(57)【要約】      （修正有）【課題】動物から得られた抗体群の遺伝子情報のなかから、抗原特異抗体の遺伝子情報を選抜する方法を提供する。【解決手段】抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程、配列データグループから分子系統樹を作成する工程及び分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を含む。オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である。【選択図】図９
2020177529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法であって、
免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；
前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；及び
前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程；
を含み、
前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、特定方法。
【請求項２】
前記準備工程で取得される配列データグループが、配列決定後の配列データグループであり、
前記準備工程が、同一の配列を示す複数の配列データを１つの配列データ（以下「ユニーク配列データ」という）に集約する工程を含み、
前記ユニーク配列データは、前記配列データに示される配列に関する情報、及び集約した配列データの個数に関する情報（以下「出現頻度（集約）」という）を含む、請求項１に記載の特定方法。
【請求項３】
前記配列データグループが、前記ユニーク配列データで構成されるユニーク配列データグループであり、
前記ユニーク配列データが塩基配列データであり、
前記ユニーク配列データグループ中、出現頻度（集約）が最も大きいユニーク配列データを基準配列データ（ｎ＝０）とし、前記基準配列データの配列（以下「基準配列」という）と同じ長さであるが、前記基準配列に対してｎ個（ｎ＝１、・・・ｍ）の塩基置換を有する配列を有するユニーク配列データを照会配列データとし、
前記準備工程が、前記基準配列データの出現頻度（集約）に対する前記照会配列の出現頻度（集約）の比率が閾値未満の照会配列を、前記基準配列データに統合する工程を含む、請求項２に記載の特定方法。
【請求項４】
前記準備工程が、
前記配列データグループ中の配列データを、配列長及び前記動物に対応する動物種のゲノム配列上のオリジナル配列のいずれか一方又は両方に基づいてクラス分けする工程；及び
前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程、
のいずれか一方又は両方を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の特定方法。
【請求項５】
前記準備工程が、前記統合工程、前記クラス分け工程、及び前記除外工程の順で実施することを含む、請求項４に記載の特定方法。
【請求項６】
前記オリジナル配列に基づくクラス分けが、
前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方と、前記動物に対応する動物種のゲノム配列とのホモロジー検索により得られた配列一致度を算出する工程、及び
前記配列データを、最も高い配列一致度を示す遺伝子断片に関するクラスに割り当てる工程を含む、請求項４または５に記載の特定方法。
【請求項７】
前記配列一致度の変化が、単位時間当たりの配列一致度の変化であり、及び抗体の種類の変化が抗体のクラススイッチである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特定方法。
【請求項８】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターか否かを判定する判定システムであって、
制御部と、記憶部とを備え、
前記記憶部は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納しており、
前記制御部は、
前記配列データグループから分子系統樹を作成する分子系統樹作成部と、
前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する配列データ判定部と
を含み、
前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、判定システム。
【請求項９】
抗原特異抗体を作製する方法であって、
免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；
前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；
前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程；
抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスターから、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；及び
選出された配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程；
を含む、作製方法。
【請求項１０】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する方法であって、
免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；及び
配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程； 
を含み、
前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、
前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、
前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、選出方法。
【請求項１１】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する選出システムであって、
制御部と、記憶部とを備え、
前記記憶部は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納しており、
前記制御部は、
前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する処理を実行すること含む、配列データ準備部と、
前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する処理を実行することを含む、配列データ選出部と
を含み、
前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、判定システム。
【請求項１２】
抗原特異抗体を作製する方法であって、
免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；
配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；及び
選出された配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程；
を含み、
前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、
前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、
前記配列一致度が閾値未満の場合に、前記配列データを、抗原特異抗体を示す配列データとして選出し、
前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法に関する。本発明はまた、抗原特異抗体を含む配列クラスターか否かを判定する判定システム、及び抗原特異抗体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、医薬分野及び分子生物学分野を含む多くの分野で利用されている生体分子である。例えば、医薬分野では治療薬及び診断薬として利用され、分子生物学分野では抗原精製用の担体及び／又は検出用試薬として利用さている。
【０００３】
抗原特異的なモノクローナル抗体は、さまざまな方法により取得することができる。例えば、抗原特異的なモノクローナル抗体は、抗原を投与した動物から取得したＢ細胞（Ｂ  ｃｅｌｌｓ）とミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）を作製し、前記ハイブリドーマの中から前記抗原に対して所定の反応性を示す抗体産生ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を選抜することを含むスクリーニング法により得ることができる。
【０００４】
また、ファージディスプレイ法及びリボソームディスプレイ法などのバイオパニング方法を用いて、抗原特異的な抗体の候補を含む抗体ライブラリーから特定の抗原に対して所定の反応性を示す抗原特異的なモノクローナル抗体を得ることができる。
【０００５】
近年、遺伝子配列の大規模かつ迅速な測定を可能にする様々なシークエンサー（「次世代シークエンサー」ともいう）が開発され、市販されている。従来のバイオパニング方法と次世代シークエンサーによる解析された遺伝子情報とを組合せ、抗原特異的な抗体を迅速かつ効率的にスクリーニングする方法が報告されている（特許文献１）。
【０００６】
バイオパニングを行うことなく、特定のリンパ節で増加した免疫細胞から次世代シークエンサーで解析して得られた遺伝子情報から、高頻度に検出されたものについて抗原特異的なモノクローナルを得る方法も報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−１１９６３７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２０１５（５）１３９２６：１−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１記載の方法のように、特定の臓器で高頻度に検出される抗体の遺伝子情報だけに着目したのでは、例えば、低頻度であるが高い親和性と抗原特異性をあわせ持つ有用な抗原特異的な抗体を見落とすことになる。
【００１０】
本発明者らは、抗原を投与した動物から複数の時点で得られた抗体群の遺伝子情報のなかで、時間経過に伴って変異の蓄積が大きい抗体集団を選抜することで、抗原特異抗体の遺伝子情報を選抜できることを見出し、本発明を完成させた。本発明者らは、さらに、抗原を投与した動物から複数の時点で得られた抗体集団の遺伝子情報から、効率的に抗原特異抗体の遺伝子情報を取得する方法を見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、以下に関する：
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；及び、前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、特定方法。
【００１２】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターか否かを判定する判定システムであって、制御部と、記憶部とを備え、前記記憶部は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納しており、前記制御部は、前記配列データグループから分子系統樹を作成する分子系統樹作成部と、前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する配列データ判定部とを含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、判定システム。
抗原特異抗体を作製する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程；抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスターから、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；及び、選出された配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程を含む、作製方法。
【００１３】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；及び、配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程を含み、前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、選出方法。
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する選出システムであって、制御部と、記憶部とを備え、前記記憶部は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納しており、前記制御部は、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含む、配列データ準備部と、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含む、配列データ選出部とを含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、判定システム。
【００１４】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；及び配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；を含み、前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、選出方法。
【００１５】
抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する選出システムであって、制御部と、記憶部とを備え、前記記憶部は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納しており、前記制御部は、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する処理を実行すること含む、配列データ準備部と、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する処理を実行することを含む、配列データ選出部とを含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、判定システム。
【００１６】
抗原特異抗体を作製する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；及び、選出された配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程を含み、前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、前記配列一致度が閾値未満の場合に、前記配列データを、抗原特異抗体を示す配列データとして選出し、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、作製方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、バイオパニングなどの実験手法を用いることなく、迅速に且つ効率的に、抗体作製の候補となる抗原特異抗体の遺伝子情報を取得することができる。また、本発明の他の態様によれば、取得された遺伝子情報に基づいて、迅速に且つ効率的に、抗原特異的な抗体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】配列決定の過程で生じ得る配列決定の誤りの統合を示す一連のグラフ。図１ａは、特定の基準配列データα（ｎ＝０）と、前記基準配列データαの配列（以下「基準配列α」という）と同じ配列長であるが、前記基準配列に対してｎ個（ｎ＝１〜５）の塩基置換を有する配列の配列データ（以下「照会配列データ」という）とを含む、基準配列αに関するヒストグラムである。図１ｂは、基準配列αに関するヒストグラムの階級値の分布（実線）がポアソン分布に関する確率密度関数（破線）に従うことを示す折れ線グラフである。図１ｃは、基準配列データαに、照会配列データ（ｎ＝１〜５）を統合した後の棒グラフである。図１ｄは、図１ａの基準配列データαとは別の基準配列データβと、前記基準配列データβの基準配列βと同じ配列長であるが、基準配列βに対してｎ個（ｎ＝１〜５）の塩基置換を有する配列の照会配列データ（ｎ＝１〜５）とを含む、基準配列βに関するヒストグラムである。図１ｅは、基準配列データβとは別の基準配列データγ（ｎ＝２）及び基準配列γから派生したと推定される配列を有する照会配列データを除外した後の、基準配列βに関するヒストグラムである。図１ｆは、図１ｄの基準配列βのヒストグラムから除外された基準配列データγと照会配列データとを含む、基準配列γに関するヒストグラムである。
【図２】図２ａは、抗体の可変領域の配列長に基づいたクラス分けを示す折れ線グラフである。図２ｂは、図２ａ中の配列長３５４ｂｐの配列データを、Ｖ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片に基づいてクラス分けした表である。
【図３】図３ａは、図２ｂにおいてクラス分けした配列データグループ（Ｖ遺伝子断片はｖｈｈ３−Ｓ１であり、Ｊ遺伝子断片はｉｇｈＪ−４である）について、配列クラスター非形成性配列データの除外を行わなかった場合の分子系統樹である（Ｕ４０≧０）。図３ｂは、４０個までの塩基置換を有する配列データの数が１０未満の配列データの除外を行った場合の分子系統樹である（Ｕ４０≧１０）。図３ｃは、４０個までの塩基置換を有する配列データの数が５０未満の配列データの除外を行った場合の分子系統樹である（Ｕ４０≧５０）。図３ａ〜３ｃにおいて、赤丸（濃色）はＩｇＧ２の配列データを示し、緑丸（淡色）はＩｇＧ３の配列データを示し、各丸の大きさは出現頻度（統合）を表す。
【図４】図４ａは、分子系統樹からの配列クラスターを抽出するための分子系統樹である。図４ｂは、図４ａの分子系統樹から抽出された９個の配列クラスター（ｂ１〜ｂ９）を示す図である。
【図５】図５ａは、配列長３７２ｂｐに基づくクラス分け配列データグループ（Ｖ遺伝子断片はＶＨＨ３−Ｓ８であり、Ｊ遺伝子断片はｉｇｈＪ−６である）について作成された分子系統樹である。図５ｂは、配列長３５４ｂｐに基づくクラス分け配列データグループ（Ｖ遺伝子断片はｖｈｈ３−Ｓ１であり、Ｊ遺伝子断片はｉｇｈＪ−４である）について作成された分子系統樹である。図５ｃ及び図５ｄはそれぞれ、図５ａ及び図５ｂ中、赤丸で示された（曲線で丸く囲われた）配列クラスター中の各配列データのビットスコアと採血のタイミングとの関係を示す散布図である。図５ｅ及び図５ｆはそれぞれ、図５ａ及び図５ｂの系統樹中の赤丸で示された（曲線で丸く囲われた）配列クラスター中の配列データから再構築した抗体の結合力を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図６】図６ａは、配列長３８１ｂｐに基づくクラス分け配列データグループ（Ｖ遺伝子断片はＶＨＨ３−Ｓ８であり、Ｊ遺伝子断片はｉｇｈＪ−６である）について作成された分子系統樹である。部６ｂは、図６ａ中の赤丸で示した（曲線で丸く囲われた）配列クラスター中の配列データのビットスコアと採血のタイミングとの関係を示す散布図である。図６ｃは、図６ａの系統樹中の赤丸で示された（曲線で丸く囲われた）配列クラスター中の配列データについて作成した分子系統樹、並びに、前記分子系統樹中の破線矢印で示した配列データ（ｃ１、ｃ２、ｃ３）から再構築した抗体の結合力を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図７】実施形態２に係る判定システム１の概略構成を示すブロック図。
【図８】実施形態２に係るデータベース１０７の概略構成を示すブロック図。
【図９】実施形態２に係る配列データグループの準備ステップを示すフローチャート。
【図１０】実施形態２に係る配列ライブラリー準備ステップを示すフローチャート。
【図１１】実施形態２に係る配列決定の誤りの統合ステップを示すフローチャート。
【図１２】実施形態２に係る統合用配列データの選出ステップを示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［定義］
