、分解または損傷は、当業者に周知のルーチンの方法によって決定可能である。例えば、軟骨の欠損（すなわち損傷）または軟骨喪失は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって、または関節鏡検査によって、決定可能である。
【０１７７】
軟骨喪失、変性または分解は、その関節またはその部位での軟骨の量の以前の測定に比較して、関節または部位における軟骨の量の減少の観察によって、決定可能である。あるいは、軟骨喪失、変性または分解は、軟骨喪失、変性または分解を経験しない同等の関節または部位に比較して、関節または部位の軟骨の量、厚みまたは体積の減少の観察によって、決定可能である。
【０１７８】
関節鏡検査によって観察される軟骨への損傷は、国際軟骨修復協会（ＩＣＲＳ）等級付けシステムにしたがって、以下のように等級付け可能である：
０＝（正常な）健康な軟骨；
１＝軟骨が柔らかいスポットまたは水疱を有する
２＝軟骨中に重大でない裂傷が見える
３＝病変が深い凹部を有する（軟骨層の５０％より深い）
４＝軟骨裂傷が根底にある（軟骨下）の骨を曝露する
等級２／３の軟骨欠損は、原線維状の（fibrillated）または切り刻まれた外見を有し
うる。軟骨への損傷はまた、Pritzkerら， Osteoarthritis Cartilage 2006 14(1):13-29に記載される変形性関節症研究協会国際（ＯＡＲＳＩ）等級付けシステムにしたがって、組織病理学によって評価することも可能である。
【０１７９】
軟骨分解と関連する酵素、または軟骨分解に反応して上方制御されることが知られる遺伝子または酵素の発現および／または活性もまた、軟骨の喪失、変性、分解、損傷または維持を決定するために使用可能である。同様に、軟骨細胞の異化活性をアッセイして、軟骨の喪失、変性、分解、損傷または維持を調べることも可能である。
【０１８０】
療法的有効量の本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与の結果としての、関節破壊または軟骨分解の阻害、あるいは軟骨組織の分解または損傷または喪失の防止または遅延、あるいは有効な軟骨組織の維持は、その関節またはその位置の軟骨量の以前の測定に比較して、関節または位置での軟骨の喪失、変性、分解または損傷が全くないかまたは最小限であることを見出すことによって、決定可能である。あるいは、関節破壊または軟骨分解の阻害、あるいは軟骨組織の分解または損傷または喪失の防止または遅延、あるいは有効な軟骨組織の維持は、未処置対照関節または部位に比較した、関節または部位の軟骨の喪失、変性、分解または損傷の減少または遅延を見出すことによって、決定可能である。
【０１８１】
遺伝子発現、例えば軟骨喪失、変性、分解または損傷に関連する遺伝子の発現は、当業者に周知の多様な方法によって決定可能である。例えば、遺伝子発現のレベルを、試料、例えば生検または組織試料において、定量的リアルタイムＰＣＲによって決定することも可能である。
【０１８２】
軟骨喪失に関連する遺伝子には、限定されるわけではないが、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、炎症仲介因子に反応して上方制御される軟骨分解酵素、アグリカナーゼ、コラゲナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＭＭＰ３およびＭＭＰ１３をコードする遺伝子が含まれる。
【０１８３】
例えば軟骨喪失、変性、分解または損傷に関連するタンパク質または酵素の発現または活性レベルを、当業者に知られるルーチンの方法によって決定可能である。例えば、試料、例えば生検または組織試料におけるタンパク質発現レベルを、イムノブロッティングまたはＥＬＩＳＡによって決定することも可能である。酵素の活性レベルを試料、例えば生検または組織試料において、その酵素の活性に関するレポーターアッセイを用いることにより、決定することも可能である。同様に、試料、例えば生検または組織試料における軟骨細胞の代謝活性を決定することも可能である。
【０１８４】
軟骨分解／破壊／喪失／損傷および／または関節破壊を、軟骨組織の喪失、変性、分解または損傷あるいは関節破壊に関連する疾患または状態の臨床的症状と相関させることも可能であり、そしてしたがって、これらはまた、軟骨分解／破壊／喪失／損傷または関節破壊、軟骨細胞の代謝活性、あるいは軟骨分解酵素の発現および／または活性を調べるかまたは評価するためにも有用でありうる。
【０１８５】
骨折
いくつかの側面において、本発明は、骨折を治療するためのＨＳ１６の療法的使用（ヒトおよび／または獣医学的）に関する。
【０１８６】
骨折は、医学的状態である。本出願において、「骨折」には、骨にひびが入るか、骨が
折れるかまたは削り取られる、骨に対する損傷または傷害が含まれる。骨が折れることは骨の不連続を指す。骨折は、物理的衝撃または機械的ストレス、あるいは骨粗鬆症または変形性関節症などの医学的状態によって引き起こされうる。
【０１８７】
骨折の整形外科的分類には、閉鎖または開放および単純または複雑骨折が含まれる。閉鎖骨折において、皮膚は損なわれていないままであり、開放骨折において、骨は創傷部位を通じて曝露される可能性もあり、これは感染のより高いリスクをもたらす。単純骨折は、単一の線に沿って生じ、骨を２つに分割する傾向がある。複雑骨折は、骨を多数の片に分割する。
【０１８８】
他の骨折タイプには、圧迫骨折、圧縮骨折（compacted fracture）、らせん骨折、完全および不完全骨折、横骨折、線状骨折および斜骨折および粉砕骨折が含まれる。
大部分の被験体において、骨治癒（骨折治癒）は自然に生じ、そして傷害後に開始される。出血は、通常、凝固、ならびに白血球および線維芽細胞の誘因を導き、その後、コラーゲン繊維が産生される。この後、骨マトリックス（カルシウムヒドロキシアパタイト）沈着（ミネラル化）がコラーゲンマトリックスを骨に変換する。未成熟再生骨は、典型的には成熟骨よりも弱く、そして未成熟骨は、時間を掛けて、リモデリングプロセスを経て、成熟「層状」骨を産生する。完全骨治癒プロセスにはかなりの時間が掛かり、典型的には数ヶ月要する。
【０１８９】
骨折が起き、そしてＨＳ１６を用いた治療から利益を得る可能性がある骨には、すべての骨タイプ、特にすべての哺乳動物骨が含まれ、限定されるわけではないが、長骨（例えば大腿骨、上腕骨、指骨）、短骨（例えば手根骨、足根骨）、平板骨（例えば頭蓋骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盤帯）、不規則骨（例えば椎骨）、種子骨（例えば膝蓋骨）が含まれる。
【０１９０】
骨折が起き、そしてＨＳ１６を用いた治療から利益を得る可能性がある骨には、骨格の骨（すなわち骨格の任意の骨）、頭蓋顔面領域の骨、中軸骨格の骨（例えば椎骨、肋骨）、四肢の骨（例えば肢の骨）、骨盤骨格の骨（例えば骨盤）が含まれる。
【０１９１】
骨折が起き、そしてＨＳ１６を用いた治療から利益を得る可能性がある骨にはまた、顔、例えば顎、鼻および頬のものを含む、頭部（頭蓋）および首のものも含まれる。ＨＳ１６を用いて、歯科または顔面または頭蓋手術中の骨の修復または再生を補助することも可能であり、これには、例えば顎骨を含む、顔および／または口骨（歯とは異なる）の再構築が含まれうる。
【０１９２】
骨折にはまた、骨粗鬆症の被験体によって示されるような、病的多孔性が含まれる。
本発明を限定するわけではないが、ＨＳ１６の一次作用は、創傷部位内の、該部位に隣接する、または該部位内に遊走が誘導された細胞に対するものであることも可能であり、そして該作用は、間葉系幹細胞、骨幹細胞、プレ骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは創傷床内に見られるかまたは遊走が誘導される任意の補助または血管原性細胞に対するものであることも可能である。
【０１９３】
ＨＳ１６、ならびにＨＳ１６を含む医薬組成物および薬剤を、哺乳動物被験体における骨折の治療法において使用するために提供する。治療は、骨における創傷治癒を含むことも可能である。治療は、骨の修復、再生および増殖を伴うことも可能である。ＨＳ１６は、新規骨増殖を促進することによって、骨折修復を促進する。ＨＳ１６は、骨折修復の速度を改善するように働き、骨治癒がより迅速に起こることを可能にし、傷害からの回復時間の改善を導く。治療は骨強度改善を導きうる。
【０１９４】
治療にはまた、骨粗鬆症または変形性関節症の治療も含まれうる。
ＨＳ１６の投与は、好ましくは、骨折を取り巻く組織に対するものである。これには、骨折が起きた骨組織への直接の投与も含まれうる。投与は、骨または骨折を取り巻く結合組織に対するもの、あるいは骨の近傍であり、そして骨に供給する血管系（例えば血管）であることも可能である。投与は、傷害部位に対して直接であってもよいし、そして初期創傷治癒によって形成される仮骨に対してであってもよい。本発明記載の薬剤および医薬組成物は、多くの経路による投与用に配合されることも可能である。最も好ましくは、ＨＳ１６は、注射用の流体または液体型で配合される。
【０１９５】
いくつかの態様において、ＨＳ１６は、徐放配合物として、例えば創傷部位に移植するための薬剤カプセル中に配合される。ＨＳ１６を、キャリアー物質（例えばバイオマテリアル）、例えばナノファイバーあるいは生物分解性の紙または織物に付着させるか、これに含浸するか、または浸漬することも可能である。
【０１９６】
ＨＳ１６を含む医薬組成物、薬剤、移植物および装具はまた、ＴＧＦ−β１も含むことも可能である。ＨＳ１６がＴＧＦ−β１に結合する能力のため、ＨＳ１６は、創傷部位にＴＧＦ−β１を送達することを補助するＴＧＦ−β１のキャリアーとして作用しうる。
【０１９７】
投与は、好ましくは、「療法的有効量」であり、これは、対応する未処置骨折に比較して、骨折の治癒を改善するために十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、骨折の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、骨折の性質、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れる。ＨＳ１６用量の単回または多数回投与を、処方する医師の指導にしたがって、投与することも可能である。純粋に例として、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５ｎｇ／ｍｌ、そして場合によって１０ｎｇ／ｍｌまたはそれより多い投薬量でＨＳ１６を送達することも可能である。個々のＨＳ１６投薬量は、１ｍｇ未満であり、そして１μｇより多い桁であることも可能であり、例えば約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約０．５ｍｇ、または約１ｍｇの１つであることも可能である。上述の技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第２０版， 2000, Lippincott, Williams & Wilkins刊行に見出されうる。
【０１９８】
ＨＳ１６を用いて、他の治療、例えば疼痛緩和または抗炎症薬剤、骨の固定および固化、例えばギプス包帯中での傷害肢の固定、例えば骨を再固化させるかまたは骨を取り除いて、ずれ、アンギュレーションまたは脱臼を修正するための外科的介入とともに、骨折を治療することも可能である。手術が必要な場合、外科的処置中に、ＨＳ１６を直接、骨折に投与（例えば適用）することも可能である。
【０１９９】
バイオマテリアル
本発明の医薬組成物および薬剤は、ＨＳ１６でコーティングされ、そして／または含浸されるバイオマテリアルの形を取ることも可能である。バイオマテリアルから移植物または装具を形成することも可能である。こうした移植物または装具を外科的に移植して、組織再生、組織再構築、および／または組織リモデリングを補助することも可能である。
【０２００】
ＨＳ１６を、移植物または装具に適用して、所望の位置での新規組織形成を加速することも可能である。ヘパラン硫酸は、タンパク質とは異なり、特に頑強であり、そして合成バイオ足場の製造、ならびに移植物および装具の適用に必要な溶媒に耐える、はるかにより優れた能力を有することが認識されるであろう。
【０２０１】
バイオマテリアルをＨＳ１６でコーティングまたは含浸してもよい。含浸は、ＨＳ１６
をバイオマテリアルの構成的構成要素と、例えば重合中に混合するか、またはバイオマテリアル内にＨＳ１６を吸着させることによって、バイオマテリアルを形成する工程を含むことも可能である。コーティングは、バイオマテリアル表面上へのＨＳ１６の吸着を含むことも可能である。
【０２０２】
バイオマテリアルは、被験体に投与されるかまたは移植された際に、コーティングまたは含浸ＨＳ１６がバイオマテリアルから放出されることを可能にしなければならない。バイオマテリアル放出動力学は、バイオマテリアルの構造、例えば多孔性を改変することによって、改変可能である。
【０２０３】
ＨＳ１６でのバイオマテリアルのコーティングまたは含浸に加えて、１またはそれより多い生物学的活性分子を、バイオマテリアル上に含浸またはコーティングすることも可能である。例えば：ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＰ−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３；ＶＥＧＦ；コラーゲン；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つである。ＴＧＦ−β１での含浸またはコーティングが好ましい可能性もある。
【０２０４】
ＨＳ１６でコーティングまたは含浸されたバイオマテリアルは、医学的および獣医学的目的の両方に有用でありうる。本発明が、患者の生活の質を改善するか、または動物、例えば交配に使用するために価値ある競走馬の寿命を潜在的に延長させることも可能であることが認識されるであろう。
【０２０５】
バイオマテリアルは、足場またはマトリックス支持体を提供する。バイオマテリアルは、組織における移植に適切であることも可能であり、または投与に適切であることも可能である（例えば溶液中のマイクロカプセルとして）。
【０２０６】
移植物または装具は、生体適合性、例えば非毒性で、そして低免疫原性（最も好ましくは非免疫原性）でなければならない。バイオマテリアルは、創傷治癒が起こるに連れて、バイオマテリアルが分解し、最終的に被験体において、ｉｎ  ｓｉｔｕで再生された組織のみが残るように、生物分解性であることも可能である。あるいは、非生物分解性バイオマテリアルを用いて、例えば大きな不連続に渡る組織再生をガイドし、そして／または治癒中の構造的支持体として作用して、創傷治癒が成功した後、バイオマテリアルの外科的除去が場合によって必要であることも可能である。
【０２０７】
バイオマテリアルは、柔らかく、そして／または柔軟であることも可能であり、例えばヒドロゲル、フィブリンウェブまたはメッシュ、あるいはコラーゲンスポンジであることも可能である。「ヒドロゲル」は、天然または合成であることも可能な有機ポリマーを固化するかまたは凝固して、三次元開放格子構造を生成して、これが水または他の溶液の分子を捕捉して、ゲルを形成する際に形成される物質である。凝固は、凝集、凝固、疎水性相互作用または架橋によって起こることも可能である。
【０２０８】
あるいは、バイオマテリアルは、比較的堅い構造であることも可能であり、例えば固形剤量、例えばプラスチックまたは生物学的不活性金属、例えばチタンで形成されることも可能である。
【０２０９】
バイオマテリアルは、架橋ポリマーによって提供されることも可能な、多孔性マトリックス構造を有することも可能である。マトリックスは、好ましくは、骨増殖に必要な栄養素および増殖因子に対して浸透性である。
【０２１０】
マトリックス構造は、架橋繊維、例えばフィブリンまたはコラーゲン、あるいはアルギ
ン酸ナトリウムの液体フィルム、キトサン、または適切な架橋剤、例えばカルシウム塩を含む他の多糖、ポリアクリル酸、ヘパリンによって形成することも可能である。あるいは、ゲルとして足場を形成し、コラーゲンまたはアルギン酸によって組み立て、当業者に知られる周知の確立された方法を用いて架橋することも可能である。
【０２１１】
マトリックス形成に適したポリマー材料には、限定されるわけではないが、生物分解性／生物吸収可能ポリマーが含まれ、これは：アガロース、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ポリカプロラクトン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノエート、そのコポリマーの群より選択されることも可能であり、あるいは非生物分解性ポリマーが含まれ、これは：酢酸セルロース；酪酸セルロース、アルギン酸セルロース、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、そのコポリマーの群より選択されることも可能である。
【０２１２】
コラーゲンは、その生体適合性ならびに細胞付着および機能を支持する好ましい特性のため、マトリックス構築のための有望な材料である（米国特許第５，０１９，０８７号；Tanaka, S.;Takigawa, T.;Ichihara, S.およびNakamura, T.  生物吸収性ポリグリコール酸−コラーゲン神経ガイドチューブの機械的特性 Polymer Engineering & Science 2006,
46, 1461-1467）。臨床的に許容されうるコラーゲンスポンジは、マトリックスの一例であり、そして当該技術分野に周知である（例えばIntegra Life Sciencesのもの）。
【０２１３】
フィブリン足場（例えばフィブリン接着剤）は、代替マトリックス材料を提供する。フィブリン接着剤は、創傷密封剤、増殖因子を送達するためのリザーバー、そして生物学的移植物の配置および固定の補助として広い臨床的適用に恵まれている（Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti.  組織操作のための増殖因子送達系：材料の展望  Ｅxpert Reviews in Medical Devices. 2006;3(1):29-47；Wong C, Inman E, Spaethe R, Helgerson S. Thromb.Haemost. 2003 89(3):573-582；Pandit AS, Wilson DJ, Feldman DS.  酸性増殖因子（ＦＧＦ−１）の送達のための有効なビヒクルとしてのフィブリン足場。  J. Biomaterials Applications. 2000;14(3);229-242；DeBlois Cote MF. Doillon CJ．  ヘパリン−
線維芽細胞増殖因子フィブリン複合体：コラーゲンに基づく材料へのin vitroおよびin vivo適用。 Biomaterials. 1994;15(9):665-672．）。
【０２１４】
本明細書に援用されるLuong-Vanら（微量被包ヘパラン硫酸のin vitro生体適合性およ
び生物活性 Biomaterials 28(2007)2127-2136）は、ポリカプロラクトンマイクロカプセ
ルからのＨＳの長期局在送達を記載する。
【０２１５】
バイオマテリアルのさらなる例は、ヒドロキシアパタイトまたはヒアルロン酸を取り込むポリマーである。
バイオマテリアルに、さらなる細胞を補充してもよい。例えば、バイオマテリアルに幹細胞、例えば間葉系幹細胞、より好ましくはヒト間葉系幹細胞を「植え付けて」（または同時に合成して）もよい。
【０２１６】
治療されるべき被験体は、任意の動物またはヒトであることも可能である。被験体は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は、非ヒト哺乳動物（例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば乳牛、またはウシ目（order Bos）の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目（order Equidae）の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類）であることも可能である。非ヒト哺乳動物は、家庭のペット、あるいは商業的目的のために飼育されている動物、例えば競走馬、あるいは農場家畜
、例えばブタ、ヒツジもしくはウシであることも可能である。被験体はオスまたはメスであることも可能である。被験体は患者であることも可能である。
【０２１７】
本発明記載の方法を、示すように、in vitroまたはin vivoで実行することも可能であ
る。用語「in vitro」は、培養中の細胞を用いた方法を含むよう意図され、一方、用語「in vivo」は、損なわれていない多細胞生物を用いた方法を含むよう意図される。
【０２１８】
培地
ＨＳ１６（好ましくは単離ＨＳ１６）を含む培地は、任意の種類のものであることも可能であるが、好ましくは液体またはゲルであり、そして他の栄養素および増殖因子（例えばＴＧＦβ１、ＦＧＦ−２）を含有することも可能である。培地を、液体またはゲルに再構成するため、乾燥型、例えば粉末または凍結乾燥型で調製することも可能である。ＨＳ１６は、好ましくは、非微量で存在するであろう。例えば、培地中のＨＳ１６の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ培地〜約１０００ｎｇ／ｍｌ培地の間の範囲であることも可能である。好ましくは、培地中のＨＳ１６の濃度は、約５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、９０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、８０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、７０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、６０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、３０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、あるいは５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満の１つである。
