(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のトランスジェニックストラテジーを使用せずに、標的化した方法で、植物ゲノムを正確に変えることができる方法の提供。【解決手段】外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のための方法であって：（ｉ）改変される内因性遺伝子を含む植物細胞を提供するステップ；（ｉｉ）配列認識ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む、配列特異的なヌクレアーゼを提供するステップ；（ｉｉｉ）前記の配列特異的なヌクレアーゼを用いて、前記植物細胞をトランスフェクトするステップ；および、（ｉｖ）前記植物ゲノム中にいかなる外因性の遺伝物質も存在せずに、検出可能な標的化したゲノム改変を有する植物細胞（１または複数）を生産するために、前記ゲノムにおいて１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導するステップ、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のための方法であって：
（ｉ）改変される内因性遺伝子を含む植物細胞を提供するステップ；
（ｉｉ）配列認識ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む、配列特異的なヌクレアーゼを提供するステップ；
（ｉｉｉ）前記の配列特異的なヌクレアーゼを用いて、前記植物細胞をトランスフェクトするステップ；および、
（ｉｖ）前記植物ゲノム中にいかなる外因性の遺伝物質も存在せずに、検出可能な標的化したゲノム改変を有する植物細胞（１または複数）を生産するために、前記ゲノムにおいて１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
前記ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される、
方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、
前記ゲノムにおける１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断の誘導は、相同組み換えメカニズムを通した前記切断（１または複数）の修復が後に続く、
方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼである、
方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、
方法。
【請求項７】
請求項１の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、精製されたタンパク質の形態である、
方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、精製されたｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態である、
方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞内局在化ドメインをさらに含む、
方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、
前記の１つまたは複数の細胞内局在化ドメインが、ＳＶ４０核局在化シグナルを含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１０の方法であって、
前記の１つまたは複数の細胞内局在化ドメインが、ｈｎＲＮＰＡ１の酸性Ｍ９ドメインを含む、
方法。
【請求項１３】
請求項１０の方法であって、
前記の１つまたは複数の細胞内局在化ドメインが、ＰＹ−ＮＬＳモチーフシグナルを含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１０の方法であって、
前記の１つまたは複数の細胞内局在化ドメインが、ミトコンドリア標的化シグナルを含む、
方法。
【請求項１５】
請求項１０の方法であって、
前記の１つまたは複数の細胞内局在化ドメインが、葉緑体標的化シグナルを含む、
方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼが、１つまたは複数の細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）をさらに含む、
方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、
前記の１つまたは複数のＣＰＰが、トランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）ペプチドを含む、
方法。
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、
前記の１つまたは複数のＣＰＰが、Ｐｅｐ−１  ＣＰＰドメインを含む、
方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項の方法であって、
前記の配列特異的なヌクレアーゼタンパク質は、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のプラスミドとともに共トランスフェクトされる、
方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、
前記の１つまたは複数のエキソヌクレアーゼは、ＴＲＥＸ２のようなＴＲＥＸエキソヌクレアーゼファミリーのメンバーを含む、
方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項の方法であって、
前記の改変される内因性遺伝子は、ＡＬＳ１またはＡＬＳ２のようなアセト乳酸シンターゼ遺伝子である、
方法。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれか一項の方法であって、
前記の改変される内因性遺伝子は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）液胞インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）のような液胞インベルターゼ遺伝子である、
方法。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項の方法であって、
前記植物細胞は、アルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、綿、亜麻、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライ麦、ベニバナ、モロコシ、大豆、ヒマワリ、タバコ、小麦の農作物種由来である、
方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、
前記植物細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属由来である、
方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法であって、
前記の種は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａである、
方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項の方法であって、
トランスフェクションは、前記の配列特異的なヌクレアーゼの、分離された植物プロトプラストへの送達を通して達成される、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
前記送達は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が仲介するトランスフェクションを含む、
方法。
【請求項２８】
請求項２６の方法であって、
前記送達は、エレクトロポレーションを含む、
方法。
【請求項２９】
請求項２６の方法であって、
前記送達は、微粒子銃が仲介するトランスフェクションを含む、
方法。
【請求項３０】
請求項２６の方法であって、
前記送達は、超音波処理が仲介するトランスフェクションを含む、
方法。
【請求項３１】
請求項２６の方法であって、
前記送達は、リポソームが仲介するトランスフェクションを含む、
方法。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか一項の方法により取得可能な、
形質転換された植物細胞。
【請求項３３】
請求項３２の植物細胞を含む、
形質転換された植物。
【請求項３４】
外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のためのキットであって、
前記キットは：
（ｉ）タンパク質またはｍＲＮＡの形での、１つまたは複数の配列特異的なヌクレアーゼ；
（ｉｉ）１つまたは複数の植物プロトプラストまたは培養された植物細胞全体；
および場合により、
（ｉｉｉ）１つまたは複数のエキソヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のＤＮＡプラスミドベクター、
