(57)【要約】      （修正有）【課題】乾燥型の加齢性黄斑変性(AMD)を有する対象を治療する方法の提供。【解決手段】本方法は、該対象の網膜下へヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程を含む。【選択図】図２
2020143137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥型の加齢性黄斑変性(AMD)を有する対象の網膜下へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程
を含む、該対象を治療する方法。
【請求項２】
網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒト多角形RPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回り、該治療有効量が投与1回当たり細胞50,000〜5,000,000個である、工程
を含む、該対象を治療する方法。
【請求項３】
デバイスを使用して、網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、該細胞を投与する該デバイスの外径が90〜100μmである、工程
を含む、該対象を治療する方法。
【請求項４】
前記デバイスがカニューレである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、前記対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記治療有効量が投与1回当たり細胞50,000〜1,000,000個である、請求項1または3に記載の方法。
【請求項７】
前記治療有効量が、投与1回当たり細胞50,000個、投与1回当たり細胞200,000個、投与1回当たり細胞500,000個、および投与1回当たり細胞1,000,000個からなる群より選択される、請求項2または6に記載の方法。
【請求項８】
前記対象の網膜下腔へ前記細胞を投与する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
単回投与で前記細胞を投与する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬学的組成物が1μl当たり細胞500個〜1μl当たり細胞10,000個を含む、請求項2または7に記載の方法。
【請求項１１】
前記量が投与1回当たり細胞50,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約500〜1000個を含む、請求項2または7に記載の方法。
【請求項１２】
前記量が投与1回当たり細胞200,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約2,000個を含む、請求項2または7に記載の方法。
【請求項１３】
前記量が投与1回当たり細胞500,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約5,000個を含む、請求項2または7に記載の方法。
【請求項１４】
前記量が投与1回当たり細胞1,000,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約10,000個を含む、請求項2または7に記載の方法。
【請求項１５】
前記網膜疾患または前記網膜異常が、色素性網膜炎、網膜剥離、網膜形成異常、網膜萎縮、網膜症、黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、マラッティア・レベンティネーズ（Malattia Leventinese）、ドイン蜂巣状ジストロフィー、ソーズビージストロフィー、パターン／蝶形ジストロフィー（pattern／butterfly dystrophy）、ベスト卵黄様ジストロフィー（Best vitelliform dystrophy）、ノースカロライナジストロフィー（North Carolina dystrophy）、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、網膜色素線条症、中毒性黄斑症、スタルガルト病、病的近視、色素性網膜炎、および黄斑変性からなる群より選択される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が加齢性黄斑変性である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記加齢性黄斑変性が、乾燥型の加齢性黄斑変性である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、
(i)55歳またはそれ以上であること；
(ii)少なくとも1つの眼において0.5乳頭面積（disc area）を超える、黄斑における地図状萎縮を伴う乾性AMDの眼底検査所見を有すること；
(iii)モニターされた麻酔管理の下で硝子体網膜外科手術を受けることができること；および
(iv)免疫不全症を有さないこと
からなる群より選択される基準のうちの少なくとも1つを満たす、請求項1または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象がAMD以外の網膜疾患を有さない、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が基準(i)〜(iv)の各々を満たす、請求項18または19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を投与する前記デバイスの外口径が90〜100μmである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２２】
前記デバイスがカニューレである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記デバイスが注射針をさらに備える、請求項4または22に記載の方法。
【請求項２４】
前記カニューレのゲージが25Gである、請求項4または22に記載の方法。
【請求項２５】
集団中のOct4+TRA-1-60+細胞の数が1:250,000を下回る、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
免疫染色によって測定された場合、前記細胞の少なくとも80%がベストロフィン1（Bestropihn 1）を発現する、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
免疫染色によって測定された場合、前記細胞の少なくとも80%が、小眼球症関連転写因子(MITF)を発現する、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
FACSによって測定された場合、前記細胞の80%超がペアードボックス遺伝子6(PAX-6)を発現する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、1日1ml当たり500 ngを上回る色素上皮由来因子(PEDF)を分泌する、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、PEDFおよび血管内皮成長因子(VEGF)を極性化（polarized）様式で分泌する、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
PEDFの基底部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率が1を上回る、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記比率が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞の前記経上皮電気抵抗が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に100オームを上回ったままである、請求項1、2、または5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
VEGFの頂端分泌に対するVEGFの基底部分泌の比率が1を上回る、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３５】
前記比率が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、網膜下投与後にRCSラットにおける視力をレスキューすることができる、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、RCSラットにおいて網膜下投与後最大180日間、光受容体をレスキューすることができる、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞をヒト胚性幹細胞のエクスビボ分化によって生成する、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞を、
(a)分化細胞を生成するように、ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養すること；
(b)ニコチンアミドおよびアクチビンAを含む培地中で該分化細胞を培養して、RPE系統へさらに分化している細胞を生成すること；ならびに
(c)ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、RPE系統へさらに分化している該細胞を培養すること
によって生成する、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
bFGFおよびTGFβを含む培地中で、前記胚性幹細胞または前記人工多能性幹細胞を増殖させる、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
ヒト臍帯線維芽細胞上で前記胚性幹細胞を培養する、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
大気酸素レベルが約10%未満である条件下において、工程(a)〜(c)が行われる、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
工程(a)の前に、ニコチンアミドの存在下で大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養する工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
工程(c)の後に、ニコチンアミドの存在下で大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で前記分化細胞を培養する工程をさらに含む、請求項42または43に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの態様において、網膜疾患、より詳細には加齢性黄斑変性(AMD)を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
hESCの誘導は、10年以上前に、治療用細胞のための出発材料として役立つことによる再生についてのこれらの細胞の潜在的な臨床使用において大きな関心を集めた。hESC由来細胞は臨床使用について未だ認可されていないが、この目標の実現に向けて長年にわたり著しい進歩がなされた。重要な前進としては、hESCの生物学のよりよい理解、様々な細胞タイプへそれらを分化させる能力における技術的な改善、および疾患特異的動物モデルにおけるそれらの治療効果の前臨床証明が挙げられる。
【０００３】
RPEは、神経網膜と脈絡毛細管板との間にある色素細胞の単層である。RPEは、頂端対基底外側の構造的および機能的極性を特徴とする。頂端側において、細胞は光受容体と直接接触している。それらの側面壁において、それらは、タイトな接着性のギャップジャンクションを形成し、それらの基底側において、それらは、下にあるブルッフ基底膜と接触しており、これは、それらを脈絡膜血管から分離している。RPE細胞は、網膜およびその光受容体の維持および機能において重要な役割を果たしている。これらとしては、血液網膜関門の形成、迷光の吸収、神経網膜への栄養素の供給、視覚色素の再生、ならびに光受容体の脱落した外節の取り込みおよび再利用が挙げられる。
【０００４】
RPE細胞の機能不全、変性、および減少は、AMD、ベスト病、および色素性網膜炎(RP)のサブタイプの顕著な特徴である。AMDは西欧諸国における視覚障害の主要原因である。75歳以上の人の中で、25〜30%が加齢性黄斑変性(AMD)に罹患しており、患者の6〜8%において失明をもたらす進行性の中心視力低下を伴う。網膜変性は、細かい視覚的な詳細および色知覚を担う網膜の中央部である黄斑に主に関わる。AMDの乾燥型は、RPEの過形成、ならびに代謝最終産物からなるRPEの真下でのまたはブルッフ膜内でのドルーゼン沈着物の形成によって開始される。それは、黄斑の広い領域にわたるRPE細胞および光受容体の変性を伴う地図状萎縮(GA)の進行期へ徐々に進み得、中心視力低下を引き起こし得る。乾性AMD患者の10パーセントは、血管新生型(湿性)AMDへ進み、血管がブルッフ膜を通って出現し、その後、眼内漏出および／または出血を伴い、中心視力の低下が加速する。併発する新生血管形成は抗-VEGF剤で治療され得るが、現在、RPEおよび光受容体変性を停止させるための有効な治療はなく、多くの患者は最終的には視力を失う。
【０００５】
動物およびヒトの両方における移植研究は、AMD患者にRPE細胞を移植することの潜在的な治療効果の証拠を提供する。ヒトにおいて、より周辺のRPE上への黄斑移動、ならびに細胞懸濁液またはRPEおよび脈絡膜のパッチとしての周辺RPEの自家移植は、比較的より健康なRPE細胞の上に黄斑を配置することが、一部のAMD患者において視覚機能を改善し得るという原理の証明を提供する。それにもかかわらず、自家移植のための外科手術は、困難であり、著しい合併症と関連する。典型的に、RPE細胞は、GAの領域とよりよく保存された中心窩外の網膜およびRPE層と間の境界に沿って黄斑領域中に作られる網膜下腔への、標準3ポート硝子体切除術に続いての小さな網膜切開によって送達される。AMDの治療におけるそのような細胞置換戦略の成功は、移植細胞の生存および機能を可能にし、かつ網膜損傷を最小限にする、安全な送達システムを確立することに左右される。
