(57)【要約】【課題】ニューロンの軸索退縮を予防するための幹細胞の使用の提案。【解決手段】本発明は概して、ニューロン損傷の治療を対象とする。特に、本発明は、急性または慢性の神経系損傷の間に生じる、活性化マクロファージとジストロフィー軸索の相互作用の結果として起こる軸索退縮（「ダイバック」）を低減することを対象とする。本発明はまた、軸索成長／再生を促進することを対象とする。本発明は具体的には、幹細胞、または例えば、馴化細胞培養培地中で生じるであろうその分泌細胞因子を使用して、軸索ダイバックを回復または予防し、かつ／または軸索の成長／再生を促進することを対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の軸索退縮に関連するニューロン損傷を治療（回復または予防）するための方法、組成物、細胞など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ニューロン損傷の治療を対象とする。特に、本発明は、急性または慢性の神経系損傷の間に生じる、活性化マクロファージとジストロフィー軸索の相互作用の結果として起こる軸索退縮（「ダイバック（ｄｉｅｂａｃｋ）」）を低減することを対象とする。本発明はまた、軸索成長／再生を促進することを対象とする。本発明は具体的には、幹細胞、または例えば、馴化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）細胞培養培地中で生じるであろうその分泌細胞因子を使用して、軸索ダイバックを回復または予防し、かつ／または軸索の成長／再生を促進することを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
軸索退縮
脊髄損傷の後、ＣＮＳ再生の主な障害となるグリア瘢痕が形成される（ＳｉｌｖｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ、２００４年）。瘢痕組織を形成する領域では、再生軸索の末端が伸長しなくなり、腫脹し歪んで、何年間も軸索路にとどまることができる様々な異形の「成長円錐」となる（Ｒａｍｏｎ  ｙ  Ｃａｊａｌ、１９２８年；ＬｉおよびＲａｉｓｍａｎ、１９９５年；ＨｏｕｌｅおよびＪｉｎ、２００１年；Ｋｗｏｎら、２００２年）。ＣＮＳ内の損傷した軸索は、最初の損傷後、数時間から数週間の間に軸索切断部位から退縮する。軸索退縮の性質、その原因、程度およびタイミングに関して異なる報告があり、さらには軸索退縮が受動的プロセスであるか、能動的プロセスであるかについても考察されている（ＦａｙａｚおよびＴａｔｏｒ、２０００年）。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏグリア瘢痕モデル
瘢痕組織を形成する領域では、コンドロイチン／ケラタン硫酸プロテオグリカン（ＰＧ）として知られる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子群を含めた、数種類の成長阻害分子が上方制御される（ＦｉｔｃｈおよびＳｉｌｖｅｒ、１９９７年；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら、２００２年；Ｊｏｎｅｓら、２００３年；Ｔａｎｇら、２００３年）。ＰＧは、病変の周辺の濃度が最も低く、その中心の濃度が最も高い大まかな勾配で組織されている（Ｄａｖｉｅｓら、１９９９年；Ｆｉｔｃｈら、１９９９年）。この阻害性ＥＣＭ成分は、反応性グリア細胞がラミニンを介して軸索再生を支持する潜在能力を遮断する（ＭｃＫｅｏｎら、１９９１年）。微量移植（ｍｉｃｒｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）実験において、成体の感覚ニューロンは、病変から離れて位置する強い再生能を有することが示される。再生線維は、損傷部位の近くに達すると、病変周辺をはい進むことができるが、ＰＧ濃度が最も高い領域に深く浸入すると最終的に伸長しなくなり、ジストロフィーになる（Ｄａｖｉｅｓら、１９９９年；ＧｒｉｍｐｅおよびＳｉｌｖｅｒ、２００４年）。
【０００３】
縁の鋭い（すなわち、ストライプの）基質によるアッセイを使用して軸索に及ぼすＰＧの影響を調べるｉｎ  ｖｉｔｒｏグリア瘢痕モデルにおいて、成長円錐の方向転換または崩壊は誘導されたが、ジストロフィーは誘導されなかった（Ｓｎｏｗら、１９９０年）。しかし、最近のグリア瘢痕のモデルにおいて、ＰＧの大まかな勾配は再生成体軸索のジストロフィー終末を生成するのに十分であった（Ｔｏｍら、２００４年）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、成体感覚ニューロンの再生軸索は、ラミニンと混合されたＰＧアグリカンのスポット勾配に対処するようになる。このグリア瘢痕モデルにおいて球状の多胞性終末が形成された。ＰＧは、成長円錐のジストロフィーおよび動的なジストロフィー終末をもたらした。
【０００４】
ニューロン組織の炎症および損傷
脊髄病変の環境は極めて複雑である。高度に硫酸化されたプロテオグリカン、ｅｐｈ、ｓｌｉｔ、およびミエリン膜断片（ＳｉｌｖｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ、２００４年；ＹｉｕおよびＨｅ、２００６年；ＢｕｓｃｈおよびＳｉｌｖｅｒ、２００７年）などのグリア瘢痕の成分ならびに神経炎症のプロセス（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＰｏｐｏｖｉｃｈ、２００７年）はすべて再生不全に寄与する。炎症細胞は病変内に蓄積する（Ｆｉｔｃｈら、１９９９年）。星状細胞は、病変の中心から離れ、肥大し、切断された線維においてジストロフィー性の終末球の形成を次には引き起こす阻害性コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の産生を上方制御する（Ｔｏｍら、２００４年）。病変内にあるオリゴデンドロサイトは死滅して脱髄をもたらし、それにより高濃度の阻害性ミエリン分解産物が生じる（ＹｉｕおよびＨｅ、２００６年；ＸｉｅおよびＺｈｅｎｇ、２００８年）。
【０００５】
プロテオグリカンおよびミエリンが軸索成長に及ぼす阻害作用が十分に確立されているが、神経炎症が再生および再生不全において果たす役割はまだ、大いに議論の余地があった（ＰｏｐｏｖｉｃｈおよびＬｏｎｇｂｒａｋｅ、２００８年）。しかし、マクロファージの浸潤により、病変サイズが拡大し、再生線維の成長が減少し、初期病変によって残されたニューロンの死滅が増大することが研究で示されている（Ｆｉｔｃｈら、１９９９年；ＭｃＰｈａｉｌら、２００４年；ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＰｏｐｏｖｉｃｈ、２００７年）。活性化マクロファージおよび好中球の負の作用は、ニューロンおよびグリアの両方に対して毒性を及ぼすことができる、サイトカイン、エイコサノイド、フリーラジカルおよびプロテアーゼの分泌によって媒介されると考えられている（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＰｏｐｏｖｉｃｈ、２００７年）。脊髄損傷後にマクロファージを枯渇させ、阻害し、または不活性化する数々の研究において、神経保護作用が生じ、再生が増大し、運動機能、感覚機能および自律機能が改善されることが報告されている（Ｏｕｄｅｇａら、１９９９年；Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９９年；ＭｃＰｈａｉｌら、２００４年；Ｓｔｉｒｌｉｎｇら、２００４年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏグリア瘢痕モデルにおいて、活性化マクロファージおよびミクログリアなどのＥＤ−１＋細胞における軸索退縮（ダイバック）は、ある種の細胞またはその細胞が増殖した馴化細胞培養培地の外部投与によって減少させることができるという本発明者らの知見に部分的に基づく。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ脊髄損傷モデルに適用することによっても確認された。
【０００７】
本発明者らは、活性化マクロファージおよびミクログリアなどのＥＤ−１＋細胞がジストロフィー軸索に接着し、これが退縮に必要であることを認めた。本発明者らは、細胞またはこの細胞由来の馴化培地をジストロフィー軸索に適用することにより、接着が低減または予防されることを見出した。本発明者らは、この細胞を培養することによって得た馴化培地を適用することにより、神経刺激作用が生じ、経突起伸長／再生が著しく増大することをさらに見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は概して、軸索退縮に関連するニューロン損傷を治療（回復または予防）するための方法を対象とする。
【０００９】
本発明は概して、病変内またはその周辺の軸索成長／再生を促進することにより、ニューロン損傷を治療（回復または予防）するための方法を対象とする。
【００１０】
さらに、本発明は概して、ニューロン損傷における軸索退縮を低減するための方法を対象とする。
【００１１】
さらに、本発明は概して、病変内またはその周辺の軸索成長／再生を促進するための方法を対象とする。
【００１２】
退縮は、活性化マクロファージおよび／またはミクログリアなどのＥＤ−１＋細胞によって引き起こされ得る。
【００１３】
さらに、本発明は概して、軸索退縮を低減するようにジストロフィー軸索へのＥＤ−１＋細胞の接着を低減するための方法を対象とする。
【００１４】
これらの結果は、細胞を病変内またはその周辺に、軸索成長／再生を促進するのに十分に病変に近接して十分な時間、十分な量で投与することによって達成される。
【００１５】
これらの結果は、細胞を、ニューロン損傷における軸索退縮を低減し、軸索退縮に関連するニューロン損傷を低減するために、病変に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することによって達成される。
【００１６】
これらの結果は、細胞を、軸索退縮をもたらすであろう、ジストロフィー性の軸索へのＥＤ−１＋細胞の接着を低減するために、病変に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することによって達成される。
【００１７】
軸索への常在性のＥＤ−１＋細胞の接着を細胞が低減するように、損傷した軸索に細胞が導入される。
【００１８】
ＥＤ−１＋細胞としては、それだけには限定されないが、マクロファージおよびミクログリアが挙げられる。
【００１９】
これらの結果は、細胞によって分泌される因子によって引き起こされる。したがって、これらの結果は、細胞培養馴化培地もしくはその画分、またはこの馴化培地に由来するタンパク質もしくは他の因子を使用することによっても達成される。馴化培地は、接着および軸索退縮を低減し、かつ／または軸索成長を促進するのに有効な細胞を細胞培養によって増殖させることによって産生される。一実施形態では、馴化培地は使用する前に凍結されていない。
【００２０】
これらの結果は、細胞溶解物または細胞画分を使用することによっても達成される。
【００２１】
上記で開示した細胞、分泌因子、画分などは、急性損傷時、最初の急性損傷後の長期間（例えば、数週間）など、軸索退縮およびそれに起因する損傷に対応する様々な時点で投与することもできる。
【００２２】
しかし、軸索退縮は、以下に記載するような慢性損傷状態でも起こる可能性があることが理解される。慢性損傷では、軸索退縮を低減するであろう任意のレジメンに従って、細胞を投与することができる。
【００２３】
細胞（および分泌因子）はまた軸索成長を促進するので、必ずしも退縮に関連するとは限らない慢性および急性の損傷においてもそれらを投与することができる。このような損傷は、病変内またはその周辺で軸索成長／再生が提供および促進されるように治療される。
【００２４】
一実施形態では、細胞は幹細胞である。幹細胞としては、それだけには限定されないが、胚性幹細胞および非胚性幹細胞が挙げられる。非胚性幹細胞は、胚性幹細胞と同様に、複数の胚性胚葉の細胞型に分化し、かつ／または複数の胚性胚葉の細胞型に分化する潜在能力に関連する１つまたは複数のマーカーを発現する能力を有することができる。非胚性細胞には、組織特異的幹細胞、すなわち、たった１つの胚性胚葉の細胞型に分化する能力を有する幹細胞、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞も含まれる。
【００２５】
特定の実施形態では、非胚性幹細胞は、「複能性成体前駆細胞」（「ＭＡＰＣ」）と称されており、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。
【００２６】
本発明は、活性化マクロファージまたはミクログリアなどのＥＤ−１＋細胞がジストロフィー軸索と相互作用し、軸索を退縮させている、軸索ジストロフィーを生じた任意の神経系損傷を包含する。この神経系には、脳および脊髄を含めた中枢神経系の組織が含まれる。ジストロフィー軸索に関連する状態としては、それだけには限定されないが、脊髄に対する任意の種類の外傷性の影響によって生じる脊髄損傷（これらの影響には、脊髄の外側から加わる任意の力（椎間板ヘルニアを含む）、または脊髄空洞症などの脊髄の内側から加わる任意の力が含まれる）；脳の内側または外側からの任意の種類の外傷性の影響によって生じる脳損傷（すなわち、頭部外傷）；中枢神経系全体にわたる脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）（虚血性または溶血性）；多発性硬化症；てんかん；アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｌｏｔｒｏｐｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ルー・ゲーリック病）およびクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などの神経変性疾患が挙げられる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
軸索退縮に関連するニューロン損傷を治療するための方法であって、幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索退縮を低減し、前記軸索退縮に関連する神経損傷を低減するために、前記損傷に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することを含む方法。
（項目２）
軸索退縮をもたらすであろうジストロフィー軸索へのＥＤ−１＋細胞の接着を低減するための方法であって、幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、前記接着を低減するために、前記ジストロフィー軸索および／または前記ＥＤ−１＋細胞に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することを含む方法。
（項目３）
幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索退縮を低減するために、有効な量で十分な時間投与することにより、被験体における軸索退縮を低減するための方法。
（項目４）
前記ＥＤ−１＋細胞がマクロファージおよび／またはミクログリアである、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索再生を促進するために、有効な量で十分な時間投与することにより、被験体における軸索再生を促進するための方法。
（項目６）
前記分泌因子が、前記幹細胞を細胞培養培地中で培養することによって馴化した前記細胞培養培地中に存在する、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記幹細胞が、胚性幹細胞、ならびに複数の胚性胚葉の細胞型に分化し、かつ／またはｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、ｓｏｘ−２およびＳＳＥＡ４の１つまたは複数を発現する能力を有する非胚性幹細胞からなる群から選択される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記非胚性幹細胞が組織特異的幹細胞である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記組織特異的幹細胞が造血幹細胞、神経幹細胞または間葉系幹細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ニューロン損傷が、脊髄損傷、脳損傷、脳卒中、多発性硬化症、てんかんまたは神経変性疾患の結果である、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症およびクロイツフェルト・ヤコブ病である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記分泌因子が投与される、項目１から３または５のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記分泌因子が、前記幹細胞を培地中で培養することによって馴化した前記培地中に存在する、項目１２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、脊髄損傷後の再生不全の概略図である。
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索ダイバックの概略図である。
【図３−１】図３は、後柱圧壊後のマクロファージ浸潤および軸索ダイバックの実際の図およびグラフ表示である。マクロファージ浸潤は、脊髄損傷後の軸索退縮と相関している。脊髄損傷後に時間の経過に伴う上行性感覚軸索の大幅な退縮が存在する。Ａ、Ｂ、病変後の後柱圧壊（ＤＣＣ）脊髄損傷２日目（Ａ）および７日目（Ｂ）の厚さ２０μｍの縦方向切片の画像モンタージュを示す。Ｄｅｘ−ＴＲ、テキサスレッド結合デキストラン３０００ＭＷ。切片の向きは、尾側が画像の左側に、吻側が右側にくるようになっている。下の白色のボックスは、各時点の１匹の動物の複数の切片の重ね合わせた線維トレーシングによる病変の中心（点線）に対する軸索の位置を表す。ルーラーティックマークは、２００μｍきざみの増分を示す。Ａ、病変後２日目に、後根神経節（赤）が、ＧＦＡＰ＋反応性星状細胞（青）によりマークされた病変の中心の軸索切断の最初の部位から短距離退縮した。病変内に活性化ミクログリア細胞である可能性が最も高いいくつかのＥＤ−１＋細胞（緑）が存在する。Ｂ、病変後７日目までに、損傷した軸索（赤）が病変の中心から大幅に退縮した。病変および周囲組織が、主として浸潤性マクロファージであるＥＤ−１＋細胞（緑）で満たされているが、反応性星状細胞（青）が病変コアを空にした。Ｃ、平均軸索退縮の時間的推移を示すグラフ。退縮の大部分は病変後７日間に発生したが、試験期間である病変後２８日まで続いていた。軸索退縮（黒色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４、２８日目と有意に異なっている（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝６．５０、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＃ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１）。マクロファージ枯渇（赤色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４および２８日目と有意であり、４日目は１４および２８日目と有意であり、７日目は２および１４日目と有意である（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝２２．８３、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、２５０μｍ。
【図３−２】図３は、後柱圧壊後のマクロファージ浸潤および軸索ダイバックの実際の図およびグラフ表示である。マクロファージ浸潤は、脊髄損傷後の軸索退縮と相関している。脊髄損傷後に時間の経過に伴う上行性感覚軸索の大幅な退縮が存在する。Ａ、Ｂ、病変後の後柱圧壊（ＤＣＣ）脊髄損傷２日目（Ａ）および７日目（Ｂ）の厚さ２０μｍの縦方向切片の画像モンタージュを示す。Ｄｅｘ−ＴＲ、テキサスレッド結合デキストラン３０００ＭＷ。切片の向きは、尾側が画像の左側に、吻側が右側にくるようになっている。下の白色のボックスは、各時点の１匹の動物の複数の切片の重ね合わせた線維トレーシングによる病変の中心（点線）に対する軸索の位置を表す。ルーラーティックマークは、２００μｍきざみの増分を示す。Ａ、病変後２日目に、後根神経節（赤）が、ＧＦＡＰ＋反応性星状細胞（青）によりマークされた病変の中心の軸索切断の最初の部位から短距離退縮した。病変内に活性化ミクログリア細胞である可能性が最も高いいくつかのＥＤ−１＋細胞（緑）が存在する。Ｂ、病変後７日目までに、損傷した軸索（赤）が病変の中心から大幅に退縮した。病変および周囲組織が、主として浸潤性マクロファージであるＥＤ−１＋細胞（緑）で満たされているが、反応性星状細胞（青）が病変コアを空にした。Ｃ、平均軸索退縮の時間的推移を示すグラフ。退縮の大部分は病変後７日間に発生したが、試験期間である病変後２８日まで続いていた。軸索退縮（黒色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４、２８日目と有意に異なっている（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝６．５０、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＃ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１）。マクロファージ枯渇（赤色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４および２８日目と有意であり、４日目は１４および２８日目と有意であり、７日目は２および１４日目と有意である（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝２２．８３、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、２５０μｍ。
