(57)【要約】      （修正有）【課題】神経障害性疼痛、特にイオンチャネルＰ２Ｘ４によって媒介される疼痛を治療するための剤および改善された方法の提供。【解決手段】Ｐ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合しかつＰ２Ｘ４チャネル活性を調節する抗体、および神経障害性疼痛および他の徴候の治療のためにＰ２Ｘ４抗体を用いる方法。さらに組換えＰ２Ｘ４ポリペプチド、およびかかるポリペプチドを作成するための方法、ならびに抗Ｐ２Ｘ４抗体を作成するための組成物および方法。【選択図】図１
2020018307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合し、かつチャネル活性を調節する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
Ｐ２Ｘ４増強物質である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｐ２Ｘ４拮抗剤である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
Ｐ２Ｘ４生物学的活性を少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％または約９５％低下させるＰ２Ｘ４拮抗剤である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＰ２Ｘ４アミノ酸１１０〜１６６を含むエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
アミノ酸１１８、１２２〜１３９、１４５、１５９、１８０、１８３、１８４、２３１、および２４４からなる群から選択される１つ以上のヒトＰ２Ｘ４アミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
Ｐ２Ｘ４の位置１３１でのアミノ酸置換により、ヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドへの抗体結合が低下するかまたは失われる、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトＰ２Ｘ４の位置１３１のセリンがアスパラギンによって置換される、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、
Ｘ1はＧ、Ｎ、Ｓ、Ｄ、またはＲであり；
Ｘ2はＹ、Ａ、Ｈ、Ｆ、またはＳであり；
Ｘ3はＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｅ、Ｄ、またはＰであり；
Ｘ4はＭ、Ｉ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、またはＶであり；
Ｘ5はＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである）；かつ／または
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15，Ｘ16を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、
Ｘ1はＡ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｒ、またはＹであり；
Ｘ2はＩまたはＭであり；
Ｘ3はＳ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｗ、またはＩであり；
Ｘ4はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｙ、またはＶであり；
Ｘ5はＧ、Ｄ、Ｓ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、Ｄ、またはＴであり；
Ｘ6はＧ、Ｓ、Ｎ、またはＴであり；
Ｘ7はＳ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、またはＤであり；
Ｘ8はＴ、Ｉ、Ｋ、またはＡであり；
Ｘ9はＹ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＫであり；
Ｘ10はＹ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり；
Ｘ11はＡ、Ｓ、Ｎ、またはＶであり；
Ｘ12はＤ、Ａ、Ｐ、Ｒ、またはＱであり；
Ｘ13はＳ、Ｐ、Ｋ、またはＮであり；
Ｘ14はＶ、Ｆ、Ｌ、またはＡであり；
Ｘ15はＫ、Ｑ、またはＥであり；
Ｘ16はＧ、Ｓ、Ａ、またはＤである）；かつ／または
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、
Ｘ1はＥ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、またはＨであり；
Ｘ2はＥ、Ｌ、Ｒ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、Ｆ、Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｖ、またはＦであり；
Ｘ3はＲ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、Ｓ、Ｍ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｅ、Ｌ、またはＩであり；
Ｘ4はＧ、Ｌ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｃ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｋ、またはＰであり；
Ｘ5はＳ、Ｇ、Ｙ、Ｄ、Ｗ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、またはＣであり；
Ｘ6はＹ、Ａ、Ｓ、Ｗ、Ｔ、Ｌ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｉ、またはＤであり；
Ｘ7はＤ、Ｅ、またはＧであり；かつ
Ｘ8はＹ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｉ、Ｓ、Ｉ、Ｈ、Ｆ、またはＤである）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、任意選択的に、アミノ酸Ｘ3〜Ｘ4の間に１〜３個のアミノ酸ＸaＸbＸcの挿入を含み、ここで、
ＸaはＧ、Ｓ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｒ、またはＮであり；かつ
ＸbＸcは各々、ＫＴである、
請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３が、任意選択的に、１〜１４個のアミノ酸Ｘa〜Ｘnの挿入を含み、ここで、
ＸaはＦ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、またはＡであり；
ＸbはＧ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり；
ＸCはＦ、Ｗ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｉ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｖ、Ｒ、またはＮであり；
ＸdはＳ、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、Ｃ、またはＳであり；
ＸeはＧ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、またはＬであり；
ＸfはＹ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、またはＶであり；
ＸgはＹ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、またはＲであり
ＸhはＹ、Ｇ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、またはＧであり、
ＸiはＴ、ＩＧ、Ｒ、またはＦであり；
ＸjはＹ、Ｇ、Ｈ、またはＥであり；
ＸKはＹ、Ｇ、Ｆ、またはＮであり；
ＸLはＦ、またはＮであり；
ＸmはＹであり；かつ
ＸnはＦである、
請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１が配列ＳＹＸ1ＭＸ2を含み、ここで、Ｘ1はＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、またはＰであり、かつＸ2はＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列：
ＸＹＡＭＳ（式中、ＸはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮまたはＲである）
ＳＸＡＭＳ（式中、ＸはＹ、Ａ、Ｈ、Ｆ、またはＳである）
ＳＹＸＭＳ（式中、ＸはＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、またはＰである）
ＳＹＡＸＳ（式中、ＸはＭ、Ｉ、Ｗ、Ｌ、Ｆ、またはＶである）
ＳＹＡＭＸ（式中、ＸはＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである）
を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１が、アミノ酸ＳＹＡＭＳを含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１５】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ；または
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＥＧ
を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列ＤＷＹＦＤＬまたはＮＷＹＬＤＬを含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、
Ｘ1はＴ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ2はＧ、Ａ、またはＬであり；
Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｄ、またはＨであり；
Ｘ4はＳ、Ｎ、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；
Ｘ5はＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、またはＤであり；
Ｘ6はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｅ、またはＴであり；
Ｘ7はＧ、Ｎ、Ｍ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、またはＴであり；
Ｘ8はＹ、Ｋ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、またはＲであり；
Ｘ9はＤ、Ｎ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｇ、またはＳであり；
Ｘ10はＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、またはＰであり；
Ｘ11はＨ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｙ、Ｎ、またはＦである）；
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、
Ｘ1はＧ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ａ、またはＥであり；
Ｘ2はＮ、Ｄ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｇ、またはＴであり；
Ｘ3はＮ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｋ、Ｙ、またはＤであり；
Ｘ4はＮ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ5はＲ、またはＬであり；
Ｘ6はＰ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ7はＳ、Ｐ、またはＴである）；
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、
Ｘ1はＱ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、またはＬであり；
Ｘ2はＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｌ、またはＨであり；
Ｘ3はＹ、Ｗ、Ｒ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、またはＧであり；
Ｘ4はＤ、Ｙ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、またはＨであり；
Ｘ5はＴ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり；
Ｘ6はＮ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｌ、またはＤであり；
Ｘ7はＬ、Ｔ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、またはＮであり；
Ｘ8はＫ、Ｗ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、またはＹであり；かつ
Ｘ9はＶ、Ｌ、またはＴである）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が、任意選択的に、Ｘ4〜Ｘ5の間に１〜３個のアミノ酸Ｘa〜Ｘcの挿入を含み、ここで、
ＸaはＳまたはＧであり；
ＸbはＮ、ＤまたはＳであり；かつ
ＸcはＩまたはＶである、
請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、任意選択的に、Ｘ７〜Ｘ８の間に１〜３個のアミノ酸Ｘa〜Ｘcの挿入を含み、ここで、
ＸaはＤ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＩまたはＨであり；
ＸbはＨ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり；かつ
ＸcはＳである、
請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が、以下の配列：
ＳＧＤＫＬ；
ＳＧＳＳＳＮＩＧ；
ＳＧＤＡＬ；
ＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ；または
ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ
のうちの１つを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２１】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２が、以下の配列：
ＧＸＸＹＲＰＳ（式中、ＸはＴ、Ｓ、Ｋである）
ＫＤＳＥＲＰＳ
ＫＡＳＴＬＥＳ
ＱＤＸＫＲＰＳ（式中、ＸはＤまたはＴである）；または
ＱＤＩＥＲＰＳ
のうちの１つを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、以下の配列：
ＱＱＳＹＳＴＰＷＴまたはＳＳＧＴＹＶＶ
のうちの１つを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列：ＳＸ1ＡＭＳ（式中、Ｘ1はＹまたはＦである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列：ＡＩＳＧＳＧＸ1ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（式中、Ｘ1はＳまたはＧである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2ＤＸ3ＷＳＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＴＡＦＤＬ（式中、Ｘ1はＨ、ＤまたはＱであり；Ｘ2はＷ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、またはＲであり；Ｘ3はＷ、ＹまたはＦであり；Ｘ4はＴ、Ｎ、Ｇ、またはＰであり；Ｘ5はＲ、Ａ、Ｓ、Ｇ、またはＹであり；Ｘ6はＳ、Ｐ、ＮまたはＴであり；Ｘ7はＧ、Ｓ、Ｒ、またはＫであり：Ｘ8はＰ、Ｍ、ＡまたはＬである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含むＶHを、
任意選択的に、
ａ．配列ＳＧＤＡＬＰＲＱＹＡＹを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１
ｂ．配列ＫＤＳＸ1ＲＰＳ（式中、Ｘ1はＥまたはＦである）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２
ｃ．配列ＱＳＡＤＳＳＧＴＹＸ1Ｖ（式中、Ｘ1はＶまたはＡである）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含むＶLと組み合わせて含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列：ＳＦＡＭＳを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列：ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧを含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列：ＱＦＤＹＷＳＴＹＳＧＰＴＡＦＤＬを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含むＶHを、
ａ．配列ＳＧＤＡＬＰＲＱＹＡＹを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１
ｂ．配列ＫＤＳＥＲＰＳを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２
ｃ．配列ＱＳＡＤＳＳＧＴＹＶＶを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含むＶLと組み合わせて含む、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体番号１〜３４または抗体番号２８７〜３１５のうちの１つからなる群から選択されるファージディスプレイ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体番号５、８、１１、１８、２９、３３、または抗体番号２８７〜３１５のうちの１つである、請求項２５に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、
Ｘ1はＳ、Ｎ、Ｄ、Ｔ、またはＲであり；
Ｘ2はＧ、Ｙ、またはＦであり；
Ｘ3はＹ、Ｈ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＦであり；
Ｘ4はＤ、Ｖ、またはＩであり；
Ｘ5はＮ、Ｈ、Ｃ、Ｒ、Ｓまたは不在である）
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15，Ｘ16を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、
Ｘ1はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｇ、またはＴであり；
Ｘ2はＧまたはＩであり；
Ｘ3はＹ、Ｗ、Ｎ、またはＣであり；
Ｘ4はＹ、Ｇ、Ｄ、またはＷであり；
Ｘ5はＳ、Ｄ、またはＥであり；
Ｘ6はＧまたはＤであり；
Ｘ7はＳ、Ｙ、Ｎ、またはＩであり；
Ｘ8はＴ、Ｐ、またはＫであり；
Ｘ9はＮ、Ａ、Ｇ、Ｄ、またはＶであり；
Ｘ10はＹまたはＦであり；
Ｘ11はＮであり；
Ｘ12はＰ、Ｓ、またはＥであり；
Ｘ13はＳ、Ａ、またはＮであり；
Ｘ14はＬまたはＦであり；
Ｘ15はＫであり；
Ｘ16はＳ、Ｇ、またはＮである）
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、
Ｘ1はＧ、Ｓ、Ａ、またはＲであり；
Ｘ2はＭ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｒ、またはＶであり；
Ｘ3はＭ、Ｄ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｍ、またはＳであり；
Ｘ4はＶ、Ｙ、Ｍ、Ｗ、またはＳであり；
Ｘ5はＬ、Ｙ、Ｓまたは不在であり；
Ｘ6はＩ、Ｄ、Ｖ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、または不在であり；
Ｘ7はＰ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、またはＡであり；かつ
Ｘ8はＮ、Ｙ、またはＴである）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１が、任意選択的にアミノ酸Ｘ6およびＸ7（各々、ＶおよびＳである）を含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、任意選択的にＸ3〜Ｘ4の間にアミノ酸ＸａおよびＸｂの挿入を含み、ここで、ＸａはＩまたはＰでありかつＸｂはＳである、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３３】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３が、任意選択的に、Ｘ6〜Ｘ7の間に１〜６個のアミノ酸Ｘａ〜Ｘｆの挿入を含み、ここで、
ＸａはＧ、Ｔ、Ｄ、またはＹであり；
ＸｂはＳ、Ａ、Ｇ、またはＦであり；
ＸｃはＹ、Ｖ、Ｐ、またはＦであり；
ＸｄはＹまたはＦであり；
ＸｅはＹであり；かつ
ＸｆはＥ、Ｆ、またはＧである、
請求項３０に記載の抗体。
【請求項３４】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列ＳＧＹＤ；ＳＧＳＤ；またはＳＧＦＤを含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３５】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列：
ＭＧＹＩＳＹＳ；
ＶＩＷＧＤＧＳＴＡ；
ＳＴＡＹＮＳ；または
ＳＴＮＹＮＰ
を含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列
ＧＭＭＶＬＩ；
ＧＶＳＳＬＳ；または
ＧＳＹＹＹＸを含み、ここで、ＸはＥ、Ｇ、またはＦである、
請求項３０に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体またはその断片が、
ａ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、
Ｘ1はＫ、Ｑ、またはＲであり；
Ｘ2はＡまたはＴであり；
Ｘ3はＳ、Ｒ、またはＮであり；
Ｘ4はＫまたはＱであり；
Ｘ5はＳ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、またはＩであり；
Ｘ6はＩまたはＳであり；
Ｘ7はＴ、Ｇ、Ｖ、またはＮであり；
Ｘ8はＮ、Ｓ、Ｈ、またはＫであり；
Ｘ9はＹまたはＷであり；
Ｘ10はＬ、Ｍ、またはＩであり；
Ｘ11はＡ、Ｓ、またはＹであり；
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、
Ｘ1はＳ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；
Ｘ2はＧ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ3はＳまたはＴであり；
Ｘ4はＴ、Ｓ、Ｋ、またはＡであり；
Ｘ5はＬであり；
Ｘ6はＱ、Ａ、またはＶであり；
Ｘ7はＳまたはＤである）
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、
Ｘ1はＱ、Ｌ、またはＨであり
Ｘ2はＱまたはＫであり；
Ｘ3はＹ、Ａ、Ｗ、またはＴであり；
Ｘ4はＹ、Ｈ、Ｓ、またはＤであり；
Ｘ5はＥ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、またはＮであり；
Ｘ6はＫ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、またはＨであり；
Ｘ7はＰであり；
Ｘ8はＹ、Ｗ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲであり；かつＰであり
Ｘ9はＴである）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３８】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列
ＫＡＳＫＸＩＴ（式中、ＸはＳ、Ｌ、またはＩである）；または
ＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬ
を含む、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列
ＳＧＳＴＬＱＳ；
ＤＡＴＳＬＡＤ；または
ＤＡＴＴＬＡＤ
を含む、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４０】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列
ＱＱＹＹＥＫＰＸＴまたはＱＱＹＹＥＮＰＸＴ（式中、ＸはＹまたはＬである）
を含む、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４１】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４３】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４４】
抗体番号３５〜４８、２０８、および３１６〜３２１からなる群から選択されるハイブリドーマ由来抗体である、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４５】
抗体番号１〜４８、２０８、および２８７〜３２１からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４６】
