(57)【要約】      （修正有）【課題】大量に入手し易く、簡素な化学構造であって、損傷を受けたヌクレオチドの除去修復を阻害する活性が強くて、毒性が低く安全性が高いヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有し原発巣の癌細胞のような腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させる腫瘍治療のために用いられる増強剤及び抗腫瘍剤の提供。【解決手段】下記ラクトン化合物（１）2020152697.tif 000018と、下記ナフトキノン化合物（３）2020152697.tif 000019、又はそれの薬学的に許容される塩を含有するもの。腫瘍治療の増強剤及び抗腫瘍剤は、このヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシ−フロピラン−２−オン骨格を有するラクトン化合物と、ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン骨格を有するナフトキノン化合物とから選ばれる縮合環状化合物、又はそれの薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項２】
前記ラクトン化合物が、下記化学式(１)
【化１】
2020152697.tif 000015
（化学式(１)中、Ｒ１は、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；置換基で置換されていてもよいアシル基；又は、脂肪酸アミド基とポリアルキレングリコール基と複素環基とアルキレン基との少なくとも何れかを有する飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基）で表されるパツリン誘導体、又は下記化学式（２）
【化２】
2020152697.tif 000016
（化学式(２)中、Ｒ２は、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；置換基で置換されていてもよいアシル基；又は、脂肪酸アミド基とポリアルキレングリコール基と複素環基とアルキレン基との少なくとも何れかを有する飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基）で表されるイソパツリン誘導体であり、
前記ナフトキノン化合物が、下記化学式(３)
【化３】
2020152697.tif 000017
（化学式(３)中、Ｒ３及びＲ４は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；又は置換基で置換されていてもよいアシル基であり、Ｒ５〜Ｒ８は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基）で表されるナフタザリン誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項３】
前記ラクトン化合物が、前記化学式(１)中のＲ１及び前記化学式(２)中のＲ２を、水素原子、炭素数１〜２２の飽和アルキル基、又は炭素数２〜２２で二重結合基又は三重結合基を有する不飽和アルキル基とし、
前記ナフトキノン化合物が、前記化学式(３)中のＲ５〜Ｒ７を水素原子とし、
Ｒ８を水素原子又は無置換プレニル基とし、又は置換プレニル基であって、水酸基；炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基；炭素数１〜２２のアシルオキシ基；及び、炭素数１〜２２の脂肪酸アミド基と炭素数２〜４のアルキレン基を有するポリアルキレングリコール基と複素環基と炭素数１〜４のアルキレン基との少なくとも何れかを有する炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基から選ばれる置換基で置換されている前記置換プレニル基とするものであることを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項４】
前記ラクトン化合物が、パツリン、メチルパツリン、又はプロピニルパツリンであり、前記ナフトキノン化合物が、シコニン、アセチルシコニン、デオキシシコニン、ナフタザリン、プロピニルシコニン、Ｏ−｛１−[アセトアミド−トリス（エトキシ）エチル｝−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール］−４−イル−エチル｝−シコニンであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項５】
腫瘍の治療用医薬であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載のヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有することを特徴とする腫瘍治療の増強剤。
【請求項７】
前記腫瘍治療が抗腫瘍剤投与治療及び活性エネルギー線照射治療から選ばれる少なくとも何れかであることを特徴とする請求項６に記載の腫瘍治療の増強剤。
【請求項８】
前記腫瘍治療の前、途中、又は後に、投与されて前記腫瘍治療を増強するように用いるためのものであることを特徴とする請求項６又は７に記載の腫瘍治療の増強剤。
【請求項９】
請求項１〜６の何れかに記載のヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷を受けたヌクレオチドを除去修復するのを阻害するヌクレオチド除去修復阻害剤、ヌクレオチドを損傷させる腫瘍治療に併用される増強剤及び抗腫瘍剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡは傷つき易く、環境中の紫外線や電離放射線、活性酸素などの化学物質によって常にダメージを受けている。生体内には、様々な要因によって損傷を受けたＤＮＡを修復する機構が備わっており、この修復機構によって突然変異、癌化、細胞死や老化などの現象が抑制されている。修復機構には様々な経路が存在し損傷の種類に応じて適切な経路が働く。
【０００３】
太陽光中の紫外線は、最も身近なＤＮＡ損傷誘発原であり、生体内で、主にシクロブタン型ピリミジンダイマー(cyclobutene pyrimidine dimer;ＣＰＤ)や(６−４)光産物(6-4 photoproduct;６−４ＰＰ)を生じさせ、ＤＮＡを損傷させてしまう。これらの損傷が修復されず放置されると、突然変異や染色体異常を引き起こし、細胞の老化や癌化、細胞死が引き起こされるため、生体の細胞にはＤＮＡ損傷の種類に応じた複数の修復機構が備わっている。
【０００４】
これらの損傷はヒト細胞ではヌクレオチド除去修復(nucleotide excision repair;ＮＥＲ)によって除去される。ＮＥＲで働く因子を先天的に欠損すると、高発癌性遺伝疾患である色素性乾皮症（xeroderma pigmentosum;ＸＰ）を発症する。そのため、ＮＥＲは腫瘍の抑制にとって重要な働きをしている。一方、シスプラチンなどの抗腫瘍剤によって誘発されるＤＮＡ損傷もＮＥＲの基質であるため、ＮＥＲはＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤の抗腫瘍活性を弱める要因にもなり得る。
【０００５】
このようなＮＥＲは損傷の認識、損傷周辺のＤＮＡ鎖の巻き戻し、損傷の両側切断、ＤＮＡ合成と再結合という複数の段階を経て、ＤＮＡ損傷を修復する(図１)。これらのコア反応は試験管内で再構成されており、必須タンパク因子の種類と各々の役割が概ね明らかにされている。しかし、細胞内におけるＮＥＲ反応は、調節機構を含めて非常に複雑であり、非常に多くの因子が関与している。
【０００６】
本出願人は、特許文献１のように、既にスクリーニングによってヌクレオチド除去修復阻害剤を見出している。また、非特許文献１のように、スピロノラクトン(SP)が、ＸＰＢを分解し、ヌクレオチド除去修復を抑制することが、報告されている。
【０００７】
ヌクレオチド除去修復活性が従来のものと同等以上であり、入手が容易で、毒性が無く安全性が高い新たなヌクレオチド除去修復阻害剤が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−２２１０１８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Alekseev, S., Ayadi, M., Brino, L., Egly, J.M., Larsen, A.K., Coin, F. (2014). A small molecule screen identifies an inhibitor of DNA repair inducing the degradation of TFIIH and the Chemosensitization of tumor cells to platinum. Chem. Biol., Vol.21, p.398-407.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、大量に入手し易く、簡素な化学構造であって、損傷を受けたヌクレオチドの除去修復を阻害する活性が強くて、毒性が低く安全性が高いヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有し原発巣の癌細胞などの腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させる腫瘍治療のために用いられる増強剤及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤は、ヒドロキシ−フロピラン−２−オン骨格を有するラクトン化合物と、ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン骨格を有するナフトキノン化合物とから選ばれる縮合環状化合物、又はそれの薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするものである。
【００１２】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、例えば、前記ラクトン化合物が、下記化学式(１)
【化１】
2020152697.tif 000002
（化学式(１)中、Ｒ１は、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；置換基で置換されていてもよいアシル基；又は、脂肪酸アミド基とポリアルキレングリコール基と複素環基とアルキレン基との少なくとも何れかを有する飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基）で表されるパツリン誘導体、又は下記化学式（２）
【化２】
2020152697.tif 000003
（化学式(２)中、Ｒ２は、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；置換基で置換されていてもよいアシル基；又は、脂肪酸アミド基とポリアルキレングリコール基と複素環基とアルキレン基との少なくとも何れかを有する飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基）で表されるイソパツリン誘導体であり、
前記ナフトキノン化合物が、下記化学式(３)
【化３】
2020152697.tif 000004
（化学式(３)中、Ｒ３及びＲ４は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；又は置換基で置換されていてもよいアシル基であり、Ｒ５〜Ｒ８は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基）で表されるナフタザリン誘導体であるというものである。
