(57)【要約】      （修正有）【課題】本開示は、ＦｃＲｎに特異的な抗体、抗体を含む製剤、治療における各々の使用、前記抗体を発現させ、任意選択により調合するためのプロセス、抗体をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む宿主の提供。【解決手段】可変領域を有する重鎖又は重鎖フラグメントを含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、前記可変領域は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３は特定のアミノ酸配列を有する、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変領域を有する重鎖又は重鎖フラグメントを含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、前記可変領域は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３に示す配列を有する、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２】
抗体又は結合フラグメントが、３つのＣＤＲを含む可変領域を有する軽鎖又はそのフラグメントをさらに含み、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６に示す配列を有する、請求項１に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１２に示す配列を含む重鎖、及び配列番号８に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項１又は２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項４】
抗体がヒト化されている、請求項１又は２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号２５に示す配列を含む重鎖、及び配列番号１６に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項１又は２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号５９に示す配列を含む重鎖、及び配列番号５１に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項１又は２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項７】
重鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、重鎖の可変ドメインは配列番号２５に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号１６に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項８】
抗体分子が、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号５に示す配列を有する、請求項７に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項９】
抗体又は結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、又はＦａｂ’フラグメントである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号３３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号２０に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項９に記載の抗ＦｃＲｎ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１１】
配列番号６３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号５５に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項６に記載の抗ＦｃＲｎ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１２】
抗体又は結合フラグメントが、例えば、デンプン、アルブミン、及びポリエチレングリコールから選択されるポリマーにコンジュゲートしている、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１３】
ポリマーが、例えば、分子量５から５０ｋＤａの範囲のＰＥＧである、請求項１２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１４】
抗体が全長抗体である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
【請求項１５】
全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４Ｐからなる群から選択される、請求項１４に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
【請求項１６】
配列番号３７、配列番号３９、又は配列番号７３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号２０に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項５、１４、又は１５に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
【請求項１７】
抗体又はその結合フラグメントが、配列番号４２に示す配列を含む重鎖、及び配列番号４０に示す配列を含む軽鎖を有するＦａｂ−ｄｓＦｖである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項５、１０、又は１６の抗体と同じヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１９】
残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＡ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される１つ又は複数の残基を含む、ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２０】
Ｌ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される１つ又は複数の残基にさらに結合する、請求項１９に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２１】
請求項５の抗体のヒトＦｃＲｎへの結合をクロスブロックするか、又は請求項５の抗体によってヒトＦｃＲｎの結合からクロスブロックされている、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２２】
ヒト化されているか、又は完全ヒトである、請求項１７から２１までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２３】
ｐＨ６及びｐＨ７．４の両方で１５０ｐＭ以下の、ヒトＦｃＲｎへの結合親和性を有する、請求項１７から２２までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２４】
ヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎへの結合をブロックする、請求項１から請求項２３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２５】
ヒトβ２ミクログロブリン（配列番号７２）に結合しない、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２６】
請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（単数若しくは複数）をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２７】
請求項２６に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項２８】
（ｉ）配列番号３０、３２、３４、若しくは３６に示す配列及び配列番号２１若しくは２４に示す配列、又は（ｉｉ）配列番号３８に示す配列及び配列番号２２に示す配列、又は（ｉｉｉ）配列番号７４に示す配列及び配列番号２２に示す配列、又は（ｉｖ）配列番号４１に示す配列及び配列番号４３に示す配列を含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載の、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９の宿主細胞を培養するステップと、抗体を単離するステップとを含む、ヒトＦｃＲｎに結合特異性を有する抗体を生成するためのプロセス。
【請求項３１】
請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項３２】
他の有効成分を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
治療において用いるための、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は請求項３１若しくは３２に記載の組成物。
【請求項３４】
重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患の処置において用いるための、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は請求項３１若しくは３２に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は請求項３１若しくは３２に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、患者を処置する方法。
【請求項３６】
処置が、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患のためである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＦｃＲｎに特異的な抗体、抗体を含む製剤、治療における各々の使用、前記抗体を発現させ、任意選択により調合するためのプロセス、抗体をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦｃＲｎは、膜タンパク質ＦｃＲｎのα鎖及びβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の非共有結合性の複合体である。成年哺乳動物では、ＦｃＲｎは、ＩｇＧアイソタイプの抗体に結合し、回収する受容体として作用することによって、血清抗体レベルを維持する上で重要な役割を果たす。ＩｇＧ分子は内皮細胞により貪食され、ＦｃＲｎに結合すると、リサイクルされ、循環中などに経細胞輸送される。対照的に、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＧ分子は細胞に侵入し、リソソーム経路に標的化され、そこで分解される。Ｈｉｓ４３５がアラニンに変異しているバリアントＩｇＧ１はＦｃＲｎ結合の選択的喪失をもたらし、血清半減期の大幅な低下をまねく（Ｆｉｒａｎら、２００１年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３巻、９９３頁）。
【０００３】
ＦｃＲｎは、少なくとも部分的に自己抗体によって引き起こされる、ある種の自己免疫障害に対する潜在的な治療標的であると仮定されている。このようなある種の障害に対する現在の処置には、血漿交換法が含まれる。血漿交換法はときに、疾患の長期マネージメントのために免疫抑制治療と一緒に用いられる。血漿の交換は、有害な自己抗体の除去に対する最も迅速な短期間の解決策を提供する。しかし、プレドニゾン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブ、又はこれらの混合物などの薬物療法を用いることによって、免疫系による自己抗体の生成を抑制するのが望ましいこともある。
【０００４】
血漿交換法で処置することができる疾患の例には、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、グッドパスチャー症候群、過粘稠血症候群、クリオグロブリン血症、パラプロテイン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重症筋無力症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）／溶血性尿毒症症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ランバート−イートン症候群、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ又はＡＰＬＳ）、顕微鏡的多発性血管炎、移植腎における再発性の巣状及び分節性糸球体硬化症、ＨＥＬＬＰ症候群、ＰＡＮＤＡＳ症候群、レフサム病、ベーチェット症候群、ＨＩＶ関連神経障害、乳児及び新生児におけるグレーブス病、尋常性天疱瘡、多発性硬化症、横紋筋融解症、並びに同種免疫疾患が含まれる。
【０００５】
血漿交換法は、救急などにおいて重篤な副作用を低減するために、治療薬を含むＦｃを除去するためのレスキュー治療法として、ときに用いられる。
【０００６】
血漿交換法はある医学的状態では役に立つが、治療法に付随する潜在的な危険性及び合併症が存在する。かなり大型の静脈内カテーテルの挿入は、出血、肺穿刺（カテーテルの挿入部位によって）をまねくことがあり、カテーテルがあまりに長期間残されると、感染症及び／又は静脈に対する損傷をまねき得、手順を繰り返す機会が制限される。
【０００７】
手順には、手順に付随するさらなる合併症があり、例えば、患者の血液が、身体の外で血漿交換装置を通過する場合、血液には凝固する傾向がある。この傾向を下げるために、一般的な一プロトコールでは、血液が回路を通って流れる間、クエン酸塩を注入する。クエン酸塩は血中のカルシウムに結合するが、カルシウムは血液を凝固するのに不可欠である。クエン酸塩は血液が凝固するのを防ぐのに非常に有効であるが、クエン酸塩を用いると生命を脅かすほどの低カルシウムレベルをまねき得る。これは、クボステク徴候又はトルソー徴候を用いて検出することができる。この合併症を防ぐには、患者が血漿交換法を受けている間、カルシウムを静脈内注入し、その上、経口によるカルシウム補充をやはり与えてもよい。
【０００８】
手順の他の合併症には、血圧低下、輸血反応又は輸血感染症（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）の危険のある血液製剤に対する潜在的な曝露、患者の免疫系の抑制、並びに針穿刺からくる出血及び血腫が含まれる。
【０００９】
加えて、血漿交換法を提供する施設は限られており、手順は非常に高価である。
【００１０】
血漿交換法に対する代替に静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）があるが、これは１０００人を超える供血者の血漿から抽出したポリクローナルＩｇＧをプールしたものを含む血液製剤である。この治療法は静脈内投与され、その領域に２週間から３か月継続する。
【００１１】
ＩＶＩＧ処置の合併症には、頭痛、皮膚炎、ＨＩＶ又は肝炎など、治療生成物の汚染からくるウイルス感染、肺浮腫、アレルギー応答、急性腎不全、静脈血栓症、及び無菌性髄膜炎が含まれる。
【００１２】
よって、侵襲性が低く、患者を医薬上の合併症にあまりさらさない、自己免疫障害に対する治療法に、重大で未だ対処されていない必要性が存在する。
【００１３】
よって、侵襲性が低く、患者を医薬上の合併症にあまりさらさない、免疫学的障害及び／又は自己免疫障害に対する治療法に、重大で未だ対処されていない必要性が存在する。
【００１４】
したがって、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合をブロック又は低減する薬剤は、このような自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置又は防止において有用であり得る。抗ＦｃＲｎ抗体は、以前にＷＯ２００９／１３１７０２、ＷＯ２００７／０８７２８９、及びＷＯ２００６／１１８７７２に記載されている。
【００１５】
しかし、改善された抗ＦｃＲｎ抗体が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
よって、一態様において、可変領域を有する重鎖又は重鎖フラグメントを含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、前記可変領域は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３から独立に選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含み、例えば、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１であり、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２であり、且つ／又はＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３である、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１７】
よって、一実施形態において、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１であり、且つＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２であり、又はＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１であり、且つＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３であり、又はＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２であり、且つＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３である。
【００１８】
別の一態様において、同族対の可変領域など、本明細書に規定する配列又は配列の組合せを含む、抗体又はフラグメントを提供する。
【００１９】
本開示の抗体は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合をブロックし、循環抗体の半減期の低減を含めたＦｃＲｎの１つ又は複数の生物学的機能の低減において有用であると考えられている。これは、患者が、自己抗体などの抗体をより速やかに一掃するのを可能にするという点で、有益であり得る。したがって、本開示の抗体は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を低減する。
【００２０】
本発明の抗体が、例えば、ｐＨ７及びｐＨ７．４の両方で、比較可能で高い結合親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合することができることが重要である。したがって、抗体がエンドソーム内でもＦｃＲｎに引き続き結合することができ、それによりＦｃＲｎのＩｇＧへの結合のブロックを最大にするのが有利である。
【００２１】
一実施形態において、本開示による抗体又は結合フラグメントは、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖フラグメントを含み、例えば、配列番号４、配列番号５又は配列番号７、及び配列番号６から独立に選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含み、特に、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４であり、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７であり、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６である。
【００２２】
よって、一実施形態において、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４であり、且つＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５若しくは配列番号７であり、又はＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１であり、且つＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６であり、又はＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５若しくは配列番号７であり、且つＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６である。
【００２３】
一実施形態において、本開示による抗体又は結合フラグメントは、配列番号１から７から選択されるＣＤＲ配列を含み、例えば、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１であり、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２であり、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３であり、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４であり、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７であり、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６である。
【００２４】
本明細書に明確に開示される抗体又は結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体又は結合フラグメントも提供する。したがって、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供し、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントは、Ａ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される１つ又は複数の（例えば、全ての）残基にさらに結合し、任意選択により、Ｌ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される１つ又は複数の残基にさらに結合する。
【００２５】
一実施形態において、本明細書に明確に開示されるヒトＦｃＲｎに対する抗体又は結合フラグメントをクロスブロックするか、又は前記抗体によってヒトＦｃＲｎの結合からクロスブロックされている、抗体又は結合フラグメントを提供する。
【００２６】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、ヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎへの結合をブロックする。
【００２７】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、β２ミクログロブリンに結合しない。
【００２８】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、ヒトβ２ミクログロブリンに結合しない。
【００２９】
一例において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、循環アルブミンレベルを、５０％を超えて低下させず、好ましくはわずか２５％しか低下させない。
【００３０】
一例において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、循環アルブミンレベルを低下させない。
【００３１】
本開示は、例えば、ＤＮＡがベクター中に組み入れられる、本明細書に記載する抗体又はフラグメントをコードする、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドにも拡張する。
【００３２】
前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。
【００３３】
抗体又はフラグメントを発現させる方法を本明細書に提供し、抗体又はフラグメントをＰＥＧなどのポリマーにコンジュゲートする方法も本明細書に提供する。
【００３４】
本開示は、前記抗体及びフラグメントを含む医薬組成物にも関する。
【００３５】
一実施形態において、本明細書に記載する治療有効量の抗体、フラグメント、又は組成物を投与するステップを含む、処置の方法を提供する。
【００３６】
本開示は、処置において、特に免疫学的障害及び／又は自己免疫障害の処置において用いるための、本開示による抗体、フラグメント、又は組成物にも拡張する。
【００３７】
よって、本開示は、ＩｇＧを異化するための身体の自然のメカニズムを加速することによって実現される、病原性ＩｇＧを除去するための、抗体、そのフラグメント、及び方法を提供する。
【００３８】
本質的に、本開示による抗体及びフラグメントは、身体においてＩｇＧをリサイクルする系をブロックする。
【００３９】
本発明の治療法は、血漿交換法が、患者にとって有利である、治療法又はＩＶＩｇ治療である、ある種の疾患に対する置換又は補充を提供する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した、トランスジェニックマウスにおける％ｈＩｇＧを示す図である。
【図１ａ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの血清における、ヒトＩＶＩｇの濃度に対する、１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの効果を示す図である。
【図１ｂ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、ヒトＩＶＩｇの濃度に対する、１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの効果を示す図である。
【図１ｃ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの薬物動態を示す図である。
【図１ｄ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの薬物動態を示す図である。
【図１ｅ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、血清アルブミン濃度に対する１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの効果を示す図である。
【図１ｆ】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、血清アルブミン濃度に対する１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの効果を示す図である。
【図２】ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す図である。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．２０ｎＭ、及び酸性バッファー中０．２２ｎＭであった。
【図３】ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧのリサイクルを阻害することを示す図である。
【図４】ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧの経細胞輸送を阻害することを示す図である。
【図５】ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＦａｂＦｖは、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧの経細胞輸送を阻害することを示す図である。
【図６】ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す図である。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．３、及び酸性バッファー中０．４３であった（表２を参照されたい）。
【図７】ＣＡ１７０＿１６３８のＣＤＲ配列を示す図である。
【図８Ａ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｂ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｃ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｄ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｅ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｆ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｇ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｈ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８ｉ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｊ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｋ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図８Ｌ】本開示による抗体配列を示す図である。
【図９Ａ】抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す図である。