本明細書において「配列データ」は、抗体の一部若しくは全部をコードする塩基配列、又はそれらのアミノ酸配列に関する情報（「配列情報」又は単に「配列」ともいう）を少なくとも含む、コンピュータに読み取り可能な電子データであって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列情報を含む電子データを意味する。抗体の配列データは、例えば、免疫刺激を受けた可能性のある動物から採取した血液サンプルに存在したリンパ系細胞から、公知の配列決定法又は市販の配列決定装置を用いて取得することができる。血液サンプルは、例えば、動物から採取した全血、血漿又は血清、若しくは抗体を単離するための処理が施されたサンプルであってよい。公知の配列決定法は、例えば、サンガー法に基づく解析方法であってよい。市販の配列決定装置は、例えば、イルミナ社のＭｉｓｅｑ又はＨｉＳｅｑ  ４０００などの次世代シークエンサーであってよい。
【００２０】
抗体の配列情報は、限定するものではないが、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする塩基配列若しくはそのアミノ酸配列に関する情報を含む。抗体の配列情報は、例えば、ＣＤＲを少なくとも含む抗体の可変領域（Ｖ領域）の一部をコードする塩基配列若しくはそのアミノ酸配列に関する情報を含む。配列データは、前記塩基配列若しくはアミノ酸配列に関する情報に加えて、例えば、配列決定の品質に関する情報（「品質スコア」ともいう）、抗体を採取した時期に関する情報、抗体を採取した動物種に関する情報を含んでもよい。
【００２１】
本明細書において「配列データグループ」は、抗体の配列情報を有する複数の配列データの集まりを意味する。配列データグループは、限定するものではないが、次世代シークエンサーによる配列決定により得られた各抗体の配列情報を有する膨大な数の配列データの集まり（「配列決定後の配列データグループ」ともいう）であってよい。配列決定後の配列データは、例えば、同一の動物から異なる時期に取得された配列データの集まりを複数個組み合せたものであってよい。配列データグループは、例えば、配列決定後の配列データグループに対して、後述のクリーンアップ、ユニーク配列データへの集約、配列決定の誤りの統合、クラス分け、及び配列クラスター非形成性配列データの除去のいずれか単独の工程又は２以上の組合せの工程若しくは全ての工程を行って生成される配列データの集まりであってもよい。膨大な数の配列データは、例えば、１万〜１０００万個、１０万〜８００万個、１００万〜７００万個、又は２００万〜６００万個の配列データであってよい。
【００２２】
本明細書において「ユニーク配列」は、ある配列データグループ内で、配列の並び及び配列長が同じ配列情報を有する唯一の配列データを意味する。ユニーク配列データは、限定するものではないが、配列決定後の配列データグループ内に、配列の並び及び配列長が同じ配列情報を有する２個以上の配列データが存在した場合に、後述のユニーク配列データへの集約処理を実行して得られた配列データグループ内に、前記した配列の並び及び配列長に加えて、集約された配列データの個数に関する情報を更に有する唯一つの配列データであってよい。他の例において、配列決定後の配列データグループ内に、配列の並び及び配列長が同じ配列情報を有する配列データがその１個のみであった場合、配列データグループ内に、前記した配列の並び及び配列長に加えて、集約された配列データの個数が１個であるとの情報を更に有する唯一の配列データであってよい。
【００２３】
本明細書において「次世代シークエンサー」は、膨大な数の遺伝子断片の配列情報を同時に決定できる配列決定装置を意味する。膨大な数の遺伝子断片は、限定するものではないが、１０万断片以上、例えば３０万断片以上、１００万断片以上、３００万断片以上、１０００万断片以上、３０００万断片以上、１億断片以上であって、例えば２億断片以下、１億断片以下、５０００万断片以下の遺伝子断片であってよい。遺伝子断片の鎖長は、限定するものではないが、３０ｂｐ〜１０００ｂｐの間、例えば９００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下であってよい。次世代シークエンサーにより配列情報が決定された抗体断片の配列データは、限定するものではないが、品質スコアを有してもよい。
【００２４】
本明細書において「抗体」は、所定の抗原に対する結合能を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の全部もしくは一部を意味する。抗体は、限定するものではないが、免疫グロブリン分子を構成する重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）のうち可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質である。抗体は、例えば、完全抗体、抗体断片、キメラ抗体を含む。抗体のタイプは、限定するものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥであってよい。ＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスであってよい。
【００２５】
本明細書において「抗体断片」は、所定の抗原に対する結合能を有する抗体の一部を意味する。抗体断片は、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。抗体断片は公知の方法により製造することができる。Ｆａｂは、例えば、完全抗体から公知の酵素処理により製造することができる。
【００２６】
本明細書において「キメラ抗体」は、所定の抗原に対する結合能を有する、２以上のタンパク質の全部又は一部が結合した融合タンパク質を意味する。キメラ抗体は、限定するものではないが、ヒト以外の種由来の抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト由来の抗体の定常領域（Ｃ領域）とを連結させた抗体、又はヒト以外の種由来の抗体のＣＤＲとＣＤＲ以外のヒト抗体部分とを連結させた抗体（「ヒト化抗体」ともいう）を含む。キメラ抗体は公知の方法により製造することができる。キメラ抗体は、例えば、遺伝子工学的手法により遺伝子を連結することで製造することができる。
【００２７】
本明細書において「抗原特異抗体」は、所定以上の結合力でもって目的とする抗原に結合する抗体を意味する。結合力は、限定するものではないが、解離定数（ＫＤ）、親和性定数（ＫＡ）、結合速度定数（ｋｏｎ）、又は解離速度定数（ｋｏｆｆ）により示される。結合力は、公知の方法若しくは市販の測定装置により測定することができる。市販の測定装置は、例えば、ＧＥヘルスケア社のＢｉａｃｏｒｅであってよい。
【００２８】
所定の結合力は、限定するものではないが、１０−５Ｍ以下、好ましくは１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下の解離定数（ＫD）であってよい。所定の結合力は、限定するものではないが、目的の抗原に対しては前記解離定数を示し、前記抗原以外の物質とは、１０−５Ｍ以上、好ましくは１０−４Ｍ以上、又はより好ましくは１０−３Ｍ以上の解離定数を示すことであってよい。
【００２９】
抗原特異抗体は、例えば、所定の抗原に対して１０−７Ｍ以下の解離定数を示し、前記抗原以外の物質とは１０−４Ｍ以上の解離定数を示す。抗原特異抗体は、例えば、所定の抗原に対して１０−８Ｍ以下の解離定数を示し、前記抗原以外の物質とは１０−３Ｍ以上の解離定数を示す。抗原特異抗体は、例えば、抗原に対して１０５Ｍ−１・ｓ−１以上、好ましくは１０６Ｍ−１・ｓ−１以上の結合速度定数を有する。抗原特異抗体は、例えば、抗原から１０−３ｓ−１以下、好ましくは１０−４ｓ−１以下の解離速度定数を有する。
【００３０】
本明細書において「可変領域（Ｖ領域）」は、免疫グロブリン分子のアミノ（Ｎ）末端側約１１０残基のアミノ酸からなる部分を意味する。Ｈ鎖の可変領域はＶＨと表され、Ｌ鎖の可変領域はＶＬと表される。本明細書において「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決める領域を意味する。ＣＤＲは、限定するものではないが、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のポリペプチド鎖中にそれぞれ３カ所に分離し存在し、Ｈ鎖ではＨ１、Ｈ２及びＨ３と表され、Ｌ鎖ではＬ１、Ｌ２及びＬ３と表される。
【００３１】
本明細書において「定常領域（Ｃ領域）」は、可変領域（Ｖ領域）以外の免疫グロブリン分子の部分を意味する。本明細書において「Ｖ遺伝子」及び「Ｃ遺伝子」はそれぞれ、可変領域（Ｖ領域）をコードする遺伝子、及び定常領域（Ｃ領域）をコードする遺伝子を意味する。
【００３２】
本明細書において「Ｖ−Ｊ組換え」は、Ｂ細胞の分化の過程で、Ｖ遺伝子断片とＪ遺伝子断片とが連結し、抗体の可変領域を形成する過程を意味する。本明細書において「ＶＤＪ組換え」は、Ｖ遺伝子断片とＪ遺伝子断片との間にさらにＤ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）遺伝子断片が連結されてＨ鎖が形成される過程を意味する。本明細書において「Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え」は、Ｖ−Ｊ組換え及び／又はＶＤＪ組換えを意味する。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えでは、ゲノム配列上に存在する複数種類のＶ遺伝子断片、及び複数種類のＪ遺伝子断片、場合により複数種類のＤ遺伝子断片からそれぞれ１つずつ組合される際に、塩基の欠失又は付加がそれらの連結部位でランダムに生じ得る。
【００３３】
本明細書において「Ｖ遺伝子断片」及び「Ｊ遺伝子断片」はそれぞれ、免疫グロブリンポリペプチド鎖の可変領域（Ｖ領域）の一部をコードする遺伝子を意味する。免疫グロブリンのＨ鎖のＶ領域は１１０〜１２０個のアミノ酸からなり、その遺伝子は、Ｎ末端から９０〜１００個のアミノ酸をコードする部分（ＶＨ）、続く数個のアミノ酸をコードする部分（ＤＨ）、残り十数個のアミノ酸をコードする部分（ＪＨ）の３つの遺伝子断片（ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ）から構成される。免疫グロブリンのＬ鎖のＶ領域は、Ｄ遺伝子断片を含まず、Ｖ遺伝子断片（ＶＬ）及びＪ遺伝子断片（ＪＬ）から構成される。
【００３４】
本明細書において「親和性成熟」は、抗体が免疫対象の抗原に示す親和性が、免疫後の時間経過とともに増加する現象を意味する。親和性成熟は、限定するものではないが、抗原で刺激されることで活性化したＢ細胞が急速に増殖する過程で、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域に点変異が生じることにより生じ得る。親和性成熟における変異では、限定するものではないが、Ｖ領域のＣＤＲに１細胞世代あたり約１つの変異が導入され得る。
【００３５】
本明細書において「オリジナル配列」（「始原配列（primordial sequence）」又は「祖先配列（ancestral sequence）」とも称される）は、抗体の配列と、その抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列を意味する。配列一致度が最も高い配列は、類似する配列が複数存在する場合に、それらの類似配列中で、配列一致度が最も高い配列を意味する。オリジナル配列の文脈において、抗体の配列は、限定するものではないが、抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方である。オリジナル配列は、例えば、抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度がホモロジー検索で示された複数の類似配列のうち、配列一致度が最も高い遺伝子断片単独又は組合せである。
【００３６】
本明細書において「ホモロジー検索」は、問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して、類似した配列をデータベースから探し出す操作を意味する。ホモロジー検索は、限定するものではないが、公知のプログラムにより実行される。そのような公知のプログラムは、例えば、ＦＡＳＴＡプログラム、ＢＬＳＡＴプログラム、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを含む。配列一致度の算出は、塩基配列又はアミノ酸配列のいずれに対しても行うことができる。
【００３７】
本明細書において「配列一致度」は、２つの配列間で配列が一致する度合いを示す指標を意味する。配列一致度は、限定するものではないが、配列一致の数、配列同一性、又は配列同一性に基づくスコア値である。他の例において、配列一致度は、配列不一致の数、配列不一致性、又は配列不一致性に基づくスコア値である。配列一致度は、限定するものではないが、ギャップペナルティを用いて算出される。
【００３８】
配列一致の数又は配列不一致の数は、問い合わせ配列と類似した配列との間で一致した又は不一致となった塩基若しくはアミノ酸の個数を意味する。配列同一性又は配列不一致性は、問い合わせ配列の長さに対する一致した又は不一致となった塩基若しくはアミノ酸の個数の割合（＝［一致した又は不一致となった塩基若しくはアミノ酸の個数］／［問い合わせ配列の長さ］）を意味する。スコア値は、配列同一性又は配列不一致性をスコア化した数値を意味する。
【００３９】
配列同一性のスコア化は、限定するものではないが、スコア行列を用いて行われる。塩基配列の一致及び不一致をスコア化するスコア行列は、例えば、各塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）が置換される確率を一定とするＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ６９モデル、Ｋｉｍｕｒａ８０モデル、Ｔａｍｕｒａ９２モデル、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉ９３モデル、一般時間反転可能モデル（ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｉｍｅ−ｒｅｖｅｒｓａｌ：ＧＴＲ）モデルがある。アミノ酸配列の一致及び不一致をスコア化するスコアモデルは、例えば、ＰＡＭ行列（例えばＰＡＭ２５０）、ＢＬＯＳＵＭ行列（例えばＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ８０）がある。
【００４０】
本明細書において「同一の配列」は、配列の並びが同一であり、且つ、配列長が同じ塩基配列又はアミノ酸配列を意味する。
【００４１】
本明細書において「配列一致度の変化」は、抗原投与後の時間経過に伴って、配列データグループ中の抗体の配列データに示される配列とそのオリジナル配列との配列一致度が変化すること意味する。配列一致度の変化は、例えば、配列一致度の傾きである。配列一致度の傾きは、採血プロトコル開始時から終了時までの経過時間に対する配列一致度の変化、又は第１回目の採血から採血終了までの採血回数あたりの配列一致度の変化であってよい。
【００４２】
本明細書において「抗体種類の変化」は、抗原投与後の時間経過に伴って、抗体のクラスが変化することを意味する。抗体種類の変化は、例えば、抗体のクラススイッチである。一例において、抗体のクラススイッチを示す指標は、ある採血の際に示された抗体集団中の抗体クラスの割合（例えば、［ＩｇＧ２の種類］／［抗体集団中のＩｇＧクラスの種類］）と、その採血後に示される抗体集団中の抗体クラスの割合との差である。
【００４３】
本明細書において「分子系統樹」は、抗体の配列に関する分岐関係を示す図を意味する。分子系統樹は、限定するものではないが、星状系統樹又は無限系統樹である。分子系統樹は、限定するものではないが、抗体のアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列をコードする塩基配列に関する情報に基づいて作成される。分子系統樹は、公知の方法により作成することができる。分子系統樹を作成するための方法は、例えば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄａｖｉｄ Ｍｏｕｎｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｇｕｓｔ １６，２００４））に記載の方法を用いることができる。
【００４４】
一例において、分子系統樹は、距離行列に基づいて作成することができる。距離行列に基づいて作成する場合、分子系統樹は、近接結合法、平均距離法又は最小進化法を用いて作成することができる。他の例において、分子系統樹は、距離行列を用いずに作成することができる。距離行列を用いずに作成する場合、分子系統樹は、最大節約法、最尤法又はベイズ推定を用いて作成することができる。分子系統樹は、限定するものではないが、公知のソフトウェア（例えば、統計分析ソフトウェア「Ｒ」のａｐｅパッケージ）、ＭＥＧＡＸ（https://www.megasoftware.net/）を用いて作成することができる。分子系統樹は、配列データグループに対して実行することができる。分子系統樹の作成は、例えば、クラスター形成性配列データグループに対して実行される。他の例において、分子系統樹の作成は、限定するものではないが、後述する配列クラスター中の配列データグループに対して実行してもよい。
【００４５】
本明細書において「配列クラスター」は、分子系統樹において、その内部に他とは区別できるような形で相互に結びついた集団（サブグループ）を意味する。配列クラスターは、限定するものではないが、ネットワーク分析の分野で用いられるサブグループを探索する公知の方法を用いて見つけ出すことができる。配列クラスターを見つけ出す方法は、例えば、分離したそれぞれの配列を連結する成分の数に基づいて探索する方法、及び、分子系統樹内部で配列情報の密度が高い部分を取り出す方法がある。これらの方法は、例えば、公知のプログラムにより実行することができる。そのような公知のプログラムとしては、例えば、Ｓｎａパッケージ、及びＩｇｒａｐｈパッケージを用いることができる。一例において、配列クラスターは、分子系統樹における分岐点（連結点ともいう）と分岐点とを結ぶ枝（Ｂｒａｎｃｈ、ｅｄｇｅ）の長さが所定の値以上である場合に、それらの分岐点間の所定の位置から分子系統樹の中心から外側の領域を配列クラスターとして抽出してもよい。
【００４６】
本明細書において「抗体作製の候補」は、配列データグループ又は抗原特異抗体を含むと判定された配列クラスターに存在する配列データを意味する。一例において、抗体作製の候補は、抗原特異抗体を含むと判定された配列クラスターに存在する配列データであってよい。一例において、抗体作製の候補は、クラス分け及び配列クラスター非形成性配列データの排除を行った後に生成された配列グループに存在する配列データであってよい。
【００４７】
本明細書において「抗体作製」又は「抗体を作製する」は、抗体を製造することを意味する。抗体は、公知の方法により製造することができる。公知の方法としては、例えば、国際特許公報ＷＯ９９／１８２１２を参照することができる。抗体は、例えば、目的のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を公知の蛋白質発現ベクターに挿入して抗体発現用のプラスミドを構築し、前記プラスミドを所定の宿主に導入し、前記宿主中に目的の抗体を発現させることにより製造又は作製することができる。宿主中に発現させた抗体は、公知の方法により回収及び精製できる。目的のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片は、発現させる宿主のコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ又はｃｏｄｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に応じて最適化できる。
【００４８】
本明細書において「抗原」又は「免疫（抗）原」は、抗体又は感作リンパ球を産生させて体液性免疫又は細胞性免疫を誘発する物質を意味する。抗原は、限定するものではないが、その動物の体外から体内に導入された物質であってもよく、又はその動物の体内で産生されたものであってもよい。体外から体内に導入される抗原としては、例えば、興味あるタンパク質性の物質、細菌、又はウイルスであってよい。体内で産生される抗原としては、例えば、突然変異又は外来遺伝子に由来して産生タンパク質性の物質、又は放射線照射等の外的要因により変性されたタンパク質であってよい。
【００４９】
本明細書において「免疫刺激を受けた可能性のある動物」は、限定するものではないが、所定の抗原が投与された動物、放射線照射を受けた動物、ウイルス感染を受けた可能性のある動物を含む。所定の抗原が投与された動物は、例えば、その動物種に関して一般に用いられる公知の投与プロトコル（投与回数、投与間隔、投与量／回）に従って、興味のあるタンパク質抗原が投与された動物である。特定の動物種について公知の投与プロトコルが存在しない場合、投与プロトコルは、当業者が近縁の動物種の公知の投与プロトコルを参照して、適宜設定できる。抗原は、少なくとも１回動物に投与される。抗原は、例えば、その動物において、抗体の親和性成熟が期待される回数投与される。抗原が２回以上投与される場合、それらの抗原の投与間隔は、一定間隔であってもよく不定間隔であってもよい。
【００５０】
