(57)【要約】【課題】本発明は、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対する溶菌活性を有する新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む感染症治療剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る感染症治療剤は、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌を原因とする感染症を治療するためのものであり、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）、およびこれら変異体から選択される１以上のバクテリオファージを有効成分として含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症の治療剤であり、
前記感染症が黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌を原因とするものであり、
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）、およびこれら変異体から選択される１以上のバクテリオファージを有効成分として含むことを特徴とする感染症治療剤。
【請求項２】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する請求項１に記載の感染症治療剤：
（１）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）において、１以上、９６５６以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す；
（２）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す。
【請求項３】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する請求項１に記載の感染症治療剤：
（３）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）において、１以上、４６６０以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（４）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
【請求項４】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する請求項１に記載の感染症治療剤：
（５）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）において、１以上、２０７５以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（６）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
【請求項５】
少なくともＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）およびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）を含む請求項１〜４のいずれかに記載の感染症治療剤。
【請求項６】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３）。
【請求項７】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）。
【請求項８】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌を原因とする感染症の治療に有効な新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む感染症治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原細菌のうち黄色ブドウ球菌は、環境中、ヒトや動物の皮膚、腸などの消化器に常在しているが、局所感染症や全身感染症の原因となる。より具体的には、食中毒、肺炎、髄膜炎、敗血症などの原因菌である。緑膿菌も自然界に広く分布しているが、やはり感染症の原因となる。
前世紀の中ごろ抗生物質の実用化が成功し、細菌感染法の問題は解決されたかに見えた。しかしながら抗生物質の濫用により１９８０年代より薬剤耐性菌が増加し、抗生物質の新規開発と耐性菌の出現という悪循環を繰り返している。現在ではほとんどの病原細菌で多剤耐性化が進行しており、黄色ブドウ球菌と緑膿菌にも、ほとんどの抗生物質が効かないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）や多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）が出現している。その一方で、抗生物質の新規開発は年々減少している。そのため、従来の抗生物質とは異なる機序を持つ細菌感染症治療薬の開発が急務である。
抗生物質を用いない細菌感染症の治療法としては、バクテリオファージを用いるファージ療法が知られている。バクテリオファージは抗生物質に比べて特異性が高く、特定の細菌株以外に溶菌性を示さないことも多いので、理論上、患者に対して無害なだけでなく、腸内細菌叢に含まれる善玉細菌など、病原性を持たず、日和見感染症を防ぐ他の細菌に対しても無害であるバクテリオファージを選択して用いることも可能であるため、副作用を起こし難いと考えられる。また、バクテリオファージは宿主細菌に感染して増殖するため、投与量や投与回数も少なくてよい。ファージ療法は、東欧やロシアを中心に臨床応用されたが、近年、西欧諸国でも薬剤耐性菌に対する治療手段として注目され、我が国の薬剤耐性国家行動計画にもその可能性が明記されている。