【００１３】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、より具体的には、
前記ラクトン化合物が、前記ラクトン化合物が、前記化学式(１)中のＲ１及び前記化学式(２)中のＲ２を、水素原子、炭素数１〜２２の飽和アルキル基、又は炭素数２〜２２で二重結合基又は三重結合基を有する不飽和アルキル基とし、
前記ナフトキノン化合物が、前記化学式(３)中のＲ５〜Ｒ７を水素原子とし、
Ｒ８を水素原子又は無置換プレニル基とし、又は置換プレニル基であって、水酸基；炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基；炭素数１〜２２のアシルオキシ基；及び、炭素数１〜２２の脂肪酸アミド基と炭素数２〜４のアルキレン基を有するポリアルキレングリコール基と複素環基と炭素数１〜４のアルキレン基との少なくとも何れかを有する炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基から選ばれる置換基で置換されている前記置換プレニル基とするというものである。
【００１４】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、前記ラクトン化合物が、パツリン、メチルパツリン、又はプロピニルパツリンであり、前記ナフトキノン化合物が、シコニン、アセチルシコニン、デオキシシコニン、ナフタザリン、プロピニルシコニン、Ｏ−｛１−[アセトアミド−トリス（エトキシ）エチル｝−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール］−４−イル−エチル｝−シコニンであると、一層好ましい。
【００１５】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、腫瘍の治療用医薬であることを特徴とするものである。
【００１６】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲に記載の腫瘍治療の増強剤は、前記ヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有することを特徴とするものである。
【００１７】
この腫瘍治療の増強剤は、前記腫瘍治療が抗腫瘍剤投与治療及び活性エネルギー線照射治療から選ばれる少なくとも何れかであることが好ましい。
【００１８】
この腫瘍治療の増強剤は、例えば、前記腫瘍治療の前、途中、又は後に、投与されて前記腫瘍治療を増強するように用いるためのものである。
【００１９】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲に記載の抗腫瘍剤は、前記ヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のヌクレオチド除去修復剤は、損傷を受けたヌクレオチドの除去修復を阻害する活性が強く、その薬効・効能が優れており、毒性が低くて安全性が高く、単独で腫瘍の治療剤として用いることができ、しかも簡素な化学構造であって、大量に入手し易く、医薬品として用いることができる。またこのヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有する腫瘍治療の増強剤は、癌細胞や悪性腫瘍細胞のような腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させる化学療法や活性エネルギー線治療の際に、その抗癌作用・抗腫瘍作用を増強することができる。また、このヌクレオチド除去修復剤は、それ自身で抗腫瘍剤となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生体内で損傷を受けたヌクレオチドを除去・修復するメカニズムを示す概要図である。
【図２】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリンのヌクレオチド除去修復評価の結果を示すグラフである。
【図３】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリンの処理又は未処理において、局所紫外線照射後の各NER因子の局在性変化を示す免疫染色の結果を示す写真である。
【図４】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリンの処理又は未処理において、局所紫外線照射後のXPBとCPDの二重染色像の結果を示す写真である。
【図５】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリンの処理のあと、NER因子の細胞内レベルでのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図６】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリンの処理のあと、異なる認識部位をもつ２種類の抗体を用いたDDB2の細胞内レベルでのウェスタンブロッティングの結果を示す写真、及びDDB2とその抗体との概要図である。
【図７】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリン除去後の細胞内DDB2レベルの変動についてのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図８】DDB2一過性過剰発現時、本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリン処理後のDDB2の変動についてのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンのヌクレオチド除去修復評価の結果を示すグラフである。
【図１０】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンについてELISA法を用いたNER阻害活性評価の結果を示すグラフである。
【図１１】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニン及びナフタザリン、並びに本発明を適用外のジュグロン処理後、ELISA法を用いたNER阻害活性評価の結果を示すグラフである。
【図１２】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンの処理／未処理でのDDB2のDNA損傷部位への集積に及ぼす影響について、免疫染色の結果を示す写真である。
【図１３】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンの処理／未処理でのXPCのDNA損傷部位への集積に及ぼす影響について、免疫染色の結果を示す写真である。
【図１４】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンの処理／未処理でのXPBのDNA損傷部位への集積に及ぼす影響について、免疫染色の結果を示す写真である。
【図１５】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニンの処理のあと、NER因子の細胞内レベルでのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１６】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるシコニン処理のあと、DDB2の細胞内レベルの変化についてのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１７】本発明を適用するヌクレオチド除去修復阻害剤であるパツリン及びその誘導体、並びにシコニン及びその誘導体のヌクレオチド除去修復評価のNER阻害作用点の類似点・相違点を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
近年の創薬プロセスの初期段階においては、膨大な化合物ライブラリーをハイスループットスクリーニングによって活性を評価し、新たな分子標的や阻害剤などのシードとなる化合物を探索する手法がよく用いられている。そこで、本出願人が金沢大学がん進展制御研究所にて所有するもので、微生物、植物、海洋産物などから得られた天然由来の天然化合物ライブラリーから、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有する化合物のスクリーニングを行い、またそれの化学修飾を行ったところ、本発明者らはヌクレオチド除去修復阻害剤の有効成分を見出した。
【００２４】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤は、特定の２系統の縮合環状化合物を含有するものである。ヌクレオチド除去修復阻害剤の好ましい一例は、第１の系統の縮合環状化合物として、ヒドロキシ−フロピラン−２−オン骨格(Hydroxy-2H,4H,6H-furo[3,2-c]pyran-2-one骨格)を有するラクトン化合物、又はそれの薬学的に許容される塩を含有するというものである。
【００２５】
前記ラクトン化合物が、下記化学式(１)
【００２６】
【化４】
2020152697.tif 000005
（化学式(１)中、Ｒ１は、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、例えば炭素数１〜２２で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状の飽和アルキル基、又は炭素数２〜２２で二重結合基又は三重結合基を有し、直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状の不飽和アルキル基；置換基で置換されていてもよいアシル基、例えば炭素数１〜２２で飽和又は不飽和のアシル基、具体的にはアセチル基；又は、炭素数１〜２２の脂肪酸アミド基と炭素数２〜４のアルキレン基を有するポリアルキレングリコール基と複素環基と炭素数１〜４のアルキレン基との少なくとも何れかを有する炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基）で表されるパツリン誘導体であることが好ましい。
【００２７】
前記ラクトン化合物が、下記化学式(２)
【００２８】
【化５】
2020152697.tif 000006
（化学式(２)中、Ｒ２は、前記Ｒ１と同じ）で表されるイソパツリン誘導体であってもよい。
【００２９】
前記ラクトン化合物が、前記化学式(１)中のＲ１及び前記化学式(２)中のＲ２を、水素原子、炭素数１〜３の飽和アルキル基、又は炭素数２〜３で二重結合基又は三重結合基を有する不飽和アルキル基であるとなお一層好ましい。
【００３０】
このようなラクトン化合物として、下記化学式（４）で示されるパツリン
【化６】
2020152697.tif 000007
であるとなお一層好ましい。パツリンは、ペニシリウム(Penicillim)属及びアスペルギウス(Aspergillus)属等の真菌によって産出されるカビ毒であることが知られていたが、ＤＮＡ修復阻害活性については、知られていなかった。
【００３１】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤の好ましい別な態様は、第２の系統の縮合環状化合物として、ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン骨格(Dihydroxy-1,4-naphthalenedione骨格)を有するナフトキノン化合物、又はそれの薬学的に許容される塩を含有するというものである。
【００３２】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、例えば、前記ナフトキノン化合物が、下記化学式(３)
