(57)【要約】      （修正有）【課題】ベクターDNAの存在及び維持のために抗生物質選択圧を必要としない、微生物宿主生物における目的タンパク質の組換え生産方法を提供する。【解決手段】微生物宿主生物における目的タンパク質の生産方法であって、a）目的タンパク質の遺伝子及び機能的frr遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築するステップ、b）a）で得られたベクターを、不活性化染色体frr遺伝子を有する宿主生物に形質転換するステップ、c）b）で得られた形質転換された宿主生物を、宿主生物における目的遺伝子の発現を可能にする条件で培養するステップ、及びd）目的タンパク質を単離するステップを含む方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物宿主生物における目的タンパク質の生産方法であって、
a）目的タンパク質の遺伝子及び機能的frr遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築するステップ、
b）a）で得られたベクターを、不活性化染色体frr遺伝子を有する宿主生物に形質転換するステップ、
c）b）で得られた形質転換された宿主生物を、宿主生物における目的遺伝子の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び
d）目的タンパク質を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
不活性化染色体frr遺伝子を有する宿主生物が、機能的frr遺伝子及びマーカー遺伝子を含むヘルパープラスミドを有し、かつa）で得られたベクターによる形質転換の後に、宿主生物がヘルパープラスミドの不存在について選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクター中のfrr遺伝子が、宿主生物に相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主生物が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
宿主生物の染色体frr遺伝子不活性化が、遺伝子欠失によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
frrの染色体遺伝子が不活性化されており、目的遺伝子と共に少なくとも一コピーの機能的frr遺伝子を含むベクターを含み、かつ抗生物質耐性のいかなる遺伝子も含まないことを特徴とする、形質転換された微生物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクターDNAの存在及び維持のために抗生物質選択圧を必要としない、微生物宿主生物における目的タンパク質の新規な組換え生産方法に関する。本発明はまた、染色体frr遺伝子が不活性化され、機能的frr遺伝子を含むベクターを含む、形質転換された宿主細胞も包含する。
【背景技術】
【０００２】
特に高コピー数でのベクターの安定的な維持は、ベクターから発現されるDNA及びタンパク質の調製にとって重要である。クローニングされた遺伝子を含み、細菌等の宿主に導入されたプラスミド等のクローニングベクターは、細菌の培養中に容易に失われる。これは、細胞分裂の際の、ベクターの娘細胞への制御されていない分配による。また、ベクターは細菌宿主にとって、代謝負荷である。プラスミドを失った細菌は、プラスミドを有する細菌と比較して、一般に良好に生育し、より多くなる。
【０００３】
プラスミドを有さない分離個体の蓄積は、それらが宿主娘細胞への秩序だった分配のためのいかなる遺伝子システムも有さないため、クローニング及び発現目的のために用いられる基本的なレプリコンプラスミドの問題の一例である。これは、大規模培養時の宿主細菌における発現プラスミドの維持における主要な産業的問題の一例である。分離個体のクローニングプラスミドの不安定性を克服するために、幾つかのアプローチが試されてきた。
【０００４】
ベクターに挿入された幾つかの抗生物質耐性遺伝子の使用、及び対応する抗生物質の増殖培地への添加が、プラスミド維持のための最もありふれた選択圧の一例である。抗生物質の経済的コストに加えて、抗生物質自身、及び産業廃棄物における抗生物質遺伝子の両方に由来する潜在的な環境への害は明白である。希釈及び／又は酵素消化の結果として、長期培養の間にプラスミド選択のために用いられる抗生物質の濃度がしばしば減少するため、プラスミドを有さない分離個体の出現は完全には防げない。
【０００５】
US 2004/0234984は、抗生物質耐性の欠失及び／又は宿主細胞におけるベクターの安定化の実施方法に関する。本発明に従って、ベクターを有する宿主細胞を全体的に選択する、新規なベクターが生産される。この特徴は、必須遺伝子の染色体コピーを欠失させ、それをプラスミド中に置換することによって得られる。結果として、プラスミド保有細胞のみが増殖し得、これにより宿主は全体的にプラスミド依存性になる。好ましくは、infA遺伝子等の小さな遺伝子が用いられる。infA遺伝子は、小さな、細胞内の、細胞生存に必須の因子である翻訳開始因子1（IF1）をコードしている。本プラスミドは、いかなる抗生物質遺伝子も含んでおらず、したがって抗生物質選択は必要でなく、これにより培養中にかなりの利点がもたらされ、顕著な環境的への懸念が排除される。本方法は宿主の排除が企図されない、温室及び自然に植えられるトランスジェニック植物のための植物細菌中のベクターを用いる安定化に対して、特に有利である。
【０００６】
Janosi et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 91, pp4249-4253, May 1994）には、大腸菌におけるfrr遺伝子の産物であるリボソーム遊離因子が、細菌の増殖に不可欠であることが記載されている。
【０００７】
Weixlbaumer et al.（Nature Structural and Molecular Biology, Vol. 14, Number 8, pages 733-737, August 2007）には、リボソームに結合するリボソームリサイクリング因子の結晶構造が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US 2004/0234984