ウイルス感染を受けた可能性のある動物は、例えば、インフルエンザウイルスなどのウイルスが流行している地域に存在する動物を含む。放射線照射を受けた動物は、例えば、放射線治療を受けた動物を含む。限定するものではないが、腫瘍に対する放射線治療を受けた動物では、免疫刺激の結果親和性成熟を経た抗体が得られる場合がある。放射線治療のプロトコルは、当業者であれば、放射線を照射すべき部位の状態及び放射線照射を受ける胴部の状態に応じて適宜設定することができる。
【００５１】
本明細書において「動物」は、限定するものではないが、軟骨魚類、鯨偶蹄類動物、げっ歯類動物、又は霊長類動物である。軟骨魚類は、例えば、サメ、エイ、およびギンザメを含む。鯨偶蹄類動物は、例えば、アルパカ及びラクダを含むラクダ科動物、ブタを含むイノシシ科動物、並びにウシ、ヤギ及びヒツジを含むウシ科動物を含む。鯨偶蹄類動物は、好ましくはアルパカである。げっ歯類動物は、例えば、ウサギを含むウサギ目動物、並びにマウス及びラットを含むネズミ目動物を含む。げっ歯類動物は、好ましくはウサギである。霊長類動物は、例えば、キツネザルを含む原猿類動物、ニホンザルを含むオナガザル科動物、並びにヒト、チンパンジー及びゴリラを含むヒト科動物である。霊長類は、例えば、非ヒト動物又はヒトである。霊長類は、好ましくはヒトである。
【００５２】
本明細書において「動物種」は、ある動物が属する生物学的種を意味する。動物種のゲノム配列は、限定するものではないが、公知のデータベース上に格納されたゲノム配列であってよい。公知のデータベースは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）、Ｅｎｔｒｅｚ（ＮＣＢＩ）、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣＢＩ）を用いることができる。
【００５３】
以下に、本発明の態様に係る実施形態について説明するが、これらの実施形態は本発明の例示であり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【００５４】
［実施形態１］
本発明の第１の態様は、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法を提供する。本発明の第１の態様の１つの実施形態（以下「実施形態１」という）について以下に説明する。
【００５５】
＜配列データグループの準備＞
前記特定方法は、免疫刺激を受けた動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程を含む。前記配列データグループを準備する工程は、特定の配列データグループを取得することを含み、場合により、取得した配列データグループに対して後述するクリーンアップなどの工程を行い、新たな配列データグループを生成することをさらに含む。
【００５６】
（配列決定後の配列データグループ）
配列データグループを準備する工程は、限定するものではないが、配列決定後の配列データグループを取得することを含む。配列決定後の配列データグループは、例えば、興味ある抗原が投与されて免疫刺激を受けた動物から異なる時期にｉ回（ｉ＝１、２、３・・・）取得された抗体集団の各抗体の配列を配列決定した配列情報を有する配列データの集まり（Ｘｉ）である。配列決定後の配列データグループの取得は、例えば、配列データグループをコンピュータに読み込ませることを含む。ｉは、限定するものではないが、１〜１５の間の整数である。ｉは、例えば、３〜８の間の整数、３、４、５、６、７又は８である。複数の抗体集団を取得する時期の間隔は一定間隔であってもよく又は不定間隔であってもよい。
【００５７】
配列決定後の配列データグループは、例えば、興味ある抗原がアジュバントとともに２週間隔で５回投与されたアルパカから、抗原投与前に１回、抗原投与間隔の間に１回ずつ、抗原投与後に１回の計６回採取された血液サンプル中のリンパ系細胞から得られた各抗体の配列データの集まりであってよい。配列決定後の配列データグループは、例えば、約３００万個の配列データを含む。
【００５８】
（アミノ酸配列を示さない配列データ等のクリーンアップ）
動物の体液（例えば、血液、リンパ液）中のリンパ系細胞から配列決定により得られた抗体の配列データには、例えばＶ（Ｄ）Ｊ組換え過程などで読み取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）がシフトしてアミノ酸配列を示さない遺伝子の配列情報を有する配列データが含まれ得る。
【００５９】
配列データグループの準備工程は、限定するものではないが、配列データグループから、アミノ酸配列を示さない配列データを除外（クリーンアップ）する工程を含む。このクリーンアップ工程は、例えば、抗体の可変領域部分又は前記部分を含む領域をコードする塩基配列が３の倍数でない塩基配列データを、配列データグループから除外することにより行われてよい。クリーンアップ工程を配列データグループに対して行うことで、アミノ酸配列を示す配列データの集まり（以下「クリーンアップ配列データグループ」ともいう）が生成される。また、クリーンアップ工程により、配列データグループにおける配列データの数を減少させることができる。
【００６０】
クリーンアップは、場合により、品質スコアに基づいて、配列データグループから所定の品質スコア未満の配列データを除外する工程をさらに含んでもよい。品質スコアに基づくクリーンアップは、塩基配列情報又はアミノ酸配列情報を有する配列データに対して行うことができる。
【００６１】
（ユニーク配列データへの集約）
動物から取得された抗体集団には、同一の配列を有する抗体が複数含まれ得る。従って、前記抗体集団を配列決定して得られる配列データの集まり（配列決定後の配列データグループ）には、同一の配列情報を有する配列データが複数含まれ得る。
【００６２】
配列データグループの準備工程は、限定するものではないが、同一の配列情報を含む複数の配列データを、前記配列情報を含む１つの配列データ（以下「ユニーク配列データ」という）に集約する工程を含む。ユニーク配列データは、集約した配列データの個数（以下「出現頻度（集約）」という）に関する情報も含む。集約工程を配列データグループに対して行うことで、ユニーク配列データの集まり（以下「ユニーク配列データグループ」という）が生成される。集約工程により、配列データグループにおける配列データの数を減少させることができる。
【００６３】
（配列決定の誤りの統合）
配列決定により得られた配列情報には、配列決定に付随する過程で生じるランダムなエラーが含まれ得ることが知られている。このランダムなエラーは、例えば、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅及び配列決定時のＤＮＡ複製を含むＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成過程、及び／又は蛍光画像からのシグナル解析過程を含む様々な過程で生じ得る。配列決定の過程で生じるランダムなエラーを有する配列情報に関する配列データを、配列決定の対象である遺伝子の配列（「本来の配列」ともいう）を示す配列データ（以下「統合ユニーク配列データ」という）に統合する。統合ユニーク配列データは、ユニーク配列データに含まれた情報に加えて、統合された配列データに含まれる出現頻度（集約）の合計値に関する情報（以下「出現頻度（統合）」という）をさらに含む。この統合工程を配列データグループに対して行うことで、統合ユニーク配列データの集まり（以下「統合ユニーク配列データグループ」という）が生成される。統合工程により、配列データグループにおける配列データの数を減少させることが可能となる。
【００６４】
配列データグループの準備工程は、限定するものではないが、配列決定の誤りを統合する工程を含む。配列決定の誤りの統合は、例えば、出現頻度（集約）を有する配列データの集まりにおいて、出現頻度（集約）が最も大きい配列データ（以下「基準配列データ」という）とし、前記基準配列データの配列（以下「基準配列」という）と同じ長さであるが、前記基準配列に対してｎ個の塩基置換を有する配列の配列データ（以下「照会配列データ」という）とし、前記基準配列データの出現頻度（集約）に対する前記照会配列データの出現頻度（集約）の比率が閾値未満の照会配列データを、前記基準配列データに統合する工程を含む。
【００６５】
前記統合工程は、前記基準配列と同じ長さの配列を有する配列データを、配列決定の誤りの統合を行う配列データグループから予め選出して、統合用配列データグループを生成する工程をさらに含んでよい。
【００６６】
配列決定の誤りの統合を、ユニーク配列データに対して実行する場合について説明する。ユニーク配列データグループ中で、本来の配列を示す（又は配列決定の誤りがない）ユニーク配列データに示される塩基配列を「基準配列」とする。前記ユニーク配列データグループ中のユニーク配列データの塩基配列であって、基準配列と同一の配列長を有し、基準配列とは配列が別の塩基配列を「照会配列」とする。
【００６７】
照会配列の塩基配列が基準配列の塩基配列の配列決定の誤りにより生じたものである場合に、照会配列を示すユニーク配列データを、基準配列を示すユニーク配列データに統合する。照会配列が基準配列の配列決定の誤りにより生じたものであるか否かを、照会配列と基準配列が出現する確率の比を計算することにより判定する。
【００６８】
例えば、配列長ｋの塩基配列のｎ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率をｐｎとする。配列決定の誤りが生じない確率（Ｐ０）は、以下の式で表すことができる。
【数１】
2020177529.tif 000003
配列長ｋの塩基配列のｉ番目の塩基に１カ所誤りが生じる確率（Ｐｉ）は以下の式で表すことができる。
【数２】
2020177529.tif 000004
【００６９】
また、配列長ｋの塩基配列のｉ番目及びｊ番目の塩基に２カ所誤りが生じる確率（Ｐｉｊ）は以下の式で表すことができる。
【数３】
2020177529.tif 000005
同様にして、「基準配列」と「照会配列」とで３カ所以上の塩基に誤りが生じる確率も計算できる。
【００７０】
配列長ｋの塩基配列に関する「基準配列」と「照会配列」とで、例えば、ｉ番目の塩基が１カ所異なっていた場合、塩基配列はＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの４種類から構成されるので、任意の塩基から別の塩基へ変化する場合の数は３である。上述のように基準配列が出現する確率をＰ０とした場合、照会配列が生じる確率は以下の式で表すことができる。塩基置換の種類によって確率が変わることもありうるが、ここでは、すべての塩基置換が同じ確率で生じるとした。
【数４】
2020177529.tif 000006
【００７１】
また「基準配列」と「照会配列」とで、例えば、i番目の塩基とｊ番目の塩基の２カ所が異なっていた場合、照会配列が生じる確率は以下の式で表すことができる。
【数５】
2020177529.tif 000007
同様にして、「基準配列」と「照会配列」とで３カ所以上の塩基が異なっていた場合の照会配列が生じる確率も計算できる。
【００７２】
ここで、基準配列の出現頻度（集約）をＦ０とし、基準配列より派生した配列の出現頻度（集約）の総和をＦｔｏｔａｌとすると、「基準配列」が出現する確率Ｐ０は以下のように表すことができる。
【数６】
2020177529.tif 000008
【００７３】
また、照会配列の出現頻度（集約）をＦｑｕｅｒｙとすると、「照会配列」が生じる確率は以下のように表すことができる。
【数７】
2020177529.tif 000009
【００７４】
［数６］及び［数７］から以下の式が導かれる。
【数８】
2020177529.tif 000010
［数６］〜［数８］は、前記ユニーク配列データグループにおける各配列データの出現頻度（集約）から計算することができる。
【００７５】
ｉ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉの値が明らかになれば、［数４］、［数５］で示した式を変形して、「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」を計算することができる。例えば、塩基配列の違いがｉ番目の塩基に１箇所のみの場合、［数４］及び［数６］から以下の式が導かれる。
【数９】
2020177529.tif 000011
【００７６】
また、塩基配列の違いがｉ番目とｊ番目の塩基の２カ所の場合は［数５］及び［数６］から以下の式が導かれる。
【数１０】
2020177529.tif 000012
同様にして、「基準配列」と「照会配列」との塩基配列の違いが３カ所以上の場合も、「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」を計算することができる。
【００７７】
照会配列の塩基配列が基準配列の塩基配列の配列決定の誤りにより生じたものであるか否かを判定するにあたって、［数９］又は［数１０］の右辺の計算値から、「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」に関する閾値（以下「閾値（確率）」ともいう）を設定することができる。前記閾値（確率）は、［数９］又は［数１０］の右辺の計算値よりも大きい値に適宜設定することができる。例えば、ユニーク配列データグループから計算できる［数８］の計算値が、閾値（確率）以下であれば、照会配列を基準配列に統合する。他方、［数８］の計算値が、閾値（確率）よりも大きな値であれば、照会配列は基準配列に統合しない。
【００７８】
塩基配列のｉ番目に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉの導出方法を以下に説明する。［数１］〜［数１０］では、配列長ｋの塩基配列においてｉ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉについて説明してきたが、ｐｉは実験ごとに決定される値である。
基準配列と照会配列との塩基配列の違いが、ｎ番目の塩基に１カ所のみある場合、ｉ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉは［数２］を変形することによって、以下の式で表される。
【数１１】
2020177529.tif 000013
【００７９】
ここで、塩基配列のｉ番目の塩基が１カ所のみ異なる塩基配列の出現頻度（集約）の総和をＦｉとした場合、Ｐｉは以下の式で表せる。
【数１２】
2020177529.tif 000014
また、ｐｉは［数６］、［数１１］及び［数１２］より以下の式で表すことができる。
【数１３】
2020177529.tif 000015
【００８０】
以上で導出されたｉ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉの計算方法を以下に説明する。まず、ユニーク配列データグループ中のユニーク配列データを出現頻度（集約）で降順に並び替え、出現頻度（集約）が第１位のユニーク配列データの塩基配列を基準配列とする。基準配列の出現頻度（集約）が［数１３］におけるＦ０となる。次に、基準配列の塩基配列と配列長が同じであるが、ｉ番目の塩基のみ異なる塩基配列を有するユニーク配列データを、前記ユニーク配列データグループから選出し（ここで、ｉ番目の塩基のみが異なるユニーク配列は、塩基の種類が４種類存在するため、最大３種類のユニーク配列データが選出され得る）、それらのユニーク配列データの出現頻度（集約）を合計する。この合計値は［数１３］におけるＦｉとなる。Ｆ０及びＦｉの値がそれぞれ得られので、それらの値を［数１３］に代入することで、ｐｉを計算することができる。
【００８１】
配列長ｋの塩基配列のｉ番目の塩基における配列決定の誤りを統合する工程を、ｉ＝１〜ｋまで繰り返すことで、ユニーク配列データグループにおいて、出現頻度（集約）が第１位のユニーク配列データについてのｐｉ（ｉ＝１〜ｋ）の値が得られる。次に、ユニーク配列データグループにおいて、出現頻度（集約）が第２位のユニーク配列データを基準配列として、上記と同じ計算を行い、出現頻度（集約）が第２位のユニーク配列データについてのｐｉ（ｉ＝１〜ｋ）の値が得られる。同様に、第３位、第４位・・・のユニーク配列データについても計算して、基準配列とされた各ユニーク配列データに関してｐｉの値が得られる。
【００８２】
得られた数多くのｐｉの値の統計値に基づいて閾値（確率）を設定してもよい。例えば得られた数多くのｐｉの値から外れ値を取り除いた後の複数のｐｉの値から平均値又は中央値を得て、その値から閾値（確率）を計算してもよいし、又は前記値に基づいて適宜設定してもよい。本明細書において「外れ値」は、複数の値から大きく外れた値を意味する。外れ値は、限定するものではないが、標準偏差、スミルノフ・グラブス、又はトンプソン検定に基づいて検出することができる。一例において、外れ値は、スミルノフ・グラブスにより検出される。
【００８３】
（クラス分け）
抗体は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程、次いで、親和性の成熟の過程を経て、成熟することが知られている。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程で、様々な配列長の抗体が生成され得る。親和性成熟の過程で、配列長は同一であるがアミノ酸配列が異なる様々な抗体が、親和性成熟の過程で生成され得る。追加の免疫刺激による抗体の成熟過程を追跡するにあたって、抗体集団の配列データを、配列長ごとにクラス分けし、並びに、Ｖ遺伝子領域及びＪ遺伝子領域ごとに抗体の配列データをクラス分けすることで、抗原特異抗体を示す配列データを効率的に見つけ出すことが可能になり得る。
【００８４】
配列データグループの準備工程は、限定するものではないが、配列データグループ中の配列データを、配列長及び前記動物に対応する動物種のゲノム配列上のオリジナル配列のいずれか一方又は両方に基づいてクラス分けする工程を含む。前記クラス分けする工程により、対応する配列データを含むクラスで構成された、クラス分け配列データグループが生成される。
【００８５】
配列データグループ中の配列データは、例えば、配列長及び前記動物種のゲノム配列上のオリジナル配列の組合せに基づいてクラス分けされる。配列長に基づくクラス分けは、例えば、配列データグループ中の配列データを、配列データに示される配列長に基づいて、対応する配列長に関するクラスにそれぞれ割り当てることを含む。オリジナル配列に基づくクラス分けは、例えば、配列データグループ中の配列データを、配列データに示される抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方と、前記動物に対応する動物種のゲノム配列とのホモロジー検索により得られた配列一致度に基づいて、前記配列データを配列一致度が最も高い遺伝子断片（すなわち、オリジナル配列）に関するクラスにそれぞれ割り当てることを含む。前記配列一致度は、例えば、配列の同一性、又は配列の同一性に関するスコア値である。
【００８６】
（配列クラスター非形成性配列データの除外）
親和性成熟の過程を考慮すれば、親和性成熟を受けてより高い親和性を示す抗原特異抗体は、分子系統樹解析を行った場合、その抗体の配列と類似する配列を有し、且つ比較的高い親和性を有する一連の抗体とともに、分子系統樹にて配列クラスターを形成すると考えられる。反対に、親和性成熟を受けていない比較的低い親和性を示す抗体は、その抗体の配列と類似する配列を有する抗体は少なく又はほとんどなく、分子系統樹解析を行った場合、その抗体は分子系統樹にて配列クラスターを形成しないと考えられる。従って、配列クラスターを形成しないと推定される抗体の配列データ（以下「配列クラスター非形成性配列データ」という）を配列データグループから予め除外することで、抗原特異抗体の配列情報を有する配列データを高効率に見つけ出すことが可能になり得る。
【００８７】
配列データグループ準備工程は、限定するものではないが、配列データグループから配列クラスター非形成性配列データを除外し、配列クラスター形成性データグループを生成する工程を含む。配列クラスター非成形性配列データの除外は、配列データグループ中の特定の配列データに示される配列に対して、所定の配列一致度を有する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データ（配列クラスター非形成性配列データ）を前記配列データグループから除外する工程を含む。
【００８８】
一例において、所定の配列一致度は、配列同一性である。配列同一性を９０％とし、配列データの個数に関する閾値を２０とした場合、配列クラスター非形成性配列データの除外は、配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と９０％の配列同一性を有する配列データの数が閾値（２０）未満の場合、その配列データは、前記配列データグループから除外される。この除外工程が繰り返された配列データグループには、ある配列と９０％の配列同一性を示す配列を有する配列データが２０個以上存在する配列データの集まりとなる。そのような配列データグループには、親和性成熟を受けた抗原特異抗体を示す配列データが非常に効率的に含まれると期待される。
【００８９】
他の例において、所定の配列一致度は、配列不一致の数である。配列不一致の数を、配列データに示される配列長の１０％に相当する数値としてよい。例えば、配列長が４００ｂｐの場合、その１０％に当たる４０を配列不一致度の数としてよい。配列不一致度の数を４０とし、配列データ数に関する閾値を１０とした場合（Ｕ４０＜１０）、配列クラスター非形成性配列データの除外は、配列データグループ中の特定の配列データに示される配列に対して不一致となる塩基又はアミノ酸が４０個まで有する配列データの数が閾値（１０）未満の場合、その配列データは、前記配列データグループから除外される。この除外工程が繰り返された配列データグループには親和性成熟を受けた抗原特異抗体を示す配列データが非常に効率的に含まれると期待される。
