(57)【要約】【課題】膜状部材の変位効率の増加による十分な駆動力を有し、かつ膜状部材の残留振動の短期化による液滴の生産性向上を実現できる液滴形成装置の提供。【解決手段】液体を保持する液体保持部と、吐出孔が形成された膜状部材と、前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置される液滴形成装置である。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を保持する液体保持部と、
吐出孔が形成された膜状部材と、
前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、
前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、
前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置されることを特徴とする液滴形成装置。
【請求項２】
２つ以上の加振手段が、それぞれ前記吐出孔を通る垂線を中心として外方に所定距離離間させて前記膜状部材に配置されている請求項１に記載の液滴形成装置。
【請求項３】
２つ以上の加振手段が、それぞれ前記吐出孔を通る垂線を中心として環状乃至枠状となるように前記膜状部材に配置されている請求項２に記載の液滴形成装置。
【請求項４】
前記駆動手段が、２つ以上の加振手段に、任意の駆動信号を選択的に印加する請求項１から３のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項５】
前記膜状部材が半径ｒの円形である場合、２つ以上の加振手段のうち一の加振手段を前記膜状部材の中心から１／２ｒよりも内側の領域に配置すると共に、他の加振手段を前記膜状部材の中心から１／２ｒよりも外側の領域に配置する請求項１から４のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項６】
前記駆動信号は、前記膜状部材の固有振動数を含んでいる請求項１から５のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項７】
前記液体保持部内の液量を検出する液量検出手段を有しており、前記駆動手段は、前記液量検出手段の検出結果に基づいて、免振波形を制御する請求項１から６のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項８】
各加振手段により発生させた前記膜状部材の変位ピークが重なるように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定する請求項１から７のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項９】
各加振手段により発生させた前記膜状部材の残留振動の変位ピークが打ち消し合うように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定する請求項１から８のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項１０】
前記吐出孔から吐出される液滴に含まれる粒子を計数する粒子数計数手段を有する請求項１から９のいずれかに記載の液滴形成装置。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の液滴形成装置を用いて液滴を形成することを特徴とする液滴形成方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の液滴形成装置を有することを特徴とする分注装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴形成装置、液滴形成方法、及び分注装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞をインクジェットで吐出して組織体を形成する技術の開発が行われている。
【０００３】
そのような中で、本願出願人は、先に、細胞を分散させた細胞懸濁液を吐出する液滴形成装置として、吐出孔が設けられた膜状部材をアクチュエータによって振動させることにより、膜状部材上の液体を吐出する装置を提案している（例えば、特許文献１参照）。この液滴形成装置は、液体を保持する液体保持部が大気開放されており、液滴の吐出に液体保持部における加圧力を用いることなく、膜状部材上の液体を直接飛翔させることが可能である。そのため、細胞懸濁液のような高表面張力の液体を用いた際にも、液体保持部内に残留した気泡による影響を受けることがなく、安定した吐出が可能である。
【０００４】
また、吐出孔を設けた膜状部材上に配置している圧電素子の圧電膜の上部電極端部と下部電極端部の間に段差を設けることにより、圧電膜に接している上部電極と下部電極の間の絶縁破壊を抑制し、圧電膜の剛性増加に伴う駆動効率の低下の抑制させる構成を有するインクジェット式記録ヘッドが提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、膜状部材の変位効率の増加による十分な駆動力を有し、かつ膜状部材の残留振動の短期化による液滴の生産性向上を実現できる液滴形成装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための手段としての本発明の液滴形成装置は、液体を保持する液体保持部と、吐出孔が形成された膜状部材と、前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、膜状部材の変位効率の増加による十分な駆動力を有し、かつ膜状部材の残留振動の短期化による液滴の生産性向上を実現できる液滴形成装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、２つ以上の加振手段の配置状態の一例を示す概略図であり、（Ａ）は初期、（Ｂ）は駆動時、（Ｃ）は曲げモーメント図をそれぞれ表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２つ以上の加振手段の配置状態の他の一例を示す概略図であり、（Ａ）は初期、（Ｂ）は駆動時、（Ｃ）は曲げモーメント図をそれぞれ表す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの液滴形成装置の膜状部材を下方から見た図である。
【図３Ａ】図３Ａは、一の加振手段に正電圧の正弦波を印加した場合の膜状部材の変位の状態を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、他の加振手段に正電圧の正弦波を印加した場合の膜状部材の変位の状態を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、加振手段の形状及び配置状態の一例を示す概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、加振手段の形状及び配置状態の他の一例を示す概略図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、加振手段の形状及び配置状態の他の一例を示す概略図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、加振手段の形状及び配置状態の他の一例を示す概略図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、加振手段の形状及び配置状態の他の一例を示す概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、加振手段への駆動信号の波形の一例を示す概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、加振手段への駆動信号の波形の他の一例を示す概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、加振手段への駆動信号の波形の他の一例を示す概略図である。
【図６Ａ】図６Ａは、各加振手段により発生させた膜状部材の変位ピークが重なるように各加振手段に印加する各振動記号を設定した場合の膜状部材の変位応答を示したグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、各加振手段により発生させた膜状部材の変位ピークが打ち消し合うように各加振手段に印加する各振動記号を設定した場合の膜状部材の変位応答を示したグラフである。
【図７】図７は、第２の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図８】図８は、第３の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図９】図９は、第３の実施形態に係る液滴形成装置の他の一例を示す概略図である。
【図１０】図１０は、第４の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図１１】図１１は、本発明の分注装置の一例を示す概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の分注装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、本発明の分注装置の動作の他の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（液滴形成装置及び液滴形成方法）
