(57)【要約】【課題】プロテオグリカンにおいて、保水性が改善されたプロテオグリカンを提供する。【解決手段】以下の１）〜３）を全て満たす鮭由来のプロテオグリカンである。１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇ。２）元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％。３）カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が４０重量％以上量、かつローリー法によるタンパク質含量が４重量％以下。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）〜３）を全て満たす鮭由来のプロテオグリカン。
１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇ
２）元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％
３）カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が４０重量％以上量、かつローリー法によるタンパク質含量が４重量％以下
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い保水性を有する新規プロテオグリカンに関する。
【背景技術】
【０００２】
肌を健康的に美しく保つためには、乾燥を防ぎ、潤いを与えるなどの手入れが必要である。そのため、肌に塗布するスキンケア製品や化粧料には保水性を有する物質を含んでいるものが多い。また、髪のつややかさを保つため、髪のケア製品にも保水性物質は使用されている。保水性を有する物質として、グリセリンやセラミドなどの低分子化合物からヒアルロン酸やコラーゲンなどの高分子化合物などが挙げられる。近年、新たな保水性物質としてプロテオグリカンが注目されてきている。プロテオグリカンは保水性以外にも、ＥＧＦ様作用などを有していることが明らかになってきている化合物である。
【０００３】
プロテオグリカンはグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物の総称であり、一般の糖タンパク質に比べて、糖含量が極めて多いのが特徴である。プロテオグリカンは動物に存在する高分子化合物で、結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している。起源となる原料や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なっており、さまざま分子種が存在する。
【０００４】
プロテオグリカンの保水性に関連した発明として、プロテオグリカンをキトサンやコラーゲン、ヒアルロン酸などと併用すること（特許文献１）、美容液や化粧品で、プロテオグリカンの保水性を補うため１０重量％以上のコラーゲンと併用すること（特許文献２）やアシル化アルカリ処理コラーゲンと併用することが行われているが（特許文献３）、プロテオグリカン以外の物質と併用しなければいけない煩わしさがある。また、分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含む魚類軟骨水抽出物もあるが（特許文献４）、プロテオグリカンの含有量が低く、プロテオグリカンの保水性は不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２５５７２６号  公報
【特許文献２】特開平６−１６６６１６号  公報
【特許文献３】特開平６−１７９６１２号  公報
【特許文献４】特開２０１７−１４２６５号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記課題を鑑み、本発明は、保水性が改善されたプロテオグリカンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を達成するためのプロテオグリカンは、以下の１）〜３）を全て満たす鮭由来のプロテオグリカンである。１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇである。２）元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％である。３）カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が４０重量％以上、かつローリー法によるタンパク質含量が４重量％以下である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、保水性が改善された新規の高保水性プロテオグリカンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２のプロテオグリカンの保水性の測定に係り、実施例１で得られたプロテオグリカンの保水性を、市販のプロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。本発明の技術的思想を具体化するための方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、下記のものに特定するものではない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された請求項が規定する技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。また、本明細書において、「約」とは後に続く数字の±１０％の範囲内をいう。
【００１１】
プロテオグリカンは動物や魚類に存在し、軟骨部に多い。プロテオグリカンは糖タンパク質の一種であり、グリコサミノグリカンの重量構成比が７０％以上のグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物からなる分子量数十万から数百万の天然高分子化合物である。ウロン酸とアミノ糖がほぼ当量で大部分を占めており、タンパク質量は一般の糖タンパク質に比較し少ない。また、特徴として、グリコサミノグリカンのヒドロキシ基に硫酸基がエステル結合している割合が高い。
【００１２】
プロテオグリカンはその起源となる生物や抽出・製造条件によって分子量や含まれる糖の種類（ウロン酸、アミノ糖、中性糖など）やアミノ酸の含有量も異なっているが、本発明の原料となるプロテオグリカンは起源となる生物や抽出・製造条件を問わない。