【図３−３】図３は、後柱圧壊後のマクロファージ浸潤および軸索ダイバックの実際の図およびグラフ表示である。マクロファージ浸潤は、脊髄損傷後の軸索退縮と相関している。脊髄損傷後に時間の経過に伴う上行性感覚軸索の大幅な退縮が存在する。Ａ、Ｂ、病変後の後柱圧壊（ＤＣＣ）脊髄損傷２日目（Ａ）および７日目（Ｂ）の厚さ２０μｍの縦方向切片の画像モンタージュを示す。Ｄｅｘ−ＴＲ、テキサスレッド結合デキストラン３０００ＭＷ。切片の向きは、尾側が画像の左側に、吻側が右側にくるようになっている。下の白色のボックスは、各時点の１匹の動物の複数の切片の重ね合わせた線維トレーシングによる病変の中心（点線）に対する軸索の位置を表す。ルーラーティックマークは、２００μｍきざみの増分を示す。Ａ、病変後２日目に、後根神経節（赤）が、ＧＦＡＰ＋反応性星状細胞（青）によりマークされた病変の中心の軸索切断の最初の部位から短距離退縮した。病変内に活性化ミクログリア細胞である可能性が最も高いいくつかのＥＤ−１＋細胞（緑）が存在する。Ｂ、病変後７日目までに、損傷した軸索（赤）が病変の中心から大幅に退縮した。病変および周囲組織が、主として浸潤性マクロファージであるＥＤ−１＋細胞（緑）で満たされているが、反応性星状細胞（青）が病変コアを空にした。Ｃ、平均軸索退縮の時間的推移を示すグラフ。退縮の大部分は病変後７日間に発生したが、試験期間である病変後２８日まで続いていた。軸索退縮（黒色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４、２８日目と有意に異なっている（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝６．５０、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＃ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１）。マクロファージ枯渇（赤色グラフ）は次の通りである：２日目は７、１４および２８日目と有意であり、４日目は１４および２８日目と有意であり、７日目は２および１４日目と有意である（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４，４０）＝２２．８３、ｐ＜０．００１；テュキーの事後検定、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、２５０μｍ。
【図４−１】図４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロンダイバックを誘発するマクロファージの経時的モンタージュを示す図である。マクロファージは、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるジストロフィー成体後根神経節軸索の大幅な退縮を誘発する。Ａ、成長促進細胞外マトリックス分子ラミニンおよび強力阻害性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの逆スポット勾配上で成長するジストロフィー成体後根神経節ニューロンの培養物に、ＮＲ８３８３マクロファージを添加した、低速度撮影動画からの単一フレーム画像の６パネルモンタージュ。各フレームの時間を各画像の右下に示し、矢印は成長円錐の中心ドメインを示す。アステリスクは、フレームシフト時の成長円錐の位置の基準としての培養物中の定点を示す。最初のマクロファージと成長円錐との接触は、３０分目のマクロファージの添加直後に行われた。６１分目に第２のマクロファージとジストロフィー軸索との間に物理的接触が認められる。１１０分目に退縮が始まったときに、その他のマクロファージが軸索の軌道を物理的に変化させた。１５０分目に成長円錐が多数のマクロファージにより見えなくなり、退縮してフレームからほぼ外れた状態になった。スケールバー、２０μｍ。Ｂ、Ａにおける完全な低速度撮影動画の成長円錐を追跡した位置グラフ。各ポイントは、単一フレームの成長円錐の中心ドメインの位置を表す（３０秒ごと）。軸索は、マクロファージ接触の後に約１００μｍという大規模な退縮を受けた。Ｃ、他の代表的な低速度撮影実験からの位置グラフ。
【図４−２】図４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロンダイバックを誘発するマクロファージの経時的モンタージュを示す図である。マクロファージは、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるジストロフィー成体後根神経節軸索の大幅な退縮を誘発する。Ａ、成長促進細胞外マトリックス分子ラミニンおよび強力阻害性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの逆スポット勾配上で成長するジストロフィー成体後根神経節ニューロンの培養物に、ＮＲ８３８３マクロファージを添加した、低速度撮影動画からの単一フレーム画像の６パネルモンタージュ。各フレームの時間を各画像の右下に示し、矢印は成長円錐の中心ドメインを示す。アステリスクは、フレームシフト時の成長円錐の位置の基準としての培養物中の定点を示す。最初のマクロファージと成長円錐との接触は、３０分目のマクロファージの添加直後に行われた。６１分目に第２のマクロファージとジストロフィー軸索との間に物理的接触が認められる。１１０分目に退縮が始まったときに、その他のマクロファージが軸索の軌道を物理的に変化させた。１５０分目に成長円錐が多数のマクロファージにより見えなくなり、退縮してフレームからほぼ外れた状態になった。スケールバー、２０μｍ。Ｂ、Ａにおける完全な低速度撮影動画の成長円錐を追跡した位置グラフ。各ポイントは、単一フレームの成長円錐の中心ドメインの位置を表す（３０秒ごと）。軸索は、マクロファージ接触の後に約１００μｍという大規模な退縮を受けた。Ｃ、他の代表的な低速度撮影実験からの位置グラフ。
【図５】図５は、軸索とマクロファージとの間で生じた接触を示す図である。マクロファージは、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてジストロフィー軸索と物理的に相互作用する。Ａ、マクロファージがジストロフィー軸索と物理的に接触している、低速度撮影の精選したフレーム。退縮が起こる前に、軸索が基質から持ち上げられ、著しく曲げられていた（矢印）間に成長円錐は依然として付着していた。Ｂ、図３Ａの第３の画像の高倍率像。マクロファージとジストロフィー軸索との間で数個所の接着接触が起こっていた。矢印は、マクロファージが軸索から離れたときに、これらの接触により形成された膜突起を示す。Ｃ、マクロファージ（緑）添加の２．５時間後の成体ＤＲＧニューロン（赤）の培養の４０倍共焦点ｚスタック３次元再構成。マクロファージがジストロフィー成長円錐と直接接触していることが認められる。Ｄ、３次元再構成の側面図を生じたｘ軸の周りにＣを９０°回転したもの。矢印は、隣接したマクロファージ（緑）により基質から持ち上げられたニューロン突起（赤）を示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、２０μｍ；Ｃ、５０μｍ。
【図６−１】図６は、マクロファージ接触による軸索ダイバックを妨げるＭＭＰ９阻害剤の低速度撮影モンタージュを示す図である。
【図６−２】図６は、マクロファージ接触による軸索ダイバックを妨げるＭＭＰ９阻害剤の低速度撮影モンタージュを示す図である。
【図７】図７は、マクロファージ誘発性後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンダイバックに対する外部添加生細胞（ＭＡＰＣ）または馴化培地の効果を評価するための実験設計を示す図である。
【図８−１】図８は、ＭＡＰＣの添加がマクロファージ誘発性ダイバックを予防することを示す、ＤＲＧと共培養したＭＡＰＣの低速度撮影モンタージュを示す図である。ＭＡＰＣは、マクロファージの添加の１日前に投与する。
【図８−２】図８は、ＭＡＰＣの添加がマクロファージ誘発性ダイバックを予防することを示す、ＤＲＧと共培養したＭＡＰＣの低速度撮影モンタージュを示す図である。ＭＡＰＣは、マクロファージの添加の１日前に投与する。
【図９−１】図９は、ＭＡＰＣ馴化培地がマクロファージ誘発性軸索ダイバックを予防することを示す実験の低速度撮影モンタージュを示す図である。馴化培地は、マクロファージの添加の３０分前に添加する。
【図９−２】図９は、ＭＡＰＣ馴化培地がマクロファージ誘発性軸索ダイバックを予防することを示す実験の低速度撮影モンタージュを示す図である。馴化培地は、マクロファージの添加の３０分前に添加する。
【図１０−１】図１０は、ＭＡＰＣ馴化培地により刺激したマクロファージが軸索ダイバックを誘発しないことを示す低速度撮影モンタージュを示す図である。
【図１０−２】図１０は、ＭＡＰＣ馴化培地により刺激したマクロファージが軸索ダイバックを誘発しないことを示す低速度撮影モンタージュを示す図である。
【図１１】図１１は、ＭＡＰＣがマクロファージ媒介性軸索ダイバックを予防することのグラフ表示を示す図である。
【図１２】図１２は、ＭＡＰＣまたは馴化培地を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の実験概要を示す図である。
【図１３】図１３は、ＭＡＰＣが後根圧壊損傷後のマクロファージ媒介性軸索ダイバックを予防し、病変コアへの再生を促進することを示す図である。ビヒクル対照またはＭＡＰＣを移植した損傷後７日脊髄切片のグラフおよび実際の表示。マクロファージは、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるジストロフィー成体後根神経節軸索の広範な退縮を誘発する。ＮＲ８３８マクロファージを、成長促進細胞外マトリックス分子ラミニンおよび強力抑制性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの逆スポット勾配上で成長するジストロフィー成体後根神経節ニューロンの培養に加えた。位置グラフは、完全な低速度撮影動画における成長円錐を追跡するものである。各ポイントは、単一フレームの成長円錐の中心ドメインの位置を表す（３０秒ごと）。軸索は、マクロファージ接触の後に約１００μｍという大規模な退縮を受けた。
【００２８】
パネルは、病変後７日目の後柱圧壊（ＤＣＣ）脊髄損傷の厚さ２０μｍの縦方向切片の１０倍画像モンタージュを示す。線維をテキサスレッド結合３０００ＭＷデキストランで標識し、マクロファージをＥＤ−１＋（紫）で視覚化している。切片の向きは、尾側が画像の左側に、吻側が右側にくるようになっている。下に病変の中心にマークし（黒実線）、各条件ごとの１匹の動物の複数の切片の３つの重ね合わせた線維トレーシングを示す。Ａ、病変およびビヒクル注射のみの後の７日目に、後根神経節軸索（赤）が病変の中心の軸索切断の開始部位から著しく遠い位置に退縮した。Ｂ、病変およびＭＡＰＣ移植後の７日目までに、損傷した軸索が数多く病変内に退縮した。Ｃ、ビヒクル対照またはＭＡＰＣ移植を受けた動物における損傷後２、４および７日にわたる平均軸索退縮を示すグラフ。条件、ＭＡＰＣ移植対ビヒクル対照は、一般的線型モデルにより互いに有意に異なっている、＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：Ａ、Ｂ、２００μｍ
【図１４−１】図１４は、ＮＧ２＋グリア細胞がマクロファージ誘発性軸索退縮を妨げないことを示す低速度撮影モンタージュを示す図である。ＮＧ２＋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軸索を安定化するが、マクロファージ攻撃の後のマクロファージ媒介性退縮を妨げない。Ａ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの２日後のアグリカンおよびラミニンの勾配上のベータチューブリン＋（赤）軸索の軸索とＮＧ２＋（緑）細胞との結合を示す４０倍共焦点像。縁を白色の点線により示す。Ｂ、ＮＧ２＋細胞がビメンチン（赤）を発現している。Ｃ、ＮＧ２＋細胞がネスチン（赤）を発現している。Ｄ、成体マウス脊髄ＮＧ２＋細胞の存在下でのアグリカン／ラミニン勾配上のマクロファージ／軸索相互作用を例示する低速度撮影動画の６つの代表的フレーム。ＮＲ８３８３マクロファージを成体ＤＲＧニューロンの２ＤＩＶ培養に加える。各フレームの時間を各画像の右下に示し、アステリスクはフレームシフト時の位置の基準としての培養皿上の定点を表す。矢印は、成長円錐の中心ドメインを示す。マクロファージを３０分の観察期間後に加え、最初の接触が１０３分目に起こる。軸索は１１０分までに既に長距離の退縮を受けていた。白矢印は、退縮線維の存在を示している。Ｅ、Ｄに示す低速度撮影動画の各フレーム（３０秒）の成長円錐の位置のグラフ。赤は、スポットの内側縁の位置を表す。矢印は、成長の最初の軌跡を示す。Ｆ、マクロファージとの接触後のアグリカン／ラミニンスポット勾配上のＮＧ２＋細胞を含む共培養中の６つのジストロフィー軸索の始点からの距離。矢じりは、軸索がＮＧ２細胞に退縮した位置を示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、Ｃ、５０μｍ。Ｄ、２０μｍ。
【図１４−２】図１４は、ＮＧ２＋グリア細胞がマクロファージ誘発性軸索退縮を妨げないことを示す低速度撮影モンタージュを示す図である。ＮＧ２＋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軸索を安定化するが、マクロファージ攻撃の後のマクロファージ媒介性退縮を妨げない。Ａ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの２日後のアグリカンおよびラミニンの勾配上のベータチューブリン＋（赤）軸索の軸索とＮＧ２＋（緑）細胞との結合を示す４０倍共焦点像。縁を白色の点線により示す。Ｂ、ＮＧ２＋細胞がビメンチン（赤）を発現している。Ｃ、ＮＧ２＋細胞がネスチン（赤）を発現している。Ｄ、成体マウス脊髄ＮＧ２＋細胞の存在下でのアグリカン／ラミニン勾配上のマクロファージ／軸索相互作用を例示する低速度撮影動画の６つの代表的フレーム。ＮＲ８３８３マクロファージを成体ＤＲＧニューロンの２ＤＩＶ培養に加える。各フレームの時間を各画像の右下に示し、アステリスクはフレームシフト時の位置の基準としての培養皿上の定点を表す。矢印は、成長円錐の中心ドメインを示す。マクロファージを３０分の観察期間後に加え、最初の接触が１０３分目に起こる。軸索は１１０分までに既に長距離の退縮を受けていた。白矢印は、退縮線維の存在を示している。Ｅ、Ｄに示す低速度撮影動画の各フレーム（３０秒）の成長円錐の位置のグラフ。赤は、スポットの内側縁の位置を表す。矢印は、成長の最初の軌跡を示す。Ｆ、マクロファージとの接触後のアグリカン／ラミニンスポット勾配上のＮＧ２＋細胞を含む共培養中の６つのジストロフィー軸索の始点からの距離。矢じりは、軸索がＮＧ２細胞に退縮した位置を示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、Ｃ、５０μｍ。Ｄ、２０μｍ。
【図１５】図１５は、スポット勾配単独上で培養したＭＡＰＣの共焦点像およびスポット勾配上でニューロンとともに成長しているＭＡＰＣの高倍率像を示す図である。
【００２９】
ＣＳ５６（赤）およびラミニンにより視覚化したアグリカンの２方向性勾配上で培養したＧＦＰ＋ＭＡＰＣ（緑）の１０倍共焦点像。βチューブリン（青）により視覚化した生体ＤＲＧニューロンと共培養したＭＡＰＣの４０倍共焦点像。成体ＤＲＧおよびＭＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日後に阻止スポット縁を越えていない。
【００３０】
アグリカンのスポット勾配に添加されたＭＡＰＣは、阻害縁を侵さなかったが、スポットの中心に十分に接着し、成体ＤＲＧ軸索と結合した。
【図１６】図１６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軸索伸長に対する対照培地またはＭＡＰＣ馴化培地の影響のグラフ表示および実際の描写を示す図である。
【図１７−１】図１７は、対照培地がマクロファージ誘発性軸索ダイバックを予防しないことを示す実験の低速度撮影モンタージュを示す図である。馴化培地は、マクロファージの添加の３０分前に加える。
【００３１】
マクロファージは、対照ＭＡＰＣ培地の存在にもかかわらず、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるジストロフィー成体後根神経節軸索の大幅な退縮を誘発する。Ａ、ＮＲ８３８３マクロファージを、成長促進細胞外マトリックス分子ラミニンおよび強力抑制性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの逆スポット勾配上で成長するジストロフィー成体後根神経節ニューロンの培養に加えた低速度撮影動画からの単一フレーム画像の６パネルモンタージュ。各フレームの時間を各画像の右下に示し、矢印は成長円錐の中心ドメインを示す。アステリスクは、フレームシフト時の成長円錐の位置の基準としての培養中の定点を示す。スケールバー、２０μｍ。Ｂ、Ａにおける完全な低速度撮影動画の成長円錐を追跡した位置グラフ。各ポイントは、単一フレームの成長円錐の中心ドメインの位置を表す（３０秒ごと）。軸索は、マクロファージ接触の後に約８０μｍという大規模な退縮を受けた。
【００３２】
低速度撮影皿へのＭＡＰＣ馴化培地の直接の添加が成長円錐の形態のジストロフィー膠着（ｓｔａｌｌｅｄ）状態から運動性扁平状態への変化をもたらした。マクロファージがこれらの軸索に依然として接触していたが、接触は、一般的に一過性であり、一般的に軸索退縮をもたらさなかった。対照ＭＡＰＣ培地は、軸索退縮を予防しなかった。ＭＡＰＣ馴化培地で前処理したマクロファージもスポット上の軸索に接触したが、退縮を引き起こさなかった（図９〜１２）。ＭＡＰＣがマクロファージに作用して、それらの受容体発現、損傷細胞に対する反応またはＭＭＰ−９の分泌を変化させた可能性がある。
【図１７−２】図１７は、対照培地がマクロファージ誘発性軸索ダイバックを予防しないことを示す実験の低速度撮影モンタージュを示す図である。馴化培地は、マクロファージの添加の３０分前に加える。
【００３３】
マクロファージは、対照ＭＡＰＣ培地の存在にもかかわらず、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるジストロフィー成体後根神経節軸索の大幅な退縮を誘発する。Ａ、ＮＲ８３８３マクロファージを、成長促進細胞外マトリックス分子ラミニンおよび強力抑制性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの逆スポット勾配上で成長するジストロフィー成体後根神経節ニューロンの培養に加えた低速度撮影動画からの単一フレーム画像の６パネルモンタージュ。各フレームの時間を各画像の右下に示し、矢印は成長円錐の中心ドメインを示す。アステリスクは、フレームシフト時の成長円錐の位置の基準としての培養中の定点を示す。スケールバー、２０μｍ。Ｂ、Ａにおける完全な低速度撮影動画の成長円錐を追跡した位置グラフ。各ポイントは、単一フレームの成長円錐の中心ドメインの位置を表す（３０秒ごと）。軸索は、マクロファージ接触の後に約８０μｍという大規模な退縮を受けた。
【００３４】
低速度撮影皿へのＭＡＰＣ馴化培地の直接の添加が成長円錐の形態のジストロフィー膠着（ｓｔａｌｌｅｄ）状態から運動性扁平状態への変化をもたらした。マクロファージがこれらの軸索に依然として接触していたが、接触は、一般的に一過性であり、一般的に軸索退縮をもたらさなかった。対照ＭＡＰＣ培地は、軸索退縮を予防しなかった。ＭＡＰＣ馴化培地で前処理したマクロファージもスポット上の軸索に接触したが、退縮を引き起こさなかった（図９〜１２）。ＭＡＰＣがマクロファージに作用して、それらの受容体発現、損傷細胞に対する反応またはＭＭＰ−９の分泌を変化させた可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は本明細書において、１つまたは複数；少なくとも１つを意味する。複数形は、本明細書において使用される場合、一般に単数を含む。
【００３６】
本明細書において、「接着する（ａｄｈｅｒｅ）、付着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）、接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）」などの用語は、軸索退縮を誘発するのに十分な期間の結合を指す。本明細書においてさらに述べると、マクロファージ（または他の細胞）とジストロフィー軸索の間で、一過性で軸索退縮を生じない物理的接触が起こり得ることが理解される。本発明の状況の中で、本発明の試薬によって低減または予防される付着は、軸索退縮を誘発するのに十分な期間起こるものである。したがって、本発明は、ジストロフィー軸索とＥＤ−１＋細胞の間の物理的接触を可能にする試薬を排除しない。したがって、本発明は、接触（例えば、一過性の物理的接触）可能にするが、軸索ダイバックをもたらすのに十分な時間の付着を可能にしない試薬を包含する。
【００３７】
「同時投与する」は、２つ以上の作用物質の同時投与または連続投与を含めて、互いと併用して、一緒に、協調的に投与すること意味する。
【００３８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定するものではないが、必ずしも他に含まれ得るものに対して制限または排除することなく、指示対象を含むこと意味する。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」は、組成物中に他のどんな成分が存在しようとも、ｘおよびｙを含有する任意の組成物を包含する。同様に、「ｘのステップを含む方法」は、ｘが方法における唯一のステップであろうと、複数のステップのうちの１つだけであろうと、どんなに多くの他のステップが存在しようと、それらと比較してｘがどんなに簡単または複雑であろうと、ｘが実施される任意の方法を包含する。語根「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語を使用した「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」および類似の句は、本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の同義語として使用され、同一の意味を有する。
【００３９】
「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の同義語である（上記参照）。
【００４０】
「馴化細胞培養培地」は、当技術分野で周知の用語であり、細胞を増殖させた培地を指す。本明細書においてこの用語は、ジストロフィーニューロンへの活性化マクロファージの接着を低減し、かつ／または神経突起伸長／軸索再生を促進するのに有効な因子を分泌するのに十分な時間、細胞を増殖させることを意味する。
【００４１】
馴化細胞培養培地は、培地中に因子が分泌されるように細胞を培養した培地を指す。本発明の目的では、培地がジストロフィーニューロンへのマクロファージの接着を低減し、したがって軸索退縮を低減し、かつ／または神経突起伸長／軸索再生を促進するように、このような因子の有効量を産生するのに十分な回数の細胞分裂によって細胞を増殖させることができる。細胞は、それだけには限定されないが、遠心分離、ろ過、免疫除去（例えば、タグ付き抗体および磁性カラムを介した）およびＦＡＣＳソーティングを含めた、当技術分野で既知の方法のいずれかによって培地から除去される。
【００４２】
「ダイバック」は、軸索への外傷の結果として起こる軸索退縮を指すのに使用される専門用語である。本発明の状況の中では、軸索退縮は、ＥＤ−１＋細胞、特にマクロファージおよびミクログリアの十分な付着の結果として起こるものを指す。このようなマクロファージおよびミクログリア（すなわち、ＥＤ−１＋細胞）は、休止または不活性の状態ではない。これらは活性化されている。「活性化される」という用語は、軸索退縮をもたらすように細胞がジストロフィー軸索に接着するのを可能にする、これらの細胞の状態を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化をもたらす条件の例は、本願明細書においてさらに記載される。しかし、このような活性化は、本明細書において開示される特定の条件に制限されないことが理解されよう。