【０００６】
背景技術としては、WO 2013/114360（特許文献1）、WO 2013/074681（特許文献2）、WO 2008/129554（特許文献3）およびWO 2013/184809（特許文献4）、米国特許出願第62/116,972号（特許文献5）および米国特許出願第62/116,980号（特許文献6）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2013/114360
【特許文献２】WO 2013/074681
【特許文献３】WO 2008/129554
【特許文献４】WO 2013/184809
【特許文献５】米国特許出願第62/116,972号
【特許文献６】米国特許出願第62/116,980号
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの態様の局面により、乾燥型の加齢性黄斑変性(AMD)を有する対象の網膜下へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程を含む、該対象を治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明のいくつかの態様の局面により、網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒト多角形RPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回り、該治療有効量が投与1回当たり細胞50,000〜5,000,000個である、工程を含む該対象を治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様の局面により、デバイスを使用して、網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、該細胞を投与する該デバイスの外径が90〜100μmである、工程を含む、該対象を治療する方法を提供する。
【００１１】
本発明のいくつかの態様により、デバイスはカニューレである。
【００１２】
本発明のいくつかの態様により、前記その細胞の少なくとも95%は、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、対象に対する細胞の経上皮電気抵抗は100オームを上回る。
【００１３】
本発明のいくつかの態様により、治療有効量は投与1回当たり細胞50,000〜1,000,000個である。
【００１４】
本発明のいくつかの態様により、治療有効量は、投与1回当たり細胞50,000個、投与1回当たり細胞200,000個、投与1回当たり細胞500,000個および投与1回当たり細胞1,000,000個からなる群より選択される。
【００１５】
本発明のいくつかの態様により、対象の網膜下腔へ細胞を投与する。
【００１６】
本発明のいくつかの態様により、単回投与で細胞を投与する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様により、薬学的組成物は細胞500個／μl〜細胞10,000個／μlを含む。
【００１８】
本発明のいくつかの態様により、量が投与1回当たり細胞50,000個である場合、薬学的組成物は細胞約500〜1000個／μlを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの態様により、量が投与1回当たり細胞200,000個である場合、薬学的組成物は細胞約2,000個／μlを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの態様により、量が投与1回当たり細胞500,000個である場合、薬学的組成物は細胞約5,000個／μlを含む。
【００２１】
本発明のいくつかの態様により、量が投与1回当たり細胞1,000,000個である場合、薬学的組成物は細胞約10,000個／μlを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの態様により、網膜疾患または網膜異常は、色素性網膜炎、網膜剥離、網膜形成異常、網膜萎縮、網膜症、黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、マラッティア・レベンティネーズ（Malattia Leventinese）、ドイン蜂巣状ジストロフィー、ソーズビージストロフィー、パターン／蝶形ジストロフィー（pattern／butterfly dystrophy）、ベスト卵黄様ジストロフィー（Best vitelliform dystrophy）、ノースカロライナジストロフィー（North Carolina dystrophy）、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、網膜色素線条症、中毒性黄斑症、スタルガルト病、病的近視、色素性網膜炎、および黄斑変性からなる群より選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの態様により、疾患は加齢性黄斑変性である。
【００２４】
本発明のいくつかの態様により、加齢性黄斑変性は、乾燥型の加齢性黄斑変性である。
【００２５】
本発明のいくつかの態様により、対象は、
(i)55歳またはそれ以上であること；
(ii)少なくとも1つの眼において0.5乳頭面積（disc area）を超える、黄斑における地図状萎縮を伴う乾性AMDの眼底検査所見を有すること；
(iii)モニターされた麻酔管理の下で硝子体網膜外科手術を受けることができること；および
(iv)免疫不全症を有さないこと
からなる群より選択される基準のうちの少なくとも1つを満たす。
【００２６】
本発明のいくつかの態様により、対象はAMD以外の網膜疾患を有さない。
【００２７】
本発明のいくつかの態様により、対象は基準(i)〜(iv)の各々を満たす。
【００２８】
本発明のいくつかの態様により、細胞を投与するデバイスの外口径は、90〜100μmである。
【００２９】
本発明のいくつかの態様により、デバイスはカニューレである。
【００３０】
本発明のいくつかの態様により、デバイスは注射針をさらに備える。
【００３１】
本発明のいくつかの態様により、カニューレのゲージは25Gである。
【００３２】
本発明のいくつかの態様により、集団中のOct4+TRA-1-60+細胞の数は、1:250,000を下回る。
【００３３】
本発明のいくつかの態様により、免疫染色によって測定された場合、細胞の少なくとも80%はベストロフィン1（Bestrophin 1）を発現する。
【００３４】
本発明のいくつかの態様により、免疫染色によって測定された場合、細胞の少なくとも80%は小眼球症関連転写因子(MITF)を発現する。
【００３５】
本発明のいくつかの態様により、FACSによって測定された場合、細胞の80%超は、ペアードボックス遺伝子6(PAX-6)を発現する。
【００３６】
本発明のいくつかの態様により、細胞は、1日1ml当たり500 ngを上回る色素上皮由来因子(PEDF)を分泌する。
【００３７】
本発明のいくつかの態様により、細胞は、PEDFおよび血管内皮成長因子(VEGF)を極性化（polarized）様式で分泌する。
【００３８】
本発明のいくつかの態様により、PEDFの基部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率は、1を上回る。
【００３９】
本発明のいくつかの態様により、比率は、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである。
【００４０】
本発明のいくつかの態様により、細胞の経上皮電気抵抗は、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に100オームを上回ったままである。
【００４１】
本発明のいくつかの態様により、VEGFの頂端分泌に対するVEGFの基底部分泌の比率は、1を上回る。
【００４２】
本発明のいくつかの態様により、比率は、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである。
【００４３】
本発明のいくつかの態様により、細胞は、網膜下投与後にRCSラットにおける視力をレスキューすることができる。
【００４４】
本発明のいくつかの態様により、細胞は、RCSラットにおいて網膜下投与後最大180日間、光受容体をレスキューすることができる。
【００４５】
本発明のいくつかの態様により、細胞をヒト胚性幹細胞のエクスビボ分化によって生成する。
【００４６】
本発明のいくつかの態様により、細胞を、
(a)分化細胞を生成するように、ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養すること；
(b)ニコチンアミドおよびアクチビンAを含む培地中で分化細胞を培養して、RPE系統へさらに分化している細胞を生成すること；ならびに
(c)ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、RPE系統へさらに分化している細胞を培養すること
によって生成する。
【００４７】
本発明のいくつかの態様により、bFGFおよびTGFβを含む培地中で、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を増殖させる。
【００４８】
本発明のいくつかの態様により、ヒト臍帯線維芽細胞上で胚性幹細胞を培養する。
【００４９】
本発明のいくつかの態様により、大気酸素レベルが約10%未満である条件下において、工程(a)〜(c)は行われる。
【００５０】
本発明のいくつかの態様により、方法は、工程(a)の前に、ニコチンアミドの存在下で、大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養する工程をさらに含む。
【００５１】
本発明のいくつかの態様により、方法は、工程(c)の後に、ニコチンアミドの存在下で、大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で分化細胞を培養する工程をさらに含む。
【００５２】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは均等な方法および材料が本発明の態様の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む、本特許明細書が、制御する。さらに、材料、方法、および例は、説明のために過ぎず、必ずしも限定であるようには意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明のいくつかの態様を、添付の図面を参照して、単に例として、本明細書において説明する。ここで詳細な図面を具体的に参照するが、示される詳細は、例としてであり、本発明の態様の説明的な議論の目的のためであることが、強調される。この点に関して、図面により得られる内容によって、本発明の態様が実施され得る方法が当業者に明らかとなる。
【図１】網膜下注射スキームの図である。この図において、手術用ポートの配置は解剖学的に正確ではないことに注意のこと(Stout and Francis, 2011, Human Gene Ther. 2011 May 22(5): 531-5)。
【図２】図2A〜Cは、製剤化された細胞の送達およびローディングのデバイスの組み立てを示す写真である。A．18Gブラントフィルニードルへ連結された注射器。B．エクステンションチューブへの18Gブラントフィルニードルの置き換え。C．組み立てられた送達デバイス。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の具体的な態様の説明
本発明は、そのいくつかの態様において、網膜疾患、より詳細には加齢性黄斑変性(AMD)を治療する方法に関する。
【００５５】
本発明の少なくとも1つの態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細にその適用が必ずしも限定されないことが、理解されるべきである。本発明は、他の態様が可能であり、即ち、様々な方法で実施もしくは実行されることが可能である。
【００５６】
AMDは、中心網膜の進行性慢性疾患であり、世界中で視力低下の主要原因である。大抵の視力低下は2つのプロセスのうちの1つに起因して疾患の後期に生じる：血管新生型(「湿性」)AMDおよび地図状萎縮型(GA、「乾性」)。血管新生型加齢性黄斑変性において、脈絡膜新生血管はRPE下または網膜下腔へ突破し、流体、脂質、および血液を漏出させ、線維性瘢痕化をもたらす。GAにおいて、網膜色素上皮、脈絡毛細管板、および光受容体の進行性萎縮が生じる。AMDの乾燥型は、より一般的であるが(全ての場合の85〜90%)、「湿潤型」へ進行し得、これは、治療しないまま放置すると、急速かつ重篤な視力低下に至る。
【００５７】
AMDの推定有病率は、米国および他の先進国において2,000人中1人である。この有病率は一般集団中の高齢者の割合と共に増加すると予想される。この疾患の危険因子は環境因子および遺伝因子の両方を含む。
【００５８】
この疾患の病因は、4つの機能的に相互に関連する組織、即ち、網膜色素上皮(RPE)、ブルッフ膜、脈絡毛細管板、および光受容体における異常を含む。しかしながら、RPE細胞機能の障害は臨床的に関連するAMD変化をもたらす分子経路における初期の重要な事象である。
【００５９】
現在、乾性AMDについて有効なまた認可された治療はない。予防策としてはビタミン／ミネラルサプリメントが挙げられる。これらは、湿性AMDを発症する危険性を低下させるが、地図状萎縮の進行の発生に影響を与えない。
【００６０】
現在、様々な臨床開発段階にある約20種類の療法がある。これらの中には、補体系阻害物質およびコルチコステロイド、視サイクルモジュレータ、抗酸化剤、神経保護薬、血管強化剤、ならびに細胞および遺伝子治療がある。例えばDugel et al., 2014, Retina Today, pages 70-72; およびPatel et al, 2015, Practical Retina, January 2015・Vol, 46, No. 1, pages 8-13を参照のこと。
【００６１】
