(57)【要約】【課題】ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病及び／または高脂血症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。【解決手段】本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病及び／または高脂血症の予防または治療用薬学的組成物及びその用途に関するものである。【選択図】図１
2020143154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することを特徴とする請求項１に記載の糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項３】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することを特徴とする請求項１に記載の糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項４】
前記薬学的組成物は、インスリンをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬学的組成物は、薬学的組成物全体重量部に対して、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩２０〜４０重量部と、インスリン６０〜８０重量部と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項６】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を薬剤学的に有効な量で個体に投与する段階を含む糖尿病治療方法。
【請求項７】
糖尿病治療または予防のための薬剤製造のためのミドドリンの用途。
【請求項８】
ミドドリンを含む血糖降下用健康補助食品。
【請求項９】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することを特徴とする請求項８に記載の高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することを特徴とする請求項８に記載の高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１２】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を薬剤学的に有効な量で個体に投与する段階を含む高脂血症治療方法。
【請求項１３】
高脂血症治療または予防のための薬剤製造のためのミドドリンの用途。
【請求項１４】
ミドドリンを含む高脂血症改善用健康補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病及び／または高脂血症の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動訓練は、骨格筋で表現型変化を起こすリモデリングプログラムを活性化させることにより、運動耐性を向上させ、適当な運動は、代謝性疾患や心疾患などの病理状態の好転に効果的である。
【０００３】
特に、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−δ）、ＰＧＣ−１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α）は、運動耐性のための骨格筋の表現型変化に関与する重要因子として知られている。
【０００４】
この際、ＡＭＰＫは、α／β／γサブユニットからなるヘテロ三量体（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ）複合体であって、筋肉収縮及び運動時に、ＡＭＰＫの上位酵素であるＬＫＢ１及びＣａＭＫＫ（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）によるリン酸化によって活性化され、グルコース恒常性、食欲、及び運動生理に対する細胞／器官代謝の主な調節子である。ＰＰＡＲ−δは、骨格筋代謝の転写調節において、核心的な役割を行い、ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア生合成及び機能の調節子であって、エネルギー代謝に関与し、骨格筋の耐性運動によって活性化される遺伝子を調節する転写共同活性化因子である。
【０００５】
ＡＭＰＫは、同時に多様な転写プログラムをターゲティングすることができると知られているが、このような転写プログラムは、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αのような基質によって調節されて、運動と類似した遺伝的効果を誘発する。これと関連して、ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ信号経路をターゲティングする運動類似薬物が、耐性表現型に対する筋肉を再びプログラミングする新たな薬剤学的戦略になりうるという点が報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
また、Ａ−７６９６６２、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）及びレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）のようなＡＭＰＫ活性化を促進する幾つかの薬物が、心不全症に対して治療効果を発揮すると報告されている。心疾患に対するＡＭＰＫの保護機能は、細胞質のうち、活性酸素種生産の減少、アンジオテンシンＩＩの活性抑制、心臓トロポニンＩのリン酸化、ＰＧＣ−１αの活性化、ｅＮＯＳ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素発現の調節、エストロゲン関連受容体の調節及びエネルギー均衡と心臓内信号伝逹の調節などの重要な機能を通じて達成されるので、ＡＭＰＫ活性化は、直接・間接的に心筋機能を向上させうる。
【０００７】
このように、ＡＭＰＫ活性化（リン酸化）及びこれと関連した因子（ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１α）は、骨格筋内でのグルコース摂取（ｕｐｔａｋｅ）、エネルギー代謝恒常性維持、心機能増大などの運動類似効果を誘導するために、運動類似効果によって治療される疾患のターゲットとして、ＡＭＰＫを活性化させる薬物に対する要求が持続的にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖｉｈａｎｇ  Ａ．Ｎａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＭＰＫ  ａｎｄ  ＰＰＡＲδ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  Ａｒｅ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３４，Ｉｓｓｕｅ  ３，８  Ａｕｇｕｓｔ  ２００８，Ｐａｇｅｓ  ４０５−４１５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、α１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）をその効能剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であるミドドリン（ｍｉｄｏｄｒｉｎｅ）を通じて活性化させる場合、糖尿病及び／または高脂血症が改善されうるということを見つけ、その作用メカニズムを鋭意研究した結果、α１−アドレナリン受容体が活性化されれば、活性型−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現が増加し、それを通じて骨格筋、心筋、肝などの多器官で運動類似効果を起こしうるということを確認して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の目的は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、有効成分であるミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩にインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）をさらに含む糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ミドドリンを利用した糖尿病治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ミドドリンを利用した高脂血症治療方法を提供することにある。
【００１１】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、前述した課題に制限されず、言及されていないさらなる課題は、下記の記載から当業者に明確に理解される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一側面において、本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む糖尿病の治療または予防のための薬学的組成物を提供する。
【００１３】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することができる。
【００１４】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することができる。
【００１５】
前記薬学的組成物は、インスリンをさらに含みうる。
【００１６】
前記薬学的組成物は、薬学的組成物全体重量部に対して、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩２０〜４０重量部；及びインスリン６０〜８０重量部；を含みうる。
【００１７】
一態様において、本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を薬剤学的に有効な量で個体に投与する段階を含む糖尿病治療方法を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、糖尿病治療または予防のための薬剤製造のためのミドドリンの用途を提供する。
【００１９】
他の側面において、本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物を提供する。
【００２０】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することができる。
【００２１】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することができる。
【００２２】
一態様において、本発明は、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を薬剤学的に有効な量で個体に投与する段階を含む高脂血症治療方法を提供する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、高脂血症治療または予防のための薬剤製造のためのミドドリンの用途を提供する。
【００２４】
本発明において、α１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）効能剤は、α１−アドレナリン受容体に作用して活性化させる物質であれば、特に制限はない。アドレナリン受容体は、α１、α２、βという３種のタイプがあり、本発明では、α１タイプの受容体を活性化させる公知の化合物を制限なしに利用することができるが、望ましくは、ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
【００２５】
ミドドリン化合物は、アマチン（ａｍａｔｉｎｅ）、プロアマチン（ｐｒｏａｍａｔｉｎｅ）、グトロン（ｇｕｔｒｏｎ）などの商標名で販売され、そのＩＵＰＡＣ名は、（ＲＳ）−Ｎ−［２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル］グリシンアミド（（ＲＳ）−Ｎ−［２−（２，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ）であって、下記化学式Ｉで表示される。
【００２６】
【化１】
2020143154.tif 000003
【００２７】
ミドドリンは、投与後、生体内で目的化合物に変化される薬物前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）であり、生体内投与後、活性代謝産物であるデスグリミドドリン（ｄｅｓｇｌｙｍｉｄｏｄｒｉｎｅ）に変化されて、α１−アドレナリン受容体を活性化させ、引き続きＡＭＰＫ活性化、ＰＰＡＲ−δ、またはＰＧＣ−１αの発現を誘導を通じて最終的に運動類似効果を誘導することができる。
【００２８】
前記化学式１で表される化合物は、「薬学的に許容可能な塩」を形成しうる。適した薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩のように、本発明が属する技術分野で通常使われるものであって、特に制限されるものではない。望ましい薬学的に許容可能な酸付加塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、過塩素酸、または臭素酸のような無機酸；酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、フマル酸、マイレン酸、マロン酸、フタル酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、シトロン酸、グルコン酸、酒石酸、サリチル酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、エンボン酸、アスパラギン酸、またはグルタミン酸のような有機酸が挙げられる。有機塩基付加塩の製造に使われる有機塩基としては、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどを例として挙げられる。アミノ酸付加塩基の製造に使われるアミノ酸としては、アラニン、グリシンなどの天然アミノ酸を例として挙げられる。
【００２９】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導するものである。
ＡＭＰＫは、生体内エネルギー状態を感知して、それを一定のレベルに保持させるエネルギーセンサー（ｅｎｅｒｇｙ  ｓｅｎｓｏｒ）の役割を行い、例えば、代謝性ストレスや運動によって細胞内のエネルギーが減少する場合、すなわち、ＡＴＰが枯渇してＡＭＰ／ＡＴＰ比率が増加する場合に活性化されて、ＡＴＰを消費する過程（例えば、脂肪酸酸化と当該過程）を促進する。ＡＭＰＫの活性化は、筋肉のような主要標的臓器に代謝的に重要な結果を誘導するが、特に、骨格筋で脂肪酸の酸化と糖吸収とを促進すると知られている。