例えば特許文献１には、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）を溶菌させる性質を有するバクテリオファージが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−５０３７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、ファージは抗生物質と作用機序が異なるため、薬剤耐性を獲得した黄色ブドウ球菌や緑膿菌に対しても効果が期待できる。しかしファージ療法は未だに一般化しておらず、有効なファージが求められている。
そこで本発明は、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対する溶菌活性を有する新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む感染症治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対して広い抗菌スペクトルを示す新規バクテリオファージを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【０００６】
［１］  感染症の治療剤であり、
前記感染症が黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌を原因とするものであり、
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）、およびこれら変異体から選択される１以上のバクテリオファージを有効成分として含むことを特徴とする感染症治療剤。
［２］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する上記［１］に記載の感染症治療剤：
（１）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）において、１以上、９６５６以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す；
（２）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す。
［３］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する上記［１］に記載の感染症治療剤：
（３）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）において、１以上、４６６０以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（４）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
［４］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８の変異体のゲノムが以下のいずれかの塩基配列を有する上記［１］に記載の感染症治療剤：
（５）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）において、１以上、２０７５以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（６）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
［５］  少なくともＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）およびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）を含む上記［１］〜［４］のいずれかに記載の感染症治療剤。
［６］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３）。
［７］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４）。
［８］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５）。
【発明の効果】
【０００７】
バクテリオファージは一般的に特異性が極めて高く単一の菌株にのみ溶菌性を示すことも多いのに対して、本発明に係るバクテリオファージは、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対して広い抗菌スペクトルを示す。よって本発明は、抗生物質によらず、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌を原因とする疾患を治療できる手段として、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明に係る新規バクテリオファージの電子顕微鏡である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７（以下、「ＫＳＡＰ７」と略記する）は、下記の通り寄託機関に寄託されている。ＫＳＡＰ７のゲノムの塩基配列を配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）として示す。ＫＳＡＰ７は、主に多くの黄色ブドウ球菌に対して溶菌活性を示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  受託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８３
【００１０】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４（以下、「ＫＰＡＰ４」と略記する）は、下記の通り寄託機関に寄託されている。ＫＰＡＰ４のゲノムの塩基配列を配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）として示す。ＫＰＡＰ４は、主に多くの緑膿菌に対して溶菌活性を示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  受託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８４