前記その抗原結合断片が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４７】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
神経障害性疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項５１】
前記抗体またはその抗原結合断片が髄腔内送達により投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
組換えＰ２Ｘ４ポリペプチドの大規模生成のための方法であって、ヒトＰ２Ｘ４タンパク質をＳＦ９細胞内、２７℃で７２時間発現させるステップと；
前記Ｐ２Ｘ４タンパク質を、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルチオ−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、およびコレステリルヘミスクシネートを含む緩衝液に可溶化することによって抽出するステップと；
次に前記可溶化されたタンパク質を単離するステップと、
を含む、方法。
【請求項５３】
前記ＳＦ９細胞が、２×１０6個の細胞／ｍｌの細胞密度で２の感染多重度でバキュロウイルス粒子の感染を受けた、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質が、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記精製されたタンパク質が、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０２５％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、０．０１２５％  ｎ−ドデシルチオ−マルトシド、０．００７５％  ＣＨＡＰＳ、および０．００１５％コレステリルヘミスクシネートを含む緩衝液中で維持される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
ミリグラム量の精製されたＰ２Ｘ４ヒトポリペプチドを作成する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｐ２Ｘ４タンパク質の大部分が三量体型である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法によって生成される組換えヒトＰ２Ｘ４ポリペプチド。
【請求項５９】
前記ポリペプチドの少なくとも約５０％〜７５％が三量体型である、請求項５８に記載の組換えヒトＰ２Ｘ４ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
慢性疼痛は、有益な目的を何も果たすものではなく、侵害受容神経回路網における病理学的変化から生じる。神経障害性疼痛は、外傷、感染、または病態によって引き起こされる神経損傷に後発する慢性疼痛の一形態である。神経障害性疼痛は、起因事象が治癒してから長期間持続する。ニューロンは、神経障害性疼痛に関与するが、この状態を媒介する唯一の細胞型である可能性は低い。神経障害性疼痛を確立し、維持する上でのグリア−ニューロン相互作用の役割を支持する証拠が増加しつつある。特に、ミクログリアは、神経障害性疼痛における主要なプレーヤーとして出現している。ミクログリアＰ２Ｘ４受容体は、神経障害性疼痛の発生および維持において重要であるように思われる。
【０００２】
イオンチャネルＰ２Ｘ４は、プリン作動性のカチオン透過性チャネルのファミリーの７つのメンバーの一つである。各Ｐ２Ｘ４サブユニットは、大規模な約２８０アミノ酸の細胞外ドメインによって分離された２つの膜貫通ドメインを有する。機能的チャネルは、中心孔を有するサブユニットの三量体配置から形成される。Ｐ２Ｘ４チャネルは、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）リガンドのその細胞外ドメイン内に含まれる残基への結合によって活性化される。これら受容体の活性化は、カチオン、例えばＣａ2+およびＮａ+のカチオン選択性チャネルを介した細胞への侵入を可能にする一連の立体構造変化を引き起こす。Ｐ２Ｘ４の活性化および上方制御は、神経障害性疼痛の主要な駆動源であると考えられる。Ｐ２Ｘ４活性化の下流で、ミクログリアは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を放出し、それは神経細胞のクロライドトランスポーターＫＣＣ２の発現を低下させるように脊髄のラミナＩニューロンで作用し、それにより、クロライドに対する電気化学的勾配を変更し、また主な阻害的神経伝達物質ＧＡＢＡの一つを興奮性にする。したがって、脊髄におけるＰ２Ｘ４媒介性ＢＤＮＦ放出は、神経障害性疼痛の主要な駆動源であると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
神経障害性疼痛は、現在利用可能な鎮痛薬に応答せず、また最も衰弱性の慢性疼痛状態のうちの１つであると考えられる。したがって、神経障害性疼痛、特にＰ２Ｘ４によって媒介される疼痛を治療するための改善された方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
下記のように、本発明は、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合しかつＰ２Ｘ４チャネル活性を調節する抗体、組換えＰ２Ｘ４ポリペプチド、およびかかるポリペプチドを作成するための方法、ならびに抗Ｐ２Ｘ４抗体を作成するための組成物および方法、ならびに神経障害性疼痛および他の徴候の治療のためにＰ２Ｘ４抗体を用いる方法を提供する。
【０００５】
第１の態様では、本発明は、ヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合しかつチャネル活性を調節する抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体はＰ２Ｘ４増強物質である。別の実施形態では、抗体はＰ２Ｘ４拮抗剤である。別の実施形態では、抗体はＰ２Ｘ４調節因子である。別の実施形態では、抗体は、Ｐ２Ｘ４生物学的活性を少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％または９５％低下させるＰ２Ｘ４拮抗剤である。別の実施形態では、抗体は、ヒトＰ２Ｘ４アミノ酸１１０〜１６６を有するエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、アミノ酸１１８、１２２〜１３９、１４５、１５９、１８０、１８３、１８４、２３１、および２４４のうちのいずれか１つ以上から選択される１つ以上のヒトＰ２Ｘ４アミノ酸を有するエピトープに結合する。別の実施形態では、Ｐ２Ｘ４の位置１３１でのアミノ酸置換により、抗体のヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドへの結合が低下するかまたは失われる。別の実施形態では、ヒトＰ２Ｘ４の位置１３１でのセリンがアスパラギンによって置換される。
【０００６】
先の態様の一実施形態では、抗体またはその断片は、
ａ．配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、Ｘ1はＧ、Ｎ、Ｓ、Ｄ、またはＲであり；Ｘ2はＹ、Ａ、Ｈ、Ｆ、またはＳであり；Ｘ3はＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｅ、Ｄ、またはＰであり；Ｘ4はＭ、Ｉ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、またはＶであり；Ｘ5はＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである）；かつ／または
ｂ．配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15，Ｘ16を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、Ｘ1はＡ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｒ、またはＹであり；Ｘ2はＩまたはＭであり；Ｘ3はＳ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｗ、またはＩであり；Ｘ4はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｙ、またはＶであり；Ｘ5はＧ、Ｄ、Ｓ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、Ｄ、またはＴであり；Ｘ6はＧ、Ｓ、Ｎ、またはＴであり；Ｘ7はＳ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、またはＤであり；Ｘ8はＴ、Ｉ、Ｋ、またはＡであり；Ｘ9はＹ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＫであり；Ｘ10はＹ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり；Ｘ11はＡ、Ｓ、Ｎ、またはＶであり；Ｘ12はＤ、Ａ、Ｐ、Ｒ、またはＱであり；Ｘ13はＳ、Ｐ、Ｋ、またはＮであり；Ｘ14はＶ、Ｆ、Ｌ、またはＡであり；Ｘ15はＫ、Ｑ、またはＥであり；Ｘ16はＧ、Ｓ、Ａ、またはＤである）；かつ／または
ｃ．配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、Ｘ1はＥ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、またはＨであり；Ｘ2はＥ、Ｌ、Ｒ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、Ｆ、Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｖ、またはＦであり；Ｘ3はＲ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、Ｓ、Ｍ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｅ、Ｌ、またはＩであり；Ｘ4はＧ、Ｌ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｃ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｋ、またはＰであり；Ｘ5はＳ、Ｇ、Ｙ、Ｄ、Ｗ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、またはＣであり；Ｘ6はＹ、Ａ、Ｓ、Ｗ、Ｔ、Ｌ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｉ、またはＤであり；Ｘ7はＤ、Ｅ、またはＧであり；かつ、Ｘ8はＹ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｉ、Ｓ、Ｉ、Ｈ、Ｆ、またはＤである）
を有する。一実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、任意選択的に、アミノ酸Ｘ3〜Ｘ4の間に１〜３個のアミノ酸ＸaＸbＸcの挿入を含み、ここで、ＸaはＧ、Ｓ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｒ、またはＮであり；かつＸbＸcは各々ＫＴである。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３は、任意選択的に、１〜１４個のアミノ酸Ｘa〜Ｘnの挿入を含み、ここで、ＸaはＦ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、またはＡであり；ＸbはＧ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり；ＸcはＦ、Ｗ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｉ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｖ、Ｒ、またはＮであり；ＸdはＳ、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、Ｃ、またはＳであり、ＸeはＧ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、またはＬであり；ＸfはＹ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、またはＶであり；ＸgはＹ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、またはＲであり、ＸhはＹ、Ｇ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、またはＧ、ＸiはＴ、Ｉ、Ｇ、Ｒ、またはＦであり；ＸjはＹ、Ｇ、Ｈ、またはＥであり；ＸKはＹ、Ｇ、Ｆ、またはＮであり；ＸLはＦ、またはＮであり；ＸmはＹであり；かつ、ＸnはＦである。一実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列ＳＹＸ1ＭＸ2を含み、ここで、Ｘ1はＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、またはＰであり、かつＸ2はＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列ＸＹＡＭＳ（式中、ＸはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮまたはＲである）；ＳＸＡＭＳ（式中、ＸはＹ、Ａ、Ｈ、Ｆ、またはＳである）；ＳＹＸＭＳ（式中、ＸはＡ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｐである）；ＳＹＡＸＳ（式中、ＸはＭ、Ｉ、Ｗ、Ｌ、Ｆ、またはＶである）；ＳＹＡＭＸ（式中、ＸはＳ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、またはＮである）を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、アミノ酸ＳＹＡＭＳを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ；またはＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＥＧを含む。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列ＤＷＹＦＤＬまたはＮＷＹＬＤＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、ａ．配列
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、Ｘ1はＴ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、またはＱであり；Ｘ2はＧ、Ａ、またはＬであり；Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｄ、またはＨであり；Ｘ4はＳ、Ｎ、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ5はＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、またはＤであり；Ｘ6はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｅ、Ｔであり；Ｘ7はＧ、Ｎ、Ｍ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、またはＴであり；Ｘ8はＹ、Ｋ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、またはＲであり；Ｘ9はＤ、Ｎ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｇ、またはＳであり；Ｘ10はＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、またはＰであり；Ｘ11はＨ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｙ、Ｎ、またはＦである）、ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、Ｘ1はＧ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ａ、またはＥであり；Ｘ2はＮ、Ｄ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｇ、またはＴ、Ｘ3はＮ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｋ、Ｙ、またはＤであり；Ｘ4はＮ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、またはＱ、Ｘ5はＲ、またはＬであり；Ｘ6はＰ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＱであり；Ｘ7はＳ、Ｐ、またはＴである）；
ｃ．配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、Ｘ1はＱ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、またはＬであり；Ｘ2はＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ3はＹ、Ｗ、Ｒ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、またはＧであり；Ｘ4はＤ、Ｙ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、またはＨ、Ｘ5はＴ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり、Ｘ6はＮ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｆ、ＬまたはＤであり；Ｘ7はＬ、Ｔ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、またはＮであり；Ｘ8はＫ、Ｗ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、またはＹであり；Ｘ9はＶ、Ｌ、またはＴである）
を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、任意選択的に、Ｘ4〜Ｘ5の間に１〜３個のアミノ酸Ｘa〜Ｘcの挿入を含み、ここで、ＸaはＳまたはＧであり；ＸbはＮ、ＤまたはＳであり；かつＸcはＩまたはＶである。別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、任意選択的に、Ｘ７〜Ｘ８の間に１〜３個のアミノ酸Ｘa〜Ｘcの挿入を含み、ここで、ＸaはＤ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＩまたはＨであり；ＸbはＨ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり；かつＸcはＳである。さらに別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、以下の配列：ＳＧＤＫＬ；ＳＧＳＳＳＮＩＧ；ＳＧＤＡＬ；ＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ；およびＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡのうちの１つを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、以下の配列：ＧＸＸＹＲＰＳ（式中、ＸはＴ、Ｓ、Ｋである）またはＫＤＳＥＲＰＳ；ＫＡＳＴＬＥＳ；ＱＤＸＫＲＰＳ（式中、ＸはＤまたはＴである）；およびＱＤＩＥＲＰＳのうちの１つを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、以下の配列：ＱＱＳＹＳＴＰＷＴまたはＳＳＧＴＹＶＶのうちの１つを含む。
【０００７】
上記態様の様々な実施形態では、抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。上記態様の他の実施形態では、抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。上記態様の他の実施形態では、抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。上記態様の他の実施形態では、抗体は、抗体番号１〜３４のいずれか１つ以上から選択されるファージディスプレイ由来抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗体番号５、８、１１、１８、２９、または３３である。
【０００８】
上記態様の別の実施形態では、抗体またはその断片は、
ａ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、Ｘ1はＳ、Ｎ、Ｄ、Ｔ、Ａ、またはＲであり；Ｘ2はＧ、Ｙ、またはＦであり；Ｘ3はＹ、Ｈ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＦであり；Ｘ4はＤ、Ｖ、またはＩであり；Ｘ5はＮ、Ｈ、Ｃ、Ｒ、Ｓまたは不在である）；
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15，Ｘ16を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、Ｘ1はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｇ、またはＴであり；Ｘ2はＧまたはＩであり；Ｘ3はＹ、Ｗ、Ｎ、またはＣであり；Ｘ4はＹ、Ｇ、Ｄ、またはＷであり；Ｘ5はＳ、Ｄ、またはＥであり；Ｘ6はＧまたはＤであり；Ｘ7はＳ、Ｙ、Ｎ、またはＩであり；Ｘ8はＴ、Ｐ、またはＫであり；Ｘ9はＮ、Ａ、Ｇ、Ｄ、またはＶであり；Ｘ10はＹまたはＦであり；Ｘ11はＮであり；Ｘ12はＰ、Ｓ、またはＥであり；Ｘ13はＳ、Ａ、またはＮであり；Ｘ14はＬまたはＦであり；Ｘ15はＫであり；Ｘ16はＳ、Ｇ、またはＮである）；
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、Ｘ1はＧ、Ｓ、Ａ、またはＲであり；Ｘ2はＭ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｒ、またはＶであり；Ｘ3はＭ、Ｄ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｍ、またはＳであり；Ｘ4はＶ、Ｙ、Ｍ、Ｗ、またはＳであり；Ｘ5はＬ、Ｙ、Ｓまたは不在であり；Ｘ6はＩ、Ｄ、Ｖ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、または不在であり；Ｘ7はＰ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、またはＡであり；かつＸ8はＮ、Ｙ、またはＴである）
を含む。一実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、任意選択的にアミノ酸Ｘ6およびＸ7（各々、ＶおよびＳである）を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、任意選択的に、Ｘ3〜Ｘ4の間にアミノ酸ＸaおよびＸbの挿入を含み、ここで、ＸaはＩまたはＰでありかつＸbはＳである。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３は、任意選択的に、Ｘ6〜Ｘ7の間に１〜６個のアミノ酸Ｘa〜Ｘfの挿入を含み、ここで、ＸaはＧ、Ｔ、Ｄ、またはＹであり；ＸbはＳ、Ａ、Ｇ、またはＦであり；ＸcはＹ、Ｖ、Ｐ、またはＦであり；ＸdはＹまたはＦであり；ＸeはＹであり；かつＸfはＥ、Ｆ、またはＧである。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列ＳＧＹＤ；ＳＧＳＤ；またはＳＧＦＤを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列：ＭＧＹＩＳＹＳ；ＶＩＷＧＤＧＳＴＡ；ＳＴＡＹＮＳ；またはＳＴＮＹＮＰを含む。一実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列ＧＭＭＶＬＩ；ＧＶＳＳＬＳ；またはＧＳＹＹＹＸを含み、ここで、ＸはＥ、Ｇ、またはＦである。
【０００９】
上記態様の別の実施形態では、抗体またはその断片は、
ａ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ここで、Ｘ1はＫ、Ｑ、またはＲであり；Ｘ2はＡまたはＴであり；Ｘ3はＳ、Ｒ、またはＮであり；Ｘ4はＫまたはＱであり；Ｘ5はＳ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、またはＩであり；Ｘ6はＩまたはＳであり；Ｘ7はＴ、Ｇ、Ｖ、またはＮであり；Ｘ8はＮ、Ｓ、Ｈ、またはＫであり；Ｘ9はＹまたはＷであり；Ｘ10はＬ、Ｍ、またはＩであり；Ｘ11はＡ、Ｓ、またはＹである）；
ｂ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ここで、Ｘ1はＳ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；Ｘ2はＧ、Ａ、またはＴであり；Ｘ3はＳまたはＴであり；Ｘ4はＴ、Ｓ、Ｋ、またはＡであり；Ｘ5はＬであり；Ｘ6はＱ、Ａ、またはＶであり；Ｘ7はＳまたはＤである）；
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ここで、Ｘ1はＱ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ2はＱまたはＫであり；Ｘ3はＹ、Ａ、Ｗ、またはＴであり；Ｘ4はＹ、Ｈ、Ｓ、またはＤであり；Ｘ5はＥ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、またはＮであり；Ｘ6はＫ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ7はＰであり；Ｘ8はＹ、Ｗ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲであり；かつ、Ｘ9はＴである）
