(57)【要約】【課題】対象タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させる新たな技術を提供する。【解決手段】下記式（１）で表される化合物［式（１）中、Ｚは下記式（２）で表される基を表し、Ｌは、−Ｃ−が、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−又は下記式（３）で表される基に置換されることにより中断されていてもよい炭素数１〜５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１はタグタンパク質のリガンドとして機能する基又は前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基を表し、下記式（２）中、Ｒ２は炭素数９以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基を表す。］。    ［化１］2020143049.tif 000025【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物。
【化１】
2020143049.tif 000021
［式（１）中、Ｚは下記式（２）で表される基を表し、Ｌは、−Ｃ−が、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−又は下記式（３）で表される基に置換されることにより中断されていてもよい炭素数１〜５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１はタグタンパク質のリガンドとして機能する基又は前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基を表し、下記式（２）中、Ｒ２は炭素数９以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基を表す。
【化２】
2020143049.tif 000022
］
【請求項２】
前記タグタンパク質及び前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基の組み合わせが、大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）タンパク質及び下記式（４）で表される基の組み合わせ、ＦＫ５０６結合タンパク質及び下記式（５）で表される基の組み合わせ、炭酸脱水酵素Ｉタンパク質若しくは炭酸脱水酵素ＩＩタンパク質及び下記式（６）で表される基の組み合わせ、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（７）若しくは下記式（８）で表される基の組み合わせ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（９）で表される基の組み合わせ、又は、光活動性黄色タンパク質及び下記式（１０）で表される基の組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
【化３】
2020143049.tif 000023
【請求項３】
前記光分解性保護基が、下記式（１１）〜（１９）のいずれかで表される基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【化４】
2020143049.tif 000024
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物からなる、前記タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤。
【請求項５】
細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、
前記細胞の細胞内に、請求項４に記載の局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基である局在化剤を導入し、その結果、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ）を含み、
前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含み、
前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、
前記細胞の細胞内に、請求項４に記載の局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基である局在化剤を導入する工程（ａ１）と、
前記工程（ａ１）の後に前記細胞に光を照射し、その結果、前記局在化剤から前記光分解性保護基が脱離し、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ２）と、を含み、
前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法。
【請求項８】
前記工程（ａ２）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含み、
前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又は前記タグタンパク質の内部に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列を有する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象タンパク質がシグナル伝達タンパク質である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象タンパク質が内在性のタンパク質であり、
前記細胞が、前記対象タンパク質をコードする遺伝子座に、前記タグタンパク質をコードする遺伝子断片をノックインした細胞である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項４に記載の局在化剤を含む、細胞内におけるタグタンパク質の局在制御用キット。
【請求項１３】
対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞、
前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、  前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質作製用ベクターを更に含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記タグタンパク質のリガンドを更に含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜又はゴルジ体に局在する化合物及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、新規化合物、タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤、細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法、及び、細胞内におけるタグタンパク質の局在制御用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
小分子化合物を用いて特定のシグナル分子を活性化する技術は、生命研究における重要なツールである。細胞内シグナル伝達は、細胞膜等の特定の局所領域を起点として開始されるため、シグナル分子の局在をコントロールする技術は、細胞内シグナルを人工的に制御する有効な手法となる。生理条件下ではシグナルの活性は可逆的であり、その活性化時間は細胞の機能や運命を決定する重要な因子である。したがって、小分子化合物を用いてシグナル分子の局在を可逆的に制御し、細胞内シグナルを任意にＯＮ−ＯＦＦコントロールする技術は、シグナルの活性化時間と細胞機能の関係を詳細に解析・解明するための強力な研究ツールになるものと期待される。そのようなシグナル分子の局在制御技術は、細胞の機能や運命をコントロールする基盤技術としての応用も期待される。
【０００３】
発明者らは、これまでに、大腸菌由来ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）のリガンドであるトリメトプリム（ＴＭＰ）と、細胞膜又はゴルジ体への局在化モチーフとを結合した化合物（ｍｇｃＴＭＰ）を合成している（例えば、非特許文献１を参照。）。ｍｇｃＴＭＰを細胞に導入することにより、細胞質に発現させた大腸菌由来ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）の融合タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在させることができる。下記式（Ａ１）にトリメトプリムの化学式を示す。
【０００４】
【化１】
2020143049.tif 000002
【０００５】
また、下記式（Ａ２）にｍｇｃＴＭＰの化学式を示す。ｍｇｃＴＭＰのうち、ミリストイル基−グリシン残基−システイン残基からなる部分が、細胞膜又はゴルジ体への局在化モチーフとして機能する。
【０００６】
【化２】
2020143049.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ishida M., et al., Synthetic self-localizing ligands that control the spatial location of proteins in living cells., J Am Chem Soc., 135(34), 12684-12689, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、発明者らは、ｍｇｃＴＭＰによりｅＤＨＦＲ融合タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させた場合に、ｅＤＨＦＲ融合タンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化が自発的に解消してしまうことを見出した。本発明は、対象タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させる新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物。
【化３】
2020143049.tif 000004
［式（１）中、Ｚは下記式（２）で表される基を表し、Ｌは、−Ｃ−が、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−又は下記式（３）で表される基に置換されることにより中断されていてもよい炭素数１〜５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１はタグタンパク質のリガンドとして機能する基又は前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基を表し、下記式（２）中、Ｒ２は炭素数９以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基を表す。
【化４】
2020143049.tif 000005
］
［２］前記タグタンパク質及び前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基の組み合わせが、大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）タンパク質及び下記式（４）で表される基の組み合わせ、ＦＫ５０６結合タンパク質及び下記式（５）で表される基の組み合わせ、炭酸脱水酵素Ｉタンパク質若しくは炭酸脱水酵素ＩＩタンパク質及び下記式（６）で表される基の組み合わせ、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（７）若しくは下記式（８）で表される基の組み合わせ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（９）で表される基の組み合わせ、又は、光活動性黄色タンパク質及び下記式（１０）で表される基の組み合わせである、［１］に記載の化合物。
【化５】
2020143049.tif 000006
［３］前記光分解性保護基が、下記式（１１）〜（１９）のいずれかで表される基である、［１］又は［２］に記載の化合物。
【化６】
2020143049.tif 000007
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物からなる、前記タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤。
［５］細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、前記細胞の細胞内に、［４］に記載の局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基である局在化剤を導入し、その結果、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ）を含み、前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法。
［６］前記工程（ａ）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含み、前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する、［５］に記載の方法。
［７］細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、前記細胞の細胞内に、［４］に記載の局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基である局在化剤を導入する工程（ａ１）と、前記工程（ａ１）の後に前記細胞に光を照射し、その結果、前記局在化剤から前記光分解性保護基が脱離し、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ２）と、を含み、前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法。
［８］前記工程（ａ２）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含み、前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する、［７］に記載の方法。
［９］前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又は前記タグタンパク質の内部に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列を有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記対象タンパク質がシグナル伝達タンパク質である、［５］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記対象タンパク質が内在性のタンパク質であり、前記細胞が、前記対象タンパク質をコードする遺伝子座に、前記タグタンパク質をコードする遺伝子断片をノックインした細胞である、［５］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］［４］に記載の局在化剤を含む、細胞内におけるタグタンパク質の局在制御用キット。
［１３］対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質作製用ベクターを更に含む、［１２］に記載のキット。