【００４３】
本発明は活性化マクロファージを特に対象とする（また、それによって例示される）ことが多いが、これらはＥＤ−１＋細胞のクラスにあり、本発明はこのような細胞の他のものにも関する。一例としては活性化ミクログリアがある。
【００４４】
「有効量」は一般に、所望の局所または全身作用をもたらす量を意味する。例えば、有効量は、有益なまたは所望の臨床結果を実現するのに十分な量である。有効量は、単回投与で一度に、または数回の投与で有効量をもたらす分割量として提供することができる。有効量と見なされる量についての正確な決定は、そのサイズ、年齢、損傷、および／または治療されている疾患もしくは損傷、および損傷が起こってから、もしくは疾患が開始してからの時間を含めた、各被験体に特有の因子に基づくことができる。当業者であれば、当技術分野で通常のこれらの考慮事項に基づいて、所与の被験体にとっての有効量を決定することができよう。本明細書において、「有効用量」は「有効量」と同一の意味を有する。
【００４５】
「有効な経路」は一般に、所望の区画、系または場所に対する作用物質の送達を提供する経路を意味する。例えば、有効な経路は、作用物質を投与して、有益なまたは所望の臨床結果を実現するのに十分な量の作用物質を所望の作用部位に提供することができる経路である。
【００４６】
「ＥＣ細胞」は、奇形癌腫と呼ばれる癌の種類の分析から発見された。１９６４年に、奇形癌腫の単一細胞が単離され、培養物中で未分化のまま維持できることが研究者らによって認められた。この種の幹細胞は、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）として知られるようになった。
【００４７】
「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」は、当技術分野で周知であり、何年にもわたり多くの異なる哺乳動物種から調製されている。胚性幹細胞は、胚盤胞として知られる初期胚の内部細胞塊に由来する幹細胞である。胚性幹細胞は、３種の一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉のあらゆる派生物に分化することができる。これらの派生物には、成体において２２０を超える細胞型のそれぞれが含まれる。ＥＳ細胞は、胎盤を除いて体のどんな組織にもなることができる。桑実胚の細胞だけが全能性であり、すべての組織および胎盤になることができる。
【００４８】
「含む、挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語の使用は、限定を意図するものではない。例えば、抗体阻害剤は断片および変異体を「含む」と述べることは、抗体阻害剤の他の形が排除されることを意味しない。
【００４９】
「人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣまたはＩＰＳ細胞）」は、例えば、未分化の表現型を体細胞に付与する外来遺伝子を導入することによって再プログラムされた体細胞である。次いで、これらの細胞を、未分化の子孫に分化するように誘導することができる。ＩＰＳ細胞は、２００６年に最初に発見された手法の変法を使用して得られている（Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１巻：３９〜４９頁（２００７年））。例えば、ある場合においては、ＩＰＳ細胞を生み出すために、科学者らは皮膚細胞から始め、次いで、レトロウイルスを使用した標準的な実験技法により遺伝子が細胞ＤＮＡに挿入されるようにこの皮膚細胞を改変した。ある場合においては、挿入される遺伝子は、細胞を胚性幹細胞様の状態にしておくように自然の制御因子として一緒に働くことがわかっているＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｆ４およびｃ−ｍｙｃである。これらの細胞は文献で報告されている。例えば、Ｗｅｒｎｉｇら、ＰＮＡＳ、１０５巻：５８５６〜５８６１頁（２００８年）；Ｊａｅｎｉｓｃｈら、Ｃｅｌｌ、１３２巻：５６７〜５８２頁（２００８年）；Ｈａｎｎａら、Ｃｅｌｌ、１３３巻：２５０〜２６４頁（２００８年）；およびＢｒａｍｂｒｉｎｋら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２巻：１５１〜１５９頁（２００８年）を参照のこと。これらの参考文献は、ＩＰＳＣおよびその生成方法の教示に関して参照により組み込まれる。このような細胞は、特定の培養条件（特定の作用物質への曝露）によって生み出すことができることも可能である。
【００５０】
「単離された」という用語は、１種または複数の細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏでは１種または複数の細胞に関連している１種もしくは複数の細胞または１種もしくは複数の細胞成分に関連していないことを指す。「濃縮された集団」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは一次培養物における所望の細胞の数の、１種または複数の他の細胞型に対する相対的な増加を意味する。
【００５１】
しかし、本明細書において、「単離された」という用語は、幹細胞だけの存在を示すものではない。むしろ、「単離された」という用語は、細胞がその自然の組織環境から取り出され、通常の組織環境と比較して高い濃度で存在することを示す。したがって、「単離された」細胞集団は、幹細胞以外の細胞型をさらに含むことがあり、別の組織成分を含むこともある。これは、例えば、細胞倍加という用語で表現することもできる。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはその元の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、脂肪組織など）におけるその元の数と比較して多く含まれるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで１０、２０、３０、４０以上の倍加を受けることができる。
【００５２】
「ＭＡＰＣ」は「複能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」の頭字語である。それは非胚性幹細胞を指す。ＭＡＰＣの「成体（ａｄｕｌｔ）」という用語は非制限的である。それは非胚性体細胞を指す。胚性幹細胞と同様に、ＭＡＰＣは、複数の胚葉の細胞系譜を生じることができる。ＭＡＰＣは、分化すると３種すべての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞型を生じ得る。胚性幹細胞と同様に、ヒトＭＡＰＣはテロメラーゼ、Ｏｃｔ３／４（すなわち、Ｏｃｔ３Ａ）、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１およびｓｏｘ−２を発現し、ＳＳＥＡ−４を発現する可能性がある（Ｊｉａｎｇ，  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：４１頁（２００２年）；Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３０巻：８９６頁（２００２年）も参照のこと）。テロメアがＭＡＰＣに広がっており、これらは核型が正常である。哺乳動物に注入されたＭＡＰＣは複数の器官に移動し、それと同化することができるので、ＭＡＰＣは自己再生する幹細胞である。ＭＡＰＣに関する「複能性の」は、分化すると複数の、例えば３つすべての原始胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞系譜を生じる能力を指す。
【００５３】
「神経突起伸長」は、損傷部位のニューロンが退縮しなくなるだけでなく、成長し伸展する性質を指す。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」は、本発明において使用される細胞にとっての任意の薬学的に許容される媒体である。このような媒体は、等張性、細胞代謝、ｐＨなどを保持することができる。この媒体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの被験体への投与に適合性であり、したがって、細胞送達および治療に使用することができる。
【００５５】
「始原胚性生殖細胞」（ＰＧ細胞またはＥＧ細胞）は、多くの未分化細胞型を産生するように培養および刺激することができる。
【００５６】
「前駆細胞」は、その最終分化した子孫の特徴のすべてではないが一部を有する、幹細胞の分化の間に産生される細胞である。「心臓前駆細胞」などの定義される前駆細胞は、特定の細胞型または最終分化した細胞型ではなく、ある系列に運命付けられる。頭字語「ＭＡＰＣ」に使用される「前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」という用語は、これらの細胞を特定の系列に限定しない。
【００５７】
本明細書において「低減する」という用語は、予防ならびに減少させることを意味する。治療の状況では、「低減する」ことは、１種または複数の臨床症状を予防または回復させることである。臨床症状は、未治療のままにしておくと被験体の生活の質（健康）に悪影響を及ぼす、または及ぼすことになる１つ（または複数）の症状である。
【００５８】
「退縮」という用語は、グリア瘢痕が形成する場所などの損傷部位から軸索が後退することを指す。ここで、再生軸索の末端は伸長を停止し、ジストロフィー性になる。次いで、これらのジストロフィー末端は、グリア瘢痕および損傷部位からさらに後退する可能性がある。
【００５９】
「自己再生」は、複製された娘幹細胞を産生する能力を指し、その娘幹細胞はそれを生み出した細胞と同一の分化能を有する。この状況で使用される類似の用語は「増殖」である。
【００６０】
「幹細胞」は、自己再生（すなわち、同じ分化能を有する子孫）を起こし、さらには分化能がより制限された子孫細胞を産生することができる細胞を意味する。本発明の状況の中では、幹細胞は、例えば、核移植、より原始の幹細胞との融合、特定の転写因子の導入、または特定の条件下での培養により脱分化された、より分化した細胞も包含するであろう。例えば、Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３８５巻：８１０〜８１３頁（１９９７年）；Ｙｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６巻：５４５〜５４８頁（２００２年）；Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻：１１９９〜１２０３頁（２００６年）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）；Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻：３１３〜３１７頁（２００７年）；およびＴａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１巻：８６１〜８７２頁（２００７年）を参照のこと。
【００６１】
脱分化は、ある化合物の投与または脱分化を引き起こすであろうｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの物理的な環境への曝露によって引き起こすこともできる。幹細胞は、奇形癌腫などの病的組織および胚様体（これらは、内部細胞塊に直接的に由来しないが胚組織に由来する点から、胚性幹細胞と見なすことができる）などのいくつかの他の供給源に由来するものでもよい。幹細胞は、幹細胞機能に関連する遺伝子を人工多能性幹細胞などの非幹細胞に導入することによって産生することもできる。
【００６２】
「被験体」は、ヒトなどの哺乳動物などの脊椎動物を意味する。哺乳動物としては、それだけには限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびブタが挙げられる。
【００６３】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物において任意の治療応答が生じるように決定される量を指す。例えば、有効量の治療用細胞または細胞関連作用物質は、患者の生存性を延長し、かつ／または明らかな臨床症状を阻害することができる。本明細書において使用される用語の意味の範囲内で治療上有効な治療には、疾患の転帰それ自体を改善しなくても被験体の生活の質を改善する治療も含まれる。このような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。したがって、「治療する」ことは、このような量を送達することを意味する。したがって、治療することにより、ジストロフィー軸索への活性化マクロファージの付着によって起こる任意の病的な症状を予防または回復させることができる。治療することはさらに、軸索再生の有益な臨床効果を指す。
【００６４】
「治療する」、「治療すること」または「治療」は、本発明に関して広く使用され、それぞれこのような用語は、療法を妨害するものおよび／または療法に起因するものを含めた、欠損、機能障害、疾患または他の有害な過程を、とりわけ、予防すること、回復させること、阻害することまたは治癒することを包含する。
【００６５】
幹細胞
本発明は、好ましくは、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、他の非ヒト哺乳類などの脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することができる。これらの幹細胞としては、それだけには限定されないが、以下に記載する細胞が挙げられる。
【００６６】
胚性幹細胞
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、無制限な自己再生および複能性分化能を有するので、最も詳細に研究されている幹細胞となっている。これらの細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から得る。または移植後胚の始原生殖細胞から得ることもできる（胚性生殖細胞すなわちＥＧ細胞）。ＥＳおよびＥＧ細胞は、最初にマウスから、それより後になって多くの異なった動物から得られ、さらに最近になって非ヒト霊長類およびヒトからも得られた。マウス胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入された際に、ＥＳＣは、動物のすべての組織に寄与できる。ＳＳＥＡ１（マウス）およびＳＳＥＡ４（ヒト）に対する抗体で陽性染色することによって、ＥＳおよびＥＧ細胞を同定することができる。例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６５６，４７９号、同第５，６７０，３７２号、同第５，８４３，７８０号、同第５，８７４，３０１号、同第５，９１４，２６８号、同第６，１１０，７３９号、同第６，１９０，９１０号、同第６，２００，８０６号、同第６，４３２，７１１号、同第６，４３６，７０１号、同第６，５００，６６８号、同第６，７０３，２７９号、同第６，８７５，６０７号、同第７，０２９，９１３号、同第７，１１２，４３７号、同第７，１４５，０５７号、同第７，１５３，６８４号および同第７，２９４，５０８号を参照のこと。これらのそれぞれは、胚性幹細胞およびそれらを作製し増殖させる方法の教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ＥＳＣおよびそれらを単離し増殖させる方法は当技術分野で周知である。
【００６７】
胚性幹細胞の能力状態にｉｎ  ｖｉｖｏで影響を与える多くの転写因子および外因性サイトカインが同定されている。幹細胞多能性に関与していることが最初に記載された転写因子はＯｃｔ４である。Ｏｃｔ４は、転写因子のＰＯＵ（Ｐｉｔ−Ｏｃｔ−Ｕｎｃ）ファミリーに属し、「八量体モチーフ」と呼ばれる八量体配列をプロモーターまたはエンハンサー領域内に含有する遺伝子の転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質である。Ｏｃｔ４は、受精した接合体の卵割期の時期に、卵筒が形成されるまで発現される。Ｏｃｔ３／４の機能は、分化誘導遺伝子（すなわち、ＦｏｘａＤ３、ｈＣＧ）を抑制し、多能性を促進する遺伝子（ＦＧＦ４、Ｕｔｆｌ、Ｒｅｘ１）を活性化することである。高移動群（ＨＭＧ）ボックス転写因子の一員であるＳｏｘ２は、Ｏｃｔ４と協働して、内部細胞塊で発現される遺伝子の転写を活性化する。胚性幹細胞におけるＯｃｔ３／４発現が特定のレベルの間に維持されることが必須である。Ｏｃｔ４発現レベルの＞５０％の過剰発現または下方制御は胚性幹細胞の運命を改変し、それぞれ原始内胚葉／中胚葉または栄養外胚葉を形成することになる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｏｃｔ４欠失胚は、胚盤胞期まで発生するが、その内部細胞塊細胞は多能性でない。代わりに、それらは、胚体外栄養芽細胞系列に沿って分化する。哺乳類Ｓｐａｌｔ転写因子であるＳａｌｌ４は、Ｏｃｔ４の上流調節因子であり、したがって、胚発生の初期段階中にＯｃｔ４の適切なレベルを維持するために重要である。Ｓａｌｌ４レベルが特定の閾値の下まで下がると、栄養芽細胞は、異所的に内部細胞塊へと増殖することになる。多能性に必要な別の転写因子はＮａｎｏｇである。これは、常若の地を意味するケルト部族「Ｔｉｒ  Ｎａｎ  Ｏｇ」にちなんだ命名である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｎａｎｏｇは、小型化桑実胚期から発現され、続いて内部細胞塊に限定され、着床期に下方制御される。Ｎａｎｏｇの下方制御は、制御されない多能性細胞の増殖を避けるため、および原腸形成中の多系列分化を可能にするために重要であり得る。５．５日目に単離されたＮａｎｏｇ欠失胚は、主として胚体外内胚葉を含有し、かついかなる識別可能なエピブラストも含有しない混乱した胚盤胞から成る。
【００６８】
非胚性幹細胞
幹細胞はほとんどの組織で同定されている。おそらく最も詳細に特徴付けられているのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、細胞表面マーカーおよび機能的特性を用いて精製できる中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝、および卵黄嚢から単離されている。ＨＳＣは、造血作用を開始し、複数の造血系列を生成する。致死線量照射動物に移植された場合、ＨＳＣは、赤血球系、好中球マクロファージ、巨核球、およびリンパ球系の造血細胞プールの再増殖を可能にする。いくつかの自己再生細胞分裂を行うようにＨＳＣを誘導することもできる。例えば、米国特許第５，６３５，３８７号、同第５，４６０，９６４号、同第５，６７７，１３６号、同第５，７５０，３９７号、同第５，６８１，５９９号および同第５，７１６，８２７号を参照のこと。米国特許第５，１９２，５５３号は、ヒト新生児または胎児の造血幹細胞または前駆細胞を単離する方法を報告している。米国特許第５，７１６，８２７号は、Ｔｈｙ−１＋前駆体であるヒト造血細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらを再生させるのに適した増殖培地とを報告している。米国特許第５，６３５，３８７号は、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体を培養する方法およびデバイスを報告している。米国特許第６，０１５，５５４号は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構成する方法を記載している。したがって、ＨＳＣおよびそれらを単離し増殖させる方法は当技術分野で周知である。
【００６９】
当技術分野で周知の別の幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖し、少なくともいくつかの神経細胞を継続的に再生できる。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養する場合、増殖するように、さらに様々なタイプのニューロンおよびグリア細胞に分化するように神経幹細胞を誘導することができる。脳に移植する場合、神経幹細胞は、神経細胞およびグリア細胞を植え込み、生成することができる。例えば、Ｇａｇｅ  Ｆ．Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻、１４３３〜１４３８頁（２０００年）、Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  Ｓ．Ｎ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、９巻、４９９〜５１３頁（１９９９年）、およびＯｋａｂｅ  Ｓ．ら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、５９巻、８９〜１０２頁（１９９６年）を参照のこと。米国特許第５，８５１，８３２号は、脳組織から得られる多能性神経幹細胞を報告している。米国特許第５，７６６，９４８号は、新生児大脳半球からの神経芽細胞の産生を報告している。米国特許第５，５６４，１８３号および第５，８４９，５５３号は、哺乳類神経冠幹細胞の使用を報告している。米国特許第６，０４０，１８０号は、哺乳類多能性ＣＮＳ幹細胞の培養物からの分化ニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成を報告する。国際公開第９８／５０５２６号および国際公開第９９／０１１５９号は、神経上皮幹細胞、乏突起グリア細胞−星状細胞前駆体、および系列限定神経前駆体の生成および単離を報告している。米国特許第５，９６８，８２９号は、胚前脳から得られた神経幹細胞を報告している。したがって、神経幹細胞およびそれらを作製し増殖させる方法は当技術分野で周知である。
【００７０】
当技術分野で詳細に研究されている別の幹細胞は、間充織幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣは、胚性中胚葉から得られ、とりわけ成人骨髄、末梢血、脂肪、胎盤、および臍帯血を含めた多くの供給源から単離できる。ＭＳＣは、筋、骨、軟骨、脂肪および腱を含めた多くの中胚葉性組織に分化できる。これらの細胞について多数の文献がある。例えば、米国特許第５，４８６，３８９号、同第５，８２７，７３５号、同第５，８１１，０９４号、同第５，７３６，３９６号、同第５，８３７，５３９号、同第５，８３７，６７０号および同第５，８２７，７４０号を参照のこと。Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻、１４３〜１４７頁（１９９９年）も参照のこと。
【００７１】
成体幹細胞の別の例は、脂肪由来成体幹細胞（ＡＤＳＣ）である。ＡＤＳＣは通常、脂肪吸引と、それに続くコラゲナーゼを用いたＡＤＳＣの放出とによって、脂肪から単離されている。ＡＤＳＣは、はるかに多くの細胞を脂肪から単離できることを除いて、様々な意味で骨髄から得られるＭＳＣに類似している。これらの細胞は、骨、脂肪、筋、軟骨、およびニューロンに分化することが報告されている。単離の方法は、米国特許出願公開第２００５／０１５３４４２号に記載されている。