を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列ＫＡＳＫＸＩＴ（式中、ＸはＸ、Ｌ、またはＩである）；またはＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列ＳＧＳＴＬＱＳ；ＤＡＴＳＬＡＤ；またはＤＡＴＴＬＡＤを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列ＱＱＹＹＥＫＰＸＴまたはＱＱＹＹＥＮＰＸＴ（式中、ＸはＹまたはＬである）を含む。
【００１０】
別の一連の実施形態では、抗体またはその断片は、
ａ．配列：ＳＸ1ＡＭＳ（式中、Ｘ1はＹまたはＦである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列：ＡＩＳＧＳＧＸ1ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（式中、Ｘ1はＳまたはＧである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列：Ｘ1Ｘ2ＤＸ3ＷＳＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＴＡＦＤＬ（式中、Ｘ1はＨ、ＤまたはＱであり；Ｘ2はＷ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、またはＲであり；Ｘ3はＷ、ＹまたはＦであり；Ｘ4はＴ、Ｎ、Ｇ、またはＰであり；Ｘ5はＲ、Ａ、Ｓ、Ｇ、またはＹであり；Ｘ6はＳ、Ｐ、ＮまたはＴであり；かつ、Ｘ7はＧ、Ｓ、Ｒ、またはＫ：Ｘ８はＰ、Ｍ、ＡまたはＬである）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含むＶHを、
任意選択的に、
ａ．配列ＳＧＤＡＬＰＲＱＹＡＹを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１
ｂ．配列ＫＤＳＸＲＰＳ（式中、ＸはＥまたはＦである）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２  ｃ．配列ＱＳＡＤＳＳＧＴＹＸＶ（式中、ＸはＶまたはＡである）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含むＶLと組み合わせて含む。
【００１１】
上記態様の様々な実施形態では、抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。上記態様の他の実施形態では、抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。上記態様のさらに他の実施形態では、抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗体は、抗体番号３５〜４８のいずれか１つ以上から選択されるハイブリドーマ由来抗体である。
【００１２】
上記態様の様々な実施形態では、その抗原結合断片は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、上記態様のいずれかの抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、上記態様のポリヌクレオチドを有するベクターを提供する。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、上記態様のベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、神経障害性疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、上記態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、髄腔内送達により投与される。
【００１７】
別の態様では、本発明は、組換えＰ２Ｘ４ポリペプチドの大規模生成のための方法であって、ヒトＰ２Ｘ４タンパク質をＳＦ９細胞内、２７℃で７２時間発現させるステップと；Ｐ２Ｘ４タンパク質を、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルチオ−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、およびコレステリルヘミスクシネートを含有する緩衝液に可溶化することによって抽出するステップと；次に可溶化されたタンパク質を単離するステップと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、ＳＦ９細胞は、２×１０6個の細胞／ｍｌの細胞密度で２の感染多重度でバキュロウイルス粒子の感染を受けた。別の実施形態では、タンパク質は、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製される。別の実施形態では、精製されたタンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０２５％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、０．０１２５％  ｎ−ドデシルチオ−マルトシド、０．００７５％  ＣＨＡＰＳ、および０．００１５％コレステリルヘミスクシネートを含有する緩衝液中で維持される。
【００１８】
別の実施形態では、本方法では、ミリグラム量の精製されたＰ２Ｘ４ヒトポリペプチドが作成される。別の実施形態では、Ｐ２Ｘ４タンパク質の大部分は三量体型である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、任意の先の態様の方法によって生成される組換えヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドの少なくとも約６５％〜７５％は三量体型である。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２１】
定義
特に定義されなければ、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。以下の用語は、本明細書で用いられるとき、特に定義されなければ、以下のそれらに帰属する意味を有する。
【００２２】
「Ｐ２Ｘプリン受容体４（Ｐ２ＲＸ４またはＰ２Ｘ４）ポリペプチド」は、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９９５７１で提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％以上のアミノ酸同一性を有し、かつＰ２Ｘ４生物学的活性を有するプリン作動性受容体タンパク質またはその断片を意味する。Ｐ２Ｘ４生物学的活性は、ＡＴＰ結合および／またはＰ２Ｘ４抗体結合に応答したＣａ2+／Ｎａ+伝導活性を含む。代表的なヒトＰ２Ｘ４配列は、以下に提供される。
【化１】
2020018307.tif 000003
【００２３】
本発明の実施形態では、ヒトＰ２Ｘ４ポリペプチドは、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９９５７１に対して少なくとも約６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに１００％の同一性を有する。他の実施形態では、本発明は、例えば、Ｅ９５Ｑ、Ｖ１０５Ｍ、Ｇ１１４Ｄ、Ａ１２２Ｖ、Ｓ１３１Ｎ、Ａ１５１Ｐ、Ｇ１５４Ｒ、Ｌ３０３Ｐ、およびＮ３０６Ｋを含む、Ｑ９９５７１参照配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含むＰ２Ｘ４ポリペプチドを提供する。
【００２４】
代表的なマウスＰ２Ｘプリン受容体４は、以下の配列：
【化２】
2020018307.tif 000004
を有するＮＣＢＩ受託番号Ｑ９ＪＪＸ６で提供される。
【００２５】
代表的なラットＰ２Ｘプリン受容体４配列は、以下の配列：
【化３】
2020018307.tif 000005
を有するＮＣＢＩ受託番号Ｐ５１５７７で提供される。
【００２６】
代表的なカニクイザル（例えばマカク）Ｐ２Ｘプリン受容体４配列は、以下の配列：
【化４】
2020018307.tif 000006
を有する。
【００２７】
「Ｐ２Ｘ４核酸分子」は、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。代表的なヒトＰ２Ｘ４ポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００２５６０で提供され、その配列は以下の通りである。
【化５】
2020018307.tif 000007
【００２８】
「Ｐ２Ｘ４生物学的活性」は、細胞質カルシウムレベルにおけるイオンチャネル伝導活性またはイオンチャネル媒介性変化を意味する。
【００２９】
「寛解する」は、疾患の発生または進行を低下させる、抑制する、減弱させる、軽減する、停止させる、または安定化させることを意味する。
【００３０】
用語「抗体」は、本開示で用いられるとき、免疫グロブリンまたはその断片または誘導体を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを、それが生成されるのがインビトロであるかまたはインビボであるかに無関係に包含する。この用語は、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、および移植抗体を含む。本開示を意図して、「インタクトな抗体」のように用語「インタクト」によって特に修飾されない限り、用語「抗体」はまた、抗原結合機能、すなわちＰ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合する能力を保持する、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および他の抗体断片などの抗体断片を含む。典型的には、かかる断片は、抗原結合ドメインを含むことになる。
【００３１】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」および「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的結合に関与する、アミノ酸を含む抗体分子の一部分を指す。抗原が大型である場合、抗原結合ドメインは、専ら抗原の一部分に結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」と称される。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶL）および抗体重鎖可変領域（ＶH）を含むが、必ずしも両方を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片はＶHドメインのみからなるが、インタクトな抗体の一部の抗原結合機能を依然として保持している。
【００３２】
抗体の結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断により産生される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体を含む。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、その同一な結合部位を各々有すると理解されている。酵素、パパインを用いた抗体の消化により、「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片（抗原結合活性を全く有しないが結晶化させる能力を有する）としても知られる２つの同一の抗原結合断片がもたらされる。酵素、ペプシンを用いた抗体の消化により、抗体分子の２つのアームが連結したままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片がもたらされる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原に架橋する能力を有する。「Ｆｖ」は、本明細書で用いられるとき、抗原認識部位および抗原結合部位の双方を保持する抗体の最小断片を指す。「Ｆａｂ」は、本明細書で用いられるとき、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨＩドメインを含む抗体断片を指す。
【００３３】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。本発明の抗体は、限定はされないが、全天然抗体（ｗｈｏｌｅ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および非定型抗体（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む。
【００３４】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有し、かつ「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ；同様に「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、米国特許法において帰属される意味を有し、またこの用語は、限定がなく、列挙されるその基本的または新規な特性が列挙されるそれを超える存在によって変化しない限り、列挙されるそれを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。
【００３５】
「検出する」は、検出されるべき分析物の存在、不在または量を同定することを指す。一実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドの存在またはレベルを検出するために用いられる。
【００３６】
「検出可能な標識」は、目的の分子に連結されるとき、目的の分子を分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段を介して検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識として、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド状粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
【００３７】
「疾患」は、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷させるかまたはそれに干渉する任意の状態または障害を意味する。疾患の例として、神経障害性疼痛、特にＰ２Ｘ４チャネル活性またはＰ２Ｘ４に応答性がある経路の活性に関連する疼痛が挙げられる。
【００３８】
用語「有効量」は、患者における症状の寛解を生じさせるかまたは所望される生物学的予後を得るため、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドの活性を低下させるのに十分な薬剤の用量または量を指す。所望される生物学的予後として、例えば、慢性疼痛またはその症状の寛解、Ｐ２Ｘ４生物学的活性の調節、またはＰ２Ｘ４活性に応答性がある経路の調節が挙げられる。
【００３９】
用語「単離された」は、天然環境下で他のエレメントを実質的に含まない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞または組織供給源に由来する細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。用語「単離された」はまた、単離されたタンパク質が医薬組成物として投与される上で十分に純粋であるか、あるいは少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋であり、より好ましくは少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋であり、さらにより好ましくは９０〜９５％純粋であり；また最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である場合の製剤を指す。
【００４０】
「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を有する。特定の実施形態では、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドの断片は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または３００のアミノ酸を有し得る。
【００４１】
「参照」は、比較の基準を意味する。
【００４２】
「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる規定された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたは全体、例えば、完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列で有り得る。ポリペプチドにおいては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、およびさらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸となる。核酸においては、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、およびさらにより好ましくは約１００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチド、あるいはそれらに近いかまたはそれらの間の任意の整数となる。
【００４３】
用語「レパートリー」は、発現される免疫グロブリンをコードする配列に全体的または部分的に由来するヌクレオチドの遺伝的に多種多様な収集物を指す。この配列は、例えば、Ｈ鎖におけるＶ、Ｄ、およびＪセグメント、ならびに例えば、Ｌ鎖におけるＶおよびＪセグメントのインビボでの再構成によって作成される。あるいは、配列は、インビトロ刺激により細胞株から作成してもよく、そのインビトロ刺激に応じて再構成が生じる。あるいは、配列の一部または全部は、例えば再構成されていないＶセグメントをＤおよびＪセグメントと組み合わせることにより、ヌクレオチド合成、ランダム突然変異誘発、および他の方法（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書に開示される）により、得てもよい。
【００４４】
「特異的に結合する」は、試料、例えば生物学的試料の中のある分子（例えばポリペプチド）に対して認識しかつ結合するが、他の分子に対して実質的に認識しかつ結合することのない薬剤（例えば抗体）を意味する。例えば、特異的に結合する２つの分子は、生理的条件下で比較的安定な複合体を形成する。特異的結合は、通常、中〜高程度の能力とともに低親和性を有する非特異的結合と区別されて、高親和性および低〜中程度の能力によって特徴づけられる。典型的には、結合は、親和性定数ＫAが１０7Ｍ-1より高いか、またはより好ましくは１０8Ｍ-1より高い場合、特異的であると考えられる。
【００４５】
Ｐ２Ｘ４と抗体との間の結合の強度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、または表面プラズモン共鳴に基づく技術（例えばＢｉａｃｏｒｅ）（これらのすべてが当該技術分野で周知の技術である）を用いて測定することができる。必要であれば、非特異的結合は、結合条件を変化させることにより、特異的結合に実質的に影響することなく低下させることができる。抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を可能にする時間、遮断薬（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの適切な結合条件は、通常の技術を用いて当業者により最適化され得る。
【００４６】
詳述されないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で用いられるとき、用語「約」は、当該技術分野で通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解される。約は、記述される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％内であると理解され得る。文脈から特に明白でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。
【００４７】
本明細書中の変数の任意の定義における化学基のリストの記述は、列挙されるグループの任意の単一のグループまたは組み合わせとしての変数の定義を含む。本明細書中の変数または態様における実施形態の記述は、任意の単一の実施形態あるいは任意の他の実施形態またはその一部との組み合わせとしての実施形態を含む。
【００４８】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれか１つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、抗体番号１、１１、２９、および３３のヒトＰ２Ｘ４変異体への結合の分析を示す。
【図２−１】ファージディスプレイ技術を用いて同定された抗体番号１〜３４のＶHおよびＶL配列を提供する。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−１の続きである。
【図２−４】図２−１の続きである。
【図３−１】ファージディスプレイ選択を用いて同定された抗体（抗体１〜３４）のＰ２Ｘ４オルソログ結合特性の概要および電気生理学的アッセイによって測定され、対照電流の割合として報告されたそれらの機能的効果の概要を提供する。凡例：＋はＦＭＡＴアッセイにおいて結合が認められたことを示す；−はＦＭＡＴアッセイにおいて結合が認められなかったことを示す；ＮＴはアッセイにおいて抗体が試験されなかったことを示す。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４】電気生理学的アッセイでスクリーニングされた抗体５、８、１１、１８、２９、および３３の結果を示す。これら抗体の各々はＰ２Ｘ４拮抗剤として同定された。抗体の存在下での３μＭのＡＴＰに応答した、作動薬に誘導される内向き電流ピークは、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）Ｐ２Ｘ４での抗体の不在下での対照電流の割合として示される。
【図５】ハイブリドーマから単離された抗体（抗体番号３５〜４８）のＰ２Ｘ４オルソログ結合特性の概要および電気生理学的アッセイによって測定され、対照電流の割合として報告されたそれらの機能的効果の概要を提供する。
【図６−１】抗体番号３５〜４８のＶHおよびＶL配列を提供する。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−１の続きである。
【図６−４】図６−１の続きである。
【図６−５】図６−１の続きである。
【図６−６】図６−１の続きである。
【図６−７】図６−１の続きである。
【図６−８】図６−１の続きである。
【図７−１】ハイブリドーマ技術を用いて単離された２５２の抗体（抗体番号３５〜２８６）における結合アッセイの結果の概要および電気生理学的アッセイによって測定され、対照電流の割合として報告されたそれらの機能的効果の概要を提供する。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−１の続きである。
【図７−４】図７−１の続きである。
【図７−５】図７−１の続きである。
【図７−６】図７−１の続きである。
【図７−７】図７−１の続きである。
【図７−８】図７−１の続きである。
【図７−９】図７−１の続きである。
【図７−１０】図７−１の続きである。
【図８Ａ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較のために重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｈｕＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図８Ｂ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較として重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｍＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図８Ｃ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較として重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｍＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図８Ｄ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較として重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｈｕＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図８Ｅ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較として重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｈｕＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図８Ｆ】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘを用いて得られた全細胞の電流トレースを示し、抗体添加の前（黒色トレース）および後（灰色トレース）の（灰色バーによって時間的に示される）作動薬応答を示す。トレースは比較として重ねられる。点線はゼロ電流を示す。検討対象のＰ２Ｘ４種は、必要に応じて（ｍ、マウス）（ｈｕ、ヒト）によって示される。ｈｕＰ２Ｘ４に対する活性を示す。
【図９】予想されるＰ２Ｘ４三量体−抗体番号１１Ｆｖ複合体構造を細胞外の視点で模式的に示す。特に、二分のエピトープ−パラトープ界面−抗体番号１１  ＶHＣＤＲ−Ｐ２Ｘ４プロモーター１の頭部（大規模界面−大きい点線円）；抗体番号１１  ＶLＣＤＲ−Ｐ２Ｘ４プロモーター２の右フリッパー部（小規模界面−小さい点線円）を図示する。３つの抗体番号１１分子は、同じＰ２Ｘ４三量体分子に潜在的に結合し得る。抗体番号１１の２つのＦａｂアームは同じＰ２Ｘ４三量体分子に結合する可能性は低い。抗体番号１１は、２つのＰ２Ｘ４サブユニットによって形成されるエピトープにわたってＰ２Ｘヘテロマーに結合することが予想される。
【図１０】ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＰ２Ｘ４配列のアラインメントを提供する。タンパク質の頭部領域が示される。予想されるエピトープ内部のアミノ酸もまた示される。