【００１３】
より具体的に本発明は、以下の１）から３）の全ての要件を満たす鮭由来のプロテオグリカンである。１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇである。２）乾燥重量当たり元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％である。３）乾燥重量当たり、カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が４０重量％以上、かつローリー法によるタンパク質含量が４重量％以下である。
【００１４】
本発明の極限粘度は固有粘度ともいい、粘度計による測定で得られる。また、元素としての炭素、硫黄、窒素の量は、燃焼式の元素分析計等により得られる。本発明のカルバゾール硫酸法は、ウロン酸の呈色反応を利用した定量法である。プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖が共有結合していることを特徴とする化合物であり、プロテオグリカン糖鎖の主成分のひとつがウロン酸である。サンプル水溶液にカルバゾール溶液と濃硫酸を添加すると、サンプル水溶液にウロン酸が含まれていれば赤紫色に呈色する。呈色度合はウロン酸含量に比例する。呈色液の吸光度を分光光度計で測定し、標準物質としてのグルクロン酸の検量線からウロン酸含量が算出される。本発明のローリー法は、タンパク質の呈色反応を利用した定量法である。サンプル水溶液をアルカリ性銅溶液とフェノール試薬で処理すると、サンプル水溶液にタンパク質が含まれていれば青色に呈色する。呈色度合はタンパク質含量に比例する。呈色液の吸光度を分光光度計で測定し、標準物質としての牛血清グロブリンの検量線からタンパク質含量が算出される。
【００１５】
本発明品は、最初に原料となる鮭鼻軟骨を脱脂処理後、破砕し、次に酢酸などの酸性の有機酸で処理し、その後、塩化ナトリウム溶液に浸漬することにより抽出する。必要に応じて、不純物のタンパク質を除去することにより、容易に製造することができる。より具体的には、鮭鼻軟骨をアセトンやエタノールなどの親水性有機溶媒を用いて脱脂し、乾燥後、破砕する。その後、酢酸や酒石酸などの有機酸の１重量％以上の濃度の溶液に浸漬する。次に残った鮭鼻軟骨を取り出し、塩化ナトリウム溶液に１日以上浸漬し、溶液中に本発明品を抽出する。溶液をろ過などにより得て、塩化ナトリウムを除去後、本発明品が製造される。溶液は噴霧乾燥や凍結乾燥、有機溶剤沈殿などにより固形状に加工してもよい。抽出溶液に夾雑物であるタンパク質が混在しているときは、製造過程において、分子量５万以上の大きさの限外ろ過膜処理や高濃度の硫酸アンモニウム添加などの常法により除去し、精製することで本発明品が製造される。
【００１６】
本発明のプロテオグリカンの使用について、その製品形態により異なるが、本発明品をおおよそ０．０１重量％以上含んだ状態で使用するのが好ましい。
【００１７】
本発明のプロテオグリカンは水溶性であることから、そのまま固体での使用以外にも、水溶液に溶解した状態でも使用可能であり、ハンドリングに優れている。化粧料として使用する場合は、化粧水、乳液、クリームなどに容易に添加することができる。また、他の原材料と一緒にカプセルの中に封じ込めたり、錠剤化してもよい。
【００１８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（プロテオグリカンの製造）
プロテオグリカンは、以下の方法により製造した。最初に鮭の頭部（４５０ｇ）の皮を剥ぎ、鼻軟骨を取り出し、これにアセトン１Ｌ加えた。一日放置し、アセトンを廃棄し、再びアセトン１Ｌ加えた。この操作を計４回行い脱脂した。鮭鼻軟骨をドラフト内に３日間放置し、乾燥した。乾燥鮭鼻軟骨を家庭用粉砕機（商品名：ミルサー、岩谷産業（株））で破砕し、４．５重量％酢酸溶液５００ｍＬ中に室温で３日間放置した。ガーゼろ過により鮭鼻軟骨を回収し、中性になるまで水洗した。次に鮭鼻軟骨を１０重量％塩化ナトリウム溶液５００ｍＬ中に４℃で放置した。３日後にこの溶液を珪藻土ろ過し、ろ液を分子量１０万のクロスフロー式の限外ろ過膜（有効ろ過面積５０ｃｍ２、商品名：ビバフロー５０、ザルトリウス社）を用いて約５０ｍＬまで濃縮した。この溶液を透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ１５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ、４℃の低温室で、外液を脱イオン水にして２日間透析した。外液の脱イオン水は１日に３回交換した。このことにより塩化ナトリウムをほとんど除去した。その後セルロースチューブ内液を回収し、７０％の濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、高速冷却遠心機（商品名：ＣＲ２２ＧＩＩＩ、日立工機（株））で１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ１５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ、４℃の低温室で、外液を脱イオン水にして３日間透析した。外液の脱イオン水は１日に３回交換した。セルロースチューブ内液を回収し、ウォーターバスで４０℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまでロータリーエバポレーター（商品名：Ｎ−１、東京理科器械（株））で濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥機（商品名：ＦＤＵ−１２００、東京理科器械（株））にて凍結乾燥し、１．２ｇの白色綿状固体の本発明品であるプロテオグリカンを得た。
【実施例２】
【００２０】
（水分含量の測定）  
実施例１に係るプロテオグリカンの水分含量は、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８１２０、（株）リガク）にて、１２０℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分として求めた。その結果、プロテオグリカンの水分含量は１７．１重量％であった。
【００２１】
（極限粘度の測定）  