ヒト胚性幹細胞がRPE細胞の生成のための細胞源として提案された。hESCからRPE細胞を得るために、2つの一般的なアプローチ、自発的分化および指向分化（directed differentiation）が使用された。自発的分化において、平らなコロニーまたは胚様体(EB)中のhESCを、色素沈着RPE細胞を含有する細胞集団へ自発的に分化させる。指向分化方法は、RPE細胞へのhESCの分化を駆動するために多数の因子を使用する。例えばWO 2008/129554を参照のこと。
【００６２】
本発明者らは、用量および治療レジメンならびに細胞を送達するためのデバイスを含む、PRE細胞を用いる臨床治療についての最適条件を今回見出した。本発明は、細胞を用いる治療によって恩恵を受けるであろう患者集団の選択基準をさらに提供する。
【００６３】
従って、本発明の一局面により、網膜疾患(例えば、乾燥型の加齢性黄斑変性(AMD))を有する対象の網膜下へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程を含む、該対象を治療する方法を提供する。
【００６４】
薬学的組成物が治療薬として役立つ眼異常としては、網膜機能不全、網膜損傷、および／または網膜色素上皮の減少と一般的に関連する網膜疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って治療され得る異常の非限定的なリストは、色素性網膜炎、レーベル先天黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、加齢性黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーならびにRPEの他のジストロフィー、スタルガルト病、光性、レーザー、炎症性、感染性、放射線、血管新生または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる損傷に起因するRPEおよび網膜損傷を含む。
【００６５】
特定の態様により、疾患は乾燥型の加齢性黄斑変性である。
【００６６】
治療され得る対象としては、霊長動物(ヒトを含む)、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ(例えば、豚))、トリ、および他の対象が挙げられる。商業的重要性を有するヒトおよび非ヒト動物(例えば、家畜および飼育動物)は、特に関心対象である。治療され得る例示的な哺乳動物としては、イヌ；ネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；齧歯動物などおよび霊長動物、特にヒトが挙げられる。非ヒト動物モデル、特に哺乳動物、例えば、霊長動物、マウス、ウサギなどが、実験的研究のために使用され得る。
【００６７】
一態様により、治療される対象は55歳またはそれ以上である。
【００６８】
別の態様により、治療される対象は、少なくとも1つの眼において0.5乳頭面積を超える(1.25mm2および最大17 mm2)、黄斑における地図状萎縮を伴う乾性AMDの眼底検査所見を有する。
【００６９】
さらに別の態様により、治療される対象は、モニターされた麻酔管理の下で硝子体網膜外科手術を受けることができるような状態にある。
【００７０】
さらに別の態様により、対象は免疫不全症を有さない。
【００７１】
さらに別の態様により、対象は、-6ジオプターを上回る軸性近視を有さない。
【００７２】
さらに別の態様により、対象は網膜剥離修復の病歴を有さない。
【００７３】
さらに別の態様により、対象はAMD以外の網膜疾患を有さない。
【００７４】
好ましくは、治療される対象は、上記基準のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6つ、または全てを満たす。
【００７５】
本明細書に記載されるように生成されたRPE細胞は、対象の眼内の様々な標的部位へ移植され得る。一態様により、RPE細胞の移植は眼の網膜下腔に対してであり、これはRPEの正常な解剖学的位置である(光受容体外節と脈絡膜との間)。さらに、細胞の遊走能および／または正のパラクリン作用に依存して、硝子体腔、内側または外側網膜、網膜周辺、および脈絡膜内を含む、追加の眼区画中への移植が考慮され得る。
【００７６】
対象へ投与され得る生細胞の数は、典型的に、注射1回当たり50,000〜5×106個、50,000〜4×106個、50,000〜3×106個、50,000〜2×106個、50,000〜1×106個、50,000〜500,000個である。
【００７７】
本発明は単回投与または複数回投与を意図する。好ましくは、眼への第1投与と同じ眼への第2投与との間の時間は、少なくとも1ヶ月間である。
【００７８】
具体的な態様により、対象の眼1つ当たり投与され得る生細胞の数は、50,000〜2×106個、50,000〜1×106個、50,000〜500,000個である。例示的な用量としては、眼1つ当たり細胞50,000個、眼1つ当たり100,000個、眼1つ当たり200,000個、眼1つ当たり300,000個、眼1つ当たり400,000個、眼1つ当たり500,000個、および眼1つ当たり1×106個が挙げられる。
【００７９】
細胞は、典型的に、担体(例えば、等張液および／または食塩水)、例えばBSS plus（商標）中に製剤化される。担体は、RPE移植、統合、生存、有効性などを支持する追加の因子を任意で含み得る。
【００８０】
50,000細胞を含む薬学的組成物の例示的な濃度は、1μl当たり細胞約500個または1μl当たり細胞1,000個である。生細胞200,000個を含む薬学的組成物の例示的な濃度は、1μl当たり生細胞約500個または1μl当たり生細胞1,000個である。細胞500,000個を含む薬学的組成物の例示的な濃度は、1μl当たり生細胞約5,000個または1μl当たり生細胞約10,000個である。細胞1×106個を含む薬学的組成物の例示的な濃度は、1μl当たり生細胞約10,000個である。
【００８１】
移植は、当技術分野において公知の様々な技法によって行われ得る。RPE移植を行うための方法は、例えば、米国特許第5,962,027号、同第6,045,791号、および同第5,941,250号、ならびにEye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997; 235(3): 149-58; Biochem Biophys Res Commun Feb. 24, 2000; 268(3): 842-6; Opthalmic Surg February 1991; 22(2): 102-8に記載されている。角膜移植を行うための方法は、例えば、米国特許第5,755,785号、ならびにEye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12; Curr Opin Opthalmol August 1992; 3 (4): 473-81; Ophthalmic Surg Lasers April 1998; 29 (4): 305-8; Ophthalmology April 2000; 107 (4): 719-24; およびJpn J Ophthalmol November-December 1999; 43(6): 502-8に記載されている。主にパラクリン作用が利用される場合、細胞はまた、半透性容器内に封入されて送達され、眼内に維持され得、これはまた宿主免疫系への細胞の接触を減少させる(Neurotech USA CNTF delivery system; PNAS March 7, 2006 vol. 103(10) 3896-3901)。
【００８２】
投与する工程は、その必要がある眼へのRPE細胞の眼内投与を含み得る。眼内投与は、網膜下腔へのRPE細胞の注射を含み得る。
【００８３】
一態様により、移植は、経毛様体扁平部硝子体切除術、続いての網膜下腔への小さな網膜開口部を介した細胞の送達によって、または直接注射によって、行われる。
【００８４】
RPE細胞は様々な形態で移植され得る。例えば、RPE細胞は、細胞懸濁液の形態で、マトリックスと共に、またはマトリックス上もしくは膜上、細胞外マトリックス上もしくは生分解性ポリマーなどの基材上、または組み合わせ上へ接着させて、標的部位中へ導入され得る。RPE細胞はまた、他の網膜細胞と一緒に、例えば光受容体と一緒に、移植され得る（同時移植）。
【００８５】
特定の態様により、水溶液(例えば、等張液および／または食塩水)または空気を網膜下腔へ投与し、それによって最初のブレブを形成する。次いで、懸濁液としてのまたはスキャフォールド上のRPE細胞を、同じ網膜下腔へ投与する。注射は注射針または注射カニューレによって行われ得る。
【００８６】
特定の態様により、細胞を、90〜100μmの外径を有する送達デバイス(例えば、注射針または注射カニューレ)を使用して細胞懸濁液として送達する。別の態様により、細胞を、65〜75μmの内口径を有する送達デバイス(例えば、注射針または注射カニューレ)を使用して細胞懸濁液として送達する。
【００８７】
本発明のこの局面の態様により、100μl当たり生細胞70,000〜1.4×106個の濃度でのそれらの最終製剤中のRPE細胞を、18G注射針を使用して送達デバイス(例えば、1 mL注射器)中へロードする(細胞70,000個を50,000用量についてロードし、細胞700,000個を500,000用量についてロードし、そして細胞1.4×106個を1×106用量についてロードする)。次いで、18G注射針をエクステンションチューブ(例えば、5〜10 cm)で置き換えてもよく、そしてエクステンションチューブを通して空気を除去する。90〜100μmの外径を有する先端(例えば、41G)を有する注射カニューレは、次いで、エクステンションチューブの末端へ取り付けられ得る。別の態様により、先端の内口径は約65〜75μm(例えば、約70μm)である。
【００８８】
注射針または注射カニューレ中へのローディング時のRPE細胞の濃度は、1μl当たり生細胞約2,000〜1μl当たり生細胞約14,000個であり得る。注射針または注射カニューレから送達される生存可能なRPE細胞の濃度は、1μl当たり生細胞約1,000個〜1μl当たり生細胞約10,000個であり得る。
【００８９】
特定の態様により、カニューレは41G先端を含む(Peregrineによって製造されるような例)。さらに別の態様により、カニューレは25Gカニューレである。
【００９０】
本発明は、18G注射針および25G/41Gカニューレを含む製品を提供する。そのようなデバイスは、RPE細胞の取り込み、およびその後のRPE細胞の眼内投与のために使用され得る。
【００９１】
デバイスは、エクステンションチューブ(例えば、約5〜15 cm)および注射器(例えば、1〜2 ml注射器)をさらに備え得る。
【００９２】
別の局面により、25G/41Gカニューレ、注射器(例えば、1〜2 ml注射器)およびエクステンションチューブ(例えば、約5〜15 cm)を含む製品を提供する。製品は18G注射針をさらに含み得る。
【００９３】
治療の効果は、視覚および眼の機能および構造の異なる指標によって評価され得、これらとしては、特に、最高矯正視力(BCVA)、暗および明順応状態における視野測定または微小視野測定によって測定されるような光に対する網膜感度、全視野、多焦点、焦点またはパターン網膜電図検査（elecroretinography）(ERG)、コントラスト感度、読取り速度、色覚、臨床生体顕微鏡検査、眼底撮影法、光干渉断層法(OCT)、眼底自発蛍光(FAF)、赤外線および多色イメージング、フルオレセインまたはICG血管造影、ならびに視覚機能および眼構造を評価するために使用される追加の手段が挙げられる。
【００９４】
対象には、RPE細胞の投与前にまたは投与と同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、プレドフォルテ（Predforte）などのコルチコステロイドが投与され得る。
【００９５】
別の態様により、対象には、RPE細胞の投与前にまたは投与と同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、プレドフォルテなどの、コルチコステロイドが投与されない。
【００９６】
免疫抑制薬は、治療前に、治療と同時に、および／または治療後に対象へ投与され得る。
【００９７】
免疫抑制薬は以下のクラスに属し得る：グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬(例えば、アルキル化薬または代謝拮抗薬)、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、イムノフィリンに作用する薬物(例えば、シクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムス)。追加の薬物としては、インターフェロン、オピオド（opiod）、TNF結合タンパク質、ミコフェノレートおよび小さな生物学的薬剤が挙げられる。
【００９８】
免疫抑制薬の例としては、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン(ALG)ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）(抗-IL-2Ra受容体抗体)、シクロスポリン(シクロスポリンA)、ダクリズマブ（登録商標）(抗-IL-2Ra受容体抗体)、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）(抗-CD20抗体)、シロリムス、タクロリムス、タクロリムスおよびまたはミコフェノール酸モフェチルが挙げられる。
【００９９】
抗生物質が、治療前に、治療と同時に、および／または治療後に、対象へ投与され得る。抗生物質の例としては、オフロックス（Oflox）、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トブレックス、ビガモックス、または眼使用を許可された任意の他の局所用抗生物質調製物が挙げられる。
【０１００】
「網膜色素上皮細胞」、「RPE細胞」、「RPE」は、文脈が許容する場合は交換可能に使用され得るが、網膜の色素上皮細胞層を形成する天然RPE細胞のそれと機能的に同様の細胞タイプの細胞を指す(例えば、眼内に移植されると、それらは天然RPE細胞のそれと同様の機能活性を示す)。従って、用語「網膜色素上皮細胞」、「RPE細胞」、または「RPE」は、網膜の色素沈着層の天然RPE細胞と、本開示に従ってヒト幹細胞(hSC)から指向分化した（directly differentiated）RPE細胞との両方を指すために使用され得る。
【０１０１】