本発明の液滴形成装置は、液体を保持する液体保持部と、吐出孔が形成された膜状部材と、前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置され、更に必要に応じてその他の手段を有する。
本発明の液滴形成方法は、本発明の液滴形成装置を用いて液滴を形成する。
【００１０】
従来の液滴形成装置では、液滴を形成する際には単一の加振手段を用いて膜状部材を振動させていた。加振手段として単一の圧電素子を用いる場合、膜状部材の変位量は圧電素子に印加可能な最大駆動電圧に依存するため、単一の圧電素子を用いると膜状部材を変位させるための十分な駆動力が発生できない（「膜状部材の変位効率が低い」）という問題が生じる。一方、単位時間当たりの液滴形成回数を増加させる際、液滴形成後に生じる膜状部材の残留振動を抑制するための抑制信号を印加する必要がある。しかし、加振手段が単一の場合、液滴を形成する吐出信号の出力が終了してから抑制信号の出力が開始するまでにインターバル時間を設ける必要がある。このため、膜状部材の残留振動が長期化するという「膜状部材の残留振動の長期化」という問題がある。
【００１１】
したがって、本発明の液滴形成装置は、液体を保持する液体保持部と、吐出孔が形成された膜状部材と、前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置され、好ましくは、前記駆動手段が、２つ以上の加振手段に、任意の駆動信号を選択的に印加して、各加振手段で発生させる振動の位相、振幅、周期を制御することにより、膜状部材の変位効率の増加による十分な駆動力が得られ、液体選択性が拡大し、かつ膜状部材の残留振動の短期化による液滴の生産性向上を実現することができる。
【００１２】
本発明の液滴形成装置は、液体保持部と膜状部材と加振手段とを備えた液滴吐出手段と、駆動手段とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
【００１３】
＜液滴吐出手段＞
液滴吐出手段は、液体保持部と、膜状部材と、加振手段とを有し、更に必要に応じてその他の部材を有することが好ましい。
液滴吐出手段としては、オープンヘッド、及びクローズヘッドのいずれであっても構わない。
【００１４】
＜＜液体保持部＞＞
液体保持部は、液体を保持する部である。
液滴吐出手段がオープンヘッドの場合には、大気開放部を上部側に有している。なお、大気開放部の位置は上部に限定されない。液体中に混入した気泡は大気開放部から排出可能に構成されている。
液体保持部の形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
液体保持部の材質としては、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどが挙げられる。
これらの中でも、粒子として細胞やタンパク質を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることが好ましい。
細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミックス（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
これら以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることもでき、例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることなどが挙げられる。
【００１５】
＜＜膜状部材＞＞
膜状部材は、吐出孔（ノズル）が形成され、液体保持部に保持された液体をその振幅運動による振動により吐出孔から液滴として吐出する部材である。
膜状部材は、液滴吐出手段がオープンヘッドの場合には、液体保持部の下端部に固定されている。
膜状部材は、液滴吐出手段がクローズヘッドの場合には、液体保持部の上端部に固定されている。
液体保持部に保持された液体は、膜状部材の振動により貫通孔である吐出孔から液滴として吐出される。
【００１６】
膜状部材の平面形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
膜状部材の平面形状としては、例えば、円形、楕円形、長方形、正方形、菱形などが挙げられる。
膜状部材の材質としては、柔らかすぎると膜状部材が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さを有する材質を用いることが好ましく、例えば、金属、セラミックス、高分子材料などが挙げられ、具体的には、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどが挙げられる。これらの中でも、上記液体保持部と同様に、粒子として細胞やタンパク質を用いる場合には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることが好ましい。
【００１７】
−吐出孔−
吐出孔としては、その配列数、配列態様、間隔（ピッチ）、開口形状、開口の大きさなどについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
吐出孔の配列数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴吐出手段の吐出面の長さ方向に沿って１列以上設けることが好ましく、１列以上４列以下がより好ましい。吐出孔を１列以上設けることにより、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができると共に、粒子の種類（例えば、細胞の種類など）応じて列を変えて一度に吐出することができる。
１列当たりの吐出孔の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択されるが、２個以上１００個以下が好ましく、２個以上５０個以下がより好ましく、２個以上１２個以下が更に好ましい。１列当たりの吐出孔の数が２個以上１００個以下であると、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができる高い生産性を有する液滴形成装置を提供することができる。
吐出孔の配列態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、規則配列（例えば、千鳥格子配列など）であっても、不規則配列であってもよい。
吐出孔が、複数列である場合には、隣接する吐出孔から吐出される液滴同士の干渉を防止し、粒子の検出感度を向上させるため、各列の間に仕切り部材を設けることが好ましい。仕切り部材としては、例えば、仕切り板などが挙げられる。
吐出孔は、等間隔に並んで配列されていることが好ましく、隣接する吐出孔の中心間の最短距離である間隔（ピッチ）Ｐとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、５０μｍ以上１,０００μｍ以下が好ましい。
吐出孔の開口形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円形、四角形などが挙げられる。
吐出孔の平均径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子が吐出孔に詰まることを避けるため、粒子の大きさの２倍以上とすることが好ましい。
粒子が、例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは、一般的に、５μｍ以上５０μｍ以下であるため、吐出孔の平均径は、使用する細胞に合わせて、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると、微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、吐出孔の平均径は、２００μｍ以下が好ましい。したがって、吐出孔の平均径は、１０μｍ以上２００μｍ以下がより好ましい。
【００１８】
＜＜加振手段＞＞
加振手段は、膜状部材を振動させて吐出孔（ノズル）から液滴を吐出させる。
加振手段は、液滴吐出手段がオープンヘッドである場合には、膜状部材の下面側（吐出面側）に形成されている。
加振手段は、液滴吐出手段がクローズヘッドである場合には、膜状部材の上面側（非吐出面側）に形成されている。
【００１９】
加振手段は、「膜状部材の変位効率の増加」及び「膜状部材の残留振動の短期化」を実現するため、２個以上設けられており、２個以上１０個以下設けられていることが好ましく、２個以上５個以下設けられていることがより好ましく、駆動手段や配線等の作製方法の簡易化の点から、２個が特に好ましい。
２つ以上の加振手段は、それぞれ吐出孔を通る垂線を中心として外方に所定距離離間させて膜状部材に配置されていることが、「膜状部材の変位効率の増加」及び「膜状部材の残留振動の短期化」を図る点から好ましい。
２つ以上の加振手段は、それぞれ吐出孔を通る垂線を中心として環状乃至枠状となるように膜状部材に配置されていることが、「膜状部材の変位効率の増加」及び「膜状部材の残留振動の短期化」を図る点から好ましい。
