(57)【要約】【課題】  標的物質を正確に検出すること、複数種の標的物質を同時に検出することを可能とする検出方法を提供する。【解決手段】  試料に含まれる標的物質を検出する検出方法であって、（ｉ）計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的物質に結合する結合部位を有する結合物質を、前記試料に添加する第１工程、（ｉｉ）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、並びに（ｉｉｉ）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的物質を検出する第３工程を有することを特徴とする検出方法。【選択図】  図１
2020180892.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる標的物質を検出する検出方法であって、
（ｉ）計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的物質に結合する結合部位を有する結合物質を、前記試料に添加する第１工程、（ｉｉ）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、並びに（ｉｉｉ）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的物質を検出する第３工程を有することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記標的物質が、抗原、酵素、及びシグナル物質からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記結合物質が、前記標的物質のリガンドである請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記結合物質が、抗原、酵素、及びシグナル物質からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記標的物質が、前記結合物質のリガンドである請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線とを比較することで、前記標的物質を検出する工程を有する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線との相関係数を算出し、前記相関係数に基づいて、前記標的物質を検出する工程を有する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線の融解温度に基づいて、前記標的物質を検出する工程を有する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
試料に含まれる標的物質を検出する試薬キットであって、
計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的物質に結合する結合部位を有する結合物質、前記計測用部位を増幅するためのプライマーペア、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項８】
試料に含まれる標的物質を検出する試薬キットであって、
前記標的物質に異なる部位で結合する２種の結合物質を含み、
前記２種の結合物質が、互いに塩基配列の異なる２種の計測用部位を３’端側に有する２種の増幅用核酸それぞれと結合し、
前記２種の計測用部位の３’端側の塩基配列が、互いに相補的であり、
さらに、前記２種の計測用部位の５’端側の塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有する２種のプライマー、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項９】
試料に含まれる標的物質を検出する試薬キットであって、
前記標的物質に異なる部位で結合する２種の結合物質Ａと結合物質Ｂとを含み、
前記結合物質Ａが、計測用部位Ａを５’端側に有し、かつ、５’末端がリン酸化されている増幅用核酸Ａと結合し、
前記結合物質Ｂが、計測用部位Ｂを３’端側に有する増幅用核酸Ｂと結合し、
前記２種の計測用部位Ａと計測用部位Ｂとが、互いに異なる塩基配列を有し、
さらに、前記計測用部位Ａの５’端側及び前記計測用部位Ｂの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有するライゲーション用核酸、前記計測用部位Ａの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有するプライマーＡ、前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一の塩基配列を有するプライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項１０】
前記酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項７又は８に記載の試薬キット。
【請求項１１】
前記酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼを含む請求項９に記載の試薬キット。
【請求項１２】
試料に含まれる標的抗原を検出する抗原検出方法であって、