【００７２】
当技術分野で公知の他の幹細胞としては、「卵形細胞」とも呼ばれる胃腸幹細胞、表皮幹細胞および肝幹細胞が挙げられる（Ｐｏｔｔｅｎ，  Ｃ．ら、Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５３巻、８２１〜８３０号（１９９８年）、Ｗａｔｔ，  Ｆ．、Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５３巻、８３１頁（１９９７年）、Ａｌｉｓｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２９巻、６７８〜６８３頁（１９９８年））。
【００７３】
複数の胚葉の細胞型に分化できると報告されている他の非胚性細胞としては、それだけには限定されないが、臍帯血からの細胞（米国特許出願公開第２００２／０１６４７９４号を参照）、胎盤（米国特許出願公開第２００３／０１８１２６９号を参照）、臍帯マトリックス（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｋ．Ｅ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２１巻、５０〜６０頁（２００３年））、小さな胚様幹細胞（ｓｍａｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（Ｋｕｃｉａ，  Ｍ．ら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５７巻補５号、５〜１８頁（２００６年））、羊水幹細胞（Ａｔａｌａ，  Ａ．、Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ、１巻、８３〜９６頁（２００７年））、皮膚由来前駆細胞（Ｔｏｍａら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３巻、７７８〜７８４頁（２００１年））、および骨髄（米国特許出願公開第２００３／００５９４１４号および同第２００６／０１４７２４６号を参照）が挙げられる。これらの開示のそれぞれは、これらの細胞の教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
体細胞を再プログラムする戦略
核移植、細胞融合、培養誘発再プログラム化などのいくつかの異なった戦略が、分化細胞から胚状態への転換を誘導するのに用いられている。核移植は、除核された卵細胞に体細胞核を注入するものであり、代理母内への移植によって、クローンを生み出すことができ（「生殖的クローニング」）、または、培養における外植によって、遺伝学的に一致した胚性幹（ＥＳ）細胞を生み出すことができる（「体細胞核移植」、ＳＣＮＴ）。ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合は、多能性ＥＳ細胞のすべての特徴を示すハイブリッドの生成をもたらす。培養における体細胞の外植は、多能性または複能性であり得る不死化細胞株を選択する。現在のところ、精原幹細胞は、出生後動物から得ることができる多能性細胞の唯一の供給源である。特定の因子を用いた体細胞の形質導入によって、多能性状態への再プログラム化を開始させることができる。これらの実験的なアプローチは広範に総説されている（ＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻、１０６１〜１０６７頁（２００６年）、およびＹａｍａｎａｋａ，  Ｓ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１巻、３９〜４９頁（２００７年））。
【００７５】
核移植
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）とも呼ばれる核移植（ＮＴ）は、ヒツジのドリーなどのクローン動物を生成するための、ドナー体細胞から、除核された卵母細胞への核の導入を指す（Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３８５巻、８１０〜８１３頁（１９９７年）。ＮＴによる生きた動物の生成は、最終分化細胞のものを含めた体細胞の後成的状態が、安定ではあるが不可逆的に固定されておらず、新規の生物の発生を指示できる胚状態に再プログラムできることを実証した。胚発生および疾患に関与する基本的な後成的作用機序を解明するための興味深い実験的アプローチの提供に加えて、核クローニング技術は、患者特異的な移植薬のための潜在的関心対象でもある。
体細胞と胚性幹細胞との融合
未分化状態への体細胞性核の後成的再プログラム化は、体細胞との胚性細胞の融合によって産生されたマウスハイブリッドで実証された。様々な体細胞と胚性癌腫細胞（Ｓｏｌｔｅｒ，  Ｄ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、７巻、３１９〜３２７頁（２００６年））、胚性生殖細胞（ＥＧ）またはＥＳ細胞（ＺｗａｋａおよびＴｈｏｍｓｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３２巻、２２７〜２３３頁（２００５年））との間のハイブリッドは、親の胚性細胞と多くの特徴を共有しており、多能性表現型がそのような融合産物で優性であることを示している。マウス（Ｔａｄａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１１巻、１５５３〜１５５８頁（２００１年））と同様に、ヒトＥＳ細胞は、融合後に体細胞核を再プログラムする能力を有する（Ｃｏｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻、１３６９〜１３７３頁（２００５年）；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、１９１７〜１９２０頁（２００６年））。Ｏｃｔ４などのサイレント多能性マーカーの活性化または不活性な体細胞Ｘ染色体の再活性は、ハイブリッド細胞内の体細胞ゲノムの再プログラム化の分子的証拠を提供した。融合の２日後に最初に観察されるＤＮＡ複製が多能性マーカーの活性化に必須であること（ＤｏおよびＳｃｈｏｌｅｒ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２巻、９４１〜９４９頁（２００４年））、および神経幹細胞に融合する際に、ＥＳ細胞内のＮａｎｏｇの強制的過剰発現が多能性を促進すること（Ｓｉｌｖａら、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻、９９７〜１００１頁（２００６年））が示唆されている。
培養誘導再プログラム化
多能性細胞は、割球および胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）などの胚供給源（ＥＳ細胞）、エピブラスト（ＥｐｉＳＣ細胞）、始原生殖細胞（ＥＧ細胞）および出生後精原幹細胞（「ｍａＧＳＣｓｍ」「ＥＳ様」細胞）から得られている。以下の多能性細胞は、それらのドナー細胞／組織と共に以下の通りである：マウス卵母細胞から単為生殖（ｐａｒｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）ＥＳ細胞が得られている（Ｎａｒａｓｉｍｈａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、７巻、８８１〜８８４頁（１９９７年））；割球から胚性幹細胞が得られている（Ｗａｋａｙａｍａら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２５巻、９８６〜９９３頁（２００７年））；内部細胞塊細胞（供給源は該当しない）（Ｅｇｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４２８巻、４４〜４９頁（２００４年））；始原生殖細胞から胚性生殖細胞および胎生期癌細胞が得られている（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ、７０巻、８４１〜８４７頁（１９９２年））；精原幹細胞からＧＭＣＳ、ｍａＳＳＣおよびＭＡＳＣが得られている（Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻、１１９９〜１２０３頁（２００６年）；Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｃｅｌｌ、１１９巻、１００１〜１０１２頁（２００４年）；およびＳｅａｎｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４４９巻、３４６〜３５０頁（２００７年））；エピブラストからＥｐｉＳＣ細胞が得られている（Ｂｒｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻、１９１〜１９５頁（２００７年）；Ｔｅｓａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻、１９６〜１９９頁（２００７年））；ヒト卵母細胞から単為生殖ＥＳ細胞が得られている（Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５Ｌ８１９頁（２００２年）；Ｒｅｖａｚｏｖａら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、９巻、４３２〜４４９頁（２００７年））；ヒト胚盤胞からヒトＥＳ細胞が得られている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２巻、１１４５〜１１４７頁（１９９８年））；骨髄からＭＡＰＣが得られている（Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、４１〜４９頁（２００２年）；ＰｈｉｎｎｅｙおよびＰｒｏｃｋｏｐ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２５巻、２８９６〜２９０２頁（２００７年））；臍帯血細胞（臍帯血から得られる）（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３５巻、１７５３〜１７６５頁（２００７年））；神経細胞から得られる神経球由来細胞（Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８巻、１６６０〜１６６３頁（２０００年））。ＰＧＣまたは精原幹細胞などの生殖細胞系列から得られるドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単能性であることが公知であるが、長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後に多能性のＥＳ様細胞（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１９巻、１００１〜１０１２頁（２００４年）またはｍａＧＳＣ（Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻、１１９９〜１２０３頁（２００６年）が単離できる。これらの多分化能細胞型の大部分はｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化および奇形腫形成が可能であったが、ＥＳ、ＥＧ、ＥＣ、および精原幹細胞由来のｍａＧＣＳまたはＥＳ様細胞のみが、出生後キメラを形成して生殖系列に寄与することができたので、より厳格な判定規準で多能性であった。最近、成体マウスの精巣精原幹細胞から多能性成体精原幹細胞（ＭＡＳＣ）が得られ、これらの細胞は、ＥＳ細胞の発現プロファイル（Ｓｅａｎｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４４９巻、３４６〜３５０頁（２００７年））とは異なるが、移植後マウス胚のエピブラストから得られたＥｐｉＳＣ細胞に類似した発現プロファイルを有していた（Ｂｒｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻、１９１〜１９５頁（２００７年）；Ｔｅｓａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻、１９６〜１９９頁（２００７年））。
特定の転写因子による再プログラム化
ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａは、体細胞をＥＳ状態に戻す再プログラム化を報告している（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  Ｃｅｌｌ、１２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年））。彼らは、４つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４のウイルス媒介形質導入と、それに続くＯｃｔ４標的遺伝子Ｆｂｘ１５の活性化との後に、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）および成体線維芽細胞を多能性のＥＳ様細胞に再プログラムすることに成功した（図２Ａ）。活性化されたＦｂｘ１５を有した細胞が新しく作り出されたｉＰＳ（人工多能性幹）細胞であり、生きているキメラを生成することはできなかったが、奇形腫を形成するそれらの能力によって多能性であることが示された。この多能性状態は、導入されたＯｃｔ４およびＳｏｘ２遺伝子の継続的なウイルス性発現に依存していたが、内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ遺伝子は、発現されなかったか、またはＥＳ細胞より低レベルで発現されており、それらのそれぞれのプロモーターは、大幅にメチル化されていることが見出された。これは、Ｆｂｘ１５−ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞には相当しなかったが、再プログラム化の不完全な状態を表したものであり得るという結論と一致している。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２が多能性に必須であることは遺伝的実験によって確立されたが（ＣｈａｍｂｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２３巻、７１５０〜７１６０頁（２００４年）；Ｉｖａｎｏｎａら、Ｎａｔｕｒｅ、４４２巻、５３３０５３８頁（２００６年）；Ｍａｓｕｉら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、９巻、６２５〜６３５頁（２００７年））、再プログラム化における２つの発癌遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４の役割はそれほど明確でない。低効率ではあるが、ｃ−ｍｙｃ形質導入の非存在下でマウスおよびヒト両方のｉＰＳ細胞が得られたので、これらの発癌遺伝子のいくつかは、実際に、再プログラム化に不要であり得る（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２６巻、１９１〜１０６頁（２００８年）；Ｗｅｒｎｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８巻、３１８〜３２４頁（２００８年）；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、１９１７〜１９２０頁（２００７年））。
【００７６】
ＭＡＰＣ
ＭＡＰＣは、「複能性成体前駆細胞」（非ＥＳ、非ＥＧ、非生殖）を表す頭字語である。ＭＡＰＣは、３種の原始胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）すべてなど、少なくとも２つの細胞型に分化する能力を有する。ＥＳ細胞において見出された遺伝子はＭＡＰＣでも見出された（例えば、テロメラーゼ、Ｏｃｔ３／４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、ｓｏｘ−２）。Ｏｃｔ３／４（ヒトではＯｃｔ３Ａ）はＥＳ細胞および生殖細胞に特異的なようである。ＭＡＰＣは、ＭＳＣよりも原始的な前駆体細胞集団を表し、上皮、内皮、神経、筋、造血、骨形成、肝、軟骨形成および脂肪系列を包含する分化能を示す（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１２巻、５０２〜８頁（２００２年）、Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，  Ｂ．Ｎ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２９巻、５４３〜５６頁（２００１年）；Ｒｅｙｅｓ，  Ｍ．およびＣ．Ｍ．  Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９３８巻、２３１〜２３３頁（２００１年）；Ｊｉａｎｇ，  Ｙら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３０８９６〜９０４頁（２００２年）；およびＪｉａｎｇ，  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、４１〜９頁（２００２年））。
【００７７】
ヒトＭＡＰＣは、米国特許第７，０１５，０３７号および米国特許出願第１０／４６７，９６３号に記載されている。ＭＡＰＣは他の哺乳類でも同定されている。例えば、マウスＭＡＰＣは、米国特許第７，０１５，０３７号および米国特許出願第１０／４６７，９６３号にも記載されている。ラットＭＡＰＣは、米国特許出願第１０／４６７，９６３号にも記載されている。
【００７８】
Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅによって単離されたＭＡＰＣを説明するためにこれらの参考文献は本明細書に組み込まれる。
【００７９】
ＭＡＰＣの単離および増殖
ＭＡＰＣの単離方法は当技術分野で公知である。例えば米国特許第７，０１５，０３７号および米国特許出願第１０／４６７，９６３号を参照のこと。これらの方法は、ＭＡＰＣの特徴付け（表現型）と共に、参照により本明細書に組み込まれる。ＭＡＰＣは、限定されるものではないが、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚を含めた複数の供給源から単離できる。したがって、骨髄穿刺液、脳または肝生検、および他の臓器を取得し、細胞を、これらの細胞で発現される（または発現されない）遺伝子に依拠して、当業者に利用可能なポジティブまたはネガティブ選択技法を用いて単離することが可能である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、上記で参照した出願に開示されているものなどの機能的または形態学的アッセイによって）。
米国特許第７，０１５，０３７号に記載のヒト骨髄由来のＭＡＰＣ
ＭＡＰＣは、共通白血球抗原ＣＤ４５または赤芽球特異グリコホリンＡ（Ｇｌｙ−Ａ）を発現しない。細胞の混成集団をＦｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ分離にかけた。次いで、抗ＣＤ４５および抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を用いて細胞をネガティブ選択にかけ、ＣＤ４５＋かつＧｌｙ−Ａ＋細胞の集団を枯渇させ、次いで、残っている約０．１％の骨髄単核細胞を回収した。細胞は、フィブロネクチンコーティングされたウェルにプレーティングし、ＣＤ４５＋かつＧｌｙ−Ａ＋の細胞を下記の通り２〜４週間培養することもできる。接着骨髄細胞の培養では、多くの接着間質細胞が細胞倍加約３０で複製老化を起こし、より均質な細胞集団が増殖を続けて、長いテロメアを維持する。
【００８０】
別法では、ポジティブ選択を用いて、細胞特異的なマーカーの組合せを介して細胞を単離することができる。当業者には、ポジティブ選択技法およびネガティブ選択技法の両方が利用可能であり、ネガティブ選択目的に適した多数のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も当技術分野で利用可能であり（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら編集（１９９５年）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、多くの供給源から市販されている。
【００８１】
細胞集団の混合物から哺乳類細胞を分別する技法も、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号（磁気分離）、Ｂａｓｃｈら、１９８３年（免疫アフィニティークロマトグラフィー）、ＷｙｓｏｃｋｉおよびＳａｔｏ、１９７８年（蛍光活性化細胞選別）に記載されている。
【００８２】
米国特許第７，０１５，０３７号に記載のＭＡＰＣ培養
本明細書に記載の通りに単離されたＭＡＰＣは、米国特許第７，０１５，０３７号および本明細書で開示の方法を用いて培養できる。これらの方法に関して、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
追加の培養方法
追加実験では、ＭＡＰＣが培養される密度は、約２００細胞／ｃｍ２から約１５００細胞／ｃｍ２まで、約２０００細胞／ｃｍ２までを含めた、約１００細胞／ｃｍ２または約１５０細胞／ｃｍ２から約１０，０００細胞／ｃｍ２まで変動し得る。密度は、種相互で異なり得る。さらに、最適密度は、細胞の培養条件および供給源に応じて異なり得る。培養条件と細胞との所与のセットについて最適な密度を決定することは当業者の技能の範囲内にある。
【００８４】
また、培養ＭＡＰＣの単離、成長および分化中の任意の時に、約１〜５％、とりわけ３〜５％を含めた、約１０％未満の有効大気酸素濃度を用いることもできる。
【００８５】
細胞は、様々な血清中濃度、例えば、約２〜２０％で培養できる。ウシ胎児血清を用いてもよい。より高濃度の血清は、より低い酸素分圧、例えば、約１５〜２０％と組み合わせて使用できる。培養皿に付着する前に細胞を選択する必要はない。例えば、フィコール勾配の後に、細胞を、例えば、２５０，０００〜５００，０００／ｃｍ２で直接プレーティングすることができる。接着コロニーを採取し、場合によりプールし、増殖させることができる。
【００８６】
実施例における実験手順で使用される一実施形態では、高血清（約１５〜２０％）および低酸素（約３〜５％）条件が細胞培養に使用された。詳細には、コロニーからの接着細胞を約１７００〜２３００細胞／ｃｍ２の密度で、１８％血清および３％酸素（ＰＤＧＦおよびＥＧＦを含む）中にプレーティングし、継代させた。
【００８７】
ＭＡＰＣに特定した実施形態では、補足物は、３つの系列に分化する能力をＭＡＰＣが保持するのを可能にする細胞因子または細胞成分である。これは、未分化状態の特異的マーカーの発現によって示され得る。ＭＡＰＣは、例えば、Ｏｃｔ３／４（Ｏｃｔ３Ａ）を構成的に発現し、高レベルのテロメラーゼを維持する。
【００８８】
細胞培養