を含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年６月１４日に出願された米国仮出願番号６１／８３５，３０７からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
［技術分野］
本願は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、非トランスジェニック方法を用いてゲノム操作植物を作製するための材料および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
増大した乾燥耐性および作物収量のような望ましい形質を植物種に導入するために、伝統的な植物育種ストラテジーが多くの年月にわたって開発されてきた。そのようなストラテジーは、それらは典型的に多くの連続する何回もの交配を必要とし、したがって、うまく特定の植物形質を変えるためには多くの年月がかかる可能性があるという欠点がある。トランスジェニック技術の出現によって、トランスジーン構築物を導入することによるゲノム変化を用いて植物を操作して、伝統的な植物育種の必要性を避けることが可能になった。しかしながら、これらのトランスジェニック技術もまた、いくつかの欠点があった。第一に、ゲノムへのトランスジーンの挿入（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにより仲介される）は非常にランダムであり、そして、多様な挿入をもたらす可能性があり、それは、分離中に、異なる染色体上に存在する多様なトランスジーンの追跡に困難性をもたらす可能性がある。さらに、トランスジーンの発現は、その染色体環境に起因して予測不可能である場合があり、多くの場合、トランスジーンの発現はサイレンシングされる。加えて、トランスジェニック植物の生産は、そのような変種の作製に反対することの多い世論により−特に、問題となっている変種が、広い地理的地域にわたって生育されて人が消費する食物として用いられる作物植物である場合に、非常に議論の的になるトピックであることが証明されている。
【０００４】
植物ゲノムの標的化した改変を可能にする方法は、これらの問題の最初の２つを克服し得て、遺伝子発現に資する単一の染色体部位に対してトランスジーンの挿入を標的化することを可能にさせ、したがって、多様なトランスジーンの挿入およびサイレンシングイベントの可能性を低減または排除する。標的化したゲノム改変は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて多くの種において示されていて、それは、予め選択された遺伝子座での二本鎖ＤＮＡ切断点の作製、および、その後のトランスジーンの挿入を、標的化した様式で可能にする（Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。この技術のバリエーションは、ＺＦＮを単純に用いて選択された遺伝子座での切断点を作製し、それから、ＮＨＥＪ（非相同末端結合）によるＤＮＡ修復を可能にすることである。このプロセス中に、新しく加わった領域内にエラーが取り込まれることが多く（例えば、ヌクレオチド欠失）、この方法は、選択された植物遺伝子の標的化した突然変異誘発、および、トランスジーン構築物の挿入を、可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物遺伝子操作における上述の利点は、操作された植物種の生産および広範囲の生育に関する社会不安を必ずしも和らげない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、この問題に対する解決は、伝統的なトランスジェニックストラテジーを使用せずに、標的化した方法で、植物ゲノムを正確に変えることができる方法である。本明細書における開示は、そのような解決を、標的化した植物ゲノムの非トランスジェニック編集に関する方法を提供することにより提供する。その方法は、より具体的には、タンパク質またはｍＲＮＡの形での、配列特異的なヌクレアーゼの植物細胞への導入に依存し、それは核へ移行し、所定の遺伝子座でＤＮＡを正確に切断するために作用する。切断の修復中に生じるエラーは、ゲノム中にいかなる外因性の遺伝物質も導入せずに、機能喪失（または機能獲得）の変異の導入を可能にする。
【０００７】
このように、残留する外因性の遺伝物質を含まない、遺伝子改変された植物種を生産することができる。
【０００８】
本明細書に記載の方法の開発の前は、植物細胞の遺伝子改変は、ヌクレアーゼまたはＤＮＡ修飾酵素のインビボでの発現のための、トランスジーンカセットの安定したゲノム組み込みが必要であった。そのような組み込みは典型的に、アグロバクテリウムが仲介する植物種の形質転換を通して達成された。しかしながら本明細書に記載のように、一貫した、および再現可能なゲノム改変は、植物細胞への、精製されたヌクレアーゼタンパク質またはそのようなヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡのいずれかの導入を通して達成することができる。組み換えヌクレアーゼまたは精製されたｍＲＮＡは、植物染色体またはオルガネラＤＮＡに対して重大な作用を有するのに十分に活性であるとは考えられていなかったため、これは予測されない効果である。さらに、本願は、ゲノム改変のための新規のプロトコルを提供し、およびまた、本明細書に記載の方法を実施するのに適切な、および、外因性のＤＮＡを導入せずに、改変された植物細胞を生産するのに適切な、配列およびベクターも提供する。
【０００９】
本願は、非トランスジェニックストラテジーを用いて、植物ゲノムを編集するための方法を記載する。配列特異的なヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−関連システム［Ｃａｓ９］を含む）は、精製されたヌクレアーゼタンパク質の形態で、またはヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡとして、植物細胞に導入される。ＣＲＩＳＰＲ−関連システム［Ｃａｓ９］の場合は、ヌクレアーゼは、標的部位認識のためのガイドＲＮＡとともに、ｍＲＮＡまたは精製されたタンパク質としてのいずれかで導入することができる。
【００１０】
機能性ヌクレアーゼは、特定の配列を標的とし、所定の遺伝子座で細胞ＤＮＡを切断する。ＤＮＡ損傷は、植物細胞が二本鎖切断を修復するのを引き起こさせる。誤り（例えば、点変異または小さな挿入／欠失）がＤＮＡ修復中に生じ、その結果、インビボでＤＮＡ配列を変える。
【００１１】
従来のＤＮＡ形質転換と異なり、本明細書に記載のタンパク質またはＲＮＡに基づくゲノム編集ストラテジーは、標的の核酸配列を特異的に改変し、その後に足跡を残さない。これらの方法では外来ＤＮＡを用いないので、このプロセスは、非トランスジェニックの植物ゲノム編集であると考えられる。
【００１２】
一態様では、本願は、外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のための方法を特徴とする。その方法は、（ｉ）改変される内因性遺伝子を含む植物細胞を提供するステップ、（ｉｉ）配列認識ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む配列特異的なヌクレアーゼを取得するステップ；（ｉｉｉ）配列特異的なヌクレアーゼを用いて植物細胞をトランスフェクトするステップ、および（ｉｖ）植物ゲノム中にいかなる外因性の遺伝物質も存在せずに、検出可能な標的化したゲノム改変を有する植物細胞（１または複数）を生産するために、ゲノムにおいて１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導するステップを、含むことができる。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復することができる。
【００１３】
配列特異的なヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであってよい。配列特異的なヌクレアーゼは、精製されたタンパク質の形態で、または、精製されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の形態で、植物細胞に送達することができる。
【００１４】
配列特異的なヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞内局在化ドメインをさらに含むことができる。１つまたは複数の細胞内局在化ドメインは、ＳＶ４０核局在化シグナル、ｈｎＲＮＰＡ１の酸性Ｍ９ドメイン、ＰＹ−ＮＬＳモチーフシグナル、ミトコンドリア標的化シグナル、または、葉緑体標的化シグナルを含んでよい。配列特異的なヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）をさらに含んでよい。１つまたは複数のＣＰＰは、トランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）ペプチドまたはＰｅｐ−１  ＣＰＰドメインを含んでよい。
【００１５】
配列特異的なヌクレアーゼは、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のプラスミドとともに共トランスフェクトすることができる。１つまたは複数のエキソヌクレアーゼは、ＴＲＥＸエキソヌクレアーゼファミリー（例えば、ＴＲＥＸ２）のメンバーを含んでよい。