【００２０】
２つ以上の加振手段の配置に関して、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、膜状部材１２の曲げモーメントの極性（＋／−）が異なる領域、つまり、曲げモーメントの極性（＋／−）転換ライン２１を挟んで＋側の領域、−側の領域それぞれに配置することが好ましい。このように配置することで、各加振手段で発生させる膜状部材の変位方向を変えることができるため、各加振手段を適切なタイミングで個別駆動させることができる。これにより、膜状部材の変位を、高い変位効率と高い免振効果が得られる状態に制御することができる。
膜状部材１２が半径ｒの円形である場合、２つ以上の加振手段のうち１つの加振手段を膜状部材の中心から略（１／２）ｒよりも内側の領域に配置すると共に、他の加振手段を膜状部材の中心から略（１／２）ｒよりも外側の領域に配置することが好ましい。ここで、略（１／２）ｒとは（１／２）ｒ近傍のラインを指し、より具体的には、（２／５）ｒから（３／５）ｒに渡るエリアに存在するラインを指す。膜状部材の厚みムラや材質ムラにより、曲げモーメントの極性（＋／−）転換ライン２１が前記範囲において変動し得る。このように曲げモーメントの極性（＋／−）転換ライン２１を挟んで内側と外側のそれぞれの領域に加振手段を配置することにより、各加振手段で発生させる膜状部材１２の変位方向を変えることができるため、各加振手段を適切なタイミングで個別駆動させることにより、膜状部材の変位効率を増加させ、残留振動を短期化させるように制御することができる。
【００２１】
各加振手段により発生させた膜状部材の変位ピークが重なるように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定することが好ましい。これにより、各加振手段により発生させる振動の変位ピークを重ねることにより、波の重ね合わせの原理に基づき、膜状部材のより高い変位効率を得られるという効果がある。
各加振手段により発生させた膜状部材の残留振動の変位ピークが打ち消し合うように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定することが好ましい。これにより、各加振手段により発生させる膜状部材の残留振動の変位ピークを打ち消し合うように重ねることにより、波の重ね合わせの原理に基づき、膜状部材のより高い免振効果が得られるという効果がある。
【００２２】
加振手段としては、圧電素子が好適に用いられる。圧電素子としては、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって膜の面横方向に圧縮応力が加わり、膜状部材を膜の面上下方向に振動させることができる。
圧電材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、又はこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたものなどが挙げられる。これらの中でも、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）が好ましい。
【００２３】
＜駆動手段＞
駆動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段が圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである場合、液滴吐出手段に駆動電圧を入力する手段などが挙げられる。この場合、駆動手段が圧電素子を変形させることにより微小な液滴を吐出させることができる。
駆動手段は、２つ以上の加振手段に、任意の駆動信号を選択的に印加する。これにより、各加振手段で発生させる振動の位相、振幅、周期を制御することにより、膜状部材の変位量を増加させたり、残留振動を抑制させたりすることが可能となる。
駆動信号は、膜状部材の固有振動数を含んでいることが好ましい。これにより、液滴形成装置は、膜状部材の共振を励起することにより、高い駆動効率が得られるという効果がある。
【００２４】
＜＜液体＞＞
液体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粒子懸濁液、高粘度インクなどが挙げられる。
粒子懸濁液としては、例えば、細胞懸濁液が好ましい。
【００２５】
＜＜液滴＞＞
液滴は、粒子を含むことが好ましい。
液滴中に含まれる粒子の個数は、１個以上が好ましく、１個以上５個以下がより好ましい。
液滴の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５μｍ以上１５０μｍ以下が好ましい。液滴の直径が２５μｍ以上であると、内包する粒子の直径が適正となり、適用できる粒子の種類が多くなる。また、液滴の直径が１５０μｍ以下であると、液滴の吐出が安定となる。
また、液滴の直径をＲとし、粒子の直径をｒとすると、Ｒ＞３ｒであることが好ましい。Ｒ＞３ｒであると、粒子の直径と液滴の直径との関係が適正であり、液滴の縁の影響を受けることがないため、粒子の計数精度が向上する。
液滴の液量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１,０００ｐＬ以下が好ましく、１００ｐＬ以下がより好ましい。
液滴の液量は、例えば、液滴の画像から液滴の大きさを求め、液量を算出する方法などにより測定することができる。
【００２６】
液滴に含まれる粒子としては、例えば、金属微粒子、無機微粒子、細胞などが挙げられる。これらの中でも、細胞が好ましい。
【００２７】
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２８】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましく、ヒト由来の細胞がより好ましい。
【００２９】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００３０】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【００３１】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【００３２】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００３３】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、容器内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【００３４】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
【００３６】
細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御して被着対象物に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【００３７】
−−光を受光したときに発光可能な細胞−−
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【００３８】
−−−蛍光色素−−−
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
【００３９】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【００４０】
−−−蛍光タンパク質−−−
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
−−−蛍光標識抗体−−−
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４２】
細胞は、特定の核酸を有することが好ましい。特定の核酸を有する細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
−−−特定の核酸−−−
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない核酸、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、特定の核酸としては、プラスミドも好適に使用することができる。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味する。
【００４４】
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。これらの中でも、ノロウイルスなどの感染症固定領域に由来するＲＮＡに対応するＤＮＡ、自然界に存在しないＤＮＡなどが好適に用いることができる。
【００４５】
特定の核酸を有する複数の細胞は、使用する細胞由来の特定の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された特定の核酸であってもよい。特定の核酸として、遺伝子導入により導入された特定の核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの特定の核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの特定の核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサー、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。
