(57)【要約】      （修正有）【課題】工業規模で生物有機化合物を製造する系及び手順の提供。【解決手段】生物有機化合物を製造するための系及び方法には、容器、生物有機化合物を産生することができる宿主細胞を含む水性媒体を含む第一の相を含んでいてもよく、該生物有機化合物には、該水性媒体と接触して、第二の相を含む方法を提供する。【選択図】図１
2020018319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 少なくとも100リットルの容量を有する容器； 
b. 炭水化物炭素源を含む第一の相を形成する、該容器内の、水性媒体；
c. 該炭水化物炭素源を少なくとも1種のC10-C20イソプレノイドに変換することができ
る、該水性媒体内の、複数の宿主細胞であって、メバロネート経路又はDXP経路の少なく
とも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改変されている、前記宿主細胞
；及び
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種のイソプレノイドを含む、自然発生的に形
成された液体有機第二の相；
を含む、C10-C20イソプレノイド化合物を製造するためのシステムであって、
該イソプレノイド化合物が、セスキテルペン、モノテルペン、又はジテルペンである、
前記システム。
【請求項２】
前記イソプレノイド化合物がセスキテルペンである、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
前記イソプレノイド化合物がモノテルペンである、請求項1記載のシステム。
【請求項４】
前記イソプレノイド化合物がジテルペンである、請求項1記載のシステム。
【請求項５】
a. 水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を産生する複数の宿主細胞を培養す
ること、ここで、該水性媒体は、炭水化物炭素源を含む第一の相を形成し、該宿主細胞は
、該炭水化物炭素源を該少なくとも1種の生物有機化合物に変換し、かつ該宿主細胞は、
メバロネート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように
遺伝子改変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、第一の相と接触して、該少な
くとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相を自然発生的に形成すること；
c. 該第一の相から該第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該第二の相から少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること；
を含む、生物有機化合物の製造方法であって、
該生物有機化合物が、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物有機化合
物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化合物が、
セスキテルペン、モノテルペン、又はジテルペンである、前記製造方法。
【請求項６】
前記有機第二の相が、前記第一の相から前記第二の相をデカントすることによって分離
される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC15生物有機化合物である、請求項5記載の方法
。
【請求項８】
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC10生物有機化合物である、請求項5記載の方法
。
【請求項９】
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC20生物有機化合物である、請求項5記載の方法
。
【請求項１０】
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC20+生物有機化合物である、請求項5記載の方法
。
【請求項１１】
前記単離工程が吸着を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
前記単離工程が蒸留を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１３】
前記単離工程が気体-液体抽出を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
前記単離工程が液-液抽出を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１５】
前記単離工程が限外濾過を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも1種の生物有機化合物がイソプレノイド化合物である、請求項5記載の方
法。
【請求項１７】
a. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、炭水化物炭素源を含む水性媒
体中で、該炭水化物炭素源から少なくとも1種のC10-C20イソプレノイド化合物を産生する
複数の宿主細胞を培養すること、ここで、該宿主細胞は、メバロネート経路又はDXP経路
の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該少なくとも1種のC10-C20イ
ソプレノイド化合物を含む有機相を自然発生的に形成すること；
c. 該水性媒体から該有機相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該有機相から該少なくとも1種のC10-C20イソプレノイド化合物を単離すること；
を含む、C10-C20イソプレノイド化合物の製造方法であって、
該C10-C20イソプレノイド化合物が、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンで
ある、前記製造方法。
【請求項１８】
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がセスキテルペンである、請求項17記載の
方法。
【請求項１９】
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がモノテルペンである、請求項17記載の方
法。
【請求項２０】
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がジテルペンである、請求項17記載の方法
。
【請求項２１】
前記有機相が水相から有機相をデカントすることによって分離される、請求項17記載の
方法。
【請求項２２】
前記単離工程が吸着を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
前記単離工程が蒸留を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
前記単離工程が気体-液体抽出を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
前記単離工程が液-液抽出を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
前記単離工程が限外濾過を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２７】
燃料組成物製造システムであって、
a.以下を含む1つ以上の発酵システム：
i）少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
ii）該少なくとも１つの容器内の、炭水化物炭素源を含む第一の相を形成する、水性
媒体；
iii）該炭水化物炭素源を少なくとも1種の生物有機化合物に変換することができる、
該水性媒体内の、メバロネート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種
核酸を含むように遺伝子改変された複数の宿主細胞；及び、
iv）少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該第一の相と接触して、
該少なくとも1種の生物有機化合物を含む、自然発生的に形成された液体有機第二の相；
ここで、該生物有機化合物が、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物
有機化合物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化
合物が、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンである；及び
b. 1つ以上の第一の相分離システムであって、これにより、該第一の相及び該第二の有
機相、又は該第二の有機相の1つ若しくは複数の成分が分離される、該第一の相分離シス
テム；
を含む、前記燃料組成物製造システム。
【請求項２８】
燃料組成物の製造方法であって、
a. 炭水化物炭素源を含む水性媒体中で、該炭水化物炭素源を少なくとも1種の生物有機
化合物に変換する複数の宿主細胞を培養すること、ここで、該水性媒体は、第一の相を形
成し、かつ該生物有機化合物は、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物
有機化合物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化
合物は、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンであり、該宿主細胞は、メバロネ
ート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改
変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該第一の相と接触して、少な
くとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相を自然発生的に形成すること；
c. 該第一の相から第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び
d. 該第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること；
を含む、前記製造方法。
【請求項２９】
1つ以上の第二の相分離システムであって、これにより、該少なくとも1種の生物有機化
合物が該第二の有機相から分離される、該第二の相分離システムをさらに含む、請求項27
記載のシステム。
【請求項３０】
1つ以上の反応器又は容器であって、該少なくとも1種の生物有機化合物が化学的又は生
物学的に修飾される、該反応器又は容器をさらに含む、請求項27記載のシステム。
【請求項３１】
1つ以上の精製システムであって、これにより、該生物有機化合物又は該修飾された生
物有機化合物が精製され、又は更に精製される、該精製システムをさらに含む、請求項30
記載のシステム。
【請求項３２】
該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合するための1つ
以上の混合容器又はシステムをさらに含む、請求項27記載のシステム。
【請求項３３】
1つ以上のさらなる精製システムであって、これにより、該少なくとも1種の生物有機化
合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物が精製され、又は更に精製される、該精
製システムをさらに含む、請求項27記載のシステム。
【請求項３４】
該少なくとも1種の生物有機化合物を化学的又は生物学的に修飾することをさらに含む
、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
該少なくとも1種の生物有機化合物又は該修飾された生物有機化合物を精製することを
さらに含む、請求項28又は34記載の方法。
【請求項３６】
該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合することをさら
に含む、請求項28記載の方法。
【請求項３７】
該少なくとも1種の生物有機化合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物を精製す
ることをさらに含む、請求項36記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、イソプレノイドの産生のための微生物（MICROOGRANISMS FOR PRODUCTION OF
ISOPRENOIDS）の表題の2006年5月26日に出願された米国仮出願第60/808,989号；生物燃
料及び産生のための方法（BIOFUELS AND METHODS FOR PRODUCTION）の表題の2006年5月26
日に出願の米国第60/808,666号；イソプレノイドの産生（PRODUCTION OF ISOPRENOIDS）
の表題の2006年12月12日に出願の米国第60/870,592号；及び生物有機化合物を製造するた
めの装置（APPARATUS FOR MAKING BIO-ORGANIC COMPOUNDS）の表題の2007年4月10日に出
願の米国60/922,782号の利益を主張する。これらの全ての内容は、参照により本明細書に
組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
伝統的に、関心対象の生物有機化合物は、植物、微生物及び動物などの天然の供与源か
らの抽出によって製造されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、大部分の生物有機化合物は、天然において少量で蓄積するので、抽出収率は、
通常非常に低い。これらの量は、大多数の市販目的のためのものよりもはるかに少ないこ
とを考えると、工業規模で生物有機化合物を製造する系及び手順に対する需要が残ったま
まである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、この需要に対処する。宿主細胞を使用して生物有機化合物を製造するための
種々の産業的規模の系が提供される。これらの生物有機化合物は、少なくとも5つの炭素
原子を有し、かつモノアルコール若しくはポリアルコール、エステル、エーテル、アルデ
ヒド、ケトン、又はアルカン、アルケン若しくはアルキンなどの炭化水素などの炭水化物
であることができる。生物有機化合物は、直鎖状又は環状であることができ、及び飽和又
は不飽和であることができる。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、種々の生物有機化合物製造系を提供する。一つの態様において、
a. 少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
b. 第一の相を含む、該容器内の、水性媒体；
c. 少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成することができる、該
水性媒体内の、複数の宿主細胞；及び、
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相
、
を含む生物有機化合物製造装置が提供される。
別の態様において、少なくとも1種の生物有機化合物を製造する方法が提供される。本
方法は：
a. 水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成する複
数の宿主細胞を培養することであって、該水性媒体は、第一の相を含み；
b. 該第一の相と接触して該生物有機化合物を含む有機第二の相を形成すること；
c. 該第一の相から該有機第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該有機第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明に使用するための少なくとも100リットルの容量を有する容器である。
【０００７】
【図２】別の容器実施態様である。
【０００８】
【図３】イソペンテニルジホスフェート（「IPP」）の産生のためのメバロネート（「MEV」）経路の概略図である。
【０００９】
【図４】IPP及びジメチルアリルピロリン酸（「DMAPP」）の産生のためのDXP経路の概略図である。Dxsは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼであり；Dxrは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートリダクトイソメラーゼであり（IspCとしても知られる）；IspDは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールシンターゼであり；IspEは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールシンターゼであり；IspFは、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロジホスフェートシンターゼであり；IspGは、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル4-ジホスフェートシンターゼ（IspG）；及びispHは、イソペンテニル／ジメチルアリルジホスフェートシンターゼである。
【００１０】
【図５】IPP及びDMAPPの、ゲラニルピロリン酸（「GPP」）、ファルネシルピロリン酸（「FPP」）及びゲラニルゲラニルピロリン酸（「GGPP」）への変換の概略図である。
【００１１】
【図６】発現プラスミドpMBIS-gppsのマップを示す。
【００１２】
【図７】発現プラスミドPam00408のマップを示す。
【００１３】
【図８】発現プラスミドpAM424のマップを示す。
【００１４】
【図９】発現プラスミドpTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A-APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-TS、pTrc99A-CS、pTrc99A-SS及びpAM373のマップを示す。
【００１５】
【図１０】プラスミドpAM489-pAM498の構築のための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な記載）
（定義）
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野の当業者によって共通に理解するものと同じ意味を有する。ここでは、
以下の意味を有することが定義されるであろう多数の用語に対して言及してある：
【００１７】
「生物有機化合物」は、炭水化物炭素源を摂取すること、及び炭水化物炭素源を所望の
産物に変換することによって宿主細胞により作製することができる少なくとも5つの炭素
原子を有する有機化合物をいう。
【００１８】
「デオキシキシルロース5-ホスフェート経路」又は「DXP経路」は、本明細書において
グリセルアルデヒド-3-ホスフェート及びピルベートをIPP及びDMAPPに変換する経路をい
うために使用される。DXP経路は、図4に模式的に図示してある。
【００１９】
「内因性」は、例えば非組換え宿主細胞において天然に存在し得る物質又は過程をいう
。
【００２０】
本明細書に使用される「異種核酸」は、以下の少なくとも一つが真である核酸をいう：
（a）核酸が、所与の宿主細胞に対して外来（「外来性」）である（すなわち、天然にお
いて見いだされない）；（b）核酸が、所与の宿主細胞において天然に見いだされる（す
なわち、「内因性」である）ヌクレオチド配列を含むが、該ヌクレオチド配列は、該細胞
において非天然の（例えば、予想されるよりも多いか、又は天然に見いだされるよりも多
い）量で産生される；（c）核酸が、内因性ヌクレオチド配列と配列が異なるヌクレオチ
ド配列を含むが、該ヌクレオチド配列は、同じタンパク質（同じ又は実質的に同じアミノ
酸配列を有する）をコードし、及び細胞における非天然の（例えば、予想されるよりも多
いか、又は天然に見いだされるよりも多い）量で産生される；又は（d）核酸が、天然に
おいて互いに同じ関係で見いだされない2つ以上のヌクレオチド配列を含む（例えば、核
酸が組換えである）。
【００２１】
「宿主細胞」及び「微生物」は、異種核酸を挿入することができるか、若しくは挿入さ
れた任意の古細菌、細菌又は真核生物の生細胞をいうために本明細書において同義的に使
用される。また、本用語は、天然の、偶発性の、又は計画的な突然変異により、本来の親
に対して形態が、又はゲノム若しくは本来の親に対して相補的な総DNAが完全に同一では
なくてもよい原細胞の子孫にも関する。
【００２２】
「イソプレノイド」及び「イソプレノイド化合物」は、本明細書において同義に使用さ
れ、イソペンテニルジホスフェートから誘導可能な化合物をいう。
【００２３】
「単離する」及び「単離すること」は、生物有機化合物を指すときに、組成物における
生物有機化合物の量を濃縮することである。結果的に、生物有機化合物が単離され、又は
単離工程に対供された後の組成物における生物有機化合物の量は、このような工程の前に
組成物に存在する量を上回る。
【００２４】
「メバロン酸経路」又は「MEV経路」は、本明細書においてアセチルCoAをIPPに変換す
る生合成経路をいうために使用される。MEV経路は、図3に模式的に図示してある。
【００２５】
核酸、酵素、細胞又は生物体に適用される「天然に存在する」とは、天然において見い
だされる核酸、酵素、細胞又は生物体をいう。例えば、天然の供与源から単離することが
でき、かつ研究室においてヒトによって故意に修飾されていない生物体に存在するポリペ
プチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００２６】
「任意の」又は「任意に」とは、その後に記述された特色又は構造が存在しても、若し
くはしなくてもよいこと、あるいはその後に記述された事象又は環境が存在しても、若し
くはしなくてもよいこと、並びに該記述には、特定の特色若しくは構造が存在する例、及
び特色又は構造が存在しない例、又は事象若しくは環境が生じる例、及び事象若しくは環
境が生じない例を含むことを意味する。
【００２７】
「ピロリン酸」は、本明細書において「ジホスフェート」と同義的に使用される。
【００２８】
本明細書に使用される「実質的に純粋な」化合物である組成物は、1種以上のその他の
化合物を実質的に含まず、すなわち組成物は、組成物の総容積に基づいて、80容量%を上
回る、90容量%を上回る、95容量%を上回る、96容量%を上回る、97容量%を上回る、98容量
%を上回る、99容量%を上回る、99.5容量%を上回る、99.6容量%を上回る、99.7容量%を上
回る、99.8容量%を上回る、99.9容量%を上回る化合物か；又は20容量%未満、10容量%未満
、5容量%未満、4容量%未満、3容量%未満、2容量%未満、1容量%未満、0.5容量%未満、0.1
容量%未満又は0.01容量%未満のその他の化合物を含む。
【００２９】
以下の記述において、本明細書に開示した全ての数は、単語「約」又は「おおよそ」が
それとともに使用されているかにかかわらず、近似値である。これらは、1パーセント、2
パーセント、5パーセント又は時には10〜20パーセントまで異なっていてもよい。下限RL
及び上限RUをもつ数値範囲が開示されるときはいつでも、範囲内に入っているあらゆる数
が具体的に開示される。特に、範囲内の以下の数は、具体的に開示される：R=RL+k*（RU-
RL）、式中kは、1パーセントの増分で1パーセント〜100パーセントの範囲の変数であり、
すなわちkは、1パーセント、2パーセント、3パーセント、4パーセント、5パーセント、…
、50パーセント、51パーセント、52パーセント、…、95パーセント、96パーセント、97パ
ーセント、98パーセント、99パーセント又は100パーセントである。更に、上記において
定義したような2つのR数によって定義される任意の数の範囲も、具体的に開示される。
【００３０】
上の定義に加えて、本明細書に記述した特定の化合物は、Z又はE異性体のいずれかとし
て存在することができる1つ以上の二重結合を有する。本発明は、特定の実施態様におい
て実質的に純粋形態の個々の異性体として、並びに各種異性体の混合物、例えば立体異性
体のラセミ混合物として、これらの化合物を包含する。
【００３１】
（生物有機化合物を製造するための装置）
本発明は、生物有機化合物を製造するための種々の製造系を提供する。一部の実施態様
において、生物有機化合物は、バッチ操作、連続操作、流加式（fed-batch）操作又は半
連続発酵操作を使用して産生してもよい。
【００３２】
バッチ発酵は、培地の組成物が発酵の初めに固定され、かつ発酵の間に人工の変化に供
されない閉鎖系であってもよい。従って、発酵の始めに、培地を所望の生物体又は生物体
群と共に播種して、系に何も添加しなくても発酵を生じさせことができる。しかし、一部
の実施態様において、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、pH及び酸
素濃度などの因子を律速する際の試みは行われることが多い。バッチ系では、系の代謝産
物及びバイオマス組成物は、発酵が止められる時まで常に変化し得る。バッチ培養内では
、細胞は、誘導期を介して高成長対数期まで、及び最終的には増殖速度が減少又は停止す
る定常期まで、穏和であろう。未処置の場合、定常期の細胞は、最終的に死滅するであろ
う。対数期の細胞は、一般に大量の最終産物又は中間体の産生の原因となる。
【００３３】
標準的なバッチ系に対する変形は、流加式系である。また、流加式発酵プロセスは、本
発明にも適しており、さらなる炭素源又は基質が発酵進行につれて増分に添加されること
を除いて、典型的なバッチ系を含む。流加式系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害しそ
うなときに、及び培地中の基質の量を限定させること望まれる場合に有用である。流加式
系における実際の基質濃度の測定は困難であり、及び従って、pH、溶存酸素、及びCO2な
どの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。
【００３４】
連続発酵は、定義された発酵培地が1つ以上のバイオリアクターに連続的に添加され、
これは連続であってもよく、及び同量の条件培地がさらなるプロセシングのために同時に
系から除去される開放系である。連続発酵は、一般に細胞が主に対数増殖期である特定の
高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞増殖又は最終産物濃度に影響を及ぼす1つの
因子又は多くの因子の調整が可能である。例えば、1つの方法では、炭素源又は窒素レベ
ルなどの栄養制御剤を固定された割合に維持して、他の全てのパラメーターを緩和するこ
とができるであろう。その他の系では、細胞濃度を一定に保持しつつ、増殖に影響を及ぼ
す多数の因子を連続的に変化させることができる。連続系では、定常状態増殖条件を維持
するよう努め、及び従って、抜き取られる培地による細胞消失を発酵における細胞増殖速
度に対してバランスをとらなければならない。
【００３５】
従って、本発明の一部の実施態様において、：
a. 少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
b. 第一の相を含む、該少なくとも１つの容器内の、水性媒体；
c. 少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成することができる、該
水性媒体内の、複数の宿主細胞；及び、
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体の有機第二の
相、
を含む生物有機製造装置が提供される。
【００３６】
本発明に使用するために適した容器は、発酵のための宿主細胞及び水性媒体を保持する
ための任意の容器であることができる。例えば、容器は、反応器又は発酵槽のためのタン
クであることができ、又はそれは、その後の処理工程でより軽い材料からより重い材料を
分離することができる遠心機の部分であることができる。或いは、一つ又は複数の容器は
、連続プロセス又は半連続プロセスに使用してもよい。
【００３７】
適切な容器100の一般的な図解例を図1に示してある。容器100は：宿主細胞、発酵培地
、並びに宿主細胞の発酵、生物有機化合物若しくは化合物の産生、及び容器内におけるさ
らなる産生工程の実行を援助し、調節し、若しくは改善するためのその他の化合物、栄養
素又は組成物の添加のための入口120と；発酵プロセスの間又は終了後に材料を除去する
ための排出口130、及び発酵プロセスの間又は後に産生される二酸化炭素などの廃ガスを
排気するための気体出口140を含む。容器100は、容器の最上部に気体のための空間がない
ように、宿主細胞、発酵培地及びその他の材料で完全に満たしてもよい。或いは、容器10
0は、部分的に満たすことができ、従って、空隙空間を気体によって占有されたままにす
ることができる。空隙空間の気体の量、圧力及び組成は、宿主細胞の増殖及び生物有機化
合物若しくは生物有機化合物類の産生を最適化し、又は最大にするように制御されていて
もよい。例えば、好気的宿主細胞の発酵の間に、気体は、典型的には上記の種々の圧力に
て空気又はその他の酸素含有気体を含んでいてもよく、気圧以下にて、例えば微好気性及
び嫌気性宿主細胞について、気体の酸素濃度は、大気濃度よりも低いがなおもゼロを上回
る範囲内で制御することができるが、嫌気性宿主細胞についての発酵の間に、気体は、典
型的にはほんの少しの酸素から全く酸素を有さず、主に又は完全に窒素又はその他の適切
な気体で完全に構成させることができる。
【００３８】
閉鎖系において、図1に示した容器100の入口120、排出口130及び気体出口140は、発酵
プロセスの間に閉じているか、又は陽圧下にあってもよい。或いは、特に、好気的宿主細
胞を使用するときに、容器100は、開放系として使用することができ、これにより、該入
口及び出口の1つ以上が雰囲気に開放されて、系を気体／液体物質移動に提供する（中へ
空気又は酸素、及び外へ二酸化炭素）。必要に応じて、気体出口140は、気体出口として
、及び酸素又は空気又はその他の気体が系に導入される気体入口として、の両方として機
能してもよい。一部の実施態様において、容器100は、分離された気体入口及び分離され
た気体出口を含む。このような開放系において、発酵の間に容器へのその他の生物体又は
その他の材料の混入又は浸潤を防止するために、さらなるハードウェアを容器に含めても
よい。
【００３９】
別の容器実施態様を図2に図示してある。図1の容器と同様の入口220、排出口230、気体
入口235及び気体出口240に加えて、図2の容器200は、混合のための撹拌機250を含む。一
部の実施態様において、撹拌機250は、モーター駆動シャフト252を含んでいてもよく、こ
れは、シャフトシール251を含み、かつ1つ以上のインペラ254に接続されていてもよい。
撹拌機250は、典型的には容器200の上部又は底面に取り付けられいていてもよい。任意に
、それぞれのインペラ254は、1つ以上のパドル256で終結していてもよい。インペラ254は
、任意の適切な形状でもよく、混合の量、宿主細胞の増殖速度、生物有機化合物の生産速
度、ずり速度、及び酸素又はその他の気体転送率を制御するように具体的に選択してもよ
い。加えて、1つ以上のバッフル258を容器200に付加して、更に混合を改善することがで
きる。別の実施態様において、撹拌は、底面などの容器の部分から材料を引き抜き、上部
などの容器の別の部分にて容器に材料を再導入するポンプを備えたリサイクルラインの形
態で供給してもよい。宿主細胞及び発酵培地の容器内での撹拌は、宿主細胞が適切な栄養
素に曝露されて、これらが増殖し、及び生物有機化合物を産生することを可能にするのを
保証するのを助ける。
【００４０】
発酵プロセスが好気プロセスである場合、気体／液体物質移動を改善させるために、酸
素又は空気を、スパージャ260を介して泡立てることができる。スパージャ260は、発酵培
地内に、好ましくは容器の底面で、又はその近くに、浸水された1つ以上の気体出口（図
示せず）を含んでいてもよい。一部の実施態様において、スパージャ260は、一般に環状
又は丸い配置で配置された、複数の気体出口を有するスパージング環であってもよい。或
いは、感受性の生物体を剪断するために、又は発泡を減少させるために、種々の通気スク
リーン、膜、線維若しくはその他の受動的な気曝装置の使用、又は容器から一部の培地を
除去し、それに酸素負荷し、及びそれを容器に返すことなどによって、容器の受動的な通
気を提供してもよい。
【００４１】
温度制御が望まれる場合、ヒーター又は熱交換器を使用して発酵反応を加熱し、又は冷
却してもよい。一つの実施態様において、温度は、容器200の少なくとも一部に囲まれ及
び又は取り付けられている加熱／冷却ジャケット270を使用して制御されていてもよく、
これは、ジャケット270を介して温度制御された熱交換液体を循環させる熱交換器（図示
せず）に接続されていてもよい。或いは、ヒーター又は熱交換器は、発酵培地に浸漬され
ていてもよい。この種のヒーター又は熱交換器の例示的な例には、電気浸漬ヒーター、加
熱水又は油などの熱交換液体を有する浸漬巻きつけ又は直線チューブ熱交換器、並びに空
気及び／又は水などの被加熱流を発酵培地に注入する1つ以上のスパージャを含む。或い
は、又は加えて、ヒーター又は熱交換器は、容器の外側に取り付けることができる。この
ようなヒーター及び熱交換器は、容器の外側の側壁上に電気的な熱テープ、及び暖められ
、又は被覆された、容器に取り付けられた再循環ラインを含む。
【００４２】
容器200は、さらなる入口及び排出口を含むことができる。一部の実施態様において、
さらなる入口及び排出口は、容器200の上面、側面又は底面に位置してもよい。一部の実
施態様において、さらなる入口は、発酵反応の間に酸素又はその他の気体、栄養素、泡及
びpH制御因子を添加するための原料ラインを含む。任意の入口及び排出口に、製造過程で
の使用を含む複数の使用、及び発酵プロセスの間の複数回の接続又は再接続のための滅菌
機構を含んでいてもよい。
【００４３】
加えて、1つ以上のプローブポート280及び／又は試料採取弁290を容器200の種々の位置
に置いて、発酵プロセスの間の種々の産物及び代謝産物の濃度、pH、液面、圧力、泡、溶
存酸素濃度、温度、撹拌速度、力、電圧、弁位置及び細胞密度などの重要なパラメーター
のモニターを補助することができる。
【００４４】
図1及び2の容器は、例示の目的のためのものであること、及び例えば、産生される宿主
細胞のタイプ、生物有機化合物又は化合物類、生産量、発酵プロセスのタイプ、下流のプ
ロセシングのタイプ、分離プロセス及びその他の考慮すべき問題に従って、発酵プロセス
のための多くの異なる容器配置を使用してもよいことを理解すべきである。
【００４５】
図2に示したものなどの容器は、バッチ発酵プロセスに使用するための適している。（
バッチ発酵プロセスと対照的に）材料が常に添加され、若しくは容器から取り除かれる連
続又は半連続発酵プロセスが望まれる場合、容器は、典型的にはさらなる入口及び排出口
を含み、これは、容器の上部、底面又は態様に位置してもよい。これらのさらなる入口及
び排出口は、容器の内及び外の材料の流れを促進する。一部の実施態様において、1つ以
上の容器が連続的に宿主細胞、発酵培地及び任意の添加物を受け、一方で容器から宿主細
胞、副産物及び／又は生物有機化合物を連続的に排出する。これらの実施態様では、1つ
の容器からの排出は、任意に新鮮な宿主細胞、発酵培地、栄養素及び／又はその他の添加
物を受ける別の容器へのフィードストックとして使用してもよい。単一の容器を、又は一
連の容器を共に、所望の平均滞流時間を宿主細胞に提供するように構成することができる
。下流の容器の1つからの排出の一部を1つ以上の上流の容器に戻して排出物をプロセシン
グのより初期の段階に再利用することができ、又は更に下流の処理工程からのその他の材
料を容器に再導入することができる。
【００４６】
本発明の一部の実施態様に使用される容器は、さらなるハードウエアを含み、これは、
プロセシングを促進するように容器に取り付けられてもよい。このようなハードウエアは
、定位置の浄化及び定位置の滅菌プロセシングを促進するためのさらなるハードウエアを
含んでいてもよい。一部の実施態様において、ポート、出口、入口、弁及び容器内部の全
てのハードウエアの1つ、いくつか又はそれぞれは、定位置で滅菌してもよい。一部の実
施態様において、滅菌は、蒸気消毒を使用して行ってもよい。例えば、ポート、出口又は
試料採取弁のいずれにも、ポート、出口又は弁に蒸気を提供し、凝縮物をこれらから戻し
、その結果、これが使用又は再利用の前に蒸気滅菌することができる、さらなるハードウ
エアを含んでいても、又はこれらに取り付けられていてもよい。
【００４７】