【図９Ｂ】抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書で用いるＦｃＲｎは、胎児性Ｆｃ受容体としても知られ、そのアミノ酸配列はＰ５５８９９という番号でＵｎｉＰｒｏｔに存在し、その細胞外ドメインは図８（配列番号４８）に示されるヒトＩｇＧ受容体アルファ鎖と、そのアミノ酸配列はＰ６１７６９の番号という番号でＵｎｉＰｒｏｔに存在するヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）との非共有結合性の複合体を指す（本明細書ではシグナルペプチドあり（配列番号５０）、シグナルペプチドなし（配列番号７２）を提供する）。
【００４２】
本明細書で用いる抗体分子は、抗体又はその結合フラグメントを指す。
【００４３】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、概ね、無傷な（全）抗体に関し、すなわち２本の重鎖及び２本の軽鎖のエレメントを含む。抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５に開示するＤＶＤ−Ｉｇ分子、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載される、いわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃにより、さらなる付加的な結合ドメインを含むことができる。よって、本明細書で用いる抗体は、２価、３価、又は４価の全長抗体を含む。
【００４４】
抗体の結合フラグメントには、単鎖抗体（すなわち、全長の重鎖及び軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されているＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されているＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、２価、３価、又は４価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２巻（３）、２０９〜２１７頁を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを創出及び製造するための方法は当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマットは、ＷＯ２００９／０４０５６２に最初に開示され、そのジスルフィド安定化されたバージョンであるＦａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に最初に開示された。本発明で用いるための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、二特異的など、多重の特異性を含むことができ、又は単一特異性でもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者のこのような一例は、ＷＯ９２／２２５８３に記載されているＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【００４５】
一実施形態において、Ｆａｂフラグメントを提供する。
【００４６】
一実施形態において、Ｆａｂ’フラグメントを提供する。
【００４７】
典型的なＦａｂ’分子は重鎖及び軽鎖の対を含み、重鎖は、可変領域ＶＨ、定常領域ＣＨ１、及び天然の、若しくは修飾されているヒンジ領域を含み、軽鎖は、可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。
【００４８】
一実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２を創出するための本開示によるダイマーのＦａｂ’を提供し、例えば、二量体化はヒンジを介してもよい。
【００４９】
一実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは結合ドメインを含む。結合ドメインは、全般的に、重鎖から３つ、及び軽鎖から３つの、６つのＣＤＲを含む。一実施形態において、ＣＤＲはフレームワークにあり、一緒になって可変領域を形成する。よって、一実施形態において、抗体又は結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、抗原に特異的な結合ドメインを含む。
【００５０】
１つ又は複数の（例えば、１、２、３、又は４つの）アミノ酸置換、付加、及び又は欠失を、抗体がＦｃＲｎに対して結合する能力を大幅に変更せずに、本発明により提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば、可変ドメイン）に行うことができることが理解されよう。任意のアミノ酸置換、付加、及び／又は欠失の効果は、例えば、本明細書、特に実施例に記載する、ＦｃＲｎ結合／ブロックを決定するための方法を用いることによって、当業者であれば容易に試験することができる。
【００５１】
１つ又は複数の（例えば、１、２、３、又は４つの）アミノ酸置換、付加、及び／又は欠失は、本発明により提供される抗体又はフラグメントにおいて用いられるフレームワーク領域に対して行うことができ、この場合、ＦｃＲｎへの結合親和性は保持又は増大される。
【００５２】
抗体可変ドメインにおける残基は、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムにしたがって慣習的にナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降「Ｋａｂａｔら（上述）」）に記載されている。別段の指摘がなければ、本明細書ではこのナンバリングシステムを用いる。
【００５３】
Ｋａｂａｔ残基の呼称は、アミノ酸残基の直鎖のナンバリングと必ずしも直接的に対応するわけではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構成成分の短縮又は構成成分中への挿入に相当する、厳密なＫａｂａｔナンバリングにおけるよりも少数の、又は付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基を、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングした配列とアラインメントすることにより、所与の抗体ごとに決定することができる。
【００５４】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにしたがって、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａによると（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁（１９８７年））、ＣＤＲ−Ｈ１に等価なループは残基２６から残基３２まで伸長する。よって、別段の指摘がなければ、本明細書で用いる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジーのループ定義との組合せによって記載される通り、残基２６から３５を指すものとされる。
【００５５】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにしたがって、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００５６】
本開示の抗体及びフラグメントは、ＦｃＲｎをブロックし、それによってＩｇＧのリサイクルにおける機能を妨げ得る。本明細書で用いるブロックは、受容体の閉塞など、物理的なブロックを指すが、立体配置の変化などを引き起こす、エピトープに抗体又はフラグメントが結合する場合も含み、これは受容体に対して天然のリガンドがもはや結合しないことを意味する。本発明の抗体分子はＦｃＲｎに結合し、それによりＩｇＧ定常領域に対するＦｃＲｎの結合を低減又は防止（例えば、阻害）する。一実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧに関して競合的にＦｃＲｎに結合する。
【００５７】
一例において、抗体又はその結合フラグメントは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合の競合的インヒビターとして機能する。一例において、抗体又はその結合フラグメントは、ＦｃＲｎ上のＩｇＧ結合部位に結合する。一例において、抗体は、ＩｇＧ結合部位をブロックする。一例において、抗体又はその結合フラグメントは、β２Ｍに結合しない。
【００５８】
本開示において用いるための抗体は、当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、ポリペプチドを（組換えで又は天然に）発現する細胞（例えば、活性化されたＴ細胞）を含むＦｃＲｎポリペプチド／タンパク質を用いて、単独で、又はβ２Ｍと組み合わせて、ＦｃＲｎを特異的に認識する抗体を生成することができる。ポリペプチドは、「成熟した」ポリペプチド若しくはその生物学的に活性なフラグメント、又はそれらの誘導体であってよい。ヒトタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ５５８９９の番号で登録されている。ヒトＦｃＲｎアルファ鎖の細胞外ドメインを、配列番号４８に示す。成熟ヒトβ２Ｍの配列を、配列番号７２に示す。
【００５９】
一実施形態において、抗原は、ＦｃＲｎが細胞において内部移行する動的なプロセシングが殆ど、又は全くないように、細胞の表面上にＦｃＲｎを提示するように操作されているＦｃＲｎの変異型であり、例えば、ＦｃＲｎアルファ鎖の細胞質内のテイルにおいて変異を作成することにより、これを実現することができ、この場合、Ｏｂｅｒら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、１５５１〜１５５９頁に記載されている通り、ジ−ロイシンがジ−アラニンに変異している。
【００６０】
宿主を免疫化するのに用いるためのポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当技術分野ではよく知られているプロセスによって調製してもよく、又は天然の生物学的供給源から回収してもよい。本開示では、「ポリペプチド」の用語には、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質が含まれる。これらは、別段の指摘がなければ、交換可能に用いられる。ＦｃＲｎポリペプチドは、ある場合には、例えば、親和性タグ又は類似物に融合している融合タンパク質などの大型タンパク質の一部であってもよい。
【００６１】
ＦｃＲｎポリペプチドに対して産生された抗体を得てもよく、この場合、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、よく知られている、ルーチンのプロトコールを用いて投与することにより、動物を免疫化することが必要であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編集）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなどの多くの温血動物を免疫化してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが、全般的に最も適切である。
【００６２】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻、７２頁）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）など、当技術分野では知られている任意の方法により調製してもよい。
【００６３】
本発明において用いるための抗体は、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻（１５）、７８４３〜７８４８ｌ頁；ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及び国際特許出願第ＷＯ２００４／１０６３７７号によって記載されている方法などにより、特異的な抗体を生成するために選択された単一のリンパ球から産生された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニング及び発現させることにより、単一リンパ球抗体方法を用いてやはり産生してもよい。
【００６４】
抗体に対するスクリーニングは、ヒトＦｃＲｎへの結合を測定するアッセイ、及び／又は受容体に対するＩｇＧ結合をブロックする能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの一例は、特にヒトＦｃＲｎ及びヒトＦｃの融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡであり、ヒトＦｃＲｎ及びヒトＦｃをプレート上に固定化し、融合タンパク質に結合している抗ＦｃＲｎ抗体を検出するための二次抗体を用いる。適切なアンタゴニストアッセイ及びブロッキングアッセイの例を、本明細書の以下に記載する。
【００６５】
本明細書で用いる特異的は、それに対して抗体が特異的である抗原のみを認識する抗体、又はそれに対して抗体が非特異的である抗原への結合に比べて、それに対して抗体が特異的である抗原に対して著しく高い結合親和性、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すものとされる。結合親和性は、本明細書以下に記載するＢＩＡｃｏｒｅなどの技術により測定してもよい。一例において、本発明の抗体は、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）に結合しない。一例において、本発明の抗体は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）のＦｃＲｎに結合する。一例において、本発明の抗体は、ラット又はマウスのＦｃＲｎに結合しない。
【００６６】
本開示によるある種の抗体のアミノ酸配列及びポリペプチド配列を提供し、これらは本発明の一態様を形成する。
【００６７】
一実施形態において、本開示による抗体又は結合フラグメントは完全ヒトであり、例えば、ファージライブラリー又は同様のものから調製される。
【００６８】
一例において、抗体は、ラットなどの齧歯動物由来であり、配列番号８に示す軽鎖可変ドメイン配列、及び配列番号１２に示す重鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６９】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントはヒト化されている。
【００７０】
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト化抗体を含む）は、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体よりもむしろＣＤＲの特異性決定残基のみを移動させる必要があり得ることが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻、２５〜３４頁を参照されたい）。ヒト化抗体は、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を、任意選択によりさらに含むことができる。後者はしばしばドナー残基と呼ばれる。
【００７１】
よって、一実施形態において、本明細書で用いる「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基（ドナー残基）を任意選択によりさらに含む、アクセプタ抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフト化されているドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）から１つ又は複数のＣＤＲ（所望により、１つ又は複数の修飾されているＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。概説には、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、５３５〜５３９頁、１９９８年を参照されたい。一実施形態において、ＣＤＲ全体を移動させるよりもむしろ、本明細書上記に記載するいずれか１つのＣＤＲから１つ又は複数の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻、２５〜３４頁を参照されたい）。一実施形態において、本明細書上記に記載する１つ又は複数のＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。別の一実施形態において、本明細書上記に記載する各ＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。
【００７２】
ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフト化する場合、マウス、霊長動物、及びヒトのフレームワーク領域を含めた、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して、任意の好適なアクセプタ可変領域フレームワーク配列を用いることができる。
【００７３】
適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプタフレームワーク領域、及び本明細書に特に提供する１つ又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。よって、一実施形態において、可変ドメインがヒトアクセプタフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、ヒトＦｃＲｎに結合するブロッキングヒト化抗体を提供する。
【００７４】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、上述）がある。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよく、ヒト生殖系列配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で入手できる。
【００７５】
本発明のヒト化抗体では、アクセプタ重鎖及び軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合性の鎖を含むことができる。
【００７６】
本発明のヒト化抗体の重鎖に対するこのような適切なフレームワーク領域の一つは、ＪＨ３とともにヒト亜群ＶＨ３配列ＩＧＨＶ３−７に由来する（配列番号４６及び４７）。
【００７７】
したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲＨ３については配列番号３に示す配列を含むヒト化抗体を提供し、重鎖フレームワーク領域は、ＪＨ３とともにヒト亜群ＶＨ３配列ＩＧＨＶ３−７に由来する。
【００７８】
ヒトＪＨ３の配列は以下の通りである：（ＤＡＦＤＶ）ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳ（配列番号６９）。ＤＡＦＤＶ（配列番号７０）モチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら、１９８１年、Ｃｅｌｌ、２７巻、５８３〜５９１頁）．
【００７９】
一例において、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号２５又は５９、例えば２５に示す配列を含む。
【００８０】
本発明のヒト化抗体の軽鎖に適するフレームワーク領域は、ＪＫ４とともにヒト亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１−２７配列に由来する（配列番号４４及び４５）。
【００８１】
したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲＬ３については配列番号６に示す配列を含むヒト化抗体を提供し、軽鎖フレームワーク領域は、ＪＫ４とともにヒト亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１−２７に由来する。
【００８２】
ＪＫ４配列は以下の通りである：（ＬＴ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）。ＬＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻、１５１６〜１５２２頁）。
【００８３】
一例において、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６又は５１、例えば１６に示す配列を含む。
【００８４】
本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプタ抗体の配列と正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、稀な残基は、アクセプタ鎖のクラス又はタイプに対してより頻繁に生じる残基に変化してもよい。或いは、アクセプタフレームワーク領域における選択された残基は、これらがドナー抗体における同じ位置に見出される残基に対応するように変化してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２４頁を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小に維持しなければならない。変化する必要があり得る、アクセプタフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００８５】
よって、一実施形態において、フレームワークにおける１、２、３、４、又は５つの残基が、代替のアミノ酸残基で置き換えられている。
【００８６】
したがって、一例において、重鎖の可変ドメインの少なくとも各々の４８位及び７８位（Ｋａｂａｔナンバリング）の残基がドナー残基であるヒト化抗体を提供し、例えば、配列番号２５に示す配列を参照されたい。
【００８７】
一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基４８が、バリンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００８８】
一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基７８が、ロイシンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００８９】
一実施形態において、本開示によるヒト化重鎖可変領域における残基４８はバリンであり、残基７８はロイシンである。
【００９０】
したがって、一例において、軽鎖の可変ドメインの少なくとも各々の７０位及び７１位（Ｋａｂａｔナンバリング）の残基がドナー残基であるヒト化抗体を提供し、例えば、配列番号１６に示す配列を参照されたい。
【００９１】
一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基７０が、アスパラギン酸などの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００９２】
一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基７１が、フェニルアラニンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００９３】
一実施形態において、本開示によるヒト化軽鎖可変領域における残基７０はアスパラギン酸であり、残基７１はフェニルアラニンである。
【００９４】
一実施形態において、本開示は、本明細書に開示する配列に８０％、例えば、ＣＤＲを除いて、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列、又は可変ドメイン配列など関連の配列の一部又は全体にわたって８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である抗体配列を提供する。一実施形態において、関連の配列は配列番号１６又は５１である。一実施形態において、関連の配列は配列番号２５又は５９である。
【００９５】
一実施形態において、本発明は、重鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、重鎖の可変ドメインは、本明細書の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性又は類似性を有する配列、例えば、配列番号２５又は５９、例えば２５に示す配列を含む。
【００９６】
一実施形態において、本発明は、軽鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１６又は５１、例えば１６に示す配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号２５に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列を有する。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号１６における配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号６に示す配列を有する。
【００９９】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号２５に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖可変ドメイン、及び本明細書に示す配列、例えば、配列番号１６に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号６に示す配列を有する。
【０１００】
本明細書で用いる「同一性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で同一であることを指摘する。本明細書で用いる「類似性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で類似のタイプであることを指摘する。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンに対して置換することができる。相互にしばしば置換することができる他のアミノ酸には、それだけには限定されないが、以下が含まれる：
−  フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
−  リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
−  システイン及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）。同一性及び類似性の度合いは、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：２６６〜２７２頁、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻：１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻：６４９〜６５６頁）。
【０１０１】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖、又はこれらのフラグメントを有する完全な抗体分子を含むことができ、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、修飾されているＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されているＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、２価、３価、又は４価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントであってよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２巻（３）、２０９〜２１７頁を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを創出及び製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。本発明において用いるための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、二特異性など多重特異性を含むことができ、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい）。
【０１０２】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号１６及び２５に示す可変領域を含む、抗体Ｆａｂフラグメントである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号２０に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号２９に示す配列を含む重鎖を有する。
【０１０３】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号５１及び５９に示す可変領域を含む、抗体Ｆａｂフラグメントである。
【０１０４】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号１６及び２５に示す可変領域を含む、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号２０に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号２９（Ｆａｂ）又は配列番号３３（Ｆａｂ’）に示す配列を含む重鎖を有する。
【０１０５】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号５１及び５９に示す可変領域を含む、抗体Ｆａｂ’フラグメントである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号５５に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号６３に示す配列を含む重鎖を有する。
【０１０６】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてはそれぞれ配列番号１６及び２５に示す可変領域を含む、全長のＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体分子は、配列番号２０に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号７３に示す配列を含む重鎖を有する。
