(57)【要約】      （修正有）【課題】生体適合性と医薬の分散性を有する医薬用キャリアである化合物の提供。【解決手段】下記式のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン。（ｐ、ｑ、ｒ、ｓ：モル百分率（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、０≦ｐ及びｑ≦６０、１≦ｒ≦５０、１≦ｓ≦９９）。Ｍｎ≧１０００。Ａ：ＣａＨ２ａ、ＣｂＨ２ｂ−ＣＯなど（１≦ａ≦６、０≦ｂ≦８）。Ｚ：Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７。ｘ：３〜２０００。）【選択図】図１
2020180225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される、グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン。
式（Ｉ）：
【化１】
2020180225.tif 000025
［ただし、式（Ｉ）中、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下であり、
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上であり、
Ａは、−（ＣａＨ２ａ）−、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−ＣＯ−、であり、ａは１以上６以下、ｂは０以上８以下、ｃは０以上８以下、ｄは２以上６以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００である。］
【請求項２】
請求項１に記載の化学式（Ｉ）で示される化合物を含む、医薬用キャリア。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬用キャリアと医薬との複合体。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬用キャリアを使用する、細胞への医薬導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン、それを含む医薬用キャリア、その医薬用キャリアと医薬との複合体、及びその複合体を用いる医薬導入方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の急激な発達によって、遺伝子レベルで、病気の解明及び治療が進められている。先天的に欠損した遺伝子が問題の場合、その欠損した遺伝子を外部から導入して補う治療方法が試みられており、また、がん細胞及びＡＩＤの場合、その細胞の増殖等を抑制する遺伝子を導入する治療方法が試みられている。
【０００３】
生体に対する安全性に優れ、遺伝子治療等に応用可能な、遺伝子導入用キャリアとして、キトサンが報告されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
特許文献１は、例えば、固有粘度（η）が０．３０ｇ／ｄｌ及び０．４５ｇ／ｄｌの低分子量キトサンを遺伝子用キャリアとして報告した（特許文献１実施例１及び２参照）。
特許文献２は、例えば、固有粘度（η）が２．０ｇ／ｄｌ及び３．０ｇ／ｄｌのキトサンを遺伝子導入用キャリアとして報告した（特許文献２実施例１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平３−１９８７８２号公報
【特許文献２】特開２０００−１５７２７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１〜２に記載のキトサンを用いるキャリアは、いずれも、遺伝子の導入効率が十分ではないという問題がある。
【０００６】
本発明は、優れた生体適合性と優れた医薬の分散性を有し、医薬用キャリアとして優れる新たな化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、ポリエチレングリコール部分を含み、グアニジノ基を含むキトサンが得られ、そのようなキトサンは医薬用キャリアに好適であることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本明細書は、下記の形態を含む。
１．  下記式（Ｉ）で示されるグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン。
式（Ｉ）：
【化１】
2020180225.tif 000003
［ただし、式（Ｉ）中、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下であり、
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上であり、
Ａは、−（ＣａＨ２ａ）−、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−ＣＯ−、であり、ａは１以上６以下、ｂは０以上８以下、ｃは０以上８以下、ｄは２以上６以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００である。］
２．  上記１に記載の化学式（Ｉ）で示される化合物を含む、医薬用キャリア。
３．  上記２に記載の医薬用キャリアと医薬との複合体。