容器又は容器群は、少なくとも100リットルの容量を有してもよい。一部の実施態様に
おいて、容器は、少なくとも1000リットル、少なくとも5,000リットル、少なくとも10,00
0リットル、少なくとも25,000リットルの容器、少なくとも50,000リットル、少なくとも7
5,000リットル、少なくとも100,000リットル、少なくとも250,000リットル、少なくとも5
00,000リットル又は少なくとも1,000,000リットルなどの100〜3,000,000リットルの容量
を有する。
【００４８】
容器又は容器群は、圧力、pH、溶存酸素濃度、温度、気体流速、液体の流速、液面、弁
位置、発泡、撹拌、力、電圧、並びに宿主細胞の増殖、及び生物有機化合物若しくは化合
物類の産生を制御し、又は最適化するのに有用な任意のその他のパラメーターなどの種々
のパラメーターを測定するためのセンサー及びプローブを含んでいても、又はこれらに取
り付けられていてもよい。センサー及びプローブは、測定される種々のパラメーターを制
御し、及び記録するための、並びに空気流速、力、容器温度を制御するための加熱若しく
は冷却、撹拌毎分回転数、ポンプ、容器若しくは任意の入口、出口、添加、試料採取弁若
しくはその他のポートの定位置での滅菌又は浄化、出口フロー制御、又は発酵のパラメー
ター若しくはパラメーター類を制御するための任意のその他の関連した機構を制御するこ
とによって任意の種々のパラメーター調整するための、1つ以上の自動化された系に情報
を供給してもよい。このような調整は、例えば種々の弁、ポンプ若しくはモーターの制御
又は作動などの任意の公知の制御機構を使用して行ってもよく、比例、比例積分又は比例
積分微分体調節系を使用してもよい。
【００４９】
自動化された系又は系類を、加えて集中制御システムによって制御しても、及びモニタ
ーしてもよく、これは、局部的又はプラント全体の制御系であってもよく、たった1種の
生物有機化合物産生プロセス又は複数の生物有機化合物産生プロセスの産生を制御しても
よい。自動化された系又は系類及び集中制御システムは、任意の適切なソフトウェア、フ
ァームウェア及び／又はハードウエアを含んでいてもよく、これらは、専売若しくは既製
品又はこれらの組み合わせであってもよく、任意の適切な通信システムを使用して通信し
てもよい。このような通信システムの非限定的な例には、デジタルでも、又はアナログで
もよい物理的に組み込まれたシステムを含み、直結を含んでいても、又はLAN又はWAN又は
イーサネットなどのネットワークの形態であってもよい。加えて、一部の実施態様におい
て、通信システムは、無線であってもよく、TDMA、FDMA、OFDM及びCDMAを含む、専売の、
BLUETOOTH、超高域バンド、802.11 a、b、g若しくはn又はZigBeeであってもよく、2.4GHz
又は5.8GHzなどの任意の適切な周波数帯域で作動してもよい。
【００５０】
生物有機化合物の産生に使用される任意の容器内には、プロセシング若しくは発酵の任
意のその他のパラメーターを促進する、さらなる撹拌機、さらなる入口、排出口、試料採
取口、さらなる放熱コイルなどのさらなる加熱／冷房装置、さらなるスパージャなどのさ
らなる通気設備、さらなるセンサー及びプローブ、さらなる洗浄又は滅菌設備などのさら
なるハードウエアを含んでいてもよい。
【００５１】
本発明の一部の実施態様において：
a. 少なくとも100リットルの容量を有する容器；
b. 第一の相を含む、少なくとも1つの容器内の、水性媒体；
c. 一つ以上のイソプレノイドを作製し、産生し、又は合成することができる、該水性
媒体内の、複数の宿主細胞；及び
d. 該第一の相と接触して、一つ以上のイソプレノイドを含む、液体有機第二の相、
を含むイソプレノイド製造装置が提供される。
【００５２】
一部の実施態様において、イソプレノイド化合物又は化合物類は、C5イソプレノイドで
ある。これらの化合物は、1つのイソプレン単位に由来し、またヘミテルペンとも呼ばれ
る。ヘミテルペンの例示的な例は、イソプレンである。その他の実施態様において、イソ
プレノイド化合物又は化合物類は、C10イソプレノイドである。これらの化合物は、2つの
イソプレン単位に由来し、またモノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの例示的な例は
、ミルセンである。その他の実施態様において、イソプレノイド化合物又は化合物類は、
C15イソプレノイドである。これらの化合物は、3つのイソプレン単位に由来し、またセス
キテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの例示的な例は、パチョウロール（patchoulol
）（これは、パチョウリアルコールとしても知られる）。その他の実施態様において、イ
ソプレノイド化合物又は化合物類は、C20イソプレノイドである。これらの化合物は、4つ
のイソプレン単位に由来し、またジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの例示的な例は、
タキサジエン（taxadiene）である。更にその他の例において、イソプレノイド化合物又
は化合物類は、C20+イソプレノイドである。これらの化合物は、4つを上回るイソプレン
単位に由来し、以下を含む：スクアレンなどのトリテルペン（6つのイソプレン単位に由
来するC30イソプレノイド化合物）；β-カロテンなどのテトラテルペン（8つのイソプレ
ノイドに由来するC40イソプレノイド化合物）；及びポリイソプレンなどのポリテルペン
（8つを上回るイソプレン単位に由来するC40+イソプレノイド化合物）。一部の実施態様
において、イソプレノイド化合物又は化合物類は、2つ以上のイソプレノイド化合物の任
意の組み合わせであってもよい。
【００５３】
本発明の別の態様において、少なくとも1種の生物有機化合物を製造するための方法で
あって：
a. 水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を産生する複数の宿主細胞を培養す
ることであって、該水性媒体は、第一の相を含み；
b. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相
を形成すること；
c. 該第一の相から該第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること、
を含む、該方法が提供される。
【００５４】
イソプレノイド製造系には：1）少なくとも1種の生物有機化合物を水性培地及び有機第
二の相から分離するための1つ以上の分離系；2）付加、置換、水素付加、アルキル化、ヒ
ドロキシル化、縮合、ハロゲン化又はその他の任意の適切な反応などによって、該少なく
とも1種の生物有機化合物を生物学的に、又は化学的に変化させるための1つ以上の反応器
；2）該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる成分と混合するための1つ以
上の混合容器又は系；3）及び更に該生物有機組成物又は該少なくとも1種の生物有機化合
物を精製するための1種以上のさらなる精製又は分離系；を含む、1つ以上のさらなるプロ
セシング成分を含んでいてもよい。
【００５５】
第二の相には、少なくとも1種の生物有機化合物を含んでいてもよい。生物有機化合物
は、第二の相の部分、大部分又は実質的に全てを形成することができる。特定の実施態様
において、生物有機化合物は、第二の相の5%〜95%、10%〜90%、20%〜80%、25%〜75%、35%
〜65%又は40%〜50%などの1%〜99%を形成する。一部の実施態様において、第二の相は、本
質的に生物有機化合物からなる。
【００５６】
一部の実施態様において、複数の宿主細胞は、複数の宿主細胞の種又は株、例えば2〜5
種類の宿主細胞の種又は株、例えば2、3、4又は5種類の宿主細胞の種又は株などの複数の
タイプの宿主細胞を含む。一部の実施態様において、複数の宿主細胞は、2〜5種類の生物
有機化合物、例えば2、3、4又は5種類の生物有機化合物などの複数の生物有機化合物を産
生してもよい。
【００５７】
生物有機化合物又は化合物類は、任意の適切な分別法を使用して第一の相及び／又は第
二の相から単離してもよい。一部の実施態様において、生物有機化合物は、それが実質的
に純粋であるように第二の相から単離されている。
【００５８】
一部の実施態様において、有機第二の相は、溶解度若しくは疎水性、密度、濃度若しく
は任意のその他の自発的相分離機構の相違などの化学物質及び分子相互作用の結果として
、自発的に生じる。その他の実施態様において、第一及び第二の相の分離は、分離容器若
しくは容器類又は系において誘導され、これは発酵容器若しくは容器類と同じか、又は異
なる容器若しくは容器類又はプロセシング系であってもよい。一部の実施態様において、
相分離は、連続遠心分離又はバッチ遠心分離などの遠心分離によって誘導される。その他
の実施態様において、相分離は、発酵反応への無乳化剤(deamulsifier)又は成核剤の導入
によって誘導される。無乳化剤は、水相で乳化する生物有機化合物又は化合物類の量を妨
げ、又は限定する。無乳化剤の例示的な例には、凝集剤及び凝固剤を含む。成核剤は、生
物有機化合物のより小さな小滴の凝集を促進して合着させ、最終的に分離相を形成する。
成核剤の十分な量が使用される場合、成核剤自体が有機第二の相を形成し、その中に生物
有機化合物が移動する。成核剤の例示的な例には、生物有機化合物又は化合物類それ自体
の小滴並びにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル及びオレイン酸メチルなどの有機溶媒
を含む。一部の実施態様では、上記の相分離材料及び方法の1つ以上の組み合わせを含ん
でいてもよい。
【００５９】
一旦相分離が生じると、分離相は、分離容器から個々に抜き取ることができる。第二の
相の任意の量を第一の相から分離することができ、例えば第二の相の全て、一部、5%〜95
%、10%〜90%、20%〜80%、25%〜75%、35%〜65%又は40%〜50%などの1%〜100%を第一の相か
ら分離してもよい。有機第二の相が水性の第一の相よりも濃くない場合、1つ以上の栓を
二相の間（好ましくは、有機第二の相内）の境界面の近くの分離容器上に提供し、又は置
いて、より密度の高い水相を除去する前に有機第二の相を、デカントする(decant)ことが
できる。或いは、水性の第一の相を、分離容器の底面の近くの出口を使用して、有機第二
の相が見えるまで、分離容器から除去することができる。この時点で、有機第二の相をさ
らなるプロセシング又は貯蔵のために別々の位置に移すことができる。水性の第一及び有
機第二の相の両方を、重力下、気体圧力、又はポンプ若しくはポンプ類の使用により、又
はこれらの組み合わせで分離容器の外に流れることができる。
【００６０】
有機第二の相が水性の第一の相より濃い場合、1つ以上の栓を、二相の間の境界面の近
く（好ましくは、有機第二の相内）の分離容器上に提供し、又は置いて、より密度の高い
有機第二の相を除去する前に水性の第一の相をデカントすることができる。或いは、有機
第二の相を、分離容器の底面の近くの出口を使用して、分離容器から除去してもよい。
【００６１】
水性の第一の相が有機第二の相よりも濃い連続法については、1つ以上の栓を備えた分
離容器には、発酵培地及び宿主細胞の特定された量を含むことができ、連続して産生され
る有機第二の相を、栓を介してデカントして貯蔵し、又は更にプロセシングしてもよい。
有機第二の相が水性の第一の相よりも濃い場合、有機第二の相を分離容器から有機第二の
相の完全な枯渇を防止する速度で連続的に分離容器の底面から除去して、水性の第一の相
から抜き取るのを回避することができる。
【００６２】
一部の実施態様において、生物有機化合物は、分子が大量の液体から吸着剤の表面上に
移動する過程である吸着を使用して有機第二の相から単離してもよい。吸着剤の例示的な
例には、活性炭；アルミナ；ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩；フラー土などの粘土；
モレキュラーシーブ；ポリスチレン及び樹脂などの有機重合体；並びにシリカゲルのよう
なシリカ；を含む。使用する吸着剤に応じて、吸着剤は、所望の生物有機産物又は望まれ
ない副産物を捕獲するために使用してもよい。吸着による単離は、バッチプロセス、連続
プロセス又は半連続プロセスを使用して行ってもよい。
【００６３】
その他の実施態様において、生物有機化合物は、これらの揮発度の相違に基づいて物質
を分離する方法である蒸留を使用して有機第二の相から単離してもよい。バッチ蒸留では
、液体の全てのバッチを最初に容器に充填し、次いで、容器内で加熱し、又は圧力を減少
させる。これにより、蒸気が連続的に発生し、濃縮されて液体留出物を形成させ、これを
収集することができる。連続平衡蒸留では、混合物の部分的な気化を生じさせて液体及び
蒸気成分を別々に回収するために、連続して流れている液体供給を加熱し、又は圧力を減
少させる。液体及び蒸気は、蒸留塔を通って流れると共に、生成物が蒸気及び液体流とし
て現れる。蒸気及び液体アプローチ相平衡のときは、これをフラッシングプロセスと呼ぶ
。必要に応じて、蒸気生成物を凝縮して、液体留出物を形成することができる。
【００６４】
その他の実施態様において、生物有機化合物又は化合物類は、気体-液体抽出を使用し
て有機第二の相から単離される。この過程は、ストリッピングとしても知られ、液体流に
溶解された成分のより濃縮された形態の蒸気流への転換である。温度及び圧力は、所望の
生物有機化合物の転換のために最適化することができる。蒸気流の例示的な例には、空気
及び蒸気を含む。典型的には、液体流は、カラムを下に流れるが、蒸気流は、上へ泡立つ
（液体流に向流的に流れる）。
【００６５】
その他の実施態様において、生物有機化合物は、液-液抽出を使用して有機第二の相か
ら単離されている。溶媒抽出としても知られる液-液抽出は、液相から別の相互不溶性液
体相への物質の移動である。
【００６６】
バッチ液-液抽出系では、供給液体（有機第二の相）を適切な容器において第二相互不
溶性液体相と混合させる。次いで、混合物を層に定着させて、抽出物とラフィネートとを
分離し、より軽い層を容器からデカントすることができる。所望の生物有機化合物又は化
合物類を、使用される製品及び溶媒に応じて、抽出物又はラフィネート内にすることがで
きる。
【００６７】
連続液-液抽出系では、密度の相違、所与の温度における蒸気圧、又は沸点を使用して
、供給液体（有機相）から所望の生物有機生成物を分離する。このような系には、分離を
達成するためにミキサー／沈澱器タンク、タワー又はカラム、遠心機及びこれらの組み合
わせを使用することができる。
【００６８】
その他の実施態様において、生物有機化合物は、限外濾過、分子サイズ及び形状に基づ
いて溶液成分を分離するために使用される圧力駆動膜過程を使用して、有機第二の相及び
／又は水性の第一の相から単離される。限外濾過膜の間の加圧力の相違の下で、溶媒及び
小溶質種は、膜を通過して透過物として収集されるが、より大きな溶質種は、膜によって
保持されて、濃縮された保留物として回収される。限外濾過は、分子寸法が溶媒のものよ
りも10倍以上大きく、かつ通常1/2ミクロンのサイズを下回る溶質を含む。巨大分子、コ
ロイド分散及び乳剤などの通常分離される溶質又は材料は、500amuよりも大きい分子量を
有する。限外濾過系の非限定的な例は、接線流限外濾過系（tangential flow ultrafiltr
ation system）である。
【００６９】
一部の実施態様において、宿主細胞は、発酵培地1リットルあたり約10〜約50グラム、
約15グラムを上回る、約20グラムを上回る、約25グラムを上回る又は約30グラムを上回る
生物有機化合物を産生することができる。
【００７０】
一部の実施態様において、宿主細胞は、乾燥菌体重量1グラムあたり約100ミリグラムを
上回る、約150ミリグラムを上回る、約200ミリグラムを上回る、約250ミリグラムを上回
る、約500ミリグラムを上回る、約750ミリグラムを上回る又は約1000ミリグラムを上回る
などの約50〜約1500ミリグラムの生物有機化合物を産生することができる。
【００７１】
（燃料組成物製造系）
一部の実施態様において、本発明は、
a. 少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも一つの容器； 
b. 第一の相を含む、該容器内の、水性媒体；
c. 少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成することができる、該
水性媒体内の、複数の宿主細胞；及び、
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相
、
を含む燃料組成物製造装置を含む。
燃料組成物製造系は、1）少なくとも1種の生物有機化合物を水性培地及び有機第二の相
から分離するための1つ以上の分離系；2）付加、置換、水素付加、アルキル化、ヒドロキ
シル化、縮合、ハロゲン化又はその他の任意の適切な反応などによって、該少なくとも1
種の生物有機化合物を生物学的に、又は化学的に変化させるための1つ以上の反応器；2）
該少なくとも1種の生物有機化合物を、石油に基づく燃料、燃料添加物又はこれらの組み
合わせなどの1種以上のさらなる燃料成分と混合するための1つ以上の混合容器又は系；3
）及び更に該燃料組成物又は前記少なくとも1種の生物有機化合物を精製するための1種以
上のさらなる精製又は分離系；を含む、1つ以上のさらなるプロセシング成分を含んでい
てもよい。
【００７２】
一部の実施態様において、燃料添加物は、酸素化物、抗酸化剤、環境保護剤、熱安定性
向上剤、セタン向上剤、安定剤、寒冷流動性向上剤、燃料油助燃剤、消泡剤、抗くもり添
加物、腐食抑制剤、潤滑性向上剤、アイシング阻害剤、注射器清浄添加物、煙抑制剤、ド
ラグ減少添加物、金属活性低下剤、分散剤、洗浄剤、無乳化剤、色素、マーカー、静電気
消散剤（dissipaters）、殺生物剤及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７３】
一部の実施態様において、燃料組成物製造装置は：
a）以下を含む1つ以上のバッチ発酵装置、流加式発酵装置又は連続流発酵装置：
i）少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
ii）第一の相を含む、該少なくとも１つの容器内の、水性媒体；
iii）少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成することができる
、該水性媒体内の、複数の宿主細胞；及び、
iv）該第一の相と接触して、少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の
相；
b） 1つ以上の第一の相分離装置であって、これにより、該第一の相及び該第二の有機
相又は第二の有機相の1つ若しくは複数の成分が分離される、該第一の相分離装置；
c） 任意に、1つ以上の第二の相分離装置であって、これにより、該少なくとも1種の生
物有機化合物が該第二の有機相から分離される、該第二の相分離装置；
d） 任意に、1つ以上の反応器又は容器であって、少なくとも1種の生物有機化合物が化
学的又は生物学的に修飾される、該反応器又は容器；
e） 任意に、1つ以上の精製装置であって、該生物有機化合物又は該修飾された生物有
機化合物が精製され、又は更に精製される、該精製装置；
f） 任意に、該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合す
るための1つ以上の混合容器又は装置；及び、
g）任意に、1つ以上のさらなる精製装置であって、これにより、該1種以上の生物有機
化合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物が精製され、又は更に精製される、該
精製装置；
を含む。
【００７４】
一部の実施態様において、1つ以上の第一の相分離装置は、第一の相を第二の有機相か
ら分離するために特異的に配置された本明細書に詳細に示した1つ以上の装置、容器又は
その他の相分離構成成分を含む。一部の実施態様において、1つ以上の第二の相分離装置
には、生物有機化合物又は化合物類を第二の有機相から分離するために特異的に配置され
た本明細書に詳細に示した1つ以上の装置、容器又はその他の相分離構成成分を含む。
【００７５】
一部の実施態様において、少なくとも1種の生物有機化合物が化学的又は生物学的に修
飾されている1つ以上の反応器には、発酵若しくは分離装置のために使用したのと同じか
、若しくは異なる容器又は容器類を含む。或いは、1つ以上の反応器には、1つ以上の異な
る容器を含み、これは、特定の反応若しくは反応類、又はその中で行われる生物有機化合
物又は化合物類に対するその他の修飾のために適したさらなるハードウエア、センサー、
ポート、プローブ及び／又は制御システムを含んでいてもよい。反応器は、バッチ反応器
、流加式反応器又は連続反応器であってもよい。
【００７６】
一部の実施態様において、生物有機化合物又は修飾された生物有機化合物又は燃料組成
物は、1つ以上の精製装置を使用して精製しても、又は更に精製してもよい。精製装置に
は、生物有機化合物又は化合物類から望まれない化合物を除去できる、又は望まれない化
合物を生物有機化合物から分離できる任意の装置を含む、任意の適切な精製装置を含んで
いてもよい。一部の実施態様において、精製装置には、所望の生物有機化合物又は化合物
類の純度を達成するように特異的に配置された本明細書に詳細に示した1つ以上の装置、
容器又は相分離構成成分を含む。一部の実施態様において、精製は、所望の純度を達成す
るための連続した1つ以上の分離装置を使用して達成してもよい。一部の実施態様におい
て、分離装置は、段階的な様式で純度を達成するために、互いに異なって構成してもよい
。
【００７７】
一部の実施態様において、精製は、生物有機化合物について、又は燃料組成物について
、連邦政府、州若しくは地方の法律、規則又は規制を達成するために行われるであろう。
一部の実施態様において、精製は、連邦政府若しくは州の法律、規則若しくは規制の規格
を越えて、生物有機化合物又は燃料組成物の機能性を改善することができる。一部の実施
態様において、連邦政府、州若しくは地方の法律、規則又は規制は、環境排出、燃料性能
、税制上の遇税及びその他の経済的遇税に属してもよい。一部の実施態様において、精製
は、生物有機化合物又は燃料組成物の環境影響、それらの炭素フットプリント、それらの
得られる信頼性、それらからの燃料効率、それらからの利用可能なエネルギー、又は長期
の経済的コストを減少させるであろう。
【００７８】
一部の実施態様において、燃料組成物装置は、少なくとも1種の生物有機化合物を1種以
上のさらなる燃料成分と混合するための1つ以上の混合容器又は装置を含む。混合容器又
は混合装置は、任意の適切な容器又は装置であってもよい。混合容器には、生物有機化合
物産生容器のために特定された、入口、出口、ポート、センサー、プローブ、撹拌機及び
その他のハードウエアのいずれか又は全てを含んでいてもよい。混合容器により、1種以
上の燃料成分を生物有機化合物又は化合物と混合してもよい。例えば3又は4種の燃料成分
などの2〜5種の燃料成分。混合装置は、バッチ、連続、又は流加式であってもよい。
【００７９】
一部の実施態様において、本発明は：
a.水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を産生し、作製し、又は合成する複
数の宿主細胞を培養することであって、該水性媒体は、第一の相を含み；
b. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相
を形成すること；
c. 該第一の相から該第二の相の少なくとも一部を分離すること；
d. 該第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること；
e. 任意に、該少なくとも1種の生物有機化合物を化学的又は生物学的に修飾すること；
f. 任意に、該生物有機化合物又は修飾された生物有機化合物を精製すること；
g. 任意に、該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合す
ること；及び、
g). 任意に、該1種以上の生物有機化合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物を
精製すること、
を含む燃料組成物を製造する方法を含む。
【００８０】
一部の実施態様において、燃料組成物には、生物燃料組成物を含む。一部の実施態様に
おいて、生物燃料には、少なくとも1種の生物有機化合物、及び石油に基づいた燃料、燃
料添加物又はこれらの組み合わせを更に含む。さらなる実施態様において、石油に基づい
た燃料は、ガソリン、ジェット燃料、灯油、ディーゼル燃料又はこれらの組み合わせであ
る。
【００８１】
一部の実施態様において、生物有機化合物製造装置又は燃料組成物製造装置は、エタノ
ール製造設備を改造することによって建設しても、又は作製してもよい。
【００８２】
一部の実施態様において、燃料組成物製造装置には、1つ以上の自動化された調節装置
を含んでいてもよい。自動化された調節装置は、生物有機製造装置のための調節装置と同
じでも、又は異なっていてもよく、燃料組成物装置内のそれぞれの装置及びそれぞれの工
程又は燃料組成物製造方法と関連する種々のプロセスパラメーターを測定し、及び制御す
るための各種センサー、プローブ及びその他の設備を含んでいてもよい。自動化された装
置又は装置類を、加えて集中制御システムによって制御しても、及びモニターしてもよく
、これは、局部的又はプラント全体の制御装置であってもよく、たった1種の生物有機化
合物産生プロセス又は複数の生物有機化合物産生プロセスの産生を制御してもよい。自動
化された装置又は装置類及び集中制御システムは、任意の適切なソフトウェア、ファーム
ウェア及び／又はハードウエアを含んでいてもよく、これらは、専売若しくは既製品又は
これらの組み合わせであってもよく、任意の適切な通信システムを使用して通信してもよ
い。このような通信システムの非限定的な例には、デジタルでも、又はアナログでもよい
物理的に組み込まれたシステムを含み、直結を含んでいても、又はLAN又はWAN又はイーサ
ネットなどのネットワークの形態であってもよい。加えて、一部の実施態様において、通
信システムは、無線であってもよく、TDMA、 FDMA、OFDM及びCDMAを含む、専売の、BLUET
OOTH、超高域バンド、802.11 a、b、g若しくはn又はZigBeeであってもよく、2.4GHz又は5
.8GHzなどの任意の適切な周波数帯域で作動してもよい。
【００８３】
（宿主細胞）
任意の適切な宿主細胞を発明の実施に使用することができる。一部の実施態様において
、宿主細胞は、所望の生物有機化合物を産生するか、又は所望の生物有機化合物の収率の
増加を行うために、核酸分子が挿入され、欠失され、又は修飾された（すなわち、変異さ
れた；例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又は反転による）遺伝子改変宿主
微生物である。
【００８４】
適切な宿主細胞の例示的な例には、任意の古細菌、細菌又は真核生物の細胞を含む。古
細菌細胞の例には、以下の属に属するものを含むが、限定されない：アエロピルム属（Ae
ropyrum）、アーケオグロブス属（Archaeglobus）、ハロバクテリウム属（Halobacterium
）、メタノコックス属（Methanococcus）メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、
パイロコッカス属（Pyrococcus）、スルフォロブス属（Sulfolobus）及びサーモプラズマ
属（Thermoplasma）。古細菌種の例示的な例には、以下を含むが、限定されない：超好熱
性古細菌（Aeropyrum pernix）、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgid
us）、メタン生成古細菌（Methanococcus jannaschii）、メタノバクテリウム・サーモオ
ートトロピカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、パイロコッカス・アビシ（
Pyrococcus abyssi）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、サーモ
プラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、サーモプラズマ・ボルカニウ
ム（Thermoplasma volcanium）。
【００８５】
細菌細胞の例には、以下の属に属するものを含むが、限定されない：アグロバクテリウ
ム属（Agrobacterium）、アリサイクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ属（A
nabaena）、アナシスティス属（Anacystis）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、ア
ゾバクター属（Azobacter）、バシラス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Breviba
cterium）、クロマティウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コ
リネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エル
ウィニア属（Erwinia）、エシュリヒア属（Escherichia）、乳酸桿菌属（Lactobacillus
）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、メソリゾビウム属（Mesorhizobium）、メチロバ
クテリウム属（Methylobacterium）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、フォル
ミディウム属（Phormidium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドバクター属（Rho
dobacter）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム属（Rhodospi
rillum）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サルモネラ（Salmonella）、セネデスムス
属（Scenedesmun）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、ブドウ球菌属（S
taphlococcus）、ストレプトマイセス属（Strepromyces）、シネコッカス属（Synnecoccu
s）及びザイモモナス属（Zymomonas）。
【００８６】
細菌種の例示的な例は、以下を含むが、限定されない：枯草菌（Bacillus subtilis）
、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacines)、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアジェネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマ
リオフィラム（Brevibacterium immariophilum）、クロストリジウム ベイエリンキイ（C
lostridium beigerinckii）、エンテロバクター・サカザキ （Enterobacter sakazakii）
、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、
メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、
シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、シュードモナス・プジカ（Pse
udomonas pudica）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバ
クター・スフェロイデス（Rodobacter sphaeroides）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhod
ospirillum rubrum）、腸炎菌（Salmonella enterica）、チフス菌（Salmonella typhi）
、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、
フレキシナ赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus）、その他。  
【００８７】
一般に、細菌宿主細胞が使用される場合、非病原性の株が好ましい。非病原性の株であ
る種の例示的な例には、以下を含むが、限定されない：枯草菌（Bacillus subtilis）、
大腸菌（Escherichia coli）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラク
トバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、緑膿菌（Pseudomonas aeru
ginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、プチダ菌（Pseudom
onas pudita）、ロドバクター・スフェロイデス（Rodobacter sphaeroides）、ロドバク
ター・カプスラータ（Rodobacter capsulatus）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospir
illum rubrum）、その他。
【００８８】
真核細胞の例には、真菌細胞を含むが、限定されない。真菌細胞の例には、以下の属に
属するものを含むが、限定されない：コウジカビ属（Aspergillus）、カンジダ属（Candi
da）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クリプトコッカス属（Cryotococcus）、
フザリウム属（Fusarium）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ネオティホジウム
属（Neotyphodium）、アカパンカビ属（Neurospora）、ペニシリウム属（Penicillium）
、ピチア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、トリコデルマ属（Trich
oderma）及びキサントフィロマイセス属（Xanthophyllomyces）（以前はファフィア属（P
haffia））。
【００８９】
真核生物の種の例示的な例には、以下を含むが、限定されない：アスペルギルス・ニデ
ュランス（Aspergillus nidulans）、クロカビ（Aspergillus niger）、コウジカビ（Asp
ergillus oryzae）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、クリソスポリウム・ルクノ
エンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium gramin
earum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、クルイベロミセス・ラクチ
ス（Kluyveromyces lactis）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、ピチア・アングス
タ（Pichia angusta）、ピチア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピチア・コ
ダメ（Pichia kodamae）、ピチア・メンブラネファシエンス（Pichia membranaefaciens
）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・オプンチアエ（Pichia opunt
iae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・ピジペリ（Pichia pijperi）
、ピチア・クレルクウム（Pichia quercuum）、ピチア・サリクタリア（Pichia salictar
ia）、ピチア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピチア・トレハロフィラ
（Pichia trehalophila）、ピチア・スチピリス（Pichia stipitis）、ストレプトマイセ
ス・アムボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオ
ファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・オーレウス（Strep
tomyces aureus）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccaromyces bayanus）、サッカロマ
イセス・ブラウディ（Saccaromyces boulardi）、サッカロマイセス・セレビジエ（Sacch
aromyces cerevisiae）、ストレプトマイセス・フンギシジカス（Streptomyces fungicid
icus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモジェネス（Streptomyces griseochromogen
es）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス
・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Str
eptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、
ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイ
セス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、トリコデルマ・レッセイ（Trichoderma r
eesei）及びキサントフィロマイセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous
）（以前はファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma））。
【００９０】
一般に、真核細胞が使用される場合、非病原性の株が好ましい。非病原性の株である種
の例示的な例には、以下を含むが、限定されない：フザリウム・グラミネアラム（Fusari
um graminearum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ピチア・パストリ
ス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・ブラウディ（Saccaromyces boulardi）及び
サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）。
【００９１】
一部の実施態様において、本発明の宿主細胞は、GRAS又は一般に安全と認められると食
品医薬品局によって指定されている。このような株の例示的な例には、以下を含む：枯草
菌（Bacillus subtilis）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラクトバ
チルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）及びサッカロマイセス・セレビジ
エ（Saccharomyces cerevisiae）。
【００９２】
（生物有機化合物を製造するための操作経路）
生物有機化合物のクラスの例示的な例は、イソプレノイドである。これらには、40,000
以上の個々の生成物の多様なファミリーを含み、これらの多くは、生きた生物に重要であ
る。イソプレノイドは、細胞の流動度、電子伝達及びその他の代謝機能を維持するために
役立つ。燃料組成物を製造する際のこれらの有用性に加えて、非常に多くの天然及び合成
イソプレノイドが、医薬、化粧品、香料、色素及び着色剤、殺真菌薬、防腐剤、機能性食
品、並びにファインケミカル中間体として有用である。
【００９３】
イソプレノイド化合物は、IPP及びその異性体であるDMAPPに収斂する2つの異なる代謝
経路を介して天然において作製される。一般に、植物以外の真核生物は、アセチル-CoAを
IPPに変換するMEVイソプレノイド経路のみを使用し、これをその後にDMAPPに異性化させ
る。原核生物は、いくつかの例外があるが、メバロン酸非依存的経路又はDXP経路を使用
して、枝分れ点を介してIPP及びDMAPPを別々に産生する。一般に、植物は、IPP合成のた
めにMEV及びDXP経路の両方を使用する。所望のイソプレノイド化合物を作製するためのME
V及びDXP経路を操作するための本明細書に記述した方法は、その他の生物有機化合物作製
するためにその他の経路を同じように操作するように容易に適応させることができる。
【００９４】
（MEV経路）
MEV経路の概略図を図3に記述してある。一般に、経路には、6つのステップを含む。
【００９５】
第1ステップでは、アセチル補酵素Aの2つの分子を酵素的に結合させて、アセトアセチ
ル-CoAを形成させる。このステップを触媒することが知られている酵素は、例えばアセチ
ル-CoAチオラーゼ（アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼとしても知られる）である
。ヌクレオチド配列の例示的な例には、以下のGenBankアクセッション番号及び配列が：
（NC_000913領域：2324131..2325315；大腸菌（Escherichia coli））、（D49362；脱窒
細菌（Paracoccus denitrificans））及び（L20428；サッカロマイセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae））に由来する生物体を含むが、限定されない。
【００９６】
MEV経路の第2ステップでは、アセトアセチル-CoAをアセチル-CoAの別の分子と酵素的に
縮合させて、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）を形成させる。このステ
ップを触媒することが知られている酵素は、例えばHMG-CoAシンターゼである。ヌクレオ
チド配列の例示的な例には：（NC_001145. 相補19061..20536；サッカロマイセス・セレ
ビジエ（Saccharomyces cerevisiae））（X96617；サッカロマイセス・セレビジエ（Sacc
haromyces cerevisiae））、（X83882；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（
AB037907；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（BT007302；ヒ
ト）及び（NC_002758、座位タグSAV2546、遺伝子ID 1122571；黄色ブドウ球菌（Staphylo
coccus aureus））を含むが、限定されない。
【００９７】
第3ステップでは、HMG-CoAを酵素的にメバロネートに変換させる。このステップを触媒
することが知られている酵素は、例えばHMG-CoAレダクターゼである。ヌクレオチド配列
の例示的な例には：（NM_206548；キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）
（NC_002758、座位タグSAV2545、遺伝子ID 1122570；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus a
ureus）、（NM_204485；ニワトリ（Gallus gallus））、（AB015627；ストレプトマイセ
ス属種（Streptomyces sp. KO 3988）、（AF542543；ハナタバコ（Nicotiana attenuata
）、（AB037907；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（AX1282
13、切断されたHMGRをコードする配列を提供する；サッカロマイセス・セレビジエ（Sacc
haromyces cerevisiae））及び（NC_001145：相補115734..118898；サッカロマイセス・
セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））を含むが、限定されない。
【００９８】
第4ステップでは、メバロネートを酵素的にメバロネート5-ホスフェートにリン酸化さ
せる。このステップを触媒することが知られている酵素は、例えばメバロン酸キナーゼで
ある。ヌクレオチド配列の例示的な例は：（L77688；シロイヌナズナ（Arabidopsis thal
iana））及び（X55875；サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））
を含むが、限定されない。
【００９９】
第5ステップでは、第二リン酸基をメバロネート5-リン酸に酵素的に付加してメバロネ
ート5-ピロリン酸を形成させる。このステップを触媒することが知られている酵素は、例
えばホスホメバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の例示的な例には：（AF429385
；パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）、（NM_006556；ヒト）及び（NC_001145.相補712
315..713670；サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））を含むが
、限定されない。
【０１００】
第6ステップでは、メバロネート5-ピロリン酸をIPPに酵素的に変換させる。このステッ
プを触媒することが知られている酵素は、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラー
ゼである。ヌクレオチド配列の例示的な例には：（X97557；サッカロマイセス・セレビジ
エ（Saccharomyces cerevisiae））、（AF290095；エンテロコッカス・ヘシュウム（Ente
rococcus faecium））及び（U49260；ヒト）を含むが、限定されない。
【０１０１】
IPPがDMAPPに変換される場合、第7ステップが必要とされる。このステップを触媒する
ことが知られている酵素は、例えばIPPイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の例示的
な例は：（NC_000913, 3031087..3031635；大腸菌（Escherichia coli））及び（AF08232
6；ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis））を含むが、限定されな
い。DMAPPへの変換が必要である場合、IPPイソメラーゼの発現増加により、IPPのDMAPPへ
の変換が経路全体にわたる律速段階を表さないことを保証する。
【０１０２】
（DXP経路）
DXP経路の概略図を図4に記述してある。一般に、DXP経路は、7つのステップを含む。第
1ステップでは、ピルベートをD-グリセルアルデヒド3-ホスフェートと縮合させて、1-デ
オキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートを作製する。このステップを触媒することが知ら
れている酵素は、例えば1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼである。
ヌクレオチド配列の例示的な例は：（AF035440；大腸菌（Escherichia coli））、（NC_0
02947、座位タグPP0527；プチダ菌（Pseudomonas pudita）KT2440）、（CP000026、座位
タグSPA2301；パラチフ菌（Salmonella enterica Paratyphi）、ATCC 9150を参照された
い）、（NC_007493、座位タグRSP_0254；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter s
phaeroides）2.4.1）,（NC_005296、座位タグRPA0952；ロドシュードモナス・パルストリ
ス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009）、（NC_004556、座位タグPD1293；ピアス病
菌（Xylella fastidiosa Temecula1）及び（NC_003076、座位タグAT5G11380；シロイヌナ
ズナ（Arabidopsis thaliana））を含むが、限定されない。
【０１０３】
第2ステップでは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートが2C-メチル-D-エリス
リトール-4-ホスフェートに変換される。このステップを触媒することが知られている酵
素は、例えば1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートリダクトイソメラーゼである。
ヌクレオチド配列の例示的な例には：（AB013300；大腸菌（Escherichia coli））、（AF
148852；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（NC_002947、座位タグPP1597；
プチダ菌（Pseudomonas putida）KT2440）、（AL939124、座位タグSCO5694；ストレプト
マイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor） A3（2））、（NC_007493、座位タ
グRSP_2709；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides） 2.4.1）及び
（NC_007492、座位タグPfl_1107；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）PfO-1）を含むが
、限定されない。
【０１０４】
第3ステップでは2C-メチル-D-エリスリトール-4-ホスフェートが4-ジホスホシチジル-2
C-メチル-D-エリスリトールに変換される。このステップを触媒することが知られている
酵素は、例えば4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールシンターゼである。ヌ
クレオチド配列の例示的な例には：（AF230736；大腸菌（Escherichia coli））、（NC_0
07493、座位タグRSP_2835；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）
2.4.1）、（NC_003071、座位タグAT2G02500；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
）及び（NC_002947、座位タグPP1614；プチダ菌（Pseudomonas putida）KT2440）を含む
が、限定されない。
【０１０５】
第4ステップでは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールが4-ジホスホシチ
ジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-ホスフェートに変換される。このステップを触媒す
ることが知られている酵素は、例えば4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール
キナーゼである。ヌクレオチド配列の例示的な例には：（AF216300；大腸菌（Escherichi
a coli））及び（NC_007493、座位タグRSP_1779；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodo
bacter sphaeroides）2.4.1）を含むが、限定されない。
【０１０６】
第5ステップでは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-ホスフェート
が2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロジホスフェートに変換される。このステップを
触媒することが知られている酵素は、例えば2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロジホ
スフェートシンターゼである。ヌクレオチド配列の例示的な例は：（AF230738；大腸菌（
Escherichia coli））、（NC_007493、座位タグRSP_6071；ロドバクター・スフェロイデ
ス（Rhodobacter sphaeroides）2.4.1）及び（NC_002947、座位タグPP 1618；プチダ菌（
Pseudomonas putida）KT2440）を含むが、限定されない。
【０１０７】
第6ステップでは、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロジホスフェートが1-ヒドロ
キシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル-4-ジホスフェートに変換される。このステップを触媒
することが知られている酵素は、例えば1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル-4-ジ
ホスフェートシンターゼである。ヌクレオチド配列の例示的な例には：（AY033515；大腸
菌（Escherichia、coli）、（NC_002947、座位タグPP0853；プチダ菌（Pseudomonas puti
da）KT2440）及び（NC_007493、座位タグRSP_2982；ロドバクター・スフェロイデス（Rho
dobacter sphaeroides）2.4.1）を含むが、限定されない。
【０１０８】
第7ステップでは、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル-4-ジホスフェートがIPP
又はその異性体であるDMAPPに変換される。このステップを触媒することが知られている
酵素は、例えばイソペンチル／ジメチルアリルジホスフェートシンターゼである。ヌクレ
オチド配列の例示的な例は：（AY062212；大腸菌（Escherichia coli））及び（NC_00294
7、座位タグPP0606；プチダ菌（Pseudomonas putida）KT2440）を含むが、限定されない
。
【０１０９】
一部の実施態様において、宿主細胞の自体の代謝プロセスと本発明によって提供される
IPPの産生に関与するプロセスとの間の「クロストーク」（又は干渉）は、最小化され、
又は完全に除去される。例えば、宿主微生物がIPPを合成するためのDXP経路のみに依存し
、かつMEV経路がさらなるIPPを提供するために導入されるときに、クロストークは、最小
化され、又は完全に除去される。このような宿主生物は、MEV経路酵素の発現を変化させ
、又はMEV経路に関連した中間体をプロセスする能力がないであろう。もっぱら、又は主
にDXP経路に依存する生物体には、例えば大腸菌（Escherichia coli）を含む。
【０１１０】
一部の実施態様において、宿主細胞は、もっぱら、又はDXP経路と組み合わせて、MEV経
路を介してIPPを産生する。その他の実施態様において、宿主のDXP経路は、宿主細胞が、
異種性に導入されたMEV経路を介してもっぱらIPPを産生するように、機能的に無能にされ
る。DXP経路は、遺伝子発現を無能にすること、又は天然に存在するDXP経路酵素の1つ以
上の機能を不活性化することによって、機能的に無能にすることができる。
【０１１１】
その他の実施態様において、宿主細胞は、もっぱら、又はMEV経路と組み合わせて、DXP
経路を介してIPPを産生する。その他の実施態様において、宿主のMEV経路は、もっぱら宿
主細胞が異種性に導入されたDXP経路を介してIPPを産生するように、機能的に無能にされ
る。MEV経路は、遺伝子発現を無能にすること、又は天然に存在するMEV経路酵素の1つ以
上の機能を不活性化することによって、機能的に無能にすることができる。
【０１１２】
（C5化合物）
例示的C5生物有機化合物は、一般にIPP又はDMAPPに由来するヘミテルペンである。ヘミ
テルペンの例示的な例は、イソプレンである。
【０１１３】
（イソプレン）
その構造が
【化１】
2020018319.tif 000003
であるイソプレンは、多くの植物で見いだされる。イソプレンは、イソプレンシンターゼ
によってIPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には：（AB 198190；
ウラジロハコヤナギ（Populus alba））及び（AJ294819；ウラジロハコヤナギ（Populus 
alba）×ヨーロピアンアスペン（Polulus tremula））を含むが、限定されない。
【０１１４】
（C10化合物）
例示的C10生物有機化合物は、ゲラニルピロリン酸（GPP）に由来し、次にDMAPPとIPPの
縮合によって作製されるモノテルペンである。この工程を触媒することが知られている酵
素は、例えばゲラニルピロリン酸シンターゼである。
【０１１５】
図5は、どのようにIPP及びDMAPPがGPPを産生することができるかを模式的に示し、これ
を更にモノテルペンにプロセスすることができる。
【０１１６】
ゲラニルピロリン酸シンターゼのためのヌクレオチド配列の例示的な例には：（AF5131
11；アメリカオオモミ（Abies grandis））、（AF513112；アメリカオオモミ（Abies gra
ndis））、（AF513113；アメリカオオモミ（Abies grandis））、（AY534686；キンギョ
ソウ（Antirrhinum majus））、（AY534687；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（
Y17376；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（AE016877、座位AP 11092；セレ
ウス菌（Bacillus cereus）；ATCC 14579）、（AJ243739；オレンジ（Citrus sinensis）
）、（AY534745；クラルキアブリウェリ（Clarkia breweri））、（AY953508；イプス・
パイニ（Ips pini））、（DQ286930；トマト（Lycopersicon esculentum））、（AF18282
8；ペパーミント（Mentha x piperita）、（AF182827；ペパーミント（Mentha x piperit
a））、（MPI249453；ペパーミント（Mentha x piperita））、（PZE431697、座位CAD244
25；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens））
、（AY866498；コオウレン（Picrorhiza kurrooa））、（AY351862；ブドウ（Vitis vini
fera））及び（AF203881、座位AAF12843；ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis
））を含むが、限定されない。
【０１１７】
次いで、GPPを種々のC10化合物に変換させる。C10化合物の例示的な例には以下を含む
が、限定されない：
【０１１８】
（カレン）
その構造が
【化２】
2020018319.tif 000004
であるカレンは、多くの樹木、特に松の樹脂において見いだされる。カレンは、カレンシ
ンターゼによりGPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には：（AF461
460、領域 43..1926；オウシュウトウヒ（Picea abies））及び（AF527416、領域：78..1
871；サルビア・ステノフィラ（Salvia stenophylla））を含むが、限定されない。
【０１１９】
（ゲラニオール）
その構造が
【化３】
2020018319.tif 000005
であるゲラニオール（ロドノール（rhodnol）としても知られる）は、バラ油及びパルマ
ローザ油の主要構成要素である。これは、ゼラニウム、レモン及びコウスイガヤにも存在
する。ゲラニオールは、ゲラニオールシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌ
クレオチド配列の例示的な例には：（AJ457070；シナモン・テヌイピルム（Cinnamomum t
enuipilum））、（AY362553；スイートバジル（Ocimum basilicum））、（DQ234300；シ
ソ（Perilla frutescens）株1864）、（DQ234299；レモンエゴマ（Perilla citriodora）
株1861）、（DQ234298；レモンエゴマ（Perilla citriodora）株4935）及び（DQ088667；
レモンエゴマ（Perilla citriodora））を含むが、限定されない。
【０１２０】
（リナロオール）
【０１２１】
その構造が
【化４】
2020018319.tif 000006
であるリナロオールは、コリアンダー種子などの多くの花及び香辛料植物において見いだ
される。リナロールは、リナロールシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌク
レオチド配列の例示的な例には：（AF497485；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
）、（AC002294、座位AAB71482；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（AY0597
57；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（NM_104793；シロイヌナズナ（Arabi
dopsis thaliana））、（AF154124；クソニンジン（Artemisia annua））、（AF067603；
クラルキアブリウェリ（Clarkia breweri））、（AF067602；レッドリボン（Clarkia con
cinna））、（AF067601；クラルキアブリウェリ（Clarkia breweri））、（U58314；クラ
ルキアブリウェリ（Clarkia breweri））、（AY840091；トマト（Lycopersicon esculent
um））、（DQ263741；イングリッシュラベンダー（Lavandula angustifolia））、（AY08
3653；ベルガモットミント（Mentha citrate））、（AY693647；スイートバジル（Ocimum
basilicum））、（XM_463918；イネ（Oryza sativa））、（AP004078、座位BAD07605；
イネ（Oryza sativa））、（XM_463918、座位XP_463918；イネ（Oryza sativa））、（AY
917193；レモンエゴマ（Perilla citriodora））、（AF271259；シソ（Perilla frutesce
ns））、（AY473623；オウシュウトウヒ（Picea abies））、（DQ195274；シトカスプル
ース（Picea sitchensis））及び（AF444798；アカシソ（Perilla frutescens var. cris
pa）栽培品種番号79）を含むが、限定されない。
【０１２２】
（リモネン）
その構造が
【化５】
2020018319.tif 000007
であるリモネンは、柑橘類果実及びペパーミントの皮において見いだされる。リモネンは
、リモネンシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な
例は：（+）-リモネンシンターゼ（AF514287、領域：47..1867；レモン（Citrus limon）
）及び（AY055214、領域：48..1889；カワミドリ（Agastache rugosa））及び（-）-リモ
ネンシンターゼ（DQ195275、領域：1..1905；シトカスプルース（Picea sitchensis））
、（AF006193、領域：73..1986；アメリカオオモミ（Abies grandis））及び（MHC4SLSP
、領域：29..1828；スペアミント（Mentha spicata））を含むが、限定されない。
【０１２３】
（ミルセン）
その構造が
【化６】
2020018319.tif 000008
であるミルセンは、ベイ（bay）、ビジョザクラ及びその名前をそれから得たミルシア（m
yrcia）を含む多くの植物の精油において見いだされる。ミルセンは、ミルセンシンター
ゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例は：（U87908；ア
メリカオオモミ（Abies grandis））、（AY195609；キンギョソウ（Antirrhinum majus）
）、（AY195608；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（NM_127982；シロイヌナズナ
（Arabidopsis thaliana）TPS10）、（NM_113485；シロイヌナズナ（Arabidopsis thalia
na）ATTPS-CIN）、（NM_113483；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ATTPS-C1N）
、（AF271259；シソ（Perilla frutescens））、（AY473626；オウシュウトウヒ（Picea 
abies））、（AF369919；オウシュウトウヒ（Picea abies））及び（AJ304839；セイヨウ
ヒイラギガシ（Quercus ilex））を含むが、限定されない。
【０１２４】
（オシメン（Ocimene））
その構造が、それぞれ
【化７】
2020018319.tif 000009
であるα-及びβ-オシメンは、バジル（Ocimum basilicum）を含む種々の植物及び果実に
おいて見いだされ、オシメンシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチ
ド配列の例示的な例は：（AY195607；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（AY19560
9；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（AY195608；キンギョソウ（Antirrhinum ma
jus））、（AK221024；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（NM_113485；シロ
イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ATTPS-CIN）、（NM_113483；シロイヌナズナ（Arab
idopsis thaliana）ATTPS-CIN）、（NM_117775；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）ATTPS03）、（NM_001036574；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ATTPS03）、（
NM_127982；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）TPS10）、（AB110642；温州ミカン
（Citrus unshiu）CitMTSL4）及び（AY575970；ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. j
aponicus））を含むが、限定されない。
【０１２５】
（α-ピネン ）
その構造が
【化８】
2020018319.tif 000010
であるα-ピネンは、松及びユーカリにおいて見いだされる。α-ピネンは、α-ピネンシ
ンターゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には：（+）
α-ピネンシンターゼ（AF543530、領域：1..1887；タエダマツ（Pinus taeda））、（-）
α-ピネンシンターゼ（AF543527、領域：32..1921；タエダマツ（Pinus taeda））及び（
+）／（-）α-ピネンシンターゼ（AGU87909、領域：6111892；アメリカオオモミ（Abies 
grandis））を含むが、限定されない。
【０１２６】
（β-ピネン）
その構造が
【化９】
2020018319.tif 000011
であるβ-ピネンは、松、ローズマリー、パセリ、イノンド、バジル及びバラにおいて見
いだされる。β-ピネンは、β-ピネンシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌ
クレオチド配列の例示的な例には：（-）β-ピネンシンターゼ（AF276072、領域：1..174
9；クソニンジン（Artemisia annua）及び（AF514288、領域：26..1834；レモン（Citrus
limon））を含むが、限定されない。
【０１２７】
（サビネン（Sabinene））
その構造が
【化１０】
2020018319.tif 000012
であるサビネンは、黒コショウ、ニンジン種子、サルビア及びチャノキにおいて見いださ
れる。サビネンは、サビネンシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチ
ド配列の例示的な例には、コモンセージ（Salvia officinalis）からのAF051901、領域：
26..1798を含むが、限定されない。
【０１２８】
（γ-テルピネン）
その構造が
【化１１】
2020018319.tif 000013
であるγ-テルピネンは、カンキツ属果実からの精油の成分である。生化学的には、γ-テ
ルピネンは、γ-テルピネンシンターゼによってGPPから作製される。適切なヌクレオチド
配列の例示的な例には、以下を含む：（レモン（Citrus limon）からのAF514286、領域：
30..1832）及び（温州ミカンからのAB110640、領域 1.. 1803）。
【０１２９】
（テルピノレン）
その構造が
【化１２】
2020018319.tif 000014
であるテルピノレンは、クロフサスグリ、イトスギ、グァバ、レイシ、パパイア、マツ及
び茶において見いだされる。テルピノレンは、テルピノレンシンターゼによってGPPから
作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には：（バジル（Scimum basilicum）
からのAY693650）及び（ダグラスファー（Pseudotsuga menziesii）からのAY906866、領
域：10.. 1887）を含むが、限定されない。
【０１３０】
（C15化合物）
例示的C15生物有機化合物は、一般にファルネシルピロリン酸（FPP）に由来し、次に1
分子のDMAPPと2分子のIPPとの縮合によって作製されるセスキテルペンである。このステ
ップを触媒することが知られている酵素は、例えばファルネシルピロリン酸シンターゼで
ある。
【０１３１】
また、図5は、どのようにIPP及びDMAPPを組み合わせてFPPを産生することができ、これ
を更にセスキテルペンにプロセスすることができるかを模式的に示す。
【０１３２】
ファルネシルピロリン酸シンターゼのためのヌクレオチド配列の例示的な例には、以下
を含むが、限定されない：（ATU80605；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（
ATHFPS2R；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（AAU36376；クソニンジン（Ar
temisia annua））、（AF461050；ウシ（Bos taurus））、（D00694；大腸菌（Escherich
ia coli）K-12）、（AE009951、座位AAL95523；有核紡錘菌亜種有核（Fusobacterium nuc
leatum subsp. nucleatum） ATCC 25586）、（GFFPPSGEN；イネ馬鹿苗病菌（Gibberella 
fujikuroi））、（CP000009、座位AAW60034；グルコノバクター・オキシダンス（Glucono
bacter oxydans）621H）、（AF019892；ヒマワリ（Helianthus annuus））、（HUMFAPS；
ヒト）、（KLPFPSQCR；クリヴェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis））、（LAU
15777；ルピヌス・アルブス（Lupinus albus））、（LAU20771；ルピヌス・アルブス（Lu
