(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経系の髄鞘化を改善するための医薬組成物の使用の提供。【解決手段】ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物によって調製する個体の中枢神経系の髄鞘化を改善するための医薬組成物の使用であって、前記抽出物は、エリナシンA、エリナシンC、エリナシンS及びそれらの組み合わせからなるグループの一つを含む。前記医薬組成物の使用により、多発性硬化症、白質ジストロフィー、慢性神経変性障害などの中枢神経疾患を治療することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物によって調製する個体の中枢神経系の髄鞘化を改善するための医薬組成物の使用であって、
前記抽出物は、エリナシンA、エリナシンC、エリナシンS及びそれらの組み合わせからなるグループの一つを含む、前記使用。
【請求項２】
前記抽出物は、ヘリシン・エリナセウス菌糸体を極性溶液で抽出することによって得られ、
前記抽出物は、個体のオリゴデンドロサイト（OLG）のオリゴデンドロサイト転写因子１（Olig1）、オリゴデンドロサイト転写因子２（Olig2）、髄鞘塩基性タンパク質（MBP）及び髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）のパフォーマンスを強化するように使用されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記極性溶液は、メタノール溶液、エタノール溶液または水であることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記極性溶液がメタノール溶液である場合、前記抽出物はメタノール抽出物であり、
前記極性溶液がエタノール溶液である場合、前記抽出物はエタノール抽出物であり、
前記極性溶液が水である場合、前記抽出物は水抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記オリゴデンドロサイト（OLG）は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（oligodendrocyte precursor cell；OPC）から分化され、
前記オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）は、ガラクトセレブロシド（galactocerebroside；GC）を分泌するように使用されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記抽出物は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）からオリゴデンドロサイト（OLG）への分化を促進するように使用され、前記中枢神経系によって損傷したオリゴデンドロサイト（OLG）の数を補償することを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、液体発酵培養によって得られ、
前記抽出物は、作用濃度が10 ng/mL〜100μg/mLであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記抽出物又は医薬組成物は、前記個体の中枢神経系における脱髄又は髄鞘損傷である疾患を治療するように使用されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、培地で培養され、
前記培地は、グルコース、酵母エキス、動植物由来のタンパク質とその加水分解物、硫酸マグネシウム及び大豆粉末を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、培養の後、乾燥、逆溶解、抽出によって前記抽出物を得ることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物によって調製する中枢神経系の髄鞘化を改善するための医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の中枢神経系には、ニューロン（neuron）とグリア（glia）という二種類の細胞が含まれている。グリアは、ニューロンに栄養素を提供し、一定の微小環境を維持する役割を担っており、ミクログリア（microglia）、アストロサイト（astrocyte）、オリゴデンドロサイト（oligodendrocyte；OLG）に細分化されている。オリゴデンドロサイト（OLG）は、先にオリゴデンドロサイト前駆細胞（oligodendrocyte precursor cell；OPC）から前髄鞘化オリゴデンドロサイトに分化し、その後分化を続けて形成する。成熟したOLGは、触手を伸ばし、神経細胞の軸索を巻き付け、脂質成分が豊富な多層髄鞘（myelin）を形成し、そのタンパク質成分は、主に髄鞘塩基性タンパク質（myelin basic protein；MBP）及び髄鞘プロテオリピドタンパク質（myelin proteolipid protein；PLP）である。髄鞘の絶縁特性は、神経信号の伝達に役立ち、ニューロンも保護する。髄鞘の構造が損傷又は脱落すると、神経伝導が遮断され、感覚、運動、認知機能などの欠陥を引き起こす。
