(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ＪＮＫを活性化させる新規な素材を提供することである。【解決手段】本発明は、ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分とするＪＮＫ活性化用組成物を提供する。また、これらのＪＮＫ活性化用組成物を含むＪＮＫ活性化用飲食品、抗酸化用飲食品、細胞防御用飲食品を提供する。【選択図】図３Ａ
2020152653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分として含むことを特徴とするＪＮＫ活性化用組成物。
【請求項２】
前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、及びラクトバチルス・ブフネリからなる群から選ばれる１以上である請求項１に記載のＪＮＫ活性化用組成物。
【請求項３】
前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカスである請求項１に記載のＪＮＫ活性化用組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体又はその培養物を有効成分として含むことを特徴とするＪＮＫ活性化用組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含むＪＮＫ活性化用飲食品。
【請求項６】
請求項１から請求項４のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含む抗酸化用飲食品。
【請求項７】
請求項１から請求項４のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含む細胞防御用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＮＫ活性化用組成物に関する。特に、乳酸菌のＳ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および前記Ｓ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物を含むＪＮＫ活性化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、様々な細胞の機能発現に重要な役割を果たしている。ＭＡＰＫは構造的に類似した複数のタンパク質から成るスーパーファミリーを形成しており、とくにＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ、以下単にＪＮＫということがある）、ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ３８）、及びＥＲＫタンパク質が知られている。このうちＪＮＫは、放射線やサイトカイン刺激、熱ショックなどのストレスによって活性化される。ＪＮＫの異常な活性化は慢性炎症に伴う各種疾患の原因となることが知られているが、一方でＪＮＫを適度に活性化させることは有益な作用をもたらす。これまでにいくつかのＪＮＫ活性化を介した有用な作用が報告されている。
非特許文献１は、ＪＮＫ活性化を介したインターフェロン発現上昇による感染防御作用を示している。
非特許文献２は、ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５が、ＪＮＫを活性化することで、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路を亢進して抗酸化能を向上させることを示している。
非特許文献３は、ラクトバチルス属乳酸菌から調製したリポテイコ酸が、ＪＮＫを活性化し、ＴＮＦα発現を誘導することを示している。
非特許文献４は、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧが産生する可溶性成分が、ＪＮＫを含むＭＡＰＫを活性化し、熱ショックタンパク質産生を誘導することで細胞防御に働くことを示している。
特許文献１は、ラクトバチルス・ヘルベティカスがＭＫＰ−１を誘導する作用があることを示している。ＭＫＰ−１はＭＡＰＫの負の制御因子であることから、ＭＡＰＫの活性化を抑制する作用が示唆されている。
しかしながら、本願の提供する解決手段はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−１７１６１６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｅｊｅｒ，Ｇ．, ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  ２００８：ｅ１０００２０８
【非特許文献２】Ｋｏｂａｔａｋｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１７：ｅ０１７７１０６
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３：２５９−２６６
【非特許文献４】Ｔａｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６：Ｃ１０１８−Ｃ１０３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ＪＮＫを活性化させる新規な素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明には以下の構成が含まれる。
〔１〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および前記Ｓ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を含むことを特徴とするＪＮＫ活性化用組成物。
〔２〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、及びはラクトバチルス・ブフネリからなる群から選ばれる１以上である〔１〕に記載のＪＮＫ活性化用組成物。
〔３〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカスである〔１〕に記載のＪＮＫ活性化用組成物。
〔４〕ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体又はその培養物を有効成分として含むことを特徴とするＪＮＫ活性化用組成物。
〔５〕〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含むＪＮＫ活性化用飲食品。
〔６〕〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含む抗酸化用飲食品。
〔７〕〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載のＪＮＫ活性化用組成物を含む細胞保護用飲食品。
【発明の効果】
【０００７】
ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳ層タンパク質（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＰ））およびその分解物、もしくはラクトバチルス・ヘルベティカス乳酸菌菌体およびその培養物などのＪＮＫを活性化する素材を体内に摂取することにより、ＪＮＫが活性化され、抗酸化作用、細胞防御作用など様々な効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示す写真である。
【図２】ＳＬＰ、加熱したＳＬＰ、ＳＬＰ分解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示す写真である。
【図３】Ｃａｃｏ−２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰを添加した際のＪＮＫリン酸化をウエスタンブロッティングで評価した結果を示す写真（Ａ）およびグラフ（Ｂ）である。
【図４】Ｃａｃｏ−２細胞をＭＡＰＫもしくはＮＦ−κＢ阻害剤処理した後にラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰを添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図５】Ｃａｃｏ−２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４５）、ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブレビスＨＹＺ３３０４３、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５から精製したＳＬＰを添加した際のＪＮＫリン酸化をウエスタンブロッティングで評価した結果を示す写真である。
【図６】Ｃａｃｏ−２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスのＳＬＰ、加熱したＳＬＰ、ＳＬＰ分解物を添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図７】Ｃａｃｏ−２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスの菌体及びＳＬＰを添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図８】Ｃａｃｏ−２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスの脱脂乳培養物を添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、新規なＪＮＫ活性化用組成物を提供するものである。
本発明のＪＮＫ活性化用組成物について以下に詳細に説明する。
（ＪＮＫ活性化用組成物）
Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＳＬＰということがある）は種々の細菌の細胞壁外層で認められ、規則的な結晶構造を呈することを特徴とするタンパク質である。ＳＬＰは細胞壁成分に非共有的に結合していることから、塩化リチウムなどのカオトロピック試薬によって菌体から抽出される。また、抽出されたＳＬＰはカオトロピック試薬を除くことで規則的な結晶構造を再形成する。この特徴を利用し、菌体からの精製が可能となる。
乳酸菌の中ではラクトバチルス属においてＳ−ｌａｙｅｒを発現していることが見出されており、向井らの報告（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，１９（１）：２１−２９，２００８）ではラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループ乳酸菌をはじめとする１３菌種でＳＬＰの発現が確認もしくは推定されている。これらの乳酸菌が発現しているＳＬＰには、等電点が９〜１０の塩基性タンパク質であること、Ｎ末端領域に２３〜３０アミノ酸残基からなるシグナルペプチド配列を持つことといった共通点がある。
本発明のＪＮＫ活性化用組成物に用いるＳＬＰは、ラクトバチルス属に由来し、当該作用を有するものであればどのようなものでも用いることができるが、ラクトバチルス・ヘルベティカスが好ましく、ラクトバチルス・ヘルベティカスのうちでもＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４５）が最も好ましい。  
また、本発明の有効成分であるラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳＬＰは、菌体から精製されたものである必要はなく、粗精製画分でも良いが、精製したＳＬＰがより好ましい。
また、本発明の有効成分には、ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌体又はその培養物を利用することもできる。菌体自体は、生菌体でも死菌体でもよく、培養物は液体培養物でも固体培養物でもいずれでもよい。
【００１０】
（ＪＮＫ活性化用組成物の製造方法）
本発明のＪＮＫ活性化用組成物に用いられるＳＬＰは、以下の方法に従って乳酸菌菌体より精製することができる。対象とするラクトバチルス属乳酸菌をＭＲＳ液体培地などの液体培地、もしくは脱脂乳で十分に培養した後に菌体を回収し、必要に応じて洗浄を行う。菌体は、寒天培地などに生育させたコロニーから回収してもよい。得られた菌体をそのまま、もしくは凍結乾燥した後に、塩化リチウム、尿素、塩酸グアニジンなどのカオトロピック試薬溶液で懸濁、攪拌して菌体表層のＳＬＰを可溶化する。可溶化したＳＬＰを含む溶液から固形物を除いた後、透析などによってカオトロピック試薬を除き、ＳＬＰを析出させる。析出したＳＬＰを回収後、必要に応じて洗浄を行い、精製ＳＬＰとする。本発明のＪＮＫ活性化用組成物に用いるＳＬＰは加熱してもＪＮＫ活性化作用が維持されることから加熱されたものであってもよい。
【００１１】
（ＳＬＰ分解物）
本発明のＪＮＫ活性化用組成物に用いられるＳＬＰ分解物は以下の方法に従って調製する。ＳＬＰの懸濁液に対して種々のプロテアーゼを適当な濃度で添加し、適宜反応させる。プロテアーゼの種類およびプロテアーゼ分解の程度は限定されるものではない。一例としてプロティナーゼＫで分解処理する条件としては、３７℃で２時間〜２４時間が望ましく、３時間〜２０時間がより好ましい。
【００１２】
（摂取量）
ＳＬＰによる抗菌ペプチド産生促進作用は分解物の状態でも発揮されることから、経口的に摂取した後に胃酸による分解を受けても作用への影響は小さいものと考えられる。このことから、ＳＬＰ又はＳＬＰ分解物を食品に添加して経口的に摂取することが望ましい。摂取量については特に制限しないが、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の場合、概算でＳＬＰ１ｍｇ／日を継続的に摂取することでＪＮＫ活性化が期待できると考えられる。
【００１３】
（食品、医薬品、飼料への配合）
精製したＳＬＰは加熱処理によってＪＮＫ活性化作用を失わないことから、常法に従って食品、医薬品、飼料に配合することが可能である。
本発明のＪＮＫ活性化用組成物を含む飲食品は、ＪＮＫ活性化用飲食品としての利用価値があり、本飲食品を摂取することにより、ＪＮＫ活性化に伴う抗酸化効果、細胞防御効果などが期待できる。すなわち、本発明は、前記ＪＮＫ活性化用組成物を含む抗酸化用飲食品、また、ＪＮＫ活性化用組成物を含む細胞防御用飲食品の発明でもある。なお、本発明のＪＮＫ活性化用組成物が動物用飼料に含まれる場合は、これを摂取した動物に同様の効果が期待できる。