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Janosi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 91, pp4249-4253, May 1994
【非特許文献２】Weixlbaumer et al., Nature Structural and Molecular Biology, Vol. 14, Number 8, pages 733-737, August 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ベクターDNAの存在及び維持のために抗生物質選択圧を必要としない、微生物宿主生物における目的タンパク質の組換え生産方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、ベクターを失った宿主生物の増殖を直ちに停止させることを目的として、宿主生物の増殖を、宿主生物におけるベクターの存在と、非常に感受性の高い方法で結び付けることである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、微生物宿主生物における目的タンパク質の生産方法であって、a）目的タンパク質の遺伝子及び機能的frr遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築するステップ、
b）a）で得られたベクターを、不活性化染色体frr遺伝子を有する宿主生物に形質転換するステップ、
c）b）で得られた形質転換された宿主生物を、宿主生物における目的遺伝子の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び
d）目的タンパク質を単離するステップ
を含む方法である。
【００１２】
本発明は、微生物におけるタンパク質の組換え生産に関する。
【００１３】
開示された発明について、目的タンパク質（PoI）は、10〜約1000、例えば20〜700、及び特に50〜500のアミノ酸がペプチド結合を介して連結されているアミノ酸鎖である。ペプチドは、任意のα−アミノ酸、特にタンパク質構成アミノ酸で構成され得る。
【００１４】
これらのPoIは、酵素又は非酵素タンパク質であり得る。酵素の例は、リパーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、プロテアーゼである。非酵素タンパク質の例は、抗菌活性、ある表面への特異的な結合、結晶化プロセス及び粒子形成における核形成特性、結晶構造の制御、金属又は金属イオンの結合、界面活性剤特性、乳化特性、泡安定化特性、細胞吸着への影響を有するタンパク質である。
【００１５】
目的タンパク質（PoI）の遺伝子は、PoIをコードするポリヌクレオチド配列である。かかるポリヌクレオチド配列は、ゲノムから公知の方法によって単離され得るか、又はDNA合成法によって合成され得る。用語「PoI遺伝子」は、広義には、PoIをコードする部分に加えて、その元々の遺伝的背景においてPoIの発現に関与するプロモーター等の制御部分も包含することを意味するものと理解される。
【００１６】
本発明に好適な微生物宿主系は、原則として、本発明に係る核酸を発現することができる任意の生物である。宿主生物は、例えば、細菌を意味する。
【００１７】
原核発現生物の非限定例は、大腸菌、枯草菌、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、及びコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等である。
【００１８】
本発明は、制御核酸配列による遺伝的制御下に目的タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物、及び少なくとも一つの前記発現構築物を含むベクターに関する。本発明に係るこのような構築物は、好ましくは特定のコード配列の5'上流にプロモーター、3'下流にターミネーター配列、及び任意に、さらなる共通制御エレメントを含み、これらはいずれもコード配列に機能可能に連結される。
【００１９】
「機能可能に連結」は、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び任意にさらなる制御エレメントの、各制御エレメントが、コード配列の発現の際に意図される機能を発揮し得る様な、連続的配置（sequential arrangement）を意味する。機能可能に連結可能な配列の例は、ターゲティング配列、またエンハンサー、及びポリアデニル化シグナル等である。さらなる制御エレメントは、選択可能マーカー、増幅シグナル、及び複製起点等である。好適な制御配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990)に記載されている。
【００２０】
天然の制御配列が、人工的な制御配列に加えて、実際の構造遺伝子の上流に依然として存在し得る。この天然の制御は、遺伝子改変によって任意にスイッチオフされ得、それによって遺伝子の発現が増加又は低減され得る。しかしながら、遺伝子構築物は、より単純な構造を有し得、すなわち、構造遺伝子の上流にいかなる付加制御シグナルも挿入されず、その制御を行う天然のプロモーターが除去されていない。あるいは、天然の制御配列は、制御がもはや起こらず、遺伝子発現が増加又は低減されるように変異している。遺伝子構築物は、核酸配列の一以上のコピーを含み得る。
【００２１】
使用可能なプロモーターの例は、グラム陰性菌において有利に用いられるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、lambda-PR又はlambda-PLプロモーター、及びグラム陽性菌プロモーターのamy及びSPO.sub.2.である。特に好ましいのは、例えば光、及び特に温度誘導性プロモーター等の誘導性プロモーター、例えばP.sub.rP.sub.lを用いることである。原則として、制御配列を有する任意の天然のプロモーターが用いられ得る。さらに、合成プロモーターも有利に用いられ得る。
【００２２】
前記制御配列は、核酸配列及びタンパク質が、特異的な方法で発現されることを可能にすることを意図する。宿主生物に応じて、これは遺伝子が誘導後にのみ発現又は過剰発現されるか、例えば直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味する。