４．  上記３に記載の医薬用キャリアを使用する、細胞への医薬導入方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の実施形態のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、生体適合性に優れ、医薬の分散性に優れる。よって、本発明の実施形態のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、それを含む医薬用キャリアとして使用することができ、医薬と複合体を形成可能であり、その複合体を用いる医薬導入方法に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施形態のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書は、ポリエチレングリコール（ポリオキシエチレン）部分を含み、グアニジノ基を含む、新規なキトサンに関し、それは下記式（Ｉ）で示される。
【化２】
2020180225.tif 000004
［ただし、式（Ｉ）中、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下であり、
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上であり、
Ａは、−（ＣａＨ２ａ）−、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−ＣＯ−、であり、ａは１以上６以下、ｂは０以上８以下、ｃは０以上８以下、ｄは２以上６以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００である。］
【００１２】
本発明の実施形態の、グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、上述の式（Ｉ）に示す化学構造を有する。従って、本発明の実施形態の、グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、下記式（ＩＩ）で示されるＮ−アセチル化アミノ基を含む繰り返し単位を有し得、
式（ＩＩ）：
【化３】
2020180225.tif 000005
下記式（ＩＩＩ）で示されるアミノ基を有する繰り返し単位を有し得、
式（ＩＩＩ）：
【化４】
2020180225.tif 000006
下記式（ＩＶ）で示されるポリオキシエチレン鎖を有する繰り返し単位を有し、
式（ＩＶ）：
【化５】
2020180225.tif 000007
下記式（Ｖ）で示されるグアニジノ基を有する繰り返し単位を有する。
式（Ｖ）：
【化６】
2020180225.tif 000008
ここで、式（ＩＩ）〜式（Ｖ）に記載されたｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ａ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｚ、ｘは、上述の式（Ｉ）で記載した通りである。
【００１３】
本明細書において、「キトサン」とは、天然由来のムコ多糖の一種であり、一般的にキチンの脱アセチル化により製造され、本発明が目的とする、グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンを得られる限り特に制限されることはない。
本明細書において、「キチン」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し単位とする天然由来のムコ多糖の一種をいう。
【００１４】
キチンとキトサンの相違点は、脱Ｎ−アセチル化の有無であり、脱Ｎ−アセチル化は任意の割合で行うことが可能なので、脱Ｎ−アセチル化の程度に応じて、キチンとキトサンの間に種々の化合物を製造し得る。
本明細書では、キチンを基準として、４０％以上の割合で脱Ｎ−アセチル化されたキトサンを、単に「キトサン」ともいい、脱Ｎ−アセチル化の程度にかかわらず使用することができる。
【００１５】
従って、式（Ｉ）において、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各々繰り返し単位が存する割合（１００モル分率）を意味し、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの合計を１００とすると、ｐは０以上６０以下であり、ｑ、ｒ及びｓの合計は４０以上１００以下である。ここで、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下である。
【００１６】
更に、ｐは、例えば、５〜５５であってよく、１０〜５０であってよく、１５〜４５であってよい。
更に、ｑは、例えば、２〜５８であってよく、４〜５６であってよく、６〜５４であってよい。
更に、ｒは、例えば、２〜４０であってよく、４〜３０であってよく、６〜２０であってよい。
更に、ｓは、例えば、１〜９０であってよく、３〜８０であってよく、５〜７０であってよい。
【００１７】
Ａは、−（ＣａＨ２ａ）−、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−ＣＯ−、であり、ａは１以上６以下、ｂは０以上８以下、ｃは０以上６以下、ｄは２以上６以下である。