［１４］前記タグタンパク質のリガンドを更に含む、［１２］又は［１３］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、対象タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させる新たな技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）は、実験例１において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）〜（ｄ）は、実験例１の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図２】（ａ）〜（ｆ）は、実験例２の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図３】（ａ）〜（ｈ）は、実験例３の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｉ）は、（ａ）〜（ｈ）の結果を数値化したグラフである。
【図４】（ａ）〜（ｌ）は、実験例４の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｃ）〜（ｆ）は、実験例５の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図６】（ａ）は、実験例６において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）〜（ｇ）は、実験例６の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図７】（ａ）は、実験例７において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例７の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）は、実験例８において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例８の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図９】（ａ）は、実験例９において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例９の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）は、実験例１０において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１０の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１１において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図１２】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１１の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１２の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１４】実験例１１及び実験例１２の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）は、実験例１４において発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）〜（ｄ）は、実験例１４の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｅ）は、実験例１４の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１５において、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの吸収スペクトルを測定した結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１５の結果を示すグラフである。
【図１８】（ａ）〜（ｈ）は、実験例１６の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｉ）は、実験例１６の結果を示すグラフである。
【図１９】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１７の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｅ）は、実験例１７において、細胞の面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。
【図２０】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１８の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｅ）は、実験例１８において、細胞の面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。
【図２１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１９において、細胞の面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。
【図２２】（ａ）は、実験例１９において、細胞の突出領域（面積が増加した領域）の面積増加量を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１９において、細胞の縮退領域（面積が減少した領域）の面積減少量を示すグラフである。
【図２３】実験例２０において、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ及びｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰの吸収スペクトルを測定した結果を示すグラフである。
【図２４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２１の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例２１の結果を示すグラフである。
【図２５】（ａ）は、実験例２２で作製したドナーベクターの構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例２２において、目的通りに挿入カセットがノックインされた細胞のゲノムＤＮＡの構造を示す模式図である。（ｃ）は、実験例２２において、目的通りに挿入カセットがノックインされた細胞が発現する融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図２６】（ａ）は、実験例２２における代表的なＰＣＲの結果を示すアガロース電気泳動の写真及びゲノムＤＮＡの構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例２２における代表的なウエスタンブロッティングの結果を示す写真及び融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図２７】（ａ）は、実験例２３で使用したｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６の構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例２３で使用したｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの構造を示す模式図である。
【図２８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例２３の結果を示す代表的な共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図２９】実験例２３の結果を数値化したグラフである。
【図３０】実験例２４におけるウエスタンブロッティングの結果を示すグラフである。
【図３１】実験例２４において測定した、相対的なリン酸化ｃＲａｆレベル及び相対的なリン酸化ＥＲＫレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［化合物］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を提供する。
【化７】
2020143049.tif 000008
［式（１）中、Ｚは下記式（２）で表される基を表し、Ｌは、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−又は下記式（３）で表される基で中断されていてもよい炭素数１〜５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１はタグタンパク質のリガンドとして機能する基又は前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基を表し、下記式（２）中、Ｒ２は炭素数９以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基を表す。
【化８】
2020143049.tif 000009
］
【００１３】
実施例において後述するように、本実施形態の化合物を用いることにより、タグタンパク質を細胞膜（細胞膜内膜）又はゴルジ体に局在化させることができる。また、タグタンパク質を対象タンパク質との融合タンパク質として細胞で発現させておくことにより、任意の対象タンパク質をタグタンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在化させることができる。
【００１４】
また、実施例において後述するように、従来のｍｇｃＴＭＰを用いて対象タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させた場合、対象タンパク質の局在化が自発的に解消してしまう。これに対し、本実施形態の化合物を用いることにより、対象タンパク質の局在化の自発的な解消を抑制し、より長時間、対象タンパク質の局在化を維持することができる。
【００１５】
また、実施例において後述するように、本実施形態の化合物が細胞膜又はゴルジ体に局在化するためには、特に上記式（２）で表される基の構造が重要である。上記式（２）で表される基は、上述したｍｇｃＴＭＰのうち、ミリストイル基−グリシン残基−システイン残基からなる部分を改変した構造であり、ｍｇｃＴＭＰのミリストイル基−グリシン残基−システイン残基からなる部分からグリシン残基を除去し、且つＬ体のシステイン残基をＤ体に置換した構造である。
【００１６】
また、実施例において後述するように、発明者らは、Ｒ２で表される基の炭素数が９以上であれば、細胞膜又はゴルジ体に局在化することができることを明らかにした。Ｒ２の炭素数の上限は特になく、少なくとも１７であっても機能することを確認している。また、Ｒ２は二重結合を含んでいてもよい。
【００１７】
上記式（１）で表される化合物において、Ｌは、上記式（２）で表される基とタグタンパク質のリガンドとして機能する基を連結するリンカーとして機能する基であれば特に限定されない。より詳細には、Ｌは、−Ｃ−が、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−又は上記式（３）で表される基に置換されることにより中断されていてもよい炭素数１〜５０の２価の炭化水素基を表す。
【００１８】
本実施形態の化合物において、タグタンパク質及び前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基の組み合わせは、特に限定されず、あらゆる組み合わせを用いることができる。
【００１９】
タグタンパク質及び前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基の組み合わせの具体例としては、大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）タンパク質及び下記式（４）で表される基の組み合わせ、ＦＫ５０６結合タンパク質及び下記式（５）で表される基の組み合わせ、炭酸脱水酵素Ｉタンパク質若しくは炭酸脱水酵素ＩＩタンパク質及び下記式（６）で表される基の組み合わせ、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（７）若しくは下記式（８）で表される基の組み合わせ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質及び下記式（９）で表される基の組み合わせ、光活動性黄色タンパク質及び下記式（１０）で表される基の組み合わせ等が挙げられる。
【００２０】
【化９】
2020143049.tif 000010
【００２１】
タグタンパク質及びタグタンパク質のリガンドとして機能する基は、互いに結合することができる限り、改変されていてもよい。例えば、タグタンパク質は、上述したタグタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで数個とは、例えば１０個であってもよく、例えば５個であってもよく、例えば３個であってもよい。また、タグタンパク質のリガンドとして機能する基は、上述した基において置換基を有していてもよい。
【００２２】
本実施形態の化合物は、タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合していてもよい。このような化合物はケージド化合物と呼ばれる。
【００２３】
実施例において後述するように、本実施形態の化合物において、タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合している場合、その機能を光照射等で制御することができる。
【００２４】
タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した状態では、タグタンパク質及びタグタンパク質のリガンドとして機能する基は結合しない。しかしながら、所定の波長の光を照射すること等により、光分解性保護基を脱保護すると、タグタンパク質及びタグタンパク質のリガンドとして機能する基が結合することが可能になる。
【００２５】
光分解性保護基は、特に限定されず、あらゆるものを使用することができる。具体的な光分解性保護基としては、例えば、下記式（１１）で表される６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、下記式（１２）で表わされる４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）基、下記式（１３）で表わされるα−メチル−６−ニトロピペロニルオキシメチル（ＭＮＰＯＭ）基、下記式（１４）で表わされる（７−ジエチルアミノクマリン−４−イル）メチルオキシカルボニル（ＤＥＡＣＭ）基、下記式（１５）で表わされる（７−ジエチルアミノチオクマリン−４−イル）メチルオキシカルボニル（ＤＥＡＴＣＯＣ）基、下記式（１６）で表される、（６−ブロモ−７−ヒドロキシクマリン−４−イル）メチルオキシカルボニル（ＢＨＣＯＣ）基、下記式（１７）で表わされる（８−ブロモ−７−ヒドロキシキノリン−２−イル）メチルオキシカルボニル（ＢＨＱＯＣ）基、下記式（１８）で表わされる（３−ニトロジベンゾフラン−２−イル）メチルオキシカルボニル（ＮＤＢＦＯＣ）基、下記式（１９）で表わされる３−ニトロジベンゾフラン−２−イルメチル（ＮＤＢＦ）基等が挙げられる。
【００２６】
【化１０】
2020143049.tif 000011
【００２７】
［タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤］
１実施形態において、本発明は、上述した化合物からなる、タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤を提供する。実施例において後述するように、上述した化合物を、タグタンパク質の細胞膜又はゴルジ体への局在化剤の用途に用いることができる。
【００２８】
［細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法］