用語「hSC由来RPE細胞」は、hSCからの指向分化によって得られるRPE細胞を表示するように本明細書において使用される。好ましい態様により、hSC由来RPE細胞は、本明細書以下に定義されるパラメーターによって示されるような機能的RPE細胞である。用語「指向分化」は、用語「RPE誘導分化」と交換可能に使用され、RPE細胞タイプへの分化を誘導／促進する培養条件下においてhSCを操作するプロセスを意味するものとして理解される。
【０１０２】
特定の態様により、RPE細胞は、TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーの存在下でのhSCの指向分化によって得られ、かつ、以下の特徴のうちの少なくとも1つを示す：
-分化の間、培養細胞はTGFβシグナル伝達に応答すること；
-RPE細胞は、最終分化を示すマーカー、例えば、ベストロフィン1、CRALBPおよび／またはRPE65を発現すること；
-移植に続いて(即ち、インサイチュで)、RPE細胞は、RPE細胞に隣接する光受容体を支持する栄養作用を示すこと；
-さらに、インサイチュで、RPE細胞は、これらの光受容体の正常な再生過程の一部としての脱落した光受容体外節の食作用によって機能することができること；
-さらに、インサイチュで、RPE細胞は、網膜関門を生成し、視サイクルにおいて機能することができること。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、句「幹細胞」は、特定の特殊機能を有する他の細胞タイプ(例えば、完全に分化した細胞)へ分化するように誘導されるまで、培養中で長期間未分化状態のままでいることができる細胞(例えば、多能性または多能幹細胞)を指す。好ましくは、句「幹細胞」は、胚性幹細胞(ESC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、成体幹細胞、間葉幹細胞および造血幹細胞を包含する。
【０１０４】
特定の態様により、RPE細胞はESCから生成される。
【０１０５】
句「胚性幹細胞」は、3つ全ての胚葉(即ち、内胚葉、外胚葉および中胚葉)の細胞へ分化することができるか、または未分化状態のままでいることができる、胚細胞を指す。句「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚組織(例えば、胚盤胞)から、胚の着床前に得られる細胞(即ち、着床前胚盤胞)；着床後／原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞(EBC)(WO2006/040763を参照のこと)；および妊娠中の任意の時点での、好ましくは妊娠10週より前の、胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖(EG)細胞を含み得る。本発明のいくつかの態様の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的に、ヒト体内着床前胚または体外受精(IVF)胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚は胚盤胞期へ拡大され得る。ヒトES細胞の単離のために、透明帯を胚盤胞から除去し、内細胞塊(ICM)をある手順によって単離し、ここで、栄養外胚葉細胞を溶解させ、穏やかなピペッティングによってインタクトなICMから除去する。次いで、ICMを、その増殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ中に平板培養する。9〜15日後、ICM由来増殖物を、機械的解離または酵素分解のいずれかによって凝集塊へ解離し、次いで、細胞を新鮮な組織培養培地上に再平板培養する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットによって個々に選択し、機械的に凝集塊へ解離し、再平板培養する。結果として生じるES細胞を、次いで、4〜7日毎にルーチンに分割する。ヒトES細胞の調製方法についてのさらなる詳細については、Reubinoff et al Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559; Thomson et al., [米国特許第5,843,780号; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; およびGardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998]を参照のこと。
【０１０６】
市販の幹細胞がまた本発明のいくつかの態様に従って使用され得ることが、認識されると考えられる。ヒトES細胞はNIHヒト胚性幹細胞登録機関から購入することができる[Hypertext Transfer Protocol://grants (dot) nih (dot) gov/stem_cells/registry/current (dot) htm]。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES 3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CTl、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNheml9、BJNhem20、SA001、SA001である。
【０１０７】
具体的な態様により、胚性幹細胞株はHAD-C102またはESIである。
【０１０８】
さらに、ES細胞は、マウス(Mills and Bradley, 2001)、ゴールデンハムスター[Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7]、ラット[Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92]、ウサギ[Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33]、いくつかの飼育動物種[Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67]および非ヒト霊長動物種(アカゲザルおよびマーモセット)[Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9]を含む、他の種から同様に得ることができる。
【０１０９】
拡張胚盤胞細胞(EBC)は、原腸形成前の段階の、受精後少なくとも9日の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、透明帯を消化し[例えばタイロード酸性溶液(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)による]、内細胞塊を露出させる。次いで、胚盤胞を、標準胚性幹細胞培養法を使用して、インビトロで、受精後少なくとも9日から多くとも14日の間(即ち、原腸形成事象前)、全胚として培養する。
【０１１０】
ES細胞を調製するための別の方法は、Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008に記載されている。この方法は、体外受精プロセスの間、胚から単細胞を除去することを含む。胚はこのプロセスにおいて破壊されない。
【０１１１】
ES細胞を調製するためのさらに別の方法は単為生殖によるものである。胚はこのプロセスにおいて破壊されない。
【０１１２】
現在実施されるES培養法は、幹細胞増殖に必要とされる因子を分泌し、一方でそれと同時に、それらの分化を阻害する、フィーダー細胞層の使用に主に基づく。例示的なフィーダー層としては、ヒト胚線維芽細胞、成体ファロピウス上皮細胞、初代マウス胚線維芽細胞(PMEF)、マウス胚線維芽細胞(MEF)、マウス胎仔線維芽細胞(MFF)、ヒト胚線維芽細胞(HEF)、ヒト胚性幹細胞の分化から得られるヒト線維芽細胞、ヒト胎児筋細胞(HFM)、ヒト胎児皮膚細胞(HFS)、ヒト成体皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、臍帯または胎盤から得られるヒト線維芽細胞、およびヒト骨髄間質細胞(hMSC)が挙げられる。ESCを未分化状態で維持するために、成長因子を培地へ添加してもよい。そのような成長因子としてはbFGFおよび／またはTGFβが挙げられる。
【０１１３】
フィーダー細胞を含まないシステムもまた、ES細胞培養において使用されており、そのようなシステムは、フィーダー細胞層の代替物として、血清代替物、サイトカイン、IL6、可溶性IL6受容体キメラおよび／または成長因子が補われたマトリックスを利用する。幹細胞は、培養培地の存在下で固体表面、例えば、細胞外マトリックス(例えば、Matrigel（登録商標）またはラミニン)上で成長させることができる。フィーダー細胞および幹細胞の同時成長を必要とし、混合細胞集団を生じさせ得るフィーダーに基づく培養とは異なり、フィーダーフリーシステムにおいて成長させた幹細胞は、表面から容易に分離される。幹細胞を成長させるために使用される培養培地は、MEF馴化培地およびbFGFなどの、有効に分化を阻害し、それらの成長を促進する因子を含有する。しかしながら、一般的に使用されるフィーダーフリー培養システムは、マウスもしくはウシ血清、またはMEF馴化培地が補われた動物ベースのマトリックス(例えば、Matrigel（登録商標）)を利用し[Xu C, et al. (2001). Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19: 971-4]、これは、ヒトES細胞への動物病原体交差移行の危険性を提示し、従って、将来の臨床適用を危険にさらす。
【０１１４】
RPE系統へESCを分化させるための多数の方法が公知であり、WO 2008/129554、2013/184809に記載されるもののような指向分化プロトコール、ならびに米国特許第8,268,303号および米国特許出願第20130196369号に記載されるもののような自発的分化プロトコールの両方を含み、各々の内容は参照により組み入れられる。
【０１１５】
特定の態様により、RPE細胞は、指向分化プロトコールを使用してESC細胞から生成される。
【０１１６】
ある例示的な分化プロトコールにおいて、胚性幹細胞を、第1分化物質を使用してRPE細胞系統へ分化させ、次いで、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバー（例えば、TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3サブタイプ、ならびに相同性リガンド、例えば、アクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB)、ノーダル（nodal）、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、いくつかの骨形態形成蛋白(BMP)、例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、ならびに成長分化因子(GDF)）を使用して、RPE細胞へさらに分化させる。具体的な態様により、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバーはアクチビンAであり、例えば、20〜200 ng/ml、例えば、100〜180 ng/mlである。
【０１１７】
特定の態様により、第1分化物質はニコチンアミド(NA)、例えば、1〜100 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば10 mMである。
【０１１８】
「ナイアシンアミド」としても公知であるNAは、ベータ細胞機能を保存および改善すると考えられている、ビタミンB3(ナイアシン)のアミド誘導体形態である。NAは化学式C6H6N2Oを有する。NAは成長およびエネルギーへの食物の変換に必須であり、それは関節炎治療ならびに糖尿病治療および予防において使用されてきた。
2020143137.tif 000003
【０１１９】
本開示の文脈において、用語NAはまた、NAの誘導体およびニコチンアミド模倣体を表示する。用語「ニコチンアミド(NA)の誘導体」は、本明細書において使用される場合、天然NAの化学修飾された誘導体である化合物を意味する。化学修飾としては、例えば、基本NA構造の(炭素または窒素環員による)ピリジン環上での置換、アミド部分の窒素または酸素原子による置換、ならびに、例えば、NAのチオベンズアミドアナログを形成するための、基の置き換えまたは削除が挙げられ得、これらの全ては有機化学の当業者によって認識される通りである。本発明の文脈における誘導体はまた、NAのヌクレオシド誘導体(例えば、ニコチンアミドアデニン)を含む。NAの様々な誘導体が、いくつかはまたPDE4酵素の阻害活性に関連して(WO03/068233; WO02/060875; GB2327675A)、またはVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害物質として(WO01/55114)、記載されている。例えば、4-アリール-ニコチンアミド誘導体を調製するプロセス(WO05/014549)。
【０１２０】
ニコチンアミド模倣体は、培地中でニコチンアミドの代わりに用いられ得る。ニコチンアミド模倣体は、多能性細胞からのRPE細胞の分化および成熟におけるニコチンアミドの効果を繰り返す任意の化合物を包含する。
【０１２１】
ニコチンアミド模倣体は、ニコチンアミドの修飾形態、およびニコチンアミドの化学的アナログを含む。例示的なニコチンアミド模倣体としては、安息香酸、3-アミノ安息香酸、および6-アミノニコチンアミドが挙げられる。ニコチンアミド模倣体として作用し得る化合物の別のクラスは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の阻害物質である。例示的なPARP阻害物質としては、3-アミノベンズアミド、イニパリブ(BSI 201)、オラパリブ(AZD-2281)、ルカパリブ(AG014699, PF-01367338)、ベリパリブ(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827、およびBMN-673が挙げられる。
【０１２２】
特定の態様により、分化は以下のとおりに行われる：
(a)第1分化物質(例えば、ニコチンアミド)を含む培地中におけるESCの培養；および