実施例１に係るプロテオグリカンの極限粘度は、以下の方法により求めた。プロテオグリカン２０ｍｇを精秤し、水２０ｍＬに溶解した。この溶液を基に５倍希釈溶液、６．６６７倍希釈溶液、１０倍希釈溶液、２０倍希釈溶液を作成し、振動式粘度計（商品名：ＬＹ−５５４、堀場製作所（株））で、粘度を測定した。液温度は２１℃であった。別に水の粘度も測定し、水の粘度に対する相対粘度と還元粘度を求め、各濃度に対する還元粘度をグラフにプロットし、直線式を導き、濃度０に外挿し、極限粘度を計算した。なお、濃度はプロテオグリカンの水分含量１７．１重量％を除して計算した。その結果、極限濃度は２１．２ｄＬ／ｇであった。
【００２２】
（炭素含量と硫黄含量と窒素含量の測定）
炭素含量と硫黄含量と窒素含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ｃｕｂｅ（エレメンタール社）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した。実施例１に係るプロテオグリカンの炭素含量は乾燥重量当たり３７重量％で、硫黄含量は乾燥重量当たり６．２重量％で、窒素の含量は３．３重量％であった。
【００２３】
（ウロン酸量の測定）
実施例１に係るプロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。プロテオグリカンの０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬに、冷却しながら濃硫酸１．５ｍＬを加えて撹拌し、次にカルバゾール溶液０．０５ｍＬを加えて撹拌し、１５分間１００℃で加熱した。冷却後、分光光度計（Ｕ−３３１０、（株）日立ハイテクノロジーズ）で５３０ｎｍの吸光度を測定した。グルクロン酸（シグマアルドリッチ社）を標準物質として作成した検量線より、プロテオグリカンのウロン酸含量は乾燥重量当たり４４．７重量％と算出された。
【００２４】
（タンパク質量の測定）
実施例１に係るプロテオグリカンのタンパク質含量をローリー法で求めた。プロテオグリカンの１．０ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２ｍＬに、アルカリ性銅溶液（２％炭酸ナトリウム（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）：０．５％硫酸銅（１％酒石酸ナトリウム水溶液）＝５０：１（ｖ：ｖ））１．０ｍＬを添加して、撹拌し、１０分間静置し、水で２倍に希釈したフォーリン＆チオカルト−フェノール試薬（和光純薬工業（株））０．１ｍＬを添加して３０分静置し、分光光度計（Ｕ−３３１０、（株）日立ハイテクノロジーズ）で７５０ｎｍの吸光度を測定した。牛血清アルブミン（生化学工業（株））を標準物質として作成した検量線より、プロテオグリカンのタンパク質含量は乾燥重量当たり３．５重量％と算出された。
【実施例３】
【００２５】
（保水性試験）
実施例１で得られたプロテオグリカンと市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）それぞれ０．１ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、それぞれを透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００２６】
図１は、実施例１で得られたプロテオグリカンと市販のプロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図１中のプロットのうち、「●プロテオグリカン発明品」は実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの０．１０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「△プロテオグリカン市販品」は市販のプロテオグリカンの０．１ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、実施例１で得られたプロテオグリカン発明品は４．６ｇ／日に対して、市販のプロテオグリカンは２．５ｇ／日であった。市販のプロテオグリカンと比較して、実施例１で得られたプロテオグリカンは約１．８倍の吸水・保水量があり、保水性が改善されていることが明らかとなった。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月1日(2019.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
以下の１）〜３）を全て満たす鮭由来のプロテオグリカン。
１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇ
２）元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％
３）カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が約４０重量％、かつローリー法によるタンパク質含量が約４重量％
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記課題を達成するためのプロテオグリカンは、以下の１）〜３）を全て満たす鮭由来のプロテオグリカンである。１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇである。２）元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％である。３）カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が約４０重量％、かつローリー法によるタンパク質含量が約４重量％である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
より具体的に本発明は、以下の１）から３）の全ての要件を満たす鮭由来のプロテオグリカンである。１）極限粘度が約２１．２ｄＬ／ｇである。２）乾燥重量当たり元素として炭素の含量が約３７重量％、硫黄の含量が約６．２重量％、窒素の含量が約３．３重量％である。３）乾燥重量当たり、カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が約４０重量％、かつローリー法によるタンパク質含量が約４重量％である。