（第１実施形態）
第１実施形態の方法は、細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、前記細胞の細胞内に、上述した局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基である局在化剤を導入し、その結果、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ）を含み、前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法である。第１実施形態の方法は、光分解性保護基を有しない局在化剤を用いて細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法である。
【００２９】
第１実施形態の方法において、細胞は、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞を使用する。細胞は真核細胞が好ましい。真核細胞としては、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞等が挙げられる。
【００３０】
融合タンパク質が有する対象タンパク質は１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。また、融合タンパク質が有するタグタンパク質は１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。ここで、対象タンパク質が複数である場合、それらの対象タンパク質は１種であってもよいし２種以上であってもよい。また、タグタンパク質が複数である場合、それらのタグタンパク質は１種であってもよいし２種以上であってもよい。
【００３１】
また、融合タンパク質において、対象タンパク質とタグタンパク質の配置の順序は特に限定されず、いずれがＮ末端側に存在していてもよい。例えば、Ｎ末端側から順に対象タンパク質、タグタンパク質の順番で配置されていてもよいし、Ｎ末端側から順にタグタンパク質、対象タンパク質の順番で配置されていてもよい。また、対象タンパク質、タグタンパク質がそれぞれ複数存在する場合、融合タンパク質におけるそれらの配置の順序は特に限定されない。
【００３２】
例えば、実施例において後述するように、融合タンパク質は１つのタグタンパク質と２つの対象タンパク質を有していてもよい。対象タンパク質としては、特に限定されず、蛍光タンパク質、シグナル伝達タンパク質、酵素等であることができる。
【００３３】
第１実施形態の方法では、工程（ａ）において、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞の細胞内に、上述した局在化剤を導入する。局在化剤の導入は、例えば、細胞の培地に局在化剤を添加すること等により行うことができる。ここで、細胞は、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを一過性に又は安定的に導入した細胞であってもよい。あるいは、対象タンパク質が内在性のタンパク質であり、対象タンパク質をコードする遺伝子座に、タグタンパク質をコードする遺伝子断片をノックインした細胞であってもよい。ここで、タグタンパク質をコードする遺伝子断片のノックインはゲノム編集により行ってもよい。
【００３４】
実施例において後述するように、細胞内に局在化剤を導入した結果、局在化剤のリガンドとして機能する基とタグタンパク質とが結合し、タグタンパク質が対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する。
【００３５】
実施例において後述するように、上述した局在化剤を用いることにより、対象タンパク質の局在化の自発的な解消を抑制し、より長時間、対象タンパク質の局在化を維持することができる。
【００３６】
第１実施形態の方法は、工程（ａ）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含んでいてもよい。この場合、前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する。すなわち、対象タンパク質の局在化が解消される。工程（ｂ）により、局在化させた対象物質の局在化を制御して解消させることができる。
【００３７】
（第２実施形態）
第２実施形態の方法は、細胞内における対象タンパク質の局在を制御する方法であって、前記細胞の細胞内に、上述した局在化剤であって、前記Ｒ１が前記タグタンパク質のリガンドとして機能する基に光分解性保護基が更に結合した基である局在化剤を導入する工程（ａ１）と、前記工程（ａ１）の後に前記細胞に光を照射し、その結果、前記局在化剤から前記光分解性保護基が脱離し、前記局在化剤の前記リガンドとして機能する基と前記タグタンパク質とが結合し、前記タグタンパク質が前記対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する工程（ａ２）と、を含み、前記細胞は、前記対象タンパク質と前記タグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞である、方法である。第２実施形態の方法は、ケージド化合物である局在化剤を用いる点で第１実施形態の方法と主に異なる。
【００３８】
第２実施形態の方法では、工程（ａ１）において、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞の細胞内に、ケージド化合物である局在化剤を導入する。第２実施形態の方法において、細胞、局在化剤の細胞内への導入方法は、第１実施形態の方法と同様である。
【００３９】
続いて、工程（ａ１）の後に、細胞に光を照射する工程（ａ２）を実施する。工程（ａ２）において照射する光は、ケージド化合物の光分解性保護基を脱保護できる条件の光であればよく、使用した光分解性保護基に応じて適宜調整すればよい。例えば、実施例において後述するように、光分解性保護基としてＮＶＯＣ基を用いた場合、波長４０５ｎｍの光を照射すればよい。また、光分解性保護基としてＤＥＡＣＭ基を用いた場合、波長４０５ｎｍの光、波長４４５ｎｍの光等を照射すればよい。
【００４０】
光を照射した結果、局在化剤から光分解性保護基が脱離する。続いて、局在化剤のリガンドとして機能する基とタグタンパク質とが結合し、タグタンパク質が対象タンパク質と共に細胞膜又はゴルジ体に局在する。
【００４１】
実施例において後述するように、第２実施形態の方法により、１細胞レベルで、あるいは、１細胞上の特定の領域でタグタンパク質の局在化を制御することができる。
【００４２】
第２実施形態の方法は、工程（ａ２）の後に、前記細胞内に前記タグタンパク質のリガンドを導入する工程（ｂ）を更に含んでいてもよい。第２実施形態の方法における工程（ｂ）は、第１実施形態の方法における工程（ｂ）と同様である。
【００４３】
この場合、前記工程（ｂ）において、前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが競合し、細胞膜又はゴルジ体に局在した前記タグタンパク質の少なくとも一部において前記リガンドとして機能する基と前記リガンドが置換し、その結果、前記対象タンパク質が細胞膜又はゴルジ体から移動する。すなわち、対象タンパク質の局在化が解消される。工程（ｂ）により、局在化させた対象物質の局在化を制御して解消させることができる。
【００４４】
上述した第１実施形態の方法又は第２実施形態の方法において、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質は、前記融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又は前記タグタンパク質の内部に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、リジン残基の数は４〜８個であってもよいし、４〜７個であってもよいし、６個（ＫＫＫＫＫＫ、配列番号１）であってもよい。
【００４５】
実施例において後述するように、融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又は前記タグタンパク質の内部に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列が配置されている場合、融合タンパク質は細胞膜に特異的に局在化する傾向にある。
【００４６】
ここで、Ｎ末端とは、Ｎ末端の近傍であればよく、例えばＮ末端から数アミノ酸の位置に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列が配置されていればよい。同様に、Ｃ末端とは、Ｃ末端の近傍であればよく、例えばＣ末端から数アミノ酸の位置に、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列が配置されていればよい。ここで、数アミノ酸とは、例えば１〜１０アミノ酸であってもよく、例えば１〜５アミノ酸であってもよく、例えば１〜３アミノ酸であってもよい。また、リジン残基が４〜１０個連続したアミノ酸配列がタグタンパク質の内部に存在する場合、その位置は、タグタンパク質がそのリガンドと結合する機能を維持している限り特に限定されない。
【００４７】
［キット］
１実施形態において、本発明は、上述した局在化剤を含む、細胞内におけるタグタンパク質の局在制御用キットを提供する。本実施形態のキットを用いることにより、細胞内におけるタグタンパク質の局在を制御することができる。
【００４８】
本実施形態のキットにおいて、局在化剤は、光分解性保護基を有するものであってもよいし、有しないものであってもよい。
【００４９】
本実施形態のキットは、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質作製用ベクターを更に含んでいてもよい。
【００５０】
本実施形態のキットにおいて、細胞としては上述したものと同様のものを用いることができる。本実施形態のキットが、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞を含む場合、上述した局在化剤を当該細胞に導入することにより、細胞内におけるタグタンパク質の局在を制御することができる。
【００５１】
本実施形態のキットが、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを含む場合、所望の細胞に当該発現ベクターを導入して発現させることにより、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞を調製することができる。この細胞に上述した局在化剤を導入することにより、細胞内におけるタグタンパク質の局在を制御することができる。
【００５２】
対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質作製用ベクターとは、例えば、プロモーターの下流に、タグタンパク質をコードする遺伝子及びマルチクローニングサイトを含むベクターが挙げられる。タグタンパク質をコードする遺伝子とマルチクローニングサイトは、いずれがプロモーター側に配置されていてもよい。融合タンパク質作製用ベクターのマルチクローニングサイトに所望の対象タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることにより、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを調製することができる。
【００５３】
続いて、所望の細胞に当該発現ベクターを導入して発現させることにより、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞を調製することができる。この細胞に上述した局在化剤を導入することにより、細胞内におけるタグタンパク質の局在を制御することができる。
【００５４】
本実施形態のキットは、タグタンパク質のリガンドを更に含んでいてもよい。実施例において後述するように、タグタンパク質を局在化させた後、タグタンパク質のリガンドを細胞に導入することにより、タグタンパク質の局在化を解消することができる。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
［実験例１］
（ｍｇｃＴＭＰによる局在化の自発的な解消）
ヒト子宮頚癌由来の細胞株であるＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。図１（ａ）は、発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。融合タンパク質のＮ末端側にｅＤＨＦＲを、Ｃ末端側にＥＧＦＰを配置した。更に、融合タンパク質のＮ末端にはＫ６タグを配置した。発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。以下、この融合タンパク質を「Ｋ６−ＤＧ」という場合がある。
【００５７】
続いて、融合タンパク質（Ｋ６−ＤＧ）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｋ６−ＤＧ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍｇｃＴＭＰを添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【００５８】
図１（ｂ）〜（ｄ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図１（ｂ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図１（ｃ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。図１（ｄ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から４０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００５９】
その結果、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。しかしながら、ｍｇｃＴＭＰの添加から４０分後には、ＥＧＦＰの局在化が自発的に解消してしまうことが明らかとなった。
【００６０】
［実験例２］
（ｍｇＤｃＴＭＰによる局在化の検討）
ｍｇｃＴＭＰのシステイン残基をＤ体に置換した局在化剤（以下、「ｍｇＤｃＴＭＰ」という場合がある。）を合成し、タグタンパク質の局在化能を検討した。
【００６１】
《ｍｇＤｃＴＭＰの合成》
まず、下記スキーム（１）にしたがって、ｍｇＤｃＴＭＰを合成した。
【００６２】
【化１１】
2020143049.tif 000012
【００６３】
具体的には、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがってＲｉｎｋアミド樹脂上でｍｇＤｃＴＭＰを合成した。
【００６４】
Ｆｍｏｃ脱保護は、室温で１５分間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２０％ピペリジンを用いて行った。また、アミノ酸カップリング反応は、ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４．１当量）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、４．０当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、４．０当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、８．０当量）の混合物を用いて室温で行った。また、全てのＦｍｏｃ脱保護およびカップリング工程は、Ｋａｉｓｅｒ試験によってモニターした。また、全ての洗浄手順はＤＭＦを用いて行った。
【００６５】
まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）（１８５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨを樹脂にカップリングさせ、ＤＭＦで洗浄した。