（１）計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的抗原を認識する認識部位を有する抗体を、前記試料に添加する第１工程、（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、並びに（３）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的抗原を検出する第３工程を有することを特徴とする抗原検出方法。
【請求項１３】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線とを比較することで、前記標的抗原を検出する工程を有する請求項１２に記載の抗原検出方法。
【請求項１４】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線との相関係数を算出し、前記相関係数に基づいて、前記標的抗原を検出する工程を有する請求項１２又は１３に記載の抗原検出方法。
【請求項１５】
前記第３工程が、前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線の融解温度に基づいて、前記標的物質を検出する工程を有する請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の抗原検出方法。
【請求項１６】
試料に含まれる標的抗原を検出する試薬キットであって、
計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的抗原を認識する認識部位を有する抗体、前記計測用部位を増幅するためのプライマーペア、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項１７】
試料に含まれる標的抗原を検出する試薬キットであって、
前記標的抗原を異なる部位で認識する２種の抗体を含み、
前記２種の抗体が、互いに塩基配列の異なる２種の計測用部位を３’端側に有する２種の増幅用核酸それぞれと結合し、
前記２種の計測用部位の３’端側の塩基配列が、互いに相補的であり、
さらに、前記２種の計測用部位の５’端側の塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有する２種のプライマー、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項１８】
試料に含まれる標的抗原を検出する試薬キットであって、
前記標的抗原を異なる部位で認識する２種の抗体Ａと抗体Ｂとを含み、
前記抗体Ａが、計測用部位Ａを５’端側に有し、かつ、５’末端がリン酸化されている増幅用核酸Ａと結合し、
前記抗体Ｂが、計測用部位Ｂを３’端側に有する増幅用核酸Ｂと結合し、
前記２種の計測用部位Ａと計測用部位Ｂとが、互いに異なる塩基配列を有し、
さらに、前記計測用部位Ａの５’端側及び前記計測用部位Ｂの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有するライゲーション用核酸、前記計測用部位Ａの３’端側と実質的に相補的な塩基配列を有するプライマーＡ、前記計測用部位Ｂの５’端側と実質的に同一の塩基配列を有するプライマーＢ、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項１９】
前記酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１６又は１７に記載の試薬キット。
【請求項２０】
前記酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼを含む請求項１８に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出方法、特に抗原検出方法、及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に存在するタンパク質を検出する方法の１つとして、抗原抗体反応を用いるものが挙げられる。例えば、抗原を検出するために、抗原と抗原抗体反応により結合する抗体に標識した分子からの蛍光・化学発光を用いる方法（特許文献１参照）がある。また、抗体に標識した酵素と基質との反応により発生する蛍光・化学発光を用いる方法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、特許文献２参照）がある。
【０００３】
一方で、試料に含まれる目的の核酸（標的核酸）を検出するために、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により得られる標的核酸の増幅産物の生成を、融解曲線を計測することで、確認する方法がある（特許文献３参照）。融解曲線とは、２本鎖の核酸の量に対する、２本鎖の核酸が解離して得られる１本鎖の核酸の量の割合の、温度依存性を示すものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭６２−０１８８６８号公報
【特許文献２】特公平０５−００２１０７号公報