【図１１】肢への圧力に応答した肢離脱閾値の同側／他側比によって測定された、くも膜下腔内に投与された（５μｇ／マウス）Ｐ２Ｘ４抗体番号３８および２０８ならびにアイソタイプ対照抗体（ＮＩＰ２２８ＴＭ）の、末梢神経結紮（ＰＮＬ）に誘導される機械的痛覚過敏の反転に対する効果を示す（ｎ＝９〜１０／群）。データは、従属因子として時間および処置を用いた二元配置分散分析を用いて分析した。次いで、統計学的有意性がテューキーのポストホック試験（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いて得られた。*Ｐ＜０．０５；***Ｐ＜０．００１−Ｏｐ＋ＮＩＰ２２８ＴＭ対Ｏｐ＋抗体２０８：＋Ｐ＜０．０５；＋＋Ｐ＜０．０１；＋＋＋Ｐ＜０．００１−Ｏｐ＋ＮＩＰ２２８ＴＭ対Ｏｐ＋抗体３８。
【図１２−１】抗体１１に由来する抗体番号２８７〜３１５のＶHおよびＶL配列のアラインメントを提供する。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−１の続きである。
【図１２−４】図１２−１の続きである。
【図１３】抗体番号２０８および３１６〜３２１のＶHおよびＶL配列を提供する。
【図１４】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘで記録されたｈｕＰ２Ｘ４電流に対する抗体番号１１、３００および３１２の効果を示す。黒色トレースがＩｇＧ添加前のＡＴＰ応答を示す一方、灰色トレースはＩｇＧとのインキュベーション後のＡＴＰ応答を示す。破線はゼロ電流レベルを示し、灰色バーはＡＴＰが細胞浸漬液に添加された時間を示す。トレースは比較のために重ねられる。用量応答曲線は実施例１４に記載のように正規化された電流値でプロットされ、平均＋／−標準誤差（ｎ＝４）を表す。
【図１５】ｈｕＰ２Ｘ４での抗体１１の、ＦＬＩＰＲまたはＱｐａｔｃｈ  １６Ｘのいずれかを用いて最適化されたバージョンにおけるＩＣ50値をまとめたものである。値は幾何平均である。
【図１６】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘで得られた、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現されたマウスＰ２Ｘ４および／またはｈｕＰ２Ｘ４での抗体３８、４３、４６および２０８におけるＩＣ50値をまとめたものである。
【図１７】Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘで測定されたマウスミクログリアＰ２Ｘ４電流に対する抗体３８、４３、４６および２０８の効果をまとめたものである。
【図１８】対照抗体ＮＩＰ２２８または抗体２０８（０．３３ｍｇ／ｍｌ）のいずれかで前処理されたマウスミクログリアからの代表的な電気生理学的電流トレースを示す。灰色バーはＡＴＰ（３０μＭ）が細胞に添加された時間を示し、点線はゼロ電流レベルを示す。
【図１９】ＡＴＰで刺激されるカルシウム応答アッセイにおける２つの抗Ｐ２Ｘ４抗体で得られたＩＣ50曲線の例を示す。
【図２０】ＦＬＩＰＲでアッセイされたマウスミクログリアから得られた抗体４６、３８および２０８におけるＩＣ50曲線（平均＋／−標準誤差）を示す。平均ＩＣ50値が以下に示される。
【図２１】ヒト単球由来マクロファージからの代表的な電気生理学的電流トレースを示す。ＡＴＰが細胞に添加された時間はオープンボックスで示される。点線はゼロ電流を示す。
【図２２】ＡＴＰ（３０μＭ）に応答したヒト単球由来マクロファージからの定常状態の内向き電流をまとめたものである。図２３は、ｈｕＰ２Ｘ４電流に対する抗体３１９〜３２１の効果をまとめたものである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
【表１】
2020018307.tif 000008
【００５１】
【表２】
2020018307.tif 000009
【００５２】
【表３】
2020018307.tif 000010
【００５３】
【表４】
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【００５４】
【表５】
2020018307.tif 000012
【００５５】
【表６】
2020018307.tif 000013
【００５６】
【表７】
2020018307.tif 000014
【００５７】
【表８】
2020018307.tif 000015
【００５８】
【表９】
2020018307.tif 000016
【００５９】
【表１０】
2020018307.tif 000017
【００６０】
【表１１】
2020018307.tif 000018
【００６１】
【表１２】
2020018307.tif 000019
【００６２】
【表１３】
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【００６３】
【表１４】
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【００６４】
【表１５】
2020018307.tif 000022
【００６５】
【表１６】
2020018307.tif 000023
【００６６】
発明の詳細な説明
下記のように、本発明は、Ｐ２Ｘ４ポリペプチドに特異的に結合しかつＰ２Ｘ４チャネル活性を調節する抗体、組換えＰ２Ｘ４ポリペプチド、およびかかるポリペプチドを作成するための方法、ならびに抗Ｐ２Ｘ４抗体を作成するための組成物および方法、ならびに神経障害性疼痛および他の徴候の治療のためにＰ２Ｘ４抗体を用いる方法を提供する。
【００６７】
Ｐ２Ｘ４の組換え発現
本発明は、安定な三量体複合体を形成する精製され、単離された組換えＰ２Ｘ４ポリペプチドを提供する。本発明は、精製され、単離されたヒトおよびマウスＰ２Ｘ４ポリペプチドの大規模生成のための方法をさらに提供し、精製され、単離された組換えタンパク質が主に安定な三量体として存在する場合、ミリグラム量のＰ２Ｘ４タンパク質を生成するのにそれは十分である。本明細書に記載の選択およびスクリーニング実験用に生成されるＰ２Ｘ４の総量は、６．２ｍｇのｈＰ２Ｘ４および３．２ｍｇのｍＰ２Ｘ４を含んだ。精製タンパク質の生成レベルは、０．２ｍｇ／Ｌ昆虫細胞培養液であった。蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによってアッセイされるとき、タンパク質調製物は５０〜７５％の三量体を含有する。
【００６８】
ＨＥＫ２９３細胞内でのＣ末端デカヒスチジンタグを用いたヒト−Ｐ２Ｘ４の発現および精製については記載がなされている（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２００８）２６２４１−２６２５１）。精製は、ドデシルマルトシド界面活性剤を用いた可溶化およびＮｉ−固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを含んだ。ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製ステップは、三量体型を単離するのに必要とされた。ｈＰ２Ｘ４の完全なる三量体調製物が単離されているように求められたが、記述される収量はわずか４０μｇ／２．５×１０8個の細胞であった。
【００６９】
三量体ラットＰ２Ｘチャネル（サブタイプ２、４および７）の小規模発現および精製に関する別の例が実施されている（Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６３（２０１１）１０６９−１０７７）。Ｃ末端ヘマグルチニンタグを有するラットＰ２Ｘ４受容体が、ｔｓＡ２０１細胞（ＳＶ４０大型Ｔ抗原を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞のサブクローン）で一過性に発現された。受容体はＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化され、親和性精製された。Ｐ２Ｘ２およびＰ２Ｘ７の発現と比べて、Ｐ２Ｘ４の発現は比較的低かった。ＡＦＭイメージングにおいては精製された受容体が用いられ、受容体の三量体配置に加えて、二重の三量体（三量体の二量体）を示した。
【００７０】
別の報告では、Ｓｆ９昆虫細胞系が、ヒトＰ２Ｘ４およびキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）Ｐ２ＸＡの発現について評価された（Ｖａｌｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８０８（２０１１）２８５９−２８６６）。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）Ｐ２ＸＡが安定な精製された界面活性剤可溶性の形態で得ることができた一方、ヒトＰ２Ｘ４は三量体型で生成される上で不適合であることが報告された。
【００７１】
先行技術で提示される方法では、組換えＰ２Ｘ４ポリペプチドを実質量で均一に単離することができなかった。さらに先行技術では、単離されたタンパク質の大部分が三量体型で存在した場合、ヒトＰ２Ｘ４複合体をミリグラム量で単離することができなかった。それに対し、スケールアップに適した本発明の方法は、精製された組換えＰ２Ｘ４ポリペプチドのミリグラム規模での生成を可能にしている。得られた精製Ｐ２Ｘ４の収量は、０．２ｍｇ／Ｌ昆虫細胞培地であり、約８μｇ／１×１０8個の細胞に対応した。
【００７２】
精製Ｐ２Ｘ４の大規模生成においては、ヒトＰ２Ｘ４およびマウスＰ２Ｘ４受容体は、バキュロウイルス発現系を用いてＳｆ９昆虫細胞内で発現された。発現およびタンパク質生成はＳｆ９昆虫細胞株に限定されず、タンパク質生成を支持する他の昆虫細胞および細胞株として、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ２１細胞またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来細胞株Ｔｎ−３６８およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４が挙げられる。タンパク質生成を増加させるため、Ｐ２Ｘ４発現レベルが回収時に監視され、また受容体の品質および均一性が、改良されたサイズ排除クロマトグラフィーを用いる一方、Ｂａｃｋｍａｒｋらによって記載される通りの（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２０１３）１１２４−１１３２）蛍光（ＦＳＥＣ）法で検出することで評価された。この方法は、ＫａｗａｔｅおよびＧｏｕａｕｘによって記載される通りの（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４（２００６）６７３−６８１）基本的なＦＳＥＣ概念と類似しているが、タンパク質上のヒスチジンタグと特異的に相互作用する蛍光プローブが適用された。本明細書に報告される驚異的な収量を得るため、細胞は、ＳＦ９００ＩＩ培地中、１．０×１０6個／ｍＬの密度で接種された。細胞は、２×１０6個の細胞／ｍｌの細胞密度、２の感染多重度で感染を受けた。タンパク質発現は２７℃で実施され、細胞は感染から７２時間後に採取された。これらの条件は、Ｐ２Ｘ４の三量体型が最適量生成されることを許容した。タンパク質の均一性は想定外であった。発現されたＰ２Ｘ４タンパク質の総量が感染後の時間経過とともに増加した一方、ＦＳＥＣによるアッセイによると、発現されたタンパク質の品質は７２時間経過すると高まらなかった。
【００７３】
抗Ｐ２Ｘ４抗体
本開示は、新規な抗原結合断片を含む抗Ｐ２Ｘ４抗体を提供する。特定の実施形態では、抗Ｐ２Ｘ４抗体は、本明細書に記載の抗Ｐ２Ｘ４抗体（例えば抗体１〜４８）またはその断片である。
【００７４】
一般に、抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または抗体ライブラリーを用いて実施されるファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２００４．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（２）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８，１９９６；（３）Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（３）：１８１−９６，１９９６）を用いて作成され得る。代表的な抗体３５〜４８は、本明細書に記載のハイブリドーマ技術を用いて得られた。代表的な抗体１〜３４は、本明細書に記載のファージディスプレイを用いて得られた。他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８も参照のこと。本発明は、任意の特定の供給源、種の由来、または産生方法に限定されない。
【００７５】
免疫グロブリンとしても知られるインタクトな抗体は、典型的には、２つの軽（Ｌ）鎖（各々、約２５ｋＤａ）および２つの重（Ｈ）鎖（各々、約５０ｋＤａ）からなる四量体グリコシル化タンパク質である。λ鎖およびκ鎖と名付けられた軽鎖の２つのタイプは、抗体中に見出される。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは５つの主要なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることができ、またこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2にさらに分かれる場合がある。
【００７６】
免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、当該技術分野で周知である。抗体構造のレビューについては、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照のこと。簡潔に述べると、各軽鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶL）および定常ドメイン（ＣL）からなる。各重鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶH）、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣH）、およびヒンジ領域からなる。ＶHに最も近いＣHドメインはＣH１と名付けられている。ＶHおよびＶLドメインは、フレームワーク領域と称される比較的保存された配列の４つの領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）からなり、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変配列の３つの領域に対する足場を形成する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用に関与する残基の大部分を有する。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される。重鎖上のＣＤＲ成分がＨ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、それ故、軽鎖上のＣＤＲ成分はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。ＣＤＲ３、特にＨ３は、抗原結合ドメイン内部の分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、アミノ酸残基で２つ程度に短いか、または２６を超える可能性がある。特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３（Ｈ３）は、およそ４アミノ酸（例えば抗体番号２を参照）と２２アミノ酸（例えば抗体番号２０および３４を参照）の間を含む。
【００７７】
Ｆａｂ断片（断片抗原結合）は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合されたＶH−ＣH１およびＶL−ＣLドメインからなる。Ｆｖ内の非共有結合されたＶHおよびＶLドメインが宿主細胞内で同時発現される場合の解離する傾向を克服するため、いわゆる一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が構築され得る。ｓｃＦｖでは、柔軟かつ十分に長いポリペプチドが、ＶHのＣ末端をＶLのＮ末端にまたはＶLのＣ末端をＶHのＮ末端にいずれか連結する。最も一般的には、１５残基（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3ペプチドがリンカーとして用いられるが、他のリンカーもまた当該技術分野で公知である。
【００７８】
抗体多様性は、可変領域をコードする複数の生殖系列遺伝子のコンビナトリアルアセンブリおよび種々の体細胞事象の結果である。体細胞事象は、完全なＶH領域を作製する、多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊ）遺伝子セグメントを有する可変遺伝子セグメントの組換え、ならびに完全なＶL領域を作製する、可変遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメントの組換えを含む。この組換えプロセス自体は、不明確であって、Ｖ（Ｄ）Ｊ連結部分でアミノ酸の欠失または付加をもたらす。多様性のこれらの機構は、抗原露出前の発達中のＢ細胞において生じる。抗原刺激後、Ｂ細胞において発現される抗体遺伝子は、体細胞突然変異を受ける。
【００７９】
生殖系列遺伝子セグメントの概算数、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムＶH−ＶL対形成に基づくと、最大１．６×１０7の様々の抗体が産生され得る（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。抗体多様性（例えば体細胞突然変異）に寄与する他のプロセスを考慮に入れる場合、１×１０10以上の様々な抗体が潜在的に作成され得ると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９５）。抗体多様性に関与する多数のプロセスのため、独立的に作成される抗体が、ＣＤＲにおいて同一であるかまたはまさに実質的に類似のアミノ酸配列を有する可能性は極めて低い。
【００８０】
本開示は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー由来の新規なＣＤＲを提供する。ＣＤＲを保有するための構造は、一般に、抗体の重鎖または抗体の軽鎖あるいはそれらの一部であり、ここで、ＣＤＲは、天然に存在するＶHおよびＶLのＣＤＲに対応する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載のように決定することができる。
【００８１】
抗Ｐ２Ｘ４抗体１〜４８、２０８、および２８７〜３２１のアミノ酸配列（それらのＶHおよびＶLドメインを含む）は図面で示され、本明細書に記載される。
【００８２】
抗Ｐ２Ｘ４抗体は、任意選択的に抗体定常領域またはその一部分を含んでもよい。例えば、ＶLドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκ鎖またはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合していてもよい。同様に、ＶHドメインに基づく特定の抗原結合ドメインは、任意の抗体アイソトープ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびに限定はされないがＩｇＧ1およびＩｇＧ4を含むアイソトープサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合していてもよい。Ｃ末端断片におけるＤＮＡおよびアミノ酸配列は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照）。
【００８３】
特定の実施形態は、Ｐ２Ｘ４抗体由来のＦｖ断片のＶHおよび／またはＶLドメインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶHおよびＶLドメインのいずれかの少なくとも１つのＣＤＲを含む。抗体番号１〜４８で示されるＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む抗体は、本発明の範囲内に包含される。特定の一実施形態では、本発明の抗体はＶHのＣＤＲ３を含む。
【００８４】
特定の実施形態では、ＶHドメインおよび／またはＶLドメインは、生殖系列化され得る、すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、従来の分子生物学技術を用いて生殖系列細胞によって産生されるＦＲに適合するように突然変異される。他の実施形態では、このフレームワーク配列は、コンセンサス生殖系列配列とは異なったままである。
【００８５】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＰ２Ｘ４の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトまたはマウスＰ２Ｘ４の細胞外ドメイン内のエピトープに１０6Ｍ-1超、１０7Ｍ-1超、または１０8Ｍ-1超の親和性で特異的に結合する。
【００８６】
本発明の抗体が、例えばＰ２Ｘ４細胞外ドメインの全部または一部を含む組換えタンパク質を含む他のタンパク質とも結合し得ることは十分に考えられる。
【００８７】
当業者は、本発明の抗体を、Ｐ２Ｘ４と一部異なるタンパク質を検出し、測定し、また阻害するために用いてもよいことを理解するだろう。本抗体は、標的タンパク質が、Ｐ２Ｘ４（ＮＣＢＩ参照番号Ｑ９９５７１）の隣接アミノ酸のうち、少なくとも１００個、８０個、６０個、４０個、または２０個の任意の配列に対して少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれを超えて同一である配列を含む限り、結合の特異性を保持することが予想される。パーセント同一性は、標準的なアラインメントアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムなど）によって決定される。
【００８８】
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照）ならびに二次構造分析および三次構造分析は、開示された抗体およびその抗原との複合体から推定される特定の３Ｄ構造を同定するため、実施することができる。かかる３Ｄ構造の例が抗体番号１１として提供される。かかる方法として、限定はされないが、Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７−１３）および本開示の抗体の仮想表示のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）が挙げられる。
【００８９】
誘導体
本開示は、Ｐ２Ｘ４に特異的な抗体を得るための方法を提供する。かかる抗体のＣＤＲは、本明細書で同定されるＶHおよびＶLの特異的な配列に限定されず、またＰ２Ｘ４に特異的に結合する能力を保持するこれらの配列の変異体を含み得る。かかる変異体は、当業者により当該技術分野で周知の技術を用いて、本明細書で列挙される配列から誘導され得る。例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加は、ＦＲおよび／またはＣＤＲにおいて施すことができる。ＦＲにおける変化が通常、抗体の安定性および免疫原性を改善するように設計される一方、ＣＤＲにおける変化は、典型的には抗体のその標的に対する親和性を高めるように設計される。ＦＲの変異体はまた、天然に存在する免疫グロブリンアロタイプを含む。かかる親和性を高める変化は、ＣＤＲを改変すること、および抗体のその標的に対する親和性を試験することを含む慣例的な技術によって経験的に決定され得る。例えば、保存的アミノ酸置換は、開示されるＣＤＲの任意の一つの範囲内で行うことができる。様々な改変が、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載される方法に従って行うことができる。これらは、限定はされないが、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、ひいては「サイレント」変化をもたらすヌクレオチド配列を含む。例えば、非極性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。陰性荷電（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。この配列内のアミノ酸における置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表１を参照）。さらに、このポリペプチドにおける任意の天然残基はまた、アラニンで置換され得る（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照）。
【００９０】
【表１７】
2020018307.tif 000024
【００９１】
本発明の抗体の誘導体および類似体は、組換え方法および合成方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＢｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む当該技術分野で周知の様々な技術によって生成することができる。
【００９２】
一実施形態では、本発明のＶHドメインのアミノ酸配列変異体であるＶHドメインを作成するための方法は、本開示のＶHドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸を付加するか、欠失させるか、置換するか、または挿入するステップ、任意選択的には、このようにして提供されるＶHドメインを１つ以上のＶLドメインと組み合わせるステップ、Ｐ２Ｘ４に対する特異的な結合についてＶHドメインまたはＶH／ＶLの１つもしくは複数の組み合わせを試験するステップ、または／および任意選択的には、例えば本明細書に記載の電気生理学的アッセイを用いて、かかる抗原結合ドメインのＰ２Ｘ４活性を調節する能力を試験するステップを含む。ＶLドメインは、本発明のポリペプチドに対して同一であるかまたは実質的に同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００９３】
本明細書中で開示されるＶLドメインの１つ以上の配列変異体が１つ以上のＶHドメインと組み合わせられる場合での類似の方法を用いることができる。
【００９４】
本開示のさらなる態様は、Ｐ２Ｘ４と特異的に結合する抗原結合断片を調製する方法を提供する。本方法は、
（ａ）置換されるべきＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３コード領域が欠如するかのいずれかのＶHドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供するステップと；