【００４６】
遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が狙いの場所に狙いの分子数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎなどが挙げられる。特に、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【００４７】
金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、銀粒子、銅粒子などが挙げられる。これらは吐出した液滴によって配線を描画する用途に用いることができる。
【００４８】
無機微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化ケイ素等が白色インクとしての用途やスペーサ材料の塗布用途等で用いられる。
【００４９】
粒子が凝集する場合には、粒子を含む液体の粒子の濃度を調整することにより、液体中の粒子の濃度と、液体中の粒子の個数とがポアソン分布に従う理論から、液体中の粒子の個数を適宜調整することができる。
液体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水、蒸留水、純水、生理食塩水、アルコール、鉱物油、植物油等の様々な有機溶媒を用いることができる。
溶媒として水を使用する際には、水分の蒸発を抑えるための湿潤剤や、表面張力を下げるための界面活性剤が含まれていることが好ましい。これらの処方には、インクジェットインクに用いられるごく一般的な材料を用いることができる。
【００５０】
＜液量検出手段＞
液滴形成装置は、液体保持部内の液量を検出する液量検出手段を有しており、液量検出手段の検出結果に基づいて、駆動手段は免振波形を制御することが好ましい。
液量検出手段を設けることにより、液体保持部内の液量の増減に伴い膜状部材の固有振動数が変化しても、液量を検出して、固有振動数の変化に合わせた免振波形を入力できるため、安定した駆動効率が得られる。
液量検出手段を用いた液量検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）液体保持部の内壁面の深さ方向に複数の電極を設け液体として導電性の液を用い、複数の電極間の導通又は抵抗値を調べることにより液量を検出する方法、（２）液体保持部の上方に光学センサを設け、該光学センサから射出された光が液面で反射し、その反射光を受光することにより、発射光と反射光の位相差から、液面までの距離を算出する方法などが挙げられる。
【００５１】
＜粒子数計数手段＞
粒子数計数手段は、液滴に含まれる粒子を計数する手段であり、液滴の吐出後、かつ液滴の被着対象物への着弾前に、液滴に含まれる粒子数をセンサによって計数する手段であることが好ましい。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
【００５２】
粒子数計数手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に粒子を観測する処理、着弾後の粒子をカウントする処理を含んでもよい。
【００５３】
液滴の吐出後、かつ液滴の被着対象物への着弾前に、液滴に含まれる粒子数の計数としては、液滴が被着対象物としてのプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の粒子を観測することが好ましい。
【００５４】
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられる穴が形成されたものを用いることが可能である。
プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
ウェルの数が複数であるプレートとしては、ウェルの数が２４個、９６個、３８４個など業界において一般的な個数及び寸法で穴が形成されたものを用いることが好ましい。
プレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後の処理のために、細胞や核酸の壁面への付着が抑制されているものを用いることが好ましい。
【００５５】
液滴中の粒子を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出する方法などが挙げられる。
【００５６】
＜その他の手段＞
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、たとえば、光照射手段、受光手段、表示手段、制御手段などが挙げられる。
【００５７】
−光照射手段−
光照射手段は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。
光照射手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザーなどが挙げられる。
固体レーザーとしては、例えば、ＹＡＧレーザー、ルビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。
ＹＡＧレーザーの市販品としては、例えば、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ（スペクトラ・フィジックス株式会社製）などが挙げられる。
レーザーのスポット径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００μｍ以上２,０００μｍ以下が好ましい。スポット径が１００μｍ以上２,０００μｍ以下であると、飛翔液滴の吐出ばらつきが発生した場合においても液滴にレーザーが照射される確率が高くなるため、液滴内の粒子のカウント精度低下を抑制可能であるという利点がある。
光照射手段から照射される光は、パルス光であることが好ましい。これにより、液滴中の粒子数のカウント精度を向上させることができる。
パルス光のパルス幅としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。
単位パルスあたりのエネルギーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、集光の有無等の光学系に大きく依存するが、０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【００５８】
光照射手段は、飛翔中の液滴に光を照射する。なお、飛翔中とは、液滴が吐出されてから、被着対象物に液滴が着滴するまでの状態を指す。
光照射手段としては、液滴の吐出に同期して光を照射できることが好ましい。これにより、異なる位置から吐出された液滴に、光をより確実に照射することができる。
ここで、同期するとは、液滴が吐出されて所定位置に達したときに光照射手段が光を照射することを意味する。つまり、光照射手段は、液滴の吐出に対して、所定時間だけ遅延して光を照射する。
光照射手段から照射される光は、飛翔中の液滴１つに照射されることが好ましい。
【００５９】
−受光手段−
受光手段は、光を照射された粒子からの発光を受光する手段である。
受光手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一次元素子、二次元素子を有するカメラなどが挙げられる。これらの中でも、二次元素子を有するカメラが好ましい。受光手段が二次元素子を有するカメラであると、発光の輝度値のみならず、発光の受光面における形状を得やすい点で有利である。
【００６０】
一次元素子としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサなどが挙げられる。これらの中でも、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードが好ましい。一次元素子が光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードであると、高感度な測定が可能となる。
二次元素子としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）撮像素子、ゲートＣＣＤなどが挙げられる。
受光手段としては、ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラが好ましい。
ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラの市販品としては、例えば、高感度カメラ（ｐｃｏ．ｅｄｇｅ、ｓＣＭＯＳ、株式会社東京インスツルメンツ製）などが挙げられる。
【００６１】
受光手段は、飛翔中の液滴に光を照射されたときに発光可能な粒子が含有されていた場合に、粒子が光を励起光として吸収して発する蛍光を受光する。蛍光は、粒子から四方八方に発せられるため、受光手段は粒子からの発光を受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光照射手段から出射される光が直接入射しない位置に受光手段を配置することが好ましい。
