(57)【要約】【課題】  本発明は、メラニン形成阻害作用が相加的ではなく相乗的に発揮される皮膚外用剤を提供する。【解決手段】  発明の皮膚外用剤は、ビタミンＣ誘導体と３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸とを有効成分として含有することを特徴とし、ビタミンＣ誘導体としては、ＡＡ２Ｇ、ＶＣ−ＩＰ、ＶＣ−エチル及びＶＣ−ＰＭＧからなる群から選ばれる１種以上の誘導体を挙げることができる。３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸は新規美白剤の基剤として非常に有用なものと考えられ、又、３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸の作用点は酵素阻害ではなく、基質(L-DOPA)との結合によるものであり、この点も他の美白剤とは異なる点である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＣ誘導体と３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸とを有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
ビタミンＣ誘導体が、ＡＡ２Ｇ、ＶＣ−ＩＰ、ＶＣ−エチル及びＶＣ−ＰＭＧからなる群から選ばれる１種以上の誘導体である請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚外用剤に関するものであり、更に詳しくは、含有する有効成分が相乗効果を発揮する優れた皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
公知の有機ゲルマニウム化合物である３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸（以下、ＴＨＧＰと略記することがある。）は、これまでに抗炎症作用・鎮痛作用・免疫賦活作用等を示すことが報告されていて、近年の研究によって、ＴＨＧＰはシスジオール構造を有する物質と錯体を形成することが明らかとなった。
【０００３】
例えば、チロシンからチロシナーゼにより誘導されるドーパ（以下、Ｌ-ＤＯＰＡと略記することがある。）は、このシスジオール構造を有する分子であり、ドーパキノンの生成を経由するメラニンの前駆体として知られている。従って、ＴＨＧＰとＬ-ＤＯＰＡとが錯体を形成すれば、Ｌ-ＤＯＰＡからのメラニン生成を阻害すると考えられた。
【０００４】
この着想に基づき、本発明の発明者らは検討を重ね、既にメラニンの生成を抑える作用を有すると共に、メラニン生成反応を媒介する酵素チロシナーゼの活性を阻害する化合物であるコウジ酸と、シスジオール構造を有する分子と錯体を形成するＴＨＧＰとを組み合わせることにより、メラニン形成阻害作用が相加的ではなく相乗的に発揮されるのではないかとの知見を得、当該知見に基づいて完成した発明についてすでに特許出願をしている。
【０００５】
一方、ビタミンＣ（以下、ＶＣと略記することがある。）として知られるアスコルビン酸は、美白効果、栄養効果や酸化防止効果があるとして、医薬品や化粧品の素材として広く使用されている。その効果は、チロシナーゼ活性の抑制、ドーパクロムからクロムへの酸化還元作用、活性酸素の除去等である。よって、酸化反応であるメラニン生成反応を、抗酸化物質であるアスコルビン酸が還元反応により抑制できることになる。しかしながら、ビタミンＣは酸化されやすく、不安定であるため、安定性を持たせその効果を増強させるために様々な誘導体が作られてきた。
【０００６】
例えば、特許文献１には、ＶＣの２位の水酸基にグルコースがα-配位で結合した化合物（以下、ＡＡ２Ｇと略記することがある。）が開示されていて、このＡＡ２Ｇは長期間に亘って安定で、しかも生体内に入ってＶＣ活性を発揮するＶＣ誘導体であるとされる。
【０００７】
又、ＡＡ２Ｇ以外にも、ＶＣ誘導体としてはテトラヘキシルデカン酸アスコルビル（以下、ＶＣ−ＩＰと略記することがある。）、エチルアスコルビン酸（以下、ＶＣ−エチルと略記することがある。）やリン酸Ｌ-アスコルビルマグネシウム（以下、ＶＣ−ＰＭＧと略記することがある。）等が知られており、各種化粧品等に使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願平０２−３１１３１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＶＣ、ＡＡ２Ｇ、ＶＣ−ＩＰ、ＶＣ−エチル及びＶＣ−ＰＭＧは、いずれも抗酸化性を有しているので、ドーパを、ＴＨＧＰと錯体形成出来ないドーパキノンへの酸化から保護し、これらの化合物により、ＴＨＧＰとドーパとの錯体形成の状態を保ちやすくすることが想定でき、即ち、これらのＶＣ誘導体のいずれかと上記ＴＨＧＰとを組み合わせることにより、より優れた相乗的なメラニン形成阻害効果を発揮することが期待されるが、従来はこのような提案はされていなかった。
【００１０】
又、前述した特許出願にかかるＴＨＧＰとコウジ酸による発明は、非常に効果的であったが、美白に関してはいくつかの素材の効果により健康被害も発生しており、コウジ酸も大きな問題ではないが現在は使いにくい素材の一つとされている。そのため、ＶＣ誘導体のような副作用の少ない安全な素材での美白効果を更に高められれば、非常に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の皮膚外用剤は、上記のような課題を解決するためになされたもので、ビタミンＣ誘導体と３−トリヒドロキシゲルミルプロパン酸とを有効成分として含有することを特徴とするものである。
【００１２】
又、上記例示したビタミンＣの誘導体としては、例えばＡＡ２Ｇ、ＶＣ−ＩＰ、ＶＣ−エチル及びＶＣ−ＰＭＧからなる群から選ばれる１種以上の誘導体を挙げることができるが、ビタミンＣの誘導体であれば本発明で有効成分として使用することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の皮膚外用剤は、ＴＨＧＰとビタミンＣ誘導体とを含むので、ＡＡ２Ｇ等のＶＣ誘導体の還元性によって、ＴＨＧＰとドーパ等との相互作用可能な状態を安定化し、ドーパ等のメラニンへの代謝経路中のシスジオール構造を有する分子とＴＨＧＰとが錯体を形成しやすくすることによって、例えばより優れたメラニン形成阻害効果等を発揮することができるのである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＴＨＧＰ、ＡＡ２Ｇをメラノーマ（黒色細胞腫）細胞に組み合わせ添加したときのメラニン産生抑制について示したグラフである。
【図２】ＴＨＧＰ、ＡＡ２Ｇをメラノーマ（黒色細胞腫）細胞に組み合わせ添加したときのメラニン産生抑制の相乗性について示したグラフである。
【図３】ＴＨＧＰ、ＶＣ−エチルをメラノーマ（黒色細胞腫）細胞に組み合わせ添加したときのメラニン産生抑制について示したグラフである。
【図４】ＴＨＧＰ、ＶＣ−エチルをメラノーマ（黒色細胞腫）細胞に組み合わせ添加したときのメラニン産生抑制の相乗性について示したグラフである。
【図５】ＴＨＧＰ或いはＡＡ２Ｇをヒト正常皮膚メラニン産生細胞に単独添加したときのメラニン産生抑制について示したグラフである。
【図６】ＴＨＧＰおよびＡＡ２Ｇをヒト正常皮膚メラニン産生細胞に組み合わせ添加したときのメラニン産生抑制(a)および相乗性(b)について示したグラフである。
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤の第１の有効成分であるビタミンＣ誘導体の構造は、いずれも公知であり、それぞれ、式
ＡＡ２Ｇ
【化１】
2020180057.tif 000003
【００１７】
ＶＣ−ＩＰ
【化２】
2020180057.tif 000004
【００１８】
ＶＣ−エチル
【化３】
2020180057.tif 000005
【００１９】
ＶＣ−ＰＭＧ
【化４】
2020180057.tif 000006
で表されるものである。
【００２０】
加えて、上記ＶＣ誘導体以外のＶＣ誘導体としては、例えば、パルミチン酸アスコルビルリン酸３ナトリウム、テチラヘキシルデカン酸アスコビル等を挙げることができる。
【００２１】
又、本発明の皮膚外用剤の第２の有効成分であるＴＨＧＰは、式
【化５】
2020180057.tif 000007
で表されるものである。このＴＨＧＰは、上記の通り例えば式
【化６】
2020180057.tif 000008
で表される、L-ドーパのような、シスジオール構造を有する物質と錯体形成することが解明されている。
【００２２】
尚、ＴＨＧＰは水溶液中でのみ上記構造をとるものであり、これを単離しようとすると、結晶化に際して脱水反応により重合して、式
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３
或いは式
[（Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３]ｎ
等で表される有機ゲルマニウム化合物となる。当該有機ゲルマニウム化合物は、重合度ｎを用いて表した場合は、重合度ｎ＝２〜∞のオリゴマー乃至ポリマー（poly-trans-[(2-carboxyethyl)germasesquioxane]）ということができるが、重合度ｎを用いずに表わした場合も同様である。
【００２３】
本発明の皮膚外用剤は、上記第１及び第２の有効成分を含有するものであるが、必要に応じ、本発明の効果を失うことがない範囲で、他の成分を添加することもできる。
【００２４】
又、本発明の皮膚外用剤において、ＴＨＧＰとビタミンＣ誘導体との量比としては、皮膚外用剤の調剤において採用される範囲を挙げることができるが、例えばビタミンＣ誘導体としてＡＡ２Ｇを採用した場合、好ましくはＴＨＧＰ１に対しＡＡ２Ｇ０．４〜１０という範囲を挙げることができる。
【００２５】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これは本発明をなんら制限するものではない。
【実施例１】
【００２６】
L-ドーパのチロシナーゼによるメラニンへの代謝に対して、THGPと、VC及びVC誘導体の有効性を評価するために、酵素反応液中にVC及びVC誘導体を添加して抑制効果を検討した。
手法及び結果
酵素を用いたTHGP並びにVC及びVC誘導体単独でのメラニン産生抑制試験
THGPとVC及びVC誘導体が、チロシナーゼによってL-ドーパから誘導されるメラニンの産生を抑制することの確認をまず行った。5mM L-DOPA 40μlと、後述する各濃度のTHGP並びにVC及びVC誘導体（AA2G、 VC-エチル及びVC）20μlの組み合わせ、及び500 U/ml チロシナーゼ 40μl（計100μl）を96-well plateに分注してメラニン形成させ、阻害作用を評価した。37℃、20分間のインキュベート後、メラニンの吸収波長である405nmの吸光度を計測した。
【００２７】
表１に明らかなように、THGPは0.2mMから5mMにかけて濃度依存的にチロシナーゼ酵素反応によるメラニン産生を抑制した（93〜67％）。又、AA2Gは25mM（89％）と30mM（38％）において、VC-エチルは20mM（64％）と40mM（42％）、VCは0.1mM（90％）と1mM（68％）において、メラニンの産生抑制が確認された。又、表１中の括弧内の数値はTHGPを添加しない場合の各VC誘導体濃度におけるメラニン量を100とした時のTHGP添加濃度ごとのメラニンの吸光度％を示していて、VC誘導体を加えない（None）場合の数値と同じならば相加効果、より小さい値なら相乗的な効果であると考えられる。よって、THGP5mMとAA2G25mM、30mMの組み合わせで、共に明確な相乗的な抑制が認められた。
【００２８】
考察
THGP及びVC誘導体の添加により、チロシナーゼの酵素反応は抑制され、いずれもかなりの高濃度においてはメラニン産生が抑制されることが確認できた。特に、AA2GとTHGPは同時添加によって相乗的な抑制が認められた。
【００２９】
【表１】
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【実施例２】
【００３０】
メラニン細胞を用いた実験により、生体の中でTHGPやVC誘導体がメラニン産生に対して抑制的に機能しうるかを評価するために、マウスの悪性メラノーマ細胞であるB16 4A5株化細胞を用いて以下の試験を行った。
【００３１】
手法
細胞におけるメラニン量の測定
B16 4A5メラノーマ細胞を24-well plateに5×104cells/wellで播種した。24時間後、50, 500, 5000μMの濃度のTHGPと、メラニン産生抑制20〜30％前後の濃度のVC誘導体及びL-DOPA 100μMを添加し、細胞内におけるメラニン産生抑制効果について検討した。72時間継続培養した培養上清を100μl回収して、96-well plateに分注し、メラニンの吸収波長である405nmの吸光度を計測した。
【００３２】
結果
細胞におけるTHGP併用によるメラニン産生抑制効果についての評価
AA2GとTHGPの組み合わせでのメラニン産生量を図１に、又、その組み合わせ効果の相乗性について図２に示し、VCエチルとTHGPの組み合わせでのメラニン産生量を図３に、又、その組み合わせ効果の相乗性について図４に示した。その結果、図１及び図２に示すように、AA2G 500μMもしくは1000μMとTHGP 500μMを併用したときに相乗効果を示した（図１）。その中でも、AA2G 1000μMとTHGP 500μMを併用した時に7.9倍と強い相乗効果を示した（図２）。又、VC-エチルと併用した場合では、VC-エチル 5000μMとTHGP 500μMを併用した時のみ約1.3倍の相乗的な抑制効果を示した（図３及び４）。尚、THGPを5000μM使用した実験系では、THGP単独でも抑制効果が十分にみられるので、本実験系には不適と考え、図２及び図４では表記を省略した。
【００３３】
考察
細胞試験においてAA2GとVC-エチルがTHGPとの相乗効果を示した。その中でも特に、AA2G 1000μMとTHGP 500μMを併用した時においてもっとも高い相乗効果を示した（図２）。THGP 500μMは、公知の有機ゲルマニウム化合物であるＧｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３に換算するとおよそ0.0085％であり、AA2G 1000μMは0.034％である。ex vivoの試験においてAA2Gの浸透率は10％ほどと報告されていて、THGPの皮膚への浸透率については解析されていないが、仮に約1％浸透すると仮定したとき、浸透した部位での作用濃度を前述のとおりとなる想定で設定すると、今回の実験結果からは、THGPの濃度が約1％、AA2Gの濃度が1％という程度の組み合わせが最も効果の高い濃度と考えられる。
【実施例３】
【００３４】
ヒトのメラニン細胞を用いた実験により、ヒトの皮膚においてTHGPやVC誘導体がメラニン産生に対して抑制的に機能しうるかを評価するために、正常なヒトの皮膚から調製された正常ヒト皮膚メラノサイト（NHEM）細胞を用いて以下の試験を行った。
【００３５】
濃度換算表
本試験において、実験はすべてモル濃度をベースにして実験を行った。重量％による濃度表記も必要と考えられるので、はじめに実験に用いたモル濃度の重量％での濃度換算表を以下に付記する。
【表２】
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【００３６】
尚、上記のように、AA2Gの皮膚透過率は、文献によると10％弱であり、2％（w/v）の製品であると0.2％弱が透過濃度となり、5000μMの0.17％は概ね妥当な濃度となる。
【００３７】
手法
細胞培養
NHEM-HP(AD) (クラボウ)は、専用培地 (DermaLife Basal Medium + DermaLife Ma Life Factors Kit) (クラボウ)を用いて培養した。細胞の継代は、Dethatch kit (クラボウ)を用いて行った。実験には、継代数3から7回のものを使用した。
メラニン量の測定
NHEMを48-well plateに1.5×104 cells/well播種した。培養24時間後、メラニン産生の基質となるL-DOPA 100μMをすべてのウェルに添加し、THGP、AA2GもしくはVCを各々単独で添加処理した。又、併用試験では、L-DOPA 100μMをすべてのウェルに添加し、THGPとAA2Gの併用もしくはTHGPとVCを併用にて添加処理した。添加培養72時間後、培養上清100μlを96-well plateに回収し、プレートリーダーを用いて、培養上清中に含まれるメラニン量を測定した。細胞内に含まれるメラニン量は、1M NaOH 200μlを細胞に加えて60℃、 20分間加熱し、メラニンを溶解後、100μlを96-well plateに移し、プレートリーダーを用いて細胞内に含まれるメラニン量を吸光度405nmで測定した。未処理群を100％としてメラニン量の割合変化を算出した。
【００３８】
結果
THGP、AA2Gの単独処理時におけるメラニン産生抑制効果の検討
NHEMにTHGPもしくはAA2Gを最終濃度0-5000μMとなるように添加し、更にL-DOPA 100μMを添加処理し、72時間培養した場合の細胞外に含まれるメラニン量を測定した。THGPは200μM以上の濃度において、有意な細胞外メラニン量の抑制効果を認め、特に1000及び5000μMではほぼ完全（5％未満）にメラニン量が抑制された(図５a)。AA2Gは40μM以上の濃度で有意な細胞外メラニン量の抑制効果を認めた(図５b)。
【００３９】
AA2GとTHGPの併用時におけるメラニン産生抑制効果の検討
NHEMにTHGPとAA2Gを併用した時の細胞外と細胞内に含まれるメラニン量を測定した。THGPとAA2Gを組み合わせることでTHGP 1000μMとAA2G 1000μM或いは5000μMの併用では高い相乗効果を認めた(図６a、図６b)。
【００４０】
結論
THGP、AA2G共に、正常ヒトメラノサイトにおいてもB16 4A5 メラノーマ細胞と同様にメラニン産生抑制効果を示した。THGPは濃度依存的に200μM以上で培地中に含まれる場合に（すなわち細胞外の）メラニン量を抑制し、特に1000μM、5000μMで高い抑制効果を示した。尚、細胞内のメラニン量では、細胞外の量程ではないが、高濃度の領域では同様のメラニン量の抑制が認められた（図５）。
【００４１】
ヒト皮膚培養モデルを用いた試験において、AA2Gの皮膚透過率は10％弱と報告されており、AA2G 2％を皮膚に塗った場合、透過率が8.5％で、メラノサイトが存在する基底層には約5000μMの濃度で到達すると予想される。THGPは皮膚に浸透し細胞内に取り込まれることが確認されているが、その浸透率については詳細には不明である。THGPについて、AA2Gの半分ほどの浸透率と仮定した場合、THGPの脱水縮合物である前記（poly-trans-[(2-carboxyethyl)germasesquioxane]）2％であれば、THGP 5000μMの濃度で基底層に到達すると考えられる。
【００４２】
又、本試験の検討では、THGP単独の時の濃度は1000、5000μMのいずれも同程度の抑制であったものの、原理からすればL-DOPA及びその代謝物との錯体形成が濃度依存でメラニンへの代謝を抑制することから、THGPに関してはより高い濃度での使用が合理的である。
【００４３】
メラニンの産生抑制は、図６bによればAA2G200〜5000μMでTHGP1000μMの時に相乗性が高く、AA2Gが5000μMにおいてはTHGP40〜1000μMのいずれの濃度でも相乗的に抑制が認められた。
【００４４】
美白剤の研究は多くなされているが、その大半がチロシナーゼ活性阻害によるメラニン産生抑制効果によるものであり、THGPは新規美白剤の基剤として非常に有用なものと考えられる。又、THGPの作用点は酵素阻害ではなく、基質(L-DOPA)との結合によるものであり、この点も他の美白剤とは異なる点である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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