【００９０】
配列データの個数に関する閾値は、限定するものではないが、一定の値であってもよく、又は前記特定の配列データの出現頻度（集約）若しくは出現頻度（統合）に応じて変動してもよい。一例において、配列データの個数に関する閾値は１０であってよい。他の例において、配列データの個数に関する閾値は、出現頻度（集約）又は出現頻度（統合）の１０％であってよい。この例において、出現頻度（集約）が１００の場合、配列データの個数に関する閾値は１０となる。
【００９１】
実施形態１では、配列データグループを準備する工程は、クリーンアップする工程、ユニーク配列データに集約する工程、配列決定の誤りを統合する工程、クラス分けする工程、そして、配列クラスター非形成性配列データを除去する工程の順で含んだが、第１の態様に係る準備工程に含まれる工程の数及び順序はこれに限定されない。配列データグループを準備する工程は、前記した工程からなる群より選択される少なくとも１つの工程、少なくとも２つの工程、少なくとも３つの工程を適宜含んでよい。前記した各工程は、配列決定の誤りを統合する工程の前に、ユニーク配列データに集約する工程が行われれば、特に制限なく様々な順序で含めることができる。ユニーク配列データに集約する工程は、好ましくは、配列クラスター非形成性配列データを除外する工程の前に実施される。配列データグループを準備する工程において、前記した工程が行われた配列データグループが取得される場合、配列データグループは配列データグループを取得する工程のみを含んでよい。
【００９２】
＜分子系統樹の作成＞
実施形態１に係る特定方法は、前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程を含む。分子系統樹は、限定するものではないが、公知のソフトウェア（統計分析ソフトウェア「Ｒ」のａｐｅパッケージ）を用いて、配列データグループ中の配列データに示される配列から距離行列を算出し、算出した距離行列から近接結合法を用いることによって作成することができる。
【００９３】
＜配列クラスターが抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かの判定＞
実施形態１に係る特定方法は、分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を含む。この判定工程により、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む１つ又は複数の配列クラスターが特定される。
【００９４】
前記オリジナル配列は、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である。オリジナル配列は、限定するものではないが、抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片それぞれと、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度がＢＬＡＳＴ検索により得られる配列同一性（％）が最も高い遺伝子断片である。
【００９５】
判定工程における配列一致度の変化は、例えば、単位時間当たりの配列一致度の変化（＝「配列一致度の傾き」）であり、前記配列一致度の傾きが、配列一致度の傾きに関する閾値未満の場合に、前記配列クラスターが抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定する。判定工程における抗体の種類の変化は、例えば、抗体のクラススイッチであり、前記抗体のクラススイッチが、一定期間の間に所定の回数を超える場合に、前記配列クラスターが抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定する。
【００９６】
判定工程は、例えば、分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との、抗原投与前の配列一致度が、抗原投与前の配列一致度に関する閾値未満の場合、前記配列データを配列特異抗体含まない配列クラスターであると判定することを含んでもよい。
【００９７】
判定工程は、分子系統樹から配列クラスターを抽出する工程をさらに含んでよい。一例において、配列クラスターは、分子系統樹における分岐点と分岐点とを結ぶ枝の長さが所定の値以上である場合に、それらの分岐点間の所定の位置から分子系統樹の中心から外側の領域を配列クラスターとして抽出してもよい。
【００９８】
実施形態１の分子系統樹の作成は、配列データグループの準備工程で準備された配列データグループについて行われたが、第１の態様に係る発明はこれに限定されない。分子系統樹の作成は、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスター中に含まれる配列データの集まりについて再度行われてよい。この再度作成された分子系統樹おける配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かの判定工程が更に行われてもよい。
【００９９】
［実施形態２］
本発明の第２の態様は、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターであるか否かを判定する判定システムを提供する。本発明の第２の態様の１つの実施形態（以下「実施形態２」という）について以下に説明する。
【０１００】
前記判定システムは、制御部と、記憶部とを備えている。前記記憶部は、抗原を投与された動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを含むデータベースを格納する。前記制御部は、前記配列データグループから分子系統樹を作成する分子系統樹作成部と、前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターであるか否かを判定する配列データ判定部とを含む。
【０１０１】
＜制御部及び記憶部＞
実施形態２に係る判定システムは、制御部と、記憶部とを備えている。
図７は、実施形態２に係る判定システム１の概略構成を示すブロック図である。判定システム１は、その全体動作を制御する制御部１１と、データベース１０７を格納した記憶部１３とを備える。判定システム１には、インターフェースを介して、ユーザが入力を行う入力装置１５と、画面表示を行う表示装置１７と、測定装置２０とが接続されている。
【０１０２】
制御部１１は、ＣＰＵ（中央処理装置）などのプロセッサに対応する処理回路と、メモリ（主記憶装置）とで構成される。制御部１１のプロセッサは、メモリにロードされたコンピュータプログラムを実行する。制御部１１は、所定のコンピュータプログラムを実行することにより、後述する配列データグループ準備部１０１、分子系統樹作成部１０３、及び配列データ判定部１０５等の機能を実現する。制御部１１は、ソフトウェアと協働して所定の機能を実現してもよいし、ハードウェアのみで所定の機能を実現してもよい。
【０１０３】
記憶部１３は補助記憶装置であり、例えば、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）である。記憶部１３には、例えば、コンピュータプログラムが格納されている。コンピュータプログラムは、メモリにロードされてプロセッサにより実行される。前記コンピュータプログラムは、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムを含む。
【０１０４】
前記アプリケーションプログラムは、後述する、配列データグループ準備部を機能させる配列データグループ準備プログラム、配列一致度を含む各種パラメーターを算出する算出プログラム、分子系統樹作成部を機能させる分子系統樹作成プログラム、分子系統樹から配列クラスターを抽出する配列クラスター抽出プログラム、配列データ判定部を機能させる配列データ判定プログラム、閾値を取得する閾値取得プログラム、及び判定結果などを表示させる表示プログラムを含む。
【０１０５】
実施形態２では、データベース１０７は、記憶部１３に格納されている。
図８は、実施形態２に係るデータベース１０７の概略構成を示すブロック図である。データベース１０７には、配列データグループ１１０、閾値データ１２０、関数データ１３０、及び動物ゲノム配列データ１４０が格納されている。
【０１０６】
配列データグループ１１０は、配列決定後の配列データグループを含む。配列データグループの配列データは、抗体の可変領域部分をコードする塩基配列に関する情報、配列長に関する情報、及び品質スコア（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ；Ｑスコア）を含む。配列データは、抗体のタイプ（ＩｇＧ２又はＩｇＧ３）に関する情報、採血時期に関する情報、及び採血した動物に関する情報をさらに含んでもよい。配列データグループ１１０は、さらに、後述するクリーンアップ配列データグループ、ユニーク配列データグループ、統合ユニーク配列データグループ、クラス分け配列データグループ、及び、配列クラスター形成性データグループを含んでもよい。
【０１０７】
閾値データ１２０は、後述の分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列の、前記配列一致度の変化に関する閾値（以下「閾値（一致度）」という）を含む。閾値（一致度）は、例えば、各抗体の配列データが取得された時間の変化あたりの配列一致度の傾きに関する所定の値を含む。閾値は、配列決定の品質スコアに関する閾値、配列決定の誤りを統合する際に利用される「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」に関する閾値「以下「閾値（確率）」という）、配列クラスター非形成性の配列データを除外する際に利用される配列データの個数に関する閾値をさらに含んでよい。
【０１０８】
関数データ１３０は、塩基配列又はアミノ酸配列のホモロジー検索における配列一致度をスコア化するスコア関数データを含む。塩基配列の一致及び不一致をスコア化するスコア関数は、例えば、以下の式で示される：
2020177529.tif 000016
［式中、Ａは動物のゲノム塩基配列に関する情報を示し、Ｂは配列データの塩基配列に関する情報を示す。］。この例において、ゲノム配列の塩基（Ａ）と対応する配列データの塩基（Ｂ）とが一致する場合（α  Ａ＝Ｂ）は１点が付与され、不一致の場合（β  Ａ≠Ｂ）は−３が付与される。このスコア関数を以下の表に示す：
2020177529.tif 000017
【０１０９】
アミノ酸配列の一致及び不一致をスコア化するスコア関数は、例えば、ＰＡＭ行列（例えばＰＡＭ２５０）、ＢＬＯＳＵＭ行列（例えばＢＬＯＳＵＭ５０）などのスコア行列である。関数データ１３０に含まれるデータは、ポアソン分布に関する確率密度関数、回帰分析に用いられる関数をさらに含んでもよい。
【０１１０】
動物ゲノム配列データ１４０は、アルパカを含む動物種に関するゲノム配列データを含む。アルパカのゲノム配列データは、抗体のＶ遺伝子、及びＪ遺伝子をコードする配列を含む。動物ゲノム配列データ１４０は、ヒトゲノム配列データをさらに含んでもよい。
【０１１１】
データベース１０７が、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、またはフラッシュメモリなどの記憶媒体に格納されている場合、記憶部１３は、記憶媒体に対して情報を読み出す／書き込むドライブ装置と、その記憶媒体とで構成されてもよい。
【０１１２】
入力装置１５は、ユーザが必要な情報（配列データグループが格納されたアドレスを指定する指定情報）および指示情報を制御部１１に入力するための機器または装置により構成される。入力装置１５は、入力情報を、インターフェースを介して制御部１１へ出力する機能を有する。入力装置１５は、例えばキーボード、マウス、および音声認識装置であってよい。入力情報の種類はこれらに限定されない。入力情報は、例えば、採血した動物に関する情報を含んでもよい。
【０１１３】
指示情報は、処理工程を指示する情報を含む。処理工程を指示する情報は、例えば、後述の配列データグループ準備部での処理に関して、配列決定後の配列データグループから、クリーンアップ処理、ユニーク配列への集約処理、配列決定の誤りの統合処理、クラス分け処理、及び配列クラスター非形成性配列データ除外処理のいずれか又は全部をどのような順序で実行するかに関する指示情報を含む。
【０１１４】
制御部１１は、入力装置１５から入力された指示に従い、データベース１０７に格納された配列データグループ１１０から配列決定後の配列データグループを取得し、後述する分子系統樹において配列クラスターを形成する可能性がある配列データの集まり（以下「配列クラスター形成性配列データグループ」という）を生成することを含む配列ライブラリーを準備する機能；前記配列データグループから分子系統樹を作成する機能；前記分子系統樹の配列クラスターが抗原特異抗体を含むか否かを判定する機能；及び判定結果などを表示する表示機能を有する。
【０１１５】
制御部１１の前記機能は、制御部１１のメモリにロードされた、対応するアプリケーションプログラムを、制御部１１のプロセッサを含む処理回路にて実行することで実現される。
【０１１６】
表示装置１７は、制御部１１の判定結果などをユーザに知覚させることが可能な装置により構成され、例えばディスプレイ、およびプリンターであってよい。
【０１１７】
測定装置２０は、遺伝子配列を測定するための装置により構成される。測定装置２０は、例えば、次世代ＤＮＡシークエンサーであってよい。測定装置２０は、測定データを、インターフェースを介して制御部１１へ出力する機能を有する。
【０１１８】
図７において、測定装置２０と制御部１１とを繋ぐ実線は、それらの要素間の有線または無線によるデータおよび信号の送受信を機能させるインターフェースを含む送受信機により構成される。図７において、これら以外の各要素を繋ぐ実線も同様である。
【０１１９】
実施形態２では、データベース１０７は判定システム１内部の記憶部１３に格納されたが、データベースが格納される場所はこれに限定されない。データベース１０７は、例えば判定システム１の外部に存在する記憶装置に格納されていてもよい。このような記憶装置は、例えば、光ディスクなどの記憶媒体の全部または一部により構成されてよく、第２の態様に係る判定システムとネットワークにより接続されるサーバーに記憶装置が設けられていてもよい。
【０１２０】
実施形態２では、判定システム１は外部に存在する測定装置２０と接続されているが、本発明に係る判定システムはこれに限定されない。例えば、測定装置２０は判定システム１の内部に存在してもよい。測定装置２０を用いて得られた測定データを、制御部１１に読み込ませ、例えば、データベース１０７に格納させてもよい。判定システム１は、測定装置２０と接続されておらず、測定データが制御部１１に読み込まれる構成であってもよい。
【０１２１】
実施形態２に係る判定システムの動作を、図９〜１１を用いて説明する。
ユーザが、入力装置１５を使用して（図７）、制御部１１に対する指示および必要な情報（各種のデータが格納されたアドレスを指定する指定情報、及び採血した動物に関する情報）を入力する。
【０１２２】
図９は、本発明に係る判定システムにおける、分子系統樹中の配列クラスターが抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かの判定を示すフローチャートである。
【０１２３】
＜配列データグループ準備部＞
実施形態２に係る判定システムは、所定の配列データグループを生成する、配列データグループ準備部を含む。
制御部１１のプロセッサは、入力装置１５を介したユーザからの指示および必要な情報の入力があると、配列データグループの準備を実行する（Ｓ１１）。配列データグループ準備Ｓ１１では、プロセッサは、記憶部１３に格納された配列データグループ準備プログラムをメモリにロードし実行する。これにより、制御部１１に、配列データグループ準備部１０１が実現される（図７）。
【０１２４】
図１０は、配列ライブラリー準備Ｓ１１における、配列データグループの準備を示すフローチャートである。配列データグループ準備部１０１は、ユーザが入力した指定情報を参照し、配列データグループの取得処理等を実行する。
【０１２５】
（配列データグループの取得）
配列データグループ準備部１０１は、ユーザが入力した指定情報を参照し、データベース１０７内の配列データグループ１１０に格納された配列決定後の配列データグループをメモリにロードする（Ｓ３１）。配列決定後の配列データグループを構成する配列データは、抗体の可変領域部分をコードする塩基配列に関する情報、配列長に関する情報、採血時期（ｗｅｅｋｓ）に関する情報、品質スコア（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ；Ｑスコア）を含む。
【０１２６】
配列データグループ準備部１０１は、ユーザが入力した指示情報を参照し、指示された処理を実行して、処理に応じた配列データグループを生成する。実施形態２において、指示情報は、配列決定後の配列データグループに対して、クリーンアップ処理によるクリーンアップ配列データグループの生成、ユニーク配列への集約処理によるユニーク配列データグループの生成、配列決定の誤りの統合処理による統合ユニーク配列データグループの生成、クラス分け処理によるクラス分け配列データグループの生成、及び配列クラスター非形成性配列データ除外処理による配列クラスター形成性配列データグループの生成の順で実行する指示、及び各処理により生成された配列データグループをデータベース１０７に格納する指示を含む。
【０１２７】
（クリーンアップ処理）
配列データグループ準備部１０１は、配列決定後の配列データグループが取得されると、アミノ酸配列を示さない配列データの除外（クリーンアップ）を実行する（Ｓ３２）。これにより、クリーンアップ配列データグループが生成され、生成された配列データグループはデータベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１２８】
クリーンアップＳ３２では、配列データグループ準備部１０１は、配列決定後の配列データグループ中の配列データに示される抗体の可変領域部分をコードする塩基配列の配列長に関する情報を取得し、前記配列長が３の倍数の場合（３ｋ）に選出タグを付与し、３の倍数でない場合（３ｋ＋１又は３ｋ＋２）に除外タグを付与する。配列データグループ準備部１０１は、選出／除外タグ付けを配列決定後の配列データグループ中の全ての配列データに対して実行する。配列データグループ準備部１０１は、配列決定後の配列データグループ中の全ての配列データにタグ付けを終えると、選出／除外タグ付けを終了する。
【０１２９】
配列データグループ準備部１０１は、タグ付終了後に、選出タグが付された配列データを配列決定後の配列データグループから選出し、選出した配列データで構成されるクリーンアップ配列データグループを生成する。生成されたクリーンアップ配列データグループは、データベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１３０】
可変領域部分をコードする塩基配列が３の倍数の場合、その配列はアミノ酸配列を示す。クリーンアップ配列データグループ中の配列データは、アミノ酸配列に関する情報をさらに含んでもよい。
【０１３１】
実施例３では、クリーンアップ処理に関して、アミノ酸配列を示さない配列データを除去する処理を説明したが、クリーンアップ処理はこれに限定されない。クリーンアップ処理は、例えば、配列データに含まれる品質スコアに基づくクリーンアップ処理であってよい。また、クリーンアップ処理は、アミノ酸配列を示さない配列データの除去及び品質スコアに基づく除去の組合せであってよい。
【０１３２】
実施形態２では、クリーンアップ処理は、選出タグが付された配列データを選出することにより実行されたが、クリーンアップ処理の内容はこれに限定されない。クリーンアップ処理は、例えば、除外タグが付された配列データを、配列決定後の配列データグループから除外することによって実行されてもよい。実施例３では、クリーンアップ処理は、塩基配列に対して実行されたが、クリーンアップ処理を実行する配列の種類はこれに限定されない。クリーンアップ処理は、アミノ酸配列に対しても実行できる。
【０１３３】
（ユニーク配列データへの集約）
配列データグループ準備部１０１は、クリーンアップ配列データグループが生成されると、同一の配列を示す複数の配列データを１つの配列データ（＝「ユニーク配列データ」）へ集約する処理を実行する（Ｓ３３）。これにより、ユニーク配列データグループが生成され、生成された配列データグループはデータベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１３４】
配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データへの集約処理において、クリーンアップ配列データグループ中の１つの配列データに集約タグ（α）を付与し、その配列データに示される配列に関する情報を取得する。配列データグループ準備部１０１は、取得した配列と同一の配列を示す他の配列データに対して同じ集約タグ（α）を付与する。配列データグループ準備部１０１は、クリーンアップ配列データグループにおいて、前記配列と同一の配列を示す配列データのすべてに集約タグ（α）を付与し終えると、集約タグ（α）のタグ付けを終了する。