【化７】
2020152697.tif 000008
（化学式(３)中、Ｒ３及びＲ４は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよく炭素数１〜２２で飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基；又は置換基で置換されていてもよくアシル基例えば炭素数１〜２２で飽和又は不飽和のアシル基、具体的にはアセチル基であり、Ｒ５〜Ｒ８は同一又は異なっていてもよいもので、水素原子；置換基で置換されていてもよい飽和又は不飽和で直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基）で表されるナフタザリン誘導体が挙げられる。より好ましくは、化学式(３)中、Ｒ５〜Ｒ７を水素原子とし、Ｒ８を、ジメチルアリル基、ゲラニル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基のような無置換プレニル基とし、又はそれらの置換プレニル基であって水酸基；炭素数１〜５の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基；炭素数１〜１８のアシルオキシ基；及び、炭素数１〜２２の脂肪酸アミド基と炭素数２〜４のアルキレン基を有するポリアルキレングリコール基と複素環基と炭素数１〜４のアルキレン基との少なくとも何れかを有する炭素数１〜２２の飽和又は不飽和で分岐鎖状又は環状のアルキルオキシ基とから選ばれる何れかからなる置換官能基若しくはそれらの何れかを何れかの順序で順次結合した置換官能基で置換されている前記置換プレニル基とするものであってもよい。
【００３３】
このようなナフトキノン化合物として、下記化学式（７）で示されるシコニン、
【化８】
2020152697.tif 000009
下記化学式（８）で示されるアセチルシコニン、
【化９】
2020152697.tif 000010
下記化学式（９）で示されるデオキシシコニン、
【化１０】
2020152697.tif 000011
下記化学式（１０）で示されるナフタザリン
【化１１】
2020152697.tif 000012
であるとなお一層好ましい。シコニンは、ムラサキ科ムラサキ(Lithospermum erythrorhizon)の根シコン(紫根)から抽出される薬用成分で、抗炎症作用や肉芽促進などの治癒促進作用、殺菌作用を有することが知られていたが、ＤＮＡ修復阻害活性については、知られていなかった。
【００３４】
なお、式（１）〜（３）中、置換されていてもよい置換基は、夫々単数又は複数であって、-ＯＨ、-ＯＲａ(但しＲａは炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和のアルキル基(例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ビニル基)、アリール基(例えばフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントリル基)又はアラルキル基(例えばベンジル基)；炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和の脂肪族アシル基(例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、(メタ)アクリル基、３，３-ジメチルアクリル基)、アラルキルアシル基(例えばフェニルアセチル基)又は芳香族アシル基(例えばベンゾイル基、フェノール性水酸基含有ベンゾイル基具体的には４-ヒドロキシベンゾイル基や３，４-ジヒドロキシベンゾイル基や４-ヒドロキシ-３-メトキシベンゾイル基))、-ＮＨ２、-ＮＨＲｂ(但しＲｂは炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和のアルキル基(例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ビニル基)、アリール基(例えばフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントリル基)又はアラルキル基(例えばベンジル基)；炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和の脂肪族アシル基(例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、(メタ)アクリル基、３，３-ジメチルアクリル基)、アラルキルアシル基(例えばフェニルアセチル基)又は芳香族アシル基(例えばベンゾイル基、フェノール性水酸基含有ベンゾイル基具体的には４-ヒドロキシベンゾイル基や３，４-ジヒドロキシベンゾイル基や４-ヒドロキシ-３-メトキシベンゾイル基))、-ＮＲｄＲｄ’(但しＲｄ及びＲｄ’は同一又は異なり、炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和のアルキル基(例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ビニル基)、アリール基(例えばフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントリル基)又はアラルキル基(例えばベンジル基)、炭素数１〜１８で直鎖状、分岐鎖状及び／又は環状で飽和又は不飽和の脂肪族アシル基(例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、(メタ)アクリル基、３，３-ジメチルアクリル基)、アラルキルアシル基(例えばフェニルアセチル基)又は芳香族アシル基(例えばベンゾイル基、フェノール性水酸基含有ベンゾイル基具体的には４-ヒドロキシベンゾイル基や３，４-ジヒドロキシベンゾイル基や４-ヒドロキシ-３-メトキシベンゾイル基)、ハロゲノメチル基、又はハロゲン原子）である。
【００３５】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、不斉炭素を有する場合に等比又は非等比のラセミ混合物、ジアステレオ混合物、エナンチオ混合物、若しくは(+)又は(-)の光学活性体であってもよい。
【００３６】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、前記ラクトン化合物や前記ナフトキノン化合物は、薬学的に許容される、無機塩及び／又は有機塩であってもよい。これらの塩は、金属塩、例えばアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩やマグネシウム塩やアルミニウム塩であってもよく、塩酸塩・硫酸塩・硝酸塩・臭化水素酸塩・ヨウ化水素酸塩・リン酸塩・メタリン酸塩のような無機酸塩であってもよく、酢酸塩・ギ酸塩・プロピオン酸塩・フマル酸塩・マレイン酸塩・クエン酸塩・酒石酸塩・マロン酸塩・安息香酸塩・メタンスルホン酸塩・トルエンスルホン酸塩・ナフタレンスルホン酸等の有機酸塩であってもよく、トリエチルアミンやテトラエチルアンモニウムのような有機アンモニウムとの塩、アルギニン・リジン等のアミノ酸との塩であってもよい。
【００３７】
このヌクレオチド除去修復阻害剤は、腫瘍の治療用医薬として、用いることができる。また、このヌクレオチド除去修復阻害剤を、有効成分として含有する腫瘍治療の増強剤として、用いることもできる。
【００３８】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、及びそれを含有する腫瘍治療の増強剤は、ヌクレオチドの損傷の除去修復を阻害するから、癌や悪性新生物などの腫瘍の原発巣中、又は転移組織中、若しくは微小転移中の癌細胞や悪性新生物細胞のような腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させる、シクロホスファミド・イホスファミド・メルファラン・ブスルファン・チオテバのようなナイトロジェンマスタード類で例示されるアルキル化剤や、シスプラチン・カルボプラチン・オキサリプラチン・ネダプラチンのような白金製剤類などによる抗腫瘍剤投与治療のような化学療法；又はＸ線、電子線、陽子線、重粒子線、α線、β線、γ線、紫外線、赤外線、近赤外線を照射する活性エネルギー線照射治療のような放射線療法の際に、用いられる。このヌクレオチド除去修復阻害剤を含有する抗腫瘍剤として、単独で、又は他の抗腫瘍剤と共に投与されてもよい。
【００３９】
このヌクレオチド除去修復阻害剤を含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤は、これら腫瘍治療の前、途中、又は後に、投与されて、癌細胞のような腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させる腫瘍治療の効果を増強するためのものである。
【００４０】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、及びそれを含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤を用いれば、腫瘍細胞のＤＮＡを損傷させたまま、ヌクレオチド除去修復阻害ができないので、それら細胞の細胞死へ誘導でき、腫瘍の病原巣や癌細胞や悪性新生物細胞のような腫瘍細胞の減少・消滅に寄与することができる。
【００４１】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、及びそれを含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤の作用は、抗腫瘍剤の活性を増強する作用であってもよく、腫瘍細胞の抗腫瘍剤感受性や抗腫瘍性や腫瘍増殖抑制性を増強する作用、抗腫瘍剤の投与量・投与回数を低減する作用、及び抗腫瘍剤の副作用の軽減作用であってもよい。
【００４２】
このヌクレオチド除去修復阻害剤や腫瘍治療の増強剤は、前記ラクトン化合物や前記ナフトキノン化合物を、有効成分として、含有し、必要に応じ、非毒性で不活性の薬学的に許容しうる賦形剤、例えば固体状、半固体状又は液状の希釈剤、分散剤、充填剤及び担体と混合することにより、製剤化されている。さらに安定剤、保存剤、ｐＨ調整剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料防腐剤、媒質、生理食塩水、別な薬効を有する薬剤が添加剤として含まれていてもよい。
【００４３】
このヌクレオチド除去修復阻害剤の剤形は、例えばエリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏、懸濁剤、液剤、腸溶剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、トローチ剤、軟膏剤、ハップ剤、リニメント剤、リモナーデ剤、ローション剤が挙げられる。液状媒体に溶解させてもよく懸濁させてもよく、固体状媒体に分散させたものであってもよい。
【００４４】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤は、経口で投与してもよく、注射・点滴で静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下に投与してもよく、皮膚・粘膜に塗布乃至貼付して経皮吸収させてもよい。
【００４５】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤中、前記ラクトン化合物や前記ナフトキノン化合物を、ヌクレオチド除去修復の有効成分として、０．００１〜９９質量％含んでいる。このヌクレオチド除去修復阻害剤や腫瘍治療の増強剤中、前記ラクトン化合物や前記ナフトキノン化合物を患者の体重に対し、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ含んでいることが好ましい。