【０２１９】
ヘパラン硫酸の投薬量
in vitroおよびin vivo使用の両方において、ＨＳ１６を約５００ｎｇ／ｍｌまたはそ
れ未満、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、９０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、８０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、７０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、６０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、３０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満；あるいは約１００ｍｇまたはそれ未満、５０ｍｇまたはそれ未満、４０ｍｇまたはそれ未満、３０ｍｇまたはそれ未満、２０ｍｇまたはそれ未満、１０ｍｇまたはそれ未満、５ｍｇまたはそれ未満、４ｍｇまたはそれ未満、３ｍｇまたはそれ未満、２ｍｇまたはそれ未満、あるいは１ｍｇまたはそれ未満；あるいは約０．３〜５μｇ／ｍｌ、０．３〜４、０．３〜３、０．３〜２．５、０．３〜２、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．９、０．３〜０．８、０．３〜０．７、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、１〜２、１〜１．７５、１〜１．５、１〜１．２５、１．２５〜２、１．５〜２、または１．７５〜２μｇ／ｍｌの１つの濃度または投薬量で用いることも可能である。
【０２２０】
いくつかの態様において、療法用量の投与前に、ＨＳ１６のプライミング用量を投与することも可能である。プライミング用量は、活性化されたＴＧＦβ１にプレ結合するように作用することも可能である。プライミング用量および療法用量は、各々、上に提供する値または範囲の１つから、独立に選択されることも可能である。
【０２２１】
配合物
ＨＳ１６を単独で投与することも可能であるが、限定されるわけではないが、薬学的にまたは美容的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、フレーバー剤、および甘味剤を含む、当業者に周知の１またはそれより多い他の薬学的または美容的に許容されうる成分とともに、ＨＳＸを含む薬学的または美容的配合物（例えば組成物、調製物、薬剤）として提示することが好ましい。
【０２２２】
したがって、本発明は、上に定義するような医薬組成物または化粧用組成物、および医薬組成物または化粧用組成物を作製する方法であって、上に定義するような少なくとも１つの活性化合物を、当業者に周知の１またはそれより多い他の薬学的または美容的に許容されうる成分、例えばキャリアー、アジュバント、賦形剤等と混合する工程を含む、前記方法をさらに提供する。別個の単位（例えば錠剤等）として配合する場合、各単位は、あらかじめ決定した量（投薬量）の活性化合物を含有する。
【０２２３】
用語「薬学的に許容されうる」は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比を伴って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題または合併症を伴わず、問題の被験体（例えばヒト）の組織と接触させて使用するために適切である、化合物、成分、材料、組成物、投薬型等に関する。各キャリアー、アジュバント、賦形剤等はまた、配合物の他の成分と適合するという意味でもまた、「許容されうる」ものでなければならない。
【０２２４】
適切なキャリアー、アジュバント、賦形剤等は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,  第１８版， Mack Publishing Company，ペンシルバニア州イーストン，１９９０；
およびHandbook of Pharmaceutical Excipients，第２版,１９９４に見出されうる。
【０２２５】
薬学業に周知の任意の方法によって、配合物を調製することも可能である。こうした方法には、１またはそれより多い付属成分を構成するキャリアーと活性化合物を会合させる工程が含まれる。一般的に、配合物は、活性化合物とキャリアー（例えば液体キャリアー、細分割固形キャリアー等）と均一にそして緊密に合わせ、そして次いで、必要な場合、産物を整形することによって、調製される。
【０２２６】
配合物は、適切に、液体、溶液（例えば水性、非水性）、場合によって生理食塩水溶液、懸濁物（例えば水性、非水性）、エマルジョン（例えば水中油、油中水）、エリキシル、シロップ、舐剤、口内洗浄液、ドロップ、錠剤（例えばコーティング錠剤を含む）、顆粒、粉末、ロゼンジ、トローチ、カプセル（例えば硬および軟ゼラチンカプセルを含む）、カシェー、ピル、アンプル、ボーラス、座薬、ペッサリー、チンキ、ジェル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、油、泡、スプレー、ミスト、またはエアロゾルの形であることも可能である。
【０２２７】
配合物は、適切に、１またはそれより多い活性化合物、および場合によって例えば透過、浸透、および吸収増進剤を含む、１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分が含浸したパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング等として提供可能である。配合物はまた、デポまたはリザーバーの形で適切に提供可能である。
【０２２８】
活性化合物は、１またはそれより多い他の薬学的にまたは美容的に許容されうる成分中に溶解されていても、懸濁されていても、またはこれらと混合されていてもよい。
経口投与（例えば摂取による）に適した配合物には、液体、溶液（例えば水性、非水性）、懸濁物（例えば水性、非水性）、エマルジョン（例えば水中油、油中水）、エリキシル、シロップ、舐剤、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、カシェー、ピル、アンプル、ボーラスが含まれる。
【０２２９】
非経口経粘膜投与に適した配合物には、液体、溶液（例えば水性、非水性）、懸濁物（例えば水性、非水性）、エマルジョン（例えば水中油、油中水）、座薬、ペッサリー、ジェル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、油、ならびにパッチ、絆創膏、デポ、およびリザーバーが含まれる。
【０２３０】
経皮投与に適した配合物には、ジェル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、およ
び油、ならびにパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング、デポ、およびリザーバーが含まれる。
【０２３１】
錠剤は、慣用的手段、例えば圧縮または成形によって、場合によって１またはそれより多い補助成分とともに作製されることも可能である。軟膏は、典型的には、活性化合物およびパラフィンまたは水混和性軟膏基剤から調製される。クリームは、典型的には、活性化合物および水中油クリーム基剤から調製される。望ましい場合、クリーム基剤の水性相には、例えば、少なくとも約３０％ｗ／ｗの多価アルコール、すなわち２またはそれより多いヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールおよびその混合物が含まれることも可能である。局所配合物は、望ましくは、皮膚または他の罹患した領域を通じて、活性化合物の吸収または浸透を増進する化合物を含むことも可能である。こうした皮膚浸透増進剤の例には、ジメチルスルホキシドおよび関連する類似体が含まれる。エマルジョンは、典型的には、活性化合物および油性相から調製され、これは、場合によって、単に乳化剤（別に、エマルジェント（emulgent）としても知られる）を含むことも可能であるし、あるいは、脂肪もしくは油と、または脂肪および油の両方とともに、少なくとも１つの乳化剤の混合物を含むことも可能である。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤とともに含まれる。油および脂肪の両方を含むこともまた好ましい。ともに、安定化剤（単数または複数）を含むまたは含まない乳化剤（単数または複数）は、いわゆる乳化ワックスを構成し、そしてワックスは油および／または脂肪とともに、いわゆる乳化軟膏基剤を構成し、これはクリーム配合物の油性分散相を形成する。適切なエマルジェントおよび乳化安定化剤には、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、およびラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。配合物に適した油または脂肪の選択は、望ましい美容的特性を達成することに基づき、これは、医薬エマルジョン配合物で用いられる可能性が高い大部分の油中の活性化合物の可溶性が非常に低い可能性があるためである。したがって、クリームは、好ましくは、非グリース状で、非染色性で、そしてチューブまたは他の容器からの漏洩を回避するために適切なコンシステンシーを備えた洗浄可能な産物であるべきである。直鎖または分枝鎖、一または二塩基性アルキルエステル、例えばジイソアジピン酸、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコール二エステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシルまたはＣｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして知られる分枝鎖エステルのブレンドを用いてもよく、最後の３つが好ましいエステルである。望ましい特性に応じて、これらを単独で、または組み合わせて使用することも可能である。あるいは、高融点脂質、例えば白色軟パラフィンおよび／または流動パラフィンまたは他のミネラルオイルを用いることも可能である。
【０２３２】
キャリアーが液体である、鼻内投与に適した配合物には、例えば鼻スプレー、点鼻剤、またはエアロゾル投与によるネブライザーによるものが含まれ、活性化合物の水性または油性溶液が含まれる。
【０２３３】
非経口投与に適した配合物（例えば注射による）には、水性または非水性、等張性、発熱物質不含、無菌液体（例えば、溶液、懸濁物、生理食塩水溶液）が含まれ、この中で、活性化合物が溶解され、懸濁され、または別の方式で提供される（例えばリポソームまたは他の微小粒子中）。こうした液体は、さらに、他の薬学的に許容されうる成分、例えば酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、殺菌剤、懸濁剤、増粘剤、および配合物を、意図されるレシピエントの血液（または他の適切な体液）と等張にする溶質を含有することも可能である。賦形剤の例には、例えば、水、生理食塩水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等が含まれる。こうした配合物で使用するために適切な等張性キャリアーの例には、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル溶液、または乳酸化リンゲル注射液が含
まれる。典型的には、液体中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである。配合物を単位用量または多数回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中で、提示することも可能であるし、そして使用直前に、無菌液体キャリアー、例えば注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することも可能である。即時注射溶液および懸濁物を、無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することも可能である。
【０２３４】
ＴＧＦβ１
本明細書において、ＴＧＦβ１は、トランスフォーミング増殖因子ベータ・スーパーファミリーのメンバーである、トランスフォーミング増殖因子１を指す。
【０２３５】
ホモ・サピエンス由来のＴＧＦβ１のアミノ酸配列は、寄託番号ＮＰ＿０００６５１．３（ＧＩ：６３０２５２２２）［配列番号２］の下にＧｅｎｂａｎｋにおいて入手可能である。
【０２３６】
ＴＧＦβ１は、プレプロタンパク質として合成され、続いて、タンパク質分解的切断を経る。単量体は、ジスルフィド架橋を通じて二量体化して、プロＴＧＦβ１二量体を形成する。ＴＧＦβ１二量体は、次いで、切断されて、小分子潜在ＴＧＦβ複合体（ＳＬＣ）を生じ、該複合体において、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）および成熟ペプチドが非共有結合を通じて会合する。大分子潜在ＴＧＦβ１複合体（ＬＬＣ）は、ＳＬＣへの大分子潜在ＴＧＦβ１結合タンパク質（ＬＴＢＰ）の共有結合によって形成される。
【０２３７】
本明細書において、「ＴＧＦβ１」または「ＴＧＦβ１タンパク質」には、プレプロＴＧＦβ１、プロＴＧＦβ１、成熟ＴＧＦβ１、および潜在ＴＧＦβ１が含まれる。プレプロＴＧＦβ１、プロＴＧＦβ１、成熟ＴＧＦβ１および潜在ＴＧＦβ１型は、タンパク質複合体、例えば小分子潜在ＴＧＦβ１複合体または大分子潜在ＴＧＦβ１複合体中に含まれることも可能である。
【０２３８】
本明細書において、「ＴＧＦβ１」には、ＴＧＦβ１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性の１つを有するタンパク質またはポリペプチドが含まれる。
【０２３９】
ＴＧＦβ１タンパク質またはポリペプチドには、好ましくはまた、配列番号１のアミノ酸配列、あるいは配列番号１に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の１つを有するアミノ酸配列を有する、ヘパリン結合ドメインも含まれる。
【０２４０】
ＴＧＦβ１タンパク質またはポリペプチドは、全長ＴＧＦβ１タンパク質またはポリペプチドの断片または一部切除物（truncate）であることも可能である。例えば、ＴＧＦβ１は、プレプロＴＧＦβ１、プロＴＧＦβ１または成熟ＴＧＦβ１ポリペプチドであることも可能である。
【０２４１】
ＴＧＦβ１タンパク質は、任意の動物またはヒト、例えば非ヒト動物、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目の任意の動物由来のものを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば乳牛、またはウシ目の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトからのものであるか、またはそれに由来することも可能である。
【０２４２】
ＴＧＦβ１の投薬量
in vitroおよびin vivo使用の両方において、ＴＧＦβ１をＨＳ１６と組み合わせて用
いることも可能である。本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性ＨＳ１６を培養に添加する。ＴＧＦβ１の適切な濃度または投薬量には、約５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、９０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、８０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、７０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、６０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、３０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満；あるいは約１００ｍｇまたはそれ未満、５０ｍｇまたはそれ未満、４０ｍｇまたはそれ未満、３０ｍｇまたはそれ未満、２０ｍｇまたはそれ未満、１０ｍｇまたはそれ未満、５ｍｇまたはそれ未満、４ｍｇまたはそれ未満、３ｍｇまたはそれ未満、２ｍｇまたはそれ未満、あるいは１ｍｇまたはそれ未満；あるいは約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．１〜１．０、０．１〜１．５、０．１〜０．２．０、０．１〜２．５、０．１〜３．０、０．１〜３．５、０．１〜４．０、０．１〜４．５、０．１〜５．０ｎｇ／ｍｌの１つが含まれる
いくつかの態様において、ＨＳ１６のin vitroおよびin vivoの使用は、外因性ＴＧＦ
β１の添加を排除する。例えば、本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性ＴＧＦβ１は培養に添加されない。
【０２４３】
本発明には、こうした組み合わせが明らかに許可され得ないかまたは明らかに回避される場合を除いて、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
本明細書で用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは見なされないものとする。
【０２４４】
本発明の側面および態様はここで、例として、付随する図を参照しながら例示されるであろう。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本文書に言及するすべての文書が本明細書に援用される。
【０２４５】
本明細書全体にわたって、続く請求項を含めて、背景が別であることを必要としない限り、単語「含む」、および変形、例えば「含む」および「含んでいる」は、言及する整数または工程、あるいは整数または工程群の包含を意味するが、いかなる他の整数または工程、あるいは整数または工程群も排除しないことが理解されるであろう。
【０２４６】
本明細書および付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別のように示さない限り、複数の指示対象が含まれる。範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして表されることも可能である。こうした範囲を示した場合、別の態様には１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までが含まれる。同様に、値を近似値で表した場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。
【実施例】
【０２４７】
実施例１：ヘパリン／ヘパラン硫酸−トランスフォーミング増殖因子−β１相互作用およびシグナル増強のための構造的要件
背景：ヘパリンは、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強することが可能である。
【０２４８】
結果：ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびＴＧＦ−β１の相互作用の分子決定基を
同定した。
結論：ＴＧＦ−β１シグナル増強に影響を及ぼす、ＴＧＦ−β１とヘパリン／ＨＳの相互作用のための定義される構造的要件がある。
【０２４９】
意義：ＨＳ−ＴＧＦ−β１相互作用の理解が、ＴＧＦ−β１療法発展をガイドしうる。
要約
トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）による軟骨形成開始を含めていくつかの生理学的プロセスに関連づけられてきている、ヘパリン結合タンパク質である。本明細書において、本発明者らは、ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合して、そしてｈＭＳＣに関してＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強することが可能であることを示す。この増強は、ＴＧＦ−β受容体を通じたＴＧＦ−β１経路の調節を通じて起こり、そして初期軟骨形成遺伝子の上方制御を導く。分子相互作用および細胞に基づくアッセイはまた、長さ１８〜２２糖（ｄｐ１８〜２２）であり、そして２−Ｏ−硫酸化を欠くヘパリン鎖がＴＧＦ−β１の結合に最適であることもまた立証した。構造プロテオミクスを通じたＴＧＦ−β１およびヘパリンの間の相互作用の照合は、ヘパリン結合に関与するＴＧＦ−β１上の新規リジン残基の同定を可能にした。この情報を元に、本発明者らは、ＴＧＦ−β１に対して増加したアフィニティを有するブタ粘膜ヘパラン硫酸（ＨＳ）の下位分画を単離した。このＴＧＦ−β１結合性ＨＳは、元来の出発ＨＳに比較して、ＴＧＦ−β１および潜在ＴＧＦ−β１両方によりよく結合し、そしてその活性を増強することが可能であった。この研究はまず、ＴＧＦ−β１とヘパリンの相互作用のための構造的要件に関して報告する最初のものである。これはまた、軟骨修復のために、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を調節するＨＳに基づく戦略の開発の基礎を構築し、ここで、外因性タンパク質用量を減少させるかまたは省くことも可能である。
【０２５０】
序論
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）１およびヘパリンは、構造的に関連する直鎖多糖であり、多数の細胞外タンパク質および増殖因子に結合し、そしてその機能を調節することが知られる（１）。トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）は、強力なヘパリン結合性増殖因子（２〜５）であり、線維症（６、７）、皮膚治癒（８）、癌転移（９、１０）および軟骨形成（１１〜１５）において役割を果たすことが示されてきている。ＴＧＦ−β１がヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の軟骨形成分化を駆動し、そして軟骨表現型を維持する能力は、軟骨修復戦略の発展において、ＴＧＦ−β１を特に関心が持たれるものにしている（１３、１５〜１８）。