【００３０】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導するものである。
ＰＰＡＲ−δは、ＡＭＰＫを調節して細胞内異化的エネルギー代謝を促進し、抗炎症作用など生体代謝の均衡（恒常性）保持に必須的な役割を行うと知られている。
【００３１】
ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア増殖の主な調節物質であって、運動、飢え、寒さのような激しい代謝的変化に反応して発現が誘導され、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｓｉｒｔｕｉｎ−１（ＳＩＲＴ１）などの調節を受けると知られている。
【００３２】
本発明による有効成分は、運動類似効果を誘導し、前記運動類似効果は、ＡＭＰＫ活性化が必要な疾患の予防または治療効果であり得る。
本発明において、運動類似効果とは、筋肉のインスリン鋭敏度増加及び酸化リン酸化機能増進、心臓機能改善（収縮力増加）、酸化リン酸化機能増進、コレステロール減少、脂肪蓄積及び体重減少など運動時に発揮される生理効果を意味し、特に制限はない。
【００３３】
本発明において、ＡＭＰＫ活性化が必要な疾患とは、ＡＭＰＫの非活性化によって生じうる多様な疾患であって、特に制限はなく、例を挙げれば、糖尿病及び／または高脂血症を含む代謝性疾患であり得る。
【００３４】
本発明において、「薬学的組成物」は、既存の治療活性成分、その他の補助剤、薬剤学的に許容可能な担体などの成分をさらに含みうる。前記薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びエタノールなどを含む。
【００３５】
前記組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われる。
【００３６】
本発明において、「投与量」は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与回数、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによって、その範囲が多様に調節されうるということは当業者には明白である。
【００３７】
本発明において、「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
【００３８】
本発明において、「薬学的有効量」は、投与される疾患の種類及び重度度、患者の年齢及び性別、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素、及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定され、前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最大効果が得られる量で、当業者によって容易に決定されうる。
【００３９】
本発明の組成物は、目的組織に到達することができる限り、「投与方法」には制限もない。例を挙げれば、経口投与、動脈注射、静脈注射、経皮注射、鼻腔内投与、経気管支投与または筋肉内投与などが含まれる。一日投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回分けて投与することが望ましい。
【００４０】
本発明の一実施例において、ミドドリン及びインスリンを混合投与時に、細胞内ブドウ糖吸収が増加して、糖尿病の予防または治療に有効であることを確認した。
【００４１】
本発明の一実施例では、α１−ＡＲ刺激効果が、心筋細胞、骨格筋細胞で運動類似遺伝子の発現に及ぼす効果を分析し、それをヒトの代謝症侯群と類似した症状を示す動物である自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）を使用して、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で心臓、骨格筋及び肝に及ぼす効果と比較した。
その結果、ヒトの代謝症侯群に該当する自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）は、ミドドリンによってα１−ＡＲを刺激時に、心臓、骨格筋、肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの活性化及び発現増加を引き起こすという事実を明らかにした。
【００４２】
また、α１−ＡＲ刺激時に、心筋でＡＭＰＫ刺激に対するＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの活性化の比率が、骨格筋と肝での数値よりもさらに高いということを確認した。このような結果は、運動類似ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δの活性化と関連し、α１−ＡＲ刺激による筋肉収縮効果とは独立したことであることを意味し、薬理学的に刺激された心筋収縮作用が心臓ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの活性化に寄与するという点を初めて報告したものである。
【００４３】
本発明では、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ実験を通じて、筋肉運動とは無関係に、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激が骨格筋でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの発現を活性化させるという点を初めて明らかにした。このような運動関連遺伝子発現が、持久的運動（ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ）を保持するための適応反応のうちの１つであるという点に対しては既に報告されている。
【００４４】
本発明では、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激時に、肝でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの活性化が誘導されることを確認した。本発明は、ミドドリンとインスリンとの複合投与によってブドウ糖吸収が増加するということを確認したので、これにより、糖尿病の予防または治療に有効であるということが分かる。
【００４５】
さらに、既存の糖尿病治療剤は、副作用として体重増加及び心不全が発生したが、ミドドリン使用時には、血糖減少と共に体重減少、心不全の予防及び抗炎症効果が共に発揮されて、既存の糖尿病治療剤に比べて糖尿調節に非常に有利である。
【００４６】
本発明では、α１−ＡＲ効能剤であるミドドリンが、α１−ＡＲ刺激によってＡＭＰＫを活性化させるものと独立して、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現を増加させて心臓機能を向上させることを確認したので、これは、運動訓練が心臓断片短縮を４０〜５０％まで増加させ、収縮及び弛緩両者の速度をいずれも向上させるためである。
したがって、α１−ＡＲ効能剤は、心臓収縮の直接的刺激に対する三重効果及びその運動効果を通じて、また、心臓、筋肉及び肝を含む多器官でのα１−ＡＲ刺激による運動類似ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δの活性化という間接的効果を通じて心臓機能を向上させることにより、インビボで運動耐性の向上に寄与すると判断される。