（ｂ）レパートリーを、ＶHＣＤＲ３（すなわちＨ３）として本明細書中に実質的に示されるようなアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせ、ドナー核酸がレパートリーのＣＤＲ３領域内に挿入されることによって、ＶHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供する、ステップと；
（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現させるステップと；
（ｄ）Ｐ２Ｘ４に特異的な結合断片を選択するステップと；
（ｅ）特異的な結合断片またはそれをコードする核酸を回収するステップと、
を含む。
【００９５】
さらに、本発明のＶLＣＤＲ３（すなわちＬ３）が、置換されるべきＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３コード領域が欠如するかのいずれかのＶLドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わされるような類似の方法を用いてもよい。ドナー核酸は、抗体番号１〜４８で実質的に示されるようなアミノ酸配列をコードする核酸から選択してもよい。
【００９６】
本発明のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）をコードする配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：７７９−７８３）に記載される方法論を用いて、各々のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）が欠如した可変ドメインのレパートリー内へ導入してもよい。特に、可変ドメイン領域の５’末端に向けたまたは隣接したコンセンサスプライマーを、ヒトＶH遺伝子の第三のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併用することで、ＣＤＲ３が欠如したＶH可変ドメインのレパートリーを提供することができる。レパートリーは、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせてもよい。類似の技術を用いて、ＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３が欠如したＶHまたはＶLドメインのレパートリーとシャッフルし、またシャッフルされた完全なＶHまたはＶLドメインは、同族のＶHまたはＶLドメインと組み合わされて、本発明のＰ２Ｘ４特異抗体を作成することができる。次に、好適な抗原結合断片を選択できるように、レパートリーは、本明細書に記載されるまたは国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに記載のようなファージディスプレイシステムなどの好適な宿主系において提示され得る。
【００９７】
類似の混合またはコンビナトリアル技術もまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）によって開示されており、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術について記載しているが、同アプローチが抗体の作成に使用可能であることを認めている。
【００９８】
さらなる実施形態では、１つ以上の選択されるＶHおよび／またはＶL遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて、本明細書で開示される配列由来の１つ以上の配列を有する新規なＶHまたはＶL領域を作成してもよい。一つのかかる技術としてエラープローンＰＣＲが、Ｇｒａｍら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）によって記載されている。
【００９９】
使用可能な別の方法が、ＶHまたはＶL遺伝子のＣＤＲに対して突然変異誘発を指示することである。かかる技術は、Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
【０１００】
同様に、１つ以上または３つすべてのＣＤＲは、ＶHまたはＶLドメインのレパートリー内に挿入することができ、次にそれらは、Ｐ２Ｘ４に特異的な抗原結合断片についてスクリーニングされる。
【０１０１】
免疫グロブリン可変ドメインの一部分は、本明細書で実質的に示されるようなＣＤＲのうちの少なくとも１つを含み、任意選択的には、本明細書で示されるようなｓｃＦｖ断片由来のフレームワーク領域に介在することになる。同部分は、ＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは双方の少なくとも約５０％を含み得、この５０％は、ＦＲ１のＣ末端の５０％であり、またＦＲ４のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端での付加的な残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築では、クローニングまたは他の操作工程を容易にするように、導入されるリンカーによってコードされるＮ末端またはＣ末端残基の導入がもたらされ得る。他の操作工程は、可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、二重特異性抗体の作成における）、または以下にさらに詳細に考察されるようなタンパク質性標識を含むさらなるタンパク質配列に連結するためのリンカーの導入を含む。
【０１０２】
実施例に例示される実施形態は、ＶHおよびＶLドメインの「マッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）」対を含むが、当業者は、代替的な実施形態が、ＶLまたはＶHドメインのいずれかに由来する単一のＣＤＲのみを有する抗原結合断片を含み得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、抗原結合断片はＶH（Ｈ３）のＣＤＲ３である。例えばＰ２Ｘ４に結合可能な２つのドメインに特異的な抗原結合断片を形成することが可能な相補性ドメインについてスクリーニングするため、一本鎖特異的結合ドメインのいずれか１つを用いることができる。スクリーニングは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに開示されるいわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって達成され得、この場合、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを有する個々のコロニーが、他鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させるために用いられ、結果的に得られる二本鎖特異的結合ドメインが、記載されるようなファージディスプレイ技術に従って選択される。
【０１０３】
本明細書に記載の抗Ｐ２Ｘ４抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体など）に連結され得る。例えば同抗体は、化学的架橋または組換え方法によって連結され得る。
【０１０４】
開示される抗体はまた、天然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するように改変してもよい。例えば、１つ以上の炭化水素部分を欠失させ、および／または１つ以上のグリコシル化部位を元の抗体に付加することができる。本開示の抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を当該分野で公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含むように改変することによって達成され得る。抗体上の炭化水素部分の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。かかる方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびＡｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載されている。抗体からの任意の炭化水素部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１、ならびにＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０に記載のように、化学的にまたは酵素的に達成され得る。抗体はまた、検出可能な標識あるいは機能的な標識を用いてタグ化され得る。検出可能な標識は、131Ｉまたは99Ｔｃなどの放射性標識を含み、それはまた慣用的な化学を用いて抗体に付着され得る。検出可能な標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼあるいはアルカリホスファターゼなどの酵素標識を含む。検出可能な標識は、ビオチンなどの化学的部分をさらに含み、特定の同族の検出可能な部分、例えば、標識化アビジンへの結合を介して検出され得る。
【０１０５】
典型的には、アミノ酸は、同様の荷電特性、疎水性特性、または立体化学的特性を有する関連したアミノ酸によって置換される。かかる置換であれば、当業者の通常技術の範囲内に含まれることになる。ＣＤＲの場合と異なり、ＦＲにおいては、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなく、さらなる実質的な変更を行うことができる。ＦＲへの変更は、限定はされないが、非ヒト由来フレームワーク残基をヒト化すること、または抗原との接触または結合部位の安定化にとって重要である特定のフレームワーク残基を操作することを含み、例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスを変更すること、Ｆｃレセプター結合などのエフェクター機能を改変し得る特定のアミノ酸残基を変更すること（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書、ならびにＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４に記載の通り）、あるいは定常領域が由来する種を変更すること、を含む。
【０１０６】
当業者は、上記の変更がすべてを網羅しているわけではなく、かつ多くの他の変更が本開示の教示の観点から当業者にとって明白となることを理解するであろう。
【０１０７】
核酸、クローニングおよび発現系
本開示は、開示される抗体のアミノ酸配列を提供する。当業者は、この情報が一旦提供されると、開示される抗体をコードする核酸分子を容易に得ることができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、また全体的または部分的に合成または組み換えであってもよい。ヌクレオチド配列への言及では、指定の配列を有するＤＮＡ分子が包含され、また指定の配列を有するＲＮＡ分子が包含され、ここでは、文脈上別に必要でない限りは、ＵはＴに置換されている。
【０１０８】
本発明の核酸分子は、本明細書で開示されるＣＤＲ、ＶHドメイン、および／またはＶLドメインに対するコード配列を含む。
【０１０９】
本開示はまた、本明細書で開示されるＣＤＲ、ＶHドメイン、および／またはＶLドメインをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むプラスミド、ベクター、ファージミド、転写または発現カセットの形態での構築物を提供する。
【０１１０】
本開示は、１つ以上の上記の構築物を含む宿主細胞をさらに提供する。
【０１１１】
また、任意のＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）ドメイン、ＶHまたはＶLドメインをコードする核酸、およびコードされた生成物を作成する方法も提供される。本方法は、コード核酸からコードされた生成物を発現することを含む。発現は、核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成され得る。発現による生成後、ＶHまたはＶLドメイン、または特異的な結合メンバーは、任意の好適な手法を用いて単離し、および／または精製し、次いで必要に応じて用いることができる。
【０１１２】
抗原結合断片、ＶHおよび／またはＶLドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、実質的に純粋または均一な形態で、それらの天然環境から単離および／または精製され得るか、あるいは核酸の場合、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子源を含まないかまたは実質的に含まない。
【０１１３】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現用の系は、当該分野で周知である。抗体産生に適した細胞については、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｓ，１９９９を参照のこと。つまり、好適な宿主細胞は、細菌、植物細胞、哺乳類細胞、または酵母系およびバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳類細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスミエローマ細胞、および多数の他の細胞が挙げられる。一般的な細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。開示された抗体を産生するのに、本発明に適合可能な任意のタンパク質発現系を用いることができる。好適な発現系は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｅｄｓ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に記載のトランスジェニック動物を含む。
【０１１４】
適切なベクターは、適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む）を含むように選択され得るか、または構築され得る。ベクターは、プラスミドまたはウイルス、例えば必要に応じてファージまたはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多数の公知の技法およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２において詳述されている。
【０１１５】
本開示のさらなる態様は、本明細書に開示された核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、かかる核酸を宿主細胞へ導入するステップを含む方法を提供する。この導入では、任意の利用可能な技法を用いてもよい。真核細胞においては、好適な技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニア、または昆虫細胞におけるバキュロウイルス）を用いた形質導入を含み得る。細菌細胞においては、好適な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含み得る。核酸の細胞への導入に引き続き、例えば遺伝子の発現用の条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にし得る。
【０１１６】
使用方法
開示される抗Ｐ２Ｘ４抗体は、Ｐ２Ｘ４の電気生理学的活性を調節することが可能である。特に、本明細書に提供される抗体は、Ｐ２Ｘ４チャネルコンダクタンスを阻害または増強するために用いてもよい。かかる抗体は、哺乳動物、特にヒトにおけるＰ２Ｘ４に関連した医学的障害を処置するために用いることができる。特に、Ｐ２Ｘ４活性を阻害する抗体は、神経障害性疼痛の治療にとって有用である。Ｐ２Ｘ４活性を増強する抗体は、限定はされないが、ミクログリア媒介性疾患および障害ならびにマクロファージ媒介性疾患および障害を含む、他の治療方法において有用である。
【０１１７】
本発明の抗体はまた、Ｐ２Ｘ４またはＰ２Ｘ４発現細胞を単離するため、用いることができる。
【０１１８】
実施例で示されるように、Ｐ２Ｘ４と抗Ｐ２Ｘ４抗体との結合により、Ｐ２Ｘ４の生物学的活性がイオンのＰ２Ｘ４チャネルの通過を増強または低減することによって調節される。
【０１１９】
本発明の抗体または抗体組成物は、治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体の医学的状態の重症度により異なる場合がある。適切な用量は、臨床的指標に基づいて、処置をする医師によって選択される。
【０１２０】
抗体は、ボーラス用量として与えられ、投与後の最長期間にわたり、抗体の循環レベルを最大化し得る。持続注入もまた、ボーラス投与後に用いてもよい。
【０１２１】
本発明の抗Ｐ２Ｘ４抗体は、生物学的試料中のＰ２Ｘ４の存在を検出するため、用いてもよい。抗体を用いる検出方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光、および免疫沈降を含む。必要に応じて、抗Ｐ２Ｘ４抗体は、例えばリガンド基（ビオチンなど）または検出可能なマーカー基（例えば、蛍光基、放射性同位元素または酵素など）で修飾される。必要に応じて、本発明の抗体は、従来の技術を用いて標識してもよい。好適な検出可能な標識として、例えば、フルオロフォア、発色団、放射性原子、高電子密度試薬、酵素、および特異的な結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、典型的にはそれらの活性によって検出される。例えば、西洋わさびペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換するその能力により検出可能であり、分光光度計を用いて定量化され得る。検出においては、好適な結合パートナーとして、限定はされないが、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該技術分野で公知の極めて多数の受容体−リガンド結合が挙げられる。他の順列および可能性は、当業者に容易に理解されることになり、本発明の範囲内で均等物として考えられる。
【０１２２】
医薬組成物および投与方法
本開示は、抗Ｐ２Ｘ４抗体（例えば抗体番号１〜４８）を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、薬学的使用および患者への投与にとって好適であり得る。組成物は、典型的には、１つ以上の本発明の抗体および薬学的に許容できる賦形剤を含む。語句「薬学的に許容できる賦形剤」は、薬学的投与と適合できる、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。組成物はまた、補足された治療機能、追加された治療機能、または増強された治療機能を提供する他の活性化合物を含有してもよい。医薬組成物はまた、容器、パック、またはディスペンサー中に投与のための使用説明書と一緒に含めてもよい。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合できるように処方される。投与を実施するための方法は、当業者に公知である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下または経皮であってもよい。一実施形態では、神経障害性疼痛は、髄腔内投与によって治療される。局所的または経口的に投与可能である組成物、あるいは粘膜を通じた伝達が可能であり得る組成物を得ることもまた、可能であり得る。
【０１２４】
皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、典型的には、以下の成分：注射用水などの滅菌希釈液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧を調節するための薬剤のうちの１つ以上を含む。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調節することができる。かかる調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアルの中に封入してもよい。
【０１２５】
注射に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液または分散物、および滅菌注射可能溶液および分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与においては、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。あらゆる場合で、組成物は、無菌でなければならず、容易なシリンガビリティー（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。微生物の作用の阻害は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合で、組成物中に等張剤、例えば、糖；ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましいことになる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒、ならびにそれらの好適な混合液であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散の場合において必要とされる粒径の維持により、および／または界面活性剤の使用により、維持され得る。注射可能組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。
【０１２６】
経口組成物は、一般に、不活性希釈液または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るかまたは錠剤に圧縮され得る。経口投与においては、抗体は、賦形剤と組み合わせ、また錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いることができる。薬学的に適合できる結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分；結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカロース）；または矯味矯臭剤（例えば、ペッパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジ香料）、あるいは類似する性質の化合物のいずれかを含有し得る。
【０１２７】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与においては、浸透されるバリアに適切な浸透剤がこの処方で用いられる。かかる浸透剤は、一般に当該技術分野で公知であり、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、口内剤、鼻スプレー、吸入器、または坐剤の使用を通じて達成され得る。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、腸、口、または肺において粘膜を通じた伝達が可能であり得る（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号明細書に記載の通り、ＦｃＲｎ受容体媒介経路を介するもの）。経皮投与においては、活性化合物は、一般に当該技術分野で公知のように、軟剤、軟膏、ゲル、またはクリーム中に処方され得る。吸入による投与においては、抗体は、加圧された容器またはディスペンサー（好適な噴霧剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む）、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、化合物を身体からの迅速な排除に対して保護することになる担体、例えば植込錠およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤を用いて調製される。生分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を用いることができる。かかる製剤を調製するための方法は、当業者にとって明らかであろう。本開示の抗体を含有するリポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容できる担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１２９】
経口または非経口組成物を用量単位形態で処方することは、投与の簡略化および用量の均一性にとって有利であり得る。用語「用量単位形態」は、本明細書で用いられるとき、処置される被験体に対する単位用量として適する物理的に別かれた単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望される治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１３０】
本発明の組成物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ50（集団の５０％における治療有効用量）を決定する場合、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表され得る。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。
【０１３１】
電気生理学的実験および動物試験から得られたデータは、ヒトで用いられる用量範囲を処方する際に用いることができる。用量は、ＩＣ50（すなわち、症状の半最大阻害を得る抗体濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るため、動物モデルにおいて処方され得る。血漿における循環レベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーにより測定され得る。任意の特定用量の効果は、好適なバイオアッセイにより監視され得る。用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のない循環濃度の範囲内である。用量は、用いられる投薬形態および用いられる投与経路に応じて変化し得る。
【０１３２】
キット
本発明は、Ｐ２Ｘ４活性を調節するためのキットを提供する。Ｐ２Ｘ４活性を増強する抗体は、本明細書に記載される通りの低下したＰ２Ｘ４活性によって媒介される徴候の治療において有用である。Ｐ２Ｘ４活性を阻害する抗体は、神経障害性疼痛ならびに／またはミクログリア媒介性疾患および障害ならびに／またはマクロファージ媒介性疾患および障害の治療または予防にとって有用である。一実施形態では、キットは、単位剤形でＰ２Ｘ４活性を調節する有効量の抗Ｐ２Ｘ４抗体を含有する治療または予防組成物を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは、治療的または予防的細胞組成物を含有する滅菌容器を含み；かかる容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当該技術分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または薬剤保持に適した他の材料で作られ得る。