【００６６】
続いて、Ｆｍｏｃ−Ａｄｏｘ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。
【００６７】
また、Ｎ末端は、ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）中、ミリスチン酸（４．１当量）、ＨＢＴＵ（４．０当量）、ＨＯＢｔ（４．０）及びＤＩＰＥＡ（８．０当量）の混合物を用いてミリストイル化した。
【００６８】
続いて、５％ヒドラジンを含有するＤＭＦで処理することにより、ｉｖＤｄｅ基を選択的に脱保護した。
【００６９】
続いて、ＤＭＦ中、化合物Ｘ１（３．１当量）、ＨＢＴＵ（３．０当量）、ＨＯＢｔ（３．０当量）及びＤＩＰＥＡ（８．０当量）の混合物を反応させて、化合物Ｘ１をリジン残基の側鎖に結合させた。
【００７０】
Ｔｒｔ脱保護及び樹脂からの切断は、５％エタンジチオール（ＥＤＴ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ｍｇＤｃＴＭＰを白色の固体として得た。
【００７１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ０．８９（３Ｈ、ｔ）、１．２８（２２Ｈ、ｍ）、１．４０（２Ｈ、ｍ）、１．５３（２Ｈ、ｍ）、１．６２（２Ｈ、ｍ）、１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．８０（２Ｈ、ｍ）、２．２６（４Ｈ、ｍ）、２．８６（２Ｈ、ｍ）、３．１８（２Ｈ、ｔ）、３．４１（２Ｈ、ｍ）、３．４５（４Ｈ、ｍ）、３．５９（６Ｈ、ｍ）、３．６６（１４Ｈ、ｍ）、３．８０（６Ｈ、ｓ）、３．８８（２Ｈ、ｓ、ｓ）、３．９２（２Ｈ、ｔ）、４．００（４Ｈ、ｓ）、４．０３（２Ｈ、ｓ）、４．４２（１Ｈ、ｍ）、４．５０（１Ｈ、ｍ）、６．５６（２Ｈ、ｓ）、７．２２（１Ｈ、ｓ）．
【００７２】
《ｍｇＤｃＴＭＰによる局在化の検討》
Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に、終濃度１０μＭとなるようにｍｇＤｃＴＭＰを添加し、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、比較のためにＫ６−ＤＧ発現細胞の培地に終濃度１０μＭのｍｇｃＴＭＰを添加した群も用意した。
【００７３】
図２（ａ）〜（ｆ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図２（ａ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図２（ｂ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図２（ｃ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００７４】
また、図２（ｄ）は、ｍｇＤｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図２（ｅ）は、ｍｇＤｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図２（ｆ）は、ｍｇＤｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００７５】
その結果、実験例１の結果と同様に、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。しかしながら、ｍｇｃＴＭＰの添加から９０分後には、ＥＧＦＰの局在化が自発的に解消してしまうことが明らかとなった。
【００７６】
また、ｍｇＤｃＴＭＰの添加から１０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。しかしながら、ｍｇＤｃＴＭＰの添加から９０分後には、ＥＧＦＰの局在化が自発的に解消してしまうことが明らかとなった。
【００７７】
以上の結果から、ｍｇｃＴＭＰの代わりにｍｇＤｃＴＭＰを用いても、ＥＧＦＰの局在化の自発的な解消を防ぐことができないことが明らかとなった。
【００７８】
［実験例３］
（ｍＤｃＴＭＰによる局在化の検討）
ｍｇｃＴＭＰからグリシン残基を除去し、更にシステイン残基をＤ体に置換した化合物（以下、「ｍＤｃＴＭＰ」という場合がある。）を合成し、タグタンパク質の局在化能を検討した。
【００７９】
《ｍＤｃＴＭＰの合成》
まず、下記スキーム（２）にしたがってｍＤｃＴＭＰを合成した。具体的には、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを樹脂にカップリングさせた後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングさせずにＮ末端をミリストイル化した点以外は実験例２におけるスキーム１と同様の反応を行った。続いて、生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、ｍＤｃＴＭＰを白色の固体として得た。
【００８０】
【化１２】
2020143049.tif 000013
【００８１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ０．８９（３Ｈ、ｔ）、１．２８（２２Ｈ、ｍ）、１．４０（２Ｈ、ｍ）、１．５３（２Ｈ、ｍ）、１．６１（２Ｈ、ｍ）、１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．８２（２Ｈ、ｍ）、２．２５（４Ｈ、  ｍ）、２．８４（２Ｈ、ｍ）、３．１８（２Ｈ、ｔ）、３．４６（６Ｈ、  ｍ）、３．５９（６Ｈ、ｍ）、３．６６（１４Ｈ、ｍ）、３．８０（６Ｈ、ｓ）、３．９２（２Ｈ、ｔ）、４．００（４Ｈ、ｓ）、４．０３（２Ｈ、ｓ）、４．４４（２Ｈ、ｍ）、６．５６（２Ｈ、ｓ）、７．２２（１Ｈ、ｓ）．
【００８２】
《ｍＤｃＴＭＰによる局在化の検討》
Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に、終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＴＭＰを添加し、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ｍＤｃＴＭＰの添加から１２０分後に、培地に終濃度１００μＭのリガンドを更に添加し、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。リガンドとしては、フリーのトリメトプリム（以下、「ＴＭＰ」という場合がある。）を使用した。
【００８３】
図３（ａ）〜（ｃ）は、比較のために示した結果であり、Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に終濃度１０μＭのｍｇｃＴＭＰを添加した場合の共焦点レーザー顕微鏡写真である。また、図３（ｄ）〜（ｇ）は、Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に終濃度１０μＭのｍＤｃＴＭＰを添加した結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。また、図３（ｈ）は、Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地にｍＤｃＴＭＰを添加してから１２０分後に、ＴＭＰを更に添加した結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【００８４】
図３（ａ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｂ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｃ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００８５】
また、図３（ｄ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｅ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｆ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｇ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１２０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図３（ｈ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１２０分後にＴＭＰを更に添加して２０分後、すなわち、ｍＤｃＴＭＰの添加から１４０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００８６】
また、図３（ｉ）は、図（ａ）〜（ｃ）、（ｄ）〜（ｈ）の結果を数値化したグラフである。図３（ｉ）中、縦軸は標準化した細胞質内の蛍光強度（相対値）を表し、横軸は局在化剤の添加後の時間（分）を表す。
【００８７】
その結果、ｍｇｃＴＭＰでは、添加から９０分後には、ＥＧＦＰの局在化が自発的に解消してしまうのに対し、ｍＤｃＴＭＰでは、少なくとも添加から１２０分後であっても、ＥＧＦＰの局在化が維持されることが明らかとなった。更に、フリーのＴＭＰを添加することによって、所望のタイミングでＥＧＦＰの局在を元に戻すことができることが明らかとなった。
【００８８】
［実験例４］
（ｍＤｃＴＭＰのミリストイル基部分の構造の検討）
ｍＤｃＴＭＰのミリストイル基部分の炭素数及び二重結合の数を改変し、タグタンパク質の局在化能を検討した。まず、下記式（２０）で表される化合物における、Ｒ３で表される基を様々に改変した化合物をそれぞれ合成した。
【００８９】
【化１３】
2020143049.tif 000014
【００９０】
具体的には、実験例２におけるスキーム１を適宜改変して、上記式（２０）におけるＲ３が、下記式（２１）に示すノナノイル基、下記式（２２）に示すデカノイル基、下記式（２３）に示すラウロイル基、下記式（２４）に示すパルミトイル基、下記式（２５）に示すステアロイル基、下記式（２６）に示すオレオイル基である化合物をそれぞれ合成した。
【００９１】
【化１４】
2020143049.tif 000015
【００９２】
続いて、Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に、終濃度１０μＭとなるように各化合物をそれぞれ添加し、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図４（ａ）〜（ｌ）は、Ｋ６−ＤＧ発現細胞の培地に終濃度５μＭの各化合物をそれぞれ添加した結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【００９３】
図４（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２１）に示すノナノイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９４】
図４（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２２）に示すデカノイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９５】
図４（ｅ）及び（ｆ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２３）に示すラウロイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９６】
図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２４）に示すパルミトイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９７】
図４（ｉ）及び（ｊ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２５）に示すステアロイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９８】
図４（ｋ）及び（ｌ）は、それぞれ、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２６）に示すオレオイル基である化合物の添加前及び添加から６０分後のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【００９９】
その結果、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２１）に示すノナノイル基である化合物では、ＥＧＦＰの細胞膜への局在化の効率が顕著に低下することが明らかになった。これに対し、上記式（２０）におけるＲ３が、上記式（２２）に示すデカノイル基である化合物、上記式（２３）に示すラウロイル基である化合物、上記式（２４）に示すパルミトイル基である化合物、上記式（２５）に示すステアロイル基である化合物、上記式（２６）に示すオレオイル基である化合物では、ＥＧＦＰの細胞膜への局在化が認められた。
【０１００】
以上の結果から、上記式（２０）で表される化合物において、Ｒ３が炭素数１０以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基を有するアシル基であれば、タグタンパク質の局在化能を有することが明らかとなった。換言すれば、下記式（２７）に示す化合物におけるＲ２が、炭素数９以上で飽和又は不飽和の直鎖状炭化水素基であれば、タグタンパク質の局在化能を有することが明らかとなった。
【０１０１】
【化１５】
2020143049.tif 000016
【０１０２】
［実験例５］
（融合タンパク質へのＫ６タグの付加の影響１）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。図５（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。融合タンパク質のＮ末端側にｅＤＨＦＲを、Ｃ末端側にＥＧＦＰを配置した。以下、この融合タンパク質を「ＤＧ」という場合がある。ＤＧのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１０３】
また、ＤＧのＮ末端にＫ６タグを配置した融合タンパク質（以下、「Ｋ６−ＤＧ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞も用意した。図５（ｂ）はＫ６−ＤＧの構造を示す模式図である。Ｋ６−ＤＧのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１０４】
続いて、ＤＧを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＤＧ発現細胞」という場合がある。）及びＫ６−ＤＧを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｋ６−ＤＧ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍｇｃＴＭＰをそれぞれ添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１０５】
図５（ｃ）〜（ｆ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図５（ｃ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加前のＤＧ発現細胞の写真である。また、図５（ｄ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＤＧ発現細胞の写真である。また、図５（ｅ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図５（ｆ）は、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。