【０１０７】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、配列番号５１及び５９に示す可変領域を含む全長のＩｇＧ１である。
【０１０８】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてはそれぞれ配列番号１６及び２５に示す可変領域を含む、全長のＩｇＧ４フォーマットである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号２０に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号２５に示す可変領域配列を含む重鎖を有する。
【０１０９】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてはそれぞれ配列番号５１及び５９に示す可変領域を含む、全長のＩｇＧ４フォーマットである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号５５に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号５９に示す可変領域配列を含む重鎖を有する。
【０１１０】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてはそれぞれ配列番号１６及び２５に示す可変領域を含む、全長のＩｇＧ４フォーマットである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号２０に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号３７又は配列番号３９に示す配列を含む重鎖を有する。
【０１１１】
一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてはそれぞれ配列番号５１及び５９に示す可変領域を含む、全長のＩｇＧ４フォーマットである。一実施形態において、抗体分子は、配列番号５５に示す配列を含む軽鎖、及び配列番号５９に示す可変領域配列を含む重鎖を有する。
【０１１２】
本明細書で用いるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンによって置き換えられている野生型ＩｇＧ４アイソタイプの変異であり、例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、３０巻（１）、１０５〜１０８頁に記載されている通り、２４１位のセリンがプロリンに変化している。
【０１１３】
一実施形態において、本開示による抗体を、例えば、全て参照によって本明細書に援用される、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１００３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２、及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載される通り、免疫グロブリン部分を含むＦｃＲｎ結合抗体融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント、及びそれに対して直接又は間接的に連結している１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）として提供する。
【０１１４】
一実施形態において、融合タンパク質は、任意選択によりジスルフィド結合によって連結されている、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の対形成などとして、２つのドメイン抗体を含む。
【０１１５】
一実施形態において、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して同じ又は同様の特異性を有する。一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、単一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して異なる特異性を有し、すなわち、融合タンパク質は多価である。一実施形態において、本発明による多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有し、例えば、その中にあるＶＨ／ＶＬ対はアルブミン結合部位を提供する。このような一実施形態において、重鎖は配列番号４２に示す配列を含み、軽鎖は配列番号４０に示す配列を含む。
【０１１６】
一実施形態において、本開示によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ＰＥＧ分子又はヒト血清アルブミンにコンジュゲートしている。
【０１１７】
ＣＡ１７０＿０１６３８ｇ４９及び１６３８．ｇ４９は、本明細書において交換可能に用いられ、いくつかの異なるフォーマットにおいて用いることができる、抗体可変領域の特異的な対を指すのに用いられる。これらの可変領域は、配列番号２５に示す重鎖配列、及び配列番号１６に示す軽鎖配列である。
【０１１８】
ＣＡ１７０＿０１６３８ｇ２８及び１６３８．ｇ２８は、本明細書において交換可能に用いられ、いくつかの異なるフォーマットにおいて用いることができる、抗体可変領域の特異的な対を指すのに用いられる。これらの可変領域は、配列番号５９に示す重鎖配列、及び配列番号５１に示す軽鎖配列である。
【０１１９】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱される機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能に関して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療使用を意図し、抗体のエフェクター機能が必要とされる場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを用いてもよい。或いは、抗体分子が治療目的を意図し、抗体のエフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを用いてもよい。これらの定常領域ドメインの配列バリアントを用いてもよいことが理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、３０巻（１）、１０５〜１０８頁に記載されている、２４１位のセリンがプロリンに変化しているＩｇＧ４分子を用いてもよい。当業者であれば、抗体は多様な翻訳後修飾を受け得ることも理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、抗体を発現させるのに用いる宿主細胞系、及び培養条件にしばしば依存する。このような修飾には、グリコシル化における変動、メチオニンの酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸の異性化、及びアスパラギン脱アミドが含まれ得る。よくある修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用による、カルボキシ末端の塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、７０５巻：１２９〜１３４頁、１９９５年に記載される）。したがって、抗体重鎖のＣ末端のリシンは存在しない可能性がある。
【０１２０】
一実施形態において、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダいずれかのＣＬドメインを含む。
【０１２１】
一実施形態において、軽鎖は配列番号２０に示す配列を有し、重鎖は配列番号２９に示す配列を有する。
【０１２２】
一実施形態において、軽鎖は配列番号２０に示す配列を有し、重鎖は配列番号３３に示す配列を有する。
【０１２３】
一実施形態において、軽鎖は配列番号２０に示す配列を有し、重鎖は配列番号３７に示す配列を有する。
【０１２４】
一実施形態において、軽鎖は配列番号２０に示す配列を有し、重鎖は配列番号７４に示す配列を有する。
【０１２５】
一実施形態において、Ｃ末端アミノ酸は、抗体分子から、翻訳後修飾の間に切断される。
【０１２６】
一実施形態において、Ｎ末端アミノ酸は、抗体分子から、翻訳後修飾の間に切断される。
【０１２７】
本発明は、本発明が提供する抗体、特に、重鎖配列ｇＨ３３（配列番号２５）及び／若しくは軽鎖配列ｇＬ７（配列番号１６）を含む抗体、又は重鎖配列ｇＨ２（配列番号５９）及び軽鎖配列ｇＬ２（配列番号５１）を含む抗体が結合している、ヒトＦｃＲｎの特異的領域又はエピトープも提供する。
【０１２８】
ヒトＦｃＲｎポリペプチドのこの特異的な領域又はエピトープは、本発明が提供する任意の１つの抗体と組み合わせて、当技術分野では知られている任意の適切なエピトープマッピング方法によって同定することができる。このような方法の例には、抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合することができる、最小のフラグメントを有する本発明の抗体への結合に対して、ＦｃＲｎに由来する多様な長さのペプチドをスクリーニングするステップが含まれる。ＦｃＲｎペプチドは、合成により、又はＦｃＲｎポリペプチドのタンパク分解性の消化により生成され得る。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析法によって同定することができる。別の一例では、ＮＭＲスペクトル分析法又はＸ線結晶構造解析法を用いて、本発明の抗体によるエピトープ結合を同定することができる。Ｘ線結晶構造解析法を用いる一例では、抗体の４Å内にあるＦｃＲｎポリペプチド上のこれらの残基として、エピトープを決定する。一例では、抗体の５Å内にあるＦｃＲｎポリペプチド上のこれらの残基として、エピトープを決定する。同定後は、本発明の抗体に結合するエピトープフラグメントを、必要であれば、同じエピトープに結合するさらなる抗体を得るための免疫源として用いることができる。
【０１２９】
一実施形態において、本開示の抗体は、以下に示すヒトＦｃＲｎアルファ鎖の細胞外配列に結合する。
【化１】
2020018301.tif 000002
【０１３０】
下線を付けた残基は、ヒトＦｃＲｎの、ヒトＩｇＧのＦｃ領域との相互作用に決定的であることが知られているものである。太字の残基は、配列番号２５に示す重鎖配列及び配列番号１６に示す軽鎖配列を含む抗体に結合するのに関与するヒトＦｃＲｎポリペプチドの残基であり、すなわち、これらはＸ線結晶構造解析によって決定して抗体の４Å内にある。イタリックの残基は、５Åで同じ抗体の結合に関与する。
【０１３１】
本発明の一態様において、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供し、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントは、Ａ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の残基など、１つ又は複数の残基にさらに結合し、任意選択によりＬ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される１つ又は複数の残基にさらに結合する。
【０１３２】
したがって、一例において、残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにＡ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の残基など、少なくとも１つの残基を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供し、前記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントは、任意選択により、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＬ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される少なくとも２、３、又は４つの残基など、１つ又は複数の残基にさらに結合する。
【０１３３】
一例において、本発明のこの態様による抗体は、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＶ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、及びＫ１０９に結合しない。
【０１３４】
一例において、本発明のこの態様による抗体は、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＥ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｆ１２０、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｋ１２３、Ｑ１２４、Ｇ１２８、及びＧ１２９に結合しない。
【０１３５】
一例において、本発明のこの態様による抗体は、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＶ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｋ１０９、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｆ１２０、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｋ１２３、Ｑ１２４、Ｇ１２８、及びＧ１２９に結合しない。
【０１３６】
一例において、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにＡ８１、Ｌ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７及びＹ８８からなる群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８個の残基など、少なくとも１つの残基を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１３７】
一例において、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにＬ１１２、Ｎ１１３、Ｄ１３０、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される少なくとも２、３、４、５、又は６個の残基など、少なくとも１つの残基を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１３８】
一例において、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにＡ８１、Ｌ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｙ８８、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｄ１３０、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１３９】
一例において、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３、並びにＡ８１、Ｌ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｙ８８、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｄ１３０、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１４０】
一例において、本発明は、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、残基Ａ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９を含み、又はこれらからなるヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１４１】
一例において、本発明は、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）の、Ａ８１、Ｌ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｙ８８、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９を含み、又はこれらからなるヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１４２】
一実施形態において、本発明が提供する、本明細書上記に記載するエピトープに結合する抗体は、完全ヒトである。一実施形態において、これらはヒト化されている。一例において、これらは、１５０ｐＭ以下の、典型的には１３０ｐＭ以下の、ヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する。
【０１４３】
本発明による抗体分子の結合をクロスブロックする抗体、特に配列番号２５に示す重鎖配列及び配列番号１６に示す軽鎖配列を含む抗体分子は、ＦｃＲｎ活性をブロックする上で同様に有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書上記に記載するいずれか１つの抗体分子のヒトＦｃＲｎへの結合をクロスブロックするか、及び／又はいずれか１つのこれらの抗体によってヒトＦｃＲｎの結合からクロスブロックされている抗ＦｃＲｎ抗体分子も提供する。一実施形態において、このような抗体は、本明細書上記に記載する抗体と同じエピトープに結合する。別の一実施形態において、クロスブロック性の中和抗体は、本明細書上記に記載する抗体が結合するエピトープと、境を接し、且つ／又は重複するエピトープに結合する。
【０１４４】
クロスブロック性の抗体は、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いるなど、当技術分野における任意の適切な方法を用いて同定することができ、これらの方法では、ヒトＦｃＲｎに対するクロスブロック性の抗体の結合が本発明の抗体の結合を妨げ、又は逆の場合も同様である。このようなクロスブロック性のアッセイは、単離された天然若しくは組換えのＦｃＲｎ、又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを用いることができる。一例において、結合及びクロスブロックは、組換えヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）を用いて測定することができる。一例において、組換えヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメインを、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号７２）との複合体において用いる。
【０１４５】
一実施形態において、ＦｃＲｎのＩｇＧへの結合をブロックし、重鎖が配列番号２５に示す配列を含み、軽鎖が配列番号１６に示す軽鎖配列を含む抗体の、ヒトＦｃＲｎへの結合をクロスブロックする、抗ＦｃＲｎ抗体分子を提供する。一実施形態において、本発明が提供するクロスブロック性の抗体は、配列番号２５に示す重鎖配列及び配列番号１６に示す軽鎖配列を含む抗体の結合を、８０％を超え、例えば８５％を超え、例えば９０％を超え、特に９５％阻害を超えて阻害する。
【０１４６】
一実施形態において、本発明が提供するクロスブロック性の抗体は完全ヒトである。一実施形態において、本発明が提供するクロスブロック性の抗体はヒト化されている。一実施形態において、本発明が提供するクロスブロック性の抗体は、１５０ｐＭ以下、１３０ｐＭ以下、又は１００ｐＭ以下のヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する。一実施形態において、本発明が提供するクロスブロック性の抗体は、５０ｐＭ以下のヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する。親和性は、本明細書以下に記載する方法を用いて測定することができる。
【０１４７】
抗体又はフラグメントなどの生物学的分子は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含み、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体的に「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、３Ｄ構造において荷電している基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は溶媒が接近できるその表面が正味の電荷を保有しないｐＨである。一例において、本発明のＦｃＲｎ抗体及びフラグメントを、好適な等電点を有するように操作してもよい。これにより、より頑強な性質、特に適切な溶解性及び／若しくは安定性のプロファイル、並びに／又は改善された精製の特徴を有する抗体及び／若しくはフラグメントがもたらされ得る。
【０１４８】
よって、一態様において、本発明は、初めに同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作した、ヒト化ＦｃＲｎ抗体を提供する。抗体は、例えば、酸性アミノ酸残基を、１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置き換えるなど、アミノ酸残基を置き換えることにより操作してもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入してもよく、又は酸性アミノ酸残基を除去してもよい。或いは、分子が、容認できないほど高いｐＩ値を有する場合は、必要に応じて、酸性残基を導入してｐＩを下げてもよい。ｐＩを操作する場合、抗体又はフラグメントの所望の活性を保持するよう注意を払わなければならないことが重要である。よって、一実施形態において、操作した抗体又はフラグメントは、「非修飾の」抗体又はフラグメントと同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【０１４９】
**ExPASYhttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html、及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムを用いて、抗体又はフラグメントの等電点を予想してもよい。或いは、又は加えて、任意の適切な標準の実験技術を用いてｐＩを測定することができる。
【０１５０】
本発明の抗体分子は、特にナノモル範囲の、高い結合親和性を有するのが適切である。親和性は、本明細書の実施例に記載する、ＢＩＡｃｏｒｅを含めた当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて、単離された天然若しくは組換えのＦｃＲｎ、又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを用いて測定してもよい。一例において、親和性を、本明細書の実施例に記載する組換えヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）を用いて測定する。一例において、親和性を、ヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号７２）と会合している、組換えヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメイン（配列番号４８）を用いて測定する。本発明の抗体分子が、単離されたヒトＦｃＲｎに対して約１ｎＭ以下の結合親和性を有するのが適切である。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約５００ｐＭ以下の結合親和性を有する（すなわち、より高い親和性）。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２００ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約１５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明は、約１００ｐＭ以下の結合親和性を有する抗ＦｃＲｎ抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、約１００ｐＭ以下の結合親和性を有するヒト化抗ＦｃＲｎ抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、約５０ｐＭ以下の結合親和性を有するヒト化抗ＦｃＲｎ抗体を提供する。
【０１５１】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＦｃＲｎに、ｐＨ６以下のｐＨ（特にｐＨ６）及びｐＨ７．４以上のｐＨ（特にｐＨ７．４）の両方で、匹敵する結合親和性で結合することができる。したがって、抗体が、エンドソーム内でもＦｃＲｎに結合し続けることができ、それによってＦｃＲｎのＩｇＧへの結合のブロックが最大になるのが有利である。
【０１５２】
一実施形態において、本発明の抗体は、ｐＨ６及びｐＨ７．４で測定した場合、１５０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、ｐＨ６及びｐＨ７．４で測定した場合、１３０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、ｐＨ６で測定した場合、１３０ｐＭ以下の結合親和性で、及びｐＨ７．４で測定した場合、５０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。
【０１５３】
本発明の抗体又は結合フラグメントの親和性、及び結合剤（例えば、抗体）が結合を阻害する度合いは、当業者によって、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５１巻：６６０〜６７２頁（１９４９年））によって記載されている技術を用いて、又はＢＩＡｃｏｒｅなどのシステムを用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって決定することができる。表面プラズモン共鳴法では、標的分子は固相上に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。固定化された標的に対してリガンドの結合が生じる場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化をまねき、反射された光線の強度における変化を検出することにより、ＳＰＲ角度の変化をリアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合及び解離の相に対する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比率により、見かけの平衡定数（親和性）を得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：２５６０〜６５頁（１９９３年）を参照されたい）。
【０１５４】
本発明において、試験抗体分子の親和性は、以下の通りＳＰＲを用いて決定するのが典型的である。試験抗体分子を固相上で捕獲し、ヒトβ２Ｍとの非共有結合性の複合体におけるヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメインを、移動相中、捕獲した抗体上に流し、ヒトＦｃＲｎに対する試験抗体分子の親和性を決定する。試験抗体分子を、固相チップ表面上で、任意の好適な方法を用いて、例えば、抗Ｆｃ又は抗Ｆａｂ’特異的捕獲剤を用いて捕獲してもよい。一例において、ｐＨ６で親和性を決定する。一例において、ｐＨ７．４で親和性を決定する。
【０１５５】
本発明が提供する抗体の親和性は、当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて変更してもよいことを理解されよう。したがって、本発明は、ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。このようなバリアントは、ＣＤＲの変異を含めたいくつかの親和性成熟のプロトコール（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４巻、３９２〜４０３頁、１９９５年）、チェインシャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁、１９９２年）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０巻、３５９〜３６８頁、１９９６年）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻、７２４〜７３３頁、１９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６巻、７７〜８８頁、１９９６年）、及びセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、２８８〜２９１頁、１９９８年）により得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、これら親和性成熟の方法を論じている。
【０１５６】
一実施形態において、本発明の抗体分子はヒトＦｃＲｎ活性をブロックする。抗体がＦｃＲｎをブロックする能力を決定するのに適するアッセイを、本明細書の実施例に記載する。抗体分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩｇＧリサイクルをブロックする能力を決定するのに適するアッセイを、本明細書以下に記載する。
【０１５７】
所望により、本発明において用いるための抗体を、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に付着することができる単一の部分を形成するように連結されている、２つ以上のこのような分子を含むことができることが理解されよう。エフェクター分子に連結している抗体フラグメントを得るのが望ましい場合、この抗体フラグメントは、抗体フラグメントがエフェクター分子に対して直接又はカップリング剤によってのいずれかで連結される、標準の化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野ではよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編集、１９８７年、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻：１１９〜５８頁、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３巻、６７〜１２３頁を参照されたい）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３／０３１５８に記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５などに記載されている、組換えＤＮＡ手順を用いて実現してもよい。