【０００３】
加齢に伴って、個体は、脱髄による持続的な軸索喪失と神経細胞死により、神経変性疾患に苦しんでいる可能性がある。また、OPCの更新や分化能の低下により、再髄鞘化（re-myelination）の困難さが増す。中枢神経系の疾患には、多発性硬化症（multiple sclerosis）、白質ジストロフィー（leukodystrophy）、慢性神経変性疾患（chronic neurodegenerative disorders）などが含まれ、OLGの脱髄又は髄鞘化の発生に関連し、神経の炎症に関連している。
【０００４】
多発性硬化症を例として、現在治療可能な薬物はない。急性多発性硬化症が発症する時、通常コルチコステロイドで治療され、一般的な制御と治療は、インターフェロンとコキソン（Copaxone（登録商標））の皮下注射である。従って、中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷の疾患を治療するための医薬組成物、或いは中枢神経系の髄鞘化を改善する医薬組成物を開発し、中枢神経系の疾患の治療又は改善を助けることを緊急に必要とされている。
【０００５】
本願の出願人は、従来の技術の欠点を考慮し、慎重な実験と研究に通じて、根気強い精神を持ち、従来技術の欠点を有効に克服する本願をようやく思いついた。本発明の簡単な説明は以下の通りである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷を治療する医薬組成物及び中枢神経系の髄鞘化を改善する医薬組成物を開発するために、本発明は、ヘリシン・エリナセウス（Hericium erinaceus (Bull.) Pers）菌糸体から自然で安全な抽出物を得る。前記抽出物は、エリナシンA（erinacine A）、エリナシンC（erinacine C）、エリナシンS（erinacine S）などの活性物質を含む。前記抽出物から調製された医薬組成物は、中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷の疾患を治療し、中枢神経系の髄鞘化を改善し、多発性硬化症、白質ジストロフィー、慢性神経変性障害、白質の損傷及び白質の炎症などのような中枢神経系の疾患の治療又は改善を助ける。又、本発明のヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物は、中枢神経系の炎症を改善する効果もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物によって調製する中枢神経系の髄鞘化を改善するための医薬組成物の使用を開示することを目的とし、前記抽出物は、エリナシンA、エリナシンC、エリナシンS及びそれらの組み合わせからなるグループの一つを含む。
【０００８】
一つの実施形態において、前記抽出物は、ヘリシン・エリナセウス菌糸体を極性溶液で抽出することによって得られ、前記抽出物は、個体のオリゴデンドロサイト（OLG）のオリゴデンドロサイト転写因子１（oligodendrocyte transcription factor 1；Olig1）、オリゴデンドロサイト転写因子２（oligodendrocyte transcription factor 2；Olig2）、髄鞘塩基性タンパク質（MBP）及び髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）のパフォーマンスを強化するように使用される。一つの実施形態において、前記極性溶液は、メタノール溶液、エタノール溶液または水である。一つの実施形態において、前記極性溶液がメタノール溶液である場合、前記抽出物はメタノール抽出物であり、前記極性溶液がエタノール溶液である場合、前記抽出物はエタノール抽出物であり、前記極性溶液が水である場合、前記抽出物は水抽出物である。一つの実施形態において、前記オリゴデンドロサイト（OLG）は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）から分化され、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）は、ガラクトセレブロシド（galactocerebroside；GC）を分泌するように使用される。一つの実施形態において、前記抽出物は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）からオリゴデンドロサイト（OLG）への分化を促進するように使用され、前記中枢神経系によって損傷したオリゴデンドロサイト（OLG）の数を補償する。