【０２５１】
当初は成功しているように見えたが、こうしたアプローチは、臨床に移行する際に重大な障壁に直面し、これは、クリアランスを克服するためにＴＧＦ−β１の超生理的な用量がしばしば使用され、そして中程度な用量であってさえ、望ましくない転帰、例えば滑膜炎症を生じることが示されてきているためである（１９、２０）。非生理学的用量の問題とは別に、線維症および発癌を含む、全身副作用を誘発することを防止するために、治療部位に該増殖因子を局在させる、進行中の必要性もある（９、１０、２１）。さらに、ＴＧＦ−β１に対する感受性は、年齢（２２）とともに減少し、したがって、適切なＴＧＦ−β１投薬は、高齢患者にはさらにより大きなリスクを提示する。これらの困難に反応して、外因性増殖因子に関する必要性を減少させるかまたは完全に除去し、治療部位に増殖因子をよりよく局在させ、そしてその送達を制御し、そして増殖因子に対する細胞感受性または該因子のシグナル伝達効率のいずれかをブーストする、新規戦略が開発されてきている。いくつかのグループは、すでに、自己組み立て性ペプチド両親媒性物質の使用を通じて、最初の２つのハードルに取り組んできており（２３、２４）、そしてＴＧＦ−β１の内因性レベルが局所ＭＳＣ分化を駆動するために十分であることを立証してきている（２５）。しかし、合成ペプチド両親媒性物質は、重大な免疫原性リスクを提示し、そして望ましい細胞ターゲット内のシグナル伝達活性を増進する必要性に取り組むことに失敗し
ている。理想的な療法は、外因性ＴＧＦ−β１適用を伴わずに、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を増進するように働くであろう。
【０２５２】
本発明者らのグループは、以前、ＨＳ  ＧＡＧが臨床的に適切ないくつかの増殖因子の効果を調節可能であることを示してきている（２６〜２９）。本明細書において、本発明者らは、ＴＧＦ−β１と、ヘパリンおよびＨＳ会合の作用機構、ならびにｈＭＳＣ内のシグナル伝達の増強を調べる。本発明者らは、ＴＧＦ−β１へのヘパリンの結合が、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体−ＳＭＡＤ２／３経路を通じてその活性を増強し、そしてこうした結合のための構造的要件には特定の制約があることを立証する。さらに、本発明者らは、この情報を、ブタ粘膜ＨＳ（ＨＳＰＭ）とは組成的に異なり、そしてＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強する際により有効である、ＨＳのＴＧＦ−β１結合性集団を単離するために利用する。この研究は、ＴＧＦ−β１−ＨＳ相互作用のさらなる研究に路を開き、そして組織修復のためにｈＭＳＣの振る舞いを制御するためのＨＳに基づく戦略の開発を補助する。
【０２５３】
実験法
ヒトＭＳＣ単離および細胞培養
初代ｈＭＳＣ（Lonza）は、以前記載されるように、プラスチック接着によって若い健
康な成人ドナーの骨髄単核細胞から単離され、そして特徴付けられた（３０、３１）。接着細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ−低グルコース（１０００ｍｇ／ｌ、ＤＭＥＭ−ＬＧ）からなる基本培地中で維持し、そして加湿大気中、３７℃および５％ＣＯ２の標準条件下で培養した。培地を３日ごとに取り替えた。７５〜８０％集密に到達した際、細胞を０．１２５％トリプシン／Versene（ｐＨ７．０）で剥離させ、
そして同じ培養条件下で３，０００細胞／ｃｍ２の密度で再プレーティングした。すべての実験を第５継代で行った。
【０２５４】
軟骨形成分化
Ｚｈａｎｇら（３２）に記載されるように、修飾微量培養系を用いて、軟骨形成分化を行った。簡潔には、第４継代のｈＭＳＣを採取し、そして化学的に定義された軟骨形成培地（ＰＴ−３００３、Lonza）中に、２ｘ１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、１２
．５μｌの小滴を２４ウェルプレート中の各ウェルの中央に植え付け、そして３７℃で２時間接着させ、その後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（１００−２１Ｃ、PeproTech）
のみ（培地）またはＴＧＦ−β１と１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma-Aldrich）（培地
＋Ｈｅｐ）のいずれかを補った５００μｌの軟骨形成培地を各ウェルに添加した。細胞小滴は、２４時間後に球状の塊に合体し、そして微量を第３日に採取した。
【０２５５】
ＴＧＦ−β１−ＧＡＧ相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく分析
Hernaizら（３３）によって報告されるプロトコルに基づいて、ビオチン化ヘパリンを
調製した。簡潔には、１ｍｌの水中で２０ｍｇのヘパリンを濾過滅菌し（０．２２μｍ）し、そして２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の８．６μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）（Pierce）と４℃で２時間インキュベーションした。次いで、ビオチン化ヘパリンを徹底的に透析し（７０００  ＭＷＣＯ）、未反応ビオチンを除去した。Biacore T100（GE Healthcare）上の固定ウィザードを
用いて、ビオチン化ヘパリンのストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ（GE Healthcare）上への固定を行い、ターゲット固定レベルはおよそ４０反応単位（ＲＵ）であった
。ＨＢＳ−ＥＰ流動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Tween20、ｐＨ７．４）を固定に用いた。
【０２５６】
ＨＢＳ−ＥＰ−０．１流動緩衝液（０．０５％の代わりに０．１％（ｖ／ｖ）Tween20
）中で希釈した一連のＴＧＦ−β１タンパク質試料（５０〜８００ｎＭ最終濃度）を調製
することによって、ＴＧＦ−β１−ヘパリン相互作用を達成した。競合結合実験のため、ＨＢＳ−ＥＰ−０．１中の最終濃度２００ｎＭのＴＧＦ−β１を、５または１０μｇの以下のＧＡＧの１つのいずれかと混合した：ヘパリン（Ｈｅｐ）；サイズ分画ヘパリン（重合の度合いｄｐ４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４）（Iduron）；選択的脱硫酸化ヘパリン（２−Ｏ−脱硫酸化、６−Ｏ−脱硫酸化およびＮ−脱硫酸化）（Iduron）；ＨＳＰＭ（ＨＯ−０３１０３、Celsus Laboratories）；アフィニ
ティ単離ＴＧＦ−β１結合性ＨＳ（ＨＳ１６陽性）；またはＴＧＦ−β１非結合性ＨＳ（ＨＳ１６陰性）。次いで、試料溶液を、ヘパリン・コーティングチップ上に、３０μｌ／分の流速で１２０ｓ注入し、ＨＢＳ−ＥＰ−０．１を続いて、チップ上にさらに１２００ｓ通過させて、ＴＧＦ−β１の解離を監視した。解離後、チップのセンサー表面を、３０μｌ／分で６０秒間、２Ｍ  ＮａＣｌを注射して２回洗浄し、再生した。時間の関数として反応を２５℃で測定した（センソグラム）。各条件の最大結合反応を、ＴＧＦ−β１のみから得られる反応に対して規準化した。
【０２５７】
ＧＡＧ結合プレートアッセイ
ＴＧＦ−β１がヘパリンに結合する能力を決定するため、本発明者らは、捕捉支持体として、正荷電ＧＡＧ結合プレート（Iduron）を利用した。ＧＡＧを各ウェルに固定し、そして次いで、製造者の支持にしたがって、ＴＧＦ−β１に曝露した。簡潔には、３つ組ウェルをまず、標準アッセイ緩衝液（ＳＡＢ：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）中で調製した５μｇ／ｍｌの全長ヘパリン、サイズ分画ヘパリン（ｄｐ１４、１６、１８、２０、２２および２４）、または選択的に脱硫酸化（ｄｅ３ｅｄ）したヘパリンでプレコーティングし、そして次いで室温で一晩インキュベーションした。プレートを次に、ＳＡＢで３回注意深く洗浄し、２５０μｌのブロッキング溶液（０．４％ｗ／ｖ魚皮ゼラチン、Sigma-Aldrich、ＳＡＢ中）
でブロッキングし、そして３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、ＴＧＦ−β１を１００、２００、または４００ｎｇ／ｍｌの濃度でブロッキング溶液中に溶解した。プレートをＳＡＢで３回洗浄し、そしてタンパク質の各希釈（２００μｌ）を３つ組ウェル内に分配し、そして３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＡＢでリンスし、そして２００μｌの７５０ｎｇ／ｍｌモノクローナルマウス抗ＴＧＦ−β１抗体（ＭＡＢ２４０１、R&D Systems）をブロッキング溶液中に添加した。次いで、プレートを３７℃で１時
間インキュベーションし、ＳＡＢで洗浄し、そして２００μｌの１μｇ／ｍｌのポリクローナル・ヤギ抗マウスビオチン化抗体（ａｂ６７８８、Abcam）をブロッキング溶液中に
添加した。再び、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、ＳＡＢで洗浄し、そして２００μｌの２２０ｎｇ／ｍｌ  ExtrAvidin AP（Sigma-Aldrich）をブロッキング溶液中に添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、そして次いでＳＡＢでリンスした。最後に、２００μｌの現像試薬（SigmaFAST  ｐ−ニトロフェニルリン酸、Sigma-Aldrich）を添加し、３７℃で４０分間インキュベーションし、そして１時間以内に４０５ｎｍで読み取った。
【０２５８】
示差走査型蛍光測定（ＤＳＦ）
以前記載されるように（３４、３５）、7500 Fast Real PCR システム（ソフトウェア
バージョン１．４、Applied Biosystems）上で、ＤＳＦを行った。ヘパリン（２５μＭ）を含みまたは含まず、ＴＧＦ−β１（２．５μＭ）を試験した。ＴＧＦ−β１の融解を促進するため、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を反応混合物に添加した。先に記載されるように（３４）実験を行った。Origin 7（OriginLab社）を用いて、融解曲線の
一次導関数を計算して、多様な条件下でＴＧＦ−β１の融解温度を決定した。実験を３つ組で行ったが、明確にするため、本明細書に提示するデータでは、複製物の平均のみを示す。
【０２５９】
細胞溶解およびウェスタンブロッティング
ヒトＭＳＣを基本培地中、６ウェルプレート中で、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、２４時間培養した。次いで、ＴＧＦ−β１処理を１ｎｇ／ｍｌもしくは５ｎｇ／ｍｌ単独、または１０μｇ／ｍｌもしくは４０μｇ／ｍｌの全長ヘパリン、あるいは１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と１０μｇ／ｍｌサイズ分画または選択的脱硫酸化ヘパリン、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６＋またはＨＳ１６−のいずれかの存在下で調製し、そして室温で１０分間インキュベーションした後、細胞に添加した。潜在ＴＧＦ−β１（ＬＴＧＦ−β１）処理を、同様に３．３ｎｇ／ｍｌ単独または１０μｇ／ｍｌの上述の多様なＧＡＧとともに調製した。阻害剤研究のため、ＴＧＦ−β１で処理する前に、細胞を１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（Sigma-Aldrich）またはＤＭＳＯと３０分間前処理した。次いで、細胞を多様なＴＧ
Ｆ−β１処理に１、６または２４時間供し、そして２ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した後、４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。次いで、試料を、ＳＭＡＤ２／３（＃３１０２、Cell Signaling）、リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２、＃３１０８、Cell Signaling）、リン酸化ＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３、＃９５２０、Cell Signaling）およびアクチン（ＭＡＢ１５０１Ｒ、Millipore）に対する抗体でイムノブロッティング
した。Quantity Oneソフトウェア（バージョン４．６．６、Bio-Rad）を用いて、濃度測
定を行った。
【０２６０】
逆転写および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
製造者のプロトコルにしたがって、ＴＲＩＺＯＬ試薬（In vitrogen、Life Technologies）を用いて、軟骨形成微量ペレットから総ＲＮＡを単離した。製造者の指示にしたがい、４２℃のインキュベーションを１時間ではなく２時間行って、SuperScript（登録商標
）ＶＩＬＯＴＭ  ｃＤＮＡ合成キット（In vitrogen、Ｌife Technologies）を用いて、
１μｇ  ＲＮＡに対して、逆転写を行った。各ｑＰＣＲは、最終体積２０μｌ中、４０ｎｇ  ｃＤＮＡ、遺伝子あたり１μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー−プローブ混合物、および１０μｌ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ普遍的ＰＣＲマスター混合物（Applied Biosystems、Life Technologies）を含有した。熱周期条件は、９５℃で２０
秒間であり、その後、４５周期の９５℃３秒間および６０℃３０秒間が続いた。各ｑＰＣＲを２つ組で実行し、そして遺伝子発現をＨＰＲＴ１発現に対して規準化して、ΔＣｔ値を得た。生物学的３つ組の平均値を取った。ヘパリンを含まない培地中で培養した軟骨形成微量ペレットを、対照（ΔΔＣｔ）として用いた。各プライマーセットの相対発現レベルを２−ΔΔＣｔ法によって倍変化として表した（３６）。以下のＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー−プローブアッセイ（Applied Biosystems、Life Technologies）を用い
た：ＨＰＲＴ１（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１００３２６７＿ｍ１）、ＳＯＸ９（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６５８１４＿ｍ１）およびＣＯＭＰ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６４３５９＿ｍ１）。
【０２６１】
保護および標識
１ｎｍｏｌのＴＧＦ−β１タンパク質および０．１％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭ
ＳＦ界面活性剤（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いてミニカラムからタンパク質を溶出したことを除いて、ＦＧＦ−２に関してＯｒｉらに記載されるように（３７）、「保護および標識」アプローチによって、ＴＧＦ−β１上のヘパリン結合部位を同定した。消化およびビオチン化ペプチドをC18 Zip Tip（Millipore）上で精製し、そして次いでタンデム質量分析（ＭＳ）によって分析した。ＥＡＳＹ−ｎＬＣ（Proxeon）を用いて、最高２μｇのビオ
チン化ペプチドをＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ装置（Thermo）内に注入した。PicoFritTMカラム（ＨＡＬＯ、Ｃ１８、９０Å、２．７μｍ、７５μｍ（ＩＤ）ｘ１００ｍｍ長）（New Objectives）上で、６０分間の直線勾配（０．１％ギ酸中、２〜４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）を用いて、ペプチドを分離した。二重圧力線形イオントラップ中でサーベイＭＳスキャンを獲得する、ＴＯＰ−１０戦略を用いて、データ獲得を行った。ＭＳスキャン範囲は３１０〜１４００ｍ／ｚであり、ＡＧＦターゲット３ｅ４および最大注入時間１０ｍｓであった。１０００を越えるイオン強度および１を除く荷電状態の１０の最も強力なイオ
ンが、４ｅ４の最大ＡＧＦターゲット値まで、最大１００ｍｓで連続して単離され、そして３０％の規準化衝突エネルギーを用いて、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって断片化された。５００の排除リストサイズ、１つの反復カウント、４５秒の反復期間、３０秒の排除期間ならびに１．０低および１．５高の質量幅で、動的排除リストを適用した。失効を無効にした。
【０２６２】
ｉｐｉ．ＨＵＭＡＮ．ｖ３．８６デコイデータベース（１８３，５６８配列）を用い、そして以下のパラメータ：消化、キモトリプシン（ＦＷＹＬ／Ｐ）；最大切断失敗、２；固定修飾、カルバミドメチル（Ｃｙｓ）；ありうる修飾、アセチル（Ｌｙｓ）、アセチル（タンパク質Ｎ末端）、ビオチン（Ｌｙｓ）、酸化（Ｍｅｔ）；親イオン耐性、２Ｄａ；断片化イオン耐性０．８Ｄａを適用して、Ｍａｓｃｏｔ検索（バージョン２．３、Matrix
Science）を用いたデータ分析を行った。２０より高いＭａｓｃｏｔスコアを有するビオチン化ペプチドを手動で検証した。
【０２６３】
３Ｈ−ヘパリン結合アッセイ
ＴＧＦ−β１由来ペプチド（配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ−ＡＨＸ−Ｋ（ビオチン）［ＡＨＸ＝６−アミノヘキサン酸］；［配列番号７］）のヘパリン結合能を決定するため、０．５ｍｇのペプチドを、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再構成した。次いで、ニトロセルロースディスク（６ｍｍ直径）を１ｍｌの再構成ペプチド中で一定に振盪しながら室温で１時間インキュベーションすることによって、ペプチドをニトロセルロースディスク上に吸着させた。ＰＢＳのみの中でインキュベーションしたディスクを陰性対照として使用した。吸着後、真空オーブン中、８０℃および−１０ｍｍＨｇ（−１０  ｉｎ  Ｈｇ）でディスクを４５分間乾燥させ、ＰＢＳで３回洗浄し、そして次いで、１ｍｌの０．１μＣｉ／ｍｌ  ３Ｈ−ヘパリンと、一定に振盪しながら室温で１６時間インキュベーションした。次いで、ディスクをＰＢＳで４回洗浄し、そして結合した３Ｈ−ヘパリンの量をシンチレーションカウンターで測定した。
【０２６４】
ＨＳ１６陽性のアフィニティ単離
上述のＴＧＦ−β１ペプチド配列を用いて、先に記載されるように（２９）、ＨＳ１６陽性の単離を行った。
【０２６５】
簡潔には、３ｍｇのペプチドをＨｉＴｒａｐ  ＴＭストレプトアビジンＨＰカラム（GE
Healthcare、英国バッキンガムシャー）にカップリングさせ、これを次いで、商業的に
入手可能なブタ粘膜ＨＳ（ＨＳＰＭ、Celsus Laboratories Inc、米国オハイオ州）を用
いたアフィニティクロマトグラフィに用いた。ＨＳＰＭを低塩緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中、１ｍｇ／ｍＬで溶解し、流速０．２ｍＬ／分で装填し、そして２３２ｎｍのベースライン吸光度（Ａ２３２）がゼロに到達するまで、同じ緩衝液でカラムを洗浄した。結合したＨＳは、高塩緩衝液（２０ｍＭリン酸、１．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）の単一工程で溶出し、ピーク分画をＡ２３２で監視し、収集し、そして低塩緩衝液で、カラムを再平衡化した。溶出（ＨＶ１６陽性）およびフロースルー（ＨＳ１６陰性）ピークを別個に収集し、凍結乾燥し、ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（GE Healthcare、英国バッキンガムシャー）上で、流速１０ｍＬ／分で脱塩し
、再び凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。
【０２６６】
プロトンＮＭＲ分光測定
ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性試料をプールし、そしてＤ２Ｏ中で３回交換し（乾燥粉末のＤ２Ｏ（０．５〜１ｍＬ）中での溶解、および完全な凍結乾燥までのフリーズドライを３回経過）、そして乾燥重量を決定した。Ｄ２Ｏ溶液として５ｍｍチューブ中、３０℃でＮＭＲ分析を行い、そしてこれには、内部標準としてｔＢｕＯＨ（０．２ｍｇ／ｍＬ）が含まれた。包括的データセットの最適濃度は、ＨＳ調製がおよそ３ｍｇ／
ｍＬであったことを除いて、〜１５ｍｇ／ｍＬ（１Ｈ）であった。プロトン（５００ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルを３チャネルBruker AvanceIII500上で記録した。プローブはＢｒ
ｕｋｅｒ２チャネル５ｍｍブロードバンド核プローブ（３１Ｐ−１０９Ａｇ）であり、アクティブシールド５０Ｇ／ｃｍ  Ｚ軸パルスフィールド勾配を装備した。ＮＭＲスペクトルは、必要に応じて位相修正され、そしてｔＢｕＯＨ（１Ｈ  δ  １．２４ｐｐｍ；１３Ｃ（メチル）δ  ３０．２９ｐｐｍ）を参照した。シグナルの割り当ては、Guerriniら（３８）によって報告されるものに基づいた。