一般に、本発明に有用な細胞は、当技術分野で利用可能であり、かつ周知の培養培地中で維持され、増殖させることができる。そのような培地としては、それだけには限定されないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｆ−１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）およびＲＰＭＩ−１６４０  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）が挙げられる。多くの培地は、ピルビン酸ナトリウム含有または非含有の低グルコース処方で利用可能である。
【００８９】
細胞培養培地に哺乳類血清を補足することも企図されている。血清は、しばしば生存および増殖に必要な細胞因子および細胞成分を含有する。血清の例としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、コウシ血清（ＣＳ）、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、新生児ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替物およびウシ胚液が挙げられる。補体カスケードの成分を不活性化することが必要であると考えられる場合、血清を５５〜６５℃で熱不活性化できると理解されている。
【００９０】
最適な成長および増殖のために必要な微量元素を細胞に供給するのに、追加の補足物を有利に用いることもできる。そのような補足物としては、インスリン、トランスフェリン、ナトリウムセレニウム、およびこれらの組合せが挙げられる。これらの成分は、限定されるものではないが、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）（ＨＢＳＳ）、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）、酸化防止補足物、ＭＣＤＢ−２０１補足物、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アスコルビン酸およびアスコルビン酸−２−ホスフェート、ならびに追加のアミノ酸などの塩溶液中に含まれ得る。多くの細胞培養培地は既にアミノ酸を含有しているが、一部は、細胞を培養する前に補足を必要とする。そのようなアミノ酸としては、それだけには限定されないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンが挙げられる。これらの補足物の適切な濃度を決定することは、十分に当業者の技術範囲内にある。
【００９１】
ホルモンも、細胞培養で有利に用いることができる。ホルモンとしては、それだけには限定されないが、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメサゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、およびＬ−チロニンが挙げられる。
【００９２】
細胞のタイプおよび分化細胞の運命に応じて、脂質および脂質担体も、細胞培養培地を補足するのに使用できる。そのような脂質および担体としては、それだけには限定されないが、とりわけシクロデキシトリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンに結合したリノール酸、アルブミンに結合したリノール酸およびオレイン酸、非結合リノール酸、アルブミンに結合したリノール−オレイン−アラキドン酸、非結合およびアルブミンに結合したオレイン酸が挙げられる。
【００９３】
支持細胞層の使用も企図されている。支持細胞は、培養しにくい培養細胞、とりわけＥＳ細胞の成長を支持するのに用いられる。支持細胞は、γ照射によって不活性化された正常細胞である。培養において、支持細胞層は、他の細胞のための基底層として働き、それら自身ではさらなる成長も分裂もせずに細胞因子を供給する（Ｌｉｍ，  Ｊ．Ｗ．およびＢｏｄｎａｒ，  Ａ、２００２年）。支持細胞層細胞の例は、典型的には、ヒト二倍体肺細胞、マウス胎児線維芽細胞、スイスマウス胎児線維芽細胞であるが、幹細胞の最適な増殖、生存および増殖を可能にするのに有利である細胞成分および細胞因子を供給できる任意の分裂終了細胞であり得る。白血病抑制因子（ＬＩＦ）に抗分化特性があるので、多くの場合、支持細胞層は、ＥＳ細胞を未分化な増殖状態に保つのに必要ではない。したがって、一部の種におけるＭＡＰＣを未分化状態に維持するのに、ＬＩＦの補足を用いることができた。
【００９４】
細胞は、低血清または無血清培養培地中で培養してもよい。ＭＡＰＣを培養するのに用いられる無血清培地は、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。多くの細胞は、無血清または低血清培地中で培養された。この場合、培地に１つまたは複数の増殖因子を補足した。一般的に使用される増殖因子としては、それだけには限定されないが、骨形成タンパク質、基礎線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子および上皮成長因子が挙げられる。例えば、米国特許第７，１６９，６１０号、同第７，１０９，０３２号、同第７，０３７，７２１号、同第６，６１７，１６１号、同第６，６１７，１５９号、同第６，３７２，２１０号、同第６，２２４，８６０号、同第６，０３７，１７４号、同第５，９０８，７８２号、同第５，７６６，９５１号、同第５，３９７，７０６号、および同第４，６５７，８６６号を参照のこと。これらすべては、無血清培地中での細胞の培養を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
培養細胞は、懸濁液中に維持することも、細胞外基質成分などの固体支持体に付着させることもできる。幹細胞は、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」、フィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリＤ、ポリＬ−リシン、トロンボスポンジン、およびビトロネクチンなど、固体支持体へのそれらの付着を促進する追加因子をしばしば必要とする。本発明の一実施形態はフィブロネクチンを利用する。例えば、Ｏｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１３巻、８８０〜８８５頁（２００７年）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０５巻、３５０〜３５４頁（２００８年）；Ｋｉｒｏｕａｃら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３巻、３６９〜３８１頁（２００８年）；Ｃｈｕａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６巻、２５３７〜２５４７頁（２００５年）；Ｄｒｏｂｉｎｓｋａｙａら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２６巻、２２４５〜２２５６頁（２００８年）；Ｄｖｉｒ−Ｇｉｎｚｂｅｒｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、２２巻、１４４０〜１４４９頁（２００８年）；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｂ．  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ、８２Ｂ巻、１５６〜１６８頁（２００７年）；およびＭｉｙａｚａｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２２巻、１９５９〜１９６４頁（２００７年）を参照のこと。
【００９６】
細胞は、「３Ｄ」（集合）培養で培養してもよい。一例は、２００８年１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／０２２、１２１号である。
【００９７】
培養中で確立されれば、細胞は、新鮮なまま用いることも、例えば、４０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭを用いて、冷凍ストックとして凍結させて、保存することもできる。培養細胞の冷凍ストックを調製するための他の方法も当業者に利用可能である。
【００９８】
医薬製剤
ある実施形態では、精製された細胞集団は、送達に適合させたおよび適当な、すなわち、生理的に適合性の組成物内に存在する。したがって、幹細胞集団の組成物は、しばしば、１つまたは複数の緩衝液（例えば、中性に緩衝された生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤を受容者の血液と等張に、低張にまたはわずかに高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤および／または防腐剤をさらに含むはずである。
【００９９】
別の実施形態では、精製された細胞集団は、冷凍または貯蔵に適合させたまたは適当な組成物内に存在する。
【０１００】
多くの実施形態では、被験体に投与するための細胞（または馴化培地）の純度は、約１００％である。別の実施形態では、この純度は、９５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、この純度は、８５％〜９５％である。特に、別の細胞との混合物の場合には、このパーセントは、約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％とすることができる。または単離／純度は、細胞が経験した細胞倍加に関して、例えば、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０回またはそれより多くの細胞倍加で表すことができる。
【０１０１】
所与の量における細胞数は、周知のおよび常法に従う手順および器具類によって決定することができる。所与の量の細胞混合物における細胞パーセントは、ほぼ同じ手順によって決定することができる。細胞は、手作業でまたは自動セルカウンターの使用によって、容易に計数することができる。特異的細胞は、所与の量において、特異的染色および目視検査を使用して、ならびに特異的結合試薬、典型的には抗体、蛍光タグ、および蛍光活性化細胞選別装置を使用して自動化された方法によって決定することができる。
【０１０２】
所与の適用のために細胞を投与するための製剤の選択は、様々な因子によって決定する。これらの中で突出しているものは、被験体の種、治療される障害、機能不全、または疾患の性質ならびに被験体におけるその状態および分布、投与される別の療法および作用物質の性質、投与のための最適な経路、その経路での生存性、投薬レジメン、ならびに当業者に明らかとなる別の因子であろう。特に、例えば、適当な担体および別の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の投薬形態の性質によって決まるであろう。
【０１０３】
例えば、細胞の生存は、細胞ベースの療法の有効性の重要な決定要素であり得る。これは、一次療法および補助療法の両方について当てはまる。標的部位が細胞播種および細胞増殖にとって適さない場合は、別の懸念が生じる。このことにより、その部位への進入路および／または治療細胞のそこへの移植を妨げる可能性がある。本発明の様々な実施形態は、細胞の生存を増加させ、かつ／または播種および／もしくは増殖に対する障害によって引き起こされる問題を克服する手段を含む。
【０１０４】
細胞／培地の水性懸濁液の最終製剤は、典型的には、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）に、および生理的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）に調整する必要があるはずである。最終製剤はまた、典型的には、マルトースなどの液体滑沢剤を含有し、これは身体に許容されなければならない。例示的な滑沢剤成分は、グリセロール、グリコーゲン、マルトースなどを含む。ポリエチレングリコールおよびヒアルロン酸ならびに非線維性コラーゲン、好ましくはスクシニル化コラーゲンなどの有機ポリマーベース材料は、滑沢剤としても機能することができる。そのような滑沢剤は、注入部位に注入された生体材料の注入可能性、侵入可能性および分散を向上させるため、および組成物の粘性を変更することによってスパイキング量を減少させるために一般に使用される。この最終製剤は、定義によれば、薬学的に許容される担体中の細胞である。
【０１０５】
その後、細胞を、組織欠損部位での正確な配置のためにシリンジまたは別の注入装置に入れる。「注入可能な」という用語は、製剤が、通常の条件下、常圧下で、実質的なスパイキングがなく、わずか２５の低ゲージを有するシリンジから分配可能であることを意味する。スパイキングは、組成物を、組織中に注入されるよりも、シリンジから漏れ出させる可能性がある。この正確な配置のために、２７ゲージ（２００μＩ．Ｄ．）またはさらには３０ゲージ（１５０μＩ．Ｄ．）の細さの針が望ましい。そのような針から押し出すことができる最大粒径は、少なくとも以下ものの複雑な関数であろう：粒子最大寸法、粒子アスペクト比（長さ：幅）、粒子硬度、粒子の表面粗さおよび粒子に影響を及ぼす関連因子：粒子粘着性、懸濁流体の粘弾性特性、および針を通過する流速。ニュートン流体中に懸濁された硬質球状ビーズは、最も単純な事例を表し、粘弾性流体中の繊維状または分岐状粒子は、より複雑であると考えられる。
【０１０６】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、または別の無機溶質もしくは有機溶質などの別の薬学的に許容される作用物質を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液に関して特に好ましい。
【０１０７】
組成物の粘性は、所望であれば、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルで維持することができる。容易におよび経済的に利用可能であり、作業しやすいため、メチルセルロースが好ましい。別の適当な増粘剤は、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどを含む。増粘剤の好ましい濃度は、選択される作用物質に依存するはずである。重要な点は、選択された粘性を達成する量を使用することである。粘性組成物は通常、そのような増粘剤の添加によって溶液から調製される。
【０１０８】
薬学的に許容される防腐剤または安定剤を利用して、細胞／培地組成物の有効期限を増加させることができる。そのような防腐剤が含まれる場合、細胞の生存可能性または有効性に影響を及ぼさない組成物を選択することは十分に当業者の認識範囲内である。
【０１０９】
当業者は、組成物の成分が化学的に不活性であるべきであることを認識するはずである。このことは、化学および医薬の原則において、当業者にとって問題とならない。問題は、標準的なテキストを参照することによって、または、本開示、本明細書において引用されている、および当技術分野において一般に利用可能である文書により提供される情報を使用して簡単な実験（過度の実験を伴わない）によって、容易に回避することができる。
【０１１０】
無菌の注入用溶液は、本発明を実施する際に利用される細胞／培地を、必要に応じて様々な量の別の成分を含む、必要量の適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、細胞／培地は、溶液、懸濁液、または乳液などの、注入可能な単位投薬形態に処方される。細胞／培地の注入のために適当な医薬製剤は、典型的には、無菌の水性溶液および分散液である。注入用製剤のための担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、および適当なそれらの混合物を含有する溶媒または分散培地とすることができる。
【０１１２】
当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の、細胞および任意選択の添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（細胞に加えて）は、リン酸緩衝生理食塩水などの溶液中、０．００１〜５０ｗｔ％の量で存在する。活性成分は、約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、および最も好ましくは約０．０５〜約５ｗｔ％などの、数マイクログラム〜数ミリグラムの水準で存在する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、細胞は、投与のために、特に、カプセル化が療法の有効性を強化する、または取扱いおよび／または貯蔵有効期限において利点をもたらす場合、カプセル化される。カプセル化は、細胞により媒介される免疫抑制の有効性を増加させるいくつかの実施形態では、結果として、免疫抑制薬療法の必要性も軽減することができる。
【０１１４】
また、カプセル化は、いくつかの実施形態では、細胞（一般に、同種異系の移植において免疫原性ではない、またはほんのわずかに免疫原性である）に対する被験体の免疫応答をさらに軽減し、それにより、細胞の投与時に起こる可能性がある移植片拒絶または炎症を低減し得る、被験体の免疫系に対する障壁を提供する。
【０１１５】
細胞は、膜、ならびにカプセルによって、植込みの前にカプセル化されてもよい。利用可能な細胞カプセル化の多くの方法のいずれを利用してもよいことが予想される。いくつかの実施形態では、細胞は、個々にカプセル化される。いくつかの実施形態では、多くの細胞が、同じ膜内にカプセル化される。植込み後に細胞が取り出される実施形態では、単一の膜内などに多くの細胞をカプセル化している比較的大きな構造が、回収のために好都合な手段をもたらし得る。
【０１１６】
広範な種類の材料を、細胞のマイクロカプセル化のために、様々な実施形態において使用することができる。そのような材料は、例えば、ポリマーカプセル、アルギン酸−ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸マイクロカプセル、バリウムポリ−Ｌ−リシンアルギン酸カプセル、バリウムアルギン酸カプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）中空糸、およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸を含む。
【０１１７】
細胞の投与のために使用することができる細胞のマイクロカプセル化のための技術は、当業者に公知であり、例えば、Ｃｈａｎｇ，  Ｐ．ら、１９９９年；Ｍａｔｔｈｅｗ，  Ｈ．  Ｗ．ら、１９９１年；Ｙａｎａｇｉ，  Ｋ．ら、１９８９年；Ｃａｉ  Ｚ．  Ｈ．ら、１９８８年；Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｍ．、１９９２年、および米国特許第５，６３９，２７５号（これは、例えば、生物学的に活性な分子を安定に発現する細胞の長期間の維持のための生体適合性カプセルを記述している）において記述されている。カプセル化のさらなる方法は、欧州特許出願公開第３０１，７７７号および米国特許第４，３５３，８８８号；同第４，７４４，９３３号；同第４，７４９，６２０号；同第４，８１４，２７４号；同第５，０８４，３５０号；同第５，０８９，２７２号；同第５，５７８，４４２号；同第５，６３９，２７５号；および同第５，６７６，９４３号にある。前述のすべては、細胞のカプセル化に関する部分において、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
ある特定の実施形態は、細胞を、バイオポリマーまたは合成ポリマーなどのポリマー中に組み込む。バイオポリマーの例としては、それだけには限定されないが、フィブロネクチン、フィビン、フィブリノゲン、トロンビン、コラーゲン、およびプロテオグリカンが挙げられる。上記で論じられたサイトカインなどの別の因子もまた、ポリマー中に組み込むことができる。本発明の別の実施形態では、細胞は、３次元ゲルの隙間に組み込まれてもよい。大きなポリマーまたはゲルは、典型的には、外科的に植え込まれる。十分に小さい粒子または繊維の形に製剤化することができるポリマーまたはゲルは、別の一般的な、より好都合な、非外科的な経路によって投与することができる。
【０１１９】
投薬
組成物は、投薬量でおよび医学および獣医学分野の当業者に周知の技術によって、年齢、性別、体重、および特定の患者の状態、および投与される製剤（例えば、液体に対して固体）などの因子を考慮に入れて、投与することができる。ヒトまたは別の哺乳動物のための用量は、過度の実験を行うことなく、この開示、本明細書において引用されている文献、および当技術分野における知識から、当業者が決定することができる。
【０１２０】
様々な本発明の実施形態に従って使用されるのに適切な細胞／培地の用量は、非常に多くの因子に依存する。この用量は、異なる環境では大きく異なり得る。一次療法および補助療法のために投与される最適な用量を決定するパラメータは、一般に、以下のいくつかまたはすべてを含む：治療される疾患およびその段階；被験体の種、それらの健康状態、性別、年齢、体重、および代謝速度；被験体の免疫能力；施される別の療法；および被験体の病歴または遺伝子型から予期される潜在的な合併症。パラメータはまた、以下を含み得る：細胞が同系、自己由来、同種異系、または異種であるかどうか；それらの効能（特異的活性）；細胞／培地が有効となるために標的とされなければならない部位および／または分布；ならびに、細胞／培地への進入可能性および／または細胞の生着などのそのような部位の特徴。さらなるパラメータは、別の因子（増殖因子およびサイトカインなど）との同時投与を含む。所与の状況における最適な用量はまた、細胞／培地が処方される方法、これらの投与される方法、および投与後に細胞／培地が標的部位に局在化する程度も考慮に入れる。最終的に、最適な投薬の決定は、最大の有益な作用の閾値より低くなく、用量に関連する有害な作用が、増加させた用量の利点より勝る閾値より高くもない有効な用量を必然的にもたらすはずである。
【０１２１】
いくつかの実施形態のための細胞の最適な用量は、自己由来の、骨髄単核球移植のために使用される用量の範囲にある。細胞の極めて純粋な調製のために、様々な実施形態における最適な用量は、投与１回当たり１０４〜１０８細胞／受容者質量ｋｇの範囲となる。いくつかの実施形態では、投与１回当たりの最適な用量は、１０５〜１０７細胞／ｋｇとなる。多くの実施形態では、投与１回当たりの最適な用量は、５×１０５〜５×１０６細胞／ｋｇとなる。参照のために、前述における高用量は、自己由来の骨髄単核球移植において使用される有核細胞の用量に類似している。低用量のいくつかは、自己由来の骨髄単核球移植において使用されるＣＤ３４＋細胞／ｋｇの数に類似している。
【０１２２】
単回用量を、すべてを一度に、断片的に、または継続的に、一定期間にわたって送達してもよいことが理解されるべきである。全体の用量をまた、単一の位置に送達しても、またはいくつかの位置にわたって断片的に広げてもよい。
【０１２３】