【０００９】
一つの実施形態において、前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、液体発酵培養によって得られ、前記抽出物は、作用濃度が10 ng/mL〜100μg/mLである。一つの実施形態において、前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、培地で培養され、前記培地は、グルコース、酵母エキス、動植物由来のタンパク質とその加水分解物、硫酸マグネシウム及び大豆粉末を含む。一つの実施形態において、前記ヘリシン・エリナセウス菌糸体は、培養の後、乾燥、逆溶解、抽出によって前記抽出物を得る。
【００１０】
本発明は、ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物、活性物質又は調製された医薬組成物を使用することにより、中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷である疾患を治療する方法を更に開示する。前記方法は、薬学的に有効な量の抽出物、活性物質又は医薬組成物が所望の個体に投与される。
【００１１】
したがって、本発明に係る中枢神経系の髄鞘化を改善する、又は中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷である疾患を治療するための医薬組成物は、医学的に有効な量のヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物を含み、前記抽出物は、エリナシンA、エリナシンC、エリナシンSなどの活性物質を含む。本発明に係る医薬組成物は、医薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤又は補助剤を含む。本発明に係る医薬組成物は、経口投与、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、舌下投与などにより患者に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エリナシンAの高速液体クロマトグラムである。
【図２】エリナシンCの高速液体クロマトグラムである。
【図３】エリナシンSの高速液体クロマトグラムである。
【図４】（A）ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）、（B）エリナシンA（HeA）、（C）エリナシンC（HeC）及び（D）エリナシンS（HeS）のそれぞれがOPCに対する細胞生存率の模式図である。
【図５】（A）ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）、（B）エリナシンA（HeA）、（C）エリナシンC（HeC）及び（D）エリナシンS（HeS）のそれぞれがOPCから分化したOLGのOlig1、Olig2、MBP及PLP1 mRNA発現量に対する模式図である。
【図６（Ａ）（Ｂ）】ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）で処理されたOPCから（A）GC陽性OLG細胞と（B）MBP陽性OLG細胞への分化の模式図である。
【図６（Ｃ）（Ｄ）】エリナシンA（HeA）で処理されたOPCから（C）GC陽性OLG細胞と（D）MBP陽性OLG細胞への分化の模式図である。
【図６（Ｅ）（Ｆ）】エリナシンC（HeC）で処理されたOPCから（E）GC陽性OLG細胞と（F）MBP陽性OLG細胞への分化の模式図である。
【図６（Ｇ）（Ｈ）】エリナシンS（HeS）で処理されたOPCから（G）GC陽性OLG細胞と（H）MBP陽性OLG細胞への分化の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の上記の目的及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照した後、当業者にはより即座に明らかになる。
【００１４】
本発明は、主に高緯度の温帯地域に分布するヘリシウム・エリナセウスを使用する。その子実体の多糖類は、五臓に利益をもたらし、消化を助け、消化不良を改善し、身体の衰弱を改善し、胃潰瘍、胃炎、胃の痛み及び膨満感を治療する。そのため、ヘリシウム・エリナセウスは、食品と薬の両用のキノコとする。
【００１５】
一、実験方法：
１．ヘリシウム・エリナセウス菌糸体の液体発酵培養
