(57)【要約】      （修正有）【課題】新規オートファジー選択的阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】強力なＡｔｇ４Ｂ阻害活性を示し、オートファジーを選択的に阻害する、下記の化学式で表される化合物。2020152696.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式１で表されるAtg4B阻害剤：
【化１】
2020152696.tif 000004
【請求項２】
請求項１に記載のAtg4B阻害剤を含むオートファジー研究用試薬。
【請求項３】
請求項２に記載の試薬を含むオートファジー研究用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオートファジー選択的な阻害剤に関する。詳しくは、オートファジーにおいて重要なシステインプロテアーゼであるAtg4Bを標的とした阻害剤（Atg4B阻害剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーに関する研究は増加傾向にあり、2017年には5000件を超える関連論文が発表されており（例えば非特許出願１〜３を参照）、いまだ増加傾向にある。しかし、研究試薬として用いられているオートファジー阻害剤は未だPI3キナーゼ阻害剤とリソソーム阻害剤しかなく、両者はオートファジー選択的な阻害剤ではない。オートファジーという現象を正しく理解するためにはオートファジー選択的阻害剤の開発が必要であり、試薬レベルでもその使用範囲は広いと推測される。尚、既存の医薬のいくつかにオートファジー阻害活性があることが報告されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開特開２０１８−００２６１９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Klionsky DJ. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Nov;8(11):931-7. Review.
【非特許文献２】The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. Mizushima N. FEBS Lett. 2017 Mar;591(5):681-689.
【非特許文献３】Development of autophagy inducers in clinical medicine. Levine B, Packer M, Codogno P. J Clin Invest. 2015 Jan;125(1):14-24.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
オートファジー選択的阻害剤はオートファジーの生理学的、病態生理学的意義の解明においても重要な研究ツールとなる。本発明の課題は、このように利用価値の高い新規オートファジー選択的阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく研究を進める中、本発明者らは膨大な数の化合物を対象として大規模なin silicoスクリーニングを行った。その際、これまでの経験と知識を踏まえ、独自の評価基準を設定した。詳細な検討の結果、オートファジーにおいて重要な分子Atg4Bに対して強い阻害活性を示し、オートファジーの選択的阻害剤として有用な化合物の同定に成功した。当該化合物は細胞レベルでオートファジーを阻害し、それ自体で研究ツール等として利用可能なものであった。
以下の発明は主として以上の成果に基づく。
［１］以下の化学式１で表されるAtg4B阻害剤：
【化１】
2020152696.tif 000002
［２］［１］に記載のAtg4B阻害剤を含むオートファジー研究用試薬。
［３］［２］に記載の試薬を含むオートファジー研究用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】同定に成功した化合物のAtg4B阻害活性。Ａ：化合物１の構造。Ｂ：in vitro 切断アッセイの結果。
【図２】前立腺がん細胞における飢餓誘導性オートファジーに対する化合物１の効果。Ａ：オートファジー阻害活性の評価。LNCaP細胞（左）と22Rv1細胞（右）にオートファジーを誘導し、化合物１の阻害活性を評価した。ポジティブコントールにPI3K阻害剤wortmannin（Ｗｏ）を用いた。Ｂ：DALgreenを用いた蛍光免疫染色試験。