【００６２】
受光手段を２個以上備えていることが好ましく、それぞれの受光手段が異なる方向から粒子からの発光を受光することが好ましい。２個以上の受光手段を有することにより、１つの受光手段により発光が重なった状態を受光した場合であっても、他の受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、他の受光手段により受光された発光に基づいて、液滴に含まれる粒子を精度よく計数することができる。
【００６３】
発光は、光が照射されたときに発光可能な粒子から四方八方に発せられるため、２個以上の受光手段は、光が照射されたときに発光可能な粒子から異なる方向に発せられる発光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、光が照射されたときに発光可能な粒子から異なる方向に発せられる発光を受光できる位置に３個以上の受光手段を配置してもよい。また、各受光手段は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
受光手段が１個であると、飛翔する液滴に複数個の光が照射されたときに発光可能な粒子が含まれる場合に、光が照射されたときに発光可能な粒子同士が重なることに起因して、粒子数計数手段が液滴に含有された光が照射されたときに発光可能な粒子の個数を誤検出する（カウントエラーが発生する）おそれがあるが、受光手段を２個以上設けることで光が照射されたときに発光可能な粒子が重なる影響を低減することが可能である。
後述する粒子数計数手段としては、光が照射されたときに発光可能な粒子の輝度値あるいは面積値と、予め設定された閾値とを比較することで実行可能である。受光手段を２個以上設置する場合、それぞれの受光手段から得られる輝度値あるいは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である（粒子の重なりが生じた場合、輝度値及び面積値のいずれも低減する結果となるため）。また、二次元受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、粒子数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
【００６４】
光を照射された粒子からの発光は、粒子から全方位に発せられる。このため、２個以上の受光手段としては、発光を受光可能な位置に配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、それぞれの受光方向とのなす角が０°とならない位置に配されることが好ましい。発光の重なりが少ない状態の情報が得られる点で有利である。
【００６５】
２個以上の受光手段が２個の受光手段である場合、一の受光手段は、その受光方向が他の受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配することが好ましい。これにより、一の受光手段及び他の受光手段を用いた場合、一の受光手段及び他の受光手段により受光した情報のうち、いずれかの情報を選択する際に、発光の重なりが少ない状態の情報を選択できる。なお、略直交とは、８０°以上１００°以下を意味する。
【００６６】
上記の２個の受光手段以外の受光手段における受光方向としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。受光手段が２個以上の場合、２個以上の受光手段を同一平面上に位置するように配するとき、隣り合う受光手段の受光方向がなす角を、受光手段の個数で３６０°を等分した角度になるようにすることが好ましい。例えば、３個の受光手段を同一平面上に位置するように配するときは、隣り合う受光手段の受光方向をそれぞれ１２０°となる位置するように配することが好ましい。
【００６７】
受光手段は、その受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配することが好ましく、すべての受光手段がその受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配することがより好ましい。これにより、受光手段の位置を調整しやすくすることができ、液滴形成装置の構造が複雑にならない点で有利である。
なお、コントラストを向上するため、光照射手段から出射される光が直接入射しない位置に受光手段を配置することが好ましい。
【００６８】
受光手段としては、複数の液滴の吐出に同期して発光を受光できることが好ましい。これにより、異なる位置から吐出された複数の液滴に、光照射手段から光が照射され、粒子からの発光をより確実に受光することができる。
なお、ここで、「同期する」とは、例えば、複数の液滴が吐出されて所定位置に達したときに液滴に光が照射され、光が照射されたときに発光可能な粒子が発光するタイミングで、受光手段が発光を受光することを意味する。つまり、受光手段は、異なる位置からの複数の液滴の吐出、及び光照射手段による光の照射に対して、それぞれ所定時間だけ遅延して発光を検出する。
【００６９】
−表示手段−
出力手段としては、ディスプレイやスピーカーなどを用いることができる。ディスプレイとしては、特に制限はなく、適宜公知のものを用いることができ、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなどが挙げられる。
【００７０】
−制御手段−
制御手段としては、液滴形成装置全体の動作を制御し、例えば、各種ソフトウェアやプログラムなどを備えたコンピュータなどが挙げられる。
【００７１】
ここで、本発明の液滴形成装置の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状などにすることができる。
【００７２】
＜第１の実施形態＞
図２Ａは、本発明の第１の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。図２Ｂは、図２Ａの液滴吐出手段の膜状部材を下方から見た図である。
この図２Ａの液滴形成装置１００は、液滴吐出手段１０、及び駆動手段２０を有している。
【００７３】
液滴吐出手段１０は、本実施形態ではオープンヘッドであり、液体保持部１１と、吐出孔１４が形成され、液体保持部１１に保持された液体１５を２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂの加振により吐出孔１４から液滴として吐出する膜状部材１２とを有する。
液体保持部１１は、液体１５を保持し、本実施形態では液滴吐出手段１０がオープンヘッドであるため、上部に大気開放部１８を有している。この大気開放部１８から、液体１５中に混入した気泡を排出可能である。
【００７４】
加振手段１３Ａ、１３Ｂは、本実施形態では、液滴吐出手段１０がオープンヘッドであるため、膜状部材１２の下面に２つ配置されている。
加振手段１３Ａ、１３Ｂは、それぞれ吐出孔１４を通る垂線を中心として外方に所定距離離間させて膜状部材１２に配置されており、吐出孔を通る垂線を中心として環状に配置されていることが、「膜状部材の変位効率の増加」及び「膜状部材の残留振動の短期化」を図る点から好ましい。
具体的には、図２Ｂに示すように、２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂは、膜状部材１２の曲げモーメントの極性（＋／−）が異なる領域、つまり、曲げモーメントの極性（＋／−）転換ライン２１を挟んで＋側の領域、−側の領域それぞれに配置することが好ましい。このように配置することで、各加振手段で発生させる膜状部材の変位方向を変えることができるため、各加振手段を適切なタイミングで個別駆動させることにより、膜状部材の変位効率を増加させ、残留振動を短期化させるように制御することができる。図２Ｂ中２２は膜状部材端部である。
図２Ｂに示すように、加振手段１３Ｂと加振手段１３Ａを配置した場合、加振手段１３Ｂに正電圧の正弦波を印加すると図３Ａに示すように、膜状部材が吐出方向（グラフのｙ軸負方向）に変位する。一方、加振手段１３Ａに正電圧の正弦波を印加すると図３Ｂに示すように、膜状部材が液体保持部方向（グラフのｙ軸正方向）に変位する。
したがって、２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂに個別に任意の駆動信号を印加して、「波の重ね合わせの原理」に基づいて膜状部材の変位状態を制御することにより、液滴形成に対して重要な駆動開始直後の変位量を増大させたり、液滴形成後の残留振動を迅速に免振させることが可能になる。
【００７５】
ここで、図６Ａ及び図６Ｂは、具体的な液滴吐出手段の駆動信号について説明する図である。
各加振手段１３Ａ、１３Ｂにより発生させた膜状部材１２の変位ピークが重なるように、各加振手段１３Ａ、１３Ｂに印加する各駆動信号を設定する。例えば、図２Ｂのように加振手段１３Ａ、１３Ｂを配置した場合、図３Ａと図３Ｂの変位応答の変位ピークが重なり強め合うように印加波形を設定すると、膜状部材の変位応答は図６Ａに示すように振幅が増大する。
【００７６】
一方、各加振手段１３Ａ、１３Ｂにより発生させた膜状部材１２の変位ピークが打ち消し合うように、各加振手段１３Ａ、１３Ｂに印加する各駆動信号を設定する。例えば、図２Ｂに示すように加振手段１３Ａ、１３Ｂを配置した場合、図３Ａと図３Ｂの変位応答の変位ピークが重なり弱め合うように印加波形を設定すると、膜状部材１２の変位応答は図６Ｂに示すように残留振動が抑制される。
