(57)【要約】【課題】生体内の成分濃度を指標として、客観的に疲労状態を検出することを可能にする新規な方法を提供すること。【解決手段】生体の疲労状態の検出を補助する方法は、生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸を定量することを含み、定量されたＤ体アミノ酸の濃度を指標とする。また、もう１つの生体の疲労状態の検出を補助する方法は、生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸及びＬ体アミノ酸を定量することを含み、定量された各Ｄ体アミノ酸の濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比を指標とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸を定量することを含み、定量されたＤ体アミノ酸の濃度を指標とする、生体の疲労状態の検出を補助する方法。
【請求項２】
前記Ｄ体アミノ酸が、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群より選ばれる少なくとも１種のＤ体アミノ酸濃度が正常群よりも有意に低い請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｄ体アミノ酸がメチオニンであり、該Ｄ体メチオニン濃度が正常群よりも有意に高い請求項１記載の方法。
【請求項４】
生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸及びＬ体アミノ酸を定量することを含み、定量された各Ｄ体アミノ酸の濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比を指標とする、生体の疲労状態の検出を補助する方法。
【請求項５】
前記Ｄ体アミノ酸が、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸及びフェニルアラニンから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸及びフェニルアラニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の各Ｄ体アミノ酸濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比が、正常群よりも有意に低い請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記Ｄ体アミノ酸がメチオニンであり、Ｌ体メチオニンの濃度との比が、正常群よりも有意に高い請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体の疲労状態の検出を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体が疲労していても疲労を感じない場合もあり、逆に、慢性疲労症候群のように、体が疲労していなくても疲労感を感じる疾患もある。このため、疲労の診断は、本人の問診のみによっては必ずしも正確に行うことができない。また、ペットや家畜等の動物に問診することは当然できない。したがって、客観的に疲労状態を検出できる方法が求められている。
【０００３】
生体中の成分をバイオマーカーとして疲労を検出する方法として、特許文献１に記載された方法が知られている。特許文献１には、このようなバイオマーカーとして、種々の物質が記載されているが、タンパク質を構成するアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン又はアスパラギン酸をバイオマーカーとして用いることも記載されている。しかしながら、各アミノ酸の光学異性体については言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO 2015/030211
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明の目的は、生体内の成分濃度を指標として、客観的に疲労状態を検出することを可能にする新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、生体内におけるＤ体アミノ酸濃度、又はＤ体アミノ酸とＬ体アミノ酸の濃度比を指標として疲労状態を検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1)  生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸を定量することを含み、定量されたＤ体アミノ酸の濃度を指標とする、生体の疲労状態の検出を補助する方法。
(2)  前記Ｄ体アミノ酸が、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群より選ばれる少なくとも１種のＤ体アミノ酸濃度が正常群よりも有意に低い(1)記載の方法。
(3)  前記Ｄ体アミノ酸がメチオニンであり、該Ｄ体メチオニン濃度が正常群よりも有意に高い(1)記載の方法。