【００４７】
このように、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激によってＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δの活性化という心臓運動類似効果が表われ、付加的にＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現増加という他の運動類似プログラムを作動させるＡＭＰＫ−独立的心臓運動効果が表われるという事実は、本発明で初めて明らかにしたものである。
【００４８】
本発明の一実施例では、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激効果が、心筋細胞、骨格筋細胞で運動類似遺伝子の発現に及ぼす効果を分析し、それをヒトの代謝症侯群と類似した症状を示す動物である自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）を使用して、インビボで心臓、骨格筋及び肝に及ぼす効果と比較した。
また、α１−ＡＲ刺激効果が、心臓機能／サイズ、アディポネクチン及び脂肪レベルなどに及ぼす効果を観察した。
【００４９】
その結果、ヒトの代謝症侯群に該当する自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）は、ミドドリンによってα１−ＡＲを刺激時に、心臓、骨格筋、肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの活性化及び発現増加を引き起こし、心臓肥大または追加的な血圧上昇なしに心臓収縮性を増加させるという事実を明らかにした。
【００５０】
また、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激時に、血液でコレステロールレベルが減少し、心筋でＡＭＰＫ刺激に対するＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの活性化の比率が、骨格筋と肝での数値よりもさらに高いということを確認した。このような結果は、運動類似ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δの活性化と関連し、α１−ＡＲ刺激による筋肉収縮効果とは独立したことであることを意味し、薬理学的に刺激された心筋収縮作用が心臓ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの活性化に寄与するという点を初めて報告したものである。
【００５１】
また、本発明では、ミドドリンが、他の運動類似効果誘発薬物（アテノロール）に比べて、さらに効果的であるという事実を明らかにした。これは、ミドドリンが心臓収縮性を向上させる二重効果を有する一方に、他の薬物は、心臓筋肉収縮に対する直接的なエネルギー代謝作用なしに運動類似効果のみを発揮するためである。また、他の運動類似剤は、それぞれの機能を高めるために、多様な薬物を混合して使われているが、α１−ＡＲ効能剤は、一種の物質でも、このような運動効果を多器官に同時多発的に表わすという長所がある。
【００５２】
また、本発明では、ミドドリンで処理されたラットで左心室拍出係数がアテノロール処理された動物ほど増加したが、心臓でのリン酸化されたＡＭＰＫは、実験グループの間に差があることを明らかにした。α１−ＡＲが心臓に対して友好的な効果を表わすにもかかわらず、α１−ＡＲ刺激の程度が長期的予後面では重要であると判断されるが、これは、心臓α１−ＡＲドライブの高度に持続した補強が収縮性機能障害、漸進的纎維化及び母細胞タンパク質遺伝子の再活性化に対して病理的リモデリングを引き起こすためである。
【００５３】
また、本発明では、α１−ＡＲ刺激にもかかわらず、心臓肥大が表われないということを明らかにし、さらに、本発明によれば、左心室質量は、アテノロール処理された群でよりもミドドリン処理された群でさらに小さく、これは、心臓ＡＴＩ発現の差として説明される。
【００５４】
また、本発明では、インビトロ及びインビボ実験を通じて、筋肉運動とは無関係に、α１−ＡＲ刺激が骨格筋でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの発現を活性化させるという点を初めて明らかにした。このような運動関連遺伝子発現が、持久的運動を保持するための適応反応のうちの１つであるという点に対しては既に報告されている。
【００５５】
また、本発明では、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激時に、肝でＡＭＰＫ活性化が誘導され、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及びＨＤＬ−コレステロールレベルが著しく減少するということを確認したので、これにより、高脂血症の予防または治療に有効であるということが分かる。
【００５６】
また、本発明では、ミドドリンを通じるα１−ＡＲ刺激時に、脂肪細胞内脂肪含有量が減少し、脂肪合成／蓄積が抑制され、体重及び腹部脂肪が減少するということを確認した。
【００５７】
さらに、高脂血症に対する効果は、コレステロール低下剤であるスタチン（ｓｔａｔｉｎ）が副作用として糖尿が来ることとは異なって、ミドドリン使用時に、コレステロールの減少と共に糖尿が予防になるので、副作用がなく、効果に優れた新たな高脂血症治療剤として適用することができる。
【００５８】
さらに他の側面において、本発明は、ミドドリンを含む血糖降下用健康補助食品を提供する。
【００５９】
さらに他の側面において、本発明は、ミドドリンを含む高脂血症改善用健康補助食品を提供する。
【００６０】
本発明の健康補助食品は、ミドドリンに各種の副材料及び食品添加物が添加される。この際、健康補助食品は、食品総重量でミドドリンを０．１〜９０重量％を含有することができる。
【００６１】
食品添加物として、例えば、単糖類、二糖類、多糖類、糖アルコールなどの糖類と、タウマチン、ステビア抽出物、サッカリン、アスパルテームなどの香味剤と、営養剤、ビタミン、食用電解質、風味剤、着色剤、増進剤（例、チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸、アルギン酸、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤などが用いられうる。
【００６２】
本発明の健康補助食品は、多様な形態で剤型が可能なので、その形態は、特に制限されるものではない。したがって、飲物、顆粒、錠剤、パウダー、丸、カプセルのうちから選択された何れか１つの剤型で形成されうる。飲物、顆粒、錠剤、パウダー、丸、カプセルの剤型を有する健康補助食品は、携帯が簡便であり、いつでもどこでも随時に摂取することが容易である。
【００６３】
本発明の健康補助食品の剤型の一例として、飲物は、ミドドリン０．１〜４０重量％、精製水６０〜９９．９重量％に組成される。また、飲物に添加物としてタウリン、クエン酸、ビタミンＣなどをさらに添加することができる。
【００６４】
それ以外にも、通常の飲物のように、さまざまな香味剤が追加成分として含有されうる。香味剤としてタウマチン、ステビア抽出物などの天然香味剤を使用することができる。
【００６５】
顆粒、錠剤、パウダー、丸、カプセルなどの剤型は、ミドドリンを１〜５０重量％を含有し、その他の粘着剤、香味料、ビタミン、炭水化物などをさらに含有することができる。