【００１６】
改変される内因性遺伝子は、アセト乳酸シンターゼ遺伝子（例えば、ＡＬＳ１またはＡＬＳ２）、または液胞インベルターゼ遺伝子（例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）液胞インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）であってよい。
【００１７】
植物細胞は、アルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、綿、亜麻、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライ麦、ベニバナ、モロコシ、大豆、ヒマワリ、タバコ、小麦の農作物種由来であってよい。植物細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属由来、または、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ種由来であってよい。
【００１８】
トランスフェクションは、分離された植物プロトプラストへの配列特異的なヌクレアーゼの送達を通して達成することができる。例えば、トランスフェクションは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が仲介するトランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃が仲介するトランスフェクション、超音波処理が仲介するトランスフェクション、または、リポソームが仲介するトランスフェクションを用いて、分離された植物プロトプラストへの配列特異的なヌクレアーゼの送達により達成することができる。
【００１９】
ゲノムにおける１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断の導入は、相同組み換えメカニズムを通した切断（１または複数）の修復が後に続くことができる。
【００２０】
また、本願は、本明細書において提供される方法により得ることのできる形質転換された植物細胞、および、その植物細胞を含む形質転換された植物も特徴とする。
【００２１】
別の態様では、本願は、外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のためのキットを特徴とする。当該キットは、（ｉ）タンパク質またはｍＲＮＡの形での１つまたは複数の配列特異的なヌクレアーゼ、（ｉｉ）１つまたは複数の植物プロトプラストまたは培養された植物細胞全体、および場合により（ｉｉｉ）１つまたは複数のエキソヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のＤＮＡプラスミドベクターを含んでよい。
【００２２】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者の一人により一般に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる説明であり、制限を意図しない。
【００２３】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細を、添付の図面および以下の説明に示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ゲノム操作に用いた配列特異的なヌクレアーゼの構造構成を示す略図である。ヌクレアーゼは、細胞透過性、細胞内タンパク質局在化、ＤＮＡ配列認識、およびＤＮＡ切断を可能にする役割を果たすドメインを含む。
【図２】Ｅ．ｃｏｌｉで生産される転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（商標））のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。ＡＬＳ２Ｔ１ＬおよびＡＬＳ２Ｔ１Ｒは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ２遺伝子内の部位を標的とするＴＡＬＥＮ（商標）である。ＶＩｎｖ７は、ジャガイモＶＩｎｖ遺伝子を標的とする、コンパクトＴＡＬＥＮ（商標）（ｃＴ）である。
【図３】Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ２遺伝子を標的とする、精製されたＴＡＬＥＮ（商標）のインビトロ活性を示すアガロースゲルの写真である。ＡＬＳ２Ｔ１  ＴＡＬＥＮ（商標）に関する標的部位を含むＰＣＲ産物が生産された。ＰＣＲ産物を、精製されたＡＬＳ２Ｔ１ＬおよびＡＬＳ２Ｔ１Ｒタンパク質の不存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。ＰＣＲ産物は２つのタンパク質の存在下でのみ切断された。ネガティブコントロールとして、精製されたＡＬＳ２Ｔ１ＬおよびＡＬＳ２Ｔ１Ｒタンパク質を、ＡＬＳ１遺伝子由来のＰＣＲ産物とともにインキュベートした；切断は観察されなかった。
【図４】タンパク質として植物細胞に送達された場合の、エピソーム標的に対するＩ−ＳｃｅＩの活性を示す表である。
【図５】タンパク質単独として、またはＴｒｅＸと組み合わせて、植物細胞に送達された場合の、染色体部位に対するＩ−ＳｃｅＩ活性の活性を示す表である。この分析に用いた４５４のシーケンシングリード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ）の全数における数を、カラム２中の括弧内に示す。
【図６】組み込まれたＩ−ＳｃｅＩ認識部位を含むトランスジェニックＮ．ｔａｂａｃｕｍ株において、Ｉ−ＳｃｅＩにより誘導された変異の例を示す配列アライメントである。一番上の列（配列番号８）は、Ｉ−ＳｃｅＩに関する認識部位のＤＮＡ配列を示す（下線）。他の配列（配列番号９〜１８）は、不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により誘導された代表的な変異を示す。
【図７】異なる形態（ＤＮＡまたはタンパク質）または処置の組み合わせで植物細胞へ形質転換した後の、ＴＡＬＥＮ（商標）ＡＬＳ２Ｔ１突然変異誘発の活性を要約するグラフである。
【図８】Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ２遺伝子において、ＴＡＬＥＮ（商標）ＡＬＳ２Ｔ１により誘導された変異の例を示す配列アライメントである。一番上の列（配列番号１９）は、ＡＬＳ２Ｔ１に関する認識部位のＤＮＡ配列を示す（下線）。他の配列（配列番号２０〜３１）は、不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により誘導された代表的な変異を示す。
【図９】インビトロのｍＲＮＡ生産に用いられる配列特異的なヌクレアーゼの構造構成を示す略図である。ヌクレアーゼ構築物は、Ｔ７プロモーター、ヌクレアーゼＯＲＦ、および、１２１ｂｐのポリＡテールを含む。
【図１０】ＹＦＰに基づくＳＳＡアッセイにおける、植物プロトプラストに送達されたＩ−ＣｒｅＩ  ｍＲＮＡの切断活性をプロットするグラフである。ｐ３５Ｓ−Ｉ−ＣｒｅＩまたはＩ−ＣｒｅＩ  ｍＲＮＡとともに、ＳＳＡ標的プラスミドが、ＰＥＧが仲介する形質転換を介してタバコプロトプラストに共送達された。形質転換の２４時間後、プロトプラストをフローサイトメトリーに供して、ＹＦＰ陽性細胞の数を定量した。
【図１１】Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＸｙｌＴ＿Ｔ０４  ＴＡＬＥＮ（商標）の標的配列（配列番号３２）である。
【図１２】タバコプロトプラストへのＸｙｌ＿Ｔ０４  ＴＡＬＥＮ（商標）  ｍＲＮＡの送達に関する４５４のピロシーケンスデータを要約する表である。カラム３中の括弧内の数は、得られたシーケンシングリードの全数である＊：ＮＨＥＪ突然変異誘発の頻度は、プロトプラストの形質転換の効率に対して、ＮＨＥＪ変異を有する４５４のリードの割合を標準化することにより得られた。この分析に用いた４５４のシーケンシングリードの全数を括弧内に示す。＊＊：ネガティブコントロールは、ＹＦＰをコードするプラスミドによってのみ形質転換されたプロトプラストから得られた。
【図１３】Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて、ＸｙｌＴ１（配列番号３３〜４３）およびＸｙｌＴ２（配列番号４４〜５４）遺伝子でＸｙｌＴ＿Ｔ０４  ｍＲＮＡにより誘導された変異の例を示す配列アライメントである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願は、非トランスジェニックの植物材料を生産するための、植物ゲノムを編集する新規のストラテジーを提供する。本明細書において提供される方法は、植物ゲノムの任意の部位における特定の配列を認識するように設計されたヌクレアーゼを用いて行われる。
【００２６】
一態様では、本願は、以下のステップの１または数個を含む、外因性の遺伝物質を挿入しない、植物ゲノムの標的化した遺伝子改変のための方法に関する：
ｉ）改変される内因性遺伝子を含む植物細胞を提供するステップ；
ｉｉ）配列認識ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む、配列特異的なヌクレアーゼを取得するステップ；