様々な実施形態では、細胞／培地を、初回用量で投与し、その後さらなる投与によって維持することができる。細胞／培地を、最初、１つの方法によって投与し、その後同じ方法または１つもしくは複数の異なる方法によって投与することができる。レベルは、細胞／培地の継続する投与によって維持することができる。様々な実施形態は、細胞／培地を、最初に、または被験体におけるそれらのレベルを維持するために、または両方で、静脈内注入によって投与する。様々な実施形態では、投与の別の形態は、患者の状態および本明細書において他の箇所で論じられている別の因子に応じて使用される。
【０１２４】
ヒト被験体は、実験動物よりも一般により長く治療されるが、治療は、疾患経過の長さおよび治療の有効性に対応する長さを一般に有することに留意する。当業者は、ヒトについての適切な用量を決定するために、ヒトにおいておよび／またはラット、マウス、非ヒト霊長類など動物において行われた別の手順の結果を使用する際に、このことを考慮に入れるはずである。これらの考慮に基づく、および本開示および従来技術により提供される手引きを考慮に入れたそのような決定により、当業者は、過度の実験を行うことなく、用量を決定することができるであろう。
【０１２５】
初回投与およびさらなる用量のための、または逐次投与のための適当なレジメンは、すべて同じであってもよく、または様々であってもよい。適切なレジメンは、本開示、本明細書において引用されている文献、および当技術分野における知識から、当業者が確認することができる。
【０１２６】
用量、頻度、および治療の継続時間は、疾患の性質、被験体、および投与され得る別の療法を含む多くの因子によって決定する。したがって、広範な種類のレジメンが、細胞／培地を投与するために使用されてもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細胞／培地は、１回用量で被験体に投与される。別の実施形態では、細胞／培地は、一連の２回またはそれより多くの用量で連続して被験体に投与される。細胞／培地が、単回用量で、２回用量で、および／または２回を超える用量で投与されるいくつかの別の実施形態では、用量は同じでも、または異なっていてもよく、これらは、等しい間隔でまたは異なる間隔で投与される。
【０１２８】
細胞／培地は、多頻度で、広範囲の時間にわたって投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞／培地は、１日未満の期間にわたって投与される。別の実施形態では、細胞／培地は、２、３、４、５、または６日にわたって投与される。いくつかの実施形態では、細胞／培地は、１週当たり１または複数回、数週間にわたって投与される。別の実施形態では、細胞／培地は、数週間にわたって１〜数カ月間投与される。様々な実施形態では、細胞／培地は、数カ月の期間にわたって投与されてもよい。別の実施形態では、細胞／培地は、１または複数年の期間にわたって投与されてもよい。一般に、治療の長さは、疾患経過の長さ、適用される療法の有効性、および治療される被験体の状態および反応に対応するはずである。
【０１２９】
例えば、脊髄損傷に関して、２つの段階が存在し得ることがこの文書において説明されている。動物モデルにおいて、第１の段階では、マクロファージは、病変に浸潤せず、これが約２４時間継続する。しかしながら、第２の段階では、マクロファージは病変に浸潤し、この一連の事象は、治療レジメンを評価するときに考慮され得る。一実施形態では、細胞は、損傷後直ちに、または可能な限り損傷の直前に、など、第１段階の間でさえ、マクロファージまたはジストロフィー軸索と相互作用するであろう別の細胞の浸潤を見越して投与される。治療はその後、最初のおよびさらなるマクロファージ浸潤と同時に起こるように継続してもよく、予防的に継続しても、または、場合により、マクロファージまたは別の関連細胞がもう損傷に浸潤していないと判断されたときは停止してもよい。
【実施例】
【０１３０】
（実施例Ｉ）
「グリア瘢痕モデル」アグリカン−ラミニン対立スポット勾配（Ｔｏｍら、２００４年；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら、２００５年）。グリア瘢痕モデルを教示するこれらの参考文献は、参照により組み込まれる。このモデルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接着／退縮の低減における細胞、タンパク質、培地などの有効性についてのアッセイを実現する。
【０１３１】
阻害性マトリックスがｉｎ  ｖｉｖｏでの病変後に発生するものとよりよく類似している空間的構造に提示される場合、ＰＧは軸索におけるいわゆるジストロフィー状態を誘発し得る。これを行うために、ＰＧアグリカンおよび成長促進分子ラミニンの溶液のスポットをニトロセルロース製カバースリップ上にのせ、風乾した。
【０１３２】
乾燥の一貫したアーチファクトにより、スポットの縁部が中心よりも濃度が次第に高くなるアグリカンを含む大まかな勾配が生じた。縁部の最も外側の部分は、中心の領域よりも低い濃度のラミニンを含んでいた。最適なＥＣＭ濃度（アグリカン０．７ｍｇ／ｍｌおよびラミニン５μｇ／ｍｌ）が良好な細胞付着をもたらした。したがって、高アグリカン−低ラミニンの外側縁部は、神経突起の再生には特に過酷な環境であると考えられた。そのシャープな外側界面を越えてラミニン周囲からスポット内に内向きに何も入らなかった。スポットの中心部の内部から求心的に成長している線維は、縁部の内側部分に入ることができたが、さらに成長することはできなかった。勾配内に入ると、軸索は捕捉されると考えられた。こん棒様のジストロフィーエンドボール（ｅｎｄｂａｌｌ）が勾配内の神経突起の末端に形成した。「ジストロフィー終末」の挙動を観察するために、経時的顕微鏡検査法を用いた。ジストロフィー成長円錐は、短距離を進もうとすることが多かったが、不可避的に、はい進む成長円錐は、より小型のボールにまとまり、退縮して、再び移動し始めることになる。
【０１３３】
（実施例ＩＩ）
軸索退縮およびマクロファージ
要約
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、後柱圧壊脊髄損傷後の切断された軸索の末端のジストロフィー退縮クラブとＥＤ−１＋細胞との間に密接な相関が認められた（図３）。グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（Ｔｏｍら、２００４年；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら、２００５年）を適用して、軸索とＥＤ−１＋細胞との間の相互作用を実時間で検討した。ジストロフィー成長円錐とＥＤ−１＋マクロファージとの間の直接的な細胞間接触が長距離の軸索退縮を誘発した（図４、５）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのマクロファージ枯渇のためにクロドロネートリポソームを用いたこと（Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９９年）の結果は、対照と比較してクロドロネート処理動物における軸索退縮の有意な減少であった。これらのデータは、ＥＤ−１＋細胞が物理的細胞間相互作用により損傷脊髄軸索の退縮に直接関与していることを示している。
【０１３４】
結果
１．上行後柱感覚軸索が脊髄損傷後に大幅に退縮する
本発明者らは、活性化マクロファージの浸潤が軸索の退縮に直接的な役割を果たす可能性があると考えた。亜急性および慢性脊髄病変内で活性化マクロファージと再生軸索の末端との間に密接な関連性が認められ、これらの２つの細胞型間の直接的な物理的相互作用の可能性が見越された。後柱圧壊損傷後の感覚軸索退縮の程度を特徴付け、病変へのマクロファージの浸潤と相関させた。成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの後柱をＣ８のレベルで圧壊し、損傷ニューロンの副次集団を坐骨神経のデキストラン−テキサスレッド標識により追跡した。病変後２、４、７、１４および２８日目に脊髄組織を採取し、標識線維の末端と病変の中心との間の距離を測定した。病変後２日目までに、軸索は既に平均距離３４３±４６．９２μｍ（平均値±ＳＤ）退縮していたが、この早期の退縮は、ニューロン自体の内部の内因性メカニズムに起因していた可能性が最も高い（Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒら、２００５年）。損傷後２日目に病変は、常在性ミクログリア細胞であった可能性が最も大きい、反応性星状細胞（ＧＦＡＰ＋）およびいくつかのＥＤ−１＋細胞から主として構成されていたことに留意することは重要である。病変後２日目から７日目までに病変内のＥＤ−１＋細胞の数の劇的な増加があり、その大多数が浸潤性マクロファージであった可能性が最も大きい（Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９７年；ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＰｏｐｏｖｉｃｈ、２００７年）。後柱内の上行感覚線維の第２段階の縮退は、最初の週にわたって最も速やかに起こり、その後、次の数週間にわたり徐々に起こった。病変後２８日目までに、軸索は病変中心から平均距離７７４±７０．２６μｍの位置に退縮した。これらのデータから、上行感覚軸索の退縮の時期が病変内のＥＤ−１＋細胞の浸潤および蓄積と時空的に一致していることがわかる。
【０１３５】
２．活性化マクロファージの枯渇がｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索退縮を減少させる
ｉｎ  ｖｉｖｏでの第２段階の軸索縮退の大部分は、マクロファージの浸潤と時間的に一致する病変後２日目から７日目までに上行後柱感覚軸索で起こる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索縮退へのマクロファージの関与をさらに実証するために、循環単球／マクロファージを枯渇させるために動物をクロドロネートリポソームで処理した（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎら、１９９７年；Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９９年）。循環単球／マクロファージを枯渇させるために動物にクロドロネートリポソームの注射を損傷の１日前に開始して１日おきに行った。次いで、病変後２日目、４日目および７日目に動物を軸索縮退について評価した（図３）。クロドロネートリポソームの注射を施した動物は、病変後４日目および７日目に対照リポソームの投与を施した動物（それぞれ５８６±４２．８９μｍおよび８０６±６２．７１μｍ）と比較して病変後４日目および７日目に退縮の有意な減少を示した（それぞれ４０２±８１．８５μｍおよび４３９±４６．３３μｍ）。退縮の減少は、空リポソーム対照と比較してクロドロネート投与動物の病変のＥＤ−１＋細胞数の有意な減少と相関していた。クロドロネートリポソームの処理は、マクロファージの枯渇が空洞化の減少につながるという以前の所見（Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９９年）と関連性がある、病変コアにおけるＧＦＡＰ＋星状細突起の増加ももたらした。重要なことに、病変後２日目にクロドロネート処理および対照リポソーム処理動物で示された退縮の量の差はなかった。この時点ではマクロファージの浸潤はまだ起こっておらず、このことは、軸索縮退の最初の段階はマクロファージ非依存性であり、内因性ニューロンメカニズムまたは、場合によっては活性化常在性ミクログリア細胞との相互作用におそらく起因することを示唆する。循環マクロファージ／単球のクロドロネート媒介枯渇によって、通常病変後４日目および７日目に認められた軸索退縮が妨げられ、この第２段階の退縮が浸潤性マクロファージによって引き起こされたことがわかった。クロドロネート投与動物における有意な再生（すなわち、病変の中心を超える軸索の伸長）の証拠はなかった。
【０１３６】
３．グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてジストロフィー成長円錐がマクロファージとの接触後に大幅に退縮する
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＤ−１＋細胞と損傷した軸索とに密接な関連性があるという所見は、これらの細胞型間の相互作用が軸索の退縮に役割を果たしている可能性があることを示唆するものである。グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける成体感覚ニューロン軸索とマクロファージとの相互作用を試験した。３０分間のベースライン観察期間の後、ＮＲ８３８３マクロファージを培養物に添加し、このマクロファージとジストロフィー軸索との相互作用をモニターした。ジストロフィー軸索とマクロファージとの間の直接的な細胞間接触を頻繁に観察した。これらの接触は、長時間にわたるものであり、マクロファージの移動と一緒になったとき、軸索の効果的な曲げおよび基質からの持ち上げをもたらした軸索の劇的な操作につながった。２つの細胞を結びつける長期にわたり這う過程が、マクロファージが軸索から離れた後に残ることが多かったので、２つの細胞型の間に強い長時間持続する接着が起こり得たことは明らかであった。しかし、退縮後にマクロファージ接触を失ったいくつかの軸索が、それらが再びジストロフィーになるまで伸長することができたので、マクロファージ誘発性退縮は、軸索の再成長を永久的に妨げなかった。これらの２つの細胞型の間の直接的な細胞間接触は、最終的には常に軸索の大幅な退縮をもたらした。したがって、マクロファージ接触は、グリア瘢痕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてジストロフィー軸索の退縮を誘発した。
【０１３７】
４．直接的な物理的細胞間相互作用がマクロファージ誘発性退縮に必要である
マクロファージが、ジストロフィー軸索に非常に近くまで移動するが、接触しないことが認められた多くの例が存在し、これらの例では軸索退縮が認められなかった。軸索とマクロファージとの間の物理的相互作用が軸索の退縮を誘発するのに必要であるかどうか、またはマクロファージ由来因子が十分であるかを判断するために、マクロファージをＤＲＧ培養物に添加する前にマクロファージをトリプシンで処理して、細胞外タンパク質を除去した。トリプシンによるマクロファージの前処理により、広範なマクロファージの移動性と軸索との複数回の衝突が可能になった。しかし、処理は、マクロファージが軸索に物理的につなぎ留められることを完全に妨げ、長時間持続する直接的な細胞間接触がない場合には、その後の退縮は認められなかった。しかし、マクロファージが退縮を誘発する因子（複数可）を分泌していた可能性があった。この仮説を検定するために、マクロファージ馴化培地をｉｎ  ｖｉｔｒｏでジストロフィー軸索に加えた。マクロファージ馴化培地は、退縮を誘発しなかった。したがって、軸索の近くにマクロファージまたは分泌因子が単に存在することでは、ジストロフィー軸索との物理的な相互作用がない場合には、軸索の退縮を誘発することができなかった。
【０１３８】
５．マクロファージ誘発性退縮における基質の役割
基質が軸索の退縮に役割を果たすかどうかを判断するために、ジストロフィー成長円錐を生じさせない均一な成長促進ラミニン基質上で成体感覚ニューロンを培養した。ラミニン上の成長円錐は、多数の糸状仮足および層状仮足により扁平であり、全体的な軸索の退縮が一定の速度で起こった。マクロファージをこれらの培養物に添加した場合、軸索との直接的な細胞間接触が認められた。しかし、これらの接触は、一過性であり、広範でないので、速やかに絶たれ、軸索の退縮をもたらさなかった。膜接触点の遺残物がニューロンに速やかに再吸収され、成長円錐が妨げられずに基質にわたって伸長し続けた。したがって、マクロファージ誘発性軸索退縮は、基質依存性であり、許容状態の基質ラミニン上で活発な成長状態のニューロンは、ＣＳＰＧ勾配により誘発されたジストロフィーの状態にあるものと異なり、マクロファージ接触に対して感受性でなかった。
【０１３９】
６．活性化初代マクロファージも軸索退縮を誘発する
さらなる問題は、初代マクロファージがＮＲ８３８３マクロファージ細胞系とｉｎ  ｖｉｔｒｏで同じようにジストロフィー軸索と相互作用するかどうかであった。成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの骨髄から前駆細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージに分化させ、８０％を超えるＥＤ−１＋細胞の培養物を得た。マクロファージのこの特定の集団は、他の身体の源から採取された集団と異なる脊髄病変に認められるマクロファージの表現型、形態および機能特性を保持することが示された（Ｌｏｎｇｂｒａｋｅら、２００７年）。次に軸索退縮を誘発する初代マクロファージの能力を評価した。非刺激初代マクロファージは、退縮を誘発することができなかった。スポット勾配ニューロン培養物に添加した場合、これらのマクロファージは、基質に接着したが、運動性でなく、休止状態のマクロファージの特性を示した。マクロファージがジストロフィー軸索上に落ち着いた場合にのみ、軸索との接触が起こった。マクロファージも、それらの細胞間相互作用も、細胞系マクロファージで以前に認められた物理的特性のいずれも、すなわち、引っ張りも、細胞過程による物理的付着の徴候なども示さなかった。
【０１４０】
ジストロフィー軸索と相互作用するためにはマクロファージが活性化された状態になければならない可能性がある。低速度撮影培養皿に添加する前に初代マクロファージを培養物中で活性化サイトカインインターフェロンガンマにより刺激した。これらのマクロファージは、中程度の活性化の状態を示し、わずかに丸い形態を示したが、依然として運動性でなく、ジストロフィー軸索との強い結合を形成せず、したがって、軸索退縮を誘発しなかった。ＤＲＧ培養物に添加する前に、初代マクロファージをインインターフェロンガンマとリポ多糖（ＬＰＳ）との組合せでさらに刺激した。これらのマクロファージは、活性化マクロファージの形態および挙動、すなわち、丸く、食細胞の形状および高度に運動性を示した。これらの活性化マクロファージは、細胞系マクロファージと同様に頻繁にジストロフィー軸索の退縮を誘発した。それらは、強い細胞間接着および物理的つかみ、基質からの軸索の引っ張りおよび持ち上げをもたらす、ジストロフィー軸索との激しい物理的相互作用を示した。初代マクロファージは、活性化状態にある場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでジストロフィー軸索の退縮を誘発した。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軸索の退縮の本試験における細胞系マクロファージの使用をバリデートするものである。したがって、ＮＲ８３８３マクロファージ細胞系が、さらなる刺激なしに脊髄病変内に認められたマクロファージと同様に一定の活性化状態にあった細胞の純粋な集団を構成していたので、実験の大部分をＮＲ８３８３マクロファージ細胞系を用いて行った。
【０１４１】
７．活性化ミクログリア細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで軸索退縮を中程度に誘発することができる
マクロファージは、一般的に病変後３日目まで損傷脊髄に浸潤しないので、ＣＮＳ内の常在性グリア細胞は損傷に即時に反応する（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９９年）。病変内のグリア細胞は、活性化マクロファージと酷似して、活性化され、食作用を有するようになる。常在性グリア細胞であった可能性が最も高かった一般的なマクロファージの浸潤の前の病変後２日目に限られた数のＥＤ−１＋細胞が損傷部内に認められた。軸索退縮に対するミクログリア細胞寄与の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて評価した。皮質ミクログリア細胞をＰ１  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから採取し、低速度撮影した培養物に添加する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた。初代マクロファージと同様に、初代ミクログリア細胞は、培養物中で活性化された状態になるためにはインターフェロンガンマおよびＬＰＳで刺激しなければならなかった。非刺激ミクログリア細胞は、ラミニン／アグリカンスポット勾配基質に接着せず、これが我々のモデルにおけるジストロフィー軸索と相互作用することを妨げた。しかし、刺激されたミクログリア細胞は、軸索と接着し、物理的に相互作用し、５０％の時間退縮を誘発したが、活性化ミクログリア細胞とジストロフィー軸索との接触は、マクロファージの接触ほど強くなかった。したがって、実験的に活性化されたミクログリア細胞も軸索退縮の誘発に役割を果たすことができる。
【０１４２】
８．他のＣＮＳ細胞型である星状細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで軸索退縮を誘発できない
他の問題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのジストロフィー軸索の退縮の誘発は、病変脊髄内で通常認められる食作用を有する細胞型に特異的であり、ジストロフィー軸索と他の細胞型との相互作用の単なる結果ではないかどうかであった。星状細胞は、ＣＮＳの損傷後のグリア瘢痕の不可欠な構成要素である。それらは、高い数で存在し、再生性軸索に広範に接触する。ＤＲＧ培養物に添加する前に、皮質星状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた。星状細胞は、基質に接着し、ジストロフィー軸索に広範に接触した。基質に結合した後、星状細胞は速やかに縁から離れてアグリカン勾配を下って移動した。星状細胞突起は、軸索上に広がり、時として軸索の側方変位をもたらした。しかし、これらの接触は、接触した軸索の退縮をもたらさなかった。したがって、退縮の誘発は、ＥＤ−１＋食細胞との相互作用に特異的であって、他の細胞型との単なる物理的相互作用ではない。
【０１４３】
材料および方法
１．後柱圧壊病変モデル
３３匹の成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）をｉｎ  ｖｉｖｏ試験に用いた。すべての外科的処置のためにラットを吸入イソフルオランガス（２％）で麻酔した。Ｔ１椎弓切除術を実施して、Ｃ８脊髄セグメントの背側面を露出させた。３０ゲージ針を用いて中線から両側０．７５ｍｍにデュロトミーを行った。次いで、Ｄｕｍｏｎｔ＃３鉗子をＣ８の後脊髄に１．０ｍｍの深さに挿入し、鉗子を押し込み、圧力を１０秒間保持し、さらに２回繰り返すことによって、後柱圧壊病変を加えた。病変の完了は、白色物質の除去の観察によって確認した。次いで、膜の穴をゲルフィルムで覆った。筋層を４−０ナイロン縫合糸で縫合し、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後２、４、７、１４または２８日目に動物を屠殺した（１群当たりＮ＝３）。すべての動物への処置は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物資源センターのガイドラインおよびプロトコールに従って実施した。
【０１４４】
２．マクロファージ枯渇
