(57)【要約】      （修正有）【課題】表皮組織における炎症反応を制御する方法、及びその炎症反応の制御を評価する方法の提供。【解決手段】表皮組織における炎症反応を制御する方法であって、真皮線維芽細胞と表皮組織とを接触させる工程を含む、前記方法。表皮組織における炎症反応の制御を評価する方法であって、表皮組織の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を指標とする、前記方法。前記遺伝子及び／又はタンパク質はＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ-８、ＭＭＰ-１、ＭＭＰ-９、ＴＲＰＶ３、ＪＮＫ及びｐ３８からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮線維芽細胞による表皮組織の炎症反応の制御方法。
【請求項２】
請求項１に記載の表皮組織の炎症反応の制御の評価方法であって、
表皮組織の遺伝子および／又はタンパク質の発現を指標とした評価方法。
【請求項３】
上記真皮線維芽細胞および表皮組織が、共培養された真皮線維芽細胞および再構成ヒト表皮である請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
上記遺伝子および／又はタンパク質が、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ-８、ＭＭＰ-１、ＭＭＰ-９、ＴＲＰＶ３、ＪＮＫおよびｐ３８からなる群より選択される少なくとも１種である請求項２〜３のいずれか一項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、表皮組織の炎症反応の制御方法とその炎症反応制御の評価方法に関する。より詳細には、真皮線維芽細胞による、表皮組織の炎症反応の制御方法と、表皮組織の遺伝子および／又はタンパク質の発現を指標とした、真皮線維芽細胞と共培養された表皮組織の炎症反応制御の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮、真皮および皮下脂肪の3層から構成されており、その最外層に位置する表皮組織は、紫外線（UV）、乾燥および微生物などの外部環境に対する最前線の防御機構となっている。表皮組織を構成する主要な細胞である表皮ケラチノサイト(表皮角化細胞)は、基底層で増殖し、基底層から離れると分化を開始し、最終的に角層を形成する。表皮ケラチノサイトの増殖および分化のバランスは皮膚恒常性およびバリア形成において重要である。
【０００３】
表皮ケラチノサイトは、バリア機能に加えて免疫反応にも寄与しており、UVや酸化ストレスおよび微生物を含む様々なストレスから刺激を受けるとＴＮＦ-α、ＩＬ-１βなどの炎症性サイトカインやＩＬ-８のようなケモカインを放出することで炎症を誘導する（非特許文献１）。
【０００４】
皮膚炎症は、感染、創傷後の創傷部位の殺菌、あるいは創傷治癒の促進において重要であるが、過剰な炎症や慢性的な炎症は、正常な皮膚組織に損傷を与え、皮膚疾患、皮膚癌および皮膚老化を引き起こす（非特許文献２〜４）。このことから炎症を制御することは非常に重要である。
【０００５】
多くの分子が炎症性サイトカインやケモカインの産生に関与している。TRPV channelsはcalcium channelであるTRPファミリーであり、TRPV channelsのいくつかは皮膚にも発現している。それらの中でTRPV3はカルシウム透過型の熱感受性ion channelであり、表皮ケラチノサイトにも多く発現している。表皮ケラチノサイトにおいてTRPV3は表皮分化、熱伝達、掻痒感知、痛覚などで役割を果たしているが（非特許文献５）、最近、炎症反応を誘導することが示されている（非特許文献６）。
【０００６】
表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞の相互作用についての研究は多く報告されており、真皮線維芽細胞がパラクライン作用を介して表皮ケラチノサイトの増殖および分化を制御することで表皮恒常性の維持に関与していることが示されている（非特許文献７〜８）。しかし、真皮線維芽細胞が表皮組織の炎症反応においてどのような役割を担っているかは未だ明らかにされておらず、炎症反応の制御に応用できることは知られていなかった。さらにその評価方法ついても同様に知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Dermatol Sci. 2000、 29-38.
【非特許文献２】Adv Exp Med Biol. 2014、 816: 437-69.
【非特許文献３】J Investig Dermatol Symp Proc. 2008、 13:15-9.
【非特許文献４】Genes Dev. 2012、 26:2144-53.
【非特許文献５】Exp Dermatol. 2013、 22: 447-52.
【非特許文献６】J Invest Dermatol. 2018、 138: 365-374.
【非特許文献７】Cell. 2000、 103: 745-55.