(4)  生体から採取された生体試料中のＤ体アミノ酸及びＬ体アミノ酸を定量することを含み、定量された各Ｄ体アミノ酸の濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比を指標とする、生体の疲労状態の検出を補助する方法。
(5)  前記Ｄ体アミノ酸が、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸及びフェニルアラニンから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸及びフェニルアラニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の各Ｄ体アミノ酸濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比が、正常群よりも有意に低い(4)記載の方法。
(6)  前記Ｄ体アミノ酸がメチオニンであり、Ｌ体メチオニンの濃度との比が、正常群よりも有意に高い(4)記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、生体内に実在する成分の濃度又は濃度比を指標として、客観的に疲労状態を検出することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法において、評価対象となる生体としては、哺乳類及び鳥類が好ましく、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；ネコ、イヌ、ハムスター等の食肉類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の草食類；マウス、ラット等の齧歯類；ニワトリ等の鳥類を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
本明細書では各種アミノ酸を一部略称で表記するが、それらの正式名称は以下の通りである。
（略称）                    （正式名称）
Ａｌａ                      アラニン
Ａｒｇ                      アルギニン
Ａｓｎ                      アスパラギン
Ｇｌｎ                      グルタミン
Ｇｌｙ                      グリシン
Ｈｉｓ                      ヒスチジン
Ｉｌｅ                      イソロイシン
Ｌｅｕ                      ロイシン
Ｌｙｓ                      リジン
Ｍｅｔ                      メチオニン
Ｐｈｅ                      フェニルアラニン
Ｐｒｏ                      プロリン
Ｓｅｒ                      セリン
Ｔｈｒ                      スレオニン
Ｔｒｐ                      トリプトファン
Ｔｙｒ                      チロシン
Ｖａｌ                      バリン
【００１１】
生体試料としては、生体から採取された試料であれば特に限定されないが、血液、尿、唾液等の体液が好ましく、特に血液が好ましい。血液試料は、全血、血清、血漿のいずれであってもよい。
【００１２】
本発明の方法により検出される「疲労状態」は、精神疲労した状態と、肉体疲労した状態の両者を包含する。下記実施例では、主に精神疲労状態が検出されていると考えられている。
【００１３】
本発明の方法では、生体試料中の少なくともＤ体アミノ酸を定量する。また、一実施形態では、Ｌ体アミノ酸も定量する。以前は、生体のタンパク質を構成しているのはＬ体アミノ酸のみであると考えられていたが、近年、分析技術が向上し、アミノ酸をＤ体とＬ体とで区別して定量することが可能となり、生体内にＤ体アミノ酸も含まれることがわかってきた。アミノ酸をＤ体とＬ体とで区別して定量する方法は公知であり（WO 2017/057433)、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００１４】
本発明の第１の実施形態では、生体試料中のＤ体アミノ酸を定量し、定量されたＤ体アミノ酸の濃度を指標として疲労状態を検出する。定量するＤ体アミノ酸としては、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、メチオニン、スレオニン及びセリンから成る群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。下記実施例では、これらのＤ体アミノ酸は、疲労群と正常群との間で統計学的有意差が認められたものである。これらのうち、プロリン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、バリン、スレオニン及びセリンは、疲労群において正常群よりも濃度が有意に低くなり、メチオニンは、疲労群において正常群よりも濃度が有意に高くなる。下記実施例で測定された、Ｄ体アミノ酸の濃度の疲労群の平均値と正常群の平均値との比（疲労群／正常群）を下記表１に示す。