ｉｉｉ）前記の配列特異的なヌクレアーゼを用いた、植物細胞の形質転換、および
ｉｖ）ゲノムにおける１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断の導入；
【００２７】
この方法は、好ましくは植物ゲノム中にいかなる外因性の遺伝物質も存在せずに、検出可能な標的化したゲノム改変を有する植物細胞（１または複数）を生産することを目的とする。
【００２８】
ゲノムにおける二本鎖切断の導入は、一般に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による切断の修復をもたらし、それは、その方法により得られる植物細胞のゲノム中に、ゲノム配列の欠失、修正または挿入を好む。
【００２９】
ヌクレアーゼに関するコード配列が合成されて発現ベクターにクローン化された後に、ヌクレアーゼタンパク質またはｍＲＮＡが生産および精製される。有効性を改善するために、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を添加して、小分子（薬剤）、タンパク質および核酸に関する細胞膜透過性を改善することができる（Ｍａｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，２００６；ＵＳ２０１２／０１３５０２１，ＵＳ２０１１／０１７７５５７，ＵＳ７，２６２，２６７）。細胞内局在化ペプチドを添加して、細胞内のタンパク質輸送を、特に核へ向かわせることもできる（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；ＵＳ２００５００４２６０３）。
【００３０】
一部の実施態様では，エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、例えば、Ｔｒｅｘ（ＷＯ２０１２／０５８４５８）および／またはＴｄｔ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）（ＷＯ２０１２／１３７１７）などが、配列特異的なヌクレアーゼにより誘導される突然変異誘発の効率を増大させるために、植物細胞へ共送達される。Ｔｒｅｘ２（配列番号６）は、本明細書に記載の突然変異誘発を増大することにより、特に効果的であることが示されている。単一のポリペプチド鎖（配列番号７）として発現されるＴｒｅｘ２の使用は、さらにより効果的であった。
【００３１】
精製されたヌクレアーゼは、様々な手段により植物細胞へ送達される。例えば、微粒子銃の粒子送達システムを用いて植物組織を形質転換してよい。標準的なＰＥＧおよび／またはエレクトロポレーション方法を、プロトプラスト形質転換に用いることができる。形質転換後に、細胞分裂、分化および再生を可能にするために植物組織／細胞を培養する。個々のイベント由来のＤＮＡを分離して、変異に関してスクリーニングすることができる。
【００３２】
一部の実施態様では、配列特異的なヌクレアーゼは、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）である。ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼと同様の機能を有する限り、任意のタイプの配列特異的なヌクレアーゼを用いて本明細書で提供される方法を行ない得ることも予想される。したがって、１つまたは複数の標的化した遺伝子座で、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することが可能であるはずであり、１つまたは複数の標的化した変異をその遺伝子座（１または複数）で生じさせ、そこでＮＨＥＪまたは他のメカニズムによる、切断の誤った修復を通して変異が生じる（Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。そのような配列特異的なヌクレアーゼは、限定されないが、ＺＦＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｒｅＩ、制限エンドヌクレアーゼおよび他のホーミングエンドヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ（商標）を含む。特定の実施態様では、用いられるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−関連のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９（Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を含む。
【００３３】
送達される配列特異的なヌクレアーゼは、精製されたヌクレアーゼタンパク質の形態、または、トランスフェクション後にタンパク質に翻訳され得るｍＲＮＡ分子の形態のいずれかであってよい。ヌクレアーゼタンパク質は、利用可能なタンパク質発現ベクター、例えば、制限されないが、ｐＱＥまたはｐＥＴを用いて、当業者に公知の多くの方法により調製され得る。適切なベクターは、様々な細胞型（Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫、哺乳類）でのヌクレアーゼタンパク質の発現およびその後の精製を可能にする。ｍＲＮＡの形態でのヌクレアーゼの合成は、例えば、細胞中へのトランスフェクションのためのキャップ化ＲＮＡの生産を可能にするＴ７ベクター（ｐＳＦ−Ｔ７）の使用を通して、当業者に公知の様々な方法により行なってもよい。
【００３４】
一部の実施態様では、ｍＲＮＡは、最適な５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非翻訳領域で改変される。ＵＴＲは、局在化、安定性および翻訳効率の調節を介して、遺伝子発現の翻訳後の制御において極めて重要な役割を果たすことが示されている（Ｂａｓｈｉｒｕｌｌａｈ，２００１）。上記のとおり、ｍＲＮＡ送達は、その非トランスジェニックの特質に起因して望ましいが、ｍＲＮＡは非常に壊れやすい分子であり、植物の形質転換プロセス中に分解されやすい。植物のｍＲＮＡ形質転換でのＵＴＲの利用は、ｍＲＮＡ分子の増大した安定性および局在化を可能にし、非トランスジェニックゲノム改変に関する増大した形質転換効率を与える。
【００３５】
一部の実施態様では、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヌクレアーゼは、細胞内での（特に核への）ヌクレアーゼタンパク質の効率的なトラフィッキングを可能にするための、１つまたは複数の細胞内局在化ドメインを含む（Ｇａｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；ＵＳ２００５／００４２６０３）。そのような局在化シグナルは、制限されないが、ＳＶ４０核局在化シグナル（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を含んでよい。また、他の非古典的なタイプの核局在化シグナルを、本明細書で提供される方法での使用に適用してもよい（例えば、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメインまたはＰＹ−ＮＬＳモチーフシグナル（Ｄｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。また、ミトコンドリアまたは葉緑体のような他の細胞内区画へのヌクレアーゼのトラフィッキングを可能にするために、局在化シグナルを取り込んでもよい。用いる特定のミトコンドリアおよび葉緑体のシグナルに関する説明は、非常に多くの刊行物に見ることができ（Ｂｈｕｓｈａｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照）、これらのシグナルを含むようにヌクレアーゼなどのタンパク質を改変する技術は、当業者に公知である。
【００３６】
一部の実施態様では、ヌクレアーゼは、細胞−透過性ペプチド領域（ＣＰＰ）を含み、細胞膜を通したタンパク質のより簡単な送達を可能にする（Ｍａｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，２００６；ＵＳ  ２０１２／０１３５０２１，ＵＳ２０１１／０１７７５５７，ＵＳ  ７，２６２，２６７）。そのようなＣＰＰ領域は、限定されないが、トランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）細胞透過性ペプチド（Ｌａｋｓｈｍａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を含む。植物細胞へのタンパク質の送達での補助に特に適切なＰｅｐ−１  ＣＰＰ領域を含む、他のＣＰＰもまた用いられ得ることが予想される（Ｃｈｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９を参照）。
【００３７】
一部の実施態様では、１つまたは複数の変異は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子ＡＬＳ１またはＡＬＳ２のうちの１つのコード配列内に生じ、または１つまたは複数の変異は、液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）遺伝子内に生じる。これらの実施態様のさらなる態様では、変異は、所定の遺伝子座において、非機能的な、または機能的に低減したコード配列を生じさせる、任意のトランジションまたはトランスバージョンであってよい。１つまたは複数の変異が、本明細書に記載の方法を用いて、任意の特定のゲノムの遺伝子座で生じ得ることが一般に予想される。