【特許文献３】特表２０１２−５０２６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、抗原を検出するために、特許文献１及び２に記載の蛍光・化学発光を用いる方法を利用して、検討を行った。一般に、蛍光・化学発光のスペクトルは、蛍光・化学発光の強度がピーク値の５０％になる波長の幅（半値幅）が広い。そのため、ブロードのスペクトル形状を見極めることが容易ではなく、それゆえ、標的抗原を正確に検出しにくいことが判明した。また、特に、複数種の目的の抗原（標的抗原）を検出する際に、複数種の標的抗原を見分けるために、複数種の色を用いる必要があるが、用いる色にも限りがあるため、複数種の標的抗原の同時検出が難しい場合があることも判明した。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、標的物質（標的抗原）を正確に検出すること、及び複数種の標的物質（標的抗原）を同時に検出することを可能とする（抗原）検出方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、標的物質（標的抗原）を正確に検出すること、複数種の標的物質（標的抗原）を同時に検出することを可能とする試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様による検出方法は、試料に含まれる標的物質を検出する検出方法であって、（ｉ）計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的物質に結合する結合部位を有する結合物質を、前記試料に添加する第１工程、（ｉｉ）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、前記第１工程で得られる前記試料に添加し、前記計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程、並びに（ｉｉｉ）前記第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、前記融解曲線に基づいて前記標的物質を検出する第３工程を有する。
【０００８】
本発明の一態様による試薬キットは、試料に含まれる標的物質を検出する試薬キットであって、計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、前記標的物質に結合する結合部位を有する結合物質、前記計測用部位を増幅するためのプライマーペア、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、標的物質（標的抗原）を正確に検出すること、及び複数種の標的物質（標的抗原）を同時に検出することを可能とする、（抗原）検出方法と試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る抗原検出方法の一例を示す図である。
【図２】本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【図４】本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【図６】本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。
【図７】本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。本発明において、試料とは、尿や血液などの、生体から採取する検体であってもよいし、精製や濃縮、検体中の検出対象物の化学修飾や断片化など、検出のための前処理を行った検体であってもよい。核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡなどが挙げられ、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明において、「実質的に同一な塩基配列」、「実質的に相補的な塩基配列」とは、２つの核酸が十分に２本鎖を形成しうる塩基配列のことを指す。塩基配列Ｘと「実質的に同一な塩基配列」の例として、塩基配列Ｘと完全同一な塩基配列、塩基配列Ｘと７５％以上の同一性を有する塩基配列、塩基配列Ｘにおいて、１〜１５個の塩基が欠失、置換、又は付加されている塩基配列が挙げられる。また、塩基配列Ｘと「実質的に相補的な塩基配列」の例として、塩基配列Ｘと完全相補的な塩基配列Ｙ、塩基配列Ｙと７５％以上の同一性を有する塩基配列、塩基配列Ｙにおいて、１〜１５個の塩基が欠失、置換、又は付加されている塩基配列が挙げられる。
【００１３】
本実施形態に係る標的物質を検出する検出方法は、以下の工程を少なくとも有する。
（ｉ）計測用部位を有する増幅用核酸が結合し、かつ、標的物質に結合する結合部位を有する結合物質を、試料に添加する第１工程
（ｉｉ）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、第１工程で得られる試料に添加し、計測用部位と相補的な塩基配列を有する計測用核酸を増幅する第２工程
（ｉｉｉ）第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、測定した融解曲線に基づいて標的物質を検出する第３工程
【００１４】
本実施形態において、第３工程は、第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線とを比較することで、標的物質を検出することができる。また、第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線との相関係数を算出し、相関係数に基づいて標的物質を検出してもよいし、融解曲線の融解温度に基づいて標的物質を検出してもよい。また、これらの方法を複数用いて標的物質を検出してもよい。ここで、相関係数とは、２つの融解曲線の類似性を定量化した指標である。例えば、上記２つの融解曲線のデータをそれぞれベクトルとし、ベクトルのすべての要素の平均値が０、ベクトルの大きさが１となるように正規化した後、その２つのベクトルの内積を相関係数とすることができる。