【０２６７】
非変性ＰＡＧＥにおけるＧＡＧのアルシアンブルー／銀染色
ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性試料における多糖鎖のサイズ分布を調べるため、８０Ｖで３０分間プレ泳動して、残渣過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を除去した、１２％非変性ＰＡＧＥゲル上で、各２μｇのＧＡＧを泳動した。Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン）で１ｘに希釈した、４ｘ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）緩衝液（４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０％（ｖ／ｖ）超純粋グリセロール、０．４％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０および４００ｍＭ  ＫＣｌ）で、最終体積２５μＬ中で試料を調製した。分子量ラダーおよびＢＳＡを分子量マーカーとして用いる一方、ヘパリンをアルシアンブルー染色の陽性対照として用いた。次いで、ゲルを２％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．５％（ｗ／ｖ）アルシアンブルーで４５分間染色し、２％（ｖ／ｖ）酢酸中で１５分間脱染色し、そしてＭｉｌｌｉＱ水中で一晩洗浄して、過剰な染色を取り除いた。続いて、ゲルを銀染色して、タンパク質マーカーを可視化し、そしてアルシアンブルー染色ＧＡＧのコントラストを増進させた。
【０２６８】
アフィニティ単離ＨＳのＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィ−屈折率（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ）
Waters 2410屈折率モニター（レンジ６４）を伴うWaters 2690 Allianceシステム上で
、直列にＴＳＫゲルＧ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）およびＴＳＫゲルＧ３０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）（ＴＯＳＯＨ社）を用いて、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラムを得た。ＲＩからの定量化のため、ｄｎ／ｄｃを０．１２９に設定した（３９）。試料を注入し（５０μｇ）、そして０．５ｍｌ／分の流速、室温で、５０ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出させた。データを収集し、そしてDAWN Astraソフトウェア（バージョン４．７３．０４、Wyatt Technologies社）を用いて分析した。分子量（ＭＷ）標準の溶出体積は、同じ条件下で流動させたヘパリンオリゴ糖（IduronおよびDextra Laboratories）の溶出体積に基づいた。これらのカラムの流動時間は、どちらの場合も１０
０分であった。すべてのＧＡＧ試料は、水中で１ｍｇ／ｍｌの濃度であった。
【０２６９】
ヘパリン・リアーゼ酵素でのＨＳ試料の消化
ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性試料を水（１１００μｌ）に可溶化し、そして濾過して（Minisart RC15、０．２μｍシリンジフィルター装置、Sartorius Stedim
、＃１７７６１）、いかなる粒子状物質も除去した。さらなるクリーンアップ工程として、濾過溶液を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１時間、１５℃）によって、２０００  ＭＷＣＯ膜（Vivaspin 2、Hydrosart、Sartorius Stedim、＃ＶＳ０２Ｈ９１、２０００  Ｍ
ＷＣＯ  ＨＹ膜、２ｍＬ限外濾過スピンカラム）に通過させた。残余分を水（３ｘ１ｍｌ）で洗浄し、フィルターから回収し、そして凍結乾燥した。精製ＨＳ試料を水に可溶化し（１ｍｇ／ｍｌ）、そして各凍結乾燥試料のアリコット（２ｘ〜１ｍｌ）を分析のために採取した。Brickmanらの方法（４０）に基づくが、いくつかの修飾を伴い、ヘパリン・リアーゼ酵素（ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、Ibex Technologies）の連続添
加によって、ＨＳ試料を二糖およびオリゴ糖まで消化した。乾燥ＨＳ試料を消化緩衝液（５００μｌ；５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）中に再溶解し、そしてヘパリン・リアーゼＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を各試料に添加した。試料を回転ホイール上で穏
やかに混合しながら（９ｒｐｍ）インキュベーションした（３７℃２時間）。ヘパリン・リアーゼＩＩＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を消化物に添加し、そしてさらに１時間（上述のように）インキュベーションした。ヘパリン・リアーゼＩＩ（５μｌ；５ｍＩＵ）を添加し、そして消化物を上述のように１８時間インキュベーションした。最後に、３つすべてのヘパリン・リアーゼのアリコット（５μｌ；５ｍＩＵ）を同時に添加し、そして消化物をさらに２４時間インキュベーションした。酵素消化を加熱（１００℃、５分間）によって終結させた。すべての３つのＨＳ試料を２つ組で消化し、そしてＵＶ検出（２３２ｎｍ）を伴うＨＰＬＣによって分析した。
【０２７０】
消化したＨＳ試料のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ
２つのＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭペプチド１０／３００ＧＬカラム（３００ｘ１０ｍｍ、GE
Healthcare）を、Waters 2410屈折率検出装置（レンジ６４）を備えたWaters 2690 Allianceシステム上で連続して直列で用いて、ＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを得た。ＲＩからの定量化のためのｄｎ／ｄｃを０．１２９に設定した（３９）。試料（２ｍｇ／ｍｌ）を注入し（５０μｌ；１００μｇ）、そして室温で５０ｍＭ酢酸アンモニウム（０．５ｍｌ／分）で溶出させた。同じ条件下で、ヘパリンオリゴ糖標準（IduronおよびDextra Laboratories）を流動させた。これらのカラムの流動時間は１２０分間であった。データ
を収集し、そしてDAWN Astraソフトウェア（バージョン４．７３．０４、Wyatt Technologies社）を用いて分析した。
【０２７１】
ＨＰＬＣによる二糖組成分析
細菌ヘパリナーゼによる高品質ブタヘパリンの消化から得られる１２の二糖標準をＩｄｕｒｏｎから購入した。二糖を水に溶解する（１ｍｇ／ｍｌ）ことによって、各二糖標準のストック溶液を調製した。二糖標準の検量線を決定するため、各２０μｇ／ｍｌの二糖を含有する標準混合物をストック溶液から調製した。この１２の二糖標準混合物から、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５および０．３１２５μｇ／ｍｌの各二糖を含有する希釈シリーズを調製した。ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性消化物（２ｍｇ／ｍｌ）を水に希釈して、１００μｇ／ｍｌ溶液を得て、そして次いで、親水性ＰＴＦＥ使い捨てシリンジフィルター装置（０．２μｍ、１３ｍｍ、Advantec）を用いて濾過した。ＨＰＬＣ分離条件は、Skidmoreら（４１）のものに基づいた。２３２ｎｍで監視するAgilent 1260 MWD VL検出装置を伴うAgilent 1260 Infinity液体クロマトグラフィシステム（Agilent Technologies）上で、分析を行った。ＨＳ由来二糖を、ガードカラムを含むＰｒｏＰａｃＴＭ  ＰＡ１カラム（Thermo Scientific、４ｍｍｘ２５０ｍｍ）上で
分離した。バイナリ溶媒系を用いて勾配溶出を行った。溶出液ＡはｐＨ３．５の水（ＨＣｌを用いて調整）であり、そして溶出液ＢはｐＨ３．５の２Ｍ  ＮａＣｌ（ＨＣｌで調整）であった。勾配プログラムは以下の通りであった：０〜１分、１００％Ａ、次いで、１〜３２分、０〜３５％Ｂ、次いで、３２〜３７分、３５〜６５％Ｂ、次いで、４７〜５７分、１００％Ｂ、次いで、５７〜６０分、１００％Ａ。注入体積は５０μｌであった。カラムを流速１．０ｍｌ／分で溶出させ、そして４０℃で維持した。ＨＳ消化物中に存在する二糖は、１２の二糖標準混合物において、二糖の溶出時間との比較によって、溶出時間から同定された。ＨＳ１６＋およびＨＳ１６−消化物を２つ組消化物あたり２回注入し（全部で４回注入）、一方、ＨＳＰＭ試料を２つ組消化物あたり１回注入した（全部で２回注入）。
【０２７２】
プラスミン消化
多様なＧＡＧがＴＧＦ−β１をタンパク質分解消化から保護する能力を決定するため、ＴＧＦ−β１（１００ｎｇ）を、ＰＢＳ中、１０μｇのＨｅｐ、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性とともに、あるいは単独のいずれかでプレインキュベーションした。０．５ｍＵのプラスミンをＴＧＦ−β１試料に添加し、そしてこれらを３７℃で１．５時間インキュベーションすることによって、プラスミン消化を実行した。続いて、試料を４
〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、そして銀染色によって視覚化した。すべての試料をＰＢＳ中で１０μｌの最終体積に構成した。
【０２７３】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ
ＢＭＰ−２活性に対するＨＳ１６陽性の影響を決定するため、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を完全Ｃ２Ｃ１２培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）中、２０，０００細胞／ｃｍ２で２つ組で植え付け、そして２４時間付着させた。次いで、完全培地を、１００ｎｇ／ｍＬ
ＢＭＰ−２および／または５μｇ／ｍＬ  ＨＳ１６陽性、ＨＳ３陽性またはＨＳＰＭを含むまたは含まない処理培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）と交換し、そして細胞を３日間インキュベーションした。次いで、総細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem、Merck Millipore、米国マサチューセッツ州）を含有するＲＩＰＡ緩衝液中に収
集し、そしてＢＣＡタンパク質アッセイキット（ThermoFisher Scientific）を用いて、
タンパク質含量を決定した。５μｇのタンパク質とｐ−ニトロフェニルリン酸（Sigma-Aldrich）とともに３７℃で１時間インキュベーションし、そして４０５ｎｍでの吸光度の
変化を読み取ることによって、ＡＬＰ活性を測定した。ＲＩＰＡ緩衝液単独および１μＬ（１０，０００Ｕ／ｍＬ）のウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs Ltd、カナダ
・オンタリオ州）を、それぞれ陰性および陽性対照として用いた。各試料を２つ組で読み取って、処理群あたり総数４の読み取りを得た。
ｈＭＳＣのヘパリナーゼ処理
ＴＧＦ−β１シグナル伝達に対する内因性ＨＳの影響を評価するため、ｈＭＳＣを、１２ウェルプレート中の基本培地中、７，５００細胞／ｃｍ２の密度で植え付け、そして一晩付着させた。次いで、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（各１．２ｍＩＵ／ｍＬ）の組み合わせを各ウェル中の培地に添加し、そして２４時間インキュベーションした。次いで、細胞をＴＧＦ−β１処理に６時間曝露し、１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬ単独のいずれかで調製するか、あるいは１０μｇ／ｍＬまたは４０μｇ／ｍＬの全長ヘパリンいずれかとともに室温で１０分間プレインキュベーションし、そして次いで２ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中、イムノブロッティングのために溶解した。処理を血清不含培地（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ−ＬＧ）中で調製して、新鮮な血清を細胞に添加した際に見られるｐＳＭＡＤのバックグラウンドレベル増加を回避した。
【０２７４】
ヘパリナーゼ消化細胞の免疫蛍光染色
ヘパリナーゼ処理がｈＭＳＣから内因性ＨＳ鎖を有効に取り除いたことを確実にするため、細胞を基本培地中、３，５００細胞／ｃｍ２の密度で、８ウェルチャンバースライド中に植え付けた。細胞を一晩付着させた後、各ウェルに直接添加されるヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（各１．２ｍＩＵ／ｍＬ）の組み合わせで２４時間処理した。続いて、細胞をＰＢＳ中、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定し、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で３０分間ブロッキングし、そして次いで、抗ＨＳ  １０Ｅ４抗体（０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：２５希釈）（AMS Biotechnology、英国アビングドン）と室温で３時間インキュベーション
した。次いで、細胞を抗マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ抗体（０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡＰＢＳ中で１：５００希釈）（BD Pharmingen TM、Becton, Dickinson and Company、米国ニュ
ージャージー州）と室温で４５分間インキュベーションし、そしてHoechst 33342（ＰＢ
Ｓ中２μｇ／ｍＬ）（Life Technologies）で室温で１０分間核染色した。Ｏｌｙｍｐｕ
ｓ  ＩＸ−８１上で試料を画像化した。
【０２７５】
結果
ヘパリンはＴＧＦ−β１に結合し、そしてその活性を増強する
ＴＧＦ−β１シグナル伝達に対するヘパリンの影響を決定するため、本発明者らはまず、ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合可能であることを確実にすることを目指した。ＳＰＲおよびＧＡＧ結合プレートアッセイはどちらも、ＴＧＦ−β１が、９６ウェルプレート中に固定された（図１Ａ）か、またはビオチン化され、そしてBiacore SAチップに固定された（図１Ｂ）か、それぞれいずれかのヘパリンに、用量依存性方式で結合したことを立証した。本発明者らのデータは、ＴＧＦ−β１が〜０．４７５μＭのおよそのＫｄでヘパリンに結合することを示す（図１Ｂ）。ヘパリンへのこの結合が、ＤＳＦによって決定されるような増進された熱安定性をＴＧＦ−β１に与えた（図２Ａ）。ＴＧＦ−β１ホモ二量体は、４つの鎖内および１つの鎖間の９つのジスルフィド結合を含み、これは、高い度合いの熱安定性を与える。これによって、ＴＧＦ−β１単独で観察される６６℃の高い融解温度が立証された（データ未提示）。ＴＧＦ−β１へのヘパリンの結合が、新規非共有分子内結合の導入を通じて、熱安定性をさらに増加させるという仮定を本発明者らが試験する際、該タンパク質の融解温度を、アッセイが検出可能であるレベルに減少させることが必要となった。これは、１０ｍＭのＤＴＴを反応に添加して、これがタンパク質内のジスルフィド結合を減少させ、それによって熱安定性を低下させることを通じて達成された。これは、６６℃から４４℃のＴＧＦ−β１の融解温度のシフトを生じた。ヘパリンを添加した際、ＴＧＦ−β１の融解温度に相当するピークが右にシフトすることが見出され、そしてタンパク質の融解温度は４７．５℃に増加した。
【０２７６】
次の工程は、ヘパリンおよびＴＧＦ−β１間の相互作用が、ＴＧＦ−β１シグナル伝達経路に影響を及ぼすかどうか決定することであった。これを達成するため、ｈＭＳＣを多様な量のヘパリンおよびＴＧＦ−β１で処理し、そしてｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３のレベルを調べるため、処理の１、６および２４時間後、タンパク質を採取した（図２Ｂ）。処理１時間後、ｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３レベルは、ＴＧＦ−β１およびヘパリンで処理したすべての細胞で飽和した（データ未提示）。ヘパリンのみで処理したいかなる細胞においても、識別可能なレベルのｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３は観察されず、ヘパリンはそれ自体ではＴＧＦ−β１シグナル伝達経路を活性化することが不可能であることが示された。処理の６時間後、すべての細胞におけるｐＳＭＡＤレベルは鎮静した。しかし、ヘパリンおよびＴＧＦ−β１の両方で処理した細胞は、ヘパリンを伴わずに同等の用量のＴＧＦ−β１で処理した細胞よりも、それぞれ、〜１．６倍および〜１．３５倍高かった（図２Ｂ）。同様に、２４時間のｐＳＭＡＤレベルは、ＴＧＦ−β１のみで処理した細胞よりも、ヘパリンおよびＴＧＦ−β１の両方で処理した細胞においてより高くあり続けた（データ未提示）。このデータは、まず、ＴＧＦ−β１のより高い用量（５ｎｇ／ｍｌ対１ｎｇ／ｍｌ）が、より長時間維持されるｐＳＭＡＤシグナルを生じることを初めて示す。次に、これらはまた、ヘパリンが、増殖因子のみに関して通常観察されるものよりもｐＳＭＡＤシグナルの半減期を延長させることが可能であることも示す。
【０２７７】
この影響をさらに調べるため、本発明者らは、続けて、ｈＭＳＣの軟骨形成分化の初期段階中に発現されるＴＧＦ−β１ターゲット遺伝子の転写物レベルを調べた。ｈＭＳＣの軟骨形成分化を培地（ＴＧＦ−β１のみ）または培地＋Ｈｅｐ（ＴＧＦ−β１＋ヘパリン）のいずれかの存在下で行った。軟骨形成培地中で３日間培養した後、培地＋Ｈｅｐ中で培養した微量ペレットは、ＳＯＸ９およびＣＯＭＰ  ｍＲＮＡ転写物両方の５倍高いレベルを示した（図２Ｃ）。総合すると、データによって、ヘパリンはＴＧＦ−β１に結合することが可能であり、そしてこうした結合が、細胞において見られるＴＧＦ−β１シグナルを増強することが示唆された。ヘパリンが実際に、ＴＧＦ−β１の活性を増強することが確立されているため、本発明者らは次に、ヘパリンがこれらの影響を、ＴＧＦ−β１シグナル伝達経路を通じるのではなく、何らかの間接的な経路を通じて生じる可能性を排除することを試みた。これを行うため、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体阻害剤であるＳＢ４３１５４２を使用した（４２）。ＳＢ４３１５４２でのｈＭＳＣの処理は、３日齢の軟骨形成微量ペレットにおけるＳＯＸ９およびＣＯＭＰ遺伝子発現両方の減少を導いた（図２Ｄ）。デ
ータによって、受容体レベルでのＴＧＦ−β１活性の阻害は、ヘパリンのＴＧＦ−β１増強効果を無効にし、やはりヘパリンはＴＧＦ−β１活性に対するその効果を、ＴＧＦ−β１シグナル伝達の調節を通じて発揮することが暗示された。
【０２７８】
ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリンの長さの要件
本発明者らは次に、ＴＧＦ−β１に結合するために必要なヘパリンの最小限の長さを決定することを試みた。可溶性サイズ分画ヘパリン断片（ｄｐ４〜ｄｐ２４）がＴＧＦ−β１のヘパリン・コーティングＳＡチップへの結合を競合的に阻害する能力は、その長さに比例して増加する（図３Ａ）。このＴＧＦ−β１結合能の増加は、ｄｐ１８以降はプラトーに達するようであり、未分画全長ヘパリン（Ｈｅｐ）に関して見られるものと類似の競合レベルであった。ＧＡＧ−結合プレートアッセイから得られる結果もまた、ヘパリン鎖の長さが１４（ｄｐ１４）から２４（ｄｐ２４）糖単位に増加するにつれて、ヘパリンへのＴＧＦ−β１結合が改善されることを示した（図３Ｂ）。ｄｐ１４より短い（すなわちｄｐ４〜１２）ヘパリン鎖は、ＴＧＦ−β１に有効に結合することができなかった（データ未提示）。多様な長さのヘパリン断片およびＴＧＦ−β１で処理した、処理後１時間のｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３レベルのウェスタンブロット分析によって、ｐＳＭＡＤシグナル両方の飽和が示された（データ未提示）。しかし、処理６時間後では、本発明者らは、多様な（ｄｐ１４〜２４）ヘパリン断片の増強活性の長さ依存性増加が観察されることを予期し、未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）およびＴＧＦ−β１で処理した細胞において観察されるものよりもなお低いとしても、ｄｐ２４−ＴＧＦ−β１の組み合わせで、最大のｐＳＭＡＤシグナルであろうことが期待された。その代わりに、本発明者らは、ＴＧＦ−β１およびｄｐ１８〜ｄｐ２２の間のヘパリン断片で処理した細胞が、未分画ヘパリンおよびＴＧＦ−β１で処理した細胞において観察されるものより高いｐＳＭＡＤレベルを示すことを観察し、シグナルのピークはｄｐ２０−ＴＧＦ−β１の組み合わせだった（図３Ｃ）。これによって、ヘパリン鎖の長さが、ＴＧＦ−β１シグナルを増強する能力に、かなりの影響を発揮することが示唆される。
【０２７９】
ＴＧＦ−β１結合および活性に関するヘパリン硫酸化要件