【００３８】
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法で用いられる植物種は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａであるが、さらなる態様では、植物種は、任意の単子葉植物または双子葉植物、例えば（制限されずに）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ；農作物（例えば、アルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、綿、亜麻、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライ麦、ベニバナ、モロコシ、大豆、ヒマワリ、タバコ、および小麦）；野菜作物（例えば、アスパラガス、ビート、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、ピーマン、ジャガイモ、パンプキン、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ、タロイモ、トマト、およびズッキーニ）；果物および木の実の穀物（例えば、アーモンド、リンゴ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、チェリー、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、フェイジョア、ハシバミ、グレープ、グレープフルーツ、グアバ、キウイ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、ピーチ、ピーナッツ、洋ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、ストロベリー、タンジェリン、クルミ、および、スイカ）；および、観葉植物（例えば、ハンの木、セイヨウトネリコ、アスペン、ツツジ、カバノキ、ツゲの木、ツバキ、カーネーション、キク、ニレの木、モミ、ツタ、ジャスミン、ジュニパー、オーク、ヤシ、ポプラ、マツ、セコイア、シャクナゲ、バラ、および、ゴム）であってよい。
【００３９】
一部の実施態様では、タンパク質またはヌクレアーゼ構築物をコードするｍＲＮＡは、分離されたプロトプラストの、ＰＥＧが仲介する形質転換を介して、植物細胞に送達される。ＰＥＧは典型的に、トランスフェクトされるｍＲＮＡまたはタンパク質懸濁液の半分から等量の範囲で用いられ、この目的においてＰＥＧ４０％が主に用いられる。
【００４０】
ある場合には、ヌクレアーゼは、微粒子銃の形質転換方法を介して、または当技術分野で公知の任意の他の適切なトランスフェクション方法を通して送達してよい（Ｙｏｏｅｔａｌ、２００７）。微粒子銃の形質転換の場合、ヌクレアーゼは、植物の細胞壁および膜を貫通するのに十分な３００〜６００ｍ／ｓのスピードまで微粒子発射（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を加速する微粒子銃デバイスを用いて、植物組織に導入することができる（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２を参照）。タンパク質またはＲＮＡを植物に導入する別の方法は、標的細胞の超音波処理を介する。
【００４１】
あるいは、リポソームまたはスフェロプラスト融合を用いて、外因性の物質を植物へ導入してよい（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７を参照）。プロトプラストおよび細胞と組織全体のエレクトロポレーションも記載されている（Ｌａｕｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００４２】
トランスフェクションに用いられる方法およびその効率に応じて、本発明者らは、本明細書に記載の方法を行なう（特にＴＡＬＥＮ（商標）を用いる）ための最適なタンパク質濃度は０．０１〜０．１μｇ／μｌであると決定した。ＰＥＧを用いる場合は、タンパク質懸濁液の容量は、一般に、２〜２０μｌであった。ＲＮＡ濃度は、１〜５μｇ／μｌの範囲で最適であることが分かり、ＲＮＡバルクを増大させるために、非コードＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ担体）を１０μｇ／μｌまで添加することが時に有利となり得ると考えられた。このＲＮＡの後の添加は、トランスフェクションを改善し、植物細胞において直面する分解酵素に関して、ヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対する保護効果を有する。
【００４３】
本明細書に記載の任意の方法により生産される植物細胞を再生することにより、植物を得ることができる。内因性遺伝子の機能が、標的ＤＮＡ部位に非サイレント変異が導入された植物細胞において抑制される場合は、そのような植物細胞から再生される植物の表現型は、内因性遺伝子の機能の抑制と関連して変化し得る。したがって、本明細書に記載の方法は、植物の育成を効率的に行うことを可能にさせる。植物細胞からの植物の再生は、当業者に公知の方法により行うことができ、それは植物細胞の種類に依存する。その例は、イネ品種の形質転換に関してＣｈｒｉｓｔｏｕら（１９９７）に記載される方法を含む。
【００４４】
一部の実施態様では、ヌクレアーゼは、配列特異的なヌクレアーゼにより誘導される突然変異誘発の効率を増大させるために、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼタンパク質をコードするプラスミドとともに共送達することができる。そのようなエキソヌクレアーゼは、限定されないが、エキソヌクレアーゼのＴｒｅｘファミリーのメンバー（治療用の赤血球交換エキソヌクレアーゼ）、例えば、ＴＲＥＸ２（Ｓｈｅｖｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を含む。本発明者らは、驚くべきことに、ＴＲＥＸのようなエキソヌクレアーゼの、精製されたＩ−ＳｃｅＩタンパク質との共送達は、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質単独の送達と比較して、観察されるＮＨＥＪイベントの頻度を増大させることを見いだした。他の適切なエキソヌクレアーゼも本明細書において提供される方法で使用してよいことに、注意すべきである。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的のためにアラインされ得る各配列における位置を比較することにより判定される。比較される配列内の位置が同一の塩基で占められる場合、その分子はその位置で同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置における同一または合致するヌクレオチドの数の関数である。アライメントのアルゴリズムおよびプログラムを用いて、２つの配列の間の同一性を計算する。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴが、ＧＣＧ配列分析パッケージの一部として利用可能であり（ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、初期設定で用いられる。また、類似性マトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ８０を用いて、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために、ＢＬＡＳＴＰを用いてもよい。別段の指示がない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰを用いる場合、類似性のパーセントはＢＬＡＳＴＰの正スコアに基づき、配列同一性のパーセントはＢＬＡＳＴＰの同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコア配列ペア内の合計残基の数および割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示し；そして、ＢＬＡＳＴＰの「正」は、アライメントスコアが正の値を有し、互いに類似する、残基の数および割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対して、これらの程度の同一性または類似性、または、任意の中間の程度の類似性の同一性を有するアミノ酸配列は、本開示により検討および包含される。同じことが、ＢＬＡＳＴＮを用いてポリヌクレオチド配列に関して当てはまる。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「相同」は、別の配列に対して十分な同一性を有して配列間で相同組み換えを生じる配列を意味することが意図され、より具体的には、少なくとも９５％同一性（例えば、少なくとも９７％同一性、または少なくとも９９％同一性）を有する。
【００４７】