【００２３】
本明細書において好ましいのは、正の影響を与え、それによって発現を増加又は低減し得る制御配列又は因子である。したがって、プロモーター及び／又は「エンハンサー」等の強力な転写シグナルを用いることによって、転写レベルで制御エレメントを有利に増強することが可能である。しかしながら、加えて、例えばmRNAの安定性を改善することによって、翻訳を増強することも可能である。
【００２４】
発現カセットは、好適なプロモーターを、好適なコードヌクレオチド配列及び終結又はポリアデニル化シグナルに融合することによって調製される。この目的のために、例えば、T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、及びT. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist,  Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)、及びAusubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載される様な周知の組換え及びクローニング技術が用いられる。
【００２５】
組換え核酸構築物又は遺伝子構築物を好適な宿主生物で発現させるために、該構築物を、宿主において遺伝子が最適に発現されることを可能とする宿主特異的なベクターに挿入することが有利であり得る。ベクターは当業者には周知であり、例えば「Cloning Vectors」(Pouwels P. H. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出される。ベクターは、プラスミドに加えて、当業者に知られる他の任意のベクター、例えばファージ、トランスポゾン、ISエレメント、コスミド、及び直鎖又は環状DNA等も含むと理解される。
【００２６】
言及され得る好適な発現ベクターの例は、一般的な融合発現ベクター、例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、及びプロテインAがそれぞれ組換え標的タンパク質に融合されている、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)、及びpRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)、並びに非融合タンパク質発現ベクター、例えばpTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315)、及びpET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)である。
【００２７】
リボソームリサイクリング因子（frr）は、細菌細胞及び真核生物の細胞小器官、特にミトコンドリア及び葉緑体においてみられるタンパク質である。frrは、タンパク質合成の完了後にリボソームを再利用する機能を有する。最近の証拠は、frrがリボソームをサブユニットに分割し、それによって結合したmRNAを遊離させることによってリボソームの再利用を達成し得ることを示唆している。細菌（特に大腸菌）では、リボソームリサイクリング因子をコードするfrr遺伝子の欠失は、有害である。
【００２８】
機能的frr遺伝子は、生物におけるfrr遺伝子の不活性又は不存在の機能を補完し得る遺伝子を意味する。これは、微生物宿主生物の相同（homologous）frr遺伝子又は異種（heterologous）frr遺伝子又は変異frr遺伝子であり得る。
【００２９】
不活性又は不活性化遺伝子、特に不活性化frr遺伝子は、機能的な遺伝子産物、特にリボソームリサイクリング因子に発現されない遺伝子、特にfrr遺伝子を意味する。frr遺伝子の不活性化は、様々な方法で、すなわち染色体のfrr遺伝子を完全に又は部分的に欠失させることによって、又は該遺伝子の読み枠を破壊するための追加のヌクレオチド又はポリヌクレオチドのfrr遺伝子への挿入によって行われ得る。遺伝子を不活性化するための別の可能性は、読み枠に停止コドンを導入すること、又はプロモーター領域などの遺伝子の制御エレメントを欠失させることである。ノックアウト又は挿入変異誘発によって遺伝子を不活性化するための、当業者に知られる周知の手順が存在する。
【００３０】
大腸菌のfrr遺伝子は、185aaタンパク質をコードしている。そのポリヌクレオチド配列は、NCBI (Protein) GI: 16128165に見出され得る。
【００３１】
機能的なfrr遺伝子を有する微生物宿主生物の形質転換のために用いられるベクターは、抗生物質耐性が、該ベクターを有する宿主生物の選択に必要ではないため、抗生物質耐性遺伝子を有さない。
【００３２】
形質転換は、ベクター又はヘルパープラスミド等のDNAの微生物宿主生物への導入を意味する。形質転換は、カルシウムリン酸沈殿又はエレクトロポレーション等の周知の技術によって実施され得る。
【００３３】
微生物大腸菌における組換え工学（recombineering）は、Zhang et al. (Nature Genetics, 20, 123-128, 1998)に記載されている様に実施され得る。
【００３４】
組換え微生物は、周知の方法に従って培養及び発酵され得る。例えば、細菌はTB又はLB培地において、20℃〜40℃及び6〜9のpHで増殖され得る。好適な培養条件は、例えばT. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に、詳細に記載されている。
【００３５】
目的タンパク質（PoI）が培養培地に分泌されない限り、その後細胞は破壊され、産物は、周知のタンパク質単離法によって可溶化液から回収される。細胞は、任意に高周波数の超音波によって、高圧によって、例えばフレンチプレッシャーセルにおいて、浸透圧溶解（osmolysis）によって、界面活性剤、溶解酵素又は有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーによって、又は記載された複数の方法を組み合わせることによって破壊され得る。
【００３６】