ヘパリン−タンパク質相互作用が主にイオン性の性質であることを考慮して、本発明者らは、次に、ヘパリンおよびＴＧＦ−β１の間の相互作用に対して、ヘパリン中の多様な硫酸基が有する影響を調べることにした。Biacore競合アッセイによって、ヘパリンから
の２−Ｏ硫酸基の喪失（２−Ｏ−脱）は、固定されたヘパリンへのＴＧＦ−β１結合を競合阻害する能力に最小限の影響しか持たないことが示された（図４Ａ）。６−Ｏ硫酸基の喪失（６−Ｏ−脱）は、およそ４０％のＴＧＦ−β１結合能の喪失を導き、一方、Ｎ−硫酸基の喪失は、ＴＧＦ−β１に結合するヘパリンの能力を無効にした。対照的に、ＧＡＧ結合プレートアッセイは、ヘパリンからの２−Ｏ硫酸基の除去（２−Ｏ−脱）が、完全に硫酸化された全長ヘパリン（Ｈｅｐ）に比較して、約６０％、ＴＧＦ−β１結合を減少させることを立証した。６−Ｏ硫酸基の除去（６−Ｏ−脱）は、ＴＧＦ−β１の能力をおよそ８０％減少させ、そしてＮ−硫酸化の欠如（Ｎ−脱）は、やはりＴＧＦ−β１結合を本質的に無効にした。興味深いことに、細胞培養中で試験した際、得た結果は、多様なヘパリン長を評価する際に見られたものと同様に多様であった。本発明者らは、６時間の２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン（２−Ｏ）で処理した細胞のｐＳＭＡＤレベルでは、完全に硫酸化されたヘパリンに比較して減少が見られると予期したが、その代わり、本発明者らは、ヘパリン処理細胞で見られるものよりも高いレベルまでの増加を観察し（図４Ｃ）、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンが、完全に硫酸化されたヘパリンよりもさらによりＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強することが示唆された。同様に、６−Ｏ−硫酸化（６−Ｏ）の除去もまた、ヘパリン処理細胞で見られるものに比較してｐＳＭＡＤレベルの安定化をもたらした。しかし、Ｎ−硫酸化（Ｎ）の喪失は、ヘパリン処理細胞のものに比較して、ｐＳＭＡＤレベルの増加を導かなかった。
【０２８０】
総合すると、データによって、ヘパリンからの２−Ｏ−硫酸化の喪失は、そしてより低い度合いで６−Ｏ−硫酸化は、実際、ヘパリンがＴＧＦ−β１シグナルを増強させる能力を改善することが示され、結合強度および生物活性の間の関係が線形ではないことが示唆された。
【０２８１】
ＴＧＦ−β１ヘパリン結合部位の同定
ヘパリンは、多くの感受性増殖因子に存在する塩基性残基の立体配置と相互作用することが知られるため、本発明者らの次の目的は、ＴＧＦ−β１内の実際のヘパリン結合部位（単数または複数）を同定することであった。ＴＧＦ−β１上の推定上のヘパリン結合部位を同定する以前の研究は、線形タンパク質配列中に存在するヘパリン結合モチーフの同定を通じてこれを行った（２、４）。しかし、こうしたアプローチは、タンパク質の完全３次元（３Ｄ）コンホメーション性質を考慮に入れることができず、そしてしたがって、タンパク質の三次構造からしか明らかになりえないヘパリン結合部位を同定することができない。こうしたものとして、本発明者らは、Ｏｒｉらによって開発された保護および標識戦略（３７）を使用して、こうした３Ｄ部位がＴＧＦ−β１内に存在するかどうかを調べることにした。本発明者らの分析は、ＴＧＦ−β１のヘパリンへの結合に関与するようである８つのリジン（Ｋ１３、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｋ３７、Ｋ６０、Ｋ９５、Ｋ９７およびＫ１１０）を同定した（図５Ａ、表１）。これらの８つのうち、７つはＭＳ／ＭＳ配列決定に基づいて、高いレベルの信頼性を持つと同定された。残りのリジンＫ６０は、中程度のレベルの信頼性を持つと同定され、ヘパリンと該リジンとの相互作用は断続的であり、そしてヘパリンへのＴＧＦ−β１の結合に必須ではない可能性が示唆され、したがって、Ｌｙｏｎらに提唱される現在のモデル（２）をやはり裏付けた。
【０２８２】
同定されたリジンのうち、Ｋ１３およびＫ１１０の２つを除いてすべてが、ＴＧＦ−β１のヘパリン結合ドメインの一部として以前同定されてきている（図５Ａ）。３Ｄ構造上にマッピングした際、Ｋ１３は、ヘパリン結合に必須の残基であると提唱されているＫ２６と同じ底面上にマッピングされた（図５Ｂ）。Ｋ１１０は、ＴＧＦ−β１単量体間の界面に沿ってマッピングされる。しかし、Ｋ１１０は、タンパク質内に包埋されているようであり、したがって、ＴＧＦ−β１が「粘着性」の性質であり、ヘパリンミニカラムからタンパク質を溶出するために２Ｍ  ＮａＣｌよりも酸感受性界面活性剤（ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭ  ＳＦ界面活性剤）の使用を必要とするため、この結果は偽陽性である可能性が高い。溶出にこの界面活性剤を使用すると、標識／ビオチン化工程の前に、タンパク質の変性が生じ、したがって、通常タンパク質コア内に包埋されている残基が曝露されて、結局誤って標識されることになる。
【０２８３】
アフィニティ選択ＴＧＦ−β１結合性ＨＳ（ＨＳ１６陽性）の単離
ヘパリン−ＴＧＦ−β１の相互作用の構造的特徴および要件が同定されたため、本発明者らの次の目的は、商業的に入手可能なＨＳＰＭ調製物を構成する異種プールからＨＳのＴＧＦ−β１結合性分画を単離することであった。これを行うため、本発明者らはまず、ＴＧＦ−β１から得られるヘパリン結合性ペプチドを設計し（図６Ａ）、そして３Ｈ−ヘパリンに結合する能力を試験した（図６Ｂ）。次いで、ＴＧＦ−β１ペプチドを用いて、本発明者らのＨＳアフィニティ単離プラットホームを用い、Muraliらに先に記載されるように（２９）、ＨＳのＴＧＦ−β１結合集団を単離した。カラムに結合しないＨＳは、ＨＳ１６陰性と称され、一方、カラムから１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出したＴＧＦ−β１結合性ＨＳは、ＨＳ１６陽性と称された（図６Ｃ）。
【０２８４】
表１．  保護および標識構造プロテオミクスによって同定されたペプチドの要約
タンデム質量分析によって標識ペプチドを同定し、そしてＭａｓｃｏｔ検索バージョン２．３（Matrix Science）によって分析した。ここで、ヘパリン結合部位に関与するペプチドの要約および標識位を提供する。
【０２８５】
【表３】
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【０２８６】
ａ残基は図５Ａにしたがって番号付けする
次いで、プロトンＮＭＲ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩおよび二糖組成分析を行って、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性の間に何らかの体系的な相違があるかどうかを決定した。３つのＨＳ試料のＮＭＲ分析によって、いくつかのわずかな相違が明らかになり（矢印、図７Ａ）、一方、ＳＥＣのクロマトグラムは、ＨＳ１６陽性が主に、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性に見られるものよりも恒常的に長いＨＳ鎖で構成されることを示した（図７Ｂ）。
【０２８７】
３つのＨＳ試料のＮＭＲスペクトルにおいて、最も明らかな相違は、ＨＳ１６陽性の〜５．４ｐｐｍでのシグナル強度のわずかな減少であり（矢印、図７Ａ）これは、Guerriniら［複合グルコサミノグリカン：２次元核磁気共鳴分光による置換パターンのプロファイリング。Anal Biocmem, 2005, 337(1):p.35-47］によって以前報告されたように、グルコサミン酢酸メチル共鳴に割り当てられた。この減少は、他の２つの分画に比較した際のＨＳ１６陽性のＮ−硫酸化のわずかにより高いレベルの指標であった。
【０２８８】
いくつかのヘパリンサイズ標準（ｄｐ８、１２、２０、および２６）の溶出時間に基づいて、本発明者らのデータはまた、ＨＳ１６陽性が、２６糖より長いＨＳ糖で構成されることも示す。最後に、３つのＨＳ試料消化物の二糖組成分析によって、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性は類似であるが、ＨＳ１６陽性はΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ＳおよびΔＵＳ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓが豊富であり、そしてより少ないΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳを含有することが示された（図７Ｃ、表２）。総合すると、データは、ＨＳ１６陽性を構成するＨＳプールが、サイズ分布および組成の両方に関して、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭとは顕著に異なることを示す。さらに、ＨＳ１６＋で見られるΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳの相対的な減少は、２−Ｏ−硫酸のヘパリンからの喪失がどのように実際にＴＧＦ−β１に対する生物活性を増加させるのかに関する本発明者らの先の知見を補強する（図４）。
【０２８９】
ＨＳ鎖は、鎖の長さに関して非常に多様であることが知られており［Esko, J.D., K. Kimata，およびU. Lindahl，  プロテオグリカンおよび硫酸化グリコサミノグリカン  Essentials of Glycobiology中，A. Varkiら監修  ２００９年,Cold Spring Harbor Laboratory Press：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］、これは部分的に、非常に多
数のタンパク質に結合する能力を説明する。所定のタンパク質に関するＨＳ調製物の相対的特異性を増進するため、この変動を減少させることが必要である。本発明者らは、３つのＨＳ試料内の多糖鎖のサイズ分布を調べた。３つの試料およびヘパリンを非変性ＰＡＧＥによって分離すると、ＨＳ１６陽性が、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭに比較して、主に
、より長いＨＳ鎖で構成されることが示された。ＨＳよりも比較的より均質であるヘパリンを用いて、ＨＳ調製物中に高い不均一性が存在することがわかった。これらの知見を検証するため、サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ）を行った。ＳＥＣ由来のクロマトグラムは、ＨＳ１６陽性が、およそｄｐ８から＞ｄｐ２６までのＨＳＰＭの多分散のサブセットからなることを示した（図７Ｂ）。しかし、ＨＳ１６陽性集団では、より長い鎖長（＞ｄｐ２６）のＨＳが濃縮されており、これは、非変性ＰＡＧＥからの本発明者らのデータおよびＴＧＦ−β１に結合するヘパリンに関する長さ要件に関する本発明者らの知見を確証する。
【０２９０】
データは、ＨＳ１６陽性を構成するＨＳプールが、サイズ分布および組成の両方に関して、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭと顕著に異なることを示す。さらに、ＨＳ１６陽性に見られるΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳの相対的な減少は、ヘパリンからの２−Ｏ硫酸の喪失が、実際に、ＴＧＦ−β１に対する生物活性を増加させるように働くという以前の観察を確証した（図４Ｃ）。ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓの相対的に増加した比率は、２−Ｏ−硫酸化の存在とは関わりなく、Ｎ−および６−Ｏ−硫酸化を含む糖に関して優先的に濃縮するペプチドから生じている可能性もある。
【０２９１】
表２．ヘパリン・リアーゼ消化ＨＳ試料の二糖組成
ＨＳ試料をヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩで消化して、そして生じた二糖をＨＰＬＣを通じて分離した。既知の二糖標準のものと溶出時間を比較することによって二糖を同定し、そして各ＨＳ試料における比率をいくつかの検量線を用いて計算した。
【０２９２】
【表４】
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【０２９３】
ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強する
ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭと比較したＨＳ１６陽性の組成の相違を考慮して、本発明者らは次に、これらの相違が何らかの機能的結果を生じるかどうかを調べることにした。これらのＨＳ分画が、Ｂｉａｃｏｒｅ競合アッセイにおいて、ＴＧＦ−β１に結合する能力を調べると、ＨＳ１６陽性は、ＨＳ１６陰性またはＨＳＰＭよりも、はるかにより高いアフィニティでＴＧＦ−β１に結合可能であることが示された（図８Ａ）。ＨＳ１６陽性は、ＴＧＦ−β１由来ペプチドを用いて単離されたため、該タンパク質上の塩基性残基を糖がマスキングする能力を評価することが重要であった。これを行うため、本発明者らは、糖（Ｈｅｐ、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性、およびＨＳ１６陰性）とＴＧＦ−β１をあらかじめ結合させ、そしてこれらをプラスミン消化に供した。プラスミンが、リジンおよびアルギニン残基のカルボキシル面を優先的に切断することを考慮して、本発明者らは、糖がＴＧＦ−β１にある程度の特異性を持って結合するのであれば、これはタンパク質にプラスミンからのある程度の保護を与えるであろうと判断した。プラスミン消化産物の銀染色は、ＨＳ１６陽性（ＴＧＦ−β１＋ＨＳ１６陽性）が、ヘパリン（ＴＧＦ−β１＋Ｈｅｐ）を含めて、試験した他のいずれの糖よりもプラスミン消化からＴＧＦ−β１をよりよく保護可能であることを明らかにした（図８Ｂ）。in vitro系において、ＨＳ１６陽性は、ｈＭＳＣにおいて、ｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３を通じて、ヘパリンと類似の程度ま
でＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強することが可能であった（図８Ｃ）。興味深いことに、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性は類似の反応を引き出すことができず、ＨＳ１６陽性は、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性の両方と、組成的にそして機能的に異なるという本発明者らの先の知見が裏付けられた。
【０２９４】
大部分のＴＧＦ−β１は、in vivoで、潜在ＴＧＦ−β１（ＬＴＧＦ−β１）として知
られる不活性型で見られ、そしてＨＳ１６陽性は、ＨＳＰＭのプールから単離されたため、本発明者らは、次に、ＨＳ１６陽性がＬＴＧＦ−β１に対して有しうる影響を調べることにした。本発明者らのデータは、再び、ＨＳ１６陽性が、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性よりもより有意にＬＴＧＦ−β１誘導性ｐＳＭＡＤシグナルを増強することが可能であることを立証した（図１０Ａ）。総合すると、本発明者らのデータは、ＨＳ１６陽性単離体が、ＨＳＰＭ出発物質および非結合性ＨＳ１６陰性と比較して、ＴＧＦ−β１に、より優れて結合し、そしてそれによって駆動されるシグナル伝達を増強することが可能であることを示す。また、ＨＳ１６陽性は、ＨＳＰＭ出発材料および非結合性ＨＳ１６陰性に比較して、生理学的により大量のＬＴＧＦ−β１によって駆動されるシグナル伝達を増強することが可能であった。
【０２９５】
ｈＭＳＣの単離および特徴付け
ヘパリン−ＴＧＦ−β１相互作用の生物学的影響を調べるため、初代ｈＭＳＣを単離する必要があった。商業的に入手可能な骨髄細胞（Lonza）を購入し、そしてプラスチック
接着を通じてｈＭＳＣを単離した。０継代の細胞を続いて拡大し、そしてバイアルあたり１ｘ１０６細胞のバッチで凍結させた。Dominiciら［多分化能間葉系間質細胞を定義するための最小限の基準。細胞療法国際会議意見書。Cytotherapy, 2006.8(4):p.315-317］によって記載されるように、第５継代でＭＳＣ表面マーカー発現に関して、ＦＡＣＳによって細胞をスクリーニングした。９５％より多い単離ｈＭＳＣがＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し、一方、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲは発現しなかった。単離細胞はまた、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞にin vitroで分化することも可能であった。したがって、プラスチック接着によって単離された細胞は、ｈＭＳＣの最小限の基準特性を満たすと考えられた。
【０２９６】
ｈＭＳＣにおけるＴＧＦ−β１シグナル伝達に対するヘパリンの影響
初代ｈＭＳＣを単離したため、本発明者らは次に、ヘパリンおよびＴＧＦ−β１の間の相互作用が、ＴＧＦ−β１シグナル伝達に対する細胞反応に影響を及ぼすかどうかを決定し、これは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３の下流リン酸化によって測定された。ヘパリンは、初代ラットおよびウシ平滑筋細胞（ＳＭＣ）ならびにＣＣＬ６４ミンク肺上皮細胞株において、ＴＧＦ−β１の影響を増強するが、初代ヒト伏在静脈（ＳＭＣ）においては増強しないことが示されてきている［McCaffrey, T.A.ら，  トランスフォーミング増殖因
子ベータ活性は、トランスフォーミング増殖因子ベータ／アルファ２−マクログロブリン不活性複合体の解離を通じて、ヘパリンによって増強される。 J. Cell Biol, 1989. 109(1):p.441-44；McCaffrey, T.A.ら，  ヘパリンおよびフコイダンによるトランスフォー
ミング増殖因子β活性の保護。 J. Cell Physiol, 1994. 159(1):p.51-59］。本発明者らはしたがって、ｈＭＳＣにおいてＴＧＦ−β１活性をヘパリンが増強するならば、効果は、ＴＧＦ−β１のみからのｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３シグナルが収まり始めてからしか見られないと推測した。したがって、本発明者らの最初のＴＧＦ−β１投薬実験のために選択した時点は、６、１２、２４および４８時間であった。第５継代の細胞をある範囲のＴＧＦ−β１用量で処理し、そして総細胞溶解物を、処理の６、１２、２４および４８時間後に収集した。次いで、溶解物試料を４〜１２％（ｗ／ｖ勾配）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にトランスファーし、そしてホスホ−ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）（１３８Ｄ４、Cell Signaling Technology）、ホスホ−ＳＭＡＤ３（
ｐＳＭＡＤ３）（Ｃ２５Ａ９、Cell Signaling Technology）、総ＳＭＡＤ２／３（Cell 
Signaling Technology）およびアクチン（クローンＣ４、Merck Millipore）に関して、
ウェスタンブロットによって探査した。本発明者らの結果は、ＴＧＦ−β１を含まなくても（０ｎｇ／ｍＬ）、低いバックグラウンドレベルのｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３シグナル伝達があることを示した。１ｎｇ／ｍＬでは、ｐＳＭＡＤ２シグナルは、処理６時間後、非常に強力であり、そして１２時間後以降、収まり始めた。ｐＳＭＡＤ３シグナルは、より低い強度ではあるが、ｐＳＭＡＤ２シグナルのものを反映した。５ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１両方で、ｐＳＭＡＤ２シグナルは、試験したすべての時点で飽和したままであるようであったが、ｐＳＭＡＤ３シグナルは、２４時間までにバックグラウンドに戻った。したがって、すべての続く実験では、６時間の時点を選択した。
【０２９７】
本発明者らの次の目的は、本発明者らの実験に使用するためのヘパリン用量を決定することであった。McCaffreyら（上記）が以前、ヘパリンの有効なＴＧＦ−β１増強用量を
１〜１００μｇ／ｍＬの間であると報告しているため、本発明者らは、この範囲内の用量を選択した。１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１で処理し、１０μｇ／ｍＬのヘパリンとプレインキュベーションした細胞は、ＴＧＦ−β１のみの同じ用量で処理した細胞と比較して、より強いｐＳＭＡＤ２およびｐＳＭＡＤ３シグナルを維持した（図３．１２）。より高い用量のヘパリン（４０μｇ／ｍＬ）は、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１で同じ効果を誘発することができなかった。５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１とプレインキュベーションした際、どちらの用量のヘパリンも、増殖因子のみで得られるものを超えるｐＳＭＡＤシグナルを増進することはできなかった。総合すると、本発明者らの結果は、ヘパリンは、ＴＧＦ−β１によって産生されるｐＳＭＡＤシグナルを増進するのではなく延長することを示唆する。
【０２９８】