【００１５】
本実施形態において、標的物質は、抗原、酵素、及びシグナル物質からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。結合物質は、これらの標的物質のリガンドであることが好ましい。抗原のリガンドは、抗体であり、酵素のリガンドは、基質であり、シグナル物質のリガンドは、受容体である。また、結合物質は、抗原、酵素、及びシグナル物質からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。標的物質は、これら結合物質のリガンドであることが好ましい。
【００１６】
以下、標的物質を抗原、結合物質を抗体とした場合の例を説明する。標的物質を抗原（以下、標的抗原と呼ぶ）とした場合、標的抗原としては、タンパク質、糖、糖タンパク質などが挙げられる。
【００１７】
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態に係る抗原検出方法の一例を示す図である。本発明は、試料１０３から標的抗原１０１、１０２を検出する抗原検出方法である。図１では、標的抗原の種類が２種である場合を示しているが、標的抗原の種類は３種以上であってもよい。
【００１８】
抗原検出方法は、以下の工程を少なくとも有する。ここで、標的抗原１０１の検出には、計測用部位１０４を有する増幅用核酸１０６が結合し、かつ、標的抗原１０１を認識する認識部位を有する抗体１０８を用いることができる（図１）。標的抗原１０２の検出には、計測用部位１０５を有する増幅用核酸１０７が結合し、かつ、標的抗原１０２を認識する認識部位を有する抗体１０９を用いることができる（図１）。さらに、計測用部位１０４を有する核酸を計測用核酸１１０とし、計測用部位１０５を有する核酸を計測用核酸１１１とする。
（１）計測用部位１０４、１０５を有する増幅用核酸１０６、１０７が結合し、かつ、標的抗原１０１、１０２を認識する認識部位を有する抗体１０８、１０９を、試料１０３に添加する第１工程
（２）酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を、第１工程で得られる試料に添加し、計測用部位１０４、１０５と相補的な塩基配列を有する計測用核酸１１０、１１１を増幅する第２工程
（３）第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線を測定し、測定した融解曲線に基づいて標的抗原を検出する第３工程
抗体としては、天然に存在する抗体、天然の抗体をベースに人工的に改変した抗体、ファージディスプレイなどの進化工学的手法で作成された人工抗体や核酸アプタマーなどが挙げられる。
【００１９】
試料に標的抗原が存在すると、標的抗原が、その標的抗原を認識する認識部位を有する抗体に結合する。抗体による標的抗原の認識により、抗体が結合した増幅用核酸を鋳型として、酵素、及び、ＮＴＰ又はｄＮＴＰの存在下で、計測用部位を有する計測用核酸が増幅する。試料中に複数種の標的抗原が存在する場合は、複数種の標的抗原それぞれを特異的に認識する複数種の抗体、及び複数種の標的抗原それぞれに対応する複数種の増幅用核酸を用いる必要がある。また、増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列も、複数の標的抗原に応じて異なる塩基配列にする必要がある。
【００２０】
融解曲線とは、２本鎖の核酸の量に対する、２本鎖の核酸が解離して得られる１本鎖の核酸の量の割合の、温度依存性を示すものである。例えば、２本鎖の核酸を含む溶液の温度を上昇させる際の、物理的信号の強度（蛍光強度など）の変化を測定することで得られる。第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線、及び予め用意する計測用核酸の融解曲線を測定する際には、融解曲線を計測する色素として、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎなどのインターカレータ色素を用いることが好ましい。インターカレータ色素は、２本鎖の核酸に結合できるものの、１本鎖の核酸には結合できないため、２本鎖の核酸の解離の挙動を、蛍光強度の変化で計測できる。なかでも、ＥｖａＧｒｅｅｎは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎと比べて、蛍光強度が大きく、色素の再分布も生じにくいので、好適に用いられる。
【００２１】
第２工程で得られる計測用核酸の融解曲線、及び予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中に増幅した計測用核酸が存在する（図１（ｂ）及び（ｃ））ことが分かれば、試料中に標的抗原が存在していることを示している。一方、試料中に増幅した計測用核酸が存在しない（図１（ａ））ことが分かれば、試料中に標的抗原が存在しないことを示している。
【００２２】
＜第２の実施形態＞