pinus albus））、（AF309508；ハツカネズミ（Mus musculus））、（NCFPPSGEN；アカパ
ンカビ（Neurospora crassa））、（PAFPS1；グアユール（Parthenium argentatum））、
（PAFPS2；グアユール（Parthenium argentatum））、（RATFAPS；ドブネズミ（Rattus n
orvegicus））、（YSCFPP；サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae
））、（D89104；シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））、（C
P000003、座位AAT87386；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes））、（CP000017、
座位AAZ51849；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes））、（NC_008022、座位YP_59
8856；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）MGAS10270）、（NC_008023、座位YP_6
00845；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）MGAS2096）、（NC_008024、座位YP_6
02832；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）MGAS10750）及び（MZEFPS；トウモロ
コシ（Zea mays））。
【０１３３】
或いは、FPPは、GPPにIPPを添加することによっても作製することができる。この反応
ができる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例は、以下を含むが、限定されな
い：（AE000657、座位AAC06913；アクイフェクス・エオリクス（Aquifex aeolicus）VF5
）（NM_202836；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（D84432、座位BAA12575
；枯草菌（Bacillus subtilis））、（U12678、座位AAC28894；ブラディリゾビウム・ジ
ャポニカムBradyrhizobium japonicum）USDA 110）（BACFDPS；ゲオバシラス・ステアロ
サーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、（NC_002940、座位NP_873754；軟
性下疳菌（Haemophilus ducreyi）35000HP）、（L42023、座位AAC23087；インフルエンザ
桿菌（Haemophilus influenzae）Rd KW20）、（J05262；ヒト）、（YP_395294；ラクトバ
チラス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）23K）、（NC_005823、
座位YP_000273；レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）血清型コペ
ンハーゲンstr. Fiocruz L1-130）、（AB003187；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococc
us luteus））、（NC_002946、座位YP_208768；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）FA 1090
）、（U00090、座位AAB91752；根粒菌属種（Rhizobium sp.）NGR234）、（J05091；サッ
カロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisae）、（CP000031、座位AAV93568；
ヘリコバクター・ピロリ（Silicibacter pomeroyi）DSS-3）、（AE008481、座位AAK99890
；肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）R6）及び（NC_004556、座位NP 779706；ピ
アス病菌（Xylella fastidiosa Temecula1））。
【０１３４】
次いで、FPPは、種々のC15化合物に変換される。C15化合物の例示的な例には、以下を
含むが、限定されない：
【０１３５】
（アモルファジエン（Amorphadiene））
その構造が
【化１３】
2020018319.tif 000015
であるアモルファジエンは、クソニンジン（Artemisia anna）によって作製されるアルテ
ミシニンに対する前駆体である。アモルファジエンは、アモルファジエンシンターゼによ
ってFPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例は、米国特許公開第2004/
0005678号の配列番号37である。
【０１３６】
図5は、どのようにIPP及びDMAPPを組み合わせてFPPを産生することができ、これを更に
アモルファジエンにプロセスすることができるかを模式的に示す。
【０１３７】
（α-ファルネセン）
その構造が
【化１４】
2020018319.tif 000016
であるα-ファルネセンは、アリのデュフール腺（Dufour's gland）、並びにリンゴ及び
西洋ナシ皮のコーティングのものを含むが、限定されない種々の生物源において見いださ
れる。α-ファルネセンは、α-ファルネセンシンターゼによってFPPから作製される。適
切なヌクレオチド配列の例示的な例には、セイヨウナシ（Pyrus communis）栽培品種d'An
jouからのDQ309034（西洋ナシ；遺伝子名AFS1）及びリンゴからのAY182241（リンゴ；遺
伝子AFS1）を含むが、限定されない。Pechouusらの論文、Planta 219（1）：84-94 （200
4）。
【０１３８】
（β-ファルネセン）
その構造が
【化１５】
2020018319.tif 000017
であるβ-ファルネセンは、アブラムシ、及びペパーミントからなどの精油を含むが、限
定されない種々の生物源において見いだされる。野生のジャガイモなどのいくつかの植物
では、β-ファルネセンは、天然の防虫剤として合成される。β-ファルネセンは、β-フ
ァルネセンシンターゼによってFPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な
例には、ペパーミント（Mentha x piperita）からのGenBankアクセッション番号AF024615
（ペパーミント；遺伝子Tspa11）及びクソニンジン（Artemisia annua）からのAY835398
を含むが、限定されない。Picaudらの論文、Phytochemistry 66（9）：961-967 （2005）
。
【０１３９】
（ファルネソール）
その構造が
【化１６】
2020018319.tif 000018
であるファルネソールは、昆虫、並びにシトロネラ、ネロリ、シクラメン、レモン草、チ
ュベローズ及びバラからなどの精油を含む種々の生物源において見いだされる。ファルネ
ソールは、ファルネソールシンターゼなどのヒドロキシラーゼによってFPPから作製され
る。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、トウモロコシ（Zea mays）からのGenBan
kアクセッション番号AF529266及びサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerev
isiae）（遺伝子Pho8）からのYDR481Cを含むが、限定されない。Song, L.の論文、Applie
d Biochemistry and Biotechnology 128：149-158（2006）。
【０１４０】
（ネロリドール）
その構造が
【化１７】
2020018319.tif 000019
であるネロリドールは、ペルビオール（peruviol）としても知られ、ネロリ、生姜、ジャ
スミン、ラベンダー、チャノキ及びレモン草からなどの精油としてのものを含む種々の生
物源において見いだされる。ネロリドールは、ネロリドールシンターゼなどのヒドロキシ
ラーゼによってFPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、トウモ
ロコシ（Zea mays）からのAF529266（トウモロコシ；遺伝子tps1）を含むが、限定されな
い。
【０１４１】
（パチョウロール（Patchoulol））
その構造が
【化１８】
2020018319.tif 000020
であるパチョウロールは、パチョウリアルコールとしても知られ、ポゴステモン・パチョ
ウリ（Pogostemon patchouli）の精油の成分である。パチョウロールは、パチョウロール
シンターゼによってFPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には：ポ
ゴステモン・カブリン（Pogostemon cablin）からのAY508730 領域：1..1659を含むが、
限定されない。
【０１４２】
（バレンセン）
その構造が
【化１９】
2020018319.tif 000021
であるバレンセンは、オレンジの臭い及び風味の主要化学成分の1つであり、オレンジの
皮において見いだされる。バレンセンは、ヌートカトン（nootkatone）シンターゼによっ
てFPPから作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、オレンジ（Citrus si
nensis）からのAF441124 領域：1..1647及びシソ（Perilla frutescens）からのAY917195
領域：1..1653を含むが、限定されない。
【０１４３】
（C20化合物）
例示的なC20生物有機化合物は、一般にゲラニルゲラニオールピロリン酸（GGPP）に由
来し、次に1分子のDMAPPと3分子のIPPとの縮合によって作製されるジテルペンである。こ
の工程を触媒することが知られている酵素は、例えばゲラニルゲラニルピロリン酸シンタ
ーゼである。
【０１４４】
また、図5は、どのようにIPP及びDMAPPを組み合わせてGGPPを産生することができ、こ
れを更にジテルペンにプロセスすることができるか、又は更にカロテノイドにプロセスす
ることができるかを模式的に示す。
【０１４５】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのためのヌクレオチド配列の例示的な例には、
以下を含むが、限定されない：（ATHGERPYRS；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
）、（BT005328；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（NM_119845；シロイヌ
ナズナ（Arabidopsis thaliana））、（NZ_AAJM01000380、座位ZP_00743052；卒倒病菌血
清型イスライレンシス（Bacillus thuringiensis serovar israelensis）（ATCC 35646 s
q1563））、（CRGGPPS；ニチニチソウ（Catharanthus roseus））、（NZ_AABF02000074、
座位ZP_00144509；有核紡錘菌亜種ビニーンティ（Fusobacterium nucleatum subsp. vinc
entii（ATCC 49256））、（GFGGPPSGN；イネ馬鹿苗病菌（Gibberella fujikuroi））、（
AY371321；イチョウ）、（AB055496；パラゴムノキ（Hevea brasiliensis））、（AB0179
71；ヒト）、（MCI276129；ムコール・シルシネロイデス・エフ・ルシタニカス（Mucor c
ircinelloides f. lusitanicus））、（AB016044；ハツカネズミ（Mus musculus））、（
AABX01000298、座位NCU01427；アカパンカビ）、（NCU20940；アカパンカビ（Neurospora
crassa））、（NZ_AAKL01000008、座位ZP_00943566；青枯病菌（Ralstonia solanacearu
m）UW551）、（AB118238；ドブネズミ（Rattus norvegicus））、（SCU31632；サッカロ
マイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（AB016095；シネコッカス・エ
ロンゲーツ（Synechococcus elongates））、（SAGGPS；シロガラシ（Sinapis alba））
、（SSOGDS；スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、
（NC_007759、座位YP_461832；シントロホス・アシジトロフィカスSB（Syntrophus acidi
trophicus SB））及び（NC_006840、座位YP_204095；ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fsc
heri）ES114）。
【０１４６】
或いは、GGPPは、FPPにIPPを添加することによっても作製することができる。この反応
ができる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には：（NM_112315；シロイヌ
ナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ERWCRTE；パントエア・アグロメランス（Pantoea
agglomerans）、（D90087、座位BAA14124；パントエア・アナティス（Pantoea ananatis
）、（X52291、座位CAA36538；ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）
）、（AF195122、座位AAF24294；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroi
des））及び（NC_004350、座位NP_721015；ストレプトコッカス・ミュータンス（Strepto
coccus mutans）UA159）を含むが、限定されない。
【０１４７】
次いで、GGPPは、種々のC20イソプレノイドに変換される。C20化合物の例示的な例には
、以下を含むが、限定されない：
【０１４８】
（ゲラニルゲラニオール）
その構造が
【化２０】
2020018319.tif 000022
であるゲラニルゲラニオールは、チャンチン（Cedrela toona）からの桐油の、及びアマ
ニ油の成分である。ゲラニルゲラニオールは、例えば発現構築物に、GGPPシンターゼのた
めの遺伝子の後にホスファターゼ遺伝子を付加することによって作製することができる。
【０１４９】
（アビエタジエン（Abietadiene））
アビエタジエンは、以下の異性体を包含し：
【化２１】
2020018319.tif 000023
アメリカオオモミ（Abies grandis）などの樹木において見いだされる。アビエタジエン
は、アビエタジエンシンターゼによって作製される。適切なヌクレオチド配列の例示的な
例は：（U50768；アメリカオオモミ（Abies grandis））及び（AY473621；オウシュウト
ウヒ（Picea abies））を含むが、限定されない。
【０１５０】
（C20+化合物）
C20+生物有機化合物も本発明の範囲内である。このような化合物の例示的な例は、セス
タテルペン（5イソプレン単位から作製されるC25化合物）、トリテルペン（6イソプレン
単位から作製されるC30化合物）及びテトラテルペン（8イソプレン単位から作製されるC4
0化合物）を含む。これらの化合物は、本明細書に記述したのと同様の方法を使用して、
及び適切なシンターゼ（類）のためのヌクレオチド配列を置換し、又は付加することによ
って作製される。
【０１５１】
（操作経路）
例示的な目的のために、本発明は、MEV及び／又はDXP経路を操作することに関して記述
したが、これらの方法は、非イソプレノイド生物有機化合物を作製するための適切な経路
と同じように操作するために適応することができる。これらの経路は、典型的には1つ以
上の酵素をコードする適切な異種配列の発現によって組換えDNA技術を使用して操作され
る。
【０１５２】
対象ヌクレオチド酸は、単一又は複数のベクターによって発現することができる。核酸
は、単一オペロンに、又は1つ以上のベクターに置かれた別々のオペロンに配置すること
ができる。所望の場合、2つの発現ベクターを使用することができ、これらのそれぞれは
、単一オペロンにおいて作動可能に連結された1つ以上の異種配列を含む。単一又は複数
のベクターの選択及び単一又は複数のオペロンの使用は、異種配列のサイズ及びベクター
の能力に依存するであろうが、これは、主に、選択した宿主細胞に発現されたときにベク
ターが提供することができる所与の生物有機化合物の全収率に依存するであろう。ある場
合には、2-オペロン発現系が、より高い収率の生物有機化合物を提供する。対象ベクター
は、エピソームにより、又は宿主細胞ゲノムの一体部分として、複製可能なままであるこ
とができる。典型的には、宿主細胞の持続された伝播のために、後者が好ましい。
【０１５３】
特定の宿主細胞において、対象核酸は、1つ以上のオペロンによって制御されていても
よい。ある場合には、2つ又は3つのオペロン系が、単一オペロン系を上回るより高い収率
の生物有機化合物を提供する。
【０１５４】
所望の場合、対象核酸配列は、選択された宿主細胞のコドン優先度を反映するように修
飾して、宿主細胞におけるこのような配列のより高い発現を行うことができる。例えば、
対象ヌクレオチド配列を、一部の実施態様において、酵母コドン優先度のために修飾する
であろう。例えば、Bennetzen及びHallの論文（1982）J：Biol. Chem. 257（6）：3026-3
031を参照されたい。別の非限定的な例として、ヌクレオチド配列を、その他の実施態様
において、大腸菌（E. coli）コドン優先度のために修飾するであろう。例えば、Gouy及
びGautierの論文（1982）Nucleic Acids Res. 10（22）：7055-7074；Eyre-Walkerの論文
（1996）Mol. Biol. Evol.13（6）：864-872を参照されたい。また、Nakamuraらの論文（
2000）Nucleic Acids Res. 28（1）：292を参照されたい。多くの生物体のためのコドン
の選択表を利用でき、これを本発明の配列をデザインする際の参照として使用することが
できる。所与の宿主微生物の広く使用されるコドンの使用は、一般に、翻訳の可能性及び
それ故、所望の配列の発現レベルを増加させる。
【０１５５】
対象核酸の調製は、種々のルーチン組換え技術及び合成手順によって実施することがで
きる。簡潔には、対象核酸は、ゲノムDNA断片、cDNA及びRNAを調製することができ、これ
らの全ては、細胞から直接抽出することができ、又はPCR及びrt-PCRを含むが、限定され
ない種々の増幅過程によって組換えで産生することができる。
【０１５６】
核酸の直接の化学合成は、典型的には3'ブロックされ、かつ5'ブロックされたヌクレオ
チド単量体の、成長するヌクレオチドポリマー鎖の5'-ヒドロキシル基に対する連続付加
を含み、それぞれの付加は、典型的にはホスホトリエステル、ホスホラミダイト又はその
他などのリン誘導体である付加される単量体の3'位置における、成長鎖の末端5'-ヒドロ
キシル基の求核攻撃によって遂行される。このような方法論は、当業者に公知であり、妥
当なテキスト及び文献に記述されている（例えば、Matteuciらの論文（1980）Tet. Lett.
521：719；Caruthersらに対する米国特許第4,500,707号；並びにSouthernらに対する米国
特許第5,436,327号及び5,700,637号）。
【０１５７】
宿主微生物における核酸の転写レベルは、多数の方法で増大させることができる。例え
ば、これは、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を増加させることによって達
成することができる（例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列を含むより高いコピー
数発現ベクター使用することにより、又は宿主微生物のゲノムに酵素をコードするヌクレ
オチド配列のさらなるコピーを導入すること、例えばrecAを媒介した組換え、「自殺」ベ
クターの使用、λファージリコンビナーゼを使用する組換え、及び／又はトランスポゾン
若しくは転移因子を経た挿入による）。加えて、これは、オペロンのポリシストロン性mR
NAにおいてコード領域の順序を変えること、又はオペロンをそれぞれのそれ自体の調節領
域と共に個々の遺伝子に分割することによって、又は酵素コード領域が作動可能に連結さ
れているプロモーター（転写開始又は転写制御配列）の強度を増大することによって（例
えば、pBluescript及びpBBR1MCSプラスミドにおいて見いだされるものなどの、修飾され
た乳糖-誘導性プロモーターの代わりに大腸菌（Escherichia coli）宿主微生物において
コンセンサスアラビノース-又は乳糖-誘導性プロモーターを使用して）、又は誘導性プロ
モーターを使用して、及び増殖培地に化学物質を添加することによって誘導性プロモータ
ーを誘導して実施することができる。宿主微生物におけるヌクレオチド配列の翻訳のレベ
ルは、以下を含むが、限定されない多数の方法で増大させることができる：mRNAの安定性
を増加させること、リボソーム結合部位の配列を修飾すること、リボソーム結合部位と酵
素コード配列の開始コドンとの間の距離又は配列を修飾すること、酵素コード領域の開始
コドンの5'「の上流に」又は5‘側に隣接して位置する全シストロン間の領域を修飾する
こと、ヘアピン及び特殊化した配列を使用してmRNA転写物の3'末端を安定化すること、酵
素のコドンの選択性を修飾すること、酵素の生合成に使用されるまれなコドンtRNAの発現
を変化させること、及び／又は例えばそのコード配列の突然変異を経て酵素の安定性を増
加させること。好ましいコドン及びまれなコドンtRNAの決定は、宿主微生物に由来する遺
伝子の配列分析に基づくことができる。
【０１５８】
対象ベクターは、コードされた酵素のコピー数の所望のレベルを産生するように構築す
ることができる。一部の実施態様において、対象ベクターは、少なくとも10、10〜20の間
、20〜50の間、50〜100の間、又は100コピーより多くの所望の酵素を産生する。低コピー
数プラスミドは、一般に細胞あたり約20よりも少ないプラスミドコピーを提供し；中程度
のコピー数プラスミドは、一般に細胞あたり約20プラスミドコピー〜細胞あたり約50プラ
スミドコピー、又は細胞あたり約20プラスミドコピー〜細胞あたり約80プラスミドコピー
を提供し；及び高コピープラスミドは、一般に細胞あたり約80プラスミドコピー〜細胞あ
たり約200のプラスミドコピー、又はそれより多くを提供する。
【０１５９】
大腸菌（Escherichia coli）のための適切な低コピー発現ベクターは、pACYC184、pBel
oBac11、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS及びその誘導体、pSC101、SuperCos（コスミド）並び
にpWE15（コスミド）を含むが、限定されない。大腸菌（Escherichia coli）のための適
切な中程度コピー発現ベクターは、pTrc99A、pBAD24、並びにColE1複製開始点及びその誘
導体を含むベクターを含むが、限定されない。大腸菌のための適切な高コピー数発現ベク
ターは、pUC、pBluescript、pGEM及びpTZベクターを含むが、限定されない。酵母のため
の適切な低コピー（動原体性）発現ベクターは、pRS415及びpRS416（Sikorski及びHieter
の論文（1989）Genetics 122：19-27）を含むが、限定されない。酵母における適切な高
コピー2ミクロン発現ベクターは、pRS425及びpRS426（Christainsonらの論文（1992）Gen
e 110：119-122）を含むが、限定されない。代わりの2ミクロン発現ベクターは、2ミクロ
ンベクターの非選択可能変異体（Bruschi及びLudwigの論文（1988）Curr. Genet. 15：83
-90）又は発現カセットを有する無処置2ミクロンプラスミド（米国特許出願第2005008497
2号において例証されたとおり）、又はLEU2d（Erhanrtらの論文（1983）J. Bacteriol. 1
56 （2）：625-635）若しくはURA3d（Okkelsの論文（1996）Annals of the New York Aca
demy of Sciences 782（1）：202-207）などの欠陥のある選択マーカーを有する2ミクロ
ンプラスミドを含む。
【０１６０】
調節エレメントには、例えばプロモーターを含み、オペレーターは、また産生される生
物有機化合物の全収率を決定する際に有意な役割を果たす1つ以上の遺伝子の発現を増加
させることによって操作した経路の代謝性フラックスを増加させるように操作することが
できる。プロモーターは、RNAポリメラーゼ酵素による核酸配列の転写を開始し、及び制
御する一連のヌクレオチドである。オペレーターは、所望の核酸配列の転写を制御するよ
うに機能するプロモーターに隣接した一連のヌクレオチドである。オペレーターは、特異
的なリプレッサータンパク質が結合することができるタンパク質結合ドメインを含む。適
切なリプレッサータンパク質の非存在下において、転写は、プロモーターを介して開始す
る。適切なリプレッサータンパク質の存在下において、リプレッサータンパク質は、オペ
レーターに結合し、これによりプロモーターからの転写を阻害する。
【０１６１】
本発明の一部の実施態様において、発現ベクターに使用されるプロモーターは、誘導性
である。その他の実施態様において、発現ベクターに使用されるプロモーターは、構成的
である。一部の実施態様において、1つ以上の核酸配列は、誘導性プロモーターに作動可
能に連結されており、及び1つ以上のその他の核酸配列は、構成的プロモーターに作動可
能に連結される。
【０１６２】
原核生物の宿主細胞に使用するために適したプロモーターの非限定の例には、以下を含
む：バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター；trpプロモーター；lacオペロ
ンプロモーター；ハイブリドプロモーター、例えばlac／tacハイブリドプロモーター、ta
c／trcハイブリドプロモーター、trp／lacプロモーター、T7／lacプロモーター；trcプロ
モーター；tacプロモーター、及びそのようなプロモーター；araBADプロモーター；ssaG
プロモーターなどのインビボで調節されるプロモーター又は関連したプロモーター（例え
ば、米国特許公開第20040131637号を参照されたい）、pagCプロモーター（Pulkkinen及び
Millerの論文、J. Bacteriol.（1991）173（1）：86-93；Alpuche-Arandaらの論文（1992
）Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 89（21）：10079-83）、nirBプロモーター（Harborne
らの論文（1992）Mol. Micro.6：2805-2813）、及びそのようなプロモーター（例えば、D
unstanらの論文（1999）Infect. Immun. 67：5133-5141；McKelvieらの論文（2004）Vacc
ine 22：3243-3255；及びChatfieldらの論文（1992）Biotechnol. 10：888-892を参照さ
れたい）；sigma70プロモーター、例えばコンセンサスsigma70プロモーター（例えば、Ge
nBankアクセッション番号AX798980、AX798961及びAX798183を参照されたい）；定常プロ
モーター、例えばdpsプロモーター、spvプロモーター及び及びそのようなプロモーター；
病原性島SPI-2に由来するプロモーター（例えば、WO96/17951を参照されたい）；actAプ
ロモーター（例えば、Shetron-Ramaらの論文（2002）Infect. Immun. 70：1087-1096を参
照されたい）；rpsMプロモーター（例えば、Valdivia及びFalkow（1996）Mol. Microbiol
.22：367 378を参照されたい）；tetプロモーター（例えば、Hillenらの論文（1989） In
Saenger W. and Heinemann U.（編）Topics in Molecular and Structural Biology, Pr
otein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162を参
照されたい）；SP6プロモーター（例えば、Meltonらの論文（1984）Nucl. Acids Res. 12
：7035-7056を参照されたい）；及びそのようなプロモーター。
【０１６３】
一部の実施態様において、それぞれの経路におけるその他の酵素と関連して生物有機化
合物の全収率に、より大きな役割を果たす異種酵素の総活性は、強力なプロモーターから
酵素を発現することによって増大される。大腸菌（Escherichia coli）のために適した強
力なプロモーターは、Trc、Tac、T5、T7及びPLambdaを含むが、限定されない。本発明の
別の実施態様において、宿主における1つ以上の操作された経路酵素の総活性は、高コピ
ープラスミドで強力なプロモーターから酵素を発現することによって増大される。大腸菌
（Escherichia coli）のための適切な例には、pBAD24、pBAD18、pGEM、pBluescript、pUC
及びpTZベクターと共にTrc、Tac、T5、T7及びPLambraプロモーターを使用することを含む
が、限定されない。
【０１６４】
真核生物の宿主細胞に使用するために適したプロモーターの非限定的な例には、CMV最
初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期又は後期SV40プロモーター
、レトロウイルスからのLTR、及びマウスメタロチオネイン-Iプロモーターを含むが、限
定されない。
【０１６５】
原核生物の宿主細胞に使用するために適した構成的プロモーターの非限定的な例には、
sigma70プロモーター（例えば、コンセンサスsigma70プロモーター）を含む。細菌宿主細
胞に使用するために適した誘導性プロモーターの非限定的な例は、以下を含む：バクテリ
オファージλのpL；Plac；Ptrp；Ptac（Ptrp-lacハイブリドプロモーター）；イソプロピ
ル-β-D44チオガラクトピラノシド（IPTG）-誘導性プロモーター、例えばlacZプロモータ
ー；テトラサイクリン誘導性プロモーター；アラビノース誘導性プロモーター、例えばPB
AD（例えば、Guzmanらの論文（1995）J. Bacteriol. 177：4121-4130を参照されたい）；
キシロース-誘導性プロモーター、例えばPxyl（例えばKimらの論文：（1996）Gene 181：
71-76を参照されたい）；GAL1プロモーター；トリプトファンプロモーター；lacプロモー
ター；アルコール-誘導性プロモーター、例えばメタノール-誘導性プロモーター、エタノ
ール-誘導性プロモーター；ラフィノース-誘導性プロモーター；熱-誘導性プロモーター
、例えば熱誘導性ラムダPLプロモーター；感熱性リプレッサーによって制御されるプロモ
ーター（例えば、C1857抑制ラムダベースの発現ベクター；例えば、Hoffmannらの論文（1
999）FEMS Microbiol Lett. 177（2）：327-34を参照されたい）；及びそのようなプロモ
ーター。
【０１６６】
酵母宿主細胞に使用するために適して構成的プロモーターの非限定的な例には、ADH1、
ADH2、PGK又はLEU2プロモーターを含む。酵母宿主細胞に使用するために適した誘導性プ
ロモーターの非限定的な例には、GAL1若しくはGAL 10プロモーターなどの多岐にわたるガ
ラクトース-誘導性プロモーター（Westらの論文（1984）Mol. Cell. Biol. 4（11）：246
7-2478）又はCUP1プロモーターを含むが、限定されない。所望の場合、対象ベクターには
、天然の大腸菌（E. Coli）Lacプロモーターよりも強力であるプロモーターを含む。
【０１６７】
細菌宿主細胞に使用するためのオペレーターの非限定的な例には、以下を含む：ラクト
ースプロモーターオペレータ（LacIリプレッサータンパク質は、乳糖と接触したときに、
高次構造を変え、これによりLacIリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを
妨げる）、トリプトファンプロモータオペレーター（TrpRリプレッサータンパク質は、ト
リプトファンと複合体を形成したときに、オペレーターに結合する高次構造を有する；ト
リプトファンの非存在下で、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合をしな
い高次構造を有する）及びtacプロモーターオペレーター（例えば、deBoerらの論文（198
3）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：21-25を参照されたい）。
【０１６８】
また、発現ベクターにおける遺伝子は、典型的には任意のコードされたmRNA遺伝子産物
の直接翻訳（すなわち、合成）のためのリボソーム結合部位をコードするであろう。大腸
菌（Escherichia coli）に使用するために適したリボソーム結合部位については、Shine
らの論文（1975） Nature 254:34及びSteitzの文献 in Biological Regulation and Deve
lopment: Gene Expression （R. F. Goldberger編）, vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Pu
blishing, N.Yを参照されたい。コード配列の上流のリボソーム結合部位をコードするヌ
クレオチド配列5'-AAAACA-3'の挿入は、酵母宿主微生物における効率的な翻訳を促進する
（Loomanらの論文（1993） Nuc. Ac. Res. 21: 4268-4271; Yunらの論文（1996） Mol. M
icrobiol. 19:1225-1239）。
【０１６９】
発現ベクターに使用してもよいその他の調節エレメントには、転写エンハンサーエレメ
ント及び転写ターミネーターを含む。例えばBitterらの論文（1987）Methods in Enzymol
ogy, 153:516-544を参照されたい。
【０１７０】
発現ベクターは、宿主微生物の特定のタイプ及びその他に使用するために適していても
よい。しかし、当業者は、所与の宿主微生物に対して特定の発現ベクターが適するかどう
かを、ルーチン実験を介して容易に決定することができる。例えば、発現ベクターは、宿
主生物に導入することができ、次いでこれを生存度、及びベクターに含まれる任意の遺伝
子の発現についてモニターする。
【０１７１】
また、発現ベクターは、発現により、発現ベクターを有する宿主細胞を選択し、又はさ
もなければ同定するために有用な1つ以上の表現型の形質を与える1つ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含んでいてもよい。真核細胞のために適した選択可能なマーカーの非限定
的な例には、ジヒドロ葉酸還元酵素及びネオマイシン耐性を含む。原核細胞のために適し
て選択可能なマーカーの非限定的な例には、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラム
フェニコール、カルベニシリン及びカナマイシン耐性を含む。
【０１７２】
工業規模での生物有機産物の産生のためには、これでは発酵培地への抗生物質の添加を
必要とする選択可能マーカーを使用するのに非実用的で、又はあまりに費用がかかりすぎ
る。従って、本発明の一部の実施態様は、プラスミド（発現ベクター）維持を保証するた
めに抗生物質抵抗性を与える選択可能マーカーの使用を必要としない宿主細胞を使用する
。本発明のこれらの実施態様において、発現ベクターは、任意にRK2プラスミド複製及び
／又は分離系と共に、60kbのIncP（RK2）プラスミドなどのプラスミド維持系を含み、抗
生物質選択の非存在下でプラスミド保持をもたらす。（例えば、Siaらの論文（1995）J. 