【０１３４】
必要に応じて、本発明の抗体は、神経障害性疼痛を有するかまたは発症するリスクがある被験体に抗体または薬剤を投与するための使用説明書とともに提供される。使用説明書は、一般に、かかる徴候の治療または予防のための組成物の使用についての情報を含むことになる。他の実施形態では、使用説明書は、治療薬の説明；免疫不全またはその症状の治療または予防のための投与計画および投与；注意事項；警告；効能；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験；および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。使用説明書は、容器（存在する場合）上に直接印刷されるか、または容器に貼付されたラベルとして、または容器内にまたは容器とともに供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくは折り畳み印刷物として印刷される場合がある。
【０１３５】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内に十分に含まれる、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学に関する従来技術が用いられる。かかる技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９６）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）に十分に解説されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、それ故、本発明を作成し、実施する場合に検討してもよい。特定の実施形態において特に有用な技術は、以下に続くセクションで考察されることになる。
【０１３６】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法における抗Ｐ２Ｘ４抗体をいかに作成し、使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：組換えＰ２Ｘ４タンパク質の生成および単離
ヒトＰ２Ｘプリン受容体４（Ｑ９９５７１）、位置２４２でＳからＧの突然変異を有するヒトＰ２Ｘプリン受容体４の天然変異体（変異体ｒｓ２５６４４に対応）およびマウスＰ２Ｘプリン受容体４（Ｑ９ＪＪＸ６）タンパク質を、Ｃ末端ＡＶＩタグ（結合活性ＬＬＣ）およびＣ末端ヒスチジンタグを用いて設計した。構築物をｐＦＡＳＴＢＡＣ１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。バクミドをＤＨ１０Ｂａｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞内で作成した。その後、組換えバキュロウイルス粒子を生成するため、バクミドを、Ｓｆ９昆虫細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞、カタログ番号１１４９６−０１５）にトランスフェクトし、次いでタンパク質発現を意図してＳｆ９細胞を感染させるために用いた。
【０１３８】
発現パラメータを、Ｂａｃｋｍａｒｋらによって記載された改良型蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２０１３）１１２４−１１３２）を用いて、発現レベル、タンパク質品質および受容体の均一性を監視することによって評価した。この方法は、ＫａｗａｔｅおよびＧｏｕａｕｘによって記載された（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４（２００６）６７３−６８１）通りの基本的なＦＳＥＣの概念と類似するが、タンパク質上のヒスチジンタグと特異的に相互作用する蛍光プローブを適用した。細胞は、典型的には、ＳＦ９００ＩＩ培地中、１．０×１０6個／ｍＬの密度で接種した。細胞は、２×１０6個の細胞／ｍｌの細胞密度、２の感染多重度で感染を受けた。タンパク質発現は２７℃で実施し、細胞は感染から７２時間後に採取した。発現パラメータは、三量体の量を増加させ、三量体として存在するタンパク質の均一性を高めるように選択した。蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによるアッセイによると、タンパク質調製物は５０〜７５％の三量体を含有する。受容体の総量が感染後の時間経過とともに増加したが、ＦＳＥＣ分析によると、発現時間が７２時間を経過すると、タンパク質の品質が低下することが示された。
【０１３９】
ヒトＰ２Ｘ４受容体およびマウスＰ２Ｘ４を次のように精製した。膜をＳＦ９細胞から調製した。膜タンパク質を、界面活性剤、塩、緩衝液および添加剤の組み合わせ、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドＣＡＳ６９２２７−９３−６（０〜２％（ｗ／ｖ））、ｎ−ドデシルチオ−マルトシドＣＡＳ１４８５６５−５８−６（０〜１％（ｗ／ｖ））、（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸／Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−［３−［［３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］アミノ］プロピル］−１−プロパンアミニウムヒドロキシド、略記ＣＨＡＰＳ  ＣＡＳ７５６２１−０３−３（０〜０．６％（ｗ／ｖ））、およびコレステリルヘミスクシネートＣＡＳ１０２６０１−４９−０（０〜０．１２％（ｗ／ｖ））を用いる界面活性剤可溶化により、膜から抽出した。理論に固定されない限り、より高濃度の指示物質ならびに他の界面活性剤は、タンパク質の膜からの抽出を支持する。タンパク質は、標準の親和性およびサイズ排除クロマトグラフィー精製を受けた。精製したタンパク質を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２５（ｗ／ｖ）％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドＣＡＳ６９２２７−９３−６、０．０１２５％（ｗ／ｖ）、ｎ−ドデシルチオ−マルトシドＣＡＳ１４８５６５−５８−６、０．００７５％（ｗ／ｖ）（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸／Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−［３−［［３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］アミノ］プロピル］−１−プロパンアミニウムヒドロキシド、略記ＣＨＡＰＳ  ＣＡＳ７５６２１−０３−３、および０．００１５％（ｗ／ｖ）コレステリルヘミスクシネートＣＡＳ１０２６０１−４９−０を含有する緩衝液中で配合した。
【０１４０】
精製したタンパク質を、リン酸塩緩衝液およびヘペス緩衝液２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸緩衝液ＣＡＳ７３６５−４５−９を含む代替条件下で配合した。様々な緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲であった。塩（ＮａＣｌ）は１２０〜６００ｍＭの間で変化していた。グリセロールは、タンパク質配合物から抽出することができる。様々な界面活性剤を、タンパク質配合物、例えばラウリルマルトースネオペンチルグリコール２，２−ジデシルプロパン−１，３−ビス−β−Ｄ−マルトピラノシド、デシルマルトースネオペンチルグリコール２，２−ジオクチルプロパン−１，３−ビス−β−Ｄ−マルトピラノシド、オクチルマルトースネオペンチルグリコール２，２−ジヘキシルプロパン−１，３−ビス−β−Ｄ−マルトピラノシド、ＣＹＭＡＬ−５５−シクロヘキシル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシドＣＡＳ２５０６９２−６５−０、ｎ−テトラデシルホスホコリン７７７３３−２８−９、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドＣＡＳ８２４９４−０９−５、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドＣＡＳ２９８３６−２６−８およびｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコシドＣＡＳ６９９８４−７３−２の中で用いている。他の界面活性剤中の配合物もまた考えられる。コレステリルヘミスクシネートＣＡＳ１０２６０１−４９−０の濃度は変化させることができ、加えてタンパク質配合物から除外することができる。
【０１４１】
実施例２：三量体Ｐ２Ｘ４複合体の精製
インビボでＰ２Ｘ受容体は機能的な三量体イオンチャネルを形成する。可溶化および精製Ｐ２Ｘ４タンパク質は、典型的には、単量体、二量体、三量体、および六量体（すなわち三量体の二量体）を含むオリゴマー状態の範囲内で存在する。オリゴマー状態のこの範囲は、例えば参考文献（Ｂａｃｋｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２０１３）１１２４−１１３２；Ｋａｗａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４（２００６）６７３−６８１；Ｋａｗａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６０（２００９）５９２−５９８；Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５１８（２００５）１０７−１１０；Ｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３（２００３）２４３−２５２）によって記載がなされている。主に三量体の安定な配置を得るため、可溶化条件を調節した。
【０１４２】
界面活性剤、添加剤、緩衝液およびｐＨの組み合わせは変化させた。より大規模なオリゴマー配置および凝集体を低減しつつも三量体のＦＳＥＣでの痕跡を高めるように最適な条件を選択した。かかる望ましくない形態は、適用されるサイズ排除カラムのボイドボリュームで溶出された。試験した条件は、ＫＰＯ４−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、６００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％（ｗ／ｖ）ｎ−ドデシル−β−マルトピラノシドＣＡＳ６９２２７−９３−６を含んだ。ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドＣＡＳ６９２２７−９３−６、ｎ−ドデシルチオ−マルトシドＣＡＳ１４８５６５−５８−６、（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸／Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−［３−［［３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］アミノ］プロピル］−１−プロパンアミニウムヒドロキシド、略記ＣＨＡＰＳ  ＣＡＳ７５６２１−０３−３を含む界面活性剤と添加剤のコレステリルヘミスクシネートＣＡＳ１０２６０１−４９−０との組み合わせを含有する緩衝液中で最適な可溶化が得られた。精製したタンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２５（ｗ／ｖ）％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドＣＡＳ６９２２７−９３−６、０．０１２５％（ｗ／ｖ）、ｎ−ドデシルチオ−マルトシドＣＡＳ１４８５６５−５８−６、０．００７５％（ｗ／ｖ）（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸／Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−［３−［［３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］アミノ］プロピル］−１−プロパンアミニウムヒドロキシド、略記ＣＨＡＰＳ  ＣＡＳ７５６２１−０３−３、および０．００１５％（ｗ／ｖ）コレステリルヘミスクシネートＣＡＳ１０２６０１−４９−０を含有する緩衝液中で配合した。
【０１４３】
実施例３：抗Ｐ２Ｘ４特異抗体をファージディスプレイ選択を用いて単離した
ナイーブヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーを、糸状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローン化し、選択用に用いた（Ｌｌｏｙｄ（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２２，１５９−１６８；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，３０９−３１４，１９９６）。抗Ｐ２Ｘ４特異抗体は、本質的にＶａｕｇｈａｎら（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記）によって先行的に記載される通り、組換えヒトＰ２Ｘ４（ｈｕＰ２Ｘ４）に対する一連の選択サイクルを用いて、ファージディスプレイライブラリーから単離した。つまり、ＰＢＳ（ダルベッコのＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のヒトＰ２Ｘ４を、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上に４℃で一晩固定化した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、次にＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ乾燥スキムミルク（３％ｗ／ｖ）で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ（３％ｗ／ｖ）中の精製したファージをウェルに添加し、コーティングした抗原に室温で１時間結合させておいた。未結合のファージを、ＰＢＳを用いた一連の洗浄サイクルによって除去した。結合したファージ粒子は、３７℃で３０分間、トリプシンで溶出させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細菌に感染させ、次の選択ラウンドのために救済した。あるいは、抗Ｐ２Ｘ４抗体は、Ｃ末端ペプチドｈｕＰ２Ｘ４370-388（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ＃ＡＰＲ−００２）に対する精製ファージライブラリーの除外を除いて上記のように単離するか、またはビーズによるフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、抗原を用いた選択の前に行った。
【０１４４】
実施例４：ハイブリドーマ技術を用いてのラット抗マウスＰ２Ｘ４抗体の作成
免疫
精製した組換えマウスＰ２Ｘ４タンパク質およびマウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、３つの群でスプラーグドーリーラットを免疫するために用いた。グループ１では、ラットをマウスＰ２Ｘ４タンパク質で免疫し、グループ２では、ラットをマウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞で免疫し、またグループ３では、ラットをマウスＰ２Ｘ４タンパク質およびマウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞で交互に免疫した。
【０１４５】
０日目のプライミング免疫、次いで７、１５、２２および２４日目の後続する４回の追加免疫を伴う２８日の免疫プロトコルを用いた。グループ１においては、等量の完全フロイントアジュバントおよびマウスＰ２Ｘ４タンパク質（総タンパク質：１００μｇ）を共に乳化し、ラットの２側に皮下送達した（２００μＬ／部位）。後続する３回の追加免疫注射においては、同量のタンパク質を用いて、フロイント不完全アジュバント中で乳化した。グループ２においては、マウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５×１０7個の細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁し、等量の完全フロイントアジュバントで乳化した。上記の通り、細胞をラットの２側に注射した（２００μＬ／部位）。後続する３回の追加免疫注射においては、同数の細胞を用いて、フロイント不完全アジュバント中で乳化した。グループ３においては、プライミング免疫では、上記のグループ１のようにマウスＰ２Ｘ４タンパク質、その後の３回の追加免疫では、マウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞、マウスＰ２Ｘ４タンパク質、およびマウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いた。
【０１４６】
最終追加免疫は２４日目に腹腔内に施し、グループ１およびグループ３のラットは、マウスＰ２Ｘ４タンパク質（トリス緩衝液中５０μｇ／ｍＬで４００μＬ）を受け、またグループ２のラットは、マウストランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞（５×１０7／ｍＬで４００μＬ）を受けた。
【０１４７】
尾静脈出血が、免疫前、初回免疫後１３日目、および２回目免疫後２０日目にラットから得られた。抗マウスＰ２Ｘ４に対するＩｇＧ力価を、細胞に基づくＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫測定法）アッセイにより測定した。
【０１４８】
細胞に基づくＤＥＬＦＩＡを用いてのマウスＰ２Ｘ４に対するラット免疫応答の評価
血清中のマウスＰ２Ｘ４に対するＩｇＧ力価を、ｍＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆおよび親ＨＥＫ細胞の双方を用いて、細胞に基づくＤＥＬＦＩＡにより測定した。血清中の抗ＨＥＫ２９３Ｆ細胞特異抗体を低下させるため、アッセイ前に細胞単独または交互タンパク質のいずれかおよび細胞による方法で免疫したラット由来の血清試料を、非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞とともにインキュベートした。タンパク質で免疫したラット由来の血清は、この予備吸着ステップなしにアッセイした。
【０１４９】
マウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞および親ＨＥＫ細胞を、ブラックコラーゲンでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート上の培地に３０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。５％ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で一晩インキュベーション後、培養上清を除去し、細胞を５０μＬ／ウェルでの３．７％ホルムアルデヒド溶液で固定した。その後のすべてのインキュベーションは室温で実施した。５分間固定後、ホルムアルデヒド溶液を廃棄し、２００μＬの３％ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳブロッキング緩衝液と交換した。１時間後、ブロッキング緩衝液を除去し、血清試料を３倍希釈系列（５０μＬ／ウェルで１：２００希釈から開始）で添加した。１時間インキュベートした後、ウェルを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を添加したＰＢＳで緩やかに３回洗浄した。次に、ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃγに特異的な二次抗体（ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳで１：５００に希釈）を５０μＬ／ウェルで添加した。さらに上記のように１時間のインキュベーションと３回の緩やかな洗浄の後、Ｅｕ−Ｎ１標識ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）をウェルに添加した（ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍＬに希釈、５０μＬ／ウェル）。３０分のインキュベーション時間後、ウェルを緩やかに５回洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液を添加した。反応を１０分間発生させておき、次にプレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０３多重標識プレートリーダーを用いて読み取った。各ウェルにおけるＴＲＦ（時間分解蛍光）シグナルを測定した（励起３４０ｎｍ、放射６１５ｎｍ）。
【０１５０】
マウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞および親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における血清適定曲線をプロットし、各々の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。マウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞で免疫したラットにおいては、マウスＰ２Ｘ４トランスフェクト細胞におけるＡＵＣ値から親ＨＥＫ細胞からのＡＵＣ値を差し引くことにより、特異的なｍＰ２Ｘ４  ＩｇＧ力価が得られた。
【０１５１】
モノクローナルラットＩｇＧの単離
最終追加免疫後４日目、リンパ節を無菌採取し、細胞を機械的破壊によって単離し、計数した。これらの細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と混合し、電気融合装置を用いて融合した。得られた融合物をメチルセルロースに基づく半固形培地と混合し、ＯｍｎｉＴｒａｙプレートに蒔いた。半固形培地は、ＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘおよびＤＭＥＭを含み、２０％ＦＣＳ、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびＯＰＩ培地添加物、２％ヒポキサンチンアザセリンおよびＦＩＴＣ結合型ヤギ抗ラットＩｇＧを添加した。半固形培地中の細胞は、５％ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で１３日間培養した。このインキュベーション期間中、クローンコロニーが単一の前駆ハイブリドーマ細胞から形成される。これらのコロニーは、半固形培地中に存在するＦＩＴＣ結合型抗ＩｇＧによりコロニー近傍で捕捉されるＩｇＧを分泌する。結果的に生じる免疫複合体の形成は、ＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬコロニーピッカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって可視化されるとき、蛍光「ハロー」として細胞周囲で認めることができる。次に、これらのハローを伴うコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに採取する。
【０１５２】
培養液中で３〜５日後、採取したコロニーの上清を回収し、細胞に基づく蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）でのアッセイによってマウスＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞および親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を比較することにより、マウスＰ２Ｘ４の特異性についてスクリーニングした。
【０１５３】
ラットＩｇＧのＤＮＡ配列決定
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から磁気オリゴ（ｄＴ）粒子を用いて抽出し、ｃＤＮＡに変換した。ポリＣおよび定常領域ＶH／ＶLプライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施した。
【０１５４】
ラットＩｇＧの精製
精製前、どのクローンがラットＩｇＧ２ａを分泌したかを判定するため、ハイブリドーマを、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡによって試験した。というのは、このアイソタイプがラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃアイソタイプに対する異なる精製マトリックスを用いて精製されるためである。
【０１５５】
細胞は、２４ウェルプレート内で増殖し、ＨｙｐｅｒＺｅｒｏおよびグルタミンを添加した血清フリーＨＬ−１培地中で過成長した。１０日後、上清を９６ウェルマスターブロックに移し、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃアイソタイプを、ＰｒｏＰｌｕｓ樹脂（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）を含有する２０μＬのＰｈｙｔｉｐｓ上で精製した。ラットＩｇＧ２ａ抗体は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｍｉｎｉｔｒａｃｋを用いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−Ｆｃ多種樹脂（Ｌｉｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するカスタムパックのＰｈｙｔｉｐｓ上で精製した。捕捉されたラットＩｇＧを、７５μＬの１００ｍＭヘペス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．０で溶出させ、次に等体積の２００ｍＭヘペス  ｐＨ８．０で中和させた。精製したＩｇＧを、ＵＶ−Ｓｔａｒ  ３８４ウェルプレート内で２８０ｎｍでの吸光度読み取りを用いて定量化した。
【０１５６】
ラットＩｇＧからヒトＩｇＧ１への再フォーマット化