(b)TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えば、アクチビンA)および第1分化物質(例えば、ニコチンアミド)を含む培地中における、工程(a)で得られた細胞の培養。
【０１２３】
好ましくは、工程(a)は、TGFβスーパーファミリーのメンバーの非存在下で行われる。
【０１２４】
上述のプロトコールは、第1分化物質(例えば、ニコチンアミド)を含むが、TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えば、アクチビンA)を欠如している培地中で、工程(b)において得られた細胞を培養することによって継続され得る。この工程は本明細書において工程(c)と呼ばれる。
【０１２５】
上述のプロトコールを、追加の態様と共に、ここでさらに詳細に説明する。
【０１２６】
工程(a)：分化プロセスは、いったん十分な量のESCが得られると開始される。それらは、典型的に、(例えば、コラゲナーゼA、ディスパーゼ、TrypLE select、EDTAを使用することによって)接着性細胞培養物から除去され、ニコチンアミドの存在下で(かつアクチビンAの非存在下で)非接着性基材(例えば、細胞培養皿)上へ平板培養される。いったん細胞が非接着性基材(例えば、細胞培養皿)上へ平板培養されると、細胞培養物は細胞懸濁液と呼ばれ得る；好ましくは、懸濁培養中の浮遊性クラスター、即ち、ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の細胞の凝集物。浮遊性幹細胞の供給源はWO 06/070370において以前記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。この段階は、最低1日間、より好ましくは2日間、3日間、1週間またはさらには10日間、行われ得る。好ましくは、細胞は、ニコチンアミドと一緒に(かつアクチビンの非存在下で)懸濁液中で2週間超培養されることはない。
【０１２７】
好ましい態様により、細胞が非接着性基材上、例えば細胞培養皿上で培養される場合、大気酸素条件は、パーセンテージが約20%未満、15%未満、10%未満、より好ましくは約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、より好ましくは約5%となるように操作される。
【０１２８】
特定の態様により、細胞を、非接着性基材上において最初に通常の大気酸素条件下において培養し、次いで、通常の大気酸素条件未満へ低下させる。
【０１２９】
非接着性基材の例としては、フィブロネクチン、ラミニン、ポリD-リジンおよびゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
非接着性細胞培養皿の例としては、Hydrocell(例えば、カタログ番号174912)、Nuncなどによって製造されるものが挙げられる。
【０１３１】
工程(b)：指向分化の第1段階(工程a；即ち、低いまたは通常の酸素大気条件下での非接着性培養条件下におけるニコチンアミド(例えば、10 mM)の存在下での培養)に続いて、半分化細胞を、次いで、接着性基材上での分化のさらなる段階へ供する-ニコチンアミド(例えば、10 mM)およびアクチビンA(例えば、140 ng/ml、150 ng/ml、160 ng/mlまたは180 ng/ml)の存在下での培養。この段階は、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、行われ得る。好ましくは、この段階は約2週間行われる。分化のこの段階は、上記の本明細書において詳述されたような、低いまたは通常の大気酸素条件で行われ得る。
【０１３２】
工程(c)：指向分化の第2段階(即ち、接着性基材上でのニコチンアミドおよびアクチビンAの存在下での培養；工程(b))に続いて、さらに分化した細胞を、任意で、接着性基材上での分化のその後の段階へ供する-ニコチンアミド(例えば、10 mM)の存在下、アクチビンAの非存在下での培養。この段階は、少なくとも1日間、2日間、5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、またはさらには4週間、行われ得る。好ましくはこの段階は約1週間行われる。分化のこの段階もまた、上記の本明細書において詳述されたような、低いまたは通常の大気酸素条件で行われ得る。
【０１３３】
この分化工程に続いて、大気酸素条件を、任意で、通常の大気条件へ戻し、ニコチンアミド(例えば、10 mM)の存在下かつアクチビンAの非存在下で、少なくともあと1日間、少なくともあと2日間、少なくともあと5日間、少なくともあと1週間(例えば、最大2週間)培養してもよい。
【０１３４】
本発明に従う基本培地は、インビトロで細胞増殖を支持することについて当技術分野において公知の任意の公知の細胞培養培地であり、典型的に、生存可能な状態での培養における細胞の維持のために必要とされる塩、糖類、アミノ酸、および任意の他の栄養素を含む、規定される基礎液を含む培地である。本発明に従って利用され得る市販の基本培地の非限定的な例は、Nutristem(ESC分化のためのbFGFおよびTGFβを含まず、ESC拡大のためのbFGFおよびTGFβを含む)、Neurobasal（商標）、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、Cellgro（商標）幹細胞成長培地、またはX-Vivo（商標）を含む。基本培地には、細胞培養を扱う技術分野において公知の様々な薬剤が補われ得る。以下は、本開示に従って使用される培養系中に含められ得る様々な補充物への非限定的な言及である。
-血清または血清代替物含有培地、例えば、それらに限定されないが、ノックアウト血清代替物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCH（商標）、N2、N2派生物、もしくはB27、または組み合わせ。
-細胞外マトリックス(ECM)成分、例えば、それらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびゼラチン。ECMは、その際、成長因子のTGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを運ぶために使用され得る。
-抗菌剤、例えば、それらに限定されないが、ペニシリンおよびストレプトマイシン。
-非必須アミノ酸(NEAA)。
-培養中のSCの生存の促進において役割を果たすことが公知であるニューロトロフィン、例えば、それらに限定されないが、BDNF、NT3、NT4。
【０１３５】
好ましい態様により、ESCを分化させるために使用される培地は、Nutristem培地(Biological Industries, 05-102-1Aまたは05-100-1A)である。
【０１３６】
特定の態様により、ESCの分化はゼノフリー条件下において行われる。
【０１３７】
一態様により、増殖／成長培地は、ゼノ汚染物質を欠如しており、即ち、血清、動物由来の成長因子およびアルブミンなどの、動物由来成分を含まない。従って、この態様により、培養をゼノ汚染物質の非存在下で行う。
【０１３８】
ゼノフリー条件下においてESCを培養するための他の方法が米国特許出願第20130196369号に提供されており、この内容はその全体が組み入れられる。
【０１３９】
RPE細胞を含む調製物は、GMP(Good Manufacturing Practice)(例えば、調製物はGMP準拠である)および／または現行のGTP(Good Tissue Practice)(例えば、調製物はGTP準拠であり得る)に従って調製され得る。
【０１４０】
分化工程の間、胚性幹細胞は、それらの分化状態についてモニタリングされ得る。細胞分化は、分化を示すことが公知である細胞または組織特異的マーカーを調べることで決定され得る。
【０１４１】
組織／細胞特異的マーカーは、当技術分野において周知の免疫学的技法を使用して検出することができる[Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7]。例としては、膜結合型および細胞内マーカーについてのフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーについての免疫組織化学、ならびに分泌分子マーカー(例えば、PEDF)についての酵素免疫測定法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
従って、本発明の別の局面により、
(a)多能性幹細胞を生成するように、分化物質を含みトランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバーを欠如している培地中で分化細胞を生成する工程；
(b)トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバーおよび分化物質を含む培地中で分化細胞を培養して、RPE系統へさらに分化している細胞を生成する工程；
(c)RPE系統へさらに分化している細胞からの色素上皮由来因子(PEDF)の分泌を分析する工程；ならびに
(d)RPE細胞を生成するように、分化物質を含む培地中で、RPE系統へさらに分化している細胞を培養する工程
を含む、網膜上皮細胞を生成する方法を提供し、工程(d)は、PEDFの量が所定のレベルを上回る場合に行われる。
【０１４３】
好ましくは、PEDFのレベルが100 ng/ml/日、200 ng/ml/日、300 ng/ml/日、400 ng/ml/日、または500 ng/ml/日を上回る場合に、工程(d)は行われる。
【０１４４】
分化プロセスの間または後の細胞の有効性を決定するための別の方法は、バリア機能ならびに極性化されたPEDFおよびVEGF分泌を分析することによるものである。
【０１４５】
いったん細胞がRPE運命へ促進されると、RPE細胞は選択および／または拡大され得る。
【０１４６】
特定の態様により、選択は、負の選択、即ち、非RPE細胞の除去に基づく。これは、非色素細胞の除去によってまたは表面マーカーの使用によって機械的に行われ得る。
【０１４７】
別の態様により、選択は、正の選択、即ち、色素細胞の選択に基づく。これは、視覚分析または表面マーカーの使用によって行われ得る。
【０１４８】
さらに別の態様により、選択は、先ず負の選択に基づき、次いで正の選択に基づく。
【０１４９】
RPE細胞の拡大は、細胞外マトリックス、例えば、ゼラチンまたはコラーゲン、ラミニンおよびポリ-D-リジン上で行われ得る。拡大のために、細胞は、無血清KOM、血清含有培地(例えば、DMEM+20%)またはNutristem培地(06-5102-01-1 A Biological Industries)中で培養され得る。これらの培養条件下において、色素細胞は色素沈着を減らし、フィブロイド様形態を得る。高密度培養物へのさらに延長された培養および増殖に続いて、細胞は、特徴的な多角形形態を再び得、RPE細胞の色素沈着を増加させる。
【０１５０】
RPE細胞は、懸濁液中でまたは単層中で拡大され得る。単層培養物中におけるRPE細胞の拡大は、当業者に周知の方法によって、バイオリアクター中での大規模拡大へ改変され得る。
【０１５１】
本明細書に記載される方法に従って生成されたRPE細胞の集団は、多数の異なるパラメーターに従って特徴決定され得る。
【０１５２】
従って、例えば、得られたRPE細胞は、形状が多角形であり、色素沈着している。
【０１５３】
一態様により、得られたRPE細胞集団の細胞の少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはさらには100%は、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)の両方を同時発現する。
【０１５４】
特定の態様により、細胞は、PMEL17(SwissProt No. P40967)と、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP; SwissProt No. P12271)、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ(LRAT; SwissProt No. 095327)および性決定領域Y-ボックス9(SOX 9; P48436)からなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドとを、同時発現する。
【０１５５】
特定の態様により、当業者に公知の方法(例えば、FACS)によってアッセイされた場合、集団の細胞の少なくとも80%は、検出可能なレベルのPMEL17および上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、CRALBP)を発現し、より好ましくは、集団の細胞の少なくとも85%は、検出可能なレベルのPMEL17および上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、CRALBP)を発現し、より好ましくは、集団の細胞の少なくとも90%は、検出可能なレベルのPMEL17および上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、CRALBP)を発現し、より好ましくは、集団の細胞の少なくとも95%は、検出可能なレベルのPMEL17および上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、CRALBP)を発現し、より好ましくは、集団の細胞の100%は、検出可能なレベルのPMEL17および上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、CRALBP)を発現する。
【０１５６】
別の態様により、CRALBPおよび上述のポリペプチドのうちの1つ(例えば、PMEL17)の同時発現のレベル(例えば、平均蛍光強度によって測定された場合)は、非分化ESCと比較して、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍、さらにより好ましくは少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50増加している。
【０１５７】
一態様において、RPEは最終分化しており、Pax6を発現しない。
【０１５８】
別の態様において、RPE細胞は最終分化しており、Pax6を発現する。
【０１５９】