本発明者らは次に、細胞表面ＨＳがＴＧＦ−β１駆動性ＳＭＡＤシグナル伝達に対して有しうる影響を調べることにした。これを行うため、第５継代の細胞をヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（各１．２ｍＩＵ／ｍＬ）で２４時間、ｈＭＳＣ培地中で処理した後、血清不含培地中でヘパリンを含みまたは含まず、ＴＧＦ−β１で処理した。ウェスタンブロッティングに用いた６時間の時点では、血清中の増殖因子がＳＭＡＤ２および３のバックグラウンドレベルに有するであろう影響を回避するため、ヘパリナーゼ処理後、血清不含培地を用いる必要があった。抗ＨＳ  １０Ｅ４抗体での細胞表面ＨＳの免疫蛍光染色によって、２４時間の処理後、ほぼすべての細胞表面ＨＳが除去されたことが示された。しかし、細胞表面ＨＳの除去は、細胞をＴＧＦ−β１で処理した際に産生されるｐＳＭＡＤシグナルには影響を及ぼさないようであった。本発明者らの結果は、ヘパリンがＴＧＦ−β１シグナル伝達を増強する際に果たす役割が、ＦＧＦ−２シグナル伝達において果たす役割とは異なることを示唆する［Schlessinger, J.ら，  三元ＦＧＦ−ＦＧＦＲ−ヘパリン複合体の結晶構造は、ＦＧＦＲ結合および二量体化におけるヘパリンに関する二重の役割を明らかにする。 Molecular Cell, 2000. 6(3);p.743-750］。
【０２９９】
ＨＳ１６陽性およびＢＭＰ−２結合性ＨＳ（ＨＳ３陽性）の比較
ＨＳ１６陽性がＴＧＦ−β１シグナル伝達を増進することが示されたため、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの活性を同様に増進させうるかどうかを決定することに関心が持たれた。本発明者らのグループは、以前、ＢＭＰ−２の活性を増進するＨＳ分画であるＨＳ３陽性のアフィニティ単離を報告した［Murali, S.ら，  骨修復のためのアフィニティ選択ヘパラン硫酸。 Biomaterials, 2013. 34(22):p.5594-5605；ＷＯ２０１
０／０３０２４４］。２つのタンパク質の間の構造的類似性は、ＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性の組成の比較を正当化した（図１２）。ＨＳ３陽性およびＨＳ１６陽性はどちらも、類似の量のΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳの類似の量を含有することが見出されており、一方、ＨＳ１６陽性は、ＨＳ３陽性よりも、より多くのΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ＳおよびΔＵＡ，
２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓを、そしてより少ないΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃを含有することが見出された。ＨＳ３陽性の組成は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定されるが、ＨＳ１６陽性およびＨＳＰＭのものは、ＨＰＬＣによって決定されず、したがって、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ二糖は、あとの２つの試料では検出されなかったことに注目しなければならない。この二糖を検出できないことは、ＨＳ変異体の組成プロファイルを改変すると議論される可能性もあるが、ＣＥ法を用いたＨＳＰＭの以前の分析は、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ二糖を含まずにＨＰＬＣで得られたものと類似の組成プロファイルを生じた。
【０３００】
ＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性の組成の観察される相違は、活性の機能的結果を有した。驚くべきことに、ＨＳ１６陽性は、ＳＰＲに基づく結合競合アッセイにおいて、ＨＳ３陽性よりもより優れてＢＭＰ−２に結合することが見出された（図１３）。しかし、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株において、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のＢＭＰ−２駆動発現を増強する能力に関して調べる際、ＨＳ１６陽性およびＢＭＰ−２の組み合わせは、ＨＳ３陽性をＢＭＰ−２とともに用いた場合に見られるものと同じレベルのＡＬＰ発現を達成することは不可能であった（図１４）。
【０３０１】
総合すると、データは、ＴＧＦ−β１ペプチドを用いてアフィニティ精製したＨＳは、元来のＨＳ調製物とは組成が異なり、全長タンパク質に結合して、そして活性型および潜在型の両方で、能動的に全長タンパク質に結合し、そしてその活性を増強することを示す。また、ＴＧＦ−β１ペプチドを用いて精製したＨＳは、ＢＭＰ−２ペプチドで精製したものとは異なり、そしてこの相違は、ＴＧＦ−β１に対する活性を改変するかまたは調整し、そして未分画ＨＳＰＭの不均一な効果を減少させるために十分である。
【０３０２】
考察
本研究において、本発明者らは、ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合可能であり、そして結合する際に、該増殖因子の熱安定性を増進させることを示した。この安定化は、ｈＭＳＣにおいて、ＴＧＦ−β１シグナル伝達活性の半減期を延長するようである。軟骨形成分化条件下で、このヘパリン仲介性増強は、初期軟骨形成遺伝子の発現を増進させた。本発明者らの知見は、この軟骨形成遺伝子発現に対するヘパリンの増強効果が、ヘパリンがＴＧＦ−β１シグナル伝達経路を通じて作用する結果として起こり、そしてＴＧＦ−β１に最適に結合し、そしてそのシグナルを増強するためには、１８〜２２糖の間の長さのＧＡＧ鎖が必要であるというアイディアを支持する。三元ＴＧＦ−β１リガンド受容体複合体を調べると、より長いヘパリン鎖は、複合体形成中にＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴβＲＩＩ）とＴＧＦ−β１の結合に干渉しうることが示された（４３）。２−Ｏ硫酸化の喪失、およびより低い度合いの６−Ｏ硫酸化は、結合アフィニティの減少にも関わらず、ヘパリンがＴＧＦ−β１シグナルを増強する能力を事実上改善する。ヘパリン鎖の長さの影響に関する本発明者らの先の知見と併せて、これらの結果は、ＨＳの現在の「糖暗号」仮説（４４〜４７）の説得力がある証拠を提供し、そして結合力および生物活性の間に非線形の関係があるというアイディア（４８）を補強する。本発明者らはまた、ヘパリン結合に関与するＴＧＦ−β１単量体上の新規残基として、Ｋ１３を同定した。このデータに導かれて、本発明者らはブタ粘膜調製物から得られる不均一混合物から、ＴＧＦ−β１に優先的に結合するＨＳ集団（ＨＳ１６陽性）を単離することにした。ＨＳ１６陽性の特徴付けによって、これがＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性とは組成的に異なり、そしてこの相違によってｈＭＳＣにおいてＴＧＦ−β１およびＬＴＧＦ−β１両方によりよく結合し、そしてそのシグナル伝達を増強することが可能になることが立証された。
【０３０３】
以前の研究によって、ヘパリンがＴＧＦ−β１に結合し、そしてこれをプロテアーゼ活性およびα２−マクログロブリンによる循環クリアランスから保護し、それによって、そのシグナルを増強することが示されてきている（３、５）。これは、いくつかの軟骨修復
研究において、ＴＧＦ−βキャリアーまたは足場材料のいずれかとしての使用につながっている（４９、５０）。いくつかの研究によって、ヘパリンは、ネズミＭＳＣの軟骨形成誘導中、増殖因子の放出を制御するために利用されてきている（５１）。しかし、この糖は、組織修復または増殖因子調節のための療法剤として広く採用されてはいないようであり、これは制御されない出血および血小板減少症のリスクのため（５２）ばかりではなく、ヘパリンの過剰硫酸化は、集団的にヘパリン・インタラクトームまたはヘパラノームとして知られる、２００を超える異なる細胞外タンパク質への乱雑な結合を可能にすることを意味するためである（５３、５４）。これは、増殖因子産生および局在を容易に制御することが不可能であるin vivo系において、ヘパリンが、ターゲティングされた増殖因子
調節のために用いられるために十分な特異性を持たないことを示す。にもかかわらず、本発明者らのin vitroデータによって、ヘパリンを用いて、ｈＭＳＣ軟骨形成分化中、ＴＧＦ−β１活性を延長することが可能であることが示され、これらの生得的な限界が克服可能であるならば、実現されるであろう療法的潜在能力があることを示唆する。
【０３０４】
ヘパリンの代わりにＨＳを使用すると、理論的にこれらのハードルを克服することが可能であり、これはＨＳがヘパリンの抗凝固活性を持たないためである（５５）。しかし、ＨＳは、未加工（ｒａｗ）調製物の過剰な多様性を含め、それ自体の一連の問題を生じさせる。しかし、これらの困難を克服するように開発された技術（２６、２７、２９）およびこれらの技術の１つを利用することによって（２９）、本発明者らは、優先的に特異的増殖因子に結合する選択的下位集団を単離可能であることを示すことが可能であった。ＴＧＦ−β１由来ペプチドを用いて、ＨＳ１６＋を単離することが可能である一方、ＨＳ１６陽性はまた、in vivoでＴＧＦ−β１のより生理学的に豊富な型であるＬＴＧＦ−β１
の影響を調節することも可能である。興味深いことに、ヘパリンは、ＬＴＧＦ−β１の活性化を阻害することが報告されている（５６）が、ＨＳ１６陽性は阻害しない。これは、正常および改変された生理学的状態中の細胞による、ＴＧＦ−β１結合性ＨＳのin vivo
合成に関して、興味深い問題を生じさせる。
【０３０５】
本明細書に報告する研究は、将来のＴＧＦ−β１−ＨＳ研究のための基盤をなし、そしてＬｙｏｎらによって提唱される結合モデルに基づく（２）。本発明者らのデータは、タンパク質単量体の間に走る溝を通じて多糖を空間的に配向することを通じて、ＴＧＦ−β１へのヘパリンの結合に影響を及ぼすようである新規残基としてＫ１３を同定する（図９）。さらに、いくつかの巨大ヘパリン断片の最近の構造解析（５７）によって、本発明者らがＴＧＦ−β１およびヘパリン構造両方の物理的測定値と、本発明者らのin vitroの知見を比較し、そして検証することが可能になった。現在のＬＴＧＦ−β１構造の限定された知識（５８〜６０）もまた、このより大きいタンパク質の活性の調節に関して、ヘパリンおよびＨＳによって果たされる役割に関する疑問を生じさせる（補図Ｓ１Ｂ、Ｃ）。
【０３０６】
ＴＧＦ−β１は、まず、プロタンパク質として合成され、これは細胞内で切断されて、小分子潜在複合体（ＳＬＣ）を生じる。成熟ＳＬＣは、二量体性潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）と非共有的に連結されたＴＧＦ−β１二量体からなる。これまでに研究された細胞タイプの大部分に関して、ＳＬＣは、潜在ＴＧＦ−β１結合タンパク質−１（ＬＴＢＰ−１）とともに放出され、したがって、大分子潜在複合体（ＬＬＣ）を形成する（６１）。ＬＴＢＰ−１は、多様な接着タンパク質と相互作用することによって、潜在ＴＧＦ−β１を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に押し出し（６２）、こうして細胞仲介性活性化に際して利用可能になりうる潜在ＴＧＦ−β１の沈着を生成する。ＬＡＰは、安定と見なされる構造を有するが、ＳＬＣ中にＴＧＦ−β１を捕捉する方式で、分子の２つの領域をアンフォールディングすることも可能である（６０）。これらの領域のコンホメーションが機械的に完全に開放された際、活性ＴＧＦ−β１は、ＬＡＰから放出される（５８）。両方のドメインのこの同時アンフォールディングは、完全ＴＧＦ−β１放出に必要な全か無かのスナップ機構であり、ＬＡＰがＬＴＢＰ−１に結合した際にのみ可能である。この機械力
の生成または放出のいずれかにＨＳが関与しているかどうか、そしてそれはどのようにかは興味深い問題である。
【０３０７】
すべてのこれらの考察は、本発明者らの結果を検証するため、ヘパリン−ＴＧＦ−β１相互作用の大規模なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング、およびＨＳ１６陽性のようなＨＳ調製物のドメイン組成を解読するためのコンピュータツールの開発の必要性を指摘する（６３）。こうした研究は、ＨＳの本発明者らのアフィニティに基づく単離を精密にする可能性、またはさらに化学的に定義されるＴＧＦ−β１特異的ＨＳ分子の合成の可能性も切り開くであろう（６４）。
【０３０８】
結論として、本発明者らは、ヘパリン、およびアフィニティ単離ＨＳを用いて、ｈＭＳＣに対するＴＧＦ−β１シグナル伝達を調節可能であることを示す。本発明者らはまた、ヘパリン−ＴＧＦ−β１相互作用のための構造的要件に関して初めて報告する。総合すると、該データは、これらの分子間の構造的相互作用の理解がどのように療法開発をガイドしうるかの重要性を繰り返す。これは、ＴＧＦβ１活性を調節してｈＭＳＣの軟骨形成分化を駆動するために炭水化物分子を利用する、軟骨修復のための新規療法戦略の開発に有望である。こうした戦略はまた、増殖因子の使用を伴う他の組織修復戦略にも拡張可能である。
【０３０９】
本発明者らの研究において、ＴＧＦ−β１のヘパリン結合部位を含有するペプチドを用いて、アフィニティ精製によって、ブタ粘膜ＨＳ（ＨＳＰＭ）から、ＨＳのＴＧＦ−β１結合性分画を単離した。単離ＴＧＦ−β１ペプチド結合性ＨＳはＨＳ１６陽性と名付けられ、ＨＳ１６陰性と名付けられた非結合性ＨＳ分画、および元来のＨＳＰＭ出発材料とは組成が異なることが見出された。組成のこの相違によって、ＨＳ１６陽性が、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭと比較して、ＴＧＦ−β１に結合し、そしてその活性を調節する能力が増進された。驚くべきことに、ＨＳ１６陽性はまた、ＴＧＦ−β１の不活性貯蔵型であるＬＴＧＦの活性を調節することも可能であった。ＢＭＰ−２活性を増進するように開発されたＨＳ変異体であるＨＳ３陽性と比較して［Murali, S.ら，骨修復のためのアフィニティ選択ヘパラン硫酸。Biomaterials, 2013, 34(22):p.5594-5605］、ＨＳ１６陽性は、組成の相違を有し、これによって、ＨＳＰＭおよびＨＳ３陽性と比較して、ＢＭＰ−２活性を増強する能力が改変されることが見出された。
【０３１０】
この研究において、用いたペプチドは、長さ１６アミノ酸であり、一方、全長成熟ＴＧＦ−β１は、長さ１１２アミノ酸である。溶液中のペプチドは、全長タンパク質の一部である際に仮定されるものとは異なるコンホメーションを採用することが知られ、そしてＰＥＰＦＯＬＤ［Maupetit, J., P. Derreumaux，およびP. Tuffery, PEP-FOLD；デノボペ
プチド構造予測のためのオンラインリソース。 Nucleic Acids Research, 2009. 37（補
遺２）：p.W498-W503；Maupetit, J., P. Derreumaux，およびP. Tuffery，大規模デノボペプチドおよびミニタンパク質構造予測のための迅速法。 Journal of Computational Chemistry, 2010. 31(4):p.726-738；および２１６.  Thevenet, P.ら，PEP-FOLD：直鎖お
よびジスルフィド結合環状ペプチド両方に関する更新されたデノボ構造予測サーバー。Nucleic Acids Research, 2012. 40(W1):p.W288-W293］を用いた、ＨＳ１６陽性単離に用いられるＴＧＦ−β１ペプチドの構造予測は、ＴＧＦ−β１の天然構造とはマッチしない。これは、本発明者らのペプチドに基づくアフィニティ精製を駆動する機構に疑念を生じさせ、これは、ペプチドの単一ストレッチは、ＴＧＦ−β１ヘパリン結合性ドメインの空間組成を再構築可能であるとは想像しにくいためである。ペプチドおよびＨＳの間の相互作用は、主に、イオン性相互作用によって駆動されると議論することも可能であり、これはペプチド−ヘパリン相互作用に関してはほぼ間違いなく真実である（本発明者らのグループによる未公表データ）が、異なるタンパク質（ＢＭＰ−２）由来のペプチドの使用は、単離ＨＳ分画のプロファイルを改変するため、この場合には当てはまらないようである。
【０３１１】
ヘパリン結合に関与する塩基性残基の大規模に調べられたコンセンサス配列は、塩基性残基の２つのモチーフ：−Ｘ−Ｂ−Ｂ−ＢＸ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−または−Ｘ−Ｂ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−（式中、Ｘは、任意の中性または酸性アミノ酸であり、そしてＢは塩基性残基である）の１つを採用すると提唱される［Cardin, A.D.およびH.J. Weintraub，タンパク質グリコサミノグリカン相互作用の分子モデリング。Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1989.9(1):p.21-32］。ＴＧＦ−β１には、第三のモチーフが
存在することが提唱されてきている：−Ｘ−ＢＸ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−［McCaffrey, T.A., D.J. Falcone，およびB. Du，トランスフォーミング増殖因子−β１はヘパリン結合性タンパク質である：推定上のヘパリン結合性領域の同定およびＴＧＦ−β１に多様なアフィニティを持つヘパリンの単離。 J. Cell Physiol, 1992. 152(2):p.430-440］。興味深いことに、PaceおよびScholtz［Nick Pace, C.およびJ. Martin Scholtz，ペプチドおよびタンパク質の実験的研究に基づくらせん傾向スケール。 Biophysical Journal, 1998. 75(1):p.422-427］は、塩基性残基が、溶液中でαらせんを形成する高い傾向を有することを報告した。これらの提唱されるモチーフ中の塩基性残基の組成およびαらせんのもの（回転あたり３．６アミノ酸残基）を考慮すると、これらのモチーフが、溶液中でらせん構造を採用し、その塩基性残基が同じ平面に沿って配置されることが見出されたのは驚くべきことではない。これが真実であれば、こうした構成は、ペプチドに、ある程度の選択性を与える可能性もある。
【０３１２】
ＨＳ１６陽性のサイズおよび組成分析によって、これが、ＨＳ１６陰性およびＨＳＰＭ両方に比較して、より長い多糖鎖に関して濃縮され、鎖サイズ分布に関してより不均一ではなく、そして６−Ｏ−およびＮ−硫酸化二糖に関して濃縮されていることが示された。これは、本発明者らがＴＧＦ−β１に有効に結合し、そしてその活性を調節するために、ヘパリン鎖がｄｐ２２と少なくとも同等であり、そして６−Ｏ−およびＮ−硫酸基を所持する必要があることを同定した、ヘパリン−ＴＧＦ−β１相互作用の本発明者らの研究からの本発明者らの知見を実証した。ＨＳの、より長い鎖に関する濃縮は、少なくとも２２糖単位が、ＴＧＦ−β１ホモ二量体上の２つのヘパリン／ＨＳ結合部位を架橋するために必要であることによって説明されうる。こうした鎖はまた、ＴＧＦ−β１と有効に相互作用する硫酸分布基準を満たす必要もあり、これは本発明者らの精製によって選択されるＨＳ鎖の範囲をさらに狭めるであろう。
【０３１３】
ＨＳ１６陽性は、ヘパリンと類似の度合いまで、ＴＧＦ−β１駆動性ＳＭＡＤシグナル伝達を増強した。予期せぬことに、ＬＴＧＦ−β１に対する影響は、ＬＴＧＦ−β１とヘパリンのものよりもより顕著であった。ＬＴＧＦ−β１は、in vivoではＴＧＦ−β１の
主な形であるため、これは、ＨＳの合成、およびＴＧＦ−β１シグナル伝達において、ＨＳが果たす生理学的役割に関する興味深い疑問を提示する。ＬＴＧＦの潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）部分は、ＬＴＧＦ−β１複合体においてＴＧＦ−β１を捕捉するような方式で、安定と見なされる構造を有するが、分子の２つの領域は、アンフォールディング可能である［Shi, M.ら  潜在ＴＧＦ−β構造および活性化。 Nature, 2011. 474(7351):p.343-349］。これらの領域のコンホメーションが、機械的に完全開放された際、活性ＴＧＦ−
β１はＬＡＰから放出される［Buscemi, L.ら，潜在ＴＧＦ−β１複合体の単一分子機構
。 Curr Biol, 2011. 21(24);p.2046-2054］。両方のドメインのこの同時アンフォールディングは、完全ＴＧＦ−β１放出に必要な全か無かのスナップ機構であり、ＬＡＰがＬＴＧＦ−結合タンパク質−１（ＬＴＢＰ−１）に結合した際にのみ可能である。ＬＡＰおよびＬＴＢＰ−１の両方がヘパリンと相互作用すると報告されてきていることに注目することが興味深い［Lee, M.J.，ヘパリンは潜在トランスフォーミング増殖因子−β１の活性
化を阻害する。Pharmacology, 2013. 92(5-6):p.238-244；Chen, Q.ら，  潜在ＴＧＦ−
β結合性タンパク質−１の集合を調節することによる、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の制御におけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの潜在的な役割。  J. B
iol Chem, 2007. 282(36):p.26418-26430；およびParsi, M.K.ら，ＬＴＢＰ−２は多数のヘパリン／ヘパラン硫酸結合部位を有する。Matrix Biology, 2010. 29(5):p.393-401］
。証拠によって、in vivoで合成されるＨＳは、ＬＴＧＦ−β１を活性化し始める可能性
もあることが示唆されるが、この機械力の生成または放出のいずれかにＨＳが関与しているかどうか、そしてそれはどのようにかは核心に関連する問題である。
【０３１４】
ＨＳ１６陽性の組成をＨＳ３陽性のものと比較すると、組成の相違が明らかになった。ＨＳ変異体がＢＭＰ−２に結合し、そしてその活性を調節する能力において観察される相違は、おそらく、その組成およびその結果のＨＳ鎖中で統合される二糖の相違の組み合わせの結果である。ＢＭＰ−２−ヘパリン相互作用のモデリング［Gandhi, N.S.およびR.L.