【発明の効果】
【００６６】
本発明のミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物は、生体内エネルギー代謝活性保持と調節とに核心的な作用を行うｐ−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの発現を増加させることにより、骨格筋細胞内へのブドウ糖吸収率を高め、ミトコンドリアの代謝障害を調節することができるので、糖尿病の予防及び治療に有用に用いられうる。
【００６７】
また、本発明のミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物は、脂肪細胞内脂肪含有と脂質蓄積とを抑制し、腹部脂肪量と体重とを減少させるだけでなく、ミトコンドリアの代謝障害を調節することができるので、高脂血症の予防及び治療に有用に用いられうる。
【００６８】
また、本発明のミドドリンは、血糖降下及び／または高脂血症改善用健康補助食品として用いられうる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１の（Ａ）及び図１の（Ｂ）は、それぞれマウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）とマウス心筋細胞株（ＨＬ１）で、ミドドリンによってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ＡＭＰＫ活性型（リン酸化型）であるｐ−ＡＭＰＫ及びＰＰＡＲ−δのタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。
【図２Ａ】基底４週齢対照群ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でα１−ＡＲのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。
【図２Ｂ】図２Ｂないし図２Ｅは、前記ラットグループの心筋、骨格筋、脂肪及び肝のそれぞれでＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。
【図３Ａ】基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でＳＤＨ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素活性度を測定した結果である。
【図３Ｂ】前記グループの骨格筋組織で、シトクロムｃオキシダーゼ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ）に対する免疫組織化学染色した結果である。
【図４】基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の心筋、骨格筋及び肝でＥＬＩＳＡ方法でＡＴＰレベルを測定した結果である。
【図５】マウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）でインスリンのブドウ糖吸収に及ぼすミドドリン効果を確認した結果である。
【図６】４週齢ラットからなる３個のグループの１ヶ月間心拍数を測定した結果である。
【図７】ラットグループの肝でＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅタンパク質（ＨＭＧＣＲ）の発現レベルを確認した結果である。
【図８】図８Ａは、脂肪細胞内脂肪含有量、図８Ｂは、脂肪合成／蓄積を抑制するＰＰＡＲ−δ、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αのタンパク質発現に及ぼすミドドリン効果を確認した結果である。
【図９】図９Ａは、体重、図９Ｂは、腹部脂肪量に及ぼすミドドリン効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００７１】
実施例１：細胞培養及び動物実験準備
１−１：細胞培養
ラット骨格筋細胞株（Ｌ６）、マウス心筋細胞株（ＨＬ１）及びマウス脂肪前駆細胞株（３Ｔ３−Ｌ１）は、３７℃  ＣＯ２培養器内で６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）あるいは２４ウェルプレートに各細胞を分注した。
【００７２】
以後、Ｌ６及びＨＬ１細胞は、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％抗生剤を含む培地（ＤＭＥＭ）で培養皿の底に８０％程度飽和されるまで育てた後、培地を１％  ＦＢＳを含む培地に取り替えて、４日間分化させるが、分化３日目に薬物を処理した。Ｌ６及びＨＬ１細胞を利用したあらゆるインビトロ実験は、薬物処理後、２４時間後に行った。
【００７３】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、１０％  ＦＢＳ、１％抗生剤を含む培地（ＤＭＥＭ）で培養皿の底に１００％まで満ちるように育てた後、新たな培地に取り替えた後、４８時間さらに培養した後、分化培地と薬物を入れ、４８時間培養した。分化培地の組成は、次の通りであった；０．０１２５ｕｍｏｌｅ／ｍｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１２．５ｕｍｏｌｅ／ｍｌ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、１０ｕｇ／ｍｌインスリン、１０％  ＦＢＳ。４８時間分化培地を処理した後、１０ｕｇ／ｍｌインスリンと１０％  ＦＢＳとを含有したインスリン培地に取り替え、４８〜９６時間処理した。以後、１０％  ＦＢＳのみを含有した一般培地に取り替え、２４〜４８時間培養後、実験した。
【００７４】
１−２：動物実験
自発性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｒａｔ；ＳＨＲ）は、遺伝性高血圧が発現される実験動物であって、ヒトの原発性高血圧と最も類似した高血圧を発現させると知られている。ＳＨＲは、ほとんど４〜６週齢に血圧が上昇し始めて、８〜１２週齢に本格的な高血圧が発現される。ＳＨＲは、心肥大、心不全及び腎障害のような高血圧性標的臓器の損傷をよく伴うために、原発性高血圧、特に、心臓病変を有した高血圧に対する動物モデルとして関連研究に幅広く使われている。
【００７５】
３週齢の自発的高血圧ラット（ＳＨＲｓ）を標準化された条件（２１℃、４１％〜６２％の湿度）下で放置するが、規則的な昼／夜（１０／１４時間）サイクルを加え、水及び餌に自在に近付くようにした。あらゆる動物実験は、大韓民国の高麗大学校動物科学規則に符合するように行った（ＫＵＩＡＣＵＣ−２０１２−１００）。実験過程及び収容条件は、高麗大学校動物実験委員会の承認を受けた。
【００７６】
適応１週後に、ラットは、下記のように、４個群のうち１つ（群当たり６匹ラット）に割り当てた：グループＩ（基底対照群（ｂａｓａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、４週齢に犠牲）、グループＩＩ（４週間ミドドリン投与）、グループＩＩＩ（４週間アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）投与）、及びグループＩＶ（４週間薬剤投与ない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ））。グループＩ及びグループＩＶは、如何なる薬物の投与なしに標準保持の餌を与え（Ｋ−Ｈ４ペレット、ｓｎｉｆｆ）、グループＩＩは、ミドドリンを含む飲用水（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄ）と共に同じ餌を与え、グループＩＩＩは、アテノロールを含む飲用水（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）と共に同じ餌を与えた。