【００１１】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８（以下、「ＫＰＡＰ１８」と略記する）は、下記の通り寄託機関に寄託されている。ＫＰＡＰ１８のゲノムの塩基配列を配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）として示す。ＫＰＡＰ１８は、主に多くの緑膿菌に対して溶菌活性を示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  受託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８８５
【００１２】
なお、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ  ＫＳＡＰ７、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ４、およびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｅｌｖｉｒｕｓ  ＫＰＡＰ１８は、それぞれ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ属、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ属、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｅｌｖｉｒｕｓ属に属するＫＳＡＰ７株、ＫＰＡＰ４株、およびＫＰＡＰ１８株を意味する。
【００１３】
本発明に係る感染症治療剤は、ＫＳＡＰ７、ＫＰＡＰ４、ＫＰＡＰ１８、およびこれらの変異体から必須的になる群より選択される１以上のバクテリオファージを含む。かかる変異体のゲノムは、１以上の変異を受けたＫＳＡＰ７、ＫＰＡＰ４、またはＫＰＡＰ１８のゲノムに相当するものであり、且つ当該変異体は黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対する溶菌性を示す。
【００１４】
上記変異体は、例えば、以下のいずれかの塩基配列のゲノムを有する。
（１）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）において、１以上、９６５６以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す；
（２）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が黄色ブドウ球菌に対する溶菌性を示す。
（３）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）において、１以上、４６６０以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（４）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の塩基配列に対して９３％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
（５）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）において、１以上、２０７５以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す；
（６）配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する前記変異体が緑膿菌に対する溶菌性を示す。
【００１５】
上記塩基配列（１）において、変異数としては、８２７７以下または６８９７以下が好ましく、５５１８以下、４１３８以下または２７５９以下がより好ましく、１３７９以下、６８９以下または２７５以下がより更に好ましい。
【００１６】
上記塩基配列（２）における同一性としては、９４％以上または９５％以上が好ましく、９６％以上、９７％以上または９８％以上がより好ましく、９９％以上、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００１７】
上記塩基配列（３）において、変異数としては、３９９４以下または３３２８以下が好ましく、２６６３以下、１９９７以下または１３３１以下がより好ましく、６６５以下、３３２以下または１３３以下がより更に好ましい。
【００１８】
上記塩基配列（４）における同一性としては、９４％以上または９５％以上が好ましく、９６％以上、９７％以上または９８％以上がより好ましく、９９％以上、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００１９】
上記塩基配列（５）において、変異数としては、１６６０以下が好ましく、１０３７以下がより好ましく、４１５以下または２０７以下がより更に好ましい。
【００２０】
上記塩基配列（６）における同一性としては、９９．２％以上が好ましく、９９．５％以上がより好ましく、９９．８％以上または９９．９％以上がより更に好ましい。
【００２１】
塩基配列の同一性は、例えばアミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）を使う方法など、当業者であれば常法を使って決定することができる。また、上記塩基配列（１）〜（６）における変異の位置も、同じく常法を使って決定することができる。
【００２２】
上記変異体が黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対する溶菌性を示すか否かは、常法により測定することができる。例えば、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌の感染症の患者の患部から細菌を単離して培養し、培養培地に変異体を添加して更に培養した後に細菌を観察し、細菌の形状の変化や溶菌斑の有無により溶菌性を判断すればよい。また、本発明に係るＫＳＡＰ７、ＫＰＡＰ４、および／またはＫＰＡＰ１８の黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌に対する溶菌性も、同様に予備試験してもよい。