本発明の実施形態に係るヘリシウム・エリナセウスは、台湾食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）からの番号ＢＣＲＣ３５６６９の品種である。しかし、本発明に適したヘリシウム・エリナセウスの品種はこれに限定されない。
【００１６】
まず、ヘリシウム・エリナセウス菌糸体（ＢＣＲＣ番号：３５６６９）をポテトデキストロース寒天（PDA）のプレート培地に無菌接種し、２５℃で７日間培養した。次に、無菌技術によってPDAプレート培地上のヘリシウム・エリナセウス菌糸体をかき取り、培地（２．０重量％のグルコース、０．１重量％の酵母抽出物、０．１重量％の動植物由来タンパク質とその加水分解物を含む）が備えられたフラスコに接種し、振盪培養器において２６℃、pH５．０、速度１２０ｒｐｍで５日間振盪していた。その後、フラスコ内のヘリシウム・エリナセウス菌糸体を、上記培地を含む発酵タンクに無菌接種し、２４℃〜３０℃、タンク圧力０．５〜１．０ｋｇ/ｃｍ２、pH５．０、１０〜１５０ｒｐｍの攪拌速度で攪拌する、或いは攪拌しない（エアリフト）場合、０．５〜１．０VVMの通気速度で空気を導入し、７〜１０日間培養しており、ヘリシウム・エリナセウス菌糸体の液体培養発酵ブロスを得た。遠心分離により上清を取り除き、残った固形物がヘリシウム・エリナセウス菌糸体である。凍結保存を容易にするために、この固形物を凍結乾燥してヘリシウム・エリナセウス菌糸体粉末を得た。
【００１７】
２．ヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物の調製
ヘリシウム・エリナセウス菌糸体粉末を極性溶液で数分間抽出し（浸漬、攪拌、振盪又は超音波抽出法を含むがこれに限定されない）、次に減圧濃縮法又は凍結乾燥法で乾燥させてヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物を取得した。極性溶液は、メタノール溶液、エタノール溶液又は水を含むが、これらに限定されない。上記溶液を個別に使用する場合、ヘリシウム・エリナセウス菌糸体のメタノール抽出物、エタノール抽出物又は水抽出物が別々に得られる。メタノール溶液は、メタノールと水の混合溶液（例えば、１％（v/v）以上、１００％（v/v）未満）又は「純」メタノールである。エタノール溶液は、エタノールと水の混合溶液（例えば、１％（v/v）以上、１００％（v/v）未満）又は「純」エタノールである。
【００１８】
本実験において、抽出は、９５％（v/v）のエタノール溶液で行う。ヘリシウム・エリナセウス菌糸体粉末をその２５倍重量の９５％（v/v）のエタノール溶液に加え、一回目の超音波衝撃抽出を１時間に行って、懸濁液を遠心分離して第一上清を得た。次に、上清を８５％（v/v）のエタノール溶液で二回目の超音波衝撃抽出を１時間に行って、懸濁液を遠心分離して第二上清を得た。第二上清を減圧濃縮し、ペースト様のヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物（抽出物と略記）を得た。
【００１９】
３．ヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物の有効成分の分析
抽出物を水、酢酸エチル（1：1、v/v）の液液分配で抽出し、酢酸エチル層を得た。更に、酢酸エチル層をシリカゲルとLH-20シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析した。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）では、CosmosilR5C18-AR-IIカラムにおいて、４０℃に、６０％のアセトニトリルで溶出し、２０分に徐々に６５％のアセトニトリルに増加し、流速が1ml/min、波長が３４０nmである。図１に示すように、エリナシンA（erinacine A、記号A、MW：432.557 g/mol）は、７．３分に現れました。HPLCでは、CosmosilR5C18-AR-IIカラムにおいて、４０℃に、６０％のアセトニトリルで溶出し、２０分に徐々に６５％のアセトニトリルに増加し、流速が1ml/min、波長が２１０nmである。図２に示すように、エリナシンC（erinacine C、記号C、MW：434.573 g/mol）は、１０．４分に現れました。HPLCでは、CosmosilR5C18-AR-IIカラムにおいて、４０℃に、６０％のアセトニトリルで溶出し、２０分に徐々に６５％のアセトニトリルに増加し、流速が1ml/min、波長が２９０nmである。図３に示すように、エリナシンS（erinacine S、記号S、MW：430.541 g/mol）は、１４．５分に現れました。エリナシンA、エリナシンC及びエリナシンSの化学構造式を以下に示す。
【化１】
2020143043.tif 000002
【００２０】