【０１０６】
その結果、ＤＧ発現細胞では、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜及びゴルジ体に局在したことが明らかとなった。一方、Ｋ６−ＤＧ発現細胞では、ｍｇｃＴＭＰの添加から１０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。
【０１０７】
以上の結果から、融合タンパク質のＮ末端にＫ６タグをつけると細胞膜への局在化の特異性が向上することが明らかとなった。
【０１０８】
［実験例６］
（融合タンパク質へのＫ６タグの付加の影響２）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。融合タンパク質のＮ末端側にＥＧＦＰを、Ｃ末端側にｅＤＨＦＲを配置した。また、ＥＧＦＰとｅＤＨＦＲとの間にＫ６タグを配置した。図６（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「Ｇ−Ｋ６−Ｄ」という場合がある。Ｇ−Ｋ６−Ｄのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１０９】
続いて、Ｇ−Ｋ６−Ｄを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｇ−Ｋ６−Ｄ発現細胞」という場合がある。）、実験例５と同様のＤＧ発現細胞及びＫ６−ＤＧ発現細胞の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＴＭＰをそれぞれ添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１１０】
図６（ｂ）〜（ｇ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図６（ｂ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＤＧ発現細胞の写真である。また、図６（ｃ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＤＧ発現細胞の写真である。また、図６（ｄ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図６（ｅ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＫ６−ＤＧ発現細胞の写真である。また、図６（ｆ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＧ−Ｋ６−Ｄ発現細胞の写真である。また、図６（ｇ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に撮影したＧ−Ｋ６−Ｄ発現細胞の写真である。
【０１１１】
その結果、ＤＧ発現細胞では、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜及びゴルジ体に局在したことが明らかとなった。また、Ｋ６−ＤＧ発現細胞では、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。また、Ｇ−Ｋ６−Ｄ発現細胞では、ｍＤｃＴＭＰの添加から９０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜及びゴルジ体に局在したことが明らかとなった。
【０１１２】
以上の結果から、融合タンパク質の内部にＫ６タグを付加しても、細胞膜への局在化の特異性は向上しないことが明らかとなった。
【０１１３】
［実験例７］
（融合タンパク質へのＫ６タグの付加の影響３）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質としてＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）を使用した。融合タンパク質のＮ末端側にＥＧＦＰを、Ｃ末端側にＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）を配置した。また、ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）のＣ末端側にＫ６タグを配置した。図７（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６」という場合がある。ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０１１４】
《ｍＤｃＳＬＦ＊の合成》
下記スキーム（３）にしたがってｍＤｃＳＬＦ＊を合成した。具体的には、化合物Ｘ１の代わりに下記式（Ｘ２）で表される化合物を使用した点、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを樹脂にカップリングさせた後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングさせずにＮ末端をミリストイル化した点、Ｆｍｏｃ−Ａｄｏｘ−ＯＨのカップリング回数が異なる点、使用した樹脂及び樹脂からの切り出し条件が異なる点以外は実験例２におけるスキーム１と同様の反応を行った。続いて、生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、ｍＤｃＳＬＦ＊を白色の固体として得た。
【０１１５】
【化１６】
2020143049.tif 000017
【０１１６】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ０．８３−０．９１（６Ｈ、  ｍ）、１．２５−１．３８（２０Ｈ、ｍ）、１．５９−２．１０（１６Ｈ、ｍ）、２．２６−２．３７（４Ｈ、ｍ）、２．５０（２Ｈ、ｍ）、２．６９−２．８５（３Ｈ、ｍ）、  ３．４２−３．４６（１０Ｈ、ｍ）、３．５７−３．６９（３９Ｈ、ｍ）、３．８０−３．８２（１０Ｈ、ｍ）、４．４６−４．５２（４Ｈ、ｍ）、５．３９（１Ｈ、ｍ）、５．５８（１Ｈ、ｍ）、６．５４（１Ｈ、ｄ）、６．５８（２Ｈ、ｓ）、６．６８（１Ｈ、ｄ）、６．７３（１Ｈ、ｄ）、６．７９（１Ｈ、  ｓ）、６．８４−６．８７（２Ｈ、ｍ）、７．１９（１Ｈ、ｍ）．
【０１１７】
《ｍＤｃＳＬＦ＊による局在化の検討》
ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度５μＭとなるようにｍＤｃＳＬＦ＊を添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１１８】
図７（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図７（ｂ）は、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加前のＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６発現細胞の写真である。また、図７（ｃ）は、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加から１２０分後に撮影したＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ−Ｋ６発現細胞の写真である。その結果、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加から１２０分後に、ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。
【０１１９】
以上の結果から、融合タンパク質のＣ末端にＫ６タグを付加しても、細胞膜への局在化の特異性を向上させることができることが明らかとなった。
【０１２０】
また、タグタンパク質及びリガンドとして機能する基の組み合わせが、ＴＭＰ及びｅＤＨＦＲの組み合わせ以外の組み合わせであっても、タグタンパク質を局在化させることができることが明らかとなった。
【０１２１】
［実験例８］
（融合タンパク質へのＫ６タグの付加の影響４）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としては蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙを使用し、タグタンパク質としてＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）を使用した。融合タンパク質のＮ末端側にＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）を、Ｃ末端側にｍＣｈｅｒｒｙを配置した。図８（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「ＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ」という場合がある。ＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１２２】
ＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度５μＭとなるようにｍＤｃＳＬＦ＊を添加した。続いて、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１２３】
図８（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図８（ｂ）は、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加前のＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の写真である。また、図８（ｃ）は、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加から６０分後に撮影したＦＫＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の写真である。その結果、ｍＤｃＳＬＦ＊の添加から６０分後に、ｍＣｈｅｒｒｙがゴルジ体に局在したことが明らかとなった。
【０１２４】
以上の結果から、Ｋ６タグを有しない融合タンパク質は、ゴルジ体に局在化する傾向にあることが明らかとなった。
【０１２５】
また、対象タンパク質及びタグタンパク質の組み合わせが、ＥＧＦＰ及びＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）の組み合わせ以外の組み合わせであっても、タグタンパク質を局在化させることができることが明らかとなった。
【０１２６】
［実験例９］
（ｍＤｃＳＡによる局在化の検討１）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質として炭酸脱水酵素Ｉタンパク質（以下、「ＣＡＩ」という場合がある。）を使用した。融合タンパク質のＮ末端側にＣＡＩを、Ｃ末端側にＥＧＦＰを配置した。図９（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「ＣＡＩ−ＥＧＦＰ」という場合がある。ＣＡＩ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【０１２７】
《ｍＤｃＳＡの合成》
下記スキーム（４）にしたがってｍＤｃＳＡを合成した。具体的には、化合物Ｘ１の代わりに下記式（Ｘ３）で表される化合物を使用した点、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨを樹脂にカップリングさせた後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングさせずにＮ末端をミリストイル化した点、Ｆｍｏｃ−Ａｄｏｘ−ＯＨのカップリング回数が異なる点、使用した樹脂及び樹脂からの切り出し条件が異なる点以外は実験例２におけるスキーム１と同様の反応を行った。続いて、生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、ｍＤｃＳＡを白色の固体として得た。
【０１２８】
【化１７】
2020143049.tif 000018
【０１２９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ０．８８−０．９１（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、１．２８−１．３１（２２Ｈ、ｍ）、１．４７−１．６７（７Ｈ、ｍ）、２．２６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、２．７３−２．８８（２Ｈ、ｍ）、３．３７−３．４６（１２Ｈ、ｍ）、３．５４−３．６１（１０Ｈ、ｍ）、３．６５−３．６７（２０Ｈ、ｍ）、３．９９−４．０２（１０Ｈ、ｍ）、４．４３−４．４８（２Ｈ、ｍ）、７．９４−７．９９（４Ｈ、ｍ）．
【０１３０】
《ｍＤｃＳＡによる局在化の検討》
ＣＡＩ−ＥＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＣＡＩ−ＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１００μＭとなるようにｍＤｃＳＡを添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１３１】
図９（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図９（ｂ）は、ｍＤｃＳＡの添加前のＣＡＩ−ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図９（ｃ）は、ｍＤｃＳＡの添加から６０分後に撮影したＣＡＩ−ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ｍＤｃＳＡの添加から６０分後に、ＥＧＦＰがゴルジ体に局在したことが明らかとなった。
【０１３２】
以上の結果から、Ｋ６タグを有しない融合タンパク質は、ゴルジ体に局在化する傾向にあることが更に支持された。
【０１３３】
また、タグタンパク質及びリガンドとして機能する基の組み合わせが、ＴＭＰ及びｅＤＨＦＲの組み合わせ以外の組み合わせであっても、タグタンパク質を局在化させることができることが更に支持された。
【０１３４】
［実験例１０］
（ｍＤｃＳＡによる局在化の検討２）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としてはＥＧＦＰを使用し、タグタンパク質として炭酸脱水酵素ＩＩタンパク質（以下、「ＣＡＩＩ」という場合がある。）を使用した。融合タンパク質のＮ末端側にＣＡＩＩを、Ｃ末端側にＥＧＦＰを配置した。図１０（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「ＣＡＩＩ−ＥＧＦＰ」という場合がある。ＣＡＩＩ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【０１３５】
ＣＡＩＩ−ＥＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＣＡＩＩ−ＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＳＡを添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１３６】
図１０（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図１０（ｂ）は、ｍＤｃＳＡの添加前のＣＡＩＩ−ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図１０（ｃ）は、ｍＤｃＳＡの添加から６０分後に撮影したＣＡＩＩ−ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ｍＤｃＳＡの添加から６０分後に、ＥＧＦＰがゴルジ体に局在したことが明らかとなった。
【０１３７】
以上の結果から、Ｋ６タグを有しない融合タンパク質は、ゴルジ体に局在化する傾向にあることが更に支持された。
【０１３８】