【００２３】
本発明に係る感染症治療剤としては、少なくともＫＰＡＰ４およびＫＰＡＰ１８を含むものが好ましい。ＫＰＡＰ４とＫＰＡＰ１８は特に緑膿菌に対して有効であり、これらを組み合わせることにより、特に広い範囲の緑膿菌を溶菌することが可能になる。
【００２４】
本発明に係る感染症治療剤の投与形態は特に制限されず、患者の症状などに応じて適宜選択すればよい。例えば、全身感染症に対しては血液中に注射投与したり経口投与すればよく、局所感染症に対しては患部に注射投与したり外用薬を塗布すればよい。
【００２５】
本発明の感染症治療剤は、上記バクテリオファージの懸濁液から調製される。バクテリオファージの懸濁液は常法により調製することができる。例えば、対象となるバクテリオファージが溶菌性を示す細菌を液体培地中で培養した後、当該培地に対象バクテリオファージを添加してバクテリオファージを細菌に感染させる。次いで、培養を継続すると細菌は溶菌され、その結果、バクテリオファージが培養液中に増加する。培養液中におけるバクテリオファージの濃度が適度、例えば１０2個／ｍＬ以上、１０12個／ｍＬ以下になったら、遠心分離や濾過などによりバクテリオファージ以外の固形成分を除去し、バクテリオファージの懸濁液とする。
【００２６】
上記液体培地や懸濁液には、バクテリオファージを安定して保存するための安定化剤を添加することが好ましい。かかる安定化剤としては、ｐＨを６以上、８以下、好ましくは６．５以上、７．５以下に維持するためのｐＨ調整剤や緩衝剤；グリシン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；塩化ナトリウムや塩化カルシウム等の塩類を挙げることができる。
液状の感染症治療剤中のバクテリオファージ濃度は、最終的に１０3ｐｆｕ／ｍＬ以上、１０14ｐｆｕ／ｍＬ以下にすることが好ましい。また、液状の感染症治療剤は、血液などの体液と等張または略等張とすることが好ましい。なお、経口投与や局所投与のための錠剤や外用剤としての固体状感染症治療剤も、上記バクテリオファージ懸濁液に賦形剤などを添加し、造粒やゲル化するなどして調製することができる。
【００２７】
本発明に係る感染症治療剤の投与量は特に制限されず、患者の年齢、性別、体重、症状、重篤度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、患者に対して１回あたり、上記バクテリオファージの力価で１０2ｐｆｕ以上、１０8ｐｆｕ以下程度とすることができる。また、１日あたりの投与回数は、０．５回以上、６回以下程度とすることができる。なお、患者はヒトに限定されず、家畜や愛玩動物など、ヒト以外の動物であってもよい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００２９】
実施例１
（１）ファージ液の調製
高知県高知市内および南国市内の下水処理場の汚水を濾紙で濾過し、濾液に１０％ポリエチレングリコール６０００と０．５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、１０，０００×ｇ、４℃で２０分遠心分離し、ファージを含むペレットを得た。得られたペレットを生理食塩水に懸濁後、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過することにより除菌してファージ液を得た。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ  ＩＩＤ９７５）と緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ１およびＰＡ３）を３７℃で１４〜１６時間、個別に事前培養した液（０．１ｍＬ）と、上記の下水処理場の汚水から得たファージ液（０．１ｍＬ）を、寒天を１．５％含むＴＳＭＢ下層寒天培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を添加したＴｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）上に接種した。また、寒天を０．５％含むＴＳＭＢ寒天培地（５ｍＬ）を５５℃で溶融し、その上に流し込んで固化させて上層培地とし、３７℃で１４〜１６時間培養した。各菌のローン上に生じたプラークを、ＴＳＭＢ液体培地で希釈後、同一の菌培養液を使用し、同様の方法で再度プラークを得るという操作を再度繰り返し、純化プラークを得た。
得られた各純化プラークをＴＳＭＢ液体培地に懸濁し、この懸濁液０．１ｍＬと、各プラークが形成された菌の液０．１ｍＬを３〜５枚のＴＳＭＢ寒天プレートに接種し、上記軟寒天ＴＳＭＢ培地５ｍＬを流し込み混合後、３７℃で１４〜１６時間培養した。完全に溶菌したプレート上（３〜５枚）に、ＴＳＭＢ液体培地（５〜１０ｍＬ）を流し込み、上層培地を破砕後、遠心管に入れ、９，８００×ｇ、４℃で５〜１０分間遠心分離した。上清を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過することにより、純化ファージ液を得た。
【００３０】
（２）ファージ感受性試験
表１に示す黄色ブドウ球菌と緑膿菌を３７℃で１４〜１６時間事前培養した。得られた各培養液（０．１ｍＬ）を、寒天を１．５％含む下層寒天培地上に接種した。また、寒天を０．５％含む寒天培地（５ｍＬ）を５５℃で溶融し、その上に流し込んで固化させて上層培地とした。上記（１）で得た各ファージ液（１０μＬ）をディスポ白金耳に付着させ、上記培地の表面に数本の線状に塗布し、３７℃で１４〜１６時間培養した。