Ａは、例えば、−（ＣａＨ２ａ）−、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−から選択されてよく、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−ＣＯ−から選択されてよく、−（ＣｂＨ２ｂ）−ＣＯ−から選択されてよい。
【００１８】
更に、ａは、例えば、１〜５であってよく、２〜４であってよく、２〜３であってよい。
更に、ｂは、例えば、０〜７であってよく、０〜６であってよく、０〜５であってよい。
更に、ｃは、例えば、０〜６であってよく、１〜５であってよく、２〜４であってよい。
更に、ｄは、例えば、２〜６であってよく、２〜５であってよく、２〜４であってよい。
【００１９】
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７である。
ｘは、３〜２０００であり、例えば、１０〜１２００であってよく、１５〜１０００であってよく、２０〜８００であってよく、２５〜５００であってよい。
【００２０】
式（ＩＶ）で示されるポリオキシエチレン鎖を有する繰り返し単位として、より具体的には、下記の繰り返し単位を例示することができる。
【化７】
2020180225.tif 000009
【化８】
2020180225.tif 000010
【００２１】
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上であり、例えば、１００００００以下であってよい。
式（Ｉ）の化合物のＭｎは、更に、例えば、２０００〜８０００００であってよく、３０００〜６０００００であってよく、５０００〜５０００００であってよい。
Ｍｗ／Ｍｎは、例えば、１．０〜２０であってよく、１．１〜１５であってよく、１．２〜１０であってよい。
【００２２】
本明細書において、式（Ｉ）で示される化合物のＭｎ及びＭｗは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定して得た値をいう。より具体的には、実施例に記載したように、HITACHI社製のＲＩ検出器L-2490（商品名）を備えたHITACHI社製のＧＰＣ装置L-2130（商品名）を使用して測定することができる。ＧＰＣカラムとして昭和電工社製のAsahipak GS-220 HQ（商品名）、 Asahipak GS-320 HQ（商品名）、 Asahipak GS-520 HQ（商品名）、 Asahipak GS-2G 7B（商品名）を各１本使用し、溶媒として酢酸緩衝塩水を用いて、０．５ｍＬ／分で試料を流す。測定で得られる値を、単分散プルラン（昭和電工社製）を使用して得た校正曲線を用いて測定値を校正して、Ｍｎ及びＭｗを得ることができる。
【００２３】
本発明の実施形態において、式（Ｉ）で示される化合物を製造することができる限り、式（Ｉ）で示される化合物の製造方法は、特に制限されることはない。式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、キトサン（ＣＳ）から製造することができる。キトサン（ＣＳ）は、一般的には、次式に示すように、キチン（ＣＴ）を脱アセチル化することで製造することができる。キトサンとして市販品を使用することができ、そのような市販品として、例えば、甲陽ケミカル株式会社社製のFL-80（商品名）、甲陽ケミカル株式会社社製のFM-80（商品名）等を例示できる。
【００２４】
【化９】
2020180225.tif 000011
［ただし、式中、ｐとｑ１の合計は１００、ｐは０以上６０以下、ｑ１は４０以上１００以下である。］
【００２５】
キトサンのアミノ基と、例えば下記式に示すように、種々のポリオキシエチレン部分を含むカルボン酸を反応させて、式（ＩＶ）の繰り返し単位を含む、式（ＶＩ）で示される前駆体化合物を製造することができる。尚、カルボン酸の代わりに、活性化カルボン酸を使用することができる。活性化カルボン酸を使用する場合、下記式中ＥＤＣ／ＮＨＳを必ずしも使用する必要はない。
【化１０】
2020180225.tif 000012
［ただし、式（ＶＩ）中、
ｐ、ｑ２及びｒは、式（ＶＩ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合（１００モル分率）を意味し、ｐ＋ｑ２＋ｒ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下であり、
Ａ１は、−（ＣｂＨ２ｂ）−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−、であり、ｂは０以上８以下、ｃは０以上８以下、ｄは２以上６以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００である。］
【００２６】
ポリオキシエチレン部分を含むカルボン酸及び活性化カルボン酸は、ポリエチレングリコールから製造することができるが、市販品を使用することができる。
Ｚがメトキシであるカルボン酸として、油化産業株式会社社製のSUNBRIGHT ME-050CS（商品名）、油化産業株式会社社製のSUNBRIGHT ME-050GS（商品名）、油化産業株式会社社製のUNBRIGHT ME-050AS（商品名）、油化産業株式会社社製のUNBRIGHT ME-050PS（商品名）、油化産業株式会社社製のSUNBRIGHT ME-050HS（商品名）、油化産業株式会社社製のSUNBRIGHT ME-050TS（商品名）等を例示することができる。
【００２７】