【０１３５】
配列データグループ準備部１０１は、集約タグ（α）を付与した配列データに示される配列と別の配列を示す１つ配列データに、集約タグ（α）とは別の集約タグ（β）を付与し、その集約タグ（β）のタグ付けは、上記と同様、クリーンアップ配列データグループにおいて前記配列と同一の配列を示す配列データのすべてに付与し終えると、終了する。さらに、配列データグループ準備部１０１は、集約タグ（β）を付与した配列データに示される配列と別の配列を示す配列データに、別の集約タグ（γ、・・・）を順にタグ付けする。配列データグループ準備部１０１は、クリーンアップ配列データグループ中の配列データの数と、集約タグを付与した配列データの数とが一致すると、集約タグの付与を終了する。
【０１３６】
配列データグループ準備部１０１は、次いで、同じ種類の集約タグが付された複数の配列データを、１つの配列データ（例えば、集約タグが付されたいずれかの配列データ、又は新たに生成した配列データ）に集約することで、ユニーク配列データを生成する。ユニーク配列データは、配列データに含まれる情報に加えて、出現頻度（集約）に関する情報をさらに含む。
【０１３７】
実施例３では、ユニーク配列データへの集約処理は、塩基配列に対して実行されたが、ユニーク配列を実行する配列の種類はこれに限定されない。ユニーク配列データへの集約処理は、アミノ酸配列に対して実行することができる。
【０１３８】
（配列決定の誤りの統合）
配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データグループが生成されると、配列決定の誤りを統合する処理を実行する（Ｓ３４）。この処理により、統合ユニーク配列データグループが生成され、生成された配列データグループはデータベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１３９】
図１１は、配列決定の誤りの統合ステップを示すフローチャートである。
（ａ）統合用配列データグループの生成
配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データグループ中のすべてのユニーク配列データから出現頻度（集約）に関する情報を取得し、出現頻度（集約）が一番大きいユニーク配列データの出現頻度（集約）が２以上の場合（Ｓ４１；ＹＥＳ）、配列データグループ準備部１０１は、統合用配列データグループの生成を実行する（Ｓ４２）。これにより、配列統合用配列データグループが生成され、前記配列統合用配列データグループの生成に用いられた配列データは、前記ユニーク配列データグループから除外される。
【０１４０】
統合用配列データグループの生成Ｓ４２において、配列データグループ準備部１０１は、一番大きい出現頻度（集約）を示したユニーク配列データ（以下「基準配列データα」という）を選出する。
配列データグループ準備部１０１は、記憶部１３に格納された算出プログラムをメモリにロードして、配列一致度を含む各種パラメーターを生成及び算出する機能を実現（以下「生成＆算出機能」という）する。生成＆算出機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、基準配列データαの塩基配列（以下「基準配列α」ともいう）と同じ配列長のユニーク配列データの塩基配列（以下「照会配列」ともいう）とを対比し、不一致となった塩基が何番目の塩基であるかに関する情報、塩基置換の種類に関する情報、及び塩基置換の数に関する情報を生成し、基準配列データαと比較された配列データ（「照会配列データ」ともいう）に付与する。配列データグループ準備部１０１は、前記情報の生成及び付与処理をユニーク配列データグループ中の全ての配列データに対して実行する。
【０１４１】
次いで、配列データグループ準備部１０１は、基準配列αから、配列決定の誤りによって生じえた塩基置換数を有する配列データを選出する。配列データグループ準備部１０１は、基準配列データαの出現頻度（集約）に関する情報及びデータベース１０７内の関数データ１３０に格納されたポアソン分布に関する確率密度関数を取得し、取得した出現頻度（集約）とポアソン分布に関する確率密度関数とから、出現頻度（集約）が１以下になる最少の塩基置換数（ｍ）を算出する。例えば、塩基置換数の期待値が０．３個の場合、塩基置換数が０、１、２、３、４となる確率はそれぞれ、０．７４、０．２２、０．０３、０．００３、０．０００３となる。この場合、基準配列データαの出現頻度（集約）が１００の場合、塩基置換数が０、１、２、３、４の配列の出現頻度はそれぞれ、１００、３０、４．５、０．５、０．０３となり、ｍは３に設定される。同様にして、基準配列データαの出現頻度（集約）が１０００の場合、ｍは４に設定される。なお、塩基置換数の期待値は、上述したｉ番目の塩基に配列決定の誤りが生じる確率ｐｉに関する式：
2020177529.tif 000018
から算出することができる。
【０１４２】
生成＆算出機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、塩基置換の数（ｍ）が設定されると、ユニーク配列データに付与された塩基置換の数に関する情報を参照し、ｍ個までの塩基置換を有する配列データ（塩基置換の数ｎ＝０、１、・・・ｍ）を選出して、統合用配列データグループを生成する。配列データグループ準備部１０１は、統合用配列データグループの生成のために選出されたユニーク配列データを、前記ユニーク配列データグループから除外する。
【０１４３】
（ｂ）統合ユニーク配列データの生成
配列データグループ準備部１０１は、統合用配列データグループが生成されると、前記統合用配列データグループ中の配列データから、統合すべき配列データ（以下「統合用配列データ」という）を選出する処理を実行する（Ｓ４３）。
図１２は、統合用配列データの選出Ｓ４３を示すフローチャートである。生成＆算出機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データに付与された情報（不一致となった塩基が何番目の塩基であるかに関する情報、塩基置換の種類に関する情報、及び塩基置換の数に関する情報）を参照し、実施形態１において詳述した「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」である比率を算出する（Ｓ５１）。算出された前記比率は、前記ユニーク配列データに付与されてよい。
【０１４４】
配列データグループ準備部１０１は、前記比率が算出されると、記憶部１３に格納された閾値取得プログラムをメモリにロードして、閾値を取得する機能を実現する。閾値取得機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、閾値データ１２０に格納された「照会配列が生じる確率／基準配列が生じる確率（Ｐ０）」に関する閾値（以下「閾値（確率）」という）を取得する（Ｓ５２）。
【０１４５】
配列データグループ準備部１０１は、閾値（確率）が取得されると、記憶部に格納された配列データ判定プログラムをメモリにロードして、配列データを判定する機能を実現する。配列データ判定機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データに付与された前記比率が取得された閾値（確率）未満である場合に（Ｓ５３；ＹＥＳ）、統合すべきユニーク配列データであること示す統合タグをそのユニーク配列データに付与する（Ｓ５４）。
【０１４６】
配列データ判定機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、ユニーク配列データに付与された前記比率が取得された閾値（確率）以上である場合に（Ｓ５３；ＮＯ）、統合すべきユニーク配列データではないこと示す非統合タグをそのユニーク配列データに付与する（Ｓ５５）。配列データグループ準備部１０１は、統合用配列データグループ中の全てのユニーク配列データにタグ付けを終えると、統合／非統合タグの付与を終了する。
【０１４７】
配列データグループ準備部１０１は、統合／非統合タグの付与が終了すると、図１１の配列決定の誤りの統合を示すフローチャートに戻って、統合用配列データグループ中のユニーク配列データに付与された統合タグを参照し、統合タグが付与されたユニーク配列データを、基準配列データαに統合する（Ｓ４４）。これにより、基準配列αに関する統合ユニーク配列データが生成され、生成された配列データはデータベース１０７に格納される。基準配列αに関する統合ユニーク配列データは、基準配列データαに含まれた情報に加えて、統合されたユニーク配列データに含まれる出現頻度（集約）の総和に関する情報（以下「出現頻度（統合）」という）をさらに含む。
【０１４８】
配列データグループ準備部１０１は、統合ユニーク配列データの生成が終了すると、統合用配列データグループ中のユニーク配列データに付与された非統合タグを参照し、非統合タグが付与されたユニーク配列データ（即ち、Ｓ４４において統合ユニーク配列データの生成に用いなかったユニーク配列データ）を、前記ユニーク配列データグループに戻す（Ｓ４５）。
【０１４９】
配列データグループ準備部１０１は、基準配列αに関する統合ユニーク配列データの生成に用いられたユニーク配列データが除外されたユニーク配列データグループ中のすべてのユニーク配列データから出現頻度（集約）に関する情報を取得し、出現頻度（集約）が一番大きいユニーク配列データの出現頻度（集約）が２以上の場合（Ｓ４１；ＹＥＳ）、Ｓ４２〜Ｓ４５を繰り返す。
【０１５０】
実施形態２の統合用配列データの選出では、比率を算出するＳ５１に続いて、閾値（確率）を取得するＳ５２が実行されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ５１、Ｓ５２は、算出された比率と取得された閾値（確率）とを比較するＳ５３が実行されるまでに、実行されれば、いずれの順序で実行されてもよく、又は同時に実行されてもよい。
【０１５１】
（ｃ）統合ユニーク配列データグループの生成
配列データグループ準備部１０１は、統合ユニーク配列データの生成に用いなかったユニーク配列データが除外されたユニーク配列データグループ中のすべてのユニーク配列データから出現頻度（集約）に関する情報を取得し、出現頻度（集約）が一番大きいユニーク配列データの出現頻度（集約）が２未満の場合（Ｓ４１；ＮＯ）、データベースに格納された統合ユニーク配列データ及び統合ユニーク配列データの生成に用いなかったユニーク配列データが除外されたユニーク配列データグループ中のすべてのユニーク配列データをメモリにロードして、統合ユニーク配列データグループを生成する（Ｓ４６）。これにより、統合ユニーク配列データグループが生成され、生成された統合ユニーク配列グループはデータベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１５２】
実施形態２の配列決定の誤りの統合では、統合ユニーク配列データグループの生成Ｓ４６は、ユニーク配列データグループにおいて一番大きい出現数（集約）が２未満と判定された後に（Ｓ４１；ＮＯ）実行されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ４６は、例えば、ユニーク配列データグループにおいて一番大きい出現数（集約）が２以上と判定された後に（Ｓ４１；ＹＥＳ）、統合ユニーク配列データを生成するＳ４４と同時に実行されてもよい。
【０１５３】
実施形態２の統合ユニーク配列データの生成に用いなかったユニーク配列データをユニーク配列データグループに戻すＳ４５は、統合ユニーク配列データの生成Ｓ４４の後に実行されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ４５は、統合用配列データ選出Ｓ４３の後であって、Ｓ４２〜Ｓ４５を繰り返すか否かを判定するためのＳ４１が実行される前に、実行されればよい。Ｓ４５は、例えば、統合ユニーク配列データの生成Ｓ４４の前実行されてもよく、Ｓ４４と同時に実行されてもよい。
【０１５４】
実施形態２の配列決定の誤りの統合では、統合ユニーク配列データの生成Ｓ４４は、統合用配列データの選出Ｓ４３の後に実行されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ４３は、例えば、ユニーク配列データグループにおいて一番大きい出現数（集約）が２未満と判定された後に（Ｓ４１；ＮＯ）実行されてよい。この場合、ユニーク配列データに付与される統合タグには、対比された基準配列の種類（例えば、基準配列データα）に関する情報が付与されており、ユニーク配列データの統合では、付与された基準配列の種類に関する情報が同じユニーク配列データが統合される。
【０１５５】
実施形態２のユニーク配列データグループにおいて一番大きい出現数（集約）が２以上か否かを判定するＳ４１は、Ｓ４２〜Ｓ４５に先行して実施されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ４１は、例えば、Ｓ４２〜Ｓ４５を繰り返すか否かを判定するために、Ｓ４５が実行された後に実行されればよい。即ち、Ｓ４１は、第１回目の統合用配列データグループの生成Ｓ４２の前に実行されてなくてもよい。
【０１５６】
実施形態２の配列決定の誤りの統合では、統合用配列データグループの生成Ｓ４２が実行されたが、これに限定されない。一例において、配列決定の誤りの統合において、統合用配列データグループの生成Ｓ４２は実行されなくてもよい。この例の場合、配列決定の誤りの統合において、参照配列データは、基準配列データの基準配列と同じ配列長の配列を有する配列データである。
【０１５７】
（クラス分け）
図１０の配列データグループの準備を示すフローチャートに戻って、配列データグループ準備部１０１は、統合ユニーク配列データグループが生成されると、配列長、オリジナルＶ遺伝子断片、及びオリジナルＪ遺伝子断片に関する情報に基づいたクラス分けを実行する（Ｓ３５）。
【０１５８】
（ａ）配列長に基づいたクラス分け
配列長に基づいたクラス分けにおいて、配列データグループ準備部１０１は、統合ユニーク配列データグループ中の各配列データの配列長に関する情報を取得し、同じ配列長の配列を示す各配列データに配列長に関する配列長クラス分けタグを付与する。
配列データグループ準備部１０１は、配列データグループ中の配列データの数と配列長クラス分けタグを付与した回数とが一致すると、配列長クラス分けタグの付与を終了する。
【０１５９】
（ｂ）オリジナルＶ遺伝子断片に基づいたクラス分け
配列データグループ準備部１０１は、配列長クラス分けタグの付与が終了すると、統合ユニーク配列データグループ中の各配列データに示される抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片と対応するゲノム配列上のＶ遺伝子断片（＝「オリジナルＶ遺伝子断片」）を推定し、その配列データにオリジナルＶ遺伝子断片に関するタグを付与する。
【０１６０】
オリジナルＶ遺伝子断片の推定において、配列データグループ準備部１０１は、記憶部１３に格納された算出プログラムをメモリにロードして、配列一致度を算出する機能を実現する。生成＆算出機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、ユーザが入力した入力情報から採血をした動物に関する情報を参照し、データベース１０７内の動物ゲノム配列データ１４０に格納された対応する動物種のゲノム情報を取得する。
【０１６１】
動物のゲノム配列データには、動物種に応じて、複数種類のＶ遺伝子断片をコードする領域が存在する。オリジナルＶ遺伝子断片の推定において、生成＆算出機能を実現した配列データグループ準備部１０１は、その配列データに示される抗体のＶ遺伝子領域を含む配列情報とゲノム配列上の各Ｖ遺伝子断片をコードする複数の領域との配列一致度をそれぞれ算出する。配列一致度は、例えば、１から不一致の数を配列長で除した値を差し引くことで算出される（［配列一致度］＝１−［不一致の数］／［配列長］）。
【０１６２】
配列データグループ準備部１０１は、算出された配列一致度のうち、最も高い配列一致度を示すゲノム配列上の領域に示されるＶ遺伝子断片をオリジナルＶ遺伝子断片とする。配列データグループ準備部１０１は、オリジナルＶ遺伝子断片に関するＶ遺伝子断片クラス分けタグをその配列データに付与する。配列データグループ準備部１０１は、配列データグループ中の配列データの数とＶ遺伝子断片クラス分けタグを付与した回数とが一致すると、Ｖ遺伝子断片クラス分けタグの付与を終了する。
【０１６３】
（ｃ）オリジナルＪ遺伝子断片に基づいたクラス分け
配列データグループ準備部１０１は、Ｖ遺伝子断片クラス分けタグの付与が終了すると、上記と同様にして、配列データに示される抗体の可変領域と対応するゲノム配列上のＪ遺伝子断片（＝「オリジナルＪ遺伝子断片」）を特定し、その配列データにＪ遺伝子断片クラス分けタグを付与する。配列データグループ準備部１０１は、配列データグループ中の配列データの数とＪ遺伝子断片クラス分けタグを付与した回数とが一致すると、Ｊ遺伝子断片クラス分けタグの付与を終了する。
【０１６４】
（ｄ）クラス分け配列データグループの生成
配列データグループ準備部１０１は、クラス分けタグの付与が終了すると、配列長、オリジナルＶ遺伝子断片の種類及びオリジナルＪ遺伝子断片の種類の組合せに対応したクラスを生成する。配列データグループ準備部１０１は、各種のクラス分けタグが付与された配列データを、対応するクラスに割当て、クラス分け配列データグループを生成する。これにより、生成されたクラス分け配列データグループは、データベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。各クラスには、そのクラスに対応する配列長の配列であって、対応するオリジナルＶ遺伝子断片及びオリジナルＪ遺伝子断片に由来する配列を示す配列データが含まれる。
【０１６５】
実施形態２のクラス分けでは、配列長に基づくクラス分け、オリジナルＶ遺伝子断片に基づくクラス分け、そしてＪ遺伝子断片に基づくクラス分けの順でクラス分けタグの付与が実行されたが、クラス分けタグの付与を実行する順序はこれに限定されない。例えば、これらのクラス分けタグの付与は同時に行われてもよい。クラス分けタグの付与は、配列長クラス分けタグの付与、Ｖ遺伝子断片クラス分けタグの付与、Ｊ遺伝子断片クラス分けタグの付与からなる群より選択される少なくとも１つのクラス分けタグの付与が実行されてよい。
【０１６６】
（配列クラスター形成性配列データグループの生成）
配列データグループ準備部１０１は、クラス分けデータグループが生成されると、各クラス中の配列データグループから配列クラスター非形成性配列データの除外を実行する（Ｓ３６）。これにより、配列クラスター形成性配列データグループが生成され、生成された配列データグループはデータベース１０７中の配列データグループ１１０に格納される。
【０１６７】
配列クラスター非形成性配列データの除外Ｓ３６において、配列データグループ準備部１０１は、ユーザが入力した指定情報を参照し、データベース１０７内の閾値データ１２０に格納された塩基置換の数に関する閾値（例えば３０個）及び配列データ数に関する閾値（例えば５０個）を取得する。
【０１６８】
配列データグループ準備部１０１は、閾値の取得が終了すると、クラス分け配列データグループ中の任意のクラス（例えば、含まれる配列データの数の多いクラス）内の各配列データの配列情報を取得する。配列データグループ準備部１０１は、上記した生成＆算出機能を実現し、前記クラス内の１つの配列データ（例えば、出現頻度（統合）が大きい配列データ）を選択し、選択した配列データの配列と前記クラス内の他の配列データとの塩基置換の数をそれぞれ算出する。
【０１６９】
配列データグループ準備部１０１は、前記塩基置換の数に関する閾値未満の塩基置換の数を示す配列データの数を計数し、計数した配列データの数が、前記配列データ数に関する閾値未満であるか以下かを判定する。配列データグループ準備部１０１は、計数した配列データの数が、配列データ数に関する閾値未満の場合、その配列データを、配列クラスター非形成性配列データとして、前記クラスから除外する。
【０１７０】
配列データグループ準備部１０１は、前記配列クラスター非形成性配列データの除外を、前記クラス中の各配列データについて実行する。配列データグループ準備部１０１は、１つのクラスにおいて配列クラスター非形成性配列データの除外処理の回数が、前記クラス中の配列データの数と一致した場合、そのクラスに対する配列クラスター非形成性配列データの除外処理を終了する。
【０１７１】
配列クラスター非形成性配列データの除外処理が実行されたクラスを構成する配列データは、後述する分子系統樹において配列クラスターを形成する可能性がある配列データの集まり（「配列クラスター形成性配列データ」）であり、それらの配列データを含む配列クラスター形成性配列データグループである。配列データグループ準備部１０１は、クラス分け配列データグループの１つのクラスに対する配列クラスター非形成性配列データの除外が終了すると、前記クラス分け配列データグループの他のクラスに対して同様に配列クラスター非形成性配列データの除外を実行する。
【０１７２】
配列データグループ準備部１０１は、実施形態２において、クラス分け配列データグループ中のクラスに含まれる配列データの数が、前記配列データ数に関する閾値未満の場合、そのクラスは、配列クラスター形成性配列データを含まないとして、クラス分け配列データグループから除外する。
【０１７３】