以下の改良を伴うが本質的にＰｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｇｅｎｅ  １８７，９−１８）に記載のように、ラットＶHおよびＶLドメインならびにヒトＩｇＧ１定常ドメインを発現するキメラ構築物を作成するため、ラットハイブリドーマＩｇＧクローンを分子的に再フォーマットした。ＣＨＯ−一過性細胞での使用を促進し、またエピソーム複製を可能にするため、ＯｒｉＰ断片を発現ベクター内に含めた。哺乳類細胞内で全ＩｇＧ１重鎖を発現させるため、ＶHドメインを、ヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを有するベクター（ｐＥＵ１．４）にクローン化した。この定常領域は、エフェクターヌルヒトＩｇＧ１を生じる三重変異（ＴＭ）Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを有した（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４，７００−７０４）。同様に、哺乳類細胞内で全ＩｇＧ軽鎖を発現させるため、ＶLドメインを、ヒト軽鎖（λ）定常ドメインおよび調節エレメントの発現用のベクター（ｐＥＵ４．４）にクローン化した。ＩｇＧを得るため、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＣＨＯ−一過性哺乳類細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧは培地中に発現され、分泌された。回収物を精製前に濾過し、次にＩｇＧをプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。培養上清を、適切なサイズのＣｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｐａｌｌ２００７８−０３６）のカラム上に負荷し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。結合ＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出させ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加によって中和させた。溶出材料に対して、Ｎａｐ１０カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−０８５４−０２）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換し、ＩｇＧの濃度を、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づき、吸光係数を用いて分光光度的に測定した（Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４，２４１１−２３）。精製ＩｇＧを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度について分析した。
【０１５７】
実施例５：ファージディスプレイ選択からのヒトＰ２Ｘ４結合抗体の同定
実施例３に記載のファージディスプレイ法から同定したＳｃＦｖ抗体を、細菌中で発現させ、（ｓｃＦｖを含有する）未精製細菌ペリプラズム抽出物としてスクリーニングし、０．２Ｍヘペス緩衝液  ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍスクロースで調製した。あるいは、重鎖および軽鎖可変領域をＰＣＲにより増幅し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞においてヒトＩｇＧ１抗体としての発現用ベクターにクローン化した。
【０１５８】
細菌ｓｃＦｖ試料のスクリーニングのため、５μｌの細菌抽出物を３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６５５）に添加した。アッセイ緩衝液を、１×ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ＳｉｇｍａＨ８２６４）、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ＰＡＡ  Ｋ０５−０１３）、２０ｍＭヘペス（Ｇｉｂｃｏ１５６３０）および１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ（ＳｉｇｍａＡ６５３５）として調製し、細菌ｓｃＦｖ抽出物を有するアッセイプレートに５μｌを添加した。抗−ｍｙｃ検出試薬（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＭＣＡ２２００）および抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ６４９（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  １１５−４９５−０７１）を各々、同じ溶液中、１５．６ｎＭおよび２４ｎＭにアッセイ緩衝液で希釈し、ｓｃＦｖ試料を有するアッセイプレートに５μｌを添加した。ヒトＰ２Ｘ４（ｈｕＰ２Ｘ４）（Ｑ９９５７１、ＥＮＳＰ０００００３３６６０７）を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アッセイ緩衝液で２．６×１０5個の細胞／ｍｌに希釈し、１５μｌをアッセイプレートに添加した。同時に、ｓｃＦｖ試料の、ｈｕＰ２Ｘ４を発現しないＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合についても試験した。
【０１５９】
ＨＥＫ２９３Ｆに発現されるＩｇＧ試料のスクリーニングのため、２．５μｌの細胞培養上清を３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６５５）に添加した。アッセイ緩衝液を上記のように調製し、ＩｇＧ試料を有するアッセイプレートに７．５μｌを添加した。抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ２１４４５）を６ｎＭにアッセイ緩衝液で希釈し、ＩｇＧ試料を有するアッセイプレートに１０μｌを添加した。ｈｕＰ２Ｘ４（Ｑ９９５７１、ＥＮＳＰ０００００３３６６０７）を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アッセイ緩衝液で４×１０5個の細胞／ｍｌに希釈し、１０μｌをアッセイプレートに添加した。同時に、ＩｇＧ試料の、ｈｕＰ２Ｘ４を発現しないＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合性についても試験した。両タイプの試料をスクリーニングするためにセットアップしたアッセイプレートを、Ｔｏｐｓｅａｌプレートシーラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５２５０）で密封し、マイクロウェルの底に定着したビーズまたは細胞に局在化した蛍光を検出する蛍光に基づくプラットフォームである蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）で読み取る前の少なくとも４時間、室温でインキュベートした（Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２３：１７７−１８６（１９９６）、Ｍｉｒａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ４：１９３−２０４（１９９９））。ＦＭＡＴ分析ソフトウェアを用いてデータを分析し、蛍光として０〜１０，０００のＦＬ１カウント、典型的には０．１５〜０．４０の色および１０〜６０のサイズに基づいて事象をゲーティングした。各ウェルについてデータを報告する前に、２０事象の最小カウントを閾値として設定した。対照ＨＥＫ２９３Ｆ細胞ではなく、ＨＥＫ２９３Ｆ  ｈｕＰ２Ｘ４細胞への結合性を示すＳｃＦｖを、ＦＬ１カウントがｈｕＰ２Ｘ４細胞に対して１０００を超えるか否かをさらに試験するために選択し、２００を超えるＦＬ１カウントの特異的なｈｕＰ２Ｘ４結合シグナルを示すＩｇＧ試料をヒットとして同定し、さらに特徴づけた。
【０１６０】
未精製試料としてＨＥＫ２９３Ｆ  ｈｕＰ２Ｘ４細胞に特異的な結合シグナルを示すＳｃＦｖまたはＩｇＧ試料に対して、ＤＮＡ配列決定を施した（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．上記，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４）、（Ｏｓｂｏｕｒｎ  １９９６；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２，１８１−１９６）。固有のｓｃＦｖを細菌で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９４．９３１−９３７に記載の通り）。ヒトＰ２Ｘ４への結合性が確認されたそれらｓｃＦｖは、実施例４に記載のように、完全ＩｇＧとして作成し、発現させ、精製した。精製したＩｇＧ抗体は、電気生理学的アッセイにおける機能的活性について、またマウスおよびカニクイザルＰ２Ｘ４を発現する細胞への結合性について、精製したＩｇＧ試料の適定を用いた以外は、上記のヒトＰ２Ｘ４細胞について説明したのと同じ方法を用いて試験した。電気生理学的アッセイの結果を図３および図４に提供する。
【０１６１】
実施例６：マウスＰ２Ｘ４に特異的に結合するハイブリドーマＩｇＧの同定
ｍＰ２Ｘ４への特異的結合を有するＩｇＧを同定するため、免疫から作成した上清をスクリーニングした。つまり、上清は、アッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、２０ｍＭヘペスおよび１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ）に１０倍希釈し、５μｌをアッセイプレートに添加した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｓ）で標識した抗ラット検出抗体を６ｎＭに希釈し、１０μｌをアッセイプレートに添加した。ｍＰ２Ｘ４を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を２．６×１０5／ｍｌに希釈し、１５μｌをアッセイプレートに添加した。同時に、ＩｇＧ試料の非特異的結合性についても、試料のＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合について試験することによって試験した。ｍＰ２Ｘ４への特異的結合およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞への非結合を示すＩｇＧをヒットとして同定し、電気生理学による抗体精製および分析用に選択した。電気生理学的スクリーニングの結果を、前述と同じアッセイを用いた、ヒトおよびカニクイザルＰ２Ｘ４を発現する細胞株に対するこれらの試料における結合結果とともに、図７に提供する。
【０１６２】
実施例７：ヒトＰ２Ｘ４変異体の作成およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションによる発現
Ｐ２Ｘ４機能的抗体が結合するエピトープを判定するため、ヒトＰ２Ｘ４において、以下の突然変異、すなわちＥ９５Ｑ、Ｖ１０５Ｍ、Ｇ１１４Ｄ、Ａ１２２Ｖ、Ｓ１３１Ｎ、Ａ１５１Ｐ、Ｇ１５４Ｒ、Ｌ３０３Ｐ、Ｎ３０６Ｋを作成した。これらの改変を伴うｈｕＰ２Ｘ４配列を有するＤＮＡベクターを、標準の分子生物学技術を用いて作成した。ＤＮＡベクターは、２９３−ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２３４７０１９）を用いて製造業者のガイドラインに従い、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。ｈｕＰ２Ｘ４変異体を発現する細胞は、抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ２１４４５）検出試薬とともに、抗体番号１、１１、２９、および３３とともにインキュベートした。結合は、ＦＭＡＴプレートリーダーを用いて測定した。変異体Ｓ１３１Ｎは、抗体番号１１、２９、および３３の結合にとって重要であることが示された。図１Ａ〜１Ｄは、ＦＭＡＴアッセイの結果を示し、ヒトＰ２Ｘ４の変異体を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのＰ２Ｘ４抗体の結合を特徴づけている。
【０１６３】
実施例８：Ｐ２Ｘ４に対するモノクローナル抗体の電気生理学的特徴づけ
ファージディスプレイ由来ｍＡｂにおける方法：図３および図４
ヒトＰ２Ｘ４、マウスＰ２Ｘ４またはカニクイザルＰ２Ｘ４を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アキュターゼを用いて５０％の培養密度で採取した。次に細胞を、２〜３×１０6個の細胞／ｍｌの密度で、ヘペス（１０ｍＭ）＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰアーゼ／ＡＤＰアーゼ活性＝１）を添加した１０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ培地に再懸濁した。ポピュレーションパッチ配置での自動化された電気生理学プラットフォームＱＰａｔｃｈ  １６Ｘ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を用いて、Ｐ２Ｘ４機能をアッセイした。ＱＰａｔｃｈ細胞外緩衝液（ＱＥＢ）の組成は、（ｍＭで）ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（２）、ＭｇＣｌ2（１）ＣａＣｌ2（２）、ヘペス（１０）であった。コンパウンドプレート細胞外緩衝液（ＣＰＥＢ１）の最終組成は、ＮａＣｌ（１３７．６）、ＫＣｌ（２．２）、ＭｇＣｌ2（０．６６）、ＣａＣｌ2（１．３）、ヘペス（６．６）、ＫＨ2ＰＯ4（０．４９）、ＮａＨ2ＰＯ4（２．６６）であった。細胞外緩衝液のｐＨはＮａＯＨ（１Ｍ）で７．４に調整し、モル浸透圧濃度はスクロースで３００ｍＯｓｍに調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。コンパウンドプレート細胞外緩衝液に０．１％ウシ血清アルブミンを添加した。ＱＰａｔｃｈ細胞内緩衝液は、（ｍＭで）ＣｓＦ（１４０）、ＮａＣｌ（１０）、ＥＧＴＡ（１）、ヘペス（１０）を含有した。細胞内緩衝液のｐＨはＣｓＯＨ（１Ｍ）で７．３に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＩｇＧは、ＮａＯＨ（１Ｍ）でｐＨ７．４に滴定した。
【０１６４】
全細胞の立体配置を得た後、細胞を−５０ｍＶで電圧固定し、７０％の直列抵抗補償を用いた。ＣＰＥＢ１中のリガンド作動薬アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ、３μＭ）を２０分間、５分毎に３秒間適用し、４つの対照作動薬応答を得た。各作動薬応答は、ＣＰＥＢ１＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）で洗い落した。次に４つの追加的な作動薬応答を、試験ＩｇＧまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＮＩＰ２２８）の継続存在下で５分毎に測定した。ＩｇＧ適用の５分後に阻害性ＩｇＧの効果を示す代表的トレースを図８Ａ中に認めることができる一方、増強性ＩｇＧの例を図８Ｄ中に認めることができる。図３および図４中に示される電気生理学的データは、リガンドの不在下での電流を差し引くことによってリーク電流を除去し、Ｐ２Ｘ４応答の大きさはリガンドの存在下での内向き電流ピークとして測定した。ＩｇＧのインキュベーションから５分後のＩｇＧ＋ＡＴＰの存在下での内向き電流ピークは、４番目の対照ＡＴＰ応答の割合として表した。次いで、データは、方程式Ｉnorm＝ＩIgG*（１／Ｉisotype）（式中、ＩIgG＝試験ＩｇＧにおける対照電流の割合およびＩisotype＝アイソタイプ対照ＩｇＧにおける対照電流の割合）を用いてアイソタイプ対照抗体応答に一致させた時間および濃度に対して正規化した。６つのＩｇＧ；抗体番号５、８、１１、１８、２９、および３３が、ヒトＰ２Ｘ４電流を有意に阻害することを見出した（図３、４、８Ａ）。Ｐ２Ｘ４電流の阻害は迅速であり、ＩｇＧ添加後の最初の時点で生じる一方、アイソタイプ対照ＩｇＧ  ＮＩＰ２２８は有意な効果を有しなかった。引き続き、ＩｇＧのマウスおよびカニクイザルＰ２Ｘ４に対する機能について試験し（図３、図４）、データをｎ＝３〜４の実験の平均として報告した。
【０１６５】
ファージディスプレイ抗体における配列を図２に提供する。ヒト、カニクイザル、およびマウスの間でのファージディスプレイ抗体における交差反応性の結果を図３に提供する。図９は、エピトープ／パラトープ界面の構造分析を提供する。図１０は、予想されるＰ２Ｘ４エピトープの配列を提供する。
【０１６６】
ハイブリドーマ由来ｍＡｂにおける方法−図５、図７および図８
マウスＰ２Ｘ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＪＪＸ６）またはヒトＰ２Ｘ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９９５７１）のいずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アキュターゼを用いて５０％の培養密度で採取した。次に、細胞を、ヘペス（１０ｍＭ）＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰアーゼ／ＡＤＰアーゼ活性＝１）を２〜３×１０6個の細胞／ｍｌの密度で添加した１０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ培地に再懸濁した。ポピュレーションパッチ配置での自動化された電気生理学プラットフォームＱＰａｔｃｈ  １６Ｘ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を用いて、Ｐ２Ｘ４機能をアッセイした。ＱＰａｔｃｈ細胞外緩衝液（ＱＥＢ）の組成は、（ｍＭで）ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（２）、ＭｇＣｌ2（１）ＣａＣｌ2（２）、ヘペス（１０）であった。コンパウンドプレート細胞外緩衝液（ＣＰＥＢ２）の最終組成は、ＮａＣｌ（１１５．５）、ＫＣｌ（１．３）、ＭｇＣｌ2（０．６６）、ＣａＣｌ2（１．３２）、ヘペス（５６．１）であった。細胞外緩衝液のｐＨはＮａＯＨ（１Ｍ）で７．４に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＱＰａｔｃｈ細胞内緩衝液は、（ｍＭで）ＣｓＦ（１４０）、ＮａＣｌ（１０）、ＥＧＴＡ（１）、ヘペス（１０）を含有した。細胞内緩衝液のｐＨは、ＣｓＯＨ（１Ｍ）で７．３に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＩｇＧは、ＮａＯＨ（１Ｍ）でｐＨ７．４に滴定した。全細胞の立体配置を得た後、細胞を−５０ｍＶで電圧固定し、７０％の直列抵抗補償を用いた。ＱＥＢ中のリガンド作動薬アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）（マウスＰ２Ｘ４に対して６μＭ、ヒトＰ２Ｘ４に対して３μＭ）を３秒間適用し、次にＱＥＢ＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）で洗い落した。次に、ＣＰＥＢ２＋ＩｇＧを３分間インキュベートし、その後２回目のＡＴＰ添加を行った。データは、リガンドの不在下での電流を差し引くことによってリーク電流を除去し、Ｐ２Ｘ４応答の大きさはリガンドの存在下での内向き電流ピークとして測定した。ＩｇＧ添加後のＡＴＰ応答は、ＩｇＧ添加前のＡＴＰ応答の割合として表した。ｈＩｇＧ１  ＮＩＰ２２８ＴＭを、機能的抗体を限定するためのカットオフを測定するための対照抗体として用いた。ＩｇＧは、最初にｍＰ２Ｘ４で二通りにスクリーニングし（図５、最初のスクリーニングおよび図７）、ｎ＝１〜２の実験の平均として表した。対照抗体ＮＩＰ２２８ＴＭは、１．０８＋／−０．２７（平均＋／−標準偏差）、ｎ＝４９の対照電流の割合を有した。これらのデータから、機能的阻害抗体を限定するためのカットオフは、＜０．５（平均から＞約２の標準偏差）で設定した。最初のスクリーニングから得た機能的抗体については、より大規模な試料セット（ｎ＝３〜４）の場合で繰り返し、データは平均＋／−標準偏差として報告した（図５）。
【０１６７】
ヒトとマウスの間でのハイブリドーマ抗体における交差反応の結果を図５および図７に提供する。ハイブリドーマ抗体における配列を図６および図１３に提供する。
【０１６８】
実施例９：神経障害性疼痛のＳｅｌｔｚｅｒモデルにおけるＰ２Ｘ４に対するモノクローナル抗体のインビボ試験
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス５０匹を試験に用いた。すべてのマウスが、同定を目的として、試験開始の少なくとも５日前、トランスポンダーの挿入を受けた。機械的痛覚過敏を、鎮痛作用測定装置を用いて測定した（Ｒａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  １９５７）（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）。各後足の背側表面に順に、増加する力を離脱応答が認められるまで加えた。この時点で力の適用を停止し、重量をグラムで記録した。データは、同側足および他側足におけるグラムでの離脱閾値として表した。ベースライン読み取りが確立してから、マウスを、坐骨神経を部分的に結紮させる手術を受けるかまたは偽手術を受ける対照としての役割を担う、ほぼ等しい同側／他側比を有する２群に分けた。手術を受けるマウスはイソフルランで麻酔した。この後、左坐骨神経の約１ｃｍを、大腿中部レベルでの切開による鈍的切開によって露出させた。次に、縫合糸（９／０  Ｖｉｒｇｉｎ  Ｓｉｌｋ：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を背側の神経の３番を通過させ、きつく結んだ。次に、接着剤を用いて切開を閉じて、試験開始前の少なくとも６日間、マウスを回復させておいた。偽手術を受けるマウスは同じプロトコルを受けたが、神経の露出後、マウスを縫合し、回復させておいた。
【０１６９】
マウスは、手術後の７日目および１０日目、痛覚過敏の発症について試験した。８０％を超える同側／他側比を示す任意のマウスを非応答者として分類し、試験から除外した。１０日目の試験後、マウスを最終的な処置群：
Ａ．グループ１：偽手術＋ＮＩＰ２２８ＴＭ  ５μｇ／マウス、くも膜下腔内（Ｎ＝１０）
Ｂ．グループ２：神経結紮＋ＮＩＰ２２８ＴＭ  ５μｇ／マウス、くも膜下腔内（Ｎ＝１０）
Ｃ．グループ３：神経結紮＋抗体番号２０８  ５μｇ／マウス、くも膜下腔内（Ｎ＝１０）
Ｄ．グループ４：神経結紮＋抗体番号３８  ５μｇ／マウス、くも膜下腔内（Ｎ＝１０）
を示すグループにさらに細分化した。
【０１７０】
マウスに対して、ＮＩＰ２２８ＴＭ（アイソタイプ対照）または試験分子を１３日目に投与し、投与から４時間後、また投与後１、２、４および７日目、機械的痛覚過敏における変化について再試験した。投与においては、マウスはイソフルランで麻酔した。くも膜下腔内投与は脊髄のＬ４〜Ｌ６領域に手動で行い、ＮＩＰ２２８ＴＭおよび全試験化合物は、１．０２ｍｇ／ｍｌ＝溶液＝１μｇ／μｌ＝５μｇ／マウスとして供した。同側および他側の読み取り値は、各試験時刻に各動物に対して取得し、同側／他側比を算出するため、ＥＸＣＥＬに入力した。概略データは、グラフィカルおよび統計学的分析のため、ＰＲＩＳＭに移した。結果は、２元配置分散分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。ペアワイズ比較は、必要に応じて、テューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔ）を用いて行った。
【０１７１】
結果の分析によると、坐骨神経の部分的結紮が機械的痛覚過敏をもたらし、それが７日目および１０日目、偽手術を受けた対照と比べて同側／他側比の有意な低下として現れることが示された。ＮＩＰ２２８での処置後、手術を受けたマウスは、機械的痛覚過敏のレベルの投与前レベルからの変化を全く示さず、これはアイソタイプ対照の機械的痛覚過敏に対する効果の欠如を示した。抗体番号２０８の投与により、応答がベースラインレベルまで戻る投与後の最大で４日間有意であるという有意な逆転がもたらされた。抗体番号３８で同様の効果が見られた（図１３）。
【０１７２】
実施例１０：ハイブリドーマ技術によるマウス抗ヒトＰ２Ｘ４抗体の作成
マウス抗ヒトＰ２Ｘ４抗体を作成するための方法は、以下の違いを除き、ラット抗マウスＰ２Ｘ４抗体の作成に関して先のセクションに記載されたのと同じ方法で実施した。
【０１７３】
免疫
ヒトＰ２Ｘ４（ｈＰ２Ｘ４）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦおよびＸＳ６３細胞を、３つの群におけるＣＤ１マウスを免疫するために用いた。グループ１では、マウスをｈＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞で免疫し、グループ２マウスは、ｈＰ２Ｘ４トランスフェクトＸＳ６３細胞で免疫し、またグループ３マウスは、ｈＰ２Ｘ４トランスフェクトＸＳ６３細胞およびｈＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞により交互に免疫した。
【０１７４】
ｈＰ２Ｘ４トランスフェクト細胞は、１×１０8／ｍＬで再懸濁し、等量の完全フロイントアジュバントで乳化し、またマウスの両側に１００μＬ／部位注射した。その後の３回の注射においては、同数の細胞をフロイント不完全アジュバントで乳化し、上記のように注射した。最終の追加免疫は２４日目に行い、２００μＬのトランスフェクト細胞を１×１０8／ｍＬで腹腔内注射した。
【０１７５】
細胞に基づくＤＥＬＦＩＡを用いてのマウスのｈＰ２Ｘ４に対する免疫応答の評価
ｈＰ２Ｘ４に対する血清ＩｇＧ力価を、親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞およびｈＰ２Ｘ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いて、細胞に基づく時間分解蛍光アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）により測定した。
【０１７６】
モノクローナルマウスＩｇＧの単離
脾臓およびリンパ節から単離したリンパ球様細胞を、電気融合法を用いてＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合物をＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧを含有する半固形選択培地に蒔いた。
【０１７７】
マウスＩｇＧにおける細胞結合アッセイ