【図３】化合物１の作用機序の確認。Ａ：化合物1と既知PLA2阻害剤の構造。Ｂ：in vitro 切断アッセイの結果。Ｃ：オートファジー阻害活性の評価。Ｄ：DALgreenを用いた蛍光免疫染色試験。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明はAtg4B阻害剤に関する。「Atg4B阻害剤」とは、Atg4Bの活性を阻害ないし抑制する剤である。Atg4BはAutophagin-1とも呼ばれ、オートファゴソーム膜の構成成分であるLC3の成熟化に必須のシステインプロテアーゼである。Atg4Bが正常に機能しないとオートファジーが完結しない。従って、Atg4Bの阻害は合理的なオートファジー阻害の作用点であると考えられている。本発明のAtg4B阻害剤は以下の化学式で表される。当該化合物は細胞レベルで飢餓誘導性オートファジーを有意に抑制した。
【化１】
2020152696.tif 000003
【０００９】
後述の通り、本発明のAtg4B阻害剤を構成する化合物は、東京大学創薬機構が提供する化合物ライブラリーに含まれるものでもあり、所定の手続を経ることで容易に入手することができる。
【００１０】
特に近年においてオートファジーは注目されており、その機構の解明やオートファジーを標的とした治療法の開発等に有用なツール（研究試薬）の開発が切望されている。本発明のAtg4B阻害剤はAtg4Bの阻害を介してオートファジーを選択的に阻害することができる。従って、上記の要望に応えるものであり、オートファジー研究用の試薬として有用である。そこで本願は、本発明のAtg4B阻害剤を含む、オートファジー研究用の試薬も提供する。オートファジー研究用試薬を研究用キットの構成要素としてよい。研究用キットは特定のアッセイを簡便に行うように構成されるものであり、追加の要素として、当該アッセイに必要なその他の試薬（酵素、緩衝液、発色試薬等）、容器・器具、標準物質等を含めることができる。また、研究用キットには通常、取扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００１１】
１．新規Atg4B阻害剤の同定
東京大学創薬機構の21万種のドラッガブルケミカルズについて長崎大学で開発されたスーパーコンピューターDEGIMAを用いてAtg4B結晶構造に対するin silicoスクリーニングを行った。全化合物のドッキングスコアと分子量との間には負の相関が認められたため、分子量の上限を600とし、スコア上位から960化合物を選定した。得られた960化合物に対して自動液体分注ロボットシステムを用いて示差走査蛍光定量法を行い、Atg4Bリコンビナントタンパク質の熱安定性を上昇させる、すなわちAtg4Bに結合可能と予想される化合物を選択した。変性中点（Tm値）に注目して十数個の化合物を選抜し、Atg4B阻害活性を評価できるin vitro 切断アッセイを行った。評価の結果、強い阻害活性を示す化合物１（図１Ａ）が見出された。
【００１２】
２．化合物１のAtg4B阻害活性（in vitro 切断アッセイ）
精製したAtg4BとLC3のC末にグルタチオン-S-トランスフェラーゼを融合させたLC3-GSTと阻害剤を混合し、37℃、15分でインキュベート後にSDS-PAGEを行い染色し、LC3-GSTからLC3とGSTへの変換量を観察した。対照群としてdimethylsulfoxide (DMSO) を添加したサンプルを調製した。変換量、変換率（％）は以下の式により算出した。変換率（％）は対照群を100％として算出した。
変換量＝（GST＋LC3）／（LC3-GST＋GST＋LC3）
変換率(％)＝（阻害剤添加時の変換量）／(DMSO添加時の変換量）×100
【００１３】
化合物１は濃度依存的にAtg4Bを阻害し、そのIC50値は10.2 ± 1.2 μMであった（図１Ｂ）。
【００１４】
３．化合物１によるオートファジー阻害活性評価
前立腺がんLNCaP細胞と22Rv1細胞を用いて新規Atg4B阻害剤（化合物１）のオートファジー阻害活性を評価した。前立腺癌LNCaP細胞と22Rv1細胞は37℃、5% CO2条件下の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。増殖培地として5% (v/v) FBS、100 U/ml penicillin-G potassium、100 μg/ml streptomycin sulfate及び10 mM [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid] HEPES緩衝液 (pH 7.0) を含むRPMI1640を用いた。両細胞を1 x 106 cells/dishで6 cm dishに播種し、24時間後にFBS濃度を2%に変えた増殖培地に置換し、化合物17もしくはWortmannin (Wo) を添加した。2時間後にアミノ酸枯渇培地に置換し、さらに3時間培養後に細胞をDPBSで回収し、以下のようにウエスタンブロットに供した。
【００１５】