本明細書に記載されるRPE細胞はまた、移植後に機能的RPE細胞として作用し得、RPE細胞は、移植細胞を受容する患者において神経感覚網膜と脈絡膜との間に単層を形成する。RPE細胞はまた、隣接する光受容体へ栄養素を供給し、脱落した光受容体外節を食作用によって処分し得る。
【０１６０】
一態様により、単層中の細胞の経上皮電気抵抗は、100オームを上回る。
【０１６１】
好ましくは、細胞の経上皮電気抵抗は、150、200、250、300、300、400、500、600、700、800オームを上回るか、またはさらには900オームを上回る。
【０１６２】
経上皮電気抵抗(TEER)を測定するためのデバイスは、当技術分野において公知であり、例えば、EVOM2 Epithelial Voltohmmeter (World Precision Instruments)を備える。
【０１６３】
本明細書に開示される細胞集団は、未分化ヒト胚性幹細胞を欠如していることが、認識されると考えられる。一態様により、例えばFACSによって測定された場合、1:250,000未満の細胞がOct4+TRA-1-60+細胞である。細胞はまた、PCRによって測定された場合、GDF3またはTDGFの(5,000倍超)ダウンレギュレートされた発現を有する。
【０１６４】
本発明のこの局面のRPE細胞は、胚性幹細胞マーカーを発現しない。前記1つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、OCT-4、NANOG、Rex-1、アルカリホスファターゼ、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、および／またはTRA-1-81を含み得る。
【０１６５】
RPE調製物は、非RPE細胞に関して、実質的に精製されており得、少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のRPE細胞を含む。RPE細胞調製物は、本質的に、非RPE細胞を含まないかまたはRPE細胞からなり得る。例えば、RPE細胞の実質的に精製された調製物は、約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の非RPE細胞タイプを含み得る。例えば、RPE細胞調製物は、約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%、または0.0001%未満の非RPE細胞を含み得る。
【０１６６】
RPE細胞調製物は、非RPE細胞および他の成熟レベルのRPE細胞の両方に関して、実質的に純粋であり得る。調製物は、非RPE細胞に関して、実質的に精製されており得、成熟RPE細胞について富化されており得る。例えば、成熟RPE細胞について富化されたRPE細胞調製物中で、RPE細胞の少なくとも約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99%、または100%が成熟RPE細胞である。調製物は、非RPE細胞に関して、実質的に精製されており得、成熟RPE細胞ではなく分化RPE細胞について富化されており得る。例えば、RPE細胞の少なくとも約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、成熟RPE細胞ではなく分化RPE細胞であり得る。
【０１６７】
本明細書に記載される調製物は、HIV 1、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、パルボウイルスB19、エプスタイン-バーウイルス、またはヘルペスウイルス1および2、SV40、HHV5、6、7、8、CMV、ポリオーマウイルス、HPV、エンテロウイルスの存在を含むがこれらに限定されない、細菌、ウイルス、または真菌の汚染または感染を実質的に含まない場合がある。本明細書に記載される調製物は、マイコプラズマ汚染または感染を実質的に含まない場合がある。
【０１６８】
本明細書に開示される細胞集団を特徴決定する別の方法は、マーカー発現によるものである。従って、例えば、免疫染色によって測定された場合、細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%は、ベストロフィン1を発現する。一態様により、細胞の85〜100%はベストロフィンを発現する。
【０１６９】
別の態様により、免疫染色によって測定された場合、細胞の少なくとも80%、85%、87%、89%、90%、95%、97%、または100%は、小眼球症関連転写因子(MITF)を発現する。例えば、細胞の85〜100%はMITFを発現する。
【０１７０】
別の態様により、FACSによって測定された場合、細胞の少なくとも80%、85%、87%、89%、90%、95%、97%、または100%は、ペアードボックス遺伝子6(PAX-6)を発現する。
【０１７１】
本明細書に記載される細胞はまた、それらが分泌する因子の量および／またはタイプに従って特徴決定され得る。従って、一態様により、細胞は、好ましくは、ELISAによって測定された場合、1日1ml当たり500、1000、2000、3000、またはさらには4000 ng超の色素上皮由来因子(PEDF)を分泌する。特定の態様により、細胞は、1日1ml当たり約1250〜4000 ngの色素上皮由来因子(PEDF)を分泌する。
【０１７２】
本明細書において生成されたRPE細胞は、PEDFおよび血管内皮成長因子(VEGF)を極性化様式で分泌することが、認識されると考えられる。特定の態様により、PEDFの基底部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率は、1を上回る。特定の態様により、PEDFの基底部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率は、2を上回る。特定の態様により、PEDFの基底部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率は、3を上回るか、4を上回るか、5を上回るか、6を上回るか、7を上回るか、またはさらには8を上回る。さらに、VEGFの頂端分泌に対するVEGFの基底部分泌の比率は、1を上回る。特定の態様により、VEGFの頂端分泌に対するVEGFの基底部分泌の比率は、1.5、2、または2.5を上回る。
【０１７３】
細胞の安定性は別の特徴決定する特徴である。従って、例えば、PEDF分泌量は、2〜8℃における6時間、8時間、10時間、12時間、またはさらには24時間インキュベーション後に、細胞中で安定したままである(細胞をBSS+緩衝液中に製剤化する場合)。さらに、PEDFおよびVEGFの極性化分泌は、2〜8℃における6時間、8時間、10時間、12時間、またはさらには24時間インキュベーション後に、安定したままである(細胞をBSS+緩衝液中に製剤化する場合)。さらに、細胞のTEERは、2〜8℃における6時間、8時間、10時間、12時間、またはさらには24時間インキュベーション後に、細胞中で安定したままである(細胞をBSS+緩衝液中に製剤化する場合)。
【０１７４】
別の態様において、細胞は、それらの治療効果を特徴とする。従って、例えば、本発明者らは、細胞集団が、網膜下投与後にRCSラットにおける視力をレスキューすることができることを示した。さらに、細胞集団は、RCSラットにおいて網膜下投与後最大180日間、光受容体(例えば、錐体光受容体)をレスキューすることができる。
【０１７５】
RPE細胞の誘導は大きな利益であることが、当業者によって十分に認識されると考えられる。それらは、それらの生存、再生および機能を促進するための新薬の開発についてのインビトロモデルとして使用され得る。RPE細胞は、RPE細胞に対して毒性または再生効果を有する化合物についてのハイスループットスクリーニングに役立ち得る。それらは、光受容体細胞の発生、分化、維持、生存および機能に重要である機構、新しい遺伝子、可溶性または膜結合型因子を明らかにするために使用され得る。
【０１７６】
RPE細胞はまた、網膜変性における機能不全または変性RPE細胞の移植、補充、および支持のための無制限のRPE細胞源として役立ち得る。さらに、遺伝子操作されたRPE細胞は、遺伝子を運び、移植後に眼および網膜において遺伝子を発現するベクターとして役立ち得る。
【０１７７】
本開示の方法によって生産されるRPE細胞は、そのような細胞の大規模かつ／または長期培養のために使用され得る。この目的のために、本発明の方法は、細胞の大規模生産に適したバイオリアクター中で行われ、かつ、ここで、未分化hSCが本発明に従って培養される。バイオリアクター中における細胞の培養についての一般的な要件は当業者に周知である。
【０１７８】
細胞の採取は、当技術分野において公知の様々な方法によって行われ得る。非限定的な例としては、機械的解体およびパパインまたはトリプシンによる解離(例えば、TrypLE select)が挙げられる。当技術分野において公知の他の方法も適用可能である。
【０１７９】
「有効量」は、本明細書において使用される場合、疾患を治療するために患者へ投与される場合、疾患についてそのような治療を行うために十分である、化合物または細胞の量を広く指す。有効量は、予防処置に有効な量、および／または予防に有効な量であり得る。有効量は、徴候／症状を低減するために有効な量、徴候／症状の発症を予防するため、徴候／症状の発症の重症度を低減するため、徴候／症状の発症を排除するため、徴候／症状の発症の発生を遅らせるため、徴候／症状の発症の発生を予防するため、および／または徴候／症状の発症の予防処置を行うために有効な量であり得る。「有効量」は、疾患およびその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、感受性、および先在する異常に依存して変動し得る。用語「有効量」は、本開示の目的について「治療有効量」と同義である。
【０１８０】
本出願から成熟する特許の存続期間の間に、多くの関連する技術がRPE細胞の生成について開発されるであろうことが予想されるが、RPE細胞という用語は、そのような新しい技術の全てを先験的に含むように意図される。
【０１８１】
本明細書において使用される場合、用語「約」は±10%を指す。
【０１８２】
用語「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「有すること」、およびそれらの活用形は、「含むが限定されない」を意味する。
【０１８３】
用語「からなる」は、「含みかつ限定される」を意味する。
【０１８４】
用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、工程、および／または部分が特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変更しない場合にのみ、追加の成分、工程、および／または部分を含んでもよいことを意味する。
【０１８５】
本明細書において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に指定しない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「1つの化合物（a compound）」または「少なくとも1つの化合物」は、その混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
【０１８６】
本出願の全体にわたって、本発明の様々な態様は範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、部分範囲、例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示したものと見なされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。
【０１８７】
本明細書において使用される場合、用語「方法」は、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学の技術分野の当業者に公知であるか、これらの当業者によって公知の方式、手段、技法、および手順から容易に開発される、方式、手段、技法、および手順を含むがこれらに限定されない、与えられたタスクを達成するための方式、手段、技法、および手順を指す。
【０１８８】
本明細書において使用される場合、用語「治療する」は、無効にすること、実質的に抑制すること、異常の進行を遅らせるかもしくは逆転させること、異常の臨床的もしくは審美的症状を実質的に改善すること、または異常の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０１８９】
明瞭さのために、分離した態様の文脈に記載されている本発明のある特徴はまた、単一の態様において組み合わせて提供され得ることが、認識される。逆に、簡潔さのために、単一の態様の文脈において記載されている本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載される態様において適切なように、提供され得る。様々な態様の文脈において記載されるある特徴は、態様がそれらの構成要素なしでは動作不能となる場合を除いて、それらの態様の必須の特徴と見なされない。
【０１９０】
上記の本明細書において説明され、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて特許請求される本発明の様々な態様および局面は、下記の実施例において実験的支持を見出す。
【実施例】
【０１９１】
上記の説明と一緒に、非限定的な様式で本発明のいくつかの態様を示す、以下の実施例をここで参照する。
【０１９２】
一般に、本明細書において使用される命名法および本発明において利用される実験室手順は、分子、生化学、微生物学および組換えDNA技法を含む。そのような技法は文献において徹底的に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第4,666,828号; 同第4,683,202号; 同第4,801,531号; 同第5,192,659号、および同第5,272,057号に記載される方法論; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に広範囲に記載さており、例えば、米国特許第3,791,932号; 同第3,839,153号; 同第3,850,752号; 同第3,850,578号; 同第3,853,987号; 同第3,867,517号; 同第3,879,262号; 同第3,901,654号; 同第3,935,074号; 同第3,984,533号; 同第3,996,345号; 同第4,034,074号; 同第4,098,876号; 同第4,879,219号; 同第5,011,771号、および同第5,281,521号; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照のこと；これらの全ては、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み入れられる。他の一般的な参考文献が本文書の全体にわたって提供される。それらの中の手順は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９３】