【００１５】
【表１】
2020180897.tif 000002
【００１６】
表１に示す疲労群／正常群比の値又はその近傍の値をカットオフ値として設定し、そのカットオフ値よりもそのＤ体アミノ酸の濃度が低ければ（メチオニンの場合には高ければ）、「疲労状態」と判定することができる。なお、この場合、カットオフ値は、試験する群によりある程度変動するので、適宜設定することが可能であり、例えば、上記表１に示す値の±３０％程度、好ましくは±２０％程度、さらに好ましくは±１０％程度の範囲に設定することができる。
【００１７】
本発明の第２の実施形態では、生体試料中のＤ体アミノ酸及びＬ体アミノ酸を定量し、定量された各Ｄ体アミノ酸の濃度と、該各Ｄ体アミノ酸と同種の各Ｌ体アミノ酸の濃度との比（以下、便宜的に「D/L比」と呼ぶことがある）を指標とする。定量するアミノ酸としては、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、アスパラギン及びフェニルアラニンから成る群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。下記実施例では、これらのアミノ酸のD/L比は、疲労群と正常群との間で統計学的有意差が認められたものである。これらのうち、プロリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン及びフェニルアラニンは、疲労群においてD/L比が正常群よりも有意に低くなり、メチオニンは、疲労群においてD/L比が正常群よりも有意に高くなる。下記実施例で測定された、各アミノ酸のD/L比の疲労群の平均値と正常群の平均値との比（疲労群／正常群）を下記表２に示す。
【００１８】
【表２】
2020180897.tif 000003
【００１９】
表２に示す疲労群／正常群比の値又はその近傍の値をカットオフ値として設定し、そのカットオフ値よりもそのＤ／Ｌ比が低ければ（メチオニンの場合には高ければ）、「疲労状態」と判定することができる。なお、この場合、カットオフ値は、試験する群によりある程度変動するので、適宜設定することが可能であり、例えば、上記表２に示す値の±３０％程度、好ましくは±２０％程度、さらに好ましくは±１０％程度の範囲に設定することができる。
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本エスエルシー株式会社）を購入し、予備飼育の後に７週齢で使用した。疲労群のラット６匹は、底面から１．５ｃｍの高さに２３±１℃に調整した水を張ったケージ内で自由摂餌、自由飲水条件下、Ｄａｙ１からＤａｙ６まで５日間飼育した。ケージ内の水は毎日交換した。一方、正常群のラット６匹は、床敷き（ペパークリーン、ペパーレット株式会社）を敷いたケージ内で自由摂餌、自由飲水条件下、５日間飼育した。  イソフルラン麻酔下で腹部大動脈から注射針と適量のヘパリンナトリウムを筒内に入れたシリンジを用いて全採血を行った。得られた血液は、４℃条件下、１８７０×ｇで１０分間遠心分離を行い、血漿を分離した。得られた血漿は分析まで−２０℃以下で保存した。
【００２２】
・試料の調製
ラット血漿２０μＬに、アミノ酸の安定同位体標識の内標準溶液２０μＬを添加後、アセトニトリル４０μＬを添加して、２０℃、２００００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清１０μＬに誘導体化試薬溶液２．５ｍｇ／ｍＬの（Ｒ）−４−ニトロフェニル−Ｎ−［２’−（ジエチルアミノ）−６，６’−ジメチル−［１，１’−ビフェニル］−２−イルカルバメートヒドロクロリド［（Ｒ）−ＢｉＡｃ］］を添加し、５５℃で１０分間反応させた後、０．１％ギ酸水溶液１００μＬを添加後、撹拌をし、液体クロマトグラフィー／三連四重極質量分析に５μＬを使用した。
【００２３】
・液体クロマトグラフィーによる分離
液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ）は島津製作所社製のＮｅｘｅｒａ（登録商標）を用いた。分析カラムの温度は４０℃に設定した。使用した分析カラム、溶離液及び流速は以下に示すとおりである。
【００２４】
（分析カラム）
ＹＭＣ社製  Ｔｒｉａｒｔ  Ｐｈｅｎｙｌ（２．１ｍｍ×７５ｍｍ  １．９μｍ）
（溶離液）
Ａ溶離液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸／水
Ｂ溶離液：９５％アセトニトリル／水
（流速）
０．４ｍＬ／ｍｉｎ
【００２５】
ＬＣによる分離は、Ａ溶離液８６％、Ｂ溶離液１４％で平衡化した分析カラムへ分析試料を導入した。Ｂ溶離液を３分で１６％まで、次いで１４．３分まで３３％、１７分まで４５％まで直線的に上昇させて分析をアミノ酸を溶出した。次いで、１７．１分からＢ溶離液を９０％まで上昇させ、１８分まで約１分間分析カラムを洗浄し、その後、２０分まで初期状態（Ａ溶離液８６％、Ｂ溶離液１４％）で平衡化した。
【００２６】
・質量分析計による検出
質量分析計は、Ｓｃｉｅｘ社製のＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ６５００（登録商標）を用い、エレクトロスプレーイオン化（正イオン）、ＳＲＭモードを使用した。質量分析は以下の条件で行った。