各種試薬で処理した細胞をDPBSで3回洗浄後、セルスクレイパーを用いて細胞を剥離した。回収した細胞はDulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) で洗浄後、8 M Urea、10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane、50 mM Na2H2PO4を含むUrea bufferにより懸濁してソニケーションにより細胞膜を破壊した。細胞破砕液を遠心分離 (15,000 x g、15分間、4℃) し、その上清を細胞抽出液とした。12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEにより分離後、ゲル上のタンパク質を電気的にpolyvinylidene difluoride (PVDF) 膜に転写した。PVDF膜は、1% BSAを用いてブロッキング後、p62とβ-actinに対する一次抗体とhorseradish peroxidase標識二次抗体と順次反応させた。抗体反応性タンパク質はECL enhanced chemiluminescence detection kit (GE healthcare) を用いた化学発光法により検出した。
【００１６】
上記の方法でLNCaP細胞と22Rv1細胞にオートファジーを誘導し、細胞内p62発現量の減少を指標にオートファジー誘導を確認した。オートファジーを阻害することが知られるPI3K阻害剤wortmannin (Wo) と同様に化合物１の前処理によって両細胞のオートファジーは有意に抑制された（図２Ａ）。
【００１７】
次に、増殖培地に懸濁したLNCaP細胞を24-well multiplate中に5×104 cells/500 μLずつ播種し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養後に、1 μM DAL green working solutionを添加し、30分インキュベートした。増殖培地で2回洗浄後、FBS濃度を2%に変えた増殖培地に置換し、化合物１もしくはWortmannin (Wo) を添加した。2時間後に5 μM tamoxifenを添加し、さらに24時間培養を続けた。PBSで2回洗浄後、余分な水分を除去し、スライドグラス上にマウント剤 (DAPI fluoromount-G) を用いてカバーグラスを固定した。蛍光免疫染色した細胞を、共焦点レーザー顕微鏡LSM700 (Carl Zeiss) にセットし、蛍光観察を行った。倒立型蛍光顕微鏡の100倍油浸対物レンズを用いて、画像を取り込んだ。DALgreen (DOJINDO) を用いた検討でも化合物１のオートファジー阻害活性が示された（図２Ｂ）。DALgreenは細胞膜を透過し、オートファジー誘導により形成されたオートファゴソーム内に取り込まれ、その後リソソームと融合し酸性環境となったオートリソソームにおいて蛍光が増大する試薬である。
【００１８】
４．化合物１の作用機序の確認
化合物１はPLA2の阻害剤として知られる。そこで、PLA2阻害活性がAtg4B阻害活性に関係しないことを確認すべく以下の検討を行った。
【００１９】
まず、in vitro 切断アッセイ（上記２．を参照）で既知のPLA2阻害剤（図３Ａ）のAtg4B阻害活性を調べた。その結果、既知のPLA2阻害剤AACOCF3とLY311727はいずれもAtg4B阻害活性を示さなかった（図３Ｂ）。従って、Atg4B阻害活性とPLA2阻害活性は関連性がないことが示された。
【００２０】
次に、上記３．と同様の実験によって、PLA2阻害剤AACOCF3のオートファジー阻害活性を調べたところ、AACOCF3はアミノ酸飢餓誘導オートファジーを全く抑制しなかった（図３Ｃ、Ｄ）。
【００２１】
以上の検討から、化合物１はPLA2活性ではなく、Atg4B阻害活性を介してオートファジー阻害活性を示すと示唆された。
【００２２】
５．まとめ
強力なAtg4B阻害活性を示す化合物１の同定に成功した。化合物１はAtg4B阻害活性を介してオートファジーを阻害した。即ち、オートファジー選択的阻害剤として有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明のAtg4B阻害剤はAtg4Bの阻害を介してオートファジーを選択的に阻害する。従って、オートファジー選択的阻害剤としてオートファジーの研究に有用である。本発明のAtg4B阻害剤は化学合成も容易であり、大量生産にも対応できる。
【００２４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2020152696.tif 000006
【図２】
2020152696.tif 000007
【図３】
2020152696.tif 000008