実施例1
送達デバイス
研究目的：2つの網膜カニューレ：MedOne PolyTip 25ゲージ(G)注射針／38Gフレキシブルカニューレと、Peregrine 25(G)注射針／41Gフレキシブルカニューレとの性能を比較すること。
【０１９４】
実験設計：RPE細胞の凍結保存されたバイアル(細胞1.5×106個/バイアル/1 ml凍結細胞懸濁液)を解凍し、内容物を、20%ヒト血清を含有するDMEMへ静かに移し、濾過し、20%ヒト血清を含有するDMEMで再び洗浄し、次いでBSS Plusで洗浄した。次いで、細胞ペレットを0.5〜1 ml BSS Plus中に再懸濁し、トリパンブルー色素排除による生細胞計数を行った。送達デバイスによる注射に続いて、100〜150μl BSS Plus当たり生細胞50×103、200×103、または500×103個の意図される第I／IIa相臨床用量をもたらすであろう異なる細胞密度で、細胞を再懸濁した。送達デバイス中へのローディング前に、製剤化されたRPE細胞の外観を試験し、目に見える外来の粒子がないことを確認した。最終製剤中のRPE細胞を、滅菌18G注射針を使用して滅菌1 mL注射器中へロードした(図2A)。次いで、18G注射針を滅菌10 cmエクステンションチューブで置き換え(図2B)、エクステンションチューブを通して空気を除去し、滅菌25G/38Gカニューレ(MedOne)または25G/41Gカニューレ(Peregrine)をエクステンションチューブの末端へ取り付けた(図2C)。次いで、細胞の液滴がカニューレの先端に現れるまで、空気をカニューレから除去した。ある選択肢により、プランジャーを押し返し、10〜20μlの空気をカニューレの末端中へ挿入する。
【０１９５】
RPE細胞を、50μl/分のおよその速度にて100〜150μlのフラクションで送達した。細胞濃度、体積、送達後の生存率、および送達速度(体積/分)を、各研究において決定し、比較した。
【０１９６】
デバイスによる送達前後のRPE細胞の生命力および機能活性を決定した。
【０１９７】
注射1回当たり送達された実際の細胞用量の再現性を、3つのテスターによって、意図された臨床用量の各々(即ち、生細胞50×103、200×103、または500×103個／100〜150μl BSS Plus)について評価した。
【０１９８】
結果
MedOneカニューレの内径および外径は、それぞれ、99μmおよび120μmである。網膜カニューレPeregrine 25(G)注射針／41Gフレキシブルカニューレは、それぞれ、71μmおよび96.5μmのより小さな内径および外径を有する。MedOneおよびPeregrineカニューレを用いて同様の細胞回収率が見られた(下記表1を参照のこと)。
【０１９９】
【表１】
2020143137.tif 000004
【０２００】
Peregrine 25G/41Gを使用した高、中、および低臨床用量の回収についての初期細胞用量の決定：
上記データにより、Peregrine 25G/41Gを用いた高臨床細胞用量(細胞500,000個/100μl)の回収率は、78.8+/-4.6%(平均値+/-SD)であった。細胞500,000個/100μlの意図された高臨床細胞用量をもたらすために、いくつかの初期細胞用量を試験し、その中で、細胞507,296+/-81,803個/100μl(平均値+/-SD、n=6、3つのテスター)をもたらした細胞700,000個/100μlの初期細胞用量を、使用のために選択した。下記表2は、3つの異なるテスターによって得られたデータを要約する。
【０２０１】
【表２】
2020143137.tif 000005
【０２０２】
細胞200,000個/100μlの意図された中臨床細胞用量をもたらすために、細胞191,250+/-67,511個/100μl(平均値+/-SD、n=6、3つのテスター)をもたらした細胞270,000個/100μl(範囲細胞247,000〜292,000個/100μl)の初期細胞用量を、使用のために選択した。下記表3は、3つの異なるテスターによって得られたデータを要約する。
【０２０３】
【表３】
2020143137.tif 000006
【０２０４】
細胞50,000個/100μlの意図された低臨床細胞用量をもたらすために、細胞50,688 +/-6,533個/100μl(平均値+/-SD、n=5、3つのテスター)をもたらした細胞70,000個/100μlの初期細胞用量を、使用のために選択した。下記表4は、3つの異なるテスターによって得られたデータを要約する。
【０２０５】
【表４】
2020143137.tif 000007
【０２０６】
Peregrine 25G/41Gによる送達後のRPE有効性：
Peregrine 26G/41Gカニューレを適格とするために、細胞700,000個/100μlの高初期臨床用量で製剤化されたRPE細胞の有効性を、送達後に試験した。有効性を、極性化アッセイを使用して評価し、RPE細胞のバリア機能、ならびに色素上皮由来因子(PEDF)および血管内皮由来因子(VEGF)を極性化様式で分泌する能力を、トランスウェルシステムを使用して試験した。表5Aにおいて理解され得るように、バリア機能／経上皮電気抵抗(TEER)ならびにPEDFおよびVEGFの極性化分泌は、送達前後で同様であった。送達後の生存率および細胞濃度は予想の範囲内にあった(表5B)。
【０２０７】
【表５Ａ】
2020143137.tif 000008
【０２０８】
【表５Ｂ】
2020143137.tif 000009
【０２０９】
維持された極性化能力に加えて、送達後のRPE細胞生命力が保存された(データを示さず)。
【０２１０】
上記の本明細書に提示されるデータは、100μl当たり細胞50,000、200,000、および500,000個の意図される臨床用量でのPeregrine 25G/41Gカニューレの使用を支持している。これらの最終臨床用量に達するために、それぞれ、100μl当たり生細胞70,000、270,000、および700,000個の最終濃度のRPE細胞を調製し得る。
【０２１１】
細胞50,000個／50μlの低臨床用量の回収についての初期RPE細胞用量の決定：
RPE細胞70,000個/50μLの細胞用量を、細胞50,000個/50μLの意図される低臨床細胞用量をもたらす能力について最初に試験した。表6に示されるように、細胞70,000個/50μLの初期細胞用量は、細胞38,697±5,505個/50μL(平均値±SD、n=3、3つのテスター)をもたらし、これを調製した。平均回収率は55%±7.8%(平均値±SD、n=3、3つのテスター)であったため、また、細胞50,000個/50μLの意図される用量に達しなかったため、細胞100,000個/50μLの初期細胞密度を、第2の実験セットにおいて試験した。表7に示されるように、細胞100,000個/50μLの初期細胞用量は細胞62,517±4,625個/50μL(平均値±SD、n=3、3つのテスター; OpRegen（登録商標）Batch 5D)をもたらした。平均回収率は61%±4.5%(平均値±SD、n=3、3つのテスター)であった。
【０２１２】
【表６】
2020143137.tif 000010
【０２１３】
【表７】
2020143137.tif 000011
【０２１４】
実施例2
臨床実験
試験設計：4つのコホートに分割された、進行した乾燥型AMDおよび地図状萎縮(GA)を有する患者15人の単一施設第I/IIa相試験：20/200またはそれ未満の最高矯正視力を有する法律上盲目の患者3人からそれぞれなる、最初の3つのコホートは、それぞれ、コホート1つ当たり細胞50×103、200×103、および500×103個の連続的に上昇する投薬量を使用する、RPE細胞の単回網膜下注射を受ける。第4コホートは、20/100またはそれ未満の最高矯正視力を有する患者6人を含み、RPE細胞500,000個の単回網膜下注射を受ける。コホート内およびコホート間で間隔をずらすことを適用する。
【０２１５】
硝子体切除術に続いて、細胞を、小さな網膜切開によってカニューレを介して黄斑領域中の網膜下腔へ送達する。最大50〜150μlの細胞懸濁液の総体積を、GA拡大の危険性がある領域に注射する。
【０２１６】
外科手術と共に、患者は、以下からなる、軽い免疫抑制および抗生物質治療を受ける。
1．硝子体切除術後に通常通りの局所ステロイドおよび抗生物質治療：6週間にわたる一連の局所ステロイド療法(プレドフォルテ点眼薬を、漸減しながら、1日4〜8回)および局所抗生物質点眼薬(オフロックスまたは等価物を1日4回)。
2．全身性(PO)タクロリムス0.01 mg/kg/日(3〜7 ng/mlの血中濃度に達するように用量は調節される)、移植1週間前から移植後6週間まで継続する。
3．全身性(PO)ミコフェノール酸モフェチル、合計2 gr/日、移植2週間前から与え、移植後1年間継続する。
【０２１７】
患者を、細胞の投与後12ヶ月間にわたって、事前に予定された間隔で、評価する。試験後追跡を手術後15ヶ月、2、3、4、および5年で行う。免疫抑制処置に関連した副作用を発症する患者においては、これらの副作用を制御する試みがなされる(例えば、高血圧が発症する場合は血圧制御を改善する)。制御不可能な副作用の場合は、原因となる免疫抑制剤を用いる処置を、試験担当内科医と相談して修正する。
【０２１８】
包含基準：
1．年齢55歳またはそれ以上。
2．両眼における乾性(非血管新生型)加齢性黄斑変性の診断。
3．試験対象の眼においてサイズが0.5乳頭面積(1.25mm2および最大17 mm2)を超え、かつ他方の眼において0.5乳頭面積を超える、黄斑における地図状萎縮を伴う乾性AMDの眼底検査所見。
4．ETDRS視力検査による試験対象の眼の、コホート1〜3においては20/200またはそれ未満、コホート4においては20/100またはそれ未満の、最高矯正中心視力。
5．手術されない眼の視力は、手術される眼の視力を上回るかまたは手術される眼の視力でなければならないこと。
6．全ての試験関連処置に参加することを可能にしそして試験(医療記録)を完了するために十分に良好な健康を有する患者。
7．モニターされた麻酔管理の下で硝子体網膜外科手術を受ける能力。
8．正常な血球数、血液化学、凝固、および尿検査。
9．HIV、HBC、およびHCVについて陰性、CMV IgMおよびEBV IgMについて陰性。
10．(試験担当医の自由裁量で)年齢適合スクリーニング検査に基づいて現在の悪性疾患またはその病歴(治療が成功した皮膚の基底細胞癌／扁平上皮癌を除く)を有さない患者。
11．手術前の7日間、アスピリン、アスピリン含有製品および任意の他の凝固改変薬の服用を中止することが許される患者。
12．自発的に全ての将来の血液および組織提供を控えること。
13．インフォームドコンセントを理解することができ、自発的に署名すること。
【０２１９】
除外基準：
1．病歴による、ならびにいずれかの眼におけるベースラインでの、臨床検査、蛍光眼底血管造影(FA)、または光干渉断層法（ocular coherence tomography）(OCT)による、血管新生型AMDの証拠。
2．糖尿病性網膜症、血管閉塞、ブドウ膜炎、コーツ病、緑内障、白内障もしくは後極視覚化を妨げる混濁、または試験対象の眼における視力を危険にさらしたかもしくは危険にさらして主要転帰の解析を混乱させ得るAMD以外の任意の重大な眼疾患の病歴または存在。
3．試験対象の眼における網膜剥離修復の病歴。
4．-6ジオプターを上回る軸性近視。
5．過去3ヶ月間における試験対象の眼の眼科手術。
6．認知障害または認知症の病歴。
7．全身的な免疫抑制の禁忌。
8．試験対象の眼における脈絡膜新生血管と関連するAMD以外の任意の異常の病歴(例えば、病的近視または推定される眼ヒストプラズマ症) 。
9．以下の疾患について活動性であるかまたはその病歴：癌、腎臓病、糖尿病、過去12ヶ月間における心筋梗塞、免疫不全。
10．女性；妊娠または授乳期。
11．別の臨床試験への現在の参加。全身投与または眼投与される薬物の臨床試験への過去の参加(6ヶ月以内)。
【０２２０】
外科手術の安全性および忍容性ならびに細胞移植片の安全性を別々に評価する。手術の安全性の評価は以下の指標を含む：
1．治癒しない網膜剥離、
2．増殖性硝子体網膜症(PVR)、
3．網膜下、網膜または硝子体内出血、
4．手術部位での比較的まだ健康な網膜に対する損傷。
【０２２１】
細胞移植片の安全性および忍容性を、National Cancer Institute (NCI)採点システムに従って採点される以下の有害事象を使用して評価する：
1．奇形腫および／または腫瘍および／または異所性組織形成、
2．感染症、
3．ブドウ膜炎、脈管炎、またはPVR、
4．GAの加速した進行、
5．試験対象の眼における血管新生型AMDへの進行、
6．同種移植細胞に対する重篤な炎症反応。
【０２２２】
副次的予備的有効度エンドポイントを、移植片生存の持続および以下の検査によって測定する：
1．GA進行の速度、
2．移植された領域における網膜感度、中心暗点の程度および深さ、
3．視力の変化。
【０２２３】
外科手術：
RPE投与について選択される眼は、より悪い視覚機能を有する眼である。外科医の自由裁量でかつ患者と議論して、モニターされた静脈内鎮静を伴うかまたは全身麻酔を伴う、眼球後または眼球周囲麻酔ブロックによって、手術を行う。手術を受ける眼を、インスティチューションプロトコールに従って無菌様式で準備し、布で覆う。開瞼器を配置した後、標準3ポート硝子体切除術を行う。これは、23G注入カニューレおよび2つの23Gポートの配置を含む。硝子体腔内の注入カニューレを目視検査した後、注入ラインを開き、眼球構造が手術の全体にわたって維持されることを確実にする。次いで、注意深い中心部硝子体切除術を標準23 G器具で行い、続いて後部硝子体面を剥離する。これは後極への邪魔されないアクセスを可能にする。
【０２２４】
後極内の所定の部位で、好ましくは、GAの境界に近接してまだ比較的保存されている領域内の網膜を貫通して、RPEを網膜下腔へ導入する。血管を避ける。細胞を、50〜150μlの体積で、小さなブレブの形成を介して、網膜下腔へ送達する。