これによれば、２０トンの発酵槽に培養されたヘリシン・エリナセウス菌糸体を乾燥させると、約１２０kgのヘリシン・エリナセウス菌糸体粉末を得る。抽出されたヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物は、エリナシンA、エリナシンC及びエリナシンSなどの活性物質を含む。エリナシンA、エリナシンC及びエリナシンSを含有するヘリシン・エリナセウス菌糸体、粉末及び抽出物は、必要に応じて各種の医薬組成物や健康食品の剤形に調製することができる。
【００２１】
４．オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）からオリゴデンドロサイト（OLG）への分化の確立と分析
１３．５〜１４．５日齢のSprague-Dawley（SD）雌ラットの胚から大脳皮質層を分離した。胚の大脳皮質層を分散させ、４０μm孔径のフィルター膜を通過させ、５〜７日間ポリアミック酸（poly-D-lysine；PDL）で処理されていない細胞培養皿で皮質層を培養して、球状神経幹細胞を形成した。AccutaseR細胞消化酵素で細胞培養皿から神経幹細胞を分離し、成長培地（２％B-27TM添加物（Gibco）、１％N-2TM添加物（Gibco）、10ng/mlの線維芽細胞成長因子2（FGF2）、10 ng/mlの上皮成長因子（EGF）及び１０ng/mlの血小板由来成長因子-AAリガンド（PDGF-AA ligand）を含むDMEM/F12）で細胞を再懸濁し、PDL処理した細胞培養皿に植えた。２日後、成長培地を分化培地（４mMのL-グルタミン（L-glutamine）、１mMのピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、０．１％ウシ血清アルブミン（BSA）、５０mg/mlのアポトランスフェリン（apotransferrin）、５mg/mlのインスリン、３０nMの亜セレン酸ナトリウム、１０nMのビオチン、１０nMのヒドロコルチゾン、１５nMのT3、１０ng/ml毛状神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor；CNTF）及び５mg/mlのN-アセチル-L-システイン（N-acetyl-L-cysteine；NAC）を含むDMEM培地）に変更し、２日間培養した。実験的ニーズに応じて、ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEMと略記）、エリナシンA（HeAと略記）、エリナシンC（HeCと略記）及びエリナシンS（HeSと略記）で処理された。
【００２２】
５．オリゴデンドロサイト（OLG）に分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の細胞生存率
この実験は、HEM、HeA、HeC、HeSがOPCの生存率に影響を与えるかどうかを評価する。まず、2×104個のOPC細胞を２４ウェル培養プレートに植え、２日間培養した後、異なる濃度の抽出物又は２４時間と４８時間に処理した。０．５mg/mlの3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide；MTT）を加え、４時間に光を避け、ジメチルスルホキシド（DMSO）で青紫色の結晶ホルマザンを溶解し、テカン  サンライズ  ELISA  リーダー（TECAN Sunrise ELISA Reader）を使用して、波長５９５nmでの吸光度を測定し、細胞生存率を計算した。
【００２３】
６．OLGの髄鞘化能力
この実験は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（quantitative real-time polymerase chain reaction；Q-PCR）を使用して、処理した細胞の特定の遺伝子発現を測定し、OLGの髄鞘化能力を分析した。まず、ヘリシン・エリナセウス抽出物で処理されたOLGのRNA（1 ug/サンプル）がM-MLV逆転写酵素（M-MLV reverse transcriptase）によってcDNAに転写された。cDNA、SYBR（登録商標）Master Mixs、及びラットのオリゴデンドロサイト（OLG）のオリゴデンドロサイト転写因子１（Olig1）、オリゴデンドロサイト転写因子２（Olig2）、髄鞘塩基性タンパク質（MBP）及び髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）プライマーを混合し（表１参照）、相対的mRNA発現レベルを測定し、ラットGAPDH遺伝子を対照群遺伝子として使用した。実験結果は、StepOneソフトウェアバージョン2.12（Applied Biosystems）で分析された。
【００２４】
【表１】
2020143043.tif 000003
【００２５】
７．ウエスタンブロット法