ポリオキシエチレン部分を含むカルボン酸の数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１５０〜８００００であってよく、５００〜５００００であってよく、７００〜４００００であってよく、１０００〜３００００であってもよい。
本明細書において、ポリオキシエチレン部分を含むカルボン酸のＭｎは、１H NMRで測定して得た値をいう。より具体的には、JEOL社製のJMN-ECP500（商品名）を使用して測定したプロトンの積分から、Ｍｎを得ることができる。
【００２８】
更に、例えば式（ＶＩ）で示される前駆体化合物に存在するアミノ基に関し、グアニジル化することで、式（Ｉ）で示される化合物を製造することができる。
【化１１】
2020180225.tif 000013
［ただし、式（Ｉ）中、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下であり、
Ａ１は、−（ＣｂＨ２ｂ）−、−ＣＯ−（ＣｃＨ２ｃ）−、又は−ＣＯ−（ＣｄＨ２ｄ−２）−、であり、ｂは０以上８以下、ｃは０以上８以下、ｄは２以上６以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００であり、
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上である。］
【００２９】
一方、例えば、キトサンのアミノ基と、下記式に示すように、種々のポリオキシエチレン部分を含むアルデヒドを反応させて、式（ＩＶ）の繰り返し単位を含む、式（ＶＩＩ）で示される前駆体化合物を製造することができる。
【化１２】
2020180225.tif 000014
［ただし、式（ＶＩＩ）中、
ｐ、ｑ３及びｒは、式（ＶＩＩ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ３＋ｒ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下であり、
Ａ２は、−（ＣａＨ２ａ）−であり、ａは０以上５以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００である。］
【００３０】
ポリオキシエチレン部分を含むアルデヒドは、ポリエチレングリコールから製造することができるが、市販品を使用することができる。
Ｚがメトキシであるアルデヒドとして、油化産業株式会社社製のSUNBRIGHT ME-050AL（商品名）、SIGMA-ALDRICH社製のmPEG-Propionaldehyde  average Mn 5,000（商品名）等を例示することができる。
【００３１】
ポリオキシエチレン部分を含むアルデヒドの数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１５０〜８００００であってよく、５００〜５００００であってよく、７００〜４００００であってよく、１０００〜３００００であってもよい。
本明細書において、ポリオキシエチレン部分を含むアルデヒドのＭｎは、１H NMRで測定して得た値をいう。より具体的には、JEOL社製のJMN-ECP500（商品名）を使用して測定したプロトンの積分値から、Ｍｎを得ることができる。
【００３２】
更に、例えば、式（ＶＩＩ）で示される前駆体化合物に存在するシッフ塩基を水素化し、更にアミノ基に関し、グアニジル化することで、式（Ｉ）で示される化合物を製造することができる。
【化１３】
2020180225.tif 000015
［ただし、式（Ｉ）中、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、式（Ｉ）の化合物中に各繰り返し単位が存する割合を意味し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１００、ｐは０以上６０以下、ｑは０以上６０以下、ｒは１以上５０以下、ｓは１以上９９以下であり、
Ａ２は、−（ＣａＨ２ａ）−であり、ａは０以上５以下であり、
Ｚは、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又はＣ３Ｈ７であり、
ｘは、３〜２０００であり、
式（Ｉ）の化合物のＭｎは１０００以上である。］
【００３３】
本発明の他の実施形態において、式（Ｉ）で示される化合物を含む、医薬用キャリアを提供することができる。
更に、本発明の好ましい実施形態において、上述の医薬用キャリアと医薬との複合体を提供することができる。
更にまた、本発明の実施形態の医薬用キャリアを使用する、細胞への医薬導入方法を提供することができる。
【００３４】
本発明の実施形態の医薬用キャリアとは、式（Ｉ）で示される化合物を含み、式（Ｉ）で示される化合物が医薬を運搬するためのキャリアとして使用できる限り、特に制限されることはない。
本明細書において「医薬」とは、医薬として人に使用することができ、本発明の実施形態の式（Ｉ）で示される化合物で運搬される限り、特に制限されることはない。そのような医薬として、例えば、DNA、RNA、ペプチド、及び抗体等を例示することができる。
【００３５】
更に、本発明の実施形態の複合体は、本発明の実施形態の医薬用キャリアと医薬との複合体であって、医薬用キャリアと医薬との混合比、複合体の平均粒径、複合体が存在する媒体など特に制限されることはない。医薬用キャリアと医薬との複合体の製造方法は、複合体が得られる限り特に制限されることはないが、適宜媒体を用いて、媒体中で医薬用キャリアと医薬とを接触させて製造することができる。接触させる際の、媒体、温度、濃度等は適宜選択することができる。