【００７７】
グループＩ中のラットは、４週齢で安楽死させた一方、他のグループのラットは、４週間薬物を処方した後、８週齢で安楽死させた。血液サンプルは、下大静脈から採取し、心臓、大動脈、肝、骨格筋肉、及び内臓脂肪（腹部脂肪）は、きれいに切開して実験に使用した。回収された臓器は、−８０℃冷蔵庫または浸漬固定のための１０％ホルマリンで保管した。
【００７８】
実施例２：実験方法
２−１：ＡＴＰ測定のためのＥＬＩＳＡ方法
実施例１−２のラットから分離した肝組織０．０２ｇを５００μＬのＰＢＳ中で均質化した。均質液を１５００ｕｇ（または、５０００ｒｐｍ）で１５分間遠心分離した以後に、上澄み液に対して測定を行った。基準物質またはサンプル１００μＬを抗体予めコーティングされたマイクロ適正プレート中の適当なウェルに注いだ後、残余溶液１０μＬをサンプルに添加した。５０μＬのコンジュゲートを各ウェルに添加し、混合した後、カバーを覆ったプレートを３７℃で１時間培養した。それぞれ５０μＬの基質Ａ及びＢをそれぞれのウェルに添加し、３７℃で１５分間培養した。それぞれのウェルに停止液を添加した後、マイクロプレート判読器を使用して４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【００７９】
２−２：ＳＤＨ酵素活性度の測定
ウェル内ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）溶液１ｍｌ当たりタンパク質分解酵素阻害剤カクテル１０μＬを添加して、ウェル当たり５００μＬになるように準備し、１Ｍリン酸緩衝溶液２５μＬ×２５＝６２５μＬ、０．２Ｍコハク酸ナトリウム１２５μＬ×２５＝３１２５μＬ、ＮＢＴ  ２５μＬ×２５＝６２５μＬ、Ｄ．Ｗ  ２３５μＬ×２５＝５８７５μＬを混ぜて作った培養溶液をウェル当たり４１０μＬになるように準備して、反応２０分前に３７℃に温めておいた。実施例１−２のラットから分離した骨格筋肉組織０．０２ｇ当たり、前記であらかじめ準備したＰＢＳ  ５００μＬを入れ、破砕機で磨くが、短い時間分けて磨いて、温度が上昇して酵素が破壊されないように準備した。１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上澄み液を収得して新たなチューブに移した。培養溶液４１０μＬをあらかじめチューブに入れて置き、サンプル９０μＬを入れて酵素反応させた。さらに他のチューブに蒸留水（ＤＷ）４１０μＬを入れ、サンプル９０μＬを添加した後、希釈液の吸光度を測定した。予め準備した酵素反応のチューブと他のチューブとをそれぞれ３７℃水湯煎に入れ、３０分間反応させ、氷にチューブを挿入して反応を終了させた後、９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注して、吸光度５５０ｎｍで測定し、結果値を次のような式に適用して、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の酵素活性度を計算した。
【００８０】
酵素活性度＝（酵素反応吸光度値−酵素液希釈液吸光度値）／タンパク質定量値（ブラッドフォード５９５ｎｍ）
【００８１】
２−３：ウェスタンブロット
タンパク質は、細胞からＰＲＥＰＴＭタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，Ｋｏｒｅａ）を用いて収得した後、タンパク質２０〜３０ｕｇを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ゲル上にローディングして分離し、ニトロセルロースペーパー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イギリス）にトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。メンブレンは、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク、０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で４℃で一晩または室温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＡＭＰＫα（全体形態のαサブユニット）、リン酸化されたＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２でリン酸化）、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αに対する１次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を投入し、室温で２時間または４℃で一晩培養した後、ワサビダイコン過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された抗ウサギ２次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ）で反応させた。検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）としてＣｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ，ＵＳＡ）を利用した。映像は、Ｋｏｄａｋ  ＧＢＸ現像及び固定試薬（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して手動で収得した。Ｘ線フィルムは、Ａｇｆａ（Ｍｏｒｔｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。細胞由来の各タンパク質の含量は、ブラッドフォード法を使用して測定した。
【００８２】
２−４：細胞内ブドウ糖吸収率の測定
実施例１−１の方法で培養したマウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）にインスリン１００μＭ／Ｌ、ミドドリン３０μＭ／Ｌ、ミドドリン３０μＭ／Ｌ及びインスリン１００μＭ／Ｌの混合物（１：２（ｗ／ｗ））をそれぞれ処理した後、２−デオキシブドウ糖（２−ｄｅｏｘｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ）でブドウ糖吸収（ｕｐｔａｋｅ）レベルを測定した。
【００８３】
２−５：心臓機能及び体重測定
実施例１−２の８週齢ラットにゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）（８ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（ｘｙｌｚｉｎｅ）（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射して麻酔させた後、ラットを左側に寝かせ、Ｍモードエコー映像を得た。あらゆる検査は、１２ＭＨｚトランスデューサを備えたｖｉｖｉｄ  ７（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して行った。乳頭筋レベルで左心室に対する最適２次元短縮映像を獲得した以後に、Ｍモードトレーシングを行う同時に心電図記録を行いながら、１００ｍｍ／ｓの速度で記録した。Ｍモードトレーシングに対する少なくとも３回連続心臓サイクルからエコー心超音波検査を用いて（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）測定方法を適用して、心臓壁の厚さ、左室駆出率（収縮機能）及び質量を測定した。