実施形態２のクリーンアップ処理Ｓ３２は、配列決定後の配列データグループに対して実行されたが、これに限定されない。クリーンアップ処理Ｓ３２は、ユニーク配列データグループ、統合ユニーク配列データグループ、クラス分け配列データグループ、又は配列クラスター形成性配列データグループに対して実行されてもよく、若しくは実行されなくてもよい。
【０１７４】
実施形態２のユニーク配列データへの集約処理Ｓ３３は、クリーンアップ後の配列データグループに対して実行されたが、これに限定されない。ユニーク配列データへの集約処理Ｓ３３は、配列決定後の配列データグループ、統合ユニーク配列データグループ、クラス分け配列データグループ、又は配列クラスター形成性配列データグループに対して実行されてもよく、若しくは実行されなくてもよい。
【０１７５】
実施形態２の配列決定の誤りの統合Ｓ３４は、ユニーク配列データグループの生成ステップの直後に実行されたが、これに限定されない。配列決定の誤りの統合Ｓ３４は、ユニーク配列データグループの生成が実行された後であれば、いずれの順序で実行されてもよく、若しくは実行されてなくてもよい。
【０１７６】
実施形態２のクラス分けＳ３５は、統合ユニーク配列データグループに対して実行されたが、これに限定されない。クラス分けステップＳ３５は、配列決定後の配列データグループ、クリーンアップ配列データグループ、ユニーク配列データグループ、統合ユニーク配列データグループ、配列クラスター形成性配列データグループに対して実行されてもよく、若しくは実行されなくてもよい。
【０１７７】
実施形態２の配列クラスター形成性配列データグループの生成Ｓ３６は、クラス分けデータグループに対して実行されたが、これに限定されない。配列クラスター形成性配列データグループの生成Ｓ３６は、配列決定後の配列データグループ、クリーンアップ配列データグループ、ユニーク配列データグループ、統合ユニーク配列データグループに対して実行されてもよく、若しくは実行されてなくてもよい。
【０１７８】
＜分子系統樹作成部＞
実施形態２に係る判定システムは、配列データグループから分子系統樹を作成する分子系統樹作成部を含む。
制御部１１のプロセッサは、配列データグループが準備されると、図９に示される分子系統樹の作成を実行する（Ｓ１２）。分子系統樹の作成Ｓ１２において、制御部１１のプロセッサは、記憶部１３に格納された分子系統樹作成プログラムをメモリにロードして実行する。これにより、制御部１１に分子系統樹作成部１０３が実現される。
【０１７９】
分子系統樹作成部１０３は、準備された配列クラスター形成性配列データグループ中の配列データについてマルチプルアライメント（multiple alignment）を行い、マルチプルアライメントを行った配列データから距離行列を計算することで分子系統樹を作成する。
【０１８０】
実施形態２の分子系統樹の作成では、距離行列を計算することにより行われたが、分子系統樹の作成方法はこれに限定されない。分子系統樹の作成は、例えば、系統樹の枝の長さの合計を最小にすることに基づく最大節約法を用いてもよい。
実施形態２の分子系統樹の作成は、配列クラスター形成性配列データグループに対して実行されたが、これに限定されない。分子系統樹の作成は、統合ユニーク配列データグループ、又はクラス分け配列データグループに対して実行されてもよい。
【０１８１】
＜配列データ判定部＞
実施形態２に係る判定システムは、分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターであるか否かを判定する配列データ判定部を含む。
【０１８２】
（分子系統樹からの配列クラスター抽出）
制御部１１のプロセッサは、分子系統樹が作成されると、記憶部１３に格納された配列データ判定部を機能させる配列データ判定プログラムをメモリにロードして実行する。これにより、制御部１１に配列データ判定部１０５が実現される。
【０１８３】
配列データ判定部１０５は、記憶部１３に格納された配列クラスター抽出プログラムをメモリにロードして実行する。これにより、配列クラスター抽出機能が実現される。配列クラスター抽出機能を配列データ実現した配列データ判定部１０５は、作成された分子系統樹からの配列クラスターの抽出を実行する（Ｓ１３）。これにより、分子系統樹から抽出された配列クラスター中の配列データが得られる。配列クラスター抽出機能を実現した配列データ判定部１０５は、作成された分子系統樹内で配列情報の密度が高い部分を配列クラスターとして抽出する。
【０１８４】
（配列クラスター中の配列データの配列一致度の傾きの算出）
配列データ判定部１０５は、配列クラスターが抽出されると、配列クラスター中の配列データの配列情報の変化（例えば、単位時間当たりの配列一致度の傾き）を算出する（Ｓ１４）。配列一致度の傾きの算出Ｓ１４において、配列データ判定部１０５は、記憶部１３に格納された算出プログラムをメモリにロードして実行する。これにより、配列データ判定部１０５に配列一致度の傾きを算出する機能が実現される。生成＆算出機能を実現した配列データ判定部１０５は、配列クラスター中の各配列データの配列情報と、その配列データに含まれるオリジナルＶ、Ｊ遺伝子断片の配列情報との配列一致度を算出する。
【０１８５】
配列データ判定部１０５は、採血時期（ｗｅｅｋｓ）に関する情報を前記配列クラスター中の各配列データから取得し、上記で算出した配列一致度を用いて、時間経過に対する配列一致度の傾きを算出する。
【０１８６】
（抗原特異抗体を含む配列クラスターであるか否かの判定）
配列データ判定部１０５は、配列一致度の傾きが算出されると、記憶部１３に格納された閾値取得プログラムをメモリにロードして、閾値を取得する機能を実現する。閾値取得機能を実現した配列データ判定部１０５は、閾値データ１２０に格納された配列一致度の傾きに関する閾値（以下「閾値（傾き）」という）を取得する（Ｓ１５）。
【０１８７】
配列データ判定部１０５は、閾値（傾き）が取得されると、算出した配列一致度の傾きと取得した閾値（傾き）とを対比し、配列一致度の傾きが閾値（傾き）より小さい場合に（Ｓ１６；ＹＥＳ）、その配列一致度の傾きを示した配列クラスターに対して、抗原特異抗体を示す配列データを含むことを示す表示タグを付与する（Ｓ１７）。
【０１８８】
配列データ判定部１０５は、配列一致度の傾きが閾値（傾き）以上の場合に（Ｓ１６；ＮＯ）、その配列一致度の傾きを示した配列クラスターに対して、抗原特異抗体を示す配列データを含まないことを示す表示タグを付与する（Ｓ１８）。
【０１８９】
＜判定結果表示＞
制御部１１のプロセッサは、表示タグが付与されると、判定結果表示を実行する（Ｓ１９）。判定結果表示Ｓ１９では、プロセッサは、記憶部１３からメモリにロードされた表示プログラムを実行し、表示タグに応じた映像信号を表示装置１７に出力する。表示装置１７は例えばディスプレイであってよい。この場合、該ディスプレイは入力された映像信号をもとに判定結果を表示する。
【０１９０】
実施形態２では、分子系統樹の作成Ｓ１２及び配列クラスターの抽出Ｓ１３は１回ずつ実行されたが、実行される回数はこれに限定されない。例えば、配列クラスターの抽出Ｓ１３に抽出された配列クラスター中の配列データの集まりに対して、再度、分子系統樹の作成Ｓ１２’を実行して作成された分子系統樹について、配列クラスターの抽出Ｓ１３’を実行してもよい。
【０１９１】
実施形態２では、配列クラスター中の配列データの配列一致度の傾きの算出Ｓ１４、そして、閾値（傾き）の取得Ｓ１５の順に実行されたが、ステップの順序はこれに限定されない。Ｓ１４及びＳ１５は、配列一致度の傾きと閾値（傾き）との対比Ｓ１６までに実行されればよく、Ｓ１４及びＳ１５はいずれの順序で実行されてもよく、若しくは同時に実行されてもよい。
【０１９２】
［実施形態３］
本発明の第３の態様は、抗原特異抗体を作製する方法を提供する。本発明の第３の態様の１つの実施形態（以下「実施形態３」という）について以下に説明する。
【０１９３】
実施形態３に係る作製方法は、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程；抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスターから、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；及び選出された配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程；を含む。
【０１９４】
実施形態３に係る作製方法における、配列データグループを準備する工程、分子系統樹を作成する工程、及び抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターであるか否かを判定する工程には、実施形態１に係る特定方法において説明した特徴及び本明細書に記載の特徴が適宜適用される。
【０１９５】
＜抗原特異抗体を示す配列データの選出＞
実施形態３に係る作製方法は、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスターについて、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程を含む。配列データは、例えば、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスター中の配列データのうち、配列データ示される配列とそのオリジナル配列との配列同一性が、配列一致度に関する閾値以下の場合に選出されてよい。他の例において、配列データは、配列データ示される配列とそのオリジナル配列との配列同一性が最も小さいもの、又は抗体を採取したタイミングが一番遅い配列データであって、配列データ示される配列とそのオリジナル配列との配列同一性が配列一致度に関する閾値以下のものであってよい。
【０１９６】
＜配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体の作製＞
実施形態３に係る作製方法は、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスター中の配列データに示されるアミノ酸配列を有する抗体を作製する工程を含む。抗体は、限定するものではないが、選出された配列データのＣＤＲを大腸菌のコドン出現頻度に応じて最適化した配列を有するＤＮＡ断片を、大腸菌用の蛋白質発現ベクターに挿入してプラスミドを構築し、前記プラスミドを大腸菌に導入して発現させることにより製造される。
【０１９７】
［実施形態４］
本発明の第４の態様は、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する方法を提供する。本発明の第４の態様の１つの実施形態（以下「実施形態４」という）について以下に説明する。実施形態４に係る選出方法は、上述した実施形態１に係る特定方法と異なる方法であるが、具体的な工程において共通する部分があるため、ここでは、実施形態１に係る特定方法との相違点を主として説明する。
【０１９８】
実施形態４に係る選出方法は、実施形態１に係る特定方法と異なり、分子系統樹を作成する工程、及び、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を、必須の工程としては含まない。実施形態４に係る選出方法は、実施形態１に係る特定方法について詳述した「配列クラスター非形成性配列データの除外」を必須の工程として含む。実施形態４に係る選出方法は、更に、配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程を必須の工程として含む。
【０１９９】
前記した配列データを選出する工程は、配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含む。前記した対比する工程は、限定するものではないが、配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度（例えば８８％の一致度）が、前記閾値（例えば９０％の一致度）よりも低い場合に、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データとして選出することを含む。前記した対比する工程は、例えば、配列一致度と閾値との対比に加えて、その抗体が取得された時期（例えば５回目）と閾値（例えば４回目）とを対比することを更に含んでよい。この例において、選出工程では、抗体が取得された時期が閾値以上の場合であって、配列一致度が閾値未満の場合に、その配列データを抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データとして選出することを含む。
【０２００】
実施形態４に係る選出方法は、実施形態１に係る選出方法において詳述した「アミノ酸配列を示さない配列データ等のクリーンアップ」、「ユニーク配列への集約」、「配列決定の誤りの統合」、及び「クラス分け」を含む。発明の第４の態様に係る選出方法は、さらに、分子系統樹を作成する工程、及び、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を含んでもよい。
【０２０１】
［実施形態５］
本発明の第５の態様は、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する選出システムを提供する。本発明の第の態様の１つの実施形態（以下「実施形態５」という）について以下に説明する。実施形態５に係る選出方法は、上述した実施形態２に係る判定システムと異なるシステムであるが、具体的なデータ処理において共通する部分があるため、ここでは、実施形態２に係る判定システムとの相違点を主として説明する。
【０２０２】
実施形態５に係る選出システムは、実施形態２に係る判定システムと異なり、分子系統樹作成部、及び、配列データ判定部を、必須の部としては含まない。実施形態５に係る選出システムは、実施形態２に係る判定システムについて詳述した「配列データ準備部」のうち「配列クラスター形成性配列データグループの生成」を必須の処理として含む。実施形態５に係る選出システムは、更に、配列データ選出部を必須の部として含む。
【０２０３】
前記した配列データ選出部は、配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する処理を実行することを含む。前記した対比する処理においては、配列データ選出部は、限定するものではないが、配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度（例えば８８％の一致度）が、前記閾値（例えば９０％の一致度）よりも低い場合に、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データであることを示す選出タグを前記配列データに付与することを含む。前記した対比する処理は、例えば、配列一致度と閾値との対比に加えて、その抗体が取得された時期（例えば５回目）と閾値（例えば４回目）とを対比する処理の実行を更に含んでよい。この例において、配列データ選出部では、抗体が取得された時期が閾値以上の場合であって、配列一致度が閾値未満の場合に、その配列データを抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データであることを示す選出タグを付与する処理を含む。
【０２０４】
実施形態５に係る選出システムは、実施形態２に係る判定システムにおいて詳述した「クリーンアップ処理」、「ユニーク配列への集約処理」、「配列決定の誤りの統合処理」、及び「クラス分け処理」を含む。発明の第５の態様に係る選出システムは、さらに、分子系統樹作成部、及び、配列データ判定部を含んでもよい。
【０２０５】
［実施形態６］
本発明の第６の態様は、抗原特異抗体を作製する方法を提供する。本発明の第６の態様の１つの実施形態（以下「実施形態６」という）について以下に説明する。実施形態６に係る作製方法は、上述した実施形態３に係る作製方法と異なる方法であるが、具体的な工程において共通する部分があるため、ここでは、実施形態３に係る特定方法との相違点を主として説明する。
【０２０６】
実施形態６に係る作製方法は、実施形態３に係る作製方法と異なり、分子系統樹を作成する工程、及び、抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を、必須の工程としては含まない。実施形態６に係る作製方法は、実施形態３に係る作製方法について詳述した「配列クラスター非形成性配列データの除外」を必須の工程として含む。実施形態６に係る作製方法は、更に、配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程を必須の工程として含む。前記した配列データを選出する工程は、実施形態４の配列データを選出する工程において説明した特徴及び本願明細書に記載の特徴が適宜適用される。
【０２０７】
実施形態６に係る作製方法における配列データグループを準備する工程には、実施形態１に係る配列データグループを準備する工程において説明した特徴及び本願明細書に記載の特徴が適宜適用される。実施形態６に係る抗体を作製する工程には、実施形態３に係る抗体を作製する工程において説明した特徴及び本願明細書に記載の特徴が適宜適用される。
【０２０８】
本発明の第１又は第４の態様に係る実施形態は、例えば、以下に記載されるものであってよいが、これらに限定されない：
［項１］抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターを特定する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程；及び前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程；を含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、特定方法。
［項２−１］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程で取得される配列データグループが、配列決定後の配列データグループであり、前記準備工程が、アミノ酸配列を示さない配列データをクリーンアップする工程を含む、項１に記載の特定方法。
［項２−２］前記準備工程が、同一の配列を示す複数の配列データを１つの配列データ（以下「ユニーク配列データ」という）に集約する工程を含み、前記ユニーク配列データは、前記配列データに示される配列に関する情報、及び集約した配列データの個数に関する情報（以下「出現頻度（集約）」という）を含む、項２−１に記載の特定方法。
［項２−３］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程で取得される配列データグループが、配列決定後の配列データグループであり、前記準備工程が、同一の配列を示す複数の配列データをユニーク配列データに集約する工程を含み、前記ユニーク配列データは、前記配列データに示される配列に関する情報、及び出現頻度（集約）に関する情報を含む、項１に記載の特定方法。
［項２−４］前記準備工程が、アミノ酸配列を示さない配列データをクリーンアップする工程を含む、項２−３に記載の特定方法。
［項２−５］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程が、配列データに含まれる配列決定の品質に関する情報と、閾値とを対比することを含み、前記閾値未満の配列データをクリーンアップする工程を含む、項１〜項２−４のいずれかに記載の特定方法。
【０２０９】
［項３］前記配列データグループが、前記ユニーク配列データで構成されるユニーク配列データグループであり、前記ユニーク配列データが塩基配列データであり、前記ユニーク配列データグループ中、出現頻度（集約）が最も大きいユニーク配列データを基準配列データ（ｎ＝０）とし、前記基準配列データの配列（以下「基準配列」という）と同じ長さであるが、前記基準配列に対してｎ個（ｎ＝１、・・・ｍ）の塩基置換を有する配列を有するユニーク配列データを照会配列データとし、前記準備工程が、前記基準配列データの出現頻度（集約）に対する前記照会配列の出現頻度（集約）の比率が閾値未満の照会配列を、前記基準配列データに統合する工程を含む、項２−２〜項２−５のいずれかに記載の特定方法。
［項４−１］前記準備工程が、前記配列データグループ中の配列データを、配列長及び前記動物に対応する動物種のゲノム配列上のオリジナル配列のいずれか一方又は両方に基づいてクラス分けする工程を含む、項１〜項３のいずれかに記載の特定方法。
［項４−２］前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含む、項１〜項３のいずれかに記載の特定方法。
［項４−３］前記準備工程が、前記配列データグループ中の配列データを、配列長及び前記動物に対応する動物種のゲノム配列上のオリジナル配列のいずれか一方又は両方に基づいてクラス分けする工程、及び、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含む、項１〜項３のいずれかに記載の特定方法。
【０２１０】
［項５−１］前記準備工程が、前記統合工程、及び前記クラス分け工程の順で実施することを含む、項４−３に記載の特定方法。
［項５−２］前記準備工程が、前記統合工程、及び前記除外工程の順で実施することを含む、項４−３に記載の特定方法。
［項５−３］前記準備工程が、前記統合工程、前記クラス分け工程、及び前記除外工程の順で実施することを含む、項４−３に記載の特定方法。