【０１５８】
本明細書で用いるエフェクター分子という用語には、例えば、抗悪性腫瘍性の薬剤、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化された金属、ナノ粒子、及びレポーター群、例えば、蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光光度法によって検出することができる化合物が含まれる。
【０１５９】
エフェクター分子の例には、細胞にとって有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含めた細胞毒素又は細胞毒性薬剤が含まれ得る。例として、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）、ヘミアステルリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又はホモログが含まれる。
【０１６０】
エフェクター分子には、それだけには限定されないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン、又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれる。
【０１６１】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化された放射性核種、又はそれだけには限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩインヒビター、タキソイド、及びスラミンなどの薬物が含まれ得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象の酵素には、それだけには限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、それだけには限定されないが、免疫グロブリン；毒素、例えば、アブリン、リシン（ｒｉｃｉｎ）Ａ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、又は組織プラスミノゲンアクチベータ、抗血栓剤（ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、又は抗血管形成薬剤、例えば、アンジオスタチン若しくはエンドスタチン；又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の成長因子及び免疫グロブリンが含まれる。
【０１６２】
他のエフェクター分子には、診断などにおいて有用な、検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出性金属（ポジトロン放出断層撮影において用いるための）、及び非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。全般的に、診断として用いるための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンには、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビのベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリスリンが含まれ、適切な発光材料にはルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【０１６３】
別の一例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大し得、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し得、且つ／又は上皮のバリアを横切った免疫系への抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物、例えば、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【０１６４】
一実施形態において、ＦｃＲｎと無関係であるエフェクター分子が提供する半減期が有利である。
【０１６５】
エフェクター分子がポリマーである場合、エフェクター分子は全般的に、合成の、又は天然に存在するポリマー、例えば、任意選択により置換されている直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝の多糖、例えば、ホモ多糖若しくはヘテロ多糖であってよい。
【０１６６】
上記に言及した合成ポリマー上に存在し得る具体的な、任意選択の置換基には、ヒドロキシ、メチル、又はメトキシ基の１つ又は複数が含まれる。
【０１６７】
合成ポリマーの具体的な例には、任意選択により置換されている直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はこれらの誘導体、特に任意選択により置換されているポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体が含まれる。
【０１６８】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はこれらの誘導体が含まれる。
【０１６９】
一実施形態において、ポリマーは、アルブミン又はそのフラグメント、例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントである。
【０１７０】
本明細書で用いる「誘導体」には、反応性の誘導体、例えば、チオール選択性反応性基、例えばマレイミドなどが含まれるものとされる。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結していてもよい。このような基の残基は、ある場合には、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【０１７１】
ポリマーのサイズは、所望により変動することができるが、全般的に、平均分子量範囲５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば、５０００から４００００Ｄａ、例えば、２００００から４００００Ｄａである。ポリマーのサイズは、特に、腫瘍などある種の組織に局在する能力、又は循環半減期を延長する能力など、生成物の意図する使用に基づいて選択することができる（再考には、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照されたい）。よって、例えば、腫瘍の処置において用いるために、生成物が循環を離れ、組織に浸透することを意図する場合などは、分子量およそ５０００Ｄａを有するなど、低分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。生成物が循環にとどまる適用には、２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するなど、より高分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。
【０１７２】
適切なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はこれらの誘導体などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが含まれる。
【０１７３】
一例において、本発明において用いるための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着している。特定の一例において、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を介して付着していてもよい。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ方法を用いてフラグメント中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されているＦａｂフラグメントであり、修飾は、エフェクター分子の付着を可能にするための、その重鎖のＣ末端終端に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加である。さらなるアミノ酸が、それに対してエフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾されているヒンジ領域を形成するのが適切である。多重の部位を用いて２つ以上のＰＥＧ分子を付着することができる。
【０１７４】
ＰＥＧ分子が、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合性に連結しているのが適切である。修飾されている抗体フラグメントに付着している各ポリマー分子は、フラグメントに位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合性に連結していてもよい。共有結合性の連結は、一般的にジスルフィド結合であり、又は特にイオウ−炭素結合である。チオール基を付着点として用いる場合、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体など、好適に活性化されたエフェクター分子を用いてもよい。活性化されたポリマーを、上記に記載するポリマー修飾されている抗体フラグメントの調製における出発材料として用いてもよい。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなど、チオール反応性基を含む任意のポリマーであってよい。このような出発材料は、市場から得てもよく（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）、又は市販の出発材料から慣例的な化学的手順を用いて調製してもよい。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【０１７５】
一実施形態において、抗体は、修飾されているＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はｄｉＦａｂであり、ｄｉＦａｂは、ＰＥＧ化されている、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法にしたがって、それに共有結合性に付着しているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編集）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２年、５４巻：５３１〜５４５頁も参照されたい］。一例において、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに付着している。一例において、ＰＥＧが修飾するＦａｂフラグメントは、修飾されているヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合性に連結しているマレイミド基を有する。リシン残基が、マレイミド基に、及びリシン残基上の各アミン基に、共有結合性に付着していてもよく、分子量およそ２０，０００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに付着していてもよい。Ｆａｂフラグメントに付着しているＰＥＧの合計分子量は、したがって、およそ４０，０００Ｄａであってよい。
【０１７６】
特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２００００）が修飾しているリシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。
【０１７７】
ＰＥＧリンカーの代替の供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ３（構造中、ｍが５未満である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍが２であり、ｎがおよそ４５０である）を供給するＮＯＦが含まれる。
【化２】
2020018301.tif 000003
【０１７８】
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【０１７９】
よって、一実施形態において、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られている、Ｍｗ４０，０００の、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬである。
【０１８０】
以下のタイプのさらなる代替のＰＥＧエフェクター分子が、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ、及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である：
【化３】
2020018301.tif 000004
【０１８１】
一実施形態において、鎖におけるアミノ酸２３２又は約２３２の、例えば、重鎖のアミノ酸２３２（連続のナンバリングにより）の、例えば、配列番号３３のアミノ酸２３２の、システインアミノ酸残基を介して付着している、（例えば、本明細書に記載するＰＥＧで）ＰＥＧ化されている抗体を提供する。
【０１８２】
一実施形態において、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧポリマー、例えば、４０ｋＤａのポリマー（単数又は複数）などの１つ又は２つのポリマーを含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。
【０１８３】
本開示によるＦａｂ’−ＰＥＧ分子は、Ｆｃフラグメントと無関係の半減期を有するという点で特に有利であり得る。一例において、本発明は、治療有効量の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを投与することを含む、ヒトＦｃＲｎをブロックすることによって回復する疾患を処置する方法を提供し、抗体又はその結合フラグメントは、ＦｃＲｎに対するＦｃの結合と無関係の半減期を有する。
【０１８４】
一実施形態において、ＰＥＧ分子、デンプン分子、又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートしているＦａｂ’を提供する。
【０１８５】
一実施形態において、ＰＥＧ分子、デンプン分子、又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートしているｓｃＦｖを提供する。
【０１８６】
一実施形態において、抗体又はフラグメントは、デンプン分子にコンジュゲートして、例えば、半減期を延長する。デンプンをタンパク質にコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に援用されるＵＳ８，０１７，７３９に記載される通りである。
【０１８７】
一実施形態において、抗ＦｃＲｎ結合分子（すなわち、抗体又はその結合フラグメント）を提供し、抗ＦｃＲｎ結合分子は：
−  血漿ＩｇＧ濃度の５０〜８０％の低減、例えば、７０％の低減を引き起こし、
−  血漿アルブミン濃度の低減は２５％若しくは２０％以下であり、且つ／又は
−  血漿ＩｇＧ低濃度の長期間の維持を実現するための反復投薬の可能性がある。
【０１８８】
本発明は、本発明の抗体分子の、重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列が、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードするのが適切である。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せにより生成される合成ＤＮＡを含むことができる。
【０１８９】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者にはよく知られている方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を一部又は全てコードするＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望により合成することができる。
【０１９０】
アクセプタフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、これらの知られているアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１９１】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全に、又は部分的に合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を、適宜用いてもよい。
【０１９２】
適切なＤＮＡ配列の例を、本明細書に提供する。
【０１９３】
１６３８．ｇ４９軽鎖可変領域をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２１に提供する。
【０１９４】
１６３８．ｇ２８軽鎖可変領域をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号５２及び配列番号５４に提供する。
【０１９５】
１６３８．ｇ４９重鎖可変領域をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号２６及び配列番号２８に提供する。
【０１９６】
１６３８．ｇ２８重鎖可変領域をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号６０及び６２に提供する。
【０１９７】
１６３８．ｇ４９軽鎖（可変及び定常）をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２４に、１６３８．ｇ２８軽鎖については、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８に配列を示し、１６３８．ｇ２８重鎖については配列番号６４又は配列番号６６に配列を示す。
【０１９８】
１６３８．ｇ４９重鎖（フォーマットに応じて可変及び定常）をコードする適切なＤＮＡ配列の例を、配列番号３０（Ｆａｂ）、配列番号３４又は３６（Ｆａｂ’）、配列番号３８（ＩｇＧ４Ｐ）、配列番号４３（ＦａｂＦｖ）、及び配列番号７４（ＩｇＧ１）に提供する。
【０１９９】
したがって、一例において、本発明は、配列番号３０、３２、３４、３６、６４、又は６６に示す配列を含む、本発明の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントの重鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。配列番号２１、２２、又は５６に示す配列を含む、本発明の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。
【０２００】
一例において、本発明は、本発明のＩｇＧ４（Ｐ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供し、重鎖をコードするＤＮＡは配列番号３８に示す配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡは配列番号２２に示す配列を含む。
【０２０１】
一例において、本発明は、本発明のＩｇＧ１抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供し、重鎖をコードするＤＮＡは配列番号７４に示す配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡは配列番号２２に示す配列を含む。
【０２０２】
一例において、本発明は、本発明のＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供し、重鎖をコードするＤＮＡは配列番号４３に示す配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡは配列番号４１に示す配列を含む。
【０２０３】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクターを提供する。クローニングベクター又は発現ベクターが、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列、並びに適切なシグナル配列を含むのが適切である。一例において、ベクターは、重鎖と軽鎖との間に遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【０２０４】
それによりベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者にはよく知られている。この点に関して、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ製作のｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０２０５】
本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。したがって、本発明は、以下を含む、本発明による抗体を発現させるための宿主細胞も提供し：
ｉ）前記抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列、及び
ｉｉ）前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列
この場合、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を提供する。
【０２０６】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるのに用いることができる。大腸菌などの細菌の、及び他の微生物系を用いてもよく（特に、抗体フラグメントを発現させるために）、又は哺乳動物などの真核生物の、宿主細胞の発現系も用いてもよい（特に、全長抗体を発現させるために）。適切な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ミエローマ、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０２０７】
本発明で用いるためのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）の適切なタイプには、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含めた、ＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、及びＤＨＦＲ選択マーカーと用いてもよいＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、又はグルタミン合成酵素選択マーカーと用いてもよいＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞が含まれ得る。抗体を発現させるのに用いる他の細胞型には、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳＯミエローマ細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が含まれ得る。
【０２０８】
本発明は、本発明のベクター又はベクター（複数）を含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適する条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む、本発明による抗体分子を生成するためのプロセスも提供する。
【０２０９】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドのみを含むことができ、この場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのコード配列のみを、宿主細胞にトランスフェクトするのに用いる必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を生成するために、細胞系に、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター、及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターをトランスフェクトしてもよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを用いてもよい。
【０２１０】
本開示による抗体及びフラグメントは、宿主細胞から良好なレベルで発現される。よって、抗体及び／又はフラグメントの性質は、商業上の加工を促進する。
【０２１１】
よって、宿主細胞を培養し、抗体又はそのフラグメントを発現させ、後者を単離し、任意選択によりそれを精製して単離された抗体又はフラグメントを提供するためのプロセスを提供する。一実施形態において、プロセスは、エフェクター分子を、単離された抗体又はフラグメントにコンジュゲートする、例えば、特に本明細書に記載するＰＥＧポリマーをコンジュゲートするステップをさらに含む。
【０２１２】
一実施形態において、不純物がカラムに保持され、抗体が溶出されるように、非結合性の様式で陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含む、抗体（特に本発明による抗体又はフラグメント）を精製するためのプロセスを提供する。
【０２１３】
一実施形態において、精製は、ＦｃＲｎカラムでの親和性による捕捉を使用する。
【０２１４】
一実施形態において、精製は、アルブミン融合又はコンジュゲート分子を精製するための、シバクロンブルー又は同様品を使用する。プロセスにおいて用いるのに適するイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）が含まれる。ステップは、例えば、ｐＨ約８で行ってもよい。
【０２１５】
プロセスは、例えば、ｐＨ約４から５、例えば、４．５で行われる陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する、開始の捕捉ステップをさらに含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）などの樹脂を使用してもよい。次いで、抗体又はフラグメントを、例えば、濃度２００ｍＭの塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を用いて、樹脂から溶出することができる。
【０２１６】
よって、クロマトグラフのステップ又はステップ（複数）は、適宜、１つ又は複数の洗浄ステップを含むことができる。
【０２１７】
精製プロセスは、透析ろ過のステップなど、１つ又は複数のろ過ステップも含むことができる。
【０２１８】
よって、一実施形態において、外毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡから実質的に精製されている、特にこれらがない、又は実質的にない、精製された抗ＦｃＲｎ抗体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体又はフラグメント、特に本発明による抗体又はフラグメントを提供する。
【０２１９】
上述で用いられる精製されている形態は、少なくとも純度９０％、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量％又はそれを超えて純粋であることを指すものとされる。
【０２２０】
外毒素が実質的にないことは、一般的に、外毒素含量が抗体生成物１ｍｇあたり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵであることを指すものとされる。
【０２２１】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的にないことは、一般的に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞のタンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ以下、例えば、適宜、１ｍｇあたり１００μｇ以下、特に１ｍｇあたり２０μｇであることを指すものとされる。
【０２２２】
本発明の抗体分子は、診断において、例えば、ＦｃＲｎに関与する疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏの診断及び画像化において用いてもよい。
【０２２３】
本発明の抗体は病理学的状態の処置及び／又は予防において有用であるため、本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む、医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、本発明の抗体分子の、医薬を製造するための使用を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む、無菌の医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０２２４】
本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とともに加え、及び混合するステップを含む、医薬又は診断用組成物を調製するためのプロセスも提供する。
【０２２５】
抗体分子は、医薬若しくは診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又はステロイド若しくは他の薬物分子、特にその半減期がＦｃＲｎの結合と無関係である薬物分子など、他の抗体成分又は非抗体成分を含めた他の有効成分を伴ってもよい。