本明細書において用いられる用語「エンドヌクレアーゼ」は、高度に特異的な位置でＤＮＡ分子において二本鎖切断をもたらすことが可能な酵素を指す。
【００４８】
本明細書で定義される用語「エキソヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖の末端（エキソ）から１つずつヌクレオチドを切断することにより働く酵素を指し、３’または５’のいずれかでホスホジエステル結合を切断する加水分解反応を生じさせる。
【００４９】
本明細書において用いられる用語「配列特異的なヌクレアーゼ」は、所望および所定のゲノムの遺伝子座で二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することが可能な、任意のヌクレアーゼ酵素を指す。
【００５０】
本明細書において用いられる用語「メガヌクレアーゼ」は、典型的に、約１２〜４０ｂｐ、より好ましくは１４〜４０ｂｐの長さのポリヌクレオチド認識部位を有する、天然または操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）レアカットのエンドヌクレアーゼを指す。典型的なメガヌクレアーゼは、それらの認識部位の内側で切断をもたらし、３’ＯＨ突出を有する４ｎｔのスタガードカットを生じる。メガヌクレアーゼは、好ましくは、ホーミングエンドヌクレアーゼであり、より具体的には、ドデカペプチドファミリー（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ；配列番号５５）（ＷＯ２００４／０６７７３６）に属し、ＴＡＬ−エフェクター様エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または、モジュラー塩基対塩基結合性ドメイン（ＭＢＢＢＤ）に融合された任意のヌクレアーゼ−すなわち、所定の核酸標的配列に結合すること、および、それに隣接する配列での切断を誘導することが可能なエンドヌクレアーゼである。これらのメガヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断を誘導するのに有用であり、それにより、ゲノム配列の標的化した操作および部位特異的な相同組み換えを促進する。
【００５１】
本明細書において用いられる用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を、細胞または細胞区画へ移行することが可能な核酸分子を指す。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することにより生産される人工の制限酵素を指す。簡単に言うと、ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合された、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む、合成のタンパク質である。ＺＦＮを用いて特定のＤＮＡ配列での二本鎖切断を誘導し得て、それにより、ゲノム配列の標的化した操作および部位特異的な相同組み換えを促進する。
【００５３】
本明細書において用いられる用語「ＴＡＬ−エフェクターエンドヌクレアーゼ」は、ＷＯ２０１１／０７２２４６においてＶｏｙｔａｓおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅにより記載されるように、キサントモナスのＴＡＬＥタンパク質由来のＤＮＡ認識ドメインを、ヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することにより生産される、人工の制限酵素を指す。ＴＡＬ−エフェクターエンドヌクレアーゼは、本出願人によりＴＡＬＥＮ（商標）と命名される（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，８  ｒｕｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｏｉｘ  Ｊａｒｒｙ，７５０１３  ＰＡＲＩＳ）。
【００５４】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、それは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：タンパク質発現のための、配列特異的なヌクレアーゼの設計および構築。
配列特異的なヌクレアーゼは、典型的に、以下の構成要素を含む（図１）：
１．植物ゲノム内の特定のＤＮＡ配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン。
２．植物ゲノム内の認識部位でＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼドメイン。非相同末端結合を通した、切断の不正確な修復が、切断部位に変異を導入する。
３．ヌクレアーゼを、核、ミトコンドリアまたは葉緑体へ向かわせる、細胞内局在化シグナル。
４．形質転換中に、配列特異的なヌクレアーゼが細胞膜を貫通するのを助ける、細胞透過性モチーフ。
【００５６】
カスタムのヌクレアーゼをコードする配列を合成して、タンパク質発現ベクター、例えばｐＱＥまたはｐＥＴにクローン化してよい。したがって、機能性タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内に発現することができ、標準的なプロトコルまたは市販キットを用いて精製することができる。あるいは、酵母、昆虫または哺乳類の細胞を含む他のタンパク質発現システムを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現および精製が困難なタンパク質を生産することができる。
【００５７】
ここでは、ｐＱＥ−８０Ｌ−Ｋａｎをタンパク質発現ベクターとして用いた。ＳＶ４０核局在化シグナルを、Ｔａｔ細胞透過性ペプチドと同様に添加した（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，１９８８，Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。配列特異的なヌクレアーゼは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ２遺伝子内の部位を標的化するＴＡＬＥＮ（商標）ペアを含んだ。加えて、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおけるＶＩｎｖ７遺伝子内の部位を標的化するコンパクトＴＡＬＥＮ（商標）も用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を、タンパク質発現に用いた（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎキットを、タンパク質の精製に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、全ての３つのＴＡＬＥＮ（商標）に関して、高収率の組み換えタンパク質が得られた（図２）。組み換えＴＡＬＥＮ（商標）を生産するためのプラスミドは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（８，ｒｕｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｏｉｘ  Ｊａｒｒｙ，７５０１３  ＰＡＲＩＳ）により提供された。
【００５８】
実施例２：精製されたＴＡＬＥＮ（商標）の、インビトロの配列特異的なヌクレアーゼ活性。
精製されたＴＡＬＥＮ（商標）の酵素活性を試験するために、等量のＡＬＳ２Ｔ１Ｌ（配列番号２）およびＡＬＳ２Ｔ１Ｒ（配列番号３）タンパク質を混合して、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ２遺伝子に由来するＰＣＲフラグメントとともにインキュベートした（ＰＣＲ産物はＴＡＬＥＮ認識部位を有する）。反応は２５℃で行ない、以下のバッファー系を有した：１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．９。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡＬＳ１遺伝子由来のＰＣＲフラグメント（ＴＡＬＥＮ認識部位を欠く）をネガティブコントロールとして用いた。２つのＴＡＬＥＮは、インビトロでＡＬＳ２遺伝子フラグメントを明らかに切断した；ＡＬＳ１フラグメントでは活性は見られなかった（図３）。データは、精製されたＴＡＬＥＮ（商標）が、配列特異的なヌクレアーゼ活性を有することを示す。
【００５９】
実施例３：タンパク質としての、植物細胞への配列特異的なヌクレアーゼの送達。