また、タグタンパク質及びリガンドとして機能する基の組み合わせが、ＴＭＰ及びｅＤＨＦＲの組み合わせ以外の組み合わせであっても、タグタンパク質を局在化させることができることが更に支持された。
【０１３９】
［実験例１１］
（ｍＤｃＴＭＰを用いた細胞内シグナルの制御１）
ｍＤｃＴＭＰを用いた細胞内シグナルを制御した。まず、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を用意した。対象タンパク質としてはＥＧＦＰ及びｃＲａｆを使用した。タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。融合タンパク質のＮ末端側から順に、ｅＤＨＦＲ、ＥＧＦＰ、ｃＲａｆを配置した。また、ｅＤＨＦＲのＮ末端側に更にＫ６タグを配置した。
【０１４０】
図１１（ａ）は使用した融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆ」という場合がある。Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【０１４１】
また、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＲＫの融合タンパク質（以下、「ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ」という場合がある。）を用意した。図１１（ｂ）はｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの構造を示す模式図である。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【０１４２】
続いて、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫをＨｅＬａ細胞に発現させた。続いて、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＴＭＰを添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１４３】
ｃＲａｆを細胞膜に局在させると、ＭＥＫを活性化し、更にＥＲＫを活性化することができる。ＥＲＫは、不活性状態では細胞質に局在するが、活性化すると核内に移行する。
【０１４４】
ＥＧＦＰの蛍光を観察することにより、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆの局在を検出することができる。また、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を観察することにより、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの局在を検出することができる。
【０１４５】
図１２（ａ）〜（ｆ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図１２（ａ）及び（ｄ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。また、図１２（ｂ）及び（ｅ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。また、図１２（ｃ）及び（ｆ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から７０分後に撮影したＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。
【０１４６】
また、図１２（ａ）〜（ｃ）はＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆのＥＧＦＰの蛍光を観察した結果であり、図１２（ｄ）〜（ｆ）はｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫのｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を観察した結果である。
【０１４７】
その結果、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆが細胞膜に局在し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫが核内に移行したことが明らかとなった。また、この状態はｍＤｃＴＭＰの添加から７０分後にも維持されていた。この結果は、ｍＤｃＴＭＰを用いて細胞内シグナルを制御することができることを示す。
【０１４８】
［実験例１２］
（ｍＤｃＴＭＰを用いた細胞内シグナルの制御２）
実験例１１と同様のＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＴＭＰを添加した。また、ｍＤｃＴＭＰの添加から２０分後に終濃度１００μＭのリガンドを更に添加した。リガンドとしては、フリーのトリメトプリム（以下、「ＴＭＰ」という場合がある。）を使用した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１４９】
図１３（ａ）〜（ｆ）は、共焦点レーザー顕微鏡写真である。図１３（ａ）及び（ｄ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。また、図１３（ｂ）及び（ｅ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。また、図１３（ｃ）及び（ｆ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から７０分後に撮影したＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。
【０１５０】
また、図１３（ａ）〜（ｃ）はＫ６−ＤＧ−ｃＲａｆのＥＧＦＰの蛍光を観察した結果であり、図１３（ｄ）〜（ｆ）はｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫのｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を観察した結果である。
【０１５１】
その結果、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆが細胞膜に局在し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫが核内に移行したことが明らかとなった。また、ＴＭＰを添加することにより、Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆの細胞膜への局在が解消し、その結果、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫが不活性状態となり、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの核内への局在も解消したことが明らかとなった。この結果は、ｍＤｃＴＭＰを用いて細胞内シグナルを可逆的に制御することができることを示す。
【０１５２】
図１４は、実験例１１及び実験例１２の結果を示すグラフである。図１４中、「ｍＤｃＴＭＰ」は、実験例１１の結果であることを示し、「ｍＤｃＴＭＰ→ＴＭＰ」は、実験例１２の結果であることを示し、「Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ／ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ」はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度の核／細胞質比を標準化した値であることを示し、「Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋ６−ＤＧ−ｃＲａｆ」は細胞質におけるＥＧＦＰの蛍光強度を標準化した値であることを示す。
【０１５３】
［実験例１３］
（ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの合成）
ケージド局在化剤を合成した。具体的には、ｍＤｃＴＭＰのトリメトプリム基に光分解性保護基が更に結合した化合物である、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを合成した。光分解性保護基として、上記式（１１）で表されるＮＶＯＣ基を使用した。ＮＶＯＣ基は、例えば波長４０５ｎｍの光を照射することにより脱保護することができる。ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの合成は、下記スキーム（５）にしたがって行った。
【０１５４】
【化１８】
2020143049.tif 000019
【０１５５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）：δ０．８９（ｔ、３Ｈ）、１．４３−１．２５（ｍ、２２Ｈ）、１．８６−１．４９（ｍ、１０Ｈ）、２．２８−２．２３（ｍ、４Ｈ）、２．７８−２．７２（ｍ、１Ｈ）、２．８８−２．８３（ｍ、１Ｈ）、３．１８（ｔ、２Ｈ）、３．７０−３．３４（ｍ、２４Ｈ）、３．７６（ｓ、６Ｈ）、４．０４−３．８４（ｍ、１２Ｈ）、４．４７−４．４０（ｍ、２Ｈ）、５．６０（ｓ、２Ｈ）、６．５４（ｓ、２Ｈ）、７．２０（ｓ、１Ｈ）、７．７０（ｓ、１Ｈ）、７．７７（ｓ、１Ｈ）．
【０１５６】
［実験例１４］
（光照射による局在化誘導１）
ＨｅＬａ細胞に、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現させた。対象タンパク質としては蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉを使用し、タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。また、ｅＤＨＦＲのＮ末端にＫ６タグを配置した。
【０１５７】
図１５（ａ）は発現させた融合タンパク質の構造を示す模式図である。以下、この融合タンパク質を「Ｋ６−ＤＳ」という場合がある。Ｋ６−ＤＳのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【０１５８】
続いて、Ｋ６−ＤＳを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｋ６−ＤＳ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加した。続いて、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの添加から５分後に細胞を洗浄した。また、比較のために、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加しなかったＫ６−ＤＳ発現細胞も用意した。続いて、波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射し、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１５９】
図１５（ｂ）〜（ｄ）は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真である。図１５（ｂ）は、光照射前のＫ６−ＤＳ発現細胞の写真である。また、図１５（ｃ）は、実験開始から１０秒後のＫ６−ＤＳ発現細胞の写真である。また、図１５（ｄ）は、実験開始から６０秒後のＫ６−ＤＳ発現細胞の写真である。また、図１５（ｅ）は、実験結果を数値化したグラフである。図１５（ｅ）中、横軸は時間（秒）を示し、縦軸は細胞質の蛍光強度比を示し、「＋ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞の結果であることを示し、「−ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加しなかったＫ６−ＤＳ発現細胞の結果であることを示す。
【０１６０】
その結果、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞では、光照射の直後にｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉが細胞膜に局在したことが明らかとなった。
【０１６１】
以上の結果から、光分解性保護基を有する化合物を使用することにより、タグタンパク質の局在化誘導を光照射で制御することが可能であることが明らかとなった。
【０１６２】
［実験例１５］
（光照射による局在化誘導２）
図１６は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの吸収スペクトルを測定した結果を示すグラフである。図１６に示すように、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰは、波長４０５ｎｍの光を吸収するが、波長４４５ｎｍの光をほとんど吸収しないことが明らかとなった。
【０１６３】
続いて、Ｋ６−ＤＳ発現細胞に、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ、波長４０５ｎｍの光照射、波長４４５ｎｍの光照射、フリーのトリメトプリム（以下、「ＴＭＰ」という場合がある。）を様々な組み合わせで作用させ、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。続いて、共焦点レーザー顕微鏡写真に基づいて、タグタンパク質の局在移行効率を測定した。ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰは終濃度１０μＭで添加し、波長４０５ｎｍの光は２．６秒間照射し、波長４４５ｎｍの光は２．６秒間照射し、ＴＭＰは終濃度１００μＭで添加した。
【０１６４】
図１７は、タグタンパク質の局在移行効率を測定した結果を示すグラフである。図１７中、「−」は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ、ＴＭＰを添加しなかったこと、又は、波長４０５ｎｍの光照射、波長４４５ｎｍの光照射を行わなかったことを示し、「＋」は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ、ＴＭＰを添加したこと、又は、波長４０５ｎｍの光照射、波長４４５ｎｍの光照射を行ったことを示す。
【０１６５】
また、グラフの縦軸は下記式（Ｆ１）により算出した局在移行効率を示す。
局在移行効率＝１−（実験開始５分後における細胞質の蛍光強度／実験開始時（０分）における細胞質の蛍光強度）  …（Ｆ１）
【０１６６】
その結果、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加し、波長４０５ｎｍの光照射を行った場合にｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉが細胞膜に局在したことが明らかとなった。また、ＴＭＰの存在下ではｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの細胞膜への局在が抑制されたことが明らかとなった。
【０１６７】
［実験例１６］
（光照射による局在化誘導３）
１細胞レベルでの光照射による局在化誘導を検討した。まず、Ｋ６−ＤＳ発現細胞の培地にｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを終濃度１０μＭで添加し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図１８（ａ）は、実験開始時の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、図１８（ａ）中、「Ｃｅｌｌ１」と示す細胞のみに対し、波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。図１８（ａ）は、実験開始から６０秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。その結果、「Ｃｅｌｌ１」と示す細胞において、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉが細胞膜に局在したことが明らかとなった。