【０２２６】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を含むのが適切である。本明細書で用いる「治療有効量」という用語は、標的の疾患又は状態を、処置、軽減、若しくは防止するのに、又は検出可能な治療若しくは予防効果を表すのに必要とされる治療剤の量を指す。任意の抗体に対して、治療有効量は、細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデル、通常、齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長動物においてのいずれかで、最初に推定することができる。動物モデルを用いて、好適な濃度範囲及び投与経路を決定してもよい。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定することができる。
【０２２７】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物併用（単数又は複数）、反応の感受性、並びに治療に対する認容性／応答に依存する。この量は、ルーチンの実験によって決定することができ、医師の判断の範囲内にある。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇである。
【０２２８】
医薬組成物は、１用量あたり、予め決定された量の本発明の有効薬剤を含む単位剤形において提示すると便利であり得る。
【０２２９】
本開示による抗体の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで明らかな毒性学的効果を示さない。
【０２３０】
本発明による抗体又はフラグメントの一実施形態において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける最高７０％の低減をもたらし得る。本発明による抗体又はフラグメントの一例において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける最高８０％の低減をもたらし得る。本発明による抗体又はフラグメントの一例において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける８０％を超える低減をもたらし得る。
【０２３１】
循環ＩｇＧにおける最大の治療的な低減は、関連の治療用量を投与して約１週間後に観察され得る。ＩｇＧのレベルは、さらなる治療用量を送達しなければ、投薬後数週にわたって回復し得る。本明細書で用いる回復は、最初の投薬を開始する前に観察されたレベルと同様のレベルに戻るレベルを指す。
【０２３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＩｇＧレベルが、本開示による抗体又はフラグメントの逐次用量の投与によって、好適に低レベルに維持され得るのが有利である。
【０２３３】
組成物は、患者に個々に投与してもよく、又は他の薬剤、薬物、若しくはホルモンと併用して（例えば、同時に、逐次的に、若しくは別々に）投与してもよい。
【０２３４】
本明細書で用いる薬剤は、投与したときに生理学的効果のある実体を指す。
【０２３５】
本明細書で用いる薬物は、治療用量で好適な生理学的効果のある化学的実体を指す。
【０２３６】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、免疫抑制治療、例えば、ステロイド、特にプレドニゾンとともに使用する。
【０２３７】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、リツキシマブ又は他のＢ細胞治療とともに使用する。
【０２３８】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、任意のＢ細胞若しくはＴ細胞変調剤、又は免疫調節薬とともに使用する。例として、メトトレキサート、ミコフェノレート（ｍｉｃｒｏｐｈｅｎｙｏｌａｔｅ）、及びアザチオプリンが含まれる。
【０２３９】
本発明の抗体分子を投与する用量は、処置しようとする状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子を予防的に用いるか、又は既存の状態を処置するのに用いるかに依存する。
【０２４０】
投薬の頻度は、抗体の半減期、その標的が媒介する性質、その効果の持続時間、及び抗薬物抗体の存在に依存する。抗体の半減期が短い（数時間）、若しくは活性が限られている場合、且つ／又は小体積の薬物を送達するのが望ましい場合（例えば、皮下注射に対して）、１日あたり１回以上の頻度など、頻繁に投薬する必要があり得る。或いは、抗体の半減期が長い場合、活性の持続時間が長い場合、又は大体積を投薬することができる（例えば、注入により）場合、投薬はまれであってよく、１日１回、又は数日、数週、若しくは数か月毎であってよい。一実施形態において、投薬間に十分な時間を与えて、抗薬物抗体のレベルを低下させる。
【０２４１】
本明細書で用いる半減期は、血清／血漿中など、循環中の分子の持続時間を指すものとされる。
【０２４２】
本明細書で用いる薬力学は、本開示による分子の、プロファイル、特に生物学的作用の持続時間を指す。
【０２４３】
薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を投与する個体に有害な抗体の生成を誘発してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、大型で、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性なウイルス粒子であってよい。
【０２４４】
鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩、又は有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩など、薬学的に許容される塩を用いることができる。
【０２４５】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセリン、及びエタノールなどの液体をさらに含むことができる。加えて、補助的な物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体により、医薬組成物は、患者が摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として調合できるようになる。
【０２４６】
投与に適する形態には、例えば、ボーラス注射又は持続的注入などによる注射又は注入による、非経口投与に適する形態が含まれる。生成物が注射又は注入用である場合、生成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤、又は乳剤の形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むことができる。或いは、抗体分子は、使用前に好適な無菌の液体と再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０２４７】
調合後は、本発明の組成物を、対象に直接投与してもよい。処置しようとする対象は動物でもよい。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適応される。適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又はフラグメントの等電点の値に同様ではなく、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれを超える範囲である場合、ｐＨ７の製剤が好適であり得る。理論によって拘泥しようとするものではないが、これは最終的に、溶液中に抗体又はフラグメントが残存するなど、安定性が改善された最終製剤を提供し得ると考えられる。
【０２４８】
一例において、ｐＨが４．０から７．０の範囲である医薬組成物は、本開示による抗体分子を１から２００ｍｇ／ｍＬ、バッファーを１から１００ｍＭ、界面活性剤を０．００１から１％、ａ）安定化剤を１０から５００ｍＭ、ｂ）安定化剤を１０から５００ｍＭ及び等張化剤を５から５００ｍＭ、又はｃ）等張化剤を５から５００ｍＭ含む。
【０２４９】
本発明の医薬組成物は、それだけには限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮膚（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内、又は直腸の経路を含めた任意の数々の経路によって投与することができる。皮下噴射器も、本発明の医薬組成物を投与するのに用いることができる。典型的に、治療用組成物は、液体の液剤又は懸濁剤いずれかとして、注射可能として調製することができる。注射前に液体のビヒクル中の液剤、又は懸濁剤に適する固体形態も調製することができる。
【０２５０】
組成物の直接的な送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋肉内の注射により、又は組織の間質腔に対する送達により遂行する。組成物を、病変中に投与することもできる。用量処置は、単一用用量スケジュールでも、又は複数の用量スケジュールでもよい。
【０２５１】
組成物中の有効成分は抗体分子であることが理解されよう。抗体分子はそれ自体、消化管において分解を受けやすい。よって、組成物を、消化管を用いた経路によって投与しようとする場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収された後は抗体を放出する薬剤を含む必要がある。
【０２５２】
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９１年）において得ることができる。
【０２５３】
一実施形態において、製剤を、吸入を含めた局所投与用の製剤として提供する。
【０２５４】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、プロペラントガスを含む計量用エアロゾル、又はプロペラントガスのない吸入可能な溶液が含まれる。有効物質を含む本開示による吸入可能な粉末は、上記に言及した有効物質のみからなってもよく、又は上記に言及した有効物質の生理学的に許容される賦形剤との混合物からなってもよい。
【０２５５】
これら吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコール若しくはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの相互の混合物が含まれ得る。適切には単糖又は二糖が用いられ、ラクトース又はグルコースは、特定には、ただしそれに限定されないが、それらの水和物の形態で用いられる。
【０２５６】
肺に堆積させるための粒子には、１〜９ミクロン、例えば、１から５μｍなど、１０ミクロン未満の粒径が必要とされる。有効成分（例えば、抗体又はフラグメント）の粒径が最重要である。
【０２５７】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができるプロペラントガスは当技術分野では知られている。適切なプロペラントガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなどの炭化水素、並びに、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化された誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記に言及したプロペラントガスは、単独で、又はこれらの混合物において用いることができる。
【０２５８】
特に適切なプロペラントガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記に言及したハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、並びにこれらの混合物が特に適切である。
【０２５９】
プロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）抗酸化剤、滑沢剤、及びｐＨを調整するための手段など、他の成分も含むことができる。これらの成分は全て、当技術分野では知られている。
【０２６０】
本発明によるプロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最高５重量％の有効物質を含むことができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２から５重量％、０．０１から３重量％、０．０１５から２重量％、０．１から２重量％、０．５から２重量％、又は０．５から１重量％の有効成分を含む。
【０２６１】
或いは、肺に対する局所投与は、例えば、コンプレッサ（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．が製造したＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサに接続されているＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）に接続されているネブライザーなどの装置を用いて、液体の液剤又は懸濁剤製剤の投与によってもよい。
【０２６２】
本発明の抗体は、溶媒中に分散させて、例えば、液剤又は懸濁剤の形態において送達することができる。本発明の抗体は、好適な生理学的溶液、例えば、食塩水、又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁することができる。当技術分野において知られている緩衝溶液の例は、ｐＨ約４．０から５．０を実現するように、水１ｍｌあたりエデト酸二ナトリウムを０．０５ｍｇから０．１５ｍｇ、ＮａＣｌを８．０ｍｇから９．０ｍｇ、ポリソルベートを０．１５ｍｇから０．２５ｍｇ、無水クエン酸を０．２５ｍｇから０．３０ｍｇ、及びクエン酸ナトリウムを０．４５から０．５５ｍｇ含むことができる。凍結乾燥抗体などの懸濁剤を用いてもよい。
【０２６３】
治療用懸濁剤又は液剤の製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含むことができる。賦形剤は、当技術分野ではよく知られており、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセリンを含む。液剤又は懸濁剤は、リポソーム又は生分解性の微粒子中に封入することができる。製剤は、一般的に、無菌製造プロセスを使用して、実質的に無菌の形態において提供する。
【０２６４】
これには、当業者にはなじみのある方法による、製剤に用いる緩衝溶媒／溶液のろ過による生成及び滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁、及び製剤の無菌容器中への分配が含まれ得る。
【０２６５】
本開示による霧化可能な（ｎｅｂｕｌｉｚａｂｌｅ）製剤を、例えば、ホイルエンベロープ中に包装した単一の用量単位（例えば、密封されたプラスチックコンテナ又はバイアル）として提供してもよい。各バイアルは、溶媒／溶液バッファー２ｍＬなどの体積中に単位用量を含む。
【０２６６】
本明細書に開示する抗体は、霧化による送達に適し得る。
【０２６７】
本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与してもよいことが、やはり想定される。これを実現するために、好適なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチューで構築されるように、患者中に導入する。
【０２６８】
本発明は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳症、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ−関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索神経障害、バロー病、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心伝導障害、コクサッキー心筋炎（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型寒冷グロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病（視神経脊髄炎）、拡張型心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸性血管中心性線維症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）、ウェゲナーを参照されたい、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン症、特発性低補体血性尿細管間質性腎炎（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｓｔｉｔｉａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４−関連疾患、ＩｇＧ４−関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍（Ｋｕｔｔｎｅｒ’ｓ  ｔｕｍｏｕｒ）、ランバート−イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、全身性ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ−ハーベルマン病、多巣性線維硬化症（Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｆｉｂｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、多発性硬化症、重症筋無力症、筋肉炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Ａ群溶連菌関連小児自己免疫神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク性多発ニューロパチー（Ｐａｒａｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー−ロンベルク症候群、パーソネージ−ターナー症候群、扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、尋常性天疱瘡���大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎（Ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維化症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺腫、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫（Ｓｐｅｒｍ  ＆  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚疾患（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｂｕｌｌｏｕｓ  ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、白斑、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、温式特発性溶血性貧血（Ｗａｒｍ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ）、及びウェゲナー肉芽腫症（現在、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）など、自己免疫疾患のコントロールにおいて用いるための抗体分子（又はそれを含む組成物）も提供する。
【０２６９】
さらなる適応症には、過粘稠度症候群、クリオグロブリン血症、移植腎における再発性限局性及び分節性糸球体硬化症、ＨＥＬＬＰ症候群、レフサム病、ＨＩＶ−関連神経障害、横紋筋融解症、及び同種免疫疾患も含まれ得る。
【０２７０】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、癲癇又は発作の処置又は予防において用いる。
【０２７１】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを多発性硬化症の処置又は予防において用いる。
【０２７２】
一実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントを、以下を含む同種免疫疾患／適応症において用いる：
−  抗ＨＬＡ抗体による移植ドナー不一致
−  胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症、ＦＮＡＩＴ（又は新生児同種免疫性血小板減少症、ＮＡＩＴＰ若しくはＮＡＩＴ若しくはＮＡＴ、又は胎児−母体同種免疫性血小板減少症、ＦＭＡＩＴＰ若しくはＦＭＡＩＴ）
【０２７３】
さらなる適応症には、Ｆｃ含有生物薬物のヒト患者からの速やかなクリアランス、及び抗ＦｃＲｎ治療の、他の治療−ＩＶＩｇ、リツキサン、血漿交換法との併用が含まれる。例えば、抗ＦｃＲｎ治療を、リツキサン治療の後に用いてもよい。加えて、抗ＦｃＲｎ治療を用いて、腫瘍を画像化する上で用いた放射標識した抗体などの造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を速やかに一掃してもよい。
【０２７４】
実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの神経学的障害において用いられる：
−  慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
−  ギランバレー症候群
−  異常タンパク性多発ニューロパチー
−  視神経脊髄炎（ＮＭＯ、ＮＭＯスペクトル障害、又はＮＭＯスペクトル疾患）、及び
−  重症筋無力症。
【０２７５】
実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの皮膚科障害において用いられる：
−  類天疱瘡
−  尋常性天疱瘡
−  ＡＮＣＡ関連血管炎
−  拡張型心筋症
【０２７６】
実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの免疫学的、血液学的障害において用いられる：
−  特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
−  血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
−  温式特発性溶血性貧血
−  グッドパスチャー症候群
−  抗ＨＬＡ抗体による移植ドナー不一致
【０２７７】
一実施形態において、障害は、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＣＩＤＰ、ギランバレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治癲癇、ＩＴＰ／ＴＴＰ、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯ不適合、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、線維化肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、強皮症、ループス、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン病、及び関節リウマチから選択される。
【０２７８】
一実施形態において、障害は、多腺性自己免疫症候群１型（ＡＰＥＣＥＤ又はウイタカー症候群）、及び２型（シュミット症候群）、汎発性脱毛症、筋無力症クリーゼ、甲状腺クリーゼ、甲状腺関連眼疾患、甲状腺眼障害、自己免疫性糖尿病、自己抗体関連脳炎及び／又は脳疾患、落葉状天疱瘡、表皮水疱症、疱疹状皮膚炎、シデナム舞踏病、急性運動性軸索性神経障害（ＡＭＡＮ）、ミラー−フィッシャー症候群、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、眼球クローヌス、炎症性筋疾患、アイザック症候群（自己免疫性神経性筋強直）、腫瘍随伴症候群、及び辺縁系脳炎から選択される。
【０２７９】
本開示による抗体及びフラグメントは、処置又は予防において用いてもよい。
【０２８０】
本発明は、個体に、本明細書に記載する治療有効用量の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを投与するステップを含む、個体における望ましくない抗体の濃度を低下させる方法も提供する。
【０２８１】
本発明は、自己免疫疾患など、本明細書に記載する病理学的障害を処置及び／又は予防するための医薬の製造における、本発明による抗体分子の使用をさらに提供する。
【０２８２】
一実施形態において、本開示は、例えば、レポーター分子にコンジュゲートしている、診断用試薬としての抗体又はそのフラグメントの使用を含む。よって、標識されている、本開示による抗体又はフラグメントを提供する。一態様において、本開示による抗体又はフラグメントを含むカラムを提供する。
【０２８３】
よって、以下のような使用のための試薬として用いるための抗ＦｃＲｎ抗体又は結合フラグメントを提供する：
１）マトリクスにコンジュゲートしており、アフィニティーカラムとして、又は（修飾されている形態の抗ＦｃＲｎとして）沈殿剤として（例えば、Ｆｃの添加により修飾され得（若しくは全長のＩｇＧとして生成され得）、任意選択により抗Ｆｃ試薬によって沈殿される、別の分子によって認識されるドメインで修飾されている形態として）用いられる、ＦｃＲｎタンパク質（又はそのフラグメント）の精製
２）生存している、或いは固定されている（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞、又は組織若しくは細胞切片においてｉｎ  ｖｉｖｏで）、細胞上又は細胞中の、ＦｃＲｎの検出及び／又は定量。このための使用には、抗ＦｃＲｎ処置の効果を追跡するための生物マーカーとしてのＦｃＲｎの定量が含まれ得る。この目的では、候補物質を、修飾されている形態において（例えば、全長のＩｇＧにおけるなど、Ｆｃドメインの添加により、又は遺伝子融合タンパク質若しくは化学的コンジュゲートとして、例えば、検出の目的に用いる蛍光タグの添加など、いくつかの他の部分の添加により）用いてもよい。
３）（１）及び（２）に例示した方法によって修飾される候補物質に結合することにより標識される、ＦｃＲｎ保有細胞の精製又は選別。
【０２８４】
本発明はまた、抗体分子などの試験分子がＦｃＲｎ活性をブロックする能力、特に細胞がＩｇＧをリサイクルする能力を評価するのに適するアッセイを提供する。このようなアッセイは、抗体分子又は小分子などのＦｃＲｎ活性のインヒビターを同定するのに有用であり得、それ自体としてこのようなインヒビターの生成におけるバッチ放出アッセイとしても有用であり得る。
【０２８５】
一態様において、抗体分子などの試験分子がヒトＦｃＲｎ活性をブロックする能力、特に、ヒトＦｃＲｎがＩｇＧをリサイクルする能力を評価するのに適するアッセイを提供し、方法は以下のステップを含む：
ａ）ヒトＦｃＲｎアルファ鎖及びヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を組換え発現する非ヒト哺乳動物細胞の表面上をコーティングするステップ、
ｂ）ｐＨ約５．９など温和な酸性条件下、細胞を、試験分子及び細胞がリサイクルしようとするＩｇＧと、試験分子及びＩｇＧの両方をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間、接触させるステップであり、任意選択により、ＩｇＧをリサイクルする前に試験分子を添加し、試験分子をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間インキュベートするステップ、
ｃ）わずかに酸性のバッファーで洗浄するステップ、及び
ｄ）細胞によって内部移行及び／又はリサイクルされたＩｇＧの量を検出するステップ。
【０２８６】
一態様において、抗体分子などの試験分子がヒトＦｃＲｎ活性をブロックする能力、特にヒトＦｃＲｎがＩｇＧをリサイクルする能力を評価するのに適するアッセイを提供し、方法は以下のステップを含む：
ａ）ヒトＦｃＲｎアルファ鎖及びヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を組換え発現する非ヒト哺乳動物細胞の表面上をコーティングするステップ、
ｂ）ｐＨ約５．９など温和な酸性条件下、細胞を、試験抗体分子及び細胞がリサイクルしようとするＩｇＧと、試験抗体分子及びＩｇＧの両方をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間、接触させるステップであり、任意選択により、ＩｇＧをリサイクルする前に試験抗体分子を添加し、試験抗体分子をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間インキュベートするステップ、
ｃ）わずかに酸性のバッファーで洗浄して、非結合のＩｇＧ及び試験抗体分子を除去するステップ、及び
ｄ）細胞によってリサイクルされたＩｇＧの量を検出するステップ。
【０２８７】
一態様において、抗体分子などの試験分子がヒトＦｃＲｎ活性をブロックする能力、特にヒトＦｃＲｎがＩｇＧをリサイクルする能力を評価するのに適するアッセイを提供し、方法は以下のステップを含む：
ａ）ヒトＦｃＲｎアルファ鎖及びヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を組換え発現する非ヒト哺乳動物細胞の表面上をコーティングするステップ、
ｂ）ｐＨ約５．９など温和な酸性条件下、細胞を、試験抗体分子及び細胞がリサイクルしようとするＩｇＧと、試験抗体分子及びＩｇＧの両方をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間、接触させるステップであり、任意選択により、ＩｇＧをリサイクルする前に試験抗体分子を添加し、試験抗体分子をＦｃＲｎに結合させるのに十分な期間インキュベートするステップ、
ｃ）わずかに酸性のバッファーで洗浄して非結合のＩｇＧ及び試験抗体分子を除去するステップ、
ｄ）ｐＨ約７．２など、中性のバッファー中で細胞をインキュベートするステップ、
ｅ）上清中に放出されたＩｇＧの量を決定することにより、細胞によってリサイクルされたＩｇＧの量を検出するステップ。
【０２８８】
適切な細胞には、マディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）ＩＩ細胞が含まれる。ＭＤＣＫＩＩ細胞の、ヒトＦｃＲｎアルファ鎖及びヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）でのトランスフェクションは、Ｃｌａｙｐｏｏｌら、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７、３１、２８０３８〜２８０５０頁によって以前に記載されている。この文献は、これらのトランスフェクトされた細胞によるＩｇＧのリサイクルも記載している。