【００３６】
医薬用キャリアと医薬との混合比は、医薬が核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの類似化合物）である場合、医薬用キャリアの繰り返し単位の数と、医薬の繰り返し単位の数との比（医薬用キャリアの繰り返し単位／核酸の繰り返し単位の数）は、例えば、１／５〜１２／１であってよく、１／３〜８／１であってよく、１／２〜６／１であってよい。
【００３７】
医薬用キャリアと医薬との複合体の平均粒径は、特に制限されることはない。例えば、使用媒体、医薬、適用箇所等によって、適宜選択することができる。
【００３８】
本発明の実施形態の細胞への医薬導入方法は、本発明の実施形態の医薬用キャリアを使用する限り、特に制限されることはない。医薬用キャリアと医薬との複合物を用いることができる。複合物は、媒体中で製造することができ、複合物の平均粒径、複合物の濃度、媒体等は、適宜選択することができる。媒体は、細胞への医薬導入が可能であれば特に制限されることはないが、例えば、純水、超純水、酢酸緩衝液、トリス緩衝塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を例示することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的かつ詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の一態様にすぎず、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
合成例で使用した原料及び生成物のスペクトル測定方法等を以下に示す。
キトサン（ＣＳ１）は、キチン（ＣＴ１）を常法によって脱アセチル化して得た（Ｍｎ＝７．６×１０３、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５、脱アセチル化度：６８．８％）。
【化１４】
2020180225.tif 000016
【００４１】
ＩＲスペクトルは、Perkin Elmer社製のSpectrum 6（商品名）を用いて、ＡＴＲ法で測定した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、JEOL社製のJMN-ECP500（商品名）を用いて、５００ＭＨｚ、重水中、３−（トリメチルシリル）−２，２’，３，３’−テトラジュウテロプロピオン酸基準で測定した。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、JEOL社製のJMN-ECP500（商品名）を用いて、１２５ＭＨｚ、重水液中、３−（トリメチルシリル）−２，２’，３，３’−テトラジュウテロプロピオン酸基準で測定した。
Ｃ／Ｎ（炭素元素／窒素元素）（質量比）は、元素分析によって測定した。元素分析は、鳥取大学  研究基盤センターに依頼した。
【００４２】
数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した。具体的には、HITACHI社製のＲＩ検出器L-2490（商品名）を備えたHITACHI社製のＧＰＣ装置L-2130（商品名）を使用した。ＧＰＣカラムとして昭和電工社製のAsahipak GS-220 HQ（商品名）、 Asahipak GS-320 HQ（商品名）、 Asahipak GS-520 HQ（商品名）、 Asahipak GS-2G 7B（商品名）を各１本使用した。溶媒として酢酸緩衝塩水を用いて、０．５ｍＬ／分で試料を流した。測定で得られた値を、単分散プルラン（昭和電工社製）を使用して得た校正曲線を用いて測定値を校正して、Ｍｎ及びＭｗを得た。
【００４３】
合成例１．ポリエチレングリコールグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＣＳ１）の合成
キトサン（ＣＳ１）１ｇを、０．１Ｍの２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）水溶液に溶解した。それに、ポリエチレングリコールカルボン酸（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１、分子量：５０００）（３ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（７０ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．２ｇ）を加え、室温で１７時間撹拌した。その溶液を大量のイソプロパノールに加え、析出した沈殿をろ過した。沈殿を１０ｍＬの水に溶かし、透析（分画分子量１５０００）、凍結乾燥して、合成例１のＰＥＧ−ＣＳ１（２．９ｇ、ＰＥＧ導入率＝１１．３％、Ｍｎ＝５．６×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２、Ｃ／Ｎ＝３２．４）を得た（収率６９．５％）。
【００４４】
【化１５】
2020180225.tif 000017
【００４５】
ＰＥＧ−ＣＳ１のスペクトルデータを以下に示す。
ＩＲ：１０９８ｃｍ−１（PEG中の-CH2-O-CH2-伸縮振動）
１Ｈ−ＮＭＲ：1.96 ppm (CH3CO-)，3.25-4.11 ppm (PEGとキトサン主鎖)，3.32 ppm（PEG末端のCH3O-），3.88 ppm（PEGの付け根の-OCH2CH2CONH-），4.47 ppm (キトサン主鎖の1位)