図２は、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料から標的抗原２０１を検出するための試薬キット２０６である。試薬キットは、計測用部位２０４を有する増幅用核酸２０３が結合し、かつ、標的抗原２０１を認識する認識部位を有する抗体２０２を含む。さらに、試薬キットは、計測用部位２０４を増幅するためのプライマーペア２０５、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【００２３】
増幅用核酸２０３は、計測用部位２０４以外の部位で抗体２０２と結合していることが好ましい。これにより、増幅用核酸２０３と抗体２０２との結合が、計測用部位２０４の増幅反応を阻害しにくい。また、抗体２０２は、増幅用核酸２０３が結合している部位以外に、標的抗原２０１を認識する認識部位を有することが好ましい。
【００２４】
プライマーペア２０５としては、計測用部位２０４の両末端の塩基配列と、実質的に同一な塩基配列、又は相補的な塩基配列であることが好ましい。酵素としては、増幅用核酸としてＤＮＡを用いる場合は、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、増幅用核酸としてＲＮＡを用いる場合は、逆転写酵素を用いることが好ましい。
【００２５】
複数種の標的抗原を検出するためには、複数種の試薬キットを含む試薬セットを用いることが好ましい。標的抗原と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的抗原に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる抗体は、標的抗原を特異的に認識する抗体であり、各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的抗原の種類に応じて、異なる。
【００２６】
図３は、本発明の第２の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。本発明の試薬キットは、例えば、イムノＰＣＲと同様の原理で、融解曲線を測定するための計測用核酸を得ることができる。まず、標的抗原３０１を認識する認識部位を有する抗体３０５を、粒子や基板などの固相３０６に結合させる。そして、試料を加えることで、試薬キットに含まれる増幅用核酸３０３が結合した抗体３０２と、固相に結合した抗体３０５とで標的抗原３０１をサンドイッチした複合体（サンドイッチ複合体）が形成される。
【００２７】
次に、上澄みを除去・洗浄して、サンドイッチ複合体を形成していない抗体などをＢ／Ｆ分離により取り除く。さらに、試薬キットに含まれる計測用部位３０４を増幅するためのプライマーペア、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、計測用部位が増幅して、計測用部位を有する計測用核酸が得られる。得られた計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的抗原を検出できる。
【００２８】
試薬キットは、融解曲線を計測するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【００２９】
＜第３の実施形態＞
図４は、本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料から標的抗原４０１を検出するための試薬キット４１５である。試薬キット４１５は、標的抗原４０１を異なる部位４０８で認識する抗体Ａ４０３、抗体Ｂ４０５（結合物質Ａ、結合物質Ｂ）を含む。２種の抗体は、互いに塩基配列の異なる計測用部位Ａ４０９、計測用部位Ｂ４１０を３’端側に有する増幅用核酸Ａ４０２、増幅用核酸Ｂ４０４それぞれと結合する。２種の計測用部位４０９、４１０の３’端側４１１、４１２の塩基配列は、互いに相補的である。試薬キット４１５は、さらに、２種の計測用部位の５’端側４１３，４１４の塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有する２種のプライマー４０６，４０７、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【００３０】
２種の増幅用核酸４０２、４０４のそれぞれは、計測用部位４０９、４１０以外の部位で抗体４０３、４０５と結合していることが好ましい。これにより、増幅用核酸４０２、４０４と抗体４０３、４０５との結合が、計測用部位４０９、４１０の増幅反応を阻害しにくい。また、抗体４０３、４０５は、増幅用核酸４０２、４０４が結合している部位以外に、標的抗原４０１を認識する認識部位を有することが好ましい。酵素としては、第２の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【００３１】
複数種の標的抗原を検出するためには、複数種の試薬キットを含む試薬セットを用いることが好ましい。標的抗原と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的抗原に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる抗体は、標的抗原を特異的に認識する抗体であり、各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的抗原の種類に応じて、異なる。
【００３２】
図５は、本発明の第３の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。抗体５０３と抗体５０５は、標的抗原５０１の異なる部位にそれぞれ結合する。これにより、それぞれの抗体に結合する増幅用核酸５０２、５０４が互いに近接する。さらに、増幅用核酸５０２の有する計測用部位５０６の３’端側と、増幅用核酸５０４の有する計測用部位５０７の３’端側が互いに相補的な塩基配列を有することで、その相補的な塩基配列の部分で、安定して２本鎖を形成できる。