【０２２５】
送達システムは、10 cmエクステンションチューブを介してPeregrine 25G/41Gフレキシブル網膜カニューレへ連結されている1 mL注射器から構成される。
【０２２６】
硝子体腔中へ逆流された任意の細胞を除去し、流体-空気交換を行う。注入カニューレの除去前に、注意深い検査を行い、医原性の網膜の裂け目または破れ目が作られなかったことを確実にする。次いで、注入カニューレを除去する。結膜下抗生物質およびステロイドを投与する。眼をパッチおよびプラスチックシールドで覆う。外科的投与処置を記録する。
【０２２７】
用量：細胞50,000個/50μLまたは細胞50,000個/100μLの低用量、細胞200,000個/100μlの中用量、および細胞500,000個/100μlの高用量を使用する。用量選択は、前臨床試験において試験された最大実行可能用量の安全性、ならびに眼およびブレブサイズに基づいて計算されたヒト等価用量に基づいた。
【０２２８】
エンドポイントパラメーター：
1．外科手術の安全性：
持続性／再発性網膜剥離
増殖性硝子体網膜症(PVR)
出血
手術部位での比較的まだ健康な網膜に対する損傷
2．製品の安全性：
奇形腫、腫瘍、および／または異所性組織発生
増殖細胞の嵩高い移植片
感染症
移植片に対する重篤な炎症性免疫反応
GAの加速した進行
試験対象の眼における血管新生型AMDへの進行
3．有効度：
移植片生存の持続
GA進行速度の低下
移植された領域における光に対する網膜感度および暗点の深さ
視力
【０２２９】
本発明はその具体的な態様と共に記載されたが、多くの代替物、修飾物、および変形物が当業者に明らかであることが明白である。従って、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲に入る代替物、修飾物、および変形物の全てを包含することが意図される。
【０２３０】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照によりそれらの全体が本明細書へ組み入れられる。さらに、本出願におけるいかなる参考文献の引用または識別も、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であるという承認として解釈されない。セクションの見出しが使用される程度まで、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
2020143137.tif 000012
【図２】
2020143137.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥型の加齢性黄斑変性（AMD）を有する対象の網膜下へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質（PMEL17）および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（CRALBP）を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程
を含む、該対象を治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
[本発明1001]
乾燥型の加齢性黄斑変性(AMD)を有する対象の網膜下へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、工程
を含む、該対象を治療する方法。
[本発明1002]
網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒト多角形RPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、該対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回り、該治療有効量が投与1回当たり細胞50,000〜5,000,000個である、工程
を含む、該対象を治療する方法。
[本発明1003]
デバイスを使用して、網膜疾患または網膜異常を有する対象の網膜へ、ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象を治療する工程であって、該細胞を投与する該デバイスの外径が90〜100μmである、工程
を含む、該対象を治療する方法。
[本発明1004]
前記デバイスがカニューレである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記その細胞の少なくとも95%が、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)および細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を同時発現し、前記対象に対する該細胞の経上皮電気抵抗が100オームを上回る、本発明1003の方法。
[本発明1006]
前記治療有効量が投与1回当たり細胞50,000〜1,000,000個である、本発明1001または1003の方法。
[本発明1007]
前記治療有効量が、投与1回当たり細胞50,000個、投与1回当たり細胞200,000個、投与1回当たり細胞500,000個、および投与1回当たり細胞1,000,000個からなる群より選択される、本発明1002または1006の方法。
[本発明1008]
前記対象の網膜下腔へ前記細胞を投与する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
単回投与で前記細胞を投与する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記薬学的組成物が1μl当たり細胞500個〜1μl当たり細胞10,000個を含む、本発明1002または1007の方法。
[本発明1011]
前記量が投与1回当たり細胞50,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約500〜1000個を含む、本発明1002または1007の方法。
[本発明1012]
前記量が投与1回当たり細胞200,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約2,000個を含む、本発明1002または1007の方法。
[本発明1013]
前記量が投与1回当たり細胞500,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約5,000個を含む、本発明1002または1007の方法。
[本発明1014]
前記量が投与1回当たり細胞1,000,000個である場合、前記薬学的組成物が1μl当たり細胞約10,000個を含む、本発明1002または1007の方法。
[本発明1015]
前記網膜疾患または前記網膜異常が、色素性網膜炎、網膜剥離、網膜形成異常、網膜萎縮、網膜症、黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、マラッティア・レベンティネーズ（Malattia Leventinese）、ドイン蜂巣状ジストロフィー、ソーズビージストロフィー、パターン／蝶形ジストロフィー（pattern／butterfly dystrophy）、ベスト卵黄様ジストロフィー（Best vitelliform dystrophy）、ノースカロライナジストロフィー（North Carolina dystrophy）、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、網膜色素線条症、中毒性黄斑症、スタルガルト病、病的近視、色素性網膜炎、および黄斑変性からなる群より選択される、本発明1002または1003の方法。
[本発明1016]
前記疾患が加齢性黄斑変性である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記加齢性黄斑変性が、乾燥型の加齢性黄斑変性である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記対象が、
(i)55歳またはそれ以上であること；
(ii)少なくとも1つの眼において0.5乳頭面積（disc area）を超える、黄斑における地図状萎縮を伴う乾性AMDの眼底検査所見を有すること；
(iii)モニターされた麻酔管理の下で硝子体網膜外科手術を受けることができること；および
(iv)免疫不全症を有さないこと
からなる群より選択される基準のうちの少なくとも1つを満たす、本発明1001または1017の方法。
[本発明1019]
前記対象がAMD以外の網膜疾患を有さない、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記対象が基準(i)〜(iv)の各々を満たす、本発明1018または1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記細胞を投与する前記デバイスの外口径が90〜100μmである、本発明1001または1002の方法。
[本発明1022]
前記デバイスがカニューレである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記デバイスが注射針をさらに備える、本発明1004または1022の方法。
[本発明1024]
前記カニューレのゲージが25Gである、本発明1004または1022の方法。
[本発明1025]
集団中のOct4+TRA-1-60+細胞の数が1:250,000を下回る、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
免疫染色によって測定された場合、前記細胞の少なくとも80%がベストロフィン1（Bestropihn 1）を発現する、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
免疫染色によって測定された場合、前記細胞の少なくとも80%が、小眼球症関連転写因子(MITF)を発現する、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
FACSによって測定された場合、前記細胞の80%超がペアードボックス遺伝子6(PAX-6)を発現する、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記細胞が、1日1ml当たり500 ngを上回る色素上皮由来因子(PEDF)を分泌する、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記細胞が、PEDFおよび血管内皮成長因子(VEGF)を極性化（polarized）様式で分泌する、本発明1001〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
PEDFの基底部分泌に対するPEDFの頂端分泌の比率が1を上回る、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記比率が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記細胞の前記経上皮電気抵抗が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に100オームを上回ったままである、本発明1001、1002、または1005のいずれかの方法。
[本発明1034]
VEGFの頂端分泌に対するVEGFの基底部分泌の比率が1を上回る、本発明1030または1031の方法。
[本発明1035]
前記比率が、2〜8℃における8時間のインキュベーション後に1を上回ったままである、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記細胞が、網膜下投与後にRCSラットにおける視力をレスキューすることができる、本発明1001〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記細胞が、RCSラットにおいて網膜下投与後最大180日間、光受容体をレスキューすることができる、本発明1001〜1035のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記細胞をヒト胚性幹細胞のエクスビボ分化によって生成する、本発明1001〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記細胞を、
(a)分化細胞を生成するように、ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養すること；
(b)ニコチンアミドおよびアクチビンAを含む培地中で該分化細胞を培養して、RPE系統へさらに分化している細胞を生成すること；ならびに
(c)ニコチンアミドを含みアクチビンAを欠如している培地中で、RPE系統へさらに分化している該細胞を培養すること
によって生成する、本発明1001〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
bFGFおよびTGFβを含む培地中で、前記胚性幹細胞または前記人工多能性幹細胞を増殖させる、本発明1039の方法。
[本発明1041]
ヒト臍帯線維芽細胞上で前記胚性幹細胞を培養する、本発明1039の方法。
[本発明1042]
大気酸素レベルが約10%未満である条件下において、工程(a)〜(c)が行われる、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
工程(a)の前に、ニコチンアミドの存在下で大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
工程(c)の後に、ニコチンアミドの存在下で大気酸素レベルが約10%を上回る条件下において、培地中で前記分化細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1042または1043の方法。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは均等な方法および材料が本発明の態様の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む、本特許明細書が、制御する。さらに、材料、方法、および例は、説明のために過ぎず、必ずしも限定であるようには意図されない。