【００４６】
このヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤の投与量、用量は、前記ラクトン化合物や前記ナフトキノン化合物の有効性、投与の形態・経路、腫瘍の進行ステージ、患者の体型・体重・年齢、併用する他の疾患の治療薬の種類や量に応じ、適宜選択される。その投与は、１日１〜５回毎日投与してもよく、１日〜１４日おきに又は２〜６週間おきに間欠的に投与してもよい。
【００４７】
この腫瘍治療の増強剤は、腫瘍治療の前、途中、又は後に、投与され、好ましくは腫瘍治療の前、より好ましくは、化学療法や放射線療法の処置の１分間〜２４時間前、一層好ましくは１〜６時間前に投与される。
【００４８】
このヌクレオチド除去修復阻害剤を含有する腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤の対象疾患として、各種腫瘍や癌が挙げられ、肺癌、食道癌・胃癌・大腸癌・肝癌・胆嚢癌・膵癌のような消化器癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、頭頚部癌、血液癌、腎癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び肉腫が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤、及びそれを含有する癌治療の増強剤又は抗腫瘍剤の具体例について、説明する。
【００５０】
本出願人が金沢大学がん進展制御研究所にて所有する天然化合物ライブラリーからヌクレオチド除去修復阻害剤の有効成分の候補物質をスクリーニングし、その作用機序及び薬効評価・有効性評価について、以下のように検討した。
【００５１】
［実施例１−１］
（１．細胞培養）
Ａ．細胞
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来細胞)、XP2YOSV(XP-F患者由来線維芽細胞)を用いた。
【００５２】
Ｂ．試薬の調製
・培養液：  D-MEM(高グルコース）(和光純薬社製)500mLにゲンタマイシン(ナカライテスク社製)500μL(final 50μg/mL)、牛胎児血清(FBS)(Sigma社製)を加えて調製した。
・PBS(-)：  10x D-PBS(-)(和光純薬社製)を超純水で10倍希釈した後、分注してオートクレーブで滅菌した。
・トリプシン：  Trypsin 10x Solution(Sigma社製)4mLをPBS(-)96mLで25倍に希釈して用いた。
【００５３】
Ｃ．培養方法
細胞が付着した100mmプラスチックデッシュ(Nalge Nunc社製)から培養液を除き、PBS(-) 5mLで2回洗浄後、トリプシン4mLを処理して細胞を剥がした。そこに、培養液10mLを加えサスペンドして細胞浮遊液を集め適度な濃度に希釈後、新しい100mmデッシュに細胞を植え込み37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。
【００５４】
（２．ヌクレオチド除去修復阻害化合物の一次スクリーニング(その１)）
Ａ．スクリーニング
本出願人が金沢大学がん進展制御研究所にて所有する天然化合物ライブラリーの内、約５００サンプルについて、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有する化合物のスクリーニングM-CINUP（microplate-formatted cell-based immunoassay for NER of UV photoproducts）を行った。
【００５５】
Ｂ．試薬の調製
・10mM PBS(pH 7.4)(希釈用バッファー)：  Na2HPO4 1.15gとNaH2PO4・2H2O 0.296g、NaCl 8.18gを超純水約800mLに溶解した後pH7.4に調整して、超純水で1,000mLにメスアップした。
・ブロッキング液：  スキムミルク(森永乳業社製)を1%になるように10mM PBSで溶解した。
【００５６】
Ｃ．抗体  （6-4PP用）
・一次抗体：64M-5 (本発明者ら作製) 300倍希釈
・二次抗体：Goat Anti-Mouse IgG Human ads-BIOT (Southern Technology社製) 100倍希釈
・三次試薬：IRDye 800CW streptavidin (商品名LI-COR) 2,500倍希釈
Sapphire 700 stain (商品名LI-COR) 2,000倍希釈
【００５７】
Ｄ．一次スクリーニング方法（M-CINUP）
96穴マイクロウェルプレート(Thermo Scientific社製)にHeLa細胞を植え込み(3×104 cells/well)、1日半培養してコンフルエントにした。各化合物を処理して所定の時間処理した後、培地をU字型96マイクロウェルプレートへ移し、細胞を100 μLのPBS(-)で2回洗浄した。その後、プレートの底からUV-C 20J/m2相当のUV-Bを照射した。照射後、U字型プレートへ移しておいた培地を細胞へ戻し、37℃で各時間インキュベートした。その後、100μLのPBS(-)で2回洗浄し、-20℃のメタノールを100μL加えて室温で10分間インキュベートして細胞固定を行った。メタノールを除き、10mM PBS 100μLと純水100μLで1回ずつ洗浄した後、2M塩酸100μLを加えて室温で30分間インキュベートしてDNAを変性させた。10mM PBS 150μLで3回洗浄後、1%スキムミルクを150μL加えて37℃で30分間インキュベートすることによりブロッキングした。同様に洗浄後、10mM PBSで希釈した一次抗体を40μLずつ加えて37℃で1時間インキュベートした。同様の洗浄後、二次抗体を40μLずつ加えて37℃で30分間インキュベートした。さらに同様の洗浄後、三次試薬40μLずつ加えて遮光しながら37℃で30分間インキュベートした。同様の洗浄後、近赤外線イメージアナライザーのOdyssey (エムエステクノシステムズ社製)を用いて680nm及び780nmの2チャンネルでDNA損傷及び細胞を検出した。
【００５８】
Ｅ．一次スクリーニング測定結果
一次スクリーニングでは、植え込んだHeLa細胞に各化合物(10μg/mL)を6時間同時処理し、紫外線照射2時間後の6-4PPを検出した。また、ポジティブコントロールとして、特許文献１の一般式(1)(R1=R2=Me、R3=MeO-)に対応するA6 (20μg/ml)、及びスピロノラクトン(SP)(20μM)を同様に処理したものも含めた。SPは、XPBを分解し、NERを抑制するカリウム保持性利尿薬である。一次スクリーニングで44サンプルに絞り込んだ。
【００５９】
Ｆ．二次スクリーニング測定結果
二次スクリーニングでは、化合物処理濃度を10μg/mLと20μg/mLの2点とし、各化合物の処理時間は6時間のままで、紫外線照射2時間後の6-4PPを検出し、一次スクリーニングの再現性で評価した。二次スクリーニングで4サンプルに絞り込んだ。
【００６０】
Ｇ.細胞毒性・修復阻害活性の条件検討
M-CINUP法は簡便性・迅速性に長けているが、細胞を固定した状態で6-4PPを検出しているため、DNAを抽出して測定するELISA法に比べると精度は劣る。そこで、この4サンプルについてM-CINUP法で濃度と時間の細かい検討を行ったところ、最終の一つとしてサンプル１が絞り込まれた。このサンプル１は、下記化学式（４）で示されるパツリン(Patulin)として、既に同定されているものである。その理化学的構造解析データは、市販品と同じであり、この構造を支持するものであった。サンプル１(パツリン)は、天然から抽出され精製されたものであってもよく、合成されたものであってもよく、Sigma-Aldrich社などからの市販のものであってもよい。このサンプル１は、90μMと120μMに絞り、処理時間の検討を行ったところ、90μMで1時間処理が最適と判断した。その結果を図２(A)に示す。
【００６１】
【化１２】
2020152697.tif 000013
【００６２】
（３．酵素標識免疫測定法(ELISA)を用いた6-4PPの定量）
細胞毒性がなく修復阻害活性が十分見られる条件を決定して、ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）を用いて、紫外線照射後0、1、2時間の6-4PPの修復阻害活性を評価した。
【００６３】
Ａ．試薬の調製
・RNase A溶液：  RNase A(Sigma社製)を20mg/mLになるように滅菌純水で溶解し、100℃で15分間加熱してDNaseを不活化した後、分注して-20℃で凍結保存した。
・エタノール(99 %)
・Proteinase K(Qiagen社製)
・Geno Plus Genomic DNA Extraction Miniprep System (VIOGENE社製)
・TE:  トリス塩基12.11gを80mLの純水に溶かし、塩酸を加えながらpH8.0に調整し、100mLにメスアップして1Mトリス塩酸バッファーを調製し、オートクレーブ滅菌した。この1Mトリス塩酸バッファー1mLと0.5M EDTA 0.2mLを純水80mLと混合した後、100mLにメスアップし、オートクレーブ滅菌して用いた。
・×10PBS：  Na2HPO4 11.5g、NaH2PO4・2H2O 2.96g、NaCl 81.8gを純水約800mLに溶解した後、pH7.4に調整し、1,000mLにメスアップした。
・PBS-T：  ×10 PBS 200mLに純水1,800mLを加え、pH 7.4であることを確認した後、Tween20を1mL加えてよく撹拌した。
・1% Protamine sulfate：  純水70mLに対して硫酸プロタミン0.7gを加えよく撹拌した。
・Citrate-phosphate buffer(pH5.0)：  クエン酸一水和物5.10g、Na2HPO4 7.29gを純水約800mLに溶かした後、pHを5.0に調整し、1,000mLにメスアップした。
・基質溶液：  Citrate-phosphate buffer(pH5.0)10mLに、o-phenylene diamine・2HCl 4mg、H2O2(30%) 2μLを溶かした(遮光して直前に調製)。
【００６４】
Ｂ．抗体  （6-4PP用）
・一次抗体：64M-5(本発明者ら作製) 1,000倍希釈
・二次抗体：Goat Anti-Mouse IgG Human ads-BIOT(サザンバイオテクノロジー社製) 1,000倍希釈
・三次試薬：HRP-streptavidin(KPL社製) 10,000倍希釈
【００６５】
Ｃ．ELISA法
C-1. 細胞の回収と凍結
60mmディッシュにHeLa細胞を植え込み、各化合物を処理して所定の時間処理した後、UV-C 20J/m2を照射して、各時間37℃でインキュベートした。その後、PBS(-)で2回洗浄し、PBS(-) 1mLを加えた後、セルスクレーパー(Nalge Nunc社製)で細胞をかき集めてマイクロチューブに移した。Centrifuge 5415R (Eppendorf社製)で5,000rpm、1分間の遠心を行い、上清除去後、PBS(-) 200μLを加えてピペッティングし、細胞をほぐした。ドライアイスで急速冷凍し、-80℃で凍結保存した。
【００６６】
C-2. DNA抽出と濃度測定
凍結保存しておいた細胞を取り出して解凍した後、Proteinase K、RNase A及びGeno Plus Genomic DNA Extraction Miniprep System(VIOGENE社製)を用いて添付プロトコルに従い、ゲノムDNAを抽出、精製した。UV-160A分光光度計(島津製作所社製)で260nmの吸光度を測定してDNA濃度を算出した。
【００６７】
C-3. 酵素標識免疫測定法(ELISA)