【０１６８】
図１８（ｃ）は、実験開始から６００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、図１８（ｃ）中、「Ｃｅｌｌ２」と示す細胞のみに対し、波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。図１８（ｄ）は、実験開始から６６０秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。その結果、「Ｃｅｌｌ２」と示す細胞において、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉが細胞膜に局在したことが明らかとなった。
【０１６９】
図１８（ｅ）は、実験開始から１２００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、図１８（ｅ）中、「Ｃｅｌｌ３」と示す細胞のみに対し、波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。図１８（ｆ）は、実験開始から１２６０秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。その結果、「Ｃｅｌｌ３」と示す細胞において、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉが細胞膜に局在したことが明らかとなった。また、図１８（ｆ）には「Ｃｅｌｌ４」と示す細胞の位置も示す。
【０１７０】
図１８（ｇ）は、実験開始から１８００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、細胞の培地にフリーのＴＭＰを終濃度１００μＭで添加した。図１８（ｈ）は、実験開始から２４００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。その結果、「Ｃｅｌｌ１」、「Ｃｅｌｌ２」、「Ｃｅｌｌ３」と示す細胞において、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの細胞膜への局在が解消したことが明らかとなった。
【０１７１】
図１８（ｉ）は、図１８（ａ）〜（ｈ）において、「Ｃｅｌｌ１」、「Ｃｅｌｌ２」、「Ｃｅｌｌ３」、「Ｃｅｌｌ４」と示す細胞における、細胞質の蛍光強度比の変化を数値化したグラフである。横軸は実験開始からの時間（秒）を示す。
【０１７２】
［実験例１７］
（光照射による局在化誘導４）
光照射による細胞運動シグナルの制御を検討した。まず、対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を用意した。対象タンパク質としてはｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉ及びＴｉａｍ１を使用した。タグタンパク質としてｅＤＨＦＲを使用した。融合タンパク質のＮ末端側から順に、ｅＤＨＦＲ、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉ、Ｔｉａｍ１を配置した。また、ｅＤＨＦＲのＮ末端側に更にＫ６タグを配置した。以下、この融合タンパク質を「Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１」という場合がある。Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【０１７３】
また、ＬｉｆｅａｃｔとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの融合タンパク質（以下、「Ｌｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ」という場合がある。）を用意した。Ｌｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。ＬｉｆｅａｃｔはＦアクチンに特異的に結合するペプチドである。
【０１７４】
続いて、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎをマウス胎児由来の線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞に発現させた。続いて、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（以下、「Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加した。続いて、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰの添加から５分後に細胞を洗浄した。
【０１７５】
続いて、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図１９（ａ）及び（ｃ）は、実験開始時の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、図１９（ａ）中、四角で囲んだ領域、すなわち細胞全体に波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。
【０１７６】
図１９（ｂ）及び（ｄ）は、実験開始から３００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。また、図１９（ｅ）は、実験開始時と実験開始から３００秒後のＫ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞を比較し、面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。図１９（ｅ）中、「増加」は実験開始時と比較して面積が増加した領域であることを示し、「減少」は実験開始時と比較して面積が減少した領域であることを示す。
【０１７７】
その結果、波長４０５ｎｍの光照射により、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞の面積が変化したことが明らかとなった。この結果から、光分解性保護基を有する化合物を使用することにより、光照射による細胞運動シグナルの制御が可能であることが明らかとなった。
【０１７８】
［実験例１８］
（光照射による局在化誘導５）
Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加した。
【０１７９】
続いて、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図２０（ａ）及び（ｃ）は、実験開始時の共焦点レーザー顕微鏡写真である。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、図２０（ａ）中、丸で囲んだ領域、すなわち細胞の一部に局所的に波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。
【０１８０】
図２０（ｂ）及び（ｄ）は、実験開始から３００秒後の共焦点レーザー顕微鏡写真である。また、図２０（ｅ）は、実験開始時と実験開始から３００秒後のＫ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞を比較し、面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。図２０（ｅ）中、「増加」は実験開始時と比較して面積が増加した領域であることを示し、「減少」は実験開始時と比較して面積が減少した領域であることを示す。
【０１８１】
その結果、波長４０５ｎｍの光照射により、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１及びＬｉｆｅａｃｔ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現細胞の面積が変化したことが明らかとなった。この結果から、光分解性保護基を有する化合物を使用することにより、光照射による細胞運動シグナルの制御が可能であることが更に支持された。
【０１８２】
［実験例１９］
（光照射による局在化誘導６）
Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１を発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（以下、「Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加した。また、比較のためにＫ６−ＤＳを発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（以下、「Ｋ６−ＤＳ発現細胞」という場合がある。）の培地にも終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加した。
【０１８３】
続いて、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。続いて、共焦点レーザー顕微鏡の機能を使って、細胞全体、又は、細胞の一部に局所的に波長４０５ｎｍの光を２．６秒間照射した。続いて、細胞の形態の変化を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１８４】
図２１（ａ）〜（ｄ）は、実験開始時と実験開始から３００秒後のＫ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞又はＫ６−ＤＳ発現細胞を比較し、面積が増加又は減少した領域を表示した画像である。図２０（ａ）〜（ｄ）中、「増加」は実験開始時と比較して面積が増加した領域であることを示し、「減少」は実験開始時と比較して面積が減少した領域であることを示す。
【０１８５】
図２１（ａ）は細胞全体に波長４０５ｎｍの光照射を行った代表的な結果であり、図２１（ｂ）〜（ｄ）は、細胞の一部に局所的に波長４０５ｎｍの光照射を行った代表的な結果である。図２１（ａ）〜（ｄ）中、「＋ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したことを示し、「−ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加しなかったことを示し、「＋Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１」はＫ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞の結果であることを示し、「＋Ｋ６−ＤＳ」はＫ６−ＤＳ発現細胞の結果であることを示す。図２１（ｃ）及び（ｄ）は陰性対照の結果である。また、図２１（ｂ）〜（ｄ）中、丸で囲んだ領域は波長４０５ｎｍの光を照射した領域を示す。
【０１８６】
また、図２２（ａ）は、細胞の突出領域（面積が増加した領域）の面積増加量を示すグラフであり、図２２（ｂ）は細胞の縮退領域（面積が減少した領域）の面積減少量を示すグラフである。また、図２２（ａ）及び（ｂ）中、「全体」は細胞全体に波長４０５ｎｍの光照射を行った結果であることを示し、「局所」は細胞の一部に局所的に波長４０５ｎｍの光照射を行った結果であることを示し、「＋」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したこと、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞の結果であること又はＫ６−ＤＳ発現細胞の結果であることを示し、「−」はｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加しなかったこと、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞を用いなかったこと又はＫ６−ＤＳ発現細胞を用いなかったことを示す。
【０１８７】
その結果、波長４０５ｎｍの光照射により、Ｋ６−ＤＳ−Ｔｉａｍ１発現細胞の面積が変化したことが明らかとなった。この結果から、光分解性保護基を有する化合物を使用することにより、光照射による細胞運動シグナルの制御が可能であることが更に支持された。
【０１８８】
［実験例２０］
（ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰの合成）
光分解性保護基を脱保護させる波長が、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰとは異なるケージド局在化剤を合成した。具体的には、下記スキーム（６）にしたがってｍＤｃＴＭＰのトリメトプリム基に光分解性保護基が更に結合した化合物である、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを合成した。光分解性保護基として、上記式（１４）で表されるＤＥＡＣＭ基を使用した。ＤＥＡＣＭ基は、例えば波長４４５ｎｍの光を照射することにより脱保護することができる。
【０１８９】
【化１９】
2020143049.tif 000020
【０１９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）：δ０．８５（ｔ、３Ｈ）、１．１２（ｔ、６Ｈ）、１．１８−１．４１（ｍ、２２Ｈ）、１．４５−１．７５（ｍ、１０Ｈ）、２．０３−２．２２（ｍ、５Ｈ）、２．５８−２．８０（ｍ、２Ｈ）、２．９９（ｑ、２Ｈ）、３．５０−３．６２（ｍ、１５Ｈ）、３．６９（ｓ、６Ｈ）、３．７５（ｔ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、２Ｈ）、３．８５−３．９５（ｍ、６Ｈ）、４．２２−４．３６（ｍ、２Ｈ）、５．３７（ｓ、２Ｈ）、６．１５（ｓ、１Ｈ）、６．５１（ｓ、２Ｈ）、６．５６（ｄ、１Ｈ）、６．６９（ｄｄ、１Ｈ）、７．０９（ｓ、１Ｈ）、７．４６（ｄ、  １Ｈ）、７．４９（ｓ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、１Ｈ）、７．６９（ｑ、２Ｈ）、７．７４（ｔ、１Ｈ）、７．９９（ｔ、２Ｈ）、８．０３（ｔ、１Ｈ）、１０．１５（ｂｒｓ、  １Ｈ）．
【０１９１】
図２３は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰ及びｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰの吸収スペクトルを測定した結果を示すグラフである。図２３に示すように、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰは波長４４５ｎｍの光を吸収しないが、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰは波長４４５ｎｍの光を吸収することができることが明らかとなった。
【０１９２】
［実験例２１］
（光照射による局在化誘導７）
Ｋ６−ＤＳを発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「Ｋ６−ＤＳ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを添加した。続いて、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰの添加から５分後に細胞を洗浄した。続いて、波長４４５ｎｍの光を２．６秒間照射し、ｍＳｃａｒｌｅｔ  Ｉの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１９３】
図２４（ａ）及び（ｂ）は、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真である。図２４（ａ）は、光照射前のＫ６−ＤＳ発現細胞の写真である。また、図２４（ｂ）は、光照射後のＫ６−ＤＳ発現細胞の写真である。
【０１９４】