【００７７】
加振手段の形状及び大きさは、膜状部材１２の形状及び大きさに合わせて設計することができ、例えば、図４Ａ〜図４Ｅに示すようなものが挙げられる。加振手段の形状は、図４Ａのように円環状（リング状）のものを使用することもできるし、図４Ｅの楕円状、図４Ｂの四角形の枠、図４Ｃの長方形の枠、図４Ｄのようにエッジを丸めた四角形の枠を用いてもよい。
加振手段の配置数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、駆動手段や配線などの作製方法の簡易化の点から２個が好ましい。ただし、加振手段の配置数を３個、４個・・・Ｎ個と増やせば、より駆動効率が高い膜状部材の変位制御も可能になるため、特に上限はない。
【００７８】
２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂとしては、典型的には圧電素子がある。圧電素子は電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり膜状部材１２を変形させることができる。
圧電素子の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、又はこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたものなど、様々な圧電材料を用いることができる。
【００７９】
２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂとしては、圧電素子に限られず、例えば、膜状部材１２上に該膜状部材１２とは線膨張係数が異なる材料が貼り付けられており、加熱することによって線膨張係数の差を利用して膜状部材を変形させることが可能である。このとき、線膨張係数の異なる材料にはヒーターが形成されており、通電によってヒーターを加熱することにより、膜状部材を変形できるようになっていることが好ましい。
【００８０】
駆動手段２０は、駆動信号として吐出波形を２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂに任意の駆動信号を選択的に印加できるようになっており、膜状部材１２を変形させることによって液体保持部１１に保持された液体１５を液滴として吐出させることができる。
２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂに異なる駆動信号を印加して、各加振手段１３Ａ、１３Ｂで発生させる膜状部材１２の振動の位相、振幅、周期を制御することにより、膜状部材１２の変位量を増加させたり、液滴吐出後の膜状部材１２の残留振動を抑制させたりすることもできる。また、２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂに印加する駆動信号は、駆動信号生成の簡易化の点から、全て同一の波形を使用することもできる。
図５Ａ〜図５Ｃは、液滴吐出手段１０の加振手段への駆動信号について説明する図です。各加振手段に印加する駆動信号を膜状部材の固有振動周期Ｔｏを含む波形に設定する。
駆動信号の波形は、図５Ａ〜図５Ｃに示すように、三角波、正弦波のみでなく、ローパスフィルタにかけてエッジを緩やかにした三角波も用いることができる。
【００８１】
液体保持部１１に保持される液体１５の量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＬ以上１ｍＬ以下が好ましい。なお、粒子として細胞を分散させた細胞懸濁液のように高価な液を使用する際には、少量の液量で液滴形成ができるようになっていることが好ましく、１μＬ以上５０μＬ以下の液量が保持できる構成とすることがより好ましい。
【００８２】
膜状部材１２の形状としては円形のものを使用することもできるし、楕円状や多角形のものを用いてもよい。しかし、加振手段は膜状部材の形状に関わらず膜状部材の内接円の領域に配置することが望ましい。また、膜状部材の半径ｒの円周の外側に加振手段を配置する場合、少なくとも加振手段の一部は膜状部材に接触するように配置することが望ましい。
膜状部材１２の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、柔らかすぎると膜状部材が簡単に振動してしまい、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難となるため、ある程度の硬さがある材質であることが必要である。一般的には、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料などを用いることができる。
【００８３】
吐出孔１４は、膜状部材１２の中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。吐出孔１４の直径は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、吐出する液滴形状の安定化の点から、１μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。
【００８４】
＜第２の実施形態＞
図７は、本発明の第２の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。なお、第２の実施形態において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【００８５】
この図７の液滴形成装置１００は、液滴吐出手段１０、及び駆動手段２０を有している。
液滴吐出手段１０は、本実施形態ではクローズヘッドであり、下端部に吐出孔１４が設けられた液体保持部１１と、液体１５を２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂの加振により吐出孔１４から、液滴を吐出する膜状部材１２とを有する。
２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂは、本実施形態では、液滴吐出手段１０がクローズヘッドであるため、膜状部材１２の上面に配置されている。２つの加振手段１３Ａ、１３Ｂに駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、膜状部材１２を加振させることができる。それによって、吐出孔１４から液滴を吐出することができる。
【００８６】
＜第３の実施形態＞
図８は、本発明の第３の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。なお、第３の実施形態において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
この図８の第３の実施形態の液滴形成装置１００は、第１の実施形態の液滴形成装置に加え、液体保持部の液量を検出可能な液量検出手段を更に有する。
図８の液滴形成装置１００は、液体保持部１１の内壁面の深さ方向に液量検出手段１６として複数の電極が設けられている。液体として導電性の液を用い、複数の電極間の導通又は抵抗値を調べることにより、液量を検出することが可能となる。
駆動手段２０は、液量検出手段１６の検出結果に基づいて免振波形を設定できるように構成することが可能である。例えば、駆動手段２０は、液量検出手段１６が検出した液量に関する信号に基づいて、適切な固有振動数を選定し、図５Ａ〜図５Ｃに示した駆動信号を出力するように構成できる。
【００８７】
また、図９に示す第３の実施形態の液滴形成装置１００では、液体保持部１１の上方に、液量検出手段１７として光学センサが設けられている。光学センサから射出された光が、液面で反射し、その反射光を光学センサが受光することにより、発射光と反射光の位相差から、液面までの距離を算出することができる。
なお、液量検出手段としては、以上説明したものに限られず、公知の様々な距離計測や液面検出技術を使用することが可能である。
【００８８】
＜第４の実施形態＞
図１０は、本発明の第４の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。なお、第４の実施形態において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
この図１０の第４の実施形態の液滴形成装置１００は、図２Ａ及び図２Ｂに示す液滴形成装置に、光照射手段３０、受光手段４１、及び粒子数計数手段５０を有している。
【００８９】
光照射手段３０は、液滴吐出手段１０の吐出孔１４から吐出され、飛翔中の液滴２１０に光を照射する。光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光を発することができる。なお、飛翔中とは、液滴２１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、被着対象物に液滴が着滴するまでの状態を指す。
ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴が飛翔して所定位置に達したときに液滴に光が照射されるタイミングで、光照射手段３０が発光することを意味する。つまり、光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光する。