Bacteriol.177：2789-97；Pansegrauらの論文（1994）J. Mol. Biol. 239：623-63を参照
されたい）。この目的のために適したプラスミド維持系は、安定な毒素及び不安定な抗毒
素をコードするRK2のparDEオペロンによってコードされる。抗毒素は、タンパク質-タン
パク相互作用によって毒素の致死作用を直接阻害することができる。parDEオペロンを収
容する発現ベクターを維持できなくなる細胞は、不安定な抗毒素が急速に欠乏して、安定
な毒素を生じ、次いで細胞死を生じさせる。RK2プラスミド複製系は、tDNA複製タンパク
質をコードするtrfA遺伝子によってコードされる。RK2プラスミド分離系は、parCBAオペ
ロンによってコードされ、これはDNA合成により生じるであろうプラスミド多量体を分解
するように機能するタンパク質をコードする。
【０１７３】
対象ベクターは、様々な確立された技術によって、安定に、又は一過性に宿主細胞に導
入することができる。例えば、1つの方法は、発現ベクターがカルシウム沈殿物を経て導
入される塩化カルシウム処理を含む。また、その他の塩、例えばリン酸カルシウムを同様
の手順に従って使用してもよい。加えて、電気穿孔法（すなわち、核酸に対する細胞の透
過性を増加するための電流の適用）を使用してもよい。その他の形質転換法には、微量注
入、DEAEデキストランを媒介した形質転換及び酢酸リチウムの存在下における熱ショック
を含む。また、脂質複合体、リポソーム及びデンドリマーを使用して宿主微生物をトラン
スフェクトしてもよい。
【０１７４】
形質転換により、種々の方法を実践して、対象ベクターが導入された宿主細胞を同定す
ることができる。1つの例示的な選択方法は、個々の細胞を継代して個々のコロニーを形
成し、続いて所望の遺伝子産物の発現について試験することを含む。別の方法は、発現ベ
クターに含まれる選択可能マーカー遺伝子の発現を介して与えられる表現型の形質に基づ
いて形質転換された宿主細胞を選択することを伴う。当業者は、これらの、又は当該技術
分野において利用可能なその他の方法を使用して遺伝子改変された宿主細胞を同定するこ
とができる。
【０１７５】
宿主細胞への本発明の種々の経路配列の導入は、PCR、サザンブロット又はノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションなどの方法によって確認することができる。例えば、核酸
を生じる宿主細胞から調製することができ、及び関心対象の特異的配列を関心対象の配列
に特異的なプライマーを使用するPCRによって増幅することができる。増幅産物は、アガ
ロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動、続い
てエチジウムブロミド、SYBR Green溶液又はその他で染色すること、又はUV検出でのDNA
の検出に供する。或いは、関心対象の配列に特異的な核酸プローブは、ハイブリダイゼー
ション反応に使用することができる。特異的な遺伝子配列の発現は、逆転写と組み合わせ
たPCR、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを介して対応するmRNAを検出すること
によって、又はコードされる遺伝子産物と反応性の抗体を使用する免疫アッセイによって
確認することができる。例示的な免疫アッセイには、ELISA、放射免疫アッセイ及びサン
ドイッチ免疫アッセイを含むが、限定されない。
【０１７６】
本明細書に開示した1つ以上の代謝経路を経た生物有機化合物の収率は、中間体を生物
有機産物の形成に向けた生産工程からそらせてしまう反応を阻害することによって増大す
ることができる。非生産的反応の阻害は、1つ以上の非生産的反応に含まれる酵素の発現
及び／又は活性を減少させることによって達成することができる。このような反応には、
生物有機化合物の全収率に影響を及ぼすレベルにて、脂肪酸生合成、アラニン生合成、ア
スパラギン酸超経路、糖新生、ヘム生合成及び／又はグルタミン酸生合成を引き起こすTC
A回路の副反応を含む。
【０１７７】
種々の方法を、関心対象の遺伝子をノックアウトし、又はノックダウンするために利用
することができる。例えば、遺伝子発現の減少は、欠失、突然変異及び／又は遺伝子再構
成によって達成してもよい。また、これは、アンチセンスRNA、siRNA、miRNA、リボザイ
ム、3本鎖DNA、並びに転写及び／又は翻訳阻害剤を使用して実施することができる。加え
て、トランスポゾンは、例えばプロモーターとコード領域との間に、又は2つの隣接遺伝
子の間にそれを挿入することによって遺伝子発現を崩壊させて、一方又は両方の遺伝子を
不活性化するために使用することができる。
【０１７８】
発酵のリットルあたりの微生物の量、又は微生物の密度は、所与の体積の発酵培地から
単離された微生物の重量を測定することによって測定することができる。通常の測定は、
発酵培地のリットルあたりの細胞の乾燥重量である。発酵をモニターする使用することが
でき、一方でこれを進行する別の方法は、培地の光学濃度の測定による。通常の方法は、
OD600又はODといわれる600nmの波長にて光学濃度を測定することである。ODは、特定の培
地内の生物体の特定タイプの密度に相関し得るが、ODと体積あたりの微生物の特異的関係
は、一般に全てのタイプの培地における全てのタイプの生物体全体に適用できないであろ
う。検量線は、細胞密度の全範囲にわたってOD及び乾燥菌体重量を測定することによって
作製することができる。場合によっては、これらの相関は、同じか又は同様の培地におけ
る、同じか又は同様の微生物における異なる発酵に使用することができる。
【実施例】
【０１７９】
本発明の実施には、別に示されない限り、当該技術分野の技術内である生合成工業他の
従来技術などを使用することができる。このような技術が本明細書に完全には記述されて
ないない範囲については、科学文献においてこれらに対する豊富な参照文献を見いだすこ
とができる。
【０１８０】
以下の実施例では、使用した数（例えば、量、温度、その他）に関する正確さを保証す
るように努力がなされたが、差異及び偏差を伴いうるし、その結果、報告された数の誤記
が本明細書に存在し、本発明が属する当業者は、本明細書に残りの開示からみて正確な量
を推定することができる。別に示されない限り、温度は、摂氏程度で報告してあり、圧力
は、海面での気圧又はその近くである。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に得
られた。以下の実施例は、説明の便宜のみを意図し、本発明の範囲をいかなる形であれ限
定しない。
【０１８１】
（実施例1）
【０１８２】
本実施例は、オペロンにおいて構成されたサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomy
ces cerevisiae）からのMEV経路の酵素をコードする発現プラスミドを作製するための方
法を記述する。
【０１８３】
発現プラスミドpMevTは、pBAD33ベクター内にMevTオペロン（配列番号：1）を挿入する
ことによって作製した。MevTオペロンは、遍在的前駆体アセチルCoAを（R）-メバロネー
トに共に転換するMEV経路酵素のセット、すなわちアセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMG-C
oAシンターゼ及びHMG-CoAレダクターゼをコードする。MevTオペロンは、大腸菌（Escheri
chia coli）ゲノムDNAからatoB遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号NC_0009
13 領域：2324131..2325315）（アセトアセチル-CoAチオラーゼをコードする）を、サッ
カロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）ゲノムDNAからERG13遺伝子のコ
ード配列（GenBankアクセッション番号X96617、領域：220..1695）（ヒドロキシメチルグ
ルタリルCoAシンターゼをコードする）を、及びサッカロマイセス・セレビジエ（Sacchar
omyces cerevisiae）ゲノムDNAからHMG1遺伝子のコード領域のセグメント（GenBankアク
セッション番号M22002、領域：1660..3165）（切断されたHMG-CoAレダクターゼ（tHMGR）
をコードする）を増幅するPCRによって作製した。HMG1遺伝子断片の増幅のために使用す
る上流PCRプライマーには、人工開始コドンを含んだ。増幅された断片は、重複伸長（SOE
ing）を使用して共にスプライスし、そのプロセスの間に、リボソーム結合部位をatoB及
びERG13コード配列の後に導入した。3'Aオーバーハングの付加の後、MevTオペロンをTAク
ローニングベクターpCR4（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合して、正確さを保証するた
めにシーケンスした。MevTオペロンは、その後ベクターpBAD33のXmaI PstI制限酵素部位
に結合させた（Guzmanらの論文（1995）. J. Bacteriol. 177（14）：4121-4130）。PLac
プロモーターの制御下のオペロンを置くために、pBAD33のaraC-PBAD NsiI-XmaI断片をpBB
R1MCSのNsiI-XmaI断片と置換して、発現プラスミドpMevTを得た（米国特許第7,192,751号
を参照されたい）。
【０１８４】
発現プラスミドpAM36-MevT66は、pAM36ベクターにMevT66オペロンを挿入することによ
って作製した。ベクターpAM36は、AscI-SfrI-AsiSI-XhoI-PacI-Fsl1-PmeI制限酵素部位を
含むオリゴヌクレオチドカセットをpACYC 184ベクター（GenBankアクセッション番号X064
03）に挿入することによって、及びpACYC 184のtet耐性遺伝子を除去することによって作
製した。MevT66オペロンは、大腸菌（Escherichia coli）からのatoB遺伝子（GenBankア
クセッション番号NC_000913 領域：2324131..2325315）、サッカロマイセス・セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）からのERG13遺伝子（GenBankアクセッション番号X96617、
領域：220..1695）及びサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）か
らのHMG1遺伝子の切断されたバージョン（GenBankアクセッション番号M22002、領域：177
7..3285）を含む、鋳型としてヌクレオチド配列、配列番号：1を使用して合成的に作製し
、これら3つ全ての配列は、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最
適化されている。合成的に作製されたMevT66オペロンは、5'EcoRI制限酵素部位及び3'Hin
d III制限酵素部位にて隣接させ、従って標準的なpUC又はpACYC起源ベクターなどのクロ
ーニングベクターの互換性制限酵素部位にクローン化することができる。この構築物から
、MevT66オペロンを隣接するSfiI及びAsiSI制限酵素部位でPCR増幅して、増幅されたDNA
断片をSfiI及びAsiSI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動に
よって分解して、およそ4.2kbのDNA断片を、Qiagenゲル精製キット（Valencia、CA）を使
用してゲル抽出し、単離されたDNA断片をpAM36ベクターのSfrI AsiSI制限酵素部位に結合
して、発現プラスミドpAM36-MevT66を得た。
【０１８５】
発現プラスミドpAM25は、pAM29ベクターにMevT66オペロンを挿入することによって作製
した。ベクターpAM29は、pZS24-MCS1からのp15A複製開始点及びkan耐性遺伝子（Lutz及び
Bujardの論文（1997）Nucl Acids Res. 25：1203-1210）をオリゴヌクレオチドで作製し
たlac UV5プロモーターと共に構築することによって作製した。MevT66オペロンを含むDNA
合成構築物（上記のものを参照されたい）は、EcoRI及びHind III制限酵素を使用して完
了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分離して、4.2kbのDNA断片をゲル抽出
し、単離されたDNA断片をpAM29のEcoRI HindIII制限酵素部位に結合して、発現プラスミ
ドpAM25を得た。
【０１８６】
発現プラスミドpMevB-Cmは、pBBR1MCS-1ベクターにMevBオペロンを挿入することによっ
て作製した。MevBオペロンは、（R）-メバロネートをIPPに共に変換する酵素のセット、
すなわちメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びメバロン酸ピロリン酸カル
ボキシラーゼをコードする。MevBオペロンは、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharo
myces cerevisiae）ゲノムDNAからERG12遺伝子のコード配列を（GenBankアクセッション
番号X55875、領域：580..1911）（メバロン酸キナーゼをコードする）、ERG8遺伝子（Gen
Bankアクセッション番号Z49939、領域：3363..4718）（ホスホメバロン酸キナーゼをコー
ドする）、及びMVD1遺伝子（GenBankアクセッション番号X97557、領域：544..1734、メバ
ロン酸ピロリン酸カルボキシラーゼをコードする）を増幅するPCRによって、並びにオー
バーラップ伸長（SOEing）を使用してPCR断片を共にスプライスすることによって作製し
た。適切なプライマー配列を選択することにより、ERG12及びERG8の終止コドンは、増幅
の間にリボソーム結合部位を導入するようにTAAからTAGに変えた。3'Aオーバーハングの
付加の後、MevBオペロンをTAクローニングベクターpCR4（Invitrogen, Carlsbad, CA）に
結合した。MevBオペロンを、PstI制限酵素を使用して完了までクローン化する構築物を消
化によって削除し、ゲル電気泳動によって反応混合物を分離して、4.2kbのDNA断片をゲル
抽出し、単離されたDNA断片をベクターpBBR1MCS-1（Kovachらの論文、Gene 166（1）：17
5-176（1995））のPstI制限酵素部位に結合して、発現プラスミドpMevB-Cmを得た。
【０１８７】
発現プラスミドpMBIは、pBBR1MCS-3ベクターにMBIオペロンを挿入することによって作
製した。MBIオペロンは、MevBオペロン、並びにIPPのDMAPPへの変換を触媒するイソペン
テニルピロホスファターゼイソメラーゼと同じ酵素をコードする。MBIオペロンは、これ
らの5'末端にXmaI制限酵素部位を含むプライマーを使用して大腸菌ゲノムDNAからidi遺伝
子のコード配列（GenBankアクセッション番号AF119715）をPCR増幅し、増幅されたDNA断
片を、XmaI制限酵素を使用して完了まで消化し、ゲル電気泳動によって反応混合物を分離
し、0.5kbの断片をゲル抽出して、及び発現プラスミドpMevB-CmのXmaI制限酵素部位に単
離されたDNA断片を結合し、これによりMevBオペロンの3'末端にidiを置くことによって作
製した。MBIオペロンをベクターpBBR1MCS-3（Kovachらの論文、Gene 166（1）：175-176
（1995））のSalI及びSacI制限酵素部位にサブクローニングして、発現プラスミドpMBIを
得た（米国特許第7,192,751号を参照されたい）。
【０１８８】
発現プラスミドpMBISは、pMBIにispA遺伝子を挿入することによって作製した。ispA遺
伝子は、IPP及びDMAPPのFPPへの変換を触媒するファルネシルピロリン酸シンターゼをコ
ードする。ispA遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号D00694、領域：484..13
83）は、SacII制限酵素部位をもつフォワードプライマー、及びSacI制限酵素部位をもつ
リバースプライマーを使用して大腸菌ゲノムDNAからPCR増幅した。増幅されたPCR産物をS
acII及びSacI制限酵素で完了まで消化して、反応混合物をゲル電気泳動法によって分離し
、0.9kbのDNA断片をゲル抽出した。単離されたDNA断片をpMBIのSacII SadI制限酵素部位
に結合し、これによりispA遺伝子をidiの3'及びMevBオペロンに置いて、発現プラスミドp
MBISを得た（米国特許第7,192,751号を参照されたい）。
【０１８９】
発現プラスミドpMBIS-gppsは、ispAコード配列をゲラニルジホスフェートシンターゼ（
「gpps」）をコードするヌクレオチド配列と置換することによって発現プラスミドpMBIS
から取り出した。ゲラニルジホスフェートシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含
むDNA断片は、鋳型として、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最
適化したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のgpps遺伝子のコード配列（GenBank
アクセッション番号Y17376、領域：52..1320）を使用して合成的に作製した。ヌクレオチ
ド配列は、リーダーSacII制限酵素部位及び末端SacI制限酵素部位に隣接させ、標準的なp
UC又はpACYC起源ベクターなどのクローニングベクターの互換性制限酵素部位にクローン
化することができる。合成的に作製したゲラニルジホスフェートシンターゼ配列を、SacI
I及びSacI制限酵素を使用してDNA合成構築物を完了まで消化することによって単離して、
ゲル電気泳動によって反応混合物を分離して、およそ1.3kbのDNA断片をゲル抽出し、発現
プラスミドpMBISのSacII SacI制限酵素部位に単離されたDNA断片を結合し、発現プラスミ
ドpMBIS-gppsを得た（プラスミドマップについては、図6を参照されたい）。
【０１９０】
発現プラスミドpAM45は、pAM36-MevT66にMBISオペロンを挿入し、2つのオペロンの前に
lacUV5プロモーターを付加することによって作製した。MBISオペロンは、5'XhoI制限酵素
部位及び3'PacI制限酵素部位を含むプライマーを使用してpMBISからPCR増幅した。増幅さ
れたPCR産物を、XhoI及びPacI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電
気泳動によって分離して、5.4kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片をpAM36-M
evT66のXhoI PacI制限酵素部位に結合し、プラスミドpAM43得た。lacUV5プロモーターを
コードするヌクレオチド配列を含むDNA断片は、オリゴヌクレオチドから合成して、pAM43
のAscI SfiI及びAsiSI XhoI制限酵素部位にサブクローニングして、発現プラスミドpAM45
を得た。
【０１９１】
（実施例2）
【０１９２】
本実施例は、オペロンにおいて構成した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）か
らのMEV経路の酵素をコードする発現ベクターを作製するための方法を記述する。
【０１９３】
発現プラスミドpAM41は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae
）HMG-CoAレダクターゼをコードするHMG1遺伝子のコード配列を、黄色ブドウ球菌（Staph
ylococcus aureus）HMG-CoAレダクターゼ（GenBankアクセッション番号BA000017、領域：
2688925..2687648）をコードするmvaA遺伝子のコード配列で置換することによって、発現
プラスミドpAM25から導いた。mvaA遺伝子のコード配列は、プライマー4-49 mvaA SpeI（
配列番号：2）及び4-49 mvaAR XbaI（配列番号：3）を使用して、黄色ブドウ球菌亜種ア
ウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus）（ATCC 70069）ゲノムDNAからPCR増
幅し、増幅されたDNA断片を、SpeI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲ
ル電気泳動によって分離して、およそ1.3kbのDNA断片をゲル抽出した。HMG1コード配列を
、HindIII制限酵素を使用してプラスミドを完了まで消化することによってpAM25から除去
した。生じる直鎖状DNA断片の末端オーバーハングを、T4 DNAポリメラーゼを使用して平
滑にした。次いで、DNA断片を、SpeI制限酵素を使用して部分的に消化し、反応混合物を
ゲル電気泳動によって分離して、4.8kbのDNA断片をゲル抽出した。単離されたDNA断片をS
peI消化したmvaA PCR産物と結合し、発現プラスミドpAM41を得た。pAM41のヌクレオチド
配列に含まれるatoB（opt）：ERG13（opt）：mvaAオペロンは、配列番号：41である。ERG
13は、HMGS又はHMG-CoAシンターゼとしても知られる。
【０１９４】
発現プラスミドpAM52は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae
）HMG-CoAシンターゼをコードするERG13遺伝子のコード配列を、黄色ブドウ球菌（Staphy
lococcus aureus）HMGS-CoAシンターゼをコードするmvaS遺伝子のコード配列（GenBankア
クセッション番号BA000017、領域：2689180..2690346）と置換することによって発現プラ
スミドpAM41から導いた。mvaS遺伝子のコード配列は、プライマーHMGS 5'Sa mvaS-S（配
列番号：4）及びHMG 3'Sa mvaS-AS（配列番号：5）を使用して黄色ブドウ球菌亜種アウレ
ウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus）(ATCC 70069) ゲノムDNAからPCR増幅し、
増幅されたDNA断片をGeiserらの論文（Bio Techniques 31：88-92（2001））の方法に従
ってpAM41におけるHMG1遺伝子のコード配列を置換するPCRプライマーとして使用して、発
現プラスミドpAM52を得た。pAM52に含まれるatoB（opt）：mvaS：mvaAオペロンのヌクレ
オチド配列は、配列番号：42である
【０１９５】
発現プラスミドpAM97は、MevT66オペロンを発現プラスミドpAM52の（atoB（opt）：mva
S：mvaA）オペロンと置換することによって発現プラスミドpAM45から導いた。発現プラス
ミドpAM45を、AsiSI及びSfiI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気
泳動によって分離して、MevT66オペロンを欠いている8.3kbのDNA断片をゲル抽出した。pA
M52の（atoB（opt）：mvaS：mvaA）オペロンは、プライマー19-25 atoB SfiI-S（配列番
号：6）及び19-25のmvaA-AsiSI-AS（配列番号：7）を使用してPCR増幅し、PCR産物を、Sf
iI及びAsiSI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分
離して、3.7kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片を発現プラスミドpAM45のAs
iSI SfiI制限酵素部位に結合させ、発現プラスミドpAM97を得た。
【０１９６】
発現プラスミドpAM97-MBIは、pAM97のMBISオペロンをpAM45のMBIオペロンと置換するこ
とによって、発現プラスミドpAM97及びpAM45から導いた。MBIオペロンは、プライマー9-7
0C（配列番号：8）及び26-39B（配列番号：9）を使用してpAM45からPCR増幅して、反応混
合物をゲル電気泳動によって分離して、4.5kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA
断片SacI及びXhoI制限酵素を使用して完了まで消化した。発現プラスミドpAM97をSacI及
びXhoI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分離して
、7.6kbの断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片をMBIオペロンPCR産物と結合し、発現
プラスミドpAM97-MBIを得た。
【０１９７】
発現プラスミドpAM97-MevBは、pAM97のMBISオペロンをpAM45のMevBオペロンと置換する
ことによって、発現プラスミドpAM97及びpAM45から導いた。MevBオペロンは、プライマー
9-70C（配列番号：8）及び26-39A（配列番号：10）を使用して、pAM45からPCR増幅し、反
応混合物をゲル電気泳動によって分離して、3.9kbのDNA断片をゲル抽出して、単離された
DNA断片を、SacI及びXhoI制限酵素を使用して完了まで消化した。発現プラスミドpAM97を
、SacI及びXhoI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって
分離して、7.6kbの断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片をMevBオペロンPCR産物と結
合し、発現プラスミドpAM97-MevBを得た。
【０１９８】
発現プラスミドpAMl28は、（atoB（opt）：mvaS：mvaA）及び発現プラスミドpAM97のMB
ISオペロンを、宿主細胞形質転換体の抗生物質の選択のための連続的必要が不要なRK2プ
ラスミド複製、分離及び維持系を含むベクターに挿入することによって作製した。RK2プ
ラスミドを、PstI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によっ
て分離して、par座位全体を含むおよそ6.3kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断
片をミニRK2レプリコンpRR10のPstI制限酵素部位にサブクローニングし（Robertsらの論
文（1990）J Bacterial. 172（11）：6204-6216）、ベクターpAM 132を得た。発現プラス
ミドpAM97を、AscI及びSacI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気
泳動によって分離して、およそ9.4kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片をpAM
132のMluI SacI制限酵素部位に結合し、発現プラスミドpAM 128を得た。
【０１９９】
（実施例3）
【０２００】
本実施例は、オペロンにおいて構成した糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）からのM
EV経路の酵素をコードする発現ベクターを作製するための方法を記述する。
【０２０１】
プラスミドpAM16は、糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）のmvaE遺伝子のコード配列
（GenBankアクセッション番号AF290092 領域：1479.3890）（アセチル-CoAアセチルトラ
ンスフェラーゼ／HMG-CoAレダクターゼ（HMGR）をコードする）をpBlueScripII-KS（+）
ベクターに挿入することによって作製した。mvaE遺伝子のコード配列は、5'リン酸化され
たプライマー4-40 mvaEF BamHI（配列番号：11）及び4-40 mvaERHindIII（配列番号：12
）を使用して糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）ゲノムDNA（ATCC 700802）からPCR増
幅した。（プライマー4-40 mvaEF BamHIは、増幅されたPCR産物のTTGからATGにmvaE遺伝
子の開始コドンを変えることに注意されたい）。生じるPCR産物をpBlueScriplI-KS（+）
（Stratagene, La Jolla, CA）のSmaI制限酵素部位に結合し、発現プラスミドpAM 16を得
た。