この実験は、従来のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及びウエスタンブロット法で、細胞のタンパク質発現を分析した。つまり、SDS-PAGEの後に細胞タンパク質がニトロセルロース膜に転写され、一次抗体を加え、低温で１５時間以上に作用した。ニトロセルロース膜をTBST緩衝液で洗浄した後、二次抗体を加え、室温で１時間に作用する。 TBST緩衝液でニトロセルロース膜を洗浄し、ECLで冷光呈色を行い、ネガフィルムに現像した。
【００２６】
本明細書で使用される「骨粗鬆症」という用語は、骨量の減少及び骨のハニカム構造の穴の拡大によって引き起こし、骨折の危険性を高め、骨の衰弱を増加させる疾患を指す。
【００２７】
８．免疫蛍光染色
処理した細胞スライドを４％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で１５分間に固定し、次に０．１％のTriton X100 PBSで１５分間に作用した。PBSで３回洗浄し、１％のウマ血清を含む抗MBP抗体（NB1018、Calbiochem）又は抗ガラクトシダーゼ（GC）の抗体（MAB342、Millipore）を添加し、4℃で一晩に作用した。PBSで３回洗浄し、ビオチンを有する二次抗体を加え、室温で１時間に作用した。PBSで３回洗浄し、アビジン-Cy3を含む三次抗体を加え、室温で４５分間に作用した。DAPI（1μg/ml）で1分間に反応させた後、最後に、スライドを９０％グリセリンで密封し、結果を顕微鏡（FV1000、日本）で観察した。
【００２８】
９．動物実験モデルの確立
振動生体組織スライサー（Microslicer（商標） DTK-1000）で７日齢のSDラットの子の小脳を厚さ３００μmの切片にカットし、インサート細胞培養皿（0.4μm  Millicell（登録商標）  細胞培養インサート、Millipore（登録商標））に配置し、小脳組織切片培養液（Cerebellar slice culture medium；５０％のアールの塩（Earle’s salt）を含む最小必須培地（MEM）、３５％のアールの平衡塩溶液、１５％の熱不活化馬血清及び１％のGlutaMAX（商標）補助剤）を３日間に培養した。切片は、１１日間さまざまな濃度のヘリシン・エリナセウス抽出物またはエリナシンで処理し、共培養の14日目に４％のパラホルムアルデヒドで２時間固定し、１％のTriton-X100 PBSで２日間に作用した。免疫蛍光法で抗髄鞘塩基性タンパク質のマウスモノクローナル抗体（anti-myelin basic protein mouse (anti-MBP) mAb，NE1018，Calbiochem）及びニューロフィラメントHに対する抗体（anti-neurofilament H antibody，NF200，AB5539，Millipore）の二重蛍光染色を行い、結果は顕微鏡（FV1000、日本）で観察された。
【００２９】
１０、統計分析
実験データは「平均値±標準誤差」として表され、グループ間の差はt検定によって分析され、p<0.05は統計的に有意であると見なされる。
【００３０】
二、実験結果：
１．HEM、HeA、HeC及びHeSのOPCに対する細胞生存率
図４（A）、（B）、（C）、（D）を参照し、（A）ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）、（B）エリナシンA（HeA）、（C）エリナシンC（HeC）及び（D）エリナシンS（HeS）のそれぞれがOPCに対する細胞生存率の模式図である。図４（A）〜（D）の対照群は、抽出物又は活性物質を加えず処理する試験である。図４（A）〜（D）において、OPC細胞を１０ng/ml〜１００μg/mlのHEMで２４〜４８時間に処理しても、OPC細胞に毒性を生じない（図４（A））。又、HeA、HeC、HeSが０．００１ng/ml〜１０ng/mlである場合、２４〜４８時間に処理してもOPC細胞に毒性を生じない（図４（B）、（C）と（D））。従って、適切な濃度で、ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）及び活性物質（HeA、HeCとHeS）がOPCの細胞生存率に影響を与えず、OPCに対して安全で無毒であることを証明できる。
【００３１】
２．OPCからOLGへの分化に対するHEM、HeA、HeC及びHeSの影響と遺伝子発現
図５（A）、（B）、（C）、（D）を参照し、（A）ヘリシン・エリナセウス菌糸体抽出物（HEM）、（B）エリナシンA（HeA）、（C）エリナシンC（HeC）及び（D）エリナシンS（HeS）のそれぞれがOPCから分化したOLGのOlig1、Olig2、MBP及PLP1 mRNA発現量に対する模式図である。図５（A）〜（D）の対照群は、抽出物又は活性物質を加えずに処理する試験である。図５（A）において、１００ng/ml〜１μg/mlのHEMがOLG細胞のOlig2 mRNA発現を増加させ（(A)-2参照）、一方、成熟OLG細胞のMBP及びPLP1 mRNA発現量も増加させた（（A）-3と（A）-4参照）。更に、１００ng/ml及び１μg/ mlのHEMで処理されたOPC細胞は、対照群よりも分化したOLG細胞の数が多かった（結果は示されていない）。