【００９０】
光照射手段３０より照射される光Ｌは、飛翔中の液滴１つに照射されることが好ましい。吐出孔１４から同時に液滴２１０が吐出され、光Ｌが液滴２１０に同時に照射された場合、液滴中に含まれる粒子２００からの発光を同時に受光してしまうため、それぞれの液滴に含まれる粒子２００の数をカウントすることが困難となってしまう。つまり、液滴中の粒子数カウントの精度を向上させるためには吐出孔１４から液滴が吐出されるタイミングをずらすことが好ましい。
【００９１】
光照射手段３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザーなどが好適に用いられる。光がパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【００９２】
受光手段４１は、飛翔中の液滴に粒子２００が含有されていた場合に、粒子２００が光を励起光として吸収して発する蛍光を受光する。蛍光は、粒子２００から四方八方に発せられるため、受光手段４１は蛍光を受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光照射手段３０から出射される光が直接入射しない位置に受光手段４１を配置することが好ましい。
受光手段４１としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の一次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光手段として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の二次元素子を用いてもよい。
【００９３】
なお、光照射手段３０が発する光と比較して粒子２００からの発光が弱いため、受光手段４１の前段（受光面側）に光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光手段４１において、非常にコントラストの高い光が粒子２００の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【００９４】
粒子数計数手段５０は、受光手段４１からの情報に基づいて、液滴中の粒子２００の個数（ゼロである場合も含む）を検出する。
粒子数計数手段５０としては、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、粒子数計数手段５０の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。但し、粒子数計数手段５０の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、粒子数計数手段５０は、物理的に複数の装置などにより構成されてもよい。
【００９５】
粒子数計数手段５０は、例えば、受光手段４１が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、粒子２００の個数を検出することができる。この場合には、受光手段４１として一次元素子を用いても二次元素子を用いても構わない。
受光手段４１として二次元素子を用いる場合は、粒子数計数手段５０は、受光手段４１から得られた二次元画像に基づいて、粒子２００の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、粒子数計数手段５０は、画像処理により粒子２００の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、粒子２００の個数を検出することができる。また、二次元素子を用いる場合には、発光を受光する直前のタイミングにて液滴の画像を撮影することで、不吐出検出も可能となる．
【００９６】
粒子２００としては、細胞が好ましく、蛍光色素によって染色された細胞及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかがより好ましい。これらは、自家蛍光を受光手段４１が受光し、粒子数計数手段５０が液滴に含有された細胞の個数を検出することができる。
蛍光色素としては、例えば、セルトラッカーオレンジ、セルトラッカーレッドなどが挙げられる。
蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ；Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
【００９７】
本発明の液滴形成装置及び液滴形成方法は、膜状部材の変位効率の増加による十分な駆動力を有し、かつ膜状部材の残留振動の短期化による液滴の生産性向上を実現できるので、各種分野に好適に用いられるが、以下に説明する本発明の分注装置に特に好適に用いられる。
【００９８】
（分注装置）
本発明の分注装置は、本発明の上記液滴形成装置を有し、制御手段を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の手段を有する。
分注装置は、被着対象物に対して液滴を吐出し、着滴させる。
【００９９】
＜被着対象物＞
被着対象物は、液滴形成装置の液滴吐出手段から吐出された液滴が着滴する部材である。
被着対象物としては、吐出された液滴が付着することができれば、その材質、形状、大きさ、構造などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
被着対象物の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどで形成されたものが好適に挙げられる。
被着対象物の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
被着対象物の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
被着対象物としては、複数の凹部が形成されたウェルプレート、凹部を有さないガラスプレートなどが挙げられる。これらの中でも、ウェルプレートが好ましい。
ウェルプレートを用いると、液滴形成装置の粒子数計数手段が、液滴に含まれる粒子の数が０個であると判定したとき、液滴吐出手段が、同じ凹部に対して液滴を再度吐出することが、凹部に確実に粒子を分注することができる点から好ましい。
ウェルプレートに設ける凹部の数は、複数であり、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、５０以上が更に好ましい。
【０１００】
＜制御手段＞
制御手段は、液滴吐出手段と被着対象物との相対的な位置関係を制御する手段であり、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、メインメモリなどを有し、分注装置全体の動作を制御するための制御プログラムに基づいて各種処理を実行する。
【０１０１】
＜その他の手段＞
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、記録手段、培養手段、加熱手段、撹拌手段、洗浄手段などを有することが好ましい。
【０１０２】
本発明の分注装置は、吐出された液滴に含まれる粒子の検出精度が向上すると共に、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができる高い生産性を有する本発明の粒子数計数装置を有しているので、再生医療、医薬、化粧品、化学物質の安全性や効能の評価などの各種分野に幅広く用いることができる組織体、特に三次元組織体の作製に好適に用いられる。
【０１０３】
ここで、本発明の分注装置の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
＜分注装置の第１の実施形態＞
図１１は、第１の実施形態の分注装置の一例を示す概略図である。第１の実施形態の分注装置では、本発明の液滴形成装置を、被着対象物の凹部に粒子を分注する分注装置として用いる形態である。なお、第１の実施形態の分注装置において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【０１０４】
図１１に示す分注装置２２０は、液滴形成装置１００と、被着対象物３０１と、ステージ４００と、制御手段５００とを有している。
液滴形成装置１００としては、図１０に示す第４の実施形態の液滴形成装置１００を用いている。
【０１０５】
被着対象物３０１は、移動可能に構成されたステージ４００上に配置されている。被着対象物３０１には、液滴形成装置１００の液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０が着滴する複数の凹部（ウェル）３３０が形成されている。
制御手段５００は、ステージ４００を移動させ、液滴形成装置１００の液滴吐出手段１０とそれぞれの凹部３３０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置１００の液滴吐出手段１０からそれぞれの凹部３３０中に、順次、粒子２００を含む液滴２１０を吐出することができる。
【０１０６】