その結果、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞では、波長４４５ｎｍの光を照射することにより、タグタンパク質の局在化を誘導することができることが明らかとなった。
【０１９５】
また、図２４（ｃ）は、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞に波長４０５ｎｍ又は４４５ｎｍの光を照射した後、タグタンパク質の局在移行効率を測定した結果を示すグラフである。
【０１９６】
また、図２４（ｄ）は、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞に波長４０５ｎｍ又は４４５ｎｍの光を照射した後、タグタンパク質の局在移行効率を測定した結果を示すグラフである。
【０１９７】
図２４（ｃ）、（ｄ）中、グラフの横軸はレーザー出力の強度（％）を示し、グラフの縦軸は下記式（Ｆ１）により算出した局在移行効率を示す。
局在移行効率＝１−（実験開始５分後における細胞質の蛍光強度／実験開始時（０分）における細胞質の蛍光強度）  …（Ｆ１）
【０１９８】
その結果、ｍＤｃＮＶＯＣＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞では、４０５ｎｍの光照射によりタグタンパク質が細胞膜に局在するが、４４５ｎｍの光照射では、タグタンパク質の局在がほとんど変化しないことが明らかとなった。一方、ｍＤｃＤＥＡＣＭＴＭＰを添加したＫ６−ＤＳ発現細胞では、４０５ｎｍの光照射でも、４４５ｎｍの光照射でも、タグタンパク質が細胞膜に局在することが明らかとなった。
【０１９９】
以上の結果から、吸収波長の異なる光分解性保護基を有する化合物を使用し、照射する光の波長を制御することにより、タグタンパク質の局在化誘導を制御することが可能であることが明らかとなった。
【０２００】
［実験例２２］
（対象タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞の作製）
ゲノム編集により、ＨｅＬａ細胞のｃＲａｆ遺伝子座に、タグタンパク質をコードする遺伝子断片をノックインし、対象タンパク質（ｃＲａｆ）とタグタンパク質との融合タンパク質を発現した細胞を作製した。
【０２０１】
《Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの発現ベクターの作製》
まず、ＣＭＶエンハンサー及びトリβアクチンプロモーターで発現制御されている野生型Ｃａｓ９発現カセットを含むベクター（ｐＸ４５９：ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ  Ｖ２．０）を準備した。ｐＸ４５９ベクターは、５’側から３’側に向かって、Ｕ６プロモーター、２つのＢｂｓＩ認識サイト、トレーサーＲＮＡ配列がこの順に配置された発現カセットを有している。
【０２０２】
続いて、ｐＸ４５９ベクターをＢｂｓＩで切断し、ガイドＲＮＡの標的配列を含む２本鎖ＤＮＡを組み込み、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを発現する発現ベクターを得た。上記の２本鎖ＤＮＡは、２つの１本鎖ＤＮＡをアニールさせて作製した。ガイドＲＮＡの標的配列の塩基配列を配列番号１４に示す。この標的配列は、ｃＲａｆ遺伝子の終止コドンのコード領域周辺を認識する。
【０２０３】
《ドナーベクターの作製》
図２５（ａ）は、作製したドナーベクターの構造を示す模式図である。ドナーベクターは、５’側から３’側に向かって、第１の組換えアーム（Ｌ．ａｒｍ、切断箇所より上流の７００ｂｐに相当する塩基配列）、挿入カセット、第２の組換えアーム（Ｒ．ａｒｍ、切断箇所より下流の７００ｂｐに相当する塩基配列）をこの順に有していた。
【０２０４】
挿入カセットは、５’側から３’側に向かって、蛍光タンパク質ｍＣｌｏｖｅｒ３をコードする塩基配列、タグタンパク質であるｅＤＨＦＲ（６９Ｋ６）をコードする塩基配列、ＨＡタグの３回繰り返し配列をコードする塩基配列、リボソームスキッピングを誘導するＰ２Ａ配列、細胞選択マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子をこの順に有していた。
【０２０５】
ｅＤＨＦＲ（６９Ｋ６）は、ｅＤＨＦＲの内部にリジン残基が６個連続したアミノ酸配列を含むタグタンパク質である。ｅＤＨＦＲ（６９Ｋ６）のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。配列番号１６に、ドナーベクターにおける、第１の組換えアーム、挿入カセット、第２の組換えアームの塩基配列を示す。
【０２０６】
図２５（ｂ）は、目的通りに挿入カセットがノックインされた細胞のゲノムＤＮＡの構造を示す模式図である。図２５（ｃ）に示すように、この細胞は、ｃＲａｆ、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ｅＤＨＦＲ（６９Ｋ６）、ＨＡタグの３回繰り返し配列がこの順に連結した融合タンパク質を発現する。
【０２０７】
《ゲノム編集》
ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、ポリエチレンイミン「Ｍａｘ」（ポリサイエンス社）を使用して、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの発現ベクター１μｇと、ドナーベクター５０ｎｇを導入した。トランスフェクションの３日後、細胞を６０ｍｍディッシュに播種し、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で７日間以上処理した。続いて、限界希釈法により、Ｇ４１８で選択した細胞を単離した。
【０２０８】
続いて、単離した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅により分析した。図２６（ａ）は代表的なＰＣＲの結果を示すアガロース電気泳動の写真及びゲノムＤＮＡの構造を示す模式図である。図２６（ａ）に示すように、目的のゲノム編集が生じたクローンでは３，８３７ｂｐの増幅断片が得られ、野生型のクローンでは１，５９７ｂｐの増幅断片が得られる。
【０２０９】
続いて、単離した細胞を抗ｃＲａｆ抗体及び抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供し、融合タンパク質の発現を検討した。図２６（ｂ）は代表的なウエスタンブロッティングの結果を示す写真及び融合タンパク質の構造を示す模式図である。図２６（ｂ）に示すように、目的のゲノム編集が生じたクローンは１２６ｋＤａの融合タンパク質を発現し、野生型のクローンは７３ｋＤａのｃＲａｆを発現する。その結果、目的のゲノム編集が生じたクローンが得られたことが確認された。
【０２１０】
［実験例２３］
（ｍＤｃＴＭＰを用いた細胞内在性タンパク質の制御１）
ｍＤｃＴＭＰを用いて細胞内在性タンパク質を制御した。細胞として、実験例２２で作製した細胞を使用した。上述したように、この細胞は、ｃＲａｆ、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ｅＤＨＦＲ（６９Ｋ６）、ＨＡタグの３回繰り返し配列がこの順に連結した融合タンパク質（以下、「ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６」という場合がある。）を発現する。図２７（ａ）は、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６の構造を示す模式図である。
【０２１１】
また、実験例１１で使用したｍＣｈｅｒｒｙとＥＲＫの融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ）の発現ベクターを用意した。図２７（ｂ）は、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの構造を示す模式図である。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。続いて、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞に、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫを発現させた。
【０２１２】
続いて、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫを発現するＨｅＬａ細胞（以下、「ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度５μＭとなるようにｍＤｃＴＭＰを添加した。続いて、ｍＣｌｏｖｅｒ３の蛍光及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０２１３】
図２８（ａ）〜（ｄ）は、代表的な共焦点レーザー顕微鏡写真である。図２８（ａ）及び（ｃ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加前のｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。また、図２８（ｂ）及び（ｄ）は、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に撮影したｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞の写真である。
【０２１４】
また、図２８（ａ）及び（ｂ）は、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６のｍＣｌｏｖｅｒ３の蛍光を観察した結果であり、図２８（ｃ）〜（ｄ）は、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫのｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を観察した結果である。
【０２１５】
ｃＲａｆを細胞膜に局在させると、ＭＥＫを活性化し、更にＥＲＫを活性化することができる。ＥＲＫは、不活性状態では細胞質に局在するが、活性化すると核内に移行する。
【０２１６】
ｍＣｌｏｖｅｒ３の蛍光を観察することにより、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６の局在を検出することができる。また、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を観察することにより、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫの局在を検出することができる。
【０２１７】
その結果、ｍＤｃＴＭＰの添加から１０分後に、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６が細胞膜に局在し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫが核内に移行したことが明らかとなった。この結果は、ｍＤｃＴＭＰを用いてゲノムにコードされた対象タンパク質及び細胞内シグナルを制御することができることを示す。
【０２１８】
図２９は、上記の共焦点レーザー顕微鏡観察を複数の細胞について実施した結果を数値化したグラフである（ｎ≧４）。また、比較のために、ｍＤｃＴＭＰの代わりに上皮成長因子（ＥＧＦ）を終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞、及び、ｍＤｃＴＭＰの代わりにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を終濃度０．０５％となるように添加した、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ発現細胞についても同様の解析を行った（ｎ≧４）。
【０２１９】
図２９中、「Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ／ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲＫ」はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度の核／細胞質比を標準化した値であることを示す。
【０２２０】
［実験例２４］
（ｍＤｃＴＭＰを用いた細胞内在性タンパク質の制御２）
ｍＤｃＴＭＰを用いて細胞内在性タンパク質を制御した。細胞として、実験例２２で作製した、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞を使用した。
【０２２１】
まず、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞の培地に、ｍＤｃＴＭＰ（終濃度５μＭ）、ＥＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）又はＤＭＳＯ（終濃度０．０５％）を添加し、５分間又は１５分間インキュベートした。
【０２２２】
また、比較のために、ゲノム編集操作を行っていない野生型のＨｅＬａ細胞の培地に、ｍＤｃＴＭＰ（終濃度５μＭ）又はＥＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、５分間又は１５分間インキュベートした。
【０２２３】
続いて、各細胞から細胞抽出物を調製し、総ｃＲａｆ、活性化されたｃＲａｆ（リン酸化ｃＲａｆ）、総ＥＲＫ、活性化されたＥＲＫ（リン酸化ＥＲＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−チューブリンのレベルをウエスタンブロッティングにより解析した。
【０２２４】
図３０はウエスタンブロッティングの結果を示すグラフである。図３０中、「ＫＩ  ｃｌｏｎｅ  ＃５」はｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞（クローン５）の結果であることを示し、「Ｉｎｔａｃｔ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ」はゲノム編集操作を行っていない野生型のＨｅＬａ細胞結果であることを示し、「ｐｃＲａｆ」はリン酸化ｃＲａｆを検出した結果であることを示し、「ｐＥＲＫ１／２」はリン酸化ＥＲＫ１／２を検出した結果であることを示す。また、「＋」は添加したことを示し、「−」は添加しなかったことを示す。
【０２２５】
また、図３１は、３回の独立した実験結果に基づいて、各細胞抽出物中の総ｃＲａｆレベルに対して正規化された、相対的なリン酸化ｃＲａｆレベル（ｐｃＲａｆ／Ｒａｆ）、及び、総ＥＲＫレベルに対して正規化された、相対的なリン酸化ＥＲＫレベル（ｐＥＲＫ／ＥＲＫ）を示す。
【０２２６】
図３１中、「Ｃｌｏｎｅ  ＃５」は、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞（クローン５）の結果であることを示し、「Ｉｎｔａｃｔ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ」はゲノム編集操作を行っていない野生型のＨｅＬａ細胞の結果であることを示す。また、「＋」は添加したことを示し、「−」は添加しなかったことを示す。
【０２２７】
その結果、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６をゲノムにコードするＨｅＬａ細胞では、ｍＤｃＴＭＰの添加から５分後及び１５分後に、ｃＲａｆ−ＧＤｉＫ６及びＥＲＫがリン酸化されたことが明らかとなった。この結果は、ｍＤｃＴＭＰを用いて内在性の対象タンパク質とその下流シグナルタンパク質を制御することができることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０２２８】
本発明によれば、対象タンパク質を細胞膜又はゴルジ体に局在化させる新たな技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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