また、本発明のＪＮＫ活性化用組成物を含む医薬は、ＪＮＫが活性化されることにより治療または予防できる疾患に使うことができる。
【００１４】
（評価方法）
本発明のＪＮＫ活性化作用とは、本発明のラクトバチルス属由来のＳＬＰ又はＳＬＰ分解物（ＳＬＰ等）を摂取した対象におけるＪＮＫのリン酸化が亢進され、ＪＮＫシグナルが活性化される作用をいう。
本発明のＪＮＫ活性化作用は、例えば以下に示す方法で評価することができる。培養細胞に対してラクトバチルス属由来のＳＬＰ等を添加し、所定の時間作用させた後に、ＪＮＫのリン酸化をウエスタンブロッティングで評価する。この場合、無添加に比べてＳＬＰ等を添加した場合の方がリン酸化の亢進がされていた場合に、ＪＮＫの活性化作用があったと評価することができる。評価には種々の細胞を用いることができる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本試験に用いたラクトバチルス属ＳＬＰ、ＳＬＰ分解物の調製例を以下に示す。
（ラクトバチルス属乳酸菌菌体の調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、生理食塩水で２回、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄し、さらに凍結乾燥を実施した（凍結乾燥菌体）。以下の試験では、凍結乾燥菌体を用いた。
【００１６】
（ＳＬＰの調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。得られた菌体はｃＯｍｐｌｅｔｅTM  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで懸濁し、室温で３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。沈殿はｃＯｍｐｌｅｔｅTMＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５Ｍ  ＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで再懸濁し、室温で再度３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液は遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。回収した上清をまとめ、０．２μｍフィルターを通した後にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２  １０Ｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）で滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析することでＳＬＰを析出させた。透析後の溶液を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、析出したＳＬＰを回収した。回収したＳＬＰは滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄後、１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液５００μＬに懸濁し、適宜攪拌しながら氷上で１５分間保持した。遠心分離によってＬｉＣｌ溶液を除き、再度滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁して凍結乾燥したものを精製ＳＬＰとした。
精製後のＳＬＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって目的サイズの４３ｋＤａ付近にバンドが認められることを確認した（図１）。また、得られたＳＬＰは３ｍｇであった。
また、同様な方法でラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブレビスＨＹＺ３３０４３、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５から調製したＳＬＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により目的サイズの４３〜５５ｋＤａ付近にバンドが認められた。得られたＳＬＰは１〜９ｍｇであった。
【００１７】
（ＳＬＰ分解物の調製例）
５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで懸濁したＳＬＰに、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ，Ｐ６５５６：Ｓｉｇｍａ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で一晩反応させた。反応後のＳＬＰを９６℃で１０分間加熱してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを不活化し、ＳＬＰ分解物とした。比較のため、ＰＢＳで懸濁したＳＬＰ、ＰＢＳで懸濁して９６℃で１０分間加熱したＳＬＰ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解したＳＬＰについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法でバンドの確認を行った（図２）。加熱したＳＬＰは、ＳＬＰと同様の４３ｋＤａ付近のほかに３７ｋＤａ付近、５ｋＤａ付近にもバンドが見られた。また、ＳＬＰ分解物は５ｋＤａ以上の明確なバンドは見られなかった。
【００１８】
（脱脂乳培養物の調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を１０％還元脱脂乳培地（１１０℃２０分滅菌）１５ｍLで３７℃、１６時間培養し、脱脂乳培養物とした。
【００１９】
〔試験例１〕ＪＮＫ活性化能の評価
継代培養したＣａｃｏ−２細胞（ヒト腸管上皮細胞）を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう６ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（終濃度１０％）（Ｌｏｔ．１１Ｄ２６４：Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（Ｍ７１４５：Ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度１００Ｕ−１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０−１２２：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して使用した。培養後、細胞が７０〜８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅにＮＥＡＡを添加）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の６ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、１時間培養した。培養後の６ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、ｃＯｍｐｌｅｔｅTM  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｈｏｓＳＴＯＰTM（Ｒｏｃｈｅ社）を添加したＲＩＰＡバッファーで細胞を溶解して回収した。回収した細胞は氷上で１時間静置した後に超音波処理し、遠心分離（７，５００×ｇ、４℃、５分間）で沈殿を除いた。得られた上清をサンプルバッファーと混合し、９５℃５分間加熱処理してサンプルとした。