【００８４】
体重は、前記心臓機能を測定したラットと同じラットを対象にして測定した。
また、実施例１−２の４週齢ラットを対象にして１ヶ月にわたって心拍数を測定した。
【００８５】
２−６：血液生化学及びアディポネクチンの測定
実施例１−２のラット由来の血液から総コレステロール、ＨＤＬ（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロール、ＬＤＬ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロール、及びトリグリセリドの濃度を測定するために、酵素発色法（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【００８６】
実施例１−２のラット由来の血液内アディポネクチンは、ラットアディポネクチン検出ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して測定した。測定されたアディポネクチンレベルは、内臓脂肪重量（ｇ）に対して定量した。
【００８７】
２−７：脂肪細胞脂肪含有の抑制確認
実施例１−１の方法で培養したマウス由来の脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を脂肪細胞に分化させた後に、ミドドリン３０μＭ／Ｌ、ミドドリン３０μＭ／Ｌ及びＧＳＫ０６６０（ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）β／δ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）５０μＭ／Ｌの混合物（１：２（ｗ／ｗ））をそれぞれ処理した後、脂肪細胞内脂肪含有程度を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７１）を用いて肉眼で観察した。
【００８８】
２−８：統計的分析
連続的変数は、平均±標準偏差（ＳＤ）で記録した。４個群にわたった変数の全般的差値は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストを使用して分析した。２つの群の間の差値は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−テストを使用して評価した。０．０５未満のｐ−数値は、統計的に有意なものと見なした。あらゆる統計的分析は、ＳＰＳＳ（ｖｅｒ．２０．０；ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して行った。
【００８９】
実施例３：実験の結果
３−１：インビトロで骨格筋細胞または心筋細胞にミドドリン投与時に、ＡＭＰＫのリン酸化に対する効果の検定
ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫリン酸化（活性化）に対するα１−ＡＲ刺激効果をインビトロで確認するために、実施例１−１で培養したマウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）とマウス心筋細胞株（ＨＬ１）とにα１−ＡＲ効能剤であるミドドリン３０μＭを処理した後、実施例２−３の方法でウェスタンブロットを行った。
【００９０】
その結果、図１の（Ａ）及び図１の（Ｂ）に示すように、骨格筋細胞のＡＭＰＫがα１−ＡＲ刺激によって発現され、リン酸化されたＡＭＰＫ発現がミドドリンの濃度によって増加したので、α１−ＡＲ刺激がＡＭＰＫの活性化に関与するということが分かった。また、ミドドリン投与によるα１−ＡＲ刺激は、骨格筋の以外に心筋細胞でも同じ態様でＡＭＰＫの発現及びリン酸化反応が表われた。
【００９１】
このように、骨格筋肉でミドドリンが作用して表われる変化（ＡＭＰＫ活性化）が心筋でも、既存に知られた心筋収縮機能向上と共に表われるので（ＡＭＰＫ活性化＋心筋収縮増加）、α１−ＡＲ刺激で追加的な心筋運動効果が表われているということが分かった。すなわち、インビトロ実験で、今までは単純に心筋細胞の収縮力のみ増加する可能性のみ知られているが、本実施例による結果では、骨格筋及び心筋細胞でＡＭＰＫ増加及びリン酸化が増加して運動効果関連作用が予想された。
【００９２】
３−２：心筋、骨格筋、脂肪及び肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αのタンパク質発現の検定
骨格筋でα１−ＡＲの存在を確認するために、基底４週齢対照群ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でα１−ＡＲのタンパク質発現状態を実施例２−３の方法でウェスタンブロッティングを行って確認した結果、図２Ａに示すように、グループＩＶでα１−ＡＲが最も高い発現を示した。
【００９３】
また、前記４個群のラット由来の心筋、骨格筋、脂肪及び肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αのタンパク質の発現状態をそれぞれ実施例２−３の方法でウェスタンブロッティングを行って確認した結果、図２Ｂ（心筋）、図２Ｃ（骨格筋）、図２Ｄ（脂肪）及び図２Ｅ（肝）に示すように、心筋の場合に、リン酸化されたＡＭＰＫタンパク質の発現は、グループＩがグループＩＶよりも高く（ｐ＜０．０５）、ミドドリン投与グループＩＩは、対照群グループＩＶよりも心筋、骨格筋、脂肪で顕著に高いＡＭＰＫ発現を示したが、アテノロール投与グループＩＩＩは、同じ年齢の対照群グループＩＶと比較する時、当該器官でさらに高いＡＭＰＫタンパク質の発現を示していない。
【００９４】
特異な点は、心筋では、ＡＭＰＫ増加に比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの増加が遥かに大きいが、骨格筋では、ＡＭＰＫ増加に比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの増加が遥かに少ないという点である。これは、心筋の運動効果が、ＡＭＰＫ活性化と共に直接にＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの発現を増加させるのに対して、骨格筋は、運動を相対的に多くしていなかったために、比較的ＡＭＰＫに比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとが増加しないということを意味する。
【００９５】
３−３：骨格筋のミトコンドリア酸化酵素の発現変化
ミトコンドリア酸化過程（ＴＣＡ回路）酵素であるＳＤＨ酵素活性度を骨格筋で実施例２−２の方法で測定した結果、図３Ａに示すように、ミドドリン投与グループＩＩで最も高く増加するということが分かった。
【００９６】
また、ミトコンドリア酸化過程酵素であるシトクロムｃオキシダーゼ酵素に対して骨格筋組織で免疫組織化学染色した結果、図３Ｂに示すように、ミドドリン投与グループＩＩで最も高く増加するということが分かった。
このような結果から、ミドドリンが、代謝作用を増進させるということが分かった。
【００９７】
３−４：組織内ＡＴＰレベルの比較