【００２７】
（イオンソースのパラメーター）
Ｃｕｒｔａｉｎ：４０
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｇａｓ  Ｓｅｔｔｔｉｎｇ：８
Ｉｏｎ  Ｓｐｒａｙ  Ｖｏｌｔａｇｅ：４５００
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６００
Ｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｇａｓ  １：７０
Ｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｇａｓ  ２：７０
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｈｅａｔｅｒ：ＯＮ
【００２８】
【表３−１】
2020180897.tif 000004
【００２９】
【表３−２】
2020180897.tif 000005
【００３０】
Ｌ体のアミノ酸は同位体由来のプロトン化分子のm+2に設定した。また、Ｌ−Ｈｉｓ，Ｌ−Ａｒｇ，Ｌ−Ｌｙｓは２価イオンで検出した。各アミノ酸のＩＳは各Ｄ体及びＬ体のアミノ酸を定量する上で使用した内標準物質を示す。
【００３１】
・定量方法
各種アミノ酸の血中の濃度は、ＬＣから分離された各アミノ酸のクロマトグラムのピーク面積を利用し、内標準法を選択して定量した。すなわち、ｘ軸に既知濃度となるアミノ酸の濃度を、ｙ軸にピーク面積比（各種アミノ酸のピーク面積値／内標準物質のピーク面積値）をプロットし、最小二乗法により検量線を作成した。次に、正常群及び疲労群のラット試料の各アミノ酸のクロマトグラムから、同様にピーク面積比（各種アミノ酸のピーク面積値／内標準物質のピーク面積値）を算出し、検量線より各種アミノ酸の濃度を算出した。
【００３２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータ取得及び解析ソフトウエアはＳｃｉｅｘ社製のＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）を使用し、試料中の各アミノ酸のクロマトグラムから定量値を算出した。
【００３３】
統計解析は、ＳＡＳ９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）およびその連動システムＥＸＳＵＳ  ｖｅｒ．８．１（株式会社ＣＡＣクロア）を用い、ｔ検定を実施した。
【００３４】
実施例１の血中Ｄ体アミノ酸濃度測定の結果を表４に示す。表中の数値は、６例の平均値と標準誤差（μＭ）を示す。表中の「＊」は、正常群と比較して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）な差であることを示す。
【００３５】
正常群のアルギニン、セリン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシン濃度は、それぞれ１．９２、１．４８、０．１０、７．２１、０．４０、０．１４および０．２１μＭであった。これに対し、疲労群のアルギニン、セリン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシン濃度は、それぞれ１．１４、１．１３、０．０７、２．４９、０．１０、０．０９および０．１２μＭであり、正常群と比較して、有意に減少した。一方、正常群のメチオニン濃度は、３．０２μＭであった。これに対し、疲労群では、４．６４μＭであり、正常群と比較して、有意に増加した。
【００３６】
実施例１の血中Ｄ体アミノ酸濃度と対応するＬ体アミノ酸濃度の比を表５に示す。表中の数値は、６例の平均値と標準誤差（％）を示す。表中の「＊」は、正常群と比較して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）な差であることを示す。正常群のアスパラギン、アラニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンのＤ体アミノ酸濃度とそれぞれ対応するＬ体アミノ酸濃度の比は、それぞれ２．９０、２．３１、０．２６、０．０６、０．１９、０．２９および０．０８％であった。これに対し、疲労群のアスパラギン、アラニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンのＤ体アミノ酸濃度とそれぞれ対応するＬ体アミノ酸濃度の比は、それぞれ２．２６、１．０３、０．０８、０．０３、０．０８、０．１６および０．０６％であり、正常群と比較して、有意に減少した。一方、正常群のＤ体メチオニン濃度とＬ体メチオニン濃度比は、５．１６％であった。これに対し、疲労群では、９．３５％であり、正常群と比較して、有意に増加した。
【００３７】
この結果から、本発明のＤ体アミノ酸又はＤ体アミノ酸濃度と対応するＬ体アミノ酸濃度の比が、疲労状態で変化することが示された。
【００３８】
【表４】
2020180897.tif 000006
【００３９】
【表５】
2020180897.tif 000007