【０２８９】
試験の間、細胞を支持するための培地には、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号２１０９０−０２２）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０３５）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ番号１１３６０−０３９）、及びＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ番号２５０３０−０２４）を含む完全培地が含まれる。
【０２９０】
酸性の洗浄液は、ＨＢＳＳ＋（ＰＡＡ番号Ｈ１５−００８）を取り、ｐＨ５．９＋／−０．５に到達するまで１Ｍ  ＭＥＳを加えることにより調製することができる。約１％のＢＳＡも加えてもよい（Ｓｉｇｍａ番号Ａ９６４７）。
【０２９１】
中性の洗浄液は、ＨＢＳＳ＋（ＰＡＡ番号Ｈ１５−００８）を取り、ｐＨ７．２＋／−０．５に到達するまで１０Ｍ  Ｈｅｐｅｓを加えることにより調製することができる。約１％のＢＳＡも加えてもよい（Ｓｉｇｍａ番号Ａ９６４７）。
【０２９２】
細胞を酸性バッファーで洗浄することで、非結合の試験抗体及び非結合のＩｇＧが除去され、さらなる分析が行えるようになる。ステップ（ｂ）において用いた酸性条件により、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合、並びにその内部移行及びリサイクルが促される。
【０２９３】
細胞の表面上のみの試験抗体又はフラグメント及びＩｇＧの量は、細胞を中性洗浄液で洗浄し、上清／洗浄液を分析して試験抗体又はＩｇＧの量を検出することにより決定することができる。溶解バッファーを使用しないことが重要である。細胞によって内部移行されるＩｇＧの量を決定するために、抗体を最初に、細胞の表面から中性の洗浄液で除去し、細胞を溶解バッファーによって溶解し、次いで、内部の含量を分析してもよい。細胞によってリサイクルされるＩｇＧの量を決定するには、細胞を中性条件下で適切な期間インキュベートし、周囲のバッファーをＩｇＧ含量に対して分析する。細胞の表面及び内部の抗体含量が必要とされる場合は、細胞を酸性洗浄液で洗浄して、細胞表面上に抗体の存在を維持し、引き続き細胞を溶解し、組み合わせた材料を分析してもよい。
【０２９４】
ＩｇＧの内部移行及びリサイクルの両方を測定するのが望ましい場合、試料を２回ずつ実施し、内部移行に対する試験及びリサイクルを別々に行う。
【０２９５】
適切な溶解バッファーには、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００が含まれ、製造元のガイドラインに記載されている通り、１０ｍｌ毎にプロテアーゼインヒビター／ホスフェートインヒビターを加える。
【０２９６】
リサイクルしようとするＩｇＧを標識化するのが典型的であり、一例において、ビオチン化ヒトＩｇＧを用いてもよい。次いで、ＩｇＧを、例えば、ＭＳＤブロッキングバッファー０．２ｕｇ／ｍＬに、ストレプトアビジンスルホ−タグ検出抗体（例えば、ＭＳＤ番号ｒ３２ａｄ−５）２５ｍＬを用いて検出することができる。ブロッキングバッファーは、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５  １．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１．５％ＢＳＡを含むことができる。
【０２９７】
或いは、ＩｇＧを、フルオロフォア又は同様の標識で予め標識化してもよい。
【０２９８】
一実施形態において、適切な表面は、９６ウエルプレート若しくは同様品などのプラスチック製のプレート若しくはウエル、スライドガラス、又は膜である。一例において、細胞の表面上を、単層の形成をもたらす密度でコーティングする。
【０２９９】
一実施形態において、本明細書に記載するアッセイは、膜を上から下にまたがるｐＨ勾配で、例えば、膜の片側が酸性条件であり、膜の裏側が中性条件である、抗体の経細胞輸送を測定するものではない。
【０３００】
一例において、試験抗体又はフラグメント、及びＩｇＧを、ステップ（ｂ）において細胞と約１時間、例えば、結合を可能にする酸性条件下、周囲温度でインキュベートしてもよい。
【０３０１】
一例において、試験抗体又はフラグメントを、ステップ（ｂ）において細胞と約１時間、例えば、結合を可能にする酸性条件下、周囲温度でインキュベートした後、リサイクルしようとするＩｇＧを加えてもよい。引き続き、細胞によってリサイクルしようとするＩｇＧを、ステップ（ｂ）における細胞と約１時間、例えば、結合を可能にする酸性条件下、周囲温度でインキュベートしてもよい。
【０３０２】
中性条件により、ＩｇＧの、上清中への放出が促進される。
【０３０３】
本明細書の文脈における含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとされる。
【０３０４】
技術的に好適である場合、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。
【０３０５】
実施形態を、ある種の特徴／要素を含むものとして本明細書で説明する。本開示は、前記の特徴／要素からなり、又は前記の特徴／要素から本質的になる別の実施形態にも拡張される。
【０３０６】
特許及び出願などの技術的な参考文献が、参照により本明細書に援用される。
【０３０７】
以下の実施例において、単なる例示の目的でさらに本発明を説明するが、参照される添付の図面は以下の通りである：
図１は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した、トランスジェニックマウスにおける％ｈＩｇＧを示す。
図１ａは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの血清における、ヒトＩＶＩｇの濃度に対する、１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの効果を示す。
図１ｂは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、ヒトＩＶＩｇの濃度に対する、１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの効果を示す。
図１ｃは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの薬物動態を示す。
図１ｄは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの薬物動態を示す。
図１ｅは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、血清アルブミン濃度に対する１６３８ＦａｂＦｖ及びＦａｂ’ＰＥＧフォーマットの効果を示す。
図１ｆは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、血清アルブミン濃度に対する１６３８ＩｇＧ４Ｐフォーマットの効果を示す。
図２は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．２０ｎＭ、及び酸性バッファー中０．２２ｎＭであった。
図３は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧリサイクルを阻害することを示す。
図４は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧ経細胞輸送を阻害することを示す。
図５は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＦａｂＦｖは、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン１５細胞においてＩｇＧ経細胞輸送を阻害することを示す。
図６は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．３、及び酸性バッファー中０．４３であった（表２を参照されたい）。
図７は、ＣＡ１７０＿１６３８のＣＤＲ配列を示す。
図８は、本開示による抗体配列を示す。
図９ａは、抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す。
図９ｂは、抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す。
【実施例】
【０３０８】
略語
℃  温度、摂氏度。
ＡＴＲ  ＦＴＩＲ  減衰全反射法フーリエ変換赤外分光測定法
ＣＨ２  重鎖定常領域２
ｃＩＥＦ  キャピラリー等電点電気泳動
ＤＳＣ  示差走査熱量測定
Ｇ０Ｆ  フコシル化アガラクトシル２分岐グリカン（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｇｌａｃｔｏｓｙｌ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｇｌｙｃａｎ）
Ｈ鎖  重鎖
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
Ｌ鎖  軽鎖
ｎＬＣＭＳ  ナノ液体クロマトグラフィー質量分析法
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水バッファー
ｐＩ  等電点
ＳＤ  標準偏差
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
ＴｏＦ  飛行時間
Ｔｍ  融解温度
ＴＣＥＰ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＨＰ  トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
【０３０９】
Ｂ細胞の培養及び抗体のスクリーニングのための材料を産生するために、以下の免疫化を行った：
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、変異ヒトＦｃＲｎ（Ｌ３２０Ａ；Ｌ３２１Ａ）（Ｏｂｅｒら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、１５５１〜１５５９頁）及びマウスβ２Ｍを同時発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞の３回注射で免疫化し、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを４回目に最終ブーストした。血清を、変異ＦｃＲｎに対するＨＥＫ−２９３細胞上の結合、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８を標識したヒトｇＧの結合を妨げる能力の両方に対してモニタリングした。両方の方法とも、フローサイトメトリーにより行った。結合に対して、フィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウス又はラットＦｃ特異的二次試薬を用いて、血清中ＩｇＧの結合を明らかにした。
【０３１０】
Ｚｕｂｌｅｒら（１９８５年）が記載したのと同様の方法を用いて、Ｂ細胞培養物を調製した。簡潔に述べると、１ウエルあたりおよそ５０００細胞の密度のＢ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２〜５％活性化ウサギ脾細胞培養物上清、及びガンマ線照射したＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウエル）を補ったＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）２００μｌ／ウエルを含む、バーコード化した９６ウエル組織培養プレート中、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で７日間、培養した。
【０３１１】
Ｂ細胞培養上清中のＦｃＲｎ特異的抗体の存在を、均一な蛍光ベースの結合アッセイを用いて、標的抗原の源として変異ＦｃＲｎ（表面を安定化した）を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を用いて決定した。上清１０ｕｌを、バーコード化した９６ウエル組織培養プレートから、１ウエルあたりトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を５０００個含むバーコード化した３８４ウエル黒色壁アッセイプレート中に、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラーを用いて移した。ヤギ抗ラット又はマウスＩｇＧＦｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）との結合が明らかになった。プレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ８２００細胞検出システム上で読み取った。３８の異なる免疫化動物を代表する３８００×９６ウエル培養プレートから、９８００個の抗ヒトＦｃＲｎバインダーを同定した。これはおよそ２５億個のＢ細胞のスクリーニングを表すと推定された。
【０３１２】
一次スクリーニング後、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘヒットピッキング（ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇ）ロボットを用いて、陽性の上清を、バーコード化した９６ウエルのマスタープレート上に集約し、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８０℃で凍結させた。次いで、高親和性の抗体を含み、ヒトＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害する（下記を参照されたい）ウエルを同定するために、マスタープレートをＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいてスクリーニングした。
【０３１３】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いた生体分子の相互作用分析を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行った。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５バッファー中ヤギ抗ラットＩｇＧ、Ｆｃガンマ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を、アミンカップリング化学反応により、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用いて、およそ１９５００応答単位（ＲＵ）の捕獲レベルに、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上で固定化した。５０ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌを、親和性アッセイ及びブロッキングアッセイに対するランニングバッファーとして用いた。Ｂ細胞培養物上清を、２００ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、１対５に希釈した。希釈したＢ細胞上清の５μｌ／分で６００秒の注射を、固定化した抗ラットＩｇＧ、Ｆｃによる捕獲に用いた。１００ｎＭのヒトＦｃＲｎを、捕獲したＢ細胞培養物上清にわたって３０μｌ／分で１８０秒注射し、引き続き３６０秒解離した。ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、３０μｌ／分で１８０秒の解離で６０秒にわたって注射した。
【０３１４】
抗体の親和定数（ＫＤ）を決定し、ＩｇＧの結合をブロックしたものを決定するために、Ｔ２００評価ソフトウエア（バージョン１．０）を用いてデータを分析した。一代替のアッセイとして、細胞ベースのヒトＩｇＧブロッキングアッセイにおいて、マスタープレートの上清もスクリーニングした。マスタープレートからＢ細胞培養物上清２５ｕｌを、９６ウエルＵ底ポリプロピレン製プレートに加えた。次いで、変異ｈＦｃＲｎをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（２５ｕｌＰＢＳｐＨ６／１％ＦＣＳ中、１ウエルあたり５０，０００細胞）を各ウエルに加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ培地１５０ｕｌで２回洗浄した。次いで、細胞を、７．５ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８又は６４９で標識したヒトＩｇＧを含むＰＢＳ／ＦＣＳ培地５０ｕｌ／ウエル中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、培地１５０ｕｌで２回洗浄し、次いで、固定液として１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ／ＦＣＳ培地３５ｕｌ／ウエル中に再懸濁した。次いで、プレートを、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ２フローサイトメーター上で読み取った。
【０３１５】
選り抜きの対象のウエルから抗体可変領域の遺伝子を回復させるために、逆重畳積分のステップを行って、Ｂ細胞の不均一な集団を含んでいた所与のウエル中、抗原特異的なＢ細胞の同定を可能にしなければならなかった。これは、蛍光輝点方法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｉ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて実現した。簡潔に述べると、陽性のウエルからの免疫グロブリン分泌性Ｂ細胞を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ、及び最終希釈１：１２００のヤギ抗ラット又はマウスＦｃγフラグメント特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）でコーティングしたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。１時間、３７℃の静的なインキュベート後、抗原特異的Ｂ細胞は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光のハロが存在したため、同定することができた。Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて同定した、これら個々のＢ細胞を、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレータで拾い、ＰＣＲチューブ中に堆積させた。蛍光輝点が、２６８個の選択されたウエルから産生された。
【０３１６】
抗体可変領域の遺伝子を、単一の細胞から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ）−ＰＣＲにより、重鎖及び軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて回収した。２ラウンドのＰＣＲを、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘリキッドハンドリングロボット上で行い、ネステッド２°ＰＣＲにより、３’及び５’終端に制限部位を組み入れ、可変領域をマウスγ１  ＩｇＧ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクター中にクローニングさせた。重鎖及び軽鎖構築物を対にしたものを、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞中に同時トランスフェクトし、体積１ｍｌ中、４８ウエルプレートにおいて培養した。発現５〜７日後、上清を収集し、抗体をさらなるスクリーニングにかけた。
【０３１７】
ＰＣＲにより、選択した１５６のウエルから、単一のＢ細胞から重鎖及び軽鎖の同源の対を上首尾に回収した。クローニングした可変領域遺伝子のＤＮＡ配列分析により、組換え抗体の数々の独特なファミリーが同定された。発現後、一過性の上清を、ヒトＩｇＧ  ＦＡＣＳブロッキングアッセイ（上記に記載した）及びＩｇＧリサイクルアッセイの両方において調査した。いくつかの場合において、精製したマウスγ１  ＩｇＧを生成し、試験した（それにしたがってデータを標識した）。
【０３１８】
リサイクルアッセイは、９６ウエルプレートの１ウエルあたり２５，０００細胞に塗抹した、ヒトＦｃＲｎ及びベータ２ミクログロブリンを過剰発現するＭＤＣＫＩＩ細胞（以下の例５、６、及び７に記載するクローン）を用いるものであった。これらを５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ７．２＋１％ＢＳＡで洗浄し、次いで、多様な濃度のＨＥＫ−２９３一過性上清５０μｌ又は精製した抗体と、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。上清を除去し、ＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ５．９＋１％ＢＳＡ５０μｌ中、ビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）５００ｎｇ／ｍｌを細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ５．９中で３回洗浄し、ＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ７．２  １００μｌを細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。上清を細胞から除去し、抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグリビール（ｒｅｖｅａｌ）抗体（ＭＳＤ）でＭＳＤアッセイを用いて合計ＩｇＧに対して分析した。阻害曲線を、非線形の回帰分析によって分析してＩＣ５０値を決定した。
【０３１９】
これらのアッセイにおける性能に基づいて、配列番号１から６に示す６個のＣＤＲを含む抗体のファミリーを選択した。抗体ＣＡ１７０＿０１６３８が最良の活性を有し、ヒト化のために選択された。
【０３２０】
（例１）ヒト化方法
ラット抗体Ｖ領域からのＣＤＲを、ヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワーク上にグラフト化することによって、抗体ＣＡ１７０＿０１６３８をヒト化した。抗体の活性を回復するために、ラットＶ領域からのいくつかのフレームワーク残基も、ヒト化配列に保持された。これらの残基を、Ａｄａｉｒら（１９９１年）（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＷＯ９１／０９９６７）が概略するプロトコールを用いて選択した。ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列の、ヒト生殖系列（アクセプタ）Ｖ領域配列とのアラインメントを図９Ａ及びＢに、デザインしたヒト化配列とともに示す。ドナーからアクセプタ配列にグラフト化したＣＤＲはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７年）が規定した通りであるが、ＣＤＲ−Ｈ１は例外であり、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組み合わされた定義が用いられる（Ａｄａｉｒら、１９９１年、Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−２７プラスＪＫ４  Ｊ−領域（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、軽鎖ＣＤＲに対するアクセプタとして選択した。ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３−７プラスＪＨ３  Ｊ−領域（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、重鎖ＣＤＲに対するアクセプタとして選択した。
【０３２１】
いくつかのバリアントの重鎖及び軽鎖のＶ領域配列をコードする遺伝子をデザインし、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨによる自動合成の取組みによって構築した。重鎖及び軽鎖両方のＶ領域のさらなるバリアントを、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によってＶＨ及びＶＫ遺伝子を修飾することにより創出した。これらの遺伝子をいくつかのベクター中にクローニングして、ヒト化１６３８Ｆａｂ又はＩｇＧ４抗体の、それぞれ大腸菌及び哺乳動物細胞における発現を可能にした。バリアント鎖、及びこれらの組合せを、親抗体に対するこれらの作用強度、これらの生物物理学的性質、及び下流のプロセシングに対する適合性に対して評価し、ｇＬ７軽鎖グラフト及びｇＨ３３重鎖グラフトが選択された。最終の選択されたｇＬ７及びｇＨ３３グラフト配列をそれぞれ図９Ａ及びＢに示す。このＶ領域の対を１６３８．ｇ４９と命名した。
【０３２２】
グラフトｇＬ７における軽鎖フレームワーク残基は全てヒト生殖系列遺伝子からのものであり、残基７０及び７１（Ｋａｂａｔナンバリング）が例外であるが、残基７０及び７１ではドナー残基のヒスチジン（Ｈ７０）及びチロシン（Ｔ７１）がそれぞれ保持された。これら２つの残基の保持は、ヒト化抗体又はＦａｂの完全な効力に重要であった。ｇＬ７グラフトのＣＤＲＬ２における残基５６は、アスパラギン酸（Ｄ５６）からグルタミン酸（Ｅ５６）残基に変異し、よってｇＬ７配列から潜在的なアスパラギン酸異性体化部位が除去された。グラフトｇＨ３３における重鎖フレームワーク残基は全てヒト生殖系列遺伝子からのものであり、残基４８及び７８（Ｋａｂａｔナンバリング）が例外であるが、残基４８及び７８ではドナー残基のロイシン（Ｌ４８）及びアラニン（Ａ７８）がそれぞれ保持された。これら２つの残基の保持は、ヒト化抗体又はＦａｂの完全な作用強度に不可欠であった。
【０３２３】
大腸菌において１６３８．ｇ４９Ｆａｂを発現させるために、ヒト化重鎖及び軽鎖のＶ領域遺伝子を、ＵＣＢ発現ベクターｐＴＴＯＤ中にクローニングしたが、ｐＴＴＯＤはヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）及びヒトガンマ−１  ＣＨ１領域（ヒンジ領域あり又はなし）（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）をコードするＤＮＡを含んでいる。
【０３２４】
哺乳動物細胞において１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４を発現させるために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列に接続して、近接する軽鎖遺伝子を創出した。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒンジ安定化変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ−４の重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列に接続して（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３年、３０巻（１）、１０５〜８頁）、近接する重鎖遺伝子を創出した。重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳動物の発現ベクター中にクローニングした。
【０３２５】
別の、より初期のグラフトである１６３８．ｇ２８を、本明細書以下に記載する例８Ａにおいて用いたが、１６３８．ｇ２８は１６３８．ｇ４９グラフト（Ｆ２４、Ｌ４８、Ｋ７１、Ｔ７３、Ａ７８、及びＶ９３）よりも重鎖（ｇＨ２）により多くのドナー残基を含んでいた。この抗体（ｇＬ２）の軽鎖も、１６３８．ｇ４９において用いられる配列番号７の修飾されているＣＤＲＬ２よりも、むしろ配列番号５に示す非修飾のＣＤＲＬ２を含んでいる。両セットの抗体の配列を図８に示す。抗体１６３８．ｇ２８は、上記に１６３８．ｇ４９に対して記載するＦａｂ’フラグメントとして発現された。
【０３２６】
（例２）１６３８．ｇ４９Ｆａｂ’−ＰＥＧコンジュゲートの調製
大腸菌のペリプラズムで発現されるＦａｂ’を、熱除去（ｈｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）により細胞から抽出した。Ｆａｂ’を、酸性溶出とともにプロテインＧ親和性精製により精製した。Ｆａｂ’を還元し、４０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３）でＰＥＧ化した。ＰＥＧを、マレイミド基によって、抗体フラグメントにおける１つ又は複数のチオール基に共有結合性に連結した。ＰＥＧ化効率を、ＳＥ−ＨＰＬＣにより確認した。Ｆａｂ’ＰＥＧを、非ＰＥＧ化Ｆａｂ’及びｄｉＦａｂ’から、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。画分を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。プールを行って不純物のレベルを最小にした。最終試料を濃縮し、所望のバッファー中に透析ろ過した。
【０３２７】
（例３）ｈＦｃＲｎ結合に対する親和性
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いた生体分子の相互作用分析を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインに対する結合を決定した。ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを、ヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメイン（配列番号４８）とβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号７２）との間の非共有結合性の複合体として提供した。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５バッファー中５０μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ＩｇＧ４捕獲用）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、５０００〜６０００応答単位（ＲＵ）間の捕獲レベルに、アミンカップリング化学反応によりＣＭ５Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上に固定化した。