【非特許文献８】J Invest Dermatol. 2014、 134: 1332-1341.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この発明の課題は、真皮線維芽細胞の表皮組織の炎症反応における役割を明らかにし、表皮組織の炎症反応の制御方法とその炎症反応制御の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、真皮線維芽細胞が表皮組織の炎症反応制御に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の表皮組織の炎症反応の制御方法は、真皮線維芽細胞による表皮組織の炎症反応の制御方法に関する。さらに表皮組織の炎症反応制御の評価方法は、表皮組織の遺伝子および／又はタンパク質の発現を指標とした、真皮線維芽細胞と共培養された表皮組織の炎症反応制御の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によると、炎症反応制御の効果について、表皮組織の遺伝子および／又はタンパク質の発現量を指標として、真皮線維芽細胞と共培養した表皮組織を単独培養した表皮組織と比較することで、細胞レベル若しくは組織レベルで又は生化学的、分子生物学的に表皮組織の炎症反応制御を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−９の遺伝子発現量を示す図表
【図２】真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるＴＲＰＶ３のタンパク質発現量を示す図表
【図３】ＵＶＢ照射後に真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＴＲＰＶ３の遺伝子発現量を示す図表
【図４】ＵＶＢ照射後に真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるＪＮＫおよびｐ３８のタンパク質発現量を示す図表
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の炎症反応の制御方法とその炎症反応制御の評価方法では、真皮線維芽細胞および表皮組織を用いる。また上記の制御方法と評価方法において、用いる真皮線維細胞および表皮組織が正常ヒト真皮線維芽細胞および再構成ヒト表皮（ＲＨＥ：Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｈｕｍａｎ   Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）であることが好ましいが、特にこれに限定されない。
再構成ヒト表皮とは３次元培養皮膚モデルの一種であり、表皮角化細胞の層で構成されている。
【００１４】
本発明で使用する細胞は、ヒトまたはヒト以外の動物の組織由来のものであって樹立された細胞株であってもよく、ヒトまたはヒト以外の動物の組織から直接取り出して培養された初代培養細胞であっても良い。
【００１５】
この発明でいう「炎症反応制御」は、真皮線維芽細胞と共培養した表皮組織における炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質の発現量が、単独培養した表皮組織の炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質の発現量と比較し、減少すれば抑制された状態を表し、増大すれば促進された状態を表す。
【００１６】
［炎症関連遺伝子および炎症関連タンパク質］
また上記の炎症反応制御の評価方法において、炎症反応制御の指標として、炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質であるＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ-８、ＭＭＰ-１、ＭＭＰ-９、ＴＲＰＶ３、ＪＮＫおよびｐ３８からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子発現および／又はタンパク質発現を用いる。炎症反応制御の指標として、上記の遺伝子および／又はタンパク質であることが好ましいが、特にこれらに限定されない。
【００１７】
炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質の発現量に関して、真皮線維芽細胞と共培養した表皮組織における炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質の発現量と、単独培養した表皮組織における炎症関連遺伝子および／又は炎症関連タンパク質の発現量を比較することで、発現量の差異が大きければ炎症反応制御の効果が大きく、差異が小さければ効果が小さいことから、真皮線維芽細胞による表皮組織の炎症反応制御を評価することができる。
【００１８】
［真皮線維芽細胞と表皮組織の共培養方法］
この発明でいう「真皮線維芽細胞による」は、真皮線維芽細胞と表皮組織を同一培地中で、接触または非接触の状態で共培養することを表す。
【００１９】
表皮組織を専用培地（アッセイ培地）で1日間培養を行う。真皮線維芽細胞を、24 ウェルプレートに播種し、5% FBSを含むMEM中で培養を行う。37℃、5%CO2条件下で24時間培養したのち、MEM培地をアッセイ培地に交換する。その後、共培養システムとしてTransウェルインサートを使用する。
【００２０】
Transウェルインサートは、独自のインサートがウェルの中心部に配置される吊り下げ式のデザインを有しており、インサートとプレートウェルでそれぞれ異なる細胞を非接触で培養できることが特徴である。
【００２１】
インサート上の表皮組織を真皮線維芽細胞が存在するウェルに移し、共培養を開始する。共培養後、表皮組織を各実験に供する。
【００２２】
表皮組織を培養する培地は、本発明に用いる表皮組織を含む細胞の培養に適切な周知の培地を使用することが可能であるが、例えば、アッセイ培地を用いることが好ましい。
【００２３】
真皮線維芽細胞を培養する培地は、本発明に用いる真皮線維芽細胞を含む細胞の培養に適切な周知の培地を使用することが可能であるが、例えば、イーグル(E)最小必須培地（ＭＥＭ）を用いることが好ましい。
【００２４】
なお、これらの培地には、常法に従って、適量の血清等を添加して細胞分裂を確実に行なわせることが好ましい。培養する細胞に適切な栄養源となる血清としては、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加すれば充分な細胞分裂が起きる。
【００２５】
［遺伝子発現量の測定］