１３Ｃ−ＮＭＲ：22.16 ppm（CH3CO-），55.39 ppm（キトサン主鎖のC2），60.15 ppm（PEG末端のCH3O-），62.22 ppm（キトサン主鎖のC6），63,22-79.34（キトサン主鎖のC3，C4，C5），174.60 ppm（CH3CO-），177.94 ppm（PEGの付け根の-CONH-）
【００４６】
合成例２．グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＧＣＳ１）の合成
合成例１のＰＥＧ−ＣＳ１（１．０ｇ）を水（４ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．３ｍＬ）、１−アミジノピラゾール塩酸塩（ＡＰ）（１．０ｇ）を加え、室温で７日間撹拌した。その溶液を大量のイソプロパノールに加え、析出した沈殿をろ過した。沈殿を水に溶かし、透析（分画分子量１５０００）、凍結乾燥して、合成例２のＰＥＧ−ＧＣＳ１（０．９５ｇ、グアニジノ基導入率＝３９．０％、Ｍｎ＝４．５×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６、Ｃ／Ｎ＝１８．５）を得た（収率９３．８％）。
【００４７】
【化１６】
2020180225.tif 000018
【００４８】
ＰＥＧ−ＧＣＳ１のスペクトルデータを以下に示す。
ＩＲ：１５９２  ｃｍ−１（N―H伸縮振動）、１７２０  ｃｍ−１（C＝N伸縮振動）
１Ｈ−ＮＭＲ：1.96 ppm (CH3CO-)，3.25-4.11 ppm (PEGとキトサン主鎖)，3.32 ppm（PEG末端のCH3O-），3.88 ppm（PEGの付け根の-OCH2CH2CONH-），4.41 ppm (キトサンユニットの1位)、4.51 ppm(グアニジル化キトサンユニットの1位)
１３Ｃ−ＮＭＲ：22.13 ppm（CH3CO-），55.39 ppm（キトサン主鎖のC2），60.16 ppm（PEG末端のCH3O-），62.18 ppm（キトサン主鎖のC6），160.18 ppm，63.20-79.54（キトサン主鎖のC3，C4，C5），174.64 ppm（CH3CO-），177.90 ppm（PEGの付け根の-CONH-）
【００４９】
合成例３．グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＧＣＳ２）の合成
合成例２の合成において、ＡＰの量を０．６７ｇに変えた他は、同様の方法を用いて、合成例３のＰＥＧ−ＧＣＳ２（グアニジノ基導入率＝１６．２％、Ｍｎ＝５．０×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０、Ｃ／Ｎ＝２１．１）を得た（収率９２．４％）。
【００５０】
合成例４．グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＧＣＳ３）の合成
合成例２の合成において、ＡＰの量を０．３３ｇに変えた他は、同様の方法を用いて、合成例４のＰＥＧ−ＧＣＳ３（グアニジノ基導入率＝８．３％、Ｍｎ＝４．５×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５、Ｃ／Ｎ＝１８．５）を得た（収率９０．６％）。
【００５１】
合成例５．ＰＥＧ−ＣＳ２の合成
合成例１の合成において、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１をＰＥＧ−ＣＯＯＨ２（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１と化学構造は類似するが、分子量が１００００である）に変えた他は、同様の方法を用いて、合成例５のＰＥＧ−ＣＳ２（ＰＥＧ導入率＝１４．１％、Ｍｎ＝１．１×１０５、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９、Ｃ／Ｎ＝７０．４）を得た（収率７４．９％）。
【００５２】
合成例６．ＰＥＧ−ＧＣＳ４の合成
合成例２の合成において、ＰＥＧ−ＣＳ１をＰＥＧ−ＣＳ２に変えた他は、同様の方法を用いて、合成例６のＰＥＧ−ＧＣＳ４（グアニジノ基導入率＝３６．９％、Ｍｎ＝８．６×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４、Ｃ／Ｎ＝４０．８）を得た（収率９５．６％）。
【００５３】
合成例７．ＰＥＧ−ＣＳ３の合成
合成例１の合成において、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１をＰＥＧ−ＣＯＯＨ３（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１と化学構造は類似するが、分子量が２０００である）に変えた他は、同様の方法を用いて、合成例７のＰＥＧ−ＣＳ３（ＰＥＧ導入率＝９．６％、Ｍｎ＝２．１×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３、Ｃ／Ｎ＝１５．４）を得た（収率７３．８％）。
【００５４】
合成例８．ＰＥＧ−ＧＣＳ５の合成
合成例２の合成において、ＰＥＧ−ＣＳ１をＰＥＧ−ＣＳ３に変えた他は、同様の方法を用いて、合成例８のＰＥＧ−ＧＣＳ５（グアニジノ基導入率＝２２．３％、Ｍｎ＝１．７×１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３、Ｃ／Ｎ＝１０．７）を得た（収率８４．３％）。