［項６］前記オリジナル配列に基づくクラス分けが、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方と、前記動物に対応する動物種のゲノム配列とのホモロジー検索により得られた配列一致度を算出する工程、及び前記配列データを、最も高い配列一致度を示す遺伝子断片に関するクラスに割り当てる工程を含む、項４−１、項４−３、項５−１、又は項５−３に記載の特定方法。
［項７−１］前記配列一致度の変化が、単位時間当たりの配列一致度の変化であり、及び抗体の種類の変化が抗体のクラススイッチである、項１〜項６のいずれかに記載の特定方法。
［項７−２］前記配列データグループが、免疫刺激を受けた可能性のある動物から、異なる時期にｉ回取得された抗体集団の各抗体の配列を配列決定した配列情報を有する配列データの集まりである、項１〜項６及び項７−１のいずれかに記載の特定方法。
【０２１１】
［項１０］抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを選出する方法であって、免疫刺激を受けた可能性のある動物から取得された抗体の配列データを含む配列データグループを準備する工程；及び配列データグループから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程；を含み、前記準備工程が、前記配列データグループ中の特定の配列データに示される配列と所定の配列一致度を有する配列に関する配列データの個数が、配列データの個数に関する閾値未満である場合に、前記特定の配列データを前記配列データグループから除外する工程を含み、前記選出工程が、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度と、閾値とを対比する工程を含み、前記オリジナル配列が、配列データに示される抗体の配列と、前記抗体が得られた動物に対応する動物種のゲノム配列との配列一致度が最も高い配列である、選出方法。
［項１３−１］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程で取得される配列データグループが、配列決定後の配列データグループであり、前記準備工程が、アミノ酸配列を示さない配列データをクリーンアップする工程を含む、項１０に記載の選出方法。
［項１３−２］前記準備工程が、同一の配列を示す複数の配列データをユニーク配列データに集約する工程を含み、前記ユニーク配列データは、前記配列データに示される配列に関する情報、及び出現頻度（集約）に関する情報を含む、項１３−１に記載の選出方法。
［項１３−３］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程で取得される配列データグループが、配列決定後の配列データグループであり、前記準備工程が、同一の配列を示す複数の配列データをユニーク配列データに集約する工程を含み、前記ユニーク配列データは、前記配列データに示される配列に関する情報、及び出現頻度（集約）に関する情報を含む、項１０に記載の選出方法。
［項１３−４］前記準備工程が、アミノ酸配列を示さない配列データをクリーンアップする工程を含む、項１３−３に記載の選出方法。
［項１３−５］前記準備工程が、クリーンアップ工程、及び除外工程の順で実施することを含む、項１３−１又は項１３−２に記載の選出方法。
［項１３−６］前記準備工程が、ユニーク配列データへの集約工程、及び除外工程の順で実施することを含む、項１３−３又は項１３−４に記載の選出方法。
［項１３−７］前記準備工程が、クリーンアップ工程、ユニーク配列データへの集約工程、及び除外工程の順で実施することを含む、項１３−２又は項１３−４に記載の選出方法。
［項１３−８］前記準備工程が、配列データグループを取得する工程を含み、前記準備工程が、配列データに含まれる配列決定の品質に関する情報と、閾値とを対比することを含み、前記閾値未満の配列データをクリーンアップする工程を含む、項１０、項１３−１〜項１３−７のいずれかに記載の選出方法。
【０２１２】
［項１４］前記配列データグループが、前記ユニーク配列データで構成されるユニーク配列データグループであり、前記ユニーク配列データが塩基配列データであり、前記ユニーク配列データグループ中、出現頻度（集約）が最も大きいユニーク配列データを基準配列データ（ｎ＝０）とし、前記基準配列データの配列（以下「基準配列」という）と同じ長さであるが、前記基準配列に対してｎ個（ｎ＝１、・・・ｍ）の塩基置換を有する配列を有するユニーク配列データを照会配列データとし、前記準備工程が、前記基準配列データの出現頻度（集約）に対する前記照会配列の出現頻度（集約）の比率が閾値未満の照会配列を、前記基準配列データに統合する工程を含む、項１３−２〜項１３−７のいずれかに記載の選出方法。
［項１５］前記準備工程が、前記配列データグループ中の配列データを、配列長及び前記動物に対応する動物種のゲノム配列上のオリジナル配列のいずれか一方又は両方に基づいてクラス分けする工程を含む、項１０及び項１３〜項１４のいずれかに記載の選出方法。
［項１６−１］前記準備工程が、前記統合工程、及び前記除外工程の順で実施することを含む、項１４に記載の選出方法。
［項１６−２］前記準備工程が、前記統合工程、前記クラス分け工程、及び前記除外工程の順で実施することを含む、項１５に記載の選出方法。
【０２１３】
［項１７］前記オリジナル配列に基づくクラス分けが、前記配列データグループ中の配列データに示される抗体の可変領域を構成するＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のいずれか一方又は両方と、前記動物に対応する動物種のゲノム配列とのホモロジー検索により得られた配列一致度を算出する工程、及び前記配列データを、最も高い配列一致度を示す遺伝子断片に関するクラスに割り当てる工程を含む、項１５又は項１６−２に記載の選出方法。
［項１８］前記配列一致度の変化が、単位時間当たりの配列一致度の変化であり、及び抗体の種類の変化が抗体のクラススイッチである、項１０及び項１３〜項１７のいずれかに記載の選出方法。
［項１９］前記配列データグループが、免疫刺激を受けた可能性のある動物から、異なる時期にｉ回取得された抗体集団の各抗体の配列を配列決定した配列情報を有する配列データの集まりである、項１０及び項１３〜項１８のいずれかに記載の選出方法。
【０２１４】
［項２０］前記配列データグループから分子系統樹を作成する工程、及び、前記分子系統樹における配列クラスター中の配列データに示される抗体の配列と前記抗体のオリジナル配列との配列一致度の変化又は抗体の種類の変化に基づいて、前記配列クラスターが抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを判定する工程を更に含み、前記選出工程が、判定工程において抗体作製の候補となる抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された、配列クラスターから抗原特異抗体を示す配列データを選出する工程に読み替えられる、項１０及び項１３〜項１９のいずれかに記載の選出方法。
［項２１］前記準備工程、分子系統樹の作成工程、判定工程、及び選出工程の順で実施する、項２０に記載の選出方法。
【０２１５】
上記した第１の態様及び第４の態様に係る実施形態について言及した特徴は、本発明の第２の態様、第３の態様、第５の態様及び第６の態様に係る実施形態の対応する工程及び処理に適宜適用することができる。
【０２１６】
以下、具体的な実施例を記載するが、この実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【０２１７】
［実施例１］
本実施例では、抗原が投与された動物由来の抗体集団を配列決定することで得られた配列データグループの中から、抗原特異抗体を示す配列データを効率的に選び出すことを目的とする。
【０２１８】
（１）抗原投与及び採血プロトコル
アルパカ一頭に、２ｍｇ／回のヒトＩｇＧ抗体のＦａｂを抗原としてアジュバントと共に投与した。抗原は２週間隔で６回投与した。前記アルパカから血液（５０ｍＬ／回）を、抗原投与前に１回、抗原投与開始から１週間ごとに１４回、計１５回採取した。抗原投与及び採血のプロトコルの概要を以下に示す。
2020177529.tif 000019
【０２１９】
（２）抗体遺伝子の配列決定
各時期に採取された血液サンプルに、ヒト用リンパ球分離液（１．０７７ｇ／ｍＬ）及びＥＤＴＡ（終濃度０．１％）を添加し、リューコセップ（遠心管）を用いた遠心分離によって末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）を分離した。分離した各時期の血液サンプルのＰＢＭＣｓをＰＢＳでそれぞれ洗浄し、次いで、各血液サンプルのｍＲＮＡを、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を用いて抽出した。
【０２２０】
抽出したｍＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ及び以下の表に示したプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により、アルパカＩｇＧ２及びＩｇＧ３抗体の可変領域をコードしたＤＮＡ断片（約３００ｂｐ〜約５００ｂｐの配列長）を得た。
【０２２１】
【表１】
2020177529.tif 000020
【０２２２】
【表２】
2020177529.tif 000021
【０２２３】
Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  ｋｉｔ（イルミナ社）を用い、前記ＤＮＡ断片に、Ｍｉｓｅｑ用のアダプター配列及びバーコード配列を付加したシークエンス用のＤＮＡ断片ライブラリーを調製した。前記ライブラリーの塩基配列は、イルミナ社の次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ）を用いて、ペアエンド法により決定した。
【０２２４】
（３）配列データグループ
（Ａ）配列決定後の配列データグループ
各時期に採取された血液サンプル中の抗体集団の各抗体の配列データを集め、配列決定後の配列データグループとした。抗体の配列データは、抗体の可変領域部分をコードする塩基配列に関する情報、抗体のタイプ（ＩｇＧ２又はＩｇＧ３）に関する情報、採血時期に関する情報、採血した動物に関する情報、及び品質スコア（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ；Ｑスコア）を有した。
配列決定後の配列データグループ中、各時期に採取された血液サンプル中の抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）に関する配列データの個数（Ａ）を以下の表ａに示す。
【０２２５】
【表３】
2020177529.tif 000022
【０２２６】
本実施例において、分析対象である配列データグループ中の配列データの個数は約４９５万であった（表ａ）。
本実施例の目的は、前記配列データグループの中から、抗原特異抗体を示す配列データを効率的に選び出すことである。この目的のために、本実施例では、配列データグループ中の配列データについて分子系統樹を作成する。一般に、分子系統樹の作成は、分析対象であるデータ数が増えると、その計算量が指数関数的に増加する。このため、過大なデータ数に対して分子系統樹の作成を行った場合、その計算に膨大な時間を要することとなり、現実的ではない。或いは、計算機の性能によっては、適切な分子系統樹が作成できない場合もある。本実施例の目的を達成するために、前記配列データグループに対して後述の処理（Ｂ）〜（Ｆ）を施して、データ数を減らしたうえで、分子系統樹を作成し、作成した分子系統樹から抗原特異抗体を選び出すこととした。
【０２２７】
（Ｂ）ユニーク配列データへの集約
前記配列データグループ中、同一の塩基配列を示す配列データを１つの配列データ（＝「ユニーク配列データ」）に集約した。ユニーク配列データの生成を、前記配列データグループ全体に対して行い、ユニーク配列データグループを生成した。このユニーク配列データの集約処理により、例えば血液サンプル（１回目）のＩｇＧ２抗体に関しては、配列ライブラリー中の配列データの個数は約２１万個（Ａ）から約９万個（Ｂ）に減少した（表ａ）。従って、ユニーク配列データへの集約処理により、分子系統樹作成のための計算量を低減させることができる。
ユニーク配列データは、配列データに含まれる前記情報に加えて、集約された塩基配列データの個数に関する情報（＝「出現頻度（集約）」）をさらに含む。
【０２２８】
（Ｃ）アミノ酸配列を示さない配列データ等の除外（クリーンアップ）
ユニーク配列データのユニーク配列の配列長が３の倍数でない場合、そのユニーク配列データは抗体となるアミノ酸に関する情報を有していないことを意味する。ユニーク配列データグループから、アミノ酸配列を示さないユニーク配列データを除外（クリーンアップ）した。このクリーンアップ処理を、ユニーク配列データグループ中の全ての配列データに対して行い、その配列長が３の倍数のユニーク配列データから構成されるクリーンアップ配列データグループを生成した。
このクリーンアップ処理により、例えば血液サンプル（１回目）のＩｇＧ２抗体に関しては、ユニーク配列データの配列ライブラリー中の配列データの個数は約９万個（Ｂ）から約６．９万個（Ｃ）に減少した（表ａ）。従って、クリーンアップ処理により、分子系統樹作成のための計算量を低減させることができる。
【０２２９】
（Ｄ）配列決定の誤りの統合
配列決定により得られた配列情報には、配列決定に付随する過程で生じるランダムなエラーが含まれ得ることが知られている。ランダムなエラーを有する配列データは、本来の配列に対して一塩基置換、二塩基置換・・・ｎ個の塩基置換が導入された配列情報を有し得る。このような塩基置換を有する配列データは、ランダムに生成されるため、当該配列データの出現率はポアソン分布に従う。あるユニーク配列データの出現率と、そのユニーク配列と一塩基、二塩基、・・・ｎ塩基異なる塩基配列を示す配列データの出現率が、ポアソン分布に従う場合、それら一群の配列データは、前記ユニーク配列にランダムなエラーが入った配列を示す配列データの集まりと考えられるため、前記一群の配列データを本来の配列を示すユニーク配列データに統合する。
【０２３０】
本実施例では、配列決定の誤りの統合は以下のように行った：
（ａ）基準配列αに関する統合用配列データグループの生成
クリーンアップ配列データグループ中、出現頻度（集約）が一番大きいユニーク配列データを基準配列データαとし、基準配列データαに示される塩基配列（以下「基準配列α」ともいう）と同じ配列長であるが、基準配列αと一塩基異なる配列を示すユニーク配列データ、二塩基異なる配列を示す配列データ、・・・ｍ個の塩基が異なる配列を示す配列データ（以下「照会配列データ（ｎ＝ｍ）」ともいう）を集め、基準配列αに関する統合用配列データグループを生成した。
【０２３１】
基準配列αに関する統合用配列データグループにおいて、基準配列αと一塩基異なる塩基配列を示す照会配列データ（ｎ＝１）には、塩基置換の数は一個で共通するが、塩基置換の場所が異なる様々な塩基配列のユニーク配列データが存在する。照会配列αに関する統合用配列データグループにおいて、照会配列データ（ｎ＝ｍ）におけるｍは、基準配列データαの出現頻度（集約）と塩基置換の期待値とから、出現頻度（集約）がはじめて１以下になる値とした。
【０２３２】
（ｂ）確率密度の算出
基準配列αに関する統合用配列データグループにおいて、基準配列データαの出現頻度（集約）と各照会配列データ（ｎ＝１、２・・・ｍ）の出現頻度（集約）の総和で、基準配列データαの出現頻度（集約）を除することで、基準配列データαの確率密度を算出した。同様に、前記総和で、各照会配列データ（ｎ＝１、２・・・ｍ）の出現頻度（集約）を除することで、各照会配列データの確率密度を算出した。ここで、照会配列データ（ｎ＝１）には、基準配列αと一塩基異なる種々のユニーク配列データが含まれている。従って、照会配列データ（ｎ＝１）の確率密度は、基準配列αと一塩基異なる個々のユニーク配列データの確率密度の合計値である。
【０２３３】
（ｃ−１）基準配列に関するヒストグラムがポアソン分布に従う場合
基準配列αに関する統合用配列データグループについて、基準配列αに対する塩基置換の個数の順に並べた、基準配列αに関するヒストグラムを作成した（図１ａ）。基準配列αに関するヒストグラムにおいて、基準配列データαの確率密度と照会配列データ（ｎ＝１〜５）の確率密度の分布がポアソン分布に従う場合（図１ｂ）、基準配列αに関する統合用配列データグループ中の照会配列データ（ｎ＝１〜５）を基準配列データα（ｎ＝０））に統合し、基準配列αに関する合ユニーク配列データを生成した（図１ｃ）。
【０２３４】
（ｃ−２）基準配列に関するヒストグラムがポアソン分布に従わない場合
基準配列βに関する統合用配列データグループについて、基準配列βに対する塩基置換の個数の順に並べた、基準配列βに関するヒストグラムを作成した（図１ｄ）。基準配列βに関するヒストグラムにおいて、基準配列データβの確率密度と照会配列データ（ｎ＝１〜５）の確率密度の分布がポアソン分布に従わなかったため、以下の処理を行った。
【０２３５】
特定の照会配列データ（例えばｎ＝２）に含まれる特定のユニーク配列データの出現率（＝［そのユニーク配列の出現頻度（集約）］／［基準配列データβの出現頻度（集約）と各照会配列データ（ｎ＝１、２・・・ｍ）の出現頻度（集約）の総和］）が、確率の観点から外れ値と判断される場合、そのユニーク配列データは、基準配列βとは別のユニーク配列と推定される。この推定に基づき、前記別のユニーク配列を示すユニーク配列データ（以下「基準配列データγ」という）を、基準配列βに関する統合用配列データグループから除外し、元のクリーンアップ配列データグループに戻した。
【０２３６】
また、基準配列データγを除外した基準配列βに関する統合用配列データグループにおいて、基準配列データγの塩基配列と同一の塩基置換（同じ塩基の番号に、同じ種類の塩基置換）を有する、基準配列γと一塩基、二塩基・・・ｌ個の塩基が異なる塩基配列を示す配列データを、基準配列βに関する統合用配列データグループから除外し、元のクリーンアップ配列データグループに戻した。この処理は、基準配列データγの塩基配列と同一の塩基置換を有する配列データは、基準配列データγの塩基配列にランダムなエラーが生じた配列を示す配列データと考えられるためである。
【０２３７】
基準配列データγの配列に関連する配列データを除外した基準配列βに関する統合用配列データグループにおいて、確率の観点から外れ値と判断される確率密度を示すユニーク配列データが存在する場合、上記除外処理を繰り返し行った。
基準配列βと別のユニーク配列を示す配列データを除外した後の基準配列βに関する統合用配列データグループにおいて、基準配列データβの確率密度とその照会配列データ（ｎ＝１、２・・・ｍ）の確率密度の分布がポアソン分布に従う場合（図１ｅ）、照会配列データ（ｎ＝１、２・・・ｍ）を基準配列データβに統合した。
【０２３８】
クリーンアップ配列データグループから配列決定の誤りの統合に用いた配列データを除外し、除外したクリーンアップ配列データグループについて、上記配列決定の誤り統合処理を繰り返す。配列決定の誤り統合処理を繰り返すうち、基準配列データδについても、配列決定の誤りの統合が実行された（図１ｆ）。
【０２３９】
（ｄ）配列決定の誤り統合後の配列データグループの生成
配列決定の誤りの統合に用いた配列データを除外した配列データグループにおいて、上記配列決定の誤りの統合処理を、一番大きい出現頻度（集約）が１になるまで繰り返した。一番大きい出現頻度（集約）が１になった場合、上記で生成した統合ユニーク配列データを集めて、統合ユニーク配列データグループを生成した。
【０２４０】
この配列決定の誤り統合処理により、配列データグループ中の配列データの個数は、例えば血液サンプル（１回目）のＩｇＧ２抗体に関して、約６．９万個（Ｃ）から約０．２万個（Ｄ）へと大幅に減少した（表ａ）。従って、配列決定の誤り統合処理により減少した個数の配列データを含む配列データグループについて分子系統樹を作成することで、その計算量を低減させることができる。
【０２４１】
統合後のユニーク配列データは、ユニーク配列データに含まれる前記情報に加えて、ユニーク配列データに統合された配列データの数に関する情報（出現頻度（統合））をさらに含む。
【０２４２】
（Ｅ）クラス分けによる、クラス分け配列データグループの生成
抗体は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え（V(D)J recombination）の過程、次いで、親和性の成熟（affinity maturation）の過程を経て、成熟することが知られている。
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程で、抗体は、ゲノム配列上に存在する複数種類のＶ遺伝子断片、複数種類のＤ遺伝子断片及び複数種類のＪ遺伝子断片からそれぞれ１つずつ組合されて産生される。この際、塩基の欠失又は付加がそれらの連結部位でランダムに生じ得る。従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子断片の種々の組合せを有する様々な配列長の抗体が、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程で生成され得る。
親和性成熟の過程で、抗体は、高頻度の点突然変異をその可変領域に受ける。この点突然変異は、塩基置換変異が主であり、塩基の欠失又は挿入は稀である。従って、配列長は同一であるがアミノ酸配列が異なる様々な抗体が、親和性成熟の過程で生成され得る。