得られたサンプルはミニプロティアンＴＧＸゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上で電気泳動させた。イモビロン−Ｐメンブレン（Ｍｅｒｃｋ）に転写させた後、結合したタンパク質について、抗Ｐ−ＪＮＫ抗体を用いるウエスタンブロッティングによりアッセイした。Ｐ−ＪＮＫバンド強度は、β―アクチンのバンド強度で補正した。検出にはイモビロンウエスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ）を使用した。
【００２０】
２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスのＳＬＰで処理した細胞では、処理しなかった細胞に比べて有意なＪＮＫリン酸化の亢進が認められた（図３）。この結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰはＪＮＫ活性化作用を有すると考えられた。
【００２１】
〔試験例２〕ＪＮＫ活性化を介した作用の検討（抗菌ペプチド発現上昇）
１．試験方法
継代培養したＣａｃｏ−２細胞（ヒト腸管上皮細胞）を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１２ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（終濃度１０％）（Ｌｏｔ．１１Ｄ２６４：Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（Ｍ７１４５：Ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度１００Ｕ−１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０−１２２：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して使用した。培養後、細胞が７０〜８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ＋１×ＮＥＡＡ）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ＭＡＰＫもしくはＮＦ−κＢ阻害剤（ｐ３８阻害剤：ＳＢ２０２１９０、ＪＮＫ阻害剤：ＳＰ６００１２５、ＥＲＫ阻害剤：ＰＤ９８０５９、ＮＦ−κＢ阻害剤：ＪＳＨ２３）２０μＭを含む培地を添加、１時間処理した。阻害剤処理後の細胞に対して、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１ＳＬＰを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、６時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃度を測定した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液から、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓ  ｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ(登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）を使用した。得られた逆転写反応液をｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲにはＴａｑＭａｎ(登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４４４４５５６）およびＴａｑＭａｎＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ｈＢＤ２：Ｈｓ００１７５４７４＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。反応には３８４ウェルプレート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４３０９８４９）を用い、ＶｉｉＡTM７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ポジティブコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＬＰＳを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、各水準の遺伝子発現はΔΔＣｔ法によってポジティブコントロールに対する相対発現量として評価した。試験はｎ＝３で実施し、増幅が認められなかったサンプルを含む水準は非検出（ｎ．ｄ．：ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）とした。
【００２２】
２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰの添加によって、抗菌ペプチドであるｈＢＤ２遺伝子の発現上昇が認められた。一方で、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）処理において顕著なｈＢＤ２遺伝子発現上昇の抑制が認められた（図４）。また、ＭＡＰＫもしくはＮＦ−κＢ阻害剤（ｐ３８阻害剤：ＳＢ２０２１９０、ＥＲＫ阻害剤：ＰＤ９８０５９、ＮＦ−κＢ阻害剤：ＪＳＨ２３）でｈＢＤ２遺伝子発現上昇の抑制が認められなかった。これらのことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスのＳＬＰによるｈＢＤ２発現誘導は、ＪＮＫ活性化による効果の一つであることが示された。
【００２３】
〔試験例３〕ＪＮＫ活性化能の評価−菌種の比較
１．試験方法
上記「〔試験例１〕ＪＮＫ活性化能の評価」と同様にＣａｃｏ−２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１、ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブレビスＨＹＺ３３０４３、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５から調製したＳＬＰをそれぞれ１０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加し、１時間培養した。その後、上記の通りサンプル調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングを行った。