全ての線で溶菌が確認されるか、溶菌線とプラークが確認されるファージを陽性、まったく溶菌が認められないファージを陰性、最初の部分だけ溶菌が認められるがプラークが確認されないファージをＬＦＷ（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）とした。黄色ブドウ球菌に溶菌活性を示すファージをＫＳＡＰ７と名付け、緑膿菌に溶菌活性を示す２種のファージをＫＰＡＰ４とＫＰＡＰ１８と名付け、結果を表１，２に示す。なお、表２中、「Ｗ」は判定困難であることを示す。
【００３１】
【表１】
2020143019.tif 000002
【００３２】
【表２】
2020143019.tif 000003
【００３３】
表１に示される結果の通り、本発明に係るファージＫＳＡＰ７については、試験した３０種の黄色ブドウ球菌のうち溶菌活性が示されなかった菌株が１種のみ、効果が十分でなかった菌株が１種のみであり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むほとんどの黄色ブドウ球菌に対して溶菌活性が示された。なお、菌株名にＭＲが付いている菌株は全てＭＲＳＡである。
また、表２に示される結果の通り、本発明に係るファージＫＰＡＰ４とＫＰＡＰ１８は多くの緑膿菌に溶菌活性を示し、両方ともが溶菌活性を示さない緑膿菌は１種のみであったため、ファージＫＰＡＰ４とＫＰＡＰ１８の併用により極めて優れる緑膿菌感染症治療剤となり得ることが分かった。
【００３４】
（３）有効ファージの同定
上記（２）で陽性と判断されたファージと、当該ファージが溶菌活性を示す黄色ブドウ球菌または緑膿菌をＴＳＭＢ培地（２００〜２５０ｍＬ）に接種し、３７℃で６〜１６時間培養した。培養後、培養液を１０，０００×ｇ、４℃で５〜１０分間遠心分離した。得られた培養上清に、１０％ポリエチレングリコール６０００と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、１０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡを含むＴｒｉｓ−Ｍｇ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，ｐＨ７．２）（１〜２ｍＬ）に懸濁し、３７℃で３０分間保温した。
ＡＡＳ溶液（１００ｍＭ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ７．２）に塩化セシウムを加えて密度を調整し、下より密度１．７ｇ／ｍＬ、１．５ｇ／ｍＬ、１．３ｇ／ｍＬの溶液を１．５ｍＬずつ重層し、その上に上記懸濁液を重層し、１００，０００×ｇ、４℃で１時間超遠心分離に付した。ファージバンドを回収し、ＡＡＳ溶液（１０００ｍＬ）を用い、４℃で１時間透析した。得られた各ファージ（１０μＬ）を電子顕微鏡で観察した。結果を図１に示す。
黄色ブドウ球菌に溶菌活性を示す図１（１）のファージＫＳＡＰ７の頭部直径は１０７ｎｍ、尾部長は２３６ｎｍであった。緑膿菌に溶菌活性を示す図１（２）のファージＫＰＡＰ４の頭部直径は８５ｎｍ、尾部長は１５ｎｍであった。緑膿菌に溶菌活性を示す図１（３）のファージＫＰＡＰ１８の頭部直径は１３１ｎｍ、尾部長は２３８ｎｍであった。これら画像の形態より、各ファージはＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するものであると同定された。
また、残りの各ファージ液を、１００，０００×ｇ、４℃で時間超遠心分離に付し、ペレットからフェノール法によりＤＮＡを回収し、次世代シークエンサーにより全塩基配列を解読した。
得られたゲノム配列をＧｅｎｅｔｙｘ  Ｖｅｒ．１３で解析したところ、黄色ブドウ球菌に溶菌活性を示すファージＫＳＡＰ７のゲノム配列（配列番号１，１３７，９５０ｂｐ）は、唯一、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｖＢ＿ＳａｕＭ＿Ｒｅｍｕｓのゲノム配列（１３４，６４３ｂｐ）のみに、９３％のゲノム領域で配列同一性が９９％であったものの、残部７％では配列同一性が低く、更にゲノムサイズに３，３０７ｂｐの違いがあるため、ファージＫＳＡＰ７は新規なものであると認められた。また、ゲノム配列より、ファージＫＳＡＰ７はＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｓｉｌｖｉａｖｉｒｕｓ属に属するものであると同定された。
緑膿菌に溶菌活性を示すファージＫＰＡＰ４のゲノム配列（６６，５７８ｂｐ）は、本発明者らが以前発表したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｇｅ  ＫＰＰ１２（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，７（１０），ｅ４７７４２）のゲノム配列（６４，１４４ｂｐ）と９３％のゲノム領域で配列同一性が９７％であったものの、残部７％では配列同一性が低く、更にゲノムサイズに２７，４３４ｂｐの違いがあるため、ファージＫＰＡＰ４は新規なものであると認められた。また、ゲノム配列より、ファージＫＰＡＰ４はＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｂｕｎａｖｉｒｕｓ属に属するものであると同定された。
緑膿菌に溶菌活性を示すファージＫＰＡＰ１８のゲノム配列（２０７，５１６ｂｐ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｇｅ  ｐｈｉＥＬのゲノム配列（２１１，２１５ｂｐ）と９９％のゲノム領域で配列同一性が９８％であったものの、ゲノムサイズに３，６９９ｂｐの違いがあるため、ファージＫＰＡＰ１８は新規なものであると認められた。また、ゲノム配列より、ファージＫＰＡＰ１８はＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｅｌｖｉｒｕｓ属に属するものであると同定された。
【図１】
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【配列表】
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