以上の合成例を表１に示した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
ポリエチレングリコールグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＧＣＳ）等と一本鎖オリゴＤＮＡ（デオキシアデノシン一リン酸の２１量体（ｄＡ２１）との複合体形成
グアニジル化ＰＥＧグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＧＣＳ１）と医薬との複合体形成を評価するために、ＰＥＧ−ＧＣＳ１と主鎖の長さがほぼ同じのｄＡ２１との複合体形成を観察した。
【００５７】
まず、キトサン（ＣＳ１）、グアニジル化キトサン（ＧＣＳ）及びＰＥＧグラフトキトサン（ＰＥＧ−ＣＳ１）とｄＡ２１との複合体形成も観察して、ＰＥＧ−ＧＣＳ１の複合体形成と比較した。いずれも、ＣＳ主鎖の繰り返し単位の数／ｄＡ２１の繰り返し単位の数＝約１であり、繰り返し単位の数は、ほぼ同じになるように調整した。ＣＳ１及びＰＥＧ−ＣＳ１は上述した化合物を用いた。ＧＣＳは、H. Izawa et al., International Journal of Biological Macromolecules, 125, 901-905(2019) 記載の方法で合成した。
【００５８】
ＣＳ１、ＧＣＳ、ＰＥＧ−ＣＳ１及びＰＥＧ−ＧＣＳ１の各々と、繰り返し単位の数が同数になるように、ｄＡ２１をサンプル瓶に入れて、０．５ｍＬの超純水を加えて、２５℃で１分間、振り混ぜて混合し、１０分後に、サンプル瓶中を目視で観察した。
【００５９】
ＣＳ１とＧＣＳ各々と、ｄＡ２１との混合物は、白濁した流体を形成した。過凝集したマクロな複合体が析出した。従って、ＣＳ１とＧＣＳは、共にｄＡ２１と複合体を形成して、水中に保持する性質に劣ることが明らかであった。
【００６０】
ＰＥＧ−ＣＳ１とＰＥＧ−ＧＣＳ１の各々と、ｄＡ２１との混合物は、共に透明な流体を形成した。従って、ＰＥＧ−ＣＳ１とＰＥＧ−ＧＣＳ１は、共にｄＡ２１と複合体を形成して、水中に保持する性質に優れることが明らかであった。
【００６１】
溶液中の平均粒径の測定
溶液中の平均粒径を、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて、ISO 22412:2017に準拠して、測定した。具体的には、大塚電子社製のELSZ-1000（商品名）を用いて、粒径分布を測定した。
上述のＰＥＧ−ＣＳ１とｄＡ２１との超純水中の複合体の平均粒径は、９０．６ｎｍであった。
上述のＰＥＧ−ＧＣＳ１とｄＡ２１との超純水中の複合体の平均粒径は、８０．７ｎｍであった。
【００６２】
更に、複合体を形成する媒体を、下記の媒体に変更して、ＰＥＧ−ＣＳ１とＰＥＧ−ＧＣＳ１の分散性を評価した。尚、ＣＳ主鎖の繰り返し単位の数／ｄＡ２１の繰り返し単位の数＝約１、３、５になるように調整して、繰り返し単位の数の比の影響も調べた。
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、
トリス緩衝塩水（ｐＨ７．４、２５ｍｍｏｌ／−Ｔｒｉｓ、０．１３７ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ）
０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）
【００６３】
分散媒が、超純水の場合を、表２に示す。
【表２】
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【００６４】
分散媒が、0.1M酢酸緩衝液の場合を、表３に示す。
【表３】
2020180225.tif 000021
【００６５】
分散媒が、トリス緩衝塩水の場合を、表４に示す。
【表４】
2020180225.tif 000022
【００６６】
分散媒が、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液の場合を、表５に示す。
【表５】
2020180225.tif 000023
【００６７】
分散媒が、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液の場合を、表６に示す。
【表６】
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【００６８】
ＰＥＧ−ＧＣＳ１は、いずれの分散媒についても、ＰＥＧ−ＣＳ１より、より小さい平均粒径を有する複合体をｄＡ２１と形成した。従って、ＰＥＧ−ＧＣＳ１は、分散性により優れることから、医薬デリバリーに優れることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の実施形態のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、生体適合性に優れ、医薬の分散性に優れる。よって、本発明の実施形態のグアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサンは、それを含む医薬用キャリアとして使用することができ、医薬と複合体を形成し、その複合体を用いる医薬導入方法に好適に使用することができる。
【図１】
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