【０２４３】
抗原の追加投与によって、特定の抗体が成熟していく過程を経時的に追跡するにあたっては、血液サンプル中の抗体集団をＶ（Ｄ）Ｊ組換えの過程で産生された抗体ごとにクラス分けし、次いで、前記グループ中の抗体のＶ遺伝子領域、及びＪ遺伝子領域の可変領域に生じた突然変異（塩基置換）を追跡することが合理的と考えた。
【０２４４】
（Ｅ−１）配列長に基づくクラス分け
上記したＶ（Ｄ）Ｊ組換えの過程を考慮し、配列データグループ中の配列データをその配列長に基づいてクラス分けし（図２ａ）、各クラスに対応する配列長を示す配列データで構成される配列長クラス配列データグループを生成した。
【０２４５】
上記したように、抗体の親和性成熟では、塩基置換が主として生じ、通常、その配列長に変化はない。このため、配列長クラス配列データグループ中の各クラスには、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにより産生された様々な抗体と、その後の親和性成熟を受けた一連の抗体とが集まっていると期待される。従って、配列長に基づくクラス分け処理により得られた各配列長クラス配列データグループについて分子系統樹を作成することで、その計算量を低減させつつ、そのクラス内に含まれる親和性成熟を受けた抗体の配列データを効率的に選び出すことが可能となる。
【０２４６】
（Ｅ−２）オリジナル配列に基づくクラス分け
親和性成熟の過程での塩基置換は、抗体のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片のうち、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する部分に集中する。Ｖ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片において、ＣＤＲ配列以外の塩基配列はゲノム配列上のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片の塩基配列とほとんど同一である。従って、その抗体のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片の塩基配列から、その抗体が、ゲノム配列上のどのＶ遺伝子断片とどのＪ遺伝子断片との組合せにより産生されたかを推定できると考えた。
【０２４７】
実際、その抗体のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片の塩基配列を、アルパカのゲノム配列に対して、配列同一性をｂｌａｓｔにより検索したところ、その抗体のＶ遺伝子断片、Ｊ遺伝子断片の配列に対応するゲノム配列上のＶ遺伝子断片、及びＪ遺伝子断片それぞれの配列を推定可能であった。
【０２４８】
抗体のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片それぞれのオリジナル配列に基づいて、配列データグループをさらにクラス分けする。例えば、抗体の可変領域の塩基配列が３５４ｂｐの配列長クラス配列データグループについて、抗体のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片それぞれのオリジナル配列に基づいてクラス分けした（図２ｂ）。このオリジナル配列に基づくクラス分けを、各配列長クラス配列データグループに対して行い、クラス分け配列データグループを生成した。
【０２４９】
オリジナル配列に基づいてクラス分けされた各配列データは、統合ユニーク配列データに含まれる情報に加えて、そのオリジナルのＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片に関する情報をさらに含む。
【０２５０】
上記したように、抗体の親和性成熟では、塩基置換が主として抗体のＣＤＲ配列に生じ、通常、その他の塩基配列に変化はない。このため、オリジナル配列データグループ中の各クラスには、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにより産生された特定の抗体と、その後の親和性成熟を受けた一連の抗体とが効率的に集まっていると期待される。従って、オリジナル配列に基づくクラス分け処理により得られた各クラスについて分子系統樹を作成することで、その計算量を低減させつつ、その分子系統樹から抗原特異抗体をより効率的に選び出すことが可能となる。
【０２５１】
（Ｆ）配列クラスター形成性配列データグループの生成
親和性成熟の過程において、抗原に対する親和性が比較的高い抗体を示すＢ細胞は、前記抗原からの刺激を優先的に受け、前記Ｂ細胞は選択的に増殖することとなる。このＢ細胞の増殖過程で前記抗体の可変領域には高い変異率で変異が導入され、より高い親和性を示す抗体が産生され得る。この親和性成熟の過程を考慮すれば、より高い親和性を示す抗原特異抗体が産生されるまでに、前記抗原からの刺激を優先的に受けることを可能にした、前記抗原特異抗体の塩基配列と類似した一連の抗体群が存在したはずである。
従って、親和性成熟を受けてより高い親和性を示す抗原特異抗体は、分子系統樹解析を行った場合、その抗体の塩基配列と類似する塩基配列を有し、且つ比較的高い親和性を有する一連の抗体とともに、分子系統樹解析において配列クラスターを形成すると考えられる。
【０２５２】
反対に、抗原に対する親和性が比較的低い抗体を示すＢ細は、前記抗原からの刺激を優先的に受けることができず、前記Ｂ細胞は選択的に増殖することができない。この結果、そのような親和性が比較的低い抗体を示す抗体遺伝子に変異が蓄積することはない。
このように、親和性成熟を受けていない比較的低い親和性を示す抗体は、分子系統樹解析を行った場合、その抗体の塩基配列と類似する塩基配列を有する抗体は少なく又はほとんどなく、分子系統樹解析において配列クラスターを形成しないと考えられる。
【０２５３】
以上より、分子系統樹解析において、配列クラスターを形成しないと推定される抗体の配列データ（以下「配列クラスター非形成性配列データ」という）を配列データグループから予め除外することで、分子系統樹作成に必要な計算量を低減させることが可能となる。
【０２５４】
本実施例では、配列決定した抗体の塩基配列の配列長は概ね３００ｂｐ〜５００ｂｐであったことから、配列同一性が約９０％となる塩基置換の数として「４０」を設定した。
上記した配列長及びオリジナル配列に基づくクラス分け配列データグループ内の任意のクラス中の特定の配列データの配列に関して、４０個までの塩基置換を有する配列を示す配列データの合計が前記クラス内で１０を下回る場合（以下「Ｕ４０＜１０」等という）、前記特定の配列データは親和性成熟を受けていない抗体に関する配列データ（即ち、配列クラスター非形成性配列データ）と評価し、前記クラスから除外した。
【０２５５】
この配列クラスター非形成性配列データの除外を、前記クラスに含まれるすべての配列データに対して行うことで、そのクラスには４０個までの塩基置換を有する配列を示す配列データが少なくとも１０個存在する配列データ（以下「配列クラスター形成性配列データ」という）が残ることとなる。このような配列クラスター形成性配列データは、親和性成熟を受けた抗原特異抗体を示す配列データであると推定されるため、配列クラスター形成性配列データで構成される配列データグループ（以下「配列クラスター形成性配列データグループ」ともいう）には、抗原特異抗体を示す配列データが非常に効率的に含まれることとなる。
【０２５６】
上記した配列クラスター非形成性配列データの除外処理により、そのクラスに含まれる配列データの個数を低減することができるため、分子系統樹作成の際の計算量を低減させることができる。また、配列クラスター形成性配列データグループについて作成した分子系統樹からは、非常に効率的に抗原特異抗体を選び出すことが可能となる。
【０２５７】
（４）分子系統樹の作成
配列データグループからＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ６９を用いて距離行列を計算し、距離行列から近接結合法（neighbor-joining method）を用いることによって分子系統樹を得た。これらの計算に、統計分析ソフトウェア「Ｒ」のａｐｅパッケージを用いた。
【０２５８】
本実施例では、まず、配列クラスター非形成性配列データの除外を行わず、３５４ｂｐの配列長及びオリジナル配列（ｖｈｈ３−ｉｇｈＪ−４）のクラス分け配列データグループについて、分子系統樹（Ｕ４０≧０）を作成した（図３ａ）。さらに、配列クラスター非形成性配列データの除外（Ｕ４０＜１０、Ｕ４０＜５０）を行い、配列クラスター形成性配列データグループについてそれぞれ分子系統樹を作成した（図３ｂ；Ｕ４０≧１０、及び図３ｃ；Ｕ４０≧５０）。ここで、本実施例において「Ｕ４０≧１０」及び「Ｕ４０≧５０」は、ある配列データに示される塩基配列に４０個までの塩基置換を有する配列を示す配列データの数（＝「Ｕ４０」）が１０以上及び５０以上であることをそれぞれ意味する。
【０２５９】
配列クラスター非形成性配列データを配列データグループから予め除外することによって、分子系統樹の作成のための計算量を低減できるだけでなく、作成される分子系統樹の複雑度（例えば、枝の分岐点（ノード）の数、枝の数）が低減した。これにより、後述する分子系統樹からの配列クラスター抽出が容易となった。
【０２６０】
（５）分子系統樹から配列クラスターの抽出
親和性成熟を受けたことが期待される一連の抗体群を示す配列データを含む配列クラスターを抽出するために、以下の処理を行った。
作成された分子系統樹において、枝同士のノードから延びる枝の長さが、枝長に関する閾値以上の場合、そのノードから延びる枝において前記閾値に対応する位置よりも枝根に対して遠方（外側）の部分を配列クラスターとして抽出した（図４ａ）。また、配列クラスター抽出後の分子系統樹において、所定範囲内のノードの数がノードの数に関する閾値以上の場合、その所定の領域範囲も配列クラスターとして抽出した（図４ｂ中のｂ２）。この配列クラスター抽出により、図４ａで示される分子系統樹から９つの配列クラスター（ｂ１〜ｂ９）が抽出された（図４ｂ）。
【０２６１】
（６）抗原特異抗体を示す配列データを含む配列クラスターであるか否かの判定
上記のように抽出された配列クラスターが、抗原特異抗体を示す配列データを含むか否かを以下のように判定した。
抗体の親和性成熟では、抗体の可変領域に点突然変異が高頻度に生じ、その結果、抗原との親和性が高い抗原特異抗体へと成熟していく。親和性成熟を受けた抗体の配列には、抗原投与後の時間経過に応じて点突然変異が数多く蓄積する。このため、その塩基配列は、そのオリジナル配列と比べた場合に、その配列同一性又はホモロジー検索におけるスコア値（配列が一致する場合に正のスコアを付与する場合）は小さくなっていくと期待される。
【０２６２】
（４）及び（５）にて説明したようにして、配列データグループから分子系統樹（図５ａ及び図５ｂ）を作成した（Ｕ４０≧１０）。図５ｂは、図４で示される系統樹（図４ａ）のうち、ｂ１で示される配列クラスター（図４ｂ）に含まれる配列データグループから作成された分子系統樹である。作成した分子系統樹における配列クラスター（図５ａ中赤丸で（曲線で丸く）囲った領域、及び図５ｂ中赤丸で（曲線で丸く）囲った領域）中の抗体の配列データについて、各抗体の配列とその抗体のオリジナル配列との配列一致度を算出した。具体的には、各抗体のＶ遺伝子領域及びＪ遺伝子領域の配列データと、ＢＬＡＳＴ検索で推定したその遺伝子領域に対応するオリジナル配列との同一性を、ビットスコア（スコア値）にて評価した。
【０２６３】
図５ａ及び図５ｂ中赤丸で（曲線で丸く）囲った配列クラスターそれぞれにおける抗体の配列データについて採血時期に応じたビットスコアの変化を示すために、横軸を抗原投与後の採血のタイミング（ｗｅｅｋｓ）とし、縦軸をビットスコアとした散布図を作成した（図５ｃ及び図５ｄ）。図５ｃ及び図５ｄにおいて丸プロット（○）はＩｇＧ２の配列データを示し、三角プロット（△）はＩｇＧ３の配列データを示す。各プロットのサイズは、各ユニーク配列データの個数（出現頻度（合計））を反映し、プロットサイズが大きいものほど、出現頻度（合計）が高いことを示す。各プロットの色（濃淡）は、その抗体配列がどの採血時期に初めて出現したかを示している（図５ｃ及びｄ中の挿入図）。
【０２６４】
（配列一致度の傾き）
図５ｃは、抗原投与前（１回目）の抗体のオリジナル配列から算出されたビットスコアと、４〜１５回の採血時期の抗体の配列データから算出されたビットスコアとがほとんど変化していないことを示す。これは、６回の抗原投与を含む本実施例のプロトコルでは、この配列クラスター（図５ａ中の赤丸（曲線で丸く囲われた領域））中の配列データに示される抗体には変異は蓄積されなかったこと、即ち、前記配列クラスターは投与した抗原に特異的な抗体を示す配列データを含まないことを示している。従って、この配列クラスターは、抗原特異抗体を含む配列クラスターではないと判定される。
【０２６５】
図５ｄは、抗原投与前（１回目）の抗体のオリジナル配列から算出されたビットスコアと比べて、４〜１５回の採血時期の抗体の配列データから算出されたビットスコアは一定の割合で低下した。これは、６回の抗原投与を含む本実施例のプロトコルにより、この配列クラスター（図５ｂ中の赤丸（曲線で丸く囲われた領域））中の配列データに示される抗体に変異が順次蓄積されたこと、即ち、前記配列クラスターは抗原特異抗体を示す配列データを含むことを示唆する。従って、この配列クラスターは、抗原特異抗体を含む配列クラスターであると判定される。
【０２６６】
（時間経過に伴う抗体種類の多様化）
図５ｄで示されるプロットの色（濃淡）は、抗原投与後からの週数（ｗｅｅｋｓ）が増えるに従って、黄色（淡色の「３」）から水色（比較的濃い色の「９」）を経て赤色（濃色の「１５」）（図５ｄ挿入図）へと変化した。この色（濃淡）の変化は、抗原の追加投与を通じて、抗体の種類が増えたことを示している。反対に、図５ｃで示されるプロットの色（濃淡）は、緑色（淡色の「４〜７」）のままであった。この色（濃淡）が変化しないことは、抗原の追加投与を通じて、抗体の種類に変化がなかったことを示している。
これらの結果は、配列クラスター内の配列データの種類が、抗原投与後のある時点で閾値よりも多い場合又は時間経過に伴って増える場合、その配列クラスターは、抗原特異抗体を含む配列クラスターであることを示唆する。従って、そのような配列クラスターは、抗原特異抗体を含む配列クラスターであると判定される。
【０２６７】
（クラススイッチ）
図５ｄでは、丸及び三角のプロットが含まれ、それらの出現比が時間経過に伴って大きく変化している。これは、この配列クラスター内にＩｇＧ２抗体とＩｇＧ３抗体とが含まれること、及び、抗体のクラスがＩｇＧ２とＩｇＧ３とで入れ替わっていること（即ち抗体のクラススイッチが生じていること）を示している。反対に、図５ｃでは、丸及び三角のプロットの出現比がほぼ一定であった。これは、この配列クラスター内でクラススイッチはほとんど生じていないことを示している。
これらの結果は、配列クラスター内の配列データに示される抗体クラスが、時間経過に伴って変化する場合、その配列クラスターは、抗原特異的な抗体を含む配列クラスターであることを示唆する。従って、そのような配列クラスターは、抗原特異抗体を含む配列クラスターであると判定される。
【０２６８】
（抗原投与前の配列一致度）
図５ｄの抗原投与前のビットスコアは約４３０であった。他方、図５ｃの抗原投与前のビットスコアは約３５０であった。本実施例において、ビットスコアは、オリジナル配列との配列一致度が高いほど、大きな数値を示す。
抗原投与前のビットスコアが小さい理由として、その抗体は、本実施例で投与された抗原とは別の抗原に対して既に親和性成熟を受けたものであることが推測される。そのような親和性成熟を受けた抗体は、本実施例で投与された抗原に対して親和性成熟を受けることは生物学的に通常ない。実際、抗原投与前のビットスコアのその最大値に対する割合が小さい抗体を含む図５ｃの配列クラスターは、上記のとおり、本実施例で投与された抗原に対する抗原特異抗体ではないと結論された。従って、抗原投与前のビットスコアのその最大値に対する割合が小さい抗体を含む配列クラスターは、抗原特異抗体を含まないと判定される。
【０２６９】
（７）配列クラスター中の配列データから再構築した抗体の結合力の測定
上記（６）のようにして、抗原特異的な抗体の配列データを含むと判定された配列クラスター中の配列データの塩基配列に基づいて、対応する可変領域を含む抗体を再構築した。
具体的には、前記配列データに示される、抗原特異的な抗体の可変領域をコードする塩基配列の情報に基づいて、大腸菌発現用に塩基コドンを最適化した塩基配列を有するＤＮＡを合成し、合成したＤＮＡを大腸菌発現用ベクター（ｐＡＥＤ４またはｐＣｏｌｄ３）に挿入して、ＶＨＨ抗体発現用プラスミドを構築した。前記プラスミドを用いて形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）を所定条件下で培養して、前記ＤＮＡから対応する可変領域を有するＶＨＨ抗体を産生させ、公知の方法に従って、大腸菌から前記ＶＨＨ抗体を回収した。
【０２７０】
回収した前記抗体の投与した抗原（ヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ）に対する結合力（解離定数）を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥヘルスケアジャパン）にて測定した。結合力測定では、回収した抗体（濃度：１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ）を、ＣＭ５センサーチップ上に固定化した抗原Ｆａｂと接触させる様式にて測定した（図５ｆ）。
【０２７１】
その結果、抗原特異的な抗体の配列データを含むと判定された配列クラスター中の前記配列データに示される可変領域を有する抗体は、抗原Ｆａｂに対して０．５ｎＭの解離定数でもって結合することが示された。実施例１の結果から、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスターは、実際に、比較的強い結合力でもって抗原に結合する抗体（抗原特異抗体）の塩基配列データを含むことが示された。
【０２７２】
同様に、上記（６）において、抗原特異的な抗体の配列データを含まないと判定された配列クラスター中の配列データの塩基配列に基づいて、対応する可変領域を含む抗体を再構築し、その抗体の前記抗原に対する結合力を測定した（図５ｅ）。その結果、抗原に対する結合力を測定することはできず、実際に、抗原特異抗体の塩基配列データではないことが示された。
【０２７３】
［実施例２］
抗原特異的な抗体の配列データを含むと判定された配列クラスター中の種々の配列データから再構築した抗体の結合力測定を行った。
図５ｂとは別のクラス分け配列データグループ（配列長：３８１ｂｐ、Ｖ遺伝子断片：ＶＨＨ３−Ｓ８、及びＪ遺伝子断片：ｉｇｈＪ−６）について、実施例１と同様にして分子系統樹を作成した（図６ａ）。図６ａの赤丸で（曲線で丸く）囲った領域中の抗体配列データについて、前述の方法と同様にして、横軸を抗原投与後の採血のタイミング（ｗｅｅｋｓ）とし、縦軸をビットスコアとした散布図を作成した（図６ｂ）。プロットの傾きおよび色（濃淡）の変遷から、この配列クラスターは抗原特異抗体を含む配列クラスターであると判定された。
【０２７４】
次に、図６ａ中赤丸で示した（曲線で丸く囲われた）配列クラスターに含まれる抗体の配列データを用いて分子系統樹を作成した（図６ｃ）。実施例１に記載の方法と実質的に同じ方法で、図６ｃ中破線矢印で示した（ｃ１、ｃ２、ｃ３）の配列データから、抗体をそれぞれ再構築した。再構築した抗体の結合力測定を実施例１と同様に行った。
【０２７５】
図６ｃ中のｃ１で示した配列データから再構築した抗体は、抗原への結合定数が３７０ｎＭであり、抗原からの解離が速い又は解離速度定数［ｎＭ／ｓ］が高いという特徴があった。図６ｃ中のｃ２およびｃ３で示した配列データから再構築した２つの抗体は、抗原への結合定数がそれぞれ６８ｎＭ及び９０ｎＭであり、いずれも図６ｃ中のｃ１の抗体に比べて、比較的高い結合力で投与した抗原と結合した。また、抗原からの解離も比較的遅かった。
【０２７６】
図６ｃ中のｃ１で示した配列データは６週目の採血のタイミングで得られたものであった。図６ｃ中のｃ１よりも強い結合力を示した図６ｃ中のｃ２及びｃ３の配列データは１３週目の採血のタイミングで得られたものであった。
【０２７７】
実施例２は、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスター中の配列データはいずれも、比較的高い結合力を有する抗体の可変領域をコードする塩基配列を含むことを示した。また、実施例２は、前記配列クラスター内にも様々な特徴を持つ抗体の可変領域をコードする塩基配列情報を有する配列データが存在することを示した。
【０２７８】
実施例２は、抗原特異抗体を示す配列データを含むと判定された配列クラスター中の配列データのなかでも、抗原の投与回数がより多く、抗原投与からの週数がより経過した抗体の配列データの方がより高い結合力を有する抗原特異抗体である可能性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月30日(2020.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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