動物に後柱圧壊損傷の前日、ならびに２日目の時点の病変後１日目、病変後１および３日目（４日目の時点）、ならびに病変後１、３および５日目（７日目の時点）にもリポソーム封入クロドロネートまたは空リポソーム対照を腹腔内注射した（１群当たりＮ＝３）。クロドロネートは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙからの寄贈であった。クロドロネートは、前述のようにリポソームの封入されていた（Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊｅｎおよびＳａｎｄｅｒｓ、１９９４年）。
【０１４５】
３．軸索の標識
屠殺の２日前に、後柱をテキサスレッド結合３０００ＭＷデキストランで一側に標識した。手短に述べると、右後肢の坐骨神経を露出させ、Ｄｕｍｏｎｔ＃３鉗子で１０秒間圧壊し、さらに２回繰り返した。１．０μＬの滅菌水中３０００ＭＷデキストラン−テキサスレッド１０％をＨａｍｉｌｔｏｎ注射器で圧壊部位の坐骨神経内に注射した。筋層を４−０ナイロン縫合糸で、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。動物を標識の２日後にイソフルランの過剰投与により屠殺し、ＰＢＳと続いて４％ＰＦＡで潅流した。組織を採取し、４％ＰＦＡで後固定し、免疫組織化学検査用に処理した。
【０１４６】
４．免疫組織化学検査
組織を４％ＰＦＡで一夜後固定し、３０％スクロースに一夜浸漬し、ＯＣＴマウンティング媒体中に凍結し、クリオスタット上で２０μｍ縦方向切片に切断した。次いで、組織を抗ＧＦＡＰ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）、抗ＥＤ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で染色し、それぞれＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４０５またはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともにインキュベートし、次いで、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡で撮像した。
【０１４７】
５．ｉｎ  ｖｉｖｏ軸索退縮の定量
１匹の動物当たり脊髄の背面の２００μｍ下の深さで始まる３連続切片を動物ごとに分析して、軸索退縮を定量した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウエアを用いて特性ＧＦＡＰおよびＥＤ−１染色パターンおよび標識軸索の末端と中心の間の距離により病変の中心を同定した。群のすべての動物のすべての切片の測定値を平均して、時点ごとの退縮の平均距離を求めた。
【０１４８】
損傷線維標識軸索をトレースするために用いた手法は、後柱内の極めて表面を検索した。また、標識された線維の数は、トレーサーを注射するレベルの坐骨神経の線維束収縮の程度によって異なることがあり得る。標識軸索は、複数の理由のためにその深さでのみ定量した。この深さは、すべての動物における標識線維を一貫して含んでいたが、一部の動物は、より深い深さの標識線維を有していなかった。病変の直線の程度は、後柱のより深いレベルで増加する。したがって、脊髄内のより深い部位にある軸索は、より表面レベルのものよりはるかに大きい病変に遭遇する。動物および群間の正確な比較を可能にするために退縮の距離の定量を病変の同様の位置で行わなければならない。標識の程度の差のため、標識軸索の全集団の定量は、結果の歪みにつながる可能性がある。その代わりに、それらを一貫して検査し、すべての動物において正確に定量することができるように、標識軸索の特定の集団および位置を定量した。
【０１４９】
６．ＤＲＧの解離
ＤＲＧは、以前に記載されたように採取した（Ｔｏｍら、２００４年；Ｄａｖｉｅｓら、１９９９年）。手短に述べると、ＤＲＧを成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから切り離した（Ｚｉｖｉｃ  Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈａｒｌａｎ）。中枢および末梢根を除去し、神経節をＨＢＳＳ中コラゲナーゼＩＩ（２００Ｕ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）およびディスパーゼＩＩ（２．５Ｕ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）の溶液中でインキュベートした。消化ＤＲＧを洗浄し、新鮮なＨＢＳＳ−ＣＭＦ中で３回緩やかに摩砕した後、低速度で遠心分離した。次いで、解離ＤＲＧをＢ−２７、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に再懸濁し、計数した。ＤＲＧを３０００細胞／ｍＬの密度、合計６０００細胞／皿でＤｅｌｔａ−Ｔ皿（Ｆｉｓｈｅｒ）上に置いた。
【０１５０】
７．経時皿の準備
Ｄｅｌｔａ−Ｔ培養皿（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をＴｏｍら、２００４年と同様に調製した。手短に述べると、２番ビットを用いて各皿の上半分に１つの穴をあけて、経時顕微鏡検査時の細胞、酵素、阻害剤などの添加用のポートを造成した。次いで、皿を滅菌水で洗浄し、ポリ−１−リシン（０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で終夜被覆し、滅菌水で洗浄し、乾燥した。培養物表面上に２．０μＬのアグリカン溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ｉｎ  ＨＢＳＳ−ＣＭＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をピペッティングすることにより、アグリカン勾配スポットを形成させ、乾燥した。１つの皿当たり６つのスポットをのせた。アグリカンスポットが完全に乾燥した後、皿の全表面をＨＢＳＳ−ＣＭＦ中ラミニン溶液（１０μｇ／ｍＬ、ＢＴＩ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）中に３７℃で３時間浸した。細胞の平板培養の直前にラミニン浴を除去した。ラミニン浴のみを用い、アグリカンを用いないで、ラミニンのみの基質を含む皿を上と同様に調製した。ここで用いた基質の濃度は、Ｔｏｍら、２００４年により用いられたものと異なる。皿調製プロトコールからニトロセルロースを除くことによって、顕微鏡検査の明瞭さを改善することができる。しかし、皿表面への基質の結合の差を補償するために、用いる基質の濃度を上記のものに再較正した。
【０１５１】
経時撮像後に、ＤＲＧを４％ＰＦＡで固定し、抗Ｂ−チューブリンＩＩＩ型（１：５００；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および抗コンドロイチン硫酸（ＣＳ−５６、１：５００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。
【０１５２】
８．細胞系マクロファージ培養
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ肺胞マクロファージ細胞系である、ＮＲ８３８３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１９２）をＹｉｎら（２００３年）に記載の通り培養した。手短に述べると、細胞を非被覆組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１５％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加したＦ−１２Ｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、週２〜３回フィードした。この細胞系は、接着性および懸濁細胞の混合培養物を形成しており、フィーディング時に浮遊細胞を収集し、再び平板培養することによって継代培養した。経時顕微鏡実験用の細胞系マクロファージを準備するために、細胞を０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて収集し、血清不含有Ｆ−１２Ｋで３回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有Ｆ−１２Ｋ中で１．０×１０６／ｍＬの密度で平板培養した。翌日経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、ＨＥＰＥＳ（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）の添加を含め上のように補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中に２．５×１０５／７０μＬの密度で再懸濁した。
【０１５３】
９．初代骨髄由来マクロファージ培養
以前に確立されたプロトコール（Ｔｏｂｉａｎら、２００４年）に基づいて骨髄前駆細胞を収集した。手短に述べると、成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２５〜２７５ｇ、Ｈａｒｌａｎ）から大腿骨を除去した。大腿骨の末端を除去し、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、ベータ−メルカプトエタノールおよびＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｄ１０Ｆ）を添加した冷ＤＭＥＭを含む注射器を大腿骨に挿入し、骨髄を流し出し、収集した。得られた細胞混合物を７０ミクロンフィルターに通し、遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットをＡＫＴ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔａｃｒｅ）に再懸濁して、赤血球を溶解し、遠心分離した。上清を除去し、骨髄前駆細胞を含むペレットを再懸濁し、さらに２０％ＬＡＤＭＡＣ細胞系馴化培地（Ｄｒ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｈａｒｄｉｎｇの寛大な寄贈物）をさらに添加した上のＤＭＥＭ中で平板培養して、マクロファージへの分化を誘導した。細胞を５、７、９日目にフィードし、１０日目に培養実験用に収集した。経時実験の１日前に、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて初代マクロファージを収集し、Ｄ１０Ｆで３回洗浄し、非被覆ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）中、Ｄ１０Ｆ中で１．０×１０６／ｍＬの密度で平板培養した。翌日、初代マクロファージをＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ＋ＨＥＰＥＳ中に５．０×１０５／７０μＬの密度で再懸濁した。
【０１５４】
１０．皮質星状細胞標本
Ｐ０−Ｐ１ラットの皮質を除去し、細切し、ＥＤＴＡ中０．５％トリプシンで処理することにより、皮質星状細胞を収集した。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンを被覆したＴ７５フラスコ上１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種し、４時間後に振とうして、非接着細胞を除去した。星状細胞を培養物中で少なくとも２８日間成熟させた。星状細胞をＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ＋ＨＥＰＥＳ中に５．０×１０５／７０μＬの密度で再懸濁した。
【０１５５】
１１．皮質ミクログリア細胞標本
Ｐ０−Ｐ１ラットの皮質を除去し、細切し、ＥＤＴＡ中０．５％トリプシンで処理することにより、皮質ミクログリア細胞を収集した。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンを被覆したＴ７５フラスコ上２０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５〜７日間平板培養した。経時実験の１日前に、フラスコを攪拌して、接着性の低い細胞を除去し、これらの細胞を非被覆ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）中、Ｄ１０Ｆ中で１．０×１０６／ｍＬの密度で平板培養した。翌日、初代ミクログリア細胞をＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ＋ＨＥＰＥＳ中に５．０×１０５／７０μＬの密度で再懸濁した。
【０１５６】
１２．経時顕微鏡試験
低速度撮像の前にＤＲＧニューロンを３７℃で４８時間インキュベートした。加熱ステージ装置に移す前にＨＥＰＥＳ（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地を培養物に添加した。１００倍油浸対物レンズを用いたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０５Ｍ顕微鏡により３時間にわたり３０秒ごとに経時画像を得た。スポットリム中にまっすぐ延び、特徴的なジストロフィー形態を有していた成長円錐を選択した。ニューロンを３０分間観察し、さらなる細胞型の添加の前にベースライン挙動を測定した（初代マクロファージＮ＝３を除くすべての群についてＮ＝６）。細胞の添加後１５０分間成長円錐を観察した。我々はＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアにより伸長／退縮および成長の速度を追跡した。
【０１５７】
１３．統計解析
データは、Ｍｉｎｉｔａｂ  １５ソフトウエアを用いて一元もしくは二元配置ＡＮＯＶＡまたは適切な場合、一般的線型モデル、およびテュキー事後検定により解析した。
【０１５８】
考察
結果は、マクロファージが直接的な物理的接触によりジストロフィー成体軸索の退縮を誘発するという最初の決定的な証拠を示している。退縮の誘発は、ニューロンの成長状態およびマクロファージの活性化状態に依存していた。初代骨髄由来マクロファージは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軸索退縮を誘発するために細胞系マクロファージおよび脊髄病変内のマクロファージと同様な活性化の状態に達するのにインターフェロンガンマおよびＬＰＳによる刺激を必要とした。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマクロファージの挙動は状態に依存し、マクロファージの浸潤のみがミエリン変性が存在する場合の軸索退縮と相関することを示す以前の研究と一致している（ＭｃＰｈａｉｌら、２００４年）。本試験は、成体感覚ニューロンが、阻害性ＣＳＰＧの勾配によって誘発された停滞した成長のジストロフィー状態にあった場合にマクロファージ誘発性退縮を受けやすかったことを示している。均一なラミニン基質上で成長の活発な状態にある成体ニューロンは、マクロファージとの接触を速やかに断ち、退縮しなかった。
【０１５９】
退縮の誘発は、複数の内因性および外因性のメカニズムを必要とする可能性がある。本試験は、マクロファージとジストロフィーニューロンとの直接的な細胞間接触なしに起こらなかったことを示している。トリプシン処理マクロファージまたはマクロファージ馴化培地のみの添加は、退縮を誘発するのに不十分であった。マクロファージは、退縮を誘発するためにジストロフィー軸索の成長円錐と特異的に接触しなければならないことはなかった。活性化マクロファージとの接触がそのジストロフィー終末から離れた軸索内のシグナル伝達経路を始動させる可能性がある。
【０１６０】
マクロファージおよびニューロンが互いを物理的に識別し、相互作用するいくつかの候補結合パートナーが存在する。マクロファージは、軸索ビトロネクチンを認識し結合するためにアルファｖおよびベータ１インテグリン受容体を使用する可能性があり（Ｓｏｂｅｌら、１９９５年）、変性末梢神経へのマクロファージの接着は、ベータ１インテグリンを阻害することによって部分的に減弱される（Ｂｒｏｗｎら、１９９７年）。視神経の損傷後に、軸索は、マクロファージ上に存在するＥｐｈＢ３受容体により認識されるｅｐｈｒｉｎＢ３を発現する（Ｌｉｕら、２００６年）。シアル酸のマクロファージ特異的受容体であるＳｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎは、ニューロン細胞膜上に存在する（Ｋｅｌｍら、１９９４年；Ｔａｎｇら、１９９７年）。マクロファージはまた、エンドサイトーシスのために損傷ニューロンに警告を与える（ｆｌａｇ）可能性がある、アポトーシスを受ける細胞の外膜表面上で曝露されるホスファチジルセリンを認識する（Ｄｅら、２００２年；Ｄｅ  Ｓｉｍｏｎｅら、２００４年）。さらに、ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅは、ＣＮＳニューロン上で主として発現するケモカインであり、一方、その受容体ＣＸ３ＣＲ１は、マクロファージ上に認められる（Ｚｕｊｏｖｉｃら、２０００年；Ｕｍｅｈａｒａら、２００１年）。これらの分子のもしあるならばどれが、マクロファージ認識のためにそれらを標的にするジストロフィー成体ニューロンの表面上で発現または上方制御されるかを判断するためにさらなる試験を行わなければならない。
【０１６１】
本試験は、上行後柱経路が退縮を受け（Ｂｏｒｇｅｎｓら、１９８６年；ＭｃＰｈａｉｌら、２００４年；Ｓｔｉｒｌｉｎｇら、２００４年；ＢａｋｅｒおよびＨａｇｇ、２００５年；Ｂａｋｅｒら、２００７年）、その時期がマクロファージの浸潤と一致することを確認するものである。軸索退縮は、下行皮質脊髄路（ＦｉｓｈｍａｎおよびＫｅｌｌｅｙ、１９８４年；Ｉｉｚｕｋａら、１９８７年；Ｈｉｌｌら、２００１年；Ｓｅｉｆら、２００７年）、延髄脊髄路（ＨｏｕｌｅおよびＪｉｎ、２００１年）および赤核脊髄路（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００５年；Ｃａｏら、２００７年）を含む脊髄内の他の経路において検討された。軸索退縮の２つの異なる段階があることを考慮することは重要である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの成体マウスの軸索切断感覚軸索を撮像した最近の試験で、損傷の最初の数時間以内の約３００μｍの軸索退縮とそれに続く病変後最初の３日間にわたる軸索の安定化が示された（Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒら、２００５年）。したがって、本試験の焦点は、活性化マクロファージに起因し、ニューロンの本質的特性ではない第２の後期の軸索退縮であった。
【０１６２】
本試験は、損傷前および正常な退縮期間中のクロドロネートリポソームの投与が病変後２〜７日目の第２段階の軸索退縮を予防したことを示している。以前の試験で、クロドロネートリポソーム媒介性マクロファージ枯渇が病変容積の減少およびニューロンの生存率の増加をもたらすことが示された（Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、１９９９年；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎおよびｖａｎ  Ｋｅｓｔｅｒｅｎ−Ｈｅｎｄｒｉｋｘ、２００２年）。これらの著者らはマクロファージ枯渇の軸索再生効果を強調しているが、本試験におけるデータは、クロドロネートリポソーム投与動物の病変の軸索含量の増加は、少なくとも一部は軸索退縮の減衰に起因する可能性があることを示唆している。
【０１６３】
（実施例ＩＩＩ）
幹細胞は活性化マクロファージのＤＲＧへの接着を妨げることができる
結果
１．モデル
後柱圧壊損傷後に、再生軸索は、マクロファージおよびミクログリア細胞に遭遇し、ジストロフィー終末を形成する。これについての概略を図１に示す。本発明者らの実験室による以前の試験で、マクロファージ浸潤が後柱圧壊損傷後の軸索ダイバックと相関することが示された（図２および３）。損傷後の上行後柱感覚軸索の軸索ダイバックの程度を特徴付けた後、本発明者らは、様々な治療戦略を評価するために用いることができる、ダイバックのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを確立した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、成長促進タンパク質ラミニンおよび強力に阻害性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの対立勾配の基質上の培養成体ＤＲＧニューロンからなっている（Ｔｏｍら、２００４年）。このスポット勾配は、軸索成長を停滞させ、損傷脊髄で認められるものと同様なジストロフィー成長円錐の形成を誘発する。
【０１６４】
経時顕微鏡検査法は、本発明者らがフィロポディア（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）の数、ラメラポディア（ｌａｍｅｌｌａｐｏｄｉａ）の程度およびジストロフィー終末における小胞の数などの成長円錐動力学を綿密に検討することを可能にするものであった。軸索の広範な退縮につながるジストロフィー軸索とマクロファージとの間の直接的細胞間接触を頻繁に観察した（図４および５）。マクロファージ馴化培地も、ジストロフィー軸索近傍のマクロファージの存在も退縮をもたらさなかったので、退縮を誘発するためには直接的細胞接触が必要であった。したがって、本発明者らは、活性化マクロファージの枯渇または調節が脊髄損傷における可能な治療標的であるという仮説を立てた。
【０１６５】
本発明者らは、マクロファージ−ニューロン相互作用がダイバックをもたらすメカニズムを解明した。マクロファージは、デブリの分解およびクリアランスを促進する様々なプロテアーゼを分泌することが公知であり、本発明者らは、マクロファージがＭＭＰ−９を発現し、分泌することを示した。彼らはプロテアーゼが、退縮することをもたらす基質からジストロフィー軸索を局所的に除去することに関与する可能性があるという仮説を立てた。マクロファージにより発現されるプロテアーゼの１つのクラスは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。特定のＭＭＰを欠くトランスジェニックマウスが、一般的なＭＭＰ阻害剤ＧＭ６００１を投与した動物と同様に、損傷後の軸索再成長の促進を示すので、ＭＭＰｓは、ＣＮＳにおける再生不良に既に関連付けられた。ＭＭＰ活性部位において亜鉛キレータとして作用するＧＭ６００１をマクロファージ添加時に経時皿に加えた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるＧＭ６００１または特異的ＭＭＰ−９阻害剤による処理（図６）は、マクロファージとの直接的な細胞間接触後にジストロフィー成長円錐の退縮を予防したが、特異的ＭＭＰ−２阻害剤は予防しなかった。ＧＭ６００１および特異的ＭＭＰ−９阻害剤は、マクロファージとジストロフィー軸索との直接的な細胞間接触を妨げなかった。したがって、ＭＭＰｓおよびＭＭＰ−９は、軸索ダイバックに役割を果たすことに関係していると見なされる。
【０１６６】