Mancera，骨形成タンパク質（ＢＭＰ）におけるヘパリン結合部位の予測。 Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics, 2012. 1824(12):p.1374-1381］に
よって、会合がヘパリンとＴＧＦ−β１のものとは有意に異なることが示唆され、このことは、ＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性の組成の相違を説明し、そしてＴＧＦ−βスーパーファミリー内のヘパリン／ＨＳ結合部位の多様性をほのめかす［Rider, C.C.，  ＴＧＦ
−βサイトカインスーパーファミリーにおけるヘパリン／ヘパラン硫酸結合。 Biochem Soc Trans, 2006. 34(Pt3):p.458-460］。ＨＳＰＭに比較して、ＨＳ１６陽性が、ＢＭＰ
−２駆動性ＡＬＰ発現を増強する能力に観察される中程度の増加は、ＨＳ１６陽性における硫酸化ＨＳ鎖が濃縮されて、ＨＳＰＭよりヘパリンに類似しているか、またはＨＳ１６陽性およびＨＳ３陽性調製物におけるＨＳ鎖の組成が重なっているかどちらかに起因しうる。
【０３１５】
ＨＳは、核酸およびタンパク質に見られるものと同じ絶対配列特異性を持ってコードされるようではないが、本発明者らの結果は、現在のＨＳ「糖暗号」仮説の説得力のある証拠を提供し［Gama, C.I.ら，  グリコサミノグリカンの硫酸化パターンは、分子認識および活性をコードする。 Nat Chem Biol, 2006. 2(9):p.467-473；Duchesne, L.ら，細胞周辺マトリックス中の線維芽細胞増殖因子２の輸送は、ヘパラン硫酸における結合部位の空間的分布によって制御される。 PLoS Biol, 2012. 10(7):p.e1001361；Ｃhang, Z.ら，ヘパラン硫酸プロテオグリカンがｉｎ  ｓｉｔｕで線維芽細胞増殖因子受容体複合体を組み立てる示差的能力。 FASEB J, 2000. 14(1):p.137-144；およびJastrebova, N.ら，ヘパ
ラン硫酸ドメイン組成および硫酸化は、ＦＧＦ２誘導性細胞シグナル伝達を調節する。 J
Biol Chem, 2010]、そして結合力および生物活性の間の非線形関係を補強する［Rudd, T.R.ら，多様なＨＳおよび非ＧＡＧ類似体によって、ＦＧＦにおいて、匹敵する安定化、
構造変化および活性が誘導可能である：配列−活性関係の暗示。 Org Biomol Chem, 2010. 8(23):p.5390-5397.］。解答されないままである主な疑問の１つは、所定のＨＳ鎖が所定のタンパク質と相互作用するために必要なストリンジェンシーレベルである。ＧＡＧ構成を解読する改善されたコンピュータツールの開発が、この努力を補助するであろうと期待される［Spencer, J.L.ら，グリコサミノグリカン構成を解読するためのコンピュータ
アプローチ PLoS ONE, 2010. 5(2):p.e9389］。
【０３１６】
実施例１に関する参考文献
【０３１７】
【化１−１】
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2020143293.tif 000014
【０３２１】
実施例２：  in vitroおよびin vivoでのＭＳＣの軟骨形成分化に対するＨＳ１６陽性
の影響
序論
関節軟骨は、長骨の端に見られる組織であり、関節において、衝撃吸収剤および潤滑剤の両方として働く。無血管性であるため、関節軟骨によって維持される傷害はしばしば治癒に失敗する。軟骨修復戦略の開発に関する現在の研究は、活性化されたバイオマテリアルの使用または細胞への誘導性の合図の提供を通じて、内因性または移植された細胞のいずれかからの反応を刺激することに焦点を置いている［１４５． Guo, X.ら，  ウサギモデルにおける、骨髄間葉系幹細胞を被包する生物分解性ヒドロゲル複合体での骨軟骨欠損の修復。 Acta Biomaterialia, 2010. 6(1):p.39-47；Chu, C.R., M. Szczodry，およびS. Bruno，軟骨再生および修復のための動物モデル。 Tissue Engineering Part B: Reviews, 2009. 16(1):p.105-115；Fritz, J.ら，  膝における関節軟骨欠損−基礎、療法および結果。 Injury, 2008. 39（１，補遺）：p.50-57；Hunziker, E.B.，関節軟骨修復：基礎科学および臨床的進展。現在の状態および展望の概説。 Osteoarthritis Cartilage, 2
002. 10(6):p.432-463；Gille, J.ら，関節軟骨欠損の治療のための、微小破壊を通じた
、細胞含有および細胞不含マトリックス誘導性軟骨形成:ヒツジにおける組織学的および
生物学的研究。 Cartilage, 2010. 1(1):p.29-42；Haleem, A.M.ら，関節軟骨欠損治療において、血小板リッチ・フィブリン接着剤上に移植されたヒト培養拡大自己骨髄間葉系幹細胞の臨床的使用。 Cartilage, 2010. 1(4):p.253-261；Moran, C.J.ら，関節軟骨の回
復。 J Bone Joint Surg Am, 2014. 96(4):p.336-344；Danisovic, L.u.ら，関節軟骨の
組織操作：細胞、足場および刺激因子。 Exp Biol Med, 2012. 237(1):p.10-17.］。ＴＧＦ−β１は、ＭＳＣの軟骨形成分化を刺激し［Buxton, A.N.ら，軟骨形成因子に一時的に曝露すると、ヒドロゲルにおけるヒト間葉系幹細胞軟骨形成が調節される Tissue Eng Part A, 2011. 17(3-4):p.371-80；２３３．Bosnakovski, D.ら，ペレット培養系における
ウシ骨髄間葉系幹細胞の軟骨形成分化。 Experimental Hematology, 2004. 32(5):p.502-509；Ng, F.ら，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＦＧＦシグナル伝達は、間葉系幹細胞（
ＭＳＣ）の分化および増殖に重要である：転写プロファイリングは、脂肪形成、軟骨形成、および骨形成系譜へのＭＳＣの分化において重要なマーカーおよびシグナル伝達経路を同定可能である。 Blood, 2008. 112(2):p.295-307.］、そして軟骨ＥＣＭ分子の発現を
駆動する［Li, H.ら，  ＩＩ型コラーゲンとの比較分析は、初代ＴＧＦβ反応性遺伝子としての軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質を区別する。Osteoarthritis Cartilage, 2011. 19(10):p.1246-1253；Iqbal, J.ら，  ウマ関節軟骨における、プロテオグリカン
合成に対するＴＧＦ−βの年齢関連効果。Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(2):p.467-471；Grimaud, E., D. Heymann，およびF. Redini，軟骨細胞代謝に対するＴＧＦ−β効果の最近の進歩：軟骨障害におけるＴＧＦ−βの潜在的な療法的役割。Cytokine Growth Factor Rev, 2002. 13(3):p.241-257；Serra, R.ら，マウス骨格組織における一部切除キナーゼ欠損性ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体の発現は、末端軟骨細胞分化および変形性関節症を促進する。J Cell Biol, 1997. 139(2):p.541-552.；Blaney Davidson, E.ら，Ｓｍ
ａｄ７の存在下で、ＴＧＦベータ誘導性軟骨修復は維持されるが、線維症はブロックされる。Arthritis Res Ther, 2006. 8(3):p.R65］能力のため、軟骨修復誘導に関する重要な作用因子として浮上してきている。こうしたものとして、今日までの大部分の研究は、内因性ＴＧＦ−β１を単独でまたは他の増殖因子とともに使用して、ｈＭＳＣ軟骨形成分化を駆動してきた［Blaney Davidson, E.N., P.M. van der Kraan，およびW.B. van den Berg，ＴＧＦ−βおよび変形性関節症。Osteoarthritis Cartilage, 2007. 15(6):p.597-604；Park, J.S.ら，ヘパリン結合性トランスフォーミング増殖因子β３は、ウサギ間葉系
幹細胞による新規軟骨形成を増進する。Transplantation, 2008. 85(4):p.589-596；Goepfert, Cら，間葉系幹細胞からの軟骨操作，Bioreactor Systems for Tissue Engineering
II中， C. Kasper, M. van Griensven，およびR. Portner監修  2010，Springer Berlin/Heidelberg,p.163-200；Mara, C.S.ら，  ヒト間葉系臍帯血細胞からの、トランスフォ
ーミング増殖因子−β３およびインスリン様増殖因子−１による軟骨形成の制御。J Rheumatol. 2010. 37(7):p.1519-1526.］。
【０３２２】
最初は成功するように見えたが、こうしたアプローチは、クリニックに移行する際に大きな障壁に直面し、これは、ＴＧＦ−β１超生理的用量がしばしば使用され、そして２０ｎｇの用量であってさえ、滑膜炎症などの望ましくない転帰を生じることが示されてきているためである［Leah, E.，  変形性関節症：軟骨変性の骨でのＴＧＦ−β過負荷  Nat Rev Rheumatol, 2013. 9(7):p.382-382；Allen, J.B.ら，トランスフォーミング増殖因子ベータによって誘導される迅速な滑膜炎症開始および過形成。J Exp Med, 1990. 171(1):p.231-247］。非生理学的用量の問題とは別に、線維症および発癌などの全身性の副作用
を誘発することを防止するために、治療部位に増速因子を局在させる必要もまたある［Jakowlew, S.，癌および転移におけるトランスフォーミング増殖因子β。Cancer Metastasis Rev, 2006. 25(3):p.435-457；Bakker, A.C.ら，ネズミ膝関節における活性ＴＧＦ−ベータ−１の過剰発現：滑膜層依存性軟骨骨棘形成の証拠。Osteoarthritis Cartilage, 2001. 9(2):p.128-136；Yang, Y.-a.ら，可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストに対する生涯の
曝露は、副作用を伴わずに、転移に対してマウスを保護する。J Clin Invest, 2002. 109(12):p.1607-1615.］。さらに、ＴＧＦ−β１に対する感受性は、年齢とともに減少し［Blaney Davidson, E.N.ら，高齢マウスの軟骨におけるトランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の減少：損なわれた修復能における役割。Arthritis Res Ther, 2005. 7(6):p.R1338-R1347.］、したがって、適切なＴＧＦ−ベータ１投薬は、高齢患者に対して
さらにより多くのリスクを提示する。これらの困難に対処して、外因性増殖因子に対する必要性を減少させるか、または完全に除去し；治療部位に増殖因子をよりよく局在させ、そして増殖因子の送達を調節し；そして増殖因子に対する細胞感受性または増殖因子のシグナル伝達効率のいずれかをブーストする新規戦略が考慮されている。
【０３２３】
ＨＳ１６陽性の開発、およびＭＳＣ単層培養においてＨＳ１６陽性がＴＧＦ−β１駆動性ＳＭＡＤ反応を増強する能力を記載してきたが、本発明者らは、内因性ＴＧＦ−β１を隔離することによって、軟骨治癒を改善するためにこれを使用することも可能であると推測した。したがって、本発明者らは、（１）in vitroでのｈＭＳＣの軟骨形成分化；および（２）ウサギモデルにおける軟骨治癒反応に対する影響を調べることにした。
【０３２４】
本実施例は、ｈＭＳＣの軟骨形成分化に対するＨＳ１６陽性のin vitro効果を調べるための修飾微量ペレット培養系の使用を記載する。これを進めて次に、軟骨修復のウサギモデルにおける滑車溝の全層骨軟骨欠損内の現在の臨床的「標準治療」と組み合わせて用いた際の、以前記載されるＨＳ変異体の効果を調べる。
【０３２５】
材料および方法
逆転写および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
製造者のプロトコルにしたがって、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Life Technologies、米国カリ
フォルニア州）を用いて、軟骨形成微量ペレットから総ＲＮＡを単離した。１μｇ  ＲＮＡに対して、製造者の指示にしたがい、SuperScript（登録商標）VILOTM cDNA合成キット（Life Technologies）を用いて、４２℃でのインキュベーションを１時間ではなく２時
間行って、逆転写を行った。各ｑＰＣＲは、４０ｎｇ  ｃＤＮＡ、遺伝子あたり１μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー−プローブ混合物、および１０μＬ  Taqman（登録商標）迅速普遍的ＰＣＲマスター混合物（Life Technologies）を最終体積２０μＬ中に
含有した。熱周期条件は、９５℃で２０秒間、その後、４５周期の９５℃１秒間および６０℃２０秒間が続いた。各ｑＰＣＲを２つ組で実行し、そして遺伝子発現をＨＰＲＴ１発現に対して規準化して、ΔＣｔ値を得た。生物学的３つ組の平均値を取った。ＧＡＧもＴＧＦ−β１も含まない培地中で培養した軟骨形成微量ペレットを、対照（ΔΔＣｔ）として用いた。各プライマーセットの相対発現レベルを２−ΔΔＣｔ法によって倍変化として表した［Livak, K.J.およびT.D. Schmittgen，リアルタイム定量的ＰＣＲおよび２−ΔΔＣＴ法を用いた相対的遺伝子発現データの分析。Methods, 2001. 25(4):p.402-408］。以下のTaqMan（登録商標）プライマー−プローブアッセイ（Life Technologies）を用いた
：
in vivo研究設計
２２の骨格的に成熟したオス・ニュージーランドホワイト・ウサギ（平均年齢９ヶ月および体重３．９ｋｇ）をこの研究に用いた。すべてのウサギに、大腿滑車溝中、両側性骨軟骨欠損を与え、そして各欠損をランダムに、４つの処置群の１つに割り当てた：（１）ゲルのみ、（２）ゲル＋ＨＳＰＭ、（３）ゲル＋ＨＳ１６陽性、および（４）ゲル＋ＨＳ１６陰性。すべての欠損に６０μＬのヒアルロン酸に基づくヒドロゲル（ゲル）（AuxiGelTM、Termira AB、スウェーデン・ストックホルム）［Bergman, K.ら，骨−組織形成のための注射可能細胞不含テンプレート。Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 91A(4):p.1111-1118］を、単独で、あるいは１０μｇのＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽
性またはＨＳ１６陰性とともに投与した。術後の胃内容うっ滞から２匹のウサギが死亡し、そしてこれらは分析には含まれなかった。
【０３２６】
欠損生成およびゲル注入
この研究に用いた研究プロトコルは、施設動物飼育使用委員会、Ａ＊ＳＴＡＲシンガポールによって認可され、そしてすべての適切な指針にしたがった。ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）注射ならびにフェースマスクを通じたイソフルランの組み合わせからなる全身麻酔下、そして無菌条件下ですべての外科処置を行った。１５〜２０ｍｍの内側膝蓋近傍皮膚切開を作製し、そして膝蓋を横方向に脱臼させた。１つの全層で重大なサイズの骨軟骨欠損（直径４ｍｍ、深さ２ｍｍ）を各大腿滑車溝の中央に作製し、石灰化した軟骨を完全にデブリードマンした。続いて、整形外科ドリルを用いて、各欠損中に３つの微小破壊（直径０．８ｍｍ、深さ２ｍｍ）を作製し、そして手術ガーゼで直接圧を適用して、示す処置を適用する前に、すべての出血が止まることを確実にした。２００μＬピペットで処置を適用し、そし固化させた。ゲルキャリアが固化する間、すべての欠損に血液が満たされることを観察した。
【０３２７】
ゲルキャリアが固化したら、膝蓋を再配置し、そして関節を１５回屈曲させて切開が層中に閉鎖される前に、処置が適所にあり続けることを確実にし、そしてウサギが体重を増やすことを可能にした。創傷部位をさらにVetbondTM組織接着剤（３Ｍ、米国ミネソタ州
）で密封した。予防的抗生物質（エンロフロキサシン、１０ｍｇ／ｋｇ）および鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．１ｍｇ／ｋｇ）を術後５日間、皮下投与した。１２週後、鎮静の後に、すべてのウサギをペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させた。遠位大腿を採取し、そして組織学的および免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析のためにプロセシングする前に、巨視的に画像化した。
【０３２８】
関節の巨視的病理学的観察
処置群を知らないブラインドの観察者が、関節の画像を調べ、そしてスコア付けした。巨視的スコア付けは、国際軟骨修復協会（ＩＣＲＳ）視覚的評価スケール（ＩＣＲＳ  Ｉスコア付けシステム）に基づいた［Brittberg, M.およびL. Peterson，関節軟骨分類の序論  ICRS Newsletter, 1998. 1:p.5-8.］。
【０３２９】
組織学分析
採取した遠位大腿骨頭を１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中、真空下で１週間固定し、そして室温で平均６〜７日間、５％（ｖ／ｖ）ギ酸中で脱灰した。続いて、試料をパラフィン蝋中に包埋し、そして欠損中央を横断して切片作製した（５μｍ）。切片を脱パラフィン処理し、そしてマッソンの三色、アルシアンブルー（ｐＨ１、ニュートラルレッドで対比染色）およびサフラニン−Ｏで染色した。
【０３３０】
免疫組織化学（ＩＨＣ）分析
Ｌｅｉｃａ  ＢｏｎｄＴＭ−ＩＩＩまたはＬｅｉｃａ  ＢｏｎｄＴＭ−Ｍａｘ自動染色装置（Leica Nussloch GmbH、ドイツ）のいずれかおよびＢｏｎｄＴＭ  Ｒｅｆｉｎｅ検
出キット（Leica）を用いて、ＩＨＣ染色を行った。切片をＢｏｎｄＴＭ脱ワックス溶液
（Leica）で脱パラフィン処理し、そしてプロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍＬ）（Sigma-Aldrich）と室温で１５分間インキュベーションすることによって、抗原回収を行った。３〜４％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２と１５分間インキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、切片を１０％（ｖ／ｖ）ヤギ血清中で３０分間ブロッキングした後、ＢｏｎｄＴＭ一次抗体希釈剤（Ｌｅｉｃａ）中で希釈した一次抗体（コラーゲンＩ型（１：１０００）、Novus Biologicals、米国コロラド州、およ
びコラーゲンＩＩ型（１：２０００）、Acris Antibodies, Inc.、米国カリフォルニア州）と室温で３０分間インキュベーションした。ＢｏｎｄＴＭ  Ｒｅｆｉｎｅ検出キットに記載されるように染色の検出を行い、そして核をヘマトキシリンで５分間対比染色した。すべての洗浄は、１ｘＢｏｎｄＴＭ洗浄溶液（Leica）で行った。
【０３３１】
組織学的スコア付け
処置群を知らないマスキングされた観察者が、染色切片の検査およびスコア付けを行った。スコア付けは、O’Driscoll［O’Driscoll, S.W., F.W. Keeley，およびR.B. Salter，連続受動的運動の影響下での関節表面における大きな全層欠損の生物学的表面再形成のための遊離自家骨膜の軟骨形成潜在能力。ウサギにおける実験的検査。J Bone Joint Surg Am, 1986. 68(7):p.1017-1035］およびＩＣＲＳ  ＩＩ［Mainil-Varlet, P.ら，ヒト軟骨修復の品質の評価のための新規組織学スコア付けシステム：ＩＣＲＳ  ＩＩ。The American Journal of Sports Medicine, 2010］スコア付けシステムに基づき、そして軟骨お
よび軟骨下空間内の各組織タイプ（すなわち骨性組織、線維性組織、線維軟骨、ハイブリッド軟骨および硝子軟骨）の割合を定量化することによって、組織充填を決定した。
【０３３２】
結果
in vitroのｈＭＳＣの軟骨形成分化に対するＨＳ１６陽性の影響
in vitroのｈＭＳＣの軟骨形成分化に対するＨＳ１６陽性の影響を評価するため、まず、ＴＧＦ−β１単独の影響を確立する必要があった。修飾微量培養系を用いて、軟骨形成分化を行った［Zhang, Lら，ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成分化：微量およびペレット培養系の間の比較。Biotechnol Lett, 2010. 32(9):p.1339-1346.］。簡潔には、第４継代の
ｈＭＳＣを採取し、そして化学的に定義された軟骨形成培地（ＰＴ−３００３、Lonza、
米国メリーランド州）中に、２ｘ１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、１２．５μｌの小滴を２４ウェルプレート中の各ウェルの中央に植え付け、そして３７℃で２時間接着させ、その後、１または１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（１００−２１Ｃ、PeproTech）
のみ、あるいは５または１０μｇ／ｍＬのヘパリン（Sigma-Aldrich）、ブタ粘膜ＨＳ（
ＨＳＰＭ）（Celsus Laboratories）、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性のいずれかを補
った５００μＬの軟骨形成培地を各ウェルに添加した。細胞小滴は、２４時間後に球状の塊に合体した。培地を３日ごとに交換し、そして微量を第３日、第７日、第１４日、および第２１日に採取した。
【０３３３】
生じた対照（対照）およびＴＧＦ−β１処理（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＴＧＦ−β１）微量ペレットの湿重量を第３日、第７日、第１４日および第２１に測定した（図１５）。どちらの処置群でもペレットの重量は時間とともに減少し、一方、重量喪失は、対照ペレットよりもＴＧＦ−β１処理ペレットにおいてより顕著でなかった。
【０３３４】
第３日（ＳＯＸ９およびＣＯＭＰのみ）、第７日、第１４日および第２１日の微量ペレットの遺伝子発現分析によって、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）での処理が、未処理対照ペレット（対照）に比較して、一貫して、軟骨形成マーカーＳＯＸ９（図１６Ａ）、ＣＯＭＰ（図１６Ｂ）、およびアグリカン（図１６Ｃ）の発現増加を導いたことが明らかになった。未分化ｈＭＳＣを第０日の対照として用いた。ＩＩ型コラーゲン転写物は、ＴＧＦ−β１処理ペレットおよび未分化ｈＭＳＣにおいてのみ検出可能であった（図１６Ｄ）。これは、ｈＭＳＣが、単層中で増殖した際、低レベルのＩＩ型コラーゲン転写物を発現するが、この発現は、これらを、ＴＧＦ−β１を含まない軟骨形成培地中、微量培養した際には失われることを示唆するようである。最後に、ＴＧＦ−β１処理ペレットは、対照ペレット（図１６Ｅ）に比較して、軟骨細胞過形成のマーカーであるＸ型コラーゲン転写物を非常に高レベルで発現していることが見出された（図１６Ｅ）。こうした高発現レベルによって、ペレットは軟骨内骨化の前兆として、軟骨形成過形成を経ると示唆される［Shen, G.，関節軟骨の軟骨内骨化の促進および制御におけるＸ型コラーゲンの役割。Orthodontics & Craniofacial Research, 2005. 8(1):p.11-17］。
【０３３５】
第２１日、パラフィン包埋ペレットを、ＧＡＧを青く染色するアルシアンブルー染色によって、組織学的検査すると、ＴＧＦ−β１処理ペレットが、対照ペレットよりもより多
くのＧＡＧを含有することが明らかになった。
【０３３６】
ｈＭＳＣの軟骨形成分化に対するＴＧＦ−β１の影響が確立されているため、本発明者らは次に、ＨＳ１６陽性の影響の検討に着手する前に、ヘパリンが有する影響を調べることにした。実施例１において、本発明者らは、処置６時間後、ヘパリンがＴＧＦ−β１に駆動されたｐＳＭＡＤに結合し、そしてそのシグナルを増強することが可能であることを示した。軟骨形成分化プロセス中、３日ごとに培地を交換するため、本発明者らは、第３日の時点を用いることを選択し、どちらも初期軟骨形成マーカーであるＳＯＸ９およびＣＯＭＰの発現に対するヘパリンの影響を調べた［Barry, F．ら，骨髄由来の間葉系幹細胞の軟骨形成分化：マトリックス構成要素の分化依存性遺伝子発現。Exp Cell Res, 2001. 268(2):p.189-200；Li, H.ら，コラーゲンＩＩ型を用いた比較分析は、一次ＴＧＦβ反応遺伝子として、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質を区別する。Osteoarthritis Cartilage, 2011. 19(10):p.1246-1253；Huang, A.H., A. Stein，およびR.L. Mauck，軟骨
組織操作のための間葉系幹細胞軟骨形成の転写組織分布。Tissue Eng Part A, 2010. 16(9):p.2699-708；Zaucke. F.ら，軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）および