遺伝子の発現量の測定は、例えば細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、次世代シーケンス解析法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、あるいはノーザンブロット解析法等を利用して、各遺伝子の発現量を定量することができる。
［タンパク質発現量の測定］
タンパク質の発現量の測定は、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、ウェスタンブロット等により行うことができるが、ウェスタンブロットがより好ましい。
【００２６】
［ＵＶＢ照射］
定常状態に加え、ストレス状態での炎症反応制御の評価を行う為、ＵＶＢ照射を行う。
照射にはＵＶＢランプを用いることが好ましい。
【実施例】
【００２７】
［真皮線維芽細胞と表皮組織の共培養方法］
表皮組織として再構成ヒト表皮を用い、専用培地（アッセイ培地）で1日間培養を行う。真皮線維芽細胞として正常ヒト真皮線維芽細胞NB1RGBを用い、24 ウェルプレートに播種し、5% FBSを含むMEM培地中で培養を行う。37℃、5%CO2条件下で24時間培養したのち、MEM培地をアッセイ培地に交換する。その後、共培養システムとしてTransウェル インサートを使用し、インサート上の再構成ヒト表皮を正常ヒト真皮線維芽細胞が存在するウェルに移し、共培養を開始する。
【００２８】
［正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮における遺伝子発現試験］
上記培養方法において供した正常ヒト真皮線維芽細胞数は、それぞれ約1,000個、10,000個および100,000個である。再構成ヒト表皮からＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより炎症関連遺伝子のＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−９の遺伝子発現量を定量し、この結果を図１に示した。
【００２９】
図１に示す結果からも明らかなように、単独培養した再構成ヒト表皮と比較して、正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮では、各炎症関連遺伝子の発現量の減少が認められ、さらに正常ヒト真皮線維芽細胞の細胞数に比例して顕著な差が認められた。
これは、正常ヒト真皮線維芽細胞が再構成ヒト表皮の炎症関連遺伝子の発現を抑制したことを意味する。
【００３０】
［正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるタンパク質発現試験：ウェスタンブロット］
再構成ヒト表皮を1% protease inhibitor cocktailおよび1% phosphatase inhibitorを含むRIPA buffer (50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1% Noident P-40、0.5% sodium desoxycholate、 0.1%SDS)で溶解し、PierceTM BCA Protein Assay Kitでタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに転写後、スキムミルクでブロッキングした。その後、メンブレンを一次抗体と4℃で一晩反応させた。PBS-Tで3回洗浄したのち、メンブレンを2次抗体と室温で30分反応させた。反応後、PBS-Tで十分に洗浄し、Clarity Western ECL substrateおよびLuminoGraphを用いてバンドを検出し、この結果を図２に示した。
【００３１】
図２に示す結果からも明らかなように、単独培養した再構成ヒト表皮と比較して、正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮では、炎症関連タンパク質であるＴＲＰＶ３の発現量の減少が認められた。
これは、正常ヒト真皮線維芽細胞が再構成ヒト表皮の炎症関連タンパク質の発現を抑制したことを意味する。
【００３２】
［ＵＶＢ照射後に正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮における遺伝子発現試験］
24時間培養した再構成ヒト表皮の培地をHanks balanced salt solutionに交換し、再構成ヒト表皮にＵＶＢを照射した。照射量は100 mJ/cm2で、照射は1日2回、2日間行った。ＵＶＢの照射後、再構成ヒト表皮を約100,000個の正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した。
上記培養方法で培養後、再構成ヒト表皮からＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより炎症関連遺伝子のＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＴＲＰＶ３の遺伝子発現量を定量し、この結果を図３に示した。
【００３３】
図３に示す結果からも明らかなように、単独培養した再構成ヒト表皮と比較して、正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮では、各炎症関連遺伝子の発現量の減少が認められた。
これはＵＶＢのストレス下においても、正常ヒト真皮線維芽細胞が再構成ヒト表皮の炎症関連遺伝子の発現を抑制したことを意味する。
【００３４】
［ＵＶＢ照射後に正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮および単独培養した再構成ヒト表皮におけるタンパク質発現試験：ウェスタンブロット］
上記ウェスタンブロットにより検出した結果を図４に示した。
【００３５】
図４に示す結果からも明らかなように、単独培養した再構成ヒト表皮と比較して、正常ヒト真皮線維芽細胞と共培養した再構成ヒト表皮では、炎症関連遺タンパク質であるＪＮＫおよびｐ３８の発現量の減少が認められた。
これはＵＶＢによるストレス下においても、正常ヒト真皮線維芽細胞が再構成ヒト表皮の炎症関連タンパク質の発現を抑制したことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
真皮線維芽細胞による、表皮組織の炎症反応の制御方法と、表皮組織の遺伝子および／又はタンパク質の発現を指標とした、真皮線維芽細胞と共培養された表皮組織の炎症反応制御の評価方法は、抗炎症剤の開発や研究などに利用することができる。
【図１】
2020180068.tif 000002
【図２】
2020180068.tif 000003
【図３】
2020180068.tif 000004
【図４】
2020180068.tif 000005