【０２０２】
プラスミドpAM18は、糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）のmvaS遺伝子のコード配列
（GenBankアクセッション番号AF290092 領域：142..1293）（HMG-CoAシンターゼ（HMGS）
をコードする）をpBlueScripII-KS（+）ベクターに挿入することによって作製した。mvaS
遺伝子のコード配列は、5'リン酸化されたプライマー4-40 mvaSF BglII（配列番号：13）
及び4-39 mvaSR BamHI（配列番号：14）を使用して、糞便腸球菌（Enterococcus faecali
s）ゲノムDNA（ATCC 700802）からPCR増幅し、PCR産物をpBlueScripII-KS（+）（Stratag
ene, La Jolla, Ca）のSmaI制限酵素部位に結合して、発現プラスミドpAM18を得た。
【０２０３】
発現プラスミドpAM22は、発現プラスミドpAM16のmvaE遺伝子のコード配列をpZE21-PL-l
acO1ベクターに挿入することによって作製した。ベクターpZE21-PL-lacO1は、tetプロモ
ーターがPL-lacO1プロモーターで置換されたベクターpZE21-MCS-1の誘導体である（Lutz
及びBujardの論文（1997）Nucl Acids Res. 25：1203-1210）。発現プラスミドpAM16を、
BamHI及びHindIII制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によっ
て分離して、mvaEコード配列を含むおよそ2.4kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDN
A断片をpZE21-PL-lacO1のBamHI HindIII制限酵素部位に挿入し、発現プラスミドpAM22を
得た。
【０２０４】
発現プラスミドpAM33は、発現プラスミドpAM18のmvaS遺伝子のコード配列を発現プラス
ミドpAM22に挿入することによって作製した。発現プラスミドpAM18を、BglII及びBamHI制
限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分離して、mvaS遺
伝子のコード配列を含むおよそ1.2kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片を発
現プラスミドpAM22のBamHI部位に挿入し、発現プラスミドpAM33を得た。
【０２０５】
発現プラスミドpAM34は、発現プラスミドpAM33のmvaS-mvaEオペロンをベクターpAM29に
挿入することによって作製した。mvaS-mvaEオペロンは、EcoRI制限酵素を使用してpAM33
を部分的に消化し、生じる直鎖状DNA断片を使用してMluI制限酵素を消化し、反応混合物
をゲル電気泳動によって分離して、およそ3.6kbのDNA断片をゲル抽出することによって単
離した。pAM29のベクターバックボーンは、発現ベクターpAM25をMluI及びEcoRI制限酵素
を使用して完了まで消化し、ゲル電気泳動によって反応混合物を分離して、およそ2.1kb
のDNA断片をゲル抽出することによって得た。2つの単離されたDNA断片を結合させて、発
現プラスミドpAM34を得た。
【０２０６】
（実施例4）
【０２０７】
本実施例は、オペロンにおいて構成した大腸菌（Escherichia coli）からのDXP経路の
酵素をコードする発現プラスミドを作製するための方法を記述する。
【０２０８】
発現プラスミドpAM408は、pAM29ベクターに「最上」DXP経路の酵素をコードする遺伝子
を挿入することによって作製した。「最上」DXP経路の酵素には、1-デオキシ-D-キシルロ
ース-5-ホスフェートシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）のdxs遺伝子によってコー
ドされる）、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートリダクトイソメラーゼ（大腸菌
（Escherichia coli）のdxr遺伝子によってコードされる）、4-ジホスホシチジル-2C-メ
チル-D-エリスリトールシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）のispD遺伝子によって
コードされる）及び4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールシンターゼ（大腸
菌（Escherichia coli）のispE遺伝子によってコードされる）を含み、これは、ピルベー
ト及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリス
リトール-2-ホスフェートに共に形質転換する。「最上」DXP経路の酵素をコードするヌク
レオチド配列を含むDNA断片は、大腸菌（Escherichia coli）株DH 1（ATCC #33849）から
のdxs（GenBankアクセッション番号U00096 領域：437539..439401）、dxr（GenBankアク
セッション番号U00096領域：193521..194717）、ispD（GenBankアクセッション番号U0009
6領域：2869803..2870512）及びispE（GenBankアクセッション番号U00096領域1261249..1
262100）遺伝子のコード配列を、付加された最適のShine Dalgarno配列、並びに5'及び3'
制限酵素部位と共に、配列番号：15〜18にて示したPCRプライマーを使用してPCR増幅する
ことによって作製した。PCR産物をゲル電気泳動によって分離して、Qiagen（Valencia, C
A）ゲル精製キットを使用してゲル抽出し、適切な制限酵素（dxs遺伝子を含むPCR産物の
ためにXhoI及びKpnI；dxr遺伝子を含むPCR産物のためにKpnI及びApaI；ispD遺伝子を含む
PCR産物のためにApaI及びNdeI；ispE遺伝子を含むPCR産物のためにNdeI及びMluI）を使用
して消化し、Qiagen（Valencia, CA）PCR精製キットを使用して精製した。次いで、おお
まかに等モルの量のそれぞれのPCR産物を結合反応に添加し、オペロン内に個々の遺伝子
を構築した。この結合反応から、1μlの反応混合物を使用して、2つの別々の遺伝子カセ
ット、すなわちdxs-dxr及びispD-ispE遺伝子カセットをPCR増幅した。dxs-dxr遺伝子カセ
ットは、プライマー67-1A-C（配列番号：15）及び67-1D-C（配列番号：18）を使用してPC
R増幅し、ispD-ispE遺伝子カセットは、プライマー67-1E-C（配列番号：19）及び67-1H-C
、（配列番号：22）を使用してPCR増幅した。2つのPCR産物をゲル電気泳動によって分離
して、ゲル抽出した。dxs-dxr遺伝子カセットを含むPCR産物を、XhoI及びApaI制限酵素を
使用して完了まで消化し、ispD-ispE遺伝子カセットを含むPCR産物を、ApaI及びMluI制限
酵素を使用して完了まで消化して、2つのPCR産物を精製した。ベクターpAM29をSalI及びM
luI制限酵素を使用して完了まで消化して、「最上」DXP経路オペロンを含む2つの消化し
たPCR産物をpAM29ベクターのSalI MluI制限酵素部位に結合し、発現プラスミドpAM408を
得た（プラスミドマップについては、図7を参照されたい）。
【０２０９】
発現プラスミドpAM4O9は、「最下」DXP経路の酵素をコードする遺伝子をpAM369ベクタ
ーに挿入することによって作製した。「最下」DXP経路の酵素は、2C-メチル-D-エリスリ
トール 2,4-シクロジホスフェートシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）のispF遺伝
子によってコードされる）、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-（E）-ブテニル-4-ジホスフェー
トシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）のispG遺伝子によってコードされる）及びイ
ソペンテニル／ジメチルアリルジホスフェートシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）
のispH遺伝子によってコードされる）を含み、これは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D
-エリスリトール-2-ホスフェートをIPP及びDMAPPに共に変換する。また、IPPは、イソペ
ンチルジホスフェートイソメラーゼ（大腸菌（Escherichia coli）のidi遺伝子によって
コードされる）の活性を介してDMAPPに変換される。DMAPPは、ファルネシルジホスフェー
トシンターゼ（大腸菌（Escherichia coli）のispA遺伝子によってコードされる）の活性
を介してFPPに更に変換することができる。「最下」DXP経路の酵素をコードするオペロン
、並びにイソペンチルジホスフェートのイソメラーゼ及びファルネシルジホスフェートシ
ンターゼは、大腸菌（Escherichia coli）株DH1（ATCC #33849）からのispF（GenBankア
クセッション番号U00096 領域：2869323..2869802）、ispG（GenBankアクセッション番号
U00096 領域：2638708..2639826）、ispH（GenBankアクセッション番号U00096 領域：262
77..27227）、idi（GenBankアクセッション番号AF119715）及びispA（GenBankアクセッシ
ョン番号D00694 領域：484..1383）遺伝子を、付加された最適のShine Dalgarno配列、並
びに5'及び3'制限酵素部位と共に、適切なPCRプライマーを使用して、PCR増幅することに
よって作製した。PCR産物をゲル電気泳動によって分離して、ゲル抽出し、適切な制限酵
素（ispF遺伝子を含むPCR産物のためにBamHI及びApaI；ispG遺伝子を含むPCR産物のため
にKpnI及びApaI；ispH遺伝子を含むPCR産物のためにSalI及びKpnI；idi遺伝子を含むPCR
産物のためにSalI及びHindIII；ispA遺伝子を含むPCR産物のためにHindIII及びNcoI）で
消化し、精製した。次いで、おおまかに等モルの量のそれぞれのPCR産物を結合反応に添
加し、オペロン内に個々の遺伝子を構築した。この結合反応から、1μlの反応混合物を使
用して、2つの別々の遺伝子カセット、すなわちispF-ispG及びispH-idi-ispA遺伝子カセ
ットをPCR増幅した。ispF-ispG遺伝子カセットは、プライマー67-2A-C（配列番号：23）
及び67-2D-C（配列番号：26）を使用してPCR増幅し、ispH-idi-ispA遺伝子カセットは、
プライマー67-2E-C（配列番号：27）及び67-2J-C、（配列番号：32）を使用してPCR増幅
した。2つのPCR産物をゲル電気泳動によって分離して、ゲル抽出した。ispF-ispG遺伝子
カセットを含むPCR産物を、BamHI及びKpnI制限酵素を使用して完了まで消化し、ispH-idi
-ispA遺伝子カセットを含むPCR産物を、KpnI及びNcoI制限酵素を使用して完了まで消化し
て、2つのPCR産物を精製した。ベクターpAM369は、pAM29からp15A複製開始点及びpZE12-l
ucからアンピシリン耐性のためのベータラクタマーゼ遺伝子（Lutz及びBujardの論文（19
97）Nucl Acids Res. 25：1203-1210）を、オリゴヌクレオチドで作製したlacUV5プロモ
ーターと共に構築することによって作製した。ベクターpAM369を、BamHI及びNcoI制限酵
素を使用して完了まで消化して、「最下」DXP経路オペロンを含む2つの単離されたPCR産
物をpAM369ベクターのBamHI NcoI制限酵素部位に結合し、発現プラスミドpAM409を得た。
【０２１０】
広範な宿主域RK2複製開始点を含む発現プラスミドpAM409の誘導体である発現プラスミ
ドpAM424は、lacUV5プロモーター及びpAM409のispFGH-idi-ispAオペロンをpAM257ベクタ
ーに移すことによって作製した。ベクターpAM257は、以下の通りに作製した：RK2par座位
をプライマー9-156A（配列番号：33）及び9-156B、（配列番号：34）を使用してRK2プラ
スミドDNA（Meyerらの論文（1975）Science 190：1226-1228）をPCR増幅し、2.6kbのPCR
産物を、AatII及びXhoI制限酵素を使用して完了まで消化して、DNA断片をベクターpZA31-
luc（Lutz及びBujard（1997）Nucl Acids Res. 25：1203-1210）からのp15複製開始点及
びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドに結合させて、プラスミドpAM37par
を得て；pAM37-parを制限酵素SacI及びHindIIIを使用して完了まで消化して、反応混合物
をゲル電気泳動によって分離して、RK2 par座位及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を
含むDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片を、ミニRK2 レプリコンpRR 10（Robert
sらの論文（1990）J Bacteriol. 172：6204-6216）のSacI HindIII部位に結合し、ベクタ
ーpAM133を得て；pAM133を、BglII及びHindIII制限酵素を使用して完了まで消化し、反応
混合物をゲル電気泳動によって分離して、アンピシリン耐性遺伝子及びoriT接合性の起源
を欠いているおよそ6.4kbのDNA断片をゲル抽出して、単離されたDNA断片を、PciI及びXho
I制限酵素部位を含んだマルチプルクローニングサイトを含む合成的に作製したDNA断片と
結合ベクターpAM257を得た。発現プラスミドpAM409を、XhoI及びPciI制限酵素を使用して
完了までに消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分離しておよそ4.4kbのDNA断片を
ゲル抽出した。ベクターpAM257を、制限酵素XhoI及びPciIを使用して完了まで消化して、
lacUV5プロモーター及びispFGH-idi-ispAオペロンを含む単離されたDNA断片を、pAM257ベ
クターのXhoI PciI制限酵素部位に結合し、発現プラスミドpAM424を得た（プラスミドマ
ップについては、図8を参照されたい）。
【０２１１】
（実施例5）
【０２１２】
本実施例は、FPP又はGPPを変換する酵素をコードする発現プラスミドを作るための方法
を記述する。
【０２１３】
発現プラスミドpTrc99A-ADSは、ベクターpTrc99Aにアモルファ-4,11-ジエンシンターゼ
（ADS）をコードするヌクレオチド配列を挿入することによって作製した。アモルファ-4,
11-ジエンシンターゼの配列は、翻訳により、アミノ酸配列がMerkeらの論文（2000）Ach.
Biochem. Biophys. 381：173-180によって記述されたものと同一であろうように、アモ
ルファ-4,11-ジエンシンターゼをコードするヌクレオチド配列が大腸菌（Escherichia co
li）における発現のために最適化されるように、およびヌクレオチド配列が5'NcoI及び3'
XmaI制限酵素部位に隣接するように、合成的に作製した（米国特許番号7,192,751号を参
照されたい）。ヌクレオチド配列は、NcoI及びXmaI制限酵素を使用して完全に消化し、反
応混合物をゲル電気泳動によって分離し、およそ1.6kbのDNA断片をゲル抽出し、単離され
たDNA断片をpTrc99Aベクター（Ammanらの論文（1985）Gene 40：183-190）のNcoI、XmaI
制限酵素部位に挿入し、発現プラスミドpTrc99A-ADSを得た（プラスミドマップについて
は、図9を参照されたい）。
【０２１４】
発現プラスミドpAM113は、pTrc99A-ADSのクロラムフェニコール耐性の誘導体である。
これは、5'リン酸化プライマー19-137 cml-pAM37-AS（配列番号：35）及び19-137cml-pAM
37-S（配列番号：36）を使用して、ベクターpZA31（Lutz及びBujard（1997）Nucl Acids 
Res. 25：1203-1210）からクロラムフェニコール耐性遺伝子をPCR増幅して、発現プラス
ミドpTrc99A-ADSのFspI制限酵素部位に920 bpのPCR産物を挿入し、発現プラスミドpAM113
を得ることによって作製した。
【０２１５】
発現プラスミドpC9は、nudF遺伝子のコード配列及び上流のゲノム配列（GenBankアクセ
ッション番号Z99116 領域：49364..48548）を含む枯草菌（Bacillus subtilis）6051のゲ
ノムDNA断片をベクターpTrc99A（Amannらの論文（1988）Gene 69：301-315）に挿入する
ことによって作製した。発現プラスミドpNudF-Hは、枯草菌（Bacillus subtilis）6051の
nudF遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号Z99116 領域：49105..48548）をベ
クターpTrc99Aに挿入することによって作製した。発現プラスミドpyhfRは、枯草菌（Baci
llus subtilis）6051 yhfR遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号Z99109 領域
：97583..97002）をベクターpTrc99Aに挿入することによって作製した。
【０２１６】
発現プラスミドpAM373は、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最
適化されたクソニンジン（Artemisia annua）のβ-ファルネセンシンターゼ（FSB）をコ
ードするヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号AY835398）をpTrc99Aベクターに
挿入することによって作製した。β-ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド
配列は、合成的に作製して、適切なプライマーを使用してそのDNA合成構築物からPCRによ
って増幅した。β-ファルネセンシンターゼを含むPCR産物においてリーダーNcoI制限酵素
部位を作製するために、本来のポリペプチド配列（セリンをコードするTCG）の第二アミ
ノ酸をコードするコドンを5' PCRプライマー（配列番号：37）においてアスパラギン酸を
コードするコドン（GAC）によって置換した。生じるPCR産物を、NcoI制限酵素を使用して
部分的に消化して、SacI制限酵素を使用して完了まで消化し、反応混合物をゲル電気泳動
によって分離し、β-ファルネセンシンターゼコード配列を含むおよそ1.7kbのDNA断片を
ゲル抽出し、単離したDNA断片を、pTrc99AベクターのNcoI SacI制限酵素部位に結合し、
発現プラスミドpAM373を得た（プラスミドマップについては、図9を参照されたい）。
【０２１７】
発現プラスミドpTrc99A-FSA、pTrc99A-GTS、pTrc99A-PS、pTrc99A-TSは、α-ファルネ
センシンターゼ（FSA）、γ-テルピネンシンターゼ（GTS）、α-ピネンシンターゼ（APS
）又はテルピノレンシンターゼ（TS）をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片をpTr
c99Aベクターに挿入することによって作製した。DNA断片挿入断片は、例えばオウシュウ
トウヒ（Picea abies）のα-ファルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアク
セッション番号AY473627、領域：24..1766）、クソニンジン（Artemisia annua）のβ-フ
ァルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号AY835398）、レ
モン（Citrus limon）のγ-テルピネンシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッ
ション番号AF514286 領域：30..1832）、アメリカオオモミ（Abies grandis）（GenBank
アクセッション番号U87909、領域：6..1892）又はタエダマツ（Pinus taeda）（GenBank
アクセッション番号AF543530 領域：1..1887）のα-ピネンシンターゼ遺伝子のコード配
列、若しくはバジル（Ocimum basilicum）（GenBankアクセッション番号AY693650）又は
ダグラスファー（Pseudotsuga menziesii）のコード配列（GenBankアクセッション番号AY
906866 領域：10.. 1887）又はアメリカオオモミ（Abies grandis）（GenBankアクセッシ
ョン番号AF139206）のテルピノレンシンターゼ遺伝子のコード配列を鋳型として使用して
合成的に作製し、全てのヌクレオチド配列は、大腸菌（Escherichia coli）における発現
のためにコドン最適化させてある。FSAのためのDNA断片を、プライマー配列番号：39及び
配列番号：40を使用してそのDNA合成構築物からPCRによって増幅した。生じるPCR産物を
、NcoI及びSacI制限酵素を使用して完全に消化し、反応混合物をゲル電気泳動によって分
離し、α-ファルネセンシンターゼコード配列を含むおよそ1.7kbのDNA断片をゲル抽出し
、単離したDNA断片をpTrc99AベクターのNcoI SacI制限酵素部位に結合し、発現プラスミ
ドpTrc99A-FSAを得た（プラスミドマップについては、図9を参照されたい）。GTS、APS及
びTSのためのDNA断片は、リーダーXmaI制限酵素部位及び末端XbaI制限酵素部位に隣接さ
れるようにデザインしてあり、標準的なpUC又はpACYC起源ベクターなどのクローニングベ
クターの互換性制限酵素部位にクローン化し、そこから、これらはXbaI及びXmaI制限酵素
を使用して、DNA合成構築物を完全に消化することによって再び遊離して、ゲル電気泳動
によって反応混合物を分離して、1.7〜1.9のテルペンシンターゼをコードするDNA断片を
ゲル抽出することができた。単離したDNA断片をベクターpTrc99A（Ammanらの論文、Gene 
40：183-190（1985））のXmaI XbaI制限酵素部位に連結し、プラスミドpTrc99A-GTS、pTr
c99A-APS又はpTrc99A-TSを得た（プラスミドマップについては、図9を参照されたい）。
【０２１８】
発現プラスミドpRS425-FSA及びpRS425-FSBは、α-ファルネセンシンターゼ（FSA）又は
β-ファルネセンシンターゼ（FSB）をコードするヌクレオチド配列をそれぞれpRS425-Gal
lベクターに挿入することによって作製した（Mumbergらの論文（1994）Nucl. Acids. Res
. 22（25）：5767-5768）。ヌクレオチド配列挿入断片は、例えばオウシュウトウヒ（Pic
ea abies）のα-ファルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番
号AY473627、領域：24..1766）、クソニンジン（Artemisia annua）のβ-ファルネセンシ
ンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号AY835398）のコード配列を鋳
型として使用して合成的に作製し、酵母における発現のためにコドン最適化した。合成的
に作製したヌクレオチド配列は、5'BamHI部位及び3'XhoI部位によって隣接し、従って、
標準的なpUC又はpACYC起源ベクターなどのクローニングベクターの互換性制限酵素部位に
クローン化することができる。合成的に作製したヌクレオチド配列を、BamHI及びXhoI制
限酵素を使用してDNA合成構築物を完全に消化することによって単離した。反応混合物を
ゲル電気泳動によって分離し、α-ファルネセンシンターゼ又はβ-ファルネセンシンター
ゼのコード配列を含むおよそ1.7kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpRS425-Ga
l1ベクターのBamHI XhoI制限酵素部位に連結し、発現プラスミドpRS425-FSA又はpRS425-F
SBをそれぞれ得た。
【０２１９】
発現プラスミドpTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS及
びpTrc99A-SSは、リナロールシンターゼ（LLS）、リモネンシンターゼ（LMS）、β-ピネ
ンシンターゼ（BPS）、β-フェランドレン（PHS）、カレンシンターゼ（CS）又はサビネ
ンシンターゼ（SS）をコードするヌクレオチド配列をpTrc99Aベクターに挿入することに
よって作製される。ヌクレオチド配列挿入断片は、例えばクソニンジン（Artemisia annu
a）のリナロールシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号AF154124、
領域：13..1764）、アメリカオオモミ（Abies grandis）のリモネンシンターゼ遺伝子の
コード配列（GenBankアクセッション番号AF006193 領域：73..1986）、クソニンジン（Ar
temisia annua）のβ-ピネンシンターゼのコード配列（GenBankアクセッション番号AF276
072 領域：1..1749）、アメリカオオモミ（Abies grandis）のβ-フェランドレンシンタ
ーゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号AF 139205 領域：34..1926）、サ
ルビア・ステノフィラ（Salvia stenophylla）のカレンシンターゼ遺伝子のコード配列（
GenBankアクセッション番号AF527416 領域：78..1871）又はコモンセージ（Salvia offic
inalis）のサビネンシンターゼ遺伝子のコード配列（GenBankアクセッション番号AF05190
1 領域：26..1798）を鋳型として使用して、合成的に作製される。β-ピネン、サビネン
及びβ-フェランドレンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、リーダーXmaI制限
酵素部位及び末端XbaI制限酵素部位に隣接し、リナロール及びカレンシンターゼをコード
するヌクレオチド配列は、リーダーNcoI制限酵素部位及び末端XmaI制限酵素部位に隣接し
、リモネンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、リーダーNcoI制限酵素部位及び
末端PstI制限酵素部位に隣接する。DNA合成構築物は、XmaI及びXbaI（β-ピネン、サビネ
ン及びβ-フェランドレンシンターゼ構築物について）、NcoI及びXmaI制限酵素（リナロ
ール及びカレンシンターゼ構築物について）又はXbaI及びPstI制限酵素（リモネンシンタ
ーゼ構築物について）を使用して完全に消化する。反応混合物をゲル電気泳動によって分
離し、およそ1.7〜1.9kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpTrc99AベクターのX
maI XbaI制限酵素部位（β-ピネン、サビネン及びβ-フェランドレンシンターゼ挿入断片
について）、NcoI XmaI制限酵素部位（リナロール及びカレンシンターゼ挿入断片につい
て）又はXbaI PstI制限酵素部位（リモネンシンターゼ挿入断片について）に連結し、発
現プラスミドpTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS及びpT
rc99A-SSを得た（プラスミドマップについては、図9を参照されたい）。
【０２２０】
（実施例6）
【０２２１】
本実施例は、本発明に有用な大腸菌宿主株の作製を記述する。
【０２２２】
表1に詳述したように、宿主株は、化学的にコンピテントな大腸菌親細胞を実施例1〜5
の1つ以上の発現プラスミドで形質転換することによって作製した。
【表１】
2020018319.tif 000024
2020018319.tif 000025
【０２２３】
宿主細胞形質転換体は、表1に詳述した抗生物質を含むLuria Bertoni（LB）寒天の上で