コラーゲンＩＸは、関節初代軟骨細胞の分化状態に関する高感度マーカーである。Biochem J, 2001. 358(1):p.17-24.］。本発明者らはまた、ヘパリンがＴＧＦ−β１の影響を増強する場合、１０ｎｇ／ｍＬの推奨される用量に反応したさらなる増加は、検出可能ではない可能性もあると判断した。したがって、推奨される用量と平行して、より低い用量のＴＧＦ−β１を用いた。本発明者らのデータは、５μｇ／ｍＬのへパリンは、用いたＴＧＦ−β１の量に関わらず、ＳＯＸ９発現レベルを有意に改変しないことを示す（図１７Ａ）。対照的に、１０μｇ／ｍＬのヘパリンはそれ自体、ＳＯＸ９発現に影響を及ぼさないが、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１とともに用いると、ＳＯＸ９の発現を増加させることが可能であった。ヘパリンの同じ用量は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１とともに用いた際、ＳＯＸ９発現にいかなる変化ももたらすことができず、ＴＧＦ−β１シグナルがすでに飽和していることが示唆された。ＣＯＭＰ発現の場合、ヘパリンのどちらの用量もそれ自体ではＣＯＭＰをわずかに減少させることが見出された（図１７Ｂ）。しかし、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１と組み合わせて用いた際、ヘパリンは、ＣＯＭＰ発現レベルを用量依存方式で増加させることが可能であった。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を伴うヘパリンのいずれの用量の使用も、ＣＯＭＰ発現のさらなる増加を誘発しなかった。事実、より高い用量のヘパリンは、実際にＣＯＭＰ発現レベルを減少させた。これは再び、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１が、軟骨形成分化を経るｈＭＳＣの飽和用量であることを示唆する。１０μｇ／ｍＬのヘパリンを１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１とともに用いた場合に見られるＣＯＭＰ発現の減少は、過剰なＴＧＦ−β１シグナルに反応した負のフィードバック機構の活性化を示唆する。
【０３３７】
１ｎｇ／ｍＬ用量のＴＧＦ−β１と組み合わせて、１０μｇ／ｍＬのＧＡＧの用量を使用することを選択した。１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１および１０μｇ／ｍＬヘパリンまたは１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１のいずれかとともに２１日間培養したペレットの組織学的分析によって、アルシアンブルー染色に基づき、より高い用量のＴＧＦ−β１がＧＡＧ産生および沈着の増加を導くことが示された。ＴＧＦ−β１を伴うヘパリンの使用は、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１単独に比較して、ＧＡＧ沈着のわずかな増加を導いたが、この増加はなお、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１で見られるものより少なかった。
【０３３８】
次に、ｈＭＳＣを１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１のみの存在下で（１  ＴＧＦ−β１）、または１０μｇ／ｍＬのＧＡＧ（ヘパリン、ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性またはＨＳ１６陰性）と組み合わせて、あるいは陽性対照として１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１（１０  ＴＧＦ−β１）とともに、２１日間分化させた。
【０３３９】
２１日でのＳＯＸ９  ｍＲＡ発現の分析によって、用いたすべての糖は、有意な変化を生じなかった（図１８Ａ）。ペレットを１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１と組み合わせたヘパリンまたはＨＳ１６陽性（Ｐ＜０．０５）とともに培養した際、ＣＯＭＰ発現は、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１単独と比較して、〜２．５倍増加した（図１８Ｂ）。低（１ｎｇ／ｍＬ）ＴＧＦ−β１およびＨＳＰＭまたはＨＳ１６陰性を補充したか、あるいは高（１０ｎｇ／ｍＬ）ＴＧＦ−β１を補充した培地中での培養は、低用量ＴＧＦ−β１のみに比較して、ＣＯＭＰ発現を有意に改変しなかった。
【０３４０】
アグリカン発現は、第２１日、ＴＧＦ−β１およびヘパリンおよびＨＳ１６陽性の低および高用量で同様であった（図１８Ｃ）。しかし、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性を伴う培養は、アグリカン転写物レベルを減少させた。高ＴＧＦ−β１は、低ＴＧＦ−β１に比較して、Ｘ型コラーゲン発現の有意な増加（Ｐ＜０．００１）を誘導した（図１８Ｄ）。ＧＡＧでの処理は、低ＴＧＦ−β１に比較してＸ型コラーゲン発現を有意に改変しなかった。ＩＩ型コラーゲン転写物は、高ＴＧＦ−β１で処理したペレットにおいてのみ検出され、そしてしたがって、ここには示さない。ＨＳ１６陽性で処理したすべての試料において、データセット内の外れ値の存在に起因する、高い分散が見られたことに注目すべきである。
【０３４１】
第２１日のアルシアンブルー染色によるペレットの組織学的検査は、低ＴＧＦ−β１に比較して、多様な糖と培養したペレット間に有意な相違を示さなかった。しかし、高ＴＧＦ−β１は、低ＴＧＦ−β１に比較して、ＧＡＧ産生の穏やかな増加を誘導した。
【０３４２】
in vivoのＭＳＣの軟骨形成分化に対するＨＳ１６の影響
軟骨修復研究において、広範囲に使用されていることに基づき、そしてかつ若年期に観察される自発的な治癒を回避するため、骨格的に成熟した成体ニュージーランドホワイト・ウサギを本発明者らのin vivo試験に選択した。本発明者らは、大腿滑車溝に、全層骨
軟骨欠損を含むモデルにおいて、本発明者らの化合物を試験することを選択し、Reinholzら［Reinholz, G.G.ら，軟骨再構築のための動物モデル。Biomaterials, 2004. 25(9):p.1511-1521.］、ＩＣＲＳ［Hurtig, M.B.ら，軟骨修復のための前臨床研究：国際軟骨修復協会からの推奨。Cartilage, 2011. 2(2):p.137-152.］、および現在の病院における標準治療［Fritz, J.ら，膝関節軟骨欠損−基礎、療法および結果。Injury, 2008. 39（１，
補遺）：p.50-57；Hunziker, E.B.，関節軟骨修復：基礎科学および臨床的進歩。現在の
状態および展望の概説。Osteoarthritis Cartilage, 2002. 10(6):p.432-463］に概略さ
れる指針に基づき、商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくヒドロゲル（ＡｕｘｉＧｅｌＴＭ、Termira AB）とともに、微小破壊を用いた［Bergman, K.ら，骨−組織形成のた
めの注射可能細胞不含テンプレート。Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 91A(4):p.1111-1118］。
【０３４３】
ウサギおよびヒトＴＧＦ−β１の配列整列によって、ＴＧＦ−β１が両種に渡って非常に保存されているだけでなく、同定されるヘパリン結合ドメインがほぼ同一であることが明らかになった（図１９）。ウサギ関節液におけるＴＧＦ−β１の平均レベルは、若いウサギの１１２．７ｐｇ／ｍＬから成体ウサギの５２．３ｐｇ／ｍＬまでの範囲であることが見出され［Wei, X.およびK. Messner，ウサギ膝関節液中のトランスフォーミング増殖
因子β１およびプロテオグリカン断片の年齢および傷害依存性濃度。Osteoarthritis and
Cartilage, 1998. 6(1):p.10-18．］、一方、抗凝固骨髄吸引物中のレベルは、成体ウサギにおいて、１９０〜８８１．８ｐｇ／ｍＬ（ｎ＝２０）であることが見出された（Lim,
Z. X. H.、未公表データ）。別個の研究もまた、血小板活性化後、最大ナノグラムレベ
ルまでのＴＧＦ−β１の増加を報告しており［Coupes, B.M.ら，血漿トランスフォーミング増殖因子β１および血小板活性化：移植レシピエントにおける研究のための暗示。Nephrol Dial Transplant, 2001. 16(2):p.361-367］、そして創傷中に軟骨修復を刺激するた
めに十分なレベルのＴＧＦ−β１の存在を報告している［Shah, R.N.ら，軟骨再生のための自己組み立てナノファイバーの超分子設計。Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(8):p.3293-3298］。こうしたものとして、本発明者らの糖処理を伴う外因性ＴＧＦ−β１の使用は排除された。
【０３４４】
以下の群を比較する１２週の研究を行った：（１）欠損あたり６０μＬのヒドロゲルで処置する対照群（ゲルのみ）；（２）６０μＬのヒドロゲルおよび１０μｇのＨＳＰＭで処置する欠損（ＨＳＰＭ）；（３）６０μＬのヒドロゲルおよび１０μｇのＨＳ１６陽性で処置する欠損（ＨＳ１６陽性）；ならびに（４）６０μＬのヒドロゲルおよび１０μｇのＨＳ１６陰性で処置する欠損（ＨＳ１６陰性）。本発明者らの以前の研究に基づいて、１０μｇ／ｍＬのＧＡＧが、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βの影響を増進するために最適であると決定された。こうしたものとして、滑膜腔内のありうる拡散を考慮した後であっても、１０μｇのＧＡＧの用量が、欠損内でこの最適な濃度を達成するために十分であると決定された。欠損を上述のように生成した。試験終了前に、胃内容うっ滞から２匹のウサギが死亡し、そしてこれらは分析には含まれなかった。
【０３４５】
試験終了時、全大腿をウサギから採取し、１０％（ｖ／ｖ）ＮＢＦ中で固定し、そして巨視的に画像化した後、脱灰し、そして組織学用にプロセシングした。１２週後の欠損の巨視的観察によって、対照（ゲルのみ）および処置群間には、組織充填に関してわずかな相違が明らかになった。各処置群内の組織充填において等量の変動があったが、対照群ではより多くの欠損が他の群におけるものに比較して、不完全に充填されていた。ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陽性およびＨＳ１６陰性で処置した群の中央値スコアは、ゲルのみのものより高く（図２０Ｂ）、ＨＳ１６陽性の使用が治癒反応の堅牢性を改善した可能性があることが示唆された。
【０３４６】
O’DriscollおよびＩＣＲＳ  ＩＩスコア付けシステムの組織学的スコアは、処置群間
で有意な相違を示さなかった。軟骨および軟骨下空間の境界をまず同定し、画像化切片上にグリッドを重ね合わせ、そして次いで各組織学的空間に充填された空間の量を測定することによって、欠損の組織充填を決定した。組織充填に関して、ほぼすべての試料は、完全な軟骨下充填および高レベルの軟骨充填を示した。すべての処置群に関して組織充填スコア間に統計的な相違はなかった。すべての試料における軟骨下充填の中央値パーセントは同様であった。すべての３つの化合物（ＨＳＰＭ、ＨＳ１６陰性およびＨＳ１６陽性）は、現在の臨床的標準治療処置である対照試料（ゲル）よりも高い中央値組織充填スコアを有した。
【０３４７】
in vitroデータによって、ＨＳ１６陽性は、ＨＳＰＭおよびＨＳ１６陰性に比較して、いくつかの軟骨形成マーカーのＴＧＦ−β１誘導性発現を増進することが可能であったことが示される。これは、移植前に、ＨＳおよびＴＧＦβ１をあらかじめ装填する、例えばゲル構築物をこれらでコーティングするかまたは含浸することが必要でありうることを示唆する。
【０３４８】
in vivoデータによって、微小破壊およびヒドロゲル移植と組み合わせて、単回用量の
糖で全層骨軟骨欠損を治療すると、少なくとも現在の標準治療処置と同程度に優れており、そしてこれは望ましくない副作用を生じないことが示される。ＨＳ１６陽性は、in vivoデータにおいて、現在の臨床的標準治療処置である対照試料（ゲル）よりも高い中央値
スコアを有した。
【図１−１】
2020143293.tif 000017
【図１−２】
2020143293.tif 000018
【図２−１】
2020143293.tif 000019
【図２−２】
2020143293.tif 000020
【図３−１】
2020143293.tif 000021
【図３−２】
2020143293.tif 000022
【図４−１】
2020143293.tif 000023
【図４−２】
2020143293.tif 000024
【図５】
2020143293.tif 000025
【図６−１】
2020143293.tif 000026
【図６−２】
2020143293.tif 000027
【図７−１】
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【図７−２】
2020143293.tif 000029
【図８−１】
2020143293.tif 000030
【図８−２】
2020143293.tif 000031
【図８−３】
2020143293.tif 000032
【図８−４】
2020143293.tif 000033
【図８−５】
2020143293.tif 000034
【図９】
2020143293.tif 000035
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020143293.tif 000038
【図１３−１】
2020143293.tif 000039
【図１３−２】
2020143293.tif 000040
【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
2020143293.tif 000043
【図１６−１】
2020143293.tif 000044
【図１６−２】
2020143293.tif 000045
【図１６−３】
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【図１７】
2020143293.tif 000047
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
2020143293.tif 000050
【図２０】
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【配列表】
2020143293000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項２】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
【表１】
2020143293.tif 000052
を含む二糖組成を有する、請求項１に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項３】
ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
【表２】
2020143293.tif 000053
を含む二糖組成を有する、請求項２に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６を含み、増殖因子をさらに含む、組成物。
【請求項５】
増殖因子が、ＴＧＦβ１である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
間葉系幹細胞をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
バイオマテリアルおよび請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む、生体適合移植物または装具。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６で、バイオマテリアルをコーティングするか、または含浸する工程を含む、生体適合移植物または装具を形成する方法。
【請求項９】
in vitroで、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させて、幹細胞を培養する工程を含む、in vitroで幹細胞を培養する方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６を含み、ＴＧＦβ１をさらに含んでもよい、培地。
【請求項１１】
医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６；および
（ｉｉ）ＴＧＦβ１タンパク質；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物。
【請求項１２】
in vitroで増殖因子の安定性を増加させる方法であって、増殖因子を、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
血液由来産物およびあらかじめ決定した量の請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む調製物。
【請求項１４】
生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料を、あらかじめ決定した量の請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
in vivoデータによって、微小破壊およびヒドロゲル移植と組み合わせて、単回用量の糖で全層骨軟骨欠損を治療すると、少なくとも現在の標準治療処置と同程度に優れており、そしてこれは望ましくない副作用を生じないことが示される。ＨＳ１６陽性は、in vivoデータにおいて、現在の臨床的標準治療処置である対照試料（ゲル）よりも高い中央値スコアを有した。
発明の態様
［態様１］ヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様２］単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様３］アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、態様１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様４］ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
［表１］
を含む二糖組成を有する、態様１〜３のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様５］ヘパリン・リアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をＨＰＬＣ分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ１６が：
［表２］
を含む二糖組成を有する、態様１〜３のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様６］（ｉ）支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがアミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨを有するヘパリン結合ドメインを含み；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、固体支持体を、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸調製物を含む混合物と接触させ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分配し；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸種を解離させ；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカン、好ましくは１またはそれより多いヘパラン硫酸種を収集する
工程を含む方法によって得られる、態様１〜５のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様７］ポリペプチドがＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨ（配列番号１）より選択されるアミノ酸配列を有するか、または該配列からなる、態様６の方法。
［態様８］グリコサミノグリカンを含む混合物が、ブタ粘膜より得られるヘパラン硫酸調製物（ＨＳＰＭ）である、態様６または７の方法。
［態様９］態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む組成物。
［態様１０］増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１をさらに含む、態様９の組成物。
［態様１１］態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む化粧用組成物、医薬組成物または薬剤。
［態様１２］ＴＧＦβ１タンパク質および／または間葉系幹細胞をさらに含む、態様１１の医薬組成物または薬剤。
［態様１３］医学的治療法において使用するための態様１１または１２の医薬組成物または薬剤。
［態様１４］医学的治療法において使用するための態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様１５］医学的治療法がin vivoの創傷治癒法を含む、態様１４記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様１６］医学的治療法が、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を含む、態様１４記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６。
［態様１７］疾患、状態または組織に対する傷害の治療のための薬剤製造における態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６の使用であって、方法が、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を含む、前記使用。
［態様１８］患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、療法的有効量のヘパラン硫酸ＨＳ１６を患者に投与し、組織、好ましくは結合組織の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法。
［態様１９］組織の再生または修復が必要である、患者の体の創傷または位置にあるまたはそれを取り巻く組織にヘパラン硫酸ＨＳ１６を投与する工程を含む、態様１８の方法。
［態様２０］患者にＴＧＦβ１タンパク質を投与する工程をさらに含む、態様１８または１９の方法。
［態様２１］患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、バイオマテリアルおよび態様１〜８のいずれかに記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む、生体適合移植物または装具を、疾患、状態または傷害の部位のまたはそれを取り巻く組織内に、外科的に移植して、組織の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法。
［態様２２］バイオマテリアルおよび態様１〜８のいずれかに記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む、生体適合移植物または装具。
［態様２３］態様１〜８のいずれかに記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６で、バイオマテリアルをコーティングするか、または含浸する工程を含む、生体適合移植物または装具を形成する方法。
［態様２４］in vitroで、態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させて、幹細胞を培養する工程を含む、in vitroで幹細胞を培養する方法。
［態様２５］態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む培地。
［態様２６］ＴＧＦβ１をさらに含む、態様２５の培地。
［態様２７］あらかじめ決定した量の態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６およびあらかじめ決定した量のＴＧＦβ１を含む、キットオブパーツ（kit of parts）。
［態様２８］医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６；および
（ｉｉ）ＴＧＦβ１タンパク質；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物。
［態様２９］増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１の安定性を増加させる方法であって、増殖因子、好ましくはＴＧＦβ１を、態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。
［態様３０］被験体に、態様１〜８のいずれか記載のヘパラン硫酸ＨＳ１６を投与する工程を含む、美容法。
［態様３１］血液由来産物およびあらかじめ決定した量のヘパラン硫酸ＨＳ１６を含む調製物。
［態様３２］血小板調製物である、態様３１の調製物。
［態様３３］生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料を、あらかじめ決定した量のヘパラン硫酸ＨＳ１６と接触させる工程を含む、前記方法。