PoIは、周知のクロマトグラフィー法、例えば分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばQセファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィーを用いて、及び他の一般的な方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析、及びネイティブゲル電気泳動によって精製されうる。好適な方法は、例えばCooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [原題: The Tools of Biochemistry], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００３７】
さらに、組換えPoIは、特定のヌクレオチド配列によってcDNAを伸長し、それによって、例えば単純な精製のために用いられる改変ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする、ベクター系又はオリゴヌクレオチドを用いることによって単離され得る。この種類の好適な改変の例は、アンカーとして作用する「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変、又は（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載される）抗体によって抗原として認識され得るエピトープである。これらのアンカーは、タンパク質を固体支持体、例えばクロマトグラフィーカラムに導入され得るポリマー基質等に固定するために用いられ得るか、又はマイクロタイタープレート若しくは他の支持体において用いられ得る。
【００３８】
同時に、これらのアンカーは、タンパク質を認識するためにも用いられ得る。さらに、これらのタンパク質は、蛍光色素、基質との反応時に検出可能な反応産物を形成する酵素マーカー、又は放射活性マーカー等の一般的なマーカーを、単独で又は前記アンカーと組み合わせて、タンパク質を誘導体化するために用いることによって認識され得る。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、微生物宿主生物における目的タンパク質の生産方法であって、
a）目的タンパク質の遺伝子及び機能的frr遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築するステップ、
b）a）で得られたベクターを、不活性化染色体frr遺伝子を有し、かつ、機能的frr遺伝子及びマーカー遺伝子を含むヘルパープラスミドを有する宿主生物に形質転換するステップ、
c）a）で得られたベクターによる形質転換の後に、ヘルパープラスミドの不存在について、宿主生物を選択する工程、
d）c）で得られた形質転換された宿主生物を、宿主生物における目的遺伝子の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び
d）任意に目的タンパク質を単離するステップ
を含む方法である。
【００４０】
この実施形態の有利な点は、不活性化染色体frr遺伝子を有する宿主生物が、ヘルパープラスミドによる補完によって、生存可能であることである。
【００４１】
目的遺伝子及び機能的frr遺伝子を有する新たなベクターがこの宿主を形質転換するために用いられた場合、形質転換直後、宿主は二つの異なるベクター、すなわち（i）ヘルパープラスミド、及び（ii）目的遺伝子を有するベクターを有しており、両方のベクターが不活性化染色体frr遺伝子を補完することができる。ヘルパープラスミドは、機能的frr遺伝子に加えて、マーカーの有無についての選抜を可能とするマーカー遺伝子をも含んでいるため、このマーカーについて選択、又はこのマーカーに対してカウンターセレクション（counterselect）することができる。したがって、ベクターのみを有し、a）ヘルパープラスミドをもはや含まない形質転換された宿主生物を選択することが可能である。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、frrの染色体遺伝子が不活性化されており、目的遺伝子と共に少なくとも一コピーの機能的frr遺伝子を含むベクターを含み、かつ抗生物質耐性のいかなる遺伝子も含まないことを特徴とする、形質転換された微生物宿主細胞である。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、特許請求の範囲に開示される。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核宿主生物における目的タンパク質の生産方法であって、
a）不活性化染色体frr遺伝子を有し、ヘルパープラスミドを有する宿主生物であって、前記ヘルパープラスミドが機能的frr遺伝子及びマーカー遺伝子を含む前記宿主生物を提供するステップ、
b）目的タンパク質の遺伝子及び機能的frr遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを前記宿主生物に形質転換するステップ、
c）前記ベクターによる形質転換の後に、前記宿主生物をヘルパープラスミドの不存在について選択するステップ、
d）前記選択された宿主生物を、宿主生物における目的遺伝子の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び
e）目的タンパク質を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ベクター中のfrr遺伝子が、宿主生物に相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主生物が大腸菌、枯草菌、バチルス・メガテリウム、又はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
宿主生物の染色体frr遺伝子不活性化が、遺伝子欠失によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
染色体frr遺伝子が不活性化されており、ベクターを含む、形質転換された原核微生物宿主であって、
前記ベクターが目的のタンパク質をコードする遺伝子と共に少なくとも一コピーの機能的frr遺伝子を含み、かつ前記ベクターが抗生物質耐性のいかなる遺伝子も含まない、前記宿主。
【外国語明細書】
2020018304000001.pdf