96穴ポリ塩化ビニル製マイクロプレート(Thermo Labsystems社製)に1%硫酸プロタミン水溶液50μLを加えて、37℃で2時間インキュベートし、DNAを効率よく吸着させるための前コーティングを行った。純水100μLで5回洗浄した後、乾燥させて使用まで室温で保存した。
加熱と急冷により一本鎖にしたDNA溶液50μL(200ng)を各ウェルに加えて、45℃で一晩インキュベートしてDNAをウェルの底に吸着させた(1サンプルにつき3ウェル使用)。PBS-T 150μLで5回洗浄後、2%仔牛血清溶液150μLを加え、37℃で90分間インキュベートすることにより抗体の非特異的吸着部位をブロックした。同様に洗浄した後、一次抗体100μLを加え、37℃で90分間反応させた。同様の洗浄後、二次抗体100μLを加え、37℃で90分間反応させた。さらに同様の洗浄後、三次試薬100μLを加え、37℃で90分間反応させた。PBS-T 150μLで3回、Citrate-phosphate buffer 150μLで2回洗浄後、基質溶液を100μL加えて37℃で30分間インキュベートすることにより発色反応を行い、2M H2SO4 50μLを加えて反応を停止させた。最後にSPECTRAFLUOR PLUS(Tecan社製)により各ウェルの発色度(485nm)を測定した。
【００６８】
Ｄ．測定結果
その結果を、図２(B)に示す。一連のスクリーニング結果と、ELISAの結果（同図）とから、サンプル１(パツリン)が細胞内NER反応を阻害していることが示された。
【００６９】
（４．局所紫外線照射後の蛍光免疫染色）
サンプル１(パツリン)がどのNER因子に影響を及ぼすことでNERを阻害しているか調べるため、紫外線局所照射後の蛍光免疫染色により各NER因子の損傷部位への集積を観察した。
【００７０】
Ａ．試薬の調製
・0.5% TritonX-100：  TritonX-100 500μLを10mM PBS 100mLに溶かした。
【００７１】
Ｂ．抗体
（XPC用）
・一次抗体：α-XPC(Sigma社製) 200倍希釈
・二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG conjugate(Molecular Probes社製) 200倍希釈
（DDB2用）
・一次抗体：DDB2 2246C4a(Santa Cruz Biotechnology社製) 100倍希釈
・二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG conjugate(Molecular Probes社製) 200倍希釈
（XPB用）
・一次抗体：TFIIH p89 Antibody (S-19)(Santa Cruz Biotechnology社製) 100倍希釈
・二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG conjugate(Molecular Probes 社製) 200倍希釈
（CPD用）
・一次抗体：TDM-2(本発明者製) 100倍希釈
・二次抗体：Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG conjugate(Molecular Probes社製) 200倍希釈
【００７２】
Ｃ.  蛍光免疫染色方法
C-1.局所紫外線照射
35mmガラスボトムカルチャーディッシュ(IWAKI社製)に培養した各種ヒト細胞を2mLのPBS(-)で2回洗浄した後、孔径5μmのアイソポアメンブレンフィルター(Millipore社製)を被せ、紫外線照射装置(殺菌灯:GL-10(東芝社製))を用いて254nmの紫外線を100J/m2照射した。フィルターはその後、PBS(-)を加えて取り除き、再び培養液を加えて各時間培養した。紫外線線量率は紫外線強度計(トプコンテクノハウス社製)にて0.80J/m2・secに調整した。
【００７３】
C-2. 蛍光免疫染色
局所紫外線照射後、各時間インキュベートした細胞をPBS(-)で洗浄し、1mLの4%ホルマリン中性緩衝液(和光純薬社製)を加え、室温で15分間インキュベートすることにより細胞を固定した。その後、10mM PBS(pH7.4) 1mLで2回洗浄後、氷上にて0.5% TritonX-100を加えて5分間インキュベートした。同様の洗浄後、最終濃度が20%となるようにFBSを混合した10mM PBS 1mLを加え、37℃で30分間処理することで抗体の非特異的吸着部位をブロックした。その後、同様に2回洗浄して一次抗体を100 mL加え、37℃で30分間インキュベートした。洗浄後、二次抗体を100 mL加えて37℃で30分間インキュベートした。さらに、洗浄後300nM DAPI(4’,6-diamidino-2-phenyliodole,dihydrochloride)(Molecular probes)溶液(in 10mM PBS(pH7.4))を150mL加え、室温で5分間インキュベートすることにより核の対比染色を行なった。洗浄後、グリセリンを滴下し、カバーグラスを被せて封入した。観察はオールインワン蛍光顕微鏡BZ9000(KEYENCE社製)を使用した。
【００７４】
C-3. XPBとシクロブタン型ピリミジンダイマーの二重染色
C-2に従ってXPBの染色を行った後、同様の洗浄を行い、再度2%ホルマリン中性緩衝液1mLで固定した。その後、2M HCl処理によるDNA変性を行った後、CPDの染色を行った。
【００７５】
Ｄ．染色結果
NERの上流が阻害されるとNERの下流も止まるため、まずNER上流の代表的な因子であるXPC、DDB2の集積を見た。
まず、HeLa細胞にサンプル１(パツリン)を1時間前処理し、局所紫外線照射後、15分間あるいは60分間培養した後のXPC及びDDB2の損傷部位への集積を調べた。その結果、未処理細胞では照射後15分後にはいずれのNER因子でも局所集積が見られ、60分後には集積は見られなくなった一方、サンプル１(パツリン)処理細胞では60分後でも両NER因子とも損傷部位への集積が残っていた(図３参照)。
次に、サンプル１(パツリン)がTFIIH複合体のXPBサブユニットの損傷部位への集積に影響を及ぼしているか調べるために照射後15分後において、CPDに対するTDM-2抗体との二重染色を行ったところ、サンプル１(パツリン)処理細胞でもCPDは生成されたが、XPBの集積は全く見られなかった。これらの結果から、サンプル１(パツリン)を処理すると、損傷部位にXPBが集積しないことが示された(図４参照)。
【００７６】
（５．NER因子の細胞内レベルの解析）
ウェスタンブロッティングにより、サンプル１(パツリン)処理時におけるNER因子の細胞内レベルを、タンパク質発現量により解析した。
【００７７】
Ａ．試薬の調製
・細胞溶解用緩衝液(SDS-PAGE Sample buffer)：  Sample Buffer Solution without Reducing Reagent (6x) for SDS-PAGE(ナカライテスク社製)と2-mercaptoethanol、超純水を9:1:20の割合で混合した。使用する直前に必要量を採取し、complete Mini(EDTA-free社製) プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社製) 1/25量を加えて用いた。
・10% APS：過硫酸アンモニウム100mgを超純水1mLに溶解した。
・0.5M Tris-HCl(pH6.8)：  トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン6.1gを超純水約60mLに溶解した後、2M HClでpH6.8に調整し、超純水で100mLにメスアップした。
・1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)：  トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン18.2gを超純水約60mLに溶解した後、2M HClでpH8.8に調整し、超純水で100mLにメスアップした。
・分子量マーカー：  Precision Plus Protein Kaleidoscope Color Standards(Bio-rad)を必要量用いた。
・SDS-PAGE Sample buffer (2x)：  Sample Buffer Solution without Reducing Reagent (6x) for SDS-PAGE(ナカライテスク社製)と2-mercaptoethanol、超純水を9:1:20の割合で混合した。
・泳動用緩衝液：  Running Buffer Solution (10×) for SDS-PAGE, Tris-Glycine(ナカライテスク社製)を超純水で10倍に希釈した。
・転写用緩衝液：  Glycine 28.8gとトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 6.0g、メタノール 200mLを超純水約600mLに溶かした後、超純水で2,000mLにメスアップした。
・ブロッキング液：  スキムミルク(森永乳業社製)を0.5%になるようにPBS-Tで溶解した。
・発光基質溶液：  Immobilon Western (Millipore社製； 内容：HRP Substrate Peroxide Solution、HRP Substrate Luminol Reagent各液を当量ずつ加えて混合した後、使用した(用時調製))。
【００７８】
Ｂ．抗体（抗体溶液：各特異抗体をブロッキング液で希釈し、以下の組み合わせで用いた。）
（XPC用）
・一次抗体：α-XPC(Sigma社製) 3,000倍希釈
・二次抗体：Stabilized Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated(Invitrogen社製) 5,000倍希釈 
（DDB1用）
・一次抗体：α-DDB1(本発明者ら作製) 1,000倍希釈
・二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signalin製) 6,000倍希釈 
（DDB2用(モノクローナル抗体)）
・一次抗体：DDB2 2246C4a(Santa Cruz Biotechnology社製) 3,000倍希釈
・二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling社製) 5,000倍希釈
（DDB2用(ホ゜リクローナル抗体)）
一次抗体：DDB2 (R&D社製) 1,000倍希釈
二次抗体：Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (Invitrogen社製) 3,000倍希釈
（PCNA用）
・一次抗体：PCNA (Ab-1)(Merck社製) 5,000倍希釈
・二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling社製) 10,000倍希釈
（RPA用）
・一次抗体：α-RPA(本発明者ら作製) 5,000倍希釈
・二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling社製) 6,000倍希釈
（GAPDH用）
・一次抗体：α-GAPDH (22A101) mouse mAb(本発明者ら作製) 6,000 倍希釈
・二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling社製) 6,000倍希釈
【００７９】
Ｃ．ウェスタンブロッティング方法
C-1.細胞溶解液の作製
35mmプラスチックデッシュ中の細胞に化合物を処理し、所定の時間処理した後、冷PBS(-) 1mLで2回洗浄した。細胞溶解用緩衝液を50μL加え、セルスクレーパー(Nalge Numc社製)で細胞溶解液をかきとり、マイクロチューブに回収してドライアイスで急速凍結した後、-80℃で保存した。