【０３２８】
親和性アッセイ用のランニングバッファーとして、５０ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％Ｐ２０又はＨＢＳ−Ｐ＋、ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。抗体１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４Ｐを、ランニングバッファー中１μｇ／ｍｌに希釈した。ＩｇＧ４の１０μｌ／分で６０秒の注射を、固定化抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃによる捕獲に用いた。ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを、捕獲した抗ＦｃＲｎ抗体（ＩｇＧ４）にわたって、３０μｌ／分の３００秒に対して、２０ｎＭから１．２５ｎＭまで滴定し、引き続き１２００秒解離した。表面を、ｐＨ６のランニングバッファーに対して１０μｌ／分の２×６０秒の５０ｍＭ  ＨＣｌにより、又はｐＨ７．４のランニングバッファーに対して６０秒の４０ｍＭ  ＨＣｌ及び３０秒の１０ｍＭ  ＮａＯＨにより再生した。データを、Ｔ２００評価ソフトウエア（バージョン１．０）を用い、ローカルＲｍａｘとの１：１結合モデルを用いて分析した。
【０３２９】
【表１】
2020018301.tif 000005
【０３３０】
したがって、１６３８．４９ｇ  ＩｇＧ４の親和性を、ｐＨ６．０では１２７ｐＭ、及びｐＨ７．４では２９ｐＭと決定した。
【０３３１】
（例４）
１６３８．ｇ４９可変領域が各フォーマットのＦａｂドメイン中に組み入れられる、ＩｇＧ４Ｐ全長分子及びＦａｂ−ｄｓＦｖ分子を、生化学的完全性及び生物物理学的安定性に対して分析した。
【０３３２】
方法及び結果
１．配列の確認
ｉ）タンパク質シーケンシング（エドマン化学方法）
ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖ両方の試料のＮ末端アミノ酸配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４機器を用いて得た。この機器を、機器の製造元が推奨する通りに操作した。各試料およそ１００ｐモルを、ポリフッ化ビニリデンのディスク（Ｐｒｏｓｏｒｂ、製造元の推奨にしたがって用いた）に適用し、ブランク走行２回及び標準を含む１８サイクルにかけ、ゆえに重鎖及び軽鎖の最初の１５個のアミノ酸残基の分析を行った。ＳｅｑｕｅｎｃｅＰｒｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｖ２．０を用いて分析を行った。
【０３３３】
各試料に対して、観察された配列は、重鎖及び軽鎖の遺伝子配列からそれぞれ予想されるＮ末端配列に一致する、およそ等しく大量にある配列であるＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧ（配列番号６７）及びＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶ（配列番号６８）の２つの混合であった。およそ等しく大量にあるということは、著しいＮ末端のブロックが殆どから全くない、等モル量の２本の鎖を示唆するものであった。
【０３３４】
ｉｉ）質量分析
ａ）インタクト質量分析
ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖ分子の２つのバッチに対して、２０ｍＭ  ＴＣＥＰで１時間還元した後、インタクト質量分析を行った。質量を、チップキューブインターフェース（ｃｈｉｐ  ｃｕｂｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）及びＣ８チップ（４３ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ３００Ａ  Ｃ８カラム＋４３ｎＬトラップ）を装着した、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５１０質量分析計上で測定した。全試料を、９８％水／２％メタノール／０．３％ギ酸（溶媒Ａ）中０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した後、注入し、０．３μＬをシステム上にローディングした。４０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に３５０ｎＬ／分の勾配を用いて、タンパク質をチップから質量分析計中に溶出した。ＴｏＦ−ＭＳデータを、５００から５０００ｍ／ｚ間のポジティブイオンモードにおいて収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウエアを用いて加工した。
【０３３５】
両フォーマットに対して軽鎖及び重鎖の両方に観察された質量を以下に示す（表２）。
【表２】
2020018301.tif 000006
【０３３６】
ＴＣＥＰで還元したＩｇＧ４のインタクト質量分析は、組換えＩｇＧに特有であるＨ鎖上、優勢なＧ０Ｆグリコシル化及び切り落とされたＣ末端リシンを有する予想配列と一致した（およそ９０％）。
【０３３７】
同様に、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ鎖のインタクト質量スペクトルは、ジスルフィドの配列質量及び予想数と一致した。おそらくＴＣＥＰによる鎖間ジスルフィドの部分的な還元のため、両方の鎖の観察される質量に不均一性が存在した。
【０３３８】
ｂ）ジスルフィドマッピングをＩｇＧ４のみに対して行った。
ＩｇＧ４（５０ｕｇ）を、５０℃のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中０．１５％Ｒａｐｉｇｅｓｔで１５分間処理し、任意の遊離のシステインをヨードアセトアミドでアルキル化した。トリプシン（１：２５ｗ／ｗ）を加え、タンパク質を室温で終夜加水分解し、次いでギ酸（５％ｖ／ｖ）を加えることによって反応をクエンチし、任意の沈殿物を遠心分離によって除去した。試料を−２０℃で貯蔵し、水で１：１希釈した後、ＬＣ−ＭＳシステム上にローディングした。アリコート（およそ３〜５ｕｇ）を、ギ酸を０．２％含む水で平衡化した２．１×１５０ｍｍＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ１．７ｕ）上にローディングし、アセトニトリル／１−プロパノールの勾配で、＋ｖｅ−イオンＭＳＥモードで操作するＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ質量分析計中に溶出した。データを、ＭａｓｓＬｙｎｘ及びＢｉｏＰｈａｒｍａＬｙｎｘソフトウエアで分析した。
【０３３９】
結果は、Ｈ−Ｈ鎖間ペプチドのＴ１９−ＳＳ−Ｔ１９種以外、予想したジスルフィド連結したペプチドが全て観察されたことを指摘し、Ｔ１９−ＳＳ−Ｔ１９種は単一のジスルフィド結合とともに、低強度で観察されるにすぎなかった。いかなるスクランブルジスルフィド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ）種又はカルバミドメチル化システイン残基の証拠も存在しなかった。
【０３４０】
２．生化学的分析
サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）
サイズ排除クロマトグラフィーにより、モノマー材料及びオリゴマー材料の分析が可能になった。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｉｅｎｔ１１００システムに接続したＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ（内径７．７ｍｍ×長さ３０．０ｃｍ）カラムを用いて行った。試料（２５μｌ／２５μｇ注入）を、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７中、１．０ｍｌ／分、３０℃で３０分間、均一濃度で溶出した。２８０ｎｍの吸光度によって溶出をモニタリングした。
【０３４１】
溶出のプロファイルは、ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖは均一であり、ＳＥＣ標準（ＢｉｏＲａｄ  １５１−１９０１）によって判断して、予想した保持時間に溶出されたことを示した。
【０３４２】
３．分子の電荷
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を行って、ｐＩ及び酸性種含量を推定した。
【０３４３】
ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖ試料を、分析用ＨＰＬＣグレードの水で１ｍｇ／ｍｌに希釈した（非還元条件）。試料をまた、還元（２ｍＭ  ＴＨＰ／３０分）及びアルキル化（２０ｍＭヨードアセトアミド／８０分）にかけてシステイン付加体に対して分析した。
【０３４４】
以下を混合することにより試料を調製した：タンパク質試料３０μｌ、メチルセルロース０．３５％、ｐＨ３〜１０両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）４％、合成ｐＩマーカー（４．６５及び９．７７）各１μｌ、並びに最終体積を１００μｌにするためのＨＰＬＣグレードの水。次いで、混合物を、ｉＣＥ２８０ＩＥＦアナライザー（Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、１５００Ｖで１分間プレフォーカシングし、引き続き３０００Ｖで６分間フォーカシングして分析した。次いで、較正した電気泳動図を、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓから）を用いて統合した。
【０３４５】
ｐＩは、主要な種（最大ピーク）のｐＩとした。
【０３４６】
ＩｇＧ４フォーマットに対して、主要な種のｐＩは７．３であった。これは、ＩｇＧ分子に非典型ではない、切り落とされた親分子（質量分析により実証される、Ｃ末端リシンの除去）であると推定された。切り落とされた分子は、親分子（７．４に基本のピーク）よりも酸性である。還元及びアルキル化の前及び後のｐＩプロファイルに対して変化はなく、システイン付加物が存在しないことが指摘された。
【０３４７】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットに対して、ｐＩは主要な種（最大ピーク）のｐＩであるとされ、主要な種のｐＩは９．０であった。還元／アルキル化後にあまり顕著ではない、より酸性の種（ｐＩ８．８）も明らかであり、還元可能な付加物の存在が指摘された。
【０３４８】
両方のフォーマットに対して、酸性（メインピークの左に）又は塩基性（メインピークの右に）いずれかの、マイナーなピークが存在した。これらの種は、主要な種の誘導体であると推定されたが、さらに特徴付けをしなかった。
【０３４９】
４．熱安定性（Ｔｍ）
タンパク質は、加熱するとアンフォールディングする傾向があり、タンパク質構造が安定にフォールディングされるほど、それをアンフォールディングするのに多くの熱が必要とされる。したがって、熱安定性（融解温度、Ｔｍとして測定する）は、タンパク質のフォールディングの安定性、又はアンフォールディング（変性）に対する分子の抵抗性の尺度であり、これらは凝集物形成に対する必要条件であり得る。温度勾配では、規定される条件において分子の５０％がアンフォールディングする温度がＴｍである。
【０３５０】
Ｔｍの推定を２つの独立した方法によって行った。
ｉ）蛍光色素（シプロオレンジ）を結合させて疎水性表面を曝露させ、熱誘導性のアンフォールディング時にこの表面が曝露されることによる、５０％アンフォールディングの測定である、熱蛍光（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）アッセイ、及び
ｉｉ）示差走査熱量測定（ＤＳＣ）。
【０３５１】
２つの方法からの結果は概ね相関するが、使用する方法が異なるため絶対値はわずかに異なる。
【０３５２】
ｉ）熱蛍光アッセイ
試料を以下の通りに調製した：３０×シプロオレンジ５μｌを、９６ウエルＶ底プレートに配置した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質試料４５μｌを加えた。この混合物を４つずつ、１０μｌを３８４ウエルプレート中にピペッティングした。３８４ウエルプレートのフォーマットは以下の通りであった：試料１：ウエルＡ１、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２；試料２：ウエルＣ１、Ｄ１、Ｃ２、Ｄ２。ＩｇＧ４と無関係のアッセイ間対照が含まれた。この対照０．１ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳｐＨ７．４中）を３０×濃縮色素５μｌに加え、このマスターミックス１０μｌを３８４ウエル中に４つずつ配置した。プレートを、７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステムに配置し、傾斜速度１．１℃／分を用いて２０℃から９９℃まで加熱し、ＣＣＤ装置がウエル中の蛍光の変化を同時にモニタリングした。修飾したＸＥ鋳型（ＩＤＢＳ）を用いて強度データを加工し、多重遷移を考慮に入れる。
【０３５３】
２つのアンフォールディング転移が、ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖ分子の両方に明らかであった。両方の分子に対するＴｍ２値はＦａｂアンフォールディングドメインを表し、ＩｇＧ４フォーマットに対してわずかに低いことが示された。Ｔｍ１値は、ＩｇＧ４及びＦａｂ−ｄｓＦｖ分子のそれぞれ、ＣＨ２（定常重鎖）ドメイン及びｄｓＦｖドメインを代表するものであった。Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４において、ＩｇＧフォーマットよりも熱的に安定であることが示された。
【表３】
2020018301.tif 000007
【０３５４】
ｉｉ）ＤＳＣ方法
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒデータを確証するために、並びに異なる２つのバッファータイプ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）の熱安定性に対する効果を決定するために、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ分子のみに対してＤＳＣ分析を行った。それぞれの基準のバッファーと、ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中、１ｍｇ／ｍｌの試料を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ機器上に３つずつローディングした。システムの設定には、２０℃から１１０℃までの温度スキャン及びスキャン速度６０℃／時間が含まれた。最終的な温度記録を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエアを用いて、製造元の指示にしたがって加工した。ソフトウエアの自動化Ｔｍ検出アルゴリズムを用いてＴｍを決定し（主要な遷移に対して）、ソフトウエアが自動的に検出しなかった任意の他の遷移に対して手操作でピークを拾った。
【０３５５】
試験した２つのバッファーにおいて、２つの異なる遷移を観察することができた。
【０３５６】
低い方のアンフォールディング（ｉｎｆｏｌｄｉｎｇ）遷移（Ｔｍ１）は、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ分子のｄｓＦｖドメインを表し、高い方の遷移温度（Ｔｍ２）はＦａｂドメインを表す。
【０３５７】
ＤＳＣのデータは、熱蛍光アッセイから得たデータと良好に一致した。この技術は、２つのアンフォールディングドメイン間を、熱蛍光アッセイよりも容易に識別することが可能であった。
【０３５８】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ分子は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５において熱安定性におけるわずかな増大を示した。
【表４】
2020018301.tif 000008
【０３５９】
５．分子構造：減弱全反射法フーリエ変換赤外線吸光光度法（ＡＴＲ  ＦＴＩＲ）
この技術を用いて、分子内のβシート間（イントラβシート）及び別々の分子間（インターβシート）の相互作用の度合いを比べた。
【０３６０】
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｔｅｎｓｏｒ  ２７ＦＴＩＲ分光計及びＢＩＯＡＴＲ  ＩＩ細胞サンプリング付属品を用いて、分解能４ｃｍ−１、１２０スキャン、アパチャー設定６ｍｍ、及び試料体積２０μＬを用いて２０℃で分析を行い、Ｆａｂ−ｄｓＦｖのみを分析するために以下の手順を行った。
１．空気のバックグラウンドスペクトルを５回、ＢＩＯＡＴＲ１０  ０６  １０．ｘｐｍ方法を用いて測定した。
２．ｓｉｇｍａＰＢＳ  ｐＨ７．４  ２０μＬを細胞に加え、次いで除去した。
３．ｓｉｇｍａＰＢＳ  ｐＨ７．４  ２０μＬを細胞に加え、スペクトルを取り、バッファーを除去し、新鮮なバッファーを加え、スペクトルを取った（２回ずつ）。
４．試料２０μＬを細胞に加え、スペクトルを取り、次いで試料を細胞から除去した。
５．ｓｉｇｍａＰＢＳ  ｐＨ７．４  ２０μＬを細胞に加え、除去した。
６．試料２０μＬを細胞に加え、スペクトルを取り、次いで試料を細胞から除去した（２回ずつ）。
７．次いで、細胞を以下の手順にしたがって清浄にした：
ａ．１％ＳＤＳ２０μＬを細胞に加える＋Ｑチップで清浄にした。
ｂ．１％ＳＤＳ２０μＬを細胞に加え、除去した。
ｃ．２０μＬ  Ｈ２Ｏを細胞に５回加え、除去した。
ｄ．バッファー２０μＬを細胞に加え、除去した。
８．データを分析して、最終のデータフォーマットを以下の方法で生成した。
ａ．バッファースペクトル１をＦａｂ−ｄｓＦｖスペクトル１から差し引き、次いで、バッファースペクトル２及びＦａｂ−ｄｓＦｖスペクトル２で繰り返した。
ｂ．データを２２００ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１に切断した。
ｃ．２回のスペクトルを平均した。
ｄ．次いで、第２の誘導体を２５ポイントの平滑化とともに取った。これが、示す最終のデータフォーマットであった。
【０３６１】
分析の結果は、Ｆａｂ−ｄｓＦｖには、抗体分子に典型的なイントラベータシートの特徴があることを示した。
【０３６２】
（例５）細胞ベースの作用強度
細胞ベースのアッセイを、ヒトＦｃＲｎ及びヒトＢ２Ｍダブル遺伝子ベクターをＧｅｎｅｔｉｃｉｎ選択マーカーと一緒に安定にトランスフェクトしたマディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）ＩＩ細胞を用いて行った。ヒトＩｇＧをリサイクルし、経細胞輸送することができる安定な細胞クローンを選択し、これを全てのこの後の試験に用いた。これをＭＤＣＫＩＩクローン１５と呼ぶ
【０３６３】
ヒトＦｃＲｎに対するＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の細胞ベースの親和性
ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識したＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４を用いて、定量的フローサイトメトリー実験を行った。ある範囲の抗体濃度にまたがる、ＦｃＲｎに対する抗体の特異的な結合を用いてＫＤを決定した。分析を、中性及び酸性両方のバッファー中で行って、血漿（ｐＨ７．４）又はエンドソーム（ｐＨ６）中に見出されるｐＨに匹敵する環境のｐＨが、抗体結合に対していかなる効果があるか否かを決定した。
【０３６４】
図２は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．２０、及び酸性バッファー中０．２２であった（表４を参照されたい）。
【０３６５】
【表５】
2020018301.tif 000009
【０３６６】
図２は、酸性及び中性のｐＨにおける、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞に対するＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の結合を示す。
【０３６７】
ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を、Ｆａｃｓバッファー（ＢＳＡ０．２％ｗ／ｖ、ＮａＮ３  ０．０９％ｗ／ｖを含むＰＢＳ）中で３０分間インキュベートした後、ｐＨ７．４又はｐＨ６いずれかのＦａｃｓバッファー中、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８を標識したＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４を１時間加えた。最終の抗体濃度は、４００ｎＭから０．００３ｎＭまでの範囲であった。細胞を氷冷したＦａｃｓバッファー中で洗浄し、次いで、Ｇｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。滴定データセットをまた、各抗体フォーマットに対する各アイソタイプの対照の抗体に対して生成して、非特異的な結合を決定した。結合した抗体のモル数を、様々な量の蛍光色素を含むビーズから産生した標準曲線から、補間値を用いて算出した。蛍光の幾何平均値を、細胞及びビーズのフローサイトメトリー分析において決定した。非特異的な結合を、抗ＦｃＲｎ抗体値から差し引き、産生した特異的な結合曲線を、１部位の結合方程式（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））を用いて非線形回帰により分析してＫＤを決定した。データは３つの実験を代表する。ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、酸性及び中性両方のｐＨで、細胞上に発現されたヒトＦｃＲｎに結合することができる。
【０３６８】
（例６）機能的な細胞ベースのアッセイ
ＦｃＲｎ発現は、本来細胞内であり（Ｂｏｒｖａｋ  Ｊら、１９９８年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻（９）、１２８９〜９８頁、及びＣａｕｚａ  Ｋら、２００５年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２４巻（１）、１３２〜１３９頁）、エンドソーム膜及びリソソーム膜と関連する。ＩｇＧのＦｃポーションは酸性のｐＨ（＜６．５）でＦｃＲｎに結合するが、中性の生理学的ｐＨ（７．４）では結合せず（Ｒｈａｇａｖａｎ  Ｍら、１９９５年）、このｐＨ依存性によりＩｇＧのリサイクルが促進される。
【０３６９】
ＦｃＲｎに結合しているＩｇＧは、一旦、ピノサイトーシスによって取り込まれ、酸性のエンドソームに侵入すると、ＦｃＲｎと一緒に細胞表面にリサイクルされるが、生理学的に中性のｐＨでＩｇＧは放出される（Ｏｂｅｒ  ＲＪら、２００４年、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７２巻、２０２１〜２０２９頁）。ＦｃＲｎに結合していない任意のＩｇＧが、リソソームの分解性経路に侵入する。
【０３７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイを確立して、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４が、ＦｃＲｎのＩｇＧリサイクル能力を阻害する能力を調べた。簡潔に述べると、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を、ビオチン化ヒトＩｇＧと、酸性バッファー（ｐＨ５．９）中、１６３８ＩｇＧ４の存在下及び非存在下でインキュベートしてＦｃＲｎに結合させた。過剰の抗体を全て除去し、表面に曝露され、結合され、内部移行したＩｇＧの上清中への放出を可能にする中性ｐＨのバッファー（ｐＨ７．２）中で細胞をインキュベートした。ＦｃＲｎの阻害を、ＭＳＤアッセイを用いて追跡して、リサイクルされ、よって上清中に放出されたＩｇＧの量を検出した。
【０３７１】
図３は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４が、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞におけるＩｇＧのリサイクルを阻害することを示す。ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を、９６ウエルプレート中１ウエルあたり１５００細胞塗抹し、５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした。細胞を、ＨＢＳＳ＋（Ｃａ／Ｍｇ）ｐＨ５．９＋１％ＢＳＡ中、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の存在下及び非存在下、ビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）１ｕｇ／ｍｌと、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＨＢＳＳ＋ｐＨ５．９で洗浄し、次いで、ＨＢＳＳ＋ｐＨ７．２中、５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。上清を細胞から除去し、ＭＳＤアッセイを用いて合計ＩｇＧに対して分析した（抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグ検出抗体（streptavidin-sulpho tag reveal antibody）（ＭＳＤ）を用いて）。阻害曲線を、非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって分析してＥＣ５０を決定した。グラフは、３つの実験から合わせたデータを表す。図３に示す通り、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４は、平均ＥＣ５０値（ｎ＝３）０．３１ｎＭで濃度依存的に、ＩｇＧのリサイクルを阻害する。
【０３７２】
ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖはヒトＩｇＧの経細胞輸送を阻害する
ＦｃＲｎは、頂端から基底面、及び基底面から頂端の両方向において、極性化した上皮細胞層をまたがってＩｇＧを輸送することができ、よってＩｇＧが、粘膜バリアの循環と内腔との間を動くのを可能にする重要な役割を果たす（Ｃｌａｙｐｏｏｌら、２００４年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１５巻（４）、１７４６〜５９頁）。
【０３７３】
ＦｃＲｎは、頂端から基底面、及び基底面から頂端の両方向において、極性化した上皮細胞層をまたがってＩｇＧを輸送することができ、よってＩｇＧが、粘膜バリアの循環と内腔との間を動くのを可能にする重要な役割を果たす（Ｃｌａｙｐｏｏｌら、２００４年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１５巻（４）、１７４６〜５９頁））。
【０３７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイを確立して、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖが、ＦｃＲｎ依存的ＩｇＧ経細胞輸送を阻害する能力を調べた。簡潔に述べると、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を、２４ウエルのトランスウエルプレートに塗抹し、３日かけて単層を形成させた。次いで、細胞を、頂端側上、ＦｃＲｎの結合を促進する酸性バッファー中、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４又はＦａｂＦｖの存在下及び非存在下、ビオチン化ヒトＩｇＧとインキュベートした。ヒトＩｇＧを、細胞を介して、頂端から基底面側に経細胞輸送し、下のチャンバーの中性バッファー中に放出させた。次いで、基底面側上のＩｇＧのレベルを、ＭＳＤアッセイを用いて測定した。
【０３７５】
図４及び５は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖが、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞において、頂端から基底面へのＩｇＧの経細胞輸送を阻害することを示す。ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を、２４ウエルのトランスウエルプレートに１ウエルあたり５００，０００細胞を塗抹し、単層が形成するまで５％ＣＯ２、３７℃で３日間インキュベートした。頂端のコンパートメントのｐＨを５．９に調整し、基底面側をＨＢＳＳ＋（Ｃａ／Ｍｇ）バッファー＋ＢＳＡ中ｐＨ７．２に調整した。頂端コンパートメント上の細胞を、指摘した濃度のＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４又はＦａｂＦｖの存在下及び非存在下、１μｇ／ｍｌビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）と５％ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、基底面の培地を回収し、合計ＩｇＧをＭＳＤアッセイによって測定した（抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグリビール抗体（ＭＳＤ）を用いて）。阻害曲線を、非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって分析してＥＣ５０を決定した。グラフは、３つの実験から合わせたデータを表す。
【０３７６】
要約すると、図４及び５は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖは、ＥＣ５０値それぞれ２．４及び０．４２ｎＭで（ｎ＝３）濃度依存的に、ヒトＩｇＧの先端から基底面への経細胞輸送を阻害することができることを示す。
【０３７７】
ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果の概略
ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｖＦｖは、ＩｇＧのリサイクル及び経細胞輸送の両方を阻害する。ＩｇＧリサイクルアッセイで実現した０．３１ｎＭというＥＣ５０は、中性バッファー中０．２ｎＭ、及び酸性バッファー中０．２２ｎＭというＫＤ値を得た、細胞親和性結合データに匹敵する。ＩｇＧ経細胞輸送アッセイでは、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖに対してＥＣ５０値それぞれ２．４ｎＭ及び０．４２ｎＭを得、ＩｇＧ４とＦａｂＦｖとの間の作用強度におけるわずかな低減が実証された。しかし、このセクションにおけるデータは、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４及びＦａｂＦｖは、ヒトＦｃＲｎ機能を阻害することができることを明らかに示すものであった。
【０３７８】
（例７）ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の非ヒト霊長動物のＦｃＲｎとの交差反応性
非ヒト霊長動物のＰＫ／ＰＤ試験及び前臨床の毒性学におけるＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の使用を検証するために、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４の、マカクザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）との相対的な親和性を調べた。マカクザルのＦｃＲｎ及びＢ２Ｍ（ＭＤＣＫＩＩ（クローン４０）を安定にトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞を、ヒトＦｃＲｎ及びＢ２Ｍを安定にトランスフェクトした、以前に記載したＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫＩＩクローン１５）とともに、細胞ベースのアッセイにおいて用いた。
【０３７９】
図６は、酸性及び中性のｐＨにおける、ＭＤＣＫＩＩクローン４０細胞に対するＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４のＩｇＧ４結合を示す。一範囲の濃度の抗体にまたがる、ＦｃＲｎに対する抗体の特異的な結合を用いてＫＤを決定した。中性及び酸性両方のバッファー中で分析を行って、血漿（ｐＨ７．４）又はエンドソーム（ｐＨ６）に見出されるｐＨに匹敵する環境のｐＨが、抗体結合に対していかなる効果があるか否かを決定した。
【０３８０】
図６は、ＣＡ１７０＿１６３８．ｇ４９  ＩｇＧ４に対する代表的な結合曲線を示す。平均ＫＤ値（ｎ＝３）はそれぞれ、中性バッファー中０．３、及び酸性バッファー中０．４３であった（表５を参照されたい）。
【表６】
2020018301.tif 000010
【０３８１】
（例８Ａ）抗ＦｃＲｎ処置は、ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｈＩｇＧのクリアランスを増強する
抗ＦｃＲｎ分子（ＣＡ１７０＿１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’ＰＥＧ（ＷＯ２０１４／０１９７２７に記載される）及びＣＡ１７０＿１６３８．ｇ２８Ｆａｂ’ＰＥＧ）の、ヒトＩＶＩＧのクリアランスに対する効果を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ、ＪＡＸ  Ｍｉｃｅ）において決定した。マウスに、ヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＩ  １０％Ｇａｍｕｎｅｘ−ｃ、Ｔａｌｅｃｒｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）５００ｍｇ／ｋｇを静脈内注入した。２４時間後、動物にビヒクル対照（ＰＢＳ）又は抗ＦｃＲｎを、単一用量（１００ｍｇ／ｋｇ）として静脈内から投薬した。抗ＦｃＲｎ処置に対して−２４、８、２４、４８、７２、９６、１４４、及び１９２時間に、連続的な尾端血液試料を採取した。ｈＦｃＲｎマウスにおけるヒトＩｇＧの血清レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。図１に表すデータは、１処置群あたりマウス５〜６匹での平均値±ＳＥＭである。試験した各抗ＦｃＲｎ分子によってｈＦｃＲｎをブロックすることにより、ｈＩＶＩＧのクリアランスの加速が結果として生じ、対照マウスに比べて低濃度の合計ＩｇＧが観察された。
【０３８２】
（例８Ｂ）抗ＦｃＲｎ処置は、ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏのｈＩｇＧのクリアランスを増強する
発見された抗ヒトＦｃＲｎ抗体は、ヒトＦｃＲｎに結合し、ヒトＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧの結合を阻害したが、マウスＦｃＲｎには結合せず、又は阻害しなかった。その結果、ヒトＩＶＩｇのクリアランスに対する、ＩｇＧ４Ｐフォーマット（１６３８．ｇ４９）、Ｆａｂ’ＰＥＧフォーマット（１６３８．ｇ２８）、及びＦａｂＦｖフォーマットにおける抗ＦｃＲｎ分子の効果を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ、ＪＡＸ  Ｍｉｃｅ）において決定した。マウスにヒトＩｇＧ（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＩ  １０％Ｇａｍｕｎｅｘ−ｃ、Ｔａｌｅｃｒｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）５００ｍｇ／ｋｇを静脈内注入した。２４時間後、動物に、ビヒクル対照（ＰＢＳ）又は抗ＦｃＲｎを、単一用量として静脈内に投薬した。用量、サンプリング時間、及び繰返しの回数は、図１ａから１ｅに示す通りであった。試料は連続的な尾端血液試料であった。ヒトＩｇＧ、内在性マウスアルブミン、及び抗ＦｃＲｎ分子自体の血清レベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定し、ペプチド配列の検出及び定量は、これら各分析物に独特であった。図１ａから１ｅに表すデータは各々幾何平均及び９５％信頼区間である。
【０３８３】
試験した３つの各抗ＦｃＲｎ分子によるｈＦｃＲｎのブロックにより、ｈＩＶＩｇのクリアランスがもたらされ、このクリアランスは、ビヒクルのみ、又は対照のＦａｂ’ＰＥＧで処置した対照マウスにおけるクリアランスに比べて促進されていた（抗ＦｃＲｎではなく、１６３８Ｆａｂ’ＰＥＧ同様、４０ｋＤａ  ＰＥＧにコンジュゲートした、Ａ３３）−図１ａ及び１ｂを参照されたい。効果は用量関連であり、より大用量では、より長期間がもたらされ、その間に遊離の抗ＦｃＲｎを血清中に検出することができ（図１ｃ及び１ｄ）、このためマウスからヒトＩＶＩｇのより長期間且つより著名なクリアランスがもたらされた。１６３８Ｆａｂ’ＰＥＧは、対照のＡ３３Ｆａｂ’ＰＥＧより短い薬物動態を示し（血清中で遊離の溶液からより速やかに消失した）、１６３８Ｆａｂ’ＰＥＧは標的媒介性の処分を受け、ＦｃＲｎ標的に対する結合によって遊離の溶液から消失することが示唆された。マウスＩｇＧは、これらのトランスジェニックマウスに存在したヒトＦｃＲｎに結合しなかったが、内因性のマウスアルブミンは結合し、ヒトＦｃＲｎによってリサイクルされた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイにおいて、ヒトＦｃＲｎに対する抗ヒトＦｃＲｎの結合は、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合をブロックしなかったが、このような阻害がｉｎ  ｖｉｖｏで生じると、マウスの内因性アルブミンのクリアランスの加速をもたらし得る。データを図１ｅに示す。血清中のアルブミン濃度はいくぶん変わりやすいため（抗ＦｃＲｎ薬の注射前、マウス３０匹の群において１６．６から５９．９ｍｇ／ｍＬ）、群の結果をより簡単に比較できるようにするため、アルブミンデータを標準化し、時間ゼロでの血清アルブミン濃度のパーセント値として図１ｅに示した。血漿アルブミン濃度に対する回収可能な効果が、Ｆａｂ’ＰＥＧ又はＦａｂＦｖのフォーマットでの投薬後に生じた可能性があった。処置の違い及び時間の違いに同時に着目して、繰返し測定に対して分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。同じ実験において同じ時間点の対照に比べた、Ｆａｂ’ＰＥＧ又はＦａｂＦｖで処置した動物の各測定では、対照は、それぞれ、無関係の（非ＦｃＲｎ結合性）Ｆａｂ’ＰＥＧ又はビヒクルのみであった。これら２つのフォーマットは、薬物注射後およそ４８から７２時間にアルブミン濃度の低下を示し（データのＡＮＯＶＡ分析における５％レベル）、レベルはその後、投薬前のレベルに回復した。血漿アルブミン濃度の最大の低下は、Ｆａｂ’ＰＥＧフォーマット１００ｍｇ／ｋｇ後に約１０％（４８時間）、又はＦａｂＦｖ２５０ｍｇ／ｋｇ後１４４時間に約２５％であった。同様のＡＮＯＶＡ分析をデータに対して行い、血漿アルブミンレベルに対する１６３８ＩｇＧ４Ｐの効果が示された（図１ｆに示す）。処置動物と対照動物との間に有意差はなく、ＩｇＧ４Ｐフォーマットでの１６３８の処置は血漿アルブミン濃度に影響を及ぼさないことが示唆された。
【０３８４】
（例９）１６３８．ｇ４９Ｆａｂ：ＦｃＲｎ複合体の結晶構造及び分析
１６３８．ｇ４９Ｆａｂを、ｈＦｃＲｎアルファ鎖ＥＣＤ領域（配列番号４８）及びヒトベータ２ミクログロブリン（配列番号７２）と共結晶化した。タンパク質は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭ  ＮａＣｌｐＨ６．０中であり、結晶化条件は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、４０％  ＰＥＧ４００、及び０．２Ｍ  ＬｉＳＯ４．Ｈ２Ｏ、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬ、及び蒸気拡散実験のシッティングドロップ中、液滴体積比タンパク質０．４μＬ対リザバー０．４μＬであった。結晶を８〜２１日間成長させ、引き続き液滴から回収し、ウエルバッファー（４０％ＰＥＧ４００をすでに含んでいたため）に移し、液体窒素中（−１８０℃）１０秒以内に瞬間凍結させた。振動法を用いてＸ線データをＳＯＬＥＩＬで回収した。結晶のセル寸法は、ａ＝１０１．４９Å、ｂ＝２１０．４Å、ｃ＝１０１．４９Å；アルファ＝９０度、ベータ＝９０度、及びガンマ＝９０度であった。空間群はＰ２１２１２と決定した。Ｐｈａｓｅｒを用いて分子充填を決定し、３０から２．７Åの間のデータを用いてＲｅｆｍａｃで分子構造精密化を行って、最終のＲファクター２１．８％及びＲｆｒｅｅ２７．２％を得た。結果を以下に示す：
【０３８５】
１６３８．４９Ｆａｂ’と相互作用する残基は全てＦｃＲｎのα鎖（β２Ｍではなく）にあり、以下のＦｃＲｎ細胞外ドメイン配列において太字で示す。
【化４】
2020018301.tif 000011
【０３８６】
下線を付した残基は、ヒトＦｃＲｎの、ヒトＩｇＧのＦｃ領域との相互作用に不可欠であることが知られている残基である。太字の残基は、４Åでの１６３８．４９Ｆａｂ’抗体の結合に関与する残基である。イタリックの残基は、５Åでの同抗体の結合に関与する残基である。
【０３８７】
４Åよりも近い抗体残基によって規定されるエピトープは、Ａ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｌ１３５、Ａ１３６、Ｑ１３９であった。
【０３８８】
５Åよりも近い抗体残基によって規定されるエピトープは、Ａ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｌ１３５、Ａ１３６、Ｑ１３９、Ｌ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、Ｄ１３０であった。
【０３８９】
［化１］及び［化４]の太字文字と斜体文字を明確にするため以下の［化５］を記す。以下の色つき文字が［化１］及び［化４]の太字文字に相当し、囲い文字が［化１］及び［化４]の斜体文字に相当する。
【化５】
2020018301.tif 000012
【図１】
2020018301.tif 000013
【図１ａ】
2020018301.tif 000014
【図１ｂ】
2020018301.tif 000015
【図１ｃ】
2020018301.tif 000016
【図１ｄ】
2020018301.tif 000017
【図１ｅ】
2020018301.tif 000018
【図１ｆ】
2020018301.tif 000019
【図２】
2020018301.tif 000020
【図３】
2020018301.tif 000021
【図４】
2020018301.tif 000022
【図５】
2020018301.tif 000023
【図６】
2020018301.tif 000024
【図７】
2020018301.tif 000025
【図８Ａ】
2020018301.tif 000026
【図８Ｂ】
2020018301.tif 000027
【図８Ｃ】
2020018301.tif 000028
【図８Ｄ】
2020018301.tif 000029
【図８Ｅ】
2020018301.tif 000030
【図８Ｆ】
2020018301.tif 000031
【図８Ｇ】
2020018301.tif 000032
【図８Ｈ】
2020018301.tif 000033
【図８ｉ】
2020018301.tif 000034
【図８Ｊ】
2020018301.tif 000035
【図８Ｋ】
2020018301.tif 000036
【図８Ｌ】
2020018301.tif 000037
【図９Ａ】
2020018301.tif 000038
【図９Ｂ】
2020018301.tif 000039
【配列表】
2020018301000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月1日(2019.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＡ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される１つ又は複数の残基を含む、ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項２】
Ｌ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される１つ又は複数の残基にさらに結合する、請求項１に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項３】
第２の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントのヒトＦｃＲｎへの結合をクロスブロックするか、又は第２の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントによってヒトＦｃＲｎの結合からクロスブロックされている、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントであって、
該第２の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントが配列番号２５に示す配列を含む重鎖配列、及び配列番号１６に示す配列を含む軽鎖配列を含む、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号２５に示す配列を含む重鎖配列、及び配列番号１６に示す配列を含む軽鎖配列を含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントと同じヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項５】
ヒト化されているか、又は完全ヒトである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項６】
ｐＨ６及びｐＨ７．４の両方で１５０ｐＭ以下の、ヒトＦｃＲｎへの結合親和性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項７】
ヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎへの結合をブロックする、請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項８】
ヒトβ２ミクログロブリン（配列番号７２）に結合しない、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項９】
抗体又は結合フラグメントが、ポリマーにコンジュゲートしている、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項１０】
ポリマーが、デンプン、アルブミン、又はポリエチレングリコールである、請求項９に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールが、５から５０ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１０に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント。
【請求項１２】
抗体が全長抗体である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
【請求項１３】
全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４Ｐからなる群から選択される、請求項１２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードする、単離されたＤＮＡ分子又は一組の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードする、クローニングベクター又は発現ベクター、或いは一組のクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６の宿主細胞を培養するステップと、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントを単離するステップとを含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントを生成するための方法。
【請求項１８】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はそのＦｃＲｎ結合フラグメントを、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１９】
他の有効成分を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
治療において用いるための、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体若しくはそのＦｃＲｎ結合フラグメント、又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
自己免疫疾患の処置において用いるための、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体若しくはそのＦｃＲｎ結合フラグメント、又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
自己免疫疾患が、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗ＦｃＲｎ抗体若しくはそのＦｃＲｎ結合フラグメント、又は医薬組成物。
【請求項２３】
ＣＩＤＰ、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治性てんかん、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯ不適合、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、線維化肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン病又は関節リウマチの治療に使用するための、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体若しくはそのＦｃＲｎ結合フラグメント又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８９】
［化１］及び［化４]の太字文字と斜体文字を明確にするため以下の［化５］を記す。以下の色つき文字が［化１］及び［化４]の太字文字に相当し、囲い文字が［化１］及び［化４]の斜体文字に相当する。
【化５】
2020018301.tif 000040
本発明の好ましい態様には以下が含まれる。
（１）可変領域を有する重鎖又は重鎖フラグメントを含む、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、前記可変領域は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３に示す配列を有する、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２）抗体又は結合フラグメントが、３つのＣＤＲを含む可変領域を有する軽鎖又はそのフラグメントをさらに含み、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６に示す配列を有する、（１）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（３）配列番号１２に示す配列を含む重鎖、及び配列番号８に示す配列を含む軽鎖を有する、（１）又は（２）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（４）抗体がヒト化されている、（１）又は（２）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（５）配列番号２５に示す配列を含む重鎖、及び配列番号１６に示す配列を含む軽鎖を有する、（１）又は（２）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（６）配列番号５９に示す配列を含む重鎖、及び配列番号５１に示す配列を含む軽鎖を有する、（１）又は（２）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（７）重鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントであって、重鎖の可変ドメインは配列番号２５に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号１６に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、上記抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（８）抗体分子が、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号５に示す配列を有する、（７）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（９）抗体又は結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、又はＦａｂ’フラグメントである、（１）から（８）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（１０）配列番号３３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号２０に示す配列を含む軽鎖を有する、（９）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（１１）配列番号６３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号５５に示す配列を含む軽鎖を有する、（６）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（１２）抗体又は結合フラグメントが、例えば、デンプン、アルブミン、及びポリエチレングリコールから選択されるポリマーにコンジュゲートしている、（１）から（１１）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（１３）ポリマーが、例えば、分子量５から５０ｋＤａの範囲のＰＥＧである、（１２）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（１４）抗体が全長抗体である、（１）から（８）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
（１５）全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４Ｐからなる群から選択される、（１４）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
（１６）配列番号３７、配列番号３９、又は配列番号７３に示す配列を含む重鎖、及び配列番号２０に示す配列を含む軽鎖を有する、（５）、（１４）、又は（１５）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体。
（１７）抗体又はその結合フラグメントが、配列番号４２に示す配列を含む重鎖、及び配列番号４０に示す配列を含む軽鎖を有するＦａｂ−ｄｓＦｖである、（１）から（８）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（１８）（５）、（１０）、又は（１６）の抗体と同じヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（１９）残基Ｅ１１５、Ｗ１３１、Ｐ１３２、及びＥ１３３からなる群から選択される１、２、３、又は４つのアミノ酸、並びにヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号４８）のＡ８１、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ８５、Ｇ８６、Ｐ８７、Ｎ１１３、Ｌ１３５、Ａ１３６、及びＱ１３９からなる群から選択される１つ又は複数の残基を含む、ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２０）Ｌ８２、Ｙ８８、Ｌ１１２、及びＤ１３０からなる群から選択される１つ又は複数の残基にさらに結合する、（１９）に記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２１）（５）の抗体のヒトＦｃＲｎへの結合をクロスブロックするか、又は（５）の抗体によってヒトＦｃＲｎの結合からクロスブロックされている、（１７）から（２０）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２２）ヒト化されているか、又は完全ヒトである、（１７）から（２１）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２３）ｐＨ６及びｐＨ７．４の両方で１５０ｐＭ以下の、ヒトＦｃＲｎへの結合親和性を有する、（１７）から（２２）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２４）ヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎへの結合をブロックする、（１）から（２３）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２５）ヒトβ２ミクログロブリン（配列番号７２）に結合しない、（１）から（２４）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメント。
（２６）（１）から（２５）までのいずれかに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（単数若しくは複数）をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
（２７）（２６）に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
（２８）（ｉ）配列番号３０、３２、３４、若しくは３６に示す配列及び配列番号２１若しくは２４に示す配列、又は（ｉｉ）配列番号３８に示す配列及び配列番号２２に示す配列、又は（ｉｉｉ）配列番号７４に示す配列及び配列番号２２に示す配列、又は（ｉｖ）配列番号４１に示す配列及び配列番号４３に示す配列を含む、（２７）に記載のベクター。
（２９）（２７）又は（２８）に記載の、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
（３０）（２９）の宿主細胞を培養するステップと、抗体を単離するステップとを含む、ヒトＦｃＲｎに結合特異性を有する抗体を生成するためのプロセス。
（３１）（１）から（２５）までのいずれかに記載の抗ＦｃＲｎ抗体又はその結合フラグメントを、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
（３２）他の有効成分を含む、（３１）に記載の医薬組成物。
（３３）治療において用いるための、（１）から（２５）までのいずれかに記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は（３１）若しくは（３２）に記載の組成物。
（３４）重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患の処置において用いるための、（１）から（２５）までのいずれかに記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は（３１）若しくは（３２）に記載の組成物。
（３５）（１）から（２５）までのいずれかに記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は（３１）若しくは（３２）に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、患者を処置する方法。
（３６）処置が、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患のためである、（３５）に記載の方法。
【外国語明細書】
2020018301000001.pdf