選択した。単一のコロニーをLB寒天から5mLのLB液体培地及び抗生物質を含む培養試験管
へ移した。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652及びB653宿主株の形質転換体を25
0rpmにて回転振盪機上で30℃にて30時間インキュベートした。その他の全ての宿主細胞は
、増殖が安定期に到達するまで250rpmにて回転振盪機上で37℃にてインキュベートした。
細胞は、0.8%のグルコース及び抗生物質を含むM9-MOPS培地の4〜5回の連続したラウンド
を介してこれらを継代することによって最少培地に適応させた（M9-MOPS培地の組成物に
ついては表2を参照されたい）。細胞は、400μLの無菌の50%グリセロール及び600μLの液
体培養からなる1mLの保存一定分量中で寒冷バイアルにおいて-80℃にて貯蔵した。
【表２】
2020018319.tif 000026
【０２２４】
（実施例7）
【０２２５】
本実施例は、RK2プラスミド複製、分離及びメンテナンスシステムを含む発現プラスミ
ドを有する大腸菌宿主株における抗生物質の非存在下での発現プラスミドの安定性を証明
する。
【０２２６】
宿主株B255の種培養は、株の保存一定分量を、40mLのM9-MOPS、2%のグルコース、0.5%
の酵母抽出物及び表1において詳述した抗生物質を含む125mLのフラスコに添加し、一晩培
養液を培養することによって確立した。
【０２２７】
種培養は、40mLのM9-MOPS培地、2%のグルコース及び0.5%の酵母抽出物をそれぞれ含む2
つの 250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種するように使用した。また、
培養#1には、100μg/mLのカルベニシリン及び34μg/mLのクロラムフェニコールを含んだ
。培養#2には、いずれの抗生物質も入れなかった。両方の培養は、およそ0.2のOD600に到
達するまで、250rpmにて回転振盪機上で37℃にてインキュベートし、その時点で宿主細胞
におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生を培養液に40μLの1MのIPTGを添加して誘導した
。誘導時に、培養は、アモルファ-4,11-ジエンを捕獲するために、8mLの有機オーバレイ
で表面を覆った。試料は、合計72時間、周期的に採取した。2つの培養における宿主株に
よるアモルファ-4,11-ジエンの産生は、実施例10に記載されているようにGC/MSによって
確認した。
【０２２８】
2つの細胞培養におけるプラスミド安定性を評価するために、それぞれの培養の試料を
、72時間にて取り出して、LB寒天板（抗生物質無し）上に画線した。37℃にて一晩インキ
ュベーションした後、それぞれの培養由来の50の個々のコロニーは、抗生物質を加えたLB
寒天（34μg/mLのクロラムフェニコール、100μg/mLのカルベニシリン）プレート及び抗
生物質の無いLB寒天（抗生物質無し）プレート上へ複製してまいた。37℃にてもう一晩イ
ンキュベーションした後、LB寒天プラス抗生物質及び抗生物質の無いLB寒天プレートには
、それぞれおよそ50コロニーを含むことが判明し、プラスミド保持は、培養液における抗
生物質の存在及び非存在下の両方にておよそ100%であることを示している。
【０２２９】
（実施例8）
【０２３０】
本実施例は、大腸菌宿主株におけるサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces ce
revisiae）のtHMGRと比較した糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）のHMGRの増加した比
活性及び安定性を証明する。
【０２３１】
宿主株B61及びB62の種培養は、20mLのM9-MOPS培地、0.8%のグルコース及び表5に詳述し
た抗生物質を含む125mLのフラスコにそれぞれの株の保存一定分量を添加することによっ
て、及び飽和まで培養物を増殖させることによって確立した。種培養は、500mLのフラス
コにおいて140mLの新鮮な培地に1：100に希釈して、およそ0.1のOD550にまで再び増殖さ
せ、その時点で、アモルファ-4,11-ジエンの産生を、それぞれの培養に140μLの1M IPTG
を添加することによって誘導した。誘導後4、12、20、28、36及び49時間にて、試料をそ
れぞれの培養から取り出し、細胞を遠心分離によってペレットにした。細胞ペレットをド
ライアイス上ですぐに凍結し、次いで-80℃にて貯蔵した。
【０２３２】
酵素アッセイを行うために、細胞ペレットを氷上で解凍させ、次いでプロテアーゼ阻害
剤混合物#3（Calbiochem, San Diego, CA）、ベンゾナーゼ（20μL oer5mL bugbuster；N
ovagen, Madison, WI）及びリゾチーム（30μg/mL）を含むBugbuster（Novagen, Madison
, WI）を使用して溶解した。サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae
）tHMGRの酵素活性は、50mM Tris HCl（pH7.5）、0.2mM NADPH（Sigma, St. Louis, MO）
及び0.3mM DL-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA（HMG-CoA）ナトリウム塩
（Sigma, St. Louis, MO）においてアッセイした。アッセイは、細胞可溶化物を添加する
ことによって開始し、NADPHの消失を340nmでの吸光度によってモニターした。NADPHの非
特異的な消失を考慮するために、HMG-CoAを欠いている対照アッセイにおいて得られた結
果を、試験試料において得られた結果から減算した。糞便腸球菌（Enterococcus faecali
s）HMGRの酵素活性は、アッセイ緩衝液が100mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）、0.4mM N
ADPH、1.0mM EDTA及び100mM KCIを含んだことを除いて、同様に測定した。
【０２３３】
タンパク質アッセイは、Bradford（（1976）Anal Biochem. 72：248-254）の方法によ
って行った。比活性は、Δnmol NADPH/min/mgタンパク質として算出した。
【０２３４】
（実施例9）
【０２３５】
本実施例は、乾燥菌体重量（DCW）でOD600の較正を記述する。
【０２３６】
DCW及びOD600の関係を得るために、代表的な株B32を実施例10〜12において記述したも
のと同様の高細胞密度プロセスにおいて増殖させた。試料をその実行を通して採取し、OD
600及びDCWをそれぞれの試料について測定した。DCWを決定するために、細胞をペレット
にし、上清を廃棄した。細胞ペレットを水で一度洗浄して、次いで、少なくとも3日間、8
0℃にて乾燥器において乾燥させた。細胞ペレットを含むチューブを重量測定し、チュー
ブの重量を測定された重量から減算し、残りの重量をそれぞれの試料（0.0015L）の初期
容積によって割り、DCWを得た。
【０２３７】
（実施例10）
【０２３８】
本実施例は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）tHMGR及びH
MGSを発現する宿主株と比較して、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）HMGR及びHM
GSを発現する大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生
の増加を証明する。
【０２３９】
宿主株B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255及びB256の種培養は、それぞれの株の
保存一定分量を25mLのM9-MOPS培地、0.8%のグルコース及び表1において詳述した抗生物質
を含む別々の125mLのフラスコに添加することによって、及び一晩培養を増殖させること
によって確立した。
【０２４０】
種培養は、40mLのM9-MOPS培地、2%のグルコース及び抗生物質を含む別々の250mLのフラ
スコにおよそ0.05の初期OD600にて播種するように使用した。培養は、およそ0.2のOD600
に到達するまで、250rpmにて回転振盪機上で30℃にてインキュベートし、その時点で、宿
主細胞におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生を、培養液に40μLの1MのIPTGを添加する
ことによって誘導した。培養は、8mLの有機オーバレイ（例えば、ドデカン、オレイン酸
メチル又はイソプロピルミリステート）で表面を覆った。有機オーバレイ層及びブロスの
試料を72時間の間、一日一回採取した。ブロス試料を使用してOD600を測定した。アモル
ファ-4,11ジエン濃度は、5μLの有機オーバレイ層を、内部標準としてβ-又はトランス-
カリオフィレンをスパイクした500μL酢酸エチルを含む清潔なガラスバイアルへ移すこと
によって測定された。
【０２４１】
有機オーバレイ／酢酸エチル試料は、Martinらの論文（2001）Biotechnol. Bioeng. 75
：497-503に記載されているように、2つのイオン、分子イオン（204m/z）及び189m/zイオ
ンについてのみ走査することによって、Hewlett-Packard 6890ガスクロマトグラフ/質量
分析計（GC/MS）で解析した。実行時間を速めるために、温度プログラム及びカラムマト
リックスを、最適のピーク分離度及び最も短い全体の実行時間を達成するように修正した
。1μLの試料をDB-XLBカラム（Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CAから入手可
能）及びヘリウムキャリアガスを使用してGCで分離した。解析のための温度プログラムは
、以下の通りだった：0.75分間100℃、60℃/分にて温度を300℃の温度まで上昇及び0.5分
間300℃にて保持。分離された試料は、Hewlett-Packardモデル5973質量選択検出器によっ
て解析し、イオン189及び204m/zをモニターした。以前の質量スペクトルは、アモルファ-
4,11-ジエンシンターゼ産物がアモルファ-4,11-ジエンであること、及びアモルファ-4,11
-ジエンがこのGCプロトコルを使用して3.7分の保持時間を有したことを証明した。β-又
はトランス-カリオフィレンを定量化のための内部標準として使用した。アモルファ-4,11
-ジエン力価は、カリオフィレンをスパイクした酢酸エチルにおける精製したアモルファ-
4,11-ジエン（0.63-10mg/LのKJF17-109-3）の定量的検量線基づいて、アモルファ-4,11-
ジエンピーク面積に対する内部標準の比を使用して算出した。
【０２４２】
（実施例11）
【０２４３】
本実施例は、最適以下の温度にて増殖された大腸菌（Escherichia coli）宿主株による
アモルファ-4,11-ジエンの産生の増加を証明する。
【０２４４】
宿主株B32の種培養は、50mLのM9-MOPS培地及び表1において詳述した抗生物質を含む250
mLのフラスコに株の保存一定分量の0.5mLを添加すること、並びに250rpmにて回転振盪機
上で37℃にて一晩培養を増殖させることによって確立した。
【０２４５】
種培養を使用して、40mLの発酵槽バッチ培地（培地組成については表6を参照されたい
）、100mM MOPS緩衝液pH7及び抗生物質のそれぞれを含む4つの250mLのフラスコに、およ
そ0.05の初期OD600にて播種した。培養は、これらが0.18〜0.22のOD600に到達するまで、
30℃又は37℃にて250rpmにて回転振盪機上でインキュベートし、その時点で、宿主細胞に
おけるアモルファ-4,11-ジエンの産生を、培養液に40μLの1MのIPTGを添加することによ
って誘導した。誘導時に、培養は、アモルファ-4,11-ジエンを捕獲するために、8mLの有
機オーバレイで表面を覆った。試料は、一日一回採取して、実施例10に記載したように解
析した。
【０２４６】
（実施例12）
【０２４７】
本実施例は、制限された炭素源条件下で増殖された大腸菌（Escherichia coli）宿主株
によるアモルファ-4,11-ジエンの産生の増加を証明する。
【０２４８】
発酵実行050608-1及び050629-1のための宿主株B32の種培養は、50mLのM9-MOPS培地及び
表1に詳述した抗生物質を含む250mLのフラスコに、0.25μLの株の保存一定分量のを添加
することによって、及びそれが1〜2のOD600に到達するまで、250rpmにて回転振盪機上で3
7℃にて培養をインキュベートすることによって確立した。
【０２４９】
発酵実行060403-3のための宿主株B32の種培養は、50mLのM9-MOPS培地及び表1に詳述し
た抗生物質を含む250mLのフラスコに、株の保存一定分量添加することによって、並びに2
50rpmにて回転振盪機上で37℃にて一晩培養をインキュベートすることによって確立した
。種培養を使用して、40mLのM9-MOPS培地及び抗生物質を含む250mLのフラスコに、およそ
1の初期OD600にて播種し、それが3〜5のOD600に到達するまで、250rpmにて回転振盪機上
で37℃にて培養を再びインキュベートした。
【０２５０】
全ての発酵プロセスについて、KH2P04、K2HP04 3H20、EDTA、クエン酸及び（NH4）2SO4
は、バイオリアクター（ADI 1010コントローラを備えた2LのApplikon Bioconsole ADI 10
25s , Applikon Biotechnology, Foster City, CA）において熱滅菌した。残りの培地成
分は、保存液としてフィルター滅菌し、ヘッドプレート（headplate）を介して注入した
。表3は、発酵実行050608-1及び050629-1についての最終的な培地組成を示す。表4は、発
酵実行060403-3についての最終的な培地組成を示す。実行050608-1についての開始体積は
0.8L、050629-1についての開始体積は1.2Lであり、及び060403-3についての開始体積は、
1Lであった。全ての実行は、ヘッドプレートを介して種培養の50mLを注入することによっ
て播種した。
【表３】
2020018319.tif 000027
【表４】
2020018319.tif 000028
【０２５１】
発酵実行050608-1（過剰な炭素）については、供給を誘導時に開始し、供給速度は、手
動で調整した。発酵実行050629-1（炭素制限的）については、供給は、表5に示したプロ
トコルに従って発酵槽に送達した。発酵実行060403-3（最低の炭素）については、供給は
、初期グルコースボーラス投与（15g）を使い果たし、溶存酸素をスパイクしたときに、
自動的に開始した。27.6g/時間までで、供給速度は、以下の方程式に従って算出された：
【数１】
2020018319.tif 000029
式中、t0は、初期グルコースが枯渇した時間である。最大速度に到達時に、グルコース
供給を9.5g/時間の速度に制限し、実行の残りの間この速度にて一定に保持した。
【表５】
2020018319.tif 000030
【０２５２】
実行050608-1及び050629-1は、37℃にて行った。バイオリアクターにおける空気流は、
1〜2L/分に設定し；pHは、水酸化アンモニウム及び/又は水酸化ナトリウムを使用して7に
て維持し；初期撹拌は、500〜600rpmであり；泡は、消泡剤B（Sigma-Aldich, St. Louis,
MO）で制御させ；溶存酸素レベルは、撹拌カスケードを使用して30%以上に維持した。培
養の5〜6時間後、宿主細胞によるアモルファ-4,11-ジエンの産生を、実行050608-1に対し
て0.8mLの1MのIPTGを、実行050629-1に対して1.2mLのIPTGを添加することによって誘導し
た。誘導により、培養温度は、30℃に減少した。
【０２５３】
実行060403-3を30℃にて行った。バイオリアクターにおける空気流は、1〜2L/分に設定
し；pHは、水酸化アンモニウムを使用して7にて維持した。溶存酸素は、撹拌カスケード
及び酸素濃縮によって30%以上で維持した。およそ28のOD600にて（播種後19時間）、宿主
細胞によるアモルファ-4,11-ジエンの産生を、1mLの1MのIPTGを添加することによって誘
導した。
【０２５４】
アモルファ-4,11-ジエンは、2つの異なるプロトコルに従って捕獲して、抽出した。実
行050608-1及び050629-1については、発生気体に存在する揮発性アモルファ-4,11-ジエン
を、200mLのヘプタノールを含む気体洗浄器を通して発生気体を排気することによって捕
獲した。次いで、ヘプタノールを、試料におけるアモルファ-4,11-ジエン濃度が0.63mg/L
〜20mg/Lとなるまで、酢酸エチルに希釈した。実行060403-3については、アモルファ-4,1
1-ジエンを、誘導時に200mLの有機オーバレイを発酵槽に添加することによって捕獲した
。産物濃度は、有機オーバレイを加えた25μLのブロスを975μLのアセトニトリルと合わ
せ、Fisher Vortex Genie 2（商標）ミキサー（Scientific Industries, Inc., Bohemia,
NY）上で最大速度にて試料を少なくとも3分間振盪して、遠心分離によって試料から細胞
を除去し、試料におけるアモルファ-4,11-ジエン濃度が0.63及び20mg/Lとなるまでアセト
ニトリル溶液を酢酸エチルに希釈することによって測定した。酢酸エチル試料は、実施例
10に記載したようにGC/MSによって解析した。
【０２５５】
（実施例13）
【０２５６】
本実施例は、制限された炭素源条件下及び最適以下の温度にて増殖された大腸菌（Esch
erichia coli）宿主株によるアモルファ-4,11-ジエンの産生の増加を証明する。
【０２５７】
宿主株B153の種培養は、50mLのM9-MOPS培地及び表1に詳述した抗生物質を含む250mLの
フラスコに、株の保存一定分量を添加することによって、及び3.5〜4.5のOD600にまで250
rpmにて回転振盪機上で37℃にて培養を増殖することによって確立した。
【０２５８】
2Lのバイオリアクター（Bioconsole ADI 1025を備えたBiocontroller ADI 1010, Appli
kon Biotechnology, Foster City, CA）を準備して、株及び誘導時間は変更されていたこ
とを除き、実行060403-3について実施例12に記載したのと同様に実行した。
【０２５９】
宿主細胞におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生は、培養液に1mLの1MのIPTGを添加す
ることによって誘導した。アモルファ-4,11-ジエンは、2つの異なるプロトコルに従って
捕獲して、抽出した。一つの方法では、発生気体に存在する揮発性のアモルファ-4,11-ジ
エンを、200mLのヘプタノールを含む気体洗浄器を通して発生気体を排気することによっ
て捕獲した。次いで、ヘプタノールは、試料におけるアモルファ-4,11-ジエン濃度が0.63
mg/L及び20mg/Lとなるまで酢酸エチルに希釈し、もう一つでは、アモルファ-4,11-ジエン
を、誘導時に有機オーバレイの200mLを発酵槽に添加することによって捕獲した。
【０２６０】
アモルファ-4,11-ジエンは、25μLブロスを975μLアセトニトリルと合わせ、Fisher Vo
rtex Genie 2(商標)ミキサー（Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY）上で最大速
度にて試料を少なくとも3分間振盪して、遠心分離によって試料から細胞を除去し、試料
におけるアモルファ-4,11-ジエン濃度が0.63〜20mg/Lとなるまでアセトニトリル溶液を酢
酸エチルに希釈することによって、培養液から抽出した。酢酸エチル試料は、実施例10に
記載されているようにGC/MSによって解析した。
【０２６１】
（実施例14）
【０２６２】
本実施例は、制限された炭素及び窒素源条件下並びに最適以下の温度にて増殖された大
腸菌（Escherichia coli）宿主株によるアモルファ-4,11-ジエン産生の増加を証明する。
【０２６３】
宿主株B86の種培養は、50mLのM9-MOPS培地及び表1に詳述した抗生物質を含む250mLのフ
ラスコに、株の保存一定分量を添加することよって確立した。培養は、250rpmにて回転振
盪機上で37℃にて一晩増殖させ、次の朝およそ1のOD600にて同じ培地に二次培養して、3
〜5のOD600にまで37℃及び250rpmにて再び増殖させた。
【０２６４】
4つの2Lのバイオリアクター（Bioconsole ADI 1025を備えたBiocontroller ADI 1010, 
Applikon Biotechnology, Foster City, CA）を準備して、窒素制限された実行が供給に
おいて硫酸アンモニウムを含まなかったことを除き、実行060403-3について実施例12に記
載したのと同様に実行した。
【０２６５】
6時間の倍加時間での指数関数的なグルコース供給は、初期グルコースボーラス投与（15g
）を使い果たし、溶存酸素をスパイクしたときに、自動的に開始した。30.4g/時間までで
、供給速度は、以下の方程式に従って算出した：
【数２】
2020018319.tif 000031
式中、□は、比増殖率であり、t0は、初期グルコースボーラス投与が枯渇した時間であ
る。最大速度に到達すると、グルコース供給は、11.4g/時間の速度に減少し、実行の残り
の間この速度にて一定に保持した。発酵実行060710-4、060724-5及び060619-5（炭素及び
窒素制限的）において、グルコース供給は、アンモニア制限が培地におけるグルコース蓄
積を導くときに、更に減少した。
【０２６６】
発酵は30℃の減少した温度にて実施した。バイオリアクターにおける気流は、1vvmに設
定し；初期撹拌は、700rpmであり；泡は、消泡剤B（Sigma-Aldich, St. Louis, MO）で制
御し；及び溶存酸素強度は、撹拌カスケード（700〜1,200rpm）及び酸素濃縮を使用して
、40%にて制御した。発酵実行060327-3（炭素制限的）では、pHを、20%のNH4OHを使用し
て7にて維持し；発酵実行060710-4、060724-5及び060619-5（炭素及び窒素制限的）ではp
Hを、最初に20%のNH4OHを使用して7にて維持して、2.5N NaOH及び10N NH4OHの50/50混合
液を使用して72時間にて開始し、更に発酵槽に入るアンモニアの量を制限した。
【０２６７】
宿主細胞におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生は、培養液に1mLの1MのIPTGを添加す
ることによっておよそ30のOD600にて誘導した。
【０２６８】
アモルファ-4,11-ジエンは、10%（v/v）の有機オーバレイで培地を覆うことによって捕
獲した。次いで、アモルファ-4,11-ジエンは、25μLブロスを975μLアセトニトリルと合
わせて、Fisher Vortex Genie 2（商標）ミキサー（Scientific Industries, Inc., Bohe
mia, NY）上で最大速度にて試料を少なくとも15分間振盪して、遠心分離によって試料か
ら細胞を除去し、10μLのメタノール溶液を、10ｍL/Lのトランス-カリオフィレンを含む9
90μLの酢酸エチルに添加することによって抽出した。
【０２６９】
試料は、実施例10に記載したようにGC/MSによって解析した。
【０２７０】
（実施例15）
【０２７１】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるDXP経路を介したアモルファ-
4,11-ジエンの産生を記述する。
【０２７２】
宿主株B003、B617、B618及びB619の種培養は、25mLのM9-MOPS及び表1において詳述した
抗生物質を含む125mLの別々のフラスコにそれぞれの株の保存一定分量を添加することに
よって、及び一晩培養を増殖させることによって確立した。
【０２７３】
種培養を使用して、40mLのM9-MOPS培地、45μg/mLのチアミン、微量栄養素、1.00E-5mo
l/LのFeSO4、0.1MのMOPS、0.5%の酵母抽出物、20g/LのD-グルコース、及び抗生物質を含
む別々の250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養は、これらが0.
2〜0.3のOD600に到達するまで、250rpmにて加湿したインキュベートシェーカーにおいて3
0℃にてインキュベートし、その時点で、宿主細胞におけるアモルファ-4,11-ジエンの産
生を、培養液に40μLの1MのIPTGを添加することによって誘導した。
【０２７４】
誘導時に、培養を、アモルファ-4,11-ジエンを捕獲するために、8mLの有機オーバレイ
で表面を覆った。試料を種々の時点にて採取し、アモルファ-4,11-ジエンを実施例10に記
載したように抽出して、GC/MSによって解析した。実験は、それぞれの宿主株の2つの独立
したクローンを使用して行い、結果は、平均した。試料間の偏差は、10%未満であること
が分かった。
【０２７５】
（実施例16）
【０２７６】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株における3-メチル-ブト-3-エン-1-オ
ール及び3-メチル-ブト-2-エン-1-オールの産生を記述する。
【０２７７】
宿主株B286、B287、B288及びB291の種培養は、表1に詳述した抗生物質を含むLB寒天上
にそれぞれの株の保存一定分量を画線することによって確立した。3つの独立したコロニ
ーをそれぞれの株について採集し、それぞれのコロニーを、抗生物質を含む7mLのLB培地
に播種した。培養を、後期対数期まで250rpmにて回転振盪機上で37℃にて一晩増殖させた
。次いで、培養を、40mlのM9-MOPS、2%のグルコース、0.5%の酵母抽出物及び抗生物質を
含む250mLのフラスコにおよそ0.05のOD600にて播種した。培養を、これらがおよそ0.2のO
D600に到達するまで250rpmにて回転振盪機上で37℃にて一晩増殖させ、その時点で、これ
らを、40μLの1MのIPTGを添加することにより誘導した。培養を250rpmにて回転振盪機上
で30℃にて72時間増殖させした。1日あたり1〜2回、それぞれの培養のOD600を測定し、70
0μLの試料を取り出した。培養液から3-メチル-ブト-3-エン-1-オール及び3-メチル-ブト
-2-エン-1-オールを抽出するために、600μLの酢酸エチルを、300μLのそれぞれの取り出
した試料に添加した。次いで、試料を15分間ボルテックスし、上相の400μLの酢酸エチル
を解析のために清潔なガラスバイアルへ移した。
【０２７８】
試料は、Hewlett-Packard 6890ガスクロマトグラフ/質量分析計（GC/MS）上で解析した
。1μLの試料をDB-5カラム（Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA）及びヘリウ
ムキャリアガスを使用してGC上で分離した。解析のための温度プログラムは、以下の通り
だった：3分間60℃、60℃/分にて300℃の温度まで温度を上昇、及び2分間300℃にて保持
。総実行時間は、9分であった。分離された試料をHewlett-Packardモデル5973質量選択性
検出器によって解析した。以前の質量スペクトルは、3-メチル-3-ブテン-1-オール及び3-
メチル-2-ブテン-1-オールがこのGCプロトコルを使用して2.067分の保持時間を有するこ
とを示した。3-メチル-ブト-3-エン-1-オール及び3-メチル-ブト-2-エン-1-オールでの検
出に焦点を当てるために、3-メチル-ブト-3-エン-1-オール及び3-メチル-ブト-2-エン-1-
オールにおけるイオン56及び68のみをモニターする選択的イオンモニリング法を使用した
。
【０２７９】
（実施例17）
【０２８０】
本実施例は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）宿主株によ
るアモルファ-4,11-ジエンの産生を記述する。
【０２８１】
宿主株EPY224の作製は、Roらの論文（Nature 440：940-943；2006）に、及びPCT特許公
報W02007/005604に記述されている。宿主株EPY224は、YPD培地における増殖によって、発
現プラスミドpRS425ADSの回復をして（「酵母遺伝学における方法」Methods in Yeast Ge
netics：Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 編集, ISBN 0-87969-728