【００８０】
C-2. ソニケーション
BIORUPTOR(COSMO BIO社製)を用いて超音波によりヒストンの高次構造を破壊した後、サンプルを4℃で15分間遠心し、上清を回収してドライアイスで急速凍結した後、-80℃で保存した。
【００８１】
C-3. タンパク質濃度の測定(Bradford法)
超純水で5倍希釈したProtein Assay Dye Reagent(Bio-rad社製) 1mLにProtein Assay Standard I(2mg/mL)(Bio-rad社製)を0、5、10、15μg/mLになるように加えた(検量線作成)。サンプルは適量を加えて室温で10〜15分間静置した後、UV-160A分光光度計(島津製作所社製)で595nmの吸光度を測定し、比色定量によりタンパク質濃度を算出した。
【００８２】
C-4. ポリアクリルアミドゲルの作製
・分離ゲル(8.0%)：  超純水2,300μLと30(w/v)% アクリルアミド/ビス混合液(29:1)(ナカライテスク社製) 1,300μL、1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1,300μL、10% SDS 50μLを混合し、10% APS 40μLとTEMED(Invitrogen社製) 4.0μLを加えて重合させた。
・濃縮ゲル(4.0%)：  超純水1,220μLと30(w/v)% アクリルアミド/ビス混合液(29:1)(ナカライテスク社製) 260μL、1.5M Tris-HCl(pH8.8) 500μL、10% SDS 20μLを混合し、10% APS 20μLとTEMED (Invitrogen社製) 2μLを加えて濃縮ゲル上に注ぎ入れ、コームを挿入して重合させた。
【００８３】
C-5. サンプルの調製と電気泳動
サンプル溶液に等量以上のSDS-PAGE Sample buffer(2x)を加えてサンプルの液量をそろえ、100℃で3分間熱変性処理を行なった。ポリアクリルアミドゲルをMini-PROTEN II Cell電気泳動装置(Bio-rad社製)に装着し、泳動用緩衝液を注いでウェルを洗浄後、各サンプルをアプライした。電気泳動装置をmyPower II500(アトー社製)に接続し、定電圧200Vで30〜40分間通電して泳動させた。
【００８４】
C-6. タンパク質のメンブレンへの転写
泳動装置からゲルを外し、分離ゲルのみを転写用緩衝液に浸して10分間bufferの交換を行なった。別の容器に転写用緩衝液を加え、ゲルと同じサイズの転写用メンブレン Immobilon-P(日本ミリポア社製)1枚と濾紙(アトー社製)8枚を浸した。Trans-Blot Turbo(Bio-rad社製)の下部電極板状に転写用緩衝液をかけながら下から濾紙3枚、メンブレン、ゲル、濾紙3枚の順に気泡が入らないように重ねて、ゲル1cm2あたり2mAの定電流で30分間通電した。
【００８５】
C-7. ブロッキングと抗体反応
転写終了後、メンブレンを必要に応じて切断し、ブロッキング液中で振盪しながら室温で60分間インキュベートした。次に、ブロッキング液を交換して一次抗体を加えて振盪しながら1時間、又は4℃で一晩反応させた。その後、PBS-Tで3分間3回洗浄し、ブロッキング液に浸した後に二次抗体を加えて室温で30分間反応させた。メンブレンを先ほどと同様にPBS-Tで洗浄し、さらに10mM PBS (pH7.4)で3分間2回洗浄した後、用時調製した発光基質溶液をメンブランに添加して5分間反応させ、LAS-4000 (富士フィルム社製)にて検出した。
【００８６】
Ｄ．ウェスタンブロッティング結果
図５は、HeLa細胞にサンプル１(パツリン)(90μM)を各時間処理し、SDS sample bufferで細胞溶解液を調製して、ウェスタンブロッティングを行い、定量後の各NER因子の相対量はGAPDHで補正した結果である。DDB1、XPC、RPA、PCNA、GAPDHは処理後60分でも変化が認められなかった。
【００８７】
（６．プロテアソーム、リソソームによる分解系の解析）
サンプル１(パツリン)によるDDB2の減少がユビキチンプロテアソーム系を介した分解であるか調べるため、プロテアソーム阻害剤MG-132併用後としたこと以外は、同様にして、DDB2レベルの変動を見たところ、DDB2の減少は抑制されず、プロテアソーム非依存的であるとわかった（不図示）。そこで、PatulinによるDDB2の減少がリソソームによる分解系であるか調べるため、リソソーム阻害剤であるChloroquine併用後のDDB2レベルの変動を見たところ、ChloroquineでDDB2の減少は抑制されなかった（不図示）。この結果から、DDB2がプロテアソーム、リソソームによって分解される系ではない。
【００８８】
（７．モノクローナル抗体／ポリクローナル抗体によるDDB2レベルの変動の解析）
Santa Cruz Biotechnology社製のDDB2抗体はN末を抗原として作製されたモノクローナル抗体(MoAb)であったため、R&D社製の全長を抗原として作製されたポリクローナル抗体(PoAb)を用い、同様にして、比較を行った。図６(A)は、HeLa細胞にサンプル１(パツリン)(90μM)を各時間処理し、SDS sample bufferで細胞溶解液を調製して、ウェスタンブロッティングを行い、定量後の各NER因子の相対量はGAPDHで補正したものである。その結果、Santa Cruz Biotechnology社製のモノクローナル抗体であるDDB2抗体では、サンプル１(パツリン)処理時に細胞内のDDB2レベルが顕著に減少していたが、R&D社製のホ゜リクローナル抗体であるDDB2抗体では細胞内のDDB2レベルに変化が見られなかった（図６(A)参照）。そこで、各種欠失型DDB2を発現するプラスミドをトランスフェクションして２種類の抗体の認識部位を調べたところ、図６(C)に示すように各抗体は異なる認識部位を持つことがわかった。一方、XPCレベルに変化が見られなかった（図６(B)参照）。
【００８９】
（８．パツリン除去後の細胞内DDB2レベルの変動）
XPBを分解し、NERを抑制することが報告されているスピロノラクトン(SP)を前処理後、SPを除去して4時間あるいは8時間後にXPBの細胞内レベルが回復することがわかっていたことから、Patulinにおいても、除去後の細胞内DDB2レベルが変動するか調べた。サンプル１(パツリン)を90μM、1時間前処理し、除去後、4、8、24時間培養したところ、Santa Cruz Biotechnology社製のDDB2抗体では、パツリン除去後24時間経過しても細胞内DDB2レベルは回復しなかった一方、R&D社製のDDB2抗体では、細胞内のDDB2レベルに変化が見られず、バンドが上下に伸びていた（図７参照）。
【００９０】
（９．  DDB2一過性過剰発現時のPatulin処理後のDDB2の変動）
N末にFLAGタグのついたp3×Flag-CMV-10 Flag-DDB2(WT)をトランスフェクションし、サンプル１(パツリン)処理後のDDB2レベルの変動を調べた。その結果、パツリンを処理すると、Santa Cruz Biotechnology社製のDDB2抗体(MoAb)では外来DDB2も内在と同じく減少した一方で、R&D社製のDDB2抗体(PoAb)では内在と同様に顕著な減少は見られず、むしろ内在とともにバンドがやや上にシフトする傾向が見られた。
【００９１】
これらの結果から、パツリンを処理すると細胞内のDDB2レベルが顕著に低下することが示されたが、認識部位の異なるDDB2抗体を用いることにより、パツリンを処理しても細胞内のDDB2レベルは変化しないことが分かった。これまでのSanta Cruz Biotechnology社製のDDB2抗体は、DDB2のN末を抗原とし、DDB2の1〜79(図６(C)参照)の範囲が認識に必要であり、R＆D社製のDDB2抗体はDDB2の全長を抗原とし、DDB2の主に80〜211(図６(C)参照)の範囲が認識に必要であることから、パツリンがDDB2のN末の1〜79に何らかの影響を与えることにより、Santa Cruz Biotechnology社製の抗体では認識できないようになっていると推察される。また、パツリンを処理すると、バンドが上下に伸びているのが見られたことから、DDB2のN末を修飾している可能性があると推察される。
【００９２】
［実施例２−１］
（１．細胞培養）
Ａ．細胞
HeLa細胞(ヒト子宮頸がん由来細胞)、XP2YOSV(XP-F患者由来線維芽細胞)を用いた。
【００９３】
Ｂ．試薬の調製
・培養液：  D-MEM (高グルコース)(和光純薬社製)500mLに、ゲンタマイシン(Sigma社製)500μL(終濃度50μg/mL)、牛胎児血清(FBS)(Sigma社製)56mLを加えて調製した。
・PBS(-)：  10x D-PBS(-)(和光純薬社製)を超純水で10倍希釈した後、オートクレーブで滅菌した。
・トリプシン：Trypsin 10x Solution(和光純薬社製)4mLをPBS(-)96mLで希釈した。
【００９４】
Ｃ．培養方法
細胞を培養している100mmプラスティックディッシュ(Nalge Nunc社製)から培地を吸引し、PBS(-)5mLで2回洗浄後、トリプシン4mLで細胞を剥がした。培養液を10mL加え、懸濁して細胞浮遊液を集めた。適度な濃度に希釈した後、新しい90mmディッシュに植え込み、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。
【００９５】
（２．ヌクレオチド除去修復阻害化合物の一次スクリーニング(その２)）
Ａ．スクリーニング
本出願人が金沢大学がん進展制御研究所で所有する天然化合物ライブラリーの内、約５００サンプルについて、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有する化合物のスクリーニングM-CINUPを行った。
Ｂ．試薬の調製、Ｃ．抗体（前記同様）
【００９６】
Ｄ．方法（M-CINUP）
96穴マイクロウェルプレート(Nunc社製)にHeLa細胞を植え込み(3×104cells/well)、2日間培養してコンフルエントにした。各化合物を処理し所定の時間処理した後、各ウェルの培地を吸引して、100μLのPBS(-)で2回洗浄し、UV-C 20J/m2相当のUV-Bをプレートの底から照射した(照射しないサンプルは黒のビニールテープで遮光した)。照射直後あるいは照射1時間又は2時間後に、予め-20℃で冷却しておいたメタノールを各ウェルに100μLずつ加えて室温で10分間インキュベートすることにより細胞を固定した。各ウェルを10mM PBS 100μLと超純水100μLで1回ずつ洗浄した後、2M HCl 100μLずつ加えて室温で30分間インキュベートしてDNAを変性させた。10mM PBS 150μLで3回洗浄後、1%スキムミルク溶液を150μLずつ加えて37℃で30分間インキュベートすることによりブロッキングした。10mM PBS 150μLで3回洗浄後、1次抗体溶液を40μLずつ加えて37℃で1時間インキュベートした。同様の洗浄後、ビオチンで標識された2次抗体溶液を40μLずつ加えて37℃で30分間インキュベートした。さらに同様の洗浄後、ストレプトアビジンと蛍光色素の結合物であるIRDye 800CW Streptavidinと細胞数標準化試薬 Sapphire 700を調製した溶液を各ウェルに40μLずつ加えて37℃で30分間インキュベートした。同様の洗浄後、赤外線イメージアナライザー・オデッセイ(エムエステクノシステムズ社製)を用いて680nm及び780nmで励起し、蛍光を測定した。6-4PP量を表す780nmの蛍光の値は、ウェル内の細胞量を表す680nmの値で補正し、紫外線未照射時の値(バックグラウンド)を引き、紫外線照射直後のDMSO(コントロール)の値を100%としたときの相対的な値を、残存6-4PP量として算出し、NER阻害活性又は促進活性を評価した。
また、NER阻害活性が既に知られているA6(20μg/mL)、スピロノラクトン(SP)(20μM)を、ポジティブコントロールとして用いた。