２．ＭＡＰＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ媒介性軸索ダイバックを妨げる
図７にＭＡＰＣがマクロファージの阻害作用を調節することができるかどうかを判断するための実験設計の概略図を示す。ＭＡＰＣを１ＤＩＶ  ＤＲＧスポット培養物に添加し、さらに１日インキュベートした。これらの共培養したニューロンの成長円錐の形態は、スポット上に一般的に認められるジストロフィー成長円錐とかなり異なっていた。これらの成長円錐は、ますます運動性となり、扁平化し、広範なラメラポディアを有していた。マクロファージは、成長円錐および軸索に接触したが、これらの接触はしばしば一過性のものであり、撮像した６つの軸索のうちの５つは、特徴的なマクロファージ媒介性退縮を受けなかった（図８）。
【０１６７】
この結果は、ＭＡＰＣの神経刺激または免疫調節作用または両方に起因する可能性がある。この問題に取り組むために、一連の馴化培地実験を実施した。解離ＤＲＧニューロンをＭＡＰＣ馴化培地で２４時間処理し、培地対照と比較して、最長の神経突起を評価した。群間に神経突起の長さの有意な差は認められず、作用は完全には神経刺激作用性ではないことが示唆された。
【０１６８】
経時皿へのＭＡＰＣ馴化培地の直接的な添加は、成長円錐の形態のジストロフィー性の停滞状態から運動性の扁平な状態への変化をもたらした。マクロファージは、依然としてこれらの軸索に接触したが、これらの接触は一般的に一過性であり、一般的に軸索退縮をもたらさなかった。ＭＡＰＣ馴化培地で前処理したマクロファージもスポット上で軸索に接触したが、退縮を引き起こさなかった（図９〜１２）。ＭＡＰＣがマクロファージに作用して、それらの受容体発現、損傷細胞に対する反応またはＭＭＰ−９の分泌を変化させる可能性がある。
【０１６９】
３．ＭＡＰＣは後柱圧壊損傷後の軸索ダイバックの程度を低下させる
ｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索ダイバックに対するＭＡＰＣの免疫調節作用を脊髄損傷の後柱圧壊モデルを用いて検討した。軸索ダイバックの最も劇的な段階は、活性化マクロファージの病変への浸潤と時空的に関連していた、病変後２〜４日目に起こる。ＭＡＰＣが、軸索ダイバックの量を減少させるように病変内の活性化マクロファージを調節する可能性があった。したがって、ＭＡＰＣを損傷直後に脊髄に移植し、病変後２〜４日目に軸索ダイバックの程度を測定した。ＭＡＰＣは、病変の約５００ミクロン尾側、中線の５００ミクロン外側に移植した。この位置は、上行路のさらなる破壊を最小限にし、細胞が病変部位で血液およびＣＳＦの流れにより脊髄から変位することを防ぐように損傷軸索の末端の近くにＭＡＰＣを置くために選択した。
【０１７０】
移植したＭＡＰＣを、病変後２および４日目に注射部位におけるＧＦＰ＋細胞の存在によって明らかなように脊髄組織に取り込むのに成功した。さらに、ＭＡＰＣは、移植部位から大幅に移動し、病変のコアを占有し、損傷軸索の終末と結合したことも認められた。病変後２日目に、ＭＡＰＣ移植動物における軸索ダイバックの程度は、対照動物と有意に異なっていなかった（図１３）。ＭＡＰＣの移植は、病変後２日目に通常認められる軸索ダイバックの程度を妨げなかった。しかし、ダイバックのこの初期の段階は、この時点ではマクロファージはまだ病変に浸潤していなかったので、内因性のニューロンメカニズムに起因する可能性が最も高く、活性化マクロファージにより媒介されるものではない。
【０１７１】
病変後４日目に、ＭＡＰＣ移植動物は、非注射対照と比較して軸索ダイバックの程度の有意な低下を示した（図１３）。ＭＡＰＣの移植は、本試験で活性化マクロファージの浸潤によって直接的に引き起こされたことが示された、この時点で通常認められる軸索ダイバックをほぼ完全に減少させた。したがって、損傷脊髄内のＭＡＰＣの存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマクロファージ誘発性軸索ダイバックを減少させるのに十分である。
【０１７２】
（実施例ＩＶ）
病変コアにおけるビメンチン／ＮＧ２＋稀突起グリア前駆細胞は、マクロファージ浸潤の時点近くに拡大し始め、軸索切断線維の末端は、この細胞集団と結合している。これは、ＣＮＳ病変内のＮＧ２＋細胞が軸索を安定化する役割を果たすことにより、ＮＧ２＋細胞がマクロファージ媒介性退縮を予防する理想的候補となることを示唆する。成体マウス脊髄からのＮＧ２＋グリア細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１日後にＤＲＧ培養物に添加した。２日目に、３０分間のベースライン観察期間の後、ＮＲ８３８３マクロファージを経時皿に添加し、さらに２．５時間観察した。ＤＲＧを含む培養物中のＮＧ２＋グリア細胞の存在は、マクロファージ誘発性退縮を予防するのに十分ではない（Ｎ＝５）。図１４において、軸索は、マクロファージ接触後に退縮し、ＮＧ２＋グリア細胞上で安定化する。
【０１７３】
方法
１．ＤＲＧ解離
ＤＲＧは、以前に記載されたように採取した（Ｔｏｍら、２００４年；Ｄａｖｉｅｓら、１９９９年）。手短に述べると、ＤＲＧを成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから切り離した（Ｈａｒｌａｎ）。中枢および末梢根を除去し、神経節をＨＢＳＳ中コラゲナーゼＩＩ（２００Ｕ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）およびディスパーゼＩＩ（２．５Ｕ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）の溶液中でインキュベートした。消化ＤＲＧを洗浄し、新鮮なＨＢＳＳ−ＣＭＦ中で３回緩やかに摩砕した後、低速度で遠心分離した。次いで、解離ＤＲＧをＢ−２７、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に再懸濁し、計数した。ＤＲＧを３０００細胞／ｍＬの密度、合計６０００細胞／皿でＤｅｌｔａ−Ｔ皿（Ｆｉｓｈｅｒ）上に置いた。
【０１７４】
２．経時皿の準備
Ｄｅｌｔａ−Ｔ培養皿（Ｆｉｓｈｅｒ）をＴｏｍら、２００４年と同様に調製した。手短に述べると、２番ビットを用いて各皿の上半分に１つの穴をあけて、経時顕微鏡検査時の細胞、酵素、阻害剤などの添加用のポートを造成した。次いで、皿を滅菌水で洗浄し、ポリ−１−リシン（０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で終夜被覆し、滅菌水で洗浄し、乾燥した。培養添加し表面上に２．０μＬのアグリカン溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ｉｎ  ＨＢＳＳ−ＣＭＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をピペッティングすることにより、アグリカン勾配スポットを形成させ、乾燥した。１つの皿当たり６つのスポットをのせた。アグリカンスポットが完全に乾燥した後、皿の全表面をラミニン溶液（１０μｇ／ｍＬ、ＨＢＳＳ−ＣＭＦ中のＢＴＩ）中に３７℃で３時間浸した。細胞の平板培養の直前にラミニン浴を除去した。
【０１７５】
３．細胞系マクロファージ培養
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ肺胞マクロファージ細胞系である、ＮＲ８３８３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１９２）をＹｉｎら（２００３年）に記載の通り培養した。手短に述べると、細胞を非被覆組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加したＦ−１２Ｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、週２〜３回フィードした。経時顕微鏡実験用の細胞系マクロファージを準備するために、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて収集し、３回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有Ｆ−１２Ｋ中で１．０×１０６／ｍＬの密度で平板培養した。経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、ＨＥＰＥＳ（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中に２．５×１０５／７０μｌの密度で再懸濁した。
【０１７６】
４．ＭＡＰＣ培養
ＧＦＰで標識したＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットＭＡＰＣを、低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４×ＭＣＤＢ−２０１培地（Ｓｉｇｍａ）、１×ＩＴＳ液体培地補足物質（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌリノール酸−アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウム／１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μＭ  ２−Ｐ−Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０００Ｕ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および２％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなるラットＭＡＰＣ培地中で生育した。培養物を１０ｎｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）被覆１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で１０００細胞／ｃｍ２の初期密度で平板培養し、その後、２００細胞／ｃｍ２で再び平板培養した。細胞は、１５ｍｌの培地／フラスコ中で３７℃および５．０％ＣＯ２で維持し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３〜４日ごとに継代を行った。
【０１７７】
５．ＭＡＰＣ馴化培地
細胞を上述のように培養し、４８時間後に５０ｍｌコニカルチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に馴化培地を収集した。馴化培地を４℃で４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を新たな５０ｍｌコニカルチューブに移した。次いで、馴化培地を４℃で保存した。
【０１７８】
ＭＡＰＣ馴化培地を上述のように得、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３  ３，０００ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて５０倍に濃縮した。
【０１７９】
６．ＭＡＰＣ馴化培地処理マクロファージ
ＮＲ８３８３ラットマクロファージを上述のように培養し、経時顕微鏡実験の１日前に、マクロファージをトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて収集し、３回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有Ｆ−１２Ｋ中で１．０×１０６／ｍＬの密度で平板培養した。１ｍＬの血清不含有Ｆ１２Ｋ培地当たり２０μＬの５０倍濃縮ＭＡＰＣ馴化培地を１×の最終濃度を得るために加えた。経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、ＨＥＰＥＳ（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中に２．５×１０５／７０μｌの密度で再懸濁した。
【０１８０】
７．経時顕微鏡検査
経時撮像の前にＤＲＧニューロンを３７℃で４８時間インキュベートした。加熱ステージ装置に移す前に、ＨＥＰＥＳ（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地を培養物に添加した。１００倍油浸対物レンズを用いたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０５Ｍ顕微鏡により３時間にわたり３０秒ごとに経時画像を得た。スポットリム中にまっすぐ延び、特徴的なジストロフィー形態を有していた成長円錐を３０分間選択して、細胞または馴化培地の添加前にベースライン挙動を観察し、次いで３時間観察した。
【０１８１】
細胞添加実験のために、培養ラット由来ＭＡＰＣを組織培養フラスコから採取し、３回洗浄し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地に再懸濁した。共培養実験のために、ＭＡＰＣ（１００，０００／皿）を２４時間後に後根神経節ニューロン培養物に添加し、経時撮像の前に３７℃でさらに２４時間インキュベートした。
【０１８２】
経時撮像時にＭＡＰＣ馴化培地をＤＲＧ培養物に添加した実験のために、３０分間のベースライン成長円錐の観察の後に９０μＬの５０×ＭＡＰＣ−ＣＭを加えた。
【０１８３】
３０分間のベースライン撮像の後にＭＡＰＣ馴化培地処理マクロファージを経時培養物に添加した（５００，０００細胞／皿）。
【０１８４】
Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアを用いて伸長／退縮、成長速度、旋回および分岐を解析した。
【０１８５】
８．免疫細胞化学検査
経時撮像後に、ＤＲＧを４％ＰＦＡで固定し、抗Ｂ−チューブリンＩＩＩ型（１：５００；Ｓｉｇｍａ）、抗コンドロイチン硫酸（ＣＳ−５６、１：５００、Ｓｉｇｍａ）および抗ＧＦＰ（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫染色した。
【０１８６】
９．初代骨髄由来マクロファージ培養
骨髄前駆細胞をＴｏｂｉａｎら、２００４年に記載されているように採取した。手短に述べると、成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）から大腿骨を除去した。大腿骨の末端を除去し、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、ベータ−メルカプトエタノールおよびＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｄ１０Ｆ）を添加した冷ＤＭＥＭを含む注射器を大腿骨に挿入し、骨髄を流し出し、収集した。得られた細胞混合物を７０μｍフィルターに通し、遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットをＡＫＴ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔａｃｒｅ）に再懸濁して、赤血球を溶解し、遠心分離した。上清を除去し、骨髄前駆細胞を含むペレットを再懸濁し、さらに２０％ＬＡＤＭＡＣ細胞系馴化培地（Ｄｒ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｈａｒｄｉｎｇの寛大な寄贈物）をさらに添加した上のＤＭＥＭ中で平板培養して、マクロファージへの分化を誘導した。細胞を１０日目に培養実験用に収集した。経時実験の１日前に、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて初代マクロファージを収集し、Ｄ１０Ｆで３回洗浄し、非被覆ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）中、Ｄ１０Ｆ中で１．０×１０６／ｍｌの密度で平板培養した。翌日、初代マクロファージをＥＤＴＡおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ＋ＨＥＰＥＳ中に５．０×１０５／７０μｌの密度で再懸濁した。
【０１８７】
１０．後柱圧壊病変モデル
成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット２５０〜３００ｇをすべての外科的処置のために吸入イソフルオランガス（２％）で麻酔した。Ｔ１椎弓切除術を実施して、Ｃ８脊髄セグメントの背側面を露出させた。３０ゲージ針を用いて中線から両側０．７５ｍｍにデュロトミーを行った。次いで、Ｄｕｍｏｎｔ＃３宝石商摂子をＣ８の後脊髄に１．０ｍｍの深さに挿入し、摂子を押し込み、圧力を１０秒間保持し、さらに２回繰り返すことによって、後柱圧壊病変を加えた。病変の完了は、白色物質の除去の観察によって確認した。次いで、膜の穴をゲルフィルムで覆った。筋層を４−０ナイロン縫合糸で縫合し、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後２、４、７、１４または２８日目に動物を屠殺した。
【０１８８】
１１．細胞移植
培養ラット由来ＭＡＰＣまたは初代骨髄由来マクロファージ（インターフェロンガンマおよびＬＰＳで２４時間刺激した）を組織培養フラスコから採取し、ＨＢＳＳ−ＣＭＦで３回洗浄し、２００，０００細胞／μＬの密度でＨＢＳＳ−ＣＭＦに懸濁した。後柱圧壊損傷の直後に、１．０μＬの細胞懸濁液を右側後柱に０．５ｍｍの深さで一側に注射した。注射部位は、中線の０．５ｍｍ外側で、病変の縁の０．５ｍｍ尾側であった。細胞は、Ｎａｎｏｊｅｃｔ  ＩＩ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）に取り付けた引きガラスピペットにより１５秒間隔で４４回の２３．０ｎＬパルスで注射した。最終の注射の２分後にガラスピペットを脊髄から引き抜いた。移植後、注射部位をゲルフィルムで覆い、筋層を４−０エチコン縫合糸で閉じ、皮膚を外科用ステープルで閉じた。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後２または４日目に動物を屠殺した
１２．軸索の標識
屠殺の２日前に、後柱をテキサスレッド結合３０００ＭＷデキストランで一側に標識した。手短に述べると、右後肢の坐骨神経を露出させ、Ｄｕｍｏｎｔ＃３鉗子で１０秒間圧壊した。１．０μＬの滅菌水中３０００ＭＷデキストラン−テキサスレッド１０％をＨａｍｉｌｔｏｎ注射器で圧壊部位の坐骨神経内に注射した。筋層を４−０ナイロン縫合糸で、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。動物を標識の２日後にイソフルランの過剰投与により屠殺し、ＰＢＳと続いて４％ＰＦＡで潅流した。組織を採取し、４％ＰＦＡで後固定し、免疫組織化学検査用に処理した。
【０１８９】
１３．免疫組織化学検査
組織を４％ＰＦＡで終夜後固定し、３０％スクロースに終夜浸漬し、ＯＣＴマウンティング媒体中に凍結し、クリオスタット上で２０μｍ縦方向切片に切断した。次いで、組織を抗ＧＦＡＰ／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４０５、抗ＥＤ−１／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５９４または−６３３、抗ＧＦＰ／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８および抗ビメンチン／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６３３で染色した。次にＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡で１０倍の倍率で撮像した。
【０１９０】
１４．軸索ダイバックの定量
軸索ダイバックを定量するために、１匹の動物当たり脊髄の背面の２００μｍ下の深さで始まる３連続切片を分析した。特性ＧＦＡＰおよび／またはビメンチン染色パターンによって病変の中心を識別し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウエアを用いて中心を定めた。病変内で最も遠く突き出している５つの標識軸索の末端と病変の中心との距離を測定した。群内のすべての動物からのすべての切片の測定値を平均して、各時点についてのダイバックの平均距離を求めた。
【０１９１】
（実施例Ｖ）
間葉幹細胞は、市販のものを入手することができる。例えば、Ｒａｔ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＣＲ０２６）は、成体Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４ラットの骨髄から分離されたすぐ使用できる初代間葉幹細胞ならびに間葉幹細胞集団の特徴付けのための陽性および陰性マーカーのパネルを備えている。陽性細胞マーカーは、間葉幹細胞上に存在する２つの細胞表面分子（インテグリンｂ１およびＣＤ５４）に対する抗体を含む。陰性細胞マーカーは、間葉幹細胞によって発現されない２つの特異的造血細胞表現マーカー（白血球上に存在するＣＤ１４ならびに単球およびマクロファージ上に存在するＣＤ４５）に対する抗体を含む。これらの間葉幹細胞を、退縮を減少させる能力について評価したところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（グリア瘢痕）で退縮を減少させた（接着を減少させた）ことが認められた。
【０１９２】
（実施例ＶＩ）
５μｇ／ｍｌラミニン上で生育した成体ＤＲＧのＭＡＰＣ馴化培地処理は、神経突起の伸長を促進する。図１６を参照のこと。各解離ＤＲＧからの最長の軸索を、培地がＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａを含み、ＭＡＰＣ馴化培地、対照培地を加えた、または追加の培地を加えなかった、群について測定した。すべての条件は、互いから有意であった。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０００１。Ｂ、無処理ＤＲＧの伸長の平均量を表す１６倍画像。Ｃ、ＭＡＰＣ馴化培地で前処理したＤＲＧの伸長の平均量を表す１６倍画像。
【０１９３】
この結果は、ＭＡＰＣの神経刺激または免疫調節作用または両方に起因する可能性がある。この問題に取り組むために、一連の馴化培地実験を実施した。解離ＤＲＧニューロンを新鮮なＭＡＰＣ馴化培地で２４時間処理し、培地対照と比較した。各ＤＲＧの最長の神経突起を測定した。新鮮ＭＡＰＣ馴化培地は、ラミニン上の伸長を有意に増加させた。このことから、ＭＡＰＣは成体ニューロンに対して神経刺激作用を有する１つまたは複数の成長因子を分泌することが示唆される。以前に凍結したＭＡＰＣ馴化培地は、ニューロンに対して同じ作用を示さなかったことから、因子が凍結過程で変化または不活性化したことが示唆される。
【０１９４】
【数１】
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【０１９５】
【数２】
2020180166.tif 000003
【０１９６】
【数３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【外国語明細書】
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