酵素Ｉ−ＳｃｅＩをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、製造会社から供給されたバッファーを除去するために透析した。手短に言うと、２０μｌ（１００Ｕ）のＩ−ＳｃｅＩを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの０．０２５μｍのＶＳＷＰフィルター（カタログ番号ＶＳＷＰ０２５００）上に置いた。フィルターを、ＭＭＧバッファー（０．４Ｍ  マンニトール、４ｍＭ  ＭＥＳ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．８）の上に、４℃で１時間浮かべた。酵素溶液がＭＭＧバッファーにより完全に平衡化された後、それを新しいチューブに移して、さらなる使用まで氷上で維持した。ＰＥＧが仲介するプロトプラスト形質転換により、タンパク質を植物細胞に送達した。タバコプロトプラストの調製方法は以前に記載したとおりであった（Ｚｈａｎｇら  ２０１３）。手短に言うと、組み込まれたＩ−ＳｃｅＩ認識部位を有するトランスジェニックのタバコ株由来の種子を、湿らせたバーミキュライトに植えて、低光条件下で３〜５週培養した（Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。若い、完全に広がった葉を集めて、表面を殺菌して、プロトプラストを分離した。
【００６０】
精製されたＩ−ＳｃｅＩタンパク質を、他に記載される、ＰＥＧが仲介する形質転換（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１５６５−１５７２，２００７）により、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプロトプラストへ導入した。手短に言うと、２０〜２００ＵのＩ−ＳｃｅＩタンパク質を、室温で、２００，０００のプロトプラストと、２００μｌの０．４Ｍマンニトール、４ｍＭ  ＭＥＳ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．８中で混合した。他の処理は、Ｉ−ＳｃｅＩをコードするＤＮＡ（配列番号１）、Ｔｒｅｘ２タンパク質をコードするＤＮＡ、または両方を用いて、プロトプラストを形質転換することを含んだ。Ｔｒｅｘ２は、ＮＨＥＪによる不正確なＤＮＡ修復の頻度を増大させるエンドヌクレアーゼである（Ｃｅｒｔｏら  ２０１２）。加えて、一部のサンプルでは、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、Ｔｒｅｘ２をコードするＤＮＡ（配列番号６）とともに共送達した。形質転換後に、等量の４０％ＰＥＧ−４０００、０．２Ｍマンニトール、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．８をプロトプラストに添加して、直ちによく混合した。０．４５Ｍのマンニトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２で１回洗浄する前に、混合物を暗所で３０分インキュベートした。それから、長期培養のために、ペトリ皿中の１ｍｌのＫ３Ｇ１に細胞を移す前に、プロトプラストをＫ３Ｇ１培地で２回洗浄した。
【００６１】
実施例４：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおける、エピソーム標的部位に対するＩ−ＳｃｅＩの活性。
植物細胞において、エピソーム部位を標的化するＩ−ＳｃｅＩのタンパク質活性を評価するために、ＳＳＡ構築物を、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質と共送達した。このアッセイのために、標的プラスミドを、非機能性ＹＦＰレポーター遺伝子内にクローン化されたＩ−Ｓｃｅ認識部位とともに構築した。レポーター遺伝子がＩ−Ｓｃｅにより切断された場合に、組み換えがダイレクトリピート間で生じて、機能がＹＦＰ遺伝子に復元するように、標的部位の横にＹＦＰコード配列のダイレクトリピートを置いた。したがって、ＹＦＰの発現は、Ｉ−ＳｃｅＩ切断活性の尺度としての役割を果たした。
【００６２】
エピソーム標的配列に対するＩ−ＳｃｅＩタンパク質の活性およびそのコントロール処理を、図４に要約する。ＤＮＡとしてのＩ−ＳｃｅＩの送達は、０．４９％のＹＦＰ発現を生じた；一方で、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、ＹＦＰの４．４％発現を生じた。ＳＳＡ構築物およびＩ−ＳｃｅＩタンパク質を連続して送達すると、ＹＦＰのＳＳＡ効率は２．４％であった。形質転換効率は３５Ｓ：ＹＦＰのＤＮＡ送達のコントロールのＹＦＰ発現により示した。
【００６３】
実施例５：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおける、それらの内因性標的部位に対するＩ−ＳｃｅＩの活性。
トランスジェニックのタバコ株は、以前に示したように、ゲノム内に単一のＩ−ＳｃｅＩ認識部位を含む（Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。このトランスジェニック株から分離した形質転換されたプロトプラストを、処理後２４〜４８時間に採取し、ゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を包含する３０１ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅した。それから、ＰＣＲ産物を４５４ピロシーケンスに供した。認識部位内に挿入／欠失（インデル）変異を有するシーケンシングリードは、ＮＨＥＪによる、切断されたＩ−ＳｃｅＩ認識部位の不正確な修復から生じていると考えられた。突然変異誘発の頻度を、全シーケンシングリードのうちのＮＨＥＪ変異を有するシーケンシングリードの数として計算した。
【００６４】
標的配列に対するＩ−ＳｃｅＩタンパク質の活性およびそのコントロール処理を、図５に要約する。ＤＮＡとしてのＩ−ＳｃｅＩ（配列番号１）の送達は、１５％の突然変異誘発の頻度を生じた。エキソヌクレアーゼＴｒｅｘ２をコードするＤＮＡと組み合わせると、突然変異誘発の頻度は、５９．２％まで増加した。Ｉ−ＳｃｅＩをタンパク質として送達した場合は、突然変異誘発の活性は検出不可能であったが、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質を、Ｔｒｅｘ２をコードするＤＮＡ（配列番号６）とともに共送達した場合は、７．７％の突然変異誘発の頻度が観察された。Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質により誘導された変異の例を図６に示す。まとめると、データは、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、タンパク質として植物細胞に送達されると、標的化した染色体切断をもたらすことを示す。さらに、これらの切断の不正確な修復が、標的化した変異の導入をもたらす。
【００６５】
実施例６：植物細胞への、ＴＡＬＥＮタンパク質の送達。
精製されたＴＡＬＥＮ（商標）タンパク質を、実施例４に記載のように、ＰＥＧが仲介する形質転換により、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストへ導入した。手短に言うと、２〜２０μｌのＡＬＳ２Ｔ１タンパク質を、２００，０００のプロトプラストと、室温で、２００μｌの０．４Ｍマンニトール、４ｍＭ  ＭＥＳ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．８中で混合した。他の処理は、Ｔｒｅｘ２タンパク質、ＡＬＳ２Ｔ１をコードするＤＮＡ、Ｔｒｅｘ２タンパク質をコードするＤＮＡ、または、ＹＦＰ発現のためのＤＮＡ構築物と組み合わせて、プロトプラストを形質転換することを含んだ。Ｔｒｅｘ２は、ＮＨＥＪによる不正確なＤＮＡ修復の頻度を増大させるエンドヌクレアーゼである。形質転換後に、等量の４０％ＰＥＧ−４０００、０．２Ｍマンニトール、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．８をプロトプラストに添加して、直ちによく混合した。０．４５Ｍのマンニトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２で１回洗浄する前に、混合物を、暗所で３０分インキュベートした。それから、長期培養のために、ペトリ皿中の１ｍｌのＫ３Ｇ１に細胞を移す前に、プロトプラストをＫ３Ｇ１培地で２回洗浄した。
【００６６】
実施例７：Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける、それらの内因性標的部位に対するＴＡＬＥＮ（商標）ＡＬＳ２Ｔ１の活性。
形質転換されたプロトプラストを、処理後４８時間に採取し、ゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＡＬＳ２Ｔ１認識部位を包含する２５３ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅した。それから、ＰＣＲ産物を４５４のピロシーケンスに供した。認識部位内に挿入／欠失（インデル）変異を有するシーケンシングリードは、ＮＨＥＪによる、切断されたＩ−ＳｃｅＩ認識部位の不正確な修復から生じていると考えられた。突然変異誘発の頻度を、全シーケンシングリードのうちのＮＨＥＪ変異を有するシーケンシングリードの数として計算した。
【００６７】
標的配列に対するＡＬＳ２Ｔ１タンパク質の活性およびそのコントロール処理を図７に要約する。ＤＮＡとしてのＡＬＳ２Ｔ１（配列番号２および３）の送達は、１８．４％の突然変異誘発の頻度を生じた。エキソヌクレアーゼＴｒｅｘ２をコードするＤＮＡ（配列番号６）と組み合わせた場合、突然変異誘発の頻度は４８％まで増加した。ＡＬＳ２Ｔ１をタンパク質として送達した場合、突然変異誘発の活性は０．０３３％〜０．３３％であったが、ＡＬＳ２Ｔ１タンパク質を３５Ｓ：ＹＦＰのＤＮＡとともに共送達した場合、０．７２％の突然変異誘発の頻度が観察された。ＡＬＳ２Ｔ１タンパク質により誘導された変異の例を図８に示す。まとめると、データは、ＡＬＳ２Ｔ１タンパク質は、タンパク質として植物細胞に送達されると、標的化した染色体切断をもたらすことを示す。さらに、これらの切断の不正確な修復が、標的化した変異の導入をもたらす。