【００３２】
図５（B）において、０．００１ng/ml〜１０μg/mlのHeAは、OLG細胞のOlig2 mRNA発現量も増加させ（（B）-2参照）、HeAもOLG細胞のMBG及びPLP1 mRNA発現量の増加を促進した（（B）-3及び（B）-4参照）。
【００３３】
図５（C）において、異なる濃度のHeCは、OLG細胞のOlig1、Olig2、MBP、及びPLP1 mRNA発現量を増加させ、例えば、HeCが０．０１ng/ml〜１０ng/mlである場合、OLG細胞のOlig1 mRNA発現量を増加させ（（C）-1参照）、HeCが０．１ng/ml〜１０ng/mlである場合、OLG細胞のOlig2 mRNA発現量を増加させ（（C）-2参照）、HeCが０．０１ng/mlである場合、OLG細胞のMBP mRNA発現量を大幅に増加させ（（C）-3参照）、HeCは、OLG細胞のPLP1 mRNA発現量に対して有意差がない（（C）-4）。
【００３４】
図５（D）において、０．０１ng/mlのHeSは、OLG細胞のOlig1、MBP、PLP mRNA発現量を大幅に増加させることができる（（D）-1、（D）-3と（D） -4参照）、０．００１ng/ml〜０．１ng/mlのHeSは、OLG細胞のOlig2 mRNA発現量を増加させることができる（（D）-2参照）。０．０１ng/mlのHeSは、OLG細胞のMBPとPLPタンパク質の発現量を促進する（ウエスタンブロッティングの結果は示していない）。
【００３５】
図６（A）〜（H）を参照し、免疫蛍光染色実験の結果は、抽出物（HEM）及び活性物質（HeA、HeCとHeS）は、OPCからGC陽性を有するOLG（図６（A）、（C）、（E）と（G）参照）及び及びMBP陽性を有するOLG（図６（B）、（D）、（F）と（H））への分化を促進できることを示す。定量的結果は、HeSがOPCからGC陽性を有するOLG及びMBP陽性を有するOLG（図６（G）と（H））への分化を促進する能力は、HeA（図６（C）と（D））又はHeC（図６（E）と（F））の方よりも優れていることも示す。
【００３６】
要約すると、本発明のヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物及びその活性物質（HeA、HeCとHeS）は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）に対して安全かつ非毒性であり、OPCからオリゴデンドロサイト（OLG）への分化を促進することができ、OLGが軸索を巻き付ける髄鞘化プロセスにおけるオリゴデンドロサイト転写因子1（Olig1）、オリゴデンドロサイト転写因子2（Olig2）、髄鞘塩基性タンパク質（MBP）及び髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）のmRNA発現量とタンパク質発現量を促進し、OLGはガラクトセレブロシド（GC）陽性及びMBP陽性を有するOLGにする。従って、本発明に係るヘリシウム・エリナセウス菌糸体抽出物及びそこに含まれるエリナシンA、エリナシンC及びエリナシンSは、個体の中枢神経系の髄鞘化を改善する、又は中枢神経系の脱髄又は髄鞘損傷である疾患を治療するための医薬組成物に使用できる。
【００３７】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加え得ることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【符号の説明】
【００３８】
なし
【図１】
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【図２】
2020143043.tif 000005
【図３】
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【図４−１】
2020143043.tif 000007
【図４−２】
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【図５−１】
2020143043.tif 000009
【図５−２】
2020143043.tif 000010
【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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