-8）、YPD寒天上で単一のコロニーをまいて、次いでCSM-Met His寒天及びCSM-Met Leu寒
天上で単一のコロニーをパッチした。CSM-Met His寒天上で増殖されたクローンは、回復
したが、CSM-Met Leu寒天は、回復しなかった（すなわち、プラスミドpRS425ADSを失った
）。一つのこのようなクローンをEPY300と命名した。LEU2の代わりにそれはLEU2d選択マ
ーカーを含むことを除いてpRS425-ADSと同じプラスミドであるEPY300を発現プラスミドpR
S425-ADS-LEU2d（Erhart and Hollenberg（1983）J. Bacteriol. 156：625-635）で形質
転換し、宿主株Y185を得た。
【０２８２】
Y185宿主細胞形質転換体を、2%のグルコース、並びにヒスチジン、ロイシン及びメチオ
ニンを除く全てのアミノ酸を含む合成限定培地（CSM-グルコース；MP Biomedicals, Solo
n, OH）で選択した。宿主株EPY300は、ロイシン生合成（leu2）について栄養要求性であ
るが、Y185における発現プラスミドpRS425-ADS-LEU2dは、ロイシン原栄養性（LEU2）を回
復する。単一コロニーを、選択培地（CSM-グルコース-ヒスチジン、ロイシン、メチオニ
ン）上にパッチし、2日間増殖させた。細胞をプレートから掻爬して、寒冷チューブの1mL
の25%（v/v）のグリセロールに移した。懸濁液を混合し、次いで-80℃にて貯蔵した。
【０２８３】
宿主株Y185の種フラスコは、ロイシン及びメチオニンを欠いている25mLのCSM-グルコー
スを含む125mLのフラスコに株の保存一定分量を添加し、一晩培養を増殖させることによ
って確立した。培養を使用して、40mLのロイシンを欠いている合成定義培地を含み、かつ
0.2%のグルコース、1.8%のガラクトース及び1mMメチオニンを含む250mLのバッフルフラス
コに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養を200rpmにて回転振盪機上で30℃にて
インキュベートした。培地におけるグルコースの存在は、ガラクトースによるGAL1プロモ
ーターの誘導を妨げるので、細胞が培地のグルコースを使い切り、これらの主な炭素源と
してガラクトースを使用するように切り替えるまで、アモルファ-4,11-ジエンの産生を誘
導しなかった。接種時に、培養を、アモルファ-4,11-ジエンを捕獲するために、8mLの有
機オーバレイで表面を覆った。試料は、72時間にて、内部標準として既知の濃度のβ又は
トランス-カリオフィレンを含む500μLの酢酸エチルを含む清潔なガラスバイアルに、有
機溶媒層の5μLを移すことによって採取した。
【０２８４】
有機オーバレイ/酢酸エチル試料は、実施例10に記載したようにHewlett-Packard 6890
ガスクロマトグラフ/質量分析計（GC/MS）で解析した。
【０２８５】
72時間の増殖後、3つの酵母培養が60.68、54.48及び59.25mg/Lのアモルファ-4,11-ジエ
ンを産生することが判明した。
【０２８６】
（実施例19）
【０２８７】
本実施例は、宿主株が天然のメバロネート経路、並びに異種制御調節の制御下にある異
種メバロン酸経路を含むサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）宿
主株におけるアモルファ-4,11-ジエンの産生を記述する。
【０２８８】
酵母株CEN.PK2-I C（Y002）（MATA；ura3-52；trpl-289；leu2-3, 112；his3Δ1；MAL2
-8C；SUC2）及びCEN.PK2-1D（Y003）（MATalpha；ura3-52；trpl-289；leu2-3,112；his3
Δ1；MAL2-8C；SUC2）（J. P. van Dijkenらの論文, Enzyme Microb Technol 26, 706（2
000年6月1日））は、標準的な富栄養培地（YPD）において、又は組込みの形質転換体、プ
ラスミド保持及び減数分裂子孫の選択を可能にする適切な栄養素を欠いている制限合成培
地において（D.Rose, F. Winston, P. Heiter, Methods in yeast genetics：a laborato
ry course manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
, 1990）培養した。
【０２８９】
S. セレビジエ（S. cerevisiae）へのDNAを媒介した形質転換は、R. H. Schiestl、R. 
D. Gietz、Curr Genet 16、339（1989年12月）によって記述されたように、酢酸リチウム
手順を使用して行った。全ての遺伝子破壊及び置換は、表現型の解析、コロニーポリメラ
ーゼ連鎖反応法（「PCR」）及び増幅されたゲノムDNAのシーケンシングによって確認した
。プラスミドpAM489-pAM498は、pCR 2.1（Invitrogen, Carlsbad CA）を使用して構築し
て、図7A-C及び表6によって模式的に記述してある。HISMXマーカー配列は、M. S. Longti
neらの論文, Yeast 14、953（1998年7月）に記述されている。プラスミドDNAの伝播は、
大腸菌（Escherichia coli）株DH5αにおいて行った。
【表６】
2020018319.tif 000032
【０２９０】
S. セレビジエ（S. cerevisiae）株Y002及びY003を以下による誘導性メバロン酸経路遺
伝子の導入のために調製した。ERG9プロモーターを、天然のERG9プロモーターに相同性の
ある45塩基を含むプライマー50-56-pw100-G（配列番号：44）及び50-56-pw101-G（配列番
号：45）を使用して、pAM328（配列番号：43）からのKanMX-PMET3領域のPCR増幅によって
、酵母MET3プロモーターと置換した。10μgの結果PCR産物を、40% w/wポリエチレングリ
コール3350（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）、100mM酢酸リチウム（Sigma）、10μg サ
ケ精子 DNA（Invitrogen）及び30分間30℃のインキュベーション、続いて30分間42℃の熱
ショックを使用して、指数関数的に増殖しているY002及びY003株に形質転換した（Schies
tl & Gietz, Curr. Genet. 16：339 （1989）によって記述されたとおり）。陽性の組換
え体を、これらが0.5μg/mlジェネテシン（Invitrogen Co, Carlsbad, CA）を含む富栄養
培地上で増殖する能力によって同定して、診断PCRによって確認した。生じたクローンに
は、名称Y93（MAT A）及びY94（MATα）を与えた。次に、ADE1オープンリーディングフレ
ームをカンジタ・グラブラータ（Candida glabrata） LEU2遺伝子（CgLEU2）と置換した
。3.5KBのCgLEU2ゲノムの座位は、ADE1オープンリーディングフレーム（ORF）に側方相同
性のある50塩基を含むプライマー61-67-CPK066-G（配列番号：46）及び61-67-CPK067-G（
配列番号：47）を使用して、C. グラブラータ（C. glabrata）ゲノムDNA（ATCC, Manassa
s, VA）から増幅した。10μgの結果PCR産物を、上記の通りに指数関数的に増殖しているY
93及びY94に形質転換した。ade1-株は、ロイシン補充の非存在下での増殖について選択し
て、診断PCRによって確認した。生じたクローンには、名称Y176（MAT A）及びY177（MAT
α）を与た。
【０２９１】
S. セレビジエ（S. cerevisiae）株Y188を作製するために、それぞれpAM491（配列番号
：48）及びpAM495（配列番号：49）由来の2μgのプラスミドDNAを、PmeI（New England B
iolabs, Beverly, MA）で一晩消化して、上記の通りに指数関数的に増殖しているY176に
導入した。陽性の組換え体は、ウラシル及びヒスチジンを欠いている培地上での増殖によ
って選択した。正確なゲノムの座位への組込みは、診断PCRによって確認した。
【０２９２】
S. セレビジエ（S. cerevisiae）株Y189を作製するために、それぞれpAM489（配列番号
：50）及びpAM497（配列番号：51）由来の2μgのプラスミドDNAを、PmeIで一晩消化して
、上記の通りに指数関数的に増殖しているY177に導入した。陽性の組換え体は、トリプト
ファン及びヒスチジンを欠いている培地上での増殖によって選択した。正確なゲノムの座
位への組込みは、診断PCRによって確認した。
【０２９３】
Y188及びY189からのおよそ1×107細胞を室温で6時間、YPD培地プレート上で混合し、接
合させた。次いで、混合した細胞培養をヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンを欠い
ている培地にまいて、二倍体細胞の増殖について選択した。pAM493（配列番号：52）から
の2μgのプラスミドDNAをPmeIで一晩消化して、上記の通りに指数関数的に増殖している
二倍体細胞に導入した。陽性の組換え体は、アデニンを欠いている培地上での増殖によっ
て選択した。正確なゲノムの座位への組込みは、診断PCRによって確認した。生じた株に
は、名称Y238を与えた。
【０２９４】
導入された遺伝子の完全な相補物を含む一倍体株を作製するために、Y238は、2%の酢酸
カリウム及び0.02%のラフィノース液体培地において胞子形成された。およそ200の遺伝的
な四分子（四分子とは、4胞子の減数分裂の産物である）を、Singer Instruments MSM300
シリーズのマイクロマニピュレーター（Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK）を
使用して単離した。導入された遺伝形質の適切な相補物を含む独立した遺伝的な単離集団
は、これらがアデニン、ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンの非存在下で増殖する
能力によって同定した。全ての導入されたDNAの組込みは、診断PCRによって確認した。生
じた株には、名称Y210（MAT A）及びY211（MATα）を与えた。
【０２９５】
S. セレビジエ（S. cerevisiae）GAL1プロモーターから発現されるS. セレビジエ（S. 
cerevisiae）コドンに最適化したアモルファデインシンターゼ（ADS）を含むpAM426（配
列番号：53）からの2μgのプラスミドDNAは、上記の通りに指数関数的に増殖しているY21
0及びY211に導入した。pAM426プラスミドを含んだ酵母株は、これらがロイシン補充の非
存在下で増殖する能力によって選択された。生じた株には、名称Y225（MAT A）及びY227
（MATα）を与えられた。
【０２９６】
酵母(s.cerevisiae)GAL1プロモーターから発現される酵母コドンに最適化されたアモル
ファデインシンターゼ（ADS）及びチトクロームP450モノオキシゲナーゼ（AMO）並びに酵
母GAL10プロモーターから発現されるチトクロームP450オキシドレダクターゼ（CPR）を含
むpAM322（配列番号：54）からの2μgのプラスミドDNAを上記の通りに指数関数的に増殖
しているY210及びY211に導入した。pAM322プラスミドを含んだ酵母株は、これらがロイシ
ン補充の非存在下で増殖する能力によって選択された。生じた株は、名称Y222（MAT A）
及びY224（MATα）を与えられた。
【０２９７】
（実施例19）
【０２９８】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるα-ファルネセン又はβ-ファ
ルネセンの産生を記述する。
【０２９９】
宿主株B552及びB592の種培養は、25mLのM9-MOPS、0.8%のグルコース、0.5%の酵母抽出
物及び表1に詳述した抗生物質を含む125mLのフラスコに、それぞれの株の保存一定分量を
添加することによって、及び一晩培養を増殖することによって確立した。
【０３００】
種培養を使用して、40mLのM9-MOPS、2%のグルコース、0.5%の酵母抽出物及び抗生物質を
含む250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養は、これらがおよそ
0.2のOD600に到達するまで250rpmにて回転振盪機上で30℃にてインキュベートし、その時
点で、宿主細胞におけるα-ファルネセン又はβ-ファルネセンの産生を、40μLの1MのIPT
Gを添加することによって誘導した。誘導時に、培養は、α-ファルネセンを捕獲するため
に、8mLの有機オーバレイで表面を覆った。試料は、内部標準としてトランス-カリオフィ
レンを加えた1mLの酢酸エチルを含む清潔なガラスバイアルに2μL〜10μLの有機オーバレ
イ層を移すことによって、24時間ごとに120時間（合計5点）まで採取した。加えて、1mL
の培養の一定分量を遠心沈殿させ、細胞ペレットを250μLの滅菌水に再懸濁して、細胞懸
濁液を内部標準としてトランス-カリオフィレンをスパイクした1mLの酢酸エチルを含むガ
ラスバイアルに移した。加えて、0.5mLの培養液全体の一定分量を、内部標準としてトラ
ンス-カリオフィレンをスパイクした1mLの酢酸エチルを含むガラスバイアルに添加した。
培養液全体の試料を、10分間ガラスバイアルをボルテックスすることによって酢酸エチル
において抽出し、その後600μLの酢酸エチル抽出を清潔なガラスバイアルに移した。
【０３０１】
有機オーバレイ/酢酸エチル試料及び酢酸エチル抽出した培養液全体の試料を、Agilent
5975質量分析計を備えたAgilent 6890Nガスクロマトグラフ（GC/MS）で、フルスキャン
モード（50-500m/z）で解析した。実行時間を早めるために、温度プログラム及びカラム
マトリックスを、最適のピーク分離度及び最も短い全体の実行時間を達成するように修正
した。1μLの試料を、HP-5MSカラム（Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA）及
びヘリウムキャリアガスを使用して分離した。解析のための温度プログラムは、以下の通
りだった：3分間150℃を保持、25℃/分にて200℃の温度まで増加、60℃/分にて300℃の温
度まで増加、及び1分間300℃にて保持。以前の質量スペクトルは、このGCプロトコルを使
用して、β-ファルネセンシンターゼ産物がβ-ファルネセンであり、β-ファルネセンが4
.33分の保持時間を有したことを示した。ファルネセン力価は、トランス-カリオフィレン
をスパイクした酢酸エチルにおける精製したβ-ファルネセン（Sigma-Aldrich Chemical 
Company, St. Louis, MO）の定量的検量線に対して、作製したピーク面積を比較すること
によって算出した。
【０３０２】
宿主株B592は、120時間にておよそ400mg/Lのα-ファルネセンを産生して（3つの独立し
たクローンの平均値）、およそ46mg/L/OD600の最大比生産性を有した。宿主株B552は、12
0時間にておよそ1.1g/Lのβ-ファルネセンを産生して（3つの独立したクローンの平均値
）、およそ96mg/L/OD600の最大比生産性を有した（1つの代表的クローン）。
【０３０３】
（実施例20）
【０３０４】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるDXP経路を経たβ-ファルネセ
ン産生を記述する。
【０３０５】
宿主株B650、B651、B652及びB653の種培養は、25mLのM9-MOPS及び表1に詳述した抗生物
質を含む別々の125mLのフラスコにそれぞれの株の保存一定分量を添加することによって
、及び培養を一晩増殖することによって確立した。
【０３０６】
種培養を使用して、40mLのM9-MOPS最少培地、45μg/mLのチアミン、微量栄養素、1.00E
−5mol/LのFeSO4、0.1MのMOPS、0.5%の酵母抽出物、20g/LのD-グルコース及び抗生物質を
含む別々の250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養は、これらが
0.2〜0.3のOD600に到達するまで、250rpmにて加湿されたインキュベートシェーカーで30
℃にてインキュベートし、その時点で、宿主細胞におけるβ-ファルネセンの産生を、培
養液に40μLの1MのIPTGを添加することによって誘導した。誘導時に、培養は、β-ファル
ネセンを捕獲するために、8mLの有機オーバレイで表面を覆った。試料は、上層の有機オ
ーバレイ層の100μLの試料を清潔なチューブに移すことによって、種々の時点にて採取し
た。チューブを遠心分離して任意の残存する細胞又は培地を分離除去し、10μLの有機オ
ーバレイ試料を、清潔なガラスGCバイアルにおける、内部標準としてβ-又はトランス-カ
リオフィレンをスパイクした500μLの酢酸エチルに移した。混合物を30秒間ボルテックス
し、次いで実施例18に記載したように解析した。大腸菌（Escherichia coli）宿主株B653
は、およそ7mg/g DCW βファルネセンを産生した。
【０３０７】
（実施例21）
【０３０８】
本実施例は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）宿主株にお
けるα-ファルネセン又はβ-ファルネセンの産生を記述する。
【０３０９】
株EPY300は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株EPY224（
Roらの論文（2006）Nature 440：940-943；PCT特許公報W02007/005604）から発現プラス
ミドを除去することによって、及び富栄養培地において培養することによって作製した。
次いで、株EPY300を発現プラスミドpRS425-FSA又はpR425-FSBで形質転換し、宿主株Y166
及びY164をそれぞれ得た。
【０３１０】
宿主細胞形質転換体は、2%のグルコース及びロイシンを除いた全てのアミノ酸を含む合
成限定培地（SM-glu）で選択した。宿主株EPY300は、ロイシン生合成（leu2）について栄
養要求性だったが、発現プラスミドpRS425-FSA又はpRS425-FSBは、ロイシン原栄養性（LE
U2）を回復させる。単一コロニーを、5mLのロイシン欠損液体SM-gluを含む培養バイアル
に移した。培養を、増殖が安定期に到達するまで、30℃にて振動してインキュベートした
。細胞は、400μL 50%のグリセロール及び600μLの液体培養で構成される1mLの凍結一定
分量における冷凍バイアルにおいて-80℃にて貯蔵された。
【０３１１】
種培養は、25mLのロイシン欠損SM-gluを含む125mLのフラスコに保存一定分量を添加す
ること、及び一晩培養を増殖することによって確立した。種培養を使用して、40mLのロイ
シン欠損の合成の定義培地、0.2%のグルコース及び1.8%のガラクトースを含む250mLのバ
ッフルフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養を200rpmにて回転振盪機
上で30℃にてインキュベートした。培地におけるグルコースの存在が、ガラクトースによ
るGal1プロモーターの誘導を妨げるので、細胞が培地におけるグルコースを使い果たし、
これらの主な炭素源としてガラクトースを使用するように切り替わるまで、ファルネセン
産生を誘導しなかった。培養は、8mLのオレイン酸メチル又はイソプロピルミリステート
で表面を覆った。試料を、内部標準として既知の濃度のβ-又はトランス-カリオフィレン
を含む500μLの酢酸エチルを含む清潔なガラスバイアルに、2〜10μLの有機溶媒層を移す
ことによって、24時間毎に一度採取された。加えて、0.5mLの培養液全体の一定分量を、
内部標準としてトランス-カリオフィレンをスパイクした1mLの酢酸エチルを含むガラスバ
イアルに添加された。培養液全体の試料を、10分間ガラスバイアルをボルテックスするこ
とによって酢酸エチルに抽出し、その後600uLの酢酸エチル抽出液を清潔なガラスバイア
ルに移した。
【０３１２】
宿主株Y166は、120時間にておよそ9.8mg/Lのα-ファルネセンを産生し（3つの独立した
クローンの平均値）、およそ3mg/L/OD600（1つの代表的クローン）の最大比生産性を有し
た。宿主株Y164は、120時間にておよそ56mg/Lのβ-ファルネセンを産生し（3つの独立し
たクローンの平均値）、およそ20 mg/L/OD600（1つの代表的クローン）の最大比生産性を
有した。
【０３１３】
（実施例22）
【０３１４】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるγ-テルピネン、α-ピネン及
びテルピノレンの産生を記述する。
【０３１５】
γ-テルピネン（大腸菌（E. coli）DH1-T1r［pMevT, pMevB-Gpps, pAM445]）、α-ピネ
ン（大腸菌（E. coli）DH1-T1r［pMevT, pMevB-Gpps, pAM443又はpAM442]）、又はテルピ
ノレン（大腸菌（E. coli）DH1-T1r［pMevT, pMevB-Gpps, pAM444]）の産生のための宿主
株の種培養は、25mLのM9-MOPS、2%のグルコース、0.5%の酵母抽出物及び表1に詳述した抗
生物質を含む別々の125mLのフラスコに、それぞれの株の保存一定分量を添加することに
よって、及び後期の対数期まで一晩培養を増殖することによって確立した。
【０３１６】
種培養を使用して、40mLのM9-MOPS、2%のグルコース、0.5%の酵母抽出物及び抗生物質
を含む250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。接種時に、培養は、ま
た、4mLのヘキサデカンで表面を覆った。培養を、これらがおよそ0.2ののOD600に到達す
るまで、200〜250rpm にて回転振盪機上で30℃にてインキュベートし、その時点で、宿主
細胞における関心対象の化合物の産生が、40μLの1MのIPTGを添加することにより誘導さ
れた。試料は、ヘキサデカン層の200μLを0.6mLのミクロチューブに移すことによって、9
6時間の間、1日に1回採取した。解析については、ヘキサデカン層は、1.8mLのGCバイアル
において、内部標準としてトランス-カリオフィレンをスパイクした酢酸エチルで1：1又
は1：10に希釈した。加えて、1mLの培養の一定分量を遠心沈殿させ、細胞ペレットを250
μLの滅菌水に再懸濁し、細胞懸濁液を、内部標準としてトランス-カリオフィレンをスパ
イクした1mLの酢酸エチルを含むガラスバイアルに移した。細胞ペレットを、15分間ガラ
スバイアルをボルテックスすることによって酢酸エチルに抽出し、その後500μLの酢酸エ
チル抽出を清潔なガラスバイアルに移した。
【０３１７】
ヘキサデカン／酢酸エチル試料及び酢酸エチル抽出した細胞ペレット試料は、Agilent 
5975質量分析計を備えたAgilent 6890Nガスクロマトグラフ（GC/MS）で、フルスキャンモ
ード（50-500 m/z）で解析した。実行時間を速めるために、温度プログラム及びカラムマ
トリックスを、最適のピーク分離度及び最も短い全体の実行時間を達成するように修正し
た。1μLの試料を分割し（1：2〜1：50の間の分割比を試料濃度に基づいて選択した）、
次いでHP-5MSカラム（Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA）及びヘリウムキャ
リアガスを使用して分離した。解析のための温度プログラムは、以下の通りだった：3分
間75℃を保持、20℃/分にて115℃の温度に温度増加、60℃/分にて300℃の温度に温度増加
、及び0.5分間300℃にて保持。種々の産物、γ-テルピネン、α-ピネン及びテルピノレン
を、それぞれ5.4、4.1、5.4及び5.9分にて観察した。力価は、トランス-カリオフィレン
をスパイクした酢酸エチルにおける精製した標準物質の定量的検量線に対して、作製した
ピーク面積を比較することによって算出した。
【０３１８】
（実施例23）
【０３１９】
本実施例は、大腸菌（Escherichia coli）宿主株におけるリナロール、リモネン、β-
ピネン、β-フェランドレン、カレン又はサビネンの産生を記述する。
【０３２０】
種培養は、25mLのM9-MOPS、0.5%の酵母抽出物、2%のグルコース及び表1に詳述した抗生
物質を含む別々の125mLのフラスコに、それぞれの株の保存一定分量を添加すること、及
び一晩培養を増殖することによって確立される。
【０３２１】
種培養を使用して、40mLのM9-MOPS、0.5%の酵母抽出物、2%のグルコース及び抗生物質を
含む遮光した250mLのフラスコに、およそ0.05の初期OD600にて播種した。培養は、これら
がおよそ0.2のOD600に到達するまで、250rpmにて回転振盪機上で30℃にてインキュベート
し、その時点で、宿主細胞における関心対象の化合物の産生を、培養液に40μlの1MのIPT
Gを添加することによって誘導する。関心対象の化合物の力価が、培地を飽和させ、かつ
第二の相を形成するほど十分大きい場合、関心対象の化合物は、溶媒-溶媒抽出を介して
、又は沈降及びデカンテーションによって培養液から分離する。
【化２２】
2020018319.tif 000033
【化２３】
2020018319.tif 000034
【化２４】
2020018319.tif 000035
【化２５】
2020018319.tif 000036
【化２６】
2020018319.tif 000037
【化２７】
2020018319.tif 000038
【化２８】
2020018319.tif 000039
【化２９】
2020018319.tif 000040
【化３０】
2020018319.tif 000041
【化３１】
2020018319.tif 000042
【化３２】
2020018319.tif 000043
【化３３】
2020018319.tif 000044
【化３４】
2020018319.tif 000045
【化３５】
2020018319.tif 000046
【化３６】
2020018319.tif 000047
【化３７】
2020018319.tif 000048
【化３８】
2020018319.tif 000049
【化３９】
2020018319.tif 000050
【化４０】
2020018319.tif 000051
【化４１】
2020018319.tif 000052
【化４２】
2020018319.tif 000053
【化４３】
2020018319.tif 000054
【化４４】
2020018319.tif 000055
【化４５】
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【化４６】
2020018319.tif 000057
【化４７】
2020018319.tif 000058
【化４８】
2020018319.tif 000059
【化４９】
2020018319.tif 000060
【化５０】
2020018319.tif 000061
【化５１】
2020018319.tif 000062
【化５２】
2020018319.tif 000063
【化５３】
2020018319.tif 000064
【化５４】
2020018319.tif 000065
【化５５】
2020018319.tif 000066
【化５６】
2020018319.tif 000067
【化５７】
2020018319.tif 000068
【化５８】
2020018319.tif 000069
【化５９】
2020018319.tif 000070
【化６０】
2020018319.tif 000071
【化６１】
2020018319.tif 000072
【化６２】
2020018319.tif 000073
【図１】
2020018319.tif 000074
【図２】
2020018319.tif 000075
【図３】
2020018319.tif 000076
【図４】
2020018319.tif 000077
【図５】
2020018319.tif 000078
【図６】
2020018319.tif 000079
【図７】
2020018319.tif 000080
【図８】
2020018319.tif 000081
【図９】
2020018319.tif 000082
【図１０】
2020018319.tif 000083
【配列表】
2020018319000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、種々の生物有機化合物製造系を提供する。一つの態様において、
a. 少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
b. 第一の相を含む、該容器内の、水性媒体；
c. 少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成することができる、該
水性媒体内の、複数の宿主細胞；及び、
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相
、
を含む生物有機化合物製造装置が提供される。
別の態様において、少なくとも1種の生物有機化合物を製造する方法が提供される。本
方法は：
a. 水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を作製し、産生し、又は合成する複
数の宿主細胞を培養することであって、該水性媒体は、第一の相を含み；
b. 該第一の相と接触して該生物有機化合物を含む有機第二の相を形成すること；
c. 該第一の相から該有機第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該有機第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること、
を含む。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
a. 少なくとも100リットルの容量を有する容器； 
b. 炭水化物炭素源を含む第一の相を形成する、該容器内の、水性媒体；
c. 該炭水化物炭素源を少なくとも1種のC10-C20イソプレノイドに変換することができ
る、該水性媒体内の、複数の宿主細胞であって、メバロネート経路又はDXP経路の少なく
とも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改変されている、前記宿主細胞
；及び
d. 該第一の相と接触して、該少なくとも1種のイソプレノイドを含む、自然発生的に形
成された液体有機第二の相；
を含む、C10-C20イソプレノイド化合物を製造するためのシステムであって、
該イソプレノイド化合物が、セスキテルペン、モノテルペン、又はジテルペンである、
前記システム。
（構成２）
前記イソプレノイド化合物がセスキテルペンである、構成1記載のシステム。
（構成３）
前記イソプレノイド化合物がモノテルペンである、構成1記載のシステム。
（構成４）
前記イソプレノイド化合物がジテルペンである、構成1記載のシステム。
（構成５）
a. 水性媒体中で、少なくとも1種の生物有機化合物を産生する複数の宿主細胞を培養す
ること、ここで、該水性媒体は、炭水化物炭素源を含む第一の相を形成し、該宿主細胞は
、該炭水化物炭素源を該少なくとも1種の生物有機化合物に変換し、かつ該宿主細胞は、
メバロネート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように
遺伝子改変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、第一の相と接触して、該少な
くとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相を自然発生的に形成すること；
c. 該第一の相から該第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該第二の相から少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること；
を含む、生物有機化合物の製造方法であって、
該生物有機化合物が、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物有機化合
物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化合物が、
セスキテルペン、モノテルペン、又はジテルペンである、前記製造方法。
（構成６）
前記有機第二の相が、前記第一の相から前記第二の相をデカントすることによって分離
される、構成5記載の方法。
（構成７）
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC15生物有機化合物である、構成5記載の方法。
（構成８）
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC10生物有機化合物である、構成5記載の方法。
（構成９）
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC20生物有機化合物である、構成5記載の方法。
（構成１０）
前記少なくとも1種の生物有機化合物がC20+生物有機化合物である、構成5記載の方法。
（構成１１）
前記単離工程が吸着を含む、構成5記載の方法。
（構成１２）
前記単離工程が蒸留を含む、構成5記載の方法。
（構成１３）
前記単離工程が気体-液体抽出を含む、構成5記載の方法。
（構成１４）
前記単離工程が液-液抽出を含む、構成5記載の方法。
（構成１５）
前記単離工程が限外濾過を含む、構成5記載の方法。
（構成１６）
前記少なくとも1種の生物有機化合物がイソプレノイド化合物である、構成5記載の方法
。
（構成１７）
a. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、炭水化物炭素源を含む水性媒
体中で、該炭水化物炭素源から少なくとも1種のC10-C20イソプレノイド化合物を産生する
複数の宿主細胞を培養すること、ここで、該宿主細胞は、メバロネート経路又はDXP経路
の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該少なくとも1種のC10-C20イ
ソプレノイド化合物を含む有機相を自然発生的に形成すること；
c. 該水性媒体から該有機相の少なくとも一部を分離すること；及び、
d. 該有機相から該少なくとも1種のC10-C20イソプレノイド化合物を単離すること；
を含む、C10-C20イソプレノイド化合物の製造方法であって、
該C10-C20イソプレノイド化合物が、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンで
ある、前記製造方法。
（構成１８）
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がセスキテルペンである、構成17記載の方
法。
（構成１９）
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がモノテルペンである、構成17記載の方法
。
（構成２０）
前記少なくとも1種のイソプレノイド化合物がジテルペンである、構成17記載の方法。
（構成２１）
前記有機相が水相から有機相をデカントすることによって分離される、構成17記載の方
法。
（構成２２）
前記単離工程が吸着を含む、構成17記載の方法。
（構成２３）
前記単離工程が蒸留を含む、構成17記載の方法。
（構成２４）
前記単離工程が気体-液体抽出を含む、構成17記載の方法。
（構成２５）
前記単離工程が液-液抽出を含む、構成17記載の方法。
（構成２６）
前記単離工程が限外濾過を含む、構成17記載の方法。
（構成２７）
燃料組成物製造システムであって、
a.以下を含む1つ以上の発酵システム：
i）少なくとも100リットルの容量を有する少なくとも１つの容器；
ii）該少なくとも１つの容器内の、炭水化物炭素源を含む第一の相を形成する、水性
媒体；
iii）該炭水化物炭素源を少なくとも1種の生物有機化合物に変換することができる、
該水性媒体内の、メバロネート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種
核酸を含むように遺伝子改変された複数の宿主細胞；及び、
iv）少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該第一の相と接触して、
該少なくとも1種の生物有機化合物を含む、自然発生的に形成された液体有機第二の相；
ここで、該生物有機化合物が、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物
有機化合物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化
合物が、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンである；及び
b. 1つ以上の第一の相分離システムであって、これにより、該第一の相及び該第二の有
機相、又は該第二の有機相の1つ若しくは複数の成分が分離される、該第一の相分離シス
テム；
を含む、前記燃料組成物製造システム。
（構成２８）
燃料組成物の製造方法であって、
a. 炭水化物炭素源を含む水性媒体中で、該炭水化物炭素源を少なくとも1種の生物有機
化合物に変換する複数の宿主細胞を培養すること、ここで、該水性媒体は、第一の相を形
成し、かつ該生物有機化合物は、C15生物有機化合物、C10生物有機化合物、又はC20生物
有機化合物であり、該C15生物有機化合物、該C10生物有機化合物、又は該C20生物有機化
合物は、セスキテルペン、モノテルペン又はジテルペンであり、該宿主細胞は、メバロネ
ート経路又はDXP経路の少なくとも1種の酵素をコードする異種核酸を含むように遺伝子改
変されており；
b. 少なくとも100リットルの容量を有する容器において、該第一の相と接触して、少な
くとも1種の生物有機化合物を含む液体有機第二の相を自然発生的に形成すること；
c. 該第一の相から第二の相の少なくとも一部を分離すること；及び
d. 該第二の相から該少なくとも1種の生物有機化合物を単離すること；
を含む、前記製造方法。
（構成２９）
1つ以上の第二の相分離システムであって、これにより、該少なくとも1種の生物有機化
合物が該第二の有機相から分離される、該第二の相分離システムをさらに含む、構成27記
載のシステム。
（構成３０）
1つ以上の反応器又は容器であって、該少なくとも1種の生物有機化合物が化学的又は生
物学的に修飾される、該反応器又は容器をさらに含む、構成27記載のシステム。
（構成３１）
1つ以上の精製システムであって、これにより、該生物有機化合物又は該修飾された生
物有機化合物が精製され、又は更に精製される、該精製システムをさらに含む、構成30記
載のシステム。
（構成３２）
該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合するための1つ
以上の混合容器又はシステムをさらに含む、構成27記載のシステム。
（構成３３）
1つ以上のさらなる精製システムであって、これにより、該少なくとも1種の生物有機化
合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物が精製され、又は更に精製される、該精
製システムをさらに含む、構成27記載のシステム。
（構成３４）
該少なくとも1種の生物有機化合物を化学的又は生物学的に修飾することをさらに含む
、構成28記載の方法。
（構成３５）
該少なくとも1種の生物有機化合物又は該修飾された生物有機化合物を精製することを
さらに含む、構成28又は34記載の方法。
（構成３６）
該少なくとも1種の生物有機化合物を1種以上のさらなる燃料成分と混合することをさら
に含む、構成28記載の方法。
（構成３７）
該少なくとも1種の生物有機化合物及び該1種以上のさらなる燃料成分の混合物を精製す
ることをさらに含む、構成36記載の方法。