【００２４】
２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外のラクトバチルス属の乳酸菌から精製したＳＬＰを添加した場合もＪＮＫ活性化が認められた（図５）。この結果より、乳酸菌より精製したＳＬＰによるＪＮＫ活性化作用は、ラクトバチルス属に広く共通するものと考えられた。
乳酸菌が産生するＳＬＰの分子量は菌種間で大きな開きがあり、さらにその遺伝子構造は同一菌種内においても多様性に富むことが示されていたところ、本発明のＳＬＰによるＪＮＫ活性化作用がラクトバチルス属に広く見出されたことは意外なものであった。
【００２５】
〔試験例４〕ＪＮＫ活性化能の評価−ＳＬＰ分解物の評価
１．試験方法
上記「〔試験例１〕ＪＮＫ活性化能の評価」と同様にＣａｃｏ−２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１のＳＬＰをそのままで、９６℃１０分間加熱したもの、もしくはｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理によって分解したものをそれぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加し、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
【００２６】
２．試験結果
評価の結果、何も処理していないＳＬＰだけでなく、加熱処理したＳＬＰおよびｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解処理したＳＬＰでもポジティブコントロールと比較して顕著に高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図６）。図中、ａ、ｂ、ｃの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
この結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰは分解物の状態でもｈＢＤ２遺伝子上昇作用を有することが示されている。ＳＢＴ２１７１のＳＬＰによるｈＢＤ２発現誘導はＪＮＫ活性化による効果であることから、ＳＢＴ２１７１のＳＬＰ分解物にもＪＮＫ活性化能があると考えられる。
【００２７】
〔試験例５〕ＪＮＫ活性化能の評価−ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体の評価
１．試験方法
上記「〔試験例１〕ＪＮＫ活性化能の評価」と同様にＣａｃｏ−２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体もしくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０もしくは５０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、６時間培養した。その後、試験例１と同様にトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
【００２８】
２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体およびＳＬＰで共にｈＢＤ２遺伝子の発現上昇が認められた（図７）。ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体では添加濃度１０μｇ／ｍＬでポジティブコントロールの約３倍、添加濃度５０μｇ／ｍＬで約２８倍のｈＢＤ２遺伝子発現が認められた。また、ＳＬＰでは添加濃度１０μｇ／ｍＬで約１９倍、５０μｇ／ｍＬで約４５倍の遺伝子発現が認められた。
この結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰだけでなく、培養菌体もＪＮＫ活性化能を有すると考えられた。図中、ａ、ｂ、ｃ、ｄの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【００２９】
〔試験例６〕ＪＮＫ活性化能の評価−ラクトバチルス・ヘルベティカス脱脂乳培養物の評価
１．試験方法
上記「〔試験例１〕ＪＮＫ活性化能の評価」と同様にＣａｃｏ−２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１脱脂乳培養物を５％含む培地を添加、６時間培養した。その後、試験例１と同様にトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
【００３０】
２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカス脱脂乳培養物でｈＢＤ２遺伝子の発現上昇が認められた（図８）。
この結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカスから精製したＳＬＰ、培養菌体だけでなく、培養物もＪＮＫ活性化能を有すると考えられた。
【００３１】
（食品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ１０ｍｇに、脱脂粉乳３０ｇ、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のＪＮＫ活性化用スティック状健康食品を製造した。
【００３２】
（飼料への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ２ｇを３９９８ｇの脱イオン水に懸濁し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫ  ＩＩ  １６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇのＳＬＰ溶液を得た。このＳＬＰ溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２．３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明のＪＮＫ活性化用飼料１０ｋｇを製造した。
【００３３】
（医薬品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の液体培養物を、４℃、７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。この菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明のＪＮＫ活性化用錠剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳＬＰ、もしくはＳＬＰ分解物、ラクトバチルス・ヘルベティカス乳酸菌菌体およびその培養物を含むＮＫを活性化させる素材を体内に摂取することにより、抗酸化作用、細胞防御作用等が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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