【００６８】
実施例８：配列特異的なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの調製。
メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（商標））を含む、配列特異的なヌクレアーゼを、Ｔ７発現ベクターにクローン化する（図９）。様々な異なる５’および３’ＵＴＲペアを、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおける転写減衰率のゲノムにわたる試験によるデータに基づいて選択した（Ｎａｒｓａｉ，２００７）。選択された配列は、様々な転写産物の半減期および機能性カテゴリーに基づいた。これらのＵＴＲペアを合成して、Ｔ７により作動するプラスミドベクターへの便利なクローニングを可能にした。生じるヌクレアーゼ構築物は、ＳａｐＩ消化により線形化される；ＳａｐＩ部位はポリＡ配列の直後に位置する。線形化されたプラスミドは、Ｔ７  Ｕｌｔｒａキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いたインビトロのｍＲＮＡ生産のためのＤＮＡテンプレートとして働く。あるいは、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、商業的な供給元により調製され得る。合成されたｍＲＮＡは、ヌクレアーゼフリーの蒸留水中に溶解され、−８０℃で保管される。
【００６９】
実施例９：ｍＲＮＡとして送達される配列特異的なヌクレアーゼの、エピソーム標的に対する活性。
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）アッセイを用いて、タバコプロトプラスト中に形質転換されたヌクレアーゼｍＲＮＡの活性を測定した（Ｚｈａｎｇら  ２０１３）。実施例４で説明したように、ＳＳＡアッセイは、ヌクレアーゼにより切断される非機能性ＹＦＰレポーターを用いる。切断の際に、レポーター内の繰り返し配列間の組み換えが、機能性ＹＦＰ遺伝子を再構成する。その結果、ＹＦＰ蛍光をフローサイトメトリーにより定量することができる。
【００７０】
ｍＲＮＡが、植物細胞に送達されて、標的化したＤＮＡ改変を仲介することができるかどうかを判定するために、Ｉ−ＣｒｅＩ  ｍＲＮＡをＳＳＡ標的プラスミドとともに、ＰＥＧが仲介する形質転換により、タバコプロトプラストへ導入した（Ｇｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。ＳＳＡレポーターは、ＹＦＰ内の繰り返し配列間にＩ−ＣｒｅＩ部位を有する。タバコプロトプラストの調製および形質転換のための方法は、以前に記載したとおりであった（Ｚｈａｎｇら  ２０１３）。ＳＳＡ標的プラスミド単独は、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。ポジティブコントロールとして、Ｉ−ＣｒｅＩを発現するＤＮＡ構築物（ｐ３５Ｓ−Ｉ−ＣｒｅＩ）およびＩ−ＣｒｅＩ  ＳＳＡレポーターを用いて細胞を形質転換した。形質転換の２４時間後、ＹＦＰ蛍光をフローサイトメトリーにより測定した（図１０）。同様のレベルの、ＳＳＡレポーターの標的化した切断が、ｐ３５Ｓ−Ｉ−ＣｒｅＩ  ＤＮＡおよびＩ−ＣｒｅＩ  ｍＲＮＡの両方で見られた。データは、機能性ヌクレアーゼが、ｍＲＮＡの形態で、プロトプラストにうまく送達され得ることを示す。
【００７１】
実施例１０：ｍＲＮＡとして送達される配列特異的なヌクレアーゼの、染色体標的に対する切断活性。
ＴＡＬＥＮペア（ＸｙｌＴ  ＴＡＬＥＮ（商標））を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの内因性β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を切断するように設計した（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）（図１１）。これらの遺伝子は、ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２と命名され、ＴＡＬＥＮ（商標）は、両方の遺伝子内に見られる同じ配列を認識する。それぞれのＸｙｌＴ  ＴＡＬＥＮ（商標）を、Ｔ７により作動される発現プラスミド内にサブクローニングした（図１２）。生じたＴＡＬＥＮ（商標）発現プラスミドは、ＳａｐＩ消化により線形化され、実施例８に記載のインビトロのｍＲＮＡ生産のためのＤＮＡテンプレートとしての役割を果たした。
【００７２】
次に、ＴＡＬＥＮ（商標）をコードするプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストへ、ＰＥＧが仲介する形質転換により導入した（Ｇｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。プロトプラストを、１ヶ月齢のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの良く広がった葉から分離した。プロトプラスト密度は、５×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌの細胞密度に調節し、２００μｌのプロトプラストを各形質転換に用いた。ｍＲＮＡ送達のために、ＲＮＡカクテルを、１５μｌのＬ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（２μｇ／μｌ）、１５μｌのＲ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（２μｇ／μｌ）、および、１０μｌの酵母ｔＲＮＡ担体（１０μｇ／μｌ）を混合することにより調製した。ＲＮＡｓｅによる分解の可能性を最小限にするために、ＲＮＡカクテルをすぐに２００μｌのプロトプラストに添加し、指でタッピングして数秒間だけ穏やかに混合した。ほぼ直後に、２１０μｌの４０％ＰＥＧを添加し、１分間指でタッピングしてよく混合した。形質転換の反応は、室温で３０分間インキュベートした。９００μｌの洗浄バッファーの添加により形質転換を止めた。数回の洗浄後、形質転換されたプロトプラストを、Ｋ３／Ｇ１培地中で、５×１０５／ｍｌの細胞密度で培養した。ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドＤＮＡも、ポジティブコントロールとして形質転換した。
【００７３】
処理の３日後に、形質転換されたプロトプラストを採取し、ゲノムＤＮＡを調製した。プロトプラストから調製したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＴＡＬＥＮ（商標）認識部位を包含する、およそ３００ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅した。それから、ＰＣＲ産物を４５４のピロシーケンスに供した。スペーサー領域内に挿入／欠失（インデル）変異を有するシーケンシングリードは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による、切断されたＴＡＬＥＮ（商標）認識部位の不正確な修復から生じていると考えられた。突然変異誘発の頻度を、シーケンシングリードの合計のうちのＮＨＥＪ変異を有するシーケンシングリードの数として計算した。
【００７４】
Ｘｙｌ＿Ｔ０４  ＴＡＬＥＮ（商標）のＤＮＡおよびｍＲＮＡを、それらの標的、すなわちＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２遺伝子に対して試験した。上記に示すように、ＴＡＬＥＮ（商標）認識部位は、ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２遺伝子の両方に存在する。図１２に要約するように、Ｘｙｌ＿Ｔ０４  ＴＡＬＥＮ（商標）のプラスミドＤＮＡは、両方の遺伝子内に３１．２％〜５４．９％にわたる非常に高頻度のＮＨＥＪ変異を誘導した。同時に、Ｘｙｌ＿Ｔ０４  ＴＡＬＥＮ（商標）のｍＲＮＡもまた、２２．９％〜４４．２％にわたる高頻度のＮＨＥＪ変異を両方の遺伝子内に誘導した。ＴＡＬＥＮ（商標）により誘導されたＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２遺伝子座上の変異の例を図１３に示す。
【００７５】
［他の実施態様］
本発明はその詳細な説明とともに記載されているが、前述の記載は説明目的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
［参考文献］
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2020018303.tif 000003
2020018303.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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