基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与したラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）に対して、心臓、骨格筋及び肝でＡＴＰレベルをＥＬＩＳＡ方法を用いて実施例２−１の方法で測定して比較した。その結果、図４に示すように、ミドドリンまたはアテノロール投与グループの心臓組織では、ＡＴＰレベルが、心臓のさらに高い収縮活性にもかかわらず、対照群ＳＨＲｓの数値よりも高く観察された。
【００９８】
３−５：細胞内ブドウ糖吸収の効果の検定
マウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）でインスリンのブドウ糖吸収に及ぼすミドドリン効果を確認した結果、図５に示すように、インスリン単独よりもインスリンとミドドリンとの混合物を処理する場合、ブドウ糖吸収率が著しく増加するということを確認した。
このような結果から、ミドドリンが、糖尿病治療に有効であるということが分かった。
【００９９】
３−６：インビボ動物モデルで心臓機能及び体重に対するミドドリン投与効果の検定
ミドドリン投与時に、インビボ心臓筋でも、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αが増加するならば、骨格筋で運動効果が既に証明されたＡＭＰＫ−ＰＰＡＲ−δ−ＰＧＣ−１αの同時発現カスケードが心筋収縮機能向上に影響を与えると見なすことができるので、実施例２−５の方法でインビボで心臓機能及び体重を確認した。
その結果、下記表１に示すように、８週齢ラットのエコー心拍動データから、ミドドリン投与ラットグループＩＩ及びアテノロール投与ラットグループＩＩＩの左心室性能が、未投与対照グループＩＶの当該数値よりもさらに高いと表われた。
【０１００】
左心室質量は、グループＩＩで最も低かったが、心臓質量は、グループの間で有意な差異点が観察されず、グループＩＩＩが最も高い体重を示した。
また、４週齢のラットからなる３個のグループ（青色：対照群、赤色：ミドドリン投与群、緑色：アテノロール投与群）で１ヶ月にわたって心拍数を測定した結果、実験の末尾にアテノロールグループで最も低かった（図６）。
【０１０１】
【表１】
2020143154.tif 000004
【０１０２】
３−７：アディポネクチン発現及び脂肪プロファイルに対するミドドリン投与効果の検定
ミドドリンの臓器投与が、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）発現及び脂肪プロファイルに及ぼす効果を実施例２−６の方法で確認した。
α１−ＡＲ刺激が如何にＡＭＰＫを活性化させるかを確認するために、ＡＭＰＫの上流分子であるアディポネクチンレベルを測定した結果、下記表２に示すように、グループＩＩが、グループＩＶに比べて、内臓脂肪重量当たり著しく高い血清アディポネクチンレベルを示した。
【０１０３】
【表２】
2020143154.tif 000005
【０１０４】
図２Ｅに示すように、肝でリン酸化ＡＭＰＫタンパク質発現は、大動脈、骨格筋、脂肪などの他臓器の結果と類似にグループＩＩで最も高く、グループＩＶでは相対的に低かった。また、図７で示すように、肝でＡＭＰＫの下部連携要素であるコレステロール合成酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅタンパク質（ＨＭＧＣＲ）の発現が、グループＩＩ、ＩＩＩで最も低く、対照君であるグループＩＶでは高かった。
【０１０５】
実際の血液での脂肪プロファイルと関連したは、下記表３に示すように、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールは、薬物投与群（グループＩＩ及びＩＶ）に比べて、対照群（グループＩ及びＩＶ）でさらに高かったが、トリグリセリドレベルは、グループの間にあまり差がなかった。
【０１０６】
このような結果から、ミドドリンが、高脂血症治療に有効であるということが分かる。
【０１０７】
【表３】
2020143154.tif 000006
【０１０８】
３−８：脂肪細胞脂肪含有の抑制、体重及び腹部脂肪減少の効果の検定
脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１）にミドドリンを処理した結果、図８Ａに示すように、脂肪細胞で脂肪含有量が減少し、ＧＳＫ０６６０（ＰＰＡＲ  β／δ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）５０μＭ／Ｌの混合物（１：２（ｗ／ｗ））を追加時に、ミドドリンの効果が減少した。また、ミドドリンを処理した脂肪細胞を実施例２−３の方法でウェスタンブロッティングした結果、図８Ｂに示すように、脂肪合成／蓄積を抑制するＰＰＡＲ−δ、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αのタンパク質発現が増加した。
【０１０９】
実施例１−２のミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢高血圧対照群ラット（ＩＶ）で、それぞれ体重を測定し、摘出した腹部脂肪（内臓脂肪）の重量を測定した結果、図９に示すように、ミドドリン投与時に、体重と腹部脂肪いずれも減少した。  このような結果から、ミドドリン使用時には、血糖減少と共に体重減少、心不全の予防効果が同時に発揮されることを確認した。
【０１１０】
また、α１−ＡＲ効能剤であるミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩によるα１−ＡＲ刺激は、骨格筋及び肝に運動時に発揮される生理効果を招き、心臓肥大または血圧上昇を伴わず、左心室の拍出係数を向上させ、自発性高血圧ラットの初期生涯のうち、初期高血圧時期に生化学的反応を変化させることが分かる。これは、直接に刺激された心臓筋肉収縮、心臓運動類似効果及びＡＭＰＫ活性化と関連する。
【０１１１】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、当業者ならば、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解できるであろう。したがって、前述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないということを理解しなければならない。
【図１】
2020143154.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020143154.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2020143154.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月3日(2020.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することを特徴とする請求項１に記載の高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項３】
前記ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することを特徴とする請求項１に記載の高脂血症の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項４】
ミドドリンまたはその薬学的に許容可能な塩を薬剤学的に有効な量で個体に投与する段階を含む高脂血症治療方法。