制御手段５００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御手段５００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。但し、制御手段５００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御手段５００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【０１０７】
図１２は、第１の実施の形態に係る分注装置の動作を示すフローチャートの例である。まず、ステップＳ１０１では、液滴形成装置１００の液滴吐出手段１０は、所定の凹部３３０に向けて液滴２１０を吐出する。
【０１０８】
次に、ステップＳ１０２では、液滴形成装置１００の粒子数計数手段５０は、飛翔する液滴２１０に含有された粒子２００の個数を検出し、検出結果を制御手段５００に送る。粒子数計数手段５０の検出結果が『１個以上』でない場合（ゼロ個の場合）には、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１０９】
ステップＳ１０２で粒子数計数手段５０の検出結果が『１個以上』である場合には、ステップＳ１０３に移行する。ステップＳ１０３では、制御手段５００はステージ４００を制御し、液滴形成装置１００の液滴吐出手段１０と次の凹部３３０とが対向する位置になるように被着対象物３０１を移動する。その後、ステップＳ１０１に移行して同様の動作を繰り返す。
【０１１０】
これにより、凹部３３０に向けて飛翔する液滴２１０に含有された粒子２００の個数がゼロ個である場合には同じ凹部３３０に向けて液滴２１０を再度吐出するため、複数の凹部３３０中に確実に粒子２００を分注することが可能となる。
【０１１１】
また、飛翔する液滴２１０に含有された粒子２００の有無ではなく、図１３に示すように飛翔する液滴２１０に含有された粒子２００の個数を検出することも可能である。
図１３は、第１の実施形態に係る分注装置の動作を示すフローチャートの他の例である。
【０１１２】
図１３では、まず、図１２と同様のステップＳ１０１を実施後、ステップＳ２０２において、液滴形成装置１００の粒子数計数手段５０は、飛翔する液滴２１０に含有された粒子２００の個数を検出し、検出結果を制御手段５００に送る。粒子数計数手段５０の検出結果が『３個』となるまで、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１１３】
なお、液滴２１０に含有された粒子２００の個数が増えると粒子数計数手段５０の検出精度が低下するおそれがあるため、必ずしも１回に吐出する液滴２１０に含有された粒子２００の個数が３個になるように設定する必要はない。例えば、１回に吐出する液滴２１０に含有された粒子２００の個数が０個又は１個になるように設定してもよい。この場合、液滴２１０に含有された粒子２００の個数の合計が３個となるまで、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１１４】
ステップＳ２０２で粒子数計数手段５０の検出結果が『３個』である場合には、ステップＳ１０３に移行し、図１２と同様のステップＳ１０３を実施する。その後、ステップＳ１０１に移行して同様の動作を繰り返す。これにより、各凹部３３０内の粒子２００の個数が３個となるように分注することが可能になる。
【０１１５】
なお、図１２及び図１３の処理において、ステージ４００に沿って液滴形成装置１００を所定の位置に移動させる機能は、例えば、制御手段５００にプログラムとして組み込むことができる。
【０１１６】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  液体を保持する液体保持部と、
吐出孔が形成された膜状部材と、
前記膜状部材を加振する２つ以上の加振手段と、
前記加振手段に駆動信号を印加する駆動手段と、を有し、
前記加振手段は，前記膜状部材の曲げモーメントの極性が異なる領域それぞれに１つ以上配置されることを特徴とする液滴形成装置である。
＜２＞  ２つ以上の前記加振手段が、それぞれ前記吐出孔を通る垂線を中心として外方に所定距離離間させて前記膜状部材に配置されている前記＜１＞に記載の液滴形成装置である。
＜３＞  ２つ以上の前記加振手段が、それぞれ前記吐出孔を通る垂線を中心として環状乃至枠状となるように前記膜状部材に配置されている前記＜２＞に記載の液滴形成装置である。
＜４＞  前記駆動手段が、２つ以上の加振手段に、任意の駆動信号を選択的に印加する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜５＞  前記膜状部材が半径ｒの円形である場合、２つ以上の加振手段のうち一の加振手段を前記膜状部材の中心から１／２ｒよりも内側の領域に配置すると共に、他の加振手段を前記膜状部材の中心から１／２ｒよりも外側の領域に配置する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜６＞  前記駆動信号は、前記膜状部材の固有振動数を含んでいる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜７＞  前記液体保持部内の液量を検出する液量検出手段を有しており、前記駆動手段は、前記液量検出手段の検出結果に基づいて、免振波形を制御する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜８＞  各加振手段により発生させた前記膜状部材の変位ピークが重なるように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜９＞  各加振手段により発生させた前記膜状部材の残留振動の変位ピークが打ち消し合うように、各加振手段に印加する各駆動信号を設定する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜１０＞  前記吐出孔から吐出される液滴に含まれる粒子を計数する粒子数計数手段を有する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜１１＞  前記液滴が、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む前記＜１０＞に記載の液滴形成装置である。
＜１２＞  前記光を照射されたときに発光可能な粒子が、細胞である前記＜１１＞に記載の液滴形成装置である。
＜１３＞  前記光を照射されたときに発光可能な粒子が、蛍光色素によって染色された細胞及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかである前記＜１１＞又は＜１２＞に記載の液滴形成装置である。
＜１４＞  前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の液滴形成装置を用いて液滴を形成することを特徴とする液滴形成方法である。
＜１５＞  前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の液滴形成装置を有することを特徴とする分注装置である。
【０１１７】
前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の液滴形成装置、前記＜１４＞に記載の液滴形成方法、及び前記＜１５＞に記載の分注装置によると、従来における諸問題を解決し、本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【０１１８】
１０      液滴吐出手段
１１      液体保持部
１２      膜状部材
１３Ａ      加振手段
１３Ｂ      加振手段
１４      吐出孔
１５      液体
１８      大気開放部
２０      駆動手段
１００      液滴形成装置
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１９】
【特許文献１】特開２０１６−１１６４８９号公報
【特許文献２】特開２０１７−２０９９８０号公報
【図１Ａ】
2020018288.tif 000003
【図１Ｂ】
2020018288.tif 000004
【図２Ａ】
2020018288.tif 000005
【図２Ｂ】
2020018288.tif 000006
【図３Ａ】
2020018288.tif 000007
【図３Ｂ】
2020018288.tif 000008
【図４Ａ】
2020018288.tif 000009
【図４Ｂ】
2020018288.tif 000010
【図４Ｃ】
2020018288.tif 000011
【図４Ｄ】
2020018288.tif 000012
【図４Ｅ】
2020018288.tif 000013
【図５Ａ】
2020018288.tif 000014
【図５Ｂ】
2020018288.tif 000015
【図５Ｃ】
2020018288.tif 000016
【図６Ａ】
2020018288.tif 000017
【図６Ｂ】
2020018288.tif 000018
【図７】
2020018288.tif 000019
【図８】
2020018288.tif 000020
【図９】
2020018288.tif 000021
【図１０】
2020018288.tif 000022
【図１１】
2020018288.tif 000023
【図１２】
2020018288.tif 000024
【図１３】
2020018288.tif 000025