上清は、ｈＰ２Ｘ４に特異的に結合するＩｇＧについて、ｈＰ２Ｘ４を発現するＨＥＫ２９３ＦおよびＸＳ６３細胞の双方ならびに親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いて、最初にスクリーニングした。ｈＰ２Ｘ４に対する特異的結合性を示し、親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する結合性を全く示さないＩｇＧは、マウスＰ２Ｘ４（ｍＰ２Ｘ４）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対するさらなる特異性試験のために選択した。ｈＰ２Ｘ４またはｈＰ２Ｘ４およびｍＰ２Ｘ４の双方に特異的に結合するＩｇＧを、抗体精製および電気生理学による機能分析のために選択した。
【０１７８】
マウスＩｇＧのＤＮＡ配列決定および精製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をハイブリドーマ細胞から磁気オリゴ（ｄＴ）粒子を用いて抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。すべてのマウスＩｇＧサブクラスに特異的なポリＣおよび定常領域ＶHまたはＶLプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施した。
【０１７９】
すべてのサブクラスのマウスＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）は、ＰｒｏＰｌｕｓ樹脂（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）上に過成長した細胞培養上清から精製した。
【０１８０】
電気生理学による機能的スクリーニング
ヒトＰ２Ｘ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９９５７１）を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アキュターゼを用いて５０％の培養密度で採取した。次に、細胞は、ヘペス（１０ｍＭ）＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰアーゼ／ＡＤＰアーゼ活性＝１）を２〜３×１０6個の細胞／ｍｌの密度で添加した１０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ培地に再懸濁した。ポピュレーションパッチ配置での自動化された電気生理学プラットフォームＱＰａｔｃｈ  １６Ｘ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を用いて、Ｐ２Ｘ４機能をアッセイした。ＱＰａｔｃｈ細胞外緩衝液（ＱＥＢ）の組成は、（ｍＭで）ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（２）、ＭｇＣｌ2（１）ＣａＣｌ2（２）、ヘペス（１０）であった。コンパウンドプレート細胞外緩衝液（ＣＰＥＢ２）の最終組成は、ＮａＣｌ（１１５．５）、ＫＣｌ（１．３）、ＭｇＣｌ2（０．６６）、ＣａＣｌ2（１．３２）、ヘペス（５６．１）であった。細胞外緩衝液のｐＨはＮａＯＨ（１Ｍ）で７．４に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＱＰａｔｃｈ細胞内緩衝液は、（ｍＭで）ＣｓＦ（１４０）、ＮａＣｌ（１０）、ＥＧＴＡ（１）、ヘペス（１０）を含有した。細胞内緩衝液のｐＨは、ＣｓＯＨ（１Ｍ）で７．３に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＩｇＧは、ＮａＯＨ（１Ｍ）でｐＨ７．４に滴定した。全細胞の立体配置を得た後、細胞を−５０ｍＶで電圧固定し、７０％の直列抵抗補償を用いた。ＱＥＢ中のリガンド作動薬アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ、３μＭ）を３秒間適用し、次にＱＥＢ＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）で洗い落した。次に、ＣＰＥＢ２＋ＩｇＧを３分間インキュベートし、その後２回目のＡＴＰ添加を行った。データは、リガンドの不在下での電流を差し引くことによってリーク電流を除去し、Ｐ２Ｘ４応答の大きさはリガンドの存在下での内向き電流ピークとして測定した。ＩｇＧ添加後のＡＴＰ応答は、ＩｇＧ添加前のＡＴＰ応答の割合として表した。ｈＩｇＧ１  ＮＩＰ２２８ＴＭを、機能的抗体を限定するためのカットオフを測定するための対照抗体として用いた。結果を図２３に提供する。抗体配列を図１３に提供する。
【０１８１】
実施例１１：抗体１１の親和性成熟
抗体番号１１を、標的化またはランダム突然変異誘発のいずれかの２つの手法とその後の親和性に基づくファージディスプレイ選択を介して、親和性について最適化した。標的化手法では、（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２００４．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）記載の標準の分子生物学技術を用いて、可変重（ＶH）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および軽（ＶL）鎖ＣＤＲ３のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、リードクローン由来の大規模ｓｃＦｖ−ファージライブラリーを作成した。ヒトＰ２Ｘ４に対してより高い親和性を有する変異体を選択するため、ライブラリーに、親和性に基づくファージディスプレイ選択を施した。選択は、４回にわたる選択で固定化したヒトＰ２Ｘ４の濃度を低下させた（１０μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌ）点を除き、本質的に実施例３で先述の通りに実施した。改善された親和性を有する抗体は、（実施例１２に記載の）抗体１１のｈｕＰ２Ｘ４発現細胞への結合に基づく競合アッセイで同定した。さらに親和性を改善したものを作成するため、標準の分子生物学技術を用いて、改善された抗体からのＣＤＲ突然変異を新たなｓｃＦｖに組み換えた。
【０１８２】
抗体１１はまた、ヒトＰ２Ｘ４への結合を改善し得る全可変ドメイン内部の主要な残基を同定するため、ランダム突然変異誘発手法を用いて最適化した。かかる技法は、エラープローンＰＣＲを用いるＧｒａｍらによって記載がなされている［Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０］。一部の実施形態では、１つもしくは２つのアミノ酸置換が、ＣＤＲの全可変ドメインまたはセット内部でなされる。上で概説した標的化選択についての記載の通り、作成したライブラリーに親和性に基づく選択を施した。
【０１８３】
この選択法から得られる代表的な抗体を、抗体２８７〜３１５として本明細書で開示し、それらの配列のアラインメントを図１２に示す。
【０１８４】
実施例１２：ヒトＰ２Ｘ４に対して親和性がより高い抗体の同定
実施例１１に記載のファージディスプレイ選択による成果物（ｏｕｔｐｕｔｓ）を、抗体１１のｈｕＰ２Ｘ４発現細胞への結合に基づく競合アッセイで活性についてスクリーニングした。つまり、抗体１１のＩｇＧは、製造業者の使用説明書（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ）に従い、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０結合キットを用いて、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０で標識した。細菌によって発現されたｓｃＦｖを、原形質周囲（ｐｅｒｉ  ｐｌａｓｍｉｃ）抽出物として、０．２Ｍヘペス緩衝液  ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍスクロースに回収し、アッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ、０．１％ＢＳＡ、１Ｕ／ｍｌアピラーゼ、２０ｍＭヘペスを含むかまたは含まない）とともにアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６５５）に添加した。
【０１８５】
抗体１１−Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６５０を、バックグラウンド結合を明確化するのに用いられるウェル以外の各ウェルに最終濃度が２ｎＭになるまで添加した。ＨＥＫ２９３Ｆ  ｈｕＰ２Ｘ４細胞を、約２０００個の細胞／ウェルの最終密度で各ウェルに添加した。ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）プレートリーダー（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｌｔｄ）で読み取り、全ＦＬ３蛍光／ウェル（中央値（平均強度）蛍光に対象数を乗じたもの）を決定する前、プレートをカバーし、室温で２〜３時間インキュベートした。個別の事象はサイズおよび蛍光に対してゲーティングし、全ＦＬ３値を報告するのに十分な事象を有するウェルを決定するため、２５を超える最小対象数を用いた。％特異的結合は、以下の方程式を用いて各ウェルに対して算出し、最大全ＦＬ３値を、ｓｃＦｖを全く受けないが原形質周囲試料用緩衝液を確実に受けるウェルから定義した。
【数１】
2020018307.tif 000025
【０１８６】
結合シグナルが８５％より低い特異的結合の場合の試料を配列決定用に選択し、配列固有ヒットを精製ｓｃＦｖとして作成した。
【０１８７】
これらのｓｃＦｖ抗体の阻害を確認するため、精製ｓｃＦｖ抗体を上記のアッセイ緩衝液で希釈して希釈系列を作成し、また希釈した試料を、抗体１１−ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０の添加前、アッセイプレートに最終濃度が２ｎＭになるまで添加し、その後ウェルあたり約２０００個のＨＥＫ２９３Ｆ  ｈｕＰ２Ｘ４細胞を添加した。プレートを、ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）プレートリーダーで読み取る前に室温で２〜３時間インキュベートした。データは、上記のように分析し、阻害を示すｓｃＦｖクローンを完全ＩｇＧ抗体として作成した。
【０１８８】
実施例１３：ヒトＰ２Ｘ４  １３２１Ｎ１細胞株ＦＬＩＰＲ（登録商標）アッセイを用いてのヒトＰ２Ｘ４に対して改善された力価を有する抗体の同定
実施例１２に記載の抗体１１競合アッセイで同定された抗体を、精製ＩｇＧとして作成し、滴定して希釈系列を作成した。これらの抗体を、ＨＢＳＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するアッセイ緩衝液で希釈し、ｈｕＰ２Ｘ４を発現する１３２１Ｎ１細胞とともに３０分間予備インキュベートした（この場合、同細胞にＦｌｕｏ−４  ＮＷカルシウム色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って先行的に負荷していた）。Ｐ２Ｘ４を、アッセイ緩衝液で希釈した１μＭのＡＴＰの添加によって活性化し、得られた細胞内カルシウムの上昇をカルシウム色素によって検出し、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて蛍光の増加によって測定した。データを計算し、アッセイ期間中、バックグラウンド蛍光を超えて認められる最大蛍光を判定した。次に、これらのデータを分析し、以下の方程式を用いて、ＡＴＰを省く場合で、ウェル内で認められる緩衝液応答単独を超える％最大応答を判定した。
【数２】
2020018307.tif 000026
【０１８９】
データをＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）で分析し、以下の方程式を用いてＩＣ50値を判定した。
Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）*ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））
【０１９０】
抗体のランク付けを可能にするため、曲線のｔｏｐおよびｂｏｔｔｏｍを各々、１００および０に固定した。試験抗体におけるＩＣ50値の幾何平均を図１５に列挙し、２つの抗体におけるＩＣ50曲線の例を、アイソタイプ対照抗体とともに図１９に示す。
【０１９１】
実施例１４：自動化された電気生理学プラットフォームＱｐａｔｃｈ  １６Ｘ上のＨＥＫ２９３Ｆ  ｈｕＰ２Ｘ４細胞株を用いてのヒトＰ２Ｘ４に対して改善された力価を有する抗体の同定
ヒトＰ２Ｘ４を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、アキュターゼを用いて５０％の培養密度で採取した。次に、細胞を、２〜３×１０6個の細胞／ｍｌの密度で、ヘペス（１０ｍＭ）＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰアーゼ／ＡＤＰアーゼ活性＝１）を添加した１０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ培地に再懸濁した。ポピュレーションパッチ配置での自動化された電気生理学プラットフォームＱＰａｔｃｈ  １６Ｘ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を用いて、Ｐ２Ｘ４機能をアッセイした。ＱＰａｔｃｈ細胞外緩衝液（ＱＥＢ）の組成は、（ｍＭで）ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（２）、ＭｇＣｌ2（１）ＣａＣｌ2（２）、ヘペス（１０）であった。細胞外緩衝液のｐＨはＮａＯＨ（１Ｍ）で７．４に調整し、モル浸透圧濃度はスクロースで３００ｍＯｓｍに調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＱＰａｔｃｈ細胞内緩衝液（ＱＩＢ）は、（ｍＭで）ＣｓＦ（１４０）、ＮａＣｌ（１０）、ＥＧＴＡ（１）、ヘペス（１０）を含有した。細胞内緩衝液のｐＨは、ＣｓＯＨ（１Ｍ）で７．３に調整し、溶液は０．２μｍで濾過した。ＩｇＧは、ＮａＯＨ（１Ｍ）でｐＨ７．４に滴定した。
【０１９２】
抗体１１の最適化された変異体の力価を測定するため、ＩｇＧをＱＥＢ＋０．１％ウシ血清アルブミンで連続希釈し、ポピュレーションパッチ配置でのＱｐａｔｃｈ  １６Ｘ上で機能について試験した。細胞外緩衝液はＱＥＢであり、細胞内緩衝液はＱＩＢであり、ＡＴＰ洗浄用緩衝液はＱＥＢ＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）であった。このアッセイでは、ＡＴＰ（３μＭ）を、１０分毎に３秒間適用し、１実験あたり全部で５回適用した。最初の２回のＡＴＰ添加（ＡＴＰ１およびＡＴＰ２）に先立ち、ＱＥＢ緩衝液＋０．１％ＢＳＡとともに５分間予備インキュベートした一方、それに続く３回のＡＴＰ添加に先立ち、漸増用量のＩｇＧとともに５分間インキュベートした。６ポイントの用量応答曲線（用量範囲１００〜０．３ｎＭ）を作成するため、事後分析で対数および半対数用量のＩｇＧをインターリーブした。データはリガンドの不在下での電流を差し引くことによってリーク電流を除去し、Ｐ２Ｘ４応答の大きさはリガンドの存在下での内向き電流ピークとして測定した。ＡＴＰに応答した内向き電流ピークは、対照電流の割合として表し（ＡＴＰ２）、Ｉ／Ｉbasalと表示した。データは、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（勾配変化）（４パラメータ）方程式を用いてＰｒｉｓｍでフィットさせた。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）*ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））。ＩｇＧ用量応答曲線のｔｏｐは、０．３ｎＭのＮＩＰ２２８への応答によって画定し、この値に固定した。曲線のｂｏｔｔｏｍは、０より大きいように固定した。図１４〜１５を参照のこと。
【０１９３】
実施例１５  マウスおよびヒトＰ２Ｘ４でのハイブリドーマ由来抗体の力価測定
Ｐ２Ｘ４を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、実施例８のように処理した。ハイブリドーマ由来ＩｇＧの力価を、ポピュレーションパッチ配置でのＱｐａｔｃｈ  １６Ｘ上でアッセイした。ＩｇＧ力価の測定においては、ＩｇＧをＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミンで連続希釈し、ポピュレーションパッチ配置でのＱｐａｔｃｈ  １６Ｘ上で機能について試験した。次に、ＩｇＧをＱＥＢ＋０．１％ＢＳＡで１：３に希釈し、ＣＰＥＢ１に等価なＮａＣｌ（１３７．６）、ＫＣｌ（２．２）、ＭｇＣｌ2（０．６６）、ＣａＣｌ2（１．３）、ヘペス（６．６）、ＫＨ2ＰＯ4（０．４９）、ＮａＨ2ＰＯ4（２．６６）、ＢＳＡ（０．１％）の緩衝液の最終組成が得られた。細胞外緩衝液はＱＥＢであり、細胞内緩衝液はＱＩＢであり、ＡＴＰ洗浄用緩衝液はＱＥＢ＋アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）であった。このアッセイでは、ＡＴＰ（３μＭ）を、１０分毎に３秒間適用し、１実験あたり全部で５回適用した。最初の２回のＡＴＰ添加（ＡＴＰ１およびＡＴＰ２）に先立ち、ＣＰＥＢ１＋０．１％ＢＳＡとともに５分間予備インキュベートした一方、それに続く３回のＡＴＰ添加に先立ち、漸増用量のＩｇＧとともに５分間インキュベートした。６ポイントの用量応答曲線を作成するため、対数および半対数用量をインターリーブした。データはリガンドの不在下での電流を差し引くことによってリーク電流を除去し、Ｐ２Ｘ４応答の大きさはリガンドの存在下での内向き電流ピークとして測定した。ＡＴＰに応答した内向き電流ピークは、対照電流の割合として表した（ＡＴＰ２）。データは、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（勾配変化）（４パラメータ）方程式を用いてＰｒｉｓｍでフィットさせた。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）*ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））。ＩｇＧ用量応答曲線のｔｏｐは１に固定する一方、曲線のｂｏｔｔｏｍは０より大きいように固定した。図１６を参照のこと。
【０１９４】
実施例１６  天然マウスミクログリアＰ２Ｘ４でのマウス反応性抗体の有効性
マウスミクログリアの培養：
Ｃ５７新生児Ｐ２由来の初代マウスミクログリアを培養した。脳をマウスの頭蓋から取り除き、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中で維持した。次に、脳を、２０ｍｌの新しい培地中に配置し、単一の細胞懸濁液を得るように粉砕する前、粘着性の脈管構造および髄膜を除去するため、回転させながら濾紙を通過させた。次に、細胞を、４０μｍのセルストレーナーを通してフィルター滅菌し、次に１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、細胞を、Ｔ１７５フラスコあたり４つの脳での４０ｍｌの培地／フラスコに再懸濁し、１週間培養した。この後、培地にＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞をさらに１週間培養した。ミクログリアを、培地に添加したヘペス（２０ｍＭ）とともに回転式振盪培養機（ＣＯ2なし）で一晩振盪させることによって取り除いた。精製したミクログリアを、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ増殖培地に再懸濁した。細胞を計数し、超低結合Ｔ７５細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に７×１０6個の細胞／フラスコで播種した。次に、ミクログリアを、Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘ電気生理学的アッセイまたはＦＬＩＰＲカルシウムイメージングアッセイに用いる前、培地中で１〜７日間維持した。
【０１９５】
細胞処理用Ｑｐａｔｃｈ：
１×Ｔ７５フラスコをｄＰＢＳで２回洗浄し、５〜１０分間アキュターゼ処理を用いて細胞を採取した。次に、細胞を２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地＋２０ｍＭヘペス＋１Ｕ／ｍｌのアキュターゼ（１０ｍｌ）に再懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心沈殿した。次に、細胞を３ｍｌの２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地＋２０ｍＭヘペス＋１Ｕ／ｍｌのアキュターゼに再懸濁し、１ｍｌの細胞懸濁液を実験毎に用いた。
【０１９６】
Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘをポピュレーションパッチ配置で用いて、細胞を−７０ｍＶで電圧固定した。細胞を、ＡＴＰ（３０μＭ）を適用する前の５分間、対照抗体または試験抗体のいずれかとともに灌流した。ＡＴＰの不在下での電流を全データから差し引いた。ＡＴＰに応答する内向き電流を測定した（図１５を参照）。外部緩衝液はＱＥＢであり、内部緩衝液はＱＩＢであった。図１７および図１８を参照のこと。
【０１９７】
ＦＬＩＰＲ：
ミクログリアを、Ｃｅｌｌ  Ｃｏａｔポリ−Ｄ−リジンでコートした３８４ウェルプレート（黒、不透明）に３０μｌ／ウェルで蒔き、加湿インキュベーター内、３７℃で４８時間培養した。
【０１９８】
培地を除去し、製造業者の使用説明書に従い、Ｓｃｒｅｅｎ  Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｆｌｕｏ−８  Ｎｏ  Ｗａｓｈ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．）を添加した、２０ｕｌ／ウェルのＨＢＳＳ緩衝液＋２０ｍＭヘペス＋０．１％ＢＳＡと交換した。次に、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、次にＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）でのアッセイ前の１５分間、室温に戻した。イベルメクチン（１２μＭ）を、さらなる３８４ウェルのコンパウンドプレート（コンパウンドプレート１）内で作成した。ＩｇＧを、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（コンパウンドプレート２）内で作成した。ＡＴＰ（３０ｕＭ）を、別の３８４ウェルコンパウンドプレート（コンパウンドプレート３）内、ＨＢＳＳ＋２０ｍＭヘペス＋０．１％ＢＳＡ中で作成した。Ｆｌｕｏ−８を４７０〜４９５ｎｍの波長で励起させ、放射光を５１５〜５７５ｎｍの波長で測定した。カメラゲインを、０．４秒の露光で静止時１０００カウントを得るように調節した。コンパウンドプレート１からの１０ｕｌの溶液を細胞に添加し、蛍光を測定した。５分間のインキュベーション後、コンパウンドプレート２からの１０ｕｌの溶液を添加した。１５分後、ＡＴＰ（最終５ｕＭ）を添加し、蛍光のピークエンドをＡＴＰ添加後２００〜３００秒間に測定した。蛍光カウントを、抗体の不在下でのＡＴＰ応答に正規化し（バックグラウンド蛍光を減算）、ＡＴＰ応答の％としてプロットした（図２１を参照）。各ＩｇＧに対する１０ポイントの用量応答曲線を二連ウェルから構築し、データは、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（勾配変化）（４パラメータ）方程式を用いてＰｒｉｓｍでフィットさせた。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）*ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））。図２０を参照のこと。
【０１９９】
実施例１７：Ｐ２Ｘ４抗体のヒト単球由来マクロファージに対する機能的効果
細胞培養
ヒト単球を、フィコール・パック勾配での遠心分離により、末梢血の単核分画から単離した。次に、細胞を、Ｔ１７５細胞培養フラスコ内、血清の不在下での細胞培地中で１時間インキュベートすることによって精製した。非接着性細胞を取り除き、残存細胞を、１０％ＦＣＳ（ＨＩ／ＧＩ）＋１％Ｐ／Ｓ＋１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ培地中で７日間成長させた。２〜３日目、追加的な１０ｍｌの培地を添加することによって細胞を成長させた。マクロファージを１０分間のアキュターゼ処理によって採取し、次いで細胞をかき取り、超低結合Ｔ７５フラスコに６×１０6個の細胞／フラスコで再播種した。次に細胞を、電気生理学的記録用に用いる前、さらに１〜１０日間培養した。実験日に、細胞をアキュターゼを用いて採取し、３ｍｌのＣＨＯ  ＡＣＦ培地＋２０ｍＭヘペスに再懸濁した。１ｍｌの細胞懸濁液を、ポピュレーションパッチ配置でのＱｐａｔｃｈ  １６Ｘ上で実験毎に用いた。Ｑｐａｔｃｈ  １６Ｘのアッセイパラメータは、実施例１６に記載の通りであった。Ｎｉｐｐｏｎ拮抗剤は、１Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］［１，４］ジアゼピン−２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ジオン（特許：国際公開第２０１０／０９３０６１号パンフレットおよび欧州特許出願公開第２３９７４８０Ａ１号明細書に記載を指す。図２１および図２２を参照のこと。
【０２００】
他の実施形態
前述の説明から、本明細書に記載の本発明を様々な使用および条件に採用するように、それに対して変形および修飾を行ってもよいことは明らかになるであろう。かかる実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０２０１】
本明細書中の変数の任意の定義における要素のリストの記述は、列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての変数の定義を含む。本明細書中の実施形態の記述は、任意の単一の実施形態あるいは任意の他の実施形態またはその一部との組み合わせとしての実施形態を含む。
【０２０２】
本明細書中に記載のすべての特許および出版物は、あたかも各々の独立した特許および出版物が参照により援用されるように詳細かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
2020018307.tif 000035
【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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