【００９７】
Ｅ．ライブラリーでの一次及び二次スクリーニング測定結果
(A)  一次スクリーニングの結果は以下の通りである。HeLa細胞に各化合物を10μg/mL、A6を20μg/mL又はスピロノラクトン(SP)を20μMで6時間前処理し、紫外線を照射した後、2時間同じ濃度の薬剤存在下で培養して固定した。DMSO処理サンプルの紫外線照射直後の損傷量を100%とし、相対値を求めた。NER阻害活性の高かったサンプル２は、40%であるものとして、見出された。サンプル２は、下記化学式（７）で示されるシコニン(Shikonin)として、既に同定されているものであった。その理化学的構造解析データは、市販品と同じであり、この構造を支持するものであった。サンプル２(シコニン)は、天然から抽出され精製されたものであってもよく、合成されたものであってもよく、及び／又はShigma-Aldrich社などからの市販のものであってもよい。
【化１３】
2020152697.tif 000014
(B)  二次スクリーニングの結果は以下の通りである。HeLa細胞に各化合物を10及び20μg/mL、A6を20μg/mL又はスピロノラクトン(SP)を20μMで6時間前処理し、紫外線を照射した後、2時間同じ濃度の薬剤存在下で培養して固定した。DMSO処理サンプルの紫外線照射直後の損傷量を100%とし、相対値を求めた。サンプル２は、6-4PP残存率が、20μg/mlで50%であり、10μg/mlで20%であり、濃度依存的なNER阻害活性をもつものとしてスクリーニングされた。
【００９８】
Ｄ．市販品での測定結果
市販のシコニン(Cayman Chemical社製)を購入し、先のスクリーニングで見られたNER阻害活性が同様に見られるのか、M-CINUP法を用いて検討した。化合物処理濃度を20〜60μMで振り、スクリーニング時と同様に6時間前処理を行い、紫外線照射2時間後の残存6-4PP率を評価した（図９参照）。前処理時間の必要性を検討するために従来の6時間の他に1時間、さらに前処理なしで紫外線照射後の培養時のみシコニンを添加の条件を追加して実験を行った。その結果、シコニンは1時間という短い前処理時間でも6時間の時と同様に濃度依存的な高いNER阻害を示し、前処理なしでもある程度の効果があることが分かった（図９参照)）。
【００９９】
（３．酵素標識免疫測定法(ELISA)を用いた6-4PPの検出）
より高い精度でNER活性を測定することができるELISA法を用いて、シコニンのNER阻害活性を評価した。
Ａ.使用した細胞
HeLa(ヒト子宮頸部癌由来細胞)を用いた。
Ｂ．試薬の調製、Ｃ.抗体（前記同様）
【０１００】
Ｃ．サンプルの調製
回収当日に細胞密度が80%程度になるように60mmディッシュ(Nunc社製)に細胞を植え込み、2日間培養した。回収当日、化合物又はDMSOで処理し、37℃でインキュベートした後、UV-Cを10J/m2照射した。培地を戻し、各時間37℃でインキュベートしてから細胞を回収した。細胞は、PBS(-) 1mLで2回洗浄し、セルスクレイパーでかき集め回収した。マイクロチューブに移した細胞懸濁液を5,000rpmで1分間遠心し、上清を捨てた後、PBS(-) 200μLで再懸濁し、ドライアイス中で急速凍結して-80℃に保存した。
すべてのサンプルが揃った段階で凍結したサンプルを解凍し、Geno Plus Genomic DNA Extraction Miniprep System(Viogene社製)を用いて添付のプロトコルに従い、ゲノムDNAを抽出、精製した。得られたDNA溶液は、10倍に希釈し、UV-160A分光光度計(島津製作所)で260nmの吸光度を測定してDNA濃度を測定した。
【０１０１】
Ｄ.ELISA法
ポリ塩化ビニル製96wellマイクロプレート(Dynatech社製)に1%硫酸プロタミン溶液を1wellあたり50μLずつ加え、37℃で2時間インキュベートした後、純水150μLで3回洗浄し、乾燥させた(使用まで常温保存)。抽出したゲノムDNAを1wellあたり200ngとなるように10mM PBSで調製し、100℃で10分間加熱後、氷中で15分間冷却することによりDNAを一本鎖化した。各ウェルにサンプルを50μLずつ加えて45℃で一晩インキュベートしDNAを固定化した。PBS-T 150μLで5回洗浄後、2% FBS溶液150μLを加え、37℃で90分間インキュベートすることによりブロッキングした。同様に洗浄した後、一次抗体溶液 100 μLを加え、37℃で90分間反応させた。同様の洗浄後、ビオチンで標識された二次抗体溶液100μLを加え、37℃で90分間反応させた。さらに同様の洗浄後、三次試薬100μLを加え、37℃で90分間反応させた。PBS-T 150μLで3回、Citrate-phosphate buffer 150μLで2回洗浄後、基質溶液を100μL加えて遮光しながら37℃で30分インキュベートすることにより発色反応を行い、2M H2SO4 50μLを加えて反応を停止させた。最後に、SPECTRAFLUOR PLUS(Tecan社製)で485nmの吸光度を測定した。
【０１０２】
Ｅ．測定結果
その結果を、図１０に示す。図１０は、HeLa細胞にシコニンを40μM又は溶媒のDMSOでHeLa細胞に1時間前処理し、紫外線照射後、1時間又は2時間同じ濃度の薬剤存在下で培養して細胞を回収し、DNA抽出を行い、アッセイした。化合物未処理細胞の紫外線照射直後の損傷量を100%とし、相対値を求めた。3回の実験の平均値と、標準偏差をプロットしたものである。図１０から明らかな通り、サンプル２(シコニン)では、紫外線照射2時間後でもほとんどの6-4PPが残存しており、顕著な細胞内NER阻害を確認できた。
【０１０３】
（４．紫外線局所照射及び蛍光免疫染色法）
Ａ．使用した細胞
HeLa(ヒト子宮頸部癌由来細胞)、XP2YOSV(XP-F患者由来細胞)を用いた。
【０１０４】
Ｂ．試薬の調製
・0.5% Triton X-100：  10mM PBS 100mLに、Trion X-100(和光純薬社製)を500μL加え攪拌した。
・20% FBS：  10mM PBSにFBSを加え20%になるよう調製した。
・300nM DAPI：  10mM PBSに100μM DAPI溶液を加え300nMになるよう調製した。
【０１０５】
Ｃ．各因子の固定法及び抗体の希釈倍率
・XPC
一次抗体：Anti-XPC antibody produced in rabbit(Sigma社製) 200倍希釈
二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit polyclonal IgG(Invitrogen社製) 200倍希釈
・XPB
一次抗体：TFIIH p89 rabbit polyclonal IgG(Santa Cruz社製) 200倍希釈
二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit polyclonal IgG(Invitrogen社製) 200倍希釈
・DDB2
一次抗体：DDB2 (2246C4a) mouse monoclonal IgG(Santa Cruz社製) 100倍希釈
二次抗体：Alexa Fluor 488 goat anti-mouse monoclonal IgG(Invitrogen社製) 200倍希釈
一次抗体：XPE/DDB2 antibody(R&D社製) 100倍希釈
二次抗体：Alexa Fluor 488 chicken anti-goat IgG(Invitrogen社製) 200倍希釈
・CPD
一次抗体：TDM-2(本発明者ら作製) 100倍希釈
二次抗体：Alexa Fluor 4594 goat anti-mouse IgG (H+L)(Invitrogen社製) 200倍希釈
【０１０６】
Ｄ．紫外線局所照射
各種ヒト細胞を35 mmガラスボトムディッシュ(IWAKI社製)に植えこんで一晩培養した。薬剤処理を行った後、PBS(-)で2回洗浄し、5μm径のアイソポアメンブレンフィルター(Millipore社製)を細胞の上においてUV-Cを100J/m2照射した。フィルターを取り除いた後、再び培養液を加えて各時間培養した。
【０１０７】
Ｅ．各種NER因子の蛍光免疫染色
紫外線局所照射後、各時間インキュベートした細胞をPBS(-)で2回洗浄し、1mLの4%ホルムアルデヒドを加えて15分間室温んでインキュベートすることにより細胞を固定した。10mM PBS(pH7.4)で2回洗浄後、1mLの0.5% Trion X-100(10mM PBSで希釈)を加えて氷上で5分間インキュベートした。同様の洗浄後、1mLの20% FBSを加えて37℃で30分間インキュベートすることにより抗体の非特異的結合部位をブロックした。洗浄後、各種一次抗体を100μL加え、37℃で30分間インキュベートした。さらに洗浄後、二次抗体100μLを加え、遮光して37℃で30分間インキュベートした。洗浄後、300nM DAPIを150μL加え、遮光して室温で5分間インキュベートし、核を染色した。洗浄後、グリセリンとカバーガラス(18×24mm)(松浪硝子社製)で封入し、蛍光顕微鏡BZ9000(KEYENCE社製)又は共焦点レーザー顕微鏡LSM700(ZEISS社製)で観察した。
【０１０８】
Ｆ．XPBとCPDの二重染色
XP2YOSV細胞に局所紫外線照射後、培養液を加えて1時間インキュベートした。上記Ｅ．に従って、XPBを一次抗体及び二次抗体で染色した。洗浄後、2%ホルムアルデヒドを1mL加え、室温で15分間再度固定した。洗浄後、純水で軽くすすいでから1mLの2M HClを加え、37℃で5分間インキュベートし、DNAを変性させた。その後、Ｅ．と同様にブロッキング、CPDの一次抗体、二次抗体、DAPIで染色し、蛍光顕微鏡で検出した。
【０１０９】
Ｇ．シコニン処理時のNER関連因子のDNA損傷部位への集積の結果
シコニン処理によるNER阻害が、NERの多段階反応のどのステップで起きているかを調べるために、局所紫外線照射法を用いてNER関連因子のDNA損傷部位への集積を確認することにし、まずNERの初期段階で働くDNA損傷認識因子のXPC及びDDB2に着目した。これらの因子は紫外線局所照射後すぐに損傷部位に集積することが知られており、紫外線照射後1時間では未処理細胞でシグナルが弱まっているのに対し、シコニン処理群では依然強いシグナルが見られた(図１２及び１３参照)。
次に、XPCやDDB2よりも下流のNER因子で、XPCにより損傷部位にリクルートされるTHIIH複合体のXPBサブユニットの抗体を用いて集積への影響を調べた。XPFを欠損しているXP2YOSV細胞を用い、紫外線局所照射後1時間の時点でXPBとCPDの二重免疫染色を行った結果、未処理細胞と比較して、シコニン処理を行った細胞ではXPBの損傷部位でのシグナルがほとんど見えなかった（図１４参照）。
これらの結果から、シコニン処理細胞において、損傷認識に関わるXPC及びDDB2は問題なく損傷部位にリクルートされるが、通常より長く損傷部位に残存し、一方で下流のXPBを含むTFIIH複合体は損傷部位にリクルートされないことが示唆された。
【０１１０】
（５．NER因子の細胞内レベルの解析）
ウェスタンブロッティングにより、サンプル２(シコニン)処理時におけるNER因子の細胞内レベルを、解析した。
Ａ．試薬の調製
・10% APS、0.5M Tris-HCl(pH6.8)、1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)は、前記同様に調製した。
・分子量マーカー：  BLUE Star Prestained Protein-Ladder(Fast Gene社製)、若しくはPrecision Plus ProteinTM KaleidoscopeTM(Bio-rad社製)を必要量用いた。
・SDS-PAGE Sample buffer (2×)：  Sample Buffer Solution without Reducing Reagent (6×) for SDS-PAGE(ナカライテスク社製)を超純水で3倍希釈したところに、2-mercaptoethanolを19：1となるように加えた。また、各種阻害剤を、Complete Inhibitor (20倍希釈)又はProtease Inhibitor (100倍希釈)の希釈倍率になるように適宜加えた。
・泳動用緩衝液：  Running Buffer Solution (10×) for SDS-PAGE, tris-Glycine(ナカライテスク社製)を超純水で10倍希釈した。
・転写用緩衝液：  Glycine 28.8 g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン6.0g、メタノール200mLを超純水約600mLに溶かした後、超純水で2,000mLにメスアップした。
・10×PBS：  Na2HPO4 11.5gとNaH2PO4・H2O 2.96g、NaCl 81.8gを超純水約800mLに溶解してpH7.4に調製後、超純水で1,000mLにメスアップした。
・PBS-T：  10×PBS 200 mLに超純水1800mLを加えpH7.4に調製後、Tween20(Sigma社製)を1mL加えて撹拌した。
・ブロッキング液：スキムミルク(森永乳業社製)を0.5 %になるようにPBS-Tで溶解した。
・基質溶液(Immobilon Western (Millipore))は、HRP Substrate Peroxide Solution、HRP Substrate Luminol Reagentの各液を等量ずつ加えてよく混合してから使用した(用時調製)。
【０１１１】
Ｂ.薬剤処理とUV-C照射
35mmディッシュ(Nunc社製)に、回収当日に細胞密度が8割程度になるようHeLa細胞を植えこみ、2日間培養した。培養後、化合物処理を行い、培地を戻して、37℃で各時間インキュベートした。
【０１１２】
Ｃ．細胞溶解液の作製
ディッシュ中の細胞を氷冷PBS(-) 1mLで2回洗浄後、SDS sample buffer (×2)をディッシュに50μL加えた。セルスクレーパー(Nunc社製)で細胞をかきとり、マイクロチューブに回収してすぐにドライアイスで急速凍結したのち、-80℃で一晩以上置いた。翌日以降、解凍したサンプルを超音波破砕機 BIORUPTOR(UCD-250HSA, コスモバイオ社製)を用いて30秒インターバルで4分30秒間を3回以上繰り返し、細胞を破砕した。その後、4℃、13,200rpmで15分間遠心して回収した上清をドライアイスで急速凍結した後、-80℃で保存した。
【０１１３】
Ｄ．タンパク質濃度の測定(Bradford法)
超純水で5倍希釈したProtein Assay Dye Reagent(Bio-rad社製) 1mLにProtein Assay Standard I(2mg/mL)(Bio-rad社製)を0，5，10，15μg/mLになるように加えた(検量線用)。サンプルは適量を加えて、紫外線可視分光光度計BioSpec-mini (島津製作所社製)で595nmの吸光度を測定し、比色定量によりタンパク質濃度を算出した。
【０１１４】
Ｅ.ポリアクリルアミドゲルの作製
・分離ゲル
10%用として超純水1,900μLと30(w/v)%アクリルアミド/ビス混合液(29:1)(ナカライテスク社製)1,700μL、1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1,300μLに10% SDS(Invitrogen社製)を混合し、10% APS 50μLとTEMED(Invitrogen社製)4.0μLを加えて重合させた。8%用として、超純水2,600μL、アクリルアミド/ビス混合液1,000μLを用いたこと以外は同様にして調製した。
・濃縮ゲル
超純水1220μLと30(w/v)% アクリルアミド/ビス混合液(29:1)(ナカライテスク社製) 260μL、0.5M Tris-HCl(pH8.8) 500μL、10% SDS(Invitrogen社製) 20μLを混合し、10% APS 20μLとTEMED(Invitrogen社製) 2μLを加えて濃縮ゲル上に注ぎ入れ、コームを挿入して重合させた。
【０１１５】
Ｆ．サンプルの調製と電気泳動
サンプル溶液に等量以上のSDS-PAGE Sample buffer (2×)を加えて液量をそろえ、100℃で3分間熱変性処理を行なった。ポリアクリルアミドゲルをMini-PROTEN電気泳動装置 (Bio-rad社製)に装着し、泳動用緩衝液を注いでウェルを洗浄後、各サンプルをアプライした。電気泳動装置Power Pac 200(Bio-rad社製)に接続し、定電圧200Vで約30分間通電して泳動させた。
【０１１６】
Ｇ.タンパク質のメンブレンへの転写
泳動装置からゲルを外し、分離ゲルのみを転写用緩衝液に浸して15分間バッファー交換を行なった。別の容器に転写用緩衝液を加え、ゲルと同じサイズに切り、予めメタノールに浸した転写用メンブレンImmobilon-P(Millipore社製)1枚と濾紙(アトー社製)6枚を浸した。トランスブロットTurbo(BIO-RAD社製)のカッセットに転写用緩衝液をかけながら下から濾紙3枚、メンブレン、ゲル、濾紙3枚の順に気泡が入らないように重ねて蓋をし、プロトコルに従って1.3A、25Vで30分間通電した。
【０１１７】
Ｈ．ブロッキングと抗体反応
転写終了後、メンブレンを必要に応じて切断し、ブロッキング液に浸してゆっくり振盪しながら室温で1時間程度インキュベートした。次に、ブロッキング液を交換して一次抗体を加え、ゆっくり振盪しながら室温で約1時間、又は4℃で一晩反応させた。その後、PBS-Tで3分間3回洗浄し、ブロッキング液に浸した後に二次抗体を加えて室温で約30分間反応させた。メンブレンを先ほどと同様にPBS-Tで洗浄し、さらに10mM PBSで3分間2回洗浄した後、用時調製した基質溶液をメンブレンにかけて、約5分間反応させ、透明ポケット(コレクト社製)に挟んで、LAS-4000(富士フィルム社製)で発光を検出した。
また、抗体溶液はブロッキング液で希釈し、以下の組み合わせで用いた。
・XPC
一次抗体：Anti-XPC antibody produced in rabbit(Sigma社製) 3,000倍希釈
二次抗体：HRP-Goat anti-Rabbit IgG (H+L)(Invitrogene社製) 6,000倍希釈
・DDB2
一次抗体：DDB2 (2246C4a) mouse monoclonal IgG(Santa Cruz社製) 2,000倍希釈
二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Invitrogene社製) 6,000倍希釈
一次抗体：XPE/DDB2 antibody(R&D社製) 4000倍希釈
二次抗体：HRP-Goat anti-Rabbit IgG (H+L)(Invitrogene社製) 6000倍希釈
・PCNA
一次抗体：PCNA (Ab-1)(Santa Cruz社製) 10,000倍希釈
二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Invitrogene) 10,000倍希釈
・RPA70
一次抗体：Anti-Replication Protein A (Ab-1) Mouse mAb (RPA70-9)(Calbiochem社製) 5,000倍希釈
二次抗体：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Invitrogene社製) 6,000倍希釈
・GAPDH
一次抗体:α-GAPDH (22A101) mouse mAb(本発明者ら作製) 10,000倍希釈
二次抗体:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(Invitrogene社製) 10,000倍希釈
【０１１８】
Ｄ．ウェスタンブロッティング結果
細胞内レベルの変動を調べたNER因子のうち、XPCとDDB1において緩やかに減少がみられたが、NERの下流で働くRPA70やPCNAでは顕著な変化は見られなかった(図１５参照)。
次に、DDB2についてSanta Cruz Biotechnology社製の抗体(MoAb)とR&D社製の抗体(PoAb)の両方で検討したところ、前者の抗体では6時間処理で半分程度までバンドが薄くなり、後者の抗体ではむしろ1.8倍程度までバンド強度が増加した(図１６参照)。
【０１１９】
［実施例２−２、及び比較例］
シコニンの構造のうち、NER阻害活性に関与する部分を特定するため、いくつかの構造類縁体を用いてNER阻害活性を評価した。シコニンの側鎖のないもので前記化学式（１０）で示されるナフタザリン(5,8-ジヒドロキシ-1,4-ナフトキノン；東京化成社製)（実施例２−２）、さらにナフタザリンの2つの水酸基のうち1つがないジュグロン(5-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン；東京化成社製)（比較例）を購入して、試料とした。処理濃度を40μMで1時間の前処理条件でELISAを行った。その結果、ナフタザリンはシコニンよりもやや弱いもののNER阻害活性を示し、一方でジュグロンはNER阻害活性を示さなかった（図１１(A)〜(B)）。
【０１２０】
［シコニン誘導体の構造活性相関］
実施例２−１〜２−２の結果から、シコニンのNER阻害活性には、側鎖の構造は重要ではなく、2つの水酸基をもつナフタザリンの構造が必要であると考えられる。
【０１２１】
［パツリン誘導体及びシコニン誘導体のNER阻害活性のメカニズム］
実施例１−１及び実施例２−１〜２−２の結果から、図１７に示す通り、２種類の化合物のNER阻害作用点は類似しており、どちらもDDB2及びXPCの損傷部位への集積が正常に見られるものの、その後にリクルートされるTFIIH複合体のXPBサブユニットの集積が著しく抑制され、２つの過程の間で異常が起きていると考えられる。相違点は、パツリン誘導体の場合、DDB2のN末領域（1〜79）で何らかの翻訳後修飾が強く示唆されるのに対し、シコニン誘導体ではさほど顕著ではない。また、XPCの一部にも翻訳後修飾が観察されたが、シコニン誘導体ではそれもほとんど見られない。一方、シコニン処理では、XPC及びDDB1/DDB2のバンドがゆっくり減少するのに対し、DDB2のN末を認識する抗体ではむしろ認識性が上昇する現象が見られ、ここでも細胞内レベルの変動というよりも何らかの構造上の変化が示唆される。現時点で、これらの反応とNER阻害作用との関係は不明であるが、XPBを含むTFIIH複合体のリクルートに影響を及ぼしている可能性が推察される。
【０１２２】
このように、パツリンやその誘導体、及びシコニンやその誘導体は、ヌクレオチド除去修復阻害剤の有効成分化合物であることが確かめられた。また、それらで処理した腫瘍細胞は紫外線照射下でヌクレオチド除去修復阻害を示すことから、腫瘍治療の増強剤や抗腫瘍剤として、有用であることが示された。このヌクレオチド除去修復阻害剤は、腫瘍細胞に処理後、培養してもコロニーを生じず、紫外線のような活性エネルギー線による腫瘍治療の増強剤として、また各種抗腫瘍剤の増強剤として、さらにそれ自身が抗腫瘍剤として、治療効果を発現する。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤は、シスプラチンなどのＤＮＡ損傷性抗腫瘍剤のアジュバントのような腫瘍治療の増強剤として、又は合成致死戦略に基づく抗腫瘍剤として利用できる。また、抗ＤＮＡ損傷抗体と組み合わせて、腫瘍治療の増強剤又は抗腫瘍剤の研究試薬として利用することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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