【００３３】
そして、試薬キットに含まれる酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、２種の計測用部位５０６、５０７の３’末端から核酸の伸長反応が起こる。そして、試薬キットに含まれる２種の計測用部位の５’端側の塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有する２種のプライマー、酵素、及び、ＮＴＰ又はｄＮＴＰにより、２種の計測用部位を有する計測用核酸がＰＣＲにより増幅する。得られた計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的抗原を検出できる。
【００３４】
試料中に標的抗原が存在しない場合は、２種の増幅用核酸が互いに近接しにくいので、２種の計測用核酸の３’端側の塩基配列の部分で、２本鎖を形成しにくい。そのため、２種の計測用核酸の３’末端から核酸の伸長反応が起こらない。これにより、２種の計測用部位を有する計測用核酸が増幅しない。
【００３５】
試薬キットは、融解曲線を計測するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【００３６】
＜第４の実施形態＞
図６は、本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本発明は、試料から標的抗原６０１を検出するための試薬キット６１９である。試薬キット６１９は、標的抗原６０１を異なる部位６０９で認識する抗体Ａ６０３、抗体Ｂ６０５を含む。抗体Ａは、計測用部位Ａ６１０を５’端側に有し、かつ、５’末端がリン酸化６１１されている増幅用核酸Ａ６０２と結合する。抗体Ｂは、計測用部位Ｂ６１２を３’端側に有する増幅用核酸Ｂ６０４と結合する。計測用部位Ａ６１０、計測用部位Ｂ６１２は、互いに異なる塩基配列を有する。また、試薬キットは、計測用部位Ａの５’端側６１３、及び計測用部位Ｂの３’端側６１５と実質的に相補的な塩基配列６１４、６１６を有するライゲーション用核酸６０６を含む。さらに、試薬キットは、計測用部位Ａの３’端側６１７と実質的に相補的な塩基配列を有するプライマーＡ６０７、計測用部位Ｂの５’端側６１８と実質的に同一の塩基配列を有するプライマーＢ６０８、酵素、及び、ＮＴＰ又はｄＮＴＰを含む。
【００３７】
２種の増幅用核酸６０２、６０４のそれぞれは、計測用部位６１０、６１２以外の部位で抗体６０３、６０５と結合していることが好ましい。これにより、増幅用核酸６０２、６０４と抗体６０３、６０５との結合が、計測用部位６１０、６１２の増幅反応を阻害しにくい。また、抗体６０３、６０５は、増幅用核酸６０２、６０４が結合している部位以外に、標的抗原６０１を認識する認識部位を有することが好ましい。酵素としては、第２の実施形態で挙げたもののほかに、ライゲーション反応を促進させる酵素であるＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ  Ｃｏｌｉ．ＤＮＡリガーゼなどを用いることができる。
【００３８】
複数種の標的抗原を検出するためには、複数種の試薬キットを含む試薬セットを用いることが好ましい。標的抗原と試薬キットは、１対１の対応関係にあり、複数種の標的抗原に対して複数種の試薬キットを用いる。各試薬キットに含まれる抗体は、標的抗原を特異的に認識する抗体であり、各試薬キットに含まれる増幅用核酸の有する計測用部位の塩基配列は、標的抗原の種類に応じて、異なる。
【００３９】
図７は、本発明の第４の実施形態に係る試薬キットの作用機序の一例を示す図である。抗体Ａ７０３と抗体Ｂ７０５は、標的抗原７０１の異なる部位にそれぞれ結合する。これにより、それぞれの抗体に結合する増幅用核酸Ａ７０２、増幅用核酸Ｂ７０４が互いに近接する。さらに、増幅用核酸Ａの有する計測用部位Ａ７０７、及び増幅用核酸Ｂの有する計測用部位Ｂ７０８と、実質的に相補的な塩基配列を有するライゲーション用核酸７０６が存在する。これにより、ライゲーション用核酸と増幅用核酸Ａと増幅用核酸Ｂとで安定な３者複合体が形成される。試料キットに含まれる酵素により、ライゲーション反応が生じることで、計測用部位Ａ７０７と計測用部位Ｂ７０８が連結される。さらに、試薬キットに含まれる２種のプライマー、酵素、及び、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸により、計測用部位Ａ７０７、計測用部位Ｂ７０８を有する計測用核酸がＰＣＲにより増幅する。得られた計測用核酸の融解曲線と、予め測定されている計測用核酸の融解曲線を比較することで、試料中の標的抗原を検出できる。
【００４０】
試料中に標的抗原が存在しない場合は、２種の増幅用核酸が互いに近接しにくいので、ライゲーション用核酸と２種の増幅用核酸との３者複合体が形成しにくい。そのため、２種の計測用部位を有する計測用核酸が増幅しない。
【００４１】
試薬キットは、融解曲線を計測するための色素を含むことが好ましい。